
=== 2.3. Фармацевтические субстанции животного происхождения


[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===



==== ФС.2.3.0006 Апротинин (Aprotininum)

Взамен ВФС 42-2175-92*

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.3.0006_1.png[]
|===

[discrete]
===== Определение

__S^5^,S^55^:S^14^,S^38^:S^30^,S^51^__-Трицикло(L-аргинил-L-пролил-L-аспартил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-лейцил-L-глутамил-L-пролил-L-пролил-L-тирозил-L-треонилглицил-L-пролил-L-цистеинил-L-лизил-L-аланил-L-аргинил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-аргинил-L-тирозил-L-фенилаланил-L-тирозил-L-аспарагинил-L-аланил-L-лизил-L-аланилглицил-L-лейцил-L-цистеинил-L-глутаминил-L-треонил-L-фенилаланил-L-валил-L-тирозилглицилглицил-L-цистеинил-L-аргинил-L-аланил-L-лизил-L-аргинил-L-аспарагинил-L-аспарагинил-L-фенилаланил-L-лизил-L-серил-L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-цистеинил-L-метионил-L-аргинил-L-треонил-L-цистеинилглицилглицил-L-аланин). 

Содержит не менее 90,0 % и не более 110,0 % заявленной активности
апротинина C~284~H~432~N~84~O~79~S~7~ на сухое вещество.

[discrete]
===== Свойства

*Описание.* Белый или почти белый порошок.

+*+ Гигроскопичен.

*Растворимость*. Растворим в воде и натрия хлорида растворе 0,9 %,
практически нерастворим в хлороформе.

[discrete]
===== Идентификация

. _ТСХ_ (ОФС «Тонкослойная хроматография»).

[none]
* _Пластинка._ ТСХ пластинка со слоем силикагеля 60 F~254~.
* _Подвижная фаза (ПФ_). Вода—уксусная кислота ледяная, содержащая 100 г/л натрия ацетата безводного 40:50. 
* _Испытуемый раствор_. Готовят раствор, содержащий 27 000 КИЕ/мл
апротинина.
* _Раствор стандартного образца апротинина._ Фармакопейный стандартный
образец апротинина разводят водой до получения раствора с активностью
27 000 КИЕ/мл.
* _Реактив для детектирования._ Растворяют 0,1 г нингидрина в смеси 6 мл
раствора меди(II) хлорида с концентрацией 10 г/л, 21 мл уксусной кислоты
ледяной и 70 мл этанола.
* На линию старта пластинки наносят по 10 мкл испытуемого раствора и
раствора фармакопейного стандартного образца апротинина. Пластинку с
нанесёнными пробами сушат при температуре 60 °С, помещают в камеру с ПФ
и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдёт около
80–90 % длины пластинки от линии старта, её вынимают из камеры, сушат до
удаления следов растворителей, опрыскивают реактивом для детектирования
и просматривают в видимом свете.
* _Результат._ Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого
раствора по положению, величине и окраске должна соответствовать зоне
адсорбции апротинина на хроматограмме раствора стандартного образца
апротинина.

[arabic,start=3]
. Субстанция должна обладать антитрипсиновой активностью.

[none]
* _Испытуемый раствор_. Готовят раствор, содержащий 27 000 КИЕ/мл
апротинина. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл
полученного раствора и доводят объём раствора буферным раствором рН 7,2
до метки.
* _Раствор хлористоводородной кислоты 0,002 М_. Разбавляют 2,0 мл
хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М водой до 100,0 мл.
* _Раствор стандартного образца трипсина_. В мерную колбу вместимостью
100 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца трипсина,
растворяют в растворе хлористоводородной кислоты 0,002 М и доводят объём
раствора тем же растворителем до метки.
* _Растворитель_. Уксусная кислота ледяная—вода—этанол 1:49:50.
* _Раствор казеина._ В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,2 г
казеина, растворяют в буферном растворе рН 7,2 и доводят объём раствора
тем же растворителем до метки.
* Смешивают 1,0 мл испытуемого раствора с 1,0 мл раствора стандартного
образца трипсина, оставляют на 10 мин и прибавляют 1,0 мл раствора
казеина. Полученный раствор термостатируют при температуре 35 °С в
течение 30 мин, затем охлаждают в ледяной воде и прибавляют 0,5 мл
растворителя, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на
15 мин. Раствор должен мутнеть.
* Контрольный раствор готовят в тех же условиях, используя буферный
раствор рН 7,2 вместо испытуемого раствора. Контрольный раствор не
должен мутнеть.

[discrete]
===== Испытания

*Прозрачность раствора.* Раствор субстанции, содержащий 27 000 КИЕ/мл,
должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции
(мутности) жидкостей»).

*Цветность раствора.* Раствор, полученный в испытании «Прозрачность
раствора», должен выдерживать сравнение с эталоном Y~7~ (ОФС «Степень
окраски жидкостей», метод 2).

*рН раствора.* От 5,0 до 7,0 (раствор субстанции, содержащий
10 000 КИЕ/мл, ОФС «Ионометрия», метод 3).

*Оптическая плотность*. Оптическая плотность раствора субстанции,
содержащего 5400 КИЕ/мл, измеренная при длине волны 277 нм в кювете с
толщиной слоя 1 см, должна быть не более 0,80 (ОФС «Спектрофотометрия в
ультрафиолетовой и видимой областях»).

*Родственные примеси*

*_1. Дез-Ала-апротинин и дез-Ала-дез-Гли-апротинин._* Определение
проводят методом капиллярного зонного электрофореза с процедурой
нормализации (ОФС «Капиллярный электрофорез»).

_Ведущий электролит._ Растворяют 8,21 г калия дигидрофосфата в 400 мл
воды и доводят рН раствора фосфорной кислотой до 3,0. Количественно
переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 500 мл и
доводят объём раствора водой до метки.

_Испытуемый раствор._ Готовят раствор субстанции в воде, содержащий не
менее 1800 КИЕ/мл.

_Раствор стандартного образца апротинина._ Готовят раствор
фармакопейного стандартного образца апротинина в воде с концентрацией,
равной концентрации апротинина в испытуемом растворе.

*Примечание*

Примесь А: апротинин-(1-56)-пептид.

Примесь В: апротинин-(1-57)-пептид__.__

_Электрофоретические условия_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Капилляр 2+|плавленый кварц без покрытия, эффективная длина 45–60 см,
внутренний диаметр 75 мкм; |

|Температура капилляра |25 ^о^С; | |

|Прекондиционирование капилляра 2+|
1 мин натрия гидроксида раствор 0,1 М при 5 кПа, +
2 мин разделяющий буферный раствор при 5 кПа;  | 
|Детектор 2+|спектрофотометрический, 214 нм; | 

|Ввод пробы |3 с 3,5 кПа; | |

|Напряжение |0,2 кВ/см; | |

|Время анализа |30 мин. | |
|===

_Относительное время миграции соединений._ Апротинин – 1 (около 22 мин);
примесь А – около 0,98; примесь В – около 0,99.

_Идентификация примесей._ Для идентификации пиков примесей А и В
используются электрофореграмма раствора стандартного образца апротинина
и электрофореграмма, прилагаемая к фармакопейному стандартному образцу
апротинина.

_Пригодность электрофоретической системы_

На электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина:

- абсолютное время миграции апротинина должно составлять от 19 до 25
мин;

- _разрешение (R~S~)_ между пиками примесей А и В должно быть не менее
0,8;

- _разрешение (R~S~)_ между пиками примеси В и апротинина должно быть не
менее 0,5;

- распределение пиков: электрофореграмма испытуемого раствора должна
быть качественно и количественно аналогична электрофореграмме раствора
стандартного образца апротинина;

- _отношение сигнал/шум (S/N)_ для пика апротинина должно быть не менее 1000. При необходимости изменяют концентрацию испытуемого раствора для
получения пиков достаточной высоты.

На электрофореграмме испытуемого раствора основная зона по положению
должна совпадать с положением зоны апротинина на электрофореграмме
раствора стандартного образца апротинина.

_Допустимое содержание примесей:_

- примесь А – не более 8,0 %;

- примесь В – не более 7,5%.

*_2. Пироглутамил-апротинин и другие._* Определение проводят методом
ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

_Подвижная фаза А (ПФА)._ В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают
3,52 г калия дигидрофосфата и 7,26 г динатрия гидрофосфата гептагидрата,
растворяют в 500 мл воды и доводят объём раствора водой до метки.

_Подвижная фаза Б (ПФБ)._ В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают
3,52 г калия дигидрофосфата, 7,26 г динатрия гидрофосфата гептагидрата и
66,07 г аммония сульфата, растворяют в 500 мл воды и доводят объём
раствора водой до метки.

_Испытуемый раствор._ Готовят раствор субстанции в ПФА, содержащий около
9000 КИЕ/мл.

_Раствор для проверки пригодности хроматографической системы._
Содержимое флакона фармакопейного стандартного образца апротинина для
проверки пригодности хроматографической системы растворяют в 2,0 мл ПФА.

_Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы._ В
мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и
доводят объём раствора ПФА до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл
помещают 0,5 мл полученного раствора и доводят объём раствора ПФА до
метки.

*Примечание*

Примесь С ((5-оксопролил)апротинин): +
__S^6^,S^56^:S^15^,S^39^:S^31^,S^52^__-трицикло(5-оксопролил-L-аргинил-L-пролил-L-аспартил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-лейцил-L-глутамил-L-пролил-L-пролил-L-тирозил-L-треонилглицил-L-пролил-L-цистеинил-L-лизил-L-аланил-L-аргинил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-аргинил-L-тирозил-L-фенилаланил-L-тирозил-L-аспарагинил-L-аланил-L-лизил-L-аланилглицил-L-лейцил-L-цистеинил-L-глутаминил-L-треонил-L-фенилаланил-L-валил-L-тирозилглицилглицил-L-цистеинил-L-аргинил-L-аланил-L-лизил-L-аргинил-L-аспарагинил-L-аспарагинил-L-фенилаланил-L-лизил-L-серил-L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-цистеинил-L-метионил-L-аргинил-L-треонил-L-цистеинилглицилглицил-L-аланин).

_Хроматографические условия_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Колонка 2+|75 × 7,5 мм, силикагель для хроматографии, сильный катионит,
10 мкм; |

|Температура колонки |40 °С; | |

|Скорость потока |1,0 мл/мин; | |

|Детектор |спектрофотометрический, 210 нм; | |

|Объём пробы |40 мкл. | |
|===

_Режим хроматографирования_

[cols="^34%,^33%,^33%",options="header",]
|===
|Время, мин |ПФА,% |ПФБ,%
|0–21 |92 → 64 |8 → 36
|21–30 |64 → 0 |36 → 100
|30–40 |0 → 92 |100 → 8
|===

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности
хроматографической системы, раствор для проверки пригодности
хроматографической системы и испытуемый раствор.

_Относительное время удерживания соединений._ Апротинин – 1 (17–20 мин);
примесь С – около 0,9.

_Пригодность хроматографической системы_

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности
хроматографической системы _отношение сигнал/шум (S/N)_ для пика
апротинина должно быть не менее 10.

На хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической
системы:

- _разрешение (R~S~)_ между пиками примеси С и апротинина должно быть не
менее 1,5;

- _фактор асимметрии_ _пика_ (_A~S~_) апротинина должен быть не более
1,3.

_Допустимое содержание примесей._ Содержание каждой из примесей в
субстанции в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС
«Хроматография»):

- примесь С ‒ не более 1,0 %;

- любая другая примесь – не более 0,5 %;

- сумма примесей – не более 1,0 %.

Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на
хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической
системы (менее 0,1 %).

*_3. Олигомеры апротинина._* Определение проводят методом эксклюзионной
хроматографии (ОФС «Эксклюзионная хроматография»).

_Подвижная фаза (ПФ)._ Ацетонитрил—уксусная кислота—вода 200:200:600.

_Испытуемый раствор._ Готовят раствор субстанции в воде, содержащий
около 9000 КИЕ/мл.

_Раствор для проверки пригодности хроматографической системы._ В
стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой помещают 30 мг субстанции,
выдерживают в сушильном шкафу при температуре 110±5 °С в течение 4 ч,
охлаждают. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 18 мг субстанции,
растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки.

_Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы._ В
мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и
доводят объём раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл
помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора водой до
метки.

_Хроматографические условия_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Колонка 2+|три последовательно соединённые колонки для эксклюзионной
хроматографии 300 × 7,8 мм, с диапазоном разделяемых масс, подходящим
для разделения апротинина, его димера и олигомеров (например, от 2000 до
80000), 10 мкм; |

|Температура колонки |25 °С; | |

|Скорость потока |1,0 мл/мин; | |

|Детектор |спектрофотометрический, 277 нм; | |

|Объём пробы |100 мкл; | |

|Время хроматографирования |40 мин. | |
|===

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности
хроматографической системы, раствор для проверки пригодности
хроматографической системы и испытуемый раствор.

_Относительное время удерживания соединений._ Мономер апротинина – 1
(около 25 мин); димер апротинина – около 0,9.

_Идентификация примесей._ Для идентификации пика димера апротинина
используют хроматограмму раствора для проверки пригодности
хроматографической системы.

_Пригодность хроматографической системы._ На хроматограмме раствора для
проверки пригодности хроматографической системы:

- _разрешение (R~S~)_ между пиками димера и мономера апротинина должно
быть не менее 1,3;

- _фактор асимметрии_ _пика_ (_A~S~_) мономера апротинина должен быть не
более 2,5.

_Допустимое содержание примесей._ Содержание каждой из примесей в
субстанции в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС
«Хроматография»):

- сумма примесей – не более 1,0 %.

Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на
хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической
системы (менее 0,1 %).

*Потеря в массе при высушивании.* Не более 6,0 % (ОФС «Потеря в массе
при высушивании», способ 2). Для определения 0,1 г (точная навеска)
субстанции сушат до постоянной массы не менее 24 ч.

*Сульфатная зола.* Не более 3,0 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для
определения используют 0,2 г (точная навеска) субстанции.

*Аномальная токсичность*. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС
«Аномальная токсичность»). Тест-доза – 3600 КИЕ апротинина в 0,5 мл воды
для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения – 48 ч.

*Бактериальные эндотоксины.* Не более 0,877 ЕЭ на 1000 КИЕ апротинина (ОФС
«Бактериальные эндотоксины»).

*Гистамин.* Не более 0,2 мкг гистамина-основания на 5400 КИЕ апротинина
(ОФС «Испытание на гистамин»).

*Микробиологическая чистота*. В соответствии с ОФС «Микробиологическая
чистота».

[discrete]
===== Количественное определение

Определение проводят методом титриметрии (ОФС «Титриметрия
(титриметрические методы анализа)»).

Активность апротинина определяют путём измерения ингибирующего действия
на раствор трипсина с известной активностью. Ингибирующую активность
апротинина рассчитывают как разность между начальным и остаточным
значениями активности трипсина.

1800 единиц ингибитора протеаз (ЕИП) ингибирует 50 % ферментной
активности 2 микрокаталей трипсина.

Все растворы используют свежеприготовленными.

_Испытуемый раствор_. Готовят раствор субстанции в 0,0015 М боратном
буферном растворе (рН 8,0), содержащий около 3000 КИЕ/мл.

_Раствор стандартного образца трипсина._ Готовят раствор фармакопейного
стандартного образца трипсина с концентрацией 0,8 микрокаталей/мл в
0,001 М растворе хлористоводородной кислоты. Раствор готовят
непосредственно перед использованием и хранят на ледяной бане.

_Раствор стандартного образца трипсина разбавленный._ Разбавляют 0,5 мл
раствора стандартного образца трипсина до 10,0 мл 0,0015 М боратным
буферным раствором рН 8,0. Полученный раствор выдерживают при
температуре 20–25 °С в течение 10 мин, затем помещают на ледяную баню.

_Раствор бензоиларгинина этилового эфира гидрохролида 0,69 %._ В мерную
колбу вместимостью 50 мл помещают 0,345 г (точная навеска)
бензоиларгинина этилового эфира гидрохролида, растворяют в воде и
доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

_Раствор трипсина и апротинина._ К 4,0 мл раствора стандартного образца
трипсина прибавляют 1,0 мл испытуемого раствора, немедленно разбавляют
до 40,0 мл 0,0015 М боратным буферным раствором рН 8,0. Полученный
раствор выдерживают при температуре (20±5) °С в течение
10 мин, затем помещают на ледяную баню. Раствор используют в течение 6 ч
после приготовления.

В ходе проведения испытания в реакторе обеспечивают постоянную атмосферу
азота, непрерывное перемешивание и постоянную температуру
(25±0,1) °С.

В реактор помещают 9,0 мл 0,0015 М боратного буферного раствора рН 8,0 с
температурой 25±0,1 °С, прибавляют 1,0 мл раствора бензоиларгинина
этилового эфира гидрохролида 0,69 %, доводят рН раствора 0,1 М раствором
натрия гидроксида до 8,0. После того как температура достигнет
равновесия при 25±0,1 °С, прибавляют 1,0 мл раствора трипсина и
апротинина. Прибавляют 0,1 М раствор натрия гидроксида, поддерживая
рН 8,0 и регистрируя расход титранта каждые 30 с. Испытания проводят в
течение 6 мин. Определяют ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия
гидроксида в мл (n~1~, мл).

В тех же условиях титруют 1,0 мл раствора стандартного образца трипсина
разбавленного, определяя ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия
гидроксида в мл (n~2~, мл).

Активность субстанции в калликреиновых единицах (КИЕ) на мг (_Х_)
вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.3.0006_2.png[]
|===

где	_n~1~_	–	ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование раствора трипсина и апротинина, мл; +
	_n~2~_	–	ежесекундный расход 0,1 М раствор натрия гидроксида, израсходованного на титрование раствора стандартного образца трипсина разбавленного, мл.


[discrete]
===== Хранение

В герметично укупоренной упаковке, в защищённом от света месте.

+*+ Приводится для информации.


[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


