[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===


 
==== ФС.2.3.0007 Гепарин натрия (Heparinum natricum)

*Взамен ФС 42-1327-99*




[discrete]
===== Определение

Мукополисахарид эфира полисерной кислоты.

Гепарин натрия представляет собой натриевую соль глюкозаминогликана,
содержащего сульфатированные и ацетилированные остатки D-глюкозамина,
D-глюкуроновой кислоты и L-идуроновой кислоты. При полном гидролизе
гепарина натрия образуются D-глюкозамин, D-глюкуроновая кислота,
L-идуроновая кислота, уксусная кислота и серная кислота. Гепарин натрия
обладает свойством удлинять время свёртывания крови катализируя
ингибирование тромбина и фактора Ха антитромбином. Гепарин натрия
получают из лёгких крупного рогатого скота или мукозы кишечника свиней.
Для получения исходного сырья используют животных, у которых отсутствуют
опасные для человека заболевания вирусной, бактериальной, микоплазменной
и прионной этиологии.

Анти-IIа активность субстанции должна составлять не менее 180 МЕ/мг
(C~24~H~31~N~2~ Na~7~O~35~S~5~)~n~ в пересчёте на сухое вещество.

[discrete]
===== Свойства

*Описание.* Аморфный порошок белого или почти белого цвета.

+*+ Гигроскопичен.

*Растворимость.* Легко растворим в воде.

[discrete]
===== Идентификация

. _Анти-IIа активность._ Проводят определение анти-IIа активности в
соответствии с ОФС «Методы количественного определения гепарина»
(определение анти-IIа активности НФГ).

. _Активность._ Проводят определение анти-Ха активности в соответствии
с ОФС «Методы количественного определения гепарина» (определение анти-Ха
активности НФГ). Отношение анти-Xa активности к анти-IIа активности,
определённой в соответствии с разделом «Количественное определение»,
должно быть от 0,9 до 1,1.

. _ВЭЖХ._ Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого
раствора А должно соответствовать времени удерживания пика гепарина на
хроматограмме стандартного раствора В (раздел «Родственные примеси»).

. _^1^H-ЯМР-спектроскопия_ (ОФС «Спектроскопия ядерного магнитного
резонанса»).

[none]
* _Растворитель_. Дейтерия оксид, содержащий 0,02 мг/мл дейтерированного
триметилсилилпропионата натрия.
* *Примечание* – В растворитель может быть добавлен 0,012 мг/мл натрия
эдетата дигидрат, если в спектре испытуемого образца или образца
сравнения сигнал при 5,22 м.д. меньше 80 % от сигнала при 5,44 м.д.
* Все растворы натрия эдетата дигидрата и натрия
тетрадейтеродиметилсилапентаноата хранят в контейнере из полиэтилена
высокой плотности.
* _Испытуемый раствор_. Растворяют 20 мг субстанции в 0,7 мл растворителя.
* _Раствор стандартного образца гепарина натрия._ Растворяют 20 мг
фармакопейного стандартного образца гепарина натрия для
ЯМР идентификации в 0,7 мл растворителя.
* _Раствор для проверки пригодности системы._ Растворяют 0,15 мг
стандартного образца избыточно сульфатированного хондроитин сульфата в
1,0 мл раствора сравнения.
* _Оборудование._ Импульсный ЯМР-спектрометр с рабочей частотой на
протонах не менее 300 МГц.

_Параметры регистрации ^1^H ЯМР спектров_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Угол поворота импульса |от 30° до 90°; | |
|Время выборки данных |не менее 2 с; | |

|Время задержки между импульсными последовательностями |не менее 4 с; | |

|Ширина спектра |10–12 м.д. с центром 4,5 м.д.; | |

|Количество накоплений сигнала свободной индукции |не менее 16; | |

|Отношение сигнал/шум для сигнала метильной группы гепарина при
2,04 м.д. |не менее 1000:1; | |

|Температура образца |20–30 °С. | |
|===

[none]
* *Примечание* – Спектры испытуемого раствора и раствора фармакопейного
стандартного образца гепарина натрия должны записываться без вращения
образца и при одинаковой температуре.
* _Параметры обработки ^1^H ЯМР спектров_
[none]
** Взвешивающая функция: экспоненциальная;
** Параметр уширения взвешивающей функции: 0,3 Гц;
** Референсный сигнал: 0,00 м.д. (ТСП).

[none]
* _Параметры пригодности системы._ На спектре раствора для проверки
пригодности хроматографической системы сигналы протонов метильных групп
_N_-ацетильных фрагментов гепарина и гиперсульфатированного
хондроитинсульфата должны наблюдаться при 2,05±0,02 и 2,16±0,03 м.д.
соответственно.
* _Анализ ^1^H ЯМР спектров_
* Спектр испытуемого раствора должен качественно соответствовать спектру
раствора стандартного образца гепарина натрия после нормализации обоих
спектров с целью уравнивания их по интенсивности. Допускается изменение
соотношения интенсивностей некоторых сигналов в области от 3,35 до
4,55 м.д. при сохранении подобия общего вида спектров.
* В спектрах должны присутствовать основные сигналы гепарина натрия
(м.д.): 2,04±0,03; 3,27±0,03 (дублет); 4,34±0,03; 5,22±0,03; 5,42±0,03.
Допускается появление дополнительного сигнала при 2,08±0,02 (дерматан
сульфат).
* В спектрах не должно наблюдаться не идентифицированных сигналов в
областях от 0,10 до 2,00 м.д., от 2,10 до 3,10 м.д. и от 5,70 до
8,00 м.д. высотой более 4 % от высоты сигнала при 5,42 м.д. Допускается
наличие идентифицированных сигналов протонов остаточных растворителей и
других технологических примесей.

[arabic,start=5]
. _Субстанция должна соответствовать требованиям раздела «Натрий».

[discrete]
===== Испытания

*Удельное вращение.* Не менее +35 в пересчёте на сухое вещество (4 %
раствор субстанции в воде, ОФС «Оптическое вращение»).

*Прозрачность раствора.* Раствор, содержащий в 1 мл 5000 МЕ субстанции,
должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции
(мутности) жидкостей»).

*Цветность раствора.* Раствор, приготовленный в испытании «Прозрачность
раствора» должен выдерживать сравнение с эталоном 5 подходящего цвета
(ОФС «Степень окраски жидкостей»).

*рН.* От 5,5 до 8,0 (1 % раствор в воде, свободной от углерода диоксида,
ОФС «Ионометрия», метод 3).

*Примеси нуклеотидов.* Оптическая плотность 0,4 % раствора субстанции в
воде, измеренная в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 260 нм,
не должна превышать 0,15 (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и
видимой областях»).

*Белок.* Не более 0,5 % (в пересчёте на сухое вещество). (ОФС
«Определение белка», метод 2 (А)).

_Испытуемый раствор._ В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г
(точная навеска) субстанции, растворяют в воде, доводят объём раствора
тем же растворителем до метки и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на
спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 5 см.

*Родственные примеси.* Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС
«Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

_Подвижная фаза А (ПФА)._ В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают
0,4 г натрия дигидрофосфата дигидрата, растворяют в воде, доводят
значение рН фосфорной кислотой разведённой 10 % до 3,0 и доводят объём
раствора водой до метки. Раствор используют свежеприготовленным.

_Подвижная фаза Б (ПФБ)._ В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают
0,40 г натрия дигидрофосфата дигидрата и 140 г натрия перхлората,
растворяют в воде, доводят значение рН фосфорной кислотой разведённой
10 % до 3,0 и доводят объём раствора водой до метки; фильтруют и
дегазируют. Раствор используют свежеприготовленным.

_Испытуемый раствор А_. В мерную колбу вместимостью 5 мл помещают 50 мг
субстанции (точная навеска), растворяют в воде при помощи вихревой
мешалки, доводят объём раствора водой до метки и перемешивают.

_Испытуемый раствор Б_. Растворяют 0,1 г (точная навеска) субстанции в
1,0 мл воды при помощи вихревой мешалки. К 0,5 мл полученного раствора
прибавляют 0,25 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М, 50 мкл
натрия нитрита раствора 25 % и выдерживают при комнатной температуре в
течение 40 мин. Для остановки реакции к полученной смеси прибавляют
0,2 мл натрия гидроксида раствора 1 М.

_Раствор стандартного образца гепарина._ Растворяют 0,25 г (точная
навеска) фармакопейного стандартного образца гепарина для
физико-химического анализа в 2,0 мл воды при помощи вихревой мешалки.

_Стандартный раствор А_. К 1,2 мл раствора стандартного образца гепарина
для физико-химического анализа прибавляют 0,3 мл фармакопейного
стандартного образца дерматана сульфата и гиперсульфатированного
хондроитина сульфата (содержит 10 мг/мл дерматана сульфата и 2,5 мг/мл
гиперсульфатированного хондроитина сульфата) и гомогенизируют при помощи
вихревой мешалки.

_Стандартный раствор Б_. К 0,5 мл стандартного раствора А прибавляют
0,25 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты, 50 мкл натрия нитрита
раствора 25 % и выдерживают при комнатной температуре в течение 40 мин.
Для остановки реакции к полученной смеси прибавляют 0,2 мл 1 М раствора
натрия гидроксида.

_Стандартный раствор В_. К 0,1 мл стандартного раствора А прибавляют
0,9 мл воды и гомогенизируют при помощи вихревой мешалки.

_Контрольный раствор_. К 0,4 мл раствора стандартного образца гепарина
для физико-химического анализа прибавляют 0,1 мл воды, перемешивают при
помощи вихревой мешалки, далее прибавляют 0,25 мл хлористоводородной
кислоты раствора 1 М, 50 мкл натрия нитрита раствора 25 % и выдерживают
при комнатной температуре в течение 40 мин. Для остановки реакции к
полученной смеси прибавляют 0,2 мл натрия гидроксида раствора 1 М.

_Хроматографические условия_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Предколонка 2+|50 × 2,0 мм, анионообменная смола, 13 мкм; |
|Колонка 2+|250 × 2,0 мм, анионообменная смола, 9 мкм; |
|Температура колонки |40 °С; | |
|Скорость потока |0,22 мл/мин; | |
|Детектор |спектрофотометрический, 202 нм; | |
|Объём пробы |20 мкл. | |
|===

_Режим хроматографирования_

[cols="^35%,^34%,^31%",options="header",]
|===
|Время, мин |ПФА,% |ПФБ,%
|0–10 |75 |25
|10–35 |75 → 0 |25 → 100
|35–40 |0 |100
|===

Колонку уравновешивают в течение не менее 15 мин.

Хроматографируют контрольный раствор, стандартный раствор Б, стандартный
раствор В, испытуемый раствор А и испытуемый раствор Б.

_Относительное время удерживания соединений._ Гепарин – 1 (около
26 мин); дерматана сульфат и хондроитина сульфат − около 0,9;
гиперсульфатированный хондроитин сульфат − около 1,3.

_Пригодность хроматографической системы._ На хроматограмме контрольного
раствора должен отсутствовать пик с относительным временем удерживания
гепарина.

На хроматограмме стандартного раствора Б:

- _разрешение_ _(R~S~)_ между суммарным пиком дерматана сульфата и
хондроитина сульфата и гиперсульфатированного хондроитина должно быть не
менее 3,0;

- _отношение сигнал/шум (S/N)_ для суммарного пика дерматана сульфата и
хондроитина сульфата должно быть не менее 10,0.

На хроматограмме стандартного раствора В:

- _отношение максимум/минимум (p/v)_ между суммарным пиком дерматана
сульфата и хондроитина сульфата и пиком гепарина должно быть не менее
1,3;

- _относительное стандартное отклонение_ площади пика гепарина должно
быть не более 5,0 % (6 введений).

_Допустимое содержание примесей._ На хроматограмме испытуемого
раствора Б:

- площадь суммарного пика дерматана сульфата и хондроитина сульфата не
должна превышать площадь соответствующего суммарного пика на
хроматограмме стандартного раствора Б (не более 2,0 %);

- сумма площадей пиков любых других примесей не должна превышать более
чем в 0,01 раз площади пиков дерматансульфата и хондроитинсульфата на
хроматограмме стандартного раствора Б (не более 0,02 %);

- не учитывают пики, которые появляются во время начального
изократического шага.

*Гиперсульфатированный хондроитин сульфат.* Определение проводят в
условиях испытания «Подлинность. ^1^H-ЯМР-спектроскопия».

_Анализ ^1^H ЯМР спектров._ В диапазоне 1,5–3,0 м.д. не допускается
присутствие характерного для гиперсульфатированного хондроитинсульфата
сигнала при 2,16±0,03 м.д.

*Азот.* От 1,5 до 2,5 % в пересчёте на сухое вещество (ОФС «Определение
азота в органических соединениях методом Кьельдаля»). Для определения
используют 0,1 г (точная навеска) субстанции.

*Натрий.* От 9,5 до 13,5 % в пересчёте на сухое вещество. Определение
проводят методом ААС (ОФС «Атомно-абсорбционная спектрометрия»).

_Раствор цезия хлорида._ В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают
1,27 г цезия хлорида, растворяют в хлористоводородной кислоты растворе
0,1 М и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

_Испытуемый раствор._ В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 50 мг
(точная навеска) субстанции, растворяют в растворе цезия хлорида и
доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

_Калибровочные растворы натрия._ В каждую из трёх мерных колб
вместимостью 100 мл помещают по 12,5 мл, 25,0 мл и 37,5 мл раствора
натрия 200 мкг/мл (ОФС «Атомно-абсорбционная спектрометрия») и доводят
объём раствора раствором цезия хлорида до метки.

_Условия испытания_

[none]
* Источник излучения: лампа для определения натрия с полым катодом;
* Длина волны: 330,3 нм;
* Атомизация: воздушно-ацетиленовое пламя;
* Расход газа: воздух – 11 л/мин, ацетилен – 2 л/мин.


Определяют значения атомной абсорбции испытуемого раствора и
калибровочных растворов. По калибровочной кривой рассчитывают
концентрацию натрия в субстанции.

*Сульфатная зола.* От 30 % до 43 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для
определения используют 0,5 г (точная навеска) субстанции.

*Потеря в массе при высушивании.* Не более 8,0 % (ОФС «Потеря в массе
при высушивании», способ 1). Сушат 1 г (точная навеска) субстанции над
фосфора(V) оксидом при температуре 60±2 °С и остаточном давлении не
более 0,67 кПа (5 мм рт. ст.) в течение 3 ч.

*Тяжёлые металлы*. Не более 0,003 %. Определение проводят в соответствии
с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 3Б) с использованием 3,0 мл эталонного
раствора 2.

*Остаточные органические растворители.* В соответствии с ОФС «Остаточные
органические растворители».

{asterisk}{asterisk} *Бактериальные эндотоксины.* Не более 0,01 ЕЭ/МЕ гепарина (ОФС
«Бактериальные эндотоксины»).

{asterisk}{asterisk} *Аномальная токсичность.* Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС
«Аномальная токсичность»). Тест-доза – 100 ME гепарина в 0,5 мл натрия
хлорида растворе 0,9 % для инъекций на мышь, внутривенно. Срок
наблюдения – 48 ч.

{asterisk}{asterisk} *Стерильность.* Субстанция должна быть стерильной (ОФС
«Стерильность»).

{asterisk}{asterisk} *Испытание на депрессорные вещества.* Субстанция не должна обладать
депрессорным действием (ОФС «Испытание на депрессорные вещества»).
Тест-доза – 5000 МЕ гепарина в 1,0 мл натрия хлорида раствора 0,9 % для
инъекций на 1 кг массы животного.

*Микробиологическая чистота.* В соответствии с ОФС «Микробиологическая
чистота».

[discrete]
===== Количественное определение

_Анти-IIа активность._ Проводят определение анти-IIа активности в
соответствии с ОФС «Методы количественного определения гепарина»
(определение анти-IIа активности НФГ).

Результаты испытания считаются достоверными, если измеренное значение
анти-IIа активности субстанции составляет не менее 90 % и не более 111 %
от предполагаемой активности.

Под предполагаемой активностью подразумевают значение активности
субстанции, которое используют при расчётах необходимых разбавлений
растворов субстанции, используемых при выполнении испытания. В случае
невыполнения данного требования необходимо провести повторное испытание
со скорректированным соответствующим образом значением предполагаемой
активности субстанции и её разведениями.

Доверительный интервал измеренной активности (P = 0,95) должен
составлять от 80 % до 125 % от измеренной активности.

[discrete]
===== Хранение

В герметично укупоренной упаковке. Если вещество стерильно, контейнер
тоже должен быть стерилен.

+*+ Приводится для информации.

{asterisk}{asterisk} Испытание проводят для субстанции, предназначенной для производства
лекарственных препаратов для парентерального применения.


[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


