Клиническая лабораторная диагностика заболеваний печени и желчевыводящих путей

Kapпищeнкo Анатолий Иванович - заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Минздрава России; начальник сектора по клинической лабораторной диагностике и метрологии СПб ГБУЗ «Медицинский информационно-аналитический центр». Автор более 300 научных работ, в том числе трех изданий руководств по клинической лабораторной диагностике «Медицинские лабораторные технологии» в двух томах и «Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы)», а также руководства для врачей «Водно-электролитный обмен и диагностика его нарушений». Председатель правления Санкт-Петербургского регионального отделения общероссийской общественной организации «Научно-практическое общество специалистов лабораторной медицины», заместитель председателя правления Ассоциации медицинской лабораторной диагностики по Санкт-Петербургу и Ленинградской области.

Мoскaлeв Александр Витальевич - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры микробиологии ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Минобороны России. Автор более 300 научных трудов, в том числе нескольких руководств, пособий и учебников для врачей и студентов. Член Российской ассоциации клинических аллергологов и иммунологов. Вошел в «Золотой фонд профессионалов Санкт-Петербурга в сфере образования и науки».

Кузнецов Валерий Валентинович - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры госпитальной терапии ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Минобороны России. Автор более 180 научных работ, в том числе 16 учебно-методических пособий, трех изданий руководств по клинической лабораторной диагностике «Медицинские лабораторные технологии» в двух томах и «Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы)», учебника по госпитальной терапии. Член правления Санкт-Петербургского общества терапевтов им. С.П. Боткина. Имеет большой опыт преподавания терапии и клинической лабораторной диагностики на факультетах первичной подготовки, а также переподготовки и усовершенствования врачей (педагогический стаж более 35 лет).

Жерегеля Сергей Николаевич - кандидат медицинских наук, доцент кафедры биологической химии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России; врач-лаборант сектора по клинической лабораторной диагностике и метрологии СПб ГБУЗ «Медицинский информационно-аналитический центр». Автор более 50 научных работ и соавтор руководства для врачей «Водно-электролитный обмен и диагностика его нарушений».

^♠ - торговое название лекарственного средства

^ρ - лекарственное средство не зарегистрировано в России

5’НТ - 5'-нуклеотидаза

АЖБП - алкогольная жировая болезнь печени

АИГ - аутоиммунный гепатит

АИХ - аутоиммунный холангит

АЛТ - аланинаминотрансфераза

АМФ - аденозинмонофосфорная кислота

апоЛП - аполипопротеины

апоЕ - аполипопротеин Е

апо(α) - апопротеин (α)

АПК - антигенпредставляющие клетки

АСТ - аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АХАТ - ацилхолестеринацилтрансфераза

АХЭ - ацетилхолинэстераза

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ГАМК - γ-аминомасляная кислота

ГГТФ - γ-глутамилтрансфераза

ГЛЮТ - белок - переносчик глюкозы

ГМГ-КоА - 3-гидрокси-3-метилглутарил кофермент А

ГПП - глюкагоноподобный пептид

ГСПГ - глобулин, связывающий половые гормоны

ГТ - глутатион S-трансфераза

ГЭЦ - гепатоэнтеральная циркуляция

ДПП-4 - дипептидилпептидаза-4

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИМФ - инозинмонофосфорная кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КоА - кофермент А

КОС - кислотно-основное состояние

КСГ - кортикостероидсвязывающий глобулин

КФ - классификация ферментов

ЛАП - лейцинаминопептидаза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛП(α) - липопротеины (α)

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ЛППП - липопротеины промежуточной плотности

ЛПС - липополисахарид

ЛХАТ - лецитинхолестеринацилтрансфераза

МАТ - метионинаденозилтрансфераза

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

мСРБ - мономерный С-реактивный белок

НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

НАДФН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат

НАЖБП - неалкогольная жировая болезнь печени

НАСГ - неалкогольный стеатогепатит

НГХ - наследственный (первичный) гемохроматоз

ОЖСС - общая железосвязывающая способность сыворотки крови

ОХС - общий холестерин

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПБЦ - первичный билиарный цирроз

ПСХ - первичный склерозирующий холангит

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РФП - радиофармпрепарат

РЭС - ретикулоэндотелиальная система

САА - сывороточный амилоид А

САР - сывороточный амилоид Р

СКВ - системная красная волчанка

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СРБ - С-реактивный белок

Т₃ - трийодтиронин

Т₄ - тироксин

ТСГ - тироксинсвязывающий глобулин

ТСПА - тироксинсвязывающий преальбумин

УДФ - уридиндифосфорная кислота

УДФГК - уридиндифосфоглюкуроновая кислота

УТФ - уридинтрифосфорная кислота

Ф-2,6-БФаза - фруктозо-2,6-бисфосфатаза

ФАФС - 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат

ФФК-2 - фосфофруктокиназа-2

ХС - холестерин

ХС-ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности

ХС-ЛПНП - холестерин липопротеинов низкой плотности

ХЭ - холинэстераза

цАМФ - циклическая аденозинмонофосфорная кислота

ЦОГ - циклооксигеназа

ЩФ - щелочная фосфатаза

α-GST - α-глутатион S-трансфераза (от англ. glutathione S-transferase)

η-GST - η-глутатион S-трансфераза (от англ. glutathione S-transferase)

АСА - антицентромерные антитела (от англ. anticentromere antibodies)

AFP - α-фетопротеин (от англ. alfa-fetoprotein)

AMA - антимитохондриальные антитела (от англ. antimitochondrial antibodies)

АNА - антиядерные антитела (от англ. antinuclear antibodies)

ANCA - антинейтрофильные цитоплазматические антитела (от англ. anti-neutrophil cytoplasmic antibody)

BSEP - экспортирующая помпа желчных кислот (от англ. bile salt export pump)

CENP-F - белок F центромеры (от англ. centromere protein F)

Con A - конканавалин А (от англ. concanavalin A)

CTL - цитотоксические Т-лимфоциты (от англ. cytotoxic T-lymphocyte)

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay)

FGF15/19 - фактор роста фибробластов (от англ. fibroblast growth factor)

FXR - ядерный фарнезоидный Х-рецептор (от англ. farnesoid X receptor)

GRP - глюкозозависимый белок (от англ. glucose-regulated protein)

GSH - восстановленный глутатион (от англ. reduced glutathione)

GSSG - окисленный глутатион (от англ. oxidized glutathione)

HAV - вирус гепатита А (от англ. hepatitis A virus)

HBV - вирус гепатита В (от англ. hepatitis B virus)

HCV - вирус гепатита С (от англ. hepatitis C virus)

HDV - вирус гепатита D (от англ. hepatitis D virus)

HLA - человеческие лейкоцитарные антигены (от англ. human leukocyte antigens)

hnRNPQ - ядерный рибонуклеопротеин (от англ. heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)

Hp - гаптоглобин (от англ. haptoglobin)

HSC - гемопоэтические стволовые клетки (от англ. hematopoietic stem cells)

hs-СРБ - высокочувствительный С-реактивный белок (от англ. highly sensitive)

IBABP - белок, связывающий желчные кислоты (от англ. intestinal bile acid-binding protein)

IDO - индоламин-2,3-дезоксигеназа (от англ. indoleamine-2,3-dioxygenase)

IFN - интерферон (от англ. interferon)

Ig - иммуноглобулин (от англ. immunoglobulin)

IGF-II - инсулиноподобный ростовой фактор II (от англ. insulinlike growth factor II)

IHL - внутрипеченочные лимфоциты (от англ. intrahepatic lymphocytes)

IIF - непрямая иммунофлюоресценция (от англ. indirect immunofluorescence)

IL - интерлейкин (от англ. interleukin)

IMP - IGF-II мРНК-связывающий белок (от англ. integral membrane protein)

K-Н₂ - восстановленная форма витамина K

LKM - печеночный/почечный микросомальный антиген (от англ. liver kidney microsomal)

LP - печеночный/поджелудочный антиген (от англ. liver pancreas)

LRH-1 - ядерный рецептор печени-1 (от англ. liver receptor homolog-1)

LSEC - печеночные синусоидальные эндотелиальные клетки (от англ. liver sinusoidal endothelial cells)

LPS - липополисахарид (от англ. lipopolysaccharide)

MCTD - смешанные заболевания соединительной ткани (от англ. mixed connective tissue disease)

MHC - главный комплекс гистосовместимости (от англ. major histocompatibility complex)

NKT-клетки - естественные киллеры Т-лимфоциты (от англ. natural killers T-cells)

NK-клетки - естественные киллеры (от англ. natural killers)

NO - оксид азота

OSTα/β - транспортер органических растворов (от англ. organic solute transporter)

PALB - преальбумин (от англ. prealbumin)

PALT - портальная тракт-ассоциированная лимфоидная ткань (от англ. portal tract-associated lymphoid tissue)

PRMT1 - аргининметилтрансфераза 1 (от англ. protein arginine methyl-transferase 1)

PSS - прогрессирующий системный склероз (от англ. progressive systemic sclerosis)

RBP - ретинолсвязывающий белок (от англ. retinol binding protein)

RRM - РНК-распознающий мотив (от англ. RNA recognition motif)

SHP - короткий гетеродимерный белок (от англ. short heterodimer protein)

SLA - растворимый печеночный антиген (от англ. soluble liver antigen)

SMA - антитела к гладким мышцам (от англ. smooth muscle antibody)

SS - синдром Шегрена (от англ. Sjogrens syndrome)

sTfR - растворимый рецептор трансферрина (от англ. soluble trans-ferrin receptor)

TCR - Т-клеточный рецептор (от англ. T-cell receptor)

TCRs - Т-клеточный рецептор секреторный (от англ. T-cell receptor secretory)

TGFβ - трансформирующий фактор роста бета (от англ. transforming growth factor beta)

Th1 - Т-хелперы 1-го типа (от англ. T-helper 1)

Th2 - Т-хелперы 2-го типа (от англ. T-helper 2)

TNFα - фактор некроза опухоли альфа (от англ. tumor necrosis factor alpha)

TRAIL - апоптозиндуцирующий лиганд семейства TNF (от англ. TNF-related apoptosis inducing ligand)

VDBP - витамин D-связывающий белок (от англ. vitamin D binding protein)

Важную роль в диагностике, определении тяжести течения и прогнозе заболеваний печени играют показатели лабораторных исследований. В большинстве случаев это становится возможным не по результатам отдельного теста, а на основании интерпретации данных, полученных при применении нескольких тестов, часто объединенных понятием «клинико-лабораторные синдромы».

В предлагаемом руководстве систематизированы сложившиеся в настоящее время представления о функциях печени, ее патологии в преломлении к задачам диагностики и лечения в клинической практике. Рассмотрена ее существенная роль в обмене углеводов, липидов, белков, витаминов, железа, билирубина и других веществ, а также в обезвреживании и выведении эндогенных токсичных веществ и ксенобиотиков.

Авторы постарались показать значение печени не только как «лаборатории» всего организма, но и как одного из мощнейших иммуно-тропных органов, регулирующего иммунный гомеостаз на местном уровне и участвующего в развитии механизмов адаптивного иммунного ответа. Гепатоиммунология является быстро растущим направлением, где пересекаются специальности гепатологии и клинической иммунологии. Основываясь на данных современной иммунологии, авторы детальным образом охарактеризовали популяции и субпопуляции лимфоцитов печени. Изложены особенности количественного и качественного их состава в здоровой неинфицированной печени и печени с иммунным воспалением, а также роль внутрипеченочных Т-лимфоцитов в развитии ее хронического повреждения. Подробно описаны синусоидальные эндотелиальные клетки печени, играющие важнейшую роль в поддержании ее иммунного гомеостаза и которым принадлежит ведущая роль как сигнальным молекулам опасности. Особо охарактеризованы Т-лимфоциты «киллеры», показана их противоинфекционная и противоопухолевая активность. Отражена роль дендритных клеток при инфекционных заболеваниях, алкогольных и неалкогольных жировых заболеваниях печени, при развитии иммунной толерантности в печени.

На современном уровне представлен иммунопатогенез вирусных и аутоиммунных гепатитов, а также рассмотрены бактериальные и паразитарные заболевания печени, гнойные абсцессы и хронические диффузные паренхиматозные заболевания печени неинфекционной природы и их диагностика.

Наряду с описанием иммунного гомеостаза печени, которому в руководстве уделено существенное внимание, с учетом новейших научных достижений охарактеризованы нарушения липидного метаболизма и связанные с ними заболевания. Исследования, основанные на самых современных достижениях теоретической и клинической медицины, определили новые подходы к диагностике и лечению заболеваний, вызываемых нарушениями липидного обмена. K этим заболеваниям отнесены облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей и органов брюшной полости, липогенный панкреатит, холестероз желчного пузыря и жировой гепатоз. В настоящее время они рассматриваются с позиции липидного дистресс-синдрома. Главным органом-мишенью при данном синдроме является печень. Морфофункциональные изменения печени связаны с работой ее ретикулоэндотелиальной системы совместно с гепатоцитами и микрофлорой желудочно-кишечного тракта. Наряду с этим происходят нарушения энтерогепатической циркуляции желчных кислот, что способствует развитию синдрома нарушенного пищеварения.

Поражения печени достаточно часто выступают патофизиологическим звеном в развитии различных заболеваний. В связи с этим особое внимание уделяется неалкогольной жировой болезни печени, признаки которой установлены у 34% населения России по результатам обследования с использованием магнитно-резонансной спектроскопии. Жировая дистрофия - это первый этап формирования фиброза печени. Запускают фиброгенез звездчатые клетки печени. Активированные звездчатые клетки трансформируются в миофибробласты, которые стимулируют первичную выработку коллагена. В последующем жировая дистрофия печени переходит в стеатогепатит, который, в свою очередь, сменяется циррозом, а затем может развиться гепатоцеллюлярная карцинома. Однако дальнейшие наблюдения показали, что такие больные не доживают до развития гепатокарциномы, а умирают от инсульта, инфаркта или нарушений сердечного ритма. Таким образом, неалкогольную жировую болезнь печени можно рассматривать как независимый предиктор сердечно-сосудистых заболеваний. Этот факт подтверждает наличие гепатокардиальных связей в развитии патологии.

На современном этапе развития гастроэнтерологии отдельные моменты функциональных взаимоотношений печени, желчного пузыря, желчевыделительных путей, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки остаются недостаточно изученными из-за отсутствия адекватных лабораторно-инструментальных методов диагностики.

Желчеобразование и желчеотделение представляют собой сложный процесс, в котором задействована вся система пищеварения. Желчный пузырь здорового человека находится в состоянии почти непрерывной деятельности, приспособленной к работе пищеварительного аппарата. При патологии органов пищеварения в большинстве случаев развивается билиарная недостаточность (снижается синтез желчных кислот), о которой лечащие врачи часто забывают, что отражается на эффективности лечения. Однако наиболее ярким примером патологии, при которой она получает развитие, является желчнокаменная болезнь. Желчнокаменная болезнь - многофакторное и многостадийное заболевание, в той или иной степени охватывающее практически все патогенетические механизмы развития билиарной недостаточности.

МОРФОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ

Печень взрослого человека - центральный орган химического гомеостаза организма. Она представляет собой сложно разветвленный железистый орган ацинарного строения, имеющий мягкую консистенцию и красно-бурый цвет. Относительные размеры и масса печени подвержены значительным колебаниям в зависимости от возраста. Длина печени у взрослого человека в среднем составляет 20-30 см, ширина - 10-21 см, высота колеблется от 7 до 15 см. Ее масса равна 1400- 1800 г, что составляет 1/50 массы тела человека. Печень у новорожденных и детей первого месяца жизни занимает 1/2 или 1/3 брюшной полости, равняясь 1/20 массы всего тела.

Печень имеет уникальное кровообращение. Через портальную вену в печень поступает кровь практически от всего желудочно-кишечного тракта, а системное кровообращение осуществляется через печеночную артерию. Более 2000 л крови ежедневно проходит через печень человека.

Кровоснабжение печени осуществляется воротной веной (несет венозную кровь от кишечника, селезенки, желудка, поджелудочной железы) и собственной печеночной артерией, несущей кровь в общие печеночные капилляры - синусоиды, формирующие систему сосудов, обеспечивающих обменные процессы. Из капилляров, в свою очередь, формируется центральная вена дольки печени, являющаяся притоком бассейна нижней полой вены. Благодаря такой системе кровоснабжения осуществляется принцип функционального раздвоения кровотока, когда по артерии в печень поступает богатая кислородом кровь, необходимая для обеспечения жизнедеятельности гепатоцитов и для выполнения их функций, а по воротной вене поступают вещества, которые всосались в кровь в стенках желудочно-кишечного тракта и в последующем подвергнутся дальнейшей переработке печеночными клетками.

В ворота печени, кроме воротной вены и собственной печеночной артерии, входят нервы, выходят общий печеночный проток и лимфатические сосуды.

От фиброзной капсулы вглубь печени отходят прослойки соединительной ткани, разделяющие паренхиму печени на дольки. Эти структурно-функциональные элементы имеют форму многогранной призмы, их диаметр составляет от 1 до 1,5 мм. По современным данным, в печени насчитывается до 500 тыс. долек.

В центре печеночной дольки находится центральная печеночная вена (первичный венозный коллектор) - сосуд, по которому кровь оттекает от органа. К центральной вене от периферии дольки сходятся кровеносные капилляры (синусоиды). Синусоиды располагаются радиарно, между печеночными балками. Они состоят из двух рядов печеночных клеток - гепатоцитов. В печеночных синусах находится несколько популяций клеток: клетки Купфера, эндотелиальные клетки синусов печени (liver sinusoidal endothelial cells, LSEC), звездчатые клетки, ямочные клетки и лимфоциты печени (рис. 1-1).

Популяция клеток синусов печени (табл. 1-1) составляет около 6,3% массы печени. В то же время она составляет приблизительно 40% общего количества клеток печени, 26% общей поверхности (только эндотелиальные синусоидальные клетки), 58% общего количества эндотелиальных везикул (пор) (главным образом LSEC), 43% общего количества объема лизосом (главным образом клетки Купфера и LSEC).

Эндотелиальные клетки печени формируют тонкий, но непрерывный слой клеток, который физически отделяет лейкоциты кровотока от гепатоцитов. В отличие от эндотелиальных клеток других органов, они не имеют базальной мембраны. Пространство между гепатоцитами и LSEC называют пространством Диссе, которое включает богатую внеклеточную матрицу, образованную LSEC, заселено звездчатыми клетками, контактирующими с LSEC, и регулирует синусоидальный кровоток, уменьшая диаметр синусов. Клетки Купфера расположены преимущественно в перипортальных областях и контролируют медленную миграцию LSEC.

Клетки Купфера в основном (80-90%) являются резидентами макрофагов во всем теле. Они составляют около 15% общего объема клеток печени, чрезвычайно активны в фагоцитозе и секретируют многочисленные растворимые медиаторы, такие как цитокины, простагландины, кислородные радикалы и протеазы. Клетки Купфера выступают из внутренней синусоидальной стенки, такая позиция позволяет им легко выполнять фагоцитирующие функции в отношении переносимых с кровью материалов, поступающих в печень. Одной из наиболее важных функций клеток Купфера является выведение циркулирующего эндотоксина. Кроме того, они эффективно элиминируют вирусы, бактерии, грибы, паразиты, а также иммунные комплексы, клетки опухоли, липосомы, липидные микросферы, железо и другие твердые частицы. Эндотоксин (липополисахарид) является мощным стимулятором клеток Купфера, что приводит к секреции воспалительных медиаторов, таких как интерлейкин 1 (IL-1) и фактор некроза опухоли альфа (TNFα), а также кислородных радикалов и протеаз. Однако существует и гетерогенность функций клеток Купфера в зависимости от их анатомического расположения в печени. Клетки Купфера, находящиеся в зоне 1 (перипортальной), обладают более высокой фагоцитарной и лизосомальной активностью ферментов с соответствующим увеличением продукции активных форм кислорода, чем клетки Купфера, находящиеся в зоне 3 (перивенозной и центральной доли).

Вследствие узкого диаметра печеночного синуса (7-12 мкм) клетки Купфера могут временно нарушать микроциркуляцию в отдельных синусах, блокируя их просвет. Вместе с другими особенностями микроциркуляции в печени это способствует медленному и хаотическому кровотоку в синусах, что создает идеальные условия для элиминирования макромолекул и инициирования межклеточного контакта между клетками синусов печени и лимфоцитами-«пассажирами».

У LSEC есть поры размером около 100-150 нм, которые могут динамически реагировать актиновым цитоскелетом на контакт клеток с продуктами алкоголя или никотина. Клетки крови, проходя через узкие печеночные синусы, оказывают своеобразный «синусоидальный массаж», приводящий к улучшению обмена между синусоидальным пространством и пространством Диссе. Полиморфные макромолекулы размером более 100 нм, а также ригидные макромолекулы размером более 12 нм не проникают через поры LSEC, выполняющих функцию своеобразного «решета», в пространство Диссе. Большие молекулы, такие как хиломикроны, превышающие в размере 100 нм, вначале подвергаются метаболизму мембрано-ассоциированной липазой, прежде чем они смогут пройти через поры. Альтернативный путь к гепатоцитам через рецептор-опосредованную связь LSEC с последующей трансдукцией эндотелиального барьера.

Ямочные лимфоциты (большие гранулированные лимфоциты), лимфоциты печени составляют гетерогенную популяцию печеночных лимфоцитов. Эти клетки находятся в тесном межклеточном контакте с клетками LSEC и купферовскими клетками и участвуют в развитии локальных иммунных механизмов защиты против патогенных микроорганизмов и опухолевых клеток. В перипортальном пространстве обнаружена специализированная субпопуляция дендритных клеток, которые вместе с купферовскими клетками идеально располагаются, для того чтобы элиминировать патогенные агенты через кровоток портальной вены.

Печень тесно контактирует с лимфатической системой. Так, частицы, введенные через портальную вену, в течение нескольких часов оказываются в ретроперитонеальных лимфатических узлах и в дендритных клетках. Предполагается, что дендритные клетки поглощают частицы, а затем мигрируют в периферические лимфатические узлы и таким образом играют одну из ключевых ролей в регулировании иммунных реакций на антигены, поступившие через кровоток печени.

Междольковый желчный проток, артерия и вена образуют печеночную триаду. На периферии каждой дольки находится несколько таких печеночных триад. Из каждой доли печени выходит выводной желчный проток (правый и левый), которые, соединяясь, образуют общий печеночный проток. Он, объединившись с пузырным протоком, образует общий желчный проток (холедох, choledoch). Структурно-функциональной единицей печени является печеночная долька. Однако некоторые авторы, наряду с классической печеночной долькой, выделяют простой печеночный ацинус, имеющий форму тутовой ягоды с диаметром 0,25-0,50 мм. Обычно терминальные ветви воротной вены делятся на три расходящихся осевых синусоида. Ориентированные вокруг осевого синусоида клетки паренхимы формируют простой печеночный ацинус. В простом ацинусе выделяют три зоны печеночных клеток в зависимости от условий кровоснабжения. Первая зона представлена клетками, которые расположены вблизи осевых синусоидов ацинуса. Они находятся в оптимальных условиях кровоснабжения. В то же время эти клетки первыми вступают в контакт с токсичными веществами, поступающими с током крови.

Вторая зона представлена клетками с ухудшенными условиями кровоснабжения. В наименее выгодных условиях находятся клетки третьей зоны, оказывающиеся тем самым наименее резистентными к любым повреждениям. Таким образом, территория каждого ацинуса затрагивает участки паренхимы, относящиеся к двум соседним долькам (рис. 1-2).

Чрезвычайно важна роль печени в процессах пищеварения и обмене веществ в организме человека. Печень участвует в обмене белков, углеводов, липидов, нейтральных жиров, холестерина, ферментов, витаминов, а также в водном и минеральном обмене, обмене желчных кислот и желчеобразовании, пигментном обмене (табл. 1-2).

Примечание. КОС - кислотно-основное состояние; ВЭО - водно-электролитный обмен.

Морфологическое строение печени у человека в норме исследовано на достаточно хорошем уровне. Подробно изучены функции печени, играющие важную роль в регуляции обменных и адаптационных процессов. Печень является «химической лабораторией», с которой связаны практически все виды обмена веществ в организме.

Доказано, что для поддержания нормального функционирования печени необходимо ее полноценное взаимодействие с другими органами и системами организма, в том числе и с кишечником.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ПИЩЕВАРЕНИИ

Процесс пищеварения - это каскад сложных многоэтапных физиологических реакций, в основе которых лежит ферментативное расщепление пищи. Отечественный ученый А.М. Уголев в 1958 г. не только открыл новый вид обработки пищи - мембранное пищеварение, но и сформулировал новую схему функционирования пищеварительной системы, назвав ее пищеварительно-транспортным конвейером, куда были включены все этапы пищеварения (ротовая полость, желудок, двенадцатиперстная кишка, тонкая кишка, толстая кишка). А.М. Уголев установил, что пищеварение является сложным процессом переработки пищевых веществ с помощью ферментов при продвижении пищевых масс по желудочно-кишечному тракту, в котором происходят:

Все органы гепатопанкреатодуоденальной зоны - активные участники процессов пищеварения. Наиболее важный этап пищеварения происходит в двенадцатиперстной кишке. Здесь объединяются пищеварительные функции желудка, печени, поджелудочной железы и тонкой кишки. Двенадцатиперстная кишка, являясь проксимальной частью тонкой кишки, выполняет и ряд важных функций, характерных в целом для тонкой кишки. Этими функциями являются:

Пищеварительные ферменты распределены по ходу тонкой кишки неравномерно. Панкреатические ферменты, адсорбированные в щеточной кайме, локализуются в двенадцатиперстной кишке и в начальных отделах тощей кишки, кишечная дисахаридаза - преимущественно в тощей кишке, а дипептидазы и липаза - в тощей и подвздошной кишке. В щеточной кайме происходит окончательный ферментный гидролиз мелких молекул пищевых веществ и их всасывание.

Процесс переваривания пищи начинается с полостного пищеварения. В водной среде просвета тонкой кишки растворены гидролитические ферменты поджелудочной железы - трипсин, химотрипсин, карбоксипептидаза, α-амилаза, липаза, эластаза и др.

Под действием трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы и эластазы гидролизуются пептиды с образованием низкомолекулярных пептидов и небольшого количества аминокислот. Под действием панкреатической α-амилазы углеводы (крахмал и гликоген) расщепляются до дисахаридов и глюкозы. Панкреатическая липаза в присутствии желчных кислот гидролизует жиры до ди- и моноглицеридов, жирных кислот и глицерина.

Тем не менее полостное пищеварение не может обеспечить всасывание пищевых веществ, поскольку они находятся слишком далеко от зоны щеточной каймы, где сосредоточены все транспортные системы, предназначенные для активного переноса образовавшихся мономеров через плазматическую мембрану внутрь энтероцита.

Пристеночное (мембранное) пищеварение осуществляется в зоне щеточной каймы, где сосредоточены кишечные ферменты, синтезируемые кишечным эпителием, и ферменты поджелудочной железы, адсорбированные на поверхности микроворсинок в гликокаликсе.

В щеточной кайме происходит окончательный ферментный гидролиз мелких молекул пищевых веществ и их всасывание. Важно отметить почти полную стерильность процесса мембранного пищеварения и всасывания в тонкой кишке, что объясняется слишком большими размерами бактерий, значительно превышающими расстояние между микроворсинками и размеры сети гликокаликса. Именно поэтому микроорганизмы не находят в тонкой кишке условий для поддержания своей жизнедеятельности и размножения.

Двенадцатиперстная кишка принимает активное участие в гуморальной регуляции экзокринной секреции поджелудочной железой. Слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки содержит эндокринные клетки, вырабатывающие секретин в ответ на поступление в просвет кишечника кислого содержимого из желудка. Секретин запускает секрецию дуктулоцитов (протоковых клеток поджелудочной железы), нарабатывающих бикарбонаты. I-клетки вырабатывают холецистокинин, который запускает секрецию ферментов ацинарными клетками поджелудочной железы, а также вызывает сокращение желчного пузыря.

Установлено, что двенадцатиперстная кишка участвует в регуляции гомеостаза глюкозы при участии гормонов желудочно-кишечного тракта, называемых инкретинами.

Инкретины - это гормоны желудочно-кишечного тракта, вырабатываемые в ответ на прием пищи и вызывающие стимуляцию секреции инсулина.

В 1964 г. было установлено, что при пероральной нагрузке декстрозой (Глюкозой^♠) инсулин секретируется в гораздо большем количестве, чем в ответ на ее внутривенное введение, несмотря на достижение одинакового уровня гликемии.

Открытие инкретинов произошло более 100 лет назад. В 1902 г. английские физиологи W. Bayliss (У. Бейлисс) и E. Starling (Э. Старлинг) обнаружили, что кишечная слизь содержит гормон, стимулирующий экзокринную секрецию поджелудочной железы, и назвали его «секретин». Четырьмя годами позже, в 1906 г., B. Moore (Б. Мур) опубликовал статью под названием «Лечение сахарного диабета при помощи экстракта слизистой двенадцатиперстной кишки». Он выделил экстракт слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и впервые использовал его для лечения пациентов с глюкозурией, эффект оказался положительным. В 1928 г. E. Zunz (Э. Зунц) и J. La Barre (Ж. Ла Барре) описали гипогликемический эффект после инъекции «секретина», извлеченного из слизистой оболочки тонкой кишки свиньи, и, используя эксперименты с поперечной циркуляцией, они смогли показать, что этот эффект опосредуется через поджелудочную железу. Термин «инкретин» был предложен J. La Barre в 1932 г. для гормона, выделенного из слизи верхнего отдела кишечника и способного вызывать гипогликемию. Доказательства существования инкретинов были подтверждены в 1960-х годах. Первый гормон с инкретиновой активностью был выделен из экстракта дуоденальной слизи свиньи. Он получил название «желудочный ингибиторный полипептид» и был отнесен к классу энтерогастронов (ингибировал секрецию соляной кислоты в желудке). Однако позднее выяснилось, что главным биологическим эффектом этого пептида является глюкозозависимая стимуляция секреции инсулина. Именно поэтому в 1973 г. ученые J.C. Brown (Дж. Браун) и J. Dupre (Дж. Дюпре) предложили переименовать желудочный ингибиторный полипептид в глюкозозависимый инсулинотропный полипептид. Местом его синтеза являются K-клетки слизистой оболочки кишечника, в основном - двенадцатиперстной и тощей кишки.

В 1983 г. были выделены два глюкагоноподобных пептида (ГПП): ГПП-1, ГПП-2. Местом синтеза этих гормонов являются L-клетки в слизистой оболочке подвздошной кишки. После выяснения роли инкретинов в регуляции углеводного обмена был создан принципиально новый класс гипогликемических средств с инкретинмиметическим механизмом действия.

Среди ряда кишечных гормонов с инкретиноподобным действием выделяют два основных: ГПП-1 и глюкозозависимый инсулинотропный пептид.

В настоящее время активно изучаются эффекты инкретинов в организме на сердечно-сосудистую систему, печень, поджелудочную железу, кишечник. Система инкретинов является перспективной фармакологической мишенью для разработки сахароснижающих препаратов для лечения сахарного диабета 2-го типа (рис. 1-3).

Представленная на рис. 1-3 схема показывает, что пути фармакологического воздействия на систему инкретинов для получения нормогликемического эффекта не ограничиваются ингибированием дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) и применением ДПП-4 устойчивых аналогов ГПП-1. В 2003 г. было установлено, что так называемые свободные жирные кислоты, постоянно циркулирующие в крови, активируют в β-клетках поджелудочной железы рецептор GPR40, тем самым влияя на уровень глюкозы. В начале 2000-х годов множество фармацевтических компаний начали разработку активаторов рецептора GPR40. Обнаружение ряда рецепторов на энтероэндокринных L- и K-клетках кишечника и β-клетках поджелудочной железы (GPR40, GPR119 и др.) открыло новый подход к созданию сахаро-снижающих препаратов. При активации этих рецепторов происходит увеличение секреции инкретинов и глюкозозависимой секреции инсулина. Представленные данные свидетельствуют о перспективности разработки агонистов рецепторов GPR40 и GPR119 в качестве пероральных гипогликемических средств. Одной из очевидных стратегий применения агонистов GPR40 и GPR119 является их комбинация с ингибиторами ДПП-4.

Переваривание и всасывание липидов

Полноценное переваривание и всасывание жиров в тонкой кишке зависит от нормального функционирования печени, желчевыводящих путей, поджелудочной железы, состояния энтероцитов и лимфатической системы кишечника. Однако до настоящего времени многие процессы функциональных взаимоотношений печени, желчевыделительной системы, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки остаются без должного внимания практикующих врачей и, как следствие, не учитываются в лечении заболевания. В данной ситуации не учитывается роль печени и билиарной системы, тогда как в метаболизме липидов им принадлежит ключевая роль. Печень выполняет ряд важных функций:

В среднем у здоровых людей за сутки выделяется от 500 до 2000 мл желчи (12-15 мл на 1 кг массы тела). На 82% она состоит из воды. Основные ингредиенты сухого остатка печеночной желчи распределяются следующим образом: желчные кислоты - 67%, фосфолипиды - 22%, белки - 4,5%, холестерол - 4%, билирубин - 0,3%, соли - 2,2%. Среди желчных кислот половина приходится на первичные желчные кислоты - холевую и хенодезоксихолевую. Соотношение между ними составляет 1:1 (табл. 1-3).

Окраска желчи обусловлена желчными пигментами - билирубином, наибольшая часть которого представлена в виде диглюкуронида билирубина (прямого билирубина), меньшая - в виде моноглюкуронида билирубина и биливердином. Печеночная желчь имеет золотисто-желтый цвет именно благодаря билирубину. При длительном стоянии желчь приобретает зеленоватый цвет за счет окисления билирубина в биливердин, имеющий зеленый цвет.

Краткая характеристика основных липидов пищи

Жиры пищи более чем на 95% состоят из сложных эфиров глицерина и жирных кислот (нейтральных жиров), преимущественно триглицеридов.

Основными липидами плазмы крови человека являются триглицериды, фосфолипиды, жирные кислоты, холестерин и эфиры холестерина.

Жирные кислоты поступают в организм с пищей. Бóльшая их часть находится в составе триглицеридов. Выделяют насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты. Степень ненасыщенности зависит от числа двойных связей в составе молекулы жирной кислоты.

Насыщенные кислоты преобладают в жирах животного происхождения, моно- и полиненасыщенные - в растительных маслах и рыбьем жире.

Насыщенные кислоты оказывают атерогенное действие, а полиненасыщенные эссенциальные жирные кислоты обладают антиатерогенным действием. Именно поэтому растительные масла, богатые полиеновыми жирными кислотами, рекомендуется использовать в пищу взамен жиров животного происхождения, где много насыщенных жирных кислот. Исключением из растительных масел являются кокосовое и пальмовое, в которых содержатся насыщенные жирные кислоты.

Триглицериды (триацилглицеролы) - это эфиры трехатомного спирта глицерина и длинноцепочечных жирных кислот. В энтероцитах тонкой кишки осуществляется ресинтез триглицеридов из всосавшихся из пищи свободных жирных кислот и моноглицеридов. Ресинтезированные в клетках кишечника «пищевые» триглицериды поступают в кишечные лимфатические сосуды в составе хиломикронов, а затем через грудной лимфатический проток поступают в кровоток. В норме экзогенные триглицериды поступают в кровь в количестве 70-150 г/сут. Именно поэтому после приема пищи, особенно жирной, уровень триглицеридов в крови заметно повышается и остается высоким в течение нескольких часов (до 10 ч).

Триглицериды выполняют в организме роль источника и «аккумулятора» энергии.

Фосфолипиды представляют собой сложные эфиры многоатомных спиртов глицерина или сфингозина с высшими жирными кислотами и фосфорной кислотой. В состав фосфолипидов также входят азотсодержащие соединения: холин, этаноламин или серин. В отличие от триглицеридов, они содержат фосфатное основание вместо одной жирной кислоты, что придает молекуле фосфолипида алифатический характер. Благодаря такому строению фосфолипиды могут взаимодействовать с липидами, а за счет полярных фосфатных головок - с водным окружением.

Фосфолипиды присутствуют в желчи, в которой, растворяя холестерин, играют важную стабилизирующую роль. При превышении величины соотношения холестерин/фосфолипиды 1:1 нарушается растворимость холестерина и происходит его кристаллизация вокруг нерастворимого ядра липида, что приводит к образованию холестериновых камней и формированию желчнокаменной болезни.

Холестерин является мононенасыщенным стерином состава С₂₇ Н₄₆ О. По своей химической структуре это одноатомный спирт (холестерол). Термин «холестерин» определяет источник, из которого он впервые был выделен (от греч. chole - желчь).

Суточная потребность организма человека в холестерине составляет около 1,2 г. Это количество обеспечивается за счет поступления холестерина с пищей (примерно 400 мг) и его синтеза в организме (примерно 800 мг). Источником экзогенного холестерина, поступающего в организм с пищей, служат продукты животного происхождения. Главным источником эндогенного холестерина является печень. Относительно небольшое количество синтезируемого холестерина поступает в кровь, а основная его часть трансформируется в желчные кислоты и попадает с желчью в просвет тонкой кишки. На синтез желчных кислот расходуется до 80% холестерина.

Образование желчных кислот

Печень является единственным органом, способным образовывать желчные кислоты из холестерина, так как ферменты, участвующие в гидроксилировании и конъюгации желчных кислот, находятся в микросомах и митохондриях гепатоцитов.

Желчные кислоты образуются в печени из холестерина (рис. 1-4).

При классическом биосинтезе первым и единственным ферментом, лимитирующим скорость синтеза желчных кислот, является холестерол-7α-гидроксилаза (CYP7A1). Она ингибируется конечным продуктом - желчными кислотами. 7α-Гидроксилаза является одним из ферментов, содержащих в качестве простетической группы цитохром Р450 и использующих кислород в качестве субстрата. Один атом кислорода из О₂ включается в гидроксильную группу в положении 7, а другой восстанавливается до воды. В результате ряда последующих превращений образуются две первичные желчные кислоты - холевая и хенодезоксихолевая. Отношение холевой и хенодезоксихолевой желчных кислот определяется активностью фермента стерол 12α-гидроксилазы (CYP8В1), который катализирует синтез холевой кислоты. Митохондриальный фермент стерол 27-гидроксилаза (CYP27A1) катализирует окисление боковой цепи стерола, в результате которого в пероксисомах отщепляется 3-карбонильный остаток и образуются С24 желчные кислоты. Далее следует этап, зависимый от активности фермента оксистерол 7α-гидроксилазы (CYP7В1). Гидроксилированные стеролы превращаются в печени в желчные кислоты.

Первичные желчные кислоты превращаются в соли вторичных желчных кислот - деоксихолевую и литохолевую, а также третичные желчные кислоты - урсодезоксихолевую и сульфолитохолевую, которые образуются в печени (рис. 1-5). Желчные кислоты представляют собой амфипатические молекулы, у которых все гидроксильные и карбоксильные группы находятся на одной стороне молекулы, а карбонильные - на другой. Повышение растворимости желчных кислот достигается в результате реакций их конъюгации с аминокислотой глицином или таурином. У человека большинство этих кислот конъюгировано с глицином.

Конъюгированные с глицином желчные кислоты могут секретироваться в желчь. Эти желчные кислоты (соли желчных кислот) накапливаются в желчном пузыре. Установлено, что желчные кислоты являются важнейшим стабилизатором коллоидного состояния желчи.

После каждого приема пищи они поступают в кишечник для участия в эмульгировании жиров. Холевая и хенодезоксихолевая кислоты под действием кишечной бактериальной 7α-дегидроксилазы превращаются, соответственно, в дезоксихолевую и литохолевую кислоты. Желчные кислоты и сами по себе стимулируют выделение желчи в кишечник.

Образованные конъюгаты повышают поляризацию молекул желчных кислот, что важно для образования в водной среде растворимых комплексов, которые содержат в своем составе такие труднорастворимые в воде вещества, как холестерин. В образовании растворимых комплексов участвуют и содержащиеся в желчи фосфолипиды. Именно нормальное соотношение холестерина, желчных кислот и фосфолипидов способствует образованию водорастворимых мицелл, а нарушение соотношения этих компонентов приводит к выпадению холестерина в осадок. Как было уже сказано, среди желчных кислот желчи преобладают конъюгаты первичных желчных кислот. В желчи взрослого человека на долю конъюгатов холевой кислоты приходится 38%. Конъюгаты хенодезоксихолевой кислоты составляют 34%, конъюгаты дезоксихолевой кислоты - 28%, и лишь 2% - конъюгаты литохолевой кислоты, которая в кишечнике практически не всасывается. Показано, что при длительном застое желчь может вызывать повреждения клеток печени, а желчные кислоты могут конъюгировать не только с глицином и таурином, но и с серной и глюкуроновой кислотами.

Часть желчных кислот реабсорбируется в терминальном отделе подвздошной кишки и по портальному кровотоку транспортируется в печень, где оказывает тормозящее действие на собственный синтез (гепатоинтестинальная, энтерогепатическая или печеночно-кишечная циркуляция желчных кислот; рис. 1-6). Около 5% желчных кислот (0,5 г/сут) выводится с калом. Эта потеря восполняется вновь синтезированными желчными кислотами.

Важную роль в регуляции синтеза, экскреции и транспорта желчных кислот играет активируемый этими кислотами ядерный фарнезоидный Х-рецептор (FXR). Гидрофобные желчные кислоты, например хенодезоксихолевые кислоты, выступают как эффективные его лиганды. FXR активирует экспортную помпу желчных кислот (bile salt export pump, BSEP), которая осуществляет их трансмембранный транспорт в желчь. В подвздошной кишке FXR на апикальной мембране эпителиоцитов индуцирует синтез белка, связывающего желчные кислоты (interstinal bile acid binding protein, IBABP), а на базолатеральной мембране - синтез транспортера органических растворов (organic solute transporter, OSTα/β). Оба транспортера осуществляют трансцеллюлярный перенос желчных кислот из просвета кишечника в систему воротной циркуляции и в печень.

Синтез желчных кислот в печени тормозится по механизму обратной связи в результате их воздействия на ядерные рецепторы при гепатоэнтеральной циркуляции (ГЭЦ) по двум механизмам. Первый механизм связан с индукцией синтеза короткого гетеродимерного белка - SHP (short heterodimer partner), активируемого желчными кислотами FXR. SHP затем подавляет активирующее действие фактора транскрипции α-фетопротеина (аlfa-fetopotein, AFP), связанного с промотором гена 7α-гидроксилазы. Второй механизм торможения синтеза желчных кислот включает индукцию с помощью FXR гена фактора роста фибробластов (fibroblast growth factor, FGF15/19).

Поскольку именно в печени и кишечнике происходит основной обмен холестерина и продуктов его превращения (метаболитов), то нарушения этого обмена ведут к развитию целого ряда заболеваний. Именно поэтому для учета взаимодействия печени и кишечника необходимо осуществлять оценку одного из важнейших показателей человеческого организма - гепатоэнтеральную циркуляцию (см. рис. 1-6). При ее нарушении изменяется выведение эндо- и экзотоксинов, атерогенных фракций холестерина, вторичных и третичных желчных кислот. Считается, что нарушения ГЭЦ лежат в основе механизмов интоксикации, развития атеросклероза и опухолевого роста.

Снижение содержания желчных кислот в просвете кишечника сопровождается нарушением абсорбции жиров. Аналогичные нарушения в энтерогепатической циркуляции желчных кислот происходят и при применении так называемых хелатных химических соединений, таких как холестирамин.

Применение анионообменных смол (холестирамина и холестипола) для снижения уровня холестерина крови основано на абсорбции желчных кислот в просвете кишечника. Небольшие количества холестерина и желчных кислот могут также связываться богатыми растительной клетчаткой пищевыми продуктами.

Переваривание липидов

В двенадцатиперстной кишке начинается эмульгирование жира под действием солей желчных кислот, поступающих сюда в составе желчи. Желчь представляет собой мицеллярный раствор. Желчные кислоты в составе желчи являются поверхностно-активными, амфипатическими молекулами, способными к самоагрегации. При этом благодаря очень узкой концентрационной норме, называемой критической концентрацией мицеллизации, образуются простые мицеллы. Холестерин, практически нерастворимый в воде, транспортируется в растворенном состоянии в желчи благодаря ее мицеллярному строению. Этот процесс называют коллоидным растворением - солюбилизацией.

Простые мицеллы обладают выраженной способностью к эмульгированию липидов, формируя смешенные мицеллы. Соли желчных кислот, располагаясь на поверхности капелек жира, снижают их поверхностное натяжение и способствуют дроблению жировых капель и увеличению их суммарной поверхности. Образуется тонкодисперсная эмульсия липидов в воде, состоящая из мельчайших капелек жира, что облегчает его взаимодействие с липазой поджелудочной железы. Под действием панкреатической липазы происходит гидролиз эфирных связей триглицеридов, в результате чего образуются моноглицериды и жирные кислоты.

Панкреатическая липаза выделяется в полость тонкой кишки из поджелудочной железы в неактивном виде. Активация происходит под действием фермента колипазы.

Она поступает в просвет кишечника в неактивном виде и в результате реакции протеолиза при участии трипсина превращается в активную форму, которая, соединяясь с панкреатической липазой в соотношении 2:1, своим гидрофобным доменом связывается с поверхностью мицеллы эмульгированного жира. Другая часть молекулы способствует формированию такой конформации панкреатической липазы, при которой активный центр фермента максимально приближен к своим субстратам - молекулам триглицеридов, поэтому скорость реакции их гидролиза резко возрастает. Кроме того, комплекс липазаколипаза более устойчив к действию трипсина.

Панкреатическая липаза гидролизует триглицериды преимущественно в положениях 1 и 3, поэтому основными продуктами гидролиза являются свободные жирные кислоты и 2-моноацилглицеролы (β-моноацил глицеролы).

Основную часть фосфолипидов в содержимом тонкой кишки составляет фосфатидилхолин (лецитин), бóльшая часть которого поступает в кишечник с желчью (11-12 г/сут) и меньшая часть - с пищей (1-2 г/сут).

В переваривании глицерофосфолипидов участвует несколько ферментов, синтезирующихся в поджелудочной железе. Фосфолипаза А₂ (КФ 3.1.1.4) гидролизует сложноэфирную связь у второго атома углерода глицерола, превращая глицерофосфолипиды в соответствующие лизофосфолипиды. На рис. 1-7 представлен пример гидролиза фосфатидилхолина.

Фосфолипаза A₂ секретируется в кишечник в виде профермента и активируется уже в полости кишечника путем частичного протеолиза. Для проявления активности фосфолипазы A₂ необходимы ионы кальция.

Жирная кислота в положении 1 отщепляется под действием лизофосфолипазы, а глицерофосфохолин гидролизуется далее до глицерола, холина и фосфорной кислоты, которые всасываются. Лизофосфолипиды - эффективные эмульгаторы жира, ускоряющие его переваривание.

Холестерол в составе пищи находится в основном в виде эфиров. Гидролиз эфиров холестерола происходит под действием холестерол-эстеразы - фермента, который синтезируется в поджелудочной железе и секретируется в кишечник. Продукты гидролиза (холестерол и жирные кислоты) всасываются в составе смешанных мицелл.

Всасывание липидов

Простые мицеллы обладают выраженной способностью к коллоидному растворению (солюбилизации) липидов. Поступив в двенадцатиперстную кишку, простые мицеллы при взаимодействии с β-моноацилглицеролом и свободными жирными кислотами формируют смешанные (сложные) мицеллы. Стабильность мицелл обеспечивается в основном солями желчных кислот.

Смешанные мицеллы построены таким образом, что гидрофобные части молекулы обращены внутрь мицеллы, а гидрофильные - наружу. Гидрофильная оболочка состоит из желчных кислот и фосфолипидов, поэтому мицеллы хорошо растворимы в водной фазе содержимого тонкой кишки. В гидрофобное ядро смешанной мицеллы входят жирные кислоты, холестерол, β-моноацилглицерол и α- и β-диацилглицерол и жирорастворимые витамины, снаружи располагаются фосфолипиды, лизофосфолипиды и желчные кислоты (рис. 1-8). Связанный билирубин не входит в состав мицелл. Поскольку межклеточные соединения билиарного дерева проницаемы для воды, пузырная и печеночная желчь изотоничны.

Мицеллы стабильны, они сближаются со щеточной каемкой клеток слизистой оболочки тонкой кишки, и липидные компоненты мицеллы диффундируют через мембраны внутрь клеток.

Смешанная мицелла по своим размерам в 100 раз меньше эмульгированной капли жира, поэтому она может проходить через стенку кишечного эпителия путем мицеллярной диффузии или пиноцитоза. Вместе с продуктами гидролиза липидов всасываются жирорастворимые витамины А, D, Е, K и соли желчных кислот.

В эпителиальных клетках ворсинок кишечника сложные мицеллы распадаются на желчные кислоты и продукты гидролиза липидов. Наиболее активно соли желчных кислот всасываются в подвздошной кишке. Желчные кислоты поступают в кровь и через портальную вену попадают в печень, затем в желчный пузырь, откуда они снова секретируются в кишечник в виде простых мицелл. Этот процесс обеспечивает многократное использование желчных кислот. В организме 3-5 г желчных кислот за сутки совершают 5-10 оборотов, обеспечивая всасывание 80-100 г жиров. Через 10 дней пул желчных кислот обновляется. Около 5% желчных кислот выделяется с фекалиями. Этот путь желчных кислот называют «энтерогепатическая циркуляция».

Всасывание жирных кислот со средней длиной цепи, образующихся, например, при переваривании липидов молока, происходит без участия смешанных мицелл. Эти жирные кислоты из клеток слизистой оболочки тонкой кишки попадают в кровь, связываются с альбумином и транспортируются в печень.

В этих же эпителиальных клетках слизистой оболочки тонкой кишки происходит и ресинтез триацилглицеролов, характерных для организма и существенно отличающихся по своему строению от пищевого жира. Это обусловлено вовлечением в синтез триацилглицеролов жирных кислот не только экзогенного, но и эндогенного происхождения. Жирные кислоты с короткой углеродной цепью (менее 10 атомов углерода) и глицерол хорошо растворимы в воде и поэтому свободно всасываются в кишечнике и попадают в кровь воротной вены. Из нее они поступают в печень, минуя какие-либо превращения в кишечной стенке. В энтероцитах также происходит ресинтез фосфолипидов. Ресинтезированные триацилглицеролы и фосфолипиды, а также холестерин в составе хиломикронов секретируются в лимфу. Сначала в этой транспортной форме экзогенные липиды по лимфатическим путям и по грудному лимфатическому протоку поступают в кровь. Основной транспортной формой экзогенных липидов являются хиломикроны. Далее хиломикроны доставляют триглицериды, которые составляют до 90% его состава, в жировую и мышечную ткани, где они депонируются или используются в энергетических целях. Хиломикроны без триглицеридов называются остаточными или ремнантными хиломикронами, в их составе остаются фосфолипиды и холестерин. Остаточные хиломикроны с током крови поступают в печень для дальнейших метаболических превращений.

Хиломикроны почти полностью состоят из триглицеридов (на 80- 95%) и являются основной транспортной формой экзогенных (пищевых) триглицеридов, перенося их из энтероцитов тонкой кишки в кровоток. В плазме крови апопротеин С-II на хиломикронах активирует эндотелиальную липопротеинлипазу, под действием которой 90% триглицеридов в хиломикронах расщепляется до глицерина и свободных неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК). НЭЖК используются в жировой и мышечной ткани в качестве энергетического субстрата. Остатки хиломикронов (ремнанты), содержащие холестерин, захватываются гепатоцитами и быстро удаляются из кровотока. Этот процесс опосредован аполипопротеином Е (апоЕ).

В печени из эндогенных триглицеридов и холестерина синтезируются липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП). ЛПОНП находятся в кровотоке до тех пор, пока триглицериды, в них содержащиеся, не поступят в периферические ткани. Остатки ЛПОНП захватываются гепатоцитами. В результате образуются липопротеины низкой плотности (ЛПНП), которые переносят холестерин в периферические ткани.

Роль моторной деятельности кишечника в пищеварении

Переваривание и всасывание белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и витаминов в тонкой кишке во многом зависят от ее моторной деятельности. В состоянии натощак преобладает пропульсивная перистальтика кишечника, направленная на продвижение химуса, а в пищеварительной фазе - ритмическая сегментация и маятнико-образное движение, которые способствуют перемешиванию содержимого кишечника, перевариванию и всасыванию пищевых продуктов.

Мембранное пищеварение и транспортные системы, обеспечивающие всасывание пищевых веществ, представляют собой единую систему.

Роль микрофлоры в пищеварении

Важную роль в процессе пищеварения играет микрофлора кишечника. Она выполняет многочисленные взаимосвязанные функции по поддержанию гомеостаза организма наряду с его другими органами и системами. Одна из основных функций нормальной кишечной микрофлоры - барьерная, в первую очередь защита от посторонней микрофлоры, попадающей в желудочно-кишечный тракт.

В норме просвет верхних отделов тонкой кишки практически стерилен. В полости верхних отделов тонкой кишки в норме присутствует небольшое количество микробных тел (м.т.) - менее 10⁴ -10⁵ м.т. в 1 мл кишечного содержимого. Эта микрофлора («П-флора») представлена в основном грамположительными аэробными микроорганизмами: стрептококками, стафилококками, молочнокислыми бактериями, бифидобактериями, энтерококками и грибами.

Другая часть микроорганизмов, обладающих адгезивными свойствами, плотно связана с внутренней поверхностью тонкой кишки. Пристеночная микрофлора (мукоидная флора, или «М-флора») тонкой кишки представлена актиномицетами, аэробами, аэробными кокками (стрептококками, стафилококками, энтерококками, коринебактериями), бифидобактериями, лактобактериями, а также небольшим количеством анаэробов (бактероидов, клостридий, пропионобактерий).

В толстой кишке присутствует более 400 видов бактерий. Пристеночная микрофлора на 90-95% состоит из анаэробов, и только 5-6% представлено облигатной аэробной факультативной флорой: молочно-кислыми бактериями, кишечной палочкой, энтерококками, стафилококками, грибами, протеем.

Микрофлора располагает набором ферментных систем, отличных от соответствующих ферментных систем животных тканей и катализирующих самые разнообразные превращения пищевых аминокислот.

Так, бифидобактерии в процессе своей жизнедеятельности продуцируют органические кислоты, которые создают в кишечнике кислую среду и препятствуют размножению патогенной микрофлоры, а также способствуют всасыванию витамина D, кальция, железа и поддерживают нормальную моторику кишечника. Лактобактерии в процессе сбраживания углеводов образуют вещества с антибиотической активностью (лизоцим, ацидофилин и др.), эшерихии - колицины, тормозящие рост энтеропатогенных кишечных палочек и т.д. Кишечная микрофлора участвует в инактивации биологически активных веществ, выполнивших свою функцию, например пищеварительных ферментов.

Кишечные палочки, бифидо- и лактобактерии выполняют витаминообразующую функцию, синтезируя витамины K, группы В, фолиевую и никотиновую кислоты. По способности синтезировать витамины лидирующая роль принадлежит кишечной палочке, которая образует девять витаминов. Бифидобактерии и лактобактерии способствуют всасыванию кальция, витамина D, улучшают всасывание железа.

Важным является участие микрофлоры кишечника в формировании иммунобиологической реактивности макроорганизма. Лимфоидная ткань кишечника является самым большим лимфоидным образованием организма (до 60% иммунных клеток организма находится в слизистой оболочке кишечника). Иммунная система контролирует ответы на белки, поступающие с пищей (профилактика пищевой аллергии), патогенные вирусы (ротавирус, полиовирус и др.), бактерии (Salmonella, Listeria, Clostridium и т.д.), паразиты (Toxoplasma).

Облигатная микрофлора кишечника способствует синтезу иммуноглобулинов М, А и G, стимулирует созревание лимфоидного аппарата, участвует в продукции интерферонов, лизоцима, веществ противоопухолевой защиты, регулирует баланс между про- и противовоспалительными цитокинами.

Нормальная флора кишечника синтезирует некоторые биологически активные вещества, которые способствуют разрушению аллергенов, нейтрализуют экзогенные и эндогенные субстраты и метаболиты. Лактобактерии стимулируют фагоцитарную активность нейтрофилов, макрофагов, синтез иммуноглобулинов и образование интерферонов,

IL-1. Бифидобактерии регулируют функции гуморального и клеточного иммунитета, препятствуют разрушению секреторного иммуноглобулина А, стимулируют образование интерферонов, вырабатывают лизоцим.

При участии микрофлоры происходит биотрансформация ксенобиотиков (чужеродных веществ) в нетоксические продукты и их выведение из организма. Микробные клетки способны аккумулировать (как биоэнтеросорбент) значительные количества различных токсических продуктов, включая тяжелые металлы, фенолы, формальдегиды, яды растительного, животного, микробного и искусственного происхождения и другие ксенобиотики, с последующим выведением их из организма естественным путем.

В кишечнике создаются оптимальные условия для образования токсичных продуктов распада аминокислот: фенола, индола, крезола, скатола, сероводорода и др. После всасывания эти продукты через воротную вену попадают в печень, где подвергаются обезвреживанию путем образования парных кислот (см. раздел «Роль печени в обезвреживании токсичных веществ», подраздел «Обезвреживание других метаболитов и ксенобиотиков», с. 110, 111, рис. 1-39 - 1-41).

Взаимоотношения микро- и макроорганизма носят сложный характер, реализующийся на метаболическом, регуляторном, внутриклеточном и генетическом уровне. Однако нормальное функционирование микрофлоры возможно только при хорошем физиологическом состоянии организма.

Таким образом, весь процесс переваривания пищи и всасывания ее ингредиентов можно условно разделить на три этапа:

Для полноценного внутриполостного гидролиза жиров, белков и углеводов необходимо:

Расстройства пищеварения во всей тонкой кишке в равной степени зависят как от гипер-, так и от гипомоторных изменений двенадцатиперстной кишки и системы желчевыделения; как от избыточного закисления, так и от повышенного рН ее среды; как от недостаточной стимуляции нейрогормональной системы двенадцатиперстной кишки, так и от повышенной ее реактивности. Чем более выражены нарушения пищеварения в двенадцатиперстной кишке, тем отчетливее страдают моторная и пищеварительная функции желудка, печени, билиарного аппарата и поджелудочной железы. Впоследствии нарушается пристеночное пищеварение, а затем и всасывание (синдром мальабсорбции). Данная порочная система функционирует независимо от того, какие болезни гастродуоденальной зоны являются причиной расстройств пищеварения в двенадцатиперстной кишке. Система нарушений неспецифична и многофакторна, однако все ее звенья прочно взаимосвязаны.

Патогенез развития острых и хронических нарушений полостного пищеварения зависит от вида патологии желудка, двенадцатиперстной кишки, поджелудочной железы, печени, желчевыводящих путей, тонкой кишки и может захватывать его звенья как в отдельности, комбинированно, так и тотально.

В настоящее время активно изучают заболевания, ассоциированные с нарушениями метаболизма липидов [атеросклероз, желчнокаменная болезнь, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), холестероз желчного пузыря, липогенный панкреатит и др.], в патогенезе которых ключевую роль играет печень. В 1998 г. по предложению академика В.С. Савельева все заболевания, патогенетически связанные с нарушениями липидного гомеостаза, были объединены в липидный дистресс-синдром.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ОБМЕНЕ БЕЛКОВ

Печень активно участвует как в обмене аминокислот, так и в обмене белков.

Высвободившиеся при пищеварении из белков аминокислоты всасываются в тонкой кишке.

В настоящее время известны следующие транспортные системы, участвующие в доставке аминокислот из просвета кишечника в энтероциты:

Перенос аминокислот через клеточную мембрану осуществляется активным транспортом. Активный транспорт - это перенос веществ с использованием градиента концентрации натрия между внутренней и наружной сторонами клеточной мембраны, создаваемого при участии мембранной Na⁺ ,K⁺ -АТФазы. Специфический белок-транспортер связывает на апикальной поверхности энтероцитов аминокислоту и ион натрия. При отсутствии натрия аминокислота не в состоянии связываться с белком-переносчиком.

Белок, изменив свое положение в мембране, отдает ион натрия в цитозоль по градиенту концентрации. Сразу после этого аминокислота теряет связь с белком и остается в цитоплазме (рис. 1-9).

Наиболее изученным механизмом транспорта нейтральных аминокислот в эпителиальную клетку тонкой кишки является γ-глутамил-трансферазный. Сначала аминокислота вступает в реакцию с трипептидом глутатионом (γ-глутамилцистеинилглицин). Эта реакция катализируется ферментом γ-глутамилтрансферазой (ГГТФ) (КФ 2.3.2.2), протекает на клеточной мембране и является ключевой в процессах интернализации аминокислот.

В связи с тем что γ-глутамильная группа при гидролизе молекулы восстановленного глутатиона (reduced glutathione, GSH) переносится на аминокислоту (рис. 1-10), приводя к образованию γ-глутамильного ее производного, которое легко проникает внутрь клетки, ГГТФ рассматривают как транспортер аминокислот. Однако исследования последнего десятилетия в оценке роли этого цикла в транспорте аминокислот противоречивы.

ГГТФ, расщепляя γ-глутамильную связь в молекуле внеклеточного GSH, дает возможность клетке использовать его как источник цистеина, который, в свою очередь, служит эссенциальным субстратом для образования внутриклеточного GSH. Необходимо подчеркнуть, что только ГГТФ способна катализировать разрыв γ-глутамильной связи глутатиона. Она также инициирует метаболизм глутатион-S-конъюгатов в меркаптоураты путем переноса γ-глутамильного остатка на акцептор аминокислоты и высвобождая цистеинилглицин.

ГГТФ является мембраносвязанным ферментом и состоит из гидрофильного и гидрофобного фрагментов. Гидрофобный домен играет роль своеобразного якоря, с помощью которого фермент крепится к мембране клетки.

ГГТФ является признанным маркером гепатобилиарных нарушений, повышение активности которого в крови связывают с воспалительными заболеваниями печени.

Ее содержание в желчи во много раз выше, чем в крови, поэтому и увеличение ее активности в сыворотке при холестазе может быть связано с поступлением желчи в кровь. Источником сывороточной ГГТФ является гепатобилиарная система, ее активность повышается практически при любом заболевании печени. Хотя ГГТФ содержится и в ряде других органов, тем не менее повышение активности фермента в сыворотке редко бывает связано с этими органами. Наиболее высокая активность ГГТФ в сыворотке (5-30-кратное повышение) наблюдается при внутри- и внепеченочном холестазе. Умеренное повышение (в 2-5 раз) наблюдается при инфекционном гепатите. Выраженное повышение ГГТФ выявляется при первичных опухолях печени и метастазах в печень. Она является более чувствительным лабораторным тестом для диагностики обтурационной желтухи, холангита и холецистита по сравнению со щелочной фосфатазой, лейцинаминопептидазой и аминотрансферазами. Повышение ее активности происходит раньше, чем других ферментов, и нормализуется позднее.

Синтез белков в печени осуществляется прежде всего из свободных аминокислот. Поступив с кровью через воротную вену в печень, они обеспечивают в первую очередь сбалансированный пул свободных аминокислот организма путем синтеза заменимых аминокислот и перераспределение азота в результате реакций трансаминирования. В печени аминокислоты участвуют не только в синтезе собственных белков и белков плазмы крови, но и в синтезе специфических азотсодержащих соединений (рис. 1-11).

К общим путям обмена аминокислот относят реакции трансаминирования, дезаминирования и декарбоксилирования, а также их участие в биосинтезе белков.

Печеночные клетки синтезируют большинство протеинов плазмы крови - практически весь альбумин, основную массу α-глобулинов и значительную часть β-глобулинов, а также и основные белки системы свертывания крови. Альбумин составляет большую часть белков плазмы; печень синтезирует примерно 12 г альбумина в сутки. Нормальное содержание альбумина в плазме составляет 35-45 г/л и отражает скорость синтеза, скорость разрушения и его распределения в организме. Синтез альбумина регулируется в зависимости от изменений пищевого статуса, осмотического давления, наличия системных воспалительных процессов, приема кортикостероидов.

Печень синтезирует такие важнейшие компоненты свертывающей системы крови, как фибриноген (фактор I), протромбин (фактор II), проакцелерин (фактор V), проконвертин (фактор VII), факторы Кристмаса (фактор IX) и Стюарта-Прауэра (фактор X); наряду с другими органами участвует в образовании гепарина. Вследствие этого система свертывания крови в значительной мере зависит от белково-синтетической функции печени и патологических изменений гепатоцитов.

Одной из важных функций печени в метаболизме белков является обезвреживание аммиака, образующегося при дезаминировании аминокислот (рис. 1-12).

Основной транспортной формой аммиака из тканей в печень, а также его источником для синтетических процессов является глутамин.

Глутамин образуется при переносе аммиака на глутаминовую кислоту при участии глутаминсинтетазы. Отщепление ионов аммония от глутамина осуществляется при участии глутаминазы. Синтез и расщепление глутамина происходят в глутаминовом цикле. В соответствии с концепцией метаболического зонирования печеночного ацинуса цикл мочевины и реакция глутаминазы глютаминового цикла локализуются в перипортальной зоне, в то время как реакция глутаминсинтетазы глутаминового цикла находится в перивенозной зоне. Поскольку фермент карбамоилфосфатсинтетаза (КФ 6.3.4.16), определяющий скорость синтеза мочевины в орнитиновом цикле, локализуется перипортально и имеет незначительное сродство к ионам аммония (Km=1-2 ммоль/л) по сравнению с перивенозно локализуемой глутаминсинтетазой глутаминового цикла (Km=0,3 ммоль/л), то обезвреживание аммиака осуществляется только при его высоких концентрациях в цикле мочевины. Таким образом, аммиак в физиологических концентрациях в портальной крови обезвреживается посредством образования мочевины, а также синтеза глутамина.

Согласно данным многих исследователей, около 80% аммиака обезвреживается в орнитиновом цикле, протекающем в гепатоцитах, с образованием мочевины.

Образование мочевины (рис. 1-13) является синтетическим процессом, требующим затраты аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Первый этап синтеза мочевины заключается в соединении аммиака с аминокислотой орнитином и АТФ, при этом образуется карбамоилфосфат.

На следующей стадии с участием орнитина синтезируется цитруллин, который выходит из митохондрий в цитозоль клеток печени. После этого в цикл вводится вторая аминогруппа в составе аспарагиновой кислоты. Происходит конденсация молекул цитруллина и аспарагиновой кислоты с образованием аргининосукцината. Аргининосукцинат расщепляется на аргининовую и фумаровую кислоты. Под действием аргиназы аргинин гидролизуется, в результате чего образуются мочевина и орнитин. В дальнейшем орнитин поступает в митохондрии и может включиться в новый цикл обезвреживания аммиака, а мочевина выделяется с мочой.

Таким образом, при синтезе одной молекулы мочевины нейтрализуются две молекулы аммиака. Для синтеза одной молекулы мочевины расходуется три молекулы АТФ, в том числе две при синтезе карбомоилфосфата и одна - для образования аргининосукцината. Фумаровая кислота может превращаться в малат и оксалоацетат (метаболиты цикла трикарбоновых кислот). Оксалоацетат в результате трансаминирования или восстановительного аминирования может превратиться в аспарагиновую кислоту. Некоторая часть азота аминокислот выделяется из организма в составе креатинина, который образуется из креатин-фосфата.

Кроме дезаминирования, аминокислоты подвергаются в печени переаминированию. Процесс переаминирования не является специфичным для печени, он происходит и в других органах, но в печени его интенсивность весьма значительна, поэтому определение активности трансаминаз у пациентов с подозрением на патологию печени имеет особое диагностическое значение.

Аминотрансферазы - ферменты, катализирующие взаимное превращение аминокислот и α-кетокислот путем переноса аминогруппы. Переаминирование протекает в присутствии кофермента пиридоксаль-5-фосфата, являющегося фосфорилированным производным витамина В₆ . Наибольшее клинико-диагностическое значение получило определение активности двух аминотрансфераз: аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1) и аланинаминотрансферазы (КФ 2.6.1.2).

Специфичность аминотрансфераз определяется аминокислотой, являющейся ее субстратом и донором аминогруппы: аланином - для аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспарагиновой кислоты - для аспартатаминотрансферазы (АСТ). Обе реакции обратимы, равновесие сдвинуто в сторону образования аспарагиновой кислоты и аланина.

Превращения аминокислот, происходящие в реакциях трансаминирования, позволяют использовать метаболиты цикла трикарбоновых кислот для катаболических и анаболических процессов. При этом α-кетоглутаровая кислота является основным акцептором атомов азота, а глутаминовая кислота - основным его переносчиком.

Схема, представленная на рис. 1-14, демонстрирует пути обмена аммиака при различных анаболических и катаболических процессах.

Реутилизация атомов азота для биосинтеза других аминокислот осуществляется через реакции трансаминирования. Аспарагиновая кислота также служит источником атомов углерода и азота при биосинтезе пиримидинов и некоторых аминокислот. Большое значение имеет участие аспарагина в синтезе мочевины, в составе которой азот выводится из организма. Амидирование глутаминовой кислоты при участии фермента глутаминсинтетазы приводит к образованию глутамина, служащего источником азота при биосинтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, а также обеспечивает возможность синтеза некоторых аминокислот и иминокислот в организме, в частности пролина, аргинина и гистидина. Атомы азота аммиака, образующегося при участии фермента глутаматдегидрогеназы, используются для синтеза глутамина или выведения его из организма в виде аммиака либо мочевины.

Таким образом, АСТ контролирует включение атомов азота (в виде аспарагиновой кислоты) в мочевину и отвечает за выведение из организма атомов углерода через цикл трикарбоновых кислот. Кроме того, данный фермент играет важную роль в транспорте восстановленных эквивалентов из цитоплазмы в митохондрии через малатаспартатный челночный механизм.

Аминотрансферазы входят в группу ферментов печеночного профиля, сывороточная активность их меняется при большинстве острых и хронических заболеваний печени.

Процесс отщепления от аминокислоты карбоксильной группы в виде СО₂ называется декарбоксилированием. Этот процесс протекает не только в клетках печени, но и в клетках легких, нервной ткани и др. Конечными продуктами данной реакции являются биологически активные вещества - биогенные амины. К биогенным аминам относятся медиаторы [серотонин, дофамин, γ-аминомасляная кислота (ГАМК)], гормоны (адреналин, норадреналин) и другие регуляторные факторы (гистамин, карнизин, спермин). Данные реакции являются необратимыми. Инактивация биогенных аминов осуществляется за счет реакций дезаминирования с образованием органических кислот и аммиака.

Некоторые аминокислоты подвергаются в печени специфическим превращениям, свойственным только данной аминокислоте. Нарушения функций печени в этих случаях существенно меняют путь распада аминокислоты.

Так, метионин участвует в процессах трансметилирования. Эта аминокислота необходима для синтеза белков и поддержания азотистого равновесия организма. Метаболизм метионина в организме весьма разнообразен, схематически он представлен на рис. 1-15.

Примерами биохимических превращений в организме, связанных с реакцией трансметилирования, являются синтез холина из этаноламина, фосфатидилхолина из фосфатидилэтаноламина, адреналина из норадреналина, образование карнитина, креатина, метилирование азотистых оснований в нуклеотидах, некоторых протеинов (например, акцелерина), биогенных аминов, стероидов, гистонов, синтез белка, метаболизм ксенобиотиков, в том числе лекарственных средств. Трансметилирование является важным этапом при синтезе в нервных клетках таких нейротрансмиттеров, как серотонин и глицин.

Однако превращения метионина становятся возможными лишь после перехода его в активное состояние (рис. 1-16). Это активирование осуществляется при участии специальных ферментных систем, содержащихся в печени, и АТФ. При поражении печеночной паренхимы количество АТФ в печеночных клетках резко снижается, и процессы трансметилирования нарушаются.

По данным Е.С. Северина и соавт. (2016), метильная группа в молекуле метионина прочно связана с атомом серы, поэтому непосредственным донором этого одноуглеродного фрагмента служит его активная форма - S-аденозилметионин. S-аденозилметионин образуется в результате присоединения метионина к молекуле аденозина, образующегося при гидролизе АТФ. Реакция катализируется ферментом метионинаденозилтрансферазой (МАТ) (см. рис. 1-16). К настоящему моменту описано три изоформы этого фермента. В клетках печени взрослого человека присутствуют I и III изоформы, в то время как II форма преобладает во всех других органах.

До 85% всех реакций метилирования, в которых участвует аденозилметионин, протекает в печени. Показано, что до 45% потребляемого животным организмом метионина метаболизируется в печени.

При патологии печени наблюдается угнетение МАТ I/III.

Доказано, что свободные радикалы (кислород, оксид азота) и некоторые цитокины (TNFα, IL-6), которые образуются при многих патологических процессах, могут инактивировать МАТ I/III, а глутатион, наоборот, приводит к восстановлению ее активности. При уменьшении концентрации МАТ I/III активность МАТ II, «нечувствительной» к действию окислительных радикалов, возрастает.

Показано, что S-аденозилметионин влияет на процессы пролиферации гепатоцитов. Это обусловливает способность печеночной ткани как к регенерации, так и к возможности развития опухолей.

Одним из наиболее важных процессов трансметилирования считается синтез фосфатидилхолина, в том числе и из фосфатидилэтаноламина (рис. 1-17). Ключевым ферментом этого процесса является фосфотедилэтаноламинметилтрансфераза. Фосфолипиды участвуют в процессах восстановления клеточных мембран, препятствуют нарушению функционирования ассоциированных с ними рецепторов и транспортных систем, восстанавливают текучесть мембраны за счет нормализации соотношения холестерина к фосфолипидам.

Еще один специфический фермент трансметилирования - аргининметилтрансфераза, которая отвечает за метилирование белков - факторов транскрипции STAT (от англ. Signal Transducer and Activator of Transcription - преобразователь сигнала и активатор транскрипции), в результате чего предотвращает связывание STAT1 с его ингибитором (PIAS1) и, таким образом, способствует развитию эффектов интерферонотерапии.

S-аденозилметионин является донором метильной группы для аргининметилтрансферазы 1 (protein arginine methyltransferase 1, PRMT1), которая осуществляет метилирование гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNPQ), а он, в свою очередь, принимает участие в активации инсулинового рецептора и в повышении его концентрации в цитоплазме.

Имеются доказательства того, что S-аденозилметионин угнетает продукцию индуцибельной NO-синтетазы, а также блокирует трансформирующий фактор роста бета (TGFβ) стимулированный синтез коллагена I типа.

При участии фермента метилтрансферазы из ГАМК с использованием S-аденозилметионина в организме происходит образование карнитина - переносчика жирных кислот через мембрану митохондрий (рис. 1-18).

Важную роль играет S-аденозилметионин во втором этапе синтеза креатина (рис. 1-19). Эта стадия синтеза креатина - метилирование гуанидинацетата при участии S-аденозилметионина, которое происходит в печени, куда гуанидинацетат поступает с током крови.

Кроме того, S-аденозилметионин участвует в реакциях транссульфурирования при синтезе глутатиона, который является основным компонентом внутриклеточной антиоксидантной системы. При этом S-аденозилметионин участвует как на этапе синтеза цистатионина из гомоцистеина, так и на этапе образования его предшественника - аденозилгомоцистеина. Обязательное условие образования глутатиона при участии S-аденозилметионина - наличие витамина B₆ , являющегося кофактором цистатионин-β-синтазы. Кроме того, известно, что S-аденозилметионин угнетает активность метионинсинтазы и бетаин-гомоцистеин-S-метилтрансферазы и таким образом блокирует образование метионина и стимулирует синтез цистатионина (в итоге - глутатиона).

Хорошо известна роль печени в метаболизме L-аргинина. Эта аминокислота увеличивает содержание полиаминов - спермина и спермидина, индуцирующих процессы транскрипции нуклеиновых кислот и «сборку» рибосом. Она увеличивает внутриклеточное содержание ионов калия, стимулируя активность Na⁺ ,K⁺ -АТФазы. L-аргинин является субстратом для образования цитруллина и оксида азота (NO). Известна способность L-аргинина индуцировать NO-синтазу. Оксид азота улучшает микроциркуляцию, способствует уменьшению синусоидального сопротивления, устранению венозного стаза в системе портальной вены, снижает проявления портальной гипертензии.

Глутаминовая кислота потенцирует антиоксидантные свойства аргинина и стимулирует образование оксида азота из аргинина. Она также способна непосредственно взаимодействовать с аммиаком в процессах восстановительного аминирования, образуя глутамин. Этот процесс наиболее активен в клетках мышечной ткани и астроцитах мозга.

Глутаминовая кислота принимает участие в синтезе основного внутриклеточного антиоксиданта - глутатиона. Недостаток глутамата в клетке может привести к дефициту глутатиона и снижению активности антиоксидантной защиты.

Печень участвует в катаболизме нуклеопротеинов, расщепляя их до аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Важно отметить, что конечные этапы катаболизма сложных белков в печени одновременно выполняют и ее детоксикационную функцию.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В УГЛЕВОДНОМ ОБМЕНЕ

Метаболизм углеводов в печени (гепатоцитах) осуществляется по следующим основным метаболическим путям (рис. 1-20):

Печень играет центральную роль в многочисленных реакциях обмена углеводов, является органом, поддерживающим нормальный уровень глюкозы в крови за счет процессов гликогенеза - синтеза гликогена из глюкозы. Депо гликогена в печени может достигать 1/5 массы органа. В периоды голодания для обеспечения энергетических потребностей организма могут мобилизоваться триацилглицеролы жировой ткани, однако для метаболизма нервной ткани, эритроцитов и сосудистого эндотелия необходимо бесперебойное поступление глюкозы. Под воздействием нервных импульсов, адреналина или глюкагона при увеличении энергетических затрат организма или в критической ситуации (стресс) в гепатоцитах из гликогена образуется глюкоза (гликогенолиз). Под влиянием гормонов коры надпочечников (глюкокортикостероидов) при уменьшении уровня глюкозы в крови в печени из аминокислот и липидов (глюконеогенез) может синтезироваться гликоген. При развитии гипоксических состояний для возмещения энергетических потребностей организма происходит усиленная мобилизация углеводов из печени.

После приема внутрь углеводов поступающая по воротной вене из кишечника кровь содержит глюкозы в несколько раз больше, чем периферическая.

Это связано с несколькими процессами. Все превращения глюкозы в клетках происходят только с ее активной формой - глюкозо-6-фосфатом, образующимся при участии фермента - гексокиназы. Фермент катализирует первую, АТФ-зависимую реакцию гликолиза с образованием глюкозо-6-фосфата. Фосфорилирование глюкозы - практически необратимая реакция, так как она протекает с использованием значительного количества энергии. Эта реакция обеспечивает удержание глюкозы в клетках (своеобразная «ловушка» для глюкозы), так как мембрана клетки непроницаема для фосфорилированной глюкозы (нет соответствующих транспортных белков), и ее участие в дальнейших внутриклеточных метаболических процессах. Кроме того, фосфорилирование уменьшает концентрацию свободной глюкозы в цитоплазме. В результате создаются благоприятные условия для облегченной диффузии глюкозы в клетки из крови.

В печени имеется две изоформы гексокиназы - гексокиназа I, которая присутствует и в других тканях, и гексокиназа IV (или глюкокиназа), специфичная для печени и поджелудочной железы. Поскольку глюкокиназа обладает меньшим сродством к глюкозе (K_m =10 ммоль/л), то ее максимальная ферментативная активность достигается только при высоких концентрациях глюкозы в плазме крови (адсорбционный период). Другой особенностью глюкокиназы является наличие особого регуляторного белка GRP (glucose-regulated protein, глюкозозависимый белок), который, связываясь с апоферментом при низкой концентрации глюкозы, направляет глюкокиназу в ядро, что вызывает ее инактивацию (рис. 1-21). После приема пищи под действием глюкозы комплекс GRP-глюкокиназа разрушается, и ее активная форма выходит в цитоплазму. Активность глюкокиназы также регулируется на уровне ее экспрессии. Она увеличивается после приема пищи и снижается в период голодания.

Когда концентрация глюкозы в крови высокая, она транспортируется в гепатоциты при помощи специфического переносчика ГЛЮТ-2 и активирует гексокиназу IV по описанному механизму. При голодании фруктозо-6-фосфат ингибирует гексокиназу IV с помощью регуляторного белка. В связи с этим печень не конкурирует за глюкозу с другими органами.

Переносчик глюкозы ГЛЮТ-2 (печеночный тип) синтезируется только в печени, почках, тонкой кишке (базолатеральная мембрана) и панкреатических β-клетках. Молекула ГЛЮТ-2 состоит из 524 аминокислотных остатков. Ген, кодирующий этот белок, локализуется на хромосоме 3. Изменения количества или структурной формы ГЛЮТ-2 вызывают снижение чувствительности β-клеток поджелудочной железы к глюкозе. Это происходит при сахарном диабете 2-го типа, когда наблюдается индукция экспрессии ГЛЮТ-2 в проксимальных канальцах почек. При этом количество ГЛЮТ-2 мРНК увеличивается в 6,5 раза, а количество ГЛЮТ-1 мРНК уменьшается до 72% нормы.

Отличительной особенностью печени от других органов является то, что она не использует глюкозу, образующуюся при распаде гликогена, для собственных нужд, а продуцирует ее для потребления другими органами. Гепатоциты способны синтезировать гликоген в своей цитоплазме как из глюкозо-6-фосфата, образующегося из глюкозы крови, так и из глюкозо-6-фосфата, образующегося в процессах глюконеогенеза. Единственным органом, который обладает полным набором реакций для метаболизма гликогена, является печень (рис. 1-22).

Синтез гликогена. Изомеризация глюкозо-6-фосфата в глюкозо-1-фосфат является началом метаболических событий, ведущих к синтезу гликогена. Эта реакция, катализируемая фосфоглюкомутазой, не требует затрат энергии и, следовательно, легко обратима. Далее при участии фермента УДФ-глюкопирофосфорилазы глюкозо-1-фосфат соединяется с уридинтрифосфорной кислотой (УТФ). В результате образуются комплекс глюкозы с уридиндифосфорной кислотой (УДФ) и пирофосфат. Реакция синтеза УДФ-глюкозы является необратимой.

Собственно синтез гликогена начинается с переноса остатка глюкозы с УДФ-глюкозы на особый самогликозилирующийся белок-затравку - гликогенин. Известно два изомера гликогенина - мышечный и печеночный. Гликогенин является ферментом гликозилтрансферазой А-типа. УДФ-глюкоза присоединяется к гликогенину при участии катионов марганца (Mn²⁺), главная функция которого, вероятнее всего, заключается в стабилизации УДФ при переносе остатка глюкозы. Гликогенин переносит остатки глюкозы с УДФ-глюкозы сначала на остаток тирозина внутри самого белка, а затем образует α-1,4-гликозидные связи до тех пор, пока олигосахаридная цепь не увеличится до 10-20 остатков глюкозы. Дальнейшее формирование полной молекулы гликогена происходит с участием гликогенсинтазы, ветвящего фермента и других ферментов лишь после того, как закончится самогликозилирование гликогенина. В результате формируется полисахаридная цепь, аналогичная по строению с «затравочной», а гликогенин остается внутри частицы гликогена.

Гликогенсинтаза аллостерически активируется глюкозо-6-фосфатом и ингибируется ковалентным фосфорилированием. Наличие глюкозо-6-фосфата способно преодолеть инактивирование фермента, связанное с фосфорилированием, и полностью восстанавливает его активность. Это свойство гликогенсинтазы позволяет использовать определение ее активности в присутствии и отсутствие глюкозо-6-фосфата для возможности оценки степени фосфорилирования фермента даже тогда, когда не все сайты фосфорилирования оказывают влияние на его активность. Полагают, что дефосфорилирование гликогенсинтазы, которое приводит к ее активации, опосредуется рядом фосфатаз (PP1Gs), содержащих каталитическую субъединицу (PP1c), связанную с соответствующей субъединицей на гликогене. В настоящее время идентифицировано семь таких связанных с гликогеном субъединиц.

Активность гликогенсинтазы может изменяться в зависимости от ее внутриклеточной локализации; так, по мере накопления гликогена локализация его синтеза перемещается от периферии к внутренним районам клетки.

Гликогенсинтаза способна активировать синтез только линейной структуры полисахарида с образованием α-1,4-гликозидной связи, но не способна участвовать в формировании участков разветвления в гликогене с образованием α-1,6-гликозидной связи. Разветвленную структуру гликогена обеспечивает участие фермента ветвления амило-1,4-1,6-глюкозилтрансферазы. Подобная структура обусловливает компактность гранул гликогена, откладывающихся в цитоплазме клеток, а также дает возможность значительно увеличить скорость синтеза и деградации этого полисахарида.

Амило-1,4-1,6-глюкозилтрансфераза представляет собой мономер, который состоит из 702 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 77 кДа. Этот фермент катализирует перенос примерно семи остатков глюкозы на невосстанавливающем конце линейного участка одной α-амилоидной цепи на С6-углеродный атом остатка глюкозы другой α-амилоидной цепи с образованием α-1,6-гликозидной связи.

Образование разветвленного полимера приводит к улучшению его растворимости и созданию большого числа невосстанавливающих концов. В свою очередь, это способствует значительному увеличению количества участков, доступных для гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы, поскольку оба фермента действуют только на невосстанавливающие концы цепей остатков глюкозы.

Расщепление гликогена (гликогенолиз) по α-1,4-гликозидной связи последовательно катализируется ферментом гликогенфосфорилазой с образованием молекул глюкозо-1-фосфата.

В активном центре гликогенфосфорилазы кофактором является фосфорилированное производное витамина В₆ - пиридоксальфосфат. Он ковалентно связан с аминокислотой лизином (Lys679), образовав шиффово основание. Гликогенфосфорилаза является димером, имеющим в своей структуре несколько участков, оказывающих действие на его каталитическую способность. Эти участки включают активный центр, состоящий из каталитического участка и участка связывания с гликогеном, а также аллостерический участок и участок обратимого фосфорилирования по серину. Присоединение аденозинмонофосфорной кислоты (АМФ) к аллостерическому участку фермента способствует его переходу из неактивного T-состояния в активное R-состояние, что сопровождается изменением его четвертичной структуры. В то же время участок обратимого фосфорилирования по серину (Ser14) является наиболее важным для каталитической активности гликогенфосфорилазы.

Реакция отщепления остатка глюкозы от гликогена с образованием глюкозо-1-фосфата осуществляется в три этапа.

Аллостерическими активаторами гликогенфосфорилазы являются АМФ и инозинмонофосфорная кислота (ИМФ), а ее ингибиторами - АТФ, АДФ, УДФ-глюкоза и глюкозо-6-фосфат. Гликогенфосфорилаза активируется глюкагоном, действие которого опосредовано цАМФ. Повышение концентрации цАМФ активирует цАМФ-зависимую протеинкиназу, которая при участии АТФ фосфорилирует неактивную киназу фосфорилазы, образуя ее активную форму. В свою очередь, активная киназа фосфорилазы фосфорилирует фосфорилазу b , превращая ее в фосфорилазу a (рис. 1-23).

Тормозящее действие на распад гликогена оказывает инсулин. Он приводит к активации фосфодиэстеразы в печени, способствуя снижению концентрации цАМФ в гепатоцитах, тем самым снижая активность фосфорилазы а.

Особенностью печеночной изоформы гликогенфосфорилазы является наличие у нее аллостерического центра для связывания глюкозы, что обеспечивает возможность печени реагировать на изменения уровня глюкозы в крови.

При нормальном уровне глюкозы в крови она способна проникать в гепатоцит и связываться с аллостерическим центром гликогенфосфорилазы. Это приводит к конформационным изменениям, в результате которых фосфорилированные остатки Ser14 становятся доступными для фосфопротеинфосфатазы-1, вызывая инактивацию гликогенфосфорилазы и запуская процессы синтеза гликогена за счет активации гликогенсинтетазы.

Гликогенфосфорилаза может действовать только на линейные цепи (α-1,4-связи) гликогена. Ее действие прекращается, когда в полимерной цепи до α-1,6-ветвления останется около четырех остатков глюкозы. Далее начинает действовать деветвящий фермент (амило-α-1,6-глюкозидаза). Деветвящий фермент обладает двумя типами активности - трансферазной и 1,6-глюкозидазной. За счет трансферазной активности фермента участок цепи гликогена, состоящий из трех остатков глюкозы, переносится из боковой цепи на соседний, невосстанавливающий конец, с образованием α-1,4-гликозидной связи. Оставшаяся молекула глюкозы, соединенная α-1,6-гликозидной связью, отщепляется в виде свободной глюкозы за счет 1,6-глюкозидазной активности фермента.

В результате такого действия деветвящего фермента гликогенфосфорилаза может продолжать расщепление α-1,4-гликозидных связей гликогена с образованием глюкозо-1-фосфата, который под действием фосфоглюкомутазы превращается в глюкозо-6-фосфат, используемый затем во многих метаболических процессах.

Одним из них является гликолиз - окисление глюкозо-6-фосфата с одновременным образованием пировиноградной кислоты и АТФ. Затем, в аэробных условиях, пировиноградная кислота окисляется до воды и углекислого газа. При недостаточном содержании кислорода в клетке при окислении глюкозо-6-фосфата образуется молочная кислота (лактат). Аэробное окисление глюкозо-6-фосфата является основным источником энергии. Однако печень получает основную часть энергии за счет распада жирных кислот. Образующийся же в печени в процессе гликолиза фосфоглицериновый альдегид превращается в глицерофосфат, являющийся одним из компонентов синтеза триглицеридов, поставляемых печенью другим органам и тканям.

Ключевыми ферментами гликолиза являются гексокиназа, фосфофруктокиназа-1 и пируваткиназа. Механизмы регуляции активности гексокиназы рассмотрены выше. Фермент фосфофруктокиназа-1 имеет эффективный механизм аллостерической регуляции. Ее активатором является фруктозо-2,6-бисфосфат. Синтез фруктозо-2,6-бифосфата катализируется бифункциональным ферментом фосфофруктокиназой-2/фруктозо-2,6-бифосфатазой (ФФК-2/Ф-2,6-БФаза). В дефосфорилированной форме фермент известен как фосфофруктокиназа-2. Он имеет субстратную специфичность к фруктозо-6-фосфату и катализирует образование из него фруктозо-2,6-бифосфата. В результате этого существенно активируется фосфофруктокиназа и одновременно ингибируется фруктозо-1,6-бифосфатаза.

Таким образом, при активации фосфофруктокиназы-2 равновесие между гликолизом и глюконеогенезом смещается в сторону гликолиза - синтезируется фруктозо-1,6-бифосфат.

Фосфорилированная форма бифункционального фермента теряет киназную активность, но приобретает фосфатазную активность, что позволяет гидролизовать фруктозо-2,6-бифосфат на фруктозо-6-фосфат и неорганический фосфат (рис. 1-24). Таким образом, метаболический эффект фосфорилирования бифункционального фермента заключается в смещении равновесия в сторону глюконеогенеза за счет завершения аллостерической стимуляции фосфофруктокиназы, в результате чего аллостерическое ингибирование фруктозо-1,6-бифосфатазы заканчивается.

Взаимопревращения бифункционального фермента осуществляются при участии цАМФ-зависимой протеинкиназы. Ее активность, в свою очередь, регулируется циркулирующими в крови пептидными гормонами.

Еще одним ключевым ферментом гликолиза является печеночная пируваткиназа. Ее активность регулируется за счет посттрансляционной модификации и на транскрипционном уровне. Посттрансляционная модификация запускается глюкагоном, в результате при участии протеинкиназы А происходит фосфорилирование пируваткиназы, что снижает ее ферментативную активность. Инсулин и ксилулозо-5-фосфат, напротив, активируют протеинфосфатазу 2А, что активирует пируваткиназу за счет ее дефосфорилирования.

О регуляции активности пируваткиназы на транскрипционном уровне свидетельствует наличие различных участков связывания транскрипционных факторов в промоторе гена данного фермента.

Молекула глюкозы сама может в ткани печени выступать в роли сигнальной молекулы, запускающей экспрессию генов, кодирующих ферменты гликолиза.

Гены, регулируемые глюкозой, обладают консервативной последовательностью в промоторе, называемом ChoRE (от англ. carbohydrate response element - элемент углеводного ответа), который обеспечивает чувствительность к глюкозе с участием транскрипционного фактора ChREBP (от англ. carbohydrate response element binding protein - фактор, связывающий углеводный элемент ответа). Tак, при голодании под действием протеинкиназы А происходит фосфорилирование ChREBP. Это приводит к связыванию транскрипционного фактора с адаптерным белком, его удалению из ядра и инактивации. Напротив, повышение концентрации глюкозы в клетке приводит к увеличению уровня ксилулозо-5-фосфата, который активирует протеинфосфатазу 2А. Она дефосфорилирует ChREBP, после чего он может проникнуть в ядро. Это ведет к индукции транскрипции целевых генов. Имеются данные, что аллостерическими регуляторами ChREBP могут являться как глюкозо-6-фосфат, так и фруктозо-2,6-бисфосфат.

В печени интенсивно экспрессируется и относящийся к семейству ядерных рецепторов фактор LRH-1 (от англ. liver receptor homolog-1 - ядерный рецептор печени-1). Фактор LRH-1 регулирует поступление глюкозы в клетку за счет непосредственной транскрипционной регуляции уровня гексокиназы. Она вместе с ChREBP формирует каскад реакций, непосредственно отвечающих за захват глюкозы гепатоцитами. Этот процесс регулирует экспрессию глюкозочувствительных генов.

Окисляется глюкоза в печени и по пентозофосфатному пути, интенсивно в ней протекающему. В этом случае глюкоза превращается в пентозы, необходимые для синтеза нуклеиновых кислот. Кроме того, в пентозофосфатном пути превращения глюкозы образуется восстановленная форма НАДФ+ (НАДФН), водород которого участвует во многих синтетических процессах (синтез холестерина, жирных кислот, стероидных гормонов).

Часть глюкозы в печени превращается в глюкуроновую кислоту, принимающую участие в обезвреживании ряда токсичных агентов за счет образования конъюгатов, более легко выводимых из организма (рис. 1-25).

Печень способна к метаболизму не только глюкозы, но и фруктозы и галактозы (взаимопревращения гексоз). Если наиболее типичным путем превращения фруктозы является образование фруктозо-6-фосфата, то в печени существует и другой путь, когда фруктоза фосфорилируется при участии фермента фруктокиназы с образованием фруктозо-1-фосфата. При участии фермента альдолазы он распадается на глицериновый альдегид и диоксиацетонфосфат. Глицериновый альдегид фосфорилируется при участии АTФ с образованием 3-фосфоглицеринового альдегида - одного из продуктов гликолиза. Подсчитано, что до 80% фруктозы, поступающей с пищей, метаболизируется в печени.

Известны наследственные нарушения обмена фруктозы вследствие дефектов ферментов.

Галактоза превращается в печени по следующей схеме:

Галактоза + АTФ → галактозо-1-фосфат.

Эта реакция катализируется ферментом галактокиназой.

Галактозо-1-фосфат + УДФ-глюкоза → УДФ-галактоза + + глюкозо-1-фосфат.

Эта реакция катализируется ферментом галактозо-1-фосфатуридилтрансферазой.

В дальнейшем глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат и далее используется клеткой. Либо под влиянием фосфатазы он образует свободную глюкозу, а УДФ-галактоза подвергается эпимеризации с образованием новой молекулы УДФ-глюкозы (рис. 1-26).

Учитывая участие печени в метаболизме галактозы, при оценке ее функции может проводиться нагрузка этим моносахаридом с последующим определением выделения галактозы с мочой. Выбор галактозы для этой цели основан на быстром всасывании и очень низком почечном пороге, что позволяет быстро обнаружить ее в моче. Tем не менее, хотя проба и относительно специфична, она малочувствительна и может давать отрицательные результаты при тяжелых поражениях печени.

Нарушения метаболизма галактозы проявляются при наследственном заболевании - галактоземии. Оно является следствием врожденного дефекта фермента галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы (ГАЛТ). Галактоземия проявляется вскоре после рождения ребенка. В крови, моче и тканях у него повышается концентрация галактозы и галактозо-1-фосфата. В гораздо более редких случаях причиной развития галактоземии могут быть наследственные дефекты других ферментов метаболизма галактозы - галактокиназы и УДФ-глюкозо-4-эпимеразы.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ЛИПИДНОМ ОБМЕНЕ

Основные липиды и липопротеины плазмы крови

Основными липидами плазмы крови человека являются триглицериды, фосфолипиды, жирные кислоты, холестерин и эфиры холестерина.

Жирные кислоты синтезируются из углеводов или поступают с пищей. Выделяют насыщенные (пальмитиновая, стеариновая), мононенасыщенные (олеиновая) и полиненасыщенные (линолевая, арахидоновая, эйкозапентаеновая, докозагексаеновая) жирные кислоты. Степень ненасыщенности зависит от числа двойных связей в составе молекулы жирной кислоты (СН₃ -СН₂ -СН₂?СООН - насыщенная, СН₃ -СН=СН-СН₂ ?СООН - мононенасыщенная, СН₃ -СН=СН-СН=СН-СН₂?СООН - полиненасыщенная).

Насыщенные кислоты преобладают в жирах животного происхождения, моно- и полиненасыщенные - в растительных маслах и рыбьем жире.

Жирные кислоты нерастворимы в воде, температура плавления понижается с увеличением числа двойных связей и укорочением цепи. Такие жирные кислоты, как линолевая, линоленовая и им подобные (с двумя и тремя двойными связями), не синтезируются внутри организма человека и называются незаменимыми, поэтому их необходимо получать с пищей.

Полиеновые кислоты делят на две группы: ω-3 и ω-6 (в зависимости от положения двойной связи от углеродного атома последней, метильной группы). Эти кислоты являются предшественниками некоторых групп гормонов местного действия - эйкозаноидов. Так, линолевая кислота является одной из ω-6 кислот. В качестве примера ω-3 кислот можно привести тимнодоновую (эйкозапентаеновую) кислоту, С20:5 (ω-3). Она имеет растительное происхождение, синтезируясь фитопланктоном. Такие рыбы, как лосось, макрель, сельдь, сардина и другие, поедая планктон, накапливают эту кислоту в своем жире. При употреблении в пищу рыбьего жира, содержащего эту кислоту, у человека понижается свертываемость крови, что можно использовать для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний.

Данные жирные кислоты относятся к категории незаменимых, или эссенциальных, то есть они должны поступать в организм с пищей растительного происхождения и могут служить субстратами для построения других полиненасыщенных жирных кислот. Недостаток линолевой и линоленовой кислот в рационе животных приводит к торможению их роста, поражению кожных покровов и почек, нарушению функции размножения. На рис. 1-27 приведена схема превращения линолевой кислоты (две двойные связи) в арахидоновую кислоту, содержащую четыре двойных связи.

Жирные кислоты в плазме крови в основном находятся в эстерифицированной форме в составе моно-, ди- и триглицеридов, фосфолипидов и эфиров холестерина или могут быть неэстерифицированы и обозначаются как свободные жирные кислоты. Местом хранения жирных кислот служит жировая ткань, где они откладываются в виде триглицеридов. Из адипоцитов человека выделено 52 жирные кислоты. Последовательное расщепление триглицеридов до глицерина и жирных кислот в жировой ткани активизирует гормонзависимая триглицеридлипаза.

Жирные кислоты в организме млекопитающих - основной поставщик энергии. Скорость обмена свободных жирных кислот плазмы достаточно высока: каждую минуту утилизируется 20-40% всех свободных жирных кислот. Жирные кислоты в составе фосфолипидов являются компонентами клеточных мембран и предшественниками некоторых физиологически активных соединений (простагландины, лейкотриены и т.д.).

Насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты выполняют в организме разные функции. Насыщенные жирные кислоты во всех клетках организма являются преимущественно энергетическим материалом. Основная функция полиненасыщенных (полиеновых) жирных кислот - пластическая: поступившие с пищей эссенциальные полиеновые жирные кислоты доставляются липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) непосредственно к клеткам, в том числе и высокодифференцированным. В свою очередь, эти клетки используют экзогенные полиненасыщенные жирные кислоты для синтеза индивидуальных жирных кислот, которые встраиваются в мембраны и во многом определяют специфичность функции клеток.

Насыщенные жирные кислоты оказывают атерогенное действие, а полиненасыщенные эссенциальные жирные кислоты обладают антиатерогенным действием, поэтому растительные масла, богатые полиеновыми жирными кислотами, рекомендуется использовать в пищу взамен жиров животного происхождения, где много насыщенных жирных кислот.

Референтные значения концентрации свободных жирных кислот в плазме крови человека находятся в пределах 0,4-0,8 ммоль/л. В плазме они связаны с альбумином. Бóльшая часть жирных кислот может образовываться в печени из углеводных предшественников.

Триглицериды (триацилглицериды) представляют собой эфиры трехатомного спирта глицерина и длинноцепочечных жирных кислот. В тонкой кишке триглицериды образуются главным образом за счет непосредственной эстерификации поступающих из пищи моноглицеридов. Ресинтезированные в клетках кишечника «пищевые» триглицериды выходят в кишечные лимфатические сосуды в форме хиломикронов, а затем через грудной лимфатический проток поступают в кровоток. В норме экзогенные триглицериды поступают в кровь в количестве 70-150 г/сут, поэтому после приема пищи, особенно жирной, уровень триглицеридов заметно повышается и остается высоким в течение нескольких часов (до 10 ч).

Синтез триглицеридов в печени и жировой ткани осуществляется по глицерофосфатному пути, однако имеются отличия, обусловленные формированием промежуточного продукта - глицерол-3-фосфата. В печени глицерол-3-фосфат образуется при фосфорилировании глицерина, тогда как в жировой ткани - путем гликолитического расщепления глюкозы при активно протекающем гликолизе в состоянии сытости.

Tриглицериды в печени на гладком эндоплазматическом ретикулуме комплексируются с холестерином, фософолипидами и апобелками в форме ЛПОНП, которые затем проходят через аппарат Гольджи и секретируются в кровоток.

Tриглицериды выполняют в организме роль источника и аккумулятора энергии.

Депонированные в адипоцитах триглицериды позволяют обеспечивать организм энергией в течение длительного времени (до 50 сут).

Измерение уровня триглицеридов натощак отражает количество эндогенных триглицеридов, находящихся в плазме. Референтные значения их содержания в плазме крови составляют 0,5-2,0 ммоль/л.

Фосфолипиды - сложные эфиры глицерина и жирных кислот, однако, в отличие от триглицеридов, они содержат фосфатное основание вместо одной жирной кислоты, что придает молекуле фосфолипида алифатический характер. Благодаря такому строению некоторые цепи жирных кислот способны взаимодействовать с липидами, а полярные фосфатные головки - с водным окружением. Фосфолипиды являются неотъемлемым компонентом всех клеточных мембран.

Фосфолипиды участвуют в процессах восстановления клеточных мембран, препятствуют нарушению функционирования ассоциированных с ними рецепторов и транспортных систем, восстанавливают текучесть мембраны за счет нормализации соотношения холестерина к фосфолипидам.

В липопротеинах фосфолипиды играют ключевую роль, поддерживая в растворимом состоянии неполярные липиды, такие как триглицериды и эфиры холестерина.

Фосфолипиды присутствуют в желчи, играют в ней важную стабилизирующую роль, растворяя холестерин. При превышении соотношения холестерин/фосфолипиды 1:1 нарушается растворимость холестерина и происходит его кристаллизация вокруг нерастворимого ядра липида, что приводит к образованию холестериновых камней и формированию желчнокаменной болезни.

Референтные значения концентрации общих фосфолипидов (по фосфору) в сыворотке крови человека составляет 1,97-4,68 ммоль/л, или 1,52-3,62 г/л.

Холестерин является мононенасыщенным стерином состава С₂₇ Н₄₆ О. По химической структуре это одноатомный спирт (холестерол). Tермин «холестерин» определяет источник, из которого он впервые был выделен (от греч. chole - желчь).

Общее количество холестерина в организме человека составляет около 140 г, из которых 90-93% находится в тканях, а 7-10% - в плазме крови и лимфе в составе липопротеинов. С возрастом количество холестерина в организме увеличивается. В организме человека холестерин находится в двух формах: в виде свободного холестерина, основная его фракция находится в клеточных мембранах и в составе фосфолипидного монослоя липопротеинов крови; в виде эфиров холестерина.

Эта форма холестерина содержится в липидных каплях цитозоля клеток и содержимом внутренней части липопротеинов.

Свободный холестерин является компонентом всех клеточных мембран. Из холестерина синтезируются стероидные гормоны и желчные кислоты. Бóльшая часть холестерина (более 2/3), циркулирующего в плазме, находится в виде его эфиров (эстерифицировано в основном линолевой и олеиновой кислотами). Эти эфиры холестерина образуются в кровотоке под действием фермента лецитинхолестеринацил-трансферазы (КФ 2.3.1.43, ЛХАТ), относительно небольшой вклад в этот процесс вносит фермент тонкой кишки и печени ацилхолестерин-ацилтрансфераза (КФ 2.3.1.26F, АХАТ).

Холестерин синтезируется во всех тканях организма человека. Однако основным местом его образования является печень, где синтезируется до 80% всего холестерина, в то время как в кишечнике образуется лишь 10%, а в коже - 5%. Суточный рацион холестерина составляет около 1,2 г. Это количество обеспечивается как за счет поступления холестерина с пищей (примерно 400 мг), так и за счет его синтеза (примерно 800 мг).

Схема синтеза холестерола приведена на рис. 1-28. Промежуточные продукты (геранилпирофосфат, фарнезилпирофосфат) могут использоваться для синтеза долихола, кофермента Q, боковой цепи гема, а также для посттрансляционной модификации белков (пренилированные белки). Помимо этого, в печени из холестерола образуются желчные кислоты, а в эндокринных железах - стероидные гормоны. Синтез холестерина происходит в цитоплазме и микросомах.

Печень является единственным органом, способным превращать холестерин в желчные кислоты, так как ферменты, участвующие в гидроксилировании и конъюгации желчных кислот, находятся в микросомах и митохондриях гепатоцитов.

Источником экзогенного холестерина, поступающего в организм с пищей, служат продукты животного происхождения. Главным источником эндогенного холестерина является печень.

На первом этапе этого процесса из трех молекул ацетата и кофермента А синтезируется 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А (ГМГ-КоА). Далее в результате воздействия фермента ГМГ-КоА-редуктазы образуется мевалоновая кислота, которая примерно через 20 последовательных биохимических реакций превращается в холестерин.

Ключевым ферментом, определяющим скорость синтеза холестерина, является ГМГ-КоА-редуктаза. Этот фермент и служит в качестве мишени для воздействия лекарственных препаратов (статинов), позволяющих вмешиваться в синтез холестерина.

Синтезируемый в печени холестерин обеспечивает в нем потребность ряда органов и тканей, а также самой печени. Известно, что средний период полужизни гепатоцита составляет не более 100 дней, в связи с чем печени требуется много холестерина для построения собственных клеточных мембран. Относительно небольшое количество синтезируемого холестерина поступает в кровь, а основная его часть трансформируется в желчные кислоты и попадает с желчью в просвет тонкой кишки. Отсюда около 97% желчных кислот абсорбируются и возвращаются в печень. Этот процесс называется энтерогепатической циркуляцией. Желчные кислоты, возвращаясь в печень, подавляют новый синтез желчных кислот до необходимого уровня за счет ингибирования фермента холестерин-7α-гидроксилазы. Повышенная потеря желчных кислот компенсируется усиленным синтезом в гепатоците, однако максимальный уровень синтеза не может превышать 5 г в сутки, что может быть недостаточным при выраженном нарушении реабсорбции желчных кислот в кишечнике. Снижение концентрации желчных кислот в просвете кишечника сопровождается нарушением абсорбции жиров. Аналогичные нарушения в энтерогепатической циркуляции желчных кислот происходят и при применении так называемых хелатных химических соединений, таких как холестирамин.

Холестерин не растворим в воде. Он может транспортироваться в желчи только в том случае, если образует с фосфолипидами и желчными кислотами мицеллы или пузырьки, которые являются водорастворимыми. Концентрация холестерина в желчи не зависит от его уровня в сыворотке крови.

Применение анионообменных смол (холестирамина и холестипола) для снижения уровня холестерина крови основано на абсорбции желчных кислот в просвете кишечника. Небольшие количества холестерина и желчных кислот могут связываться богатыми растительной клетчаткой пищевыми продуктами.

Холестерин, как и другие липиды, транспортируется в сыворотке крови в составе липопротеинов.

Референтные значения концентрации холестерина в сыворотке крови составляют:

Липопротеины представляют собой макромолекулярные комплексы, внутренняя часть которых содержит нейтральные липиды (триглицериды и эфиры холестерина), а поверхностный слой состоит из фосфолипидов, неэстерифицированного холестерина и специфических липидтранспортных белков, называемых аполипопротеинами (апоЛП) (рис. 1-29).

Идентификация липопротеинов возможна с помощью двух основных методов - электрофореза (на основании подвижности их в электрическом поле) и ультрацентрифугирования, при котором используются их различия по плотности.

По величине гидратированной плотности липопротеины принято разделять на пять классов: хиломикроны, ЛПОНП, липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), ЛПНП, ЛПВП (рис. 1-30).

При электрофорезе липопротеины разделяют на фракции, одна из которых остается на старте (хиломикроны), другие мигрируют к зоне глобулинов - β-липопротеины, пре-β-липопротеины, α-липопротеины. По электрофоретической подвижности ЛПОНП соответствуют пре-β-липопротеинам, ЛПНП - β-липопротеинам, ЛПВП - α-липопротеинам.

В плазме содержатся четыре основных класса липопротеинов: хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП, а также несколько других липопротеинов, которые представлены в сравнительно низких концентрациях:

ЛП(α) и ЛППП (табл. 1-4). Необходимо отметить, что основные классы липопротеинов, в свою очередь, весьма гетерогенны и могут быть подразделены еще на несколько более мелких подклассов, имеющих различия в структуре и метаболизме. Так, в классе ЛПНП выделяют еще четыре субкласса этих частиц (ЛПНП-1, ЛПНП-2, ЛПНП-3, ЛПНП-4).

Самые крупные и богатые триглицеридами частицы - хиломикроны. Эти липопротеины неатерогенные, так как в силу своих больших размеров они не могут проникать в стенку сосуда. Хиломикроны некоторое время после приема пищи присутствуют в плазме здорового человека, однако факт обнаружения их в крови после 12-часового голодания может указывать на наличие патологии липидного обмена.

Примечание. ЛΠOHΠ - липопротеины очень низкой плотности; ЛΠΠΠ - липопротеины промежуточной плотности; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; ЛПВП - липопротеины высокой плотности.

Более мелкие, чем хиломикроны, частицы - ЛПОНП - условно атерогенны.

Следующий класс - ЛППП - обладает атерогенными свойствами. ЛПНП являются самым атерогенным классом и основными переносчиками холестерина в виде его эфиров. Они образуются из ЛПОНП через ЛППП.

ЛПВП имеют наименьшие размеры и обладают выраженными антиатерогенными свойствами. Главная функция ЛПВП заключается в осуществлении обратного транспорта холестерина из периферических тканей и стенок сосудов в печень. Кроме того, ЛПВП препятствуют окислению ЛПНП, ингибируют агрегацию тромбоцитов, стимулируют продукцию в эндотелии простациклина - потенциального вазодилататора.

Формированию мицелл липопротеинов в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов способствуют апоЛП, они являются лигандами для специфичных рецепторов на поверхности плазматической мембраны клеток и кофакторами (активаторами и ингибиторами) процессов липолиза и метаболизма липопротеинов в сосудистом русле (см. табл. 1-4, табл. 1-5).

Хиломикроны синтезируются в энтероцитах тонкой кишки и служат для переноса экзогенных (пищевых) липидов. Хиломикроны сначала попадают в лимфатическую систему, затем в кровоток.

Основным белком первичных хиломикронов является апоВ-48. После поступления хиломикронов в кровь в их состав включаются два дополнительных апоЛП (апоС-II и апоЕ). Этот процесс происходит в сосудистом русле. АпоС-II активирует гепаринзависимую липопротеинлипазу, фермент, фиксированный на эндотелии капилляров жировой ткани, скелетных и сердечной мышц. Липопротеинлипаза гидролизует триглицериды хиломикронов с образованием свободных жирных кислот. Жирные кислоты поступают в ткань и используются в качестве энергетических субстратов. В процессе гидролиза хиломикроны теряют около 96% своей массы, в основном за счет триглицеридов, а также холестерина, фосфолипидов, апоЛП-А и -С. В результате этого они преобразуются в меньший по размерам, обогащенный холестерином ремнант хиломикронов, в котором основными апоЛП являются апоВ и апоЕ. Образованные ремнанты хиломикронов в норме из сыворотки крови элиминируются гепатоцитами посредством специфического рецептора (апоЕ-рецептор).

Примечание. ЛXAT - лeцитинxoлecтepинaцилтpaнcфepaзa; ЛПОНП - липoпpoтeины очень низкой плотности; ЛППП - липoпpoтeины промежуточной плотности; ЛПНП - липoпpoтeины низкой плотности; ЛПВП - липoпpoтeины высокой плотности; ЛΠ(α) -липопротеин α.

Через несколько часов после приема пищи метаболические процессы по утилизации экзогенных липидов перемещаются в печень.

Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП, VLDL, пре-β-ЛП) являются условно атерогенными, образуются в печени, секретируются гепатоцитами в кровоток и транспортируют эндогенные триглицериды. Насыщенные ЛПОНП имеют в своем составе только апоВ-100. В кровотоке в их состав включаются апопротеины из ЛПВП - апоС-II и апоЕ. ЛПОНП, подобно хиломикронам, деградируют под влиянием липопротеинлипазы, расположенной на эндотелии капилляров. В ходе метаболизма липопротеинов, богатых триглицеридами и содержащих апоВ (в основном происходит гидролиз триглицеридов), липопротеины меньшей плотности и больших размеров преобразуются в более плотные и меньшие по размеру ЛППП и затем в ЛПНП. У здоровых людей практически все ЛПНП образованы в сосудистом русле из ЛПОНП.

Липопротеины промежуточной плотности (ЛППП, IDL, флотирующие β-ЛП) находятся в крови в небольшом количестве, что связано с их быстрым превращением в ЛПНП или захватом гепатоцитами. В процессе превращения ЛППП в ЛПНП, кроме гепаринзависимой липопротеинлипазы, принимает участие второй липолитический фермент - печеночная триглицеридлипаза. ЛППП обладают атерогенными свойствами.

Липопротеины низкой плотности (ЛПНП, LDL, β-ЛП) образуются из ЛПОНП через ЛППП. Каждая частица ЛПНП содержит только одну молекулу апоВ-100. Период полужизни циркулирующих ЛПНП составляет около 2,5 дня. Они являются основными переносчиками холестерина в виде его эфиров.

ЛПНП удаляются из крови посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (рис. 1-31). Специфические рецепторы к ЛПНП на поверхности клеток были выявлены в 1970-х годах американскими учеными М. Brown (М. Браун) и J. Goldstein (Дж. Гольдштейн). Лигандами рецептора являются апоВ-100 и апоЕ.

Роль рецептора ЛПНП заключается в обеспечении клетки холестерином адекватно ее потребности. Печень является основным местом рецептор-опосредованного катаболизма ЛПНП: гепатоциты захватывают около половины частиц ЛПНП, где избыток холестерина окисляется в желчные кислоты и выводится из организма через кишечник. При специфическом эндоцитозе освободившийся холестерин подавляет активность ключевого фермента внутриклеточного синтеза холестерина - 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы), что приводит к угнетению синтеза рецепторов к ЛПНП, а также к увеличению скорости образования эфиров холестерина в клетках при участии фермента ацил-КоА-холестеролацилтрансферазы.

Наряду с вышепредставленным эндоцитозом ЛПНП могут включаться в клетки периферических тканей путем неспецифического эндоцитоза. Это происходит в тех случаях, когда концентрация ЛПНП в кровотоке увеличена, в частности, при семейной гиперхолестеринемии. Неспецифический эндоцитоз осуществляется через скавенджер-рецепторы тканевых макрофагов, образующихся из моноцитов крови, а также трансформированных гладкомышечных клеток. Скавенджер-рецепторы представлены в организме в основном на клетках, обладающих макрофагальными свойствами, в том числе на купферовских клетках печени. Данный вид эндоцитоза преобладает в случае модификации ЛПНП (окисления, сиалирования, гликирования и др.). Неспецифический эндоцитоз не регулируется механизмом обратной связи. ЛПНП являются самым атерогенным классом. В классе ЛПНП выделяют четыре субкласса (ЛПНП-1, ЛПНП-2, ЛПНП-3, ЛПНП-4).

Липопротеины высокой плотности (ЛПВП, HDL, α-ЛП). Выделяют три подкласса ЛПВП: ЛПВП-1, ЛПВП-2, ЛПВП-3. ЛПВП образуются в печени и тонкой кишке в процессе липолиза липопротеинов, богатых триглицеридами, или в результате взаимодействия новообразованных апоЛП с мембранами клеток.

Насцентные ЛПВП представляют собой бислойные диски, состоящие из апоЛП и фосфолипидов. При свободном контакте с периферическими тканями (клетки эндотелия, эритроциты и др.), а также с хиломикронами и ЛПОНП липопротеины высокой плотности обогащаются свободным холестерином путем его диффундирования. Холестерин эстерифицируется при участии фермента лецитинхолестерин-ацилтрансферазы.

Основная роль ЛПВП заключается в эвакуации избытка холестерина из сосудистой стенки и других тканей. При этом относительно бедная фракция ЛПВП-3 трансформируется в богатые холестерином ЛПВП-2, которые возвращаются в печень, а затем выводятся с желчью. Предполагается, что ЛПВП обладают протекторным эффектом за счет благоприятного влияния на функцию эндотелия и предупреждения образования окисленных форм ЛПНП. В настоящее время ЛПВП считаются единственным антиатерогенным классом липопротеинов. Снижение уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП) менее 0,9 ммоль/л является самостоятельным фактором риска ишемической болезни сердца (ИБС), а повышение более 2,1 ммоль/л - фактором антириска.

С ЛПВП ассоциирован важный фермент метаболизма липопротеинов - ЛХАТ, которая эстерифицирует холестерин, находящийся на поверхности ЛПВП. Активатором ЛХАТ является апоА-1.

Липопротеин (α) [ЛП(α), Lp (α)]. Апопротеин(α) [апо(α)], состоящий из 4529 аминокислот, соединяясь с ЛПНП дисульфидным мостиком, образует ЛП(α). Важным фактом является выявленное сходство в аминокислотной последовательности апо(α) и плазминогена.

Увеличение концентрации ЛП(α) в крови считают независимым фактором риска атеросклероза и инфаркта миокарда. Концентрация ЛП(α) выше 300 мг/л связана с двукратным повышением риска ИБС, а при одновременном повышении ЛП(α) и ЛПНП риск ИБС увеличивается в 5 раз. Предполагается, что такая атерогенность обусловлена высокой способностью ЛП(α) взаимодействовать с белками клеточного матрикса, такими как фибронектин и протеогликаны. Образующиеся комплексы активно поглощаются моноцитами, макрофагами и гладкомышечными клетками, в результате эти клетки трансформируются в пенистые.

Скавенджер-рецепторы на макрофагах и моноцитах имеют большое сродство к ЛП(α), что объясняет более интенсивный захват этими клетками ЛП(α) и облегчает развитие атеросклероза. Структурное сходство между апо(α) и плазминогеном, по-видимому, и определяет связь между атерогенезом и тромбозом.

Липопротеин-Х (ЛП-Х, Lp-Х). Патологический липопротеин-Х мигрирует в электрическом поле к аноду, в отличие от других классов липопротеинов. При первичном билиарном циррозе печени отмечают образование ксантом и формирование патологических липопротеинов-Х. Другим заболеванием, при котором образуются липопротеины-Х, является наследственный дефицит ЛХАТ (КФ 2.3.1.43).

Метаболизм жирных кислот

Промежуточный обмен липидов в печени включает как интенсивный синтез, так и не менее активный распад различных классов липидов. Прежде всего это касается триглицеридов. Образовавшиеся триглицериды транспортируются в другие органы в составе липопротеинов. Именно печень является основным местом синтеза и распада различных классов липопротеинов. Жирные кислоты различного происхождения в основном подвергаются в печени полному распаду с образованием воды и углекислоты. Наряду с этим в печени интенсивно образуются кетоновые тела, в частности ацетоуксусная кислота, которая, в отличие от многих других органов, самой печенью потребляется.

Синтез жирных кислот в печени осуществляется из углеводов, поступающих из кишечника после приема пищи. Источником углерода для их синтеза служит ацетил-КоА, который образуется в результате окислительного декарбоксилирования пирувата.

Синтез жирных кислот начинается с образования малонил-КоА из ацетил-КоА при участии фермента ацетил-КоА-карбоксилазы, АТФ и биотина. Далее в цитоплазме, при участии мультиферментного комплекса - синтазы жирных кислот, происходит синтез пальмитиновой кислоты за счет наращивания ацетил-КоА молекулой малонил-КоА. Роль переносчика ацильных остатков выполняет ацилпереносящий белок, на который переносится остаток уксусной и малоновой кислот. Ацетильная группа конденсируется с остатком малонила по месту отделившегося СО₂ с образованием β-кетоацил-АПБ. Он восстанавливается редуктазой, донором водорода для которой является молекула НАДФН, образованная в пентозофосфатном пути окисления глюкозы.

Синтезированный β-гидроксиацил-АПБ подвергается дегидратации, в результате чего из него образуется еноил-АПБ, который так же восстанавливается редуктазой.

В результате образуется радикал жирной кислоты, состоящий из четырех атомов углерода, связанный с мультиферментным комплексом. Во время второго цикла радикал жирной кислоты удлиняется на два атома углерода за счет малонил-АПБ. Аналогичные циклы повторяются до тех пор, пока не образуется радикал пальмитиновой кислоты (семь циклов), который гидролитически отделяется от мультиферментного комплекса, превращаясь в свободную пальмитиновую кислоту. Другие насыщенные жирные кислоты образуются из пальмитиновой кислоты путем элонгации (удлинения) в эндоплазматическом ретикулуме с участием малонил-КоА. Образование мононенасыщенных жирных кислот происходит из насыщенных в эндоплазматическом ретикулуме за счет реакции десатурации с использованием НАДФН и молекулярного кислорода.

Регуляция биосинтеза жирных кислот в основном заключается в регуляции активности ацетил-КоА-карбоксилазы, которая является ключевым ферментом этого синтеза.

Усиливают синтез жирных кислот аллостерические активаторы (цитрат и АТФ), гормоны (инсулин и эстрогены), а также пища, богатая углеводами. Тормозят синтез жирных кислот аллостерические ингибиторы (длинноцепочечные жирные кислоты - по принципу отрицательной обратной связи), гормоны (глюкагон и адреналин по цАМФ-зависимому пути передачи сигнала), а также жирная пища.

В печени и жировой ткани синтез триглицеридов наиболее интенсивно происходит в состоянии покоя и сытости. Основными жирными кислотами, используемыми в синтезе триглицеридов, являются пальмитиновая и олеиновая. Для синтеза триглицеридов и фосфолипидов в печени исходные метаболиты используются только в активной форме. Глицерин используется в виде α-глицерофосфата, а жирные кислоты - в виде ацил-КоА. α-Глицерофосфат в печени и жировой ткани образуется различными путями. В печени и молочной железе он образуется за счет фосфорилирования глицерола с участием глицеролкиназы и АТФ. В жировой ткани и мышцах глицеролкиназа отсутствует, поэтому образование α-глицерофосфата осуществляется за счет восстановления диоксиацетонфосфата - промежуточного метаболита гликолиза.

Жирные кислоты активируются с образованием ацил-КоА при участии ацил-КоА-синтетазы, затем две молекулы ацил-КоА взаимодействуют с α-глицерофосфатом. В результате реакции образуется фосфатидная кислота. Фосфатидная кислота после дефосфорилирования превращается в диацилглицерол, который в последующем ацилируется с образованием триглицерида.

Диацилглицерол используется в печени и для синтеза фосфолипидов (фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина), а фосфатидная кислота - для синтеза фосфотидилинозитов.

Триглицериды и фосфолипиды, синтезированные в печени, упаковываются в ЛПОНП, в их составе поступают в кровь и транспортируются в различные органы и ткани.

Окисление жирных кислот для печени является основным источником энергии. Окисление жирных кислот осуществляется в три основных этапа. Первый - это их активация при участии ацил-КоА-синтетаз. Протекает он в цитоплазме с затратой энергии АТФ, при этом образуется активная форма жирных кислот - ацил-КоА. Второй этап представляет собой транспорт жирной кислоты при участии карнитина через митохондриальную мембрану. Последний этап - это непосредственно процесс β-окисления жирных кислот в митохондриях с участием основных ферментов этого процесса - дегидрогеназ. β-Окисление происходит только в аэробных условиях, при этом каждый цикл повторяется многократно. Длина жирной кислоты при каждом цикле становится меньше на два углеродных атома, которые отщепляются от жирной кислоты в виде ацетил-КоА.

β-Окисление начинается с дегидрирования ацил-КоА ФАД-зависимой ацил-КоА-дегидрогеназой с образованием еноил-КоА. В следующей реакции по месту двойной связи присоединяется молекула воды, образуя β-гидроксиацил-КоА. Это соединение окисляется НАД-зависимой дегидрогеназой с образованием β-кетоацил-КоА, который подвергается расщеплению ферментом тиолазой. В результате этой последовательности из четырех реакций от ацил-КоА отделяется два углеродных атома в виде ацетил-КоА, который поступает в цикл трикарбоновых кислот, а восстановленные эквиваленты, образовавшиеся в реакциях, катализируемых дегидрогеназами, используются в реакциях окислительного фосфорилирования для образования АТФ.

Активная форма жирной кислоты, укороченная на два атома углерода, опять проходит последовательность из четырех описанных ранее реакций. Эти циклы β-окисления повторяются с радикалом жирной кислоты до тех пор, пока вся молекула жирной кислоты не превратится в ацетильные остатки.

Жирные кислоты и глюкоза имеют общий путь окисления в митохондриях гепатоцитов и не могут одновременно использоваться в качестве субстратов для энергетических потребностей клетки. При дефиците глюкозы в клетках и низком соотношении содержания инсулин/ глюкагон в крови активируется β-окисление жирных кислот в печени. В то же время скорость реакций цикла трикарбоновых кислот при этом снижена, поскольку оксалоацетат используется для глюконеогенеза. Это приводит к накоплению в митохондриях гепатоцитов ацетил-КоА, который в дальнейшем может использоваться для синтеза кетоновых тел.

Кетоновые тела - ацетон, β-оксимасляная и ацетоуксусная кислоты - являются важными источниками энергии, альтернативными жирным кислотам и глюкозе. При нормальном обеспечении кислородом все клетки, за исключением гепатоцитов, способны окислять кетоновые тела до углекислого газа и воды. В основном синтезировать и продуцировать кетоновые тела в кровь, делая их доступными для других клеток, способны только гепатоциты (рис. 1-32).

Синтез кетоновых тел осуществляется в митохондриях гепатоцита. Интенсивность их синтеза зависит от нагрузки гепатоцитов субстратами - глюкозой и жирными кислотами, регуляторного действия инсулина, глюкагона, адипоцитокинов и некоторых других гормонов.

Инсулин подавляет образование кетоновых тел, снижая активность как липолиза, так и ацилкарнитинтрансферазы - фермента, облегчающего поступление свободных жирных кислот в митохондрии гепатоцитов. Напротив, глюкагон способствует продукции кетоновых тел, стимулируя процессы поступления в гепатоциты жирных кислот, их активацию и транспорт в митохондрии.

Кетоновые тела стимулируют секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы. При сахарном диабете 1-го типа, когда нарушена или утрачена способность клеток поджелудочной железы поддерживать адекватный метаболической ситуации уровень инсулина в крови, кетоновые тела не способны инициировать гормональный механизм контроля их продукции. Напротив, при сахарном диабете 2-го типа, при сохраненной способности β-клеток поджелудочной железы синтезировать инсулин, физиологически избыточный уровень кетоновых тел в крови отсутствует.

Характеризуя особенности обмена кетоновых тел при различных состояниях организма, необходимо различать:

При каждом из этих состояний уровень кетоновых тел превышает верхний предел референтного значения практически здорового человека - 0,1 ммоль/л. Однако, помимо количественной характеристики, эти состояния различаются механизмами их формирования и исходами.

Физиологический кетоз - состояние, при котором уровень кетоновых тел в крови достигает 2 ммоль/л. В основе физиологического кетоза не лежат какие-либо метаболические аномалии. Этот вариант кетоза сопровождает поздние сроки беременности, особенно если не соблюдается режим питания, имеются длительные перерывы между приемами пищи, практикуется значительная физическая нагрузка. Прирост продукции кетоновых тел в печени направлен на удовлетворение клеток материнского организма в энергетическом субстрате, поскольку глюкоза активно используется клетками плода в пластических и трофических процессах. Несмотря на то что у беременной могут быть зафиксированы признаки изменений кислотно-основного состояния (КОС), они исчезают при адекватном поступлении глюкозы с пищей.

Патологический кетоз - состояние, при котором уровень кетоновых тел в крови превышает 2,5 ммоль/л. Причиной патологического кетоза служит дисрегуляция углеводного и липидного обмена в организме в целом и гепатоцитах в частности. Следствием этого является избыточное поступление в гепатоциты глюкозы и/или жирных кислот, которые распадаются и формируют избыток исходного субстрата синтеза кетоновых тел - ацетил-КоА. Гормональный контроль метаболизма глюкозы и жирных кислот в гепатоцитах является неэффективным или утраченным со стороны инсулина, адипоцитокинов и практически полностью сохраненным со стороны глюкагона. Недостаток регуляторного действия инсулина на гепатоциты и сохраненное влияние глюкагона предопределяют перманентное образование кетоновых тел, превышающее потребности в них клеток других тканей.

Уровни лактата, пирувата, кетоновых тел значимы в дифференциальной диагностике неотложных состояний, контроле эффективности терапии, прогнозе здоровья пациента.

Основным механизмом удаления ацетона из организма является его выделение с выдыхаемым воздухом, мочой, потом. Кетоновые тела могут служить дополнительными источниками энергии при голодании и стрессе, особенно для головного мозга, который не использует жирные кислоты в качестве источника энергии. Кетоновые тела также используют скелетные мышцы, сердце и почки. При этом β-кетобутират превращается в две молекулы ацетил-КоА, окисляющиеся в цикле трикарбоновых кислот. В результате окисления одной молекулы ацетил-КоА образуется 12 молекул АТФ.

По данным литературных источников, около 50% потребности в энергии взрослого организма обеспечивается за счет окисления жиров. Мобилизация липидов для энергетических нужд из печени происходит при многих экстремальных воздействиях и при возникновении критических ситуаций.

Так, при голодании в печени активируется глюконеогенез, для которого используется оксалоацетат, в результате чего его концентрация в клетке уменьшается. В связи с этим активируется липолиз. Жирные кислоты, поступающие в большом количестве в печень, не сгорают в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), а используются при синтезе кетоновых тел.

Ацетон не имеет метаболической ценности и удаляется легкими. Однонаправленность транспорта кетоновых тел из гепатоцитов в кровь и далее к клеткам различных тканей обусловлена тем, что гепатоциты практически не способны утилизировать кетоновые тела по причине отсутствия или незначительной активности фермента тиофоразы, образующего КоА-производные ацетоацетата и β-гидроксибутирата.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ПИГМЕНТНОМ ОБМЕНЕ

Печени принадлежит ведущая роль в распаде сложных белков - хромопротеинов, простетическая группа которых представлена окрашенными соединениями, в результате которого образуются желчные пигменты. Основным источником желчных пигментов является гемоглобин, а также другие гемсодержащие белки (миоглобин, цитохромы, каталаза). Небольшая часть желчных пигментов образуется в процессе неэффективного эритропоэза, когда в костном мозге происходит разрушение созревающих клеток эритроидного ряда. Ежедневно в организме распадается примерно 6,3 г гемоглобина.

Начальный этап распада гемоглобина - превращение его в вердоглобин - происходит в ретикулоэндотелиальной системе (купферовские клетки печени, селезенка, костный мозг). Этот этап заключается в разрыве одной связи между кольцами в тетрапиррольной структуре гемоглобина при сохранении железа и глобина. В дальнейшем происходит отщепление железа и глобина с развертыванием тетрапиррольной циклической структуры в тетрапиррольную линейную структуру одного из желчных пигментов - биливердина. Освободившееся железо не удаляется из организма, а депонируется в составе белка ферритина. Биливердин далее восстанавливается до билирубина за счет водорода НАДФН. Образовавшийся билирубин поступает в кровь, где связывается с альбумином. Его называют непрямым билирубином, так как он не вступает в специфическую цветную реакцию с диазореактивом без предварительного освобождения от альбумина.

Связанный довольно прочно с альбумином, непрямой билирубин транспортируется в гепатоциты. Одна молекула альбумина может связывать две молекулы билирубина. Некоторые вещества (салицилаты, сульфаниламидные препараты) могут конкурентно вытеснять билирубин из связи с альбумином, и тогда свободный билирубин может проникать, в частности, в нервную систему. Непрямой билирубин составляет более 75-90% концентрации общего билирубина крови в зависимости от метода определения. В гепатоците на поверхности плазматической мембраны комплекс альбумина с непрямым билирубином распадается. Высвобожденный билирубин образует временный комплекс с липидами плазматической мембраны. Облегченная диффузия билирубина в гепатоциты осуществляется двумя типами белков-переносчиков: лигандином, с ним транспортируется бóльшая часть билирубина, и протеином Z. Активность захвата билирубина гепатоцитами зависит от скорости его обмена в клетке. Образовавшийся комплекс препятствует выходу билирубина из клетки обратно в кровь.

Лигандин и протеин Z имеются также в клетках кишечника и почек, а при функциональной недостаточности печени они способны компенсировать в ней ослабление процессов детоксикации.

На следующем этапе происходит превращение непрямого билирубина в прямой билирубин. Это происходит путем соединения непрямого билирубина с одной, а затем со второй молекулой глюкуроновой кислоты. Местом ее присоединения являются остатки пропионовой кислоты в молекуле билирубина. Присоединение происходит в эндоплазматической сети гепатоцита при участии фермента билирубин-глюкуронилтрансферазы (рис. 1-33).

Далее прямой билирубин поступает в желчь (непрямого билирубина в желчи, как правило, нет). В составе желчи билирубинглюкурониды попадают в тонкую кишку, где подвергаются дальнейшим превращениям. При нарушении экскреции прямого билирубина в желчные капилляры он может выходить из клеток в кровь. Обнаружение в крови преобладания моноглюкуронидов над диглюкуронидами указывает на паренхиматозное повреждение печеночной ткани.

Прямой билирубин в кишечнике не всасывается. О метаболизме билирубина в кишечнике единого мнения нет, в особенности это касается номенклатуры образующихся продуктов и путей их выделения. В общих чертах эти превращения могут быть представлены следующим образом (рис. 1-34).

В верхних отделах кишечника из прямого билирубина образуется мезобилиноген. Он подвергается восстановлению с образованием нескольких бесцветных тетрапиррольных соединений, которые иногда называют общим понятием «уробилиногены», а иногда детализируют, разделяя на стеркобилиноген, уробилиноген и мезобилиноген. Поступая в печень, уробилиногены вовлекаются в кишечно-печеночный цикл, распадаясь в печени до дипирролов, или же возвращаются в кишечник. При нормальном круговороте метаболитов билирубина между печенью и кишечником они практически не попадают в общий круг кровообращения, а следовательно, и в мочу.

Продвигаясь по кишечнику, уробилиногены под действием микрофлоры толстой кишки подвергаются разной степени восстановлению, отличаясь от структуры билирубина на 6 (стеркобилиноген), 8 (мезобилиноген) и 12 (уробилиноген) атомов водорода (рис. 1-35). На воздухе они окисляются путем потери двух атомов водорода и образуют пигменты кала и мочи. Основной путь выделения продуктов превращения билирубина в кишечнике - выделение с калом под названием «стеркобилин» (50-280 мг/сут). Незначительное количество уробилиногена всасывается и по геморроидальным венам попадает в общий круг кровообращения, а затем и в мочу (около 4 мг/сут), где содержится в виде уробилина.

Известно, что в уробилиногены превращается не весь билирубин. Значительная часть прямого билирубина превращается в продукты невыясненной структуры.

В адаптивных реакциях важна и экскреторная функция печени как часть дезинтоксикационных механизмов и секреторная, обеспечивающая организм энергетическим и пластическим материалом.

Определение содержания желчных пигментов в крови и моче, а также продуктов их превращения, на протяжении многих лет широко используется для диагностики заболеваний печени.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ОБМЕНЕ ГОРМОНОВ

Метаболизм гормонов довольно хорошо изучен. Значительную роль в их превращениях играет печень. Так, гормоны пептидной природы инактивируются путем протеолиза и дезаминирования освобождающихся аминокислот. По крайней мере, для инсулина и глюкагона доказано, что это происходит в печени.

Гормоны щитовидной железы, являющиеся йодированными производными аминокислот, предварительно подвергаются дейодированию, дезаминированию и разрыву тиронинового ядра. Кроме того, возможна конъюгация с глюкуроновой, а иногда и с серной кислотой.

Для стероидных гормонов после ряда химических превращений характерно выведение их из организма в виде конъюгатов. Так, кортикостероиды сначала восстанавливаются, а восстановленные метаболиты выводятся в виде парных соединений с глюкуроновой кислотой. Продукты метаболизма половых стероидных гормонов (андрогенов и эстрогенов), например 17-кетостероиды, выводятся в виде конъюгатов с глюкуроновой или серной кислотой. Доказано влияние печени на гомеостатическую регуляцию уровня глюкокортикостероидных гормонов, которые, так же как и половые гормоны, инактивируются за счет образования парных соединений с глюкуроновой или серной кислотой (17-оксикортикостероиды). В печени инактивируется и основной гормон из группы минералокортикоидов - альдостерон. Там же происходит инактивация таких биологически активных веществ, как серотонин, катехоламины и гистамин. Гормоны белковой и пептидной природы метаболизируют в печени при участии протеаз, стероидные - гидроксилаз, а катехоламины - при участии аминооксидаз.

Принимает участие печень и в синтезе ряда белков, транспортирующих некоторые гормоны к своим органам-мишеням. К ним относятся тироксинсвязывающий глобулин (ТСГ), транстиретин (тироксинсвязывающий преальбумин, ТСПА), глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ), транскортин (кортикостероидсвязывающий глобулин, КСГ).

Тироксинсвязывающий глобулин является главным транспортным белком для тироксина (Т₄ ) в крови. Он относится к суперсемейству ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), хотя непосредственного действия на активность проатеазы сам и не проявляет. Этот полипептид синтезируется в печени. Для связывания тироксина он имеет только один участок. Под действием сериновых протеаз происходят конформационные изменения ТСГ, которые уменьшают его сродство к тироксину. В результате концентрация тироксина повышается.

ТСГ имеет в 10 раз большее сродство к тироксину (Т₄ ), чем к три-йодтиронину (Т₃ ). Он связывает 75% общего количества Т₄ и Т₃ , циркулирующих в крови. В нормальной сыворотке ТСГ насыщен Т₄ обычно только на 25%. ТСГ связывает не только Т₄ и Т₃ , но и ряд лекарственных препаратов, например фенитоин, диклофенак, диазепам, салицилаты и некоторые другие.

Референтные значения содержания ТСГ в сыворотке составляют 0,010-0,025 г/л.

Транстиретин (тироксинсвязывающий преальбумин) - белок, обеспечивающий транспорт тироксина и ретинола, массой 55 кДа. Синтез транстиретина осуществляется в основном в печени, сосудистом сплетении желудочков мозга и в пигментном эпителии сетчатки глаза. Стимулируется синтез глюкокортикоидами, анаболическими стероидами и андрогенами. Скорость образования преальбумина в 50 раз выше, чем ТСГ, но в 25 раз ниже, чем альбумина. ТСПА связывает в крови до 15% Т₄ и 9% Т₃ . Различия в связывании Т₄ и Т₃ объясняются тем, что при физиологических рН крови Т₄ находится в ионизированном состоянии, а Т₃ - в неионизированном. Образование этих комплексов ингибируется ацетилсалициловой кислотой и салицилатами. Примерно 99,97% циркулирующего Т₄ и 99,7% Т₃ связаны с белками. Считается, что в таком состоянии они не обладают метаболической активностью, но находятся в равновесии со свободными фракциями гормонов. Время полужизни комплекса ТСПА-Т₄ составляет 7,4 сут, а комплекса ТСПА-Т₃ - одни сутки. Время полураспада ТСПА - 1-2 дня.

ТСПА играет важную роль в срочной доставке гормонов в ткани, так как комплекс гормон-белок-переносчик быстро и легко диссоциирует в связи с его низким сродством к тиреоидным гормонам.

При некоторых соматических заболеваниях и недостаточном питании скорость синтеза ТСПА уменьшается, что сопровождается быстрым и значительным снижением его содержания в сыворотке. В связи с этим пониженная концентрация ТСПА в сыворотке крови является индикатором недостаточности белкового питания. Пониженный уровень ТСПА описан при некоторых формах наследственного амилоидоза тканей.

Референтные значения содержания транстиретина в сыворотке составляют от 120-240 мг/л, или 2250-4300 нмоль/л.

Глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ), также известный как эстрадиол-тестостеронсвязывающий глобулин, связывающий половые стероиды белок, секс-стероидсвязывающий глобулин, является циркулирующим гликопротеином с молекулярной массой приблизительно 90 кДа. Он существует в двух изоформах, синтезируемых печенью и яичками. Его биологическая функция - транспорт половых стероидных гормонов. Обладает высокой аффинностью связывания с тестостероном, дигидротестостероном и эстрадиолом. Более чем 98% этих гормонов в крови связаны с ГСПГ (45%) и альбумином (53%). В отличие от альбумина, который связывается с тестостероном с низким сродством, ГСПГ связывается с половыми стероидными гормонами с высокой аффинностью.

У мужчин с атерогенным липидным профилем часто наблюдается низкий уровень глобулина, связывающего половые гормоны, с одновременным уменьшенным содержанием общего тестостерона. Низкие концентрации ГСПГ могут предшествовать развитию сахарного диабета. Повышение содержания глобулина, связывающего половые гормоны, с возрастом может служить причиной снижения активной фракции общего тестостерона.

Референтные значения содержания глобулина, связывающего стероидные гормоны, в сыворотке составляют:

Транскортин - кортикостероидсвязывающий глобулин (КСГ), является гликопротеином с молекулярной массой 53,8 кДа (383 аминокислоты), содержит пять участков гликозилирования и один высокоаффинный к стероидам участок связывания. КСГ принадлежит к суперсемейству серпинов. КСГ у человека имеет сходство в аминокислотной последовательности с α₁ -антитрипсином на 52% и с α₁ -антихимотрипсином - на 55%. Гликозилирование аспарагина 238 на КСГ является критическим для связывания стероидов. При физиологических условиях в крови с транскортином связано 90-95% кортизола. При более высоких концентрациях (более 500 нмоль/л) возрастающая пропорция кортизола связана с альбумином, но с более низкой аффинностью. Содержание транскортина повышается при беременности (до двух раз), в меньшей степени - при введении экзогенных эстрогенов. До 50% снижается его концентрация при сепсисе, ожогах и операциях на сердце. Уменьшение содержания коррелирует с повышением уровня IL-6 и приводит к увеличению концентрации свободного кортизола. КСГ доставляет глюкокортикоиды с целевым их высвобождением в очагах воспаления при участии эластазы нейтрофилов. Пониженное содержание кортикостероидсвязывающего глобулина, как полагают, является индикатором резистентности к инсулину и слабой воспалительной реакции.

Референтные значения содержания транскортина в сыворотке крови:

Таким образом, состояние печени в значительной мере влияет на реактивность организма и на формирование адаптивных реакций.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ОБМЕНЕ ВИТАМИНОВ

Печень участвует в обмене почти всех витаминов. Принимает непосредственное участие в обмене и всасывании в кишечнике жирорастворимых витаминов A, D, E, K, F, метаболизирует витамины А, D, B₆ , В₁₂ , рибофлавин, фолиевую, пантотеновую кислоты и витамин K.

В печени происходит образование метаболически активных форм некоторых витаминов. Так, витамины РР, В₂ , пантотеновая кислота включаются в соответствующие нуклеотиды (НАД+, НАДФ+, ФМН, ФАД+, КоА-SH). Фолиевая кислота с помощью витамина С восстанавливается в тетрагидрофолиевую кислоту. Восстановление сводится к разрыву двух двойных связей и присоединению четырех водородных атомов в положениях 5, 6, 7 и 8 с образованием тетрагидрофолиевой кислоты. Восстановление протекает в две стадии в тканях при участии специфических ферментов, содержащих восстановленный НАДФ⁺ . Сначала при действии фолатредуктазы образуется дигидрофолиевая кислота, которая при участии второго фермента - дигидрофолатредуктазы - восстанавливается в тетрагидрофолиевую кислоту.

Витамины В₁ и В₆ фосфорилируются в тиаминдифосфат и пиридок-сальфосфат соответственно. Витамин В₆ (пиридоксин) - производный 3-оксипиридина. Термином «витамин В₆ » обозначают все три производных 3-оксипиридина, обладающих одинаковой витаминной активностью, - пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин.

Хотя все три производные 3-оксипиридина наделены витаминными свойствами, коферментные функции выполняют только фосфорилированные производные пиридоксаля и пиридоксамина. Фосфорилирование пиридоксаля и пиридоксамина является ферментативной реакцией, протекающей при участии специфических киназ. Синтез пиридоксальфосфата, например, катализирует пиридоксалькиназа.

Витамин В₁ (тиамин) в своей химической структуре содержит два кольца: пиримидиновое и тиазоловое, соединенных метиленовой связью. Обе кольцевые системы синтезируются отдельно в виде фосфорилированных форм, затем объединяются через четвертичный атом азота. В превращении витамина B₁ в его активную форму - тиаминпирофосфат, называемый также тиаминдифосфатом, - участвует специфический АТФ-зависимый фермент тиаминпирофосфокиназа.

Часть каротинов преобразуется в витамин А под влиянием каротин-диоксигеназы. Каротины являются провитаминами для витамина А. Главными представителями каротинов являются α-, β- и γ-каротины (C₄₀ H₅₆ ), отличающиеся друг от друга химическим строением и биологической активностью. Наибольшей биологической активностью обладает β-каротин, поскольку он содержит два β-иононовых кольца, и при распаде в организме из него образуются две молекулы витамина А.

При окислительном распаде α- и γ-каротинов образуется только по одной молекуле витамина А, поскольку эти провитамины содержат по одному β-иононовому кольцу.

Альдегид витамина А (ретиналь) в периферические ткани из печени транспортируется ретинолсвязывающим белком (retinol binding protein, RBP) совместно с преальбумином (PALB), который предотвращает его потерю через почки. Эти белки обеспечивают защиту альдегида от окислительного разрушения. В метаболизм витамина А также вовлечены белки, принадлежащие к семейству липокалинов (транспортные белки гидрофобных молекул), и внутриклеточные белки, связывающие липиды.

Большое значение печень имеет в метаболизме витамина D. В купферовских клетках печени под воздействием мембранного фермента семейства цитохрома P450 25-гидроксилазы (CYP3A4) холекальциферол и эргокальциферол путем гидроксилирования превращаются в первый активный метаболит - 25(ОН)D (25-гидроксивитамин D-кальцидиол). 25(ОН)D является основным циркулирующим метаболитом витамина D, период его полувыведения из организма составляет около трех недель. Концентрация этого метаболита в крови у здоровых детей находится в пределах 15-40 нг/мл. Уменьшение его содержания до 10 нг/мл свидетельствует о пограничной обеспеченности организма витамином D и позволяет говорить о его дефиците. Уровень 5 нг/мл и ниже соответствует состоянию D-авитаминоза. Генетически детерминированное снижение или блок активности α-гидроксилазы при назначении лекарственных препаратов (фенобарбитал и другие противосудорожные препараты, глюкокортикоиды), конкурирующих за связь с конвертирующим ферментом, приводит к нарушениям образования 25(ОН)D, что создает условия для эндогенного дефицита витамина D даже при его достаточном экзогенном поступлении в организм. Вторым фактором, участвующим в метаболизме витамина D, является синтезируемый гепатоцитами витамин D-связывающий белок (vitamin D binding protein - VDBP или DBP). Он также известен как Gc-глобулин. Является белком плазмы крови с массой 52 кДа и связывает витамин D и сходные с ним стеролы.

В печени происходит созревание белковых факторов свертывающей и противосвертывающей систем крови при участии витамина K. Так, γ-карбоксиглутаминовая кислота является Са²⁺ -связывающей аминокислотой, которая необходима для функционирования кальцийсвязывающих белков. К ним относятся факторы свертывающей системы крови: протромбин (II), проконвертин (VII), фактор Кристмаса (IX), фактор Стюарта-Прауэра (X), а также естественные антикоагулянты протеин С и протеин S, нуждающиеся в γ-карбоксиглутаминовой кислоте для Са-индуцированного взаимодействия с поверхностью клеточной мембраны. При взаимодействии восстановленной формы витамина K (K-Н₂ ) с γ-глутамилкарбоксилазой в присутствии кислорода образуется сильное основание (алкоксид), способное отнять от γ-С-атома глутаминовой кислоты водород, на место которого присоединяется СО₂ - при этом образуется γ-карбоксиглутаминовая кислота. В ходе реакции появляются короткоживущие и высокотоксичные промежуточные соединения (свободные радикалы витамина K), которые превращаются в нетоксичный эпоксид витамина K в присутствии глутаминовой кислоты. Эпоксид витамина K восстанавливается в витамин K-Н₂ с помощью ферментов редуктаз.

В печени синтезируются белки, выполняющие транспортные функции по отношению к витаминам. Например, ретинолсвязывающий белок, физиологическая роль которого состоит в переносе ретинола от печени к тканям, защищая его от окислительного разрушения (его содержание уменьшается при опухолях). Часть витаминов, в первую очередь жирорастворимых, а также продуктов их преобразований выделяется из организма с желчью.

Кроме витаминов, печень депонирует микроэлементы: железо, медь, марганец, кобальт, цинк, молибден и др.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ОБМЕНЕ ЖЕЛЕЗА

Печень взрослого человека содержит около 700 мг железа, которое почти полностью находится в составе ферритина.

Железо входит в состав гемсодержащих белков, а также металло-флавопротеинов, железосерных белков, трансферрина и ферритина. Основными регуляторами гомеостаза железа в настоящее время можно считать гепсидин, ферритин, трансферрин и растворимый рецептор трансферрина (soluble transferrin receptor, sTfR).

После всасывания или реутилизации макрофагами железо связывается с трансферрином и с его помощью транспортируется к органам и тканям.

Референтные значения содержания железа в сыворотке крови:

Трансферрин - обширное семейство двудольковых железосвязывающих белков. Это гликопротеин с молекулярной массой 79,6 кДа, содержит железосвязывающие положения для двух атомов Fe³⁺ .

Трансферрин синтезируется главным образом в печени и в клетках ретикулоэндотелиальной системы. Трансферрин имеет многочисленные изоформы. Его синтез регулируется содержанием железа в организме: при его дефиците - повышается, а при избытке - снижается. Трансферрин транспортирует железо в плазме между желудочно-кишечным трактом и органами, хранящими железо (печень, селезенка и костный мозг), и гемопоэтическими тканями. Стимулируется синтез эстрогенами, кортикостероидами и низкой концентрацией железа. Полупериод его жизни обычно составляет 10,5 дня.

Клетки с высокой потребностью в железе имеют много мембранных рецепторов для комплекса железо-трансферрин. Трансферрин связывает железо с очень высокой константой диссоциации. Ионы Fe³⁺ присоединяются к трансферрину только в присутствии кофактора - двухвалентного аниона (как правило, это СО₃^2-), который выступает в роли мостика между металлом и белком.

Около 80% переносящегося трансферрином железа поступает в костный мозг и встраивается в молекулы гемоглобина вновь образующихся эритроцитов; другими важными органами, потребляющими ионы Fe³⁺, являются печень (главное хранилище железа) и селезенка.

С трансферрином в организме связано менее 0,1% всего железа. Однако в кровяном русле в норме трансферрин насыщен железом до 33%, поэтому он очень эффективно захватывает свободное железо, а также может связывать катионы других металлов: Cr³⁺, Mn³⁺, Со³⁺, Сu²⁺.

Поступление железа из трансферрина в клетку осуществляется с помощью растворимого рецептора трансферрина. sTfR - это мембранный белок. Он связывается с двумя молекулами трансферрина и образует комплекс sTfR-трансферрин, который погружается внутрь эндоплазматической везикулы (эндосомы). Аффинность трансферрина к железу существенно зависит от pH. При снижении pH менее 4,8 наблюдается диссоциация ионов железа и трансферрина. Такая кислая среда создается внутри эндосомы благодаря АТФ-зависимому протонному насосу, находящемуся в ее мембране. Благодаря этому происходит освобождение Fe³⁺ из трансферрина, и оно оказывается внутри клетки.

Железо, не израсходованное организмом, хранится в составе молекул ферритина и гемосидерина, которые являются депо железа.

Определение концентрации трансферрина используется для оценки содержания железа в организме. Благодаря точному молярному отношению связывания железа трансферрином измерение общей железосвязывающей способности сыворотки крови (ОЖСС) было заменено количественным определением трансферрина. Измерение насыщенности трансферрина, то есть отношение количества железа к концентрации трансферрина, выраженное в процентах, является самым точным индикатором поступления железа в костный мозг. При дефиците железа степень насыщенности трансферрина - чрезвычайно чувствительный показатель функционального истощения содержания железа.

ОЖСС (мкмоль/л) = трансферрин (г/л) ? 25,12 (мкмоль/г); насыщенность трансферрина (%) = железо (мкмоль/л) / ОЖСС (мкмоль/л) ? 100 или насыщенность трансферрина (%) = 3,98 ? [железо (мкмоль/л) / трансферрин (г/л)].

Референтные значения ОЖСС составляют 45,3-77,1 мкмоль/л.

Референтные значения содержания трансферрина в сыворотке крови составляют:

Ферритин - водорастворимый протеин. Его молекулярная масса составляет примерно 450 кДа. Основная биологическая роль ферритина - это накопление железа, которое токсично для организма. В печени содержится до одной трети запасов железа. Такое же его количество находится в форме ферритина и в костном мозге. Ферритин синтезируется фактически во всех соматических клетках, где он изолирует железо в растворимой форме, обеспечивая доступные запасы для синтеза железосодержащих соединений типа гемоглобина. Он присутствует в больших количествах в макрофагах и гепатоцитах для целей хранения и в эритробластах - для метаболизма. Ферритин также является важным антиоксидантом.

Ферритин состоит из белковой оболочки - апоферритина и ядра, состоящего из железистого гидрофосфата. Апоферритин состоит из тяжелых (21 кДа) и легких (19 кДа) полипептидных цепей, составляющих 24 протомера, расположенных вокруг ядра. Разный набор протомеров в олигомере ферритина определяет образование нескольких изоформ этого белка в разных тканях. Так, ферритин селезенки и печени имеет 80-90% L-субъединиц и 10-20% Н-субъединиц. В сердце, плаценте, ткани плода, злокачественных опухолях в ферритинах в основном содержится Н-форма. Ферритины, богатые H-субъединицами, быстрее накапливают и освобождают железо, в то время как богатые L-субъединицами - медленнее высвобождают железо. Ферритины, богатые L-субъединицами, содержатся в селезенке и печени, играющих основную роль в депонировании железа в организме. Тяжелая цепь обладает ферроксидазной активностью, обеспечивая окисление двухвалентного железа (Fe²⁺) в трехвалентное (Fe³⁺). Легкая цепь содержит более заряженные аминокислоты, участвующие в стабилизации оболочки и, вероятно, в усилении железосодержащего ядра.

Ферритин имеет форму сферы, внутри которой хранится железо. Железо в него включено в составе ферригидрита, который присоединен к внутренней стенке сферы. Каждая молекула ферритина имеет потенциальную способность включать до 4500 атомов железа, но обычно содержит менее 3000 атомов. Железо поступает внутрь и освобождается наружу через каналы, пронизывающие белковую оболочку апоферритина. Железо может откладываться и в белковой части молекулы ферритина. Для высвобождения железа из ферритина оно (Fe³⁺ ) должно восстановиться до Fe²⁺. Молекулы Fe²⁺ выходят через каналы в сферической структуре, где при участии церулоплазмина окисляются в Fe³⁺ для поглощения трансферрином. Однако полностью детали хранения и высвобождения железа до настоящего времени не изучены. При значительном увеличении концентрации железа в клетке, когда система ферритинового депо не справляется с данной ситуацией, ионы железа связываются с белковой частью ферритина, нарушая его структуру и превращаясь в малорастворимый гемосидерин, который содержит до 37% железа.

Незначительная часть ферритина экскретируется из тканей в плазму крови. Поскольку поступление ферритина в кровь пропорционально его содержанию в тканях, то концентрация ферритина в крови - важный диагностический показатель запасов железа в организме.

Референтные значения содержания ферритина в сыворотке крови составляют:

Церулоплазмин (ферроксидаза) - α₂ -гликопротеин, синтезируется в печени как одиночная цепь с массой 132 кДa. Церулоплазмин играет существенную роль в обмене и железа, и меди; он связывает 90-95% меди плазмы крови. Обладает ферроксидазной и супероксиддисмутазной активностью и в плазме крови окисляет двухвалентное железо в трехвалентное, что обеспечивает его транспорт по крови трансферрином. Высвобожденное из ферритина железо, также при участии церулоплазмина, окисляется в Fe³⁺ и захватывается трансферрином для повторного использования. Таким образом предотвращается образование активных форм кислорода, например, таких как супероксид и перекись водорода, то есть церулоплазмин обладает антиоксидантным действием, которое предотвращает перекисное окисление липидов (ПОЛ) в мембране клетки, а также может модулировать функцию эндотелиальной синтазы оксида азота, регулируя NO-зависимое расслабление сосудов. Церулоплазмин оказывает противовоспалительное действие, подавляя активность гистаминазы сыворотки.

Тем не менее основной функцией церулоплазмина считается связывание и перенос меди. Одна его молекула с помощью специфических сайтов связывания прочно связывает шесть ионов меди. Синтез церулоплазмина осуществляется не только в печени, но и форменными элементами крови - лимфоцитами и макрофагами. Его синтез активируется при беременности, подавлении овуляции, воспалительных процессах, травмах. Курение ведет к снижению уровня церулоплазмина. Низкие уровни церулоплазмина характерны для новорожденных и детей в возрасте до одного года, поэтому определение его уровня не применимо для ранней диагностики болезни Вильсона-Коновалова. Церулоплазмин относят к белкам острой фазы воспаления. Его концентрация повышается при инфекциях, воспалении и травмах организма в ответ на действие интерферонов и цитокинов.

Референтные значения содержания церулоплазмина в сыворотке крови составляют 180-450 мг/л.

Гепсидин - пептид с молекулярной массой 9,4 кДа, синтезируется в печени. Он был выделен и описан в 2001 г. Гепсидин состоит из 25 аминокислот, богат цистеином, за счет чего в его структуре образуются четыре дисульфидных мостика. Благодаря такому строению он обладает высокой химической реактивностью. Было показано, что гепсидин обладает выраженными антибактериальными свойствами, а также является медиатором воспаления и одним из ключевых регуляторов обмена железа. Его уровень в моче при развитии тяжелой инфекции может повышаться в 100 раз и более. Это и послужило основанием считать гепсидин медиатором врожденного иммунитета. Было обнаружено, что синтез гепсидина может увеличиваться вне зависимости от обмена железа и активности эритропоэза, а именно под действием бактериальных липополисахаридов и провоспалительных цитокинов. Тем самым ограничивается доступ молекулы железа к патогенным микроорганизмам. Гепсидин также является регулятором захвата железа в тонкой кишке и выхода его из депонирующих макрофагов. При дефиците гепсидина наблюдается состояние «перегрузки» железом, а при его повышенном синтезе развивается дефицит железа. Гепсидин также является регулятором, блокирующим транспорт железа к плоду, на плацентарном уровне. Гепсидин, вероятно, подавляет активность цитохром-b-редуктазы (Cybrd1), которая необходима для уменьшения поглощения трехвалентного железа.

Повышенная экспрессия гепсидина приводит к анемии при таких хронических заболеваниях, как ревматоидный артрит, пиелонефрит и др.

Референтные значения содержания гепсидина составляют:

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ОБЕЗВРЕЖИВАНИИ ТОКСИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ

Обезвреживание аммиака

При дезаминировании промежуточных продуктов белкового обмена в различных органах образуется токсичный аммиак, который инактивируется за счет синтеза из него в печени мочевины. Нарушения синтеза мочевины приводят к повышенной концентрации аммиака в крови и, соответственно, к усиленному поступлению его в мозг и, как следствие, развитию печеночной энцефалопатии. Вследствие снижения способности печени обезвреживать аммиак в орнитиновом цикле и глутаминсинтетазной реакции, а также в результате портокавального шунтирования крови развивается гипераммониемия.

Увеличению содержания аммиака в крови способствует ряд факторов, встречающихся при тяжелых поражениях печени. К ним относятся кровотечения в желудочно-кишечном тракте из варикозных расширений вен, что имеет место при портальной гипертензии. Образующийся при распаде белков крови аммиак поступает через портосистемные шунты, минуя печень, в общий ток кровообращения. Аналогичная картина наблюдается и при избытке белков в рационе, в особенности при застое пищевых масс в кишечнике. Наличие гепаторенального синдрома приводит к снижению выведения мочевины из кровотока. Уровень мочевины в крови повышается, в результате чего усиливается ее диффузия в просвет кишечника, в котором уреаза бактерий разлагает ее до аммиака. Далее аммиак через портокавальные шунты возвращается в большой круг кровообращения. Существенное влияние на содержание аммиака в крови оказывает и сдвиг кислотно-основного равновесия в сторону алкалоза. Аммиак находится в организме как в форме газа (NH₃), так и в форме аниона (NH₄ ⁺), их проницаемость для мозга неодинакова. Газообразный аммиак легче проникает в мозг. Превращению аммонийного иона в газообразный аммиак способствует алкалоз:

NH₄ + + ОН^- → NH₃ + Н₂ О.

Аммиак при повышении концентрации в крови проникает через гематоэнцефалический барьер и оказывает нейротоксический эффект прежде всего на астроциты, которые тесно связаны с функционированием нейронов. В астроцитах аммиак обезвреживается в глутаминсинтетазной реакции с образованием глутамина, накопление которого вызывает повышение осмоляльности и отек клеток. В головном мозге цикл мочевины не функционирует, поэтому удаление из него аммиака происходит различными путями. В условиях избытка аммиака запасы глутамата (важного возбуждающего медиатора) истощаются и происходит накопление глутамина. Образование глутамина в астроцитах приводит к оттоку глутамата из малатаспартатного челнока, что влечет за собой снижение синтеза АТФ, которую астроцит не только использует для внутренних энергетических потребностей, но и снабжает ею нейроны. Таким образом, гипераммониемия приводит к гипоэнергетическому состоянию центральной нервной системы.

Наряду с нейротоксическим действием аммиака, в развитии печеночных энцефалопатий принимают участие меркаптан, фенол, жирные кислоты с короткой углеродной цепью, γ-аминомасляная кислота.

Обезвреживание других метаболитов и ксенобиотиков

В процессе жизнедеятельности в организме образуются и поступают в него извне в значительном количестве токсичные продукты различной химической структуры, способные нарушать течение биологических процессов. В большинстве случаев эти ксенобиотики, попадая в организм человека, либо оказывают различные прямые нежелательные эффекты, либо вследствие биотрансформации образуют токсичные метаболиты. В их обезвреживании участвуют различные органы и системы. Самым крупным и важным органом, участвующим в биотрансформации как эндогенных токсичных соединений, так и ксенобиотиков, является печень. В ней метаболизируется до 2/3 общего количества экзогенных химических веществ, поступающих в организм. В печени при функционировании микросомальных оксигеназ из липотропных ксенобиотиков образуются полярные соединения, легко вступающие в реакции конъюгации с образованием более или менее токсичных продуктов, имеющих реактивные группы. Эти метаболиты способны вступать в реакции конъюгации с образованием нетоксичных продуктов с последующим выведением из организма с мочой, желчью и калом.

Для обезвреживания ксенобиотиков и постоянно образующихся в процессе обмена веществ токсичных агентов в организме существуют хорошо изученные детоксикационные механизмы. Обезвреживание токсичных веществ гепатоцитами осуществляется за счет реакций окисления, восстановления, соединения с глюкуроновой и серной кислотами, глицином и глутамином, что приводит к образованию нетоксичных соединений.

В связи с этим понятно и разнообразие химических реакций, способствующих переводу токсических агентов в менее токсичные соединения с последующим удалением из организма (рис. 1-36). Ряд детоксикационных процессов изучен давно и детально. Это характерно для эндогенно образующихся веществ, таких как аммиак, продукты гнилостных процессов, происходящих в толстой кишке. Что же касается все расширяющегося спектра ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов, многие из которых сами оказывают побочное действие на печень, то пути метаболизма многих из них остаются недостаточно изученными.

Биотрансформация в печени ксенобиотиков и эндогенных метаболитов осуществляется преимущественно в две фазы.

I фаза - микросомальное окисление гидрофобных веществ, в ходе которого субстраты подвергаются окислению, восстановлению и гидролизу, приобретают взамен алкильным радикалам новые функционально активные группы (-ОН, -NН₂ или -СООН), которые характеризуются более высокой растворимостью.

II фаза - реакции конъюгации, в ходе которых продукты биотрансформации присоединяются к легкоионизируемым веществам, с которыми они образуют нетоксичные парные соединения. В качестве таких конъюгирующих веществ выступают (табл. 1-6):

Фаза I. В этой фазе процессы биотрансформации происходят в гладком эндоплазматическом ретикулуме печени с участием ФАД-зависимых флавопротеинов (содержащих негеминовое железо), оксидаз со смешанной функцией, цитохромов Р450, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназ, амидаз, эстераз, пероксидаз, эпоксидгидролаз, нитрозо- и нитроредуктаз и др. Большинство этих ферментов не проявляет строгой специфичности в отношении субстратов, что позволяет им легко метаболизировать вещества с различным строением. В то же время механизмы, задействованные при метаболизме различных экзогенных веществ (ксенобиотиков), у разных видов животных и человека существенно отличаются друг от друга из-за отсутствия (присутствия) необходимых для этого ферментов. Основным компонентом микросомальной монооксигеназной системы является цитохром Р450. Ферменты семейства цитохрома Р450 важны в оксидазном, пероксидазном и редукционном метаболизме множества эндогенных веществ, таких как стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, простагландины, лейкотриены, биогенные амины, пептиды и др. Цитохром Р450 представлен большим числом различающихся изоформ, индуцируемых теми или иными соединениями. Цитохром Р450 по своей структуре является гемсодержащим белком. Белок цитохрома Р450 синтезируется на рибосомах шероховатых мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. На 1 г печени человека приходится 10 нмоль цитохрома Р450. Разнообразие форм цитохрома Р450 возникает вследствие синтеза различных белков. Ключевым ферментом синтеза гема цитохрома Р450 является синтаза δ-аминолевулиновой кислоты. Цитохром Р450 - важнейший компонент микросомальной монооксигеназной системы, ответственный за активацию молекулярного кислорода и связывание субстрата.

Считается, что разная чувствительность людей к одной и той же дозе ксенобиотика определяется разным содержанием в печени цитохрома Р450 и различной степенью его сродства к конкретному препарату. Оба эти фактора зависят от генетических особенностей и состояния функции печени.

Следует отметить, что эти же ферменты участвуют в биосинтезе стероидов в организме. При участии ферментов, содержащих цитохром Р450, осуществляется синтез из тирозина адреналина и норадреналина.

Реакции с участием цитохромов Р450 чаще всего связаны с образованием гидроксильных групп (рис. 1-37) в липофильных субстратах за счет водорода НАДФН и протонов Н⁺ :

RН + O₂ + НАДФН + Н⁺ → RОН + Н₂ O + НАДФ⁺ .

В реакциях с участием микросомальных пероксидаз происходит разрушение перекиси водорода и других органических перекисей с образованием воды и спиртов. Эти реакции сопровождаются образованием побочных продуктов, способных окислять различные химические вещества - фенолы, гидрохиноны, полициклические ароматические соединения.

С участием НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы происходит окисление в печени первичных (вторичных) алифатических и ароматических спиртов путем их дегидрирования с образованием соответствующих альдегидов:

RСН₂ ОН + НАД⁺ → RСНО + НАДН + Н+.

Альдегиддегидрогеназа участвует в окислении альдегидов, эпоксидгидролаза - в гидролизе эпоксидных связей, нитрозоредуктаза - в восстановлении группы NО₂ до NН₂ , а нитроредуктазы - нитратов и нитритов. Эстеразы осуществляют гидролиз эфиров различного строения, например эфиров холина, фосфорной кислоты.

Фаза II. После преобразования эндогенных и чужеродных токсичных веществ с помощью микросомальных ферментов большая часть продуктов фазы I происходит в дальнейшем окончательную доработку через фазу II. Здесь биотрансформанты фазы I связываются с 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфатом, УДФ-глюкуроновой кислотой (рис. 1-38) и другими конъюгирующими веществами и уже в виде парных соединений выводятся из организма с мочой.

Наиболее важными из перечисленных выше конъюгирующих веществ являются глюкуроновые кислоты. С их помощью образуются конъюгаты за счет связывания с различными функциональными группами, включая карбоксильные, аминные, спиртовые и тиоловые группы. Образованные таким образом парные соединения являются нетоксичными и достаточно легко удаляются из организма с помощью активного или пассивного транспорта из клеток. Совсем недавно было обнаружено, что некоторые лекарственные вещества могут образовывать конъюгаты с глюкозой (с участием глюкозилтрансферазы), которые быстро и легко могут быть удалены из организма. В отношении этих ферментных систем известно немного.

Механизмом их обезвреживания является образование парных соединений (конъюгатов). В качестве компонента, вступающего в реакцию с токсичным агентом, чаще всего участвуют серная и глюкуроновая кислоты, аминокислота глицин. Примером такого механизма может служить образование фенолглюкуроновой (рис. 1-39), фенолсерной, крезолсерной и индоксилсерной (рис. 1-40) кислот - результат обезвреживания продуктов гниения белков в кишечнике, когда из циклических аминокислот образуются фенол, крезол, скатол, индол.

Бензойная кислота образует конъюгаты с глицином, при этом получается гиппуровая кислота (рис. 1-41). Данная реакция длительное время использовалась для оценки детоксикационной способности печени (проба Квика).

Особое место среди ферментов, участвующих в обезвреживании ксенобиотиков, нормальных метаболитов и лекарств, занимают глутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18) - семейство мультифункциональных белков, которые участвуют в метаболизме гидрофобных веществ, используя для этого восстановленный глутатион (GSH). Известно множество изоферментов глутатионтрансферазы с различной субстратной специфичностью. GSH - это трипептид Глу-Цис-Гли (остаток глутаминовой кислоты присоединен к цистеину карбоксильной группой радикала) (рис. 1-42).

Глутатионтрансферазы - универсальные ферменты, функционирующие у всех животных и человека и имеющиеся во всех тканях. Эти ферменты играют важную роль в обезвреживании собственных метаболитов: некоторых стероидных гормонов, простагландинов, билирубина, желчных кислот, продуктов ПОЛ. Обезвреживание ксенобиотиков с участием глутатионтрансфераз происходит тремя путями:

Обезвреживание ксенобиотиков с участием цитохрома Р450 иногда приводит к образованию не менее, а более токсичных метаболитов, чем исходные соединения. Эти токсичные вещества обезвреживаются глутатионтрансферазами. Глутатионтрансфераза - индуцируемый фермент.

Механизмы детоксикации эндогенных метаболитов, осуществляемые в две фазы, демонстрируют следующие примеры:

Печень является основным, хотя и не единственным, органом метаболизма различных ксенобиотиков, в том числе и лекарственных препаратов. В связи с различиями химической структуры многочисленных групп чужеродных для организма веществ (в том числе лекарств), обладающих в некоторых случаях токсическим действием, невозможно предположить какой-то единый механизм их детоксикации. По сути, он заключается в биотрансформации ксенобиотика и последующей экскреции его метаболита.

В синтетических реакциях исходное вещество или его метаболит, так же как и при превращении эндогенных соединений, образуют серные, глутатионовые и глюкуронидные конъюгаты, которые из печени могут выделяться с желчью в кишечник, подвергаться там дальнейшей биотрансформации, реабсорбироваться в кровь и вновь поступать в печень. Затем эти соединения выделяются с мочой или повторно поступают с желчью в кишечник и выделяются с калом. По этому пути идет метаболизм салициловой кислоты, морфина, левомицетина, мепробамата. При соединении с глицином конъюгаты в большей степени выделяются с мочой, чем с желчью.

Сульфаниламиды, гидралазин, изониазид, прокаинамид в процессе метаболизма подвергаются ацетилированию.

Ряд лекарственных препаратов в печени метилируется. К ним относятся, в частности, никотиновая кислота и тиоурацил.

К веществам, которые метаболизируются путем несинтетических реакций, относятся такие препараты, как психостимулятор амфетамин, антидепрессант имипрамин, фенобарбитал, фенитоин, прокаинамид, хинидин, варфарин и др.

Ряд лекарственных препаратов индуцирует собственный метаболизм. Однако в связи с неспецифическим характером индукционного эффекта могут происходить изменения свойств других лекарств, поступивших в организм. К препаратам, обладающим индукторным эффектом, относятся, например, алкоголь, фенобарбитал, бензодиазепины. Например, такой противоязвенный препарат, как циметидин, ингибирует реакции, протекающие при участии цитохрома Р450. Это также изменяет метаболизм других лекарственных веществ в печени. Подобными свойствами обладает и левомицетин.

Активность микросомальных ферментов зависит от возраста. В раннем постнатальном периоде эти ферментативные системы слабо развиты, что должно учитываться при назначении, например, таких лекарственных препаратов, как левомицетин, фенацетин, гексобарбитал. Снижается интенсивность метаболизма некоторых препаратов у пожилых людей.

Экскреция собственно препаратов или их метаболитов происходит в основном с мочой, а также с желчью в процессе активной секреции, то есть против градиента концентрации. Так, с желчью выделяются некоторые антибиотики - левомицетин, рифампицин, эритромицин, блокаторы медленных кальциевых каналов - лацидипин, нимодипин и нитрендипин, а также ряд противотуберкулезных препаратов, например ципрофлоксацин.

Суммируя все сказанное, нужно отметить, что в механизмах детоксикации остается еще много неясного.

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ПОДДЕРЖАНИИ КИСЛОТНО-ОСНОВНОГО СОСТОЯНИЯ И ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО ОБМЕНА

Определенный вклад печень вносит в регуляцию КОС. В печени происходит окисление недоокисленных продуктов и образование из аммиака мочевины, а с желчью печень выделяет избыток кислых или основных продуктов.

При синтезе мочевины, наряду с ионами аммония, также используются ионы бикарбоната и синтезируемый в печени, транспортируемый к почкам глутамин. Глутамин при участии глутаминазы печени в виде ионов аммония выводится в мочу в обмен на протоны водорода. Таким образом, посредством изменения скорости синтеза глютамина печень в состоянии стабилизировать значение рН.

При метаболическом ацидозе в печени понижается скорость синтеза мочевины, в ней снижается уровень бикарбоната. Скорость синтеза глутамина в печени повышается, транспортируемый к почкам глутамин отдает больше ионов аммония и, следовательно, протонов в мочу. При метаболическом алкалозе необратимо повышается синтез мочевины, расходуется больше бикарбоната. Напротив, вследствие уменьшенного синтеза глутамина в печени почки уменьшают подачу глутамина для выведения ионов аммония в мочу.

Велико значение печени для общего водного баланса организма. Печень - мощное депо воды, способное задержать значительное количество избыточной воды. А благодаря синтезу альбуминов печень обусловливает коллоидно-осмотическое равновесие крови, одновременно регулируемое калий-натриевым балансом крови.

БАРЬЕРНАЯ ФУНКЦИЯ ПЕЧЕНИ

Более 90% фагоцитарного комплекса ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) локализовано в клетках печени. РЭС в печени - это внутрисосудистая фагоцитарная система или «центральный васкулярный фильтр», состоящий из клеток Купфера, так называемых звездчатых клеток и эндотелиальных клеток синусоидов печени. Эти клетки участвуют в фагоцитозе и защищают печеночные клетки от многих токсических влияний; они часто содержат фрагменты эритроцитов, микроорганизмы и пигментированные гранулы, появляющиеся в результате разложения гемоглобина. Благодаря своим многочисленным функциям они являются уникальным барьером, выполняющим функцию защиты не только от бактерий, токсических агентов, но и от ряда других факторов, в том числе от иммунологических. РЭС печени поглощает денатурированные белки, корпускулярные и коллоидные частицы, поврежденные компоненты аутолизированных тканей, тромбоциты, эритроциты, иммунные комплексы, опухолевые клетки, микроагрегаты фибрина, бактерии и токсины. Печень инактивирует и выводит из организма лекарственные препараты, гормоны и вредные вещества: индол, скатол, фенол, алкоголь. Способность клеток РЭС печени выводить из кровотока чужеродные вещества обусловлена их размерами и концентрацией, функциональным состоянием и количеством макрофагов, наличием опсонинов (иммуноглобулины, фрагменты комплемента, фибронектин), характером синусоидального кровотока.

В эмбриональном периоде печени плода свойственна функция кроветворения, так как она вырабатывает эритроциты.

Завершая первую главу, следует отметить, что в организме, по сути, нет путей обмена веществ, которые прямо или косвенно не контролировались бы печенью. По некоторым оценкам, печень выполняет до 500 различных метаболических функций, причем все или почти все из этих функций выполняются клетками ее паренхимы - гепатоцитами.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ПРОБЛЕМЫ ГЕПАТОИММУНОЛОГИИ

Клетки, относящиеся к врожденному иммунитету (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, а также клетки-киллеры), распознают общие структуры инфекционных агентов и многие рецепторные структуры, экспрессируемые инфицированными и опухолевыми клетками. Распознавание молекул опасности клеточными факторами врожденного иммунитета сопровождается выделением хемокинов, которые направляют эффекторные клетки в очаг воспаления. В элиминации патогенов принимают участие клетки моноцитарно-фагоцитарной системы, цитотоксические клетки, цитокины, белки острой фазы и белки системы комплемента.

Активация адаптивных механизмов иммунной системы в первую очередь связана с Т- и В-лимфоцитами. Т-клетки экспрессируют клонотипичные рецепторы, которые распознают пептидные фрагменты белковых антигенов, представленных в сайте молекулы главного комплекса гистосовместимости антигенпрезентирующими клетками. Активация наивных Т-лимфоцитов связана с получением сигнала от Т-клеточного рецептора (TCR, T-cell receptor). Это первый сигнал активации. Второй сигнал, необходимый для полноценной активации Т-лимфоцита, производят костимулирующие молекулы. После этого лимфоцит способен осуществлять эффекторные функции.

Адаптивный иммунный ответ может развиваться как клеточно-опосредованный. Его развитие обеспечивают Т-хелперы 1-го типа (Th1), цитотоксические лимфоциты, натуральные киллеры. Или же как гуморальный иммунный ответ с преимущественным синтезом моноспецифичных антител, который обеспечивают Т-хелперы 2-го типа (Th2) и В-лимфоциты. Продуцируемые антитела нейтрализуют токсины, вирусы, опсонизируют бактерии для фагоцитоза, активируют систему комплемента.

Дифференциация Thl- и Th2-клеток, осуществляющих развитие эффекторных функций адаптивного иммунного ответа, а также супрессия иммунных реакций контролируются цитокинами, продуцируемыми регуляторными Т-клетками.

Факторы и механизмы врожденного и адаптивного иммунитета взаимодействуют и регулируют активность друг друга. Дендритные клетки и макрофаги являются центральными клеточными факторами как для развития врожденных, так и адаптивных иммунных реакций. Некоторые Т- и В-лимфоциты осуществляют развитие своих функций как клетки, относящиеся к врожденному иммунитету.

Врожденный иммунитет в поддержании иммунного гомеостаза

Эволюция стратегии защиты начала совершенствоваться с появлением многоклеточных организмов. Она связана в первую очередь с эффекторными клетками, такими как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и естественные киллеры (NK-клетки), лимфоциты и широко специализированные системы детекции, включающие клеточно-поверхностные молекулы, которые обнаруживают общие структуры на инфекционных агентах или изменения в клетках хозяина. Такие рецепторы распознавания образов (паттернраспознающие рецепторы - PRR) включают толл-подобные рецепторы, которые распознают общие компоненты микроорганизмов (липополисахариды, липопротеины, гликолипиды, флагеллин и бактериальную ДНК), а также эндогенные лиганды (белки теплового шока и др.). Экспрессия этих молекул инициирует активацию моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и/или дендритных клеток, результатом чего является гибель инфицированной или опухолевой клетки с помощью фагоцитоза или действия цитотоксических факторов.

Второй вид системы обнаружения и нейтрализации объектов опасности факторами врожденного иммунитета связан с экспрессией рецепторов на NK-клетках, которые распознают клеточные изменения, что указывает на опасность такого рода инфекции или трансформации опухоли. Такие «естественные рецепторы цитотоксичности» включают NKG2D, которые распознают стресс-индуцируемые молекулы: MICA, экспрессируемые опухолевыми и вирусинфицированными клетками; NKp46, распознающий вирусный гемагглютинин. Активация этих рецепторов приводит к немедленной гибели инфицированной или опухолевой клетки. NK-клетки также экспрессируют стимулирующие и ингибирующие рецепторы (ингибирующие рецепторы естественных киллеров - KIR и CD94 у людей; Ly49 - у мышей), обнаруживающие изменения в уровнях главного комплекса гистосовместимости молекул I класса, которые происходят при патологическом синтезе белка во время трансформации или вирусной инфекции.

Иммунное воспаление

Воспаление - общий термин, характеризующий активность иммунной системы в ответ на сигналы «опасности». Этот процесс инициируется различными полипептидными химическими мессенджерами, выделяемыми активированными клетками, относящимися к врожденной системе иммунитета, инфицированными и опухолевыми клетками. Эти химические «посыльные» включают хемокины (макрофагальный провоспалительный белок-α, IL-8) и регулирующие активацию и пролиферацию Т-клеток и секрецию цитокинов - RANTES: грануло-цитарно-моноцитарно-колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), интерлейкины (IL-1, IL-6, IL-12, IL-18) и интерфероны (IFNα и IFNβ), которые быстро диффундируют через ткани в кровоток.

Ключевой функцией этой деятельности является «вербовка» дополнительных воспалительных клеток с эффекторными функциями из других участков иммунной системы. Хемокины направляют моноциты, нейтрофилы и лимфоциты, несущие соответствующие рецепторы, к месту инфекции. Цитокины активируют синтез и высвобождение растворимых антимикробных агентов, таких как комплемент и белки острой фазы (С-реактивный белок и др.). Цитокины также стимулируют рост, дифференцировку и активацию эффекторных клеток врожденного иммунитета. Результатом этого является целенаправленный, эффективный ряд изменений. Так, нейтрофилы и макрофаги захватывают и уничтожают бактерии путем фагоцитоза. NK-клетки вызывают гибель инфицированных и опухолевых клеток в результате индукции апоптоза. Белки острой фазы и комплемента опсонизируют бактерии, «помечая» их для абсорбции и фагоцитоза. Интерфероны нарушают вирусную репродукцию. Эти эффекторные функции продолжаются до тех пор, пока инфицированные или опухолевые клетки не будут разрушены и элиминированы из макроорганизма. Следствием является активация таких противовоспалительных цитокинов, как IL-10 и TGFβ. Они снижают активность механизмов врожденного иммунного ответа и способствуют восстановлению тканей, ремоделированию ферментов и белков. В отдельных ситуациях эти иммунные эффекторные функции могут быть нарушены. Результатом такого неэффективного хронического иммунного воспаления может быть появление постоянных рубцов, повреждение тканей (ревматоидный артрит, фиброз и цирроз при хроническом гепатите).

Механизмы врожденного иммунитета активируются в течение нескольких секунд после получения сигнала «опасности». Вероятно, такие механизмы могут развиваться в любом участке макроорганизма для поддержания иммунного гомеостаза. Кроме того, возможно, что в местах с высокой концентрацией клеток с эффекторными функциями (желудочно-кишечный тракт, печень) могут развиваться неадекватные по силе иммунные реакции, итогом которых могут быть различные мутации. Тем не менее определить, когда, как часто и в каких тканях подобные воспалительные реакции будут развиваться, по-прежнему весьма затруднительно.

Адаптивный иммунитет

Если микроорганизм или опухоль способны обойти механизмы врожденного иммунитета, создать пороговый уровень чужеродных антигенов, то тогда первичное иммунное воспаление становится неэффективным, приводя к активации факторы и механизмы адаптивного иммунитета. Первый и наиболее важный шаг - активация Т-лимфоцитов. Наивный антигеннестимулированный Т-лимфоцит циркулирует в крови, периферических лимфоидных органах и тканях в роли малого Т-лимфоцита с уплотненным хроматином, несколькими органеллами и минимальной метаболической и транскрипционной активностью. В этом неактивном состоянии Т-лимфоциты остаются до тех пор, пока не встретятся с чужеродными (инфекционными) антигенами в периферических лимфоидных тканях. Распознавание антигена Т-лимфоцитами сопровождается их пролиферацией и дифференцировкой в эффекторные Т-лимфоциты, способные отвечать на сигналы «опасности».

Распознавание антигена Т-лимфоцитами

Наивные Т-лимфоциты могут активироваться только «профессиональными» антигенпредставляющими клетками (АПК), которые способны захватывать, обрабатывать и экспрессировать антиген на их клеточную поверхность. Эти функции выполняют дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты. Дендритные клетки имеют дополнительную способность транспортировать антигены к богатым Т-лимфоцитами тканям. АПК расщепляют белки антигенов до коротких пептидов и экспрессируют их на собственной клеточной поверхности в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC, от англ. major histocompatibility complex). Молекулы MHC высокополиморфны. Они могут экспрессировать широкий спектр различных пептидов. Т-клетки распознают комплексы пептид-МНС с помощью высокоспециализированных клонотипичных Т-клеточных рецепторов (TCR). Во время созревания Т-клеток большое разнообразие TCR появляется вследствие перестройки нескольких зародышевых генных сегментов, которые кодируют разные участки молекул. Это является следствием добавления нуклеотидов и гипермутации генов рецептора для антигенов в положениях, которые генерируют дополнительные разнообразия в сайтах этих антигенраспознающих молекул. Таким образом, Т-клетки способны распознавать большое количество антигенных специфичностей (до 10¹⁶ возможных антигенных детерминант TCR), обеспечивая иммунную систему огромным количеством антигенспецифических эффекторных клеток. Хотя их число значительно снижается в результате удаления Т-клеток либо появления TCR, которые не могут распознать свои молекулы МНС (положительная селекция), или тех TCR, которые являются потенциально аутореактивными (отрицательная селекция). Процессы положительной и отрицательной селекции происходят во время созревания Т-клеток в тимусе.

Активация Т-лимфоцитов

Различные популяции и субпопуляции Т-клеток распознают антигены внутри- и внеклеточно паразитирующих микроорганизмов. Пептиды, полученные из эндогенно синтезированных антигенов, таких как собственные белки или вирусные пептиды (в инфицированных клетках), в эндоплазматическом ретикулуме загружаются в сайт молекулы МНС I класса и экспрессируются на поверхности АПК для презентации CD8⁺ Т-клеткам. Они, как правило, убивают зараженные или опухолевые клетки с помощью Fas- или гранзим-опосредованной индукции апоптоза и продукции IFNγ, что нарушает вирусную репликацию. Пептиды (антигены), полученные из внеклеточно паразитирующих микроорганизмов, перерабатываются АПК, загружаются в сайты молекул МНС II класса для представления CD4⁺ Т-клеткам, которые, в свою очередь, активируют другие клетки адаптивного иммунного ответа.

Участие T-клеточного рецептора с помощью пептидных/МНС комплексов в отсутствие дополнительных сигналов является недостаточным для активации наивных Т-клеток. Вместо этого он вызывает инактивацию Т-клеток - процесс, известный как анергия, который защищает от нежелательных иммунных реакций против аутоантигенов. Полная активация наивной Т-клетки требует одновременного участия нескольких вспомогательных (адгезионных) молекул Т-лимфоцита с соответствующими ко-стимулирующими молекулами AПК, которые индуцируют сигналы опасности от врожденной иммунной системы. Молекулы В7 (семейство молекул CD80, CD86) и B7-гомологи AПК трансдуцируют ко-стимулирующие сигналы Т-клеток посредством CD28 и индуцибельных ко-стимуляторных рецепторов (ICOS). Кроме того, CD40 на АПК взаимодействует со своим лигандом Т-клеток - CD154, регулирующим экспрессию B7. К тому же неспецифические взаимодействия между молекулами адгезии на AПК и Т-лимфоцитами укрепляют физическую связь между этими клетками. Если взаимодействие между T-клеточным рецептором и пептидом/МНС сохраняется в течение необходимого порогового времени, наивные Т-клетки активируются и подвергаются клональной пролиферации и дифференцировке в эффекторные Т-клетки. Полная активация наивных Т-клеток занимает 4-5 дней и сопровождается изменениями в клеточной поверхности молекул адгезии, что направляет эффекторные Т-клетки от лимфоидной ткани в места инфекции или опасности на периферии. Эффекторные Т-клетки сохраняют способность в последующем реагировать различными способами с теми же белками МНС отдельно, без необходимости в ко-стимулирующих эффектах.

Эффекторные функции адаптивного иммунитета

Дифференцировка наивных Т-клеток в функциональные эффекторные клетки управляется сигналами от врожденной иммунной системы. Продукция IL-12 и IL-18 макрофагами, дендритными клетками и IFNγ- NK-клетками способствует развитию CD8⁺ цитотоксических Т-клеток и CD4⁺ Т-хелперов 1-го типа (Th1). Продукция IL-4 и IL-6 стимулирует развитие CD4⁺ Th2-клеток. Дифференцировка Т-лимфоцитов в Th1-клетки в основном индуцируется вирусами и внутриклеточными бактериями, в то время как дифференцировка в Th2-клетки - аллергенами и гельминтами. Th1-клетки секретируют IFNγ и TNFα и активируют макрофаги. Они также обеспечивают вспомогательную функцию для синтеза В-лимфоцитами комплементсвязывающих и вируснейтрализующих антител изотипа IgG2a у мышей. В противоположность этому Th2-клетки секретируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13 и как истинные хелперы обеспечивают синтез В-лимфоцитами IgE, IgA, IgGl. Третья популяция CD4⁺ Т-клеток с регулирующей функцией называется Th3-клетки - T-регуляторные 1 клетки (Tr1), секретирующие IL-10 и TGFβ. Они подавляют функциональную активность Th1-клеток, вовлечены в поддержание иммунологической толерантности слизистых оболочек. Иммуноглобулиновые рецепторы кодируются наборами генов, реконструирующими сегменты, и, таким образом, обеспечивают большое разнообразие и специфичность TCR в отношении антигенов. Антитела, секретируемые в растворимой форме, могут нейтрализовать токсины и вирусы, опсонизировать патогены для их фагоцитоза макрофагами и нейтрофилами, усиливают цитотоксичность NK-клеток и способствуют выделению вазоактивных аминов тучными клетками и базофилами. Антитела могут также активировать комплемент по классическому пути для лизиса бактерий. Антитела, секретируемые В-лимфоцитами, могут специфически присоединять антигены, что приводит к их интернализации и презентации Т-клеткам. Действие адаптивных иммунных реакций нивелируется противовоспалительными цитокинами, такими как TGFβ и IL-10, которые могут секретироваться рядом AПК и антигенспецифическими Т-клетками (регуляторными Т-лимфоцитами). Эти цитокины ингибируют и подавляют воспалительные эффекты и инициируют восстановление тканей. Результатом иммунных реакций Т- и В-лимфоцитов является образование антигенспецифических клеток памяти, которые гораздо быстрее реализуют индукцию специфических иммунных реакций при повторной встрече с антигеном.

Взаимодействие и взаимозависимость врожденной и адаптивной иммунной системы

До недавнего времени врожденный и адаптивный иммунитеты считались двумя независимыми, почти взаимоисключающими системами. Тем не менее врожденный иммунитет и адаптивный иммунитет находятся в непрерывном диалоге, в котором они дополняют друг друга. Макрофаги и дендритные клетки врожденного иммунного ответа действуют как AПК для Т-лимфоцитов в инициации адаптивного иммунного ответа. Селективная дифференцировка наивных Т-клеток в Thl-, Th2- или Th3-клетки контролируется сигналами клеток врожденного иммунитета. Дендритные клетки захватывают антигены в тканях и мигрируют в лимфатические узлы, где они выступают в качестве АПК для активации Т-клеток. Последние данные показали, что дендритные клетки способны направлять Т-клеточное созревание и дифференцировку на отдельные Т-клеточные подтипы. Природа антигена влияет на структуру цитокинов, секретируемых дендритными клетками, которые, в свою очередь, и определяют тип Т-клеток. Секреция IL-12 и IL-18 дендритными клетками стимулирует индукцию Th1-клеток, в то время как IL-10 стимулирует дифференцировку Th0-клеток в Th2-клетки. Последние данные свидетельствуют, что взаимодействие паттернраспознающих рецепторов с незрелыми дендритными клетками может привести к их созреванию в одном из двух ингибирующих подтипов дендритных клеток: дендритные клетки 1 или дендритные клетки 2, которые способствуют развитию иммунного ответа по Th1-или Th2-типу. NK-клетки так же могут регулировать Th1- или Тh2-дифференцировку клеток путем селективной продукции IFNγ или IL-5.

В дополнение к перекрестному взаимодействию между клетками врожденного и адаптивного иммунитета многие клетки адаптивной иммунной системы вовлечены в распознавание антигена и в развитие эффекторных механизмов, которые характерны для врожденного иммунитета. Некоторые из субпопуляций Т-лимфоцитов распознают небелковые антигены, которые не подлежат антигенному дрейфу и поэтому относительно консервативны. T-киллеры (NKТ) имеют TCR, который распознает гликолипидные антигены, представленные неклассическими антигенпрезентирующими молекулами CDl. γδT-клетки могут напрямую узнавать небольшие молекулы-метаболиты (пирофосфаты, тимидиновые метаболиты, алкиламины и гликопротеины) и стресс-индуцибельные белки (неклассические молекулы MHC I класса и белки теплового шока) без участия молекул МНС. γδТ-клетки могут также узнавать гликолипидные антигены, представленные CDl. После активации NKТ-клетки и γδТ-клетки могут быстро разрушать опухолевые клетки и регулировать дифференцировку Th1/Th2 с помощью селективной продукции IFNγ или IL-4. NK-клетки являются связующим звеном между механизмами врожденного и приобретенного иммунитета. Они избирательно секретируют цитокины, способствуя Th1- или Th2-ответу. Типичный иммунный ответ на патогенную или злокачественную клетку не будет реализован исключительно врожденной или адаптивной иммунной системой. Скорее, это сочетание активированных врожденных и адаптивных механизмов, обеспечивающих нейтрализацию наиболее угрожающих антигенов.

Кластеры дифференциации антигенов

CD1 - MHC I класса, липидные молекулы, экспрессируемые АПК и другими клетками.

CD2 - адгезионная/ко-стимулирующая молекула, экспрессируемая Т-лимфоцитами, NK-клетками.

CD3 - TCR-ассоциированный молекулярный комплекс, необходимый для TCR-опосредованной передачи сигнала.

CD4 - ко-рецептор для МНС II класса Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов.

CD8 - ко-рецептор для МНС I класса Т-лимфоцитов и некоторые NK-клетки.

CD11 - семейство адгезионных молекул лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов и макрофагов.

CD14 - рецептор для липополисахаридных антигенов и других молекул, экспрессируемых дендритными клетками и макрофагами.

CD16 - иммуноглобулиновый Fc-рецептор, экспрессируемый нейтрофилами, макрофагами и NK-клетками.

CD18 - адгезионная молекула лейкоцитов, ассоциированная с CD11.

CD19 - ко-стимулирующая молекула В-лимфоцитов.

CD20 - ко-стимулирующая молекула В-лимфоцитов.

CD25 - высокоаффинный рецептор IL-2, экспрессируемый активированными Т- и В-лимфоцитами, моноцитами.

CD28 - рецептор неактивированных Т-лимфоцитов для ко-стимулирующих молекул CD80 и CD86.

CD34 - адгезионная молекула гемопоэтических предшественников.

CD35 - рецептор большинства лейкоцитов.

CD40 - рецептор В-лимфоцитов для ко-стимулирующей молекулы CD154.

CD44 - адгезионная молекула лейкоцитов.

CD45 - сигнальная молекула, которая значительно усиливает проведение сигналов через Т-клеточные и В-клеточные антигенные рецепторы.

CD49 - семейство адгезионных молекул лейкоцитов.

CD50 - семейство адгезионных молекул лейкоцитов.

CD54 - семейство адгезионных молекул гемопоэтических клеток.

CD56 - адгезионная молекула NK-клеток.

CD58 - адгезионная молекула гемопоэтических клеток.

CD64 - иммуноглобулиновый Fc-рецептор, экспрессируемый моноцитами, макрофагами.

CD69 - лектин с неизвестной функцией, экспрессируемый активированными Т- и В-клетками, NK-клетками и макрофагами.

CD74 - МНС II класса, шаперон молекул, экспрессируемый АПК.

CD79 - В-клеточный антиген рецепторсвязанный молекулярный комплекс, необходимый для Ig-опосредованной сигнальной трансдукции.

CD80 - ко-стимулирующая молекула АПК. CD81 - ко-рецептор В-лимфоцитов.

CD86 - ко-стимулирующая молекула АПК.

CD94 - стимулирующий/ингибирующий рецептор для HLA-E, находится на NK-клетках и некоторых Т-клетках.

CD95 - апоптозиндуцирующая молекула, найдена на самых разнообразных клетках (Fas).

CD102 - адгезионная молекула, экспрессируемая неактивированными лимфоцитами, моноцитами и эндотелиальными клетками.

CD106 - адгезионная молекула эндотелиальных клеток.

CD116 - рецептор для гранулоцитов-макрофагов, колониестимулирующий фактор миелоидных клеток.

CD117 - рецептор для стволового клеточного фактора, найден на предшественниках гемопоэтических клеток.

CD119 - рецептор IFNγ на макрофагах, моноцитах и В-лимфоцитах.

CD120 - рецепторы TNFα и TNFβ многих типов клеток.

CD121 - рецептор IL-1 на Т-, В-лимфоцитах и моноцитах.

CD122 - рецептор IL-2 β-цепи NK-клеток, некоторых Т- и В-лимфоцитов.

CD124 - рецептор IL-4 зрелых Т- и В-лимфоцитов.

CD125 - рецептор IL-5 эозинофилов, базофилов и активированных В-лимфоцитов.

CD132 - общая γ-цепь рецептора для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15.

CD134 - ко-стимулирующая молекула активированных Т-лимфоцитов.

CD154 - ко-стимулирующая молекула В-лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов.

CD158 - стимулирующий/ингибирующий рецептор (KIR) NK-клеток.

CD161 - ко-стимулирующая молекула NK-клеток и некоторых Т-лимфоцитов.

ИММУНОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ

Гепатоиммунология является быстро развивающимся направлением, в котором пересекаются специальности «Гепатология» и «Клиническая иммунология». Понятие «лимфоидная печень» обеспечивает структурное обоснование для гепатоиммунологии. Клетки печени включают функционально уникальные синусоидальные эпителиальные клетки, клетки с дополнительной иммунной функцией (клетки Купфера, NK-клетки, эпителиальные клетки желчных путей) и внутрипеченочно мигрирующие Т- и В-лимфоциты. Печень обеспечивает частично толерогенную среду по причине конструктивных особенностей, этим объясняется позитивное отношение к аллотрансплантатам печени. Вопросы иммунологии печени тесным образом связаны с механизмами апоптоза. Это способствует клеточному ремоделированию и обновлению печени и желчной системы в результате элиминирования апоптотических гепатоцитов и рекрутированных Т-лимфоцитов после завершенных иммунных реакций. Хроническая инфекция с персистирующими вирусами гепатита В или С (HBV, HCV) отражает изначально неэффективный иммунный ответ гепатоцитов, экспрессирующих вирусные антигены, что приводит к нарушению иммунного гомеостаза. Аутоиммунный гепатит возникает в трех серологических и клинических подтипах.

Первичный билиарный цирроз характеризуется многообразием иммунологических реакций, инициированных митохондриальным антигеном (PDC-E2), с облитерацией желчных протоков и с развитием антиядерных реакций примерно в 50% случаев.

Гепатопатии, связанные с лекарственными препаратами, обычно иммуноопосредованы антигенными продуктами, полученными в результате детоксикации ферментной системой (цитохром P450, глюкуронилтрансфераза), конъюгированной с реактивным метаболитом препарата, или в результате неустановленного эффекта некоторых препаратов на механизмы периферической толерантности.

Печень является уникальным лимфоидным органом, в котором развиваются механизмы как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. Кроме того, печень - это место воспалительных ответов различного происхождения. Именно поэтому гепатоиммунология характеризует как физиологические свойства лимфоидной печени, так и различные иммунопатологические реакции, поражающие этот орган (иммунно-ускользающий гепатотропный вирус, аутоиммунные воспалительные заболевания; реакции, вызванные компонентами клеток печени, измененных под действием лекарственных препаратов и др.).

Структурные элементы лимфоидной ткани печени

Метаболические и выделительные функции печени зависят от состояния печеночной паренхимы и желчных протоков, которые составляют 70-80% всех клеток печени; остальные 20-30% в основном выполняют иммунологические функции. Печень имеет две анатомические дискретные области: паренхима и портальные тракты. 20-30% непаренхиматозных клеток печени содержат синусоидальные эпителиальные клетки (50%) с остатком, состоящим из резидентов и нерезидентов фагоцитов врожденной иммунной системы (клетки Купфера, дендритные клетки), NK-клеток, NKT-клеток и мигрировавших T- и В-лимфоцитов адаптивной иммунной системы. Среднее количество внутрипеченочных лимфоцитов (intrahepatic lymphocyte, IHL) из печеночных проб от людей и мышей близко по значениям (10⁶ на 1 мг). Популяции же различных лимфоцитов в печени человека составляют 10⁹ -10¹⁰ клеток. Они значительно отличаются от находящихся в крови и лимфатических узлах различных лимфоцитов.

Печеночные синусоидальные эндотелиальные клетки

Печеночные синусоидальные эндотелиальные клетки (LSEC, от англ. liver sinusoidal endothelial cells) - полифункциональные клетки. Эти клетки обеспечивают биофильтрацию между синусоидальной кровью и плазмой в пространстве Диссе, действуя в качестве поглотителя клеток, секретируя цитокины и экспрессируя конститутивные молекулы клеточной адгезии (CAM), включая CD54 (ICAM-1), CD102 (ICAM-2) и CD58 (LFA-3) или индуцированные молекулы сосудистой клеточной адгезии (VCAM-1). Экспрессия IСАМ позволяет LSEC избирательно контактировать с CD8⁺ Т-клетками, которые находятся в постактивации, а не в состоянии покоя, например, когда печень элиминирует Т-лимфоциты после завершенного иммунного ответа. Кроме того, в отличие от других сосудистых эндотелиальных клеток, LSEC могут функционировать в качестве АПК без необходимости в предварительной стимуляции цитокинами, а также могут участвовать в механизмах кросс-презентации экзогенного антигена CD8-клеткам.

Дополнительные иммунные клетки

Клетки Купфера - это мобильные макрофаги, которые взаимодействуют с LSEC и могут быть активированы эндогенными сигналами, преимущественно бактериальными липополисахаридами (ЛПС) и суперантигенами с последующей секрецией белков острой фазы и провоспалительных цитокинов. Это, в свою очередь, необходимо для активации NK- и NKT-клеток. В результате воздействия вазоактивных аминов звездчатые клетки в субэндотелиальном пространстве Диссе синтезируют внеклеточные матричные белки, активируют фиброгенез, который инициирует архитектурную деструкцию, типичную для цирроза.

Эпителиальные клетки (BEC), которые выстилают внутрипеченочные и внепеченочные желчные протоки, влияют на ток желчи из печени в кишечник. Собственно, желчь и эпителий выполняют иммунологические функции. В желчи, как и в слизистом секрете, содержатся иммуноглобулины (Ig) и частично секреторный IgA. Секретированные эпителиальными клетками хемокины и цитокины способствуют экспрессии ко-стимулирующих молекул клеточной адгезии (CD40) и, таким образом, могут выполнять функции AПК.

Внутрипеченочные лимфоциты

Внутрипеченочные лимфоциты (IHL) представляют собой разнородную популяцию клеток. В печени много естественных киллеров (NK-клеток около 31%), а также Т-киллеров - NKT-клеток, которые обеспечивают развитие механизмов врожденного иммунного ответа на внутриклеточно паразитирующие микроорганизмы с использованием антителозависимой клеточной цитотоксичности, продукции провоспалительных цитокинов и элиминирования зараженных и злокачественных клеток.

Т-лимфоциты с рецепторами CD3 включают субпопуляции NKT-лимфоцитов, которые экспрессируют CD56 или CD57 - маркеры NK-клеток, лимфоциты с фенотипами CD4 и CD8. Т-клетки с γδ-рецептором, дважды отрицательные Т-лимфоциты CD4^- CD8^- и гомодимерные CD8⁺ Т-клетки, экспрессирующие только α-цепь ТCR.

Многофункциональная субпопуляция NKT-лимфоцитов привлекает особенный интерес. Они обладают высокой способностью к секреции цитокинов и, в частности IL-4, обладают функциями лимфокин-активированных «киллеров» и регулирующими эффектами на иммунные реакции. Например, у мыши с диабетом, вызванным не ожирением, истощение субпопуляции NKT-клеток ускоряет проявление аутоиммунных реакций. Т-клетки с относительно инвариантным γδ-рецептором насчитывают около 35% лимфоцитов с TCR⁺. Они могут обеспечивать основную защиту от чужеродных антигенов микрофлоры кишечника, а также регулировать интенсивность и направленность иммунологических реакций. По сравнению с кровью и другими лимфоидными тканями доля обычных Т-клеток с αβ-цепями TCR в печени ниже, и соотношение CD4:CD8 восстанавливается в результате внутрипеченочного снижения CD8⁺ Т-клеток (рис. 2-1). Интересным свойством лимфоидной печени является также локализация в определенных участках наивных Т-клеток для последующей первичной активации.

Состав лимфоцитов и дисфункции печени

Лимфоциты играют центральную роль в противоопухолевом и противоинфекционном иммунитете. Поскольку эти проблемы могут быть напрямую связаны с печенью, иммунологические защитные механизмы должны в ней находиться на высоком уровне. Клетки, осуществляющие иммунологическую защиту, в печени взрослого человека составляют Т- и В-лимфоциты, натуральные киллеры (NK-клетки), а также большое количество γδТ-клеток, NKT-клеток, редко встречающихся в периферической крови. Изменение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов в печени может происходить под влиянием факторов, сопровождающих иммунное воспаление, - белков острой фазы, вазоактивных аминов, провоспалительных цитокинов, белков системы комплемента, удаления активированных лимфоцитов из циркуляции, местных процессов пролиферации и созревания клеток. Лимфоциты играют центральную роль в распознавании, выполнении эффекторных функций, иммунной регуляции. В основном эти функции свойственны В-лимфоцитам. Т-клетки, NK-клетки совместно могут обеспечивать развитие иммунных реакций на бактериальные, вирусные, паразитарные, опухолевые антигены. Они обнаруживают консервативные антигены или молекулы «опасности»: внеклеточную АТФ, фрагменты внеклеточного мактрикса (гиалуронан, бигликан, экстрдомен А, фибронектин, сурфактантный белок А), белки теплового шока (HSP60, 70, 22, gp96), нуклеиновые кислоты, ядерный белок HMGB-1, минимально модифицированные ЛПНП, β-дефензины, - выявляют зараженные или трансформированные клетки. NKT- и NK-клетки могут непосредственно приводить к гибели инфицированные, опухолевые клетки путем индукции апоптоза, секретировать цитокины, ингибирующие вирусную репродукцию и способствующие рекрутированию других клеток иммунной системы для развития адаптивного иммунного ответа. В-лимфоциты продуцируют антитела, которые нейтрализуют патогены и их токсины, опсонизируют бактерии для фагоцитоза, активируют комплемент по классическому пути для лизиса бактерий.

Родоначальником лимфоцитов является плюрипотентная гемопоэтическая стволовая клетка костного мозга. Созревание Т- и В-лимфоцитов происходит в центральных органах иммунной системы - тимусе и костном мозге, и только высокоспециализированные клетки, прошедшие этапы позитивной и негативной селекции, поступают в периферическую кровь и вторичные лимфоидные органы. Затем они циркулируют между периферической кровью и лимфоидными тканями и органами в виде небольших инактивированных клеток с конденсированным хроматином, несколькими органеллами и минимальной метаболической и транскрипционной активностью. Они остаются в этом неактивном состоянии, пока не встретятся с инфекционным агентом в лимфоидной ткани. Распознавание антигена и молекул «опасности» индуцирует пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в эффекторные клетки, способные нейтрализовать возбудителей различной природы. Этот процесс созревания занимает около 4-5 дней. NK-клетки не нуждаются в активации специфическим антигеном, но могут быстро реагировать на любые сигналы опасности. Таким образом, Т- и В-клетки опосредуют развитие адаптивного иммунного ответа, в то время как NK-клетки являются посредниками развития механизмов врожденного иммунитета.

Местный иммунитет

Лимфоциты рассматриваются как классические клетки, циркулирующие в периферической крови и занимающие соответствующие «зоны ответственности» в периферических лимфатических узлах, способные здесь специфически распознавать антигенные структуры патогенов. Активированные, антигеннагруженные дендритные клетки представляют переработанные антигены после их захвата в очагах инфекции наивным Т-клеткам и таким образом способствуют их созреванию в эффекторные Т-лимфоциты. Наивные В-лимфоциты получают сигналы от Т-хелперов, что способствует их превращению в зрелые клетки - плазмоциты, секретирующие антитела. Эффекторные Т- и В-лимфоциты из лимфатических узлов мигрируют в места аккумуляции антигенов, провоспалительных цитокинов, где они обеспечивают развитие киллерных эффектов по отношению к патогену, инфицированным клеткам-мишеням. Этот классический вариант развития иммунного ответа будет неполным без развития защитных иммунных реакций со стороны региональных иммунных систем, которые отвечают за местный (локальный) иммунитет. Например, кишечник имеет огромную площадь, контактирующую с внешней средой, которая подвергается воздействию инфекционных агентов и канцерогенов. В то же время пищевые антигены, микроорганизмы-комменсалы способны оказывать мощную антигенную нагрузку на лимфоидную ткань, ассоциированную со слизистой оболочкой кишечника, и это является необходимым для поддержания местного иммунитета на соответствующем уровне. Иммунная система желудочно-кишечного тракта является сложным комплексом, который включает популяции клеток, обеспечивающие регуляцию иммунных механизмов, толерантность, а также уникальные цитокины, регулирующие клеточные эффекторные функции.

Печень - орган с уникальными иммунологическими требованиями, которая должна получать около 1,5 л крови каждую минуту от портального тракта и печеночной артерии. Эти кровеносные сосуды являются одновременно и основным путем попадания в печень большинства гепатотропных бактерий, вирусов и паразитов. Кроме того, метастатические клетки проникают из кишечника, их токсины транспортируются в печень для детоксикации, в результате чего могут образовываться канцерогенные побочные продукты. Печень также постоянно получает антигенную нагрузку, связанную с кишечными микроорганизмами-комменсалами, что способствует образованию метаболитов, которые в основном безвредны и в норме не должны приводить к нарушению иммунного гомеостаза.

Иммунная система печени способна распознавать патогенные микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, опухоль-ассоциированные маркеры и отвечать развитием высокоспецифического иммунного ответа. В то же время направленность, сила иммунного ответа жестко регулируются, и преобладают механизмы толерантности к чужеродным антигенам самой различной природы. Введение антигенов биопробным животным через воротную вену индуцировало развитие к данным антигенам толерантности, в отличие от системного введения антигенов, которое индуцировало иммунный ответ. Эффекторные иммунокомпетентные клетки печени обладают специализированными функциями, индуцирующими толерантность. АПК печени, такие как клетки Купфера (резидентные макрофаги печени), дендритные клетки, LSEC, могут индуцировать либо толерантность, либо иммунный ответ с помощью селективной продукции провоспалительного цитокина IL-12 или регуляторных цитокинов, IL-10 и TGFβ. Кроме того, гепатоциты и другие клетки печени секретируют сложный набор гуморальных факторов для роста, дифференцировки и активации лимфоцитов.

Ранее присутствие лимфоцитов в печени считалось следствием развития иммуновоспалительных процессов в ответ на антигены, «молекулы опасности» с формированием инфильтратов. Они использовались в диагностике и оценке воспалительных состояний, таких как аутоиммунные и вирусные заболевания печени. В настоящее время известно, что печень взрослого здорового человека содержит облигатные печеночные лимфоциты, которые не циркулируют в периферической крови. При проведении обширной перфузии из 200 мг ткани печени может быть извлечено до 1-2 млн лимфоцитов. Это свидетельствует о том, что в печени массой 1,5 кг может находиться около 10¹⁰ лимфоцитов. Иммуногистохимическое исследование нормальных биопсионных пунктатов печени показало, что эти лимфоциты преимущественно локализуются вокруг портальных трактов, но выявлялись они и по всей паренхиме печени. Считается, что в здоровой печени лимфоциты опосредуют функции иммуновыживания.

Популяции лимфоцитов печени

Печень содержит зрелые Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, которые идентичны лимфоцитам периферической крови, а также большое количество лимфоидных клеток, редко выявляемых в периферической крови. Многие из этих клеток обеспечивают развитие механизмов врожденного иммунитета. Они способны распознавать консервативные рецепторные структуры с последующим развитием микробицидных эффектов по отношению к клеткам-мишеням и продуцируют цитокины, обеспечивающие индукцию и развитие адаптивного иммунного ответа. К этим клеткам относится большое количество NK-клеток, В1-лимфоцитов, γδТ-лимфоциты, Т-киллеры (NKT), другие Т-лимфоциты, экспрессирующие NK-рецепторы (NKRs) и лимфоидные дендритные клетки (рис. 2-2).

В-лимфоциты печени

К настоящему моменту о В-лимфоцитах печени известно не так много. Они обнаружены в здоровой печени человека, где находятся в таком же или меньшем количестве, чем в крови. На клеточной поверхности В-лимфоцитов экспрессированы универсальные и уникальные рецепторы, иммуноглобулиновые рецепторы, которые распознают конформационные эпитопы молекул антигенов. Разнообразие В-клеточных антигенраспознающих рецепторов связано с многократной перестройкой зародышевого центра сегментов гена, кодирующего различные части молекулы с добавлением нуклеотидов и последующими соматическими мутациями их антигенраспознающих сайтов. Таким образом, В-лимфоциты чрезвычайно разнообразны по своим способностям распознавания антигенов и обеспечивают иммунную систему огромным количеством упреждающих антигенспецифических клеток-эффекторов. Активации В-лимфоцитов предшествует специфическое распознавание антигена, получение дополнительных сигналов от Т-хелперов, которые контролируют В-клеточное созревание и продукцию плазмоцитами антител. В-лимфоциты играют важную роль в развитии адаптивного иммунного ответа против вирусов гепатитов А (HAV), В (HBV), C (HCV), что подтверждают вирусспецифические антитела у больных этими инфекциями. Они могут способствовать патологии печени вследствие хронической вирусной инфекции в результате продукции аутоантител против различных антигенов гепатоцитов. Продукция цитокинов В-лимфоцитами также имеет большое значение в процессах иммунорегуляции. Субпопуляция В1-лимфоцитов в печени появляется в начале онтогенеза. Она характеризуется полиспецифичностью в отношении распознавания антигена. В1-лимфоциты экспрессируют молекулу CD5 и при дифференцировке в плазмоциты секретируют большое количество низкоаффинных IgM. Они распознают повторяющиеся структуры углеводных компонентов, двухцепочечную ДНК и могут быть активированы без Т-хелперов. Именно поэтому В1-лимфоциты считаются клетками врожденного иммунитета, играющими чрезвычайно важную роль в защите печени от инфекционных агентов.

Т-лимфоциты печени

Т-клетки являются основными «дирижерами» адаптивного иммунного ответа. «Классические» секреторные Т-лимфоциты экспрессируют клонотипичные антигенраспознающие Т-клеточные рецепторы (TCRs), которые образованы α- и β-цепями в комплексе с молекулой полипротеина CD3, распознающего короткие пептидные фрагменты белковых антигенов. Они после обработки в цитозоле клетки формируют комплекс с молекулой МНС и вместе с ней экспрессируются на поверхность клетки. Т-лимфоцитам, как и В-клеткам, свойственно чрезвычайное разнообразие TCRs, связанное с перестройкой генов и соматическими рекомбинациями. CD4⁺ и CD8⁺ печеночные αβТ-клетки способны распознавать белковые антигены вирусов, бактерий, паразитов и индуцировать Т-клеточную реактивность против аутологичных антигенов печени с возможным формированием признаков хронического вирусного гепатита, лекарственного гепатита и аутоиммунной патологии.

CD8⁺ Т-клетки распознают пептиды переработанных внутрицито-плазматических белков как собственных, так и вирусных в комплексе с молекулой МНС I класса и обеспечивают развитие цитолитических эффектов по отношению к инфицированным и опухолевым клеткам. CD4⁺ Т-клетки распознают пептиды, представленные в сайте молекулы МНС II класса, и обеспечивают развитие адаптивных иммунных реакций. Подтипы CD4⁺ Т-хелперов (Th) регулируют различные адаптивные иммунные функции. Th1-клетки активируются микроорганизмами, использующими внутриклеточный тип паразитирования, в то время как Th2-клетки обеспечивают защиту от внеклеточно паразитирующих патогенов. Th1-клетки секретируют IFNγ, фактор некроза опухоли бета (TNFβ), активируют макрофаги и обеспечивают продукцию В-клетками комплементсвязывающих и вируснейтрализующих антител изотипа IgG2a. Th2 секретируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13 и, как полагают, активируют секрецию В-клетками IgE, IgA и IgGl. Третья субпопуляция CD4⁺ Т-лимфоцитов обладает регулирующими функциями и классифицируется как Тh3 или Т-регуляторные I (Tr1) клетки. Tr1/Тh3 клетки продуцируют IL-10, TGFβ, но не IL-4. Не продуцируют или продуцируют низкое количество IFNγ. Они супрессируют эффекты Th1-клеток и способствуют формированию иммунологической толерантности.

Важной особенностью Т-лимфоцитов печени является преобладание цитотоксических Т-лимфоцитов CD8⁺ по сравнению с CD4⁺. В печени их соотношение (CD4:CD8) составляет приблизительно 1:3,5, а в периферической крови - 2:1. Таким образом, в печени по сравнению с периферической кровью значительно преобладают клетки с фенотипом CD8, с цитотоксическими эффектами (рис. 2-3). Данная картина отражает способность печени как специализированного органа эффективно нейтрализовывать микроорганизмы с внутриклеточным типом паразитирования по сравнению с внеклеточными, а также блокировать опухоль-ассоциированные процессы.

Кроме того, предполагалось, что печень - орган, в котором утилизируются активированные CD8⁺ Т-лимфоциты, а высокие профили CD8⁺ Т-лимфоцитов объясняются тем, что в их число входят клетки, которые выполнили свои функции и должны быть элиминированы из организма путем апоптоза для поддержания иммунного гомеостаза. В печени находятся и необычные CD8⁺ Т-лимфоциты, которые практически не выявляются в периферической крови. В отличие от обычных CD8⁺ Т-лимфоцитов, печеночные CD8⁺ Т-клетки могут спонтанно развивать киллерные эффекты в отношении клеток-мишеней, находящихся в микроокружении без участия молекул МНС в представлении антигена. Они лишь нуждаются в неспецифических сигналах, получаемых от цитокинов - IL-2, IL-12, IL-15, и поэтому названы лимфокинактивированными киллерными клетками (LAK).

Популяция печеночных CD4^- Т-лимфоцитов, у которых TCR образован αβ-цепями, состоит преимущественно из клеток Тh1-типа, продуцирующих IFNγ и TNFα. И лишь около 5% лимфоцитов относятся CD4⁺ Th2-типа, секретирующих IL-4 и IL-5. Интересно, что цитокины, продуцируемые Тh1- и Тh2-клетками, обладают взаимно исключающими эффектами, однако некоторые печеночные Т-лимфоциты могут секретировать как IL-4, так и IFNγ. Эти необычные клетки с двойными эффектами Тh1/Тh2, скорее всего, относятся к недифференцированным или регуляторным Т-лимфоцитам, присутствующим в печени. В дополнение к обычным субпопуляциям CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов в здоровой печени присутствует повышенное количество клеток, не экспрессирующих ни CD4⁺ , ни CD8⁺ (дважды негативные Т-лимфоциты, DN-T-клетки), или клетки, экспрессирующие оба рецептора и CD4⁺ , и CD8⁺ (дважды положительные, DP-T-клетки). DN-T-клетки составляют примерно 15% печеночных Т-лимфоцитов и менее 5% Т-лимфоцитов периферической крови, они способны распознавать структуру антигенов без помощи молекул МНС. Дважды положительные CD4⁺ CD8⁺ Т-клетки, ранее идентифицируемые как клетки памяти, также встречаются в печени чаще по сравнению с периферической кровью (6 против 1%). Большинство CD8⁺ Т-клеток экспрессируют CD8 гетеродимер, состоящий из α- и β-цепей, в то же время печень содержит многочисленные Т-лимфоциты (15% их общего количества), экспрессирующие гомодимер CD8α-цепь. CD8α⁺ β^- Т-клетки выявлены и в лимфоидной ткани кишечника, и, как полагают, их пролиферация и созревание индуцируются другими сигналами, отличными от сигналов, получаемых тимоцитами. Установлено, что классические αβТ-лимфоциты вовлечены в развитие печеночных иммунных реакций против патогенов различной природы, однако существуют доказательства, что другие «неклассические» Т-лимфоциты играют более важную роль в элиминировании патогенов из печени. Эффекторные αβТ-лимфоциты, обеспечивающие развитие иммунных реакций против вирусов гепатита В и С, выявлены у пациентов с хроническим вирусным гепатитом, однако достаточно часто эти клетки не способны элиминировать вирус. С этой задачей более эффективно справляются «неклассические» Т-лимфоциты. Они способны продуцировать важнейшие провоспалительные цитокины для развития иммунного ответа против вирусных, бактериальных, паразитарных агентов, а также ингибировать опухоль-ассоциированные реакции. До 35% (в среднем 15%) печеночных Т-клеток экспресиируют TCR, состоящий из γ- и δ-цепей, который непосредственно узнает различные непептидные антигены. Значительная часть печеночных Т-клеток человека экспрессирует инвариантный αβTCR, состоящий из Va24JaQ α-цепи с ограниченным количеством β-цепей, распознающий гликолипидные антигены, представленные альтернативной антигенпрезентирующей молекулой CD1. Большинство этих «неклассических» Т-клеток экспрессирует на своей поверхности в 3 раза меньше молекул TCR, и, по всей видимости, их регуляция осуществляется через рецепторы, которые обычно находятся на NK-клетках. Эти NKR-позитивные Т-клетки являются отличительной чертой клеточного репертуара печени.

NK-клетки печени

Первое описание NK-клеток в ткани печени было сделано на крысах. Эти клетки были описаны как крупные зернистые клетки, присутствующие в синусоидах печени, которые были названы ямочными лимфоцитами, и с тех пор были описаны во многих тканях, включая периферическую кровь. NK-клетки могут спонтанно обеспечивать развитие киллерных эффектов в отношении опухолевых клеток и клеток, инфицированных вирусами и бактериями. После активации они могут секретировать интерферон γ, который способствует дифференцировке наивных CD4⁺ Т-клеток в Т-хелперы типа 1 (Th1), и IL-5, который стимулирует дифференцировку и активацию эозинофилов. В отличие от В- и Т-клеток, NK-клетки не обладают клонотипичными рецепторами для антигенов, но они могут обнаруживать и реагировать на изменения у клеток-хозяев, которые секретируют «молекулы опасности» вследствие инфицирования и опухолевой трансформации (рис. 2-4).

NK-клетки обладают разнообразными «естественными рецепторами цитотоксичности», обеспечивающими взаимодействие с лигандом, которое приводит к активации NK-клетки и цитотоксичности клетки, несущей соответствующий лиганд. У мышей семейство молекул NKР-P1 включает рецепторы NK1.1 и лектиновую молекулу NKG2D, опосредующие активацию NK-клеток. У людей также описаны естественные рецепторы цитотоксичности, включающие NKG2D - рецептор связывается со стресс-индуцированной молекулой MICA, которая распознает опухолевые и инфицированные вирусом клетки, - натуральный цитотоксический триггерный рецептор и NKp46, который распознает вирусный гемагглютинин. Экспрессия этих рецепторов приводит к немедленной атаке инфицированных или опухолевых клеток NK-лимфоцитами.

Другой механизм, с помощью которого могут активироваться NK-клетки, осуществляется через экспрессию их Fc γIII рецепторов (CD16 у человека) на Fc фрагменте молекул IgG1 и IgG3. Таким образом, IgGl и IgG3-антитела являются частью адаптивного иммунного ответа против патогенов и могут связываться с микроорганизмами и клетками-мишенями, сигнализируя NK-клеткам. Этот процесс известен как «антителозависимая клеточная цитотоксичность».

Третий механизм, с помощью которого NK-клетки распознают патогенинфицированные и опухолевые клетки, осуществляется через их способность обнаруживать изменения в уровнях экспрессии молекул МНС I класса. Молекулы МНС I класса экспрессируются всеми клетками организма. Они представляют переработанные внутрицитоплазматические белки в форме пептидов NK-клеткам и цитотоксическим Т-лимфоцитам. У человека к ним относятся «классические молекулы МНС I класса» локусов HLA-A, B и C, которые экспрессируются большинством клеток организма, в то время как другие «неклассические молекулы MHC I класса» имеют более ограниченное клеточное распределение (HLA-G в клетках трофобласта, экспрессия HLA-E зависит от совместной экспрессии HLA-A, В, С и G). Молекулы HLA-A, В, С и G представляют внутриклеточные пептиды CD8⁺ Т-клеткам. Они игнорируют клетки, представляющие собственные пептиды, но могут обнаруживать и реагировать на аномально высокие уровни пептидов, которые являются «молекулами опасности», свидетельствующими об опухолевой трансформации и репликации вируса. NK-клетки могут реагировать и на усиление экспрессии молекул МНС I класса, которые представляют белки рецептору CD94. Взаимодействие с CD94 может привести к клеточной активации или ингибированию NK-клеток, в зависимости от того, находится ли CD94 в комплексе со стимулирующим NKG2C/DAP12 или ингибирующими NKG2A трансдукцию молекулы сигналами.

Частым механизмом, который используют вирусы и опухолевые клетки для ухода от иммунного контроля, является подавление экспрессии молекул HLA-A, B и С, но это снижает их устойчивость по отношению к NK-клеткам. В число рецепторов NK-клеток для HLA-А, В и С молекул включены «киллингингибирующие рецепторы» (KIRs), которые обеспечивают трансдукцию ингибирующих сигналов NK-клеткам. Они, несмотря на то что структурно отличаются, входят в аналогичное семейство рецепторов. Белок Ly49 выполняет такую же функцию у мышей. Полиморфные эпитопы, присутствующие на молекуле HLA-C у человека, распознаются CD158а и CD158b, в то время как эпитопы HLA-A и В узнаются KIR3DL1. По крайней мере 10 различных KIRs, многие из которых являются полиморфными и лиганды которых неизвестны, были идентифицированы. Гены, кодирующие эти KIRs, дифференциально присутствуют у различных индивидуумов, так что каждый гаплотип содержит по меньшей мере от 2 до 6 изотипов KIR. У отдельных индивидуумов комбинации KIRs непрерывно кодируются разными NK-клетками, формируя сложный фенотип натуральных киллеров. Хотя КIRs были первоначально определены как «киллингингибирующие рецепторы», так как имеют «иммунорецептор на основе тирозина, ингибирующего мотивы» (ITIMs) в своих цитоплазматических доменах. Впоследствии было установлено, что некоторые KIRs не имеют ITIMs и нуждаются в помощи стимулирующей молекулы-адаптера (DAP 12), которая содержит тирозиновый рецептор, активирующий мотивы (ITАMs). Таким образом, лиганды KIR могут быть следствием активации NK-клеток.

В дополнение к естественным рецепторам цитотоксичности CD94 и KIRs NK-клетки могут получать сигналы от других лейкоцитов посредством рецепторов ингибирования (LIRs/ILTs), адгезионных и ко-стимулирующих молекул (CD2, CD161, CD11a/CD18, CD69, CD49d/ CD29). Их также могут активировать и неспецифические цитокины IL-2, IL-15, IL-21. Таким образом, регулирование активности NK-клеток весьма сложно и осуществляется через многочисленные рецепторы, имеющие собирательное название - NKRs, некоторые из них осуществляют доминирующие эффекты.

Первые научные открытия показали, что NK-клетки в печени как мышей, так и человека были преобладающими клетками и составляли до 50% всех других лимфоцитов по сравнению с лимфоцитами периферической крови, где они не превышали 10%. Количество этих клеток резко увеличивается при опухоль-ассоциированных процессах, вирусных инфекциях и может достигать 90%. NK-лимфоциты как здоровой, так и воспаленной печени могут in vitro посредством повышенной продукции IFN-7, IL-2, IL-12 и IL-15 обеспечивать развитие цитотоксических эффектов в отношении опухолевых клеток (LAK-активность) (рис. 2-5).

Цитотоксическая активность NK-клеток коррелирует с отсутствием CD3/T-клеточного рецептора (TCR) и присутствием адгезионной молекулы CD56. Анализ NK-лимфоцитов здоровой печени и периферической крови показал, что они отличаются фенотипически по экспрессии рецепторов CD8, CD16, CD161, KIR, CD94, NKG2D (рис. 2-6). Большинство NK-клеток печени человека (CD3CD56⁺) являются дважды негативными по CD4, CD8 (CD4CD8^-), однако около 20% клеток экспрессируют CD8. Большинство NK печени человека экспрессирует CD122, рецептор низкой аффинности для IL-2, IL-15, но отсутствует высокоаффинный рецептор CD25 для IL-2. Большинство NK-клеток печени человека экспрессируют антигеннеспецифичный рецептор CD45RA.

NK-клетки печени играют центральную роль в развитии органных иммунных реакций как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. Их развитие связано с локальной продукцией IL-15 не иммуно-компетентными клетками печени, его продукция приводит к усилению последующей продукции IL-15 и IL-2 только активированными Т-лимфоцитами. Они могут быть активированы через разнообразные консервативные рецепторы для антигенов и лиганды клеток-мишеней, которые экспрессируются как «молекулы опасности». Различные эффекторные функции NK могут быть выборочно активированы цитокинами, продуцируемыми клетками врожденного (IL-12, IL-15, IL-18) и адаптивного (IFNγ и IL-2) иммунитета. NK-клетки, по крайней мере частично, ответственны за развитие воспалительных реакций при аутоиммунных и вирусных гепатитах и иммунные реакции против опухолей. Они могут непосредственно вызвать повреждения клеток печени и активировать цитотоксические CD8⁺ Т-клетки и CD4^- Th1-клетки.

NKT-клетки печени

NKT-клетки (Т-киллеры) являются цитотоксическими лимфоцитами, которые, как и NK-клетки, экспрессируют рецепторы ингибирования и активации, ко-стимулирующие молекулы, способные распознавать гликолипидные антигены, представляемые CD1. У мышей NKT-клетки составляют незначительную субпопуляцию от всех Т-лимфоцитов в различных тканях (около 1-5%), но они выявлены в уникально высоких количествах в печени и костном мозге (около 40% всех Т-лимфоцитов). В настоящее время субпопуляции NKT-клеток уделяется повышенное внимание, так как, по всей видимости, именно они играют решающую роль в развитии противоопухолевого, антибактериального, противовирусного иммунного ответа, в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Мышиные NKT-клетки входят в популяцию DN и CD4 Т-лимфоцитов. Они незначительно могут экспрессировать TCR, Ly49 и низкоаффинный рецептор IL-2 (IL-2R β- и γ-рецептор), которые обычно экспрессируют NK-клетки. Большое количество печеночных мышиных NKT-лимфоцитов экспрессируют постоянный TCR с α-цепью, закодированный как Va14 сегмент гена Ja281, у которого отсутствует или возможна лишь незначительная соматическая рекомбинация, приводящая к взаимодействию с неполиморфными молекулами МНС I класса, распознающими гликопротеины CD1d. Лиганды антигена, представляемые CD1d TCR Va14Ja281, включают синтетический α-галактозилцерамид (α-GalCer) и его производные протозойные гликозилфосфатидилинозитолы. Печеночные NKT-клетки могут быть дополнительно активированы IL-12, продуцируемым дендритными клетками печени и купферовскими клетками. Особенностью мышиных NKТ-клеток является их быстрая активация и мощные эффекторные функции. Т-киллеры также могут быть активированы IL-2, IL-12 для обеспечения цитотоксических эффектов в отношении различных типов опухолевых клеток и продукции IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-10 и IL-13 для активации TCR. NKT-клетки - это единственный тип клеток, способных, как известно, секретировать IL-4 в отсутствие IL-4, продуцируемого другими клетками, и, следовательно, они, как полагают, играют центральную роль в активации Th2-клеток, переключении В-лимфоцитов на синтез иммуноглобулинов класса IgE. NKT-клетки посредством продукции медиаторов способствуют отторжению опухоли в печени мыши. Инъекции мышам синтетического гликолипида α-GalCer вызывали специфическую активацию NKT-клеток в печени CD1d-зависимым образом с последующей пролиферацией и продукцией IFNγ для усиления опухолевой цитотоксичности NK-клеток и CD8⁺ Т-клеток. Исход иммунологических реакций зависит от секреции IFNγ и IL-2 NKТ-клетками. α-GalCer также ингибирует репликацию HBV у HBV-трансгенных мышей путем активации IFNγ-секретирующих NKT-клеток, что впоследствии активирует NK-клетки и цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты. NKT-клетки участвуют в развитии специфического иммунного ответа против Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium berghei, Listeria monocytogenes, а также аутоиммунных реакций. На мышиных моделях показано, что при системной красной волчанке (СКВ), сахарном диабете 1-го типа и аутоиммунном энцефаломиелите имеют место как количественные изменения NKТ-клеток, так и изменения их функций. Репертуар печеночных NKT-клеток человека существенно отличается от мышиных. Ограниченное количество NKT-клеток с фенотипом CD1d экспрессируют TCR с α-цепью (Va24JaQ), которая имеет поразительную гомологию с мышиной Val4Ja281 цепью. Эти NKТ-клетки обладают уникальной способностью секретировать одновременно IFNγ и IL-4. Они напрямую могут развивать цитотоксические эффекты против опухолевых клеток и участвуют в иммунопатогенезе сахарного диабета 1-го типа и склеродермии. Однако существуют и выраженные различия между NKT-клетками человека и мыши. Во-первых, Va24JaQ⁺ Т-клетки составляют очень небольшую часть от всех Т-клеток в печени человека (~2%) и крови (<0,5%) по сравнению с мышиными Va14Ja281+ Т-клетками (~40 и ~5% соответственно). Во-вторых, NKT-клетки человека экспрессируют гораздо более широкий спектр молекул CD1 и более разнообразный репертуар CD1d-ограниченных T-клеток.

Таким образом, мышиные NKT-клетки кодируют один неполиморфный CD1 изотип CD1d, NKT человека способны дополнительно кодировать CD1, CD1a, CD1b и CD1с молекулы, которые распознают и представляют CD4⁺ , CD8⁺ , CD4^- , CD8^- αβ и γδT-клеткам широкий спектр гликолипидных компонентов клеточной стенки бактерий (миколовые кислоты, инозитолсодержащие фосфолипиды, мукоидные гликолипиды и изопреноидные гликолипиды). CD1a, b и с экспессируются в печени, но так как инвариантные ТCRs, связанные с узнаванием CD1a, b и с, не определены, поэтому не представляется возможным количественно определить CD1 Т-клетки в тканях человека. Однако печень человека является основным местом накопления Т-клеток, которые экспрессируют NKRs, и, хотя их антигенные особенности неизвестны, они демонстрируют функции, аналогичные CD1 ограниченным NKT-клеткам.

Т-лимфоциты печени с NK-рецептором

Особенностью печени является то, что большинство Т-лимфоцитов, в ней находящихся, экспрессируют NKRs. Как было показано выше, до 40% печеночных Т-лимфоцитов мыши (менее 5% Т-лимфоцитов периферической крови) экспрессируют низкие уровни ТCR и NKRs, NK1.1, Ly49 и/или IL-2Rβ. Большинство этих клеток имеет инвариантный участок Va14Ja281 ТCRs. Соответствующие пропорции отражают и Т-лимфоциты печени и периферической крови, экспрессирующие вариабельные NKRs у человека, но лишь немногие (около 2% в печени) экспрессируют Va24 TCR α-цепью. NKR⁺ Т-лимфоциты печени человека включают субпопуляции клеток, экспрессирующих CD56, CD161, CD16, KIR, NKG2D и/или CD94 (рис. 2-7).

Они преимущественно секретируют CD8 ко-рецептор, но CD4⁺ и CD4^- CD8^- NKR⁺ -Т-лимфоциты также находятся в печени. Эти клетки экспрессируют αβ или γδ ТCRs и активируют клетки памяти (CD28^- CD45RA^- CD45RO⁺ CD69⁺ ). NKR⁺ -Т-лимфоциты, экспрессирующие TCRs, распознающие пептид, представленный в сайте молекулы МНС I класса, были описаны как CD1-лимфоциты. Печеночные NKR⁺ -Т-лимфоциты выполняют цитотоксические функции и секретируют многофункциональные цитокины. CD56⁺ - и CD161⁺ -Т-лимфоциты периферической крови и печени человека, описанные как LAK-лимфоциты, активируются IL-2, IL-12 или IL-15 для выполнения цитотоксических функций в отношении различных типов опухолевых клеток. Они также могут обеспечивать цитотоксические эффекты посредством ТCR. Их мощные цитотоксические эффекты ингибируются стимулами через KIRs и CD94, которые экспрессируют CD56⁺ -T-клетки и CD161⁺ -T-клетки печени, выполняющие функции натуральных киллеров печени. Отличительной особенностью CD56⁺ -T-клеток печени (большинство которых экспрессируют CD161) является то, что их цитотоксические эффекты в отношении опухолевых клеток значительно усиливаются IL-12, который секретируют клетки Купфера и дендритные клетки печени. Количество CD56⁺ -T-клеток не увеличивается у лиц с гепатокарциномой, но их количество увеличено в печени у пациентов с хроническим гепатитом В и снижено у пациентов с хроническим гепатитом С.

NKR⁺ -Т-лимфоциты - мощные продуценты цитокинов. Большинство печеночных CD56⁺ и CD161⁺ T-лимфоцитов (50-80%) продуцируют IFNγ и IL-2, TNFα в течение нескольких часов активации, что подтверждает их участие в иммуновоспалительных реакциях с клетками типа Тh1. Около 15% популяции лимфоцитов продуцируют цитокины Тh2 - IL-4. Преобладание продукции цитокинов типа Тh1 подтверждает возможность секреции провоспалительных цитокинов гепатоцитами и клетками Купфера, что позволяет предположить возможность поддерживать воспалительную реакцию нормальной печенью и быть индикатором постоянной иммунной активности. Поскольку NKR⁺ -Т-клетки могут быть быстро активированы через многофункциональные (паттернраспознающие) рецепторы, отсутствует необходимость в предварительной их активации антигеном, и они способны продуцировать большое количество цитокинов типа Тh1 и Th2. Вероятно, NKR⁺ -Т-клетки представляют собой своеобразный мост между врожденной и адаптивной иммунной системами в печени, поляризуют и активируют другие популяции лимфоцитов (рис. 2-8).

Они могут участвовать и в патогенезе аутоиммунных заболеваний печени, таких как аутоимунный гепатит (АИГ), первичный склерозирующий холангит (ПСХ) и первичный билиарный цирроз (ПБЦ).

NKR⁺ -Т-клеткам печени человека свойственны функции лимфоцитов врожденного иммунитета, такие как секреция IL-12, наличие инвариантных рецепторов для стимулирующих лигандов и главного комплекса гистосовместимости (МНС) для осуществления неограниченных цитотоксических эффектов. Однако они также экспрессируют рецепторы, свойственные фенотипу Т-клеток памяти, хемокиновые рецепторы; предполагают, что они могут выполнять функции антигенспецифических Т-клеток памяти. Экспрессия CD56 зависит от продукции IL-2 Т-лимфоцитами. Экспрессия CD8⁺ -Т-лимфоцитами NKRs может быть вызвана их активацией. Обычные вирусчувствительные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки, как было показано, могут экспрессировать NKRs; возможно, что экспрессию NKR могут осуществлять субпопуляции Т-клеток памяти, которые приобрели малотоксичность и более быстрые и мощные эффекторные функции, характерные для NKR⁺ -Т-клеток. В связи с этим NKR⁺ -Т-клеткам могут быть свойственны функции Т-лимфоцитов адаптивной иммунной системы, вероятно, что они могут реагировать на сигналы, исходящие от обеих - врожденной и адаптивной - систем (рис. 2-9).

γδТ-лимфоциты печени

До 35% печеночных Т-клеток экспрессируют γδTCRs, что делает печень одним из самых богатых источников γδТ-клеток в макроорганизме. γδT-клетки находятся также в значительных количествах в эпителии тонкой кишки, кожи, легких, беременной матки, но они составляют менее 5% Т-клеток в периферической крови. Большинство печеночных γδT-клеток экспрессируют CD8⁺ или DN- и NK-клеточные маркеры (CD56, CD161, KIRs, CD94), и на их долю приходится до 60% NKR⁺ -Т-клеток печени человека. Несмотря на необычно большое количество γδT-клеток в нормальной печени, их роль полностью не выяснена. Их присутствие, однако, является еще одним свидетельством того, что печень - специализированный орган, в котором развиваются врожденные иммунные реакции. На других слизистых поверхностях γδТ-клетки накапливаются в местах инфекции и могут секретировать как Th1-, так и Th2-цитокины, лизировать инфицированные клетки-мишени. В отличие от обычных γδТ-клеток, они обладают олигоклональными или инвариантными TCRs, которые распознают широкий спектр антигенов, включая растворимые небелковые антигены и стресс-индуцируемые белки без участия молекул МНС. γδТ-клетки распознают лиганды антигенов различной природы, включая фосфорилированные тимидиновые метаболиты микобактерий, бактериальных и растительных алкиламинов, и вирусные гликопротеины. Хотя точные цели γδТ-клеток печени неизвестны, их высокая встречаемость в печени, видимо, свидетельствует о том, что они могут играть важную роль в быстрой элиминации микробов, вирусинфицированных и опухолевых клеток. γδТ-клетки могут также снижать интенсивность αβТ-клеточного ответа, что свидетельствует о роли этих клеток в иммуносупрессии.

Лимфоциты в печени: как и почему?

Ранее было широко распространено мнение, что лимфоциты попадают в печень только в результате развития иммунопатологических реакций. Так, инфильтрация лимфоцитами печени хорошо видна при АИГ, ПБЦ и вирусных гепатитах В и С, поэтому воспаление обычно считается основным стимулом для аккумуляции лимфоцитов в печени. Кроме того, считалось, что в здоровой печени отсутствуют постоянные популяции лимфоцитов. Именно поэтому, вероятно, печеночные лимфоциты играют активную роль в иммунном контроле и поддержании нормального иммунного гомеостаза. Тем не менее с начала 1990-х годов несколько исследований продемонстрировали наличие лимфоцитов в непатологической печеночной ткани. Одним из наиболее интересных объяснений их присутствия было предположение о постинфекции, что здоровая печень играла роль «кладбища» для активированных лимфоцитов CD8⁺ , которые «попадали мимо цели». Было высказано предположение, что инфекционные агенты способствуют миграции лимфоцитов в печень, где они погибают по механизму апоптоза, тем самым уменьшая количество активированных лимфоцитов, продукцию ими провоспалительных цитокинов, которые могли оказывать иммунопатологические эффекты на ткани. Исследования на мышах подтвердили эту гипотезу.

В здоровой печени выявлено большое количество лимфоцитов, особенно цитотоксических лимфоцитов CD8⁺ . В то же время большое количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации, подвергается апоптозу, другая же часть лимфоцитов по-прежнему остается наивной, неактивированной, ожидающей встречи с антигеном. Местоположение печени между желудочно-кишечным трактом и сердечно-легочной системой обеспечивает ее достаточным кровоснабжением, что в итоге способствует непрерывному проникновению в печень клеток периферической крови. Эти клетки иногда называют лимфоцитами-«пассажирами», предполагая их пассивную функцию, однако локализация лимфоцитов в паренхиме печени вокруг портальных трактов указывает на то, что они самостоятельно активно мигрировали для выполнения свойственных им эффекторных функций. С лимфоцитами печени связывают их способность выполнять уникальные локальные функции. Это также согласуется с ранее высказанным мнением, что репертуар лимфоцитов в печени значительно отличается от репертуара клеток периферической крови, которые редко определяются в периферической крови. Отбор и рекрутирование лимфоцитов в печень с их последующим созреванием находятся под влиянием цитокинов, которые ответственны за уникальную природу печеночных лимфоцитов.

Возможно локальное образование лимфоцитов печени человека?

Кроветворная функция фетальной печени подтверждена многочисленными исследованиями, в то время как роль печени взрослого человека в кроветворении считается относительно незначительной. Костный мозг является основным местом образования предшественников всех циркулирующих клеток периферической крови вместе с Т-лимфоцитами, требующими специализированной микросреды тимуса для завершения их созревания и развития. В последнее время показано, что в здоровой печени взрослого человека находится популяция гемопоэтических стволовых клеток (hematopoietic stem cells, HSC) с in vitro установленным кроветворным дифференцировочным фактором. С помощью двухцветной проточной цитометрии печеночные HSC были обнаружены в количестве, в шесть раз превышающем их содержание в периферической крови, однако в сопоставимом количестве с содержащимися в костном мозге человека гемопоэтическими стволовыми клетками. Большинство печеночных HSC, выделенных из нормальной печени, экспрессировали низкие уровни CD34, более 50% - ко-рецептор CD38. Экспрессия НLA-DR практически всеми печеночными клетками CD34⁺ свидетельствует, что они активно дифференцируются in situ. В нормальной печени менее 5% дифференцированных печеночных HSC экспрессируют ассоциированный миелоидный антиген (CD33), однако значительное количество клеток экспрессируют лимфоидные клеточно-ассоциированные маркеры, связанные с В-клетками (CD19), Т-клетками (CD7) и предшественниками NK-клеток (CD56). Это является существенным отличием от фенотипов нормальных клеток костного мозга, в котором большинство CD34⁺ клеток экспрессируют CD33. Относительно большое количество HSC, экспрессирующих CD7 и обнаруживаемых в нормальной печени, согласуется с гипотезами, что печень является местом экстратимического Т-клеточного созревания! Экспрессия CD19 и CD56 значительной популяцией печеночных HSC предполагает, что печеночная микросреда может также «поддержать» В-клеточную, NK-клеточную и CD56⁺ Т-клеточную дифференцировку. Предполагается, что мышиные Val4⁺ NKT-клетки также созревают в печени. У людей мРНК, транскрибируемая с гена, активирующего рекомбиназу-1 (RAG-1) и RAG-2 клеточных компонентов, необходимых для развития В- и Т-клеток, были обнаружены в лимфоцитах CD7⁺ , выделенных из изолятов нормальной ткани печени. Кроме того, preTCR-α, αТ-клеточный специфический шаперон экспрессируются на ранней стадии развития αβТ-клеток, что было выявлено у некоторых популяций клеток. Значительные уровни IL-7 и IL-15, необходимые для Т-клеточного, NK-клеточного и NKТ-клеточного развития, конститутивно продуцируются в печени, демонстрируя подходящее микроокружение для дифференциации лимфоцитов. Перечисленные выше результаты убедительно доказывают, что лимфопоэз продолжается и в нормальной взрослой печени человека и что, по крайней мере, из предшественников развиваются αβТ-клетки.

РОЛЬ ВНУТРИПЕЧЕНОЧНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ИММУННОМ ГОМЕОСТАЗЕ ПЕЧЕНИ

Печень является уникальным иммунологическим органом, так как имеет собственную популяцию клеток, обеспечивающих развитие реакций врожденного и адаптивного иммунного ответа. Архитектура печени, ее местоположение, тесная взаимосвязь с иммунной системой - все это способствует ее участию в индукции толерантности, а также развитию эффекторных реакций иммунной системы на чужеродные патогенные микроорганизмы.

Миграция лимфоцитов в печень - многошаговый процесс, который облегчается уникальной внутрисосудистой архитектоникой печени, которая способствует медленному кровотоку и сдвигу давления к синусоидальной мембране. Инфильтрация Т-лимфоцитов в паренхиму печени усиливается хемокинами, которые активируют различные субпопуляции Т-лимфоцитов. Тканеспецифическая миграция Т-лимфоцитов может быть индуцирована различными по природе антигенами. Внутри-печеночные Т-лимфоциты являются основными клеточными факторами, обеспечивающими защиту от микробных и вирусных агентов, в том числе от HBV, HCV в результате развития цитотоксических и нецито-токсических эффектов, опосредованных цитокинами.

Внутрипеченочный воспалительный инфильтрат состоит преимущественно из не сенсибилизированных антигеном Т-лимфоцитов и из специфичных конкретному антигену лимфоцитов, отличающихся функционально.

Fas-белок, TNFα, белки-перфорины вовлечены в индукцию апоптоза гепатоцитов вследствие воспалительных реакций со стороны печени. За счет апоптоза погибает и большое количество Т-лимфоцитов, мигрировавших в печень.

Уникальное местоположение печени между желудочно-кишечным трактом и периферическими лимфоидными органами, его эндотелием с многочисленными рецепторными структурами обеспечивают тесный контакт с многочисленными антигенами. Преимущественно это белки, транспортируемые из кишечника через систему воротной вены, а также продукты внутрипеченочного метаболизма, бактериальные и вирусные патогенные агенты. При межклеточном контакте с этими антигенами печень может индуцировать развитие толерантности, иммунные воспалительные реакции против соответствующих патогенов, а также аутоиммунные реакции против микроорганизмов, использующих внутриклеточный тип паразитирования. Развитие этих реакций связано с NK-, NKТ-клетками и цитотоксическими Т-лимфоцитами. Кроме того, печень может активно модулировать иммунные реакции, увеличивая внутрипеченочный клеточный воспалительный инфильтрат за счет хемотаксиса других клеток, многие из которых являются антигеннеспецифическими, или уменьшать его за счет индукции апоптоза активированных иммунокомпетентных клеток. Эти противоположные функции печени очень важны для понимания интимных механизмов патогенеза заболеваний печени.

Популяции лимфоцитов в здоровой неинфицированной печени

Средний вес неинфицированной печени составляет примерно 1200-1500 г и содержит 10⁹ -10¹⁰ лимфоцитов. Эта популяция лимфоцитов значительно отличается от состава лимфоцитов крови. В частности, соотношение CD4⁺ :CD8⁺ Т-клеток изменено, так как популяция CD8⁺ -клеток содержит большой процент нетрадиционных лимфоцитов (табл. 2-1).

Они включают дважды негативные CD4CD8^- Т-лимфоциты, дважды позитивные CD4⁺ CD8⁺ , γδT-лимфоциты и клетки, экспрессирующие как маркеры натуральных киллеров (CD56⁺ ), так и Т-клеточный маркер - CD3⁺ , которые отнесены к NKТ-клеткам и имеют различные функциональные характеристики, такие как способность распознавать непептидные антигены, представленные неклассическими молекулами MHC.

Индукция Т-клеточного иммунного ответа на антигены печени

К сожалению, не много известно о факторах и механизмах, которые обеспечивают состояние аутотолерантности на аутоантигены и индукции адаптивного иммунного ответа на экспрессируемые антигены патогенных микроорганизмов. Гепатоциты способны экспрессировать вирусные антигены для распознавания их определенным пулом Т-лимфоцитов, однако развития классического Т-клеточного иммунного ответа не происходит вследствие недостаточной экспрессии ко-стимулирующих адгезионных молекул и отсутствия экспрессии молекул МНС II класса. Именно поэтому макрофаги в печени - это клетки Купфера, дендритные клетки - локально распознают чужеродные антигены, претерпевают изменения, экспрессируют на своей поверхности переработанный антиген, а также хемокиновые рецепторы и мигрируют в регионарные лимфатические узлы и венулы эндотелия. Здесь они представляют антиген в сайте молекулы МНС II класса наивным CD4⁺ Т-лимфоцитам и индуцируют развитие специфических реакций и представляют антиген в сайте молекул МНС I класса CD8⁺ Т-лимфоцитам. Полученные данные свидетельствуют о том, что одни дендритные клетки могут быть индукторами адаптивного иммунного ответа, другие - индуцировать толерантность. Так, было показано, что полученные из печени дендритные клетки с сохраненной миграционной активностью способны к низкой рапознающей активности тимидина аллогенных Т-лимфоцитов в смешанных культурах. Это помогает развитию обширных апоптотических реакций активированных Т-лимфоцитов и тем самым обеспечивает толерогенный потенциал in vivo. Кроме того, эндотелиальные клетки синусоидов печени (LSEC) могут представлять антиген и, как полагают, содействуют индукции и регулированию механизмов толерантности. Эти клетки также помогают преодолению эндотелиального барьера. Как и микробные агенты, вирусы должны пройти через поры эндотелия с током крови или активно транспортироваться через эндотелий, поэтому LSEC могут играть чрезвычайно важную роль в инициализации процессов распознавания антигена. Как антигенпредставляющие клетки, LSEC выполняют уникальную функцию по индукции толерантности со стороны CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов.

Важно также отметить, что сила и специфичность развития адаптивных иммунных реакций в печени зависят от состояния механизмов внутрипеченочного врожденного иммунитета. В печени находится гораздо больше NK-клеток, чем в периферической крови или других лимфоидных органах. NK-клетки способны как распознавать, так и ингибировать распознавание инфицированных клеток, гликопротеиновых рецепторов вирусов, усиливать и снижать экспрессию МНС I класса. Они могут быть активированы интерферонами типа I (IFNα и IFNβ), продуцируемыми на ранних стадиях вирусной инфекции, и IL-12, продуцируемыми макрофагами и дендритными клетками. NK-клетки выполняют разнообразные эффекторные функции с первых часов инфицирования и в течение нескольких дней после его окончания. Кроме прямых цитолитических эффектов, NK-клетки секретируют IFNγ, ТNFα. Макрофаги секретируют множество хемокинов и провоспалительных цитокинов MIP-1α, MIP-1β, IFN-индуцибельный белок-10 (IP-10), привлекающих в очаг воспаления Т-лимфоциты. Провоспалительные цитокины, продуцируемые клетками врожденного иммунитета, обеспечивают миграцию и перераспределение внутрипеченочных Т-лимфоцитов.

Второй большой внутрипеченочной популяцией клеток врожденного иммунитета являются NKT-лимфоциты. Эти клетки экспрессируют как маркеры NK-клеток (CD56), так и рецептор зрелых Т-лимфоцитов (CD3) и способны модулировать иммунные реакции. Они могут обеспечивать развитие реакций как Тh1-типа с преимущественной продукций IFNγ, так и Тh2-типа с преимущественной продукцией IL-4.

Миграция лимфоцитов к печени

Неактивированные Т-лимфоциты экспрессируют адгезионные молекулы L-selectin, которые контактируют с эндотелием венул в лимфатических узлах и регулируют уровень экспрессии этих молекул после антигенспецифической активации, покидают лимфатические узлы через эфферентные лимфатические сосуды, мигрируют к печени, в которую попадают через большую портальную вену и малую печеночную артерию (рис. 2-10).

В пределах печени активированные Т-лимфоциты в результате многошагового процесса мигрируют из синусов в пространство Диссе и паренхиму печени. Первый этап - это распознавание Т-лимфоцитами антигенных характеристик представленного вирусного агента, взаимодействие с рецепторными структурами клеток Купфера и синусоидальным эпителием. Этот процесс значительно облегчается медленным кровотоком, низким кровяным давлением, разветвленной сосудистой сетью и высокой подвижностью клеток внутрипеченочного иммунного гомеостаза. Второй этап аналогичен мигрированию лимфоцитов в очаг воспаления с трудностями преодоления трансэндотелиального барьера. Это усиление экспрессии дополнительных адгезионных молекул с развитием фазы прочной адгезии, развитию которой способствуют многочисленные хемотаксические цитокины, активирующие лимфоциты. Заканчивается второй этап представлением антигена клетками Купфера или клетками эндотелия. В месте межклеточного контакта циркулирующие Т-лимфоциты могут находиться в печени в течение нескольких минут и продуцировать хемокины, вызывающие иммуно-воспалительные эффекты, сопоставимые с действием алкоголя и другими иммуновоспалительными заболеваниями печени.

Третий этап адгезии сопровождается преодолением трансэндотелиального барьера Т-лимфоцитами и их инфильтрацией печени. Данному процессу способствуют макрофагальный белок воспаления (MIP-1α, MIP-1β), IFN-индуцибельный белок-10 и цитокины RANTES. Данные цитокины присутствуют в небольших количествах и в невоспаленной печени, однако их количество резко возрастает в перипортальных областях при инфицировании печени и тем самым способствует образованию внутрипеченочных клеточных инфильтратов, состоящих преимущественно из примированных Т-лимфоцитов. Под действием хемокинов лейкоциты мигрируют в пространство Диссе и периваскулярное пространство, заполненное свободным коллагеном и мезенхимальными клетками, откуда они мигрируют в паренхиму печени.

Как хемокиновые сигналы распознают различные субпопуляции Т-лимфоцитов? CXCR3 и CCR5 хемокиновые рецепторы экспрессируются клетками печени с более высокой плотностью, чем лимфоцитами периферической крови. Они взаимодействуют с двумя молекулами семейства CXC [содержат два остатка цистеина, разделенных вариабельной аминокислотой (X) - cysteine-X-X], а именно с IP-10 и IFNγ. Эти хемокины преимущественно секретируются синусоидальными печеночными эндотелиальными клетками и макрофагами и сопровождают провоспалительные и хемоаттрактантные эффекты. Эффекты этих хемокинов значительно усиливают биологическую активность IFNγ и TNFα, продуцируемых лимфоцитами.

Кроме того, CCR5 взаимодействует с тремя молекулами семейства СС (содержат два остатка цистеина - cysteine-cysteine), а именно MIP-1α, MIP-1β и RANTES. MIP-1α, MIP-1β преимущественно секретируют клетки сосудистого эндотелия портального тракта, но могут секретироваться и цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые находятся в цитотоксических гранулах вместе с гранзимом А. Таким образом, цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты наряду с развитием цитоксических эффектов за счет продукции хемокинов MIP-1α/CCR5 могут привлекать в очаг воспаления другие лимфоциты. Действительно, экспериментальное введение мышам анти-CCR5 снижало количество CCR5⁺ CD8⁺ T-лимфоцитов, проникающих в печень, и тем самым защищало печень от повреждения.

Интересно, что экспрессия хемокиновых рецепторов определенными тканями связана с функциональным состоянием Т-лимфоцитов и не обязательно с природой антигена. Фактически большинство активированных Т-клеток памяти экспрессируют CXCR3, в то время как наивные (неактивированные) Т-лимфоциты экспрессируют CXCR4. Соответственно, большое количество вирусов гриппа типа А активирует эффекторные и Т-лимфоциты памяти, которые были детектированы в печени. Экспериментально на мышах было показано, что вирусы гриппа типа А получают хорошую возможность размножаться в легких и погибают в печени, тем самым подтверждая важную роль эффекторных Т-лимфоцитов в ингибировании репродукции вирусов гриппа в печени.

Другое интересное наблюдение связано с тем, что CXCR3 с высокой плотностью экспрессируют Th0- и Th1-лимфоциты, а Th2-лимфоциты - низкие уровни, в то время как другие хемокиновые рецепторы, такие как CCR3, CCR4 и CCR8, экспрессируются преимущественно Th2-лимфоцитами. Таким образом, экспрессия хемокиновых рецепторов в основном связана с биологической активностью субпопуляций Th1/Th2-лимфоцитов, которая может быть изменена модулирующими эффектами цитокинов IFNα и TGFβ. Именно этим объясняется доминирование Th1-лимфоцитов в печени.

Эффекторные функции внутрипеченочных Т-лимфоцитов

Т-лимфоциты, инфильтрирующие печень, играют, как полагают, чрезвычайно важную роль в иммунной защите макроорганизма от вирусов гепатитов В и С из-за их способности распознавать вирусные антигены в инфицированных гепатоцитах. CD4⁺ Th1-клетки распознают вирусные пептиды, представленные в виде дериватов после фагоцитоза и протеолитического расщепления в сайте молекулы МНС II класса. CD8⁺ Т-лимфоциты распознают вирусные белки в сайте молекул МНС I класса.

Вирусы гепатитов В и С считают не цитолитическими. Они попадают в гепатоциты печени, преимущественное место их репликации, через печеночную артерию или портальную вену. Противовирусный клеточный иммунный ответ в печени при обеих инфекциях связан с элиминированием вирусов и разрешением болезни. Терминальная фаза острой инфекции вируса гепатита С тесно коррелирует с иммунным ответом многофункциональных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL, от англ. cytotoxic T-lymphocyte). Точно так же острая ограниченная инфекция вируса гепатита В локализуется при участии многофункциональных T-хелперов и CTL, которые постоянно обнаруживаются в периферической крови. Этот иммунный ответ совпадает с максимальными профилями в сыворотке крови АЛТ и предшествует элиминированию HBeAg, HBsAg и их нейтрализации антителами.

Напротив, хронические вирусные гепатиты В и С связаны с неэффективным Т-клеточным иммунным ответом. Развивающиеся эффекторные реакции со стороны Т-лимфоцитов не приводят к элиминированию вируса из гепатоцитов, но способствуют развитию неэффективного хронического воспалительного процесса в печени.

Цитолитический и нецитолитический контроль репликации вируса

При остром вирусном гепатите В максимальная активность АЛТ в сыворотке крови совпадает с внутрипеченочной инфильтрацией CD8⁺ Т-лимфоцитами, тем самым способствуя некрозовоспалительным заболеваниям печени. Этот процесс был описан в опытах на трансгенных мышах, гепатоциты которых экспрессировали HBsAg. Внутривенное введение цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфичных к распознаванию HBsAg, индуцирует ранний иммунопатологический процесс, сопровождаемый апоптозом отдельных гепатоцитов. Спустя 4-12 ч антигеннеспецифические эффекторные клетки, такие как макрофаги и NK-клетки, мигрируют в печень, численно значительно превосходя присутствующие здесь CTL, формируют очаги гепатоцеллюлярных некрозовоспалительных процессов, подтверждаемые результатами гистологических исследований. Инъекции антител, нейтрализующих IFNγ, или инактивация макрофагов прекращают усиление этого антигеннеспецифического каскада. Наконец, индуцированный гепатит является следствием продолжительности жизни CTL, вызвавших данный каскад патоморфологических изменений.

Кроме литической и цитопатической эффекторных функций, лимфоциты печени развивают нецитолитический контроль вирусной репродукции. Фактически небольшое количество Т-лимфоцитов, находящихся среди огромного количества гепатоцитов, предлагает более эффективный механизм, который не требует обязательного межклеточного контакта «один к одному» между эффекторной клеткой и клеткой-мишенью. При HBV-инфекции цитокины IFNα, -β, -γ и TNFα ингибируют экспрессию вирусных генов, их репликацию и способствуют элиминированию вирусов из большинства гепатоцитов, не вызывая заболеваний печени.

Этот механизм играет важную роль в острой фазе HBV-инфекции, так как сниженная регуляция репликации HBV предшествует массивной инфильтрации CD8⁺ Т-лимфоцитов в печень и появлению симптомов гепатита. Предполагается, что эти механизмы имеют место и при HBeAg-отрицательном хроническом гепатите В, который характеризуется балансом между низкой вирусной нагрузкой и отсутствием повреждения клеток печени, низким количеством сенсибилизированных Т-лимфоцитов в паренхиме печени и в периферической крови. Таким образом, возможно, что лечебный IFNγ-опосредованный эффект преобладает над иммунопатогенетическими, цитолитическими эффектами HBV-специфических Т-лимфоцитов, если внутрипеченочный инфильтрат является небольшим и состоит в основном из HBV-специфических CD8⁺ Т-лимфоцитов.

Эффективность этого механизма зависит от чувствительности вирусов к действию цитокинов и собственно состояния инфицированных клеток. Так, HBV, цитомегаловирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), ротавирусы являются восприимчивыми к цитокинам, секретируемым CTL и другими эффекторными клетками. Возможно, такие эффекты отсутствуют при HСV-инфекции. Кроме того, было показано, что только гепатоциты и лимфоидные клетки могут обеспечивать нецитопатический контроль репродукции вируса гепатита В, который отсутствует у других типов клеток. Таким образом, низкие репликации HBV и экспрессия вирусных антигенов способствуют тому, что не происходит полноценного элиминирования вируса, а инфицированные клетки не подвергаются цитолитическим эффектам CTL, что в итоге сопровождается отсутствием повреждений печени. Согласно описанному сценарию, одни и те же механизмы могут способствовать в одном случае разрешению иммунопатогенетического процесса при остром вирусном гепатите В и в другом - не допустить полноценного восстановления у лиц с хроническим гепатитом В.

Внутрипеченочные Т-лимфоциты и хроническое повреждение печени

Периодическая активизация воспалительного иммунного ответа в печени, являющегося следствием клеточных иммунных реакций, может приводить к некротическому повреждению клеток печени при вирусных инфекциях и при аутоиммунных заболеваниях. Фактически этого воспалительного процесса достаточно для того, чтобы вызвать хроническое воспаление с некрозом клеток, в конечном итоге приводящего к гепатоцеллюлярной карциноме, что было подтверждено на моделях хронического воспаления у мышей.

Соответственно, размер внутрипеченочного воспалительного инфильтрата может использоваться в качестве маркера оценки течения хронических гепатитов В и С. Не так много известно о роли антигенпримированных Т-лимфоцитов и эффекторных клеток врожденного иммунитета в развитии воспалительных реакций в печени. При хроническом гепатите В только 9% цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов из всех CD8⁺ внутрипеченочных Т-клеток распознают эпитопы нуклеокапсида HBV. Примерно такое же количество Т-клеток распознает антигенные характеристики HСV при хроническом гепатите С. Важно, что в обоих случаях большинство вирусспецифических Т-лимфоцитов печени при хронических HBV- и HСV-гепатитах экспрессировало маркеры активации, участвующие в распознавании антигена и обеспечивающие усиление эффекторных функций. В воспаленных участках печени, в зависимости от природы антигена, локализуются лимфоциты определенной специфичности. Большинство лимфоцитов инфильтрирует портальные тракты и находится в периваскулярном пространстве печени. При продолжающемся хроническом воспалении инфильтрат может распространяться от портального тракта к центральным венам. Этот процесс характеризуется как постепенный некроз, в конечном счете печеночные дольки окружаются и изолируются друг от друга недавно синтезированной фиброзной тканью. Агрегаты лимфоцитов и зародышевые центры В-клеток выявляются гораздо чаще при HСV-, чем при HBV-инфекции, особенно в портальных трактах и зонах некроза. Эти фолликулярные центры состоят из CD20⁺ В-лимфоцитов с окружением CD4⁺ Т-лимфоцитами, которые могут выполнять посреднические функции по представлению антигенов HСV наивным (неактивированным) В-лимфоцитам.

С другой стороны, CD8⁺ Т-лимфоциты также достаточно часто инфильтрируют дольки печени. Фактически FasL CD8⁺ Т-лимфоцитов контактируют с Fas-антигеном, экспрессируемым гепатоцитами в зоне активного воспаления, и это интерпретируется как цитотоксическая гибель гепатоцитов. Инфильтрация печени лимфоцитами сопровождается не только презентацией антигена гепатоцитам, но и лизисом неинфицированных соседних гепатоцитов, у которых увеличена экспрессия рецепторов синтезированными провоспалительными цитокинами. Кроме того, инфицированные гепатоциты отличаются повышенной чувствительностью к растворимому TNFα из-за измененной РНК или синтеза белков: этот механизм гибели клеток не требует близкого межклеточного контакта (клетка-клетка) и поэтому может играть более эффективную роль в ограничении вирусной репликации.

Механизмы иммуноопосредованного повреждения печени

Может быть выделено три основных фактора, играющих важную роль в лизисе клеток, - Fas-белок, TNFα и/или белки перфорины, гранзимы в последующем иммуновоспалительном повреждении печени.

Fas-опосредованная гибель клеток - быстрый процесс, протекает в течение нескольких часов без участия РНК и синтеза белка. Как было описано выше, экспрессия Fas-белка (CD95), посредника апоптоза, осуществляется гепатоцитами, особенно в участках некроза и FasL активированными CD8⁺ Т-лимфоцитами, которые инфильтрируют печень. Фактически уровень экспрессии Fas-антигена значительно увеличивается при усилении воспаления при HСV-инфекции.

TNF-опосредованный апоптоз может быть индуцирован мембраносвязанным и растворимым TNFα. Мембраносвязанный TNFα экспрессируют инфильтрирующие печень цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты, в то время как растворимый TNFα секретируют преимущественно макрофаги и в меньшей степени активированные антигеном лимфоциты.

Наконец, перфорининдуцированному механизму может способствовать антиген-опосредованный лизис Fas-белка и TNFα резистентных клеток. Порообразующий белок перфорин относится к семейству сериновых протеаз, называемых гранзимами, находящимися в цитотоксических гранулах CD8⁺ Т-лимфоцитов и NK-клеток. Содержимое цитотоксических гранул целенаправленно секретируется в межклеточное пространство, и лизис клеток связан с формированием на клетках-мишенях мембранных повреждений. Гранзим В, являющийся триггерным фактором, эндогенно активирует внутриклеточные каспазы и в итоге приводит к каскадной гибели клеток. Такие изменения, как уплотнения хроматина, повреждения мембраны, фрагментация ядерной ДНК (апоптоз), являются окончательными сигналами каскадной гибели клеток в результате некроза.

Важно отметить, что оптимальный вирусный ответ зависит от природы вируса, его тропности к конкретным тканям и поддержания баланса между супрессирующими эффектами вирусной репликации и минимальными тканевыми повреждениями. В то время как цитопатические вирусы, такие как везикулярные поксвирусы и вирусы гриппа, преимущественно контролируются (нейтрализуются) специфическими антителами и интерферонами, то нецитопатические вирусы, такие как лимфоцитарный вирус хорионменингита (LCMV), преимущественно нейтрализуются белками перфоринами, лизирующими инфицированные клетки. При отсутствии белков перфоринов персистенция LCMV может приводить к гиперпродукции цитокинов с гормоноподобными эффектами - TNFα и IFNγ. Наконец, оптимальный противовирусный ответ зависит и от типа инфицированных клеток. Так, мышиная цито-мегаловирусная инфекция в селезенке преимущественно контролируется белками перфоринами, секретируемыми NK-клетками, в то время как репликацию этих вирусов в печени ограничивает IFNγ, продуцируемый внутрипеченочными NK-клетками.

Судьба Т-лимфоцитов в печени

Не только гепатоциты, но и инфильтрирующие печень лимфоциты погибают в результате некроза, который может развиться не ранее чем через 18 ч после попадания лимфоцитов в печень. Гибель клеток может быть опосредована двумя механизмами: пассивный некроз клеток (passive activation cell death, PACD) и индуцированный некроз клеток (activation-induced cell death, AICD).

PACD связан с недостатком секреции ростовых факторов, приводящих к низкой экспрессии ко-стимулирующих молекул в печени. Интересно, что это может предотвращать гиперэкспрессию белков Bcl-2 или Bcl-XL.

AICD может быть связан с высокой концентрацией вирусных антигенов в печени. Он может быть охарактеризован как активный механизм, приводящий к изменению Т-клеточного репертуара после антигениндуцированной экспансии клона специфических Т-лимфоцитов, а также поддержанию механизмов аутотолерантности и элиминированию аутореактивных лимфоцитов. AICD - Fas-зависимый механизм, который поддерживает IL-2 и ингибирует циклоспорин. Интересно, что некоторые лимфоциты в популяции демонстрируют готовность к AICD. Особенно две субпопуляции лимфоцитов, преимущественно находящиеся в вирусинфицированной печени, CD8⁺ -лимфоциты и CD4⁺ Th1-клетки, которые склонны к развитию апоптоза, в основе которого лежат молекулярные механизмы избирательной чувствительности этих клеток к апоптозу. И наоборот, Th2-лимфоциты экспрессируют высокие уровни FAP-1, Fas-ассоциированную фосфатазу, которые, по-видимому, ингибируют сигналы Fas, увеличивая продолжительность жизни Th2-лимфоцитов.

Таким образом, после выполнения эффекторных функций лимфоциты, инфильтрирующие печень, подвергаются запрограммированной клеточной гибели. Предполагают, что приблизительно 2×10⁸ клеток, то есть 0,1% всех лимфоцитов, подвергается апоптозу в инфицированной HСV печени каждый день. Эти данные подразумевают, что внутрипеченочные лимфоциты постоянно заменяются рекрутированными из периферической крови лимфоцитами, и это способствует поддержанию иммунного гомеостаза в печени после вирусиндуцированной экспансии антигенспецифических Т-лимфоцитов.

РОЛЬ И ФУНКЦИИ СИНУСОИДАЛЬНЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ

Печень вовлечена в индукцию периферической толерантности. Об этом свидетельствуют аллотрансплантаты печени, преодолевающие барьеры МНС, развитие толерантности к последующим пересадкам органа от того же самого донора, а также развивающаяся внутрипортальная антигенная толерантность.

Хотя в печени находятся клетки многих типов, но только синусоидальные, то есть клетки Купфера и эндотелиальные синусоидальные клетки (LSEC), могут находиться в прямом контакте с клетками иммунной системы, попадающими в печень с кровотоком. Синусоидальные клетки физически отделяют гепатоциты от других клеток в синусоидальном просвете.

LSEC экспрессируют различные паттернраспознающие рецепторы, которые позволяют клеткам выполнять две функции:

Эти две функции LSEC необходимы для выполнения детоксикационной функции печени и для координации гепатоцеллюлярных функций, таких как синтез белков острой фазы.

LSEC экспрессируют рецепторы, которые характерны для клеток миелоидного происхождения (CD1, CD4, CD11с). Они конститутивно экспрессируют ко-стимулирующие молекулы, необходимые для межклеточного контакта с Т-лимфоцитами (CD80, CD86, CD40, МНС I, МНС II). При оценке фенотипа LSEC можно считать, что они скорее близки к незрелым дендритным клеткам, чем к типичным капиллярным эндотелиальным клеткам других органов. Межклеточное взаимодействие лейкоцитов облегчено вследствие узости просвета печеночных синусов, медленного синусоидального кровотока и конститутивной экспрессии адгезионных молекул на поверхности LSEC.

У LSEC есть конститутивная способность выполнять антигенпредставляющую функцию для CD4⁺ Т-лимфоцитов. МНС II класса ограничивают презентацию растворимых антигенов LSEC-клетками, что сопровождается активацией CD4⁺ Т-лимфоцитов и их пролиферацией, и продукцией цитокинов. Ограничение представления антигенов LSEC в сайте молекул МНС II класса находится под контролем факторов печеночного микроокружения (IL-10, эндотоксины и др.). Наивные CD4⁺ Т-лимфоциты, активированные антигеном, представленным LSEC-клетками, не дифференцируются в клетки Th1-типа, но продуцируют высокие уровни супрессивных медиаторов (IL-10). Таким образом, представление антигена LSEC способствует индукции толерантности в печени к CD4⁺ Т-лимфоцитам. Представление экзогенных антигенов молекулами МНС I класса, называемое кросс-презентацией, протекает с высокой интенсивностью в LSEC и приводит к активации и пролиферации преимущественно CD8⁺ Т-лимфоцитов и продукции ими соответствующих цитокинов. Однако наивные CD8⁺ Т-лимфоциты, активированные посредством кросс-презентации LSEC, утрачивают свою способность отвечать пролиферацией и продукцией эффекторных цитокинов (IFNγ) на специфический антиген и не способны развивать специфическую цитотоксичность. Кросс-презентация LSEC in vivo приводит к пролиферации антигенспецифических CD8⁺ Т-лимфоцитов и развитию антигенспецифической иммунной толерантности.

В отличие от профессиональных АПК, таких как дендритные клетки, LSEC - это новый тип представляющих клеток. Известно, что экспрессированный антиген LSEC индуцирует гораздо больший спектр функций, чем профессиональные подвижные дендритные клетки. Так, они обеспечивают иммунологический контроль гепатоцитов в случае присутствия эффекторных Т-лимфоцитов, индуцируют толерантность наивных Т-лимфоцитов к экзогенным антигенам, способствуя в результате защите гепатоцитов от локальных иммунных реакций и ингибированию развития системных иммунных реакций.

Печень - «место встречи» чужеродных антигенов и лейкоцитов, циркулирующих в крови. Лейкоциты периферической крови находятся в печени в течение дня в 300 раз дольше, чем в периферическом кровотоке. Среди многих функций печени необходимо выделить чисто иммунологические - элиминирование макромолекул и их метаболизм. Питательные вещества поступают из портальной венозной крови и далее используются в гепатоцеллюлярном метаболизме, но в то же время печени необходимо удалить токсические продукты и провоспалительные агенты, такие как эндотоксины или бактериальные продукты деградации, поступившие из кишечника, из крови, не индуцируя иммунных реакций на все эти антигены. Об индукции толерантности в печени известно достаточно. Однако необходимо выделить три основных момента, отражающих формирование в ней толерантности к экзогенному антигену:

Прямое дренирование пересаженного органа через портальную вену или непосредственная пересадка донорских клеток в портальную вену приводили к улучшению приживаемости трансплантата.

Это свидетельствует о том, что антиген, поступивший в печень, приводит к индукции толерантности локальных иммунорегулирующих механизмов. Стало понятным, что практически каждая популяция клеток в печени вовлечена в индукцию иммунной толерантности. Однако большинство исследований сконцентрировано на изучении индукции иммунной толерантности к трансплантационным антигенам, а не к растворимым антигенам. Хотя иммунная толерантность к пересаженным органам чрезвычайно важна для медицины, толерантность к растворимым антигенам имеет не меньшее значение в повседневной жизни.

Эндотелиальные клетки синусов печени - клетки-«мусорщики»

Эндотелиальные клетки синусов печени (LSEC) имеют стратегическое анатомическое расположение в печени и способствуют замедлению синусоидального кровотока. Они экспрессируют поверхностные рецепторы, которые связывают макромолекулы и патогенные агенты, находящиеся в печеночном кровотоке (табл. 2-2).

Эффективная связывающая способность рецепторов обусловливается очень быстрой их рециркуляцией в LSEC. Так, время миграции маннозного рецептора в эндосому клетки составляет 15 с. Приблизительно 25 000 молекул маннозного рецептора обнаружено на поверхности LSEC. Высокий уровень интернализации молекул маннозного рецептора LSEC делает их одними из самых эффективных клеток по связыванию растворимых молекул даже по сравнению с профессиональными АПК, такими как макрофаги и дендритные клетки. LSEC способны фагоцитировать частицы размером, не превышающим 200 нм. В отличие от маннозного рецептора LSEC, скавенджер-рецепторы (рецепторы-«мусорщики») не могут захватывать чужеродные антигены (аллергены) с использованием макропиноцитоза. Большинство рецепторов, представленных в табл. 2-2, являются паттернраспознающими и способны распознавать патоген-ассоциированные образы абсолютного большинства микроорганизмов (PAMPs). Это свидетельствует о том, что захват и переработка патогенных агентов, продуктов их жизнедеятельности и клеточных дериватов могут осуществляться LSEC. Так, связывание эндотоксина, поступившего в портальную венозную кровь из просвета кишечника, может быть осуществлено обоими типами клеток, купферовскими клетками и LSEC. Элиминирование конечных гликатионовых продуктов осуществляется главным образом через скавенджер-рецепторы LSEC. Кроме того, LSEC являются доминирующей клеточной популяцией, участвующей в элиминировании из циркуляции коллагена и гиалуроновой кислоты. Предполагается, что процесс рецепторного связывания молекул LSEC эндоцитозом приводит к выбросу продуктов деградации в пространство Диссе, где их захватывают микроворсинки гепатоцитов и подвергают гепатоцеллюлярному метаболизму. Трансцитоз захваченных лигандов LSEC был продемонстрирован для трансферрина и церулоплазмина так же хорошо, как для маннозы/галактозы. Эта экстраординарная способность LSEC осуществлять функции клеток-«мусорщиков» позволяет им доставлять гепатоцитам макромолекулы из кровотока. В некотором смысле LSEC доставляют продукты «питания» гепатоцитам, которые в дальнейшем предназначены для метаболизма и элиминирования с желчью.

Именно поэтому анатомический барьер LSEC между синусоидальной кровью и гепатоцитами главным образом ограничивает доступ лейкоцитов-«пассажиров» и тех макромолекул, которые не могут преодолеть трансэндотелиальный барьер без помощи LSEC. Есть данные о том, что ряд патогенных микроорганизмов, таких как вирус гепатита В и другие, могут использовать физиологическую функцию «мусорщика» LSEC и в итоге инфицировать гепатоциты. Особенностью иммунопатогенеза HBV-инфекции является неспособность в ряде ситуаций HBV распознавать определенные рецепторные молекулы LSEC, что значительно повышает его инфекционность (один вирус способен вызывать инфекционный процесс), патогенность и одновременно повышает роль LSEC в предотвращении заражения гепато цитов HBV.

Синусоидальные эндотелиальные клетки печени - сигнальные молекулы опасности

Экспрессия паттернраспознающих рецепторов позволяет LSEC функционировать не только как эффективным клеткам-«мусорщикам», но и как клеткам, способным распознавать патогенные агенты. Так, LSEC конститутивно экспрессируют толл-рецептор 4-го типа для распознавания патогенных микроорганизмов, что сопровождается продукцией большого количества вазоактивных медиаторов (IL-1, IL-6, MCP-1, IP-10, MIP-1α/β, NO, PGD₂ , PGE₂ , TXA₂ , PGF₂ , PGI₂). Секреция провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, и лиганды клеток-мишеней, которые экспрессируются как «молекулы опасности». Различные эффекторные функции NK могут быть выборочно активированы цитокинами, продуцируемыми клетками врожденного (IL-12, IL-15, IL-18) и адаптивного (IFNγ и IL-2) иммунитета. NK-клетки, по крайней мере частично, ответственны за развитие воспалительных реакций при аутоиммунных и вирусных гепатитах и иммунные реакции против опухолей. Они могут непосредственно вызвать повреждения клеток печени и активировать цитотоксические CD8⁺ Т-клетки и CD4^- Th1-клетки. купферовскими клетками и LSEC индуцирует секрецию белков острой фазы гепатоцитами, так как сами гепатоциты не способны отвечать развитием воспалительных реакций на контакт с патогенными микроорганизмами из-за недостатка паттернраспознающих рецепторов. Концентрации менее 10 пг/мл эндотоксина достаточно для активации LSEC in vitro, что подтверждает высокую чувствительность этих клеток к эндотоксину и свидетельствует об их чрезвычайно важной роли в индукции системных реакций врожденного иммунитета на патогенные микроорганизмы косвенной индукцией белков острой фазы. Кроме того, секреция растворимых медиаторов клетками Купфера и LSEC после их обработки эндотоксином вызывает гликогенолиз в гепатоцитах. Секреция нитроксидных радикалов (NO) LSEC потенцирует проведение сигналов ионами кальция в микроокружении гепатоцитов. Секреция растворимых медиаторов эндотелиальными клетками способствует координации гепатоцеллюлярных клеточных функций. Кроме того, усиление экспрессии адгезионных молекул, таких как Р-селектин или CD54, после контакта с эндотоксином является результатом усиления адгезии лейкоцитов-«пассажиров», тромбоцитов к LSEC и способствует развитию воспалительных реакций. Скоординированная работа синусоидальных клеточных популяций и лейкоцитов-«пассажиров», особенно нейтрофилов, необходима для быстрого и эффективного элиминирования патогенных микроорганизмов. С другой стороны, эндотоксин - физиологический элемент портального венозного кровообращения, результат бактериального транспорта из кишечника. Обе клеточные популяции, купферовские клетки и LSEC, как установлено, обладают низкой иммунологической реактивностью по отношению к эндотоксину, что связано с уникальным микроокружением печени. Это гарантирует, что физиологические концентрации эндотоксина не индуцируют активацию и секрецию провоспалительных цитокинов LSEC и купферовскими клетками и, таким образом, не индуцируют синтез белков острой фазы и локальных воспалительных реакций в печени. Конститутивное поступление из кишечника бактериальных продуктов деградации в портальный венозный кровоток способствует формированию уникальной микросреды в печени. Эндотоксин способствует не только синтезу растворимых провоспалительных цитокинов эндотелиальными клетками, но и секреции противовоспалительных иммуносупрессивных медиаторов, таких как IL-10, TGFβ и PGE₂. Это микроокружение скорее супрессирует, чем стимулирует развитие иммунного ответа в печени.

Взаимодействие синусоидальных эндотелиальных клеток с лейкоцитами-«пассажирами»

LSEC используют свое стратегическое положение в синусах печени для межклеточного контакта с лейкоцитами-«пассажирами», находящимися в крови, проходящей через печень. Как было показано выше, этому взаимодействию способствует малый диаметр печеночных синусов и медленный, неустойчивый синусоидальный кровоток. Исследования макрососудистых эндотелиальных клеток in vitro показали, что первоначальные взаимодействия лейкоцит-эндотелий зависят от взаимодействия углеводных лигандов с молекулами семейства селектинов (такими как CD62Е), экспрессируемыми эндотелиальными клетками, что приводит к снижению скорости движения лейкоцитов и последующему их роллингу по эндотелиальным клеткам. Углеводные лиганды для селектинов встречаются в структуре разнообразных белков. Поскольку непосредственный контакт лейкоцитов с эндотелиальными клетками в печеночном синусоиде уже существует, то кажется, что нет потребности и в экспрессии CD62Е. Однако антигенная стимуляция LSEC эндотоксином в высоких концентрациях приводит к экспрессии CD62Е in vivo, хотя никакого регулирования экспрессии гена CD62Е при обработке LSEC эндотоксином in vitro не выявлено. Как уже упоминалось, участие в регулировании провоспалительных реакций CD62Р является патофизиологическим и чрезвычайно важным в индукции нейтрофил-опосредованного повреждения печени вследствие продукции повышенных концентраций эндотоксина. Дальнейшая секреция хемокинов позволяет LSEC привлечь Т-лимфоциты в печень. Разнообразие хемокиновых рецепторов, экспрессируемых Т-лимфоцитами, подразумевает существование многих субпопуляций Т-лимфоцитов, отличающихся функциональными характеристиками. Секреция определенного хемокина LSEC способствует привлечению в очаг воспаления Т-лимфоцитов с соответствующими функциями при вирусных инфекциях печени.

Прижизненная микроскопия печени выявила конститутивное взаимодействие LSEC с лейкоцитами-«пассажирами» in vivo. Это может быть связано с конститутивной стимулирующей экспрессией адгезионных молекул, таких как CD54 (ICAM-1) и CD106 (VCAM-1) LSEC, которые, как известно, стабилизируют адгезионные эффекты лейкоцитов к эндотелиальным клеткам. Конститутивная экспрессия адгезионных молекул LSEC, возможно, связана с наличием бактериальных продуктов деградации в крови портальной вены. Так, у мышей при отсутствии бактериальной стимуляции установлен гораздо более низкий уровень экспрессии CD54 и CD106 синусоидальными клетками печени, которые возвращаются к нормальным уровням после бактериальной колонизации кишечника. Кроме того, описаны морфологические изменения LSEC после обработки эндотоксином, которые приводили к сужению синусоидального диаметра и способствовали более прочному межклеточному контакту. В итоге уникальное печеночное микроокружение способствует конститутивному взаимодействию LSEC с лейкоцитами-«пассажирами» по всей видимости, это связано с иммунорегулирующей функцией LSEC. Установлено, что LSEC могут способствовать метастазам в печень клеток меланомы и лимфомы. Взаимодействие опухолевых клеток с LSEC осуществляется через паттернраспознающие рецепторы, что в итоге приводит к локальной секреции растворимых медиаторов, усиливающих экспрессию адгезионных молекул CD54 и CD106, и тем самым способствует развитию печеночных метастазов. Кроме того, за счет продукции NO и активных форм кислорода LSEC участвуют и в развитии противоопухолевых механизмов. Однако интимные противоопухолевые локальные межклеточные взаимодействия в синусоидах печени изучены недостаточно.

Поверхностные рецепторы синусоидальных эндотелиальных печеночных клеток

По сравнению с фенотипом эндотелиальных клеток других органов LSEC имеют существенные отличия (табл. 2-3).

LSEC экспрессируют достаточно большое количество рецепторов миелоидного происхождения, таких как CD1, CD4, CD11с. Однако тщательное исследование показало, что LSEC не являются клетками, производными костного мозга, а, по всей видимости, созревают в печени. Учитывая гемопоэтическую функцию фетальной печени, нельзя исключить возможность заселения печени стволовыми клетками.

Кроме того, LSEC конститутивно экспрессируют молекулы МНС I и II классов и другие ко-стимулирующие молекулы, необходимые для успешного взаимодействия с Т-лимфоцитами. Экспрессия CD11с и CD4 LSEC делает их более схожими с незрелыми дендритными клетками, чем с эндотелиальными клетками других органов. Развивающееся воспаление вследствие острой печеночной недостаточности или ишемии/реперфузии сопровождается массивной экспрессией адгезионных молекул (CD54) или ко-стимулирующих молекул CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) LSEC. Это подтверждает, что LSEC обладают дополнительными возможностями межклеточного контакта с Т-лимфоцитами в синусах печени.

Роль синусоидальных эндотелиальных печеночных клеток в антигеннеспецифическом повреждении печени

Внутривенная инъекция конканавалина А (Con A) - митогена Т-лимфоцитов, приводит к мгновенному повреждению печени с возможным смертельным исходом у мышей. Местная секреция активированными Т-лимфоцитами, а также другими клетками печени TNFα является ведущим механизмом повреждения печени, поскольку введение антител к TNFα нейтрализует повреждающие эффекты этого цитокина. Так, у мышей с нокаутом TNF-R введение Con А не приводило к повреждению печени. Было показано, что внутривенное введение Con А приводило к ограниченной активации LSEC, которые обладали дополнительными стимулирующими функциями Т-лимфоцитов и которые продуцировали TNFα. Это предполагает, что медиаторы Т-лимфоцитов повреждают LSEC и способствуют ускоренному повреждению печени вследствие нарушения ее анатомического барьера и последующего неограниченного поступления активированных Т-лимфоцитов к гепатоцитам. Кроме того, нарушения синусоидальной микроциркуляции кровообращения способствуют развитию тромбоза и гипоксии ткани, что приводит к дальнейшему повреждению печени. Печеночная недостаточность также развивалась, когда мышам внутривенно вводили антитела к CD95, что способствовало развитию апоптоза. Считается, что антитела к CD95 непосредственно связываются с гепатоцитами и это приводит к развитию мгновенного гепатоцеллюлярного апоптоза и повреждению печени. Однако ультраструктурный анализ показал, что на ранних этапах, после того как антитела к CD95 внутривенно введены мыши, они не связываются с гепатоцитами, но адсорбируются исключительно на поверхности LSEC. В экспериментах установлено, что апоптоз LSEC, экспрессирующих CD95, и развитие синусоидального тромбоза предшествовали гепатоцеллюлярному апоптозу. Это демонстрирует, что апоптоз гепатоцитов явление вторичное, развивающееся после инъекции антител к CD95, и следует за первоначальным повреждением LSEC. Именно поэтому активация иммунокомпетентных клеток LSEC приводит к усилению их эффекторных функций, то есть секретируются провоспалительные цитокины, которые должны находиться под строгим контролем, чтобы избежать повреждений печени.

Кроме того, LSEC защищены от непосредственного повреждения печени провоспалительными цитокинами. LSEC также экспрессируют «рецепторы смерти», такие как CD95L и TRAIL. Экспрессия этих поверхностных рецепторов, как показали исследования in vitro, способствует гибели лимфоцитов по механизму апоптоза. Однако окончательно не установлено, происходит ли индукция апоптоза лейкоцитов-«пассажиров» LSEC в физиологических или патофизиологических условиях.

Презентация антигена синусоидальными эндотелиальными печеночными клетками CD4⁺ Т-лимфоцитам

Экспрессия молекул МНС II класса для представления антигена CD4⁺ Т-лимфоцитам, как полагают, ограничена профессиональными АПК, такими как дендритные клетки, макрофаги и В-лимфоциты. Однако исследования последних лет показали, что активированные клетки синусов печени способны экспрессировать МНС II класса для представления антигена ограниченному количеству CD4⁺ Т-лимфоцитов, но такие различия отсутствовали при представлении антигена купферовскими клетками или LSEC. Монокультура LSEC продемонстрировала in vitro способность экспрессировать молекулы МНС II класса в ограниченном количестве для представления антигена Т-лимфоцитам и секрецией цитокинов, способствующих пролиферации и дифференцировке CD4⁺ Т-лимфоцитов. Представление антигена LSEC было почти столь же эффективно, как и представление антигена клетками Купфера или АПК костного мозга. Именно поэтому имеет место ограничение экспрессии молекул МНС II класса LSEC. Установленная способность LSEC представлять антиген CD4⁺ Т-лимфоцитам позволяет сделать предположение, что им присуща функция иммунного наблюдения и контроля, то есть представление антигена LSEC может индуцировать развитие иммунной реакции или толерантности в печени.

Представление антигена LSEC в сайте МНС II класса находится под эффективным контролем уникального печеночного микроокружения. Эндотоксин как физиологический агент портальной венозной крови вызывает секрецию противовоспалительного цитокина IL-10 купферовскими клетками. Отрицательная ауторегулирующая обратная связь секреции IL-10 купферовскими клетками приводит, по-видимому, к длительной секреции IL-10 в перипортальное пространство, распределению его вдоль печеночных синусов и к мощному снижению экспрессии ко-стимулирующих молекул LSEC. В итоге это приводит к ингибированию распознавания антигена. Кроме того, контакт LSEC с эндотоксином при отсутствии другого клеточного микроокружения приводит к снижению экспрессии молекул МНС II класса и других ко-стимулирующих молекул. Однако контроль антигенпрезентирующих функций LSEC печеночным микроокружением по-прежнему не может полноценно объяснить индукцию толерантности в печени.

Подобно дендритным клеткам, LSEC способны первыми активировать CD4⁺ Т-лимфоциты, то есть активация осуществляется цитокинами, секретируемыми наивными Т-лимфоцитами до их встречи с антигеном. В то же время для созревания дендритных клеток необходимы специфичные сигналы от высокоспециализированных компонентов лимфоидной ткани для выполнения функций АПК. LSEC не требуется созревание или миграция в лимфоидную ткань для выполнения функции АПК. Эта функция LSEC осуществляется неподвижными клетками, которые конститутивно выполняют функцию АПК, что не присуще эндотелиальным клеткам других органов. Капиллярные эндотелиальные клетки кожи или кишечника не способны выполнять антигенпредставляющую функцию наивным Т-лимфоцитам без предварительной активации IFNγ. В отличие от представления антигена дендритными клетками, CD4⁺ Т-лимфоциты, активированные антигеном, представленным LSEC, не дифференцируются в эффекторные клетки Th1 CD4⁺ Т-лимфоциты, а приобретают иммунорегулирующий фенотип. CD4⁺ Т-лимфоциты, активированные LSEC, секретируют большое количество IL-4, IL-10 посредством TCR, который рационально снижает иммунные реакции, опосредованные Т-лимфоцитами. Таким образом, представление антигена LSEC наивным CD4⁺ Т-лимфоцитам скорее сопровождается негативной регуляцией развития иммунного ответа по Th1-типу, и в то же время имеет место активация развития иммунного ответа по Th2-типу преимущественно с синтезом антител. Действительно, неэффективные клеточные иммунные реакции достаточно часто выявляются при персистирующих вирусных инфекциях печени, несмотря на присутствие специфических антител.

Эндотелиальные клетки из других участков макроорганизма одинаково не в состоянии обеспечить эффективную дифференцировку наивных CD4⁺ Т-лимфоцитов в сторону Th1-типа. Важно отметить, что эти эндотелиальные клетки не могут самостоятельно обеспечить полноценное эффективное развитие иммуномодулирующих реакций, поскольку эндотелиальные клетки или Т-лимфоциты должны быть предварительно стимулированы антигеном для эффективного функционального взаимодействия и последующего развития иммунных реакций. Установлено, что внутрипортальное введение антигена приводит к активации Т-лимфоцитов по Th2-типу с преимущественной секрецией IL-4, IL-10, что позволяет предположить, что именно LSEC, а не эндотелиальные клетки других органов вовлечены в индукцию толерантности при интрапортальном попадании антигена.

Презентация экзогенных антигенов молекулами МНС I класса CD8⁺ Т-лимфоцитов синусоидальным эндотелиальным печеночным клеткам

Цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты играют одну из ключевых ролей для обеспечения эффективной иммунной защиты макроорганизма от патогенов, использующих внутриклеточный тип паразитирования и развития опухолевых клеток. Представление антигена МНС I класса CD8⁺ Т-лимфоцитам, как полагали, ограничено теми антигенами, которые синтезированы de novo в пределах той же самой клетки. Хотя это учитывает иммунный контроль CD8⁺ Т-лимфоцитов за паренхиматозными клетками, трудно представить, как «профессиональные» АПК, не контаминированные патогенными микроорганизмами или не преобразованные в неопластическую клетку, могли обеспечивать эффективные иммунологические защитные реакции посредством CD8⁺ Т-лимфоцитов. Таким образом, для представления экзогенных антигенов требуется участие молекул МНС I класса (кросс-презентация). Как показали исследования, кросс-презентация дендритными клетками необходима для развития эффективного CD8⁺ Т-клеточного иммунного ответа против возбудителей вирусных инфекций, хотя не зараженные вирусами клетки нуждаются в кросс-презентации миелоидных АПК для индукции иммунного ответа. Именно поэтому супрессия LSEC может эффективно преодолеваться механизмами кросс-презентации чужеродных антигенов молекулами МНС I класса CD8⁺ Т-лимфоцитам. Кросс-презентация LSEC характеризуется многими особенностями: эффективным поглощением чужеродного антигена рецептор-опосредованным эндоцитозом, транспортировкой антигена из эндосомы в цитозоль для протеосомальной деградации, ТАР-зависимым помещением переработанных пептидов в de novo синтезированные молекулы МНС I класса и последующей их транспортировкой на клеточную поверхность. LSEC необходимо не более 60-120 мин для завершения кросс-презентации и последующей транспортировки загруженных пептидов в сайт молекулы МНС I класса на поверхность клетки. Мелкие антигены, размером менее 1 нм, способны индуцировать кросс-презентацию LSEC для развития иммунного ответа в печени.

Индукция иммунной толерантности CD8⁺ Т-лимфоцитов синусоидальными эндотелиальными печеночными клетками

LSEC не только кросс-презентируют антиген эффекторным CD8⁺ Т-лимфоцитам, но также и активируют наивные CD8⁺ Т-лимфоциты. После кросс-презентации LSEC наивные CD8⁺ Т-лимфоциты секретируют цитокины и начинают процессы пролиферации in vitro. Однако антигенспецифическая рестимуляция этих Т-лимфоцитов показывает, что они утрачивают способность секретировать такие эффекторные цитокины, как IL-2, IFNγ, и утрачивают свои цитотоксические функции. In vivo было продемонстрировано, что LSEC кросс-презентировали антиген наивным CD8⁺ Т-лимфоцитам вне лимфоидной системы. Итак, отдаленная активация наивных CD8⁺ Т-лимфоцитов предполагает, что она может произойти только исключительно в специфической среде микроокружения.

Вследствие активации LSEC кросс-презентацией наивные CD8⁺ Т-лимфоциты начинают локальную пролиферацию в печени. Однако исход кросс-презентации LSEC in vivo индуцирует системную иммунологическую толерантность. Подобно CD8⁺ Т-лимфоцитам, стимулированным кросс-презентацией LSEC in vitro, CD8⁺ Т-лимфоциты in vivo утрачивают способность секретировать эффекторные цитокины и обеспечивать развитие цитотоксических функций против клеток-мишеней. Удаление антигенспецифических CD8⁺ Т-лимфоцитов может иногда встречаться, но не является основным механизмом индукции толерантности LSEC.

ВНУТРИПЕЧЕНОЧНЫЕ NKT-КЛЕТКИ

В печени находятся различные популяции лимфоцитов, характеризующихся специфическими фенотипами, цитотоксическими эффектами, секрецией цитокинов. Эволюционно эти внутрипеченочные лимфоциты специально отобраны и адаптированы для выполнения уникальных иммунологических функций. Иммунная система печени содержит компоненты как врожденного, так и адаптивного иммунитета, хотя взаимодействия между ними четко не определены. Тем не менее значительная часть лимфоцитов печени (в том числе NK-клетки и Т-клетки), относящихся не только к врожденному иммунитету, способны выполнять функции, присущие клеткам врожденного иммунитета.

Натуральные киллеры (NKT-клетки) - субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующих как α/β-TCR, так и рецепторы, экспрессируемые NK-клетками. Классические молекулы МНС I и II классов в первую очередь участвуют в представлении антигенных пептидов обычным CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеткам, которые отвечают за адаптивный иммунный ответ. Молекулы MHC I класса, как CD1d молекулы, напротив, представляют липидные антигены NKТ-клеткам, которые ведут себя подобно клеткам, участвующим в развитии реакций врожденного, а не адаптивного иммунного ответа. NKТ-клетки отличаются от обычных Т-лимфоцитов своим развитием, дифференцировкой и экспрессией поверхностных молекул. NKТ-клетки имеют весьма искаженный TCR-репертуар с консервативной Vα14-Jα281 у мышей и гомологичной молекулой Vα14-JαQ в организме человека. Сразу после активации NKТ-клетки секретируют большое количество IL-4 и IFNγ и способны развивать киллерные эффекты по отношению к клеткам-мишеням. NKТ-клетки также, предположительно, играют важную роль во врожденном или раннем иммунном ответе при отторжении злокачественных опухолей, ингибировании инфекций и могут быть индукторами аутоиммунных реакций.

Распознавание антигена NKТ-клетками

NKТ-клетки, распознающие гликолипиды, представленные неполиморфными молекулами MHC I класса, как CD1d молекулы, составляют большинство NKТ-клеток у мышей. Они также являются существенной популяцией клеток у людей, но составляют лишь небольшую часть клеток с TCR α/β+ NKR^- P1A+-клеток. Ассоциация молекулы CD1d с основными субпопуляциями лимфоцитов является уникальной среди молекул МНС I класса и/или среди неклассических молекул МНС I класса. Молекулы CD1 были первыми антигенами, идентифированными с помощью моноклональных антител. Семейство белков CD1 включает линейку клеточно-поверхностных гликопротеинов, связанных с МНС-кодированными антигенпредставляющими молекулами. В отличие от высокополиморфных классических молекул МНС I и II классов, CD1 молекулы являются неполиморфными. CD1-белки включают два подсемейства: CD1a, -b и -с (группа 1) и CD1d (группа 2). У некоторых грызунов, в том числе мышей и крыс, гомологи CD1А, -В и -С были удалены, и ген CDID дублируется CD1D1, CD1D2. Аналогом человеческой CD1d молекулы является мышиная CD1d1 молекула, в то время как CD1d2 не приводят к увеличению функциональных белков у некоторых линий мышей. Кроме того, CD1d2 не может поддерживать развитие NKТ-клеток. Обе молекулы, мышиная CD1dl и человеческая CD1d, будут в дальнейшем именоваться как CD1d. CD1d в большинстве случаев экспрессируется как β₂ -микроглобулин, который связан с мембранным гликопротеином. Способность Т-клеток распознавать эту уникальную CD1d форму не была продемонстрирована, однако было показано, что поверхностная экспрессия мышиной CD1d абсолютно зависит от β₂ -микроглобулина, по крайней мере, в отношении линий тимоцитов и лимфоцитов.

Вся область неполиморфных CD1d сохранилась, несмотря на эволюционные изменения у млекопитающих. Кристаллическая структура мышиной CD1d показывает, что CD1d взаимодействует в основном с молекулами МНС I класса, а не МНС II класса.

Ткани, экспрессирующие CD1d

Мышиная CD1d мРНК экспрессируется несколькими тканями (печень и кишечник, тимус, селезенка, лимфатические узлы, гемопоэтические предшественники Т- и В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток). У человека CD1d экспрессируют кишечник, печень, поджелудочная железа, почки, матка, ткани яичка, миндалины, некоторые В-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги. Это было подтверждено окрашиванием эпителиальных клеток кишечника anti-CD1d антителами и экспрессией мРНК клетками Пеннета мышиной тонкой кишки. Однако экспрессия CD1d кишечником является спорной. Поверхностная экспрессия CD1d корковыми тимоцитами была подтверждена FACS-окрашиванием.

Презентация антигена CD1d-клетками

Распознавание антигена, презентируемого CD1d-молекулами, является важной эволюционно сформировавшейся функцией млекопитающих. Молекулы CD1а, CD1b, CD1c способны распознавать липидные и гликолипидные компоненты бактериальной клеточной стенки микобактерий. Липидные антигены, такие как миколовые кислоты, фосфоинозитиды, гликолипиды, презентируются ограниченным количеством CD1b Т-лимфоцитов. И эти Т-лимфоциты способны дифференцированно распознавать антигены. CD1b также могут презентировать гликолипиды, компоненты ганглиозидов.

Vα14TCR трансгенных мышей, α-галактозилцерамид (α-GalCer) были идентифицированы как антигены, которые могут активировать NKТ-клетки. Кроме них, CD1d-молекулы могут представлять синтетические пептиды, клеточный гликозилфосфатидилинозитол. α-GalCer первоначально был извлечен из морских губок и идентифицирован как фактор, способный ингибировать метастазы в печени. α-GalCer может избирательно активировать NKТ-клетки мышей и человека. Несомненно, что стимуляция клеток периферической крови α-GalCer приводит к экспансии NKТ-клеток с инвариантным Vα24TCR и продукции большого количества цитокинов. Ограниченное количество CD1d, распознающих α-GalCer, является общей и специфической функцией Т-лимфоцитов, экспрессирующих BV11 и AV24AJ18 цепи TCR.

Опосредованное распознавание представленной α-GalCer CD1d NKТ-клетками является чрезвычайно консервативной, эволюционно сформировавшейся функцией млекопитающих.

Инвариантные Т-клеточные рецепторы, экспрессированные NKТ-клетками человека и мыши, удивительно одинаковы в механизмах распознавания гликолипидов. В дальнейшем как мышиные, так и человеческие NKТ-клетки обладают одинаковой реактивностью в отношении представленных галактозилцерамидами. Структурные требования для распознавания галактозилцерамидов CD1-ограниченными NKТ-клетками были изучены, установлено, что только один из двух гидрофобных карманов CD1d антигенсвязывающей канавки может быть заполнен антигеном, чтобы стимулировать развитие Т-клеточного иммунного ответа.

В дополнение к α-GalCer установлено несколько дополнительных молекул-кандидатов, которые могут выполнять роль лигандов, способных связываться с молекулой CD1d. Пептиды и пептидсвязывающие мотивы, взаимодействующие с CD1d, были идентифицированы с использованием случайно полученных библиотечных наборов фаговых пептидов. Синтетические пептиды с оптимальной длиной 15-20 аминокислот с гидрофобным мотивом связываются с CD1d, в результате был генерирован CD1d-ограниченный Т-клеточный ответ. Кроме того, мышиные CD1d-ограниченные лимфоциты могут быть получены и в естественных условиях путем иммунизации мышей комбинацией плазмид, кодирующих куриный овальбумин, мышиных CD1d и ко-стимулирующих молекул. Овальбумин распознается активированными клетками и имеет типичный CD1d связывающий мотив. Распознающие CD1d-реактивные и белокспецифические CD8⁺ Т-лимфоциты не являются NKТ-клетками.

Кроме того, естественный лиганд мышиных CD1d1 был изучен с помощью масс-спектрометрии и метаболической радиометрии. Таким образом, было доказано, что клеточный гликозилфосфатидилинозитол (GPI) является основным природным лигандом мышиных CD1d. Этот тип соединения, однако, не является антигенспецифичным для NKТ-клеток, что, по крайней мере, может быть расценено как исключение из правил.

NKТ-клетки человека

NKT-клетками человека изначально были определены двойные негативные CD4-лимфоциты с характеристиками, схожими с мышиными NKТ-клетками. Обе субпопуляции взаимодействуют с CD1d человека, секретируют высокие уровни IL-4 и IFNγ при стимуляции, обладают выраженной цитотоксичностью против опухолевых клеток. Отдельные популяции NKT-клеток человека экспрессируют инвариантную TCR α-цепь Vα24, гомологичную мышиной Vα14, которая в паре с Vβ11 TCR β-цепью тесно связана с мышиной Vβ8.2. Средняя частота встречаемости Vα24⁺ Vβ11⁺ клеток среди лимфоцитов периферической крови около 0,2% NKT-клетки человека активируются и увеличиваются количественно при культивировании с α-GalCeг-импульсными дендритными клетками. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека с α-GalCer и IL-2 также приводило к увеличению количества NKТ-клеток с инвариантным TCR и секрецией большого количества цито-кинов. Человеческие NKТ-клетки могут узнавать мышиные CD1d и наоборот, что указывает на их высокую консервативную специфичность.

В большинстве исследований до сих пор NKT-клетки выявляются с помощью антител к Т-клеточным маркерам, таким как CD3, специфическим TCR Vα24 или Vβ11 и NK-клеточным маркерам, таким как CD56, CD57 и CD161 (NKR-P1A). В настоящее время человеческие NKT-клетки периферической крови идентифицируют по их способности экспрессировать рецепторы с Vα24/Vβ11 TCR и CD56 NK-ассоциированным рецептором. Они в основном дважды негативны и/или в некоторых случаях могут экспрессировать незначительное количество CD8 или CD4. Интересно, что небольшое количество клеток CD8 экспрессируют TCR с αα-цепями, а не с αβ-цепями. Мышиные NK-клетки, экспрессирующие маркеры NK1.1 и αβ TCR, характеризуются как NKT-клетки. CD161 является копией мышиного NK1.1, который также используется для идентификации NKT-клеток человека. CD161 Т-лимфоциты с инвариантным TCR Vα24 пролиферируют в ответ на α-GalCer CD1d. Однако по-прежнему идентификация NKT-клеток человека остается спорной. Например, большое количество клеток с Vα24 или Vβ11 являются скорее обычными Т-лимфоцитами, а не NKT-клетками. Кроме того, экспрессия CD161 не является абсолютным маркером NKT-клеток человека, так как более 10% Т-лимфоцитов экспрессируют этот маркер. CD1d-реактивные лимфоциты обладают разнообразными специфичностями. Остается возможным, что клетки с V-областями, кроме Vα24/Vβ11, могут быть активированы α-GalCer CD1d. Поскольку нет абсолютных специфических маркеров в идентификации NKT-клеток, то существуют и трудности в интерпретации и сравнении различных исследований. Например, было предложено идентифицировать NKT-клетки человека как Vα24+ Vβ11+ дважды негативные (CD4CD8^-) Т-лимфоциты или CD4⁺ . То же самое исследование предполагает, что большинство Vα24⁺ были CD161⁺ независимо от фенотипа CD4. В другом исследовании NKT-клетки человека были определены как Vα24⁺ Vβ11⁺ CD56⁺ клетки с преобладанием CD8⁺ или были двойными негативными, в то время как популяция клеток, экспрессирующих CD161 (NKR-P1A) c Vα24⁺ Vβ11⁺ , была чрезвычайно гетерогенной. Доступность тетрамерного молекулярного комплекса CD1d с α-GalCer позволила осуществить прямую идентификацию CD1d-ограниченных NKT-клеток, основанную на их TCR-специфичности, а не на других молекулах. Исследователи получили CD1d-тетрамер продукт бакуловируса, экспрессирующий рекомбинантный CD1d белковый комплекс с α-GalCer, позволяющий определить CD1d реактивные клетки в периферической крови и печени. На здоровых донорах было показано, что частота встречаемости CD1d-α-GalCer-ограниченных NKT-клеток человека среди лимфоцитов периферической крови составляет 0,07%. Эти клетки экспрессируют высокие уровни CD3 и TCRαβ и несут инвариантный TCRVα24, соединенный с TCRVβ11. Однако менее чем 50% этих клеток экспрессируют маркеры NK-клеток - CD56, один из неспецифических маркеров, определяемых в комбинации с Vα24/Vβ11 для идентификации NKT-клеток. Незначительная субпопуляция CD1d-α-GalCer - NKT-клетки человека периферической крови - включает особую субпопуляцию CD8⁺ -лимфоцитов в дополнение к субпопуляции CD4⁺ -лимфоцитов и дважды негативных Т-лимфоцитов (CD4CD8).

Индукция Th1/Th2-цитокинов

CD4⁺ Т-хелперы дифференцируются на две принципиально разнородные субпопуляции, Th1-клетки и Th2-клетки, секретирующие про- и противовоспалительные цитокины. Созревание и последующая дифференцировка T-хелперов находится под контролем цитокинов, таких как IL-12, IL-18, IFNγ для Th1-клеток и IL-4 для Th2-клеток. Баланс между этими двумя субпопуляциями играет важную роль в про-грессировании инфекционных, аллергических, аутоиммунных заболеваний. Роль NKT-клеток в индукции дифференцировки Thl/Th2 связана с их способностью продуцировать цитокины. Поскольку IL-4 и IFNγ оказывают противоположный эффект на дифференцировку Th2-клеток, то активация NKT-клеток способствует развитию иммунного ответа либо по Th1- либо по Th2-пути. Однако существует много противоречивых данных о Th1/Th2-пути активации NKТ-клеток.

NKT-клетки продуцируют IL-4 в ответ на TCR-лигирование и вовлечены в Th2-ответ с повышением уровней сывороточного IgE. Повторное введение мышам α-GalCer индуцирует Т-клетки селезенки к секреции IL-4 и IL-10, но одновременно резко снижается уровень IFNγ. Лечение мышей с α-GalCer приводит к быстрой активации NKT-клеток и продукции ими цитокинов IL-4 и IFNγ. Повторная стимуляция NKТ-клеток приводит к поляризации иммунных реакций, включая усиление секреции IL-4 и значительное увеличение в сыворотке крови общего IgE. Введение α-GalCer защищает мышей от экспериментально вызванного Thl-типа колита, сахарного диабета и экспериментального аллергического энцефаломиелита. Эти данные свидетельствуют о том, что стимуляция NKТ-клеток способствует развитию иммунного ответа по Th2-типу.

С другой стороны, CD1d-дефицитные мыши могут развивать типичный Th2 иммунный ответ, что поддерживает гипотезу о том, что IL-4-секретирующие NKТ-клетки не нужны для Th2-ответа. Кроме того, с помощью Jα281 NKT-дефицитных мышей было показано, что Vα14 NKТ-клетки не требуются для индукции антигенспецифического IgE-ответа, вызванного иммунизацией яичным альбумином или Nippostrongylus brasiliensis. Напротив, исследование показало, что Vα14 NKТ-клетки подавляют секрецию антигенспецифических IgE. Лиганд-активированные Vα14 NKТ-клетки также ингибируют дифференцировку Th2-клеток. Индукция продукции IL-4 и последующее активирование Th2-ответов в лимфатических узлах против Leishmania major не зависит от CD4⁺ NKT-клеток у мышей. В целом эти данные указывают на то, что развитие Th2-ответа не требует непосредственного участия NKT-клеток. Кроме того, эти данные также свидетельствуют о том, что в некоторых случаях они могут и препятствовать индукции и подавлять Th2-клеточную дифференцировку.

Имеются данные о том, что NKT-клетки могут способствовать развитию иммунного ответа по Th1-типу. Так, NKT-клетки участвуют в дифференцировке Th1-клеток против Toxoplasma gondii. Они также могут вызвать повреждения печени, подавляют печеночные метастазы при В16 меланоме, предположительно, вследствие развития иммунного ответа по Th1-типу. С другой стороны, NKT-клетки подавляют Th1-ассоциированный клеточный иммунитет в некоторых системах. Так, недавно было сообщено, что NKT-клетки могут способствовать дифференцировке в Th1- или Th2-клетки после стимуляции α-GalCer при соответствующей экспрессии ко-стимулирующих молекул. Однако если NKТ-клетки секретируют одновременно IL-4 и IFNγ, то имеются определенные трудности в поляризации иммунного ответа.

Противоопухолевая активность NKТ-клеток

α-GalCer изначально описывался как сильный противоопухолевый агент. Действительно, у мышей α-GalCer стимулирует Vα14 NKТ-клетки к секреции большого количества IFNγ и IL-4, тем самым обеспечивая развитие цитолитических и противоопухолевых эффектов in vivo. Vα14 NKТ-клетки также являются и первичной целью IL-12 в IL-12-опосредованном отторжении опухоли. В модели опухоли с α-GalCer стимулированная секреция IFNγ NKT-клетками зависит от IL-12, продуцируемого CD40/CD40-лигандзависимым взаимодействием NKT-клеток с дендритными клетками. Мыши с Jα281 NKT-дефицитом утрачивали противоопухолевую активность, индуцированную или IL-12, или α-GalCer лечением. Дендритные клетки с α-GalCer индуцируют мощный противоопухолевый цитотоксический ответ с активацией конкретных Vαl4 NKT-клеток, в результате наступает ингибирование метастазов опухоли in vivo. Кроме того, α-GalCer-инъекции в опухоли на мышах показали значительное увеличение уровня цитотоксичности, опосредованной NK-клетками. NK-клетки обеспечивают достаточную IL-12 опосредованную антиопухолевую активность. Имеются сообщения о том, что NK- и NKТ-клетки функционально связаны между собой. Так, NKТ-клетки посредством α-GalCer активируют NK-клетки in vitro. Эта активация NK-клеток зависит от секреции IFNγ NKТ-клетками и продукции IL-12 антигенпредставляющими клетками. Кроме того, активация, инициированная NKТ-клетками, распространяется, как правило, также на В-клетки и Т-лимфоциты. α-GalCer-активированные NKТ-клетки секретируют IFNγ, что приводит к активации механизмов как врожденной противоопухолевой цитотоксичности NK-клеток, так и адаптивной противоопухолевой реакции CD8⁺ Т-клеток с последующим ингибированием метастазирования опухоли в печени.

У человека Vα24 NKТ-клетки, активированные α-GalCer, способны обеспечивать развитие перфорин-опосредованных киллерных эффектов в отношении различных опухолевых клеточных линий. Однако другие исследования показывают, что α-GalCer-активированные NKТ-клетки не обладают выраженными цитотоксическими эффектами в отношении опухолевых клеток. Скорее всего, они способны потенцировать киллерные эффекты NK-клеток in vivo. NKТ-клетки могут погибать в течение нескольких часов после α-GalCer-активации. Таким образом, более вероятно, что эффект α-GalCer на опухолевые метастазы в естественных условиях обусловлен цитокинами, которые активируют NK-клетки и другие типы клеток с цитотоксическими функциями, а не прямым уничтожением клеток-мишеней. Адгезионные молекулы ICAM-1/LFA-1, а также взаимодействие CD44/гиалуроновая кислота играют важную роль в эффекторной фазе Vα24 NKТ-опосредованной клеточной цитотоксичности.

Роль NKТ-клеток при инфекции

Роль NKТ-клеток в защите макроорганизма от инфекций в настоящее время интенсивно изучается. Установлено, что Mycobacterium bovis, Listeria monocytogenes и Propionibacterium acnes индуцируют секрецию NKТ-клетками IL-4 на начальном этапе. Затем с участием клеток Купфера секреция IL-4 заменяется продукцией IL-12, IL-18 и IFNγ. На последующих стадиях секреция цитокинов в основном смещается к IFNγ. Однако роль NKТ-клеток при инфекциях в целом противоречива. Так, отмечалось временное улучшение после введения мышам анти-CD1d специфических антител при листериозе. При микобактериальной инфекции регистрировали обострение мышиного туберкулеза после введения анти-CD1d специфических антител. In vivo вакцинирование мышей микробными компонентами приводило к образованию гранулем с преобладанием в них NKТ-клеток. Однако инфекционная заболеваемость мышей, нокаутированных по CD1d, не отличалась от заболеваемости контрольных мышей. Vα14⁺ NKТ-клетки играют важную роль в резистентности мышей к грибковым инвазиям, в частности к Cryptococcus neoformans. На заключительных стадиях развития иммунного ответа NKТ-клетки посредством продукции IL-4 могут активировать В-лимфоциты к секреции антител к поверхностным белковым антигенам паразитов. Однако секреция высокоспецифических IgG к антигенам паразитов непосредственно связана с молекулами МНС II класса.

Внутрипеченочные NKТ-клетки человека

Репертуар лимфоцитов печени значительно отличается от состава лимфоцитов периферической крови и других лимфотропных органов человека, подчеркивая специализированную роль иммунной системы в печени. Среди резидентных лимфоцитов печени преобладают CD3⁺ Т-лимфоциты, В-лимфоциты составляют только около 5%. 15% печеночных CD3⁺ Т-лимфоцитов экспрессируют γδTCR, в противоположность этому только 2,7% CD3⁺ Т-лимфоцитов периферической крови экспрессируют этот рецептор и почти 50% всех γδТ-лимфоцитов экспрессируют CD8. Среди резидентных Т-лимфоцитов печени только 15% экспрессируют CD8 с α-цепью, без β-цепи (CD8α⁺ β^- ). В периферической крови такие клетки не обнаружены. NKТ-клеток с фенотипом CD56 или CD161 и CD3 гораздо больше в печени, чем в периферической крови. В недавних исследованиях было показано, что частота встречаемости CD1d-α-GalCer ограниченных NKТ-клеток в нормальной печени так же низка, как и в периферической крови здоровых людей.

NKТ-клетки и повреждения печени

NKТ-клетки играют важную роль при ЛПСили Con А-индуцированном гепатите и повреждениях печени, где ведущую роль играет α-GalCer. Механизм ЛПС-опосредованного повреждения печени может быть связан с активацией NKТ-клеток IL-12 после ЛПС-активации купферовских клеток. Повреждения клеток печени, где ведущая роль принадлежит α-GalCer, также описаны. Повреждения печени отсутствовали у CD1d-дефицитных мышей, у которых в печени было незначительное количество NKТ-клеток. Многие исследователи считают, что NKТ-клетки могут активировать NK-клетки, способные играть ведущую роль в повреждениях печени. α-GalCer NKТ-клеток индуцирует повреждение гепатоцитов посредством индуцированной экспрессии сигнальных молекул Fas-Fas-лиганд. Супрессия цитокиновых сигналов является негативной регуляцией, приводящей в итоге к активации печеночных NKТ-клеток и последующему повреждению печени.

NKТ-клетки и инфекционные заболевания печени

Чрезвычайно важна роль NKТ-клеток при вирусных гепатитах и малярии. NKТ-клетки с TCR Vα24⁺ могут накапливаться в печени у лиц с хроническим гепатитом С. В исследовании лиц с хроническим гепатитом С показано наличие в печени более 20% NKТ-клеток с фенотипом CD3⁺ CD56⁺ , что ассоциировалось с тяжестью заболевания, хотя специфика TCR этих клеток не была определена.

Введение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) трансгенным мышам позволило смоделировать вирусный гепатит В у мышей. Ряд исследований показал, что введение α-GalCer трансгенным мышам ингибирует репликацию вируса гепатита В. Это связано в первую очередь с активацией NKТ-клеток, а во вторую очередь - с активацией NK-клеток, что приводило к секреции противовирусных цитокинов в печени. Авторы полагают, что если имела место активация механизмов врожденного иммунитета в лабораторных условиях, то развивающиеся реакции адаптивного иммунного ответа обеспечат полноценный противовирусный иммунный ответ во время естественной инфекции.

NKТ-клетки и аутоиммунные заболевания печени

Участие NKТ-клеток в развитии аутоиммунных поражений печени изучено недостаточно. Con A-индуцированный экспериментальный гепатит у мышей рассматривается так же, как возможный АИГ у людей. NKТ-клетки были критическими в разработке Con A-индуцированного гепатита через Fas-Fas лиганд-взаимодействие на гепатоциты и NKT-клетки соответственно. Vα14-дефицитные мыши, лишенные NKТ-клеток, устойчивы к развитию Con A-индуцированного гепатита. Эти исследования подтвердили высокую роль NKТ-клеток при повреждении печени при различных воспалительных заболеваниях. ПБЦ характеризуется наличием антимитохондриальных аутоантител, аутореактивных Т-клеток, а также селективным разрушением эпителиальных клеток. Иммуногистохимические исследования выявили увеличение экспрессии CD1d клетками эпителия на небольшом участке желчных протоков в печени при ПБЦ. Экспериментальное использование человеческого тетрамера CD1d для изучения CD1d-α-GalCer ограниченных NKТ-клеток в периферической крови и печени у пациентов с ПБЦ показало, что их количество значительно ниже, чем у здоровых людей. В эксплантатах печени лиц с терминальной стадией ПБЦ частота встречаемости CD1d-α-GalCer-NKТ-ограниченных клеток гораздо выше, чем в здоровой печени. Определение снижения количества CD1d-α-GalCer-NKТ-клеток, опосредующих воспаление, является чрезвычайно важным для оценки воспалительного процесса или прогнозирования развития ПБЦ.

ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ И ДРУГИЕ АНТИГЕНПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ

Печень имеет развитую скавенджер-систему, что позволяет ей эффективно элиминировать чужеродный материал из желудочно-кишечного тракта и проводить детоксикацию крови от микроорганизмов.

LSEC и клетки Купфера являются чрезвычайно эффективными в быстром удалении чужеродных антигенов через систему портальной вены. Чтобы избежать активации иммунной системы безвредными пищевыми антигенами, лимфоидная ткань слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта индуцирует антигенспецифическую толерантность. Это, в свою очередь, также защищает печень от нежелательной иммунной активации. Тем не менее инфекции печени, вызванные патогенными микроорганизмами, должны быть выявлены, и должен развиться быстрый иммунный ответ, чтобы элиминировать патогенные агенты. Интересно, что среди трансплантируемых органов печень считается наименее иммуногенной. Кроме того, печень может также защитить другие органы от отторжения. Очевидно, что ответ иммунной системы должен регулироваться локально в печени деликатным и уникальным способом. Так называемые АПК, несомненно, играют важную роль в модуляции и регулировании иммунного ответа со стороны печени. Именно поэтому изучение функции этих клеток как при нормальных физиологических, так и патологических состояниях имеет большое значение.

Антигенпредставляющие клетки печени

Существуют три типа клеток, которые обладают функциями АПК печени, а именно LSEC, клетки Купфера и дендритные клетки. LSEC выстилают стенку синусоидов печени. Клетки Купфера расположены в синусоидальном просвете в перипортальной области (рис. 2-11). Дендритные клетки находятся в портальной области, в первую очередь вокруг желчных протоков и кровеносных сосудов (рис. 2-12). Помимо различий в микроанатомическом положении и поверхностном иммунофенотипе, печеночные дендритные клетки и клетки Купфера отличаются отсутствием неспецифической эстеразы и α-нафтилацетат-эстеразы.

Эндотелиальные клетки синусоидов печени

LSEC играют важную роль в фильтрации, эндоцитозе, регулировании синусоидального кровотока. Они обладают порами со средним диаметром около 100 нм. Однако даже белковые частицы размером до 15 нм не могут свободно проходить через эти поры. Таким образом, LSEC выполняют своеобразную роль барьера между макромолекулами в синусоидальных просветах и гепатоцитами. Рецептор-опосредованное поглощение макромолекул LSEC проходит быстро и эффективно с помощью паттернраспознающих рецепторов, таких как скавенджер- и маннозные рецепторы. Лейкоциты, проходящие через синусы, также взаимодействуют с LSEC. Этот межклеточный контакт зависит от конститутивной экспрессии адгезионных молекул, таких как CD54 (ICAM-1) и CD 106 (VCAM-1). Кроме того, взаимодействие между лейкоцитами и LSEC может быть частью механизма «наблюдения» печени, участвующего в индукции периферической толерантности.

LSEC могут индуцировать пролиферацию и секрецию цитокинов CD4⁺ Т-клетками in vitro без необходимости в предварительной стимуляции интерфероном γ или фактором некроза опухолей. Кроме того, LSEC конститутивно экспрессируют МНС II класса вместе с CD80, CD86, CD40 и CD58. Тем не менее LSEC также экспрессируют простагландины и трансформирующий фактор роста β, которые ограничивают антигенпрезентирующий потенциал этих клеток. Кроме того, различные цитокины и медиаторы, секретируемые купферовскими клетками печени или присутствующие в микросреде печени в естественных условиях, могут понижать регуляцию антигенпредставляющих свойств LSEC. На самом деле, хотя LSEC и могут индуцировать секрецию цитокинов наивными CD4⁺ Т-лимфоцитами, они не могут дифференцировать Т-клетки к Th1-фенотипу. С другой стороны, LSEC индуцируют секрецию IFNγ, IL-4 и IL-10 CD4⁺ клетками, что соответствует Th0-фенотипу. Именно поэтому презентация антигена LSEC жестко регулируется несколькими факторами микроокружения печени. Экспериментальные данные показывают, что LSEC могут быть вовлечены в устранение антигенов из печени без индукции иммунного ответа. Удивительно, но антигенстимулированная CD4⁺ Т-клетка путем активации LSEC супрессируется, а не усиливается TNFα в зависимости от дозы. Кажется вероятным, что LSEC в печени расположены идеально для того, чтобы индуцировать периферическую иммунную толерантность. LSEC даже способны стимулировать наивные CD4⁺ -клетки. Тем не менее после контакта с антигенпредставляющими LSEC CD4⁺ Т-клетки не могут впоследствии дифференцироваться в клетки Th1-типа, но вместо этого могут выполнять функции регуляторных Т-клеток, секретирующих IL-4 и IL-10 при рестимуляции. На сегодняшний день только LSEC, как было показано, способны и презентовать экзогенные антигены, и выполнять барьерную роль для защиты гепатоцитов от непреднамеренной иммунной атаки. Эффективная презентация экзогенного антигена LSEC к CD8⁺ Т-клеткам приводит к развитию антигенспецифической Т-клеточной толерантности.

Клетки Купфера

Клетки Купфера, как было показано, способны распознавать и представлять антиген с последующей активацией эффекторных CD4⁺ Т-лимфоцитов in vitro, но делают это несколько менее эффективно, чем макрофаги, полученные из селезенки или костного мозга. Клетки Купфера секретируют IL-10 в ответ на физиологические концентрации ЛПС, секретируемого нормальной микрофлорой кишечника. IL-10 су-прессирует активированные LSEC и клетками Купфера CD4⁺ Т-лимфоциты через понижающий регуляцию рецептор-опосредованный эндоцитоз и поверхностную экспрессию МНС II класса, CD80, CD86. Кроме того, клетки Купфера конститутивно экспрессируют TGFβ и простагландины, экспрессия которых еще более возрастает при контакте с ЛПС. Тем не менее при воздействии большого количества эндотоксина или патогенов происходит сдвиг в секреции воспалительных цитокинов. Как упоминалось выше, TGFβ и простагландины понижают регуляцию активации Т-клеток эндотелиальными клетками синусоидов печени.

Клетки Купфера также вовлечены в индукцию галотана при токсическом гепатите. Ранее галотан широко использовался в общей анестезии. В настоящее время его не применяют в связи с токсическим действием на печень. Галотан способствовал возникновению различных поражений печени: от легких до острых инсультов примерно у 20% больных, что нередко сопровождалось развитием фульминантных гепатитов. Сыворотки пациентов с галотановым гепатитом содержат антитела против известных микросомальных гетерологичных полипептидов печени крысы, что предполагает иммунологический компонент этой болезни. Вскоре было обнаружено, что межбелковые связи были сформированы путем ковалентного связывания промежуточного продукта биотрансформации галотана - трифторацетилхлорида со свободными аминогруппами нативных белков в печени с образованием стабильных белковых продуктов. Образование гаптена, таким образом, будет изменять собственный белок, что в итоге приводит к потенциальной иммуногенности. Было показано, что клетки Купфера, взятые от подвергшихся воздействию галотана морских свинок, содержат такие антигены белковой природы. Существует широкий спектр известных пептидов (25-152 кДа), связанных с трифторацетилхлоридом. Интересно, что эти белки, содержащие трифторацетилхлорид, не обнаруживаются в легких, селезенке, лимфатических узлах или периферических макрофагах крови. Это свидетельствует о том, что продукты присоединения содержатся в печени в клетках Купфера, которые могут, в свою очередь, «смонтировать» локальную иммунную реакцию на измененные собственные белки. Неизвестно, имеет ли это свойство клеток Купфера отношение к патогенезу аутоиммунных реакций в печени. Например, вполне возможно, что другие ксенобиотики, такие как пищевые добавки или лекарственные средства, могут тоже изменять собственные белки в печени. Такие неоэпитопы могли бы привести к активации иммунной системы, способствующей формированию нарушений аутотолерантности.

Активация клеток Купфера также была связана с эритропоэзом, гранулопоэзом и пролиферацией лимфоцитов в печени. Хотя пролиферация макрофагов и внетимических Т-клеток индуцируется спонтанно в печени мышей и тесно вовлечена в развитие заболевания, роль клеток Купфера в аутоиммунных заболеваниях печени до сих пор на должном уровне не изучена.

Дополнительной функцией клеток Купфера является генерация иммунологической толерантности в печени. Так, на моделях животных было показано, что при переливании крови через портальную вену развивается выраженная иммуносупрессия. Один механизм, который был предложен для PVT-индуцированной иммуносупрессии, осуществляется через изменение в клетках Купфера метаболизма арахидоновой кислоты в сочетании с повышенной секрецией супрессорного метаболита - простагландина Е₂ . Рядом исследователей было продемонстрировано, что PVT повышает продукцию и секрецию клетками Купфера простагландина Е₂ и циклооксигеназ-1 и -2 (ЦОГ-1 и ЦОГ-2). Ингибирование ЦОГ-1 и ЦОГ-2 отменяет этот эффект, тем самым указывая, что иммуносупрессивный эффект PVT может быть опосредован через повышенное регулирование клетками Купфера ЦОГ-1 и ЦОГ-2, что и приводит к иммуносупрессии. Кроме того, печень - это место, в котором апоптозные CD8⁺ -клетки являются целью для внутрипеченочных Т-лимфоцитов для захвата и киллерных эффектов. Эти механизмы аккумулируются во время формирования фазы периферического иммунного ответа. Апоптоз и последующая ликвидация апоптозных клеток являются критическим фактором в поддержании здоровья печени. Полное устранение апоптотических клеток в печени зависит как от клеток Купфера, так и от эндотелиальных клеток. Механизм апоптоза клеток может хотя бы частично объяснить важность печени в оральной толерантности, толерантности для аллогенных аллотрансплантатов печени и сохранении биологической активности некоторых патогенов печени, таких как вирус гепатита С.

Дендритные клетки

Дендритные клетки - клетки, полученные из костного мозга, функционируют как «профессиональные» АПК. В дополнение к лимфоцитам дендритные клетки являются частью мощной системы «наблюдения» в печени. Кроме того, миграция дендритных клеток увеличивается при инфекции и/или воспалении. Интерстициальные дендритные клетки захватывают и обрабатывают антигены, попадая в лимфу (дендритные клетки в печеночной лимфе), и накапливаются в области Т-клеток печеночных лимфатических узлов. В лимфатическом узле дендритные клетки представляют антигены Т- и В-клеткам, чтобы инициировать иммунный ответ. Дендритные клетки созревают по меньшей мере в два этапа, чтобы стать эффективными АПК в лимфоидной ткани. Дендритные клетки, найденные на периферии, обладают высокой фагоцитарной активностью, благодаря таким рецепторам, как DEC-205 (CD205), активируют макрофаги, но не экспрессируют такие поверхностные ко-стимулирующие молекулы, как CD80 и CD86 (см. рис. 2-12).

Дендритные клетки сразу после представления антигена готовы к миграции через афферентные лимфатические сосуды в регионарный лимфатический узел. На этом этапе они не демонстрируют высокого уровня активирующего потенциала Т-лимфоцитов, но уже не способны к фагоцитозу. Таким образом, дендритные клетки в лимфоидной ткани экспрессируют CD80, CD86, высокие уровни экспрессии молекул МНС I и II класса, высокие уровни молекул адгезии, включая ICAM-1, ICAM-2, LFA-1 и LFA-3. Дендритные клетки также экспрессируют высокие уровни DC-специфичных молекул адгезии DC-SIGN, которые связываются с ICAM-3 с очень высоким сродством. Активированные дендритные клетки секретируют и хемокины, специфически привлекающие наивные Т-клетки.

Функции печеночных дендритных клеток. Печеночные дендритные клетки экспрессируют CCR6, лиганд макрофагального белка воспаления 3α (MIP-3α), который, судя по всему, является самым мощным медиатором вектора их миграции. Исследования печени после внутривенного введения либо коллоидного углерода, либо эритроцитов барана показали, что печеночные дендритные клетки in vivo эти частицы не фагоцитируют. Тем не менее клеточно-опосредованный перенос коллоидного углерода в лимфатические узлы был отмечен после внутривенной инъекции этого агента. Хотя первоначально это было приписано миграции клеток Купфера, последующие исследования на крысах показали, что перенос коллоидного углерода в лимфатические узлы может быть связан с фагоцитарными предшественниками дендритных клеток, мигрирующими из крови в лимфатические узлы брюшной полости через печень.

Было высказано предположение, что клетки Купфера секретируют хемокины, которые привлекают и «рекрутированные» дендритные клетки через селективную адгезию, что приводит к постоянной транссудации или кровоизлияниям. У мышей, как было показано в экспериментально вызванном инфекционном процессе, предшественники дендритных клеток F4/80B220 CD11c⁺ появляются в кровотоке и во время инфекции, F4/80¯B220¯CD11c⁺ появляются в кровотоке и мигрируют в перисинусоидальные пространства для созревания через вновь образованные гранулемы. Эти «рекрутированные» дендритные клетки позже мигрируют в портальную область для взаимодействия с Т-клетками. Эту область можно назвать «портальной тракт-ассоциированной лимфоидной тканью» (PALT, от англ. portal tract-associated lymphoid tissue). Макрофагальный воспалительный белок (MIP-1α) привлекает предшественников дендритных клеток крови к синусоидальным гранулемам, в то время как хемокин вторичных лимфоидных органов (SLC) привлекает зрелые дендритные клетки к PALT.

Незрелые дендритные клетки используют несколько механизмов для захвата антигенов, таких как макропиноцитоз, рецептор-опосредованный эндоцитоз и фагоцитоз. Дендритные клетки также экспрессируют лектиновый рецептор С-типа (CD205) и Fсγ-рецепторы I типа (CD64) и II типа (CD32), которые облегчают усвоение иммунных комплексов или опсонизированных частиц. Дендритные клетки также эффективно усваивают апоптозированные и некротизированные клеточные фрагменты через CD36 и αVβ3 или αVβ5 интегрины. Дендритные клетки имеют возможность фагоцитировать белки теплового шока (gp96 и Hsp70) с помощью механизмов, которые до настоящего времени окончательно не изучены.

Многочисленные факторы могут индуцировать созревание дендритных клеток, в том числе таких, как липополисахариды, бактериальная ДНК и двухцепочечная РНК; баланс между местными провоспалительными и противовоспалительными цитокинами, включая TNF, IL-1, IL-6, IL-10, TGFβ, простагландины; семейство толл-рецепторов и лиганды для RP-105. Процесс созревания включает морфологические и фенотипические изменения. Зрелые дендритные клетки теряют эндоцитотические/фагоцитарные рецепторы/активацию и способность повышать поверхностную экспрессию таких ко-стимулирующих молекул, как CD40, CD80, CD86. Морфологические изменения, сопровождающие созревание дендритных клеток, включают потерю адгезионных конструкций, реорганизацию цитоскелета и приобретение повышенной клеточной подвижности. Дендритные клетки также перераспределяют пептидные комплексы МНС II класса. Поверхностная экспрессия пептидных МНС II комплексов имеет короткий период полураспада (около 12 ч). При созревании экспрессия МНС II увеличивается и период полувыведения пептидных комплексов МНС II удлиняется до 40-100 ч.

Дендритные клетки мигрируют из периферических тканей и при созревании экспрессируют рецепторы хемокинов CCR7. В этот период они также становятся способными реагировать на хемокины MIP-3β и 6Ckine. Миграция дендритных клеток из участков воспаления в лимфатические сосуды, как полагают, обусловлена 6Ckine, экспрессируемым лимфатическими сосудами. Эти два хемокина тоже могут привлекать наивные Т-лимфоциты и играть ключевую роль во взаимодействиях дендритных клеток и Т-клеток. После взаимодействия с Т-лимфоцитами дендритные клетки получают дополнительные сигналы для созревания от CD40L, RANK/TRANCE, 4-1ВВ и OX40L, экспрессируемых на поверхности Т-лимфоцитов. И в этот момент дендритные клетки становятся практически зрелыми. Дендритные клетки во вторичных лимфатических органах остаются функционально зрелыми до определенной степени. Они обладают сильной стимулирующей активностью в первичной аллогенной смешанной реакции лимфоцитов (MLR) по сравнению с незрелыми дендритными клетками, находящимися в тканях. Дендритные клетки в лимфе печени часто мигрируют, тесно прилегая к Т-лимфоцитам. В некоторых случаях Т-лимфоциты полностью окружены дендритными клетками, что указывает на то, что взаимодействие дендритных клеток и Т-клеток происходит до того, как дендритные клетки достигают лимфатических узлов. Дендритные клетки накапливаются в паракортикальной зоне лимфатических узлов, которая также богата наивными Т-лимфоцитами. В дополнение к «надзору» за повторно циркулирующими Т-лимфоцитами дендритные клетки также секретируют хемокины, чтобы привлечь большее количество лимфоцитов и других типов клеток для усиления иммунного ответа.

In vivo мышиные дендритные клетки печени, включая CD8α⁺ дендритные клетки, движутся к подкапсулярным и паракортикальным синусам лимфатических узлов и к периартериальной лимфатической оболочке в селезенке после инъекции в подушечки лап аллогенных мышей-реципиентов. Оказавшись в лимфатических узлах или селезенке, эти дендритные клетки могут экспрессировать свои антигены главного комплекса гистосовместимости (МНС) для наивных Т-лимфоцитов. Дендритные клетки могут обследовать бассейны с циркуляцией Т-клеток и активировать редкие антигенспецифические Т-лимфоциты напрямую. Кроме того, дендритные клетки могут погибать в лимфатических узлах или селезенке вскоре после миграции. Апоптические фрагменты в результате гибели этих дендритных клеток затем поглощают другие дендритные клетки и представляют Т-лимфоцитам опосредованно.

Дендритные клетки при заболеваниях печени

Аутоиммунные нарушения

Дендритные клетки могут играть определенную роль в развитии первичного билиарного цирроза печени. На ранних стадиях болезни дендритные клетки были обнаружены в желчном протоке. Однако на поздних стадиях болезни их гораздо меньше, тогда они чаще локализуются перед протоком. Количество интердигитальных дендритных клеток значительно выше по сравнению с CD83⁺ , активирующих дендритные клетки, что подтверждает роль дендритных клеток в разнообразных механизмах активации и их участие в патогенезе многих заболеваний.

Гранулематозные заболевания печени

Гранулематозное воспаление является следствием персистирующей или хронической инфекции. Установлено, что в формировании печеночной гранулемы участвуют не только макрофаги, но и дендритные клетки, стимулированные конкретными хемокинами. Японские исследователи показали, что во время инфекции Propionibacterium acnes у мышей линии F4/80^- В220^- CD11с⁺ предшественники дендритных клеток появляются в циркулирующей крови, мигрируют в перисинусоидальное пространство и созревают в новообразованных гранулемах печени. Эти дендритные клетки позже мигрируют в портальные области, где взаимодействуют с Т-лимфоцитами портальной лимфоидной ткани (PALT). MIP-1α (CCL3) и хемокины вторичных лимфоидных органов (SLC, CCL-21) привлекают предшественников дендритных клеток периферической крови в синусоидальную гранулему, а также и зрелые дендритные клетки до PALT соответственно.

Распределение дендритных клеток при вирусном гепатите

Наличие и расположение дендритных клеток при хронических воспалительных заболеваниях печени изучалось еще в конце ХХ в. Было показано, что наличие белка S100 и характерная морфология являются ведущими признаками для идентификации дендритных клеток. Белок S100 дендритных клеток находится в зонах частичного некроза при хроническом активированном гепатите различной этиологии. В других исследованиях in situ были использованы иммуногистохимические методы для выявления и распределения нелимфоидных воспалительных клеток при хроническом вирусном гепатите В. Показано, что клетки Купфера экспрессируют различное количество HLA-DR антигенов. Тем не менее, оценивая их случайное распределение, а также отсутствие сложной топографической ассоциации с лимфоцитами, предположили, что классические клетки Купфера не играют важной роли в клеточно-опосредованных иммунных реакциях. С другой стороны, дендритные клетки, помеченные моноклональными антителами к антигенам Mac387 и HLA-DR, были обнаружены в местах внутридолькового воспаления. Использование иммуноэлектронной микроскопии позволило выявить эти Mac387⁺ дендритные клетки в пространстве Диссе, где они находились в тесном контакте с лимфоцитами. Аналогичные дендритные клетки располагались по краю портальных трактов при хроническом активном гепатите, но отсутствовали при хроническом персистирующем гепатите. Иммуноокрашивание замороженных серийных срезов показывает их тесную топографическую ассоциацию с CD8⁺ Т-клетками. Это свидетельствует о том, что комплекс Mac387 + HLA-DR + дендритные клетки играет важную иммуномодулирующую роль в эффекторной части клеточного ответа, который развивается на периферии портальных трактов и паренхимы долек. Предполагается, что комплекс Mac387 + HLA-DR + дендритные клетки связан с активацией и пролиферацией CD8⁺ Т-клеток. Дополнительная субпопуляция дендритных клеток с фенотипом Mac387^-, но с HLA-DR⁺ расположена среди Th-клеток в центре острого воспаления портальных трактов. Эти дендритные клетки также экспрессируют LN2-маркер.

Наконец, образцы биопсии печени от пациентов с хроническим активным гепатитом С и аутоиммунными заболеваниями печени были изучены для определения фенотипа иммунокомпетентных клеток вокруг интрапортальных лимфоидных узелков. У пациентов с хроническим активным гепатитом С эти лимфоидные узелки регистрировались как лимфатические фолликулы с активированными В-лимфоцитами в зародышевых центрах, окруженных сетью фолликулярных дендритных клеток. Мантийная зона из В-клеток присутствует вокруг агрегатов активированных В-клеток. T-лимфоидная зона, содержащая CD4⁺ , CD8⁺ клетки, а также Т-лимфоциты с экспрессированным маркером активации CD25⁺ рецептором для IL-2, локализуется на периферии узелков. Иммунокомпетентные клетки, выявляемые при частичном некрозе, относятся в основном к CD4⁺ Т-хелперам, в то время как лимфоциты, находящиеся в дольках, - это прежде всего CD8⁺ цитотоксические T-клетки.

Функциональные изменения дендритных клеток при хроническом вирусном гепатите

Антигенпредставляющая функция дендритных клеток может быть снижена при вирусных инфекциях. Например, при хроническом вирусном гепатите С имеет место изменение аллостимулирующей функции дендритных клеток. Так, периферические дендритные клетки, которые были выделены от пациентов с хроническим вирусным гепатитом с использованием гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ, от англ. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) и IL-4, экспрессировали более низкие уровни CD86, чем дендритные клетки, полученные от здоровых доноров (N-DC). Хотя дендритные клетки, полученные от пациентов с хроническим гепатитом С, имели нормальную морфологию, фенотип, а также отростки (площадь) для захвата антигенов, их способность стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток была резко снижена по сравнению с наивными дендритными клетками. Хотя дендритные клетки, полученные от больных вирусным гепатитом С (HCV-DC) стимулируют аллогенные Т-клетки менее эффективно, чем N-DC, инфицированные вирусом гриппа А, HCV-DC сохраняли потенциал для пролиферации аутологичных Т-клеток. Интересно также то, что клеточные культуры аллогенных DC-T-клеток характеризуются более низкой продукцией IFNγ при культивировании с HCV-DC, чем аналогичные культуры N-DC. Это может быть связано с низкой экспрессией IL-12, р35 и р40-транскрипционных белков в HCV-DC. Кроме того, у HCV-DC, стимулированных липополисахаридом, уровень секреции IL-12 и р70 ниже, чем у N-DC. В аутологичных культурах культивирование HCV-DC с антигеном повышает продукцию p40, IL-12 и IFNγ и регулирует транскрипцию обоих субъединиц IL-12. Экзогенный IL-2 или IL-12 восстанавливает пролиферацию аллогенных Т-клеток с HCV-DC в зависимости от дозы. Таким образом, низкая экспрессия из CD86 и/или IL-12 напрямую связана с низкой аллостимуляторной активностью HCV-DC. Эти данные также показывают, что Th1-поляризация может быть затрудненной в связи с низкими концентрациями IL-12 и IFNγ при взаимодействии с дендритными клетками.

В других исследованиях показано, что дендритные клетки, полученные у пациентов с хронической HCV-инфекцией, анормально реагируют на стимулы для созревания. Они сохраняют незрелый клеточно-поверхностный фенотип и способность распознавать антиген. Более того, у них биологическая активность была снижена по сравнению со зрелыми дендритными клетками, полученными от здоровых субъектов. У них отмечена тенденция к снижению способности захвата антигенов, регулировать экспрессию соответствующих поверхностных молекул. Они повышают способность стимулировать аллогенные Т-клетки после воздействия стимулов созревания. Это означает, что неэффективные попытки элиминирования HCV у пациентов с хронической инфекцией, возможно, связаны с дефектом созревания дендритных клеток. Однако дендритные клетки от пациентов с HCV-инфекцией после курса противовирусной терапии могут восстанавливать свои функции и соответствовать дендритным клеткам здоровых доноров.

Дендритные клетки также могут способствовать распространению инфекции. Они участвуют в патогенезе вирусных инфекций. Ряд исследователей сравнивали фенотипические характеристики и биологическую функцию моноцитдоставленных HCV-DC и DC от серонегативных лиц (наивные дендритные клетки), от лиц, которым длительно проводилась противовирусная терапия (LTR-DC), и от больных с не-HCV заболеваниями печени (не-HCV-DC). Они обнаружили, что в то время как у HCV-DC отображается нормальная морфология, фенотип и антигенпоглощающая способность, пролиферация аллогенных Т-клеток оказалась значительно нарушена по сравнению с наивными дендритными клетками. Кроме того, при культивировании HCV-DC совместно с наивными дендритными клетками не наблюдалось усиления пролиферации Т-клеток. Примечательно, что стимулирующие функции LTR-DC или не-HCV-DC не были изменены. Наличие геномных последовательностей HCV было зафиксировано у пяти из шести носителей HCV либо в клетке и/или в супернатантах культур дендритных клеток. Таким образом, установлено, что течение хронического вирусного гепатита С связано с дефектом аллостимуляторной Т-клетки. Кроме того, вполне вероятно, что именно эти клетки и обеспечивают внепеченочный резервуар для вируса гепатита С. Хотя точный механизм иммунного ответа, связанного с изменениями функции клеток, еще предстоит изучить, но это, скорее всего, не должно быть связано с активацией иммуносупрессивных механизмов.

Из представленных данных следует, что функция дендритных клеток снижается у лиц с хроническими вирусными гепатитами С и В, и, возможно, эти изменения могут быть связаны с патогенезом гепатоцеллюлярной карциномы. Изучение дендритных клеток у пациентов с хронической инфекцией HCV с гепатоцеллюлярной карциномой, хроническим гепатитом и циррозом печени показало изменения профилей цитокинов, секретируемых дендритными клетками как в одиночной культуре, так в совместно культивируемых с Т-клетками. Так, секреция IL-12 дендритными клетками была снижена, в то время как секреция IFNγ и IL-10 Т-лимфоцитами оставалась в нормальных количествах. Эти данные позволяют предположить, что супрессия функциональной активности дендритных клеток может быть связана с патогенезом гепатоцеллюлярной карциномы при HCV- или HBV-инфекциях.

Дисфункции клеток Купфера при алкогольных и неалкогольных жировых заболеваниях печени

По сравнению с другими органами печень обладает одной из крупнейших популяций макрофагов, которые являются ключевыми компонентами иммунной системы. Печеночные макрофаги, то есть клетки Купфера, - это выведенные из циркуляции моноциты, которые происходят из клеток-предшественников костного мозга. После локализации в печени эти клетки дифференцируются для выполнения специализированных функций, в том числе фагоцитоза, обработки антигена и его презентации. Клетки Купфера вырабатывают различные продукты, в том числе цитокины, простагландины, оксид азота, активные формы кислорода. Эти факторы определяют не только фенотип клеток Купфера, которые их секретируют, но и фенотипы таких соседних клеток, как гепатоциты, звездчатые клетки, эндотелиальные клетки и другие клетки иммунной системы, проходящие через печень. Таким образом, клетки Купфера принимают непосредственное участие в ответе печени на инфекции, токсины, преходящую ишемию и различные другие воздействия. Ряд исследований показал, что клетки Купфера вносят свой вклад в патогенез различных видов повреждений клеток печени. Тем не менее многое еще предстоит узнать о факторах окружающей среды и генах, которые модулируют поведение клеток Купфера. Это знание, в свою очередь, поможет прояснить, как клетки Купфера регулируют жизнеспособность и функции других клеток печени.

Следовательно, лучшее понимание может способствовать появлению препаратов для лечения заболеваний печени, которые являются результатом изменений функций клеток Купфера.

Полученные данные свидетельствуют о том, что дисфункция клеток Купфера способствует развитию жировой болезни печени, связанной с ожирением (то есть НАЖБП) или вызванной чрезмерным употреблением алкоголя (то есть алкогольная жировая болезнь печени, АЖБП). Сходства в иммунологических механизмах, которые присутствуют в иммунопатогенезе этих двух типов заболеваний печени, приводят к схожести их гистологических особенностей. Оба заболевания начинаются как простой стеатоз (клинически наиболее благоприятный), который далее прогрессирует в стеатогепатит (промежуточный этап увеличения гибели клеток печени и ее воспаления) и завершается циррозом (большая часть заболеваний и смертности, ассоциированной с печеночными изменениями).

Получена информация об иммунопатогенезе АЖБП из исследований на нормальных мышах и определенным образом генетически измененных (имели естественные мутации, подавляющие выработку лептина или рецептора лептина), которых держали на этанолсодержащей диете. У обеих линий мышей жировые нарушения в печени и такие естественные существующие функции, как устойчивость к инсулину, ожирение и дислипидемия, развивались спонтанно и сильно коррелировали с НАЖБП у людей. Изначально лептин был определен как гормон адипоцитов, воздействующий на нейроны гипоталамуса и вызывающий чувство сытости. В настоящее время стало известно, что он обладает мощной иммуномодуляторной активностью. Таким образом, недостаточность лептина может способствовать иммунной дисфункции печени. Неизвестно, какая недостаточность лептина (абсолютная или относительная) является решающей при АЖБП или у холиндефицитных мышей (другая модель для НАЖБП). Существует ряд доказательств, что хроническое потребление алкоголя на самом деле увеличи вает секрецию лептина адипоцитами, что приводит к гиперлептинемии. Поскольку существует физиологическая изменчивость концентрации лептина в сыворотке крови, неясно, является ли его дефицит ведущим в регуляции функции клеток Купфера при жировой болезни печени. Тем не менее данные, полученные от лептиндефицитных грызунов, могут быть положены в основу будущих исследований роли клеток Купфера в иммунопатогенезе заболеваний печени.

Аномальный фенотип макрофагов у грызунов со сниженной активностью лептина

Исследования на крысах с сахарным диабетом, страдающих ожирением, показали, что дисфункция клеток Купфера может быть вовлечена в патогенез НАЖБП. У крыс имеется мутация в гене лептинового рецептора ObRb, который ингибирует трансдукцию лептин-инициированного сигнала. Таким образом, хотя концентрация лептина в сыворотке у крыс увеличивается, эти животные напоминают мышей с генетической недостаточностью лептина. Печень грызунов со стеатозом необычно уязвима для повреждения, вызванного бактериальным липополисахаридом (ЛПС). У таких мышей обычно безвредная доза ЛПС индуцирует тяжелый жировой гепатит печени (стеа тогепатит).

Многие исследования свидетельствуют о том, что ЛПС-опосредованное повреждение печени у нормальных крыс и мышей связано с фактором некроза опухолей (TNFα). Такие факторы, как интерлейкины IL-12, IL-18, интерферон γ (IFNγ), способствуют повышению активности TNFα, что, как правило, усугубляет повреждения печени. В то же время такие факторы, как IL-4 и IL-10, ингибирующие TNFα, являются гепатопротекторами. Хотя многие типы клеток способны продуцировать TNFα и другие цитокины, регулирующие биологическую активность TNF, считается, что клетки Купфера являются основным источником этих цитокинов после ЛПС-активации. В связи с тем что ЛПС являются мощным активатором клеток Купфера, методы лечения, подавляющие их активность, защищают крыс и мышей от ЛПС-повреждений печени. Однако экспрессия TNF у мышей после введения ЛПС анормально не увеличивалась. Это позволяет предположить, что именно повышенная чувствительность к TNF-гепатотоксичности, а не усиленная секреция TNF, является ведущим механизмом повреждений печени у мышей.

Поскольку клетки Купфера являются основными продуцентами цитокинов, которые модулируют эффекты TNFα, логично было бы предположить наличие дисфункций у макрофагов. При исследованиях было выявлено несколько дисфункций. Например, анализ образцов печени до и после ЛПС-активации мышей показал существенное и последовательное снижение экспрессии рецепторов клеток Купфера и их специфичного гена. В отличие от этого, экспрессия клеток Купфера уменьшилась после введения липополисахаридов контрольным животным лишь временно. Кроме того, у крыс отмечалось уменьшение печеночного клиренса введенных интраперитонеально люминесцентных меченых микросфер. Ни один из этих недостатков в функции клеток Купфера, вероятно, не был результатом снижения количества печеночных макрофагов. Дальнейшие исследования подтвердили, что фенотип клеток Купфера является анормальным у ЛПС-чувствительных мышей. Были выявлены и нарушения фагоцитоза, секреции цитокинов культивируемыми перитонеальными макрофагами и клетками костного мозга у животных, имеющих дисфункцию рецептора лептина. У макрофагов, полученных от всех животных с пониженной функцией эндогенного лептина, отмечалось уменьшение фагоцитарной активности in vitro. Этот дефект был нивелирован добавлением в культуру лептина. Таким образом, хроническое ингибирование лептина обратимо понижает фагоцитарную функцию макрофагов. У макрофагов, выделенных от животных со сниженной активностью лептина, также имелись и другие изменения, такие как аномальная продукция цитокинов после введения липополисахаридов. Например, ЛПС-индукция IL-6 была значительно повышена, в то время как индукция IL-10 была практически прекращена.

Механизмы отклонений у макрофагов при недостаточности лептина

Некоторые «базовые» особенности печеночных и/или перитонеальных макрофагов у генетически измененных мышей напоминают те, которые были отмечены у макрофагов нормальных животных после введения липополисахаридов, мощного активатора печеночных макрофагов. Например, липополисахариды индуцируют образование таких активных форм кислорода, как перекись водорода (Н₂О₂), активируют такие факторы транскрипции, как NF-кВ и шесть гетеромерных CCAAT-факторов (CP1A/HAP3, CBF-C/HAP-4 и др.), составляющих одно семейство. Важная роль в усилении микробицидных эффектов принадлежит усиливающему связывающему белку C/EBP-beta, регулирующему экспрессию генов провоспалительных цитокинов макрофагами. Усиление секреции активных форм кислорода имеет место у генетически измененных мышей даже в отсутствие стимуляции макрофагов экзогенными липополисахаридами. Митохондрии также могут способствовать увеличению выработки активных форм кислорода, поскольку экспрессия интегрального мембранного белка UCP-2 (uncoupling proteins-2), локализованного во внутренней митохондриальной мембране и обладающего разобщающей активностью, отличается у нормальных макрофагов и макрофагов при недостаточности лептина у грызунов. У нормальных неактивных клеток Купфера UCP-2 экспрессируется конститутивно, и такие факторы, как липополисахариды, которые ингибируют UCP-2, увеличивают продукцию супероксиданиона и перекиси водорода. Далее следуют индукции транскрипционных факторов, таких как NF-кВ и С/EBP-beta; повышенная экспрессия IL-6, индукция фермента ЦОГ-2, IL-6 индуцибельного фермента; увеличение секреции PGE₂ - продукта ЦОГ-2. Стационарные уровни митохондриальных белков-разобщителей снижаются у перитонеальных макрофагов генетически измененных мышей как до обработки липополисахаридами, так и после нее. Это связано со значительным увеличением количества оксидантов и усилением всех последующих окислительно-восстановительных регулируемых событий, кульминация которых - явное увеличение секреции IL-6 и PGE₂ .

Если подобные нарушения происходят в печеночных макрофагах, чрезмерно активированные клетки Купфера могут генерировать продукты, которые влияют на чувствительность гепатоцитов к другим ЛПС-индуцированным цитокинам, таким как TNFα. Например, увеличение секреции простагландинов клетками Купфера может повышать экспрессию белков Bcl-2 гепатоцитами генетически измененных мышей. Эти данные подтверждаются тем, что повышенная у клеток Купфера активность фермента ЦОГ-2 регулирует экспрессию белка Bcl-2 гепатоцитами в модели холестаза у мышей. Простагландины, секретируемые макрофагами, могут также индуцировать UCP-2 соседними гепатоцитами, поскольку простагландины являются эндогенными лигандами для пролиферации проксимального рецептора PPAR, который регулирует транскрипцию UCP-2. Этот механизм может объяснить, почему так называемые жирные гепатоциты у генетически измененных мышей экспрессируют большое количество UCP-2 - белка, который не экспрессируется нормальными гепатоцитами. Последние данные показывают, что индукция UCP-2 оказывает антиапоптозные эффекты. В связи с тем что UCP-2 ограничивает эффективность секреции митохондриальной АТФ, его активация также предрасполагает к некрозу гепатоцитов. Таким образом, чистые последствия адаптивных ответов на продукты клетки Купфера не всегда полезны для гепатоцитов. Кроме того, некоторые продукты макрофагов, такие как супероксид-анион, Н₂ О₂ и NO, как полагают, оказывают вредное влияние на гепатоциты, вызывая перекисное окисление и нитрозилирование структурных и регуляторных молекул или изменение гена экспресии гепатоцитов.

На данный момент нет уверенности в том, что измененный фенотип макрофагов у генетически измененных мышей является на самом деле результатом воздействия низких уровней эндогенного ЛПС или результатом прямого (или косвенного) эффекта дефицита лептина на дифференцировку макрофагов. Кишечная микрофлора является богатым источником эндогенных ЛПС и других продуктов бактерий для тканей печени, через которую проходит кровь из брыжеечных артерий. Несмотря на то что до настоящего времени нет доказательств увеличения системной или портальной эндотоксемии у таких мышей, показано, что у них при старении развиваются кишечный застой, дисбиоз кишечника и усиленное воздействие этанола и других продуктов кишечных бактерий. Таким образом, существует некоторая поддержка тому, что эндогенные, кишечно-представленные факторы активируют клетки Купфера и сенсибилизируют гепатоциты к воспалительным повреждениям у грызунов с недостаточностью лептина при НАЖБП. Тем не менее непосредственная роль недостаточности лептина в дифференцировке макрофагов тоже заслуживает внимания, так как костномозговые предшественники экспрессируют цитокины клеток Купфера, а лептин регулирует миелоидную дифференцировку.

Другие нарушения в печени при изменениях клеток Купфера у мышей

Цитокины, секретируемые клетками Купфера, такие как IL-12, IL-18, IL-15, также играют ключевую роль в модуляции дифференцировки и пролиферации различных клеток, которые регулируют механизмы иммунологических реакций врожденного иммунитета и, следовательно, первые ответы тканей на чужеродные антигены, такие как липополисахариды. Значение IL-15 в регуляции механизмов врожденного иммунитета хорошо показано при исследованиях трансгенных мышей и мышей с генетическим дефицитом β-цепи IL-2/IL15 рецептора, который необходим для IL-15 сигналов. IL-15 предотвращает апоптоз естественных киллеров (NK) и CD8⁺ Т-клеток, которые регулируют иммунологическую память. Следовательно, IL-15 трансгенные мыши накапливают огромное количество этих клеток, в то время как мыши, испытывающие недостаточность функционирования IL-15, сильно в них истощены. Некоторые типы NK-клеток, в том числе CD4⁺ NKТ-клетки, способствуют секреции IL-4 и других Th2-цитокинов, которые функционируют как негативные регуляторы воспалительных реакций. Другие цитокины клеток Купфера - IL-12 и IL-18 - способствуют местному распространению дискретных цитотоксических NK-клеточных субпопуляций, которые секретируют большие количества IFNγ в печеночную микросреду. Увеличение профилей IFNγ повышает количество и активность Th1-клеток, то есть усиливаются провоспалительные ответы в печени.

Учитывая, что механизмы врожденного иммунитета модулируют локальную воспалительную активность в печени, расширение или истощение различных клеточных компонентов этой системы имеет огромное значение, приводящее к повышенной чувствительности печени к липополисахаридам. Например, Propionibacterium acnes активирует секрецию IL-12 макрофагами, что селективно снижает количество печеночных CD4⁺ NKT-клеток. Этот эффект заметно усиливает последующее ЛПС-индуцированное повреждение печени. В частности, количество печеночных CD4⁺ NKT-клеток значительно уменьшается у мышей с естественными мутациями (подавление выработки лептина), что также проявляется в повышенной ЛПС-гепатотоксичности. Механизмы истощения печеночных CD4⁺ NKT-клеток у таких мышей до сих пор неизвестны, но рассматривается несколько возможных их причин, в том числе увеличение секреции клетками Купфера IL-12 и снижение секреции IL-15. Недостаточность лептина непосредственно не влияет на изменения продукции клетками Купфера IL-12 или IL-15, потому что их инкубация в течение ночи в среде с лептином не изменяет эти отклонения. Тем не менее, по-видимому, лептин осуществляет и другие механизмы, которые регулируют продукцию этих факторов, так как печеночная экспрессия IL-15 увеличивается у мышей, которым непрерывно осуществлялись подкожные инфузии лептина в течение двух недель. Это связано с частичным увеличением в печени CD4⁺ NKT-клеток и резким увеличением печеночной экспрессии IL-10, IL-15, индуцируемой цитокинами. Лептин-опосредованные изменения в печеночной врожденной иммунной системе, которые увеличивают секрецию IL-10 после инъекции ЛПС, могут быть частью механизма, с помощью которого дополнительный лептин защищает мышей с подавлением выработки лептина от ЛПС-гепатотоксичности. Интересно, что хотя эти мыши отличаются высокой чувствительностью к ЛПС-индуцированной гепатотоксичности, они необычайно устойчивы к Con A, который вызывает токсический гепатит. Это особенно загадочно, потому что схожий с ЛПС-индуцированным поражением печени Con A гепатит также опосредован TNFα. Тем не менее, в отличие от липополисахарида, который в первую очередь активирует врожденные иммунные реакции, Con A опосредует гепатотоксичность путем активации T-клеток. Лептин является важным фактором для Т-клеточной экспансии. Таким образом, у лептиндефицитных мышей сокращается число тимоцитов и CD4⁺ T-лимфоцитов в периферической крови. Количество CD4⁺ Т-клеток также уменьшается в печени у мышей. Таким образом, вполне вероятно, что снижение популяции CD4⁺ Т-клеток помогает в защите мышей при Con A гепатите. Гиперпродукция определенных цитокинов (таких как IL-6), секретируемых клетками Купфера, тоже может способствовать защите, поскольку IL-6, как известно, защищает нормальных мышей от Con A-индуцированного гепатита. В любом случае эти наблюдения иллюстрируют важность цитокинов, секретируемых клетками Купфера, как модуляторов врожденных иммунных реакций на чужеродные антигены. Они подчеркивают сложность взаимодействий клеток, которые определяют окончательный результат в выделении потенциальных гепатотоксинов, таких как липополисахарид и Con A, что приводит к повреждению печени, активируя иммунологические ответы.

Аномальный фенотип макрофагов у крыс с алкогольной диетой

Учитывая, что ожирение, связанное как с НАЖБП, так и с алкоголь-индуцированной АЖБП, нельзя различить гистологически, можно предположить, что подобные механизмы могут опосредовать патогенез обоих заболеваний. Макрофаги страдающих ожирением мышей и крыс с НАЖБП демонстрируют аномальный фагоцитоз, измененную продукцию цитокинов и повышенное образование Н₂ О₂ и некоторых простагландинов. Имеются данные, указывающие на то, что некоторые из этих факторов способствуют изменению фенотипа соседних гепатоцитов, а также клеток врожденной иммунной системы в печени, что и способствует развитию НАЖБП. Именно поэтому, чтобы определить, опосредуют ли подобные механизмы патогенез АЖБП, целесообразно изучить информацию о функциях макрофагов у животных, которые были подвержены действию алкоголя.

Острое или хроническое воздействие этанола влияет на функцию макрофагов. Так, продукция моноцитами/макрофагами таких провоспалительных цитокинов, как TNFα, ингибируется острым воздействием алкоголя, но стимулируется после хронического его воздействия. Это было подтверждено результатами культивирования клеток Купфера из печени крыс, которых кормили этанолом в течение нескольких недель и которые продемонстрировали зависящее от времени увеличение секреции TNFα и IL-6. Тяжесть стеатогепатита сопровождается параллельно с этим увеличением продукции клетками Купфера цитокинов, предполагая, что они могут вносить свой вклад в связанные с алкоголем повреждения печени. Это предположение было недавно подтверждено исследованиями, которые оценивали алкогольную гепатотоксичность у мышей с генетической недостаточностью НАДФ-оксидазы и у других генетически измененных мышей с дефицитом 1-го типа TNF-рецепторов. Мыши c дефицитом НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы секретируют меньшие количества TNFα и защищены от алкогольиндуцированных повреждений. Точно так же у мышей, длительное время получавших этанол и с дефицитом 1-го типа TNF-рецептора, развивается АЖБП с незначительными гистологическими изменениями. Таким образом, продукт клеток Купфера - TNFα необходим для развития АЖБП, по крайней мере у этих экспериментальных животных.

Тем не менее многое, связанное с механизмами развития алкогольной гепатотоксичности, остается неясным. Один из вопросов: «Почему TNFα не повреждает нормальные гепатоциты?» In vitro повреждались TNF только гепатоциты, предварительно обработанные агентами, ингибирующими синтез белка. Можно предположить, что гепатоциты секретируют цитозащитные факторы, препятствующие развитию повреждающих эффектов TNF. Предварительное воздействие этанола in vivo оказывает эффекты, которые имитируют те, что вызваны ингибиторами синтеза белка in vitro, о чем свидетельствуют наблюдения, показывающие, что лечение с помощью TNFα быстро убивает первичные культуры гепатоцитов у крыс, находящихся на этаноловой диете.

Хроническое употребление этанола также повышает чувствительность печени к ЛПС-индуцированной гепатотоксичности, процесс, который, как известно, тоже требует TNFα. Таким образом, представленный обзор подтверждает, что мыши и крысы с естественными мутациями необычайно уязвимы к развитию ЛПС-гепатотоксичности. Вместе с этим результаты на животных моделях НАЖБП и АЖБП увеличивают вероятность того, что подобные механизмы могут активировать клетки Купфера и приводить к изменениям печеночной микросреды, что повышает чувствительность к острой TNFα-гепато-токсичности.

Исследования хронического воздействия этанола на животных подразумевают и роль кишечных бактерий в процессе сенсибилизации. Похожие методы лечения, которые снижают активацию клеток Купфера или непосредственно блокируют TNFα-активность, и методы, которые частично дезинфицируют кишечник, также защищают крыс от индуцированных алкоголем повреждений печени. Роль кишечной флоры при НАЖБП у мышей была подтверждена при лечении их пробиотиками, которые, как известно, изменяют кишечную бактериальную колонизацию. Пробиотики снижали тяжесть НАЖБП в этой модели на животных. Эти данные показывают, что существуют некоторые различия в печеночных реакциях на пробиотики и нейтрализацию антител против TNF-антител, которые также снижают тяжесть НАЖБП у мышей. Предполагается, что полезные эффекты пробиотиков развиваются не только из-за сниженного регулирования экспрессии гена TNFα. До конца не ясно, каким образом изменения в эндогенной кишечной флоре влияют на фенотип таких иммунных клеток, как макрофаги печени. Тем не менее изменения в биологической доступности кишечной бактериальной флоры могут быть важным доказательством того, что первоначальное воздействие ЛПС или ЛПС-индуцированными цитокинами изменяет последующие ответы макрофагов на эти факторы.

Показаны нарушения функциональной активности макрофагов на животных моделях НАЖБП и АЖБП, которые включали измененную продукцию различных цитокинов, простагландинов и реактивных промежуточных форм кислорода. Дисфункция клеток Купфера у этих грызунов, скорее всего, способствовала индукции некоторых митохондриальных белков, включая членов Bcl-2-семейства и UCP-2, которые влияют на жизнеспособность гепатоцитов и состояние гомеостаза. Измененная секреция клетками Купфера различных цитокинов, вероятно, также снижает в печени некоторые из популяций лимфоцитов, изменяя тем самым уязвимость к гепатотоксическому действию агентов, которые активируют как врожденные, так и Т-клеточно-опосредованные иммунные ответы. Поскольку действие лептина, признанного иммуномодулятора, уменьшается в некоторых моделях животных с НАЖБП, неясно, в какой степени эти выводы могут быть применены к животным с АЖБП, где синтез лептина может быть увеличен. Показано, что у экспериментальных животных с НАЖБП и АЖБП имелись схожие эффекты на ЛПС со стороны клеток Купфера печени, которые приводили к изменению экспрессии гена лептина. Таким образом, нарушения синтеза лептина свидетельствуют о его вовлеченности в иммунопатогенез жировых заболеваний печени.

В любом случае лучшее понимание механизмов, которые регулируют компоненты печеночной иммунной системы, скорее всего, повысят эффективность усилий по профилактике и лечению этих общих типов хронических заболеваний печени.

ИММУННАЯ ТОЛЕРАНТНОСТЬ И ПЕЧЕНЬ

Природная иммунная толерантность зависит от нескольких процессов. Как правило, они рассматриваются в соответствии с центральной толерантностью, основанной на селективном удалении аутореактивных клеток во время созревания, развития в тимусе и периферической крови, на основе процессов, широко описанных как игнорирование, анергия и редактирование рецептора. Это в итоге влияет на последующее созревание клеток и их фенотип. Есть и другие интересные посредники развития толерантности, которые работают в лимфоидной ткани печени. В эти механизмы включены процессы попадания из печени в периферическую кровь аллогенных (донорского типа) молекул MHC I класса, а также миграция из донорской печени мобильных и выживших клеток (лимфоцитов и фагоцитов) для создания состояния микрохимеризма, активирования иммунорегуляторных свойств, преобладающих в популяции NK-клеток. Субпопуляции T-клеток в печени помогают LSEC игнорировать развитие иммунных реакций по захвату и удалению активированных клеток. В результате наивные CD8⁺ Т-клетки могут активироваться эндогенным антигеном, презентируемым паренхиматозными клетками, но при отсутствии достаточных ко-стимулирующих сигналов они погибают от развития механизмов игнорирования. Внутрипеченочная толерантность может быть физиологической необходимостью, потому что пищевые антигены и, возможно, даже некоторые кишечные бактериальные антигены должны пройти первичный контакт с иммунной системой для выработки толерантности. Возможно, оральная толерантность имеет внутрипеченочный, а также кишечный компонент. Эти установленные аспекты могут, вероятно, играть дополнительную роль в развитии внутрипеченочной толерантности по развитию устойчивости к вирусным инфекциям или аутоиммунным реакциям.

Апоптоз и печень

Иммунология печени имеет прочные исторические связи с эволюцией концепции апоптоза. Так, в 1947 г. были описаны ацидофильные белки как гистологические маркеры гибели клеток при вирусных гепатитах, а уменьшение некротических процессов было предшественником к введению термина «апоптоз». Апоптоз является процессом, отвечающим в морфогенезе за регулярное обновление клеток, включая гепатоциты в их нормальном жизненном цикле (отсюда и синоним - запрограммированная гибель клеток), а также элиминирование печеночных клеток при различных воспалительных процессах. Процессы апоптоза менее выражены в клетках желчного эпителия, которые легко удаляются, но тем не менее это очевидно в иммуноопосредованных холангиоцитах. Эффекторные пути апоптоза зависят от семейства белков с каспазной активностью, которые опосредуют гибель клеток, и семейства белков Bcl-2, локализованных в митохондриях, которые регулируют некроз клеток. Апоптоз может быть инициирован различными сигналами, но обычно процесс инициируется взаимодействиями, связанными с мембранным рецептором CD95 (Fas, APO-1), который является членом семейства туморнекротических клеточных активаторов и его лиганда CD-152 - FasL. Bcl-2-связанные белки включают активаторы и ингибиторы секреции в цитозоль митохондриального цитохрома С, способствующего каспазной активации.

Помимо роли в обновлении гепатоцитов, апоптоз имеет отношение к биологии и патологии иммунных реакций с последствиями возникновения заболеваний печени. Во-первых, апоптоз является нормальным механизмом развития собственных толерантных Т- и В-лимфоцитов, и особенно в постнатальный период для удаления избыточных постпролиферативных лимфоцитов, завершивших иммунный ответ. Самореактивные лимфоциты устраняются путем апоптоза для поддержания толерантности в центральных и периферических лимфоидных органах, как это показано в случаях лимфопролиферативных заболеваний с аутоиммунной реакцией, которые возникают у людей и мышей, когда есть дефицит механизмов апоптоза из-за унаследованных мутаций с делецией CD95/fas или его лиганда CD152 либо соматически приобретенной рекомбинационной вставки гена, кодирующего антиапоптотические молекулы в генных локусах иммуноглобулинов. Во-вторых, за счет механизмов апоптоза происходит физиологическое удаление ненужных компонентов тканей путем быстрого поглощения их макрофагами. Гибель клеток путем некроза - провоспалительный и потенциально аутоиммуногенный процесс. Однако, если гибель путем апоптоза является подавляющей или неупорядоченной с нарушением удаления апоптотических фрагментов, то они могут вызывать реактивный иммунный ответ с большим участием АПК.

Хронические воспалительные реакции в печени

Различные хронические воспалительные реакции в печени являются результатом иммунного ответа на воспринимаемые как чужеродные гепатоциты или холангиоциты, которые несут антигены и к которым ни один из подходящих вариантов (ликвидации или полной толерантности) не может быть эффективным. Такие антигены могут быть дериватами клеток макроорганизма, зараженных вирусом, аутоантигенами хозяина, наркотиками или ксенобиотиками.

Вирусные инфекции

Существуют гепатотропные вирусы, такие, например, как вирусы гепатитов В и С (HBV, HCV) и вирус желтой лихорадки, а также инфекционные агенты, влияющие на печень опосредованно. Такие вирусы в первую очередь тропны к другим тканям, например, вирус кори, вирусы простого герпеса, цитомегаловирус и ряд других. Среди них только HBV и HCV могут быть абсолютно гепатотропными и вызывать серьезные хронические заболевания (табл. 2-4). Оба вируса используют различную стратегию для уклонения от факторов иммунной системы хозяина.

Вирус гепатита В элиминируется из печени после перенесенной острой инфекции почти всегда (98-99%). Несмотря на это, очень низкий уровень ДНК HBV может долго обнаруживаться в печени или лимфоидной ткани после выздоровления человека, а также у зараженных животных. Возможно, это способствует формированию иммунологической памяти и развитию прочного иммунитета в случае реинфекции.

Персистирование HBV после перенесенной острой инфекции может быть связано с несостоятельностью иммунитета либо с перенесенными другими инфекциями, недостаточностью питания, почечной недостаточностью, наркоманией или лекарственной иммуносупрессией. Нарушения функций иммунной системы после перенесенной перинатальной инфекции способствуют и формированию иммунологической толерантности к вирусным частицам. Это, в свою очередь, приводит к накоплению поверхностного вирусного антигена (HBsAg) в клетках печени с минимальным ответом на него иммунной системы. У лиц со зрелой активной иммунной системой это происходит редко. Чем неэффективнее ответ иммунной системы на антигены HBV, тем более выражены проявления нарушений баланса между иммунным гомеостазом и толерантностью без преобладания одного над другим. Именно поэтому супрессия иммунитета вследствие стресса, инфекций, беременности или недостаточности питания позволяет уходить вирусу от иммунного контроля. Кроме того, отмена иммуносупрессивной терапии может способствовать нарушению толерантности и активации аутоиммунных реакций.

В любом случае экспрессия на мембране клеток печени HBV-антигенов (поверхностных, нуклеокапсидных, особенно антигена Е) способствует развитию клеточно-опосредованного иммунного ответа (Thl и CD8⁺). Именно с ними связаны клинические симптомы болезни, подтверждаемые гистологически.

Вирус гепатита С. Лица, инфицированные HCV, встречаются в 5-6 раз чаще по сравнению с носителями HBV. Хронизация инфекции также наблюдается гораздо чаще. Хронизации инфекции, персистированию возбудителя способствует высокая мутационная изменчивость генома HCV, что позволяет генерировать несколько квазивидов вируса, тем самым опережая процессы распознавания T-клеточным рецептором (TCR) хозяина. Кроме этого, чрезвычайно важным является отсутствие МНС (HLA) аллелей, которые могут эффективно связывать и представлять структурные пептиды HCV Т-клеткам хозяина. Мутантные белки HCV могут взаимодействовать с TCR без активации Т-лимфоцита. Репликация HCV осуществляется в иммунологически недоступных внепеченочных резервуарах (лимфоидные органы, костный мозг, иммунокомпетентные клетки), что и обеспечивает хронизацию инфекции, персистирование вируса и супрессию иммунного ответа со стороны цитотоксических Т-лимфоцитов. Этим процессам также способствуют иммунодепрессивные факторы, особенно злоупотребление алкоголем, что обеспечивает толерогенную среду в печени.

Иммунопатогенетические механизмы хронизации инфекции HCV и HBV, приводящие к многообразным изменениям иммунного гомеостаза и толерантности, способствуют клиническому разнообразию течения инфекции: от затяжного вялотекущего, даже бессимптомного, гепатита до быстро прогрессирующего цирроза и печеночно-клеточной недостаточности, переходящей в первичную карциному печени. Как и при инфицировании HBV, повреждение клетки печени обусловливает не сам вирус, а, скорее, иммунная реакция хозяина против вирусных белков, экспрессированных инфицированной клеткой. Этот аспект привлекает обширное внимание гепатологов, иммунологов, вирусологов, что и формирует сферу интересов гепатоиммунологии.

Т-клеточный ответ на HCV является сложным. Изучение пяти вариантов острой инфекции HCV показало, что развитие острого гепатита связано с активированными CD38⁺ , CD8⁺ Т-клетками, которые не продуцировали интерферон γ. Элиминированию вируса способствуют CD38⁺ , CD8⁺ Т-клетки, которые продуцируют интерферон γ и, предположительно, действуют без цитолиза. CD4⁺ Т-клеточный ответ необходим, так как HCV сохраняется при неэффективном иммунном ответе со стороны эффекторных клеток. Иммунологический фон при хронической (не элиминативной) HCV-инфекции печени характеризуется низким количеством и функционально слабыми откликами CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, которые реагировали только в ограниченном диапазоне на компоненты неструктурных белков HCV. Повреждения гепатоцитов связаны с активированными CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками, которые являются олигоспецифичными для белков HCV и также неспецифически реактивируют цитолитические клетки в печени.

Гуморальный ответ при HCV-инфекции требует некоторых комментариев. Первыми синтезируются антитела к NS3-антигену, а затем против NS4 и Е1 и E2 белков, но нет четких доказательств, что синтез антител является защитным, в отличие от нейтрализующей эффективности анти-HBs-антител. С точки зрения иммунопатологии существуют два интересных осложнения HCV-инфекции, связанных с активностью В-клеток. Одним из них является смешанная криоглобулинемия II типа, которая встречается достаточно часто в некоторых географических регионах и характеризуется васкулитом с кожной пурпурой. Это иммунное комплексно-опосредованное заболевание, в котором в состав комплексов входят РНК HCV, антитела к HCV липопротеиновой природы и олигоклональный ревматоидный фактор (RF). Эти криоглобулины являются следствием HCV-инфекции, но механизмы их образования не ясны. Другой вариант течения HCV-инфекции связан с развитием моноклональной лимфопролиферативной трансформации В-клеток, в том числе клонов В-клеток с ревматоидным фактором, которые чувствительны к лимфогенетической хромосомной транслокации, а также транслокации генов, ингибирующих апоптоз, таких как Bcl-2 из хромосомы 18 в локусе IgH на хромосоме 14.

АУТОИММУННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Аутоиммунные заболевания могут влиять на различные анатомические области печени, например на печеночную паренхиму, как при АИГ 1-го и 2-го типов, или на портальные тракты, которые содержат желчные протоки, как при ПБЦ, АИХ и ПСХ.

Аутоиммунный гепатит

АИГ достаточно подробно рассмотрен во многих публикациях. Основные сведения отражают следующие аспекты. Серологически выделяют два типа АИГ, 1-й и 2-й, которые отличаются клиническими проявлениями, географической распространенностью и генетической предрасположенностью. Для АИГ 2-го типа, который встречается реже по сравнению с 1-м типом, возможно молекулярное клонирование, связанное с цитохромом P450.

С помощью метода флюоресцирующих антител у больных АИГ 1-го типа выявлены два серологических маркера, известные в настоящее время как антиядерные антитела (ANA, от англ. antinuclear antibodies) и антитела к гладким мышцам (SMA, от англ. smooth muscle antibody). Данные маркеры отражают высокую специфичность диагностики АИГ 1-го типа. ANA выявляются при СКВ. Они частично тропны к нуклеосомам и хроматинному комплексу. Также в высоком проценте случаев выявляются антитела к двухцепочечной ДНК (dsDNA). Нуклеосома является сложной аутоантигенной структурой, включающей октамеры гистонов.

Гистоны - основной класс нуклеопротеинов, ядерных белков, необходимых для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомах. Существует пять различных типов гистонов, названных H1, H2A, H2B, H3 и H4. Последовательность аминокислот в этих белках практически не различается в организмах различного уровня организации. Гистоны - небольшие сильно основные белки, ассоциированные непосредственно с ДНК. Они принимают участие в структурной организации хроматина, нейтрализуя за счет положительных зарядов аминокислотных остатков отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК, что делает возможной плотную упаковку ДНК в ядре. Благодаря этому 46 молекул ДНК диплоидного генома человека общей длиной около 2 м, содержащих в сумме 6×10⁹ п.о., могут поместиться в клеточном ядре диаметром всего 10 мкм. По две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 составляют октамер, обвитый сегментом ДНК длиной 146 п.о., образующим 1,8 витка спирали поверх белковой структуры. Эта частица диаметром 7 нм называется нуклеосомой. Участок ДНК (линкерная ДНК), непосредственно не контактирующий с гистоновым октамером, взаимодействует с гистоном Н1. Этот белок покрывает примерно 20 п.о. и обеспечивает формирование суперспиральной структуры (соленоида) диаметром 30 нм. Когда хроматин конденсируется с образованием метафазной хромосомы, соленоидные структуры образуют петли диаметром 200 нм, содержащие ДНК длиной 80 000 п.о. Петли связаны с остовом из белков (ядерный остов), причем примерно 20 петель образуют мини-диски. Большое число мини-дисков укладывается в стопку, составляя хромосому. Вследствие этого ДНК оказывается свернута настолько плотно, что даже самая маленькая хромосома человека содержит около 50 млн п.о., окруженных двумя нитями ДНК (146 п.о.), с конденсацией хроматина в четвертичную структуру белка, который презентирует эпитопы для аутоиммунных В- и Т-клеток при СКВ и, вероятно, также при АИГ 1-го типа. Как эта структура становится аутогенетичной, неизвестно, хотя нуклеарные фрагменты, образующиеся при апоптозе, являются основным источником антигенных детерминант хроматина. Однако, учитывая вероятную схожесть антигенных характеристик ANA при СКВ и АИГ 1-го типа, вероятно, должны быть и конкретные (генетические?) отличия развития иммунного ответа при этих патологиях.

Другим важным аутоантигеном при АИГ 1-го типа являются SMA, которые характеризуются множеством аспектов, представляющих практический интерес. Однако требуется отметить, что специфичность SMA для диагностики АИГ 1-го типа достаточно спорна, поскольку довольно трудно с технической точки зрения создать такие аналитические системы, которые могли бы с высокой специфичностью подтверждать, что SMA-положительная сыворотка реагирует именно с F-актином микрофиламентов, поскольку именно анти-F-актин отличается специфичностью при диагностике по сравнению с другими нитями цитоскелета (виментин и тубулин). Возможно, и другие маркеры могут быть использованы для идентификации конкретной анти-F-актиновой реактивности, но этот вопрос еще находится в стадии изучения. Помимо диагностической специфичности, накопление F-актина клетками печени может быть использовано в качестве мишени для аутореактивных Т-клеток или цитотоксических антител. Вероятно, именно таким образом можно объяснить гепатоклеточную фокусировку иммунного ответа при АИГ 1-го типа. К сожалению, гепатоиммунологи пока недостаточно эффективно используют молекулярно-генетические исследования для выявления аутоэпитопов F-актина. К сожалению, необходимо отметить, что, несмотря на установленные конкретные специфические маркеры АИГ 2-го типа, их причинная роль в гепатоклеточных повреждениях до настоящего времени остается неясной.

Перспективными специфическими маркерами при АИГ, вероятно, могут стать антигены, связанные с мембраной клеток печени. Более поздние попытки выявить иммуноглобулины, реагирующие с мембраной клеток печени, включают обнаружение комплекса флюорохром-меченных анти-Ig с помощью микроскопии или проточной цитометрии, или меченного изотопами белка А, или вестерн-иммуноблоттинга после электрофоретического разделения компонентов из очищенной мембраны клеток печени. Эти исследования отражают выраженность иммунного воспаления у пациентов с АИГ 1-го типа или другими заболеваниями, но, к сожалению, не учитывают уровни «фоновой» реактивности при разных воспалительных заболеваниях печени. Именно поэтому остается проблемой интерпретация результатов: являются ли выявленные маркеры отражением патогенетических аутоиммунных повреждений клеток печени, или они лишь вторичные последствия воспаления.

Первичный билиарный цирроз печени

Первичный билиарный цирроз печени (ПБЦ) - аутоиммунное заболевание, встречается гораздо чаще у женщин в зрелом возрасте, имеет «экстрапаренхимальную» патологию, которая протекает в портальных трактах желчных протоков. В 5-10% случаев заболевание протекает с серологическими и гистологическими признаками аутоиммунного гепатита. Хотя ПБЦ характеризуется как аутоиммунное заболевание, для него свойственны некоторые особенности. В частности, есть два вида аутоантител в органеллах клетки, ядре и митохондриях, но непонятно, почему целью аутоиммунного процесса являются желчные протоки. Основной аутоиммунный индуктор синтеза антител и активации Т-клеток был идентифицирован в результате клонирования из базы генов как субъединица пируватдегидрогеназного ферментного комплекса дигидролипоилацетилтрансфераза (PDC-E2), и второй маркер - антитела к ядерным антигенам, экспрессия которых встречается в 50% случаев, как АNА, выявляемые иммунофлюоресценцией. В состав основных молекул, отражающих воспалительный процесс, входят центромерные белки (CENP), ядрышковые Sp 100-антигены, которые являются транскрипционными регуляторными белками, и белки ядерного комплекса gp210 и p62. Встречаются варианты, когда экспрессируются только ANA. Такой серологический вариант может характеризоваться как аутоиммунный холангит, но ANA выявляются и при классическом ПБЦ.

Было выявлено несколько интересных моментов в иммунопатогенезе ПБЦ. Так, были идентифицированы антимитохондриальные антитела (AMA, от англ. antimitochondrial antibodies) к PDC-E2. Изучение иммуногистохимических свойств фермента PDC-E2 в апикальной области желчных эпителиальных клеток показало, что они могут быть поверхностно экспрессируемыми мишенями для иммунной атаки. Важнейшим фактором иммунопатогенеза ПБЦ являются и аутореактивные Т-лимфоциты, имеющие эпитоп в качестве мишени для антител.

Аутоэпитоп В-клеток к анти-PDC-E2 локализуется во внутренней области PDC-E2. Минимальная последовательность аминокислотных остатков составляет 91-227, такой эпитоп считается конформационным, несмотря на то что короткие линейные пептиды охватывают остаток лизина в положении 173. Такие эпитопы способны присоединять антитела больных ПБЦ. Изолированные эпитопы экспрессируют разнообразные пептидные последовательности, но среди них наиболее часто встречаются две последовательности - H₁₃₁ , M₁₃₂ и F₁₇₈, (E) V₁₈₀.

Знание этих последовательностей, вместе с известной структурой NMR внутренней области, позволяет установить топографическую детерминанту, которая образована двумя отдельными частями (H₁₃₁ , M₁₃₂ и F_l78 , V₁₈₀) молекулы PDC-E2, сложенными в определенную позицию на ее внешней поверхности. В частности, молекула лизина (K₁₇₃), к которой присоединен липидный ко-фактор, долгое время считалась важнейшим компонентом в эпитопe. Полученные результаты высокой тропности антигенных детерминант были подкреплены установленным взаимодействием последовательностей ТМ и F (E) V с анти-PDC-E2.

Последовательности М, Н, F, V как в отдельности, так и в комбинации могут подвергаться процессам мутагенеза, что значительно снижает авидность взаимодействия с анти-PDC-Е2, тогда как мутагенез K_l73 не отражается на аффинности. Это было подтверждено опытами на кроликах, иммунизированных препаратами, содержащими эпитопы MH или FV, которые с высокой авидностью связывались со всей молекулой PDC-E2.

Взаимодействие Т-клеточного эпитопа с аутоантигеном PDC-E2 при ПБЦ гораздо лучше изучено, чем при большинстве других аутоиммунных заболеваний. Этот контакт индуцирует пролиферативный ответ CD4⁺ Т-клеточных клонов периферической крови и ткани печени у пациентов с ПБЦ. Взаимодействующие пептиды включают иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп GDLLAEIETDKATI (163- 176) во внутренней липидной области человеческого PDC-E2 и другие структурно сходные пептиды, HLA аллели HLA DR53. Т-лимфоциты образуют две группы. Для одной группы факторами межклеточного контакта были глутамат (E), аспарагиновая кислота (D) и лизин (K) в положениях 170, 172 и 173 (ExDK), другие аминокислоты - в пределах 163-176 положений пептида изучаемых клонов Т-лимфоцитов. Лимфоциты другой группы взаимодействовали только с E3-связывающим белком PDC-E2 (E3BP) с эпитопом EIExD. Т-лимфоциты первой группы взаимодействовали и с другими пептидами, но гораздо чаще и прочнее с белком ExDK на участках 31-44, 134-147 и 235-248 из PDC-E2 Escherichia coli, что согласуется с предположением о том, что микробный молекулярный соответствующий Т-клеточный эпитоп и PDC-E2 может инициировать ПБЦ. Таким образом, если наивные Т-клетки были стимулированы пептидом, экспрессирующим ExDK Escherichia coli, чтобы приобрести фенотип активированных клеток памяти, они могут находиться в любых участках лимфоидной ткани, удаленных от печени. Такие Т-клетки могут быть использованы для кросс-реактивации с PDC-E2 либо после антигенной презентации В-лимфоцитам, специфичным к PDC-E2, или активироваться молекулами МНС на BECs, в которых накопились PDC-E2. Следует отметить, что количество предшественников Т-клеток, которые распознавали HLA-DR53, ограниченный PDC-E2 пептидом, было в 100-150 раз выше для Т-клеток из лимфатических узлов печени или самой печени, чем из периферической крови. Хотя всё из описанных выше аспектов иммунопатогенеза касалось CD4⁺ Т-лимфоцитов, CD8⁺ -цитотоксические Т-лимфоциты с аналогичной спецификой вполне могут вызвать подобные нарушения в желчных протоках при ПБЦ.

ВНУТРИПЕЧЕНОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ И ПАРАЗИТАРНЫХ ИНВАЗИЯХ

Клеточно-опосредованный иммунный ответ является ведущим при туберкулезе. Два типа клеток осуществляют контрольные функции над инфекцией, вызываемой Mycobacterium tuberculosis, - макрофаги и CD4⁺ Т-лимфоциты. Именно эти две популяции клеток являются ведущими в секреции важнейших провоспалительных цитокинов - TNFα и IFNγ. Образование гранулем является ведущим фактором в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции. Изучение генов, отвечающих за восприимчивость и резистентность к Mycobacterium tuberculosis, генов цитокинов системы HLA, участвующих в патогенезе туберкулеза, может быть чрезвычайно полезным в идентификации микроорганизма и создании новых лекарственных препаратов или вакцин.

Бруцеллез - это зоонозная инфекция, вызываемая Brucella spp., которая может быть следствием контакта с больным животным или употребления в пищу продуктов от больного животного. Бруцеллы являются факультативными внутриклеточными микроорганизмами, вызывающими широкий спектр патологических заболеваний. Ведущим иммунопатогенетическим признаком этих инфекций является образование гранулем. Основным клеточным фактором, ингибирующим развитие инфекции, являются лимфоциты Th1-типа.

Шистосомоз - довольно широко распространенное заболевание. Достаточно часто встречается и асимптоматичное носительство, сопровождающееся отдельными повреждениями печени. Ведущим клеточным фактором отдельными ответа при шистосомозе также является иммунный ответ по Th1-типу, а иммунопатогенетическим признаком - образование гранулем. Откладывание яиц шистосомами ведет к развитию Th2-опосредованного иммунного ответа с развитием фиброза в печени.

Возбудитель малярии является внутриклеточным протозойным паразитом, имеющим особое клиническое значение, с преэритроцитарной стадией и экзоэритроцитарной стадией в печени. Основным иммунным механизмом, участвующим в печеночной стадии малярии, является продукция медиаторов с цитотоксическими эффектами CD8⁺ Т-лимфоцитов против инфицированных гепатоцитов. Весь жизненный цикл паразита направлен на уклонение от контроля иммунной системой. Это связано с эволюционными механизмами, позволяющими покидать печень до того, как CD8⁺ Т-лимфоциты, другие клетки с эффекторными функциями и их цитотоксические медиаторы смогут нейтрализовать паразита. В настоящее время исследования сфокусированы на изучении результатов, позволяющих вызвать быстрый цитотоксический эффект. Однако из-за особенностей антигенной характеристики паразита, его сложного жизненного цикла эффективная вакцина до сих пор не создана.

В настоящее время исследования сфокусированы на изучении результатов иммунизации, позволяющих вызвать быстрый цитотоксический эффект со стороны CD8⁺ Т-лимфоцитов.

Entamoeba histolytica является возбудителем амебиаза, а печень - основным органом, где осуществляется внекишечное размножение возбудителя, и местом типичного проявления амебного абсцесса. Несмотря на то что многие иммунопатогенетические эффекты трофозоитов известны, по-прежнему остается много вопросов, касающихся взаимодействия патогена и факторов иммунной системы. Так, первоначальным иммунным ответом на инвазию Entamoeba histolytica является активация макрофагов и нейтрофилов. Однако эти клетки не могут эффективно элиминировать патогены из организма, а активация этих клеток приводит к повреждению тканей. Именно поэтому перед исследователями стоит задача изучения и идентификации специфических вирулентных белков паразита, на основе которых было бы возможным создание эффективной вакцины.

Возбудитель висцерального лейшманиоза (Leishmania donovani infan-tum) также является внутриклеточным микроорганизмом, который первоначально поражает макрофаги печени. Неэффективная клеточно-опосредованная иммунная защита способствует развитию болезни. У большинства иммунокомпетентных людей развивается клеточно-опосредованный иммунный ответ Th1-типа, который снижает проявление клинических симптомов, но не обеспечивает полноценное элиминирование патогена из организма. Образование гранулем при лейшманиозе связано с поздним иммунным ответом макроорганизма, в котором участвуют как клеточные, так и гуморальные факторы вокруг инфицированных макрофагов для поддержания оптимального антимикробного ответа.

Микобактериальные инфекции

Микобактерии нескольких видов могут инфицировать печень, в том числе Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex и Mycobacterium leprae. Печень является одним из наиболее часто поражаемых органов при внелегочном туберкулезе, вызванном Mycobacterium tuberculosis. Туберкулез - одна из наиболее распространенных инфекций. Подсчитано, что в мире инфицировано Mycobacterium tuberculosis около 1,6 млрд человек. Это примерно одна четвертая часть населения земного шара. Шанс инфицированных лиц на развитие клинического заболевания составляет от 2 до 23% в течение жизни. Риск возрастает от 5 до 10% в год для лиц, инфицированных ВИЧ. Печень обычно вовлекается в процесс у пациентов с клинической формой милиарного туберкулеза.

Клеточный иммунный ответ имеет решающее значение в защите макроорганизма от Mycobacterium tuberculosis. Хотя специфические антитела и образуются к нескольким бактериальным продуктам, они не имеют решающего значения в защите макроорганизма от туберкулезной инфекции. Кроме того, выявлены гены, связанные с устойчивостью макроорганизма к Mycobacterium tuberculosis и клинической формой развития заболевания. Микобактерии попадают в легкие воздушно-пылевым или воздушно-капельным путем, а затем гематогенно доставляются в печень. Большая часть информации, касающейся иммунного контроля туберкулеза, связана с легочной инфекцией. Вполне вероятно, что те же самые процессы, которые протекают в легких, имеют место и в печени.

Патогенез и иммунный ответ. Туберкулез является типичной инфекцией иммунной системы. Устойчивость возбудителя туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis, к неблагоприятным факторам внешней среды и иммунной системы связаны с особенностями морфологии возбудителя. Так, в состав клеточной стенки микобактерий входят миколовые кислоты, пептидогликаны, арабиногалактаны. Липоарабиноманнан стимулирует провоспалительные эффекты моноцитов к секреции цитокинов, связывающихся с CD14-рецептором. Микобактерии секретируют протеазы, которые вовлечены в деструкцию тканей. Таким образом, у большинства иммунокомпетентных лиц иммунопатогенез туберкулезной инфекции зависит от состояния иммунного гомеостаза. При туберкулезе формируются гранулемы, в образование которых включены моноциты и Т-лимфоциты. Mycobacterium tuberculosis фагоцитируются преимущественно макрофагами. В фагоцитоз вовлечены многие рецепторы, в том числе рецепторы комплемента - CR1, CR3 и CR4, - маннозные рецепторы и многочисленные адгезионные молекулы. Важную роль в опосредованном поглощении микобактерий макрофагами играют и толл-подобные рецепторы. Внутриклеточные микобактерии сохраняют свою жизнеспособность, тормозя образование фаголизосомы, тем самым они ингибируют индукцию кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов фагоцитоза.

Макрофаги секретируют большое количество провоспалительных цитокинов, усиливающих иммунный ответ. Так, TNFα особенно важен в формировании гранулемы. Это подтверждено в эксперименте на мышах, которым вводили антитела против TNFα, что приводило к уменьшению размеров гранулемы и способствовало репликации Mycobacterium bovis. Последующая секреция хемокинов приводит к притоку клеток в очаг инфекции. Как только достаточное количество клеток попадает в очаг инфекции, IL-10 снижает интенсивность воспаления, что связано с природой гранулемы, этиологической причиной которой является Mycobacterium tuberculosis. Считается, что с завершением апоптоза макрофагов внутриклеточно паразитирующие микроорганизмы погибают. Инфицированные макрофаги продуцируют коллагеназы, протеазы, желатиназу, участвующие в повреждении тканей.

Т-лимфоциты играют важную роль в развитии реакций иммунной системы макроорганизма на Mycobacterium tuberculosis. Антигены представляются Т-лимфоцитам в сайте молекул МНС II класса. CD4⁺ Т-клетки способствуют развитию иммунного ответа. При развитии иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis преобладают клетки Th1-типа. Основным результатом развития иммунного ответа по Th1-типу является секреция IFNγ. IFNγ, с одной стороны, способствует росту гранулемы, с другой - ограничивает репликацию микобактерий. После формирования гранулемы быстро становятся некротическими. Пациенты, у которых выявлены дефекты гена IFNγ или рецепторов к нему, предрасположены к развитию тяжелой туберкулезной инфекции. Больным как с латентным течением инфекции, так и с активным туберкулезом назначают препараты IFNγ. Данные исследований подтверждают, что у больных с активным течением туберкулезной инфекции имеет место низкая секреция IFNγ. Вероятно, Mycobacterium tuberculosis снижают активацию макрофагов IFNγ. CD8⁺ Т-клетки играют также важную роль в защите от инфекций, но окончательно их роль при туберкулезной инфекции не выявлена. Они также могут секретировать IFNγ и тем самым обеспечивают свое участие в развитии цитотоксических эффектов и протективного иммунитета.

Генетические факторы также чрезвычайно важны для устойчивости макроорганизма к туберкулезной инфекции. Однако гены, контролирующие резистентность макроорганизма к Mycobacterium tuberculosis, не установлены, тем не менее определенные типы HLA характеризуются более легким течением легочной туберкулезной инфекции. К ним относятся HLA-DQw3 и HLA-DQB1*0402. Индивидуумы с фенотипом HLA-DR2 ассоциируются с увеличенным риском развития легочной формы туберкулеза. Другие гены также ассоциируются с увеличенным риском более тяжелого течения туберкулеза. Интимные механизмы повышенной восприимчивости организма Mycobacterium tuberculosis не совсем ясны, но установлено, что они связаны с развитием иммунного ответа на белок 38 кДа. Кроме того, у лиц с фенотипом HLA-DR2 установлены низкие уровни лизоцима и других ферментов, которые обычно повышены у пациентов с туберкулезом.

Вакцинация. При вакцинации Bacille Calmette-Guerin (BCG, БЦЖ) индуцирует развитие напряженного иммунитета к Mycobacterium bovis. В связи с этим вакцина до настоящего времени используется как превентивная во многих странах. Ее эффективность оценивается в пределах 60-80%. Однако это - живой микроорганизм, который может вызвать заболевание у иммунокомпрометированных лиц. Именно поэтому в настоящее время пытаются создать вакцину с улучшенной эффективностью и меньшим количеством диагностических проблем. Используется стратегия применения чистой ДНК или субъединиц, которые могли бы стимулировать развитие иммунного ответа по Th1-типу.

Гнойные абсцессы печени

Развитие гнойных абсцессов в настоящее время увеличилось, что, возможно, связано с интенсивной терапией желчнокаменной и панкреатической патологии. Злокачественная обструкция желчных путей сейчас является наиболее распространенной причиной печеночных абсцессов. Использование стентов и антибиотиков широкого спектра действия изменило микробный пейзаж. Появилось большое количество микроорганизмов, которые устойчивы к противомикробным препаратам. Другая причина развития гнойных абсцессов печени - миграция микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта, которые способствуют развитию таких заболеваний, как дивертикулит, аппендицит и карциномы толстой кишки.

Патогенез и иммунный ответ. Формирование абсцесса является своеобразной защитой макроорганизма от распространения инфекции, но также связано и с клиническими проявлениями. Целый ряд факторов в итоге приводит к формированию абсцесса. Это основные факторы вирулентности, такие как инкапсулирование, которое препятствует развитию эффективного фагоцитоза бактерий. Накопление фибрина и изменение микробного пейзажа способствуют формированию абсцесса. При попадании бактерий в печень у макроорганизма есть несколько стратегий иммунного ответа для привлечения иммуно-компетентных клеток в очаг воспаления. Практически все бактерии содержат белки с N-терминальной аминокислотой с N-формилметионином, которые являются хемоаттрактантами для их фагоцитоза макрофагами и полиморфно-ядерными нейтрофилами. Компоненты бактериальной клеточной стенки, такие как ЛПС, могут индуцировать сборку белков системы комплемента по альтернативному пути, а также выполнять функции хемоаттрактантов, привлекающих в очаг воспаления фагоциты. Фагоциты для преодоления трансэндотелиального барьера используют L-селектиновые и CD11b/CD18-рецепторы. После адгезии фагоциты проникают через клеточные поры, чему способствует и градиент хемоаттрактантов. Эти клетки ответственны за секрецию провоспалительных цитокинов, необходимых для усиления иммунных реакций и контроля развития инфекции.

Бруцеллез

Бруцеллез - заболевание, вызываемое Brucella spp. Передается контактным путем больными животными или при употреблении контаминированных бруцеллами молока или молочных продуктов. Печень обычно вовлекается в инфекционный процесс. Известно более 10 видов бруцелл, которые могут вызвать бруцеллез у человека. Однако чаще всего встречается шесть видов, из них наиболее патогенной является Brucella melitensis.

Патогенез и иммунный ответ. Brucella spр. - факультативные внутриклеточные патогены. Они могут выживать и развиваться в клетках РЭС. Фактором вирулентности являются основные антигены бруцелл липополисахаридной природы, что обеспечивает резистентность бруцелл к микробицидным эффектам белков сыворотки крови. Вирулентные Brucella spр. продуцируют разнообразные вещества, которые позволяют им выжить в фагоцитарной клетке. Аденин и 5-гуанозин-монофосфат подавляют активность ферментов миелопероксидазы и супероксиддисмутазы, что в итоге ингибирует кислородный взрыв.

После миграции и пролиферации в периферических лимфатических узлах бруцеллы распространяются гематогенным путем в органы РЭС, такие как печень, в которых образование гранулем является типичным патологическим процессом. Эндотоксин способствует секреции цитокинов, с которыми связана характерная симптоматика бруцеллеза.

Хотя антитела против бруцелл и появляются буквально через несколько дней после заражения, ведущим в защите макроорганизма от инфекции является клеточно-опосредованный иммунный ответ. Антитела могут играть важную роль в защите макроорганизма при реинфекции. NK-клетки являются «первой линией обороны» против многих возбудителей. Brucella активируют NK путем секреции IL-2 макрофагами. NK-клетки, в свою очередь, секретируют IFNγ, который играет определенную роль в развитии иммунного ответа по Th1-типу. Однако в животной модели удаление NK-клеток не изменяло способность мышей, инфицированных B. abortus, контролировать развитие инфекции.

Макрофаги и дендритные клетки выполняют функции АПК. Они фагоцитируют бруцеллы, что приводит к секреции TNFα, IL-1β и IL-6. Эти АПК затем стимулируют Т-клетки через МНС-пептидные комплексы. Активация антигенпредставляющих клеток приводит к секреции IL-12, что, в свою очередь, приводит к активации Т-клеток, В-клеток и NK-клеток. Это направляет развитие иммунного ответа по Th1-типу. B. abortus усиливают экспрессию молекул ICAM-I моноцитами человека, что облегчает взаимодействие между Т-клетками и АПК. Таким образом, MHC I класса ограничивают эффекты цитотоксических Т-клеток, которые необходимы для элиминирования патогенов.

Паразитарные инфекции печени

Эволюционно паразиты гораздо ближе к макроорганизму, чем бактерии и вирусы. Это оптимизирует их выживание в организме хозяина, в окружающей среде и новое заражение восприимчивого организма. Они имеют сложный жизненный цикл, сопровождающийся изменением антигенных характеристик, что позволяет паразитам эффективно уходить от контроля иммунной системы. Шистосомоз, малярия, амебиаз и лейшманиоз достаточно широко изучены. Они представляют различные печеночные патологии, которые характеризуются существенными различиями иммунопатогенеза во взаимодействиях хозяин-паразит. Очень немногие паразиты имеют человеческий печеночный этап в своей жизни, а гельминтозы являются одним из таких примеров.

Шистосомоз

Шистосомоз - инфекция, вызванная трематодами, которая затрагивает около 200 млн человек по всему миру. Печеночно-селезеночный шистосомоз является наиболее тяжелой формой заболевания, встречается примерно в 10% случаев. Большинство людей, инфицированных шистосомами, либо являются бессимптомными носителями, либо имеют симптомы, связанные с воспалением кишечника.

Шистосомоз является привлекательной моделью для изучения взаимодействий хозяин-паразит в печени. Это пример успешной адаптации паразита в организме хозяина. Заражая широкий спектр людей, в то же время шистосомы вызывают манифестную форму заболевания лишь у небольшой части инфицированных. Это демонстрирует сложное взаимодействие с печеночной иммунной системой, что, по всей видимости, связано с эволюционными процессами. Существующие модели шисто-сомоза на мышах и приматах были широко использованы для изучения роли отдельных цитокинов, монокинов, молекул адгезии и отдельных типов клеток в печени при шистосомозе. Экстраполяция этих данных на человека, наряду с эпидемиологическими и генетическими исследованиями, формирует основу для последующего понимания того, как эти паразиты взаимодействует с иммунной системой.

Данные о печеночном жизненном цикле. S. japonicum и S. mansoni являются основными микроорганизмами, вызывающими шистосомоз у людей. Жизненный цикл паразита от стадии личинки до стадии улитки является инфекционным. Они эффективно преодолевают кожные барьеры и трансформируются в незрелые стадии червя. Созревание продолжается около 6 недель, поскольку паразиты мигрируют через венозную и легочную системы. Половое размножение проходит в портальной вене, где взрослые паразиты откладывают яйца. Печеночный шистосомоз протекает, когда отложенные яйца паразитов не выделены, а находятся в ловушке для яиц размером около 50 мкм. Выделение яиц происходит примерно через 5 недель от начала инфекции. Ранний иммунный ответ на инфекцию связан преимущественно с Th1-типа с привлечением эозинофилов и формированием лейкоцитарной гранулемы. Гранулемы увеличиваются в размерах примерно в течение 8 недель, что способствует переключению иммунного ответа на Th2-тип и продолжению инфекции. Печеночный фиброз - результат портальной гипертензии с хорошо сохранившейся функцией печени. Варикозные кровотечения и асцит являются терминальными стадиями портальной гипертензии и приводят наиболее часто к смерти при печеночном шистосомозе.

Цитокиновый ответ. Изучение шистосомоза на мышиных моделях показывает, что попадание яиц паразитов в печень вызывает ранний провоспалительный ответ по Th1-типу с увеличением секреции IFN, NO, TNF и IL-4, которые в краткосрочной перспективе играют роль в ограничении развития печеночной патологии и стабилизации инфекции на стадии образования гранулемы. Откладывание яиц ведет к переключению иммунного ответа на Th2-тип и снижению секреции IFN, NO, TNF, уменьшению размеров печеночных гранулем. Модуляция развития гранулем, видимо, связана с микроокружением печеночного матрикса, так как этот феномен не был выявлен при легочных или везикулярных гранулемах в одной и той же модели. TGFβ является единственным цитокином, содержание которого остается повышенным на этом этапе, что позволяет предположить его ведущую роль в развивающемся фиброзе печени, накоплении коллагена. В исследованиях на мышах было показано, что IL-13 является ведущим профиброзным цитокином, в то время как исследования на приматах показали ведущую роль в этом процессе TGFβ и IL-4. Исследования на мышах позволили предположить, что IL-4 играет важную динамичную роль в ограничении патологии печени и кишечника с помощью ингибирования эффектов интерферона.

Другие факторы макроорганизма. Роль других факторов в спектре заболеваний шистосомозом была изучена с помощью генетических и эпидемиологических исследований в эндемичных районах. С помощью этих исследований была получена информация, объясняющая, почему некоторые люди являются бессимптомными носителями паразита, а у других заболевание протекает в манифестной форме. Это напрямую связано с особенностями индивидуального генного контроля, различиями в активации субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессии ко-стимулирующих молекул, различиях в секреции IgА и гормонального гомеостаза.

Т-клетки и иммунодефицит. У пациентов с шистосомозом и ВИЧ-инфекцией наблюдалось стертое проявление клинических симптомов и уменьшение выделения яиц с фекалиями. Так, циклоспорин снижал эффекты IL-2 как фактора роста Т-лимфоцитов и усиливал действие празиквантела. Были предложены возможные дополнительные пути развития - существования систем организма хозяина, в которых может отсутствовать сигнал от CD4-лимфоцитов печени. На мышиных лимфопенических моделях с дефицитом IL-7 показана возможность развития так называемых карликовых шистосом, которые откладывали значительно меньше яиц и у которых существенно снижен жизненный цикл. После окончания стадии яйца формируется жизнеспособная личинка, которая уже способна инфицировать промежуточных хозяев - пресноводных улиток и других, что рассматривается в качестве механизма выживания в организме промежуточного хозяина до тех пор, пока не будут созданы более благоприятные условия для продолжения жизненного цикла.

Различия в иммунопатогенезе шистосомоза человека и «мышиных моделей». Основные данные об иммунопатогенезе шистосомоза получены на изучении «мышиных моделей». Однако тем не менее выявлены и различия протекания этого заболевания у человека. Так, IgЕ играет чрезвычайно важную роль в защите макроорганизма от паразитов, но такой четкой его роли на «мышиных моделях» не установлено. Дифференцировка развития иммунного ответа по Thl- или Th2-пути гораздо менее выражена у людей, чем у мышей. У человека портальная гипертензия развивается в результате фиброза печени, а у мышей это явление вторично по отношению к формированию гранулемы.

Потенциал для иммунологического терапевтического вмешательства в патогенез шистосомоза заключается в ограничении или изменении откладывания яиц в печени. Исследования на мышах показали, что первоначальные Th1-ответы способствуют формированию гранулемы и могут быть механизмами ограничения развития инфекционного процесса и иммунопатологии в целом. Исследования показали, что это происходит вследствие блокировки iNOS (индуцируемая форма синтазы оксида азота, NO-синтазы, от англ. NO-synthase, NOS) или IL-4. Примерами такого цитокинового сдвига является ген IL-18 модифицированных гепатоцитов, которые и обеспечивают сдвиг иммунного ответа по Th1-пути, изменяют метаболизм L-аргинина, манипулируют синтезом ингибитор нитроксидных радикалов (iNO) или блокируют синтез цитокинов Th2-типа, таких как IL-13, что приводит к меньшему фиброзу.

Малярия

Малярия является самым распространенным паразитарным заболеванием у человека, охватывая, по оценкам исследователей, до 40% населения земного шара и приводя к 1,5-2,7 млн смертей и 300-500 млн клинических случаев в год. Малярию у человека вызывают Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malarie.

Жизненный цикл и иммунное уклонение. Жизненный цикл паразита отражает его стратегию иммунного уклонения. В течение нескольких минут после попадания в кровь из слюны комара спорозоиты попадают в печень, где являются внутриклеточными паразитами. Это дает им возможность уклоняться от гуморального иммунного ответа, генерируемого на их попадание в гепатоциты. В гепатоцитах спорозоиты подвергаются эффекторному воздействию клеток-киллеров и CD8⁺ Т-лимфоцитов. Тем не менее генерация этого цитотоксического ответа занимает 8-10 дней. За это время спорозоит превращается в шизонт и делится в большом количестве на мерозоиты, которые после гибели гепатоцитов выходят в кровяное русло и внедряются в эритроцит. Эритроцитарный этап жизни невосприимчив к гуморальному или цитотоксическому ответу.

Амебиаз

Entamoeba histolytica является второй ведущей причиной смерти после малярии: до 100 тыс. ежегодных смертей среди 50 млн человек, инфицированных инвазивной формой амебиаза. Фундаментальные исследования иммунологии амебиаза позволили сосредоточиться на трех основных вопросах.

Патогенез. Большинство инфицированных лиц являются здоровыми носителями простейших, в то время как у меньшинства развивается манифестная форма болезни, связанная с инвазией слизистой оболочки толстой кишки и/или последующей миграцией в отдаленные органы, например амебный абсцесс печени. Распространенность заболевания варьирует в разных странах. Африка, Центральная и Южная Америка, а также Индия несут основное бремя по заболеваемости и смертности.

Последовательность событий, приводящих к инвазии и последующему повреждению тканей, была всесторонне изучена. Было показано, что особое значение для адгезии трофозоитов к тканям-мишеням имеет лектин (гликопротеин, связывающий белки). По всей видимости, он участвует и в активных цитолитических процессах. Снижение размера амебных абсцессов печени с помощью ингибиторов протеаз в модели на мышах, инфицированных внутрипеченочной прививкой сильнодействующих трофозоитов, доказывает важность протеаз в патогенезе разрушения ткани. В дополнение к одной конкретной функции несколько белков, секретируемых Entamoeba histolytica, вызывают разнонаправленную активацию иммунной системы хозяина, чтобы уклониться от иммунной защиты. Так, например, лектины и протеазы обеспечивают устойчивость к опосредованному комплементом лизису.

Иммунный ответ. Одним из нерешенных клинических вопросов по-прежнему остается отсутствие знаний о наличии защитного иммунитета при амебиазе. Исследования, проведенные в Бангладеш, показали, что дети, у которых вырабатываются в достаточном количестве секреторные IgA-антитела к амебиазному лектину, были какое-то время устойчивы к повторному заражению. К сожалению, защита была неполной, и у 20% детей выявлялись признаки инфекции. Амебиаз вызывает системный гуморальный ответ у большинства пациентов с более высокими титрами антител на ранних фазах заболевания. Этот серологический ответ тоже вряд ли будет являться эффективной иммунологической защитой, так как высокие титры антител выявлялись и у пациентов с прогрессирующей болезнью или абсцессом печени.

Косвенные данные указывают на то, что клеточный иммунитет является более важным и эффективным в защите от Entamoeba histolytica. Спленэктомия, использование стероидов и неонатальная тимэктомия ускоряют образование абсцессов после внутрипеченочного введения возбудителя мышам. Амебный абсцесс печени сопровождался острой нейтрофильной воспалительной реакцией на начальной стадии. Впоследствии макрофаги и естественные киллеры накапливались в очаге воспаления и способствовали образованию гранулемы и последующему прогрессивному некрозу, опосредованному фактором некроза опухолей, интерфероном и интерлейкинами.

Лейшманиоз

Висцеральный лейшманиоз (кала-азар) является потенциально смертельной протозойной инфекцией, при которой макрофаги печени вместе с мононуклеарными клетками костного мозга и селезенки являются объектами для внутриклеточного паразитирования лейшманий. Клинические проявления лейшманиоза: хроническая лихорадка, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия, панцитопения и прогрессирующая кахексия являются смертельными при отсутствии лечения. На индийском субконтиненте, где наблюдается почти половина новых случаев заражения в мире (около 250 тыс. в год), и в других тропических или не тропических странах (около 80 тыс.) главным возбудителем является Leishmania donovani.

Иммунный ответ. Естественная резистентность к висцеральному лейшманиозу формируется у лиц с отсутствием дисфункций со стороны клеточного иммунитета и в первую очередь Th1-пути. Устойчивость макроорганизма к лейшманиям может страдать у лиц с вторичными иммунодефицитными состояниями (ВИЧ, иммунодепрессии, голодание и т.д.), в этих случаях, как правило, развивается манифестная форма заболевания.

Клеточный иммунный ответ соответствует другим вариантам иммунного ответа, который развивается в отношении внутриклеточно паразитирующих микроорганизмов (M. tuberculosis, M. leptae и др.). В этот процесс вовлекается большое количество эффекторных клеток, таких как NK, CD8⁺, а также цитокинов, IFNγ, IL-2 и IL-12. Патологические процессы коррелируют с формированием гранулем, что является своеобразным специализированным механизмом защиты тканей макроорганизма и подтверждено экспериментальными исследованиями на моделях мышей. Ведущим клеточным фактором в этих патологических процессах является циркулирующий моноцит, с которым связано развитие как защитных специфических иммунологических реакций, так и потенциально повреждающих. При идеальных условиях формирования гранулемы имеет место ограниченное заражение макрофагов, и данное обстоятельство позволяет эффективно клеточным и гуморальным механизмам локализовать инфекцию. Локализация паразита, его неподвижность, постоянный иммунологический контроль позволяют избежать персистирования инфекции.

Гепатиты вследствие иммунологических реакций на лекарственные препараты

Применение лекарственных препаратов (наркотических) достаточно часто сопровождается развитием иммунопатологических реакций. Средняя встречаемость таких поражений - 40-60 случаев на миллион случаев применения препарата, что, учитывая их высокий уровень потребления в обществе, объясняет достаточно высокие показатели иммунологически опосредованных реакций, не связанных с непосредственной токсичностью применяемых препаратов. Иммуноопосредованные гепатотоксические реакции усиливаются при повторном воздействии лекарственных препаратов, это подтверждают гистологические изменения, которые включают воспалительные лимфоидные инфильтраты, гранулемы, состоящие преимущественно из эозинофилов. Диагностические тест-системы для выявления иммуноопосредованных гепатотоксических реакций in vitro несовершенны, а использование биопробных животных дает не всегда адекватный результат. Именно поэтому лабораторное подтверждение гепатотоксичности лекарственных препаратов в настоящее время остается существенной проблемой для гепатоиммунологии.

Предложена классификация препаратов, применение которых может сопровождаться развитием гепатотоксических реакций и лабораторно подтверждаться серологическими маркерами аутоиммунного гепатита, напоминающего АИГ или 1-го, или 2-го типа, либо гепатита без аутоантител. Многие такие препараты сняты с производства, но некоторые остались, хотя их гепатотоксичность была подтверждена.

Иммунологические события, которые поддерживают иммуноопосредованную гепатотоксичность препаратов, сводятся в основном к следующим механизмам. Так, активный метаболит препарата, конъюгированный с ферментом, участвующим в его удалении, генерирует неоантиген с конкретными свойствами. Это включает представление чужеродных эпитопов, которые могут быть частью фермента, участвующего в метаболизме препарата, или его метаболически измененной формой. В метаболизме препаратов участвуют ферменты цитохромоксидазы Р450. Образующиеся антитела при развитии токсического гепатита установлены. Однако иммуноопосредованная гепатотоксичность препаратов, ассоциированная с серологическими особенностями АИГ 1-го типа, не укладывается в приведенную выше схему. По всей видимости, существует альтернативная возможность действия препаратов, индуцирующих нарушения механизмов аутотолерантности, что может способствовать развитию медикаментозной гемолитической анемии или волчаночному синдрому, например, связанных с метилдопой или прокаинамидом соответственно.

В практической деятельности для диагностики и контроля лечения заболеваний печени используется ряд клинических и лабораторных показателей, которые объединяются в так называемые клинико-лабораторные синдромы (цитолиз, холестаз, печеночно-клеточная недостаточность, мезенхимально-воспалительный) (табл. 3-1).

Ряд авторов дополнительно выделяют такие синдромы, как синдром токсического поражения и синдром опухолевого роста печени и др.

СИНДРОМ ЦИТОЛИЗА

Синдром цитолиза - это комплекс клинических, морфологических и биохимических изменений гепатоцитов в результате прогрессирующего структурного их расстройства вплоть до полного некроза. Он обусловлен нарушениями проницаемости клеточных мембран, распадом мембранных структур или некрозом гепатоцитов с выходом в плазму крови ферментов. Морфологической основой этого синдрома являются гидропическая и ацидофильная дистрофия и некроз гепатоцитов с повреждением и повышением проницаемости клеточных мембран.

Различают обратимую (собственно цитолиз) и необратимую (некробиоз) стадии цитолиза. Обратимая стадия характеризуется изменениями биохимических процессов в гепатоците. Она проявляется повышенным содержанием в плазме крови билирубина (за счет обеих фракций), железа, витамина В₁₂ , увеличением активности АЛТ, АСТ, лактатдегидрогеназы (ЛДГ₅ ), α-глутатион-S-трансферазы (ГТ), глутаматдегидрогеназы, сорбитолдегидрогеназы, орнитинкарбамоилтрансферазы, фруктозо-1,6-бисфосфат-альдолазы и некоторых других ферментов.

Примечание. АСТ - аспартатаминотрансфераза; АЛТ - аланинаминотрансфераза; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; ЩФ - щелочная фосфатаза; ГГТФ - гамма-глутамилтрансфераза; СОЭ - скорость оседания эритроцитов.

Если клетка погибает, то говорят о некробиозе, который в большей степени характеризуется морфологическими изменениями.

Аланинаминотрансфераза (АЛТ, КФ 2.6.1.2) - цитоплазматический фермент, катализирует перенос аминогруппы от аланина на α-кетоглутарат с образованием пировиноградной кислоты и глутаминовой кислоты (в присутствии пиридоксальфосфата).

Ее активность наиболее выражена в печени. В сердечной мышце, скелетной мускулатуре, поджелудочной железе, селезенке, легких, эритроцитах ее активность существенно ниже. У мужчин активность АЛТ в сыворотке крови несколько выше, чем у женщин. В связи с тем что АЛТ является цитоплазматическим ферментом и содержится в различных типах клеток, его поступление в кровь возможно при различных процессах, сопровождающихся повышенной проницаемостью цитоплазматических мембран.

При острых патологических процессах активность фермента в сыворотке может превышать нормальные значения в десятки раз и более. По степени активности АЛТ (и в меньшей степени АСТ) судят о степени поражения печени. Повышение активности фермента в 1,5-3 раза свидетельствует о минимальной активности процесса. При повышении активности в 4-10 раз говорят об умеренном повреждении печени, а при увеличении активности более чем в 10 раз - о высокой степени поражения гепатоцитов.

Повышение активности АЛТ часто происходит еще до развития клинической картины заболевания в продромальный период (так, например, при острых вирусных гепатитах у половины больных за 5 дней до появления желтухи, а за 2 дня - у 90% пациентов). При безжелтушной форме гепатита активность АЛТ также повышается. При хронических гепатитах (особенно при вирусном гепатите С) не всегда прослеживаются корреляции между активностью АЛТ и выраженностью морфологических изменений в печени.

Референтные значения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови - 30-420 нмоль/(с ? л), или 2-35 МЕ/л.

Аспартатаминотрансфераза (АСТ, КФ 2.6.1.1) катализирует перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на α-кетоглутарат с образованием оксалоацетата и глутаминовой кислоты.

В тканях аспартатаминотрансфераза существует в виде двух изоферментов - цитозольного и митохондриального с молекулярной массой 92,6 и 89,8 кДа соответственно. Их изоэлектрические точки находятся при рH 6 и 9. Установлены первичная и трехмерная структуры обоих изоферментов. Они образованы двумя идентичными субъединицами, которые состоят из двух доменов: большого, связывающего кофермент пиридоксальфосфат и малого - подвижного. Между ними расположен активный центр. Взаимодействие с субстратом сопровождается сдвигом малого домена в сторону активного центра. Митохондриальная изоформа АСТ также катализирует реакции трансаминирования с участием L-тирозина, L-триптофана и L-фенилаланина. Скорость этих реакций в 200-1000 раз меньше скорости основной реакции. В клетках организма 2/3 фермента представлено митохондриальной изоформой и 1/3 - цитоплазматической фракцией.

Наиболее высокая активность АСТ выявляется в сердечной мышце, печени, скелетной мускулатуре, нервной ткани и почках, меньшая - в поджелудочной железе, селезенке, легких. В миокарде у здоровых людей активность AСT примерно в 10 000 раз выше, чем в сыворотке крови.

Поскольку АЛТ локализуется в цитоплазме, а AСT - преимущественно в митохондриях, то при заболеваниях печени активность АСТ повышается в меньшей степени, чем АЛТ. Значительное повышение активности АСТ свидетельствует о более тяжелом повреждении гепатоцита.

Референтные значения активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови - 30-420 нмоль/(с ? л), или 2-35 МЕ/л.

Коэффициент де Ритиса - отношение активности АСТ/АЛТ. В клинической практике коэффициент используют для дифференциальной диагностики заболеваний печени и миокарда.

Референтные значения коэффициента де Ритиса находятся в диапазоне 0,91-1,75 и в среднем составляют 1,33±0,42. Рассчитывать коэффициент де Ритиса целесообразно только при выходе значений активности АСТ и/или АЛТ за пределы референтных значений.

При неосложненном синдроме цитолиза митохондриальные структуры повреждаются мало, поэтому общее количество поступающей в кровь АСТ невелико по сравнению с количеством АЛТ, которая целиком локализуется в цитоплазме и попадает в кровь при повреждении этих структур. Вследствие этого отношение активности АСТ/АЛТ при вирусных гепатитах определяется в пределах 0,6-0,8. Отношение активности АСТ/АЛТ меньше единицы характерно и для холестатического синдрома и во всех случаях, когда активность АЛТ превышает активность АСТ (у большинства пациентов с токсическим гепатитом, инфекционным мононуклеозом, внутрипеченочным холестазом). Это свидетельствует о преимущественном повреждении цитоплазматической мембраны гепатоцитов еще до развития морфологических нарушений, то есть в обратимой стадии заболевания.

Повышение значений коэффициента де Ритиса больше единицы (преимущественно за счет активности АСТ) наблюдается при тяжелых поражениях печени с разрушением большей части печеночной клетки и выходом в кровь митохондриальных ферментов гепатоцита. Так, отношение активности АСТ/АЛТ больше единицы характерно для хронического активного гепатита с высокой степенью активности, цирроза и опухолей печени, наличия внутрипеченочных метастазов. Отношение активности АСТ/АЛТ более 2,0 характерно для алкогольного поражения печени.

Однако для точной дифференциальной диагностики этот простой показатель непригоден, так как нередко при алкогольном поражении печени (алкогольный гепатит, цирроз печени) и неалкогольной жировой болезни печени также преобладает повышение активности АСТ, и коэффициент де Ритиса составляет 2,0-4,0 и более.

При заболеваниях печени активность АЛТ является более специфичным маркером, чем AСT.

В тяжелых случаях поражения печени, обычно в терминальной стадии печеночной недостаточности, активность ферментов плазмы крови может оказаться нормальной или даже сниженной вследствие резкого нарушения их синтеза гепатоцитами. При этом нередко наблюдается так называемая билирубин-ферментативная диссоциация: нормальная или сниженная активность АЛТ и АСТ и повышение содержания билирубина.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) - цитоплазматический цинксодержащий гликолитический фермент, обратимо катализирующий восстановление пировиноградной кислоты в молочную кислоту.

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убыли активности ЛДГ органы и ткани можно расположить в следующей последовательности: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. ЛДГ содержится в значительном количестве в эритроцитах, поэтому исследуемая сыворотка крови не должна содержать следов гемолиза. ЛДГ представляет собой тетрамер, который состоит из двух видов субъединиц - М-субъединиц (от англ. muscle - мышца) и Н-субъединиц (от англ. heart - сердце). М-субъединица синтезируется в основном в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как Н-субъединица - в тканях с преобладанием аэробных процессов. Молекулярная масса ЛДГ составляет 140 кДа, то есть молекулярная масса каждой субъединицы - 35 кДа. Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков. Каталитический центр имеется на каждой субъединице. Тем не менее при диссоциации тетрамера на димеры или мономеры происходит потеря ферментативной активности.

ЛДГ имеет пять изоферментов, представляющих различные комбинации из четырех субъединиц двух основных типов - Н и М: ЛДГ₁ (НННН), ЛДГ₂ (НННМ), ЛДГ₃ (ННММ), ЛДГ₄ (НМММ) и ЛДГ₅ (ММММ). Изоферментный спектр и тип обмена веществ в ткани коррелируют между собой: в тканях с преимущественно аэробным обменом веществ (мозг, сердце, почки и т.д.) наибольшей активностью обладают ЛДГ₁ и ЛДГ₂ ; в тканях с выраженным анаэробным обменом веществ (печень, скелетная мускулатура и др.) преобладают ЛДГ₄ и ЛДГ₅ . Это распределение имеет большой биологический смысл. Изофермент ЛДГ₁ in vitro активен при низкой концентрации пирувата и ингибируется его избытком, в то время как ЛДГ₅ сохраняет активность при сравнительно высоких концентрациях пирувата. Поскольку восстановление пирувата в лактат, катализируемое ЛДГ₁ , сильно ингибируется уже небольшими концентрациями пирувата, то в ткани, богатой этим изоферментом, например в сердце, пируват подвергается преимущественно аэробному окислению. С другой стороны, в тканях, где преобладают изоферменты ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (печень, скелетная мускулатура), АТФ в значительной степени образуется за счет анаэробного гликолиза. Высокая активность ЛДГ₅ в них обеспечивает быстрое превращение пирувата в лактат. Однако в некоторых тканях нет зависимости между типом обмена и изоферментным спектром. Так, в эритроцитах, тромбоцитах, хрусталике глаза, где преобладает анаэробный обмен, фермент представлен в основном изоформами ЛДГ₁ и ЛДГ₂ . По степени подвижности при электрофорезе изоферменты ЛДГ располагаются в следующем порядке: ЛДГ₁ ближе к аноду, а вслед за ней - ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ 4 и ЛДГ5.

Не все изоферменты ЛДГ гомогенны: при электрофоретическом разделении изоферментов ЛДГ сыворотки и эритроцитов в полиакриламидном геле обнаружено две полосы в зоне ЛДГ₃ , что позволяет предположить синтез двух форм ЛДГ₃ в тканях - это объясняется различием пространственного (цис и транс) расположения Н- и М-субъединиц в тетрамере.

Имеется закономерность в отношении активности изоферментов ЛДГ: активность ЛДГ₂ > ЛДГ₁ > ЛДГ₃ > ЛДГ₄ > ЛДГ₅ .

Активность ЛДГ определяется в крови здорового человека независимо от его пола и возраста. Общая активность ЛДГ в сыворотке крови здоровых лиц, определенная при 25 °С, составляет 100-225 МЕ/л. Методом электрофореза на любой поддерживающей среде в сыворотке крови здоровых лиц удается разделить все изоферменты ЛДГ, которые распределены следующим образом: ЛДГ₁ - 14-26%, ЛДГ₂ - 29-39%, ЛДГ₃ - 20-26%, ЛДГ₄ - 8-16%, ЛДГ₅ - 6-16%.

Общая активность ЛДГ в сыворотке крови повышается при многих патологических состояниях. Выраженное повышение наблюдается при циррозах печени, обтурационных желтухах, заболеваниях почек, опорно-мышечного аппарата, опухолях, при сердечной недостаточности и др. Активность фермента повышается при любых патологических процессах, связанных с цитолизом клеток органов и тканей, поэтому для дифференциальной диагностики заболеваний более целесообразно исследовать изменения спектра изоферментов ЛДГ. Активность ЛДГ₅ в сыворотке крови - чувствительный индикатор гепатоцеллюлярного поражения. Увеличение ее активности обычно наблюдают при гепатите, гипоксии печени (включая застой крови в печени вследствие сердечной недостаточности), лекарственной интоксикации, циррозе, опухолях и травме.

Референтные значения общей активности ЛДГ в сыворотке крови - до 533 нмоль/(с ? л) при температуре 30 °С, или 100-225 МЕ/л.

Сорбитолдегидрогеназа (КФ 1.1.1.14) при участии НАД⁺ катализирует обратимое окисление идитола в сорбозу. Этот же фермент катализирует превращение сорбитола во фруктозу. рН-оптимум сорбитолдегидрогеназы находится в пределах 7,4-7,6.

Сорбитолдегидрогеназа содержится преимущественно в печени, простате и почках. В других тканях ее активность незначительна, то есть фермент обладает высокой органной специфичностью.

Повышение активности фермента специфично отражает поражение печени. Так, при вирусном гепатите активность сорбитолдегидрогеназы увеличивается уже в дожелтушный период. Наиболее высокая ее активность наблюдается в течение первых 10 суток желтушного периода при всех острых гепатитах. Активность сорбитолдегидрогеназы нормализуется быстрее, чем активность АЛТ, однако высокая специфичность позволяет отдавать ей преимущество при лабораторной оценке цитолитического синдрома при поражениях печени. При хроническом гепатите и циррозе печени заметное увеличение активности сорбитолдегидрогеназы наблюдается в стадии обострения процесса. При механических желтухах в первые недели желтушного периода активность сорбитолдегидрогеназы может быть повышенной, но это повышение всегда менее выражено, чем при инфекционном гепатите.

Важно отметить, что при инфаркте миокарда, заболеваниях почек, простаты и скелетной мускулатуры уровень активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови практически не изменяется.

Референтные значения активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови составляют <1,5 МЕ/л или <0,03 мккат/л при температуре 25 °С.

Глутатион-S-трансфераза (ГТ, КФ 2.5.1.18). ГТ - универсальные ферменты, они катализируют перенос восстановленного глутатиона (GSH) на неполярные вещества. ГТ обнаружены во всех типах клеток, распространены шире, чем цитохром Р450, глюкуронил- и сульфо-трансферазы.

ГТ у человека включают три основных семейства: цитозольное, митохондриальное и микросомальное. В первые два семейства входят растворимые формы ферментов.

Цитозольные ГТ - самое большое семейство. Это димеры, субъединицы которых состоят из 199-244 аминокислотных остатков. На основе аминокислотных последовательностей у человека выделяют три класса цитозольных ГТ - Alpha (α или А), Ми (μ или М) и Pi (п или Р).

Цитозольные ГТ участвуют в биосинтезе лейкотриенов, простагландинов, тестостерона, прогестерона и в деградации тирозина.

Митохондриальная ГТ - димер с субъединицами, состоящими из 226 аминокислотных остатков. В цитозоле фермент отсутствует, но присутствует в нуклеосомах. Фермент подобен бактериальным дисульфидизомеразам.

Микросомальное семейство ГТ (ферменты MAPEG, от англ. membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism) - мембрано-ассоциированные белки. Они принимают участие в метаболизме эйкозаноидов и глутатиона, в детоксикации ксенобиотиков, обладают антипероксидазной и изомеразной активностью.

Все три семейства глутатионтрансфераз содержат ферменты, катализирующие конъюгацию GSH и обладающие глутатионпероксидазной активностью. Цитозольные ГТ и MAPEG катализируют реакции метаболизма различных ненасыщенных веществ и вовлечены в синтез лейкотриенов и простагландинов.

ГТ катализируют ряд реакций, характерных для других ферментов. Они восстанавливают ROOH, как глутатионпероксидаза, изомеризуют или образуют сложные эфиры, как ферменты, использующие GSH в качестве кофермента (простагландин Е-изомераза, формальдегиддегидрогеназа, глиоксалаза I). Разные формы ГТ отличаются по локализации и преимущественному метаболизму эндо- и экзогенных веществ.

В настоящее время определение активности ГТ активно внедряется в клиническую практику, поскольку диагностическая ценность этого маркера цитолиза существенно выше, чем активность аминотрансфераз. Так, например, у больных хроническим вирусным гепатитом С в стадии активной репликации с нормальным уровнем активности аминотрансфераз (а это почти 1/3 всех больных) активность α-глутатион-S-трансферазы была повышена, а также имелась корреляционная связь с выраженностью морфологических изменений в печени (в отличие от АЛТ, АСТ).

Наибольшее диагностическое значение при синдроме цитолиза имеет определение активности органоспецифических (индикаторных) ферментов печени. Эти ферменты участвуют в обменных процессах, протекающих непосредственно в печени. К ним относятся, в частности, ферменты цикла синтеза мочевины (орнитинкарбамоилтрансфераза, аргиназа, сукцинатлиаза и др.). В настоящее время известно порядка 20 органоспецифических ферментов печени. Их активность в плазме крови здоровых людей практически не определяется.

Сывороточное железо может быть повышено при синдроме цитолиза, так как оно депонируется в гепатоците. Повышение уровня железа в сыворотке крови с одновременным увеличением активности аминотрансфераз можно считать проявлением цитолитического синдрома. Если же повышение содержания сывороточного железа отмечается при нормальной активности аминотрансфераз, то необходимо искать другую причину повышения его концентрации. Например, первичный гемохроматоз, вторичная перегрузка железом и др. В этом случае необходимо дополнительно определить содержание трансферрина и ферритина, ненасыщенную железосвязывающую способность сыворотки крови, рассчитать коэффициент насыщения трансферрина железом, а при необходимости провести морфологическое исследование печени (см. раздел «Роль печени в обмене железа» в главе 1, с. 98).

Гипербилирубинемия возникает преимущественно за счет конъюгированного билирубина (прямого). Подробно механизмы развития гипербилирубинемии изложены далее, в разделе «Клинический симптом желтух вследствие нарушений обмена билирубина» (с. 274).

СИНДРОМ ХОЛЕСТАЗА

Холестаз - это уменьшение или полное прекращение оттока желчи вследствие нарушения ее образования, экскреции и/или выведения. Патологический процесс может возникнуть и протекать в любом участке гепатобилиарной системы - от синусоидальной мембраны гепатоцита до дуоденального сосочка.

Морфологической основой внутриклеточного холестаза являются ультраструктурные изменения гепатоцита - гиперплазия гладкой цитоплазматической сети, изменения билиарного полюса гепатоцита, накопление компонентов желчи в гепатоците, которые нередко сочетаются с цитолизом гепатоцитов. При внутрипеченочном холестазе выявляют накопление желчи в желчных ходах, а при внепеченочном - расширение междольковых желчных протоков.

В клинической практике синдром подразделяют на внутрипеченочный и внепеченочный холестаз.

Внутрипеченочный холестаз характеризуется уменьшением тока желчи и ее поступления в двенадцатиперстную кишку при отсутствии механического повреждения и обтурации внепеченочного билиарного протока. Внутрипеченочный холестаз подразделяется на интралобулярный холестаз, обусловленный поражением гепатоцитов (гепатоцеллюлярный) и канальцев (каналикулярный), и экстралобулярный (дуктулярный), связанный с поражением внутрипеченочных желчных протоков.

Эта форма холестаза возникает либо при нарушении образования и транспорта желчи гепатоцитами, либо при повреждении внутрипеченочных протоков, либо при сочетании указанных факторов. В результате желчь накапливается в гепатоцитах и гипертрофированных клетках Купфера и в расширенных каналикулах.

Внепеченочный холестаз возникает при обструкции и/или механическом повреждении внепеченочных желчных протоков, то есть при механической желтухе. При внепеченочном холестазе желчь находится в расширенных междольковых желчных протоках (дуктулярный билирубиностаз) и паренхиме печени в виде «желчных озер».

Холестаз может приводить к развитию билиарного фиброза и цирроза печени.

Для обеих форм холестаза характерны следующие биохимические изменения:

Щелочная фосфатаза (ЩФ, КФ 3.1.3.1) - фермент, отщепляющий неорганический фосфат от органических фосфорных эфиров. Молекула ЩФ человека представлена двумя субъединицами с молекулярной массой от 40 до 75 кДа каждая. ЩФ проявляет активность в димерном состоянии. Димеры ЩФ связывают четыре атома цинка и несколько ионов магния. Некоторые из этих ионов тесно связаны с активным центром, находящимся на каждом мономере. При удалении металлов происходит утрата каталитической активности. Фермент расположен на клеточной мембране и принимает участие во внутриклеточном транспорте фосфора.

При электрофорезе в агаровом геле выделено пять изоферментов: почечный, костный, кишечный, плацентарный, печеночный. Наиболее быстро мигрирующей от катода к аноду фракцией является печеночный изофермент. При заболеваниях печени возможно появление второй печеночной полосы ЩФ. Несколько более медленно по сравнению с печеночной фракцией движется костная фракция ЩФ. За ней движется плацентарная термостабильная фракция ЩФ. Последней мигрирующей является кишечная фракция.

Кроме того, различают еще термостабильный изофермент ЩФ «Реган», названный по имени больного раком легкого, у которого он впервые был обнаружен. Появление изофермента «Реган» может быть связано с наличием злокачественного новообразования, обнаруживаемого у l/6 всех онкологических больных и 1/3 больных с повышенной активностью ЩФ. рН-оптимум ЩФ находится в интервале 8,6-10,1, в отличие от кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2.), находящейся в простате, селезенке, печени, почках, клетках крови (лейкоциты, эритроциты, тромбоциты) и активной при кислых значениях pH (3,4-6,2). В сыворотке крови ЩФ распределена по трем белковым фракциям - α-, β-и γ-глобулинам.

ЩФ содержится практически во всех тканях человека. Изоферменты ЩФ обнаружены в стенках желчных протоков (внутри- и внепеченочных), в остеобластах, в слизистой оболочке кишечника, в плаценте и лактирующей молочной железе. В печени ЩФ локализована в клетках эндотелия синусоидов и в гепатоцитах, примыкающих к желчным канальцам. Из печени он выводится с желчью.

По данным обследования большой группы госпитализированных больных, лишь в 65% случаев высокая активность ЩФ была обусловлена заболеваниями печени. Повышение активности «печеночной» фракции фермента является следствием стимуляции его синтеза при нарушении оттока желчных кислот. Это происходит при возникновении холестаза, вызванного как внутриили внепеченочной обструкцией желчных путей, так и действием некоторых лекарственных препаратов.

Так, например, у женщин, принимающих противозачаточные препараты, содержащие эстрогены и прогестерон, может развиться холестатическое повреждение печени и, как следствие, повышается активность ЩФ за счет печеночной фракции.

Однако в связи с тем, что в клинической практике определяется суммарная активность ЩФ, а не изоферментов, ее повышение далеко не всегда свидетельствует о повреждении печени. Для подтверждения печеночного происхождения ЩФ она должна быть повышена одновременно с другими маркерами холестаза (γ-глутамилтрансферазой, лейцинаминопептидазой и др.). Так, например, одновременное повышение активности ЩФ, γ-глутамилтрансферазы и 5'-нуклеотидазы свидетельствует в пользу заболевания печени и указывает на наличие холестаза. Резкое повышение ЩФ иногда можно расценивать как онкомаркер (наблюдается у 90% больных с первичной гепатоцеллюлярной карциномой и при метастазах в печень).

При нормальном уровне активности ЩФ наличие холестаза сомнительно.

Уменьшение активности ЩФ отмечается при нарушениях роста кости, гипотиреозе, гипофосфатаземии, гиповитаминозе С, выраженной анемии. Низкая активность ЩФ у беременных - признак недостаточности развития плаценты.

Референтные значения активности ЩФ - 278-830 нмоль/(с ? л), или 0,02-0,05 МЕ.

Нормальные величины активности ЩФ в значительной степени зависят от возраста. Активность щелочной фосфатазы повышена у детей до периода полового созревания, у женщин - в результате резорбции костей после наступления менопаузы. Прием пищи повышает содержание кишечного изофермента ЩФ в сыворотке крови, особенно у людей с I и III группой крови.

5'-Нуклеотидаза (5’HT, КФ 3.1.3.5) представляет собой группу фосфатаз, которые катализируют гидролиз нуклеотидов (например, аденозин-5'-фосфата), высвобождая неорганический фосфат из 5'-позиции. Различают связанную с мембранами и цитозольные формы 5’HT. Мембранная 5’НТ (эктофермент) используется как маркер ферментов, связанных с внешней поверхностью мембран клеток. Она гидролизует нуклеозидфосфаты и дезоксинуклеозидфосфаты исключительно как 5'-монофосфаты, не проявляя активности (или очень малую) с 2'- или 3'-монофосфатами. Основным субстратом связанной с мембраной 5’НТ является АМФ. Ее активность зависит от присутствия катионов Mg²⁺ и Zn²⁺ . Фермент состоит из идентичных субъединиц с молекулярной массой 60-80 кДа каждая в зависимости от своей локализации. В нативном состоянии 5’НТ является димером с молекулярной массой 120-160 кДа. Мембранная 5’НТ под действием фосфолипаз может освобождаться из мембран в цитозоль. Цитозольная форма фермента, катализирующая гидролиз преимущественно AMФ, в нативном состоянии является тетрамером с молекулярной массой 150 кДа. Каждая субъединица имеет молекулярную массу 40 кДа.

Несмотря на то что 5’НТ присутствует в различных органах, ее активность в крови обусловлена в основном выходом из гепатобилиарных структур под влиянием детергентного действия желчных кислот на плазматические мембраны. 5’НТ сопряжена с цитоплазматической мембраной канальцевых, синусоидальных и купферовских клеток печени. Ее действие ограничено пределами мембраны печеночных клеток.

Наибольшая активность 5’HT наблюдается при холестазах любой локализации. Изменение ее активности при холестазе в крови коррелирует с активностью щелочной фосфатазы. В то же время определение активности 5’HT является более чувствительным диагностическим тестом при первичном и вторичном билиарном циррозе, а также хроническом активном гепатите. Такая же закономерность наблюдается и по отношению к опухолям печени.

На практике определение активности 5’HT является полезным для диагностики у больных без желтухи. В связи со специфичностью увеличения активности 5'-нуклеотидазы при заболеваниях печени и отсутствием ее реакции на костную патологию она имеет определенное преимущество перед исследованием щелочной фосфатазы.

Референтные значения активности 5’НТ составляют 2-17 МЕ/л.

Для 5’HT характерна низкая активность в детстве, постепенное ее возрастание в подростковом периоде и постоянство после 50 лет. Повышение активности 5’HT является нормальным у некоторых женщин в последнем триместре беременности.

Гамма-глутамилтрансфераза (γ-глутамилтрансфераза, ГГТФ, КФ 2.3.2.2) - микросомальный фермент, участвующий в обмене аминокислот.

ГГТФ представляет собой гетеродимерный белок гликопротеин, который состоит из тяжелой (68 кДа) и легкой (22 кДа) цепей. Тяжелая цепь располагается внутри клетки. Она содержит трансмембранный домен и внеклеточный компонент, который находится на наружной мембране клетки и связывает легкую цепь. На легкой цепи расположен активный центр фермента, который обеспечивает перенос γ-глутамильного остатка с γ-глутамильного пептида (глутатиона) на аминокислоту, другой пептид или на иную субстратную молекулу.

В зависимости от метода определения (электрофорез на разных носителях) выявляется от двух до пяти фракций γ-глутамилтрансферазы. Фракции отличаются друг от друга своим углеводным составом, лектинсвязывающим свойством, а также по способности очищенного апофермента образовывать агрегаты и комплексы с липидами и протеинами.

Высокая активность ГГТФ обнаружена в клетках почек и поджелудочной железы, в эндотелии сосудов и макрофагах периферической крови, значительно меньшая активность выявлена в печени, селезенке и мозге. В скелетных мышцах, сердечной мышце и легких активность ГГТФ практически не определяется. Изменение активности фермента характеризует состояние мембран клеток с высокой секреторной, экскреторной и адсорбционной активностью (эпителий желчных путей, печеночных канальцев и проксимального отдела нефрона; ворсинки тонкой кишки; панкреатическая экзокринная ткань и выводные протоки поджелудочной железы). В биологических жидкостях наиболее высокая активность фермента наблюдается в желчи и моче, в сыворотке крови активность ГГТФ в 4-6 раз ниже по сравнению с мочой.

Несмотря на то что активность фермента наиболее высока в почках, источник сывороточной ГГТФ - преимущественно гепатобилиарная система, и увеличение ее активности в сыворотке - наиболее чувствительный лабораторный показатель при заболеваниях гепатобилиарной системы (маркер холестаза в совокупности с другими маркерами). Она наиболее высока в случаях обструктивных поражений печени (внутри- или подпеченочной закупорки желчевыводящих путей), достигая повышения в 5-30 раз от нормальных значений.

В связи с тем что ГГТФ содержится в микросомах гепатоцитов, лекарственные препараты из группы индукторов микросомального окисления могут стимулировать ее активность. К индукторам микросомальных ферментов печени относятся некоторые снотворные средства, транквилизаторы, нейролептики, противосудорожные, противовоспалительные, некоторые антибиотики, диуретики и ряд других лекарственных средств.

Кроме того, индукция микросомальных ферментов печени может наблюдаться у курильщиков, при воздействии хлорсодержащих инсектицидов и при постоянном употреблении низких доз алкоголя (даже без развития алкогольного повреждения печени).

При алкогольной болезни печени (особенно остром алкогольном гепатите, развивающемся на фоне многодневного употребления спиртных напитков) активность ГГТФ повышается в большей степени, чем другие показатели повреждения печени. Активность фермента является чувствительным, но не специфичным индикатором гепатобилиарных заболеваний.

Активность ГГТФ не повышается при заболеваниях костей, при беременности, у детей старше одного года (то есть когда повышена ЩФ), поэтому для диагностики холестаза необходимо обязательно параллельное определение активности ЩФ и ГГТФ.

Референтные значения активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови составляют:

Разница в значениях активности ГГТФ у мужчин и женщин объясняется тем, что некоторое количество фермента содержится в простате. У детей в первые полгода жизни ввиду интенсивного метаболизма аминокислот активность ГГТФ в крови достигает 204 Ед/л. К году она снижается, значения не превышают 34 Ед/л. До 12 лет верхняя граница нормы - 18-23 Ед/л. Половые различия становятся заметны с подросткового возраста, когда для юношей 12-17 лет нормальными являются показатели до 45 Ед/л, а для девушек - до 33 Ед/л.

Лейцинаминопептидаза (ЛАП, КФ 3.4.11.1) является протеолитическим ферментом, обладающим широкой субстратной специфичностью. Он катализирует гидролиз пептидных связей любых аминокислот с N-конца белковых молекул (кроме аргинина и лизина). Фермент, по данным различных источников литературы, имеет молекулярную массу от 53 до 270 кДа, что позволяет предположить возможность наличия у него четвертичной структуры. В активном центре ЛАП содержится катион Zn²⁺ . Максимальная ее активность проявляется при pH 7,0-7,4 и активируется катионами Mn²⁺. ЛАП обнаружена во всех тканях человека. Высокая активность фермента отмечается в печени (в основном в эпителии желчных протоков), почках, тонкой кишке. В клинической практике активность в сыворотке крови ЛАП определяют в основном для подтверждения синдрома холестаза. Клиническое значение определения активности ЛАП примерно такое же, как и у ЩФ. Однако нужно отметить, что при заболеваниях костной ткани активность ЛАП практически не меняется. В связи с этим определение активности ЛАП применяется для дифференциальной диагностики заболеваний гепатобилиарной системы и костной ткани при повышенной активности щелочной фосфатазы. Активность ЛАП увеличивается при механической желтухе, метастазах в печень и даже в отсутствие желтухи. В то же время при других заболеваниях печени, например при гепатите и циррозе, ее активность повышается в значительно меньшей степени. Активность ЛАП также может повышаться при острых панкреатитах и холециститах, у больных саркоидозом, СКВ, инфекционным мононуклеозом, при опухолях различной локализации.

Референтные значения активности ЛАП в сыворотке крови составляют 15-40 МЕ/л.

Активность ЛАП повышается в сыворотке крови у женщин на поздних сроках беременности, что связано с поступлением в кровь плацентарной формы фермента.

Желчные кислоты являются лабораторным тестом холестаза любой этиологии. Особенно это касается длительно протекающего холестаза при билиарном циррозе, первичном склерозирующем холангите, лекарственном гепатите, длительной механической желтухе, поражении печени при алкоголизме, первичной гепатоцеллюлярной карциноме, вирусных гепатитах, острых холециститах с холангитом и другой патологии. Причиной повышения концентрации желчных кислот в крови может быть и прием их в виде лекарственных препаратов (например, с литолитической целью при желчнокаменной болезни).

Холестерин можно рассматривать в качестве маркера холестаза только при одновременном его повышении с другими лабораторными показателями (билирубин, активность ЩФ и ГГТФ и др.). При выраженном холестазе уровень холестерина может повышаться до 18- 25 ммоль/л и более. Изолированное повышение содержания холестерина в крови может иметь и другие причины и не свидетельствовать о наличии холестаза.

Поскольку холестерин синтезируется в печени, то даже выраженный холестаз при тяжелой печеночно-клеточной недостаточности может не сопровождаться повышением его содержания (чаще отмечается снижение в рамках гепатодепрессивного синдрома).

Гипербилирубинемия очень часто является самым ранним признаком поражения печени, преимущественно за счет повышения концентрации конъюгированного (прямого) билирубина. Подробно механизмы развития гипербилирубинемии изложены в разделе «Клинический симптом желтух вследствие нарушений обмена билирубина» (c. 274).

СИНДРОМ ПЕЧЕНОЧНО-КЛЕТОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Синдром печеночно-клеточной недостаточности (синдром малой печеночной недостаточности, гепатодепрессивный синдром, гепатопривный синдром) характеризуется нарушениями практически всех функций печени с различной степенью выраженности (от легкого до тяжелого). Морфологической основой синдрома являются выраженные дистрофические изменения гепатоцитов и/или значительное уменьшение функционирующей паренхимы печени вследствие ее воспалительных или некротических изменений в результате острого или хронического поражения. Преобладающими при синдроме печеночно-клеточной недостаточности являются нарушения белково-синтетической и обезвреживающей функций печени. Лабораторная оценка этих нарушений позволяет определить тяжесть поражения печени и имеет важное прогностическое значение.

Для синдрома печеночно-клеточной недостаточности характерны изменения ряда биохимических показателей, свидетельствующих о нарушениях различных функций печени:

Гипопротеинемия - уменьшение общего количества белка в плазме крови. Она главным образом возникает за счет уменьшения количества альбуминов. Выраженная гипопротеинемия является в первую очередь постоянным и патогенетически важным проявлением нефротического синдрома. Общий белок плазмы крови может снижаться до 30-40 г/л. Степень гипопротеинемии не всегда соответствует тяжести и продолжительности протеинурии. Также она развивается в результате поражения печеночных клеток при различных заболеваниях печени.

Кроме того, гипопротеинемия может возникать при увеличенной проницаемости стенок капиллярных сосудов и при белковой недостаточности, возникающей вследствие поражений желудочно-кишечного тракта, при карциноме, белковом голодании и др.

Как правило, гипопротеинемия является результатом снижения в крови содержания альбумина, то есть гипоальбуминемии.

Альбумин - основной белок плазмы крови, составляет около 60% общего количества белка плазмы. Синтезируется в печени со скоростью до 0,9-1,2 г/сут, период его полужизни в кровотоке составляет 18-20 суток, относительная молекулярная масса - 66,3 кДа. Альбумин состоит из единственной полипептидной цепи, включающей 585 аминокислотных остатков. Это высокополяризованный белок, содержащий 17 дисульфидных мостиков и одну свободную SH-группу цистеина. Синтез альбумина стимулируется тироксином и анаболическими стероидами, тогда как подавляется повышением коллоидно-осмотического давления, дефицитом аминокислот и увеличением уровня IL-6 (при реакции острой фазы). Скорость синтеза альбумина сцеплена с синтезом псевдохолинэстеразы, что приводит к повышению ее активности в условиях потери альбумина (например, при нефротическом синдроме). Несмотря на свою высокую растворимость, альбумин является переносчиком многих гидрофобных молекул, таких как свободные жирные кислоты, билирубин, гемин и ряд ксенобиотиков. Он также является переносчиком некоторых гормонов: тироксина, трийодтиронина, кортизола, альдостерона.

Имеет альбумин значение и для метаболизма кальция. Он связывает до 45% общего кальция сыворотки. Так, например, известны случаи анальбуминемии, при которых наблюдались значительные нарушения метаболизма костей.

Несмотря на незначительную молекулярную массу, отрицательно заряженные молекулы альбумина в норме практически не фильтруются в клубочках почек. Выведение альбумина с мочой в количестве 30- 300 мг за сутки называется микроальбуминурией. Микроальбуминурия относится к ранним признакам нарушения функции почек и является одним из проявлений поражения органов-мишеней (показатель дисфункции эндотелия, инсулинорезистентности и гиперкоагуляции). Период полураспада альбумина в крови составляет 18-20 дней.

Ведущую роль альбумин играет в поддержании коллоидно-осмотического (онкотического) давления плазмы и объема циркулирующей крови. Он также присутствует во внеклеточном пространстве, где его общее количество превышает содержание во внутрисосудистом русле на 30%.

При состояниях, сопровождающихся снижением содержания альбумина в плазме, общее содержание веществ, которые с ним связываются, уменьшается, хотя концентрация физиологически активных фракций веществ может быть в пределах нормы, и клинические изменения не возникают.

Альбумин крови является эндогенным резервом аминокислот и при длительном голодании расходуется в первую очередь.

У детей раннего возраста физиологическое снижение уровня альбумина наблюдается вследствие незрелости печеночных клеток. У женщин снижение уровня альбумина наблюдается во время беременности, особенно в III триместре (вследствие гемодилюции), и во время лактации.

Гипоальбуминемия при заболеваниях печени - важный диагностический и прогностический признак. Выделяют два вида гипоальбуминемии: абсолютную, возникающую при снижении содержания альбумина в крови, и относительную вследствие увеличения объема плазмы, которая часто сочетается с асцитом и повышением экстраваскулярного содержания альбумина в результате снижения его внутрисосудистого уровня.

При хронических заболеваниях печени синтез альбумина снижается, что приводит к абсолютной гипоальбуминемии, выраженность которой коррелирует с тяжестью их течения. Данный симптом не специфичен для заболеваний печени и может встречаться при патологии почек, мочевыводящих путей и желудочно-кишечного тракта.

Определение концентрации альбумина часто используют для дифференциальной диагностики асцита. С этой целью рассчитывают сывороточно-асцитический альбуминовый градиент. Он определяется как разность концентрации альбумина в сыворотке крови и альбумина в асцитической жидкости, полученных в один и тот же день. Сывороточно-асцитический альбуминовый градиент физиологически основывается на онкотическо-гидростатическом соотношении и напрямую зависит от давления в воротной вене.

У пациентов с градиентом более 11 г/л имеется портальная гипертензия, чаще всего возникающая при циррозе печени.

У пациентов с градиентом менее 11 г/л давление в воротной вене нормальное. Асцит с низким градиентом обусловлен преимущественно карциноматозом брюшины, туберкулезным перитонитом, заболеваниями поджелудочной железы, нефротическим синдромом и др.

Определение общего белка в асцитической жидкости позволяет дифференцировать транссудат и экссудат: в транссудате белка менее 25 г/л, относительная плотность - 1,005-1,015 (цирроз печени, гипоальбуминемия), в экссудате белка более 25 г/л, относительная плотность больше 0,015 (малигнизация, воспаление).

Наиболее частыми причинами гипоальбуминемии являются нарушения синтеза альбумина в печени при различных острых и хронических ее заболеваниях, амилоидозе, нарушениях питания, злокачественных новообразованиях, застойной сердечной недостаточности, генетических дефектах синтеза альбумина.

Γиперальбуминемия не имеет существенного диагностического значения, исключая состояния, связанные с дегидратацией. Повышение концентрации альбумина в сыворотке наблюдается только в условиях гемоконцентрации, либо как артефакт, либо из-за обезвоживания.

Референтные значения содержания альбумина:

Факторы коагуляции. Печень синтезирует факторы I (фибриноген), II (протромбин), V (проакцелерин), VII (проконвертин), IX (фактор Кристмаса), X (фактор Стюарта-Прауэра). Все эти факторы имеют более короткий период полужизни, чем альбумины. Первоначально происходит снижение уровня фактора VII ввиду его наиболее короткого периода полужизни, затем - факторов Х и IX.

Синтез фактора V не зависит от содержания витамина K, поэтому его определение помогает дифференцировать причину снижения протромбинового индекса или увеличения протромбинового времени между дефицитом витамина К и печеночно-клеточной недостаточностью. Повторные измерения содержания фактора V важны для определения жизненного прогноза при острой печеночной недостаточности. Если его уровень ниже 20% нормы, то в отсутствие трансплантации печени выживаемость пациента крайне низкая.

Снижение уровня фактора II отмечается при циррозе печени, гепатоцеллюлярной карциноме и у больных, получающих лечение варфарином (антагонист витамина K). Введение витамина K ведет к нормализации содержания протромбина у больных, принимающих варфарин. Значение протромбинового индекса или протромбинового времени важно для оценки тяжести поражения печени и определения жизненного прогноза при ее острых заболеваниях. Скорость превращения протромбина в тромбин после активации внешнего пути коагуляции зависит от наличия тканевого тромбопластина и кальция. При дефиците одного фактора или более, которые синтезируются в печени, уменьшается протромбиновый индекс (увеличивается протромбиновое время). Снижение протромбинового индекса при холестатических заболеваниях печени обусловлено дефицитом витамина K, который выявляют в пробе с введением 10 мг витамина K подкожно. Увеличение протромбинового индекса по меньшей мере на 30% в пределах 24 ч свидетельствует о сохранности синтетической функции печени.

Холинэстераза. В настоящее время различают два типа холинэстераз, которые обозначают как истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза - АХЭ) и псевдохолинэстеразу (холинэстераза-ХЭ). Истинная холинэстераза (ацетилхолингидролаза, КФ 3.1.1.7) отличается узкой субстратной специфичностью. Псевдохолинэстераза (ацетилхолинацилгидролаза, КФ 3.1.1.8) обладает более широкой субстратной специфичностью, благодаря чему их можно раздельно выявить и количественно определить активность. Наиболее специфичным субстратом для АХЭ является ацетилхолин, для ХЭ - бутирилхолин. ХЭ, ввиду отсутствия строгой субстратной специфичности, гидролизует и другие эфиры холина: ацетилхолин, сукцинилхолин, бензоилхолин и т.д. Обе холинэстеразы гидролизуют ацетилхолин до холина и уксусной кислоты.

АХЭ содержится преимущественно в эритроцитах, нервной и мышечной тканях, а ХЭ - в сыворотке крови, печени, поджелудочной железе и других внутренних органах. АХЭ находится на наружной поверхности мембраны эритроцитов, и ее активность зависит от возраста эритроцитов: в молодых эритроцитах активность выше. Роль АХЭ сводится к разрушению ацетилхолина в нервных синапсах и различных структурах клетки. По мнению некоторых авторов, активной является внеклеточная АХЭ, тогда как внутриклеточный фермент резервный, служит для пополнения запасов внеклеточной АХЭ. В отличие от АХЭ, ХЭ плазмы крови - это гликопротеин с молекулярной массой 348 кДа. Является внеклеточным ферментом, образующимся в клетках паренхимы печени. Физиологическая роль ХЭ не ясна.

При заболеваниях и поражениях печени активность холинэстеразы в сыворотке крови снижается, так как нарушается синтез фермента гепатоцитами. Определение активности холинэстеразы особенно ценно для наблюдения за течением болезни и при определении прогноза при хронических заболеваниях печени. При остром гепатите диагностического значения практически не имеет. Активность фермента также уменьшается при отравлениях фосфорорганическими соединениями.

Референтные значения активности холинэстеразы в сыворотке крови - 45-95 мкмоль/(с ? л), или: у женщин - 4260-11 250 Ед/л, а у мужчин - 5320-12 920 Ед/л.

Гипербилирубинемия очень часто является самым ранним признаком поражения печени, преимущественно за счет повышения концентрации неконъюгированного (непрямого) билирубина. Подробно механизмы развития гипербилирубинемии изложены в разделе «Клинический симптом желтух вследствие нарушений обмена билирубина» (с. 274).

Холестерин и другие липиды. У больных паренхиматозными заболеваниями печени выявляются также и нарушения липидного обмена. Концентрации холестерина, других липидов и липопротеинов в сыворотке крови являются довольно чувствительными, но не специфичными для патологии печени лабораторными показателями. При поражении паренхимы часто наблюдается увеличение концентрации триглицеридов, понижение концентрации эфиров холестерина и появление патологических липопротеинов. Они являются результатом сниженной активности ферментов, участвующих в обмене липидов.

Изменения показателей липидного обмена должны оцениваться в комплексе с другими маркерами данного синдрома, поскольку они могут присутствовать и при других синдромах. Так, на начальных этапах печеночно-клеточной недостаточности у больного с заболеванием печени и выраженным синдромом холестаза уровень холестерина не снижен, а, напротив, может быть даже повышен.

МЕЗЕНХИМАЛЬНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ СИНДРОМ

Мезенхимально-воспалительный (иммуновоспалительный) синдром - это проявление сложной приспособительной реакции, направленной на устранение различных патогенных воздействий в результате процессов сенсибилизации иммунокомпетентных клеток и активации РЭС в ответ на антигенную стимуляцию с развитием в печени иммунного воспаления. Морфологически данный синдром характеризуется активацией и пролиферацией клеток лимфоидной системы и РЭС, внутрипеченочной миграцией лейкоцитов, что проявляется лимфомакрофагальной инфильтрацией портальных трактов и внутридольковой стромы, то есть усилением фиброгенеза, формированием активных септ с некрозами вокруг них.

Мезенхимально-воспалительный синдром является результатом ответной сенсибилизации иммунокомпетентных клеток и активации ретикулоэндотелиальной системы на антигенную стимуляцию в виде системного воспалительного процесса. В этом случае антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток при печеночной недостаточности запускает иммунный ответ в виде кооперативного взаимодействия Т- и В-лимфоцитов и макрофагов, а также клеточных медиаторов аллергии (цитокинов).

Важную роль в системном воспалительном ответе играет цитокиновый каскад, что уже на начальных стадиях воспалительной реакции приводит к увеличению в крови TNFα, IL-1 и IL-6. Цитокины, например IL-6, обладают способностью активировать макрофаги с высвобождением из них липополисахаридов.

Индикаторы мезенхимально-воспалительного синдрома используются как для диагностики (особенно при остром вирусном гепатите, хроническом активном гепатите и циррозе печени), так и для оценки фазы заболевания, активности патологического процесса, определения показаний к лечению и установлению прогноза.

Для мезенхимально-воспалительного синдрома характерны изменения ряда биохимических и иммунологических показателей, свидетельствующих о нарушениях различных функций печени и используемых в клинической лабораторной диагностике:

Острая фаза воспаления. В развитии острой фазы воспалительного процесса участвуют такие системы организма, как иммунная, центральная нервная, эндокринная и сердечно-сосудистая, что в основном проявляется повышением температуры, изменениями проницаемости сосудов, а также метаболическими нарушениями различных органов. Они в первую очередь проявляются появлением неспецифических маркеров воспаления, в том числе и белков острой фазы воспаления.

В настоящее время известно до 30 белков плазмы крови, принимающих участие в неспецифическом ответе организма на воспалительный процесс. Они синтезируются как в печени, так и иммунокомпетентными клетками.

Регуляция синтеза белков острой фазы - сложный многофакторный процесс, индивидуальный для каждого из этих белков, а их концентрация зависит от стадии заболевания и/или от масштабов повреждений.

Синтез белков острой фазы включается и регулируется целым рядом медиаторов, среди которых цитокины, анафилотоксины и глюкокортикоиды. Некоторые из этих медиаторов образуются непосредственно в очаге воспаления активированными макрофагами, лимфоцитами и другими клетками. Эти медиаторы могут оказывать как местное, так и общее воздействие.

Особенность большинства белков острой фазы - неспецифичность по отношению к причине воспаления и высокая корреляция их концентраций в крови с тяжестью заболевания и его стадией. Это делает белки острой фазы более удобными маркерами воспаления, в отличие от таких, например, как СОЭ, количество лейкоцитов и сдвиг лейкоцитарной формулы. В то же время дифференциально-диагностическая значимость этих тестов, в силу их неспецифичности, ограниченна. Различают положительные острофазовые белки, уровень которых нарастает более чем на 25% нормы, и отрицательные острофазовые белки, уровень которых заметно снижается при тех же условиях.

Все белки острой фазы можно классифицировать по характеру их ответа на воспалительный процесс. Принято выделять пять групп таких белков.

С-реактивный белок (СРБ) относится к семейству белков пентраксинов. Он состоит из пяти одинаковых субъединиц с молекулярной массой около 21-23 кДа каждая, которые нековалентно связаны между собой, что дает общую молекулярную массу порядка 110 кДа. СРБ имеет два специфических участка, один для связывания с ионами кальция, второй отвечает за связывание рецепторов и C1q-компонента комплемента. Первый участок позволяет молекуле белка взаимодействовать с бактериальными полисахаридами и гликолипидами, с поврежденными мембранами, а также с экспонированными ядерными антигенами. Второй участок приводит к связыванию с C1q-компонента комплемента, что активирует классический каскад комплемента и в результате приводит к фиксации расщепленных продуктов фаголитического комплемента. СРБ может связываться с Fc-рецепторами, тем самым активируя фагоцитоз определенных антигенов и микроорганизмов. Связываясь с лигандами, СРБ может выполнять различные функции.

Позднее была обнаружена новая форма СРБ, названная «нео-СРБ». Она имеет другие антигенные детерминанты и состоит из свободных мономеров СРБ, не образует пентамер (мономерный СРБ, мСРБ). Антигены мСРБ были обнаружены на поверхности человеческих периферийных лимфоцитов крови, на поверхности киллерных клеток, на В-клетках и др.

Известно, что концентрация СРБ резко возрастает при воспалительном ответе. Для этого процесса необходим переход нативного пентамерного СРБ в его мономерные формы. Также было продемонстрировано, что при разных патологических процессах происходит гликозилирование СРБ. Возможно, гликозилированные формы СРБ имеют такие измененные функциональные характеристики, которые повышают эффективность связывания с вирусами, бактериями и другими патогенами, и, может быть, они по-разному способны активировать пути комплемента.

В последние годы была подтверждена функциональность мСРБ. Показано, что для индукции противовоспалительного процесса необходим переход пентамерной формы СРБ в мономерную.

Высокочувствительный С-реактивный белок (hs-СРБ). Применение для определения концентрации СРБ метода высокочувствительной (от англ. high sensitive или highly sensitive) иммунотурбидиметрии с латексным усилением позволило усилить чувствительность его определения примерно в 10 раз. В связи с этим нижняя граница области определения концентрации hs-СРБ составляет примерно 0,5 мг/л. Стало возможным определить базовую концентрацию СРБ, то есть тот его уровень, который стабильно выявляется у практически здоровых лиц, а также у пациентов при отсутствии острого воспалительного процесса или вне обострения заболевания. Именно для определения базовых уровней СРБ используют методы hs-СРБ.

Клинико-диагностическое значение определения концентрации СРБ в плазме крови связано с его ролью в развитии воспаления, при защите от чужеродных агентов, при некрозах и, что существенно, в аутоиммунных процессах. Он является одним из главных участников острой фазы воспаления. При воспалительных процессах концентрация СРБ в плазме крови может увеличиваться в 10-100 раз и коррелирует с тяжестью и динамикой клинических проявлений воспаления. Чем выше концентрация СРБ, тем тяжелее воспалительный процесс, и наоборот. В связи с этим СРБ является наиболее специфичным и чувствительным клинико-лабораторным индикатором воспаления и некроза. Изменения уровня СРБ в плазме крови зависят от причины воспалительных процессов.

При вирусных инфекциях, метастазировании опухолей, вялотекущих хронических и некоторых системных ревматических заболеваниях концентрация СРБ повышается до 10-30 мг/л.

При бактериальных инфекциях, обострении некоторых хронических воспалительных заболеваний и при повреждении тканей концентрация СРБ может возрастать до 40-100 мг/л (а иногда и до 200 мг/л).

Тяжелые генерализованные инфекции, ожоги, сепсис повышают уровень СРБ до 0,3 г/л и более. Совместно с СРБ при воспалительных процессах обычно повышается концентрация и других белков.

Референтные значения содержания СРБ в сыворотке крови - меньше 5,0 мг/л.

Сывороточный амилоид P (CAP), как и СРБ, участвует в регуляции функций лейкоцитов крови всех классов, фибробластов рыхлой соединительной ткани и гепатоцитов человека. Характер его действия в основном не зависит от пола и возраста. САP относится к высококонсервативному суперсемейству Са²⁺ -зависимых лигандсвязывающих и лектиновых (углеводсвязывающих) белков. Имеет пентрамерную структуру, в связи с чем принадлежит семейству пентраксинов - сывороточных белков неиммуноглобулиновой природы с пятилучевой структурой молекулы. В это семейство также входят СРБ и CAP-гомологичные белки. CРБ и CAP характеризуются как короткие пентраксины. Молекулярная масса CAP составляет 25 кДа. В сыворотке крови он был исходно описан как 9,5S α₁ -гликопротеин. CAP синтезируется в печени в ответ на действие медиаторов воспаления, в частности IL-6, и является белком, устойчивым к протеолизу, особенно в составе комплексов с кальцийзависимыми лигандами. CAP связывается с макромолекулярными лигандами, такими как нуклеосомная ДНК, гликоза-миногликаны и амилоидные волокна, с высокой авидностью. В агрегированном состоянии он может связывать фактор комплемента C1q и активировать классический путь комплемента. Показано, что САР, как и СРБ, ограничивает синтез IL-2, IL-4 и IFNα стимулированными митогенами клетками и ингибирует NK-клеточную активность. В то же время СРБ усиливает продукцию IL-4 нестимулированными лимфоцитами, а САР ее не изменяет. В отличие от СРБ, у человека CAP не является острофазовым реактантом. Он является нормальным компонентом плазмы крови и присутствует в цереброспинальной жидкости.

Концентрация CAP в сыворотке крови может незначительно увеличиваться при обострении хронических заболеваний и практически не изменяется после травматичных хирургических вмешательств. Существенное снижение уровня CAP наблюдается только у пациентов с тяжелой патологией печени, приводящей к снижению синтеза белков плазмы.

Референтные значения содержания САP составляют:

Сывороточный амилоид А (САА) относят к семейству гомологичных белков, которые делят на две группы. Первая группа включает САА1 и САА2 (САА1+2), которые являются острофазовыми белками типа I и синтезируются в печени. Ко второй группе относятся САА4, синтезируемые у человека, и САА3 - у мышей. Средняя молекулярная масса САА составляет 11,0-14,0 кДа. Более 70% САА связано с ЛПВП.

При остром воспалении концентрация СAA1+2 в сыворотке может увеличиваться почти в 1000 раз. Стимулируют их синтез IL-6, IL-1 и TNFα.

Основными функциями САА1+2 является участие в метаболизме и транспорте липидов, индукция ферментов деградации внеклеточного матрикса. Он способствует связыванию ЛПВП с макрофагами, которые могут затем поглощать холестерин и липидные осколки в местах некроза. Кроме того, САА1+2 может ингибировать активацию тромбоцитов, а также предотвращать кислородный «взрыв» в нейтрофилах острой фазы. Длительно высокие уровни САА1+2 при хроническом воспалении влияют на метаболизм холестерина и липопротеинов, способствуя созданию атерогенных условий. При системном амилоидозе белок амилоид А (N-терминальный фрагмент САА) откладывается в различных органах.

САА, как и СРБ, относится к наиболее чувствительным маркерам острой фазы. В связи с тем что в физиологических условиях концентрация САА1+2 в 1,5-3 раза, а в условиях воспаления - в 3-10 раз выше, чем концентрация СРБ, определение его содержания в сыворотке крови имеет преимущества перед СРБ при диагностике воспалительных процессов. Кроме того, в отличие от СРБ, уровень САА1+2 не снижается под влиянием иммуносупрессивной (в том числе кортикостероидной) терапии.

Вторая группа САА белков (САА4 у человека и САА3 у мышей) экспрессируется в организме постоянно. САА4 синтезируется различными органами и тканями и не является острофазовым белком.

Референтные значения содержания САА в сыворотке крови составляют 0-10,0 мг/л.

α₁ -Кислый гликопротеин (альфа-1-кислый гликопротеин, орозомукоид, серомукоид) является сложным белком, состоящим из 59% белка и 41% углеводов. Углеводная часть молекулы представлена сиаловыми кислотами. Молекулярная масса составляет 44,1 кДа. В полиморфно-ядерных лейкоцитах синтезируется изоформа с молекулярной массой 50-60 кДа за счет увеличения углеводного компонента.

Синтез α₁ -кислого гликопротеина в организме осуществляется гепатоцитами, причем активность данного процесса находится в прямой зависимости от уровня глюкокортикоидов, а также нормальным эндотелием сосудистой стенки, эпителием протоков молочных желез, лейкоцитами и альвеолярными макрофагами.

Молекула α₁ -кислого гликопротеина человека содержит одну полипептидную цепочку, состоящую из 183 аминокислот, с молекулярной массой около 23 кДа, к которой присоединено от трех до пяти остатков сиаловых кислот. В связи с этим молекула α₁ -кислого гликопротеина имеет самый высокий отрицательный заряд среди всех белков плазмы, и его изоэлектрическая точка находится при рН 2,7. Степень разветвленности углеводных остатков может варьировать от двух до четырех и изменяться при ряде физиологических и патологических состояний.

При различных повреждающих воздействиях его концентрация в сыворотке повышается в 2-4 раза. При воспалительных заболеваниях уровень α₁ -кислого гликопротеина, как правило, коррелирует с содержанием других положительных острофазовых белков - СРБ, С3- и С4-компонентов комплемента, гаптоглобина, α₁ -антитрипсина.

Синтез α₁ -кислого гликопротеина в гепатоцитах может быть индуцирован целым рядом медиаторов острофазового ответа, такими как IL-1, TNFα и IL-6.

Быстрое снижение содержания α₁ -кислого гликопротеина свидетельствует о степени выраженности печеночно-клеточной недостаточности, а, наоборот, увеличение его концентрации позволяет прогнозировать благоприятный исход патологического процесса.

Референтные значения содержания α₁ -кислого гликопротеина в сыворотке крови человека составляют 0,5-1,2 г/л.

Гаптоглобин (Нр) - белок плазмы крови, по своему строению является гликопротеином, при электрофорезе мигрирует во фракции α₂ -глобулинов. В организме человека имеется три типа гаптоглобина (Нр), которые состоят из комбинаций трех видов пептидных цепей, имеющих в своей структуре различное количество молекул цистеина для образования ковалентных связей в виде дисульфидных мостиков. Нр 1-1 состоит из двух α₁ -цепей и двух β-цепей с общей молекулярной массой 85 кДа. Нр 2-1 включает α₁ - и α₂ -цепи, а также β-цепи в различных количествах с общей молекулярной массой от 100 до 200 кДа. Нр 2-2 состоит из олигомеров, включающих α₂ - и β-цепи с общей молекулярной массой до 400 кДа.

Основной функцией Hp является связывание свободного гемоглобина в сосудистом русле при гемолизе, после чего данный комплекс транспортируется в РЭС, где и происходит его деградация. Это предохраняет организм от потери железа. Комплекс гемоглобин-гаптоглобин обладает высокой пероксидазной активностью, тормозит ПОЛ.

Гаптоглобин выполняет защитную функцию, образуя комплексы с белками, освобождающимися при распаде клеток, является ингибитором катепсинов, транспортирует витамин В₁₂ .

Синтез Hp стимулируется действием гормона роста, инсулина, эндотоксинов бактерий, простагландинов и цитокинов, которые вырабатываются в ответ на воспалительный процесс при инфекции, различных повреждениях, опухолях и др. Повышение его концентрации в крови происходит вследствие стимуляции интерлейкинами клеток печени. При воспалении он выполняет функции антиоксиданта, снижая активность ПОЛ, что уменьшает повреждения клеток, подавляет воспаление за счет угнетения синтеза простагландинов. Кроме того, он стимулирует рост сосудов и участвует в регуляции иммунной системы. Повышение уровня Hp отражает степень деструкции соединительной ткани (при коллагенозе, ревматизме, сепсисе, остром инфаркте миокарда, пневмониях, опухолях). Изменения относительного содержания типов Hp в сыворотке крови больных также могут иметь диагностическое значение (нефротический синдром, опухоли репродуктивной системы).

Кроме того, повышение содержания Hp в крови наблюдают при холестазе, лечении глюкокортикоидами.

Уровень Hp в плазме крови повышается обычно на 4-6-й день после начала развития воспалительного процесса. В некоторых случаях концентрация Hp в сыворотке крови может увеличиваться до 3 раз в течение 48 ч. К нормальным значениям его содержание возвращается через две недели после выздоровления.

Основные заболевания и состояния, приводящие к повышению концентрации Hp в сыворотке крови, аналогичны таковым, описанным для α₁ -кислого гликопротеина.

Кроме того, повышение содержания Hp в крови наблюдают при холестазе, лечении глюкокортикоидами.

Снижение концентрации Hp выявляют при различных патологиях: всех видах гемолиза, острых и хронических заболеваниях печени и др.

Референтные значения содержания Hp в сыворотке крови составляют:

Фибриноген - фактор I свертывающей системы крови, является гликопротеином с молекулярной массой 340 кДа, синтезируется гепатоцитами в количестве 2-5 г за сутки. Его физиологический полупериод жизни приблизительно 2,5 дня.

Молекула фибриногена состоит из шести полипептидных цепей, которые связаны друг с другом дисульфидными связями возле их N-концевого сегмента. Состав полипептидных цепей молекулы фибриногена обозначают Аα₂ , Вβ₂ , γ₂ . Заглавные буквы соответствуют тем участкам, которые отщепляются под действием тромбина при превращении фибриногена в фибрин. Фрагменты А и В пептидных цепей содержат большое количество остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Благодаря этому на концах молекул фибриногена создается сильный отрицательный заряд, который препятствует их агрегации.

Основной функцией фибриногена является участие в свертывании крови. После активации коагуляции фибриноген под действием тромбина поэтапно преобразовывается в растворимый фибринполимер. Затем при участии фактора XIII катализируется перекрестное связывание полимеров фибрина, формируя нерастворимый сгусток фибрина, что вместе с другими продолжающимися процессами приводит к прекращению кровотечения.

Плазменные белки свертывания крови и фибринолиза являются активными протеолитическими ферментами и ингибиторами. Они тесно взаимодействуют с системой комплемента и калликреин-кининовой системой, таким образом участвуя в развитии воспалительного процесса.

Содержание фибриногена, являющегося белком острой фазы, в плазме крови значительно возрастает при различных воспалительных процессах.

Явный дефицит фибриногена может иметь место при тяжелых поражениях печени в результате недостаточного его синтеза. Тем не менее обычно снижение концентрации фибриногена в плазме крови обусловлено увеличенным его потреблением, например, при диссеминированном внутрисосудистом свертывании, при коагулопатическом потреблении и гиперфибринолизе либо при врожденной патологии, связанной с нарушениями его синтеза.

Референтные значения фибриногена в плазме крови составляют 2,0- 4,0 г/л.

α₂ -Макроглобулин (альфа-2-макроглобулин) - высокомолекулярный гликопротеин плазмы крови с молекулярной массой 720 кДа, имеет тетрамерную структуру, состоит из субъединиц по 180 кДа каждая и содержит большое количество дисульфидных связей. Представитель α₂ -фракции глобулинов. Синтезируется преимущественно клетками печени, а также макрофагами, фибробластами и клетками надпочечников, откуда он поступает в кровь, где циркулирует и практически не диффундирует в другие жидкости вследствие своих больших размеров.

α₂ -Макроглобулин обладает множеством разнообразных функций. В печени активирует звездчатые клетки и стимулирует фиброгенез. Он принимает участие в ингибировании различных типов неспецифичных протеаз плазмы крови, а также ферментных каскадов в системе комплемента, калликреин-кининовой системе, системе свертывания крови и фибринолиза. Так, α₂ -макроглобулин ингибирует эластазоподобные и химотрипсиноподобные протеазы, которые поступают из гранулоцитов в воспалительные экссудаты и вызывают вторичное повреждение тканей. α₂ -Макроглобулин связывается с этими протеазами, в таком комплексе опознается макрофагами и поглощаются. Кроме того, α₂ -макроглобулин участвует в транспорте цитокинов, ростовых факторов, гормонов.

Повышение уровня α₂ -макроглобулина отмечается в период эмбриогенеза, во время беременности, у детей, а также во все периоды жизни человека, характеризующиеся активным ростом и развитием. α₂ -Макроглобулин является эстрогензависимым белком, поэтому у женщин репродуктивного возраста его уровень несколько выше по сравнению с мужчинами. У детей уровень α₂ -макроглобулина в среднем вдвое выше, чем у взрослых, и снижается до взрослого уровня в подростковом возрасте.

α₂ -Макроглобулин является белком острой фазы воспаления. Его содержание увеличивается в сыворотке крови при разрастании соединительной ткани. В клинической лабораторной диагностике определение уровня α₂ -макроглобулина используется для оценки воспалительного процесса. Его содержание в сыворотке крови служит важным диагностическим маркером фиброза печени, отражая активность патологического процесса, что имеет значение для определения стадии заболевания и назначения патогенетической терапии.

Важным диагностическим тестом является определение α₂ -макроглобулина при нефротическом синдроме, так как он имеет крупные размеры и не фильтруется почками. Снижение объема плазмы и выведение низкомолекулярных белков почками приводит к компенсаторному усилению его синтеза.

α₂ -Макроглобулин также вырабатывается клетками предстательной железы, в связи с этим увеличение его уровня в сыворотке крови может происходить при доброкачественной гиперплазии предстательной железы и снижаться при длительном онкологическом процессе в данном органе.

Референтные значения содержания α₂ -макроглобулина в сыворотке крови зависят от возраста и пола человека:

γ-Глобулины (иммуноглобулины) сыворотки крови являются одним из важных показателей состояния печени. Они обеспечивают гуморальный иммунитет, защищая организм от бактерий, вирусов, грибов и их растворимых токсинов (антигенов). К наиболее важным эффекторным механизмам действия иммуноглобулинов относятся активация системы комплемента, связывание с нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и другими иммунокомпетентными клетками, осуществляющими после такого взаимодействия фагоцитоз чужеродных агентов или уничтожение инфицированных клеток организма за счет антителозависимой клеточной цитотоксичности.

Согласно определению экспертов Всемирной организации здравоохранения, иммуноглобулины (Ig) представляют собой группу эволюционно и структурно родственных белков, обладающих свойствами антител. Основной структурной единицей молекулы иммуноглобулина является гетеротетрамер. Он построен из идентичных молекул, образованных тяжелыми и легкими полипептидными цепями и расположенных по обе стороны от оси симметрии. Тяжелые цепи содержат от 450 до 550 аминокислотных остатков, а легкие - около 220. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой при помощи одной дисульфидной связи. Количество таких связей между полумолекулами варьирует в зависимости от строения тяжелой цепи. У человека имеется два вида легких цепей - к и λ, причем примерно у 60% имеются к-цепи. Однако в любой молекуле иммуноглобулина обе легкие цепи представлены только их одним видом. Тяжелых цепей выделяют пять видов (μ, γ, α, ε, δ), согласно которым выделяют и пять классов (изотипов) иммуноглобулинов (G, А, М, D, Е). Тяжелые цепи различаются по антигенным свойствам, содержанию углеводородов и размеру. Именно они определяют различные биологические свойства, присущие каждому изотипу иммуноглобулинов: период полураспада в кровотоке, способность связываться с определенными рецепторами и активировать ферменты.

Иммуноглобулины G (IgG) - основные иммуноглобулины сыворотки. Их количество составляет около 70-80% общего содержания иммуноглобулинов в крови. Это поздние антитела, обеспечивающие вторичный иммунный ответ.

Молекула иммуноглобулина G построена из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями. Молекулярная масса IgG составляет 150-160 кДа. IgG человека существуют в виде четырех подклассов (G1, G2, G3, G4), отличающихся строением постоянных участков тяжелых цепей, а также количеством дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи. В связи с этим они различаются и своими антигенными и биологическими свойствами.

Активность различных подклассов IgG в значительной степени зависит от строения шарнирного участка их молекулы. Наиболее эффективны в запуске эффекторных механизмов иммунной защиты субизотипы IgG3, шарнирная область которых обеспечивает молекуле антител максимальное число степеней свободы. Именно поэтому значительно возрастает необходимость определения не только изотипов иммуноглобулинов, но и субизотипов IgG.

Установлено, что все субклассы IgG являются продуктами отдельных высокогомологичных генов и что, несмотря на принадлежность к одному классу молекул антител и значительное сходство отдельных характеристик, каждый из четырех подклассов IgG обладает индивидуальным профилем биологических свойств.

IgG1 - основной реактант при формировании антител против полисахаридов оболочки вирусов и капсулы бактерий; активирует систему комплемента; эффективно связывается с лимфоцитами через Fc-рецепторы; формирует аутоантитела.

IgG2 - отвечает за иммунный ответ на полисахаридные антигены пневмококков, стрептококков группы А, Hemophilus influenzae.

IgG3 - антитела с высоким сродством к белковым антигенам; самые сильные активаторы комплемента; эффективно связываются с лимфоцитами через Fc-рецепторы; формируют аутоантитела.

IgG4 - участвует в реакциях на хроническую антигенную стимуляцию; осуществляет иммунный ответ на аллергены даже после гипосенситизации, блокирует IgЕ-зависимые реакции.

Определение спектра подклассов IgG в специфических антителах к возбудителям инфекционных и паразитарных заболеваний нередко приводит к повышению чувствительности серодиагностики, дает более точную информацию о стадии заболевания, позволяет прогнозировать его развитие, а также оценить эффективность проведенной терапии.

Основные клинические показания к количественному определению подклассов IgG: снижение уровня общих антител ниже нормативных значений, частые пролонгированные или тяжелые инфекционные заболевания, причина которых не может быть объяснена данными клинических и обычных лабораторных исследований. Обнаружение пониженного уровня общих IgG одного класса и более зачастую служит индикатором каких-то нарушений кинетики иммунных механизмов, что помогает специалисту выбрать наиболее рациональный подход к проведению дальнейшего обследования.

IgG - единственный иммуноглобулин, способный преодолевать плацентарный барьер и обеспечивать гуморальный иммунитет у новорожденных первых месяцев жизни. Дополнительные порции содержащегося в молозиве IgG поступают в кровоток новорожденного через слизистую оболочку кишечника. IgG составляют основную массу антител при вторичном иммунном ответе, а также сравнительно легко выходят в тканевые жидкости, где обеспечивают антибактериальную и антитоксическую защиту. У детей необходимая их концентрация в плазме крови достигается только к 1,5-2 годам.

Иммуноглобулины A (IgA). У человека иммуноглобулины А представлены двумя подклассами - IgA1 и IgA2 и существуют в двух формах: секреторной и сывороточной. Секреторный IgA (sIgA) состоит из димеров и полимеров с молекулярной массой 400 кДа и выше, среди которых оба подкласса представлены в равных количествах. В сывороточном IgA доминируют мономерные молекулы IgA1 с молекулярной массой 170 кДа.

Димер иммуноглобулина A может связываться с полииммуногло-булиновым рецептором на базолатеральной поверхности эпителиальных клеток и в комплексе с этим рецептором проникать в эпителиальные клетки. Этот комплекс внутри клетки подвергается протеолизу. Образовавшийся комплекс димера IgA с фрагментом полиглобулинового рецептора, получивший название «секреторный компонент», секретируется через апикальную поверхность эпителиальной клетки. В результате sIgA попадает в секрет слизистых оболочек и обеспечивает их местный иммунитет, препятствуя процессам адгезии и адсорбции возбудителей (бактерий и вирусов) на чувствительных клетках. Секреторный IgA обладает выраженной бактерицидностью, антивирусными и антитоксическими свойствами, активирует комплемент, стимулирует фагоцитоз, играет решающую роль в реализации резистентности к инфекции.

IgА является основным иммуноглобулином секретов слизистых оболочек и экзокринных желез. Его синтезируют лимфоидные ткани, связанные со слизистыми покровами кишечника, дыхательных и мочеполовых путей, а также с железистым эпителием молочных, слюнных, слезных и других желез. В паренхиме этих тканей, под базальной мембраной и вокруг протоков, выводящих продукты секреции, расположены множественные лимфоидные фолликулы и одиночные клетки-продуценты IgA-антител. В тесной связи со слизистыми покровами и железами находятся скопления регионарных лимфатических узлов и особые лимфоэпителиальные образования, пейеровы бляшки и миндалины. Совокупность этих структур представляет собой отдел иммунной системы, обеспечивающий местный иммунитет. 80% всех плазматических клеток локализованы в подслизистом слое кишечника и дыхательных путей. Слизистые оболочки служат основными воротами проникновения в организм инфекционных агентов и антигенных субстанций. В связи с этим развитие иммунного ответа при попадании антигенов на слизистые оболочки и последующая секреция антител являются ключевыми механизмами поддержания иммунологического гомеостаза.

Образуя иммунные комплексы с инфекционными агентами, IgA-антитела активируют систему комплемента и в то же время усиливают действие неспецифических бактерицидных факторов (лактоферрина, лизоцима). IgA-антитела участвуют в реакциях фагоцитоза и клеточно-опосредованной цитотоксичности в качестве присоединенного через Fc-рецептор компонента мембраны нейтрофилов, макрофагов или моноцитов. Связывая токсины и ферменты, они обеспечивают нейтрализацию их активности и удаление из организма. Наружная мембрана каждой бактерии в кишечнике покрыта 107 молекулами sIgA. У sIgA отсутствуют бактерицидные эффекты, он не повреждает бактерии, а только в результате адгезии к ним способствует их вымыванию. sIgA обладает полиреактивностью, взаимодействует с одним или несколькими антигенами, с муцином и другими гликопротеинами, комплементом, Fc-рецепторами лимфоидных, миелоидных и эпителиальных клеток, а также с микробными белками-рецепторами.

Чрезвычайно важная функция секреторного IgA состоит в подавлении переноса антигенов через поверхность слизистой оболочки и попадания их в кровоток. Это предотвращает избыточную антигенную стимуляцию иммунной системы и сенсибилизацию в отношении микробных и пищевых антигенов. Понижение уровня IgA-антител при вскармливании младенцев заменителями материнского молока часто служит причиной аллергизации. При вскармливании младенцев материнским молоком наблюдается повышенная экспрессия рецепторов для sIgA-R на кишечных бактериях. При дефиците sIgA в кишечнике преобладают бактерии со сниженной экспрессией рецепторов для sIgA.

В отличие от секреторного, сывороточный IgA слабо преципитирует растворимые антигены и агглютинирует бактерии. Его роль в иммунной защите организма в значительной мере определяется взаимодействием с клетками иммунной системы, несущими на своей мембране Fcα-рецептор и осуществляющими клеточно-опосредованные защитные реакции (цитотоксические эффекты, фагоцитоз и др.). IgA сыворотки крови взаимодействует также с гуморальными факторами врожденного иммунитета (комплементом, лактоферрином, лизоцимом) и усиливает их антибактериальное действие. В целом функции сывороточного IgA пока определены недостаточно четко, однако некоторые из них уже хорошо изучены. Иммунные комплексы, формируемые сывороточным IgA, обладают высокой растворимостью, поэтому они медленно выводятся из кровотока и, как установлено, проявляют свойства толерогенных факторов, которые индуцируют неотвечаемость на антигены, проникающие в кровоток из пищеварительного тракта. Известно также, что сывороточные IgA-антитела могут блокировать реакции, опосредуемые антителами других классов (IgM и IgE), и таким образом влиять на ход воспалительных процессов и реакций, связанных с гиперсенсибилизацией. Таким образом, согласно современным представлениям, сывороточный IgA преимущественно играет роль регулятора иммунологических процессов. Продукцию IgA могут стимулировать цитокины активированных Т-лимфоцитов и макрофагов: IL-4, IL-5, IL-6, IFNγ, трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

Иммуноглобулины A в сыворотке крови человека содержатся в относительно большем количестве, чем IgМ, и составляют до 19% общего количества иммуноглобулинов. Тем не менее считается, что среди иммуноглобулинов всех классов IgA синтезируются в наибольших количествах (больше, чем IgG). Уровень продукции IgA значительно выше, чем у других классов иммуноглобулинов, так как у него короткий полупериод жизни, и значительная часть его выделяется в виде sIgA. В сутки у человека продуцируется до 3 г IgA.

После рождения количество секреторного IgA (на слизистых оболочках) у ребенка достигает уровня взрослых людей уже через 2-3 нед его жизни, в то время как сывороточного IgA - только в возрасте 14- 15 лет.

Иммуноглобулины М (IgM). Этот класс иммуноглобулинов первым появляется на самых ранних стадиях гуморального иммунного ответа на инфекцию, то есть представляет собой антитела первичного ответа. Являются маркерами остроты воспалительного процесса. После появления более поздних антител (IgG) их количество уменьшается.

Иммуноглобулины М - одни из высокомолекулярных белков (гликопротеинов) сыворотки крови с молекулярной массой около 1000 кДа, содержащих в своей структуре до 10% углеводов, вследствие высокой молекулярной массы их называют макроглобулинами. Он состоит из пяти субъединиц, каждая из которых напоминает молекулу IgG. Субъединица состоит из двух тяжелых и двух легких цепей с молекулярной массой 23 кДа и 60 кДа соответственно. Молекула IgM имеет 10 активных центров, расположенных в Fab-областях. Поливалентность молекулы обеспечивает ее высокую суммарную авидность связывания антигенов с множественными эпитопами.

В онтогенезе IgM синтезируются раньше других классов. Функционально IgM представляют собой антитела с относительно низкими константами аффинности. Наличие 10 связывающих центров может существенно увеличить их интегральную связывающую способность, однако из-за пространственных ограничений этот потенциал реализуется лишь при взаимодействии с малыми молекулами, масса которых не превышает 1,5 кДа. В реакциях с антигенами большего размера IgM ведут себя как молекулы, имеющие от двух до пяти центров связывания. Это позволяет им выступать в качестве факторов, агглютинирующих и инактивирующих вирусы и бактерии. Возможно, большой размер молекулы IgM благоприятствует связыванию и агрегации крупных частиц с малой плотностью антигенных детерминант на поверхности.

IgM в основном содержатся в кровеносном русле, небольшое их количество присутствует в тканевых жидкостях. Однако в выделениях со слизистых оболочек иммуноглобулинов M обычно нет.

В сыворотке крови содержание IgM составляет 0,5-2,0 мг/мл, или примерно до 6% общего количества всех сывороточных иммуноглобулинов.

Уровень IgM в плазме крови у ребенка после рождения постепенно увеличивается, достигая максимального значения к 9-му месяцу жизни. Затем их содержание в крови снижается и в последующем восстанавливается только в возрасте 20-30 лет.

Иммуноглобулины D (IgD). Содержание IgD в плазме крови весьма незначительно, около 1% всех иммуноглобулинов. Его молекулярная масса составляет примерно 180 кДа. Молекула IgD состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками. Тяжелая цепь IgD построена из одного вариабельного и трех константных доменов.

Биологическая роль IgD изучена недостаточно. Предполагается, что они регулируют активность других иммуноглобулинов и участвуют в антигензависимой дифференцировке В-лимфоцитов и совместно с мембранными IgM выполняют рецепторную функцию. На поверхности В-лимфоцитов находится мембранная форма IgD, входящая в состав В-клеточного рецептора. Показано, что В-лимфоциты миндалин и верхних отделов дыхательных путей продуцируют иммуноглобулины D. После высвобождения иммуноглобулин D связывается с бактериями и другими патогенами. Комплекс IgD-микроорганизм затем запускает различные антимикробные и провоспалительные механизмы в базофилах и стимулирует В-лимфоциты, таким образом защищая организм от инфекционных заболеваний верхних отделов дыхательных путей.

Иммуноглобулины E (IgE) - это антитела, которые вырабатываются плазматическими клетками и участвуют в аллергических реакциях организма. Уровень IgE повышается при аллергических реакциях (бронхиальная астма, крапивница и др.) и паразитарных инфекциях.

Молекулярная масса IgЕ - 190 кДа. Молекула IgE состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, молекулярная масса которых 22,6 и 72,5 кДа соответственно. В молекуле IgЕ содержится более 12% углеводов.

В отличие от иммуноглобулинов других классов, IgE-антитела не могут активировать комплемент, опсонизировать или агглютинировать бактерии, нейтрализовать вирусы или преципитировать антигены. Основное свойство IgE - способность сенсибилизировать в отношении определенного антигена (аллергена) мембраны тучных клеток, эозинофилов и базофилов. Связывание молекул антигена с мембранным IgE служит сигналом для освобождения из этих клеток ряда биологически активных веществ, вызывающих спазм гладкой мускулатуры, повышение проницаемости сосудов, воспалительные реакции и другие сдвиги, лежащие в основе явлений гиперчувствительности немедленного типа.

Иммуноглобулин E при помощи связывающих Fab-фрагментов специфически связывается с антигенами, попавшими в организм. Сформированный иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc-фрагментов IgE, встроенными в клеточную мембрану базофила или тучной клетки, которые содержат многочисленные гранулы с биологически активными веществами. Это взаимодействие и является сигналом для дегрануляции с высвобождением гистамина и других биологически активных веществ, что вызывает резкое расширение просвета венул с увеличением проницаемости их стенок и развертывание острой аллергической реакции. Доказано участие этого механизма в патогенезе анафилаксии и аллергии, а также в формировании и реализации иммунной защиты против паразитарных инвазий. Считают, что основная доля IgE в организме связана с рецепторами мембран тучных клеток, базофилов, лимфоцитов и других клеточных элементов, что и служит одной из главных причин низкого содержания антител этого класса в сыворотке.

В настоящее время имеются достаточные основания полагать, что биологические свойства и функции IgE-антител не ограничиваются их участием в противопаразитарном иммунитете и в реализации аллергических реакций. Возможно, взаимодействие IgE с дендритными клетками в тканях, контактирующих с внешней средой, представляет собой часть гомеостатического механизма, который в нормальном организме обеспечивает элиминацию чужеродных антигенов без существенных тканевых повреждений и потому остается до сих пор малоизученным. Вероятно, интенсивные изыскания в этой области в скором времени позволят точнее определить роль IgE как в поддержании гомеостаза нормального организма, так и в развитии аллергических заболеваний.

Изменения фракции γ-глобулинов. Увеличение содержания γ-глобулинов в сыворотке крови отражает активацию гуморального иммунитета. Повышение уровня γ-глобулинов отмечается при реакции системы иммунитета, когда происходит выработка антител и аутоантител при вирусных и бактериальных инфекциях, воспалении, коллагенозе, механических травмах и ожогах. Существенная гипергаммаглобулинемия, отражающая активность воспалительного процесса, характерна для хронических активных гепатитов и циррозов печени. Особенно значимо повышение содержания γ-глобулинов в диагностике хронического активного гепатита. Не случайно одним из названий этого заболевания было «хронический гепатит с гипергаммаглобулинемией». Увеличение количества γ-глобулинов наблюдается у 88-92% таких больных, причем значительное их повышение (до 26 г/л и выше) отмечается у 60- 65% пациентов. Примерно такие же изменения наблюдаются у больных с высокоактивным и далеко зашедшим циррозом печени. При этой патологии превышение содержания γ-глобулинов над содержанием альбуминов в плазме крови является плохим прогностическим признаком.

Повышение содержания в крови γ-глобулинов может сопровождать такие заболевания, как ревматоидный артрит, СКВ, хронический лимфолейкоз, эндотелиомы, остеосаркомы, кандидомикоз и ряд других.

При остром вирусном гепатите умеренные повышения содержания γ-глобулинов в плазме крови обычно обнаруживаются во второй половине заболевания. При остром лекарственном гепатите очень велик разброс результатов - диагностическое значение гипергаммаглобулинемии в большинстве случаев небольшое. При остром алкогольном гепатите у 40% больных отмечается более или менее повышенное содержание γ-глобулинов сыворотки крови.

Уменьшение содержания γ-глобулинов в сыворотке крови бывает первичным и вторичным. Выделяют три основных вида первичных гипогаммаглобулинемий:

Причиной вторичных гипогаммаглобулинемий могут быть многочисленные заболевания и состояния, приводящие к истощению иммунной системы.

Сопоставление характера изменений содержания альбуминов и глобулинов с изменениями содержания общего белка позволяет сделать вывод о том, что гиперпротеинемия обычно вызвана гиперглобулинемиями, а гипопротеинемия чаще всего является результатом гипоальбуминемий.

Для оценки выраженности диспротеинемий рекомендуется рассчитывать альбумин-глобулиновый коэффициент (отношение содержания альбуминов и глобулинов). В норме этот показатель составляет от 2,5 до 3,5. У больных хроническими гепатитами и циррозами печени он понижается до 1,5 и даже до 1 за счет снижения концентрации альбумина и повышения количества глобулинов.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимулов (митогенов или антигенов) с последующей трансформацией их в бласты (большие делящиеся клетки). Эта реакция определяет пролиферативный потенциал изучаемых клеток, то есть характеризует способность лейкоцитов к трансформации и размножению под воздействием антигенов, аллергенов и митогенов. Пролиферативный ответ лимфоцитов на антигены дает представление о выраженности специфической сенсибилизации организма.

В качестве активаторов реакции бластной трансформации лимфоцитов обычно используют фитогемагглютинин, Con A, митоген лаконоса, бактериальные ЛПС, ферменты, стафилококковый экстракт и др.

Подбирая митогены, можно изучать функциональную активность отдельных субпопуляций лимфоцитов. Однако реально такие условия подобрать весьма сложно, поскольку поведение клеток в многокомпонентной среде может быть неоднозначным. Так, в определенных условиях под действием фитогемагглютинина могут трансформироваться в бласты В-клетки, а надосадочная жидкость Т-клеточных культур вызывает бласттрансформацию В-лимфоцитов.

Несмотря на введение современных способов изучения популяций и субпопуляций лимфоцитов, реакция бластной трансформации лимфоцитов по-прежнему остается одним из важнейших методов, характеризующих физиологическую активность (пролиферативный потенциал) клеток как на неспецифические активаторы (митогены), так и на специфические (антигены простейших, грибов, бактерий, вирусов, тканей организма).

В норме у взрослого человека после стимуляции фитогемагглютинина не менее 70% лимфоцитов должно превращаться в бласты.

Повышение этого показателя наблюдается при гиперактивности иммунной системы при аллергических и аутоаллергических заболеваниях, активации антитрансплантационного иммунитета, остром периоде первичной инфекции, иммунном ответе на тимусзависимые антигены.

Снижение показателя свидетельствует об угнетении иммунной системы при онкологических заболеваниях, первичных и вторичных иммунодефицитах, СПИДе, тяжелых вирусных инфекциях, ожогах и травмах.

Неспецифические антитела к ДНК, гладкомышечным волокнам, митохондриям, микросомам и другим в плазме крови подробно описаны в главе 3, раздел «Аутоантитела при заболеваниях печени», с. 284.

КЛИНИЧЕСКИЙ СИМПТОМ ЖЕЛТУХ ВСЛЕДСТВИЕ НАРУШЕНИЙ ОБМЕНА БИЛИРУБИНА

Пожелтение тканей в результате отложения в них билирубина называют желтухой. Симптом желтухи часто является одним из ранних клинических проявлений поражения печени. Желтушность склер и кожи может не проявляться до тех пор, пока концентрация общего билирубина в плазме крови не превысит нормальные значения более чем в два раза (более 50,0 мкмоль/л).

Нарушения обмена билирубина

Билирубин является продуктом превращения гемоглобина и в значительно меньшей степени других гемсодержащих белков. Основная часть билирубина (до 95%) образуется при разрушении эритроцитов в РЭС (подробнее см. раздел «Роль печени в пигментном обмене», с. 88).

Отдельно хотелось бы остановиться на некоторых нарушениях пигментного обмена, так как интерпретация их биохимических проявлений (показателей) и лежит в основе дифференциальной диагностики желтух.

Гипербилирубинемия - это повышение концентрации общего, конъюгированного (прямого) и неконъюгированного (непрямого) билирубина в различных сочетаниях в плазме крови.

В клинической практике выделяют следующие клинико-лабораторные варианты гипербилирубинемии.

Неконъюгированная гипербилирубинемия (уровень билирубина, как правило, ниже 85,0 мкмоль/л) возникает вследствие нарушений конъюгации билирубина при снижении активности УДФ-билирубин-глюкуронилтрансферазы или массивном гемолизе эритроцитов. Она обусловлена избыточной продукцией и доставкой в печень таких количеств билирубина, которые превышают ее возможности захвата и конъюгации билирубина с глюкуроновой кислотой. Например, при гемолизе, неэффективном эритропоэзе, резорбции гематом и др. Кроме того, встречается идиопатическая неконъюгированная гипербилирубинемия (синдром Жильбера), которая возникает в результате дефекта захвата и хранения билирубина.

Конъюгированная гипербилирубинемия имеет следующие варианты:

Гипербилирубинемия с очень высоким уровнем билирубина. Концентрация билирубина выше 53,0 мкмоль/л обычно свидетельствует о сочетании гемолиза с диффузным поражением печени или обструкцией желчевыводящих путей.

Концентрация билирубина выше 105,0 мкмоль/л может наблюдаться у больных с гемоглобинопатиями (при серповидно-клеточной анемии), к которым присоединяется острый гепатит или обструкция желчевыводящих путей.

Оценка характера нарушений пигментного обмена проводится по результатам исследования содержания билирубина в сыворотке крови, а также билирубина и его метаболитов в моче и кале.

Процесс превращения свободного (непрямого) билирубина, образующегося при разрушении эритроцитов и распаде гемоглобина в органах РЭС, в билирубиндиглюкуронид (связанный, или прямой, билирубин) в печеночной клетке осуществляется в три этапа (подробнее см. в разделе «Роль печени в пигментном обмене», с. 88):

Дальнейший метаболизм билирубина связан с поступлением его в желчные пути и кишечник. В нижних отделах желчевыводящих путей и кишечнике под воздействием микробной флоры происходит постепенное восстановление связанного билирубина до уробилиногена.

Часть уробилиногена (мезобилиноген) всасывается в кишечнике и по системе воротной вены вновь попадает в печень, где в норме происходит практически полное его разрушение.

Другая часть уробилиногена (стеркобилиноген) продвигается дальше по кишечнику. В нижних отделах прямой кишки при контакте с кислородом стеркобилиноген окисляется до стеркобилина и выделяется с калом, окрашивая его в характерный темно-коричневый цвет.

Часть образовавшегося стеркобилиногена поступает в нижние геморроидальные вены, далее через систему нижней полой вены попадает в общий кровоток и выделяется почками с мочой в виде уробилина, который обусловливает соломенно-желтую окраску мочи.

Желтухи

В настоящее время принято выделять три основных вида нарушения пигментного обмена (желтух). В зависимости от локализации патологического процесса выделяют надпеченочную (гемолитическую), печеночную (паренхиматозную) и подпеченочную (обтурационную, или механическую) желтухи (табл. 3-2).

Гемолитическая (надпеченочная) желтуха возникает в основном за счет повышения в крови содержания непрямого (свободного) билирубина.

В результате усиленного гемолиза эритроцитов происходит повышенное поступление в печень гемоглобина, где в клетках РЭС из него образуется большое количество свободного (непрямого) билирубина. Хотя функции гепатоцитов не нарушены, они работают с повышенной нагрузкой и не успевают полностью конъюгировать весь билирубин. Печень становится неспособной превращать свободный (непрямой) билирубин в прямой за счет присоединения к нему глюкуроновой кислоты и образования билирубинглюкуронидов. В результате в крови увеличивается содержание свободного (непрямого) билирубина, который не растворим в воде, поэтому не может пройти почечный барьер и не поступает в мочу.

Поскольку печень захватывает и метаболизирует пигмента большее, чем в норме, то и количество связанного (прямого) билирубина также увеличивается. В связи с этим он усиленно выделяется с желчью в кишечник, в котором, соответственно, существенно увеличивается содержание стеркобилиногена. Цвет кала становится более темным.

Через геморроидальные вены повышенное количество стеркобилиногена попадает в общий кровоток, откуда фильтруется в мочу, повышая в ней уровень уробилина, то есть содержание стеркобилина увеличивается в крови, моче и кале.

Паренхиматозная (печеночная) желтуха у больных с заболеваниями печени появляется в результате повреждения непосредственно самих гепатоцитов, что приводит к нарушению метаболизма билирубина.

Нарушения захвата свободного билирубина печеночной клеткой и конъюгация его с глюкуроновой кислотой ведут к увеличению в крови свободного (непрямого) билирубина. Нарушение выделения билирубинглюкуронида (прямого билирубина) из печеночной клетки в желчные капилляры, обусловленное воспалением, деструкцией, некрозами или снижением проницаемости мембран гепатоцитов, приводит к регургитации желчи обратно в синусоиды и в общий кровоток и, соответственно, к увеличению содержания в крови связанного (прямого) билирубина.

Кроме того, нарушения функций гепатоцитов сопровождаются также утратой способности печеночной клетки захватывать и метаболизировать всосавшийся в кишечнике уробилиноген (мезобилиноген), который в больших количествах попадает в общий кровоток и выделяется с мочой.

Таким образом, при паренхиматозной желтухе в крови увеличивается содержание как свободного (непрямого), так и связанного (прямого) билирубина. Последний, являясь соединением, хорошо растворимым в воде, легко проходит почечный фильтр и появляется в моче, обусловливая ее выраженную темно-коричневую окраску. В моче также в больших количествах присутствуют уробилиноген (мезобилиноген) или его окисленная форма уробилин. В кале содержание стеркобилина может быть несколько уменьшено в связи с нарушением образования и выделения желчи гепатоцитами.

Механическая (обтурационная, подпеченочная) желтуха развивается при нарушении оттока желчи при внутренней закупорке внепеченочных желчевыводящих путей (камнем, гельминтом и др.) или в результате сдавления конечного отдела общего желчного протока (холедоха) извне (рак головки поджелудочной железы, метастазы рака в лимфатические узлы ворот печени и др.). В результате этого уменьшается или полностью прекращается поступление желчи в кишечник и, соответственно, снижается количество образующегося уробилиногена (мезобилиногена и стеркобилиногена). В связи с этим содержание уробилина в моче и стеркобилина в кале значительно снижается. При полной закупорке общего желчного протока желчные пигменты в кале практически полностью отсутствуют, он обесцвечен (ахоличный кал). В крови резко увеличивается концентрация связанного (прямого) билирубина, поскольку его образование печеночной клеткой в течение длительного времени не нарушается. Соответственно, в моче появляется большое количество связанного билирубина, и моча приобретает темно-коричневый цвет.

Появление билирубина в моче (билирубинурия) свидетельствует об увеличении содержания в крови конъюгированного (прямого) билирубина.

Наличие уробилиногена в моче является признаком диффузного поражения печени или гемолиза (повышенное образование билирубина). Отсутствие уробилиногена в моче у больных с желтухой является следствием блокады энтерогепатической циркуляции желчных ферментов и наблюдается при полной обструкции общего желчного протока.

Примерная схема патогенеза билирубинемий при различных нарушениях пигментного обмена (желтухах) представлена на рис. 3-1.

Дифференциальная диагностика различных типов желтух по изменению содержания в крови, моче и кале некоторых метаболитов пигментного обмена представлена в табл. 3-3.

Примечание. N - норма; ↑ - повышен; ↓ - снижен; «+» - определяется; 0 - не определяется.

В настоящее время широко используется патогенетическая классификация желтух, где лабораторные показатели занимают ведущие позиции (табл. 3-4).

При надпеченочных желтухах лабораторные данные характеризуются увеличением в крови неконъюгированного билирубина, нормальной активностью сывороточных ЩФ, АЛТ, АСТ и ГГТФ, отсутствием билирубинурии, уробилинурией (не всегда), повышением в кале стеркобилина, ретикулоцитозом и нередко анемией, укорочением продолжительности жизни эритроцитов.

Внутрипеченочная желтуха с неконъюгированной гипербилирубинемией развивается в результате нарушения захвата билирубина печеночными клетками. Другой механизм данной желтухи - снижение конъюгации билирубина в гепатоцитах (ферментная желтуха). Эти желтухи могут быть наследственными (синдромы Жильбера, Криглера-Найяра) и приобретенными (лекарственные острые и хронические паренхиматозные поражения печени, сепсис).

Лабораторные данные характеризуются увеличением в крови неконъюгированного билирубина, отсутствием билирубина в моче и уробилинурией, нормальной активностью в крови АЛТ, АСТ, ЩФ, ГГТФ, нормальным содержанием холестерина, отсутствием в крови ретикулоцитоза, анемии и изменений эритроцитов. Содержание стеркобилина в кале снижено или нормальное.

Печеночно-клеточная желтуха с конъюгированной гипербилирубинемией - одно из самых грозных и прогностически неблагоприятных острых и хронических поражений печени, свидетельствующее о выключении из функции более 2/3 печеночной паренхимы. Лабораторные данные при этом виде желтухи характеризуются увеличением уровня общего билирубина в крови с преобладанием конъюгированной фракции, активность АЛТ, АСТ часто превышает норму в 5 раз и более, активность ЩФ обычно не повышена или повышена не более чем в 2 раза, отмечаются гипо- и нормохолестеринемия, билирубинурия, уробилинурия со снижением содержания стеркобилина в кале.

Реже печеночно-клеточная желтуха с конъюгированной билирубинемией может быть обусловлена внутриклеточным холестазом, в основе которого лежат нарушения внутриклеточного транспорта конъюгированного билирубина и экскреции его в желчь.

При выявлении клинико-лабораторных признаков желтухи необходимо решить три основные диагностические задачи:

В клинической практике характер нарушений пигментного обмена не всегда соответствует приведенным выше лабораторным критериям различных видов желтух. Он даже существенно может от них отличаться.

Причиной повышения в крови непрямого билирубина могут стать и так называемые пигментные гепатозы (синдромы Жильбера и Криглера-Найяра), которые возникают при наличии у пациента генетических дефектов нарушения захвата билирубина гепатоцитами, а также при снижении в них активности или отсутствии УДФ-билирубин-глюкуронилтрансферазы. В результате нарушается процесс конъюгации непрямого билирубина, который не способен проникать в желчь через билиарный полюс гепатоцита, накапливается в клетке и возвращается обратно в кровь.

Изолированное повышение в крови содержания прямого билирубина, темно-коричневый цвет мочи и светлый кал могут наблюдаться при синдромах Дабина-Джонсона и Ротора, наследственных пигментных гепатозах, при которых генетический дефект затрагивает механизмы выделения связанного билирубина из гепатоцитов в желчь.

Так, при тяжелом поражении паренхимы печени, особенно в сочетании со значительным холестазом, поступление связанного (прямого) билирубина в кишечник и образование его метаболитов (мезобилиногена, стеркобилиногена) резко уменьшается, что приводит к значительному снижению содержания стеркобилина в кале (ахоличный кал) и уробилина в моче. Такая картина при одновременном сочетании с резким увеличением в крови уровня связанного (прямого) билирубина может соответствовать нарушениям пигментного обмена, характерным для механической желтухи (осветленный кал и темно-коричневая моча). Она нередко возникает при остром вирусном гепатите и ряде других заболеваний. Характерно, что по мере восстановления функций печени и постепенном уменьшении холестаза в моче таких больных появляется уробилин, а в кале - стеркобилин. Нормализуется также и концентрация связанного и несвязанного билирубина в крови.

Нередко при относительно длительном течении таких заболеваний, как, например, желчнокаменная болезнь, рак головки поджелудочной железы, и некоторых других, сопровождающихся закупоркой желчного протока с развитием механической желтухи, в воспалительный процесс вторично может вовлекаться паренхима печени. Развивается вторичный холестатический гепатит, при котором нарушаются процессы захвата и связывания непрямого билирубина. В сыворотке крови, наряду с повышением содержания связанного билирубина, повышается и содержание несвязанного билирубина. В результате возникает необходимость дифференцировать первичную паренхиматозную желтуху от вторичного холестатического гепатита вследствие длительного подпеченочного холестаза с помощью методов исследования, в первую очередь визуализирующих желчные протоки (эндоскопическое ультразвуковое исследование, эндоскопическая ретроградная холангиопанкреатография и др.).

АУТОАНТИТЕЛА ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ

Аутоантитела, как правило, выявляются при ряде системных заболеваний соединительной ткани, обычно уровень и профиль антител соответствуют степени проявления клинической симптоматики. Исследования системных ревматических заболеваний, таких как СКВ, склеродермия, синдром Шегрена, предоставили убедительные доказательства, что синтез аутоантител индуцируется антигеннаправленным ответом и аутоантитела являются маркерами, выявляющими причинные антигены, участвующие в иммунопатогенезе. Аутоантитела при заболеваниях печени оцениваются в первую очередь, чтобы помочь в диагностике аутоиммунных состояний, включая АИГ, ПБЦ и ПСХ. В табл. 3-5 представлен перечень аутоантител, которые используются для диагностики болезней печени.

Примечание. ANA - антиядерные антитела; SMA - антитела к гладким мышцам; AMA - анти-митохондриальные антитела; anti-LKM 1 - антитела к микросомам печени и почек 1-го типа; pANCA - антитела к перинуклеарным антинейтрофильным цитоплазматическим антигенам; anti-SLA/LP - антитела к растворимому антигену печени/поджелудочной железы; anti-dsDNA - антитела к двухцепочечной ДНК.

Диагноз АИГ требует наличия антиядерных антител (ANA), антител к гладким мышцам (SMA) или антител к печеночным/почечным микросомальным антигенам (LKM-1). Наличие антимитохондриальных антител (AMA) и/или анти-gp210 прочно ассоциируется с ПБЦ. Хотя при 1-м типе АИГ чаще выявляются ANA, однако только они не могут быть использованы для диагностики заболеваний печени, потому что ANA обнаруживаются и при других системных ревматических заболеваниях. Они также выявлены при других болезнях печени, включая ПБЦ, ПСХ, вирусный гепатит, лекарственный гепатит, алкогольную болезнь печени и гепатоцеллюлярную карциному. Тем не менее встречаемость ANA при этих заболеваниях печени значительно ниже, чем при АИГ.

Аутоантитела часто обнаруживаются методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью НЕр-2 клеток или тканей в качестве субстратов. НЕр-2 окрашивание клеток обычно используется для обнаружения аутоантител отчасти потому, что предварительно подготовленные коммерческие тест-системы легкодоступны. Ядерные модели окрашивания HЕp-2 клеток характеризуются в первую очередь как гомогенные, крапчатые, цитоплазма клетки окрашивается перинуклеарно и смешанно в виде обода и около ядрышек. В табл. 3-6 представлены данные иммунофлюоресценции при различных заболеваниях соединительной ткани.

Примечание. СКВ - системная красная волчанка; ПБЦ - первичный билиарный цирроз; АИГ-1 - аутоиммунный гепатит 1-го типа; ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома; PSS - прогрессирующий системный склероз; DM/PM - дерматомиозит/полимиозит; MCTD - смешанные заболевания соединительной ткани.

Использование HЕp-2 клеток привело к увеличению чувствительности обнаружения аутоантител, некоторые из которых являются специфичными для заболеваний печени, а другие могут быть важны для клинической диагностики системных ревматических заболеваний, которые тоже могут быть связаны с заболеваниями печени. Использование тканей культивируемых клеток в реакции иммунофлюоресценции расширило определение аутоантител к клеточным антигенам, которые имеют клеточную стадию цикла экспрессии. Например, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), ядерный антиген S и G2 фаз клеточного цикла (SG2NA), циклин Bl и центромер-ассоциированный белок F (CENP-F). Субклеточные специфические аутоантитела органелл могут быть легко идентифицированы с использованием HЕp-2 клеточных субстратов. Были описаны аутоантитела различных органелл и внутриклеточных компартментов, в том числе митохондриальные, комплекса Гольджи, эндосомальные и малых дискретных областей клетки, таких как тельца Кахаля (Cajal) (ранее известные как извитые тельца), промиелолейкозные sp100 ядерные тельца, ядрышковый регион и центросома.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ

Характер, степень поражения печени и стадию заболевания определяют преимущественно в результате классического гистологического исследования. В дополнение к стандартным методам окраски препаратов часто применяют иммуногистохимические методики.

Степень хронических поражений печени определяется тяжестью, выраженностью и глубиной ее некровоспалительного процесса. Описаны различные системы определения степени активности патологического процесса в печени. Чаще всего используют полуколичественный гистологический индекс активности (HAI), известный также как система Кноделля (Knodell, 1981) (балльная оценка разных компонентов повреждения). Однако следует отметить, что лишь первые три ее составляющие отражают степень активности, тогда как четвертая - стадию процесса (табл. 3-7).

Гистологическая оценка степени активности в одних случаях хорошо коррелирует с клиническими и биохимическими критериями, в других - не удается выявить тесной корреляции. Это происходит по разным причинам, включая ошибки при заборе биопсийного материала и тенденцию гистологических критериев медленнее изменяться в ответ на терапевтические воздействия, чем биохимические параметры. Кроме того, не установлена природа корреляции биохимических тестов с особенностями клеточных изменений или поражений.

Так, стадии хронического гепатита отражают динамику его развития. Гистологическая оценка стадий хронического гепатита основывается на оценке распространенности фиброза и цирроза (табл. 3-8). При хроническом гепатите фиброзная ткань формируется внутри и вокруг портальных трактов, сочетаясь с явлениями перипортального некровоспалительного процесса.

Ступенчатые некрозы могут распространяться на прилежащие портальные тракты и приводить к формированию порто-портальных септ. Более того, фиброзные септы распространяются на разные расстояния от портальных трактов в печеночные дольки, порой достигая центральных печеночных вен. Эти порто-центральные септы являются признаками активности процесса в дольках и их коллапса, то есть следствием мостовидных некрозов. Предполагается, что порто-центральные септы имеют большее значение при формировании цирроза, чем порто-портальные.

Для определения стадии заболевания, кроме гистологической оценки, большое значение имеет отсутствие или наличие такого осложнения, как портальная гипертензия.

Цирроз представляет собой финальную и необратимую стадию хронического гепатита. Для оценки тяжести цирроза печени предлагается пользоваться критериями Чайлда-Пью (Child-Pugh), которые основываются на данных биохимических исследований (общий билирубин, альбумин, протромбин) и клинических проявлениях - асцит и энцефалопатия (табл. 3-9).

Класс А по данной классификации соответствует состоянию компенсации, класс В - субкомпенсации, а класс С - декомпенсации печеночного процесса.

В клинике Мэйо (США) была разработана классификация тяжести состояния пациентов с терминальным заболеванием печени MELD (Model for End-Stage Liver Diseasе), которая в последующем совершенствовалась и неоднократно модифицировалась (MELD-Na, Delta MELD, MELD-XI, MELD-gender).

Данные прогностические системы (Чайлда-Пью и MELD), определяющие тактику ведения и прогноз жизни больных с циррозом печени, на 98% основаны на клинических лабораторных исследованиях, от точности которых зависит успех терапии.

НЕИНВАЗИВНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ

Основной путь прогрессирования хронических диффузных заболеваний печени - развитие последовательных стадий фиброза с формированием в конечном итоге цирроза и рака печени.

Одним из ключевых вопросов в лабораторной диагностике хронического гепатита и цирроза печени является определение степени фиброза. Именно поэтому разработка новых методов неинвазивной диагностики процесса фиброгенеза представляется весьма актуальной.

В настоящее время известно более десятка таких расчетных индексов (Forns, FIB-4, MDA, APRI и др.).

В последние годы в качестве альтернативы чрескожной пункционной биопсии печени у пациентов при различных формах хронических заболеваний печени стали использовать неинвазивные методы диагностики стадий фиброза и оценки некровоспалительного процесса в печеночной ткани (BioPredictivе, Франция). Первоначально эти тесты разрабатывались для больных хроническим гепатитом С и В, а затем стали применяться и при других нозологических формах хронических заболеваний печени.

Биопрогностические тесты:

Примечание. ГГТФ - γ-глутамилтрансфераза; АЛТ - аланинаминотрансфераза; АСТ - аспарт-атаминотрансфераза.

Из представленных данных с учетом возраста и пола пациента рассчитывается показатель, позволяющий при высокой чувствительности и специфичности определить стадию фиброза и степень активности хронического гепатита (табл. 3-11). Унифицированный калькулятор расчета показателей ФиброТеста и АктиТеста представлен на сайте www.biopredictiv.com.

Результаты этих тестов могут быть переведены в стандартные, наиболее часто используемые шкалы гистологических индексов - METAVIR, Knodell R.G., Ishak K.G. (1981) (табл. 3-12).

Для полной оценки степени фиброза печени, кроме лабораторных методов, проводятся неинвазивные инструментальные методы диагностики. К ним относятся: эластометрия печени [аппарат «Фиброскан» (Echosens, Франция)]; допплеровское исследование сосудов; компьютерная томография и магнитно-резонансная томография.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ И ИХ ОСЛОЖНЕНИЯХ

α-Глутатион-S-трансфераза в сыворотке. В печени α-глутатион-S-трансфераза (α-GST) локализована в гепатоцитах, тогда как η-GST находится в клетках желчных протоков. Гетерогенность распределения субклассов GST предполагает, что изоферменты обладают in vivo уникальными биологическими функциями в различных отделах печени и что определение уровня субклассов GST в биологических жидкостях могло бы быть очень полезно для контроля целостности определенных тканей печени.

В настоящее время повреждения гепатоцитов контролируют с помощью определения активности ферментов, например АЛТ и АСТ. Недостатком этих маркеров является то, что они не распределены равномерно в печени: концентрация в перипортальной зоне выше, чем в центре долек. Напротив, α-GST присутствует в высокой концентрации и в центре долек, и в перипортальной зоне. Поскольку центральная зона долек очень чувствительна к повреждению при различных условиях, включая отторжение трансплантата, вирусный гепатит, хронический активный гепатит, и к действию гепатотоксичных факторов, α-GST является более чувствительным индикатором острого повреждения гепатоцитов по сравнению с традиционными маркерами.

η-Глутатион-S-трансфераза в сыворотке. η-Глутатион-S-трансфе-раза (η-GST) находится в цитоплазме клеток желчных канальцев печени. η-GST была идентифицирована как основной изофермент глутатион-S-трансферазы в желчи. Таким образом, определение билиарного уровня η-GST может иметь значение при выявлении повреждений желчных канальцев. Энзиматическая активность билиарной GST ингибируется высокой концентрацией солей, присутствующих в человеческой желчи. Определение η-GST с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет избежать влияния солей. Повышенный уровень η-GST наблюдается при отторжении трансплантата, первичном билиарном циррозе, гепатоцеллюлярной карциноме. Таким образом, количественное определение η-GST в желчи человека может иметь значение для оценки статуса желчных канальцев печени у пациентов, относящихся к группе риска из-за наличия иммунологических или токсининдуцированных поражений печени. Было также показано повышение уровня η-GST в плазме при хронических холестатических заболеваниях и холангиокарциноме. Кроме того, есть основание считать, что повышенные количества тканевой и плазменной η-GST могут быть выявлены при различных злокачественных заболеваниях.

Коллаген IV типа в сыворотке. Хронические заболевания печени включают различные прогрессирующие расстройства, приводящие в итоге к циррозу печени и характеризующиеся чрезмерным накоплением коллагена.

Несмотря на то что при развитии фиброза в печени накапливаются различные коллагены (типы I, III, IV, V, VI), коллаген IV типа, являющийся компонентом базальной мембраны, заслуживает особого внимания по нескольким причинам. Его уровень отражает текущие гепатоцеллюлярные повреждения и дисфункции. Коллаген IV типа играет важную роль в гепатоцеллюлярной регенерации лобулярной структуры. Кроме того, этот тип коллагена синтезируется в первую очередь при различных повреждениях печени. При вирусном гепатите уровень коллагена IV типа в сыворотке увеличивается соответственно степени развития фиброза. У пациентов, пролеченных интерфероном, в случаях успешного лечения уровень коллагена IV типа имел тенденцию к уменьшению. Коллаген IV типа, таким образом, может быть использован как параметр оценки антивирусной терапии. Хроническая интоксикация печени может приводить к печеночному фиброзу, например, длительная терапия метотрексатом может вызвать фиброз печени. Так что коллаген IV типа является перспективным тестом для контроля терапии этим и другими препаратами, прием которых связан с риском развития фиброза печени.

Гиалуроновая кислота, продуцируемая фибробластами соединительной ткани, поступает в кровоток через лимфатическую систему. В норме гиалуроновая кислота быстро удаляется из кровотока специфическими рецепторами, экспрессирующимися синусоидальными клетками печени. При различных заболеваниях печени, в том числе таких, как цирроз, этот рецепторный механизм удаления нарушается, что приводит к возрастанию уровня гиалуроновой кислоты в сыворотке.

Было показано, что уровень коллагена IV типа (IV-C) и гиалуроновой кислоты в крови повышен при хронических вирусных заболеваниях печени и коррелирует со стадией ее фиброза. Клиническое значение инфицирования вирусом гепатита С выражается в предрасположенности к развитию цирроза печени и иногда - гепатоцеллюлярной карциномы. Эти показатели снижались только при полном исчезновении РНК вируса гепатита С при интерферонотерапии. Поскольку интерферон может быть не столь эффективен при лечении хронического гепатита С на поздней стадии фиброза, оценка степени фиброза печени может помочь выявлению тех пациентов, для которых лечение будет успешным. Обычно такая оценка базируется на данных биопсии. Результаты биопсии дают право предположить, что определение уровня гиалуроновой кислоты в сыворотке крови может быть использовано для мониторинга лечения интерфероном и может служить альтернативой биопсии печени. Также показано, что средний уровень гиалуроновой кислоты в группе пациентов, проходивших лечение по поводу злоупотребления алкоголем и не имевших каких-либо клинических или лабораторных данных о патологии печени, был достоверно выше, чем средний уровень гиалуроновой кислоты у здоровых доноров. Такие результаты свидетельствуют, что определение концентрации гиалуроновой кислоты в сыворотке клинически значимо и может быть использовано для диагностики цирроза. Более того, достоверные различия уровней гиалуроновой кислоты у здоровых лиц и у пациентов, проходящих лечение по поводу злоупотребления алкоголем, предполагают возможность использования гиалуроновой кислоты как серологического маркера для раннего выявления дисфункций печени.

α-Глутатион-S-трансфераза и η-глутатион-S-трансфераза в моче.

У человека η-глутатион-S-трансфераза (η-GST) находится в дистальных канальцах почек, тогда как α-глутатион-S-трансфераза (α-GST) - в основном в проксимальном канальце. У здоровых людей небольшое количество η-GST попадает в мочу. Любое повреждение дистального канальца может приводить к усилению выхода η-GST в мочу. Было показано, что возрастание концентрации η-GST является маркером повреждения дистального канальца при отторжении почечного трансплантата, нефротоксичности или хронических заболеваниях почек.

С другой стороны, было показано, что возрастание концентрации α-GST является маркером повреждения проксимального канальца. Таким образом, одновременное определение концентраций η-GST и α-GST позволяет проводить дифференциальную диагностику нарушений проксимального и дистального канальцев.

Коллаген IV типа в моче. В почках коллаген IV типа формирует бóльшую часть гломерулярной базальной мембраны. Коллаген IV типа является новым, чувствительным маркером почечного фиброза и повреждения почечных клубочков. Уровень коллагена IV типа в моче увеличен при ренальных фиброзах и хронической почечной недостаточности. Определение коллагена IV типа имеет значение у пациентов на ранней стадии нефропатии, когда еще не выражена микроальбуминурия. Уровень коллагена коррелирует со стадией болезни.

Антитела к базальной мембране клубочков. Антитела к базальной мембране клубочков (анти-GMB) непосредственно вызывают прогрессирующий гломерулонефрит без или с кровоизлиянием в легкие (синдром Гудпасчера). Антитела имеют высокую (более 90%) специфичность и чувствительность для синдрома Гудпасчера. Титры аутоантител коррелируют с активностью процесса, поэтому их определение используют для мониторинга болезни.

МЕТОДЫ ВИЗУАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ПЕЧЕНИ И ЖЕЛЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ

В настоящее время ультразвуковое исследование (УЗИ) как более простой и легко переносимый метод практически полностью вытеснил холецистографию. В случае развития желтухи в первую очередь выполняют УЗИ. При выявлении расширенных желчных ходов с целью установления уровня и характера обструкции проводят компьютерную томографию. Подозрение на наличие опухоли поджелудочной железы или в области ворот печени является основанием для проведения эндоскопической ретроградной панкреатохолангиографии. Этот метод позволяет установить локализацию и точную причину расширения желчных протоков. При диффузных заболеваниях печени визуальную оценку проводят с помощью УЗИ или магнитно-резонансной томографии. При подозрении на нарушения в системе кровоснабжения органа или портальную гипертензию дополнительно применяют УЗИ с цветным допплеровским изображением или магнитно-резонансную томографию с регистрацией последовательности потоков.

При очаговых поражениях печени исследования начинают с УЗИ. В дальнейшем в зависимости от предполагаемой природы очага алгоритм исследования приобретает характерную направленность. При подозрении на злокачественное поражение печени проводят биопсию этого участка под контролем УЗИ или компьютерной томографии. В случае необходимости выполняют портографию, магнитно-резонансную томографию или интраоперационное УЗИ. При доброкачественном поражении печени осуществляют радионуклидное сканирование. Например, при подозрении на гемангиому проводят сканирование с эритроцитами, меченными ^99m Тс. В случае необходимости выполняют биопсию подозрительного участка под контролем УЗИ или компьютерной томографии.

Для выявления расширения билиарного дерева, камня или опухоли в желчных протоках проводят УЗИ. Структура протоков визуализируется по данным эндоскопической ретроградной панкреатохолангиографии или транспеченочной холангиографии. В число дополнительных исследований входят компьютерная томография и эндоскопическое УЗИ, позволяющее выявить наличие конкрементов или внешнюю причину компрессии протоков.

Биопсия печени

Биопсия печени до настоящего времени оставалась важным методом диагностики ее патологии и контроля лечения больных. Показания к проведению биопсии печени:

Выраженность поражения печени и стадию заболевания определяют преимущественно путем обычного гистологического исследования. Гистологические срезы биоптатов печени интерпретируют на основе окраски их гематоксилином и эозином, а также рядом других красителей. В настоящее время возможности выявления патоморфологических изменений расширились благодаря применению новых технологий, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация in situ, проточная цитометрия, гистохимические и иммуногистохимические исследования.

В дополнение к стандартным способам окраски часто применяют иммуногистохимические методики.

Вирусные гепатиты - группа инфекционных заболеваний, которые вызываются различными гепатотропными вирусами, передающимися за счет фекально-орального (гепатиты А и Е) и парентерального (гепатиты В, С, D) механизмов. При этом термином «вирусные гепатиты» обозначают самостоятельные нозологические формы с обязательным поражением печени, определяющим течение и исход заболевания. Существуют и другие инфекции, характеризующиеся полиорганностью поражения и в том числе (с большей или меньшей частотой) - поражением печени. Однако такие гепатиты не являются самостоятельными заболеваниями, а представляют собой лишь синдром основного заболевания. В этих случаях принято называть патологический процесс по названию самих инфекций (цитомегаловирусная, аденовирусная, герпетическая инфекции, желтая лихорадка, инфекционный мононуклеоз и др.).

К настоящему времени идентифицированы и детально охарактеризованы пять типов вирусов, способных вызывать гепатиты у человека. Они обозначаются латинскими буквами А, В, С, D, Е. Эти вирусы вызывают до 90% всех случаев вирусных гепатитов, тогда как для остальных 10% заболеваний, похожих на вирусные гепатиты, этиологические агенты остаются неустановленными (неверифицированные гепатиты). В последние годы выявлены новые вирусы гепатитов F, G, SEN, TTV, однако их самостоятельная роль в развитии поражения печени не доказана.

В структуре инфекционных заболеваний во многих странах мира различные виды вирусных гепатитов занимают одно из ведущих мест. В этом заключается значительная клиническая проблема: если вирусы гепатитов А и Е вызывают только острые заболевания, то вирусы гепатитов В, С и D являются причиной и острых, и хронических форм, часто прогрессирующих с развитием циррозов печени и печеночно-клеточного рака, которые в основном и определяют инвалидизацию и смертность в рассматриваемой группе инфекций.

Необходимо отметить, что различные виды как острых, так и хронических вирусных гепатитов не имеют патогномоничных характеристик клинического течения и гистологической картины поражения печени. Следовательно, полный диагноз вирусного гепатита может быть поставлен только на основании специфических лабораторных тестов. Более того, лабораторная идентификация этиологического агента исключительно важна для определения прогноза заболевания и для оценки эффективности специфической противовирусной терапии (при количественном определении вирусных нуклеиновых кислот).

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ А

Вирусный гепатит А вызывается РНК-содержащим вирусом рода Hepatovirus из семейства Picornaviridae (HAV), открытым в 1973 г. Размер вириона составляет 27-30 нм. Вирус обладает одноцепочечной молекулой РНК, состоящей из 7478 азотистых оснований и кодирующей белок, который состоит из 2227 аминокислот. Вирусный белок впоследствии расщепляется (при участии вирусспецифических протеаз) на структурные и неструктурные белки (рис. 4-1). Структурные белки включают полипептиды оболочки (VP1, VP2, VP3 и VP4), неструктурные - хеликазу, РНК-зависимую РНК-полимеразу и цистеинсодержащую протеазу. Вирус имеет структуру икосаэдра, размером в диаметре 27 нм, геном представлен РНК длиной примерно 7,5 kb. Имеется только одна рамка считывания, разделяющая геном на три области: 5'-нетранслируемую область, рамку считывания и короткую 3'-нетранслируемую область, заканчивающуюся полиадениловым трактом. 5'-Нетранслируемая область содержит 734 азотистых основания и является самым консервативным участком генома со своей сложной вторичной структурой. Начальные 94 нуклеотида формируют вторичную структуру РНК в виде узлов, напоминающих лист клевера. Этот участок связан с вирусным белком VPg и является критичным для репликации РНК. 5'-Нетранслируемая область вследствие своей консервативности является зоной выбора при создании тест-систем для выявления HAV на основе ПЦР.

Расширенная основная поверхность гепатоцита выходит в пространство Диссе, а затем к венозным синусам, через которые вирус гепатита A, вероятно, и достигает клеток печени во время ранних стадий инфекции.

Соединенный с клеточным рецептором HAV-CR-1 гликопротеин, подобно муцину, облегчает попадание вируса в клетку. Это подтверждено исследованиями механизмов, лежащих в основе гепатотропизма вируса гепатита A. Так, специфический для HAV иммуноглобулин (IgA) способствует инфицированию вирусом гепатита A через сиало-гликопротеиновые рецепторы, которые связывают и усваивают молекулы IgA. Это было подтверждено на мышиных и человеческих гепатоцитах.

Подобно другим вирусам семейства Picornaviridae, вирус HAV проникает через клеточную мембрану с помощью эндоцитоза, сопровождаемого освобождением вирусной РНК. Репликация генома происходит в цитоплазме инфицированной клетки с синтезом дополнительной отрицательной нити, которая служит шаблоном для положительной нити. Процесс транскрипции продолжается асимметрично, с избытком молекул плюс-нитей, синтезируемых вирусной трехмерной зависимой РНК-полимеразой.

Белок, закодированный ORF, имеет молекулярную массу приблизительно 250 кДа. Протеолитическое расщепление вирусного полио-белка P1-P2-P3 является центральным в вирусном жизненном цикле и приводит к освобождению белков капсулы вируса (VPO, VP3, VP1 или VP1-2A) от Р1 или домена Р1-2A и неструктурных белков от P2 и домена P3. Было предположено, что P1-2A является функциональным предшественником структурных белков (рис. 4-2).

Общая для всех пикорнавирусов главная протеаза 3C вырезает себя из домена P3 полиобелка. Это было показано на примере провируса гепатита А-3С, который в состоянии освободить все структурные и неструктурные белки от первичного трансляционного продукта. Эффективное освобождение структурных белков от P1-2A является необходимым, но недостаточным для эффективного формирования капсулы вируса гепатита A.

Исследованию HAV препятствуют его медленный рост и низкое количество в культуре тканей. Однако, как полагают, его морфогенез сходен с морфогенезом вируса полиомиелита. Так, капсулу вируса полиомиелита образуют 12 субъединиц, названных пентамером. Эти субъединицы содержат пять копий предшественника, который состоит из одной молекулы каждого из белков капсулы вируса 1AB (VPO), 1С (VP3) и 1D (VP1) (рис. 4-3). Пентамер вируса гепатита A имеет коэффициент седиментации 14S; кроме того, были описаны HAV 70S (отсутствует капсид) и 135S, содержащие РНК частицы. Хотя описан только один серотип вируса гепатита А, выявлены генотипы с изменением последовательности нуклеотида в пределах от 15-25%.

Существует не менее четырех генотипов вируса, различающихся структурой участка, который кодирует полипептид VP1, и более 10 субтипов. Следовательно, тест-системы для детекции антител к вирусу выявляют их независимо от географического происхождения вируса.

Основные диагностические маркеры - IgM анти-HAV, IgG анти-HAV, Ag-HAV, РНК-HAV. Носительство и хронизация гепатита не встречаются. Фульминантный гепатит встречается в 0,01-0,50% случаев. Гепатокарцинома не развивается. Наличие коммерческих вакцин против вируса гепатита А показывают необходимость определения антител к HAV в пред- и поствакцинальном скрининге.

Особенности клеточного иммунного ответа в патогенезе повреждений печени при HAV-инфекции

Иммунологический ответ на инфекцию вируса гепатита А дикого типа сложен и включает клеточные и гуморальные механизмы. Важным является вовлечение в патогенез цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов. Однако по сравнению с гепатитами В и С мало что известно о клеточной иммунной реакции при гепатите А. Так, установлено, что некроз клеток может быть опосредован именно цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые распознают вирусные антигены на поверхности инфицированных клеток в контексте с HLA I класса. Оказалось, что цитотоксические лимфоциты периферической крови способны лизировать аутологичные HAV-инфицированные фибробласты кожи, которые могут быть обнаружены у пациентов с острым гепатитом А. Показано, что цитотоксичность лимфоцитов периферической крови относительно низка во время виремии, но достигает максимума через 2-3 нед после появления желтухи, то есть после нормализации лабораторных показателей. Это может происходить в результате рекрутирования цитостатических T-лимфоцитов с периферии к печени во время острой фазы гепатита А.

Исследования CTL, полученных из печени во время острой фазы гепатита А, показали, что приблизительно 50% CD8⁺ Т-лимфоцитов являются специфичными для вируса гепатита A и могут приводить к гибели зараженные этим вирусом фибробласты кожи. Учитывая, что используемые вирусы для инфекции целевых клеток были адаптированы к росту в фибробластах, то вполне вероятно, что эти процессы приводили к изменениям в антигенной специфичности и количество тропных к вирусу CTL было гораздо более высоким. С помощью электронной микроскопии было установлено, что взаимодействие между специфическими для вируса гепатита A, полученными из печени CD8⁺ Т-лимфоцитами, с нетравмированными, взятыми у той же особи зараженными вирусом гепатита A фибробластами кожи в конечном итоге приводили к полному некрозу. В очаге некроза CD8⁺ T-лимфоциты доминировали в инфильтрате над CD4⁺ Т-лимфоцитами во время острой фазы болезни, при завершении иммуновоспалительного процесса восстанавливалось соотношение CD4:CD8.

Секреция IFNγ Т-лимфоцитами является определяющей в контроле репродукции вирусов при цитомегаловирусной инфекции у мышей. Различными исследованиями показано, что вирус гепатита A не индуцирует соответствующую продукцию уровней IFNα Т-лимфоцитами или IFNβ фибробластами, способных нарушить репродукцию вируса. Было также показано, что у пациентов с инфекцией вируса гепатита A снижены уровни IFN на острой стадии и стадии реконвалесценции.

Характерная для вируса гепатита A секреция IFNγ временно коррелирует с развитием определенной для этого вируса цитотоксичности, связанной в значительной степени с CD8⁺ Т-лимфоцитами. Клоновый анализ проникновения T-лимфоцитов в ткани печени при вирусном гепатите А продемонстрировал определенную цитотоксичность против аутологичных зараженных фибробластов приблизительно в 50% случаев и вариабельную секрецию IFNγ среди клонов T-лимфоцитов (рис. 4-4). Интересно, что более 20% цитотоксических лимфоцитов составляли натуральные киллеры. NK-клетки - большие гранулированные лимфоциты с характерной морфологией, которые взаимодействуют с гликопротеинами на поверхности инфицированных вирусом клеток. Их потенциальное значение во время инфекции гепатоцитов вирусами связано с тем, что NK-клетки составляют около 20-30% внутрипеченочных лимфоцитов. NK-клетки, как показали исследования, развивают цитотоксичность и секретируют IFNγ в начальный период инфекций у мышей.

Исследования модулирующих эффектов интерферонов на иммунную систему могли бы более детально отразить развитие интимных механизмов патогенеза гепатита А. Во-первых, экспрессия IFNα/β могла бы отразить репликацию гепатоцитов при различных стадиях инфекции вируса гепатита А на мышиных моделях. Во-вторых, есть доказательства того, что IFNγ способствует процессам рекрутирования антигеннеспецифичных CD8⁺ Т-лимфоцитов, которые могут повреждать гепатоциты во время инфекции. В-третьих, IFNγ способствует экспрессии поверхностных белков клетками.

Гепатоциты при гепатите А усиливают экспрессию HLA антигенов I класса, тогда как эти молекулы не экспрессированы или очень незначительно экспрессированы на поверхности нормальных гепатоцитов. IFNγ, как полагают, является одним из главных посредников этого эффекта, приводящего к повышению эффективной T-клеточной цитотоксичности.

Таким образом, клеточно-опосредованный иммунный ответ является ведущим в элиминировании HAV. РНК-зависимая РНК-полимераза одноцепочечной плюс-цепи вируса, как правило, неэффективно выполняет считывающие функции, вызывая ошибки в 1/100 000 случаев во время продукции цепи РНК. Нестандартный нуклеотид в пределах минус-цепи является следствием ошибки во время синтеза дополнительных копий. Если при инфекции, связанной с пикорнавирусами, будет преимущественно развиваться гуморальный иммунный ответ, то такие мутации могут привести к изменениям антигенных характеристик и будут способствовать развитию антигенного дрейфа. Напротив, при HAV-инфекции, как установлено, ведущая роль принадлежит Т-лимфоцитам, которые ответственны за элиминирование вируса, и тем самым они нивелируют процессы антигенного дрейфа, способствуя циркуляции единственного серотипа. Очень интересная область исследования - коинфекция и особенности развития иммунного ответа. Так, установлено, что при острой HAV-инфекции имеет место подавление процессов репликации. Этот же механизм лежит в основе хронической HBV-инфеции. Это, вероятно, связано с секрецией цитокинов. Установлено, что при HAV-инфекции имеет место максимальная секреция IFNγ непосредственно перед тем, как уровни ДНК HВV и HBeAg начинали снижаться до минимально детектируемой концентрации. Специфичный для HВV-инфекции Т-клеточный иммунный ответ не был модифицирован, поэтому имеет место рецидив инфекции после разрешения HAV-инфекции.

В заключение необходимо сказать, что механизмы повреждения клеток печени при вирусном гепатите А до настоящего времени изучены недостаточно. Так, в противоположность другим пикорнавирусам, HAV способствует развитию бессимптомного или персистирующего течения, а не цитолитического повреждения клеточных культур in vitro. Именно поэтому роль различных механизмов в элиминировании вируса и развитии воспалительных реакций остается по-прежнему не до конца изученной. Более ранними исследованиями было показано, что повреждение гепатоцитов при HAV-инфекции вряд ли может быть связано только с комплемент-индуцированной антителозависимой цитотоксичностью к HAV. Именно поэтому HLA-ограниченные специфичные для вируса Т-лимфоциты играют чрезвычайно важную роль посредством секреции IFNγ, который может индуцировать развитие нецитолитических противовирусных механизмов против HAV. В дополнение интродукция тетрамеров класса I HLA предполагает наличие субпопуляции Т-лимфоцитов с определенной специфичностью.

Маркеры инфекции

РНК вируса (HAV RNA)

Выявляется в сыворотке крови, кале, воде и пищевых продуктах. Процедура детекции HAV RNA предусматривает предшествующий этап амплификации нуклеиновой кислоты. Выявление HAV RNA в сыворотке коррелирует с максимальным уровнем противовирусных антител класса IgM. Наличие ее в кале указывает на «инфекционность» больного, в воде и пищевых продуктах - на их зараженность вирусом. В клинической практике для подтверждения диагноза гепатита А определение HAV RNA не используется.

Антиген вируса (HAVAg)

Выявляется иммуноферментным методом в кале больного уже через 10-20 дней после инфицирования. Тем не менее в самом начале периода разгара гепатита А антиген вируса обнаруживается только у 20-50% пациентов.

Антитела к вирусу класса IgM (анти-HAV IgM)

Выявляются иммуноферментным методом в сыворотке/плазме крови в начале заболевания независимо от наличия или отсутствия клинических симптомов. Титр антител быстро нарастает; максимальная их концентрация сохраняется на протяжении 1,5-6 мес. Через год после выздоровления антитела в крови не обнаруживаются. Выявление антител класса IgM указывает на острое заболевание и позволяет проводить серологическую дифференциацию острой инфекции (присутствие анти-HAV IgM и анти-HAV IgG) и перенесенное в анамнезе заболевание (отсутствие анти-HAV IgM и присутствие анти-HAV IgG).

Антитела к вирусу класса IgG (анти-HAV IgG)

Выявляются иммуноферментным методом в сыворотке/плазме крови в начале заболевания; их концентрация достигает максимальных величин в течение нескольких недель. Отсутствие анти-HAV IgG в периоде разгара гепатита позволяет исключить связь гепатита с вирусом А; наличие анти-HAV IgG при отсутствии анти-HAV IgM указывает на факт перенесенного в прошлом вирусного гепатита А. После выздоровления анти-HAV IgG обнаруживаются в крови пожизненно и рассматриваются как показатель иммунной защиты против вируса.

Уровень анти-HAV IgG может быть определен количественно с целью оценки динамики поствакцинального иммунного ответа при вакцинировании против гепатита А.

Динамика серологических маркеров вирусных гепатитов А и Е позволяет с достаточной эффективностью верифицировать стадию инфекционного процесса.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ Е

Вирусный гепатит Е вызывается вирусом гепатита Е (HEV), представителем семейства калицивирусов. Геном его представлен одноцепочечной РНК, объединяющей три открытых рамки считывания, которые кодируют: первая РНК-зависимую РНК-полимеразу, РНК-хеликазу, метилтрансферазу и папаиноподобную протеазу; вторая - структурные белки и третья - трансмембранный белок, необходимый для внедрения вируса в клетку.

Маркеры инфекции

Серологические маркеры вирусных гепатитов А и Е на различных стадиях инфекционного процесса представлены в табл. 4-1.

Примечание. «+» - маркер обнаруживается; «-» - маркер не обнаруживается.

РНК вируса (HEV RNA)

Появляется в крови через 2-3 нед после заражения. Вирусемия свидетельствует о факте инфекции и длится около 2 нед.

Антитела к вирусу класса IgМ (анти-HEV IgM)

Появляются в крови через 3-4 нед после заражения и исчезают через несколько месяцев. Являются показателем острой фазы заболевания.

Антитела к вирусу класса IgG (анти-HEV IgG)

Преобладают на стадии выздоровления с нарастанием титра до высоких значений в течение нескольких месяцев. Как и в случае гепатита А, наличие только анти-HEV IgG не является подтверждением диагноза вирусного гепатита Е. Диагноз может быть поставлен при одновременном обнаружении анти-HEV IgM. Неизвестно, предотвращают ли анти-HEV IgG возможное последующее повторное заражение вирусом.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ В

За последние 30-40 лет методами молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и клиническими исследованиями достаточно глубоко изучен возбудитель инфекции - вирус гепатита B (HBV) (рис. 4-5). Изучены также клинические проявления и осложнения инфекции, ее патогенез. Формируется единая вирусоиммуногенетическая концепция развития и распространения инфекции гепатита В. Появились современные средства специфической профилактики и этиотропного лечения HBV-инфекции.

Вирусный гепатит В - глобально распространенная опасная вирусная инфекция. Ежегодно в мире регистрируется около 50 млн больных только острой HBV-инфекцией. Из них до 600 тыс. больных гепатитом В умирает. Из их числа около 100 тыс. человек погибает от редких, особо тяжелых фульминантных форм инфекции, смертность от которых достигает 70-90%. Из клинических данных последних лет известно, что фульминантный гепатит встречается чаще у пациентов, инфицированных мутантными штаммами HBV, и у лиц, одновременно инфицированных вирусами гепатитов В и D, В и С.

Высокие концентрации вируса обнаруживаются в сыворотке крови (до 10⁸ -10^п вирусных частиц в одном миллилитре) и печени больных гепатитом В при острой и хронической форме. Вирус гепатита В и вирусная ДНК также содержатся в селезенке, почках, в лейкоцитах крови, клетках других органов, в цереброспинальной и других биологических жидкостях больных.

Вирус гепатита В отличается исключительно высокой инфекционностью. Заражение HBV возможно при инокуляции очень малых объемов крови от больного - 0,1-0,5 мкл. Частой передаче возбудителя способствует и высокая устойчивость вируса и вирусной ДНК в условиях окружающей среды и в известных режимах дезинфекции. При комнатной температуре инфекционность вируса в крови сохраняется в течение 2-3 недель, в холодильнике - 6 мес, в замороженном виде - 15-20 лет и в высушенной плазме крови - до 25 лет. При кипячении инактивация вируса достигается за время более 30 мин, а при комнатной температуре в 1-2% растворе хлорамина - через 2 ч, в 1,5% растворе формалина - при 7-дневной экспозиции. Вирус устойчив к воздействию этилового эфира, ультрафиолетовому облучению. Высоко эффективна процедура автоклавирования при 120 °С, когда инфекционная активность HBV подавляется в течение 20 мин. В 70% растворе изопропилового спирта и в 80% этиловом спирте HBV инактивируется в течение 2 мин. Опасность и широкая распространенность гепатита В в наибольшей мере связаны также с тем, что из общего числа первично инфицированных HBV взрослых 2-10% заболевших в острой, в основном в легкой форме не выздоравливают, а становятся хроническими больными гепатитом В или носителями HBV-инфекции. У зараженных HBV лиц в младенческом или детском возрасте хроническая инфекция развивается гораздо чаще. При наличии в материнской крови вирусной ДНК и особенно НВе-антигена у новорожденного часто развивается врожденная HBV-инфекция.

Реактивация хронического гепатита В в особо тяжелой форме наблюдается редко (примерно у 14% больных), но отличается высокой (до 30%) летальностью. В последующем через несколько лет при хронической инфекции у 20% больных развивается цирроз печени и в 30% случаев - первичный рак печени. В результате ежегодно от острого и хронического гепатита В и его последствий в мире умирают 1,6-2,0 млн человек, из них около 700 тыс. - от цирроза и 300- 500 тыс. - от карциномы печени.

Острый гепатит В развивается при первичном инфицировании, и в части случаев он со временем может трансформироваться в длительно протекающую, хроническую HBV-инфекцию. Хронический гепатит В может развиваться как активная репликативная хроническая инфекция, как персистентная хроническая инфекция или как латентная хроническая инфекция часто без выраженных признаков патологии - «здоровое» носительство инфекции. Любая из названных разновидностей гепатита В обнаруживается наличием хотя бы части специфических, определяемых лабораторным исследованием антигенных (HBs- и НВе-антигены), иммунологических (антитела класса IgM и IgG к HBs-, HBe- и НВс-антигенам) или генетических (нуклеотидные последовательности ДНК HBV) специфических маркеров этой инфекции в крови, лимфе, других биологических жидкостях организма, а также в клетках и тканях различных органов. На практике, вследствие распространенности лабораторного определения маркеров в сыворотке крови, антигенные, иммунологические и генетические специфические лабораторные характеристики инфекции в крови часто объединяются под названием серологических или иммунологических маркеров. Серологическим показателем выздоровления от гепатита В служит исчезновение маркеров репликации вируса (рис. 4-6): ДНК HBV, HBs-и НВе-антигенов и антител класса IgM к НВс-антигену, выявление в крови «следов» перенесенной HBV-инфекции в виде антител класса IgG к HBs- и НВс-антигенам.

После перенесенной инфекции с появлением антител к HBs-антигену устанавливается состояние иммунитета - невосприимчивости к HBV-инфекции (табл. 4-2).

Неманифестный гепатит В протекает в виде субклинической или инаппарантной латентной инфекции. Разновидностью латентной инфекции является так называемое здоровое носительство, когда в крови человека обнаруживается только HBs-антиген (иногда с ДНК HBV) без каких-либо других маркеров инфекции и признаков патологии. В последние годы выявлена так называемая молчащая, пока еще малоизученная разновидность хронической HBV-инфекции, когда в сыворотке больных HBs-антиген не выявляется. Наличие HBV-инфекции у больных обнаруживается клиническими наблюдениями и ПЦР-анализом ДНК HBV.

Инаппарантные формы HBV-инфекции выявляются только наличием специфических маркеров инфекции по результатам лабораторного исследования, а для субклинических форм характерно дополнительное проявление неспецифических индикаторов инфекции (повышение активности аминотрансфераз АЛТ и АСТ, повышение концентрации общего билирубина в сыворотке, выявление некоторых иммунологических отклонений в крови и т.д.), устанавливаемых также лабораторным исследованием.

Примечание. «+» - маркер обнаруживается; «-» - маркер не обнаруживается; A1-A3, F0-F4 - стадии гистологических и морфологических изменений клеток печени.

«Молчащий» гепатит В и «здоровое» носительство HBs-антигена без клинических проявлений также относятся к латентной хронической HBV-инфекции. Поскольку вирусный гепатит В нередко протекает как микст-инфекция с HDV, верификация стадии инфекционного процесса осуществляется по динамике серологических маркеров (табл. 4-3).

При углубленном лабораторном изучении патогенеза могут быть установлены репликативная и интегративная формы (фазы) инфекции. Репликативная инфекция с размножением HBV в гепатоцитах характеризуется выявлением наравне с ДНК вируса и HBs-антигеном НВе-антигена и антител класса IgM к НВс-антигену в крови. Интегративная фаза инфекции характеризуется выявлением только последовательностей ДНК HBV и HBs-антигена в некоторых тканях и в крови. Это связано с тем, что при развитии HBV-инфекции одновременно с репликацией инфекционного вируса в клетке может произойти также встройка последовательностей ДНК HBV в ДНК клеток макроорганизма, в частности гепатоцитов. При завершении репликативной фазы инфекции проявление маркеров только поздней интегративной инфекции в виде персистенции HBs-антигена и ДНК HBV без клинических проявлений патологии печени соответствует носительству HBV-инфекции.

Вирус гепатита В относится к семейству Hepadnaviridae, роду Orthohepadnaviridae. Морфологически вирус гепатита В представляет собой сложную сферическую частицу диаметром 40-48 нм (в среднем 42 нм). Вирус состоит из ядра - нуклеокапсида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находятся двухцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. Нуклеотид построен из молекул HBc-антиген (core-белок). Наружную оболочку вируса, толщиной 7 нм, образует поверхностный антиген - HbsAg. Оболочка состоит из повторяющихся структур поверхностного HBs-антигена с распределенными на внешней стороне вируса участками pre-Sl-и рrе-S2-антигенов. Внутри оболочки из поверхностных антигенов размещается капсид - сердцевина вируса с внутренним коровым покрытием диаметром 25-27 нм. В капсиде упакован нуклеопротеиновый комплекс генома с вирусной ДНК-полимеразой и обратной транс-криптазой. Покрытие капсида вируса состоит из повторяющихся белковых структур, иммунологически идентифицируемых как HBcAg. При частичной денатурации НВс-антигена и в сыворотке больных может быть обнаружен другой внутренний структурный белок вируса - НВе-антиген (envelop-белок). В сыворотке крови инфицированных гепатитом В, кроме частиц Дейна, обнаруживаются в больших количествах малые сферические и продолговатые тубулярные белковые частицы вирусного происхождения диаметром 20-22 нм. Эти частицы внутри полые, не содержат ДНК вируса, следовательно неинфекционные, и главным образом состоят из HBs-антигена с небольшим содержанием рrе-S2-антигена.

Известны распространенные геномы HBV четырех основных субтипов вируса, названные по сочетанию антигенных эпитопов HBs-антигена: adw, ayw, adr и ayr. Таким образом, антигенный эпитоп α является общим для всех субтипов HBV. Различия в нуклеотидных последовательностях генома в пределах субтипа составляют менее чем 3%, тогда как между субтипами эти различия могут составлять до 9-12%. Известны также субтипы вируса с более сложным сочетанием антигенов, например субтип adyw и др. Субтипы HBV в разной степени распространены в различных регионах мира. В Западной Европе, Китае, Корее, Японии, Америке, Восточной Африке более широко представлены субтипы с сочетанием основных эпитопов ad. В России, Индии, Западной Африке, на Ближнем и Среднем Востоке более характерно распространение субтипа ау. Наличие определенных субтипов, как раньше считалось, не сказывается на тяжести клинических проявлений инфекции, вызываемой HBV, однако оно учитывается при производстве диагностических тест-систем, профилактических вакцин, предназначенных для диагностики и предупреждения HBV-инфекции в различных регионах мира.

Имеются сообщения о том, что наличие различных субтипов вируса по HBs-антигену, возможно, играет роль в развитии фульминантного гепатита. Предполагается, что накопление определенного субтипа вируса может привести к фульминантному гепатиту новорожденных.

Среди геномов так называемых диких штаммов HBV обнаруживаются штаммы с устойчивыми мутантными генами: с частыми замещениями, делециями или инсерциями (вставками) нуклеотидов в различных областях генома. При обзоре многих появляющихся в литературе сведений о мутантных HBV часто обнаруживается наличие ассоциативной связи между выявлением стабильных мутаций в геноме HBV и особенностями протекания острой и хронической HBV-инфекции. К настоящему времени зарегистрировано более 60 мутантных штаммов HBV. Обнаружение каждой новой мутантной формы вируса ставит перед исследователями задачи по определению широты ее распространения, выявлению особенностей течения и исхода гепатита В при наличии данной мутантной формы, а также по определению ее влияния на эффективность проводимой терапии или степень защиты после проведенной вaкцинoпpoфилaктики.

Заслуживают особого внимания наблюдения связи между появлением мутаций в определенных областях генома и трансформацией острой инфекции в хронический гепатит. В этом смысле в процессе трансформации в хроническую инфекцию, по-видимому, весьма значительная роль принадлежит делеционным мутациям в гене HBV, кодирующем коровые белки. Также в период трансформации инфекции происходят часто выявляемые точечные мутации А-1896 и А-1762. Первая из них в прекоровой области генома препятствует экспрессии НВе-антигена и ассоциируется с низкой репликативной активностью возбудителя инфекции и слабой восприимчивостью гепатита В к IFN-терапии. Мутация А-1762 в промоторе гена, кодирующем коровые белки, связывается с хронической инфекцией с более активной репликацией мутантного вируса и более высокой степенью воспаления печени. Такая клиническая характеристика инфекции свидетельствует в пользу восприимчивости ее к IFN-терапии. По предварительным данным, сочетанное действие процессов иммунитета и отбора мутаций в геноме HBV в ходе пролонгированной инфекции может трансформировать острый гепатит B в медленную, более устойчивую против иммунитета, хроническую инфекцию. Однако непосредственно связать отдельно выявленную мутацию с характером развития и с конкретным исходом инфекции едва ли возможно, хотя бы из-за наличия перекрывающихся участков генов в исключительно компактном геноме HBV.

При острой HBV-инфекции первая клеточная реакция, по лабораторным данным in vitro, наблюдается против preS-содержащего HBs-антигена еще в продромальный период, задолго до появления повреждений печени. В это время титр HBs-антигена в сыворотке еще возрастает, а НВе-антиген только появляется. Клеточная реакция на НВс-антиген следует позже и сопровождается немедленным появлением антител к этому антигену. С цитолизом гепатоцитов тесно коррелирует клеточная реакция на preS-отрицательный HBs-антиген, которая каждый раз обнаруживается с выявлением начала повреждения печени. Именно этой реакции Т-лимфоцитов приписывается важная роль по клеточной элиминации HBV в начале инфекции. Важно, что Т-клеточный ответ на HBs- и НВс-антигены перестает обнаруживаться в манифестный период. Для НВс-антигена клеточный ответ в этот период находится под воздействием различных супрессорных факторов, а для HBs-антигена, независимо от наличия или отсутствия preS-антигенов, клеточная реакция усиливается позже, на стадии выздоровления.

Временное снижение активности этой реакции не может быть объяснено только Т-клеточной супрессией.

При остром гепатите возбудитель HBV-инфекции выявляется еще в инкубационном периоде. В продромальной стадии HBs-антиген начинает обнаруживаться и достигать максимальной концентрации незадолго до наблюдаемого максимума активности трансаминаз. При неосложненном течении гепатита В HBs-антиген продолжает обнаруживаться в сыворотке в течение примерно от 2 до 10 нед после установления симптомов заболевания. Индикаторный маркер вирусной репликации НВе-антиген может выявляться в пределах этого срока. НВе-антиген, по-видимому, играет также дополнительную иммунорегуляторную роль, и его дальнейшая сероконверсия служит показателем продолжающегося развития иммунного ответа в острой и хронической инфекции.

При остром гепатите В в крови пациентов первыми из вирусспецифических антител появляются антитела к НВс-антигену и затем к НВе-антигену. Однако эти антигены у вируса внутренние, и антитела против них не обладают вируснейтрализующими свойствами. Антитела против главного антигена внешней оболочки вируса появляются только после исчезновения самого HBs-антигена в сыворотке и по истечении продолжительного времени в виде «серологического окна». Следовательно, эти появляющиеся поздно антитела нейтрализовать вирус и защитить организм от его размножения в острой фазе инфекции не могут.

Несмотря на то что НВс-антиген - внутренний компонент вируса, почти у всех пациентов выявляют высокий титр антител против этого антигена. Антитела появляются независимо от острой или хронической формы инфекции и независимо от наличия или отсутствия повреждений печени. При острой инфекции IgM-антитела против НВс-антигена появляются первыми и считаются ранними диагностическими. Эти антитела, как и НВе-антиген, выявляют активную репликацию вируса. Обострение хронической инфекции или краткосрочная корти-костероидная терапия тоже могут инициировать синтез IgM-антител. Со временем в ходе инфекции IgM-антитела к НВс-антигену сменяются антителами класса IgG.

Основной маркер активной репликации вируса - НВе-антиген - вызывает образование антител гораздо позже и не всегда. Эти два внутренних антигена, имеющие значительную аминокислотную гомологию, весьма сильно отличаются иммуногенностью в образовании специфических антител. НВс-антиген является тимуснезависимым, в отличие от тимусзависимого НВе-антигена. Детерминанты антител к этим двум антигенам перекрываются частично. При острой инфекции экспрессия антител к НВе-антигену может коррелировать со снижением и потерей вирусной репликации. При хронической инфекции антитела к НВе-антигену могут образоваться спустя много лет после начала синтеза антител к НВс-антигену или вовсе не появиться.

Высокая иммуногенность НВс-антигена, внутреннего антигена вируса, по сравнению с поверхностным HBs-антигеном, избыточная секреция корпускулярного поверхностного антигена, маскирующего вируснейтрализующие антитела в крови, способствуют тому, что эти антитела к HBs-антигену не могут нейтрализовать вирус в наиболее активной стадии острой инфекции. Именно поэтому в противовирусном иммунитете острой циклической инфекции гепатита В решающая роль отводится интерферону α, провоспалительным цитокинам и реакциям цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток.

Хронизация HBV-инфекции приводит к постоянной экспрессии HBs-антигена во времени. Антитела к этому антигену не обнаруживаются. В состоянии хронической инфекции высокой репликативной активности одновременно могут определяться антитела класса IgM к НВс-антигену, НВе-антиген и высокие концентрации ДНК HBV. В статусе хронической персистирующей инфекции маркеры репликативной фазы могут выявляться в минимальных концентрациях. В биоптате при хронической инфекции выявляется характерное воспалительное повреждение печени. Персистирующая хроническая инфекция может надолго стабилизироваться в состоянии экспрессии антител к НВе-антигену. Репликативная и интегративная фазы хронической инфекции отличаются тем, что в первом случае могут быть обнаружены НВе-антиген и антитела класса IgM к НВс-антигену, а во втором случае возможно выявление только антител класса IgG к этим антигенам. Для поздней стадии хронического «здорового» носительства HBs-антигена характерно постоянное обнаружение только этого маркера интегративной фазы инфекции без повреждений печени. Только ПЦР-анализ выявляет ДНК HBV в сыворотке в минимальных концентрациях. Синтез антител к HBs-антигену при избытке этого антигена в крови приводит не к эффективной нейтрализации вируса, а к образованию циркулирующих иммунных комплексов HBs-антигена с его антителами. Активная хроническая HBV-инфекция сопровождается интенсивной гипергаммаглобулинемией, образованием аутоиммунных антинуклеарных и антиэндотелиальных антител, антител против гладкой мускулатуры и ревматоидного фактора.

Начало защитных реакций иммунитета при репликации HBV в печени связано с экспрессией противовирусного интерферона α, который выявляется в периферической крови инфицированного одновременно с появлением основного маркера инфекции - HBs-антигена - еще в инкубационном периоде вирусного гепатита В. Интерфероны α/β и другие цитокины начальной фазы иммунного ответа синтезируются зараженными клетками печени, макрофагами, Т- и В-лимфоцитами и способствуют быстрому росту уровня экспрессии и экспонирования антигенов иммунного распознавания HLA I класса на гепатоцитах. Они также способствуют активации и/или пролиферации основных клеточных эффекторов иммунитета: CTL, NK-клеток, макрофагов и нейтрофилов. Как хорошо известно, HBV является слабым индуктором IFNα. При остром вирусном гепатите В IFNα уверенно определяется в сыворотке только у одной трети пациентов. Даже у лиц с манифестной HBV-инфекцией уровень IFNα ниже, чем в случае других вирусных инфекций, например при гриппе. Концентрация интерферона может повышаться при тяжелом остром гепатите В. При хронической HBV-инфекции уровень эндогенного IFNα ниже, чем у здоровых лиц. У больных вирусным гепатитом В продукция IFNγ, регулятора экспрессии молекул HLA II класса иммунокомпетентными клетками, находится в норме. По современным представлениям, сложный комплекс взаимодействия HBV с клетками иммунной системы обусловливает хронизацию и неблагоприятный исход инфекции. Течение вирусного гепатита В характеризуется изменениями в балансе как провоспалительных цитокинов, так и противовоспалительных цитокинов, регулирующих клеточные и гуморальные реакции иммунитета. Поляризация иммунного ответа с превалированием медиаторов Th1-пути либо Th2-пути играет ключевую роль в иммунопатогенезе вирусного гепатита В. Установлено, что при остром саморазрешающемся вирусном гепатите В развивается мощный поликлональный CD4⁺ - и CD8⁺ -клеточный ответ, тогда как при хронической вирусной инфекции Т-клеточный ответ существенно более слабый и направлен против меньшего числа эпитопов. Причем при хронизации инфекционного процесса иммунный баланс смещается в сторону Th2, что сопровождается усилением продукции IL-4 и IL-10 и приводит к хронизации инфекции.

Важным фактором, определяющим возникновение, прогрессирование и характер исхода вирусного гепатита В, является и генетическая детерминированность иммунного ответа. О значении иммуногенетических факторов в механизмах хронизации вирусной инфекции свидетельствует различие в уровне заболеваемости вирусным гепатитом в разных этнических группах, проживающих на одной территории. Также показано и существование аллелей генов многих цитокинов и рецепторов к ним. При этом отдельные аллельные варианты могут быть ассоциированы с уровнем продукции соответствующего белка, что оказывает влияние на характер течения, тяжесть, продолжительность и исход заболевания.

Персистенция HBV затрагивает практически все факторы противовирусного иммунитета, сочетает элементы пассивной и активной самозащиты. Особенности изменений врожденного гуморального иммунного ответа обусловлены нарастанием уровня интерферонов, сывороточных иммуноглобулинов, активацией системы комплемента и NK-клеток. Специфический иммунный ответ направлен на элиминацию циркулирующих и клеточных антигенов вируса, а также на защиту клеток от реинфицирования.

Исследование Т-клеточного звена иммунитета при HBV-инфекции показало, что он носит в большинстве случаев однонаправленный характер и проявляется снижением количества CD3⁺ CD4⁺ -лимфоцитов. Отсутствие в ряде случаев эффективного Т-клеточного ответа у пациентов с латентно протекающей инфекцией может быть обусловлено низким уровнем репликации вируса, низкой экспрессией HLA и других вспомогательных молекул на поверхности инфицированных клеток.

У пациентов с латентно протекающей HBV-инфекцией отмечается выраженное угнетение конституциональной и индуцированной способности мононуклеаров периферической крови индуцировать TNFα, IL-12, IL-2. Механизмы подавления синтеза цитокинов остаются недостаточно изученными, и, по-видимому, имеет место не один, а несколько типов ингибирования. Ограничение продукции TNFα и других провоспалительных цитокинов в условиях латентно протекающей HBV-инфекции расценивают как реакцию иммунной системы, направленную на предотвращение реализации проапоптотического потенциала вирусов и развития необратимого повреждения органов и тканей, обусловленного действием этих цитокинов Th1-пути.

Латентно протекающие HBV-инфекции сопровождаются развитием аутоиммунных процессов, которые, однако, недостаточны для элиминации вируса. Выявленный дисбаланс продукции цитокинов TNFα, IL-12, IL-2, IL-4, IL-10, вероятно, можно рассматривать как средство адаптации к новым условиям.

У больных хроническим гепатитом В в стадии активной репликации вируса (в сыворотке определяются НВе-антиген и ДНК HBV) спонтанная продукция IL-2 повышается, однако при этом наблюдается низкий пролиферативный ответ иммунокомпетентных клеток на НВс-антиген. Экспрессия IL-12 усиливает клеточную цитотоксичность и развитие Т-хелперов 1-го типа, продуцентов IFNγ и IL-2. Уровень IL-12 повышается у пациентов с исчезновением HBV в крови и при сероконверсии НВе-антигена.

По лабораторным данным, при остром гепатите возбудитель инфекции HBV выявляется еще в инкубационном периоде. HBs-антиген начинают обнаруживать в продромальной стадии. Он достигает максимальной концентрации незадолго до выявляемой максимальной активности трансаминаз. При неосложненном течении вирусного гепатита В HBs-антиген продолжает обнаруживаться в сыворотке в течение примерно от 2 до 10 недель после установления симптомов заболевания. Индикаторный маркер вирусной репликации НВе-антиген может выявляться в пределах этого срока, однако в течение менее продолжительного времени. НВе-антиген, по-видимому, играет дополнительную иммунорегуляторную роль, а его дальнейшая сероконверсия служит показателем продолжающегося развития иммунного ответа при острой и хронической инфекции.

Трансформация в хронический гепатит характерна прежде всего для лиц с несформировавшимся или ослабленным клеточным иммунитетом, неспособным, как следствие, эффективно разрушать инфицированные гепатоциты и элиминировать вирус. Возможно, при этом значительное место занимает дефицит системы интерферона у пациента. Развитие хронического гепатита В наблюдается у 5-7% взрослых пациентов в клинически манифестной форме. В случае врожденной HBV-инфекции, в раннем детском возрасте, у пожилых и иммунодепрессивных больных развитие хронического гепатита В наблюдается гораздо чаще. Процесс трансформации в хронический гепатит В и дальнейшее его развитие сопровождаются иммунной селекцией возбудителя с постепенным накоплением стабильных мутантных по НВс-антигену штаммов HBV и встраиванием вирусной ДНК в геном клеток печени. В ходе этих процессов активная репликативная инфекция постепенно затухает и переходит в медленную интегративную. При этом репликативная активность HBV, по-видимому, продолжает контролироваться внутриклеточным адаптационным иммунитетом, а интегрированный с гепатоцитами вирус может быть элиминирован из организма только апоптозным и аутолитическим некрозом инфицированных клеток. Вследствие этого у пациентов с дефицитом цитотоксического иммунитета хронический гепатит В продолжается в течение многих лет или пожизненно. Пока непонятна роль адаптивного иммунитета при всплеске репликации HBV или длительного протекания хронического гепатита высокой репликативной активности HBV. При длительном наблюдении за инфицированными HBV добровольцами установлено, что хронический гепатит со временем развивается у лиц с более высокой репликативной активностью вируса во время вялотекущей острой инфекции.

Исчезновение ДНК и антигенных маркеров инфекции и выявление антител не только к НВе- и НВс-антигенам, но и к HBs-антигену служат подтверждением полного разрешения организма и от острого, и от хронического гепатита В. Течение хронического гепатита В, как правило, сопровождается выявлением вирусологических и иммунологических маркеров инфекции. Отсутствие антител к НВе-антигену и тем более к HBs-антигену указывает на неполноту и незавершенность развития иммунного ответа и тем самым незавершенность инфекции гепатита В. Дефицит противовирусного клеточного иммунитета в начале хронической инфекции со временем дополняется вторичной аутоиммунной и неспецифической иммунопатологией печени и других органов. Более того, селекция иммунотолерантных штаммов за счет мутаций в геноме HBV, интеграция вирусного генома в клеточный геном с постоянной экспрессией HBs-антигена в ходе хронической инфекции делают крайне маловероятным полную элиминацию возбудителя и достижение иммунопротективного статуса у больных хроническим гепатитом В.

Широко распространенный субклинический острый вирусный гепатит В и протекание хронической HBV-инфекции без клинических проявлений в виде «здорового» носительства HBs-антигена или «молчащей» инфекции с репликацией ДНК HBV без экспрессии HBs-антигена и так называемый первично-хронический гепатит В продолжают изучаться, и их значение в распространении HBV-инфекции и ее последствий предстоит еще изучить.

Лабораторная диагностика вирусного гепатита В

При ИФА сывороток больных гепатитом В выявляются HBs- и НВе-антигены, антитела класса IgM и IgG к НВс-антигену и антитела класса IgG к HBs- и НВе-антигенам. Для прямого подтверждения диагноза HBV-инфекции, мониторинга хронической инфекции, изучения эффективности курса терапии гепатита В весьма информативно дополнительное определение генетического маркера (ДНК HBV) высокочувствительным методом ПЦР-анализа. Этой чувствительности, однако, часто недостаточно для выявления ДНК в случае латентной, хронической или врожденной инфекции. Резкое повышение чувствительности анализа достигается ПЦР-зондовым анализом или двойным нестед-ПЦР-зондовым анализом вирусной ДНК. Чувствительность нестед-ПЦР-анализа исключительно высока и может быть достаточной для выявления нескольких копий ДНК HBV в пробе, что превышает соответствующую чувствительность метода ИФА в определении HBV через его антигены в десятки и сотни тысяч раз.

Антигенные, иммунологические и генетические маркеры HBV-инфекции в клинической практике определяются лабораторными исследованиями с использованием стандартных диагностических ИФА и ПЦР тест-систем промышленного производства. Лабораторные исследования играют ведущую роль в установлении диагноза вирусного гепатита В, дифференциальной диагностике острого и хронического гепатитов В, мониторинге активности вирусной репликации у носителей HBsAg, оценке эффективности противовирусной терапии заболевания.

Развитие хронического гепатита В чаще происходит у людей, инфицированных перинатально или в раннем детстве, когда иммунная система еще несовершенна и не может в полной мере реализовать элиминацию вируса.

Естественное течение HBV-инфекции разделяется на четыре фазы: иммунотолерантности, иммунореактивности (иммунного клиренса), иммунного контроля (низкорепликативная), реактивации. Иммунотолерантная фаза характеризуется наличием HBeAg, высоким уровнем ДНК HBV (более 10⁶ копий/мл, или 200 000 МЕ/мл), нормальной или незначительно повышенной активностью АЛТ и нормальной или минимальной гистологической активностью. Большинство больных с перинатально приобретенной HBV-инфекцией находятся в данной фазе и представляют хронический HBeAg-позитивный гепатит с нормальной активностью АЛТ. Для иммуноактивной фазы характерны снижение вирусной нагрузки, повышение активности АЛТ и некровоспалительной активности. Данное состояние расценивается как хронический HBeAg-позитивный гепатит. При этом уровень ДНК HBV становится выше 10⁵ копий/мл (приблизительно 20 000 МЕ/мл). Проявлением иммуноактивной фазы в 65-95% случаев является сероконверсия от HBeAg к анти-НВе, которая сопровождается снижением вирусной репликации, биохимической ремиссией, в ряде случаев со спонтанным выздоровлением.

Низкорепликативная фаза чаще диагностируется при носительстве HBV и характеризуется HBeAg-негативностью и анти-НВе-позитивностью, неопределяемым или низким уровнем ДНК HBV (менее 10⁴ копий/мл, или 2000 МЕ/мл), постоянной нормальной активностью АЛТ и минимальной гистологической активностью (менее 4 баллов по шкале Кноделя). У части больных спонтанно или вследствие иммуносупрессии развивается реактивация вирусной репликации. Крайне редко она имеет место у «дикого» штамма возбудителя с обратной реверсией HBeAg-позитивного статуса. Гораздо чаще наблюдается мутация в pre-core/core регионе с последующим нарушением экспрессии HBeAg и развитием хронического HBeAg-негативного гепатита. Данный диагноз лабораторно характеризуется отсутствием HBeAg, наличием анти-НВе, уровнем ДНК HBV более 10⁴ копий/мл (приблизительно 2000 МЕ/мл), повышенной активностью АЛТ, некрозно-воспалительными изменениями в печени.

Неспецифические биохимические тесты, принятые для оценки функционального состояния печени, свидетельствуют об умеренном повышении активности АЛТ, снижении протромбинового индекса, диспротеинемии, незначительном увеличении СОЭ. При этом выраженность цитолитического синдрома достоверно коррелирует с активностью вирусной репликации (уровень ДНК HBV более 10 000 копий/мл, или 2000 МЕ/мл).

Цирроз печени соответствует следующей стадии морфогенеза хронического гепатита В прогрессирующего течения. Независимо от варианта развития течение HBV-цирроза бывает непрерывно прогрессирующим и медленно прогрессирующим с периодами длительной ремиссии. Из лабораторных данных характерны резко выраженные диспротеинемия (гипоальбуминемия, гипергаммаглобулинемия), гипербилирубинемия, высокая активность аминотрансфераз, повышение СОЭ, увеличение содержания всех классов иммуноглобулинов, циркулирующих иммунных комплексов, снижение активности протромбина, уровня общего холестерина.

Хроническая HBV-инфекция большей частью имеет клинически сглаженное малосимптомное течение. Именно поэтому первичный диагноз чаще устанавливают на основании результатов лабораторных исследований (повышение активности АЛТ, маркеры HBV) и биопсии печени. В этой связи так называемое хроническое вирусоносительство является сугубо условным наименованием и соответствует скрытно протекающему, как правило, доброкачественному хроническому гепатиту. Комплексное углубленное обследование бессимптомных HBsAg-позитивных доноров, включающее биопсию печени, показывает, что большинство «вирусоносителей» являются больными латентным хроническим гепатитом В, причем нередко с наличием слабой репликации. У пациентов с отсутствием клинической симптоматики (латентными формами вирусных гепатитов) при наличии фиброза независимо от активности воспаления, выявления маркеров активной вирусной репликации (HBeAg, ДНК HBV), присутствия анти-HBc IgM, устанавливается диагноз хронического гепатита В.

Иммунологическая (серологическая) диагностика вирусного гепатита B В качестве скринингового исследования в настоящее время наиболее широко используется выявление HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В).

HBsAg является маркером, свидетельствующим об инфицированности человека вирусом гепатита В. Он обнаруживается в сыворотке крови через 4-6 нед после заражения, еще в инкубационном периоде, примерно за 25-30 дней до появления первых клинических признаков заболевания, и сохраняется на протяжении всего острого периода гепатита В. У большинства больных он исчезает в периоде реконвалесценции, однако у отдельных пациентов продолжает обнаруживаться в крови спустя месяцы или даже годы после заражения.

HBcoreAg (HBcAg) является основным белком нуклеокапсида вируса. Он не секретируется, поэтому в сыворотке крови не обнаруживается. Его можно обнаружить непосредственно в ткани печени с помощью иммуногистохимических методов. Антитела к HBcAg, относящиеся к иммуноглобулинам класса М (анти-HBc IgM) и являющиеся серологическими маркерами острого вирусного гепатита В, диагностируются в разгаре заболевания и могут выявляться в течение года. В ряде случаев они могут быть единственным маркером острого вирусного гепатита В. Антитела к HBcAg, относящиеся к иммуноглобулинам класса G (анти-HBc IgG), свидетельствуют о перенесенной или текущей HBV-инфекции.

НBeAg - секретируемый белок (антиген). Его обнаружение в сыворотке крови является косвенным признаком активной вирусной репликации. Он выявляется в сыворотке крови как у больных острым (в разгаре заболевания), так и хроническим гепатитом В (периоде обострения). Сероконверсия по HBeAg (появление антител к HBeAg) является признаком благоприятного течения заболевания и свидетельствует о снижении активности вирусной репликации.

Алгоритм серологического обследования пациентов при подозрении на инфицирование вирусом гепатита В представлен на рис. 4-7.

Примечание. «+» - маркер выявляется; «-» - маркер не выявляется; «+/-» - маркер может встречаться/может не выявляться; «-/+» - маркер чаще не встречается.

Интерпретация результатов серологического обследования пациентов при подозрении на инфицирование вирусом гепатита В представлена в табл. 4-4.

Молекулярно-биологическая диагностика вирусного гепатита B

Выявление ДНК HBV используется для ранней диагностики острого вирусного гепатита В. ДНК HBV выявляется в крови, в среднем через месяц после заражения, и становится первым диагностическим маркером. HBsAg появляется в крови заболевшего позже как минимум на 3 нед.

Молекулярно-биологическая диагностика позволяет определять наличие мутантных по HBsAg штаммы вируса гепатита В. В настоящее время в результате реализации массовых программ вакцинации, в том числе и вируса гепатита В, наблюдается тенденция к повышению частоты таких труднодиагностируемых штаммов. Инфекция, ими вызванная, может не выявляться стандартными тестами ИФА, разработанными для обычных штаммов.

Диагностическая значимость количественной оценки уровня ДНК HBV в плазме крови (вирусной нагрузки)

Количественное исследование ДНК HBV необходимо при проведении дифференциальной диагностики между носительством HBV и хроническим течением вирусного гепатита В. У пациентов при длительном (более 6 мес) выявлении HBsAg и с нормальной активностью АЛТ лабораторным критерием дифференциальной диагностики между носительством HBV и хроническим гепатитом В выступает уровень ДНК HBV выше 2 ? 10³ МЕ/мл.

Основная роль при назначении противовирусной терапии больным хроническим вирусным гепатитом В принадлежит нескольким показателям: персистенции HBsAg более 6 мес, повышенному уровню активности трансаминаз, гистологическим признакам выраженного гепатита (индекс активности >4) и уровню ДНК HBV, превышающему 2 ? 10⁴ МЕ/мл (для НВе-позитивных пациентов).

Другие методы диагностики

Для выявления «молчащих», латентно протекающих вирусных гепатитов важное значение имеет оценка состояния клеточного звена иммунитета. Интегрирующим показателем может быть оценка концентрации высвобождающегося неоптерина, который является биологически более инертным продуктом, чем цитокины, и его концентрация не изменяется длительное время. Концентрация неоптерина отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию макрофагов/моноцитов. В организме человека синтез неоптерина начинается под влиянием высвобождающегося из Т-лимфоцитов IFNγ, который активирует ГТФ-циклогидроксилазу - ключевой фермент в цепочке превращения ГТФ в неоптерин. При этом другие цитокины (IL-1α, IL-1β, IL-2, TNFα) влияют на образование неоптерина либо незначительно, либо только опосредованно. В лабораторной практике определение содержания неоптерина используется при мониторинге инфекционных осложнений, при скрининге образцов донорской крови, для прогнозирования развития и течения заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов, для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных инфекций. Гиперпродукция неоптерина характерна у большинства больных с аутоиммунными и активными хроническими инфекционными заболеваниями, и она по времени намного предшествует появлению клинических симптомов. Определение концентрации неоптерина также используется для терапевтической оценки иммуно-модуляторов.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ С

Вирусный гепатит С вызывается РНК-содержащим флавивирусом (HCV) диаметром 55-65 нм, покрытым липидсодержащей оболочкой. Геном его (рис. 4-8) представлен одноцепочечной РНК, содержащей около 9500 нуклеотидов, он кодирует синтез вирусного протеина размером до 3033 аминокислот, который затем расщепляется клеточными пептидазами и вирусными протеазами как минимум на девять белков: сердцевинный (нуклеокапсидный) белок (С); оболочечный белок Е1; оболочечный белок, интегрированный с неструктурной зоной (E2/NS1), и неструктурные белки NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B (табл. 4-5). Для генома характерна уникальная рамка считывания, короткие 5'- и 3'-концевые нетранслируемые области и участки с высокой частотой мутаций. Было выделено шесть генотипов вируса и более 100 подтипов HCV. Особенности организации генома HCV позволили включить его в семейство Flaviviridae, род Hepacivirus.

HCV обладает широким клеточным тропизмом. Он может реплицироваться в гепатоцитах, периферических и асцитных мононуклеарных клетках, лимфо- и моноцитах, дендритных клетках, гематопоэтических клетках-предшественниках, микроглие, кардиомиоцитах, кишечном эпителии, остеобластах, В-клеточных фолликулах лимфатических узлов.

В европейской части России преобладают 1b и 3а генотипы HCV. С генотипом 1b большинство исследователей связывают случаи заболеваний с высоким уровнем виремии и низким ответом на интерферонотерапию.

Несмотря на существующую общность патогенеза с вирусным гепатитом B, существуют и значительные различия:

Важным открытием современного этапа явилось установление возможности внепеченочной репликации вирусов гепатита в клетках костного мозга и крови, лимфатических узлах и селезенке. Особое внимание привлекли к себе доказательства репликации HCV и HBV в моноцитах и макрофагах, то есть клетках, не контролируемых иммуноцитами. В этом состоит еще один существенный механизм «ускользания» HCV и HBV от иммунного надзора.

HCV - оболочечный вирус. Вирусная РНК связана с белком капсулы вируса, окруженной конвертом липида, сформированным двумя вирусными гликопротеинами Е1 и E2. HCV в диаметре составляет приблизительно 30-60 нм. Механизм попадания HCV в клетки изучен недостаточно. Описано прикрепление HCV E2 белка ко второй внеклеточной петле мембранного белка CD81. Эта петля имеет различные гетерогенные последовательности у разных видов животных, но одинаковые у людей и шимпанзе. Это может служить некоторым объяснением тропности вируса для людей и шимпанзе. CD81 экспрессируют практически все ядросодержащие клетки, но это не объясняет гепатотропизм HCV. Даже если взаимодействие E2 и CD81 не приводит к внедрению HCV в гепатоциты, видимо, взаимодействие E2-CD81 является важным для регулирования реакций врожденного иммунитета. В частности, это взаимодействие приводит к инактивации NK-клеток. Другой описанный механизм внедрения HCV в гепатоцит связан с эндоцитозом комплексов HCV с ЛПНП через рецептор LDL.

Функции p7 белка изучены не в полной мере. Интересно, что вирус HCV, как частица (HCV-VLP), генерировал более выраженную клеточную иммунную реакцию с большим количеством лимфоцитов Th1 у мышей BALB/c, иммунизированных HCV-VLP, чем частицы без p7. Таким образом, возможна потенциальная роль этого короткого белка для регулирования HCV-определенных клеточных иммунных реакций.

Гидрофобный белок NS2 вместе с частью N-терминала NS3 формирует протеазу для разрезания соединения NS2/NS3 с образованием белка NS3, обладающего полифункциональными свойствами. Белок NS3 (67 кДа, 632 ам.о.) является многофункциональным: N-концевой домен - сериновая протеаза, которая обеспечивает процессинг NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/NS5B; С-концевой домен - РНК-хеликаза с нуклеозидтрифосфатазной/РНК-хеликазной активностью, способная расплетать как РНК, так и ДНК. Для каталитической активности сериновой протеазы необходимы гистидин в положении 1083, аспарагин - в 1107 и серин - в 1165. Активация РНК-хеликазной активности происходит после прямого взаимодействия протеазного домена белка NS3 с вирусной RdRp. Хотя N-концевой домен белка NS3 обладает самостоятельной каталитической активностью, для эффективного протеолитического процессинга требуется небольшой белок NS4A (8 кДа, 53 ам.о.), выступающий в роли кофактора. Комплекс NS3-NS4A способен ингибировать RIG-I (retinoic acid inducible gene) и TLR3 (Toll-like receptor 3, толл-подобный рецептор 3) - сигнальные пути активации интерферонов IFNα и IFNβ посредством расщепления двух клеточных белков, MAVS (mitochondrial antiviral signaling protein) и TRI F (Toll/interleukin-1 receptor domain containing adaptor inducing IFNβ), а также влиять на ряд других клеточных функций. В связи с этим NS3 представляет собой одну из наиболее привлекательных мишеней для антивирусной терапии. Сериновая протеаза расщепляет несколько соединений, сформированных комплексом NS3 и NS4A. Белок NS5A был вовлечен в модуляцию интерферонзависимого противовирусного ответа хозяина. Мутации в регионе обозначили чувствительную к интерферону область - ISDR, коррелирующую с ответом на интерфероновую терапию. Взаимодействие NS5A с индуцированной интерфероном клеточной киназой (PKR) может в какой-то степени объяснить механизм проникновения вируса в клетку. Все структурные и неструктурные белки HCV могут быть целями гуморальных и клеточных механизмов иммунного ответа.

HCV - нецитопатический вирус, поэтому реакции иммунной системы играют важную роль не только в контроле инфекции, но и в патогенезе заболеваний печени. Таким образом, пациенты с острой инфекцией HCV имеют более высокий шанс выздороветь по сравнению с пациентами, у которых заболевание протекает бессимптомно, поскольку выраженные клеточные иммунные реакции связаны с вирусным разрешением, а тяжелые формы гепатита имеют высокий шанс перейти в цирроз печени или гепатоцеллюлярную карциному. Гистологическая картина болезни характеризуется качественным и количественным составом клеточного инфильтрата печени. Как правило, инфильтрат образован Т- и NK/NKT-клетками, обеспечивающими развитие иммунной реакции на вирус. В целом иммунная реакция против HCV сложна, и в ней участвуют различные типы клеток и тканей.

Врожденные иммунные реакции - защитные механизмы первой линии, образующие сложную сеть из естественных антител, гранулоцитов, моноцитов, NK- и NKT-клеток, γ- и δТ-лимфоцитов и дендритных клеток. Специфические тканевые макрофаги встречаются в различных органах и тканях, в печени - это клетки Купфера. Клетки врожденного иммунитета NK-клетки и NKT-лимфоциты выявляются гораздо чаще в печени, чем в периферической крови, поэтому очень важна их роль в иммунопатогенезе вирусного гепатита.

Противовирусный иммунный ответ индуцируется при непосредственном попадании вируса в клетку. Наиболее ранняя особенность развития механизмов врожденного противовирусного иммунитета - индукция синтеза интерферонов типа I (IFN). Синтез IFNα/β сопровождается широким диапазоном эффектов со стороны инфицированных клеток и иммуноцитов. С одной стороны, синтез белка инфицированными клетками может быть блокирован индукцией рецептора протеинкиназы (который взаимодействует также с NS5A белком HCV). С другой стороны, увеличивается экспрессия молекул MHC-клетками, представляющими антиген, и целевыми клетками. Развитие противовирусного ответа, инициированного РНК-азой и активацией NK-клетками, CD8⁺ T-клетками и дендритными клетками, блокируется активацией белка Mx или 2,5-олигоаденилатсинтетазы (2,5'-олигоаденилатсинтетаза OAS индуцируется и осуществляет ингибирование белкового синтеза в зараженных вирусом клетках). Апоптозу инфицированных клеток способствует IFNs, который сопровождается усиленной экспрессией молекул, участвующих в индукции апоптоза (например, FasL, TRAIL). Установлена роль интерферонов типа I, усиливающих цитостатические эффекты дендритных клеток, которые сопровождаются индукцией TRAIL [TRAIL - апоптозиндуцирующий лиганд семейства TNF (TNF-related apoptosis inducing ligand)]. Было продемонстрировано, что секреция интерферонов типа I в печени сопровождается снижением репликации вируса, а этому предшествовало проникновение в печень Т-лимфоцитов. Таким образом, для разрешения как инфекций HBV, так и особенно HCV чрезвычайно важны реакции врожденного иммунитета. Анализ экспрессии генов в биоптатах печени шимпанзе показал раннее увеличение экспрессии генов, связанных с IFN-ответом, которое предшествовало экспрессии поверхностных маркеров активации Т-лимфоцитов за несколько недель. В 1997 г. было установлено, что снижению хронической инфекции HCV способствуют NK-клетки. Последующие исследования показали, что хронизации инфекции и снижению активности NK-клеток способствует взаимодействие Е2 белка HCV и CD81, которое сопровождается секрецией цитокинов, снижающих цитотоксичность клеток, пролиферацию Т-лимфоцитов, но не изменяющих их функцию. Интересно, что этот эффект был также сопряжен с отрицательными сигнальными путями, связанными с NK-клетками, блокирующими рецепторы для MHC I класса.

Таким образом, HCV~E2-установленная супрессия NK-клеток представляет чрезвычайно важную стратегию уклонения вируса от иммунной реакции хозяина и способствует развитию хронической инфекции. Напротив, другой тип клеток врожденного иммунитета - γδТ-лимфоциты - активируется соединением E2-CD81. Печень пациентов с вирусным гепатитом содержит увеличенное количество T-лимфоцитов, экспрессирующих γ-, δ-клеточные рецепторы. Эти клетки являются цитостатическими и секретируют TNFα и IL-8, но не обеспечивают развитие специфических иммунных реакций против белков HCV или клеток-мишеней, инфицированных HCV. Однако кросс-активация HCV E2-CD81 способствует тому, что эти клетки существенно снижают секрецию TNFα и IL-8 и таким образом могут способствовать HCV-опосредованной болезни печени.

Гуморальный иммунный ответ

Антитела анти-HCV обычно появляются между вторым и восьмым месяцами острой инфекции HCV. Это достаточно поздно по сравнению с другими вирусными инфекциями. Сопоставление развития гуморальных реакций при HBV и HCV не позволяет выделить стадии заболевания при HCV. Антитела против антигенных детерминант ко всем белкам HCV обнаруживаются в период острой инфекции, а также при хронической инфекции и в периоде реконвалесценции после HCV. Именно поэтому не существует какого-то определенного маркера антител, тесно связанного с определенным уровнем гуморального ответа.

Антитела против антигенных детерминант в гипервариабельной области белка E2 (HVR-1) с потенциальными возможностями нейтрализации их вирулентности были обнаружены несколькими исследователями, однако их вклад в вирусное разрешение или развитие болезни не доказан. Ранний синтез антител против терминальных концов NH2 HVR-1 был связан с ограничением распространения инфекции. Поскольку в этом регионе имеет место высокая изменчивость вируса, именно поэтому гуморальная защита при HCV-инфекции неэффективна, и виремия продолжается. Это может быть связано с гетерогенным гуморальным иммунным ответом против HVR-1, который способствует хронизации иммуновоспалительного процесса. Кроме того, было продемонстрировано, что HCV может быть элиминирован даже при отсутствии гуморального ответа к поверхностным белкам вируса.

Вероятно, при HCV отсутствует длительная эффективная гуморальная защита. Напротив, уровень специфических антител HCV действительно снижается даже после острой инфекции HCV до необнаруживаемых значений.

Адаптивный клеточный иммунный ответ

Развитие клеточных иммунных реакций связано с дендритными клетками, которые представляют антигены CD4⁺ и CD8⁺ T-лимфоцитам. Дендритные клетки широко представлены и в лимфатических, и в нелимфатических тканях. Они захватывают антиген на месте проникновения инфекта, подвергаются процессам созревания и мигрируют к дренажному лимфатическому узлу, где индуцируют процессы клеточной иммунной реакции. Лимфоциты после межклеточного контакта попадают в кровоток, а затем мигрируют в печень. Сила развития иммунной реакции в значительной степени зависит от стимулирующей функции дендритных клеток, природы антигена, экспрессии MHC и ко-стимулирующих молекул. Установлено, что HCV способен размножаться в дендритных клетках. Кроме того, выявлено, что аллостимулирующие эффекты секреции IL-12 дендритными клетками ослаблены у лиц с хроническим гепатитом С, несмотря на то что дендритные клетки имели нормальную морфологию, фенотип и сохранили способность захватывать антиген. Однако исследование одной только функции дендритных клеток абсолютно недостаточно для комплексной оценки клеточных иммунных реакций при HCV. Первоочередная задача исследований - изучить функции изолированных дендритных клеток и их способность вызывать специфические иммунные клеточные реакции на определенные вирусные белки и последующие ответы со стороны Т-лимфоцитов. Кроме того, дендритные клетки периферической крови могут и не участвовать в процессах захвата антигена и в дальнейшем презентировать его в печени. Печеночные дендритные клетки отличаются от периферийных дендритных клеток. Так, у пациентов с хроническим гепатитом С зрелые дендритные клетки экспрессируют CD83. Таким образом, функции дендритных клеток (секреция цитокинов, цитотоксичность) могут играть чрезвычайно важную роль при вирусном гепатите в понимании иммунопатогенеза HCV и, возможно, будут использованы в клеточной иммунотерапии.

HCV-специфичный CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточный иммунный ответ при острой и хронической вирусной инфекции

Специфические для HCV CD8⁺ T-лимфоциты являются главными эффекторными клетками. Эти клетки обладают цитостатическими функциями, способны разрушать инфицированные клетки, вызывая апоптоз посредством секреции белков перфоринов, гранзимов, и секретировать провоспалительные цитокины, такие как TNFα и IFNγ. Специфические CD4⁺ T-клетки также играют чрезвычайно важную роль в эффективном регулировании клеточных иммунных реакций. Секрецией определенных цитокинов они могут поддерживать цитотоксические эффекты CD8⁺ Т-лимфоцитов, способствовать синтезу высокоспецифичных антител и, кроме этого, обеспечивать развитие прямых противовирусных эффектов. Исследованиями последних лет показано, что для эффективного разрешения острой HCV-инфекции необходима ассоциативная функциональная активность CD4⁺ и CD8⁺ T-лимфоцитов. CD4⁺ -активный ответ сохраняется в течение нескольких лет после перенесенной острой инфекции. CD8⁺ -ответ тоже сохраняется после перенесенной инфекции, однако данные о его продолжительности противоречивы.

Нецитолитическое ингибирование вирусной репликации соответствующими цитокинами (IFNα и IFNγ) является главным механизмом при вирусной репликации HCV. Такой же ответ сохраняется и при HCV. В экспериментальных исследованиях установлено, что виремия является достаточно постоянным признаком и детектируется уже через 1-2 нед после заражения по сравнению с HBV. Кроме того, развитие HCV-инфекции сопровождалось появлением большого количества активированных CD8⁺ T-клеток, которые сохраняли активную функцию по продуцированию IFNγ в течение 4-6 нед. Однако вирусная нагрузка HCV в это время значительно не уменьшалась, подтверждая вывод о том, что этого недостаточно для разрушения инфицированных гепатоцитов, чтобы эффективно развивать противовирусный иммунный ответ. Снижение активности CD8⁺ T-клеток регистрировали, когда они теряли маркер активации CD38. В то же самое время содержание HCV-РНК в сыворотке быстро уменьшалось, и развивался сильный HCV-специфический CD4⁺ -ответ, который, видимо, способствовал созреванию CD8⁺ -лимфоцитов.

Напротив, у пациентов с хронической инфекцией продукция IFNγ CD8⁺ T-лимфоцитами была низкая, а CD4⁺ -ответ был намного более слабым. Эти данные позволяют считать, что нецитолитические механизмы важны для развития иммунного ответа при HCV-инфекции. Различные субпопуляции T-лимфоцитов определяют особенности патогенеза HCV-инфекции. Вообще, разрешение HCV-инфекции связано с ранним IFNγ-ответом со стороны CD8⁺ Т-лимфоцитов. Снижение функциональной активности CD8⁺ Т-лимфоцитов способствует хронизации инфекции.

Активированные CD8⁺ положительные Т-клетки могут выявляться в печени пациентов с хронической HCV-инфекцией до 30 раз чаще, чем в периферической крови, и потенциально способствовать заболеваниям печени. Снижение функциональной активности CTL является чрезвычайно важным на этой стадии заболевания. Ведущая роль в этих процессах принадлежит регуляторным Т-лимфоцитам.

В целом иммунитет при гепатите С характеризуется как «субоптимальный», не обеспечивающий контроль инфекционного процесса. Перенесенная HCV-инфекция не индуцирует прочной иммунной защиты. Об этом свидетельствует высокая частота хронизации гепатита С, достигающая 80%. Допускается возможность повторного заражения не только другими генотипами HCV, но и гомологичными штаммами.

Согласно исследованиям последних лет, «ускользание» HCV из-под иммунного пресса реализуется прежде всего путем непрерывного обновления его антигенной структуры. Перманентная мультивариантная изменчивость HCV намного превышает функциональные возможности Т- и В-клеток распознавать непрерывно обновляющиеся структуры его антигенов. Избирательная гипервариабельность с наибольшей скоростью мутации присуща генотипам 1а и 1b, что определяет особые трудности лечения таких больных интерферонами.

Диагностика HCV также сводится к выявлению серологических маркеров этой инфекции методом ИФА или ПЦР. Динамика выявления серологических маркеров HCV отражена в табл. 4-6.

Примечание. «-» - маркер не обнаруживается; «+» - маркер обнаруживается; «+/-» - маркер может встречаться/может не выявляться.

Таким образом, приведенная таблица отражает, что появление различных серологических маркеров HCV, дающих основание заподозрить или подтвердить наличие инфекции, по срокам весьма растянуто во времени и зависит от состояния иммунной системы обследуемого.

Иммунопатогенез вирусного гепатита С

Гепатоциты являются основным местом размножения HCV. Считается, что HCV также может размножаться в мононуклеарных клетках периферической крови, определяя многочисленные иммунологические нарушения, регистрируемые более чем у половины больных хроническим гепатитом С. Исследование, проведенное с целью определения РНК HCV в отдельных фракциях лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺), показало, что частота инфицирования Т-лимфоцитов очень высока (82%). А инфицирование В-клеток происходило гораздо реже (33%). В CD4⁺ - и СD8⁺ -лимфоцитах РНК HCV обнаруживали с одинаковой частотой, однако средние титры антигена HCV были выше в СD8⁺ Т-лимфоцитах.

Ключевым звеном иммунопатогенеза гепатита С является высокая генетическая вариабельность РНК HCV. При сравнительном анализе гомологии РНК HCV различных генотипов было установлено наличие более 100 субтипов (уровень гомологии между различными субтипами внутри генотипа составляет 72-86%). Кроме того, различия в последовательностях в 1-14% определяют существование множественных вариантов (или квазивидов) вируса. В организме инфицированного HCV человека одновременно могут находиться многие миллионы различных квазивидов HCV. Их существование объясняют «ускользанием» вируса из-под иммунологического контроля организма, что определяет появление беспрерывно меняющихся антигенных структур вируса.

При генотипировании HCV, проведенном в различных регионах мира, установлено, что наибольшее распространение имеют генотипы la, lb, 2a, 2b и 3а. Они доминируют в Европе, Северной Америке, Азии и Океании. У HCV-инфицированных пациентов более эффективный ответ ассоциирован с генотипами 2 и 3, в отличие от генотипа 1. Развитие хронической HCV-инфекции после острого периода наблюдалось у 91% пациентов с генотипом lb, при других генотипах - в 33-50% случаев. В России, как и в Европе, доминирует субтип lb. Имеются данные, что особенно высокая скорость мутаций присуща именно субтипу HCV lb.

Жизненный цикл вирусов гепатита определяется характером иммунного ответа макроорганизма. По современным представлениям, именно сложный комплекс взаимодействия вируса с клетками иммунной системы обусловливает хронизацию и неблагоприятный исход инфекции. Течение острого и хронического гепатита характеризуется изменением в балансе как провоспалительных цитокинов, так и цитокинов, регулирующих клеточные и гуморальные реакции иммунитета. Согласно современным представлениям, поляризация иммунного ответа с превалированием медиаторов Th1-пути либо Тh2-пути (рис. 4-9) играет ключевую роль в иммунопатогенезе вирусных гепатитов.

Установлено, что при остром саморазрешающемся вирусном гепатите, вызванном HBV и HCV, развивается мощный поликлональный CD4⁺ - и СD8⁺ -клеточный ответ, тогда как при хронической вирусной инфекции Т-клеточный ответ существенно более слабый и направлен против меньшего числа эпитопов. При этом если при острой инфекции преобладает активность Th1, стимулирующая цитотоксические лимфоциты, то при xpонизации инфекционного процесса иммунный баланс смещается в сторону Th2, что сопровождается усилением продукции IL-4 и IL-10 (см. рис. 4-9). При острой саморазрешающейся HCV-инфекции в сыворотке крови и ткани печени определяются высокие концентрации TNFα, IFNγ, IL-2, IL-12.

Согласно современным данным, избыток противовоспалительных цитокинов может приводить к снижению противоинфекционной защиты и выступать в качестве основного фактора хронизации инфекции. Процессам хронизации также способствует возникающая дизрегуляция в повышенной продукции мононуклеарными и эндотелиальными клетками «провоспалительных» цитокинов при недостаточной продукции цитокинов, регулирующих активность иммунной системы. Некоторые белки, кодируемые вирусом, обладают антиапоптозной активностью, подавляют функциональную активность проапоптогенного и противоопухолевого белка р53, инактивируют каспазы, а также усиливают экспрессию ингибитора апоптоза Bcl-2. Выявлено восемь типов рецепторов, через которые инициируются механизмы апоптоза. Основными являются TNF-R1, Fas (CD95). Видимо, апоптотическим механизмам повреждения гепатоцитов с последующей хронизацией воспалительного процесса принадлежит ведущая роль при хроническом гепатите С.

Хроническое течение HCV-инфекции ассоциируется с утратой способности CD4⁺ Т-лимфоцитов, NK-клеток как к пролиферации, так и к секреции IFNγ. Таким образом, функциональное изменение HCV-специфических CD4⁺ Т-клеток, характеризующееся снижением возможности развития устойчивого продолжительного Т-хелперного ответа, может приводить к хронической персистенции HCV. Хронизации способствуют процессы апоптоза специфичных вирусу Т-лимфоцитов, что индуцирует анергию Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов по отношению к вирусу.

Эффективность гуморального иммунитета при HCV-инфекции невысока и обусловлена следующими факторами: резистентностью вирусных изотипов к нейтрализации антителами, несоответствием спектра антител антигенам HCV, низкой иммуногенностью протеинов HCV, низкими титрами антител. Антитела могут быть направлены против любого вирусного антигена, синтезируемого в инфицированной клетке, однако сдерживание инфекции обеспечивают только те антитела, которые специфичны к гликопротеинам, экспрессированным на оболочке вирусов или мембране инфицированных клеток. Многие авторы высокие титры анти-NS3-антител в течение всей острой фазы гепатита С рассматривают как маркер хронизации.

Таким образом, из лабораторных критериев, характеризующих эффекторные механизмы кинетики иммунного ответа при HCV-инфекции и отражающих возможный процесс хронизации, необходимо выделить следующие:

Кроме того, перспективным признаком патогенетического дефекта иммунной системы и хронизации HCV-инфекции является степень угнетения активационной и адгезивной способности иммунных клеток. Так, чрезмерная экспрессия CD95 на иммунокомпетентных клетках указывает на развитие иммунного ответа по пути апоптоза, что может играть важную роль в формировании вирусо-специфической анергии иммунной системы и неэффективности противовирусного ответа при HCV.

Среди других причин, способствующих персистенции и хронизации инфекции, необходимо выделить следующие:

Следовательно, при HCV-инфекции имеет место избирательное нарушение противовирусной активности макрофагов.

Лабораторная диагностика вирусного гепатита С

Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых антител к вирусным антигенам с помощью ИФА и иммуноблота, а также обнаружение РНК HCV с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT). Первичные лабораторные исследования основаны на выявлении суммарных антител к антигенам HCV (анти-HCV), определении антител к высокоспецифичным антигенам HCV: структурному (core) и неструктурным (NS3, NS4, NS5).

Позитивные в скрининге образцы сыворотки подлежат обязательному дополнительному исследованию с помощью подтверждающих тестов, так как при скрининге возможно получение ложноположительных результатов, обусловленных неспецифическими межбелковыми взаимодействиями. Повышенный уровень таких результатов отмечен у лиц с онкологическими, аутоиммунными заболеваниями, иммуно-дефицитными состояниями, у больных сифилисом, беременных. Дополнительными подтверждающими тестами являются варианты ИФА, определяющие антитела к белкам, кодированным различными зонами вирусной РНК, выявление РНК HCV методами NAT-тестирования. NAT-тесты за счет высокой чувствительности позволяют выявить раннюю стадию HCV-инфекции, когда еще специфические антитела не определяются.

В последнее время появился новый класс препаратов для серодиагностики инфекционных заболеваний - иммуночипы, принцип работы которых основан на непрямом методе выявления антител к спектру антигенов с помощью флюоресцентной детекции. Эффективность иммуночипов была продемонстрирована на стандартных коммерческих панелях проб, содержащих и не содержащих анти-HCV, а также при исследовании образцов сыворотки крови, положительных по анти-HCV в иммуноферментных тест-системах планшетного формата с раздельным выявлением антител к структурному нуклеокапсидному антигену (анти-cоrе) и комплексу неструктурных антигенов (анти-NS) HCV с разной оптической плотностью. Они позволяют успешно проводить верификацию результатов тестирования на наличие анти-HCV класса G образцов с низким содержанием антител, в частности к core-белку.

Острый гепатит С, как правило, остается клинически нераспознанным, так как патологический процесс обычно протекает латентно (субклинические, инаппарантные формы). Он может быть диагностирован лишь по повышению активности АЛТ, положительным результатам исследований на РНК HCV, несколько реже - анти-HCV IgM, IgG, при отсутствии антител к неструктурному белку NS4, которые обычно появляются значительно позже, когда патологический процесс переходит в хроническую форму.

О репликации HCV свидетельствуют выявление РНК HCV в ПЦР, а также анти-HCV IgM и, косвенно, весь спектр структурных и неструктурных антител, выявляемых методом иммуноблоттинга. Латентный ХГС характеризуется наличием периодического повышения активности АЛТ. В крови обнаруживаются РНК HCV, анти-HCV IgG (включая анти-NS4), однако анти-HCV IgM, как правило, отсутствуют.

Обострения всегда знаменуются пиком повышения активности АЛТ. Во время ремиссии активность АЛТ снижается, однако нормального уровня может не достигать. В крови закономерно наблюдается диспротеинемия, выявляется вирусемия. Как правило, во время обострения в крови регистрируются анти-HCV IgM.

У пациентов с отсутствием клинической симптоматики (латентные формы вирусных гепатитов) при наличии фиброза независимо от активности воспаления, выявления маркеров активной вирусной репликации (РНК HCV), присутствия анти-HCV IgM или отсутствия анти-HCV NS4 устанавливается диагноз хронического гепатита С.

Основной целью серологической диагностики вирусного гепатита С является как можно более раннее выявление серологических маркеров - антител и антигенов HCV. Маркерами острой HCV-инфекции считаются анти-HCV-антитела класса IgM, которые, однако, у ряда больных могут отсутствовать при наличии острой инфекции. В то же время рядом научных исследований показано, что анти-HCV-антитела класса IgM могут появляться после анти-HCV-антител класса IgG, что затрудняет дифференциальную диагностику острой и хронической HCV-инфекции, проводимую на основе выявления только серологических маркеров. Наличие анти-HCV-антител класса IgG также не позволяет дифференцировать активность и завершенность инфекционного процесса, так как данные антитела выявляются как при текущей, так и при перенесенной инфекции.

РНК HCV удается обнаружить уже на седьмой день после инфицирования HCV, а антитела к вирусу (анти-HCV) примерно с 20- 50-го дня заболевания. Спектр выявляемых антител связан с периодом заболевания. Так, одними из первых удается определить антитела, кодированные core-, E- или NS3-зонами РНК HCV. Другие антитела, в частности анти-NS4 и анти-NS5, выявляются на более поздних этапах сероконверсии.

Выявление IgM-антител к HCV не имеет решающего диагностического значения, как, например, в случае с выявлением специфических антител класса IgM к вирусу гепатита А. Результаты тестирования крови больных острым и хроническим вирусным гепатитом С на наличие анти-HCV IgM свидетельствуют о частом их выявлении среди больных обеих групп (50-93 и 50-70% соответственно). Следовательно, обнаруженные анти-HCV IgM антитела не могут служить маркером острой HCV-инфекции.

В то же время отрицательный качественный анализ молекулярно-генетических исследований на РНК HCV еще не является гарантией отсутствия вируса гепатита С в организме человека, так как может быть элиминация вируса, возникшая в результате проводимой терапии. Кроме того, следует учитывать тот факт, что анти-HCV-антитела могут находиться в циркулирующей крови пациентов, перенесших острую инфекцию, вызванную вирусом гепатита С, и выздоровевших (примерно 10-15%).

С целью верификации данных скрининговых исследований на антитела к HCV разработаны подтверждающие тесты. В основу создания таких тестов положен принцип повышения специфичности, реализуемый за счет использования в тест-системах сочетания синтетических и рекомбинантных антигенов. Наиболее часто для сорбции на полистироловые планшеты в качестве антигена используются белки HCV, кодируемые структурной (core) и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями генома HCV. С целью их раздельного выявления иммобилизация данных антигенов на поверхности планшетов проводится раздельно. Основным свойством таких тестов является способность выявлять в сыворотке (плазме) крови антитела (как IgG, так и IgM классов) к различным антигенам HCV за счет их комплементарного взаимодействия с антигенами, иммобилизованными на поверхности лунок. Образованные комплексы антиген-антитело выявляют с помощью иммуноферментного конъюгата. Остальные этапы исследования образованного комплекса (окрашивание, остановка, промывки, спектрофотометрическая регистрация) проходят, как в любом другом виде ИФА. Параллельно обязательно проводится контрольное исследование (тест с контрольными образцами сыворотки крови из тест-системы, заведомо содержащими антитела к структурным и неструктурным антигенам HCV). По результатам проведенного ИФА для каждого антигена по формулам производителя тестов рассчитывается свое значение критической оптической плотности. Затем результат, полученный для анализируемого образца, сравнивают с контролем, и если коэффициент оптической плотности образец/контроль окажется ниже единицы, то результат подтверждающих исследований расценивается как отрицательный, то есть образец не содержит антител к структурным или неструктурным антигенам HCV. Если коэффициент оптической плотности образец/контроль окажется выше единицы, то результат подтверждающих исследований расценивается как положительный, то есть образец содержит антитела к структурным или неструктурным антигенам HCV.

Молекулярно-биологическая диагностика вирусного гепатита С

Выявление РНК HCV с помощью молекулярно-биологических методов (прежде всего с использованием ПЦР) применяется для ранней диагностики острого вирусного гепатита С. РНК HCV появляется в плазме крови через три дня после заражения, однако может быть выявлена в среднем к 11-му дню болезни. Это позволяет диагностировать острый гепатит С задолго до сероконверсии, что особенно важно для ранней диагностики заболевания.

Материалом для исследования служит периферическая кровь, взятая из вены и помещенная в вакуумные пробирки, содержащие консервант - этилендиаминтетрауксусную кислоту (фиолетового цвета). Из пробы крови получают плазму центрифугированием 800-1600 г (3000 об./мин) в течение 20 мин при комнатной температуре.

Использование молекулярно-биологических методов диагностики (методики на основе ПЦР) позволяет:

В настоящее время уровень РНК HCV в плазме крови (вирусная нагрузка) измеряется в международных единицах на миллилитр (МЕ/мл). В современных исследованиях границей между высоким и низким уровнем вирусной нагрузки считается 800 000 МЕ/мл. И хотя большинством исследований было показано, что степень поражения печени при HCV напрямую не зависит от уровня вирусной нагрузки, пациенты с высокой вирусной нагрузкой, определенной до лечения, хуже отвечают на противовирусную терапию препаратами интерферона, требуют более длительного лечения.

Эпидемиологические и лабораторные особенности латентных форм вирусных гепатитов В и С

В настоящее время регистрируется чрезвычайно высокая интенсивность эпидемического процесса HCV в сочетании с резким преобладанием скрытых форм инфекции.

Многолетние наблюдения свидетельствуют о неблагоприятной тенденции роста латентно протекающих форм HCV. Среднемноголетний ежегодный темп увеличения случаев HCV составил 15,7%. Самая высокая заболеваемость латентно протекающими формами вирусных гепатитов среди подростков была характерна для воспитанников детских домов и в неполных семьях. Заражение HCV наблюдается преимущественно в возрастных группах 15-19 и 20-29 лет и характеризуется современной особенностью эпидемического процесса - бессимптомным течением с хронизацией патологического процесса примерно у 70% инфицированных. Некоторые исследователи объясняют снижение количества манифестных форм гемоконтактных вирусных гепатитов и увеличение латентно протекающих вирусных гепатитов появлением менее вирулентных, так называемых резервационных штаммов, а также увеличением количества лиц, характеризующихся слабым иммунным ответом, и «носителей» маркеров вирусных гепатитов.

Как правило, латентное течение HCV сопровождается слабым фиброзом, что в большинстве случаев соответствует первой стадии заболевания. Диагноз подтверждается лабораторным выявлением маркеров HCV. ПЦР свидетельствует о низкой вирусной нагрузке, хотя в отдельных случаях уровень виремии у обследуемых может быть высоким.

Течение инфекционного процесса большинства случаев сопровождается и отсутствием внепеченочных проявлений. Уровень общего билирубина находится в пределах нормы.

Поэтому для подтверждения диагноза у таких лиц большое значение имеет выявление лабораторных маркеров вирусных гепатитов, а также проведение неспецифических исследований, направленных на подтверждение латентно протекающего воспалительного процесса.

Оценка лейкоцитарной формулы у лиц с латентно протекающими вирусными гепатитами может выявить незначительный лимфоцитоз, эозинофилию, снижение количества тромбоцитов и нейтрофилов, что свидетельствует о включении механизмов адаптивного иммунного ответа.

Данные биохимического исследования крови (активность АЛТ, АСТ, ЩФ, белковый спектр и др.) могут выявить наличие умеренно выраженного цитолитического синдрома и диспротеинемии.

О том, что у лиц с латентно протекающими формами вирусных гепатитов задействованы механизмы адаптивного иммунного ответа, свидетельствует изменение субпопуляционного состава Т-, В-лимфоцитов и NK-клеток. Так, в периферической крови отмечается увеличение количества В-лимфоцитов, экспрессирующих СD95-антиген (CD19+CD95+), уменьшение количества NK-клеток, CD8+-лимфоцитов. Количество Т-клеток субпопуляции (CD3+CD95+), экспрессирующих рецептор CD95 (Fas-антиген), опосредующий апоптоз, превышало нормальные значения в большинстве случаев. Однако это касается лиц, у которых выявлена активность патологического процесса. В большинстве случаев на начальных стадиях патологического процесса выявить динамику субпопуляционного состава лимфоцитов, а тем более их отклонение от нормы, представляется проблематичным.

При оценке гуморальных факторов В-клеточного звена иммунной системы у лиц с латентно протекающими вирусными гепатитами выявляется, как правило, превышение нормальных значений фракции γ-глобулинов. Концентрация IgM, IgG и IgA имеет тенденцию к увеличению по сравнению с показателями здоровых лиц, но в 90-95% случаев они не выходят за пределы максимальных и минимальных показателей. Не выходят обычно за пределы максимальных и минимальных значений и IgG-подклассы (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) и IgE. Наиболее часто в патогенезе различных заболеваний принимают участие средне-и низкомолекулярные ЦИК. При изучении данного вида патологии выявлено увеличение этих молекул не менее чем в 50% случаев.

При изучении спектра цитокинов установлено, что наиболее значимыми были IL-4, IL-10, IL-6, IL-3 и TNFα. При изучении цитокинового статуса у обследуемых с данной формой вирусных гепатитов не выявлено существенных отличий в содержании IFNγ, IFNα.

При оценке состояния фагоцитарной системы, как правило, отмечается увеличение поглотительной способности нейтрофилов в результате активации кислородзависимых и кислороднезависимых систем бактерицидности нейтрофильных лейкоцитов, сопровождающееся в то же время снижением их переваривающей способности.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ D

Вирусный гепатит D (дельта) вызывается вирусом (HDV) диаметром 36 нм, имеющим оболочку, которая образована HBs-антигеном HBV. Он не способен вызывать инфекционный процесс самостоятельно, так как, будучи дефектным, для своего жизненного цикла in vivo требует наличия вируса-помощника (вируса гепатита В). По своим функциональным характеристикам он схож с вироидами (вирусоподобными патогенами) растений; сам по себе он не образует полноценных вирионов и использует HBsAg для формирования своей оболочки. Зрелые частицы HDV могут образоваться только с помощью HBsAg.

Вирус содержит кольцевидную РНК, состоящую примерно из 1700 нуклеотидов. Геном HDV кодирует синтез белка, состоящего из двух компонентов (малого - 155 аминокислот и большого - 214 аминокислот). Описаны три генотипа HDV и несколько субтипов с различиями аминокислотного состава их белков примерно на 30%. Вирусы генотипа 1 встречаются наиболее часто. Предполагают, что 1а субтип вызывает более легкие, а 1b - более тяжелые случаи заболевания.

Источником инфекции являются больные острыми и хроническими формами инфекции, протекающей как в манифестной, так и в субклинических формах. Механизм и пути передачи такие же, как при HBV.

Маркеры инфекции