Применение кишечных органоидов для персонализированной диагностики и терапии муковисцидоза

Органоиды — это самоорганизующиеся трехмерные (3D) многоклеточные структуры, являющиеся миниатюризированными и упрощенными версиями органа, полученными in vitro. Потенциально могут быть созданы органоиды любого органа для каждого человека. Культивирование органоидов чаще всего осуществляют в среде с определенными факторами роста и в толще 3D-матрикса. Разработка данной биологической модели в XXI веке открыла принципиально новые возможности для биологии и медицины. Современные достижения в этой области уже значительны — получены органоиды мозга, всех отделов желудочно-кишечного тракта, почки и др. Новые культуры органоидов и дальнейшие методические усовершенствования являются перспективным направлением, которое в будущем может завершиться возможностью трансплантации людям аутологичных органов. Культуры кишечных органоидов уже используют для персонализированной терапии муковисцидоза (МВ), одного из самых частых генетических заболеваний. В отличие от используемых подходов для диагностики, оценки эффективности лекарственных препаратов и подбора терапии МВ, применение кишечных органоидов не требует обязательного знания мутаций, вызвавших МВ. Помимо МВ, персонализированный подход с применением органоидов реализуют при терапии онкологических заболеваний.

К настоящему времени были успешно получены органоиды мозга [1, 2], печени [3], желудка и всех отделов кишечника [4—6], поджелудочной железы [7], почек [8, 9], разных опухолей [10—13]. Для каждого типа органоидов была показана экспрессия тканеспецифических маркерных белков; профиль экспрессии генов и ультраструктура органоидов также сходны с соответствующим органом [1—5, 7, 9, 13].

Органоиды получают из тканей человека [5, 7, 14], мыши [3, 4, 6, 15, 16], собаки [17]. Огромный потенциал заложен в использовании индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток. Преимущество данного подхода заключается в возможности получения из iPS клеток методом направленной дифференцировки практически любых органоидов (почек, мозга, поджелудочной железы и др.) и в неограниченном количестве [1,2, 9, 18, 19]. Полученные из IPS клеток органоиды позволят проводить персонализированную терапию различных заболеваний. Удобство данного подхода — это минимальный дискомфорт для человека при создании биобанка его iPS клеток, т.к. они могут быть получены из фибробластов кожи или волосяных фолликулов [19].

Большинство научных исследований в мире для оценки эффективности новых лекарственных препаратов проводят на животных. Такие исследования имеют высокую стоимость, поэтому были разработаны более экономичные модели, использующие клеточные культуры. Значительная часть пересеваемых (постоянных линий клеток) имеет опухолевое происхождение. В целом, все используемые линии клеток имеют недостатки и не всегда результаты, получаемые с использованием таких культур, соотносятся с данными in vivo. По этой причине, при создании новых лекарственных препаратов, лишь незначительная часть соединений, эффективных на культурах клеток, допускается до клинических испытаний. Например, для исследования слизистой толстого кишечника часто используют линию клеток человека Сасо-2, полученную из аденокарциномы. Однако, по сравнению с клетками слизистой кишечника, мембранные транспортные белки данной линии клеток экспрессируются в меньшем количестве, поэтому, например, для изучения проницаемости лекарственных препаратов с оральным введением, эта модель не подходит [20]. Культуры органоидов в большей степени, чем постоянные линии клеток соответствуют исследуемым тканям. Показательным примером служат кишечные органоиды, которые являются более адекватной моделью слизистой, чем постоянные линии клеток опухолевого происхождения СаСо2 или DLD1 [21].

По сравнению со стандартными моделями с применением пересеваемых культур клеток органоиды имеют множество преимуществ:

По сравнению с моделями на животных органоиды:

В настоящее время органоиды рассматриваются как уникальные объекты (модели) для решения многих научных и медицинских задач.

Органоиды используют при фармакологических, токсикологических, микробиологических исследованиях, при изучении генетических, инфекционных, онкологических, воспалительных заболеваний на клеточном и молекулярном уровнях [11, 21, 22, 24, 25]. Например, на культурах кишечных органоидов была исследована роль белка ATG16L1 в патогенезе болезни Крона и воспалительном заболевании кишечника [27]. На органоидах слизистой желудка исследовали роль хронического воспаления, вызванного бактерией Helicobacter, в злокачественной трансформации эпителия желудка [6].

На культурах органоидов можно проводить скрининг потенциальных лекарственных препаратов для терапии всех перечисленных классов заболеваний [6, 11]. Например, на кишечных органоидах мыши был проведен обширный скрининг препаратов, способствующих выживанию после облучения [15].

Поскольку могут быть получены органоиды любой ткани от любого человека (через использование технологий получения iPS клеток), это дает возможность разрабатывать медицинские технологии персонализированной терапии многих заболеваний, в том числе и генетических [2, 24]. На культурах опухолевых органоидов, полученных от больных, можно проводить подбор наиболее эффективных лекарственных препаратов и индивидуальной схемы лечения онкологических заболеваний [11—13].

В последнее десятилетие предпринимаются попытки применения органоидов для регенеративной медицины. В ближайшем будущем возможно создание аутологичных тканей для трансплантации на основе культур органоидов [23]. Так, было показано, что кишечные органоиды человека, полученные из iPS клеток, после вживления в почку мыши формируют полноценные ткани тонкого кишечника: эпителиальную со всеми типами клеток и гладкомышечный слой. Полученный de novo кишечник выполнял пищеварительные функции — абсорбировал пептиды [28]. Органоиды поджелудочной железы человека, также полученных из iPS клеток, после трансплантации в поджелудочную железу мыши формировали нормальные дольки и протоки. Данный процесс не сопровождался опухолевым перерождением [7].

В органоидах, полученных от пациентов с генетическими заболеваниями, мутации в гене, спровоцировавшим болезнь, могут быть отредактированы. Возможно использование таких органоидов для замещения пораженной ткани [7, 16]. Например, из iPS клеток людей, больных муковисцидозом, были получены органоиды поджелудочной железы; в дальнейшем исследователи планируют провести геномное редактирование — встроить функциональный ген CFTR в iPS клетки, а затем получить из них органоиды поджелудочной железы с функциональным белком CFTR и провести их трансплантацию пациентам [7]. Под руководством Н. Clevers были получены культуры кишечных органоидов от пациентов, больных муковисцидозом, и проведено геномное редактирование мутантного гена CFTR с использованием системы CRISPR/Cas9. Авторы предполагают, что геномно-отредактированные кишечные органоиды могут быть использованы для трансплантации [16]. В России разрабатывают условия для редактирования гена CFTR (мутация — F508del) для этиотропного лечения муковисцидоза [29, 30].

Органоиды являются незаменимой моделью для изучения фундаментальных процессов: развития разных органов и тканей, регуляторных сигнальных каскадов и многих других процессов. Например, на культурах кишечных органоидов человека исследовали распределение кислорода при гипоксии [31], формирование микробиоты кишечника у новорожденных [14]. В работе J. Kraiczy с соавторами [32] был проанализирован характер метилирования ДНК органоидов, полученных из разных отделов ЖКТ взрослых, детей и эмбрионов и было обнаружено, что он различается для разных отделов ЖКТ и для каждой возрастной группы. Органоиды могут применяться для исследования регуляции самообновления стволовых клеток, их роста и дифференцировки в разных тканях [21]. Так в работе [33] авторы на культурах кишечных органоидов изучили роль Wntи Notch-сигнальных каскадов в регуляции самообновления стволовых клеток.

Тем не менее, культуры органоидов имеют ограничения применения, связанные с отсутствием градиента концентрации ростовых факторов в культуральной среде, в отличие от систем in vivo [22].

Впервые органоиды были получены из кишечника мыши в 2009 г в Нидерландах группой исследователей под руководством Н. Clevers [4]. Авторы показали, что одиночные крипты, выделенные из тонкого кишечника мыши, могут образовывать замкнутые структуры из клеток однослойного эпителия, апикальной стороной обращенных во внутреннюю полость, которую назвали люменом, а базальной — во внешнюю среду (рис. 1). Данные структуры получили название кишечных органоидов. В 2011 г той же исследовательской группой были получены кишечные органоиды человека [21].

Кишечные органоиды по структуре и клеточному составу схожи с эпителиальной тканью кишечника in vivo (рис. 1). В кишечных органоидах выделяют домены, аналогичные криптам и ворсинкам эпителия кишечника. Как и в слизистой кишечника в «криптах» кишечных органоидов находятся стволовые клетки и клетки Панета. «Ворсинки» кишечных органоидов состоят из дифференцированных клеток — каемчатых энтероцитов, бокаловидных и энтероэндокринных клеток, что также соотносится со строением ворсинок слизистой кишечника [4, 21]. Экспериментально было показано, что все типы клеток органоида выполняют те же функции, что и в слизистой кишечника: каемчатые энтероциты абсорбируют питательные вещества, бокаловидные клетки образуют слизь, клетки Панета — противомикробные пептиды, а энтероэндокринные клетки — гормоны. Благодаря такому сходству с кишечником органоиды еще называют мини-кишечники (mini-guts) [4, 22, 23].

В ходе проведенных исследований под руководством Н. Clevers были определены условия получения кишечных органоидов из слизистой кишечника и их длительного культивирования:

Перечисленные условия (наличие стволовых клеток, ЗБ-матрикс и ростовые факторы в среде культивирования) являются ключевыми при получении органоидов любой ткани.

Помимо факторов роста для длительного (больше 6 месяцев) культивирования кишечных органоидов человека в питательной среде должны присутствовать никотинамид, ингибитор р38-киназы (SB202190) и Alk-рецептора (А8301). В отсутствии данных соединений процент дифференцированных клеток (бокаловидных и энтероэндокринных) возрастает [21]. Изменения в составе среды будут приводить к изменению соотношения разных типов клеток в органоидах. Например, в отсутствии Wnt-ЗА в кишечных органоидах человека уменьшается экспрессия мРНК LGR5 (маркер стволовых клеток кишечника) и возрастает экспрессия мРНК VIЫ (маркер энтероцитов) и MUC2 (маркер бокаловидных клеток) [18].

Для снижения стоимости методов (анализов) с применением органоидов вместо рекомбинантных ростовых факторов чаще стали использовать обогащенные этими факторами кондиционированные среды от трансфицированных линий клеток [5, 18].

Культуры органоидов стали незаменимым инструментом для персонализированной диагностики и терапии муковисцидоза.

Муковисцидоз (МВ) — частое наследственное аутосомно-рецессивное летальное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR — муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости [39]. Белок CFTR является анионным каналом (проводит ионы хлора, карбоната, а также воду), располагается на апикальной мембране эпителиальных клеток [39]. При отсутствии белка CFTR или снижении его функциональной активности происходит сгущение секрета желез внешней секреции, закупорка протоков и повреждение органа [40]. От 70 000 до 100 000 людей в мире страдают от этого тяжелого заболевания [41, 42].

Существенной проблемой для постановки диагноза и терапии МВ является аллельная гетерогенность. Известно более 2000 мутаций гена CFTR [43—45], которые подразделяют на 6 классов (рис. 2). Наиболее тяжелое течение болезни характерно при мутациях I—III классов — при отсутствии белка CFTR или его полной неактивности [39, 45, 46]. Наиболее распространенными являются 159 мутаций гена, которые встречаются у 96% больных МВ [43]. Чаще всего встречается мутация II класса F508del — у 70% больных МВ [47, 48]. В «Регистре больных муковисцидозом» в 2016 г в Российской Федерации числилось 3049 человек. Аллельная частота мутации F508del в России составляет 52% [49].

Большая часть мутаций (около 1800) — редкие или даже уникальные, т.е. обнаружены у небольшой группы больных или даже в единственной семье.

Для постановки диагноза МВ важно знать последовательность гена и мутации, однако, при назначении схемы лечения больным МВ эти знания до последнего времени практически не учитывались [50]. Терапия МВ, главным образом, была и во многих странах, включая Россию, остается симптоматической. Она сфокусирована на подавлении бактериальных инфекций, снижении воспаления, применении заместительных панкреатических ферментов, назначении специальных диет, лечении осложнений [39, 40].

Сейчас разрабатывают новые лекарственные препараты, которые непосредственно воздействуют на патогенетические звенья МВ и обеспечивают не симптоматическое лечение, а непосредственно влияют на причину заболевания. Данные вещества оказывают действие на трансляцию белка CFTR, его транспорт и встраивание в апикальную мембрану клеток, а также на кинетические характеристики (увеличивают время открытия канала). Различают потенциаторы, корректоры CFTR и ингибиторы ранней терминации. Их применение частично восстанавливает функции кишечного эпителия при ряде мутаций гена CFTR [39, 40, 44, 45]. Действие потенциаторов направлено на восстановление проводимости белка CFTR [40, 51, 52]. VX-770 — самый известный потенциатор (другие названия — калидеко и ивакафтор; производитель — Vertex Pharmaceuticals). Потенциаторы могут быть эффективными при мутациях всех классов, кроме первого (при которых полностью нарушена трансляция белка) (рис. 2). Помимо VX-770 фармацевтические компании разрабатывают новые соединения CFTR-потенциирующего действия GLPG1837 (Galapagos), Q8W251 (Novartis), С-10355, С-10358 (Concert) и др. [52]. Корректоры способствуют правильному сворачиваю (фолдингу) мутантного белка CFTR и транспорту его к апикальной мембране клеток [40, 51, 52]. Корректоры могут применяться при мутациях II, V и VI классов (рис. 2). Наиболее известный корректор — VX-809 (люмакафтор), также известны и другие — VX-661, VX-325 и Согг-4а [52]. Ингибиторы ранней терминации, например, аталурен, влияют на работу рибосом и способствуют синтезу белка CFTR при мутациях гена I класса [40, 44, 45]. Однако клинические испытания аталурена в 2017 г были приостановлены, так как он оказался неэффективным при терапии МВ [53].

Эра таргетной и персонализированной (с учетом мутаций, приводящих к болезни) терапии МВ берет свое начало в 2012 году, после одобрения FDA и ЕМА препарата калидеко (потенциатор VX-770) для лечения больных МВ, имеющих хотя бы один аллель с мутацией III класса G551D [52]. Этому событию предшествовал скрининг более 50 000 соединений [54], многолетние исследования in vitro и in vivo [48, 51]. В 2008 и 2011 гг. были опубликованы результаты клинических исследований/испытаний, в ходе которых было показано, что применение VX-770 больными МВ с мутацией G551D значительно улучшает их состояние — наблюдается восстановление функции легких, набор веса, снижается содержание хлорида в потовой пробе и др. [55, 56].

В настоящее время препарат калидеко назначают при 38 мутациях, относящихся к разным классам [57]. Для лечения больных МВ, вызванных мутацией F508del в гомозиготном состоянии, а это 45% больных [39], была принята схема лечения препаратом, включающим потенциатор VX-770 и корректор VX-809 [52]. Данный комбинированный препарат носит название оркамби. Однако десятки тысяч пациентов все равно не могут принимать эти препараты из-за побочных эффектов. В частности, оркамби из-за побочных реакций применим менее чем у 60% больных с МВ. Комбинированный препарат симдеко (комбинация калидеко и нового препарата тезакафтор — VX-661) должен решить данную проблему, так как симдеко имеет более высокий профиль безопасности, чем оркамби, не вызывает побочных респираторных проблем и не требует регулярного контроля артериального давления [58].

При остальных мутациях калидеко, оркамби и симдеко не применяют, так как неизвестно и не исследовано их влияние на течение болезни. Поскольку причиной МВ могут быть сотни различных мутаций, необходимы дальнейшие исследования влияния этих препаратов, а также других потенциаторов и корректоров на работу канала CFTR у больных МВ, особенно с редкими или уникальными мутациями гена. Следует заметить, что проведение клинических испытаний у пациентов с редкими мутациями гена CFTR для определения чувствительности к препаратам является дорогостоящим, а группы пациентов крайне малочисленны. Поэтому многим больным МВ с редкими или даже единичными мутациями гена CFTR лечение препаратами нового поколения не назначают.

Оценка функциональной активности канала CFTR при подборе лекарственной терапии таргетными препаратами для больных МВ может быть произведена in vitro на органоидах, получаемых из ректальных биоптатов кишечника пациента с тспользованием форсколинового теста. Главными достоинствами этого метода, разработанного несколько лет назад под руководством J.M. Веekman, являются индивидуальный (персонализированный) подход и высокая производительность [24, 26, 38].

Принцип метода основан на прямой активации форсколином фермента аденилатциклазы в эпителиальных клетках. Образующийся цАМФ стимулирует протеинкиназу А, которая, в свою очередь, фосфорилирует регуляторный домен канала CFTR и вызывает его открытие. Активация CFTR приводит к секреции жидкости и ионов в люмен органоидов и к их быстрому набуханию (поэтому тест еще называют FIS — Swelling», форсколин-индуцированное набухание) [38]. На этапе разработки FIS-теста с использованием кишечных органоидов мыши авторы доказали, что набухание органоидов при действии форсколина связано только с работой канала CFTR. Было показано, что ингибиторы канала CFTR (CFTRi_nh-172 или GlyH-101) и нокаут гена Cftr предотвращают форсколин-индуцированное набухание органоидов, в отличие от органоидов с функционально-активным белком CFTR [5].

Массовое культивирование кишечных органоидов — один из основных этапов для персонализированной терапии МВ. Эта методика была отработана в 2013 г. под руководством J.M. Beekman на базе наработок голландских коллег из лаборатории Н. Clevers [4, 21, 38].

Культуры кишечных (ректальных) органоидов могут быть получены от любого человека, в том числе от больных МВ. Следует заметить, что получение биоптатов — для изоляции крипт и дальнейшего наращивания культур кишечных органоидов — сопряжено с минимальным для человека дискомфортом. В Нидерландах с 2011 г для постановки диагноза МВ новорожденным используют метод измерения кишечных потенциалов с получением ректальных биоптатов, которые в настоящее время применяют для выделения культур кишечных органоидов [25].

На рис. 3 показана схема получения культур кишечных органоидов из ректальных биоптатов. Фрагменты слизистой кишечника обрабатывают дезинтегрирующим веществами и получают изолированные крипты. Затем крипты погружают в «Матригель» и высевают на культуральные планшеты в среду детерминированного состава (содержащую ростовые факторы Wnt-3A, Noggin, R-Spondin и EGF). Вскоре после посева крипты замыкаются, стволовые клетки пролиферируют, происходит разрастание органоидов и их почкование. Примерно через неделю выросшие органоиды механически разделяют и пересевают на новые планшеты. На всех этапах культивирование органоидов проводят в толще «Матригеля» в среде с ростовыми факторами [5, 36, 38]. Таким образом культуры кишечных органоидов могут поддерживать годами [22]. После получения стабильной линии кишечные органоиды используют для оценки активности канала CFTR методом FIS-теста.

Полученные от больных МВ культуры кишечных органоидов обязательно наращивают, замораживают и хранят в криобанках, для использования в случае необходимости (например, при утрате первичной культуры), без дополнительного причинения дискомфорта пациенту [24, 38].

Форсколиновый тест включает в себя следующие этапы (рис. 4 А):

После разработки форсколинового теста с его помощью исследовали остаточную функцию канала CFTR у больных МВ. В исследовании J. Dekkers с коллегами [36] было показано, что форсколин-индуцированное набухание кишечных органоидов полностью коррелирует с остаточной функцией ионного канала CFTR, а результаты FIS-теста соотносятся с другими vivo и ex vivo маркерами функциональной активности CFTR — с концентрацией ионов хлора в потовой пробе и с измерениями кишечных потенциалов. Например, кишечные органоиды от больных МВ с частой мутацией F508del практически не отвечают на стимуляцию форсколином (рис. 4 Б). Иммунофлуоресцентное окрашивание также показало, что белок CFTR при данной мутации практически не синтезируется [36].

Форсколиновый тест настолько чувствителен, что позволяет исследовать активность канала CFTR при любых мутациях гена, относящихся к разным классам и вызывающих разную степень утраты функции канала. Чем выше остаточная функция канала, тем сильнее ответ на стимуляцию форсколином, т.е. набухание органоидов [5, 36].

С использованием FIS-теста на кишечных органоидах, полученных от больных МВ, может быть оценена функциональная активность канала CFTR после действия модуляторами (потенциаторами, корректорами). По скорости и степени набухания органоидов количественно оценивают влияние модуляторов на активность канала CFTR, т.е. их терапевтический эффект [24]. Корректоры добавляют к кишечным органоидам на этапе посева, а потенциаторы — за час до обработки форсколином (рис. 4 А).

В работе J. Dekkers с соавторами [36] на культурах кишечных органоидов, полученных от 71 пациента с 28 различными генотипами CFTR, было проведено обширное исследование влияния потенциатора VX-770 и корректора VX-809 на функцию канала CFTR. Например, у органоидов с гомозиготной мутацией F508del при аппликации только VX-770 (калидеко) или только VX-809 наблюдали незначительное улучшение функционального состояния канала, однако при их совместном воздействии (оркамби) происходило практически полное восстановление его активности (рис. 4 Б) [36].

Полученные результаты in vitro по восстановлению модуляторами работы канала CFTR при ряде мутаций гена коррелировали с результатами клинических испытаний по улучшению состояния больных МВ, вызванного теми же самыми мутациями. Таким образом, форсколиновый тест позволяет исследовать влияние модуляторов на активность канала, и, в конечном счете, сделать вывод об их эффективности для персонализированной терапии пациентов, в том числе с редкими мутациями гена CFTR [25, 36]. В течение короткого времени данная научная разработка нашла применение в клинике — в начале 2015 года пациенту с МВ из Нидерландов было назначено лечение препаратом калидеко на основе результатов тестирования эффективности лекарственного средства с использованием кишечных органоидов, полученных из собственной ткани пациента. Следует заметить, что мутация, вызвавшая болезнь, была уникальной и встречалась только в этой семье [59].

Сейчас в Нидерландах при помощи FIS-теста исследуют терапевтические эффекты потенциаторов и корректоров у носителей редких мутаций гена CFTR. На основе полученных результатов может быть назначена схема лечения оркамби или калидеко, а обнаруженные новые мутации с ответом на эти препараты дополнительно вносят в список мутаций, при которых показано применение оркамби и калидеко.

Кроме оценки остаточной активности CFTR, с использованием форсколинового теста можно проводить высокопроизводительный скрининг новых соединений и потенциальных лекарственных препаратов, эффективных при МВ. Рассматривается возможность применения FIS-теста для персонализированного исследования фармакокинетики и фармакодинамики калидеко и оркамби [60].

В работе J. Dekkers с соавторами [36] был описан метод оценки активности CFTR на кишечных органоидах без стимуляции форсколином. Метод основан на измерении стабильной области люмена кишечных органоидов (SLA «Steady-state Lumen Area») по отношению к общему размеру органоида. Разработка этого подхода обусловлена недостатком FIS-теста, который заключается в сложности сравнения функции канала CFTR у больных МВ и здоровых людей, т.к. у здоровых людей, благодаря нормальной проводимости CFTR, кишечные органоиды часто имеют сферическую форму и при воздействии форсколина лишь незначительно увеличиваются в размерах или лопаются (рис. 4 В). Кишечные органоиды с нарушенной работой CFTR характеризуются меньшим размером люмена (рис. 4 Б). Оказалось, что стабильная область люмена (просвета) кишечных органоидов, полученных от здоровых людей, составляет 35—70% от общего размера органоида, а при мутациях гена CFTR — от 0 до 10%. По изменению значения SLA кишечных органоидов в присутствии модуляторов CFTR оценивают их терапевтический эффект. По сравнению с FIS-тестом метод SLA является менее чувствительным и его реже применяют.

Таким образом, в настоящее время получаемые in vitro культуры органоидов являются модельными системами, наиболее соответствующими объектам in vivo. Разработка метода получения культур кишечных органоидов стала началом персонализированной диагностики и терапии МВ. Форсколиновый и SLA тесты на культурах кишечных органоидов позволяют подбирать оптимальные схемы лечения современными модуляторами ионного канала CFTR с учетом индивидуальных особенностей пациентов, больных МВ [25]. С использованием данных методов тестируют новые соединения — потенциальные препараты для лечения МВ. В России новаторский метод персонализированной оценки остаточной функции канала CFTR FIS-тестом на культурах кишечных органоидов пока не используют, терапия больных МВ остается, главным образом, симптоматической, и таргетные препараты (калидеко, оркамби) пока назначают в единичных случаях.