Микродисбиоз и эндогенные инфекции : руководство для врачей

Впервые термин «microbiota», обозначающий нормальную микро-биоту высших организмов, был опубликован в монографии T. Rosebury «Microorganisms Indigenous to Man» в 1962 г. В настоящее время данное название микроорганизмов - обитателей человеческого организма - полностью принято в современной литературе [1-3]. Микробиота - это эволюционно сложившееся сообщество разнообразных микроорганизмов, населяющих открытые полости организма человека, определяющее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма.

Характеризуя микробиоту, используют термины: «биотоп», «популяция», «микробное сообщество» и «сукцессия» [3]. Под биотопом принято понимать участок слизистой оболочки, кожи или орган макроорганизма с однотипными условиями существования микроорганизмов. Под популяцией подразумевают совокупность особей одного вида, занимающих определенный биотоп и обладающих общим генофондом. Микробным сообществом называют совокупность нескольких популяций различных видов или родов микроорганизмов. Сообщества микроорганизмов образуют биоценоз определенного биотопа и вместе с организмом хозяина формируют постоянные или временные микроэкосистемы. Внутри микроэкосистем популяции и сообщества микроорганизмов образуют свои экологические ниши. Микробные экосистемы слизистых оболочек открытых полостей и кожи человека формируются постепенно, начиная с момента рождения ребенка, и меняются в процессе его роста и развития. Замена на определенном участке среды обитания одних микробных сообществ другими называется «микробная сукцессия».

ЖКТ человека заселяют бактерии и микроскопические грибы, относящиеся к аэробным и анаэробным микроорганизмам, распределяющиеся как вертикально (от ротовой полости до нижних отделов толстой кишки), так и горизонтально (от просвета до различных слоев слизистой оболочки) [4]. При этом наибольшее количество микроорганизмов обнаруживается в просвете толстой кишки человека. Установлено, что масса нормальной микробиоты кишечника взрослого человека составляет 2,5-3,0 кг численностью 10¹⁴ клеток. Подсчитано, что общий геном обнаруживаемых в ЖКТ бактерий, обозначаемый термином «микробиом», составляет 600 000 генов, что в 24 раза превышает размер генома человека, насчитывающего 25 000 функционирующих генов. Ранее предполагали, что микробиота кишечника включает 17 семейств, 45 родов и около 500 видов. Однако в настоящее время эти сведения пересматриваются с учетом данных, согласованных со схемами современной классификации, составленными на основании молекулярно-генетических характеристик микроорганизмов [5].

В соответствии с новой, пока весьма дискутабельной классификацией микроорганизмов, основной состав микробиоты представлен филами Firmicutes, Bacteroitedes и Actinobacteria. Фила Firmicutes состоит из 15 родов: Acetobacter, Bacillus, dostridium, Enterococcus, Eubacterium, Heliobacterium, Heliospirillum, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Mycoplasma, Spiroplasma, Sporomusa, Staphylococcus, Streptococcus. Фила Bacteroitedes включает 7 родов: Bacteroides, Porphyromonas, Chlorobium, Flavobacterium, Chlamydia, Prosthecobacter и Verrucomicrobium. Фила Actinobacteria также представлена 7 родами: Arthrobacter, Bifidobacterium, Corynebacterium, Frankia, Micrococcus, Mycobacterium и Propionibacterium.

При анализе данных, полученных путем секвенирования 13 355 генов 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (РНК) различных микроорганизмов мукозной микробиоты ЖКТ, показано, что она состоит из 395 филогенетически обособленных групп микроорганизмов, из которых 244 (62%) являются новыми [6]. При этом из 244 групп 80%, т.е. 195 групп, представлены ранее неизвестными микроорганизмами, не растущими (не культивируемыми) на питательных средах при выращивании как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Большинство новых бактерий относятся к филам Firmicutes и Bacteroitedes [7].

Характеризуя нормальную микробиоту человека, пользуются терминами: «облигатная микробиота» (резидентная, автохтонная, индигенная, основная) и «факультативная микробиота» (аллохтонная, транзиторная, добавочная, случайная).

По характеру взаимоотношений с макроорганизмами дифференцируют патогенную и непатогенную микробиоту. Если представитель факультативной микробиоты вызвал воспалительный инфекционный процесс, его рассматривают в качестве возбудителя оппортунистической инфекции. Следует отметить, что в зарубежной литературе отсутствует термин «условно-патогенные микроорганизмы», в связи с чем обозначения «оппортунистические» и «условно-патогенные» микроорганизмы использованы как синонимы в соответствии с контекстом.

ПОЗИТИВНАЯ РОЛЬ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА

В настоящее время достаточно хорошо известна важная роль, которую играет микробиота в обеспечении устойчивости слизистых оболочек кишечника при заселении патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [8-10]. Положительные функции микробиоты, ассоциируемые с синтезом симбиотическими бактериями органических кислот, лизоцима, антибиотикоподобных и других антимикробных веществ, ее иммуномодулирующей [11], детоксицирующей, анти-оксидантной, антимутагенной и антиканцерогенной активностью, приведены в табл. 1-1.

НЕГАТИВНЫЕ ФУНКЦИИ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА

Нарушения нормальной микробиоты кишечника характеризуются исчезновением или снижением количества облигатных ее представителей, с одной стороны, и увеличением популяционного уровня условно-патогенных бактерий, отсутствующих или встречающихся в ничтожном количестве в норме, с другой [12]. В итоге такие дисбиозные микробные ассоциации не в состоянии обеспечивать защитные и физиологические функции нормобиоты, осуществляемые в условиях нормобиоценоза кишечника [13].

Изменения количественного содержания и видового состава микро-биоты кишечника, именуемые дисбактериозами, могут возникать при действии самых различных факторов экзогенной и эндогенной природы, включая [14-16]:

Дисбактериоз кишечника возникает на фоне ряда заболеваний и клинических симптомов, при этом формирование дисбиотического состояния может сопровождаться не только нарушением количественного и качественного состава нормальной микробиоты, но и усилением генетического внутривидового и внутриродового обмена между представителями транзиторной нормальной микробиоты. Причиной дисбиоза также может служить заселение биотопа слизистой оболочки кишечника условно-патогенными микроорганизмами, вегетирующими в составе биопленок, образование которых контролируется так называемой QS-системой (Quorum Sensing System) - системой глобальной регуляции, определяющей социальное поведение микроорганизмов [17, 18].

ВОЗРАСТНЫЕ ФАКТОРЫ ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

Изменение структуры нормальной микробиоты ЖКТ человека в значительной степени зависит от его возраста. Для новорожденных имеют значение:

Для грудных детей и детей раннего возраста:

Для детей дошкольного и школьного возраста:

Для юношеского возраста причина дисбиоза:

Для лиц среднего возраста имеют значение профессиональные и другие негативные воздействия. Для лиц пожилого возраста - возрастные изменения свойств микробиоты (уменьшение антиканцерогенных свойств кишечной палочки, увеличение числа штаммов, синтезирующих холестерин, увеличение количества гемолитической микробиоты).

Вне зависимости от возраста значительную роль при развитии дисбактериоза играют различного рода стрессы; дефицит основных макро- и микроэлементов, не соответствующий потребностям организма; нарушение режима питания, набор несоответствующих продуктов, низкое качество продуктов; кишечные инфекции; лечение антибактериальными препаратами; длительная гормонотерапия, лечение нестероидными противовоспалительными средствами; проведение химио- и лучевой терапии у онкологических больных; вариабельные иммуно-дефицитные состояния. Пациенты, у которых выявляются факторы, способствующие развитию дисбактериоза кишечника, и наблюдаются изменения состава микробиоты при отсутствии клинических проявлений, относятся к группе риска развития дисбактериоза и нуждаются в наблюдении и профилактических мероприятиях [19].

Важно отметить, что дисбиозная микробиота ЖКТ может оказывать отрицательное влияние на жизнедеятельность и общее состояние организма [20-22]. Ее патогенный потенциал представлен в табл. 1-2.

При снижении иммунологической реактивности и формировании вариабельного иммунодефицитного состояния возможно попадание в системный кровоток условно-патогенных энтеробактерий, псевдомонад и других грамотрицательных бактерий, клеточная стенка которых содержит липополисахариды (ЛПС) или эндотоксины [23, 24]. В высоких дозах эндотоксин может обусловливать развитие токсико-септического состояния, протекающего с явлениями синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания и эндотоксического шока, характеризующегося высокой летальностью. Эндотоксин, находясь в кровотоке в определенных дозах, может активировать клетки эндотелия, гладких мышц и макрофагов, интимы артерий, которые начинают в избыточном количестве поглощать холестерин из липопротеинов низкой удельной плотности и превращаться в так называемые пенистые клетки. В конечном итоге эти процессы приводят к формированию атеросклеротических бляшек. В связи с этим длительное течение дисбактериоза может стимулировать развитие атеросклероза.

Таким образом, в настоящее время существенно изменились представления о систематике и таксономии нормальной микробиоты кишечника человека, выявлены новые микроорганизмы, пересмотрен видовой состав родов и видов, входящих в таксоны разного уровня. Достаточно полно исследованы основные функции микробиоты: обеспечение колонизационной резистентности; поддержание врожденного иммунитета в активном состоянии; морфокинетическое действие - важная роль, которую играет нормальная микробиота в восстановлении слизистой оболочки кишечника при повреждении; контроль скорости миграции энтероцитов по микроворсинкам; продукция ферментов, участвующих в метаболизме белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот; синтез витаминов, гормоноподобных и белковых антимикробных веществ; участие в водно-солевом обмене; рециркуляция желчных кислот, холестерина и стероидных гормонов. Важное значение имеет антимутагенная активность, которая проявляется в способности к детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов путем биотрансформации с образованием нетоксичных конечных продуктов или соединений, подвергающихся быстрой деградации в печени, а также в ускорении их экскреции в окружающую среду. Одной из наиболее важных функций, возможно, является подавление транслокации представителей факультативной группы нормальной микробиоты и их токсинов из просвета кишечника в лимфу и системный кровоток.

В последнее время выявлены и проанализированы некоторые виды факультативной микробиоты ЖКТ, способные при снижении защитных сил макроорганизма вызвать инфекционный процесс различной локализации. Можно констатировать, что сравнительный анализ информации, полученной в области изучения генетики и молекулярной биологии большинства представителей микробиоты кишечника человека и возбудителей ряда инфекционных процессов, привел к очевидному выводу об общности патогенеза многих заболеваний человека и значительно пополнил наши представления о роли дисбиозной микробиоты в развитии эндогенных инфекций.

Список литературы

Нормальную микробиоту кишечника, которую условно можно подразделить на доминирующую, субдоминирующую и минорную, составляют 15-20 представителей анаэробных и аэробных бактерий основных родов: Bacteroides, Bifidobacterium, Actinobacteria, Eubacterium, Fusobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Escherichia, Veillonella, Streptococcus, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus и др. [1, 2] (табл. 1-3).

ЛАКТОБАКТЕРИИ

Бактерии рода Lactobacillus представляют собой неспорообразую-щие неподвижные грамположительные палочки. Лактобациллы заселяют организм новорожденного еще в раннем постнатальном периоде. Средой обитания являются различные отделы ЖКТ: от ротовой полости до толстой кишки. Присутствуя постоянно в макроорганизме на определенных этапах жизни женщин репродуктивного возраста, они являются превалирующей микробиотой вульвовагинальной зоны.

В желудке лактобациллы содержатся в количестве 10² -10³ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл желудочного сока, в тонкой кишке - до 10³ - 10⁴ КОЕ/мл кишечного сока, в толстой (в зависимости от возраста макроорганизма) - 10⁶ -10⁷ КОЕ/г фекалий, в вагине - 10⁶ -10⁹ КОЕ/мл отделяемого (в зависимости от возраста). Лактобациллы обладают широким спектром и уровнем антагонистической активности в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонистическое воздействие лактобацилл обусловлено продукцией различных антимикробных метаболитов, в первую очередь - молочной кислоты, перекиси водорода, лизоцима, а также специфических антибактериальных субстанций - бактериоцинов (лактоцинов).

Таксономия. Лактобациллы относятся к группе молочнокислых бактерий, насчитывающих 11 родов: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Oenococcus, Carnobacterium и Weissella. Основным свойством молочнокислых бактерий, по которому их объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов, является способность образовывать в качестве главного продукта брожения молочную кислоту. Представители рода Lactobacillus включают в настоящее время 120 видов. Из слюны и десен ротовой полости 15 здоровых волонтеров и 20 больных хроническим периодонтитом было выделено 238 культур лактобацилл и с помощью рестрикционного анализа амплифицированной рибосо-мальной РНК было идентифицировано 115 штаммов, принадлежавших к 10 видам [3]. Превалирующими штаммами у здоровых лиц были L. gasseri и L. fermentum, а у больных хроническим периодонтитом преобладали L. plantarum. Среди тестируемых лактобацилл 69% инги-бировали бактерии видов Streptococcus mutans, 88% - Actinobacillus, 82% - Porphyromonas gingivalis и 65% - Prevotella intermedia. Штаммы L. paracasei, L. plantarum, L. rhamnosus и L. salivarius, выделенные от здоровых лиц, обладали более высокой антимикробной активностью в отношении S. mutans в сравнении со штаммами, изолированными от больных хроническим периодонтитом [4]. При секвенировании генов 16S рибосомальной РНК 129 культур Lactobacillus, изолированных из мукозного слоя слизистой оболочки желудка, были открыты новые виды, получившие обозначения как L. gastricus, L. antri, L. kalixensis и L. ultunensis [5]. При уточнении видового состава лактобацилл, наиболее часто выделяемых из вагинального содержимого здоровых женщин в пременопаузе, показано доминирование L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus, L. fermentum. и L. plantarum [6]. В то же время при секвенировании генов 16S рибосомальной РНК 35 штаммов, выделенных от женщин из 7 различных стран мира, выявлено доминирование видов L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri, реже встречались L. vaginalis, L. fermentum, L. mucose, L. paracasei и L. rhamnosus [7]. В настоящее время бактерии вида L. paracasei реклассифицированы в новый вид L. zeae.

Лактобациллы чрезвычайно разнообразны по форме и размерам: от коротких до длинных нитевидных палочек (рис. 1-1). Чаще всего на электронограммах клетки лактобацилл имеют правильную палочковидную форму, располагаются поодиночке, парами или в коротких цепочках. Средние размеры клеток лактобацилл составляют 0,5-1,2x1,0-10 мкм. Так, палочки L. acidophilus при выращивании в жидкой питательной среде - крупные прямые с закругленными концами. Клетки L. casei имеют форму коротких, тонких, иногда слегка извитых, расположенных парами или короткими цепочками палочек.

Ультраструктурная организация клеток лактобацилл идентична другим грамположительным бактериям. Цитоплазма клеток заполнена белково-рибосомальным комплексом, в ней хорошо различимы дискретные структуры рибосом, диаметр которых составляет около 20 нм. В области нуклеоида расположены грубофибриллярные нити дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) толщиной приблизительно 2 нм. Толщина находящейся под клеточной стенкой трехслойной цитоплаз-матической мембраны составляет 7-8 нм. Клеточная стенка лактоба-цилл представляет собой относительно гомогенный или гетерогенный электронно-плотный слой толщиной от 15 до 60 мкм.

На ультратонких срезах клеток различных видов лактобацилл обнаружены обширные инвагинации цитоплазматических мембран внутрь клетки - внутрицитоплазматические мембранные структуры мезосомального типа. Интенсивно развитые внутрицитоплазматические мембранные структуры представляют собой плотно прилежащие друг к другу ряды трубок, которые располагаются вдоль и поперек плоскостей срезов бактерий.

Процесс синтеза лактобациллами бактериоцинов сопровождается появлением внутри клеток и в межклеточном пространстве характерных глобул размером 40-50 нм, которые, по-видимому, являются фрагментами разрушающейся цитоплазмы.

Метаболическая активность. В процессе метаболизма лактобациллы способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим и антибиотикоподобные вещества, представленные различными типами бактериоцинов [8, 9]. Молекулярная масса известных бактериоцинов лактобацилл колеблется от 10³ до 10⁶ кДа. Термостабильность бактериоцинов варьирует в зависимости от степени их очистки, величины pH, ионной силы и конформации белковой составляющей.

Поражающее действие бактериоцинов на клетки-мишени условно-патогенных микроорганизмов представлены на рис. 1.2: Proteus mira bilis, Klebsiella pneumoniae и Citrobacter freundii и спорообразующие бактерии Bacillus subtilis [10].

При смешивании суспензии лактобацилл с бифидобактериями и лактококками между клетками, как правило, наблюдается возникновение тесных межклеточных контактов (рис. 1-3).

Известно, что в процессе жизнедеятельности лактобациллы вступают в сложные симбиотические или антагонистические взаимоотношения с другими микроорганизмами [11]. Проявляя антагонистическую активность, они губительно воздействуют на факультативную микробиоту, способную стать причиной развития оппортунистических инфекций. Лактобациллы и бифидобактерии являются одними из наиболее хорошо изученных симбиотических микроорганизмов, о которых известно, что они необходимы для обеспечения толерантности к пищевым аллергенам и устойчивости слизистых оболочек кишечника к колонизации патогенами.

БИФИДОБАКТЕРИИ

Представители рода Bifidobacterium являются наиболее важным компонентом нормальной микробиоты ЖКТ человека как по представительству в составе микробиоценозов, так и по полифункциональной роли в поддержании функционального постоянства макроорганизма. Большая часть бифидобактерий находится в толстой кишке, составляя у детей более 90% всех микроорганизмов. В норме количество бифидо-бактерий у грудных детей составляет 10¹⁰ -10¹¹ КОЕ/г, у детей старшего возраста и у взрослых - 10⁹ -10¹⁰ КОЕ/г. Многочисленные исследования видового пейзажа микробиоты здоровых детей и взрослых позволили выявить наиболее часто присутствующие в микробиоценозах кишечника виды бифидобактерий, а также продемонстрировали различия в спектре видов и в их количественном составе у лиц, относящихся к различным возрастным группам.

Таксономия. Род включает 32 вида. Типовой вид - Bifidobacterium bifidum. Идентификация видов бифидобактерий считается проблематичной вследствие их фенотипической и генотипической гетерогенности [12]. Наиболее часто в ЖКТ человека выявляют: B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve, B. infantis, B. animalis, В. eatenulatum, B. pseudocatenulatum и др. Бактерии B. animalis и B. lactis объединены в один вид с подвидами - B. animalis subsp. lactis и B. animalis subsp. animalis [13]. Японскими исследователями для характеристики бифидобактерий использована полимеразная цепная реакция (ПЦР) с видоспецифическими праймерами для генов 16S рибосомальной РНК, выявляющих нуклеотидные последовательности, консервативные для 10 видов бифидобактерий: В. longum, B. infantis, B. dentium, В. gallicum, В. adoslescentis, B.angulatum, B. bifidum, В. breve, В. eatenulatum и B. pseudocatenulatum. Был изучен видовой состав бифидобактерий, содержащихся в экстрактах фекалий, полученных от 27 грудных младенцев и 48 здоровых взрослых. У взрослых наиболее часто регистрировали в пробах В. eatenulatum (92%), затем следовали В. longum и В. adoslescentis, в то время как у детей - В. breve, В. infantis и В. longum [14]. В РФ с помощью ПЦР была проведена идентификация 77 изолятов бифидобактерий, выделенных из фекалий 28 детей раннего возраста. Удалось идентифицировать 63 изолята, из которых 28 (44,4%) были представлены B. longum, 23 (36,6%) - B. bifidum, 6 (9,5%) - B. catenulatum, 5 (7,9%) - B. breve и 1 (1,6%) - B. dentium. Виды B. infantis, B. adolescentis и B. angulatum не обнаружены [15].

При исследовании 70 штаммов бифидобактерий, выделенных при зубном кариесе, выявлены B. dentium и два новых вида бифидобактерий. Морфологические характеристики, биохимические свойства, потребности в питательных субстратах, электрофоретические спектры белков, данные гибридизации ДНК и содержания Г+Ц-пар оснований ДНК этих микроорганизмов показали, что две группы штаммов принадлежат к новым видам бифидобактерий, обозначенных как B. inopinatum и B. denticolens [16].

Морфология. Плеоморфные грамположительные некислотоустойчивые палочки, 0,5-1,3x1,5-8 мкм. Могут быть короткими, правильной формы, тонкими с утолщенными булавовидными концами, шарообразными почти правильной формы, а также удлиненными клетками, часто окруженными фимбриями. Расположение клеток поодиночке, парами, V-образное, иногда в виде цепочек или розеток. Неспорообразующие, неподвижные бактерии. По строению пептидогликана клеточной стенки наиболее близки к таким грамположительным представителям микробиоты, как лактобациллы (рис. 1-4).

Культуральные свойства. Бифидобактерии относятся к анаэробным микроорганизмам, неспособным расти на поверхности питательных сред в присутствии кислорода. Могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10% СО₂ . Оптимальная температура для роста - 37-41 °С, минимальная - 25-28 °С, максимальная - 43-45 °С. Оптимальные значения рН составляют 6,5-7,0. Хемоорганотрофы ферментируют углеводы с образованием уксусной кислоты (C2) и молочной кислоты с выделением СО₂ . Для роста на питательных средах нуждаются в добавлении витаминов, в частности С. Каталазоотрицательные, в редких случаях (например, при росте в атмосфере воздуха с добавлением СО₂ ) - каталазоположительные. Идентификация бифидобактерий до вида требует применения специальных методов, создающих условия анаэробиоза, при которых исследуют особенности их метаболических реакций.

ЛАКТОКОККИ

Таксономия. Род Lactococcus включает пять видов: L. lactis, L. garvieae, L. piscium, L. plantarum и L. raffionolactis. В последние годы лактокок-ки интенсивно исследуют в связи с их способностью продуцировать антибиотикоподобные вещества - лантибиотики. Низин, например, широко используют в пищевой промышленности в качестве консерванта. Лактококки часто обнаруживают в кисломолочных и растительных продуктах (сметана, йогурт), с которыми они попадают в ЖКТ человека.

Морфология. Представители рода Lactococcus - грамположительные кокки, единичные, парные, в виде небольших скоплений или цепочек (рис. 1-5). При выращивании на плотной питательной среде в большей степени выражен полиморфизм, проявляющийся в образовании круглых или частично вытянутых клеток, варьирующих по размерам: от карликовых до гигантских, даже в одной паре или цепочке. Спор и капсул не образуют. Жгутиков не имеют.

Биохимические свойства. Под действием ферментов лактококков из белков молока освобождаются биоактивные олигопептиды, содержащие казоморфины, казокинины и иммунопептиды. Биоактивные пептиды являются модуляторами самых разных процессов в организме:

Пептиды взаимодействуют с рецепторами на слизистой оболочке кишечника. Лактококки способны синтезировать антибиотикоподобные вещества - лактоцины, образующие поры в атакуемых ими клетках-мишениях.

В пищевой промышленности широкое применение нашел препарат низин, полученный на основе лактоцина L. lactis. В медицинской практике используется препарат томицид, выпускаемый на основе культуральной жидкости лактококков, продуцирующих бактериоцино-подобные вещества.

ЭНТЕРОКОККИ

Таксономия. Бактерии рода Enterococcus, ранее относимые к стрептококкам группы D, включают виды Е. faecalis, Е. faecium, E. flavescens, E. solitarius, Е. avium, E. pseudoavium, Е. casseliflavus, Е. gallinarum, Е. raffinosus, Е. hirae, Е. malodoratus и Е. mundtii. В клиническом материале от человека встречаются в основном Е. faecalis и Е. faecium, другие виды обнаруживают значительно реже [17]. Частота встречаемости и распространение энтерококков различных видов представлены в работе [18].

Бактерии вида E. faecalis наиболее часто выделяют из кишечника человека, а также из кишечника домашних птиц, крупного рогатого скота, свиней, собак, лошадей, овец и коз; E. faecium выявляют в клинических пробах от людей, в кишечнике различных животных, по распространению они занимают второе место после E. faecals; E. avium часто обнаруживают в кишечнике птиц, собак, человека по признаку образования H₂ S; E. durans - редкий клинический изолят, его обнаруживают в основном в молоке и молочных продуктах; E. casseliflavus выявлен на растениях и в почве, реже в испражнениях цыплят, они продуцируют желтый пигмент, подвижны, часто их высевают при оппортунистических инфекциях человека; E. gallinarum представлен подвижными клетками, его обнаруживают в испражнениях цыплят и при инфекциях людей, подвергавшихся гемодиализу; E. raffinosus выделяют из крови, мочи и абсцессов при инфекциях человека, они способны продуцировать кислоту из раффинозы; E. dispar обнаруживают в испражнениях и синовиальной жидкости человека; E. flavescens изолирован из крови человека, абсцессов и гнойного отделяемого у больных остеомиелитом, для них характерно наличие подвижных клеток, образующих желтый пигмент [18].

У новорожденных энтерококки выявляют из испражнений уже в первые дни жизни. В последующем у детей, находящихся на грудном вскармливании, их уровень колеблется от 10⁶ до 10⁷ КОЕ/г. У детей на искусственном вскармливании количество энтерококков может составлять 10⁸ -10⁹ КОЕ/г. Популяционный уровень энтерококков в кишечнике здорового человека остается стабильным, достигая 10⁷ 10⁸ КОЕ/г испражнений. Энтерококкам отводится существенная роль в стимуляции гуморального и клеточного иммунитета и поддержании колонизационной резистентности слизистых оболочек кишечника. В норме количество энтерококков в кишечнике не должно превышать общего количества кишечных палочек. Энтерококки осуществляют метаболизм бродильного типа, ферментируют разнообразные углеводы с образованием в основном молочной кислоты, но не газа, снижая рН до 4,2-4,6. В некоторых случаях восстанавливают нитраты, обычно энтерококки лактозопозитивные.

Морфологические и физиологические свойства. В мазках, приготовленных из бульонной культуры, энтерококки - грамположительные кокки, единичные, парные, в виде небольших скоплений или цепочек.

При выращивании на плотной питательной среде поверхность колонии энтерококков представлена в виде компактно расположенных клеток овальной формы. При выращивании в жидкой питательной среде в большей степени выражен полиморфизм, проявляющийся в образовании круглых или частично вытянутых клеток, размеры которых могут варьировать в одной и той же паре или цепочке. Спор и капсул не образуют. Очень редко встречаются подвижные энтерококки с 1-4 жгутиками.

На ультратонких срезах E. faecalis четко выявляются зона нуклеоида, содержащая нити ДНК; белково-рибосомальный комплекс, насыщенный рибосомами; клеточная стенка состоит из гомогенного пептидо-гликанового слоя (рис. 1-6).

Энтерококки - факультативные анаэробы, оптимальная температура культивирования 35-37 °С. Клетки некоторых штаммов Е. faecalis проявляют β-гемолитические свойства на агаре, содержащем кровь кролика, лошади или человека, но оказываются негемолитическими на агаровой среде с кровью барана. На кровяном агаре колонии энтерококков мелкие, кремовые или белые, гладкие с ровным краем, различающиеся по типу гемолиза. Почти все штаммы гомоферментативные, газ не образуют, конечный продукт ферментации глюкозы и некоторых других углеводов - молочная кислота. Представители отдельных видов энтерококков разжижают желатин. У энтерококков резко выражены редуцирующие свойства, они обесцвечивают лакмус и метиленовый синий в молоке, восстанавливают нитраты в нитриты.

Устойчивость к факторам внешней среды. Энтерококки высокорезистентны к различным факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам, могут длительное время сохранять жизнеспособность на предметах домашнего обихода, в течение нескольких месяцев - на агаризованной питательной среде, выдерживают нагревание до 60 °С в течение 30 мин. Замороженные при -70 °С культуры энтерококков хранятся несколько лет, а лиофилизированные - неограниченное время. У энтерококков выявлена природная резистентность к β-лактамным антибиотикам и аминогликозидам. Клинические изоляты, особенно внутрибольничные, обладают естественной или приобретенной резистентностью ко многим классам антибиотиков, включая ванкомицин.

Антигенная структура. Большинство видов рода Enterococcus по классификации Р. Лэнсфилда относятся к серогруппе D. Липотейхоевая кислота, входящая в состав клеточной стенки энтерококков, являясь одним из факторов адгезии, индуцирует образование фактора некроза опухоли (ФНО)-α и γ-интерферона, влияющих на иммунный ответ. Известно, что некоторые штаммы Е. faecalis могут продуцировать бактериоцины. Например, кодируемый плазмидой бактериоцин AS-48 проявляет литическую активность по отношению к широкому спектру грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Факторы патогенности клинических штаммов Е. faecalis и Е. faecium: Esp, Asa1 и EfaA - поверхностные белки, участвующие в процессе адгезии и инвазии; CylA и CylM - цитолизины; GelE - желатиназа; SprE - сериновая протеиназа и FsrB - феромон. Некоторые штаммы Е. faecalis обладают гиалуронидазной активностью. Энтерококковый цитолизин поражает эритроциты барана и некоторые эукариотические типы клеток, в то время как бактериальный феромон является низкомолекулярным пептидом, способствующим конъюгативной передаче плазмидной ДНК между клетками различных штаммов. Существует предположение, что этот феромон может воздействовать в качестве хемоаттрактанта в отношении нейтрофилов, способствуя усилению воспалительного ответа при развитии инфекционного процесса.

Эпидемиология. Энтерококки широко распространены в природе. Они являются представителями резидентной нормальной микробиоты человека и животных, встречаются в пищевых продуктах, воде, растениях, у животных, птиц и насекомых. У людей, как и у животных, они обитают в кишечнике, женском генитальном тракте, реже в уретре мужчин, могут колонизировать слизистые оболочки полости рта и кожу, особенно в условиях стационаров.

Энтерококки редко вызывают воспалительные процессы у здоровых лиц. Однако при снижении резистентности организма хозяина и особенно при травмах кишечника или мочеполового тракта в результате инструментальных исследований они могут проникать в стерильные в нормальных условиях органы и ткани макроорганизма, вызывая оппортунистические инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, сепсис, подострый септический эндокардит, инфекции желчных путей или абсцессы в брюшной полости. В последние годы растет роль энтерококков как внутригоспитальных патогенов. Они занимают второе место после Escherichia coli, вызывая нозокомиальные инфекции моче-выводящих путей, и третье место после коагулазопозитивных и коагулазоотрицательных стафилококков как причина внутригоспитальной бактериемии.

Патогенез и клинические проявления. Наиболее часто энтерококки вызывают инфекции мочевыводящих путей. Энтерококковая бактериурия обычно встречается у больных с анатомическими отклонениями от нормы или у лиц, подвергшихся инструментальному диагностическому обследованию мочеполового тракта. Энтерококки высевают при циститах, пиелонефритах, простатитах, околопочечных абсцессах. Второе по частоте место занимают раневые инфекции внутрибрюшной или тазовой области. Энтерококковую бактериемию, как правило, отмечают у пожилых людей на фоне ослабленного иммунитета, злокачественных новообразований, после инструментальных обследований кишечника, мочеполового или респираторного трактов, а также у больных иммунодефицитами при продолжительной госпитализации и лечении антибиотиками широкого спектра действия. Эндокардиты встречаются реже, чем бактериемия. По данным разных исследователей, частота энтерококковых эндокардитов составляет от 5 до 20% всех случаев эндокардитов. Энтерококковые абсцессы в брюшной полости могут развиться после операции кесарева сечения (КС), встречаются при эндометритах и острых воспалительных процессах тазовых органов. Редко отмечают энтерококковые инфекции респираторного тракта или центральной нервной системы. Неонатальный энтерококковый сепсис имеет острые ранние проявления и характеризуется лихорадкой, респираторными расстройствами и менингитом.

СТАФИЛОКОККИ

Таксономия. Род Staphylococcus в настоящее время насчитывает около 30 видов. Наиболее часто встречаемые: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. intermedius, S. xylosis, S. sciuri, S. hyicus, S. arlettae, S. auricularis и др. Среди них встречаются условно-патогенные микроорганизмы, обитатели кожи и слизистых оболочек человека и животных, а также возбудители госпитальных инфекций. Дифференциация видов внутри рода основана на исследовании ряда биохимических признаков. Наиболее распространенные виды стафилококков: S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus. Типовым видом рода Staphylococcus является S. aureus.

Распространение и среда обитания. Стафилококки распространены повсеместно. Их главным резервуаром являются кожные покровы и слизистые оболочки человека и животных. S. aureus часто выявляют в составе нормальной микробиоты человека, они способны колонизировать носовые ходы, подмышечные области и складки кожных покровов. Достаточно часто S. aureus высевают у новорожденных в возрасте нескольких дней. В большинстве случаев носительство S. aureus у новорожденных ограничивается несколькими неделями или месяцами. Хроническое носительство чаще характерно для персонала и пациентов медицинских учреждений. Механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя с участков колонизации на травматизированную поверхность.

Морфологические свойства. Стафилококки относят к группе грам-положительных кокков диаметром 0,5-1,5 мкм. Они располагаются обычно в виде гроздьев, чрезвычайно редко парами или короткими цепочками.

Гроздья образуются в результате деления клеток в различных плоскостях. Характерное хаотичное расположение стафилококков в группах позволяет отличать их, например, от энтерококков, которые обычно образуют цепочки. Выявление характера взаимного расположения стафилококков необходимо проводить в культурах, выращенных на мясном бульоне, так как стрептококки, растущие на твердых питательных средах, также могут образовывать гроздьевидные скопления клеток. Стафилококки не имеют жгутиков и пилей, спор не образуют (рис. 1-7).

На поверхности клеточной стенки стафилококков образуется полисахаридная микрокапсула. На электронно-микроскопическом уровне видно, что клетки внутри колонии могут тесно контактировать друг с другом за счет межклеточного матрикса или находиться на значительном расстоянии друг от друга. Колонии S. aureus сверху покрыты защитной поверхностной пленкой.

На ультратонких срезах клеток S. aureus хорошо различима поверхность клеточной стенки, окруженная микрокапсулой. Центральная часть клетки заполнена нуклеоидом, содержащим грубофибриллярные нити ДНК, цитоплазма включает белково-рибосомальный комплекс с частицами рибосом.

На электронограммах видны основные клеточные компоненты S. aureus: микрокапсула, клеточная стенка, мембранные структуры, включающие цитоплазматическую мембрану, а также клеточные перегородки. Толщина клеточной стенки у молодых, только что разделившихся клеток составляет 15-20 нм, у клеток старых культур - около 80 нм. Изнутри к клеточной стенке прилегает трехслойная цитоплазматическая мембрана, толщина которой составляет 7-8 нм.

Культуральные свойства. Стафилококки неприхотливы к составу питательных сред. Могут расти на средах с добавлением 6,5-7% натрия хлорида и 40% бычьей желчи. Оптимальная температура роста 35-37 °С, рН 6,2-8,4. Рост в жидкой питательной среде сопровождается равномерным помутнением, затем выпадает рыхлый осадок. Колонии круглые, диаметром от 2 до 5 мм, с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, пигментированные, окраска колоний меняется от кремовой до желтой.

Биохимические свойства. Факультативные анаэробы. Каталазо-позитивные, восстанавливают нитраты в нитриты, активно гидролизуют белки и жиры, сбраживают в анаэробных условиях глюкозу, глицерин, мальтозу, лактозу, сахарозу, маннит с образованием кислоты без газа. Образуют плазмокоагулазу, фибринолизин, лецитиназу, щелочную фосфатазу, ДНКазу, гиалуронидазу, протеиназу, желатиназу и гемолизин, во многом определяющие их патогенность.

Антигенные свойства. У стафилококков обнаружено более 50 типов антигенов. По специфичности антигены подразделяют на родовые, видовые и типоспецифические. Отдельно выделяют перекрестно-реагирующие антигены, общие с изоантигенами эритроцитов крови, кожи и почек человека, что при развитии стафилококковых инфекций может служить причиной аутоиммунных заболеваний.

Факторы патогенности. Факторами патогенности S. aureus являются микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты и образуемые токсические субстанции.

Микрокапсула. Микрокапсула, находясь на поверхности клеточной стенки S. aureus, представляет собой тесно связанную с клеткой внеклеточную структуру. Микрокапсула, способствуя адгезии, защищает бактерии от комплемент-опосредованного поглощения полиморфно-ядерными фагоцитами.

Клеточная стенка. Главная функция клеточной стенки - сохранение формы и целостности микробной клетки, что возможно при наличии в составе стенки жесткой и в то же время достаточно эластичной структуры. Такой структурой является пептидогликан (муреин). Это сложное макромолекулярное соединение, характерное только для микроорганизмов. На его долю приходится до 60% сухой массы клеточной стенки. Изучение биосинтеза и структуры пептидогликана позволило выяснить механизм действия на стафилококки некоторых литических ферментов и антибиотиков, нарушающих синтез муреина.

Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций: усиливают синтез интерлейкина (ИЛ)-1 макрофагами, активируют систему комплемента и являются мощными хемоаттрактантами для нейтрофилов.

Тейхоевая кислота. Вторым важнейшим компонентом клеточной стенки стафилококков является тейхоевая кислота - водорастворимый полимер, соединенный ковалентными связями с нерастворимым пептидогликаном. Как правило, на долю этих двух компонентов приходится почти вся сухая масса изолированных клеточных стенок. Пептидогликан и тейхоевая кислота являются обязательными компонентами клеточной стенки у стафилококков всех видов. Тейхоевые кислоты запускают каскад системы комплемента по альтернативному пути, активируют адгезию к поверхности эпителия.

Протеин А. Клеточная стенка содержит соединения, обнаруживаемые лишь у некоторых представителей стафилококков. В первую очередь к этим веществам относится характерный для S. aureus протеин А. Как правило, на его долю приходится примерно 6% массы клеточной стенки, но иногда эта цифра возрастает до 30%. Подобно тейхоевой кислоте, протеин А соединен ковалентными связями с пептидогли-каном. Протеин А (агглютиноген А) неспецифически связывает Fc - фрагменты молекул IgG, усиливает активность естественных киллеров.

Ферменты. Ферменты стафилококков проявляют разнонаправленное действие: каталаза защищает бактерии от О₂ -зависимых микробицидных механизмов воздействия фагоцитов и бактерий-антагонистов (представителей нормальной микробиоты); липазы облегчают адгезию и проникновение в ткани; коагулаза вызывает свертывание сыворотки крови, при этом сам фермент не взаимодействует с фибриногеном, а образует тромбиноподобное вещество, взаимодействующее с протромбином. Стафилококки выделяют четыре типа гемолизинов, отличающихся по спектру действия на эритроциты: α-гемолизин (а-токсин - неактивен в отношении эритроцитов человека), β-гемолизин (сфингомиелиназа - оказывает умеренное действие на эритроциты человека), γ-гемолизин (двухкомпонентный комплекс с умеренной активностью в отношении эритроцитов человека), δ-гемолизин (низкомолекулярное соединение, обусловливающее токсичность широкого спектра действия).

Стафилококки способны синтезировать лизоцимоподобные и бактериоциноподобные вещества, разрушающие пептидогликан клеточных стенок бактерий различных видов. На ультратонком срезе видны клетки E. coli, подвергнутые воздействию бактериоцинпродуцирующих клеток S. aureus.

Токсины. Помимо перечисленных выше ферментов, значительный вклад в патогенез поражений, вызываемых стафилококками, вносят токсины. Наибольшее значение имеют: эксфолиатины А и В, обусловливающие развитие синдрома «ошпаренной кожи»; токсин синдрома токсического шока-1, ответственный за развитие специфического симптомокомплекса; лейкоцидин и энтеротоксины A-F, активирующие образование циклического аденозинмонофосфата, что приводит к развитию пищевых интоксикаций.

Наиболее тяжелой формой проявления стафилококковой инфекции является сепсис. Первичными очагами при сепсисе могут быть стафилококковые поражения различной локализации: отит, гайморит, холецистит, нагноения послеоперационных ран и обожженных поверхностей кожи и подкожной клетчатки. Одним из наиболее частых проявлений стафилококковой инфекции является поражение органов дыхания. Описаны также различные стафилококковые поражения почек и мочевыводящих путей: гломерулонефрит, цистит, уретрит. Стафилококковые заболевания ЖКТ проявляются в виде пищевых отравлений, токсической диспепсии у грудных детей, а также острого и хронического энтероколитов. В последнее время нередко регистрируют стафилококковые поражения сердца, которым предшествуют стафилококковые ангины. Стафилококковые перикардиты наблюдаются в большей степени у больных с тяжелым течением пневмонии и сепсиса. Стафилококки могут также вызывать язвенные поражения роговицы, блефароконъюнктивиты и другие заболевания глаз. Серьезную проблему представляют полиантибиотикоустойчивые стафилококки - возбудители внутрибольничных инфекций.

АНАЭРОБНЫЕ КОККИ

Таксономия. Анаэробные кокки подразделяют на две основные группы - грамположительные и грамотрицательные кокки. Первая включает четыре рода: Coprococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, вторая группа - три рода: Acidaminococcus, Megasphaera и Veillonella. Характеристика этих родов приведена ниже.

Группа грамположительных анаэробных кокков

Род Coprococcus - сферические клетки диаметром 0,8-1,5 мкм, иногда имеют овальную форму. Образуют пары или короткие цепочки. Строгие анаэробы. На кровяном агаре формируют мелкие беловатые колонии, иногда со слабым гемолизом. Хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа; углеводы необходимы для роста либо значительно стимулируют рост. Продукты брожения включают бутират, ацетат и газ. Каталазоотрицательные. В анаэробных условиях разлагают фло-роглюцинол на C2 и СО₂ , метаболизируют флавоноиды, рамнетин и кверцетин. Оптимальная температура 37 °С. Характерное место обитания - кишечник человека. Типовой вид C. entactus.

Род Peptococcus представлен одним видом - P. niger. Клетки сферические диаметром 0,3-1,2 мкм, расположенные различным образом: парами, тетрадами, группами или короткими цепочками. Анаэробы. Хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа. Углеводы не разлагают, при разложении пептона образуют Н₂ , как правило, каталазоотрицательные. Индол не образуют, нитрат не восстанавливают.

Оптимальная температура для роста 37 °С. Образуют на кровяном агаре колонии черного цвета. Вегетируют на слизистых оболочках человека; могут быть выделены из клинического материала.

Род Peptostreptococcus - клетки сферические диаметром 0,5-1,2 мкм, иногда овальные; расположены различным образом: парами, тетрадами, группами или цепочками. Анаэробы. Хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа. Пептон разлагают углеводы либо ферментируют слабо, либо не используют. Как правило, каталазоотрицательные, но иногда обнаруживают слабую или псевдокаталазную активность. Отдельные представители образуют индол и восстанавливают нитраты. Оптимальная температура для роста 37 °С. Облигатные представители микробиоценозов слизистых оболочек ротовой полости и кишечного тракта. Могут участвовать в развитии гнойных инфекций. Среди штаммов P. micros выявлено два морфотипа: шероховатый (rough) и гладкий (smooth). Гладкий морфотип, представленный как типовой вариант, образует мелкие куполообразные колонии ярко-белого цвета негемолитические. С помощью масс-спектрометрии внутри рода идентифицированы виды P. anaerobius, P. heliotrinreducens, P. hydrogenalis, P. indolicus, P. lactolyticus, P. magnus, P. micros, P. prevotii и P. tetradius, обладающие сахаролитической активностью. В настоящее время изучение нуклеотидных последовательностей рибосомальной РНК позволило выделить внутри рода только четыре вида: P. hydrogenalis, P. lacrimalis, P. lactolyticus и P. vaginalis. Таксономия всех видов пептострептококков уточняется. Типовой вид P. anaerobius.

Род Ruminococcus - клетки сферические или слегка удлиненные, 0,3-1,5x0,7-1,8 мкм, в парах и цепочках. Могут быть подвижными за счет 1-3 жгутиков. Строгие анаэробы. Хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа, разлагают углеводы с образованием смеси кислот, этанола, СО₂ и Н₂ . Каталазоотрицательные, нитрат не восстанавливают, аммиак из аминокислот не образуют. Растут в диапазоне температур 20-45 °С (оптимум 40 °С). Место обитания - рубец, толстая и слепая кишка млекопитающих. Из фекалий человека выделен новый вид R. hydrogenotrophicus. Типовой вид R. flavefaciens.

Группа грамотрицательных анаэробных кокков

Род Acidaminococcus. Представлен одним видом: A. fermentans. Кокки диаметром 0,6-1,0 мкм, часто овальные или бобовидной формы диплококки. Оптимальная температура роста 30-37 °С. Оптимальный рН 7,0. Метаболизм бродильного типа. Основные источники энергии - аминокислоты, в первую очередь глутамат. Не используют в качестве источника энергии пируват, лактат. При росте на средах с аминокислотами накапливаются C2 и масляная кислота (C4). Выделены из кишечника свиньи и человека. Типовой вид A. fermentans.

Род Megasphaera - кокки диаметром 0,3-2,0 мкм, иногда более крупные, в парах или в цепочках. Растут при 15-40 °С. Метаболизм бродильного типа. Сбраживают фруктозу и лактат. Обнаружены в кишечнике человека, рубце крупного рогатого скота и овец. Типовой вид M. elsclenii.

Род Veillonella - кокки диаметром 0,3-0,5 мкм. Клетки образуют скопления в виде диплококков или коротких цепочек. Оптимальная температура роста 30-37 °С. Оптимальный рН 6,5-8,0. Каталазоотрицательные. Метаболизм бродильного типа. Сбраживают пируват, лактат. Не сбраживают углеводы и многоатомные спирты. Из лактата образуют ацетат, пропионат, СО*2* и Н*2.* Анаэробы, для роста нуждаются в СО₂. Встречаются в ротовой полости, кишечнике и дыхательных путях человека и животных. Типовой вид Veillonella parvula.

Патогенный потенциал анаэробных кокков. Большинство клинических штаммов грамположительных анаэробных кокков относятся к видам Peptostreptococcus micros и Peptostreptococcus magnus, которые при снижении иммунитета могут вызвать развитие оппортунистической инфекции: глубоких абсцессов органов мочеполовой системы, а также полости рта. Бактерии P. micros, являющиеся представителями нормальной микробиоты ротовой полости, могут вызывать развитие периодонтита и поражать корневой канал зуба с развитием болевого синдрома. Описаны случаи выделения P. anaerobius при послеоперационных абсцессах шейного отдела позвоночника. P. vaginalis часто вызывают инфекции органов малого таза женщин по восходящему типу, а также язвы и абсцессы нижних конечностей. При папилломавирусной инфекции и цервикальной неоплазии у женщин резко возрастает частота высева пептострептококков из урогенитального тракта. Пептострептококки могут также быть причиной развития тромбофлебита, эндокардита и перикардита. При гнойном поражении кожи и гидраденитах часто возникает смешанная инфекция, при которой выделяют разные виды пептострептококков.

Продукция гликолитических ферментов и уреазы анаэробными кокками предполагает возможность их участия в патогенезе болезни Крона и язвенном колите, так как гликозидазы разрушают гликопротеины слизистой оболочки кишечника. Уреазу продуцируют Ruminococcus albus, Coprococcus catus, Peptostreptococcus productus и др. Пептококки высевали из перитонеального экссудата у больных с распространенным перитонитом и при субдуральной эмпиеме после хирургического лечения в 4 случаях из 6 наблюдений. Veillonella parvula, вегетирующие на слизистых оболочках полости рта и кишечника, при условии иммунодефицита могут вызвать развитие абсцессов, пневмонии, синуситов и нагноений при ожогах и ранениях. Для анаэробных кокков характерна продукция ферментов, ассоциируемых с их патогенным потенциалом: уреаза, протеазы, гликозидазы (муциназы), цитотоксины. Уреаза, гидролизующая мочевину с образованием токсичных соединений аммиака, играет значительную роль в патогенезе мочевых инфекций. Описаны Fc-связывающие рецепторы, а также различного типа адгезины. Фрагменты клеточных стенок грамположительных кокков Peptostreptococcus и Coprococcus выполняют функцию, аналогичную функции эндотоксинов (индукция синтеза ФНО-α и других провоспалительных цитокинов).

Таким образом, анаэробные кокки при снижении резистентности организма могут транслоцироваться во внутренние органы, вызывая развитие оппортунистических инфекций различной локализации.

Список литературы

В данном разделе дана детальная характеристика оппортунистических бактерий семейства Enterobacteriaceae, включающего род Escherichia, относящийся к группе резидентной нормальной микробио-ты, и бактерий родов Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Erwinia, входящих в состав факультативной группы микробиоты [1]. В этой главе рассмотрены также энтеро-бактерии, относящиеся к виду Yersinia enterocolitica, повсеместно распространенные в окружающей среде, некоторые серогруппы которых, аналогично патогенным вариантам E. coli, являются вирулентными.

РОД ESCHERICHIA

Таксономия. Бактерии рода Escherichia представляют собой гетерогенную группу, включающую симбиотические и патогенные кишечные палочки. Все они различаются по генетическим, биохимическим, серологическим и другим биологическим свойствам. Род Escherichia, помимо E. coli, включает виды E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii и E. vulneris.

Распространение в природе. Средой обитания эшерихий является кишечник людей и животных (большинства птиц, многих пресмыкающихся, рыб и насекомых). С фекалиями эшерихии попадают во внешнюю среду: почву и воду; при нарушении санитарно-гигиенических правил их можно обнаружить также на овощах, фруктах и других пищевых продуктах.

Симбиотические для человека E. coli, относящиеся к резидентной группе кишечных палочек, значительно отличаются по степени антагонистической активности. В кишечнике человека E. coli появляются в первые дни после его рождения и сохраняются на протяжении жизни на уровне 10⁷ -10⁸ КОЕ/г содержимого толстой кишки.

Кишечные палочки осуществляют в организме ряд важнейших функций: способствуют гидролизу лактозы; участвуют в продукции витаминов группы В, фолиевой кислоты и др. Вырабатывают бактериоцины и микроцины с высокой и низкой молекулярной массой соответственно. Микроцины оказывают подавляющее воздействие на рост патогенных шигелл, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек и условно-патогенных бактерий различных таксономических групп. Клеточная стенка кишечных палочек содержит ЛПС, стимулирующий синтез лизоцима, пропионовую кислоту фрагмента комплемента, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, обеспечивая мощное иммуномодулирующее действие за счет активации гуморального и клеточного врожденного иммунитета. Основной экологической нишей эшерихий в здоровом организме являются толстая кишка и дистальные отделы тонкой кишки.

Морфология. E. coli - мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами. Длина клеток - около 2 мкм, ширина - 0,5 мкм.

Клетки - подвижные, несущие перитрихиальные жгутики и пили (фимбрии). Практически все эшерихии, за исключением E. blattae, подвижны за счет 3-7 перитрихиальных жгутиков (рис. 1-8).

У E. coli существует несколько типов пилей, различающихся по антигенным свойствам. Некоторые пили определяют адгезию и колонизацию бактериями клеток эпителия кишечника, связываясь с поверхностными рецепторами гликопротеиновой природы.

Спор и цист кишечные палочки не формируют, капсул не имеют, однако способны образовывать микрокапсулу.

Электронно-микроскопическими методами на ультратонких срезах можно выявить клетки, находящиеся в различном физиологическом состоянии: в физиологически активной форме и в покоящемся (неактивном) состоянии.

Морфологическая интактность структурных компонентов электронно-прозрачных клеток (справа) соответствует представлению об активном характере их метаболизма (физиологически активные клетки). Изменение ультраструктурной организации электронно-плотных клеток свидетельствует о снижении уровня их метаболической активности и переходе в покоящееся или неактивное состояние.

Подробное описание ультраструктурных различий клеток E. coli в физиологически активном и неактивном покоящемся состоянии дано в работе [2].

Обнаружение в микробных популяциях E. coli различных морфологических типов клеток относится к разряду универсальных явлений, поскольку они отмечаются у бактерий разных видов как в условиях периодического культивирования в жидких питательных средах, так и при формировании микробных сообществ на плотных питательных средах.

Морфометрические исследования физиологически активных (электронно-прозрачных) и физиологически неактивных (электронно-плотных) клеток E. coli, проведенные на анализаторе изображения IBAS-I (Германия), подтвердили корректность выявления в микробных популяциях двух морфологических типов клеток, поскольку линейные размеры электронно-прозрачных и электронно-плотных клеток E. coli различались на 39%, а объемные - на 290%.

Разделение микробной популяции по принципу интенсивности окрашивания цитоплазмы (электронно-прозрачные и электронно-плотные клетки), полученное на основании метода позитивного окрашивания, полностью совпадает с результатами электронно-микроскопического анализа клеток E. coli другим методом - ультратонких срезов (рис. 1-9).

Культуральные и биохимические свойства. Эшерихии неприхотливы к составу питательных сред. На плотных средах они образуют выпуклые средней величины колонии, влажные, блестящие, полупрозрачные, круглые с ровным краем (гладкие - S-формы) или более плоские, сухие, со слегка волнистым краем (шероховатые - R-формы). В жидких питательных средах растут диффузно либо дают осадок или пленку на поверхности, иногда образуют кольцо на стенке пробирки.

Температурный оптимум роста - 37 °С, наиболее оптимальные значения pH среды 7,2-7,4. Дифференцирование рода построено на анализе биохимических свойств эшерихий, основными из которых являются способность к ферментации лактозы, утилизации ацетата натрия, образованию индола и неспособность расщеплять цитрат натрия в среде Симмонса.

Антигенная структура. Антигенная структура кишечных палочек имеет сложное строение. Обнаружено множество различных групп антигенов (оболочечные, жгутиковые, фимбриальные, рибосомальные), но для серологической идентификации наибольшее значение имеют О-, К- и Н-антигены. В настоящее время у эшерихий насчитывают более 150 типов О-антигенов, которые, как и у всех энтеробактерий, представлены ЛПС-комплексом. Разнообразие последнего определяет серологический вариант, зависящий от структуры и состава моносахаров в полисахаридном компоненте О-антигена.

Поверхностный К-антиген эшерихий, состоящий из кислых полисахаридов, насчитывает около 100 разновидностей. Разделение К-антигена на L-, A- и В-антигены построено на различии их реакций на нагревание и воздействие некоторых химических веществ. L-антиген термолабилен, т.е. разрушается при нагревании до 100 °С в течение часа; А-антиген термостабилен (не разрушается при нагревании до 100 °С в течение часа) - это истинно капсульный антиген; В-антиген по устойчивости к нагреванию занимает промежуточное положение между L- и А-антигенами. У E. coli известно 83 серологических варианта жгутиковых Н-антигенов белковой природы.

Патогенные варианты E. coli

Патогенные эшерихии подразделяются на две группы: первую, вызывающую развитие острых кишечных инфекций (ОКИ), и вторую, ассоциированную с инфекционными процессами внекишечной локализации.

К первой группе относятся 6 патоваров: энтеропатогенные кишечные палочки, энтероинвазивные, энтеротоксигенные, энтерогеморрагические, энтероагрегативные и диффузно-адгезирующие кишечные палочки - возбудители ОКИ.

Ко второй группе относятся:

Энтеропатогенные кишечные палочки вызывают диарею у детей раннего возраста. Интенсивно размножаясь на слизистой оболочке, энтеропатогенные кишечные палочки выделяют токсины, способствующие отторжению микроворсинок и деструкции мембранных структур эпителиальных клеток. Такой тип размножения патогенных бактерий носит название «умеренная инвазия». Энтеропатогенные кишечные палочки не способны проникать за пределы пищеварительного тракта и при развитии ОКИ обусловливают нарушение водно-солевого баланса, сопровождающееся эксикозом и токсикозом.

Энтеротоксигенные кишечные палочки способны вызывать диарею, секретируя термолабильный (LT) и/или термостабильный (ST) энтеротоксины. Цитотоксический холероподобный LT энтеротоксин по механизму действия сходен с холерогеном Vibrio cholarae. Термостабильный энтеротоксин, в отличие от термолабильного энтеротоксина, обусловливает более легкую клиническую форму кратковременной диареи. К факторам патогенности энтеротоксигенных кишечных палочек относят поверхностные белки, определяющие адгезию и колонизацию к энтероцитам, их обозначают как факторы колонизации: CFA I, CFA II, CFA III (colonization factor antigen), что служит для возбудителя инфекции сигналом для начала колонизации и синтеза энтеротоксинов. Энтеротоксигенные кишечные палочки неинвазивны. Проявление клинического синдрома связано с синтезом энтеротоксинов, индуцирующих диарею за счет повышения активности фермента аденилатциклазы в случае продукции эшерихиями термолабильного токсина или гуанилатциклазы в случае синтеза термостабильного токсина. Повышение активности указанных ферментов способствует выделению из клеток кишечного эпителия ионов натрия и хлора, а также препятствует поступлению внутрь клеток ионов калия, что в конечном итоге приводит к нарушению ионно-солевого баланса и усилению процесса энтеросорбции: секреции изотонической жидкости в просвет кишечника.

Энтероинвазивные кишечные палочки вызывают дизентерие-подобные заболевания, которые протекают в более легкой форме, чем бактериальная дизентерия. Мишенью для энтероинвазивных кишечных палочек служат эпителиальные клетки толстой кишки. Энтероинвазивные кишечные палочки проникают внутрь эпителиоцитов, вызывая развитие воспалительной реакции, эрозию и изъязвление слизистой оболочки толстой кишки, при этом клинические проявления заболевания напоминают шигеллезы. Клетки энтероинвазивных кишечных палочек содержат плазмиду инвазивности, гомологичную обнаруживаемой у шигелл, наличие которой может служить критерием их вирулентности. Для выявления инвазивных свойств энтероинвазивных кишечных палочек используют кератоконъюнктивальную пробу Шерени. Для идентификации энтероинвазивных кишечных палочек определяют комплекс серологических и биологических свойств клеток: отсутствие подвижности, лактозонегативность, неспособность продуцировать газ при расщеплении глюкозы.

Энтерогеморрагические кишечные палочки продуцируют шигаподобный энтеротоксин, который по структуре и механизму действия сходен с шигатоксином шигелл. Энтерогеморрагические кишечные палочки могут вызвать развитие гемолитического уремического синдрома, характеризующегося высокой летальностью. В патогенезе заболевания основную роль играют шигаподобный энтеротоксин и сериновая протеаза, гидролизующая V-фактор свертывания крови, ассоциированный с геморрагическими явлениями и поражением почек.

Энтероагрегативные кишечные палочки обладают повышенной адгезивностью и способностью колонизировать слизистую оболочку кишечника с поражением значительных ее участков. Изучены недостаточно.

Диффузно-адгезирующие кишечные палочки способны к повышенной колонизации поверхности различных слизистых оболочек.

РОД KLEBSIELLA

Значение в медицине. Бактерии, относящиеся к роду Klebsiella, очень широко распространены в окружающей среде, их часто выделяют из воды, почвы, пищевых продуктов, а также с предметов больничного обихода. Поскольку они хорошо переносят как низкие, так и высокие температуры, ареал их распространения очень широк, вплоть до арктической зоны. Они могут присутствовать в микробиоценозах ротоглотки, кишечника и вагины. Нозологическая форма заболевания, вызываемая представителями данного рода, - клебсиеллез. Велико значение клебсиелл в возникновении органных инфекционных процессов при иммунодефицитных состояниях. Опасность заключается в том, что циркулирующие в стационарах госпитальные штаммы клебсиелл имеют высокий потенциал вирулентности. Молниеносное течение инфекции обусловлено энтеротоксином, который обладает повышенной цитотоксичностью. Наибольшее число заболеваний клебсиеллезом отмечено среди маленьких детей в возрасте до 1 года, у которых заболевание протекает в виде гнойного омфалита, бронхопневмонии, менингита или диареи. Риск развития клебсиеллезной инфекции повышается при оперативном вмешательстве, особенно если оно требует искусственной вентиляции легких. 73% госпитальных пневмоний имеют клебсиеллезную природу. Около 20% осложнений в послеоперативной практике связано с клебсиеллами. Представители данного рода создают серьезную проблему для стационаров системы родовспоможения, поскольку могут вызывать генерализованные гнойно-септические состояния, в том числе с летальным исходом, у новорожденных.

Таксономия. Ранее род Klebsiella включал четыре вида: K. pneumoniae (с подвидами K. pneumoniae, K. ozaenae и K. rhinoscleromatis), K. oxytoca, K. planticola и K. terrigena [3]. В последнее время при использовании молекулярно-генетических методов исследования, включая секвенирование генома и анализ нуклеотидных последовательностей отдельных генов, в том числе 16S rRNA, rpoB, gyrA, mdh, infB, phoE и nifH, предложено дополнительно рассматривать в роду Klebsiella 5 новых видов: K. ornitinolytica, К. variicola, K. singaporensis, K. milletis и K. senegalensis [4, 5]. На основании анализа последовательностей генов 16S rRNA и rpoB выделен новый род Raoultella, в который объединены виды Raoultella planticola, Raoultella terrigena и Raoultella, ранее относящиеся к роду Klebsiella [6]. Отличия клинических изолятов K. pneumoniae, полученные при анализе нуклеотидных последовательностей генов gyrA, parC и rpoB, позволили выделить 4 филогенетические группы (геноварианты); в то время как бактерии вида K. oxytoca на основании различий в генах 16S rRNA, rpoB, gyrA, gapDH, blaOXY предложено подразделить на 5 групп [7].

Морфология. Клетки Klebsiella - прямые палочки длиной 0,6- 6,0 мкм, шириной 0,3-1,0 мкм, одиночные или в парах, иногда образуют короткие цепочки. Клебсиеллы легко отличить от других энтеробактерий по их способности образовывать крупные мукоидные колонии на плотной питательной среде.

Клебсиеллы отличаются от других энтеробактерий двумя характерными признаками: они обладают классической полисахаридной капсулой и лишены жгутиков. Однако необходимо учитывать, что у 80% бактерий эти признаки могут быть вариабельными.

Культуральные свойства. Клебсиеллы неприхотливы к питательным субстратам, хорошо растут на средах для энтеробактерий. На средах Плоскирева и Эндо формируют выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью слизистой консистенции розовые колонии. На кровяном агаре клебсиеллы растут, не вызывая гемолиза. В жидкой питательной среде образуют пленки за счет экстрацеллюлярной слизистой оболочки капсулы.

Биохимические свойства. Основные характерные черты клебсиелл: наличие полисахаридной капсулы, положительная реакция Фогес-Проскауэра, положительная уреазная активность. Для идентификации клебсиелл разработана специальная среда с аминосалициловой кислотой (5-АСК).

Антигенная структура. Антигенное типирование клебсиелл проводят по структуре капсульного антигена. Капсульный антиген клебсиелл обозначают символом «К», он является истинно капсульным антигеном и не относится ни к одной из трех известных у энтеробактерий разновидностей поверхностных антигенов (А, В, L). На основании строения К-антигена описано 82 серотипа клебсиелл. Как и другие энтеробактерии, клебсиеллы имеют также О-антигенные комплексы.

РОД ENTEROBACTER

Таксономия. Род включает 12 видов, 5 из которых особенно часто выделяют из различного клинического материала от больных: E. aerogenes, E. amnigenus (биогруппа 1, биогруппа 2), E. cloacae, E. intermedius, E. sakazakii.

Значение в медицине. Представители данного рода широко распространены в природе: в пресной воде, почве, сточных водах, на растениях, овощах, их обнаруживают в фекалиях человека и животных. Однако долгие годы оставалась нерешенной проблема патогенности Enterobacter для человека и позвоночных животных. Только в последнее время появились сообщения о выделении Enterobacter при острых кишечных заболеваниях, инфекциях желчных и мочевыводящих путей, гнойных поражениях кожи, мозговых оболочек, сепсисе и самопроизвольных абортах.

Морфология. Клетки Enterobacter - прямые палочки, длиной около 2-3 мкм, шириной 0,6 мкм, подвижные за счет перитрихиальных жгутиков, исключением в этом смысле являются представители вида E. aerogenes.

Культуральные свойства. Питательным субстратом для клеток Enterobacter могут служить среды для энтеробактерий. На кровяном агаре энтеробактеры вызывают гемолиз эритроцитов. Оптимальный для роста бактерий диапазон температуры - 30-37 °С.

Биохимические свойства. При подозрении на принадлежность выделенных из клинического материала бактерий к роду Enterobacter целесообразно использовать следующие биохимические тесты:

Антигенная структура. Серотипирование для представителей всего рода не разработано. Сыворотки существуют только для E. cloacae, поэтому идентификация этих бактерий возможна лишь на основании результатов изучения их ферментативной активности.

РОД HAFNIA

Таксономия. Род представлен единственным видом Hafnia alvei.

Значение в медицине. Представители данного рода обнаружены в почве, воде, сточных водах и в пищевых (чаще в молочных) продуктах, их выделяют также из различного клинического материала от человека. Как правило, гафнии в норме встречаются в носоглотке и кишечнике человека и животных. При определенных условиях они могут обусловливать абсцессы, целлюлиты, бронхопневмонию, нагноение послеожо-говых ран.

Морфология. Клетки Hafnia - подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков, прямые, не образующие капсул палочки, длиной до 5 мкм, шириной 0,5 мкм.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах (Плоскирева, Эндо, ЭМС-агар), используемых для выделения энтеробактерий, гафнии растут в виде полупрозрачных или бесцветных колоний, напоминая по виду колонии некоторых лактозоотрицательных бактерий, в частности шигелл. Наибольшую подвижность гафнии проявляют при температуре 22 °С.

Биохимические свойства. Ферментативная активность гафний зависит от температуры культивирования. Эту особенность используют для идентификации, исследуя их способность к ферментации глюкозы и газообразованию. Наиболее важные для идентификации признаки исследуют при температуре 22 °С: это подвижность клеток, реакция Фогес-Проскауэра, использование цитрата натрия на среде Симмонса; последний анализ проводят также при температуре 35 °С. Клетки Hafnia лактозоотрицательные, образуют лизиндекарбоксилазу и орнитинде-карбоксилазу, KCN-положительные.

Антигенная структура. У бактерий рода Hafnia выявлено 68 серологических групп О-антигенов и 34 Н-антигена.

РОД SERRATIA

Таксономия. В последнее время было описано большое число новых видов рода Serratia: S. entomophila, S. fonticola, S. grimesii, S. plymuthica, S. marcescens - наиболее часто встречаемый вид в клинических образцах, S. rubidaea, S. odorifera (биогруппа 1 и 2), S. liquefaciens - комменсалы пищеварительного тракта тараканов, S. ficaria - единственный патогенный вид у растений.

Значение в медицине. Представители данного рода встречаются в почве, воде, на поверхности растений, а также в пищеварительном тракте человека, насекомых и грызунов в качестве комменсалов. В последнее время повысилась частота встречаемости представителей рода Serratia в качестве этиологического фактора при постоперационных осложнениях, особенно у кардиологических больных. Считается, что Serratia могут входить в состав нормальной микробиоты самых различных микробиоценозов человеческого организма, при этом допустимые титры для взрослых составляют 10⁵ кл/мл, а для детей - 10⁴ кл/мл. Присутствие этих микроорганизмов в ротоглотке и вагине является неустойчивым признаком. У лиц с ослабленной иммунной системой Serratia могут вызывать гнойные воспаления самой различной локализации.

Морфология. Serratia - прямые, не очень крупные палочки (0,5- 0,8)-(0,9-2,0) мкм. Имеют перитрихиальные жгутики. Некоторые бактерии при определенных условиях способны образовывать капсулу.

Большинство колоний Serratia за счет образованного микроорганизмами пигмента продигиозина, не способного диффундировать в питательную среду, окрашены в различные оттенки красного цвета - от бледно-розового до темно-кирпичного. Наиболее активный процесс пигментообразования отмечен у представителей трех видов: Serratia rubidaea, S. marcescens, S. plymuthica. Признак пигментообразования не является абсолютным, однако может быть использован при идентификации.

Культуральные свойства. Оптимальная температура роста Serratia - 30-37 °С, однако наиболее ярко выраженные биохимические реакции протекают при 22-25 °С. Характерным признаком Serratia является образование фермента ДНКазы, который может рассматриваться в качестве основного фактора патогенности. Наиболее важными признаками рода, используемыми для идентификации Serratia, являются: неспособность образования сероводорода и фенилаланиндезаминазы. Клетки S. marcescens, в отличие от других видов, не способны ферментировать арабинозу, инозит и адонит.

Антигенная структура. Имеющиеся в настоящее время сведения об антигенной структуре представителей рода Serratia недостаточны для создания диагностической схемы серотипирования, поэтому основным признаком, позволяющим провести идентификацию представителей данного рода, может служить наличие пигмента. Для типирования клинических изолятов Serratia могут быть использованы данные антибиотикограммы и чувствительности к бактериоцинам.

РОД PROTEUS

Таксономия. Род представлен 4 видами. Наиболее часто высеваемыми из клинического материала от больных при госпитальных инфекциях являются 3 вида: P. mirabilis, P. penneri, P. vulgaris. Четвертый вид - Р. myxofaciens - выделен из личинки непарного шелкопряда.

Значение в медицине. Протеи обнаруживают в кишечнике человека и животных, а также в почве, навозе и сточных водах. Нормальные количественные показатели протеев для взрослых в ЖКТ составляют 10⁴ кл/мл. Представители рода Proteus - наиболее легко идентифицируемые бактерии из всего семейства Enterobacteriaceae, поскольку они обладают характерной особенностью, проявляющейся в склонности к роению. Роение Proteus приводит к образованию вуалеобразного налета на плотной питательной среде и связано с периодической миграцией бактериальных клеток по поверхности агара. Бактериальная культура Proteus характеризуется специфическим гнилостным запахом. Представители данного рода могут вызывать гнойно-септические воспаления разнообразной локализации, особенно часто их выделяют из респираторного тракта и мочевыводящей системы. При различных внекишечных инфекциях, вызванных Proteus, может развиться генерализованный процесс. У маленьких детей в возрасте до 1 года P. mirabilis могут вызывать энтериты.

Морфология. Протеи - прямые палочки (0,4-0,8)-(1-3) мкм, подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Клетки, как правило, окружены многочисленными пилями (фимбриями). Представителям данного рода несвойственно образование пигмента, капсул, цист и спор.

Культуральные свойства. У большинства представителей данного рода отмечают явление роения - образование вуалеобразного налета на поверхности плотных питательных сред. Периодические циклы миграции клеток связаны с изменением гидрофобности их поверхностных структур и в некоторых случаях приводят к образованию концентрических зон на плотных питательных средах. Факторами, подавляющими роение, являются желчь, соли желчи и высокие значения pH (8,0). Для выделения представителей рода Proteus используют среду Плоскирева, которая в значительной степени подавляет их способность к роению. На кровяном агаре протеи дают обширную зону гемолиза. Оптимальная температура роста 37 °С, предпочтительные значения pH - нейтральные.

Биохимические свойства. Протеи характеризуются низкой сахаро-литической активностью. Вместе с представителями родов Morganella и Providencia они образуют группу условно-патогенных микроорганизмов, обладающих положительной фенилаланиндезаминазной активностью. Proteus проявляют положительную желатиназную активность.

Антигенная структура. Антигенная структура Proteus типична для представителей семейства Enterobacteriaceae и включает соматические О- и жгутиковые Н-антигенные комплексы, в некоторых случаях обнаруживают К-антигены. Разработаны сыворотки к О- и Н-антигенным комплексам.

РОД PROVIDENCIA

Таксономия. Род Providencia включает 5 видов. Наиболее часто из клинического материала высевают представителей 3 видов: P. alcalifacuens, P. rettgeri, P. stuartii. Случаи выделения клеток Providencia от больных достаточно редки.

Значение в медицине. Род сформирован при выделении уреазонегативных штаммов из рода Proteus, высеваемых из клинического материала от больных при желудочно-кишечных расстройствах, инфекции дыхательных и мочевыводящих путей, посттравматических инфекциях и менингите. Клетки Providencia часто выделяют из испражнений при желудочно-кишечных инфекциях, однако при диарее их этиологическая роль еще окончательно не доказана, так как эти микроорганизмы выявляют всегда вместе с энтеровирусами. В микробиоценозах пищеварительного тракта человека присутствие представителей рода Providencia атипично.

Морфология. Клетки Providencia - прямые, подвижные за счет перитрихиальных жгутиков палочки, за исключением представителей одного вида - P. stuartii. Размеры клеток составляют приблизительно 2 мкм в длину и 0,7 мкм в ширину.

Культуральные свойства. В отличие от Proteus, клетки Providencia не способны к роению. Выделяемые из клинического материала от больных бактерии данного рода способствуют защелачиванию питательной среды Эндо.

Биохимические свойства. Основные отличительные родовые свойства: сероводород не образуют, индол образуют, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, слабоположительная реакция с метиловым красным, способны расщеплять цитрат натрия на среде Симмонса, отрицательная активность аргининдигидролазы и орнитиндекарбок-силазы, отрицательная желатиназная активность, уреазная активность характеризуется стабильностью только у P. rettgeri.

Антигенная структура. Для большинства клеток Providencia установлена структура О-антигенных комплексов, но в практической микробиологии серотипирование не используют, так как существуют определенные сложности в получении сывороток.

РОД EDWARDSIELLA

Таксономия. Род Edwardsiella представлен 3 видами: E. hoshinae, E. ictaluri, E. tarda.

Значение в медицине. Бактерии, принадлежащие к данному роду, широко распространены в природе, особенно в странах с влажным и теплым климатом. Они наиболее часто встречаются в качестве комменсалов в кишечнике пойкилотермных животных и в среде их обитания - пресной воде; обнаружены также у гомойотермных животных и у человека. Выявлен симбиоз этих микроорганизмов с амебами.

У человека представители данного рода могут вызывать различные патологические процессы: пневмонии, нагноение ран, абсцессы, остеомиелиты, однако болезнь развивается в основном у лиц с ослабленной иммунной системой. Представители рода Edwardsiella чаще обусловливают инфекционные процессы внекишечной локализации, при этом заболевания, как правило, развиваются у лиц с ослабленной иммунной системой.

Морфология. Клетки данного рода - мелкие прямые палочки, их длина не превышает 3 мкм, ширина - около 0,5 мкм, снабжены перитрихиальными жгутиками. Проявляют подвижность при 25 °С, которая исчезает при увеличении температуры до 37 °С. Спор, цист и капсул не образуют.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах, используемых в работе с энтеробактериями, растут в виде бесцветных полупрозрачных колоний, сходных с колониями патогенных бактерий. На среде Плоскирева и висмутсульфит агаре не растут. На кровяном агаре растут без гемолиза. Оптимальная температура роста 37 °С, исключение составляют бактерии E. ictaluri: для них предпочтительна более низкая температура - 25-28 °С, при которой они проявляют повышенную биохимическую активность и подвижность.

Биохимические свойства. Для определения принадлежности бактерий к роду Edwardsiella используют биохимические характеристики. Биохимическим реакциям эдвардсиелл свойственна стабильность, они быстро окисляют и ферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты и, за редким исключением, газа; дают положительную реакцию на индол; обладают стойкой отрицательной уреазной активностью. Диагностика Edwardsiella не вызывает особых затруднений и проводится с использованием ряда доступных тестов минимального дифференциального ряда. Отличительной особенностью клеток E. tarda является способность образовывать сероводород.

Антигенная структура. Антигенная диагностическая схема (49 О-ан-тигенов и 37 Н-антигенов), разработанная для эдвардсиелл, не может быть признана достаточно полной, так как в литературе практически отсутствуют сведения об их антигенных связях с другими энтеробактериями.

РОД ERWINIA

Таксономия. Род включает 15 сапрофитных и фитопатогенных видов. Типовым видом является E. amylovora - возбудитель бактериального ожога груш. Вид E. uredovora - условно-патогенный микроорганизм.

Значение в медицине. Род объединяет 22 вида сапрофитных или патогенных для растений бактерий; их находят в семенах, фруктах, травах, почве и воде. Эрвинии могут быть выделены также из человеческих испражнений. В большей степени род изучен фитопатологами, для его описания разработаны специальные тесты. Представители вида E. uredovora способны вызывать заболевания у людей. Эрвинии выделяют при инфекциях желчных путей, мочевыводящей системы, а также при вялотекущих тонзиллитах. У лиц, связанных с обработкой сена, особенно часто обнаруживают поражения слизистой оболочки ротоглотки, вызванные представителями рода Erwinia.

Морфология. Клетки Erwinia подвижны за счет перитрихиальных жгутиков, капсул не образуют. Длина клеток составляет от 1 до 3 мкм, ширина - около 0,5 мкм.

Культуральные свойства. Оптимальная температура роста клеток Erwinia 25-27 °С, при 37 °С эрвинии расти не могут или дают скудный, замедленный рост. Эрвинии плохо растут на средах для энтеробактерий, на среде Плоскирева дают скудный рост в течение 2 сут, однако активно растут на шоколадном и кровяном агарах, при этом на кровяном агаре могут вызвать гемолиз эритроцитов. Клетки E. uredovora способны образовывать желтый пигмент, относящийся к группе каротиноидов.

Биохимические свойства. Большинство признаков эрвиний вариабельны. Они обладают активными протеазами. При выращивании эрвиний на полиуглеводной среде можно наблюдать неспецифическое почернение, в этом случае они проявляют цистеиназную активность. Клетки E. uredovora ферментируют глюкозу, чаще без образования газа, постоянно ферментируют маннит, мальтозу, сахарозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу. Часть штаммов эрвиний - лактозоположительные, в этих случаях на среде Эндо они образуют характерные ярко-розовые колонии.

Антигенная структура. Антигены и антигенные связи Erwinia с другими микроорганизмами изучены недостаточно.

РОД YERSINIA

Таксономия. Род объединяет 11 видов: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. kristensenii, Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. aldovae, Y. rohdei, Y. mollaretii, Y. bercovieri, Y. ruckeri.

Значение в медицине. Представители данного рода встречаются в разнообразных местах обитания: почве, воде, на овощах, фруктах, в молочных и других пищевых продуктах. Иерсиний можно обнаружить также в организме человека и животных, особенно у грызунов и насекомых.

Этиология. В настоящее время помимо возбудителя чумы этиологически значимыми в патологии человека являются: Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica - возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иер-синиоза. Вид Y. enterocolitica представлен как патогенными, так и непатогенными для человека и животных серо- и биоварами. Другие виды иерсиний нередко обнаруживают в исследуемых пробах испражнений, но они не обладают патогенными свойствами и рассматриваются как условно-патогенные микроорганизмы. Последние проявляют сходную с патогенными иерсиниями биохимическую активность, что требует их дифференцирования с использованием полного набора тестов. Бактерии Y. ruckeri существенно отличаются от других представителей данного рода, они патогенны по отношению к рыбам и вызывают у них болезнь «красный рот».

Морфология. Иерсинии - прямые, иногда приобретающие округлую форму палочки, шириной 0,5-0,8 мкм и длиной 1-3 мкм. Морфологические свойства иерсиний зависят от условий культивирования и состояния культуры. Так, например, неподвижные при 37 °С, иерсинии при 20-22 °С становятся подвижными в результате активизации деятельности перитрихиальных жгутиков. Клетки Y. pseudotuberculosis имеют 3-5, а Y. enterocolitica - множество жгутиков. Исключение составляют некоторые штаммы Y. ruckeri и вид Y. pestis, представители которых всегда неподвижны. В мазках из бульонных культур Y. pseudotuberculosis могут располагаться цепочками по 25 клеток, Y. enterocolitica цепочек не образуют. В дальнейшем свойства иерсиний будут рассмотрены на примере видов, наиболее этиологически значимых в патологии ЖКТ человека: Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Культуральные свойства. Иерсинии - факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста 22-28 °С. Способность размножаться при пониженной температуре - особенность представителей всего рода Yersinia. Иерсинии хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах МакКонки, Эндо, Серова, с индикатором бромтимоловым синим. Среды Плоскирева и висмутсульфит агар обладают выраженным ингибирующим действием на Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Оба микроорганизма способны расти на голодных средах (фосфатно-буферный раствор и др.). В жидких средах иерсинии вызывают равномерное помутнение, на плотных питательных средах образуют круглые полупрозрачные гладкие колонии диаметром от 0,1 до 1,0 мм. На сине-голубом фоне плотной питательной среды с бромтимоловым синим через 48 ч иерсинии образуют голубые колонии с фестончатым краем и выпуклым центром диаметром 1,5-2,0 мм. При взятии петлей они сдвигаются по поверхности агара.

Биохимические свойства. Клетки Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica не образуют сероводород, не разжижают желатин, не образуют фенил-аланиндезаминазу, лизиндекарбоксилазу, аргинингидролазу, не утилизируют цитрат натрия на среде Симмонса при температуре 37 °С.

Антигенная структура. Для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica разработаны самостоятельные схемы антигенного типирования. Y. pseudotuberculosis имеют жгутиковый Н-антиген; два соматических О-антигена (S и R); антигены вирулентности (V и W), расположенные в наружной мембране клеточной стенки. Экспрессия V- и W-антигенов происходит при температуре 37° C. Н-антиген термолабилен и не имеет диагностического значения. По S-структуре О-антигена Y. pseudotuberculosis выделено 8 сероваров (I-VIII). Большинство штаммов (60-90%), выделенных от людей, животных и из внешней среды, принадлежит к серовару I; часть - к III (8-13%), единичные - к серо-варам II, IV, V (2-8%). О циркуляции VI-VIII сероваров в нашей стране сведений нет. О-антигены Y. pseudotuberculosis неоднородны по своему строению и состоят из нескольких компонентов, часть из которых одинакова как для бактерий различных сероваров внутри вида, так и для других представителей семейства Enterobacteriaceae. R-антиген возбудителя псевдотуберкулеза является общим с R-антигеном возбудителя чумы. У Y. enterocolitica обнаружены О- и Н-антигены. Вирулентность Y. enterocolitica связана с наличием общей для патогенных иерсиний плазмиды с молекулярной массой 47 MDa. Н-антигены Y. enterocolitica различны по своему строению, термолабильны. Эти антигены имеют диагностическое значение и активны в реакции агглютинации при температуре культивирования иерсиний не выше 26-28 °С. По О-антигену, устойчивому к нагреванию и действию этанола, выделяют более 60 сероваров. У большинства циркулирующих штаммов Y. enterocolitica патогенность бактерий проявляется в их способности к адгезии и колонизации кишечного эпителия и продукции некоторыми штаммами термостабильного энтеротоксина, свойства которого практически идентичны таковому эшерихий.

Список литературы

Организм человека находится в симбиотических отношениях с микроорганизмами, населяющими его кожные покровы и открытые полости тела. Каковы же формы и последствия этого сосуществования? Одним из первых оценку этого явления дал И.И. Мечников еще в начале прошлого столетия [1, 2]. В своих книгах «Этюды о природе человека» и «Этюды оптимизма» он писал, что «…​флора должна оказывать влияние на самые разнообразные процессы, совершающиеся в организме, то благоприятствуя, то препятствуя наступлению болезни…​». По его мнению, в микробиоте «следует предположить существование полезных, вредных и безразличных бактерий». К настоящему времени накопилось значительное количество данных о том, что микроорганизмы в естественных условиях обитания существуют преимущественно в виде достаточно сложно организованных микробных сообществ, получивших название «бактериальные биопленки» (biofilms).

Биопленка - это прикрепленное к плотной поверхности микробное сообщество, в котором адсорбированные на субстрате и друг к другу клетки заключены в матрицу внеклеточных полимерных субстанций, продуцируемых микроорганизмами в соответствии с уровнем развития популяции и условиями транскрипции генов [3, 4]. С помощью биопленок бактерии колонизируют разнообразные неорганические и органические субстраты: почву, минералы, медицинские инструменты, имплантаты, а также ткани самого макроорганизма.

Недавно получены данные по обнаружению бактерий в биоптатах дистальных отделов тонкой и верхних отделов толстой кишки методом флюоресцентной гибридизации in situ с зондами 16S rRNA, детектирующими весь пул бактерий, и с зондами, специфичными к мишеням большинства представителей анаэробного (Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Atopobium) и аэробного (Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Streptococcus) ростков. Было показано, что бактерии обнаруживаются только на наружной стороне кишечного слоя слизи, и их численность достаточно низка. Выявить непосредственные контакты бактерий-комменсалов с энтероцитами и колоноцитами не удавалось, а равномерное распределение клеток бактериальных видов позволило предположить, что бактерии-комменсалы вегетируют в просвете кишки вне прямой связи с эпителиоцитами [5]. При исследовании ультратонких срезов и сканировании в электронном микроскопе поверхностей слепой и толстой кишки различных лабораторных животных нам удалось обнаружить морфологически разнородные бактерии, находящиеся в составе слизи, покрывающей эпителиоциты и входы в крипты.

Установлено, что ультраструктура бактериальных биопленок, развивающихся in vivo, и бактериального газона, сформированного стафилококками и эшерихиями в модельных условиях на плотной питательной среде, идентична по своему строению (рис. 1-10) [6].

В настоящее время проводят исследования по обнаружению биопленок на поверхности слизистых оболочек кишечника макроорганизма, требующие использования модифицированных подходов к взятию материла in vivo и его специальной подготовки к электронно-микроскопическому анализу.

Известно, что через стенку кишечника и вдоль нее ежесуточно проходит не менее 10 л жидкости, включая слюну, желудочный сок с пищевым химусом, желчные и печеночные секреты. В направлении, противоположном всасыванию, движется муцин, секретируемый бокаловидными клетками слизистой оболочки кишечника, он подвергается гидролизу клетками пристеночной микробиоты; образующиеся при этом метаболиты становятся энергетическим субстратом для эпителиоцитов.

Исследования, проведенные in vitro, показали, что клетки в бактериальной биопленке по сравнению с планктонными микроорганизмами характеризуются более высокой физиологической активностью, интенсивно синтезируя разнообразные биологически активные вещества. Реакция бактерий на изменение условий окружающей среды в биопленках существенно отличается от реакции клеток в планктонных монокультурах. В организме человека существование бактерий в составе биопленок важно для нормализации работы органов, функциональность которых зависит от населяющих их сообществ микроорганизмов.

Несмотря на то что проблема образования биопленок симбиотическими и условно-патогенными микроорганизмами в условиях in vivo до конца не выяснена, неоспоримо доказана связь этого феномена с проявлением социального поведения бактерий, получившего название «чувство кворума» (Quorum Sensing, QS) [7]. Установлено, что микробные сообщества представляют собой социальные системы, характеризующиеся определенной кооперацией и функциональной специализацией [8]. Процесс глобальной регуляции в таких социальных системах осуществляется за счет аутоиндукторов - специфических сигнальных молекул, которые легко диффундируют, а затем, достигая критической концентрации, активируют или репрессируют соответствующие QS-системы.

У грамотрицательных бактерий в большинстве QS-зависимых систем аутоиндукторами служат ацилированные гомосеринлактоны, у грамположительных бактерий роль аутоиндукторов играют пептиды (линейные или с тиолактоновым кольцом) и некоторые короткоцепо-чечные жирные кислоты (КЖК) (рис. 1-11). Регуляторные QS-системы являются двухкомпонентными: содержат сенсорную гистидиновую киназу, которая в ответ на связывание аутоиндуктора фосфорилирует второй компонент системы - белковый регулятор ответа. Запускается каскад киназ, и в конечном итоге фосфорилирующий и активирующий белок индуцирует транскрипцию определенного оперона ДНК.

При достижении в микробном сообществе критической численности оппортунистических микроорганизмов QS-система стимулирует усиление адгезивных свойств потенциального возбудителя и инициирует синтез факторов патогенности, что в дальнейшем и определяет развитие инфекционного процесса.

Формирование условно-патогенными бактериями биопленки будет возможно в случае активации регуляторной QS-системы, определяющей межклеточные коммуникативные связи и максимальное проявление вирулентности бактериями в микробных ассоциациях с иммунодефицитным состоянием самого макроорганизма.

В настоящее время показано, что более 65% инфекционных заболеваний ассоциированы со способностью их возбудителей формировать биопленку. На примере модели стафилококковой инфекции показано, что биопленка Staphylococcus aureus способна метастазиро-вать с места локализации инфекционного процесса в лимфу и системный кровоток с последующим развитием отдаленных очагов вторичной инфекции [9, 10]. При исследовании клинических штаммов Escherichia coli, включающих 105 культур, изолированных от здоровых людей, 68 - от детей с ОКИ, 90 - c явлениями бактериемии и 68 - от мужчин с инфекцией мочевыводящих путей, показана зависимость процесса образования биопленок от состава питательной среды и наличия у бактерий различных типов фимбрий: F-подобных (половых), фимбрий, обусловливающих агрегативную адгезию, и особых форм извитых фимбрий [11].

В наших исследованиях показано, что после завершения адгезии бактерии начинают активно секретировать экзополисахариды, заполняющие межклеточное пространство, что обеспечивает формирование мощной биопленки [12].

Следует отметить, что под термином «биопленка» микробиологи обычно подразумевают англоязычное понятие «biofilms», в то время как гастроэнтерологи имеют в виду пристеночный слой слизи ЖКТ, содержащий наряду с микроорганизмами крупные включения муцина, продуцируемого бокаловидными клетками. В истинной бактериальной биопленке микробные клетки располагаются на достаточно близком расстоянии друг от друга, что обеспечивает им в первую очередь контакты для быстрого обмена продуктами метаболизма и в конечном итоге целостность структуры всего сообщества.

Электронно-микроскопическое исследование бактериальных биопленок однородных и смешанных микробных сообществ бифидобактерий, лактобацилл, лактококков, энтерококков, стафилококков, различных видов условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris) и дрожжевых грибов Candida albicans выявило значительные черты сходства ультраструктурной организации микробных сообществ данного типа. Детальное исследование биопленок показало, что одним из основных ультраструктурных компонентов является комплекс защитных приспособлений. Указанные сообщества микроорганизмов, выращенные на агаризованной питательной среде, со стороны воздуха защищены комплексом поверхностных структур, объединяющих клетки в единую систему, - поверхностной пленкой (рис. 1-12).

Структура, находящаяся с наружной стороны биопленки, представлена в виде поверхностной пленки, одновременно выполняющей защитную и объединяющую микробное сообщество функцию. По-видимому, именно эти структуры обеспечивают контакт с внешней средой как отдельных клеток, так и всего бактериального сообщества в целом.

Основным элементом поверхностной пленки является трехслойная мембрана, ультратонкое строение которой соответствует универсальной плазматической мембране.

Наряду с трехслойной мембраной поверхностная пленка включает дополнительные аморфные полисахаридные слои, образующиеся как с внутренней, так и с ее внешней стороны, а в некоторых случаях - с обеих сторон одновременно.

Под поверхностной пленкой в нижних слоях биопленки пространство между клетками включает продукты их метаболизма и остатки автолизированных клеток - клеточный детрит. Экранирование клеток в биопленке полисахаридными слоями межклеточного матрикса, который заполняет толщу микробного сообщества, по-видимому, также способствует повышению устойчивости бактерий к действию различных повреждающих факторов внешней среды.

Таким образом, бактериальная биопленка, выявленная в микробных сообществах различных видов микроорганизмов, имеет универсальное строение и включает межклеточный матрикс, комплекс защитных структур, состоящих из трехслойной мембраны и аморфных полисахаридных слоев (поверхностная пленка).

С проблемой организации и регуляции процесса образования биопленок напрямую связан вопрос активного синтеза бактериальными клетками различных биологически активных веществ, в частности антибиотикоподобных субстанций - бактериоцинов. Так, например, образование in situ представителями нормальной микробиоты различных веществ, ассоциированных с факторами патогенности и антагонистической активностью, происходит, как правило, после образования микробной популяцией биопленки.

Следует отметить, что местный инфекционный очаг, образованный условно-патогенными микроорганизмами, представляют собой смешанное бактериальное сообщество, колонизирующее слизистую оболочку. Благодаря особой ультраструктурной организации микробных сообществ подобного типа, а именно наличию поверхностной пленки и активно развитому межклеточному матриксу, бактерии, заключенные в биопленки, более устойчивы к фагоцитозу, действию лизоцима, белков системы комплемента, антител, цитокинов и химиотерапевтических препаратов.

Выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфофизиологические изменения бактериальных биопленок отражают ультраструктурную картину проявления взаимоотношений микроорганизмов во внутривидовых и межвидовых сообществах. Полученные данные свидетельствуют о разнохарактерном ответе бактериальных клеток в биопленках при симбиотических или антагонистических взаимоотношениях, отражающих особое социальное поведение микроорганизмов на популяционном и клеточном уровнях. Электронно-микроскопический анализ архитектоники и ультраструктуры микробных популяций позволяет расширить понимание сложной проблемы биопленкообразования симбионтными и условно-патогенными микроорганизмами.

Можно привести многочисленные примеры, когда причиной одного и того же заболевания, склонного к рецидивирующему течению и хронизации патологического процесса, могут выступать различные представители условно-патогенной микробиоты того или иного микробного биотопа. Так, при вагинозах и вагинитах изолируют на высоком популяционном уровне представителей родов Gardnerella, Mobiluncus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bacteroides, Atopobium, Collinsella, Eggerthella, Candida, Mycoplasma. При пародонтитах часто доминируют Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus comitans, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum и Treponema denticola, в то время как в случае кандидозного стоматита - Candida albicans, С. tropicalis, С. parapsilosis, C. glabrata. При неспецифическом язвенном колите и болезни Крона часто обнаруживают Bacteroides vulgatus, Fusobacterium varium, Mycobacterium paratuberculosis, Escherichia coli и др. Во всех перечисленных выше случаях констатируют развитие инфекционного процесса при наличии в патологическом очаге того или иного «ведущего» патогенного агента на фоне увеличенной концентрации клеток различных видов условно-патогенных микроорганизмов и мощной местной воспалительной реакции. Пока не удается установить, на каких этапах развития инфекционного процесса идет формирование биопленки условно-патогенными микроорганизмами, какую роль она играет в поражении клеток и тканей макроорганизма, как долго сохраняется, когда дезорганизуется и под воздействием каких факторов. По-видимому, может иметь место синергизм патогенетического действия этиологического агента и сформированного микробного сообщества.

Список литературы

Большинство микроорганизмов, в том числе и лактобактерии, способны образовывать биопленки. По определению известно, что микробная биопленка - структурированное сообщество заключенных в полимерный матрикс бактериальных клеток, адгезированных к инертной или живой поверхности [1]. Обнаружен ряд генов, в результате экспрессии которых планктонные клетки переходят к формированию биопленок [2].

Необходимым условием для колонизации является способность клеток адгезироваться к клеткам слизистой оболочки кишки (рис. 1-13). Биопленка представляет собой эволюционно сложившееся сообщество клеток, которое проявляет более высокую устойчивость к бактерицидным веществам, в частности - к действию антибиотиков [3]. Выживаемость и колонизация микроорганизмами пищеварительного тракта рассматриваются как основные факторы для проявления оптимальной функциональности пробиотических бактерий, способствующих оптимизации физиологических функций организма человека.

СПОСОБНОСТЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ К БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЮ

В кишечнике биопленки, включающие пробиотические бактерии, обеспечивают колонизационную резистентность по отношению к транзиторным патогенным микроорганизмам. Большинство бактерий, колонизирующих ЖКТ, хорошо растут в виде биопленок, однако эксперименты по исследованию пробиотических свойств бактерий в основном выполнены на планктонных формах клеток. В связи с этим весьма актуальными представляются исследования по изучению положительного потенциала пробиотических бактерий, развивающихся в виде биопленок. Биопленки лактобактерий могут предотвратить или ингибировать распространение патогенных микроорганизмов, подавлять выработку факторов вирулентности или модулировать иммунные реакции [4]. В настоящее время неизученным остается вопрос о взаимосвязи способности к биопленкообразованию некоторых штаммов Lactobacillus и проявлению защитных свойств этих бактерий. Исследования в этой области выявили значительные различия в интенсивности формировании биопленок у микроорганизмов рода Lactobacillus. Показано, что L. rhamnosus GG проявляют лучшую способность к образованию биопленок по сравнению с 5 другими лактобактериями, формирование биопленок у которых в значительной степени определяется влиянием факторов культуральной среды. Кроме того, процесс биопленкообразования лактобактерий в значительной степени зависит от кислотности среды, наличия желчных кислот и т.д. [5]. Известно, что желчь стимулирует образование биопленок некоторых патогенных микроорганизмов, например холерных вибрионов, листерий и бактероидов [6]. Желчь, изменяя гидрофобность поверхностных структур клеток Lactobacillus, стимулирует синтез углеводов [7]. Многие молочнокислые бактерии способны нейтрализовать соли желчных кислот с помощью фермента BSH (гидролазы соли желчной кислоты) [8]. Этот факт может свидетельствовать о способности лактобактерий снижать негативное воздействие желчи на организм человека.

Большая часть тонкой кишки покрыта слоем слизи толщиной 150-400 мкм, в дистальном отделе толстой кишки слой слизи достигает величины 800-900 мкм [9].

Показано, что молочнокислые бактерии характеризуются высоким уровнем адгезии к компонентам слизи в кишечнике. Кроме того, есть данные о стимулирующем действии муцина на биопленкообразование некоторых штаммов лактобактерий.

ИНГИБИРУЮЩИЙ ПОТЕНЦИАЛ ЛАКТОБАКТЕРИЙ В БИОПЛЕНКАХ

Авторы отмечают недостаточность информации о закономерностях развития и жизнедеятельности бактерий в кишечнике в виде биопленок [10]. В частности, не до конца исследованы все аспекты механизма развития противовоспалительного эффекта клеток Lactobacillus на слизистую оболочку кишки. К настоящему времени достаточно глубоко проанализирована информация об антагонистическом воздействии на различные виды бактерий молочной кислоты, бактериоцинов и перок-сида водорода, которые вырабатываются лактобактериями [5]. Однако, по всей вероятности, этими возможностями ингибирующий потенциал лактобактерий далеко не ограничивается.

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ БИОПЛЕНОК ЛАКТОБАКТЕРИЙ

Известно, что лактобактерии в составе биопленок могут выделять вещества, ингибирующие выработку ФНО-а. Предположительно, что эти вещества выделяются бактериальными клетками только в составе биопленок, планктонные клетки вообще их не образуют или выделяют в небольших количествах. Показано иммуномодулирующее действие биопленок лактобактерий L. reuteri, которое выражалось в снижении выработки ФНО-α ЛПС-активированными клетками ТНР-1 [11]. В другом исследовании авторы выделили из супернатанта биопленки L. casei ATCC334 шапероны GroEL с выраженным противовоспалительным эффектом [12]. Показана корреляция между адгезией бактерий к клеткам эпителиоцитов Сасо-2 и их способностью регулировать синтез цитокинов [13]. Установлено, что L. fermentum NA4 значительно снижают секрецию провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а и способствуют секреции ИЛ-10 после TNBS-индуцированного колита, вызванного интраректальным введением 2,4,6-тринитробензензол-сульфоновой кислоты. Есть много работ, подтверждающих высокую устойчивость крыс и мышей к TNBS-колиту при проведении лактобак-териальной терапии [14].

ЛАКТОБАКТЕРИИ - ПРИЧИНА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

Внимание исследователей привлекает и тот факт, что помимо положительного эффекта некоторые лактобактерии могут стать причиной различных патологических состояний и заболеваний. Об участии лактобактерий в развитии воспалительных процессов в ротовой полости, в частности в развитии кариеса, известно довольно давно [15].

В работе B. Franko и соавт. описаны смертельные случаи у пациентов с инфекцией, вызванной лактобактериями менее чем через 30 сут после их идентификации [16]. Авторы высказывают предположение, что Lactobacillus-ассоциированная инфекция может быть индикатором тяжести состояния пациента, а не свидетельством наличия патогенного потенциала лактобактерий. В связи с этим предложено рассматривать бактериемию лактобактерий в качестве маркёра риска для развития сопутствующих заболеваний. Аргументами в пользу этой гипотезы могут служить: высокая встречаемость смешанных инфекций, связанных с распространением клеток Lactobacillus; повышенная распространенность у таких пациентов с лактобактериями основных заболеваний (онкологических на фоне иммуносупрессии); более низкая вирулентность изолированных при этом лактобактерий; ранний летальный исход, несмотря на эффективное лечение антимикробными препаратами. Сообщают о случае развития некротического энтероколита (НЭК) у недоношенного ребенка при проведении профилактики Lactobacillus rhamnosus, при этом у ребенка диагностировали вызванный этими лактобактериями неонатальный сепсис. Однако через 20 сут после отмены пробиотических препаратов и проведения специфической терапии антимикробными препаратами наблюдали полную ремиссию организма [17]. Случаи развития сепсиса у недоношенных детей с различными отклонениями развития описаны и у ряда других авторов [18].

Известно о роли пробиотических лактобактерий как в развитии антагонистических отношений с другими микроорганизмами, так и в возникновении воспалительных процессов в организме человека [19]. Однако анализ материала по данному вопросу показал, что механизмы развития этих процессов изучены не в достаточной степени. Показано, что особый интерес представляют ранние этапы воздействия биопленок лактобактерий в различных эпитопах организма человека, а также возможные причины, приводящие как к развитию положительной и защитной функции лактобактерий, так и к проявлению их патогенного потенциала.

ДЕЙСТВИЕ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШКИ

Одним из важнейших этапов для предотвращения развития инфекционного процесса является поддержание парацеллюлярного транспорта в слизистой оболочке кишки. Исследования, направленные на выявление способности молочнокислых бактерий противодействовать повышению кишечной проницаемости, были начаты около 15 лет назад. С тех пор собрано много данных, касающихся в основном экспериментов на различных моделях животных и на клеточных культурах. Известно, что пробиотические бактерии способствуют повышению общей барьерной функции кишечника за счет увеличения продукции муцина, путем иммуномодуляции и ингибирования патогенных микроорганизмов, а также из-за воздействия на всю микробиоту организма-хозяина. Однако молекулярные механизмы этих явлений до сих пор остаются мало изученными.

РОЛЬ БЕЛКОВ ПЛОТНЫХ КОНТАКТОВ TJ В ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЭПИТЕЛИЯ

Слизистая оболочка тонкой кишки человека включает один слой клеток, основными функциями которых являются поддержание целостности и сохранение селективной проницаемости. В состав эпителия тонкой кишки входят пять различных типов клеток: стволовые клетки, клетки Панета (Paneth), синтезирующие антимикробные пептиды, энтероциты, бокаловидные клетки, секретирующие слизь, и энтероэн-докринные клетки, продуцирующие гормоны. Избирательная проницаемость обеспечивается двумя путями: трансцеллюлярным и парацеллюлярным. Трансцеллюлярная проницаемость обычно ассоциируется с транспортом растворенных веществ через эпителиальные клетки и преимущественно осуществляется посредством селективных переносчиков аминокислот, электролитов, КЖК и сахаров. Парацеллюлярная проницаемость связана с переносом веществ через пространство между эпителиальными клетками и регулируется межклеточными комплексами, локализованными вдоль боковой мембраны клеток [20]. Между клетками, составляющими эпителиальный пласт слизистой оболочки, нет межклеточного вещества, и клетки тесно связаны друг с другом с помощью различных контактов - десмосом, липких контактов (A dherens Junctions, AJ) и плотных контактов (Tight Junctions, TJ) и др. Особенностью плотных контактов TJ является их избирательная проницаемость для различных ионов и молекул, обеспечивающая, во-первых, всасывание питательных веществ, электролитов и воды, содержащихся в просвете кишечника, и сохраняющая при этом эффективную защиту от внутрипросветных токсинов, антигенов и микроорганизмов кишечной микробиоты. TJ расположены в апикальной области эпителиальных клеток и состоят из трансмембранных белков, таких как окклюдин (occludin), клаудины (claudin), JAMs (Junctional Adhesion Molecules) и трицеллюлин (tricellulin). Они имеют общие черты строения; в частности, в них имеются четыре а-спиральных трасмембранных домена, N- и С-концы которых обращены к цитозолю, а домены, выступающие в межклеточное пространство, участвуют в гомоили гетерофильных взаимодействиях с подобными белками на соседних клетках.

ВОЗДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ НА TJ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Кроме обеспечения парацеллюлярного транспорта, TJ эпителиальных клеток образуют барьер, ограничивающий проникновение большинства патогенных микроорганизмов и представителей нормальной микробиоты из просвета кишки во все органы и ткани организма. Тем не менее многие патогенные микроорганизмы приобрели способность преодолевать этот барьер за счет образования факторов патогенности, нарушающих целостность TJ. Примерами такого воздействия могут служить вирусы гепатита С, который использует occludin в качестве адгезина на начальных этапах инфицирования [21] или клаудин-1 на последних этапах интернализации. Грибы, такие как Aspergillus и Penicillium выделяют охратоксин А, который приводит к нарушению проницаемости эпителия путем удаления определенных изоформ кла-удина из TJ [22]. Entamoeba histolytica синтезирует цистеин-протеазы (EhCP-А5), индуцирующие провоспалительный ответ, который, в свою очередь, приводит к увеличению проницаемости TJ [23].

НАРУШЕНИЕ ЦЕЛОСТНОСТИ TJ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭФФЕКТОРНЫХ БЕЛКОВ БАКТЕРИЙ

Многие микроорганизмы (вирусы, грибы, простейшие и патогенные бактерии) вырабатывают факторы патогенности, нарушающие целостность TJ. Например, Helicobacter pylori через систему секреции 4-типа вспрыскивает белок CagA в цитоплазму эпителиальных клеток желудка. CagA образует комплекс с белками ZO-1 и JAM, что приводит к изменениям структуры TJ между клетками, колонизированными бактериями [24]. Другие бактерии также используют сходную стратегию транслокации белков (инъекцию в цитоплазму клеток-хозяев эффекторных белков) для нарушения целостности TJ. Такие патогенные микроорганизмы, как энтеропатогенные и энтерогеморрагические Escherichia coli (ЕРЕС и EHEC), Citrobacter rodentium, Hafnia alvei, способны вызывать изменение морфологических свойств клеток эпителия, которое получило название attaching и effacing lesion (A/ Elesion). Механизм этого воздействия связан с введением в клетку энте-роцита через систему 3-го типа секреции (type 3 secretion system, T3SS) эффекторных белков, которые изменяют цитоскелет клетки за счет полимеризация актина [25]. Результатом такого воздействия являются деструкция ворсинок энтероцитов и нарушение барьерных свойств TJ. В настоящее время известно много типов эффекторных белков, таких как Tir, EspF, EspG, EspZ, EspH и Map, и регуляторных генов, таких как Ler (LEE-encodedregulator), белки-шапероны CesTf для Tir, CesDf для EspBandEspD и CesFf для EspF [26]. Кроме LEE-эффекторных белков, существуют и другие эффекторные белки, которые кодируются вне гена LEE, известные как не LEE эффекторы, например NLEA/ Espi, NleB, NLEC, NleD, NleE, EspJ, NleH, EspG, EspM и Cif [27].

В последние десятилетия исследованы молекулярные механизмы воздействия эффекторов патогенных микроорганизмов на цитоскелет клеток, приводящие к разрушению TJ, гибели клеток и индукции воспаления. Однако найти эффективные способы блокирования действия этих эффектов (LEE и не LEE) до сих пор является нерешенной задачей.

Проблема состоит в том, что аминокислотная последовательность белка многих эффекторов содержит функциональные мотивы, которые имитируют клеточные функции, такие как, например, связывающие мотивы SH3 или PDZ доменов, ответственных за белок-белковые взаимодействия. Кроме того, большинство эффекторов являются многофункциональными белками. Одним из лучших примеров такого рода эффекторов является EspF (эффектор энтеропатогенной Escherichia coli), который может действовать в цитоплазме, в митохондриях или в ядрышке пораженной клетки.

ВОЗДЕЙСТВИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ЛАКТОБАКТЕРИЙ НА TJ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Для нейтрализации действия бактериальных эффекторов со столь широким спектром действия необходима разработка новой стратегии воздействия на молекулярном уровне. Одним из путей решения поставленной задачи видится построение модели, основанной на избыточных, синергидных или антагонистических отношениях эффекторов, работающих в различных органеллах клеток-хозяина в период развития инфекционного процесса. Источником таких эффекторов могут служить представители нормальной микробиоты ЖКТ, при этом наиболее подходящими на эту роль являются бактерии рода Lactobacillus spp. Доказано, что клетки некоторых штаммов Lactobacillus spp. обладают потенциальными терапевтическими свойствами. Так, например, клетки лактобактерий Lactobacillus plantarum способствуют снижению воспалительного процесса в толстой кишке, а Lactobacillus fermentum ME-3 обладают антимикробной активностью по отношению к кишечным патогенам и высокой общей антиоксидантной активностью [28]. Однако молекулярные механизмы, способствующие развитию антагонистических отношений лактобактерий и патогенных микроорганизмов, до конца не выяснены, так как в настоящее время еще недостаточно полно исследована роль бактериальных биопленок лактобактерий ЖКТ.

Таким образом, приведенные в настоящем разделе материалы позволяют лучше представить межклеточные взаимодействия бактерий между собой и с клетками эукариотов как при симбиозе, так и при развитии патологических процессов в ЖКТ человека. Популяции симбиотических и условно-патогенных микроорганизмов могут рассматриваться в качестве высокоорганизованных сообществ, формирующих оригинальные по своей структуре микробные сообщества - биопленки, клетки в которых объединены сложными коммуникативными связями. Касаясь же вопроса организации пристеночного слоя слизистой оболочки кишечника, состоящего из муцина, продуцируемого бокаловидными клетками эпителия слизистой оболочки кишечника, и равномерно распределенных в нем микроорганизмов, можно лишь удивляться тому, насколько целесообразен биологический смысл эволюционно сложившейся системы функционирования оптимальной среды, созданной кооперацией пристеночной и просветной микробиоты для обмена продуктами метаболизма.

АНТАГОНИСТИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ЛАКТОБАКТЕРИЙ НА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Увеличение числа условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) приводит к их доминированию по отношению к нормальной микробиоте, что часто способствует развитию патологического процесса в организме человека. Известно, что в процессе жизнедеятельности лактобациллы вступают в сложные симбиотические или антагонистические взаимоотношения с другими микроорганизмами [29]. Проявляя антагонистическую активность, они губительно воздействуют на факультативную микробиоту, способную стать причиной развития оппортунистических инфекций.

Лактобациллы и бифидобактерии являются одними из наиболее хорошо изученных симбиотических микроорганизмов, о которых известно, что они необходимы для обеспечения толерантности к пищевым аллергенам и для устойчивости слизистых оболочек кишечника к колонизации патогенами.

В процессе метаболизма лактобациллы способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим и анти-биотикоподобные вещества, представленные различными типами бактериоцинов [30, 31]. Молекулярная масса известных бактериоцинов лактобацилл колеблется от 10³ до 10⁶ kDa. Термостабильность бактерио-цинов варьирует в зависимости от степени их очистки, величины pH, ионной силы и конформации белковой составляющей.

Процесс синтеза лактобациллами бактериоцинов сопровождается появлением внутри клеток и в межклеточном пространстве характерных глобул размером 40-50 нм, которые, по-видимому, являются фрагментами разрушающейся цитоплазмы (рис. 1-14, 1-15).

Активный синтез бактериальными клетками различных биологически активных веществ, в частности антибиотикоподобных субстанций - бактериоцинов, напрямую связан с образованием биопленок. Так, например, образования in situ представителями нормальной микробиоты субстанций, ответственных за антагонистическую активность, так же как и синтез факторов патогенности возбудителями заболеваний, происходят, как правило, при достижении определенной плотности микробных популяций. В связи с этим важными задачами представляются регуляция стимуляции образования биопленок пробиотическими бактериями и подавление развития биопленок в случае адгезии и колонизации условно-патогенными микроорганизмами. При профилактике и комплексной терапии дисбиозов существенным моментом являются уровень и спектр антагонистической активности вводимых в организм пробиотических

С целью выявления подавляющего действия бактериоцинов на развитие биопленок нами исследованы ультраструктурные изменения в клетках различных видов условно-патогенных бактерий при их взаимодействии с наиболее высокоактивными симбиотическими бактериоциногенными лактобациллами L. acidophilus D75 и D76, которые являются основой препарата Витафлор. Наблюдаемый эффект характерен также и для других широко известных производственных штаммов L. fermentum 97 и L. plantarum 8PA-3 [38-41]. Установлено, что ультраструктурные изменения в клетках Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, E. coli O157 и Candida albicans при их совместном выращивании с лактобациллами проявлялись как на клеточном, так и на популяционном уровне. Характерная картина, демонстрирующая разрушение клеток условно-патогенных энтеро-бактерий симбиотическими лактобактериями L. acidophilus D75 и D76, представлена на рис. 1.16, 1.17.

Морфометрический анализ процесса повреждения клеток условно-патогенных бактерий при воздействии лактобактерий L. acidophilus D75 и D76 и их метаболитов свидетельствует о существовании нескольких механизмов повреждения микроорганизмов. На популяционном уровне изменялось соотношение различных морфологических типов клеток тест-культур, что проявлялось увеличением доли инволюционных, лизированных и покоящихся форм бактериальных клеток. Интенсивность выявленных ультраструктурных изменений в клетках условно-патогенных бактерий коррелировала с продолжи-

Поражающее действие бактериоцинов на клетки-мишени условно-патогенных микроорганизмов, представленных на рисунках: Citrobacterfreundii (рис. 1-16) и Klebsiella pneumoniae (рис. 1-17), свидетельствуют о высокой антагонистической активности клеток симби-отического консорциума Lactobacillus aidophilus D75 и D76, входящих в состав пробиотического препарата Витафлор.

Следует отметить, что помимо дисбиозов желудочно-кишечного и урогенитального тракта, при которых наблюдается развитие воспалительных процессов, вызванных ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов, можно привести многочисленные примеры, когда причиной одного и того же заболевания, склонного к рецидивирующему течению патологического процесса, могут выступать различные представители условно-патогенной микробиоты того или иного микробного биотопа, в том числе кожи, полости рта, репродуктивного тракта женщин и др. В ряде случаев констатируют развитие инфекционного процесса при наличии в патологическом очаге того или иного «ведущего» патогенного агента на фоне увеличенной концентрации клеток различных видов УПМ и мощной местной воспалительной реакции. Пока не удается установить, на каких этапах развития инфекционного процесса идет формирование биопленок возбудителями заболеваний, как долго она сохраняется, когда дезорганизуется и под воздействием каких факторов. По-видимому, может иметь место синергизм патогенетического действия сформированного ассоциативного патомикробиоценоза, состав микробного сообщества которого регулируется QS-системой.

В заключение следует отметить, что выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфофизиологические изменения бактериальных биопленок отражают ультраструктурную картину проявления взаимоотношений микроорганизмов во внутривидовых и межвидовых сообществах. Полученные данные свидетельствуют о характерных изменениях в структуре бактериальных клеток, содержащихся в биопленках при антагонистическом воздействии лактобактерий, что отражает особое социальное поведение микроорганизмов на популяционном и клеточном уровнях. Электронно-микроскопический анализ архитектоники и ультраструктуры микробных популяций позволяет расширить понимание сложной проблемы антагонистических взаимоотношений между условно-пато генными микроорганизмами.

Список литературы

В последнее время не вызывает сомнения, что от генотипических особенностей организма и состояния его нормальной микробиоты в значительной мере зависит индивидуальная предрасположенность человека к заболеваниям, чувствительность организма к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды и способность индивидуумов к различным видам деятельности. В этой связи приоритетным направлением является исследование микробиоты открытых полостей организма хозяина, в особенности кишечника человека. Основной микробный спектр толстой кишки человека, выявляемый в практических лабораториях бактериологическими методами, состоит, как правило, из 15-20 доминирующих анаэробных, факультативно анаэробных и аэробных бактерий. В эту группу входят бактерии родов Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Bacillus, Peptococcus, Peptostreptococcus , Escherichia, Veillonella, Streptococcus, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus и др.

Основанием для анализа микробиоты кишечника может быть целый ряд признаков, связанных с дисфункцией ЖКТ, определяемых, в первую очередь по результатам копрологических и биохимических исследований содержимого кишечника. Однако более правильное решение о состоянии микробиоты можно принять на основании результатов, полученных в ходе микробиологического исследования. До последнего времени было принято считать, что только бактериологический анализ дает возможность оценить степень и характер нарушений микробиоты, определить избыточный рост микроорганизмов и их чувствительность к препаратам, что необходимо для последующей коррекции структуры микробиоты.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА

Однако в настоящее время в клиническую микробиологию активно включаются новые научные технологии, такие как геномика, протеомика, метаболомика, транскриптомика. Аналогичные научные технологии используют и для оценки роли нормальной микробиоты человека, что позволяет выявить тонкие механизмы ее реагирования на различные стрессовые воздействия внешней среды и установить факторы, поддерживающие биохимическое, метаболическое и иммуравновесие, необходимое для сохранения стабильности взаимоотношений между организмом хозяина и микроорганизмами.

Геномика - идентификация всех генов человека с информацией об их количестве, локализации, функциях, эволюции, а также о метаболических и сигнальных путях, участвующих в реализации экспрессии генов; выявление нарушений в геноме, приводящих к наследственным заболеваниям и предрасположенности к ним.

Протеомика - идентификация и количественное содержание всех индивидуальных белков клеток, тканей, органов и биологических жидкостей человека.

Метаболомика - идентификация и количественное содержание всех низкомолекулярных метаболитов, синтезируемых в клетках, тканях, органах и биологических жидкостях; определение направленности изменений метаболизма.

Транскриптомика - идентификация всех матричных РНК, кодирующих белки, определение количества каждой индивидуальной матричной РНК, анализ закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки, и транскрипционного профиля болезни.

Использование новых научных технологий применительно к микробиоте человека позволяет с большей точностью устанавливать функции большинства их генов, а также выявлять метаболические и сигнальные пути, влияющие на реализацию экспрессии необходимых для адаптации генов симбионтных представителей нормальной микробиоты.

Современные ОМИК-технологии, используемые в последнее время без выделения чистых культур микроорганизмов для исследования генома, транскриптома и протеома всех симбиотических, в том числе некультивируемых, микроорганизмов, присутствующих в различных биотопах человека, получили соответственно названия «метагеномика», «метатранскриптомика» и «метапротеомика» [1, 2]. Различные ОМИК-приемы нашли применение также и для оценки функциональных эффектов представителей нормальной микробиоты [3]. Комплексное использование ОМИК- и МЕТАОМИК-технологий значительно расширяет понимание молекулярного взаимодействия симбиотической микробиоты и эукариотических клеток различных органов и тканей человека при сохранении и восстановлении нормального функционирования макроорганизма [4].

Развитие геномики, протеомики и метаболомики в определенной степени способствует переосмыслению понятий «нормальной» или «здоровой» микроэкосистемы.

Однако вместе с тем на практике до сих пор используют целый ряд классических методов лабораторных исследований микробиоты кишечника. К ним относят: в первую очередь метод ПЦР; бактериологический анализ; газожидкостную хроматографию (ГЖХ) для обнаружения летучих жирных кислот (ЛЖК); хромато-масс-спектрометрию для определения длинноцепочечных клеточных жирных кислот.

При проведении анализа микробиоты кишечника необходимо понимать, что микроэкологические нарушения практически всегда являются сопутствующими изменениями на фоне инфекционного процесса, а также могут быть связаны с органической или функциональной (неинфекционной) патологией ЖКТ. Важен также учет клинико-анамнестических данных о ЖКТ: причины, вызвавшие дисбиотические изменения; признаки дисфункции: болевой синдром в различных отделах живота, метеоризм, вздутие кишечника, диарея или запор. Зачастую изменению структуры микробиоты сопутствует комплекс внекишечных симптомов: субфебрилитет, ожирение или дистрофия, анемия, аллергические проявления на коже в виде экзантемы или нейродермита. На фоне микроэкологических нарушений часто регистрируют кандидозные поражения кожи и слизистых оболочек, возможны бактериурия и бактериемия.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБИОТЫ

До последнего времени идентификацию представителей нормальной микробиоты, как правило, проводили, основываясь на определении фенотипических характеристик бактерий. Недавно стали преобладать методы генетического анализа: геноиндикация и геноидентификация, с полным секвенированием геномов основных представителей нормобиоты: бифидобактерий и лактобактерий [5-8].

Молекулярно-биологические методы определили несколько основных направлений исследования микробиоты человека. Одним из наиболее важных достижений является совершенствование классификации представителей нормальной микробиоты. Получению новых данных в этой области исследований способствовало применение методов гено-индикации и геноидентификации, разработанных на первых этапах для усовершенствования таксономии патогенных микроорганизмов, и только в дальнейшем эти приемы были успешно использованы для характеристики представителей нормобиоценоза [9-11]. Успешная интеграция данных по фенотипическим, генотипическим и филогенетическим характеристикам исследуемых микроорганизмов, получившая название полифазной таксономии, упорядочила классификацию многих видов симбиотической микробиоты, включая представителей родов Bifidobacterium и Lactobacillus [12].

Существует два методических подхода в определении последовательности нуклеиновых кислот микроорганизмов:

МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Данный метод направлен на выявление ДНК или РНК микроорганизмов. Основная цель - обнаружение в клиническом материале незначительных количеств ДНК (РНК) вирусной, бактериальной мико-тической или протозойной природы. Метод ПЦР включает несколько этапов: выделение ДНК (РНК), амплификация и детекция. ПЦР для выявления нуклеиновых кислот представителей микробиоты имеет стандартную схему, включающую общую денатурацию ДНК, отжиг праймеров и элонгацию фрагмента между праймерами. Температуру отжига праймеров, индивидуальную для каждой пары праймеров, рассчитывают с помощью специальных компьютерных программ. Размер ожидаемого фрагмента также рассчитывают с помощью компьютерных программ. Реакционные смеси для ПЦР объемом 25 мкл содержат: 1 мкл (0,03-0,04 мкг) хромосомной ДНК, 10-30 пкмоль каждого праймера, 200 мкМ смеси dNTP, 1,0 ед. Taq-полимеразы в 5-кратном буфере. ПЦР проводят начиная с предварительной инкубации проб при температуре 94 °С в течение 2 мин, а затем в течение 30 циклов при следующих условиях: денатурация (93 °С) - 30 с, отжиг (55-59 °С, в зависимости от Г-Ц состава праймеров) - 60 с, синтез (72 °С) - 60 с, конечный синтез - 10 мин (при 72 °С). Реакцию проводят в термоциклере. Результаты ПЦР оценивают после электрофореза в 1% агарозном геле в ультрафиолетовом свете. Для определения молекулярного размера ампликонов используют маркёр молекулярного веса ДНК от 100 до 1000 н.п. Для документации результатов и обработки изображений применяют различные системы видеозахвата специальными компьютерными программами. ПЦР характеризуется двумя важными параметрами: высокой чувствительностью и специфичностью.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБИОТЫ

В медицинской практике для исследования микробиоты кишечника можно проводить классический бактериологический анализ, для осуществления которого, однако, требуется большое количество питательных сред и времени (до нескольких суток и более). В процессе бактериологического исследования, как правило, можно выявить около 120 видов факультативно анаэробных бактерий и 25-30 видов анаэробов.

Эффективность диагностических приемов в большой степени зависит от набора и качества используемых селективных питательных сред. Показатель качества диагностического теста связан с количественным определением индигенных и транзиторных микроорганизмов: бифи-добактерий, лактобацилл, бактероидов, эшерихий, лактозонегативных и цитратпозитивных энтеробактерий, стафилококков, энтерококков, клостридий, представителей родов Pseudomonas, Acinetobacter, грибов рода Candida и др.

При проведении бактериологических исследований состояния микробиоты различных отделов пищеварительного тракта можно столкнуться с определенными техническими трудностями. Поскольку в различных участках ЖКТ состав микробиоты различен, для того, чтобы в данном биотопе обеспечить взятие стандартного образца, необходимо унифицировать процедуру получения исследуемого материала. Образцы гастроинтестинального содержимого из желудка, двенадцатиперстной кишки или проксимальных отделов тощей кишки получают с помощью гастродуоденоиеюноскопии. Однако такая процедура сложна и некомфортна для пациента, при этом далеко не всегда представляется возможным отбор образцов именно из указанных участков пищеварительного тракта.

В настоящее время оценке подвергают в основном просветную микробиоту, при этом мукозные и пристеночные участки до сих пор остаются малодоступными для изучения из-за сложного получения материала для исследования. В связи с этим данные, полученные при анализе испражнений, являются лишь косвенным показателем, частично отражающим степень микроэкологических нарушений.

Исследуемый материал испражнений обычно не может быть изучен сразу же после получения и до начала процедуры анализа должен храниться и быть транспортирован в бактериологическую лабораторию. Нужно понимать, что транспортировка в защитной среде, хранение в холодильнике или замораживание могут повлиять на жизнеспособность наиболее чувствительных к изменению условий окружающей среды микроорганизмов.

ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБИОТЫ

Взятие, транспортировка и подготовка материала к посеву

После поступления материала в лабораторию и его регистрации делают навеску испражнений от 0,2 до 1 г. К навеске добавляют стерильный нейтральный изотонический раствор натрия хлорида или тиогликолевый буфер из расчета 1:10 (вес/объем). Материал тщательно гомогенизируют стеклянной палочкой или бактериологической петлей либо в специальной посуде со стеклянными бусами.

Посев на селективные питательные среды для определения количественного и качественного состава микробиоты

Для посева микроорганизмов из клинического материала требуются стандартные селективные питательные среды, используемые для проведения бактериологического исследования на дисбактериоз. Схема посевов на питательные среды классическая. Необходимо подчеркнуть, что для изоляции склонных к анаэробиозу бифидобактерий используют пробирки с 9 мл жидкой агаризованной среды Блаурокка, а для изоляции лактобактерий - пробирки с 9 мл питательной среды МРС-1. Эти среды перед посевами должны быть регенированы путем прогревания на кипящей водяной бане в течение 30 мин, после чего пробирки охлаждают и заливают слоем стерильного вазелинового масла. В пробирки, опуская пипетку до дна, вносят по 1 мл материала из разведений 10^-7 и 10^-9 для выделения бифидобактерий и из разведений 10^-5 и 10^-7 для выделения лактобактерий.

Выделение и идентификация факультативно анаэробных бактерий

Пересев материала производят на селективные питательные среды: среда Эндо, желточно-солевой агар, желточно-сахарный агар, среда Cабуро, среда для микоплазм. Инкубацию проводят в течение 24, 48, 72 и 96 ч при температуре 37 °С в зависимости от предполагаемого результата.

Учет осуществляют при макроскопическом и микроскопическом изучении колоний, далее делают отсев матерала для получения чистой культуры бактерий. Инкубацию проводят в аэробных условиях.

После получения чистой культуры бактерий приступают к ее идентификации.

Выделение и идентификация анаэробных бактерий

Посев материала на селективные питательные среды в анаэробных условиях: Columbia agar Base с канамицином, ванкомицином и эритроцитами барана; Columbia agar Base с кристаллическим фиолетовым и эритромицином; Columbia agar Base с налидиксовой кислотой и колистиметатом натрия (Колистином^♠ ); Columbia agar с бараньей кровью и с циклосерином, цефокситином; МРС агар; среда Блаурокка; RCM agar; TSC agar.

Инкубацию необходимо проводить в условиях анаэробиоза в микро-анаэростате в атмосфере CO₂+H₂+N₂ в течение 72 ч при температуре 37 °С. Учет осуществляют при макроскопическом и микроскопическом изучении колоний, затем проводят отсев для получения чистой культуры бактерий на Columbia agar Base с эритроцитами барана. Отсев в жидкие питательные среды проводят на среду: Schaedler broth with Vitamin K1 (Rosenow cysteine medium, Thio-glycolate medium). Для окончательного установления принадлежности бактерий к группе строгих анаэробов производят отсев на среду Columbia agar Base с эритроцитами барана. Дальнейшую инкубацию для получения чистой культуры проводят в условиях анаэробиоза в микроанаэростате в атмосфере CO₂+H₂+N₂ 48 ч при температуре 37 °С. Далее приступают к идентификации чистых культур бактерий.

Идентификация чистых культур

Выявление бифидобактерий. Через 24 ч просматривают пробирки со средой Блаурокка и отмечают наличие роста культуры в определенных разведениях. Через 48 ч в толще агаризованной среды в определенных разведениях можно наблюдать отдельные колонии в форме «кометы». Из колоний в пробирках с наличием роста делают мазки по Граму и микроскопируют. Наличие грамположительных палочек с бифуркациями, колбовидными утолщениями или в виде китайских иероглифов свидетельствует о росте бифидобактерий. Результат учитывается по последнему разведению, в котором наблюдается рост бифидобактерий. Возможно также в определенных разведениях подсчитать количество колоний в виде «комет» и соотносить их число с объемом высеянного материала и разведением.

Выявление лактобацилл. Через 24 ч после посева клинического материала в пробирки со средой МРС-1 просматривают и регистрируют наличие роста в определенных разведениях. Через 48 ч в толще агаризованной среды в определенных разведениях можно наблюдать отдельные колонии в виде сфер. Из колоний в пробирках с наличием роста культуры делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопи-руют. О росте лактобацилл судят по наличию полиморфных грамположительных палочек. Результат учитывают по наибольшему разведению, в котором регистрируется рост лактобацилл. Иногда можно подсчитать количество колоний в виде сфер в толще агаризованной среды и соотнести это количество с объемом высеянного материала и разведением.

Выявление энтеробактерий производят на средах Эндо, Плоскирева, Левина и кровяном агаре. На чашки Петри с этими средами высевают по 0,1 мл из разведений 10^-3 , 10^-5 и 10^-7 (для среды Левина из разведений 10^-2 , 10^-4 , 10^-6 ) и растирают затем шпателем. На агаре с кровью могут обнаруживаться и другие гемолитические бактерии.

Для выделения энтерококков применяют чашки Петри с энтерококк-агаром. Посевы производят по 0,1 мл из разведений 10^-3 , 10^-5 и 10^-7.

Выявление стафилококков производят на чашках Петри с желточно-солевым агаром, на которые высевают по 0,1 мл из разведений 10^-2 , 10^-4 , 10^-6.

Для выделения анаэробных спорообразующих бактерий рода Clostridium используют среду Вильсона-Блера в пробирках. Предварительно пробирки с этой средой прогревают на водяной бане при температуре 50-60 °С в течение 30 мин, затем засевают по 1 мл из разведений 10^-3 , 10^-5 и 10^-7 , затем пробирки помещают на водяную баню при 80 °С на 20 мин для уничтожения неспоровых бактерий.

Дрожжевые грибы выделяют путем посевов по 0,1 мл из разведений 10^-2 , 10^-4 и 10^-6 на чашки Петри со средой Сабуро.

Выделение строгих анаэробов (бактероидов, пептострептококков, эубактерий, фузобактерий, клостридий и др.) производят в основном в специализированных лабораториях, обеспеченных необходимым оборудованием и материалами. Более успешное выделение бактероидов и пептострептококков возможно при сборе испражнений в пробирки с газовой смесью для выращивания анаэробных бактерий.

Для выделения бактероидов производят высевы по 0,1 мл из разведений 10^-5 , 10^-7 и 10^-9 на агар для культивирования анаэробных бактерий с канамицином и ванкомицином, а для выделения пептострептококков - по 0,1 мл из разведений 10^-4 , 10^-6 и 10^-8 на агар для выращивания анаэробных бактерий с колимицином^p или полимиксином и налидиксовой кислотой. Сразу после посевов чашки необходимо поместить в микроанаэростат вместе с индикатором для выявления свободного кислорода. Затем микроанаэростат закрывают, с помощью вакуумного насоса удаляют из него воздух, после чего микроанаэростат заполняют нулевым поверочным азотом, вновь удаляют газ насосом и заполняют его газовой смесью (СО₂ - 5%, H₂ - 10%, N₂ - 85%), после чего помещают в термостат при температуре 37 °С. Для получения более точных результатов следует из каждого разведения делать высевы на 2 чашки. После посевов все среды инкубируют при температуре 37 °С (среду Сабуро нужно инкубировать при температуре 24 °С или при комнатной температуре).

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫРАЩИВАНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ЧЕРЕЗ 24, 48, 72 И 96 ч

Учет результатов через 24 ч выращивания

Учет результатов на всех средах и подсчет колоний, выросших на агаре Плоскирева, Эндо, Левина и агаре с кровью, производят через 24 ч выращивания. Число бактерий данного вида в 1 г испражнений определяют при учете количества чашек в разведениях, объема суспензии, высеянной на чашки в разведениях, и степени разведений.

Выявление клостридий

Пробирки со средой Вильсона-Блера просматривают для регистрации роста колоний черного цвета в толще агаризованной среды в определенных разведениях. Из колоний готовят и окрашивают по Граму мазки. При микроскопировании клостридии выглядят как грамполо-жительные палочки со слегка закругленными концами.

Выявление факультативно анаэробных бактерий

Через 24 ч культивирования на среде Эндо подсчитывают общее количество лактозоположительных окрашенных в яркий малиновый цвет колоний и количество бесцветных лактозоотрицательных колоний, отбирают по 1-2 тех и других колоний и засевают на короткий пестрый ряд (агар Клиглера, Олькеницкого, Симмонса) для идентификации энтеробактерий.

На агаре Левина отбирают бесцветные колонии и пересевают на короткий пестрый ряд для последующей идентификации.

Со среды Плоскирева отбирают бесцветные, прозрачные, мелкие и средние колонии, окрашенные в черный цвет, возможно, патогенные бактерии и пересевают их на короткий пестрый ряд.

На агаре с кровью подсчитывают количество колоний, вызвавших гемолиз эритроцитов. Производят пересевы нескольких колоний с прозрачной зоной гемолиза на короткий пестрый ряд для подтверждения их принадлежности к E. coli. Отбирают колонии с наличием непрозрачной зоны гемолиза, типичные для стрептококков или энтерококков, и производят пересевы на короткий пестрый ряд и агар ДИФ-3. Все пересеянные культуры помещают в термостат при температуре 37 °С.

Анализ результатов через 48 ч выращивания

Через 48 ч выращивания производят учет культур, выросших на средах Блаурокка и МРС-1, на желточно-солевом агаре и энтерококк-агаре, на среде Сабуро, а также на всех средах, на которые производили пересевы через 24 ч культивирования. На желточно-солевом агаре подсчитывают количество всех выросших колоний и колоний с золотистым пигментом и окруженных радужным венчиком, свидетельствующим о способности микроорганизмов продуцировать лецитиназу и о принадлежности к S. aureus. Эти колонии отбирают и ставят реакцию плазмокоагуляции, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, определяя наличие грамположительных кокков, располагающихся гроздьями.

Из культур, выращенных на средах Блаурокка и МРС-1, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, определяя наличие грамположительных палочек, типичных для бифидобактерий и лактобацилл.

С энтерококк-агара, а также из среды с кровью после культивирования пересеянных подозрительных на энтерококк культур готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, определяя наличие типичных для стрептококка грамположительных кокков. С этими культурами ставят также пробу на каталазу, убеждаясь в том, что подозрительные на энтерококк культуры не образуют пузырьков кислорода при их растирании в капле перекиси водорода. Культуры, подозрительные на гемолитический стрептококк, проверяют в тесте на оксидазу.

Из колоний на среде Сабуро готовят мазки. Чашки с отрицательными посевами на микроскопические грибы оставляют инкубировать еще на сутки.

Учитывают результаты роста на коротких пестрых рядах всех культур, пересеянных после 24 ч выращивания со сред Эндо, Левина, Плоскирева, кровяного агара, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Ставят также тесты на оксидазу. Культуры, подозрительные на принадлежность к условно-патогенным энтеробактериям, пересевают для идентификации на длинные пестрые ряды. Чашки с кровью при отсутствии роста оставляют инкубировать еще на сутки.

Анализ результатов через 72 ч выращивания

Учет всех посевов и биохимических тестов производят через 72 ч выращивания. При наличии сальмонелл и шигелл оповещают санэпидслужбы. При наличии золотистых стафилококков, условно-патогенных энтеробактерий и псевдомонад проводят определение их фагочувствительности с целью назначения фагов для санации. Для этого петлю культуры эмульгируют в пробирке с 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и в количестве 0,1 мл наносят на чашки с питательным агаром и растирают шпателем. После этого на агаре делают луночки-кружочки концом бактериологической пробирки, в которые затем вносят по капле бактериофаги (пиобактериофаг, интестифаг, колипротейный, клебсиеллезный, стафилококковый, сальмонеллезный и др.). Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 96 ч.

У патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, псевдомонад, энтерококков и стафилококков определяют чувствительность к антимикробным препаратам. Культуры засевают на питательный агар тем же способом, как и при определении фагочувствительности, затем на агар помещают диски с различными антибиотиками. Чашки инкубируют при температуре 37 °С. Просматривают посевы на агаре с кровью. При наличии колоний, подозрительных на гемолитический стрептококк, ставят тесты на оксидазу и каталазу, готовят, окрашивают по Граму и микроскопируют мазки, определяя наличие типичных для стрептококков цепочек грамположительных кокков. Просматривают и учитывают рост колоний на среде Сабуро. Готовят и микроскопируют мазки, окрашенные по Граму.

Через 96 ч просматривают и учитывают результаты определения чувствительности к фагам и антимикробным препаратам.

Выявление бактероидов

Результаты посевов на агар для анаэробов с канамицином и ван-комицином анализируют через 48 ч выращивания. Подсчитывают количество выросших колоний, готовят мазки для окраски по Граму и микроскопируют, выявляя грамотрицательные палочки. Пересевают отдельные колонии на 2 чашки с тем же агаром, но без антимикробных препаратов. Одну чашку инкубируют в аэробных, а другую в анаэробных условиях при температуре 37 °С в течение 48 ч для подтверждения принадлежности выявленных грамотрицательных бактерий к строгим анаэробам.

Выявление пептострептококков

Учет результатов посевов на агар для анаэробов с колимицином_^p _ ^^ и налидиксовой кислотой и дальнейшие процедуры идентификации чистых культур проводят так же, как при обнаружении бактероидов. В данном случае в мазках ищут короткие цепочки грамположительных кокков.

ВЫЯВЛЕНИЕ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Для оценки состояния микробиоты толстой кишки в последнее время все чаще применяют скрининговый метод ГЖХ с целью количественного определения в материале содержания ЛЖК или КЖК. Данный метод дает возможность оценки состояния микробиоты в определенном микробиоценозе, при этом происходит значительная экономия времени и стоимости исследования. Применение данного метода позволяет также выявить патологические изменения органов ЖКТ и подобрать схему адекватной коррекции микробиоценоза с последующей оценкой эффективности проводимой терапии.

Определение содержания короткоцепочечных жирных кислот

Методом ГЖХ в испражнениях исследуют количественное и качественное содержание КЖК [13].

Для этого испражнения массой более 0,1 г помещают в пробирку с коническим дном, приливают 2 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора а-диметилмасляной кислоты (в качестве «внутреннего» стандарта), перемешивают путем встряхивания в течение 10 мин, добавляют 0,5 мл 1N HCl (для определения связанных кислот) (для определения свободных КЖК добавление соляной кислоты не требуется), центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробу надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования исследуемого образца, около 1 мкл в испаритель хроматографа с детектором ионизации в пламени, снабженном кварцевой капиллярной колонкой длиной 36 м с внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой FFAP (free fatty acids phase) в виде пленки толщиной 0,33 мкм. Режим работы хроматографа: изотермический с температурой термостата 150 °С, температурой испарителя и детектора 230 °С. Газноситель - азот, с давлением на входе в колонку 1,8 ат. Расход газа-носителя 2,0 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин. Соотношение потоков газа-носителя на сброс и в колонку - 50:1. Время хроматографиро-вания - около 8 мин. Содержание индивидуальных кислот в смеси (образце) определяется по формуле:

Pn =P'× Sn × Kn ÷ S' × Po, где P' - вес «внутреннего стандарта» в анализируемом образце, мг; Sn - площадь пика анализируемой кислоты; S' - площадь пика «внутреннего стандарта»; Po - вес анализируемого образца, мг; Kn - весовые поправочные коэффициенты: K2/уксусная кислота/ = 2,54 (±0,01); K3/пропионовая/ = 1,55 (±0,01); K4/масляная и изомасляная/ = 1,19 (±0,01); K5/валериановая кислота (C5) и изовалериановая/ = 1,08 (±0,01), K6/капроновая кислота (C6) и изокапроновая/ = 1 (±0,01). Определяют относительное содержание (т.е. отношение концентрации данной кислоты к общей суммарной концентрации кислот), включая C2, C3, C4 в суммарном содержании C2-C4, значения окислительно-восстановительного потенциала среды, выраженного значениями анаэробного индекса (АИ - это отношение суммы концентраций (С) восстановленных кислот к менее восстановленным: C3+C4/C2, относительного суммарного содержания изокислот (∑изо_Cn ), отдельно изоС5/C5 в содержании C2-C6.

По результатам исследования делают вывод о состоянии микробиоценоза толстой кишки. О нормальном состоянии микробиоценоза свидетельствует содержание кислот фракции C2-C4 на уровне 9,4±1,4 мг/г, фракции C2-C6 с изомерами на уровне 10,5±2,5 мг/г. Повышение или снижение абсолютного содержания кислот свидетельствует о повышении или снижении численности и активности микроорганизмов толстой кишки. Качественный состав микробиоты оценивается по профилю, т.е. по относительному содержанию кислот. В норме показатели относительного содержания C2 находятся в пределах 0,634 (±0,014), C3 - 0,189 (±0,011) и C4 - 0,176 (±0,011) в суммарном относительном содержании C2-C4; значения АИ, характеризующего окислительно-восстановительный потенциал среды, находятся в области отрицательных значений -0,576 (±0,012). Отношения содержания отдельных изомеров кислот к кислотам (∑iCn , изоC5/C5) в норме имеют значения EiCn = 0,059 (±0,015) ед., изоC5/C5 = 1,471 (±0,20) ед. Рассчитанные молярные соотношения суммы свободных КЖК и их солей ∑(R^- H⁺ )/∑(R^- Na⁺ ) в норме составляют 2:1. Увеличение относительного содержания C3 и C4 в качественном составе КЖК, отклонение значений АИ в область резко отрицательных значений (с -0,600 и менее) свидетельствуют о повышении активности анаэробных популяций микроорганизмов. При увеличении содержания C3 более 0,221 отмечается повышенная активность бактерий рода Bacteroides (I тип изменений состава КЖК), при увеличении содержания C4 более 0,198 - микроорганизмов родов Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium (II тип изменений состава КЖК); сочетанное увеличение содержания C3 (с 0,222) и C4 (0,199) свидетельствует о повышении активности смешанной анаэробной микробиоты (III тип изменений состава КЖК). О повышении активности анаэробной микробиоты, обладающей протеолитической активностью, свидетельствует повышение содержания C3 и C4 при значениях суммы изокислот 0,063±0,011 (IV тип изменений состава КЖК). Повышение значения отношения изоC5/C5 более 1,5±0,2 характеризует наличие и активизацию анаэробных микроорганизмов, обладающих гемолитической активностью (IV тип изменений состава КЖК). Увеличение относительного содержания C2 и изокислот в качественном составе КЖК, отклонение значений АИ в область слабоотрицательных значений (с -0,552 и более) свидетельствуют о повышении активности анаэробных популяций микроорганизмов. При увеличении содержания C2 более 0,651 отмечается повышенная активность факультативных аэробных бактерий родов Escherichia, Enterococcus, Streptococcus и Staphylococcus с возможным появлением условно-патогенных микроорганизмов (Klebsiella, Proteus, Streptococcus и Staphylococcus (V тип изменений состава КЖК). О повышении активности аэробной микробиоты, обладающей протеолитической активностью, свидетельствует повышение содержания C2 при значениях суммы изокислот более 0,067±0,011 (VI тип изменений состава КЖК). Повышение значения отношения изоC5/C5 более 1,5±0,2 характеризует наличие и активизацию аэробных бактерий, обладающих гемолитической активностью (VI тип изменений состава КЖК).

При использовании метода ГЖХ было показано, что при функциональной патологии кишечника с преобладанием диареи определяются повышение абсолютного содержания КЖК в кале (с 12,5±2,5 мг/г) и изменение спектра КЖК, характеризующимся увеличением C3 (в большей степени) и C4 (с 0,221 и более и 0,189 и более соответственно), отклонением значений АИ в сторону резко отрицательных значений (АИ ←0,600 ед.), сниженными значениями индексов отношения изокислот к кислотам (EiCn/Cn <0,420 ед. (±0,08), значениями суммы изокислот 0,063±0,011, отсутствием изменений показателя отношения изоC5/C5 (1,5±0,2 ед.), при этом молярные соотношения суммы свободных КЖК и их солей (∑(R^- H⁺ )/∑(R^- Na⁺ )) составляют 1:1.

При функциональной патологии кишечника с преобладанием запора определяются снижение абсолютного содержания КЖК в фекалиях (с 5,9±2,5 мг/г) и изменение спектра КЖК, характеризующегося увеличением C2 (с 0,651 и более), отклонением значений АИ в сторону слабоотрицательных значений (АИ >-0,552 ед.), повышенными значениями индексов отношения изокислот к кислотам (E_iCn/Cn_ >0,440 ед. (±0,08)), значениями суммы изокислот (более 0,067 ед.), при этом молярные соотношения суммы свободных КЖК и их солей (∑(R^- H⁺ )/ ∑(R^- Na⁺)) составляют 1:1.

При органической патологии кишечника (неспецифический язвенный колит, рак толстой кишки) определяют изменение спектра КЖК, которое характеризуется увеличением в основном C4 (с 0,221 и более), отклонением значений АИ в сторону резко отрицательных значений (АИ ←0,700 ед.), значениями индексов отношения изокислот к кислотам (Ei Cn /Cn), не превышающих 0,450 ед. (±0,08) (при неспецифическом язвенном колите), и значениями индексов отношения изокислот к кислотам (EiCn/Cn), превышающих 0,450 ед. (±0,08) (при раке толстой кишки), повышением показателя отношения изоC5/C5 (более 2,0±0,2 ед.) (в зависимости от активности воспалительного процесса и степени инвазии опухоли).

При патологии поджелудочной железы с изменением внешнесекреторной функции определяются повышение абсолютного содержания КЖК в испражнениях (с 16,5±2,5 мг/г в основном за счет кислот с длиной цепи атомов углерода более 3), изменение спектра КЖК, характеризующееся равнодолевым увеличением C3 и C4 (с 0,221 и более и 0,189 и более соответственно), отклонением значений АИ в сторону резко отрицательных значений (АИ ←0,900 ед.), повышением значений индексов отношения изокислот к кислотам (EiCn /Cn) - 0,481 ед. (±0,08), повышением суммы изокислот с 0,085 и более в зависимости от степени выраженности недостаточности поджелудочной железы.

При патологии гепатобилиарного тракта необходимо проводить сочетанное исследование КЖК в испражнениях и сыворотке крови вне зависимости от типа нарушения стула, при этом определяются снижение абсолютного содержания КЖК в испражнениях (с 5,6±2,5 мг/г) и изменение спектра КЖК, характеризующееся увеличением C3 и C4 (с 0,221 и более и 0,200 и более соответственно), отклонением значенийАИ в сторону резко отрицательных значений (АИ ←0,800 ед.), повышением значений индексов отношения изокислот к кислотам (EiCn/Cn > 0,483 ед.), повышенными значениями индексов отношения изо-кислот к кислотам (EiCn/Cn >0,465 ед. (±0,08)), значениями суммы изокислот (0,061-0,900 ед.).

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

С помощью метода хромато-масс-спектрометрии можно определить содержание более 170 клеточных жирных кислот бактерий, что дает информацию о состоянии микробиоты кишечника (Осипов Г.А. и соавт., 2001). Данным методом определяют КЖК в биоптатах, полученных во время интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией у здоровых добровольцев и пациентов с синдромом раздраженного кишечника (СРК). Поскольку регуляция состава жирных кислот контролируется на хромосомном уровне, то экспрессия жирных кислот может являться отражением или фингерпринтом бактерий. На этой основе построена хемодифференциация микроорганизмов, которая широко используется как метод их идентификации и уточнения таксономического положения. Он применяется для работы с микроорганизмами, изолированными в чистой культуре, и основан на использовании очень больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов. Известно, что разные микроорганизмы в составе липидов клеточной стенки имеют жирные кислоты, отличающиеся от клеток организма человека. Число клеток или удельный вес клинически значимых микроорганизмов вычисляют по концентрации вещества - биомаркёра, используя известные данные по содержанию жирных кислот в микробной клетке и калибровке прибора. Около половины биомассы - микробиоты, т.е. ее основную долю составляют аэробные актинобактерии. Они достаточно широко распространены в природе. Подтверждено их наличие на слизистых оболочках и коже человека и животных, а также их участие в воспалительных процессах. Они не доступны классическому выявлению бактериологическими методами в микробиологических клинических лабораториях, но благодаря наличию уникальных молекулярных маркёров могут быть обнаружены и количественно измерены методом масс-спектрометрии. Далее по численности следуют факультативно анаэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки и коринеформные бактерии) - около 25%. До 1/3 (от 20 до 30%) составляют бифидобактерии и лактобациллы. Меньшинство составляют анаэробы (пептострептококки, бактероиды, клостридии, пропионобактерии) - их численность около 10% в тонкой и до 20% в толстой кишке. На долю энтеробактерий приходится 1% суммарной микробиоты слизистых оболочек, причем основную долю составляют клебсиеллы (90%), которых на порядок больше, чем всех прочих представителей семейства Enterobacteriaceae.

Концентрацию микробных компонентов можно измерить непосредственно на участке их локализации в кишечной стенке. Поэтому можно делать прямые сопоставления между концентрацией маркёров и числом микробных клеток в условиях отсутствия пищевой липидной компоненты, если биоптаты получали натощак. Полученные данные отражают ведущую в количественном отношении компоненту микробиоценоза кишечной стенки, так как оказалось, что при наличии биоптата весом 4 мг возможно детектировать микроорганизмы, начиная с концентрации 10⁴ -10⁵ кл/г. Плотность заселения стенки кишечника в дистальном направлении меняется мало: в подвздошной кишке она в 2 раза меньше, а в толстой кишке в 1/5 раза больше, чем в тощей. Пристеночный микробиоценоз оказывается существенно более концентрированным, чем просветный, который в тонкой кишке на шесть порядков ниже по численности (10⁵ кл/мл). В ободочной кишке концентрация микроорганизмов по порядку величины соответствует таковой в ее содержимом, а их видовой состав - известным представлениям о компонентах кишечной микробиоты (КМ).

Как показал подробный анализ изменений концентрации маркёров микроорганизмов в биоптатах кишечника 18 пациентов с явлениями антибиотикоассоциированной диареи (ААД), существенные (более чем в 2 раза) отклонения в численности колонизации претерпевают многие микроорганизмы. Наиболее часто наблюдается увеличение концентрации Eubacterium, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Cl. рropionicum, Cl. difficile и микроскопических грибов. Синдром полиэтиологичен, т.е. сопровождается в целом существенным изменением нормальной микробиоты тонкой кишки, в основном - в сторону увеличения концентрации у разных больных от 7 до 30 из 50 контролируемых микроорганизмов. При ААД общая колонизация слизистой оболочки тонкой кишки увеличивается от 2 до 5 раз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение необходимо подчеркнуть следующие положения: в настоящее время определение микроорганизмов, входящих в состав микробиоты, обогатилось новыми генетическими и молекулярно-биологическими дифференцирующими приемами, позволяющими отразить в какой-то мере связи между микроорганизмами в эволюционном аспекте. Появились новые методы и технические усовершенствования: секвенирование генов, ПЦР, геномная дактилоскопия, ГЖХ, масс-спектрометрия и компьютерный анализ.

Многочисленное разнообразие особенностей микроорганизмов приводит к очевидным заключениям, что для правильного вывода при использовании даже самых современных методов диагностики требуется наиболее полная фенотипическая характеристика с учетом молекулярно-генетических методов. Таким образом, при исследовании микробиоты выделение определенных видов и выяснение их систематического положения правомерно делать только при использовании в совокупности фенотипических и генетических критериев.

Список литературы

Первичная микробная колонизация является важнейшим процессом в жизни ребенка, так как формирующаяся микробиота существенно влияет на состояние его организма, вплоть до предрасположенности к развитию определенных заболеваний [1, 2]. Первичная микробиота ребенка является основой процессов пищеварения, колонизационной резистентности и развития его иммунной системы [3].

Традиционно считалось, что развитие плода происходит в «стерильной» среде и микробная колонизация ребенка начинается во время родов при прохождении через родовые пути матери. Данные представления существенно изменились в последнее десятилетие с внедрением молекулярно-генетических методов исследования микробиоты человека. В настоящее время доказано, что ребенок получает микробиоту матери в течение всей беременности, родов и грудного вскармливания.

Следует отметить, что состав КМФ женщины изменяется во время беременности. Во II триместре беременности происходит снижение видового разнообразия микроорганизмов в кишечнике, увеличивается численность бактерий Actinobacteria и Proteobacteria [4]. Микробиота беременной обеспечивает ей метаболизм, необходимый для вынашивания здорового ребенка. Новорожденный будет иметь микробиоту, близкую по составу к материнской микробиоте в I триместре, до начала изменений ее микробиоты.

Ученые сходятся во мнении, что внутриутробный и неонатальный периоды представляют собой критические этапы формирования микробиома ребенка, от которых во многом зависит состояние его здоровья в течение всей жизни [5, 6]. Микроорганизмы начинают заселять человеческий организм еще в утробе матери. Бактерии различных родов обнаружены в плаценте, околоплодных водах, пуповинной крови и меконии новорожденных.

Результаты исследований, проведенных K. Aagaard и соавт. (2014) на основе изучения 16S рибосомальной ДНК и метагеномной технологии, свидетельствуют о наличии в плаценте клинически здоровых беременных разнообразного по видовому составу микробиома, состоящего преимущественно из представителей непатогенных Firmicutes, Tenericutes, Proteobacteria, Bacteroides и Fusobacteria [7]. При сравнении таксономического профиля микробиома плаценты и микробиома различных микробиоценозов (кишечника, ротовой полости, кожи, мочеполового тракта) беременной обнаружено максимальное сходство состава микробиома плаценты и ротовой полости. В плацентарном микробиоме преобладают Proteobacteria и часто обнаруживаются такие виды, как Prevotella tannerae и Neisseria [7]. Сходство состава микро-биоты полости рта и плацентарной микробиоты предполагает, что бактерии могут транслоцироваться во время беременности из ротовой полости в плаценту. Это может объяснить тот факт, что одонтогенные инфекции (периодонтит) матери увеличивают риск преждевременных родов и осложнений беременности [7, 8]. Наличие некоторых бактерий в составе оральной микробиоты (например, Actinomyces naselundii) ассоциируется с более низкой массой тела ребенка при рождении и преждевременными родами, в то время как присутствие лактобацилл - с более высокой массой тела при рождении и более поздними родами [9]. Таким образом, выявлено влияние состава оральной микробиоты у беременных на исход беременности.

О важности состояния микробиоценозов будущей матери для исхода беременности свидетельствует также тот факт, что нарушение микробного состава вагинальной микробиоты беременной ассоциируется с более высокой частотой преждевременных родов [10]. Неблагоприятными вариантами дисбиоза влагалища являются повышенное содержание Gardnerella и Ureaplasma spp., снижение содержания Lactobacillus spp. , колонизация Candida albicans. Снижение уровня_Lactobacillus spр._ ассоциируется с развитием вагинальной инфекции и повышенного синтеза провоспалительных цитокинов и простагландинов, вызывающих сокращение матки [11]. Бактерии Burkholderia, Streptosporangium и Anaeromyxobacter были обнаружены в плаценте у женщин с преждевременными родами, в то время как при доношенной беременности преобладали Paenibacillus [12]. Таким образом, тип и количество бактерий, содержащихся в различных микробиоценозах и амниотической полости будущей матери, имеют важное значение для исходов беременности и рождения здорового ребенка.

Внутриутробное проникновение бактерий из кишечника матери к плоду происходит путем бактериальной транслокации [13]. Е. Jimenez и соавт. (2005) [13] выделили микроорганизмы родов Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus и Propionibacterium из крови пуповины и молочнокислые бактерии из мекония здоровых новорожденных, рожденных путем КС. В.И. Никитенко и соавт. (2004) проводили бактериологическое исследование тканей ЖКТ и брыжеечных лимфатических узлов 24-недельного человеческого плода в желудке и кишечнике, где они обнаружили E. coli и бифидобактерии, в то время как кишечник плода на сроке развития 22 нед был стерилен. Авторы сделали вывод, что КМФ у плода начинает формироваться во второй половине беременности путем бактериальной транслокации материнской микробиоты [14].

Ранее предполагалось, что меконий стерилен, однако использование молекулярно-генетических методов позволило обнаружить в нем разнообразие микроорганизмов [15]. Испанские ученые в образцах мекония 20 новорожденных (перед исследованием они удалили внешние слои образцов для исключения контаминации) обнаружили ДНК лактобактерий и E. coli. Результаты бактериологических методов исследования свидетельствовали о преобладании в меконии стафилококков, в то время как энтерококки, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens были характерны для микробиоты фекалий [16]. У доношенных детей в меконии обнаружены представители Enterococcus, Escherichia, Leuconostoc, Lactococcus и Streptococcus, у недоношенных младенцев - Enterobacter, Enterococcus, Lactobacillus, Photorhabdus и Tannerela [17]. Результаты исследований L. Moles и соавт. (2013) свидетельствуют о различии состава микробиоты мекония и фекалий недоношенных новорожденных, которые они изучали молекулярно-генетическими и культуральными методами. Представители Firmicutes преобладали в микробиоте мекония, в то время как протеобактерии доминировали в микробиоте фекалий.

Микробный контакт плода с материнскими бактериями в период внутриутробного развития приводит к развитию иммунологической толерантности, что определяет процесс колонизации ребенка при его встрече с широким спектром микробов матери и окружающей среды во время родов и в постнатальном периоде [18, 19]. Ученые предполагают, что состав микробиома будущей матери влияет на формирование иммунной системы новорожденного, риски его заболеваемости и во многом зависит от состояния здоровья и образа жизни беременной.

Результаты многочисленных исследований микробиома беременной и его роли в процессах формирования микробиоты и иммунной системы ребенка являются обоснованием необходимости изучения состава различных микробиоценозов женщины и их коррекции при дисбиотических состояниях как до наступления, так и в течение беременности.

Несмотря на наличие внутриутробного периода развития человеческой микробиоты, наиболее значимая микробная колонизация ребенка происходит во время родов и после рождения. Материнский микробиом влагалища и кишечника в данный период является основой формирования неонатального микробиома путем горизонтальной передачи микроорганизмов. T. Jost и соавт. (2012) выявили удивительное сходство состава кишечного микробиома здоровых доношенных новорожденных и их матерей [20].

В настоящее время доказано, что характер колонизации новорожденного ребенка зависит от многих факторов: гестационного возраста, способа родоразрешения, антибактериальной терапии, санитарно-гигиенических условий окружающей среды, географических условий и др. Микробиота матери и санитарное состояние окружающей среды определяют характер первичной колонизации ребенка, в последующем состав кишечной микробиоты во многом зависит от типа вскармливания. В работе J. Penders и соавт. (2006) показано, что дети, рожденные вагинальным путем в срок, в домашних условиях, получающие грудное вскармливание, приобретают оптимальный состав КМ, который характеризуется высоким популяционным уровнем бифидобактерий и низким содержанием Clostridium difficile и E. coli. [21].

КМ гетерогенна в первые несколько дней жизни ребенка, независимо от типа вскармливания, и состав ее меняется очень быстро [11]. Сначала пищеварительный тракт ребенка интенсивно колонизируется аэробными и факультативными анаэробными бактериями: E. coli и другими энтеробактериями, энтерококками и стафилококками, которые снижают содержание кислорода в кишечной среде и таким образом подготавливают условия для колонизации облигатными анаэробами [22-24]. Данный период в развитии кишечной микробиоты человека может быть определен как «этап оппортунистической колонизации».

E. coli и энтерококки (Enterococcus faecalis или E. faecium) являются первыми бактериями, колонизирующими кишечник новорожденного. Основным источником этих микроорганизмов для новорожденного являются вагинальная микробиота, КМ матери, а также грудное молоко [25, 26]. Возможна внутригоспитальная передача штаммов E. coli новорожденному от других детей и медицинского персонала [24]. Позже источниками E. coli могут стать другие члены семьи и люди, ухаживающие за новорожденным. В кишечнике человека эшерихии появляются в первые дни после рождения в количестве 10⁷ -10⁸ КОЕ/г фекалий и сохраняются в этом количестве на протяжении всей жизни. Энтерококки присутствуют в кишечнике детей в количестве 10⁵ -10⁷ КОЕ/г фекалий и в норме не должны превышать общее количество кишечных палочек [27].

Условно-патогенные энтеробактерии (Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter и др.), которые часто обнаруживаются у новорожденных, редко имеют материнское происхождение [23, 28]. В основном они передаются через медицинский персонал и от других новорожденных [29, 30]. Количество бактерий каждого вида в норме не должно превышать 10⁴ КОЕ/г фекалий [27].

Стафилококки (S. epidermidis, S. aureus) появляются в кишечнике многих новорожденных в первые дни жизни, чаще у детей, получающих грудное вскармливание [23, 28]. Согласно принятым в России нормам, у грудных здоровых детей содержание непатогенных стафилококков составляет 10⁴ -10⁵ КОЕ/г фекалий, у детей старше 1 года - 10³ -10⁴ КОЕ/г фекалий, а S. aureus не должен обнаруживаться вовсе. Однако, по данным зарубежных исследователей, этот микроорганизм часто обнаруживают в составе КМ грудных детей. В работе E. Lindberg и соавт. (2000) показано, что частота колонизации кишечника S. aureus детей в возрасте 3 дней составила 16%, с последующим возрастанием этого показателя до 73% в возрастной группе 2-6 мес и последующим снижением до 53% к концу 1 года жизни. Популяционный уровень S. aureus у детей первых месяцев жизни, по данным авторов, составлял 10^6,8 КОЕ/г фекалий с последующим снижением до 10^4,0 КОЕ/г к 1 году жизни ребенка [31].

Основным источником инфицирования детей S. aureus в родильных домах являются медицинские работники - носители патогена на слизистой оболочке верхних дыхательных путей и на коже. Реже источником инфекции являются матери (5-14%) или больные с различными формами стафилококковой инфекции [32]. После выписки из родильного дома инфицирование S. aureus ребенка возможно от других членов семьи. E. Lindberg и соавт. (2004) выявляли источники колонизации ЖКТ грудных детей S. aureus в семьях. Штаммы S. aureus, выделенные из смывов кожи, носовых ходов родителей и фекалий ребенка были идентифицированы с помощью ПЦР. Колонизация ЖКТ ребенка в основном ассоциировалась с носительством стафилококков на коже родителей [33].

С конца первой недели жизни ребенка начинается колонизация ЖКТ строгими анаэробами (бифидобактериями, бактероидами и клостридиями), которые начинают доминировать в кишечной микробиоте и приводят к супрессии аэробных микроорганизмов [34]. По данным разных авторов, у детей, получающих грудное вскармливание, относительно стабильный кишечный микробиоценоз с преобладанием бифидобактерий устанавливается к концу первой недели жизни [35-37]. Доминирующими видами бифидобактерий КМ грудных детей являются B. infantis, B. longum и B. breve [38]. В норме у грудных детей популяционный уровень бифидобактерий составляет 10¹⁰ -10¹¹ КОЕ/г, у детей старшего возраста и взрослых - 10⁹ -10¹⁰ КОЕ/г фекалий. Источником бифидобактерий и бактероидов для ребенка, как правило, является КМФ матери [39, 40]. Бифидобактерии могут также распространяться среди новорожденных в детских палатах [41]. Распространение фекальных бактерий, по-видимому, продолжается в семьях, так как при наличии старших детей младенцы имеют более высокий уровень бифидобактерий [42].

Бактероиды обнаруживаются у детей, рожденных вагинальным путем, в возрасте 2 мес - в 30%, в 6 мес - в 43% и в возрасте 1 года - в 75% случаев [43]. Их уровень в толстой кишке колеблется в диапазоне 10⁷ -10¹¹ КОЕ/г фекалий, у детей в возрасте от 7 мес до 1-2 лет содержание бактероидов не превышает 10⁸ КОЕ/г [27]. Материнские филотипы бактероидов обычно присутствуют в кишечнике ребенка транзиторно в течение 1 мес [40].

Молекулярные методы исследования КМ позволили вывить у новорожденных, получающих грудное вскармливание, еще одну многочисленную группу анаэробных бактерий - Ruminococcus [36]. Известно, что данные микроорганизмы продуцируют бактриоцин - руминококкцин А, который ингибирует рост многих видов клостридий [44].

Клостридии часто выделяются из фекалий новорожденных и являются первыми анаэробами, колонизирующими ЖКТ детей, рожденных путем КС [45]. Источником колонизации обычно является окружающая среда, где эти микроорганизмы находятся в форме спор. Количество Clostridium difficile у здорового ребенка не должно превышать 10³ КОЕ/г, у старших детей и взрослых допустимо их содержание не >10⁵ КОЕ/г фекалий [27].

Вагинальная микробиота и грудное молоко матери являются основными источниками лактобактерий для новорожденного. В работе Y. Matsumiya и соавт. (2002) исследована передача вагинальных штаммов лактобацилл от матери к ребенку в 86 парах. Идентификация штаммов проводилась с помощью ПЦР. Колонизация кишечника ребенка материнскими штаммами лактобацилл произошла в 22,8% случаев, но только в 2 случаях эти штаммы сохранились до одномесячного возраста. Авторы сделали вывод, что вагинальные штаммы лактобацилл не живут в кишечнике младенца длительное время и, вероятно, заменяются лактобактериями из грудного молока или других источников после рождения [46].

Присутствие различных видов лактобактерий (L. salivarius, L. gasseri, L. fermentum) в грудном молоке доказано исследованиями группы авторов [47, 48]. Аналогичные штаммы лактобацилл обнаружены и в фекалиях вскармливаемых младенцев, что позволило сделать вывод о том, что грудное молоко является важным источником лактобактерий для ЖКТ детей. Шведские ученые изучили особенности формирования лактобациллярной микробиоты у 112 грудных детей в возрасте от 3 нед до 18 мес. Выявлено, что частота выделения лактобацилл достигала максимума к концу первого полугодия, когда они были обнаружены у 45% обследованных детей. В возрасте 1 года лактобактерии были обнаружены только у 13% детей с последующим возрастанием частоты выделения до 31% к 18 мес. Среднее содержание лактобактерий в возрасте ребенка 7 дней составило 10^6,4 КОЕ/г фекалий с возрастанием до 10^8,8 КОЕ/г в 6 мес и последующим снижением до 10^5,4 КОЕ/г к 1 году. Наиболее характерными видами лактобацилл в период грудного вскармливания были L. rhamnosus и L. gasseri. После отмены грудного вскармливания у детей доминировали штаммы лактобацилл пищевого происхождения: L. paracasei, L. plantarum, L. acidophilus и L. delbrueckii. Колонизация лактобациллами не зависела от способа родов и наличия старших детей в семье [49].

Высокие уровни аэробных и анаэробных бактерий, по мнению разных исследователей, могут сосуществовать в течение первых месяцев жизни или даже нескольких лет [37]. У детей старше 1 года возрастает численность бактероидов, снижается количество бифидобактерий, реже выделяется условно-патогенная микробиота [50]. По данным разных авторов, кишечная микробиота ребенка по своему составу становится похожей на микробиоту взрослого человека к концу первого года жизни [18]. Имеются данные, что даже в возрасте 2 лет микробиота детей по своей физиолого-биохимической активности еще существенно отличается от взрослых [51, 52].

Результаты исследований процесса микробной колонизации ЖКТ, проведенных у 235 здоровых детей Москвы на протяжении первого года жизни, показали, что в данный возрастной период нормальный биоценоз кишечника встречается крайне редко. У обследованных детей выявлялась высокая частота колонизации условно-патогенными микроорганизмами. Наиболее часто отклонения от нормативных показателей кишечного микробиоценоза имели дети первого полугодия жизни. Проведенные исследования показали, что период становления кишечного микробиоценоза у 85-90% детей продолжается в течение всего первого года жизни, а у 10-15% занимает более продолжительный период времени [35]. В.М. Коршунов и соавт. (2001) проводили многоцентровые исследования КМ у клинически здоровых детей раннего возраста, проживающих в различных регионах (России, Монголии, Швеции), и показали, что независимо от места проживания, характера диеты состав кишечного микробиоценоза обследованных детей не соответствует стандарту, принятому за норму [53].

Кесарево сечение в настоящее время является наиболее распространенной родоразрешающей операцией. Во всех странах мира, в том числе и в нашей стране, отмечается возрастание частоты КС в интересах здоровья матери и плода. В РФ частота КС в 2001 г. составляла 14,8%, в 2006 г. - 18,4% [54]. Во всем мире отмечается рост числа случаев «элективного КС», которое проводится без медицинских показаний «по желанию матери». По данным литературы, частота КС в отдельных странах достигает 60-70%. В связи с этим актуальным является анализ влияния способа родоразрешения на состояние здоровья матери и ребенка. Имеются сведения о том, что КС сопровождается увеличением риска неонатальной заболеваемости и смертности [55]. По данным литературы, у детей, рожденных путем КС, отмечается более высокая частота развития атопических заболеваний, кишечных инфекций и госпитализаций в течение первого года жизни, а также бронхиальной астмы, аллергического ринита, целиакии в более старшем возрасте [56-61]. Более частое развитие этих заболеваний у детей, рожденных путем КС, ученые объясняют нарушением процессов формирования КМ и иммунной системы.

В настоящее время доказано, что способ родоразрешения оказывает существенное влияние на формирование и состав кишечной микро-биоты ребенка [43]. При естественном родоразрешении формирование микроэкологической системы ребенка начинается в процессе родов с колонизации его слизистых оболочек и кожи бактериями кишечной, вагинальной и кожной микробиоты матери [62, 63]. Доказано, что для детей, рожденных путем КС, основным источником микроорганизмов являются микробиота кожи матери и окружающая среда (микробиота родильного зала, палат, медицинского персонала и других новорожденных). У детей, рожденных путем КС, в различных экологических нишах (кожа, слизистая оболочка полости рта, носа, фекалии) обнаруживаются бактерии, сходные с микробиотой кожи матери: Staphylococcus spp., Corynebacterium spp. и Propionibacterium spp. Санитарно-гигиеническое состояние окружающей среды является принципиально важным для первичной колонизации детей, рожденных оперативным путем [37].

Большинство проведенных исследований посвящены особенностям колонизации детей, рожденных путем КС, в течение периода новорожденности. По данным разных авторов, дети, рожденные путем КС, имеют низкий популяционный уровень кишечных бактерий в течение первой недели жизни [18, 64]. Поздняя колонизация облигатными анаэробами (бифидобактериями, бактероидами) и лактобактериями является характерной особенностью формирования кишечной микро-биоты у детей, рожденных путем КС, и причиной доминирования у них в ранние сроки после рождения разнообразных факультативных микроорганизмов [43, 62].

В литературе имеются единичные сообщения о динамике развития КМ у детей, рожденных путем КС в постнеонатальном периоде. В работе M.M. Grolund и соавт. (1999), изучавших КМ у детей, рожденных КС, в течение первого полугодия жизни, показано, что колонизация кишечника этой популяции детей бифидо- и лактобактери-ями достигла показателей вагинально рожденных детей к 1 мес и к 10 дням соответственно. Число аэробных энтеробактерий в кишечнике не зависело от способа родов. Дети, рожденные КС, в возрасте 1 мес имели более высокую степень колонизации Clostridium perfringens, чем дети, рожденные естественным путем (57 и 17% соответственно). В возрасте 6 мес дети, рожденные КС, в 2 раза реже были колонизированы Bacteroides fragilis, чем дети, рожденные вагинальным путем (36 и 76% соответственно). Выявленные особенности формирования КМ у детей, рожденных КС, авторы связывают не только со способом родоразрешения, но и с профилактической антибактериальной терапией матери, проводимой по поводу операции КС [64].

В литературе имеются единичные работы, посвященные длительным исследованиям КМ у детей, рожденных естественным путем и путем КС [65]. Наиболее длительное исследование процесса формирования КМ у детей, рожденных путем КС, было проведено шведскими учеными [43]. Авторы в динамике исследовали состав КМ у 99 детей, рожденных естественным путем, и у 17 детей, рожденных путем КС, в возрасте 3 дня, 1, 2, 4, 8 нед и в 6 и 12 мес. Было выявлено, что независимо от способа родоразрешения наиболее ранними «колонизаторами» кишечника новорожденных были стафилококки и энтерококки, которые были обнаружены в фекалиях у большинства детей на 3-й день жизни. Колонизация энтеробактериями (включая E. coli) происходила позже, и они были обнаружены в 90% случаев только в возрасте 2 мес. Среди представителей энтеробактерий у детей, рожденных естественным путем, до 6 мес доминировала E. coli, в то время как у детей, рожденных КС, на протяжении всего периода наблюдения чаще выделялись условно-патогенные энтеробактерии (Klebsiella spp., Enterobacter spp., реже - другие виды). Достоверные различия в частоте колонизации бифидобактериями между двумя группами выявлены только в возрасте 7 дней жизни, когда они были обнаружены у 69% детей, рожденных естественным путем, и у 44% детей, рожденных путем КС, в последующем частота выделения этих бактерий была равной. Cl. difficile достоверно чаще обнаруживались в составе КМ у детей, рожденных путем КС, до 1 года жизни. Бактероиды появлялись у них позже, чем у детей, рожденных естественным путем, и были обнаружены только у 1 из 17 детей в возрасте старше 2 мес. Исследователи сделали вывод, что для детей, рожденных путем КС, характерно более длительное формирование КМ.

Мы изучали особенности формирования кишечного микробиоценоза у детей, рожденных естественным путем и путем КС, в процессе длительного наблюдения (3 года) [66, 67]. В когортное исследование были включены 91 ребенок, рожденный естественным путем, и 82 ребенка, рожденных путем КС с функциональными нарушениямиЖКТ. В исследование были включены доношенные дети с массой тела 3000-4000 г и оценкой по Апгар 7-9 баллов. Бактериологические исследования КМ проводились в динамике в возрасте 1-2 мес, 6-12 мес, а также в возрасте 1-2 года, 2-3 года. Из очередного исследования исключались дети, получавшие антибиотики или перенесшие ОКИ менее чем за 1 мес до исследования.

Следует отметить, что у всех детей, рожденных оперативным путем, и у большинства (70,3%) детей из группы нормальных родов был отягощен перинатальный анамнез. Матери, которым проводилось КС, достоверно чаще, чем матери из группы нормальных родов, имели отягощенный акушерский анамнез, гинекологическую патологию, патологию беременности, и у них достоверно чаще развивались гнойно-септические заболевания в послеродовой период. У всех детей, рожденных КС, отмечалось позднее прикладывание к груди, которое в 100% случаев проводилось на фоне антибактериальной терапии матери. Мать и ребенок после операции КС находились в стационаре более длительный период, чем при естественном родоразрешении, что значительно повышало риск их инфицирования госпитальными штаммами микроорганизмов.

Исследования показали, что процесс формирования кишечного микробиоценоза имеет существенные различия у детей, рожденных естественным путем и путем КС. Так, нормальный состав КМ выявлен в группе вагинальных родов в возрасте 1 мес - в 4,9%, в 6-12 мес - в 15%, в 1-2 года - в 33,3% и в 2-3 года - в 66,6% случаев. У детей, рожденных путем КС, эубиоз выявлен в возрасте 1 мес - в 1,1%, в 6-12 мес - в 3,4%, в 1-2 года - в 9% и в 2-3 года - в 25,8% случаев.

Дети, рожденные путем КС, в течение всего периода раннего детства достоверно чаще имели различные варианты нарушения КМ, и они были более выражены, чем у детей, рожденных естественным путем. До 2 лет жизни у них достоверно чаще, чем у детей, рожденных естественным путем, обнаруживался дефицит бифидобактерий (р=0,02-0,03) и (или) лактобактерий (р=0,003-0,04). Данное явление мы связываем с тем, что эти дети не получают в родах индигенной микробиоты матери, поздно прикладываются к груди и вскармливаются на фоне антибактериальной терапии матери в послеоперационном периоде. Известно, что грудное молоко матери имеет синбиотический эффект на КМ ребенка. В работе Y. Nakao и соавт. (2008) показано, что длительное разделение ребенка и матери после родов нарушает процесс становления лактации у матери [68]. Дети, рожденные оперативным путем, до 5-го дня жизни получают меньший объем грудного молока, чем дети, рожденные естественным путем, что также может оказать влияние на процесс первичной колонизации ЖКТ ребенка [69].

В обеих группах детей выявлена высокая частота колонизации кишечника УПМ, которые обнаружены в фекалиях в возрасте 1 мес - в 92,3%, 6-12 мес - в 73,6%, 1-2 года - в 66,7% и 2-3 года - в 54,8% случаев (табл. 2-1). В возрасте старше 1 года они обнаруживались в данной группе достоверно чаще, чем у детей, рожденных естественным путем (р=0,01). УПМ также с высокой частотой обнаруживались и у детей из группы естественных родов (ЕР) аналогичного возраста (91,5%; 66,7%; 44%; 24,2%), однако у детей из группы КС факультативные микроорганизмы достоверно чаще выявлялись в ассоциациях.

Независимо от способа родоразрешения в составе факультативной части КМ по частоте встречаемости доминировали S. aureus, Klebsiella spp., Proteus spp., гемолизирующие эшерихии. Следует отметить, что данные микроорганизмы являлись доминирующими в факультативной части КМ и у здоровых детей, на основании чего можно сделать вывод об однотипности колонизации УПМ детей разных групп, что подтверждает наше предположение о вероятности наличия общих источников инфицирования новорожденных данными микроорганизмами. В возрасте старше 1 года УПМ у детей из группы КС обнаруживались чаще, чем у детей, рожденных естественным путем (р =0,01: F-критерий). Для детей, рожденных КС, было характерно более выраженное видовое разнообразие факультативной микробиоты, и только у них в грудном возрасте обнаружены Serratia spp., Morganella morganii, P. aeruginosa. Во все возрастные периоды дети из группы КС чаще были колонизированы клостридиями, а в возрасте до 1 года у них достоверно чаще обнаруживались клебсиеллы. Данные особенности состава факультативной части КМ у детей, рожденных путем КС, также, по-видимому, связаны с тем, что основным источником микроорганизмов для них является окружающая среда. Дети после операции КС попадают в атмосферу госпитальной микробиоты, что наряду с более длительными сроками пребывания в роддоме значительно повышает риск их инфицирования госпитальными штаммами микроорганизмов. Клостридии, которые выявлены в наших исследованиях преимущественно у детей, рожденных оперативным путем, являются факультативными анаэробами, которые попадают в кишечник детей в виде спор из окружающей среды и также имеют госпитальное происхождение [64, 70]. Известно, что грамотрицательные энтеробактерии (клебсиеллы, протеи и др.) часто имеют госпитальное происхождение [30].

*Достоверность различий с аналогичными показателями у детей из группы КС того же возраста по F-критерию.

Персистенция УПМ выявлена у всех детей, рожденных КС, и только в 54,7% случаев естественных родов (р<0,001), причем в 32% случаев у детей первой группы персистировали ассоциации микроорганизмов. Известно, что процесс персистенции УПМ лежит в основе развития затяжных и хронических воспалительных процессов, а также сенсибилизации организма ребенка [71, 72].

В нашем исследовании персистенция условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике выявлена у всех детей, рожденных КС, причем у каждого 3-го ребенка мы наблюдали персистенцию ассоциации двух видов микроорганизмов. Персистенция клостридий и ассоциаций УПМ у детей из группы КС развивалась достоверно чаще, чем у детей из группы ЕР. У детей, рожденных естественным путем, персистенция развилась в 54% случаях, причем в 31,2% случаев персистировали S. aureus. Более частая колонизация и персистенция УПМ у детей, рожденных путем КС, с нашей точки зрения, связаны со сниженной колонизационной резистентностью ЖКТ этих детей, а также с высоким персистирующим потенциалом госпитальной микробиоты. Весьма вероятно, что в условиях отсутствия конкурирующей индигенной микробиоты на этапе первичной колонизации ЖКТ этих детей различные виды условно-патогенных микроорганизмов включаются в состав формирующейся кишечной биопленки и прочно закрепляются в данной экологической нише.

Выявленные особенности микробной колонизации детей, рожденных КС, несомненно, имеют клиническое значение. Мы изучили клиническую симптоматику дисбактериоза кишечника у 77 детей, рожденных путем КС, и у 72 детей, рожденных естественным путем. Также было определено прогностическое значение способа родоразрешения для развития патологии, которая может быть связана с нарушением микроэкологического статуса детей. Полученные данные свидетельствуют о том, что у детей, рожденных оперативным путем, дисбактери-оз кишечника достоверно чаще, чем у детей, рожденных естественным путем, протекает в клинически манифестных формах и характеризуется более выраженными вариантами дисфункции кишечника, которые в 26,1% случаев приобретают затяжное течение. В данной группе детей достоверно чаще, чем у детей, рожденных естественным путем, развиваются кишечная колика, синдром упорных срыгиваний, колит, симптомы интоксикации. Более выраженные клинические проявления дисбактериоза кишечника у детей, рожденных путем КС, с нашей точки зрения, связаны с особенностями состава КМ, а именно с выделением ассоциаций УПМ и дефицитом облигатных бактерий, обеспечивающих колонизационную резистентность ЖКТ и антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. В настоящее время доказано, что большое значение в генезе колик у грудных детей имеет нарушение состава КМ. У детей с коликами чаще снижено количество лактобактерий, отмечается более высокое содержание газообразующих кишечных бактерий и более частая колонизация грамотрицательными энтеробактериями [73]. Наши исследования показали, что дети, рожденные путем КС, имеют повышенный риск развития орофарингеального кандидоза в возрасте 1-2 мес [RR = 3,36 (95% ДИ 1,32; 8,6)], что мы связываем с более частой колонизацией кишечника этих детей грибами рода Candida. В возрасте 1 год дети данной группы имели сниженное содержание гемоглобина (114±8,2 г/л) чаще, чем дети, рожденные естественным путем (121,3±14,5 г/л), что может быть связано с нарушением процессов всасывания железа на фоне затяжной дисфункции кишечника. У детей из группы КС достоверно чаще выявлялась абсолютная нейтропения с количеством нейтрофилов <1000 в 1 мкл. В работе V. Stadlbauer и соавт. (2008) было показано, что развитие гранулоцитарной дисфункции может быть связано с транслокацией кишечной микробиоты, компонентов грамотрицательных бактерий и токсинов в системный кровоток [74]. Развивающаяся на фоне выраженного дисбактериоза кишечника гранулоцитарная дисфункция, возможно, является одной из причин более частой заболеваемости острыми респираторными инфекциями детей из группы КС в возрасте от 1 до 3 лет (RR = 2,7). Дети, рожденные оперативным путем, в возрасте до 1 года имели более высокий риск развития атопического дерматита (RR = 1,8), что согласуется с данными других исследователей [56, 60, 75]. Частота госпитализации детей в течение первых 3 лет жизни не зависела от способа родоразрешения. Основной причиной госпитализации в обеих группах были острые респираторные и кишечные инфекции.

Полученные в результате исследования новые данные об особенностях формирования КМ у детей, рожденных путем КС, и о более высокой заболеваемости в данной группе детей являются обоснованием необходимости пробиотической коррекции кишечного микробиоценоза и диспансерного наблюдения детей, рожденных путем КС с ранним дебютом кишечной дисфункции на фоне дисбактериоза кишечника. Поскольку операция КС достаточно часто проводится по относительным показаниям, то число детей, составляющих группу риска по развитию различных заболеваний, неоправданно увеличивается. В настоящее время при плановом КС используется метод перидуральной анестезии, при котором возможно раннее прикладывание ребенка к груди матери. Кроме того, имеются данные о нецелесообразности проведения длительных курсов профилактической антибиотикотерапии у матери при абдоминальном родоразрешении [76]. Использование современных методов анестезии, выработка четкого алгоритма назначения антибактериальных препаратов, раннее прикладывание ребенка к женской груди в послеоперационном периоде и совместное пребывание их в палате, с нашей точки зрения, может существенно изменить характер микробной колонизации детей, рожденных с помощью кесарева сечения.

*Достоверность различий по F-критерию.

Список литературы

В настоящее время доказано, что состав формирующейся микробиоты ребенка в первую очередь зависит от состава микробиоценозов матери [1, 2]. Большинство имеющихся работ посвящены исследованию роли микробиоты матери в процессах формирования неонатальной КМ ребенка. Обоснована необходимость коррекции нарушений микробиоты генитального и кишечного тракта женщины во время беременности для нормального формирования микроэкологической системы ребенка и снижения частоты гнойно-воспалительных заболеваний в периоде новорожденности [1, 2]. В настоящее время остается малоизученным вопрос влияния микробиоценозов матери на состав формирующейся кишечной микробиоты ребенка в постнеонатальном периоде. Изучению прогностического значения нарушений микробиоценозов матери для состава КМ детей в период грудного вскармливания было посвящено наше исследование [3-5].

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ МАТЕРИ ДЛЯ СОСТАВА КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ ДЕТЕЙ В ПЕРИОД ГРУДНОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ

Исследования проводились на базе кафедры детских инфекций ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет», бактериологической лаборатории Республиканской инфекционной клинической больницы г. Казань.

Проведено бактериологическое обследование 72 пар мать-грудной ребенок. Для исследования были отобраны дети первого года жизни, получающие грудное вскармливание и страдающие периодической или постоянной дисфункцией кишечника. Длительность дисфункции кишечника у детей составила 2-3 мес - в 48,6%, 3-6 мес - в 29,2% и 6-12 мес - в 22,2% случаев. У детей было проведено бактериологическое исследование фекалий, у матерей - бактериологическое исследование состава микробиоты толстой кишки, зева, носа, кожи грудной железы. У 46 матерей проведено исследование грудного молока на общее содержание SIgA и SIgA, специфичных к гликолипиду E. coli, к ЛПС E. coli О114, к ЛПС Re - мутанта Salmonella minesota RE-595, к общим белковым антигенам S. aureus, Streptococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Candida spp., P. aeruginoza. Взятие материала для исследования у исследуемых пар проводили в один день.

Дисбиоз толстой кишки выявлен у матерей в 76,2%, зева - в 77,7%, носа - в 55,6% случаев. Микроэкологические нарушения у женщин в основном выявлялись на фоне хронических заболеваний органов пищеварения (47,2%) и хронических гнойно-воспалительных процессов различной локализации: фурункулез (5,6%), хронический тонзиллит (16,2%), заболевания мочеполовой системы (20,8%) и др. В 51% случаев матери получали антибактериальную терапию в период беременности или после родов.

У большинства обследованных матерей (76,4%) выявлены нарушения состава микробиоценоза толстой кишки. У каждой второй женщины имелся дефицит индигенных бактерий. Дефицит бифидобактерий выявлен в 19,4%, дефицит E. coli с нормальными ферментативными свойствами - в 26,4%, лактобактерий и энтерококков - в 13,9% случаев. Условно-патогенные микроорганизмы (клостридии, Staph. aureus, Klebsiella spp., гемолизирующие эшерихии, Candida spp.) в диагностически значимых количествах обнаружены в фекалиях у 40,3% матерей.

Несмотря на грудное вскармливание, ни у одного ребенка не выявлено нормального состава КМ. В 79% случаев состав КМ детей соответствовал характеристикам 2-3-й степени нарушения микробиоценоза кишечника. В 83,4% случаев у детей был снижен популяционный уровень облигатных бактерий и в 94,7% случаев выявлена диагностически значимая колонизация кишечника различными видами УПМ с доминированием S. aureus (55,3%), Klebsiella sp. (36,8%) и Proteus sp. (28,9%). При сопоставлении результатов микробиологического исследования фекалий матери и ребенка ни в одной паре не выявлено полного соответствия состава КМ. В 15,3% случаев у матери и ребенка в фекалиях обнаружены идентичные виды условно-патогенных микроорганизмов (S. aureus, Clostridium difficile, E. coli Hly+).

Выявлено, что у детей, вскармливаемых матерями, имеющими дефицит бифидобактерий, - в 2,2 раза, энтерококков - в 3,4 раза, лактобактерий - в 6,2 раза больший риск иметь дефицит данных микроорганизмов, чем у детей, чьи матери имеют нормальный популяционный уровень индигенных бактерий. Также выявлено, что у детей, вскармливаемых матерями, инфицированными S. aureus, в 1,6 раза больше риск инфицирования кишечника стафилококком, чем у детей, чьи матери не являются носительницами стафилококка в кишечнике (RR = 1,6 (95% ДИ 1,2-1,7). Данные результаты могут быть объяснены тем, что эти дети уже при рождении могли получить недостаточное количество индигенных бактерий от матери, имеющей дисбиоз кишечника. Однако при обследовании детей, рожденных путем КС, которые, как известно, не получают материнской вагинальной микробиоты и КМ в процессе родов, выявлено, что в возрасте 1 мес они достаточно часто имели нормальное количество бифидобактерий (46,2% случаев) и лактобактерий (72,5% случаев), что свидетельствует о том, что колонизация кишечника инди-генной флорой продолжается и после родов. Основным источником индигенных бактерий (лактобактерий, бифидобактерий, энтерококков) для ребенка после родов в настоящее время считается грудное молоко матери [6, 7]. Предположение о том, что индигенные бактерии попадают в грудное молоко матери путем транслокации из кишечника матери, недавно было подтверждено в работах R. Martin и соавт. (2004) и P. Perez и соавт. (2007) [8, 9]. Этими авторами доказано, что грудное молоко содержит 10³ КОЕ/мл живых бактерий и широкий спектр бактериальных ДНК, включая ДНК бифидобактерий, которые могут программировать иммунную систему новорожденного. Исходя из этих данных, становится очевидным, что при дефиците индигенных бактерий в кишечнике матери грудное молоко также будет содержать недостаточное их количество. Ученые также не исключают и контактный путь передачи этих бактерий от матери ребенку [10]. Этими данными может быть объяснена выявленная нами взаимосвязь состава индигенной микробиоты матери и ребенка в период грудного вскармливания.

Носительницами различных условно-патогенных микроорганизмов на слизистой оболочке верхних дыхательных путей были 63,8% матерей. Носительство S. aureus выявлено в 41,7%, Enterococcus faecium - в 25%, Haemophilus influenzae - в 11,1%, Strept. pyogenes - в 8,3%, Strept. pneumoniae - в 2,8% и Strept. гр. С - в 2,8% случаев. Дети, вскармливаемые матерями, которые были носительницами S. aureus на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, имели в2,9 раза больший риск инфицирования кишечника, чем дети, чьи матери не были инфицированы стафилококком [RR=2,46 (95% ДИ 1,39-4,29) положительный результат 93,3%; отрицательный результат 61,9%]. Полученные данные свидетельствуют о роли носительства S. aureus на слизистой оболочке верхних дыхательных путей у матери в инфицировании ЖКТ детей грудного возраста. Наши результаты исследования согласуются с данными других авторов. В работе E. Lindberg и соавт. (2004) было показано, что микробиота матери часто является источником колонизации кишечника грудных детей S. aureus [11]. В ситуациях, когда кормящая мать является носителем золотистых стафилококков, колонизация ими кишечника ребенка может достигать 50% случаев [12].

Микробиота кожи грудной железы кормящих матерей была в основном представлена S. epidermidis (83,3%), реже выделялись S. aureus (11,5%), Strept. spp. (7,7%), Enterococcus faecium (3,8%) и грамотрицательные энтеробактерии (5,6%). У всех женщин колонизация кожи грудной железы S. aureus выявлена на фоне носительства микроорганизма на слизистой оболочке верхних дыхательных путей.

Таким образом, наши исследования показали, что все матери детей с затяжными дисфункциями кишечника в грудном возрасте часто имеют нарушения состава микробиоты различных экологических ниш (кишечника, зева, носа, кожи) на фоне хронических заболеваний органов пищеварения и гнойно-воспалительных процессов. Дефицит индигенных бактерий в кишечнике у матери имеет прогностическое значение для развития аналогичных изменений состава КМ у ребенка. Дисбиозная микробиота матери является потенциальным источником инфицирования ЖКТ детей условно-патогенными микроорганизмами и в первую очередь S. aureus. Полученные данные о влиянии микробиоценозов матери на состав кишечной микробиоты ребенка в постнеонаталь-ном периоде являются обоснованием необходимости бактериологического обследования и коррекции микробиоценозов кормящей матери при затяжных дисфункциях кишечника у детей.

РОЛЬ ГРУДНОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ

Грудное вскармливание оказывает существенное позитивное влияние на процесс формирования КМ у детей. Доказано, что в кишечной микробиоте детей при естественном вскармливании доминируют бифидо- и лактобактерии, которые составляют 95% всей микробиоты. У детей на грудном вскармливании выявляется низкое содержание аэробов, среди которых преобладает непатогенная E. coli и редко встречаются условно-патогенные энтеробактерии, клостридии и бактероиды [13-15]. На фоне введения докорма смесью ребенка, получающего грудное вскармливание, показатели его КМ быстро становятся идентичными таковым у детей, получающих искусственное вскармливание [16, 17]. У детей, получающих искусственное вскармливание, кишечная микробиота содержит меньшее количество бифидобактерий. У них достаточно часто выделяются бактероиды и разнообразные УПМ.

Следует помнить, что:

Наши исследования показали, что в период введения прикормов ребенку отмечается повышение частоты выделения условно-патогенных энтеробактерий в основном за счет клебсиелл и гемолизирующих эшерихий, с чем может быть связан повышенный риск развития кишечных дисфункций и инфекций на фоне введения прикормов грудному ребенку.

Грудное молоко является важным источником молочнокислых бактерий для ЖКТ ребенка и содержит различные вещества с пребиотическими свойствами (беталактоза, олигосахариды, лактоферрин и пептиды, лактобумин, казеин), которые стимулируют рост бифидо- и лактобактерий в кишечнике ребенка [18]. Позитивное влияние грудного молока на состав формирующейся кишечной микробиоты ребенка обусловлено также присутствием в нем компонентов, способных ингибировать колонизацию и рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (SIgA, лейкоциты, компоненты комплемента, жирные кислоты, лактоферрин, лизоцим, глюкоконъюгаты и олигосахариды [19-21]. Глюкоконъюгаты и олигосахариды грудного молока блокируют колонизацию кишечного эпителия патогенными микроорганизмами [22]. Лактоферрин снижает содержание железа, необходимого для роста патогенных микроорганизмов. Антистафилококковая активность грудного молока во многом связывается с присутствием в нем жирной кислоты С 18:2 [23].

Секреторные IgA (SIgA) грудного молока играют главную роль в защите ребенка от возбудителей кишечных, респираторных инфекций и инфекций мочевой системы [24-26]. SIgA участвуют в формировании кишечной биопленки и стимулируют рост симбиотической микробиоты [27]. SIgA обладают способностью предотвращать адгезию, инвазию и транслокацию различных инфекционных агентов, а также нейтрализуют их токсины [28-30]. В связи с этим дети, получающие грудное вскармливание, могут быть инфицированы энтеропатогенами и оставаться здоровыми [20]. В грудном молоке обнаружены антитела к антигенам и токсинам многих возбудителей: S. flexneri, S. boydii, S. sonnei, C. jejuni, S. dysenteriae, E. coli (включая энтеропатогенные штаммы), H. pylori, Salmonella, P. aeruginosa, Y. enterocolitica, энтеротоксину V. cholerae, токсину Cl. difficile, ротавирусу [31]. SIgA человеческого молока нейтрализует токсин А Cl. difficile и таким образом предупреждает развитие у грудных детей Cl. difficile -ассоциированных заболеваний. Этим объясняется возможность бессимптомной колонизации грудных детей токсигенными штаммами Cl. difficile [32]. В связи с наличием в грудном молоке специфических SIgA у детей, получающих грудное вскармливание, в 2,3 раза реже развивается кампилобактериоз, чем у детей на искусственном вскармливании [33]. SIgA предупреждают транслокацию бактерий, развитие кишечного сепсиса и некротизирующего энтероколита [34, 35]. SIgA грудного молока предупреждают развитие аме-биаза у младенцев [36]. SIgA вызывают инактивацию различных вирусов (ротавирусов, энтеровирусов, RS-вирусов, герпесвирусов, реовирусов) [37]. SIgA грудного молока обладает нейтрализующей активностью в отношении ротавируса, причем женщины на сроках лактации более 6 мес имели наиболее высокие титры специфических антител [38].

Концентрация SIgA-антител изменяется в течение лактации. Наиболее высокие уровни SIgA обнаруживаются в молозиве (5-16 мг/ мл) [39]. В течение суток ребенок с грудным молоком матери получает до 600-1000 мг SIgA [40, 41]. Общее содержание SIgA в грудном молоке женщин зависит от различных факторов: возраста женщины, срока гестации, ее иммунного статуса и др. Уровень секреторных IgA в молозиве и молоке матерей недоношенных детей выше, чем в молоке матерей доношенных новорожденных [42, 43]. Старшие женщины имеют более низкое содержание SIgA. Эмоциональный стресс, депрессия коррелируют с низким уровнем SIgA, положительные случаи жизни - с высоким уровнем SIgA [44]. Материнские SIgA способствуют колонизации пищеварительного тракта ребенка симбиотическими бактериями («иммунное включение») и предупреждают колонизацию патогенными микроорганизмами («иммунное исключение») [27].

В настоящее время доказано, что грудное молоко содержит SIgA грудного молока, специфичные не только к тем возбудителям инфекционных заболеваний, с которыми мать была инфицирована ранее, но и к микроорганизмам, которыми она или ребенок инфицированы в настоящее время. Микроорганизмы, инфицирующие мать, активируют В-лимфоциты лимфоидной ткани кишечника, респираторного и урогенитального трактов. Активированные В-лимфоциты мигрирует в лимфоидную ткань молочной железы, где они «размножаются» (феномен колонизации иммунных клеток) и начинают активно синтезировать специфичные SIgA-антитела. Таким образом, с грудным молоком ребенок получает антитела, специфичные к патогенам, инфицирующим мать и ребенка [45]. В связи с этим при инфекционных заболеваниях матери грудное вскармливание (за редким исключением) должно быть продолжено!

Специфические антитела, содержащиеся в грудном молоке, фактически являются эпидемиологическим маркёром перенесенной матерью инфекции [46]. В исследованиях M. Noguera-Obenza и соавт. (2003) выявлены различия в частоте обнаружения антител к антигенам энтерогеморрагических эшерихий в грудном молоке женщин, проживающих в различных географических зонах [47].

ВЛИЯНИЕ SIGA ГРУДНОГО МОЛОКА НА СОСТАВ КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ РЕБЕНКА

Для изучения роли секреторных иммуноглобулинов грудного молока в защите от различных инфекционных заболеваний широко проводятся исследования по определению в грудном молоке SIgA, специфичных к антигенам инфекционных возбудителей. Имеющиеся работы в основном посвящены изучению протективной роли грудного молока в отношении возбудителей кишечных инфекций (шигелл, энтеропатогенных и энтеротоксигенных эшерихий, кампилобактеров, ротави-русов, лямблий и др.). В литературе имеются единичные сообщения, посвященные исследованию иммунологических характеристик грудного молока по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.

Нами проведены исследования по изучению содержания общего и специфичных к антигенам условно-патогенных микроорганизмов и эндотоксину секреторных IgA в грудном молоке и дана оценка их возможного влияния на состав КМ ребенка [48]. Исследования проводились на базе кафедры детских инфекций ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» (зав. кафедрой, проф. В.А. Анохин), ЦНИЛ Казанского государственного медицинского университета (зав. лабораторией, ст. науч. сотрудник, канд. мед. наук О.Д. Зинкевич), Республиканской инфекционной клинической больницы (зав. бак. лабораторией Е.С. Герасимова).

Определение общего содержания SIgA в грудном молоке проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Количественные результаты выражали в мг/мл. Определение антибактериальных и антиэндотоксиновых SIgA в грудном молоке проводили методом иммуноферментного анализа. В качестве антигенов эндотоксинов использовали гликолипид Salmonella minnesota RE 595 (Sigma, USA), ЛПС E. coli (Sigma, USA). В качестве антигенов Proteus mirabilis, Pseud. aeruginosa, Staph. aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans использовали ультразвуковые дезинтеграты этих бактерий, подвергнутые ультрацентрифугированию, гельфильтрации и очистке от нуклеиновых кислот цетавлоном [49]. Результаты иммуноферментного анализа выражали в мг/мл и мкг/мл.

У 46 матерей изучен микроэкологический статус и определено содержание в грудном молоке общего SIgA и SIgA, специфичных к антигенам условно-патогенных микроорганизмов и эндотоксину. В исследование включены женщины, вскармливающие доношенных детей первого года жизни с клинически выраженными формами дисбактериоза кишечника, рожденных естественным путем. Отягощенный анамнез имели 42 (91,3%) обследованные женщины. Патологию беременности имели в анамнезе 26,1%, осложненные роды - 21,7%, гнойно-септическую патологию - 17,4%, получали антибактериальную терапию в послеродовом периоде 21,7% матерей данной группы. Эпизоды лактостаза, мастит, трещины сосков выявлены в анамнезе у 24 женщин (52,1%). Абсолютно здоровыми на момент обследования были 13 матерей (11,1%). В структуре материнской патологии преобладали хронические заболевания органов пищеварения (47,2%), хронические гнойно-воспалительные процессы различной локализации (хронический гайморит, тонзиллит, фурункулез) (26%) и инфекционно-воспалительные заболевания мочеполовой системы (19,6%). Практически каждая вторая женщина (47,8%) предъявляла жалобы на постоянную или периодическую дисфункцию кишечника преимущественно в форме атонического запора.

С учетом сроков лактации (более 1,5 мес) у всех женщин было «зрелое» грудное молоко. По данным литературы, среднее содержание SIgA в «зрелом» молоке у здоровых женщин составляет 0,6-1 мг/мл [45]. Среднее содержание SIgA в грудном молоке у всех обследованных матерей составило 0,18±0,02 мг/мл. Большинство обследованных женщин (71,7%) имели концентрацию SIgA в грудном молоке <0,2 мг/мл. Мы не исключаем, что низкие показатели SIgA грудного молока у большинства женщин в нашем исследовании были связаны с перенесенными в послеродовом периоде гнойно-септическими процессами, а также хроническими воспалительными процессами.

Среднее содержание SIgA у здоровых женщин с нормальным составом КМ составило 0,2 ±0,03 мг/мл. Выявлена достоверная обратная корреляционная связь между возрастом ребенка (сроком лактации) и общим содержанием SIgA в грудном молоке (R=-0,47; p=0,01), что соответствует имеющимся данным о динамичном снижении концентрации сывороточных иммуноглобулинов грудного молока с увеличением возраста ребенка. Очевидно, что процессы синтеза секреторных иммуноглобулинов грудного молока соответствуют общим законам развития адаптивного гуморального иммунитета у ребенка.

Не выявлено достоверных различий в содержании SIgA в грудном молоке у здоровых матерей и у матерей с хроническими очагами инфекции (хронический пиелонефрит, тонзиллит и т.д.) (рис. 2-1).

У матерей с хронической гастроэнтерологической патологией содержание SIgA было ниже, чем у здоровых женщин (р>0,05). Достоверно более низкие показатели общего содержания SIgA по сравнению со здоровыми женщинами имели матери, перенесшие мастит. Не выявлено достоверных различий в содержании SIgA в грудном молоке, инфицированном S. epidermidis (0,2±0,03 мг/мл), и в стерильном молоке

Известно, что нормальная микробиота оказывает выраженное иммуномодулирующее действие на человеческий организм. Матери с дефицитом бифидо-, лактобактерий в кишечнике имели более низкое содержание SIgA (0,16±0,14 мг/мл) в грудном молоке, чем женщины с нормальным составом КМ (0,27±0,15 мг/мл) (p =0,04, t-критерий). Таким образом, выявлена связь между состоянием кишечного микробиоценоза матери и общим содержанием SIgA в грудном молоке.

В наших исследованиях выявлено, что молоко у большинства женщин содержит антитела к эндотоксину E. coli (95,7%) и антигены протея (91,3%). Реже обнаруживались SIgA, специфичные к антигенам стрептококков (42,3%), клебсиелл (41,3%), S. aureus (39,1%), Pseudomonas aeruginosa (34,7%), Re -гликолипиду (28,3%) и к антигенам Candida spp. (15,2%). Для каждой женщины был характерен индивидуальный спектр специфических секреторных иммуноглобулинов А грудного молока - от полного их отсутствия у 1 (2,2%) женщины до наличия антител ко всем изученным антигенам у 6 (13,4%) матерей.

Мы попытались выяснить роль выявленных специфических антител в процессах колонизации кишечника ребенка различными представителями условно-патогенных и симбиотических микроорганизмов. Известно, что энтерококки и E. coli являются представителями нормальной кишечной микробиоты и обнаруживаются в фекалиях уже в первые дни жизни ребенка. При избыточном росте данные микроорганизмы могут приобретать патогенный потенциал и вызывать аутоинфекцию [50, 51]. Существуют различные механизмы иммунорегуляции численности эшерихиозной микробиоты и энтерококков. В работе Van der Waaij (1988) [26] показано, что энтерококки, энтеробактерии и другие аэробные бактерии кишечника покрыты SIgA, что препятствует адгезии этих бактерий на слизистой оболочке кишечника и способствует их выведению. В работах отечественных авторов показано, что антитела крови класса IgG к Re -гликолипиду регулируют численность эшерихий в кишечнике у детей и взрослых [52, 53]. При параллельном изучении количественного содержания антител к Re -гликолипиду в пуповинной крови и содержания эшерихий в фекалиях новорожденных выявлено, что при низких титрах антител количество бактерий в 1 г испражнений превышало 10¹⁰ [53].

Антиэндотоксиновые и антистрептококковые SIgA грудного молока не влияют на частоту колонизации толстой кишки E. coli и энтерококки у детей, но оказывают влияние на их численность. Достоверная отрицательная корреляционная связь обнаружена между количественным содержанием антител к Re -гликолипиду и содержанием E. coli (р =0,04), а также между содержанием антител к антигенам Streptococcus spp. и популяционным уровнем Enterococcus spp. (р =0,01). Антиэндотоксиновые антитела грудного молока «ограничивают» избыточный рост эшерихи-озной микробиоты, а антистрептококковые SIgA - кишечных энтерококков у ребенка.

Известно, что эндотоксин и антиэндотоксиновый иммунитет играют важную роль в патологии новорожденных и грудных детей. Доказано, что тяжелые бактериальные инфекции у новорожденных и детей грудного возраста развиваются на фоне угнетения антиэндотоксинового иммунитета [54, 55]. Трансплацентарная передача материнских антител является одним из важных факторов естественного иммунитета, обеспечивающего адаптацию новорожденного к условиям внеутробной жизни. При рождении у детей в пуповинной крови определяются материнские антитела класса IgG к Re -гликолипиду эндотоксина. В нашем исследовании в грудном молоке обнаружены антитела класса SIgA к эндотоксину E. coli у 95,7% и Re- гликолипиду у 28,3% обследованных женщин, что свидетельствует о том, что грудное молоко матери также является источником пассивного антиэндотоксинового иммунитета для грудного ребенка в периоде грудного вскармливания.

В группах детей, получавших «серопозитивное» или «серонегатив-ное» грудное молоко, частота колонизации толстой кишки S. aureus, клебсиеллами, протеями, кандидами достоверно не различалась. Также не выявлено достоверной корреляционной связи между титрами специфичных SIgA и популяционным уровнем протеев, клебсиелл и S. aureus в фекалиях колонизированных детей. На основании полученных данных мы сделали вывод, что антимикробные SIgA грудного молока не влияют на частоту колонизации и на популяционный уровень данных видов микроорганизмов в кишечнике детей грудного возраста и, по-видимому, не выполняют функции «иммунного исключения» по отношению к условно-патогенным микроорганизмам. Этим можно объяснить достаточно высокую частоту встречаемости УПМ в составе кишечного микробиоценоза у детей, получающих грудное вскармливание, и возможность оппортунистической колонизации ЖКТ ребенка на ранних этапах развития КМ. Известно, что аэробы и факультативные анаэробы (E. coli и другие энтеробактерии, энтерококки и стафилококки) первыми колонизируют кишечник новорожденного и подготавливают анаэробные условия для колонизации его облигатной микробиотой (бифидобактериями, лактобактериями, бактероидами). Известно также, что условно-патогенные микроорганизмы наряду с симбиотическими микроорганизмами кишечника являются важным стимулом развития иммунной системы ребенка. Все это позволяет нам рассматривать колонизацию кишечника детей грудного возраста условно-патогенными микроорганизмами как естественный и, возможно, «биологически» целесообразный этап в процессе формирования сложной кишечной микробиоты микроорганизмами.

Специфичные SIgA грудного молока хотя и не препятствовали колонизации кишечника УПМ детей в нашем исследовании, но, по-видимому, предупреждали развитие или «ослабляли» симптомы оппортунистической инфекции, поскольку в наблюдаемой группе детей, несмотря на присутствие условно-патогенных микроорганизмов, не было зарегистрировано симптомов кишечной инфекции, а дисфункция кишечника имела умеренно выраженный характер. Таким образом, специфичные антитела грудного молока не всегда предупреждают колонизацию кишечника энтеропатогенами. В этих случаях, по мнению некоторых исследователей, материнские антитела предупреждают развитие или облегчают течение инфекционного заболевания. Поэтому дети, получающие грудное вскармливание, могут быть колонизированы возбудителями кишечных инфекций и оставаться здоровыми. Имеется предположение, что в присутствии специфических антител грудного молока возбудители инфекционных заболеваний, попавшие в организм ребенка, в основном оказывают иммунизирующий эффект [20].

МИКРОБИОТА ГРУДНОГО МОЛОКА

В настоящее время установлено, что грудное молоко имеет собственный микробиом, включающий более 700 видов бактерий, среди которых преобладают симбиотические микроорганизмы [56]. В грудном молоке здоровых женщин, по данным литературы, обнаружены различные виды комменсальных бактерий: Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Lactococcus crispatus, Lactococcus lactis, Leuconoctoc mesenteroides, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium catenulatum, Staph. epidermidis, Strep. salivarius, Strep. mitis [7, 50, 57, 58]. На основании молекулярно-генетических исследований видового состава и исследования пробиотических свойств штаммов лактобактерий, выделенных из грудного молока и фекалий ребенка, ученые сделали вывод, что грудное молоко является источником кисломолочных бактерий для кишечника ребенка и уникальным синбиотическим продуктом [6, 8, 58].

Доказано, что комменсальные микроорганизмы грудного молока обладают антагонистической активностью по отношению к патогенным возбудителям и оказывают существенное влияние на состав КМ ребенка [50]. Использование молекулярно-генетических методов исследования для определения последовательностей генов рибо-сомальной РНК различных видов бактерий позволило обнаружить в грудном молоке представителей Bacteroides spp., Pseudomonas spp., Haemophilus spp., Veillonella spp., Streptococcus spp., Clostridium spp. [59, 60].

Большинство имеющихся в литературе сообщений посвящено изучению патогенной микробиоты и УПМ грудного молока и ее роли в развитии патологии у ребенка [37, 61, 62]. Доказана возможность инфицирования ребенка через грудное молоко ВИЧ-1, Т-лимфотропным вирусом и цитомегаловирусом. ВИЧ-инфекция и заболевания, вызванные Т-лимфотропным вирусом у матери, являются абсолютными противопоказаниями для грудного вскармливания [37, 61].

Бактериальные инфекции матери редко становятся причиной инфицирования ребенка через грудное молоко [37, 61]. В литературе имеются единичные сообщения о развитии различных форм инфекционных заболеваний, в том числе и таких тяжелых, как менингит и сепсис у недоношенных новорожденных, получавших грудное молоко, инфицированное различными микроорганизмами: стрептококками группы В, клебсиеллами, сальмонеллами, стафилококками [63-67]. В литературе описаны редкие случаи инфицирования детей через грудное молоко листериозом, бруцеллезом, миелоидозом [68-70].

В США, Канаде, Бразилии и в других странах бактериологический контроль грудного молока не является рутинным исследованием и проводится только в тех случаях, когда оно используется для вскармливания недоношенных детей. Донорское молоко не должно содержать S. aureus, Strept. agaltica e, Pseudomonas aeruginosa и грамотрицательные бактерии в количестве более 100 КОЕ/мл [71, 72].

Критериями доказательств инфицирования ребенка через грудное молоко являются [37]:

В практической деятельности отечественные врачи-педиатры часто назначают бактериологическое исследование грудного молока. Для интерпретации результатов они используют методические рекомендации по бактериологическому контролю грудного молока МЗ СССР (1984), согласно которым противопоказанием для грудного вскармливания здоровых детей любого возраста является:

Противопоказанием для грудного вскармливания детей с диареей является:

Следование данным рекомендациям может стать причиной необоснованной отмены грудного вскармливания у практически здоровых детей, а также назначения антибактериальной терапии здоровой матери при асимптоматической бактериолактии, что приводит к усугублению микроэкологических нарушений у матери и ребенка.

Мы изучили частоту и этиологическую структуру бактериолактии у 743 матерей детей с различной инфекционной патологией (гнойно-воспалительные заболевания, кишечные инфекции) и дисбиозом кишечника, получавших лечение в стационарных и амбулаторных условиях [3, 5, 73]. Бактериологическое исследование грудного молока проводилось по стандартной методике с возможностью идентификации только аэробных условно-патогенных микроорганизмов. В 408 случаях матери обследованы в стационарных условиях по поводу гнойно-воспалительных заболеваний, пневмонии, ОКИ и других заболеваний у доношенных новорожденных и грудных детей, а также по поводу воспалительных заболеваний грудных желез у женщин (35,3% случаев). В 335 случаях обследование проводилось в амбулаторных условиях по поводу клинически выраженных случаев дисбактериоза кишечника у грудных детей. В данной группе матерей патологию грудных желез в форме трещин сосков имели 5,4% женщин. Также была проведена оценка прогностического и диагностического значения выделения из грудного молока отдельных видов условно-патогенных микроорганизмов для инфицирования ЖКТ ребенка и развития у него различных форм инфекционной патологии.

Различные виды микроорганизмов в грудном молоке обнаружены в 74,8% случаев: S. еpidermidis (63,5%), S. aureus (8,1%), S. saprophiticus (0,3%), Klebsiella рneumoniaе (1,1%), E. coli (1,1%), Enterobacter aerogenus (0,3%), Enterobacter аgglomerans (0,3%), Enterobacter cloacae (0,13%), Citrobacter diversus (0,13%), Citrobacter freundii (0,13%), Acinetobacter calcoaceticus (0,4%), Proteus mirabilis (0,13%), Candida albicans (0,3%).

Этиологическая структура бактериолактии у матерей при стационарных и амбулаторных случаях заболевания их детей имела существенные различия. У матерей, обследованных в амбулаторных условиях, в 96,6% случаев бактериолактия была асимптоматической, в 5,4% выявлена на фоне трещин сосков. В 62,2% случаев у матерей из грудного молока выделен S. еpidermidis, в 3,3% случаев - S. аureus. У матерей, обследованных в стационарных условиях, в 35,3% случаев бактериолактия выявлена на фоне воспалительных заболеваний грудных желез. Только при стационарных случаях заболеваний у детей в грудном молоке матерей обнаружены грамотрицательные энтеробактерии (5,1%) (Klebsiella pneumoniaе, E. coli, энтеробактеры, цитробактеры, ацинетобактеры) и Candida albicans (0,5%), а S. aureus (12%) выявлялся у них достоверно чаще, чем у женщин, обследованных в амбулаторных условиях (р ≤0,01). Частота выделения S. epidermidis в стационарных условиях составила 64,2%. Полиэтиологичность бактериолактии у женщин, обследованных в стационарных условиях, могла быть обусловлена высокой частотой воспалительных заболеваний грудной железы на ранних сроках лактации, а также риском инфицирования госпитальной микробиотой в родильном доме и инфекционной больнице.

Таким образом, в этиологической структуре бактериолактии доминировал представитель нормальной микробиоты кожи - S. epidermidis. Несмотря на столь частое присутствие в грудном молоке эпидермальных стафилококков, они редко колонизировали ЖКТ младенцев (6,1%), и их роль в развитии инфекционных заболеваний в обследованной группе детей не доказана.

Среди других УПМ из грудного молока наиболее часто выделялся S. aureus (8,4%). В большинстве случаев (87,2%) S. aureus обнаруживался в грудном молоке без признаков воспалительного процесса в молочной железе, т.е. имела место асимптоматическая бактерио-лактия. У всех матерей со стафилококковой бактериолактией одновременно выявлено носительство S. aureus на слизистой оболочке зева и (или) носа, что указывает на необходимость санации данных эпитопов в комплексной терапии бактериолактии. Не выявлено достоверных различий в частоте колонизации S. aureus у детей, получающих стерильное (61,8%) и инфицированное стафилококком грудное молоко (74,3%), что свидетельствует о незначительной роли бактериолактии в инфицировании кишечника детей грудного возраста данным микроорганизмом. Выявлено, что прогностическое значение имеет количественное содержание S. aureus >400 КОЕ/мл (RR=1,8), при меньших значениях риск инфицирования детей не больше, чем у детей, получающих стерильное грудное молоко (табл. 2-5). Тем не менее при содержании S. aureus в грудном молоке <400 КОЕ/мл и одновременном выделении данного микроогранизма из фекалий ребенка трудно полностью исключить роль бактериолактии в инфицировании ребенка. В данных клинических ситуациях целесообразно проведение дополнительных исследований: фаготипирование и (или) сопоставление спектра антибиотикорезистентности выделенных у матери и ребенка штаммов S. aureus.

Основным клиническим вариантом стафилококковой инфекции у детей, инфицированных S. aureus лактогенным путем в постнеонаталь-ном периоде, в наших исследованиях была легкая форма энтероколита (71,4%). Среднетяжелые формы энтероколита (14,3%) развивались только в случаях ассоциации стафилококка с грамотрицательными бактериями (преимущественно Kl. pneumoniae), и поэтому в данных ситуациях однозначно интерпретировать роль S. aureus в развитии инфекционного процесса не представлялось возможным.

42% штаммов S. aureus, выделенных из грудного молока, были резистентны к оксациллину (42%), т.е. являлись метициллинрезистентными стафилококками. Данные штаммы были чувствительны к ванкомицину - в 100%, к ципрофлоксацину и клиндамицину - в 95,2%, фузидовой кислоте и ко-тримоксазолу [сульфаметоксазолу + триме-топриму] - в 90,5%, к хлорамфениколу и азитромицину - в 85,7%, линкомицину - в 76,2%, к амикацину - в 81%, к гентамицину и линкомицину - в 76,2% и к эритромицину - в 62% случаев. Большинство метициллинчувствительных штаммов (75,9-100%) были чувствительны ко всем изученным препаратам, кроме пенициллина, к которому были чувствительны 10,3% штаммов. Высокая частота метициллин-резистентности также выявлена и у штаммов S. epidermidis (69,4%), выделенных из грудного молока. Большинство штаммов S. epidermidis были чувствительны к фузидовой кислоте (94%), амикацину (93%), клиндамицину (90%), линкомицину (86%), ципрофлоксацину (88%), хлорамфениколу (67%). Данные об антибиотикорезистентности S. aureus и S. еpidermidis, выделенных из грудного молока, необходимо учитывать при назначении эмпирической терапии лактационного мастита и стафилококковой инфекции у ребенка, получающего инфицированное грудное молоко.

Грамотрицательная бактериолактия выявлена у 5,3% женщин и только при стационарных случаях инфекционно-воспалительных заболеваний у детей. Почти половина случаев грамотрицательной бактериолактии была вызвана клебсиеллами. В связи с немногочисленностью случаев и полиэтиологичностью грамотрицательной бактериолактии определить ее прогностическое и диагностическое значение не представлялось возможным.

Таким образом, бактериолактия - явление распространенное и может быть вызвана различными микроорганизмами. В микробиоте грудного молока доминируют представители сапрофитной микробиоты кожи - эпидермальные стафилококки. При стационарных случаях заболеваний у детей периода новорожденности в грудном молоке матерей достоверно чаще обнаруживаются S. aureus, и только в данных клинических ситуациях в нем обнаруживаются грамотрицательные энтеробактерии и грибы рода Candida. Высокий RR (8,8) и высокая прогностическая ценность отрицательного результата бактериологического исследования грудного молока (98,6%) свидетельствуют о том, что грудное молоко является основным источником колонизации ЖКТ ребенка S. epidermidis, однако данное явление наблюдается достаточно редко и не имеет клинического значения для ребенка. Отсутствие достоверных различий в частоте колонизации S. aureus у детей, получающих стерильное и инфицированное стафилококком грудное молоко, свидетельствует о незначительной роли бактериолактии в инфицировании кишечника данным микроорганизмом у детей грудного возраста. Однако дети, получающие грудное молоко, инфицированное S. aureus в количестве >400 КОЕ/мл, имеют повышенный риск колонизации данным микроорганизмом.

Выявлена высокая частота метициллинрезистентности среди штаммов S. aureus и S. еpidermidis, выделенных из грудного молока во вне-больничных условиях, что следует учитывать при назначении эмпирической терапии лактационного мастита и стафилококковой инфекции у ребенка, получающего инфицированное грудное молоко.

Список литературы

После родов тип вскармливания и факторы окружающей среды оказывают значительное влияние на развитие микробиома младенца [1]. В настоящее время доказано, что значительное влияние на состав КМ оказывает и место проживания ребенка, что ученые объясняют различиями в питании и образе жизни людей в разных регионах [2].

Имеются сведения о различиях состава КМ у детей, проживающих в разных регионах, по содержанию бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов, энтеробактерий и энтерококков, а также по их видовому разнообразию [3, 4]. Первичная бактериальная колонизация существенно различается у младенцев в развивающихся и промышленно развитых обществах. В развитых странах акушерские и гигиенические мероприятия снизили распространенность патогенных и условно-патогенных бактерий в материнских и детских палатах, что привело к замедлению развития КМ вплоть до полного отсутствия некоторых групп интестинальных бактерий [5].

Дети, рожденные в бедных областях развивающихся стран, раньше колонизируются разнообразной бактериальной микробиотой, чем младенцы в богатом и высокоразвитом обществе. В Пакистане младенцы из малоимущих слоев общества, независимо от способа родов, раньше приобретают кишечные бактерии, и видовой состав их более разнообразный, чем у детей в Швеции [6, 7]. Колонизация энтерококками, лактобактериями и эубактериями также замедлена у детей в западных странах [3, 8]. При отсутствии конкуренции энтеробактерий колонизация кишечника «бактериями кожи» S. epidermidis стала более характерной для новорожденных в развитых странах [9, 10]. Ученые высказывают опасение, что изменение процессов колонизации, связанное с усилением гигиенических мер, может оказать глобальный неблагоприятный эффект на развитие иммунной системы грудных детей.

E.Sepp и соавт. (1997) [3] выявили различия в составе КМ у детей в возрасте 1 года, проживающих в Эстонии и Швеции. Более высокое содержание лактобацилл, эубактерий и энтерококков было выявлено у детей в Эстонии, в то время как у детей в Швеции было выше содержание клостридий и бактероидов.

M.Fallani и соавт. (2010) [2] проводили многоцентровые исследования КМ у грудных детей в пяти европейских странах: Швеции, Шотландии, Германии, Италии и Испании. Изучалось влияние места жительства, способа родов, характера питания и лечения антибиотиками на состав фекальной микробиоты детей. Исследованы фекалии 606 детей в возрасте 6 нед. Для изучения КМ использовалась флюоресцентная гибридизация in situ в сочетании с проточной цитометрией. Выявлено, что влияние места проживания на состав КМ у детей является более выраженным, чем способ родов или характера питания. Дети, проживающие в странах Северной Европы, имели более высокое содержание бифидобактерий, чем дети из стран Южной Европы, для которых были характерны более разнообразная по своему составу КМ и более высокое содержание бактероидов. Ученые сделали вывод, что различия в питании и образе жизни в разных странах Европы могут повлиять на развитие КМ у ребенка.

Таким образом, данные разных авторов свидетельствуют о различиях в составе КМ у детей, проживающих в разных географических зонах и странах, что может быть связано с различными санитарно-гигиеническими условиями, различным уровнем медицинского обслуживания, особенностями питания детей и национальными обычаями. Несмотря на общую тенденцию процессов формирования КМ у детей, рожденных путем КС в разных географических областях, прослеживаются явные различия в частоте и сроках колонизации детей разных стран отдельными представителями интестинальных бактерий. По мнению [11] I. Adlerberthn и соавт. (2008), различия в процессах формирования КМ у детей, рожденных естественным путем и путем КС, а также между детьми в промышленно развитых и развивающихся странах, отражает важность материнской микробиоты и окружающей среды как источников колонизации бактерий.

Список литературы

По данным разных авторов, у детей, получающих грудное вскармливание, относительно стабильный кишечный микробиоценоз с преобладанием бифидобактерий устанавливается к концу 1-2-й недели жизни [1-3]. Однако в настоящее время отечественные исследователи указывают на замедление процесса формирования кишечного микробиоценоза и частое несоответствие состава КМ у здоровых грудных детей общепринятым нормативным показателям [4, 5]. В связи с этим в практической педиатрии часто возникают затруднения при интерпретации микробиологических результатов исследования фекалий, имеет место гипердиагностика дисбактериоза кишечника и проводится необоснованная коррекция состава КМ у здоровых детей [6, 7]. Окончательные сроки формирования КМ у детей, т.е. возраст, в котором она начинает соответствовать составу КМ взрослого человека, до настоящего времени остаются дискутабельными.

В нашей работе мы изучили состав КМ у 178 здоровых детей раннего возраста в Казани. Исследования проводились на базе Центра микроэкологии матери и ребенка, поликлиники № 3 г. Казани [8]. Для исследования были отобраны клинически здоровые дети с неотягощенным преморбидным фоном и нормальным стулом. Все дети первого года жизни получали грудное вскармливание и прикормы в соответствии с возрастом. Дети, получившие антибактериальную терапию, а также с инфекционными и неинфекционными заболеваниями пищеварительного тракта из дальнейшего обследования исключались. Всего обследовано в возрасте 1-6 мес - 29 детей, 6-12 мес - 25, 1-2 года - 28 и 2-3 года - 22 ребенка. Бактериологическое обследование 18 детей проведено в динамике с интервалом 6 мес. Исследование микробного пейзажа толстой кишки проводили в соответствии с общепринятыми рекомендациями. Оценка степени нарушения микробиоценоза толстой кишки проводилась в соответствии с отраслевым стандартом «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Количественное содержание выделенных микроорганизмов выражали в виде десятичного логарифма (lg КОЕ/г).

Исследования показали, что состав кишечного микробиоценоза у клинически здоровых детей первых 2 лет жизни редко соответствует общепринятым нормативным показателям. Нормальный состав КМ (эубиоз) соответственно критериям Отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» имели 9,1-17,6% здоровых детей первого и 35,9% второго года жизни (рис. 2-2). Только в возрасте старше 2 лет большинство (80%) детей имели состав КМ, соответствующий нормативным показателям микробиоты здорового взрослого человека. У большинства детей состав КМ соответствовал критериям нарушений кишечного микробиоценоза 1-2-й степени, а в некоторых случаях у детей грудного возраста - 3-й степени нарушения микробиоценоза кишечника. Выраженные отклонения состава КМ от общепринятой нормы в основном регистрировались у детей первого года жизни.

Отклонения от общепринятой нормы у здоровых детей в основном проявлялись изолированным умеренным дефицитом облигатных бактерий (преимущественно бифидобактерий) и выделением 1-2 видов УПМ. Так, средний популяционный уровень бифидобактерий у детей грудного возраста по результатам наших исследований составил 9,4 lg КОЕ/г, хотя по нормативным показателям содержание этих микроорганизмов в данном возрасте должно достигать 10-11 lg КОЕ/г фекалий, а у детей старше 1 года этот показатель составил 8,4 lg КОЕ/г при норме 9-10 lg КОЕ/г. Бактероиды обнаружены в составе КМ у большинства (88%) детей грудного возраста в количестве 7-8 lg КОЕ/г и у всех детей старше 1 года в количестве 9-10 lg КОЕ/г. Среднее содержание лакто-бактерий, энтерококков и лактозопозитивной E. coli соответствовало общепринятым нормативам и в разных возрастных группах достоверно не различалось. Среднее содержание энтерококков с увеличением возраста ребенка уменьшалось, а бактероидов и молочнокислых стрептококков увеличивалось, что соответствует описанной ранее динамике развития этих микроорганизмов в возрастном аспекте.

Следует отметить высокую частоту выделения и видовое разнообразие факультативной микробиоты у здоровых детей. На частое выделение УПМ у здоровых детей грудного возраста также указывают в своих публикациях другие исследователи [4, 5]. В нашей работе условно-патогенные микроорганизмы в диагностически значимых количествах выделены у детей первого года жизни в 72,7-82,3%, в возрасте 1-2 года - в 53,9% и в 2-3 года - в 20% случаев. По частоте встречаемости в составе КМ доминировали S. aureus (39,4-56,8%) и Klebsiella spp. (32-34,5%), у детей старше 1 года - S. aureus (9-14,3%) и гемолизирующие эшерихии (9-14,3%).

Такие представители условно-патогенных микроорганизмов, как Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Candida spp., Citrobacter freundii, Clostridium spp., Serratia rubedaea и S. epidermidis, выделенные в нашем исследовании у небольшого числа (<25%) здоровых детей раннего возраста, в соответствии с показателем постоянства микробного вида [10, 11] являются случайными видами в микробиоценозе толстой кишки. Следует отметить, что у здоровых детей раннего возраста ни в одном случае не обнаружены Hafnia, Morganella, Providencia, а также неферментирующие бактерии (Pseudomonas, Acinetobacter и др.) и плесеневые грибы. С нашей точки зрения, обнаружение данных микроорганизмов в составе кишечного микробиоценоза является свидетельством дисбиотических нарушений.

Пик частоты колонизации детей условно-патогенными микроорганизмами (82,3%) приходился на второе полугодие жизни, что по срокам совпадало с расширением диеты грудных детей (введением прикормов). В этот возрастной период у здоровых детей достоверно увеличивалась частота выделения грамотрицательных энтеробактерий в основном за счет клебсиелл и гемолизирующих эшерихий (р =0,009). При этом, несмотря на уменьшение объема потребляемого грудного молока, существенных изменений в содержании бифидо- и лактобактерий не происходило. Таким образом, введение прикормов ребенку, получающему грудное вскармливание, приводит к изменениям микробной экологии кишечника с возрастанием частоты колонизации условно-патогенными энтеробактериями. Возможно, этим изменением кишечного микробиоценоза можно объяснить повышенный риск развития кишечных инфекций в период введения прикормов грудному ребенку.

Следует отметить, что среднее содержание большинства видов факультативных микроорганизмов у части здоровых детей существенно превышало возрастные показатели нормы и в некоторых случаях достигало популяционного уровня, при котором, по данным литературы, возможно развитие инфекционного процесса. Наиболее высокое содержание УПМ имели дети первого полугодия жизни, у которых популяционный уровень н екоторых представителей грамотрицательных энтеробактерий (E. coli Hly+, Klebsiella spp., Citrobacter freundii, Enterobacter spp.) достигал 7 lg КОЕ/г фекалий без развития кишечной дисфункции. Отсутствие симптомов кишечной инфекции при столь выраженном обсеменении кишечника грамотрицательными энтеро-бактериями, с нашей точки зрения, может быть связано с апатогенностью данных штаммов микроорганизмов, а также с антиинфекционной активностью грудного молока. С учетом этих данных оценка роли УПМ в развитии инфекционного процесса только по количественному содержанию микроорганизмов в фекалиях недостаточно объективна, поскольку инфекционный потенциал УПМ в значительной степени связан с наличием факторов патогенности и их способностью к синтезу органотропных токсинов [12]. У детей старше 1 года мы отмечали снижение не только частоты, но и среднего содержания всех условно-патогенных микроорганизмов. Таким образом, следует констатировать, что условно-патогенные бактерии являются частыми членами кишечного микробиоценоза у здоровых детей первых 2 лет жизни. По мнению некоторых исследователей, усиление санитарно-гигиенических процедур с целью полной элиминации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из окружения ребенка и его организма, которое успешно проводится в развитых странах, может оказать глобальный неблагоприятный эффект на развитие иммунной системы грудных детей [13, 14]. Согласно распространенной в развитых странах «гипотезe гигиены», недостаточное воздействие в раннем детстве на ребенка возбудителей инфекционных заболеваний и симбиотических микроорганизмов приводит к дисбалансу иммунного ответа. Этим объясняется значительный рост в развитых странах аллергических и аутоиммунных заболеваний [15].

Анализ состава микробиоты толстой кишки у 54 детей в возрасте от 2,5 до 4 мес позволил нам выявить абсолютное сходство бактериограмм фекалий только в одной паре - у однояйцовых близнецов мальчиков в возрасте 3 мес, что может быть связано с влиянием генетических факторов на состав кишечной микробиоты у детей. У остальных 52 детей выявлены различия в качественном и (или) количественном составе КМ, что свидетельствует о разнообразии состава кишечной микробио-ты в грудном возрасте и об индивидуальном характере развития КМ у каждого ребенка. Данное явление, с нашей точки зрения, связано с тем, что формирование КМ у детей является мультифакториальным и генетически обусловленным процессом.

Несмотря на вариабельность состава кишечного микробиоценоза в период его формирования, для практической деятельности врачей- педиатров требуются нормативные показатели состава КМ у детей раннего возраста. Понятие нормы в медицине всегда было предметом дискуссии. В настоящее время определение границ референтных интервалов лабораторных показателей основано на статистических подходах. По данным Р.И. Флетчер и соавт. (1998) [16], большинство количественных биологических признаков имеют отклонения от нормального распределения, и в этих случаях используется про-центильное определение нормы, отражающее интервал значений между произвольно установленными нижними или верхними процентилями общего диапазона. Точка разделения, на которой заканчивается норма и начинается патология, выбирается произвольно и обычно связана с одним из трех критериев патологии: это состояние (значение лабораторного показателя), необычное с точки зрения статистики, оно проявляется в виде болезни и поддается лечению. В соответствии с данными подходами к определению референтных величин мы определили два интервала популяционного уровня индигенных и условно-патогенных микроорганизмов в микробиоте толстой кишки у детей первого и второго года жизни - нормальный (2,5% процентиль-97,5% процентиль) и межквартильный (25% про-центиль-75% процентиль) [17]. Результаты исследования показали, что нормальный интервал (95% объема выборки) включает в себя значения популяционного уровня УПМ, при которых возможно развитие инфекционного процесса. Критерием лабораторной диагностики кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, является их обнаружение в фекалиях в количестве ≥10⁶ КОЕ в 1 г фекалий [18]. По мнению микробиологов, условно-патогенные микроорганизмы при достижении популяционного уровня 10⁶ КОЕ/г формируют бактериальные биопленки, способные инициировать торпидный инфекционный процесс [19]. В связи с этим для определения нормативных показателей состава микробиоты толстой кишки нами выбран межквартильный размах - с 25 по 75% процентиль.

В наших исследованиях наиболее часто отклонения от общепринятых федеральных норм состава КМ имели дети первого года жизни. У детей в возрасте от 1 до 2 лет отмечались стабилизация показателей облигатной микробиоты и снижение частоты колонизации УПМ. И только у детей старше 2 лет состав кишечного микробиоценоза в подавляющем большинстве случаев (80%) соответствовал общепринятым нормативным показателям. В связи с этим мы считаем целесообразным введение нормативных показателей для трех возрастных групп: для детей первого года жизни, детей в возрасте от 1 до 2 лет и старше 2 лет.

Полученные нормативные показатели состава КМ у детей разных возрастных групп Казани представлены в табл. 2.6, из которой видно, что по сравнению с общепринятыми нормами у здоровых детей первого года (на грудном вскармливании) допустимо более низкое содержание бифидобактерий (10⁹ КОЕ/г фекалий); более высокое содержание некоторых видов грамотрицательных условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp.) (≤10⁵ КОЕ/г); гемолизирующих эшерихий (≤10⁴ КОЕ/г), а также S. aureus (≤10⁴ КОЕ/г) и грибов рода Candida (≤10⁴ КОЕ/г). У детей в возрасте от 1 года до 2 лет допустим популяционный уровень бифидобактерий 10⁸ КОЕ/г фекалий, S. aureus ≤10⁴ КОЕ/г, гемолизирующих эшерихий ≤10⁴ КОЕ/г. Содержание клостридий у детей первых 2 лет не должно превышать 10³.

У детей старше 2 лет полученные показатели состава КМ соответствуют нормативным показателям взрослых людей.

Проведенные исследования позволяют констатировать, что для детей в современных условиях жизни характерно длительное формирование кишечной микробиоты (2-3 года) и у каждого ребенка этот процесс протекает индивидуально. В связи с разнообразием состава микробиоты, высокой частотой выделения УПМ у детей первых 2 лет жизни дисбактериоз кишечника в данной возрастной группе следует диагностировать и корригировать только в случаях наличия симптомов поражения ЖКТ, а также заболеваний, которые могут быть ассоциированы с нарушением состава КМ. Микробиологические показатели у здоровых детей раннего возраста, не соответствующие общепринятой возрастной норме состава КМ, не являются патологией, а отражают индивидуальный характер формирования кишечного микробиоценоза и не требуют коррекции.

* Представители родов Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Citrobacter, Enterobacter.

** Pseudomonas, Acinetobacter и др.

Список литературы

Лактобактерии являются важнейшими представителями инди-генной микробиоты различных экологических ниш человека (ЖКТ, респираторного, урогенитального тракта, глаз, носа, кожи) во все возрастные периоды его жизни [1-3]. Несмотря на то что они выделяются из фекалий в меньшей концентрации, чем бифидобактерии, их общий популяционный уровень в микроэкологической системе человека не уступает последним. Наряду с бифидобактериями и энтерококками лактобациллы являются основными защитными симбиотическими микроорганизмами у ребенка [4-6].

Основной зоной обитания лактобактерий является ЖКТ на всем его протяжении - от ротовой полости до толстой кишки. В желудке и тонкой кишке лактобациллы в кооперации с организмом хозяина являются основным микробиологическим звеном формирования колонизационной резистентности [7].

Формирование популяций лактобактерий у ребенка начинается в процессе родов. Материнская кишечная и вагинальная микробиоты являются основными источниками лактобактерий для новорожденного [8]. Y. Matsumiya и соавт. (2002) [9] исследовали частоту и длительность колонизации кишечника новорожденного вагинальными штаммами лактобацилл матери. Идентификация штаммов проводилась с помощью ПЦР. В работе исследовалась лактофлора 86 пар мать-ребенок. Выявлено, что колонизация кишечника у детей происходит в 22,8% наблюдений, но очень редко эти штаммы лактобактерий сохраняются до месячного возраста ребенка. По мнению авторов, колонизация кишечника новорожденного вагинальными штаммами лактобактерий имеет транзиторный характер, и в последующем они заменяются лактобактериями грудного молока или из других источников. В настоящее время доказано, что грудное молоко является источником индигенных бактерий для ЖКТ детей и содержит разные виды лактобактерий (L. salivarius, L. gasseri, L. fermentum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. plantarum, L. reuteri) [6, 10].

Наиболее динамично видовой состав кишечных лактобактерий грудного ребенка изменяется после отмены грудного вскармливания, а также на фоне введения прикорма, когда появляются лактобактерии пищевого происхождения [11].

По данным литературы, имеются явные различия видового состава лактобактерий у грудных детей, проживающих в разных странах. Так, по данным российских исследователей, типичными представителями лактобацилл у детей, находящихся на грудном вскармливании, являются L. acidophilus, L. casei, L. fermentum и L. plantarum [12]. В Швеции характерными видами кишечного микробиоценоза у грудных детей являются L. rhamnosus и L. gasseri, с последующей их сменой на лактобациллы пищевого происхождения - L. paracasei, L. plantarum, L. acidophilus и L. delbrueckii - после отмены грудного вскармливания [11]. Преобладание L. acidophilus в кишечнике у иранских детей, получающих грудное вскармливание, продемонстрировано в работе M. Mirlohi и соавт. (2008) [13]. Достаточно убедительных и доказанных объяснений различий в видовом составе лактобактерий у детей, проживающих в разных странах и регионах, в литературе нет. На наш взгляд, это может быть связано с особенностями питания и микроэкологического статуса как матерей, так и их детей.

Исключительно важная роль лактобактерий в жизнедеятельности человеческого организма определяется многообразием выполняемых ими функций. Они принимают участие в регулировании метаболических процессов, создании высокой колонизационной резистентности слизистых оболочек, ингибируют адгезию, пенетрацию и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладают широким спектром антимикробных механизмов, продуцируют биологически активные вещества белковой и небелковой природы [14-16].

Высокая антагонистическая, ферментативная и иммуномодулирую-щая активность лактобактерий является обоснованием их широкого использования для создания пробиотических препаратов и продуктов функционального питания.

В настоящее время лактосодержащие пробиотики широко используются в лечении инфекционной диареи различной этиологии у детей. Сочетание базисной терапии кишечных инфекций с приемом пробио-тиков, содержащих лактобактерии, сокращает тяжесть и длительность диареи у детей [17, 18]. Доказана эффективность лактосодержащих пробиотиков в лечении и профилактике не только бактериальных, но и вирусных диарей [19, 20]. Наиболее изучен этот вопрос в плане лечения ротавирусного гастроэнтерита [21]. Включение в терапию пробиотиков способствует сокращению сроков основных клинических проявлений вирусных диарей, восстановлению микробиоты кишечника и санации организма от возбудителя [22, 23]. Лактобактерии эффективны для профилактики и лечения ААД [18, 24-26]. У пациентов, получавших на фоне антибактериальной терапии лактосодержащие пробиотики, достоверно реже развивалась диарея и реже обнаруживался токсин клостридий, чем у пациентов, получавших вместо пробиотика плацебо [27, 28]. Одновременный прием лактобактерий и метронидазола для лечения антибиотикоассоциированного колита, вызванного Clostridium difficile, достоверно снижает частоту рецидивов данного заболевания по сравнению с монотерапией метронидазолом [29].

Эффективность применения лактобактерий в лечении и профилактике инфекционных диарей связывается не только с синтезом антимикробных веществ, но и с их способностью восстанавливать колонизационную резистентность кишечника, ингибировать адгезию и рост патогенных микроорганизмов, а также усиливать иммунный ответ организма на возбудителя [30]. Известно, что снижение колонизационной резистентности ЖКТ может быть связано не только со снижением популяционного уровня, но и с утратой антагонистической активности симбионтных микроорганизмов по отношению к различным УПМ. Лактобациллы обладают различной по силе и спектру антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Несмотря на общность функций, механизм защитного и иммуномодулирующего действия у разных видов лактобацилл различается, и их роль для физиологии человека неравнозначна. В связи с этим важными являются идентификация видов лактобацилл, представленных в микробиоценозе у людей разных возрастных групп, и определение штаммов с потенциально протективным эффектом [31]. Ранее идентификация различных видов бактерий осуществлялась в основном по фенотипическим характеристикам, однако данный метод является трудоемким и длительным, в связи с чем для этой цели в настоящее время все чаще применяется метод генотипирования [32, 33].

В составе кишечного микробиоценоза человека в настоящее время идентифицированы следующие виды лактобацилл: L. acidophilus, L. crispatus, L. delbrueckii (ssp. bulgaricus и ssp. lactis), L. fermentum, L. gasseri, L. jensenii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus и L. salivarius [31]. К автохтонным (индигенным) видам отнесены лактобактерии, которые с большим постоянством выявляются у людей в разных возрастных группах: L. acidophilus, L. fermentum, L. ruminis, L. salivarius. Такие виды как L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. delbrueckii, L. brevis, L. johnsonii, L. plantarum, L. fermentum, чаще обнаруживаются в кишечнике человека транзиторно и, вероятно, являются представителями аллохтонной микробиоты. Источником этих видов в основном является ферментированная пища, а также микробиота полости рта [34].

Видовой состав лактобактерий у взрослых людей достаточно стабилен и имеет индивидуальные особенности, что в основном связано с особенностями питания индивидуума. Для детей грудного возраста характерен процесс сукцессии лактобацилл со сменой видов лактобацилл на фоне изменения характера питания (перевод на искусственное вскармливание, введение прикормов) [35].

Имеются данные о различиях видового состава лактобактерий у грудных детей, получающих различные виды вскармливания, а также у детей, проживающих в странах с разной степенью индустриализации [12, 13, 35, 36].

Согласно данным российских исследователей, у детей, получающих грудное вскармливание, наиболее типичными представителями кишечных лактобацилл являются L. acidophilus, L. casei, L. fermentum и L. plantarum [12]. У детей Швеции в период грудного вскармливания наиболее часто обнаруживаются виды L. rhamnosus и L. gasseri. После отмены грудного вскармливания происходит сукцессия популяций лактобактерий на лактобациллы пищевого происхождения: L. paracasei, L. plantarum, L. acidophilus и L. delbrueckii [36]. О преобладании L. acidophilus в видовом составе лактобактерий у японских детей, получающих грудное вскармливание, доложено в работе R. Satokari и соавт. (2002) [37]. По данным M. Mirlohi и соавт. (2008) [13], L. acidophilus и L. plantarum являются преобладающими видами кишечных лактобактерий у грудных иранских детей. Различие в видовом составе кишечных лактобактерий у детей может иметь определенное клиническое значение. В работе F. Savino и соавт. (2005 г.) [38] показано, что только у детей с кишечными коликами обнаруживались L. brevis и L. lactis, в то время как у здоровых детей на грудном вскармливании доминирующим видом была L. acidophilus. Авторы предполагают, что Lactobacillus brevis и L. lactis могут участвовать в генезе кишечных колик, провоцируя усиление моторики кишечника.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАКТОБАКТЕРИЙ У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ ГРУДНОГО ВОЗРАСТА

Исследования выполнялись на базе кафедры детских инфекций ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» (зав. кафедрой д-р мед. наук, проф. В.А. Анохин), лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (зав. лабораторией д-р мед. наук, проф. В.М. Бондаренко), бактериологической лаборатории Республиканской инфекционной клинической больницы г. Казани (зав. лабораторией Е.С. Герасимова).

Проведена оценка видового состава, антагонистической активности и антибиотикорезистентности 20 фекальных штаммов бактерий рода Lactobacillus, которые в ПЦР при использовании родоспецифических праймеров генерировали четкие ампликоны, относящие их к роду Lactobacillus [39]. Штаммы выделены из фекалий у здоровых детей грудного возраста: 7 штаммов лактобактерий выделены от детей, получавших грудное вскармливание; 5 штаммов - от детей, получавших грудное вскармливание и прикорм в соответствии с возрастом; 5 штаммов - от детей, получавших адаптированную смесь без пробиотиков, и 3 штамма - от детей, получавших адаптированную смесь без пробио-тиков и прикорм.

ВИДОВОЙ СОСТАВ КИШЕЧНЫХ ЛАКТОБАКТЕРИЙ У ДЕТЕЙ ГРУДНОГО ВОЗРАСТА

Определение видовой принадлежности лактобацилл проводилось с помощью ПЦР с набором праймеров, приведенных в табл. 2-7. В качестве контрольных использовали известные пробиотические штаммы L. acidophilus ВКМ В846, L. plantarum 8PA-3, L. fermentum 97, L. rhamnosus GG, L. delbrueckii 78 NCIB, L. casei 1-25 [40]. Производственный штамм L. fermentum 90-4С (Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля), по данным амплификации c видоспецифическими праймерами, использованными в данной работе, был отнесен к виду L. plantarum.

В работе использовались родоспецифические праймеры для определения родовой принадлежности микроорганизмов, выросших на среде МРС (Lactobacillus spp.), а также видоспецифические праймеры для идентификации видов лактобацилл, наиболее часто встречаемых в составе кишечного микробиоценоза человека: L. acidophilus, L. plantarum, L. delbrueckii, L. fermentum L. rhamnosus, L. casei, L. рaracasei и L. zeae.

Результаты видовой идентификации показали, что доминирующими видами лактобацилл у детей грудного возраста являются L. fermentum и L. rhamnosus, которые обнаружены у 60% обследованных детей (табл. 2-8). Лактобациллы других видов (L. casei - 25%, L. paracasei - 15%) встречались только у детей, получавших прикормы. Ни у одного ребенка не обнаружены микроорганизмы видов L. acidophilus, L. plantarum и L. zeae. Для детей, получавших грудное вскармливание, а также прикормы на этом фоне, было характерно наличие ассоциаций 2-3 видов лактобактерий со стабильным присутствием L. fermentum и L. rhamnosus. В настоящее время известно, что источником этих видов лактобацилл может быть микробиота грудного молока. У детей, получавших искусственное вскармливание, выделялись преимущественно нетипированные лактобактерии. С учетом полученных данных при проведении коррекции нарушений кишечного микробиоценоза у грудных детей предпочтительными являются пробиотики, содержащие L. fermentum и (или) L. rhamnosus.

АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

Антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным возбудителям является основной характеристикой клинических и производственных штаммов лактобацилл, используемых для приготовления пробиотиков и продуктов функционального питания [41]. Лактобактерии оказывают многостороннее и полифункциональное влияние на иммунные реакции макроорганизма: усиливают активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы, естественных киллеров и цитотоксических лимфоцитов, модулируют реакции Т- и В-клеточного звена иммунного ответа. Сложная система взаимодействий, складывающаяся между индигенной интестинальной микробиотой и макроорганизмом, является основой нормальной функции его иммунной системы [42].

Примечание. н/т - не типированы.

Представители рода Lactobacillus синтезируют различные антимикробные вещества, способные угнетать рост и жизнедеятельность патогенных и условно-патогенных организмов. Антагонистическая активность лактобацилл в отношении большинства грамположительных патогенов обусловлена бактерицидным эффектом продуцируемых ими бактериоцинов [43]. Большое значение в антибактериальной активности лактобацилл в отношении грамотрицательных возбудителей имеет синтез органических кислот, перекиси водорода и лизоцима [33, 44].

Бактериоцины представляют собой комплексы, состоящие из белкового или полипептидного компонентов, проявляющие бактерицидную активность против родственных видов бактерий [43, 45]. В зависимости от штамма-продуцента, химической природы, способа воздействия на бактериальную клетку выделяют несколько групп бактериоцинов: лантибиотики (бактериальные термостабильные полипептиды), микроцины (термостабильные пептиды), высокомолекулярные термолабильные протеины и комплексы протеинов, для проявления антимикробной функции которых необходимы углеводная или липидная составляющие [33, 46]. Бактериоцины блокируют белковый синтез в микробных клетках, подавляют репликацию ДНК, нарушают процесс деления клетки, мембранный потенциал клетки, ингибируют транспорт лейцина и пролина. Доказано, что бактериоцины имеют широкий спектр антимикробной активности. Они ингибируют рост и размножение бацилл, клостридий, сахаромицетов, стрептококков, стафилококков, энтеробактерий, псевдомонад, листерий и грибов рода Candida, пилорического хеликобактера [47-50].

Внутри одного и того же вида лактобактерий, изолируемых из кишечника человека, могут существовать как сильные, так и слабые антагонисты [51]. Практический интерес представляют сильные антагонисты с широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Данные штаммы лактобацилл имеют селективные преимущества и длительно персистируют в ЖКТ, в связи с чем используются для создания пробиотических препаратов. В составе пробиотических препаратов бактериоцины и продуцирующие их штаммы посредством избирательного воздействия на микрофлору нормализуют микробный биоценоз при некоторых патологических состояниях человека [52].

Нами проведена оценка антагонистической активности 18 клинических изолятов лактобактерий, выделенных у практически здоровых детей грудного возраста, в отношении различных видов УПМ [53]. Антагонистическую способность лактобацилл выявляли на специальной плотной питательной среде «методом отсроченного антагонизма». На поверхность плотной среды МРС-4 наносили бляшками (4-8) лакто-бациллы и культивировали при температуре 37 °С в течение 48 ч. Далее на крышку чашки наносили 5 мл хлороформа, оставляя чашки перевернутыми на 5 мин. Убитые в парах хлороформа бактерии помещали в термостат на 30 мин для испарения хлороформа. Затем на чашки наслаивали слой 0,7% полужидкого мясопептонного агара с равномерно распределенной в нем тест-культурой и вновь культивировали при 37 °С в течение ночи. Положительный результат учитывали по появлению вокруг бляшки зоны отсутствия роста. В качестве контроля использовался производственный штамм бактериоцинпродуцирующий Lactobacillus plantarum 8RA-3 и штамм L № 97 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва). В качестве индикаторных культур изучали штаммы S. aureus, E. coli Hly+, Kl. рneumoniae, Kl. оxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundi, выделенные у детей с дисбактериозом кишечника. Антагонистическая активность лактобацилл оценивалась как высокая при ширине зоны задержки роста УПМ >25 мм, умеренная - 13-25 мм и низкая - 0-12 мм [54].

Выявлена различная степень антагонистической активности клинических изолятов, производственного и музейного штамма лактобацилл по отношению к условно-патогенным микроорганизмам (табл. 2-9).

Производственный штамм L. plantarum 8RA-3 продемонстрировал низкую антагонистическую активность в отношении фекальных штаммов S. aureus и гемолизирующей E. coli и не ингибировал рост штаммов Kl. рneumoniae, Kl. оxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris и Citrobacter freundii. Штамм L № 97 продемонстрировал высокую антагонистическую активность к S. aureus, но не проявил антагонизма ко всем индикаторным штаммам грамотрицательных энтеробактерий.

У всех клинических изолятов выявлена различная степень антагонистической активности по отношению к S. aureus. У 7 изолятов лактобактерий выявлена низкая, у 2 изолятов - умеренная и у 4 штаммов (L. fermentum № 5, 10, 11, 13, 20) - высокая антагонистическая активность к S. aureus. В отношении грамотрицательных энтеробактерий антагонистическая активность лактобактерий проявлялась значительно реже. Выявлено полное отсутствие антагонизма клинических изо-лятов лактобактерий по отношению к Kl. рneumoniae, Kl. оxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii (рост тестовых культур УПМ «газоном» на поверхности среды). 4 изолята лактобактерий не ингибировали рост гемолизирующей E. coli, 3 - проявляли к ней низкую, 6 - умеренную и 4 изолята - высокую антагонистическую активность

Примечания. f - L. fermentum, rh - L. rhamnosus, с - L. casei, par - L. paracasei, н/т - не типированы.

(№ 7, 12, 15, 20). У 1 культуры выявлена слабая антагонистическая активность к Citrobacterfreundii

В нашем исследовании мы обнаружили штаммы лактобактерий с потенциально пробиотическим эффектом: 5 штаммов лактобактерий, обладающих высокой антагонистической активностью по отношению к S. aureus, и 4 штамма с высокой антагонистической активностью по отношению к гемолизирующей E. coli. Наибольший интерес с этой точки зрения представляет штамм L. fermentum № 30/4, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении обоих микроорганизмов. Сопоставлены результаты исследования антагонистической активности клинических изолятов лактобактерий к условно-патогенным микроорганизмам in vitro и частоты содержания аналогичных видов УПМ в фекалиях обследованных детей. S. aureus в количестве 4-6 lgKOE/г обнаружен в составе микробиоты толстой кишки у 8 из 18 детей. Выявлено, что у детей, колонизированных лактобактериями с антагонистической активностью ≥20 мм, S. aureus в составе фекальной микробиоты обнаружен в 1 из 6 случаев, в то время как при антагонистической активности лактобактерий <20 мм он обнаружен в 7 из 11 случаев. Выявлена высокая частота колонизации обследованной группы детей с грамотрицательными энтеробактериями, которые обнаружены в составе микробиоты толстой кишки у 13 из 17 детей.

Массивный рост гемолизирующей E. coli выявлен у 1 ребенка, колонизированного лактобактериями со сниженной в отношении данного микроорганизма антагонистической активностью. Клебсиеллы (Kl. pneumoniae и Kl. uxytoca) в количестве 6-8 lg/KOE/г фекалий обнаружены у 6 детей. У 6 детей выявлен рост Proteus mirabilis в количестве 6 lg/KOE/г.

Таким образом, выявлены существенные различия среди клинических штаммов лактобактерий по способности ингибировать рост УПМ. Обращало на себя внимание полное отсутствие антагонизма клинических изолятов, а также производственного штамма L. plantarum 8RA-3 и музейного штамма L № 97 лактобактерий по отношению к клиническим штаммам Kl. pneumoniae, Kl. uxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii. Отсутствие антагонистической активности у индикаторных культур, производственного и музейного штамма лактобактерий к одним и тем же штаммам УПМ могло быть связано не только с недостаточной продукцией антимикробных факторов лактобактериями, но и устойчивостью к бактериоцинам самих условно-патогенных микроорганизмов. По данным литературы, устойчивость к бактериоцинам у различных микроорганизмов может быть обусловлена: изменением строения их поверхностных структур; синтезом молекул, связывающих эти белковые соединения, и наличием протеаз, вызывающих их разрушение, а также активным выведением бактериоцинов или формированием микроорганизмами биопленок и колоний [55].

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что недостаточная антибактериальная активность лактобактерий по отношению к различным видам УПМ может быть причиной снижения колонизационной резистентности кишечника и избыточного роста УПМ даже при нормальном популяционном уровне лактобацилл. Использование количественного критерия содержания индигенных микроорганизмов для оценки колонизационной резистентности ЖКТ имеет относительное значение. С учетом полученных данных в терапию клинически выраженных случаев дисбактериоза кишечника, протекающих с избыточной пролиферацией клебсиелл, протеев, цитробактеров, стафилококков, следует включать пробиотики, содержащие штаммы лактобактерий, высокоантагонистичные в отношении данных микроорганизмов, даже при нормальном содержании лактобактерий у ребенка [53].

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ К АНТИМИКРОБНЫМ СРЕДСТВАМ

Общеизвестно неблагоприятное воздействие антибиотиков на индигенную микробиоту человека. Антибиотикотерапия приводит к снижению колонизационной резистентности, что является основным механизмом развития дисбактериоза кишечника и ААД.

В настоящее время микробиологи озабочены проблемой, связанной с возможным участием молочнокислых бактерий в распространении генов лекарственной устойчивости среди различных видов микроорганизмов [56-58]. В случаях когда гены резистентности к антибиотикам локализуются на плазмидах или конъюгативных транспозонах ком-менсальных микроорганизмов, они могут передаваться оппортунистическим или патогенным микроорганизмам, инфицирующим человека [59]. D. Gevers и соавт. (2003) [57] в опытах in vitro выявили возможность передачи R-плазмид от диких культур лактобактерий различным видам грамположительных бактерий. Антибиотикорезистентность пробиотических штаммов лактобактерий позволяет им выжить в условиях одновременного приема этих препаратов, однако при этом возникает вероятность переноса генов резистентности от пробиотиков к патогенным для человека микроорганизмам как непосредственно, так и опосредованно через комменсальную микробиоту. В случае возникновения инфекций, вызванных полирезистентными штаммами лактобактерий, спектр антимикробных препаратов, эффективных для лечения такого пациента, существенно сокращается [60].

Антибиотикорезистентность является важной характеристикой лактобактерий человека и особенно штаммов, используемых для производства пробиотиков и продуктов функционального питания. Лактобациллы, по данным разных авторов, чувствительны к пенициллинам и ингибиторам β-лактамаз, хлорамфениколу, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину. Большинство видов резистентны к гликопептидам, аминогликозидам, оксациллину, цефалоспоринам, фторхинолонам, сульфаниламидным препаратам, метронидазолу [61, 62]. Изучение чувствительности к антибиотикам клинических изолятов лактобактерий имеет практическое значение, поскольку позволяет определить спектр препаратов, безопасных для лактобактерий ребенка. Особенно актуальна эта ситуация у часто болеющих детей, получающих повторные курсы антибактериальной терапии.

Мы оценили чувствительность кишечных лактобактерий, выделенных от 20 детей грудного возраста, к 15 антибактериальным препаратам. Чувствительность лактобактерий к антимикробным веществам определяли методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton в соответствии с методиками, рекомендованными NCCLS (Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard - Seventh Edition. Document M2-A7, M100-S11, 2000-2001) с помощью стандартных дисков фирмы HiMedia (Индия). В работе использовались диски с пенициллином, ампициллином, амоксиклавом, клавулановой кислотой, цефтриаксоном, цефотаксимом, линкомицином, амикацином, ванкомицином, линезолидом, эритромицином, ципрофлоксацином, ко-тримоксазолом [сульфаметоксазол + триметоприм], фуразоли-доном, нитроксолином, метронидазолом.

Изученные изоляты лактобацилл в 100% случаев были резистентны к фуразолидону (Fur), ципрофлоксацину (Cipr), ко-тримоксазолу [суль-фаметоксазол + триметоприм] (Cotr), цефтриаксону (Ceft), нитроксолину (Nit) и метронидазолу (Metr). 95% штаммов были резистентны к ванкомицину (Van) (рис. 2-3). Большинство лактобактерий были также устойчивы к амикацину (Ami), ампициллину (Amp), амоксиклаву (Amo) и цефотаксиму (Cefo). От 60 до 70% штаммов лактобактерий были чувствительны к пенициллину (Pen), линезолиду (Linez), эритромицину (Ery) и линкомицину (Link). Все культуры лактобактерий были полирезистентны и проявляли одновременную устойчивость к 8-15 антибактериальным препаратам. Только 1 штамм был устойчив

Так, штамм L. paracasei, выделенный в монокультуре у ребенка 6 мес, получавшего искусственное вскармливание, был резистентен ко всем тестированным антибактериальным препаратам, в то время как штамм L. fermentum, выделенный от ребенка в возрасте 3 мес, получавшего грудное вскармливание, проявлял резистентность только к 8 препаратам.

Таким образом, выявлена высокая частота резистентности кишечных лактобактерий к наиболее часто используемым антибиотикам и химиопрепаратам. Все штаммы лактобацилл были резистентны к ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу [сульфаметоксазол + триметоприм], цефтриаксону, нитроксолину, метронидазолу, что согласуется с данными других исследователей о резистентности лактобактерий к большинству ингибиторов синтеза аминокислот [62, 63]. Не исключено, что резистентность к данным антибактериальным препаратам является истинной [64]. В нашем исследовании 19 из 20 штаммов лактобактерий были резистентны к ванкомицину. По данным R. Coppola и соавт. (2005) [63], большинство видов лактобактерий имеют высокий уровень резистентности к гликопептидам (ванкомицину и тейкопланину). Истинная резистентность к ванкомицину характерна для некоторых видов лактобактерий [61]. С учетом полученных данных фуразолидон, ко-тримоксазол [сульфаметоксазол + триметоприм], цефтриаксон, нитроксолин и метронидазол могут считаться наиболее безопасными препаратами для кишечных лактобацилл грудных детей. Относительно безопасными в плане угнетения лактобактерий также являются амикацин, ампициллин, амоксиклав и цефотаксим. Применение пенициллина, линезолида, эритромицина и линкомицина в терапии различных инфекционных заболеваний будет сопряжено с риском угнетения лактобактерий ребенка, в связи с чем в данных клинических ситуациях целесообразно применение лактосодержащих пробиотиков.

Таким образом, выявлен ряд региональных особенностей видового состава, антагонистической активности и антибиотикорезистентности кишечных лактобактерий у детей грудного возраста. Полученные данные следует учитывать при назначении детям антибактериальных препаратов по поводу интеркуррентных инфекций и пробиотиков для коррекции кишечного микробиоценоза.

Список литературы

Успехи, достигнутые в последние два десятилетия в области генетики, молекулярной микробиологии и микроэкологии, расшифровка механизма развития воспалительных заболеваний привели к очевидному выводу об общности патогенеза многих заболеваний человека и значительно изменили наши представления о роли нормобиоты, обусловливающей развитие эндогенной инфекции [1, 2]. При изучении природы токсического инфекционного процесса было показано, что это наиболее крайнее состояние больного организма, часто проявляющееся высокими случаями летальности, несмотря на все усилия современной терапии [3, 4].

Общие понятия и термины

С позиции общей биологии нормальная нормобиота рассматривается как совокупность микробных биоценозов различных биотопов открытых полостей организма хозяина. Под биотопом, или «местом жизни» (от греч. bióte - жизнь и tópos - место), в микроэкологии принято считать участок слизистой оболочки, кожи или орган организма хозяина с однотипными условиями существования для заселяющих его микроорганизмов. Под биоценозом (от греч. bióte - жизнь и koinós - общий) подразумевают совокупность разных видов микроорганизмов, населяющих данный биотоп, характеризующихся определенными взаимоотношениями между собой, а также приспособленностью к данным условиям обитания [5-8]. Биотоп и биоценоз вместе образуют экосистему ЖКТ. В микроэкологии существуют такие понятия, как «биота» и «микробиота» (от греч. bióte - жизнь и micrós - малый), «экологическая ниша», «локализация».

Следует отметить, что все микроорганизмы, обитающие в том или ином биотопе, находятся между собой в сложных симбиотических взаимоотношениях, связанных с синтезом различных факторов адаптации и антагонистической активности в ассоциации с определенными трофическими цепями [7, 9-12]. При этом микроорганизмы каждого вида занимают в этой цепи определенное место, обозначаемое термином «экологическая ниша», который отражает функциональную роль каждого вида в данной экосистеме. Заселение симбионтами определенных участков слизистых оболочек открытых полостей организма определяют термином «локализация».

Характеризуя микробиоту биотопа, часто используют термины «популяция» и «сообщество». Под популяцией имеют в виду совокупность особей одного вида, занимающих определенный биотоп и обладающих общим генофондом. Под сообществом подразумевают скопление нескольких популяций различных видов микроорганизмов. Сообщества микроорганизмов образуют биоценоз определенного биотопа и вместе с организмом хозяина формируют постоянные или временные экосистемы. Внутри экосистем популяции и сообщества микроорганизмов образуют свои экологические ниши [5-7]. При этом симбионтные микроорганизмы, колонизирующие пристеночную зону слизистых оболочек ЖКТ, организованы в сообщества, получившие название «биопленки». Под бактериальной биопленкой подразумевают микробное сообщество, в котором адсорбированные на поверхности и друг к другу бактериальные клетки заключены в матрицу внеклеточных полимерных субстанций, продуцируемых микроорганизмами в соответствии с уровнем развития популяции и условиями транскрипции генов. Формирование бактериальной биопленки способствует выживанию микроорганизмов в определенном биотопе организма хозяина и зависит от их регуляторной системы, обозначенной как QS (Quorum Sensing - чувство кворума) [8, 13]. Интересные данные недавно были получены при электронной микроскопии ультратонких срезов биопленки однородных и смешанных микробных сообществ бифидобактерий, лактобацилл, лактококков, энтерококков, стафилококков, псевдомонад, различных видов энтеробактерий и дрожжей рода Candida, выращенных на соответствующих плотных питательных средах. Выявлено, что бактерии защищены комплексом оригинальных поверхностных структур, объединяющих все клетки в единую систему, при этом эти же структуры обеспечивают контакт с внешней средой как отдельных клеток, так и бактериального сообщества в целом. Следует отметить, что структура, находящаяся с наружной стороны биопленки: поверхностная пленка, - одновременно выполняет и защитную, и объединяющую микробное сообщество функции. Основным элементом поверхностной пленки является трехслойная мембрана, ультратонкое строение которой соответствует универсальной плазматической мембране. Поверхностная пленка наряду с трехслойной мембраной включает дополнительные структуры в виде аморфных полисаха-ридных слоев, образующихся с внутренней или с внешней стороны, а в некоторых случаях - и с обеих сторон одновременно. Выявлено экранирование бактериальных клеток в биопленке полисахаридными слоями межклеточного матрикса, заполняющими толщу компактного микробного сообщества [13].

Позитивная роль и патогенный потенциал симбионтной нормобиоты

Позитивную роль микробиоты кишечника трудно недооценить: регуляция газового состава кишечника и других полостей организма; морфокинетическое действие (у безмикробных животных снижены митотическая активность энтероцитов, скорость их миграции по микроворсинкам); продукция энзимов, участвуюших в метаболизме белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот; продукция биологически активных соединений (витамины, антибиотики, гормоны и др.); участие в водно-солевом обмене, в рециркуляции желчных кислот, холестерина и других макромолекул (кишечные микроорганизмы не только способны разрушать, модифицировать молекулу холестерина, но могут синтезировать данный стерин, а также вызывать деструкцию и трансформацию желчных кислот, стероидных гормонов); мутагенная/антимутагенная роль; детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов (процесс детоксикации идет по нескольким направлениям: биотрансформация с образованием нетоксичных конечных продуктов; микробная трансформация, сопровождающаяся образованием метаболитов, подвергающихся быстрой деструкции в печени; изменение полярности соединений, приводящее к изменению скорости их экскреции в окружающую среду или транслокации из кишечника в кровяное русло); обеспечение колонизационной резистентности и участие в неспецифической стимуляции иммунокомпетентных клеток и тканей (адъювантно-активные соединения, имеющие в качестве действующего начала ЛПС и мурамилдипептид, образуются из нормальной микробиоты кишечника человека под воздействием лизоцима и других литических агентов, постоянно присутствующих в просвете кишечника) [6, 9, 10, 14-17]. Известна и негативная роль КМ: пищевые токсикоинфекции (отравление продуктами, обсемененными патогенными микроорганизмами и бактериальными токсинами), конкуренция с хозяином за питательные вещества при массивном росте бактерий, источник эндогенной инфекции и хранилище микробных генов, включая геномные «острова» патогенности [9, 18, 19].

Скорее всего, развитие воспалительного процесса, вызванного факультативной дисбиозной нормобиотой, тесным образом связано с формированием биопленок, концентрация клеток возбудителя в которых достигает плотности 10⁶ -10⁹ клеток/см² , что в дальнейшем определяет развитие инфекции с образованного своего рода «плацдарма» атакующих организм сгруппированных патогенов [1, 2, 9].

Данные последних лет свидетельствуют об определяющем значении иммуногенетического статуса макроорганизма, факторов окружающей среды и дисбиозной КМ в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника, причем последней отводится важная этиологическая роль [1, 9, 16, 20-24]. Ранее на гнотобионтах было показано, что колиты не развиваются в стерильных условиях содержания животных; у человека воспалительные заболевания кишечника наблюдаются в биотопах с максимальной концентрацией микроорганизмов. Более того, терминальные отделы кишечника (подвздошная, слепая и прямая кишка) являются зонами относительного стаза, что создает условия для продолжительного контакта слизистой оболочки с кишечным содержимым. Повышенная проницаемость слизистой оболочки играет определяющую роль в поддержании состояния хронического воспаления вследствие генетической предрасположенности и/или в результате прямого контакта с бактериями и продуктами их жизнедеятельности. Основными факторами, способствующими развитию воспалительных заболеваний кишечника, являются отсутствие толерантности к симбиотической микробиоте, несостоятельность барьерной функции кишечника, нарушение функции иммунорегуляторных клеток. Все они, тем не менее, взаимосвязаны и могут быть одновременно и причиной, и следствием [7, 9, 16, 17].

Барьерная функция кишечника

Эпителию слизистой оболочки принадлежит решающая роль в организации барьера между хозяином и окружающей средой. Этот барьер состоит из трех относительно автономных барьеров (физического, врожденного иммунного и адаптивного иммунного), защищающих организм от вторжения и системного распространения как патогенных, так и комменсальных микроорганизмов. Надо отметить, что эпителиальная поверхность слизистых оболочек характеризуется наличием фолликулярных образований, содержащих определенные специализированные клетки, названные М-клетками, которые из просвета полости постоянно захватывают микроорганизмы и представляют их дендритным клеткам, которые распознают поглощенное и, мигрируя в эффекторные участки иммунной системы, формируют иммунный ответ.

Комменсальные микроорганизмы принимают активное участие в формировании структурно-функциональной организации слизистой оболочки и ее иммунной системы, при этом кишечный барьер обеспечивает комбинацию реактивных и защитных механизмов, которые достигают определенного равновесия, препятствующего вторжению комменсальных микроорганизмов внутрь организма, и поэтому создают состояние постоянного (или «физиологического») воспаления.

В отличие от комменсалов, энтеропатогенные возбудители активно инвазируют в эпителиоциты, интенсивно стимулируют врожденные механизмы защиты слизистой оболочки и вызывают развитие воспалительных процессов, часто с разрушением эпителия. Поврежденный кишечный эпителий может утрачивать барьерные функции с последующей транслокацией микроорганизмов и их токсинов во внутреннюю среду макроорганизма. Восстановление целостности эпителия осуществляется в результате ускоренного деления клеток крипты при участии стволовых клеток, активируемых сигнальными молекулами, в том числе метаболитами нормальной микробиоты. Образующиеся эпителиальные клетки мигрируют вверх от основания кишечных крипт.

Помимо физического барьера, эпителиальная поверхность в ассоциации с факторами врожденного иммунитета и комменсальными микроорганизмами формирует колонизационную резистентность, играющую ведущую роль в индукции и экспрессии адаптивной иммунной реакции слизистой оболочки. Физический барьер эпителиальной поверхности возникает также благодаря слою гликокаликса, который выделяется специальными клетками и покрывает апикальную мембрану эпителия. Толстый слой слизи, состоящий из различных муцинов, формирует дополнительную систему защиты, при этом бокаловидные клетки, продуцирующие муцин, присутствуют как в крипте, так и на ворсинчатом эпителии по всей длине тонкой и толстой кишки, включая прямую кишку. Физические или химические факторы, а также инфекционные агенты могут индуцировать массивный выброс муцина бокаловидными клетками, причем количество и качество муциновых зерен зависят от характеристик индуктора.

Основная функция слизистого слоя - формирование полупроницаемого защитного барьера, что позволяет кишечнику восстанавливаться после повреждения. Показано участие муцинов в адгезии бактерий к энтероцитам кишечника. Симбионтные бактерии способны преодолевать этот защитный физический барьер, если они синтезируют муциназы и факторы адгезии и колонизации.

Основное отличие патогенных микроорганизмов от комменсальных заключается в том, что патогены, используя факторы инвазии, достигают апикальной поверхности кишечного эпителия и даже собственной пластинки (lamina propria), вызывая нарушение барьерных функций слизистой оболочки. Гомеостаз эпителия требует постоянного поддержания баланса между реактивностью и толерантностью к микроорганизмам просвета кишечника [25]. Разрушение этого баланса ведет к развитию воспаления кишечника.

Регулирующую роль плотности бактериальных популяций микроорганизмов на поверхности слизистой оболочки кишечника играют антибактериальные пептиды и нейтрофилы хозяина. Основной класс таких пептидов - дефенсины, которые можно разделить на два семейства: α-дефенсины и β-дефенсины. Первые синтезируются клетками Панета, которые находятся в основном в тонкой кишке; вторые (β-дефенсины) синтезируются по всему желудочно-кишечному тракту, включая толстую кишку. Вероятно, им принадлежит важная регулирующая роль в контроле численности большинства популяций бактерий. У людей описан также антибактериальный пептид - кателицидин - СL37 (или CAMP), постоянно присутствующий в кишечном эпителии. В поддержании барьерной функции эпителия слизистой оболочки участвуют и нейтрофилы, привлекаемые к месту инфекции, главным образом в ответ на градиент CXC-хемокина лиганда 8 (ИЛ-8), который синтезируется эпителиальными клетками в ответ на действие метаболитов микроорганизмов, колонизирующих эпителий. С базальной стороны эпителия по градиенту патогензависимых аттрактантов нейтрофилы могут проникать в просвет полости и проявлять свою антибактериальную функцию. Повышенная экспрессия антибактериальных пептидов так же, как и привлечение воспалительных клеток, образует один из важнейших эшелонов защиты организма от проникновения микроорганизмов на уровне эпителия [10, 17].

В организации адаптивного иммунного ответа на поверхности слизистой оболочки эпителиальные клетки также принимают активное участие. Эта функция включает взаимодействие клеток эпителия с антигенпрезентирующими и другими лимфатическими клетками. В захвате из просвета полости антигенов (в том числе микроорганизмов) активное участие принимают включенные в эпителиальные фолликулы М-клетки, которые далее представляют захваченные иммуногены лим-фоидным тканям слизистой оболочки, которые могут формировать на них иммунные реакции [11, 17, 22]. Отсутствие у М-клеток прикрывающего гликокаликса способствует захвату ими комменсальных бактерий и представление их дендритным клеткам (DC), в которых небольшое количество бактерий может выживать и вызывать T-клеточные независимые IgA-реакции, объясняющие, как полагают, способность к регуляции количества эндогенных бактерий [10, 26]. Взаимодействия бактерий с лимфоидной тканью слизистой оболочки кишечника представлены на рис. 4-1 [10].

Эффекторные механизмы слизистой оболочки включают ряд гуморальных (в частности, sIgA) и клеточных (B-клетки, T-клетки и лимфоциты) факторов, ассоциированных с функцией лимфатической ткани кишечника. Полагают, что для предотвращения развития воспаления, а также чрезмерной реакции, если она возникает, важно, чтобы большая часть кишечной поверхности была защищена от плотного контакта с бактериями и продуктами их жизнедеятельности. Таким образом, слизистая поверхность находится в постоянном состоянии низкого уровня воспаления, включая слизистую оболочку толстой кишки, испытывающую максимальное давление со стороны огромного количества комменсальных микроорганизмов, не содержащая, как правило, нейтрофилов, являющихся индикаторами кишечного воспаления. Можно полагать, что в условиях нормобиоценоза сигналы, генерируемые КМ, хотя и воспринимаются иммунокомпетентными клетками, ограничиваются ответной слабо выраженной воспалительной реакцией без клинического выражения. Однако даже симбионтные представители нормальной микробиоты могут обусловливать состояние бактериемии и аутоиммунных процессов различной локализации, развивающихся на фоне иммунодефицитного состояния и нарушенной барьерной функции кишечника, способствующих транслокации бактерий и их токсинов из просвета кишки в системный кровоток [1, 6, 9, 19].

Проникновению во внутреннюю среду организма хозяина могут способствовать энтеротоксины энтеробактерий, особенно в сочетании с термостабильным эндотоксином грамотрицательных бактерий, с термолабильными энтеротоксинами стафилококков и холероподобными токсинами [27, 28]. Что касается жизнеспособных клеток возбудителя, то именно гематогенный путь обеспечивает поступление транслоцировавших микроорганизмов в отдаленные ткани и органы с возможным развитием полиорганной патологии [1, 2, 6].

Механизмы развития воспалительных заболеваний кишечника

Прежде чем перейти к рассмотрению возможных механизмов развития эндогенной инфекции, следует остановиться на причинах нарушения микробиоценоза кишечника, являющегося очагом инфекционного процесса. Одной из причин является избыточный рост бактерий, который может наблюдаться в различных отделах (биотопах) ЖКТ. В некоторых случаях наблюдается колонизация желудка и верхних отделов кишечника микроорганизмами вследствие нарушения кислотного барьера желудка. В большинстве случаев наблюдают синдром избыточного роста в тонкой кишке. При этом синдроме происходит колонизация грамотрицательными микроорганизмами тонкой кишки вследствие нарушения кишечного клиренса, причинами которого могут быть дефект перистальтики или анатомическая патология кишечника (осложнения хирургических вмешательств, дивертикулы, фистулы), что вызывает механическую задержку эвакуации и застой кишечного содержимого.

Нарушение перистальтики связывают с патологией нервно-мышечной системы кишечника, включая миопатию и невропатию, а также аутоиммунные, инфекционные, эндокринные и онкологические заболевания [14, 29]. Описанные изменения на организменном уровне могут привести не только к синдрому избыточного роста в тонкой кишке, но и к нарушению толерантности к резидентной нормобиоте, что влечет за собой необратимые последствия на клеточном и молекулярном уровнях: воспаление слизистой оболочки, нарушение барьерной функции, транслокацию бактерий и эндотоксинов из просвета кишечника в лимфатические узлы и системный кровоток со смертельными осложнениями по типу острого панкреатита, перитонита или сепсиса [15, 30, 31].

Бактериальная транслокация

Полагают, что механизм толерантности к симбиотической микробиоте кишечника в основном определяется толерантностью к эндотоксину грамотрицательных бактерий и/или липотейхоевым кислотам и пептидогликану грамположительных микроорганизмов. Этот феномен является наиболее значимым для формирования устойчивого микробиоценоза и в то же время наименее изученным. В эксперименте на лабораторных животных толерантность к эндотоксину можно воспроизвести путем ежедневной инъекции нетоксичных доз ЛПС - в этом случае формируется ранняя, преходящая фаза толерантности. Поздняя фаза толерантности - более продолжительная и наступает через 72 ч: она специфична для гомологичного эндотоксина, может быть индуцирована инъекцией бактерий или ЛПС и перенесена от иммунизированного животного к неиммунизированному с помощью сывороточной фракции. Эта поздняя толерантность основана на формировании антител к ЛПС грамотрицательных бактерий. При ежедневной наработке ЛПС бактериями, происходящей в кишечнике человека с момента его рождения, обе фазы толерантности существуют одновременно. Ранняя фаза толерантности не зависит от серологических механизмов иммунного ответа и является следствием клеточных механизмов. Первичная инъекция ЛПС провоцирует освобождение цитокинов. Эта реакция практически отсутствует при последующих инъекциях ЛПС чувствительным лабораторным животным и человеку. Установление толерантности характеризуется подавлением синтеза ФНО-α и ИЛ-1 - основных медиаторов патогенного провоспалительного действия эндотоксина [6, 12].

Кроме того, на кишечных эпителиальных клетках человека показано, что хроническое воздействие ЛПС ингибирует продукцию ИЛ-8 - основного хемоаттрактанта, инициирующего воспалительную реакцию в ответ на стимуляцию ФНО и ИЛ-1, причем этот процесс происходит независимо от функции TLR, участвующих в распознавании эндотоксина [3, 6]. Тем не менее ЛПС не влияет на другие воспалительные пути, функционирующие независимо от ИЛ-8, в частности на секрецию ИЛ-6 и последующую индукцию трансэпителиальной миграции нейтрофилов в ответ на инвазию, например, сальмонеллами. На самом деле кишечные эпителиальные клетки продуцируют ИЛ-6, но почти не синтезируют ИЛ-1 и ФНО-α. Кроме того, преимущественное воздействие имеет трансформирующий фактор роста, обладающий выраженными толерогенными свойствами и способностью к регуляции продукции IgA, который вносит свой вклад в задержку развития классического воспаления [6]. Толерантность может быть преодолена увеличением количества ЛПС, вводимого или поступающего в кровоток из кишечника при избыточном росте грамотрицательных бактерий. Повышение уровня эндотоксинов в кровотоке может быть вызвано поступлением в организм гепатотропных ядов, препятствующих детоксикации ЛПС в печени, а также может быть связано с иммунодефицитным состоянием.

Толерантность к аутомикробиоте кишечника, эволюционно формировавшаяся миллионы лет, является частью естественного иммунитета млекопитающих. Она может быть индуцирована даже у адренал-эктомированных животных, лишенных способности синтезировать кортикостероиды - сильнейшие ингибиторы провоспалительных цитокинов, и для ее преодоления необходим мощный стимул, а точнее, совокупное воздействие ряда патогенетических факторов.

Нарушение барьерной функции кишечника

Одним из наиболее значимых в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника и системных осложнений является состояние барьерной функции кишечника. От функциональной стабильности эпителиального слоя зависит подавление транслокации бактерий нормобиоты и их токсинов в лимфу и системный кровоток. В меньшей степени это касается патогенных бактерий, таких как шигеллы, сальмонеллы, листерии, энтероинвазивные кишечные палочки, которые способны проникать непосредственно в цитоплазму кишечных эпителиоцитов. На этом пути бактерии транспортируются в отдельных везикулах от апикальной к базолатеральной поверхности эпителиальных клеток и захватываются субэпителиальными макрофагами, которые обеспечивают включение иммунного ответа [3, 5, 6]. Однако некоторые виды микроорганизмов способны проникать через межклеточное пространство [32, 33]. Более того, если эпителий кишечника воспален и/или изъязвлен, то микроорганизмы и тем более продукты их жизнедеятельности беспрепятственно пересекают эпителиальный барьер и достигают лимфоцитов собственной пластинки и, наконец, брызжеечных лимфатических узлов. Дальнейшая их судьба зависит от состояния иммунитета организма [11, 17]. В здоровом организме моментально включается иммуновоспалительный механизм, нацеленный на быструю элиминацию проникших патогенов при развитии фазы острого воспаления, с последующей столь же быстрой коррекцией воспаления - антивоспалением [3, 10].

На проницаемость эпителиального кишечного барьера влияет множество факторов: острая эндотоксемия, окислительный стресс, клеточная гипоксия, подавление метаболизма, увеличение кислотности, экспозиция NO (оксид азота), провоспалительные цитокины, бактериальные токсины, парентеральное питание, протеолитические ферменты, состояние клеток глии, массивная кровопотеря, термальное поражение и др. [6, 7, 34]. Воспалительные заболевания кишечника недаром называют болезнями проницаемости, так как характерное для них повышение проницаемости кишечника коррелирует со степенью поражения.

Для того чтобы выяснить, является ли увеличение проницаемости первичным дефектом, или оно вызвано воспалением и повреждением слизистой оболочки, указанные параметры, а также секреция цитокинов были изучены у мышей, дефицитных по ИЛ-10. У животных, выращенных в стандартных условиях, уже в 2-недельном возрасте выявлялось повышение проницаемости кишечного барьера в подвздошной и толстой кишке, однако гистологические признаки воспаления при этом отсутствовали. Этот первичный дефект проницаемости был связан с повышенной секрецией провоспалительных цитокинов интерферона-γ и ФНО-α. Проницаемость барьера оставалась повышенной в процессе нарастания воспаления. У мышей-нокаутов, выращенных в стерильных условиях, признаки воспаления отсутствовали, проницаемость оставалась в пределах нормы, как и уровень цитокинов.

Многочисленные исследования свидетельствуют о тяжелом иммунологическом дисбалансе при неспецифическом язвенном колите, болезни Крона, что проявлялось в усилении выработки провоспалительных цитокинов (ФНО-α, интерферона-γ, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12), отсутствующих в условиях естественной толерантности, и снижении синтеза противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-11), приводящих в итоге к агрессивному иммунному ответу на нормальную КМ. Было предпринято несколько попыток обнаружить специфический микробный агент, вызывающий воспалительные заболевания кишечника, но безрезультатно. Анализ КМ больных людей выявил различия ее состава по сравнению со здоровыми лицами. При болезни Крона отмечалось повышение количества бактерий представителей родов Bacteroides, Eubacterium и Peptostreptococcus при значительном снижении Bifidobacterium и Lactobacillus [9], а при язвенном колите отмечена увеличенная концентрация различных анаэробных бактерий [15, 16, 21]. Генетические факторы, несомненно, играют определяющую роль при энтеропатии. Есть данные, что предрасположенность к болезни Крона связана с фенотипом CaRD-15 и мутацией гена NOD-2, результатом которой является дефект синтеза ИЛ-10 мононуклеарами крови в ответ на стимуляцию TLR бактериальными иммуномодуляторами и клетками бактероидов, что опосредует неконтролируемое воспаление [35].

Следует отметить чрезвычайно важный факт, который имеет отношение и к генетическим факторам, и к дефекту проницаемости. У здоровых лиц, имеющих родственные отношения первой степени с пациентами, страдающими болезнью Крона, выявлено нарушение кишечной проницаемости в 10-30% случаев. В этой же группе риска, характеризующейся повышенной проницаемостью барьера, в 100% случаев обнаружены признаки антигенной иммунной стимуляции, тогда как ни один из родственников с нормальной проницаемостью таковыми не обладал. Это означает, что у родственников первой степени с предсуществующим дефектом барьерной функции в дальнейшем может развиться болезнь Крона после экспозиции с определенными антигенами окружающей среды [17, 35].

Наиболее уязвимым звеном в обеспечении эпителиального кишечного барьера является состоятельность клеточных контактов. Это всецело энергозависимый процесс, который определяется структурно-функциональной стабильностью митохондрий, поставляющих энергию в форме аденозинтрифосфата при окислительном фосфорилировании. Препараты, разобщающие окислительное фосфорилирование в митохондриях, являются стрессовыми провоцирующими факторами, дестабилизирующими белки цитоскелета, участвующие в формировании контактов. В резекционных образцах тканей при болезни Крона, а также у лабораторных животных, подверженных метаболическому стрессу, выявлено нарушение митохондриальных структур, понижение уровня аденозинтрифосфата в воспаленных тканях больных с отсутствием гистологических признаков воспаления [15]. Не исключена возможность того, что дефект митохондрий предрасполагает индивидуума отвечать на резидентную симбиотическую микробиоту как на угрожающий провоспалительный стимул.

В эксперименте на модели эпителиоидных клеток Т-84, подверженных метаболическому стрессору динитрофенолу, показано, что непатогенные неинвазивные E. coli С25 вызывают нарушение проницаемости энтероцитов и индуцируют синтез ядерного фактора NF-kB с последующей продукцией хемоаттрактанта ИЛ-8, что провоцирует развитие воспалительного ответа [36]. Непатогенный штамм комменсал E. coli С25 также индуцировал вакуолизацию и набухание митохондрий в клетках Т-84, активацию ядерного фактора с последующим нарушением барьерной функции и проявлением бактериальной транслокации через клеточный монослой [33, 37]. Одним из медиаторов этих процессов является ФНО-а, который значительно усиливал транслокацию E. coli С25 через монослой клеток кишечного эпителия [38].

В развитии воспалительной реакции на микробные антигены задействованы различные типы иммунокомпетентных клеток слизистой оболочки кишечника: микрофаги, Т- и В-лимфоциты, NK-клетки (естественные киллеры). NK-клетки и макрофаги являются первичными мишенями при бактериальной стимуляции. Им отводится ведущая роль в защите организма от кишечных микробных антигенов. Есть данные, что лактобациллы способны активировать моноциты/макрофаги с индукцией ФНО-α и ИЛ-12. Подобно интерферону-γ, ИЛ-12 обеспечивает природный антибактериальный иммунитет, способствуя созреванию эффекторных клеток в NK- и CD8⁺ -клетки, осуществляющие адаптивный иммунный ответ. Лактобациллы также могут активизировать NK-клетки периферической крови человека с индукцией интерферона-γ [15]. Участие NK-клеток в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника пока мало изучено, но его нельзя исключить по следующим причинам: во-первых, благодаря синтезу интерферона, нарушающего проницаемость кишечного барьера, и, во-вторых, вследствие их способности мигрировать в любые ткани и вызывать воспалительный ответ, изначально нацеленный на элиминацию возбудителя. Кроме того, возможно развитие аутоагрессии с участием не только клеток моноцитарно/макрофагального ряда, но и NK-клеток. Их роль в механизме аутоиммунных поражений подтверждается многочисленными фактами роста числа и цитолитической активности этих клеток при системных заболеваниях соединительной и нервной тканей: ревматоидном артрите, системной красной волчанке, рассеянном склерозе [17, 24]. Возможно, дальнейшие исследования, нацеленные на изучение роли NK-клеток при воспалительных заболеваниях кишечника и ряде других системных заболеваний, помогут наконец выяснить истинный патогенез вышеупомянутых заболеваний и, соответственно, определить наиболее действенные методы их лечения.

Как и почему развиваются хронические с торпидным клиническим течением воспалительные заболевания? Несмотря на обилие информации, ответ на эти основные вопросы остается неизвестным. С одной стороны, генетическая предрасположенность, нарушение иммуново-спалительной толерантности, несбалансированный ответ на собственные микробные антигены, с другой - нарушение энергообеспечения нормальных функций, в том числе и барьерной. Что первично: дефект проницаемости или воспаление? Нарушение проницаемости может индуцировать воспаление, но и продукция воспалительных медиаторов может усугубить дефект проницаемости. Повышение проницаемости является основной причиной массивной транслокации бактерий и их токсинов из просвета кишечника в лимфу и системный кровоток. При этом облегчается проникновение из просвета кишечника в организм практически любого из представителей аутомикробиоты.

Следует обратить внимание на следующие основополагающие аксиомы: во-первых, продукция провоспалительных цитокинов при воспалительных заболеваниях кишечника повышена при отсутствии гистологических признаков воспаления; во-вторых, последнее не означает отсутствия воспаления на молекулярном уровне; в третьих, в норме эпителиальные клетки кишечника толерантны к резидентной микро-биоте, ЛПС грамотрицательных бактерий, липотейхоевой кислоте и пептидогликану грамположительных бактерий, т.е. они не отвечают на соответствующую стимуляцию активацией провоспалительного каскада (индукцией NF-χB и последующим синтезом провоспалительных цитокинов); и в четвертых, на воспаление расходуется практически вся энергия клеток и организма. Изначально активированные иммунные клетки вследствие энергодефицита неспособны адекватно реагировать на последующий патогенный стимул. Это известный в науке факт: чтобы ответить, необходима энергия. Любая антигенная стимуляция вызывает поступление ионов Ca²⁺ в клетки из окружающих тканей, преимущественно из костной, в результате чего развивается остеопороз. Учитывая медленное, постепенное развитие воспалительных заболеваний кишечника, хроническое течение с выраженными обострениями, связанными со стрессом (эмоциональные и физические нагрузки), в этом случае, по-видимому, имеет место постепенное накопление количественных изменений, постоянно поддерживающих состояние воспаления, кульминацией чего является дефект барьерной функции кишечника и иммунной системы, транслокация бактерий и продуктов их жизнедеятельности из кишечника в кровоток, что, в конце концов, приводит к полиорганной патологии [38-40].

Транслокацию бактерий из кишечника в кровоток у человека определить сложно, однако существуют косвенные свидетельства в пользу таковой. У экспериментальных животных нарушение кишечного барьера с последующей транслокацией может быть индуцировано различными патологическими состояниями, включая геморрагию, травму, термальное поражение, парентеральное питание, ишемию кишечника и закупорку желчных протоков, панкреатит, резекцию печени, эндотоксемию, радиационную и цитотоксическую терапию, воспаление. Более того, эндотоксин определяется в крови экспериментальных животных после различных стрессов - ишемия верхней брызжеечной артерии, термальное поражение, артериальная гипок-семия. Антисыворотка против эндотоксина повышает выживаемость животных при ишемии кишечника, геморрагическом шоке, облучении и термальном поражении [6]. Термальное поражение крыс, вызванное ожогом, индуцировало транслокацию бактерий и эндотоксина (уровень последнего в воротной вене повышался до 300 пг/мл при норме меньше 20), а также способствовало повышению чувствительности купферовских клеток к ЛПС. Увеличение уровня аланинтрансами-назы у ожоговых животных свидетельствовало о поражении печени. В клетках печени крыс в 4 раза повышался уровень ФНО-α и в 2 раза - уровень катионов кальция. Деконтаминация кишечника антибиотиками предотвращала отмеченные нарушения и летальность, а поражение почек после ожога коррелировало с нарушением барьерной функции кишечника у крыс, эндотоксемией и бактериемией [6, 10, 39].

Транслокация бактерий из кишечника в кровоток может индуцировать воспаление и негативно воздействовать на защитные механизмы удаленных органов. Так, например, ишемия кишечника у крыс вызывала поражение легких. При этом также отмечались нарушение кишечного барьера, увеличение количества бактерий, ЛПС и ФНО-α в крови. Предварительная антимикробная санация кишечника в значительной степени снижала исследуемые показатели [6]. Метронидазол и ципрофлоксацин показали свою эффективность в лечении воспаления толстой кишки [31]. Одним из известных примеров транслокации бактерий в брызжеечные лимфатические узлы и перитонеальную полость у человека являются септические осложнения аппендицита. Инфекционный некроз поджелудочной железы, вызванный кишечными бактериями, лежит в основе развития панкреатогенного сепсиса: при остром панкреатите отмечается значительное увеличение проницаемости кишечного барьера, что коррелирует с эндотоксемией [30]. Существует прямая связь между воспалением кишечника и артропатией, которая может быть индуцирована не только патогенными микроорганизмами, но и симбиотической факультативной нормальной микробиотой, способной поддерживать хронический воспалительный процесс в условиях потери толерантности и нарушения кишечного барьера. Предполагается участие КМ также в патогенезе системных заболеваний соединительной ткани, например анкилозирующего спон-дилоартрита, при котором не удается окончательно идентифицировать специфический микробный агент [23]. В развитии идиопатической болезни Паркинсона показано участие нервной системы кишечника и дорзальных ядер блуждающего нерва. Предполагают, что причиной этого заболевания является не центральная нервная система, а пока еще неидентифицированный возбудитель, способный проходить слизистый барьер ЖКТ и далее через постганглионарные кишечные нейроны и демиелинизированные волокна достигать ядер блуждающего нерва и центральной нервной системы, поднимаясь выше по мозговому стволу в подкорковые ядра и, наконец, в кору головного мозга. Нельзя также исключить и гематологический путь проникновения бактерий и токсинов в периферическую и центральную нервную систему, учитывая тот факт, что эндотоксин способен разрушать гематоэнцефалический барьер [31].

Наиболее тяжелая и трудно диагностируемая полиорганная патология может возникать в результате сочетанного воздействия различных видов микроорганизмов. Не только патогенные бактерии, вирусы, грибы и их токсины, но также и компоненты микроорганизмов-комменсалов (например, пептидогликаны лактобацилл и сенной палочки) способны многократно усиливать токсичные эффекты эндотоксина, вызывая синергическое увеличение генерации кислородных радикалов и провоспалительных цитокинов со всеми вытекающими последствиями, вплоть до летального эффекта. Показано 1000-кратное усиление действия эндотоксина энтеробактерий при одновременном внутрибрюшинном введении в организм мышей стафилококкового энтеротоксина [28]. Выявлен и альтернативный диареегенный механизм действия эндотоксина грамотрицательных бактерий: дозозависимая экспрессия цитокинов и молекул адгезии на эпителиоцитах в собственной пластинке тонкой кишки сопровождается активацией нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов с выходом лейкоцитов из сосудов и инфильтрацией ими кишечной стенки и развитием инфекционно-воспалительного типа диареи.

Широко обсуждается участие ЛПС грамотрицательных бактерий в поддержании липидного дистресс-синдрома и прогрессировании атеросклероза [29, 41]. Недавно была детально обсуждена проблема развития эндогенной оппортунистической инфекции [3]. Известно, что на каждом участке эпителиальных покровов имеется характерная для него микробиота, к которой организм формирует местную толерантность. Стабильность симбиотической микробиоты осуществляется с помощью клеток естественного и адаптивного иммунитета и эпителиальных клеток, которые активируются через образраспознающие рецепторы [26, 38, 40, 42].

В гомеостаз включены многообразные процессы, начиная с создания слизистого слоя на эпителии, регуляции реакций в эпителиальных клетках и субэпителиальной лимфоидной ткани, где синтезируются специфические молекулы IgA, которые, проходя через эпителий, присоединяют молекулу белка и превращаются в секреторные антитела, резистентные к разрушению ферментами. Активированные через образраспознающие рецепторы эпителиальные клетки Панета продуцируют различные антимикробные соединения, главными из которых являются дефенсины. Миграция через эпителиальный слой нейтро-филов также опосредуется активацией эпителиальных клеток через образраспознающие рецепторы. Формирование местной толерантности к части нормальной микробиоты является, несомненно, защитной реакцией организма, направленной на поддержание в нем стабильного микробиоценоза.

Установлено, что формирование местной толерантности происходит в первые месяцы жизни ребенка, при его начальном контакте с микробиотой и продуктами питания, через так называемое первичное воспаление, захватывающее всю субэпителиальную лимфоидную ткань. Для развития местной толерантности необходимо многократное повторное введение малых доз антигена, при этом в формировании местной толерантности важную роль играют супрессия образраспоз-нающих рецепторов в ответ на контакт с микроорганизмом и регуляторные Т-лимфоциты, особенно CD3⁺ , СD4⁺ и СD25⁺ клетки [3, 17]. Синергизм частично объясняет тяжелое клиническое течение при смешанных бактериальных инфекциях по сравнению с заболеванием, вызванным одним видом возбудителя.

В заключение следует отметить, что расшифрованные механизмы микробной транслокации из просвета кишечника в системный кровоток свидетельствуют о широком распространении этого феномена. Однако дальнейшая судьба микроорганизмов, транслоцировавших во внутреннюю среду организма хозяина, тесно связана с функцией врожденного иммунитета и степенью патогенности или апатогенности инфекта.

Список литературы

В последние годы на фоне широкого применения антибактериальных препаратов в педиатрии возросла актуальность изучения ААД [1, 2]. По данным Всемирной организации здравоохранения (2004), ААД - это 3 и более эпизодов неоформленного стула в течение 2 или более последовательных дней, развившихся на фоне приема антибактериальных средств и в течение 8 нед после их отмены, если не выявлено других причин.

В отечественной и зарубежной литературе нет точных данных относительно частоты развития ААД в детской популяции, в проведенных ранее исследованиях этот показатель колеблется: 5-40% [3-5]. В работах этих авторов чаще всего ААД наблюдалась у детей в возрасте от 2 мес до 2 лет независимо от способа введения антибиотика, преимущественно на фоне лечения амоксициллином/клавулановой кислотой (10-25%), эритромицином (16%) и цефалоспоринами (9-43%). В амбулаторной педиатрической практике ААД, по мнению A. Damrongmanee (2007), встречается в 6,2% случаев [6]. Исследований о частоте развития ААД у детей грудного возраста не проводилось.

Возникающие на фоне приема антибиотиков диареи могут иметь инфекционную и неинфекционную природу. В своих работах 1998-2006 гг. C. Hogenauer доказал, что патогенез развития ААД напрямую может быть связан с подавляющим воздействием антибиотиков на облигатную нормальную микробиоту, зависеть от класса антибактериальных препаратов [7-9].

К неифекционным причинам развития ААД можно отнести аллергические, токсические и фармакологические побочные эффекты собственно антибиотиков. Прямое токсическое действие на слизистую оболочку кишечника некоторых антибиотиков (например, неомицина, канамицина, тетрациклинов) вызывает мальабсорбцию и диарею [10].

Эритромицин и другие 14-членные макролиды за счет стимуляции мотилиновых рецепторов желудочно-кишечного тракта увеличивают скорость желудочной эвакуации и время транзита кишечного содержимого в проксимальных отделах толстой кишки, а клавулановая кислота стимулирует перистальтику тонкой кишки [9, 11]. Бета-лактамные антибиотики (преимущественно цефалоспорины) могут стимулировать моторику кишечника, воздействуя на постсинаптические рецепторы гамма-аминомасляной кислоты в мезентеральных сплетениях [12]. Назначение цефоперазона и цефиксима ведет к гиперосмолярной диарее из-за неполного всасывания из просвета кишечника самих антибиотиков и их метаболитов. Вследствие снижения анаэробов в полости толстой кишки (например, на фоне приема ампициллина, клиндамицина, нетилмицина, метронидазола, эритромицина) нарушается гидролиз углеводов, что сопровождается повышением осмотического давления в просвете кишечника и развитием диареи [9]. Уменьшение анаэробов в полости толстой кишки на фоне антибактериальной терапии сопровождается снижением синтеза C4 [13], которая регулирует всасывание натрия и воды, что также способствует развитию секреторной диареи.

Подавление антибиотиками облигатной интестинальной микробиоты приводит к избыточному микробному росту и нарушению гидролиза углеводов, а вместе с этим и к уменьшению КЖК, которые (особенно C4 и ацетат) служат основным источником энергии для эпителиоцитов кишечника человека, а также участвуют в секреции слизи, регуляции ионного обмена в толстой кишке, угнетают рост патогенной микробиоты [14, 15]. Роль метаболических нарушений в патогенезе диарейного синдрома наиболее вероятна в тех случаях, когда он развивается на 1-3-й день от начала антибактериальной терапии [11].

Таким образом, при нарушении микробного пейзажа на фоне приема антибиотиков существенно изменяются пищеварительные процессы на уровне просвета желудочно-кишечного тракта, что сопровождается многокомпонентным синдромом нарушенного кишечного всасывания (мальдигестии/мальабсорбции).

В большинстве случаев неинфекционные ААД имеют легкое и среднетяжелое течение, протекают без развития осложнений и признаков колита и купируются даже без специального лечения уже в течение ближайших 2 сут после отмены антибиотика. Однако есть сообщения о более тяжелом их течении. Maha Barakat и соавт. (2011, Египет) наблюдали 23 ребенка в возрасте от 2 до 11 мес, у которых развилась диарея с примесью крови в течение нескольких дней после начала антибактериальной терапии в амбулаторных условиях. Лихорадка и/ или лейкоцитоз отмечались у 8 пациентов (34,8%). При ректоромано-скопии у 18 детей (78%) выявлены различные виды эритемы (пятна, кольца, диффузное поражение слизистой оболочки) и язв (афт) и в 5 случаях (22%) - псевдомембраны, однако инфекционная природа доказана только у 3 пациентов (Cl. difficile) [16].

Инфекционный генез ААД этиологически может быть связан с различными патогенами - Clostridium difficile (Cl. difficile), Clostridium perfringens типа А, Klebsiella oxytoca (геморрагический колит) и Candida albicans (особенно у пациентов с иммунодефицитными состояниями, требующих более длительных сменных курсов антибиотикотерапии)[7, 8].

По данным S. Sparks (2001), Cl. perfringens является причиной 5-20% случаев ААД, чаще остальных отмечается выделение энтеротоксигенных Cl. perfringens типа А. Энтеротоксин Cl. perfringens представляет собой полипептид 35 кДт, продуцируемый 2-5% изолятами. Он не всасывается в кишечнике и не обнаруживается в крови больных, ограничивая область повреждения слизистой оболочки кишечника [17].

По результатам исследований U. Florian и I. Zollner-Schwetz (2008), в отличие от других колитов, ААД, вызванная Klebsiella oxytoca (антибиотик-ассоциированный геморрагический колит), возникает чаще у здоровых пациентов, амбулаторно получавших производные пенициллина, реже хинолонов и цефалоспоринов. Эндоскопически отмечались отечность, кровоточивость слизистой оболочки кишечника, а также сегментарный характер поражения преимущественно (50-70%) правых отделов или поперечно-ободочной кишки [18]. У всех обследованных токсины клостридий, E. coli, Staph. aureus были отрицательными. Цитотоксический эффект Klebsiella oxytoca был доказан культуральным методом в 50% случаев. Подобные данные были получены K.M. Hoffmann в 2009 г. [19].

R.Krause и соавт. (2001) в исследованиях роли Candida albicans при ААД у детей и взрослых пришли к выводу, что повышенный рост этой бактерии в образцах стула связан именно с лечением антибиотиками, нежели является самостоятельной причиной антибиотико-ассоцированной диареи [20]. Этими же учеными в 2003 г. доказано, что метаболизм углеводов и дегидроксилирование первичных желчных кислот бактериальными ферментными системами приводят к производству КЖК и вторичных желчных кислот, которые являются ингибиторами факторов роста и прикрепления Candida albicans к слизистой оболочки кишечника [21].

Применение антибиотиков и развитие на их фоне выраженных нарушений микробиоты кишечника - основные факторы возникновения проблемы эндогенной Cl. difficile-инфекции. Большинство исследователей считают наиболее значимым инфекционным агентом ААД Clostridium difficile, с которой ассоциировано 10-25% всех ААД и до 90-100% случаев псевдомембранозного колита [5, 22]. В немногочисленных работах российских авторов получены подобные данные - 14,7% Cl. difficile- диарей от общего числа антибиотикоассоциированных колитов [23]. За остальные 80% инфекционных агентов данных недостаточно [60].

По современной классификации вид Clostridium difficile относится к роду клостридии (Clostridium), семейству Clostridiaceae, порядку Clostridiales, классу Clostridia, типу Firmicutes, царству Eubactria [24].

Cl. difficile широко распространены в окружающей среде, а также в почве, в воде и фекалиях многих диких, домашних и сельскохозяйственных животных [11].

Для того чтобы Cl. difficile могла вызвать заболевание, должен быть соблюден ряд условий. Человек должен иметь контакт со спорами токсин-продуцирующих штаммов Cl. difficile в сочетании с изменением нормальной микробиоты толстой кишки, что будет способствовать колонизации этим микроорганизмом. Моделирование подобных ситуаций на животных и исследования микробиома кишечника человека прояснили некоторые микробные и клеточные взаимодействия в рамках этой сложной кишечной экосистемы [25]. Важную роль играет иммунная система хозяина, о чем свидетельствуют более высокая скорость инфицирования и тяжелое течение заболевания у лиц, не имеющих эффективного гуморального иммунного ответа [26, 27].

Как было показано в многочисленных работах зарубежных авторов [22, 28-32], антибиотики являются ключевым фактором риска развития Cl. difficile-инфекции в связи с гибелью эндогенной микробиоты, что позволяет Cl. difficile не только присутствовать, но и размножаться и продуцировать токсины. Тем не менее не все классы этих препаратов имеют одинаковый риск предрасположения к Cl. difficile-инфекции. J.G. Bartlett (2010) связывает такие препараты, как клиндамицин, цефалоспорины, пенициллины (особенно аминопенициллины), а последние несколько лет и фторхинолоны, с высоким риском развития Cl. difficile-инфекции [33].

Результаты исследований С. Deneve и соавт. (2009) показывают, что антибактериальная терапия может привести к Cl. difficile-инфекции не только через разрушение колонизационной резистентности, но и путем индукции бактериальной реакции на стресс (субингибирующие дозы антибиотиков, снижение рН и др.), вследствие чего увеличивается экспрессия факторов колонизации у самой клостридии. Более характерно для фторхинолонрезистентных штаммов NAP1/027 [34, 35].

В недавнем докладе V. Stevens и соавт. (2011) отметили госпитализм и совокупное воздействие антибиотиков как факторы, предрасполагающие к развитию Cl. difficille-инфекции [36]. По результатам исследования Л.Н. Мазанковой, Ю. Баселя за 2011-2013 гг. на фоне приема антибиотиков группы цефалоспоринов III в условиях стационара возрастает риск Cl. difficile-инфекции до 72,88%, значительно превышая частоту амбулаторных случаев - 27,12%. Напротив, антибиотики групп аминопенициллинов гораздо чаще вызывали клостридиальную инфекцию при приеме амбулаторно, чем в стационаре (85,71 против 14,29% соответственно) [37]. Таким образом, к факторам риска относится прием цефалоспоринов III поколения в условиях стационара и амино-пенициллинов в поликлинической практике.

В 2004 г. D.L. Paterson в своей работе о «сопутствующем ущербе» («Collateral damage») антибактериальных препаратов пришел к выводу, что антибиотико-индуцированные изменения структуры сообществ коренных представителей микробиоты кишечника человека являются одним из основных факторов, определяющих уменьшение сопротивления против колонизации Cl. difficile [38]. Доказательства последнего неоднократно были продемонстрированы на животных моделях хомяков в 2007 г. [35], мышей в 2011 г. [39] и на лигирован-ной петле толстой кишки человека в 2010 г. [40]. Примечательно, что в своей работе C.M. Theriot (2014), изучая антибиотик-индуцированные нарушения микробиома и метаболомные изменения в кишечнике мышей, определил устойчивость к спорам Clostridium difficile у мышей до антибиотикотерапии (цефоперазон) и через 6 нед после ее прекращения, а все грызуны, получавшие курс цефоперазона уже на 2-е сутки терапии, теряли колонизационную резистентность к этой бактерии [41].

Описано, что у пациентов, выздоравливающих после Cl. difficile- инфекции, рецидив может быть связан с недостаточным восстановлением предшествующего разнообразия микроорганизмов в кишечнике [42, 43]. Последнее наблюдение объясняет, почему трансплантация фекальной микробиоты так эффективна в лечении пациентов с рецидивирующим течением Cl. difficile-инфекции [44, 45]. Точные защитные механизмы нормальной микробиоты в предотвращении развития заболевания изучены не полностью. Существует несколько гипотез.

Почти 30 лет назад в экпериментах in vitro было показано, что желчь стимулирует прорастание спор Clostridium difficile. Доказано, что холаты (желчные кислоты) стимулирует прорастание спор, а дезокси- и хенодезоксихолат (вторичные желчные кислоты) обладают мощным ингибирующим действием на споры и вегетативные формы Clostridium difficile. Sorg и Sonenshein в 2008 г., исследуя влияние желчных кислот на Cl. difficile, пришли к выводу, что лечение антибиотиками подавляет микробиоту (Firmicutes и Bacteroidetes), ответственную за трансформацию первичных желчных кислот, что приводит к увеличению концентрации холата и, как следствие, процветанию Cl. difficile в толстой кишке [25]. Это было доказано на мышиной животной модели в 2014 г. C.M. Theriot [41].

M.C. Rea и соавт. в 2010-2011 гг. изучали внутренние механизмы сопротивления мокрофлоры, выявили способность микробиоты производить бактериоцины - противомикробные вещества, которые непосредственно ингибируют рост Cl. difficile [40].

Существуют предположения о врожденных защитных иммунных реакциях через TLR, активация которых способна предотвратить заболевание. В 2011 г. Jarchum показал, что активации флагеллина TLR-5 иммунных клеток мышей было достаточно, чтобы предотвратить развитие Cl. difficile-инфекции после лечения антибиотиками [46]. Однако механизм изучен не полностью.

Некоторые ученые считают, что конкуренция между нормальной микробиотой и Cl. difficile за ограниченные пищевые ресурсы также может вести к подавлению роста клостридий [19-25].

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ CL. DIFFICILE-ИНФЕКЦИИ В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ

Данные по изменению эпидемиологии Cl. difficile-инфекции у детей немногочисленны из-за ограниченного эпидемиологического надзора и недостаточного количества исследований, проводимых в педиатрической популяции. Например, в Англии и Уэльсе детей младше 2 лет исключают из обследования на Cl. difficile-инфекцию, ссылаясь на высокий процент бактерионосительства в данной возрастной группе [43]. Подобная практика существует в большинстве европейских стран и в Америке.

Несмотря на вышесказанное, английскими учеными в 2012 г. (Sumita Pai и др.) проведено исследование, в которое было включено 75 детей с Cl. difficile-инфекцией, где максимум заболеваемости был в группе младше 2 лет (средний возраст составил 2,97 года). Почти половина - 37 случаев (49,3%) имели внутрибольничную этиологию, 55 пациентов (74%) получали антибиотики за месяц до исследования, из них у 50 (91%) отмечался обильный жидкий стул до 5 раз в день. Выявлена тенденция к уменьшению общего количества случаев клостридиозной инфекции с 2005 по 2009 г. в Англии, отмечено отсутствие увеличения случаев в возрастных группах 5-17 лет [43]. Наиболее часто назначаемыми антибиотиками в данном исследовании были цефалоспори-ны, что может отражать более широкое применение у детей в целом. В отличие от этого исследования, Ким и соавт. (2008) сообщили о неуклонном увеличении ежегодной заболеваемости Cl. difficile- инфекцией среди детей в стационарах США за 5-летний период с 2001 по 2006 г. с 2,6 до 4 случаев на 1000 госпитализаций. Средний возраст детей составил 4 года. В том же исследовании 26% госпитализированных с Cl. difficile-инфекцией были в возрасте до 1 года и 5% из них - новорожденные.Они также зафиксировали увеличение случаев заболеваемости Clostridium difficile в возрастной группе от 5- до 17-летнего возраста за этот период времени [44].

В исследовании I. Adlerbertha и соавт. (Швеция, 2010) [45] с помощью ПЦР риботипирования и картирования генов изучали стойкость риботипов Cl. difficile в микробиоте детей: исследованы фекальные образцы 42 детей при рождении и в 12, 18 или 36 мес. Среди определенных 59 штаммов 71% были токсинпроизводящими. Этот показатель выше на 40%, чем рассчитанный по данным 9 объединенных исследований в недавнем обзоре 2010 г. [46]. Более половины из штаммов, выделенных от новорожденных, в шведском исследовании принадлежали к 001 и 014 риботипам (32 и 19% соответственно). Оба этих рибо-типа способны производить токсин, и оба обычно были изолированы от взрослых и пожилых людей, страдающих Cl. difficile-инфекцией в Швеции [47] и в других странах [48]. Ribotype 001 часто связывают с рецидивирующим течением заболевания [47]; возможно, это связано с эффективным производством токсина и высокой скоростью споруляции [49]. Почти все штаммы ribotype 014 были выделены от 25% детей после 2-месячного возраста, что свидетельствовало о приобретении их за пределами больницы или роддома.

В исследовании S. Khanna (2014) [49], проведенном в Олмстед Каунти (штат Миннесота, США), были зафиксированы 92 случая Cl. difficile-инфекции среди детского населения (0-18 лет) за период 1991-2009 гг. Средний возраст составлял 2,3 года; 75% случаев отнесены к внебольничной Cl. difficile-инфекции. Отмечено увеличение общей заболеваемости Cl. difficile-инфекцией в 12,5 раза - с 2,6 (19911997) до 32,6 на 100 000 (2004-2009) за период исследования (р<0,0001). Заболеваемость внебольничной Cl. difficile-инфекцией составила 10,3 на 100 000 человек и увеличилась в 10,5 раза, с 2,2 (1991-1997 гг.) до 23,4 на 100 000 (2004-2009) (p<0,0001). Тяжесть, осложнения и рецидивирующее течение Cl. difficile-инфекции составили 9, 3 и 20% случаев соответственно. В 72% случаев прослеживалась явная связь с применением антибиотиков за 10-12 нед до заболевания, в 20% (18 случаев) - с ингибиторами протонной помпы.

ОТ БЕССИМПТОМНОГО НОСИТЕЛЬСТВА ДО РАЗВИТИЯ Cl. DIFFICILE-ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

Одной из основных особенностей микроэкологии кишечника у детей раннего возраста является высокий уровень колонизации токсигенны-ми штаммами Clostridium difficile при отсутствии клинической картины заболевания. Наиболее высокая колонизация Cl. difficile регистрируется у новорожденных (до 70%). Однако наличие токсигенных штаммов у них не приводит к диарее, что объясняется отсутствием у этой группы пациентов высокоаффинных рецепторов к токсину А [9, 50].

У здоровых детей младше 1 мес жизни Cl. difficile восстанавливается в среднем из 37% образцов стула [46]. К 6 мес показатель снижается до 30% и к году составляет около 10%. После года процент бессимптомного носительства Clostridium difficile снижается, достигая к 3 годам уровня 3%, характерного для взрослого населения. Есть предположения, что высокий уровень колонизации у младенцев наблюдается из-за низкой колонизационной резистентности КМ, не способной подавить рост Cl. difficile [45]. В отличие от европейских и американских исследований, в исследовании, проведенном в Японии Shinichirou Matsuki и соавт. в 2005 г., показатели колонизации у детей в возрасте до 2 лет были значительно выше (84,4%), чем у детей 2 лет и старше (30,3%). Когда проанализировали по возрастным группам, уровни носительства составили 100, 75,0, 45,5, 24,0, 38,5 и 23,5% у детей 0, 1, 2, 3, 4 и 5 лет соответственно. С помощью ПЦР и риботипирования доказано, что максимум заражения детей Cl. difficile в Японии происходит в детских дошкольных учреждениях. Изоляты, выделенные у детей, чаще соответствовали штаммам, найденным на объектах в этих учреждениях [51].

Признанным фактором риска увеличения колонизации новорожденных считается пребывание в отделении интенсивной терапии - 54,9 против 11% в обычных палатах, что может быть связано с более высокой плотностью заселения спорами этого микроорганизма и частым контактом новорожденных в этих отделениях с медицинским персоналом и медицинским оборудованием [51].

Результаты исследования С. Rousseau и соавт. (2010) показывают, что присутствие Cl. difficile в микробиотопе кишечника, в том числе токсигенных штаммов, в значительной степени связано с изменениями в составе микробиологической экосистемы [52]. Любые факторы, потенциально влияющие на состояние микрофлоры кишечника, являются потенциальными факторами риска активации токсигенных штаммов Cl. difficile в зависимости от доношенности, возраста, типа вскармливания. Были изучены образцы стула от 53 детей в возрасте от 0 до 13 мес - 27 негативных и 26 положительных на Cl. difficile. Доминирующие профили микробиоты были оценены с помощью современных методов ПЦР риботипирования. Триггерную роль в колонизации кишечника токси-генными штаммами Clostridium difficile (!) могут играть бактерии группы Ruminococcus и Klebsiella. В микробиоте кишечника при Cl. difficile- инфекции наблюдаются увеличение количества факультативных анаэробов и снижение Bifidobacterium и Bacteroides, играющих решающую роль в колонизационной резистентности против Cl. difficile [53].

В отличие от молодых взрослых и пожилых пациентов, в фекальной микробиоте у детей преобладают Bacteroidetes, с возрастом соотношение Firmicutes/Bacteroidetes увеличивается [54, 55]. Индекс Firmicutes/ Bacteroides считается характеризующим состояние здоровья, а также может отражать эубиоз или дисбактериоз ЖКТ. В исследовании Zongxin Ling и соавт. (2014) повышенное соотношение Firmicutes/ Bacteroides использовалось в качестве индикатора для прогнозирования предрасположенности к заболеванию Cl. difficile-инфекцией. Даже при отсутствии лечения антибиотиками у новорожденных возможна колонизация токсигенными штаммами Clostridium difficile при низком индексе соотношения Firmicutes/Bacteroides и увеличении количества факультативных анаэробов [56].

Дети, находящиеся на грудном вскармливании, имеют показатели колонизации в 2 раза ниже (14%), чем на искусственном (30%) [57]. Другие исследователи также подтверждают связь между типом вскармливания и уровнем колонизации [58], что объясняют поступлением с грудным молоком IgA, защищающим слизистые оболочки ЖКТ от возбудителей кишечных инфекций, и других ценных компонентов - лизоцима, лактоферрина, пропердинов, пероксидазы, материнских макрофагов и лимфоцитов, выполняющих протективную роль и опосредованно способствующих формированию нормального биоценоза пищеварительного тракта ребенка. В ряде исследований других авторов достоверно доказано, что бифидобактерии играют защитную роль против колонизации CD на фоне повышения местного иммунитета (IgA) [59]. При снижении количества бифидобактерий уменьшается синтез секреторного IgA, повышается проницаемость эпителиального барьера кишечника для макромолекул пищи и условно-патогенных микроорганизмов, что способствует развитию аллергических реакций и инфекционного процесса [60].

CL. DIFFICILE У ДЕТЕЙ С ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ КИШКЕЧНИКА, БОЛЕЗНЬЮ ГИРШПРУНГА И ОНКОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Возможность развития Cl. difficille-инфекции у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника в последнее время вызывает особый интерес ученых. Одной из причин является несвоевременная постановка диагноза при наличии у пациента сопутствующего хронического воспалительного заболевания кишечника ввиду сходной клинической картины. Исследование образцов кала на токсины Cl. difficile обычно проводится только тогда, когда не отмечается улучшение состояния больного, несмотря на адекватно проводимую терапию. Крупнейшее исследование по данной проблеме было проведено в начале XXI в. на базе отделений гастроэнтерологии и лабораторной диагностики университетских клиник Бельгии под руководством P. Bossuyt и соавт. [61].

Крайне тяжелые и летальные случаи Clostridium difficile-инфекции в большинстве случаев отмечаются у детей с выраженной нейтропенией, у младенцев с болезнью Гиршпрунга и у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями кишечника (болезнь Крона, язвенный колит). Отдельные исследования позволяют предположить, что тяжелые Cl. difficile-инфекции могут встречаться у детей раннего возраста. Например, Cl. Difficile -псевдомембранозный колит был диагностирован при вскрытии у детей с болезнью Гиршпрунга [62]. Cl. difficile- псевдомембранозный колит также был описан у недоношенного ребенка с НЭК [22, 62].

Исследования последних лет ярко показывают тесную связь Cl. difficile-инфекции с наличием сопутствующих заболеваний, таких как гематоонкология, иммунодефициты и воспалительные заболевания кишечника, сопровождающихся иммуносупрессивными состояниями [61]. В исследовании Sumita Pai и соавт. 12 из 68 пациентов (17,6%) имели злокачественные заболевания крови и 20 (29%) - солидные опухоли органов [43]. Обе группы пациентов получали химиотерапию во время исследования или ранее. В этих группах заболеваемость вну-трибольничной Cl. difficile-инфекцией имела самые высокие показатели (59,5%). Эти данные подтверждают другие исследования [63, 64]. Ципрофлоксацин был вторым антибиотиком по частоте использования преимущественно у пациентов с заболеваниями крови и у онкологических больных.

Больные онкологическими заболеваниями крови могут быть источником распространения Cl. difficile в педиатрических стационарах [27, 65-67]. Есть данные, что это является следствием сочетания таких факторов, как частые госпитализации, длительное применение антибиотиков (наибольшее количество назначений антибиотиков) и имму-носупрессия (у 62,5% отмечалась нейтропения). Нейтрофилы играют ключевую роль в патофизиологии Cl. difficile-инфекции [66].

Таким образом, развитие у детей на фоне применения антибактериальных препаратов ААД остается актуальной проблемой практической педиатрии в настоящее время. ААД могут протекать в различных формах - от среднетяжелой самокупирующейся диареи до псевдомембранозного и фульминантного колита [47, 56]. Широкое применение антибактериальных препаратов в стационарах различного профиля придает данной проблеме общеклиническое значение. В 15-25% случаев причиной развития ААД является Cl. difficile.

В числе эпидемиологических факторов, имеющих значение в развитии Cl. difficile-инфекции, большую роль играют: возраст пациента, факт госпитализации в стационар, его профиль, прием таких антибактериальных препаратов, как цефалоспорины, амоксициллины. На фоне приема антибиотиков группы цефалоспоринов в условиях стационара возрастает риск развития Clostridium difficile-инфекции до 72,88% [23, 59].

В последние десятилетия большое внимание уделяется изучению кишечного микробиома, изменениям в его структуре под влиянием антибиотикотерапии [9, 32], а также отдаленным последствиям носи-тельства токсигенных штаммов Clostridium difficile у детей раннего воз-рата. John Penders и соавт. в 2005 г. описали причинно-следственные связи между колонизацией токсигенными штаммами Cl. difficile у детей раннего возраста и проявлениями атопии в последующем [55].

В связи с вышесказанным поиск факторов риска развития Cl. difficile- инфекции у детей на фоне приема антибиотиков остается актуальной проблемой, а профилактика нарушения микробиоценоза кишечника возможна путем назначения совместно с антибактериальными препаратами пробиотиков.

Нами проведено исследование по определению факторов риска развития ААД у детей с инфекционной патологией [67].

Под наблюдением находилось 511 детей в возрасте от 2 мес до 15 лет с антибиотикоассоциированной диареей. Антибиотикоассоциированная диарея определялась как 3 и более эпизода неоформленного стула в течение 2 или более дней, возникших на фоне применения антибактериальных средств, если не выявлена другая причина (Всемирная организация здравоохранения, 2002). В возрастной структуре обследованных больных ААД дети до года составили 7,04% (36 детей). В возрастных группах 1-3 и 4-7 лет существенных различий в количестве заболевших выявлено не было (187 и 195 больных соответственно, что составило 36,59 и 38,16%). В возрастной группе старше 7 лет диагноз ААД установлен у 93 детей, что составило 18,20%. В целом преобладали дети в возрасте от 1 года до 7 лет (74,75%). Среди обследованных детей 280 (54,8%) составили мальчики, 231 (45,2%) - девочки, гендерных различий не установлено. В исследование включались дети только с подтвержденной антибиотикоассоциированной диареей, находившиеся на лечении в инфекционных, хирургических, нефрологическом отделениях (табл. 4-1). В инфекционных отделениях было обследовано 426 больных ААД, в хирургических отделениях - 49, в нефрологическом - 36 пациентов.

* По данным двустороннего критерия Фишера.

Терапию антибиотиками и антимикробными средствами амбулаторно до поступления в стационар получали 63 ребенка, что составило 12,32% общего числа обследованных детей с ААД. Терапия антибиотиками и антимикробными средствами в условиях стационара проводилась 448 детям, что составило 87,67% общего числа обследованных. В качестве антибактериальной терапии наибольшее количество пациентов (208 детей) получали комбинированную терапию (2 препарата и более - 40,7%), цефалоспорины II-III поколения принимали 100 детей (19,7%), цефалоспорины I поколения - 89 пациентов (17,4%). Макролиды назначались в 10,4% случаев (53 пациента), аминопенициллины - в 5% случаев (25 детей). Другие антибактериальные средства принимали 6,8% пациентов (линкозамиды, фторхинолоны, цефалоспорины IV поколения, аминогликозиды).

Этиологическая структура ОКИ, по поводу которых дети с Cl. difficile- инфекцией получали антибактериальную терапию, расшифрована в 24,6% случаев. Наиболее часто отмечались ротавирусная инфекция, аденовирусная инфекция, ОКИ смешанной этиологии.

Тяжесть ААД оценивалась по выраженности и длительности инфекционного токсикоза, эксикоза, рвоты, диарейного синдрома и т.п. Среди обследованных детей 460 (90,02%) имели среднетяжелую форму ААД и 51 (9,98%) - тяжелую форму. Случаев легкой формы среди обследованных детей с ААД выявлено не было.

Лабораторные исследования включали в себя выявление токсинов АиВ Cl. difficile и проводились иммунохроматографическим методом с помощью системы Xpect® Cl. difficile Toxin A/B, которая представляет собой простой в использовании экспресс-тест и обеспечивает точные результаты в течение 20 мин. Оценка результатов: одна полоска - отрицательный результат, две полоски - положительный результат. Исследуемые образцы: замороженные или свежесобранные в транспортной среде Кэри Блера, в сердечно-мозговом бульоне токсичные культуры Cl. difficile. Специфичность теста - 96,2%. Чувствительность - 95,8%.

Из 511 обследованных больных ААД у 73 был поставлен диагноз «Cl. difficile -инфекция», что составило 14,29%. По мнению различных исследователей, Cl. difficile является причиной 15-25% случаев ААД.

Из 63 пациентов, принимавших антибиотики на дому и поступивших в больницу с симптомами ААД, токсины А и В Cl. difficile выявлены у 26 детей, что составило 41,26%. В условиях стационара ААД развилась у 448 детей, у 47 из них определялись токсины Cl. difficile А и В, что составило 10,47%. У большинства детей диарея, развившаяся на фоне антибактериальной терапии, не ассоциирована с Cl. difficile (рис. 4-3).

Проведено исследование по выявлению факторов риска развития Cl. difficile-инфекции у детей, учитывались такие показатели, как пребывание в разных отделениях стационара, возраст, группы применяемых антибиотиков.

При анализе частоты встречаемости Cl. difficile-инфекции в разных отделениях стационара (см. табл. 4-1) установлено, что ее удельный вес в хирургических отделениях достоверно ниже, чем в отделениях респираторных инфекций (8,22 и 54,79% соответственно), что связано

В отделении кишечных инфекций при обследовании поступивших в стационар детей с ААД установлено, что частота Cl. difficile-инфекции оказалась достоверно выше, чем частота Cl. difficile-отрицательных результатов обследования (35,62 и 8,45% соответственно), что связано, вероятно, с глубиной развития дисбиотических нарушений на фоне воспалительного процесса в кишечнике и применения антибиотиков. Таким образом, при оценке пребывания ребенка с ААД в различных отделениях стационара как фактора риска развития Cl. difficile- инфекции было установлено, что в отделениях респираторных и кишечных инфекций регистрируется наибольшая частота встречаемости Cl. difficile-инфекции. Пребывание в хирургическом и нефрологи-ческом отделениях не является фактором риска данного осложнения ААД, а нахождение в инфекционных отделениях, наоборот, повышает риск развития Cl. difficile-инфекции на фоне ААД.

При изучении влияния антибиотиков разных групп на развитие Cl. difficile-инфекции (табл. 4-2) к безопасным антибиотикам отнесены препараты, частота применения которых в группе Cl. difficile-отрицательных достоверно превышает частоту в группе Cl. difficile- положительных. Такими антибиотиками оказались макролиды (2,8 против 11,6% соответственно) и группа цефалоспоринов I поколения (2,75 против 19,9% соответственно). Среди детей с Cl. difficile- инфекцией преобладали дети, получавшие комбинированную антибактериальную терапию (58,9%) и цефалоспорины III поколения (19,2%).

Фактором риска развития Cl. difficile-инфекции является проведение комбинированной терапии антибиотиками: частота применения этого варианта терапии в группе Cl. difficile -положительных достоверно превышает частоту в группе Cl. difficile-отрицательных (58,90 против 37,70% соответственно. Это может быть объяснено тем фактом, что прием нескольких антибиотиков одновременно усиливает их отрицательное действие на микроэкологические взаимосвязи в ЖКТ, расширяет спектр токсических эффектов и, как следствие, создает дополнительные условия для роста и колонизации Cl. difficile, образования токсинов и развития заболевания. При более детальном анализе применения антибиотиков по отдельности, а не при моноили комбинированной терапии, было показано, что наиболее часто Cl. difficile-инфекция возникает на фоне ААД при приеме цефалоспоринов III поколения, частота применения которых в группе Cl. difficile -положительных значительно и достоверно превышает частоту применения в группе Cl. difficile- отрицательных.

*По данным двустороннего критерия Фишера.

Также частота применения аминопенициллинов в группе Cl. difficile- положительных значительно и достоверно превышает частоту применения в группе Cl. difficile -отрицательных.

При анализе частоты возникновения Cl. difficile-инфекции при приеме антибиотика в амбулаторных условиях или в условиях стационара (табл. 4-3) выявлено, что прием таких препаратов, как макролиды, ами-ногликозиды, линкозамины, карбапенемы, и антимикробных средств разных групп сопровождается развитием ААД и Cl. difficile-инфекции. На фоне приема антибиотиков группы цефалоспоринов III поколения в условиях стационара возрастает риск развития Cl. difficile-инфекции до 72,88%, частота возникновения заболевания при назначении антибиотиков этой группы в условиях стационара значительно превышает таковую в амбулаторных условиях (72,88 против 27,12% соответственно). Напротив, антибиотики группы аминопенициллинов гораздо чаще вызывают Cl. difficile-инфекцию при приеме в амбулаторных условиях, чем в условиях стационара (85,71% по сравнению с 14,29% соответственно). Таким образом, к факторам риска относится применение цефалоспоринов III поколения в условиях стационара и аминопенициллинов в амбулаторных условиях.

*По данным двустороннего критерия Фишера.

Проведен анализ частоты встречаемости Cl. difficile-инфекции у детей с разными нозологическими формами заболеваний (табл. 4-4).

Из табл. 4-4 видно, что у детей с острыми респираторными вирусными инфекциями и ангиной, получавших антибиотики, Cl. difficile- инфекция отмечалась лишь у 6,9%. Напротив, у детей, поступивших в стационар с диагнозом «ОКИ невыясненной этиологии» и в анамнезе у которых есть указание на прием антибиотиков, Cl. difficile-инфекция развилась в 41,9% случаев. Частота выявления Cl. difficile-инфекции у детей, получавших антибактериальные препараты при таких заболеваниях, как отит, бронхит, пневмония, хирургические заболевания, достоверно не отличается от средней частоты развития этого заболевания (14,29%). Частота развития Cl. difficile-инфекции у пациентов с диагнозом «пиелонефрит» очень низкая (2,56%), что позволяет условно отнести антибактериальную терапию пиелонефрита к фактору низкого риска развития Cl. difficile-инфекции.

*По данным двустороннего критерия Фишера.

Изучены возрастные особенности развития Cl. difficile-инфекции. Не выявлено достоверных различий по частоте встречаемости Cl. difficile- инфекции в разных возрастных группах детей, из чего можно сделать вывод о том, что возраст ребенка не является фактором риска развития Cl. difficile-инфекции.

Обращает на себя внимание тот факт, что в возрастной группе до 1 года Cl. difficile-инфекция была выявлена у 19,44% пациентов. Вопреки распространенному мнению о том, что дети до года не восприимчивы к токсинам А и В Cl. difficile и могут являться только бактерионосителями, нами на основании анамнеза (развитие ААД на фоне антибактериальной терапии) и клинических проявлений болезни был установлен диагноз «Cl. difficile -инфекция» и проведена эффективная противоклостридиозная терапия.

При анализе клинических особенностей Cl. difficile-инфекции установлены достоверные отличия частоты встречаемости основных симптомов заболевания в сравнении с группой детей с ААД без Cl. difficile. Установлено значительное превышение частоты развития тяжелой формы заболевания при Cl. difficile-инфекции (20,55 и 8,20% соответственно), преобладание энтероколита и гемоколита (табл. 4-5).

Боли в животе возникали достоверно чаще при Cl. difficile-инфекции (95,89%), чем при ААД без Cl. difficile (24,59%). При этом при Cl. difficile-инфекции они достоверно чаще локализовались вокруг пупка (64,38%) и в подвздошной области (31,51%). Выявлены достоверные различия в кратности стула у детей с Cl. difficile-инфекцией и у пациентов с ААД: частота стула более 10 раз в сутки составила 20,5% у Cl. difficile- положительных больных, что достоверно превышает таковую у детей с ААД без Cl. difficile (3,28%). Достоверно часто отмечались патологические примеси в стуле при Cl. difficile-инфекции, в том числе примесь крови.

При изучении частоты возникновения рвоты, ее продолжительности и кратности установлено, что рвота отмечалась лишь у 15,07% детей с Cl. difficile-инфекцией, что в 4 раза реже, чем при ААД.

При оценке клинического течения заболевания в возрастном аспекте было показано, что тяжелая форма Cl. difficile-инфекции характерна для детей до года (71,43%). В остальных возрастных группах частота встречаемости тяжелой формы достоверно не отличалась (14,24% - в группе детей от 1 года до 3 лет, 11,11% - среди пациентов 4-7 лет и 15,79% - в возрастной группе от 8 до 15 лет). Однако отмечается тенденция к снижению частоты развития тяжелой формы с возрастом. Что же касается детей до года, то было показано, что именно в этой возрастной группе дети болеют Cl. difficile-инфекцией чаще и переносят ее в более тяжелой форме, чем дети старше года.

*По данным двустороннего критерия Фишера.

Установлено снижение частоты встречаемости гемоколита с возрастом и увеличение частоты энтероколита, отмечалась одинаковая частота развития гастроэнтерита во всех возрастных группах с преобладанием среднетяжелых форм у детей старшего возраста (рис. 4-5).

Таким образом, Cl. difficile-инфекция у детей, принимавших антибиотики, характеризуется острым началом, преобладанием тяжелых форм, наличием энтероколита, гемоколита с гипертермией, что отличает ее от ААД, не ассоциированной с Cl. difficile, и позволяет заподозрить это заболевание, провести целенаправленное обследование и терапию.

Проведено сравнительное исследование особенностей лабораторных показателей в 2 группах детей с ААД в зависимости от ассоциации

При оценке изменений в общем анализе мочи, биохимическом анализе крови, коагулограмме не выявлено существенных различий между группами Cl. difficile -положительных и Cl. difficile-отрицательных пациентов с ААД.

Таким образом, в результате исследования было установлено, что к этиологической структуре ААД у детей удельный вес Cl. difficile- инфекции составляет 14,29% независимо от возраста. В 19,4% случаев заболевание развивается на фоне антибактериальной терапии у детей до 1 года.

К эпидемиологическим особенностям Cl. difficile-инфекции у детей относятся отсутствие сезонности, более частое развитие заболевания в амбулаторных условиях (41,26%). К факторам риска развития Cl. difficile -инфекции относятся применение комбинированной антибактериальной терапии (58,9%), цефалоспоринов III поколения (19,2%), реже аминопенициллинов (5,7%) у детей разных возрастных групп.

При Cl. difficile -инфекции, возникающей у детей на фоне приема антибактериальных препаратов, преобладают тяжелые (20,55%) и среднетяжелые (79,45%) формы болезни, характеризующиеся симптомами интоксикации, фебрильной лихорадкой, явлениями гастроэнтерита (15,07%), энтероколита (46,58%), гемоколита (38,36%), абдоминальным синдромом (95,89%), патогномоничными для бактериальных кишечных инфекций другой этиологии, что требует включения Cl. difficile-инфекции в алгоритм дифференциальной диагностики ОКИ инвазивного типа.

Антибиотикоассоциированные диареи без Cl. difficile протекают преимущественно в среднетяжелой форме (91,8%) с преобладанием симптомов гастроэнтерита (62,3%), энтероколита (29,5%) на фоне нормальной (39,5%) или субфебрильной (14,75%) температуры тела, что позволяет дифференцировать их от Cl. difficile-инфекции.

С целью дифференциальной диагностики острых энтероколитов и гемоколитов, развивающихся на фоне антибактериальной терапии, следует включать в алгоритм обследования детей с инвазивным типом ОКИ методы иммуноферментного анализа или иммунохроматографического метода с определением токсинов А и В Cl. difficile в динамике.

Для объективной оценки наличия воспалительного процесса и топики поражения ЖКТ с определением вариантов течения Cl. difficile- инфекции рекомендуется исследование уровня фекального кальпро-тектина.

Для профилактики ААД и Cl. difficile-инфекции следует ограничить широкое назначение цефалоспоринов III поколения и аминопени-циллинов при ОКИ и острых респираторных вирусных инфекциях, предпочтительнее назначать макролиды с антибиотикорезистентными пробиотиками, содержащими LGG и Saccharomyces boulardii.

При развитии диареи на фоне использования антибактериальных препаратов необходимо включение в стандарт терапии пробиотиков, метронидазола (15 мг/кг в сутки), ванкомицина (40 мг/кг в сутки) сроком на 14 дней с контрольным исследованием кала на токсины А и В

Cl. difficile и исследование кала на микробиоценоз с последующей пробиотической коррекцией выявленных нарушений.

Список литературы

Нами была изучена клиническая эффективность про- и пребиотиков при ОКИ разной этиологии у детей на основании определения метаболической активности КМ по уровням спектра ЛЖК методом ГЖХ (НИФ «Ультрасан» ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Канд. биол. наук О.А. Кондракова, канд. хим. наук А.М. Затевалов).

Методом случайной выборки обследовано 139 детей с ОКИ в возрасте от 1 до 15 лет, госпитализированных в 1-2-й день заболевания, у которых в анамнезе отсутствовали данные о приеме пробиотиков, антибиотиков и иммуномодуляторов. Контрольную группу составили 50 здоровых детей.

Клинический диагноз ОКИ верифицировался по типу диареи и по топике поражения ЖКТ (Учайкин В.Ф., Новокшонов А.А., Мазанкова Л.Н. Острые кишечные инфекции у детей (диагностика, классификация, лечение): Пособие для врачей, 2005). У 78,4% детей диарея протекала по осмотическому типу, что соответствует вирусной этиологии заболевания, у 21,6% больных имел место инвазивный тип диареи, характерный для бактериальной инфекции (сальмонеллез, шигеллез). По топике поражения ЖКТ у 60,4% диагностирован гастроэнтерит, у 21,0% имел место энтерит, у 13,6% - энтероколит, у 5,0% - гастро-энтероколит. По степени тяжести у 14,4% установлена легкая форма, среднетяжелая форма - у 85,6%. Среди обследованных детей у 58,2% выявлена ротавирусная инфекция, у 10,1% - сальмонеллез, у 11,5% - шигеллез и у 20,2% этиология не уточнена.

Всем детям в 1-2-е сутки пребывания в стационаре проводился комплекс лабораторной диагностики, включающий в себя общеклинические анализы, бактериологическое исследование кала на наличие патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, копрологический анализ по стандартным методикам, а также определение спектра ЛЖК, вырабатываемых анаэробными микроорганизмами, методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) (НИФ «Ультрасан» ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Канд. биол. наук О.А. Кондракова, канд. хим. наук А.М. Затевалов). В табл. 5-8 представлены основные продуценты ЛЖК и варианты их отклонений в копрофильтрате, характерные для нарушений микробиоценоза у детей, определяемых методом ГЖХ (Кондракова О.А., 2005, модификация - Мазанкова Л.Н., 2009).

Глубина нарушений метаболической активности микробиоты определялась по степеням дисбактериоза (Патент РФ «Способ разделения смеси жирных кислот фракции C2-C6 методом газожидкостной хроматографии» Ардатская М.Д., Иконников Н.С., Минушкин О.Н., № 2220755, дата выдачи 10.01.2004, приоритет от 23.07.2002). Для I степени дисбактериоза характерны сохранение нормального уровня C2 и ОУ, повышение C4 и C3 на фоне незначительного смещения АИ в отрицательную сторону, что свидетельствует о количественном дефиците и угнетении функции индигенной микробиоты.

Для II степени патогномонично снижение C2 и C4, повышение C3 на фоне значительного смещения АИ в отрицательную сторону, что характеризует микробиологический дисбаланс с дефицитом анаэробов и снижением ее ферментативной активности на фоне роста УПМ с пропионовокислым брожением.

Все больные ОКИ получали базисную терапию: пероральную регидратацию «Регидроном», энтеросорбенты, ферментотерапию. Дополнительно к базисной терапии с целью изучения эффективности коррекции дисбактериоза назначались метапробиотики и пребиотическое питание.

В I группе обследуемых 18 детей от 1 мес до 1 года получали в качестве основного лечебного питания смесь «Хумана ЛП+СЦТ» с пребиотиками в объеме от 50 до 180 мл каждые 3-3,5 ч в течение 5 дней. В группе сравнения дети получали адаптированные смеси без пребиотиков.

II группу составили 50 детей в возрасте от 3 до 15 лет, получавших «Нормофлорин-Д» (Бифилюкс, Россия), в состав которого входят 10 млрд живых метаболически активных лакто- и бифидобактерий в 1 мл препарата с высоким содержанием микробных метаболитов и пребиотиков, в дозе 7,5 мл 2 раза в день в течение 3 нед.

В III группу вошли 28 детей от 1 года до 3 лет, которым назначался метаболический самоэлиминирующийся пробиотик споробактерин (Споробактерин^♠ ) (Россия), содержащий живые микробные культуры из бактерий штамма Bacillus subtilis 534 с высокой антагонистической и иммунобиологической активностью в дозе 0,5 мл 2 раза в день в течение 7 дней.

Контрольную группу составили 50 детей, получавших базисную терапию.

Статистическая обработка выполнена с применением статистической программы BIOSTATISTICA 4,03. Количественные показатели представлены средними арифметическими значениями с их стандартными отклонениями (M±SD), а также медианой (Ме). Оценка достоверности различий средних абсолютных величин для выборок с нормальным распределением выполнена по t-критерию Стьюдента, а для рядов с неравномерным числом вариант - по критерию Манна- Уитни. Значимость различий относительных величин оценивалась по критерию Фишера и критерию z. Статистически значимыми считались различия между выборками при величине р <0,05.

У 69 детей с ОКИ вирусной этиологии средней тяжести в возрасте от 1 года до 3 лет в острый период заболевания проведено исследование состава микробиоты кишечника бактериологическим методом. У 46,4% встречались дисбиотические реакции (рост УПМ на фоне сохраненной индигенной микробиоты), дисбактериоз кишечника I степени определялся в 36,2% случаев и характеризовался снижением уровня индигенной микробиоты <10⁷ КОЕ/г и отсутствием роста УПМ. У 17,4% детей выявлен дисбактериоз степени с глубокими нарушениями в составе микробиоты, связанными с количественным ростом УПМ, преимущественно стафилококков (26%), клебсиелл (23%), протея (31%), дрожжевых грибов (20%) на фоне дефицита бифидобактерий (36,8%), лактобацилл (10,5%), бифидо- и лактобацилл (5,3%). У детей этой группы одновременно с бактериологическим обследованием в одной и той же пробе фекалий исследовалась метаболическая активность анаэробной микробиоты по уровню ЛЖК методом ГЖХ и определены сдвиги в их спектре. У 38 из 69 детей (55%) изменения метаболической активности микробиоты толстой кишки выражались в незначительном смещении отрицательного значения АИ при нормальном общем уровне ЛЖК, в снижении индекса изокислот на фоне повышения C4, что соответствует дисбактериозу кишечника I степени по биохимической классификации. У 24 детей (34,8%) в копрофильтрате отмечалось снижение ОУ, значительное смещение в отрицательную сторону АИ, повышение C3, что характерно для гиперколонизации кишечника УПМ с повышением метаболической активности анаэробов и угнетением нормальной микробиоты и соответствующей II степени дисбактериоза по биохимическим критериям. Нормальные показатели выявлены у 7 детей (10,2%) с ротавирусной инфекцией.

При I степени биохимических нарушений процент совпадения с бактериологическими критериями дисбактериоза кишечника I степени составил 65,8%. При II степени биохимических нарушений в копрофильтрате процент совпадения метода ГЖХ с микробиологическим анализом - 37,5% (р <0,05), что свидетельствует о несовпадении информативности бактериологического и биохимического анализа определения состояния микробиоты кишечника в 62,5% случаев. Метод ГЖХ является более информативным, так как расширяет возможности оценки состояния микробиоценоза и позволяет оценить не только количественные изменения в составе микробиоты, но и состояние метаболической активности анаэробных микроорганизмов кишечника с оценкой ее структурных и функциональных нарушений в экосистеме ЖКТ.

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАРУШЕНИЙ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРОБИОТЫ ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ

Известно, что микробиота кишечника у детей разного возраста отличается по количественному составу аэробов и анаэробов, их функциональной активности и характеризуется возрастными особенностями микробных консорциумов в норме и при патологии [40, 67], что влияет на течение заболеваний ЖКТ и на выбор пробиотиков для коррекции дисбактериоза в возрастном аспекте.

Изучены особенности клинического течения ОКИ у детей разного возраста со средней степенью тяжести заболевания. I группу составили 22 ребенка (35%) до 1 года, II группу - 41 (65%) от 1 года до 3 лет, в контрольную группу включено по 20 здоровых детей соответствующего возраста. Выявлено, что лихорадка наблюдалась у 100% детей до года, симптомы интоксикации - у 92% детей до 1 года и у 86% детей до 3 лет, диарея наблюдалась в обеих возрастных группах в 100% случаев, боли в животе и рвота отмечались чаще у детей до 1 года.

Нами проведено исследование метаболической активности микро-биоты толстой кишки у детей разных возрастных групп при ОКИ вирусной этиологии. Полученные в ходе анализа данные свидетельствуют о том, что изменения метаболической активности микробиоценоза толстой кишки у детей разных возрастных групп отличаются по разным параметрам (табл. 5-9).

*р <0,05.

ОУ метаболитов достоверно выше нормы у детей I группы (5,38±1,93 против 4,73 мг/мл; р <0,05), что можно объяснить угнетением метаболической активности анаэробных микроорганизмов и развитием более выраженной ферментативной недостаточности (лактазной), снижением pH кала до 5,5 при вирусной диарее и ускоренным транзитом химуса по кишечнику у детей с ротавирусной инфекцией до 1 года, чем у детей старше года. У детей до 1 года отмечались более выраженный и длительный диарейный синдром, колики, метеоризм.

АИ был подвержен значительным колебаниям в обеих возрастных группах, однако смещение в отрицательную сторону этого показателя наиболее выражено было у детей II группы (-0,68+0,11 мг/мл), чем у детей I группы (-0,5+0,13 мг/мл; р <0,05), что связано с более глубоким угнетением микроорганизмов - продуцентов C2 (E. coli и облигатных анаэробов) у детей старше года. В этой возрастной группе у 34,8% отмечался дисбактериоз II степени по биохимическим критериям, при этом клинические симптомы бактериального инфекционного процесса у детей отсутствовали.

Индекс изокислот был повышен как в I (0,47+0,12 мг/мл), так и во II группе (0,34+0,09 мг/мл) по сравнению с нормой, что свидетельствует о дефиците количества нормальной микробиоты и о снижении утилизации изокислот в условиях патологического состояния слизистой оболочки и развития вторичной ферментопатии у детей вне зависимости от возраста (см. табл. 5-9).

Показатели C2 в обеих группах достоверно не изменялись и не отличались от показателей контрольной группы.

Концентрация C3 у детей до 1 года повышалась до 1,04 и превышала норму в 1,7 раза, в то время как у детей с 1 года до 3 лет этот показатель не изменялся (0,654), что свидетельствует о преобладании процессов гиперколонизации анаэробной микробиотой с пропионовокислым брожением при нормальном C2 и ОУ (биохимические критерии дисбактериоза степени) у детей до 1 года. У 13 детей (20,6%) с высоким уровнем C3 в копрофильтрате высевалась в высоких концентрациях 10⁷ -10⁹ КОЕ/мл УПМ (протей, клебсиелла), однако влияния на клиническую картину вирусной диареи и развития микст-инфекции у этих больных не отмечено, заболевание протекало в средней степени тяжести по типу гастроэнтерита.

Особенно выражены различия в концентрации C4 у детей разного возраста. Так, в группе детей от 1 года до 3 лет показатели (C4) превышали норму в 1,5 раза (0,97+0,29 мг/мл), что характеризует более выраженные деструктивные изменения эпителия слизистой оболочки толстой кишки, снижение ее всасывательной функции и преобладание процессов брожения при колонизации УПМ. У детей до 1 года уровень C4 не отличался от нормы, что, вероятно, связано с отсутствием в их рационе питания пищевых волокон.

Концентрация C5 была выше возрастной нормы у детей обеих групп, однако у детей от 1 года до 3 лет показатели C5 в 2,5 раза превышали показатели у детей до 1 года (0,1+0,05 мг/мл) в связи с повышением концентрации продуцентов C5 (клостридии, пептококки и пептострептококки), неверифицированных при бактериологическом обследовании у детей этой группы и их возможной роли в развитии диареи, что необходимо учитывать при назначении пробиотической коррекции.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ РАЗНОЙ ЭТИОЛОГИИ

Под наблюдением находилось 30 больных в возрасте от 1 года до 3 лет с ОКИ инвазивного типа и 30 детей с вирусными диареями.

В результате проведенных исследований получены данные о том, что при всех диареях имеют место изменения метаболической активности микробиоты толстой кишки, однако глубина их нарушений зависит от характера воспалительного процесса при ОКИ разной этиологии (табл. 5-10).

Примечание. Сравнение показателей концентраций ЛЖК осуществлялось с помощью вычисления медианы (Ме) с указанием ДИ [-,+] и оценивалось по критерию Манна-Уитни.

*Достоверными считались различия между показателями при p<0,05.

Так, концентрации C2 при всех ОКИ были снижены, не достигая ни у одного ребенка нижней границы нормы. Однако более низкие показатели C2 отмечались в группе бактериальной диареи (Ме = 2,1976 мг/мл [1,3734:2,7404] против Ме = 2,6886 мг/мл [2,1616:3,0763] в группе вирусных ОКИ), что объясняется более выраженным угнетением продуцентов этого метаболита (большинство анаэробных популяций, E. coli) за счет бактериальной инвазии и развития воспалительного процесса в слизистой оболочке толстой кишки.

Особенно выраженные и статистически достоверные (р =0,02) различия между группами получены в показателях C4. При этом концентрация C4 у большинства детей в группе вирусных диарей сохранялась на высоком уровне (Ме = 0,6648 мг/мл [0,4634:1,0428]), а при бактериальных ОКИ была в 2-3 раза ниже (Ме = 0,2438 мг/мл [0,0787:0,4621]). Данный метаболит, как известно, является энергосубстратом для эпи-телиоцитов толстой кишки, и снижение этого показателя характеризует воспалительные изменения слизистой оболочки (рис. 5-1, г) при бактериальной инвазии. При вирусных диареях, характеризующихся ферментативными нарушениями (дисахаридазная недостаточность), повышение C4 связано с дефицитом дисахаридазы, а не с ростом УПМ, так как уровень индекса изокислот у детей оставался низким.

Показатели концентраций C3, продуцентами которой являются Veilonella, Propionobacterium, Bacteroides, Fusobacterium, у большинства детей обеих групп были снижены или имели тенденцию к снижению относительно нормы (Ме = 0,5647 мг/мл [0,3597:0,8878] - в группе вирусных ОКИ и Ме = 0,4258 мг/мл [0,2476:0,9906] - в группе бактериальных) при норме для детей этого возраста - от 0,8408 до 1,108 мг/мл. При этом межгрупповые различия в концентрациях C3 были недостоверными, что можно объяснить преобладанием легких форм ОКИ в сравниваемых группах.

Уровень C5, продуцируемой клостридиями, пептококками и пептострептококками, снижался у 87% детей в группе бактериальной диареи и у лишь у 7% детей - с вирусной диареей. При этом концентрация C5 при бактериальных ОКИ была более чем в 2 раза ниже таковой при вирусных (Ме = 0,0243 мг/мл [0,0125:0,0683] против Ме = 0,0497 мг/мл [0,0270:0,1127] соответственно; р =0,042), что, вероятно, свидетельствует об отсутствии колонизации слизистой оболочки клостридиями.

Концентрации изомасляной и изовалериановой кислот, являющихся конечными продуктами микробной ферментации, снижались только у детей с бактериальными диареями, что может служить критерием дифференциальной диагностики между бактериальными и вирусными диареями.

ОУ метаболитов у всех детей был ниже возрастной нормы (см. рис. 5-1, а). Однако в группе бактериальных ОКИ он был на 20-30% ниже, чем в группе вирусных (Ме = 3,33 мг/мл [1,95:4,58] против Ме = 4,28 мг/мл [3,54:5,64] соответственно), что связано с селективным угнетением нормальной микробиоты, в особенности анаэробных популяций приэпителиальной зоны на фоне ОКИ инвазивного типа, протекающего с явлениями энтероколита у детей преимущественно в среднетяжелой форме. При легкой форме бактериальной инфекции структурный дисбаланс микробиоты не выявлен.

Уровень АИ (см. рис. 5-1, б) был подвержен незначительному смещению в группе вирусных диарей (Ме = 0,65 [0,35:0,97]), отражая тем самым угнетение продуцентов C2 - нормальной кишечной палочки E. coli и анаэробных микроорганизмов. При ОКИ бактериальной этиологии АИ был ближе к возрастной норме (Ме = 0,56 [0,39:0,71]), что объясняется одновременным угнетением представителей микробиоты - продуцентов всех ЛЖК - на фоне структурного и метаболического дисбаланса внутри различных популяций нормальной микробиоты.

Для бактериальных ОКИ были характерны более высокие значения индекса изокислот, который отражает отношение суммы изомасляной и изовалериановой кислоты к сумме нормальных C4 и C5 (см. рис. 5-1, в) и свидетельствует об угнетении нормальной микрофлоры и снижении утилизации изокислот в условиях воспалительного процесса в кишечнике. Межгрупповые различия в показателях индекса изокис-лот (Ме = 0,46 [0,33:0,68] - в группе бактериальных ОКИ и Ме = 0,18 [0,14:0,39] - в группе вирусных) были достоверными (р =0,021).

ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОРРЕКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ И МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ДЕТЕЙ

Проведено исследование эффективности лечебной смеси «Хумана ЛП+СЦТ», жировой компонент которой представлен среднецепочечными триглицеридами, а углеводный компонент - смесью сиропа глюкозы и мальтодекстрина при низком содержании лактозы, что предполагает наличие пребиотического эффекта продукта и влияние на стабилизацию метаболической активности микробиоты кишечника.

Под наблюдением находились 18 детей в возрасте от 1 мес до 1 года с течением ОКИ вирусной этиологии, получавших в качестве основного питания лечебно-питательную смесь «Хумана ЛП+СЦТ»; контрольную группу составили 20 детей, получавших адаптированные молочные смеси. Эффективность лечения оценивалась по клиническим критериям.

На фоне диетотерапии у детей основной группы отмечалось значительное улучшение общего состояния с купированием симптомов интоксикации на 2-й день и лихорадки на 2-3-й день, в то время как в контрольной группе - к 4-му дню лечения (р <0,05). К концу первых суток (в группе сравнения - на 2-3-е сутки) наблюдались сокращение частоты рвоты и полное ее купирование. Продолжительность диареи в основной группе составила 2,5 дня, в контрольной группе - 3,5 дня (р <0,05).

На фоне выраженных патологических потерь жидкости с испражнениями у 2 детей (11,1%) отмечалось развитие эксикоза степени, явления которого купировались к концу 2-х суток пребывания в стационаре при адекватном проведении энтеросорбентной, регидратационной терапии и диетической коррекции. Сроки лечения и пребывания детей в стационаре в сравниваемых группах достоверно не различались.

В ходе проведения биохимического исследования кала по спектрам и уровням ЛЖК получены данные, свидетельствующие о положительных изменениях метаболитного статуса микробиоты на фоне диетической коррекции с использованием лечебной смеси «Хумана ЛП+СЦТ» (рис. 5-2).

На фоне пребиотического питания отмечалось повышение общего уровня ЛЖК (Ме = 5,982 мг/мл [3,618:7,173]), свидетельствующее о нормализации функциональной активности КМ. Достоверно снижалась продукция C2 и C3, что характеризует восстановление структурного баланса аэробных и анаэробных популяций на фоне лечения. Показатели уровня C4 повышались, приближаясь к норме (Ме = 0,319 мг/мл [0,092:0,772]) и отражая положительное влияние лечебного питания с пребиотиками на метаболическую активность сахаролитической микробиоты на фоне восстановления слизистой оболочки кишечника в периоде реконвалесценции ОКИ.

Проведено исследование клинической и пробиотической эффективности метапробиотика «Нормофлорин-Д» при ОКИ вирусной этиологии. Под наблюдением находились 50 детей в возрасте от 3 до 15 лет (основная группа - 30 детей, группа сравнения - 20 детей) с ОКИ вирусной этиологии. По топике поражения ЖКТ преобладали энтериты (40%) и гастроэнтериты (60%). Все дети в острый период заболевания получали базисную терапию с применением энтеросорбентов и ферментных препаратов на фоне оральной или парентеральной регидратации. Дети основной группы получали «Нормофлорин-Д» - 7,5 мл 2 раза в день в течение 3 нед.

Полученные результаты показали, что метапробиотик «Нормофлорин-Д» оказывает влияние на сокращение длительности симптомов интоксикации, рвоты, продолжительности диареи, абдоминального симптома в целом на 0,4-0,8 дня. Продолжительность лечения и пребывания в стационаре детей, больных с ОКИ, колебалась от 3 до 6 дней и в среднем составила 4,6±1,25 в исследуемой группе (5,7±1,06 - в группе сравнения).

На фоне применения «Нормофлорина-Д» у всех детей отмечалась стойкая нормализация стула к 5-7-му дню лечения. Исследование состояния микробиоты кишечника методом ГЖХ позволило доказать позитивное влияние метапробиотика «Нормофлорин-Д» на формирование нормального профиля кислот (C2-C4), что демонстрирует восстановление активности индигенной микробиоты и баланса аэробных/ анаэробных популяций микроорганизмов (рис. 5-3).

Полученные данные о смещении ОУ, АИ и уровня изомеров (индекса изокислот) в сторону нормальных значений характеризуют про-биотический эффект «Нормофлорина-Д», связанный с влиянием на деконтаминацию УПМ (рис. 5-4).

Для изучения влияния метаболического самоэлиминирующегося пробиотика споробактерина, содержащего Bacillus subtilis, на состав и функции микробиоты кишечника при ротавирусной инфекции обследовано 28 детей в возрасте от 1 до 3 лет. Преобладали дети со среднетяжелой формой заболевания. Курс лечения составил 7 дней, препарат назначался по 0,5 мл 2 раза в день за 30 мин до еды. Клинический эффект метапробиотика споробактерина в остром периоде ОКИ вирусной этиологии заключался в сокращении длительности диареи, купировании симптомов интоксикации, продолжительности абдоминального синдрома к 4-5-му дню лечения у 89,3% детей. У 10,7% детей длительность диареи сохранялась до 7 дней, что требовало продолжения пробиотической терапии до 10 дней. На фоне лечения споробак-терином отмечались положительные сдвиги в микробиоценозе кишечника с тенденцией к нарастанию уровня C2, C4 и общего уровня ЛЖК, однако эти показатели не достигали возрастной нормы (табл. 5-11).

Обращало на себя внимание достоверное нарастание C3 с повышением индекса изокислот, что наблюдается при усилении протеолитической активности анаэробной микробиоты при сохранении контаминации толстой кишки УПМ и либо свидетельствует о недостаточной эффективности коротких курсов лечения споробактерином, либо отражает сохраняющуюся метаболическую активность Bacillus subtilis, входящей в состав метапробиотика, относящегося к группе самоэлиминирующихся антагонистов [145].

Таким образом, применение метода ГЖХ с определением широкого спектра ЛЖК при вирусных диареях у детей раннего возраста позволяет в режиме реального времени оценить структурные изменения и метаболическую активность микробиоты кишечника. При микробиологическом анализе состава микробиоты наиболее часто выявляются дисбиотические реакции (46%), в то время как методом ГЖХ в 3 раза чаще регистрируется дисбиоз кишечника II степени по биохимическим критериям, к которым относятся повышение общего уровня ЛЖК, увеличение концентрации C4 и снижение АИ.

Примечание. Сравнение показателей концентраций ЛЖК осуществлялось с помощью вычисления медианы (Ме) с указанием ДИ [-,+] и оценивалось по критерию Уилкоксона.