Комплексная оценка возрастных изменений при судебно-медицинской идентификации личности

Состояние вопроса. В судебно-медицинской экспертной практике возраст идентифицируемого устанавливают в подавляющем большинстве случаев по скелету человека. Возможность использования других органов и тканей человека не реализована. Активный научный поиск в области возрастной морфологии с позиций клинической практики, анатомии, геронтологии, расширение возможностей гистологических техник, использование количественных методик позволяют рассматривать внутренние органы, мягкие ткани в качестве приемлемых объектов для определения возрастных модификаций. Следует отметить работы коллектива кафедры судебной медицины Саратовского государственного медицинского университета, где созданы методики установления возраста посредством оценки происходящих инволютивных трансформаций в щитовидной железе [146], почках [29], семенниках [29, 111], аорте [38, 39], коже [29, 38, 133]. Исследователи отмечают, что действенными мерами, способными повысить доказательную значимость, точность оценки возраста, являются расширение набора диагностических параметров, использование комплексного подхода [4, 29, 41].

В современной биологии накоплено много информации о морфологии возрастных изменений внутренних органов, которые целесообразно использовать для судебно-медицинского установления возраста. Еще в прошлом столетии были детально описаны этапы и сроки онтогенетического развития органов и тканей [3, 6, 7, 25, 75, 144, 161, 163].

Возрастная инволюция кожи как неизбежное проявление старения всего организма является достаточно сложным полифакторным процессом. При этом выделяют (по Международной классификации болезней 10-го пересмотра) хроностарение (L57.4) и фотостарение (L57). В контексте данного исследования нас интересует именно биологическое, «эндогенное» старение кожи, являющееся генетически детерминированным процессом [12]. В судебно-медицинской экспертной практике возраст оценивался преимущественно путем констатации степени выраженности морщин. Между тем современный уровень развития дерматокосметологии и смежных дисциплин вывел оценку возрастных изменений кожи на абсолютно новый уровень, прежде всего за счет внедрения инновационного диагностического оборудования. Это позволило сформировать огромный информационный массив знаний о возрастных изменениях кожи [30, 32, 36, 53, 59, 83, 84, 85, 87, 94, 106, 127, 145, 164, 176, 185, 188, 190, 199, 211, 215, 238, 239, 243, 259, 279, 280, 287, 288, 290, 296, 306, 317, 342, 356, 394, 402–405]. Однако в судебной медицине на сегодняшний день исследований, посвященных изучению кожи как предиктора старения, крайне мало [31, 39, 60, 133].

В.Г. Каукаль в своей работе использовал количественные значения толщины кожи различной региональной принадлежности для построения математических моделей с помощью многомерного дискриминантного анализа [60]. Представленные в работе результаты позволяют сделать вывод, что методы эмиссионной спектрографии и инфракрасной спектроскопии кожи и волос, исследование их микроэлементного состава можно применять в целях диагностики возраста лишь в комплексе с другими методиками. Автор предлагает использовать для диагностики возраста только метрические признаки (толщину) кожи и ногтей детей и взрослых. Реалии сегодняшнего времени и уровень научно-технических достижений позволяют значительно расширить арсенал используемых методов.

Ряд исследований в данном направлении выполнен под руководством А.А. Ефимова. Изучены некоторые количественные показатели инволютивных изменений кожи, выявлены их гендерные и топологические отличия, проведен сравнительный анализ синхронности происходящих с возрастом изменений кожи и крупных сосудов [38, 39, 40, 133]. При этом исследователи справедливо отмечают, что для совершенствования судебно-медицинской оценки возраста необходимо расширять круг исследуемых органов и тканей и модернизировать методы математического анализа данных [40, 41].

C.Trojahn и соавт. (2015) разработали новые параметры учета модификаций возрастного профиля кожи, которые объективно регистрируются прибором VisioScan VC98. Для оценки трансформации эпидермальных структур во времени использована оптическая когерентная томография, позволившая объективизировать дополнительные критерии неинвазивной оценки возрастных изменений кожи на открытых и защищенных от солнца участках [393, 394]. Высокое разрешение данного инструмента гарантирует диагностику ранних признаков старения кожи, в том числе формирования различных типов коллагеновых волокон [306, 345]. J.P. McLean и соавт. (2019) разработали оригинальный метод автоматизированной визуализации структурной архитектоники коллагеновых волокон и их количественной оценки на изображениях, полученных с помощью оптической когерентной томографии. Подобный подход расширяет функциональные возможности классических методов визуализации [321].

Накоплено большое количество сведений, касающихся патогенетических механизмов старения кожи [314, 342, 345]. Происходящие с возрастом изменения кожи напрямую зависят от сочетания внутреннего (хронологического) старения, модулируемого генетически предрасполагающими факторами, и внешнего старения (фотостарения). Исследователи отмечают, что значительное количество гистоморфологических преобразований, формирующихся в стареющей коже, в основном зависит от кумулятивного воздействия экзогенных факторов, среди которых главенствующая роль принадлежит ультрафиолетовому облучению. T. Kanaki и соавт. (2016) отмечают потребность в объективной оценке индивидуального патогенеза возрастных изменений посредством создания реестра биомаркеров [279]. Для этих целей используются самые разнообразные показатели.

В работе A. Kozarova и соавт. (2017) с помощью высокочастотного ультразвукового исследования (частота — 20 МГц) дана оценка возрастных изменений толщины кожи в зависимости от воздействия ультрафиолетового и инфракрасного излучения. Предложено использовать в качестве маркера выраженности фотостарения оценку субэпидермальной низкоэхогенной полосы [297]. Результаты работы Y. Koyano и соавт. (2017) также свидетельствуют о достоверном снижении толщины дермы с возрастом [296]. Ученые провели проспективное когортное исследование среди пожилых пациентов в возрасте 65 лет и старше (N=149) на протяжении 8 мес. Изучались свойства кожи предплечья (толщина дермы, эхогенность структур) с помощью ультразвукового сканера 20 МГц.

K.Kikuchi и соавт. (2015), используя систему визуализации, оснащенную осветительным устройством и цифровой камерой высокого разрешения, разработали метод оценки изображения на неоднородность цвета кожи. В ходе анализа неоднородности цвета кожи щек у 194 женщин были зафиксированы возрастные изменения меланина [288]. Продолжив исследования, коллектив авторов создал систему количественной оценки пигментных пятен на лице, доказав наличие четкой связи пигментации с возрастом [287]. Wang Hequn и соавт. (2015) разработали алгоритм для документирования возрастных дефектов кожного матрикса. В работе использовалась микроскопия с двухфотонной флуоресценцией для прямой визуализации кожных волокон кожи in vivo. На изображениях двух анатомических областей (внутренняя поверхность плеча и щека) женщин в возрасте 20– 30 лет и 60–80 лет исследованы структурные изменения дермальных волокон: пространственная ориентация, плотность. В старшей возрастной группе (60–80 лет) отмечена более высокая анизотропия в ориентации волокон кожи на внутренней поверхности плеча. Плотность волокон эластина увеличивалась с возрастом, тогда как плотность волокон коллагена уменьшалась с возрастом. Средние доли коллагеновых и эластических волокон во всей дерме составляли 28,96±14,63% и 8,06±3,75% соответственно [403]. K. Mizukoshi и соавт. (2017) также установили, что в коже более старших возрастных групп происходят снижение четкости и рост изотропности волокон коллагена и эластина [326]. В исследовании использовались CLSMизображения коллаген-эластинового каркаса от 90 японских женщин в возрасте от 20 до 60 лет. Для оценки результатов применен метод анализа основных компонентов.

Трансформация дермальных волокон является основным элементом происходящих с возрастом изменений. Выраженность данных преобразований зависит от эндогенного воздействия и максимально проявляется при фотостарении. Большинство исследователей сходятся во мнении, что состояние коллагеновых волокон сосочкового слоя дермы имеет ведущее значение в формировании статуса стареющей кожи.

Коллаген синтезируется соединительнотканными клетками, сущест вует более 20 вариантов его генетической разновидности. Содержание того или иного типа коллагена зависит от возраста, стадии репаративного процесса. Его разрушение (деградация) осуществляется в несколько этапов с участием фибробластов, различных ферментов [108, 109, 141, 400]. Существуют как внеклеточная фиброклазия, так и коллагенолиз, происходящий внутри клеток [94, 164]. Активность данного процесса зависит от типа коллагена. Естественно, что старение приводит к снижению интенсивности обмена коллагена: волокна за счет множественных «поперечных сшивок» распрямляются, становятся «жесткими», малодоступными для коллагеназы. Коллаген не только основной структурный элемент дермы, но и базисный фибриллярный белок межклеточного матрикса, необходимый для полноценного функционирования всего организма в целом. Следовательно, количественные характеристики, отражающие изменения коллагенового каркаса дермы с возрастом, можно использовать в качестве биомаркера. Коллаген выполняет в организме ряд очень важных функций. Во-первых, опорную — от количества и расположения коллагеновых волокон, а также от их качественного состава зависят механические свойства тканей организма. Во-вторых, коллаген играет важную информативнорегуляторную роль в морфогенезе тканей. Синтез коллагена, структурная организация волокон обеспечиваются в первую очередь механическим фактором. Согласно «теории регуляции роста соединительной ткани на основе обратной связи между распадом и синтезом коллагена», разработанной В.В. Серовым и А.Б. Шехтером, процесс ауторегуляции — двуфазный [141]. Первая фаза состоит из фагоцитоза макрофагами компонентов разрушенного коллагена и выработки фиброгенетического фактора, активирующего пролиферацию как соединительнотканных клеток, так и фибриллярного белка (коллагена). Вторая фаза — снижение активности соединительной ткани, активация инволютивной перестройки посредством воздействия на мембраны фибробластов. Таким образом, можно говорить о наличии общебиологических закономерностей развития соединительной ткани: развитие, стабилизация, инволюция [141]. В соответствии с концепцией биомеханического контроля морфогенеза фибробласт является ключевым звеном, способным регулировать не только свое микроархитектурное окружение, но и архитектонику ткани в целом посредством поверхностного микрорельефа клетки, ее двигательной траектории, пространственного взаиморасположения отростков. В условиях отсутствия функциональной нагрузки воло кна подвергаются резорбции. Таким образом, конструирование тканей происходит посредством обратной связи: клетка ↔ матрикс [108, 109, 141]. Снижение механического напряжения (физической активности) напрямую сказывается на формировании и архитектонике соединительнотканных элементов, в данном случае коллагена дермы.

Большое практическое значение имеют разработки коллектива авторов A.N. Annaidh и соавт. (2012) по оптимизации процессов распознания и автоматизации морфометрии дермальных структур. В предложенном ими методе используются стандартные гистологические методы и алгоритм, реализованный в инструментарии обработки изображений MATLAB. M. Ueda и соавт. (2019) применили комбинированную фотонную микроскопию для изучения пространственной организации коллагеновых волокон в дерме человека и их взаимосвязи с эластическими волокнами [399]. Согласно полученным данным, средние значения диаметра коллагенового волокна, ориентированного горизонтально, больше в сетчатом слое дермы, чем в сосочковом (средний диаметр волокна в сосочковом слое — 47±18 мкм, в сетчатом — 136±14 мкм; p <0,01). Аналогичный вывод получен и относительно диаметра эластических волокон (средний диаметр волокна в сосочковом слое — 4,4±0,6 мкм, в сетчатом — 5,9±0,8 мкм; p <0,05). Слои дермы также имели различные показатели углов ориентации между волокнами.

S.Amano и соавт. (2016) выявили, что воздействие ультрафиолетовых лучей на кожу, помимо повреждения дермальных эластических волокон, приводит к увеличению фактора роста эндотелия сосудов, ангиогенного фактора, в то время как антиангиогенный фактор уменьшается. Эти изменения вызывают ангиогенез в папиллярной дерме с увеличением миграции эластазоположительных лейкоцитов [188]. T. Ahmed и соавт. (2017) использовал инновационный подход изучения физических свойств коллагена и установил, что наличие возрастных различий в удержании воды внутри фибрилл приводит к изменению их плотности [185].

N.N. Golubtsova и соавт. (2015) провели иммуногистохимическое исследование содержания ангиомотина, эндостатина и баланса между этими веществами у лиц с момента рождения до 85 лет. Авторы отметили возрастное снижение содержания ангиомотина в кровеносных сосудах дермы в возрасте 61–85 лет. Эндостатин-положительные кровеносные сосуды были обнаружены в образцах кожи людей всех возрастов, при этом их количество увеличивалось с возрастом [259]. По данным P.M. Kinn и соавт. (2015), старение кожи сопровождается не только неизбежным истончением эпидермиса, снижением ее барьерной функции, но и постепенным ухудшением эпидермального иммунного ответа, меняется уровень и роль цитокинов, хемокинов и биологических аналитов [290]. В исследовании N.E. Chalyk и соавт. (2017) изучены образцы рогового слоя, полученные неинвазивным методом у 53 лиц женского пола. У пожилых женщин (50–73 года) наблюдалось достоверное уменьшение размера липидных капель и количества кристаллов липидов, а десквамация корнеоцитов была значительно выше [212]. R.M. Elewa и соавт. (2015), выполнив иммуногистохимическое исследование уровня белка кожи 42 молодых и пожилых людей, установили, что с возрастом формируются дефектные реакции на стресс, активируется онкогенез, что было особенно заметно в сальных железах [239].

Вполне закономерно S. Bielfeldt и соавт. (2018) приходят к выводу, что с учетом накопленных знаний о старении в целом, большого количества опубликованных обзоров клинических методов диагностики старения кожи только комплексная количественная оценка, возможно, является объективной мерой, доказательной базой как самих возрастных изменений, так и дерматологических средств, их корректирующих [199]. Помимо неинвазивных методов, позволяющих выполнить количественную оценку старения кожи, исследователи рекомендуют дополнять клинические исследования инвазивными процедурами.

На основе проведенного анализа следует констатировать, что в большинстве случаев объектом исследования была кожа лиц женского пола. Вместе с тем известно, что кожа относится к гормонально зависимым органам. Эстрогены оказывают стимулирующее влияние на рост и развитие клеток эпидермиса, его базального слоя, активируют выработку дермальных волокон фибробластами. Таким образом, эстрогены играют заметную роль в поддержании упруго-эластических свойств кожи, и научные исследования в области дерматогеронтологии доказали взаимосвязь дефицита половых гормонов со старением кожи. Вышеизложенное ограничивает возможность экстраполяции имеющихся данных о возрастных изменениях кожи на противоположный пол.

При анализе литературных источников мы также столкнулись с большим разнообразием числовых значений, характеризующих дермальные волокна. Гистоморфометрическое исследование данных структур в процессе старения — достаточно сложный процесс. Уменьшение эластических свойств кожи как проявление возрастной инволюции — известный факт. Однако разнообразие структурной композиции волокон, зависимость их от целого ряда факторов, разнообразие аранжировки и фрагментации в конечном итоге могут привести к артефактным результатам. Волокна коллагена и эластина «плотно» упакованы, что значительно затрудняет процесс морфометрического исследования. Решение данной проблемы возможно, например, по мнению L. Charles-de-Sá. N.F. Gontijo-de-Amorim, G. Rigotti и соавт. (2020), посредством использования многофотонной микроскопии [214]. Это еще раз подчеркивает необходимость разработки набора признаков, отличающихся технической воспроизводимостью и способностью объективно отражать происходящие с возрастом изменения изучаемого объекта с последующим формированием банка цифровых значений и обработкой ее ММО.

Методика исследования

Гистологический метод исследования. Приготовление препаратов из образцов кожи осуществляется по методике, включающей стандартные процедуры: фиксация в забуференном растворе формальдегида (Формалина♠) (10%) → промывка → стандартная спиртовая проводка → заливка в парафин жидкий → изготовление срезов толщиной 5–7 мкм → окраска гематоксилин-эозином (обзорная окраска).

Для выявления эластических волокон рекомендуется выполнять дополнительное окрашивание по Вейгерту: цвет окрашенных эластических волокон — темно-синий.

Для выявления коллагеновых волокон — дополнительное окрашивание по Ван-Гизону: цвет окрашенных коллагеновых волокон — различные оттенки красного, возможно, пурпурный; по Массону: цвет окрашенных коллагеновых волокон — различные оттенки синего.

Иммуногистохимический метод исследования. Препараты кожи фиксируются в 10-процентном нейтральном забуференном формальдегиде (Формалине^♠) в течение 24 ч. Микроскопическое исследование проводится по традиционным методикам: приготовленные парафиновые срезы окрашивают гематоксилином и эозином по методам Вейгерта, Ван-Гизона. Часть срезов подвергается антигенной демаскировке в 0,1 М цитратном буфере pH 6,0 в течение 30 мин [13], далее срезы обрабатываются первичными антителами Monoclonal Mouse a Hu Ki-67 Clone MM1 фирмы Novocastra (Германия), Monoclonal Mouse a Hu bcl-2 Clone bcl-2/100/D5 той же фирмы, Monoclonal Rb a Hu p53 Clone 318-6-11 фирмы Dako (США), реагентами системы визуализации EnVision+System-HRP (DAV), code K4010 фирмы Dako (США). Экспрессию иммуногистохимических маркеров Ki-67, p53 и bcl-2 определяют в базальном слое эпидермиса неповрежденной кожи путем подсчета общего количества клеток в каждом поле зрения светового микроскопа при увеличении 100–200 (не менее 50 на один гистологический препарат), клеток, меченных МКА к указанным белкам, с последующим вычислением индекса Ki-67-, p53- и bcl-2-позитивных клеток в процентах.

Морфометрический метод исследования. С помощью микроскопа в каждом объекте осуществляют микрофотографирование с проведением дальнейшего морфометрического измерения, используя программу (ImageJ) для морфометрического исследования. Морфометрия проводится в соответствии с общими методологическими рекомендациями. В каждом объекте в трех полях зрения микроскопа с пропуском двух-трех полей зрения осуществляется измерение признаков, представленных в табл. 2-1-1 (рис. 2-1-1 – 2-1-6).

D1 — толщина эпидермиса — является расчетным показателем, полученным путем деления площади эпидермиса на его длину (см. рис. 2-1-1). Аналогичным образом был получен показатель D8 (см. рис. 2-1-3). Суммарный балл возрастной инволюции отражен в показателе D2. При морфологическом описании гистологических препаратов кожи необходимо отметить признаки возрастной инволюции, для оценки степени выраженности которых использована оценка в баллах (0 — отсутствие признака, 1 — наличие признака). Оцениваются: характеристика рельефа эпидермиса в совокупности с состоянием дермо-эпидермального соединения (наличие неравномерной толщины, кератинизации, разрыхления рогового слоя, уплощение дермо-эпидермального соединения); наличие лимфоидной инфильтрации (скопление лимфоидных клеток); наличие дезорганизации коллагеновых волокон; изменение структурной композиции, толщины эластических волокон; наличие скопления меланоцитов. Гистоморфометрия показателя D3 производится на препаратах, окрашенных по Массону. При данной окраске коллагеновая соединительная ткань приобретает интенсивно-синий цвет, облегчающий процесс распознавания и последующее измерение (см. рис. 2-1-2).

Контуром желтого цвета обозначена граница сосочкового слоя дермы между базальным слоем эпидермиса и уровнем расположения поверхностных сосудов (см. рис. 2-1-3). Измерение длины дерма-эпидермального соединения (D5) — расстояние между точками А и В на рис. 2-2-4 — разметка контуром зеленого цвета. Показатель D6 — расстояние между точками А и В по прямой (см. рис. 2-1-5). Показатель D7 рассчитывается как соотношение D5/D6 (см. рис. 2-1-4, 2-1-5). Показатель D10 рассчитывается как соотношение AB/CD, где AB — длина волокна, CD — перпендикуляр к наиболее удаленной точке завитка эластического волокна (см. рис. 2-1-6). Измерение данного показателя производится на препаратах кожи, окрашенных по Вейгерту с увеличением до 200. Данная окраска позволяет выявить эластические волокна в тканях (см. рис. 2-1-4 – 2-1-6).

Характеристика возрастных изменений кожи. Гистологическая картина эпидермиса в детском возрасте характеризуется тонким, недостаточно развитым базальным слоем с повышенной митотической активностью клеток, слаборазличимыми зернистым и блестящим слоями, тонким (2–3 ряда клеток) роговым слоем. Коллагеновые волокна — в виде нежных волокнистых структур, расположенных достаточно рыхло в сетчатом слое дермы. Эластические волокна — в виде густых сплетений, напоминающих клубки. Дермальные волокна имеют меньшую, чем у взрослых, толщину (D4=1,52±0,09; σ=0,39; p <0,05). У детей и подростков практически все изученные морфометрические показатели меньше, чем у взрослых, что свидетельствует о процессе роста и развития. При иммуногистохимическом исследовании индекс пролиферации Ki-67 в кератиноцитах базального слоя эпидермиса в возрасте до 10 лет находится в пределах 22,0±4,2% (18,3–24,7) при p <0,05. Количество базальных клеток, экспрессирующих маркер апоптоза: р53=0,2±0,05% (0,1–0,3) при p <0,05. В большом количестве эпителиоцитов базального слоя экспрессируется маркер bcl-2=15,3±1,2% (12,2–17,1) при p <0,05 (рис. 2-1-7, а–в).

В юношеском возрасте суммарный балл признаков возрастной инволюции (D2) равнялся нулю. По нашим данным, именно к 20 годам гистоморфометрические показатели достигают уровня дефинитивных значений. Это и толщина эпидермиса (D1)=59,95±0,33; σ=0,98; p <0,05; и толщина сосочкового слоя дермы (D8)=137,27±2,43; σ=7,29; p <0,05. Базальная мембрана хорошо развита, о чем свидетельствуют значения интегрального индекса (D7)=1,48±0,03; σ=0,08; p <0,05.

К 20 годам увеличивается количественное содержание эластических волокон, сами волокна утолщаются: D4=1,92±0,08; σ=0,36; p <0,05. Процентное содержание коллагеновых волокон при этом по сравнению с предыдущей возрастной группой практически не меняется.

Возраст от 21 до 30 лет можно расценить как период относительной стабилизации ввиду отсутствия признаков возрастных изменений, выраженных в количественном эквиваленте (рис. 2-1-8, 2-1-16, 2-1-18, 2-1-20, 2-1-22, 2-1-24, 2-1-26). В последующей декаде уже отмечены начальные признаки возрастных изменений.

В возрасте от 31 до 40 лет незначительно снижается (на 3,5%) по сравнению с возрастной группой от 21 до 30 лет количественное содержание коллагеновых волокон, уменьшается (на 5,6%) толщина эластических волокон. Уменьшение на 14% значений показателя, характеризующего дермо-эпидермальное соединение, не сопровождается визуально различимой сглаженностью (рис. 2-1-10, 2-1-12, 2-1-14). Среднее значение количества баллов возрастных изменений D2=0,98±0,20; σ=1,27; p <0,05.

В гистологических препаратах кожи от трупов лиц в возрасте 41–50 лет возрастные изменения более выраженные: снижается (на 8%) толщина эпидермиса, главным образом за счет истончения шиповатого и зернистого слоев. Роговой слой, напротив, демонстрирует тенденцию к утолщению, разрыхлению. В базальном слое эпидермиса выявлялись единичные участки как гиперплазии, так и атрофии. Отмечается визуально различимая сглаженность дермо-эпидермального соединения. D7=1,12±0,01; σ=0,01; p <0,05. Снижение его по сравнению с декадой 21–30 лет составляет 22,3%. Толщина сосочкового слоя дермы уменьшается (на 3,5%), D8=135,10±4,11; σ=21,46; p <0,05. В верхних отделах дермы формируются первоначальные признаки изменений коллагеновых волокон в виде сглаженной фибриллярности. Нарушение периодической исчерченности исследователи связывают с недостатком зрелых молекул коллагена [36, 87]. Волокна располагаются более рыхло, появляются единичные участки гомогенизации, нарушается их пространственная ориентация за счет расположения вдоль поверхности (см. рис. 2-1-9). Снижается по сравнению с декадой 21–30 лет содержание коллагеновых волокон (на 2,8%), толщина эластических волокон увеличивается в 1,5 раза.

Различим дисбаланс коллаген-эластинового соотношения как предикт образования морщин. Следует отметить, что в целом возрастной интервал 41–50 лет имеет достаточно высокий темп возрастных изменений. Индекс пролиферации Ki-67=9,1±2,2% (7,3–11,6). Количество базальных клеток, экспрессирующих маркер апоптоза: р53=1,8±0,6% (1,0–2,3). Экспрессия маркера bcl-2 в эпителиоцитах=4,7±2,1% (2,5–7,5) (см. рис. 2-1-7, г–е).

Возрастная инволюция в последующее десятилетие (51–60 лет) продолжается, что подтверждается статистически достоверными различиями исследуемых показателей с более молодыми возрастными группами. Толщина эпидермиса по сравнению с группой 21–30 лет уменьшается на 20,7%, по сравнению с предыдущей — на 12%. Нарушается роговой слой, прогрессирует сглаженность контура дерма-эпидермального соединения, интегральный индекс (D7=1,10±0,02; σ=0,08; p <0,05). Снижение его по сравнению с возрастной группой 21–30 лет составляет 24,5%, по сравнению с предыдущим десятилетием — на 1,8%. В дерме формируются визуально различимые пустоты, прогрессирует редукция волокнистой сети. Уменьшается процентное содержание коллагеновых (на 10%) и эластических волокон, изменяется соотношение плотности их распределения. В первую очередь, с редукцией эластических волокон связывают процесс снижения эластичности возрастной кожи и формирование морщин. Фиксируются фрагментация коллагеновых волокон и гетерогенность их структуры, в препаратах появляются скрученные, комковатые волокна. По мере старения подобные явления распространяются на более глубокие слои дермы. Происходящие процессы, вероятнее всего, сопряжены с изменением гормонального уровня.

С возрастом эластические волокна характеризуются формированием участков «сенильного эластоза». Следует отличать его от солнечного актинического эластоза, представляющего собой деструкцию дермальных волокон с формированием базофильных гомогенных масс. Патогистологическим маркером фотостарения является скопление преимущественно в сосочковом слое дермы эластоидных масс на фоне дегенеративных изменений коллагена [214].

В пожилом возрасте возрастная инволюция продолжается, однако темп происходящих изменений в седьмой (61–70 лет) и восьмой (71–80 лет) декадах снижается. Эпидермис истончается и разрыхляется. Дермальные волокна с выраженной пространственной дезорганизацией имеют вид хаотичных, грубых (утолщенных) пучков с участками гомогенизации, встречаются участки «запустения» (без соединительнотканных волокон). Граница между эпидермисом и дермой выравнивается, в восьмой декаде зачастую имеет вид прямой линии. Снижено количество фибробластов. Содержание коллагеновых волокон по сравнению с периодом относительной стабилизации уменьшается на 24%. Нарушается периодическая исчерченность волокнистых структур (см. рис. 2-1-13, 2-1-23). Происходящие процессы, вероятнее всего, связаны с нарушением процесса «созревания» коллагена, нарушением соотношения предшественников и зрелых субстанций [36, 87]. Эластические волокна огрубевают, волокна теряют контурность, разбухают, окрашиваются метахромно. Толщина эластических волокон у лиц в возрасте от 61 до 70 лет увеличивается по сравнению со значениями в возрасте от 21 до 30 лет более чем в 2 раза. Значение показателя, характеризующего выраженность завитка эластического волокна, также увеличивается в 2,23 раза. Визуально различимо не только утолщение волокон, но и увеличение объемной доли этих волокон в гистологическом препарате. При окраске по Вейгерту в сосочковом слое дермы выявляются фуксинофильноокрашенные эластические волокна (см. рис. 2-1-13, 2-1-17, 2-1-19, 2-1-21, 2-1-23).

У лиц старше 75 лет эпидермис достаточно тонкий, с перинуклеарной вакуолизацией клеток. Толщина эпидермиса (D1)=47,95±1,77 (см. рис. 2-1-15). В базальном слое эпидермиса у лиц старше 70 лет индекс пролиферации Ki-67 составляет 1,7±0,6% (0,3–2,8) при p <0,05. Количество базальных клеток, экспрессирующих маркер апоптоза: р53=6,2±1,9% (5,5–7,8) при p <0,05. В умеренном количестве эпителиоцитов базального слоя экспрессируется маркер bcl-2 — 0,4±0,1% (0,1–0,5) при p <0,05 (см. рис. 2-1-7, ж–и). Сосочковый слой дермы атрофирован, граница между эпидермисом и дермой нередко представляется в виде ровной линии. В дерме, особенно в ее сосочковом слое, уменьшено количество клеточных элементов. В старческом возрасте расширяются зоны разряжения, визуализируются очаги деколлагенизации (в них различимы тоненькие волоконца, глыбки, обрывки коллагена), увеличивается фуксинофилия волокон. Деструкция эластических волокон нарастает, они набухают, утолщаются, склеиваются с формированием «комков», частично фрагментируются, распадаются.

На рис. 2-1-8, 2-1-10, 2-1-12, 2-1-14, 2-1-18, 2-1-20, 2-1-22, 2-1-24, 2-1-26 — хорошо выраженное эпидермально-дермальное соединение, множественные сосочки, эпидермис с пролиферативной активностью. Дермальные волокна относительно упорядочены, с чередованием коллагеновых и эластических волокон; равномерно расположены по всей поверхности, имеют вид «мазков» розового цвета.

На рис. 2-1-9 — сглаженность эпидермально-дермального соединения, неравномерная толщина эпидермиса, выраженная кератинизация; огрубение коллагеновых волокон, количество эластических волокон снижено.

На рис. 2-1-11, 2-1-13 — сглаженность эпидермально-дермального соединения, разрыхление рогового слоя. На рис. 2-1-13 — неравномерное истончение эпидермиса, уменьшение количества его слоев, дезорганизация, фрагментация дермальных волокон.

На рис. 2-1-15 — истончение и уменьшение количества слоев эпидермиса.

На рис. 2-1-17 — тонкие дезорганизованные волокна с фрагментацией; эластоз.

На рис. 2-1-19 — сглаженность эпидермально-дермального соединения, неравномерное истончение эпидермиса, уменьшено количество слоев, базальная мембрана не выражена; дезорганизация волокон, эластоз; уменьшение толщины сосочкового и сетчатого слоев дермы.

На рис. 2-1-21 — сглаженность эпидермально-дермального соединения (неравномерное истончение эпидермиса, избыточная кератинизация); дезорганизация волокон, эластоз.

На рис. 2-1-23 — сглаженность эпидермально-дермального соединения; дезорганизация волокон, эластоз.

На рис. 2-1-25 — сглаженность эпидермально-дермального соединения, неравномерное истончение эпидермиса, избыточная кератинизация; коллагеновые волокна расположены рыхло, параллельно поверхности эпидермиса; эластоз; дезорганизация волокон, более выраженная в верхнем слое дермы. На рис. 2-1-27 — фрагментация волокон, очаги гомогенизации.

Резюме. Возрастная инволюция, сопровождающая хроностарение кожи, присуща всем компонентам как эпидермиса, так и дермы [124, 125].

Полученные результаты [124] доказывают возможность использования иммуногистохимических маркеров Ki-67, bcl-2, p53 как количественных параметров комплексной оценки биологического возраста.

Установлено, что с возрастом коллагеновый матрикс подвергается существенным инволютивным изменениям, характеризующимся определенной динамикой. Уменьшение процентного содержания коллагеновых волокон отмечено уже у лиц в группе от 31 до 40 лет. Процент снижения данного показателя в последующие декады составил 4,2% (41–50 лет), 3,2% (51– 60 лет). Толщина эластического волокна увеличивалась на протяжении трех декад (31–40; 41–50; 51–60 лет) с минимальным приростом в последующем. Схожая динамика зафиксирована и у показателя, характеризующего выраженность завитка эластического волокна: максимум прироста в период от 31 до 60 лет и минимум в последующие годы. Количественные изменения сопровождались и качественными преобразованиями: дезорганизацией, уплотнением волокон, их утолщением и скрученностью. Интегральный индекс, характеризующий дерма-эпидермальное соединение, продемонстрировал наличие достоверных различий между возрастными группами с десятилетним интервалом. Несомненным преимуществом данного параметра является его универсальность (для измерения не требуется уникального окрашивания), а также хорошая воспроизводимость показателя.

Состояние вопроса. ЩХ (сartilagо thyrоidea) является самым крупным из девяти хрящей гортани. Он располагается впереди щитовидной железы и не полностью окружает гортань. Состоит из двух половин (пластинок) четырехугольной формы, которые конъюгируют в середине, образуя выступ гортани — «адамово яблоко». Нижний край каждой пластинки формирует с перстневидным хрящом перстнещитовидный сустав. На верхнем крае хряща имеется треугольная верхняя щитовидная вырезка. Нижняя щитовидная вырезка на нижнем крае хряща выражена слабо.

Задние края пластинок образуют верхние и нижние рога. Верхний рог является длинным и узким, а нижний — широким, коротким, толстым и заканчивается конической частью, которая дает продолжение щитовидной связке и имеет суставную поверхность для соединения с перстневидным хрящом. Весь верхний край ЩХ присоединен к подъязычной кости щитовидной мембраной. По наблюдениям С.Б. Зелигмана, первые признаки этой мембраны обнаруживаются у эмбриона, и наибольшего развития она достигает в конце периода полового созревания [51]. Верхние рога ЩХ соединяются с подъязычной костью щитоподъязычной связкой, в которой может располагаться небольшой волокнистый хрящ — сесамовидный хрящ (остаток ранее существовавшей связи между ЩХ и подъязычной костью).

ЩХ располагается на уровне IV–V шейных позвонков . Косая линия пластинок ЩХ располагается на уровне верхнебоковых краев щитовидной железы. В области верхнего края пластинок может располагаться щитовидное отверстие, пропускающее верхнюю гортанную артерию. Движение хряща в суставе вызывает изменение напряженности в голосовых складках, которая, в свою очередь, производит изменение голоса [63].

Источниками развития хрящей гортани являются энтодерма первичной кишки и мезодерма [76]. Закладки будущих хрящей появляются очень рано, на 4-й неделе внутриутробного развития, источником их развития являются вторая и третья жаберные дуги. На 5-й неделе внутриутробного развития на месте будущего образования черпаловидных хрящей формируются бугорки, представляющие собой скопления мезенхимы, — источники развития черпаловидных хрящей и черпаловидно-надгортанных складок. Спереди от них закладываются рожковидные и клиновидные хрящи. На ранней стадии развития большие рога подъязычной кости непосредственно переходят в верхние рога ЩХ. В последующем происходит их обособление, и на этом месте образуется боковая щитовидно-подъязычная связка. На момент рождения гортань у новорожденного расположена выше своей скелетотопической границы у взрослого человека, хрящи уже сформированы и находятся на уровне II–IV шейных позвонков. Пластинки ЩХ по структуре очень тонкие и эластичные, угол смыкания между пластинками тупой. У новорожденных он составляет 130°, к 16 годам у мальчиков и девочек он равен 106° и 128° соответственно [76].

По данным A. Gawlikоwska-Strоka и соавт. (2010), размеры хрящей гортани недоношенных детей, новорожденных и маленьких детей последовательно увеличиваются и находятся в прямой связи с ростом ребенка [250]. В дальнейшем в постнатальном онтогенезе происходит изменение размеров ЩХ. В первые 4 года размеры гортани быстро увеличиваются. В период полового созревания отмечается второй этап активного роста, который продолжается до 25 лет. Вместе с увеличением размеров самого ЩХ его пластинки становятся более толстыми, но продолжают сохранять свою гибкость. Дальнейшие возрастные изменения связаны с отложением солей кальция и окостенением, при этом пластинки становятся более хрупкими и ломкими [404].

Морфометрические параметры ЩХ в постнатальном онтогенезе имеют не только возрастные, но также половые и расовые (этнические) отличия [51, 186, 216, 282, 333, 346, 350]. Некоторые исследователи отмечают множество вариантов и индивидуальных особенностей процесса окостенения этих хрящей [337, 338]. Основные факторы, с которыми они связывают этот процесс, — пол, возраст, наличие сопутствующих хронических заболеваний, функциональная активность органа.

Гистологическое строение ЩХ. ЩХ состоит из гиалиновой хрящевой ткани, которая является самым распространенным типом хряща в организме человека [310]. Она формирует скелет зародыша, а во взрослом организме содержится в местах соединения ребер с грудиной, в гортани, воздухоносных путях и на суставных поверхностях костей [363].

В процессе эмбрионального развития мезенхимальные клетки из мезенхимальной бластемы дифференцируются в хондробласты, а те, в свою очередь, в хондроциты. Хондробласты и их предшественники располагаются в надхрящнице и синтезируют основное вещество хряща (его матрикс), который занимает до 95% его объема и состоит из 60–80% внутриклеточной жидкости, 15% коллагеновых волокон (80% — II типа; 15% — IX, XI; 5% — III, VI, X, XII, XIV типа), 9% глюкозоаминогликанов, протеогликанов, аггреканов (хондроэтин-4-сульфат, хондроэтин-6-сульфат, кератин сульфат) и 5% гликопротеинов и глюкозоаминогликанов [108, 109, 219, 220].

При этом клетки хрящевой ткани (хондробласты, хондроциты I, II, III типа) занимают до 5% объема хряща. Молодые клетки, выделяя глюкозоаминогликаны и другие вещества, замыкают себя в капсулу, превращаясь в хондроциты в лакунах. Далее вследствие нарушения синтетических и секреторных процессов в хондроцитах они после деления далеко не расходятся и образуют так называемые изогенные группы хрящевых клеток, зрелые хондроциты [11, 219].

Снаружи ЩХ покрыт надхрящницей, под которой располагаются молодые хондроциты веретенообразной формы. В более глубоких слоях хрящевые клетки увеличиваются в размере и приобретают овальную, округлую или кубическую форму.

С возрастом в хрящевой ткани уменьшаются концентрация глюкозоаминогликанов, количество внутриклеточной жидкости, появляются асбестовые волокна (скопление коллагеновых фибрилл), ослабляются процессы деления клеток, что приводит к дегенеративным перестройкам хряща. С помощью хондрокластов происходит резорбция дистрофически измененных клеток и межклеточного вещества. Отмечено, что в зонах перестройки хряща могут появиться кровеносные сосуды или начаться процессы кальцификации [202, 244]. Также была отмечена важная роль апоптозахондроцитов в возрастных изменениях хряща. Апоптоз является важной составляющей механизма гибели хондроцитов в процессе эндохондрального окостенения [221].

Процесс эндохондрального окостенения происходит в детском возрасте, когда на замену гиалиновому хрящу приходит кость. Кроме того, данный тип хряща формирует эпифизарную пластину роста и суставную поверхность на костях [363]. Энхондральная оссификация — это сложный процесс, во время которого покоящиеся хондроциты подвергаются быстрой клеточной пролиферации, затем гипертрофируются, подвергаются минерализации, клеточной гибели и замещаются костными клетками. Ультраструктурный анализ показал, что процесс минерализации в ЩХ начинается близко к хрящевым каналам, содержащим коллагеновые (асбестовые) волокна [221]. Причины возникновения этих процессов до конца не поняты. Kirsсh и Сlaassen установили непосредственную взаимосвязь между пузырьками в межклеточном веществе хряща, содержащими «игольчатые кристаллы», и местами возникновения полей минерализации в ЩХ в процессе эндохондральной оссификации.

С помощью иммуногистохимических исследований было показано, что большое количество зрелых хондроцитов подвергается запрограммированной клеточной гибели, сопровождающейся клеточной фрагментацией и гидропическим отеком клеток, что также вносит свой вклад в возрастную перестройку структуры ЩХ. Как и многие хрящи человека, ЩХ подвергается оссификации и кальцификации с возрастом. Отметим, что это два разных процесса, причем кальцификация всегда предшествует оссификации [338]. Вышеописанные изменения являются естественными процессами минерализации хрящевой ткани, которые обычно начинаются после подросткового периода и постепенно активизируются с возрастом [337].

Возможность идентификации личности по возрастным особенностям ЩХ. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы показал, что изучение ЩХ в целях идентификации имеет разрозненные данные о его гендерных различиях [51, 186, 220, 295] и возрастных изменениях в отдельные возрастные периоды и большую вариабельность полученных данных [220, 230, 231, 249, 337, 338, 341].

По данным отечественных ученых, обызвествление хрящей гортани и замещение их костной тканью является физиологическим процессом и начинается с момента прекращения роста скелета, с периода полового созревания, и увеличивается с возрастом [51]. В результате другого исследования И.В. Грабова и Л.В. Дервисье более точно установлено, что окостенение хрящей гортани начинается с ЩХ в возрасте 19–20 лет у мужчин, с 18 лет — у женщин. Было доказано, что скорость процесса окостенения зависит не только от пола и возраста, но и от влияния эндокринной системы и работы мышц [63].

Литературные данные о рентгенанатомии ЩХ имеют отрывочный характер. Показано, что необызвествленный хрящ частично задерживает рентгеновские лучи и представлен гомогенной малоинтенсивной тенью на уровне IV–VI позвонков. С возрастом в результате обызвествления тень хряща становится более отчетливой, и хорошо заметна его конфигурация. В пожилом и старческом возрасте ЩХ приобретает тонкую костную структуру, напоминающую атрофированную кость [243].

В 1959 г. С.Б. Зелигман на 844 образцах гортани от мужчин и женщин проследил их возрастные изменения и сделал вывод о естественной природе замещения хрящевой ткани на костную. Эти изменения он расценил как закономерные возрастные преобразования, которые начинаются в 16 лет у мужчин и в 17 лет у женщин. Особо было отмечено, что данную особенность строения гортани можно использовать для определения возраста и пола индивида [51].

Вопросы возрастных особенностей ЩХ широко освещены в работах L.M. Turk и соавт. Они проследили различные изменения в хрящах гортани человека рентгенографическими и гистологическими методами на 48 трупах (21 труп мужского пола и 27 трупов женского пола) в диапазоне от 14 до 101 года. У всех объектов исследования наблюдались рентгенологические признаки кальцификации гиалиновых хрящевых тканей хрящей гортани. Гистологическое исследование показало различные дегенеративные процессы, включая кальцификацию, но также выявило оссификацию даже у некоторых молодых образцов. Был сделан вывод о том, что рентгенологическое исследование было точным методом обнаружения кальцификации и оссификации, которые были различимы, так как более крупные массы кальцифицированного хряща имеют плотный однородный рентгенологический вид, в отличие от трабекулярного рисунка кости [395].

Известно, что хрящи гортани с возрастом претерпевают изменения, к числу которых относятся минерализация и окостенение. G.L. de la Grandmaisоn и соавт. количественно проанализировали степень непроницаемости гортанных хрящей для ионизирующего излучения, чтобы определить, может ли рентген гортани использоваться в судебной медицине для оценки возраста человека. Была выявлена положительная корреляция между степенью полной непроницаемости для ионизирующего излучения гортани и возрастом, получен коэффициент корреляции 0,7 [231].

S.Türkmen и соавт. проводили ретроспективное исследование по определению рентгенологических физиологических возрастных изменений в гортани у 300 человек. Авторы обратили внимание, что окостенение в ЩХ началось в нижнем роге и прогрессировало до переднего рога по центральной тонкой пластинке. Исследователи пришли к выводу, что возрастные изменения гортанных тканей очевидны на рентгенограммах, а потому рентгенографию ЩХ можно использовать как эффективный метод идентификации возраста [396].

M.Mupparapu и соавт. провели ряд исследований для определения изменений физиологического окостенения гортанных хрящей, оценив рентгенограммы шеи здоровых мужчин и женщин (n=359). Частоты и доверительные интервалы были получены и сведены в таблицу показателей окостенения ЩХ и перстневидного хряща. Окостенение ЩХ наблюдалось чаще по сравнению с перстневидным хрящом. Различные степени окостенения ЩХ и перстневидного хряща были обнаружены у 186 пациентов в возрасте 30 лет и старше. Рентгенологически было установлено, что темпы окостенения увеличиваются с возрастом, наиболее активно — после 30 лет [338].

В другом исследовании J. Сheng и соавт. искали точный метод определения возраста лиц мужского пола. В исследование были включены 73 мужчины, возраст которых был известен. Восемь показателей отобрали по рентгенограммам, которые были разделены на шесть уровней, а затем выстраивали математическую модель, чтобы определить возраст методом линейной регрессии. В результате среднеквадратичное отклонение для ЩХ у мужчин составило 1,854, а коэффициент корреляции — 0,9971. Таким образом, наблюдение доказало, что оценка возраста с помощью рентгенографических показателей ЩХ может подойти для возрастной идентификации лиц мужского пола от 13 до 67 лет [216].

K.D. Dang-Tran и соавт. в своей работе пришли к выводу, что дальнейшее усовершенствование методов рентгенологической визуализации ЩХ позволит более точно оценивать временные рамки его окостенения. Авторы ретроспективно проанализировали снимки компьютерной томографии 312 французских пациентов с применением программной постобработки, чтобы исследовать образец окостенения ЩХ, вычислив костный объем хряща на 3D-реконструкциях. Коэффициенты корреляции Пирсона между возрастом и морфологическими изменениями ЩХ составили 0,73 для мужчин и 0,75 для женщин (среднее квадратичное отклонение — 18,02 и 17,06) и указывали на значительную межличностную изменчивость. Хотя корреляция между возрастом и морфологическими изменениями ЩХ была найдена, авторы отмечают, что данный метод изучения окостенения ЩХ был недостаточно точным для оценки возраста конкретного индивида [230].

Из-за увеличивающейся с возрастом хрупкости ЩХ весьма подвержен повреждению при травмах шеи, особенно у лиц старшего возраста. Р. Naimо и соавт. провели исследование компьютерных томограмм головы и шеи 431 умершего человека в возрасте от 1 дня до 100 лет, включая 25 жертв удушения, для оценки их возрастных изменений. Было обнаружено, что связь возраста и окостенения существует, но в этом исследовании не было возможности установить узкие диапазоны возраста по степени кальцификации ЩХ [341, 346].

В зарубежной литературе имеется ряд работ по изучению антропометрических характеристик ЩХ в различных популяциях. Проведено исследование взрослого населения Хорватии [295], Нигерии [186], Индии [333] и др. Во всех работах была обнаружена значительная разница размеров ЩХ у мужчин и женщин, но отсутствуют данные об их возрастных изменениях.

Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что в литературе имеются разрозненные сведения, касающиеся рентгенологических, антропометрических, гистологических особенностей строения ЩХ человека. Описана динамика окостенения и строения, но отсутствует подробное описание его гистологической структуры в различные возрастные периоды. При этом следует отметить, что в большинстве работ отсутствуют количественные характеристики изучаемых показателей, так же как и комплексный подход к изучению его возрастных изменений и половых отличий.

Методика исследования

Рентгенологический метод. Рентгенологическое исследование ЩХ выполняется в передней проекции при помощи рентгенаппарата (например, SRI, модель SR-130 SDU, при следующих параметрах: KVP — 40, MAS — 0,7, TIME — 0,05, L — 86 см), с записью результатов в графические файлы формата DIСОMс последующей конвертацией в JPEG-формат. Полученное графическое изображение рентгенограммы ЩХ исследуется с помощью программы графического анализа изображений (Adоbe Phоtоshоp СS6).

Алгоритм исследования включает следующие этапы: определение на снимке рентгенограмм общей площади ЩХ, вычисление площади костной, хрящевой ткани в процентах и их соотношения относительно друг друга (рис. 2-2-1, 2-2-2).

Гистологический метод. Для гистологического исследования при вскрытии трупов необходимо изъять подъязычно-гортаннотрахеальный комплекс, провести его внешний осмотр и мануальное исследование. Далее — провести скелетирование и отслойку надхрящницы с последующим забором части правой пластинки ЩХ размером до 1,5 см (рис. 2-2-3).

Приготовление препаратов из ЩХ осуществляется по методике, включающей стандартные процедуры: это фиксация в забуференном растворе формальдегида (Формалина♠) (10%) → промывка → стандартная спиртовая проводка → декальцинация срезов в 12-процентном растворе азотной кислоты → заливка в парафин жидкий → изготовление срезов толщиной 5–7 мкм → окраска гематоксилин-эозином.

С помощью микроскопа в каждом объекте проводят микрофотографирование с проведением дальнейшего морфометрического измерения, используя программу для морфометрического исследования и программу графического анализа изображений (Adоbe Phоtоshоp СS6). Дальнейшая морфометрия проводится в соответствии с общими методологическими рекомендациями [1, 23, 24, 154, 232].

В каждом объекте в трех полях зрения микроскопа с пропуском двух-трех полей зрения осуществляется измерение следующих параметров: площадь костной ткани, площадь хрящевой ткани, средняя площадь костной ткани в поле зрения, средняя площадь хрящевой ткани в поле зрения, средняя ширина хрящевой пластинки, толщина кортикальной пластинки, количество трабекул в препарате и в поле зрения микроскопа, средняя площадь трабекул, средняя длина трабекул, максимальная толщина трабекул, минимальная толщина трабекул, средняя толщина трабекул, количество молодых хондроцитов, количество зрелых хондроцитов, ширина зоны молодого хряща, ширина зоны зрелого хряща, соотношение зон зрелого и молодого хряща, площадь ретикулярной и жировой ткани и их соотношение (табл. 2-2-1, рис. 2-2-4 – 2-2-7). Методика проведения измерений представлена в табл. 2-2-2.

Начальное поле зрения соответствует левому верхнему участку препарата, далее предметное стекло смещается слева направо и сверху вниз. Измерения проводятся не во всех полях зрения, а с пропуском до трех-четырех полей зрения.

Характеристика возрастных изменений хрящевой ткани. В возрасте до 18 лет ЩХ представлен только хрящевой тканью. Так как хрящевая ткань плохо отражает рентгеновские лучи, в данном возрастном периоде хрящи гортани достаточно плохо визуализируются, видны только наружные и внутренние контуры (очертания) ЩХ (рис. 2-2-8).

С 19 и до 35 лет в нижнезаднем углу и нижних рогах ЩХ появляются первые очаги костной ткани (костная ткань занимает до 29% площади хряща — табл. 2-2-3). С увеличением возраста к уже имеющемуся окостенению присоединяется костная ткань в нижней части пластинки: она занимает сначала 1/4 ее высоты, затем — 1/2 пластинки (табл. 2-2-3). На рентгенограмме начинают достаточно ясно и четко вырисовываться основные анатомические элементы ЩХ ввиду его прогрессирующего окостенения. Очаги кальцификации у нижнего края пластинки с возрастом распространяются в разные стороны, приобретая «костную рамку», или «краевое» окостенение (табл. 2-2-3, рис. 2-2-9, 2-2-10).

В возрастной группе от 36 до 60 лет отмечается окостенение задних краев пластинок, и общий процент окостенения занимает до 59% площади ЩХ. На рентгенограмме обнаруживаются массивные бесформенные тени окостеневшего хряща снизу пластинок с образованием «выроста», образующегося при слиянии краевого окостенения (табл. 2-2-3, рис. 2-2-11, 2-2-12).

С 61 года до 96 лет костная ткань распространяется вверх по пластинке и затрагивает всю толщину верхних рогов и большую часть пластинок (до 100% площади). Обызвествление костей и хрящей в пожилом возрасте создает прекрасные возможности для прослеживания его анатомических структур на рентгенограммах. Отмечается значительное усиление интенсивности теней окостеневших хрящей и повышение резкости их контуров (табл. 2-2-3, рис. 2-2-13).

С увеличением возраста меняется соотношение костной и хрящевой ткани в ЩХ, это выражено в увеличении площади костной и уменьшении доли хрящевой ткани.

Гистологические характеристики возрастных изменений хрящевой ткани. В возрастной группе до 18 лет ЩХ во всех случаях был представлен хрящевой тканью (рис. 2-2-14), состоящей из одиночно расположенных молодых хондроцитов небольшого размера правильной округлой и овальной формы, расположенных диффузно по всему препарату в слабоокрашенном межклеточном веществе (рис. 2-2-15 – 2-2-18). К концу данного возрастного периода появляется зона зрелого хряща, что сопровождается уменьшением количества молодых хондроцитов, появлением отдельных изогрупп, состоящих из двух-пяти зрелых хондроцитов (рис. 2-2-19).

В возрасте 19–35 лет процесс окостенения хряща начинается у нижнего края пластинки (рис. 2-2-20, 2-2-21). На препарате молодые хондроциты в небольшом количестве образуют зону молодого хряща (рис. 2-2-22 – 2-2-23), а зрелые — увеличиваются по объему и площади и преобладают над количеством молодых (рис. 2-2-24), костная ткань представлена единичными, тонкими, округлыми, шаровидными, небольшими трабекулами с расположенной между ними ретикулярной тканью (рис. 2-2-27).

На препаратах ЩХ в возрасте 36–60 лет костная ткань занимает до половины хряща (рис. 2-2-28, 2-2-29), на препарате зона зрелого хряща присутствует почти во всех полях зрения, зрелые хондроциты преобладают над единичными молодыми хондроцитами, составляющими уменьшенную зону молодого хряща (рис. 2-2-30, 2-2-33). На фоне увеличения площади костной ткани в препарате увеличивается количество трабекул (рис. 2-2-30 – 2-2-33).

По сравнению с более молодыми возрастными группами отмечается заметное увеличение толщины трабекул и их количества в поле зрения, пространство между костными балками частично заполнено жировой тканью, в отличие от более молодого возраста, где наблюдается ее полное отсутствие или преобладание ретикулярной ткани.

В возрасте более 61 года хрящевая ткань сохранена в единичных случаях только в верхней трети и представлена зрелыми и единичными молодыми хондроцитами, в остальных случаях ЩХ представлен только костной тканью (рис. 2-2-34, 2-2-35). Пространство между трабекулами заполнено в основном жировой тканью (рис. 2-2-36 – 2-2-40).

Морфометрические признаки возрастных изменений хрящевой ткани. У детей и подростков (до 19 лет) хрящевая ткань «молодая», с преобладанием хондробластов (в 2 раза больше) над числом хондроцитов. Костная ткань отсутствует. В данной возрастной группе следующие морфологические параметры имеют сильную корреляционную связь с возрастом: число хондробластов (r=–0,8), ширина участка молодого хряща (r=–0,8), ширина участка зрелого хряща (r=–0,85), соотношение зоны молодого и зрелого хряща (r=–0,86).

С 19 до 35 лет активные процессы оссификации и созревания хрящевой ткани подтверждены коэффициентами корреляции. В данной возрастной группе следующие морфологические параметры имеют сильную корреляционную связь с возрастом: площадь (S) костной ткани (%) (r=0,7); S костной ткани (мкм2) (r=0,71); S жировой ткани (r=0,82); S хрящевой ткани (%) (r=–0,76).

Корреляционная связь средней силы отмечена у показателей: число костных трабекул в препарате (r=0,59); минимальная длина трабекул (r=0,54); ширина кортикального слоя (r=0,51); число хондробластов (r=–0,67); ширина зоны зрелого хряща (r=0,57); ширина зоны молодого хряща (r=–0,54); ширина хрящевой пластинки (r=–0,68); соотношение костной и хрящевой ткани в препарате (r=0,54).

Микроскопическая картина ЩХ для возрастного периода 36–60 лет характеризуется относительной стабилизацией большинства признаков, кроме морфометрических характеристик костных балок. В данной возрастной группе наиболее выражены морфологические изменения у следующих признаков: максимальная и минимальная длина трабекул, площадь хрящевой ткани в мкм2 и соотношение площади костной к хрящевой ткани в процентах. Отмечается достоверный прирост длины трабекул (на 37%), увеличение их толщины (на 40%) и количества (в 1,18 раза). Длина трабекул в препарате имеет коэффициент корреляции с возрастом средней силы (r=0,55). Межтрабекулярное пространство заполнено жировой тканью (с увеличением ее площади по сравнению с предыдущей возрастной группой в 5,3 раза) и ретикулофиброзной (с увеличением площади по сравнению с предыдущей возрастной группой в 4,2 раза) примерно в равном долевом соотношении. Уменьшение площади хрящевой ткани сопровождается увеличением числа хондроцитов (в 1,3 раза) с явным преобладанием хондроцитов над хондробластами и формированием зоны зрелого хряща. Вокруг образованных костных структур сохраняется хрящевая ткань с группами хондроцитов из четырех-пяти клеток.

В возрастной группе старше 61 года ЩХ практически полностью оссифицирован, небольшие участки хрящевой ткани имеются в верхней трети пластинок; костные трабекулы неоднородные по длине и толщине. Зафиксированное в данной возрастной группе достоверное увеличение площади костной ткани в препарате связано с увеличением (в 1,8 раза) длины трабекул по сравнению с более молодым возрастом и средней толщины в 1,5 раза (длина минимальная в 1,45 раза, длина максимальная в 1,33 раза). Установлена достоверная связь средней силы средней толщины костных трабекул с возрастом (r=0,65). Межтрабекулярное пространство заполнено преимущественно жировой тканью, показатель соотношения площади жировой и ретикулярной ткани увеличился в 1,28 раза за счет значительного прироста (более чем в 2 раза) площади жировой ткани. Помимо уменьшения самой площади хрящевой ткани (почти в 3 раза, с 43,16 до 14,80%), резко снижено количество молодых хондроцитов (r=0,63), наблюдается уменьшение зоны молодого хряща в 1,3 раза и увеличение зоны зрелого хряща в 1,5 раза (см. рис. 2-2-10, 2-2-18, 2-2-20).

Наиболее достоверную связь с возрастом имеет показатель «площадь костной ткани» (r=0,82). Процент костной ткани имеет достоверные различия во всех возрастных группах. Минимальная площадь определяется у лиц младше 18 лет, начиная с 19 лет происходит постепенное увеличение данного параметра на протяжении всех изученных периодов. Вместе с площадью костной ткани также увеличивается количество костных балок. Данный показатель имеет минимальное значение в возрасте до 18 лет. После 19 лет во всех возрастных интервалах количество трабекул увеличивается (r=0,56).

Максимальная и средняя длина трабекул также зависит от возраста индивида. У лиц моложе 18 лет костных трабекул нет ввиду отсутствия костной ткани. Затем в возрасте от 19 до 35 лет отмечается их появление, и длина трабекул при этом наименьшая (рис. 2-2-41 – 2-2-44). В следующем возрастном интервале отмечается небольшое увеличение данного показателя, а в возрасте старше 61 года отмечается резкое достоверное увеличение значения изучаемого параметра. Коэффициент корреляции данных показателей с возрастом составил 0,53 и 0,67 соответственно.

При изучении показателя толщины кортикальной пластинки у лиц разного возраста установлено, что с возрастом отмечается рост значения данного параметра. До 18 лет кортикальная пластинка отсутствует, в группе 19–35 лет отмечается ее появление с минимального значения. В последующих возрастных группах показатель увеличивается еще больше, различия между группами становятся статистически значимыми.

При исследовании площади жировой ткани в межтрабекулярном пространстве установлено, что с возрастом отмечается рост данного показателя (рис. 2-2-45, 2-2-46). До 18 лет этого показателя нет из-за отсутствия костной ткани, в группе 19–35 лет его значение возрастает и в последующих возрастных периодах увеличивается, но различие между этими двумя группами недостоверно. В следующей возрастной группе значение площади жировой ткани достигает максимального значения, и различия между группами становятся статистически значимыми. Среднее значение жировой и ретикулярной ткани имеет наименьшее значение в возрасте 19–35 лет с последующим увеличением до максимального значения в возрасте старше 61 года.

Среднее значение площади хрящевой ткани имеет наибольшее значение в возрасте до 18 лет и занимает всю площадь препарата. С увеличением возраста после 19 лет во всех возрастных интервалах отмечается уменьшение данного показателя. При изучении средней площади хрящевой ткани в поле зрения в возрастной группе старше 61 года наблюдается небольшое увеличение площади по сравнению с возрастом 36–60 лет.

Показатель количества молодых хондроцитов в поле зрения имеет наибольшее значение в возрасте до 18 лет, после 19 лет он отчетливо уменьшает свое значение и стабилизируется в возрастных группах 19–35 лет, 36–60 лет и старше 61 года. Коэффициент корреляции данного признака с возрастом свидетельствует о наличии связи данного параметра с возрастом средней силы (r=0,5).

Ширина зоны зрелого хряща увеличивается с возрастом. До 18 лет ширина зоны зрелого хряща имеет наименьшее значение, в группе 19–35 и 36–60 лет его значение увеличивается, но различие между этими возрастными группами недостоверно. В последующей возрастной группе старше 61 года данный показатель приобретает максимальное значение, и различия между группами становятся статистически значимыми, анализ значений данного показателя свидетельствует о наличии достоверной сильной связи данного параметра с возрастом (r=0,54).

Резюме. ЩХ обладает определенной возрастной изменчивостью. Динамика происходящих изменений гистоморфометрических признаков хрящевой ткани и их совокупная оценка посредством статистического анализа позволяет выделить следующие возрастные группы: до 19 лет, 19–35, 36–60, 61–75 и старше 75 лет. Возрастные изменения, происходящие в ЩХ, связаны с процессами созревания хряща, происходящими параллельно: оссификацией хрящевой ткани и замещением ретикулярной ткани жировой.

Состояние вопроса. Идентификационное исследование неопознанного трупа, в том числе анализ неизвестного скелетного материала, требует многоуровневого, полимодального подхода, который может быть усилен применением микроскопических методов. Исследования в области биологии кости, гистоморфологии и гистоморфометрии являются основой интерпретации структуры и организации кости на микроскопическом уровне [23, 24, 65, 66, 108–110, 194, 215, 217, 220, 225–229, 235, 240, 246, 256, 284, 285, 309, 313, 331, 353, 380, 381, 387, 390–392].

В 1965 г. Эллис Р. Керли опубликовал методику, позволяющую оценить возраст на момент смерти путем микроскопического исследования компактной кости человека [285]. Данный метод, основанный на учете гистоморфологических проявлений фундаментальных процессов формирования и ремоделирования кости, получил признание благодаря заявленной точности. С 1965 г. методика претерпела множество модификаций и дополнений, расширена область ее применения к другим костям скелета.

Точность оценки возраста на момент смерти посредством гистологического исследования обусловлена возможностью учета количественных показателей. Прикладной характер подобных исследований стимулирует развитие данного направления. В течение последнего десятилетия вектор научного интереса смещается в сторону углубленного понимания биологии костной ткани посредством использования современных технологических разработок [108, 110].

Изменения механической нагрузки, динамика минерального обмена, регенеративные потребности — основные факторы, под влиянием которых костная ткань непрерывно, на протяжении всего жизненного цикла перестраивается. Таким образом, основной способностью костной ткани, позволяющей ей восстанавливать микроповреждения, адекватно реагировать на внешние воздействия, выполнять гомеостатические функции и др., является ее способность к ремоделированию. Ремоделирование представляет собой непрерывный процесс тканевого оборота путем удаления и замены «пакетов» кости, называемых костными структурными единицами, который происходит без изменения макроскопической архитектуры кости. Впервые его описал Н. Frost [246]. Процесс ремоделирования является непрерывным на протяжении всей жизни и включает в себя сложное расположение клеток, называемых основными многоклеточными единицами. Ремоделирование — основа механической компетентности костной ткани, реализующаяся через последовательную смену активации, резорбции и образования (ARF). R.B. Martin и соавт. (2015) дополнили и расширили данную схему до пяти фаз: резорбция, реверсирование, образование, минерализация и затишье [318].

Поддержание костного гомеостаза включает сложные взаимодействия на молекулярном, клеточном и тканевом уровне. Остеоциты играют ключевую роль в механотрансдукции и передаче информации к эффекторным клеткам (остеокластам и остеобластам). Данные взаимодействия представляют собой целостную операционную систему, которая позволяет поддерживать общую морфологию, микроархитектуру и механические свойства кости (рис. 2-3-1) [110].

Выявление следов повторных циклов перестройки костной ткани и количественный учет этих циклов за период жизни лежит в основе гистоморфометрического метода установления возраста [27, 29, 118]. Исследователи сходятся во мнении, что процесс ремоделирования является адекватным индикатором скелетного возраста, при этом указывают на его сложность и подверженность влиянию физиологических и механических воздействий [108, 110, 163, 318].

Традиционная гистологическая оценка возраста основана на изучении структурных единиц кости. Структурные единицы кости состоят из вторичных остеонов, подвергающихся ремоделированию в течение всей жизни, и их количество меняется с возрастом [361, 379, 380]. Наибольшее количество гистоморфометрических исследований выполнено в отношении ребра и бедренной кости. S.D. Stout представил оригинальную методику гистологической оценки возраста с использованием средней трети VI ребра [379, 380]. Выбор ребра как объекта исследования обусловлен стремлением минимизировать влияние биомеханических факторов на процесс ремоделирования. Бедренная кость также является традиционным сегментом для подобных исследований [240, 285]. Несмотря на различные вариации результативных суждений, в большинстве работ прослеживаются две основные общности: это применение линейной модели для оценки возраста на момент смерти и подсчет количества интактных и фрагментарных вторичных остеонов на единицу площади в качестве показателя скелетного возраста на момент смерти. Мы разделяем мнение авторов: для дальнейшего развития гистоморфометрических методов как индикатора возраста следует отказаться от утверждения, что ремоделирование костной ткани происходит с предсказуемой скоростью, и это означает уход от использования линейных моделей [227]. Остается до конца не изученным влияние внешних и внутренних факторов (механической нагрузки, хронической интоксикации, особенностей питания, гормонального фона и многого другого), что является перспективой для будущих исследований [348].

J.Sobol и соавт. (2015), A.H. Chan и соавт. (2007) в своих работах изучают влияние места отбора проб на конечную точность результата [213, 376]. A. Crescimanno, S.D. Stout (2012) и ряд других исследователей обращают внимание на то, что в процессе возрастной трансформации происходит заполнение средней и периостальной части кортикального слоя, в то же время уменьшается площадь эндостальных ламелл за счет расширения эндостальной полости и процессов трабекулярного ремоделирования [225, 284, 309]. На различия возрастных изменений кортикальной и трабекулярной области указывали H. Chen и соавт. (2013). Полученные ими результаты демонстрируют общее снижение толщины кортикального слоя за счет реабсорбции на эндостальном крае вследствие ремоделирования трабекулярной области [215].

Анализ эффективности современного применения гистологической оценки возраста к настоящему времени выявил ряд проблем методологического характера. Прежде всего, это сложность распознавания интактных и фрагментированных остеонов. Зачастую речь идет о субъективной оценке исследователя при их идентификации, что неизбежно приводит к ошибочным результатам и разногласиям при проведении перекрестных сравнений [217, 330]. Данное обстоятельство инициирует исследователей на создание новых определений для неповрежденных и фрагментированных остеонов, которые бы ограничили субъективность оценки [232, 267]. Dempster и соавт. (2013) подчеркивают, что для стандартизации гистологической работы целесообразно использование разработанной Американской профессиональной ассоциацией номенклатуры терминов. Это значительно повышает эффективность сравнительных (перекрестных) исследований [232]. G.S. Dragoi и соавт. (2014) в своем исследовании предлагают применять для изучения гистологических структур костной ткани поляризованный свет с интерференцией (интерференционный контраст). Подобный подход существенно улучшает визуализацию гистотопографических ориентиров, необходимых для выполнения измерений [235]. S.D. Stout (2012) высказывает мнение, что существующие проблемы в какой-то мере связаны и с тем, что выполненные исследования основаны на стереоскопическом анализе — изучении гистоструктуры костной ткани с помощью оптической микроскопии, то есть в двухмерной плоскости [379]. Традиционные гистологические методы по своей сущности являются двухмерными, что ограничивает восприятие общей биологии кости. Современные цифровые технологии, такие как микрокомпьютерная томография, магнитно-резонансная томография или программное обеспечение для пространственного анализа, позволяют исследовать возрастные изменения костной ткани на трехмерном уровне [312]. I.S. Maggiano и соавт. (2016) применили микрокомпьютерную томографию с синхротронным излучением для реконструкции пространственной визуализации гаверсовых систем (рис. 2-3-2, 2-3-3). Подобный подход позволил изучить взаимосвязи трехмерных конструкций сетей, образованных гаверсовыми каналами, и проанализировать их трансформацию с возрастом [313]. В работах D.M. Cooper и соавт. (2015) выполнен 3D-анализ морфологии остеонов. Благодаря постоянному улучшению разрешения качества сканирования микрокомпьютерной томографии становится возможным наиболее точно описать 3Dархитектуру сети костных каналов и изучить вопросы ремоделирования костной ткани [223, 268]. В работе C. Hennig и соавт. (2015) использовалась комбинация методов: гистологические данные (2D) совмещены с результатами, полученными при микрокомпьютерной томографии. Это позволило сформировать представление об ориентации остеона в 3D-пространстве, уточнить сведения о дифференциации его форм на микроструктурном уровне. Авторы пришли к выводу о том, что остеоны имеют несколько различных типов по форме и большинство из них относятся к эллиптической.

При этом с возрастом наблюдается очевидное изменение в их морфологии, они становятся менее эллипсовидными и более циркулярными. Использование современного оборудования и новые научные данные открывают возможности для дальнейшего изучения микроструктуры костной ткани не только в 3D-, но и в 4D-пространстве, что, несомненно, будет способствовать более точной оценке возрастных изменений костной ткани и особенностей ее ремоделирования.

Большинство исследователей сходятся во мнении, что фактически необходимо отказаться от понятия универсальности остеологической методологии [291]. Она (методология) не должна применяться к скелетному материалу без учета секулярного и регионального происхождения справочной коллекции, использованной при создании метода [359].

Достаточно большое количество публикаций посвящено проверке релевантности существующих методик применительно к различным популяционным выборкам. H. Cho и соавт. (2006) использовали регрессионный анализ для изучения популяционных различий в процессе ремоделирования костной ткани ребер [217]. Было проведено сравнение афроамериканской выборки и европейских американцев (белых американцев). У афроамериканцев толщина кортикального слоя больше по сравнению с белыми американцами, однако в более старших возрастных группах зафиксирована обратная тенденция [217]. D. Botha и соавт. (2019) также отмечают, что стандарты оценки возраста являются индивидуальными для различных популяций. Это создает дополнительные трудности при проведении экспертизы по установлению возраста неизвестного, так как имеющихся «эталонов» для определения возраста методом гистометрии недостаточно в различных как возрастных, так и популяционных когортах. Авторы изучили изменение с возрастом количества остеонов и их фрагментов, размеров остеона и гаверсова канала и разработали регрессионные уравнения для диагностики возраста в популяции Южной Африки с точностью до 14–17 лет [203]. S. Pfeiffer и соавт. (2016) установили, что гистоморфология костной ткани меняется по мере взросления человека и существует некоторая вариабельность механизмов и темпов процессов ремоделирования. Данные процессы остаются до конца не исследованными и поэтому необъяснимыми. Ученые подтверждают, что в работе судебно-медицинского эксперта необходима дополнительная информация о характеристиках гистологических переменных костной ткани в самых различных популяциях. Для этого ими была изучена гистоморфология кортикальной кости в популяции Южной Африки. Результаты показали, что уравнения для конкретной изучаемой популяции не увеличивают точность определения возраста, регрессионная модель для группы неизвестной этнической принадлежности определяла возраст точнее, чем уравнения, разработанные для афроамериканцев и европейцев-американцев по отдельности. Погрешность определения возраста составила ±24,44 года. Полученный результат авторы расценили как неточный, отметив завышение результатов у пожилых людей и занижение в группе молодых. Был сделан вывод о необходимости внедрения нового статистического подхода, проведения дальнейших исследований и подробного изучения факторов, влияющих на процессы ремоделирования кости [353]. Работа Seung-Ho Han и соавт. посвящена апробации метода определения возраста посредством гистоморфометрии бедренной кости в корейской популяции. Авторы изучили плотность остеонов, среднюю площадь остеонов и наибольшую ширину кортикальной пластинки. Результаты исследования свидетельствуют, что данные параметры имеют высокую корреляционную взаимосвязь с возрастом и могут применяться для оценки возраста для жителей Кореи [371].

Кроме изучения признаков географической принадлежности, весьма важным является воздействие некоторых наркотических и лекарственных веществ на процесс ремоделирования костной ткани. М.В. Федулова (2004) отметила отрицательное влияние алкоголя на динамику возрастной трансформации костной ткани [154]. В работе R. Karine (2009) было проведено сравнение ряда гистоморфометрических параметров ребра у лиц, злоупотребляющих метамфетамином, и здоровых лиц в различных возрастных группах [281]. Автор пришел к выводу, что плотность остеонов у потребителей метамфетамина ниже, чем у популяции в целом, что указывает на явные нарушения остеогенеза. На данный процесс могут влиять также продолжительность и тяжесть злоупотребления данным веществом. Исследователь подчеркивает, что ремоделирование костной ткани — это физиологический процесс, следовательно, нельзя исключать воздействие на него некоторых факторов окружающей среды, плохого питания, употребления наркотиков, перенесенных и хронических болезней. К аналогичному выводу пришла группа ученых при изучении зависимости возрастных гистоморфометрических показателей от социального статуса [284]. Подобные выводы необходимо учитывать при оценке возраста у лиц из групп риска. Они указывают на необходимость проведения расширенных исследований различных групп населения, чтобы сформировать информационный банк для более целостного представления о взаимосвязи микроостеометрических показателей с питанием, образом жизни, различными отягощающими факторами.

Активная миграция населения, выраженная глобальная акселерация, увеличение количества людей, подверженных воздействию различных наркотических и токсикоманических веществ, приводит в конечном итоге к снижению точности диагностики возраста посредством имеющихся в арсенале судебных медиков методов. Возможно, поэтому изучению микроструктуры костной ткани не придают должного значения в практике судебно-медицинского эксперта [178]. Отбор признаков, имеющих максимальную экспертную значимость, характеризующихся достоверностью и воспроизводимостью, проведение морфометрических исследований с программным обеспечением, отвечающим всем требованиям современной науки и практики, формирование межпопуляционных баз данных, включающих сведения о сопутствующих факторах, комплексная оценка результата с использованием современных математических основ (ММО) — вот необходимые составляющие модернизации существующих гистологических методик по оценке возраста неизвестного индивида.

Методика исследования. Образцы костной ткани фиксируются в 10-процентном нейтральном растворе формальдегида (Формалина♠) не менее 5 сут; после промывки в проточной воде в течение 1–2 сут из нижнего эпифиза и диафиза выпиливаются блоки толщиной 1–1,5 см. Окончательное выпиливание блоков производится с помощью столярного стусла с пилой, закрепленной в положении 90°, снабженного приспособлением для закрепления кости с возможностью ее поступательного сдвига вдоль ее продольной оси. Кость закреплялась в приспособлении, и производился первый распил, перпендикулярный продольной оси кости. Далее крепежное приспособление вместе с костью сдвигалось вдоль продольной оси кости на 1–1,5 см, и производился второй распил.

Далее проводится декальцинация костных блоков в 12-процентном растворе азотной кислоты и стандартная спиртовая проводка с заливкой препаратов в целлоидин. С помощью микротома RAICHERT изготавливаются срезы костной ткани толщиной 10 мкн. Окраска производится гематоксилином и эозином и тионином по Шморлю согласно стандартным методикам [136].

Кроме того, из зоны на границе средней и нижней трети диафиза выпиливаются поперечные срезы толщиной 450–600 мм, из которых изготавливаются недекальцинированные препараты костной ткани.

При микроскопическом исследовании изготовленных препаратов костной ткани с целью унификации качественного описания гистологических препаратов костной ткани, в том числе при травмах и патологических изменениях, исследование рекомендуется проводить по стандартизированной схеме, включающей неметрическую (балльную) оценку качественных признаков, таких как:

Дальнейшее гистоморфометрическое исследование проводится в соответствии с общими методическими рекомендациями [1, 23, 24]. Методика проведения измерений представлена в табл. 2-3-1, перечень измеряемых признаков — в табл. 2-3-2.

Морфометрическое исследование. Измерение показателя (L) «длина» (В2, В6) осуществлялось посредством ImageJ, Freehad Line с пропуском пяти полей зрения; фиксировались максимальные, минимальные и средние значения для пяти полей зрения (см. рис. 2-3-10). Измерение показателя (t) «толщина» (В10, В11, В12, В14) осуществлялось посредством ImageJ, Freehad Line с пропуском пяти полей зрения с последующим расчетом средних значений для В10, В11, В12 для пяти полей зрения. Измерение показателя (S) «площадь» структуры (В1, В5, В7) осуществлялось посредством программы ImageJ. Исходное изображение конвертировалось в черно-белое, и искомая площадь принималась равной сумме пикселей нулевой яркости. Признаки В4, В13, В15, В16, В18, В23, В24 были получены посредством подсчета количества элементов с использованием Multi-point Tool, ImageJ, при этом для показателей В4 произведен расчет среднего значения для одного поля зрения; В13, В15, В16, В18, В23, В24 — среднее значение для препарата.

Измерение показателя «диаметр» (В2, В20, В21) осуществлялось посредством ImageJ, Freehad Line с пропуском пяти полей зрения с последующим расчетом средних значений (рис. 2-3-9).

Характеристика возрастных изменений костной ткани. В возрасте до 18 лет гистоморфометрические показатели отражают происходящее структурное созревание костной ткани, рост и развитие скелета в целом. Об активности происходящих процессов свидетельствует наличие наибольшего по сравнению с последующими возрастными группами количества показателей, демонстрирующих с возрастом достоверно сильную корреляционную связь и связь средней силы. Коэффициенты корреляции с возрастом: В1 r=0,61; В2 r=–0,52; В7 r=–0,65; В8 r=0,93; В10 r=0,78; В12 r=0,71; В13 r=0,58; В15 r=0,65; В16 r=0,69; В17 r=0,68; В18 r=0,72; В19 r=0,64; В24 r=0,59, критерий достоверности (р <0,05). Микроструктура компактного слоя диафиза с хорошо выраженными слоями наружных (В10=52,36±18,65) и внутренних (В12=40,13±5,69) генеральных пластинок с небольшим количеством остеонов. Внутренние генеральные пластинки при этом находятся в фазе роста. Эти показатели характеризуют рост и развитие костной ткани: увеличение толщины костных трабекул и площади костной ткани, увеличение толщины внутреннего и наружного слоя общих пластинок, сопровождающихся остеонизацией (увеличение как толщины слоя, так и количества остеонов). Вместе с тем количество циклов ремоделирования, успевших завершиться, к данному возрасту невелико, и, следовательно, иные следы перестройки отсутствуют либо имеют недостоверные значения.

Главным отличительным признаком данного возрастного периода является отсутствие линии минерализации хряща и наличие эпифизарной хрящевой пластинки (зоны роста) на препаратах дистального эпифиза. Гистологическая картина дистального эпифиза характеризуется наличием в поле зрения большого количества (максимального по сравнению с последующими возрастными периодами) достаточно тонких костных трабекул, с единичными эндотрабекулярными остеонами и большим количеством кровеносных сосудов. Также о продолжающихся процессах развития свидетельствует зафиксированное увеличение толщины трабекул.

Активность происходящих в костной ткани процессов роста и развития, наличие специфических отличительных элементов в гистологической картине подтверждается и результатами кластеризации гистоморфометрических данных возрастных изменений костной ткани, выполненной с использованием ММО. На представленных рисунках (рис. 2-3-11, 2-3-12) визуализации кластерных структур хорошо заметна обособленность группы «<18 лет». Обозначение групп: 1 — ≤18 лет; 2 — от 19 до 30 лет; 3 — от 31 до 50 лет; 4 — 60–75 лет.

В возрастном интервале 19–30 лет наибольшую связь с возрастом демонстрируют показатели возрастной трансформации, происходящей в кортикальном слое диафиза, причем со стороны эндоста. Это толщина слоя внутренних общих пластинок (В12, r=–0,74) и толщина слоя остеонов (В11, r=0,53). Об активации процессов ремоделирования свидетельствует увеличение (в 3,62 раза) количества остеонов с перестроенным центральным отделом (В18, r=0,63) и как прямое следствие увеличение (в 3,17 раза) их доли в общем количестве остеонов в поле зрения диафиза (В19, r=0,64). Полученные данные свидетельствуют о начале резорбционных процессов со стороны эндоста. Это связано с активностью остеокластов в составе эндоста.

Об активности процессов костной перестройки можно судить и по увеличению среднего диаметра остеонов (в 1,17 раза) и гаверсова канала (в 1,05 раза). Сравнение с результатами других исследователей выявило вариативность цифровых данных. Это в очередной раз доказывает целесообразность комплексной оценки и предостерегает от использования каких-либо «универсальных» показателей процессов ремоделирования для диагностики возраста.

Гистологическая картина дистального эпифиза в данной возрастной группе характеризуется наличием линии минерализации, отсутствием зоны роста, толстыми костными балками с большим количеством эндотрабекулярных остеонов, увеличение числа которых является своего рода адаптивным ответом на возросшие метаболические потребности. Именно в данном периоде происходит накопление максимальной костной массы. Хрящевая ткань при этом также находится в фазе роста, отражая гетерохронность регистрируемых в эпифизе возрастных процессов.

Следовательно, возрастной период от 19 до 30 лет для костной ткани характеризуется завершением процесса формирования с последующим переходом к относительной стабильности. Относительность процесса выражается в непрекращающейся перестройке основного структурного компонента костной ткани — остеона — под воздействием внутренних и внешних факторов.

В период от 31 до 50 лет о происходящих процессах перестройки костной ткани в диафизе можно судить по изменяющимся показателям толщины (S) слоев компактного вещества диафиза. При этом сила связи показателей ослабла, что косвенно указывает не только на снижение темпа изменений, но и на внутригрупповую неравномерность (В11, r=–0,42; р <0,05; В12, r=–0,64; р <0,05; В13, r=–0,48; р <0,05; В14, r=–0,41; р <0,05). Возможно, это является проявлением неравномерности ремоделирования, обусловленной воздействием внешних и внутренних факторов. В предыдущем возрастном периоде подобные факторы компенсировались. В последующие же годы сила их влияния заметно увеличивается. Также следует учитывать и возрастающую при переходе к зрелому возрасту степень наследственного влияния. Этапы постнатального онтогенеза характеризуются «различной степенью влияния генетических и средовых факторов на проявления роста и старения скелета» [98].

Отмечено достоверное уменьшение (более чем в 2 раза по сравнению с числовым значением данного показателя в возрасте от 19 до 30 лет) толщины слоя наружных генеральных пластинок, тогда как с внутренней стороны инволюция только началась. Эти изменения закономерно сопряжены с остеонизацией: толщина слоя остеонов и их количество увеличились в 1,5 раза. В 1,11 раза увеличивается по сравнению с предыдущим возрастным периодом средний диаметр всего остеона и в 1,24 раза — диаметр гаверсова канала. Интенсивность процессов ремоделирования компактного слоя диафиза выше на внутренней поверхности, где, согласно нашим результатам, отмечено их более раннее начало. Зафиксирована максимальная минеральная насыщенность костной ткани, о чем можно судить по наибольшему за весь изученный возрастной диапазон значениям показателя В16 (среднее в поле зрения количество темноокрашенных ализариновым красным S остеонов; В16=2,41±0,28; r=0,51; р <0,05). Он увеличился в 1,8 раза.

В дистальном эпифизе площадь хряща (В7=3281,21±1023,61; r=–0,64; р <0,05) достигла к данному возрасту максимального значения, что позволяет говорить о наступившей стадии относительной стабилизации для данного показателя. Параллельно с этим мы видим начальные проявления остеопоротических изменений (инволюции костной ткани): уменьшается в 0,94 раза по сравнению с числовым значением данного показателя в возрасте от 19 до 30 лет S трабекулярной кости (В1=14 358,11±2132,23; r=–0,64; р <0,05), и, соответственно, уменьшается (в 0,9 раза) число эндотрабекулярных остеонов (В13=3,12±0,55; r=–0,48; р <0,05).

Гистологическая картина нижнего эпифиза характеризуется четкой линией минерализации, достаточно широкой субхондральной пластинкой, многочисленными «толстыми» трабекулами с большим количеством остеонов с расширенным гаверсовым каналом.

Компактный слой диафиза с большим количеством остеонов (часть которых с перестроенным центральным отделом) и вставочных пластинок. Толщина наружного слоя общих пластинок снижена, отмечается его прерывистость на некоторых препаратах. Наружный слой выражен значительно лучше. Проявлениями активации остеорезорбции костной ткани являются увеличение диаметра гаверсова канала, уменьшение площади костных балок губчатого вещества эпифиза.

Таким образом, совокупность большинства происходящих в костной ткани процессов в данном возрасте (от 31 до 50 лет) характеризует начало возрастных изменений.

После 50 лет начинается инволюция, затрагивающая как эпифиз, так и диафиз. Показатели с высоким уровнем значимости согласно ранжированию с использованием алгоритма Random Forest демонстрируют также достоверную, сильную и средней силы корреляционную связь с возрастом: В10, r=–0,71; В12, r=–0,74; В13, r=–0,81; В15, r=–0,61; В21, r=–0,063; В15, r=–0,68; р <0,05). Активность данных процессов подтверждается и результатами кластеризации ММО. На представленных рисунках (см. рис. 4-3-1, 4-3-2) визуализации кластерных структур хорошо заметна обособленность группы в возрасте ≥50 лет.

В нижнем эпифизе вследствие остеорезорбции (остеопороза) продолжается уменьшаться (в 1,28 раза) площадь костной ткани за счет уменьшения длины (в 1,03 раза), толщины (в 1,34 раза) трабекул; снижается количество костных балок и, как прямое следствие, плотность микрососудистого русла и число эндотрабекулярных остеонов. Возрастные изменения затрагивают хрящевую ткань: уменьшается в 1,74 раза S хряща в субхондральной пластинке и в 1,14 раза — толщина подхрящевой пластинки. Траектория инволюции хрящевых элементов длинных трубчатых костей также проходит стадии роста созревания и возрастной трансформации, но с несколько иной скоростью. Хрящевой компонент продемонстрировал относительную константность: уменьшение площади хряща в субхондральной пластинке зафиксировано только после 50 лет. Данный факт мы можем рассматривать как проявление гетерохронии структурных элементов одной кости.

Гистологическая картина нижнего эпифиза характеризуется тонкими костными балками, неоднородными по толщине, структуре, с резко сниженным числом эндотрабекулярных остеонов.

Компактный слой диафиза истончен, слои наружных и внутренних генеральных пластин значительно уменьшены; большое количество остеонов с перестроенным центральным отделом, расширенным гаверсовым каналом; неравномерно выраженные линии склеивания, наличие резорбционных полостей. Отмечается наличие полых лож остеоцитов, лакун.

В диафизе активизируются процессы ремоделирования. Продолжают увеличиваться диаметр гаверсова канала (в 1,04 раза), количество остеонов с перестроенным центральным отделом (в 1,6 раза). Уменьшается толщина слоя наружных (в 1,96 раза) и внутренних (в 2,06 раза) общих пластинок за счет остеонизации: увеличение толщины как самого слоя в 1,1 раза, так и числа самих клеток в 1,07 раза. Прирост клеточного состава напрямую связан с увеличением количества циклов ремоделирования, активность которого выше со стороны эндоста. Уменьшилось (в 1,5 раза) число темноокрашенных остеонов, что можно расценивать как объективный показатель уменьшения минерализации костной ткани. Достоверность происходящих в костной ткани после 50 лет возрастных инволюционных изменений подтверждена морфометрическими показателями. Возможно, нарастание остеопоротических изменений обусловлено угасанием функции половых желез, ограничением двигательной активности, замедлением интенсивности всех обменных процессов. Совокупность перечисленных и ряд других факторов уменьшают в конечном итоге функциональную активность остеобластов.

Состояние вопроса. В возрастной морфологии инволюция сосудов занимает особое место. Нарушение кровообращения — это не только проявление старения, но и его ключевое звено. Таким образом, мы видим реализацию порочного круга патоаутокинеза инволюционных процессов. Наиболее распространенной и изученной является взаимосвязь возраста и артерио- и атеросклероза [29, 38, 39, 144]. На основании исследования коронароангиограмм 107 человек, возраст которых от 36 до 74 лет, Т.С. Жарикова и соавт. (2018) получили данные, свидетельствующие об увеличении с возрастом общей длины коронарных артерий и длины ветви правой коронарной артерии. Подобная динамика характеризует адаптационную возрастную перестройку, направленную на поддержание адекватного кровоснабжения миокарда [43].

Значительное количество работ посвящено изучению возрастных особенностей сосудистого русла головного мозга. В исследованиях, выполненных под руководством В.Н. Николенко (2018, 2019), получены данные о возрастной анатомии и морфологии сосудистого сплетения боковых желудочков головного мозга человека, изменении биомеханических свойств артерий головного мозга у лиц отдельных возрастных групп [46, 102, 181].

В.Н. Николенко, О.А. Фомкина (2008), используя статистический анализ, получили достоверные сведения о корреляционной взаимосвязи с возрастом толщины стенки внутричерепных частей позвоночных и базилярной артерий. Полученные результаты авторы применили для создания регрессионной модели диагностики биологического возраста с точностью от 10,4 до 11,4 года [101]. Продолжая изучение возрастных изменений сосудов, О.А. Фомкина и В.Н. Николенко (2018) исследовали динамику трансформации размерных характеристик мозговых артерий, установив при этом достоверное снижение толщины стенки артерий во втором периоде зрелого возраста. Также учеными была описана последовательность возникновения данных возрастных изменений на различных артериях [159]. Комплексное исследование, сочетающее рутинное гистологическое исследование ряда морфометрических параметров с иммуногистохимическим методом (выявление посредством экспрессии белка Ki-67 активности пролиферации), позволило прийти к выводу о преобладании индивидуальной изменчивости морфологии сосудистых сплетений боковых желудочков головного мозга в процессе старения [181].

С возрастом внутриорганные сосуды артериального звена приобретают патологическую извилистость, сопровождающуюся участками сужения и расширения, склеротические процессы приводят к уменьшению диаметра, их контуры становятся неровными, капилляры запустевают. Количественная оценка подобных изменений, несомненно, имеет научно-практическую ценность, в том числе в качестве дополнительного критерия при оценке возраста.

Гистофизиологические параметры взаимоотношений нейроглии и сосудистого компонента претерпевают изменения в процессе постнатального онтогенеза. Взаимосвязь данных системных звеньев имеет отличия на протяжении жизни. Опубликованы результаты, свидетельствующие о специфике возрастной трансформации различных структур головного мозга, а также элементов, ответственных за обменные процессы, дана количественная характеристика происходящих явлений в разных возрастных группах. Полученные данные свидетельствуют о гетерохронности, топологических различиях на различных этапах постнатального онтогенеза [89, 91, 165, 166]. Проведенные детализированные исследования структурных компонентов коры головного мозга человека в различные периоды его жизни свидетельствуют о наличии корреляционной взаимосвязи между возрастом и особенностями ансамблевой организации [21]. К настоящему моменту не вызывает сомнений утверждение, что общая сущность происходящих при старении изменений в головном мозге заключается в уменьшении объема серого и белого вещества [114, 301]. При этом атрофия характеризуется достаточно выраженными региональными отличиями, обусловленными структурно-функциональными диспозициями отделов мозга [114]. Большое внимание уделяется вопросам гетеротопии: времени начала возрастной трансформации и скорости (темпа) ее развития в зависимости от области мозга. С возрастом уменьшаются нейропиль, количество нейронов, возникает недостаточность синаптических связей, снижается скорость экспрессии генов [114]. Современные исследования позволили дать морфологическую характеристику происходящим в постнатальном онтогенезе возрастным преобразованиям в различных отделах головного мозга [97, 174, 175].

Результатами морфометрического исследования с подсчетом количества нейронов в поле зрения гистологических препаратов гиппокампа CA1 и CA3 и зубчатой извилины стали выводы о наличии выраженной гетерохронии и гетеротопии происходящих изменений. Уменьшение количества нейронов начинается раньше всего в зубчатой извилине, затем это поле СА3 и только потом поле СА1. При этом у лиц в возрасте от 36 до 74 лет зафиксировано расширение нейронного профиля с последующим уменьшением данного показателя после 75 лет [377]. При исследовании динамики возрастной инволюции гиппокампа выявлены возрастные особенности нейрогенеза: ежедневное обновление нейронов (до 700 в день) формирует 1,75% годового оборота данных клеток с некоторым снижением у лиц пожилого и старческого возраста [377]. В работах лаборатории под руководством И.Н. Боголеповой исследованы процессы, происходящие в коре головного мозга в отдельные периоды жизни человека, показаны гендерные различия возрастных изменений цитоархитектонического строения изучаемых структур [18]. На основании исследования слоев коры поля 10 префронтальной коры лобной области мозга установлено наличие достоверных различий ряда морфометрических параметров между двумя группами: зрелого (20–60 лет) и пожилого (старше 75 лет) возраста [18]. Опубликованы результаты о возрастных изменениях в период раннего постнатального онтогенеза количественных и размерных характеристик пирамидных нейронов и клеток микроглии, показателей ферментов антиоксидантной защиты [80]. А.А. Баландиным (2018) на основании исследования мозжечка от 217 трупов обоего пола от 16 до 86 лет получены данные о возрастной динамике таких показателей, как масса, объем и линейные параметры, толщина молекулярного слоя мозжечка, размерные характеристики грушевидных нейронов. Результаты количественной оценки изменений структурных компонентов коры мозжечка использованы для разработки нового способа оценки биологического возраста [13].

Следует отметить достигнутые положительные результаты использования ММО данных структурно-функциональной визуализации человека для предсказания возраста человека [302, 349, 397]. Так, например, для оценки возраста индивида структура NAPR использует карты толщины коры головного мозга, полученные из их собственных локально обработанных Т1взвешенных магнитно-резонансных томограмм всего мозга. H. Pardoe и R. Kuzniecky (2017) отмечают, что использование подобного программного обеспечения имеет высокий потенциал для диагностики как биомаркеров возраста, так и маркеров здоровья [349].

Пиальная сосудистая система коры больших полушарий обладает возрастной изменчивостью, характеризующейся снижением плотности пиальной сосудистой сети и ее магистрализацией. Это сопровождается фрагментацией капилляров, появлением анастомозов, склерозированием стенки, уменьшением внутреннего диаметра [74, 137].

Изучение возрастных аспектов регуляции кровоснабжения головного и спинного мозга являлось одним из приоритетных направлений научного поиска дальневосточной нейрогистологической школы, основоположником которой является П.А. Мотавкин. Установлено, что постнатальный онтогенез человека характеризуется наличием последовательных фаз не только качественных, но и количественных изменений афферентной и эфферентной иннервации сосудов. Это позволяет использовать их для суждения о биологическом возрасте человека [89, 90, 117, 118, 119, 122]. Многолетние исследования возрастных изменений морфологических параметров сосудов головного и спинного мозга, нейроглиальных компонентов обладают научным потенциалом, который может быть реализован в судебной медицине при разработке комплексных диагностических моделей установления возраста неизвестного человека [89–91, 99, 101–104, 117, 119, 122, 137, 158, 159, 165, 173–175, 181].

Методика исследования

Гистохимический метод исследования. Для установления возрастных показателей капиллярного русла головного мозга использовалась гистохимическая реакция на щелочную фосфатазу. Учитывая, что щелочная фосфатаза выявляется только в артериальном отделе функционально активных капилляров [91], изучение препаратов, окрашенных на щелочную фосфатазу, позволяет объективно оценить морфофункциональные и морфометрические параметры кровоснабжения мозга. Для выявления щелочной фосфатазы использовали кальций-кобальтовый метод [197]. Методика приготовления препаратов включала: инкубацию срезов в растворе субстрата (β-глицерофосфат натрия, 45 мин, 37 °С) → промывку → заключение в глицеринжелатиновый гель.

Для выявления адренергических волокон использовался флюоресцентно-гистохимический метод с глиоксиловой кислотой (метод Фурнеса и Коста) [247]. После обработки исследуемых образцов 2-процентной глиоксиловой кислотой (рН 7,0) 30 мин → фиксация на покровном стекле → подсушивание на воздухе → термостат (100 °С, 4 мин) → просветление в ксилоле → заключение в полистирол. Исследование с использованием люминесцентного микроскопа и светофильтров (ДС-1, СЗС-7) позволяло увидеть результаты реакции конденсации катехоламинов с глиоксиловой кислотой.

Выявление холинацетилтрансферазы (фермент ацетилхолинового синтеза и обмена) на основе метода А.М. Burt [266]. Исследуемые образцы фиксировали в растворе формальдегида (1-процентный раствор, приготовленный на 0,1 М какодилатном буфере с 0,32 М сахарозой) → промывка [семикратная смена раствора (какодилатный буфер рН 5,2 в течение 18 ч)]. В качестве ингибитора применялся диизопропилфторфосфат.

Для выявления ацетилхолинэстеразы использовался метод Карновского–Рутс в модификации Гидрина [266]. В основе данного метода — гидролиз тиоаналогов ацетилхолина на участках с концентрацией фермента и формированием медной соли тиосульфата, которая образует сульфид меди при последующей обработке (NH4)2S. Скорость происходящей реакции и интенсивность осадка определяла активность фермента.

Дальнейшее гистоморфометрическое исследование проводится в соответствии с общими методическими рекомендациями [1]. Перечень измеряемых признаков представлен в табл. 2-4-1 и Программа признаков для исследования иннервации сосудов мягкой оболочки спинного мозга.

Длина капиллярного русла (относительная плотность капилляров в единице объема) была получена с использованием формулы для неравномерного распределения капилляров:

где Lo — суммарная длина капилляров в 1 мм³ ткани, No — количество открытых концов на 1 мм², Nr — число пересечений горизонтальных линий сетки окулярмикрометра, Nв — число пересечений вертикальных линий сетки окулярмикрометра.

Характеристика возрастных изменений капилляров головного мозга. Возрастную динамику изученных морфометрических параметров капилляров головного мозга, учитывая результаты статистического и интеллектуального (посредством ММО) анализов, можно охарактеризовать следующим образом.

Изменения линейных размеров в периоды детства, подросткового и юношеского возраста демонстрировали незначительный прирост показателей. При этом темп происходящих изменений различен: диаметр капилляров в возрасте 13–16 лет по сравнению с предыдущей группой 8–12 лет увеличился на 1,3–1,4% (r=0,78); в группе от 17 до 21 года прирост составил +1,0–1,1% (r=0,18); от 22 до 35 лет — 0,5–1,0% (r=0,16). Аналогичное снижение темпа возрастных изменений по мере взросления мы отметили и у показателя «длина капиллярного русла» (L). В возрасте 13–16 лет по сравнению с предыдущей группой он увеличился на 1,0–2,1% (r=0,77); в возрасте от 17 до 21 года — на 1,1–1,8% (r=0,8); от 22 до 35 лет — на 0,1–0,8% (r=0,08). Значения расчетных показателей: площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм3 ткани (S=πDL), количество крови на единицу поверхности капилляра в 1 мм3 ткани (Y=V/S), объем крови в капиллярах в 1 мм3 ткани V=(D2)/4)π и их изменения соразмерны трансформациям линейных размеров. Увеличение показателей в возрасте 13–16 лет составило в среднем: S=+1,0–2,4% (r=0,77), Y=+2,6–1,0% (r=0,76), V=+0,2–0,6% (r=0,78); в возрасте от 17 до 21 года: S=+1,2–1,7% (r=0,06), Y=+1,0–2,0% (r=0,26), V=+3,4–3,7% (r=0,18); от 22 до 35 лет: S=+0,2–1,9% (r=0,17), Y=+0,1–1,3% (r=0,12), V=+0,2–0,8% (r=0,14). На основании статистического анализа можно констатировать наличие достоверных различий (р ≤0,01) между значениями показателей в возрастных группах до 17 лет и 22–35 лет. Следует отметить, что в период от 17 до 35 лет длина капиллярного русла имеет наибольшие (в рамках рассматриваемого возрастного диапазона) значения: L1=315,5±1,1 мм, σ=7,8; L2=326,9±1,6 мм, σ=7,3. Наибольшие значения коэффициентов корреляции показателей с возрастом были отмечены в возрастном интервале от 13 до 16 лет. Затем темп происходящих возрастных изменений заметно снижается, о чем свидетельствуют слабая корреляционная связь с возрастом или практически ее отсутствие почти у всех изученных параметров в группах 17–21 года и 22–35 лет. Согласно статистическому анализу с расчетом средней величины прогноза возраста можно констатировать факт, что в период от 17 до 35 лет показатели достигают уровня дефинитивных значений и происходящие изменения характеризуются минимальной степенью выраженности.

В возрасте от 36 до 60 лет мы отметили признаки возрастной инволюции. На 6,0–6,9% по сравнению с периодом 22–35 лет уменьшается длина капиллярного русла (L), прирост значений диаметра капилляров (D) был незначительным: +0,9–1,5%. Расчетные показатели — S=πDL, Y=V/S, V=(D2/4)Lπ — и их изменения соразмерны трансформациям линейных размеров: S1=5,879±0,05 мм2 (σ=0,339, r=0,51); S2=5,896±0,041 мм2 (σ=0,280, r=0,49); Y1=1,567±0,014 (σ=0,053, r=0,35); Y2=1,552±0,001 (σ=0,036, r=0,34); V1=9,216±0,097 мкм3 (σ=0,656, r=0,17); V2=9,153±0,081 мкм3 (σ=0,549, r=0,16). В данном возрастном интервале мы видим, что емкостная характеристика практически не коррелирует с возрастом, а корреляционная взаимосвязь площади обменной поверхности крайне слабая. Увеличение площади обменной поверхности направлено на компенсацию происходящего возрастного снижения капиллярной плотности в связи с частичной редукцией микрососудов. Полученные нами результаты согласуются с данными С.Е. Шемякова [173]. Результаты статистического анализа зависимости точности прогнозирования от фактического возраста демонстрируют сложную связь исследованных показателей с возрастом в период от 45 до 55 лет. В последующем она становится более выраженной. В пожилом возрасте (61–75 лет) длина капиллярного русла снизилась на 5,3–7,0% (в 1,05–1,15 раза по сравнению с периодами зрелого возраста); рабочая площадь капилляров также уменьшается в 1,04 раза по сравнению с предыдущей группой; количество крови на единицу поверхности капилляра увеличивается на 2,5–3,8%, диаметр мозговых капилляров расширился на 3,0–3,8% (в 1,03–1,05 раза по сравнению с периодами зрелого возраста). Происходящие в эти годы изменения отражает сильная и средней силы корреляционная взаимосвязь исследуемых параметров с возрастом: D1 (r=0,80); D2 (r=0,75); L1 (r=–0,62); L2 (r=–0,63); S1 (r=0,58); S2 (r=0,51); V1 (r=0,68); V2 (r=0,63); Y1 (r=0,80); Y2 (r=0,75); при p >0,05. С.Е. Шемяков в своем исследовании предполагает, что «увеличение емкостных характеристик капиллярного русла является приспособительной реакцией, направленной на компенсацию одновременно идущего процесса редукции капилляров» [173].

После 75 лет направленность инволютивных изменений продолжается, тогда как их темп заметно снижается. Диаметр капилляров продолжает увеличиваться, в среднем на 1,8–2,2%. Длина капиллярного русла уменьшается на 0,7–1,0%. Данные об увеличении диаметра капилляров в старческом возрасте получены и в работах других исследователей [89, 91, 170, 173]. Они также констатируют факт формирования минимальных значений длины капиллярного русла именно в пожилом и старческом возрасте [89, 91, 170, 173]. Минимальные изменения зафиксированы у показателя S в виде незначительного прироста на 0,8– 1,1% по сравнению с пожилым возрастом.

Мы отметили соразмерность происходящих изменений линейных размеров. Увеличение в течение всего изученного периода в целом в 1,08 раза диаметра капилляров (поле 6 от 6,07±0,22 до 6,60±0,11 мкм; поле 41 от 6,06±0,17 до 6,58±0,15 мкм) сопряжено с уменьшением средней длины капиллярного русла в 1,11 раза (поле 6 от 305,4±7,73 до 274,34±9,01 мкм; поле 41 от 316,61±10,82 до 285,16±6,00 мкм). Подобные пропорциональные трансформации являются приспособительной реакцией, направленной на поддержание адекватного уровня кровообращения головного мозга при старении. Соразмерность компенсаторных изменений линейных размеров (D/L) сдерживают инволютивные изменения таких параметров, как объем крови на 1 мм³ и количество крови на единицу поверхности, являющихся базовыми характеристиками капиллярного кровообращения. Однако объем циркулирующей крови зависит и от скорости кровотока [173]. Объем крови в капиллярах в 1 мм³ ткани является важной характеристикой капиллярного кровообращения. По мере взросления организма происходит естественное увеличение объема депонированной крови и объема капилляров с последующим уменьшением по мере старения. Так, согласно нашим данным, в пожилом возрасте данный показатель снижается на 2,8–4,1%, в старческом возрасте инволюция прогрессирует, и он уменьшается еще на 2,7–3,1% по сравнению с предыдущей группой. В целом у лиц старше 75 лет снижение этого показателя от уровня дефинитивных значений составило >6%.

В палео- и неокортексе динамика происходящих изменений имеет некоторые отличия. Так, в новой коре по сравнению с палеокортексом темп происходящих изменений был более выражен, инволютивные изменения наступали несколько раньше. Также ряд исследователей указывает на наличие неоднородности происходящих изменений в зависимости от топографии исследуемого отдела мозга. Подобные факты гетеротопии и гетерохронии наиболее вероятно связаны с функциональной нагрузкой исследуемой области головного мозга [89, 91, 170].

Резюме. В динамике возрастных изменений морфометрических характеристик капилляров изученных участков головного мозга можно выделить следующие периоды: прирост количественных показателей с формированием дефинитивных значений к 35 годам, 35–55 лет — стадия волатильности линейных размеров как начальные проявления возрастной инволюции, нарастающие к 75 годам. Старение сопровождается уменьшением длины капиллярного русла (функционально активных капилляров) и площади обменной поверхности, увеличением диаметра капилляров и количества крови на единицу поверхности, то есть снижение линейных размеров компенсируется приростом емкостных показателей. Зафиксированные изменения цифровых значений у лиц старше 75 лет продемонстрировали достаточно слабую корреляционную связь с возрастом вследствие их выраженной вариабельности. На примере изменения изученных морфометрических параметров капилляров мы видим реализацию принципов витаукта «благодаря деятельности мозга в ходе возрастного развития мобилизуются приспособительные механизмы, направленные на увеличение продолжительности жизни» [161].

Характеристика возрастных изменений нервного аппарата сосудов спинного мозга. На сегодняшний день достижения нейрогистологии не оставляют сомнений в наличии взаимосвязи строения нервного аппарата сосудов, его функциональной активности с возрастом [28, 89, 90, 117, 119, 122]. Афферентная и эфферентная иннервация артерий спинного мозга претерпевает существенные изменения на всем протяжении жизни. На примере выполненного исследования иннервации передней спинальной артерии спинного мозга ход развития возрастных преобразований нервного аппарата сосудов спинного мозга выглядит следующим образом.

У детей и подростков возрастная динамика исследуемых показателей свидетельствует о фазе роста и развития. Концентрация афферентных нервных волокон и рецепторов увеличивается в среднем на 13–15%. Концентрация рецепторов в возрасте 8–12 лет — 8,4±0,5 мм2, в возрастной группе от 13 до 16 лет — 10,7±0,7 мм2; концентрация проводников — 26,7 ±2,5 и 30,1±2,2 мм2 соответственно, из которых тонкие составляют порядка 80%. Увеличивается также (при сравнении показателей этих групп между собой) количество эфферентных нервных волокон: концентрация адренергических нервных рецепторов — на 7,3% и варикозностей — на 0,6%; концентрация холинергических нервных рецепторов — на 13%; отмечается повышение интенсивности люминесценции на 3,2% и оптической плотности преципитата на 16,8%.

По окончании подросткового периода наступает фаза относительной стабилизации: у лиц молодого, зрелого (первый период, первая половина второго периода) возраста исследуемые показатели практически не изменялись. В данном случае можно говорить о достижении дефинитивного уровня параметров, характеризующих нервный аппарат стенок сосудов спинного мозга.

Появление признаков инволюционных изменений зафиксировано во второй половине второго периода зрелого возраста. Возрастной интервал 46–60 лет характеризуется наличием статистически достоверных различий показателей при сопоставлении их с периодом дефинитивных значений на отрезке с 17 до 45 лет. У лиц старше 45 лет отмечено появление афферентных волокон с наплывами и утолщениями, с различной степенью импрегнации; снижается концентрация афферентных нервных волокон за счет редукции толстых (до 1,3±0,6%) и средних (до 12,3±1,1%) проводников. Начавшиеся изменения афферентного нервного аппарата расцениваются как одно из частных проявлений «деафферентного феномена» [90, 117]. Данный возрастной период (46–60 лет) характеризуется отчетливо выраженным снижением показателей: концентрации эфферентных нервных проводников в среднем на 7,5–16%; концентрации варикозностей холинергических аксонов — на 25% по сравнению с возрастной группой 22–35 лет и на 22% — с группой 36–45 лет; адренергических на 34 и 38% соответственно. Оптическая плотность преципитата и интенсивность люминесценции адренергических волокон снижаются.

Процесс денервации с возрастом прогрессирует, формируются статистически достоверные различия цифровых показателей группы 61–74 лет с периодом дефинитивных значений 17–45 лет.

У лиц старше 60 лет мы видим неравномерное снижение количественных показателей, характеризующих афферентную иннервацию, уменьшение процентного соотношения средних проводников и практически полное отсутствие толстых. Нарастают деформационные изменения нервных волокон, их контуры приобретают неровность. Возрастные изменения сердечнососудистой системы характеризуются снижением чувствительности механорецепторов, нарушается способность адекватно воспринимать и реагировать на растяжение сосудистых стенок. В пожилом и старческом возрасте подобные инволютивные изменения рецепторного аппарата формируются во всех формах сосудистых рецепторов. Также у лиц старше 60 лет изменения эфферентных нервных сплетений характеризуются прогрессирующим снижением количества проводников: холинергических — на 21% по сравнению с возрастной группой 22–35 лет и на 12% по сравнению с предыдущей группой, адренергических — на 35 и 17% соответственно; количество варикозностей уменьшается в среднем на 46,7%. Показатели интенсивности люминесценции и оптической плотности демонстрируют выраженную отрицательную динамику. Морфология происходящих инволюционных изменений нервных сплетений подобна явлениям дистрофии и некробиоза. При сопоставлении полученных результатов с данными других исследователей можно говорить о том, что в данном возрасте формируется постмедиаторный этап вегетативной нервной системы.

У лиц старше 75 лет формируется максимальная степень выраженности дегенеративных изменений. Происходит резкое снижение концентрации нервных волокон, прежде всего за счет «исчезновения» толстых проводников; тонкие и средние с признаками анатомической деструкции: неравномерные вздутия, участки гомогенизации. Старение сопровождается выраженным нарушением анатомической целостности рецепторного аппарата: единичные клубочковые рецепторы находятся в состоянии зернистого распада, кустики со множественными неравномерными утолщениями. Эфферентный нервный аппарат артерий спинного мозга характеризуется малочисленными фрагментированными пучками нервных волокон, часть из них достаточно тонкие, фрагментированные, количество варикозностей снижена, люминесценция бледно-зеленая, оптическая плотность в виде рыхлого желто-коричневого осадка. Однако, несмотря на выраженное снижение, и адренергические, и холинергические проводники выявляются в стенках сосудов и в старческом возрасте, причем часть волокон имеет сохранную структуру. Следует отметить, что и пожилой, и старческий возраст в большей мере характеризовался вариативностью цифровых значений исследуемых показателей. Сопоставление количественных показателей концентрации нервных проводников свидетельствует о приближении данных значений к цифровым значениям, зарегистрированным у новорожденных [90, 117].

Резюме. На основании анализа полученных результатов мы приходим к выводу о том, что в процессе индивидуального развития количественных показателей афферентного и эфферентного нервного аппарата артерий спинного мозга человека регистрируются достоверные изменения. Ранее других фиксируется снижение количества рецепторов афферентной иннервации, затем процесс распространяется на адренергические и холинергические сплетения.

Изучение динамики показателей, характеризующих возрастные изменения иннервации сосудов спинного мозга, на примере передней спинальной артерии, с использованием стандартных методов статистического анализа, а также кластерного анализа и классификации посредством ММО позволяет выделить следующие возрастные интервалы: рост и развитие до 16 лет, 17– 45 лет — формирование дефинитивных значений, 46–60 лет — начальный этап возрастных изменений, нарастающих в возрасте 65–75 лет, и их максимальное проявление у лиц старше 75 лет. Следует учитывать, что инволютивные изменения нервного аппарата артерий, в отличие от процессов его созревания, характеризуются значительным разбросом цифровых значений, особенно в конце старческого возраста, что также может расцениваться как один из уровней гетерохронии.

Происходящие динамические изменения обусловлены возрастными трансформациями мозговой гемодинамики: изменяется сосудистое сопротивление, утолщается стенка сосудов за счет мышечного компонента. Для поддержания адекватного нервного контроля увеличивается концентрация нервных волокон сосудов и нейрорецепторов в них. О гетерохромности как проявлении системогенеза происходящих изменений свидетельствует зависимость темпов дифференцировки нервного аппарата от локализации и калибра спинномозговых артерий [28, 89, 90, 117, 119, 122]. Данное обстоятельство является проявлением адаптационного процесса. Значение нервного влияния с возрастом ослабевает, редуцируются компоненты нервно-волокнистого комплекса. Одной из причин инволюции нервных сплетений является дистрофия клеток симпатического ствола и ганглиев блуждающего нерва [89, 90].

При судебно-медицинском исследовании неизвестного индивида устанавливают вероятный возраст с указанием доверительных или прогнозных интервалов, то есть речь идет о синтезирующей оценке многочисленных параметров объектов для определения границ возрастной группы, к которой принадлежит идентифицируемый объект. Определение возрастной группы объекта является примером задачи классификации, в которой рассматривается множество заранее размеченных объектов, существующих в некотором признаковом пространстве и используемых в качестве обучающей выборки при построении модели, способной классифицировать неразмеченные данные. В нашем исследовании базы данных морфометрических параметров возрастных изменений, созданные в результате проведенных исследований, использовались для обучения и валидации различных моделей классификаторов. В качестве метки класса выступала возрастная группа объекта. Таким образом, мы строили модель, классифицирующую произвольные объекты схожей природы.

На основе анализа научно-технической специализированной литературы были выбраны алгоритмы классификации, которые чаще всего используются для решения медицинских задач [5, 88, 137, 318, 352, 405]. Для сравнительного эксперимента были подготовлены 5 наборов признаков — датасеты (dataset), использованные для обучения и последующего анализа работы алгоритмов (метод опорных векторов, метод стохастического градиента, метод ближайших соседей, алгоритм случайного леса, многослойная нейронная сеть). Оценка качества выполнения поставленной задачи была выполнена посредством cross-validation (перекрестной проверки) и метрики accuracy.

Принципы работы существующих алгоритмов машинного обучения имеют отличия, а заложенные в них идеи имеют разные области применения. Для оценки качества работы были использованы алгоритмы машинного обучения, которые наиболее не похожи друг на друга: метод опорных векторов (SVM), метод стохастического градиента (SGD), дерево решений, метод ближайших соседей (Kneighbors), наивный байесовский классификатор (Gaussian NB), многослойная нейронная сеть и алгоритм случайного леса (Random Forest). Результат сравнительного анализа работы алгоритмов ММО приведен на рис. 3-3.

Алгоритм метода опорных векторов показал слабые результаты на всех базах данных, а его максимальный признак точности не превысил даже 60%. Несколько лучший, но недостаточный результат показал алгоритм метода стохастического градиента — его результаты не преодолели отметку 70%. Методы многослойных нейронных сетей и Random Forest (порядка 90%) показали наилучший результат. При этом алгоритм Random Forest продемонстрировал и самые стабильные результаты, без сильного разброса в показателях качества вне зависимости от набора данных. Нейронные сети, обладая расширенными возможностями, продемонстрировали максимальную точность (>90%). База № 1 — гистоморфометрические признаки возрастных изменений кожи; база № 2 — гистоморфометрические признаки возрастных изменений хрящевой ткани; база № 3 — гистоморфометрические признаки возрастных изменений костной ткани; база № 4 — гистоморфометрические признаки возрастных изменений капилляров головного мозга; база № 5 — признаки возрастных изменений нервного аппарата сосудов спинного мозга.

Стабильность работы на различных выборках была отмечена у метода случайного леса, вследствие чего именно Random Forest был выбран для решения целевой задачи проекта (решающее правило для определения возрастной группы в виде дерева решений), так как он способен работать с пропусками в исходных данных без необходимости их предобработки. Подобное обстоятельство имеет немаловажное значение, учитывая малую (в контексте использования ММО) выборку объектов.

Деревья решений — это один из методов Data Mining, метод поиска логических закономерностей в данных и один из основных подходов в теории принятия решений. Они эффективно реализуют задачи классификации и распознавания посредством многошагового процесса принятия решений и используют особенности древовидных классификаторов, основанных на учете локальных свойств классифицируемых объектов каждого уровня и узла дерева [297]. Это позволяет реализовать как прямую, так и обратную цепочку рассуждений. Наглядность поискового процесса является его существенным достоинством.

Важным этапом при построении математической модели является подготовка и отбор признаков. Отбор признаков может оказывать существенное влияние на итоговый результат работы построенной модели, точность и эффективность работы модели в целом.

Исходные данные представлены в виде двухмерных изображений с помощью использования методов t-SNE и алгоритма машинного обучения для нелинейного снижения размерности (рис. 3-4, 3-5). Результаты визуализации свидетельствуют о плотном перемешивании возрастных групп без явной кластеризации до отбора признаков.

Здесь и далее использована разбивка на группы согласно возрастной периодизации (АПН СССР, 1965): 1-я группа — до 12 лет; 2-я группа — 13–16 лет; 3-я группа — 17–21 год; 4-я группа — 22–35 лет; 5-я группа — 36–60 лет; 6-я группа — 61–75 лет; 7-я группа — старше 75 лет.

Для оценки информативности признаков используется метод Recursive feature elimination с привлечением деревьев решений и критерия Джинни. Результаты представлены на рис. 3-6. Значимость признаков при отборе по объединенной базе данных изменяется по сравнению с оценкой признаков одного вида объектов исследования.

С помощью тепловой карты (heatmap) можно визуализировать корреляционную связь между существующим набором признаков, где красным цветом выделены признаки с сильной положительной корреляцией, а синим — с сильной обратной корреляцией. На тепловой карте (рис. 3-7) добавлены коэффициенты корреляции показателей не только с возрастом и возрастной группой, но и между собой (на пересечении).

Визуализация результатов посредством тепловой карты позволяет увидеть несколько ярких групп из связанных между собой признаков.

Учитывая тот факт, что данные признаки будут оказывать схожее влияние на результат классификации, часть из них после экспертного анализа можно удалить, тем самым сократив признаковое пространство. Это снижает потребность в вычислительных мощностях для построения математических моделей.

Оценку информативности и значимости признаков можно также выполнять посредством многомерного анализа (Multivariate), позволяющего проводить сравнение более двух переменных (рис. 3-8).

Pairplot — парные графики, симметричные относительно главной диагонали, на которой размещено распределение каждого графика. Каждая точка окрашена в зависимости от ее класса. Данные графики могут использоваться при оценке роли пары признаков в классификации.

На качество работы моделей влияет количество использованных признаков, начиная от самых информативных и далее по убыванию. Оценка качества работы классификаторов от количества используемых признаков представлена на рис. 3-9 и 3-10.

На данных рисунках можно заметить, что для моделей, основанных на деревьях решений, качество остается примерно одинаковым вплоть до использования всех исходных признаков, что можно объяснить способностью данных алгоритмов самостоятельно отбирать признаки. Для остальных алгоритмов можно заметить тенденцию к падению качества после использования более 28 признаков. Полученные ранжированные списки были сопоставлены с результатами статистического анализа, выполнены сравнительный анализ, экспертная оценка с позиций возрастной морфологии.

Двухмерная визуализация данных с использованием методов t-SNE (рис. 3-11) и uMAP (рис. 3-12) после отбора признаков и формирования фиксированного набора наглядно продемонстрировала эффективность работы. Можно заметить, что теперь наблюдается более четко выраженная кластерная структура.

Следующий этап работы — это определение оптимального возрастного интервала, диагностика которого осуществляется с максимальной точностью и надежностью.

Для алгоритма Random Forest строятся матрица ошибок (рис. 3-13) и ROC-кривые (рис. 3-14).

Матрица ошибок (см. рис. 3-13) и ROC-кривые (см. рис. 3-14) наглядно иллюстрируют то, что построенная модель достаточно точно (100%) классифицирует объекты, которые принадлежат к 1–3-й группе (то есть индивидов до 20 лет), и лиц старше 60 лет. Объекты 4-й (90%) и 5-й (92%) возрастных групп немного сложнее поддаются кластеризации, однако точность классификации данных групп также достаточно высокая. Четкая градация данных групп является отображением фундаментальных процессов постнатального онтогенеза, происходящих в костно-хрящевой системе. Стадия созревания (группы 1–3) сменяется стадией стабилизации (группа 4) и завершается инволютивными преобразованиями (группы 5–7). Наименьшая точность зафиксирована в возрастной группе 7 (≥75 лет). Подобное обстоятельство закономерно, так как в данном возрасте состояние тканей и органов обусловлено не только возрастной инволюцией, но и результирующим воздействием массы привходящих факторов, имеющих к данному возрасту выраженный кумулятивный эффект (болезни, прием лекарственных препаратов, вредные привычки, питание, образ жизни и т.д.).

Результаты классификации на группы, соответствующие десятилетнему интервалу, визуализированы на рис. 3-15 и 3-16. Полученные графические изображения демонстрируют достаточно четкую межклассовую дифференцировку. Используя алгоритм Random Forest, показавший наилучшую работу на рассматриваемых данных, была выполнена проверка качества модели, которая проводилась с использованием кросс-валидации на 5 фолдах, и построена матрица ошибок (рис. 3-17).

Согласно данным матрицы ошибок, точность классификации 1-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 8-й групп на валидационной выборке составляет 100%. Точность классификации 2-й группы (11–20 лет) — 67%. Данный интервал включает в себя периоды активного роста и развития всех органов и систем, период полового созревания, что влечет за собой неравномерность, неоднородность показателей. Следовательно, относительно низкая точность связана с широтой возрастного диапазона данной группы. Также низкая точность зафиксирована для группы 7 — 43%. Динамика показателей в период от 61 до 70 лет обусловлена проявлениями ассоциированных с возрастом болезней, с одной стороны.

С другой стороны, мы отмечали именно в данной декаде некоторое замедление возрастной трансформации. Это влечет за собой значительный разброс цифровых значений и, как прямое следствие, попадание в соседнюю, более старшую группу. Также следует признать закономерным снижение точности установления возрастной группы у лиц старше 80 лет (группа 9) — 80%.

Для анализа комплекса признаков мы использовали алгоритмы, позволяющие изучать нелинейные зависимости, например метод опорных векторов с правильно подобранным ядром, деревья решений и основанные на них методы, такие как Random Forest или Catboost.

Для визуализации подобных данных методы t-SNE и алгоритма машинного обучения для нелинейного снижения размерности работают ожидаемо лучше классических методов, таких как, например, метода анализа основных компонентов (PCA – Principal Component Analysis), используемого в аналогичных работах и показавшего ощутимо менее информативный результат (точность классификации ±30 лет) [212]. Алгоритмы t-SNE и uMAP продемонстрировали эффективность в отношении обнаружения скрытых структур в данной классификации групп и визуализации сложных наборов данных. Следует отметить их способность компенсировать нелинейные отклонения по измерениям.

Использование современного метода uMAP в совокупности с уже зарекомендовавшим себя ранее t-SNE позволило нам получить более точные результаты: определение заданной возрастной группы со средней точностью до 87%. Данный результат подтверждает эффективность использованных в работе алгоритмов для решения подобного рода задач — классификации данных для судебно-медицинской диагностики возраста.

На основании проведенного сравнительного анализа качества работы алгоритмов машинного обучения при определении возраста (метод опорных векторов, метод стохастического градиента, дерево решений, метод ближайших соседей, наивный байесовский классификатор, многослойная нейронная сеть и алгоритм случайного леса), обоснования выбора наиболее подходящих классификаторов для заявленной цели, анализа исходных данных и их предобработки представлены итоговый алгоритм классификации и разработанное на его основе веб-приложение для классификации возраста объекта.

Основная цель приложения состоит в том, чтобы построить надежную модель прогнозирования возрастного интервала. Оптимальными в данном случае являются методики, предлагающие точные гибридные классификаторы со встроенной регуляризацией, включающие методы вычислительного интеллекта. Приложение функционирует на сервере. Для того чтобы воспользоваться его функционалом, пользователю достаточно иметь устройство, имеющее доступ в интернет (компьютер, телефон, планшет). Приложение реализовано с использованием языка программирования Python 3. Среди использованных библиотек — sklearn, streamlit, matplotlib, seaborn.

Схема генерализованного алгоритма решения задачи диагностики возрастного интервала неопознанного лица дана на рис. 3-19.

Реализация вышеописанного алгоритма возможна в программно-аппаратном комплексе, структурно-функциональная организация которого представлена на рис. 3-20.

Ключевые модули программно-аппаратного комплекса:

Подобная структура функциональной организации обеспечивает максимальную эффективность решения задачи — установления биологического возраста в рамках судебно-медицинской экспертизы по идентификации личности. Расширение функциональных возможностей данного программно-аппаратного комплекса достигается посредством введения новейших информационных решений. Структура программно-аппаратного комплекса обладает расширенными адаптационными возможностями, позволяющими вводить дополнительные программные и аппаратные модульные элементы, производить доработку при выявлении в ходе функционирования недостатков. Описание межмодульного взаимодействия, этапы обработки данных, их последовательность и этап принятия итогового решения о возрастном интервале, возрасте прописываются в специальном файле конфигурации.

Математический аппарат статистического анализа, ММО, теорию нечеткой логики и логического вывода следует рассматривать в качестве базовых теоретических основ, используемых для формирования выводов, как частных, этапных, так и итоговых, результирующих. Выбор того или иного математического подхода должен быть адекватен исходным данным, используемым для установления возрастного интервала. Методы статистического, корреляционного, регрессионного анализа необходимо применять при известной четко выраженной и хорошо формализуемой зависимости результата от входных данных. Они хорошо зарекомендовали себя с позиции точности оценки при наличии хорошо изученных и подтвержденных закономерностей и фактически сводятся к построению регрессионных моделей и четко формализуемых алгоритмов, обеспечивающих расчет возраста. Зашумление данных, помеховые связи приводят к ошибкам при установлении возраста при использовании только методов статистического анализа. В случаях разнородной, искаженной, неполной информации данные методы практически бесполезны.

Методы нечеткой логики и ММО демонстрируют адекватную поставленной задаче работу в условиях зашумленного информационного массива, когда исходные данные неполные и/или разнородные. Целевая направленность этих методов схожа, и для правильной, достоверной оценки возрастного интервала необходима их корректная реализация.

Методы нечеткой логики целесообразно применять при наличии ряда словесно описываемых признаков, разрозненных совокупностей параметров и неточно измеренных значений с потенциально большой исходной погрешностью. При этом для реализации методов нечеткой логики необходима четкая формализация алгоритмов принятия решения, сформированных экспертом, в этом случае применение методов нечеткой логики является обоснованным и приносит результат.

ММО должны быть применены для случаев сложных и неформализуемых зависимостей между наборами входных данных и получаемой результирующей оценкой возраста.=

Предложенная нами экспертная модель определения биологического возраста индивида включает в себя алгоритм отнесения индивида к определенной возрастной группе и комплекс уравнений регрессии для разных возрастных групп.

В настоящее время главным методом судебно-медицинского установления возраста является математическое моделирование возрастных изменений на основе многофакторного корреляционного и регрессионного анализа. Однако следует отметить, что составление уравнений регрессий обусловлено чисто механическим подходом, на основании только коэффициентов корреляции, без учета биологической сущности используемых в них признаков. На наш взгляд, системный подход, включающий в себя использование достоверно определяемых качественных признаков и базирующейся на них периодизации возрастов, позволяет более полно анализировать всю полученную информацию и тем самым повысить точность экспертного заключения (Пиголкин Ю.И. и др., 2001).

При анализе совместного распределения доли костной ткани на рентгенограмме с возрастом было получено, что между ними имеется прямая связь, близкая к линейной, коэффициент корреляции r=0,8.

При построении прогноза ожидаемой величины возраста по доле костной ткани на рентгенограмме по методу линейной регрессии было получено следующее выражение: AGE=17,594+0,705×процент костной ткани,

где AGE — предполагаемый возраст трупа. Среднеквадратичная величина ошибки прогнозирования по данному методу равна ±8,4 года, максимальная величина ошибки прогнозирования — 26 лет.

При статистической обработке результатов морфометрического исследования при прогнозировании возраста по методу линейной регрессии были отобраны нижеперечисленные признаки и получена таблица регрессионной модели (табл. 4-2-1).

В соответствии с табл. 4-2-1 ожидаемая величина возраста определяется как:

AGE=38,837+0,106×ранг A+0,143×ранг B+0,101×С+0,054×ранг D–0,095×E–0,118×ранг F,

где AGE — предполагаемый возраст трупа; A — средняя площадь жировой ткани, мкм²; B — средняя площадь костной ткани, мкм²; С — средняя толщина кортикальной пластинки, мкм; D — максимальная длина трабекул, мкм; E — площадь хрящевой ткани, %; F — среднее количество молодых хондроцитов.

Для повышения точности прогноза при статистических расчетах пришлось использовать не только исходные величины, но и их ранги. Поэтому были составлены таблицы для пересчета исходной величины в их ранг. Значения средней площади жировой ткани, средней площади костной ткани, среднее количество молодых хондроцитов и максимальную длину трабекул переводят в ранговые значения по разработанным таблицам (приложения А–Г).

При сравнении величины прогноза возраста с фактической величиной возраста было получено, что среднеквадратичная величина ошибки прогнозирования равна ±7,09 года с диапазоном максимальной ошибки от –15,8 до 21,3.

При комплексном анализе результатов рентгенологического и морфометрического исследований для разработки модели прогнозирования возраста по методу линейной регрессии была получена табл. 4-2-2.

Проведенный анализ результатов позволил разработать экспертную модель диагностики возраста человека по комплексному исследованию ЩХ, представленную уравнением линейной регрессии, имеющим вид:

AGE=19,57+0,141×%P29+0,375×P14+2,93×P8+20,27×P13+0,219×P1–0,02×P21+11,14×P24,

где AGE — предполагаемый возраст трупа; С29 — процент костной ткани на рентгенограмме ЩХ; С14 — средняя площадь жировой ткани, мкм²; С8 — максимальная длина трабекул, мкм; С13 — средняя толщина кортикальной пластинки, мкм; С1 — средняя площадь костной ткани в препарате, %; С21 — среднее количество молодых хондроцитов; С24 — ширина зоны зрелого хряща, мкм.

Для более точной оценки возраста вся изученная совокупность индивидов была разделена на возрастные интервалы:

При рассмотрении всей совокупности индивидов независимо от возрастного интервала признаки старения обнаруживают тесную связь с возрастом (табл. 4-3-1 и 4-3-2).

При составлении регрессионных уравнений были использованы следующие обозначения:

Age — возраст;

Por — остеопороз;

Ek — экзостозы;

Ap — апиостозы;

Uz — узлы;

Porball — остеопороз суммарный;

Sklball — склероз суммарный;

Defball — общий балл сужения суставных щелей;

Totball — суммарный балл по всей кисти;

R30–33 — ширины суставной щели между средней и дистальной фалангами II–V пальцев соответственно;

Sd, Sm, Sp — сумма баллов по дистальным, средним и проксимальным фалангам соответственно;

Indcomp — индекс компактизации (по Павловскому);

Для всего возрастного диапазона

AGE=30,68+0,627×Totball+1,783×PorD–1,664×UzP4–3,544×EkM4–0,951×UzM2–1,174×EkP3+1,229×EkP5; R=0,912, R²=0,831, Std. Err.=6,850.

В интервале 18–30 лет возрастные изменения костей кисти связаны с изменением размерных характеристик костей [29, 124, 185]. Поэтому регрессионный анализ с использованием только возрастных маркеров дает неприменимый на практике результат. Анализ корреляционных матриц показал, что коэффициенты корреляции признаков с возрастом в этом возрастном интервале незначительны.

Ситуация меняется в следующем возрастном интервале — от 30 лет. Как уже говорилось выше, после 30 лет начинается отчетливо выраженное накопление количества возрастных маркеров, особенно у мужчин. Однако построение практически применимого регрессионного уравнения для широкого интервала от 30 до 50 лет невозможно, так как даже значимые коэффициенты корреляции невелики.

По-видимому, это связано с неравномерным накоплением различных признаков на разных этапах большого возрастного интервала, а также с наличием в любой группе индивидов с разным темпом старения. Точность уравнения для 20-летнего возрастного интервала не позволяет использовать его в практике эксперта. Для получения практически значимых уравнений вся совокупность индивидов была разбита на более узкие возрастные интервалы. Это позволило сузить размах случайных колебаний балльных оценок и выработать уравнения регрессии довольно высокой точности.

Таким образом, ведущими в определении возраста у мужчин молодого возраста являются признаки, связанные с абсолютными размерами суставной щели (особенно на II, а затем на V пальце) и с балловой оценкой количества суженных суставных щелей на всей кисти. Важную роль играет оценка развития экзостозов на средних фалангах и апиостозов на II и V пальцах. В более зрелом возрасте (от 45 до 60 лет) на первое место выходят признаки возрастных изменений на пятом луче кисти: почти все признаки, вошедшие в уравнение регрессии для этого возрастного интервала, определяются на мизинце. Наконец, для пожилого возраста большее значение имеют признаки, определяемые на втором и третьем лучах, а также проявления остеопороза и суммарные характеристики по всей кисти. Так как выборка пожилых мужчин невелика, мы построили еще одно регрессионное уравнение для пожилого возраста, расширив возрастные рамки, увеличили численность выборки.

Для подгруппы мужчин старше 50 лет:

AGE=51,799+0,583×Por–1,608×EkP3+2,998×EkP5–12,59×R30+0,557Sd+10,028×R33; R=0,868, R2=0,753, Std. Err.=5,36.

Отметим, что наиболее достоверны уравнения именно для пожилого возраста. Разработанная методика позволяет определять возраст человека по изменениям костей кисти с большой точностью и практически 95% достоверностью (вероятность точного определения возраста описывает R², то есть чем выше данный показатель, тем выше вероятность того, что экспертный случай попадет в рамки стандартной ошибки регрессионного уравнения).

Для женской подгруппы построение применимых на практике регрессионных уравнений возможно лишь с 45 лет, что связано с постепенным, менее скачкообразным накоплением возрастных маркеров, о чем говорилось выше.

AGE=63,128+0,457×PorN+0,131×TotballN+3,236×Sklball–17,825×Indcomp–0,826×UzP4+0,851×Defball; R=0,809, R²=0,654, Std. Err.=5,19.

В тех случаях, когда построение работающей регрессионной модели невозможно, предлагается использовать таблицы односторонних оценок возрастных интервалов, составленные на основе обработки данных по 594 индивидам — табл. 4-3-3 и 4-3-4. Использование таблиц позволяет оценить возраст с меньшей, но достаточно надежной точностью.

Изложенную в данной главе методику можно применять при установлении возраста трупов, а также живых лиц.