[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|*ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ*
|===



==== ФС.2.3.0005 Протамина сульфат (Protamini sulfas)

*Взамен ФС 42-1256-79*

+[9009-65-8]+ 

[discrete]
===== Определение

Сульфаты основных пептидов, извлечённых из сперматозоидов или молоки
рыб, обычно видов _Salmonidae_. Связывается с гепарином в растворе,
ингибируя его антикоагулянтную активность; в условиях анализа это
связывание приводит к образованию осадка. В расчёте на высушенное
вещество 1 мг протамина сульфата осаждает не менее 100 МЕ гепарина.

Содержит не менее 90,0 % и не более 110,0 % протамина сульфата в
пересчёте на сухое и свободное от серной кислоты вещество.

[discrete]
===== Свойства

*Описание.* Белый или почти белый порошок со слабым характерным запахом.

+*+ Гигроскопичен.

*Растворимость*. Умеренно растворим в воде, практически нерастворим в
спирте 96 %.

[discrete]
===== Идентификация

. _Антигепариновая активность_. Должна соответствовать требованиям
раздела «Количественное определение».

. _ВЭЖХ._ Время удерживания четырёх основных пиков (протаминовых
пептидов _A, B, C, D _) на хроматограмме испытуемого раствора должно
соответствовать времени удерживания пиков (протаминовых
пептидов _A, B, C, D_), на хроматограмме раствора стандартного образца
протамина сульфата (раздел «Родственные примеси»).

[none]
* Относительное содержание пептидов _A, B, C, D_ в субстанции рассчитывают
методом внутренней нормализации. Содержание пептида _А_ в испытуемом
растворе должно составлять от 13 до 18 %; пептида _В_ – от 21 до 28 %;
пептида _С_ – от 31 до 38 %; пептида _D_ – от 19 до 24 %.

[arabic,start=3]
. _Качественная реакция._ К 0,5 мл раствора А, полученного в испытании
«Прозрачность раствора», прибавляют 4,5 мл воды, 1,0 мл натрия
гидроксида раствора 10 %, 1,0 мл α-нафтола раствора 0,1 % и
перемешивают. Смесь охлаждают до 5 °С и прибавляют 0,5 мл натрия
гипобромита раствора; должно образоваться красное окрашивание.

. _Качественная реакция._ Субстанция должна давать реакцию на сульфаты
(ОФС «Общие реакции на подлинность»).

[discrete]
===== Испытания

*Удельное вращение.* От –65 до –85 в пересчёте на сухое вещество (1 %
раствор субстанции в хлористоводородной кислоты растворе 0,1 М,
ОФС «Оптическое вращение»).

*Прозрачность раствора.* Растворяют 0,2 г субстанции в 10 мл воды
(раствор А). К 2,5 мл полученного раствора прибавляют 7,5 мл воды.
Полученный раствор должен выдерживать сравнение с эталоном II (ОФС
«Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»).

*Цветность раствора.* Раствор, полученный в испытании «Прозрачность
раствора», должен выдерживать сравнение с эталоном BY~6~ или Y~6~ (ОФС
«Степень окраски жидкостей», метод 2).

*Оптическая плотность.* Оптическая плотность 1,0 % раствора субстанции в
воде, измеренная при длине волн от 260 до 280 нм в кювете с толщиной
слоя 1 см, не должна превышать 0,1 (ОФС «Спектрофотометрия в
ультрафиолетовой и видимой областях»).

*рН.* От 6,0 до 7,5 (1,0 % раствор субстанции, ОФС «Ионометрия»,
метод 3).

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС
«Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Растворы используют свежеприготовленными.

_Подвижная фаза А (ПФА)_. Трифторуксусная кислота—ацетонитрил—вода
1:50:950.

_Подвижная фаза  Б (ПФБ)._ Трифторуксусная кислота—ацетонитрил—вода
1:500:500.

_Испытуемый раствор._ В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 30 мг
субстанции, растворяют в 400 мкл хлористоводородной кислоты 6 М и
доводят объём раствора хлористоводородной кислотой 0,01 М до метки.

_Раствор стандартного образца протамина сульфата._ В мерную колбу
вместимостью 10 мл помещают 3 мг (точная навеска) фармакопейного
стандартного образца протамина сульфата, содержащего пептиды А, В, С, D,
растворяют в 40 мкл хлористоводородной кислоты раствора 6 М и доводят
объём раствора хлористоводородной кислоты раствором 0,01 М до метки.

_Раствор для проверки пригодности хроматографической системы._ В мерную
колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл раствора стандартного образца
протамина сульфата и доводят объём раствора хлористоводородной кислоты
раствором 0,01 М до метки.

_Условия хроматографирования_

[cols=",,^,^",grid=none,frame=none]
|===

|Колонка 2+|150 × 4,6 мм, силикагель октадецилсилильный, с пористой
поверхностью на непористой основе, эндкепированный, для хроматографии,
3,6 мкм; |

|Температура колонки |45 °С; | |

|Скорость потока |1,5 мл/мин; | |

|Детектор |спектрофотометрический, 210 нм; | |

|Температура автосамплера |5 °С; | |

|Объём пробы |30 мкл; | |

|Время хроматографирования |25 мин. | |
|===

_Режим хроматографирования_

[cols="^43%,^24%,^33%",options="header",]
|===
|Время, мин |ПФА,% |ПФБ,%
|0–2 |95 |5
|2–17 |95 → 80 |5 → 20
|17–17,2 |80 → 20 |20 → 80
|17,2–20 |20 |80
|===

Хроматографируют раствор для проверки пригодности хроматографической
системы, раствор стандартного образца протамина сульфата и
испытуемый раствор.

_Относительное время удерживания соединений._ Пептид А – 1 (от 9 до
13 мин); пептид В – около 1,05; пептид C – около 1,10; пептид D – около
1,15.

_Пригодность хроматографической системы._ На хроматограмме раствора
стандартного образца протамина сульфата:

- должно наблюдаться 4 основных пика (пептиды от А до D), время
удерживания которых должны находиться в пределах от 8 до 17 мин;

- _разрешение (R)_ между пиками пептида А и пептида B должно быть не
менее 2,0; между пиками пептида B и пептида C должно быть не менее 2,0;
между пиками пептида C и пептида D должно быть не менее 2,0;

- _фактор асимметрии (A~s~)_ пика пептида А должен быть не более 1,8;
пика пептида B – не более 1,5; пика пептида С– не более 2,5; пика
пептида D – не более 2,2;

- _относительное стандартное отклонение_ суммы площадей пиков пептидов
A, B, C и D – не более 2% (6 введений);

- _отношение сигнал/шум_ _(S/N)_ для пика пептида А на хроматограмме
раствора для проверки пригодности хроматографической системы – не менее
10.

_Допустимое содержание примесей._ Суммарное содержание примесей в
субстанции в процентах (_X_) вычисляют по формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.3.0005_1.png[]
|===

где	_S~А~{plus}S~B~{plus}S~C~{plus}S~D~_	-	сумма площадей пиков пептидов A, B, C и D на хроматограмме испытуемого раствора; +
	_ΣS_	-	сумма площадей всех пиков на хроматограмме испытуемого раствора.


Допустимое суммарное содержание примесей – не более 8,0 %.

При суммарном содержании примесей менее 0,5 % результат испытания
указывают как «менее 0,5 %».

*Потеря в массе при высушивании.* Не более 5,0 % (ОФС «Потеря в массе
при высушивании»). Для определения используют 1 г (точная навеска)
субстанции.

*Азот.* От 21,0 до 26,0 %, в пересчёте на сухое вещество (ОФС
«Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля,
метод 1). Для определения используют 70 мг субстанции и проводят
минерализацию в течение 3–4 часов. В качестве титранта используют 0,1 М
раствор хлористоводородной кислоты.

*Железо*. Не более 0,001 % (ОФС «Железо», метод 2). Растворяют 1,0 г
субстанции при нагревании в 10 мл воды.

*Сульфаты.* Не менее 16 % и не более 24 %, в пересчёте на сухое
вещество. В химический стакан помещают 0,15 г (точная навеска)
субстанции, растворяют в 15 мл воды, прибавляют 5 мл хлористоводородной
кислоты разведённой 7,3 %, нагревают до кипения и медленно прибавляют к
кипящему раствору 10 мл бария хлорида раствора 10 %. Накрывают стакан,
нагревают в течение 1 ч на водяной бане и фильтруют. Осадок промывают
несколько раз горячей водой, до отрицательной реакции на хлориды,
высушивают и прокаливают в предварительно взвешенном тигле при
температуре от 550 до 650 °С до постоянной массы.

1,0 г остатка соответствует 0,4117 г сульфатов SO~4~.

*Сульфатная зола.* Не более 0,5 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для
определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

*Ртуть.* Не более 0,001 %.

_Растворитель._ Азотная кислота концентрированная__—__серная кислота
концентрированная 1:1.

_Испытуемый раствор._ В коническую колбу вместимостью 250 мл помещают
2,0 г субстанции, прибавляют 20,0 мл растворителя, кипятят с обратным
холодильником в течение 1 ч, охлаждают и осторожно разбавляют водой.
Кипятят до полного исчезновения паров азотной кислоты. Смесь охлаждают и
количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводят
объём раствора водой до метки и фильтруют. Переносят 50,0 мл фильтрата в
делительную воронку, встряхивают последовательно с небольшими порциями
хлороформа до обесцвечивания хлороформного слоя. Отделяют хлороформный
слой. К водному слою прибавляют 25,0 мл серной кислоты разведённой
9,8 %, 115,0 мл воды и 10,0 мл гидроксиламина гидрохлорида раствора
20 %. Титруют дитизона раствором 0,0012 %, после каждого прибавления
титранта смесь тщательно перемешивают, к концу титрования смесь
оставляют для разделения слоёв. Отделяют хлороформный слой и продолжают
титровать до появления синевато-зелёного окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт.

Рассчитывают содержание ртути, используя эквивалент в мкг ртути на 1 мл
титранта, определённый при установке титра дитизона раствора 0,0012 %.

*Тяжёлые металлы.* Не более 0,002 %. Определение проводят в соответствии
с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 3Б), в остатке, полученном в испытании
«Сульфатная зола», с использованием эталонного раствора 2.

*Остаточные органические растворители.* В соответствии с ОФС «Остаточные
органические растворители».

*Аномальная токсичность.* Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС
«Аномальная токсичность»). Тест-доза – 0,5 мг субстанции в 0,5 мл воды
для инъекций на мышь. Срок наблюдения 48 ч.

*Бактериальные эндотоксины.* Не более 2,33 ЕЭ на 1 мг субстанции (ОФС
«Бактериальные эндотоксины»).

*Микробиологическая чистота.* В соответствии с ОФС «Микробиологическая
чистота».

[discrete]
===== Количественное определение

*Антигепариновая активность*. Определение проводят методом
титриметрии.

Все испытуемые растворы и раствор стандартного образца протамина
сульфата готовятся в двух повторностях; для каждого раствора проводится
3 определения.

_Испытуемый раствор А._ В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают
15 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в воде и доводят объём
раствора тем же растворителем до метки.

_Испытуемый раствор Б._ К 10,0 мл испытуемого раствора А прибавляют
5,0 мл воды и перемешивают.

_Испытуемый раствор В._ К 10,0 мл испытуемого раствора А прибавляют
20,0 мл воды и перемешивают.

_Раствор стандартного образца гепарина натрия (титрант)._ Готовят
раствор фармакопейного стандартного образца гепарина натрия в воде с
концентрацией гепарина натрия около 170 МЕ/мл.

В кювету помещают 1,5 мл титруемого раствора (испытуемый раствор А;
испытуемый раствор Б; испытуемый раствор В), устанавливают подходящую
длину волны в видимой области спектра, прибавляют титрант в малых
количествах до резкого увеличения абсорбции и записывают объём.

_Антигепариновая активность._ Количество связанного гепарина натрия в МЕ
на 1 мг субстанции (_A_) вычисляют по формуле:


[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.3.0005_2.png[]
|===

где	_V~i~_	–	объём титранта, израсходованный на титрование каждого испытуемого раствора, мл; +
	_C~Т~_	–	концентрация гепарина натрия, МЕ/мл; +
	_C~i~_	–	номинальная концентрация протамина сульфата в каждом испытуемом растворе, мг/мл.


_Относительное стандартное отклонение_ антигепариновой активности для
каждого испытуемого раствора должно быть не более 5,0 %.

За результат антигепариновой активности принимают среднее значение из
18 определений.

*_Белок._* Определение проводят методом ВЭЖХ в условиях испытания
«Родственные примеси» со следующими изменениями.

Хроматографируют раствор стандартного образца протамина сульфата и
испытуемый раствор.

Содержание протамина сульфата в процентах (_X_) вычисляют по
формуле:

[cols="^a",grid=none,frame=none]
|===

|image::im_fs_2.3.0005_3.png[]
|===

где	_S~1~_	-	среднее значение суммы площадей пиков пептидов A, B, C, D на хроматограмме испытуемого раствора; +
	_S~0~_	-	среднее значение суммы площадей пиков пептидов A, B, C, D на хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата; +
	_a~1~_	-	навеска субстанции, мг; +
	_a~0~_	-	навеска стандартного образца протамина сульфата, мг; +
	_P_	-	содержание протамина в стандартном образце протамина сульфата, мг; +
	_W_	-	потеря в массе при высушивании,%; +
	_R_	-	содержание сульфатов в субстанции, в%.



[discrete]
===== Хранение

В герметично укупоренной упаковке, в защищённом от света месте.

+*+ Приводится для информации.
   

[cols="^",grid=none,frame=none]
|===

|+________________________________________________________________________________________________________________+
|===


