Рациональная антимикробная терапия

Кровь как объект бактериологического исследования

Кровь - один из наиболее распространенных образцов клинического материала, исследуемых в бактериологической лаборатории. Ежегодно в мире отмечают не менее миллиона клинически проявляющихся случаев проникновения микроорганизмов в кровоток, 30-50% которых заканчивается летально. Следует помнить, что выявление бактерий (бактериемии) и грибов (фунгиемии) в крови - одно из наиболее ответственных и трудных микробиологических исследований.

Септицемия - бактериемия, вызванная тяжелой инфекцией, клинически проявляется как сильный озноб, лихорадка, токсикоз и гипотензия. Высшая форма проявления бактериемии - бактериальный шок.

Основные причины.

Таким образом, септицемия и бактериемия (фунгиемия) могут быть вызваны практически всеми микроорганизмами - как патогенными, так и оппортунистическими бактериями и грибами. В табл. 2-1 приведены наиболее значимые бактерии и грибы.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые патогены, выделяемые из крови, подразделяются по уровням приоритета.

Нормальная микрофлора

В норме кровь стерильна. Следовательно, бактериемия или фунгиемия - всегда патология.

Схема исследования

Исследование крови проводят у больных с длительной лихорадкой (38 °C и выше) неясного генеза, гипотермией (36 °C и ниже), лейкоцитозом (особенно со сдвигом влево) и гранулоцитопенией.

На рис. 2-1 приведен современный протокол микробиологического исследования крови.

Оценка результатов

Оценка результатов зависит от вида выделенного микроорганизма и массивности его роста. Выделение патогенных микроорганизмов, безусловно, свидетельствует об их этиологической роли в заболевании. Если из крови выделены представители группы оппортунистических бактерий и грибов, следует учитывать их количественное содержание, наличие монокультуры или ассоциации, повторность выделения одной и той же культуры от больного и идентичность гемокультуры с культурами, выделенными из другого биологического материала от этого же больного.

Контаминанты. Загрязнения крови посторонней микрофлорой можно избежать, тщательно обрабатывая кожу пациента и скрупулезно соблюдая правила асептики при выполнении всех лабораторных процедур. Тем не менее даже в идеальных условиях 3-5% проб крови оказываются загрязненными посторонней микрофлорой. С кожи в кровь попадают S. epidermi- dis, P. acnes, Clostridium spp., Diphteroides spp., из внешней среды - Acinetobacter spp., Bacillus spp. Однако эти же микроорганизмы иногда могут быть этиологическими факторами заболеваний, даже таких как эндокардиты. Для дифференциации истинной патогенетической роли микроорганизмов необходимо учитывать следующие факторы.

Правила взятия проб крови

По возможности взятие проб крови следует проводить до назначения антибиотиков. Если больной уже получает антибактериальную терапию, кровь следует забирать непосредственно перед очередным введением препарата. Лучше всего брать пробы крови, когда у пациента наблюдается озноб или пик температурной реакции. Следовательно, необходимый минимум забора - две пробы, взятые из разных рук с интервалом 30 мин. Оптимален забор (в течение 1 ч) трех проб крови из разных локусов, что значительно повышает вероятность выделения возбудителя. Большее количество проб не имеет преимуществ перед троекратным забором в плане частоты выделения микроорганизмов.

Преимущества повторного взятия проб крови:

Количество крови. Поскольку количество бактерий в 1 мл крови всегда незначительно, очень важно взять достаточное количество крови: у взрослых - 10 мл крови из вены; у детей - 2-5 мл; у новорожденных и детей неонатального периода чаще можно получить не более 1-2 мл крови.

Дезинфекция кожи. Участок кожи над веной, откуда будут брать кровь, должен быть тщательно обработан с помощью бактерицидного препарата: йод + (калия йодид + этанол), 10% повидон-йод + (калия йодид), 70% этанол или 0,5% хлоргексидин в 70% этаноле. Дезинфектант должен испариться с поверхности кожи до взятия пробы крови. Если использовался раствор йода + (калия йодид + этанол), его следует стереть 70% этанолом, чтобы избежать раздражения кожи.

Даже после тщательной обработки кожных покровов некоторые бактерии остаются в глубоких слоях кожи и могут проникнуть в образец крови, например, S. epidermidis, Propionibacterium acnes и даже споры Clostridium spp. Псевдобактериемия (ложноположительные находки микроорганизмов в крови) может быть обусловлена использованием контаминированных антисептических растворов, шприцев или игл. Другой источник контаминации - контакт иглы с нестерильной ампулой (флаконом), если тот же самый шприц использовался вначале для химических анализов крови или им проводили манипуляции для определения СОЭ.

Питательная среда для культивирования крови. Как правило, флаконы для культивирования образцов крови содержат жидкую питательную основу, обеспечивающую наилучшие условия роста всех видов клинически значимых бактерий и грибов. В настоящее время ВОЗ рекомендует использовать для этих целей триптиказо-соевый бульон (ТСБ).

Количество питательной основы. Для того чтобы разбавить присутствующие в крови антибиотики и уменьшить бактерицидный эффект человеческой сыворотки, кровь смешивают с бульоном в соотношении 1:10 (10 мл крови и 100 мл бульона).

Лабораторная посуда для культивирования крови. Отдельно следует остановиться на используемой для культивирования образцов крови лабораторной посуде. Применяются флаконы разных объемов, которые можно условно разделить на две группы.

Отрицательная сторона флаконов лабораторного приготовления:

По этим причинам частота выделения микроорганизмов из крови при использовании флаконов лабораторного приготовления существенно ниже.

Флаконы, изготавливаемые промышленным путем (коммерческие), можно разделить, в свою очередь, на две группы:

Вторые отличаются от первых встроенным в днище флакона колориметрическим (BacT/Alert) или флюоресцентным (Bactec 9000) сенсором и присутствием в жидкой основе различных адсорбирующих добавок для удаления из нее потенциально токсических органических компонентов, в том числе антибиотиков. Эти флаконы могут быть использованы только совместно с соответствующим оборудованием (automated blood culture systems).

Положительная сторона готовых коммерческих флаконов:

При исследовании образца крови на бруцеллы и другие медленнорастущие микроорганизмы рекомендуется использовать так называемые двухфазные флаконы, которые заполнены бульоном (жидкая фаза) и скошенным агаром (твердая фаза). Для приготовления как бульона, так и агара следует использовать ТСБ. Газовая среда флакона должна быть насыщена диоксидом углерода.

Непосредственно перед посевом крови резиновую пробку флакона дезинфицируют 70% этанолом и раствором йода + (калия йодид + этанол), дают подсохнуть обработанной поверхности, затем прокалывают пробку флакона иглой шприца и производят посев крови. Флаконы маркируют и до транспортировки в лабораторию содержат в термостате или при комнатной температуре (не в холодильнике!).

При отсутствии в клиническом отделении флаконов для гемокультур в исключительных случаях допускается использование 20-мл шприца с иглами. В шприц предварительно набирают 0,5~~ 0,7 мл стерильного гепарина натрия, заменяют иглу и затем пунктируют вену. Набирают 10-15 мл крови, перемешивают ее с гепарином натрия осторожным покачиванием шприца (иглу с него не снимают) и в этом же шприце с согнутой у основания иглой (или надетым на нее стерильным колпачком) немедленно отправляют в лабораторию.

Характерная особенность воздухоносных путей - присутствие разнообразных бактерий (в том числе патогенных) в верхних отделах и относительная стерильность зон газообмена. Соответственно, именно инфекции дыхательных путей доминируют среди всей инфекционной патологии, а заболеваемость некоторыми из них, например вирусными, наносит колоссальный ущерб, не сопоставимый с другими инфекциями. В практике бактериологической лаборатории основные образцы для подобных исследований - мазки из носа, носоглотки, зева, мокрота и промывные воды бронхов. Значительно реже проводят исследование биоптатов легких, аспиратов трахеи и других образцов.

Верхние дыхательные пути

Верхние дыхательные пути - полые органы, расположенные от глотки до ноздрей, к ним относятся ротоглотка и носоглотка со связывающими полостями, синусами и средним ухом.

В табл. 2-2 приведены основные возбудители инфекций верхних дыхательных путей.

Среди всех перечисленных инфекций фарингиты едва ли не самые распространенные; нелеченые инфекции могут иметь очень серьезные последствия. Бактериологическая диагностика фарингитов затруднена тем, что нормальная микрофлора ротоглотки содержит очень много разных видов аэробных и анаэробных бактерий.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые бактериальные патогены, выделяемые из верхних дыхательных путей, разделены по уровням приоритета.

Нормальная микрофлора

Обычно нормальная микрофлора по численности превосходит патогенную, роль бактериолога заключается в том, чтобы установить различия между комменсалами и патогенными микроорганизмами.

Нормальная микрофлора глотки:

Горло людей преклонного возраста, страдающих иммунодефицитными состояниями или болезнями, недостатком питания, длительно получающих антибиотики, может быть колонизировано энтеробактериями (E. coli, Klebsiella spp. и др.) и неферментирующими грамотрицательными бактериями (Acinetobacter spp. и Pseudo-monas spp.), которые также могут быть патогенами дыхательных путей.

Схема исследования

На рис. 2-2 приведен современный протокол микробиологического исследования отделяемого верхних дыхательных путей.

Слизь из носа. Обмывают крылья носа стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Материал забирают стерильным ватным тампоном из передних отделов носа, отдельно из правой и левой ноздри, избегая контакта тампона с кожей носа. Тампон помещают в пробирку (с транспортной средой или без нее) и в течение 1 ч доставляют в лабораторию.

Слизь из зева. Забирают натощак, до гигиенической обработки полости рта или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном по задней стенке глотки и миндалинам, избегая контакта тампона со слизистой оболочкой полости рта и языка. При налете нужно стараться снять его часть. Тампон помещают в пробирку (с транспортной средой или без нее) и в течение 1 ч доставляют в лабораторию.

Аспират из придаточных пазух. Исследуют при бактериальных синуситах. Материал отсылают в лабораторию в анаэробной транспортной среде или непосредственно в шприце. Не рекомендуется исследовать промывную жидкость и мазки из носоглотки, так как образцы контаминируются нормальной микрофлорой верхних дыхательных путей, что не позволяет правильно трактовать результаты анализа.

Нижние дыхательные пути

Нижние отделы дыхательных путей обычно не содержат бактерий; их инвазия и аккумуляция приводят к развитию патологического процесса. Динамика и проявление последнего существенно зависят от биологических свойств возбудителя, места его локализации и состояния местных и общих факторов резистентности. Инфекции нижних дыхательных путей - это инфекции, возникающие на уровне ниже глотки, т. е. в трахее, бронхах или легочной ткани (трахеиты, бронхиты, легочные абсцессы, пневмонии). Иногда при пневмонии в процесс вовлекается плевра, в результате чего возникает ее поражение (плеврит); иногда в плевральной полости может образоваться жидкость (плевральный выпот).

В табл. 2-3 приведены основные возбудители инфекций нижних дыхательных путей.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые бактериальные патогены, выделяемые из нижних дыхательных путей, разделены по уровням приоритета.

Нормальная микрофлора

В норме мокрота человека может быть контаминирована представителями его нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей.

Схема исследования

На рис. 2-3 приведен современный протокол микробиологического исследования отделяемого нижних дыхательных путей.

Оценка результатов

Оценка результатов зависит от способа и вида клинического материала, взятого на микробиологическое исследование.

При инвазивных методах взятия клинического материала:

При неинвазивных методах взятия материала. Для отделения нормальной симбиотической микрофлоры верхних дыхательных путей (контаминирующей мокроту) от микроорганизма - этиологического агента гнойно-воспалительного процесса используется целый комплекс тестов. С помощью количественного метода определяют содержание в мокроте определенного вида микроорганизма, исходя из того, что возбудитель находится в материале в значительно большем количестве, чем микроорганизмы-симбионты человека. Критическое число составляет 10⁶ -10⁷ КОЕ/мл. Определенное значение имеет вид выделенного микроорганизма. Альфа-гемолитические стрептококки, стафилококки, дифтероиды и нейссерии (кроме возбудителей дифтерии и менингита) составляют нормальную микрофлору носоглотки и ротоглотки и поэтому как возбудителей воспалительного процесса их следует учитывать только при определенных состояниях больного (СПИД/ВИЧ-ассоциированных инфекциях, онкологии и др.). При неинвазивном методе забора материала немаловажное значение имеет для получения достоверного результата взятие проб мокроты.

Отдельно хотелось бы остановиться на микробиологической диагностике легионелл, микоплазм, хламидий и грибов.

Легионеллезы в настоящее время микробиологически диагностируются с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) на определение антигена.

Первичная атипичная пневмония (микоплазменная) подтверждается с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) - выявления антител (IgG, IgM).

Хламидийные пневмонии диагностируются как РИФ, так и ИФА - антигены и антитела (IgG).

Пневмонии, обусловленные Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp. и другими грибами (инвазивный аспергиллез и другие микотические поражения легких), диагностируются с помощью целого ряда методов лабораторной клинической диагностики.

Правила взятия отделяемого нижних дыхательных путей для посева на микрофлору и чувствительность к антибиотикам

Мокрота. Забирают до еды, после полоскания зева и полости рта теплой водой или раствором питьевой соды (1 чайная ложка на стакан воды). Отхаркиваемую мокроту (лучше первую утреннюю порцию) собирают в стерильный контейнер с крышкой (взять в лаборатории). Если мокрота отделяется плохо, накануне пациенту дают отхаркивающие средства или проводят ингаляцию 0,9% раствором натрия хлорида.

Пробы мокроты, описанные в п. 2, не подвергают исследованию в лаборатории на инфекцию нетуберкулезной этиологии. Анализ следует повторить.

Сроки доставки мокроты в лабораторию не должны превышать 1,5-2 ч от момента ее получения (допускается хранение в холодильнике, но не более 6 ч), так как задержка ведет к аутолизу S. pneumoniae, а за счет размножения бактерий-контаминантов меняется истинное соотношение микрофлоры бронхиального секрета.

Трахеобронхиальные смывы. Специальным шприцем в трахею вводят около 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и собирают откашливаемый смыв в стерильную посуду. Бронхиальные смывы, в том числе вблизи очага воспаления, могут быть сделаны с помощью бронхоскопа. Недостаток этого метода - значительное разведение трахеобронхиального содержимого, что сильно снижает возможность выделения бактерий, так как концентрация их снижается примерно в 100 раз по сравнению с мокротой.

Браш-биопсия. Получают из глубины бронхов с помощью защищенной щеточки, что предохраняет материал от контаминации микрофлорой верхних дыхательных путей и позволяет производить исследование на анаэробы.

Пунктат инфильтрата или абсцесса. Получают трансторакальной пункцией под рентгенологическим контролем.

Плевральная жидкость. Кожу перед пункцией обрабатывают 70% этанолом, а затем йодом + (калия йодид + этанол).

После прокола жидкость собирают шприцем в стерильную пробирку и незамедлительно отправляют в лабораторию. Допускается посев плевральной жидкости (по 5 мл) в аэробные и анаэробные флаконы, используемые для исследования крови.

В пищеварительной системе отмечают своеобразное распределение микрофлоры, четко определяющее принципы взаимоотношения организма с микроорганизмами. В ротовой полости наблюдаются их широкое многообразие и выраженная обсемененность, убывающие по мере продвижения по пищеварительному тракту (пищеводу, желудку, тонкой кишке). Следующее место обширной колонизации - толстая кишка, на долю ее обитателей приходится едва ли не большая часть всей микрофлоры организма человека.

В табл. 2-4 приведены основные возбудители инфекций желудочно-кишечного тракта.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые в кале бактериальные патогены подразделяются по уровням приоритета.

Окончание табл. 2.4.

Нормальная микрофлора

В норме у здорового человека материал, взятый из разных отделов ЖКТ, в различной степени может быть контаминирован микроорганизмами от очень скудного количества в желудке и желчевыводящей системе до массивной контаминации в толстой кишке.

Схема исследования

На рис. 2-4 приведен современный протокол микробиологического исследования отделяемого из ЖКТ.

Исследование отделяемого из ЖКТ проводят при воспалительных процессах различной локализации. Воспалительные процессы в системе ЖКТ могут быть вызваны и представителями нормальной кишечной микрофлоры, и микроорганизмами-патогенами, попавшими в организм из внешней среды.

Оценка результатов

Оценка результатов зависит от вида материала. Так, например, при исследовании желчи прогностически неблагоприятным считается выделение различных энтеробактерий (чаще эшерихий, клебсиелл, протея, синегнойной палочки, бактероидов, особенно в количестве >10³ КОЕ/мл).

Правила взятия отделяемого пищеварительного тракта для бактериологического исследования

Желчь. Забирает в процедурном кабинете медперсонал. Проводят зондирование. Порции А, В, С собирают раздельно в стерильные пробирки с соблюдением правил асептики и доставляют в лабораторию. Накануне исключают из рациона питания продукты дрожжевого и молочнокислого брожения (кефир, творог и др.).

Отделяемое брюшной полости. Отделяемое из брюшной полости собирают на стерильный ватный тампон или в стерильный шприц; материал помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию.

Отделяемое тонкой кишки. Забирает в процедурном кабинете медперсонал при фиброгастроскопии или специальными зондами. Материал помещают в стерильную пробирку с 0,9% раствором натрия хлорида и доставляют в лабораторию.

Отделяемое желудка. Забирает в процедурном кабинете медперсонал при фиброгастроскопии. Материал помещают в стерильную пробирку с 0,9% раствором натрия хлорида и доставляют в лабораторию.

Промывные воды желудка. Забирает в процедурном кабинете медперсонал. Промывные воды собирают в стерильную пробирку с соблюдением правил асептики и доставляют в лабораторию.

Фекалии. Собирают в чистое судно, не содержащее следов дезинфицирующих веществ. Стерильной деревянной, пластмассовой или металлической палочкой не более 1 г фекалий сразу после акта дефекации переносят в стерильный контейнер с крышкой и доставляют в лабораторию.

Бб льшая часть инфекций мочевыводящих путей локализована в мочевом пузыре и мочеиспускательном канале. Из этих органов инфекция может подниматься по уретре (уретрит) и впоследствии поражать почки (пиелонефрит). Женщины более склонны к инфицированию мочевыводящих путей, взятие проб мочи для исследования у них также представляет большие сложности. Как у мужчин, так и у женщин инфекции мочевого тракта (ИМТ) и мочевыводящих путей (ИМП) могут протекать бессимптомно, остро или принимать хронический характер. Бессимптомное течение может быть диагностировано при выделении культур микроорганизмов. Острое течение инфекционных процессов чаще наблюдается у женщин всех возрастов; такие пациенты, как правило, лечатся в условиях поликлиники и редко попадают в стационар. Хронические инфекционные процессы как у женщин, так и у мужчин всех возрастов ассоциируются обычно с вызывающими их заболеваниями (например, пиелонефриты, простатиты, врожденные аномалии мочевыводящих путей, онкология и др.); такие пациенты, как правило, лечатся в условиях стационара. Бессимптомные, острые и хронические заболевания мочевыводящих путей - совершенно различные состояния, в связи с чем результаты лабораторных исследований мочи часто требуют различной интерпретации. Приблизительно у 10% пациентов, страдающих ИМТ, в моче могут присутствовать два микроорганизма, причем оба могут быть возбудителями заболевания. Три различных микроорганизма и более в образце мочи - серьезное основание для предположения об ошибках при взятии проб мочи или последующих манипуляциях. Вместе с тем при ИМТ у пациентов с постоянным катетером мочевого пузыря в моче часто наблюдается множество различных микроорганизмов.

В табл. 2-5 представлены основные возбудители инфекций мочевыводящей системы.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые бактериальные патогены, выделяемые из мочи, разделены по уровням приоритета.

Нормальная микрофлора

Моча здорового человека стерильна. Как правило, бактерии проникают в нее при прохождении через дистальные отделы мочевыводящих путей. Проникшие в мочу микроорганизмы быстро размножаются, так как она содержит основные вещества, необходимые для роста (углеводы, мочевину, минеральные соли и т. д.). Росту бактерий способствуют также благоприятные значения рН (5,3-6,5). К резидентной микрофлоре относят стафилококки, микрококки, дифтероиды, сарцины, энтеробактерии, нейссерии, микобактерии, микоплазмы, бактероиды, фузиформные бактерии и трепонемы. Обилие бактерий, колонизирующих наружные половые органы и переднюю часть мочеиспускательного канала и способных быстро размножаться в моче, ставит проблемы правильной интерпретации результатов бактериологического исследования.

Схема исследования

На рис. 2-5 приведен современный протокол микробиологического исследования мочи. Исследуемый материал:

Методика бактериологического исследования мочи включает следующие этапы:

Микробиологическое понятие нормы

В норме моча человека, полученная неинвазивным путем, как правило, может быть контаминирована представителями нормальной микрофлоры мочевыводящих путей.

Время проведения исследования до получения отрицательного результата - 24-72 ч.

Оценка результатов

Одна или более бактериальных клеток в поле зрения микроскопа всегда свидетельствуют о большом количестве микроорганизмов (10⁵ или более) в 1 мл мочи. Один или более лейкоцитов в поле зрения микроскопа - характерный индикатор инфекции мочевыводящих путей. В моче здорового человека во всем мазке обнаруживают лишь несколько бактериальных клеток или лейкоцитов либо не обнаруживают их вовсе.

В мазках мочи, взятой у женщин, большое количество слущенного эпителия, независимо от того, обнаружены или нет любые бактериальные клетки, служит очень серьезным основанием для предположения о контаминации мочи влагалищной микрофлорой. В таком случае необходимо взять на исследование повторную пробу мочи независимо от числа бактерий в одном поле зрения микроскопа.

Основная задача при интерпретации данных - доказательство этиологической роли микроорганизмов, выделенных из мочи. Учитывают комплекс признаков:

Степень бактериурии (табл. 2-6) позволяет дифференцировать инфекционный процесс в мочевыводящих путях или почках от контаминации мочи представителями нормальной микрофлоры человека.

Если в пробе мочи обнаруживается более двух видов микроорганизмов в категориях 2 и 3, результаты оценивают как подозрение на контаминацию мочи посторонней микрофлорой и просят направить для исследования свежую, чисто взятую пробу мочи.

Предпочтительно отбирать утренние порции мочи. Целесообразно попросить пациента накануне вечером воздержаться от мочеиспускания до взятия анализа.

Правила взятия мочи для бактериологического исследования

Взрослые. Собирают после тщательного туалета наружных половых органов 0,5% раствором калия перманганата или кипяченой водой с мылом в середине мочеиспускания (средняя порция мочи) в стерильный контейнер с крышкой (взять в лаборатории) в количестве 10-15 мл.

Новорожденные и дети. Сбор чистой порции мочи у этой категории пациентов - достаточно сложная процедура. Следует дать ребенку попить воды или другой жидкости, пригодной для питья. Чисто вымыть наружные половые органы ребенка. Можно усадить ребенка на колени матери, медицинской сестры или дежурного по палате, который затем отберет мочу ребенка в стерильную емкость в требуемом количестве. Контейнер следует закрыть крышкой и быстро доставить в лабораторию для безотлагательного исследования мочи.

В связи с тем, что моча сама по себе служит хорошей питательной средой, все пробы следует доставлять в лабораторию в течение 2 ч после отбора или хранить в холодильнике при температуре -4 °С до момента доставки в лабораторию и начала исследования, однако срок не должен превышать 18 ч.

Уретриты у мужчин клинически проявляются расстройством мочеиспускания и/или дизурией или протекают бессимптомно. Если не лечить гонококковый и хламидиозный уретриты, они могут прогрессировать и привести к эпидидимиту. У мужчин-гомосексуалистов N. gonor-rhoeae и Ch. trachomatis вызывают также инфекции прямой кишки, ротовой полости и глотки.

В целях выбора правильной тактики ведения больных уретриты следует разделить на гонококковые и негонококковые. Примерно половину случаев негонококкового уретрита вызывают Ch. trachomatis, однако в большинстве оставшихся случаев этиологический агент неизвестен. В некоторых случаях в клиническом материале обнаруживают Ureaplasma urealyticum, а Trichomonas vaginalis обнаруживают у 1-3% больных негонококковым уретритом. Внутриуретральная инфекция, вызванная вирусом герпеса человека, также может привести к нарушениям мочеиспускания. Такие бактериальные агенты, как стафилококки, различные энтеробактерии, Acinetobacter spp. и Pseudomonas spp., выделяют из мочеиспускательного канала здоровых мужчин и не могут быть безоговорочно причислены к возбудителям уретритов.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые бактериальные патогены, передаваемые половым путем, разделены по уровням приоритета.

Схема исследования у мужчин

Прямое исследование и интерпретация полученных результатов. Четыре или более полиморфноядерных лейкоцита в одном поле зрения микроскопа (масляно-иммерсионная система) - достоверный признак уретрита у мужчин.

В большинстве случаев гонореи у мужчин из мочеиспускательного канала выделяется гной; при микроскопии мазка обнаруживается значительное число (>10 в поле зрения) полиморфноядерных лейкоцитов. Однако при негонорейном уретрите, сопровождаемом менее выраженной воспалительной реакцией, эти признаки часто отсутствуют. Мазок, в котором обнаружено более 4 полиморфноядерных лейкоцитов в одном поле зрения микроскопа, но не найдены внутриклеточные грамотрицательные диплококки, позволяет с высокой степенью достоверности предположить, что это случай негонорейного уретрита.

При диагностике гонореи у мужчин как чувствительность, так и специфичность микроскопического исследования окрашенного по Граму мазка составляют более 98%. Не рекомендуется окрашивать по Граму мазки, полученные из мочеиспускательного канала, прямой кишки или ротоглотки мужчин, не имеющих клинических признаков заболевания. Вместе с тем микроскопическое исследование гнойного отделяемого, полученного при аноскопии, чрезвычайно важно диагностически.

Культивирование засеянных питательных сред. Для выделения N. gonorrhoeae используют шоколадный агар с ростовыми и селективными добавками (модифицированный агар Тайера-Мартина), который инкубируют, как уже было сказано выше, в атмосфере «свечного газа» и при высокой влажности. Чашки с посевом просматривают ежедневно в течение 2 сут.

Идентификация N. gonorrhoeae. Предварительная идентификация гонококков, выделенных из мочеполовых путей, основывается на положительной оксидазной пробе и наличии в окрашенном по Граму мазке грамотрицательных диплококков.

Нормальная микрофлора у женщин

В норме нижний генитальный тракт у женщины обычно заселен различными микроорганизмами, среди которых преобладают грамположительные палочки Дедерляйна, относящиеся к роду Lactobacillus. Могут обнаруживаться и другие бактерии: фекальная микрофлора - Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., анаэробные бактерии, грибы или микрофлора слизистой оболочки, например, Coryne-bacterium spp., Staphylococcus epidermidis, Micricoccus spp. и др.

Патогенная микрофлора у женщин

Инфекции могут возникнуть:

Бактериальные вагинозы (неспецифические вагиниты) - состояния, характеризуемые обильными зловонными влагалищными выделениями, связанными с выраженным увеличением числа Gard-nerella vaginalis и различных облигатных анаэробов и снижением числа влагалищных лактобактерий. Минимальный диагностический набор бактериального вагиноза включает четыре характерных признака:

Схема исследования у женщин

Прямое исследование и интерпретация результатов. Прямое микроскопическое исследование вагинального секрета - метод выбора для постановки этиологического диагноза при вагинитах, однако он менее информативен для диагностики цервицитов.

Готовят свежий мазок путем смешивания на предметном стекле вагинального секрета и 0,9% раствора натрия хлорида, после чего препарат накрывают сверху покровным стеклом. Предпочтение следует отдавать разведенным препаратам, позволяющим добиться отделения клеток друг от друга.

Для выявления T. vaginalis, почкующихся дрожжей и ключевых клеток применяют микроскопическое исследование с увеличением х40.

C. albicans могут формировать псевдомицелий, наблюдаемый иногда во влагалищном секрете. Ключевые клетки обнаруживают у большинства женщин с бактериальным вагинозом. Гранулы или посторонние включения в цитоплазме эпителиальных клеток (ложные ключевые клетки) - менее объективный критерий, чем «потеря» клеточной стенки. Микроскопировать свежий мазок из шейки матки не рекомендуют. Приготовление мазков, окрашенных по Граму, - метод выбора для диагностики бактериальных вагинозов. Мазок готовят путем осторожного прокатывания (а не размазывания!) тампона по предметному стеклу. В норме в вагинальном мазке содержатся преимущественно лактобактерии (палочка Дедерляйна) и не более 5 лейкоцитов в поле зрения. В типичных случаях бактериального вагиноза при микроскопии видны ключевые клетки, покрытые мелкими грамотрицательными палочками, сочетающиеся со смешанной микрофлорой из огромного числа мелких грамвариабельных и грамотрицательных палочек и коккобактерий при отсутствии более крупных грамположительных палочек. В поле зрения микроскопа обнаруживается большое количество (>5) лейкоцитов. Эта картина - чувствительный и специфический индикатор бактериального вагиноза.

Окраска мазка по Граму не особенно полезна для диагностики гонококковой инфекции у женщин. Чувствительность метода исследования окрашенного по Граму мазка эндоцервикального отделяемого для выявления интрацеллюлярных грамотрицательных диплококков в целях диагностики гонореи составляет 50-70%, а специфичность - 50-90%, что обусловливает невысокую диагностическую значимость положительных результатов при обследовании популяции с низкой распространенностью гонореи. Если в мазке цервикального отделяемого обнаруживают грамотрицательные интрацеллюлярные диплококки, именно так и сообщают лечащему врачу, не называя их гонококками. Следует избегать неправильной интерпретации результатов исследования мазков, полученных из шейки матки, в которых часто обнаруживаются грамотрицательные коккобактерии и биполярно окрашенные палочки. Исследование мазка из шейки матки наиболее информативно при выявлении слизисто-гнойных цервицитов: более 10 полиморфноядерных лейкоцитов в одном поле зрения микроскопа (с иммерсионной системой) -достаточно хороший индикатор слизисто-гнойного цервицита, чаще всего вызываемого гонококками и/или хламидиями.

Исследование окрашенного по Граму мазка из конъюнктивального мешка, - чувствительный и специфический метод диагностики конъюнктивита гонококковой этиологии. Грамотрицательные интрацеллюлярные диплококки - диагностический признак гонококкового конъюнктивита.

Культивирование. Материал, взятый из шейки матки, прямой кишки, мочеиспускательного канала, конъюнктивального мешка, подвергают культивированию на N. gonorrhoeae с использованием методов, описанных выше. Приступать к исследованию необходимо сразу же после поступления материала в лабораторию, предпочтительно начинать исследование непосредственно в клинике. Культивирование материала на гонококковую инфекцию у женщин - очень важный диагностический инструмент. Чувствительность метода культивирования материала из шейки матки для выявления гонореи составляет 80-90%. Чувствительность метода снижается, если материал для исследования взят во время менструации.

Культивировать материал на G. vaginalis или анаэробов в целях диагностики бактериальных вагинозов не рекомендуется, поскольку эти микроорганизмы обнаруживают у 20-40% женщин при отсутствии вагинальной инфекции. Обнаружение G. vaginalis в вагинальном секрете еще не служит показанием к лечению. Его следует назначать лишь тем больным, у которых выявлены другие диагностические признаки бактериального вагиноза.

По сравнению с методом микроскопического исследования метод культивирования позволяет увеличить частоту обнаружения C. albicans в 1,5-2 раза. Методы культивирования обычно более эффективны, когда материал содержит незначительное количество микроорганизмов. Вместе с тем немногочисленные C. albicans обнаруживают во влагалище 10-30% женщин с отсутствием расстройств или симптомов вагинита. Лишь большое количество C. albicans следует рассматривать как признак влагалищного кандидоза.

Посев клинического материала на специальную питательную среду Dobell-Laid-law (Bio-Rad) для выявления T. vaginalis, выполняемый в дополнение к исследованию свежего мазка, позволяет выявить бессимптомных носителей при повторном исследовании после инкубации.

В последнее время уделяется много внимания роли урогенитальных микоплазм в патогенезе уретральных инфекций. Примерно 15% сексуально активных мужчин и женщин колонизированы Micoplas-ma hominis и от 45 до 75% - Ureaplasma urealitica. Однако микоплазмы вызывают патологический процесс только при размножении в больших количествах.

Следовательно, интерпретация результатов требует не только идентификации, но и количественного определения (титрования) микоплазм в клиническом материале.

Микоплазмы - факультативные анаэробы, чрезвычайно требовательны к питательным средам. Для их культивирования в среде обязательно должны быть холестерол и другие факторы роста.

Оценка результатов при культивировании микроорганизмов из биологического образца. Обнаружение в амниотической жидкости любых микроорганизмов в монокультуре этиологически значимо. При этом особенно важны: Streptococcus agalactiae и S. pyogenes, L. monocytogenes, Capnocytophaga spp., E. coli, Gardnerella vaginalis, H. influenzae и H. parainfluenzae, N. gonorrhoeae.

При исследовании материала из протоков бартолиновой железы и абсцессов обнаружение ассоциации микроорганизмов из представителей нормальной микрофлоры при большом числе эпителиальных клеток и отсутствии в мазках по Граму лейкоцитов свидетельствует о некачественном образце. При выделении микроорганизмов в монокультуре учитывают количество (скудный, значительный, массивный рост), особое внимание уделяют S. aureus, N. gonorrhoeae, Е. coli, стрептококкам, G. vaginalis, H. influenzae. Для выявления Ch. trachomatis и U. urealyticum необходимы специальные исследования.

Обнаружение в материале из мочеиспускательного канала представителей микрофлоры кожи в чистой или смешанной культуре свидетельствует о контаминации образца. Обнаружение в образцах из мочеиспускательного канала и предстательной железы при скрининговых исследованиях V. gonorrhoeae, Ch. trachomatis и, возможно, U. urealyticum - основание для постановки диагноза. Заслуживает внимания выделение из мочеиспускательного канала грамотрицательных аэробных бактерий в чистой культуре (особенно Е. coli у гомосексуалистов), H. influenzae и Н. parainfluenzae.

При эпидидимите, абсцессах выделение представителей нормальной микрофлоры при наличии эпителиальных клеток и отсутствии лейкоцитов в мазках, окрашенных по Граму, диагностической ценности не имеет. Важно обнаружение в чистой культуре грамотрицательных бактерий, включая Pseudomonas spp. Другие бактериальные изоляты заслуживают внимания, если при микроскопии окрашенных по Граму мазков выявлены лейкоциты.

Забор, транспортировка и посев материала

Основные правила забора материала у женщин

Амниотическая жидкость. Жидкость собирают через катетер, либо аспирируют при кесаревом сечении, либо пунктируют плодный пузырь.

Мочеиспускательный канал. Отделяемое собирают стерильным ватным тампоном не ранее чем через 1 ч после мочеиспускания. Если отделяемое получить не удается, наружное отверстие мочеиспускательного канала обмывают мылом и ополаскивают кипяченой водой. Вводят в уретру тонкий стерильный уретральный тампон на глубину 2-4 см, аккуратно вращают его в течение 2 с, вынимают, помещают в соответствующую транспортную среду и доставляют в лабораторию.

Вульва, преддверие влагалища. Материал берут стерильным ватным тампоном. При воспалении бартолиновых желез их пунктируют.

Влагалище. Материал берут до мануальных исследований. После введения зеркала и подъемника во влагалище материал собирают стерильным ватным тампоном с заднего свода или с патологически измененных участков.

Цервикальный канал. Обнажают шейку матки с помощью зеркал и влагалищную ее часть тщательно обрабатывают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором натрия хлорида или стерильной водой. Тонкий стерильный ватный тампон осторожно вводят в цервикальный канал, не касаясь стенок влагалища, и берут материал. Для бактериологического исследования можно использовать соскоб слизистой оболочки, полученный при диагностическом выскабливании стенок цервикального канала.

Матка. Используют специальные инструменты. Материал из шприца помещают в стерильную пробирку.

Придатки матки. Материал из очага инфекции (гной, экссудат, кусочки ткани) получают при оперативном вмешательстве или при диагностической пункции опухолевидных образований, проводимой через влагалищные своды.

Приготовление мазков для микроскопии. Помимо взятия материала на посев, врач-гинеколог готовит мазки для микроскопии (не менее двух - для окраски по Граму и специальными методами), используя отдельные стерильные тампоны или стерильные гинекологические инструменты. Предметные стекла, предназначенные для приготовления мазков, маркируют. Материал равномерно распределяют на предметном стекле осторожными движениями, избегая грубого втирания и резких штриховых движений инструментом. Мазок высушивают при комнатной температуре, покрывают чистым предметным стеклом или помещают его в чашку Петри и отправляют в лабораторию. Не допускается хранение влажного мазка между двумя стеклами.

Отделяемое мочеиспускательного канала. Для взятия материала из мочеиспускательного канала используют или тампоны с очень узким аппликатором, или обычные тампоны, или стерильную бактериологическую петлю. Их вводят в мочеиспускательный канал на глубину 3-4 см, осторожно поворачивают и вынимают. Гнойные выделения могут быть собраны непосредственно тампоном или бактериологической петлей. Для исследования важен материал, полученный как с наконечника, так и со стержня аппликатора тампона.

Отделяемое влагалища и шейки матки.

Все материалы для анализов следует забирать во время гинекологического осмотра, используя гинекологическое зеркало. Зеркало перед манипуляцией можно смочить горячей водой, однако антисептики или кремы для гинекологического исследования применять нельзя, поскольку они могут вызвать гибель гонококков.

Для исследования на дрожжи, Trichomonas vaginalis и возбудителей бактериальных вагинозов влагалищный секрет может быть собран тампоном с задней стенки влагалища. Материал для исследования на гонококки и хламидии следует собирать со слизистой оболочки цервикального канала. После введения во влагалище гинекологического зеркала слизь с шейки матки следует промокнуть кусочком стерильной ваты. Затем специальный тампон вводят в цервикальный канал и осторожно поворачивают в нем в течение 10 с, затем вынимают.

Если немедленный посев на питательные среды и их инкубация невозможны, материал следует поместить в транспортные среды, такие как среды Амиеса или Стюарта. Время транспортировки должно быть как можно короче: при температуре окружающей среды 30 °C оно не должно превышать 12 ч. Следует избегать охлаждения материала. Транспортные среды Амиеса и Стюарта оптимальны для транспортировки материала, отобранного из шейки матки и влагалища, исключение составляет материал, предназначенный для исследования на Ch. trachomatis. При исследовании биологических материалов из цервикального канала и матки выделение ассоциации нормальных представителей вагинальной микрофлоры при отсутствии лейкоцитов свидетельствует о контаминации образца. Выделение монокультуры при лейкоцитах в мазках по Граму этиологически значимо. Обязательно исследование на гонококки. При необходимости проводят специальные исследования на выявление хламидийной, туберкулезной и герпетической инфекций.

При эндометрите этиологическими агентами могут быть Enterococcus spp., S. agalactiae, S. pyogenes, L. monocyto-genes, E. coli, G. vaginalis, H. influenzae, N. gonorrhoeae, Klebsiella spp. и другие аэробные грамотрицательные бактерии (при этом существенно выделение монокультуры в значительном количестве и лейкоцитов в мазках по Граму), а также грамположительные и грамотрицательные неспорообразующие анаэробы. У женщин с внутриматочными средствами контрацепции, а также с иммунодефицитными состояниями возрастает роль актиномицетов. Для обнаружения Ch. tra-chomatis проводят специальное исследование.

При сальпингитах, воспалительных заболеваниях органов малого таза могут иметь значение Enterococcus spp., S. aureus, S. agalactiae (и другие стрептококки), E. coli, H. influenzae, G. vaginalis, N. gonorrhoeae, Bacteroides spp., Prevotella spp., актиномицеты (при иммунодефицитах), Ch. trachomatis.

В материалах из мочеиспускательного канала обнаружение ассоциаций аэробных микроорганизмов из представителей нормальной микрофлоры кожи, фекалий, влагалища при отсутствии в мазках по Граму лейкоцитов свидетельствует о контаминации образца. При уретрите чаще встречаются N. gonorrhoeae, Ch. tra-chomatis и Е. coli.

При исследовании материала из влагалища важно сопоставление результатов посева с мазками по Граму. Обнаружение морфологически разных микроорганизмов, в том числе G. vaginalis, при отсутствии лейкоцитов и при большом количестве эпителиальных клеток отражает нормальную микрофлору влагалища. Обнаружение в мазке из влагалища так называемых ключевых клеток вместе с грамотрицательными короткими и изогнутыми палочками и кокками при отсутствии или крайне незначительном количестве лактобактерий позволяет в случае соответствующей клинической картины диагностировать бактериальный вагиноз. Выявление при вульвовагините большого количества дрожжеподобных грибов даже при наличии смешанных аэробных бактериальных культур позволяет диагностировать кандидозную инфекцию.

L. monocytogenes может быть выделена из половых путей в послеродовом периоде при листериозной инфекции.

Обнаружение в отделяемом из влагалища Capnocytophaga spp. в чистой культуре или в преобладающем количестве в смешанной культуре при лейкоцитах в мазке, окрашенном по Граму, этиологически значимо. Для определения трихомонадной и гонококковой этиологии вагинита проводят соответствующие целенаправленные исследования.

Основные правила забора материала у мужчин

Мочеиспускательный канал. Материал собирают не ранее 2 ч после мочеиспускания. В уретру вводят тонкий стерильный ватный тампон на глубину 2-4 см, аккуратно вращают его в течение 1-2 с, вынимают, помещают в транспортную среду и доставляют в лабораторию. При уретритах массаж предстательной железы не приводит к увеличению уровня выделения гонококков или хламидий.

Предстательная железа. Предстательную железу массируют через прямую кишку. Материал собирают в стерильную пробирку или стерильным ватным тампоном. Для получения более достоверных результатов можно дополнить это исследование бактериологическим исследованием мочи, полученной перед массажем предстательной железы и сразу после него, что позволит выявить источник инфекции. Основным методом лабораторной диагностики простатита, позволяющим определить локализацию очага инфекции, служит метод Мирза-Стейми (Meares-Stamey): исследованию подвергают первую и среднюю порции мочи, секрет предстательной железы и порцию мочи, полученные после массажа предстательной железы (так называемая четырехстаканная проба). При симптомах острого простатита массаж предстательной железы не проводят.

Придатки яичек. Материал собирают путем аспирации с помощью шприца и иглы.

Язва полового члена. Очищают поверхность язвы тампоном, смоченным 0,9% раствором натрия хлорида. Делают соскоб язвы до появления серозной жидкости. Стерильной салфеткой удаляют жидкость и органические наслоения. (Следует избегать кровоточивости.) Надавливают у основания язвы до появления прозрачной жидкости, аспирируют ее шприцем с тонкой иглой, закрывают иглу защитным колпачком и транспортируют в лабораторию.

В клинической практике инфекции ЦНС наблюдаются сравнительно редко. Большинство из них протекают тяжело и вызывают серьезные осложнения. Во многом тяжесть поражений обусловлена специфичностью строения и свойствами самих тканей ЦНС, а также особенностями их анатомического расположения. В зависимости от локализации, инфекции ЦНС разделяют на энцефалиты (поражения паренхимы органов ЦНС), менингиты (поражения мозговых оболочек) и миелиты (поражения тканей спинного мозга).

Исследование спинномозговой жидкости (СМЖ) необходимо проводить в случаях, подозрительных на менингит, а также при коматозных состояниях и неврологических симптомах неясного генеза.

Наиболее часто из СМЖ выделяют следующие патогены:

В табл. 2-7 представлены основные возбудители бактериальных и грибковых менингитов.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые патогены ЦНС разделены по уровням приоритета.

Нормальная микрофлора

В норме СМЖ стерильна.

Схема исследования

Время проведения исследования до получения отрицательного результата - от 24 ч до 6 дней.

На рис. 2-6 приведен современный протокол микробиологического исследования при поражении органов ЦНС.

Оценка результатов

В подавляющем большинстве случаев выделение микроорганизмов из СМЖ свидетельствует об их этиологической роли.

Правила взятия спинномозговой жидкости у взрослых для бактериологического исследования

Материал берет врач до начала антибактериальной терапии. Место пункции обрабатывают антисептиком (обычно йодсодержащим) и 70% этанолом. Иглу с мандреном вводят между поясничными позвонками (L_3- L₄ , L_4- L₅ ) или пояснично-крестцовыми (L_5- S₁ ). Достигнув субарахноидального пространства, удаляют мандрен, и СМЖ появляется на конце иглы.

Медленно набирают СМЖ в стерильные, герметично закрывающиеся пробирки. Обычно используют три пробирки - для микробиологического, клинического и биохимического анализов. Для микробиологического анализа присылают вторую пробирку или пробирку с самым мутным содержимым в объеме от 1 (для исследования на аэробные бактерии) до 2 мл (для исследования на грибы и микобактерии) и более (для исследования на анаэробы).

СМЖ незамедлительно доставляют в лабораторию, где сразу подвергают анализу. При невозможности своевременной доставки сохраняют при температуре 37 °C в течение нескольких часов. Необходимо избегать охлаждения СМЖ, поэтому для ее пересылки используют любую упаковку, где поддерживается температура около 37 °C. Такой температурный режим необходим в связи с тем, что охлаждение СМЖ ниже 30 °C ведет к гибели менингококков.

Отделяемое из глаз

Показания: гнойно-воспалительные заболевания органов зрения.

Время проведения исследования до получения отрицательного результата составляет 24-72 ч. Возбудителями гнойно-воспалительных процессов чаще бывают S. aureus, S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, M. lacunata, Ch. trachomatis и др.

Оценка результатов

Выделение из патологического материала истинно патогенных микроорганизмов свидетельствует об их этиологической роли в данном процессе. Обнаружение же оппортунистических микроорганизмов может расцениваться и как этиологический агент, и как показатель высокой степени риска развития воспалительного процесса в ближайшем будущем.

Отделяемое из ушей

Показания: гнойно-воспалительные заболевания органов слуха.

Время проведения исследования до получения отрицательного результата составляет от 24 ч до 5 дней. Возбудители гнойно-воспалительных процессов: S. aureus, P. aeruginosa, M. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, Bacteroides spp., F. nucleatum, Peptostreptococcus spp., Streptococcus группы A, грибы и вирусы.

Оценка результатов

При острых воспалительных процессах высевают в большом количестве монокультуры микроорганизмов, этиологическая значимость которых обычно не вызывает сомнений. Более трудна интерпретация результатов при хронических воспалительных процессах, когда высеваются ассоциации бактерий. В таких случаях важна количественная оценка роста различных видов микроорганизмов в ассоциации, поскольку преобладающему количественно микроорганизму обычно принадлежит ведущая роль в этиологии инфекционного процесса.

Методы выделения, идентификации и определения чувствительности к антибиотикам указанных выше микроорганизмов аналогичны тем, что описаны в других разделах данной главы.

Правила взятия отделяемого из ушей и глаз у взрослых

Отделяемое глаза. Забирает в процедурном кабинете медперсонал. Материал собирают платиновой петлей с внутренней поверхности нижнего или верхнего века, с переходной складки конъюнктивы и сразу производят посев на стерильный питательный бульон. Когда секреция обильная, пользуются стерильным ватным тампоном. При поражении края век корочки удаляют пинцетом и берут материал из язвочек у основания ресниц. При поражении слезных мешков выделяемый при массаже секрет берут петлей или стерильным ватным тампоном.

Отделяемое уха. Для забора стерильный ватный тампон вводят в слуховой канал. При скудном секрете используют стерильную марлевую салфетку, после пропитывания секретом ее помещают в пробирку со стерильным питательным бульоном.

Жидкость при тимпаноцентезе. Исследуют при среднем отите в случаях, если первичная терапия оказалась безуспешной или если тимпаноцентез проводили как лечебную процедуру.

Наружный слуховой проход очищают слабым раствором детергента, после прокола барабанной перепонки врач-оториноларинголог шприцем собирает жидкость и помещает ее в стерильный контейнер или отправляет в лабораторию в шприце с загнутой иглой или с защитным колпачком. При невозможности своевременной доставки целесообразно использовать транспортную среду.

При самопроизвольной перфорации барабанной перепонки экссудат собирают стерильным тампоном, используя слуховое зеркало. Однако в этом случае высока вероятность контаминации биологического материала эндогенной микрофлорой.

Материал при воспалении наружного уха. Обрабатывают кожу 70% этанолом и промывают стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Материал из очага берут стерильным ватным тампоном.

Частоту возникновения инфекционных осложнений у хирургических больных обусловливают разнообразные эндогенные и экзогенные факторы. К эндогенным относят состояние иммунитета пациента и его аутофлоры; к экзогенным - физические, химические характеристики окружающей среды, обсемененность ее объектов и гигиенический режим, поддерживаемый в стационаре. Один из самых распространенных инфекционных процессов - продукция гнойного (иногда серозно-гнойного) экссудата в результате бактериального инфицирования полости, ткани или органа тела. Такие инфекции могут проявляться в виде достаточно простых и безобидных папул или множества абсцессов в одном или нескольких анатомических участках. Экссудат состоит преимущественно из полиморфноядерных лейкоцитов, инородных микроорганизмов и смеси транссудата с фибрином. В одних случаях экссудат может накапливаться в межклеточном пространстве в пределах ткани (фурункул или подкожный нарыв), в других случаях он образуется в связи с открытыми ранами, из которых вытекают мутная жидкость или гной. Как анатомические участки, вовлеченные в экссудативные процессы, так и микроорганизмы, вызывающие эти процессы, весьма разнообразны.

Возбудители вирусных инфекций, в отличие от грибов и бактерий, очень редко продуцируют гнойный экссудат.

Взаимосвязь между лечащим врачом и врачом-бактериологом особенно важна при постановке диагноза и выборе тактики лечения больного при заболеваниях, сопровождаемых гнойной инфекцией. Бактериолог должен сотрудничать с клиницистом для обеспечения забора материала по всем правилам и его незамедлительной доставки в лабораторию для проведения необходимых исследований.

Приоритетность патогенов

Согласно рекомендациям ВОЗ, наиболее часто встречаемые патогены разделены по уровням приоритета.

Схема исследования

На рис. 2-7 приведен современный протокол микробиологического исследования раневого отделяемого.

Оценка результатов

Выделенные микроорганизмы - этиологические агенты воспалительного процесса. При выделении ассоциации микроорганизмов из раневого отделяемого и выпотной жидкости ведущее значение в гнойно-воспалительном процессе следует отдавать количественно преобладающим видам. В лаборатории должна быть подсчитана степень обсемененности исследуемого материала. Показано, что уровень обсемененности тканей в ране более 10⁵ КОЕ/г - критический. Его превышение указывает на возможность генерализации инфекционного процесса. Аналогичного критерия для выпотов пока не найдено.

Хирургический материал

Хирургический материал может быть получен при пункции местных абсцессов или во время других хирургических процедур. Хирургу следует посоветовать отбирать несколько маленьких кусочков различных тканей и имеющиеся образцы гнойного экссудата. При возможности не следует пользоваться ватным тампоном. Экссудат необходимо отбирать стерильным шприцем с иглой. Если использован ватный тампон, следует отбирать как можно больше экссудата и поместить тампон в соответствующую емкость для отправки в лабораторию.

Некоторые примеры клинических состояний и обнаруживаемые при этом микроорганизмы в различных образцах хирургического материала приведены ниже.

Дополнительно материал исследуют на стафилококки, стрептококки и грамотрицательные кишечные бактерии.

Макроскопическое исследование

Провести оценку образцов гноя или отделяемого ран, отобранных с помощью тампона, очень трудно, особенно при помещении тампонов в транспортную среду. Если же образцы гноя получены в стерильной емкости или шприце, бактериологу следует внимательно исследовать их для выявления особенностей цвета, консистенции и запаха.

Цвет. Цветовая гамма гноя может варьировать от желто-зеленого до красно-коричневого. Красный цвет - обычно следствие наличия крови или гемоглобина. Пунктат из первичного амебиазного печеночного абсцесса имеет светлоили темно-коричневый цвет и желатинообразную консистенцию. Гной из послеоперационных или травматических ран (ожогов) может быть окрашен в зелено-голубой цвет пигментом пиоцианином, вырабатываемым синегнойной палочкой.

Консистенция. Консистенция гноя варьирует от очень жидкой до очень густой и клейкой. Экссудаты, полученные из суставов, плевральной полости, перикардиального мешка или брюшины, обычно жидкие, с градацией от серозных до гнойных.

Гной, полученный из дренажа свищей шейной области, необходимо исследовать на маленькие желтые гранулы «серы» - колонии Actinomyces israelii. Серые гранулы позволяют предположить диагноз шейно-лицевого актиномикоза. Мелкие гранулы различного цвета (белого, черного, красного или коричневого) типичны для мицетомы - гранулематозной опухоли, обычно поражающей нижние конечности (так называемой мадурской стопы) и характеризуемой множественными абсцессами и самодренирующимися свищами. Цвет гранул определяется волокнистыми бактериями или мицелиальными грибами.

Гной из туберкулезного «холодного» абсцесса (с несколькими характерными признаками воспаления) иногда сравнивают с мягким сыром и называют казеиновым гноем.

Запах. Отвратительный фекальный запах - один из главных характерных признаков анаэробной или смешанной инфекции, хотя этого бывает недостаточно в некоторых случаях. О характерном запахе вместе с результатами микроскопии мазка, окрашенного по Граму, бактериолог должен сразу же сообщить лечащему врачу, поскольку это может повлиять на выбор схемы эмпирической антибактериальной терапии.

Микроскопическое исследование

Каждый образец следует окрашивать по Граму и микроскопировать.

Окраска по Граму. Приготовленный мазок микроскопируют в иммерсионном масле, используя объектив х100. Внимательно просматривают мазок, отмечая наличие и количество (обозначая +) такие клетки, как:

Серные гранулы актиномицетов или гранулы мицетомы должны быть раздавлены на стекле, окрашены по Граму и исследованы на наличие тонких фрагментарных грамположительных волокон.

Прямая микроскопия. По требованию лечащего врача или когда есть основания предполагать грибковую или паразитарную инфекцию, следует проводить микроскопию нативного материала. Когда исследуют гной на наличие грибов, его смешивают с каплей 10% калия гидроксида.

Сверху материал покрывают покровным стеклом и, используя объектив х10 и х40, внимательно исследуют:

Материал при раневой инфекции

Не представляется возможным описать в данном разделе детали методики взятия материала из каждого типа раны, абсцесса и т. д. Ясно, что эта задача требует тесного сотрудничества лаборатории и клинического отделения. Часто это единственная возможность получить материал для исследования,поскольку во многих случаях повторного материала для исследования просто не будет. В связи с этим выполненное по всем правилам взятие материала, его транспортировка и хранение чрезвычайно важны, и каких-либо отступлений от принятой процедуры следует избегать.

Абсцессы. В случае обнаружения абсцесса хирургу или лечащему врачу следует проконсультироваться с врачом-бактериологом для согласования дальнейших действий. Техника забора гноя и кусочков ткани из абсцесса аналогична применяемой при хирургической операции. Максимальное количество гнойного материала следует забирать шприцем, взятый материал переносить в стерильную емкость в асептических условиях. Если стерильной емкости не оказалось, материал может быть оставлен в шприце с закрытой колпачком иглой. В этом случае сам шприц доставляют в лабораторию.

Следует принять меры к недопущению забора малого количества материала с помощью тампона, если в действительности объем экссудата велик. В виде исключения тампон может быть использован для сбора гноя при скудном его количестве или при отборе гноя из анатомической области, требующей обращения с особой осторожностью, например, из глаза. После получения кусочки ткани из области абсцесса необходимо измельчить в маленьком объеме стерильного бульона, используя для этого стерильные ножницы.

Инфицированные рваные, проникающие ранения, послеоперационные раны, ожоги, пролежни. После тщательной обработки операционного поля хирург определяет места, где скапливается гной, расположены некротические ткани, выделяется газ (крепитация) или наблюдаются другие признаки инфекции. Частицы пораженных тканей, предназначенные для лабораторного исследования, помещают в стерильную марлю и затем в стерильную емкость. Гной или другой экссудат должен быть аккуратно собран и помещен в стерильную пробирку. При необходимости могут быть использованы тампоны.

Свищи или отделяемое лимфатических узлов. Если свищи или воспаленные лимфатические узлы самопроизвольно дренируются, материал должен быть тщательно собран с помощью стерильной пастеровской пипетки с резиновой грушей и помещен в стерильную пробирку. Если самопроизвольного дренирования нет, хирургу следует получить материал, используя стерильный шприц с иглой или зонд. Использования тампона следует избегать.

Бактериологическое исследование жидкости из стерильных в норме полостей

Исследуют суставную, плевральную, перитонеальную и перикардиальную жидкости. Чрескожную пункцию и аспирацию жидкости производит врач. Кожу в области пункции обрабатывают 70% этанолом, а затем 1-2% раствором йода + (калия йодид + этанол), который после завершения процедуры удаляют 70% этанолом для предотвращения ожога кожи.

Попавшие в шприц пузырьки воздуха удаляют и помещают жидкость в анаэробную транспортную систему или отправляют ее в шприце, предварительно загнув иглу или надев на канюлю шприца защитный стерильный колпачок. Избыток жидкости или гной транспортируют в стерильных контейнерах с завинчивающейся крышкой.

При достаточном количестве жидкости можно проводить посев во флаконы со средой для гемокультур в объемном соотношении 1:5-1:10. Однако в этом случае невозможна прямая бактериоскопия материала, а сроки идентификации удлиняются на сутки в сравнении с изолятами, выделенными при первичных посевах на плотные среды.

Минимальный объем жидкости для выделения бактерий - 1-5 мл, для выделения грибов или микобактерий - желательно не менее 10 мл.

Взятие материала тампоном не предохраняет анаэробы от воздействия кислорода воздуха, не позволяет приготовить качественный препарат для микроскопии, не гарантирует выделение культуры при незначительном количестве микроорганизмов в образце. Не рекомендуется использовать антикоагулянты (натрия цитрат, этилендиаминтетрауксусную кислоту), подавляющие рост некоторых видов бактерий (при необходимости лучше использовать гепарин).

Молекулярная клиническая диагностика - наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает определение генов и продуктов их деятельности - протеинов и нуклеиновых кислот. Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 1970 гг. после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии. Этому способствовали, во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определенными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузернблотта), названного так по фамилии ученого, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК). И, наконец, еще одним критическим научным событием стало открытие в 1985 г. метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту - уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии: насколько тождественны понятия «НК» и «возбудитель»? С точки зрения общей микробиологии, это неравнозначные понятия, так как возбудитель - сложная биологическая система, включающая НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Однако при этом НК не может обойтись без этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Именно поэтому с позиции клинической медицины определение НК служит эквивалентом обнаружения/необнаружения возбудителя в объекте исследования.

Внедрение в практику метода ПЦР наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или культура клеток.

Традиционный для микробиологических лабораторий культуральный метод диагностики, как правило, хорошо оправдывает себя для выявления и исследования таких свойств, как чувствительность к антибиотикам, вирулентность легкокультивируемых микроорганизмов. Однако некоторые микроорганизмы (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) могут быть чрезвычайно чувствительными к условиям забора клинического материала, транспортировки и культивирования, наличию специальных факторов роста или способны к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии).

Медленный рост на искусственных средах таких микроорганизмов, как мико-бактерии и грибы, - еще одно естественное ограничение культурального метода для диагностики этих микроорганизмов. Кроме того, работа с живыми культурами выделенных возбудителей, причем не только особо опасных, но иногда и условно-патогенных, может быть опасна для здоровья персонала лаборатории.

Среди возбудителей болезней человека известны и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита C, попытки выращивания которых в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов.

Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов: выявлении специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.

Когда использование культуральных методов проблематично или связано с недостаточной диагностической эффективностью, замена биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) ферментативным удвоением нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР особенно привлекательна. Есть различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций.

Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia tracho-matis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления Ch. trachomatis.

Принцип метода полимеразной цепной реакции

ПЦР - искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК in vitro. ДНК при ПЦР копируется специальным ферментом - ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную последовательность ДНК. Для начала синтеза цепи ДНК-полимеразе необходима РНК-затравка (праймер), к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров узнавать строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые ограничивают амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов.

Смена этапов каждого цикла производится путем изменения температуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле, т. е. растет с числом циклов экспоненциально. В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяют для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают стабильно воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.

Для ПЦР используют приборы (термоциклеры), которые изменяют температуру автоматически, на основе заданной программы. В термоциклерах пробирки с реакционной смесью помещают в металлический блок, температура которого изменяется с помощью элемента Пельтье. Элемент Пельтье позволяет изменять температуру блока с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.

В современных термоциклерах применяют специальные тонкостенные пластиковые пробирки для реакционной смеси, что ускоряет теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сокращает время проведения реакции.

Стандартная ПЦР может быть проведена за 1-3 ч. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций ПЦР.

Параллельно с усовершенствованием технологии ПЦР развивались и методы анализа продуктов реакции. Метод гель-электрофореза с последующей визуализацией специфичным к ДНК красителем, например этидием бромидом, традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера.

Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности автоматизации анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все более распространенным. В некоторых случаях применение специальных флюоресцентных маркеров позволяет контролировать проведение амплификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредственно в реакционной пробирке.

Преимущества полимеразной цепной реакции как метода диагностики

Один из критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа - показатель чувствительности. Следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность применительно к ПЦР - минимальное количество копий (геномных эквивалентов - г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, определяемое данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценивается в процентах. Есть общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем, - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95-98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности - специфичность - определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высокой специфичностью, достигающей 99-100%.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят обеспечиваемые культуральным методом, служащим «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущества метода ПЦР несомненны. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР - от 90 до 100%.

Как видно, ПЦР по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и малым временем анализа, т. е. актуальностью получения результата исследования врачом и пациентом. Приведенные выше факты позволили установить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики.

Несмотря на вышеуказанные достоинства, метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований. В настоящее время выделяют следующие.

Один из них - технологический. Метод ПЦР подразумевает высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР, государственный сертификат.

Второй недостаток - клинический, заключающийся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт часто служит необоснованным аргументом практических врачей для сомнений в полученном результате и эффективности самого метода. Поясним на примере. Показано, что только у 40-60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий - «инфицированность» и «инфекционная болезнь».

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.

Возможности применения метода полимеразной цепной реакции в диагностике инфекционных заболеваний

В случаях проблематичности использования культуральных методов или их недостаточной диагностической эффективности возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) ферментативным удвоением нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР особенно привлекательна. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления Ch. trachomatis.

Есть возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR).

Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (Ch. tra-chomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или четырех ( H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis и A. otitidis при хроническом гнойном отите) возбудителей.

Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего служат рибосомные гены (16S и 23S рРНК) сходной структуры различных прокариотических микроорганизмов.

Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных методов в целях идентификации бактерий, к которым они принадлежат. Наиболее точный метод молекулярной идентификации - определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов.

Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих этот принцип, на практике применяются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, позволяющие достоверно выявлять различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространены метод анализа расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами [метод ПДРФ (RFLP) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов] и метод определения электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP - одноцепочечный конформационный полиморфизм).

ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить, что чувствительность ПЦР широкого спектра, как правило, ниже по сравнению с видоспецифическими тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов.

Методы молекулярного типирования микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

ПЦР широко используется не только для диагностики и идентификации, но и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием) генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. Описано много методов генотипирования, производных от технологии ПЦР (табл. 2-8). На практике выбор определенного метода зависит от характера и целей проводимого эпидемиологического исследования с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации, необходимости сравнения результатов с данными, полученными из других источников, а также от возможностей конкретной лаборатории. Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, в большинстве из них применяется гель-электрофорез для разделения фрагментов ДНК разной длины, полученных от каждого штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов.

Использование полимеразной цепной реакции для выявления лекарственной устойчивости у микроорганизмов

В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности, для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам.

Пояснения: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - амплификация произвольных участков ДНК; AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) - ПЦР произвольных участков (см. RAPD); Rep-PCR (Repetitive PCR) - ПЦР, основанная на повторяющихся последовательностях; ERIC-PCR (Bnterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) - повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий - ПЦР; ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов; PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов - ПЦР; AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ).

Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов целесообразно, когда традиционные методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антибактериальных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости M. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности (табл. 2-9).

Для подобного анализа обычно используется ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях есть возможность прямого ПЦР-анализа на антибиотикорезистентность без предварительного культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНК-мишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу в целях выявления мутаций,связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например, метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину.

¹ Цефалоспорины III поколения (цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон и т. д.).

² Обратно транскриптазная ПЦР - метод обнаружения специфической РНК путем создания ее ДНК-копии и последующей амплификацией с помощью ПЦР.

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) - одноцепочечный конформационный полиморфизм. ОТ-ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией.

Есть, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов:

Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизма в целом.

Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по использованию ПЦР для определения чувствительности к антибактериальным препаратам служит дополнительным фактором, ограничивающим широкое применение этого подхода в практической диагностике.

Преимущества и недостатки метода полимеразной цепной реакции

О многих преимуществах использования ПЦР по сравнению с традиционными микробиологическими методами уже сказано. Такие свойства ПЦР, как скорость и высокая производительность (то есть возможность параллельного анализа большого количества образцов), - бесспорные преимущества этого метода. Стандартные процедуры выделения ДНК микроорганизмов из клинического материала или чистой культуры и последующей ПЦР-амплификации обычно требуют не более нескольких часов. Продукты ПЦР могут быть идентифицированы с помощью простых методов (гель-электрофореза, гибридизации) приблизительно за то же время.

Таким образом, весь процесс ПЦР-анализа - от момента поступления образца в лабораторию до получения конечного результата - занимает обычно не более одного рабочего дня. Преимущество ПЦР в скорости по сравнению с культуральными методами особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинорезистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных методов требуют не менее 3-5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки.

Важное свойство ПЦР - ее высокая специфичность, определяемая прежде всего уникальностью генетического материала каждого вида микроорганизмов. По этой причине при использовании праймеров, комплементарных определенной видоспецифической последовательности ДНК, и соблюдении оптимального температурного режима многократному копированию подвергается только ДНК искомого вида даже в присутствии большого количества другой, балластной ДНК, например, ДНК человека или других видов микроорганизмов.

При использовании ПЦР для выявления определенного возбудителя специфичность составляет несомненное достоинство этого метода. С другой стороны, всегда следует помнить об узкой направленности ПЦР в отличие от культуральных методов, которые позволяют выявить рост различных видов микроорганизмов при посеве на первичные накопительные среды.

Помимо высокой оперативности и специфичности, ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК/ РНК-последовательности в исследуемом материале. Если в качестве мишени для ПЦР используется фрагмент ДНК, представленный большим количеством копий в геноме возбудителя (например, гены 16S рРНК у многих видов бактерий), то ПЦР позволяет обнаружить менее одного микроорганизма в образце (то есть фрагмент ДНК из лизированной клетки).

Следовательно, чувствительность порядка 0,5-1 микроорганизма на пробу вполне возможна для ПЦР, что позволяет использовать ее в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого титра микроорганизмов (например, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций).

В то же время экстремальная чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кала и материала, полученного из верхних дыхательных путей и половых органов).

Экстремальная чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК - одновременно и ахиллесова пята технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению посторонними молекулами ДНК, которые могут послужить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта и ложноположительному результату.

Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частый - контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В результате ПЦР в каждой реакционной пробирке может образовываться более миллиарда копий исходной последовательности ДНК, каждая из которых, в свою очередь, служит потенциальной мишенью для последующей амплификации. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля (при открывании реакционных пробирок), через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы и приводя к ложноположительному результату анализа образцов, в которых исходно отсутствовала ДНК искомого возбудителя.

В случае высокой концентрации ДНК микроорганизмов в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой, например, через поверхность перчаток при открывании пробирок с образцами или через приспособления для механической гомогенизации тканей.

При использовании ПЦР с универсальными праймерами (см. выше) источником загрязняющей ДНК могут служить коммерческие препараты ДНК-полимераз и других реактивов, применяемых в ПЦР.

В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения.

Одно из наиболее существенных требований к диагностическим ПЦР-лабораториям - необходимость разделения лаборатории на так называемые пред-ПЦР-помещения, где осуществляются обработка образцов и приготовление реакционных смесей, и после-ПЦР-помещения, где анализируются продукты реакции. Обязательны раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах ПЦР, максимальное использование одноразовых пластиковых материалов на этапе, предшествующем амплификации, и регулярная обработка помещений ультрафиолетовым (УФ) излучением, повреждающим загрязняющие последовательности ДНК.

Дополнительные меры: использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацил-гликозилаза) и физико-химические (УФ-излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами.

Помимо опасности получения ложно-положительных результатов, есть и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого бывают ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важная из которых - ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может свидетельствовать о присутствии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Серьезная проблема - выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. Пока нет универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие автоматизацию, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать ДНК микроорганизмов для ПЦР-анализа, трудоемки и могут увеличивать риск контаминирования образцов.

Наконец, ПЦР - дорогостоящее исследование. Для его реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходных материалов. Именно поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами.

Применение метода масс-спектрометрии в медицинской микробиологии

Анализ микроорганизмов с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии на данный момент - самое бурно развивающееся направление в этой области. Использование специальных условий позволяет регистрировать масс-спектры молекул преимущественно белковой природы, что наиболее ценно: белки хорошо представлены в клетке в количественном отношении и вместе с тем характеризуются определенной изменчивостью. Этот подход подразумевает прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции лизата клетки микроорганизма и исключает выделение и очистку отдельных белков, что находит отражение в названии «прямое белковое профилирование».

Масс-спектрометрия высокопроизводительна, высокочувствительна и практически на 100% специфична, имеет непревзойденную скорость анализа. Эта технология, несомненно, открывает новую эру диагностики.

Что же такое MALDI-TOF масс-спектрометрия? Ниже даны описания ключевых терминов.

Масс-спектрометр - прибор, способный в условиях вакуума разделять находящиеся в газовой фазе заряженные частицы вещества согласно отношению их массы к заряду.

Общие принципы анализа с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии

Для получения масс-спектра нужно превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией. Второе необходимое условие - перевод ионов в газовую фазу в вакуумной части масс-спектрометра. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра.

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс-спектрометрического анализа - сортировка ионов по массам.

Скорость разогнанных ионов прямо пропорциональна их массе. Ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточную кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. На входе в это пространство у всех ионов кинетическая энергия одинакова. Следовательно, согласно формуле для кинетической энергии (E=mv² /2), ионы в зависимости от массы будут двигаться с разными скоростями и в разное время достигнут детектора. Зарегистрировав ионы, можно измерить время пролета и подсчитать их массу. Основное преимущество метода - работа с очень широким диапазоном масс, то есть легко измерять массы как очень больших, так и маленьких молекул.

Прямое белковое профилирование предполагает масс-спектрометрическое исследование кислого экстракта бактериальной клетки, используя а-циано-4-гидроксикоричную кислоту в качестве МАЛДИ-матрицы. При таких условиях анализируют преимущественно рибосомальные белки, наиболее консервативные в пределах вида микроорганизма. Сопоставление масс-спектров позволяет проводить идентификацию/классификацию микроорганизмов.

Таким образом, методика идентификации микроорганизмов на MALDI-TOF-анализаторе состоит из двух этапов.

Таким образом, на идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2 мин времени, при этом образцом может служить первичная колония! База данных анализатора, как правило, состоит из клинически значимых видов микроорганизмов (бактерий, дрожжей, плесневых грибов, дерматофитов, микобактерий) и покрывает большинство видов, встречающихся в ежедневной практике микробиологической лаборатории, и эта база постоянно пополняется.

Области применения MALDI-TOF масс-спектрометрии

Заключение

Клиницисту следует помнить, что качество микробиологической диагностики зависит не только от выбранного метода исследования и его характеристик, но и от соблюдения всех правил преаналитического этапа исследования (сбора, транспортировки клинического материала, правил его хранения), а также от знаний и квалификации специалиста, проводящего оценку и интерпретацию результатов исследования на постаналитическом этапе. Улучшение работы специалистов, ответственных за выполнение данных этапов исследования, - одна из наиболее перспективных возможностей повышения качества микробиологического исследования в целом. Наряду с общими принципами исследования биологических проб, есть специфические особенности анализа различных видов клинического материала и выделения микроорганизмов, что требует глубоких знаний в этой области как у микробиологов, так и у клиницистов.

При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой во избежание ошибочного заключения. Чистые культуры выделяют общепринятыми методами. Ключевой фактор успеха идентификации - качество питательных сред, используемых для первичного посева биоматериалов.

Дифференциация и идентификация возбудителей - определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов - осуществляется на основании изучения комплекса морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных свойств.

Результат идентификации в традиционных исследованиях получают не ранее 4-7 сут. На современном уровне быстрый и точный результат может быть получен при использовании готовых микрообъемных слайд-тестов и тест-систем для идентификации микроорганизмов. Слайд-тесты для биохимической идентификации - это готовые к использованию полистероловые планшеты или панели с сухими дифференциальными средами, или субстратами.

В одних системах субстраты находятся в ячейках (лунках), в других - в шаблонах-носителях.

Тест-наборы Микро-ЛА-Тест содержат одновременно 7-24 субстратов для идентификации энтеробактерий и вибрионов, стафилококков, стрептококков, энтерококков, неферментирующих грамотрицательных бактерий, анаэробов, нейссерий. УРЕ-АШПтест предназначен для быстрого выявления Н. pylori в биоптатах. Для быстрого определения бета-лактамазной активности используется бета-ЛАКТАМ-тест.

Кроме тест-систем дополнительно к планшетным рекомендуются диагностические полоски (они же могут быть использованы самостоятельно как идентификационные): тест-полоски на оксидазу (ОКСИтест), бета-галактозидазу (ОНПтест), гиппурат (ГИППУРАТтест), ацетоин (ВПтест), пирролидонилариламидазу (ПИРАтест). Полоски КОЛИтест и САЛМтест предназначены для быстрой идентификации кишечной палочки и сальмонелл соответственно.

Диагностические диски позволяют проводить селективную изоляцию и дифференциацию бактерий путем выявления роста прямо на питательной среде. Это диски Бацитрацин 10 ЕД, Бацитрацин S, Оптохин, Новобиоцин, V+К (ВанкомициH⁺ Колистин), Х-фактор (гемин), V-фактор (НАД), X+V фактор (гемиH⁺ НАД).

Использование МИКРО-ЛА-ТЕСТОВ существенно упрощает и стандартизирует ежедневную рутинную работу микробиологических лабораторий. Достаточно эффективны для идентификации различных микроорганизмов в течение 3-48 ч и другие зарубежные диагностические системы API, ID, BBL Crystal, MicroScan и MicroTax.

Для биохимической идентификации энтеробактерий используются также отечественные микротесты ММТ Е1 и Е2, МТС-М-12Е (для ускоренной, в течение 5 ч, идентификации - наборы Рапид Энтеро, индикаторные диагностические пластины ПБДЕ, для идентификации стафилококков - тест-системы ПБДС, коринебактерий - ММТ D, вибрионов - ММТ V).

После добавления суспензий исследуемых микроорганизмов субстраты растворяются. При инкубации в ячейках (лунках) происходят биохимические реакции, результаты которых регистрируются визуально по изменению цвета индикатора или после добавления реактива, либо автоматически с помощью фотометрии.

По результатам первичного посева и данных микроскопии проводится дифференциация культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки. Для идентификации грамположительных кокков на основании характера роста на кровяном агаре, данных морфологии и наличия каталазной активности используются тест-системы СТАФИтест 16, СТРЕПТОтест 16 или ЭН-КОККУСтест.

Система НЕЙССЕРИЯтест предназначена для идентификации грамотрицательных оксидазоположительных дипло- и тетракокков или коккобацилл.

Для выбора тест-системы при идентификации грамотрицательных палочек необходимо иметь данные по ферментации глюкозы и/или наличию оксидазной активности. Идентификация оксидазоотри-цательных микроорганизмов осуществляется с помощью тест-системы ММТ-Е1 и Е2 или ЭНТЕРОтест16 или ЭНТЕРО-тест 24. Для ускоренной идентификации некоторых энтеробактерий предназначены тест-системы ЭНТЕРО-Скрин и ЭН-ТЕРО-Рапид 24.

Оксидазоположительные культуры идентифицируют при помощи НЕФЕРМ-теста 24. Одновременно ставится тест на среде Хью-Лейфсона для определения ферментации глюкозы и наличия газообразования. Для определения подвижности микробов делается посев в полужидкий агар.

При отсутствии теста на оксидазу выбор тест-системы производится в соответствии с результатом теста на среде Хью-Лейфсона. Для культур, ферментирующих глюкозу, используются тест-системы ММТ Е1 и 2, ЭНТЕРОтест 16 или ЭНТЕРО-тест 24; для культур, не ферментирующих глюкозу, - НЕФЕРМтест 24.

Идентификация коринебактерий проводится с помощью тест-системы ММТ Д.

Для идентификации анаэробов с использованием тест-системы АНАЭРО-тест 23 помимо результатов тестов, получаемых на индикаторных средах, необходимо внести данные о морфологии микроорганизмов, реакции при окраске по Граму, наличии или отсутствии спорообразования.

Идентификация грибов осуществляется с помощью тест-системы AUXOCOLOR.

Для определения антибиотикочувствительности используются отечественные тест-системы (ТПК-тесты) с визуальным учетом результатов через 18 ч и автоматическим (с помощью фотометров) для большинства микроорганизмов - через 6 ч.

Для визуального учета результатов биохимических тестов при проведении идентификации с использованием вышеперечисленных тест-систем и регистрации результатов ТПК-тестов при определении антибиотикочувствительности создана компьютерная программа «Система микробиологического мониторинга МИКРОБ». Программа МИКРОБ-Автомат позволяет с помощью ридеров (Multiscan или приборы типа iEMS-Reader) производить автоматическое считывание с тест-систем. Преимуществом программ является возможность расширения числа идентифицируемых видов микроорганизмов, спектра изучаемых признаков (тестов), ведения баз данных для мониторинга микробного пейзажа и уровня антибиотикорезистентности. Компьютерные программы повышают степень точности получения результата и сокращают сроки выполнения микробиологического исследования до 1-2 сут от момента выделения чистой культуры.

Список литературы

К основным бактериальным возбудителям внебольничных инфекций дыхательных путей, выделение которых рассматривается как показание к назначению антибактериальной терапии, относится ограниченная группа микроорганизмов: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis и Streptococcus pyogenes.

S. pneumoniae

Бета-лактамы. Основу терапии пневмококковых инфекций составляют бета-лактамные антибиотики.

Устойчивость пневмококков к этим антибиотикам обусловлена модификацией структуры пенициллиносвязывающих белков. К настоящему времени опубликовано не так уж много работ, посвященных оценке распространения антибиотикорезистентности среди S. pneumoniae в Российской Федерации. Оценка чувствительности к бета-лактамам имеет важную особенность, связанную с ограничением по использованию диско-диффузионного метода. Его использование допускается только для скрининга чувствительности к оксациллину. Изоляты, демонстрирующие зону задержки роста 20 мм и более вокруг диска с 1 мкг оксациллина, считаются чувствительными ко всем бета-лактамам. Изоляты с меньшей зоной задержки роста подлежат дальнейшему исследованию методом серийных разведений или эпсилометрическим (E-тестом) методом. Определение МПК двумя указанными методами служит наиболее надежным способом оценки антибиотикочувствительности пневмококков. При этом интерпретация результатов осложняется различиями в критериях чувствительности, предлагаемых EUCAST [1] и CLSI [2] (табл. 3-1). Важно также отметить, что критерии чувствительности к пенициллину, цефотаксиму и цефтриаксону для изолятов, выделенных из спинномозговой жидкости и других источников, различаются. EUCAST до сих пор не обосновал критерии чувствительности к амоксициллину и предлагает использовать данные, получаемые для ампициллина.

Результаты методически наиболее корректных исследований по оценке антибиотикочувствительности S. pneumoniae приведены в табл. 3-2.

Наиболее широко цитируется в России исследование ПеГАС, в рамках которого проводили наблюдение за антибиотикорезистентностью среди S. pneumoniae с 1999 по 2009 г. [3].

*См. в тексте анализ данных, приведенных в публикации.

В цитируемой публикации приводятся данные об уровне антибиотикорезистентности изолятов пневмококков, выделенных в течение трех временных периодов: с 1999 по 2003, с 2004 по 2005 и с 2006 по 2009 гг. В каждый из указанных периодов в исследование было включено 791, 913 и 715 изолятов S. pneumoniae, полученных от пациентов всех возрастных групп из 27, 20 и 14 центров соответственно. Наиболее очевидные достоинства работы - его длительность и высокий методический уровень микробиологических исследований. В отчете приведены данные о географической локализации центров, участвующих в исследовании, но не указано, сколько изолятов было выделено в каждом из центров, что затрудняет возможность применения полученных данных для обоснования эмпирической терапии пневмококковых инфекций в отдельных географических регионах. Согласно расчетам, проведенным на основании данных, представленных в работе, в последний из временных периодов (с 2006 по 2009 гг.) в каждом из участвующих центров в исследование ежегодно включали в среднем по 13 изолятов.

К сожалению, из-за неточностей и противоречий, допущенных в публикации при оценке полученных результатов, возникают определенные трудности. В разделе «Материалы и методы» авторы указывают, что для интерпретации были использованы критерии CLSI, однако в соответствующей таблице приведены критерии, предлагаемые CLSI для изолятов, полученных из СМЖ, несмотря на то что в исследование включены преимущественно респираторные изоляты, требующие иной интерпретации. Анализ фактических данных, представленных в работе, и дополнительные расчеты позволяют заключить, что к нечувствительным по EUCAST (промежуточные + устойчивые) относятся 11,2% изолятов, а к нечувствительным по CLSI - 1,4%. В работе отмечена низкая частота выделения изолятов, нечувствительных к амоксициллину и цефотаксиму по CLSI (0,4 и 1,0% соответственно). В работе также приведены данные об уровне чувствительности пневмококков к цефиксиму и цефтибутену, однако ни CLSI, ни EUCAST не рассматривают эти препараты как антипневмококковые и не предлагают критериев чувствительности. Используемые авторами критерии чувствительности предлагаются CLSI для оценки чувствительности представителей семейства Enterobacteriaceae.

В 2010 г. были опубликованы результаты многоцентрового исследования, проводившегося в Москве, Ярославле, Санкт-Петербурге, Томске и Иркутске [4]. В рамках этого исследования наблюдение за устойчивостью пневмококков в Москве и Ярославле проводили с 1998 по 2007 гг., результаты для этих городов анализировали совместно, и в данном регионе было получено наибольшее количество изолятов. В других городах количество изолятов было существенно меньшим, в связи с чем их анализ в настоящий обзор не включали. В публикации не представлены данные о количестве центров, участвовавших в работе в каждом городе, в исследование были включены изоляты от пациентов всех возрастных групп. В течение всего периода наблюдения отмечали тенденцию к росту устойчивости к основным бета-лактамам.

В опубликованной в 2014 г. работе, посвященной в основном серотиповому составу пневмококков, приведены данные о чувствительности к пенициллину 835 изолятов пневмококков (относящихся к 45 серотипам), выделенных в 5 стационарах Москвы, преимущественно (71%) из носоглотки у детей в возрасте до 6 лет [5]. При скрининге дисками с оксациллином у 29% изолятов было выявлено снижение чувствительности. Часть (n=189) была с изучена с помощью Е-теста. Снижение чувствительности подтверждено у 176; из них у 18 МПК пенициллина была не менее 2 мг/л. Эти данные сложно интерпретировать, поскольку изоляты с МПК=2 мг/л по критериям CLSI относятся к категории чувствительных. Данных о чувствительности пневмококков к другим бета-лактамам в работе не приведено.

В настоящее время принята в печать работа [6], в которой приведены данные об антибиотикорезистентности 250 изолятов пневмококков, выделенных в период с 2010 по 2013 гг. в трех стационарах Санкт-Петербурга у детей с ОСО, ВП и у здоровых носителей. Доля пневмококков, нечувствительных к пенициллину как по критериям EUCAST, так и CLSI, оказалась существенно выше, чем в ранее цитируемых работах, составив соответственно 44,9 и 9,6%. Устойчивость к амоксициллину продемонстрировали 4,8% изолятов, к цефотаксиму - 10,0 и 3,2% по критериям EUCAST и CLSI соответственно. При ОСО и у носителей нечувствительные изоляты выделяли приблизительно с одинаковой частотой, при ВП - несколько чаще.

При сопоставлении результатов анализируемых исследований необходимо отметить, что различия в их дизайне затрудняли сравнение результатов, но обеспечивали охват больших категорий пациентов. Наиболее тревожен выявленный в последних работах выраженный рост устойчивости к бета-лактамам пневмококков, выделенных от детей в Москве и Санкт-Петербурге. В настоящее время неясно, насколько эти данные могут быть экстраполированы на другие регионы и другие возрастные группы. Одной из причин такой тенденции может быть более высокий, по сравнению с другими городами России, уровень потребления антибиотиков, однако подтверждения этому предположению нет.

Независимо от причины рост устойчивости S. pneumoniae к бета-лактамам вызывает необходимость пересматривать дозировки, используемые для лечения респираторных инфекций, прежде всего ОСО и ВП, вызванных штаммами пневмококка со сниженной чувствительностью к амоксициллину. Фармакокинетические и фармакодинамические расчеты показывают, что для лечения инфекций, вызванных пневмококками со сниженной чувствительностью к амоксициллину, суточная доза этого антибиотика должна быть увеличена для взрослых до 3-4 г [7], а у детей - до 90 мг/кг [8].

Оценивая роль бета-лактамов в лечении пневмококковых инфекций, необходимо отметить, что в этой группе антибиотиков некоторые препараты лишены значимой антипневмококковой активности, оценка чувствительности пневмококков к ним нецелесообразна. При запросе клиницистов бактериологическая лаборатория может сообщать об устойчивости, не проводя исследований [1]. К таким препаратам относят пенициллиназостабильные пенициллины, а также ряд оральных и парентеральных цефалоспоринов: цефалексин, цефазолин, цефадроксил, цефтибутен и цефтазидим [1].

Макролиды. Роль макролидов в лечении респираторных инфекций можно оценить как препаратов второй линии. Устойчивость пневмококков к этим антибиотикам опосредуется двумя основными механизмами: метилированием участка связывания 50S-субъединицы рибосомы (ферменты метилазы, кодируемые генами erm) и активным выведением (эффлюксные помпы, кодируемые генами mef). В проявлении резистентности к макролидам есть определенные закономерности. Метилирование участка связывания рибосом приводит к значительному повышению МПК (>16 мкг/мл) всех макролидных антибиотиков, а активному выведению подвергаются только 14- и 15-членные макролиды (эритромицин, кларитромицин, рокситромицин и азитромицин). Таким образом, на практике распространены следующие фенотипы пневмококков:

Для полноценной оценки чувствительности пневмококков к макролидам достаточно исследовать чувствительность к двум препаратам: одному представителю 14- и 15-членных макролидов (например, к эритромицину) и одному представителю группы 16-членных макролидов и линкозамидов (например, к клиндамицину). Часто исследуют чувствительность к эритромицину и клиндамицину.

Результаты оценки чувствительности к основным представителям указанных групп антибиотиков - эритромицину и клиндамицину представлены в табл. 3.3. Как и в случае с бета-лактамами, уже в период с 2004 по 2007 гг. уровень устойчивости к макролидам (прежде всего к 14-и 15-членным) в Москве был почти в 2 раза выше, чем среднем по России. Наиболее существенные изменения в уровне устойчивости к макролидам произошли в последние годы: в Москве уровень устойчивости достиг 26, а в Санкт-Петербурге - 31%.

Определенный интерес представляет выявление в Москве высокой частоты пневмококков (до 30%), несущих одновременно две детерминанты устойчивости к макролидам: ген erm (B) и различные варианты гена mef [5, 9]. Гены erm кодируют ферменты метилазы, опосредующие высокий уровень устойчивости ко всем макролидам и линкозамидам за счет присоединения к участку связывания антибиотиков с рибосомой метильной группы. В результате участок связывания становится недоступным для антибиотиков. Гены mef кодируют транспортные системы, осуществляющие активное выведение макролидов из бактериальной клетки (эффлюкс). Поскольку транспортные системы способны выводить из клетки только 14- и 15-членные макролиды, то при этом механизме резистентности 16-членные макролиды и линкозамиды сохраняют свою активность (так называемый фенотип M). На практике оценивать чувствительность S. pneumoniae ко всем макролидным и линкозамидным антибиотикам нет необходимости. Результаты оценки чувствительности любого из 14- и 15-членных макролидов можно экстраполировать на всю группу. Такая же закономерность характерна и для группы «16-членные макролиды - линкозамиды».

В целом в Москве превалируют изоляты S. pneumoniae, устойчивость которых связана либо с метилированием, либо с наличием двух вышеописанных механизмов. В Санкт-Петербурге и других регионах России метилирование и эффлюкс встречаются с одинаковой частотой.

Практическое значение выявленных фактов крайне велико, следует признать, что эмпирическое назначение макролидов для лечения пневмококковых инфекций сопряжено с неоправданно высоким риском неудачи лечения, особенно при тяжелом течении.

Распространение устойчивости к фторхинолонам и другим антибиотикам. Респираторные фторхинолоны до настоящего времени сохраняют высокий уровень антипневмококковой активности. Устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину не было выявлено ни в более ранних [3], ни в более поздних исследованиях [6]. Однако необходимо отметить, что в соответствии с рекомендациями по терапии респираторных инфекций респираторные фторхинолоны - препараты второго выбора. Уровень устойчивости к ко-тримоксазолу и тетрациклину во всех исследованиях был высоким, хотя и варьировал в значительных пределах (16,6-57,0 и 21,5-33,2% соответственно), что практически исключает их использование для лечения респираторных инфекций.

H. influenzae

По сравнению с пневмококками спектр природной чувствительности гемофильной палочки несколько уже. Микроорганизм малочувствителен к пенициллинам, из бета-лактамов наибольшей активностью характеризуются аминопенициллины, защищенные аминопенициллины, цефалоспорины II-III поколения. Именно эти препараты составляют основу терапии как легких, так и тяжелых инфекций, вызываемых H. influenzae. Устойчивость этих бактерий к бета-лактамам связана либо с продукцией бета-лактамаз, либо с модификацией пенициллиносвязывающих белков.

В период с 2002 по 2004 г. частота продукции H. influenzae бета-лактамаз в Москве колебалась в пределах 3,2-4,9%. Выявлены единичные изоляты, устойчивые к ампициллину, но не продуцирующие бета-лактамазы. Штаммов, устойчивых к цефтриаксону, выявлено не было. Частота устойчивости к тетрациклину и ко-тримоксазолу среди H. influenzae колебалась в пределах 8-10 и 30-40% соответственно. Ципрофлоксацин, офлоксацин и моксифлоксацин обладают сходной активностью в отношении H. influenzae, устойчивости к этим препаратам в Российской Федерации не зарегистрировано [11]. По неопубликованным данным, в 2006 г. в Москве наблюдался рост частоты устойчивости к ампициллину до 10,7%, в основном за счет продукции бета-лактамаз. В течение 2011-2012 гг. в Санкт-Петербурге были выявлены лишь единичные изоляты H. influenzae, продуцирующие бета-лактамазы.

Интерпретация результатов оценки чувствительности H. influenzae к макролидам спорна. МПК всех макролидов в отношении этого микроорганизма существенно выше, чем в отношении грамположительных бактерий. Этот факт объясняется присутствием у H. influenzae конститутивно функционирующей системы активного выведения макролидов [12]. Фармакодинамические расчеты свидетельствуют, что концентрации макролидных антибиотиков, создающиеся в очаге инфекции, недостаточны для эрадикации H. influenzae [13]. Приведенные факты в достаточной степени подтверждают точку зрения EUCAST о том, что H. influenzae следует считать природно-устойчивыми к макролидным антибиотикам, и обосновывают скептическое отношение к многочисленным публикациям о низкой частоте устойчивости H. influenzae к макролидам.

M. catarrhalis

Микроорганизм относится к достаточно редким и маловирулентным респираторным патогенам и характеризуется высокой природной чувствительностью к большинству антибактериальных препаратов. К особенностям M. catarrhalis относится наблюдаемая повсеместно высокая частота продукции бета-лактамаз, разрушающих природные и полусинтетические пенициллины, но чувствительных к действию ингибиторов. В России частота продукции бета-лактамаз колеблется в пределах 90-98% [14]. Частота устойчивости к антибактериальным препаратам других групп (фторхинолонам, макролидам, тетрациклинам, ко-тримоксазолу) отсутствует или минимальна.

S. pyogenes

Микроорганизм высокочувствителен ко многим антибактериальным препаратам, при этом устойчивости к бета-лактамам, служащим средствами выбора при лечении стрептококковых инфекций, в мире до сих пор не зарегистрировано, несмотря на почти 70-летний период применения пенициллинов, что уникально среди возбудителей болезней человека.

Определенная проблема - устойчивость к макролидам, рассматриваемым в качестве средств, альтернативных бета-лактамам. В России частота устойчивости к макролидам колеблется в пределах 5-10%. Подавляющее большинство устойчивых штаммов (до 90%) демонстрируют фенотип M, проявляющийся в устойчивости к 14- и 15-членным макролидам при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам и линкозамидам [10].

Как и в других регионах, в России наблюдают высокую частоту устойчивости к тетрациклину, в 2004-2006 гг. этот показатель колебался в пределах 35-50%, что исключает возможность применения всей группы тетрациклинов для лечения стрептококковых инфекций. В крайне редких случаях для лечения инфекций, вызванных пиогенными стрептококками, применяют фторхинолоны. В России, как и в других регионах, выделяют единичные штаммы, устойчивые к офлоксацину, устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину отмечено не было.

Ведущим патогеном внебольничных инфекций МВП считается Escherichia coli, на долю которой приходится 70-90% случаев острого цистита и пиелонефрита. Опубликованы результаты наблюдения за распространением резистентности среди возбудителей инфекций МВП в течение 2004-2005 гг. в Москве [15]. Опубликованы также результаты исследований UTAP-I и UTIAP-II, проводившихся в четырех городах России [16]. Во всех работах были получены принципиально сходные результаты, но в то же время выявлены и некоторые количественные различия.

Частота устойчивости E. coli к налидиксовой кислоте варьировала от 8,9 до 22,2%, между ципрофлоксацином и левофлоксацином была отмечена полная перекрестная резистентность, ее частота варьировала от 4,8 до 16%. К ампициллину были устойчивы 33,9-40,6% штаммов, к защищенным пенициллинам - 12,1-25,9%, к цефуроксиму - 0,8-6,8%, устойчивость к цефалоспоринам III поколения проявляли 0-3,1% штаммов. К нитрофурантоину устойчивость колебалась от 1,2 до 11,6%. Наибольший уровень устойчивости был отмечен к ко-тримоксазолу - от 19,4 до 31%. Среди более редких грамотрицательных возбудителей инфекций МВП (Klebsiella spp., Proteus spp. и др.) частота устойчивости ко всем антибактериальным препаратам была на 5-7% выше.

Тенденции, выявленные в начале 2000 гг., полностью подтвердились в ходе многоцентрового исследования «Дармис» [17]. Сохраняется тенденция к росту устойчивости к фторхинолонам и аминопенициллинам. В отношении ведущего возбудителя внебольничных инфекций МВП - E. coli наибольшую активность проявляли фосфомицин, нитрофураны и цефалоспорины III поколения (цефиксим, цефтибутен).

Среди возбудителей ИППП проблемы формирования и распространения антибиотикорезистентности касаются в основном Neisseria gonorrhoeae. Современный уровень распространения устойчивости среди гонококков в России следует считать близким к критическому. Начиная с 2004 г. в стране функционирует эффективная система наблюдения за распространением устойчивости среди этих бактерий, по данным за 2006 г., 74,8% штаммов гонококков были устойчивы к пенициллину, 74,5% - к тетрациклинам, 51,5% - к фторхинолонам [18]. На этом фоне колебания в частоте распространения устойчивости между отдельными географическими регионами в 10-20% не имеют существенного значения. В ходе наблюдения в последующие годы была выявлена тенденция к росту устойчивости к спектиномицину (до 8,3%) и азитромицину (до 5,2-10,7%) [19].

Крайне неблагоприятной тенденцией следует признать появление изолятов N. gonorrhoeae с повышенными значениями МПК цефтриаксона (0,25 мкг/мл). Насколько быстро будет распространяться устойчивость к цефтриаксону в настоящее время, сложно предсказать, однако если это произойдет, возможности этиотропной терапии гонореи будут крайне ограничены. До настоящего времени отсутствуют данные о распространении среди гонококков устойчивости к цефиксиму. В других географических регионах выделены штаммы с устойчивостью к цефалоспоринам III поколения.

На территории России, как и во всем мире, среди ведущих возбудителей кишечных инфекций - сальмонелл и шигелл наблюдают значительные межвидовые различия в частоте распространения резистентности. Так, если наиболее распространенные Salmonella enteritidis сохраняют высокую чувствительность (>85%) к основным антибактериальным препаратам, применяемым для лечения кишечных инфекций (ампициллину, тетрациклинам, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу и цефотаксиму), то для Salmonella typhimurium характерна крайне высокая частота устойчивости (>50%) ко всем перечисленным препаратам. Следует отметить, что эти результаты получены в Центральном, Западном и Северо-Западном регионах России (собственные неопубликованные данные), и экстраполировать их на другие регионы можно лишь с большой осторожностью. Среди большинства сальмонелл (в том числе и среди S. typhi) отмечаются признаки снижения чувствительности к фторхинолонам - наиболее эффективным препаратам при лечении кишечных инфекций.

Среди шигелл несколько большая частота устойчивости к ампициллину, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу и тетрациклину характерна для S. flexneri в сравнении с S. zonnei, но даже среди S. zonnei этот показатель для всех перечисленных препаратов превышает 50%. Устойчивость к фторхинолонам и цефалоспоринам III поколения среди шигелл остается редкостью.

К сожалению, в Российской Федерации практически отсутствуют данные о распространении резистентности среди таких важных возбудителей кишечных инфекций, как Campylobacter spp.

Список литературы

Бета-лактамы (бета-лактамные антибиотики) - большая группа ЛС, имеющих бета-лактамное кольцо: пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, моно-бактамы и ингибиторы бета-лактамаз. Отдельную группу составляют комбинированные препараты, состоящие из бета-лактамного антибиотика (пенициллины, цефалоспорины) и ингибитора бета-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам) и получившие название «Ингибиторзащищенные бета-лактамы».

Бета-лактамы - наиболее многочисленная группа антибактериальных ЛС, применяемых в клинической практике. Многообразие бета-лактамов обусловлено возможностью получать новые соединения путем химической модификации базовой молекулы - 6-амино-пенициллановой и 7-аминоцефалоспорановой кислот. Получено много полусинтетических ЛС в ряду пенициллинов, цефалоспоринов и карбапенемов.

Антибактериальная активность

Бета-лактамы обладают широким спектром антибактериального действия (табл. 4-1). Однако существует группа микроорганизмов, которая исключена из спектра их активности, - облигатные и факультативные внутриклеточные микроорганизмы (риккетсии, хламидии, легионеллы, бруцеллы и др.). Низкая клиническая эффективность или отсутствие эффективности при инфекциях, вызываемых этими микроорганизмами, связана с ограниченной способностью бета-лактамов проникать внутрь клетки организма, прежде всего внутрь фагоцитов, где локализуется возбудитель. Ко всем бета-лактамам устойчивы метициллинорезистентные стафилококки (кроме цефалоспоринов V поколения с антиMRSA-активностью - цефтобипрол и цефтаролина фосамил). Кроме того, природной устойчивостью к бета-лактамам обладают микоплазмы.

Грамположительные микроорганизмы

Большинство бета-лактамов высокоактивны в отношении грамположительных микроорганизмов. Единственное исключение - группа монобактамов.

* Только ингибиторзащищенные антипсевдомонадные пенициллины. ** Реальной антипсевдомонадной активностью обладают цефтазидим и цефоперазон. *** Реальной антианаэробной активностью обладают цефамицины (цефокситин, цефотетан, цефметазол).

Примечания: ++ - высокая активность; + - умеренная активность; ± - слабая активность; 0 - отсутствие природной активности; r - частота приобретенной резистентности не превышает 10%; R - частота приобретенной резистентности более 50%; r-R - частота приобретенной резистентности существенно варьирует.

Streptococcus spp. высокочувствительны к бета-лактамам. Наиболее активны природные пенициллины - ЛС выбора при лечении стрептококковых инфекций. Сравнительно малоактивны оксациллин и карбоксипенициллины. Активность других полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов различна. Однако необоснованно считать эти различия клинически значимыми, за исключением парентеральных и пероральных цефалоспоринов III поколения.

Не обнаружено ни одного штамма Streptococcus pyogenes, устойчивого к пенициллинам и другим бета-лактамам. Резистентность других стрептококков часто значительно колеблется и всегда связана с модификацией пенициллиносвязывающих белков (ПСБ). Продукция бета-лактамаз у стрептококков не выявлена.

Наиболее практически значимы пенициллинорезистентные пневмококки. В отдельных регионах Испании, Франции, Венгрии частота устойчивости достигает 60%. В России распространение устойчивости пневмококков к пенициллинам меньше, но в последние годы увеличилось (20-30%). Кроме того, умеренная устойчивость пневмококков к пенициллинам не сопровождается безуспешностью лечения бета-лактамами.

Отмечена тенденция к повышению частоты устойчивости к пенициллинам стрептококков группы В и Streptococcus viridans, но такие штаммы редки.

Предсказать чувствительность или устойчивость пенициллинорезистентных пневмококков к другим бета-лактамам достаточно сложно. Активность сохраняют цефалоспорины III поколения, практически всегда активны цефалоспорины IV поколения и карбапенемы; цефалоспорины I-II поколения часто неактивны. Резистентность пневмококков не связана с продукцией бета-лактамаз, поэтому ингибиторзащищенные бета-лактамы не имеют преимуществ. Перекрестная резистентность пневмококков к бета-лактамам изучена наиболее полно. При обнаружении устойчивого к пенициллинам штамма пневмококка определяют его чувствительность к другим бета-лактамам методом серийных разведений.

Enterococcus spp. значительно менее чувствительны к бета-лактамам, чем другие грамположительные микроорганизмы, что связано с пониженной аффинностью ПСБ к этим антибиотикам. Энтерококкам свойственны выраженные межвидовые различия чувствительности к бета-лактамам, наиболее чувствителен Enterococ-cus faecalis. Природно-устойчивы к бета-лактамам Enterococcus faecium и другие энтерококки, они синтезируют большое количество ПСБ 5-го типа с низкой аффинностью к этим антибиотикам.

Из всех бета-лактамов клинически значимой антиэнтерококковой активностью (в отношении Enterococcus faecalis) обладают природные пенициллины, аминопенициллины, уреидопенициллины и карбапенемы (за исключением эртапенема). Цефалоспорины реальной активностью не обладают. Аминопенициллины - ЛС выбора для лечения энтерококковых (En-terococcus faecalis) инфекций. Бактериостатическая активность бета-лактамов отмечена лишь в отношении Enterococcus faecalis. Бактерицидное действие проявляется только в комбинации с аминогликозидами.

Staphylococcus spp. (Staphylococcus aureus и коагулазонегативные стафилококки) от природы высокочувствительны к бета-лактамам. Наименьшие значения МПК имеют природные пенициллины и аминопенициллины. В ряду цефалоспоринов I-III поколения наблюдают некоторое снижение активности без реального клинического значения. Исключение - пероральные цефалоспорины III поколения, практически лишенные антистафилококковой активности: цефиксим и цефтибутен.

Стафилококки - первые микроорганизмы, приобретенная резистентность которых привела к резкому снижению эффективности лечения. Менее чем через 10 лет после внедрения в клиническую практику бензилпенициллина частота резистентности к нему в отдельных стационарах достигала 50%, и в настоящее время практически повсеместно, в том числе и в России. Устойчивость даже внебольничных штаммов превышает 80%.

Устойчивость обусловлена продукцией плазмидных бета-лактамаз. Ее удалось сравнительно легко преодолеть созданием полусинтетических изоксозолинпенициллинов (метициллина^♠ и оксациллина) и цефалоспориновых антибиотиков, устойчивых к ферментативному гидролизу. Амино-, карбокси- и уреидопенициллины разрушаются этими ферментами так же эффективно, как и природные пенициллины; иногда наблюдают частичный гидролиз цефалоспоринов I поколения. Стафилококковые бета-лактамазы эффективно подавляются ингибиторами, что обеспечивает высокую активность защищенных пенициллинов.

В 1961 г. появились первые сообщения о выделении метициллинорезистентных стафилококков (МРС). Резистентность оказалась связанной с появлением нового ПСБ (ПСБ-2а), отсутствующего у чувствительных штаммов и обладающего пониженной аффинностью ко всем бета-лактамам (исключение - цефтобипрола медокарил и цефтаролина фосамил). Для установления метициллинорезистентности обычно используют оксациллин, который более стабилен при хранении, поэтому появился равнозначный термин «оксациллинорезистентность».

При исследованиях in vitro цефалоспорины и карбапенемы иногда проявляют активность в отношении некоторых штаммов МРС. Формально по величине МПК или диаметру зоны ингибирования роста такие штаммы следует считать чувствительными. Однако клинические исследования показали, что при метициллинорезистентности эффективность всех бета-лактамов существенно снижается независимо от их активности in vitro.

Следовательно, при определении устойчивости стафилококков к оксациллину ни один бета-лактамный антибиотик (независимо от активности in vitro) не рекомендован для лечения, исключая цефалоспорины V поколения (цефтобипрола медокарил и цефтаролина фосамил). Оценка чувствительности к оксациллину остается ключевой при планировании лечения стафилококковых инфекций.

При лечении инфекций, вызванных штаммами, чувствительными к оксациллину, ЛС выбора - оксациллин. Практически равную эффективность проявляют защищенные пенициллины, цефалоспорины I, II и V поколения (возможно, и IV поколения), карбапенемы. Более низкую эффективность ожидают при применении цефалоспоринов III поколения. При выявлении оксациллинорезистентных штаммов применение любых бета-лактамов исключено.

Грамотрицательные микроорганизмы

Грамотрицательные кокки - Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella (Branhamella) catarrhalis - имеют высокую природную чувствительность к бета-лактамам. Их внешняя мембрана проницаема не только для цефалоспоринов и полусинтетических пенициллинов, но и для природных пенициллинов. По этому признаку они отличаются от других грамотрицательных микроорганизмов. Традиционно ЛС выбора при лечении инфекций, вызванных этими микроорганизмами, - природные пенициллины. Однако цефалоспорины (прежде всего III поколения) не уступают им в активности. Достаточно активны полусинтетические пенициллины, кроме оксациллина.

Распространение приобретенной резистентности грамотрицательных кокков, связанной с продукцией плазмидных бета-лактамаз класса А, значительно различается. Продукцию плазмидных бета-лактамаз широкого спектра выявляют чаще у Moraxella catarrhalis (60-80% штаммов). Эти ферменты гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, цефалоспорины I поколения. Остальные бета-лактамы сохраняют высокую активность.

Частота продукции бета-лактамаз с аналогичными свойствами больше у Neisseria gonorrhoeae, что снижает роль пенициллинов при лечении гонореи и на первое место ставит цефалоспорины III поколения и защищенные пенициллины.

У Neisseria meningitidis продукцию бета-лактамаз выявляют крайне редко; описаны штаммы со сниженной чувствительностью к пенициллинам,обусловленной модификацией ПСБ и снижением проницаемости наружной мембраны. Значение пенициллинов при лечении менингококковой инфекции сохранено.

Грамотрицательные палочки имеют некоторые особенности. Прежде всего, их наружная мембрана малопроницаема для природных пенициллинов, и в лечении соответствующих инфекций эти пенициллины значения не имеют. Другое принципиально важное их свойство - гены, кодирующие бета-лактамазы класса А или С.

Природная чувствительность грамотрицательных микроорганизмов к бета-лактамам определяется способностью к синтезу хромосомных бета-лактамаз и его характером (конститутивным или индуцибельным). В зависимости от типа экспрессии хромосомные бета-лактамазы разделяют на несколько групп.

Первая группа - Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp., Proteus mira-bilis, Haemophilus spp. Продукцию хромосомных бета-лактамаз класса С у этих микроорганизмов не определяют или она минимальна (конститутивно низкий уровень продукции). Они обладают природной чувствительностью ко всем бета-лактамам, кроме природных и пенициллиназостабильных пенициллинов; чувствительность к цефалоспоринам I поколения варьирует. Haemophilus spp. нечувствительны к цефалоспоринам I поколения.

Однако реальная активность аминопенициллинов, карбокси-, уреидопенициллинов и цефалоспоринов I поколения ограничена распространением приобретенной резистентности, связанной с продукцией бета-лактамаз широкого спектра. В последние годы на территории России частота продукции бета-лактамаз расширенного спектра у госпитальныхштаммов увеличилась у Escherichia coli и Proteus mirabilis и в некоторых стационарах достигает более 50%, что существенно снижает эффективность всех цефалоспоринов.

Частота продукции бета-лактамаз широкого спектра у Haemophilus spp. в России, по данным ограниченных исследований, не превышает 10%.

Таким образом, в зависимости от тяжести и характера инфекции (госпитальная или внебольничная) ЛС выбора для эмпирического лечения инфекций, вызванных этой группой микроорганизмов, - защищенные пенициллины, цефалоспорины II-III поколения или карбапенемы.

При шигеллезе и кишечном сальмонеллезе клинически значимы только аминопенициллины. Однако их роль в связи с распространением бета-лактамаз широкого спектра ослаблена, альтернатива - фторхинолоны. ЛС выбора для лечения генерализованного сальмонеллеза - цефалоспорины III поколения, так как бета-лактамазы расширенного спектра, гидролизующие эти цефалоспорины, у сальмонелл до сих пор встречаются крайне редко.

Вторая группа - Klebsiella spp., Proteus vulgaris, Citrobacter diversus - тоже конститутивно продуцируют незначительное количество хромосомных бета-лактамаз класса А. Несмотря на низкий уровень их продукции, эти ферменты гидролизуют амино-, карбокси- и частично уреидопенициллины и цефалоспорины I поколения. Бета-лактамазы Proteus vulgaris эффективно гидролизуют цефалоспорины II поколения. Таким образом, наибольшая природная чувствительность этих микроорганизмов отмечена к цефалоспоринам III-IV поколения, защищенным пенициллинам, монобактамам и карбапенемам.

Основной механизм приобретенной резистентности - продукция плазмидных бета-лактамаз широкого и расширенного спектра. Последние ограничивают активность не только полусинтетических пенициллинов, но и цефалоспоринов II-IV поколения. При внебольничных инфекциях, вызываемых этой группой микроорганизмов, цефалоспорины III поколения высокоэффективны; прогнозирование их эффективности при госпитальных инфекциях без лабораторных исследований затруднительно.

Лечение защищенными пенициллинами инфекций, вызываемых штаммами, продуцирующими бета-лактамазы расширенного спектра, не всегда эффективно.

В отношении некоторых штаммов, продуцирующих эти бета-лактамазы, in vitro активность проявляет цефепим, но данные о его клинической эффективности противоречивы. Наиболее надежные бета-лактамы при лечении этой группы энтеробактерий - карбапенемы.

В последнее десятилетие в некоторых регионах мира, в том числе и в России, получили распространение нозокомиальные штаммы Klebsiella spp., устойчивые к карбапенемам за счет продукции карбапенемаз (бета-лактамаз, гидролизующих карбапенемовые антибиотики), относящихся к разным классам - A, B и D (KPC, NDM, VIM, OXA и др.).

Третья группа - Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia spp., Morga-nella morganii, Providencia stuartii и Pro-videncia rettgeri - типичные госпитальные патогены, одна из наиболее сложных групп возбудителей при лечении бета-лактамами. У них выявлена индуцибельная продукция хромосомных бета-лактамаз класса С. Большинство бета-лактамов разрушаются этими ферментами, поэтому уровень природной чувствительности бактерий определяется способностью антибиотиков индуцировать синтез. Аминопенициллины, цефалоспорины I поколения относятся к сильным индукторам, поэтому эти микроорганизмы к ним устойчивы. Цефалоспорины II поколения в меньшей степени индуцируют хромосомные бета-лактамазы класса С, и их активность близка к промежуточной. Цефалоспорины III-IV поколения, моно-бактамы, карбокси- и уреидопенициллины в незначительной степени индуцируют синтез хромосомных бета-лактамаз и, следовательно, проявляют высокую активность. Несмотря на то что карбапенемы относятся к сильным индукторам, они не разрушаются этими ферментами, следствие - высокая природная активность этой группы ЛС.

Из механизмов приобретенной резистентности этой группы микроорганизмов имеет значение гиперпродукция хромосомных бета-лактамаз, которая связана с мутациями в регуляторных областях генома, приводящими к дерепрессии синтеза фермента. Особое значение этого механизма устойчивости - достаточно частое его формирование при лечении цефалоспоринами III поколения больных с тяжелыми госпитальными инфекциями, вызываемыми Enterobacter spp., Serratia spp. (селекция мутантов-гиперпродуцентов на фоне элиминации чувствительных микроорганизмов). Активность в отношении штаммов гиперпродуцентов сохраняют только цефалоспорины IV поколения и карбапенемы.

Неферментирующие микроорганизмы

Природной устойчивостью ко многим бета-лактамам обладают Pseudomonas spp. (прежде всего Pseudomonas aeruginosa), Acinetobacter spp. и некоторые другие неферментирующие бактерии (Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia), что обусловлено низкой проницаемостью их внешних структур и продукцией хромосомных бета-лактамаз класса С.

Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa отмечена у карбокси- и уреидопенициллинов, некоторых цефалоспоринов III поколения (цефтазидима, цефоперазона), цефалоспоринов IV поколения, монобактамов и карбапенемов (кроме эртапенема). Приобретенная резистентность этих микроорганизмов связана со многими механизмами: продукцией плазмидных бета-лактамаз, гиперпродукцией хромосомных бета-лактамаз, снижением проницаемости клеточной стенки. Часто наблюдают их сочетание.

Накоплены данные об устойчивости ко многим бета-лактамам, связанной с их активным выведением из микробной клетки. На практике это приводит к появлению и распространению штаммов, устойчивых ко всем бета-лактамам.

Acinetobacter spp. проявляют высокую природную чувствительность к бета-лактамам. Однако в госпитальных условиях происходит очень быстрая селекция штаммов с приобретенной устойчивостью, механизмы которой не всегда известны. Ацинетобактерии - одни из немногих микроорганизмов, обладающие природной чувствительностью к ингибитору бета-лактамаз - сульбактаму, что обусловливает высокую эффективность ампициллина и цефоперазона при этих инфекциях.

В определенных условиях (в отделениях реанимации и интенсивной терапии), на фоне применения карбапенемов с максимально широким среди бета-лактамов спектром действия, в результате элиминации чувствительных микроорганизмов возможна селекция видов, продуцирующих бета-лактамазы класса В (металлоэнзимы) и проявляющих природную устойчивость к этим антибиотикам, - Stenotrophomonas maltophilia, некоторые виды Flavobacterium.

Анаэробные микроорганизмы Bacteroides fragilis и родственные им микроорганизмы проявляют достаточно высокую природную устойчивость к бета-лактамам. Большинство других анаэробов высокочувствительны к бета-лактамам, в том числе и к природным пенициллинам.

Устойчивость Bacteroides fragilis в основном определяется продукцией ими хромосомных бета-лактамаз класса А. Благодаря устойчивости к гидролизу цефамицины (цефокситин, цефотетан, цефметазол) обладают клинически значимой антианаэробной активностью. Высокоактивны и защищенные бета-лактамы и карбапенемы, приобретенная устойчивость к ним крайне редка.

Механизм действия и резистентность

Антибактериальная активность бета-лактамов связана с бета-лактамным кольцом в их химической структуре.

Мишени действия бета-лактамных антибиотиков в микробной клетке - транспептидазы и карбоксипептидазы - ферменты, участвующие в синтезе основного компонента наружной мембраны грам-положительных и грамотрицательных микроорганизмов - пептидогликана. Благодаря способности связываться с пенициллинами и другими бета-лактамами, эти ферменты получили второе название - «пенициллиносвязывающие белки» (ПСБ). Молекулы ПСБ жестко связаны с цитоплазматической мембраной микробной клетки и образуют поперечные сшивки.

Связывание бета-лактамных антибиотиков с ПСБ ведет к инактивации ПСБ, прекращению роста и последующей гибели микробной клетки. Таким образом, активность бета-лактамного антибиотика в отношении микроорганизма в первую очередь определяется его аффинностью (сродством) к ПСБ. Чем ниже аффинность взаимодействующих молекул, тем более высокие концентрации антибиотика необходимы для подавления функции фермента.

Однако для взаимодействия с ПСБ антибиотик должен проникнуть через наружные структуры микроорганизма. Капсула и пептидогликан грамположительных микроорганизмов не являются существенной преградой для диффузии бета-лактамов. Липополисахаридный слой наружной мембраны грамотрицательных бактерий практически непреодолим для бета-лактамов. Единственный путь для диффузии бета-лактамов - пориновые каналы внешней мембраны - воронкообразные структуры белковой природы. Они становятся основным путем транспорта питательных веществ внутрь бактериальной клетки. Чем больше молекула антибиотика, тем медленнее его диффузия через пориновые каналы.

Доступ бета-лактамных антибиотиков к мишени ограничивают и ферменты - бета-лактамазы, гидролизующие антибиотики, которые широко распространены у разных микроорганизмов, в том числе патогенных, в результате межвидового генного переноса.

Бета-лактамазы у грамотрицательных микроорганизмов расположены в периплазматическом пространстве, между наружной и внутренней мембраной. У грамположительных микроорганизмов они свободно диффундируют в окружающую среду.

Важные практические свойства бета-лактамаз:

В клиническую практику внедрены три ингибитора: клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам. К сожалению, далеко не все известные бета-лактамазы чувствительны к ним. В перспективе ожидают появления в клинической практике новых ингибиторов бета-лактамаз (в том числе и не бета-лактамной структуры) с более широким спектром активности и способностью подавлять не только бета-лактамазы класса А, но и классов C и D. Из этих ингибиторов наиболее реально скорое появление в клинической практике авибактама^♠ .

Выделяют несколько групп бета-лактамаз, имеющих наибольшее практическое значение (табл. 4-2).

Таким образом, индивидуальные свойства бета-лактамов определяются их аффинностью к ПСБ, способностью проникать через внешние структуры микроорганизмов и устойчивостью к гидролизу бета-лактамазами.

Мишень действия бета-лактамных антибиотиков - пептидогликан - обязательный компонент микробной клетки (кроме микоплазм), поэтому все микроорганизмы в той или иной степени чувствительны к антибиотикам этого класса. Однако на практике реальная активность бета-лактамов ограничивается их концентрациями в крови или очаге инфекции. Природная устойчивость микроорганизма - если ПСБ не угнетаются практически достижимыми концентрациями антибиотиков. Истинной природной резистентностью к бета-лактамам обладают только микоплазмы, так как у них отсутствует пептидогликан.

Кроме природной чувствительности или резистентности клиническую эффективность бета-лактамов определяет приобретенная устойчивость. Она формируется при изменении одного из параметров, определяющих природную чувствительность микроорганизма. Механизмы приобретенной устойчивости:

Эти эффекты - результат различных генетических событий: мутации в существующих генах или приобретение новых.

Фармакокинетика

Всасывание бета-лактамов различно. Некоторые пенициллины (бензилпенициллин, карбокси- и уреидопенициллины) нестабильны в кислой среде, поэтому практически не всасываются при приеме внутрь и их применяют только парентерально. Среди цефалоспориновых антибиотиков выделяют ЛС для парентерального введения и для приема внутрь, причем биодоступность последних существенно различается, в том числе в зависимости от приема пищи. Биодоступность при приеме внутрь карбапенемов и моно-бактамов тоже крайне низка. Показатели биодоступности бета-лактамов и другие параметры фармакокинетики приведены в табл. 4-3.

Бета-лактамы в крови в разной степени связываются с белками плазмы, преимущественно с альбуминами. Объем распределения бета-лактамов - в среднем около 20 л - свидетельствует об их проникновении в ткани. Концентрации бета-лактамов в большинстве тканей организма равны 30-70% сывороточных концентраций, они не проникают внутрь клеток. Период полувыведения большинства бета-лактамов - около 2 ч, однако существует исключение: он больше у некоторых цефалоспоринов - цефтриаксона, цефотетана, цефиксима.

Большинство бета-лактамов выводятся с мочой в неизмененном виде; некоторые ЛС частично метаболизируются в печени (изоксозолинпенициллины, уреидопенициллины, цефалотин, цефотаксим, цефтриаксон, азтреонам). Цефоперазон значительно выводится с желчью.

Клиническое применение

Бета-лактамы применяют как в амбулаторной практике, так и в стационаре. В схемах антибактериального лечения и профилактики большинства инфекционных заболеваний (как внебольничных, так и госпитальных) бета-лактамы - ЛС выбора. Место бета-лактамов в антибактериальном лечении указано при описании отдельных групп ЛС.

Противопоказания и предостережения

Аллергические реакции

Бета-лактамы противопоказаны только при документированной гиперчувствительности. Аллергические реакции часто отмечают при применении пенициллинов (5-10%), реже - цефалоспоринов (2%), карбапенемов и монобактамов (<1%). При гиперчувствительности к пенициллину в анамнезе существует риск перекрестной реакции с другими бета-лактамами. Частота аллергических реакций на цефалоспорины увеличивается до 10% у больных с гиперчувствительностью к пенициллину. При указании в анамнезе на тяжелые реакции гиперчувствительности к пенициллину (анафилактический шок, ангио-невротический отек, бронхоспазм) применение других бета-лактамов недопустимо. При умеренных реакциях к пенициллину в анамнезе (крапивнице, рините, эозинофилии и др.) в случае крайней необходимости возможно применение цефалоспоринов или карбапенемов. Вследствие возможной перекрестной реакции на другие бета-лактамы первое введение антибиотика выполняют только в условиях, гарантирующих оказание неотложной помощи.

Беременность

Все бета-лактамы относятся к категории В. Исследования на животных не выявили токсического действия на плод и новорожденного, однако наблюдения на людях отсутствуют. При необходимости бета-лактамы можно применять для лечения инфекций у беременных.

Нарушения функций почек

Большинство бета-лактамов не оказывают нефротоксического действия, в лечебных дозах они безопасны у больных с заболеваниями почек. Ухудшение функций почек отмечено при применении первых цефалоспориновых антибиотиков (цефалоридина^♠ ). Последующие ЛС лишены прямого нефротоксического действия, за исключением цефалотина, применение которого в сочетании с аминогликозидами сопровождается определенной нефротоксичностью. При использовании метициллина^♠ описано развитие интерстициального нефрита с лихорадкой, кожной сыпью, эозинофилией, протеинурией, гематурией. Риск развития этого осложнения существенно ниже при применении других пенициллиназостабильных пенициллинов (оксациллина, клоксациллина, диклоксациллина).

Гепатотоксичность

Транзиторное повышение уровня трансаминаз и щелочной фосфатазы возможно при применении любых бета-лактамов. Эти реакции проходят самостоятельно и не требуют отмены ЛС. Описано развитие гепатита при использовании оксациллина и азтреонама. При приеме цефтриаксона возможен холелитиаз. Его не следует применять при лечении недоношенных новорожденных, так как он обладает способностью вытеснять билирубин из связи с белками плазмы и вызывать желтуху.

Реакции желудочно-кишечного тракта

Тошноту, рвоту и диарею наблюдают при применении всех бета-лактамов, чаще при приеме внутрь ампициллина. Антибиотик-ассоциированная диарея, вызванная Clostridium difficile, редка, возникает чаще на фоне приема цефалоспоринов широкого спектра действия.

Гематологические реакции - лейкопения, тромбоцитопения - малохарактерны для бета-лактамов.

Применение некоторых цефалоспори-нов и карбоксипенициллинов приводит к геморрагическому синдрому. Цефалоспорины, имеющие в структуре метил-тиотетразольное кольцо (цефамандол, цефотетан, цефоперазон, цефметазол), обладают способностью вызывать гипопротромбинемию вследствие нарушения всасывания витамина К в кишечнике; реже наблюдают кровотечения. К этой реакции располагают недостаточность питания, почечная недостаточность, цирроз печени, злокачественные опухоли. Таким больным следует с осторожностью назначать эти ЛС перед операцией.

Появление геморрагического синдрома на фоне применения карбенициллина или тикарциллина связано с нарушением функций мембран тромбоцитов. Их тоже следует с осторожностью использовать перед операцией и контролировать время кровотечения.

Нарушение толерантности к алкоголю

Дисульфирамподобные реакции при приеме алкоголя вызывают цефалоспорины, имеющие в структуре метилтиотетразольное кольцо (цефамандол, цефотетан, цефоперазон, цефметазол). Больные, получающие лечение этими антибиотиками, должны быть осведомлены о возможности такой реакции.

Побочные эффекты

Наиболее частые побочные эффекты бета-лактамов приведены в табл. 4-4.