Медицинская микробиология. От микроскопии к масс-спектрометрии

В комплектацию простого микроскопа входят двояковыпуклые линзы, утолщенные в центре. Увеличенное изображение создается в той же ориентации, что и исходный предмет, чем простой микроскоп отличается от сложного. Простые микроскопы имеют ограниченное разрешение и кратность увеличения из-за низкой числовой апертуры (способности концентрировать световые лучи линзами или конденсором). Большинство коммерчески доступных приборов дают кратность увеличения от 2 до 30 раз, а лучшие линзы дают разрешение около 10 мкм. Простые микроскопы в настоящее время нашли применение для препарирования, оценки бактериальных колоний и интерпретации реакции агглютинации. Примерами простых микроскопов являются ювелирные лупы, устройства визуализации фотодиапозитивов и простые увеличительные стекла.

Впервые такие микроскопы были созданы около 1590 г. голландскими производителями очков Захариусом и Хансом Дженссенами. Их устройство состояло из линз объектива, которые помещались вблизи образца и линз окуляра, которые располагались вблизи глаза. Линзы находились на противоположных концах трубы. Они проектировали увеличенное изображение в трубу, и окуляр увеличивал спроектированное изображение, таким образом давая двухэтапное увеличение. Такое расположение линз до сих пор используется в современных сложных микроскопах.

Стереоскопический микроскоп объединяет два сложных микроскопа, для каждого глаза в отдельности. При наложении двух изображений в мозге возникает трехмерный стереоскопический эффект. Стереоскопические микроскопы могут быть как с отраженным, так и с проходящим освещением, однако отсутствие конденсора ограничивает их числовую апертуру и разрешение. Такие устройства применяют для изучения морфологии колоний культур бактерий, грибов и клеток.

Живые неокрашенные микроорганизмы позволяет изучать темнопольная микроскопия. Так, например, с ее помощью можно изучать спиралевидные бактерии (спирохеты и лептоспиры) и подтверждать подвижность других микроорганизмов. В темнопольной микроскопии высокого разрешения используется специальный кардиоидный конденсор с высокой числовой апертурой, который блокирует центральный световой поток и создает световой конус, направленный от линз объектива под наклоном. Бактерии на стекле имеют показатель преломления, несколько отличающийся от показателя преломления окружающей среды, и световые лучи, проходя через микроорганизм, отражаются на линзы объектива, создавая яркую окраску организма на фоне темного фона. Темнопольная микроскопия повышает разрешающую способность микроскопа до 0,1 мкм или меньше, тогда как в светлопольной микроскопии этот показатель составляет 0,2 мкм.

Фазово-контрастная микроскопия помогает улучшить изображение при работе с неокрашенными биологическими образцами, прозрачными в светлом поле. Обычно для этого уменьшают размер диафрагмы конденсора, но это приводит к уменьшению разрешающей способности и появлению артефактов, вызванных дифракцией. Фазово-контрастная микроскопия улучшает контраст в таких образцах без значимой потери разрешения.

При работе с фазово-контрастным микроскопом под нижние линзы конденсора помещают кольцо для создания пучка света цилиндрической формы, пустого внутри. Этот световой пучок при прохождении через объектив существенно не изменяется и достигает задней части фокальной плоскости объектива в виде кольца. Свет, проходя через образец, отражается и замедляется так, что выходит из фазы, в которой находится неизмененный пучок света примерно на 1/4 длины волны. Этот световой пучок распространяется по всей фокальной плоскости. Свет, проходя через заднюю часть фокальной плоскости объектива, взаимодействует с кольцевидной фазовой пластиной, которая изменяет прямой световой путь на 1/4 длины волны. При достижении прямым и отраженным светом плоскости изображения они выходят из фазы на 1/2 длины волны. Этот вышедший из фазы свет действует таким образом, что образец становится просматриваемым в деталях в виде темной зоны на более светлом фоне. Поскольку расчет фазового сдвига основан на 1/4 длины волны зеленого света, фазовое изображение имеет лучшее разрешение при размещении на пути света зеленого фильтра. Зеленые фильтры также позволяют использовать менее дорогие ахроматические линзы, которые сферически скорректированы под зеленый свет. Фазово-контрастная микроскопия позволяет работать с неокрашенными образцами, но имеет меньшую разрешающую способность, чем микроскопия в ярком поле окрашенных образцов [45].

Кроме того, просматриваемые объекты часто окружены ореолом, затемняющим контуры образца. Такой вид микроскопии не позволяет рассматривать толстые образцы, так как фазовый сдвиг может быть больше ожидаемого сдвига в 1/4 длины волны.

Флуоресцентный микроскоп сконструирован в начале 1900-х гг. и сначала использовался для идентификации и локализации соединений, имеющих собственную флуоресценцию при облучении ультрафиолетом. С 1930-х гг. его стали применять вместе с флюоресцирующими соединениями для идентификации специфических компонентов тканей и инфекционных агентов, которые не обладали собственной флуоресценцией. Примеры таких флюоресцирующих соединений включают акридиновый оранжевый (встраивается в ДНК и рибонуклеиновую кислоту (РНК)), аурамин или родамин (для миколовых кислот), калькофлуор белый (для полисахаридов клеточной стенки грибов), голубой Эванса (для цитоплазмы зафиксированных клеток) и Hoechst 33258 (для минорных количеств АТ-богатых двухцепочечных ДНК).

С 1940-х гг. стали применять конъюгаты флюорохром–антитело (иммунофлуоресценция). Впервые меченные флуоресцеином антитела для детекции полисахаридных антигенов пневмококков в тканях зараженных мышей использовали Альберт Кунс и соавт. Окрашивание флюоресцирующими антителами нашло широкое применение после создания в 1950 г. флуоресцеинизоцианата и в 1958 г. его более стабильного производного - флуоресцеинизотиоцианата (FITC).

Относительно недавно появился новый класс флуоресцентных меток для биологии и медицины - квантовые точки. Эти новые флуоресцентные метки при конъюгации с антителами и другими биологическими лигандами лишены многих недостатков, свойственных традиционным флюорофорам, используемым в клинической диагностике. Они имеют хороший яркий сигнал, устойчивы к обесцвечиванию светом, и светом с одной и той же длиной волны может быть возбуждено множество флуоресцентных цветов. Последнее свойство делает флуоресцентную микроскопию со множеством цветов несложной в применении и при правильной установке длины волны дает количественную информацию о представленности лиганда. Квантовые точки нашли применение в окрашивании живых клеток, фиксированных клеток и тканей [46]. В настоящее время флуоресцентная микроскопия также используется совместно с гибридизацией нуклеиновых кислот для визуализации флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и многоцветных зондов для FISH [47–49].

Флуоресцентная микроскопия основана на способности флюоресцирующих веществ абсорбировать энергию, близкую к ультрафиолету, и переизлучать эту энергию (свет) с большей длиной волны. Флуоресцентный микроскоп должен облучать образец ультрафиолетовым светом возбуждения и отделять гораздо более слабый излучаемый свет от более яркого возбуждающего света, чтобы глаза улавливали только излучаемый свет. Полученное изображение состоит из ярко светящихся областей на темном фоне. В первых флуоресцентных микроскопах применялось освещение в темном поле или флуоресценция в проходящем свете [50].

Эти системы были громоздкими, трудоемкими в использовании и не обладали достаточным разрешением. В большинстве современных флуоресцентных микроскопов используется отраженный свет (эпифлуоресценция). В этих приборах возбуждающий свет направляется вниз через объектив на образец. Испускаемый свет и отраженный свет возбуждения собираются объективом и проходят через дихроматическое зеркало, которое удаляет свет возбуждения и позволяет излучаемому свету с большей длиной волны формировать изображение. При эпифлуоресценции объектив действует как конденсор, что устраняет проблемы выравнивания и смазывания, связанные с конденсором темного поля. Поле зрения ярче при эпифлуоресценции, разрешение выше, тушение флуоресценции происходит только в поле зрения [51].

Флуоресцентная микроскопия требует высокого уровня освещения, так как квантовый выход большинства традиционных флюорохромов низкий. Наиболее распространенные лампы, используемые во флуоресцентной микроскопии, - это лампы на основе паров ртути, работающие в диапазоне мощности от 50 до 200 Вт, или лампы на основе паров ксенона мощностью от 75 до 200 Вт. Следует отметить, что полезная яркость флуоресцентной лампы не всегда измеряется ее мощностью. 100-ваттная ртутная лампа в 4 раза ярче, чем 200-ваттная лампа, и в 11 раз ярче 150-ваттной ксеноновой лампы [52].

Лампы для флуоресцентной микроскопии находятся под высоким напряжением, и при работе с ними необходимо соблюдать осторожность во избежание их разрушения. Ни в коем случае нельзя прикасаться к этим лампам голыми руками, потому что жир на пальцах может вызвать протравливание или обесцвечивание стекла.

Флюорохромы должны возбуждаться светом определенной длины, чтобы генерировать максимальное количество излучаемого света. Поэтому для оптимизации квантового выхода флюорофора используются специальные комбинации возбудителя и барьерного фильтра. Возбуждающие фильтры используются для выбора необходимой длины световой волны из спектра света, генерируемого лампой. Возбуждающие фильтры поставляются с узкой, средней и широкой полосой пропускания - узкий, средний и широкий диапазоны световых частот, соответственно. Барьерные фильтры блокируют более короткие волны света и пропускают более длинные волны через фильтр. Барьерные фильтры важны, потому что они удаляют высокоинтенсивный возбуждающий свет, который может подавлять излучаемый свет низкой интенсивности. Барьерные фильтры также предотвращают попадание ультрафиолетового излучения в глаза, где оно может вызвать катаракту и повреждение сетчатки. Барьерные фильтры с широкой полосой пропускания обычно дают более яркие изображения, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить появление фонового света, который может подавлять излучаемый свет. Эпифлуоресцентные микроскопы также имеют дихроматическое зеркало (расщепитель луча), которое отражает входящий в объектив свет возбуждения и позволяет излучаемому свету проходить к барьерному фильтру и объективам [53].

У большинства современных эпифлуоресцентных микроскопов барьерный фильтр, возбуждающее зеркало и светоделитель размещены в съемных оптических блоках, причем в микроскоп можно установить сразу несколько таких блоков. Эта конфигурация позволяет использовать фильтры возбуждения и барьеры для различных флюорохромов. Следует соблюдать осторожность при выборе оптических блоков. Возбуждающий фильтр должен соответствовать длине волны возбуждения флюорофора, а эмиссионный барьер должен позволять испускаемому свету пройти через него. Например, при прямом флуоресцентном тестировании антител на вирусные антигены в мазках клеток обычно используются антитела, меченные FITC, и контрастное окрашивание синего Эванса. Выбор оптического блока с фильтром возбуждения от 450 до 490 нм и широкополосным барьерным фильтром 515 нм обеспечит яркое поле зрения, а контрастно окрашенные клетки будут казаться оранжево-красными. При выборе более узкополосного барьерного фильтра (от 520 до 560 нм) поле зрения будет темнее, а красный свет, излучаемый синей краской Эванса, не будет виден. Изображения, создаваемые этим оптическим блоком, будут более контрастными, так как фон темнее. Обе комбинации фильтров подходят для этой задачи, но окончательный выбор будет зависеть от предпочтений пользователя.

Одной из основных проблем при использовании и изучении флуоресцентных микроскопических изображений является тенденция традиционных флюорофоров терять флуоресценцию при воздействии возбуждающего света в течение нескольких минут. Эта потеря флуоресценции вызывается двумя механизмами: фотообесцвечиванием и тушением. Фотообесцвечивание (выцветание) - это необратимая потеря флуоресценции, вызванная химическим повреждением флюорофора [54].

Тушение вызвано наличием свободных радикалов, солей тяжелых металлов или соединений галогенов. Тушение также может быть вызвано передачей энергии испускаемого света другим флуоресцентным молекулам, находящимся в непосредственной близости от флюорофора, в процессе, называемом флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET). Для уменьшения этого эффекта препараты следует хранить в темноте при температуре от 2 до 8 °С. Кроме того, пользователь должен блокировать путь возбуждающего света, когда не просматривает и не фотографирует образец. Для этой цели большинство эпифлуоресцентных микроскопов имеют затвор на пути света. Тушение может быть серьезной проблемой при фотографировании флуоресцентных изображений, так как затвор может быть открыт в течение минуты или более. Тушение можно несколько уменьшить, добавив к раствору поглотители свободных радикалов, такие как п-фенилендиамин, 1,4-диазабицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) или н-пропилгаллат. п-Фенилендиамин и н-пропилгаллат можно использовать для уменьшения тушения в FITC и родамине. DABCO немного менее эффективен, чем п-фенилендиамин, для флуоресценции FITC, но, в отличие от п-фенилендиамина, DABCO не темнеет при воздействии света и более безопасен в использовании. Основным преимуществом флюорофоров с квантовыми точками является их устойчивость к фотообесцвечиванию.

Первым исследователем, использовавшим процедуру микрометрии (линейные измерения), был Антони ван Левенгук, который сравнил размер мелких песчинок с размером эритроцитов человека. С тех пор для определения размеров микроскопических организмов использовались различные подходы. Например, размер объекта сравнивали с измеренным или рассчитанным размером поля зрения. В другом случае, подобно Левенгуку, на изображении сравнивали размер более крупных организмов с размером эритроцита (от 6 до 8 мкм). Другие микрометрические методы включают добавление в образец шариков полистирола известного размера. Затем проводят сравнительные измерения с использованием микрофотографии или цифрового изображения. Точность этих методов непостоянна и зависит от однородности объектов сравнения.

Микроорганизмы можно измерять непосредственно, помещая их на калиброванное предметное стекло микроскопа или в счетную камеру. Точность этого метода зависит от расстояния между разлинованными линиями, но в среднем составляет от 10 до 50 мкм.

Обычно в клинико-диагностической лаборатории используется градуированная шкала (сетка) внутри одного из окуляров. Такие сетки должны быть откалиброваны по предметному микрометру для каждого объектива [55, 56].

Во избежание ненужной повторной калибровки следует записывать информацию о калибровке для каждого объектива и хранить ее рядом с рабочей станцией микроскопа. Точность измерения сетки составляет примерно от 2 до 10 мкм (от 3 до 5%), в зависимости от увеличения и разрешения предметного микрометра.

Современные световые микроскопы могут быть снабжены камерами захвата изображения, позволяющими перевести его в цифровой формат. В этом случае дальнейшая оценка свойств микроскопируемых объектов, включая их размер, может быть проведена с использованием специального программного обеспечения.

Микрофотографии уже давно используются для исследований морфологических свойств живых систем, в научных публикациях и лекциях при обучении. Фиксировать микроскопические изображения на пленку ученые начали вскоре после изобретения фотографического процесса. Современные технологии позволяют получать микрофотографии с высоким разрешением и четкостью, но их использование было ограничено длительностью обработки, связанной с проявкой пленки и печатью. С появлением цифровой фотографии и высококачественных цифровых камер микрофотографии стали доступнее для микробиологических лабораторий. В настоящее время широко используется передача цифровых микрофотографий через сеть интернет, что значительно расширило возможности локальных микробиологических и других лабораторий. В настоящее время коммерчески доступен широкий спектр микроскопов со встроенными системами камер и сложными средствами измерения размеров объекта с изменением освещенности и экспозиции.

Проблема идентификации микроорганизмов и их характеристики возникла, как только была обнаружена взаимосвязь бактерий с заболеваниями. На протяжении ста лет после смерти Роберта Коха микробиологическая диагностика оставалась практически неизменной. В классическом варианте идентификация микроорганизмов, выделенных из образцов биологического материала культивированием в лабораторных условиях, проводится с помощью микроскопии, по морфологическим и тинкториальным свойствам микроорганизмов. Окраска по Граму в большинстве случаев позволяет провести предварительную идентификацию грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, что может помочь скорректировать антибактериальную терапию. Эта процедура обычно занимает несколько минут, однако видовая идентификация требует дальнейшего культивирования c проведением биохимической идентификации, которую можно осуществить различными способами: характеристика "пестрых рядов", применение классических биохимических наборов, тест-систем, а также с помощью полу- и автоматических бактериологических анализаторов [57].

Появление бактериологических анализаторов значительно упростило работу врачей-микробиологов, дало возможность определять видовую принадлежность и чувствительность к антимикробным препаратам большого спектра микроорганизмов. Однако этот процесс занимает длительный промежуток времени и порой ведет к запоздалому получению окончательных результатов, которые могут оказаться невостребованными. К недостаткам методов автоматической биохимической идентификации можно отнести и значительную стоимость как самих приборов, так и необходимых для их работы расходных материалов, что ограничивает возможность широкого повсеместного использования этого оборудования [58].

Диагностика оппортунистических и госпитальных инфекций, вызванных условно-патогенными штаммами микроорганизмов, принципиально отличается от диагностики инфекций, вызванных явными патогенами, при обнаружении которых диагноз не вызывает сомнений. Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то само по себе выделение микроорганизмов из клинического материала, особенно из нестерильных локусов, не служит доказательством их этиологической роли, так как те же самые микроорганизмы колонизируют слизистые оболочки и в норме [59].

Только количественные микробиологические исследования, позволяющие выявить соотношения выделенных видов микроорганизмов в пробе, а также изучение их биологических свойств, могут в относительно полной мере определить этиологический фактор развития инфекции [60–62].

Другая проблема связана с тем, что далеко не все микроорганизмы поддаются культивированию на питательных средах. Примером могут служить строго анаэробные бактерии, которые не только с трудом растут на питательных средах, но и плохо поддаются идентификации классическими микробиологическими методами. Большинство из них можно культивировать лишь при определенных условиях, с затратой дополнительных средств, а идентификация биохимическими способами далека от совершенства, требует дальнейшей доработки методов и покрывает отнюдь не весь спектр известных культивируемых в настоящее время анаэробных микроорганизмов [63, 64].

Несмотря на недостатки, культуральный метод все же остается "золотым стандартом" в микробиологической диагностике большинства инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями и грибами, и благодаря ему удается получить максимально полные данные о фенотипических свойствах и чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Традиционно идентификация бактерий и грибов основывалась на биохимических реакциях в пробирках, а результаты сравнивались со справочными таблицами ожидаемых результатов биохимических реакций. Из-за потребности в более быстрых и простых методах в рутинную практику были внедрены наборы для ручного биохимического тестирования и полуавтоматические или автоматические методы. Автоматизация в микробиологии началась в 1970-х гг. с появлением полуавтоматических устройств для посева крови, затем возникли инструментальные системы для идентификации и тестирования чувствительности бактерий к антимикробным препаратам и более быстрые полуавтоматические и автоматизированные системы, основанные на анализе биохимических характеристик, структуре жирных кислот и/или других метаболических свойствах. Доступные на рынке биохимические платформы могут включать программное обеспечение для принятия решений, объединяющее результаты идентификации микроорганизмов и тестирования их чувствительности к антимикробным препаратам и рекомендациям по терапии.

На начальных этапах микроорганизмы идентифицировали с помощью того, что мы сейчас называем "рутинными процедурами", которые включают постановку биохимических реакций в пробирках и изучение физических характеристик, таких как морфология колоний и запах, в сочетании с результатами окрашивания по Граму, серологическими тестами и профилями микробной чувствительности к антибиотикам. Со временем тщательно отобранные по их положительным и отрицательным реакциям на основе набора субстратов и обычно используемые с целью идентификации микроорганизмов биохимические реакции преобразовались в более удобный формат. Эти паттерны создают метаболические профили, которые сравниваются с базами данных, сформированных на основании изучения биохимических свойств у типовых или других хорошо охарактеризованных, обычно коллекционных, штаммов микроорганизмов.

Биохимические профили определяются реакциями отдельных организмов с каждым из субстратов в диагностической тест-системе. Точность реакций зависит от того, соблюдают ли пользователи указания производителя относительно подготовки инокулята, его плотности, условий инкубации и интерпретации теста. Большинство систем полагаются на один индикатор или комбинацию нескольких индикаторов. К таким индикаторам относятся: изменения водородного показателя (pH; от лат. pondus Hydrogenii ) в результате использования субстрата, ферментативные реакции, в итоге которых высвобождается хромогенное или флюорогенное соединение, индикаторы метаболической активности на основе тетразолия в присутствии различных окисляемых углеводородных источников, обнаружение летучих или нелетучих соединений и распознавание видимого роста. Также для микробной идентификации могут быть включены дополнительные биохимические тесты, в которых используются другие средства обнаружения положительного ответа на данный субстрат.

Хотя формально такого определения, как "быстрое", для описания времени, необходимого для получения результатов, не существует, большинство микробиологов ожидают, что быстрые диагностические тест-системы будут давать пригодные для использования результаты в течение 4 ч. Ясно, что время удвоения популяции микробов (обычно 30 мин и более) не позволит выявлять биохимические реакции в столь короткий срок. Для решения данной задачи производители быстрых систем используют новые субстраты, с которыми ферменты, продуцируемые тестируемыми организмами, могут реагировать, вызывая ответы, обнаруживаемые в пределах от 1 до 4 ч, например хромогенные субстраты.

В России коммерчески доступны наборы для идентификации микроорганизмов посредством ряда биохимических реакций на планшетах. C их помощью возможно идентифицировать Enterobacteriaceae , неферментирующие грамотрицательные палочки,Neisseria spp. , Haemophilus spp. , Moraxella catarrhalis , грамположительные бактерии, дрожжевые грибы, клинически значимые анаэробные бактерии, микоплазмы, а также определять чувствительность к антимикробным препаратам. Минимальное время идентификационного теста составляет 4 ч. Примерами таких идентификационных систем являются BD BBL Crystal ID (продукция фирмы Becton Dickinson, США), Auxacolor 2 (продукция фирмы Bio-rad, США), системы индикаторные бумажные для идентификации энтеробактерий (продукция фирмы "Микроген", Россия).

За последние пять десятилетий наблюдается эволюция автоматизированных систем идентификации микроорганизмов и тестирования чувствительности к антимикробным препаратам. Такие платформы в настоящее время состоят из персонального компьютера, считывающего устройства/инкубатора и интеллектуальной несущей станции. В некоторых системах существует модуль подготовки образцов, который стандартизирует посевной материал и идентифицирует образец с помощью этикетки со штрих-кодом перед загрузкой кассет. Существует несколько доступных систем в зависимости от желаемого размера прибора и объема исследований. Имеются карты для идентификации анаэробов и коринеформных бактерий; дрожжевых грибов; видов Neisseria , Haemophilus и других прихотливых организмов; грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (Enterobacteriaceae , non -Enterobacteriaceae и высокопатогенных микроорганизмов, таких как виды родов Brucella и Francisella ). Примерами таких платформ являются система Vitek 2 (продукция фирмы bioMerieux, Франция), Phoenix (продукция фирмы Becton Dickinson, США), Trek Diagnostic System Sensititre (продукция фирмы Thermo Fisher Scientific, США).

Возможности автоматизированных систем продолжают изучаться в литературе по мере добавления новых функций и обновления версий программного обеспечения. В современных публикациях эти системы рассматриваются в контексте сравнения с новыми платформами, основанными на изучении результатов молекулярно-биологических исследований и MALDI-TOF MS. В нескольких недавних статьях сравнивалась производительность некоторых платформ; эта информация полезна для лабораторий, желающих приобрести одну из таких систем [65–68].

Некоторые автоматизированные системы, помимо обычных панелей, содержат еще и быстрые. Обычные панели включают традиционные биохимические вещества для идентификации и определения минимальной ингибирующей концентрации путем микроразведений в бульоне, и их можно считывать визуально. Быстрые панели обеспечивают идентификацию микроорганизмов уже через 2–2,5 ч, а результаты микроразведений в бульоне - через 4,5–16–18 ч. Результаты выдаются в течение 18 ч. В быстрых панелях используются флюорогенные субстраты или флюорогенные индикаторы для обнаружения изменений pH при использовании субстратов и появлении специфических продуктов метаболизма [69]. Подобно другим системам, идентификация основана на обнаружении убыли субстрата, изменений pH и роста в присутствии определенных противомикробных агентов. В зависимости от используемой панели результаты могут быть доступны через 2–42 ч после инкубации при 35 °C. Примерами такой быстрой системы являются наборы для идентификации Neisseria spp ./Haemophilus spp ., а также строго анаэробных бактерий BD BBL Crystal ID [70].

Существует система, основанная на способности микроорганизма использовать или окислять 95 углеродсодержащих субстратов, размещенных в 96-луночном полистироловом титрационном микропланшете. Для индикации используется процесс восстановления индикатора тетразолия фиолетового, который включен в состав каждого субстрата как показатель окисления тестируемого соединения. "Углеводный профиль" анализируется программным обеспечением прибора и сравнивается с обширной базой данных, содержащей более 2500 видов аэробных и анаэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Примером такой системы является OmniLog (продукция фирмы Biolog, США) [71].

Существует система идентификации бактериальных патогенов с помощью газохроматографического анализа жирных кислот. Как правило, на идентификацию требуется от 1,5 до 2 ч. Тестируемые микроорганизмы пересевают на определенные среды и инкубируют в течение 24 ч, а затем биомассу переносят в пробирки для экстракции жирных кислот перед проведением газовой хроматографии. Программа идентифицирует микроорганизмы, используя качественное и количественное сопоставление метиловых эфиров жирных кислот. Примером является платформа Sherlock, продукция фирмы MIDI, США [72].

B настоящее время возможно проведение цифровой обработки изображений, которое автоматизирует процесс считывания и интерпретации тестов диско-диффузионного метода и результатов других коммерческих наборов или тестов для идентификации и определения чувствительности в ручном режиме. Система также автоматизирует считывание минимальной подавляющей концентрации при постановке E-тестов и панелей с микроразведениями в бульоне. Примером является микробиологический анализатор BIOMIC V3 (продукция фирмы Giles Scientific, США) [72].

Применение методов, основанных на фенотипической идентификации микроорганизмов, как правило, возможно для распространенных, регулярно выделяемых из клинического материала микроорганизмов и зачастую не является быстрой процедурой.

Вместе с тем для труднокультивируемых, сложноидентифицируемых микроорганизмов могут потребоваться методы, основанные на анализе нуклеиновых кислот, такие как секвенирование ДНК-мишеней, а также методы обнаружения, специфичные для конкретного микроорганизма. Методы на основе амплификации нуклеотидных последовательностей не требуют от микроорганизма способности к выраженному росту in vitro или даже наличия жизнеспособного микроорганизма. Результаты, полученные молекулярно-биологическими методами, можно легко перемещать между лабораториями, и они могут помочь в определении таксономической взаимосвязи между микроорганизмами для эпидемиологического контроля.

Следует отметить, что, несмотря на существенный прогресс в развитии молекулярно-биологических методов, который произошел за последние 10–15 лет, эти исследования по скорости несравнимы с иммунологическими экспресс-тестами. С другой стороны, эти две группы тестов несоизмеримы и по показателям чувствительности и специфичности. Как правило, молекулярно-биологические методы, такие как ПЦР в режиме реального времени, дают результат в течение нескольких часов. Отдельные молекулярно-биологические методики, которые в настоящее время становятся все более и более доступными, могут давать результаты через 60–80 мин с очень высокой чувствительностью и специфичностью. Наиболее быстрые из них способны дать результаты примерно через 20–30 мин с достаточно высокой чувствительностью и специфичностью.

Инструменты I поколения, используемые для обнаружения нуклеиновых кислот, позволяли проводить только монопараметрический анализ и так же, как и традиционные ИФА тест-системы, были направлены на определение только одного вида бактерий или вирусов. Усовершенствование этих инструментов и разработка новых технологических решений в настоящее время открыли возможности для создания мультипараметрических тест-систем. Использование технологий микрочипов, мультиплексной ПЦР позволило проводить быструю микробиологическую диагностику. Кроме того, в то время как первые тест-системы были нацелены на обнаружение и идентификацию только самих микроорганизмов, новые технологии позволяют параллельно выявлять у них гены, ответственные за резистентность к антибиотикам [73].

Для быстрого обнаружения микроорганизмов в клиническом материале успешно используется метод ПЦР с определением продуктов реакции путем проведения гель-электрофореза (классическая ПЦР); реакция занимает в целом около 10 ч. Однако ПЦР может быть инициирована не только ДНК-мишенью, но и самими продуктами амплификации, поэтому методы, основанные на этой технологии, очень чувствительны к загрязнению и могут приводить к ложноположительным результатам [74].

Современные молекулярно-биологические методы можно поделить на две большие группы: методы, основанные на ПЦР, и методы, связанные с особенностями нуклеотидных последовательностей ДНК/РНК. Рассмотрим каждый из этих подходов подробнее.

Полимеразная цепная реакция

ПЦР представляет собой химическую реакцию in vitro , которая позволяет синтезировать практически неограниченные количества целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Основной компонент реакции - фермент ДНК-полимераза, способная копировать цепь ДНК. В простейшем случае реакционная смесь для проведения ПЦР состоит из ДНК-мишени, двух олигонуклеотидных праймеров, взятых в избытке, термостабильной ДНК-полимеразы, эквимолярной смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ), MgCl₂ , KCl и буфера Tris-HCl. Два праймера фланкируют амплифицируемую последовательность двухцепочечной ДНК, обычно от <100 до нескольких сотен оснований, и комплементарны противоположным цепям мишени.

Для начала ПЦР реакционную смесь нагревают до температуры, позволяющей двум комплементарным цепям ДНК-мишени разъединиться, а затем охлаждают, чтобы праймеры отжигались с ДНК-мишенью специфичным для нуклеотидной последовательности образом. Затем ДНК-полимераза инициирует элонгацию праймеров на их 3’-концах по направлению друг к другу. Продукты элонгации праймеров отделяются от ДНК-мишени при последующем нагреве. Каждый продукт элонгации так же, как и исходная мишень, может служить шаблоном для последующих циклов отжига и удлинения праймеров.

Теоретически в конце каждого цикла продукты ПЦР удваиваются. Таким образом, после n -циклов ПЦР целевая нуклеотидная последовательность может быть амплифицирована в 2 ⁿ раз. Вся процедура проводится в программируемом термоциклере, точно контролирующем температуру, при которой проходят стадии, время нахождения реакционной смеси при определенной температуре и число циклов. В идеале после 20 циклов ПЦР достигается 10⁶ -кратная амплификация, а после 30 циклов - 10⁹ -кратная. На практике амплификация может быть не полностью эффективной вследствие неудачной оптимизации условий реакции или присутствия ингибиторов ДНК-полимеразы. В таких случаях суммарная амплификация лучше всего описывается выражением (1+e) ⁿ , где e - эффективность амплификации (0 ≤ е ≤1), а n - общее количество циклов (рис. 1-1) .

Преимуществом метода ПЦР является также его способность обнаруживать в клиническом материале одновременно несколько видов патогенов, а также атипичные патогены бактериальной и вирусной природы, которые не могут быть выявлены культуральными методами (Chlamydia pneumoniae ,Mycoplasma pneumoniae ) [76, 77].

Цифровая полимеразная цепная реакция

В процессе ПЦР происходит экспоненциальная амплификация нуклеиновой кислоты мишени, при этом число циклов и количество продуктов амплификации теоретически позволяют рассчитать исходное количество ДНК-мишени. Однако многие факторы усложняют этот расчет, часто создавая неопределенности и неточности, особенно при низкой исходной концентрации мишени. Технология цифровой ПЦР позволяет преодолеть эти трудности путем преобразования экспоненциальных данных традиционной ПЦР в цифровые линейные сигналы, которые просто показывают, произошел ли процесс амплификации. Дополнительным преимуществом цифровой ПЦР является то, что эта технология дает возможность получить данные об абсолютном количестве нуклеиновой кислоты-мишени в образце без использования референсных стандартных кривых.

Цифровую ПЦР проводят путем улавливания или изоляции каждой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в исходном образце, во многих камерах, зонах или лунках микрочипа или каплях водно-масляной эмульсии, которые в последующем способны локализовать и концентрировать продукты амплификации до уровней, которые возможно детектировать. После ПЦР-амплификации количество лунок, или капель эмульсии содержащих продукты реакции, является прямым показателем исходного количества нуклеиновой кислоты в образце. Разделение до отдельных молекул нуклеиновых кислот можно проводить в капиллярах, микроэмульсиях, массивах миниатюрных камер или на поверхностях чипов, которые связывают нуклеиновые кислоты [78].

Цифровая ПЦР имеет множество применений, включая обнаружение и количественную оценку малых и сверхмалых количеств генетического материала патогенных микроорганизмов, редких генетических последовательностей, уровня экспрессии генов в отдельных клетках и клональной амплификации нуклеиновых кислот при секвенировании смешанных образцов нуклеиновых кислот. Клональная амплификация с помощью цифровой ПЦР является ключевым элементом многих методов секвенирования "следующего поколения" [79].

Вложенная полимеразная цепная реакция

Вложенная ПЦР разработана для повышения как чувствительности, так и специфичности ПЦР. В этом методе используются две пары праймеров для амплификации и два раунда ПЦР. Обычно одну пару праймеров используют в первом раунде ПЦР, состоящем из 15–30 циклов. Продукты первого раунда амплификации затем подвергают второму раунду амплификации со вторым набором праймеров, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, находящейся внутри нуклеотидной последовательности, амплифицированной первым набором праймеров. Повышение чувствительности возникает из-за высокого общего числа циклов, а повышенная специфичность - из-за отжига второго набора праймеров с последовательностями, обнаруженными только в продуктах первого раунда, таким образом подтверждая идентичность продуктов первого раунда [76]. Основным недостатком вложенной ПЦР является высокий уровень контаминации при переносе материала из пробирки первого раунда в пробирку второго раунда амплификации. Этого можно избежать либо путем физического разделения смесей для первой и второй амплификации слоем воска или масла, либо путем разработки однопробирочных вариантов амплификации [80]. На практике повышенная чувствительность, обеспечиваемая протоколами вложенной ПЦР, редко требуется в диагностических целях, а идентичность продукта амплификации обычно подтверждается гибридизацией с зондом нуклеиновой кислоты [81].

Мультиплексная полимеразная цепная реакция

Важнейшей модификацией ПЦР является мультипраймерная ПЦР в реальном времени (real-time PCR), которая позволяет проводить в одной пробе экспресс-диагностику сразу нескольких возбудителей различной природы (бактерии, вирусы, грибы и простейшие).

В мультиплексной ПЦР в одну реакционную смесь входят два набора праймеров и более, предназначенных для амплификации различных мишеней. С помощью этого метода более одной целевой последовательности в клиническом образце может быть совместно амплифицировано в одной пробирке. Праймеры, используемые в мультиплексной реакции, должны быть тщательно подобраны так, чтобы они имели близкие температуры отжига и не были комплементарны друг другу. Мультиплексная ПЦР оказалась более сложной в разработке и менее чувствительной, чем ПЦР с одиночными наборами праймеров [82].

Разработано множество мультиплексных тестов, особенно для выявления инфекций центральной нервной системы, органов дыхания, кровотока и желудочно-кишечных инфекционных заболеваний [83–88].

Количество мишеней может варьировать от 2–3 до 20 и более в зависимости от метода, используемого для идентификации отдельных ампликонов. Одной из первых платформ для мультиплексного ПЦР-анализа стала система, включающая полистироловые микросферы (диаметром 5–6 мкм), окрашенные двумя спектрально различающимися флюорохромами. На поверхности микросфер расположены субстанции, специфически взаимодействующие с исследуемыми аналитами, находящимися в растворе (клиническом образце). Для анализа нуклеиновых кислот олигонуклеотидные зонды должны быть ковалентно связаны карбодиимидной связью с поверхностью микросфер. Третий флюорохром связан с репортерной молекулой, по интенсивности его флуоресценции определяется количество исследуемого аналита.

Микросферы исследуют по отдельности в быстротекущем потоке жидкости, когда они проходят через два различных лазера в проточном цитометре. С помощью высокоскоростной цифровой обработки сигналов каждая микросфера классифицируется исходя из спектральных характеристик и измеряет реакцию на своей поверхности.

Мультиплексные анализы, выполняемые на такой платформе, обычно состоят из трех основных этапов: амплификация нуклеиновых кислот с помощью ПЦР, целевая (таргетная) элонгация и расшифровка массива микросфер. После ПЦР-амплификации ампликоны смешивают со вторым набором меченых праймеров, специфичных для каждой мишени. При наличии мишени меченый праймер будет удлиняться мишеньспецифическим образом. Во время этого процесса в продукт элонгации включается метка. Для идентификации помеченных продуктов элонгации добавляются микросферы с цветовой кодировкой. К каждой разноцветной микросфере прикреплен олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидной последовательности метки для каждой мишени. Затем образцы помещают в проточный цитометр, где микросферы считываются двумя цветными лазерами. Один лазер определяет цвет шарика, а другой - наличие или отсутствие маркированного продукта элонгации на этом шарике [82]. Эта технология была адаптирована для широкого спектра применений в бактериологии, микологии и вирусологии [89–91].

Другая технология мультиплексной ПЦР представляет собой полностью автоматизированную, интегрированную и автономную систему "лаборатория в кармане". Имеются блоки для лизиса клеток, очистки нуклеиновых кислот, обратной транскрипции для обнаружения РНК-мишеней, одностадийной ПЦР, мультиплексной ПЦР и планшет для проведения до 120 двухстадийных вложенных ПЦР. После выделения и очистки нуклеиновых кислот выполняется nested-мультиплексная ПЦР. Во время первой стадии ПЦР проходит единая массовая мультиплексная реакция большого объема. Затем продукты первой стадии ПЦР разбавляют и объединяют со свежей реакционной смесью, не содержащей праймеров. Аликвоты этого второго реакционного раствора распределяют в каждую лунку планшета, в которую предварительно вносится один набор праймеров. Второй этап ПЦР в малом объеме проводится в каждой лунке планшета. В конце второй стадии ПЦР-анализа используется анализ кривой плавления для идентификации каждой мишени. Хотя в этом анализе используется вложенная ПЦР, весь тест проводится в запаянной емкости, что снижает вероятность контаминации. Используя данные амплификации и кривой плавления, программное обеспечение автоматически генерирует результат для каждой мишени.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

Real-time PCR - это метод, при котором амплификация ДНК-мишени и детекция образующихся продуктов происходят одновременно в одной пробирке. Важной особенностью этого метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК микроорганизмов в исследуемом материале, а отсутствие стадии электрофореза и автоматическое получение результатов позволяют устанавливать менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории. Отсутствие стадии электрофореза позволяет уменьшить затрачиваемое время на исследование, минимизировать риск контаминации образца и уменьшить число ложноположительных результатов [92].

Принцип ПЦР в режиме реального времени идентичен принципу обычной ПЦР, за исключением того, что процессы амплификации и детекции мишени происходят одновременно в одной и той же пробирке, что позволяет отслеживать амплификацию real-time PCR; обычная же ПЦР способна измерять только конечную точку (то есть обнаруживать или визуализировать продукты ПЦР после завершения амплификации).

Для этих методов требуются специальные термоциклеры с точной оптикой, которые могут детектировать флуоресцентное излучение, исходящее из лунок с образцами. Программное обеспечение, поставляющееся с термоциклером, позволяет отследить результаты ПЦР в каждом цикле и рисует кривую амплификации для каждой реакции.

Наиболее значительным достижением real-time PCR является включение технологии детекции продукта на основе флуоресценции с использованием либо красителей, связывающих двухцепочечную ДНК, либо зондов, меченных специфическими флуоресцентными молекулами (таких как гидролизные, гибридизационные или конформационные зонды, например молекулярные маяки), чтобы обеспечить не только обнаружение специфической нуклеиновой кислоты-мишени, но и количественную оценку мишени (Q-PCR). Кроме того, real-time PCR интегрирует и автоматизирует как амплификацию, так и детекцию в приборе, поэтому для получения результатов требуется меньше времени и трудовых затрат по сравнению с выполнением традиционной ПЦР. Другие преимущества real-time PCR включают использование более коротких последовательностей-мишеней (<150 п.н.), требуется меньший объем образца, динамический диапазон обнаружения более широкий, чувствительность и специфичность анализа более высокая, есть возможность мультиплексирования и анализа кривой плавления, а также отсутствует необходимость в проведении дополнительных манипуляций, требующихся при традиционной ПЦР.

Для мониторинга амплификации во время проведения real-time PCR используются флуоресцентные репортерные молекулы. Увеличение сигнала флуоресценции прямо пропорционально количеству ампликонов ПЦР, образующихся в экспоненциальной фазе реакции. Базовый уровень real-time PCR - это уровень сигнала в течение первых 5–15 циклов, когда сигнал флуоресценции изменяется незначительно, тогда как порог представляет собой уровень сигнала, отражающий значительное увеличение по сравнению с базовым сигналом. Пороговое значение может быть установлено автоматически программным обеспечением прибора или вручную пользователем. Порог цикла (C_t ) представляет собой количество циклов ПЦР, когда сигнал флуоресценции реакции пересекает пороговое значение. Достижение C_t отражает накопление достаточного количества ампликонов, чтобы считать результат реакции положительным. C_t находится в обратной зависимости от количества исходной матрицы. Результаты real-time PCR обычно наносятся на график в виде зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов ПЦР. На рис. 1-2 показана типичная кривая амплификации при real-time PCR.

Широко распространены два метода обнаружения продуктов амплификации real-time PCR: неспецифическое обнаружение с использованием флуоресцентных красителей, интеркалирующих с любой двухцепочечной ДНК, таких как SYBR Green; и специфическое обнаружение с использованием целевых флуоресцентных зондов, таких как зонд TaqMan (зонд гидролиза), молекулярные маяки или зонды двойной гибридизации. Наиболее широко используется краситель SYBR Green, связывающий двухцепочечную ДНК при проведении real-time PCR. В растворе несвязанные молекулы красителя проявляют очень слабую флуоресценцию, но при связывании с двухцепочечной ДНК она значительно увеличивается. По мере накопления двухцепочечной ДНК SYBR Green генерирует сигналы, пропорциональные концентрации ДНК-мишени (рис. 1-3) . Считается, что основным недостатком этой технологии является недостаточно высокая специфичность, так как краситель связывается со всей двухцепочечной ДНК, образующейся в ходе ПЦР, и, следовательно, любые ложные продукты амплификации также могут вносить вклад в общие флуоресцентные сигналы.

Специфичность обнаружения продукта можно повысить за счет анализа кривой плавления. При медленном повышении температуры две цепочки ампликона распадаются, и уровень флуоресценции падает. Данные преобразуются и анализируются путем откладывания первой производной флуоресценции по оси у и температуры по оси х . Специфический амплифицированный продукт будет иметь характерный пик плавления при расчетной температуре плавления (T_m ), тогда как димеры праймеров и другие неспецифические продукты должны иметь отличные T_m или давать более широкие пики [94].

Специфичность ПЦР в режиме реального времени также можно повысить, включив в реакционную смесь зонды, работающие на принципе FRET. Зонды метят флуоресцентными красителями или комбинациями флуоресцентного и гасящего красителей. В 5’-экзонуклеазной ПЦР (TaqMan) 5’-3’-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq используется для расщепления не способного к элонгации гибридизационного зонда во время фазы удлинения праймера ПЦР [96, 97]. В этом подходе используются флюорогенные гибридизационные зонды с двойной меткой. Подход представлен на рис. 1-3 . Один флуоресцентный краситель служит репортером, а спектр его испускания гасится вторым флуоресцентным красителем. В результате нуклеазной деградации гибридизационного зонда высвобождается репортерный краситель, что приводит к увеличению пиковой флуоресцентной эмиссии. Увеличение уровня флуоресцентной эмиссии указывает на то, что получен специфический продукт ПЦР, а интенсивность флуоресценции связана с количеством продукта [98]. Специфичность повышается потому, что сигнал генерируется только тогда, когда праймер и зонд связаны с одной и той же цепью матрицы.

Использование зондов двойной гибридизации - еще один подход к проведению ПЦР в режиме реального времени. При этом методе используются два специально разработанных олигонуклеотидных зонда, специфичных для амплифицируемой нуклеотидной последовательности. Эти гибридизационные зонды предназначены для гибридизации в пределах от 1 до 5 нуклеотидов друг от друга в молекуле продукта. 3’-конец якорного зонда помечен донорным красителем, а 5’-конец репортерного зонда помечен акцепторным красителем. 3’-конец репортерного зонда фосфорилирован для предотвращения удлинения в ходе проведения ПЦР. Донорный краситель возбуждается внешним источником света и вместо излучения света передает свою энергию акцепторному красителю посредством FRET. Возбужденный акцепторный краситель излучает свет большей длины волны, чем несвязанный донорный краситель, а интенсивность светового излучения акцепторного красителя пропорциональна количеству ПЦР-продукта [99, 100].

Обнаружение и количественная оценка продуктов амплификации в режиме реального времени также могут быть выполнены с помощью молекулярных маяков [101]. Молекулярные маяки представляют собой шпилькообразные олигонуклеотидные зонды (рис. 1-4) . Петлевая часть каждой молекулы зонда комплементарна целевой нуклеотидной последовательности. Стебель зонда формируется путем отжига комплементарных последовательностей плеч на концах зонда. К одному концу одного плеча прикреплен флуоресцентный краситель, а к концу другого плеча прикреплена молекула-гаситель. Стебель удерживает флюорофор и гаситель в непосредственной близости, и излучения света не происходит [102]. Когда зонд сталкивается с молекулой-мишенью, он образует гибрид, который длиннее и стабильнее, чем стебель, и претерпевает конформационные изменения, которые раздвигают стебель, заставляя флюорофор и гаситель отдаляться друг от друга, что восстанавливает флуоресценцию [103].

Методы ПЦР в режиме реального времени сокращают время, необходимое для проведения анализа нуклеиновых кислот, так как не затрачивается дополнительное время на этап детекции продуктов амплификации. Кроме того, поскольку амплификация и детекция происходят в одной и той же закрытой пробирке, эти методы исключают манипуляции после амплификации, которые могут привести к загрязнению лаборатории ампликонами после ПЦР. Кроме того, в режиме реального времени метод ПЦР хорошо подходит для количественного применения, так как анализ выполняется на ранней стадии логарифмической фазы накопления продукта, и в результате он менее подвержен ошибкам, возникающим из-за различий в эффективности амплификации между образцами. Однако возможности мультиплексирования при этом ограничены из-за перекрывающихся спектров поглощения и испускания доступных флюорофоров, что ограничивает количество мишеней до четырех или пяти.

Отечественными разработками для проведения ПЦР в режиме реального времени являются следующие приборы: детектирующий амплификатор "ДТ-322" - для обработки 32 образцов одновременно, имеющий 2 канала измерений для двух флуоресцентных красителей в одной пробе (продукция фирмы "ДНК-технология", Россия); анализатор нуклеиновых кислот "АНК-32" - для обработки 32 образцов одновременно с использованием 4 каналов флуоресценции ("Синтол", Россия) [104].

Методы амплификации нуклеиновых кислот с обратной транскрипцией

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

С помощью традиционной ПЦР возможна амплификация только ДНК. Для амплификации РНК-мишеней была разработана комбинация ОТ-ПЦР. В этом процессе сначала получают комплементарную ДНК (кДНК) из РНК-мишеней путем обратной транскрипции, а затем кДНК амплифицируют с помощью ПЦР. В первых вариантах ОТ-ПЦР использовались два фермента: термолабильная обратная транскриптаза, например обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц, и термостабильная ДНК-полимераза. Из-за температурных требований термолабильного фермента синтез кДНК должен был происходить при температурах ниже оптимальных температур отжига праймеров. Это создавало проблемы как неспецифического отжига праймеров, так и неэффективности элонгации праймеров за счет образования вторичных структур РНК. Эти проблемы в значительной степени были преодолены благодаря применению термостабильной ДНК-полимеразы, полученной из Thermus thermophilus , которая может эффективно функционировать как в качестве обратной транскриптазы, так и в качестве ДНК-полимеразы [106]. ОТ-ПЦР с этим ферментом более специфична и эффективна, чем предыдущие протоколы с обычными термолабильными обратными транскриптазами.

Реакция транскрипционной амплификации и транскрипционно-опосредованная амплификация

Два метода - реакция транскрипционной амплификации нуклеиновых кислот (NASBA) [107] и транскрипционно-опосредованная амплификация - являются изотермическими методами амплификации РНК, смоделированными на основе репликации ретровирусов (рис. 1-5). Методы схожи тем, что РНК-мишень обратно транскрибируется с образованием кДНК, а затем с помощью фермента РНК-полимеразы синтезируются копии РНК. В NASBA для детекции специфического фрагмента нуклеиновой кислоты используются два специфических праймера и три фермента: обратная транскриптаза (ревертаза) вируса миелобластоза птиц, РНКаза H E. coli и РНК-полимераза бактериофага T7, тогда как в транскрипционно-опосредованной амплификации используется обратная транскриптаза с эндогенной активностью РНКазы H и РНК-полимераза бактериофага T7. Преимуществом таких подходов по сравнению с обычной ОТ-ПЦР является отсутствие необходимости в термоциклере, так как все реакции проходят при одной (41 °С) либо двух (41 и 65 °С) температурах [108]. Другая характерная особенность методов - то, что исходным материалом и конечным продуктом реакций являются одноцепочечные РНК.

После инкубации при 65 °С для денатурации РНК-мишени проводят ее гибридизацию со специфическим праймером Р1, который содержит промоторную последовательность для РНК-полимеразы фага Т7. На следующем этапе при температуре 41 °C ревертаза удлиняет этот праймер, создавая кДНК и гибрид РНК-кДНК. Фермент РНКаза Н гидролизует последовательность РНК-матрицы в гибриде РНК-кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК. При этом необходимо отметить, что РНКаза может гидролизовать только РНК, входящую в гибрид РНК-кДНК, но не одноцепочечную РНК. Затем второй праймер Р2 связывается с кДНК и удлиняется за счет ДНК-полимеразной активности обратной транскриптазы, что приводит к образованию двухцепочечной ДНК, содержащей промотор РНК-полимеразы Т7, переводя его в активное состояние. РНК-полимераза Т7 может транскрибировать цепь только в одном направлении 3′-5′, то есть транскрибируется смысловая цепь ДНК, а создается антисмысловая одноцепочечная РНК. Эти молекулы РНК снова входят в цикл с последующим образованием большего количества двухцепочечных молекул кДНК, которые могут служить матрицами для дальнейшего синтеза РНК. С помощью этого метода можно добиться 10⁹ -кратной амплификации целевой РНК менее чем за 2 ч.

Существует модификация, в которой одноцепочечные РНК-продукты реакции транскрипционно-опосредованной амплификации обнаруживаются путем анализа защитной гибридизации. В этом случае РНК-ампликоны, полученные в реакции транскрипционно-опосредованной амплификации, гибридизуют с олигонуклеотидными зондами, меченными модифицированными эфирами акридиния с быстрой или медленной кинетикой хемилюминесценции, чтобы можно было одновременно анализировать сигналы двух реакций гибридизации в одной и той же пробирке. Продукты NASBA выявляются с помощью реакции гибридизации с зондами, меченными трис-(2,2’-биспиридин)-рутением, и электрохемилюминесценцией. Метод NASBA также используется с молекулярными маяками для создания гомогенной кинетической амплификационной системы, аналогичной ПЦР в режиме реального времени [110].

Амплификационные системы на основе транскрипции имеют ряд преимуществ, к которым относятся отсутствие необходимости в термоциклере, быстрая кинетика реакций и образование продукта в виде одноцепочечной РНК, которая не требует денатурации перед детекцией. Кроме того, клинические анализы, проводимые в одной пробирке, и короткоживущий продукт РНК могут помочь свести к минимуму риск контаминации. Ограничения могут вносить неудовлетворительная обработка ДНК-мишеней и нестабильность сложных мультиферментных систем. Были разработаны тесты на основе транскрипционно-опосредованной амплификации для обнаружения Mycobacterium tuberculosis [111],Chlamydia trachomatis ,Neisseria gonorrhoeae , Trichomonas vaginalis [112] и вируса папилломы человека (HPV) [113]. Также доступны диагностические наборы на основе NASBA для обнаружения и количественного определения РНК-вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) [114], энтеровирусов и метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) [115]. Базовый комплект NASBA также доступен для разработки других приложений, определяемых пользователем. В своей последней версии NASBA сочетается с молекулярными маяками для амплификации и обнаружения целевых нуклеиновых кислот в реальном времени [116, 117].

Амплификация со смещением цепи

Амплификация со смещением цепи (SDA) представляет собой метод изотермической матричной амплификации, который можно использовать для обнаружения следовых количеств ДНК или РНК с определенной нуклеотидной последовательностью. Изначально SDA был концептуально простым вариантом амплификации с некоторыми техническими ограничениями [118]. Однако затем он превратился в универсальный инструмент, который технически прост в использовании, но сложен концептуально.

В современной версии реакция SDA состоит из двух дискретных фаз: генерации мишени и экспоненциальной амплификации мишени. В первой фазе двухцепочечную ДНК-мишень денатурируют при 95 °С и отжигают при 52 °С с двумя разными парами праймеров, обозначаемыми как адаптерные праймеры (B1) и праймеры для амплификации (S1) (рис. 1-6) . Праймеры для амплификации включают в себя одноцепочечную нуклеотидную последовательность, специфичную для эндонуклеазы рестрикции BsoB1, расположенную на 5’-конце последовательности связывания мишени. Адаптерные праймеры короче и отжигаются с ДНК-мишенью непосредственно выше амплифицируемой области. Праймеры элонгируют ДНК-полимеразой в присутствии смеси дНТФ, состоящей из дУТФ, дАТФ, дГТФ и тиолированного дЦТФ (Ц). Одновременно образуются продукты удлинения как адаптерных праймеров, так и праймеров амплификации. Цепь, инициированная с праймера для амплификации, вытесняется из дуплекса и становится доступна для гибридизации с другими адаптерными и амплификационными праймерами, то есть может быть использована в качестве матрицы для синтеза противоположной цепи. Образовавшаяся в итоге двухцепочечная ДНК, в отличие от исходной, содержит сайт рестрикции BsoB1 [119].

В экспоненциальной фазе рестриктаза разрывает верхнюю цепь ДНК, синтезированную с амплификационного праймера, но не нижнюю цепь, так как она содержит в сайте рестрикции тиолированный дЦМФ. Присутствие одноцепочечного разрыва позволяет ДНК-полимеразе инициировать синтез новой ДНК в месте разрыва и построить новую цепь, сместив предыдущую из дуплекса. На этом этапе образуются двухцепочечные продукты с полумодифицированной последовательностью распознавания эндонуклеаз рестрикции, и повторяется многократный процесс разрыва и смещения. Смещенные цепи способны связываться с праймерами противоположных цепей, что приводит к экспоненциальной амплификации нуклеотидных последовательностей-мишеней.

Эти одноцепочечные продукты также связываются с детектирующими зондами для детекции в режиме реального времени. Детектирующие зонды представляют собой молекулы одноцепочечной ДНК, меченные флуоресцеином и родамином. Область между метками включает структуру "стебель–петля". Петля содержит сайт распознавания фермента BsoBI. Специфичные для мишени последовательности расположены на 3’-конце метки родамина. В отсутствие специфической мишени структура "стебель–петля" находится вблизи меток флуоресцеина и родамина. Суммарный эффект заключается в том, что после возбуждения обнаруживается очень небольшое излучение флуоресцеина. После SDA зонд становится двухцепочечным, расщепляемым BsoB1. Расщепление вызывает физическое разделение меток флуоресцеина и родамина, что приводит к увеличению излучения метки флуоресцеина.

Сообщается, что SDA обладает достаточно высокой чувствительностью, позволяя обнаруживать от 10 до 50 копий молекулы-мишени. При использовании набора праймеров, предназначенного для амплификации повторяющейся нуклеотидной последовательности, содержащейся в количестве 10 копий на геном M. tuberculosis , анализ достаточно чувствителен для обнаружения различий при наличии от 1 до 5 копий в геноме бактерии. Кроме того, метод SDA адаптирован для количественного определения РНК путем добавления этапа обратной транскрипции (RT-SDA). В этом случае праймер гибридизуется с РНК-мишенью, а обратная транскриптаза синтезирует молекулу кДНК. Затем эта кДНК может служить матрицей для включения праймеров и смещения цепи. После этого продукты смещения этой цепи вводятся в схему амплификации, описанную выше. RT-SDA можно использовать для определения вирусной нагрузки ВИЧ. Коммерчески доступны тесты с использованием SDA для прямого обнаружения C. trachomatis , N. gonorrhoeae и вируса простого герпеса (HSV) 1 и 2 в урогенитальных образцах [120, 121].

Основное преимущество SDA заключается в том, что метод представляет собой изотермический процесс, который, в отличие от ПЦР, можно проводить при одной температуре после первоначальной денатурации мишени. Это устраняет необходимость в дорогостоящих термоциклерах. Кроме того, образцы можно подвергать SDA в одной пробирке, время амплификации варьирует от 30 мин до 2 ч. Основной недостаток SDA заключается в том, что, в отличие от ПЦР, относительно низкая температура проведения SDA (52,5 °C) может привести к неспецифической гибридизации праймеров с нуклеотидными последовательностями, встречаемыми в сложных смесях, таких как геномная ДНК. Следовательно, когда мишень находится в небольшом количестве по сравнению с фоновой ДНК, неспецифические продукты амплификации могут перегрузить систему, снижая чувствительность метода. Однако использование органических растворителей для повышения жесткости при низких температурах и введение более термостабильных полимераз, способных смещать цепи, в значительной степени позволили решить эту проблему.

Петлевая изотермическая амплификация

В 1998 г. был разработан метод, известный как петлевая изотермическая амплификация (LAMP) ДНК и устраняющий некоторые недостатки, присущие ПЦР [122]. При этом методе происходит увеличение числа копий целевого участка молекулы ДНК в условиях постоянной температуры с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью. При совмещении с обратной транскрипцией эта технология может с высокой эффективностью быть использована для амплификации нуклеотидных последовательностей РНК. Метод основан на автоматическом цикле синтеза ДНК цепи со смещением при использовании ДНК-полимераз с высокой активностью смещения. Реакция протекает в изотермических условиях, так как денатурация цепей происходит за счет их смещения. Этот метод высокоспецифичен и увеличивает количество амплифицированной ДНК до миллиарда копий менее чем за час по сравнению с миллионом копий, полученных с помощью ПЦР. Изотермическая амплификация может быть выполнена без современного лабораторного оборудования, например в сухом блочном нагревателе или на водяной бане. Другим инновационным аспектом метода LAMP является его высокая специфичность за счет использования нескольких праймеров (от 4 до 6), которые могут различать до 8 специфических местоположений на матрице ДНК, по сравнению только с двумя при проведении типичной ПЦР [123]. Методом LAMP можно проводить идентификацию различных микроорганизмов: вирусов, бактерий и даже простейших.

Важным этапом, ответственным за правильное протекание реакции в LAMP, является этап проектирования праймеров. Несколько пар праймеров должны быть оптимизированы с точки зрения ряда факторов, включая концентрацию, расположение пар нуклеотидов и расстояние между участками ДНК. Праймеры должны сохранять одноцепочечную структуру при температуре 60–65 °C и не должны создавать стабильную двухцепочечную структуру. При использовании большого количества праймеров для амплификации одна и та же нуклеотидная последовательность может усилить взаимодействие между ними. Проектирование праймеров для LAMP может быть выполнено с помощью программного обеспечения, доступного в сети интернет. К такому программному обеспечению относятся программы: PrimerExplorer [124], LAMP Optigene [125] или Premier Biosoft [126]. Кроме того, выбор праймеров требует проведения предварительного анализа вариаций многих геномных последовательностей у видов-мишеней в зависимости от цели LAMP. Если такая информация недоступна, необходимо применить секвенирование для определения вариативности данного гена у вида, что значительно увеличивает время и усилия, необходимые для рутинного применения LAMP.

В LAMP используются следующие пары праймеров: внутренние праймеры - прямой внутренний праймер (FIP) и обратный внутренний праймер (BIP); внешние праймеры - прямой праймер (F3) и обратный праймер (B3); и дополнительные петлевые праймеры - петлевой прямой праймер (FL) и петлевой обратный праймер (BL). Внутренние праймеры имеют длину 45–49 п.н. и комплементарны двум удаленным участкам матрицы (на смысловой и антисмысловой цепи). Внешние праймеры короче (21–24 п.н.) и вносятся в реакционную смесь в более низких концентрациях, чтобы связываться с матрицей медленнее, чем внутренние праймеры. Внутренние и внешние праймеры, как прямые, так и обратные в сочетании с ДНК-полимеразой Bst, которая демонстрирует высокую активность вытеснения ДНК-цепи при 60–65 °C, синтезируют подобную гантеле структуру ДНК [122].

Такая структура служит шаблоном для дальнейшей амплификации. Добавление петлевых праймеров, которые комплементарны гантелеобразной ДНК, увеличивает количество "стартовых точек" в ходе реакции LAMP в общей сложности до восьми амплифицированных последовательностей ДНК. Таким образом, петлевые праймеры значительно повышают эффективность и чувствительность реакции и сокращают время, необходимое для ее проведения, на 50%. Кроме того, петлевые праймеры активируются только 1 раз, когда создана искусственная матрица, что значительно повышает селективность реакции [123].

Технология LAMP не предполагает проведения этапа денатурации ДНК, так как, в силу вышеуказанной высокой вытесняющей ДНК-цепь активности ДНК-полимеразы Bst, реакция может быть проведена в изотермических условиях [127, 128]. Все этапы LAMP выполняются при стабильной температуре 60–65 °C, что устраняет необходимость использования термоциклера для точной настройки температурного и временного профилей, что необходимо при проведении обычной ПЦР. Метод LAMP можно разделить на три этапа: получение исходного материала для реакции, циклическое усиление и удлинение в сочетании с рециркуляцией. На первом этапе наиболее важным шагом является получение искусственной матрицы в виде одноцепочечной ДНК с гантелеобразной структурой. Последующие стадии включают экспоненциальную амплификацию самопраймируемой матрицы и замещение нитей, в результате чего получается смесь двухцепочечных ДНК. Конечным результатом LAMP являются структуры, похожие на цветную капусту [129].

Со временем было введено несколько вариантов LAMP, включая LAMP с этапом обратной транскрипции (RT-LAMP), мультиплексную LAMP (M-LAMP) и реакцию с возможностью наблюдения за продуктом в реальном времени путем модификации исходного протокола, что позволяет проводить анализ РНК и мультиплексную детекцию. Как и в случае с методом ОТ-ПЦР, вариант RT-LAMP для выявления последовательностей РНК проводят с использованием обратной транскриптазы в сочетании с ДНК-полимеразой, например полимеразы Bst 3.0 или OmniAmp. Эта процедура оказалась чрезвычайно полезной при диагностике РНК-вирусов. В свою очередь, посредством технологии M-LAMP можно обнаруживать одновременно несколько патогенов в одной реакции или пробирке, если используется большее количество праймеров с уникальными сигналами флуоресценции [130].

Существенным преимуществом LAMP является возможность быстрого обнаружения продуктов. Каждая амплификация ДНК, выполняемая с помощью ПЦР (за исключением real-time PCR), заканчивается электрофоретическим разделением продуктов. Однако приготовление геля (агарозного или полиакриламидного) и сам электрофорез требуют большого количества времени, а для визуализации продуктов требуются красители, большая часть которых является мутагенными или канцерогенными. Напротив, большое количество образующихся продуктов LAMP можно наблюдать и невооруженным глазом сразу после окончания реакции или даже во время ее протекания, без каких-либо дополнительных процедур.

Разработано большое число способов детекции продукта после проведения LAMP, таких как колориметрическое обнаружение с использованием флуоресцентных красителей, облучение ультрафиолетовым светом, электрофорез в агарозном геле, оценка мутности, флуоресценция в реальном времени, хроматографический или иммунохроматографический анализ. Для детекции ампликонов, синтезированных в ходе LAMP, наиболее широко используются флуоресцентные красители: кальцеин, зеленые красители SYBR и EvaGreen [131]. Другими красителями, используемыми для этой цели, являются краситель малахитовый зеленый, краситель гидроксинафтол синий, краситель Goldview, краситель GelRed, флуоресцентный краситель SYTO, краситель кристаллический фиолетовый лейкоформа и бербериновый краситель [132]. Все флуоресцентные красители после связывания с двухцепочечной ДНК излучают свет определенной длины волны, за исключением кальцеина, который образует комплекс с магнием, полученным в результате реакции LAMP. При облучении ультрафиолетовым светом результаты визуализируются, и продукт можно обнаружить невооруженным глазом по изменению цвета, например в случае кальцеина с оранжевого на зеленый. Эти методы могут быть объединены с анализом в реальном времени для обеспечения одновременной количественной оценки продукта. Однако мониторинг флуоресценции в реальном времени требует дорогостоящего оборудования и надлежащего контроля, что отличает LAMP от быстрых и дешевых тестов [133].

Быстрым методом, не требующим современного оборудования, является турбидиметрический анализ. Побочный продукт LAMP, пирофосфат магния (Mg₂ P₂ O₇ ), позволяет оценивать результаты, исходя из помутнения реакционного раствора или наличия осадка. Заметная непрозрачность указывает на присутствие продукта, тогда как прозрачный раствор свидетельствует о его отсутствии. При добавлении к удлиненной цепи ДНК последующих нуклеотидов образуется осадок. Во время синтеза пирофосфат магния вступает в реакцию с ионами магния, присутствующими в реакционном буфере, образуя осадок. Пробирка становится отчетливо мутной, когда концентрация пирофосфата магния превышает 0,5 Mм. Проведение такого анализа с помощью ПЦР невозможно, так как концентрация пирофосфата магния в этом методе составляет всего около 0,02 Mм. Кроме того, денатурация, происходящая в методе ПЦР при температуре около 95 °C, приводит к гидролизу пирофосфат-ионов до фосфат-ионов. Непрозрачность раствора при проведении LAMP позволяет провести качественную оценку продукта. Для количественной оценки LAMP можно комбинировать с анализом в реальном времени. Затем содержание пирофосфата магния сравнивают с содержанием ДНК [133].

Кроме того, необходимо отметить, что предпочтительным является использование технологии, основанной на иммунохроматографическом подходе (lateral flow test, LFA), так как такой подход удобен в использовании, практичен для применения в полевых условиях, оборудование портативное и недорогое. Детекция патогена LFA в сочетании с реакцией LAMP/RT-LAMP занимает в общей сложности 35–40 мин [127].

Положительный результат реакции LAMP также можно проверить с помощью традиционного электрофореза в агарозном геле. В отличие от изображения, получаемого после проведения ПЦР, результат реакции при LAMP заметен в виде полос различной длины. Причиной такого изображения являются различные длины и структуры полученных продуктов ДНК. Однако визуализация ампликонов в LAMP с помощью гель-электрофореза отнимает много времени и может увеличить риск перекрестной контаминации между образцами из-за большого количества ампликонов ДНК, образующихся во время анализа LAMP [133].

Хеликазозависимая амплификация

Хеликазозависимая амплификация (HDA) представляет собой изотермический процесс, при котором цепочки двухцепочечной ДНК разделяются ДНК-хеликазой и одноцепочечные нуклеотидные последовательности связываются со специальными белками, связывающими одноцепочечную ДНК (BSS). Два специфичных для соответствующих нуклеотидных последовательностей праймера гибридизуются с соответствующими им гомологичными участками целевой ДНК, а ДНК-полимераза удлиняет праймеры, отожженные на целевой нуклеотидной последовательности, с образованием двухцепочечной ДНК. Два вновь синтезированных продукта используются хеликазой в качестве субстратов в следующем раунде амплификации. Таким образом, проходит одновременная цепная реакция, приводящая к экспоненциальной амплификации выбранной нуклеотидной последовательности-мишени [134].

Поскольку хеликаза сама раскручивает двухцепочечную ДНК, первоначальную тепловую денатурацию и последующие этапы термоциклирования, необходимые при проведении традиционной ПЦР, можно пропустить.

HDA совместима со многими технологиями детекции, включающими качественные и количественные методы на основе флуоресценции, и с приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, есть возможность разработки простых портативных устройств для ДНК-диагностики на основе метода HDA, которые можно было бы использовать в полевых условиях или в местах оказания медицинской помощи. Коммерчески доступны тесты для обнаружения ДНК HSV 1 и 2 при оральных и генитальных поражениях, Clostridium difficile [135].

Метод гибридизации нуклеиновых кислот был разработан до появления и широкого распространения ПЦР в качестве классического молекулярно-биологического метода для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. Технология основана на гибридизации комплементарных цепочек ДНК или РНК с соответствующими ДНК- или РНК-зондами с образованием двухцепочечных структур [136].

Зонды нуклеиновых кислот представляют собой фрагменты ДНК или РНК, меченные радиоизотопами, ферментами или хемилюминесцентными репортерными молекулами, которые могут связываться с комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот с высокой степенью специфичности. Хотя зонды могут иметь размер от 15 до нескольких тысяч нуклеотидов, в коммерческие наборы чаще всего включают синтетические олигонуклеотиды размером менее 50 нуклеотидов. Можно разработать зонды для идентификации микроорганизмов на любом таксономическом уровне. Ряд коммерчески доступных ДНК-зондов был разработан как для прямого обнаружения патогенов в клинических образцах, так и для идентификации патогенов после выделения в чистой культуре.

Обычно используемые форматы для гибридизации зондов включают жидкофазную, твердофазную и in situ гибридизацию.

Жидкофазная гибридизация

Важным методом, используемым в лабораториях медицинской микробиологии, является жидкофазная гибридизация. Зонд одноцепочечной ДНК, меченный эфиром акридина, инкубируют с нуклеиновой кислотой-мишенью. При взаимодействии эфиров акридина с перекисью водорода в щелочных условиях появляется хемилюминесценция, измеряемая на люминометре. Анализ результатов жидкофазной гибридизации можно провести за несколько часов, метод не требует удаления несвязавшегося одноцепочечного зонда или выделения связанных с зондом двухцепочечных нуклеотидных последовательностей [137].

Твердофазная гибридизация

При твердофазной гибридизации нуклеиновые кислоты-мишени связываются с нейлоном или нитроцеллюлозой и гибридизуются с зондом в растворе [138]. Несвязавшийся зонд отмывается, а связавшийся обнаруживается с помощью флуоресценции, люминесценции, радиоактивности или по появлению окраски. Хотя твердофазная гибридизация и является мощным исследовательским инструментом, длительность и сложность процедуры ограничивают ее применение в клинической практике.

Гибридизация in situ

Гибридизация in situ представляет собой вариант твердофазной гибридизации, при котором нуклеиновая кислота содержится в тканях или клетках, прикрепленных к предметным стеклам микроскопа, и основана на тех же главных принципах, которые были описаны ранее [139, 140]. Чаще всего используются фиксированные формалином и залитые в парафин срезы тканей. Чувствительность гибридизации in situ часто ограничивается доступностью нуклеиновой кислоты-мишени в клетках.

В целом из-за слабой аналитической чувствительности методов гибридизации с неамплифицированными последовательностями нуклеиновых кислот применение этих методов для прямого обнаружения патогенов в клинических образцах ограничено теми ситуациями, в которых число микроорганизмов велико. К таким ситуациям относятся случаи фарингита, вызванного стрептококками группы А, вагиноза и вагинита, ассоциированных с определенными возбудителями. Эти методы наиболее эффективно используются в качестве тестов для подтверждения результатов культурального метода при выявлении микобактерий и системных диморфных грибов. Такие тесты помогают при ведении пациентов, обеспечивая быстрое и точное обнаружение медленно растущих, часто трудно идентифицируемых возбудителей.

Коммерчески доступны зонды нуклеиновых кислот для прямого обнаружения стрептококков группы А, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae , а также для идентификации Blastomyces dermatitidis ,Coccidioides immitis ,Histoplasma capsulatum , кампилобактерий, энтерококков, стрептококков группы А, стрептококков группы В, Haemophilus influenzae ,Listeria monocytogenes , микобактерий, N. gonorrhoeae ,Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae , выделенных в чистой культуре.

Коммерчески доступен и твердофазный анализ с зондом - нуклеиновой кислотой для обнаружения и идентификации Gardnerella vaginalis ,Trichomonas vaginalis и Candida albicans в вагинальной жидкости пациенток с вагинозом или вагинитом. В данном анализе для каждого организма используется два отдельных зонда - захватывающий и сигнальный.

Зонды пептидных нуклеиновых кислот

Зонды пептидных нуклеиновых кислот (PNA) представляют собой аналоги ДНК, в которых отрицательно заряженный сахарофосфатный остов ДНК заменен на незаряженный полиамидный или "пептидный" остов. Зонды PNA содержат те же нуклеотидные основания, что и ДНК, и следуют стандартным правилам спаривания оснований Уотсона–Крика при гибридизации с комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот [141]. Поскольку зонды PNA не заряжены, им не нужно преодолевать дестабилизирующее электростатическое отталкивание, возникающее при гибридизации двух отрицательно заряженных молекул ДНК. В результате зонды PNA быстрее и прочнее связываются с нуклеиновыми кислотами-мишенями. Кроме того, относительно гидрофобный характер зондов PNA позволяет им проникать через гидрофобную клеточную мембрану.

Коммерчески доступны зонды PNA для FISH, нацеленные на последовательности рибосомальной РНК (рРНК), для быстрой прямой идентификации S. aureus , коагулазонегативных стафилококков (CoNS), Enterococcus faecalis , некоторых других видов энтерококков, Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa ,Klebsiella pneumoniae и некоторых видов Candida spp. из флаконов с положительными гемокультурами.

Технологии усиления сигнала

В технологиях усиления сигнала концентрация зонда или мишени не увеличивается. Повышение аналитической чувствительности происходит за счет увеличения концентрации меченых молекул, присоединенных к нуклеиновой кислоте-мишени. Для улучшения детекции целевых нуклеиновых кислот используются различные ферменты, зонды, слои зондов и снижение фонового шума [142]. Хотя системы на основе амплификации мишеней, как правило, обладают большей аналитической чувствительностью, чем технологии усиления сигнала, тем не менее технологические разработки, особенно касающиеся анализа с разветвленной ДНК, снизили пределы чувствительности технологий усиления сигнала до уровней, которые сопоставимы с некоторыми более ранними методами амплификации мишеней [143].

Методы детекции с усиленным сигналом имеют ряд преимуществ по сравнению с методами амплификации мишеней. В технологиях усиления сигнала количество молекул-мишеней не меняется, и в результате сигнал прямо пропорционален количеству нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в клиническом образце. Это снижает риск ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации и упрощает разработку количественных анализов. Поскольку системы усиления сигнала не зависят от ферментативных процессов, происходящих при амплификации нуклеотидной последовательности-мишени, присутствие ингибиторов ферментов в клинических образцах на них не влияет. Следовательно, некоторые методы выделения нуклеиновых кислот могут быть упрощены. Как правило, технологии усиления сигнала используют либо более крупные зонды, либо большее количество зондов, чем системы амплификации мишеней, и, следовательно, менее подвержены ошибкам, возникающим из-за гетерогенности нуклеотидной последовательности-мишени. Наконец, количество РНК можно измерить напрямую без синтеза промежуточной молекулы - кДНК.

Исследования с участием разветвленной ДНК

Система усиления сигнала с участием разветвленной ДНК представляет собой твердофазную сэндвич-гибридизацию, включающую несколько наборов олигонуклеотидных зондов [144]. Ключом к этой технологии является молекула-усилитель, представляющая собой молекулу разветвленной ДНК с 15 идентичными ветвями, каждая из которых может связываться с тремя мечеными зондами (рис. 1-7) . Для захвата нуклеиновой кислоты-мишени на поверхности лунки микротитратора используется несколько зондов, специфичных для мишени. Кроме того, с мишенью связывается второй набор зондов, специфичных для мишени. Молекулы усилителя связываются со вторым набором зондов-мишеней. Три зонда, меченные щелочной фосфатазой, гибридизуются с каждой ветвью усилителя. Обнаружение связанных меченых зондов достигается путем инкубации комплекса с диоксетаном, представляющим собой субстрат, активируемый ферментом и способный к хемилюминесценции, измеряемой на люминометре. Результирующий сигнал прямо пропорционален количеству мишени в образце.

Неспецифическая гибридизация любого из зондов с нуклеиновыми кислотами, отличными от мишени, приводит к усилению фонового сигнала. Чтобы уменьшить потенциальную гибридизацию с нецелевыми нуклеиновыми кислотами, в анализах с участием разветвленной ДНК III поколения в молекулу-усилитель были включены изоцитидин (isoC) и изогуанозин (isoG) [145]. IsoC и isoG спариваются друг с другом, но не с каким-либо из четырех природных оснований [146]. Использование isoС- и isoG-содержащих зондов усиливает мишень-специфичный сигнал без сопутствующего увеличения уровня фонового сигнала, что повышает чувствительность метода без потери специфичности. Предел обнаружения в анализе с разветвленной ДНК III поколения для РНК ВИЧ-1 составляет 75 копий/мл. На рынке имеются наборы для количественного определения ДНК вируса гепатита В, РНК вируса гепатита С и РНК ВИЧ-1 с использованием разветвленной ДНК.

Метод гибридного захвата

Метод гибридного захвата представляет собой метод гибридизации целевой нуклеиновой кислоты с зондом в растворе с последующим захватом полученного гибрида антителом, в котором используется хемилюминесцентная детекция гибридных молекул. ДНК-мишень в образце денатурируют, а затем гибридизуют со специфическим РНК-зондом (рис. 1-8) . Гибриды ДНК-РНК захватываются антигибридными антителами, которые мобилизованы на поверхности пробирки. Вторые антигибридные антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой, связываются с иммобилизованными гибридами. Связанный конъюгат антител обнаруживают с помощью хемилюминесцентного субстрата и измеряют излучаемый свет с помощью люминометра. С каждой гибридной молекулой связывается множество конъюгатов щелочной фосфатазы, усиливая сигнал. Интенсивность излучаемого света пропорциональна количеству ДНК-мишени в образце. Коммерчески доступны исследования гибридного захвата с целью обнаружения N. gonorrhoeae , C. trachomatis и HPV [147, 148] в клинических образцах. Существуют автоматизированная и неавтоматизированная версии этих методик.

Технология захвата с участием кливазы

Такая технология захвата базируется на методе усиления сигнала, основанном на специфическом распознавании и отщеплении определенных структур ДНК с помощью фермента кливазы - члена семейства FEN-1 ДНК-полимераз. Такие полимеразы отщепляют одноцепочечный 5’-концевой участок разветвленного спаренного дуплекса. Эта ферментативная активность, вероятно, играет существенную роль в элиминации сложных структур нуклеиновых кислот, возникающих во время репликации и репарации ДНК. Поскольку такие структуры могут встречаться в любом месте реплицирующегося генома, фермент распознает молекулярную структуру субстрата независимо от последовательности нуклеиновых кислот, составляющих ДНК-комплекс [150].

В технологии захвата с участием кливазы используется два зонда (зонд захвата и сигнальный зонд), которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью-мишенью перекрывающимся образом (рис. 1-9) . При соответствующих условиях отжига зонд связывается с нуклеотидной последовательностью-мишенью. Олигонуклеотидный зонд захвата сконструирован таким образом, что он гибридизуется выше сигнального зонда с областью перекрытия между 3’-концом зонда захвата и 5’-концом сигнального зонда. Кливаза отщепляет 5’-конец сигнального зонда и высвобождает его. Далее отщепленный фрагмент сигнального зонда действует как зонд захвата в следующей реакции с ДНК-мишенью. Поскольку структура ДНК, необходимая для использования в качестве субстрата отщепления, возникает только в присутствии нуклеотидной последовательности-мишени, образование продуктов расщепления указывает на присутствие мишени. Использование термостабильного фермента кливазы позволяет проводить реакции при достаточно высоких температурах, разрешающих обмен праймерами. Это дает возможность получения большого количества продуктов кливазы из одной молекулы-мишени. Для обнаружения мишеньспецифических продуктов используются зонды FRET. Коммерчески доступны анализы для выявления генотипов HPV высокого онкогенного риска в образцах шейки матки [151–153].

ДНК-микрочипы

В настоящее время для дифференциальной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний широко используются микрочипы. В основе работы ДНК-микрочипов лежит явление гибридизации. Для РНК в ряде случаев сначала осуществляется обратная транскрипция, но существуют и чипы, непосредственно работающие с РНК. Исследуемые образцы метят различными флуоресцентными метками и наносят на микрочип. ДНК-микрочип с нанесенным на него образцом некоторое время инкубируют, чтобы произошла гибридизация комплементарных одноцепочечных молекул, после чего чип промывают. Все некомплементарные ДНК/РНК образца смываются с чипа. После этого микрочип сканируют лазером, который вызывает флуоресценцию меченых молекул образца. Подключенный к компьютеру микроскоп оценивает флуоресценцию каждого сайта ДНК-микрочипа и устанавливает наличие гибридизованных ДНК.

Достоинство микрочипов - возможность одновременного проведения большого числа (до нескольких тысяч) исследований на одном чипе и низкая стоимость исследования.

В настоящее время метод с успехом используется для диагностики острых кишечных инфекций, Mycobacterium tuberculosis , возбудителя сибирской язвы, а также для выявления генов устойчивости к различным классам антимикробных препаратов. Микрочипы применяются также и в вирусологии для детекции ВИЧ, гепатитов В и С, вирусов гриппа и острых респираторных заболеваний. Есть работы по применению данного метода в диагностике грибковых инфекций.

Общие сведения

Методы идентификации микроорганизмов путем секвенирования участков ДНК достаточно трудоемки и времязатратны, однако позволяют проводить видовую идентификацию микроорганизмов с очень высокой точностью и достоверностью. В литературе нередко можно встретить информацию о том, что идентификация микроорганизмов с использованием методов секвенирования является "золотым стандартом" современной микробиологии.

Секвенирование нуклеиновых кислот - определение последовательности нуклеиновых кислот (ДНК/РНК). Первым методом секвенирования был метод определения последовательности нуклеотидов, основанный на нуклеотидспецифичной химической деградации при обработке ДНК различными химическими агентами (метод Максама–Гилберта), который в настоящее время уже не используется. Чуть позже появился метод Сэнгера - метод дидезокситерминаторов, который стал популярным. В последнее время метод Сэнгера стал вытесняться более удобными технологиями высокопроизводительного секвенирования (Next Generation Sequencing, NGS).

Секвенирование может быть как таргетным, так и полногеномным. При таргетном секвенировании проводят секвенирование одного, заранее заданного участка нуклеиновой кислоты. При этом перед секвенированием проводится амплификация интересующего фрагмента ДНК с помощью предварительно подобранных праймеров, поэтому таргетное секвенирование в литературе также называют секвенированием с обогащением . При полногеномном секвенировании считывается информация обо всей последовательности генома. Если секвенируется тотальная ДНК, выделенная из образца, в котором содержались сразу несколько штаммов одного вида или разные виды микроорганизмов, то в таком случае идет речь о секвенировании метагенома в образце.

В современной микробиологии видовая идентификация микроорганизмов проводится, как правило, путем таргетного секвенирования участков генов, кодирующих рРНК или белки. Для бактерий чаще всего используются гипервариабельные участки гена, кодирующего 16S рРНК, либо полная последовательность этого гена. Ген 16S рРНК содержит несколько функционально различных областей, причем некоторые области имеют высококонсервативные, а другие - гипервариабельные участки [158]. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК представляет собой стабильный генотипический признак, который можно использовать для видовой или родовой идентификации бактерий [154].

Впервые сравнение данных по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК было проведено в пионерских работах Карла Везе и Джорджа Фокса в конце 70-х - начале 80-х гг. XX в. Исследователи использовали эту информацию для классификации метаногенных бактерий и открытия нового вида архебактерий Halobacterium volcanii [155, 156]. С тех пор ген 16S рРНК остается самой популярной мишенью для идентификации бактерий и генетических исследований процессов эволюции, так как другие высококонсервативные гены бактерий изучены несколько хуже. Подтверждение видовой идентификации бактериальных патогенов человека с помощью таргетного секвенирования проводится в микробиологических лабораториях в течение последних 30 лет. Это стало возможным после появления коммерческих капиллярных генетических анализаторов и общедоступных хранилищ баз данных, содержащих большое количество данных о нуклеотидных последовательностях гена 16S рРНК. В настоящее время база данных GenBank (NCBI) содержит уже более 30 000 000 записей с 16S-последовательностями различной длины и качества, полученных из широкого спектра бактерий, выделенных из различных источников [157]. Большая часть этих записей содержит только фрагменты последовательности гена 16S рРНК, но все чаще депонируются контиги или целые геномы, содержащие полные 16S-последовательности.

Более 20 лет назад опубликован ряд обзоров по применению этого метода в клинической микробиологической практике, в которых описывались такие параметры, как трудозатраты, себестоимость и технологические ограничения методов секвенирования по Сэнгеру, доступных в то время [158–160]. Впоследствии были достигнуты существенные успехи в эффективности секвенирования и стандартизированной интерпретации данных о последовательности 16S для назначения окончательной идентификации бактерий на уровне рода и/или вида. В настоящее время многие крупные учреждения мира используют универсальную ПЦР с праймерами для детекции гена 16S рРНК и последующее секвенирование с целью идентификации амплифицированной бактериальной ДНК, выделенной непосредственно из клинических изолятов или образцов [161, 162].

Видовую принадлежность бактерий устанавливают на основе сравнения полученных нуклеотидных последовательностей с нуклеотидными последовательностями референс-штаммов в базах данных (например, GenBank с помощью алгоритма Megablast). Результат сравнения считают соответствующим уровню вида в том случае, когда секвенированная последовательность гена 16S рРНК имеет сходство на уровне ≥98,7% с нуклеотидной последовательностью ближайшего известного бактериального вида из базы данных.

Аналогичным образом для надежной видовой идентификации грибов чаще всего проводится секвенирование участка гена рРНК (28S ) большой субъединицы рибосом. Этот ген имеется у всех грибов и несет достаточное количество вариабельных локусов, сравнительный анализ которых позволяет точно идентифицировать большинство грибов до уровня вида. Однако для молекулярного типирования грибов могут быть использованы и другие генные мишени.

Помимо видовой идентификации микроорганизмов, часто основанной на секвенировании единичных генных мишеней, в микробиологической практике широко используется метод мультилокусного сиквенс-типирования (MLST), который применяется для внутривидового типирования изолятов.

Метод MLST-типирования включает несколько этапов. Для каждого вида микроорганизмов разрабатывается и в дальнейшем используется собственная видоспецифическая схема типирования [163]. На первом этапе определяются несколько (чаще всего 6–7) внутренних фрагментов высококонсервативных генов из группы генов "домашнего хозяйства". В молекулярной биологии под такими генами подразумевают гены, участвующие в поддержании основных жизненных функций клетки, экспрессирующиеся на конститутивном уровне, как в нормальных, так и в стрессовых условиях, например гены транспортной РНК и рРНК и многие другие.

Нуклеотидные последовательности выбранных фрагментов обычно имеют длину 450–500 п.н. Такой размер фрагмента ДНК был предложен, так как участок такой длины может быть просеквенирован с высокой точностью на обеих нитях ДНК с использованием одной пары праймеров, что для большинства бактериальных патогенов обеспечивает достаточную вариабельность для идентификации всего разнообразия аллелей в популяции.

Для каждого фрагмента путем секвенирования определяются аллельные варианты, и комбинация аллелей в 6–7 локусах обеспечивает аллельный профиль, однозначно определяющий сиквенс-тип (ST) каждого изолята. Большое количество аллелей в каждом из локусов обеспечивает возможность различать разные аллельные профили, и крайне маловероятно, что два неродственных изолята будут иметь одинаковый аллельный профиль. Метод MLST обладает высокой степенью дискриминации, так как накопление нуклеотидных изменений в генах "домашнего хозяйства" является относительно медленным процессом, а аллельный профиль бактериального изолята достаточно стабилен с течением времени. Таким образом, MLST стал в ряде случаев удобным методом для типирования микроорганизмов, например для эпидемиологических целей.

Степень родства анализируемых микробных изолятов часто отображают в виде дендрограммы, построенной с использованием матрицы попарных различий между их аллельными профилями. Дендрограмма - удобный способ отображения тех изолятов, которые имеют идентичные или очень похожие аллельные профили, которые, как можно предположить, происходят от общего предка.

Главным недостатком метода, пока еще ограничивающим его широкое применение в диагностических и эпидемиологических целях, остается большая продолжительность, так как постановка метода требует нескольких суток, а также его высокая стоимость.

Секвенирование по Сэнгеру

При проведении секвенирования по методу Сэнгера на первом этапе выполняют ПЦР с использованием коротких олигонуклеотидных праймеров, специфичных, например, к гену 16S рРНК или других генов для синтеза комплементарных матрице ампликонов [154]. На следующем этапе при секвенировании ампликона в реакции используются термостабильная ДНК-полимераза, праймер, предназначенный для отжига матричной нуклеиновой кислоты, набор обычных дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ: дATФ, дTTФ, дГTФ и дЦTФ) и небольшое количество продуктов амплификации (двухцепочечной ДНК) в качестве матрицы-мишени. Также в реакционную смесь добавляют дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ддНTФ: ддATФ, ддTTФ, ддГTФ и ддЦTФ), меченные индивидуальными флуоресцентными маркерами различных спектров, в более низкой концентрации, чем дезоксинуклеотидтрифосфаты.

При синтезе ДНК ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК рано или поздно включается ддНTФ, вызывая прекращение удлинения нуклеотидной последовательности, так как в этих нуклеотидах не хватает 3’-гидроксильной группы, необходимой для включения следующего нуклеотида. Каждый включенный ддНTФ находится во фрагменте на конце цепи в том же положении, что и основание ддНTФ в ДНК матрицы.

Реакция циклического секвенирования последовательно приводит к образованию цепей ДНК разной длины, каждая из которых имеет свой терминальный флуоресцентно-меченный ддНTФ (A, T, Ц или Г) на 3’-конце из-за множественных событий обрыва цепи (терминатор). В наборах для секвенирования BigDye Terminator (Applied Biosystems Inc., Thermo Fisher Scientific, Фостер Сити, Калифорния) используют одиночные молекулы для резонансного переноса поглощенной энергии, которые включают в себя донора энергии и краситель-акцептор (например, дихлорродамин или родамин), соединенные высокоэффективным линкером. Такие красители имеют значительно меньшее перекрытие на максимальной длине волны возбуждения, чем обычные родаминовые красители, поэтому продукты секвенирования получаются с более чистым флуоресцентным сигналом и улучшенной точностью определения основания, особенно при больших длинах считывания.

Смесь фрагментов одноцепочечной ДНК, полученной в результате полимеразной реакции, электрокинетически загружают в полиакриламидный гелевый капилляр, помещенный в автоматический генетический анализатор, где фрагменты электрофоретически разделяются и последовательно считываются флюорометрическим детектором для получения электрофорограммы анализируемой нуклеотидной последовательности. Последовательности размером от 100 до примерно 1300 нуклеотидов могут быть разделены с получением серии полос в полиакриламидном геле, даже если фрагменты одноцепочечной ДНК отличаются только на один нуклеотид.

Автоматизированные генетические анализаторы для секвенирования обычно содержат четыре или более тонкостенных капилляра диаметром 0,1 мм, длиной от 50 до 80 см, заполненных полиакриламидным гелем; оптимальная концентрация полиакриламида в гелевой матрице составляет от 6 до 7% для разделения фрагментов одноцепочечной ДНК длиной от 100 до 750 нуклеотидов. Более длинные считывания нуклеотидных последовательностей могут быть получены путем изменения размера пор геля с использованием другой концентрации полиакриламида и изменения соотношения полиакриламид/бисакриламид.

После проведения секвенирования необходимо выполнить проверку качества полученных результатов. Данные секвенирования могут содержать ошибки, особенно если исходное количество секвенируемой ДНК было невелико и/или матрица содержала вставки или делеции или обладала конформационной сложностью.

Прочтение нуклеотидной последовательности при секвенировании должно быть начато на достаточном удалении ("выше по течению" - upstream) от анализируемой области, чтобы гарантировать включение интересующей области в пределы диапазона, подлежащего исследованию. Секвенируемый фрагмент должен охватывать как можно больше вариабельных областей цепи ДНК для оптимизации видовой дифференциации (при этом следует учитывать, что положение вариабельных областей различается у бактерий разных таксонов). Большинство приборов для капиллярного секвенирования позволяют получать нуклеотидные последовательности хорошего качества длиной от 600 до 800 п.н., но некоторые хорошо настроенные приборы могут работать с нуклеотидными последовательностями, длина которых превышает 1000 п.н., в частности когда исследование выполняется для чистых культур микроорганизмов. Получаемая в процессе секвенирования нуклеотидная последовательность часто содержит некоторое количество оснований низкого качества, обычно в начале и конце трассировки, и область высокого качества, расположенную в середине нуклеотидной последовательности. Следует использовать процедуру просмотра и обрезки участков, содержащих нуклеотидные последовательности с низким качеством регистрации с 3’- и 5’-концов, прежде чем приступать к дальнейшему анализу секвенированного фрагмента.

Высокопроизводительное секвенирование (секвенирование нового поколения)

В последнее десятилетие секвенирование по методу Сэнгера стало вытесняться новыми, более эффективными методами секвенирования - группа методов NGS (секвенирование нового поколения). При этом автоматизированный метод Сэнгера рассматривается в качестве технологии "I поколения", а более новые методы получили название "секвенирование следующего поколения" [164].

К технологиям NGS относятся принципиально разные методы, которые позволяют проводить массовое параллельное секвенирование подготовленных специальным образом библиотек однонитевых молекул фрагментированной ДНК из исследуемых образцов [165]. На рынке в настоящее время существует ряд коммерческих платформ, которые имеют как свои преимущества, так и некоторые недостатки. К основным платформам относятся: Illumina-SOLEXA, SOLiD, Helicos, IonTorrent, PacBio Sequel, Oxford Nanopore и некоторые другие. Сравнительное описание платформ приведено в табл. 1-1 .

Подробное описание всего разнообразия подходов, используемых при реализации NGS, достаточно громоздко и остается за пределами этой монографии. Желающим разобраться в технологиях NGS подробнее можно рекомендовать книгу Д.В. Ребрикова [165] и обзорную статью Майкла Метзкера [164, 165].

Основным преимуществом использования методов секвенирования нового поколения является способность производить очень большое количество коротких прочтений нуклеотидных последовательностей или ридов за один запуск прибора. В некоторых случаях количество ридов превышает 1 млрд. Такая возможность делает методологию NGS полезной для применения в различных областях современной биологии и биомедицины. Появление на рынке технологий NGS существенно изменило наше представление о научных подходах при проведении фундаментальных, прикладных и клинических исследований. Возможность секвенировать полные геномы родственных организмов позволила провести крупномасштабные сравнительные и эволюционные исследования, которые невозможно было осуществить относительно недавно.

Для подготовки матриц для NGS-реакций используются два метода: в первом матрицы нарабатываются путем амплификации из одиночных молекул ДНК, во втором - в качестве матрицы используют непосредственно одиночные молекулы ДНК. Амплификация ДНК-матриц требуется при использовании методов секвенирования, в которых системы регистрации с низкой чувствительностью не способны обнаружить слабые, единичные сигналы флуоресценции. Тремя наиболее распространенными методами амплификации являются эмульсионная ПЦР, ПЦР по типу катящегося кольца и твердофазная амплификация.

Методы секвенирования нового поколения используют четыре основных подхода: циклическая обратимая терминация, секвенирование лигированием, пиросеквенирование и секвенирование в реальном времени.

После проведения секвенирования полученные короткие считывания (риды) собираются в более длинные нуклеотидные последовательности - контиги - и затем выравниваются по референсной нуклеотидной последовательности с использованием различных инструментов биоинформатического картирования.

Несмотря на многочисленные попытки внедрить NGS в рутинную деятельность микробиологических лабораторий, в настоящее время этот метод все еще в основном используется в научно-исследовательских целях. Представляется, что в будущем, с одной стороны, стоимость исследований, проводимых с помощью NGS, снизится, а с другой стороны - будут развиваться биоинформатические подходы, и методы, основанные на секвенировании нуклеиновых кислот, в ряде случаев смогут заменить традиционные культуральные и молекулярно-биологические методы, основанные на проведении ПЦР. Проведение всего одного полногеномного исследования чистой культуры микроорганизмов способно дать полную информацию о геноме отсеквенированного микроорганизма, включая его патогенные свойства, наличие генов резистентности к антибактериальным препаратам, индивидуальные штаммоспецифичные характеристики, необходимые для эпидемиологического контроля.

Потенциально в лаборатории медицинской микробиологии можно выделить три основные области применения технологий секвенирования нового поколения: секвенирование всего генома микроорганизма (WGS), таргетное метагеномное секвенирование и полное метагеномное секвенирование [170]. Современные методы секвенирования могут быть полезны для проведения первичной идентификации патогенных микроорганизмов, выявления молекулярных механизмов устойчивости к противомикробным препаратам и для эпидемиологического отслеживания организмов внутри медицинских организаций. Внедрение NGS в практику медицинских микробиологических лабораторий - уже реальность, однако пока NGS используется в крупных референс-лабораториях и лабораториях научных медицинских центров России.

Метод применяется для дифференциальной диагностики возбудителей заболеваний и основан на применении антител, связанных с флуоресцентным красителем. Есть два варианта реализации метода: прямой и непрямой.

При реализации прямого варианта иммунофлуоресценции применяются меченые антитела к патогенам, которые наносятся на биологический материал пациента (мазок, культура клеток). Реакция протекает одноэтапно. Главный недостаток прямой иммунофлуоресценции - необходимость наличия большого набора конъюгированных специфических сывороток ко многим возбудителям инфекционных заболеваний. Непрямой метод реакции иммунной флуоресценции заключается в выявлении комплекса антиген–антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом.

При непрямом варианте иммунофлуоресценции на первом этапе исследования на анализируемый образец наносят сыворотку, антитела в которой способны связываться с определенным антигеном, находящимся в образце. Затем антитела, не связавшиеся с антигенами микроорганизмов, отмывают, а оставшиеся на микроорганизмах антитела выявляют, обрабатывая мазок антивидовой сывороткой (антикроличья, антилошадиная и т.д.) к ã-глобулинам животного, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроорганизм + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Метод широко применяется для быстрой расшифровки этиологии инфекционного заболевания при наличии мазков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей [171]. Для реализации метода чаще всего требуется наличие в лаборатории флуоресцентного микроскопа. Результаты выдаются примерно через 2–4 ч. Метод иммунофлуоресценции обладает умеренной чувствительностью и высокой специфичностью. Тесты на основе иммунофлуоресценции применяют для обнаружения антигенов вирусов гриппа, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов, вирусов парагриппа и др. В нашей стране существуют также наборы на основе иммунофлуоресценции для выявления вирусов герпеса, гепатита С, ВИЧ, цитомегаловируса, микоплазм, хламидий, легионелл, возбудителей болезни Лайма, лихорадки Ку и др.

Принцип работы иммуноферментного анализа сходен с методом иммунофлуоресценции, но антитела метятся не флуоресцентными красителями, а ферментами. В качестве ферментов чаще всего используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, реже - â-галактозидаза и различные â-лактамазы. Антитела, меченные ферментами, связываются с антигеном, добавляется субстрат для фермента, с которым конъюгированы антитела, происходит реакция ферментативного катализа, тем самым обнаруживается комплекс "антиген–фермент". Конечный продукт ферментативной реакции можно детектировать разными способами: с помощью светового микроскопа (если продукт - нерастворимый осадок) или регистрировать автоматически (если продукт окрашен, способен люминесцировать или флюоресцировать). Наиболее распространен вариант твердофазного иммуноферментного анализа, дающего окрашенный растворимый продукт реакции, который можно применять и для определения антигена, и для определения антител.

Достоинства метода: можно использовать различные виды клинического материала, так как не требуется наличия интактных клеток в образце, метод способен детектировать растворимые антигены, возможно количественное определение антигенов.

С помощью данного метода диагностируют инфекционные заболевания, передаваемые половым путем (хламидиоз, сифилис), вирусные инфекции (ВИЧ, гепатиты, ЦМВ, герпес, краснуху, корь, вирус клещевого энцефалита), паразитозы (описторхоз, трихинеллез, лямблиоз, токсокароз, эхинококкоз, токсоплазмоз), боррелиоз и др.

Метод радиоиммунного анализа заключается в мечении антител радиоизотопами, что обеспечивает высокую чувствительность в определении антигена. Метод имеет весьма существенные недостатки, такие как необходимость работы с радиоактивными изотопами и использование сложного дорогостоящего оборудования, поэтому в настоящее время метод является устаревшим и в широкой практике не используется.

Моноклональные антитела представляют собой однородные по своей структуре и специфичности антитела, которые вырабатываются иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (антитело будет его специфически связывать) и применяться для обнаружения этого вещества или его очистки [172]. Преимущества применения моноклональных антител: высокие показатели специфичности и чувствительности диагностических методов определения антигенов. Разработка системы получения моноклональных антител, выполненная с использованием современных генно-инженерных технологий, привела к достижению большого прогресса в диагностике возбудителей различных инфекций [173].

Не являются отдельной группой методов, а представляют собой системы ускоренной реализации иммунологических подходов.

Преимуществами экспресс-тестов являются высокая специфичность, быстрота (занимают считаные минуты) и простота выполнения. К недостаткам можно отнести ограниченную чувствительность по сравнению с другими методами, а отрицательные результаты экспресс-тестов следует интерпретировать с осторожностью, учитывая потенциал ложноотрицательных результатов, особенно во время вспышек инфекционных заболеваний. Примером такого теста является иммунохроматографический экспресс-тест на вирус коронавирусной инфекции 2019 г. (COVID-19; от англ. COronaVIrus Disease 2019) (рис. 1-10) .

Тест основан на методе так называемого бокового потока. Образец пациента помещают в специальный раствор, который далее наносят на тест-полоску. При наличии вируса в образце его антигены взаимодействуют со специфическими антителами, меченными, например, наночастицами коллоидного золота. После этого раствор мигрирует по нитроцеллюлозной мембране посредством капиллярного течения к нанесенным далее на тест-полоске вторым антителам, специфическим к вирусным антигенам. В присутствии в исходном растворе антигена в тестовом окне появится окрашенная линия (Т).

Таким образом, разработано большое количество разнообразных решений для дифференциальной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. В их основе лежат разнообразные методы, различающиеся по скорости, показателям чувствительности и специфичности, стоимости и требованиям к оснащению лаборатории и квалификации персонала. Культуральные методы наиболее трудоемкие и времязатратные, но при этом точные.

Наши представления о составе сообществ микроорганизмов, связанных с человеком, в значительной степени получены из исследований, основанных на культуральных свойствах микроорганизмов. Поскольку большинство видов микроорганизмов далеко не всегда культивируется в лабораторных условиях, дальнейшее изучение взаимодействия микроорганизма и хозяина несколько ограничено. Несомненно, культивирование микроорганизмов имеет неоценимое значение для медицинской микробиологии и необходимо для того, чтобы в полной мере изучить их физиологию и фенотипические свойства [175, 176]. Тем не менее методы молекулярной микробиологии в настоящее время помогают оценить меж- и внутривидовые изменения микробного состава сообщества, предоставляют более подробную и углубленную информацию о разнообразии микроорганизмов. С достижениями в области технологий секвенирования ДНК и снижения затрат на эти исследования наши знания о составе человеческой микробиоты (в том числе вагинальной и кишечной) в последние годы значительно возросли [177–181].

Наиболее точным методом дифференциальной диагностики является сочетание культуральных методов и NGS. Однако такие исследования требуют большого количества времени, высокой квалификации персонала и оснащенности лаборатории секвенаторами. С другой стороны, экспресс-методы просты в использовании, быстры и дешевы, но показатели чувствительности и специфичности у экспресс-тестов весьма невысокие. Применение методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот и LAMP для дифференциальной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний выглядит привлекательным, особенно учитывая тот факт, что в ряде случаев показатели чувствительности для метода LAMP превышают аналогичные показатели для метода ПЦР.

Традиционные ПЦР- и ОТ-ПЦР-исследования требуют высокой квалификации исследователя, работы с гелем и чувствительны к возможной контаминации, поэтому закономерно и необратимо в последние годы вытесняются ПЦР/ОТ-ПЦР-исследованиями в режиме реального времени. ПЦР в режиме реального времени является удобным и недорогим методом, способным выдавать высокие показатели чувствительности и специфичности, и результаты при этом выдаются в течение нескольких часов, а в ряде случаев и несколько быстрее.

С внедрением новых молекулярных технологий появилась возможность исследовать разнообразие микроорганизмов в различных локусах организма. В последние годы исследователи применяют методы, основанные на анализе нуклеотидной последовательности гена рРНК (16S рРНК), которые помогают исключить культивирование микроорганизмов и получить информацию непосредственно из образцов биологического материала. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей обеспечивает современную классификацию микроорганизмов и является средством определения численно доминирующих видов в сообществах и изменениях в их составе [181–183]. Так, при изучении вагинальных микробных сообществ более чем у 3000 здоровых женщин репродуктивного возраста в разных этнических группах Х. Zhou и соавт. [184] показали, что у 80% из них во влагалищном отделяемом преобладают микроорганизмы рода Lactobacillus :L. iners , L. crispatus ,L. jensenii или L. gasseri . В целом L. iners был наиболее распространенным видом (66%) у женщин разных этнических групп. Остальная часть женщин (20%) имела низкое содержание лактобацилл на фоне высокого представительства анаэробных бактерий, таких как Atopobium ,Clostridiales ,Megasphaera ,Dialister ,Anaerococcus ,Finegoldia ,Peptostreptococcus и Eubacterium . Результаты этих исследований показывают, что у практически здоровых женщин существует ограниченное число различных видов вагинальных микробных сообществ [183].

Высокая стоимость секвенирования ограничивает количество выборок, необходимых для анализа. Пионерами в решении этой проблемы стали M.L. Sogin и соавт., которые использовали методы параллельного секвенирования ДНК и коротких гипервариабельных участков генов 16S рРНК, используя NGS [185]. В настоящее время производятся секвенаторы, где более 1 млн последовательностей ДНК могут быть прочитаны за один запуск прибора. Одномоментно свыше 250 образцов анализируются методом параллельного секвенирования, единовременно исследуя 4000 последовательностей на один образец. Технология NGS позволяет менее чем за 8 ч обеспечить информацией о наличии и видовой принадлежности микроорганизмов в биообразце [186, 187].

Хотя по сравнению с традиционными методами идентификации молекулярные методы, в особенности метод секвенирования генов рРНК, достаточно надежны, значительно сокращают сроки обнаружения этиологического агента, но все же исследования продолжают оставаться дорогими, требуют наличия специализированного оборудования, отдельных помещений для лаборатории и обученного персонала. Эти факторы вводят ограничение для рутинного применения молекулярных методов диагностики, делают их непрактичными в большинстве некрупных лабораторий и больниц [188–190].

Принимая во внимание скорость развития инфекционного процесса, в особенности у пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии, становится очевидной значимость использования методов экспресс-диагностики, спектр которых в настоящее время существенно расширен [189]. В частности, при раннем выявлении инфекций большое значение придается серологической диагностике, прежде всего в выявлении вирусных инфекций, в то время как их использование не всегда бывает достаточным для обнаружения бактериальных микроорганизмов [190–194]. И здесь на помощь может прийти "быстрая микробиология" с ее возможностями MALDI-TOF MS-детекции штаммов бактерий и грибов в считаные минуты [195], а также молекулярно-биологическими технологиями выявления патогена любой природы (бактерия, микромицет или вирус) [196].

Существует два пути диагностики бактериемии и фунгемии: непосредственное выделение инфекционных агентов из крови путем культивирования и идентификация суррогатных маркеров сепсиса. Последний метод широко исследовался в 1970-х и 1980-х гг.: в крови с помощью LAL-теста пытались детектировать эндотоксин (бактериальный эндотоксин вызывает помутнение и загущение лизата амебоцитов мечехвоста Limulus polyphemus ), также проводился поиск бактериальных антигенов, но сейчас эти попытки представляют только исторический интерес. В результате единственным широко используемым лабораторным методом выявления бактериемии или фунгемии пока остается культивирование.

Первые попытки культивирования образцов крови относятся к рубежу XIX–XX вв., и к 1930-м гг. были разработаны некоторые используемые до сих пор методы. К 1960-м гг. культивирование крови широко использовалось в клинической практике, но в различных лабораториях для этой цели применялись разные методы, и к 1970-м гг. стала очевидной необходимость стандартизации всего процесса. Были проведены эксперименты и контролируемые клинические испытания по определению критических факторов, влияющих на процесс гемокультивирования, на основе которых стала возможной разработка коммерчески доступных систем гемокультивирования.

Диагностика бактериемии и фунгемии в настоящее время остается одной из наиболее важных и сложных задач медицинской микробиологии, в первую очередь в связи с высоким уровнем смертности от этих состояний - 12% [197], но также и потому, что быстрое и точное выявление пациентов с бактериемией или фунгемией имеет решающее значение для коррекции терапии. Результаты исследований крови на стерильность позволяют правильно назначить антимикробные препараты, а также диктуют необходимость быстрого удаления или замены катетеров. Вместе с тем необходимо понимать, что для диагностики бактериемии и фунгемии просто одного теста недостаточно. Требуется получение нескольких культур крови, взятых из разных мест на протяжении некоторого времени, идентификация изолятов, выделенных из образцов крови, тестирование их чувствительности к противомикробным препаратам и интерпретация результатов в сочетании с другими диагностическими тестами и микробиологическими исследованиями.

Далее будет представлен краткий обзор принципов, лежащих в основе современных диагностических методов, и альтернативных подходов к диагностике.

В настоящее время не существует "золотого стандарта" в диагностике инфекций кровотока. Даже при наличии современных систем для гемокультивирования, использовании оптимальных методов сбора образцов крови и учете только образцов крови пациентов с высокой вероятностью бактериемии или фунгемии, как правило, лишь 8–12% гемокультур оказываются положительными, из которых от 1/3 до половины образцов крови будут контаминированы микрофлорой кожи. Существует несколько возможных причин, объясняющих низкую вероятность обнаружения патогенов. Наиболее популярным объяснением является то, что образцы крови часто получают у пациентов с низким риском бактериемии или фунгемии или вообще при отсутствии такого риска. Недавно было проведено исследование с использованием байесовской модели прогнозирования объективных клинических и лабораторных факторов риска, которое показало, что вероятность истинной бактериемии на большой выборке пациентов колеблется от 0,4 до 18,4% при распространенности примерно 6,9% [198]. К другим факторам, снижающим вероятность обнаружения инфекционных агентов в крови, относятся эмпирическая противомикробная терапия; гемосорбция и плазмаферез; неправильное обращение с образцами крови; невозможность культивирования некоторых микроорганизмов в таких системах (например, облигатных анаэробов); низкий исходный уровень микроорганизма в образце; недостаточное время инкубации, используемое в автоматизированных системах, составляющее обычно 4–5 дней, тогда как для культивирования, например, актиномицет может потребоваться более 1 нед.

До недавних пор большие надежды в диагностике бактериемии и фунгемии возлагались на молекулярные методы, но в последнее время стало очевидным, что они не оправдались. Некоторые молекулярные методы оказались менее чувствительными, чем культуральное исследование, часть из них дают ложноположительные результаты, выявляя ДНК микроорганизмов у людей без бактериемии или фунгемии, а некоторые белки крови действуют как ингибиторы амплификации. Поэтому, несмотря на недостатки культурального метода, гемокультивирование остается несовершенным "золотым стандартом" лабораторных тестов по диагностике бактериемии и фунгемии.

Диагностическое значение

Идентификация возбудителя, присутствующего в крови наряду с клинической картиной заболевания, помогает клиницисту определить локализацию инфекционного процесса, так как существует тесная взаимосвязь между очагами инфекции и тем, какие патогены выделяются из кровотока [199]. Вместе с тем следует помнить, что в 29% случаев положительных гемокультур источник инфекции так и не удается обнаружить [197].

Прогностическое значение

Уровень смертности госпитализированных взрослых пациентов с бактериемией или фунгемией достигает 12%. При использовании для категоризации пациентов таких показателей, как участок инфицирования, характер обслуживания и др., оказалось, что показатели смертности сильно различаются [197, 199]. О прогностической значимости изолятов культур крови, полученной у амбулаторных больных, известно гораздо меньше, главным образом из-за отсутствия контролируемых исследований, а также потому, что большинство пациентов с бактериемией или фунгемией нуждаются в госпитализации. Кроме того, частоту внебольничной скрытой бактериемии у детей в значительной мере снижает применение конъюгированных пневмококковых вакцин и вакцин против гемофильной палочки типа b. Опубликованные данные указывают на то, что у пациентов с бактериемией, неосложненным пиелонефритом или другими неосложненными инфекциями, не требующими последующей госпитализации, микробиологическое исследование крови, как правило, не требуется, так как результаты имеют небольшую прогностическую и диагностическую ценность [200].

Долголетний опыт выявления факторов, влияющих на результативность диагностики бактериемии и фунгемии, позволил определить наиболее значимые из них. Рассмотрим каждый в отдельности, при этом понимая, что для корректного выделения патогенов из крови требуется, чтобы все эти факторы рассматривались вместе.

Объем культивируемой крови

Для взрослых пациентов и детей старшего возраста объем культивируемой крови является важнейшим фактором при выделении патогенных микроорганизмов из крови. У детей младшего возраста существуют ограничения на объем собираемой крови [201]. Существует прямая зависимость между объемом культивируемой крови и вероятностью обнаружения патогенов [201, 202]. После проведения большого количества исследований установлено, что у взрослых пациентов необходимо получить два флакона для гемокультивирования, в каждый из которых отбирают от 8 до 10 мл крови, то есть всего от 16 до 20 мл крови. Для выявления бактериемии или фунгемии во время эпизода сепсиса требуется от 2 до 4 культур крови, поэтому для оптимизации процесса необходимо взять до 80 мл крови (четыре культуры крови по 20 мл каждая). Это достаточно большой объем крови, и сбор 80 мл может потребоваться не всем пациентам, в зависимости от клинической ситуации и возбудителя. При использовании флаконов для гемокультивирования, содержащих определенные добавки, объем крови может быть уменьшен до 40 мл. Для пациентов с анемией или с другой патологией, связанной с изменением общего объема крови, уменьшение объема крови, взятого для лабораторных исследований, не рекомендуется, так как это может привести к снижению вероятности обнаружения патогена. Лучшей диагностической альтернативой является уменьшение кратности сбора крови. Для детей старшего возраста объем крови, взятый для микробиологического анализа, практически не отличается от указанного для взрослых. У новорожденных и детей младенческого возраста можно уменьшить объем крови, взятой за 1 раз, увеличив кратность анализов. Объем взятой крови не должен превышать 1% объема крови пациента, однако в случае анемии может потребоваться уменьшение и этого показателя [201]. Для правильной интерпретации результатов гемокультивирования решающее значение имеет количество образцов крови, взятых за 1 раз. Поэтому у педиатрических пациентов следует брать не менее двух образцов крови.

Количество флаконов для гемокультивирования

Сбор адекватного количества флаконов для гемокультивирования помогает правильно интерпретировать результаты анализа. Однократный результат сложно интерпретировать, за исключением случаев, когда изолят редко или вообще никогда не выделяется как контаминант (например, патогенные грибы, такие как Histoplasma capsulatum ). Обычно требуется выделение более чем одной гемокультуры для подтверждения того, что данный микроорганизм является этиологическим агентом. Контаминирующие микроорганизмы, в отличие от патогенов, как правило, обнаруживаются только в одном флаконе для гемокультивирования из нескольких взятых. У пациентов с внутрисосудистыми очагами инфекции, например инфекционным эндокардитом, возбудитель должен быть выявлен во всех полученных флаконах для гемокультивирования.

Для установления оптимального количества таких флаконов с 1975 по 2007 г. был проведен ряд исследований. Их результаты представлены в табл. 1-2 .

Как видно из таблицы, микробиологическое исследование четырех флаконов для гемокультивирования позволяет практически всегда выявлять бактериемию и фунгемию. Тем не менее рутинное взятие такого количества флаконов не всегда оправданно, а для ряда пациентов (например, недоношенных новорожденных) - невыполнимо. Кроме того, это существенно увеличивает затраты на лечение. Один из рекомендуемых подходов заключается в сборе двух флаконов для гемокультивирования в первые 24 ч, а затем еще двух в течение последующих 24 ч [201]. Однако в таком случае выявление бактериемии может быть задержано еще на одни сутки. Поэтому оптимальным в настоящее время считается получение трех флаконов для гемокультивирования в первые 24 ч.

Для ранее здоровых взрослых пациентов количество взятых флаконов для гемокультивирования не требуется корректировать по какому-либо параметру. Для пациентов, страдающих анемией, у которых сбор крови для лабораторных исследований может усугубить течение данного заболевания, необходимо, во-первых, определиться с целесообразностью назначения микробиологического анализа крови. Если он все же необходим по клиническим показаниям, нет никакого смысла снижать количество исследований крови или собираемый объем; делать и то и другое не в интересах пациента.

Разбавление крови

Ранее считалось необходимым разбавлять кровь большими объемами бульонной среды из-за противомикробных эффектов самой крови и наличия в ней антимикробных веществ. В настоящее время для современных систем гемокультивирования, использующих стандартные питательные среды, антикоагулянты и другие вещества, оптимальным является соотношение крови и бульона от 1:5 до 1:10. При введении в бульонную среду добавок, которые связывают или изолируют противомикробные вещества, достаточным может быть соотношение крови и бульона всего 1:4.

Антикоагулянты

Ранее микробиологами изучался вопрос о введении во флаконы для гемокультур различных антикоагулянтов, так как свернувшаяся кровь снижает результативность исследования [203]. Однако в настоящее время отказались практически от всех антикоагулянтов из-за ингибирования роста бактерий. Большинство коммерческих флаконов для гемокультивирования содержат полианетолсульфонат натрия (SPS) в узком диапазоне концентраций; некоторые флаконы также содержат цитрат натрия отдельно или в сочетании с SPS. SPS, помимо своего антикоагулянтного действия, также ингибирует активность комплемента, инактивирует клинически значимые концентрации некоторых аминогликозидных и других антибиотиков, инактивирует действие лизоцима и блокирует фагоцитоз. Контролируемые клинические испытания показали повышение эффективности выделения грамотрицательных бактерий и стрептококков при подходящих концентрациях SPS.

Встряхивание

Исследованиями показано, что встряхивание аэробных флаконов с гемокультурой любым способом повышает вероятность выделения патогенов, поэтому все автоматизированные системы включают процедуру встряхивания аэробных флаконов и в большинстве случаев - анаэробных флаконов [204].

В настоящее время большинство коммерческих флаконов для гемокультур содержат соевый казеиновый бульон, также известный как триптиказосоевый бульон. У ранее использовавшихся других типов сред не наблюдалось существенного преимущества, даже у разработанных для выделения определенных групп патогенов.

Ранее использовавшиеся добавки, вводимые в среду для гемокультивирования, в настоящее время коммерчески недоступны. Существующие добавки, разработанные для повышения эффективности выделения патогенов, в первую очередь для пациентов, получающих противомикробную терапию во время сбора образца крови, очевидно, улучшают детекцию патогенов, а также имеют дополнительные преимущества, позволяющие использовать меньшие объемы крови без снижения качества выделения микроорганизмов. Вместе с тем необходимо учитывать, что использование некоторых добавок может привести к повышению уровня высеваемости контаминантов.

В настоящее время диагностические преимущества и ограничения коммерчески доступных неавтоматизированных систем для культивирования крови хорошо изучены. Такие системы подходят для обнаружения основных бактериальных и грибковых патогенов, просты в использовании, требуют наличия только обычного термостата без применения CO₂ и сравнительно недороги [205]. Основным же недостатком таких систем является трудоемкость исследования, что исключает их использование в лабораториях, работающих даже с небольшим количеством культур крови.

Первые неавтоматизированные системы для гемокультивирования состояли из флаконов для гемокультур, содержащих питательные среды различного состава, антикоагулянт и иногда добавки. Выявление роста микроорганизмов осуществлялось двумя методами: пересевом через 24 или 48 ч и в конце периода инкубации (так называемый терминальный пересев) и путем визуального осмотра флаконов на гемолиз (изменение цвета, газообразование или помутнение). Этот подход оказался неприемлемым для лабораторий, выполняющих большое количество анализов гемокультур. Поскольку первые инструментальные/автоматизированные системы гемокультур имели свои недостатки, был разработан и выпущен на рынок ряд альтернативных неавтоматизированных систем для гемокультур.

В ряде случаев системы для гемокультивирования представляют собой разновидность двухфазной системы, разработанной в 1947 г. М.Р. Кастанедой для выявления штаммов Brucella spp. в крови. Такие системы называются двухфазными , потому что в них традиционная жидкая бульонная фаза сочетается с твердой, состоящей из различных агаровых сред. В двухфазных системах кровь инокулируют во флакон для культивирования и смешивают с бульонной средой. Затем с помощью специального устройства к жидкой фазе добавляют твердую. Для культивирования анаэробных бактерий существует отдельный флакон. Флаконы инкубируют (с перемешиванием или без него) и визуально просматривают 1 или 2 раза в день на предмет лизиса, свидетельствующего о росте микроорганизмов. Примером таких систем для гемокультивирования является система Septi-Chek (продукция фирмы Becton Dickinson, США).

Существует и другая разновидность флакона Кастанеды. Во флакон через резиновую перегородку в крышке вводится кровь. Имеется сигнальное устройство, состоящее из пустого пластикового цилиндра, прикрепленного к игле, которая при введении в бутылку проходит ниже поверхности бульона. В процессе роста микроорганизмов выделение газов в бульон увеличивает их концентрацию. Со временем концентрация газов в бульоне достигает равновесия с концентрацией газов в свободном пространстве бутылки, что увеличивает атмосферное давление внутри бутылки, в итоге выталкивая часть бульонной смеси вверх через иглу в прикрепленное сигнальное устройство [206–209].

Примером таких систем для гемокультивирования является система для гемокультивирования Signal (продукция фирмы Oxoid, Великобритания).

Лизис-центрифугирование

При лизис-центрифугировании образец крови инокулируют в пробирки, содержащие смесь лизирующего агента сапонина, антикоагулянта и фторуглеродного амортизирующего агента. Кровь лизируется сапонином, а смесь центрифугируется для разделения компонентов. Затем супернатант удаляют и выбрасывают, а ресуспендированный осадок используют для инокуляции на питательную среду, подходящую для выделения конкретных патогенов. Эта система использовалась для обнаружения бактериальных патогенов, но из-за отсроченной обработки, которая, как считается, ухудшает выделение анаэробных бактерий, некоторых видов Haemophilus и Streptococcus pneumoniae , были разработаны и другие коммерческие системы [210–213]. Раньше подобные системы с успехом использовались для выделения патогенных диморфных грибов, микобактерий и видов Bartonella , но в настоящее время для выделения этих патогенов существуют более эффективные системы. Обнаружение Bartonella spp. лучше всего достигается с помощью методов амплификации нуклеиновых кислот; также можно использовать серологическое тестирование. В сочетании с отсутствием автоматизации вышеперечисленные проблемы делают системы для гемокультивирования на основе лизис-центрифугирования недостаточно практичными для рутинного использования. Коммерчески доступна только одна система для лизис-центрифугирования гемокультур - Isolator (продукция фирмы Du Pont, США).

По мере возрастания количества выполняемых анализов гемокультур в 1960-х и 1970-х гг. возникла потребность в менее трудоемких и более удобных методах, что привело к разработке автоматизированных систем гемокультивирования.

В первых вариантах таких систем обнаружение роста микроорганизмов производилось путем мониторинга продукции CO₂ растущими микроорганизмами либо с помощью инфракрасной спектрофотометрии, либо путем радиометрического обнаружения ¹⁴ С-меченого CO₂ . Частота отбора проб у таких систем имела ограничения, и мониторинг более 1 или 2 раз в день был невозможен, что увеличивало время обнаружения роста микроорганизмов. Этот недостаток был в значительной мере устранен с появлением нового поколения систем гемокультивирования, таких как анализаторы Bactec 460–860 (продукция фирмы Becton Dickinson, США).

Следующим поколением систем гемокультивирования стали системы непрерывного мониторинга гемокультуры (CMBCS). Наработки по таким системам появились в конце 1980-х, а первые приборы - в 1990-х гг. В отличие от ранее существовавших автоматизированных систем гемокультивирования, которые контролировали выработку CO₂ во флаконах только несколько раз в день, такие системы контролируют выработку CO₂ гораздо чаще, как правило, раз в 10–15 мин [205].

В отличие от ранее существовавших автоматизированных систем, которые фиксировали потенциальный рост микроорганизмов, когда уровень CO₂ во флаконе превышал произвольный пороговый уровень, CMBCS применяют для обнаружения роста микроорганизмов компьютерные алгоритмы, использующие в своей работе такие параметры, как пороговый уровень, устойчивое линейное увеличение выделения CO₂ и повышение скорости образования CO₂ . Поскольку два последних параметра зависят от активного роста микроорганизмов, отсроченное размещение бутылок в прибор, позволяющее микроорганизмам расти и, таким образом, производить CO₂ до начала тестирования, может привести к задержке (или отсутствию) обнаружения микроорганизмов во флаконах.

Из-за большого объема данных, которые необходимо проанализировать для каждого флакона и большого количества флаконов в каждом инкубаторе, успех CMBCS в большой степени связан с разработкой более мощных компьютерных процессоров и памяти. Чтобы система CMBCS могла регулярно контролировать уровни CO₂ , необходимо было устранить еще два фактора, препятствующих тестированию. Во-первых, нужно было исключить необходимость отбора проб и пополнения газовой атмосферы в головном пространстве флакона. Это достигнуто за счет разработки датчиков, которые могут считывать информацию через стенки флаконов. Во-вторых, требовалось устранить необходимость повторной ручной загрузки в инкубатор. Для ее решения приборы CMBCS имеют механизм мониторинга датчика каждого флакона, поэтому не требуется перемещение флакона во время инкубации и тестирования. В целом переход к более частому контролю выработки CO₂ с помощью CMBCS сократил время обнаружения роста микроорганизмов на 1–1,5 дня по сравнению с радиометрическими и нерадиометрическими системами [205]. Примерами систем CMBCS являются системы BacT/Alert (продукция фирмы Biomerieux, Франция), Bactec 9000 (продукция фирмы Becton Dickinson, США), VersaTREK (Thermo Fisher Scientific, США).

В настоящее время в работе микробиологических лабораторий находит все большее применение бактериологический анализатор HB&L (продукция компании Alifax, Италия), принцип работы которого основан на методе лазерного светорассеяния, позволяющий с высокой чувствительностью и специфичностью выявить в пробах мочи и других биологических жидкостей бактерии и определить их чувствительность к антибиотикам.

Для диагностики бактериемии и фунгемии, помимо культуральных методов, были разработаны и другие методики. Ранние методики, такие как LAL-тесты, так и не получили широкого распространения. Чаще применяются тесты, измеряющие уровни прокальцитонина и лактата в сыворотке крови. В отношении прокальцитонина имеющиеся данные показывают, что такой анализ бесполезен для выявления бактериемии или фунгемии из-за недостаточной чувствительности и специфичности. Однако анализ может быть полезен при мониторинге пациентов с диагнозом "бактериемия" или "фунгемия" для прогноза их состояния и модификации противомикробной терапии. Результаты анализов уровня лактата в сыворотке крови могут быть интерпретированы аналогичным образом.

Новый перспективный маркер пресепсин быстрее и раньше повышается при развитии сепсиса, чем прокальцитонин и С-реактивный белок. Механизм его образования отличен от синтеза других маркеров. Пресепсин (N-концевой фрагмент рецептора макрофагов CD14 размером 13 кДа в растворимой форме) отражает реальную динамику развития инфекционного процесса, точнее прогнозирует исходы заболевания, а при улучшении клинической картины, в отличие от других маркеров, прогнозирует рецидивы. Показано, что пресепсин повышается при сепсисе, вызванном грамположительными, грамотрицательными микроорганизмами и грибами, но не вирусами. В то же время с его помощью невозможно отличить грамположительный и грамотрицательный сепсис. Чувствительность пресепсина в ранней диагностике сепсиса составляет 91,4%, тогда как чувствительность выявления в крови инфекционного агента с помощью гемокультивирования - 35,4% [214].

Существуют тесты, предназначенные для прямого обнаружения бактериемии или фунгемии в образцах крови [215]. Например, в настоящее время коммерчески доступна тест-система SeptiFast производства Roche Diagnostics (Mannheim, Germany). Система представляет собой набор реагентов для проведения ПЦР в режиме реального времени, предназначенный для обнаружения 10 видов грамотрицательных палочек, 6 видов грамположительных кокков, 5 видов дрожжевых грибов и 1 плесневого гриба непосредственно в крови. В целом система в клиническом использовании показала неоднозначные результаты [216]. Можно отметить, что SeptiFast проявляет сравнительно низкую чувствительность обнаружения патогенов в крови.

Несмотря на то что технология амплификации нуклеиновых кислот подходит для прямой детекции микроорганизмов в крови, разработано лишь небольшое количество коммерчески успешных наборов реагентов с использованием данного метода детекции. Часто такие тест-системы разрабатываются отдельными лабораториями и не выходят на рынок, но их значимость весьма ограничена, так как такие системы могут быть непригодны для использования в других лабораториях, затраты на разработку и валидацию могут оказаться чрезмерно высокими, а в некоторых странах использование таких тест-систем ограничивается нормативно-правовой базой [215]. Кроме того, в настоящее время их применение ограничено относительно небольшим числом патогенов, которые можно детектировать. Также невозможно проводить анализ полимикробных ассоциаций, и возможно тестирование лишь небольшого числа детерминант устойчивости к противомикробным препаратам.

Существуют попытки мультиплексного анализа гемокультур. Так, есть тест-системы, позволяющие детектировать комбинацию из 24 грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и дрожжевых грибов, а также три гена устойчивости к противомикробным препаратам в одном анализе. Такие тесты представляют собой тест-системы для проведения мультиплексного ПЦР-анализа с последующей детекцией путем гибридизации с олигонуклеотидами, связанными с частицами наносфер, после чего сигнал усиливается с помощью окрашивания серебром.

В нашей стране ФГБУ "НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова" Минздрава России совместно с ООО НПО ДНК-технология создан набор реагентов (тест-система), включающий праймеры на 8 родов и 11 видов бактерий и грибов рода Candida , для анализа положительных гемокультур [217]. При оценке ее эффективности из 50 образцов положительных гемокультур данная тест-система верно идентифицировала 46 образцов (92%).

Другие тесты амплификации нуклеиновых кислот

Тест-система GeneXpert (продукция фирмы Cepheid, США) включает в себя несколько тестов, которые можно использовать в сочетании с гемокультивированием для идентификации изолятов или для выявления устойчивости к противомикробным препаратам. К этой категории можно отнести тесты на определение Staphylococcus aureus и гена mecA в метициллинрезистентных штаммах Staphylococcus epidermidis и MRSA, определение vanA -гена в ванкомицинрезистентных штаммах энтерококков, а также выявление генов резистентности к карбапенемам (КРС, ОХА-48, VIM, NDM) у грамотрицательных бактерий. Как и другие методы выявления патогенов или резистентности к противомикробным препаратам в изолятах культур крови, эти анализы не заменяют культуры крови, а являются лишь дополнением.

Существуют работы, в которых другой молекулярный тест - GeneXpert MTB/RIF (Cepheid, CШA), предназначенный для обнаружения Mycobacterium tuberculosis и выявления его чувствительности к рифампицину - был использован непосредственно на образцах крови. По некоторым оценкам, чувствительность такого теста составляет всего 21%, но в этой группе пациентов положительный результат важен для разделения пациентов по группам риска преждевременной смертности [218].

Широко используемая во многих лабораториях тест-система мультиплексной ПЦР в режиме реального времени "LightCycler SeptiFast (SF) (Roche Diagnostics)" выявляет более широкий спектр грамположительных (S. aureus , CoNS, S. pneumoniae, Streptococcus spp. D ,E. faecium ,E. faecalis ), грамотрицательных (E. coli ,K. pneumoniae/K. oxytoca ,Serratia marcescens ,Enterobacter cloacae/Enterobacter aerogenes ,P. mirabilis ,P. aeruginosa , A. baumannii ,S. maltophilia ) бактерий и некоторых видов грибов (C. albicans ,C. tropicalis ,C. parapsilosis ,C. glabrata ,C. krusei ,A. fumigates ) [190, 219]. Возможность быстро и точно проводить одновременную детекцию достаточно большого количества микроорганизмов все же не избавляет от проведения дополнительного микробиологического исследования крови. Еще одним существенным недостатком тест-системы является то, что для проведения анализа требуется не менее 3 мл крови, что усложняет ее использование у новорожденных [190, 193].

В последнее время в мире стали появляться и другие варианты молекулярного анализа, с помощью которых можно быстро обнаружить патогены в крови, предоставляя возможность клиницистам ускорить назначение адекватной антимикробной терапии септическим пациентам. Одним из них является метод FISH нуклеиновых кислот- RNA FISH, который является точным и надежным способом, обеспечивающим подтверждение присутствия нуклеиновой кислоты микроорганизмов в позитивной культуре крови. В основе метода лежит анализ с помощью флуоресцентно меченных РНК зондов (рРНК) конкретных видов микроорганизмов, таких как S. aureus/CoNS, C. albicans/C. glabrata, E. faecalis, E. coli , P. aeruginosa [220]. Главным его преимуществом является идентификация возбудителя в крови в течение 90 мин, в то время как традиционное культуральное исследование занимает 1–5 дней до получения положительного результата. С RNA FISH нет необходимости проводить дополнительное субкультивирование положительных образцов. Исследования, проведенные в различных лабораториях, показывают высокую точность, чувствительность и специфичность данного метода, но, учитывая ограниченное разнообразие тестируемых микроорганизмов, его можно рассматривать только для скрининга, при этом не отказываясь от проведения культурального исследования [193, 220].

Другим подходом является флуоресцентная гибридизация с пептидо-нуклеиновой кислотой in situ . Показано, что метод, основанный на FISH с пептидо-нуклеиновой кислотой (PNA-FISH) (AdvanDx, Woburn, MA), хотя и ограничен несколькими избранными патогенами, сокращает время, необходимое для идентификации микробных патогенов, присутствующих в культурах крови. Принцип метода прост и основан на широко используемом принципе гибридизации in situ . В отличие от ДНК- и РНК-зондов, которые имеют отрицательно заряженные сахаро-фосфатные остовы, остов PNA состоит из электрически нейтральной полиамидной (пептидной) структуры. Нейтральный электрический заряд обеспечивает более быструю, плотную и специфичную гибридизацию с целевыми нуклеиновыми кислотами. Зонды помечены флуоресцентными красителями, благодаря чему их можно наблюдать с помощью флуоресцентного микроскопа. Как только гемокультура становится положительной, делается мазок из кровяного бульона с окраской по Граму. На основании этих результатов можно выбрать подходящий(е) зонд(ы) PNA-FISH для тестирования. Этот метод прост в использовании, имеет умеренную стоимость и не требует дорогостоящего оборудования [221]. Однако, чтобы в полной мере воспользоваться преимуществами метода, необходимо использовать специфические зонды для различных видов микроорганизмов, что практически нереализуемо во многих микробиологических лабораториях. Метод не дает данных о чувствительности или резистентности к противомикробным препаратам.

Одним из подходов быстрой идентификации в случае положительной гемокультуры могут быть иммунохроматографические тесты, примером которых является тест BinaxNOW (продукция фирмы Abbott, США) на определение Staphylococcus aureus , в котором используются поликлональные антитела для обнаружения специфического белка S. aureus , что позволяет дифференцировать S. aureus и другие грамположительные кокки во флаконах для гемокультур.

Другой областью применения иммунологических методов является диагностика фунгемии. Анализ международных данных в отношении инвазивных грибковых инфекций из отчетов по аутопсиям показывает, что, несмотря на все усилия по профилактике, диагностике и лечению данных заболеваний, они все еще имеют значительную распространенность и связаны с низким уровнем прижизненной диагностики [222–224]. Существуют определенные сложности при культуральной диагностике данных состояний, связанные с более длительным ростом грибов по сравнению с бактериями, сложностью выявления и идентификации плесневых грибов, а в случае зигомикоза - их легкой ранимостью, обусловленной ценоцитным (несептированным) мицелием. И здесь большую помощь может оказать серологическая диагностика. В настоящее время известно 4 антигена клеточной стенки грибов:

Для их выявления коммерчески доступны следующие тесты: иммуноферментный анализ для выявления антигенов и антител Candida spp. , Aspergillus spp. , тест латекс-агглютинации на выявление Cryptococcus neoformans , иммунофлуоресцентный анализ на Pneumocystis jirovecci , продукция фирмы Bio-Rad (США), иммунохроматографический тест на выявление Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii , иммуноферментный анализ на выявление антител против Candida spp. , антител и антигенов Aspergillus spp. , продукция фирмы Dynamiker (Китай), тесты непрямой гемагглютинации на выявление Aspergillus fumigatus , Candida spp. (продукция фирмы ELITech Microbio, Франция).

Таким образом, в настоящее время не существует доступного молекулярного или серологического анализа, который мог бы заменить микробиологическое исследование крови, но такие тесты могут быть полезны в качестве дополнения к культуральному методу.

Исследователи неоднократно пытались ответить на вопрос, можно ли использовать прямое тестирование смеси крови и бульона (без промежуточного этапа пересева) с применением обычных фенотипических (не молекулярных) методов для сокращения времени получения результатов анализа на чувствительность. Для реализации этого подхода есть ряд теоретических препятствий.

Главным препятствием является невозможность стандартизировать количество микроорганизмов в смеси крови с бульоном, используемым для тестирования. В зависимости от применяемой тест-системы могут изменяться следующие параметры: исходное количество микроорганизмов, присутствующих в образце крови, метаболические характеристики микроорганизма (например, скорость роста и газообразования) и количество микроорганизмов на 1 мл.

Во-вторых, при исследовании образцов смеси крови с добавками или без них вводится сложный жидкий матрикс (то есть кровь, бульон, антикоагулянт и любые добавки), который не предназначен для использования в коммерческих тестах на чувствительность к противомикробным препаратам. Даже с помощью центрифугирования или других процедур этот "эффект матрикса" нельзя полностью устранить или даже уменьшить.

Третья проблема, хотя, возможно, и не столь важная, касается присутствия в крови антимикробных веществ. Поскольку эти вещества назначаются в дозах, предназначенных для ингибирования роста бактерий даже при разбавлении бульонной средой, в смеси крови и бульона может сохраняться остаточная антимикробная активность [225].

В-четвертых, критерии интерпретации контрольных точек могут меняться со временем, это требует повторных проверок метода, что в большинстве случаев реализовать практически невозможно.

Пятое препятствие носит нормативный характер: большинство коммерческих тестов на чувствительность к антимикробным препаратам не включают в себя прямое тестирование смеси кровяного бульона в инструкции по применению, что делает такое использование тестов невозможным с юридической точки зрения.

Наконец, имеющиеся публикации по применению этих подходов неубедительны: есть исследования, в которых показано, что такие подходы работают, но другие исследования показывают противоположную картину. В настоящее время, когда упор делается на доказательную медицину, объективный анализ литературы не позволяет дать однозначный ответ о возможности прямого исследования чувствительности гемокультур к антимикробным препаратам.

Наиболее часто используемым показателем качества микробиологического исследования крови является уровень контаминации. Рекомендуется, чтобы уровень загрязнения культур крови госпитализированных пациентов оставался на уровне 3% или ниже, так как поддерживать уровни ниже 1% обычно невозможно, а уровни выше 5% приводят к невозможности различать контаминанты и патогены. Поскольку контаминация культур крови приводит к увеличению затрат на здравоохранение, уровень контаминации выше 5% также связан с увеличением таких затрат. Достижим ли показатель 3% для амбулаторных учреждений, особенно в отделениях неотложной помощи, - вопрос, остающийся без ответа. С точки зрения безопасности пациентов, качества и экономических затрат имеет смысл стремиться к минимально возможным уровням контаминации.

Другим распространенным показателем оценки качества является количество образцов культур крови, взятых на эпизод сепсиса. Как уже отмечалось ранее, интерпретация результатов микробиологического исследования крови в значительной степени зависит от взятия достаточного объема крови и проведения более чем одного анализа. Определение клинической значимости изолятов, выделенных из единичных культур крови, может оказаться невозможным и зависит от вида микроорганизма. В то же время сбор большего количества культур крови, чем необходимо, является избыточным, способствует анемии, вызванной флеботомией, и приводит к выделению большего количества контаминантов. Таким образом, лаборатории должны контролировать количество образцов культур крови, собранных за эпизод сепсиса.

Третьим важным показателем является адекватность заполнения флаконов для гемокультур. Этого легче всего добиться взвешиванием наполненных кровью флаконов и сравнением массы с известным эталоном. Флаконы, наполненные недостаточным объемом крови, снижают продуктивность, и о таких флаконах следует сообщить медицинскому работнику с рекомендацией повторного исследования крови. Адекватность заполнения флаконов следует контролировать с целью выявления любых признаков недостаточного (или избыточного) заполнения и принятия соответствующих корректирующих мер.

Выявление бактериемии и фунгемии остается одной из важнейших задач лабораторий медицинской микробиологии. Несмотря на разработку и внедрение ряда новых технологий, культуральное исследование крови с использованием жидких сред по-прежнему остается единственно возможным подходом. Молекулярные технологии детекции перспективны, но доступные в настоящее время методы не обладают достаточной чувствительностью для гемокультур (за исключением нескольких отдельных патогенов), дают лишь ограниченную информацию о чувствительности к противомикробным препаратам, при самостоятельном использовании не дают возможности сохранения изолятов для проведения эпидемиологических исследований и в настоящее время неэффективны для обнаружения полимикробных ассоциаций. Поскольку выделение патогенов из крови ставит перед клиницистами, микробиологами и эпидемиологами большое количество задач: прогнозирование, контроль терапии, мониторинг ответа на терапию и эпидемиологические исследования, любой метод выявления бактериемии и фунгемии должен быть способен выполнить каждую задачу. Представляется маловероятным, что в обозримом будущем какая-либо новая технология полностью заменит микробиологическое исследование крови. Что уже происходит, так это интеграция новых технологий вместе с культивированием крови в общий алгоритмический подход, использующий преимущества каждого метода.

До 1966 г. в масс-спектрометрах процесс ионизации газообразных или способных переходить в газообразное состояние веществ осуществлялся только электронным ударом (электронная ионизация). При этом источником электронов была нагретая металлическая проволока (катод) [255]. Электроны движутся от катода к аноду через область пространства, занятую анализируемым веществом, находящимся в газообразном состоянии (в ионизационной камере обязателен вакуум). Электроны вызывают возбуждение электронной оболочки молекул аналита (удара как такового не происходит), в результате чего электроны молекулы аналита перемещаются на более отдаленные орбитали. При определенном значении энергии ионизации молекула теряет электрон и становится катион-радикалом (молекулярным ионом):

Образующиеся ионы выталкиваются специальным электродом из ионизационной камеры, фокусируются в узкий пучок и направляются в анализатор. Энергия ионизирующих электронов обычно составляет 70 эВ, что соответствует ускоряющему потенциалу между катодом и анодом 70 В. Такое значение необходимо для получения воспроизводимых масс-спектров. Для ионизации большинства органических соединений необходима энергия 6–12 эВ. В результате образующийся катион-радикал получает избыточную энергию, поэтому может распасться (фрагментироваться) на 2 частицы: ион с меньшей массой (осколочный ион) и незаряженный радикал (Х^• ) или нейтральный фрагмент. Последние два прибором не запишутся.

Запись уравнений:

Если осколочный ион все еще обладает большой энергией, он, в свою очередь, также может распасться и т.д. В результате получится масс-спектр вещества, на котором крайний справа пик будет соответствовать первичному (до фрагментации) молекулярному иону, а самый высокий пик - самому устойчивому иону.

Достоинства метода:

Недостатки:

Диапазон масс - до 1000 Да.

Новым подходом в решении проблемы оптимальной ионизации газообразных соединений стал разработанный в 1966 г. Барнаби Мансоном и Фрэнком Филдом метод химической ионизации [255]. Этот способ ионизации гораздо мягче, чем электронный удар. В ходе химической ионизации молекулярный ион получает небольшое количество избыточной энергии, и поэтому степень его фрагментации гораздо меньше либо вообще отсутствует.

Сущность метода заключается в том, что в ионизирующей камере находится, помимо анализируемого вещества, переведенного в газообразное состояние, еще и другой газ-реагент (обычно метан, аммиак, изобутан, аргон) в значительно большем количестве. Вся система находится не в вакууме, а под давлением (до 1 мм рт.ст.). Сначала путем электронной ионизации происходят ионизация молекул газа-реагента и его дальнейшие химические превращения.

Сталкиваясь с молекулами образца, ионизированные молекулы газа передают свой заряд в виде протона. Далее протонированная молекула образца выталкивается электрическим полем в сторону масс-анализатора.

Достоинства метода:

Недостатки:

В 1968 г. американский химик Малкольм Доул разработал принцип еще одного метода ионизации - электроспреем (ESI) [255]. За применение этого метода для анализа "тяжелых" молекул полипептидов, белков, нуклеиновых кислот Джон Фенн в 2002 г. получил Нобелевскую премию. До этого времени масс-спектрометрия широко использовалась в химии, биохимии, исследованиях в атомной физике, однако невозможно было проанализировать "тяжелые" молекулы, не разрушив их. Фенн с помощью метода Доула перевел их в газовую фазу [256].

Сущность метода заключается в следующем. Анализируемое вещество смешивается с полярным растворителем (в качестве которого могут использоваться вода, метанол, ацетонитрил), содержащим Н⁺ и катионы щелочных металлов (натрия, калия), и поступает в тонкий капилляр диаметром 0,1 мм, к которому приложено высокое напряжение. Раствор выходит из капилляра в виде очень мелкого аэрозоля, состоящего из заряженных капель (происходит распыление) (рис. 2-6) .

Заряженные капли притягиваются к противоэлектроду, при движении уменьшаясь в размерах благодаря испарению, вызванному током сухого азота в первом сепараторе и вакуумом во втором. При определенном размере капли распадаются на более мелкие. Этот процесс повторяется, пока не образуется ион анализируемого соединения. Вода испаряется из заряженных капелек раствора, оставляя свободно парящие ионы, массы которых можно определить, отрегулировав их движение и измеряя время полета на известное расстояние. Таким образом, стало возможным перевести тяжелые органические молекулы белков и нуклеиновых кислот в газообразное состояние.

Поскольку ионизация происходит из раствора, имеющиеся в нем частицы могут соединяться с молекулами аналита. Таким образом, в масс-спектре будут наблюдаться ионы: ⁺, ⁺ , ⁺ .

Если аналит содержит несколько основных центров, то в масс-спектре появляется набор ионов типа ⁿ⁺ . А поскольку регистрируется не масса, а отношение массы к заряду, то ион с массой 100 000 Да и зарядом 100 будет виден в масс-спектре на величине 1000. Это позволяет расширить предел анализируемых масс до 100 000 Да.

Достоинства метода:

Недостатки:

Еще один метод мягкой ионизации был предложен в 1969 г. немецким ученым Хансом-Дитером Бекки для ионизации веществ, не переводимых в газообразное состояние, термически нестабильных и полярных соединений, к которым относятся углеводы, пептиды, олигонуклеотиды, синтетические полимеры молекулярной массой до 10 000 и выше [257].

При полевой десорбции для ионизации молекул, нанесенных на поверхность специально сконструированного эмиттера, используется электрическое поле (рис. 2-7) . Эмиттер представляет собой вольфрамовую проволоку диаметром 1–10 мкм, активированную так, чтобы на ее поверхности образовались микроиглы. Ионы десорбируются с поверхности под действием электрического поля, и твердые нелетучие материалы переходят в газообразное состояние. Положительный потенциал эмиттера выталкивает образующиеся ионы молекул к детектору.

Получаемые ионы обладают пониженной по сравнению с другими методами ионизации внутренней энергией и поэтому практически не распадаются. В результате на масс-спектре пик иона молекулы оказывается практически единственным сигналом.

Достоинство метода. В спектре присутствует практически только единственный сигнал иона молекулы, что не требует сложной интерпретации результата.

Главные недостатки. Хрупкость эмиттера и трудность его изготовления.

В 1976 г. Рональдом Д. Макфарланом был предложен еще один метод мягкой ионизации - плазменная десорбция . Ионизирующие частицы образуются за счет распада ядра изотопа калифорния-252. Помимо á-распада, происходит также спонтанное деление ядра. Калифорний-252 распадается на два высокоэнергетичных осколка, отбрасываемых в противоположных направлениях. Распад сопровождается выделением большого количества энергии, которая в основном переходит в кинетическую энергию осколочных частиц. Пучок частиц распада проходит через тонкую металлическую фольгу, на поверхности которой находится анализируемое вещество, вызывая его быстрый нагрев и десорбцию [258].

Наиболее популярным методом ионизации является метод лазерной десорбции , так как он используется в технике матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI). Источником ионизации являются различные типы импульсных лазеров (газовые, твердотельные). Используемые длины волн для получения ионов лежат либо в области ближнего ультрафиолета, либо в инфракрасном диапазоне. Обычно MALDI масс-спектрометры работают на азотном лазере с длиной волны 337 нм, то есть в области ближнего ультрафиолета и длительностью импульса в несколько наносекунд. Образец, представляющий собой твердый раствор или твердую смесь аналита в матрице, облучают лазером с длительностью импульса в несколько наносекунд с высокой удельной мощностью излучения. Энергия лазера создает локальный нагрев образца, переходя в кинетическую энергию молекул (энергию электронного и колебательного возбуждения). Таким образом, происходит испарение твердого аналита [259].

После изобретения методов ионизации биомолекул, не вызывающих их деградации, возникла потребность в масс-спектральной технике сверхвысокого разрешения. Метод, предложенный в 1974 г. канадскими учеными М. Комисаровым и А. Маршаллом для усовершенствования масс-спектрометрии, дает уникальную возможность для количественного анализа первичной структуры белков и других биомакромолекул, определения состава сложных химических и биохимических смесей. Масс-спектрометрия с ионно-циклотронным резонансом (ICR) основана на измерении частот циклотронного движения ионов в сверхсильных магнитных полях. Основным элементом анализатора является ячейка, размещенная в однородном магнитном поле. Ионы образца, полученные любым из методов ионизации, направляются в ячейку анализатора перпендикулярно силовым линиям магнитного поля. В результате ион начинает двигаться в ячейке по круговой орбите с частотой, пропорциональной отношению его массы к заряду. Для детекции ионов их облучают наложением радиочастотного поля. При вхождении в резонанс частоты движения иона с частотой возбуждающего импульса радиус движения иона увеличивается по спирали. Другие же ионы продолжают двигаться без изменения. Сигнал регистрируется.

Таким образом, Алан Маршалл и Мелвин Комисаров первыми применили Фурье-преобразование к масс-анализаторам ICR. Подобные масс-анализаторы получили название "масс-анализаторы ICR с Фурье-преобразованием (FT/ICR MS)" [266].

Маршалл и Комисаров впервые встретились в Стэнфорде. Маршалл в то время был аспирантом, а Комисаров - постдоком. Маршалл получил свою первую должность на факультете в 1969 г. в Университете Британской Колумбии, а Комисаров - два года спустя. В Университете Британской Колумбии Маршалл решил работать в области ядерного магнитного резонанса, а Комисаров полностью сосредоточился на ICR; сочетание именно этих двух областей науки привело к прорыву в масс-анализаторах ICR - появлению FT/ICR MS.

ICR существует с 1949 г., когда Дж. А. Хиппл впервые описал эту технику [267, 268]. В приборе ICR заряженные частицы вращаются под действием магнитного поля. Ионы облучаются колеблющимся электрическим полем, которое приводит частицы в больший радиус вращения и в фазовую когерентность (то есть все ионы с одинаковым m/z движутся синхронно). Когда ионы проходят через пластины детектора, их присутствие регистрируется в виде индуцированного электрического тока. Для получения полного спектра в ICR без Фурье-преобразования частота излучения поддерживается постоянной, в то время как магнитное поле проходит через диапазон значений; это приводит к длительному времени сбора.

Главный прорыв Маршалла и Комисарова произошел, когда исследователи поняли, что к ICR может быть применено Фурье-преобразование. Фурье-преобразование - это математическая манипуляция, которая может деконволютировать сложные волновые функции. О новом методе проведения Фурье-преобразования, который ускорял вычисления примерно в 1000 раз, было сообщено только в 1965 г. Метод применялся по отношению к нескольким другим аналитическим методам, включая ядерный магнитный резонанс и инфракрасную спектроскопию, но масс-спектрометрии пока не было в числе этих методов.

Маршалл вспоминает, как обсуждал эту проблему с Комисаровым в начале 1970-х гг.: "Я пошел к нему и сказал: "Как так получилось, что ученые, занимающиеся ICR, не проводят Фурье-преобразование?", потому что я узнал об этом из ядерного магнитного резонанса", - удивлялся он. Фурье-преобразование оказалось неоценимым для повышения скорости получения и чувствительности спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Маршалл хотел посмотреть, смогут ли они также усовершенствовать ICR. Это сработало. Теперь вместо изменения магнитного поля для получения полного спектра измерялись все ионы одновременно. "Если у вас есть возможность измерить все ионы одновременно и рассчитать результат математически, вы очень быстро получите сверхвысокую разрешающую способность без потери чувствительности", - пишет Дэвид Маддиман из Университета штата Северная Каролина. Это открытие было революционным шагом в истории развития масс-спектрометрии. Благодаря своей сверхвысокой разрешающей способности метод масс-спектрометрии ICR с Фурье-преобразованием (FT/ICR) в настоящее время является одним из наиболее значимых методов анализа сложных смесей.

Другой оптимизацией масс-спектрометров является технология орбитальной IT Orbitrap [269]. Впервые такой анализатор был выпущен компанией Thermo Fisher Scientific в 2005 г. Впоследствии прибор неоднократно усовершенствовали, повышая его разрешающую способность.

Первое упоминание об электростатической орбитальной ловушке ионов датируется 1923 г. [270], когда К.Х. Кингдон опубликовал результаты исследований по улавливанию ионов аппаратом, представляющим собой закрытый металлический цилиндр с фланцами и пропущенным внутри него проводом. Ученый обнаружил, что заряженные частицы, обладающие достаточной начальной тангенциальной скоростью, не сталкивались с проволокой, а вращались вокруг нее. Однако в последующие десятилетия это открытие не нашло практического применения [271–273]. В 1990-е гг. интенсивное развитие масс-спектрометрических методов анализа привело к всплеску интереса и к орбитальной ловушке ионов и "желанию построить новый масс-спектрометр, который позволит избежать недостатков предыдущих инструментов, таких как сложность и размеры анализаторов ICR с Фурье-преобразованием; низкая чувствительность, динамический диапазон и разрешение (в те времена) ортогональных TOF-анализаторов; ограниченная точность определения массы в анализаторах ионная ловушка" [271]. Первая орбитальная IT была разработана в конце 1990-х гг. [273, 274]. Она представляла собой центральный электрод веретенообразной формы, находящийся внутри двух точно его повторяющих симметричных внешних электродов, электрически изолированных друг от друга. Такая конструкция давала возможность улавливать ионы электрическим полем, контролировать их движение и измерять частоты аксиальных колебаний по току, наведенному на внешних электродах ловушки и детектируемому дифференциальным усилителем. Далее широкополосный частотный сигнал оцифровывался и преобразовывался с помощью преобразования Фурье в частотный спектр, а затем - в спектр отношений массы к заряду [275].

Важным моментом в развитии "быстрой микробиологии" является возможность метода MALDI-TOF MS-анализа проводить индикацию бактерий непосредственно в клиническом материале, что может оказаться неоценимым инструментом, например, в диагностике инфекций мочевыводящих путей.

В настоящее время для выявления бактериурии наряду с микроскопией осадка мочи применяют различные методы быстрой диагностики, так называемые скрининг-тесты: тест восстановления трифенилтетразолия хлорида; тест на определение эстеразы лейкоцитов; dipstick test и др. Следует отметить, что чувствительность скрининг-тестов для диагностики бактериурии невысокая, поэтому их необходимо подтверждать культуральным исследованием. "Золотым стандартом" в настоящее время считается посев мочи, так как он является наиболее информативным способом диагностики бактериурии. Метод количественный, позволяет определить степень бактериурии, количество этиологического агента, однако на его выполнение требуется от 24 до 72 ч.

В отличие от культурального исследования MALDI-TOF MS требует минимального времени пробоподготовки и способна идентифицировать бактерии в образцах мочи даже при наличии более двух уропатогенов. Пока единые методики и стандарты использования метода MALDI-TOF MS для прямой идентификации микроорганизмов в моче отсутствуют, а полученные различными исследователями результаты не всегда сопоставимы. Отличия результатов, по данным литературы, возможно, связаны с применением разных методик пробоподготовки мочи. Например, используются различные объемы и режимы центрифугирования, предварительная диафильтрация. Наибольшая точность отмечается при наличии в пробе мочи монокультуры грамотрицательных бактерий и стафилококков в высоком титре (>10⁵ КОЕ/мл). Серьезной проблемой при получении методом MALDI-TOF MS положительных результатов непосредственно в клинических образцах является отсутствие данных о титре бактерий. Дальнейшее совершенствование методологии, вероятно, повысит чувствительность анализа. Тем не менее образцы мочи с количеством бактерий в титре >10⁵ КОЕ/мл практически всегда являются клинически значимыми, тогда как образцы с меньшим количеством бактерий могут являться результатом контаминации пробы. В связи с этим необходимо проведение исследования бактериурии с помощью традиционных методов для различных групп пациентов (новорожденных, беременных, пациентов с хроническими инфекциями мочевыводящих путей). Особенно важна разработка критериев оценки диагностической значимости бактериурии у пациентов разного возраста, пола, с наличием и отсутствием клинических проявлений болезней мочевыводящей системы, а также рекомендаций по интерпретации результатов бактериологического анализа проб мочи, полученных различными способами.

В диагностике инфекций кровотока культуральный метод также остается "золотым стандартом". Однако, к сожалению, культуральный метод обладает невысокой чувствительностью, что в первую очередь может быть связано с влиянием на жизнеспособность микроорганизмов стартовой терапии антимикробными препаратами, назначаемыми врачами при первых же клинических подозрениях на развитие сепсиса.

В настоящее время диагностика инфекций кровотока состоит из культивирования микроорганизмов во флаконах с жидкой питательной средой в автоматических анализаторах в течение минимум 12 ч. При обнаружении роста выполняется окраска по Граму мазка крови из флакона, что позволяет провести корректировку антимикробной терапии. Затем требуется произвести субкультивирование образца крови для выделения чистой культуры, дальнейшую видовую идентификацию микроорганизмов и определение их чувствительности к антимикробным препаратам, которое занимает еще 24–48 ч. В результате в общей сложности на выполнение исследования затрачивается 2–3 сут. Молекулярно-биологические методы диагностики привели к определенному прорыву в микробиологии, однако имеют ряд недостатков. Основной недостаток - ограниченный спектр разработанных зондов на определенные роды и виды микроорганизмов. В отличие от молекулярно-биологических методов MALDI-TOF MS-анализ позволяет за несколько минут определить в одной пробе практически любой микроорганизм из нескольких тысяч видов, имеющихся в его базе данных. Возможность проведения прямой MALDI-TOF MS-идентификации в образцах крови во флаконах c положительным ростом культур может значительно сократить время на точное определение патогена и позволит быстрее произвести коррекцию антимикробной терапии. В настоящее время отсутствуют стандартизованные протоколы пробоподготовки образцов из флаконов с положительной культурой крови для проведения MALDI-TOF MS, и различные авторы предлагают разные способы обработки образцов и режимы центрифугирования. При прямом анализе из флаконов с положительной культурой крови отрицательную роль играет и сама питательная среда, содержащая или не содержащая уголь и другие адсорбенты. Компоненты крови также могут искажать результаты масс-спектрометрии, создавая фоновые помехи при прямом анализе образца крови. Поэтому важна предварительная пробоподготовка для уменьшения уровня этих искажений и концентрирования бактерий.

Еще в 2010 г. была опубликована работа о приготовлении бактериального осадка из положительной гемокультуры для быстрой идентификации патогенов [422–424]. С тех пор разработано большое количество протоколов, где описаны процедуры идентификации этиологических агентов при бактериемии в 70–80% случаев с точностью более 99% [425]. Разработан процесс концентрирования микроорганизмов в гемокультуре с использованием центрифугирования и стадий очистки. Полученный осадок наносят прямо на мишень [426] или проводят процедуру белковой экстракции [427]. Для этой цели также можно использовать коммерческий набор Sepsi typer (Bruker Daltonics, Германия) [428]. Метод с использованием этого набора похож на методы прямого нанесения и экстракции. Вместе с тем он дает лучшие результаты при идентификации дрожжевых грибов, что подтверждается рядом работ [429, 430]. Также подтверждается и улучшенная идентификация микромицет в гемокультуре с использованием ряда процедур [431, 432]. А. Croxatto и соавт. разработали метод пробоподготовки с использованием хлорида аммония для лизиса эритроцитов и получения чистого бактериального осадка [433]. Также успешно проводится стадия короткой инкубации после гемокультивирования [434]. Кроме того, на полученном осадке может быть применена детекция â-лактамаз, в частности карбапенемаз [435, 436].

Подобный подход также может быть использован в случаях, когда патоген редко детектируется. Например, в случае ожидаемой, но неподтвержденной грибковой инфекции, а также для медленнорастущих микроорганизмов, таких как виды рода Mycobacterium [437–440].

Кроме того, для улучшения качества результатов масс-спектрального анализа при прямой идентификации положительной гемокультуры компания Bruker Daltonics предлагает программное обеспечение Sepsityper. Данный модуль позволяет при анализе пиков исключать пики, создаваемые белками крови человека.

Недостатком MALDI-TOF MS при прямой детекции гемокультуры является неспособность или затруднительность идентифицировать все бактерии при наличии полимикробной инфекции [426].

Необходимо отдельно отметить способность MALDI-TOF MS идентифицировать анаэробные микроорганизмы напрямую из флаконов с положительной культурой крови. Таким образом, технологии масс-спектрометрии могут стать основным определяющим методом в будущем, так как это направление продолжает развиваться, а существующие базы данных микроорганизмов стремительно пополняются.

Первое доказательство наличия в образцах сыворотки дисахарида, напрямую связанного с экспериментальным инвазивным кандидозом, при грибковой инфекции на модели мышей было опубликовано в работе В. Sendid и соавт. [437]. В дальнейшем эту методологию упростили и применили для рутинной идентификации этого биомаркера в сыворотке крови пациентов с инвазивным кандидозом, инвазивным аспергиллезом и мукормикозом [438]. Показано, что детекция дисахаридного маркера (365 m/z) соответствует детекции â-D-глюкана и галактоманнана, то есть эти тесты являются взаимодополняющими. Несмотря на то что детекция биомаркера еще не валидирована, его использование может представлять собой быстрый, недорогой и нетрудоемкий способ детекции инвазивной инфекции, вызванной широким диапазоном видов грибов.

В качестве маркера ответа на противогрибковую терапию была предложена детекция с помощью MALDI-TOF MS-белков острой фазы на модели кроликов с признаками инвазивного легочного аспергиллеза [441]. Несмотря на то что эти белки не являются специфичными маркерами грибковой инфекции, было подтверждено их наличие у инфицированных кроликов, а также выявлены изменения их экспрессии в ответ на лечение антимикотиками.

В ряде исследований сообщалось о возможности идентификации специфических биомаркеров плазмы для диагностики латентного туберкулеза, используя MALDI-TOF-анализ, с помощью которых можно дифференцировать здоровых людей от пациентов с латентной инфекцией. R. Zhang и соавт. для обнаружения белков плазмы даже при наличии их в минимальной концентрации использовали магнитные катионообменные шарики (набор MB-WCX, продукция фирмы Bruker Daltonics) [329]. Затем, получив спектры белков плазмы, авторы проанализировали их с помощью алгоритма собственной разработки. Это позволило разработать модель для дифференциации здоровых людей от пациентов с вялотекущим процессом, исходя из наличия/отсутствия отдельных пиков [329]. Такая же концепция была разработана G. Sandhu и соавт. Эти исследователи обнаружили три региона в белковом спектре образцов плазмы (около 5,8, 11,5 и 21 кДа), по которым можно дифференцировать здоровых людей от пациентов с активной и вялотекущей формой туберкулеза с точностью 87–90% [439]. Преимуществом таких подходов является то, что данная методология может быть без труда стандартизирована благодаря имеющимся коммерческим наборам для выделения белков из плазмы. Тем не менее анализируемый в обоих исследованиях белковый спектр различался так же, как и получаемые результаты. Идентификация биомаркеров туберкулезного процесса могла бы сделать MALDI-TOF MS особо ценным методом скрининга, хотя маркерные пики все же требуют дополнительного подтверждения молекулярными или серологическими методами.

Подобный подход не так давно был использован при разработке панели для идентификации 10 вирусов, вызывающих инфекции дыхательных путей [442]. Авторы использовали известные клеточные линии для установления фоновых значений белковых пиков, полученных из клеточной культуры, а затем нашли специфические вирусные пики, использовав референсные вирусные штаммы. Маркерные пики также обнаруживались в культуре клеток, инфицированной вирусами, полученными из клинических образцов. Однако такой метод достаточно плохо дифференцирует близкородственные вирусы. Те же авторы в другой работе сообщали о возможности различать с помощью MALDI-TOF три серотипа полиовирусов [442]. При этом метод MALDI-TOF MS-анализа в детекции вирусов до сих пор не прижился в рутинной практике микробиологических лабораторий.