Медицинские лабораторные технологии : руководство по клинической лабораторной диагностике : в 2 т. Т. 1

Многообразие объектов исследования, их различные оптические и физические свойства налагают определенные требования на конструкцию оптической, механической и электрической частей микроскопа.

Все объекты исследования под микроскопом можно разделить на две большие группы - прозрачные и непрозрачные. К прозрачным объектам в видимой области спектра относятся почти все биологические объекты, некоторые минералы и кристаллы, фотоэмульсионные препараты; к непрозрачным - руды, угли, минералы, металлы и др.

В каждой из этих групп можно выделить амплитудные и фазовые объекты. Амплитудные объекты изменяют амплитуду (интенсивность) прошедшего через них или отраженного от них света и могут быть видимы через микроскоп без каких-либо дополнительных оптических устройств. К амплитудным объектам относятся все окрашенные препараты. Фазовые объекты не изменяют амплитуду прошедшего через них или отраженного от них света, а изменяют лишь его фазу. Вследствие того, что глаз не чувствителен к изменению фазы колебания света, такие объекты в обычный микроскоп невидимы, и для их наблюдения требуется использование специальных устройств (фазово-контрастных, интерференционных и др.). К фазовым объектам относятся живые неокрашенные микроорганизмы. Большинство объектов являются фазово-амплитудными, т. е. они одновременно изменяют и амплитуду, и фазу прошедшего через них или отраженного от них света.

Амплитудные объекты могут обладать различными коэффициентами пропускания или отражения в зависимости от длины волны падающего света (свойства селективности). Фазовые объекты неселективны в видимой области спектра, но могут иметь различное поглощение и отражение в ультрафиолетовой или инфракрасной области спектра. Исследование спектра поглощения объектом позволяет получить информацию о содержании в нем различных веществ.

Все эти объекты, в свою очередь, могут быть изотропными или анизотропными, т. е. могут обладать или не обладать оптической однородностью в различных направлениях. Для обнаружения анизотропии (двойного лучепреломления) используются специальные оптические устройства - поляризаторы и анализаторы. Анизотропными объектами являются кристаллы, минералы, а также некоторые биологические объекты.

Кроме того, некоторые объекты обладают способностью к свечению под воздействием возбуждающего излучения - явление флюоресценции. При этом длина волны света флюоресценции объекта, как правило, больше, чем длина волны возбуждающего излучения (закон Стокса). Такие объекты называют флюоресцентными или люминесцентными. К люминесцирующим объектам относятся масла, воски, некоторые минералы, бактерии, опухолевые (пораженные) клетки и др. Свечение объектов, не обладающих собственной люминесценцией, можно вызвать с помощью специальных красителей, в частности флюорохромов.

Помимо оптических свойств, объекты различаются по макро- и микроструктуре. Нижний предел наблюдаемых под микроскопом структур в видимой области спектра определяется теоретической разрешающей способностью микроскопа и составляет около 0,2 мкм.

Типы объектов микроскопии показаны на схеме 3-1.

Микроскоп предназначен для наблюдения мельчайших предметов с большим увеличением и высокой разрешающей способностью.

Глаз как приемник излучения имеет следующие основные характеристики.

Глаз не в состоянии определить истинный размер объектов, которые расположены перед ним на неизвестном расстоянии, поэтому можно говорить лишь о видимом размере объекта, соответствующем углу между лучами, проведенными из центра зрачка к двум крайним точкам объекта (рис. 3-1). Этот угол, являющийся мерой кажущейся величины объекта, называют углом зрения (ω).

Под увеличением оптической системы принято понимать отношение размера изображения объекта на сетчатке глаза, образованное при наблюдении через эту систему, к размеру изображения того же объекта, полученному на сетчатке при наблюдении невооруженным глазом. Исходя из этого определения, часто употребляют выражение "видимое увеличение". Степень увеличения Г определяется сравнением увеличенного угла зрения ω' с углом ω, под которым виден объект, находящийся на расстоянии наилучшего видения (D = 250 мм):

Микроскоп имеет оптическую систему (рис. 3-2) с двумя ступенями увеличения: первая осуществляется объективом, вторая - окуляром. Объектив и окуляр на рисунке условно изображены в виде одиночных линз. Объект находится перед объективом на расстоянии, несколько большем, чем фокусное расстояние объектива.

Объектив образует действительное перевернутое промежуточное изображение препарата в плоскости, лежащей вблизи переднего фокуса окуляра. Окуляр работает подобно лупе (промежуточное изображение является для него предметом) и образует вторично увеличенное мнимое изображение, которое расположено от глаза наблюдателя на расстоянии наилучшего видения. Такой микроскоп дает увеличенное перевернутое изображение препарата.

Видимое увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра, если нет промежуточных систем увеличения:

где Г_ок - видимое увеличение окуляра; β_об - увеличение объектива.

где D = 250 мм - расстояние наилучшего видения; f _ok - фокусное расстояние окуляра.

где f_об - фокусное расстояние объектива; А - оптическая длина тубуса.

Оптическая длина тубуса - это расстояние от заднего фокуса объектива до переднего фокуса окуляра. Величина оптической длины тубуса для каждого объектива в зависимости от его фокусного расстояния имеет свое значение и лежит в пределах 150-200 мм.

Кроме того, существуют объективы, оптическая длина тубуса которых бесконечность. В этом случае (рис. 3-3) препарат помещается в передней фокальной плоскости объектива, и из объектива выходит параллельный пучок лучей.

Промежуточное изображение, которое рассматривается посредством окуляра, строится тубусной линзой. При этом увеличение системы объектив - тубусная линза определяется как отношение фокусного расстояния тубусной линзы к фокусному расстоянию объектива: β _об-тл , = f _тл / f_об ,, а увеличение микроскопа: Г = β_об-тл Гок.

Следует различать понятия оптической и механической длины тубуса. Механической длиной тубуса называется расстояние в конструкции микроскопа от нижнего среза тубуса, определяющего положение объектива при установке на микроскопе, до верхнего среза тубуса, определяющего положение окуляра. Величина механической длины тубуса выбирается каждой фирмой по конструктивным соображениям и выдерживается одинаковой для большой группы приборов. Микроскопы ОАО "ЛОМО" стандартизованы на две механические длины тубуса: 160 и 190 мм, зарубежные фирмы выпускают приборы также с длиной тубуса 170, 215 мм и др.

В повседневной практике для расчета увеличения микроскопа используют значения увеличений, нанесенные на оправах соответствующих объективов и окуляров. Например, при работе с объективом 40х/0,65 и окуляром 10х общее увеличение микроскопа будет равно 400.

Используя различные сочетания объективов и окуляров, можно получить увеличение микроскопа в довольно широком диапазоне (от 20 до 2500 крат). Однако для визуальных исследований следует придерживаться оптимального диапазона, который определяется исходя из разрешающей способности глаза соотношением полезного увеличения: 500 А < Г < 1000 А,

где А - числовая апертура объектива.

Применение увеличения меньше 500 А не дает возможности различить все тонкости структуры объекта, которые позволяет выявить объектив с данной апертурой, так как предел разрешения глаза в этом случае меньше, чем у микроскопа. Увеличение, превышающее 1000 А, не позволяет выявить новых деталей в изображении по сравнению с теми, какие различаются при полезном увеличении. Однако на практике увеличение, превышающее 1000 А, используется достаточно часто (например, в проекционных системах - фото, видео).

Понятие апертуры можно определить как пространственный угол, под которым оптическая система позволяет рассматривать исследуемый объект. Половина этого угла называется апертурным углом (рис. 3-4).

Формула для определения числовой апертуры: А = n sinu ,

где n - показатель преломления среды между предметом и оптической системой (для воздуха n = 1); u - апертурный угол.

Таким образом, максимальное значение апертуры при нахождении объекта в воздухе теоретически может составлять 1,0. При использовании иммерсионных жидкостей оно будет приближаться к значению показателя преломления среды иммерсии.

Значение апертуры определяет ряд основных технических характеристик микроскопа, таких как разрешающая способность, полезное увеличение, глубина резкого изображения, светосила.

Под разрешающей способностью понимается способность оптической системы различить две близко расположенные на объекте точки как раздельные. Разрешающая способность может определяться как расстояние (в микронах) между этими точками или количеством разрешаемых пар линий (штрихов) на единице длины (пар лин/мм).

По дифракционной теории изображения Аббе предел разрешения микроскопа определяется как:

где λ - рабочая длина волны (при расчетах в видимой области спектра принимается равной 0,55 мкм); А_к - апертура конденсора; А_об - апертура объектива.

Из приведенных соотношений следует, что чем больше значение апертуры, тем выше предел разрешения. Предельная разрешающая способность микроскопа, работающего в видимой области спектра, составляет ~0,2 мкм (при использовании иммерсии). Достижение предельных значений разрешения требует правильного выбора объектива и системы освещения объекта.

Приведенные соотношения справедливы для наблюдений глазом, применение специальных технологий регистрации изображений позволяет расширить границы (конфокальная микроскопия, ультрамикроскопия).

Глубина резкого изображения - это расстояние, на которое может перемещаться объект относительно объектива без видимого ухудшения резкости (фокусировки) изображения. Ее величина обратно пропорциональна апертуре. Это необходимо учитывать при использовании в ходе исследования объективов разных увеличений. При переходе с малых увеличений (4-10 х) к большим (100 х) без промежуточных (20, 40 х) возможна потеря фокусировки.

Величина апертуры также определяет энергетические возможности системы - чем больше апертура, тем больший световой поток проходит через микроскоп, что позволяет выявить (обнаружить) малоконтрастные и слабосветящиеся объекты исследования.

Значения увеличения и апертуры маркируются (гравируются) на оправе объектива, как правило, в следующем виде: 10х/0,30; 20х/0,40; 63х/0,85; 100х /1,30 ми. Подробнее о маркировке и типах объективов сказано ниже.

Реальная оптическая система изображает предмет с погрешностями, которые принято называть аберрациями. Принято различать типы аберраций для монохроматического (в узком спектральном диапазоне) излучения (сферическая, кома, астигматизм, кривизна изображения, дисторсия) и сложного спектрального состава (хроматические аберрации положения и увеличения). Основными признаками наличия аберраций в оптической системе могут служить низкая контрастность изображения (сферическая аберрация); ухудшение резкости изображения от центра к краю поля, кометообразное изображение точки (кома); искажение формы изображения (дисторсия); различие в прорисовке вертикальных и горизонтальных линий (астигматизм); наличие на краях изображения радужной окантовки (хроматические аберрации). От степени коррекции аберраций зависит качество изображения, создаваемое микроскопом. Основным узлом, определяющим наличие (отсутствие) аберраций в оптической системе микроскопа, является объектив. По степени совершенства исправлений аберраций объективы классифицируются следующим образом:

Реализация возможности микроскопа в получении качественного изображения зависит от всех его оптических компонентов. Объектив играет в этом основную роль, однако без правильно подобранного освещения и системы наблюдения (окулярной насадки) получить требуемое качество изображения невозможно.

Препараты, наблюдаемые в микроскоп, в большинстве случаев несамосветящиеся, и поэтому чтобы их было видно, они должны быть освещены посторонним источником, в качестве которого могут использоваться лампы накаливания, газоразрядные лампы, светодиоды.

Наиболее эффективным способом освещения в микроскопии является способ, предложенный Кёллером.

Способ Кёллера предусматривает наличие двух систем сопряженных плоскостей, ограничиваемых диафрагмами полевой и апертурной (рис. 3.5). Полевая диафрагма сопряжена с плоскостью препарата и ограничивает поле зрения микроскопа (наблюдаемое поле на препарате). В плоскость апертурной диафрагмы проектируется изображение источника света. Апертурная диафрагма ограничивает угол освещающих лучей (апертурный угол) и таким образом регулирует уровень освещенности в плоскости препарата и соответственно в поле зрения микроскопа. Как правило, во всех микроскопах полевая и апертурная диафрагмы - "ирисовые" (имеют круглую форму и регулируемый диаметр отверстия).

Апертурная диафрагма располагается в конденсоре. Изображение источника света и апертурной диафрагмы, созданное конденсором, располагается сравнительно далеко от препарата.

Положение полевой диафрагмы - между коллектором (за источником света) и конденсором; в современных приборах, как правило, на основании микроскопа (под конденсором) или возле фонаря.

В классической системе освещения по Кёллеру указанные диафрагмы позволяют раздельно регулировать апертурный угол освещения (величину числовой апертуры) и поле зрения. Таким образом достигаются необходимая равномерность освещения, минимизация рассеянного света и качество изображения, обеспечивающее правильную передачу структур исследуемого объекта.

Кроме указанного способа освещения по Кёллеру, в микроскопии используются критический способ (при котором источник света проектируется непосредственно в плоскость предмета) и упрощенный способ по Кёллеру. Однако только микроскопы, имеющие осветитель, выполненный по классическому способу Кёллера, позволяют получать высокое качество изображения и использовать в полной мере различные методы контрастирования изображения (темного поля, фазового контраста).

Освещение по методу темного поля. Метод заключается в создании условий освещения, при которых в объектив микроскопа проходят лишь рассеянные (диффузно отраженные) от объекта лучи или лучи, отраженные элементами поверхности, имеющими необходимый наклон по отношению к оптической оси объектива (рис. 3-6).

Освещение по методу темного поля дает изображение мелких элементов объекта, светящихся на темном фоне, у более крупных структур видны только светлые контуры в их изображении. Объектами исследования могут быть дрожжи, бактерии, диатомовые водоросли, частицы коллоида, которые не представляется возможным исследовать при освещении по методу светлого поля, так как на общем светлом поле изображения таких объектов не видны.

Метод темного поля предоставляет возможность выявить структуры, если они отличаются по показателю преломления друг от друга и от окружающей среды.

При освещении по методу темного поля:

Однако следует отметить, что при этом методе освещения по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой. Кроме того, по изображению нельзя также сделать заключение об истинном виде и форме элементов структуры.

Метод фазового контраста применяется для исследования бесцветных и прозрачных объектов, не обладающих способностью поглощать световую энергию, т. е. изменять ее амплитуду (интенсивность). Отдельные участки структуры таких объектов отличаются от окружающей среды показателем преломления, и свет, прошедший через них, приобретает некоторый сдвиг по фазе. Световая волна, прошедшая сквозь объект, претерпевает различные изменения по фазе и приобретает фазовый рельеф, который не воспринимается ни глазом, ни другими приемниками света. Метод фазового контраста позволяет преобразовать фазовые изменения в амплитудные и, следовательно, изменить фазовый рельеф на амплитудный. Для преобразования необходимо искусственным путем сдвинуть фазу колебаний нулевого максимума дифракционного спектра, существующего в плоскости выходного зрачка объектива.

При введении сдвига на опережение фазы колебаний нулевого максимума на π/2 (соответствует λ/4) структуры объекта, вносящие разность фаз от 0 до π/2, будут видны темными на светлом фоне. Такой контраст принято называть позитивным фазовым контрастом. Если структуры объекта вносят разность фаз более π/2, то они будут видны светлыми на темном фоне, происходит так называемая инверсия изображения.

Для контрастирования структур с небольшой разностью фаз только одного сдвига фазы колебаний нулевого максимума дифракционного спектра недостаточно, требуется также снижение интенсивности прямого недифрагированного света. Необходимо учитывать, что в этом случае и инверсия изображения наступит при меньшей разности фаз структур.

В устройствах для фазового контраста изменение фазы и амплитуды нулевого максимума достигается установкой в его плоскости фазовой пластинки определенной формы, коэффициента пропускания и сдвига по фазе. В каждом конкретном случае положение такого элемента определяется конструкцией объектива или устройства, если система фазового контраста встроена в микроскоп.

Возможен вариант негативного фазового контраста, когда фаза колебаний нулевого максимума задерживается на π/2 и объекты становятся более светлыми, чем окружающий фон. Инверсия изображения в этом случае может произойти только для структур с очень большими сдвигами фаз, достигающими значений 3π/2.

Как правило, устройство для наблюдения методом фазового контраста в проходящем свете состоит из конденсора с набором диафрагм и комплекта объективов различного увеличения, предназначенного для работы на конкретном микроскопе.

В конденсоре (рис. 3-7) в передней фокальной плоскости вместо ирисовой апертурной диафрагмы или дополнительно к ней устанавливается ряд кольцевых (световых) диафрагм, размеры которых соответствуют размерам фазовых колец в объективах.

Выбор кольцевой формы для диафрагмы конденсора и фазовой пластинки объектива обусловлен тем, что такая форма создает минимальное перекрытие нулевого, первого и других максимумов и соответственно хорошее разделение максимумов.

Функция фазового кольца двойная: во-первых, поглощение значительной части прошедшего (недифрагированного) света, для чего наносится металлизированное покрытие; во-вторых, осуществление сдвига фазы света на π/2.

В объективе фазовая пластинка (или линза) содержит фазовое кольцо в виде канавки, поэтому лучи, не отклоненные объектом, проходят путь, несколько меньший, чем дифрагированные лучи. Фаза прямых лучей опережает фазу дифрагированных лучей. Таким образом, осуществляется позитивный фазовый контраст, при котором участкам препарата с большим показателем преломления лучей соответствуют более темные участки.

Одним из методов исследования в микроскопии является фотолюминесценция, позволяющая с высокой степенью чувствительности определять химический состав в отдельных элементах структуры объекта, их химические превращения, количество тех или иных компонентов. Фотолюминесценция возникает под действием электромагнитного излучения в видимой или ультрафиолетовой области спектра. На микроскопах исследуется свечение объектов, называемое флюоресценцией. Излучение флюоресценции, определяемое свойствами вещества, характеризуется спектральным составом, степенью поляризации, квантовым выходом. Спектр и квантовый выход остаются неизменными при изменении (в пределах полосы поглощения) длин волн возбуждающего потока. По закону Стокса спектр излучения смещен в длинноволновую область по отношению к спектру возбуждения.

Ряд объектов (нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, ароматические кислоты белков, пигменты - в частности хлорофилл), обладающих первичной или собственной флюоресценцией, светятся под действием излучения. Большинство исследуемых объектов светятся после обработки специфическими красителями (флюорохромами), такое свечение называется вторичной флюоресценцией. Ткани, кажущиеся в обычном освещении неразличимыми, под воздействием специфического красителя могут быть дифференцируемыми. Флюоресцентные исследования на микроскопе получили достаточно широкое распространение, так как обладают высокой чувствительностью к обнаружению специфических объектов (чувствительность к обнаружению вещества флюоресцентными методами оценивается как 10^-12 г) и, в силу сравнительно простой подготовки материала, обеспечивают возможность проведения экспресс-диагностики.

Особенностью флюоресцентного (люминесцентного) микроскопа по сравнению с обычным световым микроскопом является наличие светофильтров возбуждения и запирающих с согласованными спектральными характеристиками (рис. 3-8). Светофильтры возбуждения предназначены для выделения из общего потока от источника света излучения определенного спектрального состава, под действием которого возникает свечение исследуемого объекта. Запирающие (отсекающие) светофильтры предназначены для подавления остаточного рассеянного возбуждающего излучения и выделения свечения объекта.

С изобретением интерференционной светоделительной пластинки Е. М. Брумберга (Россия, 1950), создающей спектральное разделение света возбуждения и света флюоресценции, освещение объектов в люминесцентном микроскопе выполняют светом, падающим сверху через объектив. Такая схема выгодно отличается от освещения проходящим светом, так как роль конденсора в этом случае играет объектив, обладающий большей светосилой. Кроме того, при варианте верхнего освещения не регламентируется толщина препарата. Проблема энергетики для люминесцентного микроскопа является очень значимой, так как квантовый выход флюоресцирующих объектов, как правило, очень мал, поэтому применяются яркие источники света и объективы с повышенной числовой апертурой.

Вид поля зрения в люминесцентном микроскопе - светящиеся объекты на темном, практически черном фоне, что достигается за счет применения светофильтров с согласованными спектральными характеристиками и оптических элементов, у которых отсутствует собственная люминесценция.

Классическая конструкция современного биологического (медицинского) микроскопа (рис. 3-10, 3-11) сложилась в 80-х гг. ХХ века и представляет собой модульную конструкцию, базовым элементом которой является штатив.

Штатив выполняет функцию несущего элемента для крепления на нем и размещения внутри него всех частей микроскопа. Штатив жестко соединен с основанием, внутри которого размещается осветитель проходящего света. Фонарь осветителя вынесен за пределы корпуса осветителя и штатива, что связано с необходимостью обеспечения его эффективной вентиляции. В простых (рабочих) моделях микроскопов при использовании в качестве источника света галогенных ламп небольшой мощности (до 20 Вт) и построении укороченных схем освещения (упрощенный способ Кёллера, критическое освещение) источник света располагается внутри основания, в котором имеются специальные вентиляционные отверстия. Однако наличие вентиляции не позволяет избежать нагрева поверхностей корпуса основания и фонаря, температура которых в местах постоянного контакта с руками (поверхности рядом с ручками управления перемещением столика и фокусировки) может достигать 40-50 °С, а на корпусе фонаря и оправы коллекторной линзы превышать 55 °С. В фонаре предусмотрена возможность регулировки положения источника света (центрировки) относительно апертурной диафрагмы. Осветитель отраженного света устанавливается сверху штатива. В отличие от осветителя проходящего света роль конденсора в нем выполняет объектив. Для разделения световых потоков освещения и наблюдения используется светоделительная пластина, при этом происходят значительные потери света. Поэтому источники для осветителя отраженного света обычно имеют бульшую мощность, чем проходящего.

Основное требование к штативу - высокая жесткость его конструкции, обеспечивающая надежную работу микроскопа во всем диапазоне увеличений и с различными навесными элементами. На практике это означает, что манипуляции, выполняемые в процессе исследования, связанные с перемещением препарата на предметном столике, регулировкой освещения, сменой увеличений и др., не должны приводить к "потере изображения" (расфокусировке, уходу из поля зрения).

Внутри штатива расположен фокусировочный механизм, предназначенный для перемещения предметного столика в вертикальном направлении. Он управляется с помощью двух коаксиальных (расположенных на одной оси) ручек (грубой и точной фокусировки). Перемещение, обеспечиваемое грубой фокусировкой, составляет 30-50 мм, точной - 2-2,5 мм (в ряде моделей последнего поколения кинематическая схема фокусировочного механизма обеспечивает одинаковый диапазон грубой и точной фокусировки). На ручке точной фокусировки гравируется шкала, цена деления которой составляет обычно ~2 мкм. Фокусировочный механизм должен обладать высокими кинематическими характеристиками (отсутствие мертвого хода, скачков и заеданий) и жесткостью, обеспечивающей отсутствие расфокусировки при приложении на предметный столик усилия 1 кгс.

Предметный столик микроскопа служит для размещения на нем объекта наблюдения и перемещения его относительно оси микроскопа. Объекты наблюдения обычно представляют собой тонкие срезы, помещенные на предметном стекле и покрытые покровным стеклом. Для предметных стекол установлены основные размеры 46х 26 и 76х26 мм при толщине стекла 1±0,1 мм (ГОСТ 9284) и для покровных стекол - 18х 18 и 24х24 мм при толщине 0,17 +0,02, -0,04 мм (ГОСТ 6672). Отклонение толщины реального стекла в пределах ±0,01 мм обеспечивает приемлемое качество изображения для объективов, имеющих числовую апертуру более 0,7. Отклонение толщины на ±0,03 мм допустимо для объективов с числовой апертурой в пределах 0,3-0,7. Бoльшие отклонения приводят к ухудшению качества изображения из-за возникновения сферической аберрации.

В основном в медицинских исследованиях применяются прямоугольные предметные столики, обеспечивающие перемещение объекта по двум направлениям на величину 70х30 мм. В моделях микроскопов, предназначенных для исследования в поляризованном свете, применяются круглые столики. Общее требование к предметным столикам - хорошее качество поверхности установки предметного стекла (плоскостность, чистота, прочность покрытия).

Под предметным столиком устанавливается конденсор, который крепится с помощью кронштейна к фокусировочному механизму. Для возможности настройки освещения узел конденсора имеет подвижки в поперечном и продольном направлениях относительно оптической оси микроскопа. Посадочное место унифицировано, что позволяет производить замену конденсоров разных типов (светлопольный, темного поля, фазового контраста и др.).

Револьверное устройство предназначено для быстрого изменения увеличения микроскопа путем смены объектива. Револьверы различаются по количеству гнезд для установки объективов (от 3 до 8) и углу наклона: от наблюдателя (рис. 3-9) или к наблюдателю (рис. 3-10). В правильно собранном микроскопе обязательно соблюдается условие, что смена увеличения не должна приводить к расфокусировке с полной потерей изображения (допускается расфокусировка не более 50 мкм) и смещению поля зрения более чем на 1/3. На практике требование по расфокусировке выполняется для объективов близких увеличений. Это связано с большой разницей величины глубины резкости объективов малых увеличений (для 10x0,20-30 мкм) и больших увеличений (100x1,25-0,4 мкм). Отчасти данная проблема решается путем установки в револьвер объективов в последовательности возрастания увеличения.

Наблюдение объектов осуществляется с помощью бинокулярной насадки, устанавливаемой на верхнем срезе штатива. Вместо бинокулярной насадки в простейших микроскопах могут использоваться монокулярные насадки, а в микроскопах лабораторно-исследовательского класса - тринокулярные насадки, в которых дополнительно образован канал (оптический выход) для фотоили видеопроекции. Место крепления насадок к штативу микроскопа стандартизовано, что позволяет легко производить их замену. Также стандартизован посадочный размер окуляров (Ш = 23,2 или 30 мм). Место локализации промежуточного изображения относительно торца окулярной трубки может составлять 10 или 13 мм (данный параметр важно знать, если возникает необходимость использовать окуляры из "чужого" комплекта).

Для удобства наблюдения бинокулярные насадки оснащаются системой регулировки расстояния между осями окулярных тубусов в соответствии с глазной базой пользователя (55-75 мм) и диоптрийной подвижкой (устанавливается на левую окулярную трубку и позволяет компенсировать аметропию - близорукость, дальнозоркость - наблюдателя в пределах ±5 дптр). К бинокулярным насадкам предъявляется ряд требований: отсутствие посторонних засветок и виньетирования, параллельность осей бинокуляра (в вертикальном направлении не более ±15', в горизонтальном - схождение не более 20', расхождение - не более 60'). Необходимо отметить следующее: глаза могут адаптироваться к непараллельности осей бинокуляра в гораздо большем диапазоне, чем указано выше (при этом не будет наблюдаться двоения изображения), однако работа на таких микроскопах неизбежно приводит к быстрой утомляемости, а при постоянной работе - к ухудшению зрения. К сожалению, данный параметр можно проверить только на специальном оборудовании, а при покупке приходится ориентироваться только на гарантии производителя (репутацию фирмы).

Указанные в данном подразделе требования (кроме стандартизованных) к конструктивным элементам микроскопа не являются обязательными. Они связаны с назначением микроскопа - исследовать объекты при большом увеличении, и могут служить ориентиром при выборе микроскопа и оценке соотношения цены и качества.

Объектив микроскопа представляет собой сложную оптико-механическую систему, дающую увеличенное изображение предмета, и является основной и наиболее ответственной частью микроскопа. Способность объектива передать четкое резкое изображение мелких структур решает главную задачу построения изображения в микроскопе.

Микрообъективы отличаются друг от друга оптическими характеристиками, конструкцией и некоторыми другими параметрами. Общая характеристика различных типов микрообъективов приведена в табл. 3-1.

На рис. 3-11 представлены внешний вид и маркировка комплекта планахроматических объективов отраженного света светлого поля (безрефлексные) с оптической длиной тубуса бесконечность, рассчитанные на работу с препаратами без покровного стекла.

Рекомендуемые увеличения объективов, применяемых при исследованиях в практике клинической лабораторной диагностики при использовании микроскопов проходящего света, представлены в табл. 3-2.

Применение объективов, рассчитанных на работу с иммерсией, имеет ряд особенностей. Использование иммерсии, как показано выше, позволяет значительно увеличить разрешающую способность и светосилу объектива.

Иммерсионной жидкостью заполняют пространство между препаратом и объективом, а также между предметным стеклом и конденсором. Объектив, рассчитанный для работы без иммерсии или с иммерсией определенного вида (масло, вода, глицерин), должен использоваться только с такой средой, в противном случае нарушается четкость изображения.

В качестве иммерсионной жидкости наибольшее распространение получило масло иммерсионное для микроскопии (ГОСТ 13739-78) (ранее использовалось "кедровое"), предназначенное для работы в видимой области спектра с апохроматическими и ахроматическими объективами, кроме люминесцентных.

Водная и глицериновая иммерсии применяются в обычной и ультрафиолетовой микроскопии. Водная иммерсия (дистиллированная вода) часто предпочтительнее масляной по причине простоты настройки (отсутствие воздушных пузырей), а также ее дешевизны. Водная иммерсия имеет и самостоятельное значение: в частности она применяется при микроскопии живых объектов, находящихся в изотоническом растворе натрия хлорида.

Для люминесцентной микроскопии существует специальное иммерсионное масло - нефлюоресцирующее.

Применение иммерсии с изменением показателя преломления (n = 1,515±0,002) может вызвать размытость, вуаль изображения. Использование иммерсии с отклонением по дисперсии (ν = 0,0106±0,0004) вызывает окраску изображения, при этом объектив апохроматической коррекции теряет свое преимущество по сравнению с ахроматом.

Наличие пузырьков в слое иммерсии очень сильно искажает изображение. В таких случаях необходимо эту иммерсию смывать и наносить ее снова.

После работы с иммерсионным объективом (конденсором) остатки иммерсии с фронтальной линзы необходимо удалить фильтровальной бумагой или ватным тампоном. Поверхность линзы осторожно протирают ватным тампоном, намотанным на деревянную палочку и слегка смоченным специальной жидкостью для чистки оптики (рекомендуемый состав жидкости: 85% петролейный эфир, 15% спирт) или бензином.

Применять спирт для чистки объективов не рекомендуется, так как он, проникая внутрь оправы, может растворить клей и тем самым привести объектив в нерабочее состояние.

После чистки объектива необходимо с помощью лупы убедиться, что поверхность чистая и отсутствуют разводы.

Аналогично необходимо провести очистку фронтальной линзы конденсора.

Примечание. Окулярное число - это произведение увеличения окуляра на его линейное поле (например, окуляр 10x имеет линейное поле 15 мм, окулярное число в этом случае будет 10x15 = 150).

При визуальном наблюдении окуляр служит для рассматривания увеличенного изображения предмета, даваемого объективом, и выполняет функцию лупы.

По оптической конструкции окуляры, применяемые в микроскопии, можно разделить на следующие типы: окуляры Гюйгенса, Кельнера, компенсационные, ортоскопические, симметричные, гомалы (проекционные). Общая характеристика основных типов окуляров приведена в табл. 3-3.

Классификация микроскопов и типов исследований

По сложности конструкции, наполнению методиками исследований микроскопы принято разделять на три условных категории.

К категории "рабочие" (рутинные) относятся модели микроскопов, применяемые для выполнения рутинных работ в лабораторной практике, а также для обучения. Микроскопы этой категории в основном обеспечивают наблюдение объектов при освещении проходящим светом по методу светлого поля. Типовые технические характеристики моделей рабочих микроскопов: "критическое" освещение; окулярное поле зрения 18 мм; объективы ахроматической коррекции (иногда ограничены увеличением - 40x); длина тубуса чаще конечная 160 мм, но может быть и бесконечность; упрощенные устройства контрастирования. Микроскопы для рутинных работ - наиболее многочисленная и востребованная группа микроскопов.

Микроскопы категории "лабораторные" имеют улучшенные технические характеристики и предоставляют потребителям возможность исследования объектов с применением классических методов контрастирования. Типовые технические характеристики микроскопов: освещение по методу Кёллера (допускается "критическое"); стандартный ряд увеличений объективов ахроматической или полупланахроматической коррекции (5, 10, 40, 100), размер поля зрения - 18-20 мм; оптическая длина тубуса бесконечность (возможно тубус - 160 мм); тринокулярная насадка; опции темного поля, фазового контраста, поляризации.

Микроскопы категории "исследовательские" (иначе называемые универсальными) обеспечивают наиболее полный набор методов исследования с применением средств автоматизации. Объективы таких микроскопов самой высокой степени коррекции (планапохроматы); поле зрения в пространстве изображений достигает предельно допустимых значений 23-25 мм; освещение по методу Кёллера (проходящего и отраженного света), возможно применение системы освещения для флюоресцентных исследований; применение устройств автофокусировки, сканирования, автоматической обработки изображения с помощью систем цифровой обработки.

Основные модели микроскопов, выпускаемых ведущими фирмами, представлены в табл. 3-4.

Основные виды работ, выполняемых в медицинских лабораториях на микроскопах:

Световые микроскопы, применяемые в практике лабораторных исследований, - это в большей степени микроскопы проходящего (реже отраженного) света для исследования плоских (двумерных) препаратов.

Виды выполняемых исследований:

Типичный объект микроскопических исследований - мазок, срез или капля, расположенные на предметном стекле и закрытые покровным стеклом. Для подсчета клеток в суспензиях используются специальные камеры Горяева, Фукса-Розенталя и др.

На исследуемых препаратах осуществляются следующие анализы:

Наиболее распространенный вид (методика) исследования в клинических, микробиологических, патологоанатомических лабораториях - наблюдение окрашенных специфическими красителями препаратов в проходящем свете при освещении по методу светлого поля.

Общие правила подготовки микроскопа к работе

Рутинный микроскоп обычно поставляется в собранном виде и не требует дополнительных настроек и юстировок. Сложные модели лабораторных и исследовательских микроскопов, как правило, поставляются в виде отдельных модулей, которые необходимо соединить и отрегулировать. В любом случае перед началом работ необходимо ознакомиться с инструкцией и строго придерживаться ее указаний при подготовке микроскопа. Подготовка включает следующие основные работы:

Настройка освещения микроскопа

Настройка освещения микроскопа по методу светлого поля. Качество изображения в микроскопе в значительной степени зависит от освещения, поэтому настройка освещения является важной подготовительной операцией.

Классический метод освещения в микроскопе - освещение по Кёллеру.

Характерные признаки системы освещения по Кёллеру:

Настройка освещения микроскопа по Кёллеру. Для достижения качественного освещения необходимо четко соблюсти центрирование пучков световых лучей по двум системам сопряженных плоскостей - апертурных и полевых.

Предварительную настройку микроскопа начинают с объективом малого увеличения, например 10*/0,25, обладающим наибольшей выходной апертурой.

Фокусировку микроскопа на объект исследования обычно производят следующим образом:

Далее необходимо согласовать центр изображения полевой диафрагмы с центром поля зрения. Сначала нужно сфокусировать конденсор, перемещая его по высоте, на резкое изображение краев полевой диафрагмы, наблюдаемых в поле зрения одновременно с резким изображением объекта. Для наблюдения резкого изображения краев апертурная и полевая диафрагмы должны быть закрыты.

Затем необходимо привести центр изображения полевой диафрагмы в центр поля зрения, перемещая конденсор центрировочными винтами.

Далее следует раскрыть полевую диафрагму по размеру поля зрения. Наблюдая за изображением выходного зрачка объектива непосредственно в окулярный тубус при снятом окуляре или через точечную диафрагму, раскрыть апертурную диафрагму. Выходной зрачок объектива должен быть заполнен изображением нити источника света. При необходимости сместить нить лампы центрировочными рукоятками фонаря. Апертурную диафрагму следует раскрыть по размеру выходного зрачка объектива или для повышения контраста изображения объекта несколько прикрыть.

Строго говоря, такая настройка по центрировке и регулировке раскрытия полевой диафрагмы, исключающая децентрирование согласованных пучков лучей, а также регулировка раскрытия апертурной диафрагмы по выходному зрачку должны производиться для объектива каждого увеличения.

На практике, особенно, если фокусировка на полевую диафрагму обеспечена не для всех увеличений объективов, настройку необходимо повторить с объективом наибольшего увеличения.

После выполнения указанных операций можно приступить к исследованиям.

В современных системах микроскопов, в частности в микроскопах, предназначенных для рутинных работ повседневной лабораторной практики, появились упрощенные системы "критического" освещения.

К достоинствам таких систем относятся, прежде всего, возможность уменьшения массогабаритных характеристик микроскопа, улучшение соотношения цены и качества.

Характерные признаки системы "критического" освещения:

Настройка освещения при системе "критического" освещения. Настройку микроскопа, как и при освещении по Кёллеру, необходимо начинать с предварительной фокусировки на объект при наблюдении наибольшего поля на объекте, т. е. с объективом увеличением 4x (5x) или 10x. Конденсор установить в верхнее положение до упора или на расстояние ~0,5 мм от рабочей поверхности предметного столика.

Далее, наблюдая поле зрения окуляра, убедиться, что затенения отсутствуют и при прикрытии апертурной диафрагмы яркость снижается равномерно. Для повышения равномерности освещения можно незначительно переместить конденсор по высоте. При неравномерном освещении поля зрения необходимо проверить положение изображения нити лампы и при его смещении отцентрировать лампу.

При переходе к объективам других увеличений положение конденсора по высоте не менять.

Апертурную диафрагму конденсора для обоих способов освещения необходимо открывать по размеру выходного зрачка используемого объектива. Для достижения контрастного изображения рекомендуется ее прикрывать примерно на ¹ /₃ диаметра выходного зрачка объектива.

При исследовании препаратов с объективами увеличением 4x (5x) и 10x для освещения поля зрения рекомендуется снимать (вывинчивать) фронтальную линзу из корпуса конденсора.

Регулировка бинокулярной насадки. Для снижения утомляемости при наблюдении в микроскоп необходимо выставить бинокулярную насадку следующим образом:

Работа на микроскопе при наблюдении в темном поле

На микроскопах Микмед-2 и Микмед-6 исследование объектов по методу темного поля можно проводить с помощью кардиоид конденсора КОН-7Т (NA = 1,2, достигается применением масляной иммерсии). В комплект устройства КОН-7Т (рис. 3-12 несколько ниже апертуры конденсора. В комплект, предназначенный для работы с микроскопом Микмед-6, введен объектив 100х/1,25 с диафрагмой, ограничивающей его апертуру. Соответствующие объективы из комплектов указанных микроскопов должны быть заменены на объективы из комплектов устройств КОН-7Т.

Между препаратом и фронтальной линзой объектива обязательно наносится иммерсионное масло. Лучи, освещающие объект, выходят из конденсора в виде полого конуса и не попадают в объектив, если его числовая апертура не превышает NA = 1,2. Поле зрения микроскопа при отсутствии структур в препарате выглядит темным (черным).

Порядок работы. Настройка освещения по методу темного поля представляет определенные трудности для неопытного пользователя.

Упростить настройку освещения поможет предварительная фокусировка и настройка освещения микроскопа по методу светлого поля при использовании объектива увеличением 10х (20х). Очень важно при этом соблюсти заполнение выходного зрачка объектива изображением источника света.

Затем установить исследуемый объект и, закрыв апертурную диафрагму конденсора, попытаться сфокусировать (если это получится) микроскоп на объект.

После этого заменить конденсор светлого поля конденсором темного поля с нанесенной масляной иммерсией (масляная иммерсия та же, что используется для объективов), поднять конденсор сначала до контакта иммерсии с предметным стеклом, затем еще чуть выше.

Установить в окулярный тубус вместо окуляра вспомогательный микроскоп. В поле зрения вспомогательного микроскопа должно быть светлое кольцо с темным пятном посередине, которое необходимо отцентрировать относительно выходного зрачка объектива с помощью центрировочных рукояток устройства крепления конденсора.

Перемещая конденсор по высоте (в небольших пределах, чтобы слой иммерсии не разорвался), найти положение, при котором светлое кольцо выйдет за пределы выходного зрачка объектива.

Установить окуляр и наблюдать поле зрения - на темном фоне должно появиться светлое изображение объекта. Включая объективы других увеличений, провести необходимые исследования. Если при установке объектива другого увеличения возникнет сбоку светлое пятно, необходимо поправить центрировку конденсора для этого объектива.

Толщина предметного стекла не должна превышать 1,1 мм.

Пыль и другие мелкие частицы на предметном и покровном стеклах будут рассеивать свет, создавая помехи, поэтому их необходимо тщательно чистить.

Частицы препарата, лежащие ниже и выше плоскости фокусировки и рассеивающие свет, также вносят вклад в фоновую засветку поля зрения.

При работе с толстым слоем препарата возникает вредный светлый фон из-за рассеянного света, предпочтительны тонкие препараты.

Работа на микроскопе с использованием метода фазового контраста

Для наблюдения объектов по методу фазового контраста в микроскопах Микмед-2 и Микмед-6 предназначено устройство фазового контраста КФ- 4М (рис. 3-13).

В состав устройства входят:

Устройство обеспечивает работу по методу положительного фазового контраста, а также по методу светлого поля.

Конденсор содержит диск с тремя световыми диафрагмами для объективов увеличений 10x (и 20x); 40x; 100x, а также ирисовую апертурную диафрагму для освещения по методу светлого поля. При фиксированном положении диска в окне обозначается увеличение объектива или "0" свободное отверстие.

Порядок работы. Проверить настройку освещения в микроскопе при работе по методу светлого поля, обратить внимание - выходной зрачок объектива 10x должен быть заполнен изображением нити источника света.

Установить на микроскоп вместо светлопольного конденсора фазовый конденсор (диск в положении "0"), фазовые объективы и фазовый препарат.

Включить в ход лучей объектив 10x, прикрыть апертурную диафрагму и сфокусировать микроскоп на изображение препарата (при невозможности - на край покровного стекла), затем переместить препарат на участок с объектом.

Установить в окулярный тубус вспомогательный микроскоп, сфокусировать его на изображение фазового кольца в выходном зрачке объектива.

Установить диск конденсора в положение "10" (или другое положение, соответствующее выбранному объективу).

Наблюдая изображения фазового и светового колец, совместить их центрировочными винтами устройства крепления конденсора. При необходимости подвижкой конденсора по высоте добиться, чтобы изображение светового кольца конденсора полностью вписывалось в изображение фазового кольца объектива.

Заменить вспомогательный микроскоп окуляром, поправить фокусировку микроскопа и приступить к исследованиям.

При настройке освещения по методу фазового контраста необходимо обязательно соблюдать следующие условия:

При выступании светового кольца за пределы фазового происходит существенное снижение контраста или даже совсем пропадает изображение объекта.

Для повышения контраста изображения рекомендуется применять зеленый светофильтр. Светофильтр убирает цветные каемки на монохромном (черно-белом) изображении, которые вызваны ахроматической коррекцией объективов, в основном применяемых для фазового контраста; фазовые же кольца объективов рассчитываются для работы в зеленой области спектра - области наибольшей чувствительности глаза.

Работа на микроскопе с использованием метода исследования в поляризованном свете

Микроскопические исследования в поляризованном свете проводятся с целью изучения оптической анизотропии объектов. Анизотропия, или двойное лучепреломление, в биологических объектах появляется при преимущественной ориентации субмикроскопических частиц из-за механических напряжений или других причин.

Методами поляризационной микроскопии определяются ориентация частиц, направления деформаций, величина двойного лучепреломления (разность показателей обыкновенного и необыкновенного лучей) и разность хода между обыкновенным и необыкновенным лучами в объекте.

Для исследования анизотропных свойств объектов и точного их измерения применяются поляризационные микроскопы, основным отличием которых от обычного микроскопа является наличие специальных поляризационных устройств. Перед конденсором устанавливается поляризационный светофильтр-поляризатор, после объектива - компенсатор и поляризационный светофильтр-анализатор.

Исследования проводятся как при параллельном, так и при скрещенном положении поляризатора и анализатора. Скрещенным положением называется положение, когда плоскости колебаний поляризованных лучей, выходящих из поляризатора и анализатора, расположены под углом 90°. При отсутствии объекта поле зрения микроскопа в этом положении становится темным. При установке препарата, обладающего анизотропией, наблюдаются светлые или окрашенные элементы структуры. По виду элементов проводится оценка свойств анизотропии исследуемого объекта.

Точные измерения в поляризационных микроскопах выполняются с помощью вращающегося предметного столика, оснащенного угломерным лимбом. Грубая оценка разности хода производится с помощью кварцевой пластинки или кварцевого клина, для более точных определений применяют специальные компенсаторы: Сенармона, Берека и др. Такие исследования проводят при низких значениях числовой апертуры конденсора, чтобы исключить наклонные лучи, вносящие искажения в результат исследований.

Обнаружение и качественная оценка эффекта анизотропии в структурах исследуемых объектов могут быть выполнены и на обычном микроскопе, предназначенном для биологических исследований. Для этого необходимо под конденсор установить поляризатор, а над объективом - анализатор; одно из поляризационных устройств должно иметь вращение на угол не менее 100°.

В процессе флюоресцентных исследований на микроскопе осуществляются:

Общие правила настройки микроскопа аналогичны правилам настройки микроскопов проходящего света. Настройка освещения отраженного света заключается в установке лампы в рабочее положение, а точнее, в центрировке электродов лампы относительно выходного зрачка объектива. Процедура выполняется с объективом 10*/0,5. Подвижный коллектор устанавливается в положение наилучшего заполнения светом выходного зрачка объектива, при необходимости достижения наибольшей яркости объекта, наблюдаемого с другим объективом, можно воспользоваться фокусировкой коллектора. При освещении отраженным светом отсутствует необходимость в операции центрировки полевой диафрагмы путем перемещения конденсора, как в системе проходящего света, потому что роль конденсора в данном случае играет объектив. Необходимо помнить, что для работы на люминесцентных микроскопах должны использоваться оптические элементы (объективы, светофильтры и др.) и иммерсионное масло, не обладающие собственной люминесценцией (т. е. способностью "светиться" под воздействием света возбуждения). При правильной настройке и хорошем качестве оптики в поле зрения люминесцентного микроскопа должны наблюдаться светящиеся структуры препарата на темном фоне. Для получения хорошего контрастного изображения предпочтительно работать в затемненном помещении, при отсутствии посторонних засветок.

Наибольшее распространение в качестве источника света для люминесцентных микроскопов получили ртутные лампы. Их использование имеет ряд особенностей:

Для работы с различными флюорохромами микроскопы оснащаются соответствующими наборами светоделительных блоков (от 2 до 4-7), состоящих из светоделительной пластины и светофильтров (возбуждения и отсекающего). Конструктивно они могут быть выполнены как одиночные взаимозаменяемые узлы либо соединены в единый узел в виде каретки ламели или барабана. Обозначение светоделительных пластин ("Зеленая", "Красная" и др.) соответствует цвету наблюдаемой флюоресценции.

В табл. 3-5 приведены характеристики светоделительных пластин и светофильтров к ним для микроскопа Микмед-2, вариант комплектации 11.

ОАО "ЛОМО" предлагает следующие модели микроскопов для люминесцентных исследований: Микмед-6, вариант комплектации 11; Микмед-2, варианты комплектации 11, 12 и МЛП-01.

Микроскопы Микмед-2 и Микмед-6, кроме флюоресцентных исследований при освещении объектов ртутной лампой, обеспечивают наблюдение объектов в проходящем свете по методу светлого поля при освещении от галогенной лампы.

Микроскоп МЛП-01 выпускается в дорожном исполнении и обеспечивает только флюоресцентные исследования, возможность работы в проходящем свете отсутствует.

Развитие техники микроскопии идет по направлениям повышения качества изображения объектов, автоматизации операций управления микроскопом и автоматизации анализа изображения объекта. Хотя уровень автоматизации в представленных на рынке микроскопах весьма разнообразен, в целом по этому критерию современные микроскопы можно разделить на несколько групп.

Основная представленная на рынке часть микроскопов относится к группе традиционных световых микроскопов с ручным управлением и отсутствием функций автоматического анализа изображения. В таких микроскопах выбор объекта, условий его наблюдения (освещенности, увеличения, поля зрения и др.) и анализ полученного изображения полностью зависят от специалиста, проводящего исследование, вследствие чего результат исследования имеет в значительной мере субъективный характер и при отсутствии опыта может приводить к неверной диагностике.

Ко второй группе можно отнести так называемые цифровые микроскопы (ЦМ), в которых изображение поля зрения с помощью видеокамеры или цифрового фотоаппарата передается в компьютер и подвергается в нем программной обработке различными системами анализа изображений (САИ) (рис. 3-14).

В ЦМ выбор объектов и условий наблюдения также зависит от специалиста, проводящего исследование; при этом процесс анализа изображения выполняется с помощью цифровых систем обработки. Цифровой микроскоп может быть скомплектован исследователем самостоятельно из конструктивно и программно совместимых устройств (микроскоп, видеоадаптер, видеокамера, фрейм-граббер, компьютер) или являться интегрированной "рабочей станцией", поставляемой производителем в полной комплектации.

Основную группу составляют универсальные ЦМ, предназначенные для любых объектов. В случае объектов с четкими границами ЦМ может автоматически выполнять измерение и количественный анализ отобранных исследователем или всех объектов поля зрения. В случае нечетких границ размеры или границы определяются исследователем.

Цифровые микроскопы осуществляют стандартные операции информатизации (галереи кадров, база данных, печать, Интернет и др.). Типичные представители ЦМ - VISILOG (Noesis Vision) и KS 400 (Zeiss). Степень автоматизации анализа введенного кадра тем выше, чем более специализирован ЦМ под конкретный анализ или биоматериал. Примеры специализированных ЦМ и САИ: для флюоресцентного анализа - MetaMorph (Universal Imaging); для телемедицины - PACS (Siemens medical Systems); для цитогенетики - Q550CW (Leica); для количественной цитологии и гистологии - МЕКОС-Ц ("МЕКОС"); для трехмерной реконструкции - Denso (Denso). На рынке представлены десятки универсальных и специализированных ЦМ и САИ производства фирм Nicon, Olympus, Media Cybernetics, ChromaVision Medical Systems, PicoQuant, I-Cube, Improvision, Life Science Resource, Syngene, Empix Imaging и др. Среди отечественных САИ представлены программы фирм "МЕКОС", "ВИДЕОТЕСТ", "ДИАМОРФ", DiViSy и др.

Основное назначение ЦМ - визуализация (информатизация) биоматериалов и количественные анализы в случаях высокой концентрации измеряемых объектов (анализ эритроцитов в мазке крови, анализ мазков костного мозга, анализ подвижности сперматозоидов, измерения клеток в цитологических препаратах при дифференциальной диагностике рака и т. п.). При низкой концентрации исследуемых объектов из-за субъективности и трудоемкости ручного отбора кадров для выборки применение ЦМ ограничено.

Разработкой ЦМ на отечественном рынке занимается ОАО "ЛОМО". С 2006 г. началось серийное производство первого поколения ЦМ с зарегистрированным товарным знаком "Микровизор" ("μVizo^® -100"). Микровизоры сочетают в себе достоинства классических микроскопов с удобством визуализации изображения на ЖК-дисплее, цифровой обработкой в режиме on-line и преимуществами системы освещения на основе светодиодных источников. Встроенная цифровая видеокамера, современная микропроцессорная система, специализированное программное обеспечение и ЖК-дисплей делают микровизоры функционально законченными системами наблюдения, регистрации и обработки изображений микрообъектов, не требующими использования внешнего компьютера. Микровизор заменяет целый комплекс оборудования, включающий световой микроскоп, тринокулярную насадку, цифровой фотоаппарат с адаптером, компьютер с монитором и специализированным программным обеспечением.

Микровизоры серии "μVizo^® -100" предназначены для наблюдения изображения микроструктур биологических объектов в проходящем свете по методу светлого поля, а при дополнительной комплектации - по методам темного поля и фазового контраста.

Микропроцессорная система обеспечивает управление основными параметрами изображения, включая настройку цветопередачи, яркости, контраста и резкости картины. Уникальная система цифровой настройки резкости изображения обеспечивает эффект рельефного контрастирования. Программный интерфейс обеспечивает определение линейных размеров объектов, их маркировку и автоматический подсчет их количества в поле зрения. Изображения можно сохранять на flash-карте, просматривать на дисплее микровизора или пересылать в компьютер через USB-порт.

Вешний вид и основные технические характеристики микровизора представлены на рис. 3-15 и в табл. 3-6.

Следующую группу образуют автоматизированные микроскопы (АМ), встроенная моторизованная автоматика которых в той или иной степени упрощает выбор условий наблюдения, облегчая и контролируя перемещение и фокусировку препарата, смену объективов, фильтров, освещения и др. К автоматизированным микроскопам подключаются видеокамера и фреймграббер для ввода изображений в компьютер, и компьютер, через который они могут управляться (рис. 3-16).

Производители АМ снабжают их программным обеспечением общего назначения для выполнения таких функций как проход по заданным траекториям, возврат препарата в заданные точки, визуализация траектории просмотра, фиксация изображения поля зрения в базе данных, автофокусировка.

АМ комплектуются либо на базе обычных ручных микроскопов с заменой штатного предметного стола на моторизованный и с добавлением узлов моторизованной фокусировки, смены объективов и фильтров и блока управления, либо АМ разрабатывается как отдельный полностью интегрированный тип микроскопа. Первый путь, по которому до настоящего времени шли небольшие фирмы (Prior Scientific, Optimas UK, "МЕКОС" и др.), позволяет выпускать мелкие партии недорогих АМ на базе микроскопов разных типов. Отечественным представителем этой группы является МЕКОС-Ц1. В составе МЕКОС-Ц1 используются различные серийные микроскопы (Микмед-2, Motic 3B, Zeiss Axiostar, Leica DMLS, NIKON E200 и др.) с тринокуляром, разработанные "МЕКОС" средства автоматизированного перемещения и фокусировки препарата в составе моторизованного предметного стола, моторизованного узла фокусировки и блока управления, покупные средства ввода изображений и персональный компьютер.

Ряд фирм автоматизирует процесс приготовления препаратов для микроскопии (например, в состав проточных гемоанализаторов Coulter Gen-S и ABX Pentra 120 SPS входит система автоматического приготовления мазков крови). Фирма Ludl Electronics Product снабжает АМ системой автоматической подачи предметных стекол на предметный стол.

Основное назначение АМ - автоматизация простых рутинных повторяющихся операций микроскопии. Примером является "виртуальный микроскоп", когда формируется и запоминается сплошное расширенное сфокусированное изображение препарата, состоящее из группы соседних полей зрения.

Программное обеспечение АМ может предоставлять средства формирования потребителем собственных программ автоматической микроскопии (типа перемещения, фокусировки, смены фильтров и освещения, ввода кадров в соответствии с заранее заданной траекторией и временнoй диаграммой). При совместной работе с САИ автоматизированные микроскопы могут выполнять характерные для цифровых микроскопов виды анализов, автоматизируя операции по выбору условий наблюдения, но сохраняя за исследователем функцию выборки объектов анализа.

В класс автоматических микроскопов-анализаторов (МА) входят системы, состоящие из АМ, САИ и роботизирующего программного компонента, управляющего автоматизированным микроскопом и заменяющего при перемещении препарата глаза и руки исследователя. Микроскоп-анализатор самостоятельно перемещает и фокусирует препарат, выбирает траекторию просмотра в зависимости от распределения биоматериала, контролирует качество освещения и окраски, обнаруживает и записывает в базу данных изображения объектов заданных типов, выполняет измерение и анализ автоматически собранной выборки объектов.

Эффективность работы МА в значительной степени зависит от уровня стандартизации подготовки биоматериала. Поэтому система подготовки препарата является либо его частью, либо МА имеет средства контроля качества препарата. Таким образом, микроскопы-анализаторы не только сочетают в себе функции автоматизированных и цифровых, но и создают новые свойства, автоматизируя процесс сбора выборки анализируемых объектов и обеспечивая контроль качества.

Главное назначение МА - анализ препаратов с невысокой и низкой концентрацией анализируемых объектов, когда сам сбор (поиск и обнаружение) выборки объектов для анализа является трудоемкой операцией. Порядок просмотра таких препаратов исследователем в обычном микроскопе субъективен из-за отсутствия количественных критериев выбора маршрута. Поиск объектов, как правило, требует длительного высокого напряжения и достаточного опыта исследователя. Эти факторы отрицательно сказываются на представительности выборки объектов для анализа. Весьма простое обслуживание МА, выполняющего такой анализ, позволяет поручить эту работу медицинскому персоналу невысокой квалификации, при этом врач-лаборант может сосредоточиться на высококвалифицированных функциях качественной оценки собранных в галереи объектов на экране компьютера, что значительно повышает информативность и надежность анализа, увеличивает производительность труда.

Функции МА пока удалось реализовать для небольшой группы анализов. К подобным интеллектуальным системам относятся: NEOPATH (США) и PAPNET (Бельгия) для анализа мазков с поверхности шейки матки; LSC (США) для измерения субпопуляций клеток при цветной флюоресценции; ACIS (США) для анализа уровня белка HER2 при раке молочной железы; Hitachi 8200 (Япония), Diffmaster-Cellavision (Швеция) для анализа мазков крови, отечественная разработка МЕКОС-Ц1 с программным обеспечением МЕКОС-КМ для анализов мазков крови и костного мозга, мочи, воды, смывов и других биоматериалов. Благодаря мобильности МЕКОС-КМ может быть реализовано на стандартных покупных АМ, в частности на Leica DMLA.

Микроскопия является единственной областью лабораторной диагностики, где все еще доминирует трудоемкий субъективный качественный анализ. Бурный прогресс в области математических методов обработки информации, видео- и компьютерной техники, в производстве автоматизированных микроскопов создал ситуацию, когда микроскопы-анализаторы могут быть реализованы на относительно дешевом стандартном оборудовании, доступном в условиях России.

Являясь одним из видов электромагнитного излучения, свет представляет собой электромагнитные волны. Они распространяются со скоростью около 3•10⁸ м/с (в вакууме). Волновая теория света объясняет такие явления, как, например, преломление света, дифракция и некоторые другие.

К электромагнитным волнам можно применить те же характеристики, которые свойственны хорошо доступным для наблюдения механическим колебаниям - колебаниям струны или, например, морской волны (рис. 3-17): длина волны λ и частота колебаний ν - число колебаний в единицу времени.

Эти характеристики связаны между собой соотношением:

λ • ν = с,

где с - скорость света.

Длина волны измеряется в следующих единицах:

1 мкм (микрометр) = 10^-6 м = 10^-4 см;

1 нм (нанометр) = 10^-9 м = 10^-7 см;

Å (ангстрем) = 10^-10 м = 10^-8 см.

Человеческий глаз способен воспринимать только часть всего спектра электромагнитных излучений - видимый свет, частота колебаний которого соответствует длинам волн от 380 нм до 750 нм (рис. 3-18).

Спектральный диапазон современных фотометрических приборов, работающих в практических медицинских лабораториях, как правило, ограничивается диапазоном видимого света (VIS) и ближнего ультрафиолета (UV).

Кроме явлений, подтверждающих волновую природу электромагнитного излучения, известны и такие явления, связанные с распространением света, как поглощение и рассеяние. Они свидетельствуют о том, что свет - это поток материальных частиц (корпускул), названных фотонами. Энергия светового потока (энергия фотонов) Е пропорциональна частоте электромагнитных колебаний ν:

где h - постоянная Планка, равная 6,624 • 10^-34 Дж • с.

Из этого следует, что энергия излучения прямо пропорциональна его частоте и обратно пропорциональна длине волны (рис. 3-19).

Прохождение потока электромагнитной энергии через какую-либо жидкую среду сопровождается такими явлениями, как поглощение (уменьшение энергии потока), рассеяние и некоторые другие, специфика которых применительно к построению приборов для медицинских (лабораторных) исследований рассмотрена ниже.

Поток световой энергии, переносимый через единицу площади, называют интенсивностью потока световой энергии. На рис. 3-20 показано изменение интенсивности потока световой энергии при прохождении света через раствор (рис. 3-20, а) и дисперсную среду (рис. 3-20, б) с толщиной поглощающего слоя L.

Принятые обозначения:

I₀ - интенсивность падающего потока световой энергии;

I _от - интенсивность потока световой энергии, отраженной от стенки кюветы;

I_n - интенсивность потока световой энергии, поглощенной окрашенным раствором;

I_р - интенсивность потока световой энергии, рассеянного дисперсной средой;

I - интенсивность потока световой энергии, прошедшего через слой исследуемого вещества.

Если не учитывать поглощение потока световой энергии стенками кюветы, то интенсивность падающего светового потока I₀ при прохождении кюветы с раствором и дисперсной средой разлагается на составляющие следующим образом:

I₀ = I_от + I_n + I - для раствора; I₀ = I_р + I_n + I_р + I - для дисперсной среды.

В фотометрии I_от как правило, компенсируется или учитывается.

Характерной особенностью, в отличие от других частиц микромира, является отсутствие у фотона массы покоя, когда при поглощении фотона (его "торможении") прекращается само его существование, а энергия фотона превращается в другие виды энергии.

Оптическое излучение с любой длиной волны при его поглощении веществом может перейти в тепло. Однако для коротковолнового излучения (например, ультрафиолетового) велика вероятность того, что часть поглощенной энергии может возбудить люминесценцию.

При поглощении света внутренняя энергия атома или молекулы скачкообразно повышается от нормального уровня Е₀ до более высокого Е₁:

Если скорость света в вакууме выразить в нанометрах с = 3,00 • 10¹⁷ нм/с, а постоянную Планка в джоулях в секунду h = 6,63 • 10^-34 Дж • с, то энергетическую характеристику фотонов отдельных участков спектра в зависимости от длины волны можно получить из уравнения в джоулях:

Часто при рассмотрении взаимодействия излучения с веществом энергию фотона выражают в электрон-вольтах (эВ; eV).

Электрон-вольт (эВ) - единица энергии, равная энергии, которую приобретает частица, обладающая элементарным электрическим зарядом (равным заряду электрона), проходя разность потенциалов 1 вольт.

1 эВ = 1,602 • 10^-19 Дж, тогда Δ Е в единицах энергии электрон-вольт на длине волны λ будет:

В табл. 3-7 приведены приближенные значения энергии излучения фотона для различных длин волн.

Энергия фотонов коротковолнового участка спектра достаточно велика, поэтому энергетическое возбуждение отдельных молекул при поглощении света может вызвать химическую реакцию, так как энергия фотонов видимой и, особенно, ультрафиолетовой части спектра соизмерима с энергией химической связи.

Для сравнения с энергией химических реакций значение ΔΕ_λ удобнее выразить в килокалориях на моль (ккал/моль). Единица энергии 1 Дж = 0,239 кал, а моль по определению численно равен числу Авогадро (6,02 • 10²³ моль¹ ), и в килокалориях на моль выражение приобретает вид:

Энергия фотонов коротковолнового участка спектра очень велика, поэтому энергетическое возбуждение отдельных молекул при поглощении света может быть вполне достаточным для того, чтобы вызывать химическую реакцию.

Спектры излучения

Функцию распределения излучаемой электромагнитной энергии в зависимости от частоты или длины волны называют спектром излучения.

Излучение энергии на одной частоте и соответствующей ей одной длине волны называется монохроматическим излучением.

Строго монохроматического излучения в природе не существует. Под монохроматическим подразумевают излучение, которое содержит достаточно узкий интервал длин волн, чтобы его можно было охарактеризовать указанием одной длины волны. В практике фотометрии если интервал длин волн (Δλ) не превышает 4 нм, то излучение в большинстве случаев можно считать монохроматическим.

Различают два вида излучения.

Существуют также смешанные полосатые спектры, когда непрерывный спектр имеет ряд узких спектральных максимумов (например, газоразрядные лампы высокого давления).

На рис. 3-21 показаны графики распределения величины у_х , характеризующие излучение в зависимости от длины волны λ для случая линейного и сплошного спектров излучения.

Графиком распределения энергии по спектру называется такая кривая, у которой абсциссой является длина волны λ или частота излучения ν, а ординатой - величина у_х , выражающая мощность передаваемого излучения (поток, светимость, яркость, сила света).

Для линейчатого спектра излучение состоит из нескольких монохроматических излучений, полная характеристика будет представлять сумму этих излучений:

Если у (λ_i ) представляет энергетический поток излучения Φ_э (λ_i ) на длине волны λ_i , то полный поток излучения Φ будет равен:

Суммирование производится по всем . линиям, излучаемым источником в диапазоне длин волн от нуля до бесконечности.

Для сплошного спектра полная величина характеристики мощности излучения определяется интегрированием:

Если величина γ(λ) характеризуется потоком излучения Φ(λ), то полный поток определяется формулой:

где Φ(λ) - величина, которая называется спектральной плотностью потока, т. е. потоком, приходящимся на единичный интервал длин волн:

и характеризует монохроматический поток излучения с длиной волны λ.

Спектральный диапазон потока излучения в пределах от λ₁ до λ₂ равен:

Величина Φ(λ₂ -λ₁ ) - определяется заштрихованной площадью (см. рис. 3-21, б).

Следует обратить внимание, что спектральные величины потоков для линейчатого спектра Φ(λ_. ) и сплошного спектра Φ(λ) имеют различный физический смысл и различную размерность.

Для линейчатого спектра каждая линия Φ(λ_. ) представляет собой излучение в некотором узком интервале длин волн, где сосредоточена почти вся энергия излучения, а в промежутке между линиями эта энергия близка к нулю. Ординаты графика рис. 3-21, а представляют весь поток данной спектральной линии. Размерность потока Φ(λ_. ) - ватт (Вт).

Для сплошного спектра ординатами графика 3.21, б служат значения спектральной плотности потока Φ(λ). Значение потока в пределах какого-то спектрального интервала определяется площадью под кривой в пределах этого интервала. Полный поток Φ соответствует всей площади под кривой.

Единицами величины Φ(λ) служат единицы мощности, отнесенные к единицам, которыми измеряется длина волны, например ватт на нанометр (Вт/нм) или ватт на метр (Вт/м) в системе СИ.

Энергетические и световые потоки

Исторически сложилось так, что характеристики излучения в оптическом диапазоне, воспринимаемые глазом человека, принято называть световыми, а характеристики, не ориентированные на восприятие глазом человека, - энергетическими.

В системе энергетических величин излучение называют иногда лучистым потоком или энергетическим потоком излучения. Для измерения мощности энергетического потока используются общепринятые единицы мощности - ватт (Вт, W).

В системе световых величин мощность светового излучения оценивается специальной единицей - люмен (лм, lm).

В дальнейшем, когда есть необходимость различать энергетические и световые величины (при этом буквенное обозначение этих величин одинаковое), энергетическая величина обозначается с индексом "е", а световые - с индексом "ν"; когда такой необходимости нет, индексы могут быть опущены.

В каждом из двух случаев поток энергии характеризуется интенсивностью, яркостью, спектральным составом и т. д.

В отличие от энергетических величин излучения, излучение световых величин основано на физиологическом действии света и поэтому в значительной мере имеет субъективный характер.

Отношение светового потока к энергетическому называется световой отдачей сложного излучения или световой эффективностью излучения:

где Κ = (лм/Вт).

Здесь Ф_е - поток энергии характеризует свет как физическое явление, а световой поток Φ_ν характеризует физиологическое явление.

Величина Ф_е показывает, какое количество энергии проходит через некоторую поверхность в единицу времени, а Φ_ν определяет ощущение, которое вызывает эта энергия в органе зрения человека.

Соотношения и размерность некоторых энергетических и светотехнических величин представлены ниже.

где Φ_ν (λ) - световой поток на длине волны λ ; Φ_ε (λ) - энергетический поток на длине волны λ ;

Κ(λ) - коэффициент видности, или коэффициент отдачи монохроматического излучения.

Коэффициент видности Κ(λ) есть функция длины волны. Его максимум K_max приходится на длину волны 550 нм. На этой длине волны чувствительность глаза максимальна. На границах видимого спектра при длинах волн больше 750 нм и меньше 380 нм коэффициент видности равен нулю.

На практике установлено, что Κ _max = 683 лм/Вт.

Это значит, что энергетический поток (Ф_е ) на длине волны 550 нм, равный 1 Вт, соответствует световому потоку (Φ_ν ), равному 683 лм.

Относительная спектральная чувствительность среднего глаза или относительная спектральная световая эффективность, или коэффициент относительной видности, величина безразмерная:

Характер изменения относительной видности ν(λ) показан на рис. 3-22.

При решении практических задач иногда необходимо знать относительные значения световых параметров на определенном участке спектра излучателя или приемника, так как в справочной литературе, в технических условиях, в паспортах даются, как правило, абсолютные значения интегральных световых параметров излучателя или приемника.

Если площадь (S), ограниченную кривой функцией V(λ) (см. рис. 3-22), принять за 100 % интегрального значения потока в видимой области (λ = 380-750 нм), то участок площади S_Δλ . будет характеризовать потоки в интервале длин волн Δλ = λ_i+1 - λ_i . Отношение V _{Δ λ i} = S _Δλi / S показывает, какую долю от всего потока в видимой области, воспринимаемой глазом, составляет поток в интервале длин волн Δλ_i •.

Площадь определяется формулой:

где V (λ_. ) - значение относительной видности посредине интервала Δ λ_i . Чем меньше интервал Δλ _i , тем точнее расчет SΔλ_i .

В задачах, когда известно интегральное значение светового потока Φ_ν или другие характеристики световой энергии (яркость, светимость, освещенность и т. д.) и необходимо узнать эти параметры в определенном диапазоне длин волн Δλ _i , они легко рассчитываются по формуле:

Световой поток энергии Φ_{Δ λ i} . измеряется в люменах (лм), распределенный в полосе длин волн Αλ_. (нм).

Существует также понятие светового коэффициента полезного действия η, который определяется формулой:

Для монохроматического излучения перевод энергетических величин в световые величины и наоборот осуществляется через уравнение:

В дальнейшем, если специально не оговаривается, под потоком световой энергии или светом подразумевается энергия в оптическом диапазоне в пределах длин волн 200-800 нм.

Фотометрические методы исследования базируются на способности жидких сред (растворов) поглощать и/или рассеивать, отражать электромагнитное излучение и даже излучать электромагнитную энергию под воздействием световой энергии возбуждения или в результате химической реакции (схема 3-2).

Абсорбционный метод анализа

На абсорбционном методе анализа, или свойстве растворов поглощать видимый свет и электромагнитное излучение в близком к нему ультрафиолетовом диапазоне, основано действие самых распространенных фотометрических приборов для медицинских лабораторных исследований - спектрофотометров и фотоколориметров (видимый свет).

Каждое вещество поглощает только такое излучение, энергия которого способна вызвать определенные изменения в молекуле этого вещества. Иными словами, вещество поглощает излучение только определенной длины волны, а свет другой длины волны проходит через раствор.

Поэтому в видимой области света цвет раствора, воспринимаемый глазом человека, определяется длиной волны излучения, не поглощенного этим раствором. То есть наблюдаемый исследователем цвет является дополнительным по отношению к цвету поглощенных лучей (табл. 3-8).

В основу абсорбционного метода анализа положен обобщенный закон Ламберта-Бера или Бугера-Бера, или Бугера-Ламберта-Бера, который часто называют просто законом Бера (Beer). Он базируется на двух законах.

Первый закон: относительное количество энергии светового потока, поглощенного средой, не зависит от интенсивности излучения. Каждый поглощающий слой одинаковой толщины поглощает равную долю проходящего через эти слои монохроматического светового потока.

Второй закон: поглощение монохроматического потока световой энергии прямо пропорционально числу молекул поглощающего вещества.

Введем наряду с поглощением понятие пропускания световой энергии.

Пропускание (Т) - это отношение интенсивности потока световой энергии, прошедшего через слой исследуемого вещества I, к интенсивности падающего потока световой энергии I₀ (рис. 3-23, а):

Т = I /I₀

Поглощение (А) - это величина, равная lg (1 / T) = = lg (I₀ /I).

Тогда согласно закону Бугера-Ламберта при облучении раствора монохроматического излучения с длиной волны

где α_λ - коэффициент поглощения, являющийся константой и характеризующий поглощающие свойства вещества (соединения) при данной длине волны λ.

Если концентрация раствора С выражена в молях на литр, то коэффициент поглощения a принято называть молярным коэффициентом поглощения и обозначать его как ε.

Следует также иметь в виду, что в разнообразной литературе по спектрофотометрии часто встречаются различные обозначения и даже названия одних и тех же величин (табл. 3-9).

Величина пропускания Т обычно измеряется в процентах и меняется в диапазоне от 0 до 100 %. Поглощение А, экстинкция Е и оптическая плотность D - величины безразмерные. Часто они оцениваются в беллах или ЕОП (единицах оптической плотности). Соотношения между Т и А приведены в табл. 3-10.

При вертикальном направлении светового потока, проходящего через кювету с поглощающим раствором, обобщенный закон Бугера-Ламберта-Бера принимает другую форму. В этом случае (рис. 3-23, б) световой поток вертикально проходит через прозрачное дно кюветы и свободную поверхность раствора, и длина светового потока в растворе не является уже постоянной, так как зависит от наполнения кюветы или, другими словами, от объема раствора в кювете.

Если принять площадь сечения кюветы S неизменной по всей длине светового потока в растворе, то длина пути светового потока L в растворе будет пропорциональна объему раствора V в кювете.

Это следует из приведенных ниже очевидных соотношений:

где V- объем раствора в кювете; S - площадь поперечного сечения кюветы; М - количество исследуемого вещества в растворе.

Подставляя представленные выше соотношения для L и С в формулу (1), получим для закона Бугера-Ламберта-Бера следующее выражение:

При условии, что отношение a _λ /S неизменно, т. е. a _λ /S = const, из формулы (2) вытекает, что величина поглощения Α _λ зависит только от одной переменной - количества поглощающего вещества в растворе (кювете) М:

Действие обобщенного закона Бугера-Ламберта-Бера находит наглядное воплощение в графике линейной зависимости между концентрацией вещества и величиной поглощения, представленном на рис. 3-24.

В ряде случаев происходит нарушение основного закона Бугера-Ламберта-Бера, а график линейной зависимости претерпевает изменения, принимая вид кривой (пунктир на рис. 3-24).

На рис. 3-24 показано, как при концентрации С₂ вместо соответствующего закону Бугера-Ламберта-Бера значения поглощения А₂ был получен результат А₂ ¹ .

Отклонения от линейной зависимости между концентрацией и измеренным значением поглощения могут происходить по целому ряду причин.

Имеют место и другие причины, связанные главным образом с физико-химическими свойствами вещества, которые приводят к отклонению от закона Бера.

Выбор спектральной области для фотометрических измерений

Чувствительность и погрешность фотометрического анализа во многом зависят от правильного (оптимального) выбора длины волны, на которой производятся измерения, от спектра поглощения исследуемого вещества в растворе, спектра поглощения применяемых реактивов и спектра поглощения стандартных калибровочных растворов. Рассмотрим три варианта (рис. 3-25).

Вариант А. В исследуемой области спектра реагент прозрачен и не поглощает световую энергию (спектры поглощения исследуемого вещества в растворе и реагента не перекрываются). Спектры поглощения калибровочных растворов совпадают со спектром поглощения исследуемого вещества.

В этом случае измерение оптической плотности фотометрируемого раствора целесообразно производить в той области спектра, где поглощение является максимальным. Это дает возможность провести измерения с наибольшей чувствительностью и меньшей погрешностью.

Поясним сказанное на примере. На рис. 3-25, вариант А представлен спектр поглощения растворов с концентрациями С₁ , С₂ и С₃ (С₁ < С₂ < С₃ ). Если проводить измерения на участке спектра, где анализируемый раствор поглощает максимальное количество световой энергии (на рисунке этот участок ограничен длиной волны λ_max ), то концентрации С₁ соответствует поглощение 0,6, концентрации С₂ - 1,1, концентрации С₃ - 1,5 единиц оптической плотности (белл). Разность оптических плотностей между концентрациями С₁ и С₃ составляет 0,9 белл.

Если производить измерение на длине волны λ_max , то концентрации С₁ будет соответствовать по глощение 0,15, концентрации С₃ - 0,35 белла.

Разность оптических плотностей между концентрациями С₁ и С₃ в этом случае будет всего 0,2 белла.

Чувствительность измерения на длине волны λ_max в 4,5 раза больше, чем при измерении на длине волны λ_max , следовательно, и погрешность измерения на волне λ_max будет меньше.

Вариант Б. Спектры поглощения исследуемого вещества в растворе и реагента перекрываются, но спектр поглощения калибровочных растворов совпадает со спектром поглощения исследуемого вещества.

Измерение оптической плотности раствора в области максимума поглощения исследуемого раствора, как описано выше, в этом случае может не дать оптимальных результатов, поскольку при этой же длине волны происходит также поглощение световой энергии реагентом, концентрация которого значительно превышает концентрацию исследуемого вещества (для нормального протекания реакции реагент имеется в избытке).

На рис. 3-25, вариант Б показаны спектр поглощения реагента (1) с максимумом λ_p и спектр поглощения раствора исследуемого вещества (2) с максимумом Видно, что на длине волны λ_a разница Dλ_a в оптических плотностях раствора исследуемого вещества и реагента меньше, чем Dλ_max на длине волны λ_опт .

Таким образом, в случае перекрывания спектра исследуемого вещества и реагента измерение следует проводить в области оптимального поглощения, т. е. на длине волны λ_опт , где наблюдается максимальная разность Dλ_опт .

Вариант В. Другим примером, требующим специального подхода, является анализ раствора, содержащего, помимо исследуемого вещества с максимумом поглощения λ₁ , еще другое вещество, которое смещает максимум поглощения на длину волны λ₂ .

Это тот случай, когда спектр поглощения "стандартных" калибровочных растворов не совпадает со спектром исследуемого раствора.

На рис. 3-25, вариант В показан спектр поглощения калибровочного раствора (1) с максимумом поглощения λ₁ и спектр поглощения исследуемого раствора (2) с максимумом поглощения λ₂ . Во избежание ошибки анализа в данном случае требуется фотометрировать калибровочные и исследуемые растворы на длине волны λ₃ , которая соответствует точке пересечения кривых 1 и 2.

Фотоколориметры

Приборы, предназначенные для определения количества окрашенного вещества путем измерения величин поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного спектра, называются фотоколориметрами.

Принцип действия. От источника видимого света световой поток проходит через светофильтр. Благодаря его избирательности, из всего излучаемого спектра вырезается область, близкая к длине волны, соответствующей максимальной величине поглощения исследуемого вещества (рис. 3-26).

В результате на исследуемый образец падает световой поток, приближающийся к монохроматическому. Это является необходимым условием для действия закона светопропускания Бера.

После прохождения через контейнер (кювету) с исследуемым образцом световой поток, часть энергии которого была поглощена раствором, поступает на детектор. При этом величина энергии светового потока, падающего на приемное устройство детектора, оценивается путем ее преобразования в электрический сигнал.

Назначение остальных, не упомянутых здесь блоков: получение и представление окончательного результата в виде показания стрелочного прибора (в простейших моделях) или в цифровой форме на экране специального дисплея с документированием результата на печатающем устройстве (или без такового) в единицах оптической плотности (поглощения), пропускания или непосредственно в единицах концентрации исследуемого вещества.

Источник излучения (света). Источником света для видимого участка спектра, в котором работают фотоколориметры, часто служит вольфрамовая лампа накаливания.

Светофильтр. Устройство, которое пропускает световые волны определенной длины волны и поглощает другие, называется фильтром. Для этих целей в фотоколориметрах используются стеклянные фильтры.

Стеклянный фильтр представляет собой один или несколько слоев цветного стекла, пропускающих только те волны света, которые не поглощаются данным конкретным цветом фильтра. В абсорбционном фильтре Раттена (Wratten) между двумя чистыми стеклами располагается слой окрашенного желатина, позволяя тем самым только волнам определенной длины пройти сквозь фильтр, а следовательно, и через кювету с образцом.

Основные преимущества стеклянных фильтров - их низкая стоимость и простота использования. Главный же их недостаток заключается в относительно широком интервале (диапазоне) длин волн светового потока на выходе светофильтра - до 60 нм, что отдаляет характеристики этого потока от монохроматического. Диапазон длин волн, пропускаемых фильтром, называют полосой пропускания.

Чтобы получить излучение на входе образца с более узкой, чем у стеклянных фильтров, полосой пропускания, применяют интерференционные фильтры. Обычно интерференционные светофильтры имеют ширину полосы пропускания в пределах 6-20 нм.

Величина полосы пропускания любого фильтра может быть оценена по спектральной характеристике, представленной в виде зависимости пропускания Т или оптической плотности D от длины волны λ.

На рис. 3-27 на спектральной характеристике Т(λ) некоего интерференционного фильтра показана его полоса пропускания Δλ,

равная в данном случае 10 нм; видно, что полоса пропускания измеряется на уровне ¹ /₂ от максимального значения пропускания Т_max , имеющего здесь место при длине волны 450 нм. Именно уровню ¹ /₂ Т_max соответствуют точки А и В на кривой пропускания со значениями ординат 445 нм и 455 нм. Их разность и дает в нашем примере значение полосы пропускания 10 нм.

Приборы с интерференционными фильтрами обычно называют фотометрами.

Фотометры, как и колориметры, работают только на фиксированных длинах волн, при которых спектральные характеристики используемых фильтров имеют максимальные значения. Для фильтра со спектральной характеристикой, представленной на рис. 3-27, эта длина волны, как отмечалось выше, равна 450 нм.

Кюветы. Сосуд (емкость), в котором размещается исследуемый образец и который пропускает через свои стенки световой поток, т. е. является оптически прозрачным, называется кюветой.

Кюветы могут быть круглыми, квадратными, цилиндрическими или прямоугольными. Кюветы квадратного сечения из-за параллельности боковых стенок обеспечивают бoльшую точность. Кюветы с сечением круглой формы вызывают рассеивание падающего света.

Для измерений поглощения в видимом свете, т. е. при работе с фотоколориметрами, используются кюветы из стекла или из оптически прозрачного полистирола (одноразовые).

Часто кюветы, используемые в повседневной практике, рассчитаны на длину светового пути в 1 см. Для работы с образцами малых объемов применяются микроячейки для объемов проб 100 мкл и менее.

Для исключения дополнительных погрешностей в процессе фотометрических исследований следует соблюдать особую тщательность при обращении с кюветами, избегая появления на них отпечатков пальцев, воздействий, приводящих к образованию на их поверхности пятен, царапин или помутнений. Вытирать кюветы после тщательного и осторожного мытья следует только безворсовой тканью или специальной бумагой, предназначенной для протирки оптических поверхностей. Отдельные кюветы в ряде случаев конструктивно объединяются в систему кювет или ячеек, образуя специальные блоки кювет (контейнеры) для многоканальных фотометрических приборов. Они называются в зависимости от конструктивного исполнения "планшетами", "стрипами" и т. п. (см. главу 19).

Важной разновидностью конструктивного исполнения контейнеров для образца является проточная кювета. В кюветах проточного типа образец подается в измерительную проточную ячейку по тефлоновым трубкам, прикрепленным к входному и выходному отверстиям ячейки.

Для подачи образца в измерительную ячейку обычно используется перистальтический насос. Проточные кюветы обеспечивают постоянную величину пути для светового потока и быстроту замера оптической плотности образца. Между замерами ячейка автоматически промывается самим исследуемым раствором, чтобы свести к минимуму перенос вещества от одного измерения к другому.

Для обеспечения кинетических исследований в фотометрических приборах предусматривается термостатирование кюветы с поддержанием заданной температуры раствора (реакционной смеси).

Детекторы. Во всех фотометрических приборах для преобразования светового потока в электрический сигнал используются специальные устройства: фотоэлектронные умножители (ФЭУ), фотоэлементы и фотодиоды, называемые детекторами.

Фотоэлектронный умножитель преобразует световую энергию в электрические импульсы, которые усиливаются и поступают на считывающее устройство. Принцип действия современных трубчатых фотоумножителей основан на использовании специальной трубки из фоточувствительного металла, который поглощает световую энергию, испуская электроны в количестве, пропорциональном падающей лучистой энергии.

Фотоэлемент (фототрубка) состоит из светочувствительного катода, изогнутого в виде трубки и покрытого цезием, и узкого цилиндрического анода. Испускаемые катодом электроны собираются на аноде, образуя во внешней цепи ток, поступающий на датчик для измерения.

Фотодиод (светочувствительный диод - LDD) обычно изготавливается из кремниевого материала, в более современных разработках применяются кремниевые микросхемы, которые и преобразуют энергию светового потока в измеряемый затем электрический сигнал.

Работа одноканального колориметра

После представления основных элементов колориметра становится возможным понимание работы всего прибора в целом по его обобщенной структурной схеме (рис. 3-28).

Из светового потока, формируемого источником световой энергии - лампой накаливания (1), диафрагма (2) вырезает узкий луч, создавая как бы "точечный" источник света. Оптическая система (3) формирует параллельный поток световой энергии, который фильтруется полосовым фильтром (4). Φильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны λ в диапазоне длин волн Δλ. Оптическая система (5) формирует световой поток таким образом, чтобы при минимально допустимом объеме исследуемого раствора и многократной установке кюветы (6) в кюветное отделение геометрия потока не изменилась. Это значит, что площадь и форма пятна, образуемого световым потоком на чувствительной площадке детектора - фотоприемника (7), остается постоянной и практически не зависит в заданных пределах от объема раствора в кювете и смены кюветы в кюветном отделении (полагаем, что кюветы идентичны).

Φотоприемник трансформирует световую энергию в электрическую. Аналоговый сигнал в виде тока (напряжения) преобразуется аналого-цифровым преобразователем (8) в цифровую форму. Микро-ЭВМ (9) пересчитывает цифровой сигнал, принятый с преобразователя, в единицы измеряемых параметров.

Калибровочные коэффициенты, полученные в процессе калибровки прибора, хранятся в памяти ЭВМ. Данные по калибровочным растворам, необходимые для градуировки прибора, вводятся с пульта оператора (11). Результаты измерения выдаются на цифровой индикатор (10), интерфейс связи с внешней ЭВМ или регистрирующее устройство (12).

Калибровочные и исследуемые растворы подаются в кюветы, которые оператором вставляются и вынимаются из кюветного отделения.

Полосовой светофильтр, соответствующий методике проведения конкретного исследования, устанавливается также вручную.

Прибор может иметь два режима работы:

Режиму анализа должна предшествовать калибровка.

В режиме калибровки оператор с пульта вводит нормированные значения, приписанные данному калибровочному раствору, последовательно подает в кюветное отделение калибровочные растворы и проводит измерения.

В режиме анализа оператор устанавливает в кюветное отделение кювету с исследуемым раствором и проводит измерение.

Если у прибора отсутствует режим автоматической калибровки, то оператор строит градуировочный график зависимости оптической плотности и нормированных значений, приписанных калибровочным растворам.

Основное отличие спектрофотометра от фотоколориметра состоит в возможности пропустить через исследуемый образец световой поток любой требуемой длины волны, проводить фотометрические измерения, сканируя (просматривая) весь диапазон длин волн не только видимого (VIS) света - от 380 до 750 нм, но и ближнего ультрафиолета (UV) - от 200 до 380 нм.

Последнее обстоятельство не исключает целесообразности выпуска недорогих спектрофотометров, не имеющих источника ультрафиолетового излучения и работающих только в видимой части оптического диапазона волн.

Целью упомянутого и очень важного режима работы спектрофотометров - режима сканирования - является построение спектральной кривой поглощения (абсорбции) и нахождение на ней пиков, а также исследование процессов интерференции и поиск ложных пиков, приводящих к ошибочным результатам при спектрофотометрических исследованиях.

Основные компоненты однолучевого спектрофотометра показаны на рис. 3-29.

Принцип работы. Полихроматический свет от источника проходит через монохроматор, который разлагает белый свет на цветовые компоненты. Монохроматическое излучение с дискретным интервалом в несколько нанометров проходит через ту часть прибора, где располагается образец с исследуемой пробой.

Источник света. Спектрофотометр UV/VIS (ультрафиолет + видимый свет) имеет два источника света: для видимого участка спектра и источник ультрафиолета - от 100 до 390 нм.

Источником видимого света служит вольфрамовая, как правило, галогенная лампа, дающая постоянный поток света в диапазоне 380-950 нм, являясь стабильным и долговечным источником световой энергии со средним сроком службы более 500 ч.

В качестве источника УФ-лучей используются водородные или дейтериевые лампы. Ультрафиолетовые лампы, содержащие дейтерий, имеют высокую интенсивность излучаемого потока и непрерывный спектр в диапазоне от 200 до 360 нм.

Устройство и принцип работы спектрофотометра. На рис. 3-30 представлена обобщенная структурная схема спектрофотометра.

Рассмотрим взаимодействие и функциональное назначение элементов структурной схемы.

Поворотный отражатель (2) направляет поток световой энергии от одного из источников (1 или 3), через оптическую систему (4) на входную щель (5) монохроматора. С выхода монохроматора через щель (9) поступает монохроматический поток световой энергии с определенной длиной волны λ. Установка необходимой длины волны чаще всего осуществляется путем изменения угла падения полихроматического потока световой энергии по отношению к плоскости диспергирующего элемента (7) (принцип работы монохроматора рассмотрен ниже). Оптическая система (10) формирует световой поток таким образом, чтобы при минимально допустимом объеме исследуемого раствора и многократной установке кюветы (11) в кюветное отделение геометрия потока не изменилась. Далее принцип работы и устройство спектрофотометра аналогичны принципу работы и устройству одно-канального колориметра (см. рис. 3-26, 3-28).

Монохроматоры

Действие спектральных приборов - спектрофотометров - основано на том, что в некоторых физических системах условия прохождения света оказываются различными. Такие системы называются диспергирующими. Обычно в качестве диспергирующего элемента используют призму или дифракционную решетку. Устройства, позволяющие разделить полихроматический свет на монохроматический спектр излучения, называются монохроматорами (рис. 3-31).

Щель (1), на которую падает полихроматический поток световой энергии, находится в фокальной плоскости линзы (2). Эта часть прибора называется коллиматором. Выходящий из объектива (2) параллельный поток световой энергии падает на призму (3). Вследствие дисперсии (обусловленной зависимостью показателя преломления от длины волны) свет различных длин волн выходит из призмы под разными углами. Если в фокальной плоскости линзы объектива (4) поставить экран (5), то линза сфокусирует параллельные потоки энергии для различных длин волн в разных местах экрана. Поворачивая призму (3), можно просканировать через щель (6) монохроматические потоки энергии во всем спектре излучения. Часто в качестве диспергирующего элемента используется дифракционная решетка, представляющая собой стеклянную или металлическую пластину, на которую нанесены параллельные одинаковые штрихи, расположенные на строго одинаковых расстояниях друг от друга.

На рис. 3-32 показана дифракционная решетка, состоящая из чередующихся параллельных друг другу щелей одинаковой ширины (6), расположенных на одинаковом расстоянии "а" друг от друга. Сумма "а + b" является периодом этой структуры и называется постоянной решетки "d".

Через входную щель (1) полихроматический поток световой энергии линзой объектива (2) трансформируется в параллельный поток, который проходит через щели дифракционной решетки (3). В каждой точке на экране (5), расположенном в фокальной плоскости линзы объектива (4), соберутся те лучи, которые до линзы были параллельными между собой и распространялись под определенным углом Q к направлению падающей волны.

Поэтому освещенность в точке Р на экране (5) определяется результатом интерференции вторичных волн, распространяющихся как от разных участков одной щели, так и от разных щелей. Существует направление, распространяясь по которому, вторичные волны от всех щелей будут приходить в точку Р в одной фазе и усиливать друг друга, и другое - когда волны не совпадают по фазе и ослабляют друг друга. Таким образом, на экране наблюдается чередование светлых и темных полос. Условие формирования максимумов от дифракционной решетки, т. е. когда волны усиливают друг друга при интерференции, наблюдается тогда, когда разность хода равна целому числу волн. Зависимость формирования максимумов различных длин волн от угла Q дифракционной решетки выражается формулой:

где К = 0, 1, 2…​

Если на решетку падает свет разных длин волн, то максимумы для различных длин волн располагаются под различными углами Q к первоначальному направлению распространения света. Поэтому дифракционная решетка разлагает полихроматический свет в дифракционный спектр и употребляется как диспергирующий прибор.

Дифракционная решетка технологически более сложное изделие, чем призма. Большинство применяемых в настоящее время решеток изготовлены способом выжигания и голографического копирования и представляют собой пластины с большим числом параллельных штрихов - до нескольких сот на миллиметр.

Основное преимущество использования призмы в спектрофотометре - ее низкая стоимость.

Преимущество дифракционных решеток состоит в том, что они обеспечивают линейную дисперсию света на всем диапазоне видимого и УФ-спектров. Отрицательным моментом применения дифракционных решеток является их высокая стоимость в сравнении с призмами и светофильтрами.

Одна из самых важных характеристик монохроматоров - полоса пропускания, измеряемая в единицах длин волн - нанометрах.

Если интерференционные фильтры дают ширину пропускания в диапазоне 6-20 нм, то призмы и дифракционные решетки дают более узкую полосу - менее 5 нм, а следовательно, и бoльшую "чистоту" (монохромность) света, падающего на кювету с образцом. Полоса пропускания является одной из важнейших характеристик спектрофотометра. Уменьшение полосы пропускания влечет за собой повышение разрешающей способности спектрофотометра - значимой характеристики качества спектрофотометрических приборов.

Кюветы. Все сказанное выше в отношении кювет применительно к фотоколориметрам и фотометрам полностью относится и к спектрофотометрам.

Специфичным остается только применение кварцевых кювет в случае работы спектрофотометров в УΦ-диапазоне, так как обычное стекло ультрафиолетовое излучение поглощает. В спектрофотометрах также применяются одноразовые кюветы из пластика, прозрачного для ультрафиолетовых лучей.

Детекторы. Применение кремниевых фотодиодных матриц в современных моделях спектрофотометров позволяет повысить характеристики точности и быстродействия, расширить возможности выбора полос пропускания. Использование в спектрофотометрах излучения в УΦ-диапазоне накладывает повышенные требования на чувствительность детектора. При этом предпочтение, как правило, отдается фотоумножителям как более чувствительным вариантам построения детектора.

В отношении считывающих или выходных устройств спектрофотометров обычно выдвигаются более высокие требования по сравнению с требованиями к аналогичным устройствам фотоколориметров или фотометров (дисплеи, записывающие устройства, интерфейсы). Это связано, прежде всего, с задачами построения спектров, их анализа и наглядного представления, документирования и архивирования результатов.

Спектрофотометры с фотодиодной решеткой

Особый тип спектрофотометров - приборы с фотодиодной решеткой или матрицей (PDA). Здесь свет от источника направляется непосредственно на образец и уже после этого - на дифракционную решетку, которая проецирует разложенный по поддиапазонам свет на фотодиодную решетку или матрицу. Последние содержат определенное количество фотодиодных датчиков, преобразующих световую энергию в электрические импульсы. Поэтому любой диапазон длин волн при подобной конструкции спектрофотометра дает "отклик" практически мгновенно, а не последовательно, как это имеет место в традиционной спектрофотометрии. Электрические импульсы с фотодиодов обычно обрабатываются микрокомпьютером с выводом результатов на дисплей. В зависимости от используемого для работы диапазона волн используются дейтериевая и/или вольфрамовая лампы.

Количество фотодиодов определяет разрешающую способность спектрофотометрического прибора. Применение фотодиодной решетки служит важным элементом проведения кинетических исследований, позволяя одновременно производить замеры исследуемого субстрата и образующегося в ходе реакции продукта при различных длинах волн. Использование данной схемы обеспечивает высокое быстродействие при работе спектрофотометра в режиме сканирования: менее одной секунды на диапазон сканирования.

Важно подчеркнуть, что главные принципы действия спектрофотометра, отдельные оптико-механические схемы, блоки и узлы находят применение в различных специализированных приборах и автоматических анализаторах для клинических биохимических исследований.

Основное назначение современных абсорбциометрических приборов - определение концентрации растворов с исследуемым веществом посредством сравнения величин поглощения или пропускания световой энергии исследуемого раствора и раствора известной концентрации.

Различия между колориметрами, фотометрами и спектрофотометрами описаны выше.

В настоящее время на рынке фотометрических приборов и в практических лабораториях можно встретить большое разнообразие различных по конструкции и характеристикам колориметров, фотометров и спектрофотометров.

Приборы могут различаться:

Существуют и другие отличительные признаки, так или иначе влияющие на параметры и эксплуатационные характеристики приборов.

Основные параметры и характеристики колориметров

1. Спектральный диапазон. Он характеризует спектральный диапазон длин волн, в которых работает прибор. Диапазон задается в нанометрах. В большинстве случаев фотометры (колориметры) работают в спектральном диапазоне 340-700 нм. Диапазон работы спектрофотометров, как правило, значительно шире (200-950 нм). Так как фотометры, в отличие от спектрофотометров, формируют заданную длину волны дискретно с помощью полосовых фильтров, то каждому фотометру придается набор светофильтров.

Светофильтр аттестуется длиной волны, соответствующей максимуму пропускания, и полушириной полосы пропускания Δλ. Как отмечалось выше, применяются светофильтры в основном двух типов:

Ширина полосы пропускания светофильтров из цветного стекла значительно больше ширины полосы пропускания интерференционных светофильтров. В среднем для стеклянных светофильтров ширина полосы пропускания Δλ лежит в пределах 20-50 нм, для интерференционных - 6-20 нм. Фотометрическое определение получается тем точнее, чем уже полоса пропускания фильтра Δλ.

Если область максимального поглощения света фотометрируемым раствором достаточно широкая - значительно больше полосы пропускания фильтра, то влияние изменения полосы пропускания на точность измерения сказывается меньше, чем для случая, характеризуемого узкой областью поглощения света раствором.

2. Динамический диапазон измерения. Энергия светового потока, прошедшая через раствор, измеряется с помощью фотоприемников; при этом сила тока, возникающего в фотоприемнике, прямо пропорциональна интенсивности светового потока, падающего на фотоприемник. Измеряя значения возникающих фототоков для случая пропускания исследуемого раствора и раствора сравнения (нулевого раствора), а затем, логарифмируя отношение этих величин, приборы выдают значение оптической плотности (D) в беллах (Б). Иногда, как уже отмечалось выше, вместо термина "оптическая плотность" (D) используют термины "абсорбция" (А) или "экстинкция" (Е).

Измерение оптической плотности в современных колориметрах лежит в диапазоне от 0 до 2,0 Б. Существуют приборы с диапазоном измерения до 3 белл и более, однако метрологическая оценка такого диапазона весьма проблематична.

Диапазон измерения может быть представлен и диапазоном светопропускания. Светопропускание (Т) оценивается в процентах. Напомним, что оптическая плотность (D) и светопропускание (Т) связаны зависимостью:

где I₀ - интенсивность потока световой энергии на выходе кюветы с раствором сравнения (нулевым раствором); I - интенсивность потока световой энергии на выходе кюветы с исследуемым раствором.

Таким образом, диапазону оптических плотностей от 0 до 2 соответствует диапазон по свето-пропусканию от 100 до 1%.

3. Метрологические характеристики фотометрических приборов. Возможные формы представления погрешности приведены в специальном подразделе настоящей главы.

4. Максимальный и минимальный объем фотометри-руемого раствора. Максимальный объем определяется объемом измерительной кюветы, а минимальный допустимый объем раствора, при котором еще возможно получение гарантированных результатов измерений, определяется, помимо конструкции кюветы, возможностью приемно-усилительного тракта прибора. Современные фотометрические приборы могут работать с минимальными объемами раствора в диапазоне 10-500 мкл.

5. Градуировка прибора. В соответствии с ГОСТ "Метрология. Термины и определения" можно принять, что процесс приготовления набора стандартных растворов и задания им нормированной характеристики (величины концентрации раствора) есть процесс калибровки растворов (меры), по которым производится в дальнейшем градуировка прибора.

Многие современные приборы имеют процессоры, запоминающие устройства, которые позволяют автоматизировать процесс построения градуировочных характеристик самим прибором. Возможности некоторых приборов ограничены объемами памяти, что, в свою очередь, ограничивает количество (набор) стандартных растворов различных концентраций, необходимых для градуировки прибора.

Обычно признается достаточным, если прибор позволяет работать с четырьмя стандартными растворами различной концентрации. Тем не менее имеются приборы, позволяющие при построении градуировочной характеристики обрабатывать результаты измерений 24 растворов и хранить несколько градуировочных характеристик одновременно. Приборы более высокого класса, имеющие энергонезависимое запоминающее устройство, позволяют сохранять информацию, в том числе и градуировочные характеристики, в течение длительного времени (нескольких месяцев) даже при отключении прибора от сети.

6. Способы отображения и регистрации информации. В общем случае фотометры могут выдавать информацию в светопропускании, в оптической плотности, в единицах концентрации исследуемых растворов или в тех единицах, в которых указаны значения калибровочных (стандартных) растворов.

В качестве отображения информации в приборах используются стрелочные, цифровые и алфавитно-цифровые индикаторы. Информация регистрируется принтерами самых различных конструкций. Большинство приборов имеет связь с внешней ЭВМ, чаще всего через стандартный интерфейс RS-232C.

Конкретные значения упомянутых выше и других параметров можно проследить по представленным ниже примерам абсорбциометрических приборов, содержащим данные о характеристиках конкретных моделей из их фирменных проспектов.

Нефелометрический анализ

Этот вид исследования проводится с целью определения концентрации, размера и формы диспергированных частиц в дисперсных средах.

Аппаратура для нефелометрических исследований представляет собой специализированные спектрофотометры для измерения интенсивности рассеянного света под углом к направлению падающего на раствор светового потока.

Первым способность частиц рассеивать свет описал Дж. Рэлей (J. Rayleigh) более 100 лет тому назад. Важная в прикладном плане суть этого явления заключается в том, что интенсивность и направление светового потока, рассеянного гомогенной взвесью частиц, зависят от размера частиц.

На рис. 3-33 показаны два наиболее значимых случая рассеяния света. Рэлеевское, или симметричное, рассеяние имеет место, когда размер частиц не превышает 0,1 от длины волны - вариант А.

Частицы больших размеров рассеивают свет неравномерно. Когда размер (d) приблизительно равен длине волны светового потока (см. рис. 3-33, вариант А), вперед - по направлению потока - рассеивается больше света, чем в обратном направлении (см. рис. 3-33, вариант Б).

Приборы, предназначенные для нефелометрических исследований, называются нефелометрами.

Длины волн, используемые в большинстве нефелометров, находятся в диапазоне 340-650 нм.

Если учесть, что системы антиген-антитело содержат гетерогенные популяции частиц с размерами от 250 до 1500 нм, а используемые в аппаратуре длины волн - величины того же порядка, что и размеры исследуемых частиц, бoльшая часть света будет рассеиваться под углом 90°. Поэтому, хотя для измерения рассеивания света датчики могут быть установлены под углом от 5° до 90°, наилучшие характеристики по чувствительности при нефелометрических измерениях будут достигнуты, если измерять интенсивность света, рассеянного под углом 90° (рис. 3-34).

Турбидиметрический анализ

Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Метод аналогичен колориметрическому, но в ряде случаев измерение может происходить в потоке "белого света" без применения полосовых фильтров.

С точки зрения чувствительности метода, в частности при определении концентрации иммуноглобулинов, сравнение нефелометрии и турбидиметрии оказывается в пользу нефелометрии, так как этот метод более чувствителен, когда небольшое количество взвешенных частиц приводит к заметному возрастанию сигнала при незначительном фоне.

Повышение чувствительности нефелометрических исследований и их распространение в иммунологии с использованием современных автоматизированных нефелометров явилось следствием ряда причин. Частично это обусловлено введением полимеров в смесь с образцом; частично - эффективным выделением фонового рассеяния, непосредственно вызванного комплексами антиген-антитело.

Большинство современных приборов могут определять и отслеживать "избыток" антигенов автоматически. Влияние фонового рассеяния уменьшено в ряде приборов отказом от измерения рассеяния под углом 90° и электронным вычитанием фоновых сигналов (скоростная нефелометрия).

С другой стороны, принято считать, что если уровень регистрируемого рассеяния не превышает 20 % световой энергии, поступающей в дисперсную среду, то результаты турбидиметрических измерений могут оказаться недостоверными.

Преимущество турбидиметрического анализа заключается в том, что измерения могут выполняться практически на любом колориметре или фотометре. Повышение чувствительности турбидиметрических исследований может быть достигнуто за счет использования спектрофотометров с высококачественными детекторами.

Направления прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения турбидиметрических исследований, показаны на рис. 3-35.

Основные компоненты, которые используются при построении нефелометрических и турбидиметрических приборов, схожи и включают источник света, фильтр и фокусирующую световой поток систему линз, кювету с образцом и детектор с устройствами отображения и регистрации результата. В качестве источника света обычно используются ртутные дуговые лампы, вольфрамо-йодистые лампы и гелий-неоновые лазеры. Лазеры излучают монохроматический свет, сконцентрированный в узкий и интенсивный луч. Однако лазеры очень дороги и могут излучать ограниченный набор фиксированных по частоте волн.

Если световая энергия, поглощенная атомами или молекулами, отдается ими в виде светового же излучения, то такое явление называется флюоресценцией.

Спектр излучения флюоресценции многих веществ носит избирательный характер.

Как и в случае спектров поглощения, избирательность обусловлена структурой и составом излучающего вещества. Спектры излучения растворов при флюоресцентных измерениях состоят, как правило, из широкой полосы с максимумом при некоторой длине волны. Кроме веществ, дающих широкие полосы излучения, встречаются вещества с хорошо выраженной колебательной структурой спектра.

Спектр излучения не зависит от длины волны возбуждающего света. Это правило показывает, что спектр флюоресценции характеризует исследуемое вещество и является основой для обнаружения и идентификации этих веществ.

Вторым правилом является правило Стокса, согласно которому спектр флюоресценции и его максимум по сравнению со спектром абсорбции смещен в сторону больших длин волн.

Например, растворы, облученные световой энергией в ультрафиолетовом диапазоне, могут флюоресцировать любым светом, а растворы, флюоресценция которых возбуждается зеленым светом, не могут светиться фиолетовым и синим, а только желтым и красным - словом, таким светом, который соответствует большим длинам волн.

Для большинства веществ кривые спектров излучения и поглощения перекрываются.

Количественное преобразование возбуждающей энергии в энергию флюоресценции определяется выходом флюоресценции.

Существуют понятия энергетического и квантового выходов.

Квантовым выходом (В_КВ ) флюоресценции называется отношение числа излученных квантов (N_и ) к числу поглощенных

Энергетическим выходом (В_э ) называется отношение излученной энергии (Е_и ) к поглощенной (Е_п ):

Так как энергия каждого кванта равна h • v, то между энергетическим и квантовым выходами будет существовать соотношение:

где v_n - частота максимума в спектре поглощения; v_n - частота максимума в спектре излучения (флюоресценции); λ_и - длина волны максимума излучения (флюоресценции); λ_п - длина волны максимума поглощения.

Энергетический выход флюоресценции зависит от соотношения длин волн поглощения и излучения. Эта зависимость получила название закона С. И. Вавилова. Закон гласит, что энергетический выход флюоресценции увеличивается пропорционально возрастанию длины волны поглощения световой энергии до некоторой определенной длины волны, после чего энергетический выход начинает быстро уменьшаться. При этом квантовый выход остается постоянным в той же спектральной области, где энергетический выход пропорционален длине волны поглощения.

Интенсивность флюоресценции раствора (Ф_ф )

зависит от энергии светового потока (Ф_п ), поглощенной раствором, и квантового выхода флюоресценции (В_кв ). Интенсивность флюоресценции определяется формулой:

Учитывая закон Бугера-Ламберта-Бера, с некоторым приближением можно принять, что

где Ф₀ - световой поток, поступающий в раствор; Κ_λ - коэффициент поглощения на данной длине волны λ, зависящий от природы растворенного вещества; С - концентрация флюоресцирующего вещества; I - толщина поглощающего слоя; В_и - квантовый выход флюоресценции.

При больших разбавлениях раствора и поддержании постоянными значений Ф₀ , Κ_λ , I, В_кв , что вполне реально при проведении измерений, значение интенсивности флюоресценции будет пропорционально концентрации:

где К - коэффициент пропорциональности.

Следует отметить, что на пропорциональность концентрации раствора и интенсивность флюоресценции, помимо других физико-химических факторов, влияет толщина флюоресцирующего слоя.

При малых концентрациях энергия возбуждающего света равномерно поглощается слоями флюоресцирующего раствора по всей его толщине, следовательно, и поток флюоресцирующего излучения, возникающего в единице объема раствора, будет пропорционален концентрации С по всему объему раствора.

В случае больших концентраций происходит интенсивное поглощение энергии возбуждающего света первыми слоями раствора и нарушается равномерность поглощения энергии по всему объему раствора, что, естественно, ведет к изменению суммарного потока флюоресценции.

Другая причина зависимости флюоресцирующей энергии от толщины слоя раствора заключается в том, что в ряде случаев спектры поглощения и флюоресценции одного и того же раствора перекрываются, и флюоресцирующая энергия на пути от глубинных слоев раствора к его поверхности частично поглощается самим раствором. Это явление носит название вторичного поглощения, или реабсорбции света.

С учетом многочисленных физико-химических факторов отклонения от пропорциональности энергии поглощения и энергии флюоресценции от концентрации исследуемого раствора при практических определениях концентрации раствора по световой энергии требуется предварительное построение градуировочных кривых. Градуировочная кривая строится по результатам измерений флюоресценции растворов с известной концентрацией.

Основным достоинством флюоресцентных методов анализа по сравнению с другими фотометрическими методами является их высокая чувствительность.

Направления потоков световой энергии при флюориметрии показаны на рис. 3-36.

Устройство и принцип работы флюориметра.

На рис. 3-37 представлена схема работы одноканального флюориметра с импульсным источником возбуждения.

Источником световой энергии возбуждения (1) является импульсная лампа. Диафрагма (2) ограничивает размеры светового потока. Оптическая система - конденсор (3) - формирует параллельный поток световой энергии, которая фильтруется полосовым фильтром (4).

Фильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны

Поток световой энергии излучения, пройдя диафрагму (13), оптическую систему (14), нейтральный ослабитель (15) и полосовой фильтр (16), попадает на фоточувствительную площадку фотоприемника (17), преобразуется в электрический сигнал и усиливается усилителем (18).

Назначение диафрагмы (13), оптической системы (14) и полосового фильтра (16) аналогично назначению этих элементов в полосе возбуждения света.

Нейтральный ослабитель (15) служит для ослабления энергии излучения большой мощности с целью возможности измерения этой энергии в данном диапазоне измерения.

Этой же цели служит автоматическая регулировка усиления усилителя (18).

Через коммутатор (19) сигналы с усилителей (8) и (18) поочередно поступают на вход аналого-цифрового преобразователя (20) и в виде цифрового кода поступают в микро-ЭВМ (21), где происходит их обработка.

Микро-ЭВМ (21) через интерфейсы связи (на схеме не показаны) управляет системой запуска импульсной лампы (12), выбором нужного диапазона измерения коэффициента измерения усилителя (18), системой индикации (9), регистрирующим устройством (11) и через пульт (10) обменивается информацией с оператором.

Наряду с большими преимуществами применения импульсной газоразрядной лампы в фотометрии имеют место определенные трудности, связанные с нестабильностью световой энергии возбуждения, излучаемой лампой от вспышки к вспышке. Для учета нестабильности светового потока возбуждения в схеме поставлен фотоприемник (7), сигнал с которого пропорционален потоку возбуждения.

Одним из наиболее эффективных способов уменьшения влияния разброса энергии возбуждения и других случайных факторов является, как всегда, многократное измерение и усреднение результатов.

В качестве детектора (фотоприемника) энергии излучения чаще всего используют фотоэлектрические умножители.

Прибор имеет как минимум два режима работы:

Режиму анализа должна предшествовать градуировка.

В режиме градуировки оператор с пульта вводит нормированные значения, приданные данному калибровочному раствору, последовательно подает в кюветное отделение кювету с исследуемым раствором и проводит измерение.

Встроенная микро-ЭВМ строит градуировочную характеристику прибора по измеренным прибором значениям флюоресценции и введенным оператором номинальным значениям концентрации калибровочных растворов.

В режиме анализа прибор проводит измерение флюоресценции и по градуировочной характеристике пересчитывает результаты в единицы концентрации раствора.

Особое место в люминесцентном анализе занимают хемилюминесцентные методы. Обычно это реакции окисления, в ходе которых происходит возбуждение молекул продуктов реакции и выделение световой энергии (лучистая дезактивация) при возвращении их в основное состояние.

Наиболее эффективно хемилюминесцентные вещества используются в качестве индикаторов. При титровании окрашенных и мутных сред их преимущество по сравнению с флюоресцентными индикаторами заключается в том, что нет необходимости прибегать к формированию светового потока возбуждения.

В аналитической практике наибольшее применение нашли такие хемилюминесцентные индикаторы, как люминол, люцегитин, лафин и силаксен. Частный случай хемилюминесценции - биолюминесценция, имеющая биологическую природу свечения. При биолюминесценции выделение световой энергии излучения происходит в результате окислительного процесса, катализируемого ферментами - люциферазами. Эти ферменты получают из биологических систем. Наиболее широко известны два типа люциферазы: светлячковая и бактериальная.

Поскольку биологические катализаторы - ферменты, как правило, чрезвычайно избирательны, биолюминесцентные методы очень специфичны.

Как и большинство фотометрических методов, хемилюминесцентный анализ также требует градуировки.

Направление потоков световой энергии, поясняющих принцип хемилюминометрии, показано на рис. 3-38.

Количественное определение содержания веществ на твердофазных носителях реактивов условно называется системами "сухой химии".

Измеряется интенсивность светового потока, отраженного от окрашенной поверхности носителя, которая, в свою очередь, зависит от концентрации исследуемой жидкой пробы.

Определение изменения цвета окрашенной поверхности производится методом рефлектометрии (рис. 3-39).

В качестве носителя сухих реагентов выступают реагентные полоски, выполненные на специальной подложке. Они наиболее широко используются для экспресс-анализа мочи и крови.

Пример экспресс-анализаторов мочи, построенных на рефлектометрическом принципе, - анализаторы серии "Клинитек" фирмы Bayer (Германия).

Особую группу сухих носителей реагентов образуют многослойные аналитические пленки (МАП), уникальная технология изготовления которых разработана специалистами американской фирмы Kodak. Она позволила фирме в 1980-е гг. выпустить на рынок гамму принципиально новых клинических автоматических анализаторов сухой химии, работающих без использования традиционных жидких реагентов.

Примеры подобных автоматических анализаторов приведены в подразделе "Автоматизация в клинической химии".

Операции, связанные с дозированием, играют важную роль в лабораторных технологиях. Аккуратное и точное выполнение дозирования оказывает существенное влияние на качество и точность результатов проводимых исследований.

Основные режимы дозирования - прямое дозирование, обратное дозирование, многократное дозирование и режим разведения.

Прямое дозирование - наиболее распространенный режим дозирования, при котором весь забранный объем жидкости сбрасывается за один полный ход поршня. Этот режим больше подходит для дозирования водных растворов.

Обратное дозирование - в большей степени, чем прямое, отвечает задачам дозирования биологических, вязких и пенящихся жидкостей, а также дозирования очень малых объемов. При этом в наконечник набирается несколько больший по сравнению с дозируемым объем жидкости. Остающийся в наконечнике некоторый объем жидкости нивелирует погрешность, связанную с образованием пены или мениска.

Многократное дозирование предполагает повторяющиеся операции дозирования идентичных или различных объемов жидкости.

В первом случае наиболее целесообразно использовать электронные дозаторы - диспенсеры, что позволяет повторять дозирование после однократного заполнения наконечника. Применение электронных дозаторов избавляет оператора от многократно повторяющихся движений в локтевом и лучезапястном суставе, приводящих к возникновению профессиональных заболеваний.

Режим разведения жидкости. Эффективность режима может быть повышена, если в наконечник дозатора забирается первый объем, а затем перед забором второго создается воздушная подушка, и обе жидкости выливаются вместе.

Особенности проведения медицинских лабораторных исследований определяют специфические требования к дозаторам жидкости:

Классификация и принципы построения дозирующих устройств

1. По способу забора и выдачи доз дозирующие устройства подразделяются на пипеточные, клапанные и перистальтические дозаторы.

А. Пипеточные дозаторы - это бесклапанные дозаторы, где забор и выдача пробы осуществляются через один и тот же наконечник дозатора.

Пипеточные механические дозаторы, впервые представленные на мировом рынке немецкой фирмой Eppendorf, получили распространение в лабораториях в начале 1960-х гг. Их применение позволило значительно повысить точность и воспроизводимость дозирования, снизить риск профессиональных заболеваний.

Принцип дозирования пипеточным дозатором иллюстрирует рис. 3-40.

Забор дозирующей жидкости осуществляется в съемную насадку-наконечник (1), что обеспечивает высокую чистоту выполнения дозирования, практически исключает загрязнение последующей пробы предыдущей.

Физические и химические свойства материала, из которого изготовлены наконечники, их форма имеют большое значение для точности получаемого результата дозирования. К сожалению, не существует универсальных наконечников, и фирмы-изготовители пипеточных дозаторов не гарантируют высокой точности качества при пользовании наконечниками, не включенными в рекомендуемый перечень.

Перемещение дозируемой жидкости в насадке осуществляется путем передачи через воздушный тракт разрежения или давления воздуха, создаваемого в поршневой или плунжерной паре пипетки (2), при этом конструкция дозатора обеспечивает ход поршня на выдачу дозы больше, чем при заборе пробы, что улучшает условия полной выдачи дозы. Многие пипеточные дозаторы имеют устройства для сброса наконечников.

Для повышения точности дозирования в конструкции корпуса некоторых пипеток предусмотрены теплоизолирующие кожухи, уменьшающие влияние температуры руки оператора на воздушный тракт дозатора. Принимаются меры для исключения или уменьшения воздушного зазора между поршнем и дозируемой жидкостью, используются прецизионные капиллярные трубки и т. д.

Пипеточные дозаторы нашли самое массовое применение в лабораторной практике.

Пипеточный диспенсер (степпер) осуществляет разовый забор дозируемого раствора в наконечник пипеточного дозатора и осуществляет через этот же наконечник многократное пошаговое дозирование. Так же как и первую микропипетку, это нововведение в виде ручного диспенсера фирма Eppendorf первой представила на рынок в 1978 г.

Пипеточный дилютер осуществляет через наконечник последовательно забор различных жидкостей разных объемов и через этот же наконечник выдает весь суммарный объем жидкости, находящейся в нем.

Б. Клапанный дозатор имеет входной канал, куда поступает дозируемая жидкость, и выходной канал, через который выдается доза.

Принцип работы клапанного дозатора иллюстрирует рис. 3-41.

Исходное положение: вся система заполнена дозирующей жидкостью; поршень находится в верхнем положении. При движении поршня вниз в поршневой паре (2) возникает повышенное давление, которое вытесняет дозируемую жидкость через выходной клапан (1) в выходной канал. Клапан (3) закрыт. При движении поршня вверх возникает разрежение, и дозируемая жидкость из емкости (4) через входной клапан (3) заполняет систему. Цикл работы повторяется.

Следует помнить, что всякая дозирующая система, заполненная жидкостью, при всех равных условиях обладает потенциально более высокой точностью, чем система с воздушным трактом.

Диспенсер (клапанный). Принцип его работы аналогичен описанному выше (см. рис. 3-41). При движении поршня наверх осуществляется разовый забор дозируемого раствора в поршневую пару (2), после чего возможно пошаговое дозирование через выходной клапан (1).

Дозатор-дилютер (клапанный) дозирует за один цикл разные жидкости разных объемов. Принцип его работы иллюстрирует рис. 3-42.

Исходное положение: вся система заполнена жидкостью Б. Поршень поршневой пары (3) находится в нижнем положении. Поршень поршневой пары (5) находится в верхнем положении. Емкость (1) с дозирующей жидкостью А подведена к выходному каналу дозатора.

При движении поршня поршневой пары (3) вверх возникает разрежение, и жидкость А через отверстие выходного канала устремляется в систему. Механически управляемый клапан (4) закрыт. Так как клапан (4) закрыт, то объем забираемой жидкости А пропорционален ходу поршня (3). Таким образом, в выходной части канала дозатора-дилютера находится жидкость А объемом V Система готова к дозированию жидкостей А и Б в емкость (2).

При движении поршня поршневой пары (5) вниз возникает давление, при котором клапан (6) закрыт, а клапан (4) открыт, жидкость Б устремляется на выход, вытесняя одновременно жидкость А. Когда поршни дозирующих пар займут нижнее положение, в емкости (2) будут находиться отдозированные жидкости А и Б в объемах V₁ и V₂ соответственно.

На заключительном этапе поршень поршневой пары (2) начинает движение вверх. Возникает разрежение. При этом клапан (6) открыт, а клапан (4) закрыт, жидкость Б из емкости (7) поступает в систему. Когда движение поршня вверх заканчивается, наступает исходное положение.

Цикл работы дозатора-дилютера повторяется.

В. Перистальтические дозаторы (насосы).

Помимо поршневых (плунжерных) дозаторов, в медицинских лабораторных технологиях находят применение и перистальтические дозаторы. Чаще всего они применяются в качестве дозатора-насоса подачи проб и реагентов в проточных анализаторах, как составная часть последних.

Принцип действия перистальтического насоса-дозатора схематично представлен на рис. 3-43.

Трубка (1) уложена в желобообразное углубление скобы (2). Набор роликов (3), приводимых в движение двигателем, прокатываясь по трубке и прижимая ее к скобе, подпружиненной пружинами (5), проталкивает жидкость, находящуюся в трубке. Жидкость в трубку поступает из емкости (4).

Объем дозы зависит от сечения трубки и длины пробега роликов по ней.

В связи с износом и потерей эластичности трубки требуется ее регулярная замена. Другой недостаток - низкая точность дозирования. Однако перистальтический насос-дозатор конструктивно хорошо вписывается в конструкции анализаторов, при этом от одного привода могут работать несколько каналов дозирующих насосов.

2. По способу установки дозы дозаторы подразделяются на дозаторы с фиксированным объемом дозы и с регулируемыми переменными объемами дозы (рис. 3-44). При выполнении сотен стандартных дозирований наиболее надежными помощниками лаборантов являются дозаторы с фиксированными объемами дозирования, с удалителем (сбрасывателем) наконечника или без него.

В дозаторах с регулируемыми объемами доз установка дозы может осуществляться плавно или дискретно с определенным шагом. Первые - проще по конструкции, вторые - цифровые, являются более универсальными.

3. По количеству каналов дозирования дозаторы разделяются на одноканальные и многоканальные.

Одноканальные дозаторы не привязаны к форме носителя проб и реакционной смеси, в связи с чем они универсальны. Многоканальные дозаторы (рис. 3-45) ориентированы на специальные носители, они наиболее удобны при работе с микропланшетами и стрипами.

Например, 8-канальный пипеточный дозатор с расстоянием между наконечниками 9±0,2 мм ориентирован на работу с 8-луночными стрипами или 96-луночным планшетом, используемым для проведения гетерогенного иммуноферментного анализа.

Существуют так же так называемые вариканальные пипетки, в которых предусмотрена возможность варьировать в определенных пределах расстояние между каналами.

4. По способу управления дозаторы можно разделить на дозаторы с ручным приводом, автоматическим приводом и автоматическим приводом с микропроцессорным управлением - электронные дозаторы, среди которых наибольшее распространение получили электронные пипетки.

5. Пипетки с позитивным перемещением. Этот тип рекомендуется для работы с вязкими, агрессивными и летучими жидкостями, при анализе ДНК, включая методики ПЦР, при дозировании масел и основных химических растворителей.

В пипетках данной конструкции поршень через насадку приходит в непосредственное соприкосновение с жидкостью, что препятствует образованию воздушного слоя в наконечнике, который, сжимаясь и расширяясь, может влиять на точность дозирования.

6. Особые, или специальные, классы дозирующих устройств образуют разнообразные по конструкции устройства, встроенные в автоматические анализаторы, и робототехнические разливочные системы (дозирующие автоматы). Область применения и распространенность последних значительно меньше, чем традиционных дозирующих приборов.

Новым этапом в развитии технологии дозирования явились электронные пипетки. Их представила на рынок дозирующих устройств финская компания Biohit.

Компания Biohit занимает лидирующее положение в этом направлении лабораторного приборостроения, предлагая широкую гамму одно- и многоканальных дозаторов (4, 6, 8 и 12 каналов), которые могут выполнять следующие функции:

Микропроцессорное управление, быстродействующий микродвигатель, жидкокристаллический дисплей, аккумуляторная батарея и другие технологические достижения обеспечивают электронным микродозаторам следующие возможности и преимущества в сравнении с механическими:

По данным проведенных исследований, для аспирации, выполняемой при работе с механической пипеткой, лаборантом затрачиваются усилия от 0,8 до 2,5 кг, а для сброса - более 5 кг, что может привести к профессиональным заболеваниям. Хотя электронные пипетки, как и механические, управляются нажатием большого пальца, требуемые для этого усилия несоизмеримо ниже - всего около 70 г как для аспирации, так и для сброса.

За четыре десятилетия, прошедшие с момента представления немецкой фирмой Eppendorf микролитровой системы, разработка и производство полуавтоматических механических, а теперь и электронных автоматических дозирующих устройств превратились в важную отрасль медицинского лабораторного приборостроения. Для медицинских и научных лабораторий поставляют дозирующие приборы такие хорошо зарекомендовавшие себя фирмы, как Biohit, Thermo Fisher Scientific (торговая марка "Ленпипет"), Eppendorf, Gilson, Hamilton, Labsystems, Slamed, SLT-Tecan и др.

Поэтому в настоящее время имеется возможность из всего арсенала современных дозирующих изделий выбрать такие, которые в полной мере удовлетворяют наиболее удобному режиму дозирования, требованиям точности, воспроизводимости, безопасности и эргономичности, т. е. характеру и особенностям выполняемых операций и их интенсивности.

Центрифугирование применяется для разделения неоднородных жидких сред.

Центрифугирование позволяет разделить смесь, состоящую из двух или более компонентов с разной удельной плотностью, если по крайней мере один из этих компонентов - жидкость.

Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.

Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (ω, в рад/с), и расстоянию между частицей и осью вращения (r, в см):

Поскольку один оборот ротора составляет 2π радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту (об./мин) можно записать так:

а центробежное ускорение тогда будет равно:

Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g (гравитационная постоянная, равная 6,8 • 10^-8 см³ • r¹ • с^-2 и называется относительным центробежным ускорением (ОЦУ), т. е.

Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением (закон Стокса, видоизмененный Сведбергом и Никольсом):

где t - время седиментации, с;

Как следует из уравнения (3), при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно выделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды.

Описанными методами можно выделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы (или другие микротельца), микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети) и, наконец, рибосомы.

Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению (3), поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании конформации макромолекул.

Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований.

С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов.

Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.

На практике препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем более подробно, хотя оба метода строятся на общих принципах.

Дифференциальное центрифугирование

Метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый (гомогенный) осадок практически невозможно. Чтобы понять, почему это происходит, рассмотрим процесс, происходящий в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.

Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно (рис. 3-46, а), поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном (двухили трехкратном) суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность.

Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности.

Зонально-скоростное центрифугирование

Метод зонально-скоростного, или s-зонального, центрифугирования заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности.

Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос (рис. 3-47). Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК - ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.

Изопикническое центрифугирование

Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем (рис. 3-48). Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярная масса которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости (рис. 3-48). Эта особенность используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.

Перед центрифугированием частицы распределены по объему центрифужной пробирки равномерно (а); после центрифугирования более легкие частицы всплывают наверх, в то время как тяжелые оседают на дно пробирки (б)

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности

Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлорида цезия (CsCl). Молекулы сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCl, так как ионы цезия обладают большей массой.

Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК E. coli. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности также служит одним из методов разделения и изучения липопротеинов плазмы крови человека.

Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги.

Центрифуги общего назначения обычно обеспечивают центрифугирование с максимальной скоростью 8000 об./мин и ОЦУ до 6000 g. Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами или другими контейнерами для размещения центрифугируемых растворов.

Обычно центрифуги этого вида имеют большую емкость - от 4 до 6 дм³ , что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10, 50 и 100 см³ , но и сосудами емкостью до 1,25 дм³ . Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок. При неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая, таким образом, равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Скоростные центрифуги развивают скорость 25 000 об./мин и ОЦУ до 89 000 g. Камера ротора снабжена системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм³ и снабжены сменными роторами, как угловыми, так и роторами с подвесными стаканами.

Препаративные ультрацентрифуги обеспечивают центрифугирование со скоростью до 75 000 об./мин и максимальное центробежное ускорение 510 000 g.

Центрифуги специального исполнения имеют различные конструктивные варианты исполнения под те или иные специальные задачи или виды исследований. К таким центрифугам относятся рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой и др.

Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами. Роторы препаративных центрифуг обычно бывают двух типов - угловые роторы и роторы с подвесными стаканами или контейнерами (горизонтальные роторы).

Угловые роторы получили такое название потому, что помещаемые в них центрифужные пробирки все время находятся под определенным углом к оси вращения (обычно 20-35°).

В горизонтальных роторах или роторах с подвесными стаканами пробирки (стаканы и другие емкости) устанавливаются вертикально, а при вращении под действием возникающей центробежной силы они переходят в горизонтальное положение, и угол их наклона к оси вращения составляет 90°.

В угловых роторах расстояние, проходимое частицами до соответствующей стенки пробирки, весьма невелико, и поэтому седиментация происходит сравнительно быстро. После столкновения со стенками пробирки частицы соскальзывают вниз и образуют на дне осадок. При центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение частиц, скорости седиментации которых различаются довольно сильно.

В горизонтальных роторах также наблюдаются конвекционные явления, однако выражены они не так сильно. Конвекция является результатом того, что под действием центробежного ускорения частицы оседают в направлении, не строго перпендикулярном оси вращения, и поэтому, как и в угловых роторах, ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно.

Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы (ячейки Стромайера) в роторах с подвесными стаканами и регулируя (увеличивая и уменьшая) скорость вращения ротора; перечисленных выше недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности.

В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.

Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 100 000 об./мин, создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g. Аналитические центрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в УФ-области спектра, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления - с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея.

В биологии аналитическое ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярных масс макромолекул по скорости седиментации, а также для исследования конформационных изменений в макромолекулах.

Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков.