Медицинская микробиология

Предмет обсуждения этой книги - организмы, не различимые невооружённым глазом (т.е. менее 0,1 мм)- микроорганизмы, в просторечии известные как микробы. К ним относят организмы растительной (бактерии, грибы, водоросли) и животной (простейшие) природы, а также вирусы и прионы. Все они составляют микромир - грандиозную по численности и видовому составу совокупность невидимых существ, обитающих на нашей планете. Повсеместная распространённость и суммарная мощность метаболического потенциала микроорганизмов определяет их важнейшую роль в круговороте веществ и поддержании динамического равновесия в биосфере Земли. Микроорганизмы заселили Землю задолго до появления высших растений и животных (около 3-4 млрд лет назад) и в настоящее время представляют самую многочисленную и разнообразную группу существ. От их деятельности во многом зависит жизнь макромира (растений, членистоногих, птиц, животных). В значительной мере микроорганизмы участвуют в круговороте газов, химических веществ и энергии. Трудно переоценить влияние микроорганизмов на структуру и плодородие почв. Большинство микробов отличает удивительная экологическая пластичность, они - единственные формы жизни, способные заселять любые, сколько-нибудь пригодные для обитания субстраты. Именно благодаря микроорганизмам поверхность Земли не выглядит свалкой останков павших животных и погибших растений. Кроме того, они колонизируют макроорганизмы и, выступая как эндоэкологические агенты, способствуют некоторым процессам их жизнедеятельности.

Довольно значительная группа микробов (около 5000 видов) обитает в организмах других существ, включая человека. Самый древний след их «деятельности» - поражение позвонков динозавров, живших в мезозойскую эру. Человек, если считать таковым прямоходящего Pithecanthropus erectus, столкнулся с патогенными микроорганизмами 1-2 млн лет назад. Более благоприятные условия для эволюции патогенных для человека микроорганизмов развились в мустьерский период (40-100 тыс. лет назад), когда неандертальцы стали обитать в общих жилищах и вести совместный быт.

Как, пожалуй, никакие другие существа, микроорганизмы испытывают постоянное давление окружающей среды, вследствие чего постоянно эволюционируют. В свою очередь, изменчивость патогенных микроорганизмов - основная движущая сила для развития и совершенствования систем защиты животных и человека. Более того, микроорганизмы до недавнего времени служили важнейшим фактором естественного отбора в человеческой популяции. На протяжении многих веков человечество использует микроорганизмы в хлебопечении, виноделии, при выделке кож, при изготовлении сыров и кисломолочных продуктов. На фоне этого не представляется парадоксальным применение более 2400 лет назад древнеегипетскими жрецами содержащих тетрациклин экстрактов белой зерновой плесени. Разумеется, в настоящее время число известных видов микроорганизмов значительно увеличилось, соответственно расширился и спектр их хозяйственного и технологического применения.

Микробы изучает специальная наука - микробиология [от греч. mikros - мелкий, bios - жизнь, logos - учение]. В сущности, микробиология - отрасль биологии, а именно биологии организмов, не превышающих по размерам 0,1 мм. Подобно многим разделам биологии, например энтомологии, микробиология не осталась только отраслью биологии, но сложилась как отдельная область знаний, что связано, в первую очередь, со значением микроорганизмов в обмене веществ в природе. Подразделение «менее 0,1 мм - микробиология, более - биология» условно, так как практически все основные законы физиологии микробов сходны с таковыми у прочих живых организмов. В свою очередь, сами микробы настолько разнообразны, что разделение по размерам часто лишено всякого смысла, так как само понятие «микроорганизм» не имеет таксономического значения, как, например, термины «позвоночные» или «покрытосеменные» (каждый из этих терминов определяет некую биологическую группу, члены которой обладают множеством общих структурных и функциональных особенностей). В противоположность этому, микроорганизмы входят в различные таксономические группы, некоторые из которых (например, водоросли) включают гораздо более крупные организмы.

За время своего развития микробиология не только много почерпнула из смежных наук (например, иммунологии, биохимии, биофизики и генетики), но и сама дала мощный импульс для их дальнейшего развития. Микробиология изучает морфологию, физиологию, генетику, систематику, экологию и взаимоотношения микроорганизмов с другими существами. Поскольку микроорганизмы очень многообразны, то более детальным их изучением занимаются специальные её направления: вирусология, бактериология, микология, протозоология и др. Обилие фактического материала, накопленного за относительно короткий период научного развития микробиологии (со второй половины XIX в.), способствовало разделению микробиологии на ряд специализированных направлений: медицинское, ветеринарное, техническое, космическое и т.д.

Медицинская микробиология изучает микроорганизмы, патогенные и условно-патогенные для человека, их экологию и распространённость, методы их выделения и идентификации, а также вопросы эпидемиологии, специфической терапии и профилактики вызываемых ими заболеваний.

Актуальной проблемой медицинской микробиологии до настоящего времени остаётся исследование всего комплекса взаимодействий внутри экосистемы «макроорганизм-микроорганизм», будь это микроб-комменсал или микроб-патоген.

В истории медицины нередко случалось, что какая-либо из дисциплин становилась ведущей для всего комплекса медицинских знаний. Конец XIX и начало XX в. ознаменовались такого рода гегемонией медицинской микробиологии. Одновременно с её бурным развитием формировалась иммунология (сначала как раздел, изучающий механизмы специфической защиты организма от патогенных микроорганизмов) и, несколько позднее, санитарная микробиология. Последняя изучает санитарно-микробиологическое состояние окружающей среды, её влияние на здоровье человека и разрабатывает мероприятия, предупреждающие неблагоприятные воздействия болезнетворных микробов. На современном этапе к особым разделам медицинской микробиологии относят клиническую микробиологию (её объекты - условно-патогенные микроорганизмы, вызывающие поражения человека) и фармацевтическую микробиологию, изучающую микробы, вызывающие порчу лекарственного сырья, обсеменяющие лекарственные средства (ЛС), а также технологию получения различных лекарственных и диагностических препаратов из микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

Медицинская микробиология развилась в результате изучения инфекционных болезней, и история становления её как области медицины будет непонятной без рассмотрения эволюции воззрений на возникновение инфекционных болезней.

ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ ПЕРИОД ЭМПИРИЧЕСКОГО ПОЗНАНИЯ

Древний мир

С патогенными микроорганизмами человечество столкнулось на заре своего развития и, как нередко случалось в его истории, впало в наивный анимизм, объясняя появление заразных (или «прилипчивых») болезней карами богов. Вероятно, самым первым правильным понятием о способах заражения явилось представление древних евреев о контактной передаче проказы («…​если человек обнаружит пятна, пустулы или язвы на теле, то он должен обратиться к первосвященнику…​ Если первосвященник заметит, что на седьмой день они не исчезнут, но и не будут увеличиваться, то этого человека следует изолировать ещё на семь дней…​ » [Левит, 13:1-3,5]).

Многолетние наблюдения за заразными болезнями позволили сделать важные открытия, и уже древние источники указывают на роль соблюдения гигиенических правил в их профилактике. Например, древнеиндийская книга Аюрведа прямо указывает, что чуму разносят крысы, а малярию - комары. У древних евреев третьей и четвёртой «казнями египетскими» (Исход VIII, Ветхий Завет) являлись «тучи вшей, блох и мух», разносящие различные болезни. Собственно, одно из имён дьявола - Вельзевул (Баал-Зебуб) на семитском языке означает «повелитель мух». Настоящий образец организованной борьбы с инфекционными болезнями являет медицинский кодекс, включённый в свод законов вавилонского царя Хаммурапи. Так, ассирийцы знали, как предохраняться от многих воздушно-капельных, кишечных и природно-очаговых болезней. Древние индусы и китайцы, а затем греки и римляне в борьбе с инфекциями широко практиковали гигиенические мероприятия, изолировали заразных больных и даже проводили профилактику натуральной оспы путём вариоляции. Более того, в античных городах существовали специальные службы, контролирующие соблюдение гигиенических норм при строительстве зданий, а расход воды на одного человека в древнем Риме был в 10 раз больше норм, принятых в настоящее время в Европе.

Важным этапом в совершенствовании знаний о возникновении инфекций стал расцвет античной медицины с её натурфилософской идеологией, основанной на познании окружающей природы и отбросившей всё сверхъестественное. Яркими выразителями новых веяний стали Гиппократ, полагавший, что во время эпидемий воздух содержит особые болезнетворные испарения - «миазмы», и Тит Лукреций Кар, считавший, что у каждой инфекции есть особые «семена». Спартанский военачальник и философ Фукидйд предполагал наличие некоего «животного контагия» - contagium animatum [от лат. contagio - дотрагиваюсь], передающего инфекционные болезни. Им же было сформулировано положение о невосприимчивости к повторному заболеванию: «…​ кто сам переболел и выздоровел, …​ никогда не заболевал второй раз, а если и заболевал, то никогда смертельно». Другим сторонником теории о «живом возбудителе» был древнеримский поэт и философ Марк Теренций Варрон, веривший в существование приносящих эпидемии «мельчайших животных» (animalcula quaedam minuta). В эту эпоху были сделаны существенные и, что особенно важно, достаточно точные наблюдения за клинической картиной и эпидемиологией многих инфекционных болезней. Классическим примером служит описание моровой язвы Антонины, занесённой в Рим легионерами из Сирии в 166 г. Точность наблюдений автора (Клавдий Галён, к слову, ярый противник теории «животного контагия») позволила позднее установить, что причиной эпидемии явились сразу три болезни - дизентерия, брюшной тиф и оспа.

Средневековье

Волна мистицизма, затопившая Европу в начале Средневековья, задушила почти всё, что было ценного в медицинских концепциях греков и римлян. Доктрина contagium animatum была забыта, а вместо неё горячо воспринята церковная концепция «божьей кары». Да и вообще всё естественное и закономерное заменило «чудесное» - химия превратилась в алхимию, астрономия в астрологию. Лучом света во тьме всеобщего мракобесия оставалась арабская медицина, распространившаяся сначала в Испании, а затем и в других странах. Её островками в то время были медицинские школы Александрии, Кордовы, Самарканда, Исфагана, Дамаска. Огромный вклад в понимание многих вопросов эпидемиологии, профилактики и лечения инфекционных болезней внесли Абу-Бекр Мухаммед бен-Закария (Разёс), Абу-Али аль-Хусейн Алта-ибн Сина (Авиценна), Исаак бен Солей-ман, Абу Амрам Муса ибн Маймун (Маймонйд).

Ренессанс

Первое серьёзное потрясение схоластических воззрений на природу инфекционных болезней возникло в период Возрождения. Бурное развитие мореплавания и торговли привело к тому, что за сравнительно короткий период Европа перенесла ряд страшных пандемий. При их приближении население действовало согласно известной тогда пословице-совету - «cito, longe, tardo» (беги немедленно, будь в отсутствии подальше, возвращайся попозже). Этому совету последовали и герои «Декамерона» Боккаччо, сбежавшие из зачумлённой Флоренции и поселившиеся в загородном доме. В 1374 г. в Модене были построены специальные дома, где 40 дней проживали люди, приехавшие из зачумлённых мест; чуть позже в Венеции появился указ об изоляции подозрительных на чуму людей, товаров и кораблей на 40 дней (quaranta giorni), откуда и произошёл термин «карантин». Наблюдения, сделанные во время эпидемии чумы (1347-1350), позволили установить возможность передачи инфекции непосредственно от больного, что поколебало основы миазматической теории. Уже появились предтечи материалистической концепции в понимании развития инфекций. В частности, в 1553 г. Алессандро Бенедётти указал на наличие «материального заразного яда», Петрус Форёстус ввёл в медицинскую практику термин «вирус» (имея в виду тот же яд). Ещё дальше пошёл Парацёльс, широко применявший термин «вирус» для обозначения «невидимых семян, приносящих болезнь». Именно он внёс в экспериментальные исследования основополагающий принцип experimentum ad ratio (опыт перед рассуждением), отметающий все бездоказательные догмы. Наиболее чётко на природу инфекционных болезней указал итальянский врач Джироламо Фракастбро, заметивший, что они сходны с брожением, то есть передаются от одного другому посредством «живого болезнетворного начала»- contagium vivum. Именно Фракастбро (1546) ясно определил материальность болезнетворного начала и ввёл в медицину термин «инфекция», благодаря чему эпидемические болезни стали рассматривать как инфекционные, а не как конституциональные. С этого времени в медицинском мире началась ожесточённая борьба между сторонниками миазматической теории и учения о контагии. Эта борьба продолжалась до подтверждения гениальной догадки Фра-кастбро ad oculos (буквально: собственными глазами) - открытия микроорганизмов.

ОТКРЫТИЕ МИРА МИКРОБОВ

Первые микроскопы

Открытие невидимого мира стало возможным после изобретения увеличивающего оптического устройства (Г. Галилей). Этот «Колумб неба», построивший также первый в мире микроскоп (1610), считал «микроскопическую трубу» всего лишь средством развлечения, что помешало ему стать первооткрывателем нового мира. Во многом это объясняется и тем, что микроскоп Галилея был всего лишь зрительной трубой с силой увеличения обычной лупы, так как он не знал о роли фокусного расстояния для получения изображения. Первенство в изобретении настоящего устройства для изучения микроскопических объектов отдают голландским учёным (Ханс и Захариас Янсен), хотя впервые мир невидимых существ наблюдал учёный иезуит Афанасий Кйрхер, обнаруживший мельчайших «червячков» в гниющем мясе, молоке, уксусе и т.д. Он даже сообщил об их наличии в крови больных чумой. Разумеется, пользуясь микроскопом Янсенов с 32-кратным увеличением, Кйрхер не мог видеть бактерии, но его открытие укрепило ряды сторонников теории pathologiae animatae (развития болезней, вызываемых некими существами). Первым, кому бесспорно удалось проникнуть в мир микробов, был Антоний ван Лёвенгук, использовавший микроскопы с 160-кратным увеличением. Необычность микромира настолько потрясла этого преуспевающего торговца сукном из Дельфта, что всю оставшуюся жизнь он посвятил изучению этого мира. Именно ему человечество обязано открытием «анималькулей» [от лат. animalcula, зверушка], число которых существенно возросло после исследований Роберта Хука, Луи Жаблб, Кристиана Ланга и др. Впрочем, очень немногие из них считали, что эти «мельчайшие невинные создания Господни» могут быть причиной заболевания и смерти человека, так как в то время болезни рассматривали как следствие изменений «животной силы» или «брожения соков» организма. Более того, сам Лёвенгук не считал «анималькулей» возбудителями болезней у человека, и в XVI-XVIII вв. продолжала господствовать «миазматическая теория» самопроизвольного зарождения болезней. Во многом этому способствовало отсутствие методов выделения отдельных представителей микромира, что было так необходимо для установления связи с инфекциями и что так дискредитировало концепцию живого контагия.

Вопрос о самопроизвольном зарождении

Открытие микробов дало почву и для размышлений по поводу их происхождения. Некоторые исследователи считали, что микроорганизмы спонтанно зарождаются из неживой материи; другие (в том числе и Лёвенгук) полагали, что они образуются из «семян» или «зародышей», постоянно присутствующих в воздухе. И всё же большинство учёных, хотя и зная о происхождении животных от себе подобных, слепо верили, что черви самозарождаются в гниющем мясе, а глисты - в кишечнике. Доктрина о спонтанном зарождении (generatio spontanea), или абиогенезе, принималась безоговорочно с античных времён вплоть до эпохи Возрождения. Первые аргументы, противоречащие этим воззрениям, были получены Франческо Рёди, опровергнувшем мнение о самозарождении червей в гниющем мясе. Достойно упоминания имя российского естествоиспытателя середины XVIII в. Даниила Туп-тало, указывавшего и учившего, что самозарождение происходит без участия каких-либо высших сил, то есть в результате естественных причин. В 1769 г. университетский профессор из Па-вии, аббат Спалланцани доказал, что микробы также происходят от себе подобных, и установил их роль в порче различных продуктов. Это открытие о длительной сохранности различных скоропортящихся продуктов после удаления микроорганизмов нашло интересное практическое применение. В начале XIX в., задолго до окончательного решения вопроса о самозарождении, Франсуа Аппёр (1810) установил, что продукты можно сохранять, поместив их в герметичные сосуды с последующим прогревом, а метод «аппертизации» стал первым широко применяемым способом консервирования пищевых продуктов. Многие российские учёные поддержали теорию contagium vivum. Особо следует выделить исследование М.М. Терехбвского «Об анималькулях», показавшее роль различных физических и химических воздействий на микроорганизмы и подходы к термическому обеззараживанию различных объектов. Другим выдающимся сторонником этой теории был Д.С. Самойлбвич, внёсший большой практический вклад в борьбу с чумой и даже предпринявший попытку создания противочумной вакцины. Он предположил возможность искусственного создания невосприимчивости к инфекционному агенту. В определённой степени Д.С. Самойлбвича можно считать предтечей Эдварда Джённера, осуществившего профилактику натуральной оспы вакцинацией - искусственной прививкой возбудителя коровьей оспы. Окончательную точку в дискуссиях защитников теорий «болезнетворных миазмов» и «живого возбудителя» поставили открытия, сделанные в первой половине XIX в. и убедительно доказавшие патогенную роль микроорганизмов в опытах по самозаражению и моделированию заболеваний у животных.

Морфология и систематика микроорганизмов

Долгое время изучение микробов носило описательный характер, следствием чего естественно встал вопрос об их систематике. Великий шведский натуралист Карл Лйнней не делал серьёзных попыток систематизирования микроорганизмов и в XII издании своей Systema naturae (систематика природы) поместил известных тогда «анималькулей» в класс Chaos infusorium (инфузорный хаос), объединяющий живые организмы, недоступные в то время систематизации. Тем не менее, он поддерживал идею прямой связи «зверушек» с инфекционными болезнями, о чём свидетельствуют данные им различным видам названия; например, Febrium exanthematicarum contagium («заразительная сыпная лихорадка») или Siphilitidis virus humidium («жидкий сифилитический яд»). Первой научной классификацией явилась Animalcula infusoria («зверушки» распространённые» [от лат. infusus, влитый, распространённый]) К. Мюллера, выделявшая роды Monas и Vibrio, но относящая бактерии к инфузориям. Лишь после усовершенствования микроскопов (1820-1870) были предприняты попытки более точных классификаций микробов (Эренбёрг, Дюжардён, Кон, Нэгели), окончательно установившими принадлежность бактерий к царству растений. Во многом этому способствовали исследования Л.С. Ценкбвского, доказавшего близость бактерий к растительным клеткам. В 1857 г. Карл Нэгели объединил микроорганизмы в особую группу грибов-дробянок (Schizomycetes), и это название сохранилось за бактериями до настоящего времени. Изучение морфологии бактерий привело к появлению двух направлений в микробиологии: мономорфизм и полиморфизм. Мономорфисты, возглавляемые Фердинандом Коном, считали, что бактерии (как и другие организмы) сохраняют постоянство формы и специфические признаки. Полиморфисты во главе с Карлом Нэгели указывали, что форма бактерий и их свойства могут меняться в зависимости от условий окружающей среды. Некоторые из полиморфистов вообще отвергали существование возбудителей инфекционных болезней, объясняя появление последних изменениями условий окружающей среды. К концу XIX в. микробиологи стали понимать, что достоверную информацию о морфологии и физиологии микроорганизмов можно получить, лишь оперируя их чистыми культурами. К тому времени уже были разработаны методы стерилизации инструментов сухим жаром и проведением через пламя (фламбирование) . Для защиты от обсеменения сред в сосудах стали использовать ватные пробки, а также признали необходимость стерилизации всех предметов, контактировавших с исследуемым материалом. Пионером в разработке методов получения чистых культур считают А. Брёфельда, предложившего метод выделения отдельных грибковых клеток и культивирования грибов в желатине. Метод, однако, оказался непригодным для работы с бактериальными клетками, имеющими значительно меньшие размеры.

Становление научного изучения роли микроорганизмов

Уже Афанасий Кйрхер полагал, что гниение органических веществ связано с жизнедеятельностью мельчайших «червячков». Двести лет спустя Теодор Шванн и Каньяр Латур (1837) доказали, что существующие в пиве «шарики» Лёвенгука - живые клетки растительного происхождения, вызывающие брожение. Большинство врачей того времени также рассматривали болезни как «брожение соков организма», а великий Роберт Бойль ещё в XVII в. заметил, что «природу заразных болезней поймёт тот, кто познает природу брожения». Соответственно возник вопрос: если брожение пива вызывает микроб, не могут ли ему подобные вызывать брожение в организме человека? В том же году Альфред Доннё обнаружил во влагалищном отделяемом Trichomonas vaginalis, а в 1839 г. Иоханн Шёнляйн выделил возбудителя фавуса. Определённо и ясно связь между инфекциями и возбудителями доказал Якоб Хёнле, сформулировавший обобщённые критерии, подтверждающие причинную связь между микроорганизмом и болезнью: «Материя контагия не только органической, но и организованной природы, а именно, она представляет собой индивидуальное существо, которое по отношению к больному играет роль паразитического организма. Отношения к этому следующие:

«ЗОЛОТАЯ ПОРА» МИКРОБИОЛОГИИ

Середина XIX в. явилась поворотным этапом в развитии микробиологии. Она обогатилась новыми данными из физики, химии и биологии, что привело к стремительному прорыву в исследованиях микромира. Середина XIX и начало XX вв. проходят под знаком борьбы с инфекционными заболеваниями, а институты, созданные для Луи Пастёра в Париже и для Роберта Коха в Берлине, стали мировыми центрами изучения микроорганизмов и инфекционных болезней.

Луи Пастер

Всю жизнь Пастёр искал ответы на самые актуальные вопросы химии, микробиологии, эпидемиологии и патологии. Его собственное отношение к научному поиску характеризуют его же слова: «Ничто не удаётся без предвзятых идей. Нужно лишь быть настолько благоразумным, чтобы верить только тем выводам из них, которые подтверждаются опытом. Предвзятые идеи, подчинённые контролю опыта, являются огнём, оживляющим наблюдательные науки». Заслуги Пастёра хронологизированы на мемориальной доске у входа в его первую лабораторию в Ecole normal (Высшая Школа, Париж): «1857 г. - брожение, 1860 г. - самопроизвольное зарождение; 1865 г.- болезни вина и пива; 1868 г.- болезни шелковичных червей; 1881 г. - зараза и вакцина; 1885 г. - предохранение от бешенства». Не лишено иронии и поучительно то обстоятельство, что в начале работ по брожению (винокуренная фабрика, Лилль, 1857) Пастёр считал, что «дрожжи образуются из атмосферного воздуха». В течение последующих 20 лет Пастёр доказал, что каждый тип брожения, сопровождающийся образованием различных основных конечных продуктов, вызывают микроорганизмы конкретного типа. Изучая масляно-кис-лое брожение, Пастёр обнаружил, что некоторые микроорганизмы могут жить только при отсутствии кислорода, хотя ранее этот газ считали абсолютно необходимым для поддержания любой формы жизни. На основании этих опытов в практику вошли термины «аэробный» и «анаэробный» для обозначения жизни в присутствии или отсутствии кислорода. Пастёр всегда стремился применить на практике результаты своих исследований - будь то порча вина и пива или болезнь шелковичных червей. В течение 1860-1864 гг. Пастёр разбил все аргументы оппонентов и доказал, что самостоятельного зарождения в современных условиях не существует. Совершенствуя технику стерилизации, он ввёл в практику нагревание до 120 °С в паровом котле, получившем название «автоклав». Разрабатывая методы сохранения вкусовых качеств вина и пива, Пастёр предложил нагревать их до 60-70 °С, убивая этим вегетативные клетки микроорганизмов. Ныне метод известен как пастеризация. К середине XIX в. появились сообщения о находках неких «телец» в крови животных, больных сибирской язвой (Фридрих Поллёндер, Фридрих Брауэлл и Казимир Давён). Естественно, что учёного не могли не заинтересовать вопросы инфекционной патологии человека, побудившие его сделать смелое заключение, что «между болезнью и наличием микроорганизмов существует тесная связь». Выдающаяся заслуга Пастёра - создание и воспитание блестящей когорты учеников-коллег, работавших в области медицинской микробиологии: Эдгар Шамберлан, Эмиль Ру, Эдмон Нокар, Жюль Жубёр, Луи Тюйё, Виктор Бабеш, И.И. Мёчников и многие другие. В 1879 г., работая с возбудителем куриной холеры, Пастёр установил, что в определённых условиях культивирования патогенные микробы теряют вирулентность и, будучи введёнными здоровым птицам, предохраняют их от заражения. Из этого факта развилась теория аттенуации [от лат. adtenuo, attenuatus, ослабление]. Так появилась первая искусственная (в отличие от дженне-ровской прививки) вакцина. В память о Джённере он назвал ослабленные (аттенуированные) бактерии вакцинами, а сами предохранительные прививки - вакцинацией. Не зная о работах Коха, Пастёр применил принципы аттенуации в отношении возбудителя сибирской язвы и создал эффективное средство вакцинопрофилактики. Затем интересы Пастёра сфокусировались на другой актуальной проблеме - изучении бешенства. После ряда неудач он установил, что болезнь передаёт невидимый инфекционный агент, способный вызывать заболевание у здоровых лабораторных животных после субдурального заражения. При перевивании возбудителя на кроликах Пастёр установил, что инкубационный период бешенства всё время сокращался и доходил до известного предела (7 сут), за которым останавливался. Такой агент, постоянно дающий самый короткий период инкубации, получил название фиксированный вирус (virus fixe). При этом возбудитель приобрёл выраженный тропизм к нервным тканям и, введённый внутримышечно или подкожно, «не имел силы» передвигаться по нервным стволам в головной мозг, то есть не вызывал развития бешенства, и его можно было использовать для вакцинации. Однако использование живых вакцин всегда создавало риск развития самого заболевания, поэтому много времени Пастёр потратил на поиск способов атте-нуации возбудителя бешенства. Наконец, он нашёл, что если высушивать спинной мозг кролика, заражённого фиксированным вирусом, в банках с гидроксидом калия, то возбудитель постепенно теряет свою вирулентность и делается безвредным при подкожном или даже субдуральном введении. Так была создана антирабическая вакцина [от лат. anti-, против + rabies, бешенство]. Все последующие работы Пастёра и его коллег были посвящены изучению сложных и тонких проблем патогенеза, механизмов выздоровления и выработки невосприимчивости при инфекционных заболеваниях. Эти исследования охватили большинство бактериальных инфекций и стали классикой инфекционной патологии и иммунологии. «Пастеровскую школу» прошли известные отечественные бактериологи - Н.Ф. Гамалёя, А.М.Безрёдка, М.В.Вёйнберг, Г.Н.Габричёвский, Н.Н.Клодн-йцкий, И.Г. Савченко, В.И. Исаев, Л.А. Тарасёвич, В.А. Хавкин, П.В. Циклйнская и многие другие.

Роберт Кох

Свою деятельность в качестве бактериолога Роберт Кох начал с изучения сибирской язвы, эпизоотия которой разразилась в прусском городке Вольштайне, где он работал уездным врачом. Кох помещал кусочки селезёнки заражённых мышей в висячую каплю жидкости передней камеры бычьего глаза и наблюдал рост возбудителя, спорообразование и прорастание спор. Сообщение «Этиология сибирской язвы», направленное 27 мая 1876 г. известному бактериологу и автору одной из классификаций бактерий Фердинанду Кону, произвело фурор и, несмотря на негативную позицию столпов немецкой медицины того времени (Рудольф Вирхов и Макс Петтенкофер), было признано мировым открытием. Поучительно сопоставить подходы Пастёра и Коха к решению научных проблем. Многочисленные критики и сам Кох обвиняли Пастёра в «счастливой случайности» его открытий (на что тот отвечал, что «счастье улыбается только подготовленным умам»). Если Пастёр нередко заменял отсутствие фактических данных высочайшей интуицией (например, при изучении брожения), то Роберт Кох педантично добивался получения всех необходимых фактов микробного происхождения инфекционных болезней. Во многом не согласный с Пастёром, он понимал, что открытие возбудителя сибирской язвы может быть подвергнуто сомнению, так как по условиям его опытов нельзя было заключить о получении действительно чистой культуры микробов. Существовавший в то время метод разведений микробных культур был трудоёмок и ненадёжен. Большие перспективы открывали наблюдения И.Шрётера о способности бактерий образовывать отдельные скопления - колонии на картофеле, клейстере или яичном белке. Первоначально Кох остановился на картофельных пластинках, но они имели недостатки: подвижные бактерии свободно перемещались по влажной поверхности; используемый субстрат был непрозрачным, что затрудняло изучение колоний; кроме того, не все бактерии были способны расти на картофеле. Позднее Кох стал использовать желатину, засевая её небольшим количеством бактерий, быстро и без нажима разнося его по поверхности платиновой петлёй, то есть проводя посев штрихом. Вскоре он отметил, что бактерии можно не рассеивать штрихом по поверхности затвердевшей желатины, а смешивать их с расплавленной и охлаждённой желатиной. После застывания желатины бактерии оказывались иммобилизованными в её толще и давали начало росту отдельных колоний (глубинный посев). Однако многие бактерии гидролизовали желатину, разжижая субстрат, поэтому желатину пришлось заменить свернувшейся сывороткой крови, а потом агаром. Затем бактерии из отдельных колоний Кох переносил в пробирки с желатиной, застывшей под наклоном, получая чистые косяковые культуры. Возможности метода выделения чистых культур на твёрдых питательных средах позволяли чётко установить этиологическую роль того или иного возбудителя и изучать его свойства, что было невозможно сделать на бульонных культурах. Поэтому все бактериологические находки, сделанные до этого, нуждались в подтверждении с выделением и исследованием чистых культур возбудителей. В дальнейшем, основываясь на опыте выделения чистых культур возбудителей, Кох разработал основные теоретические и практические принципы проведения дезинфекции. Не менее важным вкладом Коха и его коллег в практическую бактериологию стала разработка селективных питательных сред, продиктованная стремлением создать в пробирке среду, наиболее сходную с условиями пребывания патогена в тканях хозяина. В качестве основных ингредиентов были использованы мясные настои и экстракты, и в практику прочно вошли питательные бульоны и агары. Именно разработка новых, ранее неизвестных методов выделения и культивирования бактерий привела к открытию возбудителей холеры, туберкулёза и многих других патогенных микроорганизмов. В немалой степени им способствовали усовершенствования техники микроскопии: ахроматические объективы Амйчи, иммерсионные системы Харнака и Аббе, микровинт Шевальё и др. Сам Кох также внёс серьёзные новшества в технику микроскопирования, предложив окрашивать микроорганизмы анилиновыми красителями и разработав методы микрофотографии. Исследования специфических возбудителей позволили ему экспериментально подтвердить критерии, которые за 36 лет до этого сформулировал Яков Хёнле. В настоящее время они известны как постулаты Коха.

В настоящее время эта триада во многом утратила своё значение, так как мало применима по отношению к вирусным инфекциям и риккетсиозам, возбудителей которых трудно выделить из организма больного. Кроме того, постулаты Коха не обязательны в отношении некоторых болезней (например, брюшного тифа, гонореи, малярии и др.). Коха по праву считают основателем немецкой школы бактериологов (Георг Гаффки, Фридрих Лёффлер, Эмиль Бёринг, Шибасабуро Китазато и др.), внёсшей огромный вклад в борьбу с инфекционными болезнями.

Асептика и антисептика

В Англии «микробную теорию» развития болезней Пастёра горячо поддержал Джозеф Лйстер, главный хирург клиники «Royal Infirmery» в Эдинбурге. Ознакомившись с работами по брожению, он был поражён сходством изменений бродящих органических субстратов с загниванием ран, что явно указывало на присутствие в них микроорганизмов. Для профилактики послеоперационных инфекций Лйстер ввёл в больнице жёсткие меры поддержания чистоты. В качестве дезинфицирующего и антисептического средства он предложил концентрированный раствор карболовой кислоты (50 г/ л). Им обрабатывали инструменты, мыли руки хирурги, во время операции его разбрызгивало над раной специальное устройство. Как и всё новое, «карболовое море» получило много противников и сторонников. Ничего не зная о работах Пастёра, за 5-6 лет до Лйстера карболку в хирургической практике применил Жан Лямёр, а хлорсодержащие растворы - И.В. Буяльс-кий, Н.И. Пирогов и др. Несмотря на обнадёживающие результаты, Пастёр оставался недовольным результатами антисептических мероприятий. Считая, что лучше воспрепятствовать заражению ран, он рекомендовал заменить антисептику, как метод лечения ран, асептикой - методом предупреждения инфицирования ран. Несмотря на очевидные преимущества, первая асептическая операция была проведена лишь через 15 лет в парижской клинике профессора Дельбё. Более интенсивно во Франции асептика внедрялась для профилактики «родильной горячки». Пастёр был глубоко уверен, что «врачи и акушерки передают возбудителей горячки от больных женщин к здоровым». Обнаруженный им в выделениях больных рожениц микроб имел вид бус и был назван стрептококком. Эффективность асептики в хирургических клиниках и родильных домах позволила Пастёру с коллегами сделать в Медицинской Академии сообщение «Теория о возбудителях и её применение в медицине и хирургии», получившее широкую известность.

Открытие вирусов

Изучая бешенство, Пастёр не мог обнаружить его возбудителя, но предположил наличие мелкого агента, проходящего через фильтр Шамберлана. Он предложил Н.Ф. Гамалее проверить и подтвердить это предположение на возбудителе чумы крупного рогатого скота, но Гамалея ограничился лишь констатацией факта, что заболевание вызывает мелкий фильтрующийся агент. Подлинным открывателем мира вирусов стал Д.И. Ивановский, открывший возбудителя вирусной болезни растений (табачной мозаики). Лишь немногие учёные (И.И. Мечников, Н.Ф. Гамалея и др.) оценили важность открытия, и потребовалось шесть лет (до открытия Фридрихом Лёффлером и Паулем Фрошем возбудителя ящура и повторного выделения возбудителя табачной мозаики Мартином Бейеринком) для всеобщего принятия концепции Д.И. Ивановского о фильтрующихся ультрамелких инфекционных частицах. Затем подобные агенты стали обнаруживать при различных инфекциях. Были открыты фильтрующиеся бактерии: L-формы и микоплаз-мы. Однако из-за практически полного отсутствия адекватных методов исследования, дальнейшее изучение фильтрующихся агентов быстро зашло в тупик, а сами вирусы вообще представлялись некими гипотетическими агентами.

Развитие микробиологии в первой половине хх в.

К началу XX столетия был накоплен значительный объём научных данных, открывающий новые горизонты в изучении микромира. Усовершенствования уже известных бактериологических методов исследования позволили выделить новые патогенные бактерии: бледную спирохету, лептоспиры, боррелии, риккетсии, хламидии и др. Тем не менее, этот период характеризует отсутствие адекватных методов изучения новых патогенов, существенно тормозящее развитие микробиологии. С другой стороны, эти обстоятельства побудили «охотников за микробами» к поиску новых патогенов, и этот период можно рассматривать как время интенсивного изучения паразитических простейших. Ещё более бурно развивались теоретические и прикладные аспекты иммунологии: были выявлены гуморальные факторы и клеточные факторы резистентности организма, разработаны многие диагностические реакции (Вассерманна, Видаля, Вейля-Феликса и др.), Альберт Кальмётт и Камиль Герён предложили вакцину для профилактики туберкулёза, Гастон Рамон создал дифтерийный и столбнячный анатоксины. Широкое использование лечебных сывороток породило проблему анафилаксии и иммунопатологических реакций вообще. Совершенствование знаний о структуре и функциях систем защиты организма способствовало появлению ряда теорий иммунитета, дополняющих или отвергающих фагоцитарную теорию И.И. Мёчникова - изменённых антигенов (Аг) (Х. Бюхнер), боковых цепей (П. Эрлих), отпечатков (Н.Ф. Гамалёя), матриц (Ф. Брёйнль и Ф. Горовиц), местного иммунитета (А.М. Безрёдка) и др. Важной вехой этого периода явились становление и первые сенсационные успехи химиотерапии инфекционных болезней. Её основные принципы заложили Д.Л. Романовский и Пауль Эрлих. Позднее были синтезированы аналоги хинина, Герхард Домагк получил первые сульфаниламиды, исследования Д.Вудса p-аминобензойной кислоты положили начало новому подходу к химиотерапии - синтезу аналогов известных и необходимых метаболитов. Эпохальным событием стало открытие способности грибов рода Penicillium выделять антибактериальные вещества (А.Флё-минг, 1928) и последующее получение (совместно с Х.У.Флори и Э.Б.Чейном) чистого пенициллина в 1941 г., что открыло эру антибиотикотерапии.

Вклад отечественных учёных в развитие микробиологии

Отечественным учёным принадлежит немало крупных достижений и открытий, вошедших в мировую сокровищницу микробиологии и стяжавших им прочную славу за пределами отечества. Одним из первых был известный ботаник Л.С. Ценковский, отнёсший бактерии к растениям и разработавший отечественную вакцину против сибирской язвы. В середине 50-х годов XIX в. он начал читать лекции о бактериях в Петербургском университете. Профессор ботаники Казанского университета Н.В. Сорокин в 1882-1886 гг. опубликовал четырёхтомное издание «Растительные паразиты человека и животных как причина заразных болезней», включавшее описание всех известных в то время бактерий. Большой вклад в становление отечественной микробиологии внёс Л.Л. Гейденрёйх, автор руководства «Методы исследования низших организмов» (1885), внедривший в практику автоклав и закрытые чашки взамен желатиновых пластинок Коха. Как нередко бывает, их назвали чашками Пётри, хотя последний предложил их лишь через 2 года. Основы химиотерапии и методы двойной окраски простейших эозином с метиле-новым синим разработал Д.Л. Романовский. Трудно в нескольких строках оценить вклад И.И. Мёчникова, отмеченный высшей наградой учёного - Нобелевской премией за 1906 г. Под его руководством велась подготовка студентов по микробиологии в Новороссийском (Одесском) университете. Его современник и ученик В.К. Высокович доказал, что попавшие в кровь бактерии депонируются в селезёнке, печени и костном мозге. Это открытие заложило основы учения о макрофагально-моноцитарной системе. Классические работы С.Н. Виноградского позволили создать представление о роли микробов в кругообороте веществ. Ему принадлежит установление роли микроорганизмов в фиксации азота, разработка метода накопительных культур, открытие автотрофии бактерий, использующих минеральные вещества в качестве источника энергии. Его ученик В.Л. Омелянский получил широкую известность своими трудами по почвенной микробиологии и учебнику «Основы микробиологии» (1909). Большой вклад в медицинскую микробиологию внесли исследования чумы и холеры Д.К. Заболотным. Именно им была создана первая в России кафедра микробиологии при Петербургском женском медицинском институте (1898). В 90-х годах XIX в. в Киевском университете был организован факультативный курс по бактериологии, который читали В.В. Подвысоцкий и А.Д. Павловский. Отечественная практическая медицина быстро получила большой ассортимент диагностических и лечебных сывороток, выпускаемых Харьковским (основан В.И. Недригайло-вым, Г.Л. Остряниным и др.) и Московским (основан Г.Н. Габ-ричёвским) микробиологическими институтами. В Одессе аналогичное производство было организовано крупным бактериологом и гигиенистом П.Н. Диатроптовым. В период гражданской войны и ликвидации разрухи бактериологи встали на передние рубежи отечественной медицины. Л.А. Тарасёвич организовал Государственный институт по контролю бактерийных препаратов. По инициативе Е.И. Марциновского был организован Институт тропической медицины. Н.Ф. Гамалёя, З.В. Ермольева, Г.М. Фишер и другие внесли значительный вклад в изучение бактериофагов и возможности их применения на практике. Во второй половине ХХ в. отечественные учёные добились крупных успехов в изучении природы патогенных вирусов. М.А. Морозов и Е.И. Турёвич разработали оригинальные методы окраски телец включений различных вирусов. Исследования Е.Н. Павловского, Л.А.Зйльбера, А.К.Шубладзе, В.Д.Соловьёва, М.П. Чумакова и др. стали краеугольным камнем в формировании учения о природно-очаговых и, в первую очередь, вирусных инфекций. В Московском государственном университете впервые в нашей стране ещё в 1926 г. В.Н. Шапошников начал читать курс «Техническая микробиология». Среди многих славных имён отечественных микробиологов должны быть упомянуты П.В.Циклйнская, Ф.А.Лёш, О.О.Мочутковский, Г.Н.Минх, П.Ф.Боровский, И.Г.Савченко, А.А.Смородинцев, В.Д.Тимаков, Н.А.Красйльников, Е.Н.Мишустин, П.Н.Кашкин, З.В.Ермольева, В.М.Жданов, М.П.Чумаков, С.В.Прозоровский и многие-многие другие, но о них речь пойдёт дальше.

СОВРЕМЕННЫЙ ПЕРИОД РАЗВИТИЯ МИКРОБИОЛОГИИ

На рубеже середины столетия выход естественных наук на молекулярный уровень стимулировал дальнейшее развитие микробиологии, вирусологии и иммунологии. Создание электронного микроскопа сделало видимым мир вирусов и макромолекулярных соединений. Генетика бактерий пролила свет на когда-то запутанные проблемы их изменчивости, произвела революцию в генетике в целом, «вскормила» целую область биохимии, что привело к рождению молекулярной биологии. Именно на бактериях О. Эвери, К. Маклёод и М. МакКарти доказали роль дезоксирибо-нуклеиновой кислоты (ДНК) в передаче наследственных признаков. Расшифровка основных принципов кодирования генетической информации в ДНК бактерий, а также универсальность генетического кода бактерий и вирусов позволили установить общие молекулярно-генетические закономерности, свойственные высшим организмам. Пол Берг в 1972 г. получил in vitro рекомбинантную ДНК, состоящую из фрагментов разных молекул вирусной и бактериальной ДНК. Кроме того, он расшифровал геном кишечной палочки, что сделало возможными искусственное конструирование генов и пересадку отдельных генов из одних клеток в другие. К настоящему времени методы генной инженерии используют в производстве широкого спектра биологически активных веществ (БАВ). Исследования в области молекулярной вирусологии показали способность вирусной ДНК встраиваться в геном чувствительной клетки, а также позволили идентифицировать различные вирусы на уровне их молекулярной структуры. Одновременно произошла существенная переоценка классических понятий иммунологии: возникли представления о структуре и функциях иммунной системы, объединившие концепции инфекционной и неинфекционной иммунологии. Были установлены основные популяции иммунокомпетентных клеток и их функции, выяснены закономерности развития аутоиммунных реакций и иммунной толерантности. В медицинскую практику прочно вошли понятия об иммунодефицитах и реакциях гиперчувствительности. 80-е годы завершились окончательным доказательством правоты клонально-селекционной теории генетического контроля иммунных реакций, предложенных Ф.М. Бернётом (1957). Арсенал способов диагностики инфекционных заболеваний пополнили принципиально новые методы: иммуноферментный и радиоиммунный анализы (РИА), гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и др. Расшифровка молекулярной организации многих возбудителей инфекционных болезней, получение реком-бинантных штаммов различных патогенов, а также совершенствование методов генной инженерии позволили создать вакцины нового поколения, некоторые из которых полностью синтетические. Набор средств лечения инфекционных болезней пополнили интерферон (ИФН), интерлейкины (ИЛ), факторы роста и иммуномодуляторы. В начале XXI в. микробиология по-прежнему составляет одно из основных направлений медицины, открывая новые горизонты для различных её дисциплин. Действительно, в настоящее время отмечают «реставрацию старых патогенов» (например, возбудителей туберкулёза и сифилиса), а также практически ежегодно открывают новые виды. Спектр новых возбудителей широк и включает вирусы [например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), ханта- и астровирусы], бактерии (например, Legionella, Bartonella henselae), различные простейшие (например, Cryptosporidium parvum). За последние десять лет были открыты вирусы гепатита Е (1988) и С (1989), вирус венесуэльской геморрагической лихорадки (1991), новый возбудитель холеры серовара О139 (1992), вирус бразильской геморрагической лихорадки (1994), вирус герпеса типа 8, ассоциированный с саркомой Капоши (1995). Открыты новые возбудители - прионы («инфекционные белки»). Как некое стремление к монокаузализму в патологии следует рассматривать сообщения об открытиях возбудителей инфаркта миокарда, различных гепатитов и панкреатитов, болезни Уйппла (хотя многие из них ещё нуждаются в подтверждении).

Все микроорганизмы подразделяют на три группы: высшие про-тисты (водоросли, грибы, простейшие); низшие протисты (эубак-терии, архебактерии, риккетсии и сине-зелёные водоросли) и неклеточные формы (прионы, вироиды и вирусы). Лишь ничтожная их часть в процессе эволюции приспособилась к паразитизму в организмах животных и человека. Микроорганизмы, способные вызывать инфекционные заболевания у человека, разделяют на пять основных типов: прионы, вирусы, бактерии, грибы и простейшие.

ПРИОНЫ

Прионы [от англ. proteinaceous infectious (particle), белковоподоб-ная инфекционная (частица)] - белковые инфекционные агенты, приводящие к развитию летальных неврологических заболеваний (губчатых энцефалопатий). Прионовые белки выделены как инфекционное начало скрепи у овец, спонгиоформной энцефалопатии крупного рогатого скота («коровье бешенство»), а у человека - куру, болезни Крбйтцфельдта-Якоба, синдрома Гёрстманна-Штрбйсслера-Шайнке-ра, амиотрофического лейкоспонгиоза и др. Прионы передаются ино-куляционно или алиментарным путём не только между особями одного биологического вида, но и между животными разных видов, в том числе между животным и человеком. Нормальный прионовый белок - трансмембранный гликопротеин PrP - кодируется одноимённым геном, функция этого связывающего медь гликопротеина неизвестна, его экспрессия нормально происходит в различных типах клеток. После трансляции матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) полипептид PrP^C подвергается а-спирализации, связывается с мембранами клеток и выполняет свои функции. Мутантные формы белка называют скрепиизоформными белками PrP^Sc (так как они впервые были выделены из нервных тканей овец, погибших от скрепи) PrP⁵' вместо а-спиралей образуют структуры, устойчивые к воздействию детергентов и протеаз и формирующие амилоидоподобные нерастворимые отложения. Таким образом, патогенез прионовых болезней связан не с подавлением функций PrP°, а с изменением характера укладки полипептидной цепи, то есть изменением конформации белка, и накоплением PrP^Sc . В результате формируются конгломераты в виде палочек или лент размером 25-550x11 нм. Эти прионовые формы белков устойчивы к кипячению, ультрафиолетовому (УФ) облучению, действию 70% этанола и формальдегида и сохраняются в тканях, фиксированных 10% формалином. Попадая в здоровый организм человека или животного, патологические конформеры способствуют постепенному отложению амилоидоподобных структур, в состав которых входят и нормальные белки PrP^C (более подробно см. главу 35).

ВИРУСЫ

Вирусы [от лат. virus, яд] - наименьшие по размерам агенты, имеющие геном, окружённый белковой оболочкой. Вирусы не воспроизводятся самостоятельно, они - облигатные внутриклеточные паразиты, репродуцирующиеся только в живых клетках. Все вирусы существуют в двух формах. В настоящее время известны вирусы бактерий (бактериофаги), грибов, растений и животных. Внеклеточная форма - вирион - включает в себя все составные элементы (кап-сид, нуклеиновую кислоту, структурные белки, ферменты и др.). Внутриклеточная форма - вирус - может быть представлена лишь одной молекулой нуклеиновой кислоты, так как, попадая в клетку, вирион распадается на составные элементы.

Морфология и размеры вирусов

Несмотря на внутриклеточный паразитизм, среди вирусов имеются крупные виды, соизмеримые по размерам с микоплазмами и хламидиями. Например, вирус натуральной оспы достигает 400 нм и вполне сравним с риккетсиями (300-500 нм) и хламидиями (300-400 нм). По морфологии выделяют вирусы палочковидные (например, возбудитель лихорадки Эбола), пулевидные (вирус бешенства), сферические (герпесвирусы), овальные (вирус оспы), а также бактериофаги, имеющие сложную форму (рис. 2-1). При всём разнообразии конфигураций, размеров и функциональных характеристик вирусам присущи некоторые общие признаки. В общем виде зрелая вирусная частица (вирион) состоит из нуклеиновой кислоты, белков и липидов, либо в его состав входят только нуклеиновые кислоты и белки.

Нуклеиновые кислоты

Вирусы содержат только один тип нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, но не оба типа одновременно. Например, вирусы оспы, простого герпеса, Эпстайна-Барр - ДНК-содержащие, а тогавирусы, пикорнавирусы - РНК-содержащие. Геном вирусной частицы гаплоидный. Наиболее простой вирусный геном кодирует 3-4 белка, наиболее сложный - более 50 полипептидов. Нуклеиновые кислоты представлены однонитевыми молекулами РНК (исключая реовиру-сы, у которых геном образован двумя нитями РНК) или двухнитевыми молекулами ДНК (исключая парвовирусы, у которых геном образован одной нитью ДНК). У вируса гепатита В нити двухнитевой молекулы ДНК неодинаковы по длине.

Вирусные ДНК образуют циркулярные, ковалентно сцепленные суперспирализованные (например, у паповавирусов) или линейные двухнитевые структуры (например, у герпес- и аденовирусов). Их молекулярная масса в 10-100 раз меньше массы бактериальных ДНК. Транскрипция вирусной ДНК (синтез мРНК) осуществляется в ядре заражённой вирусом клетки. В вирусной ДНК на концах молекулы имеются прямые или инвертированные (развёрнутые на 180°) повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Их наличие обеспечивает способность молекулы ДНК замыкаться в кольцо. Эти последовательности, присутствующие в одно- и двухни-тевых молекулах ДНК, - своеобразные маркёры вирусной ДНК.

Вирусные РНК представлены одноили двухнитевыми молекулами. Однонитевые молекулы могут быть сегментированными - от двух сегментов у аренавирусов до 11 - у ротавирусов. Наличие сегментов ведёт к увеличению кодирующей ёмкости генома. Вирусные РНК подразделяют на следующие группы: плюс-нити РНК (+РНК), минус-нити РНК (-РНК). У различных вирусов геном могут образовывать нити +РНК либо -РНК, а также двойные нити, одна из которых -РНК, другая (комплементарная ей) - +РНК.

Плюс-нити РНК представлены одиночными цепочками, имеющими характерные окончания («шапочки») для распознавания рибосом. К этой группе относят РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомах заражённой вирусом клетки, то есть выполнять функции мРНК. Плюс-нити выполняют следующие функции: служат мРНК для синтеза структурных белков, матрицей для репликации РНК, упаковываются в капсид с образованием дочерней популяции.

Минус-нити РНК не способны транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомах, то есть они не могут функционировать как мРНК. Однако такие РНК служат матрицей для синтеза мРНК.

Инфекционность нуклеиновых кислот. Многие вирусные нуклеиновые кислоты инфек-ционны сами по себе, так как содержат всю генетическую информацию, необходимую для синтеза новых вирусных частиц. Эта информация реализуется после проникновения вириона в чувствительную клетку. Инфекционные свойства проявляют нуклеиновые кислоты большинства +РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Двухнитевые РНК и большинство -РНК не проявляют инфекционных свойств.

Капсид

Генетический материал вирусов «упакован» в специальный симметричный «футляр» - капсид [от лат. capsa, футляр]. Капсид представлен белковой оболочкой, состоящей из повторяющихся субъединиц. Основные функции капсида - защита вирусного генома от внешних воздействий, обеспечение адсорбции вириона к клетке, проникновение его в клетку путём взаимодействия с клеточными рецепторами. Капсид образуют одинаковые по строению субъединицы - капсомеры, организованные в один или два слоя по двум типам симметрии - кубическому или спиральному. Симметричность капсида связана с тем, что для упаковки генома требуется большое количество капсомеров, а компактное их соединение возможно лишь при условии симметричного расположения субъединиц. Формирование капсида напоминает процесс кристаллизации и протекает по принципу самосборки. Число капсомеров строго специфично для каждого вида и зависит от размеров и морфологии вирионов. Капсомеры (морфологические единицы вирусов) образуют молекулы белка - протомеры (структурные единицы). Протоме-ры могут быть мономерными (содержать один полипептид) либо полимерными (включать несколько полипептидов).

Нуклеокапсид

Комплекс капсида и вирусного генома называют нуклеокапсидом. Он повторяет симметрию капсида, то есть обладает спиральной либо кубической симметрией соответственно (рис. 2-2). Спиральная симметрия. В нуклеокапсиде взаимодействие нуклеиновой кислоты и белка осуществляется по одной оси вращения. Каждый вирус со спиральной симметрией обладает характерной длиной, шириной и периодичностью нуклеокапсида. Нуклеокапсиды большинства патогенных для человека вирусов имеют спиральную симметрию (например, коронавирусы, рабдовирусы, пара- и ортомиксовирусы, буньявирусы и аренавирусы). К этой группе относят и вирус табачной мозаики. Организация по принципу спиральной симметрии придаёт вирусам палочковидную форму. При спиральной симметрии белковый чехол лучше защищает наследственную информацию, но требует большого количества белка, так как покрытие состоит из сравнительно крупных блоков. Кубическая симметрия. У подобных вирусов нуклеиновая кислота окружена капсомерами, образующими фигуру икосаэдра - многогранника с 12 вершинами, 20 треугольными гранями и 30 углами. К вирусам с подобной структурой относят аденовирусы, реовирусы, иридови-русы, герпесвирусы и пикорнавирусы. Организация по принципу кубической симметрии придаёт вирусам сферическую форму. Принцип кубической симметрии - самый экономичный для формирования замкнутого капсида, так как для его организации используются сравнительно небольшие белковые блоки, образующие большое внутреннее пространство, в которое свободно укладывается нуклеиновая кислота.

Двойная симметрия. Некоторые бактериофаги (вирусы бактерий) имеют двойную симметрию: головка организована по принципу кубической симметрии, отросток - по принципу спиральной симметрии.

Отсутствие постоянной симметрии. Для вирусов больших размеров (например, для по-ксвирусов) характерно отсутствие постоянной симметрии.

В состав нуклеокапсидов также входят внутренние белки, обеспечивающие правильную упаковку генома, а также выполняют структурную и ферментативную функции. Вирусные ферменты разделяют на вирионные и вирус-индуцированные. Первые входят в состав вирионов и участвуют в транскрипции и репликации (например, обратная транскриптаза), вторые закодированы в вирусном геноме (например, РНК-полимераза орто- и парамиксовирусов или ДНК-полимераза герпесвирусов). Вирионные ферменты также подразделяют на две функциональные группы: ферменты первой группы обеспечивают проникновение вирусных нуклеиновых кислот в клетку и выход дочерних популяций; ферменты второй группы участвуют в процессах репликации и транскрипции вирусного генома. В капсидах могут присутствовать ферменты обеих групп.

Суперкапсид

«Одетые» вирусы. Некоторые вирусы могут содержать поверх капсида особую оболочку - суперкапсид, организованный двойным слоем липидов и специфичными вирусными белками, наиболее часто образующими выросты-шипы, пронизывающие липидный бислой. Такие вирусы называют «одетыми». Образование суперкапсида происходит на поздних этапах репродуктивного цикла, обычно при отпочковывании дочерних популяций.

Липиды. Основная функция липидов - стабилизация структуры вирусов. Деградация или утеря липидов приводит к потере инфекционных свойств, так как такие вирусные частицы теряют стабильность своего состава и, соответственно, способность к заражению клеток. Состав липидов обычно зависит от характера «почкования» вирусной частицы. Например, у вируса гриппа состав липидного бислоя аналогичен таковому в клеточных мембранах. Герпес-вирусы почкуются через ядерную мембрану, поэтому набор липидов суперкапсида отражает состав липидов ядерной мембраны.

Гликопротеины входят в состав поверхностных структур суперкапсида (например, «шипов»). Сахара, входящие в состав гликопротеинов, обычно происходят из клетки-хозяина. Поверхностные белки «голых» вирусов обеспечивают взаимодействие вирусов с клеточными рецепторами и последующее проникновение в клетку путём эндоцитоза. Большинство «одетых» вирусов имеют поверхностные специальные F-белки [от лат. fusio, слияние], обеспечивающие слияние вирусных суперкапсидов и клеточных мембран. Поверхностные белки - важный компонент, облегчающий проникновение вирусов в чувствительные клетки. Их характерное свойство - способность связываться с рецепторами на поверхности эритроцитов и агглютинировать их. Способность к гемагглютинации широко используют для определения количества вирусов.

«Голые» вирусы. Вирусы, не имеющие суперкапсида, называют «голыми». Как правило, они резистентны к действию эфира и более устойчивы к денатурации.

М-белки

Негликозилированные матричные белки (М-белки) формируют структурный слой на внутренней поверхности суперкапсида и способствуют взаимодействию его с белками нуклеокапси-да, что важно на заключительных этапах самосборки вирионов (см. главу 5).

Репродукция вирусов

Вирусы не способны к самостоятельному размножению. Синтез вирусных белков и воспроизведение копий вирусного генома - необходимые условия для появления дочерней популяции - обеспечивают биосинтетические процессы клетки-хозяина. При этом белковые макромолекулы и нуклеиновые кислоты образуются отдельно, после чего происходит сборка дочерних популяций. Другими словами, для вирусов характерен дизъюнктивный (разобщённый) тип репродукции, осуществляемый при взаимодействии вируса с инфицируемой клеткой. Реализация репродуктивного цикла в существенной степени зависит от типа инфицирования клетки и характера взаимодействия вируса с чувствительной (могущей быть инфицированной) клеткой.

Характер взаимодействия «вирус-клетка»

Известны следующие типы взаимодействий «вирус-клетка»: продуктивный (образуется дочерняя популяция), интегративный (вирогенйя), абортивный (дочерняя популяция не образуется) и интерференция вирусов (инфицирование чувствительной клетки разными вирусами).

Продуктивное взаимодействие «вирус-клетка» чаще носит литический характер, то есть заканчивается гибелью и лизисом инфицированной клетки, что происходит после полной сборки дочерней популяции. Гибель клетки вызывают следующие факторы: раннее подавление синтеза клеточных белков, накопление токсических и повреждающих клетку вирусных компонентов, повреждение лизосом и высвобождение их ферментов в цитоплазму.

Интегративное взаимодействие, или вирогенйя, не приводит к гибели клетки. Нуклеиновая кислота вируса встраивается в геном клетки-хозяина и в последующем функционирует как его составная часть. Наиболее яркие примеры подобного взаимодействия - лизогенйя бактерий и вирусная трансформация клеток.

Абортивное взаимодействие не приводит к появлению дочерней популяции и происходит при взаимодействии вируса с покоящейся клеткой (стадия клеточного цикла G ) либо при инфицировании клетки вирусом с изменёнными (дефектными) свойствами. Следует⁵ различать дефектные вирусы и дефектные вирионы. Первые существуют как самостоятельные виды и функционально неполноценны, так как для их репликации необходим «вирус-помощник» (например, для репликации аденоассоциированного вируса необходимо присутствие аденовирусов). Вторые составляют дефектную группу, формирующуюся при образовании больших дочерних популяций (например, могут образовываться пустые капсиды либо безоболочечные нуклео-капсиды). Особая форма дефектных вирионов - псевдовирионы, включившие в капсид нуклеиновую кислоту клетки-хозяина.

Интерференция вирусов происходит при инфицировании клетки двумя вирусами. Различают гомологичную (при инфицировании клетки родственными вирусами) и гетерологичную (если интерферируют неродственные виды) интерференцию. Это явление возникает не при всякой комбинации возбудителей, иногда два разных вируса могут репродуцироваться одновременно (например, вирусы кори и полиомиелита). Интерференция реализуется либо за счёт индукции одним вирусом клеточных ингибиторов (например, ИФН), подавляющих репродукцию другого, либо за счёт повреждения рецепторного аппарата или метаболизма клетки первым вирусом, что исключает возможность репродукции второго.

Типы инфицирования клеток

По характеру взаимодействия генома вируса с геномом клетки выделяют автономное (геном вируса не интегрирован в геном клетки) и интеграционное (геном вируса интегрирован в геном клетки) инфицирование. Особую форму составляют латентное и персистирующее инфицирование.

Латентное инфицирование. ДНК некоторых вирусов (герпесвирусы, ретровирусы) может находиться в клетке вне хромосом, либо вирусная ДНК интегрируется в ядерный геном, но вирусоспецифические синтезы не происходят. Такая вирусная ДНК образует латентный про-вирус, реплицирующийся вместе с хромосомой. Подобные состояния вирусной ДНК нестабильны, возможны периодические реактивации с переходом в продуктивное взаимодействие «вирус-клетка», либо клетка трансформируется, давая начало злокачественному росту.

Персистирующее инфицирование. Некоторые РНК-вирусы могут вызывать персистирующие инфекции, проявляющиеся образованием дочерних популяций возбудителя после завершения острой фазы болезни. При этом происходит постепенное выделение вирусных частиц, но инфицированная клетка не лизируется. Нередко дочерние популяции вирионов дефектны (часто наблюдают у лиц с иммунодефицитами). Иногда такие хронические поражения протекают без клинических проявлений. В частности, вирус гепатита В способен вызывать персистирую-щее поражение гепатоцитов с развитием хронического гепатита; в дальнейшем возможна ма-лигнизация клеток.

Репродуктивный цикл вирусов

Изображённые на рис. 2-3 этапы репродукции (от адсорбции вирионов до высвобождения дочерней популяции) происходят при продуктивном взаимодействии вируса с клеткой.

Адсорбция. Первая стадия репродуктивного цикла - адсорбция вириона на поверхности инфицируемой клетки. Адсорбция происходит путём взаимодействия вириона со специфическими клеточными рецепторами. За распознавание рецепторов ответственны белки, входящие в состав капсида либо суперкапсида. Таким образом, понятие «тропизм вирусов» объясняется специфическим взаимодействием вирусных белков с поверхностными рецепторами инфицируемой клетки. Например, полиовирус проникает в клетки центральной нервной системы (ЦНС) и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и размножается в них, так как у человека и приматов только эти клетки имеют рецепторы к белкам полиовирусов.

Проникновение и «раздевание». «Голые» вирусы проникают в клетку путём эндоцитоза - погружения участка клеточной мембраны в месте их адсорбции. Иначе этот процесс известен как виропексис [вирус + греч. p?xis, прикрепление]. «Одетые» вирусы проникают в клетку путём слияния суперкапсида с клеточной мембраной при участии специфических F-белков (белков слияния). Кислые значения рН способствуют слиянию вирусной оболочки и клеточной мембраны. При проникновении «голых» вирусов в клетку образуются вакуоли (эндосомы). После проникновения «одетых» вирусов в цитоплазму происходит частичная депротеинизация вирионов и модификация их нуклеопротеида (раздевание). Модифицированные частицы теряют инфекционные свойства, в ряде случаев изменяются чувствительность к РНКазе, нейтрализующему действию антител (АТ) и другие признаки, специфичные для отдельных групп вирусов.

Теневая фаза. После депротеинизации вирусы невозможно выделить из культуры клеток. Этот этап репродукции известен как теневая фаза, или фаза эклипса [от англ. eclipse, затмение]. Она включает репликацию нуклеиновых кислот вируса и синтез вирусных белков. Теневая фаза не происходит при температуре 0-4 °С (исключая вирус гриппа). Различия в энергетических потребностях для теневой фазы разных групп вирусов указывают на возможное участие в этом процессе различных клеточных реакций. Теневая фаза заканчивается после образования составных компонентов вируса, необходимых для сборки дочерних популяций.

Образование дочерних вирусных частиц в заражённой клетке подразумевает необходимость трёх процессов:

Следует помнить, что генетическим материалом вирионов может быть либо ДНК, либо РНК (подробнее см. раздел главы 2 «Нуклеиновые кислоты»).

Транскрипция +РНК-содержащие вирусы. Функции мРНК выполняет геном (+РНК), поэтому у таких вирусов для синтеза вирусных белков (трансляция) нет необходимости в процессе транскрипции. Другими словами, у +РНК-содержащих вирусов транскрипция отсутствует. - РНК-содержащие вирусы и вирусы, имеющие две нити РНК. Функции мРНК выполняют транскрипты, комплементарные -РНК вириона. Поэтому у таких вирусов транскрипция существует как самостоятельный этап репродуктивного цикла. Для образования транскриптов в составе вирионов имеется собственная РНК-полимераза (транскриптаза). ДНК-вирусы. Транскрипция - самостоятельный этап репродуктивного цикла, так как геном ДНК-вирусов должен транскрибироваться для образования мРНК. Вирусы, репродуцирующиеся в ядре (например, герпес- и аденовирусы) для этой цели используют клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу (транскриптазу). Вирусы, репродуцирующиеся в цитоплазме (например, поксвирусы) лишены такой способности и содержат (как и вирусы с -РНК) собственную транскриптазу. Трансляция. Термином «трансляция» называют механизмы, при помощи которых последовательность нуклеотидных оснований мРНК переводится в специфическую последовательность аминокислот в синтезируемом полипептиде. Этому процессу предшествует связывание мРНК с рибосомами. При этом (связывание мРНК и инициация трансляции) происходит «дискриминация» клеточных мРНК, и синтетические процессы на рибосомах переходят под вирусный контроль. Вирусные геномы кодируют синтезы двух классов белков: структурные белки входят в состав дочерних популяций, а неструктурные белки обслуживают процессы репродукции, но не входят в состав дочерних популяций (ингибиторы синтеза клеточных РНК и белков, протеазы и др.).

РНК-содержащие вирусы. Поскольку вирусный геном кодирует несколько белков, то возможно два варианта трансляции: 1) каждый полипептид синтезируется отдельно от других (тога- и ретровирусы); 2 ) сначала образуется большой полипептид-предшественник, который в дальнейшем «нарезается» на отдельные полипептиды (пара- и ортомиксовирусы, а также рабдо-, арена- и буньявирусы). Некоторые вирусы используют оба этих механизма. Полипептиды, образующиеся при обоих вариантах трансляции, могут подвергаться посттрансляционной модификации (гликозилирование, фосфорилирование или сульфатирование).

ДНК-содержащие вирусы. В трансляционных процессах доминирует трансляция отдельных мРНК, кодирующих индивидуальные полипептиды. В отдельных случаях (например, у аденовирусов) не менее трёх белков образуются путём нарезания общего полипептида-предшественника.

Репликация. В зависимости от типа генетического материала (ДНК или РНК), образование дочерних копий геномов протекает по-разному. У ДНК-геномных вирусов репликация вирусных ДНК принципиально сходна с репликацией клеточных ДНК. Репликацию РНК-геномных вирусов осуществляют вирусные РНК-зависимые РНК-полимеразы (репликазы). Исключение составляют ретровирусы, их +РНК служит матрицей для синтеза ДНК. Синтез ДНК на матрице РНК осуществляет вирусная РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскрип-таза), необходимая для переписывания информации с РНК на ДНК. Синтезируемая вирусная ДНК интегрируется в клеточный геном в форме ДНК-провируса.

Однонитевые РНК. Репликация протекает в два этапа: первый включает образование матрицы, комплементарной геному; второй - образование копий РНК с этой матрицы. При репликации +РНК-вирусов количество копий -РНК (на матрице родительской нити +РНК) строго контролируется, а количество копий +РНК (с матрицы синтезированной нити -РНК) не контролируется.

Двухнитевые РНК. В качестве матрицы для синтеза +РНК вирусные репликазы используют минус-нить РНК и наоборот. Часть молекул -РНК соединяется с +РНК и образует двухнитевую молекулу РНК, а другая часть молекул -РНК функционирует как матрица для синтеза мРНК.

Сборка. У просто устроенных вирусов, состоящих из нуклеиновой кислоты и нескольких белков, сборка состоит из упорядоченного взаимодействия этих молекул. У сложно устроенных вирусов сборка дочерних популяций протекает многоступенчато. Взаимодействие нуклеиновых кислот с внутренними и оболочечными белками приводит к образованию нуклеокапсидов, или сердцевин. В процессе образования «одетых» вирусов полные нуклеокапсиды упорядоченно выстраиваются с внутренней стороны клеточной мембраны под участками, модифицированными оболочечными вирусными белками (М-белками). При нарушениях процесса самосборки могут образовываться пустые капсиды либо комплексы нуклеиновых кислот с внутренними белками.

Высвобождение дочерних вирионов - конечная стадия репродуктивного цикла. Вирусы, лишённые суперкапсида, и поксвирусы обычно высвобождаются быстро; выход дочерних популяций сопровождается разрушением цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и лизисом клетки. Вирусы, содержащие суперкапсид, высвобождаются медленнее. Модифицированные участки мембраны с заключёнными в них вирионами выпячиваются наружу и затем отпочковываются. Принцип высвобождения дочерних популяций почкованием во многом сходен с процессами, направленными на отторжение непригодного для клетки материала или обновление клеточных мембран. При высвобождении почкованием изменённая клетка иногда может сохранять жизнеспособность.

Бактерии

Бактерии [от греч. bacterion, уменьш. от baktron, трость, посох] - представители царства Procariotae, включающего бактерии и сине-зелёные водоросли. Бактерии крупнее вирусов, большинство из них можно изучать светооптической микроскопией. Прокариотическая клетка меньше эукариотической, ДНК в ней не окружена ядерной мембраной, а органеллы типа митохондрий и хлоропластов отсутствуют. Клетки бактерий окружены особо организованной клеточной стенкой, имеют ограниченное число отделов (компартментов) либо вообще лишены их (рис. 2-4). Они также имеют различия в синтезе ДНК, белков и продуктов клеточной стенки (табл. 2-1). Все известные бактерии разделяют на архебактерии (то есть древние бактерии) и эубактерии (к которым относят большинство современных видов).

Таблица 2-1. Основные различия клеток прокариотов (эубактерий) и эукариотов

string language="ru">string language="ru">string language="ru">

string language="ru">

Размер

Анаэробное дыхание Фиксация азота Мембранные структуры

string language="ru">string language="ru">string language="ru">

string language="ru">

1-10 мкм Возможно Возможна Отсутствуют

Систематика живых организмов - одна из наиболее сложных задач биологии. Систематика концентрирует все основные достижения науки - чем они более конкретны, тем более точна классификация. Любая классификация живых организмов призвана показать степень сходства и предполагаемой эволюционной взаимосвязи (при этом более высокие категории - ёмкие и широкие, а более низкие - конкретны и ограничены). Отличительные признаки в строении растений и животных, служившие до середины XIX в. основой систематики живых существ, видны с первого взгляда. В первую очередь, эти различия вытекают из способов питания. Животные поглощают органические вещества, перевариваемые и всасываемые в пищеварительном тракте. В упрощённом виде развитие животного мира должно обеспечивать создание всасывающих внутренних поверхностей, кои у всех и существуют - от кишечнополостных до млекопитающих. Растения имеют принципиально иное строение, обусловленное в первую очередь иным типом питания. Минеральные вещества они всасывают из почвы корневой системой, а органические - образуют сами в процессе фотосинтеза. Принципы классификации изучает особый раздел систематики - таксономия [от греч. taxis, расположение, порядок, + nomos, закон]. Все существующие классификации форм жизни весьма разнородны, ни одна из них не является полной, всеобъемлющей и принятой повсеместно. Чёткие границы мира растений и мира животных рухнули после открытия микроорганизмов. Для этого - третьего - царства живых существ Эрнста Хёккель (1866) предложил собирательное название протисты [от греч. protistos, первейший]. Всех их отличает более простое, чем у животных и растений, строение клетки. Высшие протисты (грибы, водоросли и простейшие) - эукариоты [от греч. eu-, хороший, добротный + katyon, ядро] - имеют морфологически обособленное ядро и митотически делятся, чем весьма напоминают растительные и животные клетки. Более просто организованную группу составляют прокариоты [от греч. pro-, предшествующий + karyon, ядро] - бактерии и сине-зелёные водоросли, чьи клетки не имеют мембраны вокруг вещества ядра. Позднее представителей микромира дополнили неклеточные формы жизни - вирусы, плазмиды, вироиды и др.

Принципы классификации микроорганизмов

Базовая категория любой биологической классификации, отражающая определённую стадию эволюции отдельной популяции организмов - вид - совокупность особей с одинаковым фенотипом, дающих плодовитое потомство и обитающих в определённом ареале. Для правильного понимания значения этого термина в классификации микроорганизмов необходимо знать различия видообразования между бактериями и высшими растениями и животными с обязательным половым размножением. Для видов последних характерно наличие популяций с относительно однородным набором генов, образовавшимся в результате перекрёстного скрещивания. Если отдельные части популяции изолировать друг от друга (например, географически), то вполне возможна их дивергентная эволюция. По прошествии определённого времени на географическую изоляцию накладывается физиологическая изоляция, приводящая к развитию отдельных частей популяции по собственному пути и образованию нового вида. В отличие от высших растений и животных, большая часть микроорганизмов не способна размножаться половым путём. Иными словами, у них отсутствуют механизмы, способные приводить к «прерывистому» видообразованию. В результате заполнения различных экологических ниш могут развиваться дивергентные эволюционные формы, но разница между ними обусловлена лишь различиями между экологическими нишами. Таким образом, определение понятия вид, как его применяют для организмов с половым размножением, нельзя полностью применять в отношении микроорганизмов. В связи с этим понятие вид для них трактуется произвольно.

Систематика микроорганизмов

Естественная (филогенетическая) систематика микроорганизмов имеет конечной целью объединение родственных форм, связанных общностью происхождения, и установление иерархического соподчинения отдельных групп. До настоящего времени отсутствуют единые принципы и подходы к объединению (или разделению) их в различные таксономические единицы, хотя для них пытаются использовать сходство геномов как общепринятый критерий. Очень многие микроорганизмы имеют одинаковые морфологические признаки, но различаются по строению геномов, родственные связи между ними часто бывают неясными, а эволюция многих просто неизвестна. Более того, краеугольное для каждой классификации понятие «вид» для бактерий до сих пор не имеет чёткого определения, а в ряде случаев истинное родство между бактериями может оказаться спорным, поскольку оно лишь отражает общность происхождения от одного далёкого предка. Такой упрощённый критерий, как размер, применявшийся на заре микробиологии, в настоящее время абсолютно неприемлем. Кроме того, микроорганизмы значительно различаются по своей архитектуре, системам биосинтезов, организации генетического аппарата. Их разделяют на группы для демонстрации степени сходства и предполагаемой эволюционной взаимосвязи. Базовый признак, используемый для классификации микроорганизмов - тип клеточной организации.

Искусственная (ключевая) систематика микроорганизмов. Более скромные задачи у искусственной систематики, объединяющей организмы в группы на основе сходства их важнейших свойств. Эту последнюю характеристику применяют для определения и идентификации микроорганизмов. С позиций медицинской микробиологии микроорганизмы обычно подразделяют в соответствии с влиянием, которое они оказывают на организм человека на патогенные, условно-патогенные и непатогенные. Несмотря на очевидную важность этого утилитарного подхода, их систематика всё же основана на принципах, общих для всех форм жизни. Для облегчения диагностики и принятия решений, касающихся лечения и прогноза заболевания, предложены идентификационные ключи. Сгруппированные в таком ключе микроорганизмы не всегда находятся в филогенетическом родстве, но перечисляются вместе, поскольку обладают несколькими, легко выявляемыми сходными свойствами. Разработаны разнообразные доступные и быстрые тесты, позволяющие, как минимум в общих чертах, идентифицировать выделенные от пациента микроорганизмы. В отношении бактерий наибольшее распространение нашли предложенные американским бактериологом Дэвид Бёрджи подходы к систематизации, учитывающие один или несколько наиболее характерных признаков. «Определитель бактерий Бёрджи» - характерный пример искусственной систематики. Согласно его принципам, легко выявляемые свойства являются основой для объединения бактерий в большие группы.

Принципы таксономии и номенклатуры микроорганизмов

Образование и применение научных названий микроорганизмов регламентируют «Международный кодекс номенклатуры бактерий», «Международный кодекс ботанической номенклатуры» (грибы), «Международный кодекс зоологической номенклатуры» (простейшие) и решения Международного комитета по таксономии вирусов. Все изменения научных названий микроорганизмов возможны лишь решениями соответствующих Международных конгрессов и Постоянных комитетов по номенклатуре.

Категории таксономической иерархии

Для микроорганизмов приняты следующие категории (таксоны) таксономической иерархии (по восходящей): Вид (Species) - Род (Genus) - Триба, или колено (Tribus) - Семейство (Familia) - Порядок (Ordo) - Класс (Classis) - Отдел (Divisio) - Царство (Regnum). При необходимости вводят категории (по восходящей): Подтриба, или подколено (Subtribus) - Подсемейство (Subfamilia) - Подпорядок (Subordo) - Подкласс (Subclassis) - Подотдел (Subdivisio).

Названия таксонов у микроорганизмов

Род и выше. Названия таксонов, имеющих ранг рода и выше, униноминальны (унитарны), то есть обозначаются одним словом, например Herpesviridae (семейство герпесвирусов).

Вид. Названия видов биноминальны (бинарны), то есть обозначаются двумя словами - название рода и вида. Например, Escherichia coli (кишечная палочка). Второе слово бинарного названия вида, взятое отдельно, не имеет статуса в номенклатуре и не может быть использовано для научного обозначения микроорганизма. Исключением выступают вирусы, видовые названия которых не бинарны, т.е. включают только видовое название (например, вирус бешенства).

Инфравидовые таксоны. Систематика бактерий включает также внутривидовые таксоны, названия которых не подчиняются правилам «Международного кодекса номенклатуры бактерий».

Подвид. Названия подвидов триноминальны (тринарны); для их обозначения применяют слово подвид (subspecies) после видового названия, например Klebsiella pneumoniae subsp ozenae (палочка озены, где ozenae - название подвида).

Вариант. Разнообразные механизмы изменчивости бактерий приводят к определённой нестабильности признаков, совокупность которых определяет тот или иной вид. Поэтому в систематике бактерий широко применяют понятие «вариант». Различают морфологические, биологические, биохимические, серологические и многие другие варианты. В медицинской бактериологии обычно выделяют серологические варианты (серовары), варианты, устойчивые к антибиотикам (резйстенсвары), бактериофагам (фаговары), а также варианты, различающиеся по биохимическим (хемовары), биологическим или культуральным признакам (биовары). Например, Vibrio cholerae биовар Eltor (холерный вибрион Эль-Тор) или Escherichia coli серовар О157:Н7 (представитель группы энтерогеморрагических кишечных палочек).

Штамм и клон. В микробиологии также применяют специализированные термины - «штамм» и «клон». Штаммом [от нем. stammen, происходить] называют культуру микроорганизмов, выделенную из определённого конкретного источника (какого-либо организма или объекта окружающей среды). Клоном [от греч. klon, отводок] называют культуру микроорганизмов, полученную из одной материнской клетки. Например, вирус гриппа A (H3N2) штамм Ленинград 34/72.

ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМАТИКИ ВИРУСОВ

Вирусы отнесены к царству Vira. В основу их классификации положен тип нуклеиновой кислоты, образующей геном. Соответственно выделяют рибовирусы (РНК-вирусы) и дезок-сирибовирусы (ДНК-вирусы). Для вирусов предложены следующие таксономические категории (по восходящей): Вид (Species) - Род (Genus) - Подсемейство (Subfamilia) - Семейство (Familia). Но категории подсемейств и родов разработаны не для всех вирусов. Видовые названия вирусов обычно связывают с вызываемыми ими заболеваниями (например, вирус бешенства) либо по названию места, где они были впервые выделены (например, вирусы Коксаки, вирус Эбола). Если семейство включает большое количество видов, то видовые названия дают в соответствии с антигенной структурой и разделяют их на типы (например, аденовирус 32 типа или вирус герпеса 1 типа). Реже используют фамилии учёных, впервые их выделивших (например, вирус Эпстайна-Барр или вирус саркомы Рауса). Иногда используют устаревшие названия групп вирусов, отражающих их уникальные эпидемиологические характеристики (например, арбовирусы). Классификационные признаки патогенных для человека вирусов приведены в табл. 3-1.

К вирусам отнесены вироиды [от virus и греч. eidos, сходство] - мелкие кольцевые однони-тевые суперспирализованные молекулы РНК (аналогичную организацию имеет геном вируса гепатита D). Поскольку у вироидов нет белковой оболочки, они не проявляют выраженных иммуногенных свойств, и поэтому их нельзя идентифицировать серологическими методами. Вироиды вызывают заболевания у растений. В качестве безымянного таксона в царство Vira также включены и прионы.

Основные критерии таксономической классификации вирусов

При систематизировании вирусов выделяют следующие основные критерии: сходство нуклеиновых кислот, размеры, наличие или отсутствие суперкапсида, тип симметрии нуклеокапсида, характеристика нуклеиновых кислот (молекулярная масса, тип кислоты (ДНК или РНК), полярность [плюс или минус], количество нитей в молекуле либо наличие сегментов, наличие ферментов), чувствительность к химическим агентам (особенно к эфиру), антигенная структура и иммуногенность, тропизм к тканям и клеткам, способность образовывать тельца включений. Дополнительный критерий - симптоматология поражений: способность вызывать генерализованные поражения либо инфекции с первичным поражением определённых органов (нейроин-фекции, респираторные инфекции и др.).

ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМАТИКИ БАКТЕРИЙ

Для идентификации и систематизации бактерий применены критерии, отражающие особенности их физиологии, морфологии, антигенных и других свойств.

Морфологические и тинкториальные свойства

Наиболее общие критерии для важных с медицинской точки зрения бактерий: величина, форма, агрегация (образование нитей, тетрад, пакетов), наличие капсулы, эндоспор, жгутиков, пигментов и способность окрашиваться красителями (то есть тинкториальные свойства). Наиболее распространена окраска по Граму - простое по технике выполнения окрашивание, основанное на способности воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового с йодом либо терять его после обработки этанолом. Грамположительные бактерии хорошо удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом. После обработки фуксином они окрашиваются в фиолетово-пурпурный цвет. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, то есть теряют комплекс генциа-нового фиолетового с йодом, и хорошо поглощают фуксин. В мазках они окрашиваются в малиново-красный цвет.

Кислотоустойчивые бактерии. Клеточная стенка некоторых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Подобные бактерии называют кислотоустойчивыми, их трудно окрашивать по Граму (хотя кислотоустойчивые бактерии рассматривают как грамположительные). Для их окраски применяют метод Цйля-Нйльсена.

Окрашивание по Граму или Цйлю-Нйльсену имеет диагностическую ценность в отношении бактерий, обладающих прочной клеточной стенкой. Они неприемлемы для окраски микоплазм (нет клеточной стенки) или спирохет (клеточная стенка тонкая и легко разрушается при окрашивании). Для изучения последних применяют различные методы нанесения на их поверхность контрастных субстратов (например, серебрение).

Подвижность

Важным дифференцирующим признаком является подвижность. В соответствии со способом передвижения выделяют скользящие бактерии, перемещающиеся за счёт волнообразных сокращений тела, и плавающие бактерии, движение которых обеспечивают жгутики или реснички.

Способность к спорообразованию

Для классификации некоторых бактерий учитывают их способность к спорообразованию, размеры спор и их расположение в клетке.

Физиологическая активность

Физиологическая активность является не менее важным отличительным признаком. Бактерии разделяют по способу питания, по типу получения энергии (дыхание, брожение, фотосинтез), по отношению к рН с указанием пределов устойчивости и оптимума роста и т.д. Наиболее важным критерием считают отношение к кислороду.

Аэробные бактерии используют молекулярный О₂ в качестве конечного акцептора электронов в процессе дыхания (см. главу 4). Большинство бактерий обладают связанной с мембраной цитохром-С-оксидазой, играющей ведущую роль в электронотранспортной цепи. Для выявления фермента применяют оксидазный тест, основанный на способности бесцветного вещества ^^диметил-р-фенилендиамина приобретать при восстановлении малиновый цвет.

Анаэробные бактерии не утилизируют молекулярный О₂ в качестве конечного акцептора электронов. Подобные бактерии получают энергию либо в процессе брожения, где конечными акцепторами электронов служат органические соединения, либо при анаэробном дыхании, используя отличный от кислорода акцептор электронов (например, NO^- , SO;!^- или Fe³+).

Факультативные бактерии могут получать энергию либо в процессе дыхания, либо при брожении в зависимости от наличия или отсутствия кислорода в окружающей среде.

Биохимические свойства

Для дифференцировки бактерий изучают их способность ферментировать углеводы, образовывать различные продукты (сероводород, индол) или гидролизовать белки.

Антигенные свойства

Антигенные свойства различных бактерий специфичны и связаны с особенностями строения клеточных структур, распознаваемых специальными антисыворотками как антигенные детерминанты. Типирование бактерий по антигенной структуре проводят в реакции агглютинации (РА), смешивая каплю антисыворотки с каплей бактериальной суспензии. При положительной реакции появляются отдельные агрегированные комочки в исходно однородной бактериальной суспензии. Выделяют следующие типы Аг:

Чувствительность к бактериофагам

Поскольку вирусы бактерий взаимодействуют только с чувствительными бактериями, то в ряде случаев для дифференцировки бактерий применяют их чувствительность к бактериофагам.

Химический состав

Важный классификационный признак - суммарный химический состав бактериальных клеток. Обычно определяют содержание и состав сахаров, липидов и аминокислот в клеточных стенках.

Генетическое родство

Для филогенетической классификации бактерий лучший и наиболее информативный показатель - генетическое родство. При систематизации бактерий на основании генетического родства учитывают ряд показателей.

Принципы систематизации бактерий в определителе Берджи

Определитель Бёрджи систематизирует все известные бактерии по нашедшим в практической бактериологии наибольшее распространение принципам идентификации бактерий, основанным на различиях в строении клеточной стенки и отношении к окраске по Граму. Определитель выделяет четыре основных категории бактерий - Gracillicutes [от лат. gracilis, изящный, тонкий, + cutis, кожа] - виды с тонкой клеточной стенкой, окрашивающиеся грамотрицательно; Firmicutes [от лат. firmus, крепкий, + cutis, кожа] - бактерии с толстой клеточной стенкой, окрашивающиеся грамположительно; Tenericutes [от лат. tener, нежный, + cutis, кожа] - бактерии, лишённые клеточной стенки (микоплазмы и прочие представители класса Mollicutes) и Mendosicutes [от лат. mendosus, неправильный, + cutis, кожа] - архебакте-рии (метан- и сульфатредуцирующие, галофильные, термофильные и архебактерии, лишённые клеточной стенки). Описание бактерий даётся по группам (секциям), в состав которых включены семейства, роды и виды; в некоторых случаях в состав групп входят классы и порядки. Патогенные для человека бактерии входят в небольшое число групп.

Группа 1. Спирохеты. Включает свободноживущие и паразитические виды; для человека патогенны представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira.

Группа 2. Аэробные и микроаэрофильные подвижные извитые и изогнутые грамотрицательные бактерии. Патогенные для человека виды входят в роды Campylobacter, Helicobacter и Spirillum.

Группа 3. Неподвижные (редко подвижные) грамотрицательные бактерии. Не содержит патогенные виды.

Группа 4. Грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки. Патогенные для человека виды включены в состав семейств Legionellaceae, Neisseriaceae и Pseudomonada-ceae; в группу входят также патогенные и условно-патогенные бактерии родов Acinetobacter, Afipia, Alcaligenes, Bordetella, Brucella, Flavobacterium, Francisella, Kingella и Moraxella.

Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки. Группа образована тремя семействами - Enterobacteriaceae, Vibrionaceae и Pasteurellaceae, каждое из которых включает патогенные виды, а также патогенные и условно-патогенные бактерии родов Calymmobac-terium, Cardiobacterium, Eikenella, Gardnerella и Streptobacillus.

Группа 6. Грамотрицательные анаэробные прямые, изогнутые и спиральные бактерии. Патогенные и условно-патогенные виды входят в состав родов Bacteroides, Fusobacterium, Porphy-romonas и Prevotella.

Группа 7. Бактерии, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфата или серы.

Не включает патогенные виды.

Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки. Включает условно-патогенные бактерии рода Veillonella.

Группа 9. Риккетсии и хламидии. Три семейства - Rickettsiaceae, Bartonellaceae и Chlamydiaceae, каждое из которых содержит патогенные для человека виды.

Группы 10 и 11 включают анокси- и оксигенные фототрофные бактерии, не патогенные для человека.

Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы. Объединяет серо-, железо- и марганецокисляющие и нитрифицирующие бактерии, не вызывающие поражения у человека.

Группы 13 и 14 включают почкующиеся и/или обладающие выростами бактерии и бактерии, образующие футляры. Представлены свободноживущими видами, не патогенными для человека.

Группы 15 и 16 объединяют скользящие бактерии, не образующие плодовые тела и образующие их. Группы не включают виды, патогенные для человека.

Группа 17. Грамположительные кокки. Включает условно-патогенные виды родов Enterococcus, Leuconostoc, Peptococcus, Peptostreptococcus, Sarcina, Staphylococcus, Stomatococcus и Streptococcus.

Группа 18. Спорообразующие грамположительные палочки и кокки. Включает патогенные и условно-патогенные палочки родов Clostridium и Bacillus.

Группа 19. Споронеобразующие грамположительные палочки правильной формы. Включает условно-патогенные виды родов Erysipelothrix и Listeria.

Группа 20. Споронеобразующие грамположительные палочки неправильной формы. В состав группы входят патогенные и условно-патогенные виды родов Actinomyces, Corynebacterium, Gardnerella, Mobiluncus и др.

Группа 21. Микобактерии. Включает единственный род Mycobacterium, объединяющий патогенные и условно-патогенные виды.

Группы 22-29. Актиномицеты. Среди многочисленных видов лишь нокардиоформные актиномицеты (группа 22) родов Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Jonesia, Oerskovia и Terrabacter способны вызывать поражения у человека.

Группа 30. Микоплазмы. Патогенны для человека виды, включённые в состав родов Acholeplasma, Mycoplasma и Ureaplasma.

Остальные группы - метаногенные бактерии (31), сульфатредуцирующие бактерии (32), экстремально галофильные аэробные архебактерии (33), архебактерии, лишённые клеточной стенки (34), экстремальные термофилы и гипертермофилы, метаболизирующие серу (35)- не содержат патогенные для человека виды.

ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМАТИКИ ГРИБОВ

Грибы отнесены к царству Fungi (Mycota), подразделяемому на отделы Myxomycota (грибы-слизевики) и Eumycota (истинные грибы). Истинные грибы, гифы которых не имеют перегородок, известны как низшие грибы. К ним относят классы Chrytidiomycetes, Hyphochrytidiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes. Представители классов Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes - высшие грибы, т.к. их гифы имеют перегородки-септы. К ним относят подавляющее большинство видов, вызывающих заболевания у человека.

Зигомицеты [от греч. zygon, сочленение, + mykes, гриб] представлены быстрорастущими видами, обычно обитающими в почве. При культивировании in vitro образуют обильный сероватый или белый воздушный мицелий. Их гифы не имеют перегородок либо септированы частично. Размножаются половым и бесполым путём (см. рис. 2-10, 2-11). Бесполое размножение реализуется через образование спорангиофоров со спорангиями. Половое размножение приводит к образованию зигот - зигоспор. Поражения человека носят выраженный оппортунистический характер. Их возбудителями могут быть представители родов Absidia, Mortierella, Mucor, Rhizopus, Entomophthora, Conidiobolus и Basidiobolus.

Аскомицеты [от греч. askos, сумка, + mykes, гриб] получили своё название из-за наличия основного органа плодоношения - сумки, содержащей 4 или 8 гаплоидных половых аскоспор. Гифы имеют выраженные перегородки. Размножаются половым (через образование аскоспор) и бесполым (через формирование конидий) путём. К аскомицетам относят и дрожжи - одноклеточные грибы, утратившие способность образовывать мицелий. Возбудителям микозов человека выступают Pseudoallescheria boydii и представителей родов Geotrichum, Microsporum и Trichophyton.

Базидиомицеты [от греч. basidon, маленькая основа, + mykes, гриб] имеют характерный орган спороношения - базидий. Последний состоит из вздутой терминальной клетки, расположенной на тонком стебле. На базидии путём мейотического деления развиваются, отшнуровы-ваясь от него, базидиоспоры. Единственным патогеном для человека видом выступает Filobasidiella neoformans (половая форма Cryptococcus neoformans var. neoformans).

Дейтеромицеты [от греч. deuteros, вторичный, + mykes, гриб] не образуют настоящую филогенетическую группу, а выступают в качестве таксономической «свалки», куда помещают виды, у которых половая (совершенная) стадия размножения отсутствует либо не выявлена. Их классификация основана на формах спороношения или других внешних признаках и служит только практическим целям. Для них установленным считают лишь бесполое размножение, поэтому дейтеромицеты также известны как несовершенные грибы (Fungi imperfecti). По морфологическим признакам большинство дейтеромицетов сходно с аскомицетами. Большая часть возбудителей микозов человека входит в группу несовершенных грибов.

Кодекс названий грибов

Кодекс названий грибов содержит положения, предусматривающие присвоение отдельных наименований совершенной (половой, или сумчатой) и несовершенной (бесполой, или кониди-альной) стадиям. У многих грибов известны бесполые стадии (анамбрфы) стадии и неизвестны половые стадии (телеомбрфы). Поэтому кодекс разрешает давать различным стадиям (если таковые есть) различные названия. Например, половые формы дрожжевого гриба Cryptococcus neoformans сероваров А и D систематизируют как Filobasidella neoformans var. neoformans либо как C. neoformans var. neoformans. Телеоморфы сероваров В и С - как Filobasidella neoformans var. bacillispora либо как C. neoformans var. gatti.

ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМАТИКИ ПРОСТЕЙШИХ

Простейшие включены в царство Animalia, подцарство Protozoa, разделённое на 7 типов. Виды, патогенные для человека, входят в состав трёх типов - Sarcomastigophora, Apicomplexa и Ciliophora. Всего насчитывают около 30 000 видов простейших, среди которых около 7000 видов патогенны для различных растений, животных и человека.

Тип Sarcomastigophora [от греч. sarx, плоть, + mastix, бич, + phoros, носить] включает подтипы Sarcodina и Mastigophora.

Подтип Sarcodina [от греч. sarkodes, мясистый] включает живущих свободно простейших - амёб, передвигающихся за счёт образования выростов цитоплазмы - ложноножек-псевдоподий. Размножаются делением, способны образовывать цисты. Включает патогенные виды, поражающие кишечник (Entamoeba histolytica) и органы ЦНС (Naegleria fowleri и виды Acanthamoeba).

Подтип Mastigophora [от греч. mastix, бич + phoros, носить]. Характерная особенность - наличие одного или нескольких жгутиков. Принципиальное отличие жгутиков простейших от жгутиков бактерий заключается в наличии кинетопласта - особой органеллы, расположенной у основания жгутика и вырабатывающей энергию для его движения. У некоторых видов движение обеспечивает ундулирующая мембрана - тонкая гребнеобразная перепонка, продольно соединяющая жгутик с телом простейшего. В организме человека обитают многочисленные представители жгутиковых, но патогенные виды входят в состав лишь четырёх родов - Trichomonas, Giardia, Leishmania и Trypanosoma.

Тип Ciliophora [от лат. cilium, ресница] включает так называемые ресничные инфузории, имеющие реснички, с помощью которых они передвигаются. Размножаются путём деления, но также способны к конъюгации. В неблагоприятных условиях образуют цисты. Среди всех видов, обитающих в кишечнике человека, безусловно патогенное значение имеет лишь Balantidium coli - самый крупный представитель паразитических простейших человека.

Тип Apicomplexa [от лат. apex, apicis, конец, вершина, + complexus, сотканный вместе]. Тип составляют только паразитические виды, колонизирующие организмы позвоночных и беспозвоночных животных. Для них характерны как исключительно половой путь развития, так и чередование полового и бесполого поколений, обычно связанное с переменой хозяев. Своим названием обязаны способности образовывать скопления клеток, защищённые общей плотной оболочкой. Нередко эти клетки условно называют спорами (отсюда название класса споровики - Sporozoea). Помимо споровиков, тип включает подклассы Coccidia и Piroplasma.

В этой главе рассмотрены морфология и химический состав бактерий (раздел «Анатомия бактериальной клетки»), а также их физиология (включая энергетический метаболизм) и генетика.

АНАТОМИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Один из основных признаков прокариотической клетки - отсутствие внутреннего разделения, обеспечиваемого элементарными мембранами. По сути, единственная мембранная система прокариотической клетки - ЦПМ, входящая в состав клеточной оболочки, часто сложно устроенная и проникающая поперечными складками глубоко в цитоплазму. В составе любой стабильной бактериальной клетки выделяют условные компартменты поверхностные структуры, клеточную оболочку и цитоплазму.

Поверхностные структуры

Основные поверхностные структуры бактериальной клетки - капсула, жгутики и микроворсинки. Их наличие - относительно стабильный признак, используемый для идентификации бактерий.

Капсула

Клеточную оболочку многих бактерий окружает слой аморфного, сильно обводнённого вещества. Этот «покров» выполняет важные функции: делает оболочку клетки (состоящей из клеточной стенки и ЦПМ) более плотной и прочной, предохраняет бактерии от воздействия бактерицидных факторов, обеспечивает адгезию на различных субстратах, может содержать запасы питательных веществ.

Организация капсул. Основную роль в организации капсул бактерий играет ЦПМ. Выделяют микрокапсулы (выявляемые только при электронной микроскопии в виде слоя мукополисахаридных микрофибрилл) и макрокапсулы (обнаруживают при световой микроскопии). У некоторых бактерий полимеры клеточной оболочки, выделяемые наружу, свободно располагаются вокруг неё, образуя слизистый слой. Капсулированные бактерии могут превращаться в бескапсульные варианты и, поскольку первые образуют мукоидные или гладкие (S), а бескапсульные - шероховатые ® колонии, это явление известно как S- и R-диссоциация. Капсула и слизистый слой не препятствуют поступлению и выходу различных веществ из бактериальной клетки, а также плохо удерживают красители.

Окраска капсул. Для облегчения микроскопирования капсулы можно сделать видимыми, проведя негативную окраску мазка по Буррй-Гйнсу или Хйссу либо с помощью реакции набухания по Нойфельду (см. ниже).

Состав капсул. В состав большинства бактериальных капсул входят сложные полисахариды. Капсулы также могут содержать соединения азота (например, у пневмококков капсула состоит из полисахаридов, глюкозамина и глюкуроновой кислоты), но могут и не содержать азот (например, капсулы лейконостоков состоят из декстрана, левулана, фруктозана и других полимеризованных моносахаров). Капсулы некоторых болезнетворных бактерий (например, Bacillus anthracis) формируют полисахариды и полипептиды, образованных мономерами D-глутаминовой кислоты. Поскольку D-аминокислоты устойчивы к воздействию протеаз, такая капсула лучше защищает бактерию от ферментативных воздействий фагоцитов.

Антигенные свойства. Капсульные Аг (К-Аг) многих патогенных бактерий проявляют выраженные иммуногенные свойства (например, вакцины против пневмококковых и менинго-кокковых инфекций готовят из материала капруа). Связывание АТ с капсулой изменяет её светопреломляющие характеристики, вызывая кажущееся набухание капсулы, видимое при соответствующих условиях освещения под микроскопом и известное как реакция Ндйфелъда.

Жгутики

По характеру движения подвижные бактерии разделяют на плавающие и скользящие (ползающие). Орган движения плавающих бактерий - жгутики; подвижность скользящих бактерий обеспечивают волнообразные сокращения тела. Расположение жгутиков - характерный признак, имеющий таксономическое значение. Варианты расположения жгутиков приведены на рис. 4-1. У некоторых бактерий жгутики расположены по всей поверхности клеточной стенки (например, у бактерий рода Proteus), такие бактерии известны как перитрихи [от греч. peri-, вокруг, + trichos, волос]. Некоторые бактерии снабжены только одним толстым жгутиком (например, представители рода Vibrio), они известны как монотрихи. Политрихи - бактерии, имеющие одиночный по виду жгутик, образованный пучком из 2-50 жгутиков. Полярные жгутики прикреплены к одному или обоим концам бактерии. Монополярно-политрихиальное расположение жгутиков имеют лофотрихи [от греч. lophos, пучок, + trichos, волос], к ним, например, относят представителей рода Pseudomonas. Биполярно-политрихиальное жгутикование имеют амфитрихи [от греч. amphi-, двухсторонний, + trichos, волос] (например, бактерии рода Spirillum).

Жгутик - спирально изогнутая полая нить, образованная субъединицами флагеллина. У разных бактерий толщина жгутиков варьирует от 12 до 18 нм, что составляет не более 1/10 диаметра жгутиков водорослей и простейших. Жгутики также различают по длине и диаметру витка. Место прикрепления жгутика к бактериальной клетке имеет сложное строение и состоит из базалъной структуры и так называемого «крюка» (рис. 4-2). У грамположительных бактерий в состав базальной структуры входит одна пара, а у грамотрицательных бактерий две пары колец. Кольца играют роль «приводного диска» и «подшипника». Вся конструкция выполняет функцию хемомеханического преобразователя (флагелли-новый мотор). У спирохет за движение ответственна особая органелла - осевая нить, состоящая из двух рядов бактериальных жгутиков, расположенных продольно внутри клетки.

Бактериальные жгутики совершают поступательные и вращательные движения, проталкивая бактерии через среду подобно корабельному винту. Они также могут изменять направление вращения и тянуть клетку подобно пропеллеру. Скорость обратного движения в четыре раза меньше скорости поступательного движения. Некоторые перитрихи могут перемещаться по поверхности агара, то есть плавающие бактерии способны к передвижению по поверхности твёрдых сред. В частности, Proteus vulgaris распространяется по поверхности агара, образуя тонкий налёт (напоминающий таковой при выдохе на холодное стекло), а неподвижные штаммы протея лишены такой способности. Это явление получило название «феномен роения», а наблюдение за ним легло в основу некоторых понятий бактериальной серодиагностики. Так, жгутиковые Аг называют Н-Аг [от нем. Hauch, выдох, налёт], а Аг клеточной поверхности - О-Аг [от нем. ohne Hauch, без налёта].

Способность бактерий к целенаправленному движению генетически обусловлена. Например, у Escherichia coli в регуляцию этого процесса вовлечено 3% генома (приблизительно 50 генов). Эти гены кодируют белки, образующие локомоторный аппарат, а также белки и ферменты, участвующие в преобразовании сигналов.

Для жгутикового аппарата характерна периодическая изменчивость. Во многом этот процесс носит адаптивный характер и наиболее выражен у патогенных микроорганизмов. В частности, некоторые бактерии выработали систему вариабельности антигенных характеристик жгутиков, позволяющую им на какое-то время избегать направленных эффектов защитных иммунных механизмов.

Лабораторная диагностика. Подвижность бактерий определяют микроскопией препаратов в «раздавленной» или «висячей» капле. Способность к движению можно определять также после внесения культуры бактерий уколом в столбик полужидкого агара (подвижные виды растут по всей толще среды, неподвижные - по уколу) или посевом бактерий в водный конденсат скошенного столбика агара (подвижные виды переплывают из конденсата на поверхность среды и колонизируют её), либо определяют способность бактерий давать «феномен роения».

Микроворсинки

Помимо жгутиков, поверхность многих бактерий покрыта цитоплазматическими выростами - микроворсинками. Обычно это волоски (числом от 10 до нескольких тысяч) толщиной 325 нм и длиной до 12 мкм. Микроворсинки встречают как у подвижных, так и у неподвижных бактерий. Эти выросты способствуют увеличению площади поверхности бактериальной клетки, что даёт ей дополнительные преимущества в утилизации питательных веществ из окружающей среды. Известны специализированные микроворсинки - фимбрии и пили. Фимбрии [от лат. fimbria, бахрома]. Многие грамотрицательные бактерии имеют длинные и тонкие микроворсинки, пронизывающие клеточную стенку. Образующие их белки формируют спиралевидную нить. Основная функция фимбрий - прикрепление бактерий к субстратам (например, к поверхности слизистых оболочек), что делает их важным фактором колонизации и патогенности. F-пили [от англ. fertility, плодовитость, + лат. pilus, волосок], или «секс-пили», - жёсткие цилиндрические образования, участвующие в конъюгации бактерий. Пили впервые обнаружены у Escherichia coli KI2, то есть у штаммов, содержащих F-фактор (см. раздел «Плазмиды»). Обычно клетка снабжена 1-2 пилями, имеющими вид полых белковых трубочек длиной 0,5-10 мкм; нередко они имеют шаровидное утолщение на конце. Большинство F-пилей образует специфический белок - пилин. Образование пилей кодируют плазмиды. Их идентифицируют с помощью донорспецифических бактериофагов, адсорбирующихся на пилях и лизирующих клетки.

Клеточная оболочка

У большинства бактерий клеточная оболочка состоит из клеточной стенки и находящейся под ней ЦПМ. С долей условности клеточную оболочку можно назвать «живой кожей» бактерий в противоположность «мёртвому веществу» капсулы. Клеточную оболочку можно сравнить с тонкой и эластичной, но в то же время прочной покрышкой футбольного мяча. Как мячу придаёт упругость хорошо накачанная футбольная камера, так и клеточной стенке бактерий дополнительную упругость придаёт внутреннее (тургорное) давление цитоплазмы, способное достигать у грамположительных бактерий 30 атм. Некоторые бактерии в качестве наружного слоя клеточной стенки дополнительно имеют внешнюю мембрану-гликокаликс. Гликокаликс [от греч. glykys, сладкий, + Icalyx, раковина] образован переплетением полисахаридных волокон (декстраны и леваны). Его не обнаруживают при выращивании на искусственных питательных средах. Основная функция гликокаликса - адгезия к различным субстратам. Например, благодаря гликокаликсу Streptococcus mutans способен прочно прикрепляться к зубной эмали.

Клеточная стенка

Основные функции клеточной стенки следующие.

Пептидогликан . Опорный каркас клеточной стенки бактерий - пептидогликан (муре-ин) - гетерополимер, состоящий из повторяющихся дисахаридных групп, соединённых поперечными и боковыми цепочками (рис. 4-3). «Остов» молекулы пептидогликана - дисахарид. Его образуют N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовая кислота, соединённые через р-гликозидные связи. К молекуле N-ацетилмурамовой кислоты присоединяются олигопептиды, образующие боковые цепочки.

Связывание фрагментов пептидогликана заключается в образовании пептидной связи между терминальным остатком аминокислотного мостика (D-аланином) с предпоследним остатком примыкающего аминокислотного мостика (L-лизином или диаминопимелиновой кислотой в зависимости от вида бактерии). Боковые мостики образуют четыре аминокислоты, поперечные (вертикально связывающие слои пептидогликана) - пять аминокислот. В состав боковых мостиков также входят уникальные аминокислоты, присутствующие только у прокариот, например, диаминопимелиновая кислота (у большинства грамотрицательных бактерий) и D-изомеры глутаминовой кислоты и алани-на. Эти соединения - «ахиллесова пята» бактерий, так как препараты, ингибирующие синтез компонентов клеточной стенки, обычно безвредны для растений и животных.

Пептидогликан лабилен к действию различных агентов. В частности, лизоцим гидролизует пептидогликан, расщепляя гликозидные связи между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой, то есть лизоцим действует как N-ацетилмурамидаза. Пептидазы расщепляют межпептидные связи, амидазы - связи между N-ацетилмурамовой кислотой и боковым пептидом (L-аланином). Лизостафин разрушает поперечные мостики пептидогликанов стафилококков. р-Лактамные антибиотики нарушают связывание боковых мостиков.

Гетерополимерные пептидогликановые цепочки, соединённые пептидными связями, образуют гигантскую мешковидную макромолекулу («муреиновый мешок»), покрывающую всё тело бактерии. На поверхности «муреинового мешка» и в его толще располагаются различные вещества, характер и содержание которых лежит в основе разделения бактерий на грамположи-телъные и грамотрицательные (рис. 4-4).

Грамотрицательные бактерии. Грамотрицательные бактерии имеют сравнительно тонкую клеточную стенку. В ней выделяют два слоя - пластичный и ригидный. Последний образован одним, редко двумя слоями пептидогликана, содержание которого составляет не более 20% сухой массы клеточной стенки. На пептидогликановом каркасе расположены фос-фолипиды, липополисахарилы (ЛПС) и белки, образующие пластичный слой. Толщина пластичного слоя значительно превышает размеры монослоя пептидогликана. Его компоненты расположены мозаично и могут образовывать дополнительную внешнюю мембрану либо переходить в капсулу.

О-специфичная боковая цепь

Повторяющееся звено, несущее антигенные свойства

Внешняя мембрана не пропускает молекулы с большой молекулярной массой, что можно рассматривать как фактор неспецифической устойчивости бактерий к некоторым антимикробным препаратам.

Грамположительные бактерии. Грамположительные бактерии имеют сравнительно просто организованную, но мощную клеточную стенку. Она состоит преимущественно из множества слоёв пептидогликана, составляющего до 90% её сухой массы (см. рис. 4-4), часто включающих вместо диаминопимелиновой кислоты лизин и уникальные водорастворимые полимеры тейхоевых кислот, состоящих из 8-50 остатков глицерина или рибита, связанных между собой фосфодиэфирными связями. Тейхоевые кислоты [от греч. teichos, стенка] могут составлять до 50% сухого веса клеточной стенки. Известно два типа кислот - рибиттейхоевые (состоят из остатков рибитфосфата и 10-50 остатков спирта) и глицеринтейхоевые (состоят из остатков глицерофосфата и 20 остатков спирта). Клеточная стенка каждого вида содержит только один тип тейхоевых кислот (за исключением вида Streptomyces). Тейхоевые кислоты - основные поверхностные Аг многих бактерий. У большей части грамположительных бактерий также имеются периплазматические тейхоевые кислоты, располагающиеся между клеточной стенкой и ЦПМ. Периплазматические кислоты, выявляемые горячей кислотной экстракцией, являются группоспецифичными Аг.

Клеточная стенка грамположительных бактерий не содержит ЛПС, но может включать различные белки. Содержание последних весьма вариабельно. Для некоторых бактерий (например, стрептококков группы А) белки служат серовароспецифичными Аг.

Аутолизины . Клеточные стенки бактерий содержат аутолизины - ферменты, растворяющие пептидогликановый слой. Их активность необходима для процессов роста клеточной стенки, деления клеток, споруляции и достижения состояния компетентности при трансформации (см. ниже).

Удаление клеточной стенки , защищающей прилежащую ЦПМ, приводит к лизису бактерии либо к образованию протопластов или сферопластов (из грамположительных или грамотрицатель-ных бактерий соответственно). Бактерии, лишённые клеточной стенки, лишь в изотонической среде способны поглощать О₂ и выделять СО₂ , а также размножаться. Сферопласты более устойчивы к изменениям осмотического давления и длительно сохраняются в неизотонической среде.

Цитоплазматическая мембрана

ЦПМ играет важную роль в обмене веществ бактерий, играя роль осмотического барьера, контролирующего поступление и выход различных веществ из клетки. Иными словами, ЦПМ - физический, осмотический и метаболический барьер между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой.

Состав. Как и многие биологические мембраны, ЦПМ состоит из двух слоёв липидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул. В состав ЦПМ бактерий входят белки (20-75%), липиды (25-40%), углеводы и РНК (последние два компонента присутствуют в незначительных количествах). Компоненты ЦПМ составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Белки ЦПМ подразделяют на структурные и функциональные. Первые образуют различные структуры ЦПМ, вторые представлены ферментами, участвующими в синтетических реакциях на поверхности мембраны и в окислительно-восстановительных процессах, а также некоторыми специализированными энзимами (например, пермеазы). Липиды, входящие в состав ЦПМ, представлены насыщенными или мононенасыщенными жирными кислотами, но не стеринами, как у эукариотических клеток.

Транспортные системы. Для ЦПМ характерна выраженная избирательная проницаемость. В ней располагаются системы активного переноса и субстратспецифичных пермеаз. Некоторые белковые молекулы, «вкрапленные» в фосфолипидный бислой, играют роль «пор», через которые движется регулируемый поток веществ. У аэробных бактерий и анаэробов, способных к так называемому «анаэробному дыханию», в ЦПМ встроена система электронного транспорта, обеспечивающая её энергетические потребности. Самые крупные молекулы, способные проходить через ЦПМ, - фрагменты ДНК.

Мезосомы. ЦПМ образует специфические инвагинаты - мезосомы, имеющие вид закрученных в спираль или клубок трубчатых образований. Мезосомы образуют поперечные перегородки между делящимися клетками; к ним обычно прикрепляется бактериальная хромосома.

Периплазматическое пространство. У некоторых бактерий между ЦПМ и клеточной стенкой располагается периплазматическое пространство - полость шириной около 10 нм. В периплазматическом пространстве имеются перемычки, соединяющие ЦПМ и пептидогликано-вый слой. Снаружи в периплазматическое пространство открываются поры клеточной стенки, изнутри в это пространство выходят некоторые клеточные ферменты (рибонуклеазы, фосфата-зы, пенициллиназа и др.).

Цитоплазма

Цитоплазма бактерий представляет собой коллоидный матрикс, служащий для реализации жизненно важных функций. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК, рибосомы и запасные гранулы; остальное пространство занимает коллоидная фаза. Её основные составляющие - растворимые ферменты и растворимые РНК (мРНК и тРНК). Разнообразные орга-неллы, характерные для эукариотической клетки, у бактерий отсутствуют, а их функции выполняет бактериальная ЦПМ, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. У подавляющего числа бактерий цитоплазма относительно неподвижна, но у видов Streptococcus, Proteus, Clostridium имеются специальные трубочки - рапидосомы, аналогичные микротрубочкам простейших.

Бактериальный геном. В бактериальной клетке нет ядерной мембраны, ДНК сконцентрирована в цитоплазме в виде клубка. Поскольку в эукариотических клетках ДНК обычно находится в ядре, то по аналогии ДНК бактерий назвали нуклебидом [от лат. nucleus, ядро + греч. eidos, сходство]. Её также называют генофором, или бактериальной хромосомой. Генофор бактерий представлен двойной спиральной, кольцевой, ковалентно замкнутой суперспирализованной молекулой ДНК. Она составляет 2-3% сухой массы клетки (более 10% по объёму). Гено-фор не содержит гистонов. Объём генетической информации, кодируемой в генофоре, различается в зависимости от вида бактерии (например, геном Escherichia coli кодирует примерно 4000 различных полипептидов). У бактерий может присутствовать дополнительная ДНК в виде включений. Эти включения, или плазмиды, несут ряд различных генов, кодирующих дополнительные свойства бактерий, но информация, содержащаяся в плазмидах, не является абсолютно необходимой для бактериальной клетки.

Бактериальные рибосомы

Бактериальные рибосомы - сложные глобулярные образования, состоящие из различных молекул РНК и связанных с ними белков. Всё образование функционирует как локус синтеза полипептидов. В зависимости от интенсивности роста бактериальная клетка может содержать от 5000 до 50 000 рибосом. Диаметр бактериальных рибосом около 16-20 нм. Скорость их осаждения при ультрацентрифугировании составляет 70 S (единиц Сведберга), тогда как у эукариотических клеток - 80 S. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц с коэффициентом седиментации 50 S и 30 S (у эукариот 40 S и 60 S). Объединение субъединиц происходит перед началом трансляции. Рибосомы прокариот и эукариот имеют сходную молекулярную структуру и механизмы функционирования, но различаются, помимо размеров, по составу белков и белковых факторов. Эти различия делают рибосомы эукариот практически резистентными к действию антибиотиков, блокирующих синтез белка у бактерий.

Запасные гранулы

Запасные гранулы содержат временный избыток метаболитов; наличие и количество гранул изменяется в зависимости от вида бактерий и их метаболической активности. В виде гранул могут запасаться полисахариды (крахмал, гликоген, гранулёза), жиры (триглицериды, сходные с жирами высших животных, запасаются у дрожжей рода Candida) воска - у микобакте-рий и нокардий; полимеры в-оксимасляной кислоты (например, в клетках Bacillus megaterium), полифосфаты (волютин) у Spirillum volutans и Corynebacterium diphtheriae, сера (у бактерий, окисляющих сульфиды), кристаллизованные белки (например, токсичный для насекомых протоксин у Bacillus thuringiensis).

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Жизнь бактерий, как и других живых существ, в упрощённом виде сводится к таким последовательным событиям: собственное воспроизведение - обеспечение жизненных функций - воспроизведение потомства. Нормальная реализация этого круговорота жизни для любого вида бактерий возможна лишь при развитии адекватных ответных реакций на любые воздействия окружающей среды, что во многом обеспечивается генетической информацией организма. Жизнь бактерий, равно как и всех живых существ, характеризуется ростом и размножением, то есть увеличением живой массы отдельной особи и популяции в целом за счёт ассимиляции веществ, находящихся вне клетки. В данном аспекте нет никакой существенной разницы между питанием паразитической бактерии или автотрофной бактерии, использующей, подобно высшим растениям, углекислоту и минеральные вещества. Во всех случаях процесс питания сводится к усвоению экзогенных субстратов и превращению их (через каскад сложных реакций) в вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности бактерий.

Питание бактерий

Пищей принято называть любое вещество, которое, попав в организм, служит источником энергии или пластическим материалом для синтеза молекул, используемых для нужд организма. Большинство животных, включая человека, способно заглатывать и переваривать плотные частички пищи в основном за счёт их гидролиза. Подобный тип питания известен как голо-зойный, а организмы - голозои [от греч. holes, полноценный, + zoikos, относящийся к животным]. Бактерии не способны захватывать твердофазные объекты, поэтому утилизируют питательные вещества в виде относительно простых молекул из водных растворов. Подобный тип питания, присущий также всем растениям, известен как голофитный, то есть бактерии - голофиты [от греч. holos, полноценный, + phytikos, относящийся к растениям]. Тем не менее, многие бактерии способны утилизировать твёрдую пищу с помощью так называемого внешнего питания, реализуемого вне клеток, то есть бактериям также присущ и голозойный тип питания. Для этого они имеют мощный ферментативный потенциал, хотя иногда секретируемые ферменты могут полностью инактивироваться в результате разведения, под действием конвекционных токов и других факторов. Контакт пищеварительных ферментов с экзогенным субстратом приводит к образованию низкомолекулярных продуктов, проникающих через клеточную стенку в цитоплазму. Начиная с этого момента, процессы их усвоения (метаболизма) в растительных и животных клетках протекают удивительно сходно.

Клетки всех живых существ, от самых примитивных форм до высокоразвитых животных и растений, не только состоят из одних и тех же веществ, но и используют одни и те же механизмы для получения энергии и для роста. По сравнению с этим фундаментальным биохимическим единством существующие различия и отклонения кажутся незначительными.

Вода

Вода составляет около 80% массы бактерий. Рост и развитие бактерий облигатно зависят от наличия воды, так как все химические реакции, протекающие в живых организмах, реализуются в водной среде. Для нормального роста и развития микроорганизмов необходимо присутствие воды в окружающей среде. Для бактерий содержание воды в субстрате должно быть более 20%. Вода должна находиться в доступной форме: в жидкой фазе в интервале температур от 2 °С до 60 °С; этот интервал известен как биокинетическая зона. Хотя в химическом отношении вода весьма устойчива, продукты её ионизации - ионы Н+ и ОН^- оказывают очень большое влияние на свойства практически всех компонентов клетки (белков, нуклеиновых кислот, липидов и т.д.). Так, каталитическая активность ферментов в значительной мере зависит от концентрации ионов Н+ и ОН^- .

Усваиваемые соединения

Основные соединения, усваиваемые бактериальной клеткой - углеводы, аминокислоты, органические кислоты, жирные кислоты, минеральные вещества, витамины и др. Бактериям совершенно безразличны источники питательных веществ; образно говоря, они «лишены вкуса и не страдают несварением желудка». Более того, бактерии иногда утилизируют вещества, не пригодные для животных клеток (например, карболовую кислоту, парафин, мыло и др.). Подобно прочим формам жизни, бактерии нуждаются в одних и тех же макроэлементах - С, Н, О, N, P, S, K, Са, Mg, Fe. Микроэлементы (следовые элементы) - Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Va, B, Cl, Na, Se, Si, Wo - не нужны каждому организму, но бактериям они необходимы для синтеза коферментов либо поддержания специфического типа метаболизма. Например, для оптимального роста некоторые бактерии нуждаются в высоких концентрациях Na+; их называют галофилами [от греч. hals, соль]. Помимо источников углерода, энергии и элементов минерального питания, многие микроорганизмы нуждаются в некоторых дополнительных веществах, называемых факторами роста. Количественная потребность в питательных элементах и их содержание у различных бактерий варьируют, но принципиально химический состав бактериальной клетки сходен с другими живыми клетками (исключением является отсутствие у бактерий стеролов).

Пути поступления веществ в бактериальную клетку

Для того, чтобы питательные вещества могли подвергнуться соответствующим превращениям в клетке, они прежде всего должны в неё проникнуть. Но большинство бактерий обитает в условиях, мало пригодных для поддержания строгих соотношений воды, неорганических и органических веществ, без которых их жизнь просто невозможна. Клеточная стенка бактерий не является существенным барьером для небольших молекул и ионов, но задерживает макромолекулы. Истинный барьер, обеспечивающий избирательное поступление веществ в клетку, - ЦПМ. Она проницаема для одних веществ и не проницаема для других. Потоки веществ движутся в обоих направлениях (внутрь и наружу). Эти перемещения обеспечивают разнообразные транспортные системы, необходимые для выполнения двух важнейших задач.

Пассивный перенос

Многие вещества способны неспецифически проникать в бактериальную клетку за счёт различия их концентраций по обе стороны ЦПМ. При этом они поступают в клетку только до выравнивания градиента концентрации с внешним раствором. Такое поступление веществ происходит пассивно, без прямых энергетических затрат. Существует два вида пассивной диффузии: простая и облегчённая.

Простая диффузия. Проникновение веществ носит неспецифический характер и целиком зависит от размеров молекул и их липофильности. Скорость подобного переноса незначительна.

Облегчённая диффузия. Механизм транспорта носит аналогичный характер, но проникновение облегчают «помощники» - специфические мембранные белки-пермеазы, способствующие прохождению различных молекул через ЦПМ. Транспорт сопровождается образованием комплекса «вещество-пермеаза». После преодоления ЦПМ комплекс диссоциирует, а пермеаза используется для последующего «проведения» других молекул. Подобный тип транспорта реализуется по градиенту концентрации и характерен для эукариот при поглощении сахаров. У прокариот единственный пример облегчённой диффузии - проникновение глицерина в клетки бактерий кишечной группы. При этом концентрация проникшего глицерина практически равна его концентрации в окружающей среде. В последующем (в результате реакций фосфорилирования) глицерин трансформируется в глицерин-3-фосфат.

Активный перенос

Концентрация некоторых веществ в бактериальной клетке может в сотни раз превышать их содержание в окружающей среде. Транспорт таких веществ в клетку происходит против градиента концентрации перемещаемого вещества, требует затрат энергии и реализуется при помощи специфических переносчиков. Например, в случае активного транспорта, как и при облегчённой диффузии, перемещение конкретного вещества через ЦПМ осуществляет специфическая для такого вещества пермеаза.

Активный транспорт сопровождается увеличением свободной энергии, которая составляет 5,71 lg C₂ /Cj кДжхмоль, где C₂ и Ц - соответственно более высокая и более низкая концентрации. Это обстоятельство делает процесс активного транспорта энергозависимым. У бактерий подобный тип поступления веществ доминирует, с его помощью транспортируются многие сахара, белки и другие вещества. Нередко у грамотрицательных бактерий в активном переносе участвуют специальные белки, отличные от пермеаз, но действующие в ассоциации с ними. Эти белки локализованы в периплазматическом пространстве. После проникновения вещества в клетку комплекс «субстрат - белок периплазмы - пермеаза» диссоциирует и для попавшего в клетку вещества вероятность выхода наружу резко снижается.

Примером активного транспорта служит концентрирование лактозы в клетках кишечной палочки. Эта система известна как р-галактозидпермеазная система. Энергия используется для снижения сродства пермеазы к лактозе на внутренней стороне ЦПМ по сравнению с её сродством к тому же субстрату на внешней. В результате скорость выхода вещества наружу становится меньше, чем скорость его поступления внутрь клетки, и концентрация лактозы в клетке возрастает. Если блокировать образование энергии, то р-галактозидпермеазная система теряет способность осуществлять активный транспорт и переключается на облегчённую диффузию, обнаруживая одинаковое сродство к р-галактозидам по обе стороны мембраны.

Транспорт, обусловленный фосфорилированием

Транспорт, обусловленный фосфорилированием - энергозависимый процесс, используемый при утилизации углеводов. Основной механизм транспорта связан с фосфорилированием субстрата, что делает невозможным его выход из клетки. Первоначально происходит фосфорилирование мембранного фермента (так называемый фермент 2, или Ф₂ ) в цитоплазме за счёт фосфоенолпирувата. Фосфорилированный фермент связывает углевод (например, глюкозу или маннозу) на поверхности ЦПМ и транспортирует его в цитоплазму. Затем комплекс диссоциирует с высвобождением углевода, связанного с фосфатной группой. За счёт фосфорилирования углевод аккумулируется в клетке и не способен выходить из неё. Данный тип транспорта не рассматривают как активный, поскольку концентрация неизменённого питательного вещества внутри клетки может быть одинаковой с его внеклеточным содержанием. Но в целом этот процесс напоминает активный транспорт против градиента концентрации вещества, так как концентрация химически изменённого питательного соединения внутри клетки может значительно превышать концентрацию неизменённого соединения в среде.

Выделение веществ из бактериальной клетки

Бактерии секретируют широкий спектр БАВ - ферменты, токсины, антибиотики и др. Некоторые соединения секретируются в окружающую среду непосредственно через ЦПМ, другие (обычно белки) первоначально попадают в периплазматическую полость в виде предшественников. Предшественник содержит сигнальный пептид, с помощью которого молекула белка проходит во внешнюю среду. На поверхности ЦПМ сигнальная пептидаза отщепляет сигнальный пептид, и этим завершает превращение внутриклеточного предшественника в зрелый сек-ретируемый белок. Процессы выделения в среду определённых соединений из бактериальной клетки нельзя рассматривать как выброс «шлаков»: это скорее механизмы адаптации микроорганизмов к условиям внешней среды, которые требуют конкурентной борьбы либо использования особых полимерных субстратов. В первом случае продукция антибиотиков даёт преимущество штамму-продуценту по сравнению с другими микроорганизмами, во втором - секреция гидролаз позволяет утилизировать труднодоступный субстрат, что обеспечивает их продуцентам успех в борьбе за источники питания в данной экологической нише

Роль ферментов в жизнедеятельности бактерий

Все питательные вещества и любые элементы, подвергающиеся взаимодействиям и превращениям с участием бактерий, вступают в реакции при участии ферментов. Ферменты [от лат. fermentum, закваска], или энзимы [от греч. enzyme, дрожжи или закваска], - специфичные и эффективные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. За каждое превращение одного соединения в другое ответственен особый фермент.

Питательные субстраты бактерий

Кислород, водород, углерод и азот - основные элементы, своего рода «кирпичики» (органогены), составляющие органические вещества. По типу питания растительные и животные организмы разительно отличаются, их рассматривают соответственно как автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы способны синтезировать все необходимые органические соединения из углекислоты, гетеротрофы нуждаются в органических источниках углерода. Для микроорганизмов данная классификация недостаточна, поскольку многообразие способов их питания можно отразить лишь с учётом источников энергии, углерода и донора водорода. Поэтому понятия «авто-трофность» и «гетеротрофность» в отношении бактерий применяют, имея в виду происхождение клеточного углерода как источника энергии.

Углерод

Наиболее доступные источники углерода для бактерий - углеводы и аминокислоты, что учитывают при изготовлении питательных сред.

Автотрбфия. Пищевые потребности автотрофных [от греч. auto, сам, + trophe, питание] бактерий ограничены; для их роста достаточно внесения в среду неорганических соединений, содержащих азот и другие минеральные элементы. Автотрофные бактерии в качестве источника углерода утилизируют двуокись углерода или карбонаты. Такие бактерии способны синтезировать все необходимые соединения из простых веществ. К ним относят фото- и хемотрофные (хемосинтезирующие) бактерии, использующие соответственно в качестве источника энергии электромагнитное излучение (свет), либо энергию окислительно-восстановительных реакций с участием субстратов, которые служат для них источником питания. Среди автотрофов не обнаружено видов, имеющих медицинское значение.

Гетеротрбфия [от греч. hetero, другой, + trophe, питание]. Некоторые бактерии не способны полностью обеспечить собственный метаболизм за счёт своих синтетических возможностей и нуждаются в наличии минимально одного органического соединения (обычно нужны аминокислоты как источник углерода и азота или углеводы в качестве источника углерода) в окружающей среде. Гетеротрофные бактерии в качестве источников углерода используют различные углеродсодержащие соединения - гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты и углеводороды. К гетеротрофным бактериям также относят бактерии-сапрофиты (метатрофы), развивающиеся на мёртвых органических остатках и бактерии-паразиты (пара-трофы), усваивающие органические соединения в форме сложных веществ живого организма.

Азот

Азот необходим бактериям для синтеза аминокислот (белков), пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также некоторых витаминов. Поскольку азот во всех живых организмах содержится в восстановленной форме, все минеральные формы азота с большей, чем у аммиака, степенью окисленности должны быть восстановлены.

Ряд микроорганизмов способен утилизировать азот только из органических соединений (аминогетеротрофы). Некоторые из микроорганизмов усваивают азот в виде неорганических форм (аминоавтотрофы). Однако многие микроорганизмы способны использовать как органический, так и минеральный азот.

Использование неорганического азота

В природе атомы минерального азота существуют в различной степени окисленности: от N⁵ + (N₂ O₅ , азотный ангидрид) до N^3- (NH₃ , аммиак). Степень усвояемости минеральных соединений азота бактериями определяется лёгкостью их превращения в аммиак, так как он является самым простым предшественником высокомолекулярных азоторганических соединений. В этой группе бактерий возможны два разнонаправленных процесса: ассимиляция (связывания минеральных форм азота в органический материал) и диссимиляция (выделения газообразных форм азота).

Ассимиляция аммиака. Большинство бактерий усваивает аммоний в ходе ассимиляции аммиака. Бактерии, растущие на средах с аммонием, могут непосредственно включать его в органические соединения. Следует помнить, что после потребления неорганических аммонийных солей в среде накапливаются анионы (SO^, Cl^- , H₃ PO^3- и др.), снижающие рН среды, что замедляет рост культур. Аммонийные соли органических кислот менее подкисляют среду и более благоприятны для роста бактерий.

Ассимиляционная нитратредукция. Подавляющее большинство бактерий и грибов, как и растения, усваивают нитрат в процессе ассимиляционной нитратредукции. На первом этапе нитраты восстанавливаются до нитритов, цикл этих превращений катализирует специфический фермент - ассимиляционная нитратредуктаза В. Второй этап представляет комплекс восстановительных реакций, катализируемых нитритредуктазой, что приводит к образованию аммиака, который используется для синтеза аминокислот и других азотсодержащих компонентов клетки.

Диссимиляционная нитратредукция (денитрификация). Ряд бактерий (Pseudomonas fluorescens, Bacillus licheniformis, Thiobacillus denitrificans и др.) ведёт восстановление нитратов и нитритов с образованием молекулярного азота в процессе диссимиляционной нитратредукции с участием фермента нитратредуктазы А.

Аммонификация нитрата. Бактерии кишечной группы способны выделять аммиак в процессе аммонификации нитрата, когда диссимиляционная нитратредуктаза А проводит только первый этап - восстанавливает нитрат до нитрита, а далее нитрит переходит в аммиак в процессе ассимиляции.

Выявление продуктов превращения исходных форм азота в среде культивирования может быть использовано для идентификации микроорганизмов. Например, денитрифицирующие бактерии выявляют на 5-6-е сутки культивирования по присутствию газа в поплавке (CO₂ , N₂ ) и отрицательной реакции на нитриты (используют реактив Грйсса) и нитраты (реакция с дифениламином).

Использование органического азота

При утилизации азота из органических субстратов он включается в биомассу бактерий в виде аминогрупп. Минерализация органических соединений происходит с выделением аммиака - аммонификация органических соединений. Выделение аммиака в ходе этого процесса используют на практике для идентификации отдельных бактерий. Выделяющийся в атмосферу аммиак меняет цвет подвешенной над средой культивирования красной лакмусовой бумажки на синий. Накопление аммиака в среде определяют реактивом Нёсслера. Первая реакция характерна для многих гнилостных бактерий, вторая - для бактерий кишечной группы. Аммонификацию органических соединений можно рассматривать как промежуточный процесс между диссимиляцией (высвобождение аммиака) и ассимиляцией, поскольку часть органического азота при этом усваивают аммонифицирующие бактерии. Основной источник азота для аминогете-ротрофов - аминокислоты, менее значимы пурины и пиримидины. Потребность в азотсодержащих субстратах у бактерий варьирует.

Фосфор

В клетках бактерий фосфор присутствует в виде фосфатов (преимущественно фосфатов сахаров) в составе нуклеотидов и нуклеозидов. Фосфор также входит в состав фосфолипидов различных мембран. Фосфаты играют особую роль в энергетическом обмене, расщеплении углеводов и в мембранном транспорте. Ферментативный синтез ряда биополимеров может начаться только после образования фосфорных эфиров исходных соединений (то есть после их фосфорилирования). Основной природный источник фосфора для бактерий - неорганические фосфаты и нуклеиновые кислоты. Они присутствуют в составе бульонов, в синтетические питательные среды их вносят дополнительно.

Сера

Сера входит в состав некоторых аминокислот (цистеин, метионин), витаминов (биотин, тиамин), пептидов (глутатион) и белков; участвует в синтетических процессах в восстановленном состоянии - в виде R-SH-групп, обладающих высокой реакционной способностью и легко дегидрирующих в R-S-S-R'-группы. Последние используются для образования более сложных соединений, соединённых дисульфидными (S-S) мостиками. Гидратирование этих соединений восстанавливает их и разрывает мостики. Подобные реакции имеют важное значение для регуляции окислительно-восстановительного потенциала в цитоплазме бактерий. Основной серосодержащий компонент бактериальной клетки - цистеин, в состав которого сера входит в виде тиоловой (-SH) группы. Так, сера в составе метионина, биотина, тиамина и глутатиона происходит из тиоловой группы цистеина. Хотя сера входит в состав аминокислот и белков в восстановленной форме, большинство бактерий утилизирует серу в форме сульфатов. Перевод окисленной серы из сульфат-иона в восстановленную форму в тиоловой группе известен как ассимиляционная сульфатредукция. У значительно меньшего числа бактерий (например, анаэробных бактерий рода Desulfovibrio) происходит диссимиляционная сульфатредукция, при которой сульфаты, сульфиты или тиосульфаты используются как терминальные акцепторы электронов. При этом образуется сероводород (H₂ S), как продукт восстановления. Способность бактерий выделять сероводород применяют на практике как дифференциально-диагностический признак. Отдельные группы бактерий (например, серобактерии родов Beggiatoa, Thiothrix) могут окислять сероводород и элементную серу до сульфатов.

Кислород

Кислород, входящий в состав органических веществ бактерий, включается в них двояким путём: опосредованно (из молекул воды либо из СО₂ ) и непосредственно. Специальные ферменты - оксигеназы - включают кислород (О^2- ) в органические соединения непосредственно из молекулярного кислорода (О₂ ). Оксигеназы необходимы для разложения многих веществ (например, ароматических углеводородов), трудно поддающихся действию других ферментов. Многие бактерии удовлетворяют свои энергетические потребности за счёт дыхания, в процессе которого кислород выступает в качестве терминального акцептора электронов и протонов в дыхательной цепи. В соответствии с потребностями в молекулярном кислороде бактерии разделяют на пять основных групп.

Облигатные (строгие) аэробы способны получать энергию только путём дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде. К строгим аэробам относят, например, представителей рода Pseudomonas. Облигатные (строгие) анаэробы. Рост таких бактерий может быть остановлен даже при низком рО₂ (например, при 10^-5 атм), поскольку у них отсутствуют ферменты, расщепляющие токсические соединения кислорода (каталазы, супероксид дисмутазы). К облигатным анаэробам относят роды Bacteroides, Desulfovibrio. Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсутствии О₂ . К факультативным анаэробам относят энтеробактерии и многие дрожжи, способные переключаться с дыхания в присутствии О₂ на брожение в отсутствии О₂ . Аэротолерантные бактерии способны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не использовать его в качестве источника энергии. Энергию аэротолерантные бактерии получают исключительно с помощью брожения (например, молочнокислые бактерии). Микроаэрофильные бактерии хотя и нуждаются в кислороде для получения энергии, лучше растут при повышенном содержании СО₂ , поэтому они также известны как «капнофиль-ные микроорганизмы» [от греч. kapnos, дым, + philos, любовь]. К микроаэрофилам относят большинство аэробных бактерий (например, бактерии родов Campylobacter и Helicobacter). Бактерии могут существовать в среде, содержащей кислород только при наличии толерантности к кислороду, которая связана со способностью бактериальных ферментов нейтрализовать токсичные соединения кислорода. В зависимости от количества электронов, одновременно переносимых на молекулу О₂ , образуются: ион пероксида О₂ ^2- (образуется флавиновыми оксида-зами при переносе 2е^- ), супероксид-радикал (могут образовать ксантин оксидаза, альдегид ок-сидаза, НАДФН-оксидаза при переносе 1е^- ), и гидроксил-радикал (продукт реакции супероксид-радикала с перекисью водорода). В детоксикации реактивных кислородных радикалов участвуют супероксид дисмутаза, пероксидаза и каталаза.

Супероксид дисмутаза конвертирует супероксид-радикал (наиболее токсичный метаболит) в Н₂ О₂ . Фермент присутствует в аэробных и аэротолерантных бактериях.

Каталаза превращает Н₂ О₂ в Н₂ О и О₂ . Фермент имеется у всех аэробных бактерий, но отсутствует у аэротолерантных организмов. Строгие анаэробы обычно каталаза- и супероксид-дисмутаза-отрицательны.

Пероксидаза. Из всех каталазоотрицательных микроорганизмов лишь молочнокислые бактерии способны расти в присутствии воздуха. Их аэротолерантность связана со способностью накапливать пероксидазу. Фермент нейтрализует Н₂ О₂ в реакции с глутатионом; при этом перекись водорода превращается в воду.

Ростовые факторы

Некоторые бактерии (особенно прихотливые [см. главу 20] или мутанты с наследственными дефектами) могут расти только в среде, дополненной определёнными компонентами, которые сами микроорганизмы синтезировать не могут. Эти компоненты известны как ростовые факторы, а подобные бактерии называют ауксотрофами [от лат. auxilium, помощь, + греч. trophe, питание]. Если ауксотрофия возникает в результате мутации, то «дикий», или основной тип, не нуждающийся в определённом факторе роста, называют прототрофным. Основные ростовые факторы - витамины, пурины и пиримидины. Наиболее важны для бактерий водорастворимые витамины, принимающие участие в функционировании большого количества ферментов в качестве коэнзимов. Потребность бактерий в этих продуктах очень мала (например, рост стафилококков обеспечивает внесение 0,003 мг тиамина и 0,2 мг никотиновой кислоты на 1 л среды), то есть факторы роста не используются в качестве пластического или энергетического материала, но обеспечивают регуляцию метаболизма.

Классификация . Факторы, стимулирующие рост бактерий, разделяют на три категории.

Пусковые факторы роста выделяют в особую категорию. Они имеют существенное значение для начала роста культуры. Позднее клетки культуры синтезируют все необходимые для их роста продукты самостоятельно. В качестве примера можно привести необходимость следовых количеств гистидина для роста ревертантов Salmonella his- и их обратной мутации в his+ (гистидин-положительный). Хотя прототрофы his+ не нуждаются в факторах роста, деление исходного ауксотрофа his-, необходимое для закрепления обратной мутации, может протекать только в присутствии гистидина.

Энергетический метаболизм бактерий

Метаболизм [от греч. metabole, изменение] - совокупность всех химических превращений, происходящих в клетках. Этот термин объединяет два процесса: катаболизм (диссимиляция, или энергетический метаболизм) и анаболизм (ассимиляция, или конструктивный метаболизм). Первый процесс включает расщепление различных субстратов для получения энергии, второй - синтез высокомолекулярных соединений, используемых для образования клеточных структур. Промежуточный обмен веществ, превращающий низкомолекулярные фрагменты питательных веществ в ряд органических кислот и фосфорных эфиров, называют амфиболизм. Различия в метаболизме у разных групп бактерий нередко используют в качестве фенотипичес-ких маркёров при идентификации микроорганизмов. На практике любая схема идентификации неизвестной бактерии включает исследование следующих параметров.

Метаболизм большинства бактерий осуществляется посредством биохимических реакций разложения органических (реже неорганических) веществ и синтеза компонентов бактериальной клетки из простых углеродсодержащих соединений. Для нормальной жизнедеятельности любому живому организму необходимы структурные фрагменты и энергия. Реакции, ведущие к синтезу различных компонентов бактериальных клеток (например, полимеризация аминокислот в белки) представляют собой эндэргонические процессы, то есть процессы, не протекающие самопроизвольно, поскольку изменение в них свободной энергии Гйббса (AG) положительно. Спонтанно в живой клетке могут происходить только экзэргонические реакции, сопровождающиеся снижением содержания в ней свободной энергии. Иными словами, для синтеза нового клеточного материала отдельные синтетические реакции должны быть сопряжены с реакциями, в результате которых высвобождается энергия, идущая на этот синтез.

Реакции, связанные с затратой энергии, реализуются через специальные макроэргические соединения. У бактерий таковыми являются нуклеозидтрифосфаты, ацилфосфаты и ацилтиоэфиры. Среди них наиболее важен АТФ, играющий роль своеобразной «разменной монеты» энергетического метаболизма. АТФ - термодинамически неустойчивая молекула и последовательно отщепляет фосфат с образованием аденозиндифосфата (АДФ) или аденозин-монофосфата (АМФ). Именно эта неустойчивость позволяет АТФ выполнять функцию переносчика химической энергии, необходимой для удовлетворения большей части энергетических потребностей клеток. Энергия каждой из двух этих фосфатных связей приблизительно равна 7,5 ккал, тогда как у обычных фосфатных связей она не превышает 2 ккал. Иными словами, для образования фосфатных связей АТФ требуется больше энергии, но и при их разрыве она выделяется в больших количествах. Другие макроэргические соединения бактериальных клеток: гуанозинтрифосфат (ГТФ), уридинтрифосфат (УТФ), цитидинтрифосфат (ЦТФ), дезокситими-динтрифосфат (дТТФ), ацетилфосфат, фосфоенолпируват, креатинфосфат, ацетилкоэнзим A (ацетил-КоА). Долгое время считали, что единственный тип энергетической валюты - высокоэнергетические химические соединения, а среди них прежде всего АТФ, однако последние работы биоэнергетиков опровергли эту догму. Оказалось, что клетка располагает тремя типами энергетической валюты: наряду с АТФ такую роль выполняет протонный и натриевый потенциалы на биологических мембранах.

Синтез (регенерация) АТФ

Синтез АТФ осуществляется тремя способами: фотосинтетическое фосфорилирование, окислительное фосфорилирование (сопряжённое с транспортом электронов по дыхательной цепи) и субстратное фосфорилирование. В первых двух процессах преобразование поступившей с потоком электронов энергии в энергию фосфоэфирных связей АТФ осуществляет особый фермент - АТФ-синтетаза. Этот фермент присутствует во всех мембранах, участвующих в преобразовании энергии (мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов). АТФ-синтетаза катализирует присоединение неорганического фосфата (Ф_н ) к АДФ, образование которого осуществляет аде-нилаткиназа (АМФ + АТФ ? 2 АДФ). Активность АТФ-синтетазы можно обнаружить по обратной реакции гидролиза АТФ: АТФ + Н₂ О ? АДФ + Ф_н + Н+. Благодаря обратимости реакции фосфорилирования, накопившийся АТФ может быть использован для создания протонного градиента, обеспечивающего энергией движение жгутиков и осмотическую работу. Энергия также направляется для обратного переноса электронов, необходимого для восстановления никотина-мидадениндинуклеотида (НАД) при использовании бактериями неорганических доноров электронов (SO² ₃ ^- , NO^- , Fe² + и др.).

Получение энергии в процессе фотосинтеза . Основной источник энергии для жизни на Земле - Солнце, но непосредственно утилизировать энергию инсоляции в мире бактерий способны лишь немногочисленные бактерии-фототрофы [от греч. photos, свет, + trophe, питание]. Фотосинтезирующие бактерии, подобно растениям, превращают энергию видимого света в протонный потенциал на энергопреобразующей мембране. В последующем с помощью АТФ-синтетазы энергия консервируется в АТФ. Основной признак, отличающий фотосинтетические реакции у пурпурных и зелёных бактерий от таковых у растений и цианобактерий, - отсутствие выделения кислорода (так как в качестве донора электронов они используют не воду, а H₂ S или органические вещества). У бактерий аналог хлоропластов растительных клеток - хроматофоры, содержащие хлорофилл и каротиноидные пигменты. Таким образом, под фотосинтезом понимают происходящее в клетках фототрофных организмов преобразование световой энергии в биохимически доступную энергию (протонный градиент на мембране тилакоидов и хлоропластов, АТФ) и восстановительную силу НАДФН+, а также связанный с этим синтез клеточных компонентов. Реакции фотосинтеза протекают в две стадии (световая и темновая фазы). Световая фаза. Под действием фотонов электрон хроматофора активируется, затем он возвращается в исходное состояние. При этом высвобождается энергия, используемая для создания протонного градиента, а затем синтеза АТФ и восстановления никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) до НАДФН+. Последнее может происходить за счёт обратного транспорта электронов с затратой АТФ. Темновая фаза. Образовавшиеся макроэргические соединения используются для ассимиляционного восстановления СО₂ в глюкозу. Глюкоза содержит значительное количество энергии (около 690 ккал/моль), что и используют гетеротрофные бактерии, разлагая глюкозу и «запасая» энергию в универсальном хранителе - АТФ.

Получение энергии при окислении химических соединений . Преобладающую часть бактерий составляют бактерии-хемотрофы, получающие энергию в результате окислительно-восстановительных реакций расщепления химических веществ, которые в ряде случаев служат для них также источником питания. Разные бактерии получают энергию либо в процессе брожения либо в процессе дыхания. При брожении АТФ образуется исключительно путём субстратного фосфори-лирования, а в процессе дыхания преимущественно путём окислительного фосфорилирования за исключением начальных этапов превращения гексоз в триозы (гликолиз, см. ниже).

Получение энергии субстратным фосфорилированием

Субстратное фосфорилирование может происходить при различных реакциях промежуточного метаболизма. При дегидрировании некоторых определённых субстратов часть энергии, освободившейся при окислении, сохраняется в форме высокоэнергетического фосфата. Богатая энергией фосфатная группа затем переносится на АДФ с образованием АТФ. Такой процесс называют фосфорилированием на уровне субстрата (субстратное фосфорилирование). В обмене углеводов важнейшие реакции, приводящие к регенерации АТФ, катализируют фосфоглицераткиназа (1,3-бифосфоглицерат + АДФ = 3-фосфоглицерат + АТФ), пируваткиназа (фосфоенолпируват + АДФ = пируват + АТФ) и ацетаткиназа (ацетилфосфат или бутирилфосфат + АДФ = ацетат или бутират + АТФ). Бактерии и дрожжи, сбраживающие сахара, располагают лишь тем АТФ, который получается с помощью этих ферментов.

Брожение. При брожении происходит анаэробное разложение углеводов и образование АТФ посредством субстратного фосфорилирования. Брожение характерно для факультативных и облигатных анаэробов. При брожении продукты расщепления органического субстрата могут служить одновременно и донорами и акцепторами водорода. Отдельные этапы окисления представляют собой дегидрирование, при котором водород переносится на НАД. Акцепторами водорода в составе НАДН+ служат промежуточные продукты расщепления субстрата. Кислород подавляет брожение, и оно у факультативных анаэробов сменяется дыханием. По выходу энергии брожение уступает дыхательному метаболизму: при сбраживании микроорганизмами 1 моля глюкозы образуется от 1 до 4 молей АТФ. Для сравнения: у дрожжей на 1 моль сброженной глюкозы образуется 2 моля АТФ, а при дыхании - 38. При ферментации субстратов в среде накапливаются конечные продукты (лактат, бутират, ацетон, 2-пропанол, этанол, ацетоин и др.). Определение природы этих продуктов - важный момент для идентификация анаэробов. Например, образование ацетоина определяют в реакции Фогеса-Проскауэра, кислотообразование - в тесте с метиловым красным, индолообразование - по методу Грациана. Применяют и другие тесты, разработанные для идентификации бактерий. Любое брожение проходит две стадии: первая (окисление) включает превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, вторая (восстановление) - присоединение атомов водорода для восстановления пировиноградной кислоты (рис. 4-7). Сам процесс образования пировиноградной кислоты включает серию реакций, общих для брожения и аэробного дыхания. У микроорганизмов выделяют три пути образования триоз (пировиноградной кислоты и глицеральдегидфосфата) из углеводов: гликолитичес-кий (фруктозо-1,6-бифосфатный), пентозофосфатный и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный (КДФГ-путь, путь Энтнера-Дудорова-Парнаса). Согласно образующимся продуктам, брожение разделяют на следующие типы.

Спиртовое брожение включает превращение пирувата в СО₂ и этанол. В течение многих веков способность дрожжей (особенно Saccharomyces cerevisiae) утилизировать глюкозу в анаэробных условиях с высоким выходом этанола и углекислоты применяют в пивоварении и виноделии. Аналогично дрожжам образует этанол Sarcina ventriculi. Бактерии кишечной группы, молочнокислые бактерии и клостридии образуют этанол в качестве побочного продукта сбраживания сахаров.

Гомоферментативное молочнокислое брожение (образуется практически только один продукт - молочная кислота) характерно для многих стрептококков и лактобацилл. Конечный продукт - молочная кислота - составляет не менее 90% всех продуктов брожения. В зависимости от стереоспецифичности лактатдегидрогеназы и наличия лактатрацемазы (фермент, переводящий один изомер в другой), могут образоваться различные изомеры молочной кислоты (D, L) или их смесь (DL-молочная кислота).

Гетероферментативное брожение (образуется смесь различных продуктов) характерно для бифидобактерий и молочнокислых бактерий, для рода Leuconostoc. Оно приводит к образованию молочной и уксусной кислот в ряде сходных процессов. Конечными продуктами могут быть дополнительно СО₂ и этанол, а при сбраживании фруктозы - маннитол.

Муравьинокислое брожение. Этот тип брожения выделяют на том основании, что характерный, хотя и не главный продукт брожения - муравьиная кислота. Часто этот тип называют брожение смешанного типа, поскольку, кроме формиата, образуется ряд других органических кислот. Так, для большинства членов семейства Enterobacteriaceae характерно выделение муравьиной и других кислот. Индивидуальные признаки брожения, осуществляемого кишечной палочкой, - расщепление пирувата с образованием ацетил-KoA и формиата, разложение формиата на углекислоту и молекулярный водород, восстановление ацетил-KoA до этанола, и, в отличие от Enterobacter aerogenes, отсутствие способности образовывать из пирувата ацетоин и 2,3-бутандиол.

Пропионовокислое брожение. Пируват или лактат карбоксилируется до оксалоацетата, затем оксалоацетат преобразуется в пропионовую кислоту через метилмалонил-коэнзим А у большинства пропионовых бактерий и через акрилоил-коэнзим А у Clostridium propionicum и Bacteroides ruminicola.

Масляно-кислое и ацетонобутиловое брожение. Масляная кислота (бутират), бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд других органических кислот и спиртов - типичные продукты сбраживания углеводов анаэробными спорообразующими бактериями (клостридиями). Если споры C. histolyticum или C. septicum попадают в открытую рану, где нет доступа воздуха, то они начинают расти, образуя дурно пахнущие продукты брожения.

Гомоацетатное брожение. Некоторые клостридии (C. formicoaceticum, C. acidi-urici) способны переносить водород, отщепляемый от субстрата, только на СО₂ . При этом образуется исключительно ацетат.

Получение энергии окислительным фосфорилированием.

У всех дышащих бактерий имеется система транспорта электронов (дыхательная цепь).

К компонентам этой системы относят локализованные в мембране ферменты с относительно прочно связанными низкомолекулярными простетическими группами. У эукариот такие ферменты локализуются на внутренней мембране митохондрий, у прокариот - в плазматической мембране. Перенос электронов осуществляется по следующей стандартной схеме: органический субстрат НАД флавопротеины железосерные белки хиноны цитохромы (a, b, c) конечный акцептор (молекулярный кислород либо иной акцептор электронов). При движении электронов по дыхательной цепи создаётся градиент протонов, энергия которого запасается в виде АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. В дыхательной цепи имеются только три точки окисления, в каждой из которых освобождается столько энергии, сколько содержится в одной высокоэнергетической связи АТФ. При переносе пары протонов от НАД+ на кислород может образоваться 3 молекулы АТФ. При использовании в качестве субстрата сукцината, от которого водород включается в цепь только на уровне флавопротеинов, образуется 2 молекулы АТФ. Фумаратное дыхание сопряжено с образованием 1 молекулы АТФ.

Наиболее часто бактерии получают энергию в результате окисления органических субстратов (чаще всего углеводов) до СО₂ и Н₂ О; иначе этот процесс известен как дыхание. Следует помнить, что дыханием следует считать окисление не только органических субстратов, так как бактерии могут окислять вещества, не подверженные ассимиляции, например, сероводород или трёхвалентное железо (так называемое «сероводородное дыхание», «железное дыхание»).

Если в реакциях окисления органических и неорганических веществ дегидрогеназами конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород, то такой тип метаболизма называют аэробное дыхание. При этом молекулярный кислород переходит в ион О^2- . Пары протонов, отщеплённые от органических субстратов, взаимодействуя с ионизированным кислородом при аэробном дыхании, образуют воду. Если терминальными акцепторами электронов выступают соединения, содержащие «связанный кислород» (нитраты, нитриты, сульфаты, карбонаты, а также способные к восстановлению элементная сера, трёхвалентное железо и органический акцептор - фумарат), то такой тип метаболизма называют анаэробное дыхание. Аэробное дыхание - наиболее распространённый процесс получения энергии среди комменсалов и патогенных для человека бактерий. Анаэробное дыхание осуществляют факультативно анаэробные бактерии и строгие анаэробы. Многие факультативные анаэробы при отсутствии кислорода в качестве акцепторов электронов используют нитраты (процесс известен как нитратное дыхание). При этом образуются характерные продукты восстановления - нитриты и другие восстановленные формы азота, что используют на практике для идентификации бактерий. В зависимости от природы утилизируемого соединения выделяют бактерии-органотрофы, использующие в качестве доноров водорода и электронов органические вещества, и бактерии-литотрофы [от греч. lithos, камень, + trophe, питание], использующие в тех же целях неорганические соединения (Н₂ , NH₃ , H₂ S, S, CO, двухвалентное железо и др.). Среди хемолитотроф-ных бактерий имеющих медицинское значение видов не обнаружено. Обычно ограничиваются указанием на основной способ получения энергии и природу донора водорода и электронов.

Катаболизм углеводов

В качестве источника питания и энергии при выращивании в искусственных условиях бактерии наиболее часто используют углеводы. Способность утилизировать различные углеводы - важный диагностический признак. Базовый субстрат - глюкоза, которую бактерии разлагают в процессе дыхания либо брожения. Многие реакции катаболизма глюкозы протекают одинаково у аэробных и анаэробных бактерий, в частности, три пути превращения гексоз в триозы (гликолиз, пентозофосфатный путь и путь Энтнера-Дудорова).

Гликолиз

Гликолитический путь (гликолиз, путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса, фруктозо-1,6-дифосфатный путь) доминирует у большинства аэробных и анаэробных микроорганизмов - у кишечной палочки, бацилл, пенициллов, дрожжей, стрептомицетов и многих других. Характерная реакция гликолиза - расщепление фруктозо-1,6-дифосфата альдолазой, в результате чего образуется смесь триозофосфатов, состоящая из дигидрооксиацетонфосфата и глицеро-альдегидтрифосфата, которые затем превращаются в пируват (рис. 4-8). Фермент обратной связи, лимитирующий скорость процесса, - фруктозо-6-фосфат дегидрогеназа (фосфофруктокиназа). В этом процессе образуется 2 моля АТФ и 2 моля восстановленного НАД (НАДН+) на 1 моль глюкозы.

Пентозофосфатный путь

Пентозофосфатный путь (схема Варбурга-Дйккенса-Хорёккера-Рэкера, фосфоглюконатный путь) включает не только образование пентозофосфатов, но и реакции превращения пентозофосфатов в триозо-3-фосфаты (рис. 4-9). В результате изомеризации фруктозо-6-фосфата в глюкозо-6-фосфат и конденсации двух молекул триозо-3-фосфата в гексозо-фосфат все перечисленные реакции замыкаются в цикл, при одном обороте которого из 3 молекул глюко-зо-6-фосфата образуются 2 молекулы фруктозо-6-фосфата, одна молекула триозо-3-фосфата, 3 молекулы СО₂ и трижды по 2 восстановленных НАДФ (НАДФН+). Последовательность подобных превращений глюкозы у бактерий идентична таковой у высших организмов. Этот путь катаболизма глюкозы следует рассматривать как второстепенный, но имеющий специальное назначение - источник пентоз для синтеза нуклеиновых кислот, а также источник восстановительных эквивалентов НАДФН+.

Путь Энтнера-Дудорова

Путь Энтнера-Дудорова, или КДФГ-путь (назван по характерному образующемуся продукту - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконату), - сравнительно редкий тип метаболизма, наблюдаемый у ряда бактерий (Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes eutrophus); у высших организмов он отсутствует (рис. 4-10). Этот путь - основной для расщепления гексоз у бактерий с дефицитом фосфофруктокиназы (например, у бактерий рода Pseudomonas). В результате расщепления 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовой кислоты образуются 3-фосфоглицериновый альдегид и пируват. Бактерии, расщепляющие глюкозу подобным образом, лишены ферментов, катализирующих образование молочной, муравьиной и прочих органических кислот.

Цикл Кребса

При аэробном дыхании пируват, образованный в ходе гликолиза и пути Энтнера-Дудорова, полностью окисляется (то есть превращается в СО₂ ) в циклическом процессе, известном как цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), или цикл Кребса (рис. 4-11). До включения в цикл пируват с помощью ферментов превращается в ацетил-КоА. ЦТК служит для полного окисления двухуглеродного соединения - ацетата до СО₂ с отщеплением водорода. При участии трёх дегидрогеназ водород переносится на НАД или НАДФ, а под действием сукцинатдегидрогеназы - непосредственно на хинон. Коферменты передают водород на дыхательную цепь. В ЦТК при окислении ацетата образуются 2 молекулы СО₂ и 8 [H] (из них 6 [H] - на уровне пиридиннуклеотидов и 2 [H] - на уровне флавопротеинов). Кроме того, образуется одна молекула ГТФ, которая может превращаться в АТФ. Энергетический баланс для катаболизма глюкозы, если он идёт по фруктозодифосфатно-му пути, можно рассчитать следующим образом: 2 моля НАДН+ образуется во фруктозодифос-фатном пути, ещё два - при дегидрировании пирувата; в ЦТК - 2x3 моля НАДН+ и 2 моля ФАДН+, то есть всего 10 молей НАДН+ и 2 моля ФАДН+. Таким образом, число синтезируемых молей АТФ в дыхательной цепи составит 10x3+2x2=34. Добавив к этому 2 моля АТФ из фрук-тозодифосфатного пути и 2 моля из ЦТК, получим в итоге 38 молей АТФ.

Катаболизм азотсодержащих органических соединений

Доступные субстраты для получения углерода, азота и энергии - аминокислоты, пурины и пири-мидины. Как аэробные, так и анаэробные бактерии используют эти соединения для синтеза белка либо непосредственно, либо после ряда превращений и вовлечения в промежуточный обмен.

Аминокислоты

Декарбоксилирование и дезаминирование. Первой реакцией катаболизма аминокислот может быть декарбоксилирование либо дезаминирование. Декарбоксилазы действуют обычно в кислой среде, образуя СО₂ и первичные амины (так называемые биогенные амины, трупные яды - кадаверин, путресцин, агматин). Поскольку при этом высвобождаются основные группы (амины), то такой процесс рассматривают как механизм нейтрализации среды и сохранения рН в физиологических пределах.

Дезаминирование аминокислот идёт с выделением аммиака. В зависимости от судьбы углеродного скелета различают дезаминирование окислительное (наиболее распространённое, например, превращение глутаминовой кислоты в 2-оксоглутаровую), гидролитическое и приводящее к образованию ненасыщенных соединений. Ферменты, катализирующие эти реакции, обычно специфичны для D- и L-изомеров аминокислот. Углеродные фрагменты, не содержащие азота, используются в процессах брожения или дыхания. Если в состав аминокислот входит сера, то последняя обычно высвобождается в форме сероводорода или меркаптанов. Разложение ароматических аминокислот (например, триптофана) происходит с образованием индола и скатола. У некоторых микроорганизмов в качестве источников энергии могут использоваться лишь некоторые продукты дезаминирования. Например, эшерихии и протеи дезаминируют триптофан с образованием индола и пирувата, из которых лишь последний утилизируется как источник энергии. Поскольку индол накапливается в культуре, то его наличие легко обнаруживают с помощью реактива Эрлиха (смесь n-диметиламинобензальдегида и HCl в этаноле), что используют для идентификации бактерий на практике.

Пурины и пиримидины

Пурины и пиримидины становятся доступными для энергетического метаболизма лишь после гидролиза нуклеотидов и нуклеозидов. В результате их разложения образуются углекислота, аммиак, муравьиная, уксусная и молочная кислоты, часть из которых включается в рассмотренные выше энергетические пути.

Катаболизм жиров и жирных кислот

Жиры (сложные эфиры глицерина и жирных кислот) и воска (сложные эфиры жирных кислот и одноатомных спиртов) - восстановленные субстраты и доступны бактериям в качестве источников энергии. Первоначально эфиры жирных кислот гидролизуются до глицерина или одноатомного спирта и свободных жирных кислот (гидролиз катализируют внутри- и внеклеточные липазы). После фосфорилирования глицерин может включаться в гликолитический путь и утилизироваться с образованием АТФ. Жирные кислоты метаболизируются через каскад окислительных реакций. Цель этих превращений - образование ацетил-КоА, вступающего в цикл Кребса.

Эндогенный энергетический метаболизм

Большинство бактерий способно длительно выживать при отсутствии экзогенных источников энергии. При этом бактерии нередко проявляют признаки активного метаболизма (например, сохраняют подвижность). Это связано со способностью бактерий продуцировать энергию окислением внутриклеточных компонентов. Основные внутриклеточные эндогенные источники энергии - ЛПС, липиды и поли-р-масляная кислота. Они расщепляются деполимеризующими ферментами до мономеров, которые включаются в вышеперечисленные пути. Эффективность подобных превращений может быть выше традиционных. Например, при гликолизе внутриклеточного крахмала или гликогена на 1 моль глюкозы образуется 3 моля АТФ, а не 2, как при простом включении глюкозы в этот путь. Это объясняется тем, что в результате расщепления крахмала с помощью а-1,4-глюканфосфорилазы (фосфоролиза) образуется глюкозо-1-фосфат, превращающийся в глюкозо-6-фосфат ещё до вступления в путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса. Следовательно, АТФ не затрачивается на его образование, и, значит, общий выход АТФ выше.

Конструктивный метаболизм

Совокупность биосинтетических реакций включения низкомолекулярных соединений в клеточные полимеры составляет суть конструктивного метаболизма. Комплекс этих реакций иногда называют пластическим обменом.

Углеродные соединения для биосинтетических реакций

Для биосинтеза клеточных компонентов необходимы соответствующие низкомолекулярные соединения-предшественники (например, сахара или аминокислоты). При наличии таких предшественников в окружающей среде они непосредственно вовлекаются в различные биосинтетические пути. Однако гораздо чаще бактериям приходится предварительно синтезировать большую часть молекул-предшественников из доступных исходных продуктов. Огромное разнообразие субстратов, которые бактерии могут использовать в качестве источников питания, вытекает из широкого спектра их метаболических возможностей. Исходные продукты для биосинтеза образуются в ходе различных путей катаболизма, включая гликолиз, КДФГ-путь, пентозофосфатный путь, окисление пирувата и ЦТК. Например, углеродные фрагменты из ЦТК - сукцинил-КоА и ацетил-КоА - используются соответственно для образования тетрапирролов и жирных кислот. Следует помнить, что подобное «изъятие» интермедиатов из ЦТК возможно лишь при постоянном восполнении их дефицита.

Биосинтез аминокислот и белков

Аминокислоты. Большинство свободно живущих бактерий способно синтезировать все необходимые им аминокислоты. Теоретически все 20 необходимых аминокислот могут находиться в окружающей среде и быть доступными для утилизации. Кроме того, бактерии способны получать аминокислоты из белковых молекул, расщепляя их бактериальными протеазами и пептидазами. Образующиеся при этом олигопептиды и аминокислоты транспортируются в клетку, где включаются в биосинтетические пути либо расщепляются на низкомолекулярные продукты. Паразитические бактерии потребляют готовые аминокислоты из организма хозяина. Бактериям, культивируемым на питательных средах, содержащих только неорганические источники азота или ограниченное количество аминокислот, приходится синтезировать некоторые из них (или даже все) из доступных азотсодержащих соединений. Основное назначение источников азота - поступление в бактериальную клетку «сырья» для формирования аминных (NH₂ ) и иминных (NH) групп в молекулах аминокислот, нуклеотидов, гетероциклических оснований и других химических компонентов. При этом азотсодержащие вещества, помимо сырья для пластического обмена, могут включаться в энергетический метаболизм (например, у анаэробов некоторые аминокислоты могут образовывать окислительно-восстановительные системы). Наиболее доступные минеральные источники азота в природе - аммонийный ион (NH+) и аммиак (NH₃ ), легко проникающие в клетки и просто трансформирующиеся в амино- и иминогруппы. Основные исходные соединения для синтеза аминокислот - пируват (образуется в гликолитическом цикле), а*-кетоглутарат* и фумарат (образуются в ЦТК). При синтезе молекул аминокислот атом азота вводится на последних этапах биосинтеза путём переаминирования; лишь L-аланин, L-глутамат и аспартат образуются через прямое аминирование.

Пептиды и белки. Бактериальная клетка способна синтезировать несколько тысяч различных белков, каждый из которых содержит в среднем 200 аминокислотных остатков. Информация, направляющая синтез этих белков, закодирована в последовательности нуклеотидов ДНК. Синтез полипептидной цепи происходит в цитоплазме клетки на рибонуклеопротеидных частицах (рибосомах) в сочетании с молекулой мРНК или информационной РНК (иРНК), которая синтезируется на матрице ДНК в процессе транскрипции. Бактериальная рибосома обладает массой 2,7x10⁶ Д и состоит на 65% из рибосомной РНК (рРНК) и на 35% из белка (примерно 50 различных белков). Информация, содержащаяся в молекулах мРНК, транслируется в полипептидную цепь при участии особого класса молекул РНК, известных как тРНК. Многофункциональность тРНК позволяет им присоединяться к определённым аминокислотам, связываться с рибосомой и узнавать определённые последовательности из трёх нуклеотидов (кодон) в составе мРНК. Узнаваемый кодон соответствует конкретной аминокислоте; нужная аминокислота «подаётся» при помощи узнающей её молекулы тРНК к концу растущей полипептидной цепочки. Так растёт будущая молекула белка.

Биосинтез нуклеотидов и нуклеиновых кислот

Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды. Образование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов de novo из низкомолекулярных соединений происходит независимыми друг от друга путями. Источник рибозилфосфатной части всех нуклеотидов - 5-фосфорибозил-1-пиро-фосфат - образуется после взаимодействия рибозо-5-фосфата с АТФ. Дезоксирибонуклеотиды образуются путём восстановления соответствующих рибонуклеотидов.

Пуриновые нуклеотиды построены на основе фосфорибозилпирофосфата, с которого и начинается путь их синтеза. Девятичленное пуриновое кольцо синтезируется последовательным присоединением аминогрупп и мелких углеродсодержащих групп, причём все интермедиаты биосинтеза - рибонуклеотиды. Пиримидиновые нуклеотиды формируются в серии последовательных превращений кар-боксилсодержащих интермедиатов, начиная с карбамоилфосфата. Рибозофосфатный остаток присоединяется только после того, как шестичленное пиримидиновое кольцо полностью синтезировано конденсацией аспарагиновой кислоты и карбамоилфосфата. Нуклеиновые кислоты. Большинство синтезируемых нуклеотидов полимеризуется в РНК и ДНК, небольшая часть используется для синтеза коферментов и богатых энергией соединений. Основная часть бактериальной ДНК находится в виде двухцепочечной кольцевой молекулы - бактериальной хромосомы. В процессе репликации хромосома с высокой точностью удваивается, обеспечивая передачу информации потомкам и давая им возможность синтезировать те же самые белки, что и родительская клетка. Синтез ДНК из субстратов-мономеров, четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ), катализируют ДНК-полимеразы. При этом на каждой одиночной цепи ДНК происходит синтез новой комплементарной цепи: ДНК-полимеразы встраивают нуклеотиды в соответствии с правилами водородного связывания (Г уанин против Ц итозина, А денин против Т имина). Процесс удвоения клеточной ДНК называют репликацией. Если цепь ДНК служит матрицей, на которой полимеризуется цепь РНК (мРНК), то этот процесс называют транскрипцией.

Биосинтез олиго- и полисахаридов

На долю внутриклеточных олиго- и полисахаридов может приходится до 60% сухой массы бактериальной клетки, тогда как количество синтезируемых внеклеточных полисахаридов может во много раз превышать массу бактерии. При отсутствии сахаров в окружающей среде бактерии синтезируют их из доступных источников углерода. Например, бактерии, растущие на средах, содержащих трёхуглеродные соединения, синтезируют гексозофосфаты из пирувата с помощью реакций, характерных для фруктозодифосфатного пути. Бактериальные олиго- и полисахариды образуются путём присоединения к акцепторным молекулам остатков сахаров из нук-леозиддифосфосахаров. Например, трегалоза, содержащая два остатка глюкозы, соединённых а-1,4-связями, образуется из уридиндифосфатглюкозы и глюкозо-6-фосфата. Характерная особенность синтеза полисахаридов, как и в случае синтеза ДНК, - необходимость затравки - короткого фрагмента того же полисахарида, который будет синтезироваться; он служит акцептором новых мономерных фрагментов.

Биосинтез липидов

Липиды - гетерогенный класс клеточных компонентов, выделенный на основании их растворимости в неполярных растворителях (эфир, бензол, хлороформ) и нерастворимости в воде. К ним относят жиры, фосфолипиды, стероиды, изопреноиды и поли-р-оксибутират. Липиды подразделяют на два большие класса: липиды, содержащие жирные кислоты, связанные эфирной связью (например, поли-р-оксимасляная кислота, гликолипидный компонент мембраны ци-анобактерий, ЛПС клеточной стенки), и липиды, состоящие из повторяющихся пятиуглеродных изопреновых фрагментов (например, бактопренол, к которому прикрепляются составляющие компоненты клеточной стенки во время её синтеза). Липиды с изопреновыми единицами содержат хлорофиллы и хиноны. Жирные кислоты синтезируются отдельно, а затем с помощью эфирной связи включаются в липиды. Число типов жирных кислот у каждого вида бактерий строго определено. У прокариот преимущественно встречают насыщенные жирные кислоты, образование которых начинается с переноса ацетильной группы с ацетил-КоА на особый ацил-переносящий белок. Этот комплекс служит акцептором, к которому последовательно присоединяются двухуглеродные фрагменты, пока не будет достигнута длина, характерная для соединения, присущего данной бактерии (обычно С₁₄ -С₁₈ ).

Взаимосвязь конструктивного и энергетического обмена

Для удобства понимания конструктивный и энергетический обмены были рассмотрены выше по отдельности. Однако разграничить процессы получения энергия и процессы, связанные с конструктивным метаболизмом, крайне сложно, так как они тесно взаимосвязаны. Особенно трудно произвести это разделение в том случае, когда одно и то же вещество потребляется и для построения клетки и как энергетический субстрат. Связующие звенья процессов распада и биосинтеза - продукты неполного окисления - ценны для бактерий не только в плане последующего выделения энергии, но и как строительный материал. Поэтому иногда даже не возникает необходимость в глубоком окислении субстрата для получения возможно большего количества энергии. Бактериальная клетка всегда поддерживает гибкий (в зависимости от условий внешней среды) баланс между реакциями катаболизма и анаболизма.

Метаболизм бактерий с различным типом питания

У гетеротрофных бактерий существует два направления использования углерода: часть его входит в состав конечных продуктов катаболизма, а часть - в строительные блоки биосинтетических путей. У автотрофных микроорганизмов углерод включается только в реакции биосинтеза, образуя различные интермедиаты в результате тех же последовательностей реакций, которые у гетеротрофов приводят к образованию АТФ, но только в обратном направлении. Подтверждение этого принципа можно найти в метаболических путях различных автотрофных микроорганизмов.

Пировиноградная кислота как ключевой метаболит

Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, катализируемое ферментами гликолиза, - основной этап катаболизма углеводов в клетках аэробных и анаэробных микроорганизмов. Обратный процесс - превращение пировиноградной кислоты в глюкозу - центральный путь биосинтеза моно- и полисахаридов. Таким образом, пировиноградная кислота занимает центральное место в обмене веществ у бактерий и в равной степени служит целям ассимиляции и диссимиляции. Особую ценность имеет свойство пирувата постепенно высвобождать энергию в ходе последовательных реакций катаболизма. При этом пировиноградная кислота служит энергетическим субстратом не только при распаде углеводов, но и белков, так как окислительное дезаминирование аминокислот приводит к образованию кетокислот, а также пирувата. В пластическом обмене пируват служит источником синтеза углеводов, белков, жиров и др. Таким образом, пировиноградная кислота или любое соединение, превращение которого ведёт к образованию пирувата, может быть единственным органическим веществом, обусловливающим рост и развитие разнообразных бактерий.

Активированные формы метаболических интермедиатов

АТФ может служить донором фосфатной группы для множества промежуточных продуктов обмена (интермедиатов), переводя их в активированную форму. Стандартная свободная энергия (AG) интермедиатов при этом повышается настолько, что позволяет им в фосфорилированной форме участвовать в термодинамически выгодных процессах (-AG). В то же время подобная реакция с участием нефосфорилированной формы реагирующего вещества была бы термодинамически невыгодной (+AG). Фосфорилирование гексоз - первый этап как в процессах синтеза полимерных углеводов, так и при катаболическом разложении сахаров. Таким образом, перед фосфорилированным углеводом всегда стоят две взаимоисключающие возможности - быть трансформированным в компонент цитоплазмы (полисахарид), либо быть разложенным на более простые вещества. Эта равнонаправленная потенция ключевых интермедиатов в фосфорилированной форме предоставляет клетке ещё одну возможность сбалансированной регуляции путей катаболизма и биосинтеза.

Регуляция метаболизма

Метаболизм микроорганизмов прежде всего регулируется факторами внешней среды. Так, кислород подавляет брожение; у денитрифицирующих бактерий нитратное дыхание может начаться лишь при недостатке кислорода; изменение рН в культурах Enterobacter и Clostridium влияет на природу образующихся продуктов брожения и прочее. Многообразие обменных процессов требует их хорошей координации. Только в этом случае клетка может приспосабливаться к меняющимся условиям внешней среды и оптимально согласовывать между собой различные метаболические процессы. Объектами такой оптимизации выступают ферменты. Регуляция клеточного метаболизма происходит на двух уровнях - на уровне синтеза ферментов и на уровне изменения их активности. На обоих уровнях участвуют аллостерические белки, свойства которых изменяются при связывании со специфическими малыми молекулами-эффекторами, например АТФ, АМФ, ацетил-КоА, фосфоенолпируватом, НАДН+ и др.

Рост и размножение бактерий

Под термином «рост» понимают увеличение количества живого вещества, чаще обусловленное делением клеток. Если у многоклеточных организмов при росте обычно наблюдают увеличение размеров тела, то у одноклеточных - как увеличение клеточной массы, так и увеличение количества клеток в результате деления.

Рост бактерий в периодической культуре

Собственно под ростом бактерий обычно подразумевают координированную репликацию всех компонентов бактерий. Поскольку деление бактериальной клетки приводит к образованию двух особей, то их число растёт в геометрической прогрессии: 2°²1^ ²2^ ²3^ ^…​2П^ . Регуляторное действие на рост бактерий оказывают качество питательной среды и условия выращивания. Рост популяции клеток в ограниченном жизненном пространстве (периодическая культура) может быть разделён по меньшей мере на четыре фазы (рис. 4-12). После внесения в среду бактерии адаптируются к её условиям и размножаются сравнительно медленно (лаг-фаза). Затем наступает фаза экспоненциального роста (экспоненциальная фаза). Далее среда истощается, в ней аккумулируются токсические продукты метаболизма, что проявляется снижением темпов размножения и прекращением увеличения числа клеток (стационарная фаза). Таким образом, рост в периодической культуре подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. В последующем бактериальная культура может погибнуть либо значительно сократиться (фаза отмирания). Спорообразующие виды переходят в стадию споруляции, у споронеобразующих видов возможно образование анабиотических форм (см. ниже). В некоторых случаях дополнительно выделяют фазу ускорения роста (начало экспоненциальной фазы) и фазу замедления роста (переход к стационарной фазе).

Лаг-фаза соответствует периоду физиологического приспособления, включающего индукцию ферментов, синтез и сборку рибосом. Продолжительность фазы зависит главным образом от возраста посевного материала (инокулята) бактерий и предшествовавших условий культивирования. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то бактериям необходимо время для адаптации к новым условиям. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от имевшихся в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может потребовать синтеза новых ферментов, в которых ранее не было необходимости.

Экспоненциальная фаза (логарифмическая) характеризуется максимальной скоростью клеточного деления. Для конкретного вида бактерий в конкретных условиях роста время генерации (то есть время, необходимое для удвоения количества бактерий) постоянно в течение всей логарифмической фазы, но вариабельно у различных видов и штаммов, а также зависит от состава среды и условий культивирования. Время генерации на оптимальной среде может быть коротким (у кишечной палочки 20 мин), либо продолжительным (у Mycobacterium tuberculosis 6 ч). В этой фазе в среде происходит максимальное накопление метаболитов бактерий (например, токсинов, бактериоцинов).

Стационарная фаза. В течение этого периода доступность важнейших питательных веществ становится лимитирующим фактором. Устанавливается равновесие между клеточным ростом и делением и процессом отмирания клеток. Спорообразующие бактерии (например, родов Bacillus и Clostridium) способны переходить в фазу споруляции, активирующуюся при нахождении бактерий в условия ограниченного питания. В определённый момент соотношение отмирающих, вновь образующихся и покоящихся клеток становится стабильным; подобное состояние известно как максимальная стационарная фаза. Биомасса бактерий в стационарной фазе обозначают как «урожай», или «выход биомассы» (разница между максимальной и исходной биомассой); или «экономический коэффициент», если прирост биомассы отнесён к единице лимитирующего рост субстрата.

Фаза отмирания (спада, лизиса) включает период логарифмической гибели, переходящий в период уменьшения скорости отмирания бактерий. Причины гибели бактерий в нормальных питательных средах до конца не ясны. Понятны случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Иногда бактерии разрушаются под действием собственных ферментов (автолиз). Скорость отмирания широко варьирует в зависимости от условий обитания и особенностей микроорганизма (например, энтеробактерии отмирают медленно, а бациллы - быстро).

Двухфазный рост. У бактерий, способных использовать два различных источника углерода, наблюдают двухфазный рост (так называемая диауксйя). Примером может служить рост кишечной палочки на среде с глюкозой и сорбитолом.

Оценка роста бактерий

Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.

Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева). Если толщина слоя среды с микроорганизмами 0,02 мм, а сторона квадрата на предметном стекле 0,05 мм (объём 5х10^-8 см³ ), то количество подсчитанных в квадрате клеток нужно умножить на 2x10⁷ , чтобы получить число клеток в 1 мл.

Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве.

Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 °С.

Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца.

Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат.

Биохимические методы определения биомассы основаны на определении общего азота в клетках (метод Кьельдаля), общего углерода (по ван Слайку-Фолчу), общего белка (по Лоури или Фолину), поскольку в бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен. В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование СО₂ или кислот).

Факторы, влияющие на рост бактерий

Кроме состава питательных сред, на которых развиваются бактерии, большое значение имеют условия культивирования и, прежде всего, температура, аэрация и концентрация водородных ионов в среде.

Культуральные среды

Культуральные среды обычно компонуют, предварительно зная, рост каких именно физиологических групп микроорганизмов хотят обеспечить. Вначале целесообразно составить минеральную основу, содержащую все необходимые питательные вещества в неорганической форме. Затем в эту основу вводят источники углерода, энергии, азота и необходимые ростовые факторы. В количественном отношении придерживаются простого правила: соотношение важнейших элементов, вводимых в воду, должно быть примерно таким же, как в бактериальной клетке (например, среднее соотношение углерод:азот:фосфор:сера:калий:кальций:магний:железо = 5:1:0,3:0,1:0,1:0,05:0,05:0,02. В граммах эти величины дают примерное содержание элементов на 1 л среды).

Температура

Оптимальная температура роста патогенных для человека микроорганизмов совпадает в основном с температурой тела человека. В отдельных случаях температурный параметр может быть использован как простой способ селекции, например, виды Campylobacter лучше растут при температуре 42 °С, слишком высокой для роста большинства других патогенов. В зависимости от требований к температурному режиму бактерии разделяют на три группы.

Мезофильные бактерии лучше всего растут в пределах 20-40 °С; к ним относят большинство патогенных для человека микроорганизмов. Термофильные бактерии лучше растут при 50-60 °С.

Психрофильные бактерии предпочитают расти в интервале температур от 0 до 10 °С.

Аэрация

Всем облигатным аэробам в качестве конечного акцептора электронов необходим кислород. При большом объёме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности; для роста в глубоких слоях требуется перемешивание. Микроорганизмы могут использовать только растворённый кислород, а его растворимость в воде очень мала (в 1 л при 20 °С содержится 0,28 моля 0₂ , что хватает для окисления лишь 8 мг глюкозы), поэтому запас кислорода обеспечить невозможно, и он должен поступать к среде непрерывно.

Для обогащения жидкости кислородом увеличивают площадь соприкосновения жидкой и газовой фаз различными способами: культивированием в тонком слое среды, перемешиванием поверхностных и глубоких слоёв жидкости путём встряхивания, вращением сосудов вокруг продольной оси, пропусканием воздуха через жидкость под давлением.

Для полного связывания растворённого кислорода (техника анаэробных культур) предусмотрено применение прокипячённых питательных сред, закрытых без пузырьков воздуха; создание бескислородной атмосферы в специальных установках для культивирования; применение адсорбентов кислорода (дитионита, хлорида одновалентной меди), восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликолата, цистеина или сульфида, если бактерии его переносят).

Концентрация ионов водорода

Установление и поддержание определённой величины рН (логарифм величины, обратной концентрации водородных ионов в молях на литр) имеет существенное значение для роста бактерий. Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо растёт при нейтральном рН, равном 7,0. Актиномицеты и бактерии, разлагающие мочевину, предпочитают среды с более высоким рН, то есть слегка щелочные. Некоторые бактерии толерантны к кислой среде (например, лактобациллы). Кислые значения рН предпочитают грибы.

Поддержание рН особенно необходимо для микроорганизмов, продуцирующих кислоты, но не обладающих устойчивостью к ним (кишечные бактерии и псевдомонады). 0пределённое буферное действие оказывают фосфаты, при более сильном выделении кислот рекомендуется добавлять к среде карбонат кальция или бикарбонат натрия.

Нарушение метаболизма при неблагоприятных значениях рН не связано с прямым действием ионов Н+ и ОН^- . Они лишь снижают степень диссоциации слабых кислот и оснований, которые в недиссоциированном состоянии легче проникают в клетку, чем продукты их диссоциации.

Пигменты бактерий

Колонии многих бактерий могут быть ярко окрашены, что связано с выделением окрашивающего вещества в среду либо окраской самих бактерий. Пигменты бактерий представлены различными веществами - каротиноидами, феназиновыми производными, пирролами, антоциана-ми и др. Пигменты бактерий - вторичные метаболиты, то есть они не являются веществами, обязательно присутствующими у всех бактерий. Например, даже внутри одного вида Serratia marcescens есть пигментообразующие и беспигментные штаммы. Среди пигментов преобладают жёлтые, оранжевые и красные каротиноидные пигменты. Способность к пигментообразованию выражена у видов Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Этот признак генетически детерминирован, поэтому его используют в качестве дифференцирующего критерия.

Спорообразование

Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать особые защитные формы - споры [от греч. sporos, семя]. Споры характеризуются высоким коэффициентом светопреломления и располагаются внутриклеточно, поэтому их также называют эндоспоры, а образующие их бактерии - спорангии. Споры образуются лишь внутри вегетирующей бактериальной клетки, и каждая клетка образует одну эндоспору. Спорообразование наблюдают у небольшой группы эубактерий, из патогенных для человека - лишь у видов Clostridium и Bacillus. На долю споры приходится большая часть сухой массы клетки-спорангия, хотя по объёму спора в 10 раз меньше объёма материнской клетки. Споры - особая форма покоящихся клеток со сведённой к нулю метаболической активностью. Они резистентны к нагреванию, радиации, высыханию и воздействию химических веществ. Благодаря этим свойствам, споры могут длительно сохраняться и обеспечивать сохранение вида в неблагоприятных условиях. Например, в почве, приставшей к растениям гербариев ботанического сада Кью Гарденс (Лондон), пролежавших 200-300 лет, обнаружены жизнеспособные споры Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Предположительно в сухой почве некоторое количество спор может сохраняться до 1000 лет, но уже через 50 лет хранения 90% спор теряет жизнеспособность. Основное значение спор в выживаемости бактерий определяет их терморезистентность. Устойчивость к нагреванию (а некоторые споры выдерживают даже кипячение в течение нескольких часов) обеспечивает кальциевая соль дипиколиновой (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислоты, составляющая 10-15% общей массы споры. Единственный фактор, к действию которого споры абсолютно лабильны - открытый огонь. Как тут не вспомнить гётевского Мефистофеля и его рассуждения о неистребимости жизни: «…​всё в мире так ведётся, что в воздухе, в воде и на сухом пути, в тепле и в холоде зародыш разовьётся; один огонь ещё, спасибо, остаётся, а то б убежища, ей-богу, не найти».

Помимо эндоспор у некоторых бактерий существуют другие покоящиеся формы - экзоспо-ры (известны только для метанокисляющих бактерий) и цисты (шарообразная толстостенная клетка у видов Azotobacter). Аналогичные клетки миксобактерий называют миксоспорами. Для медицински значимых микроорганизмов перечисленные типы спорообразования не характерны.

Морфология

Споры бывают круглыми, овальными или эллиптическими; некоторые снабжены «рёбрами жёсткости», усиливающими устойчивость к механическим воздействиям. При микроскопическом исследовании споры выделяются высоким коэффициентом светопреломления, аналогичным таковому у обезвоженного белка. В зрелой споре различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма), двухслойная ЦПМ и оболочка споры (рис. 4-13). Спороплазма (протопласт споры) включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового синтеза и некоторые другие (например, анаэробного энергообразования). Оболочка споры двухслойная; пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму. Внутренний слой (стенка споры) образован пептидогликанами, аналогичными таковым у вегетирующей клетки. Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью.

Экзоспориум. У некоторых бактерий материнская клетка образует экзоспориум - двух-трёхслойное желатинообразное покрытие, образованное липопротеинами и углеводами и во многом аналогичное капсуле бактерий. При созревании споры экзоспориум может сохраняться в виде пустого и отстающего от споры «мешка».

Споруляция

Процесс споруляции (спорообразования) начинается сразу после возникновения дефицита питательных веществ и продолжается приблизительно 8 ч. Никаких внешних источников питания или энергии при этом не требуется. Споруляцию стимулирует внесение в среду глюкозы, фосфора и NH₄ ; угнетает внесение пептона, лактозы, NaCl, CaCl₂ (у бактерий рода Bacillus - DL-аланина). Споруляция контролируется особыми генами. Их число вариабельно у различных видов и может достигать 70. Для спорообразования важна индукция гена spoO. Его транскрипция запускает последовательную транскрипцию всех остальных необходимых генов (оперонов). Детали спорообразования служат видовыми признаками, но его принципиальные закономерности одинаковы для всех бактерий. Подготовительная стадия сопровождается прекращением деления и увеличением количества липидных включений. Стадия предспоры обычно начинается бурно. В клетке появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с изменёнными плотностью и тинкториальными свойствами. Подобное образование обозначают терминами «предспора», или «примордиальная спора». Третья стадия включает появление оболочки (обычно в течение 10 мин после образования предспоры) и ещё большее увеличение коэффициента светопреломления. Стадия созревания споры сопровождается её уплотнением и снижением метаболической активности клетки. Споры могут располагаться центрально, субтерминально или терминально (рис. 4-14). У видов Bacillus диаметр споры не превышает ширины клетки, тогда как у многих видов Clostridium - значительно превышает. В ряде случаев клетка приобретает весьма характерный вид, нередко являющийся диагностическим признаком. Например, терминально расположенные споры у возбудителя столбняка придают бактериям вид «теннисных ракеток».

Поскольку споры сильно преломляют свет, то распознавание их при микроскопии не представляет затруднений. В спорных случаях прибегают к специальным методам окрашивания.

Прорастание спор

После созревания и лизиса родительской клетки спора освобождается, сохраняясь в покоящемся состоянии до попадания в благоприятные условия.

Покоящиеся (некультивируемые) формы бактерий

Специализированные анабиотические формы (такие как эндо- и экзоспоры, миксоспоры, цисты) известны лишь для ограниченного круга микроорганизмов. Однако как у спорообразующих микроорганизмов (Bacillus cereus) на фоне подавления спорообразования, так и у споронеобра-зующих (Pseudomonas carboxidoflava, Micrococcus luteus, Escherichia coli) бактерий внеклеточные микробные метаболиты, проявляющие свойства индукторов анабиоза, вызывают образование цистоподобныхрефрактерных клеток (термин связан с переходом целой клетки в покоящуюся форму и увеличенной способностью данных клеток по сравнению с обычными сильно преломлять свет). В этих клетках снижение метаболической активности (гипометаболизм) сопровождается развитием резистентности к экстремальным воздействиям. Эти формы отличаются нерегистрируемым уровнем эндогенного дыхания, повышенной терморезистентностью и специфической ультраструктурой. По сравнению с вегетативными клетками, цистоподобные рефрактерные клетки обладают рядом особенностей ультраструктурной организации: у них снижена плотность рибосом в цитоплазме, цитоплазма приобретает мелкозернистую структуру, увеличена толщина клеточной стенки, в самой клеточной стенке появляется слоистость и некоторые плотные включения. Для споронеобразующих микроорганизмов цистоподобные рефрактерные клетки - единственная покоящаяся форма, способная сохраняться в течение нескольких лет, а для спорообразующих бактерий - альтернатива спорообразования. Поскольку рефрактерные клетки невозможно выявить с помощью традиционных бактериологических подходов, то в самое ближайшее время они могут создать серьёзную проблему при оценке их эпидемиологической и экологической значимости.

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

В наши дни приоритетным направлением естествознания можно считать молекулярную биологию. Она тесно связана с микробиологией и в известном смысле является её детищем, так как в качестве основных моделей использует бактерии и вирусы, а одно из основных направлений молекулярной биологии - молекулярная генетика - долгое время являлась не чем иным, как генетикой бактерий и бактериофагов. Изучение генетики бактерий имеет также и несомненный прикладной интерес, например в плане установления механизмов передачи патогенных свойств и устойчивости к лекарственным препаратам. Бактерии - удобная модель для генетических исследований. Их отличает: относительная простота строения генома, позволяющая выявлять мутанты с частотой 10^-9 и ниже; гаплоидность, исключающая явление доминантности; половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток; наличие обособленных и интегрированных фрагментов ДНК (плазмид, транспозонов и т.д.); лёгкость культивирования и возможность получения популяций, содержащих миллиарды микробных тел.

Как и у других организмов, совокупность генов бактериальной клетки - геном - определяет её свойства и признаки (генотип). Фенотип бактериальной клетки - результат взаимодействий между бактерией и окружающей средой - также контролирует геном (так как сами признаки закодированы в бактериальных генах).

Генетический материал бактерий

Ядерные структуры бактерий имеют характерное строение, отличающее их от ядер эукари-отических клеток; их образуют так называемые хроматиновые тельца, или нуклеоиды, лишённые оболочки и включающие в себя почти всю ДНК бактерии.

Прокариотический геном

У бактерий обычно имеется одна замкнутая кольцевидная хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы обычно сопровождается её делением.

Некоторые бактерии содержат внехромосомные молекулы ДНК (плазмиды) и мобильные элементы (либо плазмидные, либо хромосомные).

Внехромосомные факторы наследственности

Внехромосомные факторы наследственности бактерий представлены плазмидами, вставочными последовательностями и транспозонами. Все они образованы молекулами ДНК, различающимися между собой по молекулярной массе, кодирующей ёмкости, способности к автономному реплицированию и др.

Плазмиды

Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой порядка 10⁶ -10⁸ дальтон, несущие от 40 до 50 генов. Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерии) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.

Плазмиды выполняют регуляторные или кодирующие функции. Регуляторные плазмиды участвуют в компенсировании тех или иных дефектов метаболизма бактериальной клетки посредством встраивания в повреждённый геном и восстановления его функций.

Кодирующие плазмиды привносят в бактериальную клетку новую генетическую информацию, кодирующую новые, необычные свойства (например, устойчивость к антибиотикам).

В соответствии с определёнными признаками, кодируемыми плазмидными генами, выделяют следующие группы плазмид.

F-плазмиды. При изучении процесса скрещивания бактерий оказалось, что способность клетки быть донором генетического материала связана с присутствием особого F-фактора [от англ. fertility, плодовитость]. F^- плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров (F+) с бактериями-реципиентами (F^- ). В связи с этим можно указать, что сам термин «плазмида» был предложен для обозначения «полового» фактора бактерий (Джошуа Лёдерберг, 1952). F-плазмиды могут быть автономными и интегрированными. Встроенная в хромосому F-плазмида обеспечивает высокую частоту рекомбинации бактерий данного типа, поэтому их также обозначают как Hfr-плазмиды [от англ. high frequency of recombinations, высокая частота рекомбинаций].

R-плазмиды [от англ. resistance, устойчивость] кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (например, к антибиотикам и сульфаниламидам, хотя некоторые детерминанты устойчивости правильнее рассматривать как связанные с транспозонами [см. ниже]), а также к тяжёлым металлам. R-плазмиды включают все гены, ответственные за перенос факторов устойчивости из клетки в клетку.

Неконъюгативные плазмиды обычно характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae). Они обычно имеют небольшие размеры (молекулярная масса примерно 1-10х10⁶ дальтон). Обнаруживают большое количество мелких плазмид (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве при клеточном деления. Неконъюгативные плазмиды могут быть также перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид. При конъюгации донор может передать и неконъюгативные плазмиды за счёт связывания генетического материала последних с конъюгативной плазмидой.

Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов - белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов. Многие плазмиды, кодирующие образование бактериоцинов, также содержат набор генов, ответственных за конъюгацию и перенос плазмид. Подобные плазмиды относительно крупные (молекулярная масса 25-150 млн дальтон), их довольно часто выявляют у грамотрицательных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1-2 копий на клетку. Их репликация тесно связана с репликацией бактериальной хромосомы.

Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. В частности F-, R-плазмиды и плазмиды бактериоциногении включают tox+-транспозоны (мигрирующий генетический элемент, см. ниже), кодирующие токсинообразова-ние. Нередко tox'''-транспозоны кодируют синтез интактных протоксинов (например, дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом.

Скрытые плазмиды. Криптические (скрытые) плазмиды не содержат генов, которые можно было бы обнаружить по их фенотипическому проявлению.

Плазмиды биодеградации. Обнаружен также ряд плазмид, кодирующих ферменты деградации природных (мочевина, углеводы) и неприродных (толуол, камфора, нафталин) соединений, необходимых для использования в качестве источников углерода или энергии, что обеспечивает им селективные преимущества перед другими бактериями данного вида. Патогенным бактериям подобные плазмиды придают преимущества перед представителями аутомикрофлоры.

Мигрирующие генетические элементы

Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные осуществлять собственный перенос (транспозицию) внутри генома. Транспозиция связана со способностью мигрирующих элементов кодировать специфический фермент рекомбинации - транспозазу.

Вставочные (инсерционные) последовательности [IS-элементы (англ. insertion, вставка, + sequence, последовательность)] - простейший тип мигрирующих элементов (рис. 4-15, А); их величина не превышает 1500 пар оснований (в среднем 800-1400). IS-элементы самостоятельно не реплицируются и не кодируют распознаваемых фенотипических признаков. Содержащиеся в них гены обеспечивают только их перемещение из одного участка в другой. Основные функции IS-последовательностей - регуляция активности генов бактериальной клетки (могут инактивировать гены, в которые включились, или, встраиваясь в хромосому, проявлять эффект промотора, включающего либо выключающего транскрипцию соответствующих генов), индукция мутаций типа делеций или инверсий (при перемещении) и дупликаций (при встраивании в хромосому), координация взаимодействий плазмид, траспозонов и профа-гов (как между собой, так и бактериальной хромосомой).

Транспозоны (Tn-элементы) состоят из 2000-25 000 пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых IS-элемента (рис. 4-15, Б). При включении в ДНК бактерий транспозоны вызывают дупликации, при выходе из определённого участка ДНК - делеции, при выходе и включении обратно с поворотом фрагмента на 180° - инверсии. Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы. Каждый транспозон обычно содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики типа множественной устойчивости к антибактериальным агентам. Поскольку транспозоны содержат гены, определяющие фенотипически выраженные признаки (например, устойчивость к антибиотикам), то их легче обнаружить, чем IS-элементы. В общем, для транспозонов характерны те же гены, что и для плазмид (гены устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, дополнительных ферментов метаболизма).

Умеренные и дефектные бактериофаги также могут быть факторами изменчивости, напоминая по своим свойствам интегрированные плазмиды. Встраиваясь в бактериальную хромосому в форме профага (провируса), они вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые свойства (см. также гл. 5).

Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы. В некоторых ситуациях факторами изменчивости могут быть умеренные, или дефектные, фаги, поскольку они могут встраиваться в хромосому (состояние профага) и выходить из неё, захватывая иногда и гены хромосомы клетки-хозяина (см. раздел «Трансдукция»). Например, р-бактериофаг сходен с IS-элементами и транспозонами, так как способен включаться практически в любой участок бактериальной хромосомы, привнося свой генетический материал и вызывая мутагенный эффект. Сохраняя все типичные свойства фага, р-бактериофаг можно рассматривать как гигантский транспозон.

Мутации у бактерий

Информация, которую несёт ДНК, не является чем-то абсолютно стабильным. Если бы она была таковой, то диапазон реакций родственных микроорганизмов на внешнее воздействие был бы постоянным, а значит, внезапное изменение условий внешней среды для микроорганизмов с «застывшим» генотипом привело бы к исчезновению вида. Реальная нестабильность генома вызвана мутациями, обменом генетической информацией между донором и реципиентом (см. ниже).

Термин «мутация» предложил де Фриз как понятие «скачкообразного изменения наследственного признака» при изучении наследственности у растений. Позднее Бёйеринк распространил это понятие и на бактерии. Мутация - изменение первичной структуры ДНК, проявляющееся наследственно закреплённой утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. Мутации подразделяют по происхождению, характеру изменений структуры ДНК, фенотипическим последствиям для клетки-мутанта и др. Факторы, вызывающие мутации, известны как мутагены. Они обычно имеют физическую или химическую природу. По происхождению выделяют мутации индуцированные, то есть вызванные искусственно, и спонтанные («дикие», возникают в популяции бактерий без видимого вмешательства извне).

Спонтанные мутации

К появлению спонтанных мутаций приводят ошибки репликации, неправильное формирование комплементарных пар оснований или структурные искажения ДНК под действием естественный мутагенов. Спонтанные мутации могут вызывать благоприятные и неблагоприятные генетические изменения. Примерный уровень спонтанного мутирования - одна мутация на каждые 10⁶ -10⁷ клеток. Численная доля мутантов в клеточной популяции для разных признаков различна и может варьировать от 10^-4 до 10^-11 . Для конкретного гена частота мутирования составляет величину порядка 10^-5 , а для определённой пары нуклеотидов 10^-8 . Например, если на среду с антибиотиком посеять миллион бактерий, можно ожидать, что в результате спонтанной мутации одна колония выживет.

Индуцированные мутации

Химический мутагенез. Некоторые химические вещества (мутагены) значительно повышают частоту мутирования до одной мутантной клетки на 10³ -10⁴ клеток. К таким веществам относят аналоги азотистых оснований (например, бромурацил), включающиеся в молекулу ДНК и вызывающие вставку некорректного основания при репликации (в частности, бромурацил аналогичен по структуре тимину, он включается в ДНК как партнёр аденина, а затем переходит в енольную форму и узнаётся полимеразой как цитозин, что приводит к включению гуанина вместо аденина); алкилирующие агенты (например, этилметансульфонат алкилирует преимущественно атом азота гуанина); азотистая кислота, дезаминирующая азотистые основания; интеркалирующие агенты (например, акридиновые красители), внедряющиеся между основаниями ДНК и вызывающие увеличение расстояния между ними, что приводит к утрате нуклеотидов, включению дополнительной пары нуклеотидов и др.

Радиационный мутагенез обычно приводит к образованию пиримидиновых димеров. УФ-, рентгеновские лучи и другие виды ионизирующего излучения оказывают на микроорганизмы как летальное (подавляющее жизнедеятельность), так и мутагенное воздействие.

Типы мутаций

Мутации могут индуцировать следующие события: модификации оснований (изменения отдельных нуклеотидов), вставки (включение дополнительных оснований), делеции (потеря одного основания или группы оснований) и деформации спирали ДНК.

В зависимости от синтеза «правильных» или «неправильных» полипептидов при считывании мРНК, отразившей изменения ДНК (то есть в зависимости от сохранения смысловой функции образующегося полипептида), различают несколько видов мутаций.

Репарация ДНК

В клетке существуют механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру изменённой ДНК. Мутации, вызванные радиацией, химическими веществами и другими факторами, теоретически могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, если бы последняя была лишена способности к репарации ДНК. Совокупность ферментов, катализирующих коррекцию повреждений ДНК, объединяют в так называемые системы репарации, принципиально различающиеся по биохимическим механизмам «залечивания» повреждений. Известно три основных направления коррекции дефектов ДНК.

Компенсация функций, нарушенных в результате мутаций

Первичная мутация может быть компенсирована вторичной мутацией, которая произошла внутри мутировавшего гена (интрагенно) или в другом гене (экстрагенно). Изменения, которые устраняют проявления мутации, не исправляя при этом первоначального нарушения в ДНК, называют супрессией.

Интрагенная супрессия вызвана вторичной мутацией, корригирующей эффекты первичной мутации. Например, точечная мутация, приводящая к синтезу дефектного белка с утраченной биологической активностью, может быть исправлена, если вторичная точечная мутация приведёт к кодированию аминокислоты, сохраняющей конфигурацию и активность белка. Точное восстановление исходной структуры гена называют истинной обратной мутацией (истинной реверсией). Если эффект первой мутации компенсирован мутацией в другой части гена, такие мутации называют вторичными реверсиями.

Экстрагенная супрессия - подавление проявления мутации, произошедшей в одном гене, вследствие мутации во втором гене.

Перенос бактериальной ДНК

Длительное время считали, что бактерии - изолированные генетические системы, и каждая особь имеет одного (и только одного) родителя, то есть их изменчивость вызвана лишь мутациями. Никто не мог себе представить, что - подобно гаметам высших организмов - бактерии способны обмениваться генетическим материалом и, по аналогии с половым размножением, давать начало потомству с новыми свойствами. Однако Лёдерберг и Тёйтем (1946), высевая на минеральную среду, предварительно смешав два типа мутантов Escherichia coli (один нуждался в биотине и метионине, другой - в треонине и лейцине), показали, что у бактерий генетические рекомбинанты со способностью к синтезу всех четырёх факторов роста возникают с частотой 10^-6 , хотя теоретическая вероятность реверсии по двум генам составляет 10^-14 -10^-16 на генерацию. Это противоречие было снято установлением факта прямой передачи генетического материала от донорной клетки к реципиентной (конъюгация). Помимо конъюгации, передача генетического материала у бактерий может осуществляться также с помощью трансформации и трансдукции (рис. 4-16).

Конъюгация

Конъюгация - прямой перенос фрагмента ДНК от донорных бактериальных клеток к реципиентным при непосредственном контакте этих клеток. Биологическая значимость этого процесса стала проясняться после внедрения в медицинскую практику антибиотиков. Устойчивость к антибиотикам можно получить в результате мутации, что происходит один раз на каждые 10⁶ клеточных делений. Однако, однажды изменившись, генетическая информация может быстро распространяться среди сходных бактерий благодаря конъюгации, поскольку каждая третья из близкородственных бактерий способна именно к этому типу генетического переноса. Для реализации процесса необходим F-фактор - плазмида, кодирующая информацию, необходимую для конъюгации.

Конъюгация требует наличия двух типов клеток: доноров (F+), обладающих F-фактором, и реципиентов (F^- ), не обладающих им. При скрещивании клеток F^- и F+ фактор фертильно-сти передаётся с частотой, близкой к 100%.

Фактор переноса содержит гены специальных и необходимых при конъюгации структур - F-пилей и ряд других генов, вовлечённых в процесс взаимодействия с F^- -клетками. Первый этап конъюгации - прикрепление клетки-донора к реципиенту с помощью F-пилей. Затем между клетками формируется конъюгационный мостик, через который передаётся F-фактор, а также и другие плазмиды, автономно пребывающие в цитоплазме донора. При попадании F-фактора в реципиентную клетку она становится F⁺ и приобретает способность передавать фактор фертильности другим F^- -клеткам. Подобный механизм обеспечивает приобретение популяционной устойчивости к антибактериальным агентам.

В популяции клеток, содержащих F-плазмиду, только те, в которых она интегрирована в бактериальную хромосому (Шг⁺ -клетки), способны быть донорами хромосомной ДНК. При переносе генетического материала бактериальная ДНК реплицируется, начиная от места включения F-фактора, одна цепь ДНК переносится в реципиентную F^- -клетку двигаясь 5"-концом вперёд, тогда как другая остаётся в Шг+-клетке, то есть донор сохраняет своё генетическое постоянство. После начала конъюгации хромосомный материал переносится, начиная от генов, близких к начальной точке транспорта (рис. 4-17). В бактерии-реципиенты обычно попадают первые из переносимых генов, размер которых зависит от времени, в течение которого проходила конъюгация, и очень редко - все гены. Позже всех переносится участок плазмиды, содержащий ген переноса, кодирующий F-пили. Поскольку полная трансмиссия - явление редкое, реципиентная клетка при Hfr-конъюгации обычно остаётся F^- . Вслед за процессом переноса в клетке-реципиенте происходит гомологичная рекомбинация между донорской ДНК и собственной ДНК реципиента.

Процесс конъюгации может происходить только при соблюдении ряда условий.

Трансформация

Трансформация - генетическое изменение клеток в результате включения в их геном экзогенной ДНК. Феномен открыл Гриффит у Streptococcus pneumoniae (1928); позднее О. Эвери, К. Маклеод и М. МакКарти (1944) выделили трансформирующее начало пневмококков в форме молекулы ДНК (заметим попутно, что именно это и явилось первым прямым доказательством того, что носитель генетической информации - ДНК). Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Как правило, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами, но при некоторых условиях такая ДНК может быть включена в геном бактерии. По происхождению ДНК может быть плазмидной либо хромосомной и нести гены, «трансформирующие» реципиента. Подобным путём в популяции могут быть распространены гены, кодирующие факторы вирулентности. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Стадии. Трансформация протекает в три стадии: 1) адсорбция двухцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток; 2) ферментативное расщепление связавшейся ДНК в некоторых случайно расположенных местах с образованием фрагментов 4-5х10⁶ дальтон; 3) проникновение фрагментов ДНК с молекулярной массой не менее 5х10⁵ дальтон, сопровождающееся разрушением одной из цепей ДНК (последний этап энергозависим). Проникшая цепь ДНК рекомбинирует с генетическим материалом реципиентной клетки.

Применение при картировании бактериальных генов. Трансформация служит хорошим инструментом для картирования хромосом, поскольку трансформированные клетки включают различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных характеристик (чем ближе расположены гены, тем более вероятно, что они оба включатся в один и тот же участок ДНК) даёт информацию о взаиморасположении соответствующих генов в хромосоме.

Трансдукция

Трансдукция - перенос бактериофагом в заражаемую клетку фрагментов генетического материала клетки, исходно содержавшей бактериофаг. Трансдуцирующий бактериофаг обычно переносит лишь небольшой фрагмент ДНК хозяина от одной клетки (донор) к другой (реципиент). Выделено три типа трансдукции: неспецифическая (общая), специфическая и абортивная. В клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК могут проникнуть фрагменты бактериальной ДНК или плазмиды. Вирусы ограничены в объёме генетического материала в соответствии с объёмом головки. Если ДНК бактериальной клетки расщепляется фагом в нетипичном месте, то чтобы освободить пространство для фрагмента хромосомной ДНК, некоторые участки вирусных ДНК «приносятся в жертву», что приводит к утере определённых их функций. При этом фаговая частица может стать дефектной. Количество аномальных фагов может достигать 0,3% всей дочерней популяции. Образовавшийся фаг и есть частица, вызывающая неспецифическую (общую) трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.

При неспецифической трансдукции фагом может быть перенесён любой фрагмент ДНК хозяина, а при специфической лишь строго определённые фрагменты ДНК. Наиболее известным примером специфической трансдукции служит трансдукция, осуществляемая фагом X. Поскольку этот фаг при переходе в состояние профага включается в хромосому бактерий между генами, кодирующими синтез галактозы и биотина, именно эти гены он может переносить при трансдукции. При абортивной трансдукции внесённый фрагмент ДНК донора не встраивается в генофор реципиента, а остаётся в цитоплазме, где его ДНК транскрибируется, но не реплицируется. Это приводит к тому, что при клеточном делении он передаётся только одной из дочерних клеток (то есть наследуется однолинейно) и затем теряется в потомстве.

Свойства трансдуцирующих фаговых частиц следующие.

Ненаследуемые изменения свойств бактерий

Приспособительная активность микроорганизмов лежит в основе их изменчивости. Во многом эта способность определяет пластичность и слаженность обменных процессов, сложившихся в ходе эволюции конкретного вида. Далеко не каждый признак признаётся пригодным для включения в наследственную информацию. Он должен быть тщательно проверен, доказана его целесообразность для потомства, то есть наследственность консервативна. Однако при действии факторов внешней среды клетка может регулировать экспрессию генов. При этом кодируемый определённым геном белок может быть практически полностью исключён из обмена либо может проводиться в больших количествах (регуляция на уровне синтеза). Белок также может быть изменён по структуре так, что его функциональная активность также меняется (регуляция на уровне активности). Врёменные, наследственно не закреплённые изменения принято обозначать как модификации. Они могут возникать в популяции любого вида, и их проявления в мире бактерий наблюдают довольно часто. Они в целом контролируются генофо-ром бактерий, но (в отличие от мутаций) не сопровождаются изменениями кодирующей структуры и утрачиваются при прекращении действия вызвавших их факторов. У бактерий наблюдают морфологические (приводящие к обратимым изменениям формы) и биохимические (приводящие к синтезу некоторых продуктов, чаще ферментов) модификации. По существу, модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменения окружающей среды, что позволяет им быстро приспосабливаться благодаря чему сохраняется определённая численность популяции. После устранения соответствующего воздействия, вызвавшего их образование, бактерии возвращаются к исходному фенотипу. Примером адаптации микроорганизмов может служить способность патогенных микроорганизмов образовывать под действием пенициллина L-формы, у которых отсутствует клеточная стенка, служащая мишенью для пенициллина.

Стандартное проявление модификации - разделение однородной популяции на два или несколько типов. Феномен впервые исследовали Вёйль и Фёликс (1917). По предложению де Крайфа (1921), он получил название диссоциация микробов. Обычно диссоциации возникают в условиях, неблагоприятных для исходной популяции (высокая концентрация ионов, неоптимальная температура, избыточно щелочная среда), при старении культуры (например, при длительном хранении) либо под действием антисыворотки, бактериофагов и сильнодействующих агентов. Простые проявления диссоциаций, доступных для наблюдений, - изменение вида и структуры бактериальных колоний на твёрдых питательных средах и особенности роста в жидких средах. Для обозначения диссоциирующих колоний Аркрайт (1921) предложил первые буквы английских названий: S-колонии [от англ. smooth, гладкий], R-колонии [от англ. rough, шероховатый], M-колонии [от англ. mucoid, слизистый] и D-колонии [от англ. dwarf, карликовый]. Диссоциация обычно протекает в направлении S -R, иногда через образование промежуточных слизистых (М) колоний. Обратный (R - S) переход наблюдают значительно реже. Большинство патогенных для человека бактерий образует S-колонии; исключение составляют возбудители туберкулёза, чумы, сибирской язвы и немногие другие. Следует помнить, что диссоциации сопровождаются изменениями биохимических, морфологических, антигенных и патогенных свойств возбудителей.

Вирусы нельзя отнести ни к растениям, ни к животным. Вне клетки они инертны, а некоторые вирусы даже образуют кристаллы. Вирусную частицу можно рассматривать не как живой организм, а как сравнительно крупный нуклеопротеид, проникающий в клетку и «тиражирующийся» в ней.

ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Хотя ещё в 1885 г. Э. Шамберлан, Э. Ру и Л. Пастёр разработали вакцину против вируса бешенства, а Джённер ещё в конце XVIII в. получил первую противовирусную (противооспенную) вакцину, первооткрывателем вирусов и основоположником вирусологии считают всемирно известного отечественного учёного Д.И. Ивановского. Собственно, отсчёт истории вирусологии следует вести от 12 февраля 1892 г., даты сообщения Д.И. Ивановского в Академии наук об открытии возбудителя «табачной мозаики», сделанном на Одесской бактериологической станции, которой тогда руководил Н.Ф. Гамалея. Позднее М. Бёйеринк установил способность возбудителя табачной мозаики диффундировать через агар и заключил, что агент Д.И. Ивановского является живым жидким контагием (contagium vivum fluidum). Последующие открытия доказали наличие микроскопических фильтрующихся инфекционных агентов, и уже в первом номере «Бюллетеня Института Пастёра» за 1903 г. Ру объявил, что «те, кто считает вирусы плодами фантазии глубоко ошибаются». Особо отметим высказывание о роли нашего соотечественника американского вирусолога У. Стэнли: «Право Ивановского на славу растёт с годами. Я считаю, что его отношение к вирусам должно рассматриваться в том же свете, как мы смотрим на отношение Пастё-ра и Коха к бактериям».

С первых шагов вирусологии многие исследователи придерживались мнения, что вирусы - мелкие, фильтрующиеся (то есть проходящие через бактериальные фильтры) формы микроорганизмов, утерявшие способность расти на обычных субстратах. Первые наблюдения над фильтрующимися формами сделал Н.Ф. Гамалёя (1898), обнаруживший просветление взвеси палочек сибирской язвы в дистиллированной воде, вызванное разрушением бактерий, и способность этой жидкости в течение 6-12 ч вызывать разрушение свежих культур сибиреязвенной палочки. В этом же плане интересные попытки вырастить вирусы на различных питательных средах делал директор Лондонского Брауновского общества Ф. Туорт. В ходе экспериментов он также обратил внимание на необычное «стекловидное перерождение» колоний стафилококков, загрязнявших его посевы.

Туорт отметил, что подобные колонии теряли способность к пересевам, а внесение их содержимого в здоровые колонии вызывало перерождение последних. В своей статье (The Lancet, 1913) он заключил, что причиной перерождения может быть фермент, разрушающий сами клетки-продуценты, или агент, поражающий бактерии. Это открытие подтвердил Ф. д’Эрёлль, выделивший из кишечника больного шигеллы, содержащие некий агент, растворяющий их, и назвал его «невидимый бактериальный антагонист», или бактериофаг (фаг). В настоящее время сам термин «бактериофаг» [от бактерия + греч. phagein, поедать] явно исчерпал своё значение и употребляется больше как дань традиции, нежели по существу. Более полно отражает его природу и наши представления о бактериофагах термин «бактериальный вирус».

Особый интерес развивающейся области придало открытие онкогенных вирусов (П. Раус, 1901). Однако длительное время развитию вирусологии препятствовало отсутствие адекватных моделей и методов изучения возбудителей. Исследования ограничивались моделированием вирусных инфекций на лабораторных животных. Исследования П. Руа (1911), Э. Гудпасчера и Э. Вудрафф (1931), Ф. Бернёта (1933) и других учёных заложили основы культивирования вирусов в эмбрионах кур, что позволило позднее перейти к использованию и других тканевых моделей. Совершенствование электронной микроскопии позволило детально изучить морфологию и организацию вирусных частиц. После того, как были открыты микоплазмы, также проходящие через фильтры, к вирусам перестали применять прилагательное «фильтрующиеся». В 1956 г. было сделано ещё одно краеугольное открытие в вирусологии - было установлено, что нуклеиновые кислоты вирусов могут проявлять инфекционные свойства. Этот факт лёг в основу открытия механизма размножения вирусов.

Благодаря успехам в разработке вакцин против многих вирусов - оспы, бешенства, полиомиелита, кори, жёлтой лихорадки и многих других - стала возможна эффективная борьба с вирусными инфекциями человека. В настоящее время эта ещё недавно довольно узкая дисциплина - одна из наиболее интенсивно развивающихся медико-биологических наук. Интерес к вирусологии объясняет, во-первых, ведущая роль вирусов в инфекционной патологии человека, их удельный вес (особенно на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии) возрастает по мере снижения заболеваемости бактериальными, грибковыми и протозойными инфекциями. Во-вторых, на моделях вирусов (как относительно просто организованных формах) разрешают многие фундаментальные вопросы биологии. Одним из крупнейших вкладов вирусологии в современную науку считают открытие фермента обратной транскриптазы, использование которой лежит в основе генной инженерии.

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ

Фундаментальное отличие вирусов от других инфекционных агентов состоит в механизмах их репродукции: вирусы не способны к самостоятельному размножению. Репликация генетического материала вирусов (ДНК или РНК), а также экспрессия вирусных генов (вирусный ген вирусный белок) осуществляются при помощи механизмов репликации, транскрипции, сплайсинга и трансляции инфицированной клетки-хозяина. Циклы репродукции вирусов в инфицированной клетке зависят от типа вирусной нуклеиновой кислоты (подробнее см. раздел «Вирусы» в главе 2).

Репродукция +РНК-вирусов

+РНК-вирусы (например, пикорна- и тогавирусы) проникают в чувствительную клетку путём виропексиса. Репродуктивный цикл начинается после высвобождения вирусного генома в цитоплазме (рис. 5-1).

Пикорнавирусы

Пикорнавирусы размножаются подобно большинству +РНК-содержащих вирусов. Среди них наиболее хорошо изучен полиовирус (возбудитель полиомиелита), имеющий небольшие размеры, «голый» капсид и однонитевую молекулу +РНК. Адсорбционные возможности полиовиру-са ограничены клетками приматов и человека, имеющих специфические рецепторы. Репликация +РНК полностью происходит в цитоплазме клетки. Репродуктивный цикл подразделяют на раннюю и позднюю стадии.

Ранняя стадия репродукции включает процессы, происходящие после проникновения вируса в клетку до образования большого количества копий +РНК в процессе репликации (см. главу 2). Поздняя стадия репродукции включает синтез белков капсида. Образованные в репликативном синтезе молекулы +РНК функционируют как мРНК, транслируясь в один гигантский полипептид, «нарезаемый» протеазами на капсидные белки. После самосборки капсидов формируется зрелая дочерняя популяция. Поскольку пикорнавирусы лишены суперкапсида, то высвобождение популяции сопровождается массивным повреждением клеточной мембраны с последующим лизисом инфицированной клетки.

Тогавирусы

После проникновения вириона в клетку синтезируется вирусная полимераза (РНК-зависимая РНК-полимераза), катализирующая образование -РНК на матрице +РНК. Образовавшиеся цепи -РНК служат матрицей для синтеза двух типов +РНК (полная и короткая нити). Каждая +РНК транслируется в большой полипептид, подвергающийся последовательному расщеплению и процессингу. Полная нить (42S) служит «шаблоном» для синтеза вирусных полипептидов или идёт на построение геномов дочерних популяций вируса; короткая нить (26S) кодирует белки капсида и два оболочечных белка. Последние гликолизируются, расщепляются и встраиваются в клеточную мембрану, модифицируя её. Дочерние вирионы почкуются через изменённые участки мембраны с образованием суперкапсида.

Ретровирусы

Репродуктивный цикл +РНК-ретровирусов уникален, так как при его реализации как промежуточный продукт образуются молекулы ДНК (рис. 5-2). Поскольку обратная транскрипция и интеграция вирусного генома предшествуют репликации, то (в противоположность прочим молекулам вирусных +РНК) плюс-молекулы РНК ретровирусов не проявляют инфекционных свойств, а служат матрицей для синтеза молекулы -ДНК РНК-зависимой ДНК-полимеразой (обратной транскриптазой, ревертазой), входящей в состав вирусной частицы. С молекул -ДНК копируются цепи +ДНК. Затем обе цепи соединяются с образованием двойной цепи и транспортируются в ядро клетки. Клеточные эндонуклеазы и лигазы (интегразы) катализируют сплайсинг ДНК клетки с вирусной ДНК. В результате образуются новые, рекомбинантные молекулы ДНК. Вновь образованная ДНК транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой в +РНК. Полная копия +РНК способна формировать геномы дочерних популяций, а также транслироваться как мРНК с образованием структурных белков и ферментов, участвующих в сборке вирионов. Эти копии могут быть подвергнуты РНК-сплайсингу - устранению интронов из мРНК-предшественника; в результате образуются малые молекулы мРНК, кодирующие поверхностные, регуляторные и добавочные белки вируса. Самосборка вирусов и созревание вирусных частиц происходит в цитоплазме. Зрелые вирионы выходят из клетки, отделяясь от неё почкованием (высвобождение вируса в окружающую среду может длиться годами).

Репродукция -РНК-вирусов и вирусов с двухнитевыми РНК -РНК-вирусы проникают в клетку путём слияния (парамиксовирусы) либо виропексиса (раб-до- и ортомиксовирусы). Для эффективной репродукции вирусная -РНК должна быть преобразована в +РНК - аналог клеточной мРНК (рис. 5-3).

-РНК-вирусы

Ранняя стадия репродукции. После высвобождения генома вирусная транскриптаза (РНК-зависимая РНК-полимераза) «запускает» синтез +РНК. При этом «шаблоном» для вирусной транскриптазы служит вирусный рибонуклеопротеин (то есть РНК и внутренние белки). В результате образуются полные и короткие молекулы-копии +РНК.

Поздняя стадия репродукции. Полные плюс-нити служат матрицами для синтеза молекул -РНК, составляющих геномы дочерней популяции. Короткие плюс-нити участвуют в синтезе ферментов и белков. Вирусные белки (гемагглютинин и нейраминидаза) взаимодействуют с участками клеточной мембраны. Там же сорбируются и вирусные М-белки (белки матрикса). Они проявляют выраженную гидрофобность за счёт содержания до 75% нейтральных аминокислот. Это свойство даёт им способность взаимодействовать с белками и липидами клеточной мембраны и быть посредником сборки вирусных частиц. С одной стороны, М-белок распознаёт участки включения гликопротеинов вируса в мембрану, с другой - его специфически распознает нуклеокапсид и связывается с ним. Сборка дочерних популяций завершается после присоединения нуклеокапсида к клеточной мембране. Их высвобождение происходит путём почкования через модифицированные участки мембраны. Отпочковывающиеся вирусные частицы захватывают её фрагменты, служащие в дальнейшем суперкапсидами.

Двухнитевые РНК-геномные вирусы

Двухнитевые РНК-вирусы представлены семейством Reoviridae (рео- и ротавирусы). Они не имеют суперкапсида и организованы по типу кубической симметрии. С вирусной РНК связана РНК-зависимая РНК-полимераза. Вирусы отличает удлинённый репродуктивный цикл и тенденция к накоплению продуктов вирусоспецифического синтеза внутри клеток. После высвобождения генома в цитоплазме клеток РНК-полимераза осуществляет синтез молекул мРНК (+РНК) на одной нити -РНК. В результате образуется до 11 функциональных молекул мРНК, соответствующих по размерам 11 сегментам одной нити -РНК. Молекулы транслируются в 11 первичных полипептидных продуктов. Их последующее расщепление приводит к образованию в заражённых клетках до 16 вторичных полипептидов. Семь первичных и два вторичных полипептида входят в состав вирусных частиц, остальные первичные и вторичные полипептиды выполняют каталитические и регуляторные функции. Параллельно, синтезированная в ходе трансляции вирусная РНК-полимераза запускает синтез минус-нитей на матрице +РНК с последующим их соединением в двухнитевую молекулу РНК. Выход образовавшихся вирионов сопровождается гибелью клетки.

Репродукция ДНК-вирусов

Вирусы, лишённые суперкапсида (например, аденовирусы) проникают в клетки путём виро-пёксиса, а имеющие таковой (покс- и герпесвирусы) - за счёт слияния суперкапсида с клеточной мембраной. Репродуктивный цикл ДНК-содержащих вирусов включает раннюю и позднюю стадии (рис. 5-4). У крупных ДНК-вирусов имеется явное несоответствие между кодирующей ёмкостью генома и молекулярной массой вирусиндуцированных белков и белков, входящих в состав вирионов. Например, у герпесвирусов лишь 15% ДНК кодирует все белки вирионов и их предшественников. Возможно, значительная часть генома содержит гены, кодирующие синтез ферментов и регуляторных белков. Папова-, адено- и герпесвирусы репродуцируются относительно однотипно, в то время как репродукция поксвирусов имеет некоторые особенности.

Ранняя стадия

Вирусная ДНК проникает в ядро клетки, где транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой. При этом считывается, а затем транслируется часть вирусного генома («ранние гены»). В результате синтезируются «ранние белки» (регуляторные и матричные белки, вирусные полимеразы).

Регуляторные белки выполняют различные функции. При заражении клетки они блокируют синтез клеточных РНК, ДНК и белка и одновременно способствуют экспрессии вирусного генома, изменяя специфичность реагирования клеточных полимераз и полирибосом. Они также запускают репликацию клеточной ДНК, модифицированной встроенными геномами ДНК-содержащих вирусов и ретровирусов, то есть репликацию вирусных геномов.

Вирусоспецифические полимеразы. В репликацию вирусных геномов также вовлечены вирусос-пецифические ДНК-полимеразы, участвующие в образовании молекул ДНК дочерних популяций.

Матричные белки необходимы для репликации нуклеиновых кислот и сборки дочерних популяций. Они образуют электронно-плотные скопления в клетке, известные как тельца включений (например, тельца Гварнери при натуральной оспе).

Поздняя стадия. На этом этапе происходит синтез нуклеиновых кислот вируса. Не вся вновь синтезированная вирусная ДНК упаковывается в вирионы дочерней популяции. Часть ДНК («поздние гены») используется для синтеза «поздних белков», необходимых для сборки вирионов. Их образование катализируют вирусные и модифицированные клеточные полимеразы.

Паповавирусы и аденовирусы

Адсорбция, проникновение и депротеинизация аналогичны таковым у РНК-содержащих вирусов, но у папова- и аденовирусов депротеинизация протекает в ядре, а у РНК-вирусов - в цитоплазме.

Ранняя фаза. Вирусная ДНК («ранние гены») транскрибируется в ядре клетки. На одной из нитей ДНК реализуется транскрипция вирусной «ранней» мРНК. Механизмы транскрипции вирусной ДНК аналогичны считыванию информации с клеточной ДНК. Специфическая мРНК транслируется, начинается синтез ферментов, необходимых для образования дочерних копий ДНК. Синтез клеточной ДНК может временно усиливаться, но затем обязательно подавляется регуляторными белками вируса.

Поздняя фаза. В течение поздней фазы дочерняя вирусная ДНК продолжает активно транскрибироваться клеточными РНК-полимеразами, в результате чего появляются продукты поздних вирусоспецифических синтезов. «Поздняя» мРНК мигрирует в цитоплазму и транслируется на рибосомах. В результате синтезируются капсидные белки дочерней популяции, которые транспортируются в ядро и собираются вокруг молекул дочерней ДНК новых вирусных частиц. Выход полных дочерних популяций сопровождается гибелью клетки.

Герпесвирусы

Основные отличия репродуктивного цикла герпесвирусов от остальных ДНК-вирусов связаны с более сложной структурой генома. Адсорбция вирусов на клетках осуществляется через специфические рецепторы. После взаимодействия с рецепторами вирусная оболочка сливается с клеточной мембраной, а нуклеокапсид высвобождается в цитоплазму. Раздевание (депротеи-низация) вирусного генома происходит на ядерной мембране, и вирусная ДНК оказывается в ядре клетки-хозяина. Репродукция включает раннюю и позднюю стадии, однако они разграничиваются нечётко.

Ранняя стадия. В ранней стадии синтезируются «ранние белки», кодируемые проксимальной третью молекулы ДНК. Они проявляют регуляторные свойства, включая активацию транскрипции других участков вирусного генома, кодирующих ДНК-полимеразу и ДНК-связывающие белки.

Поздняя стадия. В позднюю стадию вирусная ДНК-полимераза индуцирует репликацию материнской ДНК. В результате образуются молекулы ДНК дочерней популяции. Часть дочерней ДНК считывают клеточные полимеразы, что вызывает транскрипцию концевых генов, кодирующих структурные протеины (белки оболочки и гликопротеины шипов).

Сборка дочерних популяций осуществляется в ядре, где капсидные белки окружают молекулы ДНК, формируя нуклеокапсиды. Финальная стадия морфогенеза герпесвирусов - формирование суперкапсида на внутренней поверхности ядерной мембраны. Зрелые дочерние популяции отпочковываются от модифицированной ядерной мембраны, транспортируются через цитоплазму и выделяются наружу.

Поксвирусы

Поксвирусы обладают наиболее сложным репродуктивным циклом, при этом синтезируется более 100 различных белков, входящих в состав вирионов (большинство образует наружную оболочку). Репродукция поксвирусов характеризуется следующими особенностями.

В репродуктивном цикле выделяют три стадии - начальную, раннюю и позднюю. Начальная стадия запускается сразу же после раздевания вируса и выхода вирусной ДНК в цитоплазму.

Ранняя стадия. На этом этапе транскрибируется примерно половина вирусной ДНК. Синтезируются ферменты, кодируемые «ранними генами» и участвующие в репликации вирусной ДНК. Параллельно в небольшом количестве образуются структурные белки.

Поздняя стадия совпадает с началом репликации ДНК (что переключает механизмы транскрипции на считывание второй половины генома). Регуляторные белки блокируют трансляцию «ранней мРНК» и запускают синтез поздних (структурных) белков. Сборка вирионов осуществляется только в цитоплазме посредством реакций мембранного синтеза. Высвобождение зрелых популяций сопровождается лизисом клетки.

Вирус гепатита В

Вирус гепатита В не способен размножаться in vitro. Некоторые этапы его репродукции остаются плохо изученными. Геном представлен двухцепочечной молекулой ДНК, но плюс-нить несколько короче, каждая нить имеет на концах одинаковые двойные сегменты, обеспечивающие интеграцию в геном клетки. Вирионы содержат полимеразу, способную транскрибировать ДНК в РНК.

После раздевания вирусные ДНК и полимераза мигрируют в ядро, где под действием последней осуществляется дополнение плюс-цепи ДНК (в качестве матрицы используется минус-цепь). Полная двухцепочечная ДНК транскрибируется с образованием небольших молекул мРНК и полной молекулы +РНК (эта прегеномная РНК служит матрицей для репликации генома).

Синтез различных вирусных ферментов и белков реализуется на небольших молекулах мРНК. Репликация генома осуществляется через ряд последовательных процессов.

Интеграция. Одновременно с реализацией сложного репродуктивного цикла вирусная ДНК может интегрироваться в геном клетки путём расщепления на множество фрагментов, встраивающихся в различные участки клеточной ДНК. После встраивания доступным для считывания остаётся лишь фрагмент, кодирующий HB Ag, что даёт ему возможность реплицироваться даже при отсутствии возможности для полной "репродукции вируса.

Генетика вирусов и взаимодействие вирусных геномов

Патогенные для человека вирусы обладают двумя основными свойствами - наследственностью и изменчивостью, изучение которых составляет предмет особой научной дисциплины - генетики вирусов.

Характеристика вирусных популяций

Популяционную структуру вирусов и характер протекающих в них процессов определяют следующие факторы.

Высокая численность популяции, что увеличивает вероятность мутаций, которые могут быть подхвачены естественным отбором при изменении условий существования вирусов.

Быстрая смена поколений позволяет изучать изменчивость вирусов не только в эксперименте, но и наблюдать их естественную эволюцию в природе.

Гаплоидность и бесполый способ размножения определяют: генетическую чистоту популяции (отсутствие гибридов); невозможность сохранения запасов изменчивости за счёт дип-лоидности; немедленное попадание мутантов под контроль отбора.

Малая ёмкость генома и отсутствие повторяющихся генов. Для реализации инфекционного цикла необходима функциональная целостность всех генов. Незначительное изменение одного из них может вызвать летальный или условно летальный эффект для вируса.

Непрерывность в динамике эпидемического процесса, так как обязательное условие сохранения в природе - передача новым чувствительным хозяевам.

Вирусные популяции хорошо адаптированы к внешним условиям и не претерпевают существенных изменений в течение продолжительного времени. При изменении условий для выживания популяции становится необходимой перестройка наследственной структуры, обеспечивающая адаптацию к новой среде. Подобная перестройка возможна лишь при наличии в общем генофонде популяции изменённых генов. Генофонд вирусных популяций создаётся и пополняется из четырёх основных источников (табл. 5-1).

Мутации

Нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям, то есть внезапным наследуемым изменениям. Сущность этих процессов заключается в нарушениях генетического кода в виде изменений нуклеотидных последовательностей, их выпадений (делеций), вставок либо перестановок нуклеотидов или пар в одно- и двухнитевых молекулах нуклеиновых кислот. Указанные нарушения могут ограничиваться отдельными нуклеотидами или же распространяться на более значительные участки. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации. Их биологическое значение может быть связано с приобретением или потерей патогенных свойств, а также с приобретением свойств, лишающих их чувствительности к действию защитных механизмов организма-хозяина. Мутации, полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков, приводят к утрате способности к репродукции и иначе известны как летальные мутации. В их основе лежат изменения, приводящие к возникновению бессмысленных кодонов (с нарушением синтеза белковой цепочки) либо к появлению вставок или делеций (с глубокими нарушениями генетического кода). Мутации с потерей способности синтезировать определённый белок или с нарушением его функций, что в определённых условиях может привести к утрате способности к репродукции называют условно летальными.

Спонтанные мутации

Спонтанные мутации возникают под действием различных естественных мутагенов и встречаются с частотой 1:10^-8 вирусных частиц. Чаще их можно наблюдать у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции.

Индуцированные мутации

Индуцированные мутации вызывают различные химические агенты и УФ-облучение (у ДНК-содержащих вирусов). Принципиальной разницы в перестройке генома, вызванной спонтанными или индуцированными мутациями, нет. Принято считать, что применяемые мутагены лишь увеличивают частоту спонтанных мутаций. При классификации вирусных мутаций используют два разных подхода: их разделяют по характеру изменений генотипа или по изменениям фенотипа, наступающим в результате мутаций. Изучение изменений генотипа вирусов проводят редко, так как для этого необходимо детальное изучение их геномов. Чаще проводят изучение фенотипических проявлений мутаций как более доступных для исследований.

Проявление мутаций в фенотипе. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов можно разделить на четыре группы.

Генетические взаимодействия между вирусами

Заражение вирусами чувствительных к ним клеток носит множественный характер, то есть в клетку может проникнуть несколько вирионов, обычно идентичных или близкородственных. В подобных ситуациях геномы вирусных частиц в динамике репродуктивных циклов могут взаимодействовать или интерферировать. Независимо от типа нуклеиновой кислоты генетические взаимодействия между вирусами представлены несколькими формами: рекомбинация, обмен фрагментами генома, комплементация.

Рекомбинации и перераспределение генов

Рекомбинации и перераспределение генов между геномами приводят к перераспределению генетического материала в дочерних популяциях. Они отмечены во всех группах ДНК-содер-жащих вирусов, у всех РНК-содержащих вирусов с сегментированным геномом и лишь у немногих РНК-содержащих вирусов с несегментированным геномом (например, у полиовируса и вируса ящура).

Обмен фрагментами генома

Обмен фрагментами генома наблюдают у РНК-содержащих вирусов с сегментированным геномом. В отличие от рекомбинации суть процесса состоит в обмене крупных блоков наследственного материала. Например, при множественном заражении клетки мутантами вируса гриппа с изменениями, закреплёнными в различных сегментах генома, возможно появление нормального штамма вируса; в образовании популяции последнего принимают участие геномы обоих вирусов (рис. 5-6). В частности, передача двух фрагментов генома вирулентного для цыплят штамма вируса гриппа авирулентному влечёт за собой приобретение последним вирулентных свойств. В результате обмена вирус гриппа типа А может получить новые и селективно ценные типы поверхностных Аг гемагглютинина и нейраминидазы, что обеспечивает антигенный шифт [от англ. shift, перемещение] в динамике инфекционного процесса.

Комплементация

Комплементация - функциональное взаимодействие двух дефектных вирусов, приводящее к появлению возможности их репродукции в условиях, при которых невозможно размножение каждого вируса в отдельности. При реализации подобных отношений вирусные геномы взаимодействуют косвенно, то есть на уровне кодирующих их веществ. Дефектные вирусы размножаются и передаются горизонтально (то есть от одной особи к другой, в отличие от вертикального способа - от матери к плоду; рис. 5-7).

Фенотипические смешивание и маскирование

Фенотипические смешивание и маскирование (псевдотипирование). Эти формы взаимодействий можно назвать генетическими лишь в контексте взаимодействия геномов, так как приобретаемые признаки обычно не закрепляются в потомстве, которому свойственны серологические свойства одного из «родительских» штаммов.

Фенотипическое смешивание наблюдают при одновременном заражении клетки близкородственными вирусами (например, различными сероварами полиовирусов или вирусов Кокса-ки). В результате образуются вирионы с гибридными капсидами, в состав которых входят капсомеры, кодируемые геномами двух вирусов (рис. 5-8).

Образование псевдотипов происходит при множественном инфицировании. Феномен заключается в образовании нуклеокапсида, состоящего из генома одного вируса и капсида близкородственного вируса. Генетические процессы, приводящие к образованию псевдотипов, известны как фенотипическое маскирование. Процесс может развиваться и в обратном направлении при коинфицировании вирусами идентичного псевдотипа. Если все вирионы, попавшие в клетку, содержат геном типа 2 и заключены в капсид типа 1, то дочерние популяции будут включать капсид и геном типа 2, так как образование всех их структурных компонентов кодирует геном типа 2.

Интерферирующие взаимодействия

Интерференцией вирусов обозначают состояние невосприимчивости к вторичному заражению клетки, уже инфицированной вирусом. Различают интерференцию гетерологическую и гомологическую.

Гетерологическая интерференция. Инфицирование одним вирусом полностью блокирует возможность репликации второго вируса в пределах одной клетки. Один из механизмов гетерологической интерференции связан с угнетением адсорбции другого вируса путём блокирования или разрушения специфичных рецепторов. Другой механизм связан с ингибированием трансляции мРНК любой гетерологичной мРНК в инфицированной клетке.

Гомологическая интерференция. Процесс типичен для многих дефектных вирусов, особенно для повторно пассируемых in vitro и с высокой множественностью инфицирования. Дефектные вирусы обычно не способны к самостоятельной репродукции. Их репродукция возможна лишь при заражении клетки совместно с нормальным вирусом. В подобных взаимодействиях последний называют вирусом-помощником. Иногда дефектный вирус может вмешиваться в репродуктивный цикл нормального вируса и образовывать дочерние дефектные интерферирующие (ДИ) вирусные частицы.

Детерминанты патогенности вирусов и патогенез вирусных инфекций

Некоторые вирусы способны размножаться в самых различных клетках, тогда как другие проявляют специфичность и размножаются лишь в определённых тканях.

Факторы специфичности

Мутации

Довольно часто вирулентность вирусов увеличивают мутации. Например, вирулентность вируса гриппа в значительной степени связана с активностью гемагглютинина, и изменения его структуры делают штаммы возбудителя авирулентными. Обратные мутации (реверсии) генов, кодирующих структуру белка, могут восстанавливать его строение и трансформировать ранее авирулентные штаммы в вирулентные.

Особенности макроорганизма

Возраст пациента - один из ведущих факторов, влияющий на проявления заболевания. Например, у детей младшего возраста такие заболевания, как грипп, гепатит В, а также инфекции, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом (РС-вирусом) и вирусом Коксаки В, протекают гораздо тяжелее, чем у старших детей. С другой стороны, корь и ветряная оспа гораздо легче протекает у детей, чем у взрослых. Тем не менее, для значительного спектра вирусных инфекций группами риска принято считать детей младшего возраста и пожилых.

Питание. Практически все вирусные инфекции тяжелее протекают у ослабленных лиц на фоне дефицита питания, что связано с общими нарушениями гомеостаза организма.

Нарушения иммунного статуса. У лиц, страдающих нарушениями клеточных иммунных реакций, многие вирусные инфекции переходят в вялотекущие, хронические формы либо протекают более тяжело. Это связано с дефектами цитотоксических иммунных механизмов, направленных на прерывание репродуктивного цикла и удаление возбудителя из организма.

Наследственные факторы. Существует наследственная невосприимчивость к некоторым вирусным заболеваниям. Большой интерес представляют данные о роли некоторых наследственных факторов у ВИЧ-инфицированных лиц.

Особенности патогенеза вирусных инфекций

В основе патогенеза вирусных инфекций лежит взаимодействие генома вируса с генетическим аппаратом чувствительной клетки. Исключая поражения, вызываемые вирусами, распространяющимися по нервной ткани, патогенез вирусных инфекций сопровождает вирусемия (виремия) - циркуляция возбудителя в крови. В кровоток возбудитель проникает прямым путём или из лимфатической системы. Многие вирусы (например, ВИЧ, вирусы гриппа, кори, герпеса) поражают иммунокомпетентные клетки, что чаще проявляется в нарушении функций и уменьшении числа Т-хелперов, увеличении содержания и активации Т-супрессоров или В-клеток. Некоторые возбудители образуют внутриядерные или цитоплазматические тельца включений (например, тельца Бабеша-Нёгри), имеющие диагностическое значение.

Основные этапы патогенеза вирусных инфекций

Проникновение в организм. Основные входные ворота для возбудителей вирусных инфекций человека - дыхательные пути и ЖКТ, реже - кожные покровы. В некоторых случаях развиваются локальные поражения, но чаще в месте проникновения не возникает каких-либо проявлений или они носят стёртый характер, а возбудитель мигрирует в чувствительные ткани.

Распространение возбудителя в организме может носить локальный или системный характер.

Локальные поражения типичны для возбудителей респираторных и кишечных инфекций, а также для некоторых кожных заболеваний. Продолжительность инкубационного периода большинства подобных инфекций составляет 2-3 сут. Первичную репликацию часто сопровождает вирусемия. Она обычно протекает бессимптомно или по типу продромальных явлений, но может возникать и на фоне выраженной клинической картины, не вызывая развития дополнительной симптоматики. Для подобных заболеваний характерно повторное заражение, так как циркулирующие АТ не проявляют протективный эффект, а секреторный иммуноглобулин A (IgA) оказывает лишь кратковременное нейтрализующее действие на слизистой оболочке.

Системные поражения. Из места проникновения возбудители попадают в кровоток, вызывая вирусемию, и постепенно фиксируются в чувствительных тканях. Первичное распространение обычно вызывает продромальные явления. Поскольку вирусемия предшествует поражению чувствительных тканей, то продолжительность инкубационного и продромального периодов подобных инфекций могут увеличиваться до 2-3 нед. Вирусемия при системных инфекциях обычно носит двухэтапный характер. Первый этап заканчивается поглощением циркулирующих вирусов клетками ретикулоэндотелиальной системы. В дальнейшем возможно несколько вариантов:

Основные органы-мишени наиболее распространённых вирусных инфекций представлены на рис. 5-9. Многие из указанных на рисунке возбудителей могут поражать, кроме названных, и другие ткани (так, полиовирусы способны вызывать поражения ЖКТ, а вирус эпидемического паротита обладает тропностью к эпителию извитых канальцев яичек).

Типы вирусных инфекций

На уровне макроорганизма основные формы вирусных поражений принципиально не отличаются от таковых, наблюдаемых при инфицировании вирусами отдельных клеток.

Продуктивная инфекция с образованием дочерних популяций и характерными клиническими проявлениями возможна лишь при наличии в заражённом организме чувствительных клеток, в которых осуществляется репродуктивный цикл возбудителя. Например, возбудитель полиомиелита может реплицировать только в клетках ЖКТ и ЦНС приматов и человека.

Абортивная инфекция развивается при проникновении возбудителя в нечувствительные клетки (например, при попадании вируса лейкоза коров в организм человека) либо в клетки, не способные обеспечить полный репродуктивный цикл (например, находящиеся в стадии клеточного цикла G ). Способность клеток к поддержанию вирусоспецифических репродуктивных процессов также⁰ подавляет ИФН, противовирусный эффект которого направлен против самых различных вирусов.

Персистирующая инфекция возникает при таком взаимодействии между вирусом и заражённой клеткой, когда в последней продолжается выполнение собственных клеточных функций. Если заражённые клетки делятся, образуется инфицированный клон. Таким образом, увеличение числа заражённых клеток способствует увеличению общей популяции возбудителя в организме. Тем не менее, персистирующие вирусные инфекции обычно нарушают функции клеток, что в конце концов приводит к клиническим проявлениям. У человека развитие перси-стирующих инфекции в определённой степени зависит от возраста. Например, внутриутробное заражение вирусом коревой краснухи или цитомегаловирусом (ЦМВ) приводит к ограниченному по времени персистированию возбудителя. Появление симптоматики связано с возможностью плода развивать иммунные реакции на инфекционный агент.

Латентная (скрытая) инфекция. В то время как персистирующие инфекции сопровождаются постоянным высвобождением дочерних вирусных популяций, при латентных поражениях они образуются спорадически. Репродуктивный цикл подобных возбудителей резко замедляется на поздних стадиях и активируется под влиянием различных факторов. Латентные инфекции характерны для большинства герпесвирусов, вызывающих рецидивирующие и обычно не прогрессирующие заболевания.

Инаппарантные инфекции [от лат. in-, отрицание, + appareo, являться] сопровождаются бессимптомной циркуляцией незначительных количеств возбудителя в отдельных органах. При этом выявить возбудителя можно лишь специальными методами. От бессимптомного носительства подобные поражения отличает большая вероятность возникновения клинических проявлений. Этот термин применяют при целом ряде инфекций, при которых нет явных признаков заболевания. В практике вирусных инфекций у человека часто применяют альтернативный термин «субклиническая инфекция». Собственно, и латентные инфекции можно расценивать как хронически протекающие инаппаратные инфекции, при которых устанавливается баланс между организмом и возбудителем.

Дремлющая (криптогенная) инфекция - форма проявления вирусной инфекции при которой возбудитель в неактивном состоянии находится в отдельных очагах (например, в нервных ганглиях). Клинически инфекция проявляется лишь при резком ослаблении защитных сил организма. Например, вирус герпеса 3 типа, вызывающий при первичном заражении ветряную оспу, пожизненно сохраняется в организме. Рецидив заболевания в форме опоясывающего лишая возможен лишь при нарушениях иммунного статуса (наиболее часто в пожилом возрасте).

Медленные инфекции характеризуются длительным инкубационным периодом (месяцы и годы), в течение которого возбудитель размножается, вызывая всё более явные повреждения тканей. Первоначально возбудитель размножается в ограниченной группе клеток, но постепенно инфицирует всё большее их число. Заболевания заканчиваются развитием тяжёлых поражений и смертью больного. К медленным вирусным инфекциям относят подострый склерозирующий панэнцефалит, ВИЧ-инфекцию и др.

Основные реакции заражённых вирусом клеток

В заражённых вирусом клетках возможны патологические проявления разностороннего характера.

Морфология патологических эффектов

Характерные проявления взаимодействий между вирусом и чувствительными клетками - видимые поражения заражённых клеток вплоть до их гибели, а также присутствие возбудителя в исследуемом материале.

Альтерация и воспаление. При вирусных инфекциях на первый план выступает картина повреждения клеток и воспалительных изменений тканей, при различных инфекциях их соотношение и выраженность варьируют. В противоположность бактериальным инфекциям (где доминируют полиморфноядерные лейкоциты), при вирусных поражениях среди клеточных элементов воспалительных реакций доминируют мононуклеары (лимфо- и моноциты). На этапах, предшествующих разрушению клеток, можно визуально наблюдать их дегенеративные и некротические изменения.

Форма клеток. Вследствие поражения цитоскелета клетки принимают округлую форму.

Изменения структуры ядра достаточно разнообразны: кариопикноз [сморщивание ядра клетки при дистрофических изменениях в ней (от греч. karion, ядро, + pyknosis, уплотнение)], краевое расположение глыбок хроматина, его распыление и т.д. Подобные поражения способны вызывать адено-, герпес-, парамиксо-, ортомиксо- и ретровирусы.

Плазмолемма (ЦПМ). Изменения её структуры связанно с замещением собственных гликопротеинов вирусиндуцированными белками. Эти поражения характерны для инфекций, вызванных оболочечными вирусами, но некоторые «голые» вирусы также могут вызвать изменения клеточной мембраны. Нарушение структуры плазмолеммы может приводить к изменению некоторых её характеристик (например, к увеличению её проницаемости или слиянию с незаражёнными клетками). В последнем случае можно наблюдать образование симпластов (поли-кариоцитов) и синцитиев. Симпласты представлены гигантскими многоядерными клетками (например, клетки Цанка, выявляемые при герпетических поражениях), образующимися в результате модификации ЦПМ лизосомальными ферментами. Реже наблюдают образование синцитиев - больших конгломератов цитоплазмы, содержащий сотни и тысячи ядер связанных между собой клеток. Образование синцитиев обусловлено модификацией ЦПМ поверхностными гликопротеинами и характерно для парамиксовирусов.

Тельца включений. Микроскопия заражённых клеток часто позволяет выявить тельца включений - характерный, но не абсолютный признак вирусных поражений. Тельца значительно крупнее, чем отдельные вирионы, и часто окрашиваются кислыми красителями (например, эозином).

Причины гибели клеток. Размножаясь в клетке, вирусы индуцируют синтез вирусоспеци-фических белков, в той или иной степени подавляющих метаболизм клетки. Нарушение синтеза макромолекул вызвано нарушением трансляции клеточной мРНК. Среди РНК-геномных вирусов наиболее быстрое и глубокое подавление макромолекулярных синтезов в клетке вызывают пикорнавирусы, среди ДНК-геномных - покс- и герпесвирусы. Действие указанных вирусов реализуется на ранних этапах (до появления морфологических признаков цитопатического эффекта). Ингибирование синтеза РНК и ДНК обычно вторично по отношению к воздействию на белки, контролирующие экспрессию генов и пролиферацию клетки. Значительно реже нарушения вызывают вирусные белки, напрямую ингибирующие синтез нуклеиновых кислот. Среди РНК-геномных вирусов наиболее быстрое и глубокое подавление синтезов нуклеиновых кислот вызывают пикорнавирусы, среди ДНК-геномных - покс- и герпесвирусы.

Во время репродукции вируса в клетке накапливаются вирусные компоненты, оказывающие токсическое и повреждающее действие на клеточные структуры. Например, цитотоксические свойства проявляют капсомеры некоторых аденовирусов, гликопротеины парамиксовирусов. В процессе вирусной инфекции также происходит повреждение мембран лизосом, содержимое которых высвобождается и осуществляет аутолиз клетки. Таким образом, гибель клеток наступает в результате сочетания раннего подавления синтеза клеточных компонентов, накопления токсических вирусных продуктов и повреждения лизосом.

Вирусы бактерий

Бактериофаги [от «бактерии», + греч. phagein, поедать] - группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Размножение и выход дочерних популяций вируса из бактерии сопровождается её гибелью и разрушением (лизисом). Бактериофаги широко распространены в природе - их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека.

Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще. В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-вым вирусам, с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. Бактериофаги устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Большинство из них без вреда переносит высокие температуры (50-70 °C), действие дезинфектантов (за исключением кислот и формалина), прямой солнечный свет и УФ-облучение в низких дозах. Бактериофаги проявляют иммуногенные свойства, вызывая синтез специфических АТ.

Морфология

Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (рис. 5-10). Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании которых выделяют пять основных типов бактериофагов.

Головка Т-фагов

Головка Т-фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутренний белок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться в сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин).

Хвост Т-фагов

Хвост Т-фагов может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает полый стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120-140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са² +. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущены вниз, а у нечётных - загнуты вверх. У некоторых Т-фагов в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин).

Размножение бактериофагов

Взаимодействие бактериофагов с клеткой специфично, так как они, как правило, инфицируют бактерии только определённого вида (рис. 5-11). Подобно вирусам животных, репродуктивный цикл литических бактериофагов включает адсорбцию свободного фага на клетке, инъекцию ДНК, репродукцию фага, выход дочерних популяций.

Адсорбция

Прикрепление фага к бактерии происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов. Например, рецепторы для фагов Т3, Т4 и Т7 расположены в липополисахаридном слое, для Т2 и Т6 - в наружной мембране. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L-формы) бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2-фага). При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200-300 вирусных частиц.

Инъекция фага

После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са² +, активизирующие АТФазу, что вызывает сокращение чехла и вталкивание стержня хвоста через ЦПМ в клетку. Затем вирусная ДНК «впрыскивается» в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). Поскольку диаметр канала лишь немного превышает диаметр молекулы ДНК (около 20 нм), то ДНК способна попадать в цитоплазму только в форме нити.

Репродукция фага

Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНК-полимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилат синтетаза. Они появляются в клетке через 5-7 мин после её заражения. Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНК-полимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНК-полимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения. Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот.

Репликация нуклеиновых кислот реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК-полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот.

Выход дочерних популяций

Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Другой пул содержит ДНК потомства. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает около 40 мин. После образования потомства («урожай», или выход фага, составляет 10-200 из одной инфицирующей частицы) клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование ауто-лизинов либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий).

Негативные колонии бактериофага

Размножение фагов в бактериальных культурах, засеянных сплошным «газоном» на твёрдых средах, сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления - «стерильных пятен». Для их обозначения предложен термин «негативные колонии бактериофага». У разных фагов они имеют строго определённые размеры и форму (например, звёздчатую у дизентерийных фагов). При заражении бульонных культур литическим фагом наблюдают просветление среды. Способность образовывать негативные колонии в культурах чувствительных бактерий в микробиологической диагностике возбудителей инфекционных болезней известна как фагоди-агностика (рис. 5-12).

Лизогения

В некоторых случаях вирулентных свойств фага оказывается недостаточно для разрушения бактерии. Подобные вирусы - умеренные фаги - претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. При этом процессе ДНК вируса не вызывает образования вирусоспецифических белков и нуклеиновых кислот, но включается в бактериальную хромосому. С практической точки зрения бактерия приобретает новый набор генов (встроенного вируса), а также становится «иммунной» к повторному заражению (интерференция вирусов). Подобный феномен известен как лизогения, а популяции бактерий - как лизогенные культуры. ДНК умеренного вируса реплицирует синхронно с размножением лизогенной бактерии, но иногда (примерно в одной из 10² -10⁵ подобных бактерий) фаг начинает спонтанно размножаться, а клетка подвергается лизису. Некоторые умеренные фаги (например, участвующие в процессах трансдукции бактерий) не способны образовывать дочерние популяции, то есть являются дефектными вирусами. Дефектные фаги используют как векторы в генной инженерии.

Вирусная ДНК может длительно сохраняться в бактериальном потомстве. Такие латентные бактериофаги известны как провирусы, или профаги.

Практическое применение бактериофагов

Свойство специфичности бактериофагов применяют на практике, создавая специализированные иммунобиологические препараты - фаги. Их используют для идентификации выделенных бактерий, их выявления в объектах окружающей среды, а также для лечения и профилактики некоторых инфекционных болезней.

Экология микроорганизмов - наука о взаимоотношениях микробов друг с другом и с окружающей средой. В медицинской микробиологии объектом изучения служит комплекс взаимоотношений микроорганизмов с человеком.

РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ МИКРОБОВ В ПРИРОДЕ

В природе микроорганизмы заселяют практически любую среду (почва, вода, воздух) и распространены гораздо шире, чем другие живые существа. Как писал известный отечественный микробиолог В.Л. Омелянский: «…​Мириады микробов населяют стихии и окружают нас. Незримо они сопутствуют человеку на всём его жизненном пути, властно вторгаясь в его жизнь, то в качестве врагов, то как друзья». Благодаря разнообразию механизмов утилизации источников питания и энергии, а также выраженной адаптации к внешним воздействиям, микроорганизмы могут обитать там, где другие формы жизни не выживают. Естественные среды обитания большей части организмов - вода, почва и воздух. Число микроорганизмов, обитающих на растениях и в организмах животных, значительно меньше. Широкое распространение микроорганизмов связано с лёгкостью их распространения по воздуху и воде; в частности, поверхность и дно пресноводных и солёных водоёмов, а также несколько сантиметров верхнего слоя почвы изобилуют микроорганизмами, разрушающими органические вещества. Меньшее количество микроорганизмов колонизирует поверхность и некоторые внутренние полости животных (например, ЖКТ, верхние отделы дыхательных путей) и растений. В зонах обитания микроорганизмы образуют биоценозы [от греч. bios, жизнь, + koinos, сообщество] - сложные ассоциации со специфическими и часто необычными взаимоотношениями. Каждое микробное сообщество в конкретном биоценозе образуют специфичные аутохтонные микроорганизмы [от греч. autos, свой, + chthon, страна, местность], то есть микробы, присущие конкретной области. В состав этих сообществ могут внедрятся аллохтонные микробы [от греч. alios, чужой, + chthon, страна; буквально - чужестранец], (например, паразитические), обычно в них не встречающиеся. В природных биоценозах (почва, вода, воздух) выживают и размножаются лишь те микроорганизмы, которым благоприятствует окружающая среда; их рост прекращается, как только меняются условия окружающей среды. В природе большую часть бактерий поедают хищные простейшие, но часть клеток каждого вида выживает; при наступлении благоприятных условий они дают начало новым клонам микроорганизмов.

Типы взаимоотношений микробов в биоценозах

Микроорганизмы жёстко конкурируют между собой. Это связано с тем, что обитающие в конкретном биоценозе микробы обладают принципиально сходными потребностями в источниках энергии и питания. Каждый микроорганизм приспосабливается не только к неживым субстратам, но и к другим окружающим его организмам. Подобная адаптация иногда приводит к приобретению особых метаболических свойств, наделяющих обладателя способностью занимать специфические ниши. Например, нитрифицирующие бактерии могут расти без органических источников энергии, окисляя аммиак или нитриты в качестве источника энергии в отсутствие света; другие организмы в подобных условиях не развиваются. Поэтому нитрифицирующие бактерии не испытывают биологической конкуренции. Значительная часть бактерий участвует в конкурентной борьбе, адаптируясь к сосуществованию с другими формами жизни либо вступая с ними в противодействие.

Симбиоз

Симбиоз [от греч. symbiosis, совместное проживание] - совместное длительное существование микроорганизмов в долгоживущих сообществах. Взаимоотношения, при которых микроорганизм располагается вне клеток хозяина (более крупного организма), известны как эктосимбиоз; при локализации внутри клеток - как эндосимбиоз. Типичные эктосимбиотические микробы - Escherichia coli, бактерии родов Bacteroides и Bifidobacterium, Proteus vulgaris, а также другие представители кишечной микрофлоры. Как пример эндосимбиоза можно рассматривать плазмиды, обеспечивающие, например, резистентность бактерий к ЛС. Симбиотические отношения также разделяют по выгоде, получаемой каждым из партнёров. Мутуализм [от лат. mutuus, взаимный] - взаимовыгодные симбиотические отношения. Так, микроорганизмы вырабатывают БАВ, необходимые организму хозяина (например, витамины группы B). При этом обитающие в макроорганизмах эндо- и эктосимбионты защищены от неблагоприятных условий среды (высыхания и экстремальных температур) и имеют постоянный доступ к питательным веществам. Из всех видов мутуализма наиболее удивительно культивирование некоторых грибов насекомыми (жуками и термитами). С одной стороны, это способствует более широкому распространению грибов, с другой - обеспечивает постоянный источник питательных веществ для личинок. Это напоминает выращивание человеком полезных растений и микроорганизмов. Комменсализм - разновидность симбиоза, при которой выгоду извлекает только один партнёр (не принося «видимого» вреда другому); микроорганизмы, участвующие в таких взаимоотношениях, - комменсалы [от лат. com-, с, + mensa, стол; буквально - сотрапезники]. Микроорганизмы-комменсалы колонизируют кожные покровы и полости организма человека (например, ЖКТ), не причиняя «видимого» вреда; их совокупность - нормальная микробная флора (естественная микрофлора). Типичные эктосимбиотические организмы-комменсалы - кишечная палочка, бифидобактерии, стафилококки, лактобациллы. Многие бактерии-комменсалы принадлежат к условно-патогенной микрофлоре и способны при определённых обстоятельствах вызывать заболевания макроорганизма (например, при внесении их в кровоток во время медицинских манипуляций).

Паразитизм

Антагонистический симбиоз - симбиотические отношения, наносящие хозяину более или менее выраженный вред; его крайнее проявление - паразитизм [от греч. para, при, + sitos, пища]. Если микроорганизмы-сапрофиты [от греч. sapros, гнилой, + phyton, растение] утилизируют мёртвые органические субстраты, то паразитические виды живут за счёт живых тканей растений или животных. Проникая в организм хозяина, они могут вызывать у него заболевание, поэтому их обозначают как патогенные микроорганизмы.

Паразитические микроорганизмы разделяют на внутри- и внеклеточные. Внутриклеточные паразиты - вирусы, риккетсии и хламидии. Внеклеточные паразиты - большинство бактерий и простейших.

Факультативные паразиты. В зависимости от внешних условий некоторые микроорганизмы могут вести себя как паразиты, либо как сапрофиты. Поэтому их так и называют - факультативные паразиты. К ним относят большинство условно-патогенных бактерий.

Облигатные паразиты полностью утратили собственные метаболические возможности и живут, разрушая ткани хозяина.

Метабиоз

В ряде биотопов, особенно в почве, некоторые микроорганизмы утилизируют продукты жизнедеятельности других; например нитрифицирующие бактерии используют аммиак, который образуют аммонифицирующие бактерии. Подобные взаимоотношения известны как метабиоз.

Сателлизм

Некоторые микроорганизмы способны выделять метаболиты, стимулирующие рост других микроорганизмов. Например, сарцины или стафилококки выделяют ростовые факторы, стимулирующие рост бактерий рода Haemophilus. Нередко совместный рост нескольких видов микробов активирует их физиологические свойства. Подобные взаимоотношения известны как сател-лизм [от лат. satelles, сопровождающий].

Антагонизм

Ситуации, когда один микроорганизм угнетает развитие другого, известны как микробный антагонизм [от греч. antagonizmai, соперничество] и отражают сложившиеся эволюционно формы борьбы микроорганизмов за существование (то есть за источники питания и энергии). Антагонистические взаимоотношения особенно выражены в местах естественного обитания большого числа различных видов и типов микроорганизмов (например, в почве или ЖКТ), имеющих одинаковые пищевые и энергетические потребности. При этом воздействие на конкурента может быть пассивным или активным. В первом случае микроорганизмы быстрее утилизируют субстрат, лишая соперника «сырьевых ресурсов»; во втором - «объявляют войну до полного уничтожения». Формы истребления могут быть вариабельными - от банального поглощения более мелких видов до выделения высокоспецифичных продуктов, токсичных для конкурентов.

Антибиотики [от греч. anti, против, + bios, жизнь]. Биологический смысл образования антибиотиков - подавление жизнедеятельности микробов-конкурентов. В частности, действие антибиотиков грибковой природы обычно направлено против бактерий, а бактериальной - против грибов и даже простейших. Было установлено, что антибиотики образуются также в растительных и животных тканях.

Антибиотики растительного происхождения защищают растения-продуценты от патогенных микроорганизмов, а также подавляют жизнедеятельность других растений, конкурирующих за основные источники питания. К антибиотикам растительного происхождения относят фитонциды [от греч. phyton, растение, + лат. caedo (-cido), убивать] - эфирные масла, подавляющие жизнедеятельность многих микроорганизмов. Препараты, содержащие фитонциды лука, чеснока, хрена, алоэ, перца и других растений, нашли широкое применение в народной медицине; их использование в традиционной медицине ограничивают трудности получения хорошо очищенных и стойких лекарственных форм.

Антибиотики животного происхождения. Наиболее известен лизоцим (его обнаружил П.Н. Лащенков в 1909 г., детально изучил Александр Флеминг). Лизоцим содержится в белке куриных яиц, слюне, слёзной жидкости и различных тканях. Лизоцим - фермент, повреждающий муреиновый слой бактерий.

ИФН - низкомолекулярные белки, обладающие противовирусным эффектом; продуцируются фибробластами, лейкоцитами и лимфоцитами после проникновения в организм патогенных вирусов. Противовирусное действие ИФН не зависит от конкретного возбудителя; инфекционный агент не способен проявлять резистентность к эффекту этих белков.

Бактериоцины - белки, синтезируемые определёнными клонами бактерий. Бактериоцины вызывают гибель бактерий того же или близких видов, облегчая конкуренцию за жизненно необходимые субстраты внутри отдельного или близкородственных видов. В отличие от антибиотиков, секреция бактериоцинов сопровождается гибелью клетки-продуцента. В популяции бактерий количество продуцентов бактериоцинов незначительно (в среднем 1:1000 бактерий), их количество при необходимости может резко увеличиваться. Бактериоцины участвуют в формировании и поддержании стабильных бактериальных сообществ (например, в кишечнике человека бактериоцины кишечной палочки вызывают гибель патогенных энтеробактерий - шигелл и сальмонелл). Бактериоциногения (образование бактериоцинов) более выражена у грамотрицательных бактерий, но она известна и у грамположительных видов. Известно около 200 различных бактериоцинов, обычно обозначаемых по родовому или видовому названию продуцента, - колицины (Escherichia coli), пестицины (Yersinia pestis), стафилоцины (виды Staphylococcus), вибриоцины (виды Vibrio). Некоторые бактериоцины действуют на ЦПМ, другие ингибируют биосинтез белка. Основное условие для проявления активности бактериоци-на - наличие специфических рецепторов на мембранах клеток-мишеней.

Наиболее изучены колицины, продуцируемые кишечной палочкой и некоторыми энтеробактериями. Выделено около 30 колицинов, различающихся по антигенным свойствам, химическому составу и механизму действия. Способность к их синтезу используют в эпидемиологических исследованиях, выявляя тип колицина, вырабатываемого патогенным видом (колицинотипирование), либо тип плазмиды, кодирующей синтез колицина (колициногенотипирование).

МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ

Почва - главный резервуар и естественная среда обитания микроорганизмов, принимающих участие в процессах её формирования и самоочищения, а также в круговороте веществ (азота, углерода, серы, железа) в природе. Помимо неорганических веществ, почва состоит из органических соединений, образующихся в результате гибели и разложения живых существ. Микроорганизмы почвы обитают в водных и коллоидных плёнках, обволакивающих почвенные частицы. Состав микрофлоры почвы разнообразен и включает преимущественно спорообразующие бактерии, актиномицеты, спирохеты, архебактерии, простейшие, сине-зелёные водоросли, ми-коплазмы, грибы и вирусы. Состав микрофлоры зависит от вида почвы, способов её обработки, содержания органических веществ, влажности, климатических условий и других причин. В песчаных почвах преобладают аэробные организмы, в глинистых - анаэробы. Микроорганизмы почвы размножаются при 25-45 °С, термофильные виды (например, бактерии родов Thermomonospora, Thermococcus) - и при более высокой температуре. Околокорневая (ризосферная) зона растений [от греч. rhiza, корень] особенно насыщена микробами, образующими зону интенсивного размножения и повышенной активности, специфичную для каждого вида растений. При этом происходит непрерывная борьба за источники питания и кислород. Количество микроорганизмов в почве достигает нескольких миллиардов в 1г. Больше всего их в унавоженной и подвернутой обработке (пахоте и аэрации) почве - до 4,8-5,2 млрд в 1 г. Меньше микробов содержится в лесной почве, ещё меньше - в песках (0,9-1,2 млрд в 1 г). Масса микроорганизмов в почве на 1 гектар в среднем составляет около 1000 кг. На состав микрофлоры почвы влияет деятельность человека; в частности, регулярное перекапывание почвы отрицательно сказывается на сложившихся биоценозах, особенно лёгких почв (за счёт гибели анаэробных бактерий). Существенный вред микробным сообществам наносит загрязнение почвы отходами, содержащими токсические продукты. На состав микрофлоры неблагоприятно влияет регулярное попадание в почву выделений человека и животных, способствующее избыточному размножению отдельных групп микроорганизмов.

Классификация почвенных патогенных микроорганизмов

МИКРОФЛОРА ВОДЫ

Вода - естественная среда обитания разнообразных микроорганизмов; из пресных и солёных вод выделяют представителей всех таксономических групп бактерий, простейших, грибов, водорослей и вирусов. Совокупность водных микроорганизмов - микробный планктон.

Типы водной среды. На качественный состав микрофлоры основное влияние оказывает происхождение воды как среды обитания: пресные поверхностные (воды рек, ручьёв, озёр, прудов и водохранилищ), подземные (почвенные, грунтовые, артезианские), атмосферные (дождь, снег) и солёные (морские и озёрные) воды. По характеру пользования выделяют питьевую воду (централизованного и местного водоснабжения; с забором из открытых водоёмов или подземных источников), воду плавательных бассейнов, лёд медицинский и хозяйственный. С санитарной точки зрения особого внимания требуют сточные воды: хозяйственно-фекальные, промышленные, смешанные (хозяйственно-фекальные и промышленные), талые и ливневые; микрофлора этих вод загрязняет природные воды.

Характер микрофлоры водоёмов определяется особенностями конкретной водной среды. Микрофлору водоёмов образуют две группы: аутохтонные (собственно водные) и аллохтонные (попадающие извне при загрязнении) микроорганизмы.

В состав специфической водной микрофлоры входят Micrococcus candicans и M. roseus, Sarcina lutea, Bacterium aquatilis communis, Pseudomonas fluorescens, различные виды Proteus и Leptospira. Среди анаэробов в незагрязнённых водоёмах выделяют Bacillus cereus, B. mycoides, Chromobacterium violaceum, виды Clostridium.

*Для резидентов почва служит природным биотопом.

Биологическое загрязнение водоёмов. Воды поверхностных водоёмов открыты для всех видов микробной контаминации (загрязнения). Со сточными, ливневыми, талыми водами в водоёмы попадают многие виды микроорганизмов, способные резко изменить микробный биоценоз и санитарный режим.

Самоочищение водоёмов. Основной путь самоочищения - конкурентная активация сапрофитической микрофлоры, приводящая к быстрому разложению органических веществ и уменьшению численности бактерий, особенно фекального происхождения. Способность к самоочищению связана с присутствием в воде постоянных видов микроорганизмов, входящих в конкретный биоценоз. Однако количественные и качественные соотношения микробов в биоценозах нестойки и изменяются под действием различных факторов, то есть меняются в зависимости от сапробности. Термин «сапробность» обозначает комплекс особенностей водоёма, в том числе состав и количество микроорганизмов в воде, содержащей в определённых концентрациях органические и неорганические вещества. Процессы самоочищения воды в водоёмах происходят последовательно и непрерывно, с постепенной сменой биоценозов. По загрязнённости различают полисапробные, мезосапробные и олигосапробные зоны.

Полисапробные зоны (зоны сильного загрязнения) содержат большое количество легко разлагающихся органических веществ и почти полностью лишены кислорода. Микробный биоценоз подобных зон особенно обилен, но видовой состав ограничен анаэробными бактериями, грибами, актиномицетами. Количество бактерий в 1 мл воды в полисапробной зоне равно миллиону и выше.

Мезосапробные зоны (зоны умеренного загрязнения) характеризуются доминированием окислительных и нитрификационных процессов. Качественный состав разнообразен: в основном, нитрифицирующие, облигатно аэробные бактерии, а также виды Clostridium, Pseudomonas, Mycobacterium, Flavobacterium, Streptomyces, Candida и др. Общее количество микроорганизмов: сотни тысяч в 1 мл.

Олигосапробные зоны (зоны чистой воды) характеризуются окончившимся процессом самоочищения, небольшим содержанием органических соединений и окончанием процесса минерализации. Вода отличается высокой степенью чистоты. Количество бактерий от 10 до 1000 в 1 мл воды. Патогенные микроорганизмы, попадающие в водоёмы, достаточно обильны в полисапробных зонах, постепенно отмирают в мезосапробных и практически не обнаруживаются в олигосапробных зонах.

МИКРОФЛОРА ВОЗДУХА

Воздух - среда, не поддерживающая размножение микроорганизмов; это определяется отсутствием питательных веществ и недостатком влаги. Кроме того, в воздухе более выражено микробицидное действие солнечных лучей УФ-спектра. Жизнеспособность микроорганизмов в воздухе обеспечивают взвешенные частицы воды, слизи, пыли и фрагментов почвы. Атмосферный и воздух закрытых помещений значительно различаются по количественному и качественному составу микрофлоры. Бактериальная обсеменённость жилых помещений всегда выше, чем атмосферного воздуха; это справедливо и в отношение патогенных микроорганизмов, попадающих в воздух от больных людей, животных и бактерионосителей.

Микрофлору воздуха условно разделяют на резидентную (постоянно обнаруживаемую) и временную (обнаруживают спорадически). Наибольшее количество микробов содержится в околоземных слоях атмосферы. По мере удаления от земной поверхности воздух становится чище. Постоянная микрофлора атмосферного воздуха формируется почвенными микроорганизмами. Более или менее регулярно в её состав входят Micrococcus roseus, M. flavus, M. candicans, Sarcina flava, S. alba, S. rosea, Bacillus subtilis, B. mycoides, B. mesentericus, виды Actinomyces, грибы родов Penicillium, Aspergillus, Mucor и др. Временная микрофлора атмосферного воздуха также формируется за счёт микроорганизмов почвы и видов, поступающих с поверхности водоёмов. Находящиеся в атмосферном воздухе микроорганизмы подвергаются солнечному и температурному воздействию, атмосферным осадкам и ветру. Поэтому микрофлора воздуха весьма динамична, непрерывно меняется и обновляется.

Контаминация воздуха патогенными микроорганизмами происходит капельным путём; микробы содержатся в составе аэрозоля, образующегося при разговоре, кашле, чихании. Кроме того, микроорганизмы попадают в воздух со слущивающимся эпителием кожных покровов, пылью из загрязнённого постельного белья и заражённой почвы.

Капельная фаза представлена мелкими каплями, длительно сохраняющимися в воздухе, но испаряющимися до оседания.

Пылевая фаза - крупные, быстро оседающие частицы; в результате, образующие пыль, способную подниматься в воздух.

Капельные ядрышки - мелкие капельки аэрозоля (до 100 нм); высыхая, остаются в воздухе во взвешенном состоянии и образуют устойчивую аэродисперсную систему. В них частично сохраняется влага, поддерживающая жизнеспособность микроорганизмов. Последние в составе капельных ядрышек могут переноситься на значительные расстояния.

РОЛЬ МИКРООРГАНИЗМОВ В КРУГОВОРОТЕ ВЕЩЕСТВ

Круговорот веществ - совокупность превращений химических элементов, из которых построены живые организмы. Основные факторы, определяющие доминирующую роль микробов в круговороте веществ, - широкое распространение микроорганизмов (например, слой плодородной почвы толщиной 15 см может содержать до 5 т микробной биомассы на гектар) и их необычайная метаболическая гибкость при высокой скорости обмена. Большое значение имеет узкая специализация отдельных групп микроорганизмов в отношении утилизируемых веществ. Поэтому некоторые этапы круговорота веществ могут осуществляться исключительно прокариотами. В природе все организмы разделяют на три группы. Продуценты - зелёные растения и микроорганизмы, синтезирующие органические вещества, используя энергию солнца, углекислый газ и воду. Потребители (консументы) - животные, расходующие значительную часть первичной биомассы на построение своего тела. Деструкторы - бактерии (в том числе актиномицеты) и грибы, разлагающие погибшие животные и растения; при этом органические вещества превращаются в неорганические, то есть происходит минерализация.

Круговорот углерода

Взаимосвязь живых организмов на Земле особенно ярко выражена в круговороте углерода. Атмосферный воздух содержит около 0,03% СО₂ , но продуктивность зеленых растений настолько велика, что весь запас углекислоты в атмосфере (2600 х 10⁹ т СО₂ ) был бы истрачен за 20 лет - срок, ничтожно короткий в масштабах эволюции. Фотосинтез бы прекратился, если бы микроорганизмы, растения и животные не обеспечивали возвращение СО₂ в атмосферу в результате непрерывной минерализации органических веществ. Циклические превращения углерода и кислорода реализуются главным образом через два разнонаправленных процесса: кислородный фотосинтез и дыхание (либо горение в небиологических реакциях).

Круговорот азота

Азот составляет 80% земной атмосферы; количество азота, участвующего в круговороте, исчисляется 10⁸ -10⁹ т в год. Как газ азот химически инертен; он не может быть непосредственно использован растениями, животными и большинством микроорганизмов. Относительный дефицит связанного азота на поверхности Земли при практически неисчерпаемом его запасе в атмосфере подразумевает наличие определённого этапа, лимитирующего скорость круговорота. Этот этап - азотфиксация, осуществляемая исключительно азотфиксирующими бактериями. Промышленный синтез аммиака из азота и водорода составляет не более 5% фиксированного азота нашей планеты. Поэтому значение биологической азотфиксации для жизни на планете огромно.

Азотфиксация в природе осуществляется как свободноживущими микроорганизмами (несимбиотическая азотфиксация), так и бактериями, существующими в сообществе с растениями (симбиотическая азотфиксация).

Несимбиотическая азотфиксация осуществляется бактериями рода Azotobacter, фиксирующими около 20 мг азота на 1 г использованного сахара, аноксигенными фототрофными бактериями, цианобактериями, клостридиями, факультативными анаэробами Bacillus polymixa, Klebsiella pneumoniae, хемолитотрофными бактериями Alcaligenes latus, Xanthobacter autotrophicus, метилотрофными, метаногенными и сульфатредуцирующими бактериями). Симбиотическая фиксация азота осуществляется бактериями рода Rhizobium (вызывают образование клубеньков у бобовых растений), актиномицетами рода Franckia (симбионты тропических растений), цианобактериями Anabaena azollae, Nostoc punctiforme. В отсутствие кислорода бактерии из нитрата, используемого в качестве акцептора водорода, образуют молекулярный азот. Этот процесс известен как денитрификация (диссимиляци-онная нитратредукция), или «нитратное дыхание», так как в данном случае роль нитрата в качестве окислителя аналогична роли молекулярного кислорода в аэробном дыхании. Способностью к денитрификации обладают многие факультативно аэробные бактерии (Pseudomonas aeruginosa, P. stutzeri, P. fluorescens, Bacillus licheniformis, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans). Ассимиляционная нитратредукция характерна для большинства микроорганизмов и для растений. Нитрат служит источником азота для построения клеточных компонентов. Источником азота для растений и микроорганизмов может быть и аммоний, усвояемый ими в процессе ассимиляции аммиака.

Круговорот серы

Во всех организмах сера представлена главным образом сульфгидрильными (-SH) или дисульфидными (-S-S-) группами метионина, цистеина и гомоцистеина. При анаэробном разложении белков сульфгидрильные группы отщепляются десульфуразами, при этом выделяется сероводород. Этот процесс напоминает аммонификацию азотсодержащих органических соединений. Наибольшее количество сероводорода образуется при диссимиляционном восстановлении сульфатов^- (диссимиляционная сульфатредукция, или «сульфатное дыхание»), осуществляемом облигатно анаэробными бактериями (бактерии родов Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema). Последние используют сульфат для окисления низкомолекулярных органических соединений или молекулярного водорода. Диссимиляционное восстановление элементной серы в анаэробных условиях способны осуществлять бактерии рода Desulfuromonas. Сульфатредуцирующие (или десульфатирующие) бактерии в круговороте серы играют роль, сопоставимую с ролью нитратредуцирующих бактерий в круговороте азота. Их деятельность заметна на дне прудов, вдоль побережья моря по чёрному цвету ила (связан с образованием сульфида двухвалентного железа) и запаху (за счёт выделения сероводорода). Из-за токсического действия сероводорода некоторые береговые области иногда практически безжизненны.

Круговорот фосфора

В организмах фосфор находится только в пятивалентном состоянии - в форме солей и свободных фосфатных ионов (РО4^1-), либо в виде органических фосфатных веществ. Большинство органических фосфорсодержащих соединений неспособно поглощаться клетками, и потребность клеток в фосфоре удовлетворяется потреблением фосфатных ионов. Последние включаются в органические компоненты клеток и после смерти при гидролизе этих соединений вновь высвобождаются. Фосфаты доступны для сухопутных организмов благодаря непрерывному переводу нерастворимых фосфатных соединений в растворимые. В этом процессе микробам принадлежит ведущая роль. Кислые продукты метаболизма - органические и неорганические (например, азотная и серная) кислоты растворяют фосфат кальция; образуемый бактериями сероводород способствует растворению фосфатов железа. Подсчитано, что продукцию биомассы в конечном итоге лимитируют азот и фосфор. Так, из элементов, содержащихся в 1 м³ морской воды, можно создать, опираясь в расчёты в содержании углерода около 100 г биомассы, рассчитывая по азоту - 6 г, по фосфору - только 5 г биомассы.

НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА ЧЕЛОВЕКА

Организм человека в норме содержит сотни видов микроорганизмов; среди них доминируют бактерии, вирусы и простейшие представлены значительно меньшим числом видов. Подавляющее большинство таких микроорганизмов - сапрофиты-комменсалы; но как в любом биоценозе взаимоотношения в системе микроорганизм-макроорганизм могут носить как симбиотический, так и паразитический характер. Видовой состав микробного биоценоза различных отделов организма периодически меняется, но каждый индивидуум имеет более или менее характерные микробные сообщества. По Ламарку, основные условия выживания вида (включая микроорганизмы) - нормальная жизнедеятельность, быстрое воспроизведение плодовитого потомства, колонизирующего определённый ареал обитания. Для большинства комменсалов эти положения не тождественны понятиям «патогенность» и «вирулентность» и во многом определяются скоростью размножения и колонизации. Термин «нормальная микрофлора» объединяет микроорганизмы, более или менее часто выделяемые из организма здорового человека; бактерии, входящие в состав нормальной микрофлоры, представлены в табл. 6-2. Провести чёткую границу между сапрофитами и патогенными микробами, входящими в состав нормальной микрофлоры, часто невозможно. Сложившиеся положения о нормальной микрофлоре не абсолютны. Например, менингококки и пневмококки, вызывающие менингиты, пневмонии и септицемии, выделяют из носоглотки 10% клинически здоровых лиц. Для остальных 90% они представляют серьёзную опасность. Практически у каждого человека подобные бактерии могут спорадически колонизировать носоглотку; их обозначают термином «транзиторные члены микробных сообществ». Таким образом, попадание патогенного микроба в орган, чувствительный к его факторам патоген-ности, не всегда приводит к развитию заболевания. Этот феномен связан с состоянием защитных факторов макроорганизма; не менее важно участие микрофлоры, конкурирующей с потенциальным возбудителем за пищевые и энергетические источники и препятствующей его колонизации.

В течение внутриутробного периода организм развивается в стерильных условиях полости матки, и его первичное обсеменение происходит при прохождении через родовые пути и в первые сутки при контакте с окружающей средой. В случае рождения посредством кесарева сечения состав микробов, колонизирующих организм новорождённого, существенно иной (например, в первые недели жизни отмечают дефицит лактобацилл, энтеробактерий, дифтероидов).

Основные микробные биотопы

Основные отделы организма человека, заселяемые бактериями: кожные покровы, воздухоносные пути, ЖКТ, мочеполовая система. В указанных областях бактерии живут и размножаются; а их содержание варьирует в зависимости от условий существования. Например, в желудке, двенадцатиперстной кишке, мочевом пузыре, матке, в зонах газообмена в лёгких бактерий в норме практически нет, а их обнаружение даёт основания для подозрения на инфекционный процесс. Выделение бактерий из обычно стерильных тканей (кровь, СМЖ, синовиальные жидкости, а глубокие ткани) имеет диагностическое значение. Независимо от вирулентных свойств, все бактерии подвергаются воздействию защитных факторов макроорганизма.

Полость рта

В полости рта на микроорганизмы действует слюна, механически смывающая бактерии и содержащая антимикробные вещества (например, лизоцим). Тем не менее, в полости рта всегда есть области, легко колонизируемые микроорганизмами (например, десневые карманы, щели между зубами). В состав микрофлоры полости рта входят различные микроорганизмы; часть образует аутохтонную микрофлору, другие - аллохтонную (присущую другим областям). Аутохтонная микрофлора характерна для данной области (в данном случае - полость рта). Среди аутохтонных микроорганизмов различают резидентные (облигатные) и транзиторные виды. Среди последних наиболее часто встречают возбудителей инфекционных поражений, хотя к транзиторным видам относятся и комменсалы, обитающие в других биотопах (кожа, ЖКТ). Аллохтонная микрофлора полости рта представлена микробами, присущими другим областям. В её состав входят виды, обычно обитающие в кишечнике или носоглотке. Среди бактерий доминируют стрептококки, составляющие 30-60% всей микрофлоры ротоглотки; различные виды выработали определённую «географическую специализацию», например, Streptococcus mitior тропен к эпителию щёк, Streptococcus salivarius - к сосочкам языка, Streptococcus sanguis и Streptococcus mutans - к поверхности зубов. Менее аэрируемые участки колонизируют анаэробы - актиномицеты, бактероиды, фузобактерии и вейлонеллы. В полости рта также обитают спирохеты родов Leptospira, Borrelia и Treponema, микоплазмы (M. orale, M. salivarium), грибы рода Candida и разнообразные простейшие (Entamoeba buccalis и E. dentalis, Trichomonas buccalis). Первичное проникновение бактерий в полость рта происходит при прохождении плода по родовым путям; первоначальная микрофлора представлена лактобациллами, энтеробактериями, коринебактериями, стафилококками и микрококками; уже через 2-7 сут эта микрофлора замещается на бактерии, обитающие в полости рта матери и персонала родильного отделения. Обитатели полости рта обладают патогенным потенциалом, способным вызвать местное повреждение тканей. Важную роль в патогенезе местных поражений играют органические кислоты и их метаболиты, образующиеся при ферментации микроорганизмами углеводов. Основные поражения полости рта (кариес зубов, пульпиты, периодонтиты, заболевания перио-донта, воспаления мягких тканей) вызывают стрептококки, пептострептококки, актиномицеты, лактобациллы, коринебактерии и др. Реже встречающиеся анаэробные инфекции (например, болезнь Березовского-Венсана-Плаута) вызывают ассоциации бактероидов, превотелл, актиномицетов, вейлонелл, лактобацилл, нокардий, спирохет и др.

Кожа

На кожных покровах микроорганизмы подвержены действию бактерицидных факторов сального секрета, повышающих кислотность (соответственно значение рН снижается). В подобных условиях живут преимущественно Staphylococcus epidermidis, микрококки, сарцины, аэробные и анаэробные дифтероиды. Другие виды - Staphylococcus aureus, а-гемолитические и негемолитические стрептококки - правильнее рассматривать как транзиторные. Основные зоны колонизации - эпидермис (особенно роговой слой), кожные железы (сальные и потовые) и верхние отделы волосяных фолликулов. Микрофлора волосяного покрова идентична микрофлоре кожи. Первичная колонизация кожных покровов плода происходит при родах, но эта микрофлора (фактически флора родовых путей матери) в течение недели замещается вышеуказанными бактериями. Обычно на 1 см² выявляют 10³ -10⁴ микроорганизмов; на участках с повышенной влажностью их число может достигать 10⁶ . Соблюдение элементарных правил гигиены может уменьшить число бактерий на 90%.

Дыхательная система

Верхние отделы дыхательных путей несут высокую микробную нагрузку - они анатомически приспособлены для осаждения бактерий из вдыхаемого воздуха. Помимо обычных негемолитических и зеленящих стрептококков, непатогенных нейссерий, стафилококков и энтеробактерий, в носоглотке можно обнаружить менингококки, пиогенные стрептококки, пневмококки и возбудитель коклюша. Верхние отделы дыхательных путей у новорождённых обычно стерильны и колонизируются в течение 2-3 сут. По мере взросления, совершенствования защитных механизмов вероятность носительства патогенных бактерий снижается; у подростков и взрослых их находят сравнительно редко.

Мочеполовая система

Микробный биоценоз органов мочеполовой системы более скудный. Верхние отделы мочевыводящих путей обычно стерильны; в нижних отделах доминируют Staphylococcus epidermidis, негемолитические стрептококки, дифтероиды; часто выделяют грибы родов Candida, Torulopsis и Geotrichum. В наружных отделах доминирует Mycobacterium smegmatis. У 15-20% беременных женщин из влагалища выделяют Streptococcus agalactiae группы В, представляющий серьёзную опасность для новорождённых в плане развития пневмоний и гнойно-септических поражений.

ЖКТ

Наиболее активно бактерии заселяют ЖКТ; при этом колонизация осуществляется «по этажам». В желудке здорового человека микробов практически нет, что вызвано действием желудочного сока. Тем не менее, отдельные виды (например, Helicobacter pylori) адаптировались к обитанию на слизистой оболочке желудка, но общее число микроорганизмов обычно не превышает 10³ /мл. Верхние отделы тонкой кишки также относительно свободны от бактерий (менее 10³ /мл), что связано с неблагоприятным действием щелочного pH и пищеварительных ферментов. Тем не менее, в этих отделах можно обнаружить кандиды, стрептококки и лактобациллы. Нижние отделы тонкой и, особенно, толстая кишка - огромный резервуар бактерий; их содержание может достигать 10¹² в 1 г фекалий. ЖКТ новорождённого можно считать стерильным; имеется незначительное число бактерий, проникших во время прохождения по родовым путям. Интенсивная колонизация ЖКТ начинается в течение первых суток внеутробной жизни; в составе микрофлоры в дальнейшем возможны вариации. У естественно вскармливаемых детей доминирует Lactobacillus bifidus; прочие бактерии представлены кишечными палочками, энтерококками и стафилококками. У находящихся на искусственном вскармливании доминируют Lactobacillus acidophilus, энтеробактерии, энтерококки и анаэробы (например, клостридии).

Роль нормальной микрофлоры

Нормальная микрофлора играет важную роль в защите организма от патогенных микробов, например, стимулируя иммунную систему, принимая участие в реакциях метаболизма. В то же время эта флора способна привести к развитию инфекционных заболеваний.

Инфекции

Большая часть инфекций, вызываемых представителями нормальной микрофлорой, носит оппортунистический характер. В частности, кишечные анаэробы, (например, бактероиды) могут вызывать формирование абсцессов после проникновения в кишечную стенку в результате травм или хирургических вмешательств; основными возбудителями часто регистрируемых постгриппозных пневмоний считают микроорганизмы, обитающие в носоглотке любого человека. Число подобных поражений настолько велико, что возникает впечатление, что врачи чаще имеют дело с эндогенными, а не экзогенными инфекциями, то есть с патологией, индуцированной эндогенной микрофлорой. Отсутствие чёткого разграничения между условно-патогенными микробами и комменсалами даёт основание полагать, что неограниченная колонизация любым видом бактерий, способным выживать в организме человека, может приводить к развитию инфекционной патологии. Но это положение относительно - различные члены микробных сообществ проявляют патогенные свойства разного порядка (некоторые бактерии чаще вызывают поражения, чем другие). Например, несмотря на многообразие кишечной микрофлоры, перитониты, обусловленные прорывом бактерий в брюшную полость, вызывают лишь несколько видов бактерий. Ведущую роль в развитии подобных поражений играет не вирулентность самого возбудителя, а состояние защитных систем макроорганизма; так, у лиц с иммунодефицитами слабовирулентные или авирулентные микроорганизмы (кандиды, пневмоцисты) могут вызывать тяжёлые, часто фатальные поражения.

Нормальная микрофлора составляет конкуренцию для патогенной; механизмы подавления роста последней достаточно разнообразны. Основной механизм - избирательное связывание нормальной микрофлорой поверхностных рецепторов клеток, особенно эпителиальных. Большинство представителей резидентной микрофлоры проявляет выраженный антагонизм в отношение патогенных видов. Эти свойства особенно ярко выражены у бифидобактерий и лактобацилл; антибактериальный потенциал формируется секрецией кислот, спиртов, лизоцима, бактериоцинов и других веществ. Кроме того, высокая концентрация указанных продуктов ингибирует метаболизм и выделение токсинов патогенными видами (например, термолабильного токсина энтеропатогенными эшерихиями).

Стимуляция иммунной системы

Нормальная микрофлора - неспецифический стимулятор («раздражитель») иммунной системы; отсутствие нормального микробного биоценоза вызывает многочисленные нарушения в иммунной системе. Другая роль микрофлоры была установлена после того, как были получены безмикробные животные-гнотобионты [от греч. gnotos, познание, + лат. biota (от греч. bios) жизнь]. Было показано, что нормальная микрофлора оказывает постоянное антигенное «раздражение» иммунной системы, а у гнотобионтов его отсутствие вызывает недоразвитие основных иммунокомпетентных органов (например, тимуса, лимфоидной ткани кишечника). Аг представителей нормальной микрофлоры вызывают образование АТ в низких титрах. Они преимущественно представлены IgA, выделяющимися на поверхность слизистых оболочек. IgA составляют основу местной невосприимчивости к проникающим возбудителям и не дают возможности комменсалам проникать в глубокие ткани.

Вклад в метаболизм

Нормальная кишечная микрофлора играет огромную роль в метаболических процессах организма и поддержании их баланса.

Обеспечение всасывания. Метаболизм некоторых веществ включает печёночную экскрецию (в составе жёлчи) в просвет кишечника с последующим возвратом в печень; подобный печёночно-кишечный круговорот характерен для некоторых половых гормонов и солей жёлчных кислот. Эти продукты экскретируются, как правило, в форме глюкуронидов или сульфатов, не способных в этом виде к обратному всасыванию. Всасывание обеспечивают кишечные бактерии, вырабатывающие глюкуронидазы и сульфатазы. Сульфатазы могут оказывать и неблагоприятное действие, установленное на примере искусственного подсластителя цикламата. Фермент конвертирует цикламат в канцерогенный продукт циклогексамин, вызывающий злокачественное перерождение эпителия мочевого пузыря.

Обмен витаминами и минеральными веществами. Общепринятый факт - ведущая роль нормальной микрофлоры в обеспечении организма человека ионами Fe² +, Ca² +, витаминами К, D, группы В (особенно В₁ , рибофлавин), никотиновой, фолиевой и пантотеновой кислотами. Кишечные бактерии принимают участие в инактивации токсичных продуктов эндо- и экзогенного происхождения. Кислоты и газы, выделяющиеся в ходе жизнедеятельности кишечных микробов, оказывают благоприятное действие на перистальтику кишечника и своевременное его опорожнение.

Дисбактериоз

На состав микробных сообществ полостей организма влияют различные факторы: состав и качество пищи, курение и употребление алкоголя, нормальная перистальтика и своевременное опорожнение кишечника и мочевого пузыря, качество пережёвывания пищи и даже характер трудовой деятельности (сидячий или иной). Наибольшее воздействие оказывают заболевания, связанные с изменениями физико-химических свойств эпителиальных поверхностей (например, синдром мальабсорбции), и приём антимикробных препаратов широкого спектра, действующих на любые, в том числе непатогенные микроорганизмы. В результате выживают более устойчивые виды - стафилококки, кандиды и грамотрицательные палочки (энтеробактерии, псевдомонады). Следствие этого - стойкие нарушения микробных ценозов - дисбактерио-зы, или дисбиозы. Наиболее тяжёлые формы дисбактериозов - стафилококковый сепсис, системный кандидоз и псевдомембранозный колит; среди всех форм доминируют поражения микрофлоры кишечника.

Факторы внешней среды и микроорганизмы

Микроорганизмы подвержены постоянной воздействию факторов внешней среды. Влияние этих факторов может быть благоприятным либо неблагоприятным. Неблагоприятные воздействия могут приводить к гибели микроорганизмов, то есть оказывать микробицидный эффект (например, фунгиили вирулицидный), либо подавлять размножение микробов, оказывая статическое действие (например, бактериостатическое). Неблагоприятное воздействие на микроорганизмы факторов внешней среды люди использовали с древнейших времён. Например, погреба часто окуривали серой; во время эпидемий для обеззараживания предметов их прокаливали или обрабатывали специальными составами (например, смесью уксуса и винного спирта). Открытие и изучение свойств патогенных микроорганизмов стало началом направленной разработки методов подавления жизнедеятельности микробов. Было установлено, что некоторые воздействия оказывают избирательный эффект на отдельные виды, другие - проявляют широкий спектр активности.

Физические факторы

На жизнедеятельность микроорганизмов влияют температурные воздействия, высушивание, различные виды излучения и осмотическое давление внешней среды.

Температура

Микробы приспосабливаются к изменениям температуры окружающей среды. Выделяют оптимальную температуру (благоприятную для роста и размножения), минимально и максимально приемлемые (за их пределами рост прекращается). По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на мезофильные, психрофильные и термофильные.

Стерилизация. Температурные воздействия применяют для стерилизации - полного удаления микроорганизмов из различных сред и обеззараживания предметов. Разработано много режимов стерилизации; следует помнить, что термическая обработка применима лишь в отношении термоустойчивых материалов (стекло, металлы). Наиболее простые и доступные методы - прокаливание и кипячение.

Пастеризация. Метод позволяет эффективно уничтожать микроорганизмы инкубацией материала при 71,7 °С в течение 15 с с последующим быстрым охлаждением (быстрая пастеризация). Медленная пастеризация подразумевает более длительную экспозицию (30 мин) при 60 °C. Строго говоря, пастеризация - не стерилизующий метод, так как к ней чувствительны не все микроорганизмы. Метод широко применяют при обработке пищевых продуктов для профилактики кишечных инфекций, желудочно-кишечных форм туберкулёза и Ку-лихорадки.

Стерилизация сухим жаром. Проводят в сухожаровых шкафах при 160 °C в течение 2 ч; метод позволяет уничтожать не только вегетирующие клетки (погибают в течение нескольких минут), но и споры микроорганизмов (необходима экспозиция в течение 2 ч). Такие воздействия разрушают структуру большинства органических соединений и ведут к значительному испарению жидкостей (например, воды из питательных сред).

Автоклавирование (стерилизация текучим паром) включает обработку горячим паром (121 °C) под высоким давлением (1,2-1,5 атм); наиболее эффективно для стерилизации термостабильных жидкостей. Термоустойчивые споры микроорганизмов погибают в течение 15 мин. Обработка больших объёмов (более 500 мл) требует более длительной экспозиции. В лабораториях применяют специальные паровые котлы-автоклавы с горизонтальной или вертикальной загрузкой. Текучий пар нельзя применять для стерилизации сред, содержащих углеводы, молоко и желатина.

Тиндализация - метод дробной стерилизации при низких температурах - ежедневное прогревание сред при 56-58 °C в течение 5-6 сут. В результате такого дробного прогрева погибают вегетативные клетки бактерий, проросших из термостойких спор. Основной недостаток - невозможность полной элиминации микроорганизмов, так как некоторые споры не успевают прорастать во временных интервалах между сеансами прогревания, а некоторые вегетативные клетки успевают образовать термостабильные споры. Метод применяют для стерилизации сыворотки крови, асцитической жидкости и т.д.

Высушивание

При относительной влажности окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность большинства бактерий прекращается. Время их отмирания при высушивании различна (например, холерный вибрион - за 2 сут, а микобактерии - за 90 дней). Поэтому высушивание не используют как метод элиминации микробов с субстратов. Неблагоприятное влияние высушивания на микроорганизмы применяют при консервировании сухих продуктов и изготовлении сухих концентратов пищевых продуктов. Широко распространено искусственное высушивание микроорганизмов, или лиофилизация. Метод включает быстрое замораживание с последующим высушиванием под низким давлением (сухая возгонка). Лиофильную сушку применяют для сохранения иммунобиологических препаратов (вакцин, сывороток), а также для консервирования и длительного сохранения культур микроорганизмов.

Излучение

Солнечный свет губительно действует на микроорганизмы, исключением являются фототрофные виды. При этом паразитические виды более чувствительны к облучению, чем сапрофиты. Спектр солнечной активности содержит неионизирующее (УФ- и инфракрасные лучи) и ионизирующее (например, у-лучи) излучение. Наибольший микробицидный эффект оказывает коротковолновые УФ-лучи. Энергию излучения используют для дезинфекции, а также для стерилизации термолабильных материалов.

УФ-лучи (в первую очередь коротковолновые, то есть с длиной волны 250-270 нм) действуют на нуклеиновые кислоты. Микробицидное действие основано на разрыве водородных связей и образовании в молекулах ДНК димеров тимина, приводящем к появлению нежизнеспособных мутантов. Применение УФ-излучения для стерилизации ограничено его низкой проникаемостью и высокой поглотительной активностью воды и стекла.

Рентгеновское и у-излучение в больших дозах также вызывает гибель микробов. Применяют для стерилизации бактериологических препаратов, изделий из пластмасс. Работа с источниками излучения требует строгого соблюдения правил безопасности. Облучение вызывает образование свободных радикалов, разрушающих нуклеиновые кислоты и белки с последующей гибелью микробных клеток.

Микроволновое излучение применяют для быстрой повторной стерилизации длительно хранящихся сред. Стерилизующий эффект достигается быстрым подъёмом температуры.

Осмотическое давление

Высокая внеклеточная концентрация сахаров и солей приводит к выходу воды из бактерий и простейших. Это свойство концентрированных растворов сахаров и поваренной соли применяют для консервирования пищевых продуктов. Чувствительность микроорганизмов к такому воздействию вариабельна (например, возбудитель ботулизма погибает в 6% растворе NaCl, а грибы рода Candida - в 14%). Вещества, повышающие осмотическое давление, не обеспечивают достоверной гибели всех микроорганизмов; сделанные на их основе консервы нельзя считать безопасными.

Фильтрование

Эффективный метод физического удаления микроорганизмов - фильтрование. Естественное обеззараживание почвенных вод осуществляется фильтрацией через пористые породы, задерживающие микробы. Для удаления микроорганизмов применяют различные природные (например, целлюлоза, каолин, инфузорная земля, асбест) и искусственные (мелкопористое стекло, фарфор) материалы; они обеспечивают эффективную элиминацию микроорганизмов из жидкостей и газов. Микробы адсорбируются на стенках пор фильтрующего материала. Фильтры имеют форму свечей (например, свечи Шамберлана), либо пластин, вкладываемых в фильтрующие устройства (аппарат Зёйтца) или специальные насадки. Фильтрацию применяют для стерилизации жидкостей, чувствительных к температурным воздействиям, разделения микробов и их метаболитов (экзотоксинов, ферментов), а также для выделения вирусов.

Химические факторы

Способность ряда химических веществ подавлять жизнедеятельность микроорганизмов и предотвращать порчу органических субстратов известна с глубокой древности. В частности, египтяне широко применяли кислоты, щёлочи, природные ароматические вещества для мумификации умерших; персы-огнепоклонники для предохранения дерева и кожи от гниения использовали нефть и её продукты. Применение химических веществ - основа метода антисептики (предложил Джозеф Лйстер в 1867 г.). Эффективность зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Химические вещества могут подавлять рост и размножение микроорганизмов, проявляя статический эффект, либо вызывать их гибель [микробицидный эффект (от лат. caedo, убивать)]. Дезинфектанты и антисептики дают неспецифический микробицидный эффект; химиотерапевтические средства проявляют избирательное противомикробное действие.

Дезинфектанты и антисептики

Дезинфектанты - химические средства неспецифического действия, применяемые для обработки помещений, оборудования и различных предметов. Антисептики - вещества, используемые для обработки живых тканей. Дезинфицирующие средства оказывают в рабочих концентрациях бактерицидное действие, а антисептики (в зависимости от концентрации) - бактериостатическое или бактерицидное. Антисептики и дезинфектанты обычно легко растворимы в воде и действуют быстро; они дёшевы и при правильном применении не оказывают вредного воздействия на организм человека. Дезинфекция позволяет уменьшить число патогенных микроорганизмов на объектах внешней среды. Дезинфекцию проводят с определённой периодичностью (профилактическая дезинфекция), либо при возникновении инфекционного заболевания или подозрении на него (очаговая дезинфекция).

Спирты, или алкоголи (этанол, изопропанол и др.). Как антисептики, наиболее эффективны в виде 60-70% водных растворов. Спирты осаждают белки и вымывают из клеточной стенки липиды. При правильном применении эффективны в отношении вегетативных форм большинства бактерий; споры бактерий и грибов, а также вирусы к ним резистентны.

Галогены и галогенсодержащие препараты (препараты йода и хлора) широко применяют как дезинфектанты и антисептики. Препараты взаимодействуют с гидроксильными группами белков, нарушая их структуру.

Альдегиды алкилируют сульфгидрильные, карбоксильные и аминогруппы белков и других органических соединений, вызывая гибель микроорганизмов. Альдегиды широко применяют как консерванты. Наиболее известные - формальдегид (8%) и глутаральдегид (2-2,5%) - проявляют раздражающее действие (особенно пары), ограничивающее их широкое применение.

Кислоты и щёлочи применяют как антисептики. Среди кислот наиболее известны борная, бензойная, уксусная и салициловая. Применяют для лечения поражений, вызванных патогенными грибами и бактериями. Наиболее распространена салициловая кислота, применяемая в спиртовых растворах (1-2%), присыпках, мазях, пастах (например, для лечения дерматоми-козов в областях, подверженных трению); оказывает также в зависимости от концентрации отвлекающее, раздражающее и кератолитическое действие. Из щелочей наиболее распространён раствор аммиака (нашатырный спирт содержит 9,5-10,5% аммиака), применяемый для обработки рук хирурга (0,5% раствор).

Металлы. Антимикробный эффект основан на способности осаждать белки и другие органические соединения. В качестве антисептиков широко применяют нитрат серебра (ляпис), сульфат меди (медный купорос) и хромат ртути (мербромин). Соединения металлов (особенно свинца, мышьяка и ртути) не рекомендуют применять для дезинфекции и антисептики, поскольку они способны накапливаться в организме человека. Исключение - сулема (ртути дихлорид), иногда применяемая для дезинфекции белья, одежды, предметов ухода за больными.

Фенолы и их замещённые производные широко применяют как дезинфектанты, в меньших концентрациях - в качестве антисептиков. Препараты денатурируют белки и нарушают структуру клеточной стенки. От применения собственно фенола отказались давно вследствие его токсичности, но его производные (например, гексахлорофен, резорцин, хлорофен, тимол, салол) применяют часто.

Катионные детергенты оказывают бактерицидное действие, связанное с изменением проницаемости ЦПМ. Их эффект уменьшают анионные поверхностно-активные вещества (по этой причине катионные детергенты несовместимы с мылами), низкие значения рН (то есть повышенная кислотность), некоторые органические соединения, ионы металлов. Катионные детергенты адсорбируются пористыми и волокнистыми материалами. При нанесении на кожу образуют плёнку, под которой могут оставаться живые микроорганизмы. Наиболее часто применяют для обработки рук хирурга (препараты циригель, дегмицид, роккал).

Газы как дезинфектанты известны с глубокой древности. Двуокись серы ещё в античности широко применяли для обработки складов и предохранения пищевых продуктов. Не менее широкое распространение получила дератизация двуокисью серы. Для уничтожения спор микроорганизмов при стерилизации предметов из пластмасс применяют окиси этилена и пропилена под давлением при 30-60 °C. Метод позволяет эффективно уничтожать большинство микроорганизмов, в том числе в тканях и жидкостях (кровь, гнойное отделяемое). Механизм действия связан со способностью окиси этилена алкилировать белки. В частности, повреждению подвергаются сульфгидрильные группы вегетативных форм и карбоксильные группы оболочек спор.

Красители. В качестве антисептиков давно применяют различные красители (например, бриллиантовый зелёный, метиленовый синий, риванол, основный фуксин).

Окислители. Механизм антимикробной активности связан с окислением метаболитов и ферментов микроорганизмов, либо денатурацией микробных белков. Наиболее распространённые окислители, применяемые как антисептики, - перекись водорода и перманганат калия (в просторечии, марганцовка).

Химиотерапевтические средства

Вещества с избирательным действием применяют в качестве химиотерапевтических средств.

Они должны эффективно подавлять размножение или уничтожать возбудителей (см. главу 9), при этом не оказывая токсического действия на организм.

Биотехнология [от греч. bios, жизнь, + techne, мастерство] - наука, изучающая производственные процессы, основанные на использовании с различными целями микроорганизмов, биокатализаторов и различных биологических систем (культур растительных и животных тканей, протопластов и т.д.). Её отличие от традиционной микробиологической и бродильной промышленности заключается в том, что биотехнология возникла на основе достижений генной инженерии и инженерной эн-зимологии (науки о применении ферментов в микробиологической промышленности). Современная биотехнология базируется на применении последних достижений в области создания рекомбинантных ДНК и генетически модифицированных организмов.

Этапы развития биотехнологии

Истоки биотехнологии относят ко времени развития хлебопечения, виноделия, сыроварения, получения спирта брожением, силосования кормов и т.д. Лишь с 70-х годах XX столетия, со времени зарождения генной инженерии, началось бурное развитие биотехнологии. Выделяют следующие наиболее важные периоды в становлении биотехнологии.

Области применения биотехнологии

Новые методы получения промышленно важных продуктов - прежде всего методы биотехнологии, и в особенности, промышленной микробиологии. Промышленная микробиология основывается на применении микроорганизмов в промышленности для получения коммерчески ценных продуктов и лекарств. Важнейшие продукты микробного синтеза - специальные вещества, используемые для фармацевтических и пищевых целей (антибиотики, ферменты, ингибиторы ферментов, витамины, ароматизаторы, добавки для пищевой промышленности и др.). Гибкость метаболизма и высокая способность микробов к адаптации, простота культивирования, изученность генетики, разработанные методы направленного создания штаммов с заданными свойствами - преимущества, делающие микробную биотехнологию одним из перспективных направлений промышленности. Целесообразность промышленного производства определяется такими факторами, как высокий выход продукта (образование больших количеств из исходного материала), низкая стоимость производства и доступность сырья.

Области применения биотехнологии представлены в табл. 7-1. В настоящее время разработаны способы получения более 1000 наименований продуктов биотехнологическими способами. В США совокупная стоимость этих продуктов в 2000 г. оценивается в десятки миллиардов долларов. Все отрасли, в которых может быть использована биотехнология, перечислить практически невозможно.

Оптимизация микробиологических процессов в биотехнологии. Принципиальные подходы к оптимизации микробных биотехнологических процессов: управляемое культивирование (изменение состава питательной среды, целевые добавки, регуляция скорости перемешивания, аэрации, модификация температурного режима и пр.); генетические манипуляции, которые подразделяют на традиционные методы (селекция штаммов) и методы генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК).

В настоящее время микробиологическим путём получают микробную биомассу, первичные и вторичные продукты метаболизма. Первичные продукты (продукты первой фазы) - метаболиты, синтез которых необходим для выживания данного микроорганизма. Синтез вторичных продуктов (продукты второй фазы) не относится к жизненно необходимым для микроорганизма-продуцента. Оптимальные условия для получения биомассы определяются высокими скоростями протока среды через культуры микроорганизмов и стабильными химическими условиями культивирования (в том числе pH, количество кислорода и углерода). Процесс получения продуктов первой фазы (в частности, ферментов) оптимизируют в целях увеличения удельной активности фермента (единиц/гхч^-1 ) и объёмной продуктивности (единиц/литрхч^-1 ).

Для получения продуктов второй фазы (например, антибиотиков) главная задача - максимальное увеличение их концентрации, что ведёт к снижению затрат на их выделение.

Промышленное применение микроорганизмов

Производство продуктов первой фазы. К наиболее известным промышленным продуктам микробного синтеза относятся: ацетон, спирты (этанол, бутанол, изопропанол, глицерин), органические кислоты (лимонная, уксусная, молочная, глюконовая, итаконовая, пропионовая), ароматизаторы и вещества, усиливающие запахи (глутамат натрия). Спрос на последние постоянно увеличивается из-за тенденции к употреблению малокалорийной и растительной пищи, для придания вкусу и запаху пищи разнообразия. Ароматические вещества растительного происхождения можно проводить путём экспрессии генов растений в клетках микроорганизмов. Методом генной инженерии в клетки E. coli введён ген, кодирующий синтез а-антитрипсина человека, ингибирующего активность эластазы. Его образование бактериями достигает 15% синтеза всех клеточных белков. Таким образом получают препарат эглин, применяемый для компенсации врождённого отсутствия а-антитрипсина, приводящего к тяжёлой форме эмфиземы лёгких. Иммуномодулятор бестатин, ингибитор поверхностных пептидаз лимфоцитов, продуцирует Streptococcus olivoretuculi. Микроорганизмы - продуценты ингибиторов других важных в медицине ферментов. Например, ингибитор амилазы, синтезируемый Streptococcus tendae, блокирует гидролиз крахмала и снижает содержание сахара в крови; назначается больным диабетом. Каптоприл из культуральной жидкости стрептококков препятствует образованию ангиотензина II и снижает артериальное давление (АД) у гипертоников.

Производство продуктов второй фазы. С использованием микроорганизмов получают витамины В₁ , В₂ (продуценты - бактерии, грибы родов Candida, Pichia, Ashbya); фолиевую, пантотеновую кислоты, пиридоксаль, витамина В (продуценты - Propionibacterium shermanii, Pseudomonas denitrificans или метаногенные бактерии). Витамин С производят путём химического синтеза, однако этап высокоселективного дегидрирования D-сорбита в L-сорбозу осуществляют с помощью уксуснокислых бактерий.

Производство антибиотиков. Крупномасштабное производство антибиотиков способно давать десятки тысяч тонн продукта в год. Усовершенствование производства антибиотиков связано с селекцией культур, резистентных к бактериофагам, а также с применением мутантных штаммов, у которых отсутствуют системы обратного подавления синтеза антибиотиков. Крупная веха в истории антибиотиков - возможность химической модификации природных (образуемых микроорганизмами) антибиотиков. В настоящее время производят большое количество полусинтетических антибиотиков - направленное изменение структуры антибиотика позволяет расширить спектр действия и, отчасти, снять проблему устойчивости к антибиотикам.

Производство вакцин. Традиционные методы производства вакцин основаны на применении ослабленных или убитых возбудителей. В настоящее время многие новые вакцины (например, для профилактики гриппа, гепатита B) получают методами генной инженерии. Противовирусные вакцины получают, внося в микробную клетку гены вирусных белков, проявляющих наибольшую иммуногенность. При культивировании такие клетки синтезируют большое количество вирусных белков, включаемых впоследствии в состав вакцинных препаратов. Более эффективно производство вирусных белков в культурах клеток животных на основе технологии рекомбинантных ДНК. С использованием микроорганизмов получают также лимфокины (ИЛ-2, факторы роста, миелопептиды). Перспективы развития этих производств связаны с применением животных в качестве акцепторов рекомбинантной ДНК.

Важное направление биотехнологии - культивирование растительных клеток, образующих БАВ. Подобный подход отменяет необходимость в закладке больших плантаций лекарственных растений и связанные с этим проблемы (уход за посевами, профилактика болезней лекарственных растений), позволяя получить нужные препараты более дешёвыми методами. Таким образом получают БАВ женьшеня, строфанта и других растений.

Генная инженерия и биобезопасность

Производство продуктов микробного синтеза - безусловно одно из самых развитых направлений современной промышленности. Однако многие достижения современной биотехнологии связаны не только с использованием метаболитов микробов. Многие проблемы медицины, пищевой промышленности, сельского хозяйства решаются с применением организмов с модифицированном геномом. С 1982 г. ряд фирм Европы, США и Японии производят инсулин человека, выделяемый из культуральной жидкости кишечной палочки. Из 1000 л бактериальной культуры получают около 200 г человеческого инсулина. Такое количеству ранее получали из 1600 кг тканей поджелудочной железы животных. Новый продукт позволяет избежать развития аллергических реакций на животный инсулин. Необходимый для сыроваренной промышленности телячий тимозин продуцируется дрожжами. Лимфокины, иммуноглобулины (Ig) и многие другие медицинские препараты получают с помощью трансгенных микроорганизмов, в которые введены соответствующие гены человека. Наметилась тенденция применения в качестве организмов-реципиентов генов не только бактерий, но и высших животных. Например, в 1994 г. гены белков женского молока были введены трансгенному быку, его потомство даёт молоко улучшенного качества, используемое для детского питания. По оценкам экспертов, в 2000 г. стоимость продукции, выпускаемой в США на основе генно-инженерных методов, достигнет 50 млрд долларов.

Теоретическая база генной инженерии. Интенсивное развитие молекулярной биологии началось после открытия (Дж. Уотсон, Ф. Крик, М. Уилкинс, 1953) структуры наследственного материала живой клетки (ДНК) и последующей расшифровки принципов генетического кодирования. Последовательность пар оснований кодирует порядок расположения аминокислот в пептидной молекуле. Основу молекулярной биологии составляет принцип комплементарности: ДНК - саморепродуцирующаяся молекула; кроме самой себя, она способна воспроизводить копии химически родственного полимера - рибонуклеиновые кислоты, которые, в свою очередь, служат матрицами для производства клеточных белков. Белок или комплекс белков определяют конкретный признак живого организма. Этот путь - центральная догма молекулярной биологии: ДНК о ДНК о РНК - белок - признак. Первая двунаправленная стрелка символизирует процесс репликации (удвоения ДНК), вторая - процесс транскрипции, который, в случае РНК-содержащих вирусов, может также идти в обратном направлении от РНК к ДНК. Организация генетического материала. Гены [от греч. genos, рождение] - единица наследственности, участок ДНК, занимающий специфическое место в хромосоме. С точки зрения генетики, ген - наследуемый фактор и неделимая единица генетического материала. Структурный ген (цистрон) - фрагмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи. В его состав входят лидерная последовательность, кодирующие фрагменты (экзоны), вставочные последовательности (интроны) и концевая последовательность. Поскольку некоторые белки состоят более чем из одной субъединицы, формулировку «один ген - один фермент» применительно к гетеромультимерному (то есть состоящему из двух и более различных полипептидных субъединиц) белку следует трактовать как «один ген - одна полипептидная цепь».

Генотип - совокупность генов организма. Ещё в древности люди эмпирически использовали закономерности наследования. На основании этого опыта получила развитие селекция [от лат. selectio, выбирать] - наука о методах создания новых сортов растений и пород животных путём отбора и скрещивания. До недавнего времени генотип казался неприступным, не подвластным действиям человека. Открытие структуры генов позволило выделять их в изолированном виде, синтезировать биохимически и даже вводить в организм. Стало возможным воздействие на ген без его выделения из организма. Всё это создало предпосылки для манипулирования генотипом. В 80-е годы XX в. появилось новое понятие - генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с конструированием не существующих в природе сочетаний генов при помощи генетических и биохимических методов. Впервые введение чужеродного гена и изменение признаков организма осуществили английские микробиологи О. Эвери, К. Маклёод и М. -МакКарти (1944). Из клеток пневмококка (серовар III) они выделили трансформирующий фактор (как выяснилось впоследствии, последовательность ДНК). После обработки этим фактором часть непатогенных бактерий серовара IIR превратилась в патогенные, причем именно серовара III. Это была первая демонстрация факта, что некие факторы могут передаваться от клетки к клетке, изменяя ёе наследственные свойства. В 1972 г. Пол Берг с сотрудниками сообщили о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов разных молекул ДНК - вирусной (в том числе фаговой) и бактериальной. Иными словами, речь шла о получении энзимоло-гическими методами (при помощи ферментов рестриктаз) синтетической генной конструкции. Позднее были предложены новые методы выявления ДНК: блот-гибридизация, увековечившая имя его создателя Э. Саузерна в английском названии метода southern blotting (1975); методы секвенирования ДНК (анализ первичной последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК), основанные П. Сэнджером. В настоящее время для получения доступного для анализа и дальнейших манипуляций количества фрагмента ДНК применяют метод ПЦР, разработанный Нобелевским лауреатом (1994) американцем Кеем Мюллисом. Процедура получения и использования синтетической генной конструкции, состоит из нескольких этапов.

Введение чужеродного гена в организм приводит к изменению свойств и признаков последнего, то есть к созданию генно-инженерно модифицированного организма. Модифицированный генно-инженерно организм - клетка, группа клеток или вирус, содержащие генетический материал, полученный с применением методов генной инженерии. Известны три способа воздействия на генотип организма.

Трансформация бактериальных клеток в результате включения экзогенной ДНК приводит к появлению нового генетического маркёра. Для эукариот аналогичный процесс -трансфекция эукариотических клеток (в связи с тем, что термин «трансформация» обозначает переход в состояние неконтролируемого роста и применяется по отношению к опухолевому перерождению клеток).

Избирательная инактивация гена («адресное» разрушение гена, «антисмысловая» блокировка гена или производимой им РНК), позволяющая вывести из строя любой ген внутри клетки. Этот процесс известен также как «нокаутирование» [от англ. to knock out, сбивать с ног], а модифицированные организмы - как нокаутные.

Направленное изменение гена (адресный мутагенез in vivo, генная инженерия in vitro - ex vivo) по желанию исследователя.

Применение методов генной инженерии особо оправдано в следующих случаях.

Особое значение имеет создание методами генной инженерии диагностических, лечебных и профилактических препаратов, ранее получаемых дорогостоящими методами. Чаще всего это продукты, выделяемые из крови иммунизированных доноров, - животных и людей. Технология получения гибридом основана на выделении от доноров клеток-продуцентов и их слияния с миеломными (опухолевыми) клетками. В результате образуется гибридная клетка - гибридома, способная быстро и бесконечно размножаться на искусственных питательных средах и синтезировать необходимые продукты. Подобным способом часто получают АТ. Предшественники гибридом -плазматические клетки, синтезирующие Ig определённого типа. Поэтому получаемые продукты получили название моноклональных АТ (рис. 7-1). Наиболее часто применяют линии миеломных клеток мышей и крыс.

Частота слияний в смешанной культуре клеток (миеломных и донорских клеток-продуцентов) невелика - одна гибридома на 10⁴ клеток.

Образовавшиеся гибридомы немедленно реклонируют, так как многие гибридные клетки склонны «выбрасывать» лишние хромосомы, пока их число не будет равным диплоидному набору (при этом гены, ответственные за антителообразование, могут быть утрачены).

Гибридомы создают не только на основе В-клеток, но и Т-лимфоцитов и многих других, секретирующих лимфокины, факторы роста и т.д.

Продукты, полученные технологией гибридом, применяют для лечения и профилактики различных болезней, а также для изучения строения и функций различных молекул (например, клеточных рецепторов). В частности, при помощи гибридом получают моноклональные АТ, применяемые в иммуногистохимической диагностике опухолей.

Генная инженерия и биобезопасность. Воздействия на генотип могут приводить к непредсказуемым последствиям для человека, растений, животных и окружающей среды. В случае намеренного использования вышедших из-под контроля или специально изготовленных генетических агентов, поражающих живое, эти агенты рассматриваются как биологическое оружие. Биологическая безопасность - одна из приоритетных задач человечества. В 1975 г. на Международной конференции по биобезопасности (Асиломар, Калифорния) были приняты основные положения по экспериментам с рекомбинантной ДНК. В 1985 г. образована Информационная рабочая группа по биобезопасности, в которую вошли страны-участницы Организации индустриального развития при ООН (UNIDO), Программа охраны окружающей среды ООН (UNEP) и Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). В 1991 г. к ним присоединилась Организация по пищевым ресурсам и сельскому хозяйству ООН (FAO). Попытки урегулирования законодательств в области биотехнологии пока не привели к успеху; это связано с различиями в общественном восприятии биотехнологии, промышленной политике и законодательных возможностях. С одной стороны, на уровне правительств происходит легализация биотехнологических продуктов. С другой стороны, различия в законодательствах создают барьеры для продвижения продукции на глобальный рынок. В развитых странах регулирование качества продукта осуществляется задолго до его выпуска, в развивающихся странах - post factum. Потерпев поражение в борьбе за запрещение трансгенных продуктов, некоторые организации требуют введения специальной маркировки на такие товары. Одно из положительных достижений в области биобезопасности в России - принятие федерального закона «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности». Россия также подписала соглашение о маркировке генно-инженерных продуктов и препаратов.

Оценка риска, связанного с применением генетически модифицированных микроорганизмов. Все микроорганизмы с точки зрения патогенности для человека разделены на четыре группы опасности.

Группа опасности 1: наиболее вероятно не вызывающие заболеваний человека.

Группа опасности 2: могут вызывать заболевания у тех, кто с ними работает. Однако в целом микробы малоконтагиозны (например, E. coli, Mycoplasma pneumoniae, вирус папилломы человека).

Группа опасности 3: могут вызывать болезни человека и представляют серьёзную опасность для работающих с ними. Есть риск распространения в обществе, но известны меры профилактики (Bacillus anthracis, Mycobacterium leprae, ВИЧ).

Группа опасности 4: могут вызывать заболевания, опасны для работающих с ними, имеют высокий риск распространения в обществе, нет действенных мер профилактики (пример - вирусы геморрагических лихорадок).

Группы 2-4 объединяют патогенные микроорганизмы. Номер группы опасности определяет объём предохранительных мероприятий, необходимых при проведении работ. Для любого уровня обязательны правила GLP (Good Laboratory Practice). Чтобы определить уровень поддержания генетически модифицированных микроорганизмов, существуют Правила Международного Наблюдательного Комитета по Генетической Модификации (1993). По специальным таблицам оценивается тип вектора (самомобилизующийся [самостоятельно встраивающийся в хромосому], мобилизующийся плохо или немобилизующийся [оба нуждаются в присутствии встраивающего вектора]). Также учитывают тип хозяина (дикий, ослабленный, ауксотроф), тип включения трансгенной конструкции под промотор (с максимальной экспрессией, сильный, слабый, сайт-специфичный, дефектный) и опасность продуктов (токсическое вещество, БАВ с повреждающим эффектом, с маловероятным повреждающим эффектом, вероятно без эффекта, некоди-рующая последовательность ДНК). Перемножением величин факторов из таблиц получаем цифровые значения, определяющие уровень поддержания для генетически модифицированных микроорганизмов, соответствующий классу опасности.

Риск для окружающей среды определяется из таблиц как высокий, средний, низкий или нулевой посредством перемножения вероятности опасности (высокая, средняя, низкая, нулевая) на последствия опасности (значительные, средние, низкие, нулевые). В рассмотренном примере риск близок к нулю.

Генная диагностика и генная терапия

Генная диагностика имеет большое будущее в экспресс-диагностике инфекционных болезней. На ранних этапах инфекции, когда АТ в организме ещё не выработаны, диагностика основана на идентификации Аг, в том числе специфических генов возбудителя. Для этого выявления наиболее часто применяют методы гибридизации и амплификации ДНК (см. также главу 11).

Генная терапия - метод лечения заболеваний, основанный на переносе в клетки организма определённых генов. Основная проблема генной терапии - разработка эффективного и безопасного способа переноса необходимых генов в дефектные клетки организма. В качестве «средств доставки» генов используют различные векторы, наиболее часто - различные вирусы (см. ниже). В настоящее время разработки генной терапии касаются только соматических клеток. 14 сентября 1990 г. была проведена первая успешная попытка коррекции генных дефектов при наследуемом T-клеточном иммунодефиците, связанном с недостаточностью фермента аде-нозин дезаминазы. Двум больным девочкам провели пересадку собственных T-лимфоцитов, в которые был внесён трансген - нормальный ген недостающего фермента. В результате нескольких проведённых инфузий у обеих пациенток наступило полное выздоровление. В настоящее время несколько тысяч больных несут в своём организме клетки, генетически изменённые искусственным путём. В 1992 г. в США осуществили введение в клетки печени человека гена белка-рецептора, адсорбирующего липопротеины низкой плотности в гепатоциты женщины, страдающей выраженным атеросклерозом (патология была связана с дефицитом липопротеинов вследствие генных нарушений). Посредством трансфекции ген был введён в гомогенизированные клетки печени, которые затем переносили в печень пациентки. После такой процедуры состояние женщины улучшилось, хотя до пересадки «генно-инженерной печени» она перенесла инфаркт (в 16 лет) и операцию на сердце (в 26 лет).

Виды генной терапии

В настоящее время разработаны три основных вида генной терапии, различаемых по способу доставки вектора в поражённые клетки.

Генная терапия ex vivo. Поражённые клетки выделяют из организма пациента, инкубируют с вектором, после чего генно-инженерные (генетически изменённые) клетки вносят в организм. Наиболее часто метод применяют в отношении клеток крови. Это связано с простотой их выделения и последующего обратного введения.

Генная терапия in situ. В этом случае вектор вводят непосредственно в поражённые ткани. Например, пациентам с муковисцидозом аденовирусные векторы доставляют непосредственно в трахею и бронхи; в некоторые опухоли непосредственно инъецируют вектор, несущий цитокин или токсин; в мышцу больного, страдающего мышечной дистрофией, производят инъекцию вектора, несущего ген дистрофина.

Генная терапия in vivo - вектор вводят в кровоток. До настоящего времени на практике этот метод не применяли, однако метод прост и удобен, поэтому его считают наиболее перспективным.

Векторы

Как было указано выше, для переноса соответствующих генов в клетку используют различные векторы [от лат. vector, переносчик]. Основная проблема при их разработке - преодоление иммунологического барьера реципиента, ограждающего организм от различных внешних воздействий, в том числе и от внедрения чужеродной ДНК в геном клеток. В этом плане особый интерес представляют вирусы, так как из всех известных агентов лишь они способны более или менее успешно интегрировать генетический материал в геном клеток человека. Поэтому все усилия специалистов генной терапии на настоящий момент сконцентрированы в области генной инженерии вирусов, применяемых в качестве векторов, доставляющих терапевтические гены в клетки организма больного.

Векторы на основе РНК-овых вирусов. РНК-геномные вирусы легко интегрируют в геном клетки-хозяина, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию необходимого гена. Для создания генно-терапевтических векторов наиболее перспективны ретровирусы. С их участием проведено около 60% всех клинических попыток генной терапии.

Ретровирусы относительно безвредны для человека, исключая, конечно, ВИЧ и Т-лимфот-ропные вирусы человека. Наиболее часто в качестве вектора применяют вирус лейкемии мышей. При разработке векторов из их состава полностью исключают гены, кодирующие синтез продуктов, обеспечивающих репродукцию. Кодирующая ёмкость трансгенов в составе ретрови-русных векторов не превышает 8000 пар оснований нуклеиновых кислот.

Основные проблемы применения РНК-вирусных векторов - эффективная доставка генетического материала в клетки, поддержка долговременной экспрессии и трансдукция неделящих-ся клеток (большинство РНК-векторов неспособно к эффективному переносу трансгенов в покоящиеся клетки). Однако неспособность ретровирусов к трансдукции покоящихся клеток в конкретной ситуации может оказаться и выгодной, например, в генной терапии глиобластом (злокачественные опухоли мозга). Идея их применения заключается в избирательной трансдук-ции делящихся клеток в очаге поражения - опухолевых клеток и клеток сосудов; нервные клетки не делятся и потому не служат мишенью ретровирусных векторов.

Векторы на основе ДНК-геномных вирусов. Векторы, созданные на основе ДНК-вирусов обладают большими размерами по сравнению с РНК-геномными вирусами и поэтому, могут вмещать фрагменты ДНК (трансгены) длиной до 35 000 пар оснований.

Невирусные векторы (молекулы ДНК со свойствами транспозонов или вставочных последовательностей) менее распространены, чем векторы на основе вирусов. Тем не менее, невирусные векторы обладают многими преимуществами, такими как безопасность и простота конструирования. Путём констрирования синтетической системы по доставке генов внутрь клетки можно избежать опасности продуцирования рекомбинантного вируса или других токсических эффектов.

Перспективы генной терапии

Несмотря на низкой риск развития побочных реакций, связанных с генной терапией, эффективность переноса генов и их последующей экспрессии в клетках остаётся невысокой. Последнее связано со сложностями чёткой идентификации генов, кодирующих синтез тех или иных белков; трудностями их выделения и подбора соответствующих векторов. Поэтому проводимые в настоящее время клинические эксперименты можно определить как начальные стадии испытаний генной терапии, вовлекающие очень ограниченное число пациентов. Исходя из этого, методы коррекции генетических «сбоев» необходимо разрабатывать применительно к тяжёлым заболеваниям (злокачественные опухоли, наследуемые болезни, синдром приобретённого иммунодефицита (СПИД), аутоиммунные расстройства, ишемическая болезнь сердца). Тем не менее, накопление информации о генной терапии и ложные представления о невысоком риске развития побочных реакций создают опасные предпосылки для внедрения методов генной терапии в лечение патологических состояний, непосредственно не угрожающих жизни больного, коррекции косметических дефектов и улучшения общего состояния организма. Например, методы генной терапии применимы к лечению облысения, а трансдукция гена гормона роста может привести к росту организма, гена дистрофина - к наращиванию мышечной массы. К таким фривольным попыткам применения генной терапии следует подходить крайне осторожно - большинство учёных и врачей сходятся во мнении, что посягательства на геном человека на настоящий момент допустимы лишь в крайних случаях, каковыми являются угрожающие жизни состояния. Медицинское сообщество не может быть абсолютно уверено в отсутствии у генной терапии отдалённых негативных эффектов. По этим же причинам не следует применять генную терапию в отношении половых клеток.

В этой главе рассмотрены вопросы, характеризующие патоген-ность и вирулентность микроорганизмов, факторы их патогенности и вирулентности, особенности течения инфекционного процесса и эпидемиологии инфекционных болезней.

ПАТОГЕННОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Человек контактирует с множеством микроорганизмов, но лишь немногие их них способны вызывать инфекционные болезни. Патогенностъ или отсутствие таковой - видовой, генетически детерминированный признак микроорганизма. Патогенный потенциал многих возбудителей зависит как от свойств, присущих конкретному микроорганизму, так и от состояния факторов защиты организма-хозяина. В зависимости от характера данных взаимоотношений все микробы подразделяют на патогенные, условно-патогенные и непатогенные.

Патогенные микроорганизмы

Патогенные микроорганизмы вызывают инфекционные заболевания у здоровых лиц. Такие возбудители произошли от свободножи-вущих видов, адаптировавшихся к существованию во внутренней среде организма. Патогенные микробы активно проникают в чув-ствителъные организмы, так как паразитирование - важная частъ их жизненного цикла. Адаптация к паразитированию в тканях проявляется специфическими поражениями, выделенными в отдельные нозологические формы.

Условно-патогенные микроорганизмы

Условно-патогенные микроорганизмы, как правило, лишены болезнетворных свойств и не вызывают инфекционных заболеваний у здорового человека. Они нередко колонизируют кожу и слизистые оболочки, но способны и к длительному существованию во внешней среде. Условно-патогенные микробы вызывают поражения после пассивного переноса во внутреннюю среду организма (например, при нарушении целостности анатомических барьеров). Поскольку эти микроорганизмы лишены тропности к тем или иным тканям, то заболевания не имеют выраженной специфичности и больше зависят от степени поражения органа, чем от патогенных свойств возбудителя. Важные условия их развития - массивность инфицирования и нарушения сопротивляемости организма. Чем более выражены эти нарушения, тем более широкий спектр микроорганизмов способен вызывать инфекционные поражения. Обычно даже непатогенные (точнее, не способные вызывать поражения у здорового человека) микроорганизмы находят «возможность» инициировать инфекционный процесс. Их так и называют - оппортунистические патогены [от англ. opportunity, возможность, удобный случай].

Подразделение микроорганизмов на непатогенные и условно-патогенные виды имеет нечёткие границы. Например, сенная палочка (Bacillus subtilis) не патогенна для человека, но может вызывать тяжёлые глазные инфекции и бактериемию после попадания в кровь. Более правильна оценка паразитических свойств микроорганизма, так как в основе любого инфекционного процесса лежит феномен паразитизма. Паразитические микроорганизмы используют организм хозяина как источник питания, среду обитания и размножения. В соответствии со степенью паразитизма микроорганизмы разделяют на несколько типов.

Облигатные паразиты

Все этапы жизненного цикла микроорганизма связаны с организмом хозяина. Вне организма человека эти микроорганизмы быстро погибают либо не размножаются. Облигатные паразиты - хламидии, риккетсии и вирусы.

Факультативные паразиты

Факультативные паразиты часть своего жизненного цикла проводят как свободноживущие особи; тем не менее, паразитическая фаза имеет ведущее значение. Факультативные паразиты - многие кишечные бактерии.

Случайные паразиты

Случайные паразиты - свободноживущие виды, для них естественной средой обитания служит внешняя среда, а паразитирование в организме человека - случайная, абсолютно необязательная фаза жизненного цикла. Случайные паразиты - грибы, вызывающие подкожные микозы, или атипичные микобактерии.

Патогенность и вирулентность

Оба понятия близки, но не идентичны. Патогенность - не абсолютная, а относительная величина, поэтому для определения степени патогенности возбудителя применяют термин «вирулентность».

Патогенность

Патогенность [от греч. pathos, болезнь, + genos, рождение] определяет специфичностъ патологических процессов, вызываемых конкретным возбудителем, что проявляется развитием соответствующего типа инфекционного заболевания (кишечного, дыхательного и т.д.). Генотип патогена фенотипически проявляется его вирулентными и токсигенными свойствами. Так, условно-патогенные микроорганизмы способны вызывать заболевания лишь при значительных нарушениях функциональных свойств местных и общих защитных факторов. Характерными свойствами патогенных микроорганизмов являются специфичность (способность вызывать определённую инфекционную болезнь после проникновения в организм) и органотропность (способность предпочтительно поражать определённые органы или ткани).

Вирулентность

Вирулентность [от лат. virulentus, ядовитый] отражает степенъ патогенности различных изолятов или штаммов конкретного патогенного вида.

Критерии вирулентности. К критериям, определяющим вирулентность микроорганизмов, относят инфекционность, способность к колонизации, инвазивность, токсигенность и способность к длительному персистированию. С известным допущением столь внушительный набор факторов, определяющих вирулентность, можно расценивать как «ответ» инфекционного агента на многообразие защитных механизмов организма хозяина. Инфекционность - собственно способность заражать макроорганизм. Способность к колонизации - свойство заселять очаги первичного инфицирования. Инвазивность - способность проникать в ткани, лежащие за пределами входных ворот инфекции, и размножаться в них. Токсигенность - способность образовывать ядовитые вещества, вызывающие болезнетворное действие.

Способность к персистированию - свойство длительно циркулировать либо сохраняться в определённом очаге, что обусловлено способностью долгое время противодействовать влиянию защитных факторов макроорганизма.

Летальная доза. За единицу измерения вирулентности принята летальная доза (DL, от лат. dosis letalis) - наименьшее количество патогенных микроорганизмов или токсина, способное вызвать гибель определённого количества лабораторных животных. На практике применяют несколько производных от величин DL.

DCL (dosis certe letalis) - количество микробов или токсина, вызывающее гибель 100% лабораторных животных.

LD₅₀ - количество патогенных микроорганизмов, способное вызывать гибель 50% экспериментально заражённых лабораторных животных. Применяют также величины LD₇₀ , LD₇₅ , LD₉₀ и т.д.

Инфицирующая доза (ID [от англ. infectious dose]) - минимальное количество патогенных микроорганизмов, способное вызвать развитие заболевание у определённого количества лабораторных животных. По аналогии с летальным эффектом определяют ID₁₀₀ , ID₅₀ и т.д.

Генетический контроль патогенности и вирулентности

Все вышеназванные факторы и параметры патогенности и вирулентности подвержены фенотипическим и генотипическим изменениям. Причины таких изменений - эффекты различных физических и химических факторов. В первую очередь патогенные свойства бактерий находятся под контролем хромосомных и плазмидных генов. Способность к образованию экзотоксинов детерминируют внехромосомные tox-гены конвертирующих бактериофагов и плазмид (например, синтез дифтерийного гистотоксина, ботулинического нейротоксина и др.). Образование эндотоксинов кодируют хромосомные гены.

Генотипическое снижение вирулентности возможно при мутациях, рекомбинациях, утере внехромосомных наследственных факторов (плазмид, транспозонов, вставочных (IS-) последовательностей).

Фенотипическое снижение вирулентности возможно при попадании возбудителя в неблагоприятные условия. In vitro оно возникает в результате неблагоприятного режима культивирования и состава питательной среды, воздействия селективных неблагоприятных факторов либо обработки популяции гомологичной антисывороткой. In vivo снижение вирулентности возникает вследствие селекции маловирулентных штаммов в гетерогенной популяции возбудителя под действием защитных факторов, антимикробных препаратов и др. Выжившая популяция приобретает устойчивость к этим воздействиям, но «платит» своими патогенными свойствами (например, за счёт утери плазмидных или хромосомных генов патогенности). Со времён Пастёра искусственное снижение вирулентности - аттенуация [от лат. attenuo, ослаблять] - положено в основу производства ряда вакцин. Таким образом, патогенностъ - качественный признак болезнетворного микроба, а вирулентностъ - количественное проявление патогенности.

ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ

К основным факторам патогенности (вирулентности) относят способность микроорганизмов к колонизации, их устойчивость к разным микробицидным факторам организма, свойства инва-зивности и токсигенности, а также способность к длительному персистированию.

Способность к колонизации

Адгезия

Размножению бактерий в первичном очаге инфицирования предшествует адгезия [от лат. ad-haesio, прикрепляться к чему-либо], то есть закрепление бактерий на поверхности клеток, что, собственно, и служит началом инфекционного процесса. Прикрепление к поверхности клеток (например, к эпителию слизистых оболочек) обеспечивают адгезины, или факторы колонизации - различные микробные продукты - молекулы адгезии (белки, ЛПС, липотейхоевые кислоты). Молекулы адгезии могут располагаться непосредственно на поверхности бактериальной клетки либо входить в состав микроворсинок или капсул. Взаимодействие инфекционного агента с эпителиальными клетками происходит в результате нескольких типов связей, различных по природе и специфичности. Выделяют связи, основанные на взаимодействии электростатических сил, обусловленные гидрофобными свойствами поверхности, лиганд-рецепторные взаимодействия.

Заряд. Бактериальные и эукариотические клетки заряжены отрицательно, но поверхностные микроворсинки грамотрицательных бактерий снижают заряд бактерий и уменьшают электростатические силы отталкивания.

Гидрофобность. Бескапсульные бактерии обладают высокой гидрофобностью, усиливающей адгезивность; гидрофобные участки обладают сродством к лигандам на поверхности эукарио-тических клеток, что и приводит к прочности связи.

Специфические взаимодействия. На поверхности бактерий имеются молекулы, способные к стереоспецифичному связыванию с комплементарными молекулами на мембранах эукариотических клеток (например, гемагглютинины или тейхоевые кислоты).

Другие механизмы колонизации. Некоторые бактерии способны «заранее подготавливать» место для дальнейшего размножения; например, нейраминидаза облегчает проникновение холерного вибриона через слой слизи и контакт с сиалосодержащими рецепторами эпителия кишечника. Микроорганизмы также способны сорбироваться на бактериях, уже колонизировавших поверхность слизистых оболочек, либо связывать белки (например, фибронектин), рецепторы к которому имеются на многих клетках макроорганизма. У капсулированных бактерий в прикреплении активно участвуют полисахариды капсулы.

Для успешной колонизации очага первичного инфицирования бактерии должны выдержать действие многочисленных и разнообразных микробицидных факторов хозяина. Для защиты от них микроорганизмы активно используют ряд структур (например, капсулы) и синтезируемых веществ (например, ферменты).

Капсула

Капсула (или её менее выраженный аналог - слизистый слой) ингибирует начальные этапы защитных реакций - распознавание и поглощение.

Инактивирующие ферменты

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты, обезвреживающие многие гуморальные защитные факторы. Например, многие возбудители, особенно паразитирующие на слизистых оболочках, выделяют протеазы, расщепляющие в том числе и молекулы IgA. В инактивировании токсических кислородных продуктов фагоцитов задействованы каталаза и супероксид дисмутаза. Бактериальные ферменты также способны изменять рН окружающей среды, делая её пригодной для размножения. Например, Helicobacter pylori выделяет уреазу, нейтрализующую кислую среду в желудке.

Инвазивность

Патогенность многих микроорганизмов (например, шигелл) связана с проникновением в эпителиальные клетки, где они размножаются, вызывая нарушение целостности пласта эпителия. Основные факторы, обеспечивающие инвазивность бактерий, - подвижность (обеспечивает проникновение как в клетки, так и межклеточные пространства) и особые клеточные факторы - инвазины [от лат. invasio, проникать, атаковать], способствующие проникновению в эпителиоциты посредством эндоцитоза (например, поверхностные белки грамотрицательных бактерий). Некоторые микроорганизмы проникают за пределы эпителия либо посредством активной инвазии, либо в результате имплантации через различные повреждения кожных покровов. Как разновидность инвазии можно рассматривать способность микроорганизмов диссеминировать из первичного очага инфекции и циркулировать в крови.

Токсигенность

Токсины

Токсины [от греч. toxikon, яд] - важнейшие факторы патогенности, вырабатываемые микроорганизмами и реализующие основные механизмы инфекционного процесса. Роль микробных токсинов в патогенезе инфекционных болезней впервые доказали Э. Ру и А. Иерсён (1888), отделившие «ядовитое начало» возбудителя дифтерии от бактериальных клеток и сумевшие воспроизвести с его помощью клиническую картину болезни у морских свинок.

Токсины облегчают первичную колонизацию и вызывают системные поражения, характеризующие специфические проявления той или иной инфекционной болезни. Некоторые токсины не ведут к развитию клинической картины, но вносят вклад в патогенез заболевания (так называемые парциальные токсины). Спектр активности токсинов необычайно широк: от веществ, облегчающих распространение по тканям, до метаболитов, селективно повреждающих активность определённых клеток. Бактериальные токсины традиционно подразделяют на эндотоксины и экзотоксины (их основные характеристики представлены в табл. 8-1), хотя подобная классификация не совсем корректна. Более правильной была бы систематизация токсинов по химическому составу (например, фосфолипазы или детергенты) либо по механизму действия, например, на поражающие клеточную мембрану (цитолизины) и действующие на различные внутриклеточные мишени. К сожалению, химический состав значительной части токсинов и комплекс оказываемых ими биологических эффектов изучены недостаточно. Многие бактериальные токсины вырабатываются в форме предшественников (протоксины), трансформирующихся в активную форму. За единицу измерения биологической активности токсинов, как и вирулентности микроорганизмов, принята величина летальной дозы.

Экзотоксины

Экзотоксины (табл. 8-2)- секреторные белковые вещества, обычно проявляющие ферментативную активность. Нередко экзотоксины служат единственным фактором вирулентности микроорганизма, действуют дистанционно (далеко за пределами очага инфицирования) и ответственны за клинические проявления инфекции (например, энтеротоксины вызывают диарею, нейротоксины - параличи и другие неврологические симптомы). Наибольшую токсичность проявляет ботулотоксин - 6 кг токсина могли бы убить всё человечество. Высокая токсичность экзотоксинов обусловлена особенностью структуры их фрагментов, имитирующей строение субъединиц гормонов, ферментов или нейромедиаторов хозяина. В результате экзотоксины проявляют свойства антиметаболитов, блокируя функциональную активность естественных аналогов. Экзотоксины проявляют высокую иммуногенность; в ответ на их введение образуются специфические нейтрализующие АТ (антитоксины). По степени связи с бактериальной клеткой экзотоксины разделяют на три группы - А, В и С.

Группа А - токсины, секретируемые во внешнюю среду (например, токсин дифтерийной палочки).

Группа В - токсины, частично секретируемые во внешнюю среду и частично ассоциированные с бактериальной клеткой (например, тетаноспазмин столбнячной палочки).

Группа С - токсины, связанные с бактериальной клеткой и высвобождающиеся после её гибели (например, экзотоксины энтеробактерий). Свойства экзотоксинов

Эндотоксины

В определённой степени токсигенным микроорганизмам (активно секретирующими токсины) противопоставлены патогенные бактерии, обладающие токсическими субстанциями, слабо диффундирующими в окружающую среду и названные (по предложению Р. Пфайффера) эндотоксинами. Эндотоксины - интегральные компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий; большая их часть высвобождается только после гибели бактериальной клетки. Представлены комплексом протеинов, липидных и полисахаридных остатков. За проявление биологического эффекта ответственны все группировки молекулы эндотоксина. Биологическая активность напоминает таковую у некоторых медиаторов воспаления; эндотоксинемия обычно сопровождается лихорадкой, обусловленной выбросом эндогенных пирогенов из гранулоцитов и моноцитов. При попадании значительного количества эндотоксина в кровоток возможен эндотоксиновый шок, обычно заканчивающийся смертью больного. Бактериальные эндотоксины проявляют сравнительно слабое иммуногенное действие, и иммунные сыворотки не способны полностью блокировать их токсические эффекты. Некоторые бактерии могут одновременно синтезировать экзотоксины и выделять (при гибели) эндотоксины (например, токсигенные Escherichia coli и холерные вибрионы).

Экзоферменты

Важными факторами патогенности следует считать экзоферменты (например, лецитиназа, гиалуронидаза, коллагеназа и др.), нарушающие гомеостаз клеток и тканей, что приводит к их повреждению. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазив-ность бактерий - возможность проникать через слизистые оболочки, соединительнотканные и другие барьеры. Например, гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость различных тканей. Этот фермент синтезируют бактерии родов Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus и др. Нейраминида-за облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточных пространствах. Нейраминидазу секретируют холерные вибрионы, дифтерийная палочка; он также входит в состав вируса гриппа. К этой же группе следует отнести и бактериальные ферменты, разлагающие антибиотики.

Суперантигены

Некоторые токсины (например, токсин Дика стрептококков или энтеротоксин стафилококков) способны действовать как суперантигены, вызывая поликлональную активацию различных клонов лимфоцитов. Поликлональная активация сопровождается гиперсекрецией лимфокинов с развитием цитокинопосредованной интоксикации.

Способность к длительному выживанию в организме

Разнообразные микробы хорошо выдерживают воздействие защитных факторов и колонизируют нестерильные полости различных организмов. К длительному выживанию в составе микробных сообществ способны не только сапрофитические и условно-патогенные (формирующие нормальную микрофлору), но и некоторые паразитические виды.

ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС

Проникновение микроба в организм приводит к развитию комплекса физиологических (адаптационных) и патологических реакций, направленных на восстановление гомеостаза, известных как инфекционный процесс, или инфекция. Термин «инфекция» [от лат. infictio, вносить что-либо вредное, + позднелатинское infectio, заражение] может определять и сам инфекционный агент, и факт его попадания в организм, но более правильно его применять для обозначения всей совокупности реакций между возбудителем и хозяином. Проникновение любого микроорганизма в организм приводит к развитию защитных реакций. Спектр этих реакций широк, крайние его полюса - инфекционная болезнь и бессимптомная циркуляция микроорганизма. Таким образом, термины «инфекционный процесс» и «инфекционная болезнь» не тождественны, так как инфекционная болезнь - лишь частный случай инфекционного процесса, выявляемая клиническими или лабораторными методами.

Условия развития инфекции

Патогенность - видовой признак. Таким образом, всегда возможны внутривидовые вариации. Это означает, что патогенность может быть по-разному выражена у различных штаммов. Вероятность развития инфекционной болезни в значительной степени определяют видовые свойства возбудителя, количество возбудителя, пути и место проникновения в организм, скорость размножения.

Инфицирующая доза

При попадании в организм незначительного числа патогенных микроорганизмов (что бывает наиболее часто) их обычно эффективно элиминируют защитные факторы организма. Для развития заболевания необходимо, чтобы патоген обладал достаточной вирулентностью, а его количество (инфицирующая доза) превышала некоторый порог, определяемый в каждом конкретном случае вирулентностью возбудителя и состоянием резистентности организма. В контексте патогенных свойств инфицирующую дозу можно рассматривать как определённое количество микроорганизмов, обеспечивающее возможность адгезии, колонизации и инвазии в ткани.

Скорость размножения

На вероятность развития инфекционного процесса и его тяжесть существенно влияет скорость размножения возбудителя. Например, чумная палочка настолько быстро размножается в организме, что иммунная система практически не успевает ответить на её проникновение формированием защитных реакций.

Входные ворота инфекции

Не менее значимо проникновение возбудителя. Многих возбудителей отличает тропизм [от греч. trope, направление] к определённым тканям. Например, гонококк вызывает типичные поражения после попадания на слизистые оболочки половых органов или глаз, а дизентерийная амёба - на слизистую оболочку кишечника. С другой стороны, туберкулёзная или чумная палочки способны вызвать заболевание вне зависимости от пути проникновения, приводя к развитию полиморфных поражений, варьирующих в зависимости от места проникновения. Для таких патогенов характерен пантропизм. Проникнув в организм, возбудитель начинает размножаться в месте внедрения, формируя первичный очаг поражения (первичный аффект) либо распространяется (диссеминирует) в другие органы и ткани.

Динамика инфекционного процесса

При развитии инфекционного процесса можно выделить несколько стадий.

Названные состояния могут сопровождаться клиническими проявлениями либо протекать бессимптомно. Нередко микроорганизмы циркулируют в кровотоке временно, проникая в кровь при чрезмерных физических нагрузках и стрессовых ситуациях (длительной бессоннице, переохлаждении или перегреве организма). Как правило, их циркуляция протекает бессимптомно или субклинически, хотя в кровотоке практически здоровых пациентов могут циркулировать Staphylococcus epidermidis, Clostridium perfringens и др.

Клинически выраженные состояния обычно развиваются при проникновении микроорганизмов в кровь в результате травм, после медицинских манипуляций либо из инфекционного очага. Пребывание микроорганизмов в крови характерно для многих вирусных (грипп, гепатит В) и бактериальных (брюшной тиф, риккетсиозы) инфекций. Циркуляция микроорганизмов в кровотоке - важная и обязательная стадия патогенеза инфекций, передающихся через укусы членистоногих - переносчиков заболеваний (чума, сыпной тиф), поддерживающих циркуляцию возбудителя в природе и тем самым сохраняющих его как вид.

Важная особенность бактериемий - микроорганизмы циркулируют в кровотоке, но не размножаются в нём. Однако уменьшение микробицидных свойств крови даёт возможность микроорганизмам размножаться в кровотоке, что приводит к развитию тяжёлых генерализованных состояний, известных как сепсис [от греч. sepsis, гниение]. Обычно такая ситуация - следствие непрерывного или периодического поступления возбудителей в кровоток. Состояния, при которых микроорганизм только размножается в крови, определяют термином септицемия [от греч. sеpsis, гниение, + haima, кровь]. Состояния, при которых микроорганизм не только размножается в кровотоке, но и формирует новые очаги гнойного воспаления в различных тканях и органах, известны как септикопиемии [от греч. sеpsis, гниение, + pion, гной, + haima, кровь]. Если в патогенезе инфекционного заболевания ведущим звеном служит интоксикация, вызванная циркуляцией экзоили эндотоксинов возбудителя в крови, то такие состояния определяют термином токсинемия. Помимо лимфо- и гематогенного путей некоторые возбудители распространяются нейрогенным путём, в том числе непосредственно по отросткам нейронов (нейропробазйя).

Важно, что в ответ на проникновение микроорганизма и/или его токсинов в организме происходит формирование защитных реакций, направленных на инактивирование возбудителя, а также на восстановление гомеостаза. Естественное окончание инфекционного процесса - гибель больного или выздоровление пациента. Выздоровление обычно приводит к развитию невосприимчивости к повторному заражению.

Формы инфекционного процесса могут быть разнообразными; далеко не всегда инфекционный процесс проходит все стадии своего развития, так как при попадании патогена в невосприимчивый (иммунный) организм процесс заканчивается на начальных стадиях.

Особенности инфекционных болезней

Инфекционные болезни характеризуются специфичностью, контагиозностью и цикличностью.

Специфичность

Каждую инфекционную болезнь вызывает конкретный возбудитель. Однако известны инфекции (например, гнойно-воспалительные процессы), вызываемые различными микробами. С другой стороны, один возбудитель (например, стрептококк) способен вызывать различные поражения.

Контагиозность

Контагиозность (заразительность) определяет способность возбудителя передаваться от одного лица к другому и скорость его распространения в восприимчивой популяции. Для количественной оценки контагиозности предложен индекс контагиозности - процент переболевших лиц в популяции за определённый период (например, заболеваемость гриппом в определённом городе за 1 год).

Цикличность

Развитие конкретного инфекционного заболевания ограничено во времени, сопровождается цикличностью процесса и сменой клинических периодов.

Инкубационный период [от лат. incubatio, лежать, спать где-либо]. Обычно между проникновением инфекционного агента в организм и проявлением клинических признаков существует определённый для каждой болезни промежуток времени - инкубационный период, характерный только для экзогенных инфекций. В этот период возбудитель размножается, происходит накопление как возбудителя, так и выделяемых им токсинов до определённой пороговой величины, за которой организм начинает отвечать клинически выраженными реакциями. Продолжительность инкубационного периода может варьировать от часов и суток до нескольких лет.

Продромальный период [от греч. prodromos, бегущий впереди, предшествующий]. Как правило, первоначальные клинические проявления не несут каких-либо патогномоничных [от греч. pathos, болезнь, + gnomon, показатель, знак] для конкретной инфекции признаков. Обычны слабость, головная боль, чувство разбитости. Этот этап инфекционной болезни называется продромальный период, или «стадия предвестников». Его продолжительность не превышает 24-48 ч.

Период развития болезни. На этой фазе и проявляются черты индивидуальности болезни либо общие для многих инфекционных процессов признаки - лихорадка, воспалительные изменения и др. В клинически выраженной фазе можно выделить стадии нарастания симптомов (stadium incrementum), расцвета болезни (stadium acme) и угасания проявлений (stadium decrementum).

Реконвалесценция [от лат. re-, повторность действия, + convalescentia, выздоровление]. Период выздоровления, или реконвалесценции как конечный период инфекционной болезни может быть быстрым (кризис) или медленным (лизис), а также характеризоваться переходом в хроническое состояние. В благоприятных случаях клинические проявления обычно исчезают быстрее, чем наступает нормализация морфологических нарушений органов и тканей и полное удаление возбудителя из организма. Выздоровление может быть полным либо сопровождаться развитием осложнений (например, со стороны ЦНС, костно-мышечного аппарата или сердечно-сосудистой системы). Период окончательного удаления инфекционного агента может затягиваться и для некоторых инфекций (например, брюшного тифа) может исчисляться неделями.

Формы инфекционных заболеваний

Инфекционные болезни обычно сопровождаются нарушениями гомеостаза организма и его физиологических функций. Множество взаимодействующих параметров в системе «конкретный возбудитель-конкретный организм» находит отражение в различных формах инфекционного процесса и его вариантах. Другими словами, в зависимости от эпидемиологической ситуации, типа и свойств возбудителя (например, инфицирующей дозы, вирулентности и т.д.), состояния параметров гомеостаза человека, а также от конкретных особенностей взаимодействия возбудителя и организма инфицированного человека, инфекционный процесс может принимать различные формы (от клинически выраженных до бессимптомных, от суперинфекций до бактерионосительства). Ниже рассмотрены основные формы инфекционных процессов.

Экзо- и эндогенные инфекции

Экзогенные инфекции развиваются в результате проникновения в организм патогенных микроорганизмов из внешней среды.

Эндогенные инфекции обычно развиваются в результате активации и, реже, проникновения условно-патогенных микроорганизмов нормальной микрофлоры из нестерильных полостей во внутреннюю среду организма (например, занос кишечных бактерий в мочевыводящие пути при их катетеризации). Особенность эндогенных инфекций - отсутствие инкубационного периода.

Регионарные и генерализованные инфекции

Моноинфекции и миксты

Моноинфекции - заболевания, вызванные одним видом микроорганизмов.

Смешанные инфекции (миксты) развиваются в результате заражения несколькими видами микроорганизмов; подобные состояния характеризует качественно иное течение (обычно более тяжёлое) по сравнению с моноинфекцией, а патогенный эффект возбудителей не имеет простого суммарного характера. Микробные взаимоотношения при смешанных (или микст-) инфекциях вариабельны:

Суперинфекции, реинфекции, рецидивы

Суперинфекции. От смешанных инфекций следует отличать вторичные инфекции (суперинфекции), возникающие на фоне уже имеющегося заболевания.

Реинфекция - случай повторного заражения одним и тем же возбудителем. Реинфекции не следует рассматривать как рецидивы.

Рецидивы формируются под действием популяции инфекционного агента, уже циркулирующего в организме, а не в результате нового заражения.

Манифестные и бессимптомные заболевания

Манифестные инфекции могут протекать типично, атипично или хронически.

Бессимптомные инфекции. В подавляющем большинстве случаев патогенные микроорганизмы попадают в неблагоприятные условия различных областей организма, где погибают либо подвергаются действию защитных механизмов или элиминируются чисто механически. В некоторых случаях возбудитель задерживается в организме, но подвергается такому «сдерживающему» давлению, что не проявляет патогенных свойств и не вызывает развития клинических проявлений (абортивные, скрытые, «дремлющие» инфекции).

Эпидемиология инфекционного процесса

Изучением условий возникновения инфекционных болезней и механизмов передачи их возбудителей, а также разработкой мероприятий по их предупреждению занимается отдельная медицинская наука - эпидемиология. Практически любой эпидемический процесс включает три взаимосвязанных компонента:

Отсутствие одного из компонентов прерывает течение эпидемического процесса.

Источники инфекции

Различные одушевлённые и неодушевлённые объекты внешней среды, содержащие и сохраняющие патогенные микроорганизмы, обозначают термином резервуары инфекции, но их роль в заболеваемости человека далеко не одинакова. Для большинства инфекций человека основной резервуар и источник - больной человек, в том числе лица, находящиеся в инкубационном периоде (ранние носители) и на этапах реконвалесценции, либо бессимптомные (контактные) микробоносители. В соответствии с источником инфекции выделяют следующие типы инфекционных болезней.

Антропонозы. Инфекции, при которых источником инфекции является только человек, известны как антропонозы [от греч. anthropos, человек, + nosos, болезнь].

Зоонозы. Инфекции, при которых источниками инфекции являются животные, но ими могут болеть и люди, известны как зоонозы [от греч. zoon, животное, + nosos, болезнь].

Зооантропонозы. Инфекции, поражающие животных и способные передаваться человеку, известны как зооантропонозы [от греч. zoon, животное, + anthrоpоs, человек, + nosos, болезнь], например сибирская язва, бруцеллёз.

Сапронозы. Инфекции, развивающиеся после проникновения свободноживущих бактерий или грибов в организм человека с объектов окружающей среды и поверхности тела (например, при попадании в рану) известны как сапронозы [от греч. sapros, гнилой, + nosos, болезнь].

Механизмы, факторы и пути передачи

Механизмы передачи определяют способы перемещения инфекционного агента из заражённого организма в восприимчивый организм. Для этого возбудитель должен быть выведен из заражённого организма, некоторое время пребывать во внешней среде и внедриться в восприимчивый организм. Выделяют фекально-оральный, аэрогенный (респираторный), кровяной (трансмиссивный) и контактный механизмы передачи. Указанные механизмы передачи характерны для подавляющего большинства инфекций человека; с позиций эпидемиологии пути их распространения рассматриваются как горизонтальная передача возбудителя. Существует также группа заболеваний (обычно вирусных), возбудители которых способны трансплацентарно переходить от матери к плоду (вертикальная передача).

Факторы и пути передачи. Факторы передачи - элементы внешней среды, обеспечивающие передачу возбудителей инфекционных болезней. Ими могут быть вода, различные пищевые продукты, воздух, почва, членистоногие переносчики, бытовые предметы и т.д. Пути передачи определяют конкретные факторы передачи или их сочетание, обеспечивающие перенос инфекционного агента от больного человека или носителя здоровому. Обычно механизмы передачи инфекционного агента имеют несколько путей.

Специфичность пути передачи. Для большинства патогенных микроорганизмов путь передачи от больного лица здоровому специфичен, и нарушение эпидемического цикла может либо прервать его (например, попадание шигелл в дыхательный тракт), либо усугубить тяжесть заболевания (например, попадание возбудителя сифилиса в кровоток через загрязнённую инъекционную иглу). С другой стороны, проникновение патогенного микроорганизма в области, резистентные к его инвазивным потенциям, обычно не вызывает заболевания (например, большинство возбудителей респираторных инфекций, попав в ЖКТ, погибает под действием желудочного сока и пищеварительных ферментов).

Классификация инфекционных болезней

В соответствии с механизмами передачи возбудителя принята классификация инфекционных болезней, которую разработал Л.В. Громашёвский.

I группа - болезни с фекально-оральным механизмом передачи (например, кишечные инфекции);

II группа - болезни с аэрогенным механизмом передачи (например, грипп или корь);

III группа - болезни с трансмиссивным механизмом передачи (например, малярия, клещевой энцефалит);

IV группа - болезни с контактным механизмом передачи (например, венерические болезни).

Восприимчивость популяции

Известно, что при наличии в популяции 95% невосприимчивых лиц циркуляция возбудителя прекращается, а сама популяция расценивается как «эпидемически благополучная». Для предупреждения развития инфекционных заболеваний широко применяют комплекс мероприятий, направленных на различные звенья инфекционного процесса.

Мероприятия I группы направлены на выявление, изоляцию и лечение (санацию) больного или бактерионосителя. Их часто дополняют карантинными мероприятиями.

Мероприятия II группы представлены комплексом санитарно-гигиенических мер, направленных на разрыв механизмов и путей передачи возбудителя. Мероприятия состоят из обеспечения и соблюдения гигиенических нормативов, разукрупнения организованных континген-тов, санитарного контроля за пищевыми продуктами и предприятиями, их производящими, соблюдения правил асептики и антисептики в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ), проведения дезинфекций и дезинсекций и т.д.

Мероприятия III группы направлены на увеличение «иммунной прослойки» популяции. Наиболее эффективный метод - широкомасштабная активная иммунопрофилактика (вакцинация) различных инфекционных болезней.

В соответствии с эффективностью проводимых мероприятий по предупреждению инфекционных заболеваний выделяют управляемые инфекции (для их предупреждения эффективно используют различные вышеуказанные мероприятия) и неуправляемые инфекции (меры предупреждения отсутствуют).

Интенсивность эпидемического процесса

Интенсивность эпидемического процесса обусловливает множество факторов, основными из которых выступают свойства и распространённость возбудителя, характер иммунной «прослойки» в популяции, а также и географическое положение конкретных территорий. По интенсивности эпидемических процессов выделяют спорадическую заболеваемость, эпидемии и пандемии. Спорадическая заболеваемость [от греч. sporadikos, рассеянный] - обычный уровень заболеваемости конкретной инфекцией в отдельном регионе за определённый период (обычно за год). Как правило, количество больных не превышает десяти случаев на 100 000 населения. Эпидемия [от греч. epi-, над, + demos, народ]. В некоторых случаях обычный уровень заболеваемости конкретной инфекцией за определённый период резко превышает уровень спорадической заболеваемости. В таких случаях происходит эпидемическая вспышка, а при вовлечении в процесс нескольких регионов - эпидемия. Пандемия. В редких ситуациях уровень заболеваемости конкретной инфекцией за определённый период резко превышает уровень эпидемий. При этом заболеваемость не ограничивается пределами конкретной страны или материка, болезнь практически охватывает всю планету. К счастью, подобные «сверхэпидемии», или пандемии [от греч. pan-, всеобщий, + demos, народ], вызывает очень ограниченный спектр возбудителей (например, вирус гриппа). В соответствии с распространённостью инфекционные заболевания также выделяют повсеместные (убиквитарные) и эндемичные инфекции, выявляемые на определённых, нередко небольших территориях. По частоте случаев различают:

Возбудители убиквитарных инфекций распространены повсеместно. Эндемичные возбудители вызывают эндемии [от греч. en-, в, + -demos, народ]. Как критерий эпидемического процесса эндемия не отражает его интенсивность, но указывает на заболеваемость в определённом регионе. Выделяют истинные и статистические эндемии.

Природно-очаговые инфекции. Учение о природной очаговости инфекционных болезней, ставшее неотъемлемой частью медицинской микробиологии, создал выдающийся отечественный паразитолог Е.Н Павловский.

Природно-очаговые инфекции - особая группа болезней, имеющих эволюционно возникшие очаги в природе. Природный очаг - биотоп на территории конкретного географического ландшафта, заселённый животными, видовые или межвидовые различия которых обеспечивают циркуляцию возбудителя за счёт его передачи от одного животного другому, обычно через кровососущих членистоногих-переносчиков. Природно-очаго-вые инфекции разделяют на эндемичные зоонозы, ареал которых связан с ареалом животных - хозяев и переносчиков (например, клещевой энцефалит), и эндемичные метаксенозы, связанные с ареалом животных, прохождение через организм которых является важным условием распространения болезни (например, жёлтая лихорадка). При появлении в определённое время в очаге человека переносчики могут заразить его природно-очаговой болезнью. Так зоонозные инфекции становится антропозоонозными.

Конвенционные и особо опасные инфекции

Для предупреждения возникновения инфекционных болезней, представляющих особую опасность для здоровья населения и склонных к быстрому распространению, разработаны международные правила (конвенции) по получению информации об их появлении и мерам профилактики. В случае их возникновения страны обязаны ставить в известность ВОЗ и регулярно сообщать о проводимых противоэпидемических мероприятиях. ВОЗ обрабатывает и рассылает информацию во все страны мира. Рассмотрев полученную информацию, представители стран принимают решение о проведении различных карантинных мероприятий и информируют об этом ВОЗ. В настоящее время группа конвенционных, или карантинных, инфекций включает чуму, жёлтую лихорадку и холеру. Отдельную группу составляют особо опасные инфекции - острые инфекционные болезни человека, способные к внезапному появлению, быстрому распространению и характеризующиеся тяжёлым течением и высокой летальностью. К ним относят как конвенционные инфекции, так и сибирскую язву, туляремию, полиомиелит, геморрагические лихорадки Лас-са, Эбола и Марбург, сыпной и возвратный тифы, бруцеллёз, малярию, многие арбовирусные инфекции и др. Наиболее эффективный метод их предупреждения- глобальный международный контроль над их распространением. В Российской Федерации действуют правила, направленные на предупреждение заноса возбудителей из-за рубежа и их распространения по территории страны, локализацию и ликвидацию очагов особо опасных инфекций.

Краткая историческая справка

Эвристический период

Проблема лечения инфекционных заболеваний имеет такую же долгую историю, как и изучение самих болезней. С точки зрения современного человека, первые попытки в этом направлении были наивны и примитивны, хотя некоторые из них и не были лишены здравого смысла (например, прижигание ран или изоляция больных). Опыт, накопленный тяжёлым путём проб и ошибок, вооружил знахарей знаниями целебных свойств вытяжек из трав и тканей животных, а также различных минералов. Изготовление настоев и отваров из растительного сырья было широко распространено в античном мире, их пропагандировал Клавдий Галён (отсюда и термины «галеновы», «галеники»). В средневековье репутацию препаратов из лекарственного сырья значительно «подмочили» всевозможные зелья, «изыскания» алхимиков и, конечно, убеждённость в неизлечимости «кар Господних». В этой связи следует упомянуть верование в целительное действие рук «помазанников Божьих», через прикосновение царствующей особы (touche royal) проходили толпы больных. Например, Людовик XIV возложил руки на 10 000 больных, а Карл II Стюарт - на 90 000. По мере понимания врачами правильности концепции contagium vivum лечение болезней принимало всё более «этиотропный» характер. Основателем химиотерапии с полным правом должен считаться Парацёльс, названный А.И. Гёрценым «первым профессором химии от сотворения мира». Парацёльс не без успеха применял для лечения инфекций человека и животных различные неорганические вещества (например, соли ртути и мышьяка). После открытия Нового Света стало известно о свойствах коры дерева «кина-кина», использовавшейся индейцами для лечения малярии. Популярности этого средства способствовало чудесное излечение жены вице-короля Америки, графини Цинхон, и в Европу кора прибыла уже под названием «порошок графини» (polvo de la condesa), а позднее её имя присвоили и самому хинному дереву (Cinchona). Такую же славу снискало и другое заокеанское средство - ипекакуана, применявшееся индейцами для лечения «кровавых» поносов.

Становление химиотерапии

Честь разработки адекватных подходов к лечению инфекционных болезней принадлежит нашему соотечественнику: Дмитрий Леонидович Романовский в 1890 г. указал, что «истинная специфичность действия на самую сущность болезни, на производящего её паразита» заключается «в разрушительном действии на паразита» и для каждой инфекции должно быть найдено «вещество, которое при введении в заболевший организм окажет наименьший вред последнему и вызовет наибольшее деструктивное действие в патогенном агенте». История современных антимикробных средств началась с открытия Паулем Эрлихом способности анилиновых красителей убивать трипаносомы.

Красители. Пауль Эрлих и его сотрудник Киёси Шйга испытали более 500 красителей (от бриллиантового зелёного до генци-анового фиолетового) и обнаружили один, способный защищать от гибели мышей, заражённых трипаносомами. Авторы так его и назвали - трипановый красный, но вскоре оказалось, что препарат не действует на микроорганизмы, укрывшиеся в тканях. Дальнейшие их поиски выявили трипановый синий и другие красители, обладавшие бактерицидным эффектом in vitro, но не in vivo.

Производные мышьяка. Неудача с красителями не остановила Эрлиха, им овладела другая идея - излечивать сифилис. К этому времени медицина обогатилась новым противотрипано-сомозным средством атоксилом (органическое производное мышьяка). Атоксил с успехом применил Роберт Кох для лечения сонной болезни, но через несколько месяцев выяснилось страшное побочное действие препарата - дегенерация зрительного нерва. Эрлиха это не смутило, так как атоксил эффективно применяли для лечения малокровия у кур, возбудитель которого был поразительно похож на возбудителя сифилиса. Под своим любимым девизом «не спеша и без устали» (ohne Hast, ohne Rast) Эрлих с легендарным упорством испытывал всё новые и новые производные атоксила. Успех ждал исследователя на 606-м соединении. Он назвал его сальварсаном (спасающим), и, действительно, препарат спас жизни тысячам больным различными спирохетозами (сифилис, фрамбезия и др.). Теория волшебной пули. Основываясь на собственных результатах изучения АТ, «повреждающих» микробы и их токсины, но не собственные клетки организма, Эрлих разработал постулат о «волшебной пуле» (die Zauberkugel) - веществе с минимальной органотропностью и максимальной паразитотропностью. Этот постулат стал основным принципом поиска новых химиотерапевтических средств.

Сульфаниламиды

После блестящих открытий Эрлиха все поиски ЛС окутались покровом тайны. Специалисты ведущих фармацевтических фирм исследовали каждое новое соединение, не разглашая полученные результаты. В 1908 г. австрийский химик П. Гельмо получил p-аминобензолсульфамид (сульфаниламид) из каменноугольной смолы. Позднее химик фирмы «Байер» X. Герляйн установил, что присоединение сульфаниламида к кислым красителям улучшает качество окраски, и предложил новый кирпично-красный краситель - хризоидин. Уже в 1913 г. специалисты фирмы «Байер» установили его способность убивать различные бактерии. В 1932 г. фирма «ИГ Фарбениндустрие» запатентовала оранжево-красное вещество с необычным для красителей названием стрептозон. В лабораториях фирмы его детально изучил выдающийся бактериолог Г. Домагк, опубликовавший свои результаты в знаменитой статье «Ein Beitrag zur Chemiotherapie der bacteriellen Infectionen» («Вклад в химиотерапию бактериальных инфекций»), ознаменовавшей рождение нового класса химиотерапевтических агентов. Монопольные права на стрептозон (получивший название «пронтозил» или «красный стрептоцид») позволили «ИГ Фарбениндуст-рие» захватить рынок антимикробных ЛС. Но дельцы от фармацевтики не придали значения откытию П. Гельмб и не запатентовали сульфаниламид, а исследования группы Э. Фурнб из парижского Пастеровского института показали, что действующим началом пронтозила является его бесцветная фракция. Под названием «белый стрептоцид» этот препарат стали широко тиражировать во многих странах.

Антибиотики

При изучении сибирской язвы Пастёр заметил, что заражение животного смесью возбудителя и других бактерий часто мешает развитию заболевания, что позволило ему предположить, что конкуренция между микробами может блокировать патогенные свойства возбудителя. Впервые идею о возможности применения существующего антагонизма между микробами для лечебных целей высказал И.И. Мёчников. Позднее было показано, что такими свойствами обладают не только микробы, но и их стерилизованные продукты. Эти находки положили начало развитию двух направлений в подходе к лечению инфекций: применение стерилизованных микробных культур (чему особый толчок дало открытие и применение туберкулина Кбха) и особых ингибирующих агентов, продуцируемых микробами. В последующем было установлено, что отдельные почвенные спорообразующие бактерии выделяют вещества, убивающие бактерии других видов. В 70-х годах XIX в. русские врачи В.А. Маннасёин и А.Г. Полотёбнов установили бактерицидные свойства плесневых грибов (Penicillium glaucum) и эффективность экстрактов их культур при лечении инфицированных язв и ран. Для этого направления ведущее значение имело открытие А. Флёмингом пенициллинов (1928). Следствием этой знаменитой «случайности» (в открытую чашку Пётри со стафилококками нечаянно попала плесень P. notatum, образовавшая зону задержки роста) явилось получение чистого пенициллина (X. Флбри и Э. Чейн, 1940) и начало новой эры в химиотерапии. Первый отечественный пенициллин (крустозйн) был получен З.В. Ермбльевой из P. crustosum в 1942 г. Безусловно, без предшествующих многолетних исследований, в том числе и отечественных учёных, эта «случайность» вряд ли была столь плодотворной. Более того, в 1985 г. в архивах Лионского университета была найдена диссертация рано скончавшегося студента-медика (Эрнест Августин Дюшенё), за сорок лет до Флеминга подробно характеризующая открытый им препарат из плесени P. notatum, активный против многих патогенных бактерий.

Основные принципы химиотерапии инфекционных болезней

С общих позиций основу действия любого антимикробного вещества составляет принцип физиологической имитации, согласно которому действие любого препарата на патоген обусловлено соответствием конфигурации молекул этого вещества или его частей с конфигурацией молекул соединений, участвующих в физиологической регуляции процессов, специфичных для возбудителя. В настоящее время известны несколько десятков тысяч агентов, подавляющих жизнедеятельность возбудителей инфекционных заболеваний, но фармакологические свойства лишь нескольких сотен соединений позволяют применять их в качестве ЛС. Эффективность любого препарата опосредует сумма слагаемых, обеспечивающих его терапевтическое действие: сохранение стабильности структуры при введении в организм либо образование активного метаболита, скорость абсорбции и элиминации, способность к проникновению в ткани и биологические жидкости, избирательность действия, чувствительность микроорганизмов.

Критерии эффективности

При оценке эффективности антимикробных препаратов к основным критериям относят терапевтический индекс, достижимую концентрацию в сыворотке крови, спектр активности. Терапевтический индекс - частное от деления минимальной токсической дозы соединения на минимальную дозу, проявляющую антимикробную активность. Более высокие значения терапевтического индекса соответствуют большей эффективности препарата.

Достижимая концентрация в сыворотке крови зависит от массы тела пациента, дозы препарата, пути и схемы введения, а также скорости его выведения из организма. В настоящее время этот критерий не считают абсолютным, так как содержание ряда препаратов в тканях может намного превышать их концентрацию в сыворотке крови.

Спектр активности антимикробных средств

Антимикробные агенты действуют только на вегетирую-щие клетки, но не на споры или цисты. Для реализации своей биологической активности антимикробное средство должно:

Выбор препарата для химиотерапии определяет спектр его активности и чувствительность к нему микроорганизмов. Препараты со специфической активностью включают антибактериальные, противогрибковые, антипротозойные и противовирусные препараты. Препараты узкого спектра активны в отношении небольших групп микроорганизмов. Препараты широкого спектра активны в отношении больших групп микроорганизмов.

Эффекты антимикробных препаратов

Антибактериальные, противогрибковые и антипротозойные препараты тормозят рост либо вызывают гибель микроорганизмов. Противовирусные препараты ингибируют репликацию вирусов, блокируя их адсорбцию на чувствительных клетках, высвобождение вирусного генома либо подавляя вирусоспецифические синтезы. Активность химиотерапевтических препаратов выражают в единицах действия (ЕД) или в микрограммах (мкг).

Антибактериальные препараты

К антибактериальным химиотерапевтическим средствам относят антибиотики, сульфаниламидные препараты, синтетические антибактериальные средства различного химического строения, противосифилитические и противотуберкулёзные средства. Структуры бактериальной клетки, служащие мишенями для основных антибактериальных химиотерапевтических препаратов, представлены на рис. 9-1.

АНТИБИОТИКИ

В главе 6 было указано, что, различные организмы, реализуя антагонистические взаимодействия в биоценозах, выделяют БАВ (антибиотики, бактериоцины) подавляющие жизнедеятельность своих конкурентов. Антибиотики [от греч. anti-, против, + biosis, жизнь] - химические вещества биологического происхождения, избирательно тормозящие рост и размножение или убивающие микроорганизмы.

Классификация

Антибиотики классифицируют и характеризуют по их происхождению, химической структуре, механизму действия, спектру активности, частоте развития лекарственной устойчивости и т.д. Тип продуцента. В соответствии с типом продуцента выделяют антибиотики, синтезируемые грибами (например, бензилпенициллин, гризеофульвин, цефалоспорины), актиномицетами (например, стрептомицин, эритромицин) и бактериями (например, полимиксины). Способы получения антибиотиков:

Механизм действия. Антибиотики подавляют различные процессы: синтез компонентов клеточной стенки, функции ЦПМ, синтез белка, транскрипцию и синтез нуклеиновых кислот микроорганизмов.

Ингибиторы синтеза компонентов клеточной стенки

Препараты этой группы проявляют наиболее избирательное действие, так как все они так или иначе влияют на синтез пепти-догликана клеточной стенки бактерий, отсутствующего в клеточных мембранах эукариотических клеток. Наибольшее распространение получили р-лактамные антибиотики, бацитрацины, ванкомицин и циклосерин.

Р-Лактамные антибиотики

К р-лактамным антибиотикам относят пенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы. Все р-лактамные антибиотики обладают сходной структурой (содержат р-лактамное кольцо) и механизмами антимикробного действия (рис. 9-2). Они тормозят синтез пептидогликана, селективно угнетая активность ферментов, участвующих в терминальной перекрёстной сшивке линейных молекул гликопептидов. Основным ферментом среди них является транспептидаза, опосредующая соединение аланина и глицина на терминальных участках пептидной цепи (подробнее см. рис. 4-3 и поясняющий текст в главе 4). Молекулы пенициллинов структурно гомологичны D-аланин-Э-аланину, что даёт им возможность блокировать активные центры фермента и ингибировать синтез пептидогликанов. Мишенями для действия антибиотиков служат также ингибиторы аутолитических ферментов, ответственных за удаление деградирующих компонентов клеточной стенки и разъединение дочерних клеток. Активация ферментов приводит к быстрому лизису бактерий в результате нарушения целостности их клеточной стенки. Различие в чувствительности грамположительных и грамотрицательных бактерий к р-лактамам зависит от структурных отличий их клеточных стенок (количество пептидогликана, наличие липидов, природа перекрёстных сшивок, активность аутолитических ферментов). Все $-лактамные антибиотики оказывают бактерицидное действие. Пенициллины

Структурной основой пенициллинов служит 6-аминопенициллановая кислота. При расщеплении р-лактамного кольца бактериальными р-лактамазами образуется неактивная пенициллановая кислота, не обладающая антибактериальными свойствами (см. рис. 9-11). Различия в биологических свойствах пенициллинов определяют радикалы у аминогруппы 6-аминопенициллановой кислоты.

Основная мишень пенициллинов - пенициллин-связывающие белки, а также ингибиторы аутолитических ферментов. В настоящее время применяют биосинтетические (продуцируемые грибами рода Penicillium) и полусинтетические, а также потенцированные пенициллины. Пенициллины легко проникают в различные ткани и органы. Неустойчивость при кислых значениях среды делает невозможным (за небольшим исключением) назначение пенициллинов для приёма внутрь. Пенициллины обладают самой низкой токсичностью в ряду антибиотиков. Биосинтетические пенициллины (бензилпенициллин, феноксиметилпенициллин) оказывают действие на грамположительные и ограниченное число грамотрицательных микроорганизмов. Препараты не проникают в большинство грамотрицательных бактерий и инактивируются бактериальными р-лактамазами (пенициллиназами). Полусинтетические пенициллины получают присоединением к аминогруппе 6-аминопенициллановой кислоты различных радикалов. Препараты I поколения отличает узкий спектр действия, направленный преимущественно в отношении грамположительных микроорганизмов, включая штаммы-продуценты р-лактамаз (оксациллин, клоксациллин, флуклоксациллин и др.). Препараты II и III поколений отличает широкий спектр действия, но они инактивируются $-лактамазами. Аминопенициллины (ампициллин, амоксициллин и др.) активны в отношении грамположительных кокков и ряда аэробных и факультативно анаэробных грамот-рицательных бактерий; карбокси-, уреидо- и ацилпенициллины (азлоциллин, пиперациллин и др.) активны в отношении грамположительных и грамотрицательных аэробных и анаэробных бактерий (особенно видов Pseudomonas и Proteus). Потенцированные пенициллины разработаны в связи с увеличением числа бактерий, продуцирующих р-лактамазы, и возрастанием их роли в патологии человека. Эти препараты содержат дополнительное р-лактамное кольцо, связывающее р-лактамазы, что защищает молекулу антибиотика от инактивации этими ферментами. Наибольшее распространение нашли клаву-лановая кислота и сульбактам.

Клавулановая кислота расширяет антибактериальный спектр р-лактамных антибиотиков путём необратимого связывания и ингибирования многих бактериальных р-лактамаз.

Сульбактам - сульфон пенициллановой кислоты с ограниченной антибактериальной активностью. Комбинация ампициллина и сульбактама эффективна при лечении желудочно-кишечных и гинекологических инфекций.

Цефалоспорины

р-Лактамное кольцо цефалоспоринов более устойчиво (по сравнению с пенициллинами) к действию р-лактамаз и других бактериальных ферментов. Природные цефалоспорины легко модифицируются, известно множество полусинтетических препаратов. В соответствии с последовательностью внедрения в медицинскую практику различают цефалоспорины разных поколений: I поколение (цефазолин, цефадроксил, цефалексин и др.); II поколение (цефуроксим, цефа-мандол и др.); III поколение (цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефоперазон и др.); IV поколение (цефепим, цефпиром). Цефалоспорины активны против многих грамположительных и грамотрицательных бактерий и препараты каждого последующего поколения обычно имеют более широкий спектр действия.

Цефазолин, цефадроксил активны против грамположительной микрофлоры, в том числе против продуцентов р-лактамаз; к ним могут быть резистентны энтерококки.

Цефуроксим, цефамандол активны в отношении тех же микроорганизмов, что и препараты первого поколения, а также эффективно подавляют энтеробактерии, гемофилов и нейссерии.

Цефтазидим, цефоперазон активны также против синегнойной палочки и других неферментиру-ющих бактерий.

Цефокситин, цефотетан также эффективны при инфекциях, вызванных бактероидами; цефотетан проявляет пролонгированный эффект. Монобактамы и карбапенемы

Монобактамы (например, азтреонам) устойчивы к р-лактамазам и активны в отношении узкого спектра аэробных грамотрицательных бактерий (виды Pseudomonas и Serratia), проявляющих множественную антибиотикорезистентность.

Карбапенемы (например, имипенем) имеют самый широкий спектр действия среди всех антибиотиков, содержащих р-лактамное кольцо. В частности, к карбапенемам чувствительны гонококки и штаммы H. influenzae, резистентные к пенициллину и ампициллину. Из устойчивых к эффекту имипенема бактерий отметим листерии, пастереллы (Pasteurella multocida), псевдомонады и стрептококки группы D.

Бацитрацины

Бацитрацины - пептидные антибиотики, продуцируемые перед спорообразованием Bacillus subtilis и B. licheniformis; угнетают построение клеточной стенки, нарушая полимеризацию пептидогликанов. Бактерицидный эффект бацитрацинов направлен против грамположительной микрофлоры; грамотрицательные бактерии, исключая нейссерии, обычно резистентны.

Ванкомицин

Ванкомицин - гликопептид, продуцируемый различными видами Streptomyces (обычно S. orientalis). Блокирует синтез пептидогликанов клеточной стенки (связывается с D-аланил-D-аланином). Эффективен в отношении многих грамположительных бактерий. Вместе с ристомицином, клиндамицином и линкомицином составляют группу антистафилококковых антибиотиков.

Циклосерин

Продуценты циклосерина - различные виды Streptomyces. Препарат нарушает включение D-аланина в пептидогликан клеточной стенки бактерий. Оказывает бактериостатическое действие на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, тормозит рост M. tuberculosis (действует на штаммы, резистентные к стрептомицину, фтивазиду и тубазиду).

Ингибиторы функций цитоплазматической мембраны

ЦПМ служит селективно проницаемым барьером, нарушение её функций приводит к выходу из клетки белков, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, ионов с последующей её гибелью. К препаратам этой группы относят полимиксины, полиеновые антибиотики и грамицидины.

Полимиксины

Полимиксины - комплекс полипептидов, синтезируемых Bacillus polymyxa и некоторыми другими бактериями. Полимиксины нарушают осмотическую резистентность ЦПМ. Подобно катионным детергентам, полимиксины действуют на мембраны клеток бактерий, богатые фосфатидилэта-ноламином. Спектр их бактерицидного эффекта включает грамотрицательную микрофлору (эшери-хии, шигеллы, протей, клебсиеллы, псевдомонады и др.). Препараты токсичны, в медицинской практике применяют лишь полимиксины В и Е (колистин) местно.

Полиеновые антибиотики

Полиеновые антибиотики (нистатин, леворин и амфотерицин В) продуцируют виды Streptomyces (рис. 9-3). Эти антибиотики применяют как противогрибковые препараты, так как они связывают эрго-стерол ЦПМ клетки гриба, что приводит к потере клеткой низкомолекулярных соединений. Амфотерицин В иногда назначают также при первичном амёбном менин-гоэнцефалите, поражениях ЦНС, вызванных акантоамё-бами, и при лейшманиозах.

Грамицидины

Грамицидины - полипептидные антибиотики, продуцируемые Bacillus brevis. Они нарушают целостность ЦПМ; грамицидины ограниченно применяют как бактериостатические средства при инфекциях, вызванных грамположительными кокками и бациллами.

Ингибиторы синтеза белка

Ингибиторы синтеза белка - многочисленная и разнообразная по химической структуре группа антибиотиков - нарушают функциональные свойства рибосом. Бактерии имеют 70 S рибосомы, а клетки млекопитающих - 80 S рибосомы. Субъединицы этих типов рибосом и их функциональная специфичность весьма различны, что и объясняет подавление синтеза белка антибиотиками на бактериальных рибосомах без выраженного влияния на рибосомы млекопитающих. К этой группе отнесены аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфеникол, макролиды, азалиды, линкозамиды.

Аминогликозиды

История аминогликозидов ведёт своё начало от открытия стрептомицина (Ваксман, 1944), послужившего отправной точкой для широкого изучения антимикробных продуктов стреп-томицетов. В настоящее время известно более 50 препаратов, подразделяемых на поколения. Препараты I поколения - стрептомицин, канамицин и др.; II поколения - гентамицин, сизомицин, тобрамицин; III поколения - амикацин и др. Аминогликозиды показаны при резистентности микроорганизмов к другим препаратам или при необходимости быстрого достижения бактерицидного эффекта. Препараты этой группы проявляют синергизм с другими антибиотиками, в первую очередь с р-лактамными, и этот эффект часто используют при терапии инфекций, вызванных бактериями с множественной антибиотикорезистентностью (например, сочетание гентамицина с ампициллином).

Эффекты. Аминогликозиды реагируют с 30 S субъединицей 70 S рибосомы бактерий, образуя необратимый комплекс с одним из рибосомальных белков. В результате блокируются функции рибосом. Известно три варианта эффекта аминогликозидов на трансляцию: блокада образования пептидных связей; ингибирование взаимодействия тРНК с комплексом «мРНК-рибосома»; искажение кода мРНК (сборка дефектных полипептидов).

Спектр активности включает многие грамположительные и грамотрицательные бактерии; к аминогликозидам малочувствительны некоторые стрептококки (пиогенный и зеленящий) и пневмококки, абсолютно резистентны энтерококки, провиденции, бактероиды и прочие анаэробы. Ряд аминогликозидов (стрептомицин, канамицин) подавляют рост туберкулёзной палочки, а также простейших - амёб, лейшманий, токсоплазм (мономицин, канамицин).

Тетрациклины

Тетрациклины - бактериостатические антибиотики широкого спектра действия, продуцируемые видами Streptomyces, взаимодействуют с 30 S субъединицей рибосомы, блокируя присоединение тРНК к комплексу «рибосома-мРНК» и нарушая включение новых аминокислот в полипептидную цепь. В настоящее время биосинтетические тетрациклины (окситетрациклин, тетрациклин) практически вытеснены полусинтетическими препаратами (доксициклин, миноциклин). Тетрациклины активны в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также микоплазм и внутриклеточных паразитов - риккетсий, легионелл и хламидий; имеют большое значение в качестве средств лечения холеры, бруцеллёза, туляремии и др. При наличии у бактерий специфических R-плазмид тетрациклины или вообще не проникают в бактериальные клетки, или так быстро удаляются из них, что ингибирующие концентрации не создаются.

Хлорамфеникол

Хлорамфеникол (левомицетин, продуцент - Streptomyces venezuelae). Его молекула содержит нитробензен, опосредующий токсичность препарата для клеток бактерий и млекопитающих (рис. 9-4). Хлорамфеникол взаимодействует с 50 S субъединицей рибосомы и ингибирует активность пептидилтрансферазы, ответственной за образование пептидных связей. Антибиотик может быть инактивирован хлорамфениколтрансферазой, синтез фермента контролируют гены некоторых R-плазмид. Препарат действует на многие грамотрицательные и грамположительные бактерии, риккетсии, спирохеты и хламидии и относится к немногим химиотерапевтическим средствам, эффективным в отношении грамотрицательных анаэробов.

Макролиды

Макролиды (рис. 9-5) - продуцируемые видами Streptomyces антибиотики, спектр их действия несколько шире, чем у бензилпенициллина. Известны биосинтетические (эритромицин, олеандомицин и спирамицин) и полусинтетические препараты (рокситромицин, кларитромицин и др.). Препараты активны преимущественно в отношении пенициллин- и тетрациклинрезистентных штаммов бактерий, а также внутриклеточных паразитов - риккетсий, хламидий и др. Проявляют бактериостатический эффект, подавляя активность пептидилтрансфераз. Могут быть неэффективны у бактерий с мутациями в 50 S субъединице рибосомы или содержащих R-плазмиды, способные метилировать 23 S субъединицу рРНК.

Азалиды

Азалиды - антибиотики широкого спектра. Наиболее известен азитромицин, способный депонироваться в фагоцитах и действовать на поглощённые ими бактерии, а также легко проникать в различные клетки организма. Механизмы антимикробной активности аналогичны таковым у макролидов.

Линкозамиды

Линкомицин - антибиотик, вырабатываемый Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis. Спектр активности, характер и механизмы антибактериального действия сходны с таковыми у макроли-дов (однако все штаммы кишечной палочки резистентны к препарату). Для лечения инфекций, вызванных анаэробными бактериями, эффективен синтетический аналог линкомицина клиндамицин (7-хлор-7-дезоксилинкомицин), но его применение сопряжено с риском чрезмерного роста Clostridium difficile, что может привести к появлению диареи и псевдомембранозного колита.

Ингибиторы транскрипции и синтеза нуклеиновых кислот

Среди большого числа антибиотиков, подавляющих транскрипцию, на практике применяют лишь

Анзамицины (рифамицины) - продукты жизнедеятельности Streptomyces mediterranei. Наиболее известен полусинтетический препарат рифампицин (рис. 9-6). Бактерицидная активность рифампици-на опосредована ингибированием ДНК-зависимой РНК-полимеразы, что приводит к торможению синтеза любых видов бактериальной РНК, а также поздних стадий самосборки поксвирусов. Спектр действия: грамположительные и грамотрицательные бактерии, легионеллы, хламидии, бруцеллы и микобактерии. Основное показание к применению - лечение туберкулёза. Препарат назначают также при проказе, легионеллёзах. Устойчивость к рифами-цинам развивается довольно быстро. Последнее, а также эффективность при лечении туберкулёза определяют целесообразность ограничения (по возможности) их широкого применения при немикобактериальных инфекциях.

Сульфаниламиды

Сульфаниламиды - первые антибактериальные средства широкого спектра действия, нашедшие применение в медицине как системные бактериостатики. Сульфаниламиды (рис. 9-7) относят к структурным аналогам p-аминобензойной кислоты - предшественника фолиевой кислоты. Все соединения являются производными сульфаниламида (амида сульфаниловой кислоты), получаемые путём замещения атома водорода в амидной группе. Препараты проявляют бактериостатическое действие, конкурентно угнетая дигидроптероат синтетазу, что препятствует образованию дигидрофолиевой кислоты и соответственно тетрагидрофолиевой кислоты, необходимой для синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований. В результате подавляется рост и размножение микроорганизмов. Спектр активности сульфаниламидов: многие грампо-ложительные бактерии (стрептококки, актиномицеты, нокардии, палочка сибирской язвы), грибы и простейшие. Многие грамотрицательные бактерии резистентны к сульфаниламидам; тем не менее, к их действию чувствительны Haemophilus influenzae, Escherichia coli, виды Shigella, Yersinia enterocolitica, Proteus mirabilis и Chlamydia trachomatis. Клетки человека мало чувствительны к препаратам, так как не способны к синтезу фолиевой кислоты (основные потребности удовлетворяются за счёт поступления её с пищей). Структурно близкие к сульфаниламидам парааминосалициловая кислота (ПАСК) и сульфоны (например, дапсон) проявляют аналогичное действие и эффективны при лечении различных микобактериозов (туберкулёз, лепра).

Антибактериальные препараты различных классов

Из антибактериальных препаратов наибольшее применение нашли хинолоны, диаминопири-мидины, производные нитроимидазола и нитрофурана.

Хинолоны

Хинолоны (налидиксовая кислота, ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин) оказывают бактерицидное действие, так как ингибируют активность ДНК-топоизомеразы (ДНК-гираза), что препятствует спирализации молекулы ДНК и ведёт к невозможности транскрипции. Спектр активности хинолонов в большей степени включает грамотрицательные бактерии, но всё же большинство грамотрицательных анаэробных бактерий (например, бактероиды, фузобактерии) резистентны или умеренно чувствительны к их действию.

Производные нитроимидазола

Производные нитроимидазола (метронидазол) проявляют селективный бактерицидный эффект в отношении грамотрицательных анаэробных бактерий (например, рода Bacteroides и Helicobacter pylori). Антимикробное действие препарата связано с наличием у анаэробных бактерий белков-ферредоксинов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях. Ферредоксины восстанавливают нитрогруппы препарата до нитрозогидроксиламиногрупп, накапливающихся в клетках в концентрациях, в 10-100 раз превышающих таковые во внеклеточной среде. Депонированный метаболит вызывает множественные нарушения структуры ДНК. Токсический эффект не реализуется на клетках теплокровных, так как они не содержат пируват-ферредоксин оксидоредуктазы.

Производные нитрофурана

Производные нитрофурана представлены синтетическими нитрофуранальдегидами, вызывающими выраженный бактерицидный эффект in vitro. Их применяют преимущественно в виде антисептиков местно (например, фурацилин). В качестве химиотерапевтических средств производные нитро-фурана применяют для лечения инфекций ЖКТ и мочевыводящих путей (фуразолидон, фурагин, нитрофурантоин). К ним обычно чувствительны бактерии, устойчивые к антибиотикам и сульфаниламидам. При кишечных инфекциях назначают фуразолидон; препарат можно вводить ректально. Фурадонин и фурагин быстро всасываются из ЖКТ и выделяются в значительных количествах почками, где создаются их высокие бактерицидные и бактериостатические концентрации.

Диаминопиримидины

Диаминопиримидины ингибируют синтез ДНК у бактерий и некоторых грибов, подавляя активность дигидрофолат редуктазы, что ведёт к нарушению образования фолиевой кислоты. Наиболее известный препарат - триметоприм, применяемый обычно в комбинации с сульфаметок-сазолом (ко-тримоксазол), оказывает бактерицидное действие.

Противосифилитические препараты

К основным препаратам для лечения сифилиса относят пенициллины: препараты короткого (например, бензилпенициллина калиевая или натриевая соли) или пролонгированного действия (бициллины). При непереносимости бензилпенициллина применяют тетрациклины, макролиды или азалиды. Помимо антибиотиков, назначают препараты висмута - бийохинбл и бисмовербл. Бактериостатическое действие последних связано с подавлением активности ферментов, содержащих сульфгидрильные группы.

Противотуберкулёзные препараты

В связи с лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis при лечении туберкулёза применяют комбинации антибиотиков (рифампицин, стрептомицин, циклосерин, канамицин, ви-омицин) с синтетическими препаратами различных классов (изониазид, этамбутол, натрия пара-аминосалицилат).

Изониазид структурно близок пиридоксину. Механизм антибактериального эффекта связан со способностью изониазида ингибировать активность ферментов, участвующих в синтезе мико-левых кислот, являющихся основными структурными компонентами клеточной стенки мико-бактерий. Препарат действует и на внутриклеточно расположенные бактерии. При монотерапии к нему быстро развивается резистентность. В ряде случаев она обусловлена утерей гена katG, кодирующего синтез каталазы-пероксидазы.

Этамбутол подавляет синтез РНК и эффективен только в отношении возбудителя туберкулёза.

Натрия пара-аминосалицилат оказывает бактериостатическое действие только на туберкулёзную палочку, что обусловлено конкурентными взаимодействиями с p-аминобензойной кислотой, необходимой для синтеза фолиевой кислоты.

ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Арсенал средств специфической терапии грибковых поражений человека разнообразен и содержит препараты, действующие на различные этапы метаболизма возбудителей. Механизм действия подавляющего большинства противогрибковых средств связан с нарушением синтеза стеролов, входящих в состав клеточной стенки (рис. 9-8). Стеролы также служат мишенями и для таких противогрибковых средств, как рассмотренные выше полиеновые антибиотики.

Азолы

Азолы (имидазолы и триазолы) блокируют активность ферментов, участвующих в 14-деметилировании ланостерола, что ведёт к нарушению синтеза эргостерола. Изменение структуры ЦПМ грибковых клеток приводит к выходу макромолекул и ионов наружу. Чувствительность ферментов млекопитающих к азолам значительно ниже, чем ферментов грибов. Вещества проявляют широкий спектр фунгицидной активности. Наиболее известны клотримазол, миконазол, итраконазол и кетоконазол.

Фторцитозин

Фторцитозин (флуцитозин) - антиметаболит, нуклеотидный аналог, подавляющий синтез нуклеиновых кислот. После проникновения в клетку молекула подвергается дезаминированию и превращается в 5-фторурацил, ингибирующий активность тимидилат синтетазы - фермента синтеза тимидиловой кислоты. Этот фунгистатик применяют при лечении системных дрожжевых микозов, его часто комбинируют с амфотерицином В (особенно при криптококкозе).

Аморолфин

Аморолфин - производное морфолинов, ингибитор синтеза эргостерола, блокирует превращение фекостерина в эпистерин. Назначают при онихомикозах, вызываемых дрожжевыми и плесневыми грибами.

Аллиламины

Аллиламины (нафтифин, тербинафин) оказывают фунгицидное действие вследствие ингиби-рования активности скваленэпоксидазы и нарушения синтеза эргостерола. Тербинафин (ламизил) применяют для лечения дермато- и онихомикозов при возможности и необходимости системного лечения.

Цитоплазматическая мембрана

Гризеофульвин

Гризеофульвин - антибиотик, продуцируемый Penicillium griseofulvum, - проявляет фунгис-татическое действие в отношении грибов родов Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton, не действует на дрожжеподобные грибы и бактерии. Механизм антигрибковой активности обусловлен нарушением организации микротрубочек.

ПРОТИВОПРОТОЗОЙНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Простейшие резистентны к большинству антибактериальных препаратов, но всё же ряд антибиотиков подавляет их жизнедеятельность (например, доксициклин активен в отношении балантидиев и малярийных плазмодиев, клиндамицин и мономицин - малярийных плазмодиев и дизентерийных амёб). В связи с тем, что метаболизм простейших скорее напоминает таковой у животных, это сходство биохимических процессов может привести после приёма противопротозойных препаратов к развитию токсических эффектов у человека. Это обстоятельство значительно уменьшает потенциальное количество мишеней для фармакологического воздействия на простейших и ограничивает арсенал противопротозойных ЛС. Мишенями для ЛС у простейших выступают ферменты, имеющиеся только у них (уникальные ферменты), либо абсолютно незаменимые для их жизнедеятельности (незаменимые ферменты).

Уникальные ферменты простейших

Ферменты этой группы участвуют в синтезе нуклеотидов, энергетическом метаболизме и окислительно-восстановительных реакциях. Препараты, угнетающие уникальные ферменты простейших, нетоксичны для клеток млекопитающих.

Дигидроптероат синтетаза

Споровики (малярийные плазмодии, токсоплазмы и др.) не способны утилизировать экзогенные фолаты и имеют ферменты, катализирующие их синтез. Дигидроптероат синтетаза превращает птеридин и p-аминобензойную кислоту в дигидроптероевую кислоту - предшественник дигидрофолиевой кислоты. Активность фермента подавляет сульфадоксйн, а также конкурентные антагонисты p-аминобензойной кислоты - сульфаниламиды и сульфоны.

Пируват синтетаза

Пируват синтетаза (пируват-ферредоксин оксидоредуктаза). У анаэробных простейших (трихомонады, энтоамёбы) нет митохондрий, но они экспрессируют пируват синтетазу. Фермент катализирует образование ацетил-КоА в ходе электронного транспорта, в том числе перенос электронов от пирувата на нитрогруппы производных нитроимидазола (метронидазол). В результате нитрогруппы восстанавливаются в токсичные нитрозогидроксиламиногруппы. Депонированный метаболит вызывает множественные нарушения структуры ДНК.

Нуклеозид фосфотрансферазы

Многие простейшие не способны синтезировать пуриновые нуклеотиды de novo, но экспрессируют трансферазы, фосфорилирующие пуриновые и пиримидиновые основания.

Трипанотион редуктаза

Природный трипептид глутатион в восстановленной форме действует как донор, а в окисленной - как акцептор водорода. В клетках трипаносом глутатион присутствует в форме трипаноти-она - уникального конъюгата со спермидином. Посредством трипанотион редуктазы трипанотион выполняет важную роль в поддержании в восстановленном состоянии тиолов клеточных мембран.

Нифуртимокс и меларсопрол ингибируют активность этого фермента, что приводит к избыточному накоплению токсических кислородных продуктов в трипаносомах. В результате происходит окисление тиолов и гибель паразитов, так как они не синтезируют каталазы и глутатион пероксидазы.

Незаменимые ферменты простейших

Эти ферменты синтезируются как в клетках простейших, так и в клетках млекопитающих. В отличие от клеток млекопитающих, для простейших эти ферменты абсолютно незаменимы. Кроме того, ферменты, синтезируемые клетками млекопитающих и простейших, отличаются по специфичности к субстратам.

Пуринфосфорибозил трансферазы

У лейшманий и трипаносом ключевым ферментом образования пуринов является гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансфераза. Аллопуринол рибозид - структурный изомер гипоксантина, служит субстратом для фермента паразитов, но не для фермента, синтезируемого клетками млекопитающих. Препарат превращается в риботид и после фосфорилирования встраивается в РНК. Аналогичным образом препарат действует на лямблии, у которых ключевыми ферментами синтеза пуриновых нуклеотидов выступают аденин- и гуанин-фосфорибозил трансферазы.

Орнитин декарбоксилаза

Орнитин декарбоксилаза регулирует синтез полиаминов у трипаносом, плазмодиев и лямблий. Эфлорнитин ингибирует фермент, приводя к дестабилизации молекулы ДНК и нарушениям её репликации.

Гликолитические ферменты

Трипаносомы, циркулирующие в крови, лишены митохондриальных дыхательных ферментов и для восстановления НАД используют глицерол-3-фосфат оксидазу и глицерол-3-фосфат дегидрогеназу. Препарат сурамин блокирует действие обоих ферментов, препятствуя окислению НАДФ, и тем самым нарушает синтез АТФ.

Препараты для лечения и профилактики малярии

Противомалярийные препараты включают производные хинолина (хлорохин, хинин, примахин) и производные пиримидина (хлоридин). Поскольку эти препараты действуют на различные стадии развития малярийного плазмодия, их подразделяют на несколько групп.

Гематошизотропные средства

Наиболее известны 4-замещённые производные аминохинолина хлорохин и гидроксихлорохин, назначаемые при неосложнённом течении малярии. Эти ЛС взаимодействуют с ДНК и блокируют реакции матричного синтеза. Аналогичное действие они оказывают и на клетки млекопитающих, но в простейших накапливаются в значительно больших концентрациях и вызывают их гибель. Действие на малярийные плазмодии реализуется двумя путями: 1) связывание и нарушение выведения токсичного для плазмодиев феррипротопорфирина, образующегося при их паразитировании в эритроцитах; 2) нейтрализация кислых значений рН, что приводит к инактивации лизосомальных ферментов в пищеварительных вакуолях плазмодия.

При осложнённом течении малярии, вызванном хлорохинрезистентными плазмодиями, используют фансидар (сульфадоксин-пириметамин). Сульфадоксин блокирует активность дигидроптероат синтетазы, превращающей птеридин и p-аминобензойную кислоту в дигидроптероевую (предшественник дигидрофолиевой кислоты). Пириметамин ингибирует дигидрофолат редуктазу, препятствуя образованию тетрагидрофолатов из дигидрофолатов, что нарушает образование тимина из урацила. Подобное комплексное воздействие на образование фолатов вызывает нарушение синтеза ДНК. Гематошизотропную активность также проявляют сульфаниламиды, сульфоны и тетрацикли-ны (доксициклин) , применяемые в сочетании с другими противомалярийными препаратами. При эритроцитарной шизогонии также можно применять хинин и артемизин (хингхаосу).

Хинин. Алкалоид коры хинного дерева (Cinchona) для лечения малярии на протяжении многих веков применяли южно-американские индейцы. Механизмы действия аналогичны таковым у 4-замещённых производных аминохинолина. При этом хинин проявляет меньшую активность, но вызывает более быстрый терапевтический эффект.

Артемизин - терпеновый лактон, экстрагируемый из полыни (Artemisia); на протяжении многих веков применялся в Китае для лечения малярии. Молекула препарата содержит эндоперок-сидные мостики, взаимодействующие с Fe² + в инфицированных эритроцитах, что приводит к образованию токсических радикалов, окисляющих тиолы мембранных белков паразита.

Гистошизотропные средства

Жизнедеятельность преэритроцитарных форм подавляет 4-замещённое производное аминохинолина хлоридйн, ингибирующий активность дигидрофолат редуктазы, что нарушает синтез тет-рагидрофолиевой кислоты. Препарат также активен в отношении эритроцитарных шизонтов. Для элиминации гипнозоитов Plasmodium vivax из печени (параэритроцитарная форма) применяют 8-замещённое производное аминохинолина примаквйн (примахин). Примахин нарушает мито-хондриальное окисление, разрушая убихинон, играющий роль переносчика электронов. Под действием препарата в эритроцитах образуются оксиды и пероксиды металлов, оказывающие токсическое действие на паразитов.

Гамонтотропные средства

На половые формы плазмодиев действуют примахин и хлоридин, оказывающие гамонтоцидное и гамонтостатическое действие соответственно. Механизм действия препаратов аналогичен проявляемому ими при подавлении тканевой шизогонии. Повреждение половых форм приводит к нарушению разных стадий спорогонии.

Для личной химиопрофилактики малярии применяют хлоридин, хлорохин, а также прогуанйл (тиазиновый метаболит прогуанила), ингибирующий дигидрофолат редуктазу плазмодиев, что нарушает образование тетрагидрофолиевой кислоты.

Препараты для лечения амебиаза

Амебициды подразделяют (в зависимости от локализации дизентерийных амёб в организме) на несколько групп.

Амебициды, эффективные при любой локализации паразитов

Универсальным средством, эффективным при кишечном и внекишечном амебиазе, считают метронидазол. Механизм его противопаразитарного действия во многом аналогичен таковому при действии на бактерии (см. раздел «Антибактериальные препараты различных классов» главы 9). Кроме того, метронидазол, взаимодействуя с нуклеотидами, подавляет синтез ДНК и РНК. Препарат малоэффективен в отношении амёб, находящихся в просвете кишечника, и не действует на цисты паразитов.

Амебициды прямого действия, эффективные при локализации паразитов в просвете толстой кишки

Наиболее часто применяют 8-замещённое производное оксихинолина хиниофон. Препарат ингибирует синтез ДНК и РНК, подавляя жизнедеятельность вегетативных форм, а также образование цист. Аналогичный механизм действия имеет и близкий по структуре препарат йодохинол.

Амебициды непрямого действия, эффективные при локализации паразитов в просвете и стенке толстой кишки

Амебициды непрямого действия, эффективные при локализации паразитов в просвете и стенке толстой кишки, представлены антибиотиками тетрациклинового ряда. Эти препараты практически не оказывают прямого действия на амёб, а их антипротозойный эффект обусловлен подавлением жизнедеятельности бактерии, поглощающих кислород и обеспечивающих существование дизентерийной амёбы как анаэроба.

Амебициды, действующие на амёб в стенке кишечника и в печени

Препаратом выбора принято считать эметин - алкалоид корня ипекакуаны (Cephaelis ipecacuanha). Активность препарата связана с подавлением синтеза нуклеиновых кислот у паразитов.

Амебициды, действующие на амёб в печени

Для лечения применяют хлорохин, накапливающийся в паренхиме печени в высоких концентрациях. Механизм действия препарата такой же, как при действии на эритроцитарные шизонты малярийного плазмодия.

Трихомониаз, лямблиоз, балантидиаз и токсоплазмоз

Для лечения лямблиоза применяют производные нитроимидазола (метронидазол, тинидазол). Химиотерапию трихомониаза иногда дополняют производными нитрофурана (фуразолидон, фурагин). При лечении балантидиаза применяют антибиотики (тетрациклины) и хиниофон. Для подавления жизнедеятельности Toxoplasma gondii назначают пириметамин, ингибирующий дигидрофолат редуктазу и нарушающий синтез ДНК; также хлоридин и сульфаниламиды. Механизмы прямого и опосредованного действия этих препаратов аналогичны проявляемым в отношении малярийных плазмодиев, дизентерийной амёбы и различных бактерий.

Лейшманиозы

Из средств химиотерапии лейшманиозов препараты выбора - пятивалентные соединения окиси сурьмы (например, солюсурьмин). Эти ЛС трансформируются в трёхвалентные соединения, способные связывать SH-группы белков, что приводит к блокаде ферментов, участвующих в гликолизе и цикле Кребса. Для лечения кожных поражений местно применяют мепракин (акрихин) и метронидазол, а в качестве альтернативы - пентамидин, назначаемый также для лечения пневмоцистозов.

Трипаносомозы

Для лечения африканских трипаносомозов (сонная болезнь) широко применяют меларсопрол - органическое соединение мышьяка, ингибирующее активность глицерол-3-фосфат оксидазы. Препарат проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и эффективен на поздних стадиях заболевания. Реже назначают эфлорнитйн, ингибирующий активность орнитин декарбоксилазы, участвующей в синтезе полиаминов, что ведёт к дестабилизации молекулы ДНК и нарушению репликации. На ранних стадиях африканских трипаносомозов назначают сурамйн. Действие препарата основано на том, что трипаносомы, циркулирующие в крови, лишены митохондриальных дыхательных ферментов и для восстановления НАД используют глицерол-3-фосфат оксидазу и глицерол-3-фосфат дегидрогеназу. Препарат блокирует оба фермента, препятствуя окислению НАДФ и тем самым нарушая синтез АТФ. Сурамин не проникает через ГЭБ и неэффективен на поздних стадиях болезни. Для лечения болезни Чагаса назначают примахин, его механизм действия аналогичен эффекту на возбудитель малярии. Также используют нифуртимокс, вызывающий образование токсических кислородных радикалов, подавляющих жизнедеятельность Trypanosoma cruzi (последняя лишена каталазы и глутатион пероксидазы, инактивирующих кислородные радикалы). К препаратам второго ряда относится пентамидин. Механизм его эффекта на лейшмании аналогичен проявляемому в отношении грибов Pneumocystis carinii.

ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Сложность получения противовирусных средств обусловлена тесной связью этапов репродукции вирусов с метаболическими, энергетическими и ферментативными реакциями заражённой клетки. В результате любой противовирусный препарат практически всегда оказывает токсическое воздействие и на внутриклеточные процессы. Именно поэтому до сих пор не найден «пенициллин» для вирусов. Разработка противовирусных средств требует привлечения достижений в изучении молекулярной биологии вирусов, инфекционной иммунологии и принципов лечения бактериальных инфекций. В этом плане особое внимание привлекают природные соединения (в первую очередь ИФН), индуцирующие антивирусное состояние клетки, и перспективы выделения из клеток макро- и надмолекулярных продуктов, проявляющих антивирусный эффект. По характеру действия и клинической значимости препараты, применяемые для лечения вирусных инфекций, подразделяют на четыре основные группы - этиотропные, иммуномодулирующие (корригирующие дефекты иммунного реагирования, развивающиеся при заболевании), патогенетические (направленные на борьбу с интоксикацией, обезвоживанием, сосудистыми и органными поражениями, аллергическими реакциями, а также на профилактику бактериальных суперинфекций) и симптоматические (купирующие сопутствующую симптоматику, например, кашель, головную боль и др.). В настоящем разделе приведён обзор имеющихся этиотропных средств (блокаторы адсорбции и депротеинизации вирусов, ингибиторы вирусных ДНК-полимеразы и обратной транскриптазы, аналоги нуклеозидов). Большинство этиотропных препаратов имеет узкий спектр активности (в лучшем случае, в пределах одного семейства). Известно лишь несколько препаратов, воздействующих на ранние этапы репродукции, и ни одного ЛС, подавляющего сборку дочерних популяций. Рассматриваемые ниже препараты сгруппированы в порядке расположения мишеней их действия в динамике репликативного цикла вирусов (рис. 9-9).

Ингибиторы адсорбции, проникновения и депротеинизации вирусов

Ig. Первый этап взаимодействия вирусов с чувствительными клетками включает адсорбцию, проникновение в неё (посредством виропексиса и слияния мембран) и высвобождение нуклеокапсида («раздевание»). Вирусспецифические АТ, взаимодействуя с антигенными детерминантами вирусов, тем самым предупреждают распознавание вирусами рецепторов клеточных мембран.

Производные адамантана

Производные адамантана (трициклические симметричные адамантамины). Слияние клеточных мембран с вирусными суперкапсидами происходит при низких значениях рН. Ремантадин и амантадин (рис. 9-10), будучи соединениями основного характера, увеличивают значение рН эндосом, тем самым предупреждая слияние. Другой механизм ингибирова-ния слияния мембран обусловлен способностью ремантадина в низких концентрациях взаимодействовать с белком М2 вирусов гриппа типа А. Белок М2 ответственен за образование в липидной оболочке ионных каналов, предположительно обеспечивающих транспорт протонов внутрь вириона и его раздевание. Дизоксарил взаимодействует с суперкапсидами, препятствуя высвобождению вирусных нукле-капсидов.

Ингибиторы синтеза ранних белков

Основными белками, синтезируемыми на ранних стадии репродукции, выступают РНК-полимеразы и неструктурные белки. Их синтез in vitro ингибируют гуанидин, 2-(оо-гидроксибензил)-бензимидазол и аналогичные соединения. Однако этот эффект практически не воспроизводится in vivo, что связано с быстрым развитием химиорезистентности. Поэтому в арсенале противовирусных средств препараты, эффективно подавляющие синтез ранних белков, отсутствуют.

Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот

Крупным достижением в разработке противовирусных средств оказались ЛС - аналоги нуклеотидов (аномальные нуклеотиды). Эти ЛС действуют как антиметаболиты, что обусловлено их структурным сходством с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Основные механизмы антивирусного действия препаратов связаны с подавлением активности вирусных полимераз. Аналогию с нуклеотидами ЛС приобретают в результате их фосфорилирования клеточными и некоторыми вирусными киназами. В форме нуклеотидных аналогов препараты ингибируют вирусные ДНК-полимеразы и/или выступают субстратами для вирусных ферментов; в результате ЛС встраиваются в вирусные нуклеиновые кислоты, образуя дефектные полинуклеотиды или обрывая их дальнейший рост. Селективный эффект ЛС обеспечивает больший их аффинитет к вирусным полимеразам по сравнению с природными нуклеотидами. Кроме того, вирусные ферменты более лабильны к их действию по сравнению с полимеразами клеток млекопитающих.

Ингибиторы обратной транскриптазы

Ингибиторы обратной транскриптазы избирательно взаимодействуют с ферментом ретровиру-сов, включая ВИЧ.

Зидовудин (азидотимидин). Известно два механизма действия этого ЛС.

Ламивудин, ставудин, залцитабин (применяется при развитии резистентности к азидотимидину), диданозин (проявляет меньшую токсичность) имеют аналогичный зидовудину механизм антивирусного эффекта.

Невирапин - ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы. Препарат связывает гидрофобные фрагменты молекулы фермента (к чему не способны прочие ингибиторы). Штаммы ВИЧ, устойчивые к нуклеозидным ингибиторам, не обладают перекрёстной резистентностью к этому препарату.

Ингибиторы ДНК- полимераз ДНК- содержащих вирусов

Ингибиторы ДНК-полимераз ДНК-содержащих вирусов представлены препаратами, фосфорилируемыми как клеточными киназами, так и вирусными тимидин киназами. Видарабин - аналог пурина с четвертичной структурой, аналогичной дезоксиаденозину. Антивирусный эффект этого ЛС связан с подавлением ДНК-полимеразы интермедиатом видарабина аденинарабинозид-5'-трифосфатом. Видарабин - эффективное средство лечения герпетических энцефалитов, существенно снижающее смертность больных. Галогенизированные производные. Для проявления антивирусного эффекта необходимо их метаболизирование до фосфорилированных нуклеотидов, подавляющих вирусные ДНК-по-лимеразы.

Идоксуридин (5'-йодо-2'-дезоксиуридин, 5'-йододезоксиуридин, IUD) - первый и наиболее эффективный противовирусный препарат данной группы; фосфорилируется как клеточной, так и вирусоспецифической тимидин киназой, то есть его активная форма образуется как в заражённых, так и в интактных клетках. Применяют местно для лечения герпетических кератитов. Побочные эффекты препарата (подавление лейкопоэза) при системном применении ограничили возможность его широкого использования.

Трифторидин (вироптик). Степень селективного воздействия препарата на ДНК-содержащие вирусы (герпеса, оспы, аденовирусы) выше, чем идоксуридина, что обусловлено более высокой (в 15-20 раз) скоростью его фосфорилирования вирусоспецифической тимидин киназой.

Ацикловир - ациклический нуклеозидный аналог гуанозина с высокой избирательностью к инфицированным вирусами клеткам. В клетках происходит последовательное превращение ацикловира в моно-, ди- и трифосфат. Первый этап индуцирует вирусоспецифическая тимидин киназа, экспрессируемая в клетках вскоре после заражения; за реализацию остальных этапов фосфорилирования ответственны клеточные киназы. Образующийся ациклогуанозинтри-фосфат ингибирует ДНК-полимеразу вирусов, тормозя образование полноценной молекулы нуклеиновой кислоты, так как из-за отсутствия гидроксильной группы к ациклогуанозинтри-фосфату не могут присоединяться последующие нуклеотиды. Таким образом, препарат не влияет на синтез ДНК в незаражённых клетках, так как в них он не превращается в активную форму. Препарат эффективен при лечении инфекций, вызванных ВПГ. При инфекциях, вызванных другими герпесвирусами (например, ЦМВ или вирусом Эпстайна-Барр), это препарат назначать нецелесообразно, так как названные возбудители лишены вирусоспецифической тимидинкиназы.

Фамцикловир. Механизм действия фамцикловира аналогичен таковому ацикловира. Фармако-кинетика препарата позволяет применять его с большими интервалами, и он вызывает меньше побочных эффектов.

Ганцикловир - производное ацикловира; активируется под действием киназ млекопитающих и вирусных фосфотрансфераз с образованием трифосфата, ингибирующего преимущественно ДНК-полимеразу ЦМВ.

Фоскарнет. Помимо подавления активности обратной транскриптазы, препарат ингибирует активность всех ДНК-полимераз герпесвирусов и вируса гепатита В. Механизм действия обусловлен связыванием полифосфатных групп ДНК-полимеразы, что препятствует поступлению пирофосфатов из дезоксирибонуклеозидтрифосфата и блокирует элонгацию молекулы ДНК. Аналогичный механизм заложен в ингибирование обратной транскриптазы, но препарат взаимодействует с ферментом через группировки, отличные от участвующих в связывании пиро-фосфатов.

Нуклеотидные аналоги широкого спектра

Препараты этой группы ингибируют активность как РНК-, так и ДНК-полимераз вирусов. Среди большой группы соединений клиническое применение нашёл рибавирин. Этот аналог гуанозина проявляет антивирусную активность in vitro в отношении не менее чем 27 РНК- и 12 ДНК-содержащих вирусов. Основные механизмы антивирусной активности:

Ингибиторы протеаз

Ингибиторы протеаз представлены негидролизующимися синтетическими пептидами (препараты саквинавйр, ритонавйр, индинавйр). Механизм действия связан с конкурентным ингибиро-ванием протеаз ВИЧ, что ведёт к подавлению дезинтеграции молекул полипротеинов. В результате в ВИЧ-инфицированных клетках накапливаются проявляющие цитотоксическое действие нерасщеплённые предшественники gag-полипротеина.

Ингибиторы сборки дочерних популяций

Ингибиторы сборки дочерних популяций представлены производными тиосемикарбазонов. Практическое применение нашёл Г^-метилизатин-р-тиосемикарбазон (метисазон). Антивирусное действие обусловлено подавлением синтеза поздних белков (точнее, синтеза поздних мРНК или поздних полисом), что нарушает сборку дочерних популяций.

Устойчивость микроорганизмов к действию антимикробных средств

Известно два типа устойчивости микроорганизмов к антимикробным средствам - естественная (природная) и приобретённая. Естественная резистентность относится к видовым признакам микроба. Она, в основном связана с отсутствием мишеней на клеточной стенке либо непроницаемостью последней для определённых ЛС.

Химиорезистентность у бактерий

К основным механизмам резистентности к действию антибактериальных средств относят способность к синтезу инактивирующих ферментов и модификация мишеней, с которыми взаимодействует лекарственный препарат. Устойчивость к фармакологическим воздействиям обусловливают естественные (внутренние) и приобретённые факторы.

Устойчивость, не связанная с наследуемыми свойствами

Изменение метаболической активности клеток-мишеней. Большинство антибактериальных средств эффективно подавляет жизнедеятельность лишь активно растущих клеток. Значительная часть возбудителей, пребывая в латентной стадии, способна выживать в тканях в течение многих лет, оставаясь при этом резистентными к действию ЛС (например, микобактерии туберкулёза).

Уменьшение количества мишеней для ЛС. Проводимая химиотерапия способна уменьшать количество мишеней для действия препарата. Например, под действием пенициллинов отдельные бактерии способны трансформироваться в L-формы, лишённые клеточной стенки и поэтому резистентные к действию антибиотиков с подобным механизмом действия.

Устойчивость, обусловленная изменениями генома

Мутации приводят к изменениям структурных белков (например, в структуре 30 S субъединиц рибосом, поринов или пенициллин-связывающих белков клеточной стенки) и ферментов (например, ДНК-зависимых РНК-полимераз или ДНК-гираз). Также возможны мутации в локусе гена, кодирующего чувствительность к ЛС.

Спонтанные мутации, наблюдаемые с частотой от 10^-7 до 10^-12 , играют очень незначительную роль в формировании резистентности.

Селекция штаммов. На фоне применения антибактериального средства часто происходит селекция штаммов, способствующая выживанию и последующему доминированию в популяции бактерий с резистентностью к ЛС. Подобным путём ряд штаммов золотистого стафилококка вырабатывает устойчивость к метициллину. Эти штаммы известны как MRSA [от англ. methicillin resistant S. aureus].

Плазмиды резистентности

Плазмиды резистентности обычно представлены внехромосомными молекулами ДНК. Бактерии, наиболее часто содержащие такие плазмиды, перечислены в табл. 9-1. Плазмиды могут включать один и более генов, кодирующих синтез ферментов, осуществляющих инактивацию или модификацию ЛС, а также опосредующих быструю элиминацию ЛС из клетки. Гены множественной устойчивости могут также кодировать транспозоны, интегрированные в плазмиды. Плазмиды грамотрицательных бактерий, или R-факторы [от англ. resistance, устойчивость] могут придать устойчивость к одному или нескольким ЛС одновременно. Плазмиды способны вызывать состояние эпидемической резистентности передачей соответствующих дочерних популяций плазмид посредством бактериальной конъюгации или трансдукции.

Механизмы формирования лекарственной устойчивости

Защиту бактерий от действия ЛС обеспечивает комплекс факторов, основными из которых считают ферментативную инактивацию препаратов и удаление либо маскировку рецепторов для них. Гены, кодирующие синтез продуктов, обусловливающих лекарственную устойчивость, могут быть хромосомными либо включенными в состав R-плазмид, передаваемых в бактериальной популяции.

Ферментативная инактивация ЛС

Ферментативная инактивация ЛС реализуется внеклеточно и внутриклеточно. Изменения активности ферментов связаны с мутациями генов, кодирующих их структуру, либо с увеличением образования числа копий генов, кодирующих его (амплификация).

р-Лактамазы. Механизм действия обусловлен разрушением р-лактамного кольца в молекулах антибиотиков (рис. 9-11). Стафилококки секретируют ферменты после попадания препарата в окружающую их среду, что приводит к снижению его концентрации. Для них характерна популяционная резистентность - большая доза инфекционного агента вызывает более интенсивное развитие устойчивости. Синтез ферментов кодируют индуцибельные гены, то есть р-лактамазы более интенсивно образуются в присутствии препарата. Более тонкая клеточная стенка грамотрицательных бактерий позволяют антибиотикам проникать внутрь клетки, где они взаимодействуют с р-лактамазами в периплазматическом пространстве. Грамотрицательные бактерии (эшерихии, синегнойная палочка) проявляют более выраженную резистентность (по сравнению с грамположительными бактериями), не зависящую от дозы инфекционного агента. По специфичности действия р-лактамазы, продуцируемые грамотрицательными бактериями, разделяют на несколько групп (взаимодействующие только с пенициллинами, или цефалоспоринами, или и с обеими группами антибиотиков). У грамотрицательных бактерий синтез $-лактамаз происходит перманентно, вне зависимости от наличия ЛС. Ацетилтрансферазы, фосфорилазы и нуклеотидазы стрептококков, стафилококков, энтеробактерий и синегнойной палочки модифицируют аминогликозиды, препятствуя их связыванию с рибосомами (механизм действия хлорамфеникол ацетилтрансферазы, продуцируемой стафилококками и энтеробактериями аналогичен действию ацетилтрансфераз аминогликозидов). Ферменты расположены на поверхности ЦПМ и инактивируют лишь часть препарата, проникшего в клетку, так что концентрация препарата в биологических жидкостях снижается незначительно (не более чем на 0,5%).

Изменения проницаемости клеточной стенки

Способность к проникновению ЛС в бактерию детерминирована самой природой клеточной стенки. Например, большинство антибиотиков легко попадает внутрь грамположительных бактерий, в то время как оболочка грамотрицательных микроорганизмов служит барьером для многих из них, в особенности, если мишени расположены в цитоплазме и препараты проявляют выраженную гидрофильность (тетрациклины, аминогликозиды, макролиды и др.). Порины - образующие каналы в мембране энтеробактерий белки, опосредующие проникновение многих гидрофильных антибиотиков; различные факторы (например, мутации) изменяют структуру канала и тем самым снижают проницаемость клеточной стенки. ЛПС ингибируют проникновение через клеточную стенку гидрофобных (липофильных) антибактериальных агентов. R-формы, лишённые полисахаридной капсулы и содержащие незначительные количества ЛПС, обычно чувствительны к большинству антибиотиков. Изменения электронного транспорта. Проникновение аминогликозидов прямо зависит от переноса электрона к атому кислорода; такие препараты неэффективны против анаэробов и факультативных бактерий, пребывающих в анаэробных условиях (например, при образовании абсцессов). Ферментирующие бактерии (например, стрептококки) также резистентны к их действию.

Прочие факторы

Отмечена способность ряда бактерий отвечать на фармакологическое воздействие повышением синтеза транспортных белков, выводящих препараты (например, тетрациклины) из клетки. Отдельные микроорганизмы (например, Streptococcus pneumoniae) способны трансформировать бактерицидную активность антибиотиков в бактериостатическую, эффект достигается уменьшением проницаемости клеточной стенки и связыванием ЛС аутолитическими ферментами (муреингидролазами).

Химиорезистентность у вирусов

Устойчивость вирусов чаще развивается при многократном применении препаратов и передаётся последующим поколениям. Известно, что практически ко всем, заведомо немногочисленным противовирусным средствам, можно экспериментально получить устойчивые штаммы возбудителей. В основе изменения наследственных свойств вирусов лежат два различных процесса - мутация и селекция; для каждого из них важную роль играет внешняя среда как индуктор мутаций и как селективный фактор. Принимая во внимание тот факт, что спонтанные мутации вирусов позвоночных животных возникают с частотой 10^-5 -10^-6 , появление природных мутантов - достаточно редкое явление, и первоочередная роль в формировании резистентных штаммов принадлежит процессам селекции. Выделяют два основных пути преодоления устойчивости к химиопрепаратам: комбинированное применение препаратов с различными механизмами действия и использование ЛС, воздействующих на ранние этапы репродукции, что резко снижает вероятность проявления резистентности. В клинических условиях зарегистрированы случаи устойчивости к следующим препаратам.

Ацикловир. Выделены устойчивые штаммы герпесвирусов, мало патогенные для лиц с нормальным иммунным статусом, но представляющие серьёзную угрозу для больных с иммунодефицитами, так как такие штаммы способны вызывать диссеминированные поражения, включая поражения ЦНС. Механизм резистентности обусловлен отсутствием или модификациями структуры тимидин киназы; реже устойчивость опосредуют мутации генов, кодирующих структуру ДНК-полимеразу, что делает её невосприимчивой к эффектам прочих ингибиторов фермента.

Ганцикловир. Устойчивость обусловлена снижением уровня фосфорилирования ЛС в заражённых клетках в связи с изменениями структуры вирусной фосфотрансферазы и ДНК-полимеразы.

Зидовудин. Наблюдают почти 100% резистентность штаммов ВИЧ, выделенных от пациентов, получавших препарат более 6 мес, что в некоторой степени парадоксально, так как известны случаи длительного выживания больных со СПИДом, получавших препарат более 15 мес. Устойчивость обусловлена мутациями генов, кодирующих структуру ревертазы, что приводит к снижению аффинитета фермента к ЛС, но не способности транскрибировать РНК вируса.

Невирапин. Устойчивость развивается довольно быстро, иногда через несколько недель после начала химиотерапии; основные механизмы обусловлены точечными мутациями, вызывающими изменения структуры взаимодействующего с ЛС фрагмента молекулы обратной транскриптазы.

Цитозинарабинозид и рибавирин. В отличие от прочих известных противовирусных препаратов, до настоящего времени не выявлены штаммы, резистентные к цитозинарабинозиду и рибавирину.

Методы определения чувствительности к антимикробным агентам

Критериями активности того или иного препарата выступают минимальная ингибирую-щая концентрация (МИК) - наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры и минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект.

Серийные разведения в жидких средах

Метод серийных разведений в жидких средах позволяет установить МИК и МБК препарата для выделенного возбудителя. Исследования можно выполнять в различных объёмах питательной среды (1-10 мл). Используют жидкие питательные среды, соответствующие пищевым потребностям возбудителя. В пробирках (обычно восьми) готовят серию двойных разведений препарата на питательной среде. Концентрацию уменьшают соответственно от 128 до 0,06мкг/мл (базовая концентрация может варьировать в зависимости от активности препарата). Конечный объём среды в каждой пробирке составляет 1 мл. Контролем служит пробирка, содержащая чистую питательную среду. В каждую пробирку вносят по 0,05 мл физиологического раствора, содержащего 10⁶ /мл микробных клеток. Пробирки инкубируют 10-18 ч при 37 °С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока результаты учитывают по изменению оптической плотности среды визуально или нефелометрически (рис. 9-12). Также можно применять модифицированный метод, используя среду, дополненную глюкозой и индикатором. Рост микроорганизмов сопровождается изменением рН среды и, соответственно, окраски индикатора.

Серийные разведения в плотных средах

Метод серийных разведений в плотных средах во многом аналогичен методу разведений в жидких средах, но определение МБК требует более сложных манипуляций. Готовят двойные серийные разведения препарата от 1:10 000 до 1:320 000, затем вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки, содержащие по 4 мл (или 9 мл) охлаждённого до 45 °С агара. Процедуру проводят одной пипеткой с перенесением препарата от меньшей концентрации к большей. Содержимое пробирок можно быстро внести в чашки Петри, либо пробирки «скашивают» до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой стандартизированной тест-культурой (петлёй или специальным дозатором, засевающим чашку 36 видами различных микроорганизмов) и инкубируют 18-20 ч при 37 °С. После инкубации определяют МИК по отсутствию роста на чашках (пробирках), содержащих наименьшие концентрации препарата.

Диффузионные методы

Диффузионные методы менее точны, чем методы разведений, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность к нескольким ЛС одновременно. Поэтому их чаще применяют на практике. Исходный метод. Чашки Петри заполняют питательной средой, соответствующей пищевым потребностям возбудителя, слоем в 4-5 мм. После застывания агар подсушивают в термостате при 37 °С в течение 20 мин. Посев тест-культуры можно осуществлять внесением в полуостывший агар, но чаще микробную взвесь наслаивают на агар. После равномерного распределения по поверхности излишки взвеси удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемых препаратов, после чего инкубируют 18 ч при 37 °С (срок инкубации может варьировать в зависимости от скорости роста микроорганизма). Активность учитывают, измеряя диаметр зоны подавления роста для каждого препарата. Метод дисков. В настоящее время вместо классического (исходного) метода повсеместно применяют модификацию, предложенную Кйрби и Бауэром и признанную стандартным тестом (рис. 9-13). После посева тест-культуры на агар наносят диски из фильтровальной бумаги, пропитанные различными антимикробными препаратами (используют коммерческие образцы, содержащие известные концентрации). После инкубации при 37 °С в течение времени, необходимого для роста выделенного возбудителя, проводят определение диаметра зоны торможения роста. Размеры зон, полученные в опыте, сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкциях, прилагаемых к дискам, после чего выделенные микроорганизмы относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.

Определение способности к образованию р-лактамаз

Среди многочисленных методов наибольшее распространение получил р-лактамазный тест метод с использованием дисков, пропитанных нитроцефином - цефалоспорином, изменяющим окраску диска при гидролизе антибиотика (рис. 9-14). После нанесения на колонию бактерий, продуцирующих р-лактамазы, диска с нитроцефином последний через 10 мин (для стафилококков через 60 мин) изменяет окраску с желтоватой на коричнево-малиновую.

Выявление метициллинрезистентных стафилококков

Определение проводят при помощи полосок фильтровальной бумаги, содержащих 25 мкг метициллина (рис. 9-15). Предварительно производят посев исследуемой культуры и устойчивого эталонного штамма (для контроля качества полосок) параллельными штрихами. При наличии чувствительности к метициллину исследуемые бактерии образуют зоны задержки роста вокруг полоски.

Определение чувствительности к антибиотикам у анаэробных бактерий

Определение чувствительности к антибиотикам у анаэробных бактерий проводят сравнительно редко, например, при изучении нового ЛС, периодическом обследовании микробной флоры в стационарах, иногда индивидуально у некоторых пациентов. Используя соответствующую питательную среду, можно применять практически все изложенные в этой главе методы, исключая метод дисков. Следует помнить, что устойчивость к р-лактамным антибиотикам у грамотрицательных анаэробов in vitro часто обусловлена как способностью образовывать р-лактамазы, так и гидролизом самих препаратов (например, имипенема или цефокситина). Наиболее употребим метод серийных разведений в агаре.

Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам

В настоящее время разработаны компьютеризованные системы, автоматически проводящие выделение бактерий из исследуемых образцов и определяющие их чувствительность к различным ЛС. Их основное достоинство - освобождение персонала бактериологических лабораторий от большого объёма рутинных исследований и чёткая стандартизация полученных результатов. Широкое распространение этих устройств в отечественной практике ограничивает их стоимость. Среди более доступных методов наибольшее распространение нашли система Alamar и Е-тест, совмещающие в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков.

Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений (например, Baxter MicroScan Аи1;о8САК-4) - автоматизированные инкубационные системы со встроенными фотометрами, нефелометрически регистрирующими рост бактерий или его отсутствие через 24 ч после внесения микроорганизмов в лунки микропанелей. Принцип действия основан на учёте разницы оптической плотности среды в лунках, где есть рост бактерий, и в лунках, где его нет. В настоящее время разработаны устройства (например, VITEK), позволяющие получить результаты уже через 4-10 ч.

Система Alamar представляет собой панель с лунками, в каждую помещены диски из фильтровальной бумаги, содержащие различные концентрации антимикробных препаратов и пропитанные индикатором Alamar Blue. После внесения в лунку бактерий диск синеет, а при их дальнейшем росте его окраска меняется на розовую. Порядок размещения дисков в лунках соответствует двойным серийным разведениям препарата. Последняя лунка с синим диском, предшествующая лункам с порозовевшими дисками, соответствует МИК препарата.

Е-тест [от англ. ellipse, эллипс, так как при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы] - модификация метода дисков, но вместо последних используют полоски из фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями препаратов, каждая из этих зон имеет соответствующую маркировку. Полоски помещают на поверхность агара. Если бактерии чувствительны к действию препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, образуется эллипсовидная зона. Её форма обусловлена действием сразу нескольких концентраций препарата. МИК соответствует участок полоски, где её пересекает граница зоны задержки роста (рис. 9-16).

побочные эффекты антибиотикотерапии

Эффективность применения антимикробных препаратов различных классов ограничивают их многочисленные побочные эффекты (токсические и аллергические реакции, дисбактериозы и т.д.).

Токсические реакции

Характер побочных явлений зависит от органотропности препарата, его дозировок и способов введения.

Поражения паренхимы печени наиболее часто вызывают тетрациклины, рифампицин и левомицетин. Неграмотное применение последнего может привести к развитию своеобразного поражения, известного как синдром «серого ребёнка». Препарат метаболизирует в печени, образуя глюкурониды. При врождённой недостаточности глюкуронил трансферазы (например, при синдромах Жильбёра-Майленграхта и Крйглера-Найяра) левомицетин накапливается в крови в токсических концентрациях, развиваются общая слабость, рвота, появляется серый оттенок кожных покровов, боли в сердце, отёки и гепатомегалия, возможен летальный исход.

Поражения почек нередко наблюдают при назначении амфотерицина В, связывающегося с холестерином мембран эпителия почечных канальцев. Нефротоксическое действие могут также оказать линкомицин, аминогликозиды (последние также обладают ототоксичностью вследствие влияния на VIII пару черепных нервов).

Поражения органов кроветворения. Нарушения функций костного мозга (анемии, лейко- и тромбоцитопений, вплоть до апластического криза) относят к наиболее тяжёлым осложнениям антибиотикотерапии. Подобные поражения способен вызывать левомицетин. В ряде случаев проявления апластической анемии возникают даже после однократного приёма препарата.

Дисбактериозы

Дисбактериозы (дисбиозы) обычно развиваются после применения антибиотиков широкого спектра, подавляющих жизнь многих бактерий, в том числе и непатогенных. В результате конкурентный баланс в микробных ценозах резко нарушается, что даёт устойчивым видам возможность колонизировать свободные участки. Этими химиорезистентными бактериями обычно являются условно-патогенные виды. Их чрезмерное размножение может приводить к развитию вторичных эндогенных инфекций. Наиболее часто наблюдают дисбактериозы кишечника, вызванные приёмом тетрациклинов внутрь. Для профилактики этого осложнения следует назначать препараты узкого спектра, контролировать вероятность избыточного роста грибов и широко использовать эубиотики.

Аллергизирующее действие

Применение антибиотиков может вызывать аллергические реакции, их спектр варьирует от различных кожных высыпаний до анафилактического шока. Наиболее выраженным аллергизиру-ющим действием обладают природные антибиотики, особенно пенициллины. В значительной степени это связано с широким распространением грибов-продуцентов в окружающей среде и высокой сенсибилизирующей активностью их продуктов. В подобных ситуациях, применение антибиотиков играет роль введения разрешающей дозы для развития аллергической реакции. Степень её проявления прямо пропорциональна степени сенсибилизации организма.

Иммунодепрессивные эффекты

Многие антибиотики способны снижать функциональную активность защитных факторов организма. Во многом эти свойства обусловлены цитостатическим эффектом препаратов на иммуно-компетентные клетки. Поскольку эукариотические клетки практически лишены специфичных мишеней для ЛС, это действие носит неспецифический характер и направлено на самые различные клеточные популяции. Среди применяемых антибиотиков наиболее выраженным иммунодепрессивным эффектом обладают препараты, способные подавлять функции органов кроветворения, например, левомицетин. Особо следует упомянуть антибиотик циклоспорин, первоначально разработанный как противогрибковое средство, но проявивший выраженное ингибирующее действие на развитие клеточных цитотоксических реакций. Это свойство побудило использовать его при пересадках органов в качестве препарата, подавляющего отторжение трансплантата.

В этой главе рассмотрены основные этапы развития иммунологии, виды и факторы невосприимчивости к возбудителям инфекционных заболеваний, организация и функции иммунной системы и её расстройства, а также иммунодиагностика, иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекционных заболеваний.

ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ИММУНОЛОГИИ

Термин «иммунитет» происходит от латинского «immunitas» - освобождение от податей или повинностей. Эта привилегия была распространена в Древнем Риме и средневековой Европе (сравните с современным термином «депутатский иммунитет»). Лицо, на которое оно распространялось, называлось «immunis» (иммунный). Невозможно установить, кто именно ввёл эти термины в медицину, но они удивительно точно отражают состояние освобождения от «дани», которую человек «платит» патогенным микробам. Иммунология - специальная наука, изучающая проявления иммунитета; сформировалась как отдельное направление науки лишь во второй половине XX в. Гораздо более продолжительна история иммунологии как прикладного раздела инфекционной патологии и микробиологии. Многовековые наблюдения за заразными (то есть инфекционными) болезнями заложили фундамент современной иммунологии. В этом отношении наглядны комментарии Фукидйда в «Истории Пелопонесской войны» (V в. до н.э.): «…​несмотря на широкое распространение в войсках эпидемии чумы, никто не заболевал дважды, по крайней мере смертельно…​ и для захоронения трупов использовали переболевших». И в настоящее время достижения иммунологии находят основное прикладное применение в области лечения и профилактики инфекционных болезней. И по сей день термин «иммунитет» в общеупотребительном смысле связывают с устойчивостью к инфекционным болезням. В контексте накопленных данных подобные представления устарели; более корректен термин «невосприимчивость». История изучения механизмов невосприимчивости, включающая первые «любопытные факты» и глобальные открытия, - одна из ярких страниц медицины.

Эвристический период

Поскольку иммунология долгое время оставалась направлением микробиологии, этапы развития этих наук во многом сходны. В начале было эмпирическое, точнее - эвристическое познание, основанное на постепенном накоплении фактов и выяснении истины. За много веков до нашей эры появились описания невосприимчивости к инфекционным заболеваниям. Не менее древними являются попытки использовать наблюдения в практических целях, то есть предохранить человека от заболевания. Применительно к оспе эти попытки оказались успешными: на протяжении многих веков до н.э. в Индии, Китае, странах античного мира вдыхали, втирали в неповреждённые или травматизированные кожу и слизистые оболочки небольшие порции материала от выздоравливающих людей. Интересно, что подобные введения материала (сейчас известно, что это Аг) небольшими дозами применяли и для иммунизации против змеиных и прочих ядов (первенство в разработке этого метода приписывают Митридату Евпатбру). Вышеупомянутый способ вакцинации против натуральной оспы - вариоляция [от лат. variola, оспа] - получил сравнительно широкое распространение на Востоке. Только в 1721 г. жена английского посла в Стамбуле леди Мэри Монтегю перенесла этот метод в Европу. Следует отметить, что вариоляция представляла опасную процедуру, вероятность развития оспы составляла 1-20 на 1000 привитых. В России в числе первых этой процедуре подвергла себя Екатерина II. Попытки перенести методику вариоляции для профилактики других инфекций успеха не имели. Тем не менее, возможность искусственного создания невосприимчивости была доказана, что послужило предпосылкой для открытия вакцинации. В 1796 г. Эдвард Дженнер доказал, что прививка человеку вируса коровьей оспы - вакцинация [от лат. vaccinus, коровий] - эффективна для профилактики натуральной оспы. В течение следующих 2 лет было вакцинировано более 100 000 человек. Открытие вакцинации - гениальное эмпирическое достижение - не привело, однако, к дальнейшему развитию иммунологии инфекционных болезней; для этого требовались знания их этиологии и патогенеза.

Становление научного изучения иммунитета

Первые попытки объяснить невосприимчивость к заразным болезням предприняли англичане Т. Люис и Д. Каннинхэм (1872). Они связывали невосприимчивость со способностью крови противостоять брожению. В 1877 г. М. Рейнб доказал, что введение крови телят, вакцинированных против коровьей оспы, прекращает её течение у больных животных. Этот опыт можно расценивать как предвестник иммунопрофилактики, основы которой заложили открытия Кбха и особенно Пастера. Последний доказал возможность ослабления вирулентности, то есть аттенуации возбудителей. Собственно, история иммунологии как науки начинается с опыта Пастера по иммунизации овец вакциной против сибирской язвы в местечке Пюи ле Фор (5 мая 1888 г.). Исследования Пастера позволили научно обосновать главный принцип борьбы с инфекционными заболеваниями - создание массовой невосприимчивости. Э. Ру и А. Иерсен выделили дифтерийный токсин, а Э. Беринг и Ш. Китазато открыли возможность получения дифтерийного и столбнячного антитоксинов (1890-1892), что заложило основы иммунотерапии. М.Грубер и Г. Дархэм (1896) выявили агглютинины у больных и иммунизированных лиц и создали предпосылки для разработки серологической диагностики инфекционных болезней. Р. Пфайффер и В. Коллё (1898) открыли новые горизонты вакцинопрофилактики, применяя убитые микробы. В 1889 г.

X.Бюхнер доказал, что бактерицидное действие крови не связано с эритроцитами; он открыл вещество сыворотки крови и назвал его алексином [от греч. alexo, защищать]. Через 5 лет В.И. Исаев и Пфайффер описали фенбмен разрушения холерного вибриона в присутствии АТ и алексина. Уже через год Ж. Борде показал, что алексин взаимодействует с комплексом Аг-АТ, дополняя и завершая антимикробное действие АТ. По этой причине автор присвоил алексину название комплемент [от лат. complementum, дополняющий; делающий полным]. В 1909 г. П.Л. Лащенко открыл протеолитический фермент лизоцим, селективно повреждающий клеточные стенки, содержащие пептидогликаны. Позднее лизоцим выделил в чистом виде А. Флеминг (1922). Было установлено, что микробицид-ные свойства сыворотки крови обусловливают и другие вещества - плакйны тромбоцитов [от лат. plaga, повреждение], р-лизины, пропердин [от лат. pro-, для, + perdere, разрушать] и др. Установив действие формалина и высоких температур на токсины, Г. Рамбн разработал методику получения столбнячного и дифтерийного анатоксинов (1915). Полученные им данные стали основой для создания антитоксических вакцин, а изучение «вспомогательных веществ»-адъювантов [от лат. adjuvantis, помогать кому-либо] (1930-1932) позволило получить с их помощью гипериммунные сыворотки.

Разработка теорий иммунитета

Выявление роли патогенных микроорганизмов в развитии инфекционных болезней, возможность искусственного создания невосприимчивости подтолкнули к изучению факторов защиты организма от инфекционных агентов. Пастер предложил теорию «исчерпанной силы»; согласно этой теории «невосприимчивость» представляет состояние, при котором организм человека (как питательная среда) не поддерживает развитие микробов. Однако автор быстро понял, что его теория не может объяснить ряд наблюдений. В частности, Пастер показал, что если заразить курицу сибирской язвой и держать её ноги в холодной воде, то у неё развивается заболевание (в обычных условиях куры невосприимчивы к сибирской язве). Развитие фенбмена обусловливало снижение температуры тела на 1-2 °С, то есть ни о каком исчерпывании питательной среды в организме речь идти не могла.

Фагоцитарная теория иммунитета

В 1883 г. появилась теория иммунитета, опирающаяся на эволюционное учение Чарлза Дарвина и основанная на изучении пищеварения у животных, располагающихся на разных ступенях биологического развития. Автор новой теории, И.И. Мечников, обнаружил сходство внутриклеточного переваривания веществ у амёб, клеток энтодермы кишечнополостных и некоторых клеток ___ мезенхимного происхождения (моноцитов крови, тканевых макрофагов). Мечников ввёл термин «фагоциты» [от греч. phagos, поедать, + kytos, клетка], а позднее предложил разделять их на микрофаги и макрофаги. Такому разделению способствовали и достижения П. Эрлиха, дифференцировавшего посредством окраски несколько типов лейкоцитов. В классических работах по сравнительной патологии воспаления И.И. Мечников доказал роль фагоцитирующих клеток в элиминации патогенов. В 1901 г. в Париже вышел его монументальный итоговый труд «Невосприимчивость в инфекционных болезнях». Значительный вклад в распространение фагоцитарной теории внесли работы Э. Ру и учеников И.И. Мечникова (А.М. Безредка, И.Г. Савченко, Л.А. -Тарасевич, Ф.Я. Чистбвич, В.И. Исаев).

Гуморальная теория иммунитета

Ещё до появления фагоцитарной теории англичане Т. Льюис и Д. Каннигэм в 1876 г. доказали, что кровь некоторых животных способна противостоять брожению. Позднее было установлено, что плазма и сыворотка крови способны уничтожать - склеивать (агглютинировать) и осаждать (преципитировать) микробы; эта способность возрастает после вакцинации. Как выяснилось, не только бактерии и их продукты, но и другие вещества (их назвали Аг) способны вызывать выработку особых веществ (их назвали АТ), ответственных за агглютинацию и преципитацию. Отсюда вытекало, что помимо фагоцитоза организм обладает и другими способами защиты от микроорганизмов. Критику фагоцитарной теории начал Г.Н. Габричевский, доказавший, что решающую роль в элиминации возбудителя возвратной лихорадки играет сыворотка крови, а не фагоциты. П. Баумгартен и Г. Наттелл показали справедливость этого положения по отношению к сибирской язве. Э. Райт обнаружил АТ, стимулирующие фагоцитарные реакции и назвал их опсонинами. Положение о ведущей роли АТ в невосприимчивости поддержал Р. Кох, выдвинувший гуморальную теорию иммунитета. Полемика между сторонниками обеих теорий (фагоцитарной, или клеточной, и гуморальной) переросла в настоящую «войну», в которой мишенями часто становились её участники, а не теории. Позднее учёные поняли, что к познанию функций иммунной системы во всей их сложности нельзя подходить на основе взаимоисключающих положений, а правильный путь включает сопоставление и осмысление открытий, часто кажущихся противоречивыми, но согласующихся по сути. Сам И.И. Мечников впоследствии так охарактеризовал иммунитет: «Под невосприимчивостью к заразным болезням надо понимать общую систему явлений, благодаря которым организм может выдержать нападение болезнетворных микробов».

Иммунная толерантность и клонально-селекционная теория иммунитета

По мере развития знаний о структуре и функциях иммунной системы выяснилось, что многие защитные реакции организма направлены не только против Аг микробов, но и против клеток других организмов то же вида и даже собственного организма. П. Медавар (1945) установил, что клетки животного-донора, внесённые животному-реципиенту, всегда уничтожаются иммунными механизмами. Этот иммунный барьер способны преодолевать лишь ткани, взятые в организме и пересаженные в этот же организм (например, пересадка кожи с туловища на руки при ожогах). Возникал вопрос: почему ткани конкретного индивида для него самого не обладают антигенными свойствами? В 1953 г. М. Хашек установил, что контакт с Аг в плодном периоде приводит к развитию «неотвечае-мости» на аналогичный Аг у взрослого животного. В 1957 г. ответ на эти вопросы дал Ф.М. Бернет, обосновавший явление иммунной «терпимости» (толерантности). Сам фенбмен открыл английский иммунолог Бйллинхэм, установивший, что иммунизация Аг у плода приводила к тому, что его повторное введение взрослому животному не вызывало образования АТ. Таким образом, контакт организма с Аг в антенатальном периоде приводит к развитию толерантности к нему во взрослом состоянии. Открытие иммунной толерантности позволило иначе взглянуть на проблему пересадки органов, а внедрение в практику иммунодепрессантов - успешно решать задачи современной трансплантологии. Описание фенбмена иммунной толерантности позволило Бернету и Феннеру предложить теорию «непрямой матрицы». Согласно этой теории вещества организма, способные выступать в роли Аг, несут некую «метку», защищающую их от действия собственных иммунных механизмов. Эта теория во многом составила основу концепции клонального отбора иммунокомпетентных клеток.

Анафилаксия и аллергия

Анафилаксия

В 1839 г. французский невропатолог Ф. Мажандй заметил, что кролики с каждым разом всё труднее переносят введение яичного белка и умирают после третьей инъекции. Позднее врачи столкнулись со случаями шока и острой остановки сердца после повторного введения дифтерийной антитоксической сыворотки, а американский иммунолог Т. Смит воспроизвёл такой шок в эксперименте. Французские исследователи Ш. Ришё и П. Портье (1902) установили аналогичный эффект у экстрактов морского кишечнополостного Physalia physalia (португальский военный кораблик). Они показали, что первое введение как бы «подготавливает» организм для повторного. В настоящее время этот феномен известен как сенсибилизация [от лат. sensibilitas, чувствительность], то есть повышение чувствительности организма к воздействию какого-либо фактора окружающей или внутренней среды. Последующее введение играет «разрешающую» роль, вызывая видимые эффекты (бронхоспазм, остановка сердца и др.). Для того чтобы подчеркнуть негативную роль сенсибилизации, Рише дал явлению название анафилаксия [от греч. ana, против, + (pro-)phylaxis, защита] - сенсибилизация выступает против «защиты организма». Таким образом было доказано, что несчастные случаи, вызванные лечебными сыворотками, обусловлены содержащимися в них чужеродными белками (сыворотки изготовлялись из крови лошадей, овец и морских свинок). Чаще всего смерть наступала после повторного введения сыворотки. Позднее оказалось, что Рише сильно преувеличил негативный эффект сенсибилизации организма, проведя за счёт приставки анаглубокую черту между анафилаксией и иммунными реакциями - явлениями, родственными по своей природе. В 1903 г. Артюс описал феномен местной анафилаксии (позднее получивший его имя) - развитие местной некротической реакции после подкожного введения разрешающей дозы Аг. Способ и место попадания сенсибилизирующей (то есть первой) дозы при этом не имели значения. Проблема анафилаксии побудила многих исследователей к разработке методов её преодоления. Первым, кому это удалось, стал известный отечественный микробиолог А.М. Безредка, открывший (1907) метод десенсибилизации - дробного введения лечебных сывороток в малых дозах, снижающих чувствительность организма к сенсибилизирующему агенту (аллергену). Для этого первоначально вводят небольшую дозу подкожно перед основной дозой; либо несколько малых, но возрастающих доз внутривенно с интервалом 15-30 мин.

Аллергия

Несомненном сходством с анафилаксией обладает другое явление, впервые описанное Кохом. После подкожного введения взвеси убитых туберкулёзных палочек заражённым туберкулёзом морским свинкам на месте инъекции развивалась местное воспаление. Таким образом, вторая инъекция «выявляла» болезнь. Позднее именно этот метод стал одним из основных способов выявления туберкулёза. Подробные исследования явления провёл К. фон Пирке, изучавший осложнения после вакцинации против оспы. Руководствуясь наблюдениями Дженнера (появление иногда после прививки местной сыпи), он установил, что после повторного введения вакцины через несколько часов появляются кожные высыпания. Они не содержали вирус и, следовательно, были результатом реакции организма, а не действия вируса. Фон Пирке дал этому явлению название «аллергия» [от греч. allos, другой, + ergon, работа]; ответ организма на вторичную вакцинацию он назвал ранней аллергической реакцией. Позднее было установлено, что аллергию также вызывают факторы, не имеющие отношения к живым организмам (лекарства, химические вещества). Феномен анафилаксии и аллергические реакции нельзя смешивать, хотя оба состояния обусловлены сенсибилизацией организма, вызванной Аг. В 1921 г. О. Прауснитц и X. Кюстнер доказали возможность переноса факторов гиперчувствительности с помощью сыворотки крови больного, получившего впоследствии название «реакции Прауснитца-Кюстнера». Вскоре была установлено, что этот сывороточный фактор принадлежит к фракции у-глобулинов; он получил название кожносен-сибилизирующее АТ, или атопический реагин. В 1967 г. супруги Ишизака установили, что эти факторы - Ig класса E.

Задачи современной иммунологии

Вторая половина XX в. характеризуется бурным развитием иммунологии. Иммунная система была определена как комплекс биологических механизмов организма, направленных на поддержание структурного и функционального гомеостаза. Элементы иммунной системы распознают «свои» и «чужие» Аг и удаляют всё генетически отличное от него как чужеродное. Биологическая цель иммунных реакций - поддержание индивидуальности конкретного организма и отдельного вида; защита его от различных инфекционных и неинфекционных болезней. В настоящее время иммунология - биомедицинская дисциплина, включающая общие и частные направления. Общая иммунология изучает молекулярные и клеточные основы иммунных реакций, их регуляцию, генетический контроль, а также принципы наследования клеточных Аг и роль иммунных механизмов в процессах индивидуального развития. Частная иммунология носит прикладной характер; основные направления - вакцинология, иммуноонкология, иммунопатология, аллергология, трансплантационная иммунология.

Вакцинология изучает методы искусственного создания невосприимчивости к инфекционным агентам и принципы разработки новых вакцинных препаратов.

Трансплантационная иммунология изучает иммунную несовместимость тканей, отторжение трансплантатов, условия и способы преодоления несовместимости.

Иммуноонкология - наука, изучающая роль иммунной системы в развитии злокачественных заболеваний.

Иммунопатология и аллергология изучают нарушения иммунных реакций и механизмы развития извращённых реакций на Аг.

Разработка новых методов иммунодиагностики заболеваний, создание средств и способов коррекции иммунных нарушений - не менее актуальные направления современной иммунологии.

ВИДЫ НЕВОСПРИИМЧИВОСТИ К ВОЗБУДИТЕЛЯМ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ^

Многообразие систем защиты организма позволяют человеку оставаться невосприимчивым к действию инфекционных агентов. Поскольку инфекционные поражения могут быть системными или местными, то невосприимчивость (иммунитет) также подразделяют на общую и местную. Защитные механизмы могут быть направлены против различных Аг микроорганизмов. В связи с этим реакции, обеспечивающие невосприимчивость, разделяют на антимикробные и антитоксические. Различают невосприимчивость врождённую и приобретённую.

Видовой иммунитет

Видовой, или видоспецифический, иммунитет - генетически закреплённая невосприимчивость, присущая каждому виду. Например, человек никогда не заболевает чумой крупного рогатого скота. Крысы резистентны к дифтерийному токсину и, по выражению У. Бойда (1969), «…​эта устойчивость наследуется так же, как крысиные уши и хвост». В пределах вида имеются особи, не восприимчивые к некоторым патогенам (например, среди людей встречаются лица, устойчивые к возбудителям кори или ветряной оспы). Одна из форм врождённой невосприимчивости связана с переносом IgG от матери к плоду через плаценту (передача по вертикали). Это обеспечивает устойчивость новорождённого ко многим возбудителям в течение некоторого, обычно индивидуально варьирующего срока. Видовой иммунитет может быть абсолютным (например, нечувствительность человека к вирусам бактерий) или относительным (например, восприимчивость к возбудителю сибирской язвы у кур появляется после переохлаждения). Как и всякое биологическое явление, невосприимчивость к инфекциям варьирует (по типу нормального распределения) у различных индивидуумов одного вида или расы. Индивидуальная невосприимчивость проявляется среди особей одного вида, например некоторые лица не болеют корью. Индивидуальная невосприимчивость зависит от состояния иммунной и эндокринной систем, качества питания, наличия сопутствующей патологии и др. Нередко индивидуальную восприимчивость или резистентность к инфекциям детерминируют генетические особенности. Например, лица с дефицитом глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы более восприимчивы к тропической малярии, вызываемой Plasmodium falciparum. А больные серповидноклеточной анемией более устойчивы к заражению тропической малярией. Расовая невосприимчивость. Внутри одного вида могут существовать значительные расовые вариации видовой невосприимчивости. Например, многие представители негроидной расы оказываются более устойчивыми к малярии, вызываемой Plasmodium vivax, если на их эритроцитах отсутствует Аг Duffy, являющийся рецептором для паразитов. С другой стороны, вероятность развития диссеминированного кокцидиоидомикоза у выходцев из Африки в 10 раз выше, чем у европейцев.

Приобретённый иммунитет

Приобретённый иммунитет формируется в течение жизни индивидуума и не передаётся по наследству; может быть естественным или искусственным.

Естественно приобретённый иммунитет развивается после перенесённого инфекционного заболевания, протекавшего в клинически выраженной форме, либо после скрытых контактов с микробными Аг (так называемая бытовая иммунизация). В зависимости от свойств возбудителя и состояния иммунной системы организма невосприимчивость может быть пожизненной (например, после кори), длительной (после брюшного тифа) или сравнительно кратковременной (после гриппа).

Инфекционный (нестерильный) иммунитет - особая форма приобретённой невосприимчивости; не является следствием перенесённой инфекции, обусловлен наличием инфекционного агента в организме. Невосприимчивость исчезает сразу после элиминации возбудителя из организма (например, туберкулёз; вероятно, малярия).

Искусственно приобретённый иммунитет. Состояние невосприимчивости развивается в результате вакцинации, серопрофилактики (введения сывороток) и других манипуляций.

ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ОТ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ

Любой микроорганизм, попавший на кожу и слизистые оболочки, подвергается воздействию защитных факторов. Неповреждённые покровы организма (кожа и слизистые оболочки) не проницаемы для большинства представителей нормальной микрофлоры и патогенных микроорганизмов. Структуры, расположенные под эпидермисом и эпителием слизистых оболочек, стерильны. Проникновение микроорганизмов через эти барьеры может вызвать развитие инфекционного процесса. Функции этих барьеров и других защитных факторов многообразны и не ограничены только антимикробной защитой. В настоящем разделе рассмотрены системы, обеспечивающие барьерные функции, распознавание, уничтожение и элиминацию инфекционных агентов. Подобные факторы защиты разделяют на конституциональные (врождённые) и приобретённые (индуцированные). Их не следует рассматривать обособленно, так как они функционируют в постоянном взаимодействии, образуя целостную систему защиты. Факторы защиты характеризуют скорость протекания инфекционного процесса и определяют уничтожение и удаление возбудителя из организма. В зависимости от свойств возбудителя роль отдельных факторов защиты может быть различной; некоторые компоненты могут быть вообще не задействованы.

Конституциональные факторы защиты образуют естественные барьеры на путях проникновения инфекции; во многом определяют особенности строения (конституции) конкретного организма. Нередко применяют термин «факторы неспецифической резистентности», что отражает неизбирательный по отношению к инфекционному агенту характер ответа. Понятие «неспецифический иммунитет» некорректно, так как иммунный ответ всегда строго специфичен в отношении индуктора. Более правильно отождествлять активность факторов неспецифической резистентности с воспалительными реакциями, так как в них задействованы одни и те же популяции клеток и аналогичные растворимые факторы (см. далее).

Индуцибельные факторы защиты - специфические реакции иммунной системы, индуцированные проникновением инфекционного или любого другого агента, обладающего признаками чужеродности (злокачественная клетка, трансплантат и др.).

Конституциональные факторы резистентности организма

Конституциональные факторы относятся к эволюционно наиболее древним. Они крайне многообразны, а механизмы их функционирования вариабельны; конституционные факторы объединяет неспецифичность действия. Например, наиболее простой фактор устойчивости слизистых оболочек - так называемая ареактивность клеток, связанная с отсутствием рецепторов, на которых адсорбируются вирусы или фиксируются токсины. Факторы неспецифической резистентности разделяют на механические, физико-химические и иммунобиологические. Основа первых - анатомические барьеры (кожа и слизистые оболочки). Они служат первой линией защиты против возбудителей инфекций. Строение, физические свойства, секреторные вещества физико-химических барьеров не позволяют микробам попасть во внутреннюю среду организма, часто убивая либо ингибируя их рост (табл. 10-1).

Механические барьеры

Кожа и слизистые оболочки эффективно защищают организм человека от патогенов. Необходимое условие проникновения многих возбудителей - микротравмы кожи и слизистых оболочек, либо укусы кровососущих насекомых.

Кожные покровы снабжены «неприступным» многослойным эпителием. Эта «линия обороны» подкреплена секретами кожных желёз и постоянным слущиванием отмерших слоёв эпидермиса. Нарушение целостности эпидермиса (например, при травмах или ожогах) - серьёзная предпосылка для микробных инвазий, особенно при контактах с инфицированными субстратами (почва, растительные остатки и т.д.). Следует помнить, что помимо барьерной роли кожа снабжена мощной системой иммунной защиты (лимфоциты, клетки системы моно-нуклеарных фагоцитов).

Слизистые оболочки могут иметь специальные анатомические структуры (например, волоски в носовых ходах или реснички мерцательного эпителия трахеи). Погружённые в слизь реснички формируют волны однонаправленных колебаний и перемещают слизь с заключённые в ней частицами вверх (к выходу их дыхательных путей) по поверхности эпителия (процесс мукоцилиарного транспорта).

Физико-химические факторы

Кожные покровы. Механические барьерные свойства кожи дополняются секретами сальных и потовых желёз с низкими рН. Они сами проявляют прямую бактерицидную активность (за счёт действия жирных кислот) либо снижают рН кожи до неблагоприятных значений (за счёт секреции уксусной, молочной и других кислот).

Слизистые оболочки. Слизистые оболочки имеют множество защитных факторов - от кислых значений рН желудка до секреции ферментов и АТ. Резистентность слизистых оболочек дополняют различные физиологические механизмы, например кашлевой рефлекс, предотвращающий аспирацию различных объектов. Кроме того, большинство слизистых оболочек колонизирует нормальная микрофлора, противодействующая размножению патогенных микроорганизмов. Слизь. Слизистые оболочки покрыты слоем слизи - организованной гелеобразной гликопроте-иновой структуры, задерживающей и фиксирующей различные объекты, в том числе микроорганизмы. Слизь гидрофильна; через неё могут диффундировать многие образующиеся в организме вещества, в том числе бактерицидные (например, лизоцим и пероксидазы). Лизоцим. В отделяемом слизистых оболочек содержится лизоцим - фермент, лизирующий клеточные стенки преимущественно грамположительных бактерий. Лизоцим присутствует и в других жидкостях организма (например, в слюне, слёзной жидкости). Сурфактант. В нижних участках воздухоносных путей и дыхательном отделе лёгкого слизи нет, но поверхность эпителия покрыта слоем сурфактанта - поверхностно-активного вещества, способного фиксировать и уничтожать грамположительные бактерии. Ig. На поверхность эпителия ЖКТ и дыхательного тракта постоянно выделяется секреторный IgA. Кислая среда. Большинство патогенных бактерий чувствительно к низким значениям рН, что обусловливает их гибель под действием кислот, содержащихся в желудочном соке и жёлчи. Во влагалище взрослых женщин кислую рН поддерживают лактобациллы, ингибируя размножение дрожжей и анаэробных грамотрицательных бактерий.

Факторы иммунобиологической резистентности

Если возбудитель преодолевает поверхностные барьеры, его встречают факторы второй иммунобиологической линии неспецифических защитных механизмов. Такие защитные механизмы принято делить на гуморальные и клеточные. Комплекс конституциональных механизмов защиты тканей- эволюционно древняя форма организованной защиты- предшественник индуцированных (иммунных) реакций. Подтверждением этому служит факт, что значительная часть конституциональных компонентов защиты индуцибельна и находится в тканях в неактивной форме. Их активацию вызывают различные вещества-медиаторы воспаления. Ключевую роль в неспецифической защите внутренней среды организма играют комплемент и фагоцитирующие клетки. Их активность во многом дополняют различные БАВ (табл. 10-2).

Система комплемента

Система комплемента - группа по меньшей мере 26 сывороточных белков (компонентов комплемента), опосредующих воспалительные реакции при участии гранулоцитов и макрофагов (табл. 10-3). Компоненты системы участвуют в реакциях свёртывания крови, способствуют межклеточным взаимодействиям, необходимым для процессинга Аг, вызывают лизис бактерий и клеток, инфицированных вирусами. В норме компоненты системы находятся в неактивной форме. Активация комплемента приводит к поочередному (каскадному) появлению его активных компонентов в серии протеолитических реакций, стимулирующих защитные процессы (рис. 10-1 ). Основные функции компонентов комплемента в защитных реакциях - стимуляция фагоцитоза, нарушение целостности клеточных стенок микроорганизмов мембранопов-реждающим комплексом (особенно у видов, устойчивых к фагоцитозу, например гонококков) и индукция синтеза медиаторов воспалительного ответа (например, ИЛ-1; табл. 10-4). Кроме того, система комплемента стимулирует воспалительные реакции (некоторые компоненты - хемоаттрактанты для фагоцитов), участвует в развитии иммунных (через активацию макрофагов) и анафилактических реакций. Активация компонентов комплемента может происходить по классическому и альтернативному путям.

Классический путь. Активация комплемента по классическому пути комплексами АгАТ. Включает поочередное образование всех 9 компонентов (от С1 до С9). Компоненты классического пути обозначают латинской буквой «С» и арабскими цифрами (С1, С2…​С9), для субкомпонентов комплемента и продуктов расщепления к соответствующему обозначению добавляют строчные латинские буквы (dq, C3b и т.д.). Активированные компоненты выделяют чертой над литерой (например, С2), инактивированные компоненты - буквой «i» (например, iC3b). Первоначально с комплексом Аг-АТ взаимодействует С1 (субкомпоненты C1q, C1r, C1s), затем к ним присоединяются «ранние» компоненты С4, С2 и С3. Они активируют компонент С5, прикрепляющийся к мембране клетки-мишени (бактерии, опухолевые или инфицированные вирусами клетки) и запускающий образование литического комплекса (С5Ь, С6, С7, С8 и С9). Иначе он называется мембраноповреждающий (мембраноатакующий) комплекс, так как его образование на мембране вызывает разрушение клетки. Примеры микробных продуктов, активирующих систему комплемента по классическому пути, - ДНК и белок А стафилококков.

Альтернативный путь. Активация комплемента по альтернативному пути происходит без участия АТ и задолго до их появления. Факторы альтернативного пути имеют буквенное обозначение: P (пропердин), B и D (ферменты системы комплемента). Запуск альтернативного пути осуществляет активация компонента С3, взаимодействующего с факторами B и D. Затем через образование компонента С5 (но без участия С1, С2 и С4) альтернативный путь также завершается образованием на поверхности клеток-мишеней мембраноповреждающего комплекса. Альтернативный путь активируется такими микробными продуктами, как эндотоксины бактерий, вирусы (например, гриппа).

Фагоцитирующие клетки

Фагоциты выполняют не только защитные (поглощают и разрушают чужеродные агенты), но и дренажные функции (удаляют погибшие и деградировавшие структуры организма). Фагоциты представлены клетками миелопоэтического ряда (полиморфноядерные лейкоциты) и макрофа-гально-моноцитарной системы (моноциты, тканевые макрофаги). Основные свойства фагоцитирующих клеток представлены в табл. 10-5.

Полиморфноядерные лейкоциты имеют дольчатое ядро и множество мелких цитоплаз-матических гранул (поэтому их также называют гранулоциты). По окрашиванию гранул выделяют три типа клеток: нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Нейтрофилы - основные эф-фекторные клетки острого воспаления; у взрослых лиц они составляют самую многочисленную популяцию лейкоцитов. Основная часть нейтрофилов циркулирует в крови в течение 6-7 ч. Затем они скапливаются в капиллярах, где формируют краевой пул, прикрепляясь к эндотелию (по периметру кровотока); в таком состоянии нейтрофилы находятся в готовности немедленно покинуть кровеносное русло (феномен краевого стояния). Нейтрофилйя (увеличение их количества в периферической крови) часто указывает на наличие воспалительной реакции. Потенциал эозинофилов направлен не столько на фагоцитирование бактерий, сколько на нейтрализацию паразитов, особенно гельминтов (например, нематод). Поэтому, эозинофилия - признак, указывающий на возможную глистную инвазию. Кроме того, эозинофилы участвуют в разрушении гистамина, выделяя гистаминазу. Именно поэтому эозинофилию также наблюдают при аллергических заболеваниях. Определённая роль в подобной специализации эозинофилов принадлежит специфическим гранулам, содержащим пероксидазы и катионные белки (например, основный белок, катионные белки эозинофилов), активные именно в отношении паразитов. В активации эозинофилов важную роль играют IgE, образующиеся в ответ на сенсибилизацию организма аллергенами (в том числе микробными).

Макрофаги и моноциты. В поглощении и элиминации патогенов участвуют также макрофаги и моноциты. Последние представляют предшественники макрофагов и циркулируют в кровотоке 1-2 дня. Затем они мигрируют за пределы сосудистого русла и заселяют различные ткани, превращаясь в резидентные макрофаги и формируя, в отличие от полиморфноядерных лейкоцитов, фиксированные линии тканевой защиты. Выделяют альвеолярные и лёгочные (интерстициальные) макрофаги, макрофаги печени (клетки фон Купффера), соединительной ткани (гистиоциты), почек (мезангиальные клетки) и др. Активация макрофагов возможна лишь в присутствии конкретных стимулов (например, бактериальных продуктов, C3b, у-ИФН). Подобная особенность позволяет некоторым бактериям, грибам и простейшим персистировать в цитоплазме неактивированных макрофагов. Активация макрофагов протекает бурно, сопровождаясь интенсивным выходом микробицидных веществ, а также цитокинов, регулирующих уровень воспалительной реакции и индуцирующих развитие иммунного ответа.

Фагоцитоз - процесс поглощения и переваривания фагоцитами микроорганизмов, других клеток, фрагментов некротизированной ткани и чужеродных частиц. Механизмы активации фагоцитов обоих типов (полиморфноядерные лейкоциты и моноциты/макрофаги) принципиально одинаковы. Активирующими стимулами могут быть бактериальные продукты (например, ЛПС, N-формиловые пептиды и др.), компоненты комплемента (например, С3 и С5), многие цитокины и АТ, рецепторы к которым присутствуют на мембранах фагоцитов. Фагоцитоз состоит из четырёх последовательных стадий: хемотаксис, прикрепление к объекту, поглощение и уничтожение. Хемотаксис [от греч. сИвтеа, химия, + taxis, упорядоченное концентрирование] - амёбовидное передвижение фагоцитов по градиенту концентрации активирующих стимулов (хемотаксинов, или факторы хемотаксиса). Свойством активировать миграцию макрофагов обладают C3b, C5a, C5b, C6-, C7- и Ва-компоненты комплемента, бактериальные ЛПС, продукты деградации клеток, хемокины. Скорость привлечения клеток при хемотаксисе легко представить, оценив, например, время образования гноя и его объём после попадания занозы (рис. 10-2).

Адгезия [от лат. adhaesio, приклеиваться]. Одно из условий успешного поглощения возбудителя - эффективная адгезия к микробу. Жгутики позволяют микробам быстро перемещаться в жидкой фазе, а фагоциты не умеют «плавать», но хорошо «бегают», то есть свои поглотительные свойства они способны реализовывать только на какой-либо плотной поверхности (например, на эпителии). Опсонины [от греч. opson, лакомство], такие как AT, C3b, фибронектин, сурфактант, обволакивают микроорганизмы и существенно ограничивают их подвижность. Опсонины делают поглощение более эффективным, что связано со стабильностью взаимодействий опсонинов с соответствующими рецепторами (к Fc-фрагментам AT, компонентам комплемента, фибронектину и др.) на мембране фагоцита (рис. 10-3). Отсутствие этих рецепторов приводит к резкому снижению функциональной активности фагоцитов (например, врождённый дефицит C3b-рецепторов сопровождается высокой частотой бактериальных инфекций и даже выделен в отдельную нозологическую форму - недостаточность адгезии лейкоцитов).

Поглощение. Поглощение микробов идентично таковому у амёб; в результате образуется фагосома с заключённым внутри объектом фагоцитоза (рис. 10-4, А). К фа-госоме устремляются лизосомы и выстраиваются по её периметру. Затем мембраны фагосомы и лизосом сливаются (фагосомо-лизосомальное слияние), и ферменты лизосом изливаются в образовавшуюся фаголизосому. Поглощению способствует взаимодействие поверхностных рецепторов фагоцитов с Аг или фрагментами опсонинов, сорбированных на поверхности бактерии. Эта реакция напоминает действие замка-молнии (так называемый зйпперный механизм поглощения [от англ. zip, замок-молния]). Фагоцитированные микроорганизмы подвергаются атаке комплекса различных микробицидных факторов, разделяемых на кислородзависимые и кислороднезависимые.

Кислородзависимая микробицидная активность реализуется через образование значительного количества продуктов с токсическим действием, повреждающих микроорганизмы и окружающие структуры. За их образование ответственны НАДФ-оксидаза (флавопротеин -цитохромредуктаза) плазматической мембраны и цитохром b; в присутствии хинонов этот комплекс трансформирует О₂ в анион супероксида (О₂ ^- ). Последний проявляет выраженное повреждающее действие, а также быстро трансформируется в перекись водорода по схеме: 2О^- + Н₂ О= Н?О₂ + О₂ (процесс катализирует фермент супероксид дисмутаза). Пероксид водорода (Н₂ О₂ ) проявляет меньший повреждающий эффект, но в его присутствии фермент миелопероксидаза конвертирует ионы Cl^- в ионы HC1O^- , обладающие бактерицидным действием, во многом аналогичным эффекту хлорной извести (NaClO).

Кислороднезависимые механизмы активируются в результате контакта опсонизированного объекта с мембраной фагоцита. В процессе фагосомолизосомального слияния первыми с мембраной фагосомы сливаются гранулы, содержащие лактоферрин и лизоцим, затем к ним присоединяются азурофильные гранулы, содержащие катионные белки (например, САР57, САР37), протеиназы (например, эластазу и коллагеназу), катепсин G, дефензины и др. Эти продукты вызывают повреждение клеточной стенки и нарушение некоторых метаболических процессов; в большей степени их активность направлена против грамположительных бактерий.

Завершённость фагоцитарных реакций. Поглощённые фагоцитами бактерии обычно погибают и разрушаются (рис. 10-4, Б). Некоторые бактерии, снабжённые капсулами или плотными гидрофобными клеточными стенками, могут быть устойчивы к действию лизосомальных ферментов; другая часть патогенов способна блокировать слияние фагосом и лизосом. В подобных случаях фагоцитоз носит незавершённый характер, и возбудитель выживает в цитоплазме поглотившей его клетки. Многие факультативные и облигатные внутриклеточные паразиты не только сохраняют жизнеспособность внутри клеток, но и способны размножаться. Персистирование патогенов опосредуют три основных механизма.

Блокада фагосомолизосомального слияния. Подобный механизм отмечен у вирусов (например, вируса гриппа), бактерий (например, микобактерий) и простейших (например, токсоплазм).

Резистентность к лизосомальным ферментам (например, гонококки и стафилококки). Способность патогенных микроорганизмов быстро покидать фагосомы после поглощения и длительно пребывать в цитоплазме (например, риккетсии). Другие защитные функции фагоцитов

Прочие факторы неспецифической резистентности

Система ИФН - важнейший фактор неспецифической резистентности организма человека. Следует отметить, что открытие ИФН А. Айзексом и Ж. Линденманном (1957) было плодом блестящей случайности, по своей значимости сравнимой с открытием пенициллинов Флемингом: изучая интерференцию вирусов (см. главу 5), авторы обратили внимание на то, что некоторые клетки становились резистентными к повторному заражению вирусами. В настоящее время ИФН относят к классу индуцируемых белков клеток позвоночных. Важнейшие их функции: антивирусная, противоопухолевая, иммуномодулирующая и радиопротективная. Различают три ИФН: а-ИФН синтезируют лейкоциты периферической крови (ранее был известен как лейкоцитарный ИФН); р-ИФН синтезируют фибробласты (ранее известен как фибробластный ИФН); у-ИФН - продукт стимулированных Т-лимфоцитов, NK-клеток и (возможно) макрофагов (ранее был известен как иммунный ИФН). По способу образования различают ИФН типа I (образуется в ответ на обработку клеток вирусами, молекулами двухцепочечной РНК, полинуклеотидами и рядом низкомолекулярных природных и синтетических соединений) и ИФН типа II (продуцируется лимфоцитами и макрофагами, активированными различными индукторами; действует как цитокин). ИФН видоспецифичны. Каждый биологический вид, способный к их образованию, продуцирует свои уникальные продукты, похожие по структуре и свойствам, но не способные проявлять перекрёстный антивирусный эффект (то есть действовать в условиях организма другого вида). Механизм антивирусного действия. ИФН индуцируют «антивирусное состояние» клетки (резистентность к проникновению или блокада репродукции вирусов). Блокада репродуктивных процессов при проникновении вируса в клетку обусловлена угнетением трансляции вирусной мРНК. При этом противовирусный эффект ИФН не направлен против конкретных вирусов; то есть ИФН не обладают вирусспецифичностью. Это объясняет их универсально широкий спектр антивирусной активности. ИФН взаимодействует с интактными клетками ещё неинфицированными клетками, препятствуя реализации репродуктивного цикла вирусов за счёт активации клеточных ферментов (протеинкиназ). ИФН I. Основной биологический эффект - подавление синтеза вирусных белков; способны воздействовать на другие этапы репродукции вирусных частиц, включая отпочковывание дочерних популяций. «Антивирусное состояние» клетки развивается в течение нескольких часов после введения ИФН или индукции их синтеза. При этом ИФН не влияют на ранние этапы репликативного цикла (адсорбцию, пенетрацию и «раздевание» вирусов) - противовирусное действие проявляется даже при заражении клеток инфекционными РНК. ИФН не проникают в клетки, а взаимодействуют со специфическими мембранными рецепторами (ганглиозиды или аналогичные структуры, содержащие олигосахара). По связыванию ИФН с рецептором и реализации его эффектов механизм активности напоминает действие некоторых гликопептидных гормонов. ИФН активирует гены, некоторые из которых кодируют образование продуктов с прямым антивирусным действием - протеинкиназы и 2'5'-олигоаденилат синтетазы (рис. 10-5). ИФН II (р-ИФН) также способны проявлять антивирусный эффект. Он связан с несколькими механизмами. Во-первых, активация ИФН NO-синтетазы приводит к повышению внутриклеточного содержания оксида азота, ингибирующего размножение вирусов. Во-вторых, ИФН активирует эффекторные функции NK-клеток, Т-лимфоцитов, моноцитов, тканевых макрофагов и гранулоцитов, проявляющих антителозависимую и антителонезависимую цитотоксичность. Кроме того, ИФН блокирует депротеинизацию («раздевание») вирусов, высвобождение зрелых вирусных частиц из клетки, а также нарушает метилирование вирусной РНК. В смешанных культурах ИФН-чувствительных и ИФН-резистентных клеток «антивирусное состояние» чувствительных клеток распространяется и на популяции резистентных клеток. Естественные АТ («антигеннезависимые», «неспецифические» АТ) составляют до 7% общего количества Ig в сыворотке крови неиммунизированных людей и животных. Их происхождение связывают с ответом иммунной системы на Аг нормальной микрофлоры. В эту же группу входят АТ, длительно циркулирующие после выздоровления от инфекционного заболевания. Часть пула подобных АТ синтезируется параллельно с образованием специфических АТ. Необходимость в их появлении остаётся неясной. Эти АТ низкоспецифичны, но способны перекрёстно реагировать с широким спектром Аг. Вызывают агглютинацию микробов, их разрушение (в присутствии комплемента), нейтрализуют вирусы и токсины, а также стимулируют фагоцитарные реакции (через опсонизацию возбудителей).

Факторы, выделяющиеся при разрушении клеток, - комплекс продуктов различного происхождения, проявляющих бактерицидное действие. Основные продукты этой группы - лейкины (высвобождаются при разрушении нейтрофилов) и плакины (высвобождаются при разрушении тромбоцитов).

Воспаление

Воспаление - комплекс защитно-приспособительных реакций, возникающих в сосудах и окружающих тканях в ответ на повреждение или патологическую стимуляцию, вызванную физическим, химическим или биологическим агентом. Впоследствии ткани могут полностью восстанавливать свою структуру и функции, либо в них формируются стойкие дефекты. Хорошо известны классические признаки острого воспаления, предложенные Цельсом: покраснение (rubor), отёк (tumor), боль (dolor), повышение температуры (calor) и нарушение функций органа или ткани (functio laesа). Иногда острая реакция меняет свои характеристики и принимает хроническое течение. Воспаление начинается с активации систем комплемента и гемостаза. Многие компоненты этих систем известны как медиаторы воспалительных реакций. Гистамин - основной медиатор воспалительных реакций - вызывает расширение поверхностных венул кожи и слизистых оболочек, увеличение сосудистой проницаемости и стимуляцию терминалей чувствительных нейронов типа С (проводят болевые импульсы; их активация вызывает чувство зуда и боли), высвобождающих нейропептиды (вещество P) в задних рогах спинного мозга. Выброс гистамина из тучных клеток и базофилов индуцируют IgE-зависимые механизмы, различные вещества (опиаты, аминогликозиды) и анафилатоксины (компоненты системы комплемента C3a и C5a). Кинины - низкомолекулярные пептиды (олигопептиды), увеличивающие проницаемость сосудов и высвобождение медиаторов полиморфноядерными фагоцитами. Предшественники ки-нинов - кининогены (высокомолекулярные белки). Протеолиз кининогенов с образованием кининов осуществляют калликреины - специфические протеазы полиморфноядерных фагоцитов. Ключевой субстрат этих реакций - фактор Хагемана, играющий важную роль в реакциях свёртывания.

Лейкотриены и простагландины, а также их метаболиты, - основные медиаторы острого воспаления. Повышают проницаемость сосудов, вызывают сокращение гладкомышечных клеток. Лейкотриен В₄ активирует хемотаксис полиморфноядерных фагоцитов; тромбоксан А₂ индуцирует агрегацию тромбоцитов, а простагландины, действуя на гипоталамус, вызывают повышение температуры тела. Кроме того, простагландины воздействуют на нервные окончания волокон типа C - именно поэтому стимулы, в норме не вызывающие болевой реакции, при воспалении провоцируют приступ боли.

Белки острой фазы воспаления. Воспалительная реакция сопровождается высвобождением различных белков (преимущественно из печени), также выполняющих медиаторные функции. Их объединяют общим термином «белки острой фазы воспаления». Наиболее известны С-реактивный белок, ЛПС-связывающий белок, сывороточный амилоидный белок А, а₁ -антитрипсин.

Цитокины. Многие продукты бактерий активируют клетки системы мононуклеарных фагоцитов и лимфоциты; эти клетки отвечают выделением комплекса БАВ. Такие факторы относят к двум крупным классам - цитокины (подклассы: ИЛ, ИФН, факторы роста, колониестимулирующие факторы гемопоэзов) и хемокины (хемоаттрактанты). Так, известно не менее 18 ИЛ. Большинство из них - также медиаторы иммунных реакций. В воспалительных реакциях основную роль играет ИЛ-1, стимулирующий лихорадочные реакции, повышающий проницаемость сосудов и адгезивные свойства эндотелия, а также активирующий моно- и полиморфноядерные фагоциты.

Большинство реакций острого воспаления резко изменяет лимфо- и кровообращение в очаге воспаления. Вазодилатация и повышение проницаемости капилляров облегчают выход из просвета капилляров макромолекул (например, компонентов комплемента) и полиморфноядерных фагоцитов, то есть сопровождается образованием экссудата. При умеренной воспалительной реакции экссудат содержит небольшое количество белка (серозный экссудат); при более интенсивной реакции содержание белков (например, фибриногена) резко возрастает (фибринозный экссудат). Механизмы свёртывания направлены на образование фибриновых сгустков, предупреждающих диссеминирование возбудителя с кровью и лимфой. Полиморфноядерные фагоциты, покинувшие кровеносное русло, устремляются в направлении хемотаксического стимула и поглощают проникшие микроорганизмы. Фагоцитоз заканчивается внутриклеточным их перевариванием. Важный фактор - снижение рН в тканях при воспалении, обусловленное секрецией молочной кислоты фагоцитами. Снижение рН оказывает губительное действие на бактерии и снижает резистентность к антимикробным химиопрепаратам. Закисление среды активирует клеточные протеазы, индуцирующие лизис полиморфноядерных фагоцитов. Им на смену в очаг воспаления мигрируют мононуклеарные фагоциты, поглощающие фрагменты лейкоцитов и микроорганизмов, завершая тем самым местную острую воспалительную реакцию.

Индуцибельные факторы защиты организма (иммунная система)

Иммунная система - совокупность органов, тканей и клеток, обеспечивающих структурное и генетическое постоянство клеток организма; образует вторую линию защиты организма. Функции первого барьера на пути чужеродных агентов выполняют кожа и слизистые оболочки, жирные кислоты (входящие в состав секрета сальных желёз кожи) и высокая кислотность желудочного сока, нормальная микрофлора организма, а также клетки, выполняющие функции неспецифической защиты от инфекционных агентов. Иммунная система способна распознавать миллионы разнообразных веществ, выявлять тонкие различия даже между близкими по структуре молекулами. Оптимальное функционирование системы обеспечивают тонкие механизмы взаимодействия лим-фоидных клеток и макрофагов, осуществляемые при прямых контактах и с участием растворимых посредников (медиаторов иммунной системы). Система обладает иммунной памятью, сохраняя информацию о предыдущих антигенных воздействиях. Принципы поддержания структурного постоянства организма («антигенной чистоты») основаны на распознавании «своего-чужого». Для этого на поверхности клеток организма имеются гликопротеиновые рецепторы (Аг), составляющие главный комплекс гистосовместимости - MHC [от англ. major histocompatibility complex]. При нарушении структуры этих Аг, то есть изменении «своего» иммунная система расценивает их как «чужое». Спектр молекул MHC уникален для каждого организма и определяет его биологическую индивидуальность; это и позволяет отличать «своё» (гистосовместимое) от «чужого» (несовместимого). Выделяют гены и Аг двух основных классов MHC. Молекулы I и II классов контролируют иммунный ответ. Они сочетанно распознаются поверхностными дифференцировочными CD-Аг клеток-мишеней и участвуют в реакциях клеточной цитотоксичности, осуществляемой цитотоксическими T-лимфоцитами (ЦТЛ).

ОРГАНИЗАЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Органы иммунной системы человека подразделяют на центральные (костный мозг, вилочковая железа) и периферические (селезёнка, лимфатические узлы, скопления лимфоидной ткани в собственном слое слизистой оболочки ЖКТ).

Клетки иммунной системы

Иммунокомпетентные клетки (лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки) по функциям подразделяют на эффекторные и регуляторные (табл. 10-6). Взаимодействия иммунокомпе-тентных клеток с другими регулируют цитокины (табл. 10-7), известные также как медиаторы иммунного ответа. Лимфоциты выполняют основную функцию иммунной системы - высокоспецифичное распознавание чужеродных и изменённых собственных Аг. В организме лимфоциты постоянно рециркулируют между зонами скопления лимфоидной ткани. Распределение лимфоцитов в лимфоидных органах и их миграция по кровеносному и лимфатическому руслам упорядочены и отражают функции конкретных клеток. При изучении в световом микроскопе лимфоциты имеют одинаковую морфологию, но их функции, поверхностно-клеточные маркёры, индивидуальное (клональное) развитие и судьба различны. Все лимфоциты происходят из единой стволовой клетки костного мозга, но популяции лимфоцитов и других клеток крови развиваются под влиянием различных дифференцирующих факторов. По наличию специфических поверхностных маркёров лимфоциты разделяют на функционально различные популяции и субпопуляции. У млекопитающих основные популяции: Т-лимфоциты, созревающие в вилочковой железе [лат. thymus]; В-лимфоциты, созревающие в аналоге сумки [лат. bursa] Фабрициуса у птиц (у человека - костный мозг или лимфоидная ткань кишечника).

Т-лимфоциты

T-лимфоциты (Т-клетки) выполняют различные функции, в связи с чем их подразделяют на субпопуляции. Т-клетки распознают Аг, в том числе переработанные Аг-представляющими клетками, обеспечивают реализацию клеточных иммунных реакций. Кроме того, T-лимфоциты взаимодействуют с B-лимфоцитами в ходе выработки последними гуморальных иммунных реакций. Активация Т-клеток происходит под действием макрофагов.

Созревание Т-клеток. Предшественники Т-клеток (тимоциты) созревают в вилочковой железе. Их дифференцировку регулируют взаимодействия с эпителиальными и дендритными клетками стромы тимуса, а также гормоноподобные полипептидные факторы эпителиальных клеток тимуса (например, тимозины, тимопоэтины).

Маркёры Т-клеток. T-клетки обладают маркёрами - специфическими поверхностными белковыми молекулами, присущими тем или иным субпопуляциям этих клеток. CD-маркёры. При дифференцировке Т-лимфоцитов на их плазмолемме появляются специфические Аг, выступающие в роли маркёров. Эти так называемые «кластеры дифференцировки» - CD-маркёры [от англ. cluster of differentiation] - указывают на функциональные способности лимфоцитов и некоторых других клеток. CD-маркёры идентифицируют с помощью моноклональных АТ. После выхода зрелых клеток из тимуса они экспрессируют CD4 или CD8, а также CD3. При некоторых иммунодефицитах обнаруживают нарушения нормального содержания клеток с тем или иным маркёром (например, CD4⁺ -клеток при СПИДе). Т-клетки подразделяют на субпопуляции в соответствии с их функцией и профилем мембранных маркёров, в частности CD-Ar (см. табл. 10-6). Рецептор Т-клеток. Т-клетки распознают Аг с помощью двух типов мембранных гликопроте-инов - Т-клеточных рецепторов и CD3. Т-клеточный рецептор - гетеродимер, содержащий а- и р-цепи (примерно 98% всех Т-клеток) или 5-цепи (около 1,5-2% клеток) с молекулярной массой 40-50 кД. Т-клеточный рецептор входит в суперсемейство Ig-подобных молекул клеточной поверхности, участвующих в реакциях распознавания. Механизмы трансмембранной передачи с рецептора T-клетки остаются неизвестными; предположительно они обусловлены CD3, нековалентно связанными с рецепторами T-лимфоцитов.

Активация Т-клеток. Для активации Т-клеток необходимо два сигнала от макрофагов. Первый сигнал - представление Аг, второй - секреция активирующего фактора (ИЛ-1). Последний стимулирует синтез T-лимфоцитами ИЛ-2, активирующего эти клетки (аутокринная регуляция). Одновременно на мембранах T-клеток повышается экспрессия рецепторов к ИЛ-2 (CD25).

Субпопуляции T-лимфоцитов. На основании поверхностных маркёров различают несколько субпопуляций T-лимфоцитов, выполняющих различные функции. Для дифференциров-ки Т-клеток применяют набор моноклональных АТ, выявляющих поверхностные маркёрные CD-Аг [от англ. cluster of differentiation, кластер дифференцировки]. Все зрелые Т-клетки экспрессируют поверхностный CD3-A^ помимо него субпопуляции Т-лимфоцитов также экспрессируют и другие CD-Аг.

CD4⁺ -лимфоциты. Мембранные молекулы CD4 несут различные популяции клеток, условно разделяемые на регуляторные (хелперы) и эффекторные (T^).

T-хелперы [от англ. to help, помогать] специфически распознают Аг и взаимодействуют с макрофагами и В-клетками в ходе индукции гуморального иммунного ответа. Отношение CD4+/CD8+-клеток - важный параметр оценки иммунного статуса; в нормальных условиях отношение CD4+/CD8+ приблизительно равно двум и отражает доминирующее влияние на иммунный ответ стимулирующих факторов. При некоторых иммунодефицитных состояниях отношение обратное (менее 1, то есть CD8+-клетки доминируют), указывая на преимущественное влияние иммуносупрессорных эффектов; лежит в основе патогенеза многих иммунодефицитов (например, СПИДа). Аг-распознающие Т-лимфоциты «узнают» чужеродный эпитоп вирусного или опухолевого Аг в комплексе с молекулой MHC на плазматической мембране клетки-мишени.

Т_ГЗТ [T-эффекторы реакций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)] опосредуют реакции ГЗТ.

CDS'''-лимфоциты. Мембранные Аг CD8 экспрессируют субпопуляции T-клеток, разделяемые на регуляторные (супрессоры) и эффекторные (цитотоксические T-лимфоциты). Т-супрессоры [от англ. to supress, подавлять] регулируют интенсивность иммунного ответа, подавляя активность CD4+-клеток. T-супрессоры предотвращают развитие аутоиммунных реакций, защищают организм от нежелательных последствий иммунных реакций. Эти клетки обеспечивают толерантность матери к чужеродным Аг, представленным на клетках вынашиваемого плода. Это даёт возможность развиваться чужеродному в иммунном отношении плоду в организме матери. T-супрессоры дифференцируются из предшественников в результате антигенной стимуляции. По-видимому, активация супрессоров находится вне контроля MHC, и представления Аг макрофагом не требуется. Аутоантигены могут стимулировать развитие ауторегуляторных T-супрессоров. Чужеродные Аг в неиммуногенной форме (гаптены) или иммуногенные Аг в очень высокой концентрации также способны индуцировать специфическую супрессорную активность клеток. После распознавания Аг зрелые лимфоциты препятствуют развитию иммунного ответа, действуя непосредственно на клетки или секретируя супрессорные факторы. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), или Т-киллеры [от англ. to kill, убивать] лизируют клетки-мишени, несущие чужеродные или видоизменённые аутоантигены (например, клетки опухолей, трансплантатов, инфицированные вирусами, клетки, несущие поверхностные вирусные Аг). В большинстве случаев функция ЦТЛ также MHC-рестригирована - ЦТЛ распознаёт чужеродный вирусный, опухолевый или трансплантационный Аг в комплексе с молекулой MHC I на мембране клетки-мишени. Индукция цитотоксических свойств клетки-предшественницы T-киллера происходит под действием двух сигналов. Первый сигнал включает взаимодействие между двумя комплексами: поверхностной молекулой CD8 лимфоцита и комплексом эпитоп-молекула MHC I на клетке-мишени. Второй сигнал - ИЛ, секретируемые близлежащими макрофагами и Т-клетками. T-хелпер играет ключевую роль в стимуляции ЦТЛ в качестве источника необходимых цитокинов, усиливающих их пролиферацию и созревание до функционально активных ЦТЛ. Цитотоксический эффект T-киллеров реализуется через образование в клетках-мишенях пор под действием особых белков - перфоринов. Нарушение осмотического баланса с внеклеточной средой приводит к гибели клетки. Т-клетки памяти образуются при первичном иммунном ответе. Специфически распознают Аг и участвуют иммунном ответе при вторичном попадании Аг. Большинство клеток памяти обладает функциями Т-клеток, экспрессируют CD4 и рестригированы по молекулам MHC II, то есть узнают Аг только на Аг-представляющих клетках в связи с молекулой MHC II.

B-лимфоциты

Известны субпопуляции В-клеток: предшественники антителообразующих (плазматических) клеток и В-клетки памяти (эффекторы вторичных иммунных реакций). Доминирующую субпопуляцию составляют предшественники антителообразующих клеток, дифференцирующиеся после антигенной стимуляции в плазматические клетки (плазмоциты), синтезирующие Ig.

Созревание В-лимфоцитов

Из костного мозга пре-В-клетки мигрируют в тимуснезависимые зоны лимфоидных органов. Так, в физиологических условиях в селезёнке В-лимфоциты располагаются в краевой зоне белой пульпы, в лимфатических узлах - в наружной зоне кортикального слоя, где они формируют зародышевые центры фолликулов. Сигналы, определяющие судьбу и дифференци-ровку этих иммунокомпетентных клеток, поступают из красного костного мозга, стромальных клеток и других клеток иммунной системы. На периферии (вне костного мозга) В-лимфоциты приобретают характерные для них поверхностно-клеточные маркёры. Продолжительность жизни В-лимфоцитов различна - от многих лет (В-клетки памяти) до нескольких недель (клоны плазматических клеток).

После антигенной стимуляции В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки (интенсивно синтезирующие и секретирующие АТ) и В-клетки памяти. Плазматические клетки синтезируют Ig того же класса, что и мембранный Ig В-лимфоцита-предшественника.

Маркёры В-клеток. Основные маркёры В-лимфоцитов -мембранные Ig; при этом клетки одного клона (быстро формирующегося в результате серии последовательных делений потомства одной В-клетки) экспрессируют молекулы Ig, специфически связывающие только один эпитоп Аг. Такие клетки синтезируют моноклональные АТ, способные распознавать и связывать только один Аг. Аг-связывающий участок мембранного Ig В-лимфоцита играет роль клеточного Аг-распознающего рецептора. Помимо мембранных Ig, В-лимфоцит несёт другие маркёры: рецепторы Fc-фрагмента Ig, CD10 (на незрелых В-клетках), CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 (вероятно, участвуют в клеточной активации), рецепторы к С3Ь и C3d, молекулы MHC классов I и II.

Естественные киллеры

Популяцию естественных киллеров [NK-клеток (от англ. natural killer, естественный киллер)] составляют большие зернистые лимфоциты, уничтожающие ауто-, алло- и ксеногенные опухолевые клетки, а также клетки, инфицированные вирусами, бактериями и простейшими. NK-клетки не имеют основных маркёров Т- или В-лимфоцитов (поэтому их также называют нулевые лимфоциты), но экспрессируют дифференцировочные CD2, CD56 и CD16 (рецептор Fc-фрагмента АТ) Аг. В отличие от цитотоксических лимфоцитов, способность NK-клеток к цитолизу связана со самостоятельным распознаванием «своё-чужое» на поверхности мишени. NK-клетки уничтожают клетку-мишень после установления с ней прямого контакта при помощи специальных белков - перфоринов. Перфорины встраиваются в мембрану чужеродной или трансформированной клетки, образуя в ней «дыру», приводящую к необратимому и гибельному выравниванию ионного состава между цитоплазмой и внешней средой. Активность NK-клеток регулируют цитокины (у-ИФН и ИЛ-2 усиливают их цитолитическую активность). Наряду с макрофагами, нейтрофилами и эозинофилами, они также участвуют в антителозависимом кле-точно-опосредованном цитолизе. Для этого NK-клетки экспрессируют на своей поверхности рецептор Fc-фрагмента IgG (CD16). Реакция зависит от присутствия АТ, узнающих клетку-мишень и связывающихся с ней. Fc-фрагмент связанных с клеткой-мишенью АТ взаимодействует с рецептором Fc-фрагмента, встроенным в плазматическую мембрану NK-клетки. Природа агента, убивающего клетку-мишень в этом случае, не известна.

Аг-представляющие клетки

Важную роль в индукции и регуляции иммунного ответа играют мононуклеарные фагоциты. Участие макрофагов в иммунных реакциях включает неспецифическое поглощение Аг, их «переработку» (то есть расщепление на меньшие фрагменты) и представление Аг Т-лимфоцитам, образование ИЛ-1, а также других цитокинов (см. табл. 10-7). Помимо макрофагов, представлять Аг способны В-лимфоциты, фолликулярные клетки лимфатических узлов и селезёнки, клетки Лангерханса кожи и воздухоносных путей, М-клетки лимфатических фолликулов пищеварительного тракта, дендритные эпителиальные клетки вилочковой железы. Наряду с нейтро-филами и эозинофилами, макрофаги участвуют в антителозависимом клеточно-опосредованном цитолизе (имеют поверхностный рецептор к Fc-фрагменту IgG, представляющий CD16).

Иммунные реакции

Большинство иммунных реакций требует взаимодействия Аг-распознающих, Аг-представляющих, эффекторных и регуляторных клеток. Иммунные реакции традиционно разделяют на гуморальные (реализуются циркулирующими в средах организма АТ) и клеточные (реализуются при непосредственном контакте иммунокомпетентных клеток). Вместе с тем все иммунокомпетентные клетки - компоненты единой иммунной системы. Поэтому такое разделение носит условный характер, тем более, что АТ синтезируются клетками (плазмоцитами), а Т-лимфоциты проявляют свою активность через различные растворимые факторы (цитокины и хемокины).

Антигены

Аг - вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций (гуморальных, клеточных, состояние иммунной толерантности, индуцирование иммунной памяти). Свойства Аг определяются комплексом признаков: иммуногенность, антигенность, специфичность, чужеродность.

Способностью вызывать развитие иммунного ответа и определять его специфичность обладает фрагмент молекулы Аг - антигенная детерминанта (эпитоп), избирательно реагирующая с Аг-распознающими рецепторами и АТ. Антигенные детерминанты располагаются в областях Аг, обращённых к его микроокружению. Эпитоп - наименьшая распознаваемая единица Аг; молекула Аг может иметь несколько эпитопов, то есть быть поливалентной. Чем сложнее молекула Аг и чем больше у неё эпитопов, тем больше вероятность развития иммунного ответа. Структура многих антигенных детерминант известна. Например, в полипептидной последовательности эпитопом может быть фрагмент из 7-8 аминокислотных остатков; свойства анти-генности и специфичности определяются также пространственной конфигурацией фрагмента.

Моноклональные AT специфически распознают только одну Аг-детерминанту и связываются с ней. Поликлональные АТ, как правило, распознают несколько антигенных детерминант в составе Аг.

Валентность Аг. Белки содержат несколько Аг-детерминант. Количество молекул АТ, связывающих все эпитопы, определяет валентность Аг (возрастает пропорционально увеличению молекулярной массы белковой молекулы).

Классификация Аг

Аг разделяют на иммуногёны, гаптёны и толерогёны.

Иммуногены

Большая часть Аг способна запускать иммунные реакции, выступая в последующем в качестве мишени, в отношении которой эти реакции реализуются. Иначе иммуногены известны как полные Аг. Часть Аг имеют малые размеры и простое строение, тогда как другие представляют крупные и сложные молекулы, содержат множество эпитопов, каждый из которых распознают различные рецепторы лимфоцитов и/или АТ.

Гаптены

Гаптены [от греч. hapto, прикрепляться] обладают антигенностью (то есть взаимодействуют со специфическими АТ), но не иммуногенны (то есть не способны запускать иммунные реакции). Иначе гаптены известны как неполные Аг. Как правило, они имеют небольшую молекулярную массу и не распознаются иммунокомпетентными клетками. Гаптены могут быть простыми и сложными: простые гаптены взаимодействуют с АТ в организме, но не способны реагировать с ними in vitro; сложные гаптены взаимодействуют с АТ in vivo и in vitro. Гаптены могут стать иммуногенными при связывании с высокомолекулярным носителем, обладающим собственной иммуногенностью . Например, хром и никель, связываясь с белками кожи, способны вызвать аллергический контактный дерматит, развивающийся при повторных соприкосновениях кожи с хромированными или никелированными предметами. При этом антигенные детерминанты гаптена полностью маскируют аналогичные структуры носителя. Непреципитирующие гаптены взаимодействуют с АТ, блокируют их, но не образуют видимых преципитатов. АТ, связавшиеся с такими гаптенами, не реагируют с полными Аг, вызывающими образование АТ. Преципитирующие гаптены образуют видимые преципитаты при взаимодействии со специфическими АТ. Свойствами преципитирующих гаптенов обладают полисахариды энтеробакте-рий и пневмококков.

Полугаптены - неорганические вещества (например, йод или хром), присоединение которых к молекуле белка меняет его иммуногенные свойства. Образующиеся АТ специфичны к йоду или хрому, т.е. к детерминантам на поверхности полного Аг, но не к белку-носителю.

Проантигены - гаптены, способные присоединяться к белкам организма и сенсибилизировать его как аутоантигены. Например, метаболиты грибков пенициллов или продукты распада пенициллинов могут связывать белки и вызывать развитие к ним иммунных реакций.

Адъюванты

Адъюванты [от лат. adjuvans, помогать] - вещества, введение которых одновременно с Аг (или гаптеном) усиливает иммунный ответ. Другими словами, адъювант - носитель, повышающий иммуногенность различных Аг и гаптенов. Распространённые адъюванты - суспензии неорганических веществ, на которых адсорбируется Аг. Классический пример - коллоидная суспензия из убитых туберкулёзных палочек, вазелина, ланолина, известная также как полный адъювант Фройнда.

Толерогены

Особую группу составляют Аг, способные подавлять иммунные реакции с развитием специфической неспособности отвечать на них. Это состояние известно как иммунная толерантность. Благодаря генетическому разнообразию индивидуумов, вещество-иммуноген для одного из них, может быть толерогеном для другого. Действуя как иммуноген при парентеральном введении (например, внутримышечно), то же вещество может быть толерогеном при введении другим путём (например, пероральным).

Природа и специфичность Аг

В роли Аг выступают белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты; эти соединения могут образовывать комбинации между собой или с липидами. Сами липиды неиммуногенны, что определяется недостаточной жёсткостью структуры этих молекул и преимущественно линейной конфигурацией. Наибольшей иммуногенностью обладают белковые Аг. Чем дальше от человека в эволюционном отношении отстоят организмы, тем большую иммуногенность проявляют их белки. Примеры сильных иммуногенов - бактериальные экзотоксины, вирусная нейрамини-даза и гемолизины, H-Аг бактерий.

Молекулярная масса Аг имеет существенное значение. Вещества с массой более 5-10 кД - сильные иммуногены. Исключение - нуклеиновые кислоты, обладающие большой молекулярной массой, но слабой (по сравнению с белками) иммуногенностью.

Растворимость - важное условие для проявления иммуногенности Аг. Нерастворимые белки (например, кератины) не могут находиться в коллоидной фазе и не вызывают развития иммунных реакций.

Специфичность Аг

По способности специфично взаимодействовать с АТ выделяют несколько типов Аг: видовые, групповые, гетерогенные, аллоантигены.

Видовые Аг представлены антигенными детерминантами, присутствующими у особей одного вида. Отдельные штаммы микроорганизмов могут содержать внутривидовые Аг, по которым их разделяют на серологические варианты (серовары).

Групповые Аг представлены антигенными детерминантами, обусловливающими внутривидовые различия у особей одного вида, что позволяет разделять их на группы.

Гетерогенные (перекрёстно реагирующие) Аг представлены антигенными детерминантами, общими для организмов разных таксономических групп. Характерный представитель -полисахаридный Аг Форссмана, присутствующий в эритроцитах кошек, собак, овец и почке морских свинок. У человека типичные перекрёстные Аг является Rh-система эритроцитов: Rh-Аг человека перекрёстно агглютинируют АТ к эритроцитам обезьян Macacus rhesus. Известны общие Аг эритроцитов человека и палочки чумы, вирусов оспы и гриппа. Перекрёстно реагирующие Аг могут блокировать способность Аг-распознающих клеток идентифицировать чужеродные структуры. Например, сходство Аг эритроцитов группы 0 и чумной палочки затрудняет распознавание последних иммунной системой; во многом это обусловливает высокую смертность от чумы.

Аллоантигены (изоантигены) - Аг конкретного индивидуума, обладающие иммуногенностью по отношению к другим представителям этого вида, но не к организму-донору трансплантата. Яркий пример изоантигенов - групповые Аг крови, присутствующие на мембранах эритроцитов и других клеток. Поскольку человек обладает естественными АТ к групповым Аг крови, последние приобретают свойства сильных трансплантационных Аг. Поэтому перед трансплантацией и гемотрансфузией необходимо определить группы крови донора и реципиента. У микроорганизмов имеются собственные изоантигены, также известные как типоспецифичные Аг. Например, по составу полисахаридных Аг пневмококки подразделяют на типы I, II, III и т.д., а возбудителей ботулизма - на типы A, B, C, D и т.д.

Органо- и тканеспецифические Аг

Многие ткани организма человека имеют большое количество собственных Аг. Их идентификация позволяет различать клетки отдельных тканей, а также определять изменения в клетках при дифференцировке и трансформации.

Патологические Аг

Некоторые воздействия могут вызывать изменения клеточных молекул (в первую очередь белков), придавая им антигенные свойства. Например, под действием излучения или высокой температуры в организме образуются так называемые лучевые или ожоговые Аг. Нормальный набор клеточных Аг может изменяться в результате злокачественного перерождения, что приводит к появлению аномальных Аг. Такие опухолевые Аг (или онкоантигены) - важные маркёры злокачественного роста; их выявление - один из важных методов диагностики опухолей.

Аутоантигены

Некоторые Аг при определённых условиях способны проявлять аутоантигенные свойства и индуцировать синтез аутоантител. Такие аутоантигены разделяют на врождённые и приобретённые.

Врождённые аутоантигены. Некоторые ткани организма обладают антигенными свойствами и запускают иммунные реакции в собственном организме. К ним относятся головной мозг, глаз (передняя камера, роговица, хрусталик, сетчатка, стекловидное тело), семенные канальцы яичек, фолликулы щитовидные железы, подкожная жировая клетчатка, волосяные луковицы, рубцовая ткань. В норме Аг этих органов находятся вне иммунного надзора (так называемые иммунно-привилегированные области организма). При повреждении этих органов возможен контакт ауто-антигенов с иммунокомпетентными клетками и развитие аутоиммунных реакций.

Приобретённые аутоантигены. Способностью запускать аутоиммунные реакции обладают ткани, находящиеся в зоне иммунного надзора, и изменяющие свои антигенные свойства под различными воздействиями (ЛС, переохлаждение, вирусные и бактериальные инфекции).

Суперантигены

Суперантигены - Аг, способные непосредственно и без предварительной «переработки» Аг-представляющими клетками взаимодействовать с молекулами MHC. В подобных ситуациях распознавание Аг теряет строгую избирательность, перестаёт быть «правом» Аг-специфических лимфоцитов и вовлекает большие группы Т-клеток. Их активация сопровождается избыточной продукцией различных медиаторов иммунного ответа, что приводит к ряду нежелательных реакций. Избыток цитокинов вызывает интоксикацию организма. В поликлональную активацию могут быть вовлечены Т-клетки, способные распознавать аутоантигены, что может привести к развитию аутоиммунных реакций. Свойства суперантигены проявляют Аг микоплазм, стрептококков, кампилобактеров и др.

Аг микроорганизмов

Большинство возбудителей инфекционных заболеваний человека, их структуры и токсины - полноценные Аг, вызывающие развитие иммунных реакций.

Аг бактерий. По расположению в бактериальной клетке выделяют Аг: капсульные (К- Аг; у видов, образующих капсулу), соматические (О-Аг) и жгутиковые (Н-Аг) (рис. 10-6).

О-Аг большинства бактерий представлены термостабильным липополисахаридно-полипептидным комплексом; у грамотрицательных бактерий О-Аг представляет эндотоксин. Термолабильные Н-Аг образованы белком флагеллином. Капсульные Аг большинства бактерий имеют полисахаридную природу. У сальмонелл также выделен термолабильный Vi-Аг (Аг вирулентности), выявление которого имеет важное значение для серотипирования бактерий.

Особую группу составляют протективные Аг [от лат. pwtectio, защита] - термолабильные белки, иммунизация которыми защищает лабораторных животных от гибели после заражения летальными дозами патогенных микроорганизмов. В настоящее время подобные Аг выделены у возбудителей сибирской язвы, чумы, бруцеллёза, туляремии и коклюша. Нередко протективные

Аг применяют для изготовления вакцин.

Аг вирусов. Заражённые вирусами клетки начинают экспрессировать вирусоспецифичес-кие Аг, что изменяет состав мембранных Аг MHC. Появление мембранных вирусспецифических Аг - характерная особенность и маркёр вирусной инфекции.

Тимуснезависимые Аг

Большинство иммунных реакций запускает взаимодействие Аг с Аг-распознающими Т-лимфоцитами (Т-хелперами) и Аг-представляющими клетками (обычно макрофагами). Т-лимфоциты стимулируют «переработку» Аг макрофагами и сборку эпитопов, обеспечивающую специфический сигнал эффекторных клеток. Источник второго (неспецифического) сигнала являются Т-хелперы. Поскольку ответ на такие Аг требует участия Т-лимфоцитов, их также обозначают термином «тимусзависимые Аг». Однако существуют Аг, структура которых сама напоминает «обойму», образуемую Аг-представляющими клетками. Таковыми являются поли- и ЛПС бактерий, представляющие жёсткую цепь с густо расположенными, регулярно чередующимися и аналогичными друг другу Аг-детерминантами. Для таких мультигаптенных молекул не нужен неспецифический, Т-клеточный сигнал и их также обозначают как «тимуснезависимые Аг».

Гуморальные иммунные реакции

В гуморальных иммунных реакциях участвуют три клеточных типа: макрофаги (Аг-представляющие клетки), Т-хелперы и В-лимфоциты (рис. 10-7).

Аг-представляющие клетки фагоцитируют микроорганизм и перерабатывают его, расщепляя на фрагменты (процессинг Аг). Фрагменты Аг выставляются на поверхности Аг-представляю-щей клетки вместе с молекулой MHC. Комплекс «Аг-молекула MHC класса II» предъявляется Т-хелперу. Распознавание комплекса Т-хелпером стимулирует секрецию ИЛ-1 макрофагами.

T-хелпер под действием ИЛ-1 синтезирует ИЛ-2 и рецепторы к ИЛ-2; последний по ауток-ринному механизму стимулирует пролиферацию Т-хелперов, а также ЦТЛ. Таким образом, после взаимодействия с Аг-представляющей клеткой Т-хелпер приобретает способность отвечать на действие ИЛ-2 бурным размножением. Биологический смысл этого явления состоит в накоплении Т-хелперов, обеспечивающих образование в лимфоидных органах необходимого пула плазматических клеток, вырабатывающих АТ к данному Аг.

B-лимфоцит. Активация B-лимфоцита предполагает прямое взаимодействие Аг с молекулой Ig на поверхности B-клетки. В этом случае сам B-лимфоцит перерабатывает Аг и представляет его фрагмент в связи с молекулой MHC II на своей поверхности. Этот комплекс распознаёт Т-хелпер, отобранный при помощи того же Аг. Узнавание рецептором Т-хелпера комплекса Аг-молекула MHC класса II на поверхности B-лимфоцита приводит к секреции Т-хелпером ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 и у-ИФН, под действием которых B-клетка размножается, образуя клон плазматических клеток (плазмоцитов). Плазмоциты синтезируют АТ. Секрецию АТ стимулирует ИЛ-6, выделяемый активированными Т-хелперами. Часть зрелых В-лимфоцитов после антиген-зависимой дифференцировки циркулирует в организме в виде клеток памяти.

Антитела

АТ - эффекторные молекулы гуморального иммунитета. Синтез АТ запускают Аг, поступающие в организм извне (при инфекциях, вакцинации, действии ксенобиотиков) или образующиеся эндогенно. Как правило, АТ специфически взаимодействует с комплементарным Аг. Существуют, однако, АТ, взаимодействующие с Аг-детерминантами, общими для различных Аг. Такие АТ известны как перекрёстно реагирующие, или гетероспецифичные. АТ существуют в миллионах разновидностях, и каждая молекула имеет уникальный участок связывания Аг-детерминанты. В большинстве случаев АТ представлены сывороточными гликопротеинами, мигрирующими в составе медленной фракции у-глобулинов при электрофорезе белков сыворотки крови. Поэтому для обозначения сывороточной фракции АТ иногда применяют термин «у-глобулины». АТ также называют «иммуноглобулины». АТ образуют одну из основных фракций белков крови, составляя 20% массы общего белка плазмы. АТ устойчивы к действию слабых кислот и щелочей, а также к нагреванию до 60 °С. Структурная единица АТ - мономер - молекула цилиндрической формы, состоящая из двух идентичных тяжёлых Н-цепей [от англ. heavy, тяжёлый] и двух идентичных лёгких L-цепей [от англ. light, лёгкий]. Тяжёлые и лёгкие цепи Ig состоят из аминокислотных остатков и соединены дисульфидными (-S-S-) связями (рис. 10-8). В цепях различают вариабельную область, или V-область [от англ. various, разный], и константную область, или C-область [от англ. constant, постоянный]. V-область у разных АТ варьирует. V-области L- и H-цепей образуют Аг-евязывающий центр (активный центр АТ, паратоп), или Fab-фрагмент [от англ. fragment, фрагмент, + antigen biding, связывающий Аг]. Константная область молекулы называется Fc-фрагмент [от англ. fragment crystallizable, фрагмент кристализации]. В месте соединения Fab- и Fc-фрагментов расположена шарнирная область, позволяющая Аг-связывающим фрагментам разворачиваться для более тесного контакта с Аг.

Fab- фрагмент

Fab-фрагменты АТ взаимодействуют с антигенными детерминантами. Аг-связывающий центр комплементарен эпитопу Аг (принцип «ключ-замок»). Связывание Аг с АТ нековалентно и обратимо. Аффинность (сродство) Аг к АТ определяется физико-химическими свойствами взаимодействующих молекул и соотношением концентраций связанных и свободных Аг и АТ. На сродство влияют пространственное соответствие взаимодействующих участков молекул, электростатические, гидрофобные взаимодействия и силы Ван дер Ваальса. Авидность - интегральная характеристика силы связи между Аг и АТ, учитывающая взаимодействие всех активных центров с эпитопами Аг.

Валентность - число активных (Аг-связывающих) центров АТ. Молекула полного Ig как минимум двухвалентна. Такие АТ известны как полные АТ; мономеры с меньшей валентностью -неполные АТ.

Полные АТ (в частности IgM, IgG) вызывают агрегацию Аг, видимую невооружённым глазом (например, РА бактерий).

Неполные АТ содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны (например, АТ, вырабатываемые при бруцеллёзе). Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью. Неполные АТ функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные АТ могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных АТ; поэтому их также называют блокирующими АТ.

Fc-фрагмент

Константные участки тяжёлых цепей определяют характер взаимодействий АТ с клетками и молекулами иммунной системы, в частности, специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами (например, фагоцитами, тучными клетками), несущими на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагменту. Fc-фрагмент определяет также эффекторные функции АТ (например, активацию комплемента). Для реализации этих свойств сразу после связывания Аг Fab-фрагментами происходят конформационные изменения структуры Fc-фрагментов. Пространственно изменённые Fc-фрагменты распознают фагоциты, именно они способствуют фиксации С1а-компонента комплемента и запуску комплементарного каскада по классическому пути. В противном случае ни клетки, ни эффекторные молекулы были бы не в состоянии отличить интактные АТ или АТ, связавшие Аг.

Взаимодействие АТ с Аг

Взаимодействие АТ с Аг включает специфическую и неспецифическую фазы.

Классы Ig

Константные участки лёгких цепей бывают двух типов - каппа (к) и лямбда (А,); константные участи тяжёлых цепей представлены пятью основными формами - мю (р), гамма (у), дельта (5), альфа (а) и эпсилон (е). Каждая из них ассоциирована с отдельным классом Ig. Выделяют 5 классов АТ: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM (рис. 10-9, табл. 10-8). Молекулы IgG, IgD и IgE представлены мономерами, IgM - пентамерами; молекулы IgA в сыворотке крови - мономеры, а в экск-ретируемых жидкостях (слёзная жидкость, слюна, секреты слизистых оболочек) - димеры.

IgM синтезируются при первичном попадании Аг в организм. Пик образования приходится на 4-5-е сутки с последующим снижением титра. Образование IgM к некоторым Аг (например, жгутиковым Аг бактерий) осуществляется постоянно. К IgM относят значительную часть АТ, вырабатывающихся к Аг грамотрицательных бактерий. Наличие IgM к Аг конкретного возбудителя указывает на острый инфекционный процесс. Молекула IgM - пентамер; пять субъединиц соединены J-цепью [от англ. joining, связывающий], в результате чего молекула IgM приобретает 10 Аг-связывающих участков. Молекулы IgM опсонизируют, агглютинируют, преципи-тируют и лизируют содержащие Аг структуры, а также активируют систему комплемента по классическому пути (для комплементзависимого лизиса бактерии достаточно одной молекулы IgM).

IgG - основной класс АТ (до 75% всех Ig), защищающий организм от бактерий, вирусов и токсинов. После первичного контакта с Аг синтез IgM обычно сменяется образованием IgG. Максимальные титры IgG при первичном ответе наблюдают на 6-8-е сутки. Обнаружение высоких титрое IgG к Аг конкретного еозбудителя указыеает на то, что организм находится на стадии реконеалесценции или конкретное заболееание перенесено недаено. В особо больших количествах IgG синтезируется при вторичном ответе. IgG представлены 4 подклассами: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; их относительное содержание (в %) составляет соответственно 6670, 23, 7-8 и 2-4. IgG непосредственно участвуют в реакциях иммунного цитолиза, реакциях нейтрализации, а также усиливают фагоцитоз, действуя как опсонины и связывая рецепторы Fc-фрагмента в мембране фагоцитирующих клеток (в результате этого фагоциты эффективнее поглощают и лизируют микроорганизмы). Только IgG способны проникать через плаценту, что обеспечиеает формироеание у плода пассиеного иммунитета.

IgA циркулируют в сыворотке крови (составляет 15-20% от всех Ig), а также секретируются на поеерхность эпителиее. Присутствуют в слюне, слёзной жидкости, молоке и на поверхности слизистых оболочек. АТ класса IgG усиливают защитные свойства слизистых оболочек пищеварительного тракта, дыхательных, половых и мочевыделительных путей. В сыворотке крови IgA циркулируют в виде двухвалентных мономеров; в секретируемых жидкостях преобладают четырёхвалентные димеры, содержащие одну J-цепь и дополнительную полипептидную молекулу (синтезируемый эпителиальными клетками секреторный компонент). Эта молекула присоединяется к мономерам IgA в ходе их транспорта через эпителиальные клетки на поверхность слизистых оболочек. Секреторный компонент участвует не только в связывании молекул IgA, но обеспечивает их внутриклеточный транспорт и выделение на поверхность слизистых, а также защищает IgA от переваривания протеолитическими ферментами (рис. 10-10). Молекулы IgA участвуют в реакциях нейтрализации и агглютинации возбудителей. Кроме того, после образования комплекса Аг-АТ они участвуют в активации комплемента по альтернативному пути.

IgE специфически взаимодействуют с тучными клетками и базофильными лейкоцитами, содержащими многочисленные гранулы с БАВ. Их выделение из клетки (дегрануляция) вызывает резкое расширение просвета венул и увеличение проницаемости их стенки. Подобную картину можно наблюдать при аллергических реакциях (например, бронхиальной астме, аллергическом рините, крапивнице). Аг-связывающие Fab-фрагменты молекулы IgE специфически взаимодействуют с Аг, попавшим в организм. Сформированный иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc-фрагментов IgE, встроенных в клеточную мембрану базофила или тучной клетки. Это взаимодействие и является сигналом для дегрануляции с высвобождением гистамина и других БАВ и развёртыванием острой аллергической реакции. Защитные свойства IgE направлены преимущественно против гельминтов (нематод). Синтез IgE увеличивается при паразитарных инвазиях, IgE-монокло-нальной миеломе, а также первичных иммуно-дефицитах (атаксия-телеангиэктазия, синдромы Вйскотта-Олдрича, Незелофа, Ди Джорджи).

IgD. Биологическая роль этой разновидности АТ не установлена. IgD обнаруживают на поверхности развивающихся B-лимфоцитов; в сыворотке крови здоровых лиц присутствует в очень низкой концентрации. Содержания IgD достигает максимума к 10 годам жизни; некоторое увеличение титров отмечают при беременности, у больных бронхиальной астмой, системной красной волчанкой и лиц с иммунодефицитами.

Генерация разнообразия АТ

Кроме различных классов Ig, между молекулами АТ существуют аллотипические, изотипические и идиотипические отличия. Аллотипы. Аллотипические детерминанты расположены на лёгких и тяжёлых цепях Ig, генетически детерминированы и строго индивидуальны для каждого организма. Их образование обусловлено различиями небольших аминокислотных последовательностей константных участков тяжёлых и лёгких цепей в результате незначительного полиморфизма генов, кодирующих их синтез. Аллотипические различия не влияют на функциональные свойства молекул АТ и характеризуются моногенным (менделевским) наследованием.

Изотипы. Изотипические детерминанты носят видовые признаки и идентичны у всех представителей одного вида. По их структуре различают классы и подклассы тяжёлых цепей и варианты лёгких цепей. Образование изотипических детерминант обусловлено более существенными структурными различиями в составе цепей, влияющими на функциональные свойства АТ.

Идиотипы. Идиотипические детерминанты определяют индивидуальную характеристику конкретного АТ и соответствуют его Аг-связывающим участкам. Все молекулы Ig, продуцируемые отдельным лимфоцитом и его потомками (то есть клоном плазматических клеток), несут один и тот же идиотип и обозначаются термином «моноклональные АТ».

Основные типы АТ

АТ обычно разделяют в соответствии с типом их реакций с Аг.

Основные функции АТ

АТ через Аг-связывающие центры взаимодействуют с различными Аг. Тем самым АТ предотвращают инфицирование или элиминируют возбудитель либо блокируют развитие патологических реакций, активируя при этом все системы специфической защиты.

Опсонизация (иммунный фагоцитоз). АТ (через Fab-фрагменты) связываются с клеточной стенкой микроорганизма; Fc-фрагментом АТ взаимодействует с соответствующим рецептором фагоцита. Это опосредует последующее эффективное поглощение фагоцитом образовавшегося комплекса.

Антитоксический эффект. АТ могут связывать и, тем самым, инактивировать бактериальные токсины.

Активация комплемента. АТ (IgM и IgG) после связывания с Аг (микроорганизм, опухолевая клетка и др.) активируют систему комплемента, что приводит к уничтожению этой клетки путём перфорации её клеточной стенки, усиления хемотаксиса, хемокинеза и иммунного фагоцитоза.

Нейтрализация. Взаимодействуя с рецепторами клетки, связывающими бактерии или вирусы, АТ могут препятствовать адгезии и проникновению микроорганизмов в клетки организма-хозяина.

Циркулирующие иммунные комплексы. АТ связывают растворимые Аг и образуют циркулирующие комплексы, с помощью которых Аг выводится из организма, преимущественно с мочой и жёлчью.

Антителозависимая цитотоксичность. Опсонизируя Аг, АТ стимулируют их разрушение цитотоксическими клетками. Аппарат, обеспечивающий распознавание мишеней, - рецепторы к Fc-фрагментам АТ. Разрушать опсонизированные мишени способны макрофаги и грану-лоциты (например, нейтрофилы).

Динамика антителообразования

На скорость образования АТ влияет ряд факторов: доза Аг (сила Аг-воздействия), частота Аг-стимуляции и состояние иммунной системы индивида (то есть его иммунный статус). Если организм впервые встречается с Аг, то развивается первичный иммунный ответ, а при повторном контакте - вторичный ответ (рис. 10-11).

Первичный ответ. Появлению АТ предшествует латентный период продолжительностью 3-5 сут. В это время происходит распознавание Аг и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза, соответствующая поступлению АТ в кровь; её продолжительность- 7-15 сут. Постепенно титры АТ достигают пика и наступает стационарная фаза, продолжительностью 15-30 сут. Её сменяет фаза снижения титров АТ, длящаяся 1-6 мес. В основу пролиферации клеток-продуцентов АТ заложен принцип селекции. В динамике антителообразования титры высокоаффинных АТ постепенно нарастают: после иммунизации аффинность АТ к Аг постоянно уееличиеается. Первоначально образуются IgM, но постепенно их образование уменьшается и начинает преобладать синтез IgG. Так как переключение синтезов от IgM к IgG не меняет идиотипа АТ (то есть его специфичность по отношению к конкретному Аг), то оно не связано с клональной селекцией. Особенности переичного отеета - низкая скорость антителообразоеания и пояеление сраенительно нееысоких титрое АТ.

Вторичный ответ. После антигенной стимуляции часть В- и Т-лимфоцитов циркулирует в виде клеток памяти. Особенности еторичного иммунного отеета - еысокая скорость анти-телообразоеания, пояеление максимальных титрое АТ и длительное (иногда многолетнее) их циркулироеание. Основные характеристики вторичного ответа:

Клеточные иммунные реакции

Помимо образования АТ, реализующих гуморальные реакции иммунитета, иммунная система в ряде случаев связывает и элиминирует Аг при непосредственном участии эффекторных иммунокомпетентных клеток (клеточно-опосредованный иммунный ответ). При этом иммунокомпе-тентные клетки, как и при гуморальных иммунных реакциях, сначала должны распознать Аг, а затем мобилизовать другие клетки для элиминации Аг и несущих их клеток. При клеточно-опосредованном иммунном ответе Аг-распознающие рецепторы остаются связанными с мембраной Т-лимфоцита. Подобно гуморальному, клеточный иммунный ответ специфичен: Т-клетки распознают и реагируют с Аг либо в комплексе с молекулой MHC I на поеерхности чужеродных клеток, либо распознают и реагируют с эндогенными иммуногенами в комплексе с молекулой MHC класса I на поеерхности собстеенных еирус-инфицироеанных и опухолееых клеток.

Эффекторы клеточных иммунных реакций - цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) и Т-клетки ГЗТ (Тгзт). Ключевое различие в функциональной активности состоит в том, что ЦТЛ обладают прямой цитотоксичностью, в то время как Тгзт преимущественно вовлекают в ответ клетки других типов. Тгзт отличаются от ЦТЛ и по мембранным CD-Аг: первые имеют CD4, вторые - CD8.

Индукция T-клеточно-опосредованных реакций. Развитие Т-клеточно-опосредованных реакций имеет много общего с опосредованными АТ гуморальными реакциями и также начинается с поглощения и процессинга Аг Аг-представляющими клетками (макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерханса). Обязательное услоеие езаимодейстеия Аг-предстаеляющей клетки и Т-лимфоцита - идентичность молекул MHC (то есть Аг распознаётся, будучи представленным Т-лимфоциту только в контексте собственного аллельного варианта молекулы MHC на поверхности макрофага). СБ4⁺ -клетки распознают Аг е сочетании с молекулами MHCII, а СБ8+-клетки - е сочетании с молекулами MHCI. Другими словами, Аг-реактивные (сенсибилизированные) Тгзт и ЦТЛ образуются только при взаимодействии процессированного Аг и экспрессированных гликопротеинов комплекса MHC.

Уничтожение клетки-мишени цитотоксическими Т-лимфоцитами. Представленный на поверхности клетки-мишени Аг в комплексе с молекулой MHC I связывается с рецептором ЦТЛ. В этом процессе участвует молекула CD8 клеточной мембраны Т-клетки. Секретируемый Т-хелперами ИЛ-2 стимулирует пролиферацию ЦТЛ. ЦТЛ раыюзнаёт клетку-мишень и прикрепляется к ней. В цитоплазме активированного ЦТЛ присутствуют мелкие гранулы, концентрирующиеся в той части ЦТЛ, которая расположена в области контакта с клеткой-мишенью. Параллельно происходит переориентация цитоcкелета, смещение в эту область комплекса Гольджи, в котором и формируются эти гранулы. Гранулы содержат белок перфорин. Выделяемые ЦТЛ молекулы перфорина полимеризуются в мембране клетки-мишени в присутствии Ca² + и формируют перфориновые поры, пропускающие воду и ионы, но не молекулы белка. В результате клетка-мишень погибает вследствие быстрого выравнивания ионного состава клетки и межклеточного пространства. Cам лимфоцит защищён от цитотоксического действия перфорина. Механизмы подобной самозащиты остаются неизвестными.

Альтернативный механизм уничтожения клетки-мишени. Нашло подтверждение представление о другом механизме цитотоксического действия, согласно которому ЦТЛ и NK-клетки - источники сигнала, запускающего уже предcущеcтвующую cуицидальную программу в клетке-мишени. Действие этого сигнала усиливают глюкокортикоиды. Реакции ГЗТ. Тгзт-клетки распознают чужеродные Аг (преимущественно микроорганизмы), секретируют у-ИФН и другие лимфокины, стимулируя тем самым цитотоксичность макрофагов и усиливая другие Т- и В-клеточные ответы. ГЗТ - местный клеточно-опосредоеанный иммунный отеет. Реакции ГЗТ могут развиваться в любой ткани, но исторически их рассматривают в контексте кожного тестирования (например, проба с туберкулином). Кожная реакция ГЗТ развивается только у сенсибилизированного индивидуума приблизительно через 24-48 ч после внутри-кожного введения Аг. В месте инъекции возникают эритема, уплотнение или, как крайняя степень реакции, некроз. Развитием ГЗТ на вводимый Аг отвечают только организмы с предсуществующей сенсибилизацией. Гистологически реакция ГЗТ характеризуется инфильтрацией очага: сначала нейтрофилами, затем лимфоцитами и макрофагами. Развитие реакции ГЗТ включает комплекс межклеточных взаимодействий, ведущих к активации макрофагов. Сенсибилизированные Тгзт распознают эпитопы (чаще внутриклеточных патогенов), представленные на мембране дендритных клеток, и секретируют цитокины, активирующие макрофаги и привлекающие другие провоспалительные клетки. Активированные макрофаги в свою очередь секретируют множество БАВ, вызывающих воспаление и уничтожающих бактерии, опухоли и другие чужеродные клетки. К этим БАВ относят цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа), активные метаболиты кислорода (О^- , ОН^- , OCl^- , Н₂ О₂ и др.), протеазы, катионные белки, лизоцим и лактоферрин.

ИММУННАЯ ПАМЯТЬ

Иммунная память - способность иммунной системы отвечать на вторичное проникновение Аг быстрым развитием специфических реакций по типу вторичного иммунного ответа. Реализацию этого эффекта обеспечивают стимулированные Т- и В-лимфоциты, не выполняющие эффекторные функции. Феномен иммунной памяти проявляется как в гуморальных, так и в клеточных реакциях. Клетки памяти циркулируют в покоящемся состоянии, а при повторном контакте с Аг образуют обширный пул «Аг-представляющих» клеток (не следует путать с клетками макрофагально-моноцитарной системы, задействованных в первичном ответе). Иммунная память может сохраняться долгое время, поддерживаясь преимущественно Т-клетками памяти.

Бустер-эффект - феномен интенсивного развития иммунного ответа на вторичное попадание Аг [от англ. to boost, усиливать]. Его используют для получения лечебных и диагностических сывороток с высокими титрами АТ (гипериммунные сыворотки) от иммунизированных животных. Для этого животных иммунизируют Аг, а затем проводят повторное, бустерное его введение. Иногда повторную иммунизацию проводят несколько раз. Бустер-эффект также применяют для быстрого создания невосприимчивости при повторных вакцинациях (например, для профилактики туберкулёза).

Вакцинопрофилактика. Эффект иммунной памяти составляет основу вакцинопрофилактики многих инфекционных болезней. Для этого человека вакцинируют, а затем (через определённый временной интервал) ревакцинируют. Например, вакцинопрофилактика дифтерии включает повторные ревакцинации с интервалом 5-7 лет.

Иммунное реагирование при различных инфекциях

Иммунный ответ при вирусных инфекциях

Исход вирусных инфекций зависит от функциональной активности защитных факторов, ограничивающих диссеминирование либо элиминирующих инфекционный агент из поражённых тканей. В то же время, еыздороеление при острых еирусных инфекциях е значительной степени обуслоелено дейстеием неиммунных механизмое, таких как лихорадочная реакция, синтез ИФН и активность естественных киллеров (NK-клетки). Это связано с тем, что вирусные инфекции имеют короткий инкубационный период, а быстрая репродукция в первичном очаге и разнос возбудителя с кровотоком осуществляются до образования значимых титров вируснейтрализу-ющих АТ и формирования цитотоксических механизмов. Определённую роль в удалении вирусов играют фагоциты, поглощающие возбудитель, изолирующие и разрушающие инфицированные клетки. В ходе вирусных инфекций вырабатываются Ig классов M, G и А, но внутриклеточное персистирование часто защищает вирусы от нейтрализующего действия АТ. Выздоровление при хронических инфекциях в значительной степени обусловлено активностью цитотоксических иммунных механизмов, разрушающих инфицированные клетки (рис. 10-12).

Гуморальные иммунные реакции

Вирусоспецифические АТ появляются после распознавания иммуногенных структурных компонентов вирусов - капсидных белков безоболочных и поверхностных гликопротеинов оболочечных вирусов. Особо важную роль АТ играют в поддержании невосприимчивости к вирусным инфекциям. Их появление при повторном проникновении инфекционного агента или ревакцинации опосредовано активностью клеток памяти. Противовирусные АТ взаимодействуют с вирусными Аг на мембранах заражённых клеток, что ведёт к комплементзависимому цитолизу, анти-телозависимой цитотоксичности и проявлению активности ЦТЛ. При вирусных инфекциях образуются нейтрализующие и комплементсвязывающие АТ.

Нейтрализующие АТ оказывают защитное действие, препятствуя проникновению возбудителя в клетки. Эти АТ езаимодейстеуют с капсидными белками «голых» и поеерхностными гликопротеинами «одетых» еирусое.

Одна молекула АТ одновременно реагирует с двумя эпитопами капсидных белков, вызывая пространственную перестройку всей структуры капсида. Это нарушает взаимодействие вируса с клеточным рецептором или блокирует высвобождение вирусного генома после проникновения нуклеокапсида в цитоплазму.

Взаимодействие АТ с поверхностными гликопротеинами также ингибирует слияние оболочки с клеточной мембраной или мембранами эндосом, препятствуя высвобождению нуклеокапсида в цитоплазму.

Комплементсвязывающие АТ имеют важное значение при серологической диагностике вирусных инфекций. Противовирусный эффект реализуется через участие в комплементзависи-мом цитолизе заражённых клеток и комплементзависимом разрушении структуры вирусных оболочек. Последнее обусловлено необратимыми изменениями структуры поверхностных шипов, представленных гликопротеинами; такой механизм нейтрализации (виролизис) реализуется в отношении вирусов, имеющих суперкапсиды.

Клеточные иммунные реакции

Клеточные иммунные реакции - основная система уничтожения и удаления патогенных вирусов. Нарушения свойств иммунокомпетентных клеток значительно осложняют течение вирусных заболеваний: возбудители обычно лёгких и самоограничивающихся поражений могут вызывать тяжёлые, трудно излечиваемые инфекции. Важнейшую роль в разрушении инфицированных клеток играют цитотоксические Т-лимфоциты. После появления достаточных титров АТ способность убивать заражённые вирусами клетки приобретают макрофаги и гранулоциты.

Иммунный ответ при бактериальных инфекциях

Первую ступень защиты от патогенных бактерий образуют факторы неспецифической резистентности - кожные и слизистые барьеры, а после их преодоления - фагоцитирующие клетки. Действие факторов неспецифической резистентности направлено не на Аг бактерий, а на бактериальную клетку в целом. Вторую ступень защиты образуют факторы специфической защиты, среди которых наиболее значимую роль играют антибактериальные АТ. Характер специфических защитных реакций определяется особенностями патогенеза того или иного заболевания. Если возбудитель продуцирует экзотоксины, то доминируют механизмы их нейтрализации; при этом сам возбудитель может выживать и длительно сохраняться в организме реконвалесцентов и здоровых лиц (например, возбудитель дифтерии). Ig различных классов нейтрализуют (агглютинируют или пре-ципитируют) бактерии и их токсины; опосредуют разрушение бактерий (преимущественно через комплементзависимый цитолиз); опсонизируют их, стимулируя фагоцитоз бактерий, а также экранируют рецепторы чувствительных клеток. Проникновение бактерий, способных к внутриклеточному паразитированию, увеличивает значимость клеточных реакций, уничтожающих заражённые клетки. Следует упомянуть о реакциях ГЗТ, практически постоянно встречающихся при многих бактериальных инфекциях с длительным инкубационным периодом (туберкулёз, бруцеллёз). В некоторых случаях иммунные механизмы не в состоянии обеспечить полное удаление возбудителя, что приводит к развитию носительства или хронизации инфекции.

Иммунный ответ при грибковых инфекциях

Грибковые клетки и их продукты - сильные иммуногены. Их распознавание иммунной системой проявляется в виде клеточных и гуморальных реакций. Многие грибковые Аг проявляют сенсибилизирующее действие, поэтому аллергический компонент -важное звено патогенеза микозов. Однако при микозах сенсибилизация не строго специфична, не отражает уровня иммунного реагирования и нередко не имеет прогностическое значение. Патогенные грибы содержат большой набор Аг.

Гуморальные реакции

Большинство грибковых поражений сопровождается образованием высоких титров АТ. Вид АТ и нарастание концентрации отражают статус и прогрессирование инфекции. При микозах образуются высокие титры АТ классов IgM, IgG и IgA; при сенсибилизирующем действии грибковых Аг дополнительно образуются IgE. Значение цитотоксического действия АТ в комплементзависимом цитолизе невелика, так как комплемент непосредственно действует на грибковую клетку, активирующую его по классическому и альтернативному пути. Сложность антигенной структуры возбудителей микозов приводит к появлению значительного пула АТ, не участвующих напрямую в уничтожении возбудителя и не проявляющих строгой видоспецифичности.

Клеточные реакции

Клеточные реакции играют основную роль в элиминации патогенных грибов. Исключая поверхностные микозы (где нет контакта между Аг и иммунокомпетентными клетками), у заражённых лиц развивается реакция ГЗТ, обнаруживаемая уже через 10-14 сут. Предполагается, что основная роль в формировании резистентности принадлежит именно клеточным реакциям, но клинических данных, подтверждающих это положение, нет. В эксперименте показана важная роль ЦТЛ, так как их перенос сингенным реципиентам (клетки или организмы с идентичным набором Аг MHC) приводит к состоянию резистентности; участие Т-хелперов реализуется в активации клеток макрофагально-моноцитарной системы и полиморфноядерных клеток (при респираторных микозах) и стимуляции их фагоцитарной активности.

В ряде случаев иммунные реакции не только не препятствуют, но и способствуют развитию патологических реакций (гиперчувствительность, аутоиммунные поражения), что приводит к хроническому, рецидивирующему течению многих микозов.

Иммунные реакции при протозойных инфекциях

Аг патогенных простейших вызывают развитие гуморальных и клеточных реакций, но их роль в защите организма неравноценна. Это связано с паразитированием некоторых простейших в областях пониженного иммунного надзора (например, в СМЖ, головном мозге), тогда как другие паразитируют в сосудистом русле (в этом случае роль защитных реакций в их уничтожении высока). Величина паразитов, сложность их организации и наличие систем устойчивости позволяют им более или менее эффективно избегать действия защитных механизмов. Весьма важно и то, что на Аг или группу близкородственных Аг простейших организм человека формирует два типа АТ с противоположными эффектами - паразитоцидные и индуцирующие изменчивость паразита. В результате иммунные реакции начинают играть роль экологического фактора, регулирующего взаимоотношения в системе «паразит-хозяин» и поддерживающего длительное её существование.

Простейшие, обитающие в кровотоке (африканские трипаносомы, малярийные плазмодии) избегают действия иммунных механизмов за счёт изменения основных Аг у дочерних популяций. Другими словами, очередная популяция антигенно и иммуногенно обособлена, что резко снижает эффективность иммунных реакций.

Полостные паразиты (гиардии, амёбы, трихомонады) контактируют с иммунокомпетентны-ми клетками, что приводит к ограниченной индукции иммунных реакций. Эти реакции имеют некоторую значимость: известно, что у лиц с иммунодефицитами гиардиоз наблюдают часто.

Прочие патогенные простейшие (американские трипаносомы, лейшмании и токсоплазмы) вызывают развитие гуморальных и клеточных реакций, но полному удалению патогенов из организма препятствует их способность длительно паразитировать в разнообразных клетках организма.

Толерантность и аутоиммунитет

В этом разделе рассмотрены толерантность [от лат. tolerantia, устойчивость, терпимость], иммунодепрессивное состояние и аутоиммунные реакции.

Толерантность

Иммунная система должна различать «своё» и «чужое», атаковать чужеродные Аг, не повреждая при этом собственные. Подсчитано, что иммунокомпетентные клетки могут распознать не менее 10⁶ -10⁷ разных Аг. Иммунный ответ против собственных тканей организма в нормальных условиях не развивается, то есть иммунная система толерантна к собственным Аг и не толерантна к чужеродным. Иммунная толерантность представляет явление, противоположное обычным иммунным реакциям; при этом состояние толерантности вызывают толерогены - вещества, имеющие свойства Аг. Толерантность обеспечивается удалением или подавлением иммунокомпетентных клеток, способных реагировать с Аг собственных тканей.

Механизмы поддержания

Толерантность - активный процесс, подобно прочим иммунным реакциям, тщательно контролирующийся. При истинной толерантности (в отличие от иммунодефицитов) ответ на соответствующий Аг подавлен, а на другие Аг сохранён, то есть иммунная толерантность специфична и распространяется только на Аг, которые её индуцировали. Состояние толерантности поддерживают разнообразные механизмы: Т-супрессоры, уничтожение клонов Т- и В-клеток, экспрессирующих соответствующие рецепторы, ограничение взаимодействия Аг-представляющих клеток и лимфоцитов. Врождённую толерантность обеспечивает отсутствие клона лимфоцитов, контактировавших с Аг плода в антенатальном периоде. Приобретённую толерантность опосредует активация Т-супрессоров, а также АТ, блокирующие Аг.

Естественная толерантность развивается по отношению к аутоантигенам. Состояние естественной толерантности развивается до рождения. Поскольку в это время лимфоциты функционально незрелы, то для развития толерантности необходимо длительное присутствие Аг в организме. Природа этих Аг может быть различной, ими могут быть даже микробные продукты. Попав в организм в период иммунной некомпетентности, они впоследствии воспринимаются как собственные Аг. Этим объясняется трудность развития естественной толерантности во взрослом состоянии.

Искусственная толерантность может индуцироваться различными веществами, попавшими в организм в начальном периоде постнатального развития. Такие вещества называют толерогенами. Толерогенами могут быть практически любые Аг, но толерантность легче развивается при попадании в организм растворимых и низкомолекулярных Аг. Высокоиммуногенные Аг реже вызывают состояние толерантности, по сравнению с малоиммуногенными. Чем больше генетических различий между реципиентом и толерогеном, тем труднее формируется толерантность.

Иммунный паралич - близкое к толерантности состояние, развивающееся после введения очень больших доз Аг. При этом повторное введение Аг в возрастающих количествах через короткие промежутки более эффективно, чем однократная иммунизация. В этом имеется определённая аналогия с десенсибилизацией организма по А.М. Безредке. При этом дозы Аг могут быть более низкими (так называемая толерантность «низкой дозы»), чем однократное введение больших количеств Аг.

Расщеплённая толерантность. При введении гаптенов может развиваться расщеплённая толерантность: АТ при сохранении клеточных реакций иммунитета не образуются или наоборот, имеются АТ при отсутствии клеточных реакций.

Нарушения толерантности. Если естественная толерантность сохраняется годами, то искусственная - не более нескольких месяцев. Толерантность может развиваться при некоторых заболеваниях, но значительно чаще она нарушается по отношению к собственным Аг, результате чего развиваются аутоиммунные заболевания. Это состояние впервые наблюдал П. Эрлих и назвал его horror autotoxicus (дословно «самоотравляющий ужас»). Действительно, в большинстве случаев аутоиммунный процесс вызывает гораздо больше повреждений, чем провоцирующее его заболевание (например, ревматоидный артрит или гломерулонефрит после стрептококковой инфекции).

Иммунодепрессивное состояние

Не следует путать иммунную толерантность и неспецифическое подавление иммунной реактивности, отличающиеся механизмом развития и направленностью. Если толерантность достигается введением толерогена, то иммунодепрессивное состояние носит неспецифическое действие, вовлекая все фазы иммунного ответа и основные популяции иммунокомпетентных клеток. Иммунодепрессивные состояния обычно приводят к нежелательным последствиям; в частности они являются основной причиной развития инфекций, вызываемых условно-патогенной и оппортунистической микрофлорой, а также создают предпосылки для развития болезней злокачественного роста. Искусственное создание иммунодепрессивного состояния проводят в целях предотвращения отторжения трансплантата и для лечения аутоиммунных заболеваний. Состояние иммунодепрессии могут вызывать различные физические, химические и наследственные факторы. Врождённые иммунодефициты - как правило редкие генетические заболевания, характеризующиеся изолированным T- или B-клеточным дефицитом или комбинированным (T- и B-) расстройством.

Гиперкортицизм (синдром Ку’шинга) возникает в результате значительного повышения содержания глюкокортикоидов в крове.

Двусторонняя гиперплазия коры надпочечников (болезнь Иценко-Кушинга) - наиболее частая причина развития синдрома. Эктопическее neioac адернокортикотропного гормона опухолями (например, овсяно-клеточная карцинома лёгкого, карцинома поджелудочной железы) oae?a вызывает гиперплазию надпочечников и синдром Кушинга. Ятрогенный синдром Кушинга обычно развивается у больных, длительное время получающих глюкокортикоиды по поводу бронхиальной астмы, артрита и других заболеваний. Ионизирующая радиация повреждает пролиферирующие иммунокомпетентные клетки. Антилимфоцитарная сыворотка. Иммунодепрессивный эффект основан на феномене антите-лозависимого цитолиза иммунокомпетентных клеток (феномен впервые установил И.И. Мечников в 1899 г.).

Химические иммунодепрессанты: глюкокортикостероиды, цитостатики (антиметаболиты и алкилирующие агенты), а также антибиотики. Инфекционные заболевания. Многие вирусные инфекции (например, грипп, корь и др.) вызывают развитие транзиторных иммунодепрессивных состояний, длящихся недели и месяцы. Иммунодепрессивные свойства вирусов создают предпосылки для развития бактериальных суперинфекций, столь характерных для многих ОРВИ. Особую группу составляют так называемые лимфотропные вирусы семейства Retroviridae, вызывающие Т-клеточные иммунодефициты, в дальнейшем приводящие к тотальной иммунодепрессии (СПИД; см. главу 33).

Аутоиммунные реакции

Аутоиммунные реакции могут быть результатом формирования новых Аг-детерминант в составе носителя Аг или повреждения существующих аутоантигенных детерминант.

Реакции гиперчувствительности

При инфекционной патологии связывание Аг АТ обеспечивает пониженную чувствительность к действию различных микроорганизмов и их токсинов. Повторный контакт с Аг вызывает развитие вторичного ответа, протекающего намного интенсивнее. Аг не всегда стимулируют выработку АТ, понижающих чувствительность к ним. В определённых условиях вырабатываются АТ, взаимодействие которых с Аг повышает чувствительность организма к его повторному проникновению (реакции гиперчувствительности). Такую повышенную чувствительность, обусловленную иммунными механизмами, обозначают термином «аллергия», а вещества вызывающие её, - «аллергены». Изучением реакций повышенной чувствительности и обусловленных ими заболеваний занимается отдельная наука - аллергология. Аллергические реакции могут существенно отличаться друг от друга, в первую очередь, по времени их проявления после повторного контакта с аллергеном. В соответствии с этим выделяют реакции гиперчувствительности немедленного типа (развиваются через несколько минут) и реакции ГЗТ (развиваются через 6-10 ч и позднее). По классификации Джелла и Кумбса все аллергические реакции в зависимости от механизмов развития разделяют на четыре типа. Это классификация условна, поскольку различные типы повреждения тканей могут возникать одновременно или сменять друг друга.

Типы реакция гиперчувствительности

Реакции гиперчувствительности I типа

Реакции гиперчувствительности I типа обусловлены взаимодействием аллергена с IgE, сорбированным на мембранах тучных клеток и базофилов (поэтому эти реакции также называют IgE-опосредованными). Из-за цитофильных свойств (способности реагировать с поверхностью тучных клеток и базофилов) IgE также обозначают как реагины. Цитофильность IgE обусловлена наличием особых рецепторных структур в области Fc-фрагмента молекулы АТ. Иначе способность связываться с собственными клетками называется гомоцитотропность. Именно это свойство выражено у IgE, тогда как другие АТ (например, IgG) взаимодействуют и с чужеродными клетками (то есть они гетероцитотропны). Взаимодействие аллергена с IgE, сорбированным на тучных клетках и базофилах, приводит к высвобождению БАВ (гистамин, серотонин, эозинофильный и нейтрофильный хемотаксические факторы, протеазы). Эти вещества (так называемые преформированные медиаторы) образуются ещё до контакта с аллергеном. После взаимодействия последнего с IgE синтезируются новые медиаторы - фактор активации тромбоцитов (PAF), медленно реагирующее вещество анафилаксии (лейкотриены В4, С4, D4) и другие продукты метаболизма фосфолипидов клеточных мембран (простагландины и тромбокса-ны). Медиаторы взаимодействуют с рецепторами мышечных, секреторных и многих других клеток, что приводит к сокращению гладкой мускулатуры (например, бронхов), повышению проницаемости сосудов и отёку. Клинически реакции первого типа проявляются преимущественно анафилаксией и атопическими заболеваниями. Реже наблюдают острую крапивницу и ангионевротические отёки. Развитие анафилаксии могут блокировать циркулирующие АТ (IgM, IgG), способные, в отличие от сорбированного IgE, быстрее связывать Аг. Но обычно они образуются в незначительных количествах, что даёт аллергену возможность беспрепятственно достигать поверхности тучных клеток и базофилов с фиксированными на их поверхности IgE. Анафилактические реакции иммунно специфичны и развиваются после попадания аллергена, к которому организм был предварительно сенсибилизирован. Состояние гиперчувствительности формируется через 7-14 сут после первого контакта с Аг и сохраняется годами. Реакции могут быть системными или местными. Системные проявления в виде анафилактического шока могут развиваться после попадания аллергена практически любым путём (подкожно, парентерально, ин-галяционно). Проявления местных реакций - атопии [от греч. atopia, странность]. Их развитие обусловлено образованием IgE в ответ на длительное воздействие аллергенов. Клинически проявляются ринитами, конъюнктивитами, бронхиальной астмой, отёком Квинке.

Реакции гиперчувствительности II типа

Ведущий механизм - цитотоксическое повреждение. Образующиеся АТ (обычно IgG или IgM) связывают чужеродные Аг, фиксированные на клетках индивидуума. Формирование иммунных комплексов на клеточной поверхности активирует систему комплемента. Активированные компоненты образуют мембраноповреждающий комплекс и стимулируют фагоцитарные реакции. В реакции могут вовлекаться различные популяции клеток (ЦТЛ, гранулоциты, макрофаги), несущие Fc-рецепторы для IgG. Благодаря взаимодействию с IgG они вовлекаются в реакции антителозависимой цитотоксичности. Клинически реакции типа II проявляются поражениями крови (иммунные цитопении), поражениями лёгких и почек при синдроме Гудпасчера, острыми отторжениями трансплантатов, гемолитической болезнью новорождённых.

Реакции гиперчувствительности III типа

Реакции гиперчувствительности III типа также называют иммунокомплексными. Они обусловлены образованием иммунных комплексов, фиксирующихся в тканях и вызывающих их повреждение. В норме образующиеся комплексы Аг-АТ эффективно элиминируются фагоцитами. Иногда концентрация иммунных комплексов может достигать высоких значений, и они легко преципити-руют (выпадают в осадок). Комплексы задерживаются в тканях (часто не имеющих отношения к источнику Аг) и запускают местные или системные воспалительные реакции. Связывая и активируя компоненты комплемента, они привлекают фагоцитирующие клетки (макрофаги, нейтрофилы). Последние не способны поглощать такие большие структуры и выделяют протеолитических ферменты и другие медиаторы воспаления, повреждающие ткани, в которых фиксирован комплекс. Типичное проявление реакций третьего типа - феномен Артюса. Клинические примеры реакций III типа - сывороточная болезнь (после попадания чужеродных белков или медикаментов в кровоток), экзогенный аллергический альвеолит (после фиксирования комплексов в лёгочных капиллярах), системная красная волчанка, ревматоидный артрит (после фиксирования комплексов в синовиальных оболочках суставов), васкулиты (при поражениях эндотелия кровеносных сосудов), гломерулонефрит (при фиксации комплексов в фильтрующем аппарате почек).

Реакции гиперчувствительности IV типа

Реакции гиперчувствительности IV типа также называют ГЗТ. Они обусловлены клеточными иммунными реакциями. В отличие от реакций немедленного типа, они развиваются не ранее чем через 24-48 ч после повторного введения Аг. Развитие реакций ГЗТ индуцируют продукты микроорганизмов и гельминтов, природные и неприродные Аг и гаптены (лекарства, косметические красители). Классические примеры ГЗТ - туберкулиновая проба и контактный дерматит. Распознавание Аг, связанного с белками организма, иммунокомпетентными клетками вызывает активацию T-хелперов, что приводит к клональной пролиферации Т-эффекторов ГЗТ. Сенсибилизированные лимфоциты секретируют цитокины, привлекающие другие лимфоциты и макрофаги в очаг аллергической реакции. На более поздних этапах в реакцию включаются полиморфноядерные фагоциты, стимулирующие воспалительный ответ.

Трансплантационный иммунитет

С давних пор врачей привлекала идея замены повреждённого органа здоровым донорским органом. Многочисленные, но неудачные попытки показали, что итоги подобных операций зависят не от искусства врача, а представляют следствие активного иммунного по природе отторжения пересаженного органа. П. Медавар (1945) выяснил, что отторжение чужеродных тканей и органов - следствием распознавания их поверхностных клеточных Аг иммунными механизмами.

Типы трансплантатов

Аутотрансплантация - пересадка ткани в пределах одного организма - почти всегда проходит успешно. Свойство аутотрансплантатов легко приживаться применяют при лечении ожогов - на поражённые участки тела проводят пересадку собственной кожи. Практически всегда приживаются и сингенные трансплантаты - ткани, генетически близкородственные донорским (например, полученные от однояйцовых близнецов или инбредных животных). Аллогенные трансплантаты (аллотрансплантаты; ткани, пересаженные от одной особи другой генетически чужеродной особи того же вида) и ксеногенные трансплантаты (ксенотрансплантаты; ткани, пересаженные от особи другого вида) обычно подвергаются отторжению.

Главный комплекс гистосовместимости

В основе неудач по приживлению алло- и ксенотрансплантатов - распознавание «своего» и «чужого» - основополагающий принцип функционирования иммунной системы. Узнавание «своих» клеток обеспечивает система мембранных гликопротеиновых рецепторов, присутствующих на поверхности всех клеток организма. Эти гликопротеины составляют главный комплекс гистосовместимости -MHC major histocompatibility complex]. Несовпадение этих гликопротеинов между трансплантатами и клетками организма-реципиента приводит к развитию иммунного ответа, то есть молекулы MHC проявляют свойства Аг. Поэтому их называют Аг гистосовместимости, а кодирующие их гены - генами гистосовместимости. Система MHC обеспечивает биологическую индивидуальность каждого организма и строго контролируется генами гистосовместимости. У человека комплекс MHC иногда называют HLA [от англ. human leucocyte antigens, Аг лейкоцитов человека]. В системе НЬА известно более 100 Аг, сгруппированных в регионы НЬА-А, НЬА-B, НЬА-С, НЬА-D, НЬА-DR. Их образование контролирует локус НЬА, состоящий из ряда сублокусов, расположенных в хромосоме 6. Экспрессия Аг НЬА в различных органах сильно варьирует: она наиболее выражена на лимфоцитах и клетках кожи, меньше - в лёгких, печени, почках, кишках, сердце и сосудах, а в наименьших количествах такие Аг присутствуют на мембранах клеток ЦНС.

Интенсивность, продолжительность и исход реакций отторжения определяются степенью антигенных различий между донором и реципиентом; уровнем реактивности реципиента; характером трансплантата, наличием в нём лимфоидной ткани, удельным содержанием Аг гистосов-местимости и т.д. Все гены гистосовместимости разделяют на две категории. Гены главного комплекса гистосовместимости кодируют «сильные» Аг, вызывающие у реципиентов быстрое отторжение трансплантатов. При трансплантации тканей (органа) от индивидуума, несовместимого по «сильным» Аг MHC, трансплантат отторгается в течение 12 нед. Повторная трансплантация ткани от того же донора сопровождается ускоренным разрушением трансплантата. Формирование иммунной памяти к данному набору трансплантационных Аг происходит за 4-5 сут и сохраняется на протяжении многих лет. Гены минорного комплекса гистосовместимости кодируют «слабые» Аг, вызывающие более медленное отторжение трансплантатов.

Реакция отторжения трансплантата

Большинство случаев отторжения трансплантата обусловлено Т-клеточными реакциями организма-реципиента. Повторная иммунизация Аг MHC в большинстве случаев вызывает образование аллоантител.

Клеточные реакции. Ведущая роль клеточных реакций была установлена при изучении кожных и опухолевых трансплантатов в эксперименте. Оказалось, что они резистентны к действию АТ, но подвержены повреждающему действию цитотоксических клеток. Более того, цитотоксические реакции против трансплантата можно индуцировать переносом сенсибилизированных лимфоцитов. Аллоантитела (агглютинины или цитотоксины) обусловливают цитотоксический эффект в отношении эндотелия сосудов донорских органов. АТ вызывают повреждение эндотелия за счёт активации комплемента и реакций антителозависимой клеточной цитотоксичности. Реакции отторжения также можно индуцировать введением антисыворотки к Аг трансплантата. Антигенный барьер - важнейшее препятствие для развития клинической трансплантологии и основной фактор, ограничивающий её успехи. Наибольшее значение в приживлении трансплантата имеют антигенные различия между донором и реципиентом.

Типирование Аг. Основной метод определения спектра трансплантационных Аг - постановка микролимфоцитотоксической реакции с лимфоцитами обследуемых и набором антисывороток к отдельным антигенным детерминантам (в присутствии комплемента). Наборы антисывороток получают отбором сывороток лиц, содержащих анти-НЬА-АТ, образовавшиеся вследствие переливаний крови или повторных беременностей резус-несовместимым плодом. Каждая сыворотка содержит АТ к нескольким Аг. Поэтому для установления антигенной характеристики клеток нужно использовать несколько сывороток, выявляющих данный Аг. В последнее время проводятся попытки получения моноспецифических сывороток иммунизацией людей лимфоцитами, отличающимися от собственных лишь по одному трансплантационному Аг. При учёте результатов используют упрощённую классификацию степени несовместимости донора и реципиента, в которой группа А обозначает полное их соответствие, В - несовместимость по одному Аг, С - по двум и D - по трём и более основным Аг.

Методы подавления отторжения трансплантатов

Для подавления отторжения трансплантата применяют два принципиально различных подхода: создание специфической толерантности реципиента к трансплантату и применение средств, неспецифически подавляющих иммунный ответ организма на чужеродные Аг.

Создание толерантности. Этот подход имеет несомненное преимущество, поскольку не препятствует нормальному развитию иммунных реакций на другие, в первую очередь инфекционные, Аг. При развитии толерантности иммунный конфликт не развивается и происходит стойкое приживление трансплантата. В настоящее время подобные исследования не вышли за рамки эксперимента, а успехи клинической трансплантологии в первую очередь связаны с совершенствованием методов неспецифической иммунодепрессивной терапии.

Иммунодепрессанты. Основа эффекта иммунодепрессантов - подавление метаболизма иммунокомпетентных клеток. Иммунодепрессанты часто оказывают цитостатическое действие и на клетки других тканей. Современный арсенал трансплантологии содержит химические и биологические иммунодепрессанты. В некоторых случаях, главным образом при пересадке костного мозга, их применение дополняют ионизирующим облучением. Возможно общее облучение в низких дозах, локальное облучение селезёнки и тимуса, облучение трансплантата, а также экстракорпоральное облучение крови и лимфы реципиента.

Стероидные гормоны (преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон) подавляют пролиферацию лимфоцитов в лимфатических узлах и селезёнке и уменьшают количество лимфоцитов в крови.

Антиметаболиты включают аналоги пуриновых (например, имуран или азатиоприн) и пиримидиновых оснований (5-фторурацил, 5-бромоксипиридин и др.), антагонисты фолиевой кислоты (аметоптерин, метотрексат) и алкилирующие агенты.

Противоупохолевый иммунитет

Изучение противоракового иммунитета и причин его нарушения, лечение и профилактика новообразований посредством иммунизации и иммуномодуляции - важные проблемы современной медицины.

Опухоли

Постоянство содержания клеток в организме реализуется таким образом, что пролиферация клеток находится в зависимости от скорости их отмирания. Этот баланс поддерживает постоянный размер органов. Некоторые клетки не подчиняются такой регуляции, бесконечно пролифери-руют, что может привести к возникновению крупных образований - опухолей. Опухоли (неопла-зии, или новообразования), вызваны избыточной пролиферацией клеток. Если пролиферация клеток носит неконтролируемый характер, такие опухоли известны как злокачественные. Развитие злокачественных опухолей обусловлено пролиферацией клеток, лишённых признаков тканевой дифференцировки (клеточная атипия). Злокачественные опухоли могут происходить из эпителиальных клеток (карцинома, или рак) или из клеток мезенхимного генеза (саркомы).

Из основного очага в другие органы злокачественные клетки могут распространяться путём метастазирования (например, по лимфатическим путям или через кровоток). Свойства метастазов обусловлены природой первичного очага. Злокачественные опухоли как правило прорастают в окружающие ткани и метастазируют по всему организму. Доброкачественные новообразования не прорастают и не метастазируют в другие органы.

Известны многочисленные теории злокачественного роста. В основе всех теорий - изменение клеточного генома. Озлокачествление нормальной клетки (то есть злокачественное перерождение) связано с генетическими изменениями. К озлокачествлению могут приводить мутации, изменяющие генетический материал, либо избирательная активация латентных генов, приводящая к бесконтрольному росту.

Канцерогенные факторы

Злокачественное перерождение могут вызывать различные химические, физические и биологические факторы.

Химические факторы

Индуцировать канцерогенез способны многие химические агенты, условно разделяемые на канцерогены и промоторы.

Канцерогены (например, бензпирены, афлатоксин В₁ ) быстро действуют на клетки-мишени, что необходимо, но не всегда достаточно для опухолевой трансформации. Механизм трансформирующего действия канцерогенов изучен мало; все канцерогены обладают мутагенным эффектом. Для его выявления используют тест Эймса, определяющего способность повышать частоту мутаций у бактерий (например, рода Salmonella).

Промоторы (например, форболмиристат ацетат, гормоны яичников) стимулируют деление клеток. Для злокачественной трансформации, вызванной канцерогеном, требуются по крайней мере два цикла их деления. Действие промотора обратимо и само не является канцерогенным. Чтобы вызвать трансформацию, он должен действовать после обработки клеток канцерогеном.

Физические агенты

Трансформирующее действие, основанное на мутагенном эффекте, проявляют УФ- и ионизирующее излучение. В частности, широко известно, что избыточное солнечное излучение - этиологический фактор развития злокачественной меланомы. Мишень такого воздействия - нуклеиновые кислоты. Излучение приводит к появлению дефектов в геноме.

Онкогенные вирусы

Способностью трансформировать инфицированные клетки обладают некоторые ДНК- и РНК-содержащие вирусы - онкогенные, или онковирусы.

ДНК-содержащие онкогенные вирусы. Трансформацию способны вызывать папова-, герпес- и аденовирусы. Злокачественной трансформации подвергается небольшая часть заражённых клеток, что обусловлено развитием абортивной вирусной инфекции клеток. Трансформированные клетки сохраняют один или несколько вирусных геномов, встроенных в геном клетки-хозяина.

РНК-содержащие онкогенные вирусы. Среди РНК-геномных вирусов трансформирующими свойствами обладают только ретровирусы. Под действием обратной транскриптазы, закодированных в геноме вирусов, в инфицированной клетке синтезируются двухцепочечные замкнутые ДНК-копии генома вируса (см. также главу 5). Последний встраивается в клеточный геном хозяина, нарушая контроль над пролиферацией. В подобных ситуациях провирусы играют роль носителей онкогенов. В геномах только ретровирусов выделено до 35 онкогенов; каждый из них имеет клеточный гомолог (протоонкоген).

Опухолевые Аг

В 1908 г. Пауль Эрлих сформулировал положение о том, что раковые клетки возникают часто и их мембраны изменены таким образом, что могут быть распознаны организмом хозяина как чужеродные Аг. Действительно, на мембранах опухолевых клеток обычно выявляют структуры, отличающиеся по антигенным свойствам от аналогичных структур интактных клеток. Опухолевые Аг запускают клеточные и гуморальные реакции, направленные против них. Анализ противоопухолевых иммунных реакций позволил обнаружить опухоли с перекрёстно-реагирующими Аг, опухолеспецифичными Аг и Аг, общими для части нормальных клеток. В настоящее время выделяют четыре класса опухолевых Аг.

Опухолево-эмбриональные Аг присутствуют на поверхности злокачественных клеток, а также выявляются в эмбриональном и плодном периодах развития. Пример - канцероэмбриональные Аг прямой кишки, обнаруживаемые на опухолевых клетках, происходящих из энто-дермального эпителия кишечной трубки или органов, развивающихся из эпителия энтодермы (поджелудочная железа, печень и жёлчный пузырь). Эти Аг присутствуют только на небольшой части нормальных взрослых клеток, и в здоровом организме общая концентрация канцероэмбриональных Аг прямой кишки низка.

Аг, индуцированные химическими канцерогенами. Каждая индуцированная канцерогеном опухоль имеет присущие только ей поверхностные Аг; такие Аг идентичны для всех клеток конкретной опухоли, но отличаются от Аг других опухолей.

Аг, индуцированные онкогенными ДНК-содержащими вирусами. Вирусная трансформация клеток сопровождается появлением уникальных Аг. При этом определённый вирус индуцирует одинаковые Аг, вне зависимости от ткани и биологического вида, в которых произошла трансформация. У человека с наибольшей вероятностью ДНК-овые вирусы вызывают лимфому Бёркитта, назофарингеальную карциному и рак шейки матки.

Аг, индуцированные онкогенными РНК-содержащими вирусами. При трансформации инфицированных клеток онкогенными РНК-содержащими вирусами также появляются специфические Аг, одинаковые для всех трансформированных клеток. В отличие от ДНК-овых вирусов, большинство из них представляют собой вирусные белковые Аг. Эти Аг могут проявлять групповую (например, вирусы лейкоза мышей), типовую (например, вирусы лейкоза Гросса), а также видовую специфичность.

Противоопухолевые иммунные реакции

В реакциях противоопухолевого иммунитета задействованы практически все субпопуляции иммунокомпетентных клеток.

Распознавание трансформированных клеток. Аг-распознающие CD4⁺ -лимфоциты идентифицируют опухолевые Аг и индуцируют начало иммунной реакции. В механизме распознавания важную роль играет несовпадение трансформированных Аг MHC клеток опухоли и молекул MHC на мембранах распознающих Т-лимфоцитов. Распознавание Аг стимулирует другие субпопуляции Т-лимфоцитов, а также В-лимфоциты и макрофаги.

Цитотоксические Т-клеточные реакции. Активация предшественников эффекторных Т-клеток приводит к образованию пула ЦТЛ. Действие ЦТЛ на опухолевую клетку реализуется посредством перфоринов.

Эффекторы ГЗТ играют вспомогательную роль в цитотоксических реакциях, продуцируя различные медиаторы. Их действие направлено на активность лимфоцитов, а не на трансформированные Аг MHC клеток-мишеней.

NK-клетки. Естественные киллеры распознают изменённые НЬА^-Аг комплекса MHC на опухолевых клетках человека и повреждают их, независимо от наличия АТ, комплемента и макрофагов. Основные мишени естественных киллеров -инфицированные или трансформированные онковирусами клетки. Активность естественных киллеров увеличивают Т-лимфоциты, облегчающие контакт NK-клеток с опухолевыми.

В-лимфоциты. Гуморальные иммунные реакции проявляются образованием цитотоксических АТ, направленных против Аг опухолевых клеток. Такие АТ обнаруживают при ряде опухолей человека и животных. Возможность разрушения опухолевых клеток АТ без участия цитотоксических клеток низка.

Макрофаги играют важную роль в разрушении опухолевых клеток. Поэтому большое число макрофагов в опухоли - благоприятный прогностический признак. Если лимфоциты в отсутствии макрофагов в значительной степени утрачивают активность, то изолированные от лимфоцитов макрофаги оказывают ещё более выраженное цитотоксическое действие. Способность повреждать клетки-мишени обусловлена фагоцитарным потенциалом и цитотоксическими свойствами макрофагов. Макрофаги уничтожают трансформированные клетки в реакции антителозависимой цитотоксичности. Они способны уничтожать различные опухолевые клетки, в том числе и не имеющие Аг к цитотоксическим АТ на поверхности макрофагов. Таким образом, трансформация клеток запускает комплекс иммунных реакций, подобных реакциям, наблюдаемым при проникновении в организм экзогенных Аг. При этом роль гуморальных и клеточных реакций не равнозначна. Большинство опухолей не чувствительны к действию только АТ и комплемента, но чувствительны к воздействию цитотоксических клеток. В большинстве случаев доминирует ответ ЦТЛ. Трансформированные клетки белой крови достаточно чувствительны к NK-клеткам, АТ и комплементу, а также к антителозависимым цитотоксическим реакциям.

Опухоли и иммунодефициты

Поскольку Т-клеточные цитотоксические реакции играют ведущую роль в уничтожении трансформированных клеток, то у лиц с дефицитом этой системы часто наблюдают спонтанное развитие опухолей.

Эффективность иммунного надзора

Несмотря на признание теории нарушений иммунного надзора в ходе канцерогенеза, к моменту обнаружения опухоли у большинства больных регистрируют как клеточные, так и гуморальные иммунные реакции против опухолевых Аг. Это означает, что иммунологический надзор оказывается неэффективным. В настоящее время известно несколько механизмов «ускользания» трансформированных клеток от реакций иммунного надзора.

Иммунная толерантность. Экспериментальная прививка опухоли до развития полной иммунной компетентности или введение опухолевых Аг в высокой концентрации вызывает развитие специфической ареактивности (если эти Аг им позднее пересаживают). Кроме того, в областях, лежащих за пределами иммунного надзора (например, в головном мозге) опухоли не подвергаются действию иммунных механизмов.

Иммунный отбор. В крупных популяциях опухолевых клеток встречаются клетки, утратившие собственные, присущие данной опухоли поверхностные Аг. В подобной ситуации противоопухолевые реакции не препятствуют пролиферации таких клеток и росту опухоли.

Антигенная модуляция. Под действием иммунных реакций некоторые опухолевые Аг могут менять свою структуру, снижая специфичность действующих иммунных механизмов.

Иммуносупрессия. Подавление противоопухолевого иммунитета также негативно сказывается на состоянии больных, активируя развитие неоплазий. Известно несколько механизмов развития иммунодепрессивных состояний.

Ятрогенная иммуносупрессия вызывается физическими и химическими агентами, применяемыми для лечения болезней злокачественного роста. Большинство из них, включая облучение и цитостатики, разрушает иммунокомпетентные клетки.

Иммуносупрессивное действие опухолей. В некоторых случаях опухолевые клетки сами выделяют факторы, угнетающие активность защитных механизмов. Например, при лимфогранулематозе опухолевые клетки в единичном лимфатическом узле выделяют или стимулируют секрецию факторов (макрофагами, T-клетками), подавляющих клеточные иммунные реакции.

Иммунодиагностика и иммунотерапия опухолей

Диагностика

Методы выявления опухолевых Аг принципиально аналогичны применяемым в отношение других Аг. Наиболее часто для их идентификации применяют иммуноферментный метод и иммуно-флюоресцентную микроскопию. Распространение получили непрямые методы, позволяющие обнаружить незначительные количества опухолевых Аг на поверхности клеток. Также применяют цитотоксические тесты, учитывающие гибель опухолевых клеток под действием сыворотки крови больного и комплемента. Для подсчёта содержания онкоантигенов и определения места их фиксации применяют иммуноферментный анализ (ИФА) и РИА. Большое прогностическое значение имеет оценка иммунного статуса пациента, особенно реактивности Т-лимфоцитов.

Терапия

Методы иммунотерапии при болезнях злокачественного роста не получили достаточного теоретического обоснования, хотя история их применения начитывает более 50 лет. Широкому внедрению иммунотерапии мешает отсутствие чётких показаний к её назначению и критериев эффективности. Избежать многих побочных эффектов иммунотерапии можно путём рационального использования и прогнозирования её действия. Попытки переноса пациенту иммунокомпетентных клеток, сенсибилизированных антигенами опухоли, наталкиваются на развитие реакций отторжения трансплантата. Большие перспективы имеет применение препаратов, оказывающих стимулирующий эффект на активность защитных факторов. Способностью воздействовать на активность иммунокомпетентных клеток при антигенной стимуляции обладают различные химические агенты (алюминий, латекс), вещества растительного происхождения (лектины, сапонины), микроорганизмы и их метаболиты, митогены (фитогемагглютинин, митоген лаконоса), витамины (ретинол, токоферол), нуклеиновые кислоты, синтетические полинуклеотиды, ИФН, гормоны (тимозин, эстрогены) и другие вещества Для иммунотерапии опухолей возможно применение нескольких групп препаратов.

Адъюванты. Каждый адъювант имеет свои эффекты и клетки-мишени. Молекулы адъюванта сорбируются на клетках-мишенях, запуская их пролиферацию, дифференцировку, изменение мембранных функций и секрецию медиаторов. Основное действие большинства адъювантов - увеличение цитотоксического эффекта. На практике наибольшее распространение нашли различные микроорганизмы и их продукты (БЦЖ, ЛПС грамотрицательных палочек, продигиозан и др.).

Иммуномодуляторы - группа природных и синтетических веществ, восстанавливающих утраченные или подавленные функции иммунокомпетентных клеток. К природным продуктам относят экстракты вилочковой железы, тимозин и различные медиаторы иммунных реакций (тимопоэтин, миелопид). Синтетические вещества - большая группа соединений; в терапии болезней злокачественного роста наиболее длительно применяют левамизол и изопринозин (инозиплекс). Эти вещества повышают функциональную активность периферических Т-лимфоцитов, фагоцитов, стимулируют предшественники Т-лимфоцитов, вызывая их дифференцировку и созревание. Левамизол и изопринозин входят в особую группу препаратов - тимомиметиков; они имитируют действие гормонов тимуса, стимулируя созревание Т-лимфоцитов.

Особенности иммунотерапии опухолей. Введение низких доз иммуномодуляторов часто стимулирует ответ на опухолевые Аг. Высокие дозы препаратов могут подавлять иммунный ответ на опухолевые Аг. Один из критических факторов успешности терапии - степень генетической несовместимости опухолевых Аг и нормальных Аг MHC организма. При слабых антигенных различиях можно наблюдать супрессорное действие иммунотерапевтических препаратов. Таким образом, для эффективного осуществления иммунотерапии опухолей необходимо иметь данные о состоянии иммунного статуса больного.

ИММУННЫЙ СТАТУС ЧЕЛОВЕКА

Иммунная система играет важнейшую роль в выздоровлении от многих, особенно инфекционных болезней. Её состояние (то есть иммунный статус) на момент развития и течения патологического процесса представляет исключительный интерес. Нарушения иммунного статуса делают организм восприимчивым к различным возбудителям, в том числе к условно-патогенным. Кроме того, существенно возрастает риск развития аутоиммунных процессов и болезней злокачественного роста. Распознавание дефектного звена иммунного статуса - актуальная задача клинической медицины. Состояние иммунной системы можно оценить комплексом показателей.

Возрастные особенности иммунной системы

Подобно другим системам, организация защитных факторов претерпевает возрастные изменения. Полностью система защитных факторов развивается к 15-16 годам. По мере старения организма функции иммунной системы ослабевают.

В период внутриутробного развития у плода формируется система Аг MHC, органы иммунной системы, популяции иммунокомпетентных клеток и система комплемента. Иммунная система матери толерантна к аллоантигенам плода, поскольку их число относительно невелико, а также в силу избирательной проницаемости плаценты и наличия в крови матери и плода различных иммуносупрессивных факторов (а-фетопротеина, эстрогенов, прогестерона, простагландинов и т.д.).

У новорождённых иммунная система структурно организована, но функционально несостоятельна. Снижено содержание компонентов комплемента, IgG, IgA и основных популяций иммунокомпетентных клеток. На проникновение инфекционных агентов лимфоидные органы отвечают гиперплазией, проявляющейся лимфаденопатией.

В развитии ребёнка выделяют критические периоды, во время которых на антигенный стимул иммунная система даёт неадекватные или парадоксальные реакции.

Иммунная система в пожилом возрасте. Ослабление свойств иммунокомпетентных клеток проявляется нарушениями распознавания клеток, несущих изменённые Аг MHC и снижением специфичности иммунных реакций. В этот период возрастает риск развития аутоиммунных и иммунодефицитных состояний, а также злокачественных опухолей.

Нарушения иммунного статуса

Функции иммунной системы снижают различные факторы - несбалансированное питание, инфекции, ионизирующее излучение, химические вещества. Подобные нарушения - иммунодефициты - разделяют на первичные (врождённые) и вторичные (приобретённые). Врождённые дефекты иммунной системы встречают сравнительно редко и обусловлены генными дефектами. Вторичные нарушения часто представляют звенья патогенеза многих патологических состояний (например, болезней злокачественного роста, эндокринных расстройств). Особенно часто вторичные расстройства развиваются при бактериальных и вирусных инфекциях, обычно нося временный характер (транзиторные иммунодефициты). Дефекты могут затрагивать различные компоненты иммунной системы. Выделяют Т-клеточные, В-клеточные и комбинированные (Т-В-клеточные) иммунодефициты. Также возможны расстройства гуморальных и клеточных факторов неспецифической защиты организма.

Дефекты системы комплемента

Дефекты системы комплемента обусловлены нарушениями синтеза или функциональных свойств компонентов комплемента либо механизмов регуляции системы. Этиология, клинические особенности и диагностика этих синдромов представлены в табл. 10-10.

Расстройства функций фагоцитов

Нарушения фагоцитарной активности (табл. 10-11) могут быть стойкими или транзиторными и проявляться на любом этапе фагоцитоза. При патологии неинфекционной природы чаще наблюдают изменения хемотаксиса и метаболизма клеток, на фоне различных инфекций - нарушения внутриклеточного уничтожения возбудителей. Нарушения, обусловленные действием инфекционных агентов, практически всегда носят транзиторный (временный) характер. Клинические проявления врождённых дефектов схожи. Обычно это рецидивирующие кожные, лёгочные инфекции и хроническое воспаление полости рта. Для первичных иммунодефицитов типичны рецидивирующие, часто угрожающие жизни инфекции, вызванные Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae и бактериями рода Aspergillus.