Практические рекомендации по обеспечению качества и надежности цитогенетических исследований

Показания для направления пациента на цитогенетическое обследование изложены в Приложении А. В лаборатории должны быть разработаны четкие правила, в каких случаях необходимо проведение дополнительных исследований, не проводящихся в этой лаборатории, например, FISH, анализ хромосомной нестабильности или молекулярно-генетическое исследование.

В случае передачи материала для проведения дополнительного исследования в другую лабораторию, необходимо запросить и получить копию результата. Лаборатория, направляющая материал на дополнительное исследование, несет ответственность за интерпретацию своих результатов после получения дополнительной информации.

В лаборатории рекомендуется иметь регистр учреждений, в которые могут быть направлены образцы. Необходимо проводить регистрацию всех образцов, направляемых в другие лаборатории. Образцы следует отправлять в лаборатории, обладающие соответствующей компетенцией.

В соответствии с Федеральным Законом РФ №323ФЗ информированное добровольное согласие необходимо как для цитогенетических, так и для молекулярно-цитогенетических исследований. Пациент (или его законный представитель) должен быть осведомлен о возможностях и ограничениях использованного метода и клиническом значении полученного этим методом возможного результата (норма, хромосомная аномалия). Пациент (или его законный представитель) также должен быть информирован, что могут быть обнаружены другие хромосомные аномалии, не соответствующие ожидаемым (случайные находки), а также могут быть получены результаты, которые потребуют дополнительных исследований.

Для всех методик и оборудования, использующихся в лаборатории, согласно Национальному стандарту РФ ГОСТ Р ИСО15189-2015 (НЦ ГОСТ Р ИСО 15189), должны быть разработаны и утверждены руководителем стандартные операционные процедуры (СОП). СОП должны быть написаны на понятном персоналу языке и быть доступны для персонала, их необходимо ежегодно пересматривать. Руководитель лаборатории отвечает за то, чтобы персонал был обучен и понимал СОП. Устаревшие версии СОП следует хранить в доступном формате не менее 3 лет.

СОП для новых методик должны быть утверждены до внедрения в практику.

Для диагностических целей возможно использование только серийно изготовленных зондов и расходных материалов, согласно Федеральному Закону № 532-ФЗ.

Контроль работы оборудования должен проводиться ежегодно в соответствии с НЦ ГОСТ Р ИСО 15189. Для уменьшения риска, связанного с неисправностью техники, все необходимое оборудование должно быть дублировано (два инкубатора, две центрифуги и т. д.). Если по какой-то причине оборудование нельзя продублировать, в лаборатории необходимо иметь «экстренный план» выполнения работы в случае неисправности техники. Необходимо регулярно проводить техническое обслуживание оборудования с внесением соответствующих записей в журнал эксплуатации оборудования. Всё электрическое оборудование необходимо регулярно тестировать в отношении безопасности, соответствующие записи необходимо сохранять. Чтобы избежать простоя оборудования из-за неисправности, необходимо его регулярное обслуживание, для чего заключается договор обслуживания (например, для микроскопов и систем анализа изображений).

Все биологические образцы потенциально могут быть загрязнены патогенными микроорганизмами, например, вирусом гепатита В. Лаборатории должны быть оснащены ламинарными боксами 2 класса защиты.

Все инкубаторы и другое оборудование должны быть оснащены аварийной сигнализацией или системой автоматической защиты от сбоя температурного режима или изменений уровня СО₂ (при его использовании). При возможности рекомендуется централизованный мониторинг систем аварийной сигнализации.

Для проведения FISH-исследований необходимо выделить отдельные помещения с возможностью затемнения. Специальное оснащение должно включать оборудование для инкубации при разных температурных режимах, микроцентрифугу, флуоресцентный микроскоп с набором фильтров, камерой и системой анализа изображений. Необходимо использовать вытяжной шкаф, чтобы защитить персонал от ядовитых веществ, таких как формамид, метанол и т.д. Лаборатории, производящие собственные ДНК-зонды, должны проводить мероприятия для предотвращения контаминации образцов ДНК.

Для поддержания высокого качества работы всех систем, анализирующих изображения, необходимо регулярное обновление их программного обеспечения.

В приложении А представлены общие рекомендации по клиническим показаниям для назначения цитогенетического исследования.

Рекомендуются дублирование и независимая обработка культур. При культивировании пренатальных образцов рекомендуется постановка, по крайней мере 2-х, а лучше 3-х независимых культур, раздельный анализ которых может понадобиться при выявлении мозаицизма. (Эти вопросы более подробно рассмотрены в разделе 5 «Особенности хромосомного анализа».)

Если качество образца не соответствует требованиям лаборатории, лаборатория имеет право отказать в его приеме и запросить повторный образец. Если образец ненадлежащего качества все же принят, то лаборатория несет ответственность за получение результата методами, соответствующими причине направления на анализ.

Кариотипирование следует проводить с применением методов дифференциального окрашивания хромосом. Наиболее широко используют G-окрашивание, так как с его помощью можно получить наибольший уровень разрешения (табл. 1). Если используют другие методы дифференциального окрашивания (например, R- или Q-бэндинг) лаборатория должна обеспечить, соответствие уровня окраски 550 сегментам G-бэндинга. В абсолютном большинстве случаев необходим полный анализ всего набора дифференциально окрашенных хромосом. В редких случаях, например, при синдромах, связанных с повышенной ломкостью хромосом, достаточно использования метода сплошного окрашивания.

Международная система цитогеномной номенклатуры (ISCN 2016) [3] определяет пять уровней дифференциального окрашивания 300-, 400-, 550-, 700- и 850 бэндов на гаплоидный набор. В табл. 1 приведено руководство для определения минимального качества окрашивания, необходимого для проведения анализа в зависимости от показаний. Полностью анализ должен быть завершен при уверенности специалиста в том, что числовые и структурные аномалии исключены на уровне, соответствующем причине направления на исследование.

В табл. 2 представлены критерии идентификации числа сегментов (бэндов) при G-окрашивании хромосом.

В тех случаях, когда при анализе препаратов не удается достичь минимально допустимого для соответствующего показания уровня разрешения дифференциальной окраски, и аномалии не выявлены, не всегда необходимо повторное исследование. После обсуждения с врачом, направившим пациента на исследование, можно выдать заключение, сделав в нем соответствующие комментарии.

В лаборатории должны быть разработаны протоколы с критериями хромосомного анализа при различных показаниях. Для анализа используют полные метафазные пластинки с хорошим разбросом хромосом. Неполные пластинки (с числом хромосом менее 44), также как пластинки с множественными наложениями, должны быть исключены из анализа.

Метафазный анализ включает сопоставление гомологичных хромосом (а также оценку блоков X- и Y-хромосом) – посегментный анализ («бэнд за бэндом»). Если один гомолог из пары вовлечен в наложение, эта пара гомологов должна быть независимо проанализирована в других пластинках, чтобы исключить структурные перестройки. Таким образом, для полного анализа, как правило, должны быть подсчитаны и проанализированы дополнительные пластинки. В таблице 3 приведено число метафазных пластинок, которое должно быть проанализировано для каждого типа тканей. Для конститутивного анализа в большинстве случаев должно быть просмотрено 11 метафазных пластинок (с качеством окраски не ниже минимального для данной причины направления). Правила лаборатории могут предусматривать посегментный анализ и подсчет большего числа пластинок, чем минимальное, указанное в табл. 3, например, для исключения мозаицизма во всех случаях, а не только в тех, где его можно предполагать на основании информации, указанной в направлении.

*При обнаружении нормального кариотипа в случае выраженной клинической картины (множественные врожденные пороки и/или аномалии развития, умственная отсталость) для уточнения диагноза желательно использование молекулярно-генетических и молекулярноцитогенетических технологий.

Традиционное исследование хромосом при микроскопии желательно дополнять использованием анализирующих систем. При этом следует иметь в виду, что при анализе изображений метафазных пластинок с чрезмерным разбросом хромосом малые маркерные или сверхчисленные хромосомы могут оказаться не выявленными.

При наличии в штате лаборатории не менее двух специалистов-цитогенетиков желательно переходить на коллегиальный способ работы. При этом каждый образец исследуют два специалиста. Один цитогенетик проводит хромосомный анализ в объеме, соответствующем направлению на исследование, второй цитогенетик («проверяющий») проводит посегментный сравнительный анализ гомологов по 3 метафазным пластинкам. Для проверки могут быть использованы те же самые метафазные пластинки, что и для первичного анализа. Рекомендуется независимая («слепая») проверка, когда проверяющий не знает результат первичного анализа. По окончании работы специалисты составляют совместное заключение о кариотипе, и подписывают его. При коллегиальном способе работы годовая нагрузка цитогенетика должна быть уменьшена на 25%. В случае, если в лаборатории работает только один специалист-цитогенетик, желательно предусмотреть возможность сотрудничества с другими лабораториями.

Для снижения риска контаминации или потери культуры из-за неисправности инкубатора необходимо дублировать культуру, обрабатывать образцы отдельно и содержать в разных термостатах, при возможности подключенных к независимым источникам энергии. Необходимо проводить предварительное тестирование каждой партии культуральных сред и других реагентов, чтобы избежать ингибирования роста клеток пренатальных образцов. Пренатальные культуры рекомендуют содержать в двух разных средах или в одной и той же культуральной среде, но из разных партий. То же самое относится и к использованию других реактивов.

Примечание:

Расширение анализа или увеличение числа проанализированных клеток обосновано, если есть клинические указания или подозрение на мозаицизм.

При проведении пренатальной диагностики наличие контаминации материнскими клетками должно быть обязательно отмечено и записано в соответствии с лабораторными правилами. При анализе необходимо иметь в виду возможности контаминации культуры материнскими клетками, псевдомозаицизма, истинного мозаицизма и хромосомных аберраций in vitro (как результата культивирования клеток). Для распознавания таких артефактов должна быть разработана специальная система контроля культивирования клеток и их анализа. Не следует проводить фиксацию или субкультивирование всех клеточных культур из одного образца одновременно. По возможности рекомендуется поддерживать резервные культуры до выдачи окончательного заключения. Также желательно иметь оборудование для криоконсервации жизнеспособных клеток, например в случаях аномалий развития у плода, до момента завершения беременности (искусственного прерывания беременности, преждевременных или срочных родов). Лабораториям следует отдавать себе отчет, что при проведении исследований могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.

Для цитогенетического анализа препаратов из ВХ доступны либо спонтанно делящиеся эпителиальные клетки цитотрофобласта, либо стимулированные к делению in vitro фибробласты стромы ворсин. Анализ хромосом на препаратах, приготовленных прямым методом из нативных образцов или краткосрочных органных культур хориона/плаценты (цитотрофобласта), рекомендуется дополнять анализом препаратов из долгосрочных клеточных культур (экстраэмбриональной мезодермы) [6,7,8]. Сочетание этих двух способов анализа позволяет минимизировать диагностические ошибки, обусловленные неравномерным распределением анеуплоидных клеток в тканях хориона/плаценты.

Перед приготовлением препаратов и культивированием проводится обязательная визуальная оценка объема и качества образца с использованием стереомикроскопа или бинокулярной лупы, а также удаление примеси крови и децидуальной ткани (при их наличии). Если объем образца недостаточен для приготовления препаратов двумя способами, возможен выбор одного из них (предпочтительнее – культура фибробластов). Рекомендации по культивированию, фиксации и анализу фибробластов стромы ВХ аналогичны рекомендациям по культурам клеток амниотической жидкости. При недостаточном для метафазного анализа митотическом индексе и/или при мозаицизме анализ на «прямых» препаратах может быть дополнен методом FISH с соответствующими ДНКзондами.

При интерпретации результатов анализа клеток ВХ важно помнить, что для определения типа межтканевого мозаицизма необходимо исследовать не только клетки экстраэмбриональных тканей (цитотрофобласта и стромы ворсин), но и клетки плода. Следует помнить, что общая частота плацентарного мозаицизма с тканеспецифичной или равномерной локализацией анеуплоидных клеток в экстраэмбриональных тканях при нормальном кариотипе плода (типы 1, 2, 3) не превышает 2%; мозаицизма с нормальным кариотипом в плаценте и анеуплоидным в клетках плода (типы 4, 5, 6) – 0,5%; генерализованного мозаицизма (с наличием анеуплоидных клеток и в плаценте, и в тканях плода) – 0,1%.

Перед культивированием следует убедиться, что образцы пуповинной крови не содержат примесей материнской крови и имеют только плодное происхождение. Для этого можно применять различные лабораторные методы: автоматический счетчик частиц, определение щелочной фосфатазы, метод КлейхауэрБетке или тест Апта (цветная реакция на гемоглобин в растворе гидроокиси натрия или калия). Если одновременно проводятся амниоцентез и кордоцентез, то нужно культивировать и анализировать оба образца (и клетки амниотической жидкости, и пуповинную кровь), кроме случаев, когда появляются веские причины этого не делать (например, если в образце пуповинной крови будет выявлена несбалансированная хромосомная аномалия).

Верификация (подтверждение) кариотипа плода в случае выявления хромосомной аномалии пренатально и последующего прерывания беременности желательна и может являться частью внутрилабораторного контроля качества. Для выявления хромосомной патологии в хорионе/плаценте, лимфоцитах пуповинной крови плода или клетках амниотической жидкости могут быть использованы цитогенетический, FISHанализ или молекулярно-генетические технологии.

В случаях, когда можно ожидать наличие мозаицизма (например, при аномалиях половых хромосом или синдромах, обусловленных ломкостью хромосом), число просмотренных и изученных метафаз должно быть достаточным, чтобы исключить мозаицизм и клональность. Расширенный анализ, включающий исследование не менее 30 метафазных пластинок, рекомендуется при подозрении на мозаицизм по клиническим показаниям (таблицы границ доверительных интервалов для исключения мозаицизма в культивируемых лимфоцитах и комментарии к ним см. в работе Е. Hook, 1997 [9]). В случаях выявления мозаицизма по половым хромосомам прежде всего следует иметь в виду связанную с возрастом потерю одной из X-хромосом у женщин и Y-хромосомы у мужчин.

При обследовании женщин с привычным невынашиванием беременности без подозрений на синдром Шерешевского—Тернера наличием клеток с моносомией Х-хромосомы на уровне не более 10% при анализе 30—60 метафазных пластинок можно пренебречь [10—13]. Но следует помнить о существовании не только межклеточного, но и межтканевого мозаицизма (то есть о различиях между тканями по наличию и доле клеток с разным кариотипом). При этом соотношение нормального и аномального клонов в различных тканях может быть различным.

Кроме того, при культивировании клеток возможно образование клонов с аномальным кариотипом. Это явление носит название «псевдомозаицизма». Например, у нормальных индивидуумов могут встречаться единичные метафазные пластинки с транслокацией между хромосомами 7 и 14, что вызвано условиями культивирования лимфоцитов.

FISH является наиболее подходящим методом для подтверждения мозаицизма при наличии соответствующих зондов. В некоторых случаях необходимо исследовать препараты из клеток другой ткани, например, при трисомии по хромосоме 8. При подозрении на синдром Паллистера—Киллиана (Pallister—Killian, OMIM 601803) исследование нужно проводить на препаратах из клеток некультивированной крови и другой ткани.

Никакие анализы не могут однозначно исключить мозаицизм. В случае выявления низкого уровня мозаицизма с неясной клинической значимостью до выдачи заключения результат следует обсудить с врачом, направившим на исследование.

Если контаминация материнскими клетками превышает уровень III или составляет более 10% клеток в одной культуре, необходимо до выдачи заключения провести дополнительные исследования с использованием любого молекулярного метода, который позволяет подтвердить или исключить химеризм путем сравнительного анализа с материнскими аллелями.

Так как некоторые больные с этим заболеванием, наряду с клетками с повышенной частотой сестринских хроматидных обменов (СХО), имеют популяцию клеток с нормальной частотой таких обменов, рекомендуют исследовать не менее 20 метафазных пластинок. Следует учитывать частоту СХО в контрольных образцах при соблюдении одинаковых методических условий.

Для исключения соматической мутации, типичной для анемии Фанкони, рекомендуют проанализировать 50, а лучше - 100 метафазных пластинок.

Эффективность используемого кластогена следует оценить либо в сравнении с необработанным контролем, либо по уровню СХО в обработанных и не обработанных образцах. Следует подсчитать среднее количество разрывов в аберрантных клетках и среднее количество разрывов на нормальную клетку.

Частоту хромосомных аберраций в культуре после ионизирующего облучения следует определять, анализируя 50–100 метафазных пластинок. Так как у некоторых пациентов с атаксией-телеангиэктазией клетки имеют промежуточную реакцию на облучение, следует проводить анализ 50 дифференциально окрашенных метафазных пластинок с целью выявления перестроек, вовлекающих локусы рецептора Т-клеточного антигена на хромосомах 7 и 14.

Для выявления центромерного пуффинга (разрыхления центромер) или хромосом с преждевременным расхождением хроматид в центромерных районах рекомендуют проанализировать 50 С-окрашенных метафазных пластинок. Для подтверждения анеуплоидии следует проанализировать не менее 50 дифференциально окрашенных метафазных пластинок.

Для идентификации аномалий гетерохроматиновых районов на хромосомах 1, 9 и 16 и выявления разветвленных конфигураций рекомендуют проанализировать 50 дифференциально окрашенных метафазных пластинок.

Для анализа используют серийно изготовленные зонды, так как они являются более надежными. Интерпретировать локализацию точек разрывов при использовании FISH-метода следует очень осторожно. Результаты такого исследования сопоставляют с результатами, полученными при анализе с использованием дифференциального окрашивания.

Нужно помнить, что разрешающая способность разных цельнохромосомных зондов может варьировать. Небольшие перестройки могут быть пропущены при анализе с использованием цельнохромосомных зондов из-за неравномерного связывания зонда с последовательностями вдоль хромосомы-мишени.

В диагностических лабораториях обычно используют доступные серийно изготовленные зонды или наборы реагентов (kits). Число проанализированных клеток должно соответствовать чувствительности и специфичности зонда на препарате, но не должно быть менее 5. При подозрении на микродупликацию результаты желательно подтвердить альтернативными (молекулярными) методами.

Особое внимание следует уделять интерпретации результатов. Должно быть проанализировано достаточно большое число клеток (50-100), так как сигнал в интерфазных клетках может быть вариабельным.

При проведении пренатальной диагностики в случае контаминации образца материнскими клетками, должны быть сделаны соответствующие комментарии. Следует иметь в виду, что метод интерфазного FISHанализа позволяет выявлять лишь определенные хромосомные аномалии, что недостаточно для заключения о кариотипе. Более того, если в дополнение к FISH-анализу не было проведено исследование дифференциально окрашенных хромосом, исследователь может сделать ошибочное заключение.

Интерфазная FISH может быть дополнительным тестом для оценки уровня мозаицизма или химеризма в клеточных линиях с аномалиями, предварительно установленными при стандартном хромосомном анализе.

Как и для стандартного хромосомного анализа при достаточной укомплектованности штатов желательно использовать «коллегиальный» способ работы. Результат интерфазного FISH-исследования должен быть независимо подтвержден вторым специалистом-цитогенетиком. Проверяющий должен просмотреть 30—70% от общего количества клеток, использованных для анализа. Если специалист, проводивший первичный анализ, и проверяющий получили различные результаты, необходимо участие третьего специалиста (возможно из другой лаборатории) для выработки окончательного заключения. Этот специалист должен быть информирован о предыдущих результатах.

Для контроля FISH-исследований метафазных пластинок используют те же правила, что и для контроля цитогенетического анализа при дифференциальном окрашивании хромосом.

Для диагностических целей возможно использование только серийно изготовленных зондов и расходных материалов (согласно ФЗ РФ №323-ФЗ). При этом необходимо тестирование как специфичности используемого зонда к ДНК последовательности-мишени на препарате, так и аналитической чувствительности зондов. Несмотря на то, что для серийно изготовленных зондов эти параметры уже установлены производителем, необходимо самостоятельно оценить долю гибридизационных сигналов как на нормальных образцах, так и образцах с соответствующими аномалиями. Чувствительность и специфичность должны быть высокими (близкими к 100%), чтобы исключить ошибку. Аналитическую чувствительность и специфичность оценивают по доле мишеней, демонстрирующих сигнал (чувствительность) и по доле сигналов на мишени по сравнению с сигналами на других районах хромосом (специфичность).

Следует также помнить о возможности кроссгибридизации зонда (связывании зонда с последовательностями ДНК других хромосом), которая характерна для зондов к повторяющимся последовательностям ДНК (зонды к центромерным районам хромосом, районам прицентромерного гетерохроматина и району Yqh). Игнорирование этого фактора может привести к неправильной трактовке результатов интерфазной FISH.

При отсутствии серийно изготовленных зондов на конкретный хромосомный локус возникает необходимость разработки собственных зондов для подтверждения/исключения предполагаемой хромосомной патологии. Разработка зондов должна проводиться специалистом, владеющим соответствующими знаниями и навыками, и/или лабораторией, имеющей опыт в соответствующей области. Полученный зонд/набор зондов может быть использован только в научных целях или должен пройти процедуру регистрации и сертификации в установленном порядке.

Название зонда и производитель, а также любые ограничения использованного зонда должны быть указаны в заключении.

Специалист, осуществляющий интерпретацию результатов, должен четко знать особенности использованных ДНК-зондов. FISH-исследование позволяет получить информацию только о состоянии локусов, соответствующих использованным зондам, поскольку оно не эквивалентно полному хромосомному анализу. С осторожностью следует интерпретировать результаты FISH на интерфазных ядрах, основанные на использовании зондов к вариабельным по копийности повторяющимся последовательностям, так как в некоторых случаях их размеры могут оказаться недостаточными для эффективной гибридизации.

Запись результатов исследования должна приводиться в соответствии с действующей версией ISCN [3].

Бланки результата анализа должны включать название и уровень разрешения использованного метода дифференциального окрашивания, а также дополнительных методов анализа, если они применялись. Следует указать способ получения препарата (прямые методы или культивирование клеток).

Если при использовании дополнительных тестов (например, FISH) цитогенетические данные подтверждаются, но никакой дополнительной информации не получено, нет необходимости включать эти данные в формулу кариотипа, они должны быть упомянуты только в перечне использованных методов.

В запись результата должна быть включена следующая информация, применительно к использованному тесту (см. также ГОСТ Р ИСО 15189):

В случае обнаружения аномалии запись результата дополнительно должна включать следующую информацию:

Лаборатория должна стремиться к тому, чтобы результаты, имеющие серьезные последствия, не сообщали непосредственно пациенту без предоставления адекватной генетической консультации.

Полиморфные варианты, такие как размер или перицентрическая инверсия гетерохроматинового района, размер спутников и спутничных нитей, интенсивность флуоресценции, не следует указывать в заключении, чтобы не вводить в заблуждение неспециалистов. Подобные варианты следует отмечать только в лабораторных записях (протокол исследования, рабочий журнал).

Экстремальные варианты полиморфизма могут быть отмечены в тех случаях, когда их идентификация потребовала уточнения с использованием дополнительных методов дифференциальной окраски (QFQ-, CBG-, AgNOR- и т. д.) или FISH.

Если вариант нормального полиморфизма включен в формулу кариотипа, в заключении должна быть подробно разъяснена его клиническая нейтральность.

Решение о наличии мозаицизма принимают в соответствии с рекомендациями [3, 8, 9] (см. также Приложение Б). Клоном или клеточной линией считают наличие двух и более клеток с одинаковой структурной перестройкой, двух и более клеток с одинаковой трисомией/ полисомией, трех и более клеток с одинаковой моносомией. Наличие культуральных артефактов, встретившихся при проведении цитогенетического исследования и обусловленных особенностями приготовления хромосомного препарата, в заключении не указывают.

Если контаминация материнскими клетками могла повлиять на интерпретацию результата, то в заключении необходимо сделать соответствующее примечание. Это должно быть всегда отражено в рабочем лабораторном заключении.

В случаях, когда по качеству или уровню анализ не достигает минимального стандарта, это должно быть отражено в заключении с разъяснениями об ограничениях использования полученного результата.