Рациональная антимикробная фармакотерапия

Все микроорганизмы подразделяются на клеточно-организованные и не имеющие клеточного строения. Среди микроорганизмов с клеточной организацией выделяют простейшие, грибы и бактерии. К не имеющим клеточного строения относят вирусы. По строению микроорганизмы делятся на прокариоты и эукариоты. Основные различия в организации эукариотической и прокариотической клеток представлены в табл. 1-1.

В данной главе представлена информация о бактериях и рассматриваются:

Элементы строения и функции

Морфология бактерий Различают следующие основные формы бактерий:

Строение бактерий

Схематическое внутреннее строение условной бактериальной клетки представлено на рис. 1-1. Бактерии относятся к организмам с прокариотическим типом организации клетки (табл. 1-1). Дифференцируют внутреннее строение бактерий, пограничные и поверхностные структуры.

Внутреннее строение бактерий

По внутреннему строению бактерии практически не различаются. В цитоплазме всех бактерий имеются нуклеиновые кислоты (дезоксирибонуклеиновая – ДНК и рибонуклеиновая – РНК), рибосомы и гранулы с питательными веществами.

Основной нуклеиновой кислотой, несущей генетическую информацию, является ДНК. Бактериальная ДНК существует в виде хромосомы и плазмид.

Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую молекулу ДНК, включающую жизненно важные гены, определяющие уникальность данного вида микроорганизма. Хромосома не окружена специальной мембраной, т. е. истинное ядро у бактерий отсутствует. Длина бактериальной хромосомы приблизительно в тысячу раз превосходит длину клетки, но занимает лишь незначительную часть объема цитоплазмы. Это становится возможным за счет компактной пространственной организации хромосомной ДНК, которую осуществляет сложный аппарат. Важную роль в его функционировании играют ферменты топоизомеразы, наиболее значимые из них ДНК-гираза и топоизомераза IV. Топоизомеразы являются мишенью действия хиноловых антибактериальных препаратов. Подавляя активность топоизомераз, хинолоны нарушают пространственную организацию бактериальной ДНК и тормозят рост и размножение бактерий.

Плазмиды представляют собой внехромосомные кольцевые молекулы ДНК, однако их размеры намного меньше, чем у хромосомы, и относятся к подвижным генетическим элементам, т. е. они способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой (в отличие от хромосомы). Этот процесс - один из основных путей генетического обмена у бактерий. Плазмиды не являются обязательным компонентом микробной клетки. В их состав могут входить гены, определяющие устойчивость бактерий к факторам внешней среды, в том числе и к антибиотикам, вирулентность и другие свойства, не являющиеся жизненно важными, но дающие их обладателям определенные преимущества в процессе эволюции.

Рибосомы представляют собой органеллы, синтезирующие белок. Они представлены большой (50S) и малой (30S) субъединицами, в свою очередь, состоящими из рибосомальных РНК (рРНК) и белков. Синтез белка в рибосомах - это сложный, многоэтапный процесс. В результате транскрипции синтезируется молекула одноцепочечной информационной РНК (иРНК), являющейся точной копией ДНК, кодирующей определенный ген. Собственно синтез белка происходит в процессе трансляции - считывания информации с молекулы иРНК на бактериальных рибосомах. Рибосомы присоединяются к молекуле иРНК и двигаются вдоль нее. Необходимые для построения белка аминокислоты доставляются к рибосомам транспортной РНК (тРНК) и включаются в растущую полипептидную цепь. Специфичность включения в полипептидную цепь необходимой аминокислоты определяется комплементарностью кодона (единицы генетического кода, представляющей собой группу из трех азотистых оснований, кодирующую включение определенной аминокислоты в полипептидную цепь) в составе иРНК и антикодона (участок молекулы - триплет - тРНК, посредством которого осуществляется ее взаимодействие с кодоном). Вдоль одной молекулы иРНК обычно выстраивается несколько рибосом, образующих полисому. При росте бактерий в период интенсивного синтеза белка до 80–90% рибосом входит в состав полисом.

Рибосомы являются мишенью действия многих антибиотиков, угнетающих биосинтез белка. С большой субъединицей рибосом связываются макролидные и линкозамидные антибиотики, а также хлорамфеникол; с малой субъединицей - аминогликозидные и тетрациклиновые антибиотики.

Кроме нуклеиновых кислот и рибосом, в цитоплазме бактерий можно обнаружить гранулы, содержащие запасы питательных веществ: полисахариды, липиды, полифосфат и другие.

Пограничные структуры бактерий

В составе пограничных структур бактерий, отделяющих цитоплазму от окружающей среды, выделяют цитоплазматическую мембрану (ЦПМ), клеточную стенку, пептидогликан (муреин).

Цитоплазматическая мембрана. ЦПМ у всех бактерий имеет принципиально одинаковую структуру. Для бактерий характерна ЦПМ, которая отделяет содержимое клетки (цитоплазму) от внеклеточной среды. ЦПМ представляет собой двойной слой из молекул фосфолипидов, состоящих из фосфата и двух жирных кислот (фосфолипидный бислой).

В состав ЦПМ бактериальных клеток входит также значительное количество белков (около 200), к мембранным белкам, в частности, относятся бактериальные цитохромы. Белки выполняют различные функции:

Благодаря тому, что значительная часть мембранных белков не фиксирована в определенных точках, а способна к перемещению, ЦПМ представляет собой динамичную, постоянно меняющуюся структуру.

Клеточная стенка. У бактерий, не имеющих капсулы или слизистого слоя, клеточная стенка непосредственно контактирует с внешней средой и служит механическим барьером между протопластом и внешней средой, придавая клеткам определенную форму и механически защищая их от проникновения избытка воды.

Строение клеточной стенки у различных бактерий различно (рис. 1-2 ). Это приводит к определенному окрашиванию бактерий по методу Грама. В клеточных стенках прокариотических микроорганизмов, обработанных сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки данный комплекс либо удерживается, и клетка сохраняет цвет, либо вымывается, клетка обесцвечивается, а при дополнительной окраске приобретает другой цвет. Это свойство послужило основанием для разделения микроорганизмов на две большие группы: грамположительные (окрашивающиеся в сине-фиолетовый цвет) и грамотрицательные (окрашивающиеся в красный цвет). Различия в характере окраски по Граму коррелируют с фундаментальными особенностями строения внешних структур бактериальной клетки.

На практике в некоторых случаях характер окраски по Граму зависит от тщательности выполнения методики (длительности стадии обесцвечивания) и фазы роста микробной культуры. Известны случаи, когда грамположительные по своей структуре микроорганизмы окрашиваются как грамотрицательные, и наоборот.

Пептидогликан. Снаружи ЦПМ у всех бактерий находится слой пептидогликана, ответственный за поддержание специфической формы бактерии и выдерживающий внутриклеточное давление, достигающее нескольких атмосфер.

Пептидогликан состоит из параллельных полисахаридных цепей, образующих вокруг микробной клетки каркас, жесткость которого обеспечивается поперечными сшивками между полисахаридными цепями. Полисахаридные цепи пептидогликана состоят из чередующихся молекул N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина, соединенных между собой посредством бета-1,4-гликозидных связей.

Поперечные сшивки формируются за счет замыкания ковалентных связей между короткими боковыми цепями аминокислотной природы, отходящими под прямым углом от основных полисахаридных цепей. Замыкание поперечных сшивок осуществляет группа специализированных ферментов. Специфически подавляют функцию этих ферментов бета-лактамные антибиотики, в чем и заключается механизм действия данных препаратов. Благодаря способности связываться с пенициллином ферменты получили название "пенициллинсвязывающие белки" (ПСБ).

Несмотря на принципиальное сходство в строении пептидогликана, у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов имеются и определенные различия. По химическому составу пептидогликан грамотрицательных бактерий несколько отличается от пептидогликана грамположительных бактерий.

У грамположительных бактерий молекулы пептидогликана образуют сложную и многослойную пространственную структуру. Муреиновый слой у многих видов ковалентно связан с тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами, которые могут входить в состав рецепторов для некоторых бактериофагов. В составе клеточной стенки некоторых грамположительных бактерий возможно наличие небольшого количества полисахаридов, белков и липидов. У большинства видов грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой образует одно- или двухслойную структуру, сшитую редкими поперечными связями между гетерополисахаридными цепями.

Более важным различием в структуре клеточной стенки является наличие у грамотрицательных бактерий дополнительной внешней (наружной) мембраны, располагающейся снаружи от пептидогликанового слоя. Внешняя мембрана грамотрицательных микроорганизмов, в отличие от цитоплазматической мембраны, асимметрична. Ее внутренний слой составляют молекулы фосфолипидов, структура внешнего слоя более сложная. В его состав, кроме фосфолипидов, в значительном количестве входят молекулы липополисахарида (ЛПС).

Молекула ЛПС состоит из трех фрагментов:

Липидный фрагмент молекулы ЛПС обладает гидрофобными свойствами, а полисахаридный - гидрофильными. В соответствии с этими свойствами липидный фрагмент ориентирован внутрь внешней мембраны, а полисахаридный - наружу.

ЛПС грамотрицательных бактерий, прежде всего его фрагмент липид А, играет ключевую роль в патогенезе системной воспалительной реакции, являясь наиболее активным из всех известных стимуляторов продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, -6, ФНО).

Липополисахаридный слой практически не проницаем для экзогенных гидрофильных соединений, к которым относится большинство питательных веществ (сахаров, аминокислот) и антибиотиков. Транспорт перечисленных соединений внутрь бактериальной клетки осуществляется через воронкообразные белковые структуры (порины, пориновые каналы), встроенные в липополисахаридный слой. Гидрофобные соединения (среди антибиотиков к таковым относятся хинолоны, макролиды и тетрациклины) способны диффундировать через липополисахаридный слой.

Сравнительно высокомолекулярные гидрофильные антибиотики, такие как гликопептиды, природные пенициллины, с трудом проникают через пориновые каналы грамотрицательных бактерий, чем и объясняется природная устойчивость этих микроорганизмов к перечисленным препаратам.

Кроме поринов, в состав внешней мембраны грамотрицательных микроорганизмов входят и другие белки, выполняющие транспортные функции.

Поверхностные структуры бактерий

К таким структурам относят жгутики, ворсинки, пили и гликокаликс.

Жгутики относятся к органеллам, ответственным за подвижность бактерий. Длина жгутиков обычно составляет около 100 нм, диаметр - 20 нм. Жгутики состоят из закрепленного в ЦПМ базального тела белковой природы, переходного фрагмента "крюка" и длинной спиральной цепи, состоящей из мономеров белка флагеллина. При движении жгутики вращаются, как пропеллер; вращение генерируется в базальном теле, однако биохимические детали этого процесса изучены недостаточно.

Движение бактерий может быть хаотичным или направленным. В последнем случае в зависимости от стимула различают хемотаксис, фототаксис, аэротаксис и магнетотаксис.

Ворсинки и пили внешне напоминают жгутики, однако они не участвуют в движении бактерий. Ворсинки (фимбрии), как правило, имеются у бактерий в большом количестве. Они короче жгутиков, а их основная функция - обеспечение адгезии микроорганизмов к эпителиальным поверхностям. Ворсинки представляют собой тонкие и длинные белковые структуры диаметром около 10 нм и длиной в несколько сотен нанометров. Дистальная часть ворсинки представлена еще более тонкой фибриллой, на конце которой располагается молекула собственно адгезина. Бактериальными адгезинами, как правило, являются белковые молекулы, а рецепторами - карбогидраты фрагментов клеток эпителия. У грамотрицательных бактерий различают несколько типов ворсинок, основой для классификации служат структура ворсинок, рецептор связывания и механизм сборки. Один штамм микроорганизмов может иметь несколько типов ворсинок. Адгезины Р-ворсинок Е. coli (белок PapG) связываются с карбогидратными фрагментами Galoc (l-4) Gal-мембран клеток уроэпителия, а ворсинки I типа - с остатками маннозы.

Структура пилей напоминает структуру ворсинок, тем не менее, они значительно длиннее и обнаруживаются на бактериальных клетках в незначительном количестве. Одной из функций пилей является прикрепление к различным поверхностям. Однако не меньшее значение имеет их участие в передаче генетической информации при конъюгации. Посредством половых пилей (F-пилей) происходит прикрепление бактерии-донора к бактерии-реципиенту. После прикрепления пили служат каналом для передачи ДНК.

Если жгутики, ворсинки и пили характерны преимущественно для грамотрицательных микроорганизмов, то наличие гликокаликса - в основном для грамположительных бактерий. Выделяют два основных варианта гликокаликса: капсулу и слизь. По структуре обе формы гликокаликса схожи и представляют собой сеть поверхностного гликопротеина. Различия касаются прочности связи с клеткой. Если капсула связана достаточно прочно, то слизь легко отделяется от бактериальной клетки. Функции гликокаликса связаны с прикреплением к поверхностям, антифагоцитарной защитой, предотвращением высыхания и сохранением питательных веществ.

Метаболизм и биохимическая активность микроорганизмов

Дифференцирование отдельных видов микроорганизмов внутри крупных таксономических групп на основании морфологии и характера окраски по Граму невозможно. Так, при световой микроскопии Escherichia coli (кишечная палочка) микроорганизм, входящий в состав нормальной микрофлоры, и возбудитель брюшного тифа ( Salmonella typhi ) выглядят практически одинаково.

Основное практическое значение для дифференцирования микроорганизмов имеет характер их метаболизма.

Для выделения и идентификации бактерии разделяют на несколько групп в зависимости от их отношения к кислороду.

Облигатные (строгие) анаэробы - бактерии, размножающиеся в отсутствие свободного кислорода. Кислород в концентрации 2% и более оказывает на эти микроорганизмы токсическое действие.

Аэротолерантные анаэробы - менее чувствительные к токсическому действию свободного кислорода микроорганизмы, сохраняющие жизнеспособность при концентрациях кислорода от 2 до 10%.

Факультативные анаэробы - микроорганизмы, способные размножаться как в анаэробных условиях, так и в атмосферном воздухе.

Микроаэрофилы - микроорганизмы, нуждающиеся для роста в кислороде, однако не способные размножаться в атмосферном воздухе. Оптимальная концентрация кислорода для их роста составляет около 5%.

Облигатные (строгие) аэробы - сравнительно небольшая группа микроорганизмов, нуждающихся для роста в свободном кислороде.

Большинство современных бактерий представляют собой факультативные анаэробы.

По характеру метаболизма выделяют микроорганизмы с ферментативным и окислительным метаболизмом.

В отсутствие свободного кислорода микроорганизмы утилизируют углеводы (прежде всего глюкозу), являющиеся основными источниками энергии, в результате ферментативного метаболизма (брожения). Накопление энергии в виде АТФ происходит в результате субстратного фосфорилирования. Конечные продукты брожения - это низкомолекулярные органические кислоты (молочная и др.), возможна также продукция спиртов и углекислого газа.

Альтернативным ферментативному является окислительный метаболизм (дыхание). Накопление АТФ при окислительном характере метаболизма происходит в основном в результате окислительного фосфорилирования, в процессе транспорта электронов в дыхательных цепях, а конечным акцептором электронов выступает кислород. При дыхании происходит более полная утилизация глюкозы - до воды и углекислого газа. Соответственно, эффективность окислительного метаболизма гораздо выше, чем ферментативного.

Факультативные анаэробы в зависимости от наличия свободного кислорода утилизируют углеводы либо по ферментативному, либо по окислительному типу. Группа микроорганизмов, утилизирующих глюкозу только в результате окислительного метаболизма, исторически получила название "неферментирующие" (неспособные к ферментации). К неферментирующим микроорганизмам относятся такие патогены, как P. aeruginosa , Acinetobacter spp. и некоторые другие.

Классификация бактерий

"Официальной" классификации бактерий не существует, и вряд ли она будет разработана, ее роль на сегодняшний день выполняют публикации Международного комитета по систематике прокариот. В наиболее развернутом виде фенотипическая классификация представлена в "Определителе бактерий Берджи" (Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology) - издании, осуществляемом один раз в 10 лет.

Принципы формирования названий микроорганизмов регламентируются "Международным кодексом номенклатуры бактерий", а названия видов бактерий - "Утвержденным списком названий бактерий" и регулярно издаваемыми дополнениями. В его издании 1989 г. приведены названия более 2,3 тыс. видов бактерий, этот список продолжает постоянно пополняться, и к настоящему времени количество описанных видов достигло 4 тыс.

Современная систематика бактерий далека от совершенства и отражает уровень знаний, существующих на данный момент. Динамичность представлений о таксономии микроорганизмов вызывает некоторые сложности в практической деятельности не только врачей-клиницистов, но и микробиологов.

Существуют филогенетическая и фенотипическая схемы классификаций.

Филогенетическая классификация бактерий

Филогенетическая классификация бактерий основана на концепции естественной эволюции микроорганизмов (рис. 1-3, 1-4 ).

С филогенетической точки зрения в пределах домена Eubacteria выделяют 16 отделов. Практически все микроорганизмы, имеющие значение в патологии человека, относят к пяти отделам.

А. Грамположительные бактерии ( Firmicutes - фирмикуты).

C. Протеобактерии ( Proteobacteria ).

D. Спирохеты ( Spirochetes ).

F. Бактероиды ( Bacteroides - Flavobacterium ).

G. Хламидии ( Chlamydia ).

Выделяют также несколько бактерий с неясным таксономическим положением: Francisella , Fusobacterium , Streptobacillus .

Ниже приведен сокращенный вариант классификации клинически наиболее значимых бактерий в пределах пяти основных отделов.

Отдел А: грамположительные бактерии ( Firmicutes - фирмикуты).

Подотдел А1: грамположительные бактерии с высоким содержанием G + С, ветвь актиномицетов - Actinomyces , Bifidobacterium , Corynebacterium , Gardnerella , Mycobacterium , Propionibacterium .

Подотдел А2 : грамположительные бактерии с низким содержанием G + С, ветвь Clostridium - Bacillus : Clostridium , Bacillus , Enterococcus , Lactobacillus , Lactococcus , Listeria , Mycoplasmatales , Peptostreptococcus , Staphylococcus , Streptococcus .

Отдел С: Протеобактерии (Proteobacteria).

Подотдел Cl : альфа-подкласс - Bartonella , Brucella , Rickettsiaceae .

Подотдел С2 : бета-подкласс - Burkholderia , Neisseriaceae .

Подотдел С3: гамма-подкласс - Acinetobacter , Aeromonas , Coxiella , Enterobacteriaceae , Legionellaceae , Moraxella , Pseudomonas , Stenotrophomonas , Vibrio .

Подотдел С4 : дельта-подкласс.

Подотдел С5 : эпсилон-подкласс - Campylobacter , Helicobacter .

Отдел D: Спирохеты (Spirochetes). Borrelia , Leptospira , Treponema .

Отдел F: Бактероиды (Bacteroides - Flavobacterium ).Bacteroides , Flavobacterium , Prevotella .

Отдел G. Хламидии (Chlamydia).

Фенотипическая классификация бактерий

Используемая в повседневной работе фенотипическая классификация предполагает подразделение микроорганизмов на группы с учетом морфологии, культуральных и биохимических свойств. Она приведена в "Определителе бактерий Берджи", в девятом издании которого все прокариотические микроорганизмы разделены на 35 групп.

Клинически наиболее важные микроорганизмы включены в следующие группы.

Группа 1. Спирохеты: Borrelia , Leptospira , Treponema .

Группа 2. Аэробные/микроаэрофильные, подвижные, спиральные/изогнутые грамотрицательные бактерии: Campylobacter , Helicobacter .

Группа 4. Грамотрицательные, аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки: Afipia , Alcaligenes , Bordetella , Brucella , Chryseomonas , Legionella , Moraxella , Neisseria , Pseudomonas .

Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки: Enterobacteriaceae , Vibrionaceae .

Группа 6. Грамотрицательные анаэробные, прямые, изогнутые и спиральные бактерии: Bacteroides , Fusobacterium , Prevotella .

Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки: Veillonella .

Группа 9. Риккетсии и хламидии.

Группа 17. Грамположительные кокки: Enterococcus , Lactococcus , Leuconostoc , Peptococcus , Peptostreptococcus , Staphylo - coccus , Streptococcus .

Группа 18. Грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры: Bacillus , Clostridium .

Группа 19. Грамположительные неспорообразующие палочки: Eryzepelothrix , Listeria .

Группа 20. Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы: Arcanobacterium , Bifidobacterium , Corynebacterium , Gardnerella , Mobiluncus , Propionibacterium .

Группа 21. Микобактерии.

Группа 22–29. Актиномицеты.

Группа 30. Микоплазмы (молликуты): бактерии без клеточной стенки.

Инфекционный процесс и патогенность микроорганизмов

Все разнообразие микроорганизмов с точки зрения их роли в патологии человека можно разделить на несколько групп.

Облигатные патогены человека и вызываемые ими заболевания указаны ниже.

Грамположительные бактерии:

Bacillus anthracis - сибирская язва;

Corynebacterium diphtheriae - дифтерия;

Erysipelothrix rhusiopathiae - эризипелоид;

Listeria monocytogenes - листериоз;

Mycobacterium leprae - проказа;

Mycobacterium tuberculosis - туберкулез;

Mycoplasma pneumoniae - микоплазменная пневмония.

Грамотрицательные бактерии:

Bordetella pertussis - коклюш;

Bordetella parapertussis - паракоклюш;

Borrelia spp. - боррелиоз (болезнь Лайма);

Brucella spp. - бруцеллез;

Burkholderia pseudomallei - мелиоидоз;

Campylobacter spp. - кампилобактериоз;

Chlamydia spp. - хламидиоз;

Coxiella burnetii - Ky-лихорадка;

Francisella tularensis - туляремия;

Haemophilus ducreyi - мягкий шанкр;

Legionella spp. - легионеллез;

Neisseria gonorrhoeae - гонорея;

Neisseria meningitidis - менингит;

Rickettsia spp. - сыпной тиф, риккетсиозы;

Salmonella spp. - брюшной тиф, сальмонеллезы;

Shigella spp. - дизентерия;

Yersinia pestis - чума.

В таблице 1-2 перечислены микроорганизмы (бактерии, грибы и простейшие), входящие в нормальную микрофлору человека, а также наиболее характерные для этих микроорганизмов места обитания в организме человека.

Обозначения : ДП - дыхательные пути; МПП - мочеполовые пути; ЖКТ - желудочно-кишечный тракт; К - кожа; Р - простейшие; F - грибы.

Приведенная классификация крайне важна с практической точки зрения, поскольку она является основой для оценки значимости микроорганизмов, выделяемых из патологического материала в процессе микробиологической диагностики инфекционных болезней. Выделение из любого биологического субстрата облигатного патогена, безусловно, означает наличие инфекционной болезни. В случае же выделения условного патогена необходима интерпретация этого факта. Для правильной интерпретации необходимы данные о клинической картине заболевания, особенностях полученного для исследования биологического субстрата.

Современная ситуация осложняется и тем, что с точки зрения их вирулентности многие виды условно-патогенных микроорганизмов нельзя рассматривать как однородные. Так, в составе Escherichia coli - одного из наиболее часто встречающихся в организме человека вида бактерий - можно выделить группы штаммов, обладающих крайне разнообразными свойствами: от комменсалов до штаммов, вызывающих гемолитико-уремический синдром или менингиты новорожденных. К настоящему времени генетические основы этих различий хорошо изучены.

С другой стороны, имеются многочисленные примеры, когда генетически отдаленные микроорганизмы используют сходные механизмы вирулентности. Вполне возможно, что в обозримом будущем для диагностики инфекционной болезни необходимо будет не только выделить возбудитель, но и определить наличие у него детерминант вирулентности.

Таким образом, следует признать, что происходит определенное "размывание" границ между патогенными, условно-патогенными микроорганизмами и комменсалами. Постепенно формируется представление о том, что контакт хозяина и микроорганизма всегда приводит к развитию комплекса генетически запрограммированных процессов как со стороны микро-, так и макроорганизма. Исходы этих процессов для хозяина могут быть самыми разнообразными: от элиминации микроорганизма до более или менее выраженных повреждений хозяина, иногда несовместимых с его жизнью.

На основании анализа накопленных данных A. Casadevall и L.-A. Pirofski предложили унифицировать терминологию, описывающую взаимодействия хозяин–паразит (рис. 1-5 ). Для каждого из предлагаемых вариантов взаимодействия характерна определенная динамика повреждения организма хозяина во времени.

В результате контакта хозяина и паразита развивается инфекционный процесс.

Варианты развития инфекционного процесса:

А - элиминация микроорганизма в результате физических или иных факторов резистентности.

В - при быстром нарастании повреждения отмечается развитие клинически выраженного инфекционного процесса, характеризующегося нарастанием во времени повреждения организма хозяина.

H - при неконтролируемом нарастании повреждения происходит смерть.

G - при полном купировании повреждения отмечаются эрадикация возбудителя и выздоровление.

I - при фиксации повреждения на одном уровне складывается персистенция.

J - при медленном нарастании повреждения макроорганизма формируется колонизация, исходом которой могут быть элиминация возбудителя (D), болезнь (E), персистенция (F).

К - при отсутствии после контакта микроба и хозяина повреждения последнего формируется комменсализм, исходом которого может быть симбиоз (L) или болезнь (С).

Термин "инфекция" (инфекционный процесс) предложено использовать для описания всех процессов приобретения хозяином нового микроорганизма и размножения последнего в организме хозяина. В частности, инфекцией является заселение организма новорожденного "нормальной" микрофлорой.

Для характеристики возможных вариантов исходов и характера течения инфекционного процесса предлагается использовать следующие термины.

Комменсализм - состояние, при котором сохранение микроба в организме хозяина не сопровождается повреждением последнего, однако отмечается активация систем специфической и неспецифической резистентности.

Симбиоз (мутуализм) - состояние, при котором и микроб, и хозяин получают адаптивные преимущества.

Инфекционная болезнь - клинические проявления повреждений макроорганизма, возникающие в результате взаимодействия хозяин–паразит.

Персистенция - состояние, при котором факторы резистентности хозяина не обеспечивают элиминацию микроорганизма, сопровождается длительным по времени, но незначительным повреждением, в зависимости от баланса взаимодействия хозяин–паразит может эволюционировать в инфекционную болезнь.

Колонизация - состояние, развивающееся вслед за приобретением хозяином нового микроорганизма, характеризуется динамичностью и неустойчивостью взаимоотношений хозяин–паразит, эволюционирует в другие формы взаимоотношений.

Дифференцирование патогенных, условно-патогенных и апатогенных микроорганизмов является чисто практической задачей. Объектом антибактериальной терапии должны быть те микроорганизмы, которые вызвали инфекционный процесс у конкретного больного. Ошибка в выборе объекта терапии ведет не только к неоправданному назначению антибиотиков, но и к высокому риску неблагоприятного исхода болезни.

Литература

Введение

Общие правила получения биологического материала для микробиологического исследования

Хирургический материал

Хирургический материал может быть получен при пункции местных абсцессов или во время других хирургических процедур. Хирургу следует посоветовать отбирать несколько маленьких кусочков различных тканей и имеющиеся образцы гнойного экссудата. При возможности не следует пользоваться ватным тампоном. Экссудат необходимо отбирать стерильным шприцем с иглой. Если использован ватный тампон, следует отбирать как можно больше экссудата и поместить тампон в соответствующую емкость для отправки в лабораторию.

Некоторые примеры клинических состояний и обнаруживаемые при этом микроорганизмы в различных образцах хирургического материала приведены ниже.

Макроскопическое исследование

Провести оценку образцов гноя или отделяемого ран, отобранных с помощью тампона, очень трудно, особенно при помещении тампонов в транспортную среду. Если же образцы гноя получены в стерильной емкости или шприце, бактериологу следует внимательно исследовать их для выявления особенностей цвета, консистенции и запаха.

Цвет . Цветовая гамма гноя может варьировать от желто-зеленого до красно-коричневого. Красный цвет - обычно следствие наличия крови или гемоглобина. Пунктат из первичного амебиазного печеночного абсцесса имеет светло- или темно-коричневый цвет и желатинообразную консистенцию. Гной из послеоперационных или травматических ран (ожогов) может быть окрашен в зелено-голубой цвет пигментом пиоцианином, вырабатываемым синегнойной палочкой.

Консистенция . Консистенция гноя варьирует от очень жидкой до очень густой и клейкой. Экссудаты, полученные из суставов, плевральной полости, перикардиального мешка или брюшины, обычно жидкие, с градацией от серозных до гнойных.

Гной, полученный из дренажа свищей шейной области, необходимо исследовать на маленькие желтые гранулы "серы" - колонии Actinomyces israelii . Серые гранулы позволяют предположить диагноз шейно-лицевого актиномикоза. Мелкие гранулы различного цвета (белого, черного, красного или коричневого) типичны для мицетомы - гранулематозной опухоли, обычно поражающей нижние конечности (так называемой мадурской стопы) и характеризуемой множественными абсцессами и самодренирующимися свищами. Цвет гранул определяется волокнистыми бактериями или мицелиальными грибами.

Гной из туберкулезного "холодного" абсцесса (с несколькими характерными признаками воспаления) иногда сравнивают с мягким сыром и называют казеиновым гноем.

Запах . Отвратительный фекальный запах - один из главных характерных признаков анаэробной или смешанной инфекции, хотя этого бывает недостаточно в некоторых случаях. О характерном запахе вместе с результатами микроскопии мазка, окрашенного по Граму, бактериолог должен сразу же сообщить лечащему врачу, поскольку это может повлиять на выбор схемы эмпирической антибактериальной терапии.

Микроскопическое исследование

Каждый образец следует окрашивать по Граму и микроскопировать.

Окраска по Граму . Приготовленный мазок микроскопируют в иммерсионном масле, используя объектив ×100. Внимательно просматривают мазок, отмечая наличие и количество (обозначая +) такие клетки, как:

Серные гранулы актиномицетов или гранулы мицетомы должны быть раздавлены на стекле, окрашены по Граму и исследованы на наличие тонких фрагментарных грамположительных волокон.

Прямая микроскопия . По требованию лечащего врача или когда есть основания предполагать грибковую или паразитарную инфекцию следует проводить микроскопию нативного материала. Когда исследуют гной на наличие грибов, его смешивают с каплей 10% калия гидроксида.

Сверху материал покрывают покровным стеклом и, используя объективы ×10 и ×40, внимательно исследуют:

Материал при раневой инфекции

Не представляется возможным описать в данном разделе детали методики взятия материала из каждого типа раны, абсцесса и т.д. Ясно, что эта задача требует тесного сотрудничества лаборатории и клинического отделения. Часто это единственная возможность получить материал для исследования, поскольку во многих случаях повторного материала для исследования просто не будет. В связи с этим выполненное по всем правилам взятие материала, его транспортировка и хранение чрезвычайно важны, и каких-либо отступлений от принятой процедуры следует избегать.

Абсцессы . В случае обнаружения абсцесса хирургу или лечащему врачу следует проконсультироваться с врачом-бактериологом для согласования дальнейших действий. Техника забора гноя и кусочков ткани из абсцесса аналогична применяемой при хирургической операции. Максимальное количество гнойного материала следует забирать шприцем, взятый материал переносить в стерильную емкость в асептических условиях. Если стерильной емкости не оказалось, материал может быть оставлен в шприце с закрытой колпачком иглой. В этом случае сам шприц доставляют в лабораторию.

Следует принять меры по недопущению забора малого количества материала с помощью тампона, если в действительности объем экссудата велик. В виде исключения тампон может быть использован для сбора гноя при скудном его количестве или при отборе гноя из анатомической области, требующей обращения с особой осторожностью, например, из глаза. После получения кусочки ткани из области абсцесса необходимо измельчить в маленьком объеме стерильного бульона, используя для этого стерильные ножницы.

Инфицированные рваные проникающие ранения, послеоперационные раны, ожоги, пролежни . После тщательной обработки операционного поля хирург определяет места, где скапливается гной, расположены некротические ткани, выделяется газ (крепитация) или наблюдаются другие признаки инфекции. Частицы пораженных тканей, предназначенные для лабораторного исследования, помещают в стерильную марлю и затем в стерильную емкость. Гной или другой экссудат должен быть аккуратно собран и помещен в стерильную пробирку. При необходимости могут быть использованы тампоны.

Свищи или отделяемое лимфатических узлов . Если свищи или воспаленные лимфатические узлы самопроизвольно дренируются, материал должен быть тщательно собран с помощью стерильной пастеровской пипетки с резиновой грушей и помещен в стерильную пробирку. Если самопроизвольного дренирования нет, хирургу следует получить материал, используя стерильный шприц с иглой или зонд. Использования тампона следует избегать.

Бактериологическое исследование жидкости из стерильных в норме полостей Исследуют суставную, плевральную, перитонеальную и перикардиальную жидкости. Чрескожную пункцию и аспирацию жидкости производит врач. Кожу в области пункции обрабатывают 70% этанолом, а затем 1–2% раствором йода (калия йодид + этанол), который после завершения процедуры удаляют 70% этанолом для предотвращения ожога кожи.

Попавшие в шприц пузырьки воздуха удаляют и помещают жидкость в анаэробную транспортную систему или отправляют ее в шприце, предварительно загнув иглу или надев на канюлю шприца защитный стерильный колпачок. Избыток жидкости или гной транспортируют в стерильных контейнерах с завинчивающейся крышкой.

При достаточном количестве жидкости можно проводить посев во флаконы со средой для гемокультур в объемном соотношении 1:5–1:10. Однако в этом случае невозможна прямая бактериоскопия материала, а сроки идентификации удлиняются на сутки в сравнении с изолятами, выделенными при первичных посевах на плотные среды.

Минимальный объем жидкости для выделения бактерий - 1–5 мл, для выделения грибов или микобактерий - желательно не менее 10 мл.

Взятие материала тампоном не предохраняет анаэробы от воздействия кислорода воздуха, не позволяет приготовить качественный препарат для микроскопии, не гарантирует выделение культуры при незначительном количестве микроорганизмов в образце. Не рекомендуется использовать антикоагулянты (натрия цитрат, этилендиаминтетрауксусную кислоту), подавляющие рост некоторых видов бактерий (при необходимости лучше использовать гепарин).

Особенности хранения и транспортировки образцов для скрининга некоторых групп микроорганизмов

Actinomyces spp . Важно соблюдать обычные меры предосторожности при взятии материала для исследования на анаэробы. Если в материале присутствуют гранулы (друзы), их переносят стерильной петлей или пинцетом на предметное стекло, аккуратно раздавливая. Приготовленный препарат окрашивают по Граму, затем проводят бактериоскопию под малым увеличением для обнаружения фрагментов нитей из палочко- и кокковидных грамположительных структур. Раздавленные гранулы также могут быть засеяны на соответствующую питательную среду.

Clostridium spp . Исследование на С. difficile и определение ее токсинов проводят только при жидком характере стула. Транспортные среды не используют. Посев следует делать в течение 2 ч после забора материала. При невозможности проведения исследования в указанные сроки образцы могут быть помещены в анаэробные условия (транспортную среду для анаэробов). Кал для исследования на С. difficile можно хранить при температуре 5 °C до 2 дней, для исследования на цитотоксины - при 5 °C до 3 дней или при –70 °C более длительное время (не следует хранить образцы из-за значительного снижения активности цитотоксинов). Выделение некоторых других видов клостридий (C. tetani и C. botulinum ) требует более сложных методических подходов (см. ниже).

Campylobacter spp . Образец кала исследуют в течение не более 1 ч после его получения. Возможно бактериологическое исследование материала, полученного с помощью ректального тампона. При невозможности доставки биологического материала в лабораторию в течение 2 ч или при получении материала с помощью ректального тампона используют щелочную пептонную воду с тиогликолем и цистином. Возможно также использование коммерческих транспортных сред, таких как модифицированная среда Стюарта или среда Cary–Blair . Образцы в транспортных средах хранят при температуре 4 °C.

Helicobacter spp . H. pylori редко выделяется при бактериологическом исследовании кала. Для бактериологического исследования используют образцы, полученные при биопсии желудка. Поскольку H. pylori высокочувствителен к высыханию, необходимо или в течение 2 ч проводить посев биологического материала, или использовать транспортные среды, содержащие 20% глицерол или среду Стюарта.

Corynebacterium diphtheriae . Материалом для исследования служат мазки из очагов воспаления в ротоглотке. Материалом для бактериологического исследования могут также служить дифтеритические пленки. Тампоны доставляют в лабораторию не позднее 3 ч после взятия материала. При невозможности своевременной доставки биоматериала в бактериологическую лабораторию рекомендуется проводить посев материала на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду с калия теллуритом. При доставке биоматериала на дальние расстояния можно использовать тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина. В осенне-зимнее время года засеянный на чашки Петри или в транспортную среду материал доставляют в сумках с грелками. При невозможности немедленной доставки используют полужидкую транспортную среду, например, Амиеса.

Listeria monocytogenes . Легко выделяется из стерильных в норме образцов (крови, спинномозговой жидкости, амниотической жидкости, плаценты). Посев образцов на среды должен проводиться сразу же после получения и культивироваться при температуре 35 °C или храниться при 4 °C не более 48 ч.

Neisseria meningitidis . Чрезвычайно термолабильна, поэтому образцы немедленно доставляют в лабораторию, избегая чрезмерного перегрева и особенно охлаждения. Спинномозговую жидкость можно хранить в течение нескольких часов в термостате при температуре 37 °C или в термосе, в котором его доставляют на исследование.

Neisseria gonorrhoeae . Материалом для бактериологического исследования служит отделяемое из цервикального канала у женщин и мочеиспускательного канала у мужчин. Для забора материала используют специальные тампоны из дакрона или вискозы, так как кальция альгинат может быть для гонококков токсичен. Нежелательно использование хлопковых тампонов, так как ворсинки хлопка могут содержать жирные кислоты и ингибировать рост гонококков. Хлопковые тампоны и тампоны, содержащие кальция альгинат, могут быть использованы только для инокулирования материала на селективную среду сразу после забора материала. Среду предварительно согревают, а засеянные чашки помещают в СО₂ -анаэростаты или специальные пластиковые пакеты и транспортируют в лабораторию.

Peptostreptococcus spp . Высокочувствительны к действию кислорода, поэтому биоматериал необходимо доставить в лабораторию в течение 1 ч или использовать специальные анаэробные транспортные среды.

Streptococcus pneumoniae . Подвержен спонтанному аутолизу и гибели при хранении биоматериала в холодильнике или задержке сроков проведения исследования.

Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica. Исследуют свежий кал в течение 1 ч после получения пробы либо применяют транспортную среду.

Материал при исследовании на анаэробы

Общие показания к обследованию:

Исследуемые материалы:

Не подлежат исследованию на анаэробы:

Молекулярные методы диагностики в микробиологии

Молекулярная клиническая диагностика - наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает определение генов и продуктов их деятельности (протеинов и нуклеиновых кислот; НК). Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 1970-х гг. после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии. Этому способствовали, во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определенными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотта), названного так по фамилии ученого, предложившего данный способ разделения НК. И, наконец, еще одним критическим научным событием стало открытие в 1985 г. метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту - уровень определения НК (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии: насколько тождественны понятия "НК" и "возбудитель"? С точки зрения общей микробиологии это неравнозначные понятия, так как возбудитель - сложная биологическая система, включающая НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Однако при этом НК не может обойтись без этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Именно поэтому с позиции клинической медицины определение НК служит эквивалентом обнаружения/необнаружения возбудителя в объекте исследования. Внедрение в практику метода ПЦР, наряду с серологической диагностикой, существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или культурах клеток.

Традиционный для микробиологических лабораторий культуральный метод диагностики, как правило, хорошо оправдывает себя для выявления и исследования таких свойств, как чувствительность к антибиотикам, вирулентность легкокультивируемых микроорганизмов. Однако некоторые микроорганизмы (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) могут быть чрезвычайно чувствительными к условиям забора клинического материала, транспортировки и культивирования, наличию специальных факторов роста или способны к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии).

Медленный рост на искусственных средах таких микроорганизмов, как микобактерии и грибы, - еще одно естественное ограничение культурального метода для диагностики этих микроорганизмов. Кроме того, работа с живыми культурами выделенных возбудителей, причем не только особо опасных, но иногда и условно-патогенных, может быть опасна для здоровья персонала лаборатории.

Среди возбудителей болезней человека известны и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae , Treponema pallidum и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита C, попытки выращивания которых в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов.

Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов: выявлении специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.

Когда использование культуральных методов проблематично или связано с недостаточной диагностической эффективностью, замена биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) ферментативным удвоением НК in vitro с помощью ПЦР особенно привлекательна. Есть различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis , в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления Ch. trachomatis .

Преимущества полимеразной цепной реакции как метода диагностики

Один из критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа - показатель чувствительности. Следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность применительно к ПЦР - минимальное количество копий (геномных эквивалентов - г/э) ДНК или РНК в 1 мл раствора образца, определяемое данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценивается в процентах. Есть общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем, - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности - специфичность - определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высокой специфичностью, достигающей 99–100%.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят обеспечиваемые культуральным методом, служащим золотым стандартом в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущества метода ПЦР несомненны. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40–60%, иммуноферментный анализ (ИФА) - 50–70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55–75%, культуральное исследование - 60–80%, а ПЦР - от 90 до 100%.

Как видно, ПЦР по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и малым временем анализа, т.е. актуальностью получения результата исследования врачом и пациентом. Приведенные выше факты позволили установить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики.

Несмотря на вышеуказанные достоинства, метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований. В настоящее время выделяют следующие.

Один из них - технологический. Метод ПЦР подразумевает высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР, государственный сертификат.

Второй недостаток - клинический, заключающийся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт часто служит необоснованным аргументом практических врачей для сомнений в полученном результате и эффективности самого метода. Поясним на примере. Показано, что только у 40–60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий - "инфицированность" и "инфекционная болезнь".

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.

Возможности применения метода полимеразной цепной реакции в диагностике инфекционных заболеваний

В случаях проблематичности использования культуральных методов или их недостаточной диагностической эффективности возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) ферментативным удвоением НК in vitro с помощью ПЦР особенно привлекательна. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего МОМР Chlamydia trachomatis , в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и ИФА), традиционно используемые для выявления Ch. trachomatis .

Есть возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR).

Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (Ch. trachomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или четырех (H. influenzae , S. pneumoniae , M. catarrhalis и A. otitidis при хроническом гнойном отите) возбудителей.

Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего служат рибосомные гены (16S и 23S рРНК) сходной структуры различных прокариотических микроорганизмов.

Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных методов в целях идентификации бактерий, к которым они принадлежат. Наиболее точный метод молекулярной идентификации - определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов.

Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих этот принцип, на практике применяются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, позволяющие достоверно выявлять различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространены метод анализа расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами [метод ПДРФ (RFLP) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов] и метод определения электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP - одноцепочечный конформационный полиморфизм).

ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить, что чувствительность ПЦР широкого спектра, как правило, ниже по сравнению с видоспецифическими тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов.

Использование полимеразной цепной реакции для выявления лекарственной устойчивости микроорганизмов

В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности, для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов целесообразно, когда традиционные методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антибактериальных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости M. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности (табл. 2-1).

Для подобного анализа обычно используется ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях есть возможность прямого ПЦР-анализа на антибиотикорезистентность без предварительного культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНК-мишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу в целях выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например, метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину.

Есть, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов:

Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизма в целом.

Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по использованию ПЦР для определения чувствительности к антибактериальным препаратам служит дополнительным фактором, ограничивающим широкое применение этого подхода в практической диагностике.

Применение метода масс-спектрометрии в медицинской микробиологии

Анализ микроорганизмов с использованием MALDI-TOF-масс-спектрометрии на данный момент - самое бурно развивающееся направление в этой области. Использование специальных условий позволяет регистрировать масс-спектры молекул преимущественно белковой природы, что наиболее ценно: белки хорошо представлены в клетке в количественном отношении и вместе с тем характеризуются определенной изменчивостью. Этот подход подразумевает прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции лизата клетки микроорганизма и исключает выделение и очистку отдельных белков, что находит отражение в названии "прямое белковое профилирование".

Масс-спектрометрия высокопроизводительна, высокочувствительна и практически на 100% специфична, имеет непревзойденную скорость анализа. Эта технология, несомненно, открывает новую эру диагностики.

Что же такое MALDI-TOF-масс-спектрометрия? Ниже даны описания ключевых терминов.

Основа для использования масс-спектрометрии в микробиологии для идентификации и типирования бактерий определяется возможностью регистрации ионов биомаркеров, спектры которых уникальны для всех таксонов микроорганизмов.

Масс-спектрометр - прибор, способный в условиях вакуума разделять находящиеся в газовой фазе заряженные частицы вещества согласно отношению их массы к заряду (m/z ratio).

Общие принципы анализа с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии

Для получения масс-спектра нужно превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией. Второе необходимое условие - перевод ионов в газовую фазу в вакуумной части масс-спектрометра. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра.

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс-спектрометрического анализа - сортировка ионов по массам.

Скорость разогнанных ионов прямо пропорциональна их массе. Ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточную кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. На входе в это пространство у всех ионов кинетическая энергия одинакова. Следовательно, согласно формуле для кинетической энергии (E=mv² /2), ионы в зависимости от массы будут двигаться с разными скоростями и в разное время достигнут детектора. Зарегистрировав ионы, можно измерить время пролета и подсчитать их массу. Основное преимущество метода - работа с очень широким диапазоном масс, то есть легко измерять массы как очень больших, так и маленьких молекул.

Прямое белковое профилирование предполагает масс-спектрометрическое исследование кислого экстракта бактериальной клетки, используя α-циано-4-гидроксикоричную кислоту в качестве МАЛДИ-матрицы. При таких условиях анализируют преимущественно рибосомальные белки, наиболее консервативные в пределах вида микроорганизма. Сопоставление масс-спектров позволяет проводить идентификацию/классификацию микроорганизмов.

Таким образом, методика идентификации микроорганизмов на MALDI-TOF-анализаторе состоит из двух этапов.

I - подготовка образца. На подложке масс-спектрометра смешивают биоматериал из колонии бактерий и специальную матрицу (2’,5’-дигидроксибензойную кислоту, раствор которой устойчив к свету и готовится заранее). Затраты по времени для подготовки 24 изолятов - 10 мин, для 96 изолятов - 33 мин.

II - идентификация. Образец помещают в прибор и подвергают воздействию наносекундных лазерных импульсов. При этом молекулы матрицы и аналита (в частности, белки) переходят в газовую фазу, а протонированные молекулы матрицы взаимодействуют с белками, перенося на них положительный заряд. Под действием электрического поля ионизированные белки движутся от источника ионизации к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам. Программное обеспечение прибора оценивает время пролета частиц и преобразует эту информацию в спектр молекулярных масс (масс-спектр). Масс-спектр сравнивается со спектрами из базы данных, и на основании сведений о массах характеристических белков происходит идентификация микроорганизмов. Затраты по времени для идентификации 24 изолятов - 12 мин, для 96 изолятов - 43 мин.

Таким образом, на идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2 мин, при этом образцом может служить первичная колония! База данных анализатора, как правило, состоит из клинически значимых видов микроорганизмов (бактерий, дрожжей, плесневых грибов, дерматофитов, микобактерий) и покрывает большинство видов, встречающихся в ежедневной практике микробиологической лаборатории, и эта база постоянно пополняется.

Заключение

Клиницисту следует помнить, что качество микробиологической диагностики зависит не только от выбранного метода исследования и его характеристик, но и от соблюдения всех правил преаналитического этапа исследования (сбора, транспортировки клинического материала, правил его хранения), а также от знаний и квалификации специалиста, проводящего оценку и интерпретацию результатов исследования на постаналитическом этапе. Улучшение работы специалистов, ответственных за выполнение данных этапов исследования, - одна из наиболее перспективных возможностей повышения качества микробиологического исследования в целом. Наряду с общими принципами исследования биологических проб есть специфические особенности анализа различных видов клинического материала и выделения микроорганизмов, что требует глубоких знаний в этой области как у микробиологов, так и у клиницистов.

Список литературы

Глобальное распространение среди возбудителей инфекционных болезней человека антибактериальной резистентности (антибиотикорезистентности), происходящее на фоне сокращения разработок новых препаратов, представляет серьезную угрозу для систем здравоохранения большинства стран, в том числе и России. В этих условиях формирование стратегии рациональной антибактериальной терапии приобретает первостепенное значение. Предпосылками для формирования такой стратегии должны служить доказательные данные об эффективности антибактериальных препаратов при отдельных нозологических формах инфекционных болезней, а также данные о текущем уровне резистентности среди ведущих возбудителей. Применительно к возбудителям внебольничных инфекций общепринята практика оценки распространенности резистентности в пределах государства или крупного географического региона. В случае России использование в качестве ориентира для формирования стратегии антибактериальной терапии результатов многоцентровых исследований, охватывающих значительные регионы, может привести к определенным ошибкам. При всей важности результатов таких исследований приоритет должен сохраняться за более локальными данными, вероятно, в пределах регионов, характеризующихся устойчивыми внутренними экономическими и социальными связями.