Между мастопатией и раком молочной железы: факторы риска и патогенетическое лечение

Главным и наиболее активным эстрогеном считается эстрадиол. Однако, согласно современным представлениям, основным фактором, стимулирующим клетки гормон-чувствительных органов и тканей к патологической эстроген-зависимой пролиферации, является не столько сам абсолютный или относительный избыток эстрадиола, сколько нарушение баланса его метаболитов - эстрогенов, имеющих разную способность к активации клеточной пролиферации.

Основной пул эндогенных эстрогенов утилизируется посредством монооксигеназной системы цитохрома Р450. Микросомальные ферменты цитохрома Р450 экспрессируются главным образом в печени, но представлены также в других органах и тканях, в частности в эпителии и строме МЖ. Эта система катализирует образование гидроксипроизводных эстрадиола, что облегчает их растворимость и последующее выведение из организма через почки и желчевыводящие пути. Основными гидроксиметаболитами эстрадиола являются 2-гидроксиэстрон (2-ОНЕ1) и 16α-гидроксиэстрон (16α-ОНЕ1) [4] (см. рис. 7). Цитохром CYP1A1, катализирующий 2-гидроксилирование эстрона, - это индуцибельный изозим, который активируется в ответ на некоторые пищевые ингредиенты и сигаретный дым. В отличие от CYP1A1, активность изофермента, катализирующего 16α-гидроксилирование эстрона, не повышается при добавлении диетических компонентов, но стимулируется в ответ на ксенобиотические канцерогены и пестициды.

Принципиально важно, что 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 имеют противоположные биологические свойства. По сравнению с другими эстрогенами и их метаболитами, 2-гидроксипроизводные обладают относительно низким сродством к эстрогеновым рецепторам [5] и быстро выводятся из кровотока [6], в результате чего понижается количество биодоступных эстрогенов и ослабляется суммарный эстроген-зависимый внутриклеточный сигнал. Поэтому метаболит 2-ОНЕ1 в литературе получил название "хорошего эстрогена". Он практически не влияет на пролиферативную клеточную активность, в большинстве случаев действуя как слабый агонист эстрадиола (низкоактивный эстроген), а в некоторых опытных моделях даже как антиэстроген [7, 8] (см. рис. 8, а). Повышение уровня 2-ОНЕ1 способствует усилению апоптотической гибели и торможению пролиферации опухолевых клеток [9, 10]. В масштабных клинических исследованиях усиление 2-гидроксилирования эстрогенов ассоциировалось с пониженным риском развития РМЖ [11, 12, 13].

Есть сведения о других положительных свойствах 2-ОНЕ1, не относящихся к его геномной активности. Установлено, что низкие (0,5–1,0 мкМ) концентрации 2-ОНЕ1 в несколько раз более эффективно, чем эстрадиол и витамин Е, подавляют окисление липопротеинов низкой плотности до токсичных атерогенных продуктов [14]. Указывается также на участие 2-ОНЕ1 в регуляции секреции гонадотропных гормонов гипофиза [15].

В отличие от "хорошего эстрогена" 2-ОНЕ1, его антипод - "плохой эстроген" 16α-ОНЕ1 - является мощным агонистом эстрадиола. При повышенном уровне 16α-ОНЕ1 патологические пролиферативные и туморогенные процессы в гормон-зависимых органах и тканях репродуктивной системы многократно усиливаются [16]. Это происходит потому, что 16α-ОНЕ1, обладая особой химической структурой (уникальной взаимной ориентацией 16α-ОН-группы и кетогруппы), образует прочные ковалентные связи с эстрогеновым рецептором [17], в результате чего продолжительность эстроген-зависимого пролиферативного сигнала, генерируемого комплексом гормон–рецептор, возрастает до нескольких часов и дней [18, 19] (см. рис. 8, б). Показано, что столь продолжительный гормональный сигнал обусловлен неспособностью стабильного комплекса 16α-ОНЕ1 с ER нормально рециклировать в цитоплазме [17].

Помимо аномальной активации клеточной пролиферации, 16α-OHE1 может взаимодействовать с ДНК и ядерными белками-гистонами, вызывая различного рода генотоксические повреждения наследственного материала [20]. Поэтому повышенное содержание 16α-ОНЕ1 - эстрогенного метаболита с агрессивными протуморогенными свойствами - в настоящее время рассматривается как фактор риска развития РМЖ и других репродуктивных раков [4].

Концепция, предполагающая ведущую роль дисбаланса 2- и 16α-гидроксипроизводных эстрогена в нарушении гормонального равновесия в организме и развитии гормон-зависимых злокачественных опухолей, начала формироваться в 80-х гг. ХХ в. Тогда впервые была установлена значимая 50%-ная активация 16α-гидроксилирования эстрона у женщин с диагностированным РМЖ [21]. Позднее в проведенном в Англии масштабном рандомизированном клиническом исследовании, в котором участвовали 5104 пациентки с РМЖ в возрасте ≥35 лет, наблюдавшиеся в течение девяти с половиной лет, было показано статистически значимое понижение соотношения 2-ОНЕ1/16α-OHE1 в группе постменопаузальных женщин с прогрессирующими опухолями МЖ по сравнению с контрольной группой [22]. В итальянском проспективном исследовании "случай–контроль", в котором участвовало 10 876 женщин 35–69 лет, наблюдавшихся пять с половиной лет, отмечалось достоверное снижение риска развития инвазивного РМЖ у пациенток пременопаузального возраста при повышенном уровне образования физиологического метаболита 2-ОНЕ1 [13].

Другим авторам удалось не только подтвердить статистически значимую обратную зависимость между соотношением 2-ОНЕ1/16α-OHE1 и риском РМЖ [10, 23], но и обнаружить корреляцию между показателями "плохого" и "хорошего" эстрогена и стадией развития опухоли. У пациенток с III и IV стадиями РМЖ определялось более низкое соотношение 2-ОНЕ1/16α-OHE1, чем у пациенток с I и II стадиями [24].

На основании результатов многочисленных клинических исследований было установлено, что для поддержания нормального гормонального баланса у пременопаузальных и постменопаузальных женщин необходимо, чтобы концентрация в организме 2-ОНЕ1 превышала концентрацию 16α-OHE1 как минимум вдвое. При понижении данного соотношения статистически значимо возрастал риск возникновения РМЖ и других видов рака женской репродуктивной системы (рака шейки матки, рака тела матки, рака эндометрия) [4, 25, 26].

Таким образом, соотношение метаболитов эстрадиола 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 было признано универсальным биомаркером и надежным диагностическим критерием при определении риска и прогноза развития эстроген-зависимых опухолей, в частности РМЖ. В норме это соотношение должно быть ≥2.

Результаты клинических исследований, проведенных в России и за рубежом, показали, что пониженное (<2) соотношение гидроксиметаболитов эстрогена 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 наблюдается не только при РМЖ, но и при доброкачественных заболеваниях МЖ, в частности при мастопатии, сопровождающейся циклической масталгией/мастодинией и/или ожирением [10, 27–29]. Величина индивидуального показателя 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 обратно коррелировала с признаками мастопатии на маммограмме [30].

В исследовании, проведенном в 2015 г. в отделении онкогинекологии (руководитель отделения - д-р мед. наук, проф., акад. РАН Л.А. Ашрафян) ФГБУ "Российский научный центр рентгенорадиологии", изучалась частота эндокринно-обменных нарушений у больных РМЖ (n =86) в сравнении с контрольной группой, которую составляли женщины без признаков патологии МЖ (n =50) [29]. Известно, что избыточный вес/ожирение и сопутствующие этому метаболические нарушения (метаболический синдром) являются независимым фактором риска РМЖ [31, 32]. Было показано, что в группе больных РМЖ только 16,3% женщин имели нормальный ИМТ против 56,0% в контроле. Более половины (51,2%) пациенток c РМЖ имели повышенный ИМТ (25,00–29,99) и почти у трети (32,5%) диагностировалось ожирение (ИМТ >30), в то время как в контрольной группе повышенный ИМТ и ожирение выявлялись соответственно в 20 и 24% случаев.

Почему ожирение повышает онкориски?

В разделе "Введение" мы говорили о том, что у женщин с избыточной массой тела повышен уровень агрессивного проканцерогенного метаболита 16α-ОНЕ1 и, напротив, понижен уровень физиологического метаболита 2-ОНЕ1, в результате чего усилена эстроген-зависимая клеточная пролиферация и генетическая нестабильность [10, 33]. Есть данные, что при ожирении в сыворотке крови снижена концентрация глобулина, связывающего половые гормоны, и, как следствие, повышены сывороточные концентрации биодоступных эстрогенов [34, 35]. Показано, что подобная избыточная эстрогенная гиперстимуляция, приводящая к аномальной клеточной пролиферации и генотоксическим повреждениям, происходит на фоне активации протуморогенных процессов воспаления, оксидативного стресса, гипоксии, неоангиогенеза, ЭМП, фиброза, аномальных эпигенетических модификаций и нарушенного клеточного метаболизма [36–40].

Известно также, что жировая ткань является важнейшим эндокринным органом и мощным резервуаром иммунных клеток и провоспалительных молекул (цитокинов, хемокинов, адипокинов), способствующих развитию инсулинорезистентности и опосредующих канцерогенез [37, 41]. Установлено, что связь между ожирением и риском развития диабета, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний обусловлена процессами хронического системного воспаления низкой степени [42–45]. Таким образом, жировая ткань, секретируя широкий спектр системных и паракринных провоспалительных факторов, формирует специфическую протуморогенную среду. При неблагоприятных условиях эта протуморогенная среда может стать составной частью микросреды злокачественной опухоли, внутри которой устанавливаются сложные перекрестные взаимодействия между адипоцитами и раковыми клетками, влияющие на канцерогенез [38].

Наконец, жировая ткань является потенциальным местом накопления высокотоксичных химических веществ - стойких органических загрязнителей, к которым относятся пестициды, полихлорбифенилы, диоксины, фураны и другие опасные органические соединения. Благодаря своей липофильности, стойкие органические загрязнители способны биоаккумулироваться в жировой ткани и при наличии ожирения существенно увеличивать токсическую нагрузку на организм [46]. Даже низкие концентрации таких веществ крайне негативно влияют на репродуктивную, иммунную, эндокринную и нервную систему человека, создавая реальную угрозу для его здоровья и здоровья его потомков. Многие стойкие органические загрязнители вызывают онкологические заболевания. По данным популяционных исследований, накопление диоксинов в женском грудном молоке может повышать риски неопластических процессов в МЖ [47, 48].

Таким образом, наличие у женщины с мастопатией повышенной массы тела или ожирения с большой вероятностью указывает на имеющиеся у нее метаболические нарушения и дисбаланс эстрогенных метаболитов, а следовательно, позволяет отнести ее к группе риска развития эстроген-зависимых опухолевых заболеваний, в частности РМЖ.

Помимо ожирения, на метаболизм эстрогенов негативно влияет прием препаратов ЗГТ. Об этом свидетельствуют результаты зарубежных клинических исследований, а также исследования, проведенного нами в 2007 г. совместно с сотрудниками Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова (руководители исследования - д-р биол. наук, проф., чл.-кор. РАН В.И. Киселев и д-р мед. наук, проф. В.П. Сметник) [30].

Мы изучали динамику состояния МЖ и содержания метаболитов 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 на фоне различных режимов ЗГТ в моче у здоровых постменопаузальных женщин (n =58, средний возраст - 52,4±4,6 года) с жалобами на проявления климактерического синдрома различной степени тяжести. В течение минимум трех месяцев до начала исследования пациентки не получали препараты ЗГТ. Исключались пациентки с опухолями МЖ и другими эстроген-зависимыми злокачественными новообразованиями, обнаруженными в ходе исследования или имевшимися в анамнезе, а также с хроническими заболеваниями (сахарный диабет второго типа, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, патология печени), тромбоэмболическими расстройствами, цереброваскулярными заболеваниями/инсультом и маточными кровотечениями неясной этиологии.

Пациентки, включенные в исследование, были разделены на три группы, отличавшиеся по режиму введения препаратов ЗГТ. Первую группу (n =21) составляли женщины c хирургической менопаузой после гистерэктомии, получавшие монотерапию трансдермальным эстрадиолом. Пациентки второй группы (n =15), имевшие интактную матку, получали комбинацию трансдермального эстрадиола и интравагинального микронизированного прогестерона в непрерывном режиме. Пациентки третьей группы (n =22), также имевшие интактную матку, получали пероральный комбинированный препарат ЗГТ. Длительность приема ЗГТ во всех трех группах составляла 6 мес. Исходно, до начала проведения ЗГТ, у 48% пациенток в 1-й и 2-й группах и у 73% пациенток в 3-й группе на маммограммах отмечалась повышенная маммоплотность (Р2 по шкале Вульфа).

По результатам исследования после 6-месячного приема ЗГТ у пациенток 1-й и 2-й групп уровень антипролиферативного метаболита 2-ОНЕ1 практически не изменился, в то время как уровень агрессивного метаболита 16α-ОНЕ1 повысился примерно вдвое (р <0,05). В итоге среднее соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в обеих группах упало ниже нормы: в 1-й группе - c 3,4 до 1,7 (в 2 раза), а во 2-й группе - с 2,2 до 1,4 (в 1,6 раза), то есть оба режима ЗГТ - монотерапия трансдермальным эстрадиолом (1-я группа) и комбинация трансдермального эстрадиола c интравагинальным микронизированным прогестероном (2-я группа) - привели к одинаковому результату: сдвигу баланса метаболитов эстрогена в неблагоприятную сторону, а значит, к повышению риска РМЖ. В 3-й группе на фоне пероральной комбинированной ЗГТ резко вырос уровень обоих гидроксиметаболитов: 2-ОНЕ1 - в 1,8 раза, 16α-ОНЕ1 - в 4,3 раза (р <0,05). В итоге среднее соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 у пациенток 3-й группы уменьшилось с 2,7 до 1,4, достигнув уровня в 1-й и 2-й группах.

Таким образом, при приеме ЗГТ соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 понижалось примерно вдвое и смещалось в неблагоприятную сторону независимо от способа (трансдермального или перорального) введения прогестина. Но поскольку при трансдермальном режиме конечный уровень протуморогенного генотоксического метаболита 16α-ОНЕ1 был в несколько раз меньше, чем при пероральном, можно сделать вывод о большей безопасности первого способа.

Выявленная нами закономерность соответствовала результатам ранее проведенных зарубежных исследований. В одном из них была установлена взаимосвязь между пероральным приемом ЗГТ (монотерапия эстрогенами и комбинированная эстроген-гестагенная терапия) и уровнем в моче гидроксиметаболитов 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1, а также между ответом пациентки на эстрогенсодержащую ЗГТ и исходным соотношением метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 [49]. Другие авторы показали, что уровень гидроксипроизводных эстрона 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 может зависеть от режима приема препаратов ЗГТ и вида входящих в них прогестинов, а также от влияния средовых факторов (питание, занятия спортом, прием лекарственных препаратов, курение) [50].

В исследовании Lippert et al. женщины постменопаузального возраста с климактерическим синдромом в течение 28 дней принимали перорально эстрадиола валерат в дозе 2 мг/сут (1-я группа) и трансдермально эстрадерм^℘ в дозе 0,05 мг/сут (2-я группа) [51]. Было обнаружено, что при обоих режимах приема ЗГТ усиливалась экскреция гидроксиэстронов с мочой, однако динамика этого процесса в указанных группах существенно различалась. При пероральном приеме эстрадиола в высокой дозе уровень 2-ОНЕ1 повышался в 36,5, а 16α-ОНЕ1 - в 24,2 раза. При трансдермальном низкодозном режиме уровень 2-ОНЕ1 увеличивался в 2,7, а 16α-ОНЕ1 - в 6,2 раза. Таким образом, в 1-й группе исходно пониженное соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 возрастало с 1,0 до 1,5 (улучшалось) при высоком конечном уровне "плохого эстрогена" 16α-ОНЕ1, а во 2-й группе исходно нормальное соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 уменьшалось с 2,3 до 1,0 (ухудшалось) при более низком по сравнению с 1-й группой уровне метаболита 16α-ОНЕ1, однако в обеих группах конечные показатели 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 были ниже нормы.

Заметим, что у пациенток, составлявших 1-ю группу, то есть у половины участниц данного исследования, средняя величина соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 до начала приема ЗГТ составляла 1,0. Поскольку авторы не указывают на наличие у них никакой другой патологии, можно предположить, что климактерический синдром в постменопаузе может сопровождаться нарушением обмена эстрогенов (низким соотношением метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1).

В проспективном клиническом исследовании Murkes et al. было показано, что в постменопаузе респонсивность МЖ при приеме гормональных препаратов определяется не только способом и режимом их применения, но и происхождением их активных компонентов [52]. Природный эстрадиол в составе геля, применяемого трансдермально в циклическом режиме, в сочетании с пероральным микронизированным прогестероном не вызывал заметного усиления пролиферации маммарного эпителия на клеточном и транскрипционном уровне. Более того, при этом даже несколько усиливался апоптоз (понижался уровень антиапоптотического белка Bcl-2). В то же время пероральный прием синтетического прогестерона в составе препарата медроксипрогестерона (Медроксипрогестерона ацетата^#) в сочетании с препаратом конъюгированных лошадиных эстрогенов, напротив, существенно стимулировал пролиферацию эпителия МЖ и повышал маммоплотность. По данным молекулярно-генетического анализа, в первом случае происходило изменение экспрессии порядка 600 генов, во втором - около 2500.

Таким образом, мы видим, что во всех случаях на фоне приема препаратов постменопаузальной ЗГТ (трансдермальный эстрадиол, комбинация трансдермального эстрадиола и интравагинального микронизированного прогестерона, пероральный комбинированный препарат ЗГТ )наблюдается уменьшение соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 до значений ниже нормальных, что свидетельствует о сдвиге гормонального баланса в неблагоприятную сторону и повышении риска эстроген-зависимых пролиферативных заболеваний.

В заключение необходимо подчеркнуть, что молочная железа в отношении влияния на нее гормонального фактора занимает в организме особое место. Она является уникальным интракринным гормон-зависимым органом, в составе которого имеются все необходимые ферменты для локального синтеза и метаболизма эстрогенов. Известно, что концентрация эстрадиола в сыворотке крови зачастую не отражает уровень данного гормона, продуцируемого клетками МЖ. В то же время концентрации эстрогенов в маммарной ткани в значительной степени определяются локальным уровнем и соотношением в ней ключевых эстрогенных гидроксиметаболитов - 2-OHE1 и 16α-OHE1.

В многочисленных зарубежных клинических исследованиях 1990–2000-х гг., в том числе рандомизированных двойных слепых плацебо-контролируемых, было установлено, что I3C, принимаемый перорально в дозе 300–400 мг/сут в течение 1–3 мес, обладает выраженным антиэстрогенным эффектом и стимулирует образование "хорошего эстрогена" 2-ОНЕ1, улучшая таким образом соотношение метаболитов 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 в пользу первого (метаболиты эстрогена определялись в моче). При этом нормализация эстрогенного баланса поддерживалась на протяжении нескольких месяцев после прекращения приема I3C, а сам долговременный прием I3C не вызывал негативных побочных эффектов [53–57].

Параллельно с этим изучалась онкопрофилактическая активность I3C в составе его природного источника - овощей семейства крестоцветных (капуста брокколи, кочанная капуста, цветная капуста, брюссельская капуста, листовая капуста). В одном из таких исследований было показано увеличение соотношения метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 на 0,4 единицы у здоровых добровольцев, которым на протяжении 12 дней ежедневно в состав дневного рациона добавляли 500 г капусты брокколи [58]. Ранее в экспериментах in vivo на моделях РМЖ и рака эндометрия было установлено повышение уровня 2-гидроксилирования эстрогенов в печени под действием добавляемого в корм животным индивидуального I3C [59, 60], а также I3C в составе кочанной и листовой капусты в сочетании с низкожировой диетой [61]. При этом нормализация эстрогенного баланса в присутствии I3C сопровождалась выраженным противоопухолевым эффектом - снижением частоты и торможением развития опухолевых и предопухолевых очагов. У животных, потреблявших I3C, отмечалось также снижение частоты развития фиброаденомы МЖ.

В 1996 г. были опубликованы результаты международного сравнительного исследования, в котором анализировались данные, предоставленные официальными органами 66 стран с целью определения наиболее важных предикторов смертности от РМЖ [62]. Учитывались такие факторы, как потребление табака и алкоголя на душу населения, социально-экономический статус, репродуктивные факторы и широкий спектр диетических показателей. В итоге было показано, что смертность от рака груди возрастает при повышенном потреблении населением продуктов животного происхождения. В то же время в странах с высоким уровнем потребления крестоцветных овощей, напротив, отмечалась пониженная смертность от РМЖ. В проведенном в 1990-е гг. в США масштабном проспективном исследовании, в котором участвовало более 80 тыс. женщин 33–60 лет, было установлено статистически значимое снижение риска РМЖ при длительном употреблении в пищу различных видов капусты [63]. Данные эпидемиологических исследований и мета-анализов последних лет подтверждают, что высокое потребление овощей семейства крестоцветных [64], в том числе крестоцветных с высоким содержанием метаболических предшественников I3C [65], уменьшает риск РМЖ на 15–50%.

Таким образом, стало понятно, что онкопрофилактическая активность I3C, как минимум отчасти, обусловлена его способностью нормализовать метаболизм эстрогенов.

В клиническом исследовании, проведенном в 2008–2014 гг. в ФГБУ "Российский научный центр рентгенорадиологии" (руководитель исследования - д-р мед. наук, проф., акад. РАН Л.А. Ашрафян), изучали соотношение метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 и его фармакологическую коррекцию у больных разными типами РМЖ при назначении им биологически активной добавки Индинол^® (активное вещество - высокоочищенный индолкарбинол) (АО "МираксБиоФарма", Россия) [29, 66].

Из 136 женщин, включенных в исследование, 42 пациентки были объединены в группу с морфологически подтвержденным гормон-зависимым РМЖ, 44 - в группу с гормон-независимым РМЖ, в контрольную группу вошли 50 женщин без признаков патологии МЖ. Средний возраст пациенток с РМЖ составлял 47,3±4,1 года, пациенток в контрольной группе - 49,6±2,5 года. Среди больных РМЖ преобладали пациентки с ранними стадиями заболевания. На первом этапе лечения всем больным РМЖ было выполнено хирургическое лечение в объеме мастэктомии по Маддену с последующим иммуногистохимическим определением уровня гормональных рецепторов, в зависимости от которого решался вопрос о назначении им антиэстрогенной терапии. На втором этапе проводилась лучевая терапия и химиотерапия по стандартным схемам. В послеоперационном периоде все пациентки с РМЖ принимали Индинол^® 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 4 капсулы) в течение 6 мес. У всех участниц исследования определяли абсолютный уровень и соотношение метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 в моче с использованием иммуноферментного набора ESTRAMET 2/16 ELISA (IMMUNA CARE CORPORATION, США).

В итоге у больных РМЖ после 3 мес приема Индинола^® в послеоперационном периоде наблюдалось заметное улучшение метаболизма эстрогенов: существенно уменьшался уровень 16α-ОНЕ1 (с 18,63 до 12,00 нг/мл) и повышался уровень 2-ОНЕ1 (с 7,8 до 11,31 нг/мл), в результате чего соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 возрастало более чем в 2 раза (с 0,42 до 0,94). Через 6 мес приема Индинола^® у больных РМЖ исходно пониженное соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 полностью восстанавливалось до нормы и составляло 2,31. При этом продукция агрессивного метаболита 16α-ОНЕ1 была втрое ниже (6,2 против 18,63 нг/мл), а физиологического метаболита 2-ОНЕ1, напротив, почти вдвое выше (14,14 против 7,8 нг/мл), чем до начала лечения (см. рис. 9). Важно отметить, что в данном исследовании нормализация соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 на фоне длительного приема Индинола^® происходила у пациенток как с гормон-зависимым, так и с гормон-независимым РМЖ, хотя динамика этого процесса в указанных группах несколько различалась (см. рис. 10). У женщин контрольной группы соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 соответствовало норме и составляло в среднем 2,09, при средних показателях содержания 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1 25,08 нг/мл и 12,00 нг/мл соответственно.

В 2013 г. были опубликованы результаты отечественного рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого многоцентрового исследования, в котором изучалась эффективность лекарственного препарата индолкарбинол (Индинол Форто^®) у пациенток с диагнозом циклическая масталгия/мастодиния, в том числе на фоне доброкачественной дисплазии МЖ [28]. В исследовании участвовало 156 женщин 20–45 лет (средний возраст - 33 года). Стаж мастопатии в среднем составлял 2 года. В течение шести менструальных циклов пациентки основной группы (n =104) получали индолкарбинол (Индинол Форто^®) 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 2 капсулы), пациентки контрольной группы (n =52) получали плацебо.

Клиническая эффективность препарата оценивалась на основании данных дневников пациенток, протоколов УЗИ и результатов пальпаторного обследования МЖ, проводимого врачом. Данные дневников включали расчет и анализ средней интенсивности боли в МЖ в течение менструального цикла (всего 6 циклов), а также дней в цикле (%), в которые отмечалось нагрубание МЖ. Критерием эффективности лечения мастодинии являлся факт уменьшения (снижение более чем на 2 балла по визуально-аналоговой шкале) либо исчезновения нагрубания и боли в МЖ.

Отдельно оценивалась эффективность лечения пациенток, у которых циклическая масталгия (мастодиния) развилась как проявление доброкачественной дисплазии МЖ (мастопатии). В настоящем исследовании таких пациенток было 104 из 154 (67,5% от общего числа участниц): 70 - в группе индолкарбинола (Индинола Форто^®) и 34 - в группе плацебо. Частота мастопатии в группах индолкарбинола (Индинола Форто^®) и плацебо значимо не различалась (р =1,0, точный критерий Фишера). Диагноз устанавливался по данным УЗИ (наличие диффузных изменений МЖ и кист). Критерием эффективности лечения мастопатии признавался факт уменьшения числа и/или размеров кист, исчезновения дуктэктазии, снижения эхоплотности МЖ при УЗИ, а также нормализации либо положительной динамики плотности и однородности МЖ по данным пальпации.

У всех пациенток в начале и в конце исследования (через 6 мес терапии) проводилось определение уровня метаболитов эстрогенов в моче с помощью иммуноферментного набора ESTRAMET 2/16 ELISA (IMMUNA CARE CORPORATION, США).

В итоге после 6 мес лечения у 82,0% пациенток, принимавших индолкарбинол (Индинол Форто^® ), отмечалось увеличение (нормализация) и у 18,0% - уменьшение соотношения метаболитов эстрогена 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1. В группе плацебо эти показатели составляли соответственно 43,3 и 56,7% (р =0,001, точный критерий Фишера), при этом, в отличие от основной группы, средний показатель 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 все еще не достигал нормы (был <2) (см. рис. 11, а).

При изучении изменений гормонального профиля пациенток на фоне лечения в группе индолкарбинола (Индинола Форто^®) через 3 и 6 мес терапии был установлен динамический прирост содержания в плазме крови глобулина, связывающего половые стероиды. Можно предположить, что увеличение плазматического глобулина, связывающего половые стероиды, при приеме индолкарбинола (Индинола Форто^®) приводит к уменьшению фракции свободных эстрогенов и ослаблению общего эстрогенного фона. Как говорилось выше, для женщин с ожирением характерен пониженный уровень данного глобулина и повышенный уровень биодоступных эстрогенов [34, 35].

Важно подчеркнуть, что нормализация эстрогенного баланса при приеме индолкарбинола (Индинола Форто^®) сопровождалась выраженным улучшением симптоматики и клинической картины заболевания. По субъективному критерию оценки "боль в МЖ" (данные дневников пациенток), эффективность лечения в общей основной группе пациенток, принимавших индолкарбинол (Индинол Форто^® ), значимо превышала эффективность в общей группе плацебо как после трех (80,2 против 61,5%; р =0,044, точный критерий Фишера), так и после шести (84,4 против 53,3%; р =0,002, точный критерий Фишера) месяцев терапии (см. рис. 11, б). В подгруппе пациенток с мастопатией через 6 мес лечения индолкарбинолом (Индинолом Форто^®) эффективность терапии была также значимо выше по сравнению с плацебо и составляла 85,1 против 50,0% (р =0,004, точный критерий Фишера) (см. рис. 11, в). Полученные данные приобретают особую значимость в связи с тем, что в настоящее время циклическая масталгия рассматривается как достоверный клинический маркер повышенного риска РМЖ (см. раздел "Введение").

По данным пальпаторного обследования, проведенного через 6 мес терапии, эффективность лечения была значимо выше по сравнению с группой плацебо как в общей основной группе (60,0 против 31,4%; р =0,011, точный критерий Фишера), так и в подгруппе пациенток с мастопатией (60,4 против 29,2%; р =0,023, точный критерий Фишера) (см. рис. 11, г).

По данным УЗИ, в группе индолкарбинола (Индинола Форто^®) через 6 мес терапии уменьшение размеров кист отмечалось у 18%, стабилизация кист - у 71%, рост кист - у 11% пациенток. В группе плацебо стабилизация размеров кист наблюдалась у 75%, рост кист - у 25% пациенток, уменьшения размеров кист отмечено не было (см. рис. 11, д). Побочные эффекты в группах плацебо и индолкарбинола (Индинола Форто^®) наблюдались с одинаковой частотой и не требовали отмены препарата. В целом врачами и пациентами отмечалась хорошая переносимость терапии.

Данные, подтверждающие высокую эффективность препарата индолкарбинол (Индинол Форто^®) и биологически активной добавки Индинол^® при лечении различных форм фиброзно-кистозной мастопатии были получены и во многих других клинических исследованиях, проведенных на больших выборках пациентов в московских и региональных медицинских центрах РФ в период с 2007 по 2020 г. [67–73]. В общей сложности в этих исследованиях участвовало около 1 тыс. женщин пременопаузального возраста. При этом у подавляющего большинства пациенток, принимавших индолкарбинол (Индинол Форто^®) и Индинол^® , отмечались:

Таким образом, на фоне приема лекарственного препарата индолкарбинол (Индинол Форто ^® ) в течение 3–6 мес нормализуется баланс метаболитов эстрогена, сниженный при злокачественных и доброкачественных заболеваниях МЖ, улучшается клиническая картина заболевания и субъективное состояние пациентов.

Необходимо отметить, что I3C - активный компонент индолкарбинола (Индинола Форто^®) и Индинола^® - это весьма нестабильное соединение, которое в кислой среде желудка быстро превращается в несколько олигомерных производных, главным из которых является его димерная форма -3,3’-дииндолилметан (англ. 3,3’-diindolylmethane, DIM) [74]. Показано, что I3C после перорального приема обнаруживается в плазме крови животных лишь в течение первых 45 мин [75], а в плазме крови человека не определяется совсем. Одновременно с этим на фармакокинетических графиках регистрируется появление характерного пика DIM, амплитуда которого плавно убывает в течение последующих нескольких часов [76, 77]. Есть сведения о самопроизвольной конверсии I3C в DIM в условиях in vitro при нейтральных значениях водородного показателя рН, в результате чего минимум 50% от исходного I3C превращается в DIM и устанавливается приблизительно эквимолярное соотношение указанных индолов [74, 78, 79].

В многочисленных исследованиях было установлено, что DIM обладает практически всем набором противоопухолевых свойств, присущих I3C [80–84], в том числе способностью нормализовать метаболизм эстрогенов у пациентов с РМЖ, ДЗМЖ, а также с предраковыми и доброкачественными заболеваниями других гормон-зависимых органов [27, 85–88]. Показано, что в условиях in vitro DIM как индивидуальное вещество проявляет высокую стабильность и бо́льшую, чем его метаболический предшественник, биологическую активность [89–92]. В связи с этим большинство авторов справедливо полагают, что положительные терапевтические эффекты при приеме I3C обусловлены его физиологическим метаболитом - DIM. В то же время есть данные, указывающие на самостоятельную противоопухолевую активность I3C в экспериментах in vitro и in vivo [75, 93, 94].

По результатам рандомизированного плацебо-контролируемого клинического исследования, проведенного Zeligs et al., у здоровых женщин пременопаузального возраста, принимавших перорально нутрицевтик BioResponse-DIM (BR-DIM) [Indolplex^® ] (BioResponse, LLC, Boulder, CО, США) в суточной дозе 60 мг DIM (4 капсулы, 1 раз в сутки), симптоматическое облегчение боли в МЖ, ассоциированной с масталгией, отмечалось уже через 1 мес приема. Через 3 мес приема в опытной группе статистически значимо уменьшалась продолжительность и выраженность масталгии, в то время как в группе плацебо уменьшения боли в МЖ не наблюдалось [27]. Улучшение симптоматики масталгии на фоне приема BR-DIM сопровождалось повышением уровня циркулирующего метаболита 2-ОНЕ1 и сдвигом соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в благоприятную сторону.

Cогласно определению, эпигенетика является разделом генетики, который изучает наследуемые изменения экспрессии генов, не связанные с изменениями последовательности ДНК. Приставка "эпи" (греч. ἐπι - над, выше, внешний) подразумевает влияние факторов, действующих поверх или в дополнение к традиционным генетическим факторам наследственности, то есть таких факторов, которые не могут быть объяснены с классических позиций генетического кода.

У истоков этой науки стоял британский биолог Конрад Хэл Уоддингтон (1905–1975). Считается, что именно он впервые ввел термин эпигенетика и (еще до наступления эры молекулярной биологии!) обозначил предмет ее изучения - "причинные взаимодействия между генами и их продуктами, создающими фенотип" [1]. В 1957 г. Уоддингтон предложил концепцию "эпигенетического ландшафта" , которая метафорически описывала воздействие генов на развитие организма и объясняла формирование разнообразных клеточных типов в ходе дифференцировки эмбриональных стволовых клеток [2, 3]. Он провел аналогию между меняющимся под влиянием внешних условий географическим ландшафтом, формирующим русло реки, и динамичным "эпигенетическим рельефом", определяющим судьбу неспециализированной стволовой клетки - потомка оплодотворенной яйцеклетки (траекторию движения мраморного шарика с вершины горы к ее подножию,рис. 13 ). Ученый полагал, что в рамках предложенной им модели по мере продвижения шарика вниз по склону изначально неограниченное число возможных траекторий его спуска (вариантов клеточной судьбы) будет неуклонно сокращаться, в результате чего останется один возможный путь с единственным конечным исходом (траекторией онтогенеза).

Исторический метафорический рисунок Уоддингтона удивительно точно отражал суть эпигенетической концепции, однако ее содержание за прошедшие десятилетия качественно изменилось и расширилось. Сегодня эпигенетика не ограничивается объяснением процессов дифференцировки и формирования клеточного многообразия в организме (хотя следует признать, что в свое время это было гениальным предвидением ее основоположника), а рассматривается как биологическая основа сложнейшей системы регуляции генной активности, формирующей не что иное, как "второй информационный код жизни".

Современная эпигенетика - это новая молодая наука, находящаяся на стыке генетики и молекулярной биологии, темпы развития которой абсолютно беспрецедентны. В 2008 г. несколько научно-исследовательских центров Национального института здоровья США инициировали масштабный проект, нацеленный на полную расшифровку эпигенома более ста различных типов человеческих клеток. Организатором данного проекта с инвестированием около двухсот миллионов долларов выступил Международный консорциум по эпигеному человека. Впоследствии были разработаны единые рекомендации по регламенту эпигенетических исследований и созданы общедоступные базы эпигенетических данных, что значительно ускорило и вывело на качественно новый уровень научные изыскания в данной области.

По значимости совершаемых открытий и масштабу открывающихся возможностей эпигенетика ставится в один ряд с такими эпохальными достижениями в естествознании, как теория эволюции Дарвина, открытия Менделя и установление структуры ДНК. Можно сказать, что современная эпигенетика - это огромная научная индустрия, которая предлагает новые, ранее недоступные возможности для диагностики и лечения многих опасных заболеваний, прежде всего онкологических. Ученые по праву называют ХХI в. веком эпигенетики и предсказывают, что расшифровка эпигенетических механизмов развития и жизнедеятельности живых организмов приведет к настоящей революции в биологии и медицине. Уже сейчас открытия в области эпигенетики кардинально меняют устоявшиеся научные теории и парадигмы.

Что же такое эпигенетика с точки зрения молекулярной биологии? И как именно она влияет на экспрессию генов, не меняя при этом структуру ДНК?

В основе эпигенетической регуляции лежит доказанный факт пластичности (непостоянства )генной экспрессии . Оказалось, что, при безусловно главенствующей роли последовательности ДНК как базового носителя наследственной информации, в функциональном смысле геном - это весьма подвижная и динамичная структура, в которой, начиная с ранних периодов морфо- и эмбриогенеза и на протяжении всей последующей жизни организма, уровень активности (экспрессии) генов под влиянием различных внешних и внутренних факторов претерпевает многочисленные изменения. Поэтому иногда эпигенетику называют еще "прижизненной генетикой".

Такая прижизненная регуляция активности генов осуществляется посредством эпигенетических модификаций (химических реакций), обусловленных ковалентным присоединением/диссоциацией химических групп к определенным нуклеотидам цепочки ДНК, а также к аминокислотным остаткам белков - гистонов хроматина. В результате подавляется или, наоборот, усиливается экспрессия функционально важных генов и, соответственно, понижается или увеличивается выработка кодируемых ими белков. Самыми известными и наиболее изученными эпигенетическими модификациями, приводящими к ингибированию генной экспрессии, являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов хроматина .

ДНК-метилирование, или ковалентное присоединение метильной группы (–CH₃ ) к молекуле ДНК, происходит по пятому углеродному атому пиримидинового кольца основания цитозина под действием фермента ДНК-метилтрансферазы (англ. DNA-methyltransferase, DNMT) в строго определенных CpG(цитозин-фосфат-гуанозин)-динуклеотидных участках. Донором метильных групп в данной реакции выступает S-аденозил-метионин (см. рис. 14, а ).

У млекопитающих обнаружены три изофермента DNMT: DNMT1, DNMT3A и DNMT3B. DNMT1 - это главный широко экспрессирующийся ДНК-метилирующий изозим, который поддерживает нормальный уровень метилирования после репликации, добавляя необходимые метильные группы к полуметилированным/частично метилированным CpG-сайтам вновь образованной копии ДНК. Два других изофермента являются метилтрансферазами de novo , которые действуют независимо от репликации и одинаково активны в отношении как неметилированной, так и частично метилированной ДНК. Известны примеры, когда спектры активностей трех ДНК-метилтрансфераз взаимно перекрываются и они функционально замещают друг друга [4, 5].

Описаны два механизма подавления генной экспрессии, обусловленных ДНК-метилированием. В первом случае напрямую блокируется связывание фактора транскрипции с целевой последовательностью ДНК. Второй, доминирующий, механизм действует опосредованно с привлечением особых метилсвязывающих белков, которые специфически взаимодействуют с метилированной ДНК и рекрутируют к промоторному участку гена другие репрессоры и корепрессоры транскрипции. К ним относятся гистонмодифицирующие репрессорные ферменты, в первую очередь гистондеацетилаза (см. ниже). В результате формируются мультимолекулярные репрессорные комплексы и создаются стерические пространственные затруднения для инициации транскрипции.

СpG-динуклеотиды, подвергающиеся ДНК-метилированию, распределены в геноме не случайным образом. Их концентрация повышена в генных промоторах - регуляторных участках инициации транскрипции, где они образуют кластеры ("СpG-островки") приблизительно в 60% белок-кодирующих генов млекопитающих [6–8]. В здоровых клетках большинство промоторных CpG-динуклеотидов находится в неметилированном состоянии. Присоединение метильной группы к промоторной области опухоль-супрессорного гена (самостоятельно или в сочетании с диссоциацией ацетильного остатка от гистонов) приводит к подавлению его транскрипции и функциональной блокаде - так называемому "эпигенетическому умолканию" ("сайленсингу"). В итоге противоопухолевая защита организма снижается.

В опухолевых клетках, помимо характерного для них промоторного гиперметилирования онкосупресcорных генов, имеет место общее (глобальное) гипометилирование - сниженный по сравнению с нормой уровень 5-метилцитозина в составе CpG-динуклеотидов, локализованных вне промоторных CpG-островков. В результате глобального гипометилирования происходит активация транскрипции блокированных в норме участков генома, кодирующих тандемные ДНК-повторы и мобильные генетические элементы (ретротранспозоны), что стимулирует мутагенез, аномальную рекомбинацию и генетическую нестабильность [9].

Значительно реже, чем локальное промоторное гиперметилирование, в раковых клетках обнаруживается локальное промоторное гипометилирование ДНК. Понижение уровня метилирования происходит в промоторных участках протоонкогенов (потенциальных онкогенов), что приводит к активации их экспрессии и усилению канцерогенеза [10]. К числу генов, подвергающихся локальному гипометилированию и функциональной активации при РМЖ, относится, в частности, ген множественной лекарственной устойчивости MDR1 [11]. Он кодирует трансмембранный гликопротеин PgP, экспортирующий из клетки лекарственные соединения и опосредующий опухолевую резистентность к стандартной противоопухолевой терапии.

Заметим, что первооткрывателем процесса ДНК-метилирования был ныне здравствующий российский ученый, проф., чл.-корр. РАН Борис Федорович Ванюшин. Еще в 1970 г. он обнаружил явление "тканевой (клеточной) разнокачественности метилирования ДНК" (факт того, что в разных клетках одного и того же организма ДНК метилирована по-разному) и впервые сформулировал мысль о том, что ДНК-метилирование - это механизм регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировки. В 1960–70-х гг. Б.Ф. Ванюшин с коллегами первыми показали, что уровень метилирования ДНК у позвоночных меняется с возрастом и что нарушение этого процесса связано с развитием онкологических заболеваний. Впоследствии работы российских ученых привлекли внимание исследователей за рубежом и послужили толчком к широкому исследованию ДНК-метилирования во всем мире.

Второй ключевой механизм эпигенетической инактивации генов - деацетилирование гистонов хроматина ^[11] - осуществляется с помощью фермента гистондеацетилазы (англ. histone deacetylase, HDAC), точнее, обширного суперсемейства, состоящего из множества изоферментов (18 у человека), сгруппированных в четыре класса. Ферменты HDAC - эволюционно очень древние белки, которые появились еще у прокариот.

Ацетилированные гистоновые белки поддерживают хроматин в деконденсированном ("рыхлом") состоянии в виде транскрипционно активного эухроматина, с которого свободно считывается генетическая информация. Это происходит благодаря тому, что ацетилирование N-концевых участков ("N-хвостов") гистонов нейтрализует их положительный заряд (обусловленный аминокислотами лизином и аргинином) и уменьшает способность гистонов связываться с отрицательно заряженными фосфатными группами остова ДНК. Гистоновые деацетилазы, удаляя ацетильную группу с N-хвоста гистона, увеличивают его положительный заряд и усиливают связывание гистона с остовом ДНК, что приводит к конденсации структуры хроматина и образованию неактивного ("плотного") гетерохроматина. Более плотная упаковка ДНК уменьшает ее доступность для транскрипционных факторов и, как следствие, ослабляет транскрипцию. Ингибирование HDAC, напротив, приводит к подавлению деацетилирования (то есть к усилению ацетилирования), "разрыхлению" хроматина и активации транскрипции (см. рис. 14, б ).

Обратимое ацетилирование/деацетилирование является самым распространенным и наиболее изученным, но далеко не единственным способом эпигенетической модификации гистонов хроматина. У млекопитающих животных и человека гистоны могут подвергаться также моно-, ди-, триметилированию, фосфорилированию, убиквитинилированию, сумоилированию, гликозилированию, АДФ-рибозилированию, карбонилированию, цитруллинированию, биотинилированию и некоторым другим биохимическим процессам.

Множественные модификации гистонов осуществляются под контролем соответствующих ферментов и составляют биологическую основу широкой информационной сети, регулирующей генную экспрессию посредством изменения плотности упаковки хроматина. Густота расположения гистонов и компактизация ДНК в конкретном участке генома определяют доступность расположенных там генов для ядерного транскрипционного аппарата. Современная наука доказала, что подобное изменение структуры хроматина - это не просто сумма отдельных независимых химических реакций, а невероятно сложноорганизованный, динамичный процесс, объединяющий множество разнообразных и взаимосвязанных гистоновых модификаций. Эти модификации могут привлекать различные белки и ферменты, регулирующие транскрипцию, и в итоге по-разному интерпретироваться сигнальной клеточной системой, усиливая или ослабляя активность генов. Комбинация таких модификаций, создающая эпигенетическую маркировку и определяющая конечную генную экспрессию в клетке или группе клеток, получила название гистонового кода [12, 13].

Как мы уже говорили, ферменты DNMT и HDAC часто функционируют в виде единого мультимолекулярного репрессорного комплекса, в состав которого, помимо них самих, входят другие регуляторные белки и ферменты, контролирующие генную транскрипцию [14–16] (см. рис. 15 ). В связи с этим некоторые авторы образно сравнивают процесс ДНК-метилирования, приводящий к стойким эпигенетическим изменениям, с "механическим выключателем" экспрессии генов, а гистоновые модификации, в силу их разнообразия и множественности, - с "регулятором громкости" - инструментом более тонкой настройки генной активности [17].

Кроме химических модификаций ДНК и гистонов хроматина, существует отличный от них, третий базовый механизм эпигенетической регуляции, который реализуется посредством особого класса коротких (18–25 нуклеотидов) одноцепочечных молекул РНК - микроРНК (см. рис. 14, в ). МикроРНК связываются c частично или полностью комплементарными сайтами в 3’-нетранслируемых участках целевой молекулы матричной мРНК, в результате чего частично или полностью подавляется синтез белка (в последнем случае мРНК подвергается деградации). Продукция функционально активных молекул микроРНК в клетке осуществляется в несколько этапов. Сначала в ядре происходит транскрипция генов, кодирующих микроРНК, а затем транскрипты микроРНК подвергаются процессингу и созреванию в цитоплазме.

На данный момент у человека идентифицировано более 2500 различных микроРНК [18, 19], мишенями которых являются более 60% белок-кодирующих генов. При этом одна молекула микроРНК может регулировать множество целевых мРНК, и, наоборот, одна мРНК может контролироваться одновременно несколькими разными микроРНК. Установлено, что не менее трети от общего числа транскриптов мРНК регулируется с помощью микроРНК [20, 21]. По данным масштабных полногеномных исследований, общее снижение экспрессии микроРНК наблюдается при многих видах рака, в том числе при РМЖ [22].

Необходимо отметить, что, помимо микроРНК, в процессах эпигенетической регуляции участвуют и другие виды регуляторных некодирующих РНК, в частности, малые интерферирующие РНК, антисмысловые РНК, а также активно изучающиеся в последнее время длинные некодирующие РНК (более подробно свойства и функции некодирующих микроРНК и длинных РНК мы обсудим в III части книги, см. главу 7, раздел 7.7: "Некодирующие РНК и эпигенетическая регуляция. Белок-некодирующая часть генома, кодирующая микроРНК и длинные некодирующие РНК как вероятный главный источник наследуемой маммоплотности").

Все три механизма эпигенетической регуляции тесно связаны между собой на функциональном и генетическом уровне. Это касается не только кооперации процессов ДНК-метилирования и деацетилирования гистонов. Показано, что при многих видах рака мишенями аберрантного ДНК-метилирования, помимо белок-кодирующих опухоль-супрессорных генов, являются гены микроРНК [23]. И наоборот, экспрессия DNMT (и других эпигенетических ферментов) может регулироваться на посттранскрипционном уровне с помощью молекул микроРНК [24].

Принципиально важно, что эпигенетические модификации, или, как их еще называют, "эпимутации", в отличие от истинных генетических мутаций, не затрагивают структуру ДНК и являются потенциально обратимыми, а значит, могут регулироваться многочисленными средовыми факторами. Действительно, трудно найти фактор внешней и внутренней среды организма, который не влиял бы на его эпигеном. Доказано, что на активность генов у человека влияют возраст, особенности питания и образа жизни, инфекционные агенты, неблагоприятная экология, хронические патологические процессы, лекарственная терапия, эмоциональный стресс и многие другие стимулы. При этом эпигенетические изменения, вызываемые внутренними и внешними индукторами, всегда направлены на усиление адаптации клетки и всего организма к изменившимся условиям их существования.

Еще одной важной особенностью эпимутаций является то, что они не только сохраняются в ходе последовательных митотических делений соматических клеток, но и могут передаваться следующим поколениям при мейозе. Именно поэтому под эпигенетикой в широком смысле понимают наследственные изменения генной экспрессии, не связанные с изменением последовательности ДНК [1, 25, 26], или стабильные изменения фенотипа без изменений генотипа [27]. Такое понимание создает совершенно новые отправные точки для эффективных профилактических программ оздоровления, а каждому человеку как отдельному индивиду предоставляет возможность влиять не только на собственную биологическую судьбу, но и на биологическую судьбу своих потомков [28].

Мы рассказали об основных эпигенетических процессах, приводящих к подавлению экспрессии и инактивации генов. Конечно, в реальной живой клетке человеческого организма все устроено гораздо сложнее и в работу эпигенетического аппарата, помимо вышеперечисленных, вовлечено огромное количество других биологически активных молекул. Однако если максимально упростить суть эпигенетической регуляции в опухолевых и трансформированных клетках, то три ее базовых механизма можно уподобить своеобразным "молекулярным меткам", которыми в определенные моменты времени "маркируются" те или иные участки генома (см. рис. 16 ). Такая "эпигенетическая маркировка" означает переход регулируемого опухоль-супрессорного гена в статус "молчащего". Маркированный эпигенетически молчащий ген перестает работать как матрица для считывания информации и функционально инактивируется аналогично тому, как это происходит в случае его классической генетической мутации, однако структура гена при этом не нарушается. Обратимость, а следовательно, регулируемость эпигенетических механизмов подразумевает возможность "снятия маркировки" с молчащего опухоль-супрессорного гена фармакологическими агентами (например, удаление связанной с его промотором метильной группы с помощью ингибитора DNMT или повышение уровня ацетилирования гистонов хроматина при помощи ингибитора HDAC), возвращения гена в исходное функционально активное состояние и повышения общей противоопухолевой защиты организма.

В заключение приведем несколько примеров, иллюстрирующих проявление эпигенетической регуляции у человека.

Один из самых известных фактов, подтверждающих действие эпигенетики в нормальных физиологических условиях, - существование в человеческом организме десятков триллионов генетически идентичных клеток, имеющих разную специализацию. Сегодня мы знаем, что благодаря эпигенетически обусловленным механизмам клеточной дифференцировки более 200 типов клеток, составляющих различные органы и ткани человека, могут по-разному использовать информацию, содержащуюся в их генах. Обладая одним и тем же геномом, но имея разные эпигеномы, в составе которых активируется экспрессия одних и блокируется экспрессия других генов, клетки приобретают специфический фенотип, необходимый для их нормального функционирования.

Другой классический пример - это неодинаковая предрасположенность однояйцевых близнецов к заболеваниям (в том числе наследственным), которая часто усиливается с возрастом. Имея одинаковый набор генов, но разные (в силу разной чувствительности к влиянию факторов внешней среды) "эпигенетические инструкции", регулирующие их работу, идентичные близнецы могут болеть разными болезнями и иметь разную продолжительность жизни.

Последние несколько десятилетий изучения генетической активности у различных видов живых организмов ознаменовались открытием целого ряда уникальных эпигенетических феноменов. Один из них - геномный импринтинг, при котором аллели гена имеют разный профиль метилирования и уровень экспрессии в зависимости от того, от родителя какого пола они получены. Другие примеры: инактивация Х-хромосомы - механизм, уравнивающий дозу Х-сцепленных генов между мужским (ХY) и женским (ХХ) полом, и супрессия повторяющихся ДНК-последовательностей. Установлено, что процесс старения как этап онтогенеза также является эпигенетическим, а значит, потенциально управляемым с точки зрения возможности продления активной и здоровой человеческой жизни.

Резюмируя вышесказанное, подчеркнем, что эпигеном высокоразвитых многоклеточных организмов, представляющий собой неисчислимое множество поливариантных сочетаний эпигенетических модификаций и РНК-интерференций, сегодня называют "второй информационной системой" и "вторым кодом жизни", который в дополнение к детерминированному генетическому коду обеспечивает мощнейший ресурс для сложной многоуровневой регуляции их жизнедеятельности [28, 29]. За счет четко отлаженных эпигенетических механизмов обеспечивается поддержание нормальных жизненных функций и сохранение клеточной идентичности у человека. Нарушение эпигенетической регуляции (ослабление "эпигенетических ремней безопасности") приводит к аномальному изменению профиля генной экспрессии и создает молекулярно-генетическую основу для развития патологии.

К настоящему моменту доказана определяющая роль эпигенетики в этиологии большинства распространенных заболеваний. В их числе сахарный диабет первого [30] и второго [31] типа, метаболический синдром [32], болезни cердечно-сосудистой [33] и нервной системы (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, аутизм, шизофрения) [34], псориаз [35], а также вирусные [36, 37] и хронические воспалительные [38, 39, 40] заболевания. Особенно активно изучается роль эпигенетики в инициации и прогрессии злокачественных опухолей, что привело к формированию самостоятельного научного направления - эпигенетики рака [41, 42].

Первые официальные сведения об участии эпигенетики в развитии рака были опубликованы в журнале Nature в 1983 г. [43]. Cегодня, спустя 40 лет после этого эпохального события, эпигенетическая природа онкологических заболеваний, означающая глобальную потерю внутриклеточного эпигенетического контроля, является общепризнанной. К настоящему моменту практически для всех видов злокачественных новообразований обнаружены характерные ранние эпигенетические нарушения, имеющие причинное значение. Доказано, что дисрегуляция основных биологических процессов, обусловливающих канцерогенез (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ангиогенез, клеточная адгезия и миграция, репарация ДНК, иммунный ответ, воспаление, детоксикация, гормональный сигналинг), происходит на эпигенетическом уровне [44, 45]. В связи с этим "аберрантное немутационное эпигенетическое перепрограммирование" в настоящее время признается одним из основополагающих свойств, отличающих раковые клетки от здоровых [46].

О важности эпигенетики в этиопатогенезе злокачественных опухолей говорят следующие факты. Показано, что при спорадических формах рака как минимум половина (!) всех инактивированных генов, контролирующих противоопухолевую защиту, транскрипционно неактивна вследствие обратимых эпигенетических модификаций, а не в результате необратимых генетических мутаций, как это считалось ранее [47]. По другим данным, наблюдающееся при раке аномальное промоторное гиперметилирование онкосупрессорных генов, частота которого варьирует от 600 до 1000 модификаций на опухоль, является более частым событием, чем классические мутации [48, 49].

Важно подчеркнуть, что возникающие в раковых клетках генетические и эпигенетические нарушения неразрывно связаны между собой, как "две стороны одной медали" [50]. В результате полногеномного секвенирования образцов ДНК, полученных из большого массива опухолевых биоптатов, было выявлено множество инактивирующих мутаций в генах, контролирующих работу эпигенома. Эти мутации характеризовались как "драйверные" и затрагивали гены, кодирующие ключевые эпигенетические ферменты DNMT и HDAC, а также факторы транскрипции, регуляторные метилсвязывающие белки, регуляторы упаковки хроматина и другие эпигенетические молекулы [50–52]. С другой стороны, для многих видов рака было показано, что в результате эпигенетических модификаций умолкают и инактивируются важнейшие опухоль-супрессорные гены, отвечающие за процессы ДНК-репарации (BRCA1 , MGMT , WRN , MLH1 ), то есть за нативность и целостность генома [53–58].

Установлено, что на ранних этапах канцерогенеза эпимутации предшествуют истинным мутациям противоопухолевых генов и онкогенов [59], а в некоторых случаях клетка может превращаться из нормальной в раковую вообще без участия мутаций - только в результате эпигенетических модификаций [60]. Такая поистине революционная точка зрения подтверждается данными модельных экспериментов in vitro и in vivo , в которых в отсутствие изменений мутационного профиля была индуцирована трансформация нормальных соматических стволовых клеток в злокачественные опухоль-образующие путем направленного метилирования всего двух опухоль-супрессорных генов - HIC1 и RASSF1A [61]. И напротив, обращение раковых фенотипов в нормальные происходило под действием физиологических регуляторов клеточной дифференцировки (цитокинов и других сигнальных молекул) или лекарственных препаратов, обладающих эпигенетической активностью [62].

Колоссальный объем информации, накопленный в области эпигенетики рака, создал основу для глобального переосмысления сложившихся представлений о молекулярной природе канцерогенеза. На протяжении более полувека считалось, что рак - это исключительно результат необратимых нарушений в структуре генома, и, соответственно, основной парадигмой канцерогенеза являлась теория соматических мутаций ("мутационная теория" ) [63]. Сегодня все более популярной становится новая концепция, согласно которой рак - это не только генетическое, но в той же, если не в большей степени эпигенетическое заболевание [45, 64, 65]. Становится очевидно, что именно эпигеном - как более пластичная структура - первый воспринимает аномальные изменения тканевого микроокружения, формирует общую нестабильность генома и создает условия для перестройки клеточного метаболизма в направлении онкотрансформации. При этом случайные мутации ДНК являются важным, но побочным продуктом данного процесса, а отнюдь не первопричиной развития опухоли [62].

Тот факт, что эпигенетические нарушения начинают возникать на очень ранних этапах канцерогенеза, задолго до появления признаков клинического рака, позволяет использовать их для создания новых высокоселективных методов молекулярно-генетической доклинической диагностики и инструментов прогнозирования и мониторинга лечения онкозаболеваний. С помощью эпимаркеров можно оценить агрессивность (инвазивный и метастатический потенциал) злокачественной опухоли, ее ответ на терапию и успешность применения того или иного лекарственного средства: наличие предсуществующей резистентности, вероятность развития приобретенной резистентности и рецидива заболевания [41].

Наибольший интерес у ученых и клиницистов традиционно вызывает изучение эпигенетических маркеров ДНК-метилирования - процесса, в результате которого образуются химически стабильные продукты, легко определяемые в лабораторных условиях в небольшом объеме биологического материала, - тканевом биоптате или биологической жидкости [66]. С этой целью проводятся полногеномные исследования с применением метода метилспецифической полимеразной цепной реакции (ПЦР) и инновационных чиповых технологий [67]. Однако в последние годы в качестве диагностических и прогностических эпимаркеров рака все чаще рассматриваются продукты ацетилирования/деацетилирования гистонов хроматина и особенно регуляторные некодирующие микроРНК, также высокоустойчивые и доступные для определения в биологических жидкостях [68]. Известно, что у человека около 50% генов, кодирующих микроРНК, расположены в ассоциированных с раком или нестабильных ("ломких") участках генома [69].

Обратимость, а значит, потенциальная регулируемость эпигенетических нарушений делает эпимаркеры чрезвычайно привлекательными терапевтическими мишенями при разработке противоопухолевых таргетных препаратов нового поколения. Подавляющее большинство известных сегодня эпипрепаратов являются ингибиторами аномально активированных в раковых клетках эпигенетических ферментов - ДНК-метилтрансферазы и гистондеацетилазы [70].

Эра эпигенетической противоопухолевой терапии началась в 2000-е гг., когда FDA США были зарегистрированы и разрешены к клиническому применению четыре первых эпипрепарата, предназначенных для лечения онкогематологических заболеваний. Два из них - азацитидин (Вайдаза ) (активное вещество - 5-азацитидин) и родственный ему децитабин (Дакоген ) (активное вещество - 5-аза-2’-дезоксицитидин) - являются химическими аналогами нуклеозида цитозина. Замещая цитозин в ходе ДНК-репликации, они ингибируют ДНК-метилтрансферазу и восстанавливают активность аберрантно метилированных опухоль-супрессорных генов. Азацитидин назначается взрослым пациентам с миелодиспластическим синдромом с высокой или промежуточной 2-й степенью риска по международной шкале IPSS, которым не может быть выполнена трансплантация костного мозга. Другие показания для назначения азацитидина - острый миелоидный лейкоз и хронический миеломоноцитарный лейкоз без признаков миелодиспластического синдрома. Децитабин используют для лечения миелодиспластического синдрома всех типов у ранее леченых и нелеченых больных [71].

Интересно, что в конце 1960-х гг., то есть за несколько десятилетий до того, как у азацитидина и децитабина была обнаружена эпигенетическая активность, эти вещества использовались в качестве обычных цитотоксических химиотерапевтических средств, однако их применение в стандартных дозах оказалось чрезмерно токсичным для пациентов [72–76].

По результатам плацебо-контролируемых клинических исследований III фазы у больных с миелодиспластическим синдромом, которым назначался азацитидин или децитабин, относительно продолжительный терапевтический ответ наблюдался в среднем в 20% случаев, включая 9% пациентов, продемонстрировавших полный терапевтический ответ. При этом медиана выживаемости увеличивалась соответственно с 11 до 18 мес для азацитидина и с 8 до 12 мес для децитабина [77, 78]. В других исследованиях была показана целесообразность применения азацитидина и децитабина при лечении миелодиспластического синдрома высокого риска [79] и острой миелоидной лейкемии в пожилом возрасте [80, 81]. В настоящее время изучается терапевтическая эффективность данных препаратов при раке толстой кишки, раке яичников, раке легких, РМЖ и других солидных раках.

Два других сертифицированных эпипрепарата - ингибиторы фермента гистондеацетилазы: вориностат (Золинза^# ) (активное вещество - субероиланилид гидроксамовой кислоты) и ромидепсин (Истодакс^℘ ) (натуральный продукт, получаемый из бактерий Chromobacterium violaceum ) - были одобрены FDA для лечения пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой в случае персистирования заболевания, ухудшения прогноза или неуспешности предыдущей терапии. Подобно двум DNMT-ингибиторам, исходно эти препараты были синтезированы и апробированы как обычные химиотерапевтические средства, а их эпигенетическая активность была обнаружена позже.

Вориностат и ромидепсин по результатам II фазы клинических исследований у больных кожной Т-клеточной лимфомой показали неплохую эффективность. При их применении более чем у 30% пациентов отмечался положительный терапевтический ответ [82–85]. Недавно вориностат был одобрен FDA для лечения рака головы и шеи [86].

В 2014–2015 гг. FDA были сертифицированы еще два ингибитора гистондеацетилазы - белиностат (Белеодак^℘ ) и панобиностат (Фаридак^# ). Первый препарат предназначается для лечения рецидивной или рефрактерной периферической Т-клеточной лимфомы, второй - рецидивирующей и/или рефрактерной множественной миеломы у взрослых, которые ранее получали как минимум два курса лечения, включая бортезомиб и иммуномодулятор. Панобиностат - единственный HDAC-ингибитор, разрешенный к применению в Европе [87].

Всего в настоящее время в стадии разработки и испытания находится более сотни противоопухолевых эпигенетических препаратов [88]. Несколько десятков ингибиторов DNMT и HDAC проходят клинические исследования I–II–III фазы, где они применяются в комплексе с препаратами стандартной, таргетной, гормональной и иммунной противоопухолевой терапии при солидных злокачественных опухолях, в том числе при РМЖ [41, 67, 89–93].

Важно отметить, что при использовании DNMT- и HDAC-ингибиторов, помимо опухоль-супрессорных генов, восстанавливается активность эпигенетически молчащих генов, контролирующих восприимчивость опухоли к стандартной химиотерапии и гормональной терапии [94–96]. Эпигенетически опосредованное повышение чувствительности резистентных злокачественных опухолей к применявшимся в ходе первичного лечения агентам, или эписенсибилизация , сегодня рассматривается как новая перспективная стратегия комбинированного лечения агрессивных резистентных видов рака, повышающая эффективность стандартной терапии и выживаемость онкопациентов [97–99].

Выход на фармацевтический рынок лекарственных средств с четко прописанным эпигенетическим механизмом действия, безусловно, имел огромное значение и знаменовал начало нового этапа в современной таргетной терапии. Однако обнаруженные при их применении недостатки заставили ученых активизировать усилия по поиску и разработке новых противоопухолевых эпипрепаратов - более стабильных, эффективных, селективных и безопасных.

Как мы говорили, более чем у половины пациентов, принимающих лицензированные эпигенетические препараты, отмечается частичный или нулевой ответ на лечение. У части больных развивается лекарственная резистентность. Кроме того, эти препараты весьма токсичны и недостаточно специфичны, поэтому при их приеме часто возникают осложнения и серьезные побочные эффекты: миелосупрессия (тромоцитопения, нейтропения, анемия), иммуносупрессия, нарушения работы желудочно-кишечного тракта, гиперхолестеринемия, утомляемость, кардиотоксичность, транзиторная цитопения [41, 100–102]. Еще одна проблема - высокая стоимость курса лечения. В связи с этим основным требованием к DNMT- и HDAC-ингибиторам нового поколения, кроме эффективности и селективности, является доступная цена и максимально сниженная токсичность, что сделало бы возможным их продолжительное безопасное применение. Важной задачей является также получение эпипрепаратов в удобной для практического использования таблетированной/капсулированной лекарственной форме.

Для решения этого комплекса задач используются разные приемы, прежде всего усовершенствуются разрешенные к применению эпигенетические агенты. В качестве примера можно привести проходящий клинические испытания DNMT-ингибитор второго поколения гвадецитабин^℘ (SGI-110), который представляет собой динуклеотид децитабина, то есть улучшенный децитабин [103]. Также разрабатываются и тестируются в клинических исследованиях менее токсичные DNMT-ингибиторы ненуклеозидной природы, в том числе полученные с помощью современных молекулярно-генетических технологий.

Однако наиболее перспективным подходом при создании противоопухолевых эпипрепаратов будущего следует признать использование низкотоксичных веществ природного происхождения, обладающих опухолеспецифической эпигенетической активностью [104–107]. Среди природных соединений с доказанными эпигенетическими свойствами одними из самых эффективных являются флавоноид эпигаллокатехин-3-галлат и пищевые индолы - I3C и его физиологический метаболит DIM. В большом количестве исследований убедительно продемонстрировано, что указанные фитовещества эффективно и специфично влияют на все три основных механизма эпигенетической регуляции, не оказывая в терапевтических дозах отрицательного токсического воздействия [108–120].

За четыре десятилетия, прошедших после первой публикации по эпигенетике рака, накопилась обширная информация об участии трех базовых эпигенетических механизмов в инициации и прогрессии злокачественных опухолей, в том числе РМЖ. Хотя наиболее изученным из них было и остается аномальное ДНК-метилирование, в последнее время стремительно растет интерес к изучению эпимаркеров РМЖ, связанных с обратимыми модификациями гистонов, а также с экспрессией некодирующих онкогенных и опухоль-супрессорных микроРНК, число которых приближается к сотне [9, 121–127]. Доказано, что ассоциированные с РМЖ микроРНК играют критически важную роль в маммарном канцерогенезе и участвуют в регуляции опосредующих его ключевых биологических процессов: гиперпролиферации, сниженного апоптоза, усиленного неоангиогенеза, инвазии, метастазирования, аномального энергообмена, репликативного бессмертия, уклонения от иммунологического надзора [124].

Важно отметить, что, согласно современным данным, спектры генов, инактивированных в результате эпигенетических нарушений, и спектры мутантных генов при РМЖ очень незначительно перекрываются друг с другом. Оказалось, что подавляющее большинство генов, для которых in vitro была обнаружена связь их мутаций с развитием РМЖ, в реальных опухолевых образцах подвергаются мутациям менее чем в 5% случаев. Данный факт еще раз подтверждает первоочередную важность эпигенетической составляющей в патогенезе РМЖ [51].

Как мы уже говорили, DNMT1 - ключевой изофермент ДНК-метилтрансферазы - обеспечивает поддержание правильного набора паттернов ДНК-метилирования в нормальном эпигеноме. Аномальная гиперэкспрессия DNMT1, наблюдающаяся при многих видах рака, включая РМЖ, приводит к инактивации противоопухолевых генов и, как следствие, к усилению онкогенных процессов и опухолевой прогрессии [103, 128, 129]. Установлена прогностическая клиническая значимость при РМЖ и другого изозима ДНК-метилтрансферазы - DNMT3B. Повышенная экспрессия DNMT3B у пациентов с РМЖ достоверно ассоциировалась с более высокой степенью злокачественности опухоли, ее ERα-негативным статусом, повышенной экспрессией пролиферативного маркера Ki-67 и сниженной безрецидивной выживаемостью [130].

В общей сложности в ходе генетических исследований, в том числе проведенных с помощью методов полногеномного анализа, было обнаружено более сотни генов, гиперметилированных и инактивированных при РМЖ. Доказано, что метилирование многих из них имеет клиническую значимость и вовлечено в регуляцию характерных для раковых клеток аберрантных процессов клеточного деления, дифференцировки, апоптоза, миграции, ангиогенеза, гормонального сигналинга, ДНК-репарации, детоксикации и иммунного ответа [44, 131, 132].

В число генов - признанных прогностических и предикторных эпигенетических маркеров, для которых был показан повышенный уровень промоторного метилирования при РМЖ, входят:

В качестве вероятных эпимаркеров аномального ДНК-метилирования при РМЖ называются также: ген АТМ (кодирует серин/треониновую протеинкиназу, опосредующую остановку клеточного цикла, репарацию ДНК и апоптоз) [141], ген RASGRF1 (кодирует RAS-специфический фактор 1 обмена гуаниновых нуклеотидов, подавляющий пролиферацию, инвазию и метастазирование опухолевых клеток), ген CPXM1 (кодирует белок, участвующий в межклеточных взаимодействиях), ген DACH1 (кодирует фактор транскрипции, ингибирующий клеточный рост, пролиферацию, инвазию, метастазирование и активность эстрогеновых рецепторов), ген DOK7 (кодирует белок, обеспечивающий нервно-мышечное соединение) и некоторые другие гены [142, 143].

Поговорим более подробно о трех эпигенетических маркерах РМЖ - генах BRCA1, ESR1 и WIF-1 .

Ген BRCA1. Опухоль-супрессорные гены BRCA1 (хромосома 17q21) и BRCA2 (хромосома 13q12) имеют особую значимость для патогенеза РМЖ, что следует из их полного англоязычного названия - BReast Cancer Associated (рус. : ассоциированные с раком молочной железы). Наличие у женщины кровных родственников, которые в течение жизни болели РМЖ и были носителями мутантных генов BRCA1/2 , является важнейшим фактором риска развития у нее рака груди. Мутации генов BRCA1/2 в герминальных (половых) клетках детерминируют наследственную предрасположенность к РМЖ и раку яичников и повышают их риск соответственно до 55–85 и 40% [144–147].

Наследственный РМЖ, обусловленный аномалиями генов BRCA1/2 ,- это, как правило, гормон-независимый, трижды негативный РМЖ, склонный к рецидивам и имеющий худший прогноз по сравнению с другими типами РМЖ. Такой РМЖ часто диагностируется в молодом возрасте (возрастные пики выявления РМЖ у носителей мутаций BRCA1 - 35–39 лет, BRCA2 - 43–54 года). Он отличается высокой частотой развития рака в противоположной железе, высокой степенью злокачественности и характерными морфологическими признаками (высокий митотический индекс, трабекулярный и ограниченный характер роста, выраженный ядерный полиморфизм, некроз, умеренная или сильная лимфоцитарная инфильтрация) [148, 149].

Кодируемые генами BRCA одноименные белки выполняют в клетке важные антионкогенные функции. В гормон-чувствительных и гормон-резистентных опухолевых клетках МЖ белки BRCA участвуют в репарации двухцепочечных разрывов ДНК и поддерживают общую стабильность генома [150]. Соответственно, в клетках с пониженной функцией генов/белков BRCA возрастает частота анеуплоидии, амплификации центросом и хромосомных аномалий, что повышает их предрасположенность к последующим мутациям. Кроме того, белки BRCA могут взаимодействовать с транскрипционными факторами и ремоделирующими белками хроматина и таким образом функционировать как корегуляторы транскрипции большой группы генов, контролирующих клеточную пролиферацию, выживаемость и защиту от оксидативного стресса [151–153]. Показано, что при оксидативном стрессе ген/белок BRCA1 значимо влияет на окислительно-восстановительный внутриклеточный статус, повышая соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона, а также специфически активирует ядерный фактор эритроидного происхождения 2 (англ. nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2), контролирующий транскрипцию генов антиоксидантного ответа.

Надо сказать, что процесс выявления молекулярных мишеней, опосредующих антиоксидантный клеточный ответ, в силу множественности индуцируемых при этом механизмов, представляет для экспериментатора большую сложность. Поэтому таких достоверно установленных мишеней сегодня известны единицы. К их числу принадлежит вышеупомянутый фактор транскрипции Nrf2, взаимодействующий с соответствующим респонсивным участком ДНК и активирующий экспрессию широкого спектра белков с антиоксидантными функциями [154].

Важнейшей функцией опухоль-супрессорного белка BRCA1 является его участие в созревании и дифференцировке стволовых клеток МЖ. Подробнее об этом мы расскажем в части IV (см. главу 2, раздел 2.10: "Роль опухоль-супрессорного гена BRCA1 в созревании и дифференцировке стволовых клеток молочной железы. Дисфункция BRCA1 как причина образования опухолевых стволовых клеток и развития рака молочной железы").

Интерес к роли генов/белков BRCA особенно возрос после того, как было доказано их участие в патогенезе ненаследственного (спорадического) РМЖ. По некоторым данным, потеря гетерозиготности гена BRCA1 в 17q21-области наблюдается более чем в половине случаев спорадического РМЖ и рака яичников и более чем в половине случаев спорадического РМЖ отмечается снижение иммунореактивности белка BRCA1 [155]. Согласно другим источникам, при спорадическом РМЖ в 30–40% случаев отмечается пониженная или нулевая продукция мРНК белка BRCA1 в опухолевой ткани, а в 20% случаев - полная блокада экспрессии белка BRCA1 [156–160]. Доказано, что низкая экспрессия BRCA1 у пациенток со спорадическим РМЖ имеет прогностическую клиническую значимость [161].

Установлена ассоциация между экспрессией белка BRCA1 и стадией РМЖ [158, 162], а также степенью злокачественности (клеточной дифференцировки) опухоли. В низкодифференцированных высокозлокачественных опухолях МЖ с высокой пролиферативной активностью определялся минимальный уровень BRCA1 [160, 163]. Другими авторами была обнаружена корреляция между низкой экспрессией BRCA1, степенью злокачественности, метастазированием и такими прогностическими маркерами РМЖ, как статус эстрогеновых рецепторов и повышенный уровень онкобелка с-HER2 [156, 164–166].

Опираясь на результаты многочисленных исследований, можно утверждать, что главной причиной пониженной или нулевой экспрессии генов и белков BRCA при спорадическом РМЖ, в частности при его наиболее агрессивном подтипе - базальноподобном/трижды негативном РМЖ, является прогностически значимая эпигенетическая модификация генов BRCA в виде гиперметилирования их промоторных участков [55, 56, 155, 162, 167–175].

По данным Stefansson et al., приобретенное в течение жизни аномальное промоторное метилирование гена BRCA1 обнаруживалось примерно в половине случаев трижды негативного РМЖ [172]. В других исследованиях спорадические опухоли МЖ с промоторным метилированием BRCA1 имели негативный статус гормональных (ER и PR) рецепторов [168, 176] и демонстрировали патологические и молекулярно-генетические характеристики, сходные с таковыми при наследственном BRCA1 -ассоциированном РМЖ [55, 177, 178]. Лишь в 25% случаев РМЖ, диагностированного в возрасте до 40 лет и имевшего морфологию BRCA1 -обусловленного РМЖ, удавалось обнаружить герминальные мутации гена BRCA1 [179]. Показано, что промоторное метилирование BRCA1 ассоциируется с повышенным в 3,5 раза риском развития РМЖ в молодом возрасте [179] и высокой степенью злокачественности опухоли [180].

В итоге была сформулирована гипотеза о том, что спорадические эпигенетические модификации в виде ДНК-метилирования гена BRCA в нормальной ткани МЖ являются первым шагом в канцерогенезе и обусловливают такое же или даже бóльшее повышение риска раннего РМЖ, как и наследственные мутации генов BRCA . Другими словами, была высказана идея о том, что риск развития РМЖ не зависит от природы низкой экспрессии генов BRCA в клетках МЖ - генетической или эпигенетической.

Впоследствии это предположение получило блестящее экспериментальное подтверждение. В двух работах австралийских исследователей, опубликованных с разницей в три года, было показано, что аберрантное de novo метилирование гена BRCA1 в промоторном участке, возникающее у некоторых молодых женщин в нормальных клетках МЖ, можно рассматривать как достоверный биомаркер предрасположенности к развитию у них в будущем спорадического РМЖ, имеющего морфологические признаки наследственного BRCA1 -обусловленного РМЖ. Авторы установили, что чем выше был уровень конститутивного метилирования гена BRCA1 (достигавшего в отдельных случаях 50–100%) в нормальных клетках у здоровых пациенток, тем больше морфология развившегося впоследствии спорадического РМЖ соответствовала морфологии наследственно обусловленного BRCA1 -зависимого РМЖ [179, 181].

Аналогичный эффект, когда конститутивное ДНК-метилирование имитирует эффект генетических мутаций и при этом обусловливает предрасположенность к спорадическому раку, фенотипически идентичному наследственному, был установлен и для других опухоль-супрессорных генов и видов рака [182–185].

Ген ESR1. Экспрессия в опухолевой ткани эстрогенового рецептора ERα, кодируемого геном ESR1 , является основным диагностическим и прогностическим фактором, определяющим возможность назначения больным РМЖ в качестве адъювантной терапии антиэстрогенных препаратов. ER-негативные опухоли МЖ, не содержащие ER, отличаются более агрессивным поведением и имеют худший клинический прогноз. Они труднее поддаются лечению и более склонны к рецидивированию и метастазированию.

На протяжении десятилетий "золотым стандартом" адъювантной антиэстрогенной (эндокринной) терапии раннего гормон-зависимого РМЖ был и остается тамоксифен - первый препарат из группы селективных ER-модуляторов, с помощью которого удалось спасти и продлить многие человеческие жизни. Однако от 1/4 до 1/3 пациентов с первичным РМЖ не отвечают на эндокринную терапию тамоксифеном по причине отсутствия экспрессии в опухоли эстрогеновых рецепторов [186]. Нечувствительность опухолей МЖ к тамоксифену может развиться и в процессе лечения. Приобретенная резистентность обнаруживается приблизительно у 40% больных с начальным ER(+) статусом РМЖ, исходно реагировавших на гормональную терапию. Хотя в основе сложной по структуре, приобретенной гормональной резистентности могут лежать различные молекулярные процессы (в частности, активация альтернативных гормон-независимых сигнальных путей), доказано, что функциональная блокада эстрогеновых рецепторов посредством эпигенетического умолкания кодирующих их генов является одним из главных ее механизмов.

Поскольку, несмотря на активный поиск, ученым так и не удалось выявить распространенные генетические мутации в гене ESR1 , было высказано предположение о промоторном метилировании как главной причине подавления его экспрессии при гормон-нечувствительном РМЖ, что впоследствии подтвердилось на практике.

В нескольких независимых исследованиях 1990–2000-х гг. было установлено, что в ER(–) клетках РМЖ 5’-фрагмент промоторного участка гена ESR1 находится в гиперметилированном состоянии, что обусловливает пониженный уровень его экспрессии [187, 188], в то время как ER(+) клетки РМЖ, напротив, содержат в промоторной области гена ESR1 гипометилированные CpG-островки [189]. Тогда же было показано, что уровень мРНК и активность ДНК-метилтрансферазы в ER(–) клетках РМЖ человека по сравнению с аналогичными показателями в ER(+) клетках повышены соответственно в 40 и в 9 раз [187]. Добавление к клеткам трижды негативного РМЖ ингибиторов данного фермента - нуклеозидных аналогов [190] или антисмысловых олигонуклеотидов [191] - приводило к восстановлению экспрессии и функциональной активности эстрогеновых рецепторов.

В недавних исследованиях была установлена прямая корреляция между повышенной экспрессией ДНК-метилтрансферазы и уровнем метилирования гена ESR1 в нормальных и опухолевых клетках МЖ. Zhang et al. показали, что в нормальной маммарной ткани отмечается низкая экспрессия мРНК и белка DNMT1, в то время как при РМЖ эти показатели, коррелирующие с метилированием и экспрессией гена ESR1 , значимо возрастают, причем в ER(–) опухолях существенно больше, чем в ER(+) опухолях [192]. Было также установлено, что гиперэкспрессия изоферментов DNMT при РМЖ достоверно ассоциируется с устойчивостью опухолей к тамоксифену и пониженной выживаемостью онкобольных [103].

Надо сказать, что сегодня мы довольно много знаем об эпигенетической составляющей опухолевой гормональной резистентности и можем оценить сложность опосредующих ее механизмов. Известно, в частности, что эпигенетическая регуляция экспрессии гена ESR1 , кодирующего рецептор ERα, осуществляется посредством совместно действующих процессов ДНК-метилирования и деацетилирования гистонов хроматина, а точнее, согласованного функционирования в его проторном участке эпигенетических ферментов (DNMT1, DNMT3a/DNMT3b и HDAC1/HDAC2) и корепрессоров транскрипции. Гиперактивация этих белков вызывала компактизацию хроматина и уменьшала доступность данного гена для транскрипционного аппарата [193, 194]. И наоборот, добавление к гормон-резистентным ER(–) клеткам РМЖ ингибиторов DNMT и HDAC приводило к синергетической индукции экспрессии гена ESR1 и, как следствие, к восстановлению чувствительности клеток к тамоксифену [195–197].

В исследовании Leu et al. причинно-следственная связь между ER-сигналингом и эпигенетическими процессами ДНК-метилирования и деацетилирования гистонов была подтверждена другим изящным способом [198]. Авторы предложили экспериментальную модель, имитирующую последовательность событий при развитии приобретенной гормональной резистентности. Они показали, что в клетках гормон-чувствительного РМЖ подавление ER-зависимого сигнального пути с помощью молекул малых интерферирующих РНК вызывает последовательную эпигенетическую инактивацию молекулярных мишеней рецептора ERα. При этом основные события разворачиваются в промоторных областях целевых ER-респонсивных генов при участии ферментов DNMT и HDAC.

В настоящее время показатели метилирования маркерных генов при РМЖ рассматриваются как адекватные прогностические факторы, предсказывающие вероятность развития гормональной резистентности и характер ответа пациентки на эндокринную адъювантную терапию. Есть мнение, что эпигенетические биомаркеры являются более информативными и достоверными показателями, чем гормональный ER(+) или ER(–) статус опухоли [199].

В 2000 г. в лаборатории Yang et al. [200], а затем и другими авторами [201] были получены данные о том, что ингибиторы HDAC могут самостоятельно (без участия ингибиторов DNMT) восстанавливать экспрессию эпигенетически молчащего гена ESR1 в клетках гормон-резистентного РМЖ. При этом ожидаемо не менялся уровень промоторного метилирования CpG-островков в гене ESR1 , однако восстанавливалась чувствительность ERα(–) клеток РМЖ к тамоксифену [202]. В другом исследовании HDAC-ингибитор - субероиланилид гидроксамовой кислоты - в ER(+) клетках РМЖ вызывал протеасомную деградацию ERα через убиквитин-зависимый механизм и действовал как потенциальный агент гормональной абляции [203].

Впоследствии было установлено, что эпигенетическая регуляция гормональной опухолевой резистентности (особенно приобретенной) не ограничивается инактивацией гена ESR1 , кодирующего рецептор ERα. В гормон-нечувствительных клетках РМЖ в результате аномального ДНК-метилирования и деацетилирования гистонов, помимо гена ESR1 , в статус эпигенетически молчащих переходили также гены, кодирующие прогестероновые рецепторы А- и В-типа [195, 204], ген эстроген-индуцируемого секретируемого полипептида pS2 [194], ген циклин-зависимой киназы 10 (СDK10) [205] и другие эстроген-респонсивные гены, контролирующие клеточную пролиферацию и гормональный ответ. По данным Fan et al., после того как клетки гормон-зависимого РМЖ линии MCF-7 приобретали резистентность к тамоксифену, 75% эстрадиол-индуцибельных генов становились эстроген-неиндуцибельными [206]. В других исследованиях при комбинированном применении ингибиторов DNMT (нуклеозидные аналоги) и HDAC (субероиланилид гидроксамовой кислоты, вальпроевая кислота), помимо реактивации генов, кодирующих эстрогеновые и прогестероновые рецепторы, восстанавливалась активность множества других "молчащих" генов, отвечающих за противоопухолевую защиту [207–209].

Итак, согласно современным данным, первичная и приобретенная гормональная резистентность РМЖ к тамоксифену, сопровождающаяся подавлением экспрессии гена эстрогенового рецептора ERα и других (ER-респонсивных) генов, возникает не в результате необратимых генетических мутаций, а вследствие обратимых эпигенетических модификаций [59, 210].

Как мы поняли, основными эпигенетическими механизмами, обусловливающими нечувствительность опухолей МЖ к эндокринной терапии, являются промоторное ДНК-метилирование и деацетилирование гистонов хроматина. Их изучению посвящена основная масса публикаций по данной теме. Однако гормональную резистентность РМЖ могут опосредовать и другие модификации гистонов, в частности их метилирование и фосфорилирование [211], а также регуляторные некодирующие микроРНК. В исследованиях последних 10–15 лет удалось обнаружить молекулы микроРНК, подавляющие экспрессию гена и белка ERα при РМЖ в условиях in vitro и ex vivo [212–214]. Показано, что некоторые микроРНК могут быть предикторами терапевтического ответа ER(+) РМЖ на тамоксифен, а также потенциальными молекулярными мишенями эпигенетических препаратов, применяемых с целью реактивации ERα и повышения чувствительности опухолей МЖ к эндокринной терапии [214].

В настоящее время разработка и тестирование лекарственных средств, способных обращать эпигенетические нарушения и восстанавливать экспрессию генов гормональных рецепторов, является актуальным направлением таргетной терапии РМЖ и других гормон-зависимых злокачественных опухолей [215]. Проводятся десятки клинических исследований I–II фазы, в которых изучается эффективность применения ингибиторов DMNT и HDAC при местнораспространенном и метастатическом РМЖ [211, 216, 89]. Особенно активно направление эпигенетической противоопухолевой терапии развивается для лечения трижды негативного РМЖ [103].

Ген WIF-1. Ген WIF-1 кодирует одноименный белок WIF-1 - эндогенный ингибитор эмбрионального Wnt-каскада (см. рис. 18 ). Wnt-каскад индуцируется образующими обширное семейство секреторными Wnt(wingless-type)-белками (отсюда и его название), а его ключевым эффектором является белок β-катенин, первоначально идентифицированный как регулятор активности белков адгезии - кадгеринов (β-катенин является субъединицей белкового комплекса кадгерина).

В норме, в отсутствие Wnt-сигналов, β-катенин неактивен благодаря ингибирующему действию со стороны мультимерного комплекса, в состав которого, помимо него самого, входят два фермента - киназа-3β гликогенсинтазы (англ. glycogen synthase kinase 3-beta, GSK3β) и казеинкиназа 1α (англ. casein kinase 1-alpha, CK1α), опухоль-супрессорный белок АРС и проапоптотический белок аксин [217]. Внутри этого комплекса β-катенин фосфорилируется, а затем подвергается убиквитин-зависимой протеасомной деградации [218]. Cвязывание Wnt-лигандов с рецепторами двух типов - Frizzled и LRP (low-density lipoprotein-related receptor protein) - приводит к ингибированию киназ GSK3β и CK1α и разрушению белкового комплекса β-катенин-APC-аксин-GSK3β-CК1α. После этого дефосфорилированный β-катенин транслоцируется в ядро, где взаимодействует с факторами (Tcf/Lef) и кофакторами (CBP, p300, TNIK, Bcl9, Pygopus) транскрипции и индуцирует экспрессию целевых генов (cMYC, циклина D1, теломеразы, сурвивина), опосредующих процессы пролиферации, дифференцировки и ЭМП [219–221].

Белок WIF-1, связываясь с Wnt-лигандом, ингибирует эмбриональный Wnt-каскад на его начальном этапе [222].

Wnt-опосредованная сигнальная трансдукция представляет собой эволюционно консервативный механизм, широко представленный в живой природе. В норме у человека Wnt-каскад регулирует процессы клеточной пролиферации, дифференцировки, выживаемости и миграции, основополагающие в фазе эмбрионального развития и важные для поддержания тканевого гомеостаза во взрослом организме [223]. Его дисрегуляция наблюдается при сахарном диабете 2-го типа, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и других заболеваниях. Аномальная активация Wnt-сигналинга, характерная для низкодифференцированных туморогенных опухолевых стволовых клеток (ОСК, см. часть IV), наблюдается при многих видах рака, поэтому его компоненты считаются перспективными лекарственными мишенями в современной таргетной противоопухолевой терапии [217, 224].

При неблагоприятных условиях (хроническое воспаление, продолжительная тканевая репарация, оксидативный стресс, стойкий иммунодефицит) создаются условия для эпигенетического перепрограммирования нормальных стволовых клеток и их потомков - прогениторных клеток и формирования на их основе пула ОСК. Помимо низкой степени дифференцировки, такие клетки отличает повышенная способность к миграции и метастазированию, а также устойчивость к стандартной химио- и радиотерапии, то есть высокая агрессивность. Утверждение, что первичный и рецидивный рак возникает из туморогенных опухолевых клеток с фенотипом стволовых, сегодня поддерживается огромным числом исследователей [225].

В 2000-е гг. была установлена одна из главных причин гиперактивации Wnt-каскада в опухолевых клетках - эпигенетическое умолкание опухоль-супрессорного гена WIF-1 в результате его промоторного гиперметилирования. В 2006 г. вышла в свет первая работа, посвященная гиперметилированию и инактивации гена WIF-1 в клетках РМЖ [226]. Впоследствии ассоциированное с канцерогенезом гиперметилирование данного гена было обнаружено при других видах рака [227–230]. В настоящее время статус промоторного метилирования гена WIF-1 предлагается рассматривать как достоверный диагностический и прогностический клинический маркер при выявлении и комплексном лечении многих видов онкозаболеваний [227, 231, 232].

Следует добавить, что, согласно современным данным, в норме Wnt-каскад, помимо регуляции морфо- и эмбриогенеза, обеспечивает функционирование эндо- и миометрия в ходе менструального цикла у женщин репродуктивного возраста. Установлена связь между аномальным Wnt-сигналингом и патогенезом гормон-зависимых доброкачественных гинекологических заболеваний: лейомиомы матки, эндометриоза, аденомиоза и гиперплазии эндометрия [233–235].

Известно, что в пролиферативной фазе менструального цикла Wnt-каскад активируется под действием эстрадиола, а в секреторной фазе ингибируется под действием прогестерона. В случае, если усиленный эстрогенный сигнал не уравновешен прогестероном, конститутивная активация Wnt-каскада способствует развитию гиперплазии эндометрия, которая при неблагоприятных условиях может привести к раку эндометрия [236]. Есть данные, что в зрелых клетках миометрия, а также в клетках миоматозного узла Wnt-каскад выполняет роль паракринного регулятора, позволяющего им в ответ на действие эстрогена и прогестерона передавать сигналы расположенным поблизости стволовым клеткам и таким образом стимулировать рост миомы матки [237]. В наших исследованиях было показано участие аномального метилирования гена WIF-1 в патогенезе миомы матки и цервикальных интраэпителиальных неоплазий [238–240].

Итак, мы выяснили, что аберрантное гиперметилирование опухоль-супрессорных генов, возникающее на ранней доклинической стадии и продолжающееся на последующих этапах онкологического заболевания, позволяет оценить агрессивность злокачественной опухоли и предсказать ее ответ на лечение [241, 242]. В связи с этим в настоящее время эпигенетические маркеры ДНК-метилирования, определяемые в сыворотке, плазме, цельной крови и опухолевых биоптатах, рассматриваются как перспективные диагностические и прогностические клинические факторы РМЖ [126, 132, 179, 243–248], а также как предикторы эффективности его лечения и инструменты классификации/стратификации [122, 249–251].

Развитию современных эпигенетических методов диагностики, прогнозирования и лечения РМЖ способствует доступность необходимых для масштабного метиломного анализа информационных баз данных, а также технологий высокопроизводительного полногеномного секвенирования и ДНК-микрочипирования, позволяющих изучить профиль метилирования одновременно сотен тысяч генов в больших когортах пациентов [123, 125, 132, 252]. В отличие от подхода "ген-кандидат", когда с целью ранней диагностики и прогнозирования риска РМЖ в крови выявляется аберрантный уровень метилирования одного или нескольких кандидатных генов-маркеров, в ходе полногеномных исследований в метиломном профиле генома определяются характерные для РМЖ генные сигнатуры₁₂ метилирования ДНК, обусловливающие уникальную идентичность опухолевой клетки. Объектом исследования в этих случаях является циркулирующая в кровотоке опухолевая ДНК или внеклеточная ДНК.

К сожалению, сегодня на фармацевтическом рынке отсутствуют лицензированные диагностические тесты для определения биомаркеров аномального ДНК-метилирования при РМЖ, как это доступно для некоторых других видов рака [248]. Хотя перечень достоверных эпигенетических маркеров РМЖ хорошо известен, для подтверждения специфичности и чувствительности большинства из них необходимо провести дополнительные крупномасштабные проспективные клинические исследования, а также регламентировать и привести к единому стандарту саму процедуру диагностического тестирования. Тем не менее успехи на этом пути есть, и весьма впечатляющие.

В 2006 г. американские авторы Hoque et al. продемонстрировали успешное использование четырех опухоль-супрессорных генов APC, GSTP1 ,RASSF1 и RARβ в качестве плазматических эпигенетических маркеров при обнаружении первичного РМЖ в популяции западноафриканских женщин [253]. Было показано, что гиперметилирование хотя бы одного из них с высокой вероятностью указывает на наличие у пациентки РМЖ. Чувствительность данного метода составила 62%, а специфичность - 87%, что позволило в 33% случаев выявить РМЖ на ранней стадии. По мнению авторов, данный подход является перспективным методом диагностики раннего РМЖ, особенно в развивающихся странах, испытывающих трудности с организацией и проведением маммографического скрининга.

В 2011 г. группа швейцарских ученых сообщила об апробации другого эпигенетического теста для определения аномального ДНК-метилирования при РМЖ [246]. Данный тест, разработанный на основе панели из 8 генов (APC ,BIN1 ,BRCA1, CST6 ,GSTP1 ,p16 ,p21 ,TIMP3 ), позволяет выявлять РМЖ в кровотоке и опухолевой ткани с чувствительностью и специфичностью более 90%.

В настоящее время активно проводятся исследования по определению эпигенетических маркеров РМЖ в циркулирующей внеклеточной ДНК (вкДНК ). Сегодня вкДНК признается ценным ресурсом для создания новых методов диагностики, прогнозирования и лечения широкого спектра заболеваний, в том числе злокачественных опухолей. Известно, что бо́льшая часть вкДНК у онкопациентов представлена молекулами опухолевого происхождения, попадающими в кровоток либо в результате лизиса клеток, находящихся на стыке между опухолевым очагом и кровеносными сосудами, либо вследствие разрушения циркулирующих опухолевых клеток или микрометастазов [254].

Показано, что уровень вкДНК у больных РМЖ повышен в 2,5 раза по сравнению со здоровыми женщинами и всего в 1,3 раза по сравнению с пациентками с доброкачественными опухолями МЖ. Установлена корреляция между содержанием вкДНК и клинико-патологическими характеристиками опухоли (степень злокачественности, поздняя стадия, поражение лимфоузлов) [255–258]. Известны случаи успешной апробации высокочувствительных тест-систем для определения аберрантно метилированной циркулирующей вкДНК, улучшающих диагностику, прогнозирование и мониторинг лечения РМЖ [143, 259].

Недавно было инициировано долговременное широкомасштабное исследование с участием сотен тысяч онкопациентов и здоровых добровольцев c целью создания геномного атласа вкДНК. Ожидается, что на его основе будет разработан более точный по сравнению c маммографией тест для обнаружения раннего РМЖ у бессимптомных лиц, с помощью которого удастся совершить качественный прорыв в парадигме скрининга рака [126, 260–262].

Надо сказать, что актуальность создания новых эпигенетических методов диагностики РМЖ обусловлена в том числе объективно существующими ограничениями метода маммографии - общепринятого "золотого стандарта" обследования МЖ. Маммографический скрининг, внедренный во многих развитых странах в практику медицинского обслуживания на уровне национальных программ, позволил снизить показатели смертности от РМЖ у женщин в возрастной группе 40–74 лет [263, 264]. Однако среди экспертов вызывает беспокойство наблюдающийся при этом большой процент случаев ложной гипердиагностики и, как следствие, последующих избыточных биопсий и неоправданного лечения [27]. Так, по данным Американской рабочей группы по профилактическим мероприятиям, на каждую женщину, которой удалось избежать смерти от РМЖ благодаря маммографическому скринингу, приходится 2–3 женщины, которые проходили курс лечения без должной необходимости [265].

Известно, что маммографический скрининг имеет ограниченную чувствительность и специфичность у женщин с плотными МЖ [266, 267] и женщин молодого возраста [268, 269]. По данным Suzuki et al., чувствительность скрининговой маммографии в комплексе с клиническим обследованием МЖ была существенно снижена у женщин 40–49 лет по сравнению с женщинами 50–59 и 60–69 лет [270].

Еще одна группа пациентов, для которых маммографическое исследование сопряжено с рядом ограничений, - это женщины из группы повышенного риска РМЖ, имеющие к нему наследственную предрасположенность или РМЖ в анамнезе. У них маммография начинает проводиться раньше и/или проводится чаще, чем у других пациенток, вследствие чего они подвергаются повышенным суммарным дозам облучения.

В связи с этим в настоящее время ведется активный поиск инновационных неинвазивных диагностических методов и надежных биомаркеров для раннего обнаружения РМЖ, подходящих для экономически эффективного рутинного скрининга [126]. Эпигенетические маркеры, определяемые в легкодоступных биологических жидкостях (сыворотка и плазма крови), в этом смысле являются приоритетными.

Помимо аномально метилированных генов, в последнее время в качестве эпимаркеров РМЖ изучаются молекулы микроРНК в образцах, полученных с помощью жидкостной биопсии. Минимально инвазивный метод жидкостной биопсии позволяет осуществить забор материала из крови и других биологических жидкостей и исследовать свойства опухоли путем анализа ее компонентов: циркулирующих опухолевых клеток, фрагментов циркулирующей опухолевой ДНК, различных белковых, генетических и эпигенетических маркеров [271]. Поэтому сегодня все настойчивее звучат призывы специалистов разработать новый подход к скринингу РМЖ, объединяющий маммографию и жидкостную биопсию, с помощью которого можно будет определять уровень ассоциированных с канцерогенезом некодирующих микроРНК [272, 273]. Ожидается, что использование чувствительных и специфичных эпимаркеров улучшит существующие протоколы маммографического и магнитно-резонансного исследования у молодых женщин и женщин, входящих в группы риска. Это позволит повысить точность и безопасность скрининговых процедур (снизить дозу облучения), а также увеличить эффективность персонализированного лечения РМЖ [132].

Важным направлением современной эпигенетической терапии является эписенсибилизация - повышение чувствительности резистентных злокачественных опухолей к препаратам стандартной терапии с помощью эпигенетических лекарственных средств [97]. Применительно к РМЖ это в первую очередь означает преодоление гормональной опухолевой резистентности путем реактивации эпигенетически молчащих генов эстрогеновых и прогестероновых рецепторов и/или генов, ассоциированных с гормональной резистентностью (PTEN, CDK10, HOXC10 и др.) [274].

Как мы говорили ранее, в большом проценте случаев гормон-нечувствительного РМЖ (в частности, при трижды негативном РМЖ) приобретенная и предсуществующая резистентность к тамоксифену возникает не в результате мутаций, делеций и других необратимых структурных нарушений гена эстрогенового рецептора ERα, а вследствие его обратимых эпигенетических модификаций [187, 210, 275–278]. Только у 1% (!) пациентов с первичным РМЖ обнаруживаются точечные мутации в данном гене [275]. В результате прогресса, достигнутого в области эпигенетической сенсибилизации, удалось повысить восприимчивость гормон-резистентных опухолей МЖ к тамоксифену в клинических исследованиях [195, 279, 280], а также к стандартной/таргетной терапии и радиотерапии в экспериментах in vitro и in vivo [123, 281].

В последние годы в качестве ресенсибилизирующих агентов, способных восстанавливать чувствительность гормон-резистентного РМЖ к эндокринной терапии (тамоксифену), все чаще рассматриваются нетоксичные вещества природного происхождения, обладающие противоопухолевой эпигенетической активностью [282–285].

Согласно современным данным, аномальное промоторное гиперметилирование опухоль-супрессорных генов достоверно обнаруживается не только на стадии неинвазивного и инвазивного РМЖ, но и в гистологически нормальном/доброкачественном эпителии МЖ [134, 135, 242, 244, 286, 287]. Чаще всего среди генов-мишеней, подвергающихся аномальному гиперметилированию в доброкачественном маммарном эпителии, называется триада ассоциированных с маммарным канцерогенезом генов APC, RARβ2 и RASSF1A . Есть данные о повышении частоты метилирования опухоль-супрессорного гена BRCA1 при увеличении возраста пациенток в образцах доброкачественного эпителия МЖ, полученных с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем пальпации [288].

В исследовании Chen et al. участвовали пациентки, у которых, помимо РМЖ, были диагностированы одно или несколько ДЗМЖ (фиброаденома, гиперплазия, склерозирующий аденоз, апокринная метаплазия, папиллома, атипичная дольковая, протоковая гиперплазия) и дольковая/протоковая карцинома in situ [134]. В образцах ДНК, полученных из опухолевой ткани, доброкачественных поражений и нормального эпителия МЖ (если он имелся) определялся уровень метилирования 22 опухоль-супрессорных генов. В итоге авторы обнаружили, что в пределах одной МЖ в морфологически нормальном эпителии, в доброкачественных и предраковых (карцинома in situ ) поражениях, а также в очаге РМЖ с разной частотой подвергались промоторному гиперметилированию 11 опухоль-супрессорных генов (из 22 протестированных): RASSF1 ,APC ,GSTP1 ,TIMP3 ,CDKN2B, CDKN2A ,ESR1, CDH13 ,RARβ ,CASP8 и TP73 . При этом их эпигенетическая инактивация происходила в непрерывном континууме трансформации нормальной ткани в доброкачественную и далее в инвазивный РМЖ и классифицировалась как частое и раннее событие в канцерогенезе. Максимальная частота метилирования ожидаемо отмечалась в очаге РМЖ и составляла для генов RASSF1, APC и GSTP1 , соответственно, 82, 71 и 53%. Однако важно, что в образцах неопухолевой доброкачественной ткани МЖ (пациентки с высоким риском РМЖ) частота метилирования указанных генов также достигала высоких значений (71, 64 и 43%), сопоставимых с показателями при РМЖ.

В исследовании Euhus et al. аномальное гиперметилирование опухоль-супрессорных генов APC, RARβ2 и RASSF1A выявлялось в доброкачественном эпителии ипсилатеральной и контрлатеральной МЖ у 59% пациенток с РМЖ, при этом уровень их метилирования составлял 20–40% от уровня метилирования в очаге РМЖ [287]. Авторы обнаружили, что частота метилирования указанных генов в образцах ипсилатерального доброкачественного эпителия была сопоставима с таковой в образцах доброкачественной ткани МЖ, полученных у женщин без онкологического диагноза из группы высокого риска РМЖ (модель Гейла), а частота метилирования в образцах контрлатерального доброкачественного эпителия была сопоставима или превышала частоту метилирования в образцах доброкачественной ткани МЖ, полученных у женщин без онкологического диагноза из группы низкого риска РМЖ (модель Гейла) (см. рис. 19 ).

В конечном итоге было установлено, что по сравнению с другими изучавшимися генами опухоль-супрессорный ген RASSF1A был метилирован чаще как в очаге РМЖ (67%), так и в доброкачественных образцах, полученных у пациенток с РМЖ (19% - в контрлатеральной МЖ, 27% - в ипсилатеральной МЖ) и пациенток с ДЗМЖ (9% - в группе низкого риска РМЖ, 37% - в группе высокого риска РМЖ). Таким образом, частота метилирования гена RASSF1A в доброкачественной ткани у больных РМЖ была сопоставима с частотой его метилирования у женщин без онкологического диагноза из группы высокого риска РМЖ (см. рис. 20, а ). Уровень метилирования гена RASSF1A у пациенток с ДЗМЖ 32–55 лет линейно увеличивался с возрастом и коррелировал с прогнозируемым риском РМЖ (отношение рисков =5,28), атипической цитологической картиной (отношение рисков =4,11) и ДЗМЖ, требующими биопсии (отношение рисков =6,12) (см. рис. 20, б ).

На основании полученных данных авторы заключили, что промоторное метилирование гена RASSF1A может рассматриваться как достоверный эпигенетический маркер начальных стадий маммарного канцерогенеза и использоваться для ранней диагностики РМЖ и стратификации риска РМЖ.

Свой вклад в изучение эпигенетики РМЖ и предшествующих ему доброкачественных поражений МЖ внесли российские ученые из НИИ медицинской генетики и НИИ онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра РАН и из Сибирского государственного медицинского университета. Они проанализировали профили ДНК-метилирования в образцах первичного операбельного РМЖ, доброкачественных пролиферативных процессов и регионарных лимфатических узлов с метастазами в сравнении с контрольными (условно нормальными) образцами, в которых отсутствовали морфологические изменения маммарного эпителия [289]. С помощью современных метилочиповых технологий авторы выявили группу опухоль-супрессорных генов, гиперметилированных при РМЖ, и показали, что те же самые гены гиперметилируются, хотя и с существенно меньшей частотой, при доброкачественных пролиферативных заболеваниях МЖ. По сравнению с морфологически неизмененной маммарной тканью в доброкачественных образцах МЖ наблюдалось повышенное метилирование генов ARHGDIB, IL8 ,MAPK12 и HLA-DPA/А1, контролирующих клеточную пролиферацию (арест клеточного цикла), адгезию, секрецию, иммунный ответ и организацию цитоскелета.

Двумя годами ранее в той же лаборатории было проведено исследование по изучению эпигенетики раннего лимфогенного метастазирования при РМЖ [290]. Было показано, что эпигенетические нарушения, сопровождающие маммарный канцерогенез, в том числе формирующие метастатический клеточный фенотип, начинают возникать на ранних этапах опухолевой трансформации. По мнению авторов, полученные ими результаты поддерживают гипотезу о раннем возникновении клона клеток, ответственных за метастазирование в регионарные лимфатические узлы, и о значимой роли эпигенетического компонента в детерминации этого процесса [290].

Итак, мы выяснили, что три ключевых опухоль-супрессорных гена APC, RARβ2 и RASSF1A, являющиеся признанными эпигенетическими маркерами РМЖ, с высокой частотой гиперметилируются и функционально инактивируются (эпигенетически умолкают) при ДЗМЖ.

Поговорим об этих генах подробнее.

Ген APC (Adenomatous Polyposis Coli) был картирован в 1986–1987 гг., а впервые клонирован в 1991 г. Ген получил свое название в связи с тем, что его мутации являются причиной и обнаруживаются в 50–70% случаев редкого наследственного заболевания - семейного аденоматозного полипоза кишечника.

Опухоль-супрессорная активность гена APC обусловлена ингибирующим эффектом, который оказывает кодируемый им белок на внутриклеточный уровень β-катенина - ключевого компонента эмбрионального Wnt-каскада [291]. К менее известным функциям белка APC относится его способность регулировать сегрегацию хромосом и сборку веретена деления, а также апоптоз и дифференцировку нейронов [292].

Как мы говорили выше, в отсутствие сигнала от Wnt-лиганда β-катенин неактивен по причине ингибирующего действия со стороны мультимерного комплекса, в состав которого, помимо него самого, входят ферменты GSK3β и CK1α, проапоптотический белок аксин и интересующий нас опухоль-супрессорный белок АРС. Cвязывание Wnt-лигандов с рецепторами приводит к ингибированию киназ GSK3β и CK1α и к разрушению белкового комплекса, в результате чего нефосфорилированный β-катенин транслоцируется в ядро, где связывается с факторами и кофакторами транскрипции и индуцирует экспрессию генов, контролирующих процессы пролиферации, дифференцировки и ЭМП (см. рис. 18 ). Мутации гена APC приводят к нарушению работы комплекса GSK3β-CK1α-аксин-APC и повышению уровня β-катенина.

Помимо аденоматозного полипоза кишечника, функционально значимые мутации APC , активирующие Wnt-сигналинг, обнаруживаются при различных видах рака, включая РМЖ [293–295]. Пониженная экспрессия опухоль-супрессорного гена APC , вызванная его мутацией или гиперметилированием, выявляется в 70% случаев спорадического РМЖ [296–298]. Доказано участие мутантного гена АРС в развитии опухолевой резистентности (снижении эффективности стандартной химиотерапии) при лечении РМЖ [299, 300].

Согласно данным последних мета-анализов, промоторное метилирование гена АРС достоверно ассоциируется с риском и коррелирует со стадией РМЖ, вследствие чего может рассматриваться как ценный биомаркер для его диагностики, прогнозирования и мониторинга лечения [301, 302].

Ген RARβ2 (retinoic acid receptor beta 2) был картирован в 1987–1988 гг. Он кодирует одноименный белок - β-рецептор ретиноевой кислоты, который входит в состав суперсемейства ядерных рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов, функционирующих как лиганд-зависимые факторы транскрипции. Рецептор RARβ2 связывает ретиноевую кислоту - биологически активную форму витамина А, опосредующую сигнальную трансдукцию в эмбриональном морфогенезе, а также в ходе клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза во взрослом организме [303]. RARβ2 функционирует как естественный ограничитель роста многих типов клеток путем регуляции генной экспрессии и рассматривается как перспективная лекарственная мишень в современной таргетной терапии рака [304].

Показано, что нейтрализация положительного эффекта ретиноевой кислоты в клетках РМЖ обусловлена аномальными эпигенетическими изменениями на уровне ДНК и гистонов хроматина, подавляющими экспрессию гена RARβ2 [207, 305–307]. В экспериментах in vitro добавление к опухолевым клеткам различного происхождения сертифицированного деметилирующего агента 5-аза-2’-дезоксицитидина (децитабина) повышало экспрессию и опухоль-супрессорную активность RARβ2 [308–311]. Флавоноид эпигаллокатехин-3-галлат - вещество растительного происхождения с доказанной противоопухолевой эпигенетической активностью - способен восстанавливать экспрессию гена RARβ2 посредством специфического ингибирования фермента ДНК-метилтрансферазы [108].

В многочисленных клинических исследованиях статус промоторного метилирования опухоль-супрессорного гена RARβ2 коррелировал с его инактивацией и использовался как биомаркер ранних стадий рака, в том числе РМЖ, а также как промежуточный прогностический маркер при оценке эффективности применявшихся для лечения химиопрофилактических агентов [286, 311–317]. При первичном РМЖ промоторное гиперметилирование RARβ2 наблюдалось в 69% образцов, полученных c помощью тонкоигольной аспирационной биопсии, и положительно коррелировало со степенью выявляемых в них цитологических изменений [314].

Согласно данным мета-анализов, суммирующих результаты ~60 клинических исследований с участием тысяч больных РМЖ, промоторное гиперметилирование гена RARβ2 ассоциируется с семикратно повышенным риском РМЖ, регионарным метастазированием в лимфоузлы, TNM-стадированием и степенью злокачественности опухолей, поэтому может рассматриваться как достоверный эпигенетический маркер при диагностике и мониторинге лечения РМЖ [318, 319].

Ген RASSF1A (Ras-association domain family member 1) был клонирован и охарактеризован в 2000 г. Кодируемый им одноименный опухоль-супрессорный белок RASSF1A напрямую ингибирует онкобелок Ras, регулирующий процессы клеточной пролиферации, выживаемости, дифференцировки, организации цитоскелета, везикулярного транспорта и апоптоза [320, 321]. В своей активной конформации онкобелок Ras взаимодействует с внутриклеточными эффекторами - серин-треониновой протеинкиназой Raf и киназой PI3K. В первом случае инициируется МАР-киназный сигнальный каскад Ras/Raf/MEK/ERK, во втором - каскад PI3K/Akt. Оба этих каскада известны как ключевые протуморогенные сигнальные пути, конститутивно активированные при многих видах рака, а их компоненты являются признанными лекарственными мишенями в противоопухолевой таргетной терапии [322].

Все белки семейства RASSF, в частности наиболее изученный из них RASSF1A, отличает отсутствие ферментативной активности и способность функционировать как "скаффолд-молекулы" ("каркасные молекулы"). Один скаффолд-белок может взаимодействовать с компонентами разных сигнальных каскадов, что приводит к формированию многокомпонентных белковых комплексов, оказывающих антипролиферативный и онкопротективный эффект. Дисфункция скаффолд-белков вызывает масштабные внутриклеточные изменения, ослабляющие противоопухолевую защиту.

Опухоль-супрессорная активность RASSF1A реализуется в клетке различными способами. Помимо ингибирования белка Ras, индукции Ras-зависимого митохондриального апоптоза [323] (в тех случаях, когда Ras стойко гиперактивирован, Ras-зависимые проапоптотические сигналы могут перекрывать опосредованные им сигналы пролиферации и выживания [321]) и активации других (неапоптотических) механизмов клеточной гибели, RASSF1A может ингибировать G1- и G2/М-стадии клеточного цикла, напрямую взаимодействуя с белками микротрубочек и тубулином, то есть блокировать клеточное деление [324, 325]. Есть данные, что супрессорный контроль со стороны RASSF1A над онкопротеином K-Ras осуществляется при участии эпигенетического фермента гистондеацетилазы [326].

Характерной особенностью белков RASSF является высокая частота эпигенетической инактивации кодирующих их генов в опухолевых клетках. В многочисленных исследованиях, в том числе обобщенных в мета-анализах, было установлено, что аберрантное гиперметилирование и подавление экспрессии опухоль-супрессорного гена RASSF1A наблюдается при разных видах рака [327–333], включая наследственный и спорадический РМЖ [327, 334–337]. При этом более чем в 30 типах злокачественных опухолей частота метилирования RASSF1A превышала частоту метилирования других противоопухолевых генов [338].

Напомним, что в цитированном выше исследовании Euhus et al. RASSF1A был метилирован чаще других опухоль-супрессорных генов у пациенток с ДЗМЖ и высоким риском РМЖ [287]. Еще одним доказательством важности гена RASSF1A как эпигенетического маркера являются данные Teng et al. (о них мы также упоминали выше), согласно которым трансформация нормальных стволовых клеток в клетки с фенотипом ОСК может происходить в результате метилирования всего лишь двух генов, один из которых - ген RASSF1A [61].

Показано, что у больных РМЖ уровень метилирования RASSF1A в опухолевых биоптатах, а также в плазме и сыворотке крови достоверно коррелирует с клинической картиной заболевания, экспрессией гормональных рецепторов и ответом на адъювантную терапию, то есть имеет выраженную прогностическую значимость [335, 337, 339]. Диагностическая и прогностическая ценность промоторного гиперметилирования гена RASSF1A при РМЖ, в том числе его ассоциация с повышенным риском рецидивирования РМЖ и ухудшением выживаемости пациентов, была подтверждена в последних мета-анализах [340, 341].

Все эти факты свидетельствуют о первоочередной значимости аномального метилирования гена RASSF1A в канцерогенезе вообще и маммарном канцерогенезе в частности. Восстановление активности генов и белков RASSF с помощью эпипрепаратов в настоящее время рассматривается как актуальное и перспективное направление в современной таргетной онкотерапии .

В многочисленных молекулярно-генетических исследованиях, в том числе проведенных с использованием современных технологий полногеномного скрининга, секвенирования и микрочипирования, было показано, что основная масса транскрипционных изменений, связанных с аномальным промоторным метилированием опухоль-супрессорных генов, ассоциированных с РМЖ (RARβ, RASSF1A, CCND2, TWIST, HIN-1 и др.), происходит на ранних этапах маммарного канцерогенеза - при переходе от нормального эпителия к атипической протоковой гиперплазии или протоковой карциноме in situ [133, 241, 341–348]. Более того, в последние годы растет количество данных, указывающих на то, что бо́льшая часть аномальных реакций ДНК-метилирования возникает до появления ранних атипических поражений в молочной железе [27] и что лишь небольшое число генов, контролирующих межклеточные/клеточно-матриксные взаимодействия и инвазивную клеточную активность, существенно меняют статус метилирования и функциональную активность на поздних этапах канцерогенеза - при переходе от протоковой карциномы in situ к инвазивной протоковой карциноме МЖ [349–353].

Попробуем разобраться, когда именно в маммарных клетках начинают появляться первые эпигенетические аномалии и можно ли говорить о том, что они сопровождают самые ранние признаки тканевого неблагополучия в молочной железе. Для этого нам придется немного коснуться ее морфологии.

Общепризнанной морфофункциональной и гистопатологической единицей МЖ считается терминальная протоково-дольковая единица . Терминальная протоково-дольковая единица в норме имеет размеры от 1 до 4 мм и состоит из внедолькового и внутридолькового терминальных протоков и собственно дольки (см. рис. 21 ) [353a]. Во время лактации эти эпителиальные структуры внутри МЖ дифференцируются в секретирующие грудное молоко ацинусы, а в течение всей остальной репродуктивной жизни женщины они претерпевают многократные структурные изменения.

В большинстве случаев патологические пролиферативные процессы, приводящие к ДЗМЖ и РМЖ, возникают в одном из двух терминальных протоков и диагностируются как гиперпластические изменения внедольковых (протоковая гиперплазия) и/или внутридольковых (дольковая гиперплазия) протоков.

В последние годы появляются факты, указывающие на важную роль в маммарном канцерогенезе так называемых столбчато-клеточных поражений - патологических изменений, возникающих в столбчатых эпителиальных клетках МЖ [354–356]. Такие клетки аномально замещают обычный кубический эпителий, выстилающий терминальные протоково-дольковые единицы. Столбчато-клеточные поражения МЖ представляют собой кистозно-расширенные, увеличенные в размерах терминальные протоково-дольковые единицы, имеющие один-два (столбчато-клеточные изменения) или более (столбчато-клеточная гиперплазия) слоев столбчатых клеток и часто содержащие интралюминальные продукты секреции и микрокальцинаты. При обнаружении в ткани МЖ аномальной клеточной архитектоники или плазменно-ядерной атипии ставится диагноз "столбчато-клеточные изменения с атипией" или "столбчато-клеточная гиперплазия с атипией" [357]. В 2000-е гг. зарубежными авторами был предложен новый подход к классификации пролиферативных и предраковых состояний МЖ, согласно которому столбчато-клеточные поражения МЖ являются недостающим патоморфологическим звеном между нормальной маммарной тканью и протоковой карциномой in situ [354, 358, 359].

Таким образом, категория "столбчато-клеточные поражения" включает ранние и очень ранние (предшествующие гиперплазии )внутритканевые патологические изменения в молочной железе.

В исследовании Verschuur-Maes et al. 2012 г. проводился сравнительный анализ статуса промоторного метилирования 50 опухоль-супрессорных генов в образцах нормального маммарного эпителия, столбчато-клеточных поражений, протоковой карциномы in situ (DCIS) и инвазивной протоковой карциномы МЖ [347]. В итоге, как и ожидалось, было обнаружено повышенное метилирование исследуемых генов в опухолевых клетках DCIS и инвазивной протоковой карциномы по сравнению с нормальной тканью. Максимальное аномальное гиперметилирование отмечалось для генов RASSF1, CCND2, ID4, SCGB3A1 и CDH13 . Между стадиями DCIS и инвазивной протоковой карциномы существенных изменений профиля ДНК-метилирования выявлено не было. Однако важно, что многие опухоль-супрессорные гены демонстрировали значимый уровень гиперметилирования уже на стадии столбчато-клеточных поражений МЖ. Для гена RASSF1 (и ряда других генов) достоверное увеличение метилирования наблюдалось еще раньше - при переходе от нормы к столбчато-клеточным поражениям, при этом дальнейшего роста его метилирования на стадиях DCIS и инвазивной протоковой карциномы не отмечалось.

В 2016 г. в журнале Breast Cancer был опубликован фундаментальный обзор, существенно расширивший наши представления о том, когда и при каких условиях в маммарной ткани начинают возникать первые генетические и эпигенетические нарушения [360]. Его автор - американский ученый Дэвид Дэнфорт проанализировал и обобщил результаты нескольких десятков исследований, в которых изучались количественные и структурные хромосомные изменения, аномальные реакции ДНК-метилирования, а также изменения профиля генной экспрессии в образцах нормальной и доброкачественной ткани МЖ при нормальном и высоком риске спорадического РМЖ в сравнении с биоптатами из очагов РМЖ.

Тканевые образцы, соответствующие нормальному риску РМЖ, были взяты у женщин, не имевших персональной истории РМЖ. Это были биоптаты, полученные в ходе редукционной маммопластики, биоптаты морфологически нормальной и доброкачественной маммарной ткани, а также образцы тонкоигольной аспирационной биопсии, полученные из соска или периареолярной области у женщин с низким риском РМЖ.

Группу образцов с высоким риском РМЖ составляли образцы гистологически нормальной ткани МЖ, расположенной рядом c очагом предрака (атипической гиперплазии) с высоким риском малигнизации либо рядом с очагом РМЖ (DCIS или инвазивной протоковой карциномы); образцы нормальной ткани из контрлатеральной МЖ у женщин с РМЖ (DCIS или инвазивной протоковой карциномой); образцы нормальной ткани МЖ, взятые у женщин, у которых впоследствии развился РМЖ; образцы нормальной ткани, взятые у женщин из группы высокого риска РМЖ, рассчитанного по стандартной шкале, и образцы, полученные путем протокового лаважа ^[12].

В итоге в образцах маммарной ткани с нормальным риском РМЖ количественные хромосомные изменения, как правило, не обнаруживались, хотя в единичных случаях тенденция к анеуплоидии все-таки проявлялась. В то же время структурные хромосомные изменения в виде потери гетерозиготности и аллельного дисбаланса, ведущие к утрате функции противоопухолевых генов, в таких образцах отмечались как массовое явление. При этом, в числе прочих, мутациям подвергались важнейшие опухоль-супрессорные гены BRCA, RB1, TP53 и CDKN2A/p16 .

Следует подчеркнуть, что указанные генетические мутации выявлялись в тканевых образцах, полученных у здоровых женщин в ходе редукционной маммопластики, а также в образцах нормального протокового эпителия и доброкачественных непролиферативных поражений МЖ у пациенток, не входящих в группу риска РМЖ.

Вспомним, что к аналогичному выводу пришли авторы исследования, которое мы цитировали в самом начале книги в разделе "Введение" [361]. В этом исследовании изучался мутационный профиль маммарных клеток при простой гиперплазии МЖ - заболевании, имеющем общепризнанный низкий риск прогрессии до РМЖ. На основании результатов мутационного анализа, показавшего наличие в большинстве образцов простой гиперплазии МЖ множественных точечных мутаций онкогенов протуморогенного каскада PI3K/Akt/mTOR, авторы заключили, что с точки зрения целостности и стабильности генома простую гиперплазию МЖ следует рассматривать как истинное неопластическое клональное поражение или вариант ранней опухолевой внутрипротоковой пролиферации.

Далее Дэнфорт проанализировал частоту генетических и эпигенетических аномалий в образцах нормальной ткани МЖ, полученных у пациенток с высоким риском РМЖ [360].

Как и следовало ожидать, в нормальной маммарной ткани у таких женщин уровень хромосомных нарушений оказался существенно выше, чем в аналогичных образцах с низким риском РМЖ. При этом не только структурные, но и количественные (анеуплоидия) хромосомные нарушения принимали массовый характер и затрагивали многие противоопухолевые гены.

Помимо хромосомных аномалий, в подавляющем большинстве исследований, процитированных в обзоре, в нормальной ткани с высоким риском РМЖ наблюдались массовые эпигенетические аберрации в виде промоторного гиперметилирования опухоль-супрессорных генов, ассоциированных с РМЖ. Доля образцов с аномальным гиперметилированием составляла соответственно для генов: RASSF1A - 3–100%, RARβ2 - 2–93%,АРС - 11–83%,CCND2/cyc D2 - 11–83%,TIMP3 - 50%,CDKN2A/p16 - 2–100%, CDKN2B/p15 - 28%,CDH1 - 4–100%,CDH13 - 3–28%, GSTP1 - 3–52%, BRCA1 - 5–32%,ESR1/ERα - 7–26%,MGMT - 8%. Причем для некоторых генов эти показатели были сопоставимы с показателями метилирования в очаге РМЖ.

Заметим, что в цитированном выше исследовании Chen et al. [134] у пациенток, имевших одновременно РМЖ и ДЗМЖ, высокая частота метилирования опухоль-супрессорных генов тоже обнаруживалась не только в опухолевой и доброкачественной, но и в нормальной маммарной ткани с высоким риском РМЖ. При этом частота метилирования гена RASSF1 (признанного эпигенетического маркера РМЖ) в нормальных образцах составляла 37,5% (!) (для сравнения: в том же исследовании в доброкачественных биоптатах и в очаге РМЖ этот показатель составлял соответственно 71 и 82%), гена TIMP3 - 25%, а генов АРС, GSTP1, CDKN2B/p15, ESR1/ERα, TP73 и TIMP3 - 12,5% для каждого.

Однако самым удивительным, на наш взгляд, выводом, к которому пришел Дэнфорт, было заключение о том, что во многих случаях повышенное метилирование противоопухолевых генов в доброкачественной и нормальной ткани МЖ наблюдается не только при высоком, но и при нормальном риске РМЖ . При этом так же, как и в образцах с высоким риском РМЖ, гиперметилированию подвергались достоверно ассоциированные с РМЖ опухоль-супрессорные гены: RASSF1A - с частотой 7–37% [133, 286, 343, 344, 362], RARβ2 - с частотой 9% [286], АРС - с частотой 10–26% [286, 345], CCND2/cyc D2 - с частотой 2–7% [360], CDKN2A/p16 - с частотой 20–47% [345, 363–366], CDH13 - с частотой 17% [286], BRCA1 - с частотой 14–20% [345, 363], ESR1/ERα - с частотой 5–40% [360].

Важно подчеркнуть, что тканевые образцы ФКБ, соответствовавшие нормальному риску РМЖ, в которых выявлялось аномальное гиперметилирование опухоль-супрессорных генов, и аналогичные образцы без гиперметилирования при гистологическом анализе были неразличимы [345].

Таким образом, в нормальной/доброкачественной маммарной ткани, полученной у пациенток с нормальным риском РМЖ (в том числе у здоровых женщин, прошедших операцию по редукционной маммопластике), в значительном проценте случаев наблюдались массовые структурные хромосомные изменения (утрата гетерозиготности и аллельный дисбаланс) и аномальное метилирование широкой панели опухоль-супрессорных генов, ассоциированных с РМЖ. Это означает, что у многих клинически здоровых женщин, не входящих в группу риска РМЖ, состояние МЖ на молекулярно-генетическом уровне не соответствует норме и имеет признаки снижения противоопухолевой защиты (предрасположенности к канцерогенезу ).

В итоговой таблице (см. рис. 22 ) суммированы данные, полученные тремя независимыми группами ученых (все эти публикации мы цитировали выше), изучавших частоту метилирования опухоль-супрессорных генов в образцах маммарной ткани с разной степенью опухолевой трансформации, а именно:

При очевидном разбросе конечных показателей, обусловленном объективными причинами, нельзя не заметить отчетливо выраженную тенденцию к увеличению частоты метилирования изучаемых генов в ряду: нормальная/доброкачественная ткань МЖ с нормальным риском РМЖ - нормальная/доброкачественная ткань МЖ с высоким риском РМЖ - РМЖ . При этом обращает на себя внимание высокий уровень метилирования противоопухолевых генов в неопухолевых образцах не только при высоком, но и при нормальном риске РМЖ.

Еще раз подчеркнем, что все вышеперечисленные гены, для которых было показано аномальное гиперметилирование в биоптатах доброкачественной и нормальной маммарной ткани с нормальным онкориском (в том числе полученных у пациенток с ФКБ), являются общепризнанными опухоль-супрессорными генами, тормозящими развитие РМЖ.

О функциях, а также о диагностической и прогностической значимости при РМЖ гиперметилированных генов АРС, BRCA1, RARβ2 и RASSF1A мы подробно рассказали выше. Не менее важными маркерами аномального метилирования в доброкачественной и нормальной ткани при раннем РМЖ являются ген CDKN2A/p16 , кодирующий ингибитор клеточного цикла - белок р16, и ген CDH13 , кодирующий белок адгезии кадгерин 13.

Белок р16 известен как ингибитор циклин-зависимых киназ - ключевых драйверов клеточного цикла. Его гиперэкспрессия вызывает остановку клеточного деления. Нарушение сигнального пути p16/циклин D1/pRb, регулирующего клеточный цикл, характерно для многих злокачественных опухолей [367, 368]. При разных видах рака [369], в том числе при спорадическом и наследственном РМЖ, часто происходит эпигенетическое умолкание гена p16INK4A вследствие его промоторного гиперметилирования, в связи с чем данный ген рассматривается как перспективный диагностический и прогностический эпимаркер многих онкозаболеваний [370–372].

Второй маркер, метилирование которого было обнаружено в доброкачественной и нормальной маммарной ткани, - ген CDH13 - кодирует кадгерин 13, входящий в обширное семейство белков кадгеринов. Кадгерины являются универсальными трансмембранными рецепторами межклеточной адгезии, критичной для поддержания нормальной структуры ткани и динамической реорганизации цитоскелета. Помимо участия в механическом соединении клеток друг с другом, кадгерины участвуют в трансдукции сигналов, опосредующих клеточный рост, деление, дифференцировку и выживаемость. Дисфункция этих сигнальных механизмов меняет фенотип клеток в направлении их опухолевой трансформации и прогрессии [373, 374].

Опухоль-супрессорная активность кадгерина 13 проявляется в его способности индуцировать остановку клеточного цикла, активировать апоптоз, ингибировать ангиогенез и миграцию [375–378]. Показано, что функциональная блокада гена CDH13 вследствие его промоторного гиперметилирования имеет диагностическую и прогностическую клиническую значимость при многих видах рака [379–381], включая РМЖ [335, 382, 383].

Говоря о ранних генетических и эпигенетических изменениях в нормальной маммарной ткани при нормальном и низком риске РМЖ, необходимо добавить, что у таких пациентов, помимо гиперметилирования опухоль-супрессорных генов, ассоциированных с РМЖ, отмечалась повышенная экспрессия некоторых протоонкогенов, в частности протоонкогена HER2/neu [360, 384–388]. Известно, что гиперэкспрессия или амплификация гена/белка HER2/neu наблюдается в 10–34% случаев РМЖ и связана с агрессивностью опухоли и неблагоприятным клиническим прогнозом [389, 390].

Итак, мы поняли, что морфологически нормальная ткань молочной железы далеко не всегда является нормальной с молекулярно-генетической точки зрения. В значительном проценте случаев в ней обнаруживаются необратимые генетические и обратимые эпигенетические нарушения.

Закономерно возникает вопрос: какова причина этих нарушений и что вызывает их появление в структурно интактных клетках МЖ у здоровых женщин?

В своем обзоре Дэнфорт уделил внимание и этой проблеме [360]. В качестве главных индукторов генотоксической активности в маммарных клетках у пациенток с нормальным риском РМЖ он называет эстрогены и их производные. По мнению автора, у многих женщин эпигенетические нарушения и мутации, влияющие на экспрессию генов клеточного деления, выживаемости, дифференцировки, адгезии, ангиогенеза, инвазии и метастазирования, появляются в нормальных клетках МЖ под влиянием эстрогенов и их агрессивных метаболитов еще в подростковом возрасте начиная с периода менархе, а затем в течение жизни происходит накопление молекулярных отклонений и cуммирование их отрицательного эффекта. При этом важно, что такие ранние генетические и эпигенетические аномалии возникают в физиологических условиях при нормальной регуляции менструального цикла задолго до проявления клинической симптоматики.

Следует сказать, что современная научная литература изобилует информацией о генотоксичности и мутагенности эстрогенов. 30–40 лет назад в многочисленных лабораторных и клинических исследованиях была доказана протуморогенная активность и ассоциация с риском РМЖ эстрогенного метаболита - 16α-гидроксиэстрона (16α-ОНЕ1) [391] (см. часть I). Как отмечалось выше, помимо индукции пролонгированной гормон-зависимой пролиферации, обусловленной образованием прочного комплекса 16α-ОНЕ1 с эстрогеновым рецептором, данный метаболит способен вызывать различные генотоксические повреждения наследственного материала. Показано, что повышение уровня 16α-ОНЕ1 отмечается у женщин с ожирением [392, 393], а также у пациенток, принимающих препараты ЗГТ [394, 395].

Кроме 16α-ОНЕ1, известны и другие эстрогенные производные, проявляющие генотоксический, мутагенный и канцерогенный эффект в различных органах и тканях, в том числе в МЖ [396]. В экспериментах in vitro и in vivo были обнаружены повреждения ДНК, вызванные ДНК-аддуктами с электрофильными метаболитами эстрогенов. Было показано, что промежуточные хиноновые соединения, образующиеся в ходе окисления катехол-эстрогенов - 4-гидрокси-эстрадиола и 4-гидроксиэстрона, могут реагировать с пуриновыми основаниями ДНК (аденином и гуанином) и формировать аддукты, индуцирующие появление высокомутагенных апуриновых сайтов. По другим данным, метаболиты катехол-эстрогенов способны генерировать образование потенциально мутагенных реактивных кислородных радикалов, вызывающих генетические и/или эпигенетические нарушения. В ряде исследований эстрадиол и синтетический аналог эстрогена диэтилстильбэстрол в условиях in vitro индуцировали количественные и структурные хромосомные нарушения, некоторые типы генетических мутаций и микросателлитную нестабильность [396–399]. Известны и другие факторы, влияющие на проявление канцерогенных свойств эстрогенов [396]. Так, реактивные метаболиты лошадиного эстрогена в составе препаратов ЗГТ повышали риск РМЖ за счет ингибирования ферментов II фазы детоксикации - глутатион-S-трансферазы и катехол-O-метилтрансферазы [400, 401].

Повреждающий эффект эстрогенов у здоровых женщин, приводящий к генетическим и эпигенетическим аномалиям, Дэнфорт объясняет постоянством и длительностью такого воздействия. Простейший расчет показывает, что при среднем возрасте пациенток - 40–50 лет и нормальном возрасте менархе (12 лет) их маммарная ткань подвергалась постоянному митогенному и генотоксическому эффекту эстрогенов в среднем в течение 30 и более лет. По мнению автора, если в какой-то период жизни на женщину начинают действовать другие факторы внешней и внутренней среды, повышающие риск РМЖ, в том числе связанные с гормональным фоном (раннее менархе, бездетность, поздняя первая доношенная беременность, долговременный прием комбинированных оральных контрацептивов, поздняя менопауза, постменопаузальное ожирение) или с влиянием внутренних патологических состояний (гинекологические и/или хронические воспалительные заболевания), то процессы опухолевой трансформации в ее МЖ получают дополнительный импульс к ускорению [402, 403]. В качестве примеров множественного перекрестного влияния средовых факторов на эпигеном Дэнфорт приводит следующие факты. В группе клинически здоровых женщин, прошедших редукционную маммопластику, семейный онкологический анамнез был ассоциирован с повышенным в 2–7 раз по сравнению с контролем уровнем метилирования генов p16INK4 ,BRCA1 и гена ERα , а гиперметилирование гена p16INK4 , кроме семейной истории, ассоциировалось с регулярным употреблением алкоголя [362].

Можно предположить, что раннее появление и последующее длительное накопление геномных и эпигеномных нарушений в МЖ, вызванных множественными онкогенными факторами, является главной предпосылкой высокой частоты не диагностированного при жизни предрака и рака МЖ in situ в постмортальных гистологических исследованиях. По данным Nielsen et al., при изучении аутопсийных образцов МЖ, взятых у женщин, умерших по не связанным с РМЖ причинам, в 32% случаев выявлялись гиперпластические поражения, в 27% - атипичная протоковая гиперплазия, в 18% - протоковая карцинома in situ (DCIS) и в 2% - инвазивный РМЖ. Причем почти у половины женщин с DCIS диагностировалось двустороннее и/или многоочаговое заболевание [404]. В более позднем постмортальном исследовании Black и Welch в 39% образцов, взятых у женщин 40–50 лет, погибших от травм и несчастных случаев и не имевших при жизни онкологического диагноза, был обнаружен РМЖ in situ [405], при том что прижизненно РМЖ выявляется только у 1% женщин этой возрастной категории.

Другие авторы указывали на неожиданно частые находки молекулярных и гистологических изменений в биоптатах МЖ, полученных в ходе редукционной маммопластики у клинически здоровых женщин [406].

Резюмируя свой анализ, Дэнфорт предложил новую модель маммарного канцерогенеза, в соответствии с которой начиная с периода менархе в нормальных клетках МЖ при нормальном риске РМЖ под действием эстрогенов, их агрессивных метаболитов и других канцерогенных индукторов (вредных средовых факторов - Е.М., В.К., Н.Р., Л.А. ) возникают генетические и эпигенетические изменения в противоопухолевых генах, ассоциированные с ранним канцерогенезом и повышенным риском РМЖ. Эти изменения со временем накапливаются, в результате чего формируется так называемое "поле канцеризации" (см. далее главу 7: "Концепция поля канцеризации"), усиливается общая нестабильность генома, растет клональная экспансия трансформированных клеток, повышается их восприимчивость к накоплению новых мутаций и эпигенетических аберраций. При этом маммарная ткань продолжает оставаться морфологически нормальной, с нормальным кариотипом, без грубых хромосомных нарушений. В течение последующей репродуктивной жизни женщины на фоне перманентного митогенного и генотоксического влияния эстрогенов начинают действовать дополнительные факторы, в том числе напрямую ассоциированные с риском РМЖ (семейный онкологический анамнез, наличие ДЗМЖ, предрака МЖ, РМЖ и др.), которые отрицательно влияют на тканевое благополучие МЖ [360].

Следует сказать, что генетический и эпигенетический портрет морфологически нормальной маммарной ткани у здоровых женщин изучался и в других исследованиях, не вошедших в обзор Дэнфорта. Результаты этих работ позволили их авторам прийти к следующим важным выводам, поддерживающим вышеприведенную концепцию.

С учетом сказанного, становится понятно, что гетерогенность РМЖ, являющаяся важнейшей проблемой современной клинической онкологии, как минимум отчасти обусловлена вариативностью молекулярно-генетического профиля нормальной маммарной ткани. Именно нормальные клетки МЖ после воздействия на них проканцерогенных индукторов становятся источником различных эпигенетических и генетических дефектов, связанных с онкогенными рисками. Таким образом, при изучении механизмов маммарного канцерогенеза необходимо исследовать индивидуальные особенности не только опухолевой, но и морфологически нормальной ткани МЖ [407].

По мнению специалистов, такой подход имеет большие перспективы для разработки новых методов эпигенетической диагностики (в том числе как инструментов скрининга) раннего доклинического РМЖ у бессимптомных женщин с не вызывающими опасения маммограммами и нормальными результатами клинического обследования, а также для создания новых эффективных методов широкомасштабной онкопрофилактики, обоснованной с точки зрения молекулярного патогенеза [132, 411]. Подтверждена эффективность использования эпигенетических маркеров для заблаговременного (за годы до постановки онкологического диагноза) выявления пациентов с повышенным риском РМЖ [412–414].

Впервые теория поля канцеризации была сформулирована американским ученым Данели Слоттером в 1953 г. Исходно она описывала взаимосвязь между мультифокальностью (многоочаговостью) злокачественных опухолей, их способностью к рецидивированию и визуально наблюдаемыми гистологическими отклонениями в прилежащих к опухоли обширных (более 5–7 см в диаметре) участках эпителиальной и стромальной ткани, то есть в окружающем опухоль поле дефектных клеток [415, 416]. Тогда впервые была высказана идея о том, что рак - это не локальное событие местного значения, затрагивающее небольшую группу клеток, а результат дисфункции и нарушенного взаимодействия множества клеток в том или ином участке организма.

Впоследствии смысловое содержание данной концепции качественно изменилось. Объектом изучения стал молекулярно-генетический портрет визуально нормальных тканей, примыкающих к опухолевому очагу [417–420], в частности к очагу РМЖ [136, 421]. Согласно обновленному понятию поля канцеризации, распространение злокачественной опухоли происходит за счет трансформации клеток прилежащего нормального эпителия, а не в результате их разрушения опухолевым клоном. При этом пул опухолевых клеток увеличивается по причине накопления в наследственном аппарате нормальных клеток аберрантных молекулярных событий, активирующих или инактивирующих ассоциированные с раком гены клеточной пролиферации, дифференцировки, выживаемости и апоптоза. Допускается, что каждое такое событие в отдельности не является летальным, однако в сумме их эффект может нарушать внутритканевой баланс и приводить к образованию устойчивого патологического клеточного клона, обладающего протуморогенными свойствами [422].

По прошествии некоторого времени было сделано важное наблюдение. Было показано, что профиль генной экспрессии в морфологически нормальной ткани, прилежащей к очагу РМЖ, соответствует генетической сигнатуре, характерной для процессов ранозаживления, фиброза и эпителиально-мезенхимального перехода [423–425]. При этом в пределах поля канцеризации, помимо повышенной генетической нестабильности, наблюдалось подавление экспрессии противоопухолевых генов и, напротив, усиление экспрессии генов, опосредующих онкогенез и опухолевую прогрессию [426, 427]. Присутствие в нормальной маммарной ткани генетически измененных клеток, оставшихся после хирургического удаления первичной опухоли, достоверно повышало риск развития рецидивных и метастатических очагов РМЖ [427].

Важнейшим этапом формирования современной концепции поля канцеризации явилось доказательство его эпигенетической основы . Ученые установили, что экспрессия функционально важных генов в прилежащей к опухоли нормальной ткани нарушается не в результате генетических мутаций (как считалось ранее), а главным образом вследствие обратимых эпигенетических модификаций и прежде всего - аномального ДНК-метилирования [121, 422, 428–430]. Причем эти эпигенетические аберрации затрагивают наиболее чувствительные к опухолевой трансформации и малигнизации, низкодифференцированные клетки-предшественники - нормальные стволовые и опухолевые стволовые клетки [278, 431].

Сначала в качестве средовых факторов, изменяющих эпигенетический портрет нормальных клеток, рассматривались исключительно канцерогенные метаболиты эстрогенов, однако позднее перечень эпигенетических индукторов существенно расширился [432]. После того как была установлена приоритетная значимость эпигенетики для формирования поля канцеризации, в таргетной противоопухолевой терапии стали активно разрабатываться подходы, направленные на его коррекцию с помощью эпигенетических препаратов.

Обновленная эпигенетическая концепция поля канцеризации получила новое мощное развитие применительно к опухолям МЖ. В ходе исследований по полногеномному скринингу ДНК-метилирования было установлено, что процесс формирования поля эпигенетически дефектных маммарных клеток из нормальных клеток протекает в рамках непрерывного тканевого континуума. Выявляемые при этом эпигенетические полевые дефекты возрастали в количестве по мере прогрессии опухоли и были идентичны маркерам недифференцированных туморогенных клеток-предшественников (белкам эмбриональных сигнальных каскадов и каскадов ростовых факторов) [430].

Таким образом, сегодня при оценке поля канцеризации предлагается использовать эпигенетические маркеры, а при его фармакологической коррекции - эпигенетические препараты, обладающие противоопухолевой активностью [430, 433]. Такой подход признается перспективным для разработки новых методов диагностики и лечения РМЖ, поскольку позволяет свести к минимуму вероятность развития опухолевого рецидива после хирургической операции, а также предотвратить переход карциномы in situ в инвазивный и метастатический РМЖ у женщин, имеющих эпигенетические риски [136, 421].

В многочисленных исследованиях, в том числе проведенных с использованием современных методов полногеномного анализа, было установлено, что I3C и его физиологический метаболит DIM - вещества природного происхождения с доказанной мультитаргетной противоопухолевой активностью - положительно действуют на все три основных эпигенетических механизма, нарушенные в канцерогенезе. Они специфически обращают аномальное гиперметилирование ДНК и деацетилирование гистонов хроматина, а также модулируют экспрессию некодирующих микроРНК, в результате чего в клетке восстанавливается нормальный профиль генной экспрессии и повышается противоопухолевая защита.

В экспериментах in vitro и in vivo при разных видах рака, в том числе при РМЖ, I3C и DIM, ингибировали активность и экспрессию ключевых эпигенетических ферментов, опосредующих подавление экспрессии и инактивацию опухоль-супрессорных генов: трех изоформ ДНК-метилтрансферазы (DNMT1, DNMT3а, DNMT3b) [109, 110, 116, 117, 434] и четырех изоформ гистондеацетилазы первого класса (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8) [112, 115, 116, 435]. Эти процессы сопровождались торможением роста и повышением чувствительности опухолей к стандартной терапии.

Было показано, что DIM-опосредованное ингибирование изоферментов гистондеацетилазы первого класса (HDAC I) обусловлено их избирательной протеасомной деградацией и коррелирует с активацией ингибиторных белков клеточного цикла - р21 и р27, блокадой пролиферации (остановкой клеточного цикла в фазе G2), потенцированием митохондриального апоптоза (уменьшением уровня антиапоптотических и повышением уровня проапоптотических белков), а также количественным ростом повреждений ДНК [112, 115, 435].

Заметим, что, в отличие от HDAC I, экспрессия гистондеацетилазы второго класса (HDAC II) ассоциируется с хорошим клиническим прогнозом. Поэтому способность DIM селективно ингибировать HDAC I является его важным преимуществом по сравнению со стандартными HDAC-ингибиторами, которые или одновременно подавляют активность HDAC I и HDAC II, или, в лучшем случае, ингибируют только один из изоферментов HDAC I (вальпроевая кислота, фактор TNFα), то есть проявляют существенно меньшую специфичность, чем DIM [436, 437].

В экспериментах на животных моделях восстановление нормального профиля генной экспрессии, опосредованное эпигенетической активностью DIM, коррелировало с усилением апоптоза и снижением пролиферации раковых клеток, а также со значительным уменьшением количества предопухолевых, первичных опухолевых и метастатических очагов [116].

В исследовании Lyn-Cook et al. инкубация клеток рака поджелудочной железы линии MiaPaCa2 с I3C в течение 24 и 48 ч приводила к дозозависимому промоторному деметилированию и выраженной реактивации одного из ключевых опухоль-супрессорных генов - р16 ^INK4a [110]. Как мы говорили ранее, кодируемый данным геном белок входит в группу эндогенных ингибиторов клеточного цикла и инактивация гена р16 ^INK4a посредством промоторного гиперметилирования считается универсальным событием в раннем канцерогенезе при разных видах рака. Примечательно, что положительным контролем в цитируемом исследовании был сертифицированный ДНК-деметилирующий агент - 5-азацитидин, который также реактивировал ген р16 ^INK4a после 48-часовой обработки опухолевых клеток, но при этом, в отличие от I3C, проявлял выраженную токсичность [110]. Известно, что недостаточная специфичность и токсичность лицензированных эпигенетических препаратов часто приводят к серьезным побочным эффектам и ограничивают их широкое применение [41, 100–102].

В экспериментах in vitro и in vivo в присутствии DIM, на фоне снижения уровня ДНК-метилирования и ингибирования экспрессии эпигенетических ферментов (трех изоформ DNMT и двух изоформ HDAC - HDAC2 и HDAC3), наблюдались деметилирование и реактивация гена, кодирующего фактор Nrf2, а также реактивация Nrf2-целевых генов [116]. При этом у трансгенных мышей, потреблявших с кормом DIM, отмечалось подавление пролиферации и усиление апоптоза опухолевых клеток, а также значительное уменьшение частоты образования неоплазий, первичных опухолей и метастазов по сравнению с контрольными животными, не получавшими DIM.

Напомним, что транскрипционный фактор Nrf2 регулирует и координирует экспрессию большой группы ферментов детоксикации и антиоксидантной защиты и играет ключевую роль в предохранении клетки от оксидативного стресса и развития воспаления в канцерогенезе. Есть данные о функциональном перекрестном взаимодействии Nrf2- и NF-êB-сигнальных систем. Показано, что положительное влияние пищевых индолов на активность универсального фактора транскрипции NF-êB обусловлено, в том числе, активацией Nrf2-зависимых сигнальных каскадов [438].

Способность I3C и DIM индивидуально и в сочетании с другими природными химиопрофилактическими соединениями стимулировать экспрессию Nrf2-целевых генов и белков, а также повышать общую антиоксидантную и противоопухолевую защиту организма при разных видах рака была подтверждена во многих исследованиях in vitro и in vivo [438–443]. По данным Fan et al., усиление Nrf2-сигналинга в нормальных и раковых клетках в присутствии физиологически релевантных микромолярных и субмикромолярных концентраций DIM объяснялось DIM-опосредованной активацией экспрессии опухоль-супрессорного белка BRCA1 [444]. В экспериментах in vivo Nrf2-опосредованная антиоксидантная активность DIM существенно ослабляла гемато- и кардиотоксичность противоопухолевого препарата доксорубицина [445].

Недавно нами в соавторстве с коллегами было показано, что I3C проявляет селективную ДНК-деметилирующую активность в клетках метастатического РМЖ линии MDA-MB-231. I3C специфически обращал аномальное промоторное гиперметилирование и функционально реактивировал ген WIF-1 , кодирующий одноименный белок - ингибитор эмбрионального Wnt-каскада [446] (см. часть II, главу 3 "Эпигенетика рака молочной железы"). После 48-часовой инкубации клеток РМЖ с 100 мкМ I3C уровень промоторного метилирования гена WIF-1 падал со 100 до 41%. Одновременно с этим понижалась экспрессия генов CCND1, Sp1, CDK6, EGFR и FASN , для которых ранее была установлена регуляторная взаимосвязь с Wnt-каскадом [447–449]. Эпигенетические эффекты I3C сопровождались уменьшением выживаемости и миграционной активности опухолевых клеток.

В качестве положительного контроля мы использовали клеточную линию MCF-10A. Эти иммортализованные нетуморогенные эпителиальные клетки, выделенные из ткани МЖ у пациенток с ФКБ, являются признанной экспериментальной моделью неопухолевой (условно нормальной) маммарной ткани [450]. В нашем исследовании в условно нормальных клетках MCF-10A, в отличие от клеток метастатического РМЖ, I3C не оказывал деметилирующего эффекта. Исходный более низкий уровень промоторного метилирования гена WIF-1 в клетках MCF-10A, составлявший 66,7%, после их продолжительной инкубации с 100 мкМ I3C не изменился. На том же исходном уровне остались выживаемость и миграционная активность контрольных клеток. Данный факт полностью согласуется с ранее установленным селективным действием I3C и его физиологического метаболита DIM исключительно на раковые и трансформированные клетки [451, 452].

С большой вероятностью можно предположить, что обнаруженная нами способность I3C обращать аномальное гиперметилирование гена WIF-1 распространяется не только на МЖ, но и на другие органы и ткани. Известно, что женщины, проходящие лечение по поводу ДЗМЖ, часто имеют одно или несколько сопутствующих гинекологических заболеваний (миома матки, дисплазия шейки матки и др.), при которых отмечаются повышенное метилирование и инактивация WIF-1 в ткани пораженного органа. В клинических исследованиях, проведенных в российских медицинских центрах, применение у таких пациенток препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ) оказывало терапевтический эффект одновременно в МЖ и в матке. В результате обеспечивалась фармакологическая коррекция не только ДЗМЖ, но и других (гинекологических) заболеваний репродуктивной системы, объединенных общностью молекулярного патогенеза. Можно предположить, что такая множественная терапевтическая активность препарата отчасти обусловлена I3C-опосредованными деметилированием и реактивацией опухоль-супрессорного гена WIF-1 в различных органах-мишенях.

Разработка и апробация лекарственных препаратов - специфических ингибиторов Wnt-каскада - является актуальной задачей современной фармакологии [453, 454]. В настоящее время проводятся десятки клинических исследований, в которых изучается их эффективность. Наименее токсичными из них считаются препараты, ингибирующие продукцию индукторных Wnt-белков, так как они блокируют начальные этапы Wnt-каскада и не затрагивают молекулярные мишени, участвующие в нижележащих сигнальных процессах. Однако даже такие препараты, проходящие сейчас клинические испытания, к сожалению, демонстрируют недостаточную селективность и эффективность [455].

Препарат индолкарбинол (Индинол Форто ^® ), активным компонентом которого является I3C- вещество природного происхождения, деметилирующее и активирующее опухоль-супрессорный ген WIF-1, можно рассматривать как нетоксичный селективный ингибитор Wnt-каскада, эффективный при злокачественных и доброкачественных заболеваниях женской репродуктивной системы. На сегодняшний день это единственный зарегистрированный лекарственный препарат в этой группе.

Мы рассказали о деметилировании и реактивации гена WIF-1 под действием I3C. Однако важно понимать, что деметилирующая активность I3C, обусловленная его способностью ингибировать фермент ДНК-метилтрансферазу, распространяется и на многие другие гены, аномально метилированные и инактивированные при РМЖ. Установлено, что в условиях in vitro I3C и DIM модулируют экспрессию широкой панели генов, контролирующих рост и распространение опухолевых клеток. В ходе полногеномного анализа клеток гормон-зависимого и гормон-независимого рака предстательной железы, предварительно инкубированных с DIM, на фоне ингибирования DNMT изменялся уровень промоторного метилирования соответственно 2,4 и 4,4 тыс. генов, ассоциированных с канцерогенезом. В присутствии DIM отмечалось деметилирование и, как следствие, реэкспрессия и реактивация "молчащих" генов, регулирующих клеточную подвижность, адгезию, апоптоз, ангиогенез, транскрипцию, иммуновоспалительный ответ, межклеточный и гормональный сигналинг [117].

Следует отметить, что результатом противоопухолевой эпигенетической активности I3C и DIM может быть не только повышение экспрессии опухоль-супрессорных, но и понижение экспрессии протуморогенных генов. В полногеномных исследованиях на раковых клетках с применением микрочиповых технологий, помимо массовой реактивации противоопухолевых генов, под действием I3C и DIM происходило усиление промоторного метилирования и подавление экспрессии целого ряда онкогенов [117, 456]. Этот парадоксальный, на первый взгляд, факт объясняется, с одной стороны, сложностью механизмов эпигенетической регуляции, а с другой стороны - многообразием способов влияния на них пищевых индолов. Ведь I3C и DIM обладают способностью не только напрямую ингибировать фермент DNMT, но и опосредованно влиять на ДНК-метилирование, воздействуя на широкий спектр мишеней, обусловливающих его взаимодействие с другими эпигенетическими процессами. Таким образом, помимо ферментативной активности DNMT, конечный профиль ДНК-метилирования будет определяться целым рядом других факторов, влияющих на плотность упаковки и транскрипционную доступность хроматина, а именно: присутствием или отсутствием ассоциированных с хроматином регуляторных белков, локальным распределением гистоновых меток (гистоновый код) и пр. [117].

В исследовании, проведенном в США в лаборатории Фазлула Саркара, использовались микрочиповые технологии и метод ПЦР в реальном времени. После 24-часовой инкубации клеток рака простаты с I3C и DIM авторы наблюдали более чем двукратное изменение экспрессии 727 (в присутствии I3C) и 738 (в присутствии DIM) генов. При этом первые признаки модуляции генной экспрессии отмечались уже через 6 ч обработки клеток данными веществами. По данным кластерного анализа, I3C и DIM повышали экспрессию генов, контролирующих активность ферментов I и II фазы детоксикации, и, напротив, подавляли экспрессию онкогенов, активирующих процессы клеточного роста, пролиферации, сниженного апоптоза, протуморогенного сигналинга и транскрипции [456].

Неопровержимые доказательства плейотропности действия I3C как регулятора генной экспрессии при РМЖ были недавно получены турецкими учеными Odongo et al., применившими системный фармакологический подход [457]. В этом инновационном исследовании клетки РМЖ различных подтипов после их инкубации с I3C подвергали транскриптомному анализу, после чего полученные данные совмещали с картой белкового интерактома (картой внутриклеточных молекулярных взаимодействий) и в сконструированных таргетных подсетях выявляли онкогенные сигнальные пути. В итоге в разных подтипах РМЖ сигнальные процессы, регулируемые I3C, на уровне транскрипции достоверно проецировались на онкогенные. При этом существенно повышалась экспрессия противоопухолевых генов, что свидетельствовало об их специфической активации под действием I3C.

Мы обсудили способность I3C и его метаболита DIM обращать аберрантные реакции метилирования ДНК и деацетилирования гистонов. Однако пищевые индолы эффективно действуют и на третий базовый эпигенетический механизм, изменяя профиль экспрессии многочисленных регуляторных РНК. В настоящее время количество исследований, в которых изучается участие в канцерогенезе некодирующих микроРНК и длинных РНК, растет колоссальными темпами. Есть все основания ожидать, что в недалеком будущем в этой области эпигенетики рака нас ожидает настоящий прорыв и мы станем свидетелями появления новых эффективных средств диагностики и лечения злокачественных опухолей.

В экспериментах in vitro и in vivo в опухолевых клетках различного происхождения, в том числе РМЖ, а также в нормальных/неопухолевых клетках, находящихся в состоянии метаболического стресса, в присутствии I3C и DIM повышалась экспрессия опухоль-супрессорных и понижалась экспрессия онкогенных микроРНК, относящихся к семействам: let-7 (let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f), miR-30 (miR-30a, miR-30c), miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c), miR-125 (miR-125a, miR-125b), miR-181 (miR-181a, miR-181b) и miR-200 (miR-200b, miR-200c). Установленными мишенями I3C и DIM в опухолевых и трансформированных клетках являются также опухоль-супрессорные и онкогенные микроРНК, а также их предшественники: miR-1, miR-10a, miR-16, miR-17-5р, miR-19a, miR-20a, miR-21, miR-22, miR-26a, miR-31, miR-93, miR-99b, miR-106a, miR-122a, miR-123-prec, miR-124a-prec, miR-130a, miR-140s, miR-145-prec, miR-146-prec, miR-146a, miR-146b, miR-191-prec, miR-192, miR-210, miR-219-prec, miR-221, miR-222-prec, miR-222, miR-223-prec, miR-294, miR-377, miR-494 [114, 120, 458–468]. Для многих из них (miR-26a, miR-34a, miR-21 и др.) доказана прямая ассоциация с маммарным канцерогенезом и участие в регуляции процессов клеточного роста, пролиферации, апоптоза, неоангиогенеза, инвазии, метастазирования и энергетического метаболизма [124].

I3C-/DIM-опосредованная модуляция экспрессии вышеперечисленных микроРНК приводила к снижению продукции онкогенных и повышению продукции опухоль-супрессорных белков, остановке клеточного цикла, ингибированию протуморогенных сигнальных процессов, cнижению экспрессии гормональных рецепторов, а также к ослаблению опухолевой химиорезистентности, уменьшению пула ОСК и обращению процесса ЭМП.

В длинном списке микроРНК - мишеней I3C и DIM - следует особо выделить miR-21. Это одна из первых молекул микроРНК, обнаруженных у млекопитающих, которая отличается высокой консервативностью структуры и входит в число самых изучаемых микроРНК в мире. Показано, что miR-21 гиперэкспрессируется при многих видах рака, в том числе при РМЖ, и участвует в регуляции пролиферации и митохондриального апоптоза, взаимодействуя с сигнальными белками Akt, Bcl-2 и Bax [124, 469–471]. Cогласно данным мета-анализа 2016 г., аномально повышенный уровень miR-21 может использоваться в качестве высокочувствительного и специфичного биомаркера в диагностике раннего РМЖ [472]. Аномально высокая экспрессия miR-21 наблюдается также при фиброзных заболеваниях легких, почек, печени и сердца [473–476]. Есть мнение, что повышенный уровень miR-21 в ткани может отражать общую патологическую реакцию организма на избыточный клеточный стресс [477].

Установлено, что в основе протуморогенной и профиброзной активности miR-21 лежит способность данной молекулы усиливать пролиферацию посредством ингибирования опухоль-супрессорной фосфатазы PTEN (признанного блокатора пролиферативного PI3K/Akt- и ERK-сигналинга) [478, 479], а также стимулировать фиброгенез путем активации TGFβ-каскада и процесса ЭМП [476, 480]. Таргетное ингибирование miR-21 приводило к регрессии патологических фиброзных повреждений [474, 479, 481–483].

В 2010 г. на животной модели химически индуцированного рака легких [460] и в 2015 г. на моделях in vitro и in vivo гепатоцеллюлярной карциномы [465] была показана способность I3C подавлять гиперэкспрессию miR-21. В данных исследованиях использовались микрочиповые технологии, метод ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинг-анализ. В присутствии I3C наблюдалось повышение экспрессии фосфатазы PTEN и других miR-21-целевых опухоль-супрессорных белков, ингибирование активированного протуморогенного Akt-каскада и подавление процесса ранозаживления (ЭМП).

Участие в регуляции и дисрегуляции фиброза и, соответственно, наличие антифиброзной или профиброзной активности сегодня установлено не только для miR-21, но и для других микроРНК - мишеней I3C и DIM, а именно: let-7, miR-1, miR-26, miR-30, miR-34, miR-122, miR-192, miR-200 и miR-377 [475, 484–486]. Показано, что ассоциированные с фиброзом микроРНК регулируют ключевые сигнальные каскады, опосредующие клеточный цикл, митохондриальный апоптоз, активацию и дифференцировку фибробластов, синтез компонентов внеклеточного матрикса и процесс ЭМП [485]. Большая часть этих молекул, помимо фиброза, ассоциирована с развитием РМЖ [124, 127].

Подчеркнем, что тема фиброза как патологического процесса, тесно связанного с канцерогенезом, представляет для нас особый интерес, поскольку при мастопатии всегда в большей или меньшей степени присутствует фиброзный компонент. Показано, что фиброзные процессы играют важную роль в патогенезе повышенной маммоплотности, часто сопутствующей мастопатии и являющейся сильным фактором риска РМЖ (см. часть III "Повышенная маммографическая плотность").

В проведенном в 2013 г. исследовании Zhang et al. была обнаружена способность DIM - основного физиологического метаболита I3C - ингибировать экспрессию miR-21 при фиброзе печени [462].

Известно, что основными эффекторами фиброза печени - заболевания, для которого пока не существует доступного и адекватного медикаментозного лечения, являются звездчатые клетки (синонимы: липоциты, клетки Ито, жирозапасающие клетки). Они локализованы в перисинусоидальном пространстве печеночной дольки и функционируют в двух состояниях: покоя и активации. Покоящиеся звездчатые клетки присутствуют в неповрежденной здоровой печени, где составляют 5–8% от общего клеточного пула и содержат в цитоплазме запасы витамина А в форме жировых капель. При повреждении печени звездчатые клетки подвергаются трансдифференцировке и переходят в активированную форму, для которой характерны пролиферация, хемотаксис, сократимость, потеря запасов витамина А и образование клеток, напоминающих миофибробласты. Активация звездчатых клеток, опосредованная TGFβ/Smad2/3-сигнальным каскадом, является критическим событием в фиброгенезе и патогенезе цирроза печени. Активированные звездчатые клетки печени активно продуцируют цитокины, хемокины, коллаген, α-гладкомышечный актин, протеогликаны и другие компоненты внеклеточного матрикса.

В своем исследовании Zhang et al. изучали терапевтический эффект DIM и обусловливающие его молекулярные механизмы при фиброзе. Эксперименты проводились в условиях in vitro с использованием культивируемых звездчатых клеток печени линии HSC-T6 (стандартная клеточная линия при изучении фиброза печени) и первичных звездчатых клеток, а также in vivo на мышиной модели тиоацетамид-индуцированного фиброза печени. Влияние DIM на активацию звездчатых клеток оценивали путем анализа экспрессии в них гладкомышечного актина, коллагена I и miR-21. В качестве ингибитора miR-21-опосредованных эффектов использовался антисенс-олигонуклеотид с антагонистической активностью.

В результате было установлено, что DIM способен подавлять TGFβ/Smad2/3-опосредованную активацию звездчатых клеток печени и последующий фиброз, ингибируя в них экспрессию miR-21. При этом ингибированию miR-21, обусловленному DIM, предшествовала супрессия транскрипционного фактора AP-1, одной из ключевых мишеней которого является сигнальная киназа JNK, гиперактивированная в миофибробластах при фиброзе печени [487], а также в маммографически плотной ткани МЖ и в опухолевой строме при РМЖ [488].

Важно отметить, что в экспериментах Zhang et al. потребление животными DIM в дозе 50 мг/кг не приводило к снижению уровня печеночных ферментов аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, то есть терапевтическая активность DIM была обусловлена его прямым действием на фиброгенез и не являлась результатом предотвращения тиоацетамид-индуцированного некроза гепатоцитов.

В итоге авторы пришли к выводу о целесообразности использования DIM в качестве фармакологического средства при лечении фиброза печени.

Способность DIM подавлять экспрессию miR-21 на уровне транскрипции, а именно уменьшать количество предшественника данной микроРНК, была подтверждена другими авторами, в том числе нами [467, 468]. В нашем исследовании была установлена взаимосвязь между DIM-опосредованным ингибированием продукции miR-21-5p (предшественника miR-21) и повышением чувствительности клеток РМЖ к комбинированной противоопухолевой химиотерапии на основе циклофосфамида и метотрексата [468]. Эксперименты проводились на культивируемых органоидах, полученных от больных РМЖ. В настоящее время экспериментальная модель опухолевых органоидов становится все более популярной. Считается, что трехмерные органоиды в большей степени воспроизводят генетическую гетерогенность первичной опухоли и лишены основных недостатков, свойственных обычным двумерным клеточным культурам. Поэтому с помощью таких исследований можно более точно предсказать клинический ответ пациентов на действие химиотерапевтических препаратов [489, 490].

Маммографическая плотность (МП) характеризует тканевое строение МЖ при рентгеновской визуализации и отражает соотношение на маммограмме фиброзно-железистого и жирового компонентов. Фиброзно-железистая ткань состоит из волокнистой соединительной ткани и паренхимы, а та, в свою очередь, - из железистых эпителиальных клеток, сгруппированных в альвеолы, и эпителиоцитов, выстилающих млечные протоки. Радиологически плотные эпителиальная и соединительная ткани МЖ сильнее ослабляют рентгеновское излучение и на маммограмме выглядят светлыми, в отличие от жировой ткани, которая на маммограмме выглядит темной (см. рис. 24 ) [1].

Установлено, что МП положительно коррелирует с ростом женщины, ее семейной историей РМЖ, неспособностью к деторождению, поздним возрастом первых родов и отрицательно коррелирует с возрастом, числом родов в анамнезе и ИМТ [2–5].

В настоящее время, с поправкой на возраст и ИМТ, повышенная маммоплотность признается важнейшим независимым фактором риска всех типов РМЖ [6]. При этом способность к динамическим изменениям под влиянием внешней среды является отличительной чертой МП по сравнению с другими факторами риска РМЖ.

Надо сказать, что как независимый фактор риска РМЖ повышенная маммографическая плотность (ПМП) стала рассматриваться относительно недавно, долгое время ее связь с канцерогенезом недооценивалась. Впоследствии было показано, что только пожилой возраст и наследственные мутации генов BRCA1/2 являются более сильными факторами риска РМЖ, чем ПМП, и что относительный риск РМЖ, ассоциированный с ПМП, существенно превышает относительный риск РМЖ, ассоциированный с любым из антропометрических или репродуктивных факторов, а также с семейной историей РМЖ [7].

Есть данные, что риск РМЖ, связанный с ПМП, превышает относительный риск РМЖ, связанный с любым другим фактором, независимо от статуса генов BRCA1/2 [8]. Известно, что у 55–65% женщин - носителей мутаций гена BRCA1 - к 70-летнему возрасту развивается наследственный РМЖ, при этом такие опухоли составляют не более 2–5% от всех случаев РМЖ в женской популяции [9, 10]. В то же время ПМП, в среднем умеренно повышая риск РМЖ, часто обнаруживается у женщин, не входящих в группу риска РМЖ. Установлено, что 50% женщин в возрасте 40–49 лет и 30% женщин в возрасте 70–79 лет имеют МП ≥50%. Согласно результатам трех независимых исследований, в которых участвовали женщины 25–79, 46–73 и 40–74 лет, в общей женской популяции доля женщин с МП >25–50%, то есть с ПМП, превышает 40% [11–13].

Таким образом, можно заключить, что риск РМЖ, связанный с повышенной маммоплотностью, вносит значительный вклад в сумммарный показатель заболеваемости РМЖ.

В настоящее время FDA введен нормативный акт, обязывающий информировать каждую пациентку в письменной форме о данных проведенного маммографического исследования. По состоянию на январь 2018 г. в 30 штатах США в законодательном порядке введено требование обязательного уведомления пациентов о показателе МП, установленном в ходе маммографии [14–16]. В настоящее время в Америке идет активная подготовка к принятию соответствующего федерального закона [17]. К сожалению, в России маммоплотность пока мало используется при оценке индивидуального риска РМЖ и мониторинге женщин, входящих в группу риска РМЖ.

Хорошо известно, что плотная ткань МЖ, затрудняющая успешное проведение рентгеновской маммографии, - весьма распространенное явление среди здоровых женщин молодого возраста [18–22]. Менее известно, что между повышенной МП и формированием агрессивного опухолевого фенотипа у молодых женщин установлена взаимосвязь и что этот феномен давно изучается и обсуждается в литературе [23]. Есть данные, что высокая МП является ключевым фактором, определяющим агрессивность и высокую злокачественность РМЖ в молодом возрасте [24]. Всемирно известный канадский специалист, основоположник концепции о связи ПМП с канцерогенезом, Норман Бойд, в своей статье, опубликованной в 2009 г. в журнале The Lancet Oncology , сформулировал это так: "Повышенная плотность молочной железы у молодых женщин может быть ключевым фактором риска рака молочной железы, поскольку отражает количество недифференцированных клеток, наиболее подверженных злокачественной трансформации до тех пор, пока не проявится положительный защитный эффект их дифференцировки во время беременности и возрастной инволюции" [23] (cм. часть IV, главу 2, раздел 2.1 "Маммарные опухолевые стволовые клетки и рак молочной железы в молодом возрасте"). Возрастное постменопаузальное понижение МП отражает обратные (инволютивные) изменения в МЖ - уменьшение объема эпителиальной и соединительной ткани и увеличение объема жировой ткани [25].

По данным мета-анализов, обобщающих результаты нескольких десятков эпидемиологических исследований с общим числом участников около 300 тыс. человек, рост показателя МП достоверно повышает риск развития РМЖ независимо от наличия других факторов риска. При этом при каждом следующем повышении МП на 25% риск РМЖ возрастает в 1,7–2 раза [1, 24, 26, 27]. В среднем у женщин с МП ≥75%, по сравнению с женщинами с МП≤10%, риск РМЖ повышен в 4–6 раз. Женщины с ПМП >50% имеют приблизительно вдвое больше шансов получить диагноз РМЖ, чем женщины с МП 11–25%, а те - вдвое больше, чем женщины с низкой МП (0–10%). У пациенток с ПМП повышенные риски развития РМЖ сохранялись в течение 10 и более лет наблюдения [28].

Согласно эпидемиологическим данным, МП ≥50% является независимым предиктором развития РМЖ. Считается, что в эпидемиологическом смысле 1/3 всех случаев РМЖ у женщин в возрасте до 56 лет объясняется МП ≥50% [29]. Однако необходимо помнить, что уже МП >25% ассоциируется с достоверно повышенным риском РМЖ и должна вызывать онконастороженность у врача и пациентки [30].

При ПМП повышается вероятность обнаружения РМЖ как во время скрининговых исследований, так и в промежутках между ними, когда выявляются пропущенные в предыдущих профилактических обследованиях новообразования и быстрорастущие опухоли с коротким временем удвоения объема. Есть данные, что высокая МП связана с повышенным риском местного рецидивирования [31] и поражения лимфоузлов при РМЖ [23], а также с развитием инвазивного и метастатического РМЖ [32–35]. При протоковой карциноме in situ (DCIS) и высокой МП в ипсилатеральной МЖ риск развития контрлатерального РМЖ был вдвое выше, чем при DCIS и низкой МП [36]. У женщин с высокой МП и развившимся впоследствии инвазивным РМЖ чаще диагностировались агрессивные опухоли бо́льшего размера, более поздней стадии и более высокой степени злокачественности по сравнению с женщинами с низкой МП [33, 37, 38].

В течение последних 30 лет было проведено большое количество гистологических исследований, в которых маммографически плотная ткань МЖ изучалась на микроскопическом уровне. Прежде всего ученых интересовал вопрос: какой тип маммарных клеток - эпителиальные или стромальные - несет главную ответственность за формирование фенотипа ПМП.

Итак, мы поняли, что патобиологическую основу высокой маммоплотности составляют индуцированные жестким матриксом биомеханические сигнальные каскады, в результате которых повышается экспрессия генов и белков клеточной пролиферации, выживаемости, миграции и инвазии. Активация этих протуморогенных процессов на фоне аномального иммуновоспалительного микроокружения объясняет причины повышенного риска РМЖ у женщин с ПМП [98, 254].

Помимо изучения ассоциированного с ПМП внутриклеточного сигналинга и опосредующих его мишеней, предпринимались многочисленные попытки выявления индивидуальных белков с аномальной экспрессией в маммографически плотной ткани МЖ с помощью иммуногистохимических, иммуноферментных и молекулярно-генетических методов. В итоге было установлено, что при ПМП аномально гиперэкспрессируются следующие молекулы:

Для всех этих белков установлена корреляция их экспрессии с величиной МП и риском РМЖ [98]. Основная часть вышеперечисленных молекул секретируется фибробластами и обусловливает протуморогенные и провоспалительные свойства маммарной стромы при повышенной МП.

Рассмотрим индивидуальные биомаркеры фенотипа ПМП подробнее.

IGF-1. Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) - общепризнанный мощный митоген, участвующий в эндокринной, аутокринной и паракринной регуляции клеточного роста и дифференцировки. IGF-1 играет определяющую роль в нормальном морфогенезе тканей МЖ в пубертатном периоде, при беременности и постлактационной инволюции [258, 259], а также в маммарном канцерогенезе [260]. Показано, что нормальные эпителиальные клетки МЖ продолжают пролиферировать в бессывороточной среде в ответ на добавление IGF-1 [261].

В нормальной и опухолевой ткани МЖ фактор IGF-1 продуцируется главным образом стромальными и (редко) эпителиальными клетками, в то время как его рецептор, напротив, экспрессируется в маммарном эпителии [262]. Образующийся после связывания с рецептором лиганд-рецепторный комплекс активирует сигнальные каскады PI3K/Akt и RAF/MAPK, которые стимулируют пролиферацию и подавляют апоптоз [263].

В лабораторных экспериментах in vitro и in vivo , а также в клинических и эпидемиологических исследованиях обнаружена важная роль IGF-1-сигналинга в развитии и прогрессии РМЖ [264, 265]. Согласно данным мета-анализов, уровень циркулирующего IGF-1 достоверно связан с риском развития РМЖ и эта связь не зависит от менопаузального статуса женщины [266, 267]. Установлена положительная корреляция между высокой концентрацией IGF-1 в кровотоке и плохим прогнозом у пациентов c РМЖ, получавших гормональную терапию [268], а также у онкопациентов в пременопаузе [269]. Показано, что повышенный уровень циркулирующего IGF-1 положительно коррелирует с высокой общей смертностью при РМЖ [270] и повышенным риском наследственного РМЖ у женщин - носителей мутаций генов BRCA [271].

В иммуногистохимическом исследовании Guo et al. в биоптатах МЖ, полученных у пациенток 45–55 лет с ДЗМЖ (непролиферативная мастопатия, пролиферативная мастопатия без атипии и с атипией) и ПМП ≥50%, определялся на 30% более высокий уровень фактора IGF-1 по сравнению с пациентками, имевшими низкую МП [74]. Эти данные хорошо согласуются с результатами последующих исследований, в которых была обнаружена положительная корреляция между величиной МП и уровнем сывороточного IGF-1 у пременопаузальных и постменопаузальных женщин [272, 273].

ERα. Известно, что примерно в 2/3 случаев диагностированного РМЖ определяется аномально высокая экспрессия эстрогеновых рецепторов ERα и около 70% таких опухолей отвечают на антиэстрогенную терапию тамоксифеном и препаратами этого ряда. Гиперэкспрессия ERα обнаруживается также в гистологически нормальном эпителии, прилежащем к очагу РМЖ [274]. Показано, что повышенный уровень ERα в доброкачественном маммарном эпителии связан с повышенным риском развития РМЖ [275].

ERα играют ключевую роль в индукции гормон-зависимой и важную роль в индукции гормон-независимой (через перекрестную активацию ростовых факторов) клеточной пролиферации. Протуморогенная активность ERα как фактора транскрипции обусловлена стимулированием экспрессии митогенных и онкогенных белков (циклина D1, c-Myc и др.) и подавлением экспрессии опухолевых супрессоров (ингибиторов клеточного цикла р21, р27 и др.) [276, 277].

В исследовании Lundstrom et al. 2006 г. была установлена положительная корреляция между повышенной МП и уровнем ERα в образцах нормального эпителия МЖ, полученных у постменопаузальных женщин в ходе операции по поводу РМЖ [201]. Впоследствии эти данные подтвердились в молекулярно-генетическом исследовании Sun et al., в ходе которого у пациентов с РМЖ проводился анализ паттернов генной экспрессии в образцах гистологически нормальной маммарной ткани, смежной с опухолью [254]. Авторы показали, что у больных РМЖ маммографически плотная нормальная ткань отличается повышенной эстрогенной респонсивностью по сравнению с тканью низкой маммоплотности.

Ароматаза. Фермент ароматаза (CYP19, изоформа цитохрома Р450) катализирует превращение андрогенов в эстрогены - главные индукторы клеточной пролиферации в эстроген-чувствительных органах и тканях, в том числе МЖ. Участие ароматазы в биосинтезе эстрогенов предопределяет ее этиологическую роль в маммарном канцерогенезе.

Повышенная экспрессия ароматазы при РМЖ была обнаружена многими авторами, применявшими разные методы анализа. В экспериментах in vitro с использованием ароматаза-трансфицированных клеток РМЖ и на трансгенных животных моделях было установлено, что продуцируемый in situ эстроген оказывает существенно большее влияние на опухолевые процессы в МЖ, чем циркулирующие гормоны. Такой локально действующий эстроген способен индуцировать новые предраковые и неопластические изменения в нормальной ткани МЖ, а также усиливать рост уже имеющихся очагов РМЖ через ауто- и паракринные механизмы. В настоящее время положительная корреляция между повышенным уровнем ароматазы, образованием первичных и ростом существующих опухолей МЖ считается доказанной [278–281]. Есть данные, указывающие на наличие связи между высоким ИМТ и риском РМЖ у постменопаузальных женщин и гиперэкспрессией ароматазы в жировой ткани МЖ.

Применение ингибиторов ароматазы является регламентированной второй линией терапии у пациентов с гормон-зависимым РМЖ при неуспешной терапии тамоксифеном. От 20 до 30% таких пациентов отвечают на лечение ингибиторами ароматазы [281, 282].

В иммуногистохимическом исследовании Huo et al. в тканевых образцах с ПМП, полученных у здоровых женщин с повышенным риском РМЖ (наличие мутаций BRCA1/ 2, семейной истории РМЖ или РМЖ в анамнезе), перенесших профилактическую мастэктомию, отмечалась значительно более высокая по сравнению с образцами с низкой МП иммунореактивность ароматазы в строме и железистой ткани МЖ [61].

Аналогичные результаты были получены в исследовании Vachon et al., в котором участвовали бессимптомные здоровые женщины-добровольцы в возрасте ≥40 лет без РМЖ в анамнезе, имевшие нормальную скрининговую маммограмму в течение шести месяцев после биопсии. В исследование не включались пациентки, принимавшие ЗГТ, комбинированные оральные контрацептивы, другие препараты эндокринной терапии и антикоагулянты. В итоге в кор-биопсийных образцах маммографически плотной МЖ отмечалась вдвое бо`льшая иммунореактивность ароматазы по сравнению с образцами низкой МП. При этом уровень ароматазы в строме был почти в 5 раз выше, чем в эпителии [257]. По мнению авторов, повышенная экспрессия стромальной ароматазы и, как следствие, усиленная продукция эстрогена в МЖ могут быть отчасти ответственны за проявление фенотипа ПМП и его связь с повышенным риском РМЖ у здоровых женщин.

СОХ-2. Фермент циклооксигеназа катализирует первый этап синтеза простагландинов в цикле арахидоновой кислоты. Под действием циклооксигеназы арахидоновая кислота, высвобождающаяся из мембранных фосфолипидов, превращается в PGG₂ , который затем метаболизируется в PGH₂ , а тот - в другие эйкозаноиды: простагландины, тромбоксаны и простациклины. Участвуя в регуляции многочисленных процессов в организме, простагландины одновременно являются самыми известными клеточными медиаторами воспаления.

В отличие от конститутивного протективного изозима - циклооксигеназы-1 (СОХ-1), регулирующего физиологические функции, циклооксигеназа-2 (СОХ-2) является индуцибельным ферментом, который в норме в большинстве тканей не обнаруживается. Однако уровень СОХ-2 существенно повышается при воспалении после воздействия стрессорных провоспалительных стимулов: инфекций, травм, ишемии, табакокурения, потребления алкоголя и пр.

Большинство функций СОХ-2 осуществляется через простагландин PGE₂ , который при определенных условиях может проявлять протуморогенную активность. Считается, что конститутивная экспрессия гена COX-2 , кодирующего фермент COX-2, и связанный с этим устойчивый биосинтез PGE₂ необратимо приводят к развитию и прогрессии злокачественных опухолей. При этом простагландин PGE₂ :

Согласно результатам эпидемиологических, лабораторных и клинических исследований, повышенная экспрессия COX-2 сопряжена с канцерогенными процессами во многих органах и тканях и вносит вклад в развитие опухолевой химио- и радиорезистентности [285]. С помощью иммуногистохимического анализа и метода ПЦР в реальном времени на всех стадиях РМЖ была обнаружена гиперэкспрессия СОХ-2, которая имела прогностическую клиническую значимость [141, 286–291].

Одним из факторов, активирующих СОХ-2 и повышающих риск РМЖ, является ожирение. Мы уже говорили о том, что избыток жировой ткани в организме считается мощным проканцерогенным индуктором, который формирует специфическую иммуновоспалительную среду и стимулирует хроническое системное воспаление. При ожирении наблюдается инфильтрация маммарной и висцеральной жировой ткани макрофагами, активация ядерного фактора транскрипции NF-êB, гиперэкспрессия COX-2, повышенная секреция PGE₂ , а также других провоспалительных медиаторов и адипокинов: IL-6, IL-1β, фактора TNFα, лептина, резистина [292–295].

Важно подчеркнуть, что гиперэкспрессия СОХ-2 - это раннее событие в маммарном канцерогенезе. Изозим СОХ-2 отсутствует в нормальной ткани МЖ, однако определяется при предшествующих раку ДЗМЖ, сопровождаемых дисплазией/клеточной атипией, где выступает как биомаркер повышенного риска РМЖ [296, 297].

В настоящее время ингибирование СОХ-2 рассматривается как эффективный способ профилактики и таргетной терапии злокачественных опухолей, в частности РМЖ [298, 299]. В доклинических исследованиях на трансгенных животных и клинических исследованиях на больных РМЖ при регулярном длительном (от 5 до 10–20 лет) приеме нестероидных противовоспалительных препаратов - неселективных ингибиторов СОХ-2 [ацетилсалициловая кислота (Аспирин^# ), ибупрофен, пироксикам, сулиндак], а также при курсовом приеме селективных ингибиторов СОХ-2 (целекоксиб, рофекоксиб) наблюдалось снижение риска, роста, прогрессии, частоты рецидивирования РМЖ и смертности от данного онкозаболевания [284, 300–304]. В клинических исследованиях II фазы была продемонстрирована терапевтическая эффективность целекоксиба при инвазивном РМЖ [305, 306]. В нескольких исследованиях оценивалась эффективность применения целекоксиба как монопрепарата и в составе комбинированной терапии со стандартными химиопрепаратами у больных РМЖ [307]. Есть данные, что селективные ингибиторы СОХ-2 снижают риск РМЖ на 16% [308].

На сегодняшний день целекоксиб является единственным селективным ингибитором СОХ-2, одобренным FDA [309]. Целекоксиб назначается при остеоартрите, ревматоидном артрите, ювенильном ревматоидном артрите, анкилозирующем спондилите (болезнь Бехтерева), острой боли у взрослых, первичной дисменорее и как дополнение к премедикации при эндоскопии.

Выпуск рофекоксиба - второго зарегистрированного селективного ингибитора СОХ-2 - был приостановлен компанией-производителем в 2004 г. в связи с повышенным риском сердечно-сосудистых осложнений, возникающих при его приеме.

В иммуногистохимическом исследовании Yang et al. 2010 г. изучался уровень экспрессии ряда биомаркеров в гистологически нормальных биоптатах МЖ, полученных у женщин во время хирургической операции по поводу РМЖ. Было установлено, что при повышенной МП в нормальной строме у больных РМЖ определяется достоверно более высокий уровень СОХ-2, чем при низкой МП [234].

Спустя несколько лет американские авторы Esbona et al. подтвердили эти данные в экспериментах in vivo [310]. Они изучали провоспалительную и протуморогенную активность СОХ-2 в обогащенной коллагеном, плотной маммарной ткани на модели трансгенных мышей линии MMTV-PyMT/Col1a1tm1jae, обладавших способностью к усиленному отложению коллагена в МЖ. Ранее было показано, что у таких животных кратно повышены частота образования и размеры первичных и метастатических очагов РМЖ [126, 127]. В качестве контроля Esbona et al. использовали нетрансгенных мышей дикого типа с нормальным уровнем маммарного коллагена. Опытным и контрольным животным вводили целекоксиб или плацебо. Образовавшиеся в обеих группах опухоли МЖ исследовали с помощью тканевой визуализации, а также иммуногистохимического, иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализа, определяя в них содержание СОХ-2, коллагена, растворимых провоспалительных молекул и стромальных клеточных компонентов.

В конечном итоге опухоли, образовавшиеся у трансгенных животных в обогащенной коллагеном плотной ткани, имели более агрессивную природу и более выраженное провоспалительное микроокружение, чем опухоли у мышей дикого типа. У трансгенных животных очаги РМЖ были большего размера, быстрее росли, активнее экспрессировали COX-2 и PGE₂ . При введении трансгенным мышам целекоксиба отмечалось уменьшение размеров опухолевых очагов, понижение степени метастазирования до контрольного уровня, подавление экспрессии COX-2, PGE₂ , Ki-67, цитокинов и факторов роста, а также уменьшение количества маммарного коллагена, фибробластов и привлеченных в очаг РМЖ опухоль-ассоциированных макрофагов и нейтрофилов. В то же время целекоксиб оказывал минимальное влияние на опухоли у контрольных животных дикого типа. Таким образом, было показано, что молекула СОХ-2 обладает специфической протуморогенной активностью в плотном маммарном матриксе и может рассматриваться как перспективная лекарственная мишень при лечении пациенток с ПМП и ранним РМЖ, а целекоксиб - как препарат-кандидат для патогенетической химиопрофилактики РМЖ у женщин с ПМП.

Другими авторами в экспериментах на животной модели послеродового РМЖ была обнаружена положительная корреляция между гиперэкспрессией СОХ-2, повышенным уровнем фибриллярного коллагена и инвазивным опухолевым фенотипом. При введении животным нестероидных противовоспалительных препаратов - ингибиторов СОХ-2 - отмечалось уменьшение фибриллогенеза коллагена, а также подавление роста и распространения опухолевых клеток [139].

В исследовании Chew et al. 2015 г. оценивалась дифференциальная экспрессия COX-2 при высокой и низкой МП у здоровых женщин из группы повышенного риска РМЖ (наличие мутаций BRCA1/2 , семейной истории РМЖ, РМЖ в анамнезе) после профилактической мастэктомии, а также на валидированной ксенографтной животной модели повышенной МП. В результате в обоих случаях при ПМП в строме и в эпителии МЖ наблюдалась повышенная экспрессия СОХ-2 [311].

IL-6. Интерлейкин IL-6, как и фермент СОХ-2, является важнейшей провоспалительной молекулой. Этот мультифункциональный цитокин играет ключевую роль в системном воспалении, регулируя воспалительный ответ и тканевой метаболизм при острых раздражениях. Помимо воспаления, IL-6 участвует в регуляции физиологических функций: гемопоэза, иммунного ответа, метаболизма костной ткани, нейронального развития и др. Дисфункция IL-6 может стимулировать опухолевый рост вследствие активации протуморогенных каскадов, усиливающих пролиферацию и ослабляющих апоптоз. В клетке IL-6-индуцированный пролиферативный сигнал передается по двум основным направлениям: через JAK/STAT- и МАР-киназный трансдукторные пути.

Гиперэкспрессия IL-6 и его рецептора обнаруживается в опухолевом микроокружении при многих видах рака, в том числе при РМЖ, где основным источником секреции данного цитокина являются стромальные опухоль-ассоциированные фибробласты. В нескольких исследованиях была убедительно продемонстрирована иммунопатогенетическая функция IL-6 и опосредуемых им сигнальных каскадов в маммарном канцерогенезе, а именно в процессах опухолевого роста, метастазирования и развития химиорезистентности [312]. При РМЖ in situ уровень циркулирующего IL-6 (и других провоспалительных цитокинов) существенно превышал контрольный и коррелировал с клинической стадией заболевания, регионарным метастазированием, экспрессией эстрогеновых рецепторов и рецепторов HER2 [313].

Таким образом, есть все основания рассматривать IL-6 как потенциальный прогностический/предикторный маркер и перспективную лекарственную мишень в таргетной терапии РМЖ [312, 314, 315].

В исследовании Hanna et al. была установлена положительная корреляция между экспрессией IL-6 в нормальном эпителии МЖ и величиной маммоплотности (после внесения поправок на возраст и ИМТ) у женщин, перенесших частичную или тотальную мастэктомию по поводу впервые диагностированного РМЖ [256].

TGFβ. Трансформирующий фактор роста TGFβ (точнее, семейство из трех его изоформ TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) широко распространен в тканях человеческого организма и экспрессируется во многих типах клеток. Данный цитокин реализует свои эффекты через взаимодействие с трансмембранными рецепторами I и II типа (TFGβRI и TGFβRII), образующими между собой гетероолигомерный комплекс [316].

TGF-β-сигналинг активен на стадии эмбриогенеза и морфогенеза. Во взрослом организме он регулирует клеточную дифференцировку, иммунный ответ, ранозаживление, тканевую репарацию и поддержание тканевого гомеостаза.

В нормальных и опухолевых эпителиальных клетках TGFβ является ключевым индуктором и медиатором эпителиально-мезенхимального перехода - универсальной биологической программы онтогенеза и контроля клеточного поведения [317]. Способность TGFβ индуцировать обратимый процесс ЭМП в нормальном эпителии МЖ была продемонстрирована на культурах нормальных и иммортализованных нетуморогенных эпителиальных клеток, а также на животных моделях in vivo [318–320].

После взаимодействия TGFβ с рецептором дальнейшая трансдукция сигнала может осуществляться разными способами. Основной канонический сигнальный путь реализуется через активацию факторов транскрипции Smad, которые после транслокации в ядро и взаимодействия с другими ДНК-связывающими факторами транскрипции (Snail, ZEB, Sox, Twist) стимулируют экспрессию сотен целевых генов, регулирующих процесс ЭМП [321, 322]. Неканонические механизмы TGFβ-сигналинга осуществляются через активацию Smad-независимых путей, опосредованных ГТФазой Rho, MAP-киназами ERK, p38, р42/р44, JUNK, киназами PI3K, Akt и фактором транскрипции NF-êB [323–328].

Отличительной чертой фактора TGFβ является его бифункциональность как регулятора канцерогенеза. На стадиях, предшествующих развитию рака, а также при раннем раке TGFβ действует как опухолевый супрессор, ингибирующий клеточную пролиферацию и индуцирующий апоптоз, в то время как на более поздних стадиях - TGFβ, напротив, является классическим опухолевым промотором, стимулирующим опухолевый рост, ангиогенез, инвазию и метастазирование [316, 317]. Считается, что TGFβ вносит основной вклад в образование костных метастазов [329].

TGFβ продуцируется как опухолевыми клетками, так и клетками стромы. Еще один источник TGFβ - мегакариоциты костного мозга и их циркулирующие производные - тромбоциты [330]. TGFβ высвобождается при активации тромбоцитов вместе с другими факторами роста и цитокинами, хранящимися в их α-гранулах. У онкологических больных обычно наблюдается ускоренный оборот тромбоцитов в кровотоке и повышенный риск тромботической окклюзии сосудов [331]. Есть данные, что прямой контакт между опухолевыми клетками и тромбоцитами индуцирует процесс ЭМП и стимулирует метастазирование [332].

За счет аутокринной и паракринной регуляции TGFβ оказывает эффект как на саму опухоль, так и на опухолевое микроокружение (внеклеточный матрикс, сосудистые эндотелиальные клетки, иммунные клетки), активируя ростовые факторы, индуцируя ЭМП и подавляя иммунный ответ [333, 334]. В клетках РМЖ гиперэкспрессия рецептора HER2 повышала продукцию TGFβ, что приводило к индукции TGFβ/Smad-сигнального пути, активации экспрессии маркеров ЭМП in vitro и усилению метастазирования in vivo [335].

В результате TGFβ-индуцированного ЭМП происходит дедифференцировка эпителиальных маммарных клеток и повышается их стволовость. Клетки приобретают фибробластоподобный фенотип и миграционную активность, а при наличии злокачественной опухоли - фенотип химиорезистентных и метастатических ОСК (см. часть IV) [336, 337]. На клеточных моделях РМЖ было показано, что, помимо TGFβ, связь между ЭМП и стволовостью раковых клеток опосредуется компонентами эмбрионального Wnt-каскада и белками BMP [338].

Другим следствием TGFβ-индуцированного ЭМП является увеличение количества стромальных эндотелиальных клеток и, главное, опухоль-ассоциированных CAFs-фибробластов, поддерживающих опухолевую прогрессию и развитие фиброза [339, 340]. В отсутствие рака образование активированных фибробластов под действием избыточного TGFβ1 приводило к гиперэкспрессии генов, кодирующих белки ВКМ, избыточному отложению коллагена и усилению фиброза [341, 342]. Подавление избыточного TGFβ-сигналинга, напротив, понижало экспрессию маркеров стволовости и индуцировало прямую дифференцировку клеток РМЖ в менее агрессивные клеточные фенотипы [343]. В экспериментах in vivo на ксенографтной модели раннего РМЖ опухоль-супрессорная активность TGFβ сопровождалась уменьшением численности туморогенных опухоль-инициирующих клеток и их потомков - ранних прогениторных клеток. При этом активно делившиеся до этого прогениторные клетки дифференцировались в менее агрессивные клетки с меньшим митотическим индексом [344].

Долгое время открытым оставался вопрос, каким образом в клетке происходит переключение онкопротективной активности TGFβ на протуморогенную. Накопленные за последние 20 лет данные, в том числе полученные в молекулярно-генетических исследованиях, позволили существенно продвинуться в понимании этого загадочного явления. Выяснилось, что TGFβ по-разному проявляет свою активность в зависимости от типа клеток и "клеточного контекста", который тесно ассоциирован со спектром TGFβ-регулируемых генов и белков, то есть с их эпигенетическим и транскрипционным профилем [340, 345, 346]. Так, по данным Engle et al., ингибирование экспрессии TGFβ на ранних стадиях онкогенеза стимулировало опухолевый рост не в результате утраты контроля над пролиферацией (мы знаем, что в раннем канцерогенезе TGFβ выступает как опухолевый супрессор), а в результате нарушения тканевой архитектоники, усиления воспаления и генетической нестабильности [347]. И наоборот, в некоторых случаях трансформированные клетки образовывали злокачественные опухоли, несмотря на сохранение их чувствительности к супрессорному действию TGFβ [348].

Сегодня контекст-зависимые генетические и эпигенетические изменения, определяющие характер и интенсивность TGFβ-сигналинга и затрагивающие внутриклеточные структуры и компоненты ближайшего тканевого микроокружения, считаются главной причиной бифункциональности TGFβ [333, 334, 340, 349]. Согласно современным данным, множественные механизмы эпигенетического контроля (ДНК-метилирование, модификации гистонов хроматина, экспрессия некодирующих микроРНК и длинных РНК) в сочетании с механизмами контроля трансляции, посттрансляционных модификаций и альтернативного сплайсинга играют ключевую роль в регуляции TGFβ-индуцированного ЭМП [316, 340].

В молекулярно-генетическом исследовании Shipitsin et al. при анализе биоптатов, полученных у больных РМЖ, было установлено, что фенотипически различные опухолевые клетки, имеющие разный уровень стволовости и туморогенности, даже в пределах одной и той же опухоли и одного типа ткани, по-разному реагируют на активацию TGFβ [343]. При этом критическим событием, обусловливающим ингибирование TGFβ-сигнала в некоторых клеточных клонах, являлось понижение экспрессии в них рецептора TGFβRII вследствие эпигенетического умолкания кодирующего его гена. Промоторное ДНК-метилирование и модификации гистонов хроматина как вероятные механизмы, приводящие к подавлению экспрессии TGFβRII, были описаны и для других видов рака [350–352].

Итак, мы выяснили, что утрата клетками чувствительности к ингибирующему действию фактора TGFβ сопровождается повышением его экспрессии и ассоциируется с опухолевой трансформацией и прогрессией [353]. В клинических исследованиях гиперэкспрессия TGFβ (TGFβ1, TGFβ2) и других компонентов TGFβ-сигналинга коррелировала с повышенным метастатическим потенциалом опухоли и худшим прогнозом для пациентов при многих видах рака [354, 355], включая РМЖ [353, 356, 357]. По данным Kong et al., высокий уровень TGFβ1 в плазме крови у пациентов с РМЖ уменьшался после хирургического удаления опухоли [358].

В настоящее время эффективность ингибиторов, блокирующих фактор TGFβ, оба типа его рецепторов и нижестоящие в TGFβ-каскадах белки-мишени, в таргетной терапии злокачественных опухолей, в том числе РМЖ, изучается в доклинических и клинических исследованиях I–II фазы [329, 334, 359, 360]. Разрабатываются лекарственные препараты, направленные на селективное ингибирование аномально активированного TGFβ-сигналинга при фиброзных заболеваниях [361].

А что известно о сигнальных свойствах TGFβ в доброкачественной маммографически плотной ткани молочной железы?

В исследовании Gobbi et al. была обнаружена дисрегуляция экспрессии TGFβ-рецептора II типа при неатипической эпителиальной гиперплазии МЖ [362]. Пациентки со сниженной экспрессией TGFβRII в МЖ, не имевшие в анамнезе РМЖ и/или атипическую гиперплазию МЖ, демонстрировали пятикратно повышенный относительный риск последующего развития инвазивного РМЖ.

В двух молекулярно-генетических исследованиях было показано, что в образцах гистологически нормальной маммографически плотной ткани МЖ, полученных у пациенток в ходе операции по поводу РМЖ, по сравнению с образцами с низкой маммоплотностью, наблюдалось снижение экспрессии генов TGFβ-сигнального каскада на фоне усиленного эстрогенного ответа [254] и повышенной экспрессии маркеров пролиферации и воспаления - Ki-67 и СОХ-2 [234].

В то же время в молекулярно-генетическом исследовании Lisanti et al., которое мы неоднократно цитировали выше, были получены прямо противоположные результаты [119]. Сравнивая профили генной экспрессии в фибробластах, полученных из "здоровой" маммарной ткани с высокой и низкой МП, авторы обнаружили повышение активности генов TGFβ-сигнального каскада в маммографически плотных образцах. Усиление TGFβ-сигналинга в фибробластах высокой МП происходило одновременно с активацией широкой панели протуморогенных генов, контролирующих процессы пролиферации, воспаления, ангиогенеза, клеточного стресса, стволовости и фиброза. При этом активировались сигнальные каскады, опосредованные киназой JNK-1, индуцибельной синтазой оксида азота, ГТФазой Rho, а также рецепторами факторов роста EGF, FGF, PDGF, рецепторами HER2, ErbB3, CXCR4 и фактором транскрипции NF-êB, в результате чего создавалась обогащенная цитокинами и хемокинами провоспалительная, пролиферативная и профиброзная среда.

Таким образом, мы видим, что разные авторы получили разные данные, касающиеся активности TGFβ-сигнального каскада в гистологически нормальной маммографически плотной МЖ. В первых двух случаях фактор TGFβ действовал как опухолевый супрессор и активность опосредуемого им сигналинга была снижена [234, 254], в последнем случае - как опухолевый промотор и его сигнальная активность была повышена [119]. Как это можно объяснить?

Во-первых, очевидно, что в этих исследованиях изучались образцы, неравноценные по клеточному составу. В исследовании Lisanti et al. это была фракция стромальных фибробластов, изолированных из биоптатов МЖ с повышенной МП, в двух других - использовались образцы интактной маммографически плотной МЖ. Как мы знаем, опухолевые фибробласты, на которые очень похожи фибробласты при ПМП, являются главным источником фактора TGFβ. Во-вторых, в исследовании Lisanti et al. генетический профиль "здоровых" ПМП-фибробластов имел выраженное сходство с генной сигнатурой, характерной не только для активированных опухоль-ассоциированных фибробластов, но и для стромы первичного и рецидивного РМЖ. Вероятно, фракция таких "здоровых" ПМП-фибробластов была получена из тканевых образцов, имевших больший протуморогенный потенциал (больший показатель МП) и/или соответствовавших более поздней стадии опухолевой трансформации, для которой характерна активация TGFβ-сигналинга. Нельзя также исключить, что расхождение приведенных результатов обусловлено методическими различиями и/или разными условиями проведения экспериментов.

CD36. CD36 - еще одна сигнальная молекула, которая рассматривается в качестве потенциального биомаркера фенотипа ПМП. Это мультифункциональный скэвенджер-рецептор ("рецептор-мусорщик"), локализованный на поверхности клеток (в частности, макрофагов) и взаимодействующий c длинноцепочечными жирными кислотами, фосфолипидами, окисленными липопротеинами низкой плотности, коллагеном и некоторыми другими лигандами [363]. CD36 продуцируется в метаболически активных тканях, где регулирует усвоение липидов (жирных кислот) [364].

Экспрессия гена, кодирующего рецептор CD-36, контролируется фактором транскрипции Nrf2, который, как отмечалось выше, регулирует и координирует работу большой группы ферментов детоксикации и антиоксидантной защиты. Накопление Nrf2 в ядре (то есть активация транскрипционной активности Nrf2) происходило в ответ на стимуляцию перекисного окисления липидов [365].

Кроме фактора Nrf2, регулятором экспрессии CD-36 и трансдукции опосредуемого им сигнала является фактор транскрипции PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) - γ-рецептор, активируемый пероксисомными пролифераторами. PPAR-γ необходим для поддержания энергетического клеточного баланса и нормальной дифференцировки адипоцитов [366]. Считается, что CD-36- и PPAR-γ-опосредованная трансформация макрофагов (после избыточного поглощения ими липопротеинов) в менее подвижные пенистые клетки сопровождается изменением липидного метаболизма и воспалительного ответа в стенках кровеносных сосудов и играет ключевую роль в молекулярном патогенезе атеросклероза [367, 368].

Показано, что CD36 играет важную роль в формировании фенотипа ПМП посредством контроля двух факторов: содержания стромальных адипоцитов и отложения внеклеточного матрикса [77]. В нормальной маммарной ткани CD36 стимулирует дифференцировку адипоцитов и тормозит избыточное образование ВКМ. В экспериментах in vitro и in vivo на модели РМЖ при низкой экспрессии CD36 отмечалось подавление дифференцировки адипоцитов и усиленное накопление ВКМ с повышенным содержанием коллагена, что приводило к увеличению опухолевой нагрузки, активации ангиогенеза и метастазирования [127, 369]. К числу других функций рецептора CD36 относится его способность регулировать ангиогенез и апоптоз, а также стимулировать TGFβ-зависимый сигналинг и иммунный ответ - процессы, при которых данная молекула также проявляет выраженные антионкогенные свойства [363].

В своем исследовании DeFilippis et al. использовали широкий набор современных лабораторных методов, в том числе ДНК-микрочиповые технологии и метод количественного ПЦР-анализа. Было показано, что в образцах маммографически плотной ткани МЖ, полученных у здоровых пациенток в ходе редукционной маммопластики, в различных типах стромальных клеток (фибробласты, адипоциты, эндотелиальные клетки, макрофаги) наблюдается существенно сниженная экспрессия СD36 по сравнению с нормальной маммарной тканью низкой плотности. Аналогичный дефицит экспрессии CD36 наблюдался в образцах опухолевой стромы при различных типах РМЖ: ER()/PR(), HER2(+) и трижды негативном инвазивном РМЖ. При этом более агрессивные низкодифференцированные формы РМЖ (трижды негативный РМЖ) отличались более выраженной супрессией СD36 [77].

Спустя два года в той же лаборатории были получены данные, объясняющие причину аномального дефицита CD36 при повышенной МП и РМЖ. Было показано, что важный вклад в этот процесс вносят первичные генетические нарушения в эпителии и последующие эпителиально-стромальные клеточные взаимодействия [370]. В итоге авторы пришли к выводу, что снижение уровня экспрессии CD36 в маммарной строме является ранним молекулярным событием, которое предшествует РМЖ и имеет предикторное и прогностическое значение, а сама молекула CD36, с учетом ее множественной противоопухолевой активности, может считаться перспективной лекарственной мишенью в таргетной терапии РМЖ.

* * *

Мы рассказали о наиболее изученных молекулярных маркерах фенотипа повышенной маммоплотности. Конечно, в действительности при ПМП изменяется экспрессия существенно большего числа генов и белков, роль и значимость которых еще предстоит выяснить.

Так, в упомянутом выше исследовании Yang et al. было показано, что в образцах маммографически плотной МЖ, полученных у женщин во время хирургической операции по поводу РМЖ, из 34 тыс. проанализированных генов 73 гена показали полуторакратное изменение экспрессии, из них 26 генов - повышение и 47 генов - понижение [234].

В молекулярно-генетическом исследовании Lisanti et al., которое мы также цитировали ранее, в образцах, полученных из маммографически плотной "здоровой" ткани МЖ, наблюдался повышенный уровень экспрессии более 1250 генов, кодирующих компоненты протуморогенных сигнальных каскадов [119].

В генетическом исследовании Yang et al. в биоптатах гистологически нормальной маммарной ткани с высокой (>50%) и низкой (<50%) маммоплотностью, полученных в ходе хирургической операции на МЖ, была обнаружена разница в экспрессии 841 гена. Причем на уровень этой экспрессии не влиял ни гормональный, ни менопаузальный статус пациенток [371]. Авторы показали, что при высокой МП среди генов с измененной экспрессией максимально активны были гены индукторов эмбриональных сигнальных каскадов Notch (DLK1) и Wnt (FZD10), а также ген белка IGFBP1, связывающего фактор роста IGF-1. Патологическая активация этих генов и белков, регулирующих самообновление (пролиферацию) нормальных стволовых клеток, наблюдается в туморогенных ОСК - источнике роста, прогрессии и рецидивирования злокачественных опухолей (см. часть IV). Помимо трех вышеуказанных генов, в данном исследовании при повышенной МП отмечалась гиперэкспрессия генов некодирующих регуляторных РНК (MALAT1, TncRNA) и факторов сплайсинга РНК (SFRS1, SFRS3, SFRS4, SFRS7). В итоге авторы заключили, что в гистологически нормальной маммографически плотной ткани МЖ нарушены эпигенетика и регуляция активности стволовых клеток-предшественников, что усиливает ее туморогенные свойства и повышает риск РМЖ.

По статистике, фиброзные болезни являются причиной почти трети естественных смертей во всем мире [372] и половины естественных смертей в экономически развитых странах [373]. В группу заболеваний, ассоциированных с фиброзом, входят легочный фиброз, цирроз печени, прогрессирующие заболевания почек, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, а также системный склероз соединительных тканей кожи и внутренних органов.

Наличие фиброзных поражений значительно увеличивает риск развития рака легкого (при фиброзе легких частота фибробластических очагов, содержащих миофибробласты, является показателем плохого прогноза и снижения выживаемости пациентов [374, 375]), печени [376, 377] и молочной железы [25, 378]. В целом считается, что с хроническим фиброзом, обусловленным инфекционным или аутоиммунным воспалением, связано до 20% раковых заболеваний [379].

Заметим, что выявляемая при УЗИ десмоплазия (десмопластическая реакция ), представляющая собой гиперэхогенный периферический ободок вокруг патологического очага, непосредственно связана с фиброзом и отражает рост доброкачественной фиброзной ткани после первичного тканевого повреждения вследствие опухолевого поражения или действия инфекционного агента.

В большом количестве исследований доказана связь повышенной МП с фиброзными изменениями в МЖ [57, 380–385]. Установлена достоверная положительная корреляция между степенью фиброза и процентной МП [30, 66]. Показано, что фиброз, наблюдаемый при ПМП, может сопровождаться образованием микрокальцинатов, эпителиальной гиперплазией [384, 386] и возникновением крупных фибротических очагов с их последующим слиянием (распространенный фиброз при МП >75%) [381].

Стромальный фиброз МЖ (разрастание и уплотнение соединительной ткани МЖ) - это патологический процесс, провоцирующий образование кист и узлов. Выраженные в большей или меньшей степени фиброзные изменения являются обязательным атрибутом мастопатии. Стромальный фиброз может протекать в различных структурах МЖ: снаружи и внутри долек, а также около или между млечными протоками [382]. Установленная в гистологических исследованиях связь между усиленным фиброзом, отложением коллагена, увеличенным количеством фибробластов и повышенным риском РМЖ обнаруживается у пациентов с доброкачественными биопсиями и ПМП [57, 381, 382, 387, 388].

Еще раз подчеркнем, что повышенная маммоплотность достоверно ассоциируется не только с РМЖ, но и с гистологически верифицированными пролиферативными и непролиферативными ДЗМЖ, в том числе пролиферативной и непролиферативной мастопатией [74, 380, 383, 388, 470]. В рентгенологическом изображении диффузная мастопатия характеризуется массивным уплотнением всей или значительной части железистой маммарной ткани, при котором на фоне обширных полей фиброза выделяются грубые линейные тени резко утолщенных фиброзно-измененных млечных ходов. В масштабном когортном исследовании Boyd et al. у пациенток с МП >75%, по сравнению с пациентками с нулевой МП, риск развития РМЖ был повышен в 3,10 раза при непролиферативной мастопатии, в 12,20–13,85 раза при гиперплазии без атипии и в 9,23–9,70 раза при атипической гиперплазии и/или карциноме in situ [57, 388].

Есть мнение, что при ПМП возрастает частота пролиферативных и снижается частота непролиферативных форм мастопатии. В исследовании Guo et al. методами иммуногистохимического анализа и количественной микроскопии оценивалась экспрессия факторов роста и стромальных матриксных белков в биоптатах МЖ, полученных у пациенток пременопаузального возраста с низкой и высокой МП [74]. При этом в группе с низкой МП <25% (в основном <10%) (n =46, средний возраст - 48,5 года) в 50% случаев диагностировались непролиферативные фиброзно-кистозные изменения и в 17,4% случаев - пролиферативные фиброзно-кистозные изменения без атипии. У 21,7% женщин с низкой МП образцы соответствовали норме. В группе пациенток с высокой МП ≥50% (в основном >75%) (n =46, средний возраст - 49 лет) только 1 образец соответствовал норме, а непролиферативные фиброзно-кистозные изменения и пролиферативные фиброзно-кистозные изменения без атипии выявлялись соответственно в 37 и 45,7% случаев. У одной пациентки с высокой МП определялись пролиферативные фиброзно-кистозные изменения с атипией. У четырех пациенток с низкой МП и пяти пациенток с высокой МП был диагностирован стромальный фиброз.

В скрининговом исследовании Friedenreich et al. у пациенток с ПМП ≥25% (n =165), по сравнению с контрольной группой (МП <25%, n =217), почти вдвое возрастала частота обнаружения пролиферативных ДЗМЖ в диапазоне от склерозирующего аденоза до атипичной протоковой гиперплазии [471].

Однако в других исследованиях было показано, что при ПМП возрастает частота как пролиферативной, так и непролиферативной мастопатии, причем непролиферативная мастопатия обнаруживалась с той же частотой или даже чаще, чем пролиферативная. Приведем несколько примеров.

В 1970–1980-х гг. в США проводилось масштабное скрининговое исследование в рамках программы LBCDDP (Louisville Breast Cancer Detection Demonstration Project) с участием более 10 тыс. бессимптомных женщин 35–74 лет, наблюдавшихся в течение 5 лет [470]. В ходе данного исследования у 4903 пациенток с низкой МП (N1, P1 по шкале Вульфа) было выявлено 24% от всех случаев непролиферативной мастопатии, 29% от всех случаев пролиферативной мастопатии и 36% от всех случаев РМЖ. Соответственно у 5228 пациенток с высокой МП (P2, DY по шкале Вульфа) диагностировали 76% от всех случаев непролиферативной мастопатии, 71% от всех случаев пролиферативной мастопатии и 64% от всех случаев РМЖ. Окончательный диагноз ставился на основании данных гистологического анализа. Всего в данном исследовании при низкой МП был выявлен 191 случай мастопатии (39 - пролиферативной и 152 - непролиферативной) и 52 случая РМЖ, а при высокой МП - 569 случаев мастопатии (98 - пролиферативной и 471 - непролиферативной) и 92 случая РМЖ. В итоге при повышенной маммоплотности РМЖ выявлялся в 1,8 раза чаще, а мастопатия - в 3 раза чаще, чем при низкой МП. При этом количество случаев непролиферативной мастопатии в 4–5 раз превышало количество случаев пролиферативной мастопатии не только при низкой (152 против 39), но и при высокой (471 против 98) маммоплотности.

Fisher et al. сравнивали показатели МП у женщин с гистологически верифицированным РМЖ (n =50) и фиброзно-кистозной мастопатией (n =50). У многих пациенток с РМЖ обнаруживалась также мастопатия [380]. В данном исследовании непролиферативная мастопатия значительно чаще выявлялась во второй группе (пациентки с мастопатией), чем в первой (пациентки с РМЖ плюс пациентки с РМЖ и мастопатией), в то время как пролиферативная мастопатия обнаруживалась в обеих группах примерно с одинаковой частотой: 46 и 50% соответственно. В итоге при переходе от низкой МП к высокой МП преобладания пролиферативной формы мастопатии над непролиферативной ни в одной из групп не наблюдалось. Таким образом, как и в предыдущем исследовании, при низкой и высокой МП непролиферативная мастопатия выявлялась значительно чаще, чем пролиферативная. Следует отметить, что у пациенток с высокой МП (DY по шкале Вульфа) и максимальным риском РМЖ при гистологическом анализе значительно чаще обнаруживалась фиброзная мазоплазия (фиброзный аденоз) - специфическая форма мастопатии с повышенным риском малигнизации. Небольшое увеличение доли аденоза отмечалось у пациенток с повышенной P-маммоплотностью по сравнению с пациентками с нормальной N-маммоплотностью. Микрокисты МЖ при повышенной DY- и P-маммоплотности также обнаруживались чаще, чем при нормальной N-маммоплотности.

Что касается взаимосвязи ПМП и клеточной атипии, то, по мнению большинства авторов, при высокой МП атипия эпителиальных клеток МЖ встречается чаще, чем при низкой МП [381, 387, 472]. Лишь в одном известном нам исследовании такой корреляции обнаружить не удалось [383].

Общеизвестно, что МЖ является типичным гормон-зависимым органом и нарушения гормонального фона играют ведущую роль в этиологии и патогенезе ДЗМЖ и РМЖ. Гиперэстрогения - это один из ключевых факторов риска РМЖ. Повышенная маммоплотность в настоящее время также признается сильным независимым фактором риска РМЖ. Поэтому стремление ученых выявить взаимосвязь между уровнем эндогенных половых гормонов и величиной МП с самого начала выглядело закономерным и оправданным.

Изучение влияния на маммоплотность женских и мужских половых гормонов (эстрогенов, прогестерона, тестостерона, андростендиона), а также функционально связанных с ними белков и митогенных факторов роста началось с попыток установления прямой взаимосвязи между их содержанием в сыворотке крови и уровнем МП. Таких исследований было проведено немало. Некоторые из них увенчались относительным успехом [473–477], однако в целом такие попытки не привели к желаемому результату. В подавляющем большинстве случаев статистически значимой положительной корреляции между величиной МП и уровнем циркулирующих половых гормонов у пременопаузальных и постменопаузальных женщин установить не удалось [473, 474, 476, 478–482].sp;напрямую, путем дефосфорилирования киназы FAK [161–163].

В качестве официальной причины таких неудовлетворительных результатов назывался разный дизайн исследований. Действительно, все они отличались по объему выборки и методам отбора пациентов, а также способам определения МП и уровня сывороточных гормонов, который, как известно, чрезвычайно лабилен и, помимо фазы менструального цикла, зависит от множества других внешних и внутренних факторов. Кроме того, изучаемые параметры оценивались с поправкой на антропометрические и другие варьирующие показатели, которые сами по себе влияют на величину МП.

Несмотря на неудачные итоги исследований первой волны, большое количество косвенных данных свидетельствовало о несомненном вкладе женских половых гормонов в показатель МП. В частности, было установлено понижение высокой МП у постменопаузальных и у пременопаузальных женщин, не имевших диагноза РМЖ, на фоне длительного (в течение нескольких лет) профилактического приема антиэстрогенного препарата тамоксифена [483–486], его аналога - ралоксифена [487] и ингибиторов ароматазы [488], а также у пременопаузальных женщин в результате приема контрацептивов на основе агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона [489]. У пациенток с РМЖ, принимавших тамоксифен (в том случае, если МП у них снижалась в течение года или более), риск РМЖ уменьшался на 63% [490]. В другом исследовании у женщин с РМЖ и высокой МП, принимавших тамоксифен как средство адъювантной терапии, в случае снижения маммоплотности более чем на 20% отмечалось существенное улучшение ассоциированной с РМЖ выживаемости, на основании чего его авторы сделали вывод о прогностическом значении данного наблюдения [491]. В настоящее время в литературе обсуждается возможность использования показателя МП в качестве суррогатного маркера для оценки эффективности адъювантной и профилактической гормональной терапии при РМЖ [492].

Одновременно с этим в большом количестве клинических исследований, в том числе рандомизированных плацебо-контролируемых, было показано, что естественным образом понижающаяся в менопаузе маммоплотность значимо возрастает при продолжительном приеме препаратов постменопаузальной ЗГТ, особенно содержащих прогестины [493–505]. Прекращение приема ЗГТ приводило к снижению МП [499]. На основании полученных данных авторы этих исследований заключили, что прием препаратов ЗГТ повышает риск РМЖ, а растущую при этом МП можно рассматривать как валидный суррогатный биомаркер данного процесса. Таким образом, при назначении препаратов постменопаузальной ЗГТ необходимо учитывать их влияние на плотность МЖ [502].

Greendale et al. оценивали уровень эндогенных и экзогенных половых гормонов при различных схемах приема эстрогенсодержащих и комбинированных гормональных препаратов в постменопаузе. Была обнаружена положительная корреляция между величиной МП и количеством эндогенного эстрона, общего эстрадиола, биодоступного эстрадиола, прогестерона и общего тестостерона [475]. В другом исследовании в двух группах пациенток с пониженным и повышенным уровнем циркулирующего эстрона, принимавших постменопаузальную комбинированную ЗГТ, также удалось установить взаимосвязь между повышенной МП и содержанием гормона в кровотоке [502, 506].

Важно подчеркнуть, что на фоне комбинированной эстроген-прогестин-ЗГТ (независимо от режима приема прогестинов) маммоплотность всегда увеличивалась намного больше, чем при монотерапии эстрогенами [496, 497, 500, 507–509]. При этом на повышение МП не влияли ни антропометрические факторы, ни семейная история РМЖ, ни способность к деторождению, ни результаты предыдущих биопсийных исследований МЖ [510]. Единственным фактором, который коррелировал с данным процессом, был исходный уровень МП, зависевший от индивидуальных молекулярно-генетических показателей пациентки. У женщин с низкой МП после приема ЗГТ маммоплотность повышалась чаще, чем у женщин с исходно высокой МП. Однако у последних была выше вероятность последующего развития РМЖ.

Заметим, что на фоне приема ЗГТ маммоплотность повышается не всегда, то есть в женской популяции наблюдается гетерогенность ответа МЖ на действие экзогенных гормонов. По разным данным, доля постменопаузальных женщин, отвечающих на прием ЗГТ повышением МП, варьирует от 20–35 до 49% [10, 493, 496, 497, 508].

О влиянии гормонального фактора на маммоплотность говорят и данные иммуногистохимических исследований. В биоптатах МЖ с высокой МП была обнаружена повышенная, по сравнению с образцами с низкой МП, иммунореактивность ароматазы - ключевого фермента биосинтеза эстрогенов (эти данные мы приводили выше), что, по мнению авторов, может обусловливать увеличение продукции эстрогена при ПМП [61, 257].

Ранее (см. часть I, главу 2 "Какие факторы вызывают нарушение метаболизма эстрогенов при доброкачественных заболеваниях молочной железы?") мы рассказали о проведенных нами и другими авторами исследованиях, в которых была установлена взаимосвязь между приемом постменопаузальной ЗГТ и системным нарушением метаболизма эстрогенов. Речь шла о том, что даже при непродолжительном приеме ЗГТ в постменопаузе соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в организме женщины опускается ниже нормы, то есть гормональный баланс смещается в неблагоприятную сторону и повышается риск эстроген-зависимых опухолевых заболеваний (РМЖ).

В нашем исследовании в группах пациенток, принимавших ЗГТ, был проведен корреляционный анализ между динамикой соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 и величиной МП по классификации Вульфа [511]. Оказалось, что у женщин с исходно высокой МП снижение соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 коррелировало с продолжительностью терапии ЗГТ (3–6 мес). В итоге через 6 мес приема ЗГТ у всех пациенток с высокой МП (Р2) индивидуальная величина МП находилась в обратной зависимости от рассчитанного показателя 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1. Такая же корреляция наблюдалась в случае маммографической картины мастопатии.

Таким образом, было показано, что чем меньше было у пациентки соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 после приема ЗГТ, тем выше были у нее маммоплотность и степень выраженности мастопатии на маммограмме.

В первой части книги мы подробно говорили о значимости гормонального фактора, а именно дисбаланса эстрогенных метаболитов, в патогенезе доброкачественных и злокачественных заболеваний МЖ. Там же детально обсуждались уникальные возможности его фармакологической коррекции, которыми обладают вещество природного происхождения I3C и разработанный на его основе лекарственный препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ). Поэтому здесь мы ограничимся только следующим кратким выводом.

Между аномально сниженным соотношением 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 и повышенной маммоплотностью существует клинически доказанная взаимосвязь. Дисбаланс метаболитов эстрогена, наблюдаемый при повышенной маммоплотности и мастопатии, может быть восстановлен до нормы с помощью лекарственного препарата индолкарбинол (Индинол Форто ^® ).

В масштабных эпидемиологических исследованиях с участием моно- и дизиготных сестер-близнецов, так называемых "близнецовых исследованиях" [378, 512–514], а также в исследованиях по изучению семейной агрегации в сестринских парах и парах "мать–дочь" в сравнении с пациентками-неродственницами [515] было показано, что маммоплотность является высоконаследуемым количественным признаком, который (с поправкой на возраст, ИМТ, репродуктивную способность, менопаузальный статус и прием гормональной терапии) на 65% (запомним эту цифру!) обусловлен наследственными генетическими факторами и на оставшиеся 35% - факторами внешней среды [58, 378, 513].

В двух популяционных исследованиях при анализе маммографических регистров была установлена положительная корреляция между семейной историей РМЖ и повышенной маммоплотностью, определявшейся по шкале BI-RADS [3, 516]. При этом достоверной связи между наследуемым уровнем МП и носительством мутантных генов BRCA1/2 , обусловливающих развитие наследственного РМЖ (в том числе у женщин с развившимся впоследствии РМЖ), выявлено не было [517, 518], хотя среди носителей данных мутаций высокая МП ассоциировалась с повышенным риском РМЖ, одинаковым для носительниц мутаций BRCA1 и BRCA2 , а также для пре- и постменопаузальных женщин [517].

На следующем этапе предстояло выяснить, какие именно гены в женском генотипе детерминируют столь высокий уровень наследуемой МП. Ученые, стоявшие у истоков изучения данного вопроса, предполагали, что число генетических факторов, ответственных за повышенную МП, будет существенно меньше числа факторов, ассоциированных с РМЖ и их удастся легко идентифицировать. Таким образом, с точки зрения онкопрофилактики воссоздание генетического портрета наследуемой МП окажется более продуктивным, чем воссоздание генетического портрета РМЖ [519]. В будущем это позволит более результативно формировать группы риска РМЖ, что особенно важно для молодых женщин, которые по возрасту еще не подлежат обязательному прохождению маммографического скрининга [482]. Однако в действительности все оказалось намного сложнее и неоднозначнее, чем ожидалось вначале. Но обо всем по порядку.

Итак, мы поняли, что повышенная маммоплотность достоверно ассоциируется с повышенным риском РМЖ и часто определяется при маммографическом исследовании у пациенток с ДЗМЖ, в частности при мастопатии.

Лекарственный препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ) эффективно снижает плотность МЖ, о чем свидетельствуют многочисленные клинические данные.

В отечественном рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом многоцентровом исследовании, в котором участвовали пациентки (n =156, средний возраст - 33 года) с циклической масталгией/мастодинией, в том числе на фоне доброкачественной дисплазии МЖ (мастопатии), в качестве критерия эффективности индолкарбинола (Индинола Форто^® ), применявшегося для ее лечения, признавался факт уменьшения числа и/или размеров кист, исчезновения дуктэктазии, снижения эхоплотности МЖ по данным УЗИ, а также факт нормализации либо положительной динамики плотности и однородности МЖ по данным пальпации [717]. (Известно, что плотность МЖ можно субъективно оценить при ее пальпаторном обследовании [718].)

В результате 6-месячного приема индолкарбинола (Индинола Форто^® ) в дозе 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 2 капсулы) в группе больных с симптомами циклической масталгии/мастопатии, по сравнению с группой плацебо, на фоне нормализации эстрогенного баланса отмечалось выраженное улучшение клинической картины и объективных признаков заболевания, в том числе уменьшение болезненности и плотности МЖ при пальпации. Через 6 мес терапии в группе индолкарбинола (Индинола Форто^® ) эффективность лечения была значимо выше, чем в группе плацебо, и составила 60,4 против 29,2% [полные результаты этого регистрационного исследования представлены в первой части книги, см. главу 3 в части IV "Как препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ) нормализует эстрогенный баланс и оказывает другие антиэстрогенные эффекты при раке молочной железы и доброкачественных заболеваниях молочной железы?"].

В 2019 г. были опубликованы результаты клинического исследования, проведенного в НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова, в котором изучалась эффективность препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ) (доза приема: 2 раза в сутки по 200 мг, всего 400 мг I3C в сутки, 2 капсулы) у пациенток с мастопатией (n =60, средний возраст - 36,3 года), сопровождавшейся болевым синдромом [719]. Оценивались интенсивность боли в МЖ, плотность маммарной ткани, изменение размеров кист и фиброаденом через 3 и 6 мес терапии, а также спустя 6 мес после прекращения основного лечения (то есть через 12 мес от начала исследования), в течение которых пациентки получали профилактический трехмесячный курс индолкарбинола (Индинола Форто^® ) в прежней дозировке.

В итоге после первых 3 мес применения препарата уменьшение боли в МЖ наблюдалось у 52%, пальпаторной плотности - у 58%, размеров кист - у 40%, эхоплотности - у 27% пациенток. Терапевтическая эффективность индолкарбинола (Индинола Форто^® ) отмечалась во всех возрастных группах. При контрольном обследовании через 6 мес лечения интенсивность боли снизилась у 85%, пальпаторная плотность - у 70%, эхо-плотность - у 55% женщин. Изменений размеров кист и фиброаденом по сравнению с предыдущим визитом не наблюдалось. В результате 6-месячного наблюдения за 11 пациентками с фиброаденомами, получавшими индолкарбинол (Индинол Форто^® ) после хирургического лечения (прием препарата начинался через 7 дней после операции), рецидива заболевания выявлено не было. Через 6 мес лечения пальпаторно оцениваемая плотность МЖ снизилась у 70%, а эхо-плотность - у 55% пациенток. Через 12 мес от начала исследования 30% пациенток боль в МЖ не беспокоила, 30% женщин отмечали периодическое появление боли в МЖ и 38% - сообщили, что болезненность появляется редко и полностью отсутствует во время приема препарата. У 11 прооперированных пациенток с фиброаденомами спустя 12 мес по-прежнему не наблюдалось признаков рецидива. У 6 пациенток, которым выполнялась лечебно-диагностическая пункция крупных кист, спустя 12 мес пунктированные кисты не превышали в диаметре 1 см. Через 12 мес, по данным плановой маммографии и УЗИ, отмечалось стойкое снижение плотности МЖ.

В том же 2019 г. были опубликованы результаты клинического исследования, проведенного на базе Ростовского государственного медицинского университета МЗ РФ, в котором изучалась эффективность препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ) у пациенток с фиброзно-кистозной мастопатией и повышенным ИМТ [720]. В исследовании участвовали 164 пациентки 16–35 лет (средний возраст - 25,3±3,7 года) с фиброзно-кистозной мастопатией, длительность которой не превышала 2 лет, и избыточной массой тела или ожирением I–III степени (пациентки с ожирением I степени составляли 43% от общего числа участниц). Были сформированы две клинические группы: 1-я группа (n =80) в течение 6 мес получала индолкарбинол (Индинол Форто^® ) 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 2 капсулы), 2-я группа (n =84) в течение 6 мес получала индолкарбинол (Индинол Форто^® ) в той же дозировке и индивидуальную диетотерапию. Ежемесячно проводилось анкетирование пациенток, велся контроль ведения пищевого дневника, выполнялись антропометрические измерения. Также проводились консультации гинеколога и диетолога и оценивалась (совместно гинекологом и эндокринологом-диетологом) эффективность лечения основного заболевания и сопутствующей патологии. С целью объективной оценки течения мастопатии осуществлялся УЗИ-контроль МЖ через 3 и 6 мес терапии.

По итогам исследования в обеих группах наблюдались существенные изменения эхо-плотности маммарных образований. После 6 мес терапии в 1-й и 2-й группе доля пациенток, у которых определялись структуры с повышенной эхо-плотностью, снизилась соответственно на 48 и 61%, а доля пациенток с крупными (1,0–1,5 см) новообразованиями МЖ - на 54 и 70%. Одновременно с этим уменьшилось число пациенток с дуктэктазией (расширенными протоками желез): в 1-й группе - на 43%, во 2-й группе - на 59%. В результате индивидуально разработанной диеты, применявшейся вместе с индолкарбинолом (Индинолом Форто^® ), сократилось число женщин с ожирением всех трех степеней и увеличилось число женщин с нормальной массой тела. Через 6 мес терапии число пациенток с I, II и III степенью ожирения уменьшилось в 2,5, 2 и 3 раза соответственно, а число женщин с нормальной массой тела возросло от 0 до 21%. Таким образом, в обеих группах пациенток на фоне применения индолкарбинола (Индинола Форто^® ) отмечалась положительная динамика УЗИ-показателей МЖ, снижался ИМТ и улучшалось качество жизни.

Терапевтическая эффективность препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ) была подтверждена также в исследовании, проведенном в 2020 г. в Рязанском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова МЗ РФ [721]. 32 пациентки (средний возраст - 40,9±11,2 года) с доброкачественной дисплазией МЖ и масталгией, среди которых у 63% была выявлена диффузная, а у 37% - узловая или диффузно-узловая мастопатия, получали в течение 6 мес индолкарбинол (Индинол Форто^® ) 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 2 капсулы). В результате проведенного лечения у всех женщин наблюдалось уменьшение болевых ощущений в МЖ в интервале от 2 до 5 баллов по визуально-аналоговой шкале, вплоть до их полного купирования. У 96% пациенток на фоне ослабления масталгии отмечалось улучшение эмоционального состояния и настроения. По данным УЗИ, через 6 мес терапии узловые образования подверглись регрессу в виде уменьшения размеров и количества кист у 67% пациенток с диффузно-узловой мастопатией, у 17% - регресс исходно небольших кист был полным. При этом у всех женщин достоверно снижалась эхографическая плотность МЖ. При хорошей переносимости препарата отмечалось отсутствие нежелательных явлений средней и тяжелой степени, отклонений в продолжительности менструального цикла и изменений массы тела.

Следует сказать, что до выхода на фармацевтический рынок лекарственного препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ) в большом количестве исследований изучалась эффективность при комплексном лечении различных форм фиброзно-кистозной мастопатии биологически активной добавки Индинол^® (активный компонент - высокоочищенный I3C). Эти исследования проводились врачами Российского научного центра рентгенорадиологии, региональных онкодиспансеров, поликлиник и медицинских центров РФ. В общей сложности в этих исследованиях приняли участие около 1 тыс. женщин, средний возраст которых составлял ~40 лет. Индинол^® назначался в дозе 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 4 капсулы) в течение 3–6 мес.

По результатам этих исследований на фоне приема Индинола^® у пациенток с диффузными формами фиброзно-кистозной мастопатии субъективное улучшение состояния в виде полного исчезновения жалоб на боли отмечалось в 85–87% случаев после трехмесячной и в 90–92% случаев после шестимесячной терапии. У 100% пациенток с фиброзно-кистозной мастопатией с преобладанием железистого компонента (аденоз МЖ) боли были купированы полностью. У всех женщин с жалобами на выделения из соска к концу курса лечения выделения прекратились. На маммограммах и при УЗИ на фоне приема Индинола^® наблюдалось уменьшение плотности МЖ, исчезновение отека, уменьшение размеров и количества кистозных образований. Объективное улучшение состояния объемных образований (узлов, доброкачественных опухолей, кист), вплоть до их полного регресса, регистрировалось у 38–46% больных после трехмесячного и у 56–65% - после шестимесячного курса лечения. У пациенток с аденозом МЖ значительное уменьшение числа и размеров уплотнений отмечалось уже через 3 мес приема Индинола^® [722–725].

В открытом проспективном клиническом исследовании, проведенном в 2021 г. под руководством д-ра мед. наук, проф. Ю.Э. Доброхотовой на базе Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова и Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена (филиал Национального медицинского исследовательского центра радиологии), изучалась эффективность биологически активной добавки Индинол^® у женщин с сочетанной патологией: ДЗМЖ, сопровождавшиеся масталгией, и гиперплазия эндометрия [726]. В исследовании участвовали 42 пациентки пременопаузального возраста (средний возраст - 48,5±1,8 года), у которых после комплексного гинекологического и маммологического обследования, включавшего клинико-лабораторное, ультразвуковое и маммографическое исследования МЖ, а также цитологическое исследование выделений из соска (при их наличии), была диагностирована гиперплазия эндометрия без атипии и которые категорически отказались от приема гормональной терапии. Критериями исключения были гиперпластические процессы с атипией и злокачественная патология любой локализации. У 91% обследованных пациенток с гиперплазией эндометрия была диагностирована доброкачественная дисплазия МЖ. Все пациентки предъявляли жалобы на масталгию, при этом у 17% из них отмечалась выраженная, у 71% - умеренная и у 12% - слабая интенсивность болевого синдрома. У 12% женщин наблюдались серозные выделения из соска. По результатам цитологического исследования, атипических клеток в МЖ у пациенток обнаружено не было, цитограммы соответствовали картине фиброзно-кистозных изменений. Отклонение от нормального соотношения гидроксиметаболитов эстрадиола (2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1<2) было обнаружено у 64% пациенток.

Исходно при маммографическом исследовании заключения о картине BI-RADS-1 и BI-RADS-2 были сделаны в 9,5 и 88%, а при УЗИ - в 9,5 и 90,5% случаев соответственно. Одна женщина с заключением маммографии BI-RADS-3 была направлена на консультацию к онкологу, где ей была проведена кор-биопсия МЖ. В результате морфологического исследования у данной пациентки был выявлен фиброз без гиперплазии эпителиальных структур, что дало основание оставить ее в исследовании.

Всем пациенткам после проведения раздельного диагностического выскабливания полости матки и цервикального канала под контролем гистероскопии и последующей морфологической верификации диагноза был назначен прием Индинола^® 2 раза в сутки по 200 мг (всего 400 мг I3C в сутки, 4 капсулы) в течение 12 мес. Контроль эффективности проводимой терапии осуществлялся в ходе динамического наблюдения, включавшего клиническое обследование. Через 6 и 12 мес лечения оценивали М-ЭХО при УЗИ органов малого таза. УЗИ МЖ выполняли через 6 и 12 мес, рентгеновскую маммографию - через 12 мес.

В итоге через 6 мес терапии исчезновение болевого синдрома отметили 60% пациенток. Через 12 мес терапии полное купирование болевого синдрома наблюдалось у 88% пациенток, у остальных 12% - он был выражен в слабой степени. Выделения из соска прекратились у всех пациенток, имевших их ранее. Через 6 мес лечения соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 нормализовалось у 22%, а через 12 мес - у 93% женщин. Через 12 мес терапии улучшение картины BI-RADS (снижение плотности МЖ) по данным УЗИ отмечалось у 19%, по данным маммографии - у 29%, а улучшение показателей МП по системе АСR - у 33% пациенток. По результатам УЗИ органов малого таза был сделан вывод об отсутствии у пациенток рецидива основного заболевания - гиперплазии эндометрия. В целом отмечалась хорошая переносимость препарата.

И в заключение еще об одном интересном исследовании, проведенном в 2020 г. в Израиле [727]. Его авторы изучали влияние на плотность МЖ нутрицевтика DIM-Evail^тм (Invivo Healthcare, США) - биодобавки на основе DIM. Напомним, что DIM является основным in vivo -метаболитом I3C - активного компонента лекарственного препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ) и биологически активной добавки Индинол^® . В этом проспективном когортном исследовании участвовали женщины в возрастном промежутке от 35 лет до 71 года (n =46, средний возраст - 47 лет) - носительницы мутаций генов BRCA1/2 , не болевшие РМЖ, но имевшие в семейном анамнезе онкологические заболевания (РМЖ, рак яичников, рак поджелудочной железы). 78% пациенток находились в постменопаузе, из них три принимали препараты ЗГТ. 76% пациенток до начала исследования подверглись операции профилактической двусторонней сальпингоофорэктомии. В ходе исследования 23 женщины (основная группа) в течение 1 года принимали перорально DIM в дозе 100 мг/сут в составе биологически активной добавки DIM-Evail^тм ; 23 женщины, проходившие лечение в той же клинике и составлявшие группу контроля, не принимали DIM. В начале и в конце исследования на 7–15-й день цикла пациенткам проводилась магнитно-резонансная томография МЖ, в ходе которой два независимых эксперта-радиолога по визуальной шкале BI-RADS определяли два параметра: объем фиброзно-железистой ткани и фоновое контрастирование паренхимы .

Следует сказать, что, согласно последним данным, плотность МЖ, установленная с помощью параметров магнитно-резонансной томографии - объема фиброзно-железистой ткани и фонового контрастирования паренхимы, считается адекватным эквивалентом рентгенологической МП. Доказано, что между показателем объема фиброзно-железистой ткани, характеризующим долю плотной фиброзно-железистой ткани МЖ, и процентной МП существует положительная линейная корреляция [728–730]. Определявшиеся в ходе маммографии величины процентной МП превышали соответствующие показатели объема фиброзно-железистой ткани приблизительно на 16% [730]. Второй параметр - фоновое контрастирование паренхимы - характеризует усиление электронного сигнала при поглощении внутривенного контраста в рутинных исследованиях магнитно-резонансной томографии. Как и маммоплотность, он достоверно коррелирует с риском РМЖ и качественно кодифицирован в атласе BI-RADS [41]. Показано, что этот показатель, отражающий степень микроваскуляризации ткани и/или проницаемости клеток, регулируется эндогенными гормонами (в первую очередь эстрогеном) и чувствителен к фазе менструального цикла, гормональному фону, антиэстрогенной, химио- и лучевой терапии. В настоящее время магнитно-резонансная томография МЖ рекомендуется в качестве скринингового подхода в группах риска РМЖ или у женщин, имеющих противопоказания к проведению цифровой маммографии [731, 732].

По итогам израильского исследования [727], в основной группе пациенток, принимавших DIM в течение 1 года, отмечалось статистически значимое снижение среднего уровня объема фиброзно-железистой ткани с 2,8±0,8 до 2,65±0,84 (р =0,031). При этом у 30% из них он уменьшился на 0,6, то есть более чем на 20%, и ни у одной из пациенток не увеличилась плотность МЖ. Только у трех женщин из 23 (13%), получавших ЗГТ, уменьшения плотности МЖ на фоне приема DIM не наблюдалось. Что касается фонового контрастирования паренхимы, то статистически значимых изменений его среднего значения у пациенток, принимавших DIM, зафиксировано не было (1,3±5,7 против 1,3±1,73; р =0,43). У двух женщин из 23 данный параметр вырос. В отличие от группы приема DIM, в группе контроля в течение 1 года не отмечалось изменений обоих показателей: объема фиброзно-железистой ткани (2,28±0,9 против 2,3±0,89; р =0,33) и фонового контрастирования паренхимы (1,48±0,66 против 1,5±0,6; р =0,81). Уменьшение плотности МЖ на фоне приема DIM в опытной группе сопровождалось снижением среднего уровня эстрадиола (со 159 до 102 пмоль/л, р =0,01) и тестостерона (с 0,42 до 0,31 пмоль/л, р =0,007). Терапия DIM переносилась хорошо. В итоге авторы сделали вывод о статистически значимом снижении объема фиброзно-железистой ткани МЖ после годичного приема DIM в дозе 100 мг у здоровых носительниц мутаций генов BRCA и рекомендовали таким пациенткам использовать биодобавки на основе DIM в качестве средств первичной онкопрофилактики.

* * *

Важно понимать, что объективное снижение плотности МЖ на фоне приема индолкарбинола (Индинола Форто^® ) и Индинола^® у пациенток с мастопатией имеет под собой достоверную патогенетическую основу. Оно объясняется способностью активного компонента данных препаратов I3C и его физиологического метаболита DIM воздействовать на широкий спектр молекулярных мишеней и сигнальных каскадов, обусловливающих патогенез повышенной МП.

Пищевые индолы I3C и DIM известны как уникальные вещества с мультитаргетной противоопухолевой активностью, специфически блокирующие гены и белки, опосредующие процессы пролиферации, воспаления, ангиогенеза, стволовости и фиброза в маммарном канцерогенезе. Как мы выяснили, те же самые процессы активируются при ПМП в неопухолевых клетках МЖ. Увеличенное количество стромальных фибробластов, избыточное отложение ВКМ (прежде всего коллагена), усиленная секреция растворимых молекул, активирующих сигнальную трансдукцию, и сниженный иммунный ответ создают в маммографически плотной МЖ провоспалительную и протуморогенную среду, обусловливающую потенциальную опухолевую трансформацию маммарных клеток.

Давайте подытожим информацию, изложенную в третьей части книги, и вспомним, какие молекулярные мишени и сигнальные пути активируются при фенотипе ПМП.

В исследовании Lisanti et al. было установлено, что при высокой МП в ткани МЖ наблюдается массовая гиперэкспрессия генов, контролирующих ассоциированные с РМЖ каскады киназы клеточного стресса JNK-1 (ее гиперактивация обнаруживается также в миофибробластах при фиброзе печени [733]), фактора TGFβ, ГТФазы Rho, индуцибельной NO-синтазы, рецепторов факторов роста EGF, FGF и PDGF, рецепторов HER2 и ErbB3, рецепторов хемокинов (CXCR4) и ядерного фактора NF-êB [119].

Напомним, что конститутивно активированный фактор транскрипции NF-êB стимулирует экспрессию широкой панели (>500) генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, ферментов, ростовых факторов, белков адгезии и других биоактивных молекул, регулирующих клеточное деление, выживаемость, неоангиогенез, миграцию, инвазию, воспаление и иммунный ответ [734–738]. В серии экспериментов in vivo была подтверждена ключевая роль NF-êB при переходе хронического воспаления в рак [739–741]. Доказана критическая важность конститутивной активации NF-êB-сигналинга в развитии резистентности злокачественных опухолей к гормональной (тамоксифен, ингибиторы ароматазы) и химиотерапии, а также связь гиперэкспрессии NF-êB с повышенным риском раннего рецидивирования у больных гормон-зависимым РМЖ [742].

В число достоверных молекулярных мишеней, опосредующих фенотип ПМП, входят также киназы FAK, PI3K и Akt, МАР-киназы, опухоль-супрессорная фосфатаза PTEN, фактор роста IGF-1, интерлейкин IL-6, фермент СОХ-2, белок клеточной адгезии Е-кадгерин, фактор гипоксии HIF-1α, трансмембранный рецептор CD-36, компоненты эмбриональных каскадов Notch и Wnt, онкогенный белок MYC и белок иммунных контрольных точек PD-1. Некоторые из этих молекул участвуют в передаче пролиферативных сигнальных каскадов, индуцированных избыточным коллагеном аномально жесткого внеклеточного матрикса. Остальные опосредуют патологический фиброз, неоангиогенез, аномальный иммуновоспалительный ответ и другие протуморогенные процессы, характерные для фенотипа ПМП.

Как отмечалось выше, маммографически плотная ткань МЖ отличается повышенной эстрогенной респонсивностью. Молекулярными мишенями, ассоциированными с аномальным ответом плотной маммарной ткани на эстрогенный сигнал, являются рецепторы ERα и ферменты метаболизма эстрогенов: ароматаза, катализирующая образование эстрогенов, и уридин-5-дифосфат-глюкуронилтрансфераза, отвечающая за их метаболическую инактивацию. Есть данные, указывающие на наличие клинической взаимосвязи между ПМП и пониженным (<2) соотношением гидроксиэстронов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1.

Важный вклад в патобиологическую основу ПМП и сопутствующего ей фиброза вносит аномальная эпигенетика, ведь, как мы поняли, маммоплотность - это не только генетически детерминированный, но и изменяемый под влиянием средовых факторов, то есть эпигенетически регулируемый признак. Напомним, что молекулярно-генетическую основу фиброза - обязательного компонента повышенной МП - составляет ЭМП 2-го типа, представляющий собой процесс эпигенетического перепрограммирования клеток эпителия. Показано, что в патогенезе фиброза задействованы все три механизма эпигенетической регуляции: ДНК-метилирование, посттрансляционные модификации гистонов хроматина и экспрессия некодирующих длинных и коротких микроРНК.

Следует подчеркнуть, что все вышеперечисленные молекулы, опосредующие фенотип ПМП, являются доказанными мишенями I3C и DIM в опухолевых и трансформированных клетках. Это создает патогенетическую основу для терапевтического эффекта разработанных на основе данных веществ фармацевтических препаратов, применяемых с целью снижения ПМП, а именно препарата индолкарбинол (Индинол Форто^® ).

Как именно действуют I3C и его физиологический метаболит DIM на молекулярные мишени фенотипа повышенной маммоплотности (см. рис. 34 ) ?

В первой части книги мы подробно обсудили множественную антиэстрогенную активность пищевых индолов I3C и DIM: их способность нормализовать соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1, уменьшать количество рецепторов ERα, а также оказывать другие положительные эффекты, ослабляющие аномальный эстрогенный сигналинг.

В заключительной 8-й главе второй части книги, посвященной эпигенетике, говорилось о том, что при разных видах рака в присутствии I3C и DIM наблюдается специфическое ингибирование активности и экспрессии ключевых эпигенетических ферментов, опосредующих функциональную инактивацию противоопухолевых генов (а значит, и генов, контролирующих протуморогенные процессы при ПМП): трех изоформ DNMT (DNMT1, DNMT3а, DNMT3b) [743–746] и четырех изоформ HDAC I (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8) [747–749]. Там же отмечалась способность I3C и DIM модулировать экспрессию многочисленных микроРНК, ассоциированных с канцерогенезом, в число которых входят микроРНК, контролирующие фиброз - неотъемлемый компонент фенотипа ПМП: let-7, miR-1, miR-21, miR-26, miR-30, miR-34, miR-122, miR-192, miR-200, miR-377 [444–448, 750–753].

Еще раз отметим, что особое место среди микроРНК - мишеней I3C и DIM - занимает miR-21 - одна из первых молекул микроРНК, обнаруженных у млекопитающих, и одна из самых изучаемых микроРНК в мире. Гиперэкспрессия miR-21 наблюдается во многих злокачественных опухолях, в том числе при РМЖ, а также при фиброзе различных органов. Установлено, что протуморогенная и профиброзная активность miR-21 обусловлена способностью данной молекулы стимулировать пролиферацию посредством ингибирования опухоль-супрессорной фосфатазы PTEN (ключевого блокатора пролиферативных PI3K/Akt- и ERK-МАРК-сигнальных каскадов ^[26]) и усиливать фиброгенез путем активации TGFβ-сигналинга. Таргетное ингибирование miR-21 приводило к устранению патологических фиброзных повреждений и восстановлению нормальной структуры ткани. В связи с этим разработка лекарственных препаратов, обладающих специфической miR-21-ингибирующей активностью, является актуальной задачей современной фармакологии.

В нескольких независимых исследованиях in vitro и in vivo была показана способность I3C и DIM подавлять экспрессию miR-21, что сопровождалось активацией фосфатазы PTEN, а также ингибированием киназы Akt и TGFβ-индуцированного ЭМП [445–448]. На экспериментальной животной модели фиброза печени удалось продемонстрировать терапевтический эффект DIM, при котором, помимо подавления экспрессии miR-21, наблюдалось снижение уровня коллагена и профиброгенных маркеров [более подробно результаты этих исследований изложены во второй части книги, см. главу 8 "Как препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ) восстанавливает эпигенетические нарушения в маммарном канцерогенезе?"].

Наблюдавшиеся в присутствии I3C и DIM ослабление фиброза, вызванного химическими агентами или TGFβ, и ингибирование при разных видах рака, в том числе при РМЖ, биологической основы фиброза - TGFβ-индуцированного ЭМП (точнее, обоих его механизмов: Smad-зависимого и Smad-независимого PI3K/Akt/mTOR/NF-êB) - были установлены и другими авторами [342, 750, 754-763]. В экспериментах in vitro и in vivo I3C и DIM подавляли дифференцировку фибробластов в фиброзные миофибробласты, а также экспрессию маркеров фиброза (гладкомышечного актина, виментина, коллагена) и ассоциированных с фиброзом микроРНК. Кроме этого, I3C и DIM ослабляли TGFβ-сигналинг и уменьшали визуально детектируемое отложение коллагена в строме.

В блестящей работе Lee et al., опубликованной в 2019 г. в журнале Science , было детально изучено свойство I3C реактивировать фосфатазу PTEN - вышеупомянутую мишень фенотипа ПМП - в условиях in vivo [764]. Авторы убедительно показали, что восстановление опухоль-супрессорных функций PTEN в опухолевых клетках реализуется через I3C-опосредованное блокирование онкогенного MYC-WWP1-сигнального пути. Сам факт PTEN-активирующей способности I3С в опухолях различного происхождения, в том числе при РМЖ, был установлен ранее в исследованиях in vitro , in vivo и ex vivo [444, 765, 766]. В 2020 г. способность активировать PTEN была обнаружена и у DIM - физиологического метаболита I3C [767].

Говоря об уникальности терапевтических свойств I3C, необходимо упомянуть еще об одном интересном факте. В 2021 г. в престижном журнале Cell Death & Disease была опубликована фундаментальная работа большой группы европейских и американских авторов, посвященная антиковидной активности I3C. Было показано, что in vitro I3C понижает продукцию коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (англ. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) - вируса, с которым связано распространение охватившей планету пандемии коронавирусной инфекции 2019 г. (COVID-19), и оказывает выраженный противовирусный эффект [768]. В присутствии I3C наблюдалось специфическое ингибирование гиперэкспрессии HECT-E3-лигаз - белков WWWP1 и NEDD, обеспечивающих жизнеспособность и вирулентную активность SARS-CoV-2. Ферменты WWWP1 и NEDD являются компонентами онкогенного сигнального каскада MYC-WWP1 (см. выше), I3C-опосредованное ингибирование которого было установлено двумя годами ранее Lee et al. [764].

В 2022 г. вышла в свет очередная публикация этой авторской группы [768а]. На этот раз антиковидная активность I3C была подтверждена в экспериментах на клеточной линии VeroE6 и культивируемых органоидах инфицированных легких человека, где I3C напрямую подавлял репликацию SARS-CoV-2, оказывал антивирусный эффект (в том числе в отношении варианта "Омикрон") и модулировал экспрессию генов врожденного иммунитета и воспалительного ответа. По результатам экспериментов in vivo , проведенных на мышиной модели, был сделан вывод о высоком профиле безопасности I3C как противовирусного агента.

Способность I3C [769, 770] и DIM [771] блокировать в опухолевых клетках на уровне транскрипции и трансляции протоонкогенный белок MYC - другой ключевой компонент MYC-WWP1-каскада и мишень фенотипа ПМП - была доказана еще раньше.

Надо сказать, что MYC играет очень важную роль в онкогенезе. Как многофункциональный фактор транскрипции он регулирует экспрессию около 15% всех генов, глобально влияя на структуру хроматина и генетическую программу клетки. Гены-мишени MYC контролируют процессы клеточного деления, дифференцировки, выживаемости, метаболизма, ангиогенеза и стабильности генома. Поэтому данный онкобелок считается важнейшей молекулярной мишенью в противоопухолевой таргетной терапии. Однако до настоящего времени ни один из разработанных анти-MYC препаратов не получил одобрения для клинического использования по причине их низкой эффективности и быстрой деградации в организме [772].

Помимо самого онкобелка MYC, доказанными терапевтическими мишенями I3C и DIM в опухолевых клетках, в том числе маммарных, являются регулируемые им активаторы (циклины D1, D2, E; циклин-зависимые киназы CDK2, СDK4, CDK6; E2F и др.) и ингибиторы (p15, p21, p27, p57) клеточного цикла. Изменение экспрессии/активности указанных молекул в присутствии I3C и DIM сопровождалось остановкой клеточного цикла в фазе G1/S и антипролиферативным противоопухолевым эффектом [773–782].

Как мы уже говорили, I3C и DIM - это уникальные вещества с множественной противоопухолевой активностью. В огромном количестве исследований на раковых клетках различного происхождения, в том числе РМЖ, а также на животных моделях опухолевых и системных воспалительных (инфекционный колит и ревматоидный артрит) заболеваний была продемонстрирована их способность стимулировать апоптоз, подавлять пролиферацию, воспаление, ангиогенез, клеточную миграцию и инвазию. Специфическая антипролиферативная и проапоптотическая активность I3C и DIM сопровождалась ингибированием ростовых факторов и их рецепторов (FGF, TGFβ2, EGFR, HER2, PDGFRβ), а также нижестоящих мишеней в каскадах, опосредуемых этими и другими (IGF-1) индукторами, а именно сигнальных протеинкиназ (MAРK, PI3K, Akt) и ядерного фактора транскрипции NF-êB [759, 770, 776, 778, 781, 783–804]. В других исследованиях выраженный противовоспалительный эффект со стороны I3C и DIM, помимо ингибирования фактора NF-êB, сопровождался понижением экспрессии и/или активности ключевых провоспалительных белков: IL-6, COX-2, индуцибельной NO-синтазы и киназы JNK [788, 803–810]. Все они опосредуют фенотип ПМП.

Китайские ученые Du et al. изучали противовоспалительные свойства DIM в культуре активированных синовиальных фибробластов, выделенных из тканей больных ревматоидным артритом, а также в экспериментах in vivo на животной модели [804]. Было показано, что DIM подавляет пролиферацию, миграцию, инвазию и провоспалительную активность синовиоцитов и оказывает выраженный терапевтический эффект. При этом наблюдалось ингибирование сигнальных каскадов Akt/mTOR и ERK, в том числе активной фосфоформы вышеупомянутой киназы JNK - важной молекулярной мишени фенотипа ПМП. Заметим, что в патогенезе ревматоидного артрита активированные фибробластоподобные синовиоциты ведут себя подобно опухолевым клеткам. Они так же усиленно растут и делятся, секретируют провоспалительные молекулы и металлопротеиназы, проявляют устойчивость к апоптозу, генетическую нестабильность, повышенную миграционную и инвазивную активность. Вместе с макрофагами, лимфоцитами, нейтрофилами, тучными и дендритными клетками фибробластоподобные синовиоциты создают воспалительную среду в синовиальной оболочке и привлекают еще больше иммунных клеток в поврежденное место, в результате чего происходит эрозия хряща и разрушение сустава.

Какие еще молекулярные мишени отвечают за фенотип ПМП?

Киназа FAK - центральный сигнальный белок фокальных контактов - играет ключевую роль в трансдукции интегрин-зависимых пролиферативных каскадов, индуцируемых избыточным коллагеном в маммографически плотной МЖ. В исследовании Ho et al. инкубация клеток гормон-зависимого РМЖ и трижды негативного метастатического РМЖ с I3C приводила к подавлению клеточной миграции и ЭМП, а также к ингибированию металлопротеиназ ММР-2, ММР-9 и киназы FAK [760].

Е-кадгерин (эпителиальный кадгерин, кадгерин 1-го типа) - важнейшая молекула клеточной адгезии, отвечающая за интеграцию эпителиальных клеток и поддержание целостности тканей организма. Помимо межклеточной адгезии, Е-кадгерин участвует в регуляции подвижности и пролиферации эпителия, выступая как потенциальный супрессор инвазивной клеточной активности. Его экспрессия понижается в результате процесса ЭМП - биологической основы фиброза. Установлено, что Е-кадгерин является достоверной молекулярной мишенью I3C при РМЖ [765, 811]. В присутствии I3C экспрессия Е-кадгерина повышалась дозозависимым образом, при этом наблюдалось торможение процессов клеточной адгезии, миграции и инвазии in vitro , а также драматическое уменьшение количества метастазов РМЖ in vivo .

Известно, что фенотип ПМП формируется в том числе при участии оксидативного стресса. В свою очередь, вещества природного происхождения I3C и DIM обладают выраженной антиоксидантной активностью. В условиях in vitro микромолярные концентрации указанных индолов (25 мкМ I3C и ≤1 мкМ DIM) эффективно защищали эпителиальные опухолевые клетки МЖ и простаты от негативного воздействия свободных радикалов [812, 813]. Данный эффект был сопряжен с опухоль-супрессорной активностью белка BRCA1, антиоксидантная функция которого была установлена ранее [814]. Было показано, что BRCA1 - как фактор транскрипции - стимулирует экспрессию множества генов (глутатион-S-трансферазы, оксидоредуктазы и др.), вовлеченных в цитопротективный и антиоксидантный клеточный ответ, а также повышает активность другого транскрипционного фактора Nrf2, регулирующего экспрессию большой группы ферментов детоксикации и антиоксидантной защиты.

В экспериментах in vitro и in vivo на животной опухолевой модели TRAMP (трансгенная мышиная аденокарцинома простаты, спонтанно развивающаяся в метастатический рак) в присутствии очень низких (2,5–5,0 мкМ) концентраций DIM, на фоне ингибирования экспрессии фермента ДНК-метилтрансферазы, наблюдалось промоторное деметилирование и реактивация гена Nrf2 , повышение продукции белка Nrf2, активация экспрессии Nrf2-зависимых генов и антиоксидантных белков [745]. Об этом и других исследованиях, доказывающих способность I3C и DIM стимулировать экспрессию фактора Nrf2 и усиливать Nrf2-cигналинг, мы подробно говорили во второй части книги [см. часть II, главу 8 "Как препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ) восстанавливает эпигенетические нарушения в маммарном канцерогенезе?"].

Важная молекулярная мишень фенотипа ПМП, опосредующая также воспаление и патологический неоангиогенез в канцерогенезе, - гипоксия-индуцибельный фактор HIF-1α. Известно, что фактор гипоксии HIF-1α, взаимодействуя со специфическим сайтом в промоторном участке гена сосудистого фактора роста VEGF, стимулирует его транскрипцию, а также транскрипцию других генов, контролирующих неоангиогенез и способствующих выживанию опухолевых клеток в условиях недостатка кислорода. В экспериментах in vitro инкубация клеток РМЖ с I3C в условиях нормоксии и гипоксии приводила к статистически значимому подавлению экспрессии факторов HIF-1 и VEGF и уменьшению размеров кровеносных сосудов. При этом наблюдалось прямое взаимодействие I3C с HIF-1 [815, 816]. DIM в гипоксических опухолевых клетках также существенно понижал уровень HIF-1α, его транскрипционную активность и экспрессию HIF-1α-респонсивных генов, в результате чего происходила инактивация гипоксия-зависимых молекул: VEGF, енолазы-1, глюкозного транспортера-1, фосфофруктокиназы и др. Уменьшение уровня HIF-1α в гипоксических опухолевых клетках, обработанных DIM, сопровождалось ускоренной ферментативной и протеасомной деградацией HIF-1α, а также подавлением HIF-1α-опосредованной генной транскрипции [817].

Хемокиновый рецептор CXCR4 - еще одна сигнальная молекула, которая участвует в патогенезе повышенной маммоплотности и в канцерогенезе (а именно, в процессах клеточной инвазии и метастазирования) и является мишенью пищевых индолов. CXCR4 экспрессируется на поверхности первичных опухолевых клеток и после взаимодействия со специфическим лигандом CXCL12, секретируемым клетками органов, опосредует прогрессирование и метастазирование РМЖ и других видов рака. В экспериментах in vitro была показана способность DIM подавлять экспрессию рецептора CXCR4 и лиганда CXCL12 в клетках гормон-зависимого (MCF-7) и трижды негативного метастатического (MDA-MB-231) РМЖ, а также в клетках рака яичников (BG-1) [758, 818].

Помимо гиперэкспрессии протуромогенных и провоспалительных сигнальных молекул, для фенотипа ПМП характерно усиление "стволовости" маммарных клеток (понижение уровня их дифференцировки) на фоне активации сигнальных каскадов Wnt и Notch. Известно, что эмбриональные каскады Wnt, Notch и Hedgehog, конститутивно активированные в агрессивных злокачественных опухолях (точнее, в туморогенных ОСК, см. часть IV), обусловливают их повышенный метастатический потенциал и устойчивость к стандартному терапевтическому лечению.

Как отмечалось выше, ключевым эффектором и преобразователем сигнала Wnt-каскада является белок β-катенин. В отсутствие внешних Wnt-лигандов фосфорилированный β-катенин неактивен по причине ингибирующего действия со стороны мультимерного комплекса, в состав которого, помимо него самого, казеинкиназы CK1α, опухоль-супрессорного белка АРС и проапоптотического белка аксина, входит киназа GSK3β, фосфорилирующая β-катенин. Cвязывание Wnt-лигандов с рецепторами приводит к ингибированию GSK3β, разрушению белкового комплекса и транслокации дефосфорилированного β-катенина в ядро, где он связывается с факторами и кофакторами транскрипции. В результате индуцируется экспрессия целевых генов, опосредующих процессы пролиферации, дифференцировки и метастазирования (см. рис. 18 ).

I3C и DIM успешно справляются с задачей ингибирования гиперактивированного Wnt-каскада. В 2007 г. американские ученые Li et al. показали, что антипролиферативный и проапоптотический эффект нутрицевтика BR-DIM в опухолевых клетках простаты, сопровождающийся блокированием Wnt-сигналинга, обусловлен повышением уровня неактивного фосфорилированного β-катенина, торможением его транслокации в ядро и подавлением активации киназы GSK-3β [794]. Спустя 8 лет эти результаты были подтверждены другими авторами. По их данным, обработка клеток колоректального рака DIM приводила к дозозависимому уменьшению экспрессии гена и белка β-катенина, в то время как уровень неактивного фосфо-β-катенина, напротив, возрастал [771]. Еще одно доказательство Wnt-ингибирующей способности I3C мы привели во второй части монографии при цитировании результатов собственного недавнего исследования по изучению ДНК-деметилирующей активности I3C [819]. Нам удалось показать, что в клетках метастатического РМЖ (MDA-MB-231) I3C деметилирует и функционально реактивирует ген WIF-1 , кодирующий одноименный опухоль-супрессорный белок - ингибитор Wnt-каскада.

В клиническом исследовании Kong et al. в биоптатах, полученных у пациентов с раком простаты, которые перед радикальной простатэктомией в течение 2–4 нед принимали нутрицевтик BR-DIM, на фоне противоопухолевых эпигенетических эффектов (реэкспрессии опухоль-супрессорных микроРНК) и ослабления андрогенного гормонального сигналинга, отмечалось понижение уровня рецепторного белка Notch-1 - компонента эмбрионального каскада Notch [752].

И в заключение еще о двух молекулярных мишенях фенотипа ПМП, на которые специфически действует препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ), но действует опосредованно, регулируя активность факторов транскрипции, контролирующих экспрессию кодирующих данные белки генов.

Первая мишень - это белок иммунных контрольных точек PD-1. Как мы говорили ранее, при связывании трансмембранного рецепторного белка PD-1, локализованного на поверхности Т-лимфоцитов, со специфическим лигандом PD-L1 происходит торможение иммунного клеточного ответа (см. часть III, главу 2, раздел 2.3 "Иммунные клетки и иммуновоспалительный ответ при раке молочной железы, доброкачественных заболеваниях молочной железы и при повышенной маммоплотности"). Аномальная активация PD-1/PD-L1-сигнала, наблюдаемая в злокачественных опухолях различной локализации, а также в строме и эпителии МЖ при ПМП, не позволяет Т-лимфоцитам полноценно реализовать свои эффекторные функции по уничтожению трансформированных клеток и ослабляет общую противоопухолевую защиту организма. На лекарственные препараты - ингибиторы иммунных контрольных точек PD-1 и PD-L1 - возлагаются большие надежды в современной иммунотерапии рака.

В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что экспрессия лиганда PD-L1 регулируется фактором транскрипции STAT3 (членом семейства STAT-белков), который напрямую связывается с промотором гена, кодирующего PD-L1 [820, 821]. Известно, что функции белков STAT заключаются в передаче сигналов от цитокинов (IL-6, IL-10, интерферон, фактор TNFα), факторов роста (EGF, VEGF, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и других внешних индукторов (облучение, оксидативный и генотоксический стресс, геморрагический шок, аутофагия) в ядро, где активированные (фосфорилированные и ассоциированные в димеры) белки STAT стимулируют транскрипцию широкого спектра генов клеточного деления, дифференцировки, выживаемости, ангиогенеза, воспаления, миграции, инвазии и иммунного ответа. Фосфорилирование белков STAT осуществляется посредством Janus (янус)-киназ JAK - тирозиновых протеинкиназ, ассоциированных с клеточной мембраной. Семейство янус-киназ включает в себя три киназы JAK (JAK 1–3) и тирозинкиназу 2 (TYK2). Важнейшим индуктором каскада JAK/STAT является интерлейкин IL-6 - ключевой провоспалительный и протуморогенный цитокин.

В нормальных клетках лиганд-зависимая активация JAK/STAT-каскада носит транзиторный характер, в то время как в опухолевых клетках, в том числе клетках РМЖ, а также в очагах хронического воспаления и фиброза наблюдается его конститутивная активация. Установлена роль STAT3 как индуктора процесса ЭМП при раке и фиброзе. Показано, что в основе профиброзной активности STAT3 лежит его способность стимулировать продукцию внеклеточного матрикса. Как фактор транскрипции, STAT3 напрямую взаимодействует с промотором гена коллагена I и повышает его экспрессию, а также модулирует экспрессию генов матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов. Кроме того, аномально активированный STAT3 способствует TGFβ-индуцированному переходу фибробластов в фиброзные миофибробласты и препятствует апоптозу выполнивших свою функцию миофибробластов при нормальном ранозаживлении [822]. В связи с этим разработка специфических ингибиторов белка STAT3 и JAK/STAT-сигнального каскада является актуальной задачей современной фармакологии [426, 822–824].

В экспериментах in vitro и in vivo , проведенных разными авторами на различных типах опухолевых клеток, была показана способность I3C и DIM дозозависимо снижать уровень конститутивно активированных (фосфорилированных) белков STAT3, STAT5 и киназы JAK2, подавлять их цитокин (IL-3-, IL-6)-индуцированную активацию и транслокацию в ядро, а также блокировать связывание с ДНК и транскрипционную активность STAT3, то есть тотально ингибировать JAK/STAT-сигналинг [770, 825–828]. Наблюдаемая JAK/STAT-ингибирующая активность I3C и DIM сопровождалась множественными противоопухолевыми эффектами: подавлением пролиферации, инвазии, метастазирования, ангиогенеза и усилением апоптоза. Есть данные о DIM-опосредованном ингибировании STAT3-сигнального каскада в экспериментах in vitro и in vivo при изучении ремоделирования сонной артерии после ее повреждения. В этом случае DIM блокировал фенотипическую модуляцию гладкомышечных сосудистых клеток и гиперплазию неоинтимы ^[27] после повреждения сосудов, то есть предотвращал рестеноз [800].

Поскольку I3C и DIM тотально ингибируют JAK/STAT-сигналинг и подавляют функциональную активность фактора STAT3 - активатора экспрессии белка иммунных контрольных точек PD-L1, можно заключить, что данные индолы опосредованно подавляют экспрессию лиганда PD-L1 и ослабляют индуцируемый им PD-1/PD-L1-сигнал, то есть снижают функциональную активность рецептора PD-1 - доказанной молекулярной мишени фенотипа ПМП.

Говоря об иммунных контрольных точках как о важнейших молекулярных мишенях I3C и DIM, не следует забывать о ранее установленной способности данных индолов модулировать локальный и системный иммунный ответ, а именно нормализовать созревание и активность иммуноцитов (В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, NK-клеток, макрофагов) и активировать интерферон-зависимую сигнальную систему [159, 829–836]. Напомним, что при повышенной МП увеличивается количество клеток врожденного и приобретенного иммунитета и создаются условия для сниженного противоопухолевого иммунного ответа.

Еще одна молекулярная мишень фенотипа ПМП, которая опосредованно регулируется препаратом индолкарбинол (Индинол Форто^® ) на уровне транскрипции, - мембранный белок CD-36. Ранее мы говорили о том, что CD-36 является скэвенджер-рецептором в метаболически активных тканях. Он вовлечен в регуляцию широкого спектра клеточных функций и играет важную роль в формировании фенотипа ПМП посредством контроля содержания стромальных адипоцитов и отложения ВКМ. При повышенной МП и РМЖ наблюдается аномальный дефицит данного белка. Положительным регулятором активности CD-36 является фактор транскрипции Nrf2, контролирующий экспрессию ферментов детоксикации и антиоксидантной защиты и являющийся достоверной молекулярной мишенью I3C и DIM. В многочисленных исследованиях in vitro и in vivo I3C и DIM стимулировали экспрессию Nrf2 и активировали Nrf2-зависимые cигнальные механизмы, в результате чего усиливались антиоксидантные и противоопухолевые клеточные функции [см. часть II, главу 8 "Как препарат индолкарбинол (Индинол Форто^® ) восстанавливает эпигенетические нарушения в маммарном канцерогенезе?"; часть III, главу 3 "Молекулярные маркеры повышенной маммоплотности в эпителии и строме молочной железы: данные иммуногистохимических, иммуноферментных и молекулярно-генетических исследований"].

Поскольку в присутствии пищевых индолов возрастали количество и биологическая активность фактора Nrf2 - активатора экспрессии гена и белка CD-36, можно заключить, что I3C и DIM опосредованно повышают уровень CD-36, то есть уменьшают его дефицит, характерный для фенотипа ПМП.