NGS: ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Большинство современных методов молекулярной биологии предполагает использование множества идентичных макромолекул для получения детектируемого сигнала. К ним относятся различные виды хроматографии, рентгеноструктурный анализ, масс-спектрометрия и т. д. Секвенирование ДНК также требует усиления сигнала за счет использования в анализе множества одинаковых молекул ДНК. Ниже рассмотрены подходы с предварительной амплификацией ДНК (путем обычного или in vitro клонирования) для получения миллионов идентичных фрагментов, забираемых в дальнейший анализ.

Описанные ниже методы отличаются отсутствием этапа клональной амплификации библиотеки (или отдельного фрагмента) ДНК. Это упрощает методику, но, главное, убирает один из этапов искажения исходного материала (ведь в перечисленных выше методах секвенируется не исходная ДНК, а примерно ее 20-я копия: попробуйте последовательно 20 раз скопировать эту страницу на Xerox, делая новую копию с предыдущей, - увидите влияние амплификации). Однако регистрация сигнала от единственной молекулы накладывает чрезвычайно высокие требования к соответствующим детекторам.

Отметим, что ряд авторов называют описанные ниже варианты NGS как технологии третьего поколения (в отличие от технологий NGS второго поколения, требующих клональной амплификации ДНК).

Кроме перечисленных выше подходов есть множество гораздо менее технически и идейно проработанных технологий: метод колебаний [28], секвенирование при помощи вращающегося поля [29] и т. д. Вследствие недостаточной проработанности методов мы не сочли нужным раскрывать детали этих подходов в столь кратком обзоре технологий.

В случае исследования РНК первым этапом после очистки от примесей является обратная транскрипция. Следовательно, метод очистки РНК должен эффективно удалять из биологического образца примеси, способные помешать работе ревертазы. Если же предполагается секвенирование генома, чувствительным к примесям этапом может стать ферментативное разрушение ДНК или этап лигирования адаптеров (если разрушение ДНК выполнялось физическими методами).

Все современные методы очистки нуклеиновых кислот можно глобально разделить на две группы: методы с поэтапным удалением примесей из водного раствора НК и методы, основанные на сорбции НК на твердой фазе. Наиболее известной методикой первого типа является, пожалуй, фенол-хлороформная экстракция [1].

Вторая группа методик основана на использовании силикатных сорбентов, эффективно связывающих НК в растворе с высокой ионной силой. Одной из первых появившихся методик такого типа является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами [2]. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN) - и последующей сорбции ДНК на твердом носителе (сейчас основанные на оксиде кремния сорбенты можно встретить под названиями «стеклянные бусы», «диатомовая земля», «стеклянное молоко» и т. д.). После промывки сорбента на нем остается чистая НК, легко снимающаяся дистиллированной водой. В последнее время чрезвычайно распространены одноразовые пластиковые микроколонки с упакованным в них сорбентом (например, наборы реагентов фирм QIAGEN, Ambion и др.). Промывка колонок растворами с высокой ионной силой удаляет белки и низкомолекулярные соединения, после чего проводят элюцию очищенных нуклеиновых кислот раствором с низкой ионной силой.

В целом требования к чистоте препарата НК при постановке NGS не слишком высоки и примерно соответствуют таковым для обычного клонирования в плазмидный вектор.

Концентрацию полученных препаратов ДНК или РНК (перед обратной транскрипцией, разрушением или уже разрушенных образцов) можно измерить непосредственно по спектру поглощения нуклеиновых кислот (на спектрофотометре), по флуоресценции интеркалирующего красителя (после электрофореза или при помощи флуориметра) или методом количественной ПЦР.

Производители оборудования для NGS рекомендуют осуществлять измерение с помощью компактных флуориметров (типа Qubit от Life Technologies или Quantus от Promega) (рис. 2.2). Принцип их действия основан на измерении флуоресценции интеркалирующего в ДНК красителя типа SYBR. Точность измерения определяется калибровкой прибора с помощью двух стандартов перед каждой серией измерений. Преимущество флуоресцентного определения концентрации перед спректрофотометрическим (с помощью довольно распространенных приборов типа Nanodrop) заключается в гораздо более широком диапазоне концентраций, внутри которого флуориметр выдает достаточно точные результаты.

Метод количественной ПЦР как способ определения концентрации ДНК несколько сложнее и дольше в исполнении, но дает гораздо более точные и воспроизводимые результаты в огромном линейном диапазоне значений. Если стартовым материалом является геномная ДНК, можно использовать праймеры на уникальный регион (представленный в геноме один раз), если к ДНК - можно оценивать количество одного или двух средне- или низкопредставленных транскриптов. Праймеры для таких ПЦР-систем желательно располагать близко, оставляя место только под олигонуклеотидую пробу (обычно типа TaqMan).

Отдельно следует упомянуть ситуацию, когда по каким-либо причинам невозможно получить достаточное стартовое количество ДНК или кДНК (мало биологического материала, исследование единичных клеток и т. п.). В этом случае можно перед началом создания библиотеки фрагментов амплифицировать НК одним из стандартных способов.

В случае малого количества геномной ДНК можно прибегнуть к методике полногеномной амплификации (whole genome amplification, WGA), основанной на изотермическом синтезе ДНК полимеразой Phi29 [3]. Существуют достаточно хорошо работающие коммерческие наборы реагентов для WGA (например, REPLI-g Single Cell Kit от QIAGEN).

Если работа начинается с малого количества РНК, можно использовать амплификацию к ДНК [4]. Для этих целей также подходит множество наборов реагентов, имеющихся на рынке (например, набор Mint компании «Евроген»).

В любом случае при использовании предварительной амплификации ДНК или к ДНК в проектах NGS необходимо помнить об искажениях, которые неизбежно вносит этот прием. Для анализа результатов секвенирования единичных клеток разработаны специальные алгоритмы, позволяющие учесть часть искажений и получить лучшие результаты [5] (см. разд. 4.4.2).

Исходным материалом для исследования могут служить любые нуклеиновые кислоты: ДНК всех типов, РНК всех типов, включая микроРНК, продукты ПЦР, отдельные области генома (таргетное секвенирование или обогащение), комплексы нуклеиновых кислот с белками и т. д. Несмотря на различие в целях и задачах экспериментов, создание библиотеки в итоге сводится к разрушению ДНК до фрагментов определенного размера (или отбор определенной фракции из существующего спектра фрагментов), лигированию адаптеров и увеличению количества ДНК одним из методов наработки in vitro (амплификации). Если исходным материалом служит РНК, ее переводят в кДНК и продолжают подготовку библиотеки, как для генома.

Фрагментировать ДНК можно физическими или энзиматическими способами. В ряде случаев, например если стартовым материалом служит микроРНК или короткие продукты ПЦР, этап разрушения не требуется (однако может потребоваться этап отбора фракции фрагментов нужной длины).

Физически ДНК можно разрушить ультразвуком (часто процесс называют соникацией), пропусканием через микроотверстие (небулизацией) (рис. 2.3), гидродинамическим воздействием (гидроширингом) и др. К преимуществам физических методов перед энзиматическими можно отнести хорошую воспроизводимость результатов (стабильный диапазон длин получаемых фрагментов) даже для разного по качеству стартового материала и низкую зависимость от последовательности.

Наиболее распространенными приборами для разрушения ДНК ультразвуком (в рамках технологии NGS) являются приборы фирмы Covaris (рис. 2.4). С их помощью можно проводить разрушение ДНК в диапазоне 200-1500 п. н. К недостаткам оборудования этой фирмы можно отнести высокую стоимость и сравнительно низкую производительность приборов (в случае с моделями М- и S-серий, рассчитанных на один образец).

Гидродинамические фрагментаторы, в частности Hydroshear от Digilab (рис. 2.5), позволяют проводить эффективное разрушение в диапазоне 1-10 т. п. н. и хорошо подходят для конструирования инвертированных библиотек.

Энзиматические методы расщепления ДНК предполагают использование различных эндонуклеаз (наборы реагентов для энзиматического расщепления ДНК во множестве представлены на рынке как производителями платформ для секвенирования, так и биотехнологическими компаниями, предлагающими альтернативные, как правило, более дешевые решения для приготовления библиотек - например, DS Fragmentase от New England Biolabs). Чаще всего для расщепления ДНК используют смеси модифицированных нуклеаз (типа эндонуклеазы Т7 и нуклеазы из Vibrio vulnificus), а также транспозаз.

Постановка ферментативной реакции не требует больших трудозатрат, протокол легко можно оптимизировать под особенности каждого типа разрушаемой ДНК и ожидаемых длин фрагментов в любом диапазоне значений. Оптимизация протокола заключается в подборе периода обработки нуклеазами и температуры реакции: чем короче фрагменты нужно получить, тем дольше проводят реакцию (рис. 2.6).

Следует отметить, что правильно расщепленная ДНК представляет собой набор фрагментов, длина которых распределена по закону Гаусса с максимумом в требуемом диапазоне значений. В случае если ДНК «перерезана» или «недорезана», можно, несмотря на отличные аппаратные показатели секвенирования, при биоинформатическом анализе получить «бедные» данные, так как значительная часть ДНК оказалась вне оптимума размеров.

Некоторые технологии создания библиотек используют отбор фракций нужной длины сразу после расщепления ДНК (чаще - для инвертированных библиотек), другие берут в лигирование весь спектр фрагментов.

К преимуществам ферментативного разрушения ДНК перед физическими методами можно отнести образование однотипных концов необходимой структуры («липких», или «тупых»), по которым и проводится присоединение сиквенсных адаптеров (тогда как физически разрушенная ДНК требует ферментативной «полировки» концов). Заметим, что после каждой ферментативной реакции необходимо проводить очистку от фермента и иных компонентов реакции (спиртовым осаждением ДНК или сорбентными методами), что всегда сопряжено с потерями исследуемого материала.

Наиболее распространенным способом оценки длины фрагментированной ДНК является метод электрофореза в геле. Это может быть как обычный электрофорез в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием, так и готовые аппаратные решения, например с использованием электрофореза в микрокапиллярах на небольшой пластиковой подложке (так называемая лаборатория-на-чипе) (рис. 2.6 и 2.7). Длина фрагментов ДНК, п. н.

Среди встречающихся на отечественном рынке приборов для капиллярного гель-электрофореза можно отметить BioRad Experion и Agilent 2100 Bioanalyzer (рис. 2.8). Эти аналоги проводят высокочувствительный электрофорез в капиллярах о регистрацией ДНК по флуоресцирующему интеркалятору. Преимуществом таких устройств перед обычным электрофорезом в агарозном геле является большая чувствительность (до 1 нг ДНК) и воспроизводимость результатов. Несмотря на довольно высокую стоимость приборов и расходных материалов для автоматического капиллярного гель-электрофореза, можно рекомендовать их использование с целью повышения стабильности работы NGS-лаборатории. Кроме оценки степени разрушения исходной ДНК это же оборудование можно использовать для выявления димеров праймеров и не сработавших адаптеров, а также определения размеров полученной библиотеки.

После получения фрагментов ДНК желаемого размера (путем подбора условий разрушения ДНК или непосредственно отбором оптимальной фракции фрагментов) выполняют лидирование адаптеров, с которых будет осуществляться амплификация библиотеки и ее секвенирование.

Во всех коммерчески доступных технологиях NGS к фрагментам присоединяют два разных адаптера, причем в секвенирование пойдут только фрагменты ДНК, несущие по концам разные адаптеры (фрагменты с одним адаптером не будут амплифицированы из-за эффекта супрессии ПЦР) [6]. В большинстве случаев фрагменты должны иметь «тупые» концы.

На этапе лигирования важно выдержать соотношение между концентрацией адаптеров и фрагментированной ДНК для того, чтобы лигирование прошло эффективно. Косвенным признаком эффективности присоединения адаптеров является количество циклов ПЦР с праймерами, отжигающимися на адаптерах, необходимое для получения детектируемого продукта реакции.

Данный этап требуется в том случае, если количество исходной ДНК гораздо ниже рекомендуемого.

Опасность любой амплификации ДНК in vitro (не важно, методом ПЦР или другими методами) заключается в неизбежном искажении исходной представленности фрагментов. В случае ПЦР искажение происходит вследствие разной эффективности амплификации для разных по длине и последовательности фрагментов ДНК.

Для снижения таких искажений количество циклов при амплификации библиотеки должно быть минимальным (но в любом случае не превышающим 13-15 циклов ПЦР). Большее количество циклов ПЦР для образцов геномной или кДНК ведет к снижению сложности смеси фрагментов ДНК (потере некоторых последовательностей из библиотеки) и значительному искажению результатов секвенирования.

«Сужение» профиля распределения длин фрагментов библиотеки существенно повышает эффективность ее секвенирования (так как более короткие фрагменты в сравнении с оптимальными дают слишком короткие прочтения, а более длинные искажают результаты измерений и подбор соотношений для оптимального сиквенса).

Для отбора нужной фракции библиотеки (size-select) можно использовать как обычный электрофорез в агарозном геле, так и аппаратные решения разных производителей (также на основе гель-электрофореза). Во всех случаях осуществляют разделение библиотеки ДНК в геле вместе с маркером длин (например, с шагом в 50 п. н.) на одной из дорожек, а затем вырезают из геля фракцию нужной длины.

Самым дешевым способом является обычный агарозный гель-электрофорез с вырезанием участка геля при помощи скальпеля с элюцией из него ДНК набором реагентов для экстракции из геля (например, производства «Евроген» или Qiagen) (рис. 2.9). К минусам данного метода можно отнести низкую устойчивость к ошибкам лаборанта и высокую вероятность кросс-контаминации (связанную с многократным использованием камеры для электрофореза, заливочного столика, гребенок и т. д.). Также практика показывает, что качество селектированной таким образом библиотеки оказывается ниже полученной с использованием автоматизированных подходов (см. ниже) (рис. 2.10).

Более предпочтительными для отбора определенной фракции фрагментов ДНК являются специализированные системы, работающие на картриджных гелях, такие как E-gel от Life Technologies Thermo Fisher Scientific или Pippin Prep от Sage Science.

E-gel представляет собой прибор в компактном корпусе, состоящий из источника тока, камеры для картриджа и транслюмминатора. Система позволяет визуализировать гельэлектрофорез непосредственно во время его прохождения. Элюция нужной фракции осуществляется из специальных лунок, расположенных в конце геля, которые исследователь заполняет дистиллятом или трис-ЭДТА буфером (рис. 2.11, а). Всего процедура разделения и элюции занимает около получаса. Pippin Prep - полностью автоматизированный прибор, в котором диапазон нужной фракции задается исследователем на компьютере, правда, стоит эта система существенно дороже (рис. 2.11, б).

Поскольку технологии NGS весьма производительны, часто исследуемый образец не требует столь высокого покрытия и объема данных на выходе, сколько дает NGS-платформа с одного запуска. Для экономии средств можно смешать несколько исследуемых образцов и секвенировать их вместе, в ходе одной процедуры. Если ДНК предварительно пометить образец-специфичными адаптерами (секвенируемыми вместе с уникальной частью фрагментов ДНК), биоинформатический анализ полученных прочтений позволяет разделить данные от разных биологических образцов. Такой подход получил название «штрих-кодирования» (или «бар-кодирования»), по аналогии с широко используемыми в маркировке товаров уникальными метками - штрих-кодами (barcodes).

Пример рационального использования «штрих-кодов» секвенирование экзома человека (который составляет около 1% от гаплоидного генома размером 3 млрд п. н.) на платформе SOLiD 5500, использующей одну проточную камеру с шестью дорожками, с каждой из них получается около 24 млрд п. н. Наносить на одну дорожку с такой производительностью один образец экзома экономически неоправданно. Технологии создания библиотек фрагментов ДНК для NGS 57 Рациональнее пометить уникальным образом несколько разных образцов, смешать их эквимолярно («пулировать») и провести одновременное секвенирование, а результаты разделить уже биоинформатически на основании наличия в каждом прочтении специфичной метки. Метки представляют собой короткие (около 10 п. н.) последовательности, которые также прочитываются в процессе секвенирования (см. рис. 2.1). Их присоединяют к фрагментам ДНК на стадии конструирования библиотеки (при лигировании сиквенсных адаптеров к фрагментам ДНК). Таким образом «штрих-код» представляет собой участок адаптера для секвенирования, расположенный после участка отжига праймера, с которого начинается сиквенс. Как правило, для разных образцов используют один и тот же адаптер 1 (отжигающийся на микросферах для проведения эмульсионной ПЦР), и набор адаптеров 2, отличающихся штрих-кодирующими участками (см. рис. 2.1).

Важным условием проведения хорошего секвенирования для всех образцов, внесенных в одну реакцию, является их эквимолярное смешивание, что обеспечит равномерную представленность прочтений для каждого образца. На это стоит обратить особое внимание: нужно очень аккуратно измерить концентрацию каждой библиотеки перед смешиванием (для этого можно использовать прибор Bioanalizer или ПЦР «в реальном времени» - второй вариант предпочтителен вследствие большей точности).

Ключевым элементом большинства технологий высокопроизводительного секвенирования является одновременная наработка множества разных по последовательности фрагментов ДНК так, чтобы получаемые ампликоны были локализованы вместе (на одной микросфере или в одной точке на поверхности). Существует два метода такого ПЦР-клонирования: мостиковая ПЦР и эмульсионная ПЦР.

Как уже было сказано, большинство технологий NGS недостаточно чувствительны, чтобы регистрировать сигнал от единичной молекулы ДНК, и требуют применения так называемого клонирования in vitro: способа ферментативной наработки отдельных молекул ДНК с получением изолированных друг от друга пулов идентичных фрагментов. Простейшим способом клонирования фрагментов ДНК in vitro может быть обычная ПЦР, приготовленная, например, в 96-, 384- или 1536-луночном планшете так, чтобы в среднем в каждую реакцию попала единственная стартовая молекула ДНК [6]. Таким образом, все наработанные в данной лунке фрагменты будут клонами единственной молекулы (очевидно, что в некоторые лунки попадет две или более стартовых молекул, а в некоторые - ни одной, такие реакции являются неизбежным «браком» методики).

На принципе амплификации фланкированных адаптерами отдельных фрагментов ДНК основано множество молекулярных технологий [4, 7].

Специально, чтобы запутать пользователя и продать ему старый товар под новым соусом, компании постоянно придумывают новые названия давно известным вещам. Так возникли два термина, активно используемых в протоколах NGS, но не обозначающих ничего нового: «paired-end» и «mate-pair libraries». Переведем их так: обычная и инвертированная библиотеки фрагментов ДНК соответственно. Если используемая технология NGS предполагает прочтение каждого фрагмента библиотеки с двух сторон, сущностным отличием этих библиотек является расстояние (по исходной ДНК) между получаемыми в результате секвенирования одного фрагмента последовательностями (если для обычной библиотеки это расстояние соответствует физической длине фрагмента и, как правило, не превышает 2-3 т. п. н., то для инвертированной библиотеки это могут быть и десятки тысяч пар нуклеотидов). 2.10.1. Обычная (paired-end) библиотека фрагментов ДНК для NGS Технология создания обычной, фланкированной разными адаптерами заданной структуры, библиотеки фрагментов ДНК известна давно. Такие библиотеки уже более 20 лет используют для амплификации к ДНК, вычитающей гибридизации геномов, дифференциального дисплея и т. п. [4, 6, 7, 11]. Принцип создания обычной библиотеки с разными адаптерами по концам прост: надо расщепить ДНК на фрагменты требуемой длины и пришить по концам фрагментов разные по последовательности адаптеры (самый простой способ - использовать так называемые псевдо-двуцепочечные супрессионные адаптеры [6].

Этапы создания обычной библиотеки фрагментов ДНК для NGS показаны на рис. 2.13 и включают:

В процессе секвенирования обычная библиотека может быть прочитана как в одном направлении, так и в обоих. Платформы на технологиях Ion Torrent и 454 Life Sciences в настоящее время позволяют проводить только однонаправленное секвенирование фрагментов (с дистального по отношению к микросфере адаптера). Для Ion Torrent показана возможность по окончании сиквенса в одном направлении провести денатурацию библиотеки ДНК прямо в чипе и «смыть» синтезированную фракцию ДНК, а затем провести секвенирование тех же фрагментов, расположенных в тех же микрореакторах, в противоположном направлении, однако на рынке она пока не появилась.

Технологии Illumina и SOLiD позволяют осуществлять секвенирование фрагмента с двух сторон. После прочтения с одного из адаптеров проводят чтение в обратном направлении (с праймера, комплементарного адаптеру на противоположном конце). Чтение с двух сторон хорошо тем, что это позволяет значительно повысить объем данных с одной библиотеки и, в случае перекрывания прочтений, - их общую длину (а при отсутствии перекрывания дает примерное расположение прочтений друг относительно друга). Заметим, что качество сигнала быстро падает от начала секвенирования к концу фрагмента, так что прочтение короткого фрагмента с двух сторон насквозь позволяет компенсировать низкое качество прочтения «на излете».

Основанная на принципе пиросеквенирования платформа 454 Life Sciences [1, 2], пожалуй, является первой широкодоступной технологией секвенирования второго поколения, на базе которой в 2005 году был представлен первый коммерчески доступный автоматический секвенатор. Название технологии возникло из номера проекта в компании CuraGen Corporation и не несет какого-то скрытого смысла. Разработавшее технологию подразделение компании CuraGen Corporation в 2007 году было приобретено компанией Roche Diagnostics.

В настоящее время Roche Diagnostics предлагает две базирующиеся на технологии 454 Life Sciences модели секвенаторов: Genome Sequencer FLX+ и Genome Sequencer J unior (рис. 3.1). Первый прибор позволяет получать до 1 млн прочтений с длиной до 800-1000 п. н., второй - до 100 000 прочтений с длиной 600-800 п. н. В 2014 году производитель обещает достичь длины прочтения на обоих приборах в 1000 п. н. Длина прочтения и довольно высокое его качество - важнейшее преимущество 454 Life Sciences по сравнению с технологиями-конкурентами (не считая гораздо менее распространенных PacBio RS). Она сравнима по длине прочтения с методом Сенгера и позволяет довольно просто решать некоторые специфические задачи, например определение гаплотипов HLA при скрининговых исследованиях или метагеномные исследования микробиомов на основе анализа гена 16S рибосомальной РНК.

Подготовку образцов проводят стандартным способом: исследуемый образец ДНК расщепляют (например, пропусканием через небольшое отверстия под высоким давлением газа (азота) - методика небулизации). Затем к полученным фрагментам (длиной около 1000 п. н.) присоединяют разные по последовательности адаптеры и проводят клональную наработку фрагментов ДНК (методом эмульсионной ПЦР, см. разд. 2.9.2). Полученные сферы с однотипными молекулами ДНК помещают в матрицу с микрореакторами так, что в каждую ячейку попадает только одна сфера (рис. 3.2, а; см. также рис. 1.9). Матрицу размещают в секвенаторе, где осуществляется последовательная подача всех четырех типов нуклеотидов и детекция уровня экстинкции света от каждой пиколитровой ячейки с расположенной в ней микросферой (рис. 3.2,6). Свет передается по световоду к ПЗС-матрице (по сути, как у цифрового фотоаппарата). Несмотря на то что время осуществления всей последовательности химических реакций измеряется долями секунды, общее время одного цикла (добавление нуклеотида, каскад химических реакций, детекция света, обработка апиразой для удаления остатков дНТФ) лимитируется скоростью доставки реактивов до каждой отдельной пиколитровой ячейки и составляет уже минуты, что с учетом числа циклов дает в итоге порядка 10 ч работы.

Как и технология Ion Torrent, 454 Life Sciences имеет проблемы с прочтением гомополимеров. Дела тут обстоят чуть лучше, но все же 8-10 повторяющихся нуклеотидов приводят к ошибке в подсчете точного числа оснований в повторе.

Несмотря на статус пионера и отставание от конкурентов по производительности и стоимости определения одного нуклеотида, технология 454 Life Sciences лучше других подходит в тех случаях, когда важна длина одного прочтения. Ио сути, это аналог капиллярных секвенаторов, но на порядки более производительный.

С 2016 года Roche снимает с производства секвенаторы на основе технологии 454 Life Sciences и делает ставку на технологии третьего поколения (в частности, на совместные разработки с Pacific Biosciences, см. разд. 3.5).

Технология SOLiD (sequencing by oligonucleotide ligation and detection - секвенирование с помощью лигирования и д&текции олигонуклеотидов) основана на методе, разработанном исследователями Гарвардского университета, США [3]. В настоящее время она принадлежит компании Thermo Fisher Scientific. Сейчас компания предлагает платформу SOLiD в двух вариантах: SOLiD 5500 (на один чип) и SOLiD 5500x1 (на два чипа) (рис. 3.3). Также существует версия SOLiD 5500 Wildfire, в которой вместо эмульсионной ПЦР для клональной амплификации применяется мостиковая ПЦР, однако эта платформа не получила широкого распространения.

В отличие от большинства других платформ технология SOLiD использует принцип секвенирования с помощью лигирования (без применения ДНК-полимеразы). Это позволяет «читать» одну и ту же цепь ДНК в любом направлении (тогда как методы на основе ДНК-полимераз могут «читать» только в направлении растущего 3'-конца затравки).

Подготовка библиотек аналогична таковой в технологии 454 Life Sciences. Методом эмульсионной ПЦР (см. разд. 2.9.2) создают иммобилизованную на микрочастицах библиотеку фрагментов ДНК (так, что каждая микрочастица несет множество одинаковых фрагментов ДНК). Микрочастицы впрыскивают в плоскую прозрачную камеру (наподобие расположенных на расстоянии нескольких микрометров двух предметных стекол) так, чтобы микрочастицы монослоем распределились между стеклами (такую камеру называют проточной - flow cell или flow chip - поскольку с одной стороны в нее можно впрыскивать реагент, с другой стороны он вытекает (рис. 3.4, а).

Метод секвенирования лигированием по технологии SOLiD основан на использовании флуоресцентно-меченых (с помощью четырех красителей) октамерных олигонуклеотидов (проб), у которых специфичны только два основания с 3'-конца, остальные позиции вырождены. Таким образом, всего существует 16 типов проб, по 4 каждого цвета (см. рис. 1.8).

Секвенирование начинается с отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем в проточную ячейку добавляют все 16 типов проб, которые находят себе места посадки на фрагментах ДНК по принципу комплементарности. После отжига проб лигаза зашивает разрыв между пробой и праймером (в том случае, если проба отожглась вплотную к праймеру). Несвязавшиеся пробы смывают, а у связавшихся прибор детектирует флуоресценцию.

Затем три 5'-концевых нуклеотида пробы вместе с флуорофорами химически отсоединяются и удаляются из проточной ячейки, оставляя только часть с известным динуклеотидом и тремя случайными основаниями, а на 5'-конце появляется место для присоединения новой пробы. По прошествии 10-15 последовательных лигирований производится так называемая перезагрузка праймера - новосинтезированная цепь отплавляется от матрицы, а на ней отжигается праймер, отличающийся по длине от первого на один нуклеотид. Таких перезагрузок праймеров проводят 4, что приводит к гарантированному прочтению каждого основания исходной матрицы два раза в разных пробах. Технология SOLiD является довольно производительной (до 300 Гбайт данных за один запуск автоматического секвенатора), но сильно уступает по длине прочтения Illumina (75 нуклеотидов у SOLiD против 250 у Illumina).

Из-за высокой стоимости секвенирования, сложности и длительности процедур, в настоящее время технология SOLiD не привлекает особого интереса, и можно прогнозировать ее скорый уход с рынка.

Первоначально технология секвенирования синтезом была разработана Баласубраманяном и Кленерманом в Кембриджском университете в 1998 году [4]. В том же году они основали компанию Solexa с целью коммерциализации метода секвенирования. В 2004 году компания Solexa приобрела компанию Manteia Predictive Medicine, среди прочего для того, чтобы получить более мощную технологию параллельного секвенирования на основе ДНК-колоний (получаемых с использованием клональной амплификации ДНК на поверхности). В этом способе праймеры прикреплены к подложке, а отжигающиеся на них молекулы ДНК нарабатываются полимеразой. В результате мостиковой ПЦР образуются ДНК-колонии или колонии ДНК (см. разд. 2.9.1, рис. 2.12).

В 2006 году Solexa выпустила свой первый коммерческий Genome Analyzer. Машина давала 1 млрд п. н. за один запуск (~4 дня работы прибора) [5]. В 2007 году компания Illumina приобрела Solexa, и в 2011 году был выпущен обновленный вариант секвенатора - HiSeq 2500, дающий 200 Гбайт данных за один запуск (по 25 Гбайт в день). Прибор позволяет делать парные прочтения (2х100 п. н.) или чтение с одной стороны (рис. 3.5, а).

В 2012 году Illumina выпустила на рынок секвенатор MiSeq с пониженной частотой ошибок, что позволяет выполнять более длинные прочтения (до 250 п. н.). Прибор позиционируется для небольших научно-исследовательских или клинических лабораторий, так как позволяет за относительно небольшие деньги (если иметь в виду стоимость запуска прибора, а не стоимость прочтения миллиона пар нуклеотидов) секвенировать экзом человека (рис. 3.5, в). В 2014 году вышел средний по производительности NextSeq 500. Результаты прочтения на секвенаторах Illumina обычно имеют средний процент ошибок < 1%.

Библиотеку фрагментов для всех трех аппаратов готовят на основе мостиковой ПЦР. Секвенирование на аппаратах от Illumina осуществляется с использованием четырех меченых разными флуорофорами нуклеотидов, 3'-конец которых заблокирован (так называемых обратимых терминаторов), что не позволяет включать ДНК-полимеразе в синтезируемую цепь более одного основания за цикл (рис. 3.6).

Каждый цикл состоит из следующих этапов (см. рис. 1.10):

Последовательность операций для приборов HiSeq, NextSeq и MiSeq одинакова.

Платформа Illumina выгодно отличается от конкурентов более простой методикой подготовки библиотек ДНК к секвенированию (так как лишена этапов, связанных с проведением эмульсионной ПЦР), а также возможностью получать прочтения до 250 п. н., причем с двух сторон.

В начале 2010 года компанией Ion Torrent Systems Inc. была представлена технологическая платформа, разработанная по лицензии DNA Electronics Ltd. и основанная на принципе регистрации изменения проводимости среды за счет появляющихся в результате акта присоединения нуклеотида протонов. Первый полупроводниковый секвенатор, Ion PGM - Personal Genome Mashine (рис. 3.7, a) - был представлен Ion Torrent Inc. в 2010 году (в настоящее время вся технология принадлежит компании Life Technologies, в феврале 2014 года приобретенной Thermo Fisher Scientific). В 2012 году на рынке появился усовершенствованный (более мощный) аппарат Ion Proton, работающий на том же принципе (рис. 3.7, б).

Основы технологии полупроводникового секвенирования описаны в разд. 1.1.8, поэтому здесь мы остановимся на практических особенностях реагентной и приборной базы данной технологической платформы.

Подготовка образцов для Ion PGM и Ion Proton является стандартной: исследуемый образец ДНК расщепляют любым способом до фрагментов длиной 100-500 п. н. в зависимости от используемого типа реагентов для секвенирования (см. ниже). Затем к полученным фрагментам присоединяют разные по последовательности адаптеры и проводят клональную наработку фрагментов ДНК (методом эмульсионной ПЦР): фрагменты амплифицируют на ISP-сферах (ion sphere particles), на которых закреплены комплементарные одному из адаптеров праймеры. Как было сказано выше, для эмульсионной ПЦР важнейшим условием является соблюдение соотношения концентрации сфер и фрагментов ДНК - в случае избытка фрагментов в один микрореактор эмульсионной ПЦР попадет более чем один фрагмент ДНК, тем самым сфера окажется поликлональной и даст множественный сигнал. При малом количестве фрагментов падает выход сработавших микросфер, «облепленных» фрагментами ДНК, и секвенирование не даст ожидаемого количества данных (см. разд. 2.9.2).

В настоящее время эмульсионную ПЦР для платформ Ion PGM Torrent и Ion Proton можно проводить в автоматическом режиме с помощью приборов серии OneTouch (рис. 3.8). Приборы OneTouch сконструированы таким образом, что их «заряжают» реактивами на несколько запусков одного типа: например, набор реагентов для эмульсионной ПЦР от Ion Proton рассчитан на проведение 8 реакций. Технологически возможен переход с одного типа реагентов на другой (например, если в лаборатории имеется еще и Ion PGM) и для этой процедуры разработан специальный протокол. Однако ее проведение сопряжено с некоторыми потерями масла и recovery-реагента, что при частых переходах приведет к тому, что пользователю не хватит набора на обещанные 8 реакций. Поэтому логичным видится планирование работ, при котором последовательно будет проводиться эмульсионная ПЦР одного типа (на одинаковых реагентах).

В 2013 году появилась полностью автоматизированная система пробоподготовки - Ion Chef, выполняющая эмульсионную ПЦР, обогащение и загрузку чипа в автоматическом режиме.

Но покупка такой станции оправдана только в высокопроизводительных лабораториях, где работа секвенаторов осуществляется в непрерывном режиме. Стоит отметить, что Life Technologies Termo Fisher Scientific ведет разработку технологии амплификации библиотеки для платформ Ion PGM и Ion Proton без использования эмульсионной ПЦР, по-видимому, идеологически сходной с мостиковой ПЦР, используемой в Технологии Illumina. В настоящее время для Ion PGM поставляются реагенты, обеспечивающие длину прочтения в 200 или 400 нуклеотидов. Регулировать длину прочтения можно в ручном режиме, и практика показывает, что на тех же реагентах можно добиться прочтений в 250 и 440 п. н. с достаточно хорошим качеством чтения последних 50 нуклеотидов. Также для PGM предлагаются три варианта чипов: 314, 316 и 318, имеющие 1,2, 6,2 и 11,1 млн пикселей (ячеек, в которые загружаются обогащенные микросферы), соответственно, обеспечивающие приблизительно 3-5-кратное увеличение масштаба получаемых данных. К примеру, на чипе 318 с реагентами для прочтения 400 п. н. можно получить порядка 3 млрд п. н. необработанных данных.

Напомним, что чип для полупроводникового секвенирования представляет собой матрицу из микрореакторов, размер которых таков, что в один реактор может поместиться только одна ISP-сфера с прикрепленными к ней (одинаковыми) молекулами ДНК (см. рис. 1.11). Такая частица несет на себе несколько миллионов одинаковых (клонированных) ДНК единственной исходной молекулы. Каждый микрореактор расположен над ISFET-сенсором (ISFET - ion sensitive field-effect transistor, канальный транзистор измерения концентрации ионов), передающим сигнал от возникающих ионов водорода в программу, переводящую его в последовательность нуклеотидов.

Полупроводниковые микрочипы обладают гораздо большим разрешением в сравнении с оптическими системами детекции: самый «слабый» чип, 314, на первом полупроводниковом приборе Ion PGM имеет разрешение в 1,2 млн микрореакторов, а чип PI у следующей версии данной технологии - Ion Proton, незначительно отличающийся от чипа 314 размерами, несет уже около 150 млн микрореакторов. Производитель анонсирует выпуск реагентов для прочтений в 600 п. н., что существенно расширит спектр применения PGM.

Важным преимуществом полупроводникового секвенирования, помимо достаточно простой и дешевой реагентной составляющей, является скорость: один цикл реакции, включающий введение раствора нуклеотида, включение комплементарных нуклеотидов, измерение сигнала и очистку чипа от несвязавшихся молекул нуклеотида, занимает всего несколько секунд (а время прохождения секвенирования - всего несколько часов). К примеру, секвенирование 200 п. н. на чипе 318 осуществляется в течение 4 ч и на выходе дает более 1 млрд п. н. данных. Детекция сигнала происходит сразу в виде цифрового значения, т. е. не требуется анализировать изображение, полученное с микроскопа.

Для присутствующего на рынке с 2012 года более производительного варианта - Ion Proton - пока выпускаются только чипы PI в 150 мегапикселей, а реагенты доступны с длиной прочтения до 200 п. н. Таким образом, производительность Proton сейчас достигает 10-12 млрд п. н. за запуск. В 2014 году должны появиться чипы следующего масштаба, PII, которые, по-видимому, обеспечат 3-5-кратное увеличение производительности прибора. Пробоподготовка для Ion Proton такая же, как и на Ion PGM.

Проблемой полупроводникового секвенирования остается чтение гомополимеров: если во фрагменте встречается повтор из более чем пяти одинаковых оснований, выделяемое количество протонов не позволяет точно определить число нуклеотидов, и результаты чтения оснований после гомополимера отбраковываются («тримминг») программным обеспечением прибора. Кроме того технология Ion Torrent крайне чувствительна к качеству воды, из которой готовят рабочие буферы. mQ-Вода на открытом воздухе быстро теряет качество из-за растворения в ней диоксида углерода, этого буфера может быть вполне достаточно для снижения чувствительности прибора при секвенировании, поэтому в непосредственной близости от секвенатора должен располагаться источник mQ-воды.

Заметим, что система подачи реактивов в PGM и Proton пневматическая и работает на инертных газах (аргон или азот), поэтому, несмотря на его настольный формат, следует иметь в виду, что рядом с секвенатором должен располагаться баллон высокого давления, по правилам хранящийся в специальном металлическом шкафу. Также оператор PGM обязан иметь сертификаты, удостоверяющие его навыки работы с газобаллонным оборудованием.

Технологии секвенирования одиночных молекул только начинают выходить на рынок, но им можно прочить большое будущее. Недаром некоторые авторы называют методы, основанные на прочтении единичных молекул нуклеиновых кислот, методами секвенирования третьего поколения (в сравнении с технологиями второго поколения, перечисленными выше).

Pacific Biosciences - один из поставщиков оборудования и реагентов для секвенирования отдельных молекул ДНК. Компания была создана в 2004 году на базе лабораторий Корнелльского университета США, а в 2011 году выпустила свой первый коммерчески доступный секвенатор PacBio RS. Весной 2013 года вышла вторая версия прибора - PacBio RSII (рис. 3.9). На начало 2014 года в мире установлено порядка 80 таких устройств.

В данный момент это нишевый прибор, используемый в качестве дополнительного устройства к приборам Illumina или Ion Torrent.

Технология секвенирования PacBio базируется на принципах ближнего (эванесцентного) поля - апертура имеет размер порядка нескольких нанометров. Фактически такое устройство представляет собой совокупность тысяч флуоресцентных микроскопов. Метод получил название SMRT (single molecule real time) - секвенирование одиночных молекул «в реальном времени», и относится к классу «секвенирования синтезом», т. е. с использованием ДНК-полимеразы.

В основе метода SMRT лежит разработанная основателями компании технология оптической детекции включения отдельных флуоресцентно-меченых нуклеотидов в строящуюся цепь молекулы ДНК. По сути, в чипе для секвенирования проделаны сверхмалые рабочие камеры (zero-mode waveguides ZMW), на дне которых закреплена молекула ДНК-полимеразы ф29. При синтезе цепи ДНК происходит включение нуклеотидов по принципу комплементарности. Каждый нуклеотид мечен своим флуорофором, отсоединяющимся от основания при образовании фосфодиэфирной связи (в этот момент прибор фиксирует флуоресценцию отделенной единичной молекулы флуорофора, а также длительность испускания света).

Основным преимуществом технологии SMRT является огромная длина прочтений: в среднем сейчас она составляет 8500 п. н., причем некоторые прочтения достигают длины в 30 т. п. н. Производитель утверждает, что в перспективе по этой технологии он сможет добиться длины прочтения в 70 т. п. н. Очевидно, что биоинформатический анализ массивов данных такого уровня с легкостью позволяет прочитать многие проблемные для других платформ участки генома - к примеру, тандемные повторы. Также анализ кинетики включения нуклеотидов в строящуюся цепь, по заявлению разработчиков, позволяет проводить прямой анализ уровня метилирования геномов.

К недостаткам PacBio (во всяком случае, PacBio RS) стоит отнести низкую точность прочтения отдельных оснований. До недавнего времени для качественного секвенирования результаты PacBio приходилось в обязательном порядке объединять с результатами по тому же эксперименту, полученными на другой платформе. Возможно, новая версия прибора и реагентов для него решит этот вопрос, что станет понятно после появления публикаций от независимых коллективов. Также к минусам PacBio можно отнести громоздкость прибора - он весит более тонны.

Насколько известно авторам, в России пока нет секвенаторов от Pacific Biosciences.

Еще одна технология секвенирования отдельных молекул представлена компанией Helicos Biosciences. Компания была основана в 2003 году (в настоящее время является банкротом и не ведет деятельности). В 2008 году компания выпустила прибор HeliScope (рис.3.10), который на то время обладал выдающимися характеристиками и являлся первым аппаратом, проводящим секвенирование одиночных молекул по технологии tSMS (true single molecule sequencing, истинное секвенирование отдельных молекул), т. е. без предварительной аплификации ДНК.

Технология HeliScope похожа на технологию Illumina. Определение последовательности нуклеиновой кислоты осноКоммерческие технологии NGS 81 вано на регистрации флуоресцентного сигнала при присоединении нуклеотида. Единственное серьезное отличие от Illumina состоит в том, что на чипе Helicos не требуется амплификация. Отдельные фрагменты из библиотеки присоединяются к поверхности без мостиковой амплификации. Фрагменты ДНК распределяются таким образом, чтобы в один пиксель матрицы попадало не более одной молекулы, чтобы можно было зарегистрировать единичный сигнал.

Для секвенирования фрагментированную ДНК модифицируют с 3'-конца добавлением участка поли-А, чтобы матрица (денатурированная, в виде одноцепочечных фрагментов) могла отжечься на иммобилизованных на подложке праймерах (олиго-dT). Секвенирование осуществляется с помощью ДНК-полимеразы и четырех флуоресцентно-меченых нуклеотидов, которые добавляются в реакцию последовательно в течение одного цикла секвенирования. Детекция сигнала флуоресценции от отдельных нуклеотидов осуществляется в конце каждого цикла с помощью четырех лазеров и системы, сходной с конфокальным микроскопом. Так как молекулы ДНК неподвижны на чипе для секвенирования, в процессе секвенирования получается набор изображений, на которых имеются (в случае включения соответствующего нуклеотида) яркие точки - флуорофоры, излучающие свет под воздействием лазера. Сопоставляя сигнал на изображении с координатами точек, программное обеспечение Helicos определяет последовательность отсеквенированных нуклеотидов для каждого из фрагментов матрицы. Максимальная длина прочтения у Helicos составляет 55 нуклеотидов и не имеет блестящей точности, что связано в первую очередь с высоким уровнем шума.

На начало 2014 года в мире установлено лишь около 20 приборов. Насколько известно авторам, в России нет секвенаторов Heliscope.

В табл. 3.1 приведены показатели производительности, цена и ключевые параметры технологии для присутствующих на рынке платформ NGS.

Как уже было сказано в главе 3, приборы для определения последовательности ДНК (автоматические секвенаторы) в процессе работы считывают некоторый сигнал, соответствующий определенному нуклеотиду в последовательности ДНК: электрический (технология полупроводникового секвенирования) или оптический (большинство других технологий NGS). Исследователь же в большинстве случаев имеет дело с уже обработанными данными в виде последовательности букв А, Т, G, С и приписанных каждой букве значений, соответствующих достоверности полученного результата. Прибор сохраняет результаты в файл определенного формата. Наиболее распространенные форматы файлов приведены в табл. 4.1.

Рассмотрим организацию файла с данными на примере наиболее распространенного формата секвенирования FASTQ. Для каждого прочтения (последовательности) запись в формате FASTQ состоит из четырех строк:

Первая строка начинается со знака @, в ней записывается имя последовательности (иногда информация о ее длине). Вторая строка - это сама последовательность. Третья строка начинается со знака +, изначально в ней повторялось название последовательности, но сейчас она чаще всего не содержит ничего, кроме «+». В четвертой строке записана информация о качестве прочтения каждого нуклеотида [1]. Обычно для записи информации о качестве прочтения используют значение Phred, определяемое по формуле:

где Q - значение Phred, Р - вероятность ошибки.

Таким образом, Q = 10 означает, что вероятность ошибки в данной позиции составляет 10%, Q = 20 соответствует 1% и т. д.

Изначально такая оценка качества данных секвенирования была введена для автоматизации обработки данных секвенирования по методу Сенгера (см. разд. 1.1.2). Она основывалась на форме пиков и расстоянии между ними. Расчет вероятности ошибки производили на основании данных секвенирования известной последовательности [2, 3]. Пример такой хроматограммы приведен на рис. 1.5. Для каждого типа приборов калибровку проводит производитель по собственной технологии. В случае NGS используют иные параметры сигнала, однако общий принцип калибровки остается тем же.

Значение Q - число, но для экономии места удобно записывать каждое значение Q в виде символа. Чтобы файл был читаем для человека, были выбраны печатаемые символы кодировки ASCII. Для данных сенгеровского секвенирования исторически использовали значения от 0 до 93 и символы с 33-го по 126-й:

В 2004 году компания Solexa для своих данных предложила несколько иной метод расчета значения Q:

Для записи значений от -5 до 62 были выбраны символы с 59-го по 126-й, но обычно качество прочтения отдельной буквы не превышает 40. Изначально для Illumina использовался формат Solexa, но, начиная с версии программного обеспечения 1.3, Illumina перешла на расчет значения phred Q, при этом для сохранения совместимости с предыдущими данными Solexa, для значений Q от 0 до 62, были выбраны символы с 64-го. Начиная с версии 1.8 Illumina снова стала использовать первый формат записи, когда значению 0 соответствует 33-й символ кодировки ASCII, однако значения, превышающие 40, невозможны. Для записи оценки качества данных технологии Ion Torrent (приборы Ion PGM, Ion Proton) используют такой же формат, как и для последних версий Illumina.

Технологии SOLiD и 454 Life Sciences используют другие методы оценки качества, совместимые со специально разработанными для этих приборов программами для картирования, сборки и поиска вариаций. При необходимости можно воспользоваться доступными в Интернете скриптами^[1] и перевести данные о качестве прочтений из специальных форматов в формат FASTQ.

К сожалению, в настоящее время ни одна из технологий секвенирования не позволяет определять последовательность генома непрерывно на протяжении многих миллионов пар геномной ДНК. Все технологии предполагают фрагментирование ДНК (см. гл. 2) и дают в результате сравнительно короткие, но перекрывающиеся участки последовательности (длиной 50-1000 п. н.). Поэтому в случае определения генома какого-либо организма впервые возникает необходимость его сборки - определения полной последовательности по огромному набору фрагментов [4].

При сборке генома исследователь обычно имеет дело с большим количеством коротких последовательностей (прочтений), случайным образом соответствующих исходной ДНК, причем для возможности сборки из коротких перекрывающихся фрагментов более протяженных регионов (в идеале целых хромосом), суммарная длина этих фрагментов должна в несколько раз превышать длину исследуемого генома. Чем больше превышение (покрытие), тем более длинные последовательности можно составить. Необходимую суммарную длину коротких прочтений, достаточную для получения определенного процента собранного генома (так называемую степень покрытия секвенирования или покрытие генома), можно оценить с помощью уравнения Ландера-Ватермана (LanderWaterman model), которое базируется на предположении, что фрагменты случайно распределены по геному (т. е. подчиняются распределению Пуассона). В соответствии с уравнением Ландера-Ватермана вероятность того, что нуклеотид не будет определен, равна:

где с = NL_R / L_G - степень покрытия, здесь N - число прочтений, L_R - длина прочтения, L_G - длина генома.

В табл. 4.2 приведена доля пропущенных нуклеотидов и их число для генома человека (3 млрд п. н.) в зависимости от степени покрытия секвенирования (с). Видно, что при с — 5 будет определено 99% генома, однако около 20 млн нуклеотидов будут пропущены, при с = 22 теоретически будет определена почти вся последовательность генома.

Целью сборки является получение минимального числа контигов максимальной длины.

В настоящее время для сборки протяженных регионов из сравнительно коротких последовательностей нуклеотидов (прочтений) используют два основных алгоритма [5].

Первый из алгоритмов был предложен в 1980 году [6] и получил название OLC (overlap-layout-consensus - перекрытие-расположение-согласованность). Это интуитивно понятный алгоритм, в котором сначала проводят попарное сравнение и выравнивание всех прочтений, после чего строится граф, где узлами являются прочтения, и если перекрытие между прочтениями оказывается не меньше, чем заданная величина Г, узлам приписывается связь. Число узлов графа равно числу прочтений, и оно линейно растет с увеличением глубины секвенирования, число связей при этом возрастает по логарифмическому закону.

При использовании алгоритма OLC можно оценить число контигов (непрерывных последовательностей, собранных из перекрывающихся между собой отдельных прочтений) по формуле:

где с = NL_R / L_G - глубина секвенирования, N - число прочтений, L_R - длина прочтения, L_G - длина генома, Т - минимальное перекрытие, - вероятность для прочтения оказаться крайним правым в контиге [7].

Из формулы видно, что число контигов зависит от количества и длины прочтений, длины генома и минимального перекрытия, которое считается приемлемым. Если зафиксировать длину необходимого перекрытия прочтений и построить график зависимости числа контигов от глубины секвенирования для разной длины прочтения (рис. 4.1), можно заметить, что для получения с помощью фрагментов длиной 50 п. н. такого же числа контигов, что и для 10-кратного покрытия фрагментами по 500 п. н., необходимо 30-кратное покрытие.

Этот алгоритм используется во многих широко распространенных программах, таких как: Arachne [8], Celera Assembler, САРЗ [9], Phrap [10], Phusion [11], Newbler и т. п.

Второй алгоритм основан на использовании графов де Брёйна (de-bruijn-graph) и на первый взгляд не так очевиден. Все прочтения разбивают на более короткие участки одинаковой длины k, которые являются узлами в графе, тогда как ребрами являются k + 1-меры. На рис. 4.2 представлен пример графа для k = 2 (указаны последовательности, соответствующие ребрам графа).

В идеальном случае, когда каждый k-мер встречается в геноме только один раз, количество узлов графа будет примерно равно длине генома (L_G - k + 1), число связей (L_G - k) тоже почти равно длине генома. Однако на практике так не бывает, поскольку в геноме всегда присутствуют повторяющиеся последовательности, и кроме того - ошибки секвенирования, ведущие к появлению дополнительных связей.

Число контигов в данном алгоритме можно оценить по аналогии с числом контигов для модели Ландера-Ватермана. Считая, что минимальная величина перекрытия равна k, число контигов можно оценить по формуле:

где d_k = N(L_R - К + 1) / L_G , N - число прочтений, L_R - длина прочтения, L_G - длина генома, К - длина k-мера.

Этот алгоритм был предложен в 1995 году, а первый основанный на этом алгоритме программный продукт был представлен в 2001 году [12]. Вначале, при работе с данными секвенирования методом Сенгера, этот алгоритм был непопулярен, но с появлением технологий высокопроизводительного секвенирования он оказался крайне востребован и в настоящее время используется в программах Euler-USR [13], Velvet [14]), ABySS [15], AllPath-LG [16] and SOAPdenovo [17]. Сначала алгоритм на основе графов де Брёйна плохо справлялся со сборкой больших геномов, и его применяли в основном для сборки геномов прокариот. Однако программное обеспечение и аппаратная база совершенствовались, и в настоящее время разработано несколько основанных на графах де Брёйна программных продуктов, позволяющих собирать большие геномы эукариот [18, 19].

Из-за меньших требований к объему оперативной памяти ЭВМ (в сравнении с программным обеспечением на основе алгоритма OLC) и отсутствия вычислительно затратного этапа выравнивания программы, основанные на графах де Брёйна, часто оказываются даже более эффективны для сборки геномов из большого количества коротких прочтений.

К сожалению, на практике исследователь всегда имеет дело с данными, в которых присутствуют ошибки секвенирования, существенно усложняющие и без того непростую задачу по сборке de novo. Для частичного устранения ошибок секвенирования полученные данные предварительно обрабатывают. Выше уже было сказано, что, помимо последовательности нуклеотидов, приборы для секвенирования выдают данные о качестве прочтения каждой буквы. Отбрасывая данные, имеющие низкое качество, можно значительно сократить количество ошибок. Большинство программ для сборки геномов позволяют проводить такую фильтрацию, для тех же, где она не предусмотрена, желательно провести ее самостоятельно перед сборкой.

Тем не менее даже после фильтрации часть ошибок секвенирования все равно остается. Для программ, работающих на базе алгоритма OLC, эта проблема решается сравнительно просто: можно «разрешить» алгоритму допускать 1-2 несовпадающих основания при выравнивании и определить наличие ошибок секвенирования на основании вероятностной модели, полагая, что правильные прочтения встречаются значительно чаще, чем неправильные. Для алгоритма де Брёйна из-за ошибок секвенирования возникают новые пути, усложняющие работу программы, но, поскольку ошибки секвенирования все-таки сравнительно редки, возможен их поиск и исправление на основании частоты встречаемости А-меров.

Кроме ошибок секвенирования существует еще одна распространенная проблема - повторяющиеся последовательности, присутствующие в любом геноме. Проблемой являются повторы, превышающие длину одного прочтения для использованной технологии NGS. На рис. 4.3 изображено представление повторов для разных алгоритмов сборки. Для алгоритма OLC прочтения, относящиеся к повторяющимся участкам генома, соответственно будут выравниваться с большим числом прочтений, что требует существенного увеличения необходимого объема аппаратной памяти для хранения информации о связях. Поэтому для программного обеспечения на базе алгоритмов OLC повторяющиеся элементы обычно исключают из сборки. С увеличением длины прочтения и заданной величины перекрытия количество повторов, не поддающихся сборке, падает.

В случае использования графов де Брёйна повторяющиеся k-меры собираются («схлопываются») в один узел и вычислительная сложность не увеличивается. Однако при этом увеличение длины прочтения почти не дает дополнительных преимуществ, поскольку последовательности в любом случае разбиваются на k-меры, длина которых, как правило, не превышает 31 п. н. (иногда до 127 п. н.). С увеличением длины k-меров быстро возрастает потребность в вычислительных ресурсах, и при использовании более длинных k-меров становится сложнее обнаружить участки гетерозиготности и ошибки секвенирования, что снижает качество сборки.

Таким образом, основная задача при использовании программного обеспечения для сборки длинных регионов из коротких прочтений заключается в поиске непрерывного пути обхода графа без ветвлений с остановкой на границе региона с повторяющейся последовательностью нуклеотидов. Последовательности, получившиеся в результате такого непрерывного обхода, называют контигами.

Поскольку длина одного прочтения (и, как следствие, максимальная длина региона с повторяющимся мотивом, который можно прочесть насквозь) ограничена технологически, для дальнейшего объединения контигов в скэффолды (системы правильно расположенных друг относительно друга, но разъединенных неизвестными регионами контигов) используют инвертированные библиотеки со вставками различных размеров (см. главу 2) и/или чтением фрагментов с двух сторон (парно-концевое прочтение библиотеки). Если из сцепленной пары прочтений одно прочтение выравнивается на один контиг, а прочтение с другой стороны фрагмента - на другой, то, зная примерное расстояние между прочтениями (по средней длине фрагментов приготовленной библиотеки), можно предположить, как расположены контиги друг относительно друга (рис. 4.5, а). Проблемы возникают с контигами, содержащими повторы или встречающимися в геноме более одного раза. Обычно такие контиги отличаются по величине покрытия и распознаются программами для сборки как повторяющиеся. Еще одна возможная сложность - чередование контигов (рис. 4.5, б). Такие контиги можно правильно расположить, используя для NGS библиотеку с меньшим размером фрагментов ДНК.

Многие современные программы для сборки последовательностей, такие как Velvet [14], ABySS [15], SOAP [17], ALLPATHS-LG [16], позволяют учитывать информацию, полученную от парно-концевых прочтений и эффективно собирать контиги в скэффолды. При использовании программного обеспечения без этой функции можно воспользоваться отдельными программами для выстраивания контигов в скэффолды на основании данных парно-концевых прочтений, например: SSPACE [22], Bambus [23], GRASS [24] и др.

Помимо инвертированных библиотек, прочитанных с двух сторон, информацию о расположении контигов в геноме можно получить и на основании сравнения с уже собранными геномами генетически близких видов, однако нужно помнить, что такие допущения необходимо подтверждать экспериментально из-за часто встречающихся (даже для близких таксонов) крупных перестроек в геномах.

Недавно был опубликован подход к сборке скэффолдов, основанный на данных о пространственном расположении участков ДНК в хроматине - метод Hi-C [25]. При использовании данного метода ДНК непосредственно в составе хроматина расщепляют с помощью эндонуклеаз рестрикции, дающих выступающий («липкий») 5'-конец. 5'-концы достраивают ДНК-полимеразой с использованием биотинилированного основания, после чего проводят лигирование в условиях, при которых вероятность реакции максимальна для близко расположенных концов расщепленной ДНК. В результате образец ДНК содержит продукты лигирования, помеченные биотином в месте стыка соседних фрагментов. Продукты лигирования отбирают на частицы со стрептавидином и секвенируют. Поскольку вероятность лигирования пропорциональна расстоянию между участками и значительно выше внутри хромосомы, чем между хромосомами, данный метод позволяет установить распределение контигов по хромосомам и их относительное расположение. Авторами показана принципиальная возможность использования этого метода на геномах человека, мыши и дрозофилы. Кроме того, было определено положение некоторых контигов в геноме человека, для которых оно до сих пор не было известно.

После сборки контигов в скэффолды между контигами остаются участки. Длина их приблизительно известна, а последовательность - нет. Наличие таких разрывов, как правило, обусловлено либо протяженной повторяющейся последовательностью (которую невозможно правильно собрать из коротких прочтений), либо недостаточным покрытием генома. В первом случае дополнительную информацию можно попробовать получить из прочтений, отфильтрованных перед сборкой из-за отнесения их к повторяющимся последовательностям. Во втором случае необходимо дополнительное секвенирование.

Несмотря на огромный поток экспериментов по секвенированию геномов и широкий спектр методических приемов, на сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос, какие комбинации технологий секвенирования и программ для сборки дают наилучшие результаты при секвенировании de novo. Нет и единых критериев оценки качества сборки.

Одним из способов оценки качества сборки является значение параметра N50, отвечающего такой длине контига, для которой более длинные контиги в сумме включают не менее 50% от общей длины всех контигов в проекте. Аналогичным образом определяется значение N90 (превышающие данный показатель контиги в сумме содержат 90% последовательностей). Однако информативность оценки качества сборки с помощью этой метрики вызывает сомнения.

Для выбора наилучшего программного обеспечения для оборки последовательностей некоторые авторы проводят их сопоставление с помощью различных тестовых баз данных [26, 27, 28]. Сравнения проводят разными способами, в том числе в виде соревнования (assemblathon), в котором разработчикам программ для сборки коротких прочтений предлагает©я посоревноваться в качестве получаемого результата [28].

Геномы двух организмов одного и того же вида, как правило, не являются полностью идентичными. Наиболее частыми различиями в близкородственных геномах являются однонуклеотидные вариации - отличия ДНК по нуклеотиду в определенной позиции, дающие так называемый внутривидовой однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism, SNP), являющийся основной причиной существования аллелей. Наряду с SNP часто встречаются вставки или делеции одного нуклеотида. Более протяженные вставки или делеции обычно называют вариацией числа копий региона, они могут быть разной протяженности: от нескольких нуклеотидов до целой хромосомы. Отклонение числа хромосом от нормального называют анеуплоидией. Кроме того, возможны инверсии - изменения структуры хромосомы, вызванные разворотом одного из ее участков на 180°, и транслокации - перенос участка хромосомы в новое место.

Все эти изменения можно обнаружить с помощью методов высокопроизводительного секвенирования, как правило, в варианте повторного секвенирования генома. Общие принципы обработки данных NGS 101

Ряд биологических задач предполагает повторное определение последовательности ДНК вида организмов, геном которого уже есть в базе данных. Для прокариот это может быть секвенирование отличающихся определенными свойствами (патогенностью, продуктивностью и т. п.) штаммов микроорганизма. Для эукариот - накопление данных о вариабельности генома внутри вида, ассоциативные исследования (в том числе поиск генетических детерминант определенных фенотипов).

Если перед исследователем стоит задача определения последовательности генома организма, данные для которого уже есть в базе данных (т. е. стоит задача повторного секвенирования, ресеквенирования), ее решение существенно упрощается. В этом случае проводят сравнение полученных данные с референсным геномом, и от качества такого сравнения зависят результаты дальнейшего анализа данных.

Для сравнения полученных данных геномного секвенирования с уже имеющимися полными геномами, совсем не обязательно собирать геном заново, достаточно выровнять (картировать) прочтения на уже имеющуюся референсную последовательность.

Несмотря на то что задача выравнивания на референсный геном намного проще, чем сборка_ de novo,_ и здесь существует ряд трудностей. Во-первых, даже для сравнительно небольшого генома бактерии (скажем, в 5 млн п. н.) для каждого фрагмента в ходе выравнивания (и если искать только места точного совпадения) необходимо проверить 5 млн возможных вариантов расположения этого участка на геноме. Но в референсном геноме могут быть и небольшие отличия - однонуклеотидные замены, делеции или вставки. Если разрешить алгоритму позиционировать последовательность с учетом наличия единственного несовпадающего нуклеотида на 100 п. н., то мы получим 3·100·5 000 000 вариантов расположения фрагмента на референсном геноме, т. е. для каждого прочтения нужно выполнить уже 1,5 млрд сравнений. Если предположить наличие делеции или вставки, количество сравнений возрастет еще больше. Для современных персональных ЭВМ решение по выравниванию бактериального генома на референсный геном занимает около двух часов.

В общем виде задачу картирования прочтений на референсном геноме можно сформулировать следующим образом: дан набор полученных в эксперименте последовательностей Q, набор референсных последовательностей R, набор ограничений и пороговое значение дистанции k. Необходимо найти все подстроки m в R, удовлетворяющие всем ограничениям, в том числе и такому, что расстояние между M и любой последовательностью q из Q не превышает k, т. е. d(q, m) ≤ k, где d(q, m) - функция расстояния. Ее обычно рассчитывают на основании количества замен, делеций или вставок. Также она может учитывать протяженность делеций или вставок и характерные ошибки использованной платформы секвенирования.

Основная цель картирования - найти правильное расположение в геноме каждой последовательности q из Q с учетом ошибок секвенирования и структурных вариантов. При этом важно отличать ошибки секвенирования от реальных различий в сравниваемых последовательностях.

Для картирования прочтений, полученных методом Сенгера, был разработан набор программ, успешно справляющихся с такими задачами: SSAHA [29], BLAST [30, 31], BLAT [32]. Однако технологии высокопроизводительного секвенирования дают на порядки больший объем данных, и методы, успешно применявшиеся для сенгеровского секвенирования, оказываются недостаточно эффективны для работы с большими массивами данных. Поэтому были разработаны новые алгоритмы, требующие меньше аппаратной мощности и времени на выполнение.

Число программ для картирования прочтений уже превысило полсотни и постоянно растет. На рис. 4.6 приведен список некоторых программ для картирования прочтений на референсный геном в порядке их появления. Видно, что после разработки методов высокопроизводительного секвенирования, количество программ для картирования начало быстро расти [33].

Большая часть алгоритмов выравнивания использует дополнительные структуры данных - индексы. Индексируются или референсный геном, или прочтения. В зависимости от используемой структуры данных можно выделить 3 группы алгоритмов:

Наиболее популярными являются программы, использующие первые две группы алгоритмов.

Выбирая подходящую программу для картирования прочтений, нужно учитывать, для каких данных и каких задач создавалась та или иная программа (ДНК, РНК, микроРНК, изучение паттерна метилирования ДНК посредством обработки ее бисульфитом или паттерна расположения ДНК-связывающих белков после иммунопреципитации хроматина и т. д.). Кроме того, некоторые программы разработаны специально для работы с данными конкретной технологической платформы для секвенирования и учитывают характерные особенности или ошибки именно этой платформы (например, прочтение гомополимерных участков для Ion Torrent и 454 Life Sciences, однонуклеотидные замены и ухудшение качества данных к концу прочтений для Illumina) и особенности формата данных (цветовое кодирование для данных SOLiD).

При работе с данными секвенирования транскриптомов важным является алгоритм поиска мест сплайсинга. Он может производиться как на основании существующих баз данных (таких как X-mate [41] или же de novo на основе машинного обучения - например MapSplice [42] либо GMAP [43]). В первом случае, если в образце присутствуют ранее не описанные варианты сплайсинга, программа может их не найти [33].

Как было сказано выше, при картировании прочтений они не всегда точно совпадают с референсной последовательностью. Причиной таких несовпадений может быть реальное отличие референсной последовательности и исследуемой ДНК, ошибка секвенирования или неверное картирование прочтения.

Поскольку наиболее частым и интересным с биологической точки зрения различием в близкородственных геномах является однонуклеотидный полиморфизм (SNP), исследователи часто решают задачу его обнаружения в близкородственных геномах. Основной сложностью при поиске SNP является необходимость отличать реальные изменения последовательности от ошибок секвенирования и картирования. На первый взгляд ничего сложного тут нет: ошибки секвенирования происходят случайно, а следовательно, вероятность оказаться даже в двух независимых прочтениях в одном и том же месте очень мала (за исключением случая, когда ошибка возникает на этапе амплификации ДНК на первых циклах ПЦР). Вместе с тем, если речь идет о геномах диплоидных эукариот, для вариабельных позиций внутри полученных прочтений соотношение аллелей должно быть 50/50. Однако в случае секвенирования, например, ДНК опухолевой ткани в образце могут Общие принципы обработки данных NGS 105 встречаться клетки с соматическими мутациями, так что соотношение частот разных аллелей при этом может быть любым (и отфильтровывать такие вариации нельзя, поскольку именно они могут быть предметом поиска).

Для оценки того, является ли данный полиморфизм достоверным, учитывают, какая доля прочтений несет такой вариант и соответствует ли частота варианта ожиданиям исследователя.

Задача становится еще более сложной, если речь идет об исследованиях, при которых для экономии средств в одном образце смешивают ДНК нескольких организмов и полученную смесь секвенируют (например, подход часто используют при полногеномном поиске ассоциаций - genome-wide association study, GWAS). Поскольку значимыми в таких экспериментах часто оказываются именно редко встречающиеся варианты, необходимы подходы, отличающие их от ошибок секвенирования [44]. Для поиска таких вариантов используют методы, основанные на машинном обучении. Они позволяют оценивать достоверность обнаруженного полиморфизма на основании большого числа параметров. Для обучения используют два набора данных: соответствующие истинным полиморфизмам и ошибки секвенирования. На основании предварительного обучения определяют параметры, позволяющие достоверно отличить реальный полиморфизм от ложного, обусловленного технологическими ошибками ([45]).

Для поиска SNP обычно используют результаты выравнивания на референсный геном в виде файлов формата SAM. Для работы с этими файлами можно использовать программные пакеты SAMTools [46], GATK [47], Atlas [48] и ряд других. Наиболее популярным является GATK. При этом программы постоянно совершенствуются, появляются новые, проводятся исследования для выявления наилучших алгоритмов [49].

Сразу отметим, что структурные изменения в геноме можно обнаружить не только с помощью NGS. Существуют альтернативные подходы: флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH), супрессионная вычитающая гибридизация (SSH) и ряд других. FISH позволяет обнаружить изменения размером не менее 5-10 млн п. н., a CGH - изменения порядка 10-25 т. п. н. Несмотря на то что SSH позволяет найти изменения любого размера - места стыка для крупных вставок либо делеций или же обнаружить короткие делеции целиком, этот подход является довольно сложным в исполнении и неустойчив к минимальным отклонениям от протокола. В этой связи для поиска сравнительно небольших изменений в геноме исследователи все чаще прибегают к NGS.

Существует два основных способа поиска структурных изменений в геноме. Первый использует информацию о глубине и равномерности покрытия референсного генома прочтениями. В этом подходе подсчитывают число прочтений вдоль генома в «окне» определенной длины и устанавливают, являются ли различия с соседними участками статистически значимыми. Поскольку для многих технологий NGS частота прочтений зависит от GC-состава секвенируемого региона, перед анализом обычно проводят предварительную нормализацию данных, сглаживающую подобные отклонения, используя CNV-seq [50], SegSeq [51] и другие инструменты. Второй способ, помимо покрытия, учитывает информацию о выравнивании парно-концевых прочтений: если направление парного прочтения или расстояние до него отличается от ожидаемого, это может говорить о наличии структурных изменений. Инструменты, учитывающие информацию о парно-концевых прочтениях: CNVer [52], CNAseg [53], CNVnator [54] и др. В первом подходе возможно обнаружение только вставок и делеций, тогда как во втором - любые структурные вариации, включая инверсии и транслокации [55].

После того как вариации обнаружены, возникает вопрос об их роли в изучаемом биологическом процессе (заметим, что большинство вариаций является вариантами нормы). Первое, что необходимо сделать, - посмотреть, что же известно про эти изменения к текущему моменту. Существует множество баз данных, в которых собрана информация о значимости того Общие принципы обработки данных NGS 107 или иного изменения. Более всего таких баз существует для генома человека и среди них наиболее известной является dbSNP.^[2] В ней собраны собственно SNP, короткие вставки и делеции. Большинство программ для поиска SNP сопоставляют полученные результаты с имеющимися в этой базе данными. В зависимости от того, какие именно данные интересуют исследователя, он может выбрать соответствующую базу данных. Так, информация о клинически значимых вариациях генома человека собрана в базе данных OMIM,^[3] а информация о вариантах нормы аккумулирована в базе данных проекта НарМар.^[4] Для описания встречающихся в норме крупных вставок и делеций была создана база данных DGV.^[5] На том же ресурсе, что и dbSNP, сформирована dbVAR,^[6] включающая более крупные изменения, чем SNP. Для описания крупных клинически значимых вставок и делеций создана база данных ISCA,^[7] но она не является открытой. Информация во многих открытых базах данных дублируется. Как правило, между ними есть некоторая синхронизация, но она не всегда актуальна. Кроме того, существуют базы данных, посвященные отдельным заболеваниям человека и другим организмам. Многие базы данных предоставляют интерфейс программирования приложений API (application programming interface), что позволяет осуществлять поиск в них с помощью скриптов.

Если в ходе анализа генома обнаружена новая вариация, возникает вопрос, какое биологическое значение она может иметь. Конечно, без экспериментальных данных биоинформатические подходы сказать что-то наверняка не могут, но могут дать направление для дальнейшего поиска.

Для этих целей разработаны инструменты, позволяющие на основании информации о месте расположения вариации сделать предположение о ее возможной биологической роли. Такие программные продукты позволяют определить, находится ли вариабельная позиция в кодирующей последовательности, регуляторной области, в области некодирующей РНК и т. д. Если вариация обнаружена в кодирующей последовательности, то является ли она значимой, приводит ли к замене аминокислоты, влияет ли на рамку считывания и т. д. [56].

Типовой набор задач, решаемых сиквенсным центром, примерно следующий: прием данных с секвенаторов, их первичная обработка, сборка de novo геномов или транскриптомов, картирование, аннотирование, выравнивание разных типов. К ним также относятся различные задачи вычислительной филогенетики, сравнительной геномики, популяционной генетики и др.

Для разных научно-исследовательских и инженерных целей вычислительные центры строят с начала 50-х годов XX века. Стандартные вычислительные задачи, решаемые, скажем, в области физики высоких энергий, гидродинамики, молекулярной динамики, требуют от центра высокой вычислительной мощности при сравнительно небольшом объеме хранения (обычно это вычислитель с большим числом ядер и множеством серверов, связанных очень быстрой сетью, у каждого сервера сравнительно небольшая оперативная память).

Однако для хранения данных NGS необходимы довольно большие хранилища информации (например, один запуск секвенатора SOLiD 5500x1 дает около терабайта данных). Облачные решения здесь плохо подходят по причине сложности пересылки таких объемов данных по обычным каналам связи. Таким образом «классическая» схема организации вычислительного центра (рис. 5.1) для обработки данных высокопроизводительного секвенирования не подходит. В случае NGS стоит задача обработки большого объема данных при сравнительно простых действиях с этими данными.

Среди современных задач по структуре данных и операциями с ними высокопроизводительное секвенирование больше всего похоже на компьютерные системы компаний мобильной связи (для которых уже давно существуют типовые решения). Это некоторое количество вычислительных серверов и сопоставимое число хранилищ данных (рис. 5.2).

Для сборки эукариотических геномов нужен сервер с большой оперативной памятью - около терабайта. Собрать такой сервер можно далеко не на всякой платформе. Обычно для данной цели применяется платформа HiEnd самого высокого класса (наподобие устанавливаемых на атомных станциях), хотя для обработки сиквенсных данных столь высокий уровень надежности не требуется, нужен лишь большой объем оперативной памяти, а на надежности можно существенно сэкономить.

Производители оборудования для NGS (Illumina, Life Technologies) уже поставляют со своими приборами миникластеры, в которых можно проанализировать кое-что из NGS-данных (например, BioScope Cluster, LifeScope Cluster и LifeScope Workstation от Life Technologies Thermo Fisher Scientific).

На рис. 5.3 показан конкретный пример организации центра обработки данных NGS. Центр включает три системы хранения по 144 Тбайта и отдельные системы хранения (а не просто диски, вставленные в сервера). В этом классе решений системы хранения необходимо выносить отдельно по многим причинам. В представленном на рисунке варианте использован один узел с 512 Гбайтами памяти для сборки геномов и других мощных проектов и 30 вычислительных узлов с 48 Гбайтами памяти. Хранилище можно организовать по технологии Fiber Channel, при которой можно динамически подключать диски к каждому серверу.

Есть часть для развертывания на ней распределенной файловой системы (например, Lustra, используемой в большинстве суперкомпьютеров и позволяющей равномерно распределить нагрузку на дисковые подсистемы).

При организации собственного центра обработки данных NGS необходимо уже на старте иметь хорошо проработанный технический проект, учитывающий наличие серверов с большой памятью, специализированных систем хранения (а не серверов с дисками), расчетных серверов, использование Fiber Channel для гибкого подключения дисков, специализированных систем вентиляции и электроснабжения.

Для установки программного обеспечения, модификации и администрирования системы желательно иметь своих IT-специалистов в команде. Чтобы получить максимальный эффект от работы столь «гетерогенного» коллектива, желательно расположить рабочие места IT-специалистов, биоинформатиков и биологов близко друг к другу для их тесного взаимодействия.

Отдельное внимание необходимо уделить обеспечению бесперебойного электроснабжения. Если, например, ваш институт относится ко второму классу энергопотребления, диспетчер местной локальной сети может вас отключить от оети на пять минут без предупреждения, поэтому при организации вычислительного центра (как, впрочем, и при организации сиквенсного центра) необходимо закупить мощные источники бесперебойного питания.

Важна и система охлаждения помещений и оборудования. Аппаратура генерирует большое количество тепла, которое летом необходимо эффективно удалять из помещения (то же относится и к организации сиквенсного центра).

Чаще всего для работы с данными NGS используют операционную систему Linux (в частности, Scientific Linux) и очередь задач Torque, для мониторинга - алгоритмы iiTagios и Puppet. Кроме того, существует множество биоинформатических пакетов для конкретных биологических задач (см. гл. 4).

Ниже перечислены некоторые популярные биоинформатические пакеты для решения биологических задач разного типа.

Доступ к мощному центру обработки данных есть не всегда. Обычная лаборатория, как правило, не имеет собственного отдельного биоинформатического центра и программистов. Для биологического эксперимента исследователю необходимо выбрать технологию секвенирования и на стадии получения данных обратиться в какой-то геномный центр для их обработки.;

Однако в случае не слишком сложных задач (если не требуется сборка эукариотического генома de novo) можно воспользоваться обычным ПК или сетевыми (облачными) решениями, предлагаемыми рядом компаний.

В Интернете можно обнаружить множество специализированных проектов для решения конкретной задачи по обработке данных NGS (см. разд. 5.2). Такие проекты позволяют картировать на референсные геномы, сравнивать геномы по базовым аннотациям, искать полиморфизм и т. п. [1-3]. Есть ряд узкоспециализированных решений, например поиск дифференциально представленных генов, аннотация внутриклеточных сигнальных каскадов и т. п. [4-6].

При решении подобных задач оптимальной является система с модульным принципом в подходе к организации и хранению информации. Проект предлагает лишь базовый уровень организации сервиса (аналог Nessus РНР Interface), в котором пользователь может запускать собственные приложения или легко модифицировать уже имеющиеся под конкретные проекты. У пользователя должна быть возможность выбора из широкого спектра программ картирования, аннотации, инструментов анализа данных.

Одной из первых подобных платформ стал Galaxy Project, запущенный в 2008 году группой ученых из Пенсильванского университета в США. Этот проект полностью отражает идеологию модульного построения систем. У него неплохие внутренние интерфейсы, и в скором времени с его помощью можно будет анализировать NGS-данные. Плюсы проекта - он бесплатный и в нем есть возможность масштабировать на облако.

Другой пример - платформа Postparser.net. С его помощью к настоящему моменту уже реализовано несколько NGS-проектов: поиск новых сайтов метилирования в геноме, новых профилей некодирующих РНК (например, микроРНК при раке), сравнение множества близкородственных геномов эукариот, поиск полиморфных вставок в геном, анализ регуляторных участков мобильных генетических элементов человека и т. д. Одним из преимуществ подобных платформ является приближение биолога к пониманию алгоритма анализа данных NGS. Зачастую биоинформатики приносят биологу готовые картинки для статей, и биолог понятия не имеет, как были сделаны вычисления. В сетевых сервисах биолог получает прямой доступ к данным, может их самостоятельно редактировать, комментировать, отбирать.

В качестве специализированных сетевых программных решений следует отметить такие, как CLC Bio^[8] или Knome.^[9]

Планирование эксперимента - это процедура выбора количества и условий проведения опытов, необходимых и достаточных для решения поставленной задачи с требуемой точностью. Цель планирования эксперимента заключается в создании схемы, позволяющей получить наибольший объем информации при наименьших затратах. Среди классических характеристик экспериментального плана выделяют: сравнение (как правило, в научном эксперименте объект сравнивается либо с неким заранее заданным стандартом, либо с контрольным объектом), рандомизацию, повторяемость (или репликацию, не путать с удвоением ДНК), однородность и блокировку (стратификацию). Рассмотрим чуть подробнее некоторые из перечисленных характеристик применительно к NGS.

Рандомизация представляет собой процесс, используемый для группировки объектов таким образом, чтобы у каждого из них была равная вероятность попасть в контрольную или опытную группу. Другими словами, выбор участников исследования должен происходить случайно, чтобы исследование не было отклонено в сторону «предпочтительного» для исследователя результата. Рандомизация необходима для применимости статистических методов для анализа данных исследования, она помогает предотвратить смещения, обусловленные причинами, которые не были непосредственно учтены в плане эксперимента. Для этого, например, формирование экспериментальных групп лабораторных животных производится случайным образом.

Рассмотрим важность рандомизации на конкретном примере. Допустим, вы заинтересованы в поиске различий между двумя образцами ДНК. Для повышения надежности были собраны по шесть повторностей для каждого типа образцов (шесть контрольных и шесть экспериментальных). Предположим, вы секвенировали образцы на платформе Illumina HiSeq/GAIIx, используя две дорожки, причем каждая дорожка содержит шесть (мультиплексированных) повторностей. На рис. 6.1 показаны хороший и плохой варианты мультиплексирования. Неверным является подход с нанесением одинаковых образцов в одну дорожку сиквенсного чипа. При планировании такого эксперимента необходимо помнить пословицу «Не клади все яйца в одну корзину». Нанесение обоих типов образцов вперемешку позволяет исключить систематическую ошибку (в данном случае - эффект дорожки), а также получить хотя бы половину данных в случае неудачного прочтения одной из дорожек.

Конкретный пример: поиск дифференциально представленных транскриптов методом секвенирования транскриптомов контрольной и экспериментальной групп образцов. Если одна из дорожек по какой-либо причине даст меньше прочтений, при плохом дизайне можно принять аппаратно возникшую разницу за биологический сигнал. Гораздо надежнее в приведенном примере нанести в каждую из дорожек равное количество образцов из контрольной и экспериментальной групп. Выбор образцов из каждой группы для нанесения в одну дорожку лучше всего производить случайным образом [1, 2].

Другой пример возникновения систематической ошибки влияние «штрих-кодирования» образцов (см. разд. 2.8). Дело в том, что присоединение адаптеров также влияет на качество секвенирования и разные по последовательности адаптеры влияют по-разному. При планировании эксперимента необходимо принимать в расчет влияние адаптеров и строить экспериментальную схему в направлении минимизации систематической ошибки.

Для выявления источника вариабельности необходимо провести несколько испытаний - повторов. Использование повторностей в NGS не очень распространено по двум причинам: из-за высокой стоимости исследования и того факта, что один из типов экспериментальных повторностей уже встроен в сам алгоритм секвенирования - это число прочтений каждого участка последовательности (так называемая степень покрытия). Однако другие типы повторностей, такие как биологические повторности, инструментальные повторности и повторности для разных технологий NGS могут быть крайне информативны и важны для корректной постановки эксперимента [3].

Биологические повторности (когда собирают по несколько однотипных биологических образцов) являются важной составляющей любого биологического эксперимента, позволяя снизить экспериментальную ошибку (стохастические ошибки секвенирования).

Благодаря возможности кодирования образцов присоединением адаптеров заданной последовательности исследователь может довольно легко решить задачу инструментальных повторностей (секвенирование одного и того же образца несколько раз).

Использование разных NGS-платформ (особенно основанных на разных принципах секвенирования) также может существенно улучшить результаты. Например, комбинация длинных, но не очень точных прочтений на платформе PacBio и точных, но коротких прочтений на Illumina.

С повторностями связана чувствительность и специфичность эксперимента. В частности, повторности могут быть использованы для определения чувствительности и специфичности методов поиска полиморфизма последовательностей ДНК.

Ниже приведен перечень типовых ошибок, допускаемых в ходе экспериментов с использованием с NGS. На этапе планирования эксперимента исследователю следует обратить особое внимание на перечисленные ниже источники ошибок во избежание их совершения.

Источники ошибок на этапе пробоподготовки:

Источники ошибок на этапе подготовки библиотеки для NGS:

Источники ошибок на этапе собственно секвенирования:

За последние несколько лет наблюдается шквал публикаций с применением высокопроизводительного секвенирования для различных целей. Наиболее популярные приложения NGS включают в себя: полногеномное секвенирование (de novo или повторное); исследование различных РНК (часто называемое RNA-Seq); крупномасштабный анализ метилирования ДНК; изучение ДНК-белковых взаимодействий (ChlP-seq) и ряд других (табл. 6.1). В ближайшие годы список приложений NGS, несомненно, будет расти благодаря непрерывному усовершенствованию существующих подходов и выходу на рынок принципиально новых технологий (в частности, технологий секвенирования одиночных молекул нуклеиновых кислот).

Появление высокопроизводительного секвенирования дало значительный толчок развитию микробиологии и смежным областям. Дело в том, что наблюдающийся в течение последних трех лет быстрый рост количества практически полных последовательностей геномов бактерий в открытых базах данных позволил по-новому взглянуть на эволюцию прокариот, обнаружить принципиально новые типы генетических событий на уровне возникновения видов живых организмов, с тем чтобы эффективно восстанавливать метаболизм одноклеточных. Для некультивируемых микроорганизмов, например микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях среды, геномные методы становятся важнейшим способом их изучения и отправной точкой для последующей разработки биохимических методов и методов генной инженерии.

Другая область применения NGS в микробиологии - это медицина. Исследование генома отдельных микробов методами NGS позволяет быстро выявлять «островки патогенности» и локусы, определяющие устойчивость к антибиотикам, а изучение микробных сообществ человека - понять взаимосвязь микробиоценозов и состояния здоровья пациента (см. гл. 8).

Еще одно важное направление - биотехнологии. Применяя бактерии в различных промышленных процессах, на основе геномных данных можно идентифицировать новые ферменты и понять, как модификации генома связаны с функционированием микроорганизмов.

Наконец, NGS имеет значение для молекулярной биологии в целом в части понимания основных механизмов функционирования живой клетки.

На начало 2014 года определено около 1500 полных геномов микроорганизмов, а число частично собранных геномов (представленных в виде множества неупорядоченных фрагментов) составляет уже около десяти тысяч и быстро растет.

Первые полные геномы бактерий, определяемые методом Сенгера, начали публиковать, начиная с конца 1990-х годов. Геномы кишечной палочки {Escherichia coli) и Helicobacter pylori были опубликованы в 1997 году [1, 2]. А далее последовал шквал полногеномных исследований прокариот.

Секвенирование бактериального генома методом Сенгера производили, создавая сначала библиотеку длинных фрагментов (30-40 т. п. н.) в векторах на основе геномов фагов (космидах или фагмидах) с получением картированной коллекции фрагментов, покрывающих весь геном бактерии. Затем каждый крупный фрагмент субклонировали в плазмидах фрагментами по 2-3 т. п. н. и секвенировали их насквозь (часто используя не только стандартные праймеры на вектор, но и множество геном-специфичных праймеров) [3, 4]. Такой проект обычно продолжался более года и стоил сотни тысяч (если не миллионы) долларов США.

Позднее, с удешевлением стоимости секвенирования (за счет выпуска более производительных секвенаторов, но работающих по-прежнему на принципе Сенгера), исследователи стали использовать более простой подход: метод дробовика, когда геном сразу клонируют в плазмидный вектор вставками по 2-3 т. п. н. и секвенируют с многократным покрытием генома по «сырым» данным (разд. 1.1.2).

В настоящее время методы NGS полностью вытеснили принцип Сенгера из области геномного секвенирования. Однако современный подход очень похож на метод дробовика: получают последовательность коротких фрагментов генома, добиваясь сборки 95-98% последовательности генома.

Так же как и при использовании метода Сенгера, определение последовательности бактериального генома методами NGS начинают с секвенирования библиотеки случайных фрагментов ДНК.

Наилучшие результаты показывает алгоритм секвенирования, использующий оба типа библиотек: обычную и инвертированную (см. гл. 2). После секвенирования обычной библиотеки исследователь получает хорошее покрытие генома, но сборка дает много сравнительно коротких контигов. Для сборки контигов в более длинные регионы можно использовать повторное прочтение генома с использованием инвертированной библиотеки. При совмещении данных из двух библиотек можно добиться 99% сборки генома.

Наиболее продолжительным и трудозатратным этапом любого бактериального геномного проекта является его завершение с получением полной кольцевой молекулы ДНК. Сегодня, при использовании технологий NGS, 98% генома можно получить в течение недели, а получение полной кольцевой молекулы может занять несколько лет.

Для закрытия пробелов в последовательности и сборки контигов в полный геном существует несколько подходов. Один из наиболее надежных, но и трудоемких подходов - создание космидной библиотеки крупных фрагментов бактериального генома (по 40 т. п. н.). Путем скрининга космидной библиотеки при помощи ПЦР (с праймерами на концевой регион контига) можно быстро и недорого определить, на какой именно фрагмент космидной библиотеки приходится пробел, после чего определить последовательность данного клона методом дробовика (по Сенгеру).

Другой подход: классическая «прогулка по геному» (genome walking). Для этого получают библиотеку фрагментов бактериального генома (расщепленного по сайту редкощепящей эндонуклеазы рестрикции) с прилигированными супрессионными адаптерами, после чего проводят ПЦР с праймером на концевой участок контига и дистальным праймером на адаптер [5].

Если в базах данных есть геном близкого вида, можно провести сравнение полученных последовательностей с родственным геномом и попытаться расположить контиги друг относительно друга. Для контигов, предположительно расположенных рядом (на расстоянии не более 5-7 т. п. н.), синтезируют праймеры на концевые участки и проводят «дальнобойную» ПЦР, оптимизированную для наработки длинных фрагментов (long-range PCR). Полученные фрагменты секвенируют пошагово методом Сенгера (всякий раз заказывая новый праймер на концевой участок известной последовательности).

Наиболее сложными при сборке являются регионы повторяющихся последовательностей, длиннее одного прочтения методом Сенгера (т. е. свыше 800-1000 п. н.). Такие регионы приходится собирать опосредованными методами, например ориентируясь на длину сквозного ПЦР-продукта, предполагая, что весь регион состоит из одинаковых повторов (но следует помнить, что это лишь допущение и истинная структура региона не известна).

Еще один вариант: если не удается перекрыть весь участок повторов с помощью «дальнобойной» ПЦР, можно попробовать найти какие-то зацепки в дистальной части уже имеющейся последовательности. Это могут быть полиморфные основания в повторе, микроделеции, «неправильные» стыки повторов и т. п. Существуют примеры программного обеспечения, специально адаптированного для поиска таких мест в повторяющихся регионах.^[10]

В данном разделе рассмотрен протокол приготовления и секвенирования библиотеки геномной ДНК бактерии при помощи технологии секвенатора Ion PGM (с длиной прочтения 200 п. н.) с практическими рекомендациями пользователю.

Протокол состоит из следующих этапов.

Анализ геномных данных, несомненно, сложнее процесса их получения. Вообще, в настоящее время мы наблюдаем в научной сфере интересный парадокс: после выхода на рынок технологий NGS скорость накопления данных о последовательностях геномов существенно превысила скорость из анализа. Купить оборудование для NGS и освоить коммерческую технологию любая лаборатория (имеющая не это деньги) может за очень короткий срок (за пару месяцев). На создание же эффективной научной группы из высококлассных профессионалов - биологов, биоинформатиков и программистов - в некоторых случаях могут уйти годы.

Анализ геномных данных можно разделить на две составляющих: аннотацию генома (т. е. идентификацию генов в последовательности и предсказание их функций) и биологический анализ (реконструкцию метаболизма, установление взаимосвязи фенотипа и генотипа и т. д.). Задача аннотирования прокариотических геномов на сегодняшний день имеет ряд неплохих решений (а продолжающиеся биоинформатические разработки в этой области сулят появление в скором времени еще лучших алгоритмов). Существующие программные продукты позволяют в автоматическом режиме получить достаточно хорошо аннотированный геном.^[11]

Отдельно следует указать на особенности полногеномного секвенирования de novo некультивируемых бактерий. Вследствие малого количества стартовой ДНК ее, как правило, подвергают амплификации (по технологии WGA). Наличие этапа амплификации сильно усложняет задачу последующего анализа данных, поскольку покрытие амплифицированного генома оказывается очень неравномерным (вследствие искажений амплификации), а при использовании инвертированных библиотек с двусторонним прочтением длину вставки гораздо сложнее контролировать. Кроме того, в процессе амплификации возникают ошибки и химерные прочтения. Существуют специальные программы для сборки таких (амплифицированных) геномов [6, 7].

Биологический анализ - это понимание того, как продукты генов работают в системе и как микроорганизм использует имеющийся набор генов в тех или иных условиях. Этот этап пока не подлежит автоматизации и зависит от квалификации и эрудиции исследователя.

Бактериальный транскриптом (по аналогии с транскриптомом эукариотическим) - это совокупность всех транскриптов данной бактериальной клетки. В среднем на рибосомальную РНК у бактерий приходится 80% от суммарной РНК (по массе), на транспортную РНК - 15%, на матричную и некодирующие РНК - 4-5%.

Сложность бактериального транскриптома долгое время была недооценена. Лишь с созданием технологий высокопроизводительного секвенирования удалось показать, что у бактерий есть практически все те же механизмы регуляции экспрессии, что и у эукариот. Так, у бактерий были найдены т ранс-кодируемые малые РНК. Это участки, расположенные в пространстве между белок-кодирующими генами и способные взаимодействовать с другими РНК либо белками. Найдены у бактерий и цыс-кодируемые малые РНК. Они могут занимать 1-2 гена по длине или же иметь протяженность в несколько генов [8]. Найдены рибопереключатели - структуры, чаще всего сенсорные, расположенные в 5'-концевой нетранслируемой области РНК, способные изменять конфигурацию транскрибируемой молекулы и тем самым либо препятствовать, либо помогать экспрессии. У бактерий обнаружены безлидерные РНК (РНК без транслируемой области, в связи с чем меняется схема сборки рибосом на таких транскриптах).

У прокариот обнаружен широкий спектр эпигенетических модификаций, влияющих на спектр транскриптов в транскриптоме. Обнаружена компартментализация транскриптов: было показано, что транскрипты белков, которые в дальнейшем будут взаимодействовать, обычно транскрибируются рядом. Так как у бактерий транскрипция и трансляция сопряжены, время сборки необходимых белковых комплексов у бактерий сокращено.

Описаны различные модификации бактериального сплайсинга, полиаденилирования, редактирования РНК и т. д. [9].

Упрощенная схема исследования бактериального транскриптома такова: выделение РНК из интересующей бактерии, синтез кДНК, создание библиотеки фрагментов и собственно секвенирование. На каждой стадии возможны дополнительные манипуляции. Например, можно провести обогащение РНК интересующей последовательностью. Можно отобрать фракцию только малых РНК либо рибосомальных РНК.

В конечном итоге после секвенирования исследователь получает набор файлов (например, в формате FASTQ, см. разд. 4.1). Базовая схема анализа данных секвенирования бактериального транскриптома стандартна: вначале проводят контроль качества полученных файлов (например, с помощью программы FASTQC). Затем проводят фильтрацию прочтений и удаление адаптерных последовательностей. После этого проводят картирование прочтений на референсный геном (при этом могут быть использованы программы Bowtie, BWA, SOAP и др.). Файлы, содержащие картированные последовательности, отбирают и проводят качественный либо количественный анализ данных (а чаще - оба вида анализа). В ходе качественного анализа транскриптома выполняют визуализацию - распределение прочтений по геному бактерии. При количественном анализе определяют функциональные категории или метаболические пути, в которых могут быть представлены найденные гены.

В результате качественного анализа бактериальных транскриптов можно найти новые гены - как короткие (кодирующие белки), так и гены новых некодирующих РНК. Часто в ходе анализа уточняют границы генов, выявляют некодирующие и нетранслируемые участки. Так как у бактерий большинство генов собрано в опероны, можно выявлять опероны (как области покрытия генома прочтениями, включающие сразу несколько генов). Наконец, можно выявлять антисмысловую РНК - это покрытие прочтениями генома по цепи, противоположной смысловой цепи известного гена. Для многих бактерий антисмысловая транскрипция может составлять существенный процент транскриптома. В ряде случаев он может превышать объем транскрипции по смысловой цепи. За счет сопоставления количества прочтений в двух и более библиотеках можно проводить поиск дифференциально представленных транскриптов.

Важно отметить, что в ряде биологических задач исследование транскриптома (или протеома) может быть крайне информативным. Так, было показано, что бактерии Helicobacter pylori из разных участков одного и того же пораженного желудка не отличаются генетически, но сильно отличаются по уровню экспрессии генов (т. е. бактерии находятся в разных функциональных состояниях). При этом профиль экспрессии может значительно отличаться - до сотни генов с существенно разным уровнем экспрессии.

Ряд работ демонстрирует, что даже в культуре каждая бактерия уникальна по профилю экспрессии генов. Анализируя транскриптом в популяции бактерий, исследователь измеряет «среднюю температуру по больнице». Поэтому в перспективе исследование бактериальных транскриптомов методами NGS должно стремиться к возможности определения профиля представленности транскриптов одной клетки [10].

Любое исследование с применением секвенирования начинается с экстракции ДНК и, в некоторых случаях, ее амплификации. При проведении метагеномных исследований в зависимости от задачи, стоящей перед исследователем, могут возникнуть следующие трудности на этапе очистки ДНК.

Для исследования видового состава прокариот в какойлибо среде обитания можно использовать метод, основанный на секвенировании высококонсервативных регионов генома. Чаще всего для этих целей выбирают ген 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). У гена 16S рРНК (длиной около 1500 п. н.) есть константные и вариабельные участки (рис. 8.1). Константные участки позволяют создать «универсальные» праймеры для ПЦР, взаимодействующие с ДНК подавляющего большинства прокариот с примерно равной эффективностью. Методом ПЦР можно наработать расположенные между такими праймерами вариабельные участки гена 16S рРНК. Секвенирование одного или нескольких вариабельных регионов позволяет идентифицировать последовательности, принадлежащие разным видам.

До появления технологий высокопроизводительного секвенирования полученные продукты ПЦР клонировали в плазмидные векторы (в Escherichia coli), после чего каждый клон оеквенировали с помощью метода Сенгера. Использование сенгеровского секвенирования позволяет получить последовательности высокого качества, почти полностью покрывающие ген 16S рРНК (что существенно для точной идентификации и различения близких видов) (см. рис. 8.1). Однако подход с клонированием достаточно дорог, а само клонирование вносит дополнительные искажения в конечный результат (см. разд. 10.3).

Появление технологий высокопроизводительного секвенирования с длиной прочтения в несколько сотен нуклеотидов позволило использовать NGS для анализа микробных сообществ по гену 16S рРНК без этапа клонирования, что позволяет ускорить и удешевить исследование. Первой для подобных исследований была применена технология 454 Life Sciences [11]. Показана эффективность применения при секвенировании гена 16S рРНК парно-концевых прочтений на платформах Illumina и Ion Torrent [12-13].

Использование NGS позволяет получать гораздо большее число прочтений, а следовательно, обнаруживать организмы с низкой представленностью в сообществе.

Недостатком методов NGS в данном применении является по-прежнему меньшая, чем в методе Сенгера, длина прочтения (секвенирование клонов методом Сенгера с двух сторон дает де 1400 п. н. единой последовательности). По короткому участку гена 16S рРНК (в 200-400 п. н.) зачастую можно определить бактерию лишь до рода. Кроме того, вероятность ошибок для технологий NGS гораздо выше, чем для сенгеровского секвенирования, таким образом, возникает проблема фильтрации ошибок секвенирования (см. разд. 4.4). Существуют работы, показывающие, что в ряде метагеномных проектов якобы большое видовое разнообразие сообщества в результате оказалось следствием ошибок секвенирования [14].

Крайне важным является подбор пары праймеров для амплификации регионов гена 16S рРНК. Даже в константных участках этого гена между последовательностями некоторых видов могут встречаться однонуклеотидные вариации, в результате чего эффективность амлификации ДНК разных видов может в значительной мере различаться (а для части видов может и вовсе не нарабатываться). Этой проблеме посвящен ряд исследований, предлагающих различные варианты пар праймеров для получения ампликонов разной длины [15, 16]. В любом случае, при выборе пары праймеров для ПЦР стоит проверить, будут ли с ее помощью амплифицироваться последовательности гена 16S рРНК тех видов, которые ожидаются для данного микробиома, и какие виды при этом могут быть утеряны [11, 17].

Несомненным плюсом использования в качестве маркера гена 16S рРНК при анализе симбиотического микробиоценоза является исключение из анализируемого образца примеси ДНК организма-хозяина (за счет наличия этапа амплификации).

Помимо разной эффективности амплификации, при попытке количественно оценить состав микробиоты возникает еще одна сложность: копийность гена 16S рРНК может варьировать от 2 до 15 копий на гаплоидный геном [18]. Причем она может отличаться даже для микроорганизмов, относящихся к одному виду [19]. Оценка представленности различных видов с учетом числа копий гена 16S рРНК [20] или с помощью референсных генов, копийность которых постоянна [21], может улучшить точность получаемых результатов.

Для биоинформатической обработки данных высокопроизводительного секвенирования ампликонов используют два подхода [22].

Путем секвенирования ампликонов можно не только определить таксономический состав микробного сообщества, но и провести количественную оценку содержания того или иного микроорганизма в образце. В первом приближении можно принять долю прочтений ампликона (фрагмента гена 16S рРНК) с генома данного микроорганизма за долю микроорганизма в сообществе. Современные программы для анализа последовательностей позволяют строить удобные диаграммы процентного содержания бактерий в образце. Но, как уже было сказано, число генов рРНК у разных видов микроорганизмов варьирует, поэтому желательно делать на это поправку.

Помимо использования для анализа микробного сообщества отдельных консервативных регионов генома (таких, как ген 16S рРНК или других филогенетических маркеров), можно напрямую выделить и секвенировать содержащуюся в образце ДНК. Важным преимуществом такого подхода является отсутствие этапа амплификации, вносящего значительные искажения в результаты.

Впервые термин «метагеном» был предложен Хандельсманом с соавт. в 1998 году [29]. Он обозначает суммарный набор генов, выявленных в исследуемом образце (как геном одного псевдоорганизма), используемый для воссоздания свойств исследуемого микробного сообщества.

Первый эксперимент по метагеномному секвенированию был проведен в 2004 году [30] и позволил обнаружить 148 ранее неизвестных видов бактерий и более 1,2 млн ранее неизвестных генов. Первые работы, так же как и в случае с 16S рРНК, проводили с помощью клонирования фрагментов ДНК в плазмидных векторах в клетках бактерии кишечной палочки и последующего секвенирования методом Сенгера. Длинные прочтения в значительной степени упрощали сборку и анализ данных, но из-за клонирования возникали искажения, поскольку некоторые последовательности плохо поддаются клонированию (например, если участок бактериальной ДНК несет ген, токсичный для Е. coli, то такой фрагмент может быть утерян в ходе клонирования). Эту проблему можно обойти, используя несколько разных организмов для клонирования [31].

Как уже было сказано, технологии высокопроизводительного секвенирования позволяют избежать клонирования и, соответственно, получить намного больше данных за меньшие деньги. Для метагеномного секвенирования используют практически все доступные на сегодняшний день технологии: 454 Life Sciences [32, 33], Illumina [34], Ion Torrent [35]. В некоторых случаях такое секвенирование позволяет получить полную последовательность генома для некультивируемых бактерий [36].

Существуют работы по сравнению технологий высокопроизводительного секвенирования применительно к метагеномам. Так, в работе Тяхта с соавт. было проведено метагеномное секвенирование одного и того же образца с помощью четырех технологий: 454 Life Sciences, SOLiD, Ion Torrent и Illumina. Авторы получили высокую сходимость результатов - больше 0,93 [37].

Каждый из перечисленных выше способов анализа таксономического состава сообщества (по 16S рРНК и по метагеному) имеет свои достоинства и недостатки. Праймеры поразному амплифиЦйруют 16S рРНК разных микроорганизмов и могут существенно исказить реальное соотношение бактерий в образце. В то же время, метагеном как метод гораздо менее чувствителен к минорным представителям сообщества и контиги получаются только для доминирующих видов.

В этой связи оптимальным представляется комбинированный алгоритм, сочетающий в себе как чтение коротких вариабельных участков, так и метагеномное секвенирование.

Последовательность шагов в таком алгоритме может быть следующей:

В качестве дополнительных информативных шагов можно распределить контиги между микроорганизмами (например, по покрытию или по частотам встречаемости тетрануклеотидов).

Некоторые биологические задачи предполагают исследование схожих, но территориально разделенных сообществ микроорганизмов. Например, сравнение образцов из разных буровых скважин или микробиоты кишечника разных людей и т. п.

Кроме сопоставления видового состава сообщества и процентного соотношения микроорганизмов в ряде задач имеет смысл исследовать генетическое разнообразие отдельных видов бактерий в сообществе, пользуясь нуклеотидным полиморфизмом. Например, для микробиоценозов человека (кишечного или урогенитального) можно обнаружить, что в разных странах или при разных физиологических состояниях человека бактерии одного вида в сообществе могут быть очень далеки филогенетически [37].

Биоинформатическое обнаружение гена в последовательности генома далеко не всегда означает, что он работоспособен. Для понимания функциональных возможностей сообщества в дополнение к метагеномным данным может быть полезно определение метатранскриптома (секвенирование суммарных мРНК сообщества). Исследования метатранскриптомов осложнены нестабильностью молекул РНК и, как следствие, необходимостью быстрой и эффективной фиксации образца. Особенно это актуально при исследовании образцов почв (из-за наличия РНКаз и адсорбции молекул РНК на частицы почвы). Для экстракции РНК из столь сложных образцов разрабатываются специальные методы [63]. Кроме того, поскольку 95% от всех РНК в клетке составляют рибосомальная и транспортная РНК, «забивающие» библиотеку, от них тоже приходится избавляться [63]. Чтобы понять, какие гены экспрессируются и в какой степени, необходимо выравнивание полученных данных метатранскриптома на метагеном, аннотация и нормализация. Возможно и выравнивание на референсные геномы из баз данных, но более информативным будет выравнивание и аннотация относительно метагеномных данных для того же образца.

В заключение главы отметим, что «мета»-исследования сегодня являются одной из быстро развивающихся областей биологии, в том числе благодаря появлению методов NGS. Метагеномика вместе с метатранскриптомикой и метапротеомикой позволяют понять состав и функционирование микробных сообществ (в том числе и симбиотических человеку), что, в свою очередь, может помочь предсказывать их поведение в зависимости от условий среды обитания.^[13]

В 2009 году стартовал проект «Микробном человека» [64], ставящий своей целью охарактеризовать обитающие на теле человека микробные сообщества для здоровых людей и пациентов различными заболеваниями. Первые результаты подобных исследований показывают, что некоторые изменения в составе микробиоценозов человека могут серьезно угрожать его здоровью [65, 66].

Секвенирование генома человека и других организмов в 1990-х и 2000-х годах осуществлялось впервые (de novo), из-за чего ученые сталкивались со сложной задачей по сборке коротких прочтений в единую последовательность [1]. Осуществление такой сборки тем сложнее, чем больше размер Секвенирование геномов эукариот 163 генома исследуемого организма и чем сложнее его организация. Размеры геномов эукариот варьируют от десятков миллионов пар нуклеотидов (например, 29 млн п. н. у паразитической микроспоридии Encephalitozoon cuniculi) до сотен миллиардов пар нуклеотидов (150 млрд п. н. у растения Paris japonica). Столь существенные различия в размерах геномов возникают главным образом по причине увеличения так называемых некодирующих последовательностей (в основном за счет амплификации разного рода мобильных генетических элементов и сателлитных повторов), что приводит к накоплению в геномах большого количества повторяющихся последовательностей. Таким образом, различия в размерах эукариотических геномов между видами зачастую определяются количеством повторов [2].

Трудность сборки генома из секвенированных фрагментов впервые была продемонстрирована в середине 1980-х годов [3, 4]. В зависимости от длины прочтений и длины повторов в исследуемой последовательности задача по сборке генома может быть тривиальной (если все повторы короче прочтений), вычислительно неразрешимой (когда требуется перебрать такое число способов перестановки прочтений, которое не обеспечивает даже использование суперкомпьютера) и неразрешимой в принципе (если информации, полученной из прочтений, недостаточно, чтобы выбрать правильный контиг из равнозначных вариантов) (рис. 9.1). Тривиальной бывает сборка только небольшого (вирусного) генома. В случае секвенирования геномов большего размера ассемблеры - программы для сборки геномов - не могут собрать геном полностью, давая на выходе несколько отдельных фрагментов или ошибочно собранный геном (см. разд. 4.2).

Одновременно с разработкой биоинформатических подходов развивались и методы секвенирования. Сборка становится волее точной с увеличением длины одного прочтения и при добавлении информации о взаимном расположении нескольких прочтений друг относительно друга (рис. 9.2).

Кроме того, ввиду необходимости в значительном перекрывании прочтений при построении контигов возникает необходимость в многократном прочтении одного и того же участка генома. Однозначного мнения о достаточном покрытии при секвенировании генома de novo пока нет. Однако очевидно, что с увеличением покрытия (количества прочтений для одного и того же участка генома) увеличивается точность оборки, снижение числа контигов и повышение доли прочитанного генома. В публикациях последних лет в зависимости от исследуемого организма и сиквенсной платформы авторы используют различные покрытия - от 6-кратного (для «чернового» прочтения) до более чем 100-кратного (для создания точной референсной последовательности генома нового организма) [5].

Метод Сенгера, позволивший определить первые геномы эукариот, обладает достаточно большой длиной прочтения (около 800 п. н.) и низкой частотой ошибок, однако из-за высокой стоимости определения одного нуклеотида и трудоемкости в конце 2000-х годов метод перестали использовать для секвенирования геномов [6].

В настоящее время исследователю приходится выбирать между максимальной длиной прочтений и наличием информации об их взаимном расположении, поскольку технология, позволяющая совмещать оба параметра, пока не разработана.

Технология секвенирования 454 Life Sciences сегодня позволяет осуществлять прочтения длиной до 1200 п. н. (что соответствует лучшим показателям метода Сенгера) с возможностью получить до нескольких миллионов прочтений в течение суток. Этот метод секвенирования второго поколения появился одним из первых и активно применялся во второй половине 2000-х годов для определения геномов эукариот [7]. Однако с появлением более дешевых методов секвенирования и возможности получать информацию о взаимном расположении прочтений технология 454 Life Sciences от Roche теряет свои позиции.

Еще более длинные прочтения позволяют получить секвенаторы третьего поколения, такие как PacBio (прочтения длиной до 20 000 п. н.). Однако такие приборы только появились на рынке, и стоимость определения нуклеотида и новизна технологии пока сдерживают их распространение.

К наиболее популярным технологиям, дающим прочтение фрагмента с двух сторон, относятся технология SOLiD, которая позволяет прочесть несколько десятков нуклеотидов с двух концов для нескольких миллиардов фрагментов и технология Illumina, способная определить последовательности длиной в несколько сотен нуклеотидов для чуть большего числа фрагментов (см. гл. 3) [8]. Видно, что «двусторонние» технологии (в литературе их часто называют парно-концевым#) дают гораздо более короткие прочтения (в сравнении с 454 Life Sciences), зато дают информацию о расстоянии между прочтениями (и расстояние это исследователь может регулировать на уровне создания библиотеки фрагментов для NGS, см. гл. 2).

Выбор средней длины фрагментов при использовании «двусторонней» технологии NGS является важным нюансом секвенирования de novo. Слишком короткие фрагменты дают мало информации для ассемблера, а слишком длинные снижают качество и объем получаемых с одного запуска секвенатора данных. Большинство авторов при секвенировании больших эукариотических геномов de novo для двустороннего прочтения рекомендуют использовать инвертированные библиотеки с длиной фрагментов 3-10 т. п. н.

Таким образом, при запуске проекта секвенирования эукариотического генома de novo можно рекомендовать исследователю следующий алгоритм: 1) использовать две разных NGS-платформы (с длинными односторонними прочтениями и короткими двусторонними), 2) для двусторонних прочтений сделать две (или несколько) библиотек фрагментов ДНК с разной длиной фрагментов (например, в 3 т. п. н. и 10 т. п. н.) и секвенировать их независимо, 3) после сборки контигов пытаться закрывать пробелы методом ПЦР, оптимизированной для наработки длинных фрагментов (long-range PCR), с секвенированием получаемых фрагментов методом Сенгера (рис. 9.3).

Заметим, что использование нескольких технологий секвенирования в одном проекте вдобавок позволяет повысить надежность результатов за счет учета типовых ошибок приборов.

Полное или частичное секвенирование генома организма, при условии что геном этого организма (или близкого родственника) уже есть в базах данных (так называемый референсный геном), называют ресеквенированием. Проект по ресеквенированию может преследовать различные цели: изучение однонуклеотидного полиморфизма (SNP), небольших вставок или делеций (Indel), больших структурных вариаций (SVs), поиск новых участков (отсутствующих в референсном геноме), гаплотипирование и пр. [9].

Теоретически полиморфные позиции, делеции и вставки можно обнаружить даже в результате одно- или двукратного прочтения с последующей коррекцией ошибок секвенирования. Однако референсный геном также может содержать ошибки. Например, в настоящее время в референсном геноме человека содержится примерно 0,01% ошибок, поэтому однонуклеотидное несоответствие исследуемого генома референсному не всегда является следствием проявления SNP. Наличие повторов или SNP в последовательностях, фланкирующих делецию, также затрудняет ее обнаружение.

Сравнительно небольшие делеции (вставки) могут быть достоверно обнаружены при прочтении «насквозь» (охватывая смежную область, содержащую разрыв). Практика показывает, что большинство делеций (вставок) в уникальных последовательностях генома человека обнаруживаются уже при длине прочтения в 75-100 п. н.

Делеции (вставки), превышающие длину прочтения, можно искать двумя способами: 1) анализируя среднее покрытие (read depth), при котором частота прочтений определенного сегмента ДНК отражает его копийность; 2) картируя парноконцевые прочтения (в основном для инвертированных библиотек) и сравнивая расстояние между прочтениями в исследуемом и референсном геноме (этот метод подходит также для поиска инверсий).

Ни один из существующих методов не является оптимальным для поиска больших структурных вариаций. Многие из SVs находятся в повторяющихся последовательностях, что не позволяет точно расположить конкретное прочтение на геноме. Кроме того, SVs часто являются результатом совокупности событий, произошедших близко друг от друга, что не позволяет обнаружить их при использовании коротких прочтений NGS. Например, для обнаружения транспозонов требуются специальные алгоритмы. Тем не менее обилие повторяющихся последовательностей в геномах приводит к тому, что большинство SVs обнаружить не удается [10].

Методы поиска новых последовательностей также недостаточно надежны, особенно при малой длине прочтения. Теоретически, использование метода парно-концевых прочтений в случае, когда один край фрагмента лежит в известной области, а второй - во вновь обнаруженной, может позволить обнаружить такие участки и затем, собрав их в контиги, встроить в референсный геном. Однако подобные алгоритмы плохо автоматизированы и требуют ручной доработки.

Требования к получаемым данным со стороны алгоритмической обработки при ресеквенировании менее строгие, чем при сборке de novo. Однако принципы выбора технологий аналогичны - отдается предпочтение парно-концевым прочтениям с длиной 50-250 п. н. (с небольшим размером фрагментов геномной библиотеки) Среднее покрытие, как правило, находится в диапазоне х12-50, что позволяет добиваться точности определения SNP на уровне 98-99%. Дальнейшее увеличение покрытия не ведет к заметному росту полноты секвенирования и точности определения SNP (рис. 9.4).

Дополнительную сложность при анализе данных ресеквенирования эукариотического генома создает его диплоидность. Наличие двух наборов хромосом приводит к тому, что могут быть одновременно получены прочтения, как соответствующие референсному геному, так и отличающиеся от него. Более того, диплоидность требует определения, в какой из хромосом локализован данный вариант (аллель). Процесс определения принадлежности аллеля одной из хромосом называют фазированием (phasing).

Если ресеквенируют геном индивида, геномы обоих родителей которого были секвенированы ранее, фазирование становится сравнительно простой задачей, которую можно решить сравнением генотипов. Когда же, как чаще всего бывает на практике, геномы родителей недоступны, применяют статистические методы, предполагающие, что гаплотипы объединены в генотипы случайным образом. Основная идея такого анализа состоит в том, что, если проанализировать геномы индивидуумов, гомозиготных по большому количеству л оку сов, можно рассчитать частоты встречаемости гаплотипов. Статистические методы могут быть основаны на методе максимального правдоподобия, парсимонии, комбинаторике или использовании априорных распределений из теории коалесценции. Последний подход лег в основу работы программы PHASE [11]. Недавно разработан подход, предлагающий рассматривать фазирование как способ восстановления последовательности в случае потери части данных при анализе диплоидного генома [12].

Экспериментальное фазирование очень трудозатратно. Для точного фазирования при отсутствии информации о близких родственниках необходимо использовать специальные методы уже на этапе секвенирования. Некоторые методы позволяют полностью фазировать хромосомы, в то время как другие позволяют разделить лишь отдельные участки. Во втором случае требуется повторная сборка таких фрагментов de novo, чтобы получить гаплотип. В такой ситуации принято говорить о «проблеме реконструкции гаплотипа отдельного индивидуума».

Подходы к экспериментальному фазированию можно разделить на полногеномные (когда секвенирование проводят таким образом, чтобы получить как можно больше информации о гаплотипе) и основанные на выделении информации о гаплотипе из прочтений после обычного секвенирования.

Референсный геном человека, установленный International Human Genome Sequencing Consortium (проект «Геном человека»), был получен с использованием библиотеки, содержащей длинные вставки с последующим секвенированием методом дробовика. Вставка в каждом клоне библиотеки представляла отдельный гаплотип, что позволяло получать гаплоидные последовательности. Собственно такой подход можно было бы использовать при секвенировании, чтобы получить максимум информации для последующего фазирования, однако это очень дорого и трудозатратно. При замене метода дробовика современным NGS стоимость полногеномного фазирования снизилась до 150 тыс. руб за образец. В результате были получены фрагменты гаплотипов, которые было необходимо объединять в полный геном. На этом этапе могут возникать ошибки из-за наличия гомозиготных участков, превышающих длину вставки в одном клоне библиотеки. Такой модифицированный подход не позволил полностью разделить все однонуклеотидные маркеры (SNP), но тем не менее от 94 до 99% маркеров было фазировано (рис. 9.5) [13].

Избежать ошибок фазирования можно, разделив хромосомы до начала секвенирования. Сейчас появляются методы, позволяющие при помощи микрофлюидики разделить метафазные хромосомы отдельной клетки, которые затем можно секвенировать [14].

Прямое секвенирование также дает некоторую информацию для фазирования. При секвенировании по Сенгеру, 454 Life Sciences и PacBio получаются довольно длинные (более 700 п. н.) прочтения, дающие достаточно информации для разделения гаплотипов. Другие технологии секвенирования (например, Illumina и Ion Torrent) не позволяют получить прочтений такой длины, однако при использовании парно-концевых прочтений с последующим применением специальных компьютерных программ (Haplotype Improver и «read-backed phasing», алгоритм программного пакета Genome Analysis Tool Kit) они позволяют достигать аналогичных показателей при более низкой стоимости эксперимента [15].

С развитием технологий не только растет производительность секвенаторов, но и наблюдаются значительные улучшения в процессе пробоподготовки - требуется все меньше ДНК для проведения анализа. В последнее время стало возможным секвенирование генома отдельной клетки. Это открывает перед научным сообществом недоступные ранее возможности: секвенирование геномов некультивируемых микроорганизмов, анализ циркулирующих в кровотоке опухолевых клеток или клеток плода, генетическое исследование клеток на ранних этапах эмбрионального развития, изучение транскрипционного шума, гетерогенности опухолевых клеток, микроэволюции и т. д.

Секвенирование отдельных клеток применимо как к одноклеточным, так и многоклеточным организмам, в данном разделе будет уделено особое внимание использованию этого подхода для изучения геномов млекопитающих.

Любой проект по изучению клеточного генома начинается с изоляции индивидуальных клеток (поскольку ткани, как правило, состоят из десятков и сотен клеток различных типов). Все способы получения отдельных клеток можно разделить на две большие группы: рандомизированные (случайные) и таргетные (направленные). Пробоподготовка, подразумевающая рандомизацию, лучше отражает состав исследуемой ткани, а таргетный подход позволяет выделить и изучить редкие типы клеток.

Получение клеток из плотных тканей включает два основных шага: взятие фрагмента ткани (биопсия) с последующим разделением его на отдельные клетки (обычно для этого используют ферменты) и помещение клеток в отдельные реакционные ячейки для последующего лизиса и дальнейшей работы.

Клетки можно разделить, используя микроманипуляторы (стеклянные капилляры) или же проведя серию разбавлений. Методы, основанные на микроманипуляции, дешевы, но низкопроизводительны, кроме того, при идентификации клеток под микроскопом крайне важен опыт исследователя. Использование клеточных сортеров (метод FACS, fluorescenceactivated cell sorting - сортировка флуоресцентно-меченых клеток) - позволяет реализовать как рандомизированный, так и таргетный подходы, исключает человеческий фактор и значительно повышает выход сортированных клеток. Однако для разделения на сортере требуется значительно большее количество исходного материала, что особенно критично для небольших клеточных популяций.

Если два вышеописанных метода подразумевали обязательное использование клеточных суспензий, то лазерная захватывающая микродиссекция (laser-capture microdissection - LCM) позволяет изолировать клетки непосредственно из образцов тканей. Образец ткани, покрытый специальной пленкой, анализируют под микроскопом, затем в результате воздействия лазера выбранные клетки прилипают к пленке и извлекаются из образца. Сама процедура извлечения клеток накладывает ряд ограничений на использование данного метода. Он подразумевает высокую квалификацию исследователя, часть цитоплазмы может быть потеряна при извлечении или же, напротив, частично может захватываться цитоплазма соседних клеток, ядро также может быть частично повреждено.

С развитием микрофлюидики стали появляться устройства для выделения отдельных клеток и даже отдельных хромосом. Вероятно, за такими устройствами будущее пробоподготовки для изучения геномов индивидуальных клеток.

После получения отдельной клетки необходимо амплифицировать ее геномную ДНК, так как единственной копии, содержащейся в клетке, недостаточно для проведения анализа. Впервые метод полногеномной амплификации (WGA) был предложен в 1992 году для случаев, когда количество ДНК в образце мало, но требуется провести множество анализов (например, при сравнительной геномной гибридизации). Методы WGA можно разделить на методы с использованием ПЦР и методы, основанные на амплификации со множественным замещением цепи (multiple displacement amplification - MDA). Существует два основных ПЦР-метода WGA: degenerate oligonucleotide PCR (DOPPCR) и primer extension preamplification (PEP). Основное различие этих методов состоит в том, что в РЕР используют случайные праймеры и низкую температуру отжига, в то время как в DOP-PCR - частично вырожденные праймеры (CGACTCGAGNNNNNNATGTGG) и повышенную температуру отжига. Использование Taq-полимеразы ограничивает длину фрагментов в 3 т. п. н. и приводит к возникновению ошибок. Кроме того, оба этих метода могут приводить к неполной или неравномерной амплификации генома вследствие предпочтительного отжига праймеров на некоторых участках генома.

Амплификация со множественным замещением цепи лишена недостатков ПЦР-подходов. В этом методе октамерные олигонуклеотиды связываются с денатурированной ДНК, после чего синтез осуществляется полимеразой Phi29 при постоянной температуре. Двигаясь вдоль геномной ДНК, Phi29, достигнув следующего праймера, не диссоциирует, а продолжает синтез, замещая (отталкивая) ранее синтезированную копию ДНК. На такие «ДНК-ветки» также отжигаются праймеры, и они тоже начинают «ветвиться». Таким образом из копий ДНК образуются разветвленные структуры. В конце процедуры S1 нуклеаза разрезает полученную ДНК-сеть. Процессивность и точность полимеразы Phi29 позволяют получать фрагменты до 100 т. п. н.

После амплификации генетический материал можно подготовить к секвенированию, используя обычные коммерческие наборы реагентов.

В заключение главы обобщим вышесказанное: секвенирование геномов эукариот является сложной задачей из-за размера и наличия повторяющихся элементов. При секвенировании геномов de novo и ресеквенировании применяются схожие подходы, отличающиеся длиной фрагментов библиотек и биоинформатическими алгоритмами. Выбор платформы для секвенирования, количества данных, способа пробоподготовки и обработки данных зависит от множества параметров и зачастую носит эмпирический характер. В то же время предпочтение можно отдать парно-концевым прочтениям максимальной длины при минимальной стоимости данных.

Методы высокопроизводительного секвенирования оказались крайне востребованы в области исследования рибонуклеиновых кислот. Такие задачи, как измерение уровня экспрессии всех генов (в ткани или отдельной клетке), поиск соматических мутаций, альтернативно-сплайсированных форм (изоформ транскриптов) и белок-некодирующих РНК, секвенирование различных типов малых РНК и т. д., оказались хорошо совместимы с NGS-подходами. Отметим, что в литературе высокопроизводительное секвенирование с целью изучения РНК получило некорректное название - РНК-секвенирование (RNA-seq) (в большинстве технологий NGS секвенируют не РНК, акД Н К)[1].

В табл. 10.1 показаны некоторые из задач транскриптомики и способы их решения методами высокопроизводительного секвенирования.

Несмотря на появление технологий NGS, позволяющих анализировать непосредственно молекулы РНК (например, технологии PacBio, см. гл. 3), наиболее распространенные платформы NGS по-прежнему используют в качестве стартового материала копию к ДНК с исходной молекулы РНК. В этой связи одним из первых этапов секвенирования РНК является перевод РНК в кДНК путем обратной транскрипции (реакции синтеза копии ДНК (комплементарной ДНК, кДНК) на матрице РНК с использованием специального фермента - обратной транскриптазы, или ревертазы).

Эффективность синтеза кДНК зависит от качества очистки РНК. Сегодня на рынке присутствует множество наборов реагентов для очистки РНК, но методика классической фенольной экстракции остается одним из наиболее стандартных подходов.

Для удаления геномной ДНК из библиотеки можно рекомендовать на финальных этапах очистки осаждение РНК хлоридом лития и обязательную последующую обработку препарата ДНКазами (с маркировкой «RNAse free»).

Для синтеза кДНК на матрице РНК можно использовать несколько типов олигонуклеотидных затравок (праймеров), существенно отличающихся по сложности и количеству получаемой в результате реакции к ДНК, а также по-разному влияющих на соотношение отдельных транскриптов после обратной транскрипции. Основные варианты стадии затравления следующие:

Следует отметить, что температура гибридизации относительно коротких (обычно длиной 6-8 нуклеотидов) случайных затравок, а также олиго-dT праймера, значительно ниже оптимальной температуры для термостабильной реакции обратной транскрипции, поэтому эти типы затравок не могут быть использованы в работе с термостабильными ферментами для обратной транскрипции без предварительного этапа инкубации при более низкой температуре [16].

Вне зависимости от того, какой тип затравок будет использован в реакции обратной транскрипции, начало синтеза кДНК может происходить вследствие случайного эндогенного затравления обрывками РНК и ДНК, образовавшимися в ходе очистки нуклеиновых кислот и за счет формирования вторичных структур в РНК. В экспериментах по постановке обратной транскрипции с меченым Р32-стандартом при использовании обратных транскриптаз AMV, MMLV и мутантов MMLV было установлено, что по количеству полученной кДНК продукты реакций, выполненных с добавлением и без добавления затравок, практически идентичны. Высокая эффективность самозатравочного механизма обратной транскрипции типична для реакций, проводимых с использованием обратных транскриптаз AMV или MMLV при стандартных условиях. На это следует обратить особое внимание в тех случаях, когда необходимо получить первую цепь кДНК с определенной затравки и без примеси второй цепи (например, при получении ориентированных библиотек к ДНК). Для этого можно рекомендовать добавление ревертазы при высокой температуре и использование актиномицина D в качестве агента, снижающего спонтанный синтез второй цепи [17].

Другим вариантом проведения обратной транскрипции является использование случайных затравок. В реакцию обратной транскрипции добавляют смесь всех возможных вариантов коротких дезоксирибонуклеотидов (чаще всего - гексамеров). Короткие затравки обеспечивают начало синтеза к ДНК во множестве точек на всем протяжении молекулы РНК, производя, таким образом, несколько (укороченных) молекул к ДНК с одной молекулы мишени. По некоторым данным, этот метод позволяет получить наибольшее количество кДНК и лучше всего применим к транскриптам с развитой вторичной структурой. Также использование этого подхода рекомендовано в случае использования деградированной (разрушенной на короткие фрагменты) РНК.

Синтез первой цепи к ДНК (цепи, непосредственно синтезируемой на молекуле РНК) с использованием смеси вырожденных гексамеров можно проводить при комнатной температуре. Однако при использовании суммарной фракции РНК в качестве стартового материала большая часть полученной библиотеки кДНК будет соответствовать рРНК и секвенирование даст миллионы ненужных прочтений. Поэтому при использовании случайной затравки необходимо предварительно избавиться от рРНК (см. разд. 10.4.2 и 10.4.3).

Синтез кДНК с использованием праймера олиго-dT более специфичен к мРНК (в сравнении со смесью случайных гекоамеров), поскольку этот тип затравки плохо работает на неполиаденилированной рРНК. Для получения к ДНК с использованием праймера олиго-dT крайне важным является отсутствие деградации и качество очистки РНК. Выбор этого типа затравления не рекомендован, если РНК фрагментирована.

Несмотря на наличие широкого спектра обратных транскриптаз (табл. 10.2), разработчиками методики по-прежнему пе решено несколько проблем, связанных с проведением обратной транскрипции (ОТ): все ревертазы (РНК-зависимые ДНК-полимеразы), в сравнении с ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами, имеют низкую точность копирования матрицы (вследствие своей вирусной природы). Также «в противофазе» находятся эффективность фермента и его термостабильность. Низкая термостабильность ревертаз - серьезная проблема, поскольку для эффективной обратной транскрипции желательно денатурировать развитые вторичные структуры РНК, что возможно в случае проведения реакции при высокой температуре.

Общие рекомендации подготовки библиотек фрагментов ДНК для высокопроизводительного секвенирования описаны в главе 2. Здесь рассмотрим лишь особенности подготовки библиотек применительно к исследованию различных типов РНК.

В зависимости от того, какие транскрипты предполагается изучать, необходимо создать соответствующую библиотеку кДНК. Для комплексных проектов необходимо, чтобы в библиотеку вошли все классы РНК, включая белок-кодирующие мРНК, некодирующие РНК, антисмысловые РНК и пр. Однако часто исследователь планирует изучить только белок-кодирующие мРНК или только малые РНК - в таком случае существуют подходы выборочного обогащения библиотеки определенными видами молекул РНК.

При рассмотрении методов целевого обогащения можно выделить ряд параметров, характеризующих тот или иной подход:

Подходы, обеспечивающие высокую однородность и эффективность обогащения, позволяют получить оптимальное покрытие при меньшем объеме первичных данных, что удешевляет процесс секвенирования. Кроме того, для выбора подходящего метода целевого обогащения для конкретного проекта нужно учитывать размер интересующего региона, количество образцов и необходимость смешивания образцов (со «штрих-кодированием») для оптимального использования мощности секвенатора.

Ниже рассмотрены наиболее распространенные методы целевого обогащения.

Так или иначе, но почти все методы обогащения библиотеки фрагментов ДНК целевыми последовательностями используют на определенном этапе метод полимеразной цепной реакции. Для некоторого структурирования подходов мы разделили их на две группы - в одной метод ПЦР является ключевым «сепаратором», тогда как в другой дискриминирующим фактором является иной принцип, а ПЦР используется лишь для увеличения концентрации библиотеки.

Этот принцип обогащения целевыми последовательностями давно и успешно используется в различных областях молекулярной биологии. Например, на нем основан отбор полиаденилированной (полиА) фракции РНК из суммарной РНК (за счет взаимодействия синтетического праймера олиго-dT с полиА). Ниже рассмотрены два подхода, применяемых сегодня в NGS: с заранее посаженными на твердую фазу пробами (разд. 11.3.1) или с отбором проб после гибридизации (разд. 11.3.2).

Для снижения вероятности образования неспецифичных продуктов и димеров праймеров при мультиплексировании иногда используют подход с инвертированными молекулярными пробами (molecular inversion probes, MIP). Данная технология используется компаний Affim etrix для работы с микрочипами, однако ряд работ позиционирует этот подход для NGS [6].

Принцип метода заключается в использовании длинного синтетического одноцепочечного олигонуклеотида, фланкированного последовательностями, комплементарными краям целевого региона и содержащего сайты посадки праймеров и регион со «штрих-кодом» (рис. 11.6).

В одной реакции можно смешивать сотни таких проб с разными флангами. Каждая проба взаимодействует с краями целевого участка последовательности, и ДНК-полимераза достраивает весь регион с 3'-конца пробы («упираясь» в конце пути в 5'-конец той же самой пробы). Затем лигаза ковалентно замыкает синтезированное таким образом кольцо. Незакольцованные фрагменты разрушают с помощью экзонуклеаз, а кольцевые молекулы амплифицируют с универсальными (одинаковыми) праймерами, отжигающимися на пробу. Подход позволяет обогащать до нескольких миллионов пар нуклеотидов.

Можно выделить сразу несколько достоинств метода:

Однако MIP как метод целевого обогащения фрагментов не лишен и недостатков, основные из которых:

Секвенирование иммунопреципитированных элементов хроматина (chromatin immunoprecipitation, ChIP) представляет собой метод анализа ДНК-белковых взаимодействий. ChIP является мощным методом выборочного обогащения последовательностей ДНК, связанных с конкретным белком в живых клетках. До появления технологий NGS широкое использование этого метода было ограничено отсутствием достаточно надежных и недорогих методов определения всех обогащенных последовательностей ДНК. Сочетание иммунопреципитации хроматина с высокопроизводительным секвенированием (ChlP-seq) дало возможность массово определять сайты посадки на геном любого интересующего белка.

Чаще всего ChlP-seq используют для определения местоположения сайтов связывания (на геноме) факторов транскрипции и модифицированных гистонов. Существенным преимуществом метода ChIP является возможность фиксации ДНК-белковых взаимодействий непосредственно в живых клетках, позволяя получить «снимок» этих взаимодействий в экспериментально важный момент.

Алгоритм исследования включает два этапа: иммунопреципитацию и собственно секвенирование полученных фрагментов. На этапе ChIP ковалентно сшитые за счет воздействия формальдегидом или ультрафиолетовым излучением ДНК-белковые комплексы отбирают (обогащают) с использованием антитела против исследуемого белка (метод иммунопреципитации) [7]. Затем к отобранным таким образом коротким фрагментам ДНК присоединяют адаптеры, амплифицируют и секвенируют при помощи любой платформы NGS [8, 9].

Первые исследования с использованием метода ChlP-seq были посвящены определению локализации транскрипционных факторов и модификации гистонов в Т-клетках человека [8, 9] и в клетках HeLa S3 [10]. ChlP-seq можно использовать и для исследования модификаций молекулы ДНК (в частности - сайтов метилирования).

Преимуществами ChlP-seq в сравнении с обычным вариантом ChIP или технологией ChlP-chip (когда полученные фрагменты гибридизуют с посаженными на микрочип олигонуклеотидами) являются более высокое разрешение метода, возможность идентифицировать сайты связывания в повторяющихся регионах и меньшая стоимость всего исследования [11-13].

Сравнение методов целевого обогащения последовательностей показывает, что ПЦР на данный момент является безусловным лидером по специфичности и однородности обогащения. В то же время ПЦР не позволяет проводить обогащение протяженных регионов или большого числа участков.

У обогащения гибридизацией и MIP также есть преимущества. Эти методы позволяют работать с большими целевыми регионами. Так, к примеру, для покрытия экзома человека потребуется провести десятки тысяч индивидуальных ПЦР, каждая реакция потребует оптимизации, полученные продукты нужно будет нормализовать перед объединением в пул, а для того, чтобы начать работу потребуется более 100 мкг геномной ДНК. Подобный эксперимент с использованием обогащения гибридизацией займет один экспериментальный день для подготовки библиотеки, и до двух дней уйдет на гибридизацию и элюцию обогащенного материала, а для начала работы потребуется всего несколько нанограмм ДНК.

Сравнение распространенных методов таргетного обогащения по ключевым параметрам представлено в табл. 11.1, а общий принцип выбора технологии обогащения в зависимости от количества образцов и размера целевого региона на рис. 11.7.

Генетическое тестирование может потребоваться отдельному пациенту или семье в целом ряде случаев, но обычно показанием к исследованию служит наличие симптомов генетически обусловленного заболевания или же наличие родственников, страдавших таким заболеванием. Тестирование может быть диагностическим, прогностическим или проводится для определения статуса носителя наследственного заболевания. По возрасту пациента и причине проведения анализа генетические исследования можно разделить на следующие группы:

Использование генетической диагностики в клинической практике позволяет применять оптимальные схемы лечения и повышать процент выздоравливающих пациентов. В ряде случаев генетические исследования позволяют в значительной степени снизить смертность и заболеваемость вследствие своевременного врачебного вмешательства (например, в результате колоноскопии и удаления полипов во избежание развития наследственного неполипозного рака толстой и ободочной кишки или превентивной мастэктомии для снижения риска развития наследственного рака молочной железы). Даже в тех случаях, когда заболевание неизлечимо, молекулярно-генетическая диагностика позволяет принять своевременное решение при планировании семьи.

Отдельным направлением применения технологий NGS являются инфекционные заболевания. Технологии NGS позволяют секвенировать микробный геном за несколько часов. что может быть крайне полезно в случае эпидемии. NGS уже использовались для мониторинга распространения метициллин-устойчивого штамма S taphylococcus aureus, секвенирования генома Е. coli после массовых случаев инфекции в Европе. Возможно, вскоре NGS станет золотым стандартом эпидемиологии.

Еще одним направлением применения NGS в медицине является исследование симбиотических микробных сообществ человека. С пониманием важности состояния микробиоценозов для здоровья пациента исследователи и врачи начали активно внедрять методы оценки их состояния. Сейчас для этого активно используют подходы на основе количественной ПЦР (например, набор реагентов «ФЕМОФЛОР», компания «ДНК-технология»). Однако удешевление методов NGS делает данный подход пригодным для экспресс-анализа сложных сообществ в диагностических целях.

Таким образом, методы высокопроизводительного секвенирования уже сейчас находят активное применение в диагностике наследственных заболеваний, выявлении рисков мультифакторных заболеваний, определении статуса носителя рецессивных заболеваний и в пренатальной диагностике.

Отдельного внимания заслуживает использование секвенирование в онкологии, что позволяет выявлять мутации, ставшие причиной злокачественной трансформации, а в некоторых случаях - предсказывать эффективные пути терапии.

Ввиду быстрого развития технологий секвенирования далеко не все экспериментальные методики сейчас доступны в клинической практике, однако целая плеяда перспективных методов проходит клинические испытания во многих странах и появляется на локальных рынках.

Коллектив авторов — сотрудники научного подразделения ЗАО «НПФ ДНК-Технология», ведущего в нашей стране разработчика оборудования и реагентов для медицинской ДНК-диагностики.

В книге в полной мере освещаются особенности методов определения структуры нуклеиновых кислот, дается точная, написанная доступным языком картина процессов, идущих в реакционной пробирке. В первую очередь, книга предназначена сотрудникам научно-исследовательских лабораторий и студентам, стремящимся разобраться в фундаментальных принципах и особенностях высокопроизводительного секвенирования. Вместе с тем, каждая глава содержит много конкретных рекомендаций, делая книгу незаменимым практическим руководством для работников сиквенсного центра.