ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

«Всякому известно, что в способе производить анализ, предшествующий наблюдению, один ум чрезвычайно разнится от другого. Анализ этот составляет сущность акта наблюдения. Наблюдателем следует назвать не того, кто только видит находящуюся пред его глазами вещь, а того, кто видит, из каких она частей состоит. Исполнить это хорошо — есть редкое дарование. Один человек от невнимания или оттого, что надлежащим образом направляет свое внимание, не замечает половины того, что видит; другой отмечает более того, что видит, смешивая видимое с воображаемым или с выводимым; другой отмечает род всех обстоятельств, но, будучи неопытен в оценке их степени, оставляет количество каждого обстоятельства неопределенным и неизвестным; иной хотя и видит целое, но неловко делит его на части, соединяет в одну массу вещи, которые должны быть отделены, и разъединяет другие, которые удобнее было бы рассматривать как одну вещь, так что результат тот же, а иногда и хуже того, как если бы он и не пытался анализировать»^[1].

Редким аналитическим дарованием обладал А. Тардье, знаменитый судебный медик, c помощью химических методов неоднократно сумевший определить и доказать в суде случаи отравления ядами, идентификация которых и сегодня бывает затруднительна. Однако именно Тардье на основании своей огромной практики сделал заключение: «Ядов в научном смысле нет».

В практической деятельности судебные медики, судебные химики, токсикологи нередко используют термины «яд» или «ядовитое вещество». Но какое определение можно дать понятию «яд»? В начале ХIХ в. основоположник научной токсикологии Матье Джозеф Бонавентура Орфила (1787—1853), химик, физик и врач, профессор и декан медицинского факультета Сорбонны, писал: «Яд — вещество, которое в малом количестве, будучи приведенным в соприкосновение с живым организмом, разрушает здоровье или уничтожает жизнь».

Ранее, в ХV в., последователь Аристотеля, Гиппократа и Галена, выдающийся ученый Филиппус Аурелиус Теофрастос Бомбастус фон Гогенхейм (Парацельс) сформулировал основы ятрохимии:

Но задолго до Парацельса великий иранский поэт Рудаки (941 г.) написал: «Что ныне снадобьем слывет, то завтра станет ядом. И что ж? Лекарством этот яд опять сочтут больные». По мнению известного российского токсиколога Н.В. Лазарева, «яды — суть вещества, которые вызывают повреждение немеханическим путем» (1936 г.). Согласно определению судебного химика М.Д. Швайковой, «ядовитым веществом или ядом называют (условно) такое вещество, которое, будучи введено в организм в малых количествах и действуя на него при определенных условиях химически или физико-химически, способно вызвать болезнь или смерть» (1965 г.). Каждое из приведенных определений, как и множество других, можно подвергнуть критике. Авторы солидарны с мнением токсикологов, которые считают, что термин «яд» следует исключить из определений современной токсикологии и, в частности, с постулатом С.А. Куценко, что «ядом становится любое химическое вещество, если при соприкосновении с организмом оно вызвало заболевание (интоксикацию) или гибель».

В исследовательской и практической деятельности как в РФ, так и за рубежом гораздо чаще используются термины «токсикант» и «ксенобиотик» (часто как синонимы). Однако некоторое различие между этими понятиями существует.

Токсикант — это токсичное химическое вещество любой химической природы, способное нарушить гомеостаз биологической системы и оказать на нее вредное влияние при взаимодействии, вызывая повреждение или гибель.

Ксенобиотик — это чужеродное вещество, введенное любым путем в организм.

В российских научно-методических и учебных изданиях по токсикологии (Н.А. Лошадкин, С.А. Куценко, Б.А. Курляндский, В.А. Филов и др.) науку токсикологию определяют как «учение о токсичности и токсическом процессе — феноменах, регистрируемых при взаимодействии химических веществ с биологическими объектами».

Токсичность — свойство или способность химических веществ, действуя на биологические системы немеханическим путем, вызвать их повреждение или гибель.

Токсическое действие веществ, регистрируемое на популяционном и биогеоценологическом уровнях, называют экотоксическим (см. гл. 9).

Токсический процесс проявляется метаболическими, патоморфологическими, клиническими альтерациями (повреждениями), связанными с патогенетическим механизмом действия токсичного вещества. Развитие токсического процесса обусловлено действием многих факторов. Проявления токсического процесса изучают на молекулярно-генетическом, клеточном, органном, организменном и популяционном уровнях. На организменном уровне токсические процессы классифицируют как процессы, формирующиеся по пороговому (интоксикация) или беспороговому (тератогенез) принципу. Последний имеет вероятностный характер.

Интоксикация (отравление) — это нарушение функций организма под влиянием токсиканта, которое может привести к расстройству здоровья или смерти. Интоксикации могут быть острыми, подострыми и хроническими.

Острая интоксикация развивается в результате однократного или повторного действия веществ в течение ограниченного времени, подострая — в результате непрерывного или прерываемого во времени действия токсиканта продолжительностью до 3 мес, хроническая — в результате продолжительного действия токсиканта (иногда в течение многих лет).

По степени тяжести интоксикацию подразделяют на тяжелую (угрожающую жизни), средней тяжести (необратимое повреждение органов и систем, приводящее к инвалидности, длительному течению заболевания, тяжелым осложнениям) и легкую (заканчивается полным выздоровлением пострадавшего).

Действие токсиканта может быть местным (процесс развивается непосредственно на месте аппликации токсиканта), общим (в процесс вовлекаются многие органы и системы) и избирательным (специфическое поражение органа или системы, имеющих низкий порог чувствительности к токсиканту).

В токсикологии, гигиене, экологии, медицине труда приняты нормативы допустимого воздействия химических веществ, находящихся в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе, воде и так далее, нормативы допустимых выбросов и сбросов химических, в том числе радиоактивных, веществ. Это юридически утвержденные дозы веществ, признаваемые для человека безопасными в повседневной жизни, на производстве, в аварийных ситуациях. Они рассчитываются на основе принятия концепции пороговости. Дозу, ниже которой современными методами исследования нельзя обнаружить действие токсиканта на биообъект, принято считать пороговой дозой.

Зависимость доза–эффект, т. е. зависимость наблюдаемого изменения в системе от содержания токсичного вещества в ней или в объектах окружающей среды, распространяется на все уровни организации биосистем.

Зависимость доза–ответ — это частота встречаемости наблюдаемых отклонений (ответов), достоверно отличающихся от нормальных уровней в изучаемой биосистеме, в зависимости от дозы токсиканта, поступившего в систему, или содержания токсиканта в объектах окружающей среды.

Основным параметром зависимости доза–эффект для конкретного токсиканта и определенного биообъекта является величина среднеэффективной дозы (ED₅₀) вещества, при действии которой на объект развивается эффект, составляющий 50% максимально возможного.

В клинико-токсикологических и судебно-химических исследованиях интерпретация аналитических результатов как юридического ответа невозможна без сравнительной оценки полученных данных с общепринятыми и представленными в справочной литературе терапевтическими, токсическими или летальными концентрациями веществ в биожидкостях и тканях человека.

Терапевтическая концентрация — это концентрация лекарственного вещества в крови (сыворотке или плазме) человека, при которой препарат оказывает эффективное клиническое действие без значительных побочных эффектов. Токсическая концентрация — это концентрация лекарственного или другого химического вещества в крови (сыворотке или плазме) человека, при которой появляются значительные токсические симптомы. Летальная концентрация — это концентрация лекарственного или другого химического вещества в крови (сыворотке или плазме) человека, которая вызывает смерть или настолько превышает терапевтическую или токсическую концентрацию, что может вызвать смерть. Летальные концентрации веществ в крови трудно установить. Смерть может быть объяснена комплексом различных факторов: отравлением на фоне склеротического поражения органов, интоксикацией на фоне синдрома абстиненции и др.

Знание физико-химических свойств токсикантов позволяет оценить многообразие их химических превращений, происходящих в организме, в том числе при взаимодействии со структурой-мишенью (см. гл. 2), выбрать способ обнаружения и количественного определения токсиканта в биосредах (см. гл. 4) и при необходимости — методы детоксикации.

Химические вещества характеризуются разной токсичностью, которая может различаться в тысячи и десятки тысяч раз. Токсичность вещества определяется его природой. Взаимосвязь структуры вещества с его физическими и химическими свойствами изучают биоорганическая и бионеорганическая химия.

Можно выделить многие свойства токсиканта, влияющие на его токсичность, однако ни одно из них не будет определяющим, так как биоактивность вещества проявляется при его взаимодействии с рецептором. Что же следует понимать, говоря о связи структура–токсичность (активность)?

Действие токсиканта представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Ассоциация токсиканта с рецептором — лишь начальный этап реализации биологической активности, за которым следуют дальнейшие события, которые в конечном счете могут проявиться в виде интоксикации (см. гл. 2). В связи с этим о влиянии строения вещества на его действие уместно говорить, только если рассматривается действие на рецептор.

Трудами многих выдающихся ученых ХХ в., в том числе и наших соотечественников, предложена обобщенная концепция регуляторных механизмов функций клетки. «Рецепторы — это генетически детерминированные мобильные, лабильные, главным образом белковые структуры, функции которых заключаются в “узнавании” химического сигнала и последующей его трансформации в адекватный ответ клетки» (П.В. Сергеев, 1999). Первоначально происходит «узнавание» рецептором соответствующего лиганда, которое характеризуется специфическим взаимодействием молекул-партнеров с высоким сродством друг к другу. В результате этого взаимодействия реализуется вторая функция рецепторов — трансформация полученного сигнала в биохимическую и затем в физиологическую реакцию живых систем. Рецепция, обеспечивающая восприятие и передачу информации клетке для формирования адекватной ответной реакции при воздействии кого-либо химического сигнала, является важнейшим гомеостатическим механизмом на клеточном и субклеточном уровнях. Большинство рецепторов представляют собой белки, их агрегаты и комплексы с нуклеиновыми кислотами или определенные низкомолекулярные вещества (см. гл. 2). Химический агент реализует свой эффект через взаимодействие с рецептором, который располагается либо на поверхности клетки, либо в одном или нескольких участках внутри нее. В ответ на возбуждение рецептора изменяется функция многих клеточных органелл и метаболических систем.

Существуют различные классификации рецепторов. Возрастающий уровень знаний в области биохимии и топографии рецепторов отражается и в их ранжировании. Информация об агонистах и антагонистах рецепторов, их клеточной локализации и сопряженности с биоструктурами приведена в гл. 2, 6–10.

По принципу выполняемых функций рецепторы делят на две группы:

Деление на основные рецепторы и рецепторы-модуляторы достаточно условно, кроме того, основные рецепторы могут функционировать и взаимосвязанно. Рассмотрение только одного типа рецепторов недостаточно для понимания всех возможностей регуляции интегрального ответа клетки.

Рецепторы не метаболизируют токсикант, а сами претерпевают обратимые химические изменения, вызывающие последующие ступенчатые химические процессы, которые, в свою очередь, и приводят к определенному (например, токсическому) конечному эффекту.

Длительность и селективность взаимодействия токсиканта и рецептора определяются особенностями их химической природы, а также видом связей между ними. Между рецептором и токсикантом могут возникать ковалентные, водородные, ионные связи, диполь-дипольное или дисперсионное взаимодействие. Образование или разрыв любой из этих связей — химическая реакция, протекающая с заметным изменением энергии.

Прочную ковалентную связь с рецепторами токсиканты образуют редко. Чаще происходит образование клатратов, представляющих собой физическое включение молекул токсикантов в «карманы» (изгибы) молекул биополимера. Проявлению клатратного эффекта в значительной мере способствует образование нековалентных связей. Если (в большинстве случаев) проявление биологического эффекта не связано с образованием ковалентной связи, то метаболизм токсиканта всецело определяется разрывом ковалентных связей в его молекуле. Разновидностью ковалентной связи является координационная связь, образование которой часто происходит во многих биохимических реакциях. Это связано с процессами синтеза, преобразования и разложения белков, реальную возможность протекания которых, их направление и скорость нередко обусловливают ионы металлов (см. гл. 7). Например, летальное действие цианид-ионов вызвано образованием координационной связи с центральным атомом железа, хелатированным в порфирине (гемы).

Водородные связи образуются лишь при очень малом расстоянии между взаимодействующими атомами и строго ориентированы в пространстве, поэтому они обладают высокой избирательностью и направленностью, что крайне важно при связывании токсиканта с рецептором. Эти связи во многом ответственны за формирование пространственной структуры биополимеров (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) и протекание важнейших биохимических процессов.

Электростатические взаимодействия (с большим радиусом действия) также играют существенную роль при взаимодействии токсикантов с рецепторами. Этот тип связей обеспечивает легкость обмена ионов. Прочность ионной связи уменьшается обратно пропорционально квадрату расстояния между разноименными зарядами, не имея строгой направленности в пространстве. В биологических средах, содержащих много конкурирующих гидратированных ионов, продолжительность существования таких связей может составлять 10^–5 с именно вследствие ионного обмена.

Электростатическое взаимодействие между токсикантом и рецептором тем не менее может существовать в течение длительного времени, особенно если расстояние между ними способствует образованию еще и короткодействующих ван-дер-ваальсовых сил, таких как диполь-дипольное и дисперсионное взаимодействия. Энергия диполь-дипольного взаимодействия обратно пропорциональна III степени расстояния между частицами. За счет электростатического притяжения могут возникать также связи между диполями и ионами. Дисперсионное взаимодействие возникает между неполярными молекулами в тех случаях, когда структура двух молекул дает им возможность подойти друг к другу на достаточно близкое расстояние. Врéменные (наведенные) диполи, образующиеся в молекулах за счет колебательной энергии, индуцируют диполи в других, соседних молекулах, что в конечном счете и приводит к возникновению притяжения между ними. Дисперсионные взаимодействия проявляются сильнее между молекулами с длинными цепями. Таким образом, в результате тесного контакта агента с рецептором между ними могут возникнуть достаточно прочные дисперсионные взаимодействия. Энергия дисперсионного взаимодействия изменяется обратно пропорционально VI степени расстояния между молекулами. Наличие в молекуле токсиканта ионизированной группы способствует сближению молекул до расстояния, на котором начинают действовать ван-дер-ваальсовы силы. Этот тип связи, по-видимому, имеет первостепенное значение в соединении токсиканта с рецептором.

Две молекулы могут быть связаны друг с другом ионными силами в одной точке и ван-дер-ваальсовыми — в другой, как, например, при интеркалировании токсикантом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (см. гл. 2), что значительно повышает прочность связи. Например, ряд лекарственных препаратов (рубомицин, адриамицин, акрихин, хингамин и др.), имея плоскую часть молекулы, интеркалируют в ДНК, вклиниваясь между пáрами оснований. Такой комплекс стабилизируется ван-дер-ваальсовыми силами, ионными связями с фосфатными группами ДНК (например, с карбкатионами токсиканта), координационными связями и другими, что препятствует расплетанию цепей ДНК и ее нормальному функционированию.

Теория рецепторных взаимодействий хорошо объясняет тот факт, что одна и та же химическая группа в зависимости от своего химического окружения может обусловливать действие как агониста, так и антагониста [например, ацетилхолина (АХ) и тубокурарина]. Агонисты возбуждают рецепторы, антагонисты блокируют их. При действии на один и тот же рецептор меньшая молекула точно соответствует участку связывания и активирует его, тогда как бóльшая молекула, перекрывая рецептор, оказывает блокирующее действие.

Для проявления биологического действия наиболее важные свойства — распределение электронной плотности и пространственное строение молекулы токсиканта. От распределения электронной плотности зависит способность молекулы к ионизации, облегчающей или препятствующей взаимодействию вещества с рецептором. Стерические свойства молекулы определяют степень ее комплементарности к рецептору. Например, ионы Сu²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺ и ряда других металлов эффективно конкурируют с протонами за атом азота (серы, кислорода) в содержащих донорные атомы лигандах. Стерические особенности образуемых комплексов способствуют увеличению их проницаемости через клеточные мембраны и модулируют доступность подобных комплексов для разнообразных клеточных рецепторов. Токсичность многих лекарственных веществ, имеющих в составе молекул атомы азота, серы и кислорода, объясняется способностью хелатировать ионы металлов (см. гл. 7).

Многие токсиканты имеют в своих молекулах асимметрические атомы углерода и существуют в виде стереоизомеров, часто (но не всегда) проявляющих различную активность (токсичность). Энантиомер с более высоким сродством к рецептору называется эутомером, противоположный — дистомером (от греч. eu — хороший и dis — плохой). Левовращающий изомер адреналина (эутомер) в 15 раз активнее своего оптического правовращающего антипода (дистомера). Один из синтетических аналогов каннабиноидов (левовращающий изомер) проявляет в 4000 раз более высокую психотропную активность, чем его правовращающий энантиомер и приблизительно в 100 раз более высокую, чем природный (3R, 4R)(-)-Δ¹-тетрагидроканнабинол (ТГК, см. гл. 6).

Известен принцип трехточечного взаимодействия: в рецепторе имеются три группировки атомов, благодаря которым возможно связывание комплементарных атомных групп (атомов) хирального токсиканта. Поэтому только один из энантиомеров может связываться с рецептором полностью (другой может объединиться с рецептором лишь двумя атомными группами).

Различный биологический эффект при взаимодействии рецептор–токсикант может наблюдаться при связывании либо с тремя, либо с двумя лигандами. Достоверно прогнозировать ожидаемую активность энантиомеров, рацематов, π-диастереомеров или других стереоизомеров, различных конформеров токсикантов можно только при изучении механизма образования связи с определенным рецептором или рецепторами.

Рецепторы и токсиканты могут изменять конформации друг друга. Конформации рецепторов (например, гликолипидных) клеточных мембран человека изменяются под действием токсикантов, например некоторых бактериальных токсинов. Взаимодействие токсина с нерецепторной частью гликолипида не вызывает конформационных изменений в мембране. Другие химически родственные гликолипиды могут инактивировать токсины, конкурентно ингибируя их связывание с рецепторными молекулами.

Конформационные изменения передают приносимую биополимерами информацию через клеточную мембрану. Одни токсиканты имеют жесткую структуру, а другие могут деформироваться под действием рецептора. В свою очередь, это может вызвать такую деформацию белкового рецептора, что токсикант входит в им же созданную в рецепторе полость («индукция соответствия»). Принцип «индукции соответствия» может как повышать, так и значительно снижать токсическое действие вещества.

Степень ионизации токсиканта (в той или иной среде организма) определяет его всасывание в определенных отделах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), взаимодействие с катионными или анионными центрами рецепторов, проникновение через различные типы мембран, распределение в тканях и жидкостях организма, а также возможность выделения из биообъектов при ХТА (см. гл. 3 и 4). Она теоретически зависит от двух основных параметров: рН среды и рK_а токсиканта. При реальных значениях рН биожидкостей степень ионизации токсиканта зависит от многих факторов: липофильности, способности к специфической или неспецифической сольватации за счет диполь-дипольных или дисперсионных взаимодействий соответственно, поверхностной активности, окислительно-восстановительных превращений; комплексообразования с белками, металлами и др. (см. гл. 3 и 4). Взаимодействия токсикантов различной химической природы с определенными рецепторами обсуждаются во второй части книги при изложении характеристик отдельных групп токсичных веществ.

Используют различные классификации токсичных веществ: общие, основанные на принципе, пригодном для всех химических веществ (например, по классу опасности), и специальные, отражающие связь между отдельными физико-химическими или другими свойствами веществ и проявлениями токсичности этих веществ.

Согласованная на глобальном уровне система классификации и маркировки химических веществ (СГС) разработана Международной организацией труда (МОТ), Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) и Организацией Объединенных Наций (ООН) на основе постановления Конференции ООН по окружающей среде и развитию (ЮНСЕД) в 1992 г. в Рио-де-Жанейро. В СГС предусматривается классификация химических веществ в зависимости от класса опасности и предлагаются согласованные элементы указания на опасность, включая маркировочные знаки и информационные карточки безопасности. Цель СГС — обеспечить наличие информации о физических опасностях и острой токсичности химических веществ, чтобы улучшить систему защиты здоровья людей и окружающей среды. СГС служит основой для согласования норм и правил, касающихся химических веществ, на национальном, региональном и мировом уровнях. Последняя редакция системы СГС была принята в 2002 г. в Йоханнесбурге на Саммите ООН по устойчивому развитию.

Понятие о биологических маркерах

Биомаркер (биологический маркер) — это измеряемое содержание токсиканта или его метаболитов, находящихся в организме, а также событие, происходящее в биологической системе, отражающее воздействие токсиканта.

Определение индивидуальных реакций организма на воздействие токсиканта до получения достоверно фиксированных морфологических или токсикологических изменений способствует ранней диагностике повреждений, вызванных химическим веществом (см. гл. 2). Обычно выделяют три вида биологических маркеров: биомаркеры воздействия, биомаркеры эффекта и биомаркеры чувствительности.

Биомаркеры используют с целью:

Биомаркеры воздействия и эффекта являются доклиническими индикаторами аномалий, между ними не существует четкого разграничения.

Биомаркеры воздействия

Биомаркер воздействия — это токсикант или его метаболиты, присутствующие в биосубстратах человека.

В качестве биомаркеров воздействия широко используются аддукты ДНК — продукты взаимодействия токсикантов или их метаболитов со структурными фрагментами ДНК. Аддукты ДНК могут быть обнаружены в клетках крови или тканей, а специфические фрагменты ДНК могут выводиться с мочой (см. гл. 2). Другие макромолекулы также могут образовывать аддукты или окисляться, например, при действии ряда токсикантов происходит образование аддуктов гемоглобина с аминокислотами^[2].

Современные аналитические методы (см. гл. 5) позволяют достоверно регистрировать биомаркеры воздействия в биологическом материале.

Биомаркеры эффекта

Биомаркер эффекта — это эндогенный компонент клетки или измерение нарушения функции органа (системы органов) или индикаторы нарушения гомеостаза организма или системы органов, на которые оказано воздействие.

Биомаркеры эффекта делят на специфические и неспецифические. Специфические биомаркеры указывают на биологический эффект конкретного воздействия (например, повышенное содержание карбоксигемоглобина в крови при вдыхании угарного газа, изменение содержания цинк-протопорфирина в эритроцитах при избыточном поступлении в организм соединений свинца и других, см. ниже и гл. 6–10).

Неспецифические маркеры не указывают на конкретную причину эффекта, но отражают общий, комплексный ответ организма. Например, оксидативный стресс, который вызывают многие токсиканты различной химической природы, сопровождается изменением активности ряда ферментных систем и накоплением продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) (малонового диальдегида, β-микроглобулина и др.).

Белки теплового шока (БТШ) (стрессорные белки, или белки стресса) часто образуются в ответ на различные вредные воздействия, в том числе химические (см. гл. 2). Выведение с мочой белков с малой молекулярной массой, таких как альбумин, может быть использовано в качестве биомаркера ранней стадии поражения почек. Однако проявление нефротоксичности может сопутствовать действию гемато- или гепатоксикантов (см. ниже).

Качественные (выявление биомаркеров) и количественные характеристики метаболических процессов при действии конкретных токсикантов с учетом индивидуальных гено- и фенотипов являются практическими задачами современных технологий — метаболомики и метабономики (см. гл. 2).

Индивидуальные особенности организма обусловливают различные последствия воздействия малых доз потенциально вредных веществ для здоровья. Поэтому используют другой надежный (специфический) способ оценки эффекта воздействия токсиканта — генную диагностику, преимущества и трудности которой изложены в главе 2.

Примеры биомаркеров воздействия и биомаркеров эффекта, используемых в токсикологических исследованиях, приведены в табл. 1.1.

Биомаркеры чувствительности

Биомаркер чувствительности — это индикатор чувствительности человека к эффекту токсиканта, его метаболитов или группы подобных соединений.

Гиперчувствительность может быть вызвана как наследственными причинами, так и течением хронических и/или инфекционных заболеваний либо факторами окружающей среды. Особое внимание уделяется генетически обусловленной чувствительности. Например, окисление чужеродных химических веществ осуществляется главным образом ферментами, принадлежащими к семейству цитохрома Р450 (см. гл. 2 и 3). Другие ферменты путем конъюгации способствуют водорастворимости метаболитов (N-ацетилтрансфераза, глутатион-S-трансфераза и др.). Активность этих ферментов контролируется генетически и варьирует в широких пределах. Поэтому восприимчивость к воздействию конкретного токсиканта связывают с генетической предрасположенностью. Однако люди, страдающие хроническими заболеваниями, более чувствительны к действию профессиональных или экотоксикантов, чем здоровые. Если заболевание или предыдущее воздействие токсичных химических веществ вызвало субклиническое поражение органов, то сопротивляемость новым токсическим воздействиям будет ниже. В этом случае биохимические показатели функций органов могут быть использованы как биомаркеры восприимчивости. Индивидуальные привычки (курение, алкоголь) и принимаемые лекарства также могут вызывать повышенную восприимчивость к действию токсиканта. Например, при курении сигарет в организм обычно попадает значительное количество кадмия. У курильщика повышается риск развития заболеваний почек в случае профессионально обусловленного воздействия кадмия.

Существует ряд ограничений при выборе и использовании биомаркеров, а также интерпретации данных, полученных с их участием. В первую очередь это влияние генетических факторов. Многие биомаркеры были определены в опытах на животных, и токсико-кинетическая модель далеко не всегда может быть перенесена на человека (пример — трагические последствия использования талидомида). Применение биомаркеров нецелесообразно для оценки воздействия химических веществ с коротким жизненным циклом in vivo. Некоторые химические вещества могут депонироваться и длительное время не оказывать повреждающего действия либо оказывать воздействие на органы и системы, оценка которого с использованием биомаркеров затруднена [например, определенное воздействие на центральную нервную систему (ЦНС)]. Использование новых технологий (метаболомики, метабономики) направлено и на поиск новых биомаркеров (см. гл. 2 и 5). Так, ученые выявили два специфических белка-биомаркера, возможно, способных помочь в диагностике психических заболеваний. Образцы цереброспинальной жидкости больных шизофренией и психическими расстройствами, в том числе вызванными рядом токсикантов, были исследованы с помощью тандемных методов ВЭЖХ-МС-МС-ЯМР ^[4] (см. гл. 5). Структура одного из маркеров установлена — это транстиретин (transthyretin).

Очень важно знать путь введения токсиканта, который определяет наличие (преобладание) в биологических жидкостях тех или иных метаболитов токсиканта, эндогенных маркеров воздействия и влияет на интерпретацию полученных результатов (см. гл. 4 и 5).

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости учета многих факторов для адекватной интерпретации результатов и получения достоверных выводов при оценке степени воздействия ксенобиотиков. К таким факторам относятся знание закономерностей токсикокинетики, механизма взаимодействия между токсикантом и мишенью биосистемы, а, следовательно, структурно-функциональных особенностей органов и систем организма, наиболее активно участвующих в метаболизме ксенобиотиков и подвергающихся их сильному воздействию. Поэтому при изложении свойств отдельных токсикантов (см. гл. 6–10) будут обсуждаться и виды токсичности.

Гепатотоксичность

Гепатотоксичность — это свойство токсикантов при действии на организм немеханическим путем вызывать структурные и/или функциональные нарушения печени.

Промышленные токсиканты, лекарственные средства, природные токсины, экотоксиканты, алкоголь, технические жидкости и многие другие ксенобиотики вызывают разнообразные по клиническим проявлениям и механизмам развития патологические изменения в печени, ранняя диагностика которых затруднена. Профилактика повреждений печени, вызываемых действием токсиканта, малоэффективна. Многие лекарственные средства способны вызывать разнообразные поражения печени, что является одной из наиболее распространенных причин изъятия из обращения ранее одобренных к применению лекарственных препаратов. Частота лекарственных поражений печени неодинакова в разных странах. В России острые медикаментозные поражения печени выявляются у 2,7% госпитализированных больных и чаще всего связаны с приемом противотуберкулезных, антибактериальных, аналгетических, гормональных, цитостатических, гипотензивных и антиаритмических средств. В Англии первое место в этиологии печеночной недостаточности занимает парацетамол. В США ежегодно острые отравления парацетамолом, требующие госпитализации, регистрируются с частотой 29 на 100 000 населения, в Израиле — 57, в Великобритании — 200 на 100 000 населения.

К сожалению, большинство токсических поражений печени протекает скрыто, клинически их трудно отличить от других заболеваний печени. Если лекарственное поражение печени вовремя не диагностировано и прием медикаментов продолжается, тяжесть поражения многократно возрастает. Смертность при токсических гепатопатиях достигает 5%, при отравлениях парацетамолом даже в невысоких дозах (4–12 г) — 19%.

Гепатотоксичность свойственна большому числу соединений различной химической природы (табл. 1.2).

Большой перечень только классов химических веществ, обладающих гепатотоксичностью, вполне объясним. Печень — основной орган, ответственный за биотрансформацию абсорбированных во внутреннюю среду ксенобиотиков. Биотрансформация токсикантов осуществляется посредством химических реакций различного механизма действия (см. гл. 3), следствием которых нередко является повреждение печени.

Вещества, вызывающие поражение печени, можно разделить на две группы.

Патологические состояния печени, обусловленные действием химических веществ различной природы, классифицируют как цитотоксические или холестатические.

Часто поражения печени химической этиологии имеют смешанную форму. Предшествующие повреждения печени алкоголем повышают чувствительность к гепатотропным ядам. Токсический эффект усиливается при вирусной и бактериальной инфекции, дефиците белков в пище. Типы поражения печени зависят от природы химического вещества и продолжительности действия.

Различают прямое и опосредованное действие токсикантов на печень.

Механизм стимуляции аутоиммунных процессов, развивающихся вследствие взаимодействия токсиканта с макромолекулами белка клеток печени, изучен недостаточно (например, повреждение печени при хроническом алкоголизме).

Гематотоксичность

Кровь — особая разновидность ткани мезенхимного происхождения, образующая вместе с лимфой внутреннюю среду организма.

Основные функции крови:

Гематотоксичность — это свойство токсикантов при действии на организм немеханическим путем избирательно нарушать функции клеток крови или ее клеточный состав.

Виды гематотоксичности представлены в табл. 1.3.

Снижение числа форменных элементов одного типа при интоксикациях встречается редко. Например, гранулоцитопения (агранулоцитоз) может возникнуть при химиотерапии цитостатиками, антибиотиками (левомицетином), противовоспалительными средствами (бутазолидином). Апластическую анемию, лейкемию, агранулоцитоз, тромбоцитопению токсического происхождения констатируют в случаях, когда сокращение количества определенного типа клеток является основным признаком отравления.

В табл. 1.4 приведены примеры химических соединений, способных проявлять гематотоксичность.

Нефротоксичность

Нефротоксичность может быть следствием как прямого воздействия токсикантов и/или их метаболитов на клеточные структуры почки или мочевого пузыря, что сопровождается выделением специфических биомаркеров, связанных с поврежденным сегментом, так и опосредованного действия химических веществ.

Нефротоксичность — это свойство токсикантов при действии на организм немеханическим путем вызывать структурно-функциональные нарушения почек.

Причины, которые вызывают повреждение почек, могут иметь преренальный (нарушение гемодинамики — снижение гемоперфузии почек и др.), ренальный (повреждение ткани почек) или постренальный (закупорка дистальных канальцев нефрона) характер.

К органам мочевой системы относятся почки, мочеточники, мочевой пузырь и мочеиспускательный канал. Почки — мочеобразующие органы, остальные — мочевыводящие пути.

В табл. 1.5 приведены вещества, вызывающие острую и хроническую почечную недостаточность.

Особую роль в оценке токсического действия вещества играет индивидуальная восприимчивость человека, т. е. генетическая основа дифференциальной реакции на химические вещества, содержащиеся в лекарствах, пище и загрязнителях окружающей среды. Получение достоверной информации о генетически предопределенном многообразии ферментов, участвующих в метаболизме токсикантов, позволяет надежно оценивать токсический риск, связанный с применением многих лекарств или других ксенобиотиков (см. гл. 2). Однако на практике пока часто используют разнообразные, но неспецифичные тесты: определение плотности и рН мочи, содержание сахара в крови и моче, оценка скорости гломерулярной фильтрации по концентрации креатинина и мочевины в крови, клиренса креатинина, инулина, меченных изотопами соединений, определение состояния канальцевых функций, микроскопия мочи и др.

Необходимость диагностики субклинических форм почечной патологии химической этиологии повсеместно признается врачами-токсикологами, экологами, профпатологами как актуальная задача профилактики острой и хронической почечной недостаточности. Дальнейшее развитие и широкое использование новых технологий — метаболомики и метабономики (см. гл. 2 и 5) сделает эту задачу выполнимой.

Дерматотоксичность

Кожа образует внешний покров тела и составляет около 20% общей массы человека. К производным кожи относят волосы, ногти, потовые, сальные и молочные железы. Кожа состоит из двух частей: эпителиальной (эпидермис) и соединительнотканной (дерма с сосочковым и сетчатым слоями). Гиподерма — подкожная жировая клетчатка — соединяет кожу с нижележащими тканями и состоит из рыхлой сети коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон, в петлях которых располагаются дольки жировой ткани — скопления крупных жировых клеток.

Дерматотоксичность — это свойство токсикантов при действии на организм немеханическим путем вызывать повреждение кожных покровов.

Кожа выполняет ряд чрезвычайно важных физиологических функций, к которым относятся:

Токсиканты могут воздействовать на кожу непосредственно при контакте и вызывать контактный дерматит или проникать в кожу через кровь при других (кроме трансдермального) способах введения, вызывая токсидермию.

Контактный дерматит может быть обусловлен как иммунными, так и неиммунными механизмами. В первом случае говорят об аллергическом контактном дерматите, во втором — о простом контактном дерматите. Контактный дерматит составляет 10% всех кожных болезней и более 90% профессиональных кожных болезней. Простой контактный дерматит встречается гораздо чаще, чем аллергический. Контактный дерматит могут вызвать фототоксические и фотоаллергические реакции, при которых поражение кожи возникает под действием химического вещества или аллергена и солнечных лучей.

Простой контактный дерматит обусловлен прямым повреждением эпидермиса. Из поврежденных клеток высвобождаются медиаторы воспаления и факторы хемотаксиса, вызывающие расширение сосудов (эритема), выход жидкости в дерму и эпидермис (отек и волдырь) и клеточную инфильтрацию. В пораженном участке сначала выявляется лимфоцитарная, затем нейтрофильная инфильтрация. Наблюдается внеклеточный и внутриклеточный отек эпидермиса. Простой контактный дерматит, вызванный однократным воздействием на кожу едкого вещества, например сильной кислоты или щелочи, называют химическим ожогом. При химическом ожоге воспаление развивается в течение нескольких минут или часов. Более легкая форма простого контактного дерматита возникает при многократном воздействии слабого раздражающего вещества, например моющего средства, и может проявиться через несколько недель или месяцев после первого контакта с этим веществом. Некоторые вещества могут вызывать как простой, так и аллергический контактный дерматит.

Аллергический контактный дерматит обычно обусловлен аллергическими реакциями замедленного типаВ отличие от других типов аллергических реакций, в аллергических реакциях замедленного типа антитела не участвуют. Эти реакции обусловлены взаимодействием T-лимфоцитов с антигеном, которые могут возникать при непосредственном контакте кожи с аллергенами. Аллергические реакции замедленного типа развиваются лишь на вещества с молекулярной массой более 5000 Д, а неповрежденный роговой слой эпидермиса проницаем только для веществ, молекулярная масса которых не превышает 500 Д. Поэтому, чтобы вызвать аллергическую реакцию замедленного типа, низкомолекулярные вещества должны связаться с тканевыми белками и образовать антиген, который после взаимодействия с внутриэпидермальными макрофагами (клетками Лангерганса) подвергается атаке T-лимфоцитов. Стимулированные антигеном T-лимфоциты секретируют интерлейкин-2 (фактор роста Т-клеток), который индуцирует их пролиферацию. Активированные T-лимфоциты мигрируют по лимфатическим сосудам в регионарные лимфатические узлы. Часть T-лимфоцитов принимает участие в иммунном ответе, остальные превращаются в клетки иммунологической памяти — Т-клетки памяти. После первого контакта с аллергеном происходит накопление распознающих его T-лимфоцитов, которое длится обычно 10–14 сут. После этого T-лимфоциты выходят из регионарных лимфатических узлов в кровь и заселяют все периферические органы иммунной системы. При повторном контакте с аллергеном происходит активация Т-клеток памяти и более быстрое накопление клеток-эффекторов аллергической реакции замедленного типа — макрофагов и лимфоцитов CD4 и CD8^[10].

Фототоксические и фотоаллергические реакции. По патогенезу фототоксические реакции сходны с простым контактным, а фотоаллергические — с аллергическим контактным дерматитом. Однако для развития фототоксических и фотоаллергических реакций необходимо действие УФ-излучения. Вещества, вызывающие фототоксическую реакцию, под действием УФ-излучения расщепляются с образованием токсичных продуктов, а вещества, вызывающие фотоаллергическую реакцию, связываются с эндогенными белками-носителями. Фототоксические и фотоаллергические реакции проявляются такими же гистологическими изменениями, как простой и аллергический контактный дерматит.

Основной механизм развития токсидермии аллергический, реже встречается токсическая реакция (например, на недоброкачественные продукты питания, препараты ртути, мышьяка).

При токсидермии наблюдаются повышение активности δ-аминолевулиновой кислоты и тирозиназы, образование реакционноспособного промежуточного соединения фермента с порфириногеном, вызывающего порфирию, изменение обмена глюкокортикоидов, повышение активности гормонов этой группы, сенсибилизация к их действию соответствующих цитозольных и ядерных рецепторов тканей организма, избыточный синтез кератогиалина.

Причиной развития токсикодермии являются продукты питания, химические вещества (производственные и бытовые), обладающие аллергенными и/или токсическими свойствами и поступающие в организм главным образом через пищеварительный тракт или дыхательные пути, либо лекарственные препараты, которые могут быть введены внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутривагинально, уретрально, ректально (табл. 1.6).

Способы детоксикации

«Все заболевания есть отравления, лечение — антидотная терапия», — кредо медицины Средних веков. «Antidotarium of Nieolaus» — первый аналог современной фармакопеи; в XVII столетии «Antidota Specifia» — настольная книга европейского врача.

В настоящее время вместо господствующего в 50-х годах ХХ в. антидотного принципа лечения отравлений разработан комплексный метод эфферентной терапии и стимуляции естественной детоксикации организма. Характерные особенности течения отравления, механизмы формирования эндотоксикоза в токсикогенной стадии острых отравлений, а также результаты клинико-токсикологического анализа биологических сред являются основой для выбора врачом-токсикологом метода лечения и вещества (при необходимости), используемого в качестве детоксиканта (антидота).

В апреле 2022 г. ученые опубликовали результаты секвенирования, или «прочтения» последних 8% (а это 151 млн пар нуклеиновых оснований!) генома человека, которые оставались еще неизученными и рядом исследователей даже назывались как «мусорная ДНК». Оказалось совсем не так! В результате появилось новое понимание того, как делятся клетки, а следовательно, и ключ к изучению причин ряда тяжелых заболеваний. Расшифровкой занимались ученые из более чем 30 стран, включая Россию. Так, канд. биол. наук И. Александров и группа ученых под руководством Е. Рогаева внесли значительный вклад в изучение центромер, играющих важную роль в процессе деления ядра клетки и в контроле экспрессии генов.

«Внешние факторы сами по себе не создают в организме специфических изменений. Но последние возникнут с неизбежностью, когда внешний фактор найдет себе специфическое, т. е. адекватное, функциональное и морфологическое, преломление. Этим именно путем в организме возникли и закреплялись те или иные структуры и приспособительные устройства», — писал один из основоположников русской школы патологической анатомии академик И.В. Давыдовский (1962). Организм — сложная динамическая полилигандная и полиметаллическая система, для функционирования которой необходимо поддержание металлолигандного гомеостаза (МЛГ). Токсиканты — химические факторы нарушения гомеостаза. Изменение экспрессии генов далеко не всегда является результатом непосредственного взаимодействия токсикантов с ДНК, гораздо чаще это результат взаимодействия химических агентов с белками. Модификации белков влияют на белковые сигнальные цепи и факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию генов. Таким образом, внешние факторы, изменяющие функции белков, сказываются на экспрессии генов.

Современные технологии дали возможность проводить одновременно анализ экспрессии тысяч генов и облегчили изучение клеток как систем, состояние которых определяется общей экспрессией всех генов. Изменения экспрессии генов отражают в дальнейшем изменения и в протеомах.

Протеом — это сумма всех протеиновых молекул, сформированных в клетке на определенный момент времени, или набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в определенный момент времени (по аналогии с геномом — совокупностью всех человеческих генов).

Первоначальные представления о том, что один ген отвечает за синтез одного белка, оказались ошибочными. Один ген может отвечать за синтез ряда белков, который осуществляется или через альтернативный сплайсингСплайсинг (сшивание, сращивание) — процесс вырезания интронов («ненужных» участков молекулы РНК) и сращивания экзонов (участков ДНК, несущих информацию о строении белка) при образовании иРНК. Осуществляется специальными ферментами, или через посттрансляционные модификации. Протеом — понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе было бы невозможно передать наследственные свойства от поколения к поколению, обеспечить сохранение видов и т.д. Проявления внезапных реакций могут наблюдаться только на уровне протеома. Определить функциональную роль отдельных белков путем экспериментального сопоставления их качественного и количественного состава в клетке на разных стадиях и в разных состояниях ее развития, установить взаимосвязи между структурой белка и его функциями — грандиозная задача. По приблизительному подсчету, число возможных белков у человека лежит между 1 и 100 млн. Протеины могут взаимодействовать друг с другом, и число таких взаимодействий не поддается подсчету.

В 1998 г. N.G. Anderson писал: «ДНК — это на самом деле не нижняя точка: любой современный учебник биологии объясняет, что протеины определяют активную жизнь клетки, в то время как нуклеиновые кислоты представляют собой только план этой активности».

Проект «Геном человека» длился более 30 лет (1990–2022). Основная версия, названная Build35, закончена в 2004 г. Число белок-кодирующих генов у человека 20 000–25 000 (принято считать — 24 000), что меньше, чем предсказывалось раньше (от 30 000 до 40 000 генов). В результате картирования генома человека создан атлас последовательности нуклеотидов геномной ДНК человека (референтная последовательность) и собраны базы данных:

Но белками все не исчерпывается. Проект «Геном человека» доказал, что существует, кроме матричных, транспортных и рибосомальных РНК (рибонуклеиновая кислота), еще множество типов некодирующих РНК, которые в свою очередь подразделяются на инфраструктурные (о них известно из курса биологии) и регуляторные, выполняющие весьма важные для жизни функции.

Расшифровка генома человека привела к возникновению ряда научных направлений принципиально нового характера, получивших собирательное название «постгеномные технологии». К постгеномным технологиям относятся геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика, биоинформатика и нанобиотехнология.

В 2010 г. был запущен проект «Протеом человека», который должен составить полный список человеческих белков.

Протеомика — это совокупность технологий, позволяющих определить число и структуру синтезированных организмом белков, последовательность взаимодействий белок–белок и посттрансляционные модификации последовательности белок–другая молекула внутри клетки.

В течение жизни клетки практически каждый белок при своем функционировании взаимодействует со множеством макромолекул, а также низкомолекулярных лигандов. Взаимодействие белок–белок крайне важно для жизнедеятельности клетки, например для координации работы внутриклеточных ферментов и др. (см. курс биохимии). Наиболее сложная задача (сверхзадача) — изучить регуляцию взаимодействий между группами различных белков, так как один и тот же белок в зависимости от условий (которые трудно учесть или изменить in vivo) может вести себя совершенно по-разному. Для ее решения необходимы новые технологии изучения живых систем, например идентификация совокупностей белков методом МС с высокой пропускной способностью (high-throughput mass spectrometric protein complex identification, HMS-PCI) и новые достижения биоинформатики, например создание базы данных о межбелковом взаимодействии — Biomolecular Interaction Network Database (BIND).

Итак, протеомика — это одно из направлений молекулярной биологии, занимающееся сравнительным изучением клеточных протеомов.

Генные исследования и протеомика комплементарны в том смысле, что гены определяют образование специфических протеинов. Набор генов в любой клетке один и тот же, набор белков для каждой клетки индивидуален. Геном «сообщает», какие процессы могут теоретически протекать внутри данной клетки, а протеом, судя по имеющимся протеинам, «сообщает», что на самом деле происходит здесь и сейчас. Протеом постоянно меняется, ведь на состав белковых молекул влияют самые разные факторы. Динамичная модификация белков — обязательный контрольный механизм в живых системах. Различные эндогенные процессы, такие как фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование и убиквитилирование (конъюгация белка-мишени и белка убиквитина), регулируют многие функции, взаимодействия и превращения белков.

Повреждающие факторы могут влиять на модификационный статус белков несколькими путями (рис. 2.1). Некоторые токсиканты биотрансформируются в активные электрофилы, которые считаются причинами модификаций. Другие токсиканты могут привести к формированию оксидантов и эндогенных электрофилов, которые также модифицируют белки. Модификации эндогенных регуляторных белков весьма чувствительны к изменениям, вызванным факторами окружающей среды.

Количество токсикантов и способов повреждения ими биологических систем возрастают по мере совершенствования организации последних.

Обычно выделяют следующие уровни организации биосистем: молекулярный и молекулярных систем, субклеточный, клеточный, органный, органно-тканевый, организменный, популяционный, биогеоценотический, биосферный. Фундаментальные свойства биосистемы: метаболизм, пластический и энергетический обмен, регуляция и раздражимость, репродукция и изменчивость — взаимосвязаны. Токсиканты могут оказывать повреждающее действие как на организм в целом, так и избирательно на отдельные фундаментальные свойства системы. Чем выше токсичность ксенобиотика, тем значительнее выражена избирательность его действия. Мишенью для воздействия токсиканта может быть любая молекула организма.

Молекулярные системы изменяют свои свойства под влиянием токсикантов. Например, система глутатиона, принимающая непосредственное участие в процессах, связанных с поддержанием внутриклеточного гомеостаза, при воздействии токсикантов выступает как биохимическая система естественной цитопротекции. В настоящее время установлена взаимосвязь между выраженностью цитотоксического действия ксенобиотиков (судорожных ядов, психотропных веществ, метгемоглобинобразователей, летучих ядов, алкилирующих агентов, цитостатиков и др.) и тяжестью повреждения системы глутатиона, изменением концентрации восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, снижением активности глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, каталазы.

Молекулярные комплексы, цепи или сети, сформированные из молекулярных систем, участвуют в синтезе и организации более сложных субклеточных фрагментов, например ядра или митохондрий. Действие токсикантов иногда является избирательным, и токсиканты называют цитоплазматическими, лизосомными, мембранными и т.д. Функциональные или структурные нарушения в клетках ведут к развитию токсического повреждения во всем многоклеточном организме.

Различные органы имеют селективную чувствительность к определенным токсикантам, что связано с эволюционным развитием отдельных систем организма. Токсическое повреждение органа — это и нарушение целостности организма. Количество токсичных веществ, способных оказывать повреждающее действие на человека и высших животных, значительно больше, чем токсикантов, опасных для растений и примитивных одноклеточных и многоклеточных организмов, но по мере усложнения биосистемы возрастают и ее адаптационные возможности.

В многоклеточном организме взаимодействие между клетками происходит не только механически, но и коммуникационно. Разнообразие типов и подтипов рецепторов обеспечивает многочисленные физиологические ответы и передачу большого объема информации сигналпередающими путями. Основой механизмов обмена информацией между клетками является различие в сродстве к лигандам у различных типов рецепторов (например, имея сходство более чем 50%, β₁- и β₂-адренорецепторы дифференцируют адреналин и норадреналин).

Рецепторы имеют один или несколько центров связывания сигнальных молекул и проявляют высокое сродство к своим лигандам. Любая клетка, ткань, орган содержит огромное количество потенциальных рецепторов различных типов, причем связывание лиганда (как эндогенного вещества, так и ксенобиотика) с рецептором данного типа является избирательным лишь в определенном диапазоне концентраций. Увеличение концентрации лиганда в биосистеме приводит к расширению спектра рецепторов, с которыми он вступает во взаимодействие, и, следовательно, к изменению его биологической активности.

Набор рецепторов, характерный для клетки, зависит от выполняемых ею функций. В одной только клеточной мембране могут находиться более десяти типов рецепторов. Связываясь с рецептором, внеклеточные химические посредники (сигнальные вещества) воздействуют на протекание в клетке-мишени физиологически важных процессов. В настоящее время описаны сотни рецепторов для гормонов, нейромедиаторов, простагландинов, вирусов, бактериальных токсинов, бактерий и простейших организмов. Например, клеточные образраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors — PRRs), в частности Toll-рецепторы, быстро распознают и элиминируют бактерии, вирусы, некоторые виды грибов и простейших, а также могут распознавать ряд эндогенных активаторов врожденного иммунитета (БТШ, продукты некроза и апоптоза).

Рецепторами (см. гл. 1) могут являться молекулы или фрагменты белков, глико-, липо- или нуклеопротеинов и др. Для обозначения активного рецептора, инициирующего токсический процесс, используют термин структура-мишень.

Фрагмент биомолекулы (рецептора), который химически взаимодействует с лигандом, называют рецепторной областью. Например, рецептором оксида углерода(II) в организме является молекула гемоглобина, а рецепторной областью — ион железа(II) порфиринового кольца гема.

Для поддержания гомеостаза особое значение имеет взаимодействие эндогенных лигандов с селективными рецепторами, обладающими наивысшим сродством к отдельным биорегуляторам. Строение и свойства селективных рецепторов генетически кодируются.

К числу постоянных селективных рецепторов относятся рецепторы нейромедиаторов, гормонов, ферментов, транспортных протеинов.

Рецепторы с изменяющейся структурой формируются в клетках-предшественниках зрелых клеточных форм вследствие индуцированной внешними воздействиями рекомбинации двух-пяти генов, контролирующих их синтез. Как правило, это антитела и антигенсвязывающие рецепторы Т-лимфоцитов.

Структурный компонент биологической системы, взаимодействие которого с токсикантом не приводит к формированию ответной реакции, называют немым рецептором.

Токсиканты могут быть как агонистами, так и антагонистами эндогенных лигандов, в результате изменяется определенная биологическая функция, находящаяся под контролем селективных рецепторов. Токсиканты, взаимодействующие с ферментами и транспортерами, могут быть ингибиторами или аллостерическими регуляторами.

Структура и свойства комплексов взаимодействия рецепторов и лигандов зависят:

Воздействие токсиканта выражено тем сильнее, чем большее количество активных рецепторов (структур-мишеней) вступило во взаимодействие с ним, а также чем большее значение имеют рецептор и повреждаемая биологическая система для поддержания гомеостаза организма.

Основные биологические функции клетки, как известно, реализуются посредством взаимодействия внеклеточного стимула (первичного мессенджера) с рецептором на поверхности клетки и передачи сигналов внутрь клетки.

Различают три больших класса рецепторов клеточной поверхности:

Последний класс рецепторов служит регулятором работы ионных каналов.

В мембранных рецепторах выделяют внеклеточный и внутриклеточный домены. На внеклеточном домене (гидрофильном участке рецептора, расположенном за пределами липидного бислоя) имеются места связывания с лигандами (рецепторная область).

В зависимости от механизма передачи сигнала рецепторы клеточной поверхности подразделяются на четыре класса:

Рецепторы, сопряженные с G-белками. В системе клеточной сигнализации существуют эффекторные молекулы, которые запускают образование вторичных посредников (вторичных мессенджеров). Рецепторы, сопряженные с G-белком^[11], передают сигнал таким эффекторным молекулам, как аденилатциклаза (АС), фосфолипаза С (PLC), фосфолипаза А2 (PLA2), сGMP-специфическая фосфодиэстераза фоторецепторов, и нескольким типам ионных каналов^[12].

Рецепторы, связанные с G-белками, представляют собой трансмембранные белки, имеющие семь трансмембранных доменов, внеклеточный N-конец и внутриклеточный C-конец. Сайт связывания с лигандом находится на внеклеточных петлях. К рецепторам, связанным с G-белками, относят мускаринчувствительные холинергические рецепторы (М-холинорецепторы, по зарубежной терминологии — холиноцепторы), α- и β-адренорецепторы (адреноцепторы), дофаминергические, серотонинергические, гистаминергические рецепторы, а также ряд близких рецепторных структур, различающихся незначительными особенностями связывания с липидной мембраной, третичной структуры и/или конформацией.

Стимулирующие G-белки активируют в ходе передачи сигнала аденилатциклазу клеток-эффекторов, а ингибиторные G-белки этот фермент угнетают.

Совокупность взаимодействующих между собой макромолекул, осуществляющих передачу сигналов по пути, опосредованному G-белками, называют системой сигнальной трансдукции (ССТ). Перечень вторичных мессенджеров включает цАМФ, цГМФ (циклический гуанозин-3',5'-монофосфат), фосфоинозитиды, ионы Са²⁺, протон, метаболиты арахидоновой и ретиноевой кислот, оксид азота (II) NO, другие химические соединения биогенного происхождения. Результатом действия внутриклеточных посредников передачи сигналов является фосфорилирование белков, активация их ионами Са²⁺ или другими факторами, что приводит к ответу на клеточном уровне: секреции, сокращению, индукции различных генов, пролиферации и др.

ССТ обрабатывает и внеклеточные сигналы различной химической природы или световые воздействия. Алгоритм действия ССТ постоянен, а результирующие ответы клеток весьма разнообразны.

С рецепторами данного типа избирательно взаимодействует большое количество веществ, например наркотические средства, обладающие психодислептической активностью [диэтиламид лизергиновой кислоты (ЛСД), псилоцин, псилоцибин, буфотенин, мескалин, хинуклидинилбензилат [BZ] и др., см. гл. 6], лекарственные препараты, действующие на холинэргические, катехоламинергические, серотонинергические синапсы (см. гл. 6), интоксикация которыми развивается как при перевозбуждении, так и при блокаде рецепторов.

Рецепторы, формирующие ионные каналы, участвуют в передаче нервных импульсов в ЦНС и на периферии. Наиболее известные каналообразующие рецепторы — это никотинчувствительный рецептор АХ (Н-холиноцептор) для ионов Na⁺, ГАМКергический и глицинергический рецепторы для ионов Cl^-. Пример агониста Н-холинорецепторов — алкалоид никотин; агониста ГАМК-рецепторов — содержащийся в рыбной ягоде (лат. Anamírta cócculus) сесквитерпеноид пикротоксинин, который иногда используют в качестве противоядия при отравлении барбитуратами; агониста рецепторов к глицину — алкалоид стрихнин (см. гл. 6).

Каналообразующие рецепторы состоят из нескольких субъединиц. Одни субъединицы образуют рецепторную область, другие после взаимодействия рецепторной области с лигандом изменяют свою конформацию и участвуют в формировании ионного канала. Например, холинергический рецептор никотинового типа имеет гликозилированные с внешней стороны субъединицы (полипептидные цепи которых 4 раза пронизывают липидный бислой мембраны), а внутри взаимодействующие с белками тубулинового и актинового скелета. Связывание АХ с двумя α-субъединицами рецептора вызывает конформационные изменения в олигомерном комплексе, в результате чего ионы Na⁺ входят в клетку. Ионные натриевые, калиевые и кальциевые каналы возбудимых мембран имеют рецепторную область связывания высокотоксичных ядов животного происхождения, таких как тетродотоксин, сакситоксин, батрахотоксин (см. гл. 10).

Сигнальные молекулы (первичные мессенджеры) также могут проникать через плазмалемму путем изменения ионных каналов.

Рецепторы с тирозинкиназной активностью (рецепторы, ассоциированные с цитозольными тирозиновыми протеинкиназами). Рецепторные протеинкиназы фосфорилируют белки по тирозиновым остаткам, поэтому их называют тирозинкиназными рецепторами (RTK). Они играют ведущую роль в процессах роста, развития и дифференцировки клеток. Лигандами рецепторов этого типа являются факторы роста (GF, митогены) — полипептиды, состоящие из 50–100 аминокислот. Каждый тип GF связывается с внеклеточным доменом собственного специфического рецептора и, наоборот, не связывается с рецепторами для других факторов роста. Например, эпидермальный фактор роста (EGF) может связаться на поверхности клеток только с EGF-рецептором, но не с рецептором к фактору роста тромбоцитов, который может также находиться на поверхности тех же клеток. В настоящее время выделяют 14 различных семейств тирозикиназных рецепторов. Различие между семействами в основном проявляется в структуре их экстраклеточных доменов.

RTK состоит из четырех основных доменов. Экстраклеточный лиганд-связывающий N-концевой домен участвует в получении внешнего сигнала и связывании лиганда (например, фактора роста GF), которое изменяет конформацию рецептора. Экстраклеточный домен соединен одиночным трансмембранным доменом со специализированным C-концевым доменом — ферментом в цитоплазме. Трансмембранный домен, являющийся гомодимером, субъединицы которого связаны дисульфидным мостиком, однократно пронизывает мембрану и соединяет вне- и внутриклеточные домены. Конформационные изменения рецептора активируют цитоплазматический тирозинкиназный домен (290 аминокислот), который определяет биологический ответ. Различные рецепторы содержат один или более регуляторных доменов, на которых расположены участки аутофосфорилирования множества близлежащих цитоплазматических субстратных белков, которые затем передают сигнал далее в клетку. После связывания лиганда многие рецепторы путем эндоцитоза (см. гл. 3) погружаются внутрь клетки. К рецепторам данного типа также относятся рецепторы к инсулину. Избирательно действующие токсиканты неизвестны.

Рецепторы, образующие межрецепторные сети. Существует группа рецепторов с молекулярной массой около 30 000–50 000 Д, образующих межрецепторные сети на поверхности клеток. Связывание таких рецепторов с лигандом не вызывает непосредственной передачи сигнала на эффекторные молекулы. Пример — рецепторы к Fc-фрагменту (fragment crystalline) антител (иммуноглобулинов). Образование межрецепторных сетей IgE-Fc-рецепторов происходит при связывании антигена с молекулами фиксированных на мембранах тучных клеток антител, что приводит к выбросу гистамина из тучных клеток и возникновению анафилактических реакций.

Гормоны (например, стероидные и тиреоидные гормоны) взаимодействуют не только с основными типами рецепторов клеточной поверхности, но и с растворимыми внутриклеточными рецепторами.

В 80-х годах ХХ в. была сформулирована новая модель рецепции стероидных гормонов, включающая следующие положения:

Все гормональные рецепторы являются белками, способными нековалентно связывать гормон, и делятся на две группы в зависимости от природы связываемого гормона. Липофильные гормоны (например, стероиды) легко проходят через клеточную мембрану, связываются с рецептором и приобретают дополнительное сродство к ядерным акцепторным структурам. Гидрофильные гормоны, не способные проникать через клеточную мембрану, связываются с рецепторами на ее поверхности, что обеспечивает запуск передачи сигнала внутрь клетки.

Независимо от локализации, рецепторы гормонов имеют ряд общих характеристик:

Таким образом, тканевая и структурная специфичность рецепторов обеспечивает действие гормона только в своей ткани-мишени.

Отдельной областью внутриклеточной сигнализации можно считать кальциевую систему сигнализации. Для нормального функционирования клетки необходимо поддержание низкой концентрации ионов Са²⁺ (в диапазоне 10^-6—10^-7 М), так как длительное повышение уровня кальция в цитозоле приводит к гибели клетки (см. п. 2.2).

Из-за огромного числа потенциальных токсикантов и множества биологических структур и процессов, которые они могут нарушать, существует большое количество путей реализации токсического действия. Обычно токсикант, доставленный к мишени, реагирует с ней, вызывая клеточную дисфункцию. Иногда ксенобиотики не реагируют с конкретной мишенью, а неблагоприятно влияют на все биологическое окружение, вызывая дисфункции органелл, клеток или органов.

Схема токсического процесса включает несколько этапов (рис. 2.2). Сначала токсикант доставляется к цели или целям (этап 1) и взаимодействует с эндогенными молекулами-мишенями (этап 2a), вызывая изменения функций клетки и/или структур (этап 3), которые запускают восстановительные механизмы на молекулярном, клеточном, и/или тканевом уровнях. Сила воздействия токсиканта может превышать способности механизмов репарации или вызывать «неправильное срабатывание» этих процессов (этап 4). В этом случае развиваются следующие процессы:

Этап 1 — доставка токсиканта от места воздействия к мишени

Интенсивность токсического эффекта зависит от концентрации и времени нахождения конечного токсиканта вблизи мишени.

Конечный токсикант — это вещество, которое реагирует с эндогенной молекулой-мишенью или повреждает биологическое окружение, инициируя структурные и/или функциональные нарушения.

Конечным токсикантом могут быть как исходное соединение, так и его метаболиты (см. гл. 3), а также активные формы кислорода (АФК), генерированные при биотрансформации токсиканта или эндогенной молекулы.

Концентрация конечного токсиканта в мишени зависит от относительной эффективности процессов, сопровождающих его транспорт, который облегчается процессами абсорбции, диффузии, реабсорбции, токсикации и тормозится процессами пресистемной элиминации, обратной диффузии, экскреции и детоксикации (см. гл. 3).

Токсикация, или метаболическая активация, — это биотрансформация токсикантов в более ядовитые продукты (подробно см. гл. 3). Иногда в результате биотрансформации вещества приобретают реактивность и структурные признаки, позволяющие более эффективно взаимодействовать со специфическими рецепторами или ферментами. Однако значительно чаще токсикация изменяет эндо- и ксенобиотики так, что они приобретают способность взаимодействовать с функциональными группами молекул различных эндогенных соединений и превращать их в электрофилы, свободные радикалы (супероксид-анион радикал О₂^•ˉ, гидроксидный радикал НО^•, гидропероксидный радикал НОО^•), нуклеофилы, редокс-активные частицы.

Детоксикация — это биотрансформация, в ходе которой обезвреживается основной токсикант или предотвращается его образование. В ряде случаев детоксикация может конкурировать с токсикацией. Детоксикация ксенобиотиков, не содержащих функциональные группы, как правило, происходит в две фазы. Сначала в молекулу внедряется функциональная группа, например гидроксидная или карбоксильная (фаза I), а затем к этой группе с помощью ферментов присоединяется эндогенная кислота, например глюкуроновая, серная или аминокислота (фаза II). За некоторыми исключениями конечные продукты неактивны, высокогидрофильны и легко экскретируются (см. гл. 3).

Детоксикация токсикантов-нуклеофилов в большинстве случаев осуществляется путем конъюгации по нуклеофильным функциональным группам (фаза II биотрансформации).

Детоксикация токсикантов-электрофилов обычно включает в себя конъюгацию с нуклеофилом глутатионом (фаза II биотрансформации). Эта реакция может идти спонтанно или индуцироваться глутатион-S-трансферазой.

Детоксикация свободных радикалов — это прежде всего элиминация супероксид-анион радикала О₂^•ˉ, так как он может превращаться в гораздо более активные частицы.

Известно два пути токсического действия супероксид-анион-радикала О₂^•ˉ:

Превращение О₂^•ˉ в Н₂О₂ идет спонтанно или катализируется супероксиддисмутазой (SOD, СОД). Распад пероксида водорода до гидроксильного радикала HO^• и гидроксид-иона ОН¯ называется реакцией Фентона и катализируется ионами металлов. Образование гидроксильного радикала обусловливает чрезвычайно высокую токсичность ксенобиотиков, генерирующих О₂^•ˉ.

В другом случае О₂^•ˉ бурно реагирует с оксидом азота NO^[13], который синтезируется в организме из аминокислоты аргинина NO-синтазой (NOS), образуя пероксинитрит (ONOOˉ). Спонтанная реакция пероксинитрит-иона с оксидом углерода(IV) приводит к образованию нитрозопероксикарбоната (ONOOCO₂ˉ), который гомолитически распадается до ^•NO₂ — радикала оксида азота(IV) и карбонат-анион-радикала CO₃^•¯. Три продукта (CO₃^•¯, HO^•, HOˉ) являются окислителями, ^•NO₂ — еще и нитрующий агент.

Ферментов, элиминирующих НО^•, не существует; единственной эффективной защитой является предотвращение образования НО^• путем трансформации его предшественника пероксида водорода в воду. Супероксиддисмутазы, содержащиеся в цитозоле (Сu-SOD, Zn-SOD) и митохондриях (Mn-SOD), превращают О₂^•ˉ в Н₂О₂, который затем восстанавливается до воды цитозольной глутатионпероксидазой или пероксисомной каталазой.

Пероксинитрит-ион (ONOO¯) не является свободнорадикальным окислителем и более стабилен, чем НО^•. Глутатионпероксидаза способна восстанавливать ONOO¯ до нитрита (ONO¯). Кроме того, ONOO¯ реагирует с оксигемоглобином, гемсодержащими пероксидазами и альбумином. Эти реакции важны для элиминации ONOO¯. Предотвращение синтеза ONOO¯ возможно путем удаления двух его предшественников (прекурсоров): NО — за счет его взаимодействия с гемоглобином^[14] и О₂^•ˉ — за счет взаимодействия с супероксиддисмутазой.

Пероксидазогенерированные свободные радикалы разрушаются путем переноса электронов с глутатиона. Это сопровождается окислением глутатиона, который регенерируется NADPH-зависимой глутатионредуктазой. Таким образом, глутатион играет важную роль в детоксикации и электрофилов, и свободных радикалов.

В детоксикации природных токсинов — ядов животного и растительного происхождения (см. гл. 10) участвуют вне- и внутриклеточные протеазы. Например, при действии фосфолипазы происходит восстановление дисульфидной группы эрабутоксина и теряется его активность.

Если токсикант инактивирует детоксицирующие ферменты, то детоксикация неэффективна, образуются его токсичные метаболиты, активно идет процесс токсикации.

Этап 2 — взаимодействие конечного токсиканта с молекулой-мишенью

Обычно токсичность обусловлена реакцией конечного токсиканта с молекулой-мишенью (см. рис. 2.2, этап 2a). Фактически все эндогенные соединения — потенциальные цели для токсикантов. Наиболее распространенные и токсикологически значимые цели — мембраны клеток, внутриклеточные структуры, нуклеиновые кислоты (особенно ДНК), белки и часто ферменты, участвующие в синтезе активных метаболитов токсикантов.

Конечный токсикант может связываться с молекулами-мишенями ковалентно и нековалентно. Нековалентное связывание — образование водородных, ионных и других связей — типично для токсикантов, взаимодействующих с мембранными и внутриклеточными рецепторами, ионными каналами и некоторыми ферментами. Оно обычно обратимо из-за сравнительно низкой энергии связи. Нековалентное связывание с белками клетки, не вызывающее нарушения ее функций, может быть видом детоксикации, оберегающим токсикологически значимые цели (см. гл. 3).

Необратимое ковалентное связывание полностью повреждает эндогенные молекулы. Образование ковалентного аддукта характерно для электрофильных токсикантов, реагирующих с нуклеофильными центрами в биологических макромолекулах (белках и нуклеиновых кислотах). Свободные радикалы типа HO^•, NO₂^• и C1₃C^• могут ковалентно связываться с макромолекулами или отщеплять атомы водорода от эндогенных соединений, превращая их в радикалы.

Ковалентное связывание токсикантов или их метаболитов с белками может приводить к образованию антигенов и развитию иммунного ответа.

Некоторые токсиканты активируют молекулы-мишени, однако чаще ингибируют их функции, блокируя рецепторы, ионные каналы или ферменты. Функция белка нарушается при изменении его конформации, которая, в свою очередь, существенно меняется при взаимодействии с токсикантом. Многие белки содержат субъединицы, обеспечивающие их активность или способность соединяться в макромолекулярные комплексы. Ковалентное связывание и/или окисление таких субъединиц ксенобиотиками может привести к нарушениям передачи сигнала, энергетического обеспечения клеток и метаболического гомеостаза. Некоторые химические агенты (динитрохлорбензол, пенициллин, соединения никеля) могут спонтанно связываться с белками, другие могут приобрести такую способность вследствие аутоокисления или энзиматической биотрансформации (см. гл. 3).

Действие большинства конечных токсикантов на эндогенные молекулы зависит от их реакционной способности, а пути превращения могут значительно различаться.

Токсиканты могут нарушать матричную функцию ДНК. Ковалентное связывание химических агентов с ДНК (образование аддуктов) вызывает ошибки при репликации. Кроме образования аддуктов, токсиканты изменяют первичную структуру эндогенных молекул поперечным сшиванием или фрагментацией. Сшивки меняют пространственную подвижность и функциональность молекул.

Молекулы-мишени после химической атаки часто подвергаются спонтанной деградации. Свободные радикалы типа Cl₃COO^• и HO^• могут инициировать пероксидное разрушение липидов. Это приводит к деградации липидов в клеточных мембранах и образованию свободных радикалов жирных кислот и электрофилов, нарушающих структуру ДНК.

Некоторые ксенобиотики вызывают токсическую реакцию, не воздействуя на молекулы-мишени, а изменяя рН среды, нарушая структуру клеточных мембран и приводя к исчезновению разности ионных концентраций или конкурируя с эндогенными молекулами за физиологически важное пространство.

Этап 3 — клеточная дисфункция

Взаимодействие с молекулой-мишенью может приводить к нарушению функций клетки. Каждая клетка в многоклеточном организме участвует в определенных процессах, контролируемых соответствующими системами. Одни программы обеспечивают клеточное деление, дифференцировку и апоптоз, другие управляют функциональной деятельностью дифференцированных клеток. Регулирование работы клетки осуществляется с помощью СТС, которая может быть активирована или инактивирована внешними сигнальными молекулами.

Первичная клеточная дисфункция, вызванная токсикантом, — не обязательно окончательный результат, все зависит от функции молекулы-мишени. Если молекула-мишень участвует в клеточной регуляции (передаче сигналов), то прежде всего происходит дисрегуляция экспрессии генов и/или дисрегуляция выполняемой клеткой функции. Однако если молекула-мишень вовлечена в процессы клеточного жизнеобеспечения, ее повреждение может привести к гибели клетки. Воздействие токсиканта на внутриклеточные структуры, обеспечивающие выполнение внешних функций клетки, может изменить активность других клеток.

Нарушение регуляции клеточных функций. Деятельность клеток регулируется сигнальными молекулами, которые активируют определенные клеточные рецепторы, передающие сигнал регуляторным областям генов и/или функциональным белкам. Активация рецептора может привести к изменению экспрессии гена и/или химической модификации определенных белков (обычно путем фосфорилирования). Программы, управляющие жизнью клеток, прежде всего затрагивают экспрессию генов. Программы, контролирующие функции клеток, влияют на деятельность функциональных белков; однако один сигнал часто вызывает оба ответа из-за переходов и взаимосвязи сетей передачи сигналов.

Дисрегуляция генной экспрессии происходит при воздействии на структуры, принимающие участие в транскрипции, передаче сигналов, синтезе, хранении или выделении экстрацеллюлярных сигнальных веществ.

Нарушение регуляции транскрипции. Транскрипция, представляющая собой передачу генетической информации от ДНК к мРНК, управляется взаимодействием факторов транскрипции (TFs) и промоторных участков гена. Токсиканты могут нарушать этот процесс. Обычно повреждаются те TFs, в связывании и активации которых участвуют природные соединения, например гормоны и витамины. Биогенный или чужеродный лиганд может оказывать токсический эффект в двух случаях — при воздействии в больших дозах и/или в определенные периоды онтогенеза. Другие вещества, взаимодействующие с TFs, могут нарушать дифференцировку клеток за счет усиления экспрессии различных генов.

Нарушение процессов передачи сигнала. Экстрацеллюлярные сигнальные молекулы (факторы роста, цитокины, гормоны и нейротрансмиттеры) могут в конечном счете активировать TFs, воздействуя на мембранные рецепторы и/или внутриклеточную систему передачи сигнала. Примером может служить кодируемый c-myc протоонкогеном c-Myc-белок — TFs, который способен как активировать, так и репрессировать транскрипцию генов. c-Myc-белок после димеризации с Max-белком и связывания комплекса с определенной нуклеотидной последовательностью активирует гены циклинов D и E. Последние в свою очередь ускоряют деление клетки, активируя циклинзависимые киназы. Синтезированные при этом сигнальные молекулы ускоряют клеточную пролиферацию. Сигнал от мембранных рецепторов до TFs передается последовательным взаимодействием белок–белок и изменением конформации белка при фосфорилировании, т. е. сигнальная молекула вызывает фосфорилирование белка, например митогенактивируемой киназы (МАRK), которая, в свою очередь, фосфорилирует и активирует другой белок. Лиганды к мембранным рецепторам фактора роста запускают процесс аутофосфорилирования этих рецепторов. Затем уже фосфорилированные рецепторы передают сигнал на Ras (G-белок). Активный Ras инициирует каскад МАRK, запуская последовательное фосфорилирование белков киназами и передавая сигнал на TFs. Передаточные молекулы обычно, но не всегда активируются фосфорилированием (катализируется киназами) и инактивируются дефосфорилированием (катализируется фосфатазами). Химические агенты могут нарушать (прекращать или извращать) передачу сигнала путем повреждения структур, участвующих в фосфорилировании (например, G-белков), и в конечном счете влиять на клеточный цикл.

Сигнал от рецепторов EGF, действующих на тирозинкиназные рецепторы, передается на промежуточные белки — Shc, Grb2, SOS. Эти белки превращают ГДФ-связанный Ras (G-белок, неактивный) в активную ГТФ-форму. Последняя активирует МАR-киназный каскад (Rаf, MARKK, МАRK). Он состоит из трех протеинкиназ. Протеинкиназы — это ферменты, способные катализировать реакцию присоединения фосфата к остатку серина, треонина или тирозина в молекуле белка, образуя фосфорилированную форму этой молекулы. При этом конформация молекулы меняется: белок активируется или ингибируется. Фосфорилирование — один из главных способов регуляции внутриклеточных процессов, и в первую очередь регуляции процессов считывания генетической информации (по разным оценкам, существует от 2000 до 10 000 разных протеинкиназ). Последняя стадия МАR-каскада — образование активной киназы, называемой МАR-киназой (МАRK). Этот фермент фосфорилирует и тем самым меняет активность нескольких белков-мишеней. МАRK становится активной киназой только после того, как к ней будет присоединен фосфат. Для того чтобы активировать МАRK, в клетке существует другая (специализированная) киназа, которая умеет фосфорилировать только МАRK — это киназа МАRK (МАRKK). Исходно этот фермент неактивен, как и МАRK, и в свою очередь тоже активируется присоединением фосфата. Для этого в клетке существует еще одна протеинкиназа — Rаf (киназа киназы МАR-киназы). Она исходно тоже неактивна, но ее активирует Ras, получивший извне сигнал, проходящий через цепочку внутриклеточной сигнализации, связанную с вторичными мессенджерами.

Фосфорилированная МАRK переходит в ядро и фосфорилирует TFs, позволяя им связаться со специфическими последовательностями промотора.

Все сигнальные системы взаимосвязаны. Для передачи митогенного сигнала от рецепторов используется тот же путь передачи: рецептор EGF → MARK. Митогенный сигнал, переданный через рецептор EGF на MARK, может быть усилен, например, Raf-катализируемым фосфорилированием белка IkB, который отщепляет от ингибирующего белка транскрипционный фактор NF-kВ. NF-kВ может активироваться, например, АФК, введением в клетку фенобарбитала или пролифераторов пероксисом. Активация происходит опосредованно через Ras-Raf-MARKK-MARK сигнальный путь.

Рецептор трансформирующего ростового фактора β (TGF-β) активирует путем фосфорилирования цитоплазматические медиаторы — белки Smad. Это группа родственных внутриклеточных белков, передающих сигнал в ядро от сверхсемейства TGF-β. Smad блокирует клеточный цикл, прерывая путь передачи сигнала. Усилить митогенный сигнал можно MARK-катализируемым фосфорилированием Smad.

Митогенный сигнал появляется также при активации протеинкиназ (РKС, СаМK, МАRK) ионами кальция. Некоторые ксенобиотики способны блокировать проведение сигнала. Часть из них может стимулировать пролиферацию (активация митогенных протеинкиназ, например РKС, инактивация фосфатаз РТР, РР2А, инактивация GAP, IkB). Другая часть, например ингибиторы PKC, препятствуют митозу и вызывают апоптоз.

Представленная схема передачи сигналов очень упрощенная. Фактически все компоненты системы передачи сигналов (например, G-белки, PKC, MARK) присутствуют в многочисленных, функционально различных формах, характерных только для определенных клеток. Системы, участвующие в регуляции экспрессии генов, не только определяют жизненный цикл клеток, но и управляют некоторыми процессами клеточной деятельности. Например, NF-kВ стимулирует синтез белков теплового шока (БТШ, HSP).

Химически нарушенная передача сигнала с пролиферативным эффектом. Ксенобиотики, облегчающие фосфорилирование фрагментов цепи передачи сигнала, часто провоцируют усиление клеточного деления и формирование опухоли. Эфиры форбола и фумонизин В активируют протеинкиназу С (ПКС, PKC), подражая диацилглицеролу (ДАГ, DAG) — одному из физиологических активаторов PKC. Ионы двухвалентного свинца имитируют действие другого физиологического активатора PKC — Са²⁺. Активированная PKC передает сигнал далее, запуская киназный каскад и в конце концов позволяя TFs связаться с участками ДНК. Протеинкиназы могут активироваться и поврежденными белками.

Усиление фосфорилирования белков является результатом сниженной активности фосфатаз. Ингибирование фосфатаз — основной механизм действия ряда химических агентов. Оно происходит и при УФ-облучении. Растворимая фосфатаза 2А (РР2А) отвечает за инактивацию МАRK. PP2A дефосфорилирует инициирующую митоз протеинкиназу. Существуют и другие ингибирующие ферменты. Так, ингибиторный белок IkB, гомологичный структурному белку анкирину, связывается с NF-кВ и предотвращает его проникновение в ядро (блокирование функции TFs).

Среди транскрипционных регуляторных белков NF-kB (NF-kappaB) является уникальным. Он играет роль внутриклеточного медиатора большого количества внешних воздействий в некоторых типах клеток. Уникальность этого цитоплазматического фактора транскрипции состоит в наличии большого числа внутриклеточных путей его активации (воспалительными цитокинами, окисленными липидами, факторами, присутствующими в атероматозных бляшках) и его способности быстро активировать множество генов. NF-kB — важный интегрирующий инструмент клетки. Комбинаторное использование его разных субъединиц приводит к возможности дифференциальной регуляции множества генов с различными функциями в разных типах клеток в разное время. Все эти белки работают в клетке как ДНК-связывающие транскрипционные факторы. МАRK могут регулировать транскрипцию, фосфорилируя ингибиторы TFs. В случае NF-kB как раз и осуществляется подобная регуляция. NF-kB находится в цитоплазме в виде комплекса с одним из членов семейства ингибиторных белков I-kB и удерживается там этим ингибитором за счет белок-белковых взаимодействий. Роль ингибитора состоит в том, что он маскирует сигнал ядерной локализации фактора. Ингибитор фосфорилирован, но при получении сигнала он фосфорилируется интенсивнее и затем деградирует. Неизвестно, какие именно из киназ осуществляют фосфорилирование в ответ на внеклеточные сигналы. Положение осложняется тем, что есть несколько родственных ингибиторов и, возможно, разные ингибиторы фосфорилируются разными киназами. Но как бы там ни было, фактор NF-kB освобождается и направляется в ядро, где взаимодействует со специфическими последовательностями в регуляторных участках генов и активирует транскрипцию определенных групп генов.

NF-kB, являясь важным TFs, контролируют широкий спектр клеточной активности (пролиферацию, взаимодействие клеток при развитии иммунного ответа, процессы воспаления и т.д.).

IkB-деградация и NF-кВ-активация также могут быть вызваны кислородным голоданием.

Химически нарушенная передача сигнала с антипролиферативным эффектом. Падение интенсивности сигнала пролиферации (последовательность: ингибирование Raf белков → уменьшение деградации IkB → угнетение процесса связывания NF-kВ с ДНК → снижение интенсивности синтеза белка c-Myc мРНК), возникающее после повреждения клеток, ставит под угрозу процесс регенерации. Нарушение регуляции митогенного сигнала — путь к апоптозу.

Нарушение регуляции синтеза внеклеточных сигнальных веществ. Гормоны передней доли гипофиза активируют деление и пролиферацию клеток в эндокринных железах. Снижение уровня секреции гормонов гипофиза под действием токсикантов приводит к развитию дегенеративных процессов в периферических железах и апоптозу.

Нарушение регуляции клеточной активности. Токсиканты могут изменять функции специализированных клеток путем нарушения любого этапа передачи сигнала.

Нарушение регуляции процессов передачи сигналов в электрически активных клетках. Многие ксенобиотики влияют на деятельность нейронов, клеток скелетной и сердечной мускулатуры. Средством передачи информации от нейрона к другим клеткам: другому нейрону, мышечной клетке, клетке железы или другим видам клеток — служат нейротрансмиттеры (нейромедиаторы). Содержание информации, передаваемой нейротрансмиттером, различно. Это может быть управляющая информация, информация о состоянии объекта управления, информация o результатах управления. Все виды информации необходимы для структурно-функциональной организации элементов субклеточных систем, клеток, тканей, органов, систем органов.

Влияние токсикантов может проявляться:

Последние два вида воздействия осуществляются на участках рецептора, удаленных от зоны связывания с лигандом.

Некоторые токсиканты способны активировать (инактивировать) потенциалзависимые натриевые каналы. Сигнал в клетке формируется за счет изменения тока катионов; удаление их посредством ионных каналов или транспортеров приводит к терминации сигнала. Ингибирование ионных каналов и транспортеров может продлевать эффекты веществ. Токсиканты могут нарушать процесс терминации сигнала.

Многие изученные механизмы регуляции реализуются и в слабовозбудимых клетках (экзокринных железах, клетках Купера, β-клетках поджелудочной железы). Повреждение механизмов регуляции в таких клетках мало влияет на функции органов.

Повреждение процессов внутриклеточного жизнеобеспечения: механизмы токсической клеточной смерти

Для выживания все клетки должны синтезировать эндогенные молекулы, собирать макромолекулярные комплексы, мембраны и клеточные органеллы, поддерживать постоянство внутренней среды, производить энергию. Агенты, повреждающие эти процессы, ставят под угрозу жизнь клетки. Существует три механизма инициирования клеточной смерти:

Истощение запасов АТФ. ATФ играет центральную роль в жизнеобеспечении клетки, выступая в качестве и субстрата для биосинтеза, и главного источника энергии. ATФ необходим для синтеза нуклеиновых кислот, процесса мышечных сокращений, энергетического обеспечения и деления клеток. АТФ осуществляет деятельность ионных транспортеров. Химическая энергия высвобождается при гидролизе ATФ до АДФ или АМФ. АДФ рефосфорилируется в митохондриях АТФ-синтетазой. Многие токсиканты нарушают этот процесс (см. гл. 6–10).

Повышение уровня внутриклеточного кальция. Плазматическая мембрана непроницаема для ионов Са²⁺. Концентрация ионов Са²⁺ в цитозоле регулируется активностью транспортных систем, которые перекачивают их в эндоплазматический ретикулум и митохондрии.

Выявлено два типа передачи сигнала посредством ионов Са²⁺. Первый из них — потенциалуправляемый — характерен для электровозбудимых, преимущественно нервных, клеток. Деполяризация их плазматической мембраны вызывает поглощение нервным окончанием ионов Са²⁺ через потенциалзависимые кальциевые каналы. Это вызывает секрецию нейромедиатора. Второй тип передачи сигнала посредством ионов Са²⁺ — рецепторуправляемый — заключается в следующем. Синтез вторичных мессенджеров (вследствие связывания сигнальной молекулы с рецептором на поверхности клетки) приводит к высвобождению из внутриклеточного депо ионов Са²⁺, эффекторные ферменты активируются и происходит запуск кальцийопосредованных внутриклеточных реакций. Агонисты могут регулировать оба известных типа передачи сигнала посредством ионов Са²⁺.

Токсиканты увеличивают уровень цитоплазматического кальция путем усиления потока кальция внутрь клетки и/или ослабления потока из клетки. Открытие рецептор- или потенциалуправляемых кальциевых каналов или повреждение плазматической мембраны приводит к тому, что в клетку по градиенту концентрации из внеклеточного пространства устремляются ионы Са²⁺ (концентрация ионов Са²⁺ в межклеточной жидкости равна примерно 10^–3 М). Уровень ионов Са²⁺ может повышаться также при выкачивании кальция из эндоплазматического ретикулума и митохондрий. Повышенное содержание ионов Са²⁺ оказывает токсическое действие на клетку, проявляющееся истощением энергетических запасов (ингибирование АТФазы), дисфункцией микрофиламентов и микронитей (цитоскелет), активацией гидролитических ферментов и генерацией АФК.

Из-за высокого уровня цитоплазматического кальция усиливается поток ионов внутрь митохондрий. В результате отрицательный потенциал мембраны митохондрий исчезает, что приводит к остановке процесса синтеза АТФ. Кроме того, химические агенты, окисляющие НAДH, активируют транспортер, выкачивающий кальций из матрикса. Повышенный уровень цитоплазматического кальция повреждает микрофиламенты. Происходит разрушение актиновых нитей: отделяются нити α-актинина и фодрина, ответственные за прикрепление микрофиламентов к плазматической мембране. В результате в мембране появляются разрывы. Высокий уровень ионов кальция приводит к активации гидролитических ферментов, разрушающих белки, фосфолипиды и нуклеиновые кислоты. В частности, кальцийактивируемые нейтральные протеазы разрушают встроенные мембранные белки. Неизбирательная активация фосфолипаз ионами кальция приводит к повреждению клеточной мембраны, одновременно происходит образование детергентов из фосфолипидов. Активация Ca²⁺, Mg²⁺-зависимых эндонуклеаз вызывает фрагментацию хроматина.

Генерирование АФК и/или активных форм азота. Многие ксенобиотики способны генерировать АФК (см. гл. 6–10), например, кальций активирует дегидрогеназы цитратного цикла, повышается скорость переноса электронов, в результате чего увеличивается количество О₂^•¯ и Н₂О₂, активация NO-синтетазы приводит к синтезу ONOO¯ и т.д.

Механизмы повреждения клеточных структур взаимосвязаны:

Нарушение митохондриальных процессов: некроз и апоптоз

Некроз. Приток ионов кальция в митохондрию приводит к увеличению проницаемости внутренней мембраны митохондрий (до размеров частиц 1500 Д). Такие изменения обеспечивают переход протонов в матрикс митохондрии, полностью устраняя мембранный потенциал. Поврежденная митохондрия уже не способна синтезировать АТФ, но деполяризация мембран реверсирует АТФазу, и она начинает гидролизовать АТФ. Происходит бессмысленная трата энергии. Теперь под угрозу ставится процесс гликолиза, так как для некоторых стадий необходим АТФ (гексокиназа, фосфофруктокиназа). Тотальное истощение энергетических запасов приводит к лизису или некрозу клетки.

Апоптоз. Химические агенты способны нарушать регуляцию апоптоза клеток — генетически запрограммированного процесса, при котором клетка активно способствует своей гибели. Апоптоз является механизмом активного удаления поврежденных клеток и способом восстановления структуры ткани. Апоптоз запускается через специальные «рецепторы смерти» на поверхности клетки или нерецепторным путем, что ведет к активации регуляторных белков, которые останавливают митотическую активность клетки, вызывают фрагментацию ДНК (эндонуклеазы), деградацию жизненно важных белков (каскад протеолитических ферментов, каспаз), нарушают связь клетки с внеклеточным матриксом и т.д. Ранним проявлением апоптоза являются падение электрохимического потенциала митохондриальной мембраны и повышение продукции АФК. Морфологически апоптоз характеризуется образованием мембранных пузырей, агрегацией хроматина вблизи ядерной мембраны, конденсацией и фрагментацией клетки с образованием апоптотических телец с последующим их фагоцитозом. Конечным этапом является полный распад клетки. В отличие от некроза при апоптозе не возникает выраженной воспалительной реакции.

Чаще всего процесс гибели клетки связан с деградацией митохондрий. Другой путь — выход в цитоплазму цитохрома с (cyt c), гемсодержащего белка, который обычно находится на поверхности внутренней мембраны в митохондриальном межмембранном пространстве. Сyt с — последний компонент цепи переноса электронов, его отсутствие полностью блокирует синтез АТФ. Происходит увеличение содержания О₂^•¯, и начинается процесс некроза. Одновременно свободный cyt с является запускающим фактором апоптоза. Сyt с после соединения с АТФ и специфическим белком может стимулировать протеолитический распад белков под действием каспаз (цистеиновых протеаз). Некоторые каспазы активируют прокаспазы. Это ведет к активации так называемых эффекторных каспаз, которые расщепляют определенные клеточные белки, активируя или инактивируя их.

Основные пути клеточной смерти — через повреждение митохондрий или запуск cyt c — контролируются семейством белков Bcl-2. Среди этих белков присутствуют те, которые облегчают протекание процессов клеточной смерти, например Bax, Bad и Bid, и те, которые ингибируют этот процесс, например Bcl-2, Bcl-хL. Соотношение антагонистических белков является «переключателем» между жизнью и смертью клетки. Проапоптические белки Bax и Bid являются инициаторами реакций апоптоза. Они запускают цепь реакций, ведущих к деградации структуры ДНК, через активацию мембранных рецепторов семейства Fas. Повреждение ДНК вызывает стабилизацию и активацию p53-белка, который усиливает синтез Bax-белка (проапоптотического белка), что в конечном счете связано с риском появления мутаций и канцерогенеза. Поэтому апоптоз является природным механизмом защиты. Возбуждение Fas-рецепторов может непосредственно активировать каспазы и вовлекать митохондрии в процесс разрушения клеточных структур (программа каспаззависимой активации Bid).

Таким образом, апоптоз реализуется разными путями, но в любом случае при участии каспаз. Реализация апоптоза в каждом конкретном случае зависит от инициирующего фактора и состояния клетки.

Форму клеточной смерти определяет наличие АТФ. Многие токсиканты могут вызывать и апоптоз, и некроз. Апоптоз обычно индуцируется при воздействии низких концентраций токсикантов, при высоких концентрациях развивается некроз. Исследования показали, что решающим фактором является количество свободного АТФ. Когда повреждается небольшая часть митохондрий, они лизируются и процесс останавливается. Когда же происходит разрушение значительной части митохондрий, механизм аутолиза не срабатывает, а высвобождающийся cyt c запускает процесс активации каспаз и апоптоз. При вовлечении в процесс всех митохондрий запасы АТФ полностью истощаются и процесс апоптоза не может запуститься (для запуска необходима энергия). Происходит цитолиз.

Этап 4 — восстановление или повреждение?

Этап 4 в развитии токсического процесса обусловлен неадекватным восстановлением поврежденных структур. Многие токсиканты повреждают макромолекулы, что увеличивает масштаб альтерации и способствует развитию токсического эффекта.

Поврежденные молекулы могут быть восстановлены различными способами, например окисление тиоловых белков или метилирование ДНК может быть полностью устранено. После химического повреждения ДНК и пероксидного окисления жиров клетка гидролитически удаляет поврежденную часть. В некоторых случаях поврежденная молекула полностью деградирует, и необходим повторный синтез.

Восстановление белков. Тиоредоксин и глутаредоксин способны восстанавливать в белках окисленные тиольные группы (дисульфидные), способствуя поддержанию редокс-гомеостаза. Восстановление белков происходит и при участии восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН). Восстановление окисленного гемоглобина осуществляется путем передачи электронов с цитохрома b5, последний регенерируется при участии НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы. Молекулы индуцибельных шаперонов (БТШ) активно синтезируются в ответ на денатурацию белков. Они восстанавливают структуру поврежденных белков. Последние уничтожаются протеолизом. АТФ/убихинон-зависимые протеолитические системы контролируют уровень регуляторных белков (например, р53, IkB, циклинов), которые элиминируют поврежденные внутриклеточные белки.

Восстановление жиров. Окисленные жиры восстанавливаются в ходе сложного процесса, включающего ферменты класса редуктаз, глутатионпероксидазу и глутатионредуктазу. Для регенерации редуктаз необходим НАДФН.

Восстановление ДНК. Благодаря высокой плотности упаковки и наличию механизмов репарации ядерная ДНК довольно устойчива к действию свободных радикалов и электрофилов. Митохондриальная ДНК не имеет достаточно эффективных механизмов репарации и потому более уязвима.

Участки ковалентных сшивок цепей ДНК репарируются ферментами, например ДНК-фотолиазой, которая вырезает сшитые УФ-излучением пиримидиновые основания. Этот хромофорсодержащий фермент функционирует только при освещении. Метильные группы, присоединенные к О₆-атому гуанина, удаляются О₆-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазой, и структура полностью восстанавливается.

Удаление участка ДНК состоит из двух процессов — удаления поврежденных оснований и нуклеозидов. Незначительные дефекты (не нарушающие спиральную структуру) опознаются и устраняются относительно специфичной ДНК-гликозилазой (гидролизует N-гликозидные связи и образует беспуриновые и беспиримидиновые участки). Эти участки распознаются эндонуклеазой, которая гидролизует фосфорно-эфирные связи. После удаления поврежденного участка структура восстанавливается ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой. Крупные участки удаляются АТФ-зависимой нуклеазой. Этот фермент распознает искаженные участки и вырезает его вместе с частью неповрежденных нуклеотидов (с обеих сторон от поврежденного участка). Вырезанный участок ДНК восстанавливается путем вставок нуклеотидов ДНК-полимеразами и лигазами. Вторая нить используется как шаблон.

PARP, вероятно, является важным инструментом репарации. Этот фермент присоединяется и активируется поврежденными участками ДНК. Активная PARP гидролизует НАД⁺ и использует освободившуюся АДФ-рибозу для формирования на ядерных белках цепей поли-АДФ-рибозы. Так как АДФ-рибоза заряжена отрицательно, то получающаяся цепь также заряжается отрицательно. Цепи ДНК содержат много анионных частиц. Одноименный заряд приводит к расхождению цепей ДНК и молекул ядерных белков, происходит деконденсация хроматиновой структуры. Этот процесс необходим, потому что репарации подлежат только освобожденные от белков и частично раскрученные цепи ДНК.

В том случае если реплицируется поврежденная ДНК, реализуется механизм рекомбинационного (пострепликационного) восстановления. Это предотвращает синтез дефектных нитей ДНК. Результатом репликации являются две двухцепочечные молекулы ДНК: одна из них содержит длинный пострепликационный участок во вновь синтезированной цепи, другая идентична материнской ДНК. Последняя путем обмена участками (кроссовером) восстанавливает поврежденную цепь другой ДНК. Такой механизм обычно встречается при сшивках цепей ДНК.

Восстановление клеток (на примере периферических нейронов). Восстановление нейронов — крайне медленный процесс. Зрелые нейроны потеряли способность к делению, поэтому не происходит замещения поврежденных клеток здоровыми. Восстановление повреждений аксонов в периферических нейронах происходит с участием макрофагов и шванновских клеток, формирующих миелин. Макрофаги удаляют поврежденный участок, выделяют цитокины и факторы роста, активирующие шванновские клетки, на поверхности которых локализуется белок Par-3 в момент контакта с подлежащим миелинизации аксоном. Полярный белок Par-3 регулирует, как было установлено в 2005 г., процесс миелинизации. Клетки Шванна пролиферируют и запускают процесс восстановления нейронов. Дифференцированная клетка Шванна образует канал, по которому происходит рост аксона, кроме того, она выделяет факторы роста.

В ЦНС млекопитающих избыточное удлинение аксонов предотвращается ингибиторными гликопротеинами и хондроитинсульфатпротеогликанами, которые выделяются олигодендроцитами и астроцитами.

Восстановление тканей. В тканях, способных к регенерации, дефекты устраняются некрозом или апоптозом и пролиферацией.

Апоптоз может предотвращать появление новообразований, уничтожая клетки с опасными изменениями в структуре ДНК. Эффективное восстановление структуры тканей при апоптозе возможно только при замещении удаленных клеток новыми, т. е. в органах с высокой пролиферативной активностью (костный мозг, дыхательный эпителий, эпителий ЖКТ, эпидермис) или с относительно высокой — клетки печеночной и почечной паренхимы. Восстановления нейронов, кардиомиоцитов, яйцеклетки не происходит в связи с потерей способности к делению.

Ткани состоят из различных клеток и внеклеточного матрикса. Прикрепление клеток друг к другу обеспечивают кадгерины — семейство трансмембранных кальцийзависимых гликопротеинов, осуществляющих адгезивные межклеточные контакты. Пространство между клетками заполняют коннексины — нестабильные белки, живущие несколько часов. Интегрины — поверхностные гетеродимерные белки связывают клетки с внеклеточным матриксом. При восстановлении поврежденных тканей происходит регенерация клеток и компонентов внеклеточного матрикса, а также реинтеграция новых клеток в ткани и органы. Почти сразу после повреждения клеток соседние с ними клетки начинают делиться. Покоящиеся клетки (фаза G0) переходят в фазу G1. Начинается процесс митоза. В делящихся клетках происходит изменение экспрессии генов. Увеличивается экспрессия предранних генов, кодирующих TFs. Последние также активируют экспрессию некоторых генов. Через несколько часов экспрессируются поздние гены, кодирующие белки — регуляторы клеточного цикла. Преобладающими процессами в клетке становятся синтез ДНК и митоз.

Регенеративный процесс запускается особыми веществами, выделяемыми поврежденными клетками. Макрофаги и эндотелий, чувствительные к этим веществам, выделяют свои сигнальные молекулы, инициирующие регенерацию. Фактор некроза опухолей α (ФНОα, или TNFα) и интерлейкин β (ИЛ-β) способствуют активации покоящихся клеток, далее эти клетки под влиянием гепатоцит-ростового фактора (HGF) и трансформирующего ростового фактора альфа (TGF-α) переходят к фазе митоза.

Кроме митоза, восстановление ткани возможно за счет миграции клеток. В слизистой оболочке ЖКТ этот процесс происходит быстрее, чем рост новых клеток. Восстановление слизистой оболочки управляется факторами роста и цитокинами.

Восстановление внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс состоит из белков, гликозаминогликанов, гликопротеинов и протеогликанов. Активация покоящихся звездчатых клеток происходит под влиянием тромбоцитарного ростового фактора и TGF-β, которые выделяются при разрушении тромбоцитов. Пролиферация звездчатых клеток вызывается сильным митогеном тромбоцитарного ростового фактора, в то время как TGF-β вызывает усиление синтеза звездчатыми клетками элементов внеклеточного матрикса (коллагенов, фибронектина, тенасцина, протеогликанов).

Побочные реакции при повреждении тканей

Макрофаги и эндотелиоциты выделяют большое количество веществ, среди которых белки острой фазы (БОФ) воспаления, приводящие к развитию воспаления и лихорадки. В ответ на повреждение тканей макрофаги выделяют цитокины (ФНОα, ИЛ-1), нарушающие процессы микроциркуляции и способствующие развитию воспаления. Цитокины стимулируют ближайшие стромальные клетки (эндотелиоциты, фибробласты), которые начинают выделять медиаторы, расслабляющие микрокапилляры и вызывающие увеличение проницаемости сосудистой стенки. Активированные эндотелиоциты облегчают переход лейкоцитов в поврежденные ткани (под действием хемоаттрактантов и молекул клеточной адгезии). Адгезия лейкоцитов к эндотелиальным клеткам обеспечивается внутриклеточными молекулами адгезии (ICAM-1). После фазы адгезии происходит выход лейкоцитов через сосудистую стенку в ткани. Он облегчается разностью концентраций хемоаттрактантов, усиливающих в лейкоцитах синтез интегринов. Хемоаттрактантами являются хемотаксические цитокины (хемокины) — производные липидов, например тромбоцитактивирующий фактор и лейкотриен В4 (LTB4). Клетка любого типа, находящаяся вблизи места повреждения, выделяет ICAM-1, которые вызывают выход лейкоцитов в ткани. Лейкоциты синтезируют медиаторы, способствующие развитию воспалительного процесса.

В процессе воспаления генерируются АФК. В организме АФК выполняют ряд позитивных функций, связанных с их включением в продуцирование энергии, фагоцитоз, регулирование клеточного роста и межклеточной коммуникации. Например, одним из этапов естественного защитного механизма является генерация фагоцитами существенных количеств О₂^•ˉ. В поврежденных тканях макрофаги инициируют процесс выделения большого количества свободных радикалов и активных ферментов. Мембранная НАДФН-оксидаза после активации макрофагами и/или гранулоцитами также продуцирует супероксидный анион-радикал О₂^•ˉ, который затем превращается в гидроксидный радикал. NO макрофаги синтезируют путем окисления аргинина NO-синтетазой. Далее радикалы реагируют друг с другом и образуют другие свободные радикалы — NO₂^• и CO₃^•ˉ. Гранулоциты выделяют во внеклеточное пространство миелопероксидазу, катализирующую образование HOCl из пероксида водорода и хлорид-иона. HOCl при взаимодействии с Fe²⁺ или О₂^•ˉ образует гидроксильный радикал. Все свободные радикалы усиливают воспаление, одновременно препятствуя микробному заражению.

Цитокины макрофагов и эндотелиоцитов — ИЛ-6, ИЛ-1, ФНОα, действуя на мембранные рецепторы, усиливают экспрессию генов, кодирующих положительные и отрицательные БОФ.

Положительные БОФ способствуют уменьшению повреждения тканей и запускают процессы регенерации. Одним из способов их действия является ингибирование лизосомальных ферментов.

К отрицательным БОФ относятся альбумин, транстиретин, трансферрин, некоторые формы цитохрома P450 и глутатион-S-трансферазы. Они влияют на концентрацию химических агентов и определяют их место накопления в острую фазу. Эти белки играют важную роль в детоксикации, а иногда и усилении токсичности ксенобиотиков.

Генерализованные реакции

Цитокины активированных макрофагов и эндотелиоцитов изменяют нейрогормональный статус. ИЛ-1, ФНОα и ИЛ-6 действуют на температурный центр в гипоталамусе. Одновременно ИЛ-1 и ИЛ-6 усиливают продукцию АКТГ, стимулирующего выход кортизола из надпочечников. Обеспечивается и обратная связь — кортизол ингибирует синтез цитокинов.

Системы восстановления иногда не способны выявить повреждение. Регенерации не будет, если повреждаются кофакторы и ферменты системы восстановления, а также при ковалентном связывании ксенобиотиков с белками.

Возможен случай, когда системы восстановления усиливают токсический эффект. Примеры — истощение запасов НАД⁺ под действием PARP при восстановлении ДНК или расходование НАДФН на восстановление окисленных белков. Из-за истощения запасов доноров электронов под угрозу ставится процесс синтеза АТФ. При неконтролируемой пролиферации также возможно усиление токсического эффекта, что может привести к новообразованиям и фиброзу.

Неэффективность процессов регенерации

Отсутствие или неэффективность процессов регенерации может встречаться на всех уровнях (молекулярном, клеточном, тканевом).

Повреждение клеток заканчивается клеточной смертью при неэффективности процессов восстановления или необратимости повреждений. Развитие некроза могут остановить два механизма: апоптоз и пролиферация. Апоптоз предотвращает воспаление. Пролиферация запускается вскоре после повреждения ткани. Этот процесс способствует восстановлению структуры и функций ткани. Чувствительность тканей к повреждающим факторам и способность к восстановлению изменяются во времени и определяют выживание клеток. Эффективность репарации также зависит от концентрации токсиканта, но не только потому, что токсикант вызывает сильное повреждение клеток, но и из-за нарушения самих механизмов восстановления. При неэффективности механизмов восстановления клеток и отсутствии апоптоза и митоза развивается некроз.

Фиброз — патологический процесс, характеризующийся чрезмерным образованием межклеточного матрикса ненормального состава. Как уже было сказано, повреждение клеток запускает процессы пролиферации и ресинтеза компонентов межклеточного матрикса. Если последний процесс по каким-то причинам не останавливается, то развивается фиброз. Главным фактором фиброгенеза является TGF-β. Повышенное образование этого вещества в острую фазу — нормальный ответ на повреждение тканей. Его синтез прекращается по завершении процессов регенерации. Фиброзная активность TGF-β обусловлена стимуляцией синтеза и ингибированием деградации компонентов межклеточного матрикса. В процессе фиброза происходит изменение состава межклеточного матрикса. Непропорционально увеличено количество коллагенов и ламинина — адгезивного гликопротеина, полипептидные цепи которого ассоциированы в форме асимметричного креста и удерживаются вместе дисульфидными связями.

Канцерогенез. Химические канцерогены нарушают процессы репарации ДНК, апоптоза и терминации клеточной пролиферации.

Повреждение репарации ДНК. Химические и физические факторы могут вызывать неопластическую трансформацию клеток посредством генотоксических и негенотоксических механизмов. Химические агенты, действующие на ДНК, вызывают образование аддуктов, оксиление, сшивки цепей. Если эти повреждения не устраняются, появляются мутации и новые цепи ДНК уже будут отличаться от материнских. Наиболее неблагоприятная ситуация — экспрессия поврежденными генами белков-регуляторов клеточного деления. Такие клетки способны к сверхнормальному росту и вытесняют здоровые структуры. Результатом является образование опухоли.

Протоонкогены — это гены, кодирующие белки-регуляторы клеточного цикла. Белки-регуляторы включают факторы роста, рецепторы к факторам роста, внутриклеточные системы передачи сигнала (G-белки, протеинкиназы, циклины, циклинзависимые протеинкиназы) и TFs. Периодическое увеличение экспрессии этих генов необходимо для обеспечения клеточного цикла. Постоянное усиление активности протоонкогенов вызывает неоплазию. Изменение структуры протоонкогенов — это генотоксический механизм повреждений. Поврежденный ген (онкоген) запускает процесс усиленного синтеза белков-регуляторов. Примером мутационной активации онкогенных белков могут служить Ras-белки. Они расположены на внутренней поверхности клеточной мембраны, и в их функции входит синтез трансмиттеров в ответ на действие рецепторов факторов роста. Ras — молекулярный «переключатель», активный в ГТФ-форме и неактивный в ГДФ-форме. Некоторые мутации кодирующего его гена приводят к снижению активности ГТФазы. Белок более продолжительное время остается в форме ГТФ. Постоянный синтез медиаторов приводит к неконтролируемой пролиферации и трансформации.

Мутации в опухоль-подавляющих генах. Эти гены кодируют белки, замедляющие все фазы клеточного цикла, — ингибиторы циклинзависимых протеинкиназ, TFs. Ген р53 кодирует белок массой 53 000 Д. Он активирует экспрессию генов, кодирующих вещества — ингибиторы клеточного цикла. Одновременно он провоцирует апоптоз (блокада антиапоптотических факторов и активация проапоптотических). Повреждение ДНК и неисправимые мутации стабилизируют белок р53. Происходит его накопление, замедляется клеточный цикл, облегчается репарация или запускается апоптоз.

Накопление мутаций в протоонкогенах и опухольподавляющих генах — основной механизм злокачественной трансформации клеток. Так как жизнь клеток регулируется равновесием митоза и апоптоза, то любые изменения в генетической программе могут привести к смещению этого равновесия. Облегчение процессов апоптоза препятствует развитию опухоли, и наоборот. Усиленная митотическая активность провоцирует канцерогенез по следующим причинам.

Модификация генетического материала человека химическими агентами представляет одно из наиболее серьезных последствий воздействия токсикантов. Однако число агентов или процессов, которые известны как приводящие к таким изменениям, ограничено.

К настоящему времени генотоксиканты выявлены среди ароматических соединений и их галогенопроизводных, полихлорированных дифенилов и ароматических полициклов, простых и сложных эфиров (например, эфиры фталевой кислоты), галогенированных алифатических углеводородов, нитрозаминов, фенолов, пестицидов различной химической природы.

Генотоксичность — это способность химических, физических и биологических факторов оказывать повреждающее действие на генетические структуры организма.

Химические агенты инициируют последовательность событий, которая начинается с рецептора, сдерживающего/активизирующего генную и протеиновую экспрессию.

Экспрессия гена — это активизация транскрипции гена, в процессе которой на смысловой нити ДНК синтезируется мРНК.

Поскольку мРНК — предшественники ферментов, то измерение их относительного содержания в образцах ткани или клеток, подверженных действию токсиканта, показывает потенциальное вовлечение генов в этиологию токсичности. Образец экспрессии генов гораздо более информативен для выявления конкретных типов повреждений по сравнению с определением метаболита или активности единичного фермента, так как содержание метаболитов и активность ферментов могут быть изменены под влиянием многих факторов (см. гл. 3).

Использование микронабора ДНК, с помощью которого можно измерить уровень экспрессии в тысячах генов одновременно, значительно повысило чувствительность и специфичность диагностических тестов (рис. 2.3).

Высокоспецифичные изменения экспрессии генов помогают установить механизм токсичности химического агента, например, последовательность передачи сигнала или причины ингибирования ферментных систем, следовательно, определить эффективные биомаркеры, предупредить лекарственные взаимодействия, предвидеть побочные эффекты.

Достижения медицинской науки ежегодно приводят к внедрению новых лекарственных средств. В мультицентровых клинических испытаниях MERIT-HF, COMET, OASIS, ATLAS, PREVENTMARS, FATS, CLAPT, LRT, EXCEL и ряде других сообщается о значительной распространенности нежелательных реакций на лекарственные средства различных групп.

Часто развитие таких реакций обусловлено высокой концентрацией лекарственных средств в плазме крови вследствие полиморфизма генов, кодирующих ферменты биотрансформации и транспортеров. В настоящее время согласно концепции доказательной медицины в доклинических исследованиях новых лекарственных средств необходимо учитывать их влияние на состояние ферментной системы биотрансформации и транспортеров. При проведении клинических испытаний отбор пациентов должен проводиться с учетом генотипа изоферментов метаболизма. В диагностических целях доступно применение около 200 генетических тестов, и их число увеличивается с каждым годом. Во всех развитых странах значительно возросли требования к объему и качеству токсикогенетической информации, целью которых является стандартизация критериев необходимости и достаточности генетических исследований при изучении токсического действия различных ксенобиотиков.

Соотношение экспрессии генов и фенотипа

Фенотип может быть определен с помощью функциональных тестов, измерения компонентов сыворотки крови, гистологической оценки тканей и т.д. Взаимосвязь совокупности параметров экспрессии генов с данными клинических исследований — ключ к поиску биомаркеров токсических эффектов и формированию гипотезы относительно механизма действия токсиканта. Например, для многих токсикантов почка является мишенью, что связано с ее анатомическим строением и физиологическими функциями. В табл. 2.1 приведены некоторые вещества различной химической природы, оказывающие токсическое действие на почку (подробнее см. гл. 1).

Для оценки изменений генной экспрессии, которые происходят под влиянием классических почечных токсикантов, были проведены токсикогенетические исследования. Мишенью цисплатина — цис-дихлородиамин платины(II) — (CIS) и охратоксина А (OTA) является сегмент проксимального канальца S3. CIS токсичен для представителей всех биологических видов. Его токсичность может выявляться несколькими способами, включающими измерение креатинина плазмы, мочевины крови и т.д. ОТА — токсин, выделенный из особых видов грибов, включающих Aspergillus ochraeus и Penicillium verrucosum, которые присутствуют во множестве различных продуктов и напитков, таких как зерновые, орехи, специи, кофе и красное вино (см. гл. 10). Проводили независимые исследования генной экспрессии в почке при воздействии токсическими дозами CIS и OTA. При этом наблюдали почти одинаковые гистопатологические изменения, включающие некроз S3-клеток проксимального канальца и рассеянный апоптоз. Оба соединения накапливались в определенной области проксимального канальца. Гистологическая оценка послужила отправной точкой проверки взаимосвязи параметров генной экспрессии и морфологических повреждений. Анализировали гены крыс, которым вводили CIS, и крыс, которым вводили ОТА. Несмотря на то что в исследование включили только 250 генов, было обнаружено несколько функциональных классов генов, которые могут быть удовлетворительными биомаркерами. Таким образом, структурно и фармакологически разные соединения, делящие одни и те же токсикологические конечные точки, имеют сходство и в экспрессии генов.

Кандидаты в биомаркеры должны соответствовать многим требованиям, включая возможность раннего детектирования, при этом гены, протеиновые продукты которых секретируются в кровяное русло, являются лучшими кандидатами по сравнению с другими биомаркерами. Использование высокоточных технологий определения экспрессии генов может дать в ближайшее время ответы на многие вопросы, например:

Интерпретация изменений экспрессии генов возможна лишь в совокупности с данными клинической химии, гистологических исследований и других параметров, определяющих фенотип.

К генотоксикантам относят:

Механизмы индуцирования генетических изменений

Типы повреждений ДНК варьируют от разрыва одной или двух спиралей ДНК до пересечений между основаниями ДНК, между участками ДНК и белками, а также путем получения аддуктов ДНК при взаимодействии азотистых оснований с химическими агентами, либо опосредованно через интеркаляцию химического соединения между парными основаниями. Алкилирование основания может привести к его отрыву от молекулы ДНК с образованием беспуринового или беспиримидинового участка, который обычно называется АП-сайтом (участком). Включение посторонних оснований в АП-сайт приводит к мутациям. Эндогенные агенты ответственны за несколько тысяч повреждений ДНК, ежедневно происходящих в каждой клетке, преимущественно — за изменения оснований ДНК (например, 8-оксигуаниновых) и образование АП-сайтов. Клеточные процессы, которые могут привести к повреждениям ДНК — это избыточное накопление АФК, дезаминирование цитозинов и/или S-метилцитозинов, приводящее к образованию соответственно урацила и тимина.

Процесс репликации ДНК чреват возможными ошибками, например полимеразой может быть добавлено постороннее основание.

Два вида процессов помогают клетке устранять повреждения своей ДНК. Если повреждения значительны, то клетка может войти в стадию апоптоза. Если повреждение менее значительно, то в клетке происходят процессы восстановления: безошибочная или чреватая ошибками репарация (починка) ДНК.

Основные этапы большинства процессов репарации ДНК — это:

Возникновение генных мутаций

Генная (точковая) мутация представляет собой изменение последовательности нуклеотидов в пределах одного гена, приводящее к изменению характера действия гена.

Точковые мутации можно разделить на несколько типов в зависимости от характера молекулярного изменения в гене.

Относительная частота мутаций — это результат состязания между починкой и репликацией. Чем больше починок, которые производятся перед репликацией, тем меньше частота мутаций для данного количества индуцированных повреждений ДНК. Значимыми регуляторами этого состязания являются проверочные гены клеточного цикла (например, ген р53), поскольку если клетка не допускается для входа в S-фазу на проверочном пункте G1 / S, то возможно большее число починок, прежде чем клетка начнет воспроизводить свою ДНК. Важным моментом в оценке генных мутаций, индуцированных химическими агентами, является отношение между продолжительностью нанесения повреждения и длительностью репликации ДНК (т. е. если повреждение нанесено, может ли оно быть починено до репликации).

Одни методы обнаружения генных изменений определяют прямые мутации, другие методы — обратные. Прямые мутации — это генетические изменения в первозданном гене, и они обнаруживают себя изменением фенотипа. Обратная мутация восстанавливает функцию гена в мутанте и приводит к возвращению первозданного фенотипа.

Многие соединения, которые сами по себе не являются мутагенными или канцерогенными, могут превратиться в мутагены и канцерогены вследствие обмена веществ в организме. Частично совпадающие или индивидуальные характеристики генного ответа на определенный токсикант используют не только для выработки стратегии лечения экологически обусловленных заболеваний, выбора лекарственной терапии, но и для адекватной интерпретации результатов судебно-химической экспертизы или клинико-токсикологического исследования. Вот несколько примеров. Гены алкогольдегидрогеназы печени представлены тремя полиморфными локусами (ADH-1, ADH-2, ADH-3), альдегиддегидрогеназы — двумя (ALDH-1 и ALDH-2). Специфические реакции на алкоголь (тахикардия, жжение в желудке, мышечная слабость и др.) людей, у которых отсутствует изоформа ALDH-1, объясняют наследственными вариациями в молекулах двух ферментов, расщепляющих этанол. У некоторых больных при ингаляционном наркозе (фторотан и др.) появляется злокачественная гипертермия (температура тела повышается до 44°С), развиваются тахикардия, гипоксия, ацидоз, гиперкалиемия, что связано с мутацией в гене рианодинового рецептора и других генах. В хирургии для мышечной релаксации применяется дитилин, который действует по типу яда кураре (остановка дыхания) и быстро разлагается сывороточной холинэстеразой. Если холинэстераза атипичная из-за мутации в соответствующем гене, то при введении дитилина происходит остановка дыхания на 1 ч (в течение этого времени необходима искусственная вентиляция легких). Поэтому эксперт, делающий заключение по такого рода химико-токсикологическим исследованиям, должен учитывать генетические особенности потерпевшего.

Любые фармакогенетические реакции человека развиваются на основе эволюционно сформировавшегося генетического полиморфизма. Хорошо известна значительная вариабельность эффективности и побочных действий лекарств у разных групп населения и отдельных лиц. Клинические испытания лекарственных препаратов проводятся для выявления побочных эффектов у 1 из 500 человек или 1 из 1000 человек, и маловероятно, что они учитываются у 1 из 50 000. Становится ясно, что чем более специализировано новое лекарство, тем более вероятно «выпадение» определенного числа пациентов из успешного лечения. При введении стандартной дозы лекарства его концентрация в крови у одних людей через определенный промежуток времени оказывается ниже оптимальной, а у других достигает токсического уровня. Вариабельность генома человека (2,85 млрд пар оснований), по современным оценкам, составляет 2–10 млн пар оснований, часть из которых и определяет индивидуальные особенности ответа на воздействие химического агента.

Таким образом, индивидуальная переносимость химических соединений обусловлена генетическими особенностями каждого индивидуума. Воздействие токсикантов на организм реализуется через реакции, осуществляемые специфическими ферментативными системами клеток. Превращение исходной молекулы токсиканта в цепи метаболических реакций фазы I (см. гл. 3) осуществляется в основном изоферментами цитохрома Р450 и реже — флавинсодержащими монооксигеназами и алкогольдегидрогеназами. Вариабельность некоторых цитохромов суперсемейства цитохромов Р450 обусловливает различную скорость биотрансформации ксенобиотиков. Так называемые быстрая и медленная группы пациентов отличаются по показателям накопления и выведения химических соединений в 10–100 раз. Большинство каскадов реакций с участием микросомальных ферментов имеют в качестве терминального звена цитохром Р450. В организме цитохром Р450 существует в виде множества изоформ (на сегодняшний день известно около 400), кодируемых различными генами. Эти белки обладают различной, иногда перекрывающейся субстратной специфичностью и различными механизмами регуляции экспрессии (большинство изоформ цитохрома являются индуцируемыми, т. е. их количество в клетках значительно увеличивается при появлении субстрата).

В соответствии с принятой номенклатурой семейства обозначаются римскими цифрами, подсемейства — заглавными буквами латинского алфавита, а отдельные изоформы (индивидуальные ферменты) — арабскими цифрами^[16]. В биотрансформации ксенобиотиков принимают участие изоферменты трех семейств (I, II и III).

Изоферменты семейства I ответственны за метаболизм полициклических углеводородов, гетероциклических соединений, ароматических аминов у позвоночных; индуцируются диоксином. Изоферменты семейства II ответственны за метаболизм лекарств и химических веществ окружающей среды у позвоночных и беспозвоночных. Изоферменты семейства III ответственны за метаболизм лекарств и химических веществ окружающей среды у позвоночных.

Каждая изоформа имеет специфический спектр метаболизируемых субстратов, но при этом одно и то же соединение может метаболизироваться различными изоформами Р450 с образованием как одинаковых, так и различающихся продуктов. В зависимости от преобладания в клетке той или иной изоформы может меняться и состав продуктов реакции, в частности соотношение продуктов активации и детоксикации. У генов ряда изоформ существуют аллельные варианты с различной ферментативной активностью белка-продукта. Наличие таких аллелей в значительной степени обусловливает существование внутривидовых и межтканевых различий в чувствительности к токсикантам. Есть 39 генов, которые кодируют изоформы цитохрома P450. Три семейства (I, II и III) включают 19 изоформ.

Полиморфизм был выявлен в нескольких изоформах (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 и CYP3A4). Генный полиморфизм, связанный в особенности с CYP2D6, важен с токсикологической точки зрения. Например, есть препараты, для которых биотрансформация в организме регулируется этим ферментом (опиаты, β-блокаторы, антиаритмические препараты и антидепрессанты). Другие препараты действуют как ингибиторы этого фермента (метадон, декстропропоксифен). У пациентов с мутациями в CYP2D6 происходит нарушение метаболизма препаратов, и они имеют тенденцию накапливаться в организме.

Следовательно, значительно возрастает риск токсичности, если доза не подобрана согласно генотипу. Другой пример. Основным метаболитом кодеина, декстрометорфана и этилморфина является морфин. Приблизительно 7% представителей народов Кавказа имеют дефицит фермента, обеспечивающего метаболический путь указанных веществ. В связи с этим у таких людей образуется недостаточное количество морфина и анальгезирующий эффект проявляется слабее. Еще примеры. CYP1A1 — ген, кодирующий фермент арилуглеводородгидроксилазу (АНН — aryl hydrocarbon hydroxylase) из суперсемейства цитохромов Р450. Субстратом для этой изоформы являются вещества, содержащиеся в табачном дыме, которые при оксигенировании превращаются в токсичные производные фенола и различные эпоксиды. На сегодняшний день идентифицировано четыре полиморфизма в гене CYP1A1. Цитохром CYP1A2 участвует в метаболической активации проканцерогенных ариламинов и гетероциклических аминов, образующихся при термической обработке пищи. Фермент клеток печени, который участвует в метаболизме амфетаминов, сердечных гликозидов, нитрозаминов и ряда других веществ, кодируется геном CYP2D6. У 5–10% европеоидов в зависимости от ареала проживания такой фермент отсутствует.

Примером фермента, не принадлежащего к группе цитохромов, является NADPH-хиноноксидоредуктаза 1 (ген NQO1). NQO1 играет ключевую роль в детоксикации бензола, инактивируя хиноны, образующиеся в результате метаболизма. Обнаружено два полиморфных сайта в гене NQO1: С609Т (NQO1*2) и Т464С (NQO1*3). Полиморфизм NQOP2 можно считать нонсенс-мутацией, так как он приводит к появлению стоп-кодона и отсутствию белка-продукта, однако частота встречаемости его в различных популяциях варьирует (13–30%). Аллель NQO1*3 встречается реже, его частота не превышает 5%. Для фермента этого аллеля показано снижение энзиматической активности в 2 раза по сравнению с нормальным ферментом, который катализирует превращение хинонов в гидрохиноны, подвергающиеся затем конъюгации и выведению. При этом предотвращается образование полухиноновых радикалов с последующим формированием АФК. Экспрессия гена NQO1 индуцируется окислительным стрессом, влиянием циклических углеводородов табачного дыма и промышленных акрилатов.

Достижения молекулярной биологии и медицины последних лет изменили представления о системе биотрансформации и транспортеров токсикантов, цель функционирования которой — предотвращение проникновения токсикантов в системный кровоток, органы и ткани, снижение их биологической активности, уменьшение липофильности и повышение гидрофильности для облегчения выведения и удаления (экскреции) из организма. Активность ферментов биотрансформации и системы транспортеров (специализированных белков-переносчиков) — главный лимитирующий фактор метаболических процессов в организме. Транспорт ксенобиотиков играет значительную роль в развитии токсического эффекта. Белки, осуществляющие транспорт, являются детерминантами распределения токсиканта. Один из наиболее изученных транспортных белков — трансмембранный белок Р-гликопротеин — АТФ-зависимый насос, основными функциями которого являются препятствие всасыванию токсикантов в тонком кишечнике и предотвращение их проникновения через гистогематические барьеры при попадании в организм, а также скорейшее выведение печенью в желчь и почками в мочу. Р-гликопротеин является продуктом гена MDR1, для которого характерен полиморфизм.

Ген MDR1, кодирующий Р-гликопротеин, принадлежит к генам, отвечающим за клеточную защиту. Его гиперэкспрессия определяет устойчивость клетки к ряду химиотерапевтических препаратов, известную как множественная лекарственная устойчивость. В систему биотрансформации и транспортеров токсикантов включены ферменты фаз I и II биотрансформации, а также транспортеры органических анионов и катионов, осуществляющие выведение токсикантов печенью в желчь и почками в мочу (см. гл. 3). Для генов, кодирующих эти белки, так же как и для гена MDR1, характерен полиморфизм.

Субстрат, окисленный при участии цитохрома Р450 или какого-либо другого фермента, далее подвергается воздействию ферментов конъюгации, катализирующих включение в молекулу вещества водорастворимых остатков: глутатиона, серной кислоты и др. (фаза II, см. гл. 3). В результате метаболит становится гидрофильным и выводится из организма с мочой. На этом этапе работают S-трансферазы, эпоксидгидролазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы и ацетилтрансферазы. В случае сниженной активности такого фермента, например вследствие присутствия специфического аллеля гена, в клетке будет происходить накопление продуктов фазы I биотрансформации и, соответственно, повышаться риск повреждения ДНК. Ряд веществ под действием ферментных систем фазы II биотрансформации способен превращаться в активные канцерогенные метаболиты. Например, гидрирование эпоксидгидролазами 7,8-оксида бензапирена до гидродиола с дальнейшим образованием из него диолэпоксида приводит к активации молекулы и превращению ее непосредственно в канцерогенный метаболит (см. гл. 3 и 9). Введение глюкуроновой кислоты в продукт фазы I биотрансформации — важнейшая реакция детоксикации соединений. Два генных семейства кодируют изоформы глюкуронозилтрансферазы: UGT1 и UGT2. Мутация изоформы (UGT1A1) приводит к гипербилирубинемии, что связано с последующими нарушениями метаболизма.

Суперсемейство GST — это глутатион-S-тpaнcферазы. GST участвуют в активации и детоксикации многих ксенобиотиков. Например, токсичность парацетамола в больших дозах связана с истощением печеночного глутатионового депо. Функциональная роль глутатион-трансфераз заключается в ферментативной конъюгации сульфгидрильной группы с электрофильными центрами молекул ксенобиотиков или их метаболитов, образовавшихся в процессе фазы I. Подобная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к ПОЛ, алкилированию белков и другим процессам с участием свободных радикалов. Существует несколько классов глутатионтрансфераз в зависимости от субстрата и органной принадлежности ферментов. Их синтез контролируется генами, расположенными на различных хромосомах. Для каждого из них описано несколько видов полиморфизма, который влияет на функциональную активность ферментов. Так, отмечена высокая распространенность у людей генного полиморфизма для нескольких GST, что, как считают специалисты, связано с увеличением риска развития рака, обусловленного действием экотоксикантов (см. гл. 9).

В метаболизме гетероциклических ароматических аминов у человека важную роль играет ариламин-N-ацетилтрансфераза (NAT). Этот фермент катализирует ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и относится к ферментам фазы II биотрансформации ксенобиотиков. Известны две изоформы NAT человека — NAT1 и NAT2. NAT2 обладает меньшей специфичностью и метаболизирует более широкий круг веществ, экспрессируется преимущественно в клетках печени, а также синтезируется в тканях, например, молочной железы. По фенотипическим проявлениям активности NAT2 людей можно разделить на быстрые, промежуточные и медленные ацетиляторы (ранее выделяли только группы быстрых и медленных ацетиляторов). В настоящее время известно 36 аллелей гена NAT2, которые различаются сочетанием 12 миссенс-мутаций, 4 молчащих мутаций и делеции одного нуклеотида, приводящей к сдвигу рамки считывания. Частоты встречаемости аллелей NAT2 значительно варьируют в разных популяциях. К наиболее распространенным среди европеоидов медленным аллелям относятся кластеры NAT2*5 (Т341С) и NAT2*6 (G590A) (в скобках указана характерная мутация). Кластер NAT2*7 (G857A) представлен в основном у монголоидов, а NAT2*14 (G191A) — только у представителей экваториальной расы. Изменение скорости ацетилирования связано с токсическими эффектами ксенобиотиков, относящихся к ариламинам, гетероциклическим аминам, гидразинам.

Сульфатирование и метилирование — также важные пути метаболизма многих ксенобиотиков. Сульфотрансферазы (SULT, SULT1 и SULT2) и метилтрансферазы [метилтрансфераза (МТ), катехол-О-метилтрансфераза (COMT), метилтрансфераза тиопурина (TPMT) и триметилтрансфераза (TMT)] катализируют эти реакции. В настоящее время для этих ферментов идентифицировано несколько видов полиморфизма, но их клиническое проявление еще неясно.

Степень канцерогенного воздействия химических соединений на уровне их метаболизма определяется балансом активирующих и детоксифицирующих реакций, осуществляемых полиморфными ферментными системами. Клеточные защитные механизмы против избыточного накопления АФК включают следующие ферменты: глутатион- пероксидазу, каталазу и семейство супероксиддисмутаз. Mn-SOD синтезируется в цитозоле и после посттрансляционной модификации транспортируется в митохондрии. В гене Mn-SOD присутствует однонуклеотидный полиморфизм (GTT–GCT), приводящий к замене 16 аминокислоты (Val–Ala) в сигнальном пептиде, теряемом в процессе посттрансляционной модификации. При подобной замене происходит изменение вторичной структуры белка (трехскладчатый слой вместо α-спирали) и нарушается транспорт фермента в митохондрию.

Вклад генетических факторов в вариабельность ответной реакции организма на введение токсиканта составляет от 20 до 95%. На сегодняшний день накоплено множество примеров, показывающих, что эти различия обусловлены вариантами нуклеотидной последовательности генов, кодирующих ферменты биотрансформации токсикантов, молекулы-переносчики лекарств и рецепторы, взаимодействующие с лекарствами. В отличие от других факторов наследственная детерминированность ответа остается постоянной на протяжении всей жизни индивида.

Определение генного полиморфизма ферментов — основа выявления индивидуальной химической чувствительности.

Биочипы были изобретены в конце 90-х годов ХХ в. в России и США. История создания отечественного биочипа связана с именем академика РАН А. Мирзабекова, рано ушедшего из жизни (1937–2003). В настоящее время технология биочипирования активно используется для определения экспрессионных профилей работы генов и определения однонуклеотидных замен (вариабельных локусов ДНК), являющихся признаками конкретного генотипа. Эта технология позволяет проводить высокочувствительный, селективный, экспрессный, производительный и информативный анализ, составляя основу генетической паспортизации населения. Биочипирование дает возможность определять индивидуальный полиморфный профиль ферментов, например цитохрома P450. Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют, DNA microarrays, — организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе — платформе, пластинке из стекла или пластика площадью около 1 см², на которой в определенном порядке расположены ячейки (до 1 млн на 1 см²), содержащие иммобилизованные одноцепочечные олигонуклеотиды с уникальной последовательностью оснований. Базовым принципом для создания ДНК-чипов является линейное узнавание стереокомплементарных оснований (A — T / U, G — C) нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). Олигонуклеотиды чипа гибридизуются с меченными, например, флуоресцентной меткой, наборами молекул ДНК или РНК. Спустя некоторое время платформу промывают. Если в наборе имеется олигонуклеотид, комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними образуется водородная связь, и при промывании такой нуклеотид не будет удален, в отличие от тех, которым не нашлось комплементарных оснований. Затем производится детекция наличия меченых молекул в ячейках. Информация считывается с помощью флуоресцентного микроскопа или специального лазерного устройства для чтения. Способы изготовления биочипов бывают разными, например способом фотолитографии с использованием специальных микромасок и лазера, аналогично изготовлению электронных чипов. На одном чипе расположены десятки (а иногда и сотни) тысяч пятен размером в несколько микрометров. Каждое пятно — это один уникальный фрагмент ДНК длиной в десятки нуклеотидов. Изготовленный таким образом биочип в дальнейшем гибридизуют с меченными красителем молекулами ДНК. После гибридизации на биочипе возникают паттерны — причудливые узоры, различающиеся у нормальных и поврежденных клеток. Сопоставив структуры взаимодействующих с исследуемым образцом олигонуклеотидов и интенсивность сигнала, получают информацию о последовательности меченой молекулы ДНК (РНК) или о наличии и количестве искомой последовательности в образце. По виду паттернов можно с большой вероятностью на самой ранней стадии предсказать течение патологического процесса.

Как регулируется активность отдельных генов в рамках генома как целого? Технологии биочипирования позволяют определить функциональное состояние всех генов: какие гены работают в данной клетке на какой-либо стадии развития, какие находятся в неактивном состоянии, а также установить взаимосвязь сигнальных регуляторных путей клетки. На биочипах проводят одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов и сравнивают экспрессию этих генов в здоровых и в поврежденных клетках. Такие исследования помогают увидеть (сразу, за один эксперимент!) влияние различных ксенобиотиков на работу десятков тысяч генов и выяснить, на какие гены и каким образом они действуют. В настоящее время разрабатывают «белковые» микрочипы для определения протеома.

В России разработаны биочипы, позволяющие при биологической угрозе (см. гл. 10) определять возбудители сибирской язвы, оспы, чумы и бруцеллеза как наиболее вероятные для использования в качестве биооружия. В США для американской армии разработан специальный биочип, сигнализирующий о наличии бактериальной угрозы. Если на такой биочип попадает ДНК патогенных микробов, то фрагменты ДНК зондов с прикрепленными к ним микроскопическими частицами золота выстраиваются в ряд, между электродами идет ток, и биочип сигнализирует об угрозе.

В последние годы произошел значительный прогресс в методах определения генотипов (в SNP-анализе). Согласно принятому определению, SNP (single nucleotide polymorphisms) — это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причем редкий аллель встречается с частотой не менее 1%. Иногда дополнительно определяются «распространенные SNP», для которых частота встречаемости редкого аллеля более 20%. Практический интерес к SNP сильно возрос в ходе реализации проектов по определению полных нуклеотидных последовательностей ряда модельных организмов. В самом определении SNP заложена ориентация на их использование в качестве генетических маркеров (ограничение по частоте встречаемости противопоставляет их редким мутациям). Огромное количество SNP в геноме человека (по различным оценкам, 3–10 млн распространенных SNP) позволяет отобрать порядка 100 000 SNP-маркеров; при этом на каждый известный или предполагаемый ген приходится в среднем по два маркера. Никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность картирования. Скрининг SNP — это основа стандартного подхода к исследованию молекулярной природы индивидуальной химической чувствительности.

Для идентификации генетических изменений используют различные методы детекции SNP, например ферментативные, химические (расщепление или лигирование), методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК (секвенирование ДНК), хроматографию (например, высокоэффективную жидкостную хроматографию — ВЭЖХ), МС, резонансное тушение флуоресценции и др.

Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом, составляет всего несколько секунд и позволяет оценить долю SNP при анализе нескольких образцов одновременно. Ионизированные молекулы ДНК отрываются от подложки методами MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisation) — лазерной десорбционной ионизации или ESI (electrospray ionisation) — электроспрейной ионизации (см. гл. 5). Молекулы ДНК разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скорости фрагмента молекулы, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна отношению массы фрагмента молекулы к его заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) уникальны для каждой молекулы нуклеиновой кислоты и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, поэтому чувствительность метода чрезвычайно высока. Метод позволяет работать с нанолитрами образца.

Постгеномные технологии — геномика, протеомика, метаболомика, метабономика имеют большие возможности для определения качественных и количественных изменений метаболических процессов в организме человека при воздействии токсикантов. Генетический код генерирует сигналы (транскриптом), определяющие состав протеома, который, в свою очередь, устанавливает каталитические факторы метаболизма. Метаболом описывает совокупность метаболических процессов в каждой клетке, ткани, биологической жидкости или организме в целом. По существу, метаболом регулирует геном посредством специальных белково-метаболических взаимодействий, которые прямым или косвенным путем контролируют генную транскрипцию. В биосистемах существует много примеров таких генов, которые регулируются промежуточными или конечными продуктами метаболизма посредством обратной связи. Самыми изученными регуляторными системами в организме млекопитающих являются метаболизм холестерина и метаболизм глюкозы. Оксид азота(II) и кислород как продукты метаболических превращений также участвуют в регуляции транскрипции генов.

Токсичные вещества, взаимодействующие с ДНК, мРНК и белками, определяют конечный (реальный) метаболом биологических систем, тогда как геном и протеом определяют лишь возможный метаболом (рис. 2.4).

Определения терминов «метаболомика» и других «омиков» не являются строгими в научном смысле. Подобно геномам и протеомам существуют различные метаболомы, содержащиеся как в клетках одноклеточных организмов, так и в клетках тканей многоклеточных организмов. Существуют метаболомы и в биологических жидкостях — моче, спинномозговой жидкости и плазме, в которых можно обнаружить различные метаболиты при нормальных метаболических процессах и при воздействии токсикантов на организм. Новейший тандемный метод — ядерно-магнитный резонанс в совокупности с масс-спектрометрией (ЯМР-МС) является основным инструментом для подобных исследований (см. гл. 5).

В метаболических исследованиях используют два подхода к применению ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и ЯМР-МС. Первый подход объединен под общим названием «метаболомика». Этот термин подразумевает совокупность технологий идентификации всех эндогенных соединений и метаболитов ксенобиотиков. Второй подход разработан Д. Николсоном с сотрудниками и назван метабономикой. Этот термин подразумевает совокупность технологий идентификации в биологических жидкостях эндогенных соединений и метаболитов ксенобиотиков, характеризующих конкретное патологическое состояние организма, и построение моделей различных патологических состояний. Метаболомика и метабономика позволяют отличить «нормальный» метаболизм от «измененного». В токсикологических исследованиях используются оба подхода. В конечном счете в результате исследования важно ответить на ключевые вопросы: чем различаются белки больной и нормальной клетки, какой вред нанесен клетке и как это связано с определенным патологическим состоянием?

«Метаболическое профилирование» и «биохимическое профилирование» — также широко используемые термины для описания метаболических исследований. Метаболическое профилирование является способом определения состава и/или количества небольших молекул в биологическом объекте. Анализ может включать один или несколько технологических приемов, таких как ВЭЖХ, газовая хроматография (ГХ), капиллярный электрофорез (КЭФ), МС и ЯМР (см. гл. 5). Исторически профилирование эндогенных метаболитов сводилось к определению специфических соединений или типов соединений. Например, после приема красного вина органические кислоты в моче или флавоноиды в крови могут быть обнаружены несколькими методами — ГХ-МС, ВЭЖХ-МС или ЯМР. Таким образом получался «снимок» уровня метаболитов в определенное время и в определенном состоянии. В настоящее время метаболическое профилирование должно быть рассмотрено уже в составе (системе) метаболома. Современные аналитические технологии позволяют это выполнить, однако пока существует серьезная проблема, которая заключается в разработке единых (стандартных) аналитических методик определения и регистрации результатов при исследовании биологических объектов. Для определения большого количества метаболитов стали использовать МС и ЯМР, их разновидности, комбинированные методы, например ВЭЖХ-МС-ЯМР. Данные, полученные в этих исследованиях для воссоздания реально происходящих процессов in vivo, опираются на установление полной структуры определяемых веществ (см. гл. 5). Во многих токсикологических исследованиях в результате мониторинга процессов, происходящих в организме в ответ на действие токсиканта, отмечается, что изменения в метаболизме предшествуют гистологическим изменениям.

В начале 2007 г. было сообщено о создании базы данных и компьютерной модели, в которых впервые представлены все известные биохимические реакции, происходящие в организме человека, и связи активности многих генов с обменом веществ и последующей выработкой соответствующих белков, ферментов и метаболитов. Разумеется, карты отдельных метаболических циклов существовали и раньше, однако такая работа по глобальному обобщению проделана впервые. База данных, которая теперь будет постоянно пополняться, сегодня включает 5300 различных химических реакций. Биохимические реакции и их взаимосвязи описаны для каждого известного типа клеток организма. В компьютерную модель можно вводить различные исходные данные и на выходе получать результаты в виде концентрации тех или иных веществ. Для испытания системы были использованы 288 различных ситуаций, в частности, синтезы тестостерона и эстрогена, а также метаболизм жиров, поступающих в организм с пищей. Модель имеет общий характер, и сегодня использовать ее с учетом особенностей индивидов пока непросто.

В настоящее время метаболомические исследования применяются и для разработки новых лекарственных средств. Так, в США, Японии и Евросоюзе организованы небольшие компании с целью выполнения различных метаболомических исследований для крупных фармацевтических фирм, занимающихся разработкой новых лекарственных препаратов. Одна из задач этих компаний заключается в быстром получении ранних метаболических маркеров токсичности (или безопасности) лекарственных средств. Другая задача заключается в открытии новых метаболических маркеров, образующихся в организме человека в ответ на действие химического агента, которые могут в дальнейшем использоваться для выявления индивидуальной химической чувствительности.

Заключение

Общепризнанна жидкостно-мозаичная модель мембраны клетки, предложенная Сингером и Николсоном (1972). В липидный бислой мембраны встроены молекулы гликопротеинов, определяющие ее тип и свойства, в частности проницаемость для химических веществ (см. ниже табл. 3.7). Переход веществ через биологические мембраны осуществляется путем пассивного или специфического транспорта.

1. Пассивный транспорт:

Пассивная диффузия. Скорость диффузии вещества через мембрану является функцией градиента концентрации. При этом большое значение имеют:

Константа диффузии токсиканта зависит от его липофильности, молекулярной массы, пространственной конфигурации и степени диссоциации (в случае слабого электролита).

Процесс пассивной диффузии описывается уравнением Фика. Пассивная диффузия происходит в направлении падения концентрации вещества, ведет к равномерному распределению вещества по всему занимаемому им объему, не требует затрат энергии и возможна в обоих направлениях (как в клетку, так и из нее). С ростом молекулярной массы вещества коэффициент диффузии заметно снижается. Через биологические мембраны могут проходить молекулы жирорастворимых веществ, воды и некоторых низкомолекулярных гидрофильных соединений.

Липофильные токсиканты свободно диффундируют через мембрану. С увеличением растворимости веществ в липидах их проницаемость через биологические барьеры растет, но, достигнув определенного уровня, резко снижается. Вещества с очень высокой липофильностью не проникают через мембрану, а накапливаются в ней.

Гидрофильные токсиканты не могут беспрепятственно преодолеть липидный бислой мембраны. Транспорт таких молекул возможен благодаря мембранным белкам, формирующим в липидном слое водные каналы (поры), и определяется размерами транспортируемой молекулы, но не зависит от коэффициента распределения в системе масло/вода. Если диаметр молекулы больше диаметра пор, то она не проникает через мембрану. Диффузия через поры также описывается уравнением Фика, но под диффузионной поверхностью понимают эффективную площадь пор.

Для всех ионизированных молекул, независимо от размера, липидная мембрана плохо проницаема или совсем непроницаема. Величина заряда иона имеет большее значение, чем его размер, что обусловлено как взаимодействием иона токсиканта с зарядами белковых молекул на стенках канала, так и его гидратацией в водной среде. Проницаемость мембран для двухзарядных ионов хуже, чем для однозарядных, так как степень гидратации тем выше, чем больше заряд (так, трехзарядные ионы не преодолевают биологические барьеры).

Для транспорта токсикантов, являющихся слабыми органическими кислотами и основаниями, большое значение имеет величина их рK_а (см. гл. 1). Недиссоциированные молекулы таких веществ проникают через липидные мембраны и поры в соответствии с величиной коэффициента распределения в системе масло/вода. Ионы, образовавшиеся при диссоциации молекул таких веществ, через липидный бислой и поры не диффундируют.

Фильтрация — это процесс прохождения жидкости и растворенных в ней веществ с малыми размерами молекул через пористые мембраны под действием гидростатического или осмотического давления. Она осуществляется в капиллярном отделе кровеносного русла (капилляры проницаемы для низкомолекулярных веществ), в гломерулярном аппарате почек (образование первичной мочи) (см. гл. 1). Большинство токсикантов экскретируется из организма путем фильтрации (см. ниже).

2. Специфический транспорт:

Активный транспорт веществ через мембрану осуществляется против градиента концентрации или градиента электрохимического потенциала, требует затраты энергии и протекает в одном направлении. Известны специфические транспортные системы как для эндогенных веществ, так и для ксенобиотиков. Транспортные белки и гликопротеины играют важнейшую роль в регуляции абсорбции, распределения и экскреции многих токсикантов. Примеры — Р-гликопротеин, основной функцией которого является энергозависимый (за счет гидролиза АТФ) трансмембранный транспорт многих веществ; пептиды — переносчики органических катионов и анионов, играющие важную роль в поступлении токсикантов в печень, и др.

Процесс, при котором энергия АТФ непосредственно расходуется на перемещение молекулы или иона через мембрану, — это первичный активный транспорт. Известно четыре типа таких процессов, которые называют ионными насосами:

Принцип действия ионных насосов аналогичен работе специализированных белков-переносчиков, встроенных в мембрану — пермеаз. Механизм работы пермеазы заключается в специфическом связывании переносимого вещества на внешней поверхности мембраны, последующего фосфорилирования с помощью АТФ и изменения конформации пермеазы, в результате чего переносимое соединение оказывается внутри клетки. Белки ионного насоса могут находиться в двух конформациях. Например, в одной конформации белок связывает три иона натрия, в другой — два иона калия.

Вторичный активный транспорт включает два транспортных механизма:

Облегченная диффузия — это процесс прохождения молекул вещества через барьеры по градиенту концентрации с помощью специальных белков-переносчиков. Этот процесс специфичен и протекает с более высокой скоростью, чем пассивная диффузия. Скорость транспорта веществ облегченной диффузией зависит от трансмембранного градиента концентраций переносимого вещества, скорости связывания вещества переносчиком на одной поверхности мембраны, от количества белков-переносчиков в мембране, скорости их конформационных изменений, в результате которых вещество переносится через мембрану (например, с внешней поверхности) и высвобождается на другой поверхности мембраны (например, внутренней). После уравнивания концентрации вещества по обе стороны мембраны процесс транспорта прекращается. В отличие от активного транспорта облегченная диффузия не требует затрат энергии.

При облегченной диффузии, как и в процессе активного транспорта, возможен котранспорт — транспорт иона или молекулы, сопряженный с переносом другого иона.

Прохождение через барьеры путем цитозов ^[19] включает эндоцитоз, экзоцитоз, трансцитоз, синцитоз и интрацитоз.

Эндоцитоз. Макромолекулярные комплексы или корпускулярный материал (например, частицы металлической, асбестовой или угольной пыли, чужеродные и отмирающие собственные клетки организма, крупные вирусы, бактерии и др.) клетка захватывает с помощью фагоцитоза — явления поглощения и переваривания клетками корпускулярных частиц. Везикула размером в несколько микрометров, содержащая частицы, отделяется от клеточной мембраны и переносится в цитоплазму.

Капли жидкости и растворенные в ней вещества, окруженные клеточной мембраной, образуют везикулы диаметром около 0,1 мкм и захватываются клеткой (пинозитоз).

Рецептор-обусловленный эндоцитоз — высокоспецифичный и независимый от концентрации токсиканта процесс — состоит из нескольких этапов. Рецепторы эндоцитоза представляют собой глико- и липопротеины, липофильная часть которых связана с липидной мембраной, а гидрофильные части обращены внутрь и наружу клетки (например, акроглобулиновый/липопротеиновый рецептор — LRP, выполняющий функции основного рецептора эндоцитоза). Вначале молекулы транспортируемого вещества (лиганда) взаимодействуют с липофильной частью рецептора, расположенной на внешней поверхности мембраны. При этом часть рецептора, которая находится в цитоплазме клетки, взаимодействует со специализированным белком, называемым адаптином (adaptine).

Полученный комплекс лиганда, рецептора и белка мигрирует в определенную зону мембраны, на которой уже сконцентрировались другие аналогичные комплексы, окаймленные специализированным белком — клатрином (clathrin), играющим одну из главных ролей при образовании везикул. На следующем этапе «окаймленные ямки», находящиеся на мембране, втягиваются в клетку, отделяются от мембраны, образуя везикулы. Находясь внутри клетки, везикула практически сразу теряет клатриновую оболочку и адаптины. Далее разрушается комплекс лиганда с рецептором, который встраивается обратно в структуру клеточной мембраны, т. е. осуществляется рециркуляция рецептора, а лиганд, попав во внутреннюю среду клетки, целенаправленно доставляется к ядру, аппарату Гольджи или другим органеллам, не смешиваясь с другими макромолекулами клетки. Путем рецептор-обусловленного эндоцитоза в клетку поступают высокомолекулярные вещества, регулирующие ее метаболизм (например, гормоны, факторы роста, трансферрин, липопротеины низкой плотности и др.), а также проникают некоторые токсины белковой природы (например, тетанотоксин, ботулотоксин, см. гл. 10).

Экскрецию макромолекул из клетки во внеклеточное пространство называют экзоцитозом.

Трансцитоз — специализированный транспорт, характерный для некоторых типов клеток (например, эпителиальных), — объединяет признаки рецептор-обусловленных эндоцитоза и экзоцитоза при участии фузогенных (от лат. fusio — слияние) мембранных белков. Везикула транспортируется через внутриклеточное пространство к противоположной мембране и выделяет свое содержимое во внеклеточное пространство (например, сосуды).

В главах 6–10 при рассмотрении свойств отдельных токсикантов даны пояснения о преобладающем механизме транспорта.

В организм токсиканты могут поступать энтеральным (перорально с последующим всасыванием в ЖКТ) и парентеральным путями. Парентеральные пути поступления ксенобиотиков разнообразны (внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, трансдермальный, ингаляционный и др.).

По своим физико-химическим свойствам большое количество веществ способно как к местному, так и к резорбтивному, или системному, действию. При внутривенном или внутриартериальном введении токсикант сразу и полностью попадает в кровоток. Если вещество оказывает повреждающее действие на месте введения (поступления), то такое воздействие называют местным, например действие сильных кислот и щелочей на кожу.

В зависимости от того, какой из барьеров преодолевает вещество, говорят об ингаляционном, трансдермальном, пероральном или другом пути поступления токсиканта в организм.

Резорбция (абсорбция) — процесс переноса (проникновения) токсиканта из места поступления (окружающей среды или ограниченного объема внутренней среды организма) в системный лимфо- и кровоток — происходит при всех путях введения, кроме внутрисосудистого.

На скорость и способ резорбциии токсиканта влияют многие факторы (табл. 3.2). Резорбция ксенобиотика характеризуется коэффициентом резорбции (k_рез), который определяется долей вещества, перешедшего в системный лимфо- и кровоток из места введения.

Резорбция через кожу

Поступление веществ через кожу осуществляется через эпидермис, сальные и потовые железы или волосяные фолликулы путем пассивной диффузии. На скорость резорбции токсикантов влияет ряд факторов (табл. 3.3).

Резорбция через слизистые оболочки

Топография слизистых оболочек в организме человека разнообразна. Слизистые оболочки выстилают внутренние органы, сообщающиеся с внешней средой (легкие, ЖКТ, влагалище и др.), а также глаза. С поверхности слизистых оболочек, как и с поверхности кожи, происходят всасывание токсикантов и их поступление в системный кровоток.

Скорость резорбции большинства токсикантов через слизистые оболочки пищеварительного тракта определяется их растворимостью в липидах и способностью к ионизации при определенном рН среды. Некоторые токсиканты всасываются путем активного транспорта. При введении токсикантов внутрь скорость их абсорбции в разных отделах ЖКТ различная.

Резорбция в ротовой полости. В хорошо снабжаемой кровью ротовой полости (рН среды 6,6–6,9) происходит быстрое всасывание многих находящихся в молекулярной форме токсикантов, которые затем поступают в сердце, малый круг кровообращения и далее в общий кровоток. При резорбции в ротовой полости токсиканты распределяются в организме, минуя печень.

Резорбция в желудке. Резорбция токсикантов в желудке (рН среды 0,9–2,0) происходит путем простой диффузии. Липофильные вещества абсорбируются лучше, чем гидрофильные. Кислотность желудочного содержимого определяет особенности всасывания токсикантов. Например, при физиологических значениях рН среды желудка морфин присутствует исключительно в протонированной по азоту форме и практически не резорбируется из желудка. Аналогичным образом ведет себя большинство алкалоидов.

Как правило, натощак всасывание в желудке идет интенсивнее, так как взаимодействие токсиканта с компонентами пищи снижает его концентрацию и соответственно скорость диффузии в кровь. С другой стороны, прием пищи вызывает изменение рН содержимого желудка и увеличивает время эвакуации токсиканта из желудка, что часто сопровождается повышением степени резорбции. Холодные растворы токсикантов часто оказываются более токсичными, чем теплые, так как быстрее покидают желудок.

Резорбция в кишечнике. Токсиканты всасываются в кровь преимущественно в кишечнике (рН среды тонкой кишки 6,5, сока поджелудочной железы 8,6–9,0, сока тонкой кишки 5,07–7,07, толстой кишки 6,8), бóльшая часть — путем пассивной диффузии, остальные — посредством активного транспорта. В кишечнике не резорбируются сильные кислоты и основания, затруднено всасывание ионизированных молекул, содержащих четвертичный азот. Резорбция слабых кислот определяется величиной их рK_а. Важно отметить, что с увеличением концентрации токсиканта в кишке повышается скорость его всасывания, но при этом сохраняется доля (процент) всосавшегося вещества.

Если вещество нерастворимо в липидах, то оно практически не проникает из кишечника в кровь. Высоколипофильные (практически нерастворимые в воде) соединения также не резорбируются в кишечнике. На резорбцию влияют и размеры молекул: чем больше молекулярная масса, тем труднее проникает вещество через эпителий кишечника.

Токсиканты резорбируются во всех отделах кишечника, что связано с его морфофункциональными особенностями. Наиболее высокая скорость всасывания наблюдается в тонкой кишке.

В настоящее время активно изучается роль Р-гликопротеиновой системы клеточного переноса, расположенной на поверхности эпителиальных клеток тонкой кишки (см. табл. 3.2). Установлено, что Р-гликопротеин является выкачивающим насосом, способным переносить широкий спектр соединений из внутриклеточного пространства снова во внеклеточный матрикс и таким образом снижать эффективное всасывание токсикантов. Например, если ввести лекарственный препарат лоперамид — опиоид, который обычно не влияет на ЦНС, — одновременно с квинидином (ингибитором Р-гликопротеина), то лоперамид вызывает побочные эффекты со стороны ЦНС. В экспериментальных моделях на животных ингибировали Р-гликопротеин, вводили различные лекарственные средства и определяли их концентрации. При этом концентрация препаратов повышалась в 10–100 раз по сравнению с контрольной группой.

В толстой кишке скорость резорбции ниже, так как концентрация токсикантов меньше, чем в вышерасположенных отделах кишечника.

Всасывание неорганических ионов зависит от их природы, величины заряда и ряда физико-химических свойств. Невсосавшаяся часть токсиканта через некоторое время удаляется из ЖКТ вместе с содержимым и слизью, выстилающей стенки кишечника. Значения k_рез установлены для многих элементов, попадающих в ЖКТ в ионном виде (табл. 3.4).

На скорость и степень резорбции токсикантов на протяжении всего ЖКТ оказывают влияние эндогенные соединения (ферменты, желчные кислоты, гормоны и др.), объем и состав пищи (например, продукты, стимулирующие секрецию желудочного сока и соляной кислоты), количество принятой жидкости, интервал между приемом пищи и введением токсиканта, курение и прием алкоголя, микрофлора кишечника. Так, прием алкоголя и курение способствуют увеличению резорбции свинца в кровь почти в 2 раза, лактобактерии, энтерококки, клостридии кишечника деметилируют наркотик метамфетамин, у грудных детей возможны восстановление нитратов до нитритов под действием микроорганизмов кишечника и образование метгемоглобина (см. гл. 6–10).

При интерпретации результатов ХТА (см. гл. 4, 6–10) учитывают феномен печеночно-кишечной циркуляции токсикантов, сущность которого заключается в следующем. Конъюгаты токсикантов с глюкуроновой кислотой (см. ниже) плохо растворимы в жирах и хорошо — в воде, в связи с чем их резорбция в кишечнике затруднена. При частичном гидролизе конъюгатов концентрация липофильных молекул агликона (свободного токсиканта или его метаболита) вновь возрастает, и они обратно резорбируются в кровоток.

Резорбция в легких. Через легкие в организм поступают газообразные (парообразные, летучие) токсиканты и аэрозоли (см. гл. 7). Это происходит не только в производственных и лабораторных условиях, но и в быту, а также в связи с загрязнением окружающей среды, с химическими и другими катастрофами (см. гл. 9). Поступление веществ при вдыхании их паров зависит от природы токсиканта и ряда физиологических параметров альвеолярной вентиляции, остаточного объема легких, проницаемости для данного вещества альвеолярно-капиллярной мембраны (барьера), скорости легочного кровотока, минутного объема сердца, общего объема крови, массы легочной ткани и других показателей.

Резорбция слизистой оболочкой глаз. Контакт паров, аэрозолей или капель токсиканта со слизистой оболочкой глаза оказывает как местное, так и системное действие. Например, взаимодействие паров зарина (фосфорорганическое боевое отравляющее вещество) со слизистой оболочкой глаза не только вызывает паралич мышц зрачка, потерю способности глаза к аккомодации и ослабление зрения, но и ингибирует действие фермента холинэстеразы.

Скорость резорбции определяется природой вещества (растворимость в липидах и воде, заряд молекулы, значение рK_а, размер молекулы) и особенностями липидного барьера роговицы глаза, через который легко проникают жиро- и водорастворимые вещества.

Токсикант, контактирующий с роговицей, равномерно распределяется по поверхности склеры и конъюнктивы глаз. Часть его смывается слезной жидкостью, содержащей 1,5% хлорида натрия, 0,5% альбумина и слизь, в состав которой входит лизоцим. Токсикант задерживается на роговице от нескольких секунд до 6–10 мин, его максимальное содержание в структурах глаза наблюдается в роговице, минимальное — в хрусталике. Склеротические процессы (в том числе возрастные) в сосудистой системе глаза нарушают процессы резорбции.

Резорбция из тканей

При подкожном и внутримышечном введении или через раневую поверхность токсикант также может поступить в кровь. При подкожном введении токсикант попадает в подкожную клетчатку, богатую жировой тканью, выступающей в качестве депо для ксенобиотика. Скорость резорбции и биодоступность токсиканта значительно меньше, чем при внутримышечном введении, когда вещество вначале поступает в мышцу, накапливается в ней, а затем резорбируется в кровь. В этом случае мышца служит депо для токсиканта.

Различие в концентрациях токсиканта в месте введения, окружающей ткани и крови является условием резорбции вещества в кровь и внутренние среды организма. Сеть капилляров и лимфатических сосудов хорошо развита в подкожной клетчатке и межмышечной соединительной ткани. Кровеносные капилляры — наиболее многочисленные и самые тонкие сосуды, имеющие, однако, различный просвет. Наиболее узкие капилляры (диаметром 4,5–7 мкм) находятся в поперечнополосатых мышцах, легких, нервах и т.д., более широкие (диаметром 7–11 мкм) — в коже и слизистых оболочках. В мышце человека на 1 мм² насчитывается 1400–2000 капилляров, а в коже на той же площади — 40. Пористость (диаметр пор 3–4 нм) и малая толщина стенок капилляров, огромная площадь их соприкосновения с тканями [более 6000 м², медленный кровоток (0,5 мм/с), низкое артериальное давление (20–30 мм рт. ст.)] обеспечивают наилучшие условия для обменных процессов. Поверхность всасывания в тканях для липофильных соединений в сотни раз больше, чем для водорастворимых веществ, проникающих в кровь только через поры.

Резорбция токсиканта зависит и от процента функционирующих (раскрытых) капилляров и давления крови в тканях, которое регулируется вазоактивными факторами [эндотелийзависимые релаксирующие факторы, оксид азота(II), простагландины, эндогенные регуляторы — адреналин, норадреналин, ацетилхолин, серотонин]. Мембрана капилляра проницаема для водорастворимых, а также и высокомолекулярных веществ, если размер их молекул не превышает размера пор капилляра. Поэтому проникновение очень многих токсикантов в кровь вполне возможно при их введении в мышцы.

Биодоступность

При любом способе поступления токсиканта, кроме внутривенного, далеко не все количество вещества достигает кровеносного русла, так как вещество не полностью всасывается в ЖКТ, а также инактивируется печенью или экскретируется с желчью. Поэтому используют понятие биодоступность, т. е. степень абсорбции токсиканта в кровь при внесосудистом введении относительно внутривенного введения.

Для суждения о биодоступности обычно измеряют площадь под кривой (AUC — area under the concentration versus time curve), отражающей зависимость между концентрацией вещества в плазме крови и временем, поскольку этот показатель прямо пропорционален количеству вещества, попавшему в системный кровоток.

Биодоступность вещества при внутривенном введении принимают за единицу или за 100%. Реальные значения биодоступности всегда меньше единицы, что отражает частичную абсорбцию вещества в системный кровоток (табл. 3.5).

Распределение — это динамический процесс, включающий связывание молекул токсиканта с белками плазмы и форменными элементами крови, проникновение (пенетрацию) в эфферентные органы (ткани), поступление в метаболизирующие или экскретирующие органы.

После абсорбции вещества попадают в кровь, а затем в органы и ткани. Главной характеристикой процесса распределения токсикантов в организме является неравномерность. Концентрацию вещества в плазме крови в любой момент времени t принято рассчитывать по формуле

С = С₀ · е^-kt,

Для того чтобы рассчитать С₀, нужно знать объем, в котором распределяется вещество, т. е. объем распределения. Объем распределения не является физиологическим объемом и может быть меньше, чем объем плазмы или крови, а для некоторых веществ — больше. С₀ равно количеству вещества в организме, деленному на объем распределения, поэтому объем распределения характеризуется отношением общего содержания вещества в организме к содержанию его в плазме.

Объем распределения (кажущийся объем распределения вещества) V_d — это гипотетический объем жидкостей организма, необходимый для равномерного распределения всей дозы поступившего в организм вещества в концентрации, равной его концентрации в крови в момент исследования.

V_d выражается в литрах на 1 кг массы и определяется соотношением

Объем распределения характеризует степень проникновения веществ из плазмы крови и внеклеточной жидкости в ткани и депонирования в них (табл. 3.6). Для липофильных соединений, легко проникающих через тканевые барьеры, характерно высокое значение V_d. Если вещество в основном циркулирует в крови, V_d имеет низкие величины. Сильное связывание молекул токсиканта тканями приводит при расчетах к большим значениям объема распределения.

V_d используют при определении константы элиминации и периода полужизни, или периода полувыведения вещества t_1/2 (см. раздел 3.4. Выведение токсикантов).

Зависимость концентрации вещества в плазме крови от времени, прошедшего после его введения, — кривая концентрация — время характеризует токсикокинетические процессы, происходящие с исследуемым веществом. На основе зависимости концентрации вещества в крови или плазме от времени строят токсикокинетические модели, используя специальные компьютерные программы математического моделирования. Организм — сложная гетерогенная система, состоящая из большого числа компартментов (камер), разделенных биологическими барьерами (см. ниже). Для математического моделирования токсикокинетических процессов организм представляют в виде одной или нескольких частей (камер), ограниченных проницаемой мембраной, в которых равномерно распределяется токсикант. Понятие «камера» условно, так как за ним не стоит какое-либо анатомически ограниченное пространство; это единица формализованной токсикокинетической системы.

Накопление токсиканта далеко не всегда происходит в органе (ткани)-мишени, что приводит к снижению токсического эффекта. Некоторые токсиканты избирательно накапливаются в том или ином органе (ткани) или клетках определенного типа. Характер распределения токсикантов зависит от ряда причин, в том числе и от генетически детерминированных индивидуальных особенностей, что определяет вариацию токсикокинетических параметров и степень развития токсического эффекта.

Распределение токсикантов осуществляется посредством жидких сред (жидкостей) организма.

Скорость и характер распределения вещества в тканях определяется скоростью диффузии вещества через соответствующие барьеры (табл. 3.7), скоростью перфузии (интенсивностью кровотока), свойствами клеточных мембран, сродством токсикантов к молекулам-мишеням или другим химическим структурам, находящимся в клетках. В различных органах стенки капилляров имеют различные свойства и, следовательно, различную проницаемость для химических веществ.

Токсиканты распределяются в виде молекул и ионов, некоторые из них при физиологическом значении pH крови образуют коллоидные частицы, становясь третьей формой, которая содержится в этой жидкости. Молекулы, ионы и коллоидные частицы токсикантов могут переноситься кровью разными способами:

Для большинства токсикантов в крови наблюдается динамическое равновесие между двумя фракциями токсиканта: находящегося в свободном и связанном с белками плазмы или эритроцитами крови состоянии.

Некоторые токсиканты переносятся элементами крови, прежде всего эритроцитами и, реже, лейкоцитами. Внешняя поверхность мембраны эритроцитов заряжена отрицательно из-за наличия молекул мукополисахаридов. Положительно заряженные ионы, особенно содержащие четвертичный атом азота, активно взаимодействуют с поверхностью эритроцитов. Токсиканты неорганической природы могут абсорбироваться поверхностью эритроцита (например, мышьяк, цезий, торий, радон, свинец и натрий) либо связываться с лигандами стромы. Попадая внутрь эритроцита, ксенобиотики могут взаимодействовать с гемом (моноксид углерода) или с глобином (²¹⁰Ро) и накапливаться в силу этого преимущественно в крови пострадавших. Один и тот же элемент в зависимости от степени окисления ведет себя по-разному: ионы НCr₂О₇^– и НCrО₄^– связываются исключительно с эритроцитами, а ионы Cr³⁺ неспособны проникать через клеточные мембраны (см. выше). Органические соединения ртути (например, метилртуть) в основном связываются с эритроцитами, а ионы ртути переносятся преимущественно альбумином плазмы. За перенос цинка конкурируют эритроциты, а также специфические и неспецифические белки-переносчики (см. гл. 7). Газы и пары могут растворяться в плазме.

Большинство токсикантов переносятся белками плазмы. Плазма крови человека содержит около 75 мг/мл белка и представлена альбуминами (35–55 мг/мл), глобулинами (иммуноглобулинами), белками свертывающей системы крови, белками системы комплемента, ингибиторами протеолиза, липо- и гликопротеинами (0,9 мг/мл). Белки плазмы имеют общую поверхность площадью 600–800 км², способную абсорбировать токсиканты.

Альбумин обладает уникальной способностью связывать многие низкомолекулярные токсиканты. Молекулярная масса альбумина около 66 000 Д. Его молекула, содержащая 585 остатков аминокислот (третичная структура поддерживается 17 дисульфидными связями) при рН 7,4 находится преимущественно в анионной форме. Молекулы альбумина содержат около 109 катионных и 120 анионных участков для связывания ионов. Альбумин переносит, например, ионизированные формы таких соединений, как динитро- и орто-креозолы, нитро- и галогенопроизводные ароматических углеводородов, барбитураты, витамин С, гистамин и многих других соединений разных классов. Большинство попавших в кровь веществ фиксируется на альбуминах независимо от того, являются они нейтральными, кислыми или основными соединениями.

В молекуле альбумина человека выделяют несколько связывающих участков (их число точно не установлено, предполагают, что их больше шести). Центры связывания (табл. 3.8) отличаются друг от друга сродством к веществам с различными рK_а, механизмами взаимодействия с токсикантами, константами устойчивости (нестойкости) комплекса белок — токсикант. Вещества, связывающиеся с одним и тем же участком, могут конкурентно (согласно закону действующих масс) вытеснять другие, что приводит к изменению их концентрации в плазме крови и продолжительности действия (например, антикоагулянты и сульфаниламиды).

Достаточно часто встречается гипоальбуминемия, что нарушает или изменяет транспорт токсикантов.

Молекулы α₁-, α₂-, β₁-, β₂-, γ-глобулина переносят малые молекулы ксенобиотиков (витамины А, В₁₂, D, Е, K, стероидные гормоны и др.), ионы некоторых металлов (медь, цинк, железо) и коллоидные частицы. Липопротеины плазмы переносят липофильные токсиканты, такие как полихлорированные дифенилы (см. гл. 9). Гликопротеины связывают молекулы, обладающие свойствами слабых оснований. Другие белки плазмы — трансферрин, металлотионин, церулоплазмин конкурируют с органическими кислотами за перенос катионов, образуя прочные специфические комплексы (см. гл. 7).

Органические кислоты (молочная, глутаминовая, лимонная) образуют комплексы с некоторыми токсикантами (например, катионами щелочно- и редкоземельных элементов), имеющими высокую степень диффузии и легко распределяющиеся в тканях и органах.

В зависимости от степени сосудистой (кровяной) перфузии организм человека можно разделить на следующие компартменты в нисходящем порядке:

Хорошо перфузируемые внутренние органы обычно получают наивысшую концентрацию токсикантов за короткое время. Поступление токсикантов в ткани с пониженной перфузией происходит гораздо медленнее, однако степень их удерживания выше и период пребывания (аккумуляция) более продолжительный (табл. 3.9).

Важнейшую роль в межклеточном распределении токсикантов играет содержание влаги, липидов и белков в клетках различных тканей и органов. Гидрофильные токсиканты более активно распределяются в жидкостях и клетках организма с высоким содержанием влаги, а липофильные токсиканты — в клетках с повышенным содержанием липидов (жировые ткани). Токсиканты из крови попадают в органы, богато снабжаемые кровью, а затем они перераспределяются в соответствии с другими свойствами тканей, например, наличием специальных механизмов захвата веществ, высоким содержанием структур, связывающих ксенобиотик, или соотношением жира и воды в органе или ткани. Конечное распределение токсикантов органической природы, длительно сохраняющихся в организме, не зависит от особенностей кровоснабжения органов.

Молекулы высокомолекулярных водорастворимых веществ белковой природы (например, токсинов, см. гл. 10), циркулирующие в крови, не диффундируют в ткани, если их размер превышает диаметр пор стенки капилляров. Такое же исключительно внутрисосудистое распределение характерно для комплексов низкомолекулярных веществ с белками плазмы крови. Процесс комплексообразования токсиканта с белком подчиняется глобальному закону химии — закону действующих масс. Поэтому по мере диффузии несвязанных молекул токсиканта происходит диссоциация белковых комплексов до тех пор, пока концентрация свободного токсиканта не достигнет равновесных значений во внутри- и внесосудистом пространстве.

Водорастворимые токсиканты, которые связываются с альбуминами и кислыми гликопротеинами, попадают в клетки лишь через поры клеточных мембран, диаметр которых значительно меньше пор стенок капилляров. На способность веществ проникать через клеточные мембраны влияет величина рK_а. Если изменяется кислотность плазмы крови (при ряде заболеваний наблюдается алкалоз или ацидоз), то меняется соотношение ионизированной и неионизированной форм молекул токсиканта и характер их распределения по тканям и органам.

Среди водорастворимых веществ есть и такие, которые проходят через стенки капилляров, но не проникают внутрь клеток, накапливаясь в экстрацеллюлярном пространстве тканей (сульфаты, тиоцианаты и др.).

Токсиканты, хорошо растворяющиеся в липидах, легко проникают не только через гистогематические барьеры (см. ниже), но и через клеточные мембраны, попадают внутрь клеток и накапливаются в жировой ткани и тканях, богатых липидами (ЦНС). Таковы, например, пестициды, галогенопроизводные алифатических и ароматических углеводородов и др. (см. гл. 7). Некоторые экополлютанты (см. гл. 9) и пестициды (ДДТ) — практически нерастворимые в воде вещества — накапливаются в жирах, концентрация их в крови незначительная, однако при снижении содержания жира в организме такие вещества поступают из депо в кровь и оказывают токсическое действие.

В клетки экзокринных желез токсиканты поступают путем диффузии через биологические липидные пористые мембраны. Кислотность секрета желез отличается от кислотности плазмы крови, например, рН слюны и грудного молока ниже рН крови. Для этанола, например, соотношение содержания в грудном молоке и крови больше единицы. Использование секретов экзокринных желез в качестве биологического объекта для ХТА (см. гл. 4) объясняется прямой зависимостью между содержанием токсикантов в крови и секрете желез.

Барьерные функции — это физиологические механизмы, обеспечивающие защиту организма и отдельных его частей от изменений окружающей среды и сохранение необходимого для нормальной жизнедеятельности постоянства состава, физико-химических и биологических свойств внутренней среды (кровь, лимфа, тканевая жидкость). Например, проникновение в ЦНС водорастворимых ионизированных веществ крайне затруднено, что обусловлено наличием гистогематического барьера между кровью, с одной стороны, и тканью мозга или цереброспинальной жидкостью — с другой.

Внутренние барьеры получили название тканевых, гематопаренхиматозных, сосудисто-тканевых и т.д. Наиболее распространен термин гистогематический барьер.

Гистогематический барьер — это совокупность физиологических механизмов, регулирующих обменные процессы между кровью и тканями и тем самым обеспечивающих постоянство состава и физико-химических свойств тканевой жидкости, а также задерживающих переход в нее чужеродных веществ из крови. Особенностью гистогематического барьера является его избирательная проницаемость.

Большое значение для жизнедеятельности организма имеют специализированные барьеры: гематоэнцефалический (между кровью и ЦНС), гематоофтальмический (между кровью и внутриглазной жидкостью), гематолабиринтный (между кровью и эндолимфой лабиринта), барьер между кровью и половыми железами. К гистогематическим относят также барьеры между кровью и жидкими средами организма — цереброспинальной жидкостью, лимфой, плевральной и синовиальной жидкостью — соответственно гематоликворный, гематолимфатический, гематоплевральный и гематосиновиальный барьеры. Барьерными свойствами, защищающими развивающийся плод, обладает плацента.

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ, BBB — blood-brain barrier) — барьер между кровью и мозгом. Капилляры мозга, в отличие от всех других капилляров, имеют значительно меньший эффективный радиус пор. Клетки эпителия в капиллярах плотно прилегают друг к другу. Мозг как центральный орган охраняется особенно тщательно от проникновения большинства соединений. Для питательных веществ (аминокислоты, пурины, глюкоза и т. п.), которые должны попасть в мозг, существуют специальные переносчики через мембраны эпителиальных клеток капилляров.

Токсикокинетические процессы находятся под генетическим контролем. Повышение проницаемости ГЭБ вследствие снижения экспрессии гена MDR1, приводящего к уменьшению количества Р-гликопротеина в эндотелиоцитах ГЭБ у лиц с генотипом ТТ, не наблюдается у лиц с генотипом СС (рис. 3.2; см. табл. 3.2). Индивидуальные генетические различия между людьми являются серьезным фактором, который следует учитывать при интерпретации результатов химико-токсикологического анализа. Например, оценивая концентрацию дигоксина в крови при подозрении на интоксикацию сердечными гликозидами, следует иметь в виду, что концентрация дигоксина достоверно выше у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с пациентами, имеющими генотипы СС и СТ, и это связано с наличием полиморфного маркера С3435Т гена MDR1, экспрессирующего Р-гликопротеин.

Депонирование — это разновидность распределения токсикантов в организме, при котором происходят их накопление и удерживание в определенном органе или ткани в течение некоторого времени (от нескольких суток до многих лет) при относительно одинаковой концентрации. Депонирование связано с высоким химическим сродством токсиканта к определенным эндолигандам, содержащимся в депонирующей ткани, и/или высокой липофильностью токсиканта.

Накопление токсиканта в конкретном компартменте обычно имеет временный характер, что связано с различием между скоростью абсорбции и элиминации токсиканта. Нередко накоплению токсиканта в ткани сопутствует его перераспределение в другие ткани, что часто определяется функциональным состоянием органов, гормональным или микроэлементным балансом, обеспеченностью организма витаминами, приемом лекарственных средств и другими причинами.

Токсиканты, существующие в плазме крови в виде молекул, ионов и коллоидных частиц, можно разделить на несколько групп в соответствии с их преимущественным удерживанием и накоплением в конкретном компартменте (табл. 3.10).

Итак, липофильные токсиканты, проникнув в энтероциты, могут вновь «выбрасываться» в просвет кишечника Р- гликопротеином. В энтероцитах, а затем и в гепатоцитах липофильные токсиканты подвергаются биотрансформации до гидрофильных метаболитов, которые либо попадают в системный кровоток, либо активно секретируются в желчь транспортерами органических анионов и катионов. Находясь в гепатоцитах, не успевшие метаболизироваться липофильные лекарственные средства также способны активно секретироваться в желчь с помощью Р-гликопротеина. Проникновение в ткани липофильных токсикантов затруднено функционированием Р-гликопротеина эндотелиоцитов кровеносных сосудов. Неметаболизировавшиеся липофильные вещества способны активно секретироваться Р-гликопротеином проксимальных почечных канальцев в мочу.

Гидрофильные метаболиты токсикантов фильтруются в почечных клубочках или секретируются транспортерами органических анионов и катионов в проксимальных почечных канальцах в мочу. Гидрофильные токсиканты путем простой диффузии транспортируются из сосудистого русла в гепатоциты транспортерами органических анионов и катионов (табл. 3.11).

Биотрансформация — это процесс превращения вещества в форму, удобную для выведения из организма. Биотрансформация токсикантов — сложный многоплановый процесс, в который вовлечено большое количество веществ, находящихся во взаимодействии друг с другом, и на течение которого влияет множество факторов. Биотрансформация, как правило, приводит к снижению активности токсикантов — дезактивации (детоксикации). Однако в некоторых (и не таких редких) случаях метаболиты ксенобиотиков становятся, наоборот, более токсичными соединениями (процесс токсикации), а также могут изменить характер токсического действия или инициировать другой токсический процесс (см. гл. 2).

Биотрансформация токсикантов состоит из двух фаз, каждая из которых выполняет свои функции, а в итоге липофильный ксенобиотик превращается в водорастворимую форму, выводимую из организма. Различают две фазы биотрансформации.

Фаза I — модификация молекулы токсиканта, создающая или освобождающая функциональные группы (например, –ОН, –NH₂, –SH и др.) и осуществляемая различными ферментными системами, локализованными в большей степени в клетках печени.

Фаза II — конъюгация, или синтетические реакции токсикантов и/или их метаболитов с эндогенными веществами, в результате чего образуются конъюгаты — гидрофильные соединения.

Наиболее часто процесс протекает именно в такой последовательности, но природа ряда токсикантов, прежде всего наличие в молекуле ксенобиотика функциональных групп, способных к конъюгации, позволяет миновать фазу I.

Различают печеночную и внепеченочную биотрансформацию.

Особенно интенсивно процессы биотрансформации протекают в печени. При прохождении токсикантов через печень большинство из них подвергается биотрансформации в паренхиматозных клетках печени, что называют эффектом первого прохождения или пресистемным метаболизмом.

Метаболиты как фазы I, так и фазы II из печени поступают в кровь, распределяются по органам и тканям, ферментативная активность которых значительно ниже, а также реабсорбируются печенью для последующей экскреции с желчью.

Поскольку почки, легкие, кишечник, селезенка, мышечная ткань, плацента, мозг, кровь содержат ферментные системы обеих фаз биотрансформации, то они, хотя и менее интенсивно, чем печень, но также участвуют в этом процессе. В ряде случаев токсикация ксенобиотиков в метаболически менее активных органах (например, в мозге) приводит к катастрофическим последствиям (см. гл. 6 и 7).

При внепеченочной биотрансформации могут образоваться отличные от печеночных метаболиты одного и того же токсиканта.

Метаболиты, поступившие с желчью в кишечник, частично реабсорбируются и вновь поступают в печень (печеночная рециркуляция).

Основная часть ферментов, участвующих в биотрансформации, локализована в гладком эндоплазматическом ретикулуме клеток печени. Ферменты, локализованные в цитоплазме, в плазматической мембране, лизосоме или мембране ядра, также участвуют в биотрансформации.

Большинство реакций фазы I и фазы II являются энзиматическим преобразованием молекул токсиканта.

Фаза I биотрансформации

Существуют десятки суперсемейств ферментов, осуществляющих биотрансформацию токсикантов, однако изоферментам цитохрома Р450 принадлежит ведущая роль. Многие реакции биотрансформации являются НАДФ⁺/НАДФН- или НАД⁺/НАДН-зависимыми реакциями (табл. 3.12).

Цитохром Р450. Гетерогенный фермент цитохром Р450 (Р450) локализован в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, незначительные количества фермента обнаружены в легких, почках и мозге (см. п. 2.3). Его суперсемейство обозначают CYP, помечая отдельных представителей буквами и цифрами (например, CYP2С9).

Цитохром Р450 — фосфолипидопротогемсульфид-протеиновый комплекс, имеющий в восстановленной форме сродство к оксиду углерода(II), — получил такое название вследствие образования с СО прочного комплекса с максимумом поглощения при 450 нм. Цитохромы Р450 относят к группе гемопротеинов. Для генов, кодирующих Р450, характерен значительный полиморфизм (табл. 3.13).

В отечественной и зарубежной литературе собран огромный экспериментальный и клинический материал o содержании и активности отдельных ферментов Р450, зависящих от генетических, экологических факторов, наличия в организме ингибиторов или индукторов фермента, например лекарственных средств (табл. 3.14).

Реакции токсикации

Реакции токсикации приведены в главах 6–10 при обсуждении путей метаболизма конкретных токсикантов.

Фаза II биотрансформации — конъюгация

Экзогенные соединения, содержащие функциональные группы (гидрокси-, амино-, карбокси-, эпокси-, галоген) или представляющие собой метаболиты реакций фазы I, подвергаются биосинтетическим реакциям — реакциям конъюгации, или реакциям фазы II. Биохимическое конъюгирование — это взаимодействие вышеперечисленных субстратов с такими эндогенными соединениями, как глюкуроновая кислота, серная кислота, аминокислоты, глутатион и др. Как правило, продукты конъюгации более полярны, менее липидорастворимы, быстрее выводятся из организма и менее токсичны.

Реакции конъюгации делят на два типа в зависимости от того, какой объект реакции (субстрат или реагент) активирован.

Первый тип — реакции, протекающие при участии активированных форм присоединяемых агентов (образование гликозидов, сульфатов, метилатов и ацетилатов).

Второй тип — реакции, протекающие при участии активированных форм токсикантов (конъюгация с глутатионом или аминокислотами).

Важнейшие внутриклеточные системы конъюгации приведены в табл. 3.15.

Первый тип конъюгации

Глюкозидная конъюгация

Глюкозидная конъюгация проходит в три стадии. На первой стадии образуется активированный промежуточный продукт — уридиндифосфатглюкоза (УДФГ), на второй — уридиндифосфатглюкуроновая кислота (УДФГК).

УТФ — уридинтрифосфат.

На третьей стадии активный промежуточный продукт УДФГК взаимодействует с агликоном (субстратом):

Реакция третьей стадии является результатом нуклеофильного замещения (S_N2) в функциональной группе субстрата с Вальденовским обращением.

Образование О-глюкуронидов. Возможно образование нескольких типов О-глюкуронидов.

Образование N-глюкуронидов. Образование N-глюкуронидов возможно при конъюгации токсикантов, имеющих ароматические аминогруппы, сульфаниламидную группу, гетероциклический азот, карбамильную группу.

Образование S-глюкуронидов. Образование S-глюкуронидов возможно при конъюгации токсикантов, имеющих тиольную группу.

Образование С-глюкуронидов возможно, например, при реакции с фенилбутазоном.

Полярные глюкуронидные конъюгаты выводятся с мочой и желчью траспортными системами для органических анионов (см. табл. 3.11). Однако такие конъюгаты являются субстратами β-глюкуронидаз, присутствующих в кишечной микрофлоре и частично высвобождающих агликон (токсикант или его метаболит). Свободный токсикант или его метаболит подвергается печеночной (или энтерогепатической) рециркуляции, что задерживает его выведение из организма, а также может привести к ошибкам определения содержания токсиканта при ХТА (см. гл. 4, 6–10).

Сульфатная конъюгация

Образование эфиров серной кислоты известно для первичных, вторичных, третичных спиртов, фенолов и ароматических аминов. Конъюгаты с серной кислотой полностью диссоциируют, хорошо растворяются в воде и быстро выводятся из организма. Сульфатирующим агентом является аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфат (АФФС):

Реакция протекает по схеме:

Сульфатный донор, концентрация которого в клетке в 5 раз ниже, чем УДФГК, синтезируется из неорганического сульфат-иона (источник — цистеин) и АТФ. Сульфатирование снижает токсичность большинства ксенобиотиков за исключением веществ, содержащих ароматическую аминогруппу. Иногда сульфатные конъюгаты служат субстратами для последующих реакций биотрансформации.

Метилирование

Метилирование — реакция, включающая перенос метильной группы от трех важнейших коферментов к аминам, фенолам, тиолам и образование N-, О- и S-метилконъюгатов. Коферменты — 3-аденозилметионин (или S-аденозилметионин — SАМ), производные N-метилтетрагидрофолата и витамина В₁; наиболее важный из них первый.

N-метилирование

S-метилирование. В организме метилируются различные токсиканты неорганической природы, содержащие ртуть, свинец, олово, палладий, таллий, золото, мышьяк, селен, теллур. Коферментами реакции являются S-аденозилметион и витамин В₁₂. У метилатов низкая растворимость в воде.

Ацетилирование

Экзогенные амины ацетилируются ацетил-коэнзимом А (А-СоА) по схеме:

Реакция приводит к образованию плохо растворимых в воде соединений (труднее выводимых), однако менее токсичных. Например, ацетилирование токсичного лекарственного препарата изониазида, снижающего его способность к комплексообразованию с ионами металлов, облегчает его выведение через почки.

Второй тип конъюгации

Глутатионовая конъюгация

Известно более 40 различных типов химических соединений, способных образовывать глутатионовые конъюгаты. Всех их объединяет наличие электрофильного центра, способного реагировать с SН-группой глутатиона.

Субстраты:

Конъюгация:

Трипептид глутатион содержит аминокислоты глицин, цистеин и глутаминовую кислоту. Общая схема конъюгации ксенобиотиков, имеющих электрофильные центры, с глутатионом представляет собой перенос остатка глутаминовой кислоты, отщепление глицина и ацетилирование. Нуклеофильная атака глутатион-тиалат-аниона (GS^—) электрофильного атома токсиканта — основной механизм образования тиоэфиров. Токсикант по своей химической природе реагирует с глутатионом неферментативно. Однако глутатион-S-трансфераза значительно ускоряет процесс за счет депротонирования GSН в GS^—. Ряд ксенобиотиков взаимодействует с глутатионом стереоселективно только с участием этого фермента. Реакции конъюгации с глутатионом:

Возможна конъюгация глутатиона с веществами, содержащими гетероатомы О, S, N с последующим образованием окисленного глутатиона GSSG (см. гл. 2, 6, 7).

Конъюгаты глутатиона в почках превращаются в меркаптуровые кислоты (см. гл. 7) и выделяются с мочой. В неизмененном виде экскретируются с желчью.

Конъюгирование с аминокислотами

Реакция экзогенных соединений, содержащих карбоксильную группу, с СоА в присутствии АТФ приводит к получению производных ацил-S-СоА, которые затем ацилируют α-аминогруппу аминокислот с образованием конъюгата:

Большую роль в определении характера реакции конъюгации с аминокислотами играет химическая структура ксенобиотика. Так, ароматические кислоты образуют конъюгаты с глицином, арилуксусные кислоты — с глутаминовой кислотой. Косубстратом может быть и таурин — серосодержащая аминокислота, которая способствует нормализации метаболизма витамина А. Таурин содержится в тканях мышц, сердца, сетчатой оболочки глаза, ЦНС.

Токсиканты, содержащие фрагмент ароматического гидроксиламина, образуют конъюгаты с серином или пролином (см. гл. 7).

Энзимы кишечной флоры

Метаболиты фазы II биотрансформации, поступая с желчью в кишечник, могут под действием бактериальных энзимов (гидролаз) гидролизоваться с образованием исходных неконъюгированных агликонов, которые подвергаются реосорбции.

Нитроароматические соединения, например, 2,6-динитротолуол, в анаэробной среде кишечника под действием бактериальных глюкуронидазы и нитроредуктазы могут восстанавливаться до аминов, которые, поступая в печень, вновь подвергаются биотрансформации.

Токсиканты могут быть субстратами, ингибиторами или индукторами ферментов, участвующих в реакциях биотрансформации. Нередко один и тот же токсикант можно отнести к нескольким из указанных категорий. В табл. 3.16 приведена краткая характеристика индукторов и ингибиторов ферментов, влияющих на метаболизм токсикантов.

Прогнозирование метаболических путей ксенобиотика

Зная общие закономерности метаболических превращений и химическую структуру токсиканта, можно прогнозировать образование его метаболитов. При этом следует иметь в виду следующее.

Экскреция — это выведение токсиканта и/или его метаболитов из организма во внешнюю среду без дальнейшего изменения их химической структуры.

Элиминация включает процессы, приводящие к снижению содержания чужеродного вещества в организме, т. е. биотрансформацию, депонирование и экскрецию. Основные количественные характеристики элиминации устанавливают по графику зависимости концентрации вещества в крови (С) от времени, прошедшего после приема этого вещества (t). Мерой скорости элиминации вещества является величина угла наклона касательной к кривой, проведенной в интересующей исследователя точке. Скорость элиминации уменьшается с течением времени, поскольку уменьшается величина C. Однако неизменной характеристикой процесса остается коэффициент пропорциональности kэл, или константа элиминации. Скорость выведения токсиканта характеризуется периодом полувыведения t_1/2 (или Т_1/2). Период полувыведения — это время, за которое концентрация вещества в плазме крови снижается на 50%. Поэтому из формулы

С = С₀ · е^–kэлt

при t = t_1/2 следует, что С = С₀ / 2.

С₀ / 2 = С₀ · е^{–kэл·t1/2}, t_1/2 = ln2 / kэл = 0,693 / kэл.

Период полувыведения измеряется чаще всего в часах. Одновременное введение нескольких токсикантов может увеличивать или уменьшать скорость выведения каждого из них. Период полувыведения зависит и от рН мочи.

Клиренс (Cl) вещества определяется условным объемом плазмы крови (в литрах, миллилитрах), из которого вещество полностью удаляется за единицу времени (секунды, часы). Единицы измерения клиренса — л/с, л/мин, л/ч, а при расчете на единицу массы тела — л/(кг·с), л/(кг·мин) л/(кг·ч). Клиренс — величина, характеризующая индивидуальное вещество.

Общий клиренс (Cl_tot) объединяет все процессы, участвующие в элиминации.

Клиренс рассчитывается путем деления величины введенной дозы на величину площади под кривой зависимости концентрации вещества в плазме крови от времени, прошедшего после его введения. Следовательно, чем меньше Cl, тем медленнее вещество выводится из организма. Можно рассчитать отдельно почечный клиренс, клиренс желчью или выдыхаемым воздухом с учетом количества вещества, выделяемого через эти органы (табл. 3.17).

Период полувыведения является функцией объема распределения и скорости элиминации:

t_1/2 = ln2 · V_d / Cl_tot.

Из уравнения следует, что чем больше объем распределения при одном и том же значении клиренса, тем дольше выводится вещество из организма. Увеличение клиренса сокращает период полувыведения. Соотношение между значениями клиренса, объема распределения и времени полувыведения вещества для однокамерной модели выражается формулой

Cl_tot = kэл · V_d = ln2 · V_d / t_1/2.

Выделяют четыре этапа элиминации токсикантов:

Токсикокинетические параметры конкретных веществ рассматриваются в связи с методами их обнаружения и определения в биологических объектах во второй части книги (см. гл. 6–10).

Токсиканты могут экскретироваться через легкие, с потом, слюной и желчью, грудным молоком, но преимущественно выводятся через почки. Ряд токсикантов (например, наркотиков, металлов, экополлютантов) депонируется в ногти и волосы, где они могут быть определены физико-химическими методами (см. гл. 4, 6–10).

Эндогенные соединения имеют оптимальные механизмы выведения. Эти же механизмы действуют и для выведения токсикантов, близких по строению к эндогенным веществам, однако если ксенобиотики значительно отличаются от них по структуре, то выводятся долго и трудно, претерпевая значительную трансформацию своих молекул, или надолго депонируются в соответствующих тканях, как, например, ДДТ или свинец. Уровень экскреции токсикантов определяется степенью их метаболических превращений в фазах I и II биотрансформации в более полярные и тем самым более легко выводимые соединения, а также генетически детерминированной активностью Р-гликопротеина, белка MRP2 и транспортеров органических анионов и катионов (см. табл. 3.11).

Если показатель липофильности нелетучего токсиканта позволяет ответить на вопрос, насколько быстро будет он выведен из организма или не будет экскретирован вовсе, то величина молекулярной массы нелетучего токсиканта определяет основной путь его выведения. Соединения с молекулярной массой менее 300 Д выводятся в основном с мочой, а с массой выше 500 Д — главным образом с желчью. Для конъюгированных метаболитов необходимо учитывать увеличение молекулярной массы за счет конъюгированной группы. Так, конъюгация с глюкуроновой, серной кислотами, глицином и глутатионом увеличивает молекулярную массу соответственно на 193, 96, 74 и 306 Д.

Экскреция почками

Почками экскретируется большинство продуктов нормального метаболизма и бóльшая часть полярных токсикантов и гидрофильных метаболитов липофильных веществ. Процесс выведения через почки реализуется посредством трех механизмов:

Путем фильтрации выделяются все низкомолекулярные вещества, находящиеся в растворенном состоянии в плазме крови. Секреция эпителия почечных канальцев способствует выведению органических катионов и анионов. Реабсорбция включает пассивную обратную диффузию всех жирорастворимых веществ, неионизированных молекул органических кислот, активную реабсорбцию глюкозы, лактата, аминокислот, мочевой кислоты, электролитов. Большое значение имеет рН мочи.

Клубочковая фильтрация. Около 140 мл плазмы крови в 1 мин отфильтровывается через гломерулярно- капиллярный барьер. Размеры молекул токсикантов определяют возможность их прохождения через поры почечных клубочков и присутствия в первичной моче. Вещества, связанные с белками плазмы, не могут проникать через поры. Фильтрат содержит все составные части плазмы крови, имеющие размеры меньше, чем размеры фильтрующих пор базальной мембраны. Скорость фильтрации может меняться в зависимости от ряда факторов, например, увеличиваться при повышении давления крови в гломерулярных капиллярах или уменьшении содержания белка, особенно альбумина, в плазме крови.

У здорового человека белки плазмы крови не подлежат фильтрации, и через почки выделяются лишь вещества, не связанные с белками. В крови согласно закону действующих масс поддерживается равновесная концентрация свободной и связанной с белком форм токсиканта, поэтому как только молекулы несвязанного токсиканта отфильтровываются, равновесие нарушается, что вызывает разрушение комплекса белок–токсикант и высвобождение токсиканта, который опять отфильтровывается через гломерулярно-капиллярный барьер. Некоторые вещества практически полностью отфильтровываются в клубочках почек в течение нескольких часов. Прочно связанные в комплекс с белком токсиканты высвобождаются медленно, поэтому процесс их выделения затягивается.

Уровень выведения большинства токсикантов почками в основном зависит от степени фильтрации в клубочках. Фильтрация токсиканта в клубочках зависит:

Большое значение для выведения имеют степень и скорость биотрансформации токсиканта (или его метаболитов).

Неионизированные формы вещества экскретируются клубочковой диффузией (фильтрацией), а ионизированные формы — почечными канальцами.

Канальцевая реабсорбция (выделение и обратное всасывание в почечных канальцах). Суточный объем первичной мочи содержит большое количество веществ, необходимых организму, таких как глюкоза, аминокислоты, соли. До 99% первичной мочи с содержащимися в ней физиологически необходимыми веществами подвергается реабсорбции в почечных канальцах. Это приводит к значительному повышению концентрации растворенных в моче веществ и формированию высокого градиента концентрации между содержимым канальцев и плазмой крови, что является движущей силой обратной диффузии веществ из первичной мочи в кровь.

Реабсорбция ксенобиотиков определяется теми же правилами, которые обусловливают проникновение различных соединений через клеточные мембраны, т. е. липофильные соединения проникают через мембраны легче, чем полярные. Липофильные токсиканты длительнее циркулируют в организме, потому что реабсорбируются в большей степени, а выводятся с мочой в меньшей степени, чем полярные токсиканты.

Выведение ксенобиотиков в почечных канальцах селективное и может быть активным или пассивным. Активное выведение, осуществляемое транспортерами органических катионов и анионов, характерно для экскреции ионизированных органических оснований и кислот, включая глюкурониды и конъюгированные сульфаты. Слабые электролиты выделяются по пассивному механизму. Эти соединения липофильны в неионизированной форме. Быстро проникая через мембраны стенок канальцев, они попадают в канальцевый проток, где часть их ионизируется при величине рН протока и выводится с мочой, а остальная часть реабсорбируется.

Проницаемость канальцевого барьера сопоставима с проницаемостью слизистой оболочки кишечника, поэтому легко резорбирующиеся вещества при приеме per os c трудом выводятся через почки, так как реабсорбируются из первичной мочи обратно в кровоток, а затем вновь из кровотока в первичную мочу. Барьер, образованный эпителием канальцев, межуточным веществом и эндотелием капилляров, оплетающих стенку канальцев, затрудняет свободную диффузию веществ.

Полярные токсиканты, легко растворимые в плазме, отделяются от нее в основном за счет фильтрации в почечных клубочках, концентрируются в канальцах и системой транспортеров выводятся в мочу.

Р-гликопротеин и транспортеры органических катионов и анионов участвуют в транспорте молекул токсикантов в мочу.

Выведение печенью

Билиарная экскреция обеспечивает удаление из организма ряда экзогенных и эндогенных веществ, которые не выводятся почками. Желчные кислоты и глутатион являются основными компонентами билиарной секреции. Печень — основной орган биотрансформации токсикантов — выступает и как орган их экскреции в желчь через барьер, образуемый эндотелием печеночных синусов, базальной мембраной и гепатоцитами. Экскреция ксенобиотиков осуществляется путем простой диффузии или активного транспорта. Природа токсиканта — определяющий фактор выбора пути экскреции. Р-гликопротеин, белок MRP2 и транспортеры органических катионов и анионов участвуют в активном транспорте молекул токсикантов в желчь: Р-гликопротеин переносит преимущественно липофильные ароматические соединения с молекулярной массой 300–500 Д и вещества, имеющие аминогруппу, MRP2 транспортирует конъюгаты с УФДК и глутатионом.

Желчь является важным объектом исследования при проведении ХТА. Для многих токсикантов установлено соотношение между концентрацией ксенобиотика в крови и желчи (см. гл. 4).

Выведение через кишечник

Соединения, выделяемые с желчью, могут подвергнуться реабсорбции в кишечнике. В первую очередь будут реабсорбироваться токсиканты, которые не были метаболизированы в печени. Кишечная экскрекция протекает медленно и является способом выведения токсикантов, не подвергающихся биотрансформации. С фекалиями выделяются вещества, образовавшиеся в результате бактериальной биотрансформации, изменяющей структуру токсиканта. В ряде случаев под воздействием кишечной флоры повышается способность токсиканта к реабсорбции.

Выведение через органы дыхания

Легкими выводятся газы, летучие органические жидкости и летучие метаболиты (вещества, находящиеся при 37°С в газовой фазе) некоторых нелетучих токсикантов. «Летучий яд», находясь в крови, проникает через альвеолярно-капиллярный барьер по механизму пассивного транспорта и переходит из крови в выдыхаемый воздух. Специфической транспортной системы экскреции, как полагают, в легких нет. Уровень выделения легкими летучих токсикантов будет зависеть от их растворимости в плазме крови, градиента концентрации или парциального давления между средами, а также эффективности легочной вентиляции и величины легочного кровотока. Зависимость между летучестью токсиканта и его растворимостью в крови используется, в частности, при экспертизе алкогольного опьянения по выдыхаемому воздуху (см. гл. 7).

Возможен способ легочной экскреции альвеолярно-бронхиальным путем. В этом случае сурфактант, содержащий токсикант, выделяется в просвет дыхательных путей и выводится вместе с адсорбированными на поверхности эпителия частицами аэрозоля из дыхательных путей благодаря мукоцилиарному восходящему току в гортань, заглатывается и поступает в ЖКТ.

Другие пути выведения токсикантов

Выведение токсикантов может осуществляться секретами экзокринных желез путем простой диффузии (грудное молоко, пот, слезы), что позволяет использовать их в качестве биомаркеров воздействия (см. гл. 1) и объектов исследования при проведении химико-токсикологического анализа (см. гл. 4, 6–10).

Экскреция ксенобиотиков в молоко зависит от продолжительности их нахождения в организме. Липофильные токсиканты с большим периодом полувыведения, например инсектициды, содержатся в молоке в значительных концентрациях. Доказаны экскреция токсикантов (наркотиков, многих лекарственных препаратов, этанола и др.) в грудное молоко матери и возможность отравления младенцев при грудном вскармливании.

Заключение к п. 3.1–3.4

В табл. 3.18 приведены три алгоритма предполагаемого поведения в организме токсиканта органической природы в зависимости от его липофильности и способности к биотрансформации.

Реально модель поведения вещества может в большей или меньшей степени измениться под влиянием многих факторов, однако общие закономерности сохранятся.

К факторам, влияющим на биотрансформацию токсикантов, относят естественные факторы (генетические особенности, пол, возраст, питание, вредные привычки, окружающая среда), патологические изменения органов, изменение активности ферментов под влиянием экзогенных веществ.

Для оценки и прогнозирования токсического эффекта ксенобиотика иногда используют расчетный способ.

Посмертные метаболические процессы, или вторичный метаболизм, подразделяют:

Тление — аэробный процесс относительно быстрого разложения — приводит к образованию веществ, более токсичных, чем образующиеся при анаэробном процессе — гниении. Мумификация сопровождается образованием жировосковых веществ, и в течение длительного времени токсиканты сохраняются в неизмененном состоянии.

В результате вторичного метаболизма претерпевают изменения экзогенные вещества и более 1300 эндогенных соединений. Под действием специфических бактериальных гидролитических ферментов — катепсинов происходит аутолиз — самопериваривание клеток. Через несколько часов после смерти бактерии кишечника проникают через его стенку и по кровеносным сосудам распределяются по всему трупу, при этом кислотность среды и активность катепсинов возрастают, наступает процесс путрификации органов и тканей.

Примеры реакций вторичного метаболизма эндогенных соединений:

Химический состав продуктов вторичного метаболизма эндогенных соединений (фона) зависит от времени разложения трупного материала, наличия влаги, доступа воздуха, бактериальной флоры и других факторов.

При вторичном метаболизме продолжаются процессы детоксикации ксенобиотиков путем гидроксилирования, метилирования, конъюгации и т.д. Катализаторами этих процессов являются специфические ферменты, образующиеся только после смерти. Особенность вторичного обмена — отделение образовавшихся продуктов от протоплазмы и сохранение (запасание) вне клетки или в метаболически неактивных частях клетки.

При вторичном метаболизме белков идут процессы дезаминирования, декарбоксилирования, биосинтеза.

Из оротовой кислоты образуются производные барбитуровой кислоты по схеме:

Реакции трансформации различных азотсодержащих веществ приводят к получению аминов:

–NO₂ ⟶ –NH₂

–N=N– ⟶ –NH₂

≡N–O ⟶ –NH₂

При проведении 1-го этапа ХТА (скрининг) разложившегося трупного материала можно получить ложноположительные результаты за счет содержания большого количества низкомолекулярных соединений, дающих с искомым (подозреваемым) токсикантом идентичные результаты. Поэтому экспертиза загнившего трупного материала требует особых способов пробоподготовки образцов (см. гл. 4).

Основные процессы превращения токсикантов в трупном материале — окисление, восстановление, дезаминирование, декарбоксилирование, десульфирование. Сохраняемость токсикантов в трупном материале различна и зависит от ряда факторов, в первую очередь от природы токсиканта:

В табл. 3.19 приведены примеры сохраняемости токсикантов в трупном материале.

Задача достоверного обнаружения и количественного определения широкого круга веществ различной химической природы в часто кардинально отличающихся друг от друга по своим свойствам и характеристикам объектах может решаться исключительно с привлечением нескольких химических, иммунохимических и физико-химических методов исследования, результаты которых взаимно дополняют и уточняют друг друга.

ХТА — системное аналитическое исследование, целью которого являются идентификация токсикантов и определение их концентрации в анализируемых объектах. Каждое исследование, проведенное судебным химиком-экспертом, имеет юридические последствия. Достоверность и надежность полученных результатов определяются правильностью организационных мероприятий (отбор пробы, хранение проб, постоянный контроль над работой оборудования, чистотой реагентов и др.), чувствительностью и специфичностью используемых методов, знанием природы и метаболизма токсиканта.

Различают (условно) несколько направлений (видов) ХТА, каждое из которых имеет свои задачи и некоторые особенности (табл. 4.1).

ХТА имеет судебно-правовую направленность, которая заключается в том, что юридические вопросы решаются аналитическими методами, а полученный результат на конечной стадии преобразуется в юридический ответ.

Существует три варианта проведения ХТА в зависимости от конкретных обстоятельств дела, клинических и других ситуаций.

Стратегия проведения анализа выстраивается в зависимости от особенностей направленного или ненаправленного исследования.

При проведении направленного анализа необходимы:

На основании знания физико-химических свойств токсичного вещества подбирают условия и технику изолирования, которая позволяет селективно отделить анализируемое вещество от биологической матрицы. В некоторых случаях возможно прямое обнаружение токсиканта в биологическом образце.

Если в первом варианте проведения ХТА для выбора оптимальных условий анализа можно воспользоваться справочной информацией или данными литературы, то второй и третий варианты более сложные. Они требуют многоступенчатой методики изолирования, поскольку необходимо охватить все подозреваемые вещества с самыми разнообразными физико-химическими свойствами.

В случае ненаправленного анализа общим методическим подходом является скрининг (англ. screening — просеивание, отбор) — обнаружение групповой принадлежности возможно присутствующего токсиканта, основанное на каких-либо общих свойствах веществ данной группы (например, группа бензодиазепинов, группа барбитуратов и др.). Скрининговые тесты, как правило, имеющие невысокую специфичность, позволяют в минимальное время из большого круга токсикантов выявить одно или несколько веществ, для подтверждения обнаружения которых далее проводится целенаправленное исследование (идентификация и количественное определение).

Выбор совокупности аналитических методов исследования определяется главной тактической задачей анализа — добиться минимума отрицательных и максимума положительных результатов при определении токсиканта в биообъектах — и основан на таких характеристиках аналитических методов, как чувствительность и специфичность. В ХТА принято дальнейший поиск токсиканта не проводить, если получен отрицательный результат. В этом случае в экспертном заключении указывают, что результат имеет отрицательное судебно-химическое значение.

Во всех вариантах проведения ХТА аналитик сталкивается с получением ложноположительных и ложноотрицательных результатов (схема 4-1). Первые связаны с недостаточной селективностью методов обнаружения, а вторые — с их недостаточной чувствительностью.

Схема 4-1. Формирование положительных и отрицательных результатов

Ложноотрицательный ответ (результат) — это отрицательный ответ на присутствие подозреваемого вещества, полученный при исследовании объекта, содержащего это вещество. Количество ложноотрицательных ответов обратно пропорционально чувствительности метода анализа: чем выше чувствительность, тем меньше ложноотрицательных ответов и больше положительных. Получение ложноотрицательных результатов связано не только с недостаточной чувствительностью используемого метода, но и с преднамеренной фальсификацией пробы, недостаточной квалификацией эксперта, систематическими ошибками исследований.

Ложноположительный ответ (результат) — это положительный ответ на присутствие подозреваемого вещества, полученный при анализе объекта, не содержащего это вещество. Ложноположительные результаты указывают на возможное присутствие какого-либо токсиканта, хотя на самом деле его нет, или на присутствие определенного токсиканта, тогда как присутствует другое токсичное вещество. Ложноположительные результаты теста приведут к дополнительным тестам, но не к ложному заключению. Ложноположительные результаты (их число может достигать 10–15%) обусловлены недостаточной специфичностью используемого метода за счет перекрестных реакций, слабой профессиональной подготовкой эксперта, систематическими ошибками, загрязненными реагентами, плохой организацией труда, некачественной документацией.

Ложноотрицательные и ложноположительные результаты выявляются, как правило, на ранних стадиях аналитического процесса и рационально решаются.

Выбор стратегии (греч. strategus, «искусство полководца» — способ достижения сложных целей, полный план действий при всевозможных ситуациях, способных возникнуть) выполнения ХТА — важнейшая профессиональная задача эксперта. Выбранная стратегия определяет действия эксперта в любой момент исследования и для любого возможного развития событий, способного привести к любой ситуации. Как известно, наука стратегия проявляется только в практической деятельности и требует наличия стратега, личность и искусство которого являются важными, порой главными, элементами стратегии. Недаром о проведении экспертных исследований, в частности химико-токсикологических, говорят как об искусстве, в котором стратегия является инструментом, а стратег (эксперт) — творцом.

Основными этапами ХТА являются:

После выяснения и уточнения обстоятельств, приведших к необходимости проведения ХТА, определяют его правовой аспект, вид, цель и задачи.

Далее выбирают совокупность методов проведения экспертизы, обеспечивающую надежность полученных результатов, и разрабатывают конкретный план исследования. После отбора аналитических методик проверяют правильность каждого избранного метода (определение систематической ошибки измерений с использованием эталонных растворов веществ сравнения и/или другими независимыми методами) и оценивают воспроизводимость результатов аналитического исследования (определение случайной ошибки).

Процесс обнаружения и идентификации разделен на две стадии: первая — предварительная (скрининг), вторая — подтверждающая. Методы первой стадии должны обладать высоким уровнем чувствительности, высокой производительностью, достаточно широким охватом классов токсичных соединений, но не обязательно высокой специфичностью. На этой стадии нужно получить минимум отрицательных ответов и максимум положительных, однако при таком методологическом подходе число ложноположительных результатов значительно. При использовании даже самого чувствительного предварительного метода результаты скрининга должны быть подтверждены аналитическими методами, основанными на других физико-химических принципах.

Вторая стадия — удаление всех (в идеале) ложноположительных результатов. Подтверждающие методы должны быть равными или превосходить по чувствительности предварительные методы для уменьшения числа ложноотрицательных результатов и должны превосходить их по специфичности для снижения числа ложноположительных результатов.

Полученные качественные и количественные результаты должны отличаться особой надежностью, так как имеют юридические последствия. Надежность работы химико-токсикологической лаборатории оценивается способностью достоверно обнаружить химическое вещество, вызвавшее отравление, и/или его метаболиты в биожидкостях и тканях потерпевшего, а также в объектах небиологического происхождения, с которыми контактировал человек. Не менее важно достоверно не обнаружить такие вещества, если отсутствовало их потребление или контакт с ними.

Надежность полученного ответа во многом зависит от правильной организации получения, приема и хранения объектов исследования (биоматериал, объекты небиологического происхождения), четкого документирования всего процесса работы, постоянного надзора за правильностью работы оборудования и чистотой всех реагентов, профессиональной подготовки кадрового состава лаборатории. Для подтверждения надежности результатов часто возникает необходимость в моделировании аналитического процесса, т. е. проведении эксперимента, имитирующего влияние окружающей среды, условий хранения, пробоподготовки на химический состав объекта исследования. Если требуется установить химическое строение и количественно определить содержание токсиканта, то необходимо воспользоваться паспортизированными стандартными образцами. Все этапы ХТА должны быть проконтролированы.

Контроль на стадии отбора пробы проводится в связи с возможным уничтожением вещественного доказательства или фальсификацией объекта, малой по массе пробой, ее загрязнением или изменением химического состава под воздействием окружающей среды.

Контроль на стадии пробоподготовки проводится в связи с риском частичной или даже полной потери определяемых веществ. Эта операция должна состоять из действий, направленных на сохранение определяемого вещества. Рекомендуется проведение экспрессных тестов, не требующих предварительной подготовки, т. е. непосредственно в биоматериале и других объектах (иммунохимические, химические и некоторые другие тесты). Для большинства методов ХТА стадии пробоподготовки и концентрирования являются обязательными.

Контроль на стадии обнаружения, идентификации и количественного определения. Выбор совокупности методов определения токсиканта должен предполагать применение методов, основанных на разных физико-химических принципах. В ХТА первичное обнаружение токсичного вещества принято подтверждать с помощью повторных исследований методами, имеющими отличную от предварительных методов анализа физико-химическую природу. При некоторых обстоятельствах может быть применен метод ГЖХ в качестве предварительного и подтверждающего теста, например, если на второй стадии исследования используется дериватизация (см. ниже) образца (силилирование или ацетилирование), ведущая к изменению аналитического сигнала ГЖХ — времени удерживания, характерного для токсиканта. Однако подтверждающее исследование с использованием метода ГЖХ на колонке, подобной, но не идентичной использованной в предварительном анализе, обычно неприемлемо, так как данные об относительном времени удерживания многих веществ не будут существенно различаться при переходе к близким условиям хроматографирования (от одной системы к другой), например использование фазы OV-1 или OV-17 (см. п. 5.3.2).

Применение радиоиммунного анализа (РИА) для подтверждения положительных результатов, полученных другим иммунохимическим методом, например поляризационным флуоресцентным иммуноанализом (ПФИА), неприемлемо, хотя эти два метода и различаются по своей сущности. Это связано с тем, что вещества, исследуемые первым методом, будут давать те же самые перекрестные реакции, что и при использовании второго метода (специфичные антитела могут реагировать на те же токсичные вещества или на вещества, сходные с ними; см. п. 5.2).

Если сравнивать надежность тонкослойной хроматографии (ТСХ) и иммунных методов при проведении скрининга, то иммунные методы превосходят ТСХ-скрининг в отношении обнаружения токсичных веществ, потребляемых в низких (миллиграммовых и субмиллиграмовых) количествах, например галлюциногенов. В случаях острых отравлений, летальных исходов, когда дозы токсичного вещества повышены из-за передозировки, ТСХ-скрининг является вполне удовлетворительным методом.

Что касается использования ТСХ как подтверждающего метода для иммунохимических тестов и наоборот, то единой точки зрения нет. ТСХ считается недостаточно надежным подтверждающим методом при решении юридических задач, но достаточно надежным для решения клинических вопросов. Что касается использования иммунохимических методов (ИХМ) для подтверждения данных ТСХ, необходимо помнить, что в большинстве случаев они подтверждают наличие не индивидуального вещества, а класса веществ, к которому нередко могут относиться соединения, проявляющие разное токсическое действие. Однако в последние годы успехи иммунохимии настолько значительны, что стало возможным определение ряда индивидуальных веществ либо узкой группы аналогов (см. п. 5.2). Повторно использовать иммуноферментный метод с различной перекрестной реактивностью можно для аргументации первичного скрининга, например, за неспецифичным иммуноферментным анализом (ИФА) с широким спектром перекрестных реакций на опиаты следует сделать более специфичный иммунный тест на конъюгированный морфин. Тем не менее комбинирование ИХМ/ТСХ или ИХМ/ГЖХ требует использования еще одного подтверждающего метода, например ГХ-МС.

Подтверждающими методами являются в первую очередь гибридные методы ВЭЖХ-МС, ГХ-МС или капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием (КЭФ-МС), которые соединяют высокоэффективное разделение веществ, содержащихся в образце, с высокочувствительным масс-селективным детектированием.

Подтверждение идентичности обнаруженного вещества в нескольких экстрактах одной и той же пробы является обоснованным и правильным приемом. Подтверждение результата только в единичном экстракте образца не может быть аргументировано, поскольку не исключена возможность загрязнения экстракта в процессе пробоподготовки. Использование подтверждающих методов идентификации рекомендуется в отношении всех видов токсичных веществ, включая этанол и оксид углерода(II).

Метод количественного определения содержания искомого вещества может быть одновременно и подтверждающим методом идентификации, если определяемое вещество было изначально обнаружено методом, отличающимся по своей природе (например, ПФИА + ГХ-МС).

Внутренний и внешний контроль. Для надежной работы лаборатории важным условием является наличие внутреннего и внешнего контроля над всеми этапами работы от получения объекта исследования до выдачи ответа. Для внутреннего контроля, проводимого в самой лаборатории, можно использовать объекты, в которых уже обнаружено то или иное токсичное вещество, и объект, заведомо не содержащий этого вещества. Желательно, чтобы количество токсичного вещества в контрольных объектах было ниже, на уровне и выше порогового уровня чувствительности скринингового метода, применяемого в данной лаборатории. Контрольные образцы должны составлять не менее 10% всех исследуемых проб.

Внешний контроль проводится по специальным программам крупными клиническими, токсикологическими и наркологическими учреждениями и центрами, возглавляющими службу ХТА. Проверка работы лабораторий проводится открытым способом, когда лаборатории знают, что они исследуют контрольные пробы, и скрытым способом, когда лаборатории не знают, что они исследуют контрольные пробы. Открытый способ проверки способствует выявлению максимальных технико-организационных возможностей лаборатории, скрытый — реализации этих возможностей в рутинном анализе.

Отбор пробы

Эффективность определения содержания токсичного вещества снижается из-за манипулирования (с умыслом или без) с образцом, отбираемым на анализ (особенно у живых лиц). Образец может быть разбавлен, подменен или загрязнен. Имеется широкий выбор информации о том, как замаскировать тест, начиная от устных рекомендаций до ресурсов Интернета и популярных журналов. Кроме того, существует достаточное количество данных по премедикации, в которых показано, какими способами можно создать интерференцию в тестировании, например, наркотиков, для получения ложноотрицательных результатов. Не исключен вариант выпуска подпольными наркосиндикатами готовых форм, заведомо содержащих химические вещества, могущие впоследствии замаскировать употребление запрещенного средства.

В свою очередь, для противостояния возможному манипулированию с образцом лаборатории должны использовать систему организационных мероприятий с целью обеспечения надежности результатов тестирования. Они охватывают все этапы ХТА, включая отбор проб, пробоподготовку, предварительные и подтверждающие методы анализа.

Отбор образцов трупного материала при проведении СХА. Эксперт руководствуется нормативными документами, регламентирующими его работу, и составляет план исследования посмертного материала при невыясненных обстоятельствах отравления химическим агентом. Вначале анализируется первичная информация и результаты вскрытия.

Если у патологоанатома судебно-медицинского эксперта нет особых сведений для судебного химика-аналитика, ответственность за решение, какие тесты должны быть проведены, лежит исключительно на профессиональной компетентности специалиста-химика. Каждый биообъект подвергается ненаправленному анализу. Для скрининга широкого спектра веществ большинство эффективных схем проведения экспертизы включает сочетание иммунохимических методов с хроматографическими методами и химическими тестами. В лабораториях судебно-химических отделений биообразцы анализируются по стандартизированным схемам согласно методическим указаниям, утвержденным соответствующими организациями.

Образцы трупного материала морфологически разнообразны и вариабельны по содержанию токсиканта. Отбор образца основан на анамнезе случая, указаниях органов дознания или доступности изъятия. В качестве исследуемых объектов отбираются кровь (из сердца и периферическая), вся доступная моча и желчь, стекловидное тело, все доступное содержимое желудка и ткани органов, в первую очередь печени (табл. 4.2). При этом выполняются соответствующие инструкции и приказы об отборе максимального количества образца. В случаях когда вскрытие не производили, отбираются периферическая кровь, моча и стекловидное тело.

Выбор биообъекта, его отбор, консервирование и хранение — важнейшие процедуры СХА.

Судебная защищенность результатов ХТА зависит от качества и типа отобранных образцов, их сохранности и документального оформления, а также контроля во время отбора пробы и процесса хранения.

Консервирование образца (см. примеры в гл. 6–9)

До исследования объекты консервируют только при подозрении на отравление сердечными гликозидами. Для этого внутренние органы заливают этанолом-ректификатом до образования уровня жидкости 1 см над их поверхностью. После исследования оставшиеся биологические жидкости и внутренние органы (архивный материал) хранят в морозильных камерах при температуре –18°С в течение 1 года.

Документирование и маркировка отобранных биообъектов (см. примеры в гл. 6–9)

При поступлении в судебно-химическое отделение биологических образцов в соответствии с направлением на исследование от врача-танатолога производится регистрация в журнале учета экспертиз (исследований). В ряде случаев биологический материал может быть направлен непосредственно органами следствия, судом.

Каждый контейнер с отобранным образцом биологического материала должен быть промаркирован и содержать следующую информацию: идентификационный номер, фамилию, имя, отчество потерпевшего, дату смерти (если имеется информация), дату и время отбора образца, подпись танатолога, тип образца, место отбора. Эта информация отражается в акте судебно-химического исследования или заключении эксперта.

Преданалитическая подготовка пробы

Существует два направления скрининга токсичных агентов. Одно из них — прямое обнаружение (без изолирования и очистки) в образце специфического агента или класса соединений хромогенными, микрокристаллоскопическими, иммунохимическими и другими методами. Другой путь — это изолирование токсиканта и/или его метаболитов из биологической матрицы (биожидкостей и тканей органов) с последующим исследованием концентрированного экстракта.

Большинство методов определения токсикантов и/или его метаболитов требует пробоподготовки образцов. Существует два методологических подхода к подготовке проб:

Основная цель пробоподготовки — отделение анализируемого вещества (выделение, изолирование) от основной массы экзогенных веществ и биоматрицы — достигается выполнением ряда важных процедур. К ним относятся удаление возможных загрязнений, увеличение концентрации аналита, превращение аналита в форму, пригодную для экстракции, разделение и некоторые другие.

К настоящему моменту не найдено универсального способа пробоподготовки, позволяющего выделить любой из предполагаемых токсикантов. В исследовании на «неизвестный яд» традиционным остается использование отдельных аликвот биопроб и определенного способа пробоподготовки, направленного на выделение той или иной группы токсикантов, различающихся по физико-химическим свойствам.

Анализируемые объекты, содержащие токсичные вещества, делятся:

Не только каждая из этих групп, но и каждый биообъект группы имеет морфологические особенности и требует особой аналитической процедуры пробоподготовки. Способы изолирования токсикантов из мочи, крови и тканей значительно различаются. Так, процедура удаления белков, обычно необходимая для крови и плазмы, совсем не обязательна для мочи, содержащей небольшое количество белка. Еще бóльшие сложности представляет пробоподготовка разложившихся объектов исследования из-за значительного количества соэкстрагентов в полученном экстракте (см. п. 3.5).

Этапы преданалитической подготовки пробы:

Некоторые этапы опускаются в зависимости от конкретной аналитической задачи и природы токсиканта (см. гл. 6–10).

1. Способы предварительной обработки образцов

Они зависят от выбора методов исследования, природы токсиканта, типа биообъекта, других факторов и включают:

2. Гидролиз конъюгированных метаболитов

Гидролиз проводится с целью получения свободных метаболитов и возможности их дальнейшего исследования. Конъюгированные метаболиты из-за высокой полярности и большой молекулярной массы нельзя анализировать, например, методом ГЖХ; они лучше растворяются в воде, чем в органических растворителях, что затрудняет экстракцию.

Кислотный гидролиз проходит быстро, прост в осуществлении. Однако вследствие неспецифичности реакции расщепления ковалентной связи, жестких условий проведения гидролиза в среде концентрированной кислоты при кипячении или нагревании в автоклаве под давлением образуется большое количество побочных продуктов и теряется информация о некоторых токсикантах (например, разрушение 6-МАМ — биомаркера героина, деградация бензодиазепинов до метаболитов и др., см. гл. 6).

Энзимный гидролиз под действием ферментов (например, β-глюкуронидазы, β-сульфатазы, трипсина и др.) является специфичным, проходит в мягких условиях, уменьшает образование побочных продуктов, в результате чего образец (после гидролиза) получается более чистым. Способ имеет недостатки: необходимость строгого соблюдения условий (рН, температура, состав буфера, активность фермента), длительное время инкубирования (12–20 ч), изменение активности фермента в зависимости от происхождения и сроков хранения, ингибирование фермента веществами, присутствующими в пробе (соли).

3. Экстракция

Основные задачи экстракции в ХТА заключаются в том, чтобы:

В ХТА принято делить большинство изолируемых агентов на вещества кислого, нейтрального, слабоосновного и основного характера. Экстракцией могут быть изолированы токсичные вещества, относящиеся к различным классам и группам химических соединений, в том числе нелетучие органические вещества: наркотики, ядовитые, сильнодействующие лекарственные вещества, пестициды и др.

Жидкость-жидкостная экстракция

Суммарный процесс взаимодействия токсичного вещества с биосистемой определяется многими факторами и прежде всего химической природой токсиканта. Вещества основного характера при щелочных значениях рН среды находятся в неионизированной форме, в то время как вещества кислотного характера будут ионизированы. Неионизированные формы соединений, как правило, лучше растворяются в липофильных органических растворителях, чем в воде. На этом принципе и основано изолирование токсичных веществ из биологических объектов.

При выборе методики экстракции необходимо учитывать, с одной стороны, характеристики анализируемого соединения: значение рK_а, липофильность, растворимость в водных и органических средах, значение дипольного момента, а также его устойчивость к воздействию воздуха, света, температуры. С другой стороны, выбирая конкретную экстракционную систему, необходимо принимать во внимание характеристики растворителей: полярность, селективность, дипольный момент, плотность и поверхностное натяжение, смешиваемость с водой, летучесть органического растворителя и его безопасность для здоровья. Как правило, у растворителя, выбранного в качестве экстрагента из группы растворителей, удовлетворяющих условиям жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) конкретного аналита, не существует особых преимуществ.

Выбор экстрагента — всегда компромисс между видом биообъекта, характером анализируемого соединения и свойствами растворителя. При выборе схемы экстракции, которая определяется природой токсиканта, морфологическими особенностями биообъекта, возможными методами исследования, эксперт должен обратить внимание и на потенциальные фоновые соединения экзогенного и эндогенного характера, присутствие которых в анализируемом образце неизбежно. Количество фоновых соединений будет определяться видом объекта, условиями его хранения, особенностями поведения анализируемого образца в нем и другими факторами. Обязательным является учет возможного связывания токсичных соединений с макромолекулами биологической матрицы, в основном белками.

Оптимальный выход токсиканта и селективность выделения достигаются:

Подбор растворителей. Полярность растворителя выбирают исходя из конкретных задач и общего правила: чем меньше полярность растворителя, тем лучше обеспечивается растворимость аналита в органической фазе. Неполярные растворители: гексан, гептан, диэтиловый эфир, циклогексан, толуол, хлороформ, бутилацетат, хлористый метилен. Относительно полярные растворители: спирты (амиловый, пропиловый, бутиловый), ацетон, этилацетат, ацетонитрил. Увеличение полярности растворителя достигается добавлением небольшого объема относительно полярного растворителя (этилацетата, изопропанола) к низкополярной фазе (гексану). Используют как одиночные растворители, так и многокомпонентные смеси.

Контроль рН среды. Оптимальное значение рН при проведении экстракции является функцией рK_а аналита.

При ненаправленном анализе:

Для скрининга веществ кислого и нейтрального характера используют ацетатные и фосфатные буферы, создающие для крови и кровьсодержащих тканей рН 4,5–7,4. Более кислая среда вызывает экстракцию из крови окрашенных веществ.

Для скрининга веществ основного и нейтрального характера создают рН 9,0–10,0 добавлением гидроксида аммония или буфера: карбонатного, насыщенного боратного, трис-гидроксиметиламинометана.

При исследовании амфотерных веществ (например, морфина) выбирают интервал рН, предварительно проведя расчеты по уравнению Гендерсона–Гассельбаха.

Для ионизированных веществ (четвертичные аммонийные соли) применяется ион-парная (ионно-парная) экстракция.

При направленном анализе значение рK_а токсиканта известно, поэтому величина рН может быть точно рассчитана по уравнению Гендерсона–Гассельбаха. Экстракцию проводят под строгим рН-контролем.

Соблюдение методики проведения операции. Учитывая плотность растворителей, подбирают их так, чтобы токсикант остался в нижнем слое, так как легче удалить растворитель, находящийся в верхнем слое, который затем отбрасывают. Если аналит планируют определять инструментальными методами, то экстракцию проводят без использования делительных воронок. Растворитель удаляют пастеровской пипеткой с помощью водоструйного насоса.

Добавление соли, раствор которой имеет нейтральную среду (высаливание), позволяет уменьшить растворимость аналита в водной фазе (из-за увеличения ионной силы), снижает смешиваемость воды с органическим растворителем (более резкая граница между двумя фазами) и возможность образования эмульсий.

Для веществ, являющихся очень сильными основаниями (или кислотами) проводят дополнительную очистку — реэкстракцию. Встряхивают органическую фазу с разбавленной кислотой, например 0,1 Н раствором Н₂SО₄. Вещество основного характера переходит в ионизированную форму и лучше растворяется в водной фазе и хуже — в фазе органического растворителя. Эндогенные основания также могут быть соэкстрагированы. Подбор соответствующей величины рН среды и полярности растворителя позволяет удалить бóльшую часть соэкстрактивных аминов из экстракта. Затем водную кислую фазу подщелачивают добавлением, например, раствора NаОН и встряхивают с новой порцией органического растворителя, чтобы перевести анализируемое вещество в органическую фазу. Органическую фазу отделяют, упаривают и анализируют.

В большинстве случаев органическую фазу, содержащую токсикант, промывают водой, которую затем отбрасывают. Этот этап должен быть тщательно проконтролирован. Например, если анализируемое вещество является сильным основанием, а промывная вода имеет слабокислую среду, то часть анализируемого вещества может перейти в водную фазу и будет наблюдаться большой разброс аналитических данных.

В связи с использованием современных инструментальных методов анализа (см. гл. 5) технология ЖЖЭ претерпела изменения. Отпала необходимость во фракционных разделениях и больших объемах опасных для здоровья растворителей (например, бензола и хлороформа), появилась возможность использовать однократную экстракцию, расходуя значительно меньшие объемы растворителей и меньшие по весу пробы. При этом однократная экстракция позволяет получать воспроизводимые результаты количественного определения. Снизить возможность образования нежелательных эмульсий (с высоким содержанием жира в матрице) помогают рациональный выбор растворителя, центрифугирование, помещение пробы в морозильник, добавление изооктана (см. гл. 6–10).

В практике судебно-химических лабораторий РФ нередко продолжают использовать классические способы изолирования Стаса–Отто (настаивание с подкисленным спиртом), Швайковой–Васильевой (настаивание с водой, подкисленной щавелевой кислотой), Валова (для выделения веществ кислого характера), Крамаренко (для выделения веществ основного характера) и др.

Твердофазная экстракция

Концентрирование анализируемого соединения (или группы соединений) и удаление фоновых веществ способом твердофазной экстракции (ТФЭ) обеспечивается использованием специальных сорбентов. Обычно (но не всегда) в качестве сорбента применяют модификации силикагеля, содержащие амино-, нитрильные, полиольные группы, углеводородные привитые фазы и др. После сорбции биоматериала фоновые вещества на сорбенте вымываются водой или буферными смесями, а затем осуществляется десорбция нужных соединений подходящим органическим растворителем.

ТФЭ выполняют с помощью микроколонок, заполненных твердыми сорбентами. Пропускание аналитов через твердые сорбенты (картриджи или диски), аналогичные используемым в ВЭЖХ, основано на гидрофобных, водородных или ионных взаимодействиях. Система для вакуумирования позволяет одновременно анализировать серию 8–30 образцов и поддерживать одинаковые условия изолирования. Очистку производят с помощью смеси вода — буфер — органический растворитель. Аналит элюируют органическими растворителями.

ТФЭ обычно характеризуется почти количественным выходом и хорошей воспроизводимостью. Для выполнения ТФЭ необходимо:

Обычно разделение компонентов может происходить тремя способами:

Изменяя и подбирая условия для ТФЭ (типы сорбентов для патронов, контроль рН, полярность элюентов), можно найти наилучшее решение конкретной аналитической задачи, получив максимально концентрированные и очищенные экстракты.

ТФЭ совместима с любыми методами, используемыми в ХТА.

Каждый индивидуальный этап ТФЭ зависит от вида анализируемого вещества, типа экстракционной колонки, метода определения.

В табл. 4.3 приведена сравнительная характеристика процедуры ЖЖЭ и ТФЭ.

Другие способы экстракции

Другие способы экстракции — сверхкритическая флюидная экстракция, экстракция в микроволновом поле, твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ), экстракция с помощью иммуноаффинной хроматографии — обсуждаются ниже и в п. 5.2, гл. 6–10.

Сверхкритическая флюидная экстракция (СФЭ) предназначена для выделения из твердых или жидких проб матрицы органических веществ путем их перевода в «сверхкритический газ», что достигается контактированием пробы с газообразным экстрагентом при температуре и давлении выше его критической точки. В качестве экстрагентов можно использовать СО₂, этан, этилен, пропан, SF₆ и некоторые другие газы.

Сверхкритические жидкости имеют плотность, близкую к плотности обычных жидкостей, но характеризуются более высокими (на 2–3 порядка) коэффициентами диффузии и более низкой (на 1–2 порядка) вязкостью по сравнению с обычными жидкостями. Метод позволяет в десятки раз сократить время экстракции и полностью автоматизировать процесс. В качестве сверхкритического растворителя наиболее широко используют диоксид углерода (как в чистом виде, так и в смеси с сорастворителями) из-за его высокой растворяющей способности, дешевизны, доступности, нетоксичности и невысоких критических параметров (t_крит 31,3°С, Р_крит 7,36 МПа).

СФЭ — двухстадийный непрерывный процесс, протекающий в специальных аппаратах, в которых осуществляется циркуляция растворителя (CO₂). Проба помещается в термостатируемую экстракционную камеру. Изменением давления и температуры в экстракционной колонке создаются необходимые условия для перехода CO₂ в сверхкритическое состояние, при котором начинается процесс экстракции. Жидкий CO₂ заполняет цилиндр шприцевого насоса и после переключения клапанов поступает в экстракционную камеру. Микропроцессорная система насоса позволяет определять и поддерживать необходимое количество CO₂, прокачиваемого через ячейку при заданном давлении.

На второй стадии экстрагент регенерируют путем сброса давления или изменения температуры, что приводит к полному осаждению извлеченных веществ. Затем рабочие параметры газа изменяют до требуемых значений и снова направляют его на первую стадию.

Основные характеристики: скорость подачи насоса 0,005–10 мл/мин, максимальное рабочее давление 40 МПа, объем шприцевого насоса 150 мл, объемы контейнеров экстракционной камеры — 0,5; 3,0; 10,0 мл.

СФЭ — селективный способ. Автоматизация процесса позволяет проводить экстракцию и очистку быстро и за один прием. Хорошие результаты получены для полихлорированных бензолов, диоксинов, полиароматических углеводородов, остатков углеводородного топлива из объектов окружающей среды, стабилизаторов и пластификаторов из пластмасс (см. гл. 9), а также неполярных и малополярных пестицидов (см. гл. 7), терпенов, альдегидов, стероидов, биологически активных веществ из растительного сырья (см. гл. 6).

Микроволновая экстракция основана на использовании энергии микроволнового излучения и позволяет количественно извлекать органические соединения из матрицы за 10–15 мин с использованием минимального количества органических растворителей (2–10 мл растворителя на 1 г образца).

Твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ) — миниатюризация способа ТФЭ с применением специальных игл на основе карбовакса, дивинилбензола, карбоксена.

Экстракция на жидкостных мембранах. Жидкостные мембраны — полупроницаемые жидкие фазы, разделяющие два других раствора (донорный и акцепторный). Удобно использовать жидкостные мембраны из органического растворителя, помещенного в поры полимерной подложки.

4. Очистка

Как следует из сравнительной характеристики процедуры ЖЖЭ и ТФЭ (см. табл. 4.3), очистка требуется только после проведения ЖЖЭ и достигается ионизацией аналита, удалением нейтральных загрязняющих веществ и реэкстракцией. Для этого обрабатывают аналит разбавленной кислотой, а после подщелачивания реэкстрагируют. В воде остаются белки, в органическом растворителе — липиды. Если в дальнейшем планируют исследование аналита методом ГЖХ с использованием пламенно-ионизационного (ПИД) или азотно-фосфорного детектора (АФД), а также проведение скрининга токсикантов, которые в кислой среде разлагаются, то проводить реэкстракцию не рекомендуется.

Вопрос дополнительной очистки грязных экстрактов решается компромиссно: оценивается значимость чистоты экстракта по отношению к потерям трудноэкстрагируемых веществ. Обычно такие экстракты высушивают и подвергают очистке перераспределением в гексан или гептан (наиболее гидрофобные растворители) и этанол (метанол) или используют гексан и ацетонитрил.

5. Дериватизация

Алгоритм действий при проведении ХТА должен быть разработан исследователем еще на стадии планирования экспертного исследования. Если в ходе анализа исследователь предполагает использовать газохроматографический метод для определения полярных и малолетучих соединений, то необходимо предусмотреть этап их дериватизации.

Дериватизация — это реакция получения производных искомого токсиканта путем преобразования полярных групп в неполярные без изменения основной структуры молекулы. При этом не только исключаются потери веществ из-за низкой летучести и сорбции, но и улучшаются характеристики газохроматографического анализа (см. п. 5.3). При хроматографическом исследовании токсикологически важные вещества делят на три группы: 1) летучие вещества; 2) нелетучие или менее летучие вещества, которые после соответствующей дериватизации становятся достаточно летучими и термически стабильными; 3) вещества, которые из-за высокой молекулярной массы не могут быть летучими даже после дериватизации (например, полимеры).

Для веществ, относящихся ко второй группе, проведение дериватизации с целью образования летучих производных необходимо. Ее проводят с помощью реакций ацилирования (уксусный ангидрид, трифторуксусный ангидрид, пентафторпропионовый ангидрид и др.), алкилирования (например, метилирование диазометаном и др.), силилирования [ВСА — N,O-бис (триметилсилил) ацетамид, BSTFA — бис (триметилсилил) трифтороацетамид, SILYL-991 — BSTFA, содержащий 1% триметилхлорсилана (BSTFA-TMCS 99:1), MSTFA — N-метил-N-триметилсилилтрифтороацетамид и др.]. Термин «силилирование» означает замещение подвижного водорода в функциональных группах (например, –COOH, –OH, –NH или SH) силильной группой для улучшения хроматографических характеристик и увеличения летучести соединений.

При выборе реагента для дериватизации учитывают:

Для дериватизации одного соединения может быть использовано несколько реактивов в зависимости от числа функциональных групп, которые необходимо блокировать. Проведение дериватизации значительно улучшает определение низких концентраций (нг/мл) анализируемых веществ в биологическом материале. Вследствие гидролитической неустойчивости продуктов дериватизации, приводящей к последовательной потере введенных групп вплоть до образования исходных соединений, дериватизацию проводят непосредственно перед газохроматографическим определением.

При сравнении способов дериватизации предпочтение (во многих случаях) отдается силилированию фторсодержащими реагентами (например, BSTFA и MSTFA), что практически не приводит к загрязнению детекторов (АФД, ПИД и масс-спектрального) газового хроматографа (см. п. 5.3).

Триметилсилилирование проводят в мягких условиях, оно универсально, увеличивает молекулярную массу. Силилирование функциональных групп токсикантов значительно повышает надежность количественного определения таких веществ, как морфин (спиртовый и фенольный гидроксилы), бензоилэкгонин (карбоксильная группа), метилендиоксиметамфетамин — МДМА (аминогруппа), фенобарбитал (амидогруппа).

Процедура дериватизации: выпарить досуха экстракт, полученный после ЖЖЭ или ТФЭ, добавить дериватизирующий реагент, нагреть при 70°С в течение 20 мин и 1–2 мкл ввести в инжектор хроматографа.

Особенности преданалитической подготовки пробы при определении токсикантов, относящихся к группе летучих ядов

Отнесение токсикантов к группе летучих ядов основано на низких температурах кипения этих веществ (см. гл. 7). Необходимо отметить два обстоятельства:

Летучие яды в основном определяют методом ГЖХ. Особенности подготовки пробы к определению методом ГЖХ описаны в п. 5.3.2, 5.3.3 и 7.1–7.3.

Природа летучих ядов (низкие температуры кипения) предусматривает и такие способы изолирования, как простая перегонка (дистилляция), перегонка с водяным паром, микродиффузия, экстракция и сорбция.

Особенности преданалитической подготовки пробы при определении токсикантов неорганической природы

Пробоподготовка для проведения элементного анализа биообъекта состоит из двух этапов:

Правильный отбор проб и строгое следование аналитическим методикам являются решающими факторами, предотвращающими загрязнение (контаминацию) образцов при элементном анализе. Чтобы получить адекватные результаты анализа и избежать артефактов, необходимо выбрать наиболее подходящие для цели исследования биообъекты (см. п. 7.5).

Часто для определения элементов используют кровь, мочу, волосы, ткани, например костную, органы. Концентрации элементов в моче и крови коррелируют с прямым или косвенным воздействием токсиканта в недавнем временном интервале, либо с нарушением МЛГ вследствие других причин (см. п. 7.5). В ряде случаев высокий уровень металла, например кадмия, в моче является следствием его накопления в почечной ткани при хронической интоксикации. Диагностическим тестом может служить содержание металла в конкретной форме. Так, уровень металлотионеин-кадмия в моче имеет гораздо большее токсикологическое значение, чем общее содержание кадмия (см. п. 7.5).

Для выявления нарушения минерального обмена в организме и/или хронического токсического воздействия отдельных элементов широко применяют исследование волос и ногтей, содержание макро- и микроэлементов в которых отражает элементный статус организма в целом. Пробы волос и ногтей являются не только интегральным показателем минерального обмена, но и надежным архивным материалом. С учетом постоянного совершенствования аналитической базы это открывает новые возможности при проведении судебно-химической экспертизы по прошествии длительного времени после отравления (воздействия), а также при сравнительной оценке влияния других факторов.

Сложность определения микроэлементов в биосубстратах связана как с низкими концентрациями элементов в тканях и биожидкостях, так и с постоянным их присутствием в организме, необходимым для обеспечения жизнедеятельности. Определение собственно химических элементов брутто проводят после полной деструкции органической матрицы.

Биосубстраты человека, используемые для элементного анализа, и способы пробоподготовки образцов приведены в табл. 4.4.

Стадия пробоподготовки, которая называется минерализацией, одна из самых ответственных в элементном анализе. Цель минерализации — ликвидировать органическую матрицу, не потеряв при этом определяемые элементы.

Сухое озоление. Традиционный (сухой) способ минерализации — прокаливание в муфельных печах (нагревание возможно до температуры 1150°C). Образец помещают в платиновый или керамический тигель и после озоления растворяют в кислоте (HCl). Высокая вероятность контаминации стенок тигля и муфельной печи не гарантирует получение надежных результатов для элементов, нормальное содержание которых составляет, например, 10^–10%. При сухом озолении происходит потеря некоторых летучих элементов: Hg, As, (иногда Mn и Cr, Pb в присутствии Cl^—).

Озоление на воздухе или в атмосфере кислорода имеет те же недостатки и всегда приводит к неизбежной потере летучих элементов.

Воздействие высокой температуры, вызывающее деструкцию матрицы, происходит при окислительном сплавлении, например со щелочами. При этом способе проба сильно загрязнена, потому что все примеси, неизбежно содержащиеся в щелочи, накапливаются и в пробе.

Мокрое озоление (наиболее распространенный способ минерализации) — это обработка образца концентрированными кислотами-окислителями, например азотной, серной, иногда хлорной. Окисление азотной кислотой предпочтительнее, поскольку ее можно эффективно очистить. При проведении мокрой минерализации потери микроэлементов снижаются. Кислоту (HNO₃) добавляют непосредственно к свежему или высушенному образцу ткани, который затем нагревают конвекционно при помощи термоблока либо микроволнового поля. Для уменьшения риска контаминации можно использовать фторопластовые реакционные сосуды.

Часто мокрую минерализацию осуществляют в автоклаве. Многие неорганические материалы легко растворяются в кислотах, не производя при этом большого количества реакционных газов. Однако образцы, содержащие большое количество органического вещества, образуют при разложении значительные объемы побочных газообразных продуктов реакции. При микроволновом нагреве смесей органического материала с азотной кислотой до температуры выше 140–160°C реакции разложения становятся экзотермическими, что приводит к увеличению давления в автоклавах и требует надежного контроля параметров в процессе разложения.

Разложение проб в автоклаве (с тефлоновым вкладышем) в микроволновой печи имеет следующие преимущества:

Однако такой способ имеет и недостатки. При слишком высокой температуре (выше 250°C) или неудачном выборе параметров процесса может начаться плавление фторопластовых полимеров, что приведет к потери автоклавами жесткости и их разрушению. Как правило, при разложении органических матриц температура не должна превышать 250°C, для белковых и углеводных матриц достаточно температуры 160°C, для жиров — 180–200°C.

Способ пробоподготовки образца в автоклаве, размещенном в микроволновой печи, является официально признанным и рекомендован в аттестованных методиках, нормативных документах и методических указаниях.

В зависимости от выбора метода измерения аналитического сигнала эффективной может быть пробоподготовка не только с полной, но и с частичной деструкцией матрицы (см. п. 5.4.2).

При фотоколориметрическом или атомно-абсорбционном определении металлов преимущественно используют минерализацию, при ГЖХ-, ТСХ-, ВЭЖХ-исследованиях — минерализацию и последующее получение хелатов определяемых металлов. Используя вольтамперометрию и полярографию, предварительно помимо минерализации проводят специальную подготовку пробы, а применяя ИХМ, не проводят пробопоготовку (см. п. 5.2 и 5.4.2).

Итак, общий подход к преданалитической пробоподготовке в ХТА определяется:

В практической деятельности при выборе наиболее рациональной схемы преданалитической пробоподготовки, как правило, следует учитывать все указанные позиции.

Методики преданалитической подготовки образцов для определения конкретных токсикантов различной химической природы изложены в гл. 6–10.

Даже при получении достоверных аналитических данных возможно неверное истолкование (интерпретация) конечных результатов ХТА. Например, нельзя использовать для объяснения влияния тех или иных обстоятельств на факт смерти в результате отравления концентрацию токсичного агента, которая определена только в образцах крови. Необходимо принимать во внимание данные о посмертном высвобождении и/или перераспределении токсичных веществ из ткани в кровь, что может привести к закономерным разногласиям в оценке полученных результатов (см. примеры в гл. 6-9).

Острые отравления развиваются в результате однократного, реже повторного воздействия токсичного вещества и характеризуются быстрым проявлением клинической картины.

При острых отравлениях необходимо немедленное оказание медицинской помощи, начиная с догоспитального этапа и продолжая в стационаре токсикологического или реанимационного профиля. В тех случаях когда клинические проявления на ранних стадиях развития интоксикации не позволяют установить причину отравления, проводят качественные и количественные исследования в возможно короткие сроки (максимум в течение 1–2 ч после поступления больного в стационар). Успех проведения ХТА при диагностике острых отравлений и в конечном счете успех лечения в значительной степени зависят от качества и скорости обмена информацией между клиницистом и химиком.

Объем и глубина проведения КТА в большинстве случаев определяется потребностями клиницистов. Подробное изучение клинической картины отравления, характерных симптомов отравления отдельными токсикантами — одно из основных условий адекватного выбора методов ХТА. Поэтому химик-токсиколог должен знать главные симптомы острых отравлений различными токсикантами (см. п. 1.4).

Объектами КТА при острых отравлениях, как правило, являются кровь, сыворотка или плазма, моча, содержимое желудка (промывные воды), слюна. Кровь, сыворотку или плазму в количестве до 10 мл обычно отбирают при поступлении больного. В большинстве случаев отбор мочи затруднен, поэтому проводят катетеризацию и отбирают мочу в количестве до 50 мл. В содержимом желудка (при пероральном отравлении) обычно находится действующее вещество в высокой концентрации, поэтому собирают промывные воды. Слюну отбирают в пробирки (специальные пластмассовые контейнеры) при необходимости.

В клинических лабораториях широко используют метод ВЭЖХ и экспертные системы, обеспечивающие проведение исследований биообразцов на нескольких колонках с последующим детектированием в УФ и видимой части спектра и позволяющие на основе сопоставления времени удерживания и характеристик поглощения света с банком данных по токсикологически значимым веществам в автоматическом режиме идентифицировать и количественно определять до нескольких сотен веществ и их метаболитов.

При проведении КТА используют хроматографические (ТСХ, ГХ, ВЭЖХ), спектральные (УФ-спектрометрия, флуоресценция) и комбинированные (ГХ-МС, ВЭЖХ-МС) методы исследования (см. гл. 5). Анализ элементного статуса при подозрении на отравление металлами проводят в зависимости от показаний методами атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) или методом индуктивно-связанной плазмы с масс-спектральным детектированием — ИСП-МС (см. п. 5.4.3 и 7.5). ТСХ используют главным образом при исследовании мочи и содержимого желудка (см. гл. 5). Из-за недостатка времени обычно применяют ограниченное количество хроматографических систем и способ последовательной обработки пластин различными проявляющими реактивами, используя экспертные системы для ТСХ.

Анализ спиртов и суррогатов, летучих ядов и газов проводят методом ГЖХ на капиллярных колонках с пламенно-ионизационным детектором или катарометром.

Анализ лекарственных препаратов и наркотиков проводят методом ГЖХ на капиллярных колонках с ПИД или АФД, с масс-спектрометром.

Анализ пестицидов проводят методом ГЖХ на капиллярных колонках с электронно-захватным и/или АФД.

При экспресс-диагностике острых отравлений применяют:

Определение в биологических пробах живых лиц наркотических, психотропных и сильнодействующих веществ (см. гл. 6) проводят с целью установления факта их присутствия в организме человека.

Для определения наркотических, психотропных и сильнодействующих веществ чаще всего как наиболее информативный биообъект исследования используется моча. Образец мочи обычно может быть получен в достаточном количестве, а концентрация психоактивных веществ и/или их метаболитов в моче, как правило, относительно высокая. К недостаткам этого биообъекта следует отнести возможность фальсификации образца. Для установления факта употребления наркотика спустя недели или месяцы следует провести исследование волос и ногтей (см. ниже). В табл. 4.5 приведены данные литературы о времени возможного выявления часто используемых наркотических и психотропных веществ и некоторых их метаболитов в моче.

Подавляющее большинство химико-токсикологических исследований на наличие наркотиков у живых лиц носит ненаправленный характер. Из поступающей сопроводительной информации известны, как правило, две позиции:

Направленность исследования имеет крайне важное значение, так как определение некоторых веществ не укладывается в общепринятые схемы ХТА, существуют частные методики обнаружения отдельных веществ с использованием специального оборудования (см. гл. 6). В соответствии с требованиями надежности, достоверности и доказательности результатов анализов, а также рекомендациями ВОЗ и общепринятыми мировыми стандартами, лабораторное исследование на наличие наркотических веществ должно состоять из двух этапов: предварительного (скринингового) и подтверждающего.

Согласно международным правилам, которые приняты в РФ, методы определения наркотиков разделяются на три категории (табл. 4.6).

Предлагаются следующие варианты их использования:

Комбинированный метод (ГХ-МС) рассматривают как два раздельных метода.

При скрининговых исследованиях обнаружения наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ часто используют иммунохроматографический анализ (ИХА) на тест-полосках, ПФИА и ИФА (см. п. 5.2). При получении положительного результата, т. е. когда концентрация вещества превышает пороговую, необходимо провести дальнейшее исследование образца мочи подтверждающими альтернативными методами. Проведения дальнейшего исследования при отрицательном результате не требуется.

В лабораториях применяют различные комбинации методов категории А, В и С.

Все пробы, поступающие в лабораторию, подвергаются обязательному предварительному иммунохимическому исследованию на наличие трех основных групп наркотических веществ: опиатов и амфетаминов с использованием соответствующих наборов реагентов для ПФИА, каннабиноидов — с помощью тест-полосок и ПФИА. В случае когда наркологом выявлена клиническая картина наркотического опьянения, но по результатам предварительных исследований опиатов, амфетаминов и каннабиноидов в образце мочи не обнаружено, данный образец направляется на дополнительное расширенное иммунохимическое исследование на наличие бензодиазепинов, барбитуратов, метадона, кокаина (по бензоилэкгонину), экстази, фенциклидина с дальнейшим подтверждающим определением методом ГХ-МС.

При направленном исследовании образцов мочи на наличие триметилфентанила и клофелина в лаборатории используется ИФА с соответствующими наборами реагентов. Так, при приеме обычной разовой терапевтической дозы клофелина (60–120 мкг) он обнаруживается с помощью ИФА даже спустя 48–60 ч.

Метод ТСХ является условно подтверждающим только при совпадении с результатами иммунохимических исследований. Иногда для получения достоверного результата используют три метода исследования (до 5% всех проб), что приводит к увеличению срока выдачи результатов на 1–2 дня. Например, если при ТСХ не удалось надежно идентифицировать то или иное вещество (в большинстве случаев это относится к следовым количествам веществ), то проба направляется дополнительно на анализ методом ГХ-МС. ГХ-МС — основной подтверждающий метод химико-токсикологического исследования. Это особенно важно при обнаружении каннабиноидов, бензоил- и метилэкгонина (метаболитов кокаина), 6-МАМ (метаболита героина), фенциклидина, триметилфентанила, буторфанола (стадола), декстрометорфана, доксиламина (донормила), кетамина, фармакологически активных пищевых добавок и др.

Метод ГХ является подтверждающим для ограниченного числа наркотических средств и психотропных веществ. В частности, при серийных анализах он используется для подтверждения основного метаболита марихуаны в моче — ∆⁹-тетрагидроканнабиноловой кислоты. Парофазный метод ГХ применяется при обнаружении и количественном определении летучих токсичных веществ в моче и крови токсикоманов после одурманивания органическими растворителями, бензином, клеем «Момент» и др. При этом наиболее часто обнаруживаются толуол, ацетон, этилацетат.

Большой трудностью при выполнении химико-токсикологических исследований является отсутствие необходимых стандартов наркотических веществ. Отечественная промышленность такой вид продукции выпускает в ограниченном ассортименте, заказ по зарубежным химическим каталогам невозможен в нашей стране из-за законодательных запретов. На сегодняшний день в качестве стандартов наркотических веществ официально можно использовать наборы калибраторов и «контролей» наркотических веществ с низкими концентрациями в моче; экстракты мочи наркоманов, охарактеризованные методом ГХ-МС. При анализе методом ГХ-МС используют также библиотечные данные характерных МС наркотических веществ. Сложность интерпретации полученных результатов исследований связана со следующими моментами:

Ввиду высокой чувствительности ИХМ следует осторожно подходить к оценке и интерпретации полученных результатов при анализе образцов с крайне малым содержанием наркотических веществ и возможным влиянием пищевых добавок и общедоступных распространенных лекарств. Наиболее проблематичная группа веществ в отношении корректной трактовки результатов — опиаты. Так, например, при умеренном (обычном) употреблении кондитерских и хлебобулочных изделий с маком ИХМ (особенно ИХА и ИФА) дают положительный результат на опиаты в образце мочи, собранной спустя 1–8 ч после употребления. При анализе методом ГХ-МС при этом обнаруживается морфин в следовых количествах.

При оценке результатов анализа опиатов необходимо дифференцировать лекарственное потребление кодеина и нелегальный прием опиатных наркотиков. Очень важно, что после употребления кодеина, который входит в состав многочисленных противокашлевых лекарственных препаратов, одним из его метаболитов является морфин (морфин свободный — 1%, морфина 3-глюкуронид — 5–13%). Несмотря на то что однозначные критерии дифференцирования отсутствуют, наиболее вероятна следующая оценка результатов: при обнаружении методом ГХ-МС незначительного количества морфина (менее 30 нг/мл) на фоне среднетерапевтических концентраций кодеина результаты анализа свидетельствуют об обнаружении только кодеина (см. гл. 6).

Еще один важный пример: при однократном приеме 1 мл валокордина (содержащего 20 мг фенобарбитала) возможен положительный результат определения барбитуратов ИХМ даже через 4–7 дней после употребления лекарства.

Ограничения на применение мочи и крови в качестве объектов исследования следующие:

Альтернативными объектами для определения наркотиков являются волосы, ногти и потожировые выделения кожи.

Необходимо проводить раздельное определение веществ, адсорбированных поверхностью этих объектов, и веществ, находящихся in vivo. В случае обнаружения наркотиков на поверхности исследуемых объектов следует провести процедуру отмывки с обязательным контролем чистоты. Например, после употребления наркотиков их концентрация на поверхности кожи, волос и ногтей обычно составляет 10^–6–10^–7 г, а после отмывки поверхностных загрязнений — 10^–8–10^–11 г.

Имеются схемы пробоподготовки образцов кожи, волос и ногтей и методы определения в них наркотиков.

Особенности анализа объектов небиологического происхождения на наличие наркотиков (криминалистический анализ)

Разнообразие видов и форм контролируемых веществ, а также противозаконная деятельность их производителей, направленная на маскировку и сокрытие своей продукции, обусловливают специфические аспекты криминалистического анализа при обнаружении наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ.

Для отнесения того или иного объекта к какому-либо виду наркотиков с целью установления мер контроля над его оборотом требуется проведение исследований этого объекта несколькими независимыми методами. По сложившейся международной и отечественной практике во многих случаях достаточно двух-трех методов. Иногда при анализе сложных смесей число методов значительно увеличивается.

Применяемые экспертами-криминалистами методы исследования делятся на предварительные и подтверждающие (табл. 4.8).

Методы МС, ИК-спектрометрии и спектрометрии ядерного магнитного резонанса дают информацию о структуре исследуемого вещества и являются арбитражными. В случае недоступности методов структурного анализа используют комбинацию как минимум трех методов. Например, для отнесения порошка неизвестного происхождения к наркотическому средству героину достаточно подвергнуть порошок капельному химическому анализу с помощью селективных реактивов, используемых по соответствующей схеме, и исследованию методом хромато-масс-спектрометрии. В то же время для отнесения растительного материала к наркотическим средствам, получаемым из конопли, достаточно (но не всегда) применить капельные химические тесты на эти наркотики, ТХС и провести фармакогностическое микро- и макроскопическое определение. При этом эксперт всегда должен помнить о том, что коноплю наркоманы часто используют в качестве носителя для более тяжелых наркотиков: многочисленных производных фенилалкиламина, ЛСД, фенциклидина или ДОБ (см. гл. 6).

Перед экспертом после отнесения им того или иного образца вещества, изъятого из незаконного оборота, к наркотическим средствам или психотропным веществам обычно встают следующие вопросы:

Для решения этих вопросов эксперт на основе исследования предоставленных образцов наркотика должен:

Основной объем незаконного оборота наркотиков составляют наркотики растительного происхождения, получаемые из мака снотворного, конопли, эфедры и кокаинового куста. Наряду с характерными особенностями, присущими растительному сырью, наркотические средства, произведенные в географической близости друг от друга, будут иметь близкий состав.

Любой наркотик растительного происхождения, изымаемый из незаконного оборота, является смесью веществ, и крайне редко встречаются образцы высокоочищенных наркотиков. При этом качественный и количественный состав получаемых продуктов непостоянен и, более того, изменяется по мере продвижения его от производителя к потребителю.

Все вещества, входящие в состав наркотического средства, делятся на четыре основные группы:

Образцы одного и того же наркотика, полученного по одной и той же технологии, имеют один и тот же качественный химический состав, за исключением веществ, добавляемых на различных этапах цепи распространения. Их количественный состав (соотношения компонентов) часто различается, что обусловлено специфическими особенностями исходного сырья, методами получения или производства, условиями распространения и хранения. Схожие проблемы появляются при исследовании синтетических наркотиков.

Эксперт должен решать многие задачи, от установления связей между наркоторговцем и конкретным потребителем наркотика до выявления цепи распространителей и определения географического региона, в котором наркотик был произведен.

Состав наркотиков в значительной степени зависит от метода производства и способа дальнейшей их транспортировки к месту продажи. На каждом из этапов наркотрафика в наркотик добавляются различные компоненты. Это создает ситуацию, когда партия, полученная в одной подпольной лаборатории, может распространяться через разные сети и, следовательно, может иметь различный химический состав. С другой стороны, конкретный распространитель (как правило) добавляет в наркотики, полученные от разных производителей, одни и те же компоненты.

При хранении наркотиков растительного происхождения изменяется их качественный и количественный состав, что необходимо учитывать при проведении сравнительных исследований. Например, при хранении марихуаны и гашиша происходит взаимопревращение каннабиноидов, в образцах героина — окисление аскорбиновой кислоты, которой его часто разбавляют, при повышенной влажности и температуре частично разлагаются наркотики, имеющие сложноэфирные группировки, например героин и кокаин.

Цель углубленного и расширенного исследования наркотиков — выявить криминалистически значимые признаки в конкретных образцах наркотика, исходя из всей совокупности возможного изменения их качественного и количественного состава. Многообразие таких признаков требует проведения значительно большего объема исследований по сравнению с обычным криминалистическим подходом и соответственно расширения круга исследований.

Отличительной особенностью методов, применяемых при углубленных исследованиях наркотиков, является необходимость выявления и идентификации близких по своим химическим свойствам компонентов, содержащихся в исследуемом продукте, на уровне ниже 0,1–0,001%, по сравнению с действующим началом. Например, в опии на указанном уровне концентраций содержится несколько десятков алкалоидов, которые в зависимости от условий выделения могут переходить в героин (частично или полностью, в неизменном виде или измененными). Аналогичная ситуация характерна для других наркотиков растительного происхождения. Для определения подобных природных компонентов, переходящих в конечный продукт (наркотик), требуется использование комплекса физических, физико-химических и биологических методов (см. табл. 4.8). Следует установить:

При интерпретации данных ХТА необходимо учитывать многие факторы, имеющие значение для корректной оценки результатов. Так, при выполнении СХА и КТА необходимо учитывать принятую дозу, способ и частоту введения, толерантность к действию токсичных веществ, время, прошедшее с момента отравления, особенности тканевого распределения токсикантов, потому что это важно для правильного определения места отбора пробы. Значимость медико-правовой классификации смерти (ущерба здоровью) и правильного отбора образцов всегда остается приоритетной.

Достоверное количественное определение токсикантов в крови, печени, содержимом желудка или других биообъектах является надежной основой для интерпретации полученных результатов ХТА. Токсичные и летальные дозы известны для многих соединений и отражены в различных справочных материалах.

Должно быть обязательно проведено исследование на соответствие терапевтической дозы принятого потерпевшим лекарственного препарата и его концентрации, обнаруженной в биологических образцах в результате ХТА, даже если вскрытие установило совсем другую причину смерти. Так, в случае апоплексического удара танатолог может потребовать провести скрининг на присутствие противоэпилептических средств, чтобы определить, было ли использовано такое медикаментозное лечение. То же самое справедливо в отношении теофиллина при смерти больного бронхиальной астмой. Некоторым лицам, пытавшимся покончить жизнь самоубийством, могли быть прописаны для снятия депрессии или лечения других заболеваний терапевтические дозы соответствующих лекарств. Количественное определение этих препаратов в биообъектах может показать, есть ли связь между фактом смерти (ущерба здоровью) и использованной дозой вещества. В судебной токсикологии отрицательный лабораторный результат имеет не меньшую значимость, чем положительный.

В отношении других факторов (например, наркотрафика употребленных наркотических средств или результатов лабораторного исследования образцов небиологического происхождения и т. п.) должно быть доказано их влияние на факт смерти (ущерба здоровью).

Эксперт должен различить случаи хронического использования высоких доз токсичного вещества (лекарственного средства) и острого отравления при передозировке.

Случаи хронического и острого отравления можно различить, если сопоставить концентрации токсичного соединения и его метаболитов в крови. Как правило, более высокая концентрация метаболита в крови свидетельствует о хроническом применении, а значительное превышение концентрации токсиканта над концентрацией метаболита — об остром отравлении.

Причина смерти не может быть установлена только на основании данных о концентрации токсичного вещества в крови. Равные концентрации токсичных веществ в печени и крови (при анализе образца печени) будут свидетельствовать о хроническом использовании высоких доз. В случае острого отравления концентрация токсиканта в печени будет значительно превышать концентрацию в крови.

Знание способа введения токсичного соединения в организм также имеет значение, во-первых, для определения максимальной концентрации токсиканта и времени, за которое эта концентрация достигнута, а во-вторых, для правильной интерпретации результатов, полученных при анализе образцов различных органов. Внутривенное введение и ингаляция первоначально дают более высокую концентрацию токсичного соединения в крови, в то время как оральное, внутримышечное и подкожное введение вследствие медленного всасывания — более низкую концентрацию. При внутривенном введении или ингаляции (что приводит к более высокой концентрации токсиканта не только в крови, но и в легких, мозге и даже почках) в печени обнаруживается более низкая концентрация токсичного соединения, чем при оральном введении.

Для оценки быстро всасывающихся токсичных соединений необходимо знать их концентрации в крови и печени. Следует учитывать, что кровь продолжает циркулировать обычно в течение нескольких минут после остановки дыхания, поэтому концентрация токсичных веществ при внутривенном введении будет намного меньше, чем при оральном введении такой же дозы.

При оральном приеме большой дозы почти всегда концентрация токсиканта в печени более чем в 3 раза превышает таковую в крови, в то время как после внутривенного введения его концентрации в печени и в крови почти равны.

При ингаляции концентрация токсичного вещества в тканях такая же, как после внутривенного введения, возможно, в легких она более высокая.

Другие типы введения изучены недостаточно, чтобы их сравнивать.

Высокая концентрация токсичных веществ в крови на раннем этапе после внутривенного и орального введения будет соответствовать более высокой концентрации в легких и печени, в то время как в период выведения концентрации в желчи и моче будут более высокими по сравнению с концентрацией в крови.

В то же время концентрация метаболитов может быть выше концентрации исходного соединения почти во всех тканях, что особенно важно в отношении метаболитов, обладающих фармакологической активностью.

Если известно или предполагается, что смерть наступила в результате отравления лекарственным веществом после одноразового приема, то можно оценить интервал между введением и смертью на основе определения концентрации токсиканта в тканях. Так, в 245 исследованных случаях смерти, вызванной барбитуратами, концентрация в печени обычно в 4 раза превышала таковую в крови, если время между приемом и смертью составляло более 5 ч.

Определено, что концентрация морфина в крови в случае введения смертельной дозы героина обратно пропорциональна времени в случаях, если жертва отравления живет более 24 ч.

Токсичные вещества основного характера дают относительно низкие концентрации в крови, и соотношение концентрации в печени и крови часто превышает отношение 10:1.

Соединения кислотного характера дают умеренно высокие концентрации в крови, и отношение концентрации токсиканта в печени к концентрации в крови составляет 2:1–5:1.

Для нейтральных соединений характерны очень высокая концентрация в крови и почти одинаковое распределение в других тканях.

Высокая концентрация токсичных соединений в желудке будет указывать на оральный путь введения, хотя необходимо иметь в виду и другие пути попадания его в желудок.

Если моча недоступна для тестирования, то она может быть заменена экстрактом или фильтратом содержимого желудка. Лекарственный скрининг содержимого желудка недостаточен, чтобы определить все потенциальные токсиканты. Например, лекарственные (наркотические) средства, обычно применяемые внутривенно, при курении или ингаляционно, не могут проникнуть в желудок в детектируемых количествах, поэтому их обнаружение проводят ИХМ в крови или плазме.

Токсичные вещества, принятые за несколько часов до смерти, не всегда сохраняются в желудке. Некоторые вещества основного характера после всасывания в кровь будут диффундировать обратно в желудок и находиться там в ионизированном состоянии из-за кислой реакции среды. Результирующая концентрация токсиканта в содержимом желудка будет частично определяться значением рK_а и концентрацией этого вещества в крови.

Результаты скрининга содержимого желудка должны быть сопоставлены с данными ИХМ, полученными при исследовании плазмы крови и стекловидного тела, или скрининга веществ основного характера в крови методом ГЖХ с АФД (см. гл. 5).

Вместо скрининга мочи (в случае если моча недоступна) проводят по определенной схеме исследование содержимого желудка, крови или гомогенатов тканей (в случае если кровь недоступна).

ИХМ можно применять для анализа негемолизированной и гемолизированной плазмы, посмертной цельной крови или стекловидного тела. Если результат ИХМ неудовлетворительный, то образец разбавляют равным объемом необходимого буфера, что бывает достаточно, чтобы сделать образец аналитически доступным. При необходимости скрининг крови может быть осуществлен с помощью спектрофотометрии, причем гемоглобин и другие белки необходимо сначала осадить ацетоном, метанолом или ацетонитрилом. После такой обработки надосадочная жидкость может быть исследована с помощью соответствующих калибраторов.

Применительно к образцам крови, плазмы, стекловидного тела ИХМ должны быть калиброваны по низкой пороговой чувствительности, которые используются для скрининга мочи. Cut-off порядка 50 нг/мл (500 нг/мл для барбитуратов) дает некоторое количество ложноположительных результатов, которые вследствие перекрестного реагирования интересующих анализируемых веществ минимизируют получение ложноотрицательных результатов (см. начало главы). Все положительные результаты, полученные с помощью ИХМ, должны быть подтверждены и отражены в конечном отчете. Если обстоятельства дела включают летальный исход, необходимо провести иммунохимические исследования на присутствие фенацетина и салицилатов.

ГЖХ-скрининг веществ основного характера крови более чувствителен, чем таковой содержимого желудка, но также и более трудоемок. ГЖХ-скрининг может быть включен в общий скрининг, особенно когда моча недоступна как объект или когда известно, что имела место интоксикация, но скрининг содержимого желудка дает отрицательный результат.

В тех случаях когда первоначальный хроматографический скрининг дает неидентифицированные пятна при ТСХ или неидентифицированные пики на хроматограмме (ГЖХ) в отсутствие нужных стандартных веществ сравнения, образец в дальнейшем может быть подвергнут скринингу методом ГХ-МС (см. гл. 5).

Для интерпретации результатов ХТА обязательно сопоставляются обстоятельства дела, результаты вскрытия, клинические данные (если возможно) и результаты исследования, а также информация о специфических физиологических реакциях, обусловленных действием того или иного токсиканта. Нарушение сердечного ритма, частота дыхания, размер зрачка и отсутствие узнавания, несохраненные рефлексы, конвульсии и некоторые другие предсмертные симптомы могут свидетельствовать о механизме токсичности подозреваемого агента и указывать на некоторые токсиканты среди большого числа возможных (см. гл. 6–10).

Результаты вскрытия помогают химико-токсикологическому исследованию. Состояние слизистой оболочки желудка или пищевода может подтвердить или исключить действие едких обжигающих токсикантов. Наличие в венозных сосудах алой крови может указать на возможное отравление угарным газом (СО). Отек легких может указать на предсмертное угнетение дыхания, некроз печени — в первую очередь на отравление фенацетином или парацетамолом, бледной поганкой среди других токсичных агентов, обладающих гепатотоксичностью. Следы инъекций позволяют предположить передозировку вещества при внутривенном введении.

При ненаправленном СХА на «общее неизвестное», т. е. когда химическая природа токсикантов неизвестна, должны соблюдаться следующие правила.

Специалист в области ХТА должен проанализировать результаты фармакологических и токсикологических исследований, возможность лекарственного отравления при передозировке, установить посмертные изменения токсичных агентов и анализируемых биообъектов.

В итоге своей работы эксперт надеется получить ответы на следующие вопросы.

Когда химико-токсикологическое исследование завершено, полученные результаты суммируются в виде отчета — акта судебно-химической экспертизы, который представляется танатологу (судебно-медицинскому эксперту). В акте указывают имя умершего, если известно, или номер, ему присвоенный; подробное описание примененных методик; анализируемые биообъекты и химические агенты, обнаруженные в каждом образце; найденные концентрации этих веществ, занесенные в таблицы утвержденной формы. В акте также указывают вещества, в отношении которых были сделаны попытки их обнаружения, но которые обнаружены не были (особенно если в направлении содержалась просьба их обнаружить). Если были обнаружены какие-либо токсиканты, но их наличие не было подтверждено другими методами, то этот факт обязательно отражается в отчете (акте). Кроме того, сообщается любая информация о биообъекте, например дата и время отбора предсмертной крови (известны сложности при интерпретации результатов, связанные с посмертным перераспределением многих токсикантов), или какие-либо необычные факты, характеризующие биообъект. В отчете должно быть указано, по чьей инициативе был проведен отбор проб.

Значение многих работ в области ХТА снижается из-за отсутствия согласованной системы представления полученных результатов. Как правило, эксперт довольно редко имеет возможность осуществить детальное межлабораторное статистическое исследование, ограничиваясь лишь рядом повторных определений в своей лаборатории. Выполняя количественное определение, аналитик должен ответить на вопрос: когда и в какой части процесса обеспечивается самая высокая точность?

Для получения надежных результатов исследований необходимо иметь стандартные образцы и его эталонные растворы.

Стандартное вещество сравнения (первичный стандарт) — паспортизованный образец определяемого вещества высокой чистоты, служит для приготовления эталонных растворов вещества сравнения.

Эталонный раствор вещества сравнения — раствор стандартного вещества определенной концентрации в воде или органическом растворителе. Используют для калибровки приборов или аналитического контроля.

Рабочий раствор вещества сравнения – раствор, приготовленный разбавлением эталонных веществ сравнения. Используют для проведения контрольного опыта.

Контрольный образец (модельная смесь) – биологический образец с внесенным анализируемым веществом в известной концентрации.

Холостой образец – биологический образец, идентичный контрольному образцу по биологической матрице, но не содержащий исследуемого вещества.

Фон — искусственная интерференция каких-либо материалов в контрольном или аналитическом образце, которая может вызвать положительную или отрицательную ошибку.

Результаты обрабатывают по одному из методов: абсолютной градуировки, методом внутреннего стандарта, методом стандартной добавки.

Калибровку необходимо строить для каждого нового образца. При калибровке нужно также включать холостой образец. Для построения градуировочного графика необходимо иметь набор смесей анализируемого вещества в концентрациях, охватывающих исследуемый диапазон концентраций. Искусственные смеси готовят из веществ с аттестованной степенью чистоты. Также должна быть известная погрешность определения искомого соединения в искусственных смесях выбранным методом исследования, т.е. методика приготовления искусственных смесей должна быть метрологически аттестована.

При проведении количественного определения токсиканта необходимо:

Обеспечение качества и надлежащая лабораторная практика (принципы GLP в работе современной лаборатории)

Надлежащая лабораторная практика (GLP) — это система мероприятий по обеспечению качества результатов анализов в лаборатории (организационный процесс и условия, в которых планируются, осуществляются, контролируются, регистрируются лабораторные исследования и представляются их результаты) (см. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014. Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 02.12.2009 №544-ст). В мире такая система действует более 20 лет. В Евразийском экономическом союзе (ЕАЭС) единые правила GLP вступили в силу 6 мая 2017 г.

Контроль качества – это:

Руководство по качеству

Руководство по качеству – это внутрилабораторный документ, регламентирующий административную, хозяйственную и научную стороны ее деятельности. Оно обеспечивает условия проведения лабораторных работ под надлежащим контролем и достижения поставленной цели при соблюдении всех требуемых нормативов и стандартов с тем, чтобы результаты работ могли быть приняты в качестве доказательства в ходе судебного процесса самого высокого уровня.

Руководство по качеству содержит следующие разделы:

Руководство по качеству предусматривает полное описание должностных обязанностей всех сотрудников. Должна быть предусмотрена по крайней мере одна должность сотрудника, ответственного за оценку качества результатов работы.

Порядок работы с образцами

Лаборатория должна иметь подробные инструкции о порядке приема, способах маркировки, регистрации и обработки материалов, поступающих на исследование, а также о порядке их последующего возвращения или уничтожения. Все представленные образцы должны быть тщательно упакованы, промаркированы, должны иметь сопроводительную документацию, выполненную по соответствующей форме. Принимать образцы должны специально выделенные сотрудники, каждый образец должен заноситься в систему регистрации. Вся сопроводительная документация по каждому из образцов хранится в соответствующем месте в лаборатории.

Отбор проб и образцов

Главная задача при отборе проб – осуществление правильного и достоверного химического анализа. Отобранные образцы должны быть представительными. В зависимости от задачи процедура отбора образцов может претерпевать изменения.

Особенности отбора биообразцов

Необходимо обеспечивать соответствие изымаемого образца проверяемому объекту, обеспечивать их сохранность. Также необходимо избегать подмены или фальсификации образцов на всех стадиях проведения исследования.

Контрольные эталоны, материалы и реактивы

В лаборатории должна вестись документация, касающаяся контрольных эталонов, контрольных проб или образцов и ступенек калибровок оборудования, которые необходимы в различных аналитических процедурах и методах. Стандарты должны быть получены из соответствующих национальных и международных стандартов с сопровождающей документацией. Контрольный эталон должен быть сертифицирован, должен соответствовать характеру исследований, проводимых в лаборатории, где должна быть документация, указывающая на источник и дату их приобретения и должен храниться в условиях, которые обеспечивают его сохранность и стабильность. Если контрольный эталон изготавливается в лаборатории, это также отражается в документации. Рекомендуется, чтобы лаборатория сама проверяла контрольный эталон на чистоту и состав путем сравнения этих показателей с ранее использованным эталоном. Калибраторы при анализе биологических проб должны иметь ту же биологическую матрицу, что и матрица исследуемых проб.

Контрольные пробы или образцы готовятся из эталонных материалов, либо приобретаются, либо получаются из фонда ранее исследованных проб. Используются для проверки правильности калибровки.

Ответственность за приобретение и содержание контрольных эталонов должна быть возложена на специально назначенного сотрудника, который должен вести регистр всех этих материалов.

Качество реактивов должно соответствовать требованиям лабораторных исследований. Все реактивы должны быть снабжены этикетками с информацией о дате получения, сроке годности, дате начала использования. В лаборатории необходимо вести тетрадь записей о приготовлении реактивов.

Оборудование

Для контроля оборудования необходимы наличие в лаборатории инвентарной описи оборудования и ведение соответствующей документации, касающейся расположения, даты приобретения, данных об уходе за оборудованием, его техническом обслуживании и ремонте. Инструкции по эксплуатации должны находиться поблизости. Должен быть назначен ответственный за конкретное оборудование и в случае неисправности он должен быть немедленно оповещен. Оборудование должно быть выведено из эксплуатации до устранения неполадок.

Вследствие разнообразия используемого оборудования имеются конкретные требования к различным его видам с учетом специфики.

Оснащение лаборатории, условия работы и техника безопасности

От того, с каким видом проб будет работать лаборатория, зависит ее оснащение, требования к площади, правилам хранения и техника безопасности. В соответствии с проектной нагрузкой лаборатория обеспечивается оборудованием и персоналом. При размещении оборудования следует учитывать последовательность приемки, хранения, предварительной обработки, анализа, удаления проб и образцов. Посуда, применяемая при исследовании токсикантов с высокими концентрациями, должна использоваться отдельно от посуды, применяемой при работе со следовыми количествами в биологических пробах. Оборудование, чувствительное к окружающим условиям, должно размещаться в местах с ограниченным доступом.

При работе в лаборатории должны соблюдаться обычные санитарно-гигиенические требования. Это применение лабораторных перчаток, халатов, средств защиты глаз. В помещениях лаборатории не должен быть прием пищи и напитков. Пожарная безопасность – одно из основных требований при работе в химической лаборатории, включающее правила хранения воспламеняющихся растворов и реактивов, лаборатория должна быть оснащена средствами пожаротушения, должны быть назначены лица, ответственные за противопожарную безопасность, должны регулярно проводиться тренинги. Для обеспечения биологической безопасности при работе с биологическим материалом следует пользоваться средствами биологической защиты. Источником радиационной опасности могут служить радиоиммунологические исследования (изотоп ¹²⁷I₂ или тритий), а также электронно-захватные детекторы (ЭЗД) в ГХ (обычно ⁶³Ni). Необходимо соблюдать правила по использованию и утилизации радиоактивных материалов. Персонал должен носить дозиметры для радиационного контроля дозы облучения.

Отчетность

Система качества проведения работ должна предусматривать следующие требования к ведению отчетности в лаборатории:

Аккредитация и сертификация

Аккредитация – процедура, посредством которой орган по аккредитации официально признает правомочность лаборатории или лица выполнять конкретные работы.

Сертификация – процедура, посредством которой орган по сертификации официально признает, что лицо или продукция соответствуют определенным техническим условиям.

Аккредитация и сертификация внешними организациями являются целью разработки обеспечения качества.

Основные составляющие системы GLP, согласно международным правилам

Валидация – это организация такой документальной проверки, которая предоставляет высокую степень уверенности в том, что выбранный процесс проверки воспроизводимо обеспечивает получение достоверных сведений о соответствии продукции заранее определенной спецификации на эту продукцию. Валидация – доказательство того, что любые процедура, процесс, оборудование, материал, система, вид деятельности действительно соответствуют ожидаемым результатам. Это проверка данных на достоверность или соответствие установленным стандартам, правилам или договоренностям. Валидация включает в себя проверку работоспособности оборудования, правильности получаемых результатов. Валидация компьютеризированной системы – демонстрация того, что компьютеризированная система соответствует своему назначению.

Валидация аналитических методик – установленный процесс проверки метрологических характеристик аналитического метода на соответствие своему предназначению, проводимый в лабораторных условиях.

Термин «квалификация» — процесс проверки и предоставления доказательств того, что оборудование работает правильно и его работа приводит к ожидаемым результатам. Квалификация является частью процесса валидации и всегда относится к определенному продукту, товару, персоналу, услуге и пр.

Прибор не может выдавать достоверные результаты, если не проведены или не проводятся надлежащим образом следующие этапы его квалификации:

Основными объектами валидации и квалификации в лаборатории являются:

Валидация не гарантирует от ошибок, но обеспечивает высокую степень уверенности в достоверности результатов.

ХТА выполняют с использованием подходящих методов, возможности которых соответствуют решаемой задаче. Выбор метода определения токсиканта и проведение ХТА невозможно без знания основ аналитической и органической химии, физики и математики.

Информационная эффективность методов анализа. Качество результата определения оценивается с точки зрения его погрешностей, при этом должны быть охарактеризованы надежность, качество этой погрешности. Согласно современным нормативным документам, необходимо учитывать следующие параметры качества анализа:

Все многообразие характеристик можно свести к одному интегрирующему показателю в численной мере. Общий интерес представляют такие параметры, как время, необходимое для выполнения анализа, точность получаемых результатов и разрешающая способность метода. Аппарат хемометрики — пограничной области науки, в которую входят статистика, аналитическая химия и методы вычислительной математики — позволяет подойти к решению проблемы с точки зрения теории информации исходя из уравнения Шеннона. Так, в качественном анализе возможны только два вывода: компонент присутствует или отсутствует. Поэтому в качественном анализе максимальное получаемое количество информации H_макс = log₂2 = 1 составит 1 бит (от binary digit — двоичная единица измерения количества информации по Шеннону).

В количественном анализе учитывают конкретные особенности метода анализа, например время выполнения определения, разрешающую способность метода, рабочий диапазон измеряемых концентраций и др. Поэтому объем информации I, предоставляемой методом анализа, может быть оценен по следующей более сложной формуле:

Таким образом, если качественный анализ способен предоставить только 1 бит информации, то количественные химические методы, например гравиметрия и титриметрия, — 1–2 бит, атомный эмиссионный анализ и рентгеновская спектрометрия — уже сотни бит, а МС — тысячи бит информации. Это объясняется тем, что в современных приборах велик диапазон измеряемых сигналов и диапазон измеряемых содержаний — до 5–6, а точность очень высокая.

При всесторонней оценке метода анализа немалую роль играет и стоимость, которая складывается из всех действительных затрат (амортизация аппаратуры, стоимость материалов, энергии, заработная плата и т.д.). Поэтому отношение количества полученной информации к затратам может характеризовать рентабельность метода анализа. С точки зрения рассмотренного информационного подхода большему диапазону определяемого содержания при прочих равных условиях отвечает и бóльшая информационная эффективность метода. Физико-химические методы анализа имеют принципиально более низкие пределы обнаружения и несравненно более эффективны, чем классические химические методы (гравиметрия и титриметрия). Информационная мощь таких гибридных методов, как ГХ-МС или ВЭЖХ-МС-ЯМР (см. ниже), имеет значительные преимущества при выполнении сравнительных исследований большого числа определяемых аналитов.