[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===



===== ОФС.1.2.1.2.0011 Гидрофобная хроматография

*Вводится впервые*

 
Гидрофобная хроматография является разновидностью метода жидкостной
колоночной обращённо-фазовой хроматографии по механизму разделения. В
гидрофобной хроматографии удерживание разделяемых веществ обусловлено
гидрофобным взаимодействием их молекул с относительно неполярной
неподвижной фазой, а для изменения элюирующей силы подвижной фазы
используют, в первую очередь, изменение ионной силы (концентрации соли в
подвижной фазе).

Гидрофобная хроматография – жидкостная хроматография на неполярных
сорбентах, в которой в качестве подвижной фазы используют водные или
водно-органические буферные растворы и разделение смеси веществ
происходит в результате различия в их взаимодействии с гидрофобными
группами сорбента в условиях убывающего градиента солей в элюенте с
высокой разрешающей способностью. Гидрофобная хроматография  сохраняет
биологическую активность белков благодаря более слабому взаимодействию,
чем другие хроматографические методы.

Основное назначение гидрофобной хроматографии – разделение и очистка
биополимеров (прежде всего, белков).

====== Область применения

Гидрофобная хроматография – один из эффективных методов разделения
сложных смесей белков, основанный на различиях в гидрофобности их
молекул и широко применяемый как в аналитической химии, так и в
химической технологии. Метод применяют как для качественного, так и для
количественного анализа лекарственных средств в испытаниях
«Подлинность», «Родственные примеси» и «Количественное определение».

Различные модификации метода широко используют для очистки и разделения
пептидов (таких как окситоцин, липрессин, пептидный гормон роста –
соматотропин), антибиотиков, лейкоцитарного интерферона,
высокомолекулярных белков (химотрипсиногена, ферритина и др.),
моноклональных антител и др.

====== Основы метода

Разделение белковых молекул основано на различиях в их поверхностной
гидрофобности, обусловленной отличиями в первичной структуре молекул
белков (наличие гидрофобных функциональных групп в молекулах исходных
аминокислот) и третичной структурой этих молекул в водном растворе:
гидрофобные участки белковых молекул (например, фенилаланин, тирозин и
триптофан) обратимо взаимодействуют с гидрофобными функциональными
группами неподвижной фазы (фенил, октил, бутил и др.). Эти
взаимодействия, немаловажную роль в которых играет гидратация молекул
белка и функциональных групп неподвижной фазы в водном растворе,
усиливаются прямо пропорционально увеличению ионной силы подвижной фазы
при постоянных температуре и pH среды. После связывания разделяемых
белков с неподвижной фазой состав подвижной фазы изменяют таким образом,
что ионная сила подвижной фазы уменьшается (плавно или ступенчато), а
разделяемые белки поочерёдно элюируются с колонки в порядке увеличения
их гидрофобности (<<im_ofs_1.2.1.2.0011_1,рис. 1>>). Для детектирования белков, как правило,
используют спектрофотометрический детектор (λ = 214 или 280 нм).

[[im_ofs_1.2.1.2.0011_1]]
[caption="Рисунок 1. "]
.Типичная хроматограмма разделения смеси белков методом гидрофобной хроматографии
image::im_ofs_1.2.1.2.0011_1.png[]


Свойства разделяемых белков и функциональных групп неподвижной фазы, а
также состав подвижной фазы (выбор соли, обеспечивающей ионную силу
подвижной фазы, и её концентрации) являются основными параметрами,
влияющими на конечные характеристики хроматографического разделения
белков методом гидрофобной хроматографии (селективность и разрешающая
способность, эффективность, экспрессность и др.).

====== Оборудование

Для проведения гидрофобной хроматографии используют оборудование,
применяемое в методе высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Основные компоненты хроматографической системы совпадают с набором узлов
для любой жидкостной колоночной хроматографии (узел подготовки подвижной
фазы, насосная система, система ввода пробы, хроматографическая колонка,
система детектирования, система сбора и обработки данных и др.).

====== Неподвижная фаза

Неподвижная фаза в гидрофобной хроматографии, как правило, представляет
собой полимерную матрицу (полиметилакрилат или агароза с различной
степенью сшивки, стирол-дивинилбензол и др.) в виде пористых или
непористых сферических частиц со средним диаметром 10^1^–10^2^ мкм,
поверхность которых модифицирована относительно гидрофобными
функциональными группами (<<tab_ofs_1.2.1.2.0011_1,табл. 1>>).

[[tab_ofs_1.2.1.2.0011_1]]
[caption="Таблица 1. "]
.Функциональные группы, используемые в неподвижных фазах для гидрофобной хроматографии

[cols="^23%,^24%,^27%,^26%",options="header",]
|===
|*Функциональная группа* |*Структурная формула* |*Функциональная группа*
|*Структурная формула*
|Фенил a|image:im_ofs_1.2.1.2.0011_2.png[] |Октил
|-O-(CH~2~)~7~-CH~3~

|Бутил-S |-S-(CH~2~)~3~-CH~3~
|Пропиленгликоль |-O-CH~2~-CHOH-CH~2~-OH

|Бутил |-O-(CH~2~)~3~-CH~3~ |Изопропил
|-O-CH-(CH~3~)~2~
|===

Неподвижные фазы, обладающие сравнительно более высокой гидрофобностью,
как правило, показывают большую ёмкость по отношению к белку при низких
концентрациях соли в подвижной фазе.

====== Состав подвижной фазы и её pH

При использовании гидрофобной хроматографии следует учитывать
способность определённых ионов в растворе влиять на гидрофобные
взаимодействия белков. Способность ионов элюировать или осаждать белки
показана в ряду Гофмейстера (<<im_ofs_1.2.1.2.0011_3,рис. 2>>).

[[im_ofs_1.2.1.2.0011_3]]
[caption="Рисунок 2. "]
.Ряд Гофмейстера
image::im_ofs_1.2.1.2.0011_3.png[]



Небольшие ионы (например, хлориды, сульфаты), несущие большой заряд,
являются сильными "соосадителями" (антихаотропными агентами), тогда как
органические кислоты и основания, некоторые другие соединения повышают
растворимость и стабилизируют белки в растворе (хаотропные агенты). В
качестве хаотропных агентов обычно используют бутанол, 2-пропанол,
этанол, гуанидина гидрохлорид, лития перхлорат и ацетат, магния хлорид,
натрия тиоцианат, натрия лаурилсульфат, мочевину и тиомочевину.
Хаотропные агенты способствуют разрушению структурированной системы
водородных связей между молекулами воды, изменению гидратации
макромолекул белков в растворе и ослаблению гидрофобных взаимодействий.
Антихаотропные агенты, напротив, способствуют образованию упорядоченной
системы водородных связей и усиливают гидрофобные взаимодействия.

Необходимо отметить, что соли кальция и магния являются менее
выраженными «соосадителями», чем это следует из ряда Гофмейстера, за
счёт специфического связывания с сайтами на поверхности белка.

Сульфаты натрия, калия и аммония являются сильными осаждающими агентами
и оказывают стабилизирующее действие на белки. Именно поэтому эти соли,
а также натрия хлорид, калия хлорид и аммония ацетат, наиболее часто
используются в гидрофобной хроматографии (<<im_ofs_1.2.1.2.0011_4,рис. 3>>). С целью достижения
требуемых характеристик разделения для приготовления подвижной фазы
могут также использоваться бинарные смеси солей.

[[im_ofs_1.2.1.2.0011_4]]
[caption="Рисунок 3. "]
.Сравнительная выраженность антихаотропного эффекта различных солей
image::im_ofs_1.2.1.2.0011_4.png[]



Увеличение концентрации соли в подвижной фазе приводит к увеличению
ионной силы и гидрофобных взаимодействий. Исходная концентрация соли в
подвижной фазе обычно составляет от 0,5 до 3 М (в зависимости от
используемой неподвижной фазы, свойств разделяемых белков и
антихаотропного эффекта соли). При выборе исходной концентрации соли в
подвижной фазе (при которой происходит введение образца в колонку) для
разделения конкретного набора белков в образце следует учитывать, что
при превышении определённой концентрации соли (специфичной для каждой
конкретной пары соль-белок) в подвижной фазе происходит выпадение белка
в осадок из раствора, чего следует избегать при введении образца в
хроматографическую колонку.

Удерживание белков неподвижными фазами для гидрофобной хроматографии
происходит не только в присутствии «классических» солей. Некоторые
цвиттер-ионные органические соединения (например, аминокислоты – глицин
и аргинин) могут использоваться для этих же целей. Добавка этих
соединений в подвижную фазу также способствует улучшению
воспроизводимости получаемых результатов.

Обычно pH подвижной фазы сохраняют неизменным в ходе разделения и, как
правило, выбирают максимально близким к изоэлектрическим точкам
разделяемых белков. Чаще всего разделение проводят в нейтральной среде
(pH 7,0). В то же время изменение характеристик разделения при
варьировании pH подвижной фазы в области 5–8,5 в общем случае выражено
незначительно, при этом увеличение pH ослабляет гидрофобные
взаимодействия.

В качестве отправной точки при выборе условий разделения белков методом
гидрофобной хроматографии можно использовать элюенты следующего состава:


[cols=",,,",grid=none,frame=none]
|===

|[.underline]#Начальный буфер (А):#  |50 мМ раствор натрия фосфата, +
рН 7,0 + 0,5–1,5 М аммония сульфата.  | |
|[.underline]#Элюирующий буфер (В):#  |50 мМ раствор натрия фосфата, рН 7,0 | | 
|===

====== Термостатирование колонки и образцов

Влияние температуры на разделение в гидрофобной хроматографии до конца
не изучено и имеет сложный характер. По этой причине разделение
рекомендуют проводить при постоянной температуре (обычно в диапазоне
20–25 °С). В общем случае увеличение температуры колонки усиливает
гидрофобные взаимодействия. Температуру термостатирования образцов, как
правило, устанавливают такую же, как и для разделяющей колонки. Низкая
температура образца перед введением, по сравнению с температурой
разделяющей колонки, может послужить причиной снижения времени
удерживания белка и ухудшения его воспроизводимости.

====== Подготовка и введение образцов

Образцы должны быть свободны от твёрдых частиц. В качестве растворителя
для образцов, как правило, используют подвижную фазу, состав и pH
которой соответствуют начальным условиям элюирования. Общее количество
белка, вводимое в колонку, не должно превышать общую связывающую
способность (ёмкость) колонки по отношению к белку. При градиентном
элюировании белок в колонку, как правило, вводят в количестве, не
превышающем 30 % от максимальной ёмкости колонки, что обеспечивает
оптимальное разрешение. Нагрузка белка на колонку может быть увеличена
при условии сохранения приемлемого разрешения или в случае ступенчатого
изменения концентрации соли в ходе элюирования. Для оптимального
разделения при градиентном элюировании используют примерно одну пятую
общей связывающей способности колонки. При подборе условий разделения
смеси белков при обращённо-фазовой хроматографии обязательно учитывают
рН раствора, вязкость и температуру.

Максимальная динамическая ёмкость колонки по отношению к белку зависит
от скорости потока подвижной фазы (обратно пропорционально) и/или
размеров разделяемых белков и пор частиц неподвижной фазы. Крупные и
несимметричные молекулы с трудом проникают вглубь частиц неподвижной
фазы, и их удерживание обеспечивается в основном гидрофобными
взаимодействиями на поверхности частиц, что снижает динамическую ёмкость
неподвижной фазы по отношению к таким молекулам.


