НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ: ОТ ИДЕИ ДО ВНЕДРЕНИЯ

Идея направленного транспорта лекарственных средств – «волшебной пули» – принадлежит выдающемуся немецкому учёному Паулю Эрлиху, который выдвинул её в 1906 г. «Волшебная пуля», по его мнению, представляет собой идеальное лекарство, «которое способно самостоятельно найти источник болезни или очаг заболевания и поразить их, не затрагивая здоровые органы и ткани организма».

Пауль Эрлих (1854-1915) является крупнейшим ученым конца XIX – начала XX веков. С его именем связаны важнейшие достижения в области медицины, биологии и химии. Он был одним из первых лауреатов Нобелевской премии в области физиологии и медицины.

Родился П. Эрлих в 1854 г. в еврейской семье на востоке Германии, в Силезии, в маленьком городке Штрелен. Большое влияние на Эрлиха оказал его двоюродный брат Карл Вейгерт (1845–1904), микробиолог, один из пионеров применения синтетических анилиновых красителей для избирательного окрашивания определенных элементов живых тканей и приготовления биологических препаратов для микроскопических исследований. Тогда же сложился и стиль мышления Пауля – конкретный, естественнонаучный, химико-биологический. Окончив гимназию, он поступил на медицинский факультет Страсбургского университета, где преподаватели хотели приобщить его к медицине в том виде, как они сами ее понимали. Эрлиха же тянуло в сторону химии и микробиологии, его воодушевляли идеи Луи Пастера и Роберта Коха. Диплом врача он получил в Лейпциге в 1878 г. После этого П. Эрлих начал работать врачом в известной берлинской университетской клинике Шарите, и вскоре стал заведующим отделением. Свою докторскую степень по медицине он получил, защитив диссертацию по теории и практике окрашивания тканей животных. Его дальнейшие исследования красителей заложили основы работ по гематологии и окрашиванию тканей. В 1890 г. он начал свои, ставшие классическими, иммунологические исследования, за которые получил Нобелевскую премию (1908 г., совместно с русским ученым И.И. Мечниковым). Также П. Эрлих считается основоположником научной химиотерапии: именно он «привел химию в медицину». Постоянная работа с красителями, с химическими соединениями привела его к представлению о том, что иммунитет обусловлен действием химических соединений. Свою работу он основывал на идее, что химическая структура используемых лекарств должна изучаться применительно к их способу действия и их сродству к тем клеткам организма, против которых они направлены. Целью П. Эрлиха было подобрать идеальное лечебное средство с минимальным воздействием на ткани всего организма и максимальным на родственные структуры рецепторов бактерий и паразитов.

В 1904 г. П. Эрлих опубликовал три статьи в Бостонском медицинском и хирургическом журнале, предшественнике «Журнала медицины Новой Англии». Эти статьи касались исследований ученого в области иммунологии. В них описаны иммунохимия, механизм иммунного гемолиза in vitro и теория боковых цепей, обосновавшая механизм образования антител к чужеродным веществам.

На протяжении многих лет П. Эрлих изучал воздействие на бактерии, трипаносомы, простейшие и другие организмы различных химических веществ – мышьяковистых, нитробензольных и некоторых других соединений. В 1910 г. он объявил научному миру о создании синтетического препарата, который освобождает организм от спирохеты, возбудителя сифилиса. “Препарат 606” получил впоследствии название сальварсан – “спасающий мышьяк”. Это была успешная 606-ая попытка создать лекарство. Сальварсан принес П. Эрлиху мировую славу. Еще через три года был создан “препарат 914” – неосальварсан, более эффективный и безопасный, он преимущественно и использовался в дальнейшем.

Идея «волшебной пули» не сразу получила свое развитие. Это объясняется трагическими событиями первой половины ХХ в., такими как мировые войны и революции, а также эмпирическим характером развития химии и практическим отсутствием аппаратурных методов исследования. Не было известно, как устроены мишени, как работают лекарства. Всё это выяснялось в дальнейшем по мере развития химии, физики, биологии, медицины и техники. Последующее развитие науки и появление новых методов исследования через десятки лет привели к возрождению идеи П. Эрлиха.

Благодаря тому, что П. Эрлих сформулировал принципы лечения инфекционных заболеваний с помощью химических веществ, медицина перешла в новую эпоху химиотерапии, которая получила ускоренное развитие с открытием сульфаниламидных препаратов.

Сульфаниламиды – лекарственные средства, используемые для лечения инфекционных заболеваний, в основном бактериального происхождения. Их открытие, описанное ниже, подтверждает предсказание П. Эрлиха о возможности создания лекарственных систем для избирательного поражения бактерий.

Открытие этого класса лекарственных соединений произошло при исследовании азокрасителей – синтетических красителей, в структуру которых входит сульфаниламид H₂N‒(C₆H₄)‒SO₂NH₂. В 1932 г. химики немецкого концерна «I.G. Farbenindustrie» получили пронтозил (красный стрептоцид), а в 1934 г. немецкий ученый- фармаколог Г. Домагк, руководивший исследовательским отделом корпорации, открыл его противобактериальные свойства. Он выяснил, что этот азокраситель эффективен против стрептококковых инфекций у мышей. За открытие антибактериального эффекта пронтозила ему в 1939 г. была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. Однако по указу Гитлера гражданам Германии было запрещено принимать нобелевские награды. Медаль и диплом Г. Домагк получил только в 1947 г. Позже французский химик Э. Фурно обнаружил, что антибактериальным действием обладает именно сульфаниламидная часть молекулы пронтозила, а не структура, придающая ему окраску.

Действие лекарства основано на подавлении роста и размножения микроорганизмов. Оно связано с тем, что сульфаниламид нарушает образование необходимых для их развития ростовых факторов, в частности фолиевой кислоты, в молекулу которой входит пара-аминобензойная кислота. Сульфаниламид является конкурентным антагонистом для пара- аминобензойной кислоты, которая участвует в синтезе фолиевой кислоты. При его наличии фермент, осуществляющий биосинтез фолиевой кислоты, вместо n-аминобензойной кислоты использует ее имитатор-антагонист (сульфамидный фрагмент). В результате микроорганизм вместо фолиевой кислоты (1) синтезирует псевдофолиевую кислоту (2) (рис. 1).

Эти изменения в структуре фолиевой кислоты блокируют образование нормальных метаболитов. В результате в клетке микроорганизма угнетается синтез нуклеиновых кислот и достигается бактериостатический эффект.

Постулат о том, что лекарственное вещество (агент) для осуществления своего эффекта должно сначала связаться с соответствующими рецепторами в клетках патологического очага (мишени) был сформулирован Джоном Лэнгли.

Темой его работ было влияние ядов и лекарств на функции нервной системы. В 1878 г. он изучал, как влияют алкалоиды пилокарпин и атропин на слюноотделение; позже в 1905 г. исследовал действие никотина и кураре на скелетные мышцы. Дж. Лэнгли предположил, что клеточные рецепторы - белки, под действием различных веществ меняют своё состояние и за счет этого управляют работой клетки. Этот постулат получил дальнейшее развитие в работах Пауля Эрлиха.

В декабре 1932 г. Д. Джонсон зарегистрировал британский патент от имени «I.G. Farbenindustrie Aktiengesellschaft», в котором указано, что «фармацевтические препараты для инъекций в мышечную систему или подкожно, могут быть получены путем комбинирования лекарственных средств с жидкостями, такими как жиры или масла, при необходимости вместе с восками или воскоподобными веществами, с водой или другими жидкостями, и диспергирующим агентом. Получена система, способная удерживать любую желаемую дозу лекарственного средства, высвобождая его в течение любого желательного промежутка времени постепенно …​ без малейшего ущерба для организма». Но что представляла собой эта «эмульсия», почему она удерживала лекарство, авторы патента не знали, да и предположить не могли. Ответ на этот вопрос, был получен только через 30 лет.

Но, тем не менее, эти фармацевтические препараты мы вправе считать прототипом системы доставки, так как их отличает выполнение некоторых важных требований, предъявляемых к идеальным системам доставки ЛС, а именно то, что система способна удерживать любую желаемую дозу лекарственного средства и высвобождать его в течение любого желательного промежутка времени постепенно без малейшего ущерба для организма.

В 1950-х гг. А.Д. Бэнгхем и Р.М.К. Доусон, исследуя взаимодействие фосфолипаз с дисперсиями лецитина, получили мутные жидкости и назвали образующие их тела «эмульсионными частицами» и «мицеллами». Авторы проводили исследования, измеряя только электрофоретическую активность полученных дисперсий, поскольку в то время они не имели других методов исследования.

Дисперсии образовывали большие и малые «сферолиты», независимо от того, были ли они получены путем ручного встряхивания или с помощью ультразвука, причем в последнем случае в образце было больше мелких сферолитов. Сферолиты имели слоистую структуру с липидным слоем толщиной 4,4 нм и полостью размером 2,6 нм, заполненной водой. Целью этой работы было установить, может ли метод негативного окрашивания визуализировать такой бимолекулярный липидный бислой, который мог бы наблюдаться in vivo, а также возможно ли модифицирование такой структуры.

Примеры полученных А.Д. Бэнгхемом и Р.В. Хорном электронных микрофотографий приведены на рис. 3.

Выше упоминалось, что в 1950-х гг. А.Д. Бэнгхем и Р.М.К. Доусон исследовали взаимодействие фосфолипаз с дисперсиями лецитина в буфере, но видеть то, чем образованы эти их дисперсии, они не могли. Вот, что пишет А.Д. Бэнгхем в своих воспоминаниях об этом исследовании: «В ноябре 1961 г., вскоре после приобретения Институтом физиологии животных в Бабрахаме первого электронного микроскопа, Р.В. Хорн и я попытались визуализировать дисперсию фосфолипидов в водном негативно окрашенном пятне. К концу 1962 г. мы убедились, что видим небольшие мешочки диаметром около 50 нм, первые «липидные сомы» – липосомы (от греч. липос– жир и сома– тельце или частица), как мы их назвали. Мы утверждали, что наша модель может быть сформирована из фосфолипидов с добавлением или без добавления холестерина, длинноцепочечных катионов или анионов и при этом не было необходимости в растворителях. После того как мы изучили осмотические свойства липосом, наша работа в 1965 г. была представлена на международном совещании по мембранам во Фраскати (Италия) и стала очень популярной».

В 1972 г. A.Д. Бэнгхем опубликовал некоторые из ранних работ по системам упорядоченных фаз с участием липидов и воды, в том числе и британский патент Дж. Джонсона (фармацевта в «I.G.Farbenindustrie») от 1932 г. на эмульсионные фармацевтические препараты для инъекций в мышечную систему или подкожно. В патенте было описано и приготовление эмульсии: «Эмульсию готовят из: 25 частей лецитина; 20 частей воды; 1,5 части холестерина; 0,03 частей строфантина». Конечно, представляется маловероятным, что фармацевты «I.G. Farbenindustrie» в 1930-е годы понимали, что их непрозрачная «эмульсия» состояла в действительности из замкнутых бимолекулярных мембран, каждую из которых разделяла водная среда, содержащая растворённый строфантин, так как они не могли изучить эти структуры из-за отсутствия соответствующих методов исследования.

Молекулы липидов способны образовывать в водной среде два различных типа структур – липосомы и мицеллы. Обычно термины «липосомы» и «липидные везикулы» используют как синонимы. Однако впервые липосомами были названы частицы, образующиеся при механическом диспергировании взвеси набухших фосфолипидов в воде.

Липосомы представляют собой замкнутые пузырьки, образованные одним или несколькими бислоями липидов, внутри которых заключено пространство, обычно заполненное водой с растворенными в ней веществами (рис. 4).

Липосомы классифицируют на несколько видов по их размеру и характеру ламеллярности (рис. 5).

Различают малые моноламеллярные липосомы (диаметром 10 – 100 нм), большие моноламеллярные липосомы (диаметром 100 – 1000 нм) и гигантские моноламеллярные липосомы (диаметром более 1мкм). Помимо этого выделяют мультиламеллярные липосомы, образованные множеством концентрически расположенных сферических бислоев, и олиговезикулярные липосомы, в которых малые липосомы располагаются внутри большой липосомы.

В 1976 г. английский исследователь Грегори Грегориадис предложил помещать внутрь липосом лекарственные вещества, чтобы способствовать их проникновению в организм. Это может считаться началом использования наноконтейнеров. Г. Грегориадис был автором статей и патентов по созданию «липосомных препаратов» (термин автора).

Исследование липосом Г. Грегориадис начал в 1970-х гг. Он изучил распределение липосом в организме, воздействие противораковых и противомикробных липосомных препаратов in vivo, впервые продемонстрировал нацеливание липосом на опухолевые клетки in vitro (с помощью привитых антител). Его научные обзоры, опубликованные в 1976 г., привлекли внимание к системам доставки на основе липосом. Г. Григориадис основал биотехнологическую компанию «Xenetic Biosciences Inc.». Он обладатель патента на методику получения липосомных препаратов. Его фирма выпускает такие препараты, как «PolyXen», представляющий собой систему доставки белков, «ImuXen», который можно использовать как систему доставки липосомных вакцин, и «VesicALL» – систему доставки цитостатических препаратов.

Для получения липосом используют различные способы. Дегидратация, при которой липид растворяют в органическом растворителе, причем наиболее универсальным растворителем является хлороформ. После этого при высушивании раствора образуется пленка липида. Затем к этой пленке добавляют воду и получают многослойные липосомы. Если обработать липидную суспензию ультразвуком, то можно получить однослойные липосомы. Также липосомы получают методом испарения в обращённой фазе, путем растворения в детергенте, методом экструзии и др.

От выбранного способа получения зависят характеристики и размер липосом. Чаще всего используют мелкие липосомы, так как они дольше выводятся ретикулоэндотелиальной системой (РЭС). При увеличении размера липосом возрастает их захват РЭС.

Первоначально идея направленного транспорта была реализована путём создания препаратов для регионарного (местного) введения (табл. 1). Коллоидные системы на основе липидов были разработаны и испытаны как для местного нанесения на кожу или слизистую, так и для парентерального введения.

Анализ приведенных в таблице результатов свидетельствует, что использование липосом с инкапсулированными в них лекарственными средства и приводило к увеличению их концентрации в патологическом очаге, увеличению времени действия препарата и способствовало высвобождению ЛС в определенном месте. В случае местного введения липосомальных препаратов не требуется специфического транспорта липосом; они действуют, медленно высвобождая ЛС в окружающую среду.

В 1987 г. на рынок были выведены новые косметические продукты на основе липосом: в частности, гель «Каптюр» фирмы «Кристиан Диор» и крем для кожи под названием «Ниосомы» фирмы «Л’Ореаль».

Рассмотренные лекарственные препараты с некоторой услвностью можно отнести к «drug delivery» первого поколения, которые более подробно будут рассмотрены в главе 3 (раздел 3.5).

По одной из классификаций адресную доставку можно подразделить на пассивный направленный транспорт и активный направленный транспорт (рис. 6).

Пассивный направленный транспорт, например, основан на эффекте повышенной проницаемости и накопления (ППН) и зависит от микроокружения опухолей. Пассивный направленный транспорт основан на способности ЛС самопроизвольно накапливаться в нужных органах или тканях. Это вполне возможно, так как в пораженных очагах часто наблюдаются ацидоз и гипертермия. Активный направленный транспорт осуществляется за счет связывания с ткане-/клеточно-специфическими маркерами, ведущего к локализованному накоплению наноносителей.

Впервые эксперимент с использованием вектора был выполнен в 1958 г. Для нацеливания ЛС (метотрексата) оно был конъюгировано (связано) с антителом. Однако термина «вектор» в то время еще не существовало, он появился только в 1970-х гг. В 1975 г. иммунологи С. Мильштейн и Г. Кёллер разработали метод создания гибридных соматических клеток для получения антител. Это открыло возможность широкого применения антител.

Вектор – это соединение, обеспечивающее адресность доставки лекарственного средства в фармакологическую мишень. После присоединения вектора к конъюгату «наноноситель – ЛС» полученная структура должна быть стабильной и нетоксичной, должны сохраняться способность распознавания мишени и эффективность загрузки наноносителя ЛС.

В качестве векторов могут выступать специфические белки (трансферин, пептидный гормон гаподолиберин), радиомеченные моноклональные антитела, вирусы, фолиевая кислота. Вектор (в генетике) – генетический элемент, обычно бактериофаг или плазмида, используемый для переноса фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в клетку реципиента с целью клонирования гена.

Первыми векторами, использованными для направленной доставки, были антитела, связанные с липосомами. Метод их присоединения был относительно прост и позволял прививать достаточное количество антител к поверхности липосом без нарушения целостности липосом или изменения сродства и специфичности антител. Конъюгация ЛС с белковым векторм может быть осуществлена с помощью химической сшивки (образование дисульфидной или тиоэфирной связи), полиэтиленгликолевого или полипептидного линкера (рис. 7). При этом способ конъюгации должен обеспечивать высокий выход реакции и возможность внутриклеточного расщепления конъюгата.

В дальнейшем специфические антитела были использованы и в случае нелипосомных носителей. Так, наночастицы, изготовленные из желатина и сывороточного альбумина, были модифицированы герцептином – антителами, рецептор-специфичными к терапевтической мишени, а именно к белку HER-2. Также различные антитела связывали с поверхностью наночастиц дендримеров – синтетических сверхразветвлённых полимеров, имеющих структуру каскадно-разветвлённой цепи. Такие модифицированные частицы дендримера приобретали способность специфически связываться с опухолевыми клетками, содержащими соответствующие рецепторы.

Векторными свойстами обладает также трансферин. Из-за того, что трансферрин сверхэкспрессируется на поверхности многих опухолевых клеток, он является популярным вектором для разных носителей ЛС в опухоли. Дополнительное связывание трансферрина с ПЭГилированными липосомами (см. раздел 3.4.) обеспечивает направленность ЛС в опухоли. Так, конъюгат трансферрина с иммунолипосомой был использован для направленной доставки лекарства в головной мозг.

Широко используется в качестве вектора фолиевая кислота. Так, конъюгат доксорубицина с липосомами доставлялся в различные опухолевые клетки благодаря фолиевой кислоте. Фолиевую кислоту и затем препарат паклитаксел присоединяли к наночастицам на основе ПЭГ-поликапролактона. Этот конъюгат показал высокую цитотоксичность. Фолиевой кислотой были модифицированы магнитные наночаcтицы. Они лучше усваивались раковыми клетками, чем обычные наночастицы.

Отдельного внимания заслуживает высвобождение молекул ЛС и его проникновение в клетку при попадании системы доставки в патологический очаг. Этот процесс в значительной степени зависит от характера взамодействия носителя (например липосом) с мембраной клетки. Характер взаимодействия липосом с мембраной клетки может быть разным (рис. 8):

Также мембрана липосом может «откупориваться», т.е. в ней образуются «дырки», через которые ЛС будет выделяться в окружающую среду (рис. 9). После освобождения от ЛС мембрана липосом восстанавливается

При использовании конъюгатов «наноноситель – лекарственное средство», в которых ЛС ковалентно связано с носителем, высвобождение ЛС происходит путём разрыва химических связей, удерживающих ЛС на носителе. Стоит также отметить, что возможно действие всего конъюгата и без разрыва химических связей

В 1970-х гг. основными факторами, стимулировавшими развитие систем доставки лекарственных средств на основе липосом, стало использование трёх ключевых методов.

Первый метод – это покрытие липосом полиэтиленгликолем. Такое покрытие сделало липосомы более защищенными от ретикулоэндотелиальной системы за счет снижения узнаваемости их макрофагамии, что позволило замедлить процесс выведения липосом из организма. Полиэтиленгликоль создает также повышенное осмотическое давление вокруг липосомы, препятствующее приближению других клеток. В результате ПЭГилированные липосомы дольше циркулируют в крови, накапливаются в опухолевых тканях в большем количестве, чем обычные липосомы.

Второй метод – применение антител в качестве векторов, что обеспечило возможность адресной доставки ЛВ за счёт взаимодействия закреплённого на частице антитела с рецептором на клеточной мембране. Первые попытки создания таких липосом были неудачными, так как липосомы быстро выводились из крови. После увеличения времени циркуляции в крови (благодаря предыдущему открытию – покрытию полиэтиленгликолем) стало возможно создание иммунолипосом – липосом, к поверхности которых прикреплены полиэтиленгликоль и антитела. Доставка в опухолевые клетки происходит через опосредованный моноклональными антителами (МКА) эндоцитоз.

Третий метод появился благодаря открытию эффекта ППН. Этот эффект связан с тем, что эндотелиальные клетки опухолевых сосудов пролиферируют в 30-40 раз быстрее, чем эндотелиальные клетки сосудов нормальных тканей, поэтому для капилляров опухолей характерны бóльшие поры. Эти поры стали использовать для пассивной доставки (см. рис. 6, а) липосомального препарата в опухоль.

Иммунолипосомы можно разделить по характеру прикрепления антител и полиэтиленгликоля к поверхности липосом (рис. 10).

Сначала иммунолипосомы получали прикреплением антител непосредственно к поверхности липосом посредством короткого якоря (тип А), но они не были эффективны из-за быстрого выведения из организма. Иммунолипосомы типа Б – это ПЭГилированные липосомы, в которых антитела также ковалентно связаны с ними посредством короткого якоря; они были более эффективны за счет увеличения времени циркулирования их в крови. Но недостатком являлось снижение связывания липосом с клетками из- за наличия полиэтиленгликоля на поверхности липосом. Иммунолипосомы типа В (Pendant-type PEG-immunoliposomes) – это стерически стабилизированные ПЭГлипосомы, в которых антитела прикреплены к дистальному терминальному концу ПЭГ. Они наиболее эффективны и распространены.

На основе липосом созданы новые формы лекарственных препаратов. Из 56 представленных в табл. 2 препаратов 25 препаратов успешно прошли клинические испытания и достигли рынка. Широкое применение коммерческих препаратов на основе липосом сдерживается пока их высокой стоимостью.

Липосомы обладают такими преимуществами как биосовместимость, биодеградируемость, нетоксичность, защита содержащегося внутри них вещества от контакта с биологической средой. Кроме того, они могут обеспечивать доставку содержимого липосом в клетку при слиянии их мембраны с клеточной. Также липосомы постепенно высвобождают лекарственное вещество, что увеличивает его время действия.

До 1950-х гг. лекарственные средства изготавливали преимущественно в форме таблеток или капсул. При этом высвобождение ЛС не контролировалось, а определялось скоростью дезинтеграции лекарственной формы (ЛФ). Эта скорость зависела не только от физико-химических свойств ЛФ, природы вспомогательных веществ (таких как связующие, разрыхляющих, улучшающих сыпучесть гранул и др.) в таблетках, но и от индивидуальных особенностей пациента (температуры, величины рН биологических сред и др.). Системы же доставки должны контролировать высвобождение ЛС.

По одной из предложенных классификаций системы доставки ЛС можно разделить на три поколения. Критерием этой классификации служит способ доставки ЛВ и механизм его высвобождения.

Первое поколение систем доставки (1950-1980) началось с введения препарата с замедленным высвобождением. В 1952 г. компания «Smith, Kline & French» (SKF) представила препарат Декседрин (декстроамфетамина сульфат) с замедленным высвобождением Лс. Лекарственное средство высвобождалось в течение 12 часов, что достигалось за счет использования биоразлагаемого полимерного покрытия.

Первое поколение систем доставки ЛС было сфокусировано на разработке препаратов для перорального и трансдермального типов введения с пролонгированным высвобождением ЛС из них в желудочно-кишечном тракте или в кожном покрове и прилегающих мышечных тканях. Преобладали такие экспериментальные способы контролируемого высвобождения ЛС, как растворение, диффузия, осмос.

В 1980-2010 гг. началась разработка второго поколения систем доставки ЛС. Основные усилия учёных были направлены на создание систем, в которых скорость выделения ЛС была бы постоянна во времени и не зависела от концентрации (высвобождение нулевого кинетического порядка). Впоследствии от этой идеи отказались, так как высвобождение нулевого порядка приводило к поддержанию постоянной концентрации в токе крови, а не, что особенно важно, в патологическом очаге.

В этот же период начали разрабатывать саморегулирующиеся системы доставки, которые основаны на использовании полимеров, чувствительных к изменению температуры и рН среды.

Основные проблемы систем доставки второго поколения были связаны с невозможностью преодолеть биологические барьеры. Стоит также отметить, что временной этап второго поколения систем доставки совпадает со временем бурного развития химии полимеров.

Главное внимание ученых при создании систем доставки третьего поколения сосредоточено на использовании нанотехнологий, в частности на целенаправленной доставке ЛС к опухолям и доставке генов с использованием различных наночастиц. Так как у большинства лекарственных веществ невысокая проницаемость через гематоэнцефалический барьер, то особый интерес вызывают наноносители, способные проникать в центральную нервную систему.

Несмотря на достоинства липосом транспорт с использованием их как носителей ЛС не является оптимальным. Так, липосомам сложно проникать в ткани с серьезными нарушениями микроциркуляции, они могут блокировать легочные капилляры (что приводит к микроваскулярной эмболии), могут вызывать повышение уровня глюкозы в крови, приводить к нарушению свертываемости крови и обмена холестерина. Поэтому основное внимание исследователей перешло на поиск других наночастиц в качестве платформ в системах доставки.

Современный этап развития медицины характеризуется направленностью на создание принципиально новых препаратов для генной терапии, которая связана с лечением наследственных и приобретенных заболеваний путем введения в соматические клетки пациента генетических элементов для восстановления или подавления функций определенных генов и придания клеткам заданных свойств. Именно в этой области перспективно использование систем доставки.

Традиционный подход предполагает доставку нужного гена с помощью вектора. В доставке генов в мишень выделяют следующие этапы: получение гена, присоединение к нему вектора, доставку полученного конъюгата до клетки-мишени, получение трансформированных клеток и их отбор.

Для того чтобы осуществить успешную доставку гена в клетку-мишень вектор должен обладать способностью к репликации, содержать селективный маркер, который позволит отличать клетки с введенным геном, содержать сайты рестрикции. Наиболее распространенными векторами являются бактериальные плазмиды (рис. 28) и вирусы.

Плазмидный вектор содержит точку начала репликации (ORI) и ген для селекции рекомбинантных плазмид ampr, который контролирует синтез фермента β-лактамазы, инактивирующего действие ампициллина. Участок для вставки экзогенной ДНК выделен скобкой. Вставка фрагмента ДНК в этот участок не нарушает репликацию вектора и экспрессию гена ampr.

Однако вирусные векторы обладают недостатками: они способны активировать онкогены и блокировать опухолевые супрессорные гены в инфицированных клетках, вызывать сильный иммунный ответ Исследования в области генной терапии и, в частности, в создании эффективных систем доставки генов в настоящее время интенсивно развиваются.

Таким образом, рассмотренные в главе 4 данные позволяют заключить, что в качестве платформы для создания систем доставки лекарств можно использовать материалы в виде наноконтейнеров, наносфер или сплошных наночастиц. Сведения о таких материалах и размерах наночастиц представлены в табл. 6.

Цель работы: определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) в водных растворах ПАВ.

Оборудование, посуда: для проведения работы необходимы:

Реактивы: исследуемое ПАВ (натрия каприлат, натрия олеат), краситель (пинацианолхлорид, или пинацианолиодид, 0,01%-ный раствор), вода очищенная

От преподавателя студент получает указание, с каким ПАВ и с каким красителем проводить работу.

Введение

Термодинамически устойчивые дисперсные системы (ДС) образуются самопроизвольно при условии ∆G_обр.<0. Типичными примерами таких систем являются мицеллярные растворы ПАВ, микроэмульсии и критические эмульсии. Мицеллярные растворы ПАВ содержат наряду с индивидуальными молекулами (или ионами) агрегаты коллоидного размера, состоящие из достаточно большого количества молекул (ионов), которые называются мицеллами.

В зависимости от природы растворителя и ПАВ мицеллы могут быть прямыми и обратными. В полярных растворителях (обычно в воде) самоорганизация молекул ПАВ приводит к образованию прямых мицелл, а в неполярных растворителях – обратных (обращенных) мицелл. Прямая мицелла состоит из гидрофобного ядра, образованного углеводородными цепями молекул (ионов) ПАВ и экранированного от растворителя полярными группами. В обращенной мицелле, наоборот, полярные группы формируют ядро, а углеводородные цепи молекул ПАВ находятся в неполярной фазе.

С увеличением концентрации ПАВ в водном растворе при критической концентрации мицеллообразования (ККМ) возникают прямые мицеллы, содержащие от нескольких десятков до нескольких сотен молекул (или ионов). Способностью к мицеллообразованию, в подавляющем большинстве случаев, обладают ПАВ, содержащие от 8 до 18 атомов углерода в углеводородной цепи ®. Когда концентрация ПАВ в растворе (с) меньше ККМ, вещество находится в мономерной форме. При с > ККМ образуются мицеллы, дальнейшее увеличение концентрации приводит к росту концентрации агрегированного вещества (c_mic), тогда как концентрация неассоциированной формы (с₁) остается практически постоянной и равной ККМ.

Одним из основных свойств мицелл ПАВ является их способность самопроизвольно аккумулировать (солюбилизировать) малорастворимые в воде органические вещества, существенно повышая их растворимость в водной среде. Это явление называется солюбилизацией, растворяемое липофильное вещество – солюбилизатом, а ПАВ, формирующее мицеллы, – солюбилизатором. В зависимости от природы ПАВ и солюбилизата последний может располагаться в различных частях мицеллы (в углеводородном ядре, во внешнем гидрофильном слое), либо при дифильном строении встраиваться в мицеллу, наряду с основным ПАВ. Природа солюбилизации в водных растворах ПАВ, в основном, имеет энтропийный характер, обусловленный гидрофобным эффектом. В ряде случаев, когда солюбилизат локализован в полярной части мицеллы вследствие специфических взаимодействий, вклад энтальпии также может быть существенным. В присутствии солюбилизата величина ККМ ПАВ может уменьшаться.

Определение ККМ основано на фиксировании резкого изменения какого-либо физико-химического свойства раствора ПАВ при изменении его концентрации. Выбор экспериментального метода зависит от природы ПАВ. Универсальными являются методы тензиометрии (измерения поверхностного натяжения), осмометрии, кондуктометрии, светорассеяния, солюбилизации красителя и т.д.

Кондуктометрический метод основан на измерении электропроводности водных растворов ПАВ в широкой области концентраций. Однако следует отметить, что он применим только для ионогенных ПАВ. Типичная зависимость удельной электропроводности (æ) от концентрации (с) раствора ПАВ приведена на рис. 1Л.

При ККМ наблюдается излом, т.е. скачкообразное уменьшение dæ/dc. Удельная электропроводность раствора зависит от числа кинетических единиц и их подвижности. При с > ККМ уменьшение dæ/d обусловлено меньшей подвижностью мицелл (по сравнению с ионами) и высокой степенью связывания противоионов мицеллами.

Метод определения ККМ по солюбилизации красителя основан на анализе спектров поглощения красителя в растворах ПАВ разной концентрации. Известно, что спектр поглощения некоторых красителей зависит от микроокружения молекул красителя, т.е. от полярности растворителя. Важно правильно подобрать пару ПАВ – краситель: краситель должен концентрироваться, т.е. солюбилизироваться в углеводородном ядре, и не должен уменьшать ККМ данного ПАВ в водной среде. В этом случае при с < ККМ краситель находится в воде, а при с > ККМ наблюдается солюбилизация его в мицеллах ПАВ. Если краситель солюбилизируется в углеводородных ядрах мицелл (неполярное микроокружение), наблюдается изменение максимума поглощения и окраски раствора.

Метод тензиометрии основан на измерении краевых углов при смачивании водными растворами мицеллообразующих ПАВ твердых поверхностей (например, пластин гидрофобных полимеров полиэтилена или политетрафторэтилена).

Порядок выполнения работы

Во избежание образования пены, воду в исходный раствор следует приливать по стенке сосуда и полученный раствор не взбалтывать!

Цель работы: определение оптической плотности растворов латекса и вычисление размера глобул по уравнению Релея

Оборудование, посуда фотоэлектроколориметр-нефелометр, колбы мерные емкостью 100 мл, ?штук, пипетки на 10 и 1мл

Реактивы:

Введение

Размер частиц можно определять двумя методами: нефелометрическим и турбидиметрическим. По первому методу определяют непосредственно интенсивность света, рассеянного под некоторым углом к падающему лучу света. По второму методу измеряют ослабление интенсивности света при прохождении его через дисперсную систему. Последний метод используется в данной работе. Этот метод основан на том, что при прохождении света через коллоидный раствор, содержащий малые прозрачные частицы, поглощение практически отсутствует и ослабление интенсивности света равно полной интенсивности света, рассеянного коллоидным раствором во всех направлениях (полное светорассеяние). Для систем, содержащих частицы с размерами, значительно меньше длины световой волны, величина полного светорассеяния подчиняется уравнению Рэлея. В этом случае, измерив с помощью фотометра или колориметра ослабление интенсивности падающего света по уравнению Рэлея можно рассчитать средний размер частиц золя.

Способность системы рассеивать свет и оптическая плотность раствора D связаны следующим образом:

D = lg (I₀/I_пр), (1)

где I₀ и I_пр ‒ интенсивности падающего и прошедшего света.

Ослабление интенсивности света в результате рассеяния его слоем коллоидного раствора толщиной l при сечении 1 см² определяется следующим образом:

ln (I₀/I_пр) = 2.3lg (I₀/I_пр) = τ l, (2)

где τ – коэффициент, характеризующий способность системы рассеивать свет, он называется мутностью.

Исходя из уравнений (1) и (2) можно установить связь между мутностью и оптической плотностью:

τ = 2,3D / l (3)

Мутность системы можно выразить через интенсивность рассеянного света

I_р. Очевидно, что I_пр = I₀ – I_р, тогда из уравнения (3) при l = 1 см следует:

τ = ln (I₀/I_пр) = ln [I₀/(I₀ –I_р)] (4)

Учитывая, что I_р<< I₀, и пользуясь разложением в ряд, можно получить:

ln [I₀/(I₀ –I_р)] ≈ ln(1+ I_р /I₀ )] ≈ I_р /I₀ (4)

Для суспензии со сферическими частицами уравнение Релея можно записать в виде

I_р /I₀ = 24 π³/λ⁴ ∙ ² ∙ c_об ∙ v, (5)

где I_р – полная интенсивность света, рассеянного 1 см³ системы в секунду; λ – длина волны света, см; n₁ – показатель преломления дисперсной фазы; n₂ – показатель преломления дисперсионной среды; c_об – объемная доля дисперсной фазы; v – объем частицы, см³.

Пользуясь уравнениями (4) и (5), можно рассчитать объем частицы и ее диаметр.

Порядок проведения работы

Цель работы: получить липосомы, нагруженные инсулином, двумя методами, оценить влияние способа получения на размеры липосом.

Оборудование, посуда:

Реактивы:

Введение

Липосомы – это микроскопические сферические частицы, оболочка (мембрана) которых состоит из молекул липидов, чаще всего – фосфолипидов. Как известно, липиды – гидрофобные соединения, т.е. отталкивающие от себя молекулы воды; они являются одним из основных компонентов биологических клеточных мембран, создающих в организме энергетический резерв, а также способных образовывать защитные покровы.

Водорастворимые (гидрофильные) лекарственные средства могут быть заключены во внутреннее водное пространство липосом, а жирорастворимые (гидрофобные) включаются в бислойную липидную мембрану. В последнее время липосомы находят все большее признание в мире, как перспективные носители лекарственных средств, поскольку многочисленные клинические испытания показали, что последние в составе липосом более эффективны и менее токсичны, чем вводимые в свободном виде.

Достоинства липосом как носителей лекарственных средств очевидны: полученные из природных фосфолипидов липосомы, в отличие от полимерных систем доставки полностью биодеградируемы и биосовместимы, пригодны для включения в них многих фармакологических агентов, в том числе ферментов, гормонов, витаминов, антибиотиков, иммуномодуляторов, цитостатиков. Включенные в липосомы лекарственные средства становятся более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий, в частности, от разрушения в желудочно- кишечном тракте, и в свою очередь в меньшей степени оказывают общетоксическое действие на организм. Уникальной особенностью липосом является возможность доставки лекарственных средств внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют путем слияния или эндоцитоза. Модифицируя мембрану липосом молекулами, обеспечивающими «узнавание» клетки или органа-мишени, можно осуществлять направленную транспортировку лекарственных средств.

Порядок выполнения работы

Приготовление липосом методом обращения фаз

(Данный метод позволяет иммобилизовать в липосомах до 78% действующего вещества).

Приготовление липосом инжекционным методом

Приготовление липосом методом ручного встряхивания

Приготовление липосом методом ультразвуковой обработки

Оценку полученных липосом проводят органолептически, измеряют рН среды, с помощью микроскопа определяют наличие конгломератов липосом.

Органолептическая оценка качества липосом заключается в определении их цвета, проверке на отсутствие запаха эфира и хлороформа, что свидетельствует о качестве отгонки растворителя на определенной стадии производства липосом.

Для визуальной оценки с вежеприготовленное «липосомальное молочко» отбирают в пробирку в количестве 8-10 мл, оставляют при комнатной температуре на 50 мин, по истечении времени наблюдают расслоение эмульсии, что говорит о наличии липосом. Далее проверяют наличие конгломератов во взвеси липосом; их отсутствие свидетельствует о хорошем качестве изготовленных липосом.

Анализ размера липосом проводят следующим образом.

Средний диаметр липосом в препарате рассчитать по формуле:

D=^(1/3)K-1

Где:

Цель работы: синтез водного золя наночастиц серебра, стабилизированных цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ)

Оборудование:

Реактивы: серебра нитрат AgNO₃, цетилтриметиламмония бромид [(CH₃)₃N⁺C₁₆H₃₃]Br^‒ (ЦТМАБ), натрия боргидрид NaBH₄, вода очищенная.

Введение

Взаимодействие внешнего электромагнитного поля с проводящими объектами, такими как наночастицы серебра, имеет свою особенность, сказывающуюся на их оптических свойствах.

При попадании проводящего объекта размером, существенно меньшим длины волны внешнего электромагнитного излучения, в силу высокой подвижности электронов в нем происходит поляризация и связанное с ней перераспределение поверхностного заряда. Это явление в оптике получило название поверхностный плазмонный резонанс. Резонансная частота, при которой это происходит, соответствует максимуму поглощения в оптических спектрах пропускания золей наночастиц металлов (рис. 2Л).

Для благородных металлов максимальное поглощение поверхностного плазмонного резонанса находится в области УФ – видимого излучения. Так, пик плазмонного резонанса для платины лежит около 270, для серебра – около 400 (рис. 3Л), для золота – около 530 нм.

Наличие пика поверхностного плазмонного резонанса является качественным критерием наличия в системе металлических наночастиц.

Спектр поглощения получают, регистрируя интенсивность излучения, прошедшего сквозь образец при изменении длины волны монохроматического излучения, выделенного с помощью монохроматора (рис. 4Л).

При использовании однолучевого прибора необходимо проводить две съемки спектров поглощения ‒ сначала образца сравнения (построение и запоминание нулевой линии), затем – анализируемого образца.

Из-за избыточной энергии, связанной с высокой долей поверхностных атомов, металлические наночастицы термодинамически неустойчивы и стремятся к коагуляции. Это обстоятельство объясняет то, что, как правило, с использованием механического измельчения не удается получить наноразмерное состояние для металлов. Поэтому основным методом их получения является химический синтез.

Обычно в реакцию вводят три компонента: соединение металла, восстановитель и стабилизатор. Роль последнего состоит во взаимодействии с получаемой in situ наночастицей, понижении ее поверхностной энергии и, достигаемой таким образом, стабилизации системы. Одним из видов стабилизаторов для серебра являются поверхностно-активные соединения, например, ЦТМАБ.

Порядок выполнения работы