[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===

===== ОФС.1.5.3.0018 Стерины в маслах жирных растительных и жирах

*Вводится впервые*

 
Метод определения стеринов в маслах жирных растительных и жирах основаны
на использовании газовой хроматографии (ОФС «Газовая хроматография»),
после получения неомыляемых веществ.

====== Методика 1

Получают неомыляемые вещества масла жирного растительного или твёрдого
жира и отделяют стериновую фракцию методом тонкослойной хроматографии
(ОФС «Тонкослойная хроматография»), используя пластинки, покрытые слоем
силикагеля толщиной от 0,2 мм до 0,5 мм.

_Испытуемый раствор А_. В колбу вместимостью 150 мл, помещают раствор
0,2 % бетулина в метиленхлориде в таком объёме, чтобы количество
бетулина соответствовало 10 % содержания стеринов в испытуемом образце,
(например, оливы европейской плодов свежих масла жирного прибавляют
500 мкл, в случае других масел жирных растительных 1500 мкл раствора
бетулина). Выпаривают в токе азота до сухого остатка.

Если в фармакопейной статье определяется только содержание
индивидуальных стеринов в процентах к стериновой фракции, раствор
бетулина можно не прибавлять.

В колбу помещают 5 г (точная навеска) испытуемого образца, прибавляют
50 мл калия гидроксида раствора спиртового 2 М и кипятят с обратным
холодильником на водяной бане в течение 1 ч, при частом
перемешивании. Охлаждают до температуры ниже 25 °С и количественно
переносят в делительную воронку с помощью 100 мл воды. В делительную
воронку прибавляют 100 мл эфира и осторожно встряхивают. Эфирные
извлечения сливают и операцию повторяют ещё 2 раза порциями по 100 мл.
Объединённые эфирные извлечения переносят в делительную воронку,
прибавляют 40 мл воды, осторожно встряхивают в течение 3-5 минут,
оставляют до полного расслоения и отбрасывают водный слой. Эфирный слой
встряхивают с несколькими порциями воды, по 40 мл каждая, до тех пор,
пока водный слой не перестанет давать щелочную реакцию по фенолфталеину.
Эфирный слой количественно переносят в доведённую до постоянной массы
колбу.

Эфир отгоняют досуха, к сухому остатку прибавляют 6 мл ацетона. В токе
азота аккуратно удаляют ацетон. Остаток в колбе сушат до постоянной
массы при температуре 100 – 105 °С, охлаждают в эксикаторе и взвешивают.
Сухой остаток растворяют в минимальном объёме метиленхлорида. Упаривают
содержимое в токе азота до объёма 1 мл. В зависимости от неомыляемого
содержимого испытуемого образца, обеспечивают конечную концентрацию
раствора 2,5–5 %.

_Испытуемый раствор Б._ В колбу вместимостью 150 мл помещают 5 г (точная
навеска) рапса семян масла жирного и далее поступают так, как указано в
методике приготовления испытуемого раствора А, начиная со слов
«…прибавляют 50 мл калия гидроксида раствора спиртового 2 М….».

_Испытуемый раствор В._ В колбу вместимостью 150 мл помещают 5 г (точная
навеска) подсолнечника однолетнего семян масла жирного и далее поступают
так, как указано в методике приготовления испытуемого раствора А,
начиная со слов «…прибавляют 50 мл калия гидроксида раствора спиртового
2 М….».

_Раствор сравнения._ Растворяют 25 мг холестерина и 10 мг бетулина в
1,0 мл метиленхлорида.

На пластинки (для каждого испытуемого раствора используют отдельную
пластинку): в виде полосы длиной 10 мм – наносят 10 мкл раствора
сравнения, в виде полосы длиной 150 мм – 0,5 мл испытуемого раствора А,
Б или В, соответственно. Пластинки с нанесёнными пробами сушат при
комнатной температуре, помещают в камеру со смесью растворителей гексан
– эфир (65:35) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт
растворителей пройдёт около 80 - 90 % длины пластинки от линии старта,
её вынимают из камеры, сушат в токе азота, обрабатывают
дихлорфлуоресцеина раствором 0,2 % в этаноле и просматривают в УФ-свете
при длине волны 254 нм.

_Пригодность хроматографической системы._ На хроматограмме раствора
сравнения должны обнаруживаться две зоны адсорбции: зона адсорбции
холестерина и под ней зона адсорбции бетулина.

_Результат._ На хроматограммах испытуемых растворов А, Б, В должны
обнаруживаться зоны адсорбции с близкими значениями R~f~ зон адсорбции
соответствующим стеринам.

С хроматограммы каждого испытуемого раствора снимают силикагель зоны
адсорбции стеринов, а также дополнительно зоны на 2 – 3 мм выше и ниже
видимых зон адсорбции на хроматограмме раствора сравнения и помещают
раздельно в три колбы вместимостью 50 мл каждая.

В каждую колбу прибавляют по 15 мл метиленхлорида и нагревают с обратным
холодильником в течение 15 мин, постоянно перемешивая. Растворы
фильтруют через стеклянный фильтр или соответствующую фильтровальную
бумагу и промывают фильтры тремя порциями метиленхлорида по 15 мл
каждая. Каждый из трёх объединённых фильтратов со смывами помещают в
колбу, упаривают в токе азота до объёма 5 - 10 мл. Растворы переносят в
небольшие пробирки и выпаривают в токе азота досуха.

_Испытуемый раствор._ К сухому остатку, полученному из испытуемого
образца методом тонкослойной хроматографии, прибавляют
свежеприготовленную смесь из 0,04 мл хлортриметилсилана, 0,1 мл
гексаметилдисилазана и 0,5 мл пиридина безводного. Смесь отстаивают в
течение 5 мин и используют жидкую фазу.

_Раствор сравнения А._ К 9 частям стеринов, выделенных из рапса семян
масла жирного методом тонкослойной хроматографии, прибавляют 1 часть
холестерина. К полученной смеси прибавляют свежеприготовленную смесь из
0,04 мл хлортриметилсилана, 0,1 мл гексаметилдисалазана и 0,5 мл
пиридина безводного, отстаивают в течение 5 мин и используют
надосадочную жидкость.

_Раствор сравнения Б._ К стеринам, выделенным из подсолнечника
однолетнего семян масла жирного методом тонкослойной хроматографии,
прибавляют свежеприготовленную смесь из 0,04 мл хлортриметилсилана,
0,1 мл гексаметилдисалазана и 0,5 мл пиридина безводного. Смесь
отстаивают в течение 5 мин и используют надосадочную жидкость.

Все растворы используются свежеприготовленные.

_Условия хроматографирования_

[cols="32%,42%,26%"]
|===
|Колонка |Кварцевая капиллярная +
20-30 м × 0,25 - 0,32 мм, поли[метил(95)фенил(5)]силоксан или
поли(цианопропил)(7)(фенил)(7)метил(8)силоксан, 0,25 мкм |
|Детектор |пламенно-ионизационный |

|Газ-носитель |Гелий, водород для хроматографии |

|Деление потока |1:50 или 1:100 |

|Скорость потока, см/с |30-50 см/с (водород) или 20 – 35 см/с (гелий)
|

|Объём пробы, мкл |1 |

.3+.^|Температура |Колонка |260 °С
|Инжектор |280 °С
|Детектор |290 °С
|===

_Идентификация примесей._ Для идентификации пиков примесей холестерина,
брассикастерина, кампестерина и β-ситостерина используют хроматограмму
раствора сравнения А. Для идентификации пиков примесей
кампестерина, стигмастерина, β-ситостерина и ∆7-сигмастенола
(∆7-стигмастерина) используют хроматограмму раствора сравнения Б.

Относительные времена удерживания стеринов (по отношению к
β-ситостерину) приведены в <<tab_ofs_1.5.3.0018_1,табл. 1.>>

[[tab_ofs_1.5.3.0018_1]]
[caption="Таблица 1. "]
.Относительные времена удерживания стеринов (по отношению к β-ситостерину) для двух различных колонок
[cols="^34%,^32%,^34%",options="header",]
|===
|*Смесь веществ* |*Поли(цианопропил)(7) (фенил)(7)(метил)(86) силоксан*
|*Поли [метил(95)-фенил(5)] силоксан*
|Холестерин |0,64 |0,63

|Брассикастерин |0,70 |0,71

|24-метиленхолестерин |0,79 |0,80

|Кампестерин |0,82 |0,81

|Кампестанол |0,83 |0,82

|Стигмастерин |0,87 |0,87

|∆7-Кампестерин |0,93 |0,92

|∆5,23-Стигмастадиенол |0,95 |0,95

|Клеростерин |0,96 |0,96

|β-Ситостерин |1 |1

|Ситостанол |1,01 |1,02

|∆5-Авенастерин |1,03 |1,03

|∆5,24-Стигмастадиенол |1,09 |1,08

a|
∆7-Стигмастенол

(∆7-стигмастерин)

|1,13 |1,12

|∆7-Авенастерин |1,18 |1,16

|*Бетулин |1,4 |1,4
|===

+*+ Пик внутреннего стандарта (бетулин) должен быть чётко отделён от пиков
определяемых стеринов; площадь пика внутреннего стандарта при расчётах
не учитывают.

Содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого образца в
процентах (Х) вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.5.3.0018_1.png[]
|===

где	_S~1~_ 	–	площадь пика, соответствующего определяемому стерину; +
	_ΣS_	–	сумма площадей всех пиков, соответствующих компонентам, указанным в <<tab_ofs_1.5.3.0018_1,таблице 1>>; не учитывают пик бетулина.


Содержание каждого стерина в мг на 100 г испытуемого образца (Х)
вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.5.3.0018_2.png[]
|===

где	_S~1~_ 	–	площадь пика, соответствующего определяемому стерину; +
	_S~0~_ 	–	площадь пика внутреннего стандарта бетулина; +
	_a~0~_	–	навеска внутреннего стандарта бетулина, мг; +
	_a_	–	навеска испытуемого образца, мг.


====== Методика 2

Неомыляемые вещества получают в соответствии с ОФС «Масла жирные
растительные». Одновременно, в таких же условиях, получают и неомыляемые
вещества из подсолнечника однолетнего семян масла жирного
и отделяют стериновую фракцию методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии.

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная
хроматография»).

_Испытуемый раствор._ В пробирку вместимостью 15 мл с помощью трех
порций (каждое по 4 мл) растворителя, использованного при получении
неомыляемых веществ (обычно: эфир или петролейный эфир) переносят
неомыляемые вещества. Выпаривают в токе азота досуха. Сухой остаток
растворяют в достаточном объёме подвижной фазы для получения раствора с
концентрацией около 4 %. Для улучшения растворимости добавляют несколько
капель 2-пропанола и фильтруют через мембранный фильтр (размер пор
0,45 мкм).

_Раствор сравнения._ Готовят, как описано для испытуемого раствора с
использованием неомыляемых веществ, полученных из подсолнечника
однолетнего семян масла жирного.

_Условия хроматографирования_

[cols="20%,80%",]
|===

|Предколонка |5 мм × 4,6 мм, силикагель для хроматографии, 5 мкм, размер пор 6 нм

|Колонка |
250 мм × 4,6 мм, силикагель для хроматографии, 5 мкм, размер пор 6 нм

|Подвижная фаза |гексан - 2-пропанол (1:99)
|Скорость потока, мл/мин |1
|Температура колонки, °С |25
|Детектор |спектрофотометрический
|Длина волны, нм |210
|Объем пробы, мкл |50
|===

_Идентификация стеринов._ Стериновая фракция элюируется в конце
хроматограммы. Устанавливают расположение собираемой фракции по
хроматограмме раствора сравнения, на которой наблюдается два основных
пика, элюирующихся между 23-й и 32-й минутами. Собирают фракцию на
выходе из детектора в пробирку вместимостью 15 мл с завинчивающейся
крышкой и выпаривают растворитель в потоке азота.

Определение проводят методом ГХ (ОФС «Газовая хроматография»).

_Испытуемый раствор._ Остаток стериновой фракции, полученный методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше для
испытуемого раствора, растворяют в 0,2 мл пиридина безводного и 0,2 мл
смеси N,О‑бис(Триметилсилил) трифторацетамид – хлортриметилсилан (99:1).
Плотно закрывают пробирку и нагревают при 80 °С в течение 20 мин,
выдерживают до охлаждения и используют жидкую фазу.

_Раствор сравнения._ Остаток стериновой фракции, полученный методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше для
раствора сравнения, растворяют в 0,2 мл пиридина безводного и 0,2 мл
смеси N,О‑бис(Триметилсилил) трифторацетамид - хлортриметилсилан (99:1).
Плотно закрывают пробирку и нагревают при 80 °С в течение 20 мин,
выдерживают до охлаждения и используют надосадочную жидкость.

_Условия хроматографирования_

[cols="44%,17%,^17%,^22%"]
|===

|Колонка |Кварцевая капиллярная +
30 м × 0,25 мм, поли[метил(95)фенил(5)]силоксан, 0,25 мкм | |
|Детектор |пламенно-ионизационный | |
|Газ-носитель |Гелий для хроматографии | |
|Деление потока ^|1:25 | |
|Скорость потока, мл/мин ^|2,6 | |
|Объём пробы, мкл ^|1-3 | |
.6+.^|Температура .4+.^|Колонка |Время (мин) |Температура ºС
^|0–38 ^|260
^|38–44 ^|260 → 290
^|44–49 ^|290
|Инжектор | ^|290 °С
|Детектор | ^|290 °С 
|===

_Идентификация примесей._ Для идентификации пиков примесей кампестерина,
стигмастерина, β-ситостерина и ∆7-сигмастенола используют хроматограмму
раствора сравнения. Идентифицируют пики стеринов на хроматограмме
испытуемого раствора с использованием хроматограммы раствора сравнения и
относительных времён удерживания компонентов по отношению к
β‑ситостерину (основной пик), приведённых в таблице 1.

_Пригодность хроматографической системы_. На хроматограмме раствора
сравнения _разрешение_ (_R~S~_) между пиками кампестерина и
стигмастерина должно быть не менее 4,0.

Содержание каждого определяемого стерина в стериновой фракции
испытуемого образца в процентах (Х) вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.5.3.0018_3.png[]
|===


где	_S~1~_ 	–	площадь пика, соответствующего определяемому стерину; +
	_ΣS_	–	сумма площадей всех пиков (за исключением бетулина), соответствующих компонентам, указанным в <<tab_ofs_1.5.3.0018_1,таблице 1.>>


[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


