МР 4.2.0161-19. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы индикации биологических пленок микроорганизмов на абиотических объектах. Методические рекомендации (утв. Роспотребнадзором 23.12.2019)

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют методы санитарно-бактериологических исследований по идентификации бактерий, в том числе в состоянии биологических пленок, на абиотических поверхностях в медицинских организациях и на предприятиях по производству пищевой продукции.

1.2. Биологические пленки являются одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных процессов. На сегодняшний день достоверно установлена роль биопленок при большинстве случаев всех хронических и/или рецидивирующих инфекций. Биопленки с высокой устойчивостью к антибиотикам и другим противомикробным препаратам являются причиной более 65% случаев инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП, HAIs), которые, по данным зарубежных центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC и ECDC, соответственно), ежегодно поражают более 6 миллионов человек. Биопленки участвуют в развитии 80% всех микробных инфекций в организме, в том числе связанных с медицинскими устройствами, такими как катетеры, эндотрахеальные трубки, протезы суставов и клапанов сердца. Биопленки значительно задерживают заживление ран и снижают эффективность антимикробной терапии инфицированных кожных ран, участвуют в развитии инфекций среднего уха, кариеса, гингивита, простатита и т.д.

В окружающей среде бактерии обнаруживаются в двух формах существования:

Большинство популяций бактерий (более 95%) существует в прикрепленном состоянии и образуют биопленки на различных поверхностях, как биотических, так и абиотических, в природе и в организме различных хозяев.

Выделяют пять стадий развития биопленки:

Планктонные бактерии присоединяются друг к другу и к поверхностям в течение нескольких минут. Соединенные микроколонии образуются в течение 2 - 4 часов. В течение 6 - 12 часов клетки вырабатывают внеклеточные полисахариды, и биопленка становится толерантной к антибактериальным средствам. Зрелые биопленки, резистентные к биоцидам, образуются в течение 24 - 48 - 72 часов, в зависимости от видов бактерий и условий роста. Биопленки быстро восстанавливаются после механического разрушения и вновь формируют зрелую форму в течение 8 - 12 - 24 часов. Дисперсия планктонных клеток из зрелых биопленок происходит по достижении максимальной зрелости микроколоний (более 72 часов).

Биологические пленки способствуют формированию устойчивости бактерий к неблагоприятным факторам окружающей среды, включая воздействие антибактериальных препаратов, образуя экзополисахаридный матрикс (далее - ЭПМ), обладающий защитными (протективными) функциями. При наличии биопленок на поверхностях возможно получение ложноотрицательных результатов при проведении санитарно-бактериологических исследований (смывов), т.к. зрелый ЭМП препятствует механическому переносу бактерий на диагностические питательные среды. Разрушение ЭПМ позволяет проводить высокоэффективные смывы, исключая вероятность ложноотрицательного результата.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, проводящих санитарно-эпидемиологические экспертизы, исследования и иные виды оценок, а также для аккредитованных лабораторий, проводящих отбор проб, исследования и контроль за санитарно-гигиеническим состоянием и микробиологическими показателями в медицинских организациях и на предприятиях по производству пищевой продукции.

1.4. Объектами санитарно-бактериологических исследований являются поверхности объектов окружающей среды медицинских организаций (в операционных блоках, хирургических, послеоперационных палатах и отделениях, палатах и отделениях реанимации и интенсивной терапии, перевязочных и процедурных кабинетах и других подразделениях) и изделия медицинского назначения (включая эндоскопическое оборудование, зонды, катетеры, бужи и прочее), а также объекты производственной среды пищевых производств (смывы с технологического оборудования, тары, инвентаря, стен, полов, одежды и т.д.).

1.5. При проведении исследований используются питательные среды, расходные материалы и средства, перечисленные в приложении 1 к настоящим МР, либо аналогичные или с лучшими характеристиками.

1.6. В медицинских организациях бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов окружающей среды осуществляется в соответствии с методическими указаниями <1>.

<1> Пункт 3.2.1 МУК 4.2.2942-11 "Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях" (далее - МУК 4.2.2942-11).

1.7. На предприятиях по производству пищевой продукции перечень микроорганизмов, подлежащих контролю (общее количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), стафилококки, бактерии группы кишечных палочек, клостридии, бактерии родов Salmonella, Proteus, Listeria, Campylobacter и др.), определяется в соответствии со стандартами <2>.

<2> ГОСТ 31746; ГОСТ 31747; ГОСТ 10444.15; ГОСТ 31659; ГОСТ 28560; ГОСТ 29185; ГОСТ 32031; ГОСТ ISO 10272-1.

2.1. К методам и этапам индикации биологических пленок относятся:

Примечание. Каталазный экспресс-тест применяется для экспресс-индикации мест возможного биологического загрязнения, в том числе для определения мест последующего применения ферментного теста.

Примечание. Флуорохромный экспресс-тест является вспомогательным и не обязательным для исполнения. Данный экспресс-тест может применяться, в том числе, для проверки качества текущих и генеральных уборок.

Примечание. Ферментный тест является базовым для обнаружения бактерий в состоянии биопленки.

Этапность и очередность тестов не является обязательной. Тесты применяются в зависимости от конкретных поставленных задач.

2.2. Каталазный экспресс-тест обнаружения бактериальной контаминации абиотических поверхностей, в том числе в состоянии биопленок, основан на реакции индикатора на основе пероксида водорода с каталазой - ферментом системы антиоксидантной защиты бактериальной клетки.

Реакция основана на ферментативном разрушении перекиси водорода до кислорода и воды.

Наличие незначительного количества каталазонегативных штаммов бактерий не влияет на чистоту проведения каталазного экспресс-теста, поскольку биопленка, как правило, имеет поливидовой состав.

Чувствительность каталазного экспресс-теста, при условии соблюдения всех рецептурных характеристик индикатора, - от 10⁴ кл./мл бактерий.

Каталазный индикатор (в соответствии с п. 8 приложения 1) наносят на очищенную и продезинфицированную исследуемую поверхность, не допуская взбалтывания, в соответствии с инструкцией производителя (порядка 2,0 - 3,0 мл на 5 см² поверхности) распылением с расстояния от 10 до 15 см.

При положительной реакции в течение 5 - 30 секунд после нанесения индикатора начинается процесс барботирования (образования микропузырьков при реакции выделения кислорода), что является подтверждением наличия каталазоположительных форм бактерий, в том числе в состоянии биологической пленки, на исследуемой поверхности.

Примечание. При проведении исследования на эндоскопах индикатор не должен быть густым, раствор индикатора должен свободно проникать в каналы эндоскопа.

При исследовании эндоскопа дистальный подвижный конец опускается в раствор индикатора, а в исследуемый инструментальный канал эндоскопа индикатор заливается принудительно, в объеме, достаточном для возникновения реакции (обычно 150 - 200 мл на эндоскоп).

2.3. Экспресс-тест с флуорохромным красителем применяется для обнаружения структур ЭПМ биологических пленок методом окрашивания их флуорохромным красителем (в виде раствора на основе флуорохромного красителя Нильский красный (Nill red) согласно пункту 9 приложения 1 и дальнейшей визуализации при помощи специального освещения.

Индикатор избирательно связывается с липидами и липополисахаридами ЭПМ биологических пленок грамположительных и грамотрицательных бактерий. Детекция ЭПМ биологических пленок проводится методом визуализации свечения флуорохромного красителя, после отмыва водой, в темноте, в проходящем зеленом свете. Визуализация производится в специальных очках красно-оранжевого фильтра.

Степень свечения зависит от зрелости матрикса биопленки и от количества липидов и липополисахаридов ЭПМ.

Примечание. Данный экспресс-тест не применяется для индикации биопленок на поверхности и в каналах эндоскопов.

Флуорохромный индикатор наносится на обрабатываемую поверхность в количестве 3 - 5 мл распылением с расстояния от 10 до 15 см.

Через 5 - 10 секунд после нанесения индикатора обработанную поверхность промывают дистиллированной водой, без применения механических методов обработки поверхности.

Положительная реакция визуализируется в специальных защитных очках с красно-оранжевым фильтром согласно ГОСТ Р 12.4.230.1 (ЕН 166) в проходящем зеленом свете фонарика.

Отрицательная реакция заключается в отсутствии свечения (или флуоресценции) красителя, что указывает на отсутствие загрязнения на исследуемых поверхностях.

Примечание. Индикатор необходимо наносить только на очищенные и продезинфицированные поверхности.

2.4. Ферментный тест, включающий применение ферментных индикаторов перед проведением бактериологических смывов, позволяет провести разрушение структур ЭПМ, в результате чего бактериальные клетки освобождаются от защитного барьера и могут быть уничтожены, удалены или идентифицированы в ходе последующих процедур.

Ферментный индикатор согласно пункту 10 приложения 1 представляет собой стерильный раствор, основным действующим веществом которого является смесь специальных энзимов из группы карбогидраз в рабочем растворе, содержащем функциональные и технологические компоненты, увеличивающие эффективность раствора и обладающие бактерицидным, фунгицидным и бактерицидным действием (катионные ПАВ, растворители и стабилизаторы активности).

Ферментный индикатор применяют методом протирания или локального распыления на поверхности перед проведением отбора проб смывов. Метод распыления применяют при обработке небольших по площади или труднодоступных поверхностей. Индикатор в виде раствора или в виде пены (при наличии специальной насадки на триггере-распылителе) наносится на поверхности в достаточном количестве (порядка 5 мл на 10 см²) с расстояния 10 - 15 см. После нанесения индикатора на поверхность время экспозиции составляет 10 минут.

При обработке эндоскопов ферментный индикатор наносится на места смывов с поверхностей или вносится в каналы эндоскопа в количестве не менее 150 мл. Время экспозиции после обработки ферментным индикатором составляет 10 минут.

2.5. Отбор проб для проведения микробиологических исследований осуществляют методом смывов с чистых поверхностей различных объектов и проводят после обязательного проведения процедур, указанных в пункте 2.4. Рекомендуется предварительно определить места проведения ферментного теста и отбора проб смывов путем применения каталазного теста в соответствии с пунктом 2.2. После отбора проб поверхности (объекты) подвергают промывке водопроводной водой либо обработке в соответствии с требованиями, установленными для конкретных изделий (в частности, для медицинских изделий - предстерилизационной очистке, дезинфекции высокого уровня или стерилизации).

3.1. Отбор проб смывов с объектов больничной среды и производственной среды предприятий по производству пищевой продукции осуществляется при следующих условиях:

3.2. При определении объектов, которые подлежат санитарно-бактериологическим исследованиям на выявление биопленок, основное внимание необходимо уделять объектам, которые имеют постоянный и периодический контакт с жидкостями и органическими веществами, которые могут быть использованы бактериями в качестве питательных веществ.

Труднодоступные места, такие как отверстия или щели в волокнистом, пористом, трудно моющемся оборудовании, пустотелые материалы, являются потенциальными участками для отбора проб на наличие биопленок. Для отбора проб в труднодоступных и недоступных местах необходима разборка оборудования. Выбор места отбора проб должен определяться в соответствии с поэтапной проверкой технологической цепи (процесса).

3.3. Ориентировочные места отбора проб в медицинских организациях и на предприятиях по производству пищевой продукции указаны в приложении 2 к настоящим МР.

3.4. Санитарно-бактериологические исследования по обнаружению биопленок на абиотических поверхностях в медицинских организациях необходимо проводить:

<3> МУ 3.5.1.3439-17 "Оценка чувствительности к дезинфицирующим средствам микроорганизмов, циркулирующих в медицинских организациях".

3.5. Санитарно-бактериологические исследования по обнаружению биопленок на абиотических поверхностях на предприятиях по производству пищевой продукции необходимо проводить в порядке, определенном программой производственного контроля организации (после проведения генеральных уборок), и по эпидемиологическим показаниям.

4.1. Для обнаружения стафилококков делают посев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл 6,5% солевого бульона. Засеянные культурой пробирки инкубируют при 37 °C в течение (24 +/- 2) ч, после чего делают посев на желточно-солевые среды или другие питательные среды, разрешенные к применению в установленном порядке.

4.2. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек делают посев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл среды Кесслера по пункту 17 приложения 1 к настоящим МР. После посева пробирки инкубируют при 37 °C в течение (24 +/- 2) ч и делают пересев на среду Эндо по пункту 2.21 приложения 1 к настоящим МР. Колонии, выросшие на среде Эндо, подвергают дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным энтеробактериям.

4.3. Для обнаружения сальмонелл делают посев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл одной из сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппопорта - Вассилиадиса). Засеянные пробирки инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 ч, делают пересев на среду Эндо (по пункту 21 приложения 1 к настоящим МР) и агар висмут-сульфитный (по пункту 18 приложения 1 к настоящим МР) с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

4.4. Для обнаружения синегнойной палочки делают посев на среду N 8 по пункту 19 приложения 1 к настоящим МР (бульон для накопления стафилококков и синегнойной палочки) и среду N 9 по пункту 20 приложения 1 к настоящим МР (для определения синегнойной палочки по наличию пигмента пиоцианина) или другие питательные среды, разрешенные к применению в установленном порядке.

8. Каталазный индикатор

Индикатор содержит в качестве основного действующего вещества пероксид водорода (3%), функциональные компоненты (увеличивающие чувствительность индикатора - N-Кокоалкил-N,N-диметиламиноксид) и технологические компоненты (загустители, растворители).

9. Флуорохромный индикатор

Раствор флуорохромного красителя Нильский красный (Nill red). Для реакции используется раствор в концентрации 5-10 μM. Для приготовления базового стокового 100-кратного раствора используется диметилсульфоксид (ДМСО), индикатор (рабочий раствор) готовят на физиологическом растворе.

10. Ферментный индикатор

Состав ферментного индикатора:

Водный раствор смеси энзимов из группы карбогидраз (1,6-α-D-глюкано-гидралаза и 1,4-(1,3:1,4)-β-D-глюкан-4-глюкано-гидролаза) - 0,5 - 1,0%. Функциональный (микробиоцидный) компонент: смесь N-Кокоалкил-N,N-диметиламиноксида, дидецилдиметиламмониум хлорида, бензалкониум хлорида и N,N-бис(3-аминопропил)додециламин (не менее 0,04% по сумме действующих веществ).

Для проведения качественных процедур в практических исследованиях необходимо использовать ферменты с подтвержденной активностью:

В реакции используется стерильный раствор промышленного изготовления.

11. Нейтрализатор для ферментного индикатора

Для нейтрализации действующего вещества индикатора, которое может быть перенесено с материалом тест-объекта при его посеве в питательную среду, используют нейтрализатор - вещество, которое устраняет (нейтрализует) действие химического агента на микробную клетку, но не убивает и не задерживает рост тест-микроорганизма.

После воздействия химического агента поверхности (или объекты) промывают или протирают раствором нейтрализатора либо добавляют его непосредственно в транспортную или питательную среду в концентрации 0,1%.

Состав нейтрализатора для ферментного индикатора: стерильный 1,0% водный раствор лаурилсульфата натрия.

Стерилизовать автоклавированием при 0,7 атм. (115 °C) в течение 15 мин.

18. Агар висмут-сульфитный

Стерилизовать автоклавированием при 0,7 атм. (115 °C) в течение 15 мин.

19. Среда питательная N 8

Стерилизовать автоклавированием при 0,7 атм. (115 °C) в течение 15 мин.

20. Питательная среда N 9

Стерилизовать автоклавированием (112 +/- 2) °C в течение 20 мин.

21. Среда Эндо

Примечание. Допускается использование питательных сред, расходных материалов и средств с аналогичными или лучшими характеристиками.