СТАНДАРТНЫЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕДУРЫ ПРИ МОРФОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ БИОПСИЙНОГО И ОПЕРАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА

Наименование фиксирующей жидкости.

Поле для записи.

Наименование производителя, каталожный номер, срок годности фиксатора.

Фамилия и инициалы пациента

Внутренний номер направления

Краткое наименование лечебно-профилактического учреждения

Номер флакона

Количество кусочков во флаконе

Не следует в каждом кабинете иметь свою отдельную нумерацию – при этом в одном транспортировочном контейнере могут одновременно оказаться одинаково пронумерованные материалы, что затруднит их идентификацию.

При наличии нескольких кабинетов, в которых выполняются биопсии, следует принять меры для обеспечения уникальности нумерации материала – можно, например, использовать единый для всех кабинетов регистрационный журнал, или ввести идентификатор (буквенный или цифровой), проставляемый вначале регистрационного номера.

Не следует каждый новый рабочий день (каждую смену) начинать нумерацию материалов с единицы – при этом в одном транспортировочном контейнере могут одновременно оказаться одинаково пронумерованные материалы, что затруднит их идентификацию.

Следует организовать сквозную нумерацию материала, действующую, например, в течение календарного года.

Кроме регистрационного номера маркировка материала обязательно должна содержать фамилию и инициалы пациента и краткое наименование лечебно-профилактического учреждения – полное совпадение этих трех параметров маловероятны, что является дополнительной гарантией от путаницы материала.

Подготовка контейнеров (расфасовка фиксирующей жидкости и наклеивание этикеток) выполняется в централизованных патоморфологических лабораториях.

В лечебно-профилактические учреждения поступают герметично закрытые контейнеры, уже содержащие фиксирующую жидкость и имеющие наклеенную этикетку.

Использование неунифицированных контейнеров (флаконы из-под медикаментов, детского питания и проч.) категорически не допускается.

Использование неунифицированных фиксирующих жидкостей (спирт и др.), равно как и формалина, приготовленного в других учреждениях (аптеки и др.), а также иных способов фиксации категорически не допускается.

Контейнеры не являются одноразовыми, после каждого использования подвергаются специальной обработке и затем используются повторно.

В централизованной лаборатории патоморфологии ведется ежедневный учет выданных в лечебно-профилактические учреждения контейнеров. Возврат новых (готовых к повторному использованию) контейнеров в лечебно-профилактические учреждения осуществляется по обменному принципу.

Тканевой материал фиксируется немедленно по иссечении путем погружения в специальный фиксирующий раствор.

Правила использования контейнеров (табл. 1):

Последовательность действий медицинского персонала при взятии материала на морфологическое исследование:

Хранение материала, помещенного в фиксирующую жидкость, осуществляется при комнатной температуре.

Дополнительное охлаждение, тем более - замораживание, как нефиксированного, так и фиксированного материала не допускается категорически.

При отсутствии возможности доставить материал в лабораторию в течение 1 суток, на следующий день фиксирующую смесь из контейнеров с материалом следует аккуратно слить (при этом не потерять кусочки) и залить свежим фиксирующим раствором.

Если размеры кусочков ткани не превышают 10 мм в наибольшем диаметре, то срок хранения материала в чистом фиксирующем растворе до доставки в лабораторию не должен превышать 7 дней.

Если размеры кусочков (фрагментов органов, тканей) превышают 10 мм. В наибольшем диаметре – такой материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 1 суток.

Фамилия и инициалы пациента

Внутренний номер направления

Краткое наименование лечебно-профилактического учреждения

Номер стекла

Не следует в каждом кабинете иметь свою отдельную нумерацию – при этом в одном транспортировочном контейнере могут одновременно оказаться одинаково пронумерованные материалы, что затруднит их идентификацию.

При наличии нескольких кабинетов, в которых выполняются биопсии, следует принять меры для обеспечения уникальности нумерации материала – можно, например, использовать единый для всех кабинетов регистрационный журнал, или ввести идентификатор (буквенный или цифровой), проставляемый вначале регистрационного номера.

Не следует каждый новый рабочий день (каждую смену) начинать нумерацию материалов с единицы – при этом в одном транспортировочном контейнере могут одновременно оказаться одинаково пронумерованные материалы, что затруднит их идентификацию.

Следует организовать сквозную нумерацию материала, действующую, например, в течение календарного года.

Кроме регистрационного номера маркировка материала обязательно должна содержать фамилию и инициалы пациента и краткое наименование лечебно-профилактического учреждения – полное совпадение этих трех параметров маловероятны, что является дополнительной гарантией от путаницы материала.

В лечебно-профилактические учреждения поступают готовые к использованию предметные стекла, они не требуют дополнительной очистки и обезжиривания.

Использование неунифицированных предметных стекол (толстые, не бесцветные, с неровной поверхностью, царапанные, ранее использовавшиеся) категорически не допускается.

Предметные стекла являются одноразовыми, после использования не подлежат обработке и повторному использованию.

В централизованных патоморфологических лабораториях ведется ежедневный учет выданных в лечебно-профилактические учреждения предметных стекол. Возврат новых предметных стекол в лечебнопрофилактические учреждения осуществляется по обменному принципу.

Клеточные мазки фиксируются путем высушивания при комнатной температуре.

При манипуляциях с предметными стеклами во время подготовительных процедур и нанесения мазков следует брать их только за боковые грани, нельзя прикасаться руками, даже в перчатках, к поверхности стекол, чтобы не оставлять на них посторонних объектов (кожное сало, частички роговых чешуек с рук, тальк с перчаток и др.).

Последовательность действий медицинского персонала при взятии материала на цитологическое исследование (браш-биопсии, соскобы, тонкоигольные биопсии, мазки-отпечатки):

Последовательность действий медицинского персонала при приготовлении мазков из биологических жидкостей (экссудаты, транссудаты, содержимое кистозных полостей, промывные воды, секреты желез и др.):

Хранение мазков в течение 1-й рабочей смены допускается при комнатной температуре.

Не следует при хранении складывать планшеты со стеклами друг на друга во избежание их прилипания и повреждения мазков.

При отсутствии возможности доставить материал в лабораторию в течение 1 смены, мазки рекомендуется хранить в нижнем отделении бытового холодильника при температуре не ниже +5^оС не более 3-х суток до доставки в лабораторию.

Прием материала и контроль его маркировки осуществляется в целях проверки полноты и качества за оформления направлений, соответствия данных направлений маркировке материала (рис. 11).

Если доставка материалы осуществляется медицинским работником направившего лечебно-профилактического учреждения (отделения, кабинета) – прием материала осуществляется в его присутствии.

Извлечь из транспортировочного контейнера все флаконы с биоматериалом и расставить их на специальном столе в порядке возрастания регистрационного номера, присвоенного в лечебно-профилактическом учреждении (рис. 11, п. 4) или, в отсутствие регистрационных номеров, по фамилиям пациентов (рис. 11, п.1).

Извлечь из транспортировочного контейнера направления и разложить их в порядке возрастания регистрационного номера, присвоенного в лечебнопрофилактическом учреждении (рис. 11, п. 4) или, в отсутствие регистрационных номеров, по фамилиям пациентов (рис. 11, п.1).

Проверить – ко всем ли присланным направлениям имеются флаконы с биоматериалом, и ко всем ли присланным флаконам с биоматериалом имеются направления.

Сверить записи в направлениях с маркировкой флаконов (рис. 11):

Регистрационный номер биоматериала (в случае его наличия) на направлении и на этикетке флаконов должен совпадать (рис. 11, п. 4).

В случаях выявления дефектов маркировки материала патоморфологическая лаборатория имеет право:

Поступивший в патоморфологическую лабораторию биоматериал регистрируется в специальном журнале (рис. 12) под роспись.

В случаях выявления дефектов оформления направлений в части полноты и разборчивости заполнения требуемых граф патоморфологическая лаборатория имеет право востребовать уточнения по телефону.

Прием материала на цитологические исследования (мазки) осуществляется в том же порядке (см. пп. 1-8).

Регистрация заключается в присвоении биоматериалу уникального регистрационного номера.

Регистрационный номер является основным идентификатором биологического материала в патоморфологической лаборатории, и используется для маркировки всех записей и первичных материалов морфологического исследования.

Регистрационный номер является системообразующим параметром технологического процесса в любой патоморфологической лаборатории, он должен быть уникальным и формироваться исходя из четкого алгоритма, ясного для всех работников данной лаборатории.

Формат регистрационного номера

Система нумерации

Дополнительные идентификаторы

Регистрация биологического материала, поступившего в патоморфологическую лабораторию, производится в специальном регистрационном журнале (рис. 13).

Уникальный регистрационный номер проставляется на направлении одновременно с записью в регистрационном журнале.

Уникальный регистрационный номер проставляется на всех первичных материалах исследования – парафиновых блоках (заливочных кассетах при заливке) и микропрепаратах (предметных стеклах при микротомии).

Для нанесения регистрационного номера на заливочных кассетах и предметных стеклах используются простые графитовые карандаши или специальные гистологические принтеры с несмываемой краской.

Регистрационный номер на заливочных кассетах и предметных стеклах должен наноситься четко и ясно, без исправлений и помарок.

Регистрационный номер на предметном стекле должен четко соответствовать регистрационному номеру блока, с которого изготовлен данный микропрепарат.

Регистрация цитологического материала осуществляется в том же порядке. Целесообразно цитологический материал регистрировать отдельно от гистологического с использованием отличительных дополнительных идентификаторов.

Характер, объем и степень необходимой детализации макроскопического описания определяется общепринятыми стандартами и протоколами, а в неопределенных случаях – соображениями диагностической целесообразности, определяемыми врачом-патологоанатомом.

В любом макроскопическом описании должен содержаться минимально необходимый набор морфологических феноменов, наличие которых в описании, по своей совокупности, формально позволяет обосновать сформулированный далее диагноз (заключение).

Кроме предусмотренных стандартами описаний метрических и качественных характеристик патологического процесса, не следует пренебрегать детальным описанием зрительно доступных термических повреждений хирургического края удаленных фрагментов тканей, наличия шовного материала, участков механического (разможжение, дополнительные разрезы, проколы) и химического повреждения тканей, а также участков экзогенных пигментаций, попавших в макропрепарат.

Термические повреждения материала, часто обнаруживаемые в биопсиях, проявляются в виде коагуляционного некроза тканей. Термическое повреждение образца может быть следствием термического воздействия на любом этапе обработки, но наиболее часто – при термических воздействиях на нативную нефиксированную ткань, то есть при взятии материала вследствие ожога лазером, электрокоагулятором или при использовании других горячих инструментов. Частой причиной сгорания тканевого образца бывает использование завышенных более необходимого мощностей электрохирургических инструментов, применяемое при иссечении тканей в целях снижения кровоточивости в краях хирургической раны. Ширину зоны термического повреждения хирургического края образца должно отмечать в протоколе микроскопического исследования.

Шовный материал может быть представлен в препарате как отдельными фрагментами, так и цельными волокнами, срезанными поперечно, продольно или косо. Шелковые хирургические нити дают выраженное двойное лучепреломление в поляризованном свете, что можно использовать как идентификационный признак данного вида материала. Шовный материал в кусочке может повредить нож микротома, что приведет к образованию полос на срезе при микротомии, потому видимые инородные структуры необходимо удалять из кусочка по возможности во время вырезки и соответствующим образом описывать в протоколе макроскопического исследования.

Мягкие ткани могут быть легко повреждены при манипуляциях с использованием катетеров, как iv vivo, так и на фиксированных тканевых образцах. Рекомендуется использовать все имеющиеся профессиональные и административные возможности противодействия любым манипуляциям с макропрепаратами операционного материала (дополнительные разрезы, проколы и прочие механические воздействия) в отсутствие врача-патологоанатома. Любые подобные действия, чем бы они ни были мотивированы, могут в значительной степени повредить материал, нарушить анатомические взаимоотношения тканей, вызвать раздавливание (разможжение) тканей, что, в свою очередь может осложнить дальнейший морфологический анализ и интерпретацию полученных результатов исследования.

Нефиксированные ткани (особенно лимфатические узлы) очень подвержены раздавливанию зажимами, пинцетами, другими инструментами или руками медицинского персонала. Следует помнить о необходимость минимизации любых механических воздействий на ткани как in vivo, так и на извлеченные тканевые образцы.

Следует строго следить за тем, чтобы макропрепараты операционного материала не подвергались воздействию никаких жидкостей, химических и физических агентов, кроме унифицированных растворов формалина, в который макропрепарат следует помещать тотчас после иссечения.

Дегенеративные изменения в тканях начинают развиваться сразу после прерывания кровотока. Аутолиз обусловлен воздействием гидролитических ферментов лизосом при нарушении внутренних мембран клеток. Признаки аутолиза могут быть в различной степени представлены в различных тканях, обычно бывают более выражены в эпителиальных тканях, чем в мезенхимных, что связано с большей устойчивостью последних к гипоксическим повреждениям. В некоторых органах, таких как поджелудочная железа, процессы посмертного аутолиза более выражены из-за обилия протеолитических ферментов. В биопсийном материале, который обычно фиксируется немедленно, признаки аутолиза бывают менее выражены, чем в аутопсийном. Избежать аутолиза, позволяет быстрая фиксация материала. Затормозить процессы саморазрушения тканей трупа до вскрытия позволит охлаждение тела до 4^оС. При любых обстоятельствах явления аутолиза трупного материала будут тем менее выражены, чем скорее будет произведено вскрытие, изъятие и фиксация тканевых образцов. Раннее вскрытие позволяет идентифицировать прижизненные повреждения органов и тканей. При поздних вскрытиях отличить прижизненные повреждения и посмертный аутолиз органов и тканей весьма затруднительно.

В макропрепаратах кожи могут быть обнаружены нерастворимые экзогенные пигменты, используемые для нанесения татуировок. Эти депозиты обычно инертны по отношению к гистохимическим тестам и не дают анизотропии в поляризованном свете. Однако же весьма желательно описывать наличие татуировок в протоколе операции и при макроскопическом исследовании нефиксированного операционного материала – это поможет избежать немалых затрат времени и ресурсов на выяснение природы пигментации в случаях когда это имеет решающее диагностическое значение.

В ряде случаев используют цветное маркирование хирургического края удаленного образца для его правильной ориентации в макропрепарате или для заливки в блоке. Для маркировки обычно используются India ink, Silver nitrat, Alcian blue, Alcian green и многие патентованные составы различных цветов, которые окрашивают поверхность образца и могут проникать в ткань на различную глубину.

Кроме диагностически значимой нагрузки, процедура макроскопического описания несет в себе и важные технологические элементы, призванные обеспечить доказательность диагностического заключения – это методически правильная вырезка и маркировка материала.

Проверка качества предварительной фиксации всегда рекомендуется производить перед началом работы с материалом. При этом следует выяснить качество фиксирующей жидкости и оценить соблюдение общих правил фиксации в части размера образцов, размеров контейнера и количества фиксирующей жидкости. В первую очередь, следует определить – какая жидкость залита в контейнер. Не редки случаи, когда вместо формалина в биопсийный контейнер заливаются другие жидкости, не пригодные для целей фиксации тканей. Во-вторых, следует помнить, что при фиксации образцов, содержащих большое количество жидкой крови или жировой ткани, фиксирующая жидкость быстро загрязняется посторонними примесями. В таких случаях фиксирующую жидкость следует сменить в течение нескольких часов после начала фиксации. Если доставка биопсийного материала в лабораторию откладывается на более длительный срок – эту процедуру следует осуществить на месте взятия материала. Недостаточное внимание должной фиксации заведомо проблемных (крупных) образцов часто приводит к дефектам гистологической обработки тканей.

Недостаточно фиксированные образцы не следует запускать в дальнейшую проводку. Дефекты фиксации образцов обнаруживаются при вырезке. как правило, в глубине больших кусочков, и отличаются от поверхностных слоев ткани красноватым оттенком окраски. Плохо, если такие участки захватывают область интереса – именно в них могут проявиться дефекты дальнейшей гистологической обработки, а при микроскопическом исследовании нередко обнаруживаются аутолитические изменения тканей. Все отмеченные дефекты фиксации следует подробно описать в протоколе вырезки материала.

Из крупного образца вырезаются более мелкие кусочки, толщиной не более 3-4 мм. Это особенно важно для плотных тканей. Приготовление образцов толщиной более 6 мм может быть причиной некачественной проводки ткани. При вырезке следует помнить и то, что площадь кусочка в последующем может оказать влияние на толщину парафиновых срезов – зависимость здесь обратно пропорциональная. Идеальны для микротомии кусочки с площадкой среза, сторона которой не превышает 5-8 мм. Для парафиновой заливки с использованием стандартных заливочных форм следует вырезать кусочки трех типоразмеров – до 5х5 мм, 5-10 мм и 10-20 мм. При значительных размерах зоны интереса следует помнить, что предельный размер кусочков при заливке в стандартные биопсийные формы не может превышать 20 мм. В таких случаях можно для заливки вырезать несколько последовательно ориентированных кусочков, что позволит в дальнейшем реконструировать микроскопическую картину.

Форма вырезаемых образцов. Вырезку следует производить так, чтобы в итоге поверхность образца в области интереса, предназначенная для среза, была плоской и на ней должны быть представлены все слои ткани. Неровные образцы требуют значительной обрезки при микротомии, что может привести к потере части ткани образца и повышенному износу микротомных лезвий.

Количество вырезаемых образцов определяется общепринятыми стандартами и протоколами, а в неопределенных случаях – соображениями диагностической целесообразности, определяемыми врачом-патологоанатомом.

При вырезке рекомендуется придерживаться правила: в одну кассету для проводки следует помещать только один кусочек, на одну кассету следует наносить только один уникальный регистрационный номер, соответствующий номеру кусочка.

Следует избегать повреждений тканей, в особенности не полностью профиксированных – не давить, использовать только острые лезвия, разрезы производить плавными движениями в один рез. Грубое обращение с образцами, использование тупых лезвий или ножниц приводят к деформациям и повреждениям ткани.

Каждый образец следует класть на чистую поверхность, чтобы исключить попадание мелких фрагментов тканей от другого образца. Поверхность, на которой производится вырезка, перед вырезкой каждого нового образца должна быть тщательно очищена влажной салфеткой. При вырезке на неочищенной поверхности возможен перенос частичек злокачественной опухоли на образец с доброкачественными процессами. Особенно это важно в тех случаях, когда один за другим обрабатываются образцы одного типа. То же касается и инструментов, используемых при вырезке. Всякий раз при переходе к вырезке нового образца инструменты следует тщательно очистить от остатков ткани предыдущего образца.

Свежие или не полностью зафиксированные ткани, а также толстоигольные биоптаты не следует зажимать между губчатыми гистологическими прокладками. Маленькие, свежие или не полностью зафиксированные образцы, помещенные на губчатые гистологические прокладки, могут быть повреждены в результате сдавления.

Для проводки ткани следует выбирать соответствующий тип кассет, чтобы избегать дополнительной деформации, сдавления или утраты образцов. Во время проводки фрагменты ткани сжимаются и могут продавливаться через слишком большие отверстия кассеты в растворы для проводки или в другую кассету. Не следует исходить из принципа «один размер кассет подходит для любых образцов».

Образцы в кассетах всегда следует размещать плоской поверхностью, предназначенной для среза, вниз. В последующем и при заливке образцы переносятся из кассет в заливочные формы этой же поверхностью вниз. Таким образом, поверхность, выбранная для среза врачом во время вырезки, всегда попадет на вершину парафинового блока.

Кассеты не следует переполнять образцами – таким образом, обеспечивается наилучший доступ реагентов и предотвращается искажение формы образца. Если образец слишком велик – необходимо использовать вторую кассету. Если в кассеты кладется слишком большое количество образцов – это затрудняет доступ реагентов и приводит к деформации кусочков.

Необходима четкая и разборчивая маркировка кассет, что важно для правильной идентификации образцов. Трудночитаемые номера недопустимы во избежание неоднозначного толкования маркировки. Если в лаборатории нет специального гистологического принтера для кассет, то для ручной маркировки следует использовать простой грифельный карандаш средней твердости, обеспечивающий легкое нанесение маркировки. Если при маркировке кассеты допущена ошибка – не следует стирать надпись ластиками, лучше всего ошибочную надпись сцарапать лезвием скальпеля. Маркировка кассеты должна быть максимально лаконична. Лучше всего ограничиться нанесением на кассету только индивидуального уникального номера кусочка. Любая избыточная маркировки затрудняет идентификацию надписи на последующих этапах гистологической обработки материала.

Часто при размещении мелких образцов в кассетах для проводки используются гистологические прокладки. Если образец недостаточно фиксирован и при закрывании кассеты плотно зажимается биопсийными прокладками, он деформируется с образованием треугольных и ромбовидных дефектов, повторяющих губчатую структуру материала прокладок. Для того, чтобы избежать этого артефакта, следует запускать в проводку только полностью зафиксированные образцы такой толщины, чтобы при закрывании кассеты кусочек не сдавливался (не более 3-4 мм).

Достаточно распространена ситуация, когда образцы тканей для срочного исследования после приготовления замороженных срезов оттаивают в фиксаторе для последующей заливки в парафин. В таких случаях в образцах тканей могут обнаруживаться повреждения кристаллами льда или изменения, характерные для оттаивания. Например, в образце ткани, залитом в парафин после замораживания/оттаивания ядра часто бывают окружены светлой каймой цитоплазмы, хроматин менее конденсирован и интенсивно окрашен. Ядерные и цитоплазматические структуры хуже идентифицируются. Эти изменения необязательны, но вполне характерны. Особенно выражены низкотемпературные повреждения тканей при медленном замораживании – при этом тканевая жидкость кристаллизуется, а вокруг кристаллов льда формируются микроскопические трещины и разрывы. Для минимизации этих артефактов рекомендуется быстрое замораживание тканевых образцов при температуре не выше -20⁰С, что позволяет тканевой жидкости застывать в аморфном состоянии, и использование специальных смесей для криомикротомов, способствующих равномерному охлаждению/замораживанию и медленному размораживанию кусочков в формалине. Но и при этом допускается только однократное замораживание/оттаивание образца, в противном случае качество гистологических препаратов будет прогрессивно снижаться прямо пропорционально числу циклов замораживания/оттаивания.

Попадание инородной ткани в исследуемый образец в большинстве случаев происходит при вырезке, например, когда нож или поверхность рабочего стола недостаточно очищаются после обработки предыдущего материала. Обработка скальпеля и рабочей поверхности водой или спиртовыми салфетками позволит избежать этого артефакта. Важно помнить, что расходные материалы (например, биопсийные кассеты, гистологические прокладки, растворы для проводки), при их многократном использовании тоже могут служить источником загрязнения препарата. При проводке материала, частички ткани могут задерживаться на кассетах или в многократно применяемых растворах. Для снижения риска загрязнения материала необходимо следить, чтобы биопсийные кассеты и полиуретановые прокладки использовались однократно. Следует также стремиться всегда использовать свежеприготовленные растворы. Загрязнение образца инородной тканью может произойти и на других стадиях обработки материала, например: при расправлении срезов в водяной бане после микротомии (флотация), если с поверхности воды не были удалены фрагменты срезов с предыдущего блока или если на поверхности воды одновременно расправляются срезы с нескольких блоков; в результате применения грязных пинцетов, заливочных форм, парафина; при окраске материала, если фрагменты срезов слетевших со стекла, попадают в красящий раствор, а потом оседают на другом препарате. В тех случаях, если возникают сомнения по поводу истинности наблюдаемых в образце изменений, необходимо провести повторное исследование, чтобы исключить возможность контаминации. Пренебрежениеэтим в ряде случаев, может стать причиной диагностических ошибок.

Образец необходимо помещать в фиксирующий раствор немедленно после взятия. Важно, чтобы кусочки оставались незафиксированным максимально короткое время. Флаконы с материалом следует содержать при температуре не менее 4ºС. При отложенной фиксации дегенерация компонентов ткани начинается сразу после того, как ткань лишается кровоснабжения.

Соотношение объема фиксирующего агента и тканевого образца должно быть не менее, чем 20:1. Для этого необходимо правильно подбирать размер контейнера. При использовании контейнеров неадекватно малого размера возможно механическое повреждение, деформация и недостаточная фиксация образца (снижение объема фиксирующей жидкости меньше, чем 20:1).

Оптимальным для фиксации в текущей гистологической практике для решения большинства диагностических задач является раствор формалина, забуференный при рН 6,8-7,0. Не рекомендуется использовать фиксирующие растворы с неустановленным рН. Кислый формалин приводит к образованию в ткани так называемого «формалинового пигмента» бурого цвета, вследствие взаимодействия с гемоглобином. При решении некоторых диагностических задач требуется приложение дополнительных усилий для идентификации химической природы этого пигмента, что может привести к существенному удорожанию исследования. В качественных гистологических препаратах формалинового пигмента быть не должно.

Для лабораторного приготовления забуференного формалина рекомендуется использовать пропись R.D. Lillie. Но наиболее предпочтительно использование стандартизованных готовых растворов формалина для гистологии, выпускаемых многими производителями (Merсk, Sigma, Panreac, BioOptica и другие). Использование стандартизованных фиксирующих смесей позволяет стандартизовать процедуру и варьировать лишь время экспозиции в зависимости от особенностей исследуемых образцов. Кроме того, использование стандартизованных фиксирующих смесей позволяет избежать многих артефактов фиксации.

В ряде случаев для выполнения специальных диагностических или исследовательских задач требуется использование иных фиксирующих агентов, которых известно множество. При этом следует строго соблюдать протокол, предусмотренный оригинальной методикой, и помнить о том, что использование любых методов ускоренной фиксации, или методов фиксации, позволяющих исключить из дальнейшей гистологической обработки этапы щадящей дегидратации (безводные фиксаторы), чреваты появлением грубых тканевых артефактов. К специальным методам фиксации не следует прибегать без особой нужды, когда эта необходимость диктуется особыми диагностическими или исследовательскими задачами. Во всех случаях традиционной гистологии рекомендуется использование стандартной фиксации материала забуференным формалином.

Большие образцы тканей следует как можно быстрее доставлять в лабораторию для вырезки более мелких кусочков и обеспечения правильной фиксации. В крупных образцах, оставленных в фиксирующем растворе на длительное время до вырезки центральная часть остается незафиксированной и может подвергаться значительным разрушениям. Ускорить фиксацию крупных образцов тканей можно дополнительными разрезами толщиной не более 10 мм. Это обусловлено тем, что средняя скорость проникновения формалина в ткани равна 1 мм в час, и она замедляется по мере удаления от поверхности образца. Считается, что без ущерба для качества фиксации можно вырезать кусочки толщиной не более 5 мм.

При фиксации ткань уплотняется и деформируется. Особенно важно избегать деформации нежных столбиков ткани, полученных при пункционных биопсиях, а также любых малых и тонких объектов. Для предотвращения фиксационной деформации столбики ткани рекомендуется до погружения в фиксирующую жидкость разместить на полоске плотной тонкой бумаги, плохо впитывающей жидкость, такой как, например, калька. Излишки кальки можно обрезать на расстоянии 1.0-1.5 мм от края кусочка ткани, и в таком виде образец вместе с калькой погружается в фиксирующую жидкость. Подложка из кальки не позволяет кусочку деформироваться в процессе фиксации. Нефиксированный кусочек хорошо прилипает к бумажной подложке. Кусочек, даже на короткое время помещенный в фиксирующую жидкость, к бумажной подложке не прилипнет. Потому процедуру эту следует выполнять непосредственно после получения образца ткани, и очень быстро, чтобы кусочки оставались незафиксированным максимально короткое время.

Особенно важно не допускать механических повреждений пункционного образца при манипуляциях с ним – столбик ткани рекомендуется придерживать пинцетом только за самый край и только в одном и том же месте. Определенную трудность может представлять извлечение столбика ткани из канала пункционной иглы. Для наиболее бережного извлечения столбика ткани пункционную иглу следует полностью раскрыть, поместить мандрен с желобом, в котором находится образец, в каплю теплого физиологического раствора, расположенную на горизонтальной чистой поверхности, и осторожными движениями с помощью тонких препаровальных инструментов снять образец с иглы в каплю физиологического раствора. После этого столбик ткани легко может быть перемещен на бумажную подложку. Этот прием удобно также использовать и при необходимости точной пространственной ориентировки кусочка при некоторых специальных видах исследования.

Окончательная фиксация тканевых образцов должна быть полной и адекватной. Забуференный формалин является вполне оптимальной фиксирующей жидкостью, и превышение экспозиции в качественном и незагрязненном растворе на часы или даже сутки не оказывает негативного влияния на ткани. Излишнее стремление минимизировать время фиксации в формалине может привести к недостаточной фиксации тканевых образцов, вызвать появление дефектов при дальнейшей обработке материала.

В порядке оптимизации лабораторных работ можно рекомендовать уже на этапе вырезки разделять потоки разнородных материалов. При этом материал эндоскопических и пункционных биопсий, соскобов эндометрия, биопсий кожи и шейки матки, операционного материала и проч. запускается в обработку отдельными сериями. Для каждой из этих серий материала желательно подобрать оптимальные условия фиксации. Это не сложно, ибо при использовании стандартизованных растворов фиксатора приходится варьировать лишь экспозицией, величина которой зависит от размеров кусочков и некоторых особенностей тканей (избыток жидкой крови, жира и проч.).

При аппаратных методах проводки всегда следует первым шагом устанавливать окончательную фиксацию материала продолжительностью не менее 2-3 час. независимо от того, насколько полноценно материал зафиксирован до загрузки в аппарат. Этого времени, при адекватных размерах кусочков, как правило, достаточно, чтобы нивелировать незамеченные недостатки предварительной фиксации материала. Но и при этом, не следует помещать в одну корзину (реакционную емкость) кассеты со слишком разнородным материалом. Загрязняющие фиксирующую жидкость примеси крови от соскобов эндометрия или жира от жировой клетчатки и атером могут ухудшить качество фиксации других тканевых образцов, и, кроме того, будут способствовать увеличению расхода фиксирующей жидкости, которую придется менять перед каждым новым циклом проводки.

Программу проводки необходимо выбирать в зависимости от типа ткани и размеров образцов. Слишком длинная программа для маленьких (например, эндоскопических) биопсий или слишком короткая для крупных образцов, особенно содержащих жировую ткань (молочная железа и др.), может привести к дефектам проводки материала. Вариантов программ проводки может быть множество, и по большому счету не важно – какому из этих вариантов отдается предпочтение, важно конечное качество гистологических препаратов и какой ценой это достигается. Всегда наиболее предпочтительно использовать надежную, апробированную программу проводки, в случае если она дает хороший и стабильно воспроизводимый результат. Модернизация программ может потребоваться, например, при решении задач увеличения производительности лаборатории. При этом изменения в привычную программу проводки рекомендуется вводить пошагово, четко документируя все нововведения, сколь незначительными они бы ни казались, с оценкой получаемых результатов путем пробных проводок малых партий материала.

При переходе от ручных методов проводки к аппаратным начинать следует с программ, рекомендуемых фирмой-производителем, с последующей их коррекцией исходя из особенностей конкретного материала. При этом изменения в стандартную программу проводки рекомендуется вводить пошагово, четко документируя все нововведения, сколь незначительными они бы ни казались, с оценкой получаемых результатов путем пробных проводок малых партий материала.

Программы проводки следует подбирать исходя из конкретных технологических условий лаборатории, видов и объемов исследуемого материала. Не редко в лаборатории одновременно используется несколько программ проводки – например, для малых биопсий, для операционного материала, для аутопсийного материала. Кроме стандартной плановой программы проводки, в некоторых лабораториях требуется выполнять ускоренную проводку материала – в таких случаях полезны дополнительные технические возможности современных гистологических процессоров – такие как вакуум, повышенное давление, микроволновое облучение и др.

Укорочение стандартной процедуры проводки возможно только с применением дополнительных методов физического воздействия на образцы, ускоряющих пропитывание ткани – таких как вакуум, повышенное давление, микроволновое облучение и др.

Остатки формалина при недостаточном его отмывании способствуют задержке в тканях капель воды, не удаляемых при процедуре дегидратации – в этих участках не будет полноценного пропитывания парафином. Потому не следует произвольно укорачивать время отмывки после формалина, причем чем кусочки большего размера – тем время отмывания должно быть больше.

Произвольное укорочение времени дегидратации и пропитывания при обычных внешних условиях проводки (температура, давление и проч.) могут привести к резкому ухудшению качества пропитывания ткани. Недостаточная дегидратация ткани возможна при произвольном укорочении процедуры или при использовании загрязненных спиртовых растворов. Оставшиеся в тканях капли воды препятствуют полноценному пропитыванию образца парафином.

Высушивание образцов возможно при использовании в процедуре проводки хлороформа вместо ксилола. Хлороформ очень летуч и потому быстро испаряется с поверхности кусочков, вызывая их высушивание и растрескивание. При использовании хлороформа в процедуре проводки следует насколько возможно сократить время пребывания кусочков на открытом воздухе при переносе между емкостями (при ручной проводке или при использовании процессоров карусельного типа). Высушивание образцов возможно и при резком увеличении времени пребывания кусочков на открытом воздухе из последней спиртовой емкости в ксилол или между ксилольными емкостями.

Перегрев образцов возможен при инкубации образцов в первой парафиновой емкости сильно загрязненной ксилолом при 56⁰С. Дело в том, что температура плавления ксилол-парафиновой смеси приближается к 37⁰С, а при 56⁰С смесь близка к кипению – в результате кусочки практически «свариваются» или «пережигаются». Единственный способ избежать этого артефакта – своевременно менять первый парафин. Примеси ксилола во второй и третьей парафиновых емкостях вообще недопустимы.

Для оптимальной проводки и получения качественных микропрепаратов ткань должна быть хорошо зафиксирована. Если после неполной фиксации образцы ткани при проводке попадают в спирт, то возникает феномен зональной фиксации (формалиновая фиксация по периферии образца, спиртовая фиксация в центре). При аппаратных методах проводки всегда следует первым шагом устанавливать окончательную фиксацию материала продолжительностью не менее 2-3 час. независимо от того, насколько полноценно материал зафиксирован до загрузки в аппарат. Этого времени, при адекватных размерах кусочков, как правило, достаточно, чтобы нивелировать незамеченные недостатки предварительной фиксации материала. Но и при этом, не следует помещать в одну корзину (реакционную емкость) кассеты со слишком разнородным материалом. Загрязняющие фиксирующую жидкость примеси крови от соскобов эндометрия или жира от жировой клетчатки и атером могут ухудшить качество фиксации других тканевых образцов, и, кроме того, будут способствовать увеличению расхода фиксирующей жидкости, которую придется менять перед каждым новым циклом проводки.

Для получения наилучших результатов при проводке материала необходимо использовать реагенты высокого качества. Реагенты для проводки необходимо заменять в четком соответствии с протоколом. Предпочтительно использование системы контроля за реагентами, применяемой в современных гистологических процессорах. Использование загрязненных или разбавленных реагентов приводит к плохому качеству проводки материла.

Традиционно для дегидратации используется этиловый спирт (этанол). Спирты, используемые для проводки должны сохранять характерный запах, быть прозрачными. Всегда следует заменить спирты перед проводкой новой партии образцов, если они имеют мутный вид. Наиболее быстро загрязняется первая емкость с 70% спиртом, при больших объемах материала его приходится менять практически перед проводкой каждой новой партии образцов. Очень важно для адекватной дегидратации материала в последней спиртовой емкости всегда иметь чистый неразбавленный спирт – потому ее тоже надо заменять довольно часто (при использовании процессоров карусельного типа спиртовые емкости просто сдвигают на одну позицию назад). К сожалению, возможности использования в здравоохранении спирта этилового 96-98% в настоящее время отсутствуют, и лучшее что мы можем получить для лаборатории – это «спирт медицинский 95%». Широко использовавшиеся ранее методические приемы кустарного обезвоживания спирта в лабораторных условиях с помощью сульфата меди (медный купорос) – малопроизводительны и теперь уже мало где применяются. Выходов из этой ситуации три. Первый – четко контролировать каждую поступающую партию спирта медицинского с помощью спиртометра и корректировать методику разведения спиртов в зависимости от концентрации исходного раствора. Из опыта можем отметить, что поступающий в лечебнопрофилактические учреждения фармакопейный «спирт медицинский 95%» в реальности может иметь концентрацию основного вещества от 93,7% до 95,7%. Второй – использовать для проводки только высококачественный ксилол квалификации не ниже «чда». Это тоже может оказаться проблемой, но вполне решаемой. Третий – использовать для проводки высокоочищенный изопропиловый спирт (изопропанол) с концентрацией основного вещества не менее 99,5%, в котором осуществляются все этапы дегидратации и пропитки до парафина – таким образом, из использования исключаются те только этанол, но и ксилол.

Формалин, используемый для проводки, должен сохранять характерный резкий запах, быть прозрачным, допускается слегка желтоватый оттенок цвета. Всегда следует заменить формалин перед проводкой новой партии образцов, если он загрязнен примесью крови (красно-бурый цвет), жира (опалесцирует или имеет хорошо различимые жировые капли), мелкими фрагментами тканевых образцов из предыдущей партии проводки, или если он имеет мутный вид и осадок.

Промывочную воду необходимо заменять на свежую перед проводкой каждой новой партии материала независимо от того, насколько чистой она кажется глазу.

Ксилол, используемый для проводки должен сохранять характерный запах, быть прозрачным. Всегда следует заменить ксилол перед проводкой новой партии образцов, если он имеет мутный вид. Наиболее быстро загрязняется первая емкость ксилола, следующая за спиртом, при больших объемах материала его приходится менять практически перед проводкой каждой новой партии образцов. Очень важно для адекватной пропитки материала в последней ксилольной емкости всегда иметь чистый ксилол – потому ее тоже надо заменять довольно часто (при использовании процессоров карусельного типа ксилольные емкости просто сдвигают на одну позицию назад).

Для получения наилучших результатов при проводке и заливке материала необходимо использовать парафин высокого качества. В настоящее время предлагается множество марок специализированного гранулированного парафина для гистологии. Основные качественные характеристики – температура плавления 56⁰С (отсутствие легко- и тугоплавких фракций), гомогенность (поверхность разлома застывшего парафинового блока должна иметь равномерный мелкозернистый вид), пластичность (не растрескивается при замораживании до -20⁰С). Парафин, используемый для проводки, должен быть полностью расплавленным при температуре, заданной протоколом, с легким, почти неуловимым запахом воска. Недопустимы примеси ксилола во второй и третьей парафиновых емкостях – парафин, загрязненный ксилолом, имеет резкий нехарактерный запах, более жидкую консистенцию при 56⁰С, так как температура его плавления много ниже (приближается к 37⁰С). Очень важно для адекватной пропитки материала в последней парафиновой емкости всегда иметь чистый парафин – потому ее тоже надо заменять довольно часто (при использовании процессоров карусельного типа парафиновые емкости просто сдвигают на одну позицию назад).

По возможности рекомендуется применять методы проводки без использования ксилола (реализовано в некоторых современных гистологических процессорах – отказ от использования токсичных реагентов без потери качества проводки материала). Существенный недостаток – значительно бóльшая стоимость этих технологий. Из наиболее доступных заменителей ксилола для гистологической проводки можно рекомендовать высокоочищенный изопропиловый спирт (изопропанол) с концентрацией основного вещества не менее 99,5%, в котором осуществляются все этапы дегидратации и пропитки до парафина – таким образом, из использования исключаются те только ксилол, но и этанол.

Не рекомендуется запускать в одной серии проводки разнородный тканевой материал. Предпочтительно мелкие биопсии (гастробиопсии, пункционные биопсии) запускать в проводку отдельно, например, от операционного материала, или от тканей, содержащих много жидкой крови (соскобы эндометрия) или жира (кожа, липомы). В учреждениях с большими объемами разнородного материала всегда следует разделять потоки разнородного материала, основываясь на особенностях, могущих оказать влияние на качество проводки тканей. Понятно, что программы проводки также следует адаптировать отдельно для каждого вида тканей – только тогда можно рассчитывать на стабильно хорошее качество препаратов.

Унифицированная процедура проводки определяется выбранной программой проводки. Подбор адекватной программы для каждого типа материала, с учетом пробных проводок, может занять достаточно продолжительное время, но потраченные усилия обеспечат стабильность работы лаборатории на длительную перспективу.

Реагенты для проводки необходимо заменять в четком соответствии с протоколом. Предпочтительно использование системы контроля за реагентами, применяемой в современных гистологических процессорах.

Во избежание путаницы следует всегда производить одновременную заливку в блок только одного образца из одной кассеты. Не следует одновременно вскрывать несколько кассет при процедуре заливки.

Не следует в один блок заливать кусочки из нескольких кассет. Не следует в один блок заливать несколько кусочков, даже если они проводились в одной кассете. Всегда рекомендуется следовать правилу – в один блок следует заливать только один кусочек, на один блок следует наносить только один уникальный регистрационный номер, соответствующий номеру кусочка.

Всегда перед заливкой следует проверить четкость маркировки блока (основание кассеты или заливочное кольцо) и ее соответствие маркировки кассеты.

Заливочные формочки следует подбирать сообразно размерам тканевых образцов. Не следует использовать для всех образцов одинаковые заливочные формочки. При использовании крупных формочек для мелких образцов на поверхности блока, предназначенной для реза, остается широкая полоса пустого парафина, не содержащего ткани, что значительно увеличивает площадь среза. Чем больше площадь среза, тем сложнее получить равномерно тонкий качественный срез. В таких ситуациях площадь поверхности среза обычно уменьшают путем ручной обрезки излишков парафина вокруг кусочка, что является непроизводительными тратами времени.

Все манипуляции с образцами выполняются аккуратно. При заливке образцы не следует с силой придавливать ко дну заливочной формочки – некоторые образцы, деформировавшиеся на предыдущих этапах обработки, при этом могут быть сломаны.

Образцы следует переносить из кассет в заливочные формы параллельно – то есть той же поверхностью вниз, как они лежат и в кассетах. Таким образом, поверхность, выбранная для среза врачом во время вырезки, всегда попадет на вершину парафинового блока. Неплотное прилегание кусочка к поверхности реза в блоке увеличивает количество «пустого» парафина, который при микротомии приходится срезать – это увеличивает время процедуры микротомии, вызывает дополнительный износ микротомных лезвий и увеличивает площадь среза.

Если образец имеет вытянутую форму – его следует ориентировать по длинной оси заливочной формы, чтобы при микротомии рез приходился по малой стороне кусочка.

Температуру горячей части заливочного комплекса и резервуара с парафином рекомендуется проверять регулярно. Если температура горячей части заливочного комплекса и резервуара с парафином превышает температуру плавления парафина, то и на этой стадии обработки образец может быть поврежден воздействием высокой температуры. Локальные термические повреждения кусочков возможны при их контакте с раскаленными браншами щипцов с помощью которых производится заливка материала. Перегрев инструментов выше температуры плавления парафина при заливке возможен при использовании спиртовки, как это обычно бывает в процедуре ручной заливки. Щипцы, с помощью которых производится перенос материала из кассет и ориентация образцов в заливочной форме следует нагревать не более чем до температуры плавления парафина. Современные заливочные станции оснащены специальными гнездами для нагрева браншей пинцетов, причем температура нагрева в них соответствует температуре парафинового танка. Термические повреждения образцов возможны и за счет перегрева горячей части заливочного комплекса и резервуара с парафином выше температуры плавления парафина. Перегрев инструментов при заливке возможен при использовании спиртовки, как это обычно бывает в процедуре ручной заливки. Если щипцы, с помощью которых производится заливка материала, нагреваются до температуры большей, чем температура плавления парафина – это может приводить к локальным термическим повреждениям ткани в области контакта с раскаленными щипцами.

Избыточное количество парафина вызывает его затекание между кассетой и формой. Потеки парафина вокруг блока требуют обрезания его по краям, кассеты не плотно фиксируются в микротоме, что приводит к нестабильности блока и возможности повреждения образца при микротомии. Иногда при обрезании избытков парафина могут быть утрачены некоторые элементы маркировки блока. Кроме того, обрезание излишков парафина вокруг блоков являются непроизводительными тратами времени. В заливочную формочку следует наливать ровно столько парафина, чтобы заполнить ее до краев.

Парафин следует наливать в хорошо прогретую заливочную форму, иначе он преждевременно застынет, что влечет за собой неравномерное застывание парафина в блоке, появление трещин в толще блока и в окружности кусочка. При появлении таких дефектов блок надо перезалить. Если этот дефект обнаруживается во время микротомии следует заливочную форму с кусочком на некоторое время оставить на горячей плате заливочного комплекса до полного расплавления парафинового ореола, и только после этого продолжить монтаж основания блока. Если кусочек при переносе из кассеты в заливочную форму долго находится на воздухе, парафин на его поверхности застывает, и при перемещении в парафин не успевает полностью расплавиться. В результате, вокруг кусочка формируется зона неравномерного застывания парафина в виде мутного ореола с трещинами. Во время микротомии нередко кусочки из таких блоков выкрашиваются и выпадают при ударе о нож. При появлении таких дефектов блок надо перезалить. Если этот дефект обнаруживается во время микротомии следует заливочную форму с кусочком на некоторое время оставить на горячей плате заливочного комплекса до полного расплавления парафинового ореола, и только после этого продолжить монтаж основания блока.

Выбрать заливочную форму, соответствующую по размеру кусочку. Для заливки следует использовать чистые, насухо протертые заливочные формы, не содержащие остатков парафина от предыдущих заливок.

Поместить заливочную форму на горячей поверхности заливочного комплекса и прогретьее до температуры плавления парафина.

Налить парафин в заливочную форму так, чтобы заполнить только углубление для кусочка. При этом парафин должен оставаться расплавленным, Если по краям или днищу формы появляются белесоватые фокусы застывания парафина – значит форма недостаточно прогрета, и ее следует оставить на горячей поверхности до тех пор, пока весь налитый в нее парафин ни расплавится полностью.

Извлечь одну кассету с материалом из горячей емкости для кассет и разместить ее основанием вниз на горячей поверхности.

Открыть кассету, и крышку выбросить в рядом стоящий лоток.

Аккуратно приподнять верхнюю прокладку и перевернуть ее, проверить – не прилипли ли к прокладке мелкие кусочки материала. При этом следует проверить соответствие фактического числа кусочков, находящихся в кассете, маркировке. Если к внутренней стороне прокладке прилипли мелкие кусочки материала из кассеты, ее следует перевернуть кусочками кверху и разместить на горячей поверхности радом с открытой кассетой. Если на верхней прокладке кусочков не обнаруживается – тогда ее можно выбросить в рядом стоящий лоток, но обязательно внутренней поверхностью вверх. Лоток для отработанных прокладок должен быть отдельным, отработанные прокладки следует складывать по порядку, чтобы всегда можно было бы восстановить какая прокладка относится к какой кассете на случай, если потеряется один из кусочков.

Осторожно, горячим пинцетом, извлечь из кассеты кусочки вместе с нижней прокладкой, и разместить её на горячей поверхности рядом с открытой кассетой.

Подготовить основание для блока и проверить его маркировку. В один блок следует заливать только один кусочек. Потому, если в кассете осуществлялась проводка нескольких кусочков – следует приготовить основания для блоков по количеству кусочков, находящихся в кассете. В качестве основания блока можно использовать как основания кассет, так и заливочные кольца. Перед монтажом блока основание также следует держать нижней поверхностью на горячей поверхности прибора.

Проверить маркировку приготовленных оснований блоков – каждый блок должен быть маркирован уникальным номером, соответствующим номеру залитого в него образца.

Осторожно, горячим пинцетом, взять кусочек и аккуратно перенести его в заливочную форму с расплавленным парафином (см. п.3), стараясь как можно меньшее время держать его на открытом воздухе. Кусочек следует переносить параллельно, максимально сохраняя его расположение в кассете, обращая особое внимание на то, что поверхность кусочка, располагавшаяся на дне кассеты, должна оказаться и на дне заливочной формы.

Предпочтительно ориентировать кусочек по центру углубления и по длине заливочной формы.

Все манипуляции с кусочком в заливочной форме следует производить горячим пинцетом, не допуская даже частичного застывания парафина. Если кусочек имеет малые размеры и может быть сдвинут струей парафина при заполнении блока – его можно зафиксировать к днищу заливочной формы легким подмораживанием, для чего форму на одну (не более!) секунду можно переместить на холодную поверхность заливочного комплекса.

Установить основание блока сверху заливочной формы так, чтобы верхняя кромка залитого в него парафина покрывала пластиковую решетку основания.

Зафиксировать основание блока в заливочной форме можно переместив форму на одну (не более!) секунду на холодную поверхность заливочного комплекса. Это также позволит подморозить края прилегания основания к металлической заливочной форме и предотвратить вытекание парафина из блока до его застывания.

Заполнить расплавленным парафином основание блока до ³/₄ объема внутренней полости и переместить блок на холодную поверхность прибора.

Дождаться полного застывания парафина. Заливочные формы должны отделяться от застывшего блока легко, без усилий.

Парафиновый блок должен иметь гладкую поверхность без выщербин и прочих дефектов.

Кусочек в блоке должен быть расположен максимально близко к поверхности реза, и возможно более точно к середине площадки. При продолговатой форме кусочка, он должен быть ориентирован по длиннику блока.

Застывший парафин в блоке должен иметь однородный вид, без трещин, зон уплотнений и разрежений. Особо следует обращать внимание на отсутствие трещин или белесоватых ореолов вокруг кусочка в блоке.

Блок должен иметь достаточно много парафина в основании, чтобы не отломиться под ударом ножа при микротомии.

На блоке не должно быть посторонних потеков парафина за пределами основания или заданной формы. При наличии таких потеков их следует аккуратно срезать скальпелем.

Маркировка блока должна быть четкой и хорошо различимой, не смазанной и не залитойпарафином.

Для микротомии всегда следует использовать острые лезвия высокого качества. Не следует использовать лезвия до появления полос на срезе.Борозды на препарате чаще всего являются результатом повреждения материала ножом при микротомии. Следы от ножа могут просматриваться по всей поверхности среза, но чаще выявляются в виде единичных борозд, идущих по направлению хода ножа. Грубые борозды хорошо видны макроскопически. Поверхность ножа может иметь зазубрены, быть недостаточно заточенной или поврежденной в процессе работы (после контакта с металлическими инструментами или при резке плотной ткани, содержащей участки кальцификации).

При использованием тупых ножей, грубой микротомии с применением слишком мягких заливочных сред может произойти смещение костных балок, коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон, что обусловлено изменением их направления и механической ориентацией по ходу ножа.

Угол наклона ножа настраивается отдельно для каждого микротома, вида ножа и плотности блока. Если угол наклона ножа не изменяется в зависимости от изменения условий – другой микротом, другой тип ножа, другой парафин – это приводит к снижению качества срезов.

Появление тонких параллельных разрывов препарата обычно объясняется нестабильным положением ножа при микротомии плотных образцов тканей. В большинстве случаев это связано с недостаточной фиксацией лезвия в микротоме.

Кроме того, чрезмерная ломкость материала может быть обусловлена высушиванием образца при проводке или чрезмерным охлаждением кусочка при приготовлении замороженных срезов.

Грубые вибрационные повреждения материала возникают в первую очередь при обработке больших кусков плотных тканей (чаще всего, препараты шейки и тела матки), при плохом закреплении ножа микротома или образца в держателе. В ряде случаев причиной вибрационных повреждений могут быть технические характеристики микротома.

В качестве подготовки к микротомии с поверхности реза блока необходимо удалить лишний парафин, выровнять ее таким образом, чтобы в срез попадала максимальная площадь кусочка, а также отполировать. Подрезку (тримминг) блоков следует производить бережно, чтобы не утратить важные фрагменты ткани. Для полировки поверхности блока толщину последних нескольких срезов тримминга всегда следует делать равной конечной толщине среза. Если для ускорения процесса блоки подрезаются не аккуратно (высокая скорость, очень большая величина подачи), поверхность не полируется перед изготовлением финальных срезов – это приводит к формированию большого количества рваных дефектов ткани, в срезе похожих на дырки "проеденные молью".

Если кусочек залит в блок таким образом, что прилежит к плоскости реза не ровной (изогнутой, деформированной) поверхностью, при попытке добиться максимальной площади ткани в срезе можно при тримминге срезать критически большой объем кусочка, или вовсе утратить объект. В таких случаях блок лучше перезалить, и при перезаливке постараться, насколько это возможно, более плотно прижать кусочек к дну заливочной формы.

Перед микротомией блоки следует охлаждать так как они всегда должны быть холодными во время резки. Чем холоднее блок, тем плотнее парафин, и тем проще будет получить тонкие срезы. Если для микротомии используются неохлажденные блоки – это приводит к сильной деформации кусочка при резке. Считается, что идеальна для охлаждения блоков температура «талого льда». Традиционно лаборанты используют для охлаждения блоков перед микротомией пластиковые емкости со льдом. Это не очень технологично, так как на поверхности льда помещается не много блоков, он быстро подтаивает, и емкости приходится часто менять, для чего необходимо отрываться от рабочего места, чтобы подойти к холодильнику.

Рядом фирм, специализирующихся на выпуске медицинского лабораторного оборудования, производятся настольные морозильные камеры малых размеров с горизонтально расположенной морозильной камерой, вместимостью до 200 блоков. Этот прибор удобно размещается на рабочем месте рядом с микротомом, и избавляет лаборанта от непроизводственных потерь времени.

Надо помнить, что блоки перед микротомией не следует сильно замораживать – это может привести к появлению трещин в парафине, особенно по краю залитого кусочка, в виде белесоватого ореола. Качественный парафиновый блок не должен растрескиваться при охлаждении до -20⁰С. При появлении трещин в блоках при температурах в указанном пределе следует обратить внимание на качество используемого парафина.

При микротомии следует устанавливать малую скорость реза. При высокой скорости реза в момент удара ножа о край блока, из него выколачиваются мелкие зерна парафина, из-за чего в срезе появляются рваные дефекты в виде выщербин или полос. В таких случаях поверхность реза следует заново отполировать ножом, чтобы в дальнейшем получить нормальные срезы.

Если в лаборатории традиционно используются адгезивные средства, добавляемую во флотационную жидкость, то существует опасность отложений избытков адгезива на срезах. Адгезивы могут откладываться на срезах в виде аморфных слабо базофильных гомогенных масс в результате вымывания или испарения флотационной жидкости. Отложению адгезивов на срезах могут способствовать неоднородная структура тканей (легкое), низкое качество срезов и использование адгезивов, которые плохо стекают с предметного стекла. Не следует помещать на плитку для высушивания стекла, содержащие избыток раствора адгезива.

Использование тонких (3-5 мкм) срезов и высококачественных предметных стекол с идеально ровной гладкой поверхностью обеспечивает надежное прилипание тонких срезов к стеклу за счет сил поверхностного натяжения и, таким образом, исключает необходимость применения адгезивных средств при большинстве гистологических окрасок, не предполагающих термической обработки срезов.

Пузырьки воздуха могут образоваться под срезом при его помещении во флотационную ёмкость. Если пузырьки сохраняются под срезом при переносе его на предметное стекло, они препятствуют плотной его адгезии, и в этих участках при высушивании образуются округлой или овальной формы мелкие дефекты в виде трещин и разрывов, выявляемые при микроскопии. Чаще всего это связано с нарушениями техники монтирования среза на предметное стекло. Самой частой ошибкой является захват и подведение пузырьков воздуха под срез предметным стеклом. Правильной тактикой является натягивание среза на стекло, расположенное под углом к поверхности воды. Для уменьшения количества пузырьков воздуха во флотационную ёмкость рекомендуется заливать свежекипячёную воду с минимальным содержанием растворенных газов.

Загрязнения микропрепаратов фрагментами плоского эпителия встречается не редко и связаны с попаданием на срез чешуек кожи пальцев, перхоти или эпителия слизистых оболочек носоглотки и ротовой полости при чихании и кашле. Лаборантов следует предупредить о соблюдении элементарных гигиенических мер, направленных на исключение такого рода контаминаций, и строго за это спрашивать. За кожей рук необходимо ухаживать с использованием питательных и увлажняющих кремов и смазок, волосы необходимо полностью убирать под медицинские шапочки, для исключения распыления слюны следует использовать медицинские маски. Никогда не следует прикасаться руками ни к срезам, ни к поверхности предметных стекол – все манипуляции со срезами необходимо производить лишь с использованием кисточек и специальных инструментов, а предметные стекла можно брать рукой только за ребра по краям матовой полосы для записи.

Хрящевая ткань одна из наиболее сложных для обработки, так как препараты плохо расправляются. Избежать складок в материале помогает применение специальных техник обработки: пропитывание в целлоидин-парафиновых смесях (double-embedding) или заливка в смолы. Образование складок связано в первую очередь с тем, что хрящевая ткань в процессе проводки сильно ссыхается и лишь частично расправляется при флотации.

Смонтированные срезы, оставленные неокрашенными на длительный срок на открытом воздухе, могут быть загрязнены различными агентами, например: микроорганизмами, особенно аэробными грибами, взвешенными в воздухе частицами, волосками от кисточки, при переносе среза с лезвия в ванночку, частицами целлюлозы с салфеток, используемых для очистки ванночки или покровных стекол, пылью. Желательно свежеприготовленные срезы перед окраской высушивать в закрытых контейнерах. Срезы, которые предполагается хранить некоторое время неокрашенными рекомендуется содержать в закрытых контейнерах. Кроме того, стекла необходимо тщательно промывать перед процедурой окрашивания.

Воду в емкости для флотации (водяная баня) следует заменять так часто как это возможно. Если вода в емкости заменяется редко, а только добавляется, то на срез могут попасть различные загрязняющие агенты, такие как споры грибов или фрагменты срезов с других блоков. Если поверхность воды во флотационной емкости не очищается после каждого блока – это может привести к попаданию частичек одного препарата на другой и быть причиной диагностических ошибок. Перед микротомией каждого нового блока следует тщательно очищать поверхность воды от мелких остатков срезов с предыдущего блока. Микротомию разнородного материала следует производить на разных микротомах, или полностью менять воду в водяной бане перед началом работы. Часто на поверхности воды остаются мелкие фрагменты срезов от абортного материала (мелкие ворсины) – потому этот материал следует направлять на микротомию либо на отдельное рабочее место, либо последним в течение рабочего дня.

Для расправления срезов в водяной бане рекомендуется всегда использовать свежеприготовленную дистиллированную воду – это гарантирует избавления от избытков солей и механических примесей.

Перед использованием всегда следует проверять чистоту предметных стекол. Предметные стекла следует готовить для размещения на них срезов непосредственно перед микротомией и в количестве, необходимом для изготовления требуемого числа препаратов. Нельзя раскладывать стекла заранее и оставлять их лежать на воздухе длительное время. Прикосновение к стеклам руками необходимо исключить, или свести к минимуму, чтобы предотвратить загрязнение их чешуйками плоского эпителия кожи рук. Никогда не следует прикасаться руками к поверхности предметных стекол, предметные стекла можно брать рукой только за ребра по краям матовой полосы для записи. Если чистота предметных стекол не контролируется, на них попадают частички грязи и микроорганизмы, которые портят даже хороший микропрепарат.

Для гистологических микропрепаратов предпочтительно выбирать предметные стекла, изготовленные из нейтрального стекла, толщиной не более 1,0 мм, бесцветные, с идеально ровной и гладкой поверхностью и матовой полосой для записи. Наличие шлифованного края существенно увеличивает стоимость стекла. Вместе с тем, стекла с нешлифованным краем, особенно при неосторожном обращении, дают много мелких осколков на предметном столе микроскопа, фронтальной линзе конденсора и приводе препаратоводителя. Очень важно проследить точность линейных размеров предметного стекла. В некоторых случаях, особенно это характерно для менее качественных и недорогих стекол, ширина стекол варьирует даже в пределах одной партии более чем на 1,0 мм. Это может оказаться критичным в случае если в лаборатории используются автоматы для заключения срезов под покровное стекло – эти приборы очень чувствительны к изменению ширины предметных стекол. Как правило, высококачественные предметные стекла для гистологии (Menzel, TermoShandon и другие) поступают к конечному потребителю готовыми к употреблению, и не требуют дополнительной чистки и обезжиривания.

Срезы более чем с одного блока не должны находиться вместе во флотационной емкости. Не следует оставлять во флотационной емкости срезы с двух или нескольких блоков – это может привести к неверной идентификации образцов. Особенно высок такой риск, когда одновременно обрабатываются тканиодного типа.

Температуру воды во флотационной емкости следует тщательно контролировать. Оптимальна температура – на 4-5 ºС ниже температуры плавления парафина – то есть 51-52^oС. При такой температуре срезы быстро расправляются, но парафин не плавится. Парафин срезов никогда не должен плавиться на поверхности водяной бани. Если срезы оставляются на водяной бане более 15 минут или если парафин срезов плавится, происходит перерастяжение среза, за счет чего формируются повреждения и разрушения ткани среза в виде разрывов.

Качественные срезы при помещении во флотационную емкость должны быстро расправляться без образования складок. Если срезы полностью не расправляются, причиной этому может служить слишком холодная вода во флотационной емкости или слишком большая толщина срезов.

Расправление складок на срезах с помощью щеточки или щипцов следует выполнять лишь в исключительных случаях и чрезвычайно аккуратно, чтобы не повредить срез. Если расправление складок на срезах с помощью щеточки или щипцов выполняется энергичными движениями, возникают макро- и микроскопические повреждения срезов.

Никогда не следует переносить на стекло первый и второй срезы из серии. Первый и второй срезы выглядят лучше, поскольку они всегда толще из-за теплового расширения холодного блока при первом прохождении ножа.

Любые видимые пузырьки воздуха плавающие на поверхности флотационной жидкости следует удалять до того, как срезы помещаются в воду. Пузырьки воздуха могут образоваться под срезом и при его помещении во флотационную ёмкость. Если пузырьки сохраняются под срезом при переносе его на предметное стекло, они препятствуют плотной его адгезии, и в этих участках при высушивании образуются округлой или овальной формы мелкие дефекты в виде трещин и разрывов, выявляемые при микроскопии. Чаще всего это связано с нарушениями техники монтирования среза на предметное стекло. Самой частой ошибкой является захват и подведение пузырьков воздуха под срез предметным стеклом. Правильной тактикой является натягивание среза на стекло, расположенное под углом к поверхности воды. Пузырьки, попадающие под срез исчезают при его высыхании, но несмотря на это, область среза над пузырьком часто разрушается и может быть утрачена. Для уменьшения количества пузырьков воздуха во флотационную ёмкость рекомендуется заливать свежекипячёную воду с минимальным содержанием растворенных газов.

Отклеивание срезов от предметного стекла может происходить при подготовке к окраске и во время процедуры окрашивания. Это может быть связано с недостаточным прилипанием срезов к предметному стеклу. Наиболее частыми причинами являются недостаточное высушивание срезов после микротомии, или толстые срезы или использование некачественных предметных стекол с неровной поверхностью. Отклеивание срезов от предметного стекла может происходить и при процедуре термической обработки срезов, требуемых для некоторых вариантов окрасок (демаскировки антигена перед иммуногистохимическим окрашиванием). В таких случаях следует использовать коммерческие предметные стекла со специальным адгезивным покрытием. Использование технологий ручного покрытия предметных стекол специальными адгезивами (AAS) не желательно, так как может повлечь за собой появление специфических артефактов. Использование тонких (3-5 мкм) срезов и высококачественных предметных стекол с идеально ровной гладкой поверхностью обеспечивает надежное прилипание тонких срезов к стеклу за счет сил поверхностного натяжения и, таким образом, исключает необходимость применения адгезивных средств при большинстве гистологических окрасок, не предполагающих термической обработки срезов.

Перед переносом стекол на плитку или в сушильный аппарат с них необходимо удалить избыток воды в вертикальном положении путем стекания. Если стекло нормально обезжирено и не загрязнено, то избыток флотационной жидкости легко стекает с его поверхности. Если вода не удаляется со стекла перед сушкой, это может привести к деформации срезов, связанной с различной теплоемкостью стекла, воды и парафина.

Температуру плитки или в сушильном аппарате следует постоянно контролировать. Оптимальна температура – на 4-5 ºС ниже температуры плавления парафина – то есть 51-52⁰С. При такой температуре срезы достаточно быстро высыхают, но парафин не плавится. Если температура плитки или в сушильном аппарате превышает рекомендованные значения, это может вызывать появление так называемых «тепловых пятен» и участков неравномерного окрашивания препарата, связанных с плавлением парафина и пережиганием самого тканевого среза.

Время сушки стекол следует тщательно контролировать. Длительная сушка при высоких температурах может быть губительна для срезов. Кроме того, не следует оставлять стекла на открытом воздухе из-за опасности внешних загрязнений срезов различными агентами, например: микроорганизмами, особенно аэробными грибами, взвешенными в воздухе частицами, пылью. Желательно свежеприготовленные срезы перед окраской высушивать в закрытых контейнерах, или прикрывать поверхности плитки с сушащимися стеклами чехлом.

Поместить блоки, приготовленные для микротомии, в холодильник, или в охлаждающий модуль, или на поверхность льда для охлаждения.

Закрепить лезвие в держателе ножа микротома, и максимально отвести держатель ножа от объектодержателя. Установить требуемый угол наклона ножа, и надежно закрепить все крепежные винты узла держателя ножа.

Вставить блок в объектодержатель. Блок должен четко подходить к крепежным элементам объектодержателя специальными выступами. Если на основании блока имеются потеки излишнего парафина, мешающие его правильному расположению в держателе – их следует удалить. Следует также обратить внимание, чтоб поверхность блока была не блажной и не содержала замерзших капель воды.

Осторожно подвести блок держателя ножа к блоку, в непосредственной близости ножа к поверхности реза блока перейти к режиму механической подачи до появления первого среза парафина.

Выполнить подрезку блока в режиме тримминга до получения максимальной площади среза тканевого образца, причем, для окончательной полировки поверхности реза, толщина последних 2-3 срезов при тримминге не должна превышать 3-5 мкм.

Проверить очищена ли от остатков срезов с предыдущего блока поверхность флотационной жидкости в водяной бане.

Приготовить и промаркировать необходимое количество предметных стекол, исходя из количества окрасок, назначенных для данного блока.

Приступить к штатной микротомии. При нормальном качестве фиксации, проводки и заливки современные ротационные микротомы позволяют на валовом материале изготавливать парафиновые срезы стандартно толщиной не более 3 мкм.

Изготовить серию из нескольких последовательно получаемых срезов, слегка придерживая ленту за первый срез.

Перенести ленту срезов на поверхность флотационной жидкости в водяную баню для расправления.

Выбрать срезы, пригодные для изготовления микропрепатов. Никогда не следует выбирать первый и второй срезы – они всегда толще остальных срезов в серии из-за теплового расширения парафина на поверхности блока.

Перенести отобранные срезы на заранее приготовленные и промаркированные предметные стекла, удалить излишки флотационной жидкости со стекол и поместить их на нагревательную плату для высушивания.

Следует тщательно отслеживать продолжительность каждого этапа окраски. Если технологическая процедура окраски нарушается или пропускаются некоторые этапы, это приводит к получению несопоставимых препаратов. Оптимальным для обеспечения стандартизованной процедуры окрашивания является внедрение автоматов для окраски микропрепаратов (stainer).

Для контроля качества окраски рекомендуется постоянно изготавливать контрольные препараты. При отсутствии контроля окраски H&E становится невозможным определить причину плохого качества препаратов (например – некачественные реагенты, ошибки протокола, недостаточная фиксация и др.).

Условия окраски (такие как время окрашивания, перемешивания, промывки, сушки и др.) должны быть оптимизированы для каждого этапа. При неоптимизированной промывке и сушке реагенты в последующих емкостях быстро загрязняются, а нестандартизованная процедура перемешивания может повлиять на качество окраски ткани – качество окраски становится несопоставимым. Оптимальным для обеспечения стандартизованной процедуры окрашивания является внедрение автоматов для окраски микропрепаратов (stainer).

При подготовке срезов к окраске необходимо всегда добиваться полной депарафинизации препаратов. При неполной депарафинизации препаратов на стеклах остаются участки парафина, обусловливающие их гидрофобность по отношению к водным растворам красителей. В результате в препаратах появляются неокрашенные или неравномерно окрашенные участков срезов. Для исправления дефекта можно попробовать отмыть краску, заново довести препарат до этапа депарафинизации, а затем повторить процедуру окрашивания.

Реагенты следует регулярно менять в зависимости от числа окрашенных в них препаратов. Не следует дожидаться снижения качества окраски как повода для замены реагентов. Особенно тщательно надо следить за вспомогательными жидкостями – промывочными растворами, спиртовыми растворами, депарафинирующими реагентами.

Промывочную воду необходимо заменять на свежую перед окраской каждой новой партии препаратов независимо от того, насколько чистой она кажется глазу.

Спирты, используемые в процедуре окраски препаратов (гидратация перед окрашиванием и дегидратация перед заключением препаратов), должны сохранять характерный запах, быть прозрачными. Всегда следует заменить спирты перед окраской новой партии препаратов, если они имеют мутный вид. Наиболее быстро загрязняется емкость с 70% спиртом (последняя при гидратации и первая при дегидратации), при больших объемах материала его приходится менять чаще. Довольно быстро загрязняется и первая после ксилола спиртовая емкость (неразбавленный спирт) при процедуре гидратации. Очень важно для адекватной дегидратации срезов в последней перед заключением спиртовой емкости всегда иметь чистый неразбавленный спирт – потому ее тоже надо заменять довольно часто (обычно спиртовые емкости просто сдвигают на одну позицию назад). Не рекомендуется использовать для дегидратации перед заключением препаратов ту же батарею спиртовых емкостей, что использовалась для гидратации после депарафинирования.

Перед окрашиванием препараты следует тщательно отмыть от остатков ксилола и спиртов и довести до воды (гидратация). Не полностью отмытые от ксилола и спиртов препараты загрязняют раствор гематоксилина, что приводит к снижению качества окраски. Кроме того, не отмытые капли ксилола, несмешиваемого с водой, препятствуют контакту красителей со срезом, в результате чего на срезе могут остаться плохо прокрашенные участки, соответствующие по размерам этим каплям.

Характеристики раствора гематоксилина следует тщательно контролировать, так как в процессе работы гематоксилин значительно разбавляется водой со стекол и штативов и окисляется. Влиять на окисление гематоксилина могут площадь поверхности емкости, в которой он хранится, продолжительность доступа кислорода во время окрашивания и температура окружающей среды. Наиболее надежным признаком ухудшения качества гематоксилина является худшее прокрашивание ядер, снижение дифференцировки тонких ядерных структур – при появлении этих признаков раствор гематоксилина следует заменить на свежий.

После окраски гематоксилином для полного созревания следует использовать раствор Scott (щелочной заменитель водопроводной воды) или аммониевую воду (дистиллированная вода с несколькими каплями аммиака). Использование водопроводной воды, как это указано в классических руководствах, не рекомендуется, так как в наших конкретных условиях водопроводная вода далеко не всегда, как того требует протокол окраски, имеет слабощелочную реакцию, характеризуется разными показателями жесткости, часто содержит большое количество растворимых и нерастворимых примесей, влияние которых на качество окраски ни предсказать, ни нормировать не представляется возможным.

После окраски гематоксилином и дифференцировки в щелочной воде следует тщательно отмыть щелочные агенты из препарата, ибо окраска эозином происходит в кислой среде и остатки щелочи могут ее ослабить. Неполное отмывание щелочных реагентов может привести к слабому или неравномерному окрашиванию препарата эозином, появлению на срезе потеков красителя.

Для оптимального окрашивания рН раствора эозина стабилизируют на значении около 5,0. Для подкисления раствора красителя используется уксусная кислота. Повышение рН раствора эозина вызывается загрязнением щелочной водой, используемой для созревания гематоксилиновой окраски ядер. Для уменьшения нейтрализующего влияния аммиачной воды можно добавить одну дополнительную промывочную емкость с чистой дистиллированной водой или 70% этанолом перед помещением препаратов в раствор эозина. Не следует дожидаться снижения качества окраски как повода для замены эозина.

Неравномерное окрашивание среза одним из красителей при сложных окрасках с использованием автостейнеров может быть обусловлено недостаточным наполнением реагентных ёмкостей.

Депозиты могут быть обусловлены нерастворенными частицами красителя или его преципитацией во время окраски. Преципитация возможна при испарении растворов красителей, например, при использовании методов, предусматривающих нагревание или длительное время окрашивания. Проблема усугубляется при окраске препаратов на открытых поверхностях. Использование стандартизованных ёмкостей для окрашивания, поддерживающих стекла в вертикальном положении, позволяет свести подобные артефакты к минимуму.

Микроорганизмы, загрязняющие растворы красителей, нередко осаждаются на препаратах. Во избежание этого артефакта рекомендуется своевременно менять красящие растворы или добавлять в них антибактериальные препараты, такие как тимол или метиолат. Если краситель поменять невозможно, фильтрация раствора позволит избавиться от этих загрязнений.

Препараты следует полностью дегидратировать перед тем, как поместить в ксилол для просветления. Если препараты быстро проводятся через спирты, осветление в ксилоле, загрязненном водой, приводит к появлению микроскопических капель воды на поверхности препарата.

Ксилол для просветления должен быть всегда свежий, должен сохранять характерный запах, быть прозрачным. Примесь спирта и воды вызывает его помутнение. Всегда следует заменить ксилол перед окраской новой партии препаратов, если он имеет мутный вид. Наиболее быстро загрязняется первая емкость ксилола, следующая за спиртом, при больших объемах материала его приходится менять практически перед окраской каждой новой партии препаратов.

Покрытие препаратов покровными стеклами всегда следует осуществлять до того, как препарат успевает высохнуть. Если препараты частично высыхают перед накрытием покровными стеклами, некоторые ядра клеток становятся черными, или как бы обведенными темным контуром.

Желательно использовать гистологическую среду высокого качества. Следует иметь ввиду, что среды низкого качества при длительном хранении могут кристаллизоваться. Кристализованная гистологическая среда при длительном хранении может образовывать кристаллы и "поднимать" покровные стекла.

Разведение монтирующей среды ксилолом, как правило, не дает требуемого результата – через некоторое время среда под покровным стеклом все равно кристаллизуется, мутнеет.

Предпочтительно использовать высококачественную монтирующую среду, готовую к употреблению, и не требующую дополнительного разведения.

Качество микропрепаратов является интегральным выражением состояния организации технологического процесса в патоморфологической лаборатории. В лаборатории следует создать необходимые и достаточные условия для качественного выполнения всех видов лабораторных работ.

Ответственность за состояние организации технологического процесса в лаборатории и качество конечного лабораторного продукта (микроскопических препаратов) несет руководитель лаборатории.

Контроль качества микропрепаратов в патоморфологической лаборатории должен осуществляться как минимум на трех уровнях – лаборантом, врачомпатологоанатомом и руководителем лаборатории.

Каждый лаборант должен уметь распознавать лабораторные дефекты в микропрепаратах, нельзя допускать, чтобы некачественные препараты подавались врачу.

Ни один микропрепарат с лабораторными дефектами не может быть использован для диагностики. Формулирование заключение (диагноза) по некачественным микропрепаратам не допустимо.

Каждый врач-патологоанатом должен уметь распознавать лабораторные дефекты в микропрепаратах и оказывать необходимую методическую помощь лаборанту в анализе и поиске путей устранения выявленных дефектов.

Каждый случай выявления некачественных микропрепаратов расценивать как повод для полноценной экспертизы всего производственного процесса с целью выявления дефектов на отдельных этапах технологической цепочки.

При анализе дефектов микропрепаратов рекомендуется последовательно разобрать все этапы технологического процесса с максимальной детализацией (качество используемых реагентов, соблюдение стандартных протоколов лабораторных процедур, действия персонала и др.).

По каждому некачественному микропрепарату следует поднять соответствующий блок, изготовить с него новый препарат и заново его окрасить – это позволит, по крайней мере, устранить дефекты микротомии, окраски и заключения среза. В случаях выявления дефектов просветления среза, достаточно снять с препарата покровное стекло, заново просветлить и заключить препарат.

При поступлении некачественных препаратов на консультативный пересмотр, всегда следует препараты переделать, для чего рекомендуется всегда просить направлять на пересмотр микропрепараты вместе с блоками.

В случаях выявления в микропрепаратах неустранимых дефектов фиксации или проводки – наличие этих артефактов всегда должно быть отмечено в описании и заключении, рекомендуется также отмечать насколько повлияли эти дефекты на возможность адекватного микроскопического анализа материала.

Предметное стекло, используемое для изготовления микропрепарата должно быть тонким (толщиной не более 1,0 мм), бесцветным, с идеально гладкой поверхностью и матовой полосой для записи.

Срез должен располагаться как можно ближе к геометрическому центру предметного стекла.

Под покровным стеклом не должно быть пузырьков воздуха и других посторонних включений.

При осмотре микропрепарата на просвет или при наклоне под углом по отношению к источнику света, на срезе не должны выявляться участки помутнения, он должен быть прозрачен по всей своей площади.

При внешнем осмотре следует обращать внимание и на равномерность окраски срезов как в пределах одного микропрепарата, так и в серии препаратов, находящихся на одной планшетке.

Качественный микропрепарат, окрашенный гематоксилином и эозином должен иметь светло-сиреневый тон окраски.

При микроскопии, в первую очередь, следует оценить общее состояние среза в микропрепарате – равномерность окраски, наличие посторонних включений, общие признаки сохранности ткани.

Толщина среза не должна превышать 3-5 мкм, или 1 слоя клеток – это легко проверить с помощью шкалы микровинта. Для выяснения толщины среза следует навести фокус на верхнюю плоскость среза и заметить деление микровинта, стоящее напротив риски, затем перевести фокус на нижнюю плоскость среза, и определить на сколько делений сместилась шкала микровинта.

В срезе должны отсутствовать следы механических, термических и вибрационных повреждений.

В срезе должны быть сохранны все тканевые элементы. Отсутствие тонкой структуры и сморщивание ядер клеток, вакуолизация цитоплазмы, разрушение межклеточных связей, межуточный отек, признаки периваскулярного и перицеллулярного «отека», тканевые смещения, фокальные коагуляционные изменения клеток и волокон, экзогенные пигменты, трещины среза – эти и другие феномены могут быть признаками артифициальных повреждений ткани.

Для оценки качества микропрепаратов рекомендуется сверяться с микрофотографиями из лучших руководств (WHO Blue Books, Ackermann Surgical Pathology), которые можно принять за эталонные изображения.

Каждое патоморфологическое заключение по биопсийному и операционному материалу должно быть увязано с основными клиническими проявлениями заболевания, данными инструментальных и лабораторных исследований.

Ответственность за полноту представления диагностически значимой дополнительной клинической информации в направлении на морфологическое исследование лежит на оперирующем или лечащем враче.

Отсутствие в направлении на морфологическое исследование диагностически значимой дополнительной клинической информации не допустимо.

Рекомендуется использовать все имеющиеся профессиональные и административные возможности для обеспечения наиболее полного отражения диагностически значимой дополнительной клинической информации в направлении на морфологическое исследование.

К разряду диагностически значимой дополнительной клинической информации относятся следующие сведения:

При отсутствии в направлении необходимого объема дополнительной клинической информации врач-патологоанатом должен востребовать ее от клиницистов.

Задержка ответа по биопсийному или операционному материалу сверх установленных сроков, если она связана с задержкой предоставления дополнительной клинической информации по вине оперирующего или лечащего врача, должна считаться обоснованной и допустимой.

Всякая дополнительная клиническая информация от оперирующего или лечащего врача, если она получена устно, должна быть немедленно занесена в бланк направления с соответствующей пометкой типа: «получено по телефону от врача И.И.Иванова 11.02.2011 г.». Дополнительная клиническая информация, предоставленная в виде отдельных выписок, должна быть присовокуплена к направлению и считаться неотъемлемой его частью. Не рекомендуется оставлять какую-либо диагностически значимую дополнительную клиническую информацию не занесенной в направление или протокол микроскопического исследования.

Диагностическая ошибка, связанная с непредоставлением значимой дополнительной клинической информации, должна расцениваться исходя из совокупной ответственности лечащего врача (за не предоставление информации) и врача-патологоанатома (за не востребование информации, если такая необходимость была очевидной).

Если отсутствие необходимой дополнительной клинической информации выявляется в момент доставки материала в лабораторию, допускается в приеме материала отказать. При этом рекомендуется немедленно связаться с оперирующим или лечащим врачом, и поставить его в известность о дефектах заполнения направления. В таких случаях допускается материал не регистрировать до поступления в лабораторию полной дополнительной клинической информации, о чем следует поставить в известность руководителя лаборатории и сделать соответствующую запись на направлении.

Если отсутствие необходимой дополнительной клинической информации выявляется при вырезке уже зарегистрированного материала, рекомендуется, если это возможно, пригласить на вырезку оперирующего или лечащего врача для выяснения всех не ясных вопросов. При этом всякая дополнительная клиническая информация от оперирующего или лечащего врача, полученная устно, должна быть немедленно занесена в бланк направления с соответствующей пометкой типа: «получено по телефону от врача И.И.Иванова 11.02.2011 г.». Если нет возможности пригласить на вырезку оперирующего или лечащего врача (при исследовании материала из других лечебно-профилактических учреждений) – макроскопическое описание и вырезку материала рекомендуется выполнять в присутствии руководителя лаборатории или старшего ординатора. В таких случаях в протоколе макроскопического описания материала должны быть отражены все неопределенности, связанные с отсутствием необходимой дополнительной клинической информации.

Если отсутствие необходимой дополнительной клинической информации выявляется при микроскопическом изучении материала, рекомендуется немедленно затребовать от лечащего врача необходимую информацию, о чем следует поставить в известность руководителя лаборатории и сделать соответствующую запись в протоколе исследования. Решение о задержке ответа рекомендуется принимать совместно с руководителем лаборатории.

Если отсутствие необходимой дополнительной клинической информации выявляется по уже законченному случаю – тогда следует поднять все первичные материалы, относящиеся к этому исследованию для внутреннего комиссионного пересмотра. В случае если полученная post factum дополнительная клиническая информация требует изменения формулировки предыдущего заключения по этому материалу – рекомендуется оформить протокол пересмотра с присвоением новых регистрационных номеров и обязательной ссылкой на номера пересматриваемого материала.

В ряде случаев для полноценного морфологического исследования требуется выполнение дополнительных исследований.

Использование дополнительных исследований при морфологическом исследовании биопсийного и операционного материала для некоторых нозологических форм предусмотрено существующими профессиональными стандартами или протоколами. Так, привлечение иммуноморфологических методов часто необходимо для гистогенетической верификации опухолей, гистобактериоскопических – для выявления некоторых возбудителей инфекционных болезней. В этих случаях выполнение дополнительных методов исследований обязательно для обоснования морфологического диагноза, а отказ от их выполнения должен расцениваться как неполное морфологическое исследование.

Использование дополнительных исследований при морфологическом исследовании биопсийного и операционного материала для некоторых нозологических форм не предусмотрено существующими профессиональными стандартами или протоколами. Однако, привлечение дополнительных методов часто необходимо для уточнения некоторых морфологических феноменов – например, для верификации пигментов, депозитов или цитоплазматических включений, для выяснения характера клеточного синтеза, решения иных диагностических задач. В этих случаях выполнение дополнительных методов исследований не обязательно, но весьма желательно для обоснования морфологического диагноза, а принятие решения о привлечении дополнительных методов находится в исключительной компетенции врача-патологоанатома.

При назначении дополнительных методов исследования врач-патологоанатом должен руководствоваться существующими профессиональными стандартами, протоколами или, в их отсутствии, соображениями диагностической целесообразности, исходя из стремления к наиболее полной морфологической верификации диагноза, и в интересах пациента.

Назначаемые дополнительные методы должны быть зафиксированы в технологической части протокола морфологического исследования.

Каждый дополнительный препарат, окрашенный дополнительной окраской, является самостоятельной учетной единицей патологоанатомического исследования биопсийного и операционного материала.

Результаты использованных дополнительных методов должны быть зафиксированы в описательной части протокола морфологического исследования (микроскопическое описание).

Характер, объем и степень необходимой детализации микроскопического описания определяется общепринятыми стандартами и протоколами, а в неопределенных случаях – соображениями диагностической целесообразности, определяемыми врачом-патологоанатомом.

В любом микроскопическом описании должен содержаться минимально необходимый набор морфологических феноменов, наличие которых в описании, по своей совокупности, формально позволяет обосновать сформулированный далее диагноз (заключение).

Кроме предусмотренных стандартами описаний качественных характеристик патологического процесса, не следует пренебрегать детальным описанием имеющихся в препарате термических повреждений хирургического края кусочка, наличия шовного материала, участков механического (разможжение, дополнительные разрезы, проколы) и химического повреждения тканей, а также участков экзогенных пигментаций, попавших в макропрепарат.

Термические повреждения материала, часто обнаруживаемые в биопсиях, проявляются в виде коагуляционного некроза тканей. Термическое повреждение образца может быть следствием термического воздействия на любом этапе обработки, но наиболее часто – при термических воздействиях на нативную нефиксированную ткань, то есть при взятии материала вследствие ожога лазером, электрокоагулятором или при использовании других горячих инструментов. Частой причиной сгорания тканевого образца бывает использование завышенных более необходимого мощностей электрохирургических инструментов, применяемое при иссечении тканей в целях снижения кровоточивости в краях хирургической раны. Ширину зоны термического повреждения хирургического края образца должно отмечать в протоколе микроскопического исследования.

Шовный материал может быть представлен в препарате как отдельными фрагментами, так и цельными волокнами, срезанными поперечно, продольно или косо. Шелковые хирургические нити дают выраженное двойное лучепреломление в поляризованном свете, что можно использовать как идентификационный признак данного вида материала. Шовный материал в кусочке может повредить нож микротома, что приведет к образованию полос на срезе при микротомии, и должно быть соответствующим образом описано в протоколе микроскопического исследования.

Мягкие ткани могут быть легко повреждены при манипуляциях с использованием катетеров, как iv vivo, так и на фиксированных тканевых образцах. Рекомендуется использовать все имеющиеся профессиональные и административные возможности противодействия любым манипуляциям с макропрепаратами операционного материала (дополнительные разрезы, проколы и прочие механические воздействия) в отсутствие врача-патологоанатома. Любые подобные действия, чем бы они ни были мотивированы, могут в значительной степени повредить материал, нарушить анатомические взаимоотношения тканей, вызвать раздавливание (разможжение) тканей, что, в свою очередь может осложнить дальнейший морфологический анализ и интерпретацию полученных результатов исследования.

Дегенеративные изменения в тканях начинают развиваться сразу после прерывания кровотока. Аутолиз обусловлен воздействием гидролитических ферментов лизосом при нарушении внутренних мембран клеток. Признаки аутолиза могут быть в различной степени представлены в различных тканях, обычно бывают более выражены в эпителиальных тканях, чем в мезенхимных, что связано с большей устойчивостью последних к гипоксическим повреждениям. В некоторых органах, таких как поджелудочная железа, процессы посмертного аутолиза более выражены из-за обилия протеолитических ферментов. В биопсийном материале, который обычно фиксируется немедленно, признаки аутолиза бывают менее выражены, чем в аутопсийном. Избежать аутолиза, позволяет быстрая фиксация материала. Затормозить процессы саморазрушения тканей трупа до вскрытия позволит охлаждение тела до 4^оС. При любых обстоятельствах явления аутолиза трупного материала будут тем менее выражены, чем скорее будет произведено вскрытие, изъятие и фиксация тканевых образцов. Раннее вскрытие позволяет идентифицировать прижизненные повреждения органов и тканей. При поздних вскрытиях отличить прижизненные повреждения и посмертный аутолиз органов и тканей весьма затруднительно.

В микропрепаратах кожи могут быть обнаружены нерастворимые экзогенные пигменты, используемые для нанесения татуировок. Эти депозиты обычно инертны по отношению к гистохимическим тестам и не дают анизотропии в поляризованном свете. Однако же весьма желательно описывать наличие татуировок в протоколе операции и при макроскопическом исследовании нефиксированного операционного материала – это поможет избежать немалых затрат времени и ресурсов на выяснение природы пигментации в случаях когда это имеет решающее диагностическое значение.

В ряде случаев используют цветное маркирование хирургического края удаленного образца для его правильной ориентации в макропрепарате или для заливки в блоке. Для маркировки обычно используются India ink, Silver nitrat, Alcian blue, Alcian green и многие патентованные составы различных цветов, которые окрашивают, главным образом, поверхность образца, и в микропрепаратах обнаруживаются по краю срезов.

Микроскопическое описание является обязательной частью протокола морфологического исследования биопсийного и операционного материала.

Микроскопическое описание практически является обоснованием заключения (диагноза), потому оно должно быть объективным, основанным на конкретных морфологических феноменах, имеющих место в данном материале.

В тексте микроскопического описания должна содержаться возможно более полная качественная характеристика наблюдаемого патологического процесса, в сумме дающая основание для формулировки конкретного заключения (диагноза).

При формулировке заключения рекомендуется, тогда когда это возможно, стремиться использовать четкие формулировки нозологического характера в соответствии с общепринятыми международными классификациями и протоколами.

В ряде случаев формализованные классификационные формулировки не вполне отражают индивидуальные особенности данного патологического процесса, и требуют различных уточнений. Тогда полезно вводить в протокол морфологического исследования рубрику «Дополнительные замечания», в которой можно размещать все необходимые уточнения по исследуемому материалу.

При отсутствии возможности использовать формулировки нозологического характера допускается так называемый «описательный ответ».

Пожелания врача-патологоанатома относительно необходимости выполнения повторных, контрольных или расширенных биопсий и прочие можно размещать в рубрике «Рекомендации».

Хранение микропрепаратов рекомендуется осуществлять в едином архиве, организованном по принципу сквозной нумерации – только такой принцип позволяет содержать архив в безупречном порядке и вести полноценный учет и контроль за движением архивных материалов.

Хранение микропрепаратов рекомендуется осуществлять в специализированных архивных шкафах. Подобные шкафы выпускаются многими производителями и вполне доступны на рынке.

Перед помещением в архивный шкаф микропрепараты следует тщательно высушить, чтобы предотвратить слипание стекол в ящиках в ходе хранения.

Архивные модули рекомендуется маркировать по номерам помещенных в них микропрепаратов. Учитывая, что самые вместительные архивные системы позволяют размещать в одном ящике до 400 стекол, для облегчения работы с архивом внутри каждого ящика можно использовать дополнительные разделители, отграничивающие, например, каждую сотню номеров.

Изъятие микропрепаратов из архива должно строго учитываться и соответствующим образом регистрироваться. Отсутствие препаратов в архиве, не подкрепленное соответствующей документацией, должно расцениваться как чрезвычайное происшествие.

Рекомендуется использовать дополнительные разделители и для маркировки номеров стекол, временно изъятых из архива. Для таких разделителей удобно ввести различную цветовую индикацию, например красным цветом помечать номера, выданные для пересмотра в другие учреждения, зеленым – номера, изъятые для выполнения различных работ внутри лаборатории (внутренние ретроспективные пересмотры, фотографирование, выполнение научных работ и др.).

Рекомендуется размещать микропрепараты в ящики таким образом, чтобы стекла, относящиеся к одному случаю, располагались в одном ящике неделимым блоком.

Появление пузырей в монтирующей среде при длительном хранении микропрепаратов хорошо знакомо большинству специалистов. Это происходит, если препарат, извлеченный из ксилола, успевает высохнуть перед заключением его под покровное стекло. Под покровным стеклом появляются мелкие пузырьки вокруг тканевых структур. Высыхание среза может проявляться и изменениями прозрачности ядер клеток, которые при микроскопии выглядят более темными и теряют свои детали. Решить проблему можно, перенакрыв срез.

При недостаточной дегидратации препарата, остаточная вода выявляется в виде непросветленных участков. В некоторых случаях при микроскопии вода в препаратах выявляется в виде капель. Это снижает качество препаратов и со временем приводит к выцветанию окраски. При обнаружении воды в препарате необходимо снять покровное стекло, повторить дегидратацию спиртовыми растворами восходящих концентраций и заново заключить срез под покровное стекло.

Некачественно приготовленная полистерол-содержащая монтирующая среда может растрескиваться или кристаллизоваться с течением времени. При этом необходимо удалить покровное стекло и дефектную монтирующую среду и перемонтировать препарат. Для заключения срезов полистиролом лучше вообще не пользоваться – при этом никогда не получаются качественные препараты.

При длительном хранении под прямыми солнечными лучами препараты могут выцветать. Для обеспечения наилучшей сохранности препараты стоит перекрасить и хранить в темноте. Выцветание препарата также может быть вызвано воздействием интенсивного пучка света при микроскопии.

Хранение парафиновых блоков рекомендуется осуществлять в едином архиве, организованном по принципу сквозной нумерации – только такой принцип позволяет содержать архив в безупречном порядке и вести полноценный учет и контроль за движением архивных материалов.

Хранение парафиновых блоков рекомендуется осуществлять в специально оборудованном сухом и прохладном помещении.

В помещении для хранения архива парафиновых блоков следует на регулярной основе проводить мероприятия по дератизации и дезинсекции.

В качестве архивных модулей для хранения блоков могут быть использованы как специализированные архивные системы, так и приспособленные контейнеры.

Архивные модули рекомендуется маркировать по номерам помещенных в них блоков.

Изъятие блоков из архива должно строго учитываться и соответствующим образом регистрироваться. Отсутствие блоков в архиве, не подкрепленное соответствующей документацией, должно расцениваться как чрезвычайное происшествие.

При повышенной температуре в помещении, где хранится архив блоков, парафин может подвергнуться размягчению, а блоки – деформации и слипанию.

При наличии в помещении, где хранится архив блоков, крыс, мышей и тараканов, нередки случаи частичной или полной утраты блоков из-за погрызов.

Изъятие микропрепаратов и блоков из архива может производится только с ведома руководителя патоморфологической лаборатории, должно строго учитываться и соответствующим образом регистрироваться.

Отсутствие препаратов или блоков в архиве, не подкрепленное санкцией руководителя лаборатории, должно расцениваться как чрезвычайное происшествие.

Выдача микропрепаратов и блоков из архива для пересмотра в другие учреждения на основании официального запроса лечебно-профилактического учреждения. Рекомендуется требовать от врачей сторонних учреждений указывать в запросе фамилию, имя и отчество пациента и цель запроса (например – консультация в таком-то учреждении).

Микропрепараты из архива для пересмотра в другие учреждения могут быть выданы только самому пациенту или его законному представителю.

Рекомендуется требовать от лица, осуществляющего получение первичных материалов исследования из архива лаборатории, заполнение расписки о получении соответствующих архивных материалов (рис. 14).

В целях обеспечения сохранности архива первичных материалов исследований, в бланк расписки о получении архивных материалов рекомендуется включить обязательство возврата стекол и блоков в архив.

Документы об изъятии первичных материалов исследований из архива лаборатории (запросы сторонних учреждений и расписки получателей) являются, как и сам архив микропрепаратов и блоков, материалами постоянного хранения без ограничения срока давности.

Выдача микропрепаратов из архива по запросам суда и следственных органов может быть осуществлена при условии соблюдения установленных действующим Законодательством процессуальных норм, и только с ведома руководителя учреждения, в состав которого входит соответствующая патоморфологическая лаборатория.