[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===



===== ОФС.1.2.1.1.0013 Спектроскопия кругового дихроизма

*Взамен ОФС.1.2.1.1.0013.18*

 
Спектроскопия кругового дихроизма (КД-спектроскопия) основана на
анизотропии оптически активных молекул при пропускании света,
поляризованного по правому или левому кругу.

====== Область применения

КД-спектроскопию используют в основном для изучения структуры
органических молекул, обладающих оптической изомерией. С помощью данного
метода можно дифференцировать вклады полос поглощения различных изомеров
в суммарную оптическую активность исследуемого образца. Этот метод
используют для анализа смесей оптических изомеров биологически активных
веществ, для контроля качества лекарственных средств. Кроме того,
КД-спектроскопию широко используют для определения количества белка и
контроля за его вторичной структурой в растворах (т.е. за
денатурационными изменениями).

====== Метод

При прохождении через любую оптически активную среду
плоскополяризованного света он становится эллиптически поляризованным.
Данное явление связано с различными величинами поглощения средой двух
волн, составляющих этого света, с противоположной круговой поляризацией.
Разность этих величин поглощения называют круговым дихроизмом.
Полученные в ходе эксперимента спектры кругового дихроизма сравнивают со
стандартными спектрами КД. Благодаря этому получают качественный и
количественный состав исследуемого образца. Метод КД обладает высокой
чувствительностью (вплоть до анализа десятков микрограммов субстанции).

*_Методика_*

Из образцов готовят растворы одинаковой концентрации. Концентрацию
подбирают таким образом, чтобы при максимуме поглощения исследуемого
вещества оптическая плотность составляла примерно 1.

Растворы помещают в кварцевую кювету и проводят измерение КД на
соответствующем приборе в указанном диапазоне длин волн. Далее проводят
анализ полученных спектров, сравнивая их со стандартными спектрами.

Непосредственное измерение оптической плотности даёт следующее
выражение:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_ofs_1.2.1.1.0013_1.png[]
|===

где	_ΔA_	–	оптическая плотность кругового дихроизма;  +
_A~1~_	-	оптическая плотность для света с левой круговой поляризацией; +
_A~2~_	-	оптическая плотность для света с правой круговой поляризацией.


Величину кругового дихроизма рассчитывают по следующей формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_ofs_1.2.1.1.0013_2.png[]
|===

где	_Δε_	–	молярный круговой дихроизм или молярный дифференциальный дихроичный коэффициент поглощения, л/моль−1/см^−1^; +
_ε~1~_	-	молярный коэффициент поглощения для света с левой круговой оляризацией; +
_ε~2~_	-	молярный коэффициент поглощения для света с правой круговой поляризацией; +
_c_	-	концентрация испытуемого раствора, моль/л^−1^; +
_l_	-	длина оптического пути, см.



Кроме того, для характеристики кругового дихроизма также используют
следующие единицы:

_Коэффициент асимметрии_:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_ofs_1.2.1.1.0013_3.png[]
|===

где	_ε_	–	молярный коэффициент поглощения. 

_Молярная эллиптичность_

Некоторые типы приборов непосредственно показывают величину молярной
эллиптичности _Θ_, выраженную в градусах. При использовании таких
приборов молярная эллиптичность может быть рассчитана по следующему
уравнению:


[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_ofs_1.2.1.1.0013_4.png[]
|===

где	_[Θ]_	–	величина молярной эллиптичности, градус/см^2^/децимоль^-1^; +
_Θ_	-	величина эллиптичности, показываемая прибором; +
_M_	-	относительная молекулярная масса исследуемого вещества; +
_c_	-	концентрация испытуемого раствора, г/мл; +
_l_	-	длина оптического пути, см.


Молярная эллиптичность также связана с молярным круговым дихроизмом
уравнением:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_ofs_1.2.1.1.0013_5.png[]
|===



Молярную эллиптичность используют в анализе белков и нуклеиновых кислот.
В этом случае молярную концентрацию, выраженную в единицах мономерных
остатков, рассчитывают исходя из отношения молекулярной массы к числу
аминокислот.

Для белков среднее значение относительной молекулярной массы мономерного
остатка составляет от 100 до 120 (обычно 115), для нуклеиновых кислот (в
виде натриевой соли) – около 330.

====== Оборудование

Основные составляющие КД-спектрометра или, по-другому, дихрографа:

- источник излучения (обычно ксеноновая лампа);

- система круговой поляризации света (двойной монохроматор, кварцевые
призмы, двоякопреломляющий модулятор);

- детектор (фотоумножитель);

- усилитель сигнала.

Источником излучения (S) является ксеноновая лампа (<<im_ofs_1.2.1.1.0013_6,рис. 1>>). Свет
проходит через двойной монохроматор (М), оснащённый кварцевыми призмами
(Р1, Р2). Линейный пучок, пройдя через первый монохроматор, разделяется
на 2 части, поляризованные под прямыми углами во втором монохроматоре.
Поляризованный и монохроматический свет проходит через
двоякопреломляющий модулятор (Cr), в результате чего получается
переменный свет с круговой поляризацией. Затем пучок проходит через
испытуемый образец (С) и достигает фотоумножителя (PM), после чего
попадает на усилитель, который производит 2 электрических сигнала: одним
является прямой ток V~c~, а другим – переменный ток с частотой модуляции
V~ac~, характерной для испытуемого образца. Отношение V~ac~/V~c~
пропорционально изменению поглощения _ΔА_, которое создаёт сигнал.

Дихрограф способен производить измерения в диапазоне длин волн от 170 нм
до 800 нм.


[[im_ofs_1.2.1.1.0013_6]]
[caption="Рисунок 1. "]
.Оптическая схема дихрографа
image::im_ofs_1.2.1.1.0013_6.png[]



====== Калибровка прибора

Для проверки _правильности шкалы оптической плотности_ используют
раствор изоандростерона в диоксане (10 мг изоандростерона растворяют в
10,0 мл диоксана). Снимают КД-спектр в диапазоне от 280 нм до 360 нм.
Величина _Δε_, измеренная при 304 нм, должна быть равна {plus}3,3. Возможно
также использование раствора (1__S__)-({plus})-10-камфорсульфоновой кислоты.

_Линейность модуляции_ проверяют обычно с помощью раствора
(1__S__)-({plus})-10-камфорсульфоновой кислоты в воде (10 мг кислоты
растворяют в 10,0 мл воды). Сначала спектрофотометрически определяют
точную концентрацию камфорсульфоновой кислоты, используя удельный
показатель поглощения при 285 нм, равный 1,49. Далее снимают КД-спектр в
диапазоне от 185 нм до 340 нм. Величина _Δε_, измеренная при 290,5 нм,
должна быть равна от {plus}2,2 до {plus}2,5, а измеренная при 192,5 нм – от −4,3
до −5. Также возможно использование (1__S__)-({plus})- или
(1__R__)-(−)-аммония 10-камфоросульфоната.


[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


