[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===



===== ОФС.1.2.3.0020 Спектрофотометрическое определение фосфора

*Взамен ОФС.1.2.3.0020.15*

 
Методы спектрофотометрического определения фосфора основаны на
использовании окислительного разложения, в результате которого фосфор
переводится в фосфат-ионы, образующие с молибденовой кислотой окрашенные
соединения.

Выбор метода спектрофотометрического определения фосфора и способа
минерализации связан с составом, свойствами лекарственного средства и
количеством содержащегося в нём фосфора.

Минерализацию осуществляют методами:
[none]
* 1) сжигания в атмосфере кислорода (метод 1);
* 2) сжигания с окислительными смесями концентрированных кислот
(метод 2);
* 3) сухой минерализацией – сплавлением с твёрдыми окислителями
(метод 3).

В ряде случаев (при определении фосфора в фосфолипидах, нуклеиновых
кислотах и других соединениях) до минерализации проводят выделение
испытуемого вещества.

Определение фосфора нуклеиновых кислот по Спирину проводят
спектрофотометрическим методом с определением оптической плотности при
двух значениях длин волн – 270 нм и 290 нм в ультрафиолетовой области
спектра.

Способы минерализации

====== Метод 1

Испытание проводят в соответствии с ОФС «Метод сжигания в колбе с
кислородом».

====== Метод 2

_Методика 1._ Используется для лекарственных средств из животного и
растительного сырья. В колбу Кьельдаля помещают точную навеску (или
отмеренный объём) лекарственного средства, указанную в фармакопейной
статье, содержащую 0,2–0,3 мг фосфора, прибавляют 3 мл серной кислоты
концентрированной и 3 мл азотной кислоты концентрированной или 3 мл
хлорной кислоты, перемешивают. Колбу закрывают стеклянной воронкой и
осторожно нагревают, начиная с 50 °С, постепенно повышая температуру до
250±50 °С. Прибавляют по каплям 1 мл азотной кислоты концентрированной;
повторяют добавление кислоты по 1 мл каждые 5 мин до получения раствора
слабо-жёлтого цвета и прекращают нагревание. К охлаждённому раствору
осторожно, небольшими порциями, прибавляют 20 мл воды и кипятят 30 мин.
Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу.

_Методика 2._ Используется преимущественно для витаминных лекарственных
средств с минералами. В колбу Кьельдаля или высокую термостойкую
пробирку помещают точную навеску лекарственного средства, эквивалентную
содержанию фосфора 100 мг или указанному в фармакопейной статье,
прибавляют 25 мл азотной кислоты концентрированной, осторожно нагревают
в течение 30 мин на газовой горелке, электрическом колбонагревателе или
плитке, прибавляют 15 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и
продолжают нагревание до исчезновения бурых паров.

====== Метод 3

Метод используется для витаминных лекарственных средств с минералами.

Помещают точную навеску предварительно подготовленного, как описано в
фармакопейной статье, лекарственного средства в платиновый или кварцевый
тигель (при необходимости в образцах с маслом тигель выдерживают в
сушильном шкафу при 110 °C в течение 10 мин или более для полной
абсорбции масла магния оксидом), осторожно сжигают на открытом пламени
газовой горелки или электроплитке в присутствии магния оксида (от 3,0 мг
до 2,5 г; количество магния оксида должно быть указано в фармакопейной
статье) до обугливания, и продолжают сжигание в муфельной печи при
температуре 900±100 °С до тех пор, пока весь остаток не станет белого
цвета (3±2 ч).

Спектрофотометрические методики определения фосфора

Образующиеся после минерализации фосфат-ионы взаимодействуют с
молибденовой кислотой с образованием жёлтых гетерополикомплексов –
фосфорномолибденовых кислот, переходящих под действием восстановителей
(аскорбиновой кислоты, гидразина сульфата, эйконогена, метола или
других) в фосфорномолибденовую синь, интенсивность окраски которой
пропорциональна содержанию фосфора. Состав фосфорномолибденовой сини
зависит от природы восстановителя, кислотности раствора, температуры и
других условий. От природы восстановителя зависят скорость реакции,
чувствительность метода и положение максимума поглощения.

В спектре поглощения фосфорномолибденовой сини для испытуемого
лекарственного средства определяют положение максимума. При
необходимости перед проведением цветной реакции испытуемый раствор
нейтрализуют натрия гидроксида раствором 5 М (или другой концентрации,
указанной в фармакопейной статье) в присутствии 1–2 капель фенолфталеина
раствора 1 %, избыток щёлочи нейтрализуют серной кислоты раствором
0,05 М (или другой концентрации, указанной в фармакопейной статье).

_Методика 1_

Используется преимущественно для витаминных лекарственных средств с
минералами, с аскорбиновой кислотой.

_Ацетатный буферный раствор рН 4,0._ В мерную колбу вместимостью 200 мл
помещают 10 мл уксусной кислоты раствора 1 М, 25 мл натрия ацетата
раствора 0,1 М и доводят объём раствора водой до метки. Срок годности
полученного раствора – 3 мес.

Методы минерализации и приготовления раствора должны быть указаны в
фармакопейной статье. В одну из трёх мерных колб вместимостью 25 мл
помещают 2,0 мл раствора, приготовленного после минерализации, в другую
– 2,0 мл фосфора стандартного раствора 20 мкг/мл и в третью – 2,0 мл
воды (контрольный раствор). В каждую из трёх колб прибавляют по 10 мл
ацетатного буферного раствора рН 4,0, 2,5 мл аммония молибдата раствора
1 % в серной кислоте и 2,5 мл свежеприготовленного аскорбиновой кислоты
раствора 1 % и доводят объёмы растворов ацетатным буферным раствором рН
4,0 до метки. Точно через 10 мин после добавления аскорбиновой кислоты
раствора 1 % измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартного
растворов в максимуме поглощения при длине волны 740 нм в кювете с
толщиной слоя 1 см относительно контрольного раствора.

Содержание фосфора в субстанции или препарате в процентах (_Х_)
вычисляют по формуле:


[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.2.3.0020_1.png[] (1)
|===

где	_A~1~_	–	оптическая плотность испытуемого раствора;	+
_A~0~_	–	оптическая плотность стандартного раствора; +
_V_	–	объём воды, используемый для приготовления испытуемого раствора после минерализации, мл; +
_a_	–	навеска субстанции или препарата, г;	+
_20_	–	концентрация фосфора в фосфора стандартном растворе 20 мкг/мл.


_Методика 2_

Используется преимущественно для лекарственных средств из животного и
растительного сырья.

_Восстанавливающий раствор_. В мерную колбу вместимостью 1000 мл
помещают 4,0 г метола и 10,0 г натрия сульфита гептагидрата, растворяют
в 150 мл воды, прибавляют 196 г натрия метабисульфита, растворённого в
600 мл воды, доводят объём раствора водой до метки и фильтруют. Срок
годности раствора – 30 сут.

_Проба на содержание фосфора в используемых реактивах._ При смешивании
5 мл восстанавливающего раствора, 10 мл аммония молибдата раствора 5 % в
серной кислоте (2) и 20 мл натрия ацетата раствора насыщенного не должно
появляться синего окрашивания.

Проводят минерализацию, как указано в методике 1 метода 2. Содержимое
колбы количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл,
доводят объём раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют через
сухой обеззоленный бумажный фильтр, отбрасывая первые 15 мл фильтрата. В
мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 15,0 мл фильтрата, прибавляют
35 мл воды, 5,0 мл восстанавливающего раствора, 10 мл аммония молибдата
раствора 5 % в серной кислоте (2) и выдерживают в течение 10 мин при
комнатной температуре, периодически перемешивая. Соотношение фильтрата и
воды (общий объём 50 мл) может быть изменено в зависимости от содержания
фосфора в фильтрате.

Параллельно в аналогичных условиях готовят стандартный и контрольный
растворы, помещая в мерную колбу вместимостью 100 мл 20,0 мл фосфора
стандартного раствора 20 мкг/мл, 30 мл воды (стандартный раствор) или
50 мл воды (контрольный раствор) и те же количества реактивов, как для
испытуемого раствора.

Точно через 10 мин в колбы с испытуемым, стандартным и контрольным
растворами прибавляют по 20 мл натрия ацетата раствора насыщенного,
доводят объём раствора в каждой колбе водой до метки, тщательно
перемешивают и через 22,5±2,5 мин измеряют оптическую плотность
испытуемого и стандартного растворов в максимуме поглощения при длине
волны 725 нм в кювете с толщиной слоя 1 см относительно контрольного
раствора.

Содержание фосфора в субстанции или препарате в процентах (Х) вычисляют
по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.2.3.0020_2.png[] (2)
|===

где	_A~1~_	–	оптическая плотность испытуемого раствора; +
_A~0~_	–	оптическая плотность стандартного раствора; +
_a_	–	навеска субстанции или препарата, г; +
_20_	–	концентрация фосфора в фосфора стандартном растворе 20 мкг/мл.


_Методика 3_

Используется преимущественно для витаминных лекарственных средств с
минералами, с гидрохиноно.

Способ минерализации, навеска лекарственного средства или содержание
фосфора в пробе должны быть указаны в фармакопейной статье. В мерную
колбу вместимостью 500 мл с помощью воды количественно переносят
полученный остаток после минерализации, растворяют в воде и доводят
объём раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу
вместимостью 100 мл помещают 10,0 мл полученного раствора, доводят объём
раствора водой до метки и перемешивают. В одну из трёх мерных колб
вместимостью 25 мл помещают 5,0 мл испытуемого раствора, в другую –
5,0 мл фосфора стандартного раствора 20 мкг/мл и в третью – 5,0 мл воды
(контрольный раствор). В каждую из трёх колб прибавляют по 1,0 мл
аммония молибдата раствора 5 % в серной кислоте (3), 1,0 мл гидрохинона
раствора 0,5 % и 1,0 мл натрия гидросульфита раствора 20 %, перемешивают
и доводят объёмы растворов в каждой колбе водой до метки, перемешивают и
выдерживают в течение 30 мин, измеряют оптическую плотность испытуемого
и стандартного растворов в максимуме поглощения при длине волны 650 нм в
кювете с толщиной слоя 1 см относительно контрольного раствора.

Содержание фосфора в субстанции или препарате в процентах (Х) вычисляют
по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.2.3.0020_3.png[] (3)
|===

где	_A~1~_ - оптическая плотность испытуемого раствора; +
_A~0~_ - оптическая плотность стандартного раствора; +
_a_	–	навеска субстанции или препарата, г; +
_20_ - концентрация фосфора в фосфора стандартном растворе 20 мкг/мл.


_Методика 4_

Используется для определения примесей или количественного определения
фосфора, с эйконогеном.

_Раствор эйконогена_. Готовят одним из двух способов.
[none]
* A. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,750 г натрия сульфита,
14,150 г натрия гидросульфита и 0,105 г эйконогена, растворяют в воде и
доводят объём раствора водой до метки. Полученный раствор используют
свежеприготовленным.
* Б. Готовят сухую смесь из 5,0 г натрия сульфита, 94,3 г натрия
гидросульфита и 0,70 г эйконогена при тщательном перемешивании. В день
определения в мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,5 г сухой
смеси, растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки.

Полученный остаток после минерализации (методику выбирают в зависимости
от природы вещества) растворяют в 10 мл воды и количественно переносят в
мерную колбу вместимостью 25 мл, перемешивают, прибавляют 0,75 мл
аммония молибдата раствора 8,3 % в серной кислоте, 1,0 мл раствора
эйконогена и доводят объём раствора водой до метки.

Готовят стандартный раствор, помещая 1–3 мл фосфора стандартного
раствора 5 мкг/мл в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляя те же
реактивы, что и в испытуемый раствор.

Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартного растворов в
максимуме поглощения при длине волны 620 нм в кювете с толщиной слоя
1 см относительно контрольного раствора.

Содержание фосфора в субстанции или препарате в процентах (_Х_)
вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.2.3.0020_4.png[] (4)
|===

где	_A~1~_	–	оптическая плотность испытуемого раствора; +
	_A~0~_	–	оптическая плотность стандартного раствора; +
	_a_	–	навеска субстанции или препарата, г; +
	_V~0~_	–	объём фосфора стандартного раствора, мл; +
	_5_	–	концентрация фосфора в фосфора стандартном растворе 5 мкг/мл.


Для нормирования предельного содержания примесей возможно сравнение
значений оптической плотности испытуемого и стандартного растворов.
Оптическая плотность испытуемого раствора не должна превышать оптическую
плотность стандартного раствора.

_Методика 5_

Используется преимущественно для витаминных лекарственных средств с
минералами, с гидразина сульфатом.

_Молибденовый реактив._ Растворяют 6,86 г натрия молибдата в 200 мл воды
(раствор А); растворяют 0,40 г гидразина сульфата в 100 мл воды (раствор
Б). В мерную колбу вместимостью 1000 мл, содержащую 500 мл воды,
осторожно прибавляют при охлаждении и перемешивании 100 мл серной
кислоты концентрированной, туда же полностью переносят растворы А и Б и
доводят объём раствора водой до метки. Реактив используют
свежеприготовленным.

Остаток после минерализации (способ минерализации указывают в
фармакопейной статье), содержащий от 0,25 до 1,50 мг фосфора, переносят
в мерную колбу вместимостью 500 мл с помощью 45±5 мл воды, прибавляют
20 мл серной кислоты раствора 1 М и перемешивают. Если остаток не
растворился, прибавляют ещё небольшое количество серной кислоты раствора
1 М и доводят объём раствора водой до метки.

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 5,0 мл полученного раствора,
прибавляют 20 мл молибденового реактива, 50 мл воды и выдерживают на
кипящей водяной бане, в течение 30 мин. Охлаждают до комнатной
температуры, доводят объём раствора водой до метки и измеряют оптическую
плотность полученного раствора в максимуме поглощения при длине волны
830 нм в кювете с толщиной слоя 1 см относительно контрольного раствора
и определяют концентрацию фосфора в испытуемом растворе по
калибровочному графику.

_Построение калибровочного графика._ В мерные колбы вместимостью 100 мл
помещают 2,0; 5,0; 7,5; 10,0 и 15,0 мл фосфора стандартного раствора
10 мкг/мл, прибавляют по 20 мл молибденового реактива и далее поступают,
как указано выше для испытуемого раствора.

Строят калибровочный график, откладывая по оси ординат оптическую
плотность, а по оси абсцисс – концентрацию фосфора в мкг/мл.

Содержание фосфора в субстанции или препарате в процентах (_Х_)
вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.2.3.0020_5.png[] (5)
|===

где	_С_	–	концентрация фосфора, определенная по калибровочному графику, мкг/мл; +
_a_	–	навеска субстанции или препарата, г.


Определение фосфора нуклеиновых кислот по Спирину

Метод основан на измерении разности показателей поглощения в
ультрафиолетовой области при двух значениях длин волн после обработки
испытуемого лекарственного средства раствором хлорной кислоты при
нагревании. В фармакопейных статьях в зависимости от соотношения
содержания нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой,
а также их фрагментов) допускаются модификации методик гидролиза.

_Методика_

К 1,0 мл раствора образца, содержащего 15–35 мкг нуклеиновых кислот,
помещенного в термостойкую центрифужную пробирку или колбу, прибавляют
5,0 мл хлорной кислоты раствора 0,5 М (другие условия указывают в
фармакопейной статье) и закрывают стеклянным колпачком или присоединяют
воздушный холодильник. Смесь выдерживают на кипящей водяной бане в
течение 20 мин, охлаждают и при необходимости (при наличии осадка)
центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин, измеряют оптическую
плотность гидролизованного прозрачного раствора или надосадочной
жидкости при длинах волн 270 нм и 290 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
При высоких значениях оптической плотности растворы разводят хлорной
кислоты раствором 0,5 М (разведение должно быть указано в фармакопейной
статье). В качестве контрольного раствора используют хлорной кислоты
раствор 0,5 М.

Метод применим при выполнении условия: _А_~270~ и _А_~290~ не должны
отличаться более чем на 15 %.

Содержание фосфора в субстанции или препарате в процентах (_Х_)
вычисляют по формуле:


[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image:im_ofs_1.2.3.0020_6.png[] (6)
|===

где	_A~270~_	–	оптическая плотность испытуемого раствора при 270 нм; +
_A~290~_	–	оптическая плотность испытуемого раствора при 290 нм; +
_a_	–	навеска субстанции или препарата, г; +
_V_	–	объём, в котором растворена субстанция или препарат, мл; +
_F_	–	степень дополнительного разведения испытуемого раствора; +
_l_	–	толщина оптического слоя, см; +
_0,19_	–	разность удельных показателей поглощения нуклеиновых кислот (ΔА~1см~) при длинах волн 270 и 290 нм при содержании фосфора 1 мкг/мл, мл/(мкг·см).



[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


