[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===

 

==== ФС.2.1.0470 Метотрексат (Methotrexatum)


*Взамен ФС 42-1592-88*

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.1.0470_1.png[]
|===

[discrete]
===== Определение

(2__S__)-2-(4-{[(2,4-Диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)пентандиовая
кислота.

Cодержит не менее 97,0 % и не более 102,0 % метотрексата
C~20~H~22~N~8~O~5~ в пересчёте на безводное и свободное от остаточных
растворителей вещество.

[discrete]
===== Свойства

 
*Описание*. Жёлтый или оранжевый кристаллический порошок.

+*+ Гигроскопичен.
 

*Растворимость*. Практически нерастворим в воде, спирте 96 %,
метиленхлориде.

*Растворяется в разбавленных растворах минеральных кислот, щелочей и
карбонатах.

[discrete]
===== Идентификация

. _ИК-спектрометрия_ (ОФС «Спектрометрия в средней инфракрасной
области»). Инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия
бромидом, в области от 4000 до 400 см^–1^ по положению полос поглощения
должен соответствовать спектру фармакопейного стандартного образца
метотрексата.

. _ВЭЖХ_. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого
раствора должно соответствовать времени удерживания пика метотрексата на
хроматограмме раствора стандартного образца метотрексата (раздел
«Количественное определение»).

[discrete]
===== Испытания

*Удельное вращение*. От +19 до +24 в пересчёте на безводное вещество
(1 % раствор субстанции в натрия карбоната растворе 0,05 М,
ОФС «Оптическое вращение»).

*Прозрачность раствора*. Раствор 50 мг субстанции в 10 мл натрия
карбоната растворе 0,05 М должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и
степень опалесценции (мутности) жидкостей»).

*Родственные примеси*. Определение проводят методом ВЭЖХ
(ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

*_1. Энантиомерная чистота_*

_Буферный раствор._ Смешивают 600 мл натрия дигидрофосфата раствора
0,05 М с 500 мл динатрия гидрофосфата раствора 0,05 М и доводят значение
pH раствора натрия гидроксида раствором 8,5 % до 6,9.

_Подвижная фаза (ПФ)_. Пропанол—буферный раствор 80:920.

_Испытуемый раствор_. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 20 мг
субстанции, растворяют в ПФ и доводят объём раствора тем же
растворителем до метки.

_Раствор сравнения_. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл
испытуемого раствора и доводят объём раствора ПФ до метки.

_Раствор для проверки разделительной способности хроматографической
системы_. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 4 мг фармакопейного
стандартного образца метотрексата, для проверки пригодности
хроматографической системы, содержащего примесь F, растворяют в ПФ и
доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

*Примечание*

Примесь F:
(2__R__)-2-(4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)пентандиовая
кислота [51865-79-3].

_Хроматографические условия_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Колонка 2+|150 × 3,9 мм, силикагель модифицированный альбумином для
хиральной хроматографии, 7 мкм, размер пор 30 нм; |
|Температура колонки |25 °С; | |

|Скорость потока |1,5 мл/мин; | |

|Детектор |спектрофотометрический, 302 нм; | |

|Объём пробы |20 мкл; | |

|Время хроматографирования 2+|3-кратное от времени удерживания пика
метотрексата. |
|===

Хроматографируют раствор для проверки разделительной способности
хроматографической системы, раствор сравнения и испытуемый раствор.

_Относительное время удерживания соединений_. Метотрексат – 1 (около
7,5 мин); примесь F – около 2,3.

_Идентификация примесей._ Для идентификации пика примеси F используют
относительное время удерживания соединения и хроматограмму раствора для
проверки разделительной способности хроматографической системы.

_Пригодность хроматографической системы_. На хроматограмме раствора для
проверки разделительной способности хроматографической системы
_разрешение (R~S~)_ между пиками метотрексата и примеси F должно быть не
менее 2,0. Для достижения требуемого разрешения содержание пропанола в
ПФ может быть уменьшено на 6–8 %.

_Допустимое содержание примеси_. На хроматограмме испытуемого раствора:

- площадь пика примеси F не должна более чем в 3 раза превышать площадь
основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 3,0 %).

*_2. Другие примеси_*

_Буферный раствор_. Растворяют 3,4 г натрия дигидрофосфата в 900 мл воды
и доводят значение рН раствора натрия гидроксида раствором 1 М до 6,0,
количественно переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью
1000 мл и доводят объём раствора водой до метки.

_Подвижная фаза А (ПФА)_. Ацетонитрил—буферный раствор 50:950.

_Подвижная фаза Б (ПФБ)_. Ацетонитрил—буферный раствор 500:500.

_Испытуемый раствор_. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 40 мг
(точная навеска) субстанции, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака раствора
10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки.

_Раствор сравнения А_. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают
5,0 мл испытуемого раствора и доводят объём раствора ПФА до метки. В
мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5,0 мл полученного раствора и
доводят объём раствора ПФА до метки.

_Раствор сравнения Б_. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5,0 мл
раствора сравнения А и доводят объём раствора ПФА до метки.

_Раствор для проверки разделительной способности хроматографической
системы_. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 5 мг субстанции,
5 мг примеси B, 5 мг фармакопейного стандартного образца примеси C, 5 мг
фармакопейного стандартного образца примеси D и 5 мг фармакопейного
стандартного образца примеси E, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака
раствора 10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки.

_Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы_. В
мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 3,0 мл раствора сравнения Б и
доводят объём раствора ПФА до метки.

_Раствор для идентификации_. Растворяют 8 мг фармакопейного стандартного
образца метотрексата для идентификации пиков, содержащего примеси H и I,
в смеси 0,1 мл аммиака раствора 10 % и 1 мл ПФА, и доводят объём
раствора ПФА до метки.

*Примечание*

Примесь В: +
(2__S__)-2-(4-{[(2,4-Диаминоптеридин-6-ил)метил]амино}бензамидо)пентандиовая
кислота [54-62-6].

Примесь C: +
(2__S__)-2-(4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)пентандиовая
кислота [2410-93-7].

Примесь D: +
4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензойная
кислота [5623-18-7].

Примесь E: +
4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензойная
кислота [19741-14-1].

Примесь H: +
(2__S__)-2-(4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)-5-метокси-5-оксопентановая
кислота [67022-39-3].

Примесь I: +
(4__S__)-4-(4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)-5-метокси-5-оксопентановая
кислота [66147-29-3].

_Хроматографические условия_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Колонка 2+|250 × 4,0 мм, силикагель октадецилсилильный, эндкепированный
для хроматографии, 5 мкм; |
|Температура колонки |25 °С; | |

|Скорость потока |1,5 мл/мин; | |

|Детектор |спектрофотометрический, 280 нм; | |

|Объём пробы |20 мкл. | |
|===

_Режим хроматографирования_

[cols="^34%,^33%,^33%",options="header",]
|===
|Время, мин |ПФА,% |ПФБ,%
|0–10 |100 |0
|10–20 |100 → 95 |0 → 5
|20–28 |95 → 50 |5 → 50
|28–37 |50 |50
|===

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности
хроматографической системы, раствор для проверки разделительной
способности хроматографической системы, раствор для идентификации,
раствор сравнения Б, раствор сравнения А и испытуемый раствор.

_Относительное время удерживания соединений_. Метотрексат – 1 (около
18 мин); примесь B – около 0,3; примесь C – около 0,4; примесь D – около
0,9; примесь E – около 1,4; примесь I – около 1,5; примесь H – около
1,6.

_Идентификация примесей._ Для идентификации пиков примесей В, С, D и Е
используют относительное время удерживания соединений и хроматограмму
раствор для проверки разделительной способности хроматографической
системы. Для идентификации пиков примесей I и H используют относительное
время удерживания соединений и хроматограмму раствор для идентификации.

_Пригодность хроматографической системы._ На хроматограмме раствора для
проверки чувствительности хроматографической системы _отношение
сигнал/шум (S/N)_ для пика метотрексата должно быть не менее 10.

На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности
хроматографической системы:

- _разрешение (R~S~)_ между пиками примесей B и C должно быть не менее
2,0;

- _разрешение (R~S~)_ между пиками примеси D и метотрексата должно быть
не менее 1,5.

На хроматограмме раствора для идентификации _разрешение (R~S~)_ между
пиками примесей I и H должно быть не менее 1,5.

Если разрешение между пиками примеси D и метотрексата менее требуемого,
следует увеличить скорость потока.

_Поправочные коэффициенты_. Для расчёта содержания площади пиков
следующих примесей умножают на соответствующие поправочные коэффициенты:
примесь E – 0,8; примесь I – 1,4.

_Допустимое содержание примесей_. На хроматограмме испытуемого раствора:

- площадь пика примеси C не должна превышать площадь основного пика на
хроматограмме раствора сравнения А (не более 0,5 %);

- площадь пика каждой из примесей B и E не должна превышать 0,6 площади
основного пика на хроматограмме раствора сравнения А (не более 0,3 %);

- площадь пика каждой из примесей H и I не должна превышать более чем в
2 раза площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения Б (не
более 0,2 %);

- площадь пика любой другой примеси не должна превышать 0,5 площади
основного пика на хроматограмме раствора сравнения Б (не более 0,05 %);

- сумма площадей пиков всех примесей, за исключением примесей B, C и E,
не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора
сравнения А (не более 0,5 %).

Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на
хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической
системы (менее 0,03 %).

*Вода*. Не более 13,0 % (ОФС «Определение воды», метод 1). Для
определения используют 0,1 г (точная навеска) субстанции.

*Сульфатная зола*. Не более 0,1 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для
определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

*Тяжёлые металлы*. Не более 0,001 %_._ Определение проводят в
соответствии с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 3Б) в зольном остатке,
полученном после сжигания 1,0 г субстанции, с использованием эталонного
раствора 1.

*Остаточные органические растворители.* В соответствии с ОФС «Остаточные
органические растворители».

*Бактериальные эндотоксины.* Не более 0,2 ЕЭ на 1 мг метотрексата (ОФС
«Бактериальные эндотоксины»). Для проведения испытания готовят исходный
раствор субстанции с концентрацией метотрексата 10 мг/мл в натрия
гидроксида раствора 0,1 М.

*Микробиологическая чистота*. В соответствии с ОФС «Микробиологическая
чистота».

[discrete]
===== Количественное определение

Определение проводят методом ВЭЖХ в условиях испытания «Родственные
примеси. Другие примеси» со следующими изменениями.

_Испытуемый раствор_. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 25 мг
(точная навеска) субстанции, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака раствора
10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки. В мерную
колбу вместимостью 50 мл помещают 5,0 мл полученного раствора и доводят
объём раствора ПФА до метки.

_Раствор стандартного образца_ _метотрексата_. В мерную колбу
вместимостью 50 мл помещают 25 мг (точная навеска) фармакопейного
стандартного образца метотрексата, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака
раствора 10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки. В
мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5,0 мл полученного раствора и
доводят объём раствора ПФА до метки.

Хроматографируют раствор стандартного образца метотрексата и испытуемый
раствор.

_Пригодность хроматографической системы_. На хроматограмме раствора
стандартного образца метотрексата _фактор асимметрии_ _пика_ (_A~S~_)
метотрексата должен быть не более 1,5;

Содержание метотрексата C~20~H~22~N~8~O~5~ в субстанции в пересчёте на
сухое вещество в процентах (_X_) вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.1.0470_2.png[]
|===

где	_S~1~_	–	площадь пика метотрексата на хроматограмме испытуемого раствора; +
	_S~0~_	–	площадь пика метотрексата на хроматограмме раствора стандартного образца метотрексата; +
	_а~1~_	–	навеска субстанции, мг; +
	_а~0~_	–	навеска фармакопейного стандартного образца метотрексата, мг; +
	_W_	–	суммарное содержание воды и остаточных органических растворителей в субстанции,%; +
	_P_	–	содержание метотрексата в фармакопейного стандартном образце метотрексата,%.


[discrete]
===== Хранение

В плотно закрытой упаковке в защищённом от света месте.

+*+ Приводится для информации.


[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


