Медицинская микробиология, вирусология и иммунология : Т. 1

Различают несколько основных форм бактерий (рис. 2-1):

Сферические формы, или кокки, - шаровидные бактерии размером 0,5-1,0 мкм, которые по взаимному расположению делятся на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины и стафилококки.

Микрококки (от греч. micros - малый) - отдельно расположенные клетки.

Диплококки (от греч. diploos - двойной), или парные кокки, располагаются парами (пневмококк, гонококк, менингококк), так как клетки после деления не расходятся. Пневмококк (возбудитель пневмонии) имеет с противоположных сторон ланцетовидную форму, а гонококк (возбудитель гонореи) и менингококк (возбудитель эпидемического менингита) имеют форму кофейных зерен, обращенных вогнутой поверхностью друг к другу.

Стрептококки (от греч. streptos - цепочка) - клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними в месте деления.

Сарцины (от лат. sarcina - связка, тюк) располагаются в виде пакетов из 8 кокков и более, так как они образуются при делении клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях.

Стафилококки (от греч. staphyle - виноградная гроздь) - кокки, расположенные в виде грозди винограда в результате деления в разных плоскостях.

Палочковидные бактерии различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Длина клеток 1-10 мкм, толщина 0,5-2,0 мкм. Палочки могут быть правильной (кишечная палочка и др.) и неправильной булавовидной (коринебактерии и др.) формы. К наиболее мелким палочковидным бактериям относятся риккетсии.

Концы палочек могут быть как бы обрезанными (сибиреязвенная бацилла), закругленными (кишечная палочка), заостренными (фузо-бактерии) или в виде утолщения. В последнем случае палочка похожа на булаву (коринебактерии дифтерии).

Слегка изогнутые палочки называются вибрионами (холерный вибрион). Большинство палочковидных бактерий располагается беспорядочно, так как после деления клетки расходятся. Если после деления клетки остаются связанными общими фрагментами клеточной стенки и не расходятся, то они располагаются под углом друг к другу (корине-бактерии дифтерии) или образуют цепочку (сибиреязвенная бацилла).

Извитые формы - спиралевидные бактерии, которые бывают двух видов: спириллы и спирохеты. Спириллы имеют вид штопорообразно извитых клеток с крупными завитками. К патогенным спириллам относятся возбудитель содоку (болезнь укуса крыс), а также кампилобак-терии и хеликобактерии, имеющие изгибы, напоминающие крылья летящей чайки. Спирохеты представляют тонкие длинные извитые бактерии, отличающиеся от спирилл более мелкими завитками и характером движения. Особенность их строения описана ниже.

Ветвящиеся формы - палочковидные бактерии, которые могут иметь разветвление в форме латинской буквы Y, встречаемое у бифи-добактерий, также могут быть представленными в виде нитевидных разветвленных клеток, способных переплетаться, образуя мицелий, что наблюдается у актиномицет.

Структура бактерий хорошо изучена с помощью электронной микроскопии целых клеток и их ультратонких срезов, а также других методов. Бактериальную клетку окружает оболочка, состоящая из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Под оболочкой находится протоплазма, состоящая из цитоплазмы с включениями и наследственного аппарата - аналога ядра, называемого «нуклеоид» (рис. 2-2). Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.

Клеточная стенка - прочная, упругая структура, придающая бактерии определенную форму и вместе с подлежащей цитоплазматической мембраной сдерживающая высокое осмотическое давление в бактериальной клетке. Она участвует в процессе деления клетки и транспорте метаболитов, имеет рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных веществ. Наиболее толстая клеточная стенка у грамполо-жительных бактерий (рис. 2-3). Так, если толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий около 15-20 нм, то у грамположительных она может достигать 50 нм и более.

Основу клеточной стенки бактерий составляет пептидогликан. Пептидогликан является полимером. Он представлен параллельными полисахаридными гликановыми цепями, состоящими из повторяющихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидной связью. Эту связь разрывает лизоцим, являющийся ацетилмурамидазой.

К N-ацетилмурамовой кислоте ковалентными связями присоединен тетрапептид, который состоит из L-аланина, связанного с N-ацетилмурамовой кислотой; D-глутамина, который у грамполо-жительных бактерий соединен с L-лизином, а у грамотрицательных бактерий - с диаминопимелиновой кислотой, представляющей собой предшественник лизина в процессе бактериального биосинтеза аминокислот и служащей уникальным соединением, присутствующим только у бактерий; 4-й аминокислотой является D-аланин (рис. 2-4).

В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов и белков. Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90% массы клеточной стенки. Тетрапептиды разных слоев пептидогликана у грам-положительных бактерий соединены друг с другом полипептидными цепочками из 5 остатков глицина (пентаглицина), что придает пептидо-гликану жесткую геометрическую структуру (см. рис. 2-4, б). С пептидо-гликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. tekhos - стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола и рибитола, соединенных фосфатными мостиками. Форму и прочность бактериям придает жесткая волокнистая структура многослойного, с поперечными пептидными сшивками пептидогликана.

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генциановый фиолетовый в комплексе с йодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем. Кроме этого, последующая обработка мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидогликане и тем самым задерживает краситель в клеточной стенке.

Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, что обусловлено меньшим количеством пептидогликана (5-10% массы клеточной стенки); они обесцвечиваются спиртом и при обработке фуксином или сафранином приобретают красный цвет. Это связано с особенностями строения клеточной стенки. Пептидогликан в клеточной стенке грамотрицательных бактерий представлен 1-2 слоями. Тетрапептиды слоев соединены между собой прямой пептидной связью между аминогруппой диаминопимелиновой кислоты одного тетрапептида и карбоксильной группой D-аланина тетрапептида другого слоя (см. рис. 2-4, а). Кнаружи от пептидогликана расположен слой липопротеина, соединенный с пептидогликаном через диаминопимелиновую кислоту. За ним следует наружная мембрана клеточной стенки.

Наружная мембрана является мозаичной структурой, представленной липополисахаридами (ЛПС), фосфолипидами и белками. Внутренний слой ее представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен ЛПС (рис. 2-5). Таким образом, наружная мембрана асимметрична. ЛПС наружной мембраны состоит из трех фрагментов:

ЛПС заякорен в наружной мембране липидом А, обусловливающим токсичность ЛПС и отождествляемым поэтому с эндотоксином. Разрушение бактерий антибиотиками приводит к освобождению большого количества эндотоксина, что может вызвать у больного эндотоксический шок. От липида А отходит ядро, или стержневая часть ЛПС.

Наиболее постоянной частью ядра ЛПС является кетодезоксиоктоновая кислота. О-специфическая полисахаридная цепь, отходящая от стержневой части молекулы ЛПС, состоящая из повторяющихся олигосахаридных единиц, обусловливает серогруппу, серовар (разновидность бактерий, выявляемая с помощью иммунной сыворотки) определенного штамма бактерий. Таким образом, с понятием «липополисахарид» связаны представления об О-антигене, по которому можно дифференцировать бактерии. Генетические изменения могут привести к дефектам, укорочению ЛПС-бактерий и появлению в результате этого шероховатых колоний R-форм, теряющих О-антигенную специфичность.

Не все грамотрицательные бактерии имеют полноценную О-специфическую полисахаридную цепь, состоящую из повторяющихся олигосахаридных единиц. В частности, бактерии рода Neisseria имеют короткий гликолипид, который называется «липоолигосахарид». Он сравним с R-формой, потерявшей О-антигенную специфичность, наблюдаемой у мутантных шероховатых штаммов Escherichia coli (E. coli). Структура липоолигосахарида напоминает структуру гликосфинголипида цитоплазматической мембраны человека, поэтому липоолигосахарид мимикрирует микроб, позволяя ему избегать иммунного ответа хозяина.

Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемые «порины» , окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы с относительной массой до 700 Д.

Между наружной и цитоплазматической мембраной находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, β-лактамазы), а также компоненты транспортных систем.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма и других соединений образуются клетки с измененной (часто шаровидной) формой:

После удаления ингибитора клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, то есть приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму.

Бактерии сфероили протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются «L-формы» (от названия Института им. Д. Листера, где они впервые были изучены). L-формы могут возникать и в результате мутаций. Они представляют собой осмотически чувствительные, шаровидные, колбовидные клетки различной величины, в том числе и проходящие через бактериальные фильтры. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к изменениям бактерий, могут реверсировать, возвращаясь в исходную бактериальную клетку. L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных болезней.

Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану (два темных слоя толщиной по 2,5 нм каждый разделены светлым - промежуточным). По структуре она похожа на плазмолемму клеток животных и состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов, с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. Некоторые из них являются пермеазами, участвующими в транспорте веществ. В отличие от эукариотических клеток, в цитоплазматической мембране бактериальной клетки отсутствуют стеролы (за исключением микоплазм).

Цитоплазматическая мембрана является динамической структурой с подвижными компонентами, поэтому ее представляют как мобильную текучую структуру. Она окружает наружную часть цитоплазмы бактерий и участвует в регуляции осмотического давления, в транспорте веществ и энергетическом метаболизме клетки (за счет ферментов цепи переноса электронов, аденозинтрифосфатазы - АТФазы и др.). При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цито-плазматическая мембрана образует инвагинаты - впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые «мезосомы». Менее сложно закрученные структуры называются «внутрицитоплазматические мембраны». Роль мезосом и внутрицитоплазматических мембран до конца не выяснена. Предполагают даже, что они являются артефактом, возникающим после приготовления (фиксации) препарата для электронной микроскопии. Тем не менее считают, что производные цитоплазматической мембраны участвуют в делении клетки, обеспечивая энергией синтез клеточной стенки, принимают участие в секреции веществ, спорообразовании, то есть в процессах с высокой затратой энергии. Цитоплазма занимает основной объем бактериальной клетки и состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул - рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков.

Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 808-рибосом, характерных для эукарио-тических клеток. Поэтому некоторые антибиотики, связываясь с рибосомами бактерий, подавляют синтез бактериального белка, не влияя на синтез белка эукариотических клеток. Рибосомы бактерий могут диссоциировать на две субъединицы: 50S и 30S. рРНК - консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S-рРНК входит в состав малой субъединицы рибосом, а 23S-рРНК - в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S-рРНК служит основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов.

В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, β-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей.

Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Толуидиновым синим^♠ или Метиленовым синим^♠ волютин окрашивается в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма бактерии - в синий. Характерное расположение гранул волютина отмечается у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки. Метахроматическое окрашивание волютина связано с высоким содержанием полимеризованного неорганического полифосфата. При электронной микроскопии они имеют вид электронноплотных гранул размером 0,1-1,0 мкм.

Нуклеоид - эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, плотно уложенной наподобие клубка. Нуклеоид бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). У большинства бактерий содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК. Однако у некоторых бактерий имеются две хромосомы кольцевой формы (V. cholerae) и линейные хромосомы (см. раздел 5.1.1). Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после окраски специфическими для ДНК методами: по Фельгену или Романовскому-Гимзе. На электронограммах ультратонких срезов бактерий ну-клеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК, связанной определенными участками с цитоплазматической мембраной или мезосомой, участвующими в репликации хромосомы.

Кроме нуклеоида, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности - плазмиды (см. раздел 5.1.2), представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.

Капсула, микрокапсула, слизь. Капсула - слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при специальных методах окраски мазка по Бурри-Гинсу, создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг капсулы. Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов, например, у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна, включает большое количество воды. Она препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела к капсуле вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы).

Многие бактерии образуют микрокапсулу - слизистое образование толщиной менее 0,2 мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии.

От капсулы следует отличать слизь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких внешних границ. Слизь растворима в воде.

Мукоидные экзополисахариды характерны для мукоидных штаммов синегнойной палочки, часто встречаемых в мокроте больных кистоз-ным фиброзом. Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам); их еще называют гликокаликсом.

Капсула и слизь предохраняют бактерии от повреждений, высыхания, так как, являясь гидрофильными, хорошо связывают воду, препятствуют действию защитных факторов макроорганизма и бактериофагов.

Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цито-плазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из трех частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (одна пара дисков у грамположи-тельных и две пары у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем - ротором, вращающим жгутик. В качестве источника энергии используется разность протонных потенциалов на цитоплазматической мембране. Механизм вращения обеспечивает протонная АТФ-синтаза. Скорость вращения жгутика может достигать 100 об/с. При наличии у бактерии нескольких жгутиков они начинают синхронно вращаться, сплетаясь в единый пучок, образующий своеобразный пропеллер.

Жгутики состоят из белка флагеллина (flagellum - жгутик), являющегося антигеном - так называемый Н-антиген. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали.

Число жгутиков у бактерий разных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен, отходящих по периметру бактерии (перитрих), у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки.

Жгутики выявляют с помощью электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелыми металлами, или в световом микроскопе после обработки специальными методами, основанными на протравливании и адсорбции различных веществ, приводящих к увеличению толщины жгутиков (например, после серебрения).

Ворсинки, или пили (фимбрии), - нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм × 0,3-10 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина. Известно несколько типов пилей. Пили общего типа отвечают за прикрепления к субстрату, питание и водно-солевой обмен. Они многочисленны - несколько сотен на клетку. Половые пили (1-3 на клетку) создают контакт между клетками, осуществляя между ними передачу генетической информации путем конъюгации (см. гл. 5). Особый интерес представляют пили IV типа, у которых концы обладают гидрофобностью, в результате чего они закручиваются. Располагаются они по полюсам клетки. Эти пили встречаются у патогенных бактерий. Они обладают антигенными свойствами, осуществляют контакт бактерии с клеткой-хозяином, участвуют в образовании биопленки (см. гл. 3). Многие пили являются рецепторами для бактериофагов.

Споры - своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которых размер споры не превышает диаметр клетки, называются бациллами. Спорообразующие бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, от чего они принимают форму веретена, называются «клостридии», например бактерии рода Clostridium (от лат. Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нельсена в красный, а вегетативная клетка - в синий цвет.

Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор бывает овальной и шаровидной, расположение в клетке - терминальное, то есть на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы).

Процесс спорообразования (споруляция) проходит ряд стадий, в течение которых часть цитоплазмы и хромосома бактериальной вегетативной клетки отделяются, окружаясь врастающей цитоплазматиче-ской мембраной, - образуется проспора.

В протопласте проспоры находятся нуклеоид, белоксинтезирующая система и система получения энергии, основанная на гликолизе. Ци-тохромы отсутствуют даже у аэробов. Не содержится АТФ, энергия для прорастания сохраняется в форме 3-глицеринфосфата.

Проспору окружают две цитоплазматические мембраны. Слой, окружающий внутреннюю мембрану споры, называется «стенка споры», он состоит из пептидогликана и является главным источником клеточной стенки при прорастании споры.

Между наружной мембраной и стенкой споры формируется толстый слой, состоящий из пептидогликана, имеющего много сшивок, - кортекс .

Кнаружи от внешней цитоплазматической мембраны расположена оболочка споры, состоящая из кератиноподобных белков, содержащих множественные внутримолекулярные дисульфидные связи. Эта оболочка обеспечивает резистентность к химическим агентам. Споры некоторых бактерий имеют дополнительный покров - экзоспориум липопротеиновой природы. Таким образом формируется многослойная плохо проницаемая оболочка.

Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем и формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. Спора приобретает термоустойчивость, которую связывают с наличием в ней дипиколината кальция.

Спора долго может сохраняться из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма. В почве, например, возбудители сибирской язвы и столбняка могут сохраняться десятки лет.

В благоприятных условиях споры прорастают, проходя три последовательные стадии: активации, инициации, вырастания. При этом из одной споры образуется одна бактерия. Активация - это готовность к прорастанию. При температуре 60-80 °С спора активируется для прорастания. Инициация прорастания длится несколько минут. Стадия вырастания характеризуется быстрым ростом, сопровождаемым разрушением оболочки и выходом проростка.

Спирохеты - тонкие длинные извитые бактерии. Они состоят из наружной мембранной клеточной стенки, которая окружает цитоплазматический цилиндр. Поверх наружной мембраны располагается прозрачный чехол гликозаминогликановой природы. Под наружной мембранной клеточной стенкой располагаются фибриллы, закручивающиеся вокруг цитоплазматического цилиндра, придавая бактериям винтообразную форму. Фибриллы прикреплены к концам клетки и направлены навстречу друг другу. Число и расположение фибрилл варьируют у разных видов. Фибриллы участвуют в передвижении спирохет, придавая клеткам вращательное, сгибательное и поступательное движение. При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые названы вторичными завитками. Спирохеты плохо воспринимают красители. Обычно их окрашивают по Романовскому-Гимзе или серебрением. В живом виде спирохеты исследуют с помощью фазово-контраст-ной или темнопольной микроскопии.

Спирохеты представлены тремя родами, патогенными для человека: Treponema, Borrelia, Leptospira.

Трепонемы (род Treponema) имеют вид тонких штопорообразно закрученных нитей с 8-12 равномерными мелкими завитками. Вокруг протопласта трепонем расположены 3-4 фибриллы (жгутики). В цитоплазме имеются цитоплазматические филаменты. Патогенными представителями являются Т. pallidum - возбудитель сифилиса, T. pertenue - возбудитель тропической болезни фрамбезии. Имеются и сапрофиты - обитатели полости рта человека ила водоемов.

Боррелии (род Borrelia), в отличие от трепонем, более длинные, имеют по 3-8 крупных завитков и 7-20 фибрилл. К ним относятся возбудитель возвратного тифа (В. recurrentis) и возбудители болезни Лайма (В. burgdorferi) и других заболеваний.

Лептоспиры (род Leptospira) имеют завитки неглубокие и частые, в виде закрученной веревки. Концы этих спирохет изогнуты наподобие крючков с утолщениями на концах. Образуя вторичные завитки, они приобретают вид букв S или С; имеют две осевые фибриллы. Патогенный представитель L. interrogans вызывает лептоспироз при попадании в организм с водой или пищей, приводя к кровоизлияниям и желтухе.

Риккетсии (род Rickettsia) - мелкие грамотрицательные палочковидные бактерии (0,3-2,0 мкм), облигатные (обязательные) внутриклеточные паразиты. Размножаются бинарным делением в цитоплазме, а некоторые в ядре инфицированных клеток. Обитают в членистоногих (вши, блохи, клещи), которые являются их хозяевами или переносчиками. Форма и размер риккетсий могут меняться (клетки неправильной формы, нитевидные) в зависимости от условий роста. Структура риккетсии не отличается от таковой грамотрицательных бактерий.

Риккетсии обладают независимым от клетки хозяина метаболизмом, однако, возможно, они получают от клетки хозяина макроэргические соединения для своего размножения. В мазках и тканях их окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Маккиавелло-Здродовскому (риккетсии красного цвета, а инфицированные клетки - синего).

У человека риккетсии вызывают эпидемический сыпной тиф (R. prowazekii), клещевой риккетсиоз (R. sibirica), пятнистую лихорадку Скалистых гор (R. rickettsii) и другие риккетсиозы.

Хламидии - мелкие грамотрицательные бактерии шаровидной или овоидной формы. Не образуют спор, не имеют жгутиков и капсулы. Хламидии относятся к облигатным внутриклеточным паразитам. Они имеют кокковидную форму, грамотрицательны (иногда грамвариабель-ны).

Строение их клеточной стенки напоминает таковую грамотрицательных бактерий, хотя имеются отличия. Она не содержит типичного пептидогликана: в его составе полностью отсутствует N-ацетилмурамовая кислота. В состав клеточной стенки входит двойная наружная мембрана, которая включает ЛПС и белки. Несмотря на отсутствие пептидо-гликана, клеточная стенка хламидий обладает ригидностью. Цитоплазма клетки ограничена внутренней цитоплазматической мембраной.

Основным методом выявления хламидий является окраска по Рома-новскому-Гимзе. Цвет окраски зависит от стадии жизненного цикла: элементарные тельца окашиваются в пурпурный цвет на фоне голубой цитоплазмы клетки, ретикулярные тельца - в голубой цвет.

Хламидии размножаются только в живых клетках: их рассматривают как энергетических паразитов; они не синтезируют АТФ и гуанозин-трифосфат. Вне клеток хламидии имеют мелкую сферическую форму (0,3 мкм), метаболически неактивны и называются «элементарные тельца». Элементарные тельца попадают в эпителиальную клетку путем эндоцитоза с формированием внутриклеточной вакуоли. Внутри клеток они увеличиваются в размере и превращаются в делящиеся ретикулярные тельца, образуя скопления в вакуолях (включения). Из ретикулярных телец формируются элементарные тельца, которые выходят из клеток путем экзоцитоза или лизиса клетки. Вышедшие из клетки элементарные тельца вступают в новый цикл, инфицируя другие клетки.

У человека хламидии вызывают поражения глаз (трахома, конъюнктивит), урогенитального тракта, легких и др.

Aктиномицеты - ветвящиеся, нитевидные или палочковидные грамположительные бактерии. Свое название (от греч. actis - луч, mykes - гриб) они получили в связи с образованием в пораженных тканях друз - гранул из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся колбовидными утолщениями. Актиномицеты, как и грибы, образуют мицелий - нитевидные переплетающиеся клетки (гифы). Они формируют субстратный мицелий, образующийся в результате врастания клеток в питательную среду, и воздушный, растущий на поверхности среды. Актиномицеты могут делиться путем фрагментации мицелия на клетки, похожие на палочковидные и кокковидные бактерии. На воздушных гифах актиномицетов образуются споры, служащие для размножения. Споры актиномицетов обычно не термостойки.

Общую филогенетическую ветвь с актиномицетами образуют так называемые нокардиоподобные (нокардиоформные) актиномицеты - собирательная группа палочковидных бактерий неправильной формы. Их отдельные представители образуют ветвящиеся формы. К ним относят бактерии родов Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Нокар-диоподобные актиномицеты отличаются наличием в клеточной стенке сахаров арабинозы, галактозы, а также миколовых кислот и большого количества жирных кислот. Миколовые кислоты и липиды клеточных стенок обусловливают кислотоустойчивость бактерий, в частности микобактерий туберкулеза и лепры (при окраске по Цилю-Нельсену они имеют красный цвет, а некислотоустойчивые бактерии и элементы ткани, мокроты - синий цвет).

Патогенные актиномицеты вызывают актиномикоз, нокардии - нокардиоз, микобактерии - туберкулез и лепру, коринебактерии - дифтерию. Сапрофитные формы актиномицетов и нокардиоподобных актиномицетов широко распространены в почве, многие из них являются продуцентами антибиотиков.

Микоплазмы - мелкие бактерии (0,15-1,0 мкм), окруженные только цитоплазматической мембраной, содержащей стеролы. Они относятся к классу Mollicutes. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмотически чувствительны. Имеют разнообразную форму: кокковид-ную, нитевидную, колбовидную. Эти формы видны при фазово-контрастной микроскопии чистых культур микоплазм. На плотной питательной среде микоплазмы образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью: центральная непрозрачная часть, погруженная в среду, и просвечивающая периферия в виде круга.

Микоплазмы вызывают у человека атипичную пневмонию (Mycoplasma pneumoniae) и поражения мочеполового тракта (М. hominis и др.). Микоплазмы вызывают заболевания не только у животных, но и у растений. Достаточно широко распространены и непатогенные представители.

Химический состав бактериальной клетки

Бактериальная клетка на 80-90% состоит из воды и только 10% приходится на долю сухого вещества. Вода в клетке находится в свободном или связанном состоянии. Она выполняет механическую роль в обеспечении тургора, участвует в гидролитических реакциях. Удаление воды из клетки путем высушивания приводит к приостановке процессов метаболизма, прекращению размножения, а для многих микроорганизмов губительно. В то же время особый способ высушивания микроорганизмов в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) обеспечивает сохранение жизнеспособности большинства микроорганизмов. Лиофилизация используется для приготовления проб, пригодных для длительного хранения.

В сухом веществе бактерий 52% составляют белки, 17% - углеводы, 9% - липиды, 16% - РНК, 3% - ДНК и 3% - минеральные вещества.

Белки являются ферментами, а также составной частью клетки, входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, клеточной стенки, жгутиков, спор и некоторых капсул. Некоторые бактериальные белки являются антигенами и токсинами бактерий. В состав белков бактерий входят отсутствующие у человека D-аминокислоты, а также диаминопимелиновая кислота.

Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди-, олигосахаров и полисахаридов, а также входят в состав комплексных соединений с белками, липидами и другими соединениями. Полисахариды входят в состав некоторых капсул, клеточной стенки; крахмал и гликоген являются запасными питательными веществами. Некоторые полисахариды принимают участие в формировании антигенов.

Липиды или жиры входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, клеточной стенки грамотрицательных бактерий, а также служат запасными веществами, входят в состав эндотоксина грамотрицательных бактерий, в составе ЛПС формируют антигены. В бактериальных жирах преобладают длинноцепочечные (С14-С18) насыщенные жирные кислоты и ненасыщенные жирные кислоты, содержащие одну двойную связь. Сложные липиды представлены фосфатидилинозитом, фосфатидилглицерином и фосфатидилэтаноламином. У некоторых бактерий в клетке находятся воски, эфиры миколовой кислоты. Микоплазмы - единственные представители царства Procatyotae, имеющие в составе цитоплазматической мембраны стеролы. Остальные бактерии в составе цитоплазматической мембраны и ее производных не имеют стеролов.

В бактериальной клетке присутствуют все типы РНК: иРНК, транспортная РНК (тРНК), рРНК, менее известная антисенс РНК (асРНК). Молекулы асРНК пока не обнаружены в клетках эукариот. Информация об асРНК записана в хромосоме, в так называемых антисенс-генах. АсРНК принимает активное участие в регуляции различных клеточных процессов, в том числе репликации ДНК бактерий, вирусов, плазмид и танспозонов. АсРНК представляет собой короткую молекулу, комплементарную определенному участку иРНК, и, соединяясь с ней, блокирует процесс синтеза белка. При этом в клетке подобные комплексы могут накапливаться, и при диссоциации асРНК и иРНК одновременно начинается синтез белка на большом числе однотипных матриц. Искусственные молекулы асРНК пытаются использовать для борьбы с бактериями за счет угнетения ими синтеза в клетке определенных жизненно важных белков.

Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - это те строительные блоки, из которых синтезируются нуклеиновые кислоты. Кроме того, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды входят в состав многих ко-ферментов и служат для активации и переноса аминокислот, моносахаров, органических кислот.

ДНК выполняет в бактериальной клетке наследственную функцию. Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара дезоксирибо-зы и фосфатной группы (рис. 3-1, б). Азотистые основания представлены пуринами (аденин, гуанин) и пиримидинами (тимин, цитозин). Каждый нуклеотид обладает полярностью. У него имеется дезоксирибозный 3'-конец и фосфатный 5'-конец. Нуклеотиды соединяются в полинуклеотидную цепочку посредством фосфодиэфирных связей между 5'-концом одного нуклеотида и 3'-концом другого (рис. 3-1, а).

Соединение цепей обеспечивается водородными связями между комплементарными азотистыми основаниями: аденина с тимином, гуанина с цитозином. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположены 5'-конец одной цепи и 3'-конец другой цепи. Процентное содержание гуанинцитозиновых пар в ДНК определяет степень родства между бактериями и используется при определении таксономического положения бактерий.

Минеральные вещества обнаруживаются в золе, полученной после сжигания клеток. В большом количестве представлены N, S, Р, Са, К, Mg, Fe, Mn, а также микроэлементы Zn, Cu, Co, Ва.

Азот входит в состав белков, нуклеотидов, коферментов. Сера входит в виде сульфгидрильных групп в структуру белков. Фосфор в виде фосфатов представлен в нуклеиновых кислотах, АТФ, коферментах. В качестве активаторов ферментов используются ионы Mg, Fe, Mn. Ионы К и Mg необходимы для активации рибосом. Са является составной частью клеточной стенки грамположительных бактерий. У многих бактерий имеются сидерохромы, которые обеспечивают транспортировку ионов Fe внутрь клетки в виде растворимых комплексных соединений.

Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии

Основная цель метаболизма бактерий - рост, то есть координированное увеличение всех компонентов клетки. Поскольку основными компонентами бактериальной клетки являются органические соединения, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды, остов которых построен из атомов углерода, то для роста требуется постоянный приток атомов углерода. В зависимости от источника усвояемого углерода бактерии подразделяют на аутотрофы (от греч. autos - сам, trophe - питание), которые используют для построения своих клеток неорганический углерод в виде СО₂ , и гетеротрофы (от греч. heteros - другой), которые используют органический углерод. Легкоусвояемыми источниками органического углерода являются гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты, липиды.

Белки, жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты являются крупными полимерными молекулами, которые синтезируются из мономеров в реакциях поликонденсации, протекающих с поглощением энергии. Поэтому для восполнения своей биомассы бактериям, помимо источника углерода, требуется источник энергии. Энергия запасается бактериальной клеткой в форме молекул АТФ.

Организмы, для которых источником энергии является свет, называются «фототрофы». Те организмы, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций, называются «хемотрофы».

Среди хемотрофов выделяют литотрофы (от греч. lithos - камень), способные использовать неорганические доноры электронов (Н₂ , NH₃ , H₂ S, Fe²⁺ и др.), и органотрофы, которые используют в качестве доноров электронов органические соединения.

Бактерии, изучаемые медицинской микробиологией, являются ге-терохемоорганотрофами. Отличительной особенностью этой группы является то, что источник углерода у них служит источником энергии. Учитывая разнообразие микромира и типов метаболизма, далее изложение материала ограничено рассмотрением метаболизма у гетерохе-моорганотрофов.

Степень гетеротрофности у различных бактерий неодинакова. Среди бактерий выделяют сапрофиты (от греч. sapros - гнилой, phyton - растение), которые питаются мертвым органическим материалом и независимы от других организмов, и паразиты (от греч. parasites - нахлебник) - гетеротрофные микроорганизмы, получающие питательные вещества от макроорганизма.

Среди паразитов различают облигатные и факультативные. Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток макроорганизма. К ним относятся представители родов Rickettsia, Coxiella, Ehrlichia, Chlamydia и др., размножающиеся только внутри клеток макроорганизма. Факультативные паразиты могут жить и без хозяина и размножаться, так же как и сапрофиты, на питательных средах in vitro, то есть вне организма.

Культивирование бактерий в системах in vitro осуществляется на питательных средах. Искусственные питательные среды должны отвечать следующим требованиям.

В зависимости от консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара.

Агар - полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 °С, но при охлаждении остывает при температуре 45-50 °С. Агар добавляют в концентрации 0,5% для полужидких сред и 1,5-2% для создания плотных сред. В зависимости от состава и цели применения различают простые, сложные, элективные, минимальные, дифференциально-диагностические и комбинированные среды.

По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, питательный бульон, мясо-пептонный агар. На основе простых сред готовят сложные среды, например сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.

В зависимости от назначения среды подразделяются на элективные, обогащения, дифференциально-диагностические. Под элективными понимают среды, на которых лучше растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9,0, служит для выделения холерного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого рН на этой среде не растут.

Среды обогащения - это среды, которые стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, среда, содержащая селенит натрия, стимулирует рост бактерий рода Salmonella, ингибируя рост кишечной палочки.

Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бактерий ферментировать сахара.

Комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры, и дифференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроба. Примером таких сред служат среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, используемые при выделении патогенных кишечных бактерий. Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.

В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредук-тазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут как локализоваться внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз являются экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиа-луронидаза, коллагеназа, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и в некоторых случаях для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить с помощью дифференциально-диагностических сред. Для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Энергия в бактериальной клетке накапливается в форме молекул АТФ. У хемоорганотрофных бактерий реакции, связанные с получением энергии в форме АТФ, - это реакции окисления-восстановления, сопряженные с реакциями фосфорилирования. Окисленный в этих реакциях углерод выделяется клеткой в виде СО₂ . Для удаления отщепившегося в этих реакциях водорода, который находится в форме восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД), разные бактерии используют различные возможности в зависимости от конечного акцептора водорода (или электронов, что является эквивалентным понятием). В зависимости от способа получения энергии у бактерий имеется несколько типов метаболизма: окислительный, или дыхание; бродильный, или ферментативный; смешанный. Тип метаболизма определяет не только реакции, в результате которых образуется АТФ, но и конечные продукты этих реакций, которые используются при идентификации бактерий, а также условия культивирования бактерий.

При использовании в качестве источника углерода и энергии глюкозы или других гексоз начальные этапы окисления глюкозы являются общими как при оксидативном, так и при бродильном метаболизме. К ним относятся пути превращения глюкозы в пируват (при использовании в качестве источника энергии отличных от глюкозы гексоз, или дисахаридов, они в результате химических превращений вступают в цепь реакций, превращающих глюкозу в пируват). Пируват, образовавшийся при расщеплении глюкозы, превращается при участии кофакторов в активированную уксусную кислоту или ацетилкоэнзим А. Последний окисляется в СО₂ с отщеплением водорода в цикле трикар-боновых кислот.

Цикл трикарбоновых кислот не только выполняет функцию конечного окисления питательных веществ, но и обеспечивает процессы биосинтеза многочисленными предшественниками: пируват α-кетоглутаровая, щавелевая и янтарные кислоты - для синтеза аминокислот, щавелевоуксусная - для синтеза пиримидиновых нуклеотидов, малонат - для синтеза аминокислот, пиримидиновых нуклео-тидов и жиров (рис. 3-2).

Окислительный метаболизм. Бактерии, обладающие окислительным метаболизмом, энергию получают путем дыхания. Дыхание - процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором - только неорганические соединения.

У бактерий, обладающих окислительным метаболизмом, акцептором электронов (или водорода Н⁺ ) является молекулярный кислород. В этом случае пируват полностью окисляется в цикле трикарбоновых кислот до СО₂ . Цикл трикарбоновых кислот выполняет функции поставщика как предшественников для биосинтетических процессов, так и атомов водорода, который в форме восстановленного НАД переносится на молекулярный кислород через серию переносчиков, обладающих сложной структурно оформленной мультиферментной системой - дыхательной цепью. Дыхательная цепь у бактерий локализована в цитоплазматической мембране и во внутриклеточных мембранных структурах.

Электрохимическую энергию бактерии получают в процессе переноса электронов по окислительно-восстановительным цепям в мембране, в результате чего происходит неравномерное распределение Н⁺ по обеим ее сторонам. Переносчики электронов располагаются в мембране таким образом, что во внешней среде происходит накопление ионов водорода (при этом возникает подкисление среды), а в цитоплазме их число уменьшается, что сопровождается подщелачиванием среды. Неравномерное распределение положительно заряженных протонов (большее число на наружной и меньшее на внутренней поверхности плазматической мембраны) приводит к формированию расположенного поперек мембраны электрического поля, мембранного потенциала. В результате при переносе электронов возникает трансмембранный электрохимический градиент ионов водорода, обозначаемый символом ΔμH⁺ и измеряемый в вольтах. Энергия мембранного потенциала используется для синтеза локализованной в мембране АТФазой АТФ.

Энергия в форме ΔμHН⁺ не теряется при ее запасании и может образовываться и потребляться клеткой в условиях, когда невозможен синтез АТФ. В последние годы показано, что аналогичным образом перераспределяются и атомы Na+ с образованием энергии, обозначаемой как ΔμКа+. Данные формы энергии тратятся преимущественно на движение бактерий (у подвижных форм) и транспорт веществ в клетку и из нее.

Типичная цепь выглядит следующим образом:

ЦТК → НАД(Н₂ ) → Флавопротеид → Хинон → Цитохромы: b с а → О₂ .

Конечным этапом переноса электронов (протонов) по дыхательной цепи является восстановление цитохромов а + а₃ (цитохромоксидазы). Цитохромоксидаза является конечной оксидазой, передающей электроны на кислород. Образующиеся при окислении флавинаденин-динуклеотида (ФАД) или хинонов протоны связываются ионами О^2- с образованием воды.

В то время как у эукариотов ферменты дыхательной цепи имеют относительно постоянный состав, у бактерий встречаются вариации в составе дыхательной цепи. У некоторых бактерий цитохромы отсутствуют и при контакте с кислородом происходит непосредственный перенос водорода на кислород с помощью флавопротеидов, конечным продуктом при этом оказывается перекись водорода (Н₂ О₂ ).

Помимо углеводов, прокариоты способны использовать другие органические соединения, в частности белки, в качестве источника энергии, окисляя их полностью до СО₂ и Н₂ О.

Аминокислоты и белки также могут выступать в качестве энергетических ресурсов. Их использование связано в первую очередь с определенными ферментативными преобразованиями подготовительного характера. Белки вначале вне клетки расщепляются протеолитическими ферментами на пептиды, которые поглощаются клеткой и расщепляются внутриклеточными пептидазами до аминокислот. Аминокислоты могут использоваться в конструктивном метаболизме, а могут у аммонифицирующих бактерий служить основным материалом в энергетических процессах при окислительном дезаминировании, в результате которого происходят выделение аммиака и превращение аминокислоты в кетокислоту, которая через цикл трикарбоновых кислот вступает в конструктивный метаболизм.

Процесс аммонификации известен как гниение, при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специфическим запахом образующихся при этом первичных аминов. Гнилостные бактерии осуществляют минерализацию белка, разлагая его до СО₂ , NH₃ , H₂ S. К гнилостным бактериям относятся Proteus, Pseudomonas, Bacillus cereus.

Анаэробное дыхание. Некоторые бактерии обладают способностью использовать в анаэробных условиях нитрат как конечный акцептор водорода. Восстановление нитрата может происходить двумя путями:

Сульфатное дыхание. Использовать сульфат как конечный акцептор водорода при анаэробном дыхании способна лишь небольшая группа бактерий, включающая только два рода: Desulfovibrio, Desulfotomaculum. Эти бактерии являются строгими анаэробами, они обитают в сероводородном иле и не имеют значения в медицинской микробиологии. Они способны использовать в качестве донора электронов молекулярный водород, поэтому их относят к хемолитотрофам. Этим бактериям принадлежит ведущая роль в образовании сероводорода в природе.

Бродильный (ферментативный) метаболизм. Ферментация, или брожение, - процесс получения энергии, при котором отщепленный от субстрата водород переносится на органические соединения. Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Ферментироваться могут углеводы, аминокислоты (за исключением ароматических), пурины, пиримидины, многоатомные спирты. Не способны сбраживаться ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, жирные кислоты. Эти вещества разлагаются и окисляются только в присутствии кислорода, в анаэробных условиях они стабильны. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.

При ферментации гексоз (глюкозы) пируват лишь частично окисляется в цикле трикарбоновых кислот. Последний выполняет только функции поставщика предшественников для биосинтетических процессов. Энергия в форме двух молекул АТФ образуется в результате субстратного фосфорилирования, протекающего при окислении трио-зофосфата в пируват. Отщепившийся от субстрата водород, находящийся в форме восстановленного НАД, переносится на пируват, превращая его в цепи реакций в этанол, кислоты, газы. Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов брожения углеводов: спиртовое, молочнокислое, муравьинокислое, маслянокислое.

Спиртовое брожение встречается в основном у дрожжей. Конечными продуктами являются этанол и СО₂ . Спиртовое брожение используется в хлебопекарной промышленности и виноделии.

Молочнокислое брожение происходит у S. pyogenes, E. faecalis, S. Salivarius, а также у бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Продуктами этого типа брожения являются молочная кислота, этанол и уксусная кислота. Продукты молочнокислого брожения играют большую роль в формировании колонизационной резистентности бактериями рода Lactobacillus и Bifidobacterium, составляющих облигатную флору кишечника. Молочнокислые бактерии широко используются в молочной промышленности для получения молочнокислых продуктов, а также в создании пробиотиков.

Муравьинокислое (смешанное) брожение встречается у представителей семейств Enterobacteriaceae и Vibrionaceae. Различают два типа этого брожения. При первом происходит расщепление пирувата с образованием через цепь реакций муравьиной, янтарной и молочной кислот. Сильное кислотообразование можно выявить реакцией с индикатором метиленовым красным, который меняет окраску в сильнокислой среде. При втором типе брожения образуется целый ряд кислот, однако главным продуктом брожения являются ацетоин и 2,3-бутандиол, образующиеся через цепь реакций из двух молекул пирувата. Эти вещества при взаимодействии с а-нафтолом в щелочной среде вызывают образование окраски бурого цвета, что выявляется реакцией Фогеса-Проскауэра, используемой при идентификации бактерий.

Маслянокислое брожение. Масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол и ряд других органических кислот, в частности уксусная, капроновая, валериановая, пальмитиновая, являются продуктами сбраживания углеводов сахаролитическими строгими анаэробами. Спектр этих кислот, определяемый с помощью газожидкостной хроматографии, используется как экспресс-метод при идентификации анаэробов.

Ферментация белков. Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называются «пептолитические». Пептолитическими являются некоторые клостридии, в частности С. histolyticum и C. botulinum. Пептолитические бактерии гидролизуют белки и сбраживают аминокислоты. Многие аминокислоты сбраживаются совместно с другими, при этом одна выполняет функцию донора, а другая - функцию акцептора водорода. Аминокислота-донор дезаминируется в кетокислоту, которая в результате окислительного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту.

Основные органические компоненты бактериальной клетки, как уже было отмечено, синтезируются в реакциях полимеризации из строительных блоков: аминокислот, фосфатов, сахаров, пуриновых и пи-римидиновых оснований, органических кислот. Поставщиками этих строительных блоков являются промежуточные продукты основных путей энергетического метаболизма (см. рис. 3-2). Среди бактерий выделяется группа, называющаяся «прототрофы», которые способны синтезировать все компоненты клетки из одного источника углерода и энергии. Если бактерии теряют способность образовывать какое-либо жизненно важное вещество (аминокислоту, витамин, фактор роста и др.), участвующее в биосинтетических процессах, то для их роста и размножения требуется его поступление в готовом виде. Такие вещества называют «фактор роста», а бактерии, возникшие, как правило, в результате мутаций, - «ауксотрофы».

Факторами роста служат аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, которые входят в состав простетических групп коферментов.

Биосинтез аминокислот и синтез белка. Большинство бактерий обладают способностью синтезировать все 20 аминокислот, из которых состоят белки. Белки в бактериальной клетке выполняют ферментативную функцию, а также являются составной частью структурных образований клетки: цитоплазматической мембраны и ее производных, клеточной стенки, жгутиков, капсулы и спор у некоторых бактерий.

Углеродные скелеты аминокислот образуются из промежуточных продуктов обмена. Исходным материалом служат промежуточные продукты фруктозодифосфатного и пентозофосфатного путей, цикл три-карбоновых кислот: пируват, кетоглутаровая кислота, оксалоацетат, фумарат, эритрозо-4-фосфат, рибозо-4-фосфат. Аминогруппы вводятся в результате непосредственного аминирования или переаминирования. Перевод неорганического азота в органические соединения происходит всегда через аммиак. Нитраты, нитриты и молекулярный азот предварительно восстанавливаются в аммиак и только после этого включаются в состав органических соединений. В результате прямого аминирования образуются лишь L-аланин, L-аспартат, L-глутамат и L-глугамин. Все остальные аминокислоты получают свою аминогруппу в результате переаминирования с одной из первичных аминокислот. Синтез белка осуществляется у бактерий так же, как в клетках эукариот.

Синтез белка происходит на рибосомах и обычно подразделяется на три процесса:

Инициация синтеза белка заключается в связывании мет-тРНК с малой субъединицей рибосомы с последующим встраиванием инициирующего кодона иРНК. Элонгация происходит за счет поочередного присоединения аминокислотных остатков к растущей полипептидной цепи. Терминация наступает, когда синтез полипептида достигает стоп-кодона. У E. coli известны три таких кодона: УАА, УГА и УАГ. В результате действия факторов терминации происходят остановка синтеза белка и диссоциация молекулы иРНК и рибосомы.

Скорость синтеза белка в микробной клетке очень велика, так как ДНК бактерий не отграничена мембраной от цитоплазмы, не содержит интронов (участков ДНК, не несущих информации) и, соответственно, у микробов отсутствуют вырезание их копий из иРНК и сшивание копий экзонов (участков, кодирующих белки). В результате в клетках прокариот не происходит физического разделения процессов синтеза иРНК (транскрипции) и трансляции, поэтому оба процесса часто идут одновременно: трансляция начинается раньше, чем завершена транскрипция. Бактерии также способны одновременно синтезировать несколько идентичных молекул на одной матрице иРНК. При этом иРНК связывается с несколькими рибосомами с образованием комплекса, получившего название «полисомы».

Процесс синтеза белка представляет собой важную мишень для разнообразных антимикробных препаратов. При этом антибиотики имеют различные мишени и механизмы действия, например аминогликозиды и тетрациклины соединяются с малой, а макролиды и линкозамиды - с большой субъединицей рибосом. Белки, синтезируемые клеткой, могут использоваться внутри нее или выделяться в окружающую среду или периплазматическое пространство (грамотрицательные бактерии).

Многие годы считали, что после синтеза на рибосомах молекулы белков сами приобретают нужную форму (третичную структуру). Сейчас мы знаем, что большинство из них приобретают нужную конформацию молекулы с помощью специальных белков, получивших название «шапероны». Молекулы шаперонов не только обеспечивают правильное складывание белков, но и препятствуют неправильному их закручиванию. Эти молекулы абсолютно необходимы для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки как эу-, так и прокариот. Процесс укладки белковых молекул является энергетически зависимым и сопровождается расходом энергии АТФ. Количество шаперонов резко возрастает, когда клетка подвергается стрессорному воздействию различных факторов внешней среды (температуры - тепловой шок, токсинов, нарушающих метаболические реакции и др.) При этом шапероны защищают многие белки, включая ДНК-полимеразы, от разрушения. Еще одной важной функцией шаперонов является их участие в транспорте белков через мембраны.

Биосинтез нуклеотидов. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - это те строительные блоки, из которых синтезируются нуклеиновые кислоты. Кроме того, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды входят в состав многих коферментов и служат для активации и переноса аминокислот, сахаров, липидов в реакциях полимеризации. Исходным соединением для образования пентозной части нуклеотидов служит рибозо-5-фосфат, образующийся в фруктозодифосфатном пути. Углеродный скелет пиримидинов происходит из аспартата, который образуется в цикле трикарбоновых кислот. Атомы азота и аминогруппы пуринов и аминосодержащих пиримидинов происходят из аспартата и глутамина.

Ключевой промежуточный продукт для биосинтеза жирных кислот - ацетилкоэнзим А. Ключевые промежуточные продукты для синтеза фосфолипидов - продукт фруктозодифосфатного пути, диоксиацетилфосфат, восстанавливающийся в глицерол-3-фосфат, который соединяется с остатками жирных кислот.

Биосинтез углеводов. Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди- и полисахаридов, а также комплексных соединений.

Синтез глюкозы происходит из пирувата за счет обратных реакций, путей распада глюкозы. Для обхода реакций, идущих только в одном направлении, имеются обходные пути, например глиоксилатный цикл.

Транспорт веществ в бактериальную клетку

Для того чтобы питательные вещества могли подвергнуться превращениям в цитоплазме клетки, они должны проникнуть в клетку через пограничные слои, отделяющие клетку от окружающей среды. Ответственность за поступление в клетку питательных веществ лежит на ци-топлазматической мембране.

Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку: пассивный и активный.

При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затрат энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного переноса: простую диффузию и облегченную диффузию.

При активном переносе вещество проникает в клетку против градиента концентрации с помощью белка-переносчика пермеазы. При этом происходит затрата энергии. Имеется два типа активного транспорта. При первом типе активного транспорта небольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара) накачиваются в клетку и создают концентрацию, которая может в 100-1000 раз превышать концентрацию этого вещества снаружи клетки.

Второй механизм, получивший название «транслокация радикалов» (фосфотрансферазный путь), обеспечивает включение в клетку некоторых сахаров (например, глюкозы, сахарозы), которые в процессе переноса фосфорилируются, то есть химически модифицируются.

Для осуществления этих процессов в бактериальной клетке локализуется специальная фосфотрансферазная система, составной частью которой является белок-переносчик, находящийся в активной фосфорилированной форме. Фосфорилированный белок связывает свободный сахар на наружной поверхности мембраны и транспортирует его в цитоплазму, где сахар освобождается в виде фосфата. Поступив в клетку, органический источник углерода и энергии вступает в цепь биохимических реакций, в результате которых образуются АТФ и ингредиенты для биосинтетических процессов. Ферменты, входящие в состав фосфотрансферазной системы, принимают участие в регуляции процесса под названием катаболическая репрессия. Когда в питательной среде присутствуют два углевода, то бактериальная клетка начинает утилизировать энергетически более выгодный. Проникновение другого углевода в клетку и его утилизация при этом репрессируются. Например, если в питательной среде присутствуют одновременно глюкоза и лактоза, то глюкоза блокирует расщепление лактозы. Биосинтетические (конструктивные) и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. Они тесно связаны между собой через общие промежуточные продукты, которые называются «амфиболиты».

Транспорт веществ из бактериальной клетки

В процессе жизнедеятельности бактериям требуется выделять в окружающую среду различные белки и ферменты. Секретируемые белки необходимы для жизнедеятельности бактерий. Они участвуют в построении клеточных оболочек, жгутиков, пилей, расщепляют крупные полимерные молекулы, используемые в качестве питательных веществ, до размеров, способных проходить через бактериальную цитоплазматическую мембрану; осуществляют взаимодействие с системами макроорганизма. У грамположительных микробов белки секретируются непосредственно во внешнюю среду. А у грамотрицательных бактерий они должны пересечь наружную мембрану. Наличие наружной мембраны привело к формированию у грамотрицательных бактерий различных по структуре и функциям систем секреции 6 типов.

Белки, секретируемые по I, III, IV и VI путям, пересекают внутреннюю цитоплазматическую и наружные мембраны в один этап без участия sec -белков, без химической модификации, тогда как белки, секретируемые по II и V путям, проходят через внутреннюю и наружную мембрану отдельными этапами при участии sec -белков.

Seс -белки (транслоказы) являются небольшими белками в 30 аминокислот, которые способны узнавать сигнальную последовательность, расположенную на N-терминальном конце секретируемого белка, и связываться с ней сразу же после завершения процесса трансляции, предотвращая включение секретируемого белка в метаболизм клетки. В процессе транслокации белка, которая сопровождается поглощением энергии, происходит отщепление пептидазой в периплазматическом пространстве сигнальной последовательности, а в результате взаимодействия с шаперонами происходит формирование четвертичной структуры переносимого белка.

Зрелый белок проходит через пору в наружной мембране в окружающую среду. Секреция II типа является основным путем для секреции экстрацеллюлярных гидролитических ферментов у грамотрицательных бактерий. У V. cholerae по этому пути выделяются холерный токсин, нейраминидаза, гемагглютининпротеаза, а у P. aeruginosa - эластаза, фосфолипаза С.

Секреторная система V типа отличается от II тем, что в периплазматическом пространстве из С-терминальной части секретируемого полипептида формируется β-цилиндрическая структура, выполняющая роль поры, через которую проходит N-терминальный конец. Внеклеточный протеолиз приводит секретируемый белок в активное функциональное состояние. По этому пути секретируются IgA-протеаза у N. gonorrhoeae, белок пертактин у B. pertussis.

Секреторная система I типа протекает одноэтапно и требует наличия трех секреторных белков: белка, формирующего в цитоплазматической мембране пору АТФазы; белка цитоплазматической мембраны, пронизывающего периплазматическое пространство; белка клеточной стенки, формирующего пору.

Транспортные белки узнают секретируемый белок по наличию сигнальной последовательности, расположенной на С-терминальном конце белка. Данным путем секретируются в основном пороформирующие токсины: гемолизин, металлопротеаза, а также внеклеточная аденилат-циклаза у B. pertussis (рис. 3-3).

Секреторная система IV типа (Т4СС) представляет систему, расположенную на поверхности бактериальной клетки, посредством которой бактериальная клетка способна как секретировать, так и захватывать молекулы ДНК и секретировать эффекторные белки в клетку-мишень. Секреторная система IV типа (Т4СС) представляет белковый комплекс, состоящий из 12-13 белков, формирующих канал, по которому ДНК из бактериальной клетки-донора доставляется в клетку-реципиент в процессе конъюгации (см. раздел 5.4.1), а также захватывается ДНК из окружающей среды в процессе естественной трансформации (см. раздел 5.4.3). По этому каналу также происходит доставка поршневым механизмом эффекторных молекул в клетку-мишень. Благодаря этому обеспечивается внутриклеточное обитание бруцелл и коксиелл (рис. 3-4).

Секреторная система VI типа (Т6СС) обладает структурной гомологией со структурой отростка бактериофага Т4 (см. раздел 3.4). Это белковая система, которая формирует тубулярную структуру (Нср), покрытую сокращающимся белком (рис. 3-5). При активации системы чехол сокращается и в результате вращающегося движения происходит пронизывание клетки-мишени с помощью находящегося на поверхности белка VrG.

Особый интерес для медицинской микробиологии представляет секреторная система III типа (Т3СС), возникшая эволюционно у грамотрицательных бактерий для транспорта из клетки компонентов жгутиков. Показано, что он используется также для направленной доставки в клетку эукариот бактериальных белков. В результате действия последних в клетке возникают различные нарушения функций, приводящие в конечном счете к появлению у человека заболеваний. В процесс выделения молекул из клетки данным способом вовлечено более 20 различных белков. Секреторная система III типа (Т3СС) представляет шприцеподобную структуру (рис. 3-6), способную инъецировать эффекторные молекулы непосредственно в цитозоль клетки-хозяина. Белки секреторной системы III типа можно разделить на три группы: белки, формирующие «шприц» секреторной системы III типа; белки транслокационного комплекса, обеспечивающие транслокацию эффекторных молекул в цитоплазму клеток хозяина; эффекторные белки, которые непосредственно оказывают модулирующее действие на клетку-хозяина.

Белки транслокационных комплексов формируют поры в мембране клетки-хозяина, создавая канал для доставки эффекторных молекул. Транслокация через сформировавшийся канал в клетку-хозяина эффекторных молекул происходит при участии белков-шоперонов.

Эффекторные белки вызывают реорганизацию цитоскелета клетки-хозяина, что способствует проникновению бактерии в клетку-хозяина, а также вызывают различные нарушения функций клеток хозяина, приводящие в конечном счете к возникновению патологического процесса.

Экспрессия генов секреторной системы III типа (Т3СС) регулируется различными транскрипционными регуляторами, которые интегрируют сигналы окружающей среды, такие как осмолярность, концентрация кислорода, рН, температура, концентрация ионов Са. Секреторная система III типа имеется у Salmonella, Shigella, Yersinia, P. aeruginosa, Chlamydia, у некоторых патогенных E. coli.

Выделение молекул из клетки также осуществляется с помощью белков-переносчиков и фосфотрансферазным путем. Одним из вариантов переносчиков можно считать белковые помпы, обеспечивающие выведение из клеток ряда антимикробных препаратов, например тетрациклинов. Фосфотрансферазный путь широко используется при выведении молекул, необходимых для построения различных структур бактерий, расположенных кнаружи от плазматической мембраны, в частности клеточной стенки, капсулы и др. Некоторые из стадий подобного транспорта подавляются используемыми в практике антимикробными препаратами, например, транспорт через мембрану N-ацетилглюкозамина блокируется гликопептидным антибиотиком ванкомицином. Особым типом транспорта веществ из клеток бактерий является недавно открытая секреция мембранных пузырьков. Хотя механизм их выделения остается не совсем ясным, показано, что они могут содержать липиды, белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды, в том числе некоторые бактериальные токсины.

Регуляция функций бактерий может приводить к появлению или исчезновению активности, а также изменению ее уровня. Эффективность клеточных регуляторных механизмов очень велика и обеспечивает максимально экономичное использование питательных веществ, предупреждает избыточный синтез промежуточных и конечных метаболитов и способствует адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. Регуляторные процессы в клетке происходят на разных уровнях и начинаются на уровне генома. Изменение числа копий определенного гена приводит к повышению синтеза закодированного в нем белка.

Регуляция на уровне транскрипции сводится к тому, что ряд генов бактерий транскрибируется только в определенных условиях. Регуляция осуществляется специальными транскрипционными факторами и компонентами глобальной регуляторной сети. Под ее контролем находятся ответы микробной клетки на изменения температуры и рН среды, наличие питательных веществ и двухвалентных катионов (особенно Са²⁺ ), фаза роста культуры. На уровне транскрипции регулируются III тип транспорта веществ из бактерий в клетку хозяина и процессы, обеспечивающие поддержание жизнедеятельности клетки в экстремальных для нее условиях. К последним относятся системы холодового и теплового шока, адаптационная система, индуцибельная система репарации ДНК (SОS-ответ) и др. Синтез белка этих систем начинается, когда клетка попадает в неблагоприятные условия и образование молекул иРНК других белков замедляется. Количество одного и того же фермента у бактерий в разных условиях может изменяться от 1-2 молекул на клетку до нескольких процентов от ее массы. Известны некоторые механизмы регуляции на уровне транскрипции, связанные с регулятор-ными генами. Различают негативную и позитивную регуляцию. При позитивной регуляции индуктор взаимодействует с репрессором и освобождает ген-оператор. При негативной регуляции происходит блокирование гена-оператора белком-репрессором.

В регуляции различных свойств бактерий в ответ на изменения условий окружающей среды принимают участие так называемые двух-компонентные системы передачи сигнала. Основными компонентами системы проведения сигнала являются сенсор, принимающий сигнал, которым обычно является трансмембранная протеинкиназа, изменяющая свою активность под влиянием фактора окружающей среды, и расположенный в цитозоле регулятор, который она активирует и который, в свою очередь, влияет на экспрессию соответствующих оперонов.

Регуляция на уровне ферментов осуществляется регуляцией интенсивности ферментативных реакций. Скорость последних может регулироваться двумя основными способами: путем изменения количества ферментов и путем изменения их активности.

Построение микробной клетки представляет собой сложный процесс, включающий не только синтез компонентов и деление. Для формирования нормальной клетки необходимо также образование всех структур, расположенных кнаружи от плазматической мембраны, то есть клеточной стенки, жгутиков, ресничек капсулы и т.п. Морфогенез начинается с синтеза молекул-предшественников в цитоплазме клеток. Эти молекулы представляют собой компоненты будущих внешних структур. Синтезированные молекулы различными путями переносятся через плазматическую мембрану. Компоненты пептидогликана, например, переносятся за счет фосфотрансферазного пути, некоторые белки - по II типу секреции. Компоненты жгутиков переносятся за счет специальных белков - транслоказ, являющихся компонентами III типа вывода белков из клетки. На поверхности мембраны перенесенные молекулы собираются в блоки, которые, в свою очередь, транспортируются к конечному месту своего расположения и формируют ту или иную внешнюю структуру.

Все этапы морфогенеза контролируются специфическими транспортными и связующими белками, регулируются различными внешними и внутренними факторами и являются мишенями действия ряда антимикробных препаратов. Кроме компонентов клетки, во внешнюю среду также выносятся органические молекулы, предназначенные для образования внеклеточного матрикса и поверхностной пленки, отделяющей сообщества от внешней среды. Многие стадии морфогенеза регулируются за счет активности связанных с мембраной ферментов, работа которых, в свою очередь, зависит от различных факторов, например температуры. Так, при 30 °С у мезофильных возбудителей болезней человека не образуются полноценные капсулы и капсулоподобные оболочки, реснички, функционально активные молекулы токсинов. Последние могут накапливаться в клетке или периплазме в виде гигантских молекул - протоксинов, у которых не происходит разрезания (ограниченный протеолиз), делающего их функционально активными. Синтез самих молекул-предшественников при этом может не изменяться. Интересно, что после возвращения микроба к оптимальной температуре нормальная структура всех компонентов клетки восстанавливается обычно уже через 2-3 ч и микроб вновь становится вирулентным.

Хотя бактерии и клетки животных имеют в большинстве своем сходные пути промежуточного метаболизма, ряду бактерий свойственны дополнительные реакции, в ходе которых синтезируются различные уникальные соединения. Совокупность подобных реакций получила название «вторичный метаболизм», а полученные в результате вещества - «вторичные метаболиты». Наиболее характерными примерами вторичных метаболитов являются антибиотики, синтезируемые представителями ограниченного числа родов бактерий, включающего Bacillus, Streptomyces и Nocardia.

Отношение к температуре

Влияние температуры на бактерии в медицинской микробиологии имеет два основных результата: возможность размножаться и сохранение жизнеспособности. В последнем случае речь идет о возможности восстановления способности к росту и размножению после пребывания при экстремальных температурах (повышенных или пониженных) для данного вида. Температурные условия на Земле различаются в широком диапазоне от 90 до 2500 °С, и всюду встречаются микробы, приспособившиеся к ним. Бактерии, вызывающие болезни людей, максимально адаптированы к температуре тела человека. В то же время некоторые из них могут жить и размножаться в окружающей среде (воде, почве, организмах различных животных), в связи с чем оптимальная температура для их роста может быть ниже или выше 37 °С.

По отношению к температуре роста бактерии принято разделять на три основные группы:

Психрофилы живут и размножаются при пониженных температурах (диапазон температур роста от +10 до -20 °С). При этом строгие (облигатные) психрофилы не способны размножаться при температуре выше 20 °С, а факультативные имеют оптимум роста от 22 до 30 °С. Именно в группе факультативных психрофилов обнаружены возбудители болезней человека (например, возбудитель чумы - Yersinia pestis, иер-синиоза - Yersinia enterocolitica, гнойно-воспалительных процессов - Aeromonas spp.). Бактерии, растущие при низких температурах, содержат повышенное количество ненасыщенных жирных кислот и имеют ряд особенностей структуры ферментных белков, что позволяет им расти при низких температурах.

Мезофилы включают бактерии, температурный диапазон роста которых находится между 10 и 45 °С, а диапазон оптимальных температур роста лежит между 30 и 40 °С. Именно к этой группе относится большинство возбудителей болезней человека, оптимальный рост которых возможен при 37 °С.

Термофилы представляют группу микробов, способных расти при повышенных температурах. Различают термотолерантные формы, для которых оптимальной температурой роста являются 37 °С, но возможность роста, в отличие от мезофилов, сохраняется до 60 °С. Факультативные термофилы проявляют максимальный рост при 50-60 °С, но также растут при 20-40 °С, в то время как облигатные термофилы не могут расти при температуре ниже 40 °С; оптимальная температура для их размножения 70 °С. Известны также экстремальные термофилы, размножающиеся при температуре выше 80 °С. Ряд микробов, являющихся экстремальными термофилами, относятся к доминиону Археи. В строении термофилов одним из важнейших факторов, обеспечивающих термоустойчивость, является структура их белков. Хотя среди термофилов пока не найдены возбудители болезней человека, продукты их жизнедеятельности используются в медицинской промышленности (протеазы, нанесенные на перевязочный материал, для инфицированных ран) и при изготовлении моющих средств (ферменты-биодобавки для очистки тканей от органических молекул).

Сохранение жизнеспособности бактерий при различных температурах зависит от строения клеток. Наиболее устойчивыми следует считать споры, выживающие в широком диапазоне температур - от минусовых до температуры кипящей воды. Вегетативные формы бактерий для выживания в условиях, несколько отличающихся от оптимальных, используют дополнительные индуцибельные генетические программы - системы холодового и теплового шока, относящиеся к так называемым стрессовым системам. Особенности чувствительности бактерий к температуре учитываются при дезинфекции и стерилизации.

Отношение к кислотности среды

Один из важных факторов, определяющих возможности жизни бактерий, - кислотность среды (концентрация ионов водорода). Большинство возбудителей болезней человека живут при рН среды от 4 до 9 с оптимумом около 7. Вместе с тем известны микробы, предпочитающие щелочную среду рН от 9 и выше (алкалофильные бактерии). К их числу можно отнести возбудитель холеры - Vibrio cholera. Некоторые микробы растут только в кислой среде при рН 4 и ниже (ацидофильные бактерии). Представители этой группы микроорганизмов используются в пищевой промышленности для получения молочнокислых продуктов. Известны микробы, устойчивые к изменениям рН среды и способные сохранять жизнеспособность как в сильнокислой, так и в сильнощелочной средах. К таким бактериям относятся возбудители туберкулеза, проказы и микобактериозов (Mycobacterium spp. ), а также актиномицеты и нокардии.

Отношение к молекулярному кислороду

Кислород, широко распространенный в природе, находится в свободном и связанном состоянии. В клетках он находится в связанном состоянии в составе воды и органических соединений. В атмосфере он присутствует в свободном состоянии в виде молекулярной формы, объемная доля которого составляет 21%. По отношению к кислороду, а также по использованию его в процессах получения энергии микроорганизмы подразделяются на три группы:

Облигатные аэробы растут и размножаются только в присутствии кислорода, используют кислород для получения энергии путем кислородного дыхания. Энергию получают оксидативным метаболизмом, применяя кислород как терминальный акцептор электронов в реакции, катализируемой цитохромоксидазой.

Облигатные аэробы подразделяются на строгие аэробы, которые растут при парциальном давлении воздуха, и микроаэрофилы, которые, используя кислород в процессах получения энергии, растут при его пониженном парциальном давлении. Это связано с тем, что у микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями и активны только при низких значениях парциального давления кислорода, например фермент гидрогеназа.

Облигатные анаэробы не используют кислород для получения энергии. Тип метаболизма у них бродильный, за исключением метаболизма у двух видов бактерий: Desulfovibrio и Desulfotomaculum , которые относятся к хемолитотрофам и обладают сульфатным дыханием. Облигат-ные анаэробы подразделяются на две группы: строгие анаэробы и аэротолерантные. Строгие анаэробы характеризуются тем, что молекулярный кислород для них токсичен: он убивает микроорганизмы или ограничивает их рост. Энергию строгие анаэробы получают маслянокислым брожением. К строгим анаэробам относятся, например, некоторые кло-стридии (С. botulinum, С. tetani), бактероиды.

Аэротолерантные микроорганизмы не используют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере. К ним относятся молочнокислые бактерии, получающие энергию гетероферментативным молочнокислым брожением.

Факультативные анаэробы способны расти и размножаться как в присутствии, так и при отсутствии кислорода. Они обладают смешанным типом метаболизма. Процесс получения энергии у них может происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а при его отсутствии переключаться на брожение. Для этих бактерий характерно наличие анаэробного нитратного дыхания.

Различное физиологическое отношение микроорганизмов к кислороду связано с наличием у них ферментных систем, позволяющих существовать в атмосфере кислорода. Следует отметить, что в окислительных процессах, протекающих в атмосфере кислорода, при окислении флавопротеидов образуются токсичные продукты: перекись водорода Н₂ О₂ и закисный радикал кислорода О₂ ^- - соединение, имеющее не-спаренный электрон. Эти соединения вызывают перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот и окисление SH-групп белков.

Для нейтрализации токсичных форм кислорода микроорганизмы, способные существовать в его атмосфере, имеют защитные механизмы. У облигатных аэробов и факультативных анаэробов накоплению закисного радикала О₂ ^- препятствует фермент супероксиддисмутаза, расщепляющая закисный радикал на перекись водорода и молекулярный кислород. Перекись водорода у этих бактерий разлагается ферментом каталазой на воду и молекулярный кислород.

Аэротолерантные микроорганизмы не имеют супероксиддисмутазы, и ее функцию восполняет высокая концентрация ионов марганца, который, окисляясь под действием О₂ ^- , убирает тем самым супероксидный ион. Перекись водорода у этих микроорганизмов разрушается ферментом пероксидазой в катализируемых ею реакциях окисления органических веществ.

Строгие анаэробы не имеют ни каталазы, ни пероксидазы. Однако супероксиддисмутаза встречается у многих строгих анаэробов, и наличие этого фермента коррелирует с их устойчивостью к кислороду. Некоторые строгие анаэробы (роды Bacteroides, Fusobacterium) не выносят присутствия даже незначительного количества молекулярного кислорода, тогда как некоторые представители рода Clostridium могут находиться в атмосфере кислорода. Для культивирования строгих анаэробов создаются условия, позволяющие удалять атмосферный кислород: использование специальных приборов, анаэростатов и анаэробных боксов, добавление в питательные среды редуцирующих кислород веществ, например тиогликолята натрия, использование поглотителей кислорода.

Отношение к излучению

Важнейшим естественным источником излучения для Земли является солнечная радиация. Поверхности Земли достигают преимущественно волны длиной от 300 нм и более, поскольку более короткие волны задерживаются атмосферой. Свет в диапазоне от 300 до 1000 нм, приходящийся в основном на видимый свет, оказывает заметное влияние на жизнь различных прокариотов, включая бактерии - возбудители болезней человека. Излучение в этом диапазоне индуцирует в бактериальной клетке процессы фотореактивации, необходимые для поддержания постоянства состава ДНК и повышения выживаемости (световая репарация ДНК), а также синтез некоторых макромолекул. В медицине излучение используется для дезинфекции воздуха, различных поверхностей оборудования и материалов. Источником излучения в этом случае являются специальные лампы, получившие название бактерицидных. Бактерицидное действие этих ламп связано с действием коротковолнового излучения от 220 до 300 нм. При этом излучение с длиной волны около 220 нм вызывает ионизацию молекул кислорода с образованием озона О₃ . Действие коротковолнового излучения в бактериальных клетках приводит к повреждениям ДНК, сопровождающимся или появлением мутаций, или гибелью клеток, и к изменению и разрушению других органических макромолекул. Среди бактерий наиболее устойчивыми к действию солнечной радиации и обработке ультрафиолетовым светом искусственного происхождения являются их споры.

Радиоактивное излучение в естественных условиях преимущественно связано с излучением горных пород и сильно варьирует в различных географических точках, а также в городах и сельской местности. В настоящее время мало известно о роли подобной радиации в изменении свойств бактерий, актуальных для практической медицины. Искусственная радиационная обработка, используемая для лечения ряда заболеваний (прежде всего злокачественных новообразований), может изменять состав нормальной микрофлоры, что требует коррекции для профилактики различных осложнений.

Рост бактериальных клеток связан с синтезом и накоплением всех компонентов, входящих в ее состав, и увеличением размера, характерного для данного вида. В условиях, обеспечивающих рост микробов, происходит и процесс их деления. Для большинства бактерий характерно поперечное бинарное деление, приводящее к образованию двух дочерних клеток. У грамположительных бактерий при этом происходит синтез перегородки между делящимися клетками. Перегородка начинает формироваться на периферии и «движется» к центру клетки. Для грамотрицательных бактерий характерно первоначальное формирование перетяжки, отделяющей клетки. После ее образования окончательное разделение дочерних клеток сопровождается синтезом перегородки между ними.

Деление бактериальной клетки начинается спустя некоторое время после завершения цикла репликации хромосомы, которая у бактерий протекает по полуконсервативному механизму. Это означает, что каждая из двух нитей ДНК хромосомы служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи ДНК. В процессе репликации бактериальной хромосомы участвует более 20 ферментов. Перед репликацией цепи родительской молекулы матричной цепи ДНК должны быть разделены. В этом процессе участвуют фермент хеликаза, которая в энергопоглоща-емой реакции расплетает двойную спираль, и фермент топоизомераза (гираза), которая предотвращает образование вторичных завитков. SSB-белок связывается с одноцепочечной ДНК, предотвращая повторное скручивание в двойную спираль. В результате образуется репликативная вилка (рис. 3-7). Синтез новых цепей ДНК осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. ДНК-полимераза не способна инициировать новые цепи ДНК, а может присоединять комплементарные матрице нуклеотиды к свободному 3'-концу растущей цепи. Поэтому для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепи полимеразе требуется затравка, праймер (от англ. primer - запал). Праймер представляет собой короткую нуклеотидную цепочку РНК, комплементарную матричной цепи, со свободным 3'-концом. Достраивание осуществляется присоединением к свободной гидроксильной группе 3'-конца затравки нового нуклеотида. Расплетенные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов, то есть синтез ДНК начинается с синтеза РНК. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент ДНК-праймаза, способная инициировать синтез РНК по одноцепочечной ДНК матрицы при отсутствии какой-либо затравки. После того как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравка удаляется, а удаляющиеся бреши застраиваются ДНК-полимеразой с высокой точностью. Сохранение высокой степени точности, необходимой при репликации, обеспечивается различными функциями ДНК-полимеразы. Кроме полимеразной активности она способна к проверке считывания. В ходе последней фермент проверяет, правильно ли осуществлено присоединение очередного нуклеотида. Если выявляется нарушение правила комплементарности, проявляется третья функция данного фермента - экзонуклеазная, и происходит отщепление неправильно присоединенного нуклеотида. После его удаления вновь осуществляется полимеразная реакция с последующей проверкой ее правильности. В целом в благоприятных условиях синтез ДНК в клетке значительно опережает скорость ее деления. В реальных условиях одна микробная клетка содержит от 2 до 10 копий хромосом. Показано, что многие бактерии без повреждения клетки выделяют избыток ДНК в окружающую среду. Этот процесс играет важную роль в обмене генетической информацией между бактериями.

Процесс репликации ДНК бактерии продолжается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК. Репликация начинается в одной избранной области, называемой origin (от англ. origin - начало), имеющей определенную последовательность нуклеотидов. На origin могут возникать одна или две репликативные вилки. Последовательность нуклеотидов на origin -участке способствует необходимому для репликации ДНК расплетанию двойной спирали и служит местом «посадки» на ДНК комплекса ферментов, участвующих в репликации. Правильное распределение вновь синтезированных нитей ДНК по дочерним клеткам достигается у бактерий за счет прикрепления ДНК к мембране. Пространственная организация участка прикрепления и зоны роста мембраны и клеточной стенки обеспечивает автоматическое растаскивание двух копий реплицированной ДНК по дочерним клеткам. Размножение бактерий бинарным делением приводит к росту числа бактериальных клеток в геометрической прогрессии.

При внесении бактерий в питательную среду они растут и размножаются до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды не достигает минимума, после чего рост и размножение прекращаются. Если на протяжении всего этого времени не прибавлять питательные вещества и не удалять конечные продукты обмена, то получаем статическую бактериальную культуру. Статическая (периодическая) культура бактерий ведет себя как многоклеточный организм с генетическим ограничением роста. Если построить график, по оси абсцисс которого отложить время, а по оси ординат - число клеток, то получим кривую, описывающую зависимость числа образующихся клеток от времени размножения, которая называется кривой роста (рис. 3-8).

На кривой роста бактерий в жидкой питательной среде можно различить несколько фаз, сменяющих друг друга в определенной последовательности.

Продолжительность жизни бактерий мало изучена. Известно, что мезофилы на питательной среде при комнатной температуре в условиях, когда размножение бактерий минимально, могут сохранять свою жизнеспособность в течение 1-2 лет. Очевидно, что биологическая смерть бактерий в большей степени связана с ограничением числа возможных делений. Считается, что большинство бактерий могут делиться около 50 раз, после чего клетка погибает. Механизмы гибели остаются не до конца изученными, но показано существование у бактерий генов, изменение активности которых специфически направлено на самоуничтожение клеток. Постоянное нахождение бактериальной популяции в логарифмической фазе роста наблюдается в непрерывной культуре, что достигается постепенным дозированием поступления питательных веществ, контролем плотности бактериальной суспензии и удалением метаболитов. Непрерывные бактериальные культуры используются в биотехнологических процессах.

Накопление бактериальной массы (числа бактерий) при культивировании зависит от многих факторов (качество питательных сред, посевная доза, температура выращивания, рН, наличие активирующих рост добавок и др.).

На жидких питательных средах рост и размножение бактерий проявляются в виде диффузного помутнения, образования придонного осадка или поверхностной пленки. Особенностью размножения бактерий роста Leptospira на жидких средах является отсутствие видимых проявлений роста.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопление клеток - колонии, которые принято считать потомком одной клетки. Колонии различаются формой, размерами, поверхностью, прозрачностью, консистенцией и окраской. Колонии с гладкой блестящей поверхностью принято называть колониями в S-форме (от англ. smooth - гладкий). Колонии с матовой шероховатой поверхностью называют R-формами (от англ. rough - шероховатый).

Окраска колоний определяется способностью бактерий синтезировать пигменты. Пигменты различаются по цвету, химическому составу и растворимости. Пигменты предохраняют бактериальную клетку от ультрафиолетовых лучей, обезвреживают токсичные кислородные радикалы, обладают антибиотическими свойствами, принимают участие в реакциях, сопутствующих фотосинтезу в фототрофных бактериях.

Вид, форма, цвет и другие особенности колоний, а также характер роста на плотных питательных средах определяются как культуральные свойства бактерий и учитываются при их идентификации.

Помимо бинарного деления, некоторые представители царства Procaryotae имеют иные способы размножения.

Актиномицеты могут размножаться путем фрагментации гифов. Представители семейства Streptomycetaceae размножаются спорами.

Микоплазмы являются полиморфными бактериями, что обусловлено особенностями их размножения. Помимо поперечного деления, если оно происходит синхронно с синтезом ДНК, микоплазмы могут размножаться почкованием. В этом случае основной морфологической репродуцирующейся единицей являются элементарные тельца сферической или овоидной формы, размножающиеся фрагментацией и почкованием.

Хламидии не обладают способностью к бинарному делению. Они проходят через цикл развития, который предусматривает существование двух форм: внеклеточных инфекционных, малых размеров элементарных телец, не обладающих способностью к бинарному делению, и внутриклеточного, метаболически активного, крупных размеров ретикулярного тельца, способного к бинарному делению. В результате бинарного деления ретикулярного тельца формируются дочерние элементарные тельца, которые выделяются из клетки.

Некоторые спирохеты, например Treponema pallidum, способны образовывать в неблагоприятных условиях цисты, которые, распадаясь на зерна, дают потомство новым бактериальным клеткам.

Некультивируемые формы бактерий. Некоторые неспорообразующие бактерии способны переживать неблагоприятные для размножения условия окружающей среды, переходя в некультивируемое состояние. В этом состоянии бактериальные клетки сохраняют свою метаболическую активность, но не способны к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста на жидких и плотных питательных средах. При смене условий существования, в частности при попадании в организм человека или животных, клетки вновь приобретают способность к размножению и сохраняют свой патогенный потенциал. Переход в некультивируемое (покоящееся) состояние обеспечивает сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды. При переходе в некультивируемую форму бактериальные клетки уменьшаются в размерах, приобретают сферическую форму, меняют вязкость цитоплазматической мембраны. У них сохраняются транспорт электронов по дыхательной цепи и невысокий уровень метаболической активности. На переход в некультивируемую форму влияют температура, концентрация солей, свет, парциальное давление кислорода, содержание питательных веществ, а также метаболиты водорослей, находящихся в биоценозе с бактериями. Выявить наличие бактерий, находящихся в некультивируемой форме, можно с помощью полимеразной цепной реакции (см. раздел 5.6.3) или красителей, меняющих окраску в окисленной и восстановленной формах. Возврат способности к размножению и росту находящихся в покоящейся форме клеток могут вызвать естественные факторы: простейшие, обитатели почв и водоемов, фитогормоны, выделяемые корневыми волосками растений.

Для культивирования бактерий необходимо соблюдать ряд условий.

Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Этого можно достичь повышением парциального давления СО₂ в атмосфере культивирования до 1-5% против 0,03% СО₂ в атмосфере воздуха. Для этих же целей используют специальные СО₂ -инкубаторы или же посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горящую свечу.

Облигатные анаэробы для своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха. Это достигается следующими мерами:

Для культивирования хемо- и фотоавтотрофных бактерий создается атмосфера, насыщенная СО₂ .

Популяция бактерий, будь то в окружающей среде или в организме хозяина, представляет собой не совокупность отдельных клеток, а сообщество, живущее по социальным законам, члены которого общаются между собой посредством понятного им языка. В настоящее время стало известно явление, получившее название quorum sensing, или чувство кворума.

Quorum sensing - это межклеточный механизм бактериального общения, предназначенный для контроля экспрессии генов в зависимости от плотности бактериальной популяции.

Регуляторные системы quorum sensing обычно состоят из двух компонентов: небольшой диффундирующей сигнальной молекулы и транскрипционного активаторного белка. В грамотрицательных бактериях сигнальные молекулы называются «аутоиндукторы». По типу quorum sensing регулируется широкий ряд физиологических процессов, включая биолюминесценцию, синтез антибиотиков, детерминант вирулентности, перенос конъюгативных плазмид (см. раздел 5). Такой тип межклеточной коммуникации позволяет индивидуальным бактериям следить за плотностью собственной популяции в окружающей среде, будь то внешняя среда или организм хозяина, и регулировать экспрессию специфических генов. Патогенным бактериям, которые вызывают развитие заболевания, необходимо достичь критической плотности для эффективного распространения и заселения соответствующих ниш в организме хозяина. Патогенные бактерии чувствуют необходимость экспрессии детерминант вирулентности при достижении определенной концентрации.

Социальным поведением патогенных бактерий объясняется такое важное для медицины явление, как образование биопленок. Биопленки представляют высокоорганизованные сообщества бактерий, необратимо прикрепленных к субстрату и друг к другу и защищенных продуцируемым этими клетками внеклеточным полимерным матриксом. Они снабжены каналами для водоснабжения, распределения питательных веществ между членами сообщества и удаления отходов жизнедеятельности. Биопленки могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов и состоят из активно функционирующих и покоящихся (некультивируемых) клеток. Образование биопленки является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде, поскольку в составе биопленки они защищены от антибактериальных препаратов, включая антибиотики, дезинфектанты, бактериофаги. Многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования - катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств.

Образование биопленки начинается с прикрепления к твердой поверхности отдельной бактериальной клетки, которая выделяет полисахариды. Делящиеся затем клетки образуют микроколонию уже внутри полисахаридного матрикса. Эти микроколонии сливаются или включают в свой состав бактерии этого или другого вида, и процесс заканчивается образованием биопленки. В процессе образования биопленки важная роль принадлежит полярно расположенным пилям IV типа (рис. 3-9).

Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой, то есть репродукция вируса (от лат. re - повторение, productio - производство), проходит несколько стадий:

Адсорбция вириона, то есть его прикрепление к клеточной мембране, - первая стадия репродукции вирусов. Она происходит в результате взаимодействия поверхностных молекул (белковых лигандов) вируса с мембранными рецепторами клеток вирусов. Белки поверхности вирусов, например гликопротеины липопротеиновой оболочки, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками.

Лиганды вирусов и специфические рецепторы клеток имеют различную природу. Так, гемагглютининовые шипы вируса гриппа связываются с сиаловой кислотой в составе гликопротеинов и гликолипидов (ганглиозидов) клеток дыхательных путей. Гликопротеины вируса иммунодефицита человека взаимодействуют с CD4-молекулами и хемокиновыми рецепторами Т-хелперов, моноцитов и дентритных клеток. Капсидные белки вируса полиомиелита связываются с CD155-молекулой, а капсидные белки риновирусов - с ICAM (молекулой адгезии) клеток. На клетке находятся десятки тысяч специфических рецепторов, поэтому на ней могут адсорбироваться десятки и сотни вирионов, но проникают в клетку только определенные вирионы или их содержимое.

В основе избирательности поражения вирусами определенных клеток, тканей и органов (так называемого тропизма) лежат специфичность рецепторов поражаемой клетки и возможность развития в ней репродуктивного цикла вируса (пермиссивные условия клетки). Например, вирусы, репродуцирующиеся преимущественно в клетках печени, называются гепатотропными, в нервных клетках - нейротропными, в иммунокомпетентных клетках - иммунотропными и т.д.

Проникновение вирусов в клетку возможно в результате рецепторзависимого эндоцитоза или слияния оболочки вируса с клеточной мембраной. Возможно также сочетание этих механизмов. Рецепторзависимый эндоцитоз происходит в результате захватывания и поглощения вириона клеткой: клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячиваются с образованием эндосомы (внутриклеточной вакуоли). Эндоцитоз вирусов осуществляется с помощью везикул, покрытых клатрином («ямки, окаймленные клатрином»). Содержимое эндосомы закисляется, что приводит к слиянию липопротеиновой оболочки сложного вируса с мембраной эндосомы и к выходу вирусного нуклеокапсида в цитозоль клетки. Эндосомы объединяются с лизосомами, которые разрушают оставшиеся вирусные компоненты. Пенетрация компонентов вируса в цитозоль обычно происходит в ранних или поздних эндосомах при уменьшенном значении рН.

Стали известны новые клатриннезависимые, альтернативные пути соединения вируса с эндосомами. Одним из них может быть макропиноцитоз с образованием крупной вакуоли, окруженной плазматической мембраной, наполненной в основном жидкостью. Другим путем попадания вируса может быть вовлечение эндоплазматического ретикулума. Этот путь начинается с формирования различных везикул (кавеолярный эндоцитоз). Вируснесущие везикулы, сформированные в плазматической мембране, маленькие (диаметр около 70 нм). В результате проникновение вируса в цитозоль может происходить на уровне плазматической мембраны, эндосомы, кальвеосомы и эндоплазматического ретикулума.

Слияние вириона с клеточной мембраной характерно только для некоторых оболочечных вирусов (герпесвирусов, парамиксовирусов, ретровирусов), в составе которых имеются белки слияния. В результате взаимодействия вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны вирусная липопротеиновая оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса попадает в цитозоль клетки.

Существует три варианта проникновения безоболочечных вирусов в клетку: мембранный прокол (вирион образует пору в мембране, через которую геном попадает в цитозоль, а капсид в него не попадает; перфорация (капсид переносится через мембрану без основного лизиса мембраны); лизис (вирионы индуцируют поломку мембраны цитоплазматических органелл, что способствует проникновению вируса и его компонентов в цитозоль). Выход безоболочечных (простых) вирусов из эндосомы в цитозоль остается малоизученным.

Попав в клетку, вирусы лишаются многих белков («раздевание», или депротеинизация вирусов). В результате депротеинизации удаляются поверхностные структуры вируса и высвобождается его внутренний компонент, способный вызывать инфекционный процесс. Первые этапы «раздевания» вируса начинаются в процессе его проникновения в клетку путем слияния вирусных и клеточных мембран или же при выходе вируса из эндосомы в цитозоль. Последующие этапы «раздевания» вируса тесно взаимосвязаны с их внутриклеточным транспортом к местам депротеинизации. Для разных вирусов существуют свои специализированные участки «раздевания» в клетке: для пикорнавирусов - в цитоплазме с участием лизосом, аппарата Гольджи, для герпесвирусов - околоядерное пространство или поры ядерной мембраны, для аденовирусов - сначала структуры цитоплазмы, а затем ядро клетки. Конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеиновая кислота, нуклеопротеид (нуклеокапсид) или сердцевина вириона. Так, конечным продуктом «раздевания» пикорнавирусов является нуклеиновая кислота, ковалентно связанная с одним из внутренних белков. А у многих оболочечных РНК-содержащих вирусов конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеокапсиды или сердцевины, которые не только не препятствуют экспрессии вирусного генома, а, более того, защищают его от клеточных протеаз и регулируют последующие биосинтетические процессы.

Следующей стадией репродукции является синтез белков и нуклеиновых кислот вируса, который разобщен во времени и пространстве.

Синтез вирусных белков. В вирусинфицированной клетке синтезируются две группы белков: неструктурные белки, обслуживающие разные этапы репродукции вируса; структурные белки, которые входят в состав вириона (нуклеопротеины, связанные с геномом вируса, капсидные и оболочечные белки).

К неструктурным белкам относятся: ферменты синтеза нуклеиновых кислот (РНКили ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и репликацию вирусного генома; белки-регуляторы; предшественники вирусных белков, отличающиеся своей нестабильностью в результате быстрого нарезания на структурные белки; ферменты, модифицирующие вирусные белки, например протеиназы и протеинкиназы.

Синтез белков в клетке осуществляется в соответствии с хорошо известными процессами транскрипции путем «переписывания» генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность иРНК или мРНК и трансляции - считывания иРНК на рибосомах с образованием белков. Передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК у разных групп вирусов неодинакова.

Репликация вирусных геномов, то есть накопление копий вирусных геномов, которые используются при сборке вирионов в клетке, отличается у вирусов, имеющих двунитевую ДНК, однонитевую ДНК, плюс-однонитевую РНК, минус-однонитевую РНК, двунитевую РНК и идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирусы).

Выход вирусов из клетки. Продолжительность цикла вирусной репродукции колеблется от 6-8 ч (вирус гриппа, пикорнавирусы) до более чем 40 ч (некоторые герпесвирусы). Вирусное потомство составляет 10-1000 зрелых вирионов и в несколько раз большее количество дефектных вирионов. Репродукция вирусов заканчивается выходом их из клетки, который происходит взрывным путем, почкованием, или экзоцитозом.

Взрывной путь характерен для простых (безоболочечных) вирусов: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирио нов.

Почкование, или экзоцитоз, присуще сложным вирусам, имеющим липопротеиновую оболочку, которая является производной от клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокапсид, или сердцевина вириона, транспортируется к участкам клеточных мембран, в которые уже встроены вирусспецифические белки, после чего начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся почка отделяется от клетки в виде сложного вируса, а клетка может длительно оставаться жизнеспособной, продуцируя вирусное потомство. Вирусы, формирующиеся в ядре клетки (например, герпесвирусы), почкуются в перинуклеарное пространство через модифицированную ядерную мембрану, приобретая таким образом липопротеиновую оболочку. Затем они транспортируются в составе цитоплазматических везикул на поверхность клетки.

Почкование вирусов, формирующихся в цитоплазме, может происходить либо через плазматическую мембрану (например, парамиксо-вирусы, тогавирусы), либо через мембраны эндоплазматической сети с последующим их выходом на поверхность клетки (буньявирусы).

Вирусы могут вызывать апоптоз инфицированной клетки, предотвращая распространение инфекционного процесса на другие клетки. С другой стороны, многие вирусы имеют механизмы, предотвращающие апоптоз клетки. Так, некоторые ДНК-вирусы кодируют белки, сходные с клеточными ßс/-2-белками, контролирующими апоптоз в результате усиления клеточной пролиферации.

Иногда вирус заражает клетку, но его репродукция не завершается. Если вирусный геном персистирует в клетке, то говорят о латентной инфекции.

Латентная инфекция поддерживается в инфицированной клетке в виде последовательности вирусной ДНК, интегрированной в геном клетки, или в виде множественных копий ковалентно замкнутой циркулярной ДНК вируса. Например, герпесвирусы обычно вызывают латентные инфекции, при которых вирусный геном поддерживается как циркулярная эписома в ядре, экспрессируя только несколько вирусных генов и не образуя инфекционного вируса. В эукариотической клетке вирусная ДНК связана с гистонами этой клетки, которые играют стабилизирующую роль в латенции.

Абортивный тип взаимодействия вирусов с клеткой не завершается образованием вирусного потомства. Причины развития абортивного типа разнообразны:

Различают дефектные вирусы и дефектные вирионы.

Абортивный тип взаимодействия чаще наблюдается при заражении непермиссивных (нечувствительных) клеток стандартным вирусом. Механизм генетически обусловленной резистентности клеток к вирусам широко варьирует. Он может быть связан: с отсутствием на плазматической мембране специфических рецепторов для вирусов; неспособностью данного вида клеток инициировать трансляцию вирусной иРНК; отсутствием специфических протеаз или нуклеаз, необходимых для синтеза вирусных макромолекул, и т.д. Абортивный тип взаимодействия может также возникать при изменении условий, в которых происходит репродукция вирусов: повышение температуры организма, изменение рН в очаге воспаления, введение в организм противовирусных препаратов и др. Некоторые абортивные инфекции могут приводить к уничтожению клетки-хозяина. При устранении неразрешающих условий абортивный тип переходит в продуктивный тип взаимодействия вирусов с клеткой.

Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой (вирогения) заключается во взаимном сосуществовании вируса и клетки в результате интеграции (встраивания) генома вируса в хромосому клетки хозяина. При этом интегрированный геном вируса реплицируется и функционирует как составная часть генома клетки.

Интегративный тип взаимодействия характерен для умеренных ДНК-содержащих бактериофагов, онкогенных вирусов и некоторых инфекционных вирусов, как ДНК-содержащих (например, вируса гепатита В), так и РНК-содержащих (например, ВИЧ). С геномом клетки интегрирует двунитевая ДНК вируса в кольцевой форме, которая прикрепляется к клеточной ДНК в месте гомологии нуклеотидных последовательностей и встраивается в определенный участок хромосомы при участии ферментов (рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз).

Более сложным является процесс интеграции у РНК-содержащих вирусов. Он начинается с механизма обратной транскрипции, который заключается в синтезе комплементарной нити ДНК на матрице вирусной РНК с помощью вирионной обратной транскриптазы (ревертазы). После образования двунитевой ДНК и замыкания ее в кольцо происходит интеграция ДНК-транскрипта в хромосому клетки. Встроенная в хромосому клетки ДНК вируса называется провирусом, или провирусной ДНК. Провирус реплицируется в составе хромосомы и переходит в геном дочерних клеток, то есть состояние вирогении наследуется. Однако под влиянием некоторых физических или химических факторов провирус может исключаться из хромосомы клетки и переходить в автономное состояние с развитием продуктивного типа взаимодействия с клеткой.

Дополнительная генетическая информация провируса при вирогении сообщает клетке новые свойства, что может быть причиной онкогенной трансформации клеток и развития опухолей, а также развития аутоиммунных и хронических заболеваний. Сохранение вирусной информации в виде провируса в составе клеточного генома и передача ее потомству лежат в основе персистенции (от лат. persistentia - упорство, постоянство) вирусов в организме и развития латентных (скрытых) вирусных инфекций.

Вещества растительного и животного происхождения минерализуются микроорганизмами до углерода, азота, серы, фосфора, железа и других элементов.

Круговорот углерода. В круговороте углерода, кроме растений, водорослей и цианобактерий, активное участие принимают микроорганизмы, разлагающие ткани отмерших растений и животных с выделением СО₂ . При аэробном разложении органических веществ образуются СО₂ и вода, а при анаэробном брожении - кислоты, спирты и СО₂ . Так, при спиртовом брожении дрожжи и другие микроорганизмы расщепляют углеводы до этилового спирта и диоксида углерода. Молочнокислое (вызываемое молочнокислыми бактериями), пропионовокислое (вызываемое пропионобактериями), маслянокислое и ацетонобутиловое (вызываемое клостридиями) брожение и другие виды брожения сопровождаются образованием кислот и диоксида углерода.

Круговорот азота. Клубеньковые бактерии и свободноживущие микроорганизмы почвы связывают атмосферный азот. Органические соединения растительных, животных и микробных остатков минерализуются микроорганизмами почвы, превращаясь в соединения аммония.

Процесс образования аммиака при разрушении белка микроорганизмами получил название «аммонификация», или «минерализация азота». Белок разрушают псевдомонады, протей, бациллы и клостридии. При аэробном распаде белков образуются аммиак, сульфаты, диоксид углерода и вода, при анаэробном - аммиак, амины, диоксид углерода, органические кислоты, индол, скатол, сероводород. Уробактерии, выделяющиеся с мочой, расщепляют мочевину до аммиака, диоксида углерода и воды. Аммонийные соли, образующиеся при ферментации бактериями органических соединений, используются высшими зелеными растениями. Однако наиболее усвояемыми для растений являются нитраты - азотнокислые соли, которые образуются при распаде органических веществ в процессе окисления аммиака до азотистой, а затем азотной кислоты. Этот процесс называется «нитрификация», а микроорганизмы, его вызывающие, - «нитрифицирующие». Нитрификация проходит в две фазы: первую фазу осуществляют бактерии рода Nitrosomonas и др., при этом аммиак окисляется до азотистой кислоты, образуются нитриты; во второй фазе участвуют бактерии рода Nitrobacter и др., при этом азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты. Нитрифицирующие бактерии выделил и описал русский ученый С.Н. Виноградский. Нитраты повышают плодородие почвы, однако существует и обратный процесс: нитраты могут восстанавливаться в результате процесса денитрификации до выделения свободного азота, что снижает его запас в виде солей в почве, приводя к снижению ее плодородия.

Количество только бактерий в 1 г почвы достигает 10 млрд. Микроорганизмы участвуют в почвообразовании и самоочищении почвы, кругообороте в природе азота, углерода и других элементов. В ней, кроме бактерий, обитают грибы, простейшие и лишайники, представляющие собой симбиоз грибов с цианобактериями. На поверхности почвы микроорганизмов относительно мало из-за губительного действия ультрафиолетовых лучей, высушивания и других факторов. Пахотный слой почвы толщиной 10-15 см содержит наибольшее количество микроорганизмов. По мере углубления количество микроорганизмов уменьшается вплоть до их исчезновения на глубине 3-4 м. Состав микрофлоры почвы зависит от ее типа и состояния, состава растительности, температуры, влажности и т.д.

Большинство микроорганизмов почвы способны развиваться при нейтральном рН, высокой относительной влажности, температуре 25- 45 °С.

В почве живут спорообразующие палочки родов Bacillus и Clostridium. Непатогенные бациллы (Вас. megaterium, Вас. subtilis и др.) наряду с псевдомонадами, протеем и некоторыми другими бактериями являются аммонифицирующими, составляют группу гнилостных бактерий, осуществляющих минерализацию органических веществ. Почва также служит местом обитания азотфиксирующих бактерий, усваивающих молекулярный азот (Azotobacter, Azomonas, Mycobacterium и др.). Азотфикси-рующие разновидности цианобактерий, или сине-зеленых водорослей, применяют для повышения плодородия рисовых полей. Патогенные спорообразующие палочки (возбудители сибирской язвы, ботулизма, столбняка, газовой гангрены) могут длительно сохраняться, даже размножаться в почве. Представители семейства кишечных бактерий (семейство Enterobacteriaceae) - кишечная палочка, возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов и дизентерии, попав в почву с фекалиями, отмирают. В чистых почвах кишечная палочка и протей встречаются редко; обнаружение бактерий группы кишечной палочки (колиформные бактерии) в значительном количестве является показателем загрязнения почвы фекалиями человека и животных и свидетельствует об ее санитарно-эпидемиологическом неблагополучии из-за возможности передачи возбудителей кишечных инфекций. Количество простейших в почве колеблется от 500 до 500 000 на 1 г почвы. Питаясь бактериями и органическими остатками, простейшие вызывают изменения в составе органических веществ почвы. В почве находятся также многочисленные грибы, токсины которых, накапливаясь в продуктах питания человека, вызывают интоксикации - микотоксикозы и афлатоксикозы.

В воде формируются определенные биоценозы с преобладанием микроорганизмов, адаптировавшихся к условиям местонахождения, то есть физико-химическим условиям, освещенности, степени растворимости кислорода и углекислого газа, содержания органических и минеральных веществ и т.д. Микрофлора воды активно участвует в процессе самоочищения от органических отходов. Утилизация органических отходов связана с деятельностью постоянно обитающих в воде микроорганизмов, то есть составляющих аутохтонную микрофлору. В пресных водоемах находятся различные бактерии: палочковидные (псевдомонады, аэромонады и др.), кокковидные (микрококки), извитые и нитевидные (актиномицеты). На дне водоемов, в иле увеличивается количество анаэробов. При загрязнении воды органическими веществами появляется большое количество непостоянных (аллохтонных) представителей микрофлоры воды, которые исчезают в процессе самоочищения воды.

Вода - фактор передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний. Вместе с загрязненными ливневыми, талыми и сточными водами в озера и реки попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтеровирусных инфекций, криптоспоридиоза и др.). Некоторые возбудители могут даже размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы). Вода артезианских скважин практически не содержит микроорганизмов, так как последние обычно задерживаются верхними слоями почвы.

Вода океанов и морей также содержит различные микроорганизмы, в том числе архебактерии, светящиеся и галофильные (солелюбивые) бактерии, например галофильные вибрионы, поражающие моллюски и некоторые виды рыб, при употреблении которых в пищу развивается пищевая токсикоинфекция. Кроме этого, отмечено большое количество нанобактерий, например Sphingomonas, которые проходят через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

В воздух попадают микроорганизмы из почвы, воды, а также с поверхности тела, из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений, микробная обсемененность которых зависит от условий уборки помещения, уровня освещенности, количества людей в помещении, частоты проветривания и др. Большее количество микроорганизмов присутствует в воздухе крупных городов, меньшее - в воздухе сельской местности. Особенно мало микроорганизмов в воздухе над лесами, горами и морями.

Здесь обнаруживаются кокковидные и палочковидные бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы. Воздух рассматривают как фактор передачи респираторных инфекций, при которых возбудитель передается воздушно-капельным или воздушно-пылевым путем. Солнечные лучи и другие факторы способствуют гибели микрофлоры воздуха. Для снижения микробной обсемененности воздуха проводят влажную уборку помещения в сочетании с вентиляцией и очисткой (фильтрацией) поступающего воздуха. Применяют также аэрозольную дезинфекцию и обработку помещений лампами ультрафиолетового излучения (например, в микробиологических лабораториях и операционных блоках).

В бытовых объектах встречаются микроорганизмы почвы, воды, воздуха, растений, выделений человека и животных. В формировании микрофлоры объектов медицинских учреждений может принимать участие патогенная и условно-патогенная микрофлора, выделяемая от больных или медицинского персонала, а также микрофлора, привносимая с перевязочным или другими материалами, лекарственными препаратами и т.д. В увлажненных участках (душевые, ванные, водосточные трубы, раковины и др.) могут размножаться возбудители сапронозных и оппортунистических инфекций - легионеллы, аэромонады, псевдомонады, клебсиеллы, протеи.

Дезинфекция (от лат. infectia - инфекция и французской отрицательной приставки des) - комплекс мероприятий по уничтожению во внешней среде не всех, а только определенных возбудителей инфекционных заболеваний.

Различают механический, физический и химический способы дезинфекции.

Механический метод заключается в удалении микроорганизмов без их гибели путем встряхивания, выколачивания, влажной уборки и вентиляции помещений и т.д. Он не позволяет достигнуть полного обеззараживания обрабатываемых объектов, однако приводит к значительному уменьшению числа патогенных микроорганизмов во внешней среде. К механическому методу относится и использование мембранных фильтров (см. раздел 4.3.2).

Физический метод предполагает воздействие на микроорганизмы физических агентов - высокой температуры, ультрафиолетового излучения.

Кипячение применяют для дезинфекции хирургических инструментов, игл, резиновых трубок. Однако даже кипячение в течение 30 мин в специальных аппаратах-стерилизаторах не уничтожает споры и некоторые вирусы.

Пастеризация - это обеззараживание многих пищевых продуктов (вино, пиво, соки), при этом достигается только частичная стерильность; споры микроорганизмов и ряд вирусов не уничтожаются.

Ультрафиолетовые лучи применяют для дезинфекции воздуха в микробиологических лабораториях, боксах, операционных. Ее проводят, как правило, ртутными бактерицидными лампами различной мощности (БУВ-15, БУВ-30 и др.) с длиной волны излучения 253-265 нм. В настоящее время широко используют импульсные ксеноновые лампы, которые отличаются от ртутных тем, что при их разрушении в окружающую среду не попадают пары ртути.

В микробиологической практике широкое применение нашли способы химической дезинфекции рабочего места, отработанного патологического материала, градуированных и пастеровских пипеток, стеклянных шпателей, стекол.

Γалогенсодержащие соединения. Хлорсодержащие вещества, такие как гипохлориты (соли натрия или калия хлорноватистой кислоты), органические соединения хлора (хлорамин Б, дихлорризоциануровая кислота), хлороформ и другие, оказывают выраженное антимикробное действие на большинство бактерий, вирусов и простейших. Aнтимикробный эффект растворов хлорсодержащих веществ связан с наличием активного хлора, который вступает во взаимодействие с белками микробов, вызывая их повреждение. Хлорную известь обычно используют только для дезинфекции, хлорамин Б в виде 1-3% раствора - для дезинфекции, а более слабые растворы - в качестве антисептического вещества: 0,25-0,5% растворы для обработки рук медицинского персонала, 1,5-2% растворы для промывания инфицированных ран.

Окислители. Механизм антимикробного действия окислителей связан с выделением атомарного кислорода, который оказывает на микроорганизмы сильное повреждающее действие. Водорода пероксид (3% раствор) обладает относительно слабым антимикробным действием и используется в хирургической практике для обработки инфицированных ран в качестве антисептика. В более высокой концентрации водорода пероксид уничтожает практически все микроорганизмы и вирусы и может использоваться для химической стерилизации.

Поверхностно-активные вещества - катионные, анионные и амфолиты, их антимикробный эффект связан с изменением проницаемости цитоплазматической мембраны и нарушением осмотического равновесия. Поверхностно-активные вещества обладают выраженной активностью в отношении бактерий, грибов, вирусов и некоторых простейших.

Наибольшей антимикробной активностью обладают катионные вещества, из которых широкое применение получили четвертичные аммониевые соединения (цетримид, цетилпиридиния хлорид и др.). Они широко используются в качестве антисептиков (для обработки рук хирурга и операционного поля и др.) и дезинфектантов (для обработки помещений и предметов ухода за больными и др.).

Спирты. Чаще всего используются в медицине алифатические спирты (этанол и изопропанол) как антисептическое средство (70% спирт для обработки рук хирурга, 90-95% спирт для дезинфекции хирургических инструментов). Спирты вызывают коагуляцию белков микробной клетки, однако грибы, вирусы и споры бактерий обладают к спиртам выраженной устойчивостью.

Альдегиды характеризуются дезинфицирующими, антисептическими и химиотерапевтическими свойствами. Механизм бактерицидного действия связан с алкилированием амино-, сульфгидрильных и карбоксильных групп белков. Для обработки рук и стерилизации инструментов (0,5-1,0% растворы), а также для дезинфекции белья, одежды и особенно обуви используют 40% водный раствор формальдегида (Формалин^♠ ).

Фенолы. Механизм их антимикробной активности связан с денатурацией белков клеточной стенки. Одним из наиболее известных препаратов этой группы является карболовая кислота (в настоящее время применяется крайне редко). При оценке антимикробной активности новых антисептиков и дезинфектантов фенол используется в качестве эталона (фенольный коэффициент). Его применяют в виде 2-5% мыльно-карболовой смеси для дезинфекции одежды, выделений и предметов ухода за больным. Для консервации широко используют также эфиры п-гидроксибензойной кислоты (парабены).

При испытании антимикробной активности дезинфектантов и антисептиков используют стандартные тест-культуры микроорганизмов (золотистый стафилококк, кишечная палочка, бациллы, микобактерии, грибы-трихофитоны и кандиды). Для определения вирулицидной активности применяют тест-вирусы гепатита А и полиомиелита.

Стерилизация (от лат. sterilis - бесплодный) - освобождение от всего живого, полное уничтожение в материалах всех микроорганизмов и их спор.

Различают физические, химические и механические способы стерилизации.

Прокаливанием на пламени спиртовки стерилизуют металлические инструменты, бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметные стекла.

Стерилизация сухим жаром применяется для обеспложивания стеклянной посуды, пробирок, колб, чашек Петри и пипеток. Для этой цели используют сухожаровые шкафы (печи Пастера), в которых необходимый эффект достигается при температуре 160 °С в течение 2 ч или при температуре выше 170 °С в течение 40 мин.

Принципиальные преимущества сухого жара заключаются в том, что при его применении не происходит коррозии металлов и инструментов, не повреждаются стеклянные поверхности; он пригоден для стерилизации порошков и не содержащих воды нелетучих вязких веществ. К недостаткам данного метода относятся медленная передача тепла и продолжительность стерилизации; при использовании сухого жара более высокие температуры (выше 170 °С) могут неблагоприятно действовать на некоторые металлы, а также вызывать обугливание и возгорание ватных пробок и бумаги.

При обработке сухим жаром микроорганизмы погибают в результате окисления внутриклеточных компонентов. Споры бактерий более устойчивы к сухому жару, чем вегетативные клетки.

Стерилизация паром под давлением - один из наиболее эффективных методов, основанный на сильном гидролизующем действии насыщенного пара. Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки), жидкости, приборы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Для этой цели применяют паровые стерилизаторы (автоклавы) с вертикальным или горизонтальным размещением котла.

Большинство паровых стерилизаторов относятся к гравитационным: пар движется в них сверху вниз под действием разности плотностей пара и воздуха.

Питательные среды, перевязочные материалы и белье стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин, питательные среды с углеводами - при 0,5 атм в течение 15 мин, патогенный материал обеззараживают при 1,5-2,0 атм.

Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов. Химические термотесты представляют собой вещества, изменяющие свой цвет или физическое состояние при стерилизации и имеющие разную температуру плавления.

Бактериологический контроль режима стерилизации заключается в том, что в стерилизационную камеру помещают полоски с нанесенными на них спорами одного или двух видов бактерий, со спорами известной численности, со спорами и определенным количеством культуральной среды, суспензиями спор и т.д.

Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) - это обеспложивание объектов, разрушающихся при температуре выше 100 °С (питательные среды с аммиачными солями, молоко, желатин, картофель, некоторые углеводы). Обеспложивание проводят в паровом стерилизаторе при открытом спускном кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха по 15-30 мин в течение 3 дней подряд. При первой стерилизации погибают вегетативные формы микробов, некоторые споры при этом сохраняются и прорастают в вегетативные особи в процессе хранения питательных сред при комнатной температуре. Последующая стерилизация обеспечивает достаточно надежное обеспложивание объекта.

Тиндализация - это стерилизация материалов, легко разрушающихся при высокой температуре (сыворотки, витамины); стерильность достигается повторным прогреванием объекта при 60 °С по 1 ч ежедневно в течение 5-6 дней подряд.

Лучевая стерилизация осуществляется либо с помощью γ-излучения, либо с помощью ускоренных электронов, под влиянием которых повреждаются нуклеиновые кислоты. Проводится в промышленных условиях для стерилизации одноразовых инструментов и белья, лекарственных препаратов.

Химическая стерилизация предполагает использование токсичных газов: окиси этилена, смеси ОБ (смесь оксида этилена и бромистого метила в весовом соотношении 1:2,5) и формальдегида. Глутаровый альдегид после активирования буферными системами используется для химической стерилизации тех материалов, которые нельзя стерилизовать другими методами. Эти вещества являются алкилирующими агентами, способными инактивировать активные группы в ферментах, ДНК, РНК, приводя к гибели микробов. Стерилизация газами проводится в специальных камерах. Используется для стерилизации изделий из термолабильных материалов, снабженных оптическими устройствами. Метод небезопасен для людей и окружающей среды, так как стерилизующие агенты остаются на объекте стерилизации.

Механические методы стерилизации. Фильтрование применяют в тех случаях, когда повышенная температура может резко повлиять на качество стерилизуемых материалов (питательные среды, сыворотки, антибиотики), а также для очистки бактериальных токсинов, фагов и различных продуктов жизнедеятельности бактерий. Как окончательный процесс оно менее надежно, чем стерилизация паром, из-за большой вероятности прохождения микроорганизмов через фильтры.

Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря поровой структуре их материала. Существуют два основных типа фильтров - глубинные и мембранные.

Глубинные фильтры состоят из волокнистых или гранулированных материалов, которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в материале фильтра. Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру, получают их из нитроклетчатки, и захват ими частиц определяется в основном размером пор. Они пропускают вирусы и микоплазмы, поэтому фильтрование через мембранные фильтры относят к механическим методам дезинфекции.

Почва дает приют разнообразным микроорганизмам. Так, количество только бактерий в почве достигает 10 млрд в 1 г. Микроорганизмы участвуют в почвообразовании и самоочищении почвы, в кругообороте в природе азота, углерода и других элементов. В ней, кроме бактерий, обитают грибы, простейшие и лишайники, представляющие собой симбиоз грибов с цианобактериями. На поверхности почвы микроорганизмов относительно мало из-за губительного действия ультрафиолетовых лучей, высушивания и других факторов. Пахотный слой почвы толщиной 10-15 см содержит наибольшее число микроорганизмов. По мере углубления количество микроорганизмов уменьшается вплоть до их исчезновения на глубине 3-4 м. Состав микрофлоры почвы зависит от ее типа и состояния, состава растительности, температуры, влажности и т.д. Большинство почвенных микроорганизмов способны развиваться при нейтральном рН, высокой относительной влажности, температуре от 25 до 45 °С.

В почве живут спорообразующие палочки родов Bacillus и Clostridium. Непатогенные бациллы (Вас. megaterium, Вас. subtilis и др.) наряду с псевдомонадами, протеем и некоторыми другими бактериями являются аммонифицирующими, составляя группу гнилостных бактерий, осуществляющих минерализацию органических веществ. Патогенные спорообразующие палочки (возбудители сибирской язвы, ботулизма, столбняка, газовой гангрены) способны длительно сохраняться, а некоторые даже размножаться в почве (Clostridium botulinum). Почва также является местом обитания азотфиксирующих бактерий, усваивающих молекулярный азот (Azotobacter, Azomonas, Mycobacterium и др.). Азот-фиксирующие разновидности цианобактерий, или сине-зеленых водорослей, применяют для повышения плодородия рисовых полей.

Представители семейства кишечных бактерий (семейство Enterobacteriaceae) - кишечная палочка, возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов и дизентерии, попав в почву с фекалиями, отмирают. В чистых почвах кишечная палочка и протей встречаются редко. Обнаружение бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий) в значительном количестве является показателем загрязнения почвы фекалиями человека и животных и свидетельствует об ее санитарно-эпидемиологическом неблагополучии из-за возможности передачи возбудителей кишечных инфекций. Количество простейших в почве колеблется от 500 до 500 000 на 1 г почвы. Питаясь бактериями и органическими остатками, простейшие вызывают изменения в составе органических веществ почвы. В почве находятся также многочисленные грибы, токсины которых, накапливаясь в продуктах питания человека, вызывают интоксикации - микотоксикозы и афлатоксикозы.

Результаты исследования почв учитывают при определении и прогнозе степени их опасности для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах (по эпидемиологическим показаниям), профилактике инфекционной и неинфекционной заболеваемости (предупредительный санитарный надзор), текущем санитарном контроле за объектами, прямо или косвенно воздействующими на окружающую среду.

При проведении текущего санитарного надзора за состоянием почвы ограничиваются кратким санитарно-микробиологическим анализом, указывающим на наличие и степень фекального загрязнения.

Показатели, включенные в эту группу, также характеризуют процессы самоочищения почвы от загрязнителей органической природы и энтеробактерий. Полный санитарно-микробиологический анализ почвы проводят в форме предупредительного санитарного надзора. По эпидемиологическим показаниям проводят индикацию патогенной микро-биоты.

В лаборатории из 5 точечных проб почвы, взятых с одного участка, готовят усредненную пробу, тщательно перемешивая и растирая в стерильной фарфоровой чашке резиновым пестиком в течение 5 мин. Посторонние примеси (корни растений, камни, щепки) удаляют путем просеивания почвы через сито, которое предварительно протирают ватным тампоном, смоченным 96% этиловым спиртом. Из усредненной пробы отбирают навески (от 1 до 50-55 г в зависимости от перечня определяемых показателей) и готовят суспензию 1:10 на стерильной водопроводной воде (10 г почвы на 90 см³ воды). Для десорбции микроорганизмов с поверхности почвенных частиц приготовленную почвенную суспензию встряхивают в течение 3 мин на мешалке механического диспергатора. После отстаивания суспензии в течение 30 с готовят последовательные 10-кратные разведения почвы до концентрации 10^-4 -10^-5 г/см³ .

Оценку результатов санитарно-микробиологического исследования почв проводят путем сопоставления данных, полученных на опытных и контрольных участках почв одинакового состава, расположенных в непосредственной территориальной близости. Схемы оценки санитарного состояния почвы на основании отдельных санитарно-микробиоло-гических критериев представлены в Методических указаниях № 144676 (табл. 4-2).

В Методических указаниях 2.1.7.730-99 «Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест» представлена схема оценки эпидемической опасности почв населенных мест. В данном документе для оценки интенсивности биологической нагрузки на почву используются такие показатели, как бактерии группы кишечных палочек и индекс энтерококков, а для оценки эпидемической опасности почвы - патогенные энтеробактерии и энтеровирусы.

Микробиологическое исследование воздуха предусматривает определение общего содержания микроорганизмов, а также стафилококков в 1 м³ воздуха. В отдельных случаях проводят исследование воздуха на грамотрицательные бактерии, плесневые и дрожжеподобные грибы. По эпидемиологическим показаниям спектр выявляемых в воздухе возбудителей может быть расширен.

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с использованием аппарата Кротова. Вполне допускается использование седимента-ционного метода Коха. Исследованию подлежат следующие помещения лечебно-профилактического учреждения: операционные блоки, перевязочные и процедурные кабинеты, асептические палаты (боксы), палаты отделения анестезиологии и реанимации, палаты и коридоры лечебных отделений, помещения аптек, стерилизационных и акушерско-гинекологических отделений и станций (отделений) переливания крови. Исследование воздуха методом Коха используют в исключительно редких случаях для ориентировочной оценки степени микробного загрязнения воздуха. Для определения общего количества микроорганизмов в воздухе операционных до начала работы открывают чашки с питательным агаром и устанавливают их примерно на высоте операционного стола - 1 чашку в центре и 4 в углах помещения («метод конверта») на 10 мин, а для выявления золотистого стафилококка используют чашки с желточно-солевым агаром на 40 мин. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С, сутки при комнатной температуре, затем подсчитывают количество колоний. При этом исходят из классической формулы В.Л. Омелянского: на 100 см² поверхности питательной среды за 5 мин экспозиции оседает такое количество бактерий, которое содержится в 10 л воздуха (в 1 м³ - 1000 л). При этом на чашках с питательным агаром не должно вырастать более 5 колоний микроорганизмов, а на желточно-солевом агаре золотистый стафилококк не должен обнаруживаться.

Пищевые продукты могут обсеменяться различными микроорганизмами, что приводит к их порче, развитию пищевых токсикоинфекций и интоксикаций, а также таких инфекций, как сибирская язва, бруцеллез, туберкулез и др. Заболевания животного, травмы или неблагоприятные условия его содержания способствуют нарушению защитных барьеров организма и транслокации (переносу) микроорганизмов в обычно стерильные ткани и органы (прижизненное обсеменение). В результате происходят обсеменение тканей забитого животного протеями, клостридиями и другими микробами, попадание при маститах в молоко стафилококков и стрептококков. Возможно и вторичное обсеменение микроорганизмами пищевых продуктов. В этом случае источником загрязнения являются объекты окружающей среды (почва, вода, транспорт и т.д.), а также больные люди и бактерионосители. При низкой температуре хранения мяса и мясных продуктов даже в замороженном мясе могут находиться микробы, способные к размножению в психрофильных условиях (псевдомонады, протей, аспергиллы, пенициллы и др.). Микробы, обитающие в мясе, вызывают его ослизнение; в нем развиваются процессы брожения и гниения, вызванные клостридиями, протеем, псевдомонадами и грибами.

Злаковые культуры, орехи в условиях повышенной влажности могут загрязняться грибами (аспергиллами, пенициллами, рода фузариум и др.), что служит причиной развития пищевых микотоксикозов.

Мясные блюда (студни, салаты из мяса, блюда из мясного фарша) могут быть причиной заболеваний, связанных с размножившимися в них сальмонеллами, шигеллами, диареегенными кишечными палочками, протеем, энтеротоксигенными штаммами стафилококков, энтерококками, Clostridium perfringens и Bacillus cereus.

Молоко и молочные продукты могут быть фактором передачи возбудителей бруцеллеза, туберкулеза и шигеллеза. Возможно также развитие пищевых отравлений в результате размножения в молочных продуктах сальмонелл, шигелл и стафилококков. Яйца, яичный порошок и меланж при эндогенном первичном инфицировании сальмонеллами яиц, особенно утиных, являются причиной сальмонеллеза.

Рыба и рыбные продукты чаще загрязняются бактериями Clostridium botulinum и Vibrio parahaemolylicus - возбудителями пищевых интоксикаций и токсикоинфекций. Эти заболевания наблюдаются и при употреблении рыбных продуктов, загрязненных большим количеством сальмонелл, протея, Bacillus cereus, Clostridium perfringens.

Овощи и фрукты могут загрязняться и обсеменяются диареегенными кишечными палочками, шигеллами, протеем, энтеропатогенными штаммами стафилококков. Соленые огурцы могут быть причиной токсикоинфекции, вызванной Vibrio parahaemolyticus.

Все результаты микробиологического анализа пищевых продуктов могут быть получены не ранее 48-72 ч, то есть когда продукт уже может быть реализован. Поэтому контроль по этим показателям носит ретроспективный характер и служит целям санитарно-гигиенической оценки предприятия, производящего или реализующего пищевые продукты.

Обнаружение повышенной общей микробной обсемененности, колиформных бактерий позволяет предположить нарушение температурного режима при приготовлении и/или хранении готового продукта. Обнаружение патогенных микроорганизмов расценивают как показатель эпидемиологического неблагополучия столовой, предприятия торговли.

Нормирование микробиологических показателей безопасности пищевых продуктов осуществляется для большинства групп микроорганизмов по альтернативному принципу, то есть нормируется масса продукта, в которой не допускаются бактерии группы кишечных палочек, большинство условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы и Listeria monocytogenes. В других случаях норматив отражает количество КОЕ в 1 г (см³ ) продукта.

В продуктах массового потребления, для которых в таблицах Санитарных норм и правил 2.3.2.1078-01 гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов отсутствуют микробиологические нормативы, патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не допускаются в 25 г продукта.

Санитарно-бактериологическому контролю в обязательном порядке должны подвергаться объекты приготовления и реализации пищевой продукции.

Данные санитарно-микробиологического исследования дают возможность объективно оценить санитарно-гигиеническое состояние обследуемых объектов, выявить нарушения санитарного режима и оперативно проводить целенаправленные мероприятия по их устранению.

Различают несколько способов отбора проб с различного оборудования и инвентаря для микробиологического исследования: способы тампонных смывов, отпечатков, агаровой заливки. Из них наиболее часто используют способ тампонных смывов. Санитарно-микробиоло-гический контроль основан на обнаружении в смывах бактерий группы кишечных палочек - показателей фекального загрязнения исследуемых предметов. Исследования на стафилококк, патогенные бактерии семейства кишечных, определение общей микробной обсемененности проводят по показаниям. Например, взятие смывов для обнаружения стафилококков необходимо при обследованиях кондитерских цехов, молочных кухонь и пищеблоков лечебных учреждений. Объекты санитарно-микробиологического контроля:

Смывы с рук персонала, занятого обработкой сырых продуктов, забирают до начала работы. Смывы доставляют в бактериологическую лабораторию в течение 2 ч. Допускаются их хранение и транспортирование не более 6 ч при 1-10 °С.

В лаборатории производят посевы смывов на среды Кесслер с лактозой или КОДА, при этом в пробирку со средой опускают тампон и переносят оставшуюся смывную жидкость. Посевы на средах Кесслер и КОДА инкубируют при 37 °С. Через 18-24 ч из всех пробирок со средой Кесслер производят высев на секторы чашек со средой Эндо, со среды КОДА высев производят только в случае изменения окраски среды (из исходной фиолетовой до желтой или зеленой) или ее помутнения. Посевы на среде Эндо выращивают при 37 °С 18-24 ч.

Из колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек, готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют, при необходимости дополнительно идентифицируют по общепринятым тестам для бактерий группы кишечных палочек. При оценке результатов санитарно-микробиологического обследования исходят из нормативов, что в смывах, взятых с объектов продовольственного назначения, бактерии группы кишечных палочек должны отсутствовать. Обнаружение бактерий группы кишечных палочек в смывах с поверхностей чистых, подготовленных к работе предметов, инвентаря, оборудования, рук и санитарной одежды персонала свидетельствует о нарушении санитарного режима. В случае повторного обнаружения бактерий группы кишечных палочек в значительном проценте смывов рекомендуется провести исследование смывов на наличие патогенных энтеробактерий. При этом производят посев тампона и смывной жидкости на среды обогащения - селенитовый бульон или магниевую среду (возможно использование сред Мюллера и Кауфмана). Дальнейшее исследование проводят по общепринятой методике.

Исследование молока и молочных продуктов

Микрофлора молочных продуктов

Молоко является весьма благоприятной питательной средой для развития многих микроорганизмов. После употребления в пищу инфицированного молока и молочных продуктов могут возникать такие инфекции, как брюшной тиф, дизентерия, холера, эшерихиозы, бруцеллез, туберкулез, скарлатина, ангина, ку-лихорадка, ящур, клещевой энцефалит, сальмонеллезные токсикоинфекции, отравление стафилококковым энтеротоксином и др.

Различают специфическую и неспецифическую микрофлору молока и молочных продуктов. К специфической микрофлоре молока и молочных продуктов относят микробов-возбудителей молочнокислого, спиртового и пропионовокислого брожения. Микробиологические процессы за счет жизнедеятельности этих микроорганизмов лежат в основе приготовления кисломолочных продуктов (творога, кефира, простокваши, ацидофилина и др.). Бактерии молочнокислого брожения считаются нормальной микрофлорой молока и молочных продуктов. Главную роль при скисании молока и молочных продуктов играют молочнокислые стрептококки S. lactis, S. cremaris и др. Менее активные расы молочнокислых стрептококков (S. citrovorus, S. lactis subsp. diacetylactis) продуцируют летучие кислоты и ароматические вещества и поэтому широко используются при получении сыров. В группу молочнокислых бактерий также входят молочнокислые палочки: Lactobacterium bulgaricum, Lactobacterium casei, Lactobacterium acidophilus и т.д.

Основными возбудителями спиртового брожения в молоке и молочных продуктах являются дрожжи (Saccharomyces lactis и др.).

Неспецифическую микрофлору молока составляют гнилостные бактерии (Proteus), аэробные и анаэробные бациллы (В. subtilis, В. megatherium , C. putrificum) и многие другие. Эти микроорганизмы разлагают белок молока, участвуют в молочнокислом брожении и придают молоку неприятный вкус и запах. Поражение молочнокислых продуктов плесенью (Mucor, Oidium, Aspergillus и др.) придает им вкус прогорклого масла. Бактерии кишечной группы, попадая в молоко, вызывают изменение вкуса и запаха молока. Микробное обсеменение молока начинается уже в вымени. В процессе дойки происходит добавочное его обсеменение с поверхности кожи вымени, с рук, из сосуда, куда оно поступает, и из воздуха помещения. Интенсивность этого добавочного обсеменения в общем зависит от того, насколько соблюдаются элементарные санитарно-гигиенические условия при получении молока. Плохие условия хранения молока также могут способствовать дальнейшему нарастанию в нем микрофлоры.

Деятельность сменяющейся микрофлоры прекращается только с наступлением полной минерализации всех органических веществ молока. При некоторых условиях процесс смены микробных биоценозов может отклоняться от приведенной выше схемы. Так, молочнокислые бактерии могут быть с самого начала угнетены микробами группы кишечных палочек, если последние присутствуют в большом количестве. Дрожжи могут вырабатывать заметные концентрации спирта, что имеет место в таких продуктах, как кефир (0,2-0,6%) и особенно кумыс (0,9-2,5%). Наличие спирта создает условия для последующего развития уксуснокислых бактерий, сбраживающих спирт в уксусную кислоту. Наличие в молоке антибиотиков и других ингибирующих и нейтрализующих микрофлору веществ также может замедлять молочнокислые процессы.

Санитарно-гигиенический контроль молочных продуктов. Кисломолочные продукты получают в основном путем внесения в молоко особых заквасок, представляющих собой чистые или смешанные культуры определенных микроорганизмов (например, при приготовлении кефира так называемые зерна кефира, при приготовлении ацидофильного молока - культура L. acidophilum).

Ослизнение молока вызывается В. viscosus lactis, B. cloacae, B. aerogenes, S. cremoris и др. Вкус молока при этом не изменяется. В то же время для некоторых молочнокислых продуктов тягучая консистенция является нормальной. Она достигается искусственным внесением культуры слизеобразующих штаммов молочнокислых бактерий.

При продолжительном хранении молока в условиях относительно низкой температуры молочнокислые бактерии не могут развиваться, а некоторые виды дрожжей и гнилостных бактерий находят возможность развития. Они вызывают пептонизацию белков, в результате которой молоко приобретает горький вкус (Torula amara, В. fluorescens liquifaciens, а в сгущенном молоке - Torula lactis condensis).

Прогоркание сливок и сливочного масла обусловлено жизнедеятельностью липолитических микроорганизмов (гриба Oidium lactis, B. fluorescens, B. liquifaciens).

В результате того что в молоке патогенные бактерии находят условия для обильного размножения, при употреблении зараженного молока доза попадающих внутрь микроорганизмов может оказаться огромной. Таким образом, санитарный контроль за молочной продукцией, включающий бактериологическое исследование, имеет большое профилактическое значение.

Для сохранения молока его подвергают стерилизации или пастеризации. При этом не только гибнет микрофлора молока, но и разрушаются витамины, нарушается агрегатное состояние белков и жиров, и тем самым снижается питательная ценность продукта.

Эффективность пастеризации зависит от заданного температурного режима и степени микробного загрязнения молока. При очень высокой обсемененности бактериями часть микробов переживает пастеризацию, в результате чего порча молока происходит быстрее. Наибольшую опасность представляет сохранение в пастеризованном молоке патогенных энтеробактерий и энтеротоксигенных стафилококков.

В последнее время нашел применение и другой метод обработки молока - бактофугирование, позволяющее проводить освобождение молока от микроорганизмов путем обработки на специальных центрифугах.

В Санитарных нормах и правилах 2.3.2.1078-01 нормированы следующие показатели, характеризующие санитарно-бактериологическое состояние молока и молочных продуктов: мезофильные аэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы, бактерии группы кишечных палочек (коли-формы) и патогенные (в том числе сальмонеллы). В мороженом и ряде заквасок для кисломолочных продуктов также нормируется масса продукта, в которой не допускается содержание S. aureus, а также дрожжей и плесеней.

Методы микробиологического анализа предусматривают определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КОЕ/г) и определение бактерий группы кишечных палочек.

Определение количества аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов производят по общим правилам путем посева указанных разведений в количестве 1 см³ в чашки Петри с последующей заливкой плотным питательным агаром. Посевы выдерживают в термостате при 30±1 °С в течение 72 ч.

Число выросших на чашке колоний подсчитывают. Общее количество в 1 см³ (в 1 г) находят по формуле:

X = n × 10m,

где n - количество сосчитанных колоний; m - число десятикратных разведений.

Бактерии группы кишечных палочек - бесспоровые грамотрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные палочки, в основном являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, сбраживающие в питательной среде лактозу с образованием кислоты и газа при 37±1 °С в течение 24 ч. Объем (масса) молокопродуктов, засеваемых в среду Кесслер, представлен в табл. 4-3.

Из каждого разведения засевают по одной пробирке. При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считают, что бактерии группы кишечных палочек в нем обнаружены. Для ориентировочной характеристики микрофлоры кисломолочных продуктов дополнительным методом является микроскопия мазка, приготовленного из цельного или разведенного материала. Мазки фиксируют и окрашивают 10% Метиленовым синим^♠ . Кисломолочные продукты имеют свою специфическую микрофлору, которую используют для их приготовления (табл. 4-4).

На сырое молоко нормативов нет, но как косвенный показатель бактериальной обсемененности используют редуктазную пробу (Государственный стандарт 9225-84). Принцип метода состоит в том, что в процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду ферменты (редуктазы). Для исследования пробы на редуктазу в пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора Метиленового синего^♠ и по 20 см³ молока, закрывают, трижды переворачивают пробирки, затем помещают в водяную баню (38 °С). Изменение окраски молока фиксируют через 40 мин, 2,5 и 3,5 ч. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока. В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из 4 классов (табл. 4-5).

Исследование для выявления S. aureus проводят в соответствии с Государственным стандартом 30347-97, а плесеней и дрожжей - с Государственным стандартом 10444.12-88.

В процессе получения растительного лекарственного сырья возможно его инфицирование через воду, нестерильную аптечную посуду, воздух производственных помещений и руки персонала. Обсеменение происходит также за счет нормальной микрофлоры растений и фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей заболеваний растений. Микроорганизмы находятся на поверхности (на листьях, стеблях, семенах) и на корнях растений.

Микроорганизмы на поверхности растений относятся к эпифитам (от греч. epi - над, phyton - растение). Они не наносят вреда, являются антагонистами некоторых фитопатогенных микроорганизмов, растут за счет обычных выделений растений и органических загрязнений поверхности растений. Эпифитная микрофлора усиливает иммунитет растений, защищая их от фитопатогенных микроорганизмов. Наибольшее количество эпифитной микрофлоры составляют грамотрицательные палочковидные бактерии Erwinia herbicola (новое название Pantoea agglomerans), служащие антагонистами возбудителя мягкой гнили овощей. Обнаруживают в норме и другие бактерии - Pseudomonas fluorescens, реже Bacillus mesentericus и небольшое количество грибов.

Состав микрофлоры растений зависит от вида, возраста растений, типа почвы и температуры окружающей среды. Нарушение поверхности растений и их семян способствует накоплению на них большого количества пыли и микроорганизмов. При повышении влажности численность эпифитных микроорганизмов возрастает, при понижении влажности - уменьшается.

Около корней растений в почве находится значительное количество микроорганизмов. Эта зона называется ризосферой (от греч. rhiza - корень, sphaira - шар). В ризосфере часто присутствуют псевдомонады и микобактерии, встречаются также актиномицеты, спорообразующие бактерии и грибы. Микроорганизмы ризосферы переводят различные субстраты в соединения, доступные для растений, синтезируют биологически активные соединения (витамины, антибиотики и др.), вступают в симбиотические взаимоотношения с растениями, обладают антагонистическими свойствами против фитопатогенных бактерий.

Микроорганизмы поверхности корня растений (микрофлора ризо-планы) в большей степени, чем ризосфера, представлены псевдомонадами. Симбиоз мицелия грибов с корнями высших растений называют «микориза», то есть грибокорнем (от греч. mykes - гриб, rhiza - корень). Микориза улучшает рост растений.

Более загрязнены микроорганизмами растения окультуренных почв, чем растения лесов и лугов. Их много появляется на растениях, растущих на полях орошения, свалках, вблизи складирования навоза, в местах выпаса скота. При этом растения могут загрязняться патогенными микроорганизмами и при неправильной заготовке сырья являются хорошей питательной средой для размножения микроорганизмов. Высушивание растений препятствует росту в них микроорганизмов.

К фитопатогенным микроорганизмам относят бактерии, вирусы и грибы. Болезни, вызываемые бактериями, называют бактериозами. К бактериозам относятся различные виды гнилей, некрозы тканей, увядание растений, развитие опухолей и др. Среди возбудителей бактериозов встречаются псевдомонады, микобактерии, эрвинии, коринебактерии, агробактерии и др. Возбудители бактериозов передаются через зараженные семена, остатки больных растений, почву, воду, воздух или путем переноса насекомыми, моллюсками, нематодами. Бактерии проникают в растения через устьица, нектарники и другие части растений, а также через небольшие повреждения. Представители рода Erwinia вызывают болезни типа ожога, увядания, мокрой или водянистой гнили, например E. amylovora - возбудитель ожога яблонь и груш, Е. carotovora (новое название Pectobacterium carotovorum) - возбудитель мокрой бактериальной гнили. Псевдомонады (род Pseudomonas) вызывают бактериальную пятнистость (Р. syringae и др.), при этом на листьях образуются разнообразные пятна. Поражают листья и бактерии рода Xanthomonas, которые, проникая в сосудистую систему растения и закупоривая ее элемент, вызывают пятнистость и гибель растения. Некоторые представители рода Corynebacterium и виды Curtobacterium flaccumfaciens, Clavibacter michihanensis вызывают сосудистые и паренхиматозные заболевания растений. Гликопептиды этих бактерий повреждают клеточные мембраны сосудов, в результате чего происходят закупорка сосудов и гибель растения. Агробактерии рода Agrobacterium способствуют развитию различных опухолей у растений (корончатый галл, корень волосяной, рак стеблей), что обусловлено онкогенной плазмидой, передаваемой агробактериями в растительные клетки.

Вирусы вызывают болезни растений в виде мозаики и желтухи. При мозаичной болезни растений появляется мозаичная (пятнистая) расцветка пораженных листьев и плодов, растения отстают в росте. Желтуха проявляется карликовостью растений, измененными многочисленными боковыми побегами, цветками и т.д.

При употреблении продуктов питания из пораженного грибами зерна могут возникать пищевые отравления - микотоксикозы, например эрготизм - заболевание, возникаемое при употреблении продуктов, приготовленных из зерна, зараженного спорыньей (гриб Claviceps purpurea). Гриб поражает в поле колоски злаковых: образуются склероции гриба, называемые рожками. В условиях повышенной влажности, низкой температуры на вегетирующих или скошенных растениях могут развиваться грибы родов Fusarium, Penicillium, Aspeigillus и др., вызывающие у людей микотоксикозы.

Для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами выращивают выносливые растения, очищают и обрабатывают семена, обеззараживают почву, удаляют пораженные растения, уничтожают переносчиков возбудителей болезней, обитающих на растениях.

Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей домена Procaryotae варьируют. Например, у Е. coli бактериальная хромосома содержит 4,7×10⁶ н.п. На ней располагается около 4300 генов. Для сравнения: размеры ДНК вирусов составляют порядка 10³ н.п., дрожжей - 10⁷ н.п., а суммарная длина хромосомных ДНК человека составляет 3×10⁹ н.п.

Бактериальная хромосома у Е. coli представлена одной кольцевой молекулой ДНК. Одну кольцевую хромосому имеет также ряд других бактерий: Shigella spp. , Salmonella spp. , P. aeruginosa, B. subtilus. Однако такое строение генома не является универсальным. У некоторых бактерий, в частности у V. cholerae, L. interrhogans, Brucella spp., имеется две кольцевых хромосомы. У ряда других бактерий (B. burgdorferi, Streptomyces spp. ) обнаружены линейные хромосомы.

Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.

Плазмиды представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК размером от 10³ до 10⁶ н.п. Они могут быть кольцевой формой и линейными. Плазмиды кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.

Для характеристики плазмидных репликонов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же механизмом.

Плазмиды, которые могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона, называются «интегративные», или «эписомы».

Плазмиды, способные передаваться из одной клетки в другую, иногда даже принадлежащую иной таксономической единице, называются «трансмиссивные» («конъюгативные»). Трансмиссивность присуща лишь крупным плазмидам, имеющим tra-оперон, в который объединены гены, ответственные за перенос плазмиды. Эти гены кодируют половые пили, которые образуют мостик с клеткой, не содержащей трансмиссивную плазмиду, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку. Этот процесс называется конъюгацией (подробно он будет рассмотрен в разделе 5.4.1). Бактерии, несущие трансмиссивные плазмиды, чувствительны к «мужским» нитевидным бактериофагам.

Мелкие плазмиды, не несущие tra -гены, не могут передаваться сами по себе, но способны к передаче в присутствии трансмиссивных плазмид, используя их аппарат конъюгации. Такие плазмиды называют «мобилизуемые» , а сам процесс - «мобилизация» нетрансмиссивной плазмиды.

Особое значение в медицинской микробиологии имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам, которые получили название R-плазмид (от англ. resistance - противодействие), и плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности, способствующих развитию инфекционного процесса в макроорганизме. R-плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, разрушающих антибактериальные препараты (например, антибиотики). В результате наличия такой плазмиды бактериальная клетка становится устойчивой (резистентной) к действию целой группы лекарственных веществ, а иногда и к нескольким препаратам. Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, распространяясь в популяции бактерий, делая ее недоступной к воздействию антибактериальных препаратов. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, очень часто являются этиологическими агентами внутрибольничных инфекций.

Плазмиды, детерминирующие синтез факторов патогенности, в настоящее время обнаружены у многих бактерий, являющихся возбудителями инфекционных заболеваний человека. Патогенность возбудителей шигеллезов, иерсиниозов, чумы, сибирской язвы, иксодового бореллиоза, кишечных эшерихиозов связана с наличием у них и функционированием плазмид патогенности.

Некоторые бактериальные клетки содержат плазмиды, детерминирующие синтез бактерицидных по отношению к другим бактериям веществ. Например, некоторые Е. coli владеют Col-плазмидой, определяющей синтез колицинов, обладающих микробоцидной активностью по отношению к колиформным бактериям. Бактериальные клетки, несущие такие плазмиды, обладают преимуществами при заселении экологических ниш.

Плазмиды используются в практической деятельности человека, в частности в генной инженерии при конструировании специальных рекомбинантных бактериальных штаммов, вырабатывающих в большом количестве биологически активные вещества (см. гл. 6).

Подвижные генетические элементы обнаружены в составе бактериального генома как в бактериальной хромосоме, так и в плазмидах. К подвижным генетическим элементам относятся:

Вставочные (инсерционные) последовательности - IS-элементы (от англ. insertion sequences) - это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. IS-элементы имеют размеры 1000 н.п. и содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения - транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения. Эти гены по флангам окружены инвертированными повторами, которые служат сайтами рекомбинации, сопровождающей перемещения вставочной последовательности при участии транспозиционных ферментов, в частности транспозаз.

Инвертированные повторы узнает фермент транспозаза (рис. 5-1), которая осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дубликат перемещается на новый участок.

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако, в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид, подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация - составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.

IS-элементы различаются по размеру, типу и количеству инвертированных повторов.

Транспозоны - это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие в своем составе структурные гены, то есть гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

Перемещение подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами вызывает:

Помимо плазмид и подвижных генетических элементов, у бактерий существует еще одна система, способствующая распространению генов, - система интегронов. Интегроны являются системой захвата малых элементов ДНК, называемых «генные кассеты», посредством сайт-специфической рекомбинации и их экспрессии.

Интегрон состоит из консервативного участка, расположенного на 5'-конце, который содержит ген, кодирующий фермент интегразу, сайт рекомбинации att и промотор Р (рис. 5-2).

Кассета может существовать в двух формах: линейной, когда кассета интегрирована в интегрон, и в виде маленькой кольцевой двух-цепочечной ДНК. Кассеты имеют размеры от 260 до 1500 н.п. Они содержат преимущественно 1 ген антибиотикорезистентности и сайт рекомбинации, состоящий из 59 пар оснований, расположенный на 3'-конце.

Интеграза осуществляет рекомбинацию между участком 59 н.п. кассеты и участком att интегрона, включая гены кассеты в интегрон в такой ориентации, чтобы они могли экспрессироваться с промотора Р интегрона. Интеграция кассет в интегрон является обратимым процессом. Интегроны могут располагаться как на хромосоме, так и на плазмидах. Поэтому возможно перемещение кассет с одного интегрона на другой как в пределах одной бактериальной клетки, так и по популяции бактерий. Один интегрон может захватывать несколько кассет антибиотикорезистентности. Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.

В геноме патогенных бактерий (см. гл. 7) имеются участки ДНК протяженностью не менее 10 000 пар нуклеотидов, которые отличаются от основного генома составом G-C-пар нуклеотидных оснований. Эти участки ответственны за синтез факторов патогенности, которые обеспечивают развитие патологического процесса в организме хозяина, поэтому были названы островами патогенности. Острова патогенности обычно по флангам имеют прямые повторы последовательностей ДНК или IS-элементы. Некоторые имеют в своем составе участки, характерные для сайтов интеграции, расположенных вблизи генов тРНК. Большинство островов патогенности локализовано на хромосоме бактерий (Salmonella), но также они могут находиться в составе плазмид (Shigella) и фаговых ДНК (V. cholerae O1, O139).

Защита от чужеродной дезоксирибонуклеиновой кислоты

Установлено, что в процессе регуляции генной активности принимают участие малые, длиной 50-200 нуклеотидов sРНК (от англ. small - маленький). Они реализуют свою регуляторную функцию или непосредственно связываются с комплементарной последовательностью иРНК, вызывая изменение ее вторичной структуры, способствуя тем самым процессу трансляции или связываясь с белком, обозначенным как Cas9, обладающим эндонуклеазной активностью. В последнем случае комплекс sРНК-Cas9 соединяется с комплементарным участком проникшей в клетку ДНК, уничтожая ее. Этим механизмом осуществляется так называемый адаптивный иммунитет бактериальной клетки, к повторному проникновению в нее умеренного фага, плазмиды или транспозонов. Реализация этого происходит с участием РНК-Cas9 через CRISPR (clastered regularly interspaced short palindromic repeated), короткие палиндромные повторы, которые разделены вставками, представляющие чужеродный генетический материал (ДНК умеренных фагов и плазмид). При повторном попадании в бактериальную клетку ДНК фага или плазмиды sРНК транскрибируются с CRISPR, соединяются с Cas9 и этим комплексом соединяются с комплементарным участком внедренной ДНК, разрушая ее (рис. 5-3).

При гомологичной рекомбинации в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Процесс гомологичной рекомбинации находится под контролем генов, объединенных в REС -систему, состоящую из генов recA, B, C, D. Продукты этих генов производят расплетание нитей ДНК и их переориентацию с образованием полухиазмы, структуры Хо-лидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации.

Этот тип рекомбинации не зависит от функционирования генов recA, B, С, D, не требует протяжных участков гомологии ДНК, но для его протекания необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальный ферментативный аппарат, специфичные для каждого конкретного случая. Примером этого типа рекомбинации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными IS-элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага лямбда в хромосому Е. coli. Сайт-специфическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении активности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгутикового Н-антигена.

Незаконная, или репликативная, рекомбинация не зависит от функционирования генов recA, B, С, D. Примером ее является транспозиция подвижных генетических элементов по репликону или между репли-конами, при этом, как уже было отмечено в разделе 5.1.3, транспозиция подвижного генетического элемента сопровождается репликацией ДНК.

Рекомбинация является конечным этапом передачи генетического материала между бактериями, которая осуществляется тремя механизмами: конъюгацией (при контакте бактерий, одна из которых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (с помощью бактериофага), трансформацией (с помощью высокополимеризованной ДНК).

Передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент путем непосредственного контакта клеток называется «конъюгация», впервые она была обнаружена Дж. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г.

Необходимым условием для конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды. Трансмиссивные плазмиды кодируют секреторную систему IV типа (см. гл. 3), аппарат которой формирует пилю, образующую конъюгационную трубочку между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по ней плазмидная ДНК передается в новую клетку. Механизм передачи плазмидной ДНК из клетки в клетку заключается в том, что специальный белок, кодируемый trа -опероном, узнает определенную последовательность в ДНК плазмиды (называемую от англ. origin - начало), вносит в эту последовательность одноцепочечный разрыв и ковалентно связывается с 5'-концом. Затем цепь ДНК, с которой связан белок, переносится в клетку-реципиент, а нера-зорванная комплементарная цепь остается в клетке-доноре. Клеточный аппарат синтеза ДНК достраивает одиночные цепи и в доноре, и в реципиенте до двухцепочечной структуры. Белок, связанный с 5'-концом перенесенной цепи, способствует замыканию плазмиды в реципиент-ной клетке в кольцо. Этот процесс представлен на рис. 5-4, на примере переноса в реципиентную клетку плазмиды F (от англ. fertility - плодовитость), которая является как трансмиссивной, так и интегративной плазмидой. Клетки-доноры, обладающие F-фактором, обозначаются как F⁺ -клетки, а клетки-реципиенты, не имеющие F-фактора, обозначаются как F^- -клетки. Если F-фактор находится в клетке-доноре в автономном состоянии, то в результате скрещивания F⁺ ×F^- - клетка-реципиент приобретает донорские свойства.

Если F⁺ -фактор или другая трансмиссивная плазмида встраиваются в хромосому клетки-донора, то плазмида и хромосома начинают функционировать в виде единого трансмиссивного репликона, что делает возможным перенос бактериальных генов в бесплазмидную клетку-реципиент, то есть происходит процесс конъюгации. Штаммы, в которых плазмида находится в интегрированном состоянии, переносят свои хромосомные гены бесплазмидным клеткам с высокой частотой и поэтому называются Hfr (от англ. high frequency of recombination - высокая частота рекомбинации) (см. рис. 5-4, б).

Процесс переноса хромосомных генов в случае скрещивания Hfr ×F^- всегда начинается с расщепления ДНК в одной и той же точке - в месте интеграции F-фактора или другой трансмиссивной плазмиды. Одна нить донорской ДНК передается через конъюгационный мостик в ре-ципиентную клетку. Процесс сопровождается достраиванием комплементарной нити до образования двунитевой структуры. Перенос хромосомных генов при конъюгации всегда имеет одинаковую направленность, противоположную встроенной плазмиде. Сама трансмиссивная плазмида передается последней. Переданная в реципиентную клетку и достроенная до двунитевой структуры нить ДНК донора рекомбинирует с гомологичным участком реципиентной ДНК с образованием стабильной генетической структуры. Из-за хрупкости конъюгационного мостика половой фактор редко передается в клетку-реципиент, поэтому образовавшийся рекомбинант донорскими функциями, как правило, не обладает.

Вследствие направленности передачи генов конъюгация используется для картирования генома бактерий и построения генетической карты.

Трансдукцией называют передачу бактериальной ДНК посредством бактериофага. Этот процесс был открыт в 1951 г. Н. Циндером и Дж. Ледербергом. В процессе репликации фага внутри бактерий (см. раздел 3.3) фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в реципиентную бактерию во время фаговой инфекции.

Существует два типа трансдукции.

Феномен трансформации впервые был описан в 1928 г. Ф. Гриффитсом, обнаружившим превращение бескапсульного R-штамма пневмококков (Streptococcus pneumoniae) в штамм, образующий капсулу S-формы. Гриффитс ввел мышам одновременно небольшое количество авирулентных R-клеток и убитых нагреванием S-клеток. R-клетки были получены от штамма, капсульное вещество которого принадлежало к типу S II, а убитые нагреванием S-штаммы - к типу S III. Из крови погибших мышей были выделены вирулентные пневмококки с капсулой S III.

В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти установили природу трансформирующего фактора, показав, что ДНК, экстрагированная из инкапсулированных пневмококков, может трансформировать некапсулированные пневмококки в инкапсулированную форму. Таким образом, было доказано, что именно ДНК является носителем генетической информации.

Процесс трансформации может самопроизвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий B. subtilis, H. influenzae, S. pneumoniae, когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками. Процесс трансформации зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния донорской трансформирующей ДНК.

Компетентность - это способность бактериальной клетки поглощать ДНК. Она зависит от присутствия особых белков в клеточной мембране, обладающих специфическим аффинитетом к ДНК. Состояние компетентности у грамположительных бактерий связано с определенными фазами кривой роста. Состояние компетенции у грамотрицательных бактерий приходится создавать искусственным путем, подвергая бактерии температурному или электрошоку.

Трансформирующей активностью обладает только двунитевая высокоспирализованная молекула ДНК. Это связано с тем, что в клетку-реципиент проникает только одна нить ДНК, тогда как другая - на клеточной мембране - подвергается деградации с высвобождением энергии, которая необходима для проникновения в клетку сохранившейся нити. Высокая молекулярная масса трансформирующей ДНК увеличивает шанс рекомбинации, так как внутри клетки трансформирующая нить ДНК подвергается воздействию эндонуклеаз. Интеграция с хромосомой требует наличия гомологичных с ней участков у трансформирующей ДНК. Рекомбинация происходит на одной нити, в результате чего образуется гетеродуплексная молекула, одна нить которой имеет генотип реципиента, а другая - рекомбинантный генотип. Рекомби-нантные трансформанты формируются только после цикла репликации (рис. 5-6).

В настоящее время этот метод является основным методом генной инженерии, используемым при конструировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом.

Рестрикционный анализ основан на применении ферментов, носящих название «рестриктаз». Рестриктазы представляют собой эндонуклеазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов молекулярной генетики имеют рестриктазы, которые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии, так называемыми палиндромами. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относительно нее.

В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходить разрыв двойной спирали ДНК. В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы. Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированного размера. Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют в ультрафиолетовым излучении. Таким способом можно получить рестрикционную карту определенного вида микробов.

Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различных штаммов, можно определить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергнутые мутациям. Этот метод используется также как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.

Определение плазмидного профиля бактерий. Плазмидный профиль позволяет произвести внутривидовую идентификацию бактерий. Для этого из бактериальной клетки выделяют плазмидную ДНК, которую разделяют электрофорезом в агарозном геле для определения количества и размеров плазмид.

Риботипирование. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, характеризуется наличием как консервативных участков, которые подверглись малым изменениям в процессе эволюции и имеют сходное строение у различных бактерий, так и вариабельных последовательностей, которые родо- и видоспецифичны и являются маркерами при генетической идентификации. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких копиях. Фрагменты ДНК, полученные после обработки ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующего вида бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов, как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам, варьируют у различных видов бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штаммов и определение их вида. В настоящее время риботипирование проводится в автоматическом режиме в специальных приборах.

Мультилокусное секвенирование-типирование. Метод генетического типирования, основанный на определении последовательности нуклеотидов в небольших фрагментах (500 н.п.) ряда генов, с последующим сравнением соответствующих последовательностей у разных микроорганизмов. Чаще анализу подвергаются «гены домашнего хозяйства», которые необходимы для протекания реакций основного метаболизма бактериальной клетки и, следовательно, присутствуют у всех бактерий. В силу своей исключительной важности они характеризуются низкой скоростью накопления мутаций.

Сравнение нуклеотидных последовательностей таких генов позволяет легко установить степень филогенетического родства между популяциями и систематизировать их.

Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения, а также для обнаружения микроба в исследуемом материале без его выделения в чистую культуру. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, то есть расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда.

Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радиоактивными нуклидами, ферментом, флюорохромным красителем, с которой сравнивают исследуемую ДНК.

Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль, факт которой фиксируют методами в зависимости от типа метки зонда: подсчетом радиоактивности, иммуноферментным анализом или денситометрией.

Определение наличия микроба в исследуемом материале с помощью микрочипа

Микрочип представляет стеклянную пластинку, с которой связано от 100 до 1000 молекулярных ДНК-зондов, представляющих последовательность нуклеотидов, специфичных для данной таксономической единицы, локализованных в определенных участках (рис. 5-7).

Из исследуемого образца выделяют общую ДНК, которую можно амплифицировать по стабильной последовательности 16S РНК-гену. Выделенную ДНК метят флуорохромом или ферментом и обрабатывают ею микрочип, создавая условия для гибридизации. Отмывают не-связавшуюся ДНК, определяют локализацию молекулярных гибридов постановкой иммуноферментного анализа или денситометрией.

Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.

Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного микроба гена. Обнаружение гена осуществляют его накоплением. Для этого необходимо иметь праймеры (затравки) комплементарного 3'-концам ДНК исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняют следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях в случае комплементарности ДНК гена и праймера происходит присоединение нуклеотидов к 3'-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена увеличивается каждый раз вдвое (рис. 5-8). Проводят реакцию в специальных приборах-амплификаторах. Результат оценивают последующей денситометрией амплифицированной ДНК или ее электрофорезом в полиакриламидном геле. Полимеразную цепную реакцию применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Для обнаружения РНК-содержащих вирусов используют полимеразную цепную реакцию с оборотной транскрипцией (ОТ-ПЦР), включающую предварительный этап синтеза комплементарной ДНК на матрице искомой РНК при помощи ОТ.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени представляет ускоренный метод полимеразной цепной реакции, при котором амплификация и определение продукта амплификации проводится одновременно. Полимеразная цепная реакция в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способна обнаружить даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе. Для этой цели в амплификационную пробирку вводят дополнительный молекулярный зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. К концам этого зонда присоединены флуорофор и тушитель. Когда флуорофор и тушитель связаны с разными концами олигонуклеотидного зонда, тушитель подавляет свечение флуорофора. Во время процесса амплификации, когда этот зонд связывается с амплифицированной цепью за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, флюоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флюоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата (рис. 5-9). Реакция проводится в автоматическом режиме.

Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК используется для диагностики смешанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гибридизации амплифицированных рРНК, специфичных для определенного вида бактерий. Исследование проводят в три этапа:

Реакцию проводят в автоматическом режиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносят для гибридизации комплементарные видоспецифические рРНК-меченые олигонуклеотиды.

Тот факт, что одни микроорганизмы могут каким-то образом задерживать рост других, был известен давно, однако химическая природа антагонизма между микробами долгое время была неясна.

В 1928-1929 гг. А. Флеминг открыл штамм плесневого гриба пеницилла (Penicillium notatum), выделяющего химическое вещество, которое задерживает рост стафилококка. Вещество было названо пенициллином, однако лишь в 1940 г. Х. Флори и Э. Чейн смогли получить стабильный препарат очищенного пенициллина - первый антибиотик, нашедший широкое применение в клинической практике. В 1945 г. А. Флеминг, Х. Флори и Э. Чейн были удостоены Нобелевской премии. В нашей стране большой вклад в учение об антибиотиках внесли З.В. Ермольева и Г.Ф. Гаузе.

Сам термин «антибиотик» (от греч. bios - против жизни) был предложен С. Ваксманом в 1942 г. для обозначения природных веществ, продуцируемых микроорганизмами и в низких концентрациях антагонистичных росту других бактерий.

Антибиотики - это химиотерапевтические препараты из химических соединений биологического происхождения (природные), а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги, которые в низких концентрациях оказывают избирательное повреждающее или губительное действие на микроорганизмы и опухоли.

Классификация антибиотиков по химической структуре

Антибиотики имеют различное химическое строение, и по этому признаку их подразделяют на классы. Многочисленные препараты антибиотиков, принадлежащих к одному классу, имеют сходный механизм и тип действия, им свойственны похожие побочные эффекты. По спектру действия при сохранении характерных для класса закономерностей различные препараты, особенно разных поколений, нередко имеют различия.

Основные классы антибиотиков:

Источники получения природных и полусинтетических антибиотиков

Основными продуцентами природных антибиотиков являются микроорганизмы, которые, находясь в своей естественной среде (в основном в почве), синтезируют антибиотики в качестве средства борьбы за выживание. Клетки растений и животных также могут вырабатывать разнообразные химические вещества с селективным антимикробным действием (например, фитонциды, антимикробные пептиды и др.), однако широкого применения в медицине в качестве продуцентов антибиотиков они не получили.

Таким образом, основными источниками получения природных и полусинтетических антибиотиков стали:

Способы получения антибиотиков

Основные способы получения антибиотиков:

Антибиотики этого класса подразделяют:

Пенициллины. Выделяют природные (получены из грибов) и полусинтетические пенициллины. Природный препарат - бензилпеницил-лин (пенициллин G) и его соли (калиевая и натриевая) - активен против грамположительных бактерий, однако имеет много недостатков: быстро выводится из организма, разрушается в кислой среде желудка, инактивируется пенициллиназами - бактериальными ферментами, разрушающими β-лактамное кольцо. Полусинтетические пенициллины, полученные путем присоединения к основе природного пенициллина - 6-аминопенициллановой кислоте - различных радикалов, имеют преимущества перед природным препаратом, в том числе широкий спектр действия.

Цефалоспорины. Один из наиболее обширных классов антибиотиков. Основным структурным компонентом этой группы антибиотиков является цефалоспорин С, структурно подобный пенициллину.

Общие свойства цефалоспоринов: выраженное бактерицидное действие, низкая токсичность, широкий терапевтический диапазон, не действуют на энтерококки, листерии, метициллинрезистентные стафилококки, вызывают перекрестную аллергию с пенициллинами у 10% больных. Спектр действия широкий, но более активны в отношении грамотрицательных бактерий.

По последовательности внедрения различают 4 поколения (генерации) препаратов, которые отличаются по спектрам активности, устойчивости к β-лактамазам и некоторым фармакологическим свойствам, поэтому препараты одного поколения не заменяют препараты другого поколения, а дополняют:

Монобактамы (азтреонам, тазобактам и др.) - моноциклические β-лактамы узкого спектра действия. Очень активны только против грамотрицательных бактерий, в том числе синегнойной палочки и грамотрицательных колиформных бактерий. Резистентны к β-лактамазам.

Карбапенемы (имипенем, меропенем и др.) - из всех β-лактамов имеют самый широкий спектр действия за исключением метициллинрезистентных штаммов S. aureus и Enterococcus faecium. Резистентны к β-лактамазам. Карбапенемы - антибиотики резерва, назначаются при тяжелых инфекциях, вызванных множественными устойчивыми штаммами микроорганизмов, а также при смешанных инфекциях.

Гликопептиды (ванкомицин, тейкопланин). Активны только в отношении грамположительных бактерий, включая метициллинрезистентные стафилококки. Не действуют на грамотрицательные бактерии вследствие того, что гликопептиды представляют собой очень крупные молекулы, которые не могут проникнуть через поры грамотрицательных бактерий. Токсичны (ототоксичны, нефротоксичны, вызывают флебиты). Используются при лечении тяжелых инфекций, вызванных стафилококками, устойчивыми к другим антибиотикам, особенно метициллинрезистентными стафилококками, при аллергии к β-лактамам, при псевдомембранозном колите, вызванном Clostridium difficile.

Липопептиды (даптомицин) - новая группа антибиотиков, полученных из стрептомицетов, проявляют бактерицидную активность, в связи с высокой частотой побочных эффектов одобрены только для лечения осложненных инфекций кожи и мягких тканей. Имеют высокую активность в отношении грамположительных бактерий, включая полирезистентные стафилококки и энтерококки (устойчивые к β-лактамам и гликопептидам).

Аминогликозиды - соединения, в состав молекулы которых входят аминосахара. Первый препарат - стрептомицин - был получен в 1943 г. Ваксманом как средство для лечения туберкулеза. Сейчас различают несколько поколений (генераций) препаратов:

Аминогликозиды обладают бактерицидной активностью, прежде всего в отношении грамотрицательных аэробных микроорганизмов, включая Pseudomonas aruginosa, а также стафилококков, действуют на некоторых простейших. Не действуют на стрептококки и облигатно-анаэробные микроорганизмы. Используются для лечения тяжелых инфекций, вызванных энтеробактериями и другими грамотрицательными аэробными микроорганизмами. Нефро- и ототоксичны.

Тетрациклины - это семейство крупномолекулярных препаратов, имеющих в своем составе четыре цикличных соединения. Тип действия - статический. Обладают широким спектром активности в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, внутриклеточных паразитов. Назначаются прежде всего для лечения инфекций, вызванных внутриклеточно расположенными микробами: риккетсиями, хламидиями, микоплазмами, бруцеллами, легионеллами. В настоящее время применяют полусинтетические препараты, например доксициклин.

Новой генерацией тетрациклинов являются полусинтетические аналоги тетрациклина - глицилциклины, к которым относится препарат Тигециклин^♠ . Глицилциклины обладают более прочной связью с рибосомами. Тигециклин^♠ активен против широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая мультирезистентные, неферментирующие грамотрицательные бактерии, такие как Acinetobacter spp., метициллинрезистентные штаммы стафилококков, резистентные к ванкомицину, энтерококки и резистентные к пенициллину пневмококки. Препарат способен реагировать с рибосомами бактерий, устойчивыми к действию природных тетрациклинов. Неактивен в отношении P. aeruginosa. Тетрациклины не используются в педиатрической практике, так как накапливаются в растущей зубной ткани («синдром черных зубов»).

Макролиды (и азалиды) - это семейство больших макроциклических молекул. Эритромицин - наиболее известный и широко используемый антибиотик. Более новые препараты: азитромицин, кларитромицин (их можно применять всего 1-2 раза в сутки). Тип действия - статический (хотя в зависимости от вида микроба может быть и цидным). Спектр действия - широкий, активны и в отношении внутриклеточных паразитов (хламидий, риккетсий, легионелл и микоплазм). Активность этой группы препаратов направлена прежде всего против грамположительных микроорганизмов, а также гемофильных палочек, бордетелл, нейс-серий.

Линкозамиды (линкомицин и его хлорированный дериват - клинда-мицин). Спектр активности и механизм действия схож с макролидами, клиндамицин высокоактивен в отношении облигатно-анаэробных микроорганизмов. Бактериостатический эффект.

Стрептограмины. Природный антибиотик Пристиномицин^ρ получен из стрептомицет. Комбинация двух полусинтетических дериватов Пристиномицина^ρ : Хинупристин/Дальфопристин^ρ в соотношении 3:7 обладает бактерицидным эффектом в отношении стафилококков и стрептококков, включая штаммы, резистентные к другим антибиотикам.

Хлорамфеникол. Статический тип действия, обладает широким спектром антимикробной активности, включая грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, а также внутриклеточные паразиты (хламидии, риккетсии), микоплазмы. Имеет в составе молекулы нитробензеновое «ядро», которое делает препарат токсичным для клеток организма человека. Вызывает обратимый депрессивный эффект костномозгового кроветворения. У новорожденных вызывает развитие синдрома «серого ребенка» ^[2] .

Рифамицины (рифампицин). Действие - бактерицидное, спектр - широкий (в том числе внутриклеточные паразиты, очень эффективны против микобактерий). Активны в отношении многих стафилококков, стрептококков, легионелл и микобактерий. Неэффективны в отношении энтеробактерий и псевдомонад. В настоящее время применяются прежде всего для лечения туберкулеза. При использовании этого препарата биологические жидкости окрашиваются в розовый цвет. Вызывает транзиторные нарушения функции печени.

Полипептиды (полимиксины). Спектр антимикробного действия - узкий (грамотрицательные бактерии), тип действия - бактерицидный. Очень токсичны. Применение - наружное, в настоящее время не используются.

Полиены (амфотерицин В, нистатин идр.). Противогрибковые препараты, токсичность которых достаточно велика, поэтому применяются чаще местно (нистатин), а при системных микозах препаратом выбора является амфотерицин В.

Методами химического синтеза целенаправленно создано много антимикробных веществ с избирательным действием, которые не встречаются в живой природе, но похожи на антибиотики по механизму, типу и спектру действия.

Впервые синтетический препарат для лечения сифилиса (Сальварсан^ρ ) синтезировал П. Эрлих в 1908 г. на основе органических соединений мышьяка. В 1935 г. Г. Домагк предложил Пронтозил^ρ (красный стрептоцид) для лечения бактериальных инфекций. Действующим началом Пронтозила^ρ был сульфаниламид, который высвобождался при разложении Пронтозила^ρ в организме.

С тех пор создано много разновидностей антибактериальных, противогрибковых, противопротозойных синтетических химиотерапевтических лекарственных средств разного химического строения. В настоящее время для конструирования новых синтетических антимикробных лекарственных средств ведется постоянный целенаправленный поиск у микробов таких белков, которые могли бы стать новыми мишенями, обеспечивающими принцип избирательности действия этих препаратов.

К наиболее значимым группам широко применяемых синтетических препаратов, активных против клеточных форм микроорганизмов, относятся сульфаниламиды, нитроимидазолы, хинолоны/фторхинолоны, оксазолидиноны, нитрофураны, имидазолы и многие другие (противотуберкулезные, противосифилитические, противомалярийные и т.п.).

Особую группу составляют синтетические противовирусные препараты (см. раздел 6.6).

Сульфаниламиды. Бактериостатики обладают широким спектром активности, включая стрептококки, нейссерии, гемофильные палочки. Основу молекулы этих препаратов составляет парааминогруппа, поэтому они действуют как аналоги и конкурентные антагонисты параамино-бензойной кислоты, которая необходима бактериям для синтеза фолие-вой (тетрагидрофолиевой) кислоты - предшественника пуриновых и пиримидиновых оснований. Роль сульфаниламидов в лечении инфекций в последнее время снизилась, так как существует много устойчивых штаммов, отмечаются серьезные побочные эффекты и активность сульфаниламидов в целом ниже, чем у антибиотиков. Единственным препаратом этой группы, который продолжает достаточно широко использоваться в клинической практике, является ко-тримоксазол [сульфа-метоксазол + триметоприм] (Бактрим ^♠ , Бисептол ^♠ ) и его аналоги. Это комбинированный препарат, который состоит из сульфаметоксазола и триметоприма. Триметоприм блокирует синтез фолиевой кислоты, но на уровне другого фермента. Оба компонента действуют синергически, потенцируя действие друг друга. Действует бактерицидно. Применяют при инфекциях мочевого тракта, вызванных грамотрицательными бактериями.

Хинолоны/фторхинолоны (налидиксовая кислота, ципрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин и др.) - фторированные производные 4-хинолон-3-карбоновой кислоты. У фторхинолонов спектр широкий, тип действия - цидный. Фтор-хинолоны высокоактивны в отношении грамотрицательного спектра микроорганизмов, включая энтеробактерии, псевдомонады, хламидии, риккетсии, микоплазмы. Неактивны в отношении стрептококков и анаэробов.

Новые поколения фторхинолонов (моксифлоксацин, левофлоксацин) обладают активностью в отношении пневмококков. Их применяют также при инфекциях, вызванных грамотрицательными бактериями (в том числе синегнойной палочкой), внутриклеточными паразитами, микобактериями. Негативно влияют на растущую хрящевую ткань, поэтому ограничено их использование в педиатрической практике.

Нитроимидазолы [метронидазол (Трихопол^♠ )]. Тип действия - цидный, спектр - анаэробные бактерии и простейшие (трихомонады, лямблии, дизентерийная амеба). Метронидазол способен активироваться бактериальными нитроредуктазами. Активные формы этого препарата способны расщеплять ДНК. Особенно активны против анаэробных бактерий, так как они способны активировать мет-ронидазол.

Имидазолы (клотримазол идр.) - противогрибковые препараты, действуют на уровне эргостеролов цитоплазматической мембраны.

Нитрофураны (фуразолидон и др.). Тип действия - цидный, спектр действия - широкий. Накапливаются в моче в высоких концентрациях. Применяются как уросептики для лечения инфекций мочевыводящих путей.

Оксазолидиноны (линезолид). Тип действия в отношении стафилококков статический, в отношении некоторых других бактерий (в том числе грамотрицательных) - цидный, спектр действия - широкий. Обладает активностью против многих грамположительных бактерий, включая метициллинрезистентные стафилококки, пенициллинрезистентные пневмококки и ванкомицинрезистентные энтерококки. При длительном применении может приводить к угнетению функций кроветворения (тромбоцитопения).

Важнейшими группами антимикробных препаратов, избирательно действующих на синтез клеточной стенки бактерий, являются β-лактамы, гликопептиды и липопептиды.

Пептидогликан - основа клеточной стенки бактерий. Синтез предшественников пептидогликана начинается в цитоплазме. Затем они транспортируются через цитоплазматическую мембрану, где происходит их объединение в гликопептидные цепи (эту стадию ингибируют гликопептиды путем связывания с D-аланином). Образование полноценного пептидогликана происходит на внешней поверхности цитоплазматической мембраны. Этот этап включает в себя процесс образования поперечных сшивок гетерополимерных цепей пептидогликана и совершается при участии белков-ферментов (транспептидаз), которые называют пенициллинсвязывающими белками, так как именно они служат мишенью для пенициллина и других β-лактамных антибиотиков. Ингибирование пенициллинсвязывающих белков приводит к накоплению в бактериальной клетке предшественников пептидогликана и запуску системы аутолиза. В результате действия аутолитических ферментов и увеличения осмотического давления цитоплазмы происходит лизис бактериальной клетки.

Действие липопептидов направлено не на синтез пептидогликана, а на формирование канала в клеточной стенке при необратимом соединении гидрофобной части молекулы липопептида с клеточной мембраной грамположительных бактерий. Образование такого канала приводит к быстрой деполяризации клеточной мембраны из-за выхода калия и, возможно, других ионов, содержащихся в цитоплазме, в результате чего также наступает гибель бактериальной клетки.

Мишенью для этих препаратов являются белоксинтезирующие системы прокариот, которые имеют отличия от рибосом эукариот, что обеспечивает селективность действия этих препаратов. Синтез белка - многоступенчатый процесс, где задействовано множество ферментов и структурных субъединиц. Известны несколько точек-мишеней, на которые способны воздействовать препараты этой группы в процессе биосинтеза белка.

Аминогликозиды, тетрациклины и оксазолидиноны связываются с 30S-субъединицей, блокируя процесс еще до начала синтеза белка. Аминогликозиды необратимо связываются с 30S-субъединицей рибосом и нарушают присоединение к рибосоме тРНК, происходит образование дефектных инициальных комплексов. Тетрациклины обратимо связываются с 30S-субъединицей рибосом и препятствуют присоединению нового аминоацила тРНК к акцепторному сайту и перемещению тРНК с акцепторного на донорский сайт. Оксазолидиноны блокируют связывание двух субъединиц рибосом в единый 70S-комплекс, нарушают терминацию и высвобождение пептидной цепи.

Макролиды, хлорамфеникол, линкозамиды и стрептограмины соединяются с 50S-субъединицей и ингибируют процесс элонгации по-липетидных цепей при синтезе белка. Хлорамфеникол и линкозамиды нарушают формирование пептида, катализируемого пептидилтрансферазой, макролиды ингибируют транслокацию пептидил тРНК. Однако эффект этих препаратов бактериостатичен.

Стрепторамины, Хинупристин/Дальфопристин ^ρ ингибируют синтез белка в синергичной манере, оказывая бактерицидное действие. Хи-нупристин^ρ связывает 50S-субъединицу и предупреждает элонгацию полипептида. Дальфопристин^ρ присоединяется рядом, изменяет конформацию 50S-рибосомальной субъединицы, увеличивая тем самым прочность связывания с ней Хинупристина^ρ .

Несколько классов антимикробных препаратов способны нарушать синтез и функцию бактериальных нуклеиновых кислот, что достигается тремя способами:

В большинстве своем в эту группу входят синтетические препараты, из антибиотиков подобным механизмом действия обладают только ри-фамицины, которые присоединяются к РНК-полимеразе и блокируют синтез мРНК.

Действие фторхинолонов связано с ингибицией синтеза бактериальной ДНК путем блокирования фермента ДНК-гиразы. ДНК-гираза является топоизомеразой II, которая обеспечивает расплетание молекулы ДНК, необходимое для ее репликации.

Сульфаниламиды - структурные аналоги парааминобензойной кислоты, могут конкурентно связываться и ингибировать фермент, который нужен для перевода парааминобензойной кислоты в фо-лиевую кислоту - предшественник пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти основания необходимы для синтеза нуклеиновых кислот.

Число антибиотиков, специфически действующих на мембраны бактерий, невелико. Наиболее известны полимиксины (полипептиды), к которым чувствительны только грамотрицательные бактерии. Полимиксины лизируют клетки, повреждая фосфолипиды клеточных мембран. Из-за токсичности их применяют лишь для лечения местных процессов и не вводят парентерально. В настоящее время на практике не используют.

Противогрибковые препараты (антимикотики) повреждают эргостеролы цитоплазматической мембраны грибов (полиеновые антибиотики) и ингибируют один из ключевых ферментов биосинтеза эргосте-ролов (имидазолы).

Применение антимикробных химиопрепаратов не только оказывает на микробы прямое угнетающее или губительное воздействие, но и может привести к формированию атипичных форм микробов (например, к образованию L-форм бактерий) и персистирующих форм микробов. Широкое использование антимикробных лекарственных средств приводит также к формированию антибиотикозависимости (редко) и лекарственной устойчивости - антибиотикорезистентности (достаточно часто).

Природная устойчивость - врожденный видовой признак микроорганизма. Она связана с отсутствием мишени для конкретного антибиотика или ее недоступностью. В этом случае использование данного антибиотика с лечебной целью нецелесообразно. Некоторые виды микробов исходно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени, например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому нечувствительны ко всем препаратам, действующим на этом уровне, или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата, например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет узкие поры.

Приобретенная устойчивость характеризуется способностью отдельных штаммов микроорганизмов выживать при концентрациях антибиотиков, способных ингибировать основную часть микробной популяции данного вида. При дальнейшем распространении антибиотико-резистентных штаммов они могут стать преобладающими.

Начиная с 1940-х годов, когда антибиотики стали внедряться в медицинскую практику, бактерии стали чрезвычайно быстро приспосабливаться, постепенно формируя устойчивость ко всем новым препаратам. Приобретение резистентности - это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. К химиопрепаратам могут адаптироваться не только бактерии, но и остальные микробы - от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми госпитальными штаммами, у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к разным группам антимикробных химиотерапевтических препаратов (так называемая полирезистентность).

Устойчивость к антимикробным препаратам определяется и поддерживается генами, обусловливающими резистентность, и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Эти гены могут быть локализованы как в бактериальной хромосоме, так и в плазмидах, а также могут входить в состав профагов и мобильных генетических элементов (транспозонов). Транспозоны осуществляют перенос генов, обусловливающих резистентность с хромосомы на плазмиды и обратно, а также перенос между плазмидами и бактериофагами.

Возникновение и распространение приобретенной устойчивости к антимикробным препаратам обеспечиваются генотипической изменчивостью, связанной в первую очередь с мутациями. Мутации происходят в геноме микробов независимо от применения антибиотика, то есть сам препарат не влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора, так как в присутствии антибиотика происходит селекция устойчивых особей, тогда как чувствительные - погибают. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя резистентные штаммы. Предполагается также существование так называемой коселекции, то есть селективного давления не только антибиотиков, но и других факторов.

Таким образом, приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:

Для осуществления своего антимикробного действия препарат должен, оставаясь активным, пройти сквозь оболочки микробной клетки и потом связаться с внутриклеточными мишенями. Однако в результате приобретения микроорганизмом генов резистентности некоторые свойства бактериальной клетки изменяются таким образом, что действие препарата не может быть выполнено.

Наиболее часто устойчивость реализуется следующими способами.

Сдерживанию распространения антибиотикорезистентности способствует выполнение ряда рекомендаций.

Следует до назначения препарата установить возбудитель инфекции и определить его чувствительность к антимикробным химиотерапевтическим препаратам (антибиотикограмма). С учетом результатов антибиотикограммы больному назначают препарат узкого спектра, обладающий наибольшей активностью в отношении конкретного возбудителя, в дозе, в 2-3 раза превышающей минимальную ингибирующую концентрацию. Поскольку начинать лечение инфекции нужно как можно раньше, то пока возбудитель неизвестен, обычно назначают препараты более широкого спектра, активные в отношении всех возможных микробов, наиболее часто вызывающих данную патологию. Коррекцию лечения проводят с учетом результатов бактериологического исследования и определения индивидуальной чувствительности конкретного возбудителя (обычно через 2-3 дня). Дозы препаратов должны быть достаточными, для того чтобы обеспечить в биологических жидкостях и тканях микробостатические или микробоцидные концентрации.

Необходимо представлять оптимальную продолжительность лечения, так как клиническое улучшение не является основанием для отмены препарата, потому что в организме могут сохраняться возбудители и может быть рецидив болезни. Следует минимально использовать антибиотики в целях профилактики инфекционных заболеваний; в процессе лечения через 10-15 дней антибиотикотерапии менять антимикробные препараты, особенно в пределах одного стационара; при тяжелых, угрожающих жизни инфекциях проводить лечение одновременно 2-3 сочетающимися антибиотиками с различным молекулярным механизмом действия; применять антибиотики, комбинированные с ингибиторами β-лактамаз; уделять особое внимание рациональному применению антибиотиков в таких областях, как косметология, стоматология, ветеринария, животноводство и т.п.; не использовать в ветеринарии антибиотики, применяемые для лечения людей. Однако в последнее время даже эти меры становятся менее эффективными в связи с разнообразием генетических механизмов формирования резистентности.

Весьма важным условием для правильного выбора антимикробного препарата при лечении конкретного пациента являются результаты специальных тестов для определения чувствительности возбудителя инфекции к антибиотикам.

Классификация факторов вирулентности зависит от их структуры, происхождения, механизма действия и назначения.

По структуре и происхождению факторы вирулентности можно классифицировать на две основные группы:

Структурные компоненты бактериальной клетки

К ним относятся капсула, пили, пептидогликан клеточной стенки, белки наружной мембраны и ЛПС грамотрицательных бактерий.

Секретируемые факторы

Помимо структур бактериальной клетки, способствующих проявлению ее вирулентных качеств, известна группа микробных секретируемых факторов, участвующих в инфекционном процессе: бактериоцины, экзотоксины, ферменты «защиты и агрессии», секретируемые факторы персистенции.

Бактериоцины - белки, медиаторы межмикробного взаимодействия, секретируются бактериальной клеткой в качестве антагонистически активных веществ. Бактериоцины выделяются в условиях близкородственного антагонизма внутри вида, рода бактерий. Бактериоцины обеспечивают колонизацию вирулентным штаммом определенного биотопа, подавляя нормальную микрофлору: колицины Shigella flexneri подавляют E. coli, стафилококкцины S. aureus подавляют S. еpidermidis и т.д. Колициногенные штаммы шигелл чаще вызывают затяжные и более тяжелые формы заболевания, чем неколициногенные. Бактериоциногенные штаммы стафилококков значительно чаще выделяются от больных из патологических очагов, чем с кожи и слизистых оболочек здоровых людей. При хронических формах стрептококковой инфекции (ревматизм, хронический тонзиллит) бактериоциногенные штаммы обнаруживаются в 2 раза чаще, чем у здоровых людей.

Экзотоксины - вещества белковой природы, секретируемые вирулентными штаммами микроорганизмов и оказывающие токсическое действие на клетки и ткани организма хозяина.

К факторам вирулентности относятся и ферменты, продуцируемые бактериальной клеткой. Ферменты вирулентности образно называют ферментами «защиты и агрессии». Ферменты защиты обеспечивают устойчивость патогена к иммунитету хозяина: фермент коагулаза свертывает плазму крови, вследствие чего вокруг бактериальной клетки образуется защитная капсула; протеазы иммуноглобулинов разрушают антитела. Ферменты агрессии обеспечивают распространение патогена по организму, они разрушают структуры клеток и тканей организма: гиалуронидаза разрушает соединительную ткань (S. аureus, S. руogenes), нейраминидаза расщепляет сиаловые кислоты оболочек клеток (вирус гриппа), фибринолизин растворяет сгустки фибрина (S. рyogenes), ДНКаза разрушает нуклеиновые кислоты (S. aureus), эластаза расщепляет лизоцим клеток организма (Pseudomonas).

Ферменты метаболизма бактерий, вызывающие образование токсичных веществ при расщеплении субстратов организма, также рассматривают в качестве ферментов вирулентности: микробная уреаза при гидролизе мочевины образует токсичные вещества (Helicobacter pylori), декарбоксилаза при разрушении белка способствует накоплению биогенных аминов (Salmonella Enteritidis). Вирулентность бактерий обеспечивается ферментами супероксиддисмутазой и каталазой, которые инактивируют высокоактивные кислородные радикалы при фагоцитозе (Leg. pneumophila, M. tuberculosis).

Секретируемые факторы персистенции бактерий подавляют специфические и неспецифические механизмы защиты хозяина, обеспечивая бактериям выживание при инфекции. По химической природе это в основном бактерийные протеазы, расщепляющие специфический субстрат хозяина, создающий ему защиту от патогена. Они обеспечивают антилизоцимную, антиинтерфероновую, антикомплементарную, антигистоновую, антилактоферриновую и антигемоглобиновую активность.

В реализации вирулентности возбудителя важна доставка вирулентных протеинов на поверхность бактериальной клетки в участок контакта ее с поверхностью эукариотической клетки и/или введения протеинов в цитозоль клетки хозяина. В процессе эволюции у бактерий выработано несколько типов секреторных систем, которые подробно описаны в разделе 3.1.5. Термин «секреция» используется для описания активного транспорта протеинов из цитоплазмы через внутреннюю и наружную мембраны в супернатант (окружающую среду) бактериальной культуры или на поверхность бактериальной клетки. Секреция отличается от экспорта, который заключается в транспортировке протеинов из цитоплазмы в периплазматическое пространство.

Напомним, что секреторная система I типа (Т1СС) является sec- независимым путем (не находится под контролем sec-гена, отвечающего за секрецию). Этим путем транспортируются α-гемолизин E. coli, внеклеточная аденилатциклаза B. pertussis, протеазы P. аeruginosa. Молекулы, транспортируемые секреторной системой I типа, требуют для транспортировки 3-4 вспомогательные молекулы, участвующие в образовании трансмембранного канала, через который и происходит выход протеинов.

Секреторная система II типа (Т2СС) - основная для экстраклеточных расщепляющих энзимов грамотрицательных бактерий. Эта система использует традиционные sec-зависимые пути для выведения экспортируемых молекул через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство. II тип секреторной системы участвует в экспорте огромного количества разнообразных молекул, включая вирулентные факторы: пили у P. аeruginosa (IV типа) и родственные им энзим-pullulanase y Klebsiella, пектические энзимы и целлюлазы y Erwinia, эластазы, экзотоксин А, фосфолипазы С и другие протеины y Pseudomonas aeruginosa, амилазы и протеазы у Aeromonas hydrophila и т.д.

Секреторная система III типа (Т3СС) - большая экспортная система, независимая от sec-системы, которая играет существенную роль в секреции вирулентных факторов у возбудителей болезней человека и растений. III тип секреторной системы отвечает за секрецию наружных протеинов Yersinia spp., факторов инвазии и вирулентности сальмонелл и шигелл, молекул сигнальной трансдукции энтеропатогенной кишечной палочки и вирулентных факторов некоторых возбудителей заболеваний растений, а также вовлечен в биосинтез поверхностных органелл - флагеллярных белков.

В отличие от секреторного пути I типа, являющегося истинной секреторной системой, в котором секреторные энзимы приобретают активность в экстраклеточном пространстве, тип III - это механизм для транслокации протеинов в цитозоль эукариотической клетки, ибо он обеспечивает сборку на поверхности бактериальной клетки супермолекулярных структур, участвующих в транспорте протеинов в эукариотическую клетку. Аппарат секреторной системы III типа включает около 20 протеинов, большинство которых располагается во внутренней мембране, и цитоплазматическую мембраносвязанную АТРазу (АТФазу) (рис. 7-1).

Секреторная система IV типа (Т4СС) представляет закрепленный на клеточной поверхности мультипротеиновый комплекс, внутри которого находится канал. Через этот канал происходит доставка эффекторных молекул в клетку-хозяина поршневым механизмом. Обеспечивает внутриклеточное существование бруцелл, коксиелл, легионелл.

Секреторная система V типа (Т5СС) включает группу так называемых аутотранспортеров - семейство секреторных протеинов, осуществляющих свой собственный транспорт из бактерий: гонококковую IgA-протеазу и IgA-протеазу H. influenzaece.

Секреторная система VI типа (Т6СС) была обнаружена в 2006 г. у V. cholera, P. aeruginosa. Мутации в генах, детерминирующих эту структуру, приводили к снижению вирулентности. Представляет собой полипротеиновую структуру, по архитектонике напоминающую строение хвостового отростка фага Т4. Способна секретировать эффекторные молекулы в эукариотическую клетку. Придает бактериям преимущество в бактериальных биоценозах.

Классификация факторов патогенности по назначению и механизму действия включает патогенетически значимые продукты бактерийной клетки, определяющие этапность развития инфекционного процесса и его исход. Эти факторы объединяют в 4 группы: колонизации, инвазии, токсигенности и персистенции.

Факторы колонизации патогена

Колонизация - расселение микроорганизмов в определенном биотопе хозяина. Этот этап инфицирования организма начинается с адгезии - прикрепления возбудителя к клеткам организма у входных ворот инфекции. За прикрепление микроба отвечают специальные структуры - адгезины. У грамотрицательных бактерий в этот процесс включаются пили (ворсинки), белки наружной мембраны, а у грамположительных микроорганизмов - тейхоевые кислоты, поверхностные белки. Адгезия специфична у каждого возбудителя с учетом его тропности к тканям, клеткам хозяина, где и осуществляется рецепторлигандное прикрепление возбудителя. Последующее закрепление возбудителя на эукариотических клетках организма вызывает расселение микроорганизмов в инфицированном биотопе хозяина. Этому способствуют участие бактериальных протеаз, блокирующих секреторную защиту организма IgA, продукция бактериоцинов, антиоксидантов, продукция сидерофоров, конкурирующих с лактоферрином за ионы Fe. Таким образом, адгезия и последующая колонизация - начальные (ранние) стадии патогенеза инфекционного процесса.

Факторы инвазии микроорганизмов

Инвазия - проникновение возбудителя внутрь клеток организма (пенетрация), преодоление естественных барьеров организма (кожа, слизистые оболочки, лимфатическая система и др.). Этим процессом управляют инвазины - молекулы бактерий, способствующие проникновению патогена в клетку. В этот период усиливается действие токсичных продуктов - уреаза осуществляет гидролиз мочевины с образованием в организме аммиака, токсичных биогенных аминов. Микроорганизмы продуцируют гемолизин, разрушающий эритроциты, лейкоцидин, разрушающий лейкоциты, спридинг-факторы - ферменты агрессии, способствующие генерализации инфекции за счет распространения возбудителя в организме. Включаются в работу такие ферменты агрессии, как лецито-вителлаза, расщепляющая липопротеид мембран клеток хозяина, фибри-нолизин, устраняющий сгусток фибрина для дальнейшего распространения микроба по организму; гиалуронидаза, расщепляющая гиалуроновую кислоту - вещество соединительной ткани; нейраминидаза - фермент распространения патогена, IgA-протеаза, обеспечивающая устойчивость возбудителя к перевариванию фагоцитами и действию антител и др. Процесс инвазии у некоторых грамотрицательных бактерий обеспечивается III типом секреторной системы, которая отвечает за секрецию факторов инвазии, в частности, у сальмонелл и шигелл; молекул сигнальной трансдукции энтеропатогенной кишечной палочки. В процессе инвазии в эпителиальные клетки возбудитель (S. typhimurium) вступает в интимные отношения с клетками и использует физиологические механизмы обеспечения их жизнедеятельности для обслуживания собственных нужд, вызывая массивную реаранжировку цитоскелета клетки-хозяина и активацию вторичных мессенджеров - транзитное повышение уровня инозитолтрифосфата и выброс Ca2+.

В защите от фагоцитоза принимают участие как поверхностные структуры бактериальной клетки, так и продуцируемые ею вещества. Антифагоцитарной активностью обладают капсулы (S. pneumoniae, N. meningitidis), поверхностные белки: А-белок у S. aureus, M-протеин у S. pyogenes. Некоторые бактерии, например возбудитель коклюша, продуцируют внеклеточную аденилатциклазу, ингибирующую хемотаксис, таким образом позволяя бактерии избежать захвата фагоцитами. Ферменты супероксиддисмутаза и каталаза инактивируют высокореактивные кислородные радикалы при фагоцитозе (Y. pestis, L. pneumophila, S. typhi). Отмечено участие секреторной системы III типа у некоторых бактерий в реорганизации цитоскелета фагоцита, предотвращающее образование фаголизосомы.

Факторы токсигенности бактерий

Токсигенность - продукция бактериями токсичных веществ, повреждающих клетки и ткани организма хозяина.

Наличие токсина у бактерий является патогенетически значимым в ходе развития инфекционного процесса. Токсичный компонент присутствует практически при любой инфекции и проявляет свое действие, хотя и в разной степени.

Токсины, секретируемые возбудителем в среду, обнаруживаются в фазе роста и накапливаются в цитоплазме. Это белки-экзотоксины. Эндотоксины входят в состав клеточной стенки и высвобождаются лишь при гибели микробной клетки.

К эндотоксинам относят ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий, пептидогликан, тейхоевые и липотейхоевые кислоты, гликолипиды микобактерий. Хорошо изучены эндотоксины энтеробактерий (эшерихии, шигеллы, сальмонеллы, бруцеллы). Некоторые бактерии одновременно образуют как экзо-, так и эндотоксины (холерный вибрион, некоторые патогенные кишечные палочки и др.).

Сравнительная характеристика бактериальных экзотоксинов и эндотоксина ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий представлена в табл. 7-1.

Экзотоксины секретируются живой бактериальной клеткой, являются белками, полностью инактивируются под действием высокой температуры (90-100 °С). Они обезвреживаются формальдегидом в концентрации 0,3-0,4% при 37 °С в течение 3-4 нед, при этом сохраняют свою антигенную специфичность и иммуногенность, то есть переходят в вакцину-анатоксин (столбнячный, дифтерийный, ботулиновый, стафилококковый и др.).

Экзотоксины обладают специфичностью действия на клетки и ткани организма, определяя клиническую картину заболевания.

Специфичность экзотоксина определяется механизмом его действия на определенные мишени (табл. 7-2). Способность микробов к продукции экзотоксинов обусловлена в основном конвертирующими бактериофагами.

Информация об эндотоксинах заложена в хромосомных генах бактерий, как и в любом другом клеточном компоненте.

Эндотоксины, в отличие от экзотоксинов, обладают меньшей специфичностью действия. Эндотоксины всех грамотрицательных бактерий (E. coli, S. typhi, N. meningitidis, Brucella abortus и др.) угнетают фагоцитоз, вызывают падение сердечной деятельности, гипотонию, повышение температуры тела, гипогликемию. Большое количество поступившего в кровь эндотоксина приводит к токсикосептическому шоку.

Как и вирулентность, сила действия токсинов измеряется величиной летальных доз DLM, LD₅₀ , DCL, определяемой на животных.

Токсины, повреждающие цитоплазматическую мембрану клеток организма, способствуют лизису клеток: эритроцитов (гемолизины стафилококков, стрептококков и др.), лейкоцитов (лейкоцидин стафилококков).

Разнообразна группа токсинов, нарушающих функцию ферментов клетки. Экзотоксин C. diphtheriae, являясь цитотоксином, блокирует синтез белка на рибосоме клеток миокарда, надпочечников, нервных ганглиев, эпителиоцитов слизистой оболочки зева. Развиваются некроз клеток и тканей, воспаление: дифтеритическая пленка, миокардит, полиневрит. Энтеротоксины холерного вибриона, энтеротоксигенных штаммов E. coli, S. aureus и другие активируют аденилатциклазу в эпителиоцитах слизистой оболочки тонкой кишки, что приводит к повышению проницаемости стенки кишечника и развитию диарейного синдрома. Нейротоксины палочек столбняка и ботулизма блокируют передачу нервных импульсов в клетках спинного и головного мозга.

Особая группа токсинов стафилококков и стрептококков (эксфолиатины, эритрогенины) нарушает межклеточные взаимодействия, что приводит к поражению кожи (пузырчатка новорожденных, скарлатинозная сыпь) и других органов.

Эритрогенный токсин является суперантигеном, вызывает пролиферацию Т-клеток, активируя тем самым каскад компонентов эффекторного звена иммунной системы, выброс медиаторов с цитотоксическими свойствами - интерлейкинов (ИЛ), факторов некроза опухоли (ФНО), ИФН-γ. Инфильтрация лимфоцитов и локальное действие цитокинов играют важную роль в патогенезе инвазивной стрептококковой инфекции при целлюлитах, некротических фасцитах, септических поражениях кожи, поражениях внутренних органов.

Факторы персистенции патогенов

Персистенция возбудителя - форма симбиоза, способствующая длительному выживанию микроорганизмов в инфицированном организме хозяина (от лат. рersistere - оставаться, упорствовать).

Переход бактерий из одной среды существования в другую (внешняя среда - клетка хозяина) - вынужденный ход микроорганизмов, позволяющий в конечном счете обеспечить им выживание как вида, поэтому персистенция бактерий в организме рассматривается как стратегия выживания вида. Смена экологической ниши бактериальной клеткой и ее переход в организм хозяина сопровождаются неизменным появлением новых биологических характеристик у бактерий, облегчающих адаптацию патогена к новым условиям среды обитания.

Выживание бактерий в тканях хозяина определяется динамическим процессом равновесия между разрушением бактерий защитными факторами организма и накоплением (размножением) бактерий, которые угнетают защитные механизмы макроорганизма или избегают их.

При блокировании бактериями защитных механизмов хозяина, то есть освоении ими экологической ниши, определенную роль играют структурные особенности патогена.

В отличие от вирусов или риккетсий, бактерии имеют свои особенности при персистировании, связанные со своеобразием строения бактериальной клетки. Наличие пептидогликана, который присутствует только у прокариот и отсутствует в эукариотических клетках, делает его отличной иммунологической мишенью в организме хозяина, быстро определяющем чужеродную субстанцию. Пептидогликан - маркер чужеродности бактерий в условиях инфицированного хозяина. Поэтому любые адаптационные процессы бактериальной клетки, направленные на защиту (или изоляцию) пептидогликановой структуры клеточной стенки, можно рассматривать в качестве механизмов персистенции бактерий.

В процессе взаимодействия обоих участников инфекции у возбудителя эволюционно закрепилось 4 способа защиты пептидогликана от факторов иммунитета: экранирование клеточной стенки бактерий; продукция секретируемых факторов, инактивирующих защиту хозяина; антигенная мимикрия; образование форм с отсутствием (дефектом) клеточной стенки бактерий (L-формы, микоплазмы).

Персистенция микроорганизмов - базовая основа формирования бактерионосительства.

В патогенетическом плане бактерионосительство - одна из форм инфекционного процесса, при которой наступает динамическое равновесие между микро- и макроорганизмом на фоне отсутствия патологических изменений, но с развитием иммуноморфологических реакций и антительного ответа.

Для бактерионосительства характерна взаимная адаптация паразита и хозяина в целях симбиоза и возможной персистенции патогена. При этом, с одной стороны, происходит селекция биоваров носительских штаммов с комплексом факторов колонизации, персистенции и патогенности, а с другой - перестройка механизмов защиты хозяина с формированием его иммунокомпрометированного статуса (иммунный дисбаланс, толерантность, дефицит местного иммунитета). В итоге создаются условия для персистенции (выживания) возбудителя, что и приводит к бактерионосительству.

Рассматривать жизнь возбудителя в инфицированном организме, вероятно, следует как серию шагов генной активации в ответ на дискретный комплекс окружающих условий. Эта генная регуляция вирулентности бактерий является экологически зависимой, обеспечивающей пластичность микроорганизмов, их адаптивные потенции.

Известно, что бактерии обладают одним большим эволюционным механизмом, благодаря которому идет формирование патогенных представителей. Гены вирулентности чаще всего обнаруживаются в больших сложных блоках, обозначенных как хромосомные вставки или патогенные острова (см. подробнее раздел 5.1.5). Эти острова и островки связаны между собой общими последовательностями, что указывает на приобретение ДНК-сегмента с помощью таких событий, как «незаконные» рекомбинации, имеющие сходство с транспозицией или вставкой фага. Эти ДНК-блоки наиболее часто встраиваются в горячие точки хромосомы - самые восприимчивые участки к вторжению чужеродных ДНК или места встраивания фага. Например, большие сегменты ДНК, кодирующие различные вирулентные факторы, встроены в одно и то же место хромосомы, как у уропатогенной, так и у энтеропатогенной E. coli - возбудителей двух различных заболеваний, причем последовательности, расположенные внутри патогенного островка, не обнаруживают гомологии с теми, что наблюдаются у непатогенных клонов, подобных E. coli K-12, но последовательности, непосредственно прилегающие к патогенному островку, демонстрируют общность у патогенных и непатогенных штаммов.

Регионы хромосомных ДНК, кодирующих несколько кластрированных генов вирулентности, общие среди микроорганизмов от возбудителей растений до Helicobacter pylori и Yersinia pestis. В то же время, несмотря на определенную консервативность (в частности, хромосом E. coli, S. typhimurium), бактериальные хромосомы не являются константными, а постоянно изменяются. Фенотипические изменения способны модифицировать патогенность внутри различных клональных вариантов одного вида. Например, хромосома S. typhi, которая вызывает заболевание только у человека, подлежит большой геномной реаранжировке в ходе своей эволюции по сравнению с нетифоидными сальмонеллами, а именно инверсиям, транспозициям и вставкам через события гомологических рекомбинаций. Естественно, некоторые из этих событий могут изменять вирулентность S. typhi и повышать ее специфические адаптационные способности к организму человека. Регуляцию и экспрессию хромосомных вирулентных факторов могут изменять и такие эпизоды, как перетасовка хромосомных генов.

Считают, что патогенные микроорганизмы эволюционируют не за счет медленной адаптивной эволюции предсуществующих генов, а через сумму скачков, как правило, овладевая генетическими сегментами (которые кодируют множественные вирулентные факторы) не только родственных, но и неродственных организмов, и включают даже эукариотические последовательности (приобретение тирозиновой фосфатазы Yersinia). В последующем приобретенная генетическая информация интегрируется в хромосому или стабильную плазмиду. Соответствующая селекция вирулентных факторов обеспечивает сохранность таких последовательностей у возбудителей, а распространение этой генетической информации через мобильные генетические элементы (многие вирулентные гены кодируются на мобильных генетических элементах ДНК) дает гарантию возможности получения любыми микроорганизмами селективных преимуществ. Информация, которая не является необходимой, в основном теряется, так как отсутствует селективное условие для ее сохранения.

Экспрессия факторов вирулентности тесно связана с различными сигналами окружающей среды, в том числе с температурой, концентрацией ионов, осмолярностью, уровнем железа, рН, наличием источника углерода, уровнем кислорода и рядом других, пока не установленных. Возбудитель способен использовать как один сигнал, так и их комплекс, чтобы «почувствовать», какое микроокружение он оккупирует внутри хозяина или даже внутри специализированного компартмента единственной клетки хозяина. Поэтому на каждом шаге инфекционного цикла (в ходе достижения бактериями своих биологических задач) в ответ на калейдоскоп защитных ответов хозяина происходят динамическое включение и выключение различных генов - согласованный и взаимообусловленный процесс.

Например, экспрессия одного из антифагоцитарных факторов возбудителя чумы, фракции F₁ , экспрессируется максимально при 35- 37 °С, когда возбудитель находится в организме человека, и падает при 28 °С при нахождении его в организме блохи. Инвазивные гены обычно включаются на ранней стадии инфекции, но репрессируются, когда бактерия оказывается внутри клетки хозяина. Дезорганизация экспрессии патогенных факторов во времени может разрушить процесс инвазии бактерий.

Таким образом, регуляция патогенности - это комплексное событие. Все вирулентные факторы могут контролироваться одновременно несколькими регуляторными системами, которые измеряют различные параметры окружающей среды, и в то же время несколько регуляторных систем могут регулировать один вирулентный фактор. Кроме того, регуляторные факторы обычно регулируют сами себя, что создает иерархию в регуляции и тонком контроле за экспрессией вирулентных факторов. В результате уровень вирулентности определяется средней величиной всех сигналов (окружения и регуляции).

Естественная резистентность организма включает ряд анатомо-физиологических барьеров, препятствующих как проникновению патогена в организм, так и его распространению по организму. Среди основных анатомо-физиологических барьеров естественной защиты организма при инфекции выделяют: кожу и слизистые оболочки (наружный барьер), нормальную микрофлору; лимфатические узлы, клетки ретикулоэндотелиальной системы, воспаление; кровь - клеточные и гуморальные факторы; гематоэнцефалический барьер.

Кожа не только служит механическим барьером для патогена, но и обладает бактерицидным свойством за счет секретов сальных и потовых желез. Чистота кожи повышает ее бактерицидность. Известен показатель бактерицидной активности кожи, который определяется по отношению к индикаторным тест-штаммам E. coli. Этот показатель входит в число стандартных тестов оценки резистентности организма космонавтов перед полетом в космос. Повреждение кожи является условием для развития раневых инфекций: газовой гангрены, столбняка, бешенства.

Слизистые оболочки обеспечивают защиту не только как механический барьер за счет слизи, целостности эпителиального покрова, функции ворсинок. Эпителиоциты слизистых оболочек и железы разных биотопов выделяют на поверхность бактерицидные секреты: слюну, слезную жидкость, желудочный сок, сок тонкой кишки, вагинальный секрет, лизоцим и т.д. При нарушении барьерной функции слизистые оболочки становятся входными воротами инфекции для многих патогенов: возбудителей кишечных инфекций и инфекций дыхательных путей, возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем и др.

Важная роль в защите биотопов организма от патогена отводится нормальной (резидентной или индигенной) микрофлоре. Основными представителями нормальной микрофлоры толстой кишки являются кишечная палочка и бифидобактерии, в носоглотке - коринеформные бактерии и непатогенные нейссерии, на коже - эпидермальные стафилококки.

Микрофлора слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у детей существенно отличается от таковой у взрослых и меняется в зависимости от возраста ребенка, условий его существования, характера питания и т.д. Так, у детей до прорезывания зубов в микрофлоре рта преобладают аэробные бактерии. После прорезывания зубов микрофлора рта ребенка аналогична микрофлоре взрослых, что связано и с изменением характера питания.

Огромное количество микроорганизмов содержится в полости кишечника. Исследование кишечной флоры у детей показало, что микробы в мекониуме появляются со второй половины первых суток жизни. Вначале появляются кокки, затем в кишечнике определяются грампо-ложительные палочки со спорами. В небольшом количестве в мекониуме обнаруживаются также кишечные палочки, вульгарный протей. С 3-го дня, когда появляются бифидобактерии, споровые палочки исчезают.

Основой кишечной микрофлоры у детей, находящихся на грудном вскармливании, являются бифидобактерии, которые составляют около 90% всех микробов кишечника. Встречаются кишечные палочки, энтерококки, ацидофильная палочка и аэрогенные бактерии. У детей, находящихся на искусственном вскармливании, превалируют кишечные палочки, а количество бифидобактерий снижается. Защитная роль нормальной микрофлоры состоит в выделении антагонистически активных веществ (антибиотиков, бактериоцинов, микроцинов), подавляющих патоген, его способности колонизировать кожу, слизистые оболочки. Нормальная микрофлора образует пленку в биотопе. Кроме защитного антагонизма, известны детоксицирующая, иммуностимулирующая и витаминообразующая функции нормальной микрофлоры, ее участие в пищеварении. Подавление нормальной микрофлоры вследствие заболевания или широкого применения антибиотиков приводит к формированию дисбактериоза, который может стать причиной развития различных форм патологии, в том числе и микробного генеза. Для профилактики и лечения дисбактериоза используются эубиотики - препараты, содержащие живые антагонистически активные штаммы: представители нормальной микрофлоры организма (колибактерин, бифидумбактерин, лактобактерин).

Второй защитный барьер организма включает функцию лимфатических узлов, клеток ретикулоэндотелиальной системы, развитие воспаления. Лимфатические узлы выполняют барьерофиксирующую функцию, могут длительно задерживать патоген, не допуская его проникновения в кровь (например, фиксация гемолитического стрептококка в лимфоидной ткани миндалин, задержка бруцелл, возбудителя чумы, стафилококка, туберкулезных палочек в регионарных лимфатических узлах). За счет лимфатических узлов предотвращается развитие генерализованной формы инфекции. При подавлении барьерной функции лимфатических узлов могут развиться бактериемия (брюшной тиф, бруцеллез) и сепсис (чума, стафилококковая и стрептококковая инфекции).

Печень, селезенка, эндотелий кровеносных сосудов за счет клеток ретикулоэндотелиальной системы являются своеобразными фильтрами, в которых застревают патогены и таким образом не допускается генерализация инфекции (брюшной тиф). Воспаление в своей основе служит защитной реакцией организма, так как в результате воспалительной реакции вокруг патогена концентрируются специализированные клетки, которые должны либо уничтожить возбудителя, либо ограничить его распространение, например при гнойном мастите стафилококковой этиологии в ткани молочной железы образуется локальный гнойный очаг (абсцесс), предотвращающий генерализацию стафилококковой инфекции.

Одним из методов лечения хронических инфекций является назначение препаратов, усиливающих воспалительную реакцию организма как защитную (хроническая гонорея, хроническая дизентерия). Однако иногда воспаление может выполнять противоположную патогенетическую функцию, то есть способствовать развитию патологического процесса, нарушению структуры и функции органа (ткани): воспаление легких (пневмония), воспаление почек (нефрит). В таком случае назначают противовоспалительную терапию.

Третья достаточно мощная преграда на пути распространения патогена по организму - это кровь. Бактерицидная активность крови, то есть ее способность к самоочищению, обеспечивается комплексом гуморальных и клеточных факторов естественной резистентности организма. Если кровь перестает выполнять свою бактерицидную функцию, то возбудитель беспрепятственно пребывает и размножается в крови, а через кровь проникает и локализуется в разных органах и тканях. В таких случаях развиваются тяжелые, генерализованные формы инфекции, сепсис и септикопиемия, которые создают реальную угрозу жизни организма-хозяина (чумной сепсис, сибиреязвенный сепсис, стафилококковая септикопиемия).

Четвертый барьер организма - гематоэнцефалический, который защищает ткань мозга (головного, спинного) от поражения патогеном. В защитные структуры гематоэнцефалического барьера входят оболочки мозга, стенки кровеносных сосудов, питающих мозговую ткань. Проникновение возбудителя в мозговую ткань приводит к развитию менингоэнцефалитов (менингококк, риккетсии Провачека, вирусы бешенства и энцефалитов). Ткани головного мозга защищены нейро-секретируемыми гормонами задней доли гипофиза - окситоцином и вазопрессином, которые наряду с антимикробной активностью подавляют и персистентный потенциал многих патогенов, что используется в клинической практике для борьбы с инфекцией.

Известно, что организм человека живет и развивается в непосредственном контакте с представителями живой и неживой природы и разнообразными биоорганическими молекулами естественного или искусственного происхождения, обладающими биологической активностью. Попадая в организм человека, чужеродные молекулы могут вмешиваться и нарушать биологические процессы, создавая угрозу жизни отдельному индивидууму. Отличительной чертой этих агентов является генетическая чужеродность. Зачастую подобные продукты образуются внутри организма человека в результате синтетической активности населяющей нас микрофлоры, клеточных мутаций и всевозможных модификаций макромолекул, из которых мы построены.

Для защиты от нежелательной и губительной интервенции эволюция создала у представителей живой природы специальную систему противодействия, совокупный эффект которой был определен как «иммунитет» (от лат. immunitas - освобождение от чего-либо, неприкосновенность). Применялся этот термин уже в средние века для обозначения, например, освобождения от уплаты от податей, а позже - неприкосновенности дипломатической миссии. Смысл этого термина точно соответствует тем биологическим задачам, которые определила эволюция в отношении иммунитета. Основными задачами служат распознавание генетического отличия интервента от собственных структур и устранение его влияния на биологические процессы, протекающие в организме, с помощью комплекса специальных реакций и механизмов. Конечная цель деятельности системы иммунной защиты - сохранение гомеоста-за, структурной и функциональной целостности и генетической индивидуальности, как отдельного организма, так и вида в целом, а также выработка средств профилактики подобных интервенций в будущем.

Следовательно, иммунитет - это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ экзогенного и эндогенного происхождения, направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма и генетической индивидуальности каждого организма и вида в целом.

Иммунитет как общебиологическое и общемедицинское явление, его анатомические структуры, механизмы функционирования в организме изучает специальная наука - иммунология. Эта наука возникла более 100 лет назад. По мере прогресса человеческих знаний менялись взгляды на иммунитет, на его роль в организме, на механизмы иммунных реакций, расширялась сфера практического использования достижений иммунологии, а в соответствии с этим менялось и определение иммунологии как науки. Зачастую иммунологию трактуют как науку, которая изучает специфическую невосприимчивость к возбудителям инфекционных болезней и разрабатывает способы защиты от них. Это однобокий взгляд, который не дает всестороннего, всеобъемлющего понимания науки, исходя из сущности и механизмов иммунитета и его роли в жизнедеятельности организма.

На современном этапе развития учения об иммунитете иммунологию можно определить как общебиологическую и общемедицинскую науку, которая изучает способы и механизмы защиты организма от генетически чужеродных веществ экзогенного и эндогенного происхождения в целях поддержания гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма и генетической индивидуальности отдельного индивидуума и вида в целом.

Одним из важнейших разделов иммунологии является медицинская иммунология. В настоящее время медицинская иммунология решает такие важные проблемы, как диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней (иммунопрофилактика или вакцинология), аллергических состояний (аллергология), злокачественных опухолей (иммуноонкология), болезней, в механизме которых играют роль иммунопатологические процессы (иммунопатология), иммунные взаимоотношения матери и плода на всех стадиях репродукции (иммунология репродукции), изучает иммунные механизмы и вносит практический вклад в решение проблемы трансплантации органов и тканей (трансплантационная иммунология); можно также выделить иммуногематологию, изучающую взаимоотношения донора и реципиента при переливании крови, иммунофармакологию, изучающую влияние на иммунные процессы лекарственных веществ.

Хронологически иммунология как наука уже прошла два больших периода:

В течение второго периода завершилось формирование классической иммунологии, которая носила в основном характер инфекционной иммунологии. С середины XX в. иммунология вступила в третий молекулярно-генетический период, который продолжается до наших дней. Этот период характеризуется быстрыми темпами развития молекулярной и клеточной иммунологии и иммуногенетики. Предохранение от заболевания натуральной оспой путем прививки человеку коровьей оспы предложил более 200 лет назад английский врач Э. Дженнер, однако это наблюдение носило чисто эмпирический характер. Поэтому основоположниками научной иммунологии по праву считаются французский ученый-химик Л. Пастер, открывший принцип вакцинации, русский ученый-зоолог И.И. Мечников - автор учения о фагоцитозе, и немецкий врач-биохимик П. Эрлих, сформулировавший гипотезу об антителах. В 1888 г. за выдающиеся заслуги Л. Пастера перед человечеством на народные пожертвования был учрежден Институт иммунологии (ныне Институт Пастера), ставший школой, вокруг которой группировались иммунологи многих стран.

Российские ученые активно участвовали в становлении и развитии иммунологии. Более 25 лет И.И. Мечников был заместитель директора по науке в Институте Пастера, то есть был его ближайшим помощником и единомышленником. В Пастеровском институте работали многие выдающиеся русские ученые: М. Безредка, Н.Ф. Гамалея, Л.А. Тарасович, Г.Н. Габричевский, И.Г. Заболотный, В.А. Барыкин, Н.Я. и Ф.Я. Чистовичи и многие другие. Эти ученые продолжали развивать традиции Пастера и Мечникова в иммунологии и, по существу, создали русскую школу иммунологов.

Российским ученым принадлежат многие выдающиеся открытия в области иммунологии: И.И. Мечников заложил основы учения о фагоцитозе, В.К. Высокович одним из первых сформулировал роль ретикулоэндотелиальной системы в иммунитете, Г.Н. Габричевский описал явление хемотаксиса лейкоцитов, Ф.Я. Чистович стоял у истоков открытия тканевых антигенов, М. Райский установил феномен ревакцинации, то есть иммунологической памяти, М. Сахаров - один из основоположников учения об анафилаксии, акад. Л.А. Зильбер стоял у истоков учения об антигенах опухолей, акад. П.Ф. Здродовский обосновал физиологическое направление в иммунологии, акад. Р.В. Петров внес весомый вклад в развитие неинфекционной иммунологии.

Российские ученые по праву являются лидерами в разработке фундаментальных и прикладных проблем вакцинологии и иммунопрофилактики в целом. Хорошо известны в нашей стране и за рубежом имена создателей вакцин: Б.Я. Эльберт, Н.А. Гайский (против туляремии); Н.Н. Гинзбург (против сибирской язвы); М.П. Чумаков, А.А. Сморо-динцев (против полиомиелита); А.А. Смородинцев (против кори, паротита, гриппа); П.Ф. Здродовский (против ку-лихорадки и сыпного тифа); А.А. Воробьев, Г.В. Выгодчиков, П.Н. Бургасов (против полианатоксинов, против раневых инфекций и ботулизма) и др. Российские ученые принимали активное участие в разработке вакцин и других иммунобиологических препаратов, стратегии и тактики иммунопрофилактики, глобальной ликвидации и снижении уровня инфекционных болезней. В частности, по их инициативе и с их помощью ликвидирована натуральная оспа на земном шаре (В.М. Жданов, О.Г. Анджапаридзе), успешно ликвидируется полиомиелит (М.П. Чумаков, С.Г. Дроздов). Иммунология за сравнительно короткий исторический период добилась существенных результатов в снижении и ликвидации болезней человека, сохранении и поддержании здоровья людей нашей планеты.

Способность к распознаванию чужеродных структур и защите собственного организма от интервентов сформировалась довольно рано. Элементарные системы защиты от любых чужеродных веществ имеют уже низшие организмы, в частности беспозвоночные (губки, кишечнополостные, черви). Организм человека, как и всех теплокровных животных, уже имеет сложноорганизованную систему противодействия генетически чужеродным агентам. Однако анатомическое строение, физиологические функции и реакции, обеспечивающие такую защиту у отдельных видов животных, у человека и низших организмов в соответствии с уровнем эволюционного развития существенно различаются. Так, фагоцитоз и аллогенная ингибиция как одни из ранних филогенетических защитных реакций присущи всем многоклеточным организмам. Дифференцированные лейкоцитоподобные клетки, выполняющие функции клеточного иммунитета, появляются уже у кишечнополостных и моллюсков; у круглоротых (миноги) возникают зачатки тимуса, Т-лимфоциты, иммуноглобулины, отмечается иммунная память. У рыб уже есть типичные для высших животных лимфоидные органы - тимус и селезенка, плазматические клетки и антитела класса М. Птицы обладают центральным органом иммунитета в виде сумки Фабрициуса, у них появляется способность реагировать в виде гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). Наконец, у млекопитающих иммунная система достигает наиболее высокого уровня развития: формируются Т- и В-системы иммунных клеток, осуществляется их кооперативное взаимодействие, появляется способность синтеза иммуноглобулинов разных классов и формы иммунного реагирования.

В зависимости от уровня эволюционного развития, особенностей и сложности сформировавшейся иммунной системы, способностей последней отвечать теми или иными реакциями на антигены, в иммунологии принято выделять отдельные виды иммунитета. Так, введено понятие о врожденном и приобретенном иммунитете (рис. 8-1).

Врожденный (естественный, видовой) иммунитет - это выработанная в процессе филогенеза генетически закрепленная, передаваемая по наследству невосприимчивость особей данного вида к какому-либо чужеродному агенту. Примерами могут служить невосприимчивость человека к некоторым возбудителям, в том числе к особо опасным для сельскохозяйственных животных (чума крупного рогатого скота, болезнь Ньюкасла, поражающая птиц, оспа лошадей и др.), нечувствительность человека к бактериофагам, поражающим клетки бактерий. Объяснить видовой иммунитет можно с разных позиций: неспособностью чужеродного агента к адгезии на клетках и молекулах-мишенях, определяющих запуск патологического процесса и активацию иммунной системы, его быстрой деструкцией ферментами макроорганизма, отсутствием условий для колонизации макроорганизма.

Видовой иммунитет может быть абсолютным и относительным. Например, нечувствительные к столбнячному токсину лягушки реагируют на его введение при повышении температуры их тела. Лабораторные животные, не чувствительные к какому-либо чужеродному агенту, реагируют на него на фоне введения иммунодепрессантов или удаления центрального органа иммунитета - тимуса.

Приобретенный иммунитет - это невосприимчивость к чужеродному агенту чувствительного к нему организма человека, животных, приобретаемая в процессе индивидуального развития, то есть развития каждой особи в отдельности. Основой ее является иммунная защита, которая реализуется лишь при необходимости и в определенных условиях. Приобретенный иммунитет, точнее, его конечный результат сам по себе не наследуется.

В табл. 8-1 представлена сравнительная характеристика врожденного и адаптивного иммунитета.

Различают естественный и искусственный приобретенный иммунитет. Примером естественного приобретенного иммунитета у человека может служить невосприимчивость к инфекции, возникающая после перенесенного инфекционного заболевания (так называемый постинфекционный иммунитет), например после скарлатины. Искусственный приобретенный иммунитет создается преднамеренно для формирования невосприимчивости организма к определенному агенту путем введения специальных иммунобиологических препаратов, например вакцин, иммунных сывороток, иммунокомпетентных клеток (см. гл. 13).

Приобретенный иммунитет может быть активным и пассивным.

Активный иммунитет обусловлен непосредственным вовлечением системы иммунитета в процесс его формирования (например, поствакцинальный, постинфекционный иммунитет).

Пассивный иммунитет образуется за счет введения в организм уже готовых иммунореагентов, способных обеспечить необходимую защиту. К таким препаратам относятся антитела (препараты иммуноглобулинов и иммунные сыворотки) и лимфоциты. Пассивный иммунитет формируется у плода в эмбриональном периоде за счет проникновения материнских антител через плаценту, а в период грудного вскармливания - при поглощении ребенком антител, содержащихся в молоке (см. рис. 8-1).

Поскольку в формировании иммунитета принимают участие клетки иммунной системы и гуморальные факторы, принято иммунитет дифференцировать в зависимости от того, какой из компонентов иммунных реакций играет ведущую роль в формировании защиты от антигена. В связи с этим различают гуморальный и клеточный иммунитет. Примером клеточного иммунитета может служить противовирусный и противоопухолевый иммунитет, когда ведущую роль в иммунитете играют цитотоксические Т-лимфоциты и естественные киллеры. Иммунитет при токсинемических инфекциях (дифтерия) и интоксикациях (столбняк, ботулизм) обусловлен в основном антителами (антитоксинами), то есть ведущую роль играют гуморальные факторы.

В зависимости от направленности иммунитета, то есть природы чужеродного агента, выделяют антитоксический, противовирусный, противогрибковый, антибактериальный, антипротозойный, трансплантационный, противоопухолевый и другие виды иммунитета.

Иммунитет может поддерживаться, сохраняться либо при отсутствии или только в присутствии чужеродного агента в организме. В первом случае такой агент играет роль пускового фактора, а иммунитет называют «стерильный», во втором - «нестерильный». Примером стерильного иммунитета является поствакцинальный иммунитет при введении убитых вакцин, а нестерильного - иммунитет при туберкулезе, который поддерживается постоянным присутствием в организме микобактерий туберкулеза.

Иммунитет может быть системным, то есть генерализованным, распространяющимся на весь организм, и местным, при котором наблюдается более выраженная резистентность отдельных органов и тканей. Как правило, учитывая особенности анатомического строения и организации функционирования, понятие «местный иммунитет» используется для обозначения резистентности слизистых оболочек (мукозальный иммунитет) и кожных покровов.

В случае когда входными воротами инфекции являются кожа и/или слизистые оболочки, патоген взаимодействует с целым спектром факторов иммунитета (табл. 8-2). Прежде всего, это гуморальные факторы врожденного иммунитета - неспецифические антитела, антимикробные пептиды, белки системы комплемента и др. Также в качестве барьера можно рассматривать бактерии нормофлоры, эпителиальные клетки и другие факторы (которые напрямую к иммунитету не относятся).

Если возбудитель имеет ряд факторов (к примеру, инвазивных), то он может проникнуть в субэпителиальную ткань, где развивается острая воспалительная реакция, ограничивающая возбудителя во входных воротах. Воспаление обеспечивается рядом клеточных (нейтрофилы, макрофаги и др.) и гуморальных факторов (провоспалительные цитокины) врожденного иммунитета.

Далее патоген может проникать в регионарные лимфатические узлы, куда он транспортируется лимфой по лимфатическим сосудам, дренирующим соединительную ткань. Лимфатические сосуды и узлы отвечают на внедрение развитием лимфангиита и лимфаденита. После преодоления этого барьера микробы по эфферентным лимфатическим сосудам проникают в кровь, где патоген может стать причиной сепсиса, а также распространяться по всему организму, попадая в разные органы и системы, вызывая генерализацию инфекционного процесса. Механизмы адаптивного иммунитета (при первичном проникновении) развиваются только через несколько суток/недель после попадания патогена в организм.

Кожа и слизистые оболочки. Слой эпителиальных клеток, выстилающий поверхность кожи и слизистых оболочек, является тем барьером, который практически непроницаем для микробов. Он отделяет стерильные ткани организма от заселенного микробами внешнего мира.

Кожа покрыта многослойным эпитерием, в котором различают два слоя: роговой и базальный. Кератиноциты рогового слоя - это погибшие клетки, устойчивые к агрессивным химическим соединениям. На их поверхности отсутствуют рецепторы для адгезивных молекул микроорганизмов, поэтому они обладают значительной устойчивостью к колонизации и являются самым надежным барьером на пути большинства бактерий, грибов, вирусов, простейших. Устье сальных и потовых желез, волосяных фоликулов в коже наиболее уязвимы, поскольку здесь слой ороговевшего эпителия истончается. В защите этих участков важную роль играют продукты потовых и сальных желез, содержащих молочную, жирные кислоты, ферменты, антимикробные пептиды. Именно в устьях придатков кожи располагается глубокая резидентная микрофлора, образующая микроколонии и продуцирующая защитные факторы (см. гл. 4).

В эпидермисе, помимо кератиноцитов, содержатся еще два типа клеток - клетки Лангерганса и Гринстейна (отростчатые эпидермоциты, составляющие 1-3% кариоцитов базального слоя). Клетки Лангерганса и Гринстейна имеют миелоидное происхождение и относятся к дендритным. Предполагается, что по функции эти клетки являются оппозитными. Клетки Лангерганса участвуют в презентации антигена, индуцируют иммунный ответ, а клетки Гринстейна продуцируют цитокины, подавляющие иммунные реакции в коже. Типичные кератиноциты и дендритные клетки эпидермиса в совокупности с лимфоидными структурами дермы принимают активное участие в реакциях приобретенного иммунитета (см. ниже).

Здоровая кожа обладает высокой способностью к самоочищению. Это легко доказать, если нанести на ее поверхность патогенные бактерии - через некоторое время такие микробы исчезают. На этом принципе основаны методы оценки бактерицидной функции кожи.

Слизистые оболочки. Большинство инфекций проникает в организм через слизистые оболочки. Это связано, во-первых, с большей площадью их поверхности (слизистые оболочки около 400 м² , кожа около 2 м² ), во-вторых, с меньшей защищенностью.

Слизистые оболочки организма постоянно подвергаются воздействию патогенных и непатогенных (комменсалов) микроорганизмов. Факторы врожденного мукозального иммунитета поддерживают баланс между толерантностью к условно-патогенной микрофлоре и иммуногенностью к патогенным микробам. Для борьбы с потенциальными патогенами организмом используется лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми оболочками (MALT - mucosa-associated lymphoid tissue - лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми оболочками). Слизистые оболочки можно разделить на два типа: первый тип характеризуется тем, что эпителий однослойный, присутствует MALT и нет клеток Лангерганса. Главный защитный механизм на слизистых оболочках I типа связан с IgA. Для второго типа характерны многослойный неороговевающий эпителий, наличие клеток Лангерганса и отсутствие MALT. Можно выделить главную функцию слизистой оболочки II типа - обеспечение физического барьера.

Среди лимфоидных образований слизистой оболочки выделяют:

Верхние отделы женского репродуктивного тракта (фаллопиевы трубы, матка) покрыты слизистыми оболочками I типа и предназначены для развития плода, тогда как нижние его отделы (цервикальный канал, влагалище) содержат слизистые оболочки II типа и участвуют в непосредственной защите от патогенов и в процессе родов.

На поверхности ряда слизистых оболочек располагается лишь один слой эпителиоцитов. В кишечнике это однослойный цилиндрический эпителий, бокаловидные секреторные клетки и М-клетки (мембранные эпителиальные клетки), располагающиеся в слое эпителиоцитов, покрывающие лимфоидные скопления. М-клетки наиболее уязвимы для проникновения многих патогенных микроорганизмов из-за целого ряда особенностей: наличия специфических рецепторов для некоторых микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, патогенных эшерихий и др.), которые не обнаружены на соседних энтероцитах; истонченного слизистого слоя; способности к эндоцитозу и пипоцитозу, благодаря чему обеспечивается облегченный транспорт антигенов и микроорганизмов из кишечной трубки в мукозоассоциированную лимфоидную ткань (см. гл. 10); отсутствия мощного лизосомального аппарата, характерного для макрофагов и нейтрофилов, благодаря чему бактерии и вирусы перемещаются в субэпителиальное пространство без разрушения. М-клетки относятся к эволюционно сформировавшейся системе облегченного транспорта антигенов к иммунокомпетентным клеткам, а бактерии и вирусы используют этот путь для своей транслокации через эпителиальный барьер.

Аналогичные М-клеткам кишечника эпителиоциты, ассоциированные с лимфоидной тканью, имеются у слизистых оболочек бронхоаль-веолярного дерева, носоглотки, половой системы.

Колонизационная резистентность покровного эпителия. Любой инфекционный процесс начинается с адгезии возбудителя на поверхности чувствительных эпителиоцитов (за исключением микроорганизмов, передаваемых через укусы насекомых или вертикально, то есть от матери к плоду). Только закрепившись, микробы приобретают возможность размножиться во входных воротах и образовывать колонию. В колонии накапливаются токсины, ферменты патогенности в количестве, необходимом для преодоления эпителиального барьера. Этот процесс называется «колонизация». Под колонизационной резистентностью понимают устойчивость эпителия кожи и слизистых оболочек к заселению посторонними микроорганизмами. Колонизационную резистентность слизистых оболочек обеспечивает муцин, секретируемый бокаловидными клетками и образующий на поверхности сложноорганизованную биопленку. В этот биослой встроены все защитные инструменты: резидентная микрофлора, бактерицидные вещества (лизоцим, лактоферрин, токсичные метаболиты кислорода, азота и т.д.), секреторные иммуноглобулины, фагоциты. Роль нормальной микрофлоры в создании колонизационной резистентности описана в разделе 4.2.

Важнейшим механизмом участия резидентной микрофлоры в колонизационной резистентности является их способность продуцировать бактериоцины (антибиотикоподобные субстанции), короткоцепочечные жирные кислоты, молочную кислоту, сероводород, перекись водорода. Муцин, наряду с полисахаридами, продуцируемыми резидентными бактериями (в частности, лактобактериями), образует на поверхности слизистых оболочек выраженный гликоналикс (биопленку), который эффективно экранирует сайты адгезии и делает их недоступными для случайных бактерий. Бокаловидные клетки образуют смесь сиало- и сульфомуцинов, соотношение которых различается в разных биотонах. Своеобразие состава микрофлоры в различных экологических нишах в значительной степени определяется количеством и качеством муцина.

Колонизационная резистентность слизистых оболочек усиливается за счет секреторных IgA, синтезируемых мукозоассоциированной лимфоидной тканью. Покровный эпителий мукозального тракта постоянно регенерирует за счет стволовых клеток, расположенных в толще слизистых оболочек. В кишечнике эту функцию выполняют клетки крипт, в которых наряду со стволовыми располагаются клетки Панета - особые клетки, синтезирующие антимикробные пептиды (альфа-дефенсины 5 и 6). Эти белки защищают не только стволовые клетки, но и покровные эпителиоциты. При воспалении в стенке слизистой оболочки продукция этих белков усиливается. Колонизационная резистентность покровного эпителия обеспечивается всей совокупностью защитных механизмов врожденного и приобретенного (секреторные иммуноглобулины) иммунитета и является основой устойчивости организма к большинству микроорганизмов, обитающих во внешней среде. Отсутствие на эпителиоцитах специфических рецепторов для определенных микроорганизмов, по-видимому, считается базовым механизмом генетической резистентности животных одного вида к микробам, патогенным для животных другого вида.

К гуморальным факторам врожденного иммунитета относится целый спектр молекул: белки системы комплемента, антимикробные пептиды (дефенсины, кателицидины), неспецифические IgM, белки острой фазы, белки теплового шока и многие другие. В данном разделе речь пойдет только о некоторых из них.

Система комплемента. Система комплемента - это многокомпонентная полиферментная самособирающаяся система сывороточных белков, которые в норме находятся в неактивном состоянии.

При появлении во внутренней среде микробных продуктов запускается процесс, который называют активацией комплемента (с образованием мембраноатакующего комплекса). Активация протекает по типу каскадной реакции, когда каждый предшествующий компонент системы активирует последующий. В процессе самосборки системы образуются активные продукты распада белков, которые выполняют три важнейшие функции: вызывают перфорацию мембран и лизис клеток, обеспечивают опсонизацию микроорганизмов для их дальнейшего фагоцитоза, инициируют развитие сосудистых реакций воспаления.

Комплемент под названием «алексин» был описан в 1899 г. французским микробиологом Ж. Борде, а затем немецким микробиологом П. Эрлихом, который назвал его «комплемент» (complement - дополнение) - как фактор, дополнительный к антителам, вызывающим лизис клеток. В систему комплемента входит 9 основных белков (обозначаемых как С1, С2-С9), а также субкомпоненты - продукты расщепления этих белков (Clg, С3в, С3а и т.д.), ингибиторы и рецепторы комплемента (CR1, CR2 и др.). Ключевым событием для системы комплемента является его активация. Она может происходить тремя путями: классическим, лектиновым и альтернативным (рис. 8-2).

Биологические эффекты продуктов активации комплемента: вне зависимости от пути активация комплемента завершается образованием мембраноатакующего комплекса и лизисом клеток (бактерий, эритроцитов и других клеток); образующиеся С3а-, С4а- и С5а-компоненты являются анафилотоксинами, они связываются с рецепторами кровяных и тканевых базофилов, индуцируют их дегрануляцию - выброс гистамина, серотонина и других вазоактивных медиаторов (медиаторов воспалительного ответа). Кроме этого, С5а является хемоаттрактантом для фагоцитов, он привлекает эти клетки в очаг воспаления; С3в, С4в являются опсонинами, повышают адгезию иммунных комплексов с мембранами макрофагов, нейтрофилов, эритроцитов и тем самым усиливают фагоцитоз.

Растворимые рецепторы для патогенов. Это белки крови, непосредственно связывающиеся с различными консервативными, повторяющимися углеводными или липидными структурами микробной клетки (puttern -структурами). Эти белки могут выступать в качестве опсонинов, некоторые из них активируют комплемент. Основную часть растворимых рецепторов составляют белки острой фазы. Концентрация этих белков в крови быстро нарастает в ответ на развитие воспаления при инфекции или повреждении тканей.

К белкам острой фазы относятся:

Существует ряд белков, которые можно объединить относительно их антимикробного действия. Одним из таких белков является лизоцим - это фермент муромидаза с молекулярной массой 14 000-16 000 кДа, вызывающий гидролиз муреина (пептидогликана) клеточной стенки бактерий и их лизис. Открыт данный белок в 1909 г. П.Л. Лащенковым, выделен - в 1922 г. А. Флемингом. Известно, что лизоцим содержится во всех биологических жидкостях: сыворотке крови, слюне, слезе, молоке. Он продуцируется нейтрофилами и макрофагами (содержится в их гранулах). Лизоцим в большей степени действует на грамположительные бактерии, основу клеточной стенки которых составляет пептидогликан. Клеточные стенки грамотрицательных бактерий также могут повреждаться лизоцимом, если на них предварительно подействовал мембраноатакующий комплекс системы комплемента.

Антимикробные пептиды. В середине 1980-х годов профессорами R. Lehrer и В.Н. Кокряковым были открыты антимикробные пептиды, которые можно определить как эффекторные молекулы врожденного иммунитета, обладающие прямым противомикробным действием относительно вирусов, бактерий, грибов, простейших и др. Известно, что данная группа пептидов объединена не только по принципу их действия, антимикробные пептиды также имеют небольшую молекулярную массу (от 2 до 10 кДа) и положительный заряд. Также антимикробные пептиды являются сигнальными молекулами, задействованными в процессах репарации и активации клеток иммунной системы. По литературе известно около тысячи представителей антимикробных пептидов, которые секретируются клетками различных организмов: рептилий, амфибий, насекомых, млекопитающих и др. У человека хорошо охарактеризовано два семейства: дефензины и кателицидины.

Дефенсины. Особенность первичной структуры дефенсинов - наличие шести остатков цистеина, участвующих в образовании трех внутримолекулярных дисульфидных мостиков, делающих их устойчивыми к действию протеиназ и стабилизирующих вторичную структуру пептидной молекулы.

У человека определены α- и β-дефенсины. Известно, что α-дефенсины (HNP - human neutrophile protein) продуцируются в основном нейтрофилами и «выбрасываются» в окружающую среду путем де-грануляции нейтрофилов. При стимуляции HNP1-4 могут вырабатываться моноцитами и Т-лимфоцитами. HD-5 и HD-6 вырабатываются клетками Панета в криптах кишечника и участвуют в защите слизистых оболочек от энтеробактерий и энтеровирусов. β-Дефенсины (HBD - human β-defensin) в основном продуцируются клетками эпителия. Причем некоторые дефенсины могут вырабатываться на постоянном уровне (HBD-1) - конститутивно, а другие - только после действия какого-то патогена - индуцибельно.

Другое семейство катионных противомикробных пептидов - кателицидины - состоят из консервативного N-концевого сигнального пептида и вариабельного С-концевого противомикробного домена. Основные свойства С-концевого домена следующие: противомикробный эффект, способность нейтрализовать ЛПС бактерий, активировать хемотаксис фагоцитов и других клеток. У человека наиболее распространен кателицидин LL-37, который продуцируется нейтрофилами, эпителиальными клетками, кератиноцитами, моноцитами и др.

Антимикробные пептиды являются одними из основных компонентов защиты слизистых оболочек и кожи от патогенных микроорганизмов. Механизм действия антимикробных пептидов основан на различиях между микробной клеткой и клетками млекопитающих. В состав мембран эукариот могут входить холестерин и другие компоненты, не несущие на себе электростатического заряда. У прокариот можно обнаружить в большом количестве отрицательно заряженные гидроксилированные фосфолипиды. Так, трансмембранный потенциал клеток млекопитающих составляет от -90 до -110 мВ, у бактериальных клеток он находится в пределах от -130 до -150 мВ. Соответственно, антимикробные пептиды, которые по природе своей несут положительный заряд, будут связываться с мембранами бактерий и нарушать их целостность. Известны и другие пути действия антимикробных пептидов на бактериальные и вирусинфицированные клетки.

Среди гуморальных факторов иммунитета, в частности врожденного, центральное место занимают цитокины. Известно, что цитоки-ны - это гликозилированные полипептиды с молекулярной массой порядка 25 кD, которые являются универсальными регуляторами. Они участвуют в регуляции дифференцировки, пролиферации, функциональной активации, апоптоза и других процессов. Цитокины могут вырабатываться широким спектром клеток: лимфоцитами, клетками макрофагально-моноцитарного звена, клетками, которые не относятся к иммунной системе (клетки эпителия, эндотелия и др.). Цитокины можно классифицировать на провоспалительные (ИЛ-1, 6, 8, ФНО-α) и противовоспалительные [ИЛ-4, -10, трансформирующий фактор роста (ТФР) β].

Ниже представлена классификация цитокинов по их функциональной активности (табл. 8-3).

Цитокины могут действовать на разные мишени: на клетку, которая их же и продуцировала, - аутокринное действие; на соседнюю клетку - паракринное действие; на клетку, которая располагается относительно далеко (необходим транспорт цитокина через кровь), - эндокринное действие. Цитокины между собой могут работать по принципу сети. Взаимодействие между цитокинами может происходить по следующим вариантам: агонизм - цитокины вызывают одинаковый эффект; антагонизм - действие цитокинов направлено на ингибирование действия других цитокинов; каскадность - цитокины активируют продукцию других цитокинов. Цитокины взаимодействуют с клеткой через специальные рецепторы. Среди цитокиновых рецепторов существуют различные семейства, которые отличаются не только по цитокину, но и по строению. Цитокины являются универсальными регуляторами и принимают участие во многих иммунных процессах, о которых речь пойдет в последующих разделах.

Примечание. NKT - естественные киллеры Т-лимфоциты; Г-КСФ - гранулоцит-колониестимулирующий фактор; ГМ-КСФ - гранулоцит-моноцит-колониестимулирующий фактор.

Особое место в противовирусном врожденном иммунитете занимают интерфероны. ИФН был открыт в 1957 г. А. Айзексом и Ж. Лин-деманом при изучении интерференции вирусов (от лат. inter - между, ferens - несущий).

Интерференция - это явление, когда ткани, инфицированные одним вирусом, становятся устойчивыми к заражению другим вирусом. Было установлено, что такая резистентность связана с продукцией зараженными клетками особого белка, который и был назван интерфероном. В настоящее время ИФН хорошо изучены. В зависимости от источника получения эти белки делят на ИФН I и II типа.

Первый тип включает ИФН-α и -β, которые продуцируются инфицированными вирусом клетками: ИФН-α - лейкоцитами, ИФН-β - фибробластами. В последние годы описаны три новых ИФН:

В противовирусной защите участвуют ИФН-α и -β.

Механизм действия ИФН-α не связан с прямым влиянием на вирусы. Он обусловлен активацией в клетке ряда генов, блокирующих репродукцию вируса. Ключевое звено - индукция синтеза протеинкиназы R, которая нарушает трансляцию вирусной мРНК и запускает апоптоз зараженных клеток через Вс1-2 и каспазазависимые реакции. Другой механизм - это активация латентной РНК-эндонуклеазы, которая вызывает деструкцию вирусной нуклеиновой кислоты.

Второй тип включает ИФН-γ. Он продуцируется Т-лимфоцитами и естественными киллерами после антигенной стимуляции. ИФН синтезируется клетками постоянно, его концентрация в крови в норме мало меняется. Однако продукция ИФН усиливается при заражении клеток вирусами или действии его индукторов - интерфероногенов (вирусной РНК, ДНК, сложных полимеров).

В настоящее время интерфероны (как лейкоцитарные, так и рекомбинантные) и интерфероногены широко применяются в клинической практике для профилактики и лечения острых вирусных инфекций (грипп), а также в терапевтических целях при хронических вирусных инфекциях (гепатиты В, С, герпес, рассеянный склероз и др.). Поскольку ИФН обладают не только противовирусной, но и противоопухолевой активностью, они применяются также для лечения онкологических заболеваний.

В реакциях врожденного иммунитета, помимо гуморальных факторов, значительную роль играют и клеточные. Известно, что на клетках врожденного иммунитета присутствует широкий спектр рецепторов. Основными распознающими структурами врожденного иммунитета являются паттернраспознающие рецепторы, которые можно объединить в следующие группы.

В настоящее время у человека открыто 10 toll-подобных рецепторов. Каждый рецептор различается по специфичности к разным лигандам. Отдельные TLR отвечают на ограниченное число лигандов, тогда как все семейство TLR может отвечать на широкий спектр протеинов бактерий, вирусов, грибов и паразитов (табл. 8-4).

Следует отметить, что лигандами эндосомальных рецепторов (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) в основном являются нуклеиновые кислоты, характерные для патогенов (двухцепочечная ДНК вирусов, одноцепочечная РНК, неметилированные CpG-повторы ДНК бактерий и вирусов).

TLR распознают не только структуры микробных клеток и вирионов, но и эндогенные молекулы, вырабатываемые при повреждениях ткани и травмах. TLR4 может быть активирован фибронектином, который несет дополнительный домен А. Белки теплового шока 70 и 60 (Hsр70 и Hsр60) увеличивают продукцию провоспалительных цитокинов при действии на TLR4 и TLR2. Биологический смысл активации механизмов врожденного иммунитета эндогенными молекулами до конца не выяснен. Логично предположить, что подобный механизм обеспечивает выведение из организма модифицированных молекул и поддержание антигенного гомеостаза организма.

Активация toll-подобных рецепторов приводит к запуску сигнальных каскадов, завершающихся активацией транскрипционных факторов (NF-κB, AP-1, IRF и др.) (рис. 8-3). Общим для всех TLR адаптером является белок MyD88 (myeloid differentiation factor 88). В настоящее время существует огромное количество вариантов путей трансдук-ции сигнала с TLRs. Рассмотрим два основных: MyD88-зависимый и MyD88-независимый. MyD88-зависимый путь приводит к продукции ФНО-α, ИЛ-1, -6 и -8, а также противомикробных пептидов, а MyD88-независимый - к активации транскрипционного фактора IRF-3/7 (IFN regulatory factor) и экспрессии ИФН I типа (ИФН-α и -β).

TLRs экспрессируются практически на всех клетках врожденного иммунитета, а также на других клетках (эпителиальных и др.). Уровень экспрессии TLRs может изменяться под действием различных факторов, таких как цитокины, в ответ на микробную инвазию и другие факторы. Так, Mycobacterium avium вызывает увеличение экспрессии мРНК TLR2 и снижение экспрессии мРНК TLR4 макрофагами. Под действием H. influenzae происходят TLR2-опосредованная активация NF-κB и повышение экспрессии TLR2 на поверхности эпителиальных клеток. Вирусная инфекция приводит к увеличению уровня экспрессии TLR1-3 и TLR7 в макрофагах. При этом экспрессия TLRs снижается при обработке клеток анти-ИФН-α/-β антителами, что указывает на участие ИФН I типа в регуляции экспрессии TLRs. Показано, что под действием ЛПС происходит увеличение экспрессии TLR2 на поверхности макрофагов.

В механизмах врожденного иммунитета участвуют следующие клетки: макрофаги, нейтрофилы, естественные киллеры, дендритные клетки, базофилы, В1-лимфоциты и др., а также вспомогательные клетки врожденного иммунитета, которые не являются иммунными, но участвуют в реакциях - клетки эпителия, эндотелия и др.

Нейтрофилы и макрофаги. В процессе эволюции в организме многоклеточных сформировались специализированные клетки, основной функцией которых является фагоцитоз (от греч. phagos - пожираю, cytos - клетка) - поглощение частиц диаметром не менее 0,1 мкм (в отличие от пиноцитоза - поглощения частиц меньшего диаметра и макромолекул) и уничтожение захваченных микробов. Такими свойствами обладают полиморфноядерные лейкоциты (в основном нейтрофилы) и мононуклеарные фагоциты/макрофаги (эти клетки иногда называют профессиональными фагоцитами).

Впервые идея о защитной роли подвижных клеток (микро- и макрофагов) была сформулирована в 1883 г. И.И. Мечниковым, который за создание клеточно-гуморальной теории иммунитета (в соавторстве с П. Эрлихом) был удостоен в 1909 г. Нобелевской премии. Нейтрофилы и макрофаги имеют общее миелоидное происхождение из стволовой кроветворной клетки. Однако эти клетки различаются рядом свойств.

Нейтрофилы (полиморфноядерные лейкоциты) - наиболее многочисленная (60-75% общего количества лейкоцитов) и подвижная популяция фагоцитов, дифференцировка которых проходит в костном мозге. Нейтрофилы - короткоживущие клетки, продолжительность их жизни около 15 сут. Из костного мозга они выходят в кровоток уже зрелыми клетками, утратившими способность к дифференцированию и пролиферации. Из крови нейтрофилы перемещаются в ткани, в которых они либо гибнут, либо выходят на поверхность слизистых оболочек, где и заканчивают свой жизненный цикл. Нейтрофилы осуществляют свою киллерную функцию посредством двух основных механизмов: внеклеточный киллинг (или внешний цитолиз) с участием контактных взаимодействий и секретируемых из гранул эффекторных молекул («респираторный взрыв») и фагоцитоз. В гранулах нейтрофилов содержатся эффекторные молекулы:

Также есть везикулы, которые содержат противомикробные пептиды - дефензины. Транспорт нейтрофилов и других клеток врожденного иммунитета осуществляется путем «роллинга» (рис. 8-4).

Мононуклеарные фагоциты представлены промоноцитами костного мозга, моноцитами крови и тканевыми макрофагами. Моноциты, в отличие от нейтрофилов, - незрелые клетки, которые, попадая в кровяное русло и далее в ткани, созревают в тканевые макрофаги (плевральные и перитонеальные, купферовские клетки печени, альвеолярные, интердигитальные клетки лимфатических узлов, костного мозга, остеокласты, микроглиоциты, мезангиальные клетки почек, сертолиевы клетки яичек, клетки Лангерганса и Гринстейна кожи). Продолжительность жизни мононуклеарных фагоцитов от 40 до 60 сут. Макрофаги функционируют во всех тканях и, в отличие от нейтрофилов, имеют необходимость в столь срочной мобилизации. Важной особенностью нейтрофилов и макрофагов является наличие в их цитоплазме большого количества лизосом - гранул размером 200-500 нм, содержащих различные ферменты, бактерицидные и биологически активные продукты (лизоцим, миелопероксидаза, дефензины, бактерицидный протеин, лактоферрин, протеиназы, катепсины, коллагеназа и т.д.). Благодаря столь разнообразному «вооружению» фагоциты обладают мощным деструктивным и регуляторным потенциалом.

Наряду с фагоцитозом эти клетки выделяют наружу продукты, содержащиеся в их лизосомах (лизоцим, пероксидаза, лактоферрин, дефанзины, токсичные метаболиты кислорода, азота), которые повышают антимикробные свойства секретов. В основном макрофаги (в меньшей степени нейтрофилы) оснащены богатым арсеналом рецепторов, располагающихся на их цитоплазматической мембране:

Макрофаги также участвуют в фагоцитозе поврежденных и умирающих клеток:

Основной функцией нейтрофилов и макрофагов является фагоцитоз.

Фагоцитоз - это процесс поглощения клеткой частиц или крупных макромолекулярных комплексов. Он складывается из нескольких последовательно протекающих этапов:

После поглощения частицы фагосомы сливаются с лизосомами - образуется фаголизосома, в которой бактерии гибнут под действием бактерицидных продуктов гранул (кислороднезависимая система бактерицидности). Одновременно в клетке усиливается потребление кислорода и глюкозы - развивается так называемый респираторный (окислительный) взрыв, что приводит к образованию токсичных метаболитов кислорода и азота (Н₂ О₂ , супероксиданиона О₂ , гипохлорной кислоты, пироксинитрита), обладающих высокой бактерицидностью (кислородзависимая система бактерицидности). Не все микроорганизмы чувствительны к бактерицидным системам фагоцитов. Гонококки, стрептококки, микобактерии и другие выживают после контакта с фагоцитами, такой фагоцитоз называется «незавершенный». Фагоциты, помимо фагоцитоза, могут осуществлять свои цитотокси-ческие реакции путем экзоцитоза - выделения своих гранул наружу (дегрануляция), таким образом фагоциты осуществляют внеклеточный кил-линг. Нейтрофилы, в отличие от макрофагов, способны образовывать внеклеточные бактерицидные ловушки - в процессе активации клетка выбрасывает наружу нити ДНК, в которых располагаются гранулы с бактерицидными ферментами. Благодаря липкости ДНК бактерии приклеиваются к ловушкам и под действием фермента погибают. Нейтрофилы и макрофаги являются важнейшим звеном врожденного иммунитета, однако их роль в защите от различных микробов неодинакова. Нейтрофи-лы эффективны при инфекциях, вызванных внеклеточными патогенами (гноеродные кокки, энтеробактерии и др.), индуцирующими развитие острого воспалительного ответа. При таких инфекциях эффективна кооперация нейтрофил-комплемент-антитело. Макрофаги защищают от внутриклеточных патогенов (микобактерии, риккетсии, хламидии и др.), вызывающих развитие хронического гранулематозного воспаления, где главную роль играет кооперация макрофаг - Т-лимфоцит.