Патологические рубцы. Этиология, профилактика и лечение

Гистологическому исследованию патологических рубцов постоянно уделяется большое внимание. С развитием технического оснащения гистологов постепенно уточняются особенности формирования патологического рубца. На сегодняшний день дана исчерпывающая информация об изменениях в коже в процессе рубцевания не только в норме, но и при патологии.

Основополагающим трудом по электронно-микроскопическому изучению рубцов в нашей стране стала работа «Келоидные рубцы» (Болохвитинова Л.А., Павлова М.Н., 1977). В ней подробно изложена характеристика клеточных структур патологических рубцов, выявлены «очаги роста» растущего келоидного рубца, образованные глубокими, более зрелыми тканями. В зонах роста определяются крупные и гигантские фибробласты. Условно были выделены 4 группы фибробластов по продуктивности полисом эндоплазматического ретикулума.

Данные изменения фибробластов наблюдают в процессе роста келоида, отмечая отличительное свойство данного рубца — наличие гигантских фибробластов. Таким образом, описан механизм формирования келоидной ткани, знание которого необходимо использовать для уточнения воздействия на рубец. Также отмечено наличие полибластов — клеток, выявляемых при разрушении стенки капилляра и перерождающихся в гигантские фибробласты, синтезирующие коллагеновый белок.

В келоидном рубце обнаружено увеличение количества гиалуроновой кислоты (ГК), что ведет к набуханию коллагеновых волокон и является признаком незрелой соединительной ткани. Отсутствие плазматических клеток в рубце расценивают как нарушение иммунологической реакции организма. Наблюдают в 2–3 раза меньшее количество капилляров, чем в обычных рубцах. Крупные перициты плотно прилегают к базальной мембране капилляров. Эндотелиальные клетки в разрушающихся капиллярах идентичны полибластам.

В старых келоидных рубцах васкуляризация постепенно нормализуется, но даже через 10 лет в келоиде сохраняются участки молодой соединительной ткани. В гипертрофических рубцах отсутствуют зоны незрелой соединительной ткани, выявляются эластиновые волокна, отсутствуют гигантские фибробласты.

Приведенные наблюдения позволяют сделать вывод, что появляющиеся из перицитов и полибластов гигантские фибробласты, синтезируя гиалуроновую кислоту и коллаген, являются важной фазой формирования келоидного рубца.

У больных с патологическим рубцом репарация останавливается на пролиферативно-фибротической стадии. А.А. Дельвиг определил, что синтез коллагена в келоидах в 20 раз выше, чем в нормальной коже, и в 8 раз выше, чем в гипертрофических рубцах. Интерстициальная коллагеназа — ключевой фермент, индуцирующий распад коллагена. В патологических рубцах повышен метаболизм коллагена в результате подавления синтеза коллагеназы и других тканевых протеаз сывороточными α-глобулинами и α1-макроглобулинами. Пиридинолиновых сшивок в 2 раза больше в коллагене келоида, чем в гипертрофическом рубце. Устойчивый к коллагеназе «рубцовый» коллаген продуцируют «неправильные» гигантские фибробласты. Однако в последующем представление об их ведущей роли в образовании коллагеновых волокон при созревании грануляционной ткани в рубцовую было отвергнуто.

Таким образом, можно предположить, что именно нарушение иммунологического состояния организма является предрасположением к развитию «келоидной болезни» после повреждения кожных покровов больного.

Ряд авторов проанализировали действие пирогенала на ткань рубца. Положительное действие объясняют разрушением гигантских фибробластов. В последующем было подчеркнуто, что прекращение роста рубцов и их размягчение не всегда ведут к полному устранению контрактуры.

Оригинальная клинико-морфологическая классификация кожных рубцов основывается на соотношении клиники и гистологической картины. Были выделены 4 вида рубцовой ткани, в то же время выявлены характерные сочетания гистологических изменений в процессе формирования различных структур.

Активной зоной роста келоида являются тонкие коллагеновые волокна, вероятно, продуцированные атипичными гигантскими фибробластами. Функция этих фибробластов в отношении продукции эластических волокон также подавлена. В келоидной рубцовой ткани эластических волокон не наблюдают. Пусковым фактором развития келоида является дисплазия соединительной ткани, являющаяся причиной изменения фенотипа фибробластов. Ряд авторов получили подтверждение, что источником диспластических гигантских фибробластов является фиброзно-измененная ткань, так как именно в ней выявлены источники диспластических фибробластов. В частности, можно предположить патогенез первичных келоидов, формирующихся при незначительных повреждениях кожи.

Трансформация дермы или трансплантированных лоскутов зависит от микроциркуляции. При минимальной ишемии дерма метаболически инертна. При увеличении ишемии образуются узлы 2-го типа и формируется гипертрофическая грануляционная ткань. При дисплазии фибробластов в узлах 2-го типа формируется келоидная соединительная ткань. В связи с этим необходима профилактика нарушений микроциркуляции и избыточного напряжения в краях ушиваемой раны.

Клинический тип рубца определяется соотношением фиброзно-измененной ткани и гипертрофически измененной ткани, входящей в рубец. Процесс перехода от гипертрофического к нормотрофическому рубцу является постепенным и наблюдается в течение 4–5 лет. При отсутствии механического натяжения в области рубца грануляционная рубцовая ткань постепенно трансформируется в нормотрофическую. При превращении атрофических рубцов в нормотрофические происходит фиброзирование тканей дермального происхождения, при этом в гипертрофических рубцах наблюдают торможение активности фибробластов.

Таким образом, указанные наблюдения подтверждают мнение, что главным составляющим механизмом патологического рубцевания являются чрезмерное натяжение тканей и ишемия краев при ушивании операционной раны. По-видимому, в результате этого запускается механизм нарушения микрокровотока, при котором в результате повреждения сосудов из перицитов и эпителиоцитов нарушенной сосудистой стенки формируются диспластические фибробласты, формирующие, в свою очередь, коллаген, специфический для рубцовой ткани.

Как хирургами, так и дерматологами отмечено, что особую сложность для профилактики, диагностики и лечения больных представляют келоидные рубцы. Количество пациентов, обратившихся к врачу по поводу келоидных рубцов, продолжает увеличиваться. Из общего числа больных с рубцами до 20% составляют больные с келоидными рубцами. Особенную сложность в клинической диагностике представляет тот факт, что келоидный рубец может начать формироваться не сразу после получения травмы или в раннем послеоперационном периоде. При клиническом осмотре сложно провести дифференциальную диагностику между гипертрофическим и келоидным рубцом. Наибольшей информативностью при этом обладают гистологическое и гистохимическое исследования, включая электронную микроскопию.

Клинические проявления келоида — это боль и зуд в области рубца. При обширном поражении мягких тканей, в особенности после ожоговых поражений, отмечают ограничение подвижности суставов с развитием послеожоговой контрактуры.

Тенденция рассматривать келоидные рубцы как отдельную нозологию — «келоидную болезнь» — не совсем верна. По-видимому, вначале следует лечить больного от основного заболевания, а затем приступать к терапевтическому или хирургическому лечению келоидных проявлений как симптома основного заболевания.

Психоэмоциональные расстройства являются характерной особенностью больных с келоидными рубцами. Высокие эстетические стандарты современного мира к внешнему виду обусловливают формирование у более 80% из них неврозов и депрессий. Коррекция должна быть направлена на снятие психической напряженности, формирование положительных социальных установок по отношению к собственному «я», окружающей среде и факту заболевания, повышение самооценки и стрессовой толерантности, а также на выработку адекватной целевой системы и мотивации.

Таким образом, следует отметить, что «келоидную болезнь» в настоящее время рассматривают как отдельную морфологическую форму, выделенную в группу патологических рубцов. Келоид классифицируют по частоте локализации в так называемых келоидоопасных зонах, на различных участках тела. Келоид может появиться спонтанно, однако чаще всего причиной возникновения рубцов являются травматические повреждения и различные оперативные вмешательства. К неблагоприятным факторам относят чрезмерное натяжение тканей (38,5%), склонность к гипертрофическому рубцеванию (38,2%), а также эндокринные расстройства (6,5%). В отличие от гипертрофических рубцов келоиды начинают формироваться спустя некоторое время после травмы (операции). Случаи возникновения келоида без предшествующей травмы трактуется уже как «келоидная болезнь».

К настоящему времени предложено множество способов лечения при патологических рубцах, что подтверждает отсутствие единой эффективной лечебной технологии. В консервативном терапевтическом лечении основной упор делается на устранение внешних проявлений патологического рубца для достижения эстетических результатов. В случае существенного снижения качества жизни больного основным методом лечения патологических рубцов является хирургическая операция.

Несмотря на технические возможности хирургических методов, лечение рубцов остается актуальной медико-социальной проблемой. При первичном заживлении раны основными факторами, под влиянием которых происходит образование рубцов с неудовлетворительными эстетическими характеристиками, являются: избыточное натяжение линии швов и последующее растяжение формирующегося рубца, направление и форма разреза, а также вид шовного материала и способ наложения швов. При нормотрофических рубцах чаще используют корригирующую операцию, и все же размеры «нового» рубца всегда превышают исходные.

При гипертрофических рубцах чаще применяют сочетание хирургического иссечения с последующим консервативным лечением, однако в практическом плане не уделяется должного внимания вариантам профилактики грубого рубцевания.

Предложено множество методов хирургической коррекции рубцов кожи: иссечение рубца с замещением образовавшегося дефекта посредством различных вариантов местной пластики, пересадка свободных кожных лоскутов, перемещение лоскутов на питающей сосудистой ножке, комбинированные методы пластики. Несмотря на совершенствование методов лечения рубцов кожи, количество рецидивов после консервативного лечения колеблется в пределах 40–70% случаев, в то время как хирургическое иссечение келоидов приводит к рецидивам от 50 до 100% случаев.

Гипертрофический рубец после операций встречается в 40–70%, а после ожоговой травмы — от 33 до 91%. При изолированном иссечении келоидов рецидив отмечается в 50–100% наблюдений. Опасность и вероятность рецидива келоида является причиной предпочтения лечения этого заболевания с помощью терапевтических методик.

Хирургическое лечение послеожоговых рубцовых контрактур крупных суставов конечностей рекомендуют проводить независимо от времени, прошедшего после заживления ожоговых ран. Основным принципом устранения контрактур является компенсация дефицита тканей по длине за счет лоскутов с боковых поверхностей, а оптимальным методом лечения — встречное перемещение местных трапециевидных лоскутов, селективное использование местных лоскутов вместе с пересадкой кожных аутодермотрансплантатов, пластикой лоскутами на ножке или на микрососудистых анастомозах. А.А. Осипов считает, что при оперативном лечении сформировавшихся рубцовых контрактур суставов лучшие результаты оперативного лечения отмечаются при использовании пластики местными тканями: трапециевидными, треугольными лоскутами, эндоэкспандерными дермотензионными лоскутами.

В терапии патологических рубцов используют многочисленные методики. Показателями эффективности консервативного лечения являются приостановление активного роста рубца, предупреждение развития рецидива после предшествующей хирургической коррекции. Для выравнивания поверхности кожи в области рубца используют различные виды дермабразии, фракционный фототермолиз, лазеротерапию в сочетании с силиконом, применяют силиконовые пластыри и накладки для торможения патологического рубцевания.

С помощью инъекций или фонофореза в рубцы вводят триамцинолон, фторурацил, кератин. В некоторых случаях рост келоидного рубца замедляют путем прессотерапии. Для уменьшения рубца применяют коллагеновые препараты, кремы, мази, такие как Ферменкол^♠ , Контрактубекс^♠ , бишофит℘, эгаллохит℘, дерматикс℘, триамцинолон, бовгиалуронидаза азоксимер (Лонгидаза^♠ ) 3000 МЕ, Коллагеназа КК^♠ .

В последнее время на патологические рубцы воздействуют клеточной терапией. Введение препаратов проводят методом ультрафонофореза или мезотерапии. Физические методы доставки ферментных препаратов в ткани рубца (электро- и ультрафонофорез) не только улучшают проницаемость эпидермиса, но и сами обладают фибромодулирующим эффектом и усиливают их действие. Для разрушения ткани рубца применяют криодеструкцию, для замедления роста келоида — Букки-терапию. Сочетают сверхвысокие частоты и криотерапию, что, по мнению авторов, дает лучшие результаты. Используют ферментные препараты, гормонотерапию, хотя рецидивы после гормонотерапии наблюдаются у 50% больных. Введение глюкокортикоидов сопровождается побочными эффектами, такими как подкожная атрофия, стойкая гиперемия с телеангиэктазиями и др.

Такое большое количество методик консервативного лечения доказывает нерешенность данной проблемы. В патогенезе и лечении больных с патологическими рубцами сравнительно новым направлением является использование пептидов. Биомиметические пептиды — уменьшенные копии факторов роста клеток, способные связываться с рецепторами на поверхности фибробластов и клеток эпителия и активировать клеточное деление, созревание и дифференцировку. Биогенные пептиды используют для восполнения дефицита коллагена и эластина в клетках кожи.

Механизм проникновения пептида в клетку основан на захвате пептида плазматической мембраной с последующим отщеплением внутрь клетки в виде пузырька и доставкой плазмидной ДНК внутрь клетки. SPASE-пептид в 1000 раз увеличивает содержание ГК в коже. Сигнальные пептиды воздействуют на щелевые контакты, обеспечивающие межклеточное сообщение эпидермиса и дермы. Через щелевые контакты происходит передача импульсов при заживлении раны и рубцевании. Другая группа пептидов участвует в деградации коллагеновых структур в составе рубцовой ткани. При заживлении раны выделены стимуляторы ангиогенеза пептидной природы, к которым относят фактор роста фибробластов, ростовой фактор сосудистого эндотелия (фактор сосудистой проницаемости), фактор роста эндотелиальных клеток, эпидермальный фактор роста, ангиогенин, ангиотропин. В крови больных келоидом отмечено увеличение фактора роста TGF-β, стимулирующего рост экстрацеллюлярного матрикса. Кроме того, пептиды могут оказывать опосредованное действие через факторы роста. Фактор роста сосудистого эндотелия открыт сравнительно недавно. Этот ростовой фактор обладает ангиогенными свойствами как in vitro, так и in vivo. Он увеличивает проницаемость сосудистой стенки и поэтому называется также фактором сосудистой проницаемости.

Учитывая данные о возможных регуляторных способностях пептидных препаратов формировать коллагеновые структуры, появились попытки лечения келоидных рубцов с помощью пептидсодержащих препаратов. Из них хотелось бы выделить следующие. Олигопептид-54 (ноккин) улучшает микроциркуляцию кожи. Олигопептид-73 (EPG) запускает пролиферацию кератиноцитов и фибробластов, защищает фибробласты от окислительного стресса. Октапептид-2 (Прохаэрин бетта 4) стимулирует синтез коллагена, эластина фибробластами. Олигопептид-45 (Дермахил) активирует пролиферацию фибробластов. Олигопептид-62 (Лифтин) активирует синтез коллагена и фиброкинетина. Олигопептид-24 (EDP-3) регулирует обновление всех структур кожи. Олигопептид-20 (IDP-5) активирует и ускоряет восстановление поврежденной кожи. Ацетил декапептид-3 (Rejuline) участвует в восстановлении клеточных структур кожи, стимулирует синтез коллагена и эластина. Пептидсодержащие препараты используют в основном в косметологии для восстановления и омоложения кожи. Опубликованы исследования in vitro о влиянии пептидов на культуру фибробластов.

Таким образом, многочисленные научные исследования пептидной регуляции процессов рубцевания кожной раны доказывают вероятность объективного улучшения процессов заживления. Изучение способов применения пептидов в хирургии открывает новые возможности воздействия на процесс формирования послеоперационного рубца.

Изучение литературных источников позволяет прийти к выводу, что профилактика и лечение больных с патологическими кожными рубцами является важной и актуальной проблемой современной медицины. Изучен механизм образования патологических рубцов, их гистологическая структура. Избыточное натяжение краев операционной раны и нарушение в связи с этим микроциркуляции ведет к патологическому рубцеванию. Однако при этом нет объективных критериев оценки зависимости изменения микрокровотока от степени натяжения краев операционной раны.

Келоидный рубец чаще всего рассматривают как самостоятельное заболевание. Выделение келоидного рубца как одного из симптомов, в частности нарушения функции ЩЖ (гипотиреоз), позволит по-новому планировать профилактику грубого рубцевания.

Факторы риска, патогенетические механизмы развития АИТ многообразны, неспецифичны, вариабельны, и в настоящее время продолжается их уточнение.

Согласно современным представлениям о генезе аутоиммунных заболеваний, возникновение болезни происходит в результате реакции иммунной системы на собственные ткани, ставшие для нее антигенами. Причиной может послужить врожденная или приобретенная особенность иммунной системы или антигенное изменение структуры самой ткани.

В настоящее время в мировой литературе значительная роль в механизме возникновения АИТ отводится генетическим факторам. Подтверждается это тем, что АИТ имеет тенденцию проявляться в виде семейных форм, а носительство тиреоспецифичных антител наблюдается у родственников пробанда. Кроме того, отмечено сочетание АИТ с генетическими анормальностями, такими как синдром Дауна, Клайнфельтера и Тернера.

По современным представлениям, генетика аутоиммунных эндокринных заболеваний человека, в том числе и АИТ, предполагает полигеннное наследование. Опубликовано много работ о связи АИТ с системой гистосовместимости. Показана связь определенных типов HLA-системы с клиническими или анатомо-морфологическими признаками АИТ. Генетическую предрасположенность к АИТ связывают c HLA-B8, HLA-DR3. С носительством различных генов системы гистосовместимости связывают и различные формы АИТ. Наличие HLA-DR3 связывают с вероятностью развития атрофической формы, а HLA-DR5 — гипертрофической формы АИТ.

Наследование генов, отвечающих за развитие АИТ, не поддается простым менделевскими законам. Их пенетрантность составляет около 50% и зависит от других факторов. Многочисленные исследования описывают различные провоцирующие и индуцирующие факторы, такие как пол, возраст, стресс, инфекции, травма, лекарственные средства, курение, облучение, питание, потребление йода, беременность.

Большинство опубликованных работ сообщают о более высокой частоте АИТ у женщин, особенно в предменопаузальный период.

Механизмы индукции иммунопатологического процесса инфекционными агентами не до конца ясны. Одна из версий объясняет это дефектом HLA-системы. В результате нарушается экспрессия антигенов на тиреоцитах, и последние воспринимаются Т- и В-лимфоцитами как чужеродные. Другая версия состоит в том, что в результате инфекции для иммунной системы становятся доступными ранее скрытые микросомы и тиреоглобулин тиреоцитов. Выявлено также, что АИТ развивается у лиц с дефектом Т-супрессоров.

Некоторые авторы предполагают, что в возникновении аутоиммунных заболеваний ЩЖ играет роль бактериальная и вирусная инфекции.

Роль пускового механизма приписывается многим бактериям. B. Wenzel и D. Corapcioglu предположили связь Yersinia enterocolitica и АИТ, так как обнаружили у таких больных носительство антител к данной бактерии. D.A. Luis указывает на связь Helicobacter pylori у лиц с атрофической формой АИТ. Другие авторы предполагают, что носительство антител к микробам является артефактом, так как наличие гомологии между тиреоидными и бактериальными антигенами не означает обязательного присутствия бактериальной инфекции. H. Akamine предположил, что человеческий лимфотрофичный вирус 1-го типа может играть роль в патогенезе АИТ. Он обнаружил, что 30% носителей этого вируса имели антитела к ЩЖ.

Избыточное поступление йода в организм тоже может способствовать развитию АИТ. Показано, что эта тиреопатия реже встречается в регионах с низким потреблениям йода с пищей. В то же время при неудачной профилактике эндемического зоба (т.е. при избыточном поступлении йода) происходит рост заболеваемости АИТ. N.R. Rose и другие авторы обнаружили, что Т-лимфоциты человека с АИТ пролиферируют в присутствии йодированного ТГ.

Развитие АИТ отмечено при воздействии некоторых фармакологических препаратов. Так, например, отмечено развитие этого заболевания при терапии амиодароном, лечении психических заболеваний литием, а женщин с гиперпролактинемией — стимуляторами дофаминовых рецепторов, гепатита С и В — α-интерфероном и интерлейкином-2 (ИЛ-2). Большинство работ указывает, что само носительство вируса гепатита С без лечения α-интерфероном не связано с развитием аутоиммунных заболеваний ЩЖ. K.W. Westman отметил высокую распространенность антител к ЩЖ при иммуносупрессивной терапии гломерулонефрита.

Есть работы, сообщающие, что рост АИТ связывают и с неблагоприятной экологической обстановкой. Например, И.Г. Рахматуллин (1990) связывает высокую заболеваемость АИТ в Башкирии с загрязнением атмосферы продуктами нефтехимического производства. Об этиологической роли ионизирующего излучения говорят очень многие работы отечественных авторов. И.Д. Левит (1991), Н.Б. Пешинская (1991), К.А. Поляков (1991), А.С. Павлюк (1992), Е.В. Эпшнейн (1992) отмечают повышение уровня заболеваемости АИТ в регионах, которые пострадали после аварии на Чернобыльской АЭС.

Возможно, развитие АИТ связано и с липидным обменом. F. Festuccia показал, что 22% пациентов с ожирением имеют данную тиреопатию.

Повреждение клеток ЩЖ и нарушение ее функции при АИТ вызывается путем гуморальных и/или клеточно-медиаторных механизмов. О том, что Т-лимфоциты играют важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ, стало известно с конца 70-х гг. XX в. Во многих работах показано, что Т-лимфоциты больных с АИТ сенсибилизированы к интактным клеткам ЩЖ или к отдельным тиреоидным антигенам (ТГ, ТПО, рецепторам тиреотропного гормона).

Сенсибилизированные Т-лимфоциты и/или антитела связываются с мембранами клеток ЩЖ, вызывая их лизис и воспалительные реакции. Нарушение функции железы происходит вследствие действия активирующих или блокирующих антител, которые связываются с рецепторами к ТТГ (тиреотропному гормону) на мембранах тиреоцитов.

В патогенезе АИТ принимает участие и клеточное звено. N. Amino отметил увеличение числа К-клеток в крови больных АИТ. Этот автор также сообщает, что при АИТ стимулированные тиреоидными антигенами лимфоциты выделяют значительное количество лимфотоксинов и фактор некроза опухоли. Количество этих клеток коррелировало с уровнем сывороточного ТГ и было обратно пропорционально уровню гормонов ЩЖ. Активность и количество естественных киллеров при данном заболевании остается нормальным.

Есть работы, указывающие, что в процессе тиреоидной деструкции играют роль и иммунокомплексные механизмы.

В ответ на повреждающее действие аутоагрессии для поддержания состояние эутиреоза развивается гиперплазия ЩЖ, иногда сопровождающаяся гиперфункцией. Длительный процесс аутоагрессии постепенно приводит к снижению функции ЩЖ.

В последнее время появляются работы, показывающие, что в развитии АИТ играет роль и апоптоз.

Таким образом, в основе АИТ лежат врожденные изменения, в том числе и антигенспецифичный дефект функции Т-лимфоцитов, который вместе с другими внешними неблагоприятными факторами приводит к развитию этой патологии ЩЖ и появлению в крови тиреоспецифичных антител. Наличие данных антител у больных, возможно, является не только диагностическим критерием, но и фактором прогнозирования протекания АИТ.

Изучение аутоиммунного генеза заболеваний ЩЖ началось с обнаружения в 1957 г. в крови больного тиреоидитом Хашимото тиреоспецифичных антител — антител к ТГ. В этом же году N. Rose и E. Witebsky создали экспериментальную модель этого заболевания. В настоящее время изучено около 10 органоспецифичных аутоантител к разнообразным антигенам ЩЖ, которые появляются при АИТ. Это антитела к ТПО, ТГ, 2-му коллоидному компоненту, тиреоидным гормонам (тироксину и трийодтиронину), рецепторам ТТГ; антитела к мембранам; рост-стимулирующие антитела к рецепторам ТТГ; рост-ингибирующие антитела к рецепторам ТТГ.

Наиболее хорошо изученными являются антитела к ТГ, ферменту ТПО, а также антитела к рецепторам тиреотропного гормона.

Описаны другие антитела, такие как натрий-йодистый симпортер (Natrium iodide symporter), однако его диагностическое значение для АИТ не подтверждено. Существуют также биоспецифичные антитела, которые связываются с ТГ и ТПО. При АИТ эти антитела обнаруживаются у 61% пациентов.

В настоящее время общепризнано, что антитела к рецепторам ТТГ гетерогенны. Они могут стимулировать рецепторы ТТГ и тем самым усиливать функцию ЩЖ, как бывает при диффузном токсическом зобе (H.A. Drexhage, 1994). Стимулирующие антитела обнаруживаются у 70–80% пациентов. Антитела могут и блокировать рецепторы ТТГ, тем самым вызывая атрофию ЩЖ и развитие гипотиреоза. Антитела с блокирующим эффектом присутствуют у 69–70% больных с атрофической формой АИТ (H.A. Drexhage, 1994). Таким образом, именно наличием блокирующих или стимулирующих антител к рецепторам ТТГ объясняется в настоящее время развитие различных анатомических форм АИТ.

Механизм блокирования наиболее ярко проявляется у новорожденных. Блокирующие антитела к рецепторам ТТГ, полученные от матери, вызывают у младенцев развитие АИТ.

Основная теория, объясняющая причину появления в крови антител, сводится к следующему. В результате воздействия провоцирующих факторов происходит «переворачивание» клеток ЩЖ — тиреоцитов. Это приводит к тому, что на апикальной стороне этих клеток появляются ТГ и ТПО, ранее скрытые в фолликулах. Эти вещества не контактировали с элементами иммунной системы и поэтому являются чужеродными. Как следствие, происходит образование антител на эти аутоантигены.

ТГ — это йодированный белок, на поверхности которого происходит синтез гормонов ЩЖ. Он является натрийсодержащим гликопротеином, состоящим из двух субъединиц. Его молекулярная масса составляет 660 кДа. Продуцируется ТГ клетками ЩЖ в просвет фолликулов. В процессе синтеза гормонов ЩЖ происходит полимеризация, а затем разрушение ТГ. Этот белок может определяться и в крови здорового человека. Титр ТГ зависит от чувствительности используемого метода определения. Нормальные колебания ТГ в плазме человека составляют от 0 до 30–50 мкг/л, а уровень данного белка в крови зависит от следующих факторов:

Предполагают, что повышение уровня ТГ является неспецифическим показателем повреждения ЩЖ. Самая высокая концентрация ТГ в крови встречается при раке ЩЖ. Повышение тиреоглобулина в рамках компенсаторной реакции на йодную недостаточность отмечено в эндемичных зонах. Это наблюдение позволило ВОЗ включить сведения об уровне тиреоглобулина в критерии определения эндемичности региона.

Отмечено повышения уровня ТГ и у нормальных эутиреоидных субъектов. Более высокий уровень отмечается у женщин. Повышается этот белок и при курении.

Измерения уровня ТГ используется:

При искусственном тиреотоксикозе, а также врожденном гипотиреозе отмечается низкий уровень ТГ.

Патологическая роль антител к ТГ в настоящее время ясна не до конца. Наличие антител к ТГ в течение беременности является фактором риска для развития АИТ у младенцев вследствие пассажа этих антител через плаценту от матери. Они могут обнаруживаться и в плазме здоровых людей. Кроме того, эти антитела обнаруживаются у родственников больных тиреоидитом в первом поколении. Однако некоторые ученые считают, что появление антител к ТГ является предиктором развития АИТ.

Клиническое значение обнаружение высокого титра антител к тиреоглобулину заключается прежде всего в диагностике АИТ. По данным H.A. Drexhage, они обнаруживаются в крови у 90–100% больных АИТ. При диффузном токсическом зобе у 40% пациентов также можно выявить антитела к ТГ.

Определение наличия антител к ТГ важно при карциноме ЩЖ. При этой патологии встречаемость данных антител наблюдается в 2 раза чаще, чем в популяции (~20 и 10% соответственно). Кроме того, уровень антител к ТГ (даже в низком титре) коррелирует с уровнем ТГ, поэтому оценка уровня данных антител используется как дополнительный тест к определению уровня ТГ при диагностике карциномы ЩЖ, а также для динамического наблюдения после хирургического лечения этой патологии. Через 1–4 года при отсутствии рецидивов карциномы ЩЖ антитела к ТГ исчезают. Повышение этих антител после лечения радиоактивным йодом является первым признаком рецидива опухоли.

В йоддефицитных зонах антитела к ТГ также обнаруживаются в общей популяции. Предполагается, что это связано с повышением уровня самого ТГ в рамках компенсаторного механизма на дефицит йода. Это наблюдение позволило использовать измерение уровня антител не только для диагностики АИТ, но и для контроля за терапией йодом в эндемичных районах.

Значение низкого уровня титра антител к ТГ в настоящее время неясно. Есть предположение, что низкий уровень этих антител является естественным для здорового индивидуума. Отмечено также, что данные антитела в низком титре появляются в ответ на выход антигенов в кровь при хирургическом вмешательстве на ЩЖ или при терапии радиоактивным йодом тиреотоксикоза.

Таким образом, определение уровня антител к ТГ клиницистами используется:

ТПО является гликопротеидом, связанным с мембраной. Его молекулярная масса составляет 110 кДа. Молекула ТПО состоит из 3 доменов: большого внеклеточного, короткого трансмембранного и внутриклеточного. ТПО участвует в синтезе гормонов ЩЖ. Большая часть ТПО находится внутри фолликула. Описано несколько изоформ ТПО, которые синтезируются разными рибонуклеиновыми кислотами. Ранее антитела к ТПО назывались антимикросомальными. Ряд исследований предполагает, что антитела к ТПО цитотоксичны для ЩЖ. Другие считают, что сами по себе эти антитела не оказывают повреждающего эффекта. Наличие антител к ТПО коррелирует с лимфоидной инфильтрацией и степенью повреждения ЩЖ.

Выявление антител к ТПО является наиболее чувствительным тестом для диагностики аутоиммунного заболевания ЩЖ. Наличие этих антител гораздо больше, чем наличие антител к ТГ, коррелирует с нарушением функции и гистологией ЩЖ. Предполагается, что действия этих антител приводит к развитию:

Приблизительно у 70% пациентов с диффузным токсическим зобом также обнаруживаются антитела к ТПО (Drexhage H.A., 1994). Та или иная степень тиреоидной дисфункции имеет место у 72% лиц, «позитивных» по антителам к ТПО.

Определение уровня этих антител в качестве скрининга на АИТ имеет большое значение, так как было показано, что появление антител к ТПО предшествует деструкции ткани ЩЖ. Особенно это важно для пациентов с болезнью Дауна, так как вероятность развития гипотиреоза, вызванного АИТ, у таких лиц очень высока и составляет 39%.

Есть исследования, результаты которых предполагают, что наличие антител к ТПО является фактором риска для развития дисфункции ЩЖ (в т.ч. послеродового и лекарственного АИТ). На фоне функциональных проявлений послеродового тиреоидита титр антител к ТПО еще более возрастает.

У пациентов, у которых, помимо АИТ, имеются другие аутоиммунные заболевания (например, пернициозная анемия или сахарный диабет 1-го типа), антитела к ткани ЩЖ встречаются более часто. Обнаружено и повышение антител к ТПО у лиц, страдающих геморрагическими васкулитами.

Высокая частота встречаемости тиреоспецифичных антител, особенно у мужчин, отмечена при саркоидозе. Рассеянный склероз также отличается высокой встречаемостью тиреоспецифичных антител. Есть работы, которые показывают, что повышение титра антител к ТПО сопровождается высоким риском развития выкидышей, а также снижением способности к оплодотворению in vitro.

Клиническое значение низкого уровня антител при АИТ ясно не до конца. Это может встречаться и в отдельных случаях подросткового тиреоидита, нетоксического зоба, папиллярного рака ЩЖ.

В клинической практике определение антител к ТПО используется для диагностики АИТ, а также для оценки риска развития:

Нормальный уровень тиреоспецифичных антител определяется в когорте из 120 пациентов, которые отвечают следующим требованиям: мужчины в возрасте до 30 лет, являющиеся эутиреоидными (т.е. уровень ТТГ равен 0,5–2 мЕд/л), не имеющие зоба, семейного анамнеза заболеваний ЩЖ и других аутоиммунных заболеваний.

Контроль за титром антител с современной точки зрения в течение терапии АИТ не принят. Это связано с тем, что лечение АИТ направлено на компенсацию нарушенной функции, а не на причину заболевания. В то же время уровень антител отражает активность болезни.

Таким образом, тиреоспецифичные антитела являются отражение патологических процессов, протекающих в ЩЖ при АИТ, который характеризуется изменением морфологии и функции ЩЖ, что и определяет его клиническую картину.

Дебют АИТ установить практически невозможно из-за незаметного начала. Можно предположить только возможность возникновения АИТ у лиц с семейным анамнезом заболеваний ЩЖ и при наличии антител к ТПО или ТГ.

В большинстве случаев АИТ отличается медленно прогрессирующим течением с тенденцией к постепенному нарастанию деструктивных изменений в ЩЖ и формированием гипотиреоза. Описаны случаи длительного протекания АИТ без развития гипофункции ЩЖ, а также АИТ, при котором спонтанно происходит чередование гипотиреоза с нормальной функцией ЩЖ.

Классический АИТ начинается с постепенного увеличения ЩЖ. Именно гипертрофия ЩЖ, которая встречается в 90% случаев, и характерная плотность являются ведущими признаками АИТ. При этом железа увеличена за счет обеих долей (реже — за счет одной доли). Поверхность ЩЖ иногда бугристая, плотность ее неравномерная. Зоб длительное время может оставаться незамеченным. Лишь у некоторых пациентов он может вызывать диспноэ и дисфагию. С течением времени при гипертрофической форме АИТ начинают появляться признаки гипотиреоза. В то же время пациенты с АИТ могут иметь увеличенную железу и с нормальной функцией или гипотиреоз с нормальной, увеличенной или атрофичной ЩЖ.

При атрофической форме АИТ, которая наблюдается в 10% случаев, ЩЖ практически не пальпируется, а гипотиреоз развивается сравнительно быстро. Описаны формы заболевания, при которых размеры ЩЖ не отличаются от нормальной. В детском и юношеском возрасте преобладает гипертрофическая форма АИТ без нарушения функции ЩЖ.

Клиническая картина в основном определяется функцией ЩЖ. Течение АИТ длительное, в фазе эутиреоза бессимптомное. В 10% случаев дебютирует АИТ транзиторным тиреотоксикозом.

Гиперфункция ЩЖ при этом заболевании характеризуется легким и непродолжительным течением (не более 3–6 мес), быстрым ответом на супрессивную терапию. Очень часто тиреотоксикоз при АИТ выявляется случайно, когда обнаруживается подавление ТТГ.

В большинстве случаев диагностируется АИТ уже на стадии первичного гипотиреоза. Приблизительно 20% пациентов при первом обращении больных к врачу имеют клинические признаки гипотиреоза.

Снижение функции ЩЖ может проявляться в виде субклинического гипотиреоза. Этот диагноз устанавливается на основании повышения уровня ТТГ.

Жалобы пациентов с АИТ широко варьируют и зависят от степени выраженности снижения функции ЩЖ.

У больных с гипотиреозом могут иметь место слабость, утомляемость, артралгии, миалгии, мышечные судороги, непереносимость холода, сонливость, головные боли, нарушение функции кишечника (запоры), нарушения менструальной функции (меноррагии), отечный синдром (хриплый голос, периферические отеки, увеличение массы тела). У таких пациентов при осмотре выявляется сухость и желтушность кожных покровов, ломкость ногтей и волос, бледность, неврологические нарушения (удлинение времени расслабления глубоких сухожильных рефлексов), макроглосия.

Нарушение функции сердечно-сосудистой системы проявляется в повышении диастолического давления, снижения частоты сердечных сокращений. Хорошо известен синдром микседематозного сердца с брадикардией, артериальной гипотензией, дистрофическими изменениями на электрокардиограмме, сочетающийся нередко с коронарной болезнью сердца.

Артериальную гипертензию считали нетипичной для гипотиреоза и относили на счет сопутствующей гипертонической болезни. Это связано с тем, что, как правило, повышенное артериальное давление наблюдалось у лиц, имеющих семейный анамнез по артериальной гипертензии, а дефицит тиреоидных гормонов является мощным реализатором наследственной предрасположенности к этому заболеванию. Присутствие в клинике артериальной гипертонии и стенокардии обычно рассматривалось как обстоятельство, затрудняющее адекватную заместительную терапию тиреоидными гормонами. В настоящее время показано, что артериальная гипертензия может быть проявлением гипотиреоза, то есть самостоятельной формой симптоматической (вторичной) гипертонии.

Это предположение основано на том, что высокое давление при гипотиреозе резистентно к обычной гипотензивной терапии. В то же время оно снижается при заместительной терапии тиреоидными гормонами. Механизм подъема артериального давления при гипотиреозе связан с повышением периферического сопротивления за счет сужения артериол и снижения минутного объема сердца. Артериальная гипертензия в таких случаях характеризуется повышением диастолического и снижением систолическое давления.

У больных с гипотиреозом отмечаются и кардиалгии, которые очень напоминают коронарогенные боли, но они исчезают под влиянием тиреоидной терапии. Ряд авторов, располагающих аналогичными наблюдениями, не выявляли у таких больных при коронарографии поражения венечных сосудов сердца. Предполагается, что потребность миокарда в кислороде снижается в меньшей степени, чем кровоснабжение, поэтому стенокардия развивается редко. Возможно сочетание ишемической болезни сердца и сниженной функции ЩЖ, особенно у пожилых людей. Частота этого сочетания может возрастать. Это связано с тем, что при гипотиреозе степень атерогенности повышается за счет снижения липопротеидов высокой плотности и повышения липопротеидов низкой плотности. От 2 до 5% больных с гипотиреозом жалуются на загрудинные боли уже при первом обращении к врачу. Таким образом, артериальная гипертензия и коронарный синдром у пожилых больных может иногда быть своеобразной маской гипотиреоза.

У больных с гипофункцией ЩЖ возможно развитие анемии. Причин этому может быть несколько.

АИТ может сочетаться с эндокринной офтальмопатией (экзофтальм и офтальмоплегия) независимо от функционального состояния ЩЖ и другими заболеваниями ЩЖ — диффузным токсическим зобом и подострым тиреоидитом.

Различия клинических и анатомо-морфологических признаков АИТ привели к многочисленным попыткам классификации этой болезни. В настоящее время общепризнанной является классификация, предложенная в 1989 г. R. Volpe. Он выделил следующие формы АИТ:

Многообразие, неспецифичность клинической картины, длительное асимптомное протекание АИТ привело к тому, что верифицировать это заболевание, особенно в стадии эутиреоза, можно только на основании лабораторно-инструментальных методов исследования.

Основными методами исследования при патологии ЩЖ является ультразвуковое, радиоизотопное, морфологическое и лабораторные исследования.

Для оценки анатомической характеристики ЩЖ широко применяется ультразвуковое исследование. Этот метод позволяет получить полное изображение ЩЖ при поперечном сканировании с определением ее размеров, формы, структуры.

Наиболее характерными ультразвуковыми признаками АИТ является расширение перешейка, снижение эхогенной плотности ткани ЩЖ, неоднородность структуры, наличие мелких эхонегативных образований округлой или овальной формы — микроузлов. Гипоэхогенные участки обычно являются доброкачественными коллоидными узлами.

G.Messina проводил цитологическое исследование пациентов с разными ультразвуковыми картинами ЩЖ. Он обнаружил, что гипоэхогенная структура (диффузная или очаговая) была чаще, чем гиперэхогенная, ассоциирована с гистологическими признаками АИТ.

S.M. Lai попытался сопоставить клиническую и ультразвуковую картину ЩЖ. Он обнаружил, что уровень тетрайодтиронина значительно ниже при гипоэхогенной структуре ЩЖ, чем при гиперэхогенной или изогенной. Кроме того, он обнаружил корреляцию между уровнем антител к ТПО и структурой ЩЖ. Более высокий титр антител к ТПО наблюдался при гипоэхогенной структуре.

Заключение ультразвукового исследования носит описательный характер и не содержит клинического диагноза. По данным W. Raber, 96% пациентов с изменениями ЩЖ, выявленными при помощи ультразвукового исследования, имеют ее дисфункцию, а 91% пациентов с нормальным объемом и структурой ЩЖ по данным ультразвукового исследования и негативным уровнем антител к ТПО имеют ее нормальную функцию.

Для оценки структуры ЩЖ широко применяется ее радиоизотопное сканирование с использованием радиофармпрепарата — радиоактивного йода (¹²³ I) и технеция пертехнетата (⁹⁹ Tcm). Суть метода состоит в определении степени поглощения тканью ЩЖ радиофармпрепарата. Йод и технеций транспортируются в фолликулярные клетки ЩЖ, а йод еще и органифицируется. Примерно 20% дозы ¹²³ I, принятой внутрь, поглощается ЩЖ в течение 24 ч после приема. Степень поглощения изотопа коррелирует с функциональной активностью ЩЖ. Она может быть нормальной, сниженной или повышенной. Благодаря этому методу исследования также можно оценить размеры и структуры ЩЖ, наличие узлов.

С помощью радиоизотопного сканирования узлы подразделяются на гипофункционирующие («холодные»), изофункционирующие («теплые») и гиперфункционирующие («горячие»). Функционирующие узлы редко бывают злокачественными — менее 4%. Среди «холодных» узлов 10–20% являются неоплазмами.

Сканограмма гипертрофической формы АИТ характеризуется неравномерностью поглощения изотопа — участки с повышенным поглощением («горячие») чередуются с зонами разряжения («холодными»).

S.Yarman проводил сравнительную характеристику ультразвуковой и сцинтиграфической картины АИТ. Было выявлено, что при сканировании ЩЖ процент обнаружения признаков узлообразования значительно выше. При данном исследовании узлы обнаружены у 60,4% пациентов, а при радиоизотопном — у 74,9%. Такое различие, возможно, связано с наличием «псевдоузлов» при АИТ, проявляющихся «холодными» участками на сканограмме.

Изменения, выявляемые при радиоизотопном сканировании, многообразны и могут встречаться при других болезнях ЩЖ. Именно поэтому для диагностики АИТ этот метод может быть использован в сочетании с клинической картиной, данными ультразвукового обследования и уровнем тиреоспецифичных антител.

Лабораторные методы исследования при АИТ служат оценкой функции ЩЖ и определения титра тиреоспецифичных антител.

Уровень гормонов ЩЖ (свободный тироксин, трийодтиронин, ТТГ) позволяет определить, имеется ли у больного гипер-, гипо- или эутиреоз.

Одним из важных диагностических критериев является выявление специфичных аутоантител к ткани ЩЖ — антител к ТПО и ТГ.

C позиции диагностики и экономической выгоды более оправдано определение антител к ТПО. R.A. Nordyke показал, что среди всех больных, имеющих тиреоспецифичные антитела, антитела к ТПО имели 64% пациентов, а к ТГ — только 1%. Даже низкие титры антител к ТПО коррелируют к лимфоидной инфильтрации ЩЖ. При высоких титрах этих антител диагноз АИТ более вероятен. Низкие титры или вообще отсутствие антител к ТПО наблюдается у малого количества больных. Хотя, как показал K. Kasagi, наличие антител к ТГ чаще соответствует гистологическому диагнозу АИТ, чем антитела к ТПО.

В настоящее время считается, что определение уровня антител к ТГ для диагностики АИТ целесообразно прежде всего в йоддефицитных регионах у пациентов с узловым зобом. Другие тиреологи утверждают, что определение в этих регионах только уровня антител к ТГ для диагностики данного заболевания недостаточно. Это мнение связано с тем, что, по данным некоторых исследований, наличие у пациентов антител к ТГ без антител к ТПО очень редко сопровождается дисфункцией ЩЖ.

Многие исследования показали, что антитела к ТГ и ТПО обнаруживаются в плазме у большинства больных АИТ. В то же время C. Poropatich обнаружил, что и при отсутствии тиреоспецифичных антител в периферической крови у ряда лиц цитологически выявляется картина АИТ, даже при асимптомном течении болезни. Антитела обнаруживаются и в плазме здоровой популяции. Около 20% всех женщин (17,8% — Prentice L.M. et al., 1990; 26% — Vanderpump M.P. et al., 1995; 16,9% — Knudsen N. et al., 1999) и около 7% мужчин (9% — Vanderpump M.P. et al., 1995; 6,6% — Knudsen N. et al., 1999) имеют циркулирующие антитела к ЩЖ. В исследовании, проведенном J.G. Hollowell, обнаружено, что около 12% обследованных пациентов без заболеваний ЩЖ имели антитела к ТПО и 10% — к ТГ. С возрастом встречаемость аутоантител к ЩЖ возрастает.

Косвенным признаком повышения содержания тиреоспецифичных антител является увеличение содержания в крови γ-глобулинов, в частности иммуноглобулинов класса G.

Лабораторные методы исследования также позволяют обнаружить повышение уровня холестерина, печеночных ферментов, креатинкиназы, пролактина; снижение натрия, а также анемию (нормохромную, нормоцитарную и макроцитарную), что служит отражением гипотиреоза.

Для диагностики заболеваний ЩЖ применяется тонкоигольная биопсия ЩЖ. Впервые в качестве диагностического теста этот метод исследования был применен более 50 лет назад. При этой процедуре врач вводит тонкую иглу в область ЩЖ и берет образец содержимого ткани. Полученный материал наносят на предметное стекло. Опыт клиники Мэйо свидетельствует, что данные цитологии позволяют определить патологию ЩЖ в 85% случаев, в остальных 15% случаях данные являются негативными, то есть недиагностическими.

Проведение тонкоигольной биопсии при АИТ необходимо далеко не всегда. Это связано с тем, что данная патология редко озлокачествляется и уровень тиреоспецифичных антител коррелирует с гистологической картиной АИТ. Кроме того, этот метод диагностики дорогостоящий и требует привлечения квалифицированных специалистов. Тем не менее цитологическое исследование ткани ЩЖ необходимо в сомнительных случаях, т.е. при подозрении на малигнизацию.

Диагностическая эффективность этой процедуры при многоузловом зобе снижается, так как нет гарантий получения цитологического материала из всех узлов. Риск наличия рака в одном из узлов при многоузловом зобе значительно реже, чем при одинарном. Кроме того, АИТ может сочетаться не только с раком, но и с лимфомой ЩЖ. Казуистически редко этот вид тиреопатии может также имитировать диффузный склерозирующий папиллярный рак.

Таким образом, показаниями для проведения тонкоигольной биопсии ЩЖ при АИТ является наличие доминантного узла (независимо от размера), особенно если он является «холодным».

Гистологические особенности, которые выявляются при исследовании ткани ЩЖ, полученной путем тонкоигольной биопсии, позволяют установить диагноз АИТ.

Начальным патологоанатомическим субстратом для развития АИТ являются дегенеративные изменения тиреоидного эпителия, инфильтрация межфолликулярных пространств лимфоцитами и плазматическими клетками. Лимфоидные инфильтраты носят очаговый характер, а плазматические — диффузный. Наблюдается формирование типичных лимфоидных фолликул различного размера со светлыми центрами и четкой мантийной зоной. Лимфоциты могут располагаться и в стенках фолликул, разрушая мембрану этих клеток, но при этом сохраняя свою. Степень лимфоидной инфильтрации ЩЖ коррелирует с уровнем антител к ТПО. Инфильтраты вызывают разобщение тиреоидных фолликул. При гипертиреозе отмечается сохранение крупных долек, в которых фолликулы имеют морфологические признаки повышенной функциональной активности.

При гипертрофической форме в ЩЖ обнаруживают очаги компенсаторной регенеративно-гиперпластической метаплазии фолликулярных структур. Появляются очаги гипертрофии, гиперплазии, сосочковой пролиферации тиреоцитов. В эпителии таких клеток также появляются очаги метаплазии — плоскоклеточной и оксифильной.

Одним из главных морфологических критериев АИТ является появление гигантских клеток Гюртле–Ашкенази. Это клетки больших размеров с оксифильной цитоплазмой, гиперхромией и полиморфизмом ядер. Трансформация фолликулярного эпителия в эти клетки происходит в уцелевших и дегенеративных фолликулах.

Результатом аутоиммунной метаплазии ЩЖ является фиброзная метаплазия. В начальной фазе образуются аргирофильные волокна между тиреоидными фолликулами. В дальнейшем эти волокна превращаются в фиброзно-волокнистую сеть. Финальным этапом аутоиммунного преобразования ЩЖ является появление обширных полей гиалинизированной соединительной ткани.

Гистологический полиморфизм АИТ объясняет различия, обнаруживаемые при физикальном и ультрасонографическом обследовании: неравномерность структуры ЩЖ, ее уплотнения и бугристость, формирование «псевдоузлов», которые трудно отличить от истинных, неодинаковая эхогенность тиреоидной ткани.

Таким образом, клиническая картина и результаты лабораторно-инструментальных способов исследования позволяют поставить диагноз АИТ. Кроме того, особенности АИТ, выявляемые при этом, позволяют предположить, как будет протекать данное заболевание.

Факторы, которые могли бы помочь в предположении, как будет протекать АИТ, в настоящее время не определены. Ряд ученых пытались определить прогноз АИТ в зависимости от наличия тиреоспецифичных аутоантител. В своей работе J. Takamatsu определял уровни аутоантител к ЩЖ и параллельно проводил ультрасонографическое исследование. Результаты этого исследования показали, что пациенты, у которых выявлены антитела к ТПО, имели нормальную эхограмму и маленькую железу. Гипофункцией ЩЖ страдали 50% этих пациентов. В группе пациентов с наличием антител к ТГ более половины пациентов (53%) имели узлы в увеличенной железе. Гипотиреоз среди данных больных встречался почти в 2 раза реже (у 23%). Таким образом, результаты исследования, проведенного J. Takamatsu, показали, что высокий титр аутоантител к ТПО предрасполагает к развитию гипотиреоза без узлообразования. В то же время высокий титр аутоантител к ТГ сопровождается микроузлообразованием при меньшей тенденции к гипотиреозу.

M.Hasegawa опубликовал противоположные данные. Он показал, что количество гипотиреоидных пациентов с антителами к ТГ в течение 5 лет наблюдения удвоилось. Подобной тенденции при повышенном уровне антител к ТПО не наблюдалось. В этом же исследовании было отмечено, что гипотиреоз наблюдался более часто именно при повышенных антитела к ТГ. Менее выраженная подобная корреляция наблюдалась также и при повышении уровня антител к ТПО.

Прогностическая роль антител к ЩЖ была оценена в Викгемском исследовании (Whickham study). С 1972 по 1995 г. проводилось наблюдение 2779 пациентов. Оказалось, что развитие гипотиреоза составило 3,5 случая на 1000 женщин в год и 0,6 случая на 1000 мужчин при наличии тиреоспецифичных антител — 2,1%, повышении ТТГ — 2,6% и при сочетании этих факторов — 4,3%. По результатам этого исследования было выявлено, что наличие антител к ТПО является фактором риска для развития гипотиреоза. В то же время в этом исследовании обнаружили, что пациенты с низким титром антител к ТПО (от 2 МЕ/л) также имели высокий риск развития гипотиреоза. Это позволило сделать предположение, что низкий уровень антител к ТПО также клинически значим. Таким образом, было предположено, что антитела к ТПО являются фактором риска развития АИТ.

Об увеличении риска перехода субклинического гипотиреоза в явный при повышении тиреоспецифичных антител указывает A.D. Toft. Он обнаружил, что в течение 4–8 лет этот переход развивался у 20–50% больных с субклиническим снижением функции ЩЖ. R. Volpe также указывает, что при наличии антитиреоидных антител частота перехода субклинического гипотиреоза в явный составляет 5%.

В то же время в литературе существует и противоположное мнение. Ряд ученых считает, что исследование динамики циркулирующих антител к ЩЖ с целью оценки развития и прогрессирования АИТ не имеет диагностического и прогностического значения.

АИТ, как говорилось выше, является следствием дефектов иммунной системы. Последние нарушения могут приводить к развитию аутоантител к другим тканям и органам и, как следствие, — к развитию иных аутоиммунных заболеваний.

У больных АИТ гораздо чаще, чем в общей популяции, обнаруживаются другие заболевания аутоиммунного генеза. Приблизительно в 80% случаев антитела к ткани ЩЖ выявляются при пернициозной анемии, в 40% — при болезни Аддисона. R. Frati обследовал 15 126 пациентов с АИТ и обнаружил, что 18,5% обследованных имеют витилиго. АИТ может также сочетается с системной красной волчанкой, ревматоидным артритом, сахарным диабетом I типа, синдромом Шегрена, миастенией, алопецией, идиопатическим гипопаратиреозом, аутоиммунной тромбоцитопенией, гемолитической анемией.

H.Akamine обнаружил, что 40,4% больных, страдающих Т-клеточной лимфомой, имели АИТ. Описаны в литературе и сочетания АИТ с другими видами лимфом, такими как В-клеточная и другие неходжкинские лимфомы. Данные типы лимфом чаще встречаются у женщин в возрасте от 50 до 80 лет и обычно ограничены только ЩЖ.

Также была обнаружена высокая распространенность АИТ при заболеваниях толстого кишечника, в том числе при болезни Крона, атрофическом гастрите, первичном билиарном циррозе, саркоидозе. Отмечена высокая распространенность антител к ЩЖ у детей, страдающих различными аллергическими реакциями.

По данным F. Gaches, наиболее часто при АИТ встречается системная красная волчанка и синдром Шегрена. Описаны случаи сочетания АИТ, сахарного диабета 1-го типа и пернициозной анемии у целой семьи.

Кроме того, S. Morita и В. Jasani обнаружили, что у пациентов, страдающих аутоиммунным заболеванием ЩЖ (АИТ и диффузным токсическим зобом), имеется повышенный титр и других аутоантител. При этом обследуемые лица не имели никаких клинических признаков других аутоиммунных болезней. Встречаемость у таких пациентов антиядерных антител составила 26%, антител к гладкой мускулатуре — 36%, к ДНК — 34%, что было значительно выше, чем в контроле (8,4 и 4% соответственно).

Возможно, это не является следствием перекрестной реактивности антигенов разных тканей, а отражает одновременное наследование генов восприимчивости к нескольким заболеваниям. L.M. Chuang обнаружил, что имеются определенные гены гистосовместимости (HLA DRB1/DQA1/DQB1), которые чаще встречаются у пациентов, страдающих АИТ и сахарным диабетом 1 типа.

Критерии особенностей протекания АИТ в настоящий момент не определены. В литературе есть данные, указывающие на связь изменений функции ЩЖ и ее морфологии в зависимости от титра тиреоспецифичных антител.

В нашей работе было обнаружено, что высокий титр антител к ТПО чаще встречается у больных с развившимся гипотиреозом, чем у больных с эутиреозом, а увеличенный титр антител к ТГ, наоборот, чаще наблюдается у лиц с эутиреозом, чем с гипофункцией ЩЖ. Аналогичные результаты были получены J. Takamatsu. В своей работе он показал, что при наличии антител к ТПО у пациентов чаще встречается гипотиреоз.

Однако статистически достоверной разницы между группами пациентов с гипотиреозом и гипертиреозом в отношении повышенного титра антител к ТГ или ТПО в начале периода наблюдения получено не было, как и разницы между группами пациентов с нормальной и сниженной функцией ЩЖ при визите № 1, хотя повышение титра антител к ТПО чаще встречалось при гипотиреозе, а к ТГ — при эутиреозе. Возможно, это связано с малым количеством пациентов в группе гипотиреоза. Разница между другими группами сравнения при всех визитах достигала статистической достоверности.

Нам кажется, что о прогностическом значении увеличенного титра антител к ТПО в отношении развития гипотиреоза говорит и тот факт, что при последнем визите все пациенты, у которых развился гипотиреоз, имели именно увеличенный титр данных антител.

Изменение размеров ЩЖ в нашем исследовании также коррелировало с уровнем антител. Повышенный титр антител к ТГ достоверно чаще встречался у пациентов с гипертрофированной ЩЖ. Разница была статистически достоверна при всех визитах (р <0,05).

Увеличенный титр антител к ТПО наблюдался чаще у пациентов с нормальными размерами ЩЖ, а также у лиц, имевших тенденцию к снижению объема железы, даже если ранее ее объем был увеличен. Разница была статистически достоверна при визитах № 2, 3, 4 (р <0,05). В начале периода наблюдения гипертрофия ЩЖ чаще, чем эутиреоз, встречалась при увеличенном титре антител к ТГ. Отсутствие статистически достоверной разницы, возможно, также связанo с малым количеством лиц в группах сравнения.

Результаты нашего исследования аналогичны данным, полученным J. Takamatsu. Его исследования показали, что пациенты, у которых были выявлены антитела к ТПО, не имели увеличенного объема ЩЖ.

По данным литературы, титр тиреоспецифичных антител в процессе болезни у каждого конкретного пациента может меняться. В нашем исследовании мы это наблюдали, в связи с чем проводили статистический анализ зависимости различной функции и объема ЩЖ при каждом визите пациента. Несмотря на колебание уровня антител, результаты, полученные при каждом визите, были подобны.

Мы думаем, что, если у пациента хотя бы однократно был обнаружен увеличенный уровень тех или иных тиреоспецифичных антител, уже можно предположить, как в дальнейшем будет протекать АИТ.

В связи с колебанием уровня тиреоспецифичных антител у каждого пациента для оценки их прогностического значения в протекании АИТ мы не только провели статистический анализ корреляции уровня данных антител с объемом, функцией и узлообразованием ЩЖ при каждом визите, но и оценили динамику этих показателей в течение 3 лет.

Единственным неблагоприятным последствием АИТ является развитие гипотиреоза, поэтому в анализе результатов динамики функции ЩЖ в зависимости от титра тиреоспецифичных антител все пациенты были разделены на 2 группы — лица, у которых сформировался гипотиреоз, и пациенты, которые сохранили эутиреоз, независимо от того, имели ли они в начале периода наблюдения эутиреоз или гипертиреоз. Кроме того, из статистического анализа были исключены пациенты, у которых уже при первом обращении был диагностирован гипотиреоз. Это было сделано с целью получения максимально аналогичных групп сравнения в отношении сроков возникновения АИТ. Наше решение было основано на предположении, что у лиц с гипотиреозом АИТ протекал более длительно, так как он уже привел к нарушению функции ЩЖ. Кроме того, всем пациентам требовалось назначение заместительной терапии гормонами ЩЖ, а, по данным литературы, эта терапия может привести к нормализации уровня тиреоспецифичных антител.

В процессе течения АИТ объем ЩЖ меняется. У одних пациентов имелась тенденция к гипертрофии размеров ЩЖ, у других — к уменьшению. В связи с этим для анализа динамики объема ЩЖ мы выделили 3 группы пациентов — с увеличением объема ЩЖ, с неизменной ЩЖ и с тенденцией к уменьшению, даже если ранее ЩЖ была увеличена.

Результаты анализа динамики функции, размеров и наличия узлов в ЩЖ демонстрировали те же тенденции, обнаруженные при визитах. Увеличенный титр антител к ТГ достоверно чаще встречался у пациентов с сохраненной функцией ЩЖ, чем с гипотиреозом при всех визитах (p <0,01), причем все пациенты, у которых сохранилась нормальная функция ЩЖ, имели повышенный титр антитела к ТГ при каждом визите.

Антитела к ТПО чаще встречались у пациентов, у которых произошло формирование гипотиреоза, чем у лиц, сохранивших эутиреоз. Статистически достоверная разница получена при визитах № 1, 3, 4 (p <0,01). При визите № 2 наблюдалась аналогичная тенденция, хотя разница недостоверна (p >0,05). В конце периода наблюдения все пациенты, у которых сформировался гипотиреоз, имели повышенный титр антител к ТПО. Отсутствие статистически достоверной разницы при визите № 2 между группами сравнения возможно связано с малым количество пациентов в группах.

Наши данные наличия повышенного титра антител ТПО подобны результатам Викгемского исследования, в котором было показано, что наличие антител к ТПО является фактором риска для развития гипотиреоза.

В литературе существует много указаний на сочетание АИТ с другими аутоиммунными заболеваниями, однако оценки течения АИТ в зависимости от наличия сопутствующих заболеваний аутоиммунного генеза мы не обнаружили.

Мы предположили, что наличие других аутоиммунных заболеваний говорит о более глубоком дефекте иммунной системы и, возможно, более агрессивном течении АИТ. Поэтому в своей работе мы провели анализ зависимости динамики функции, объема ЩЖ и процесса узлообразования от наличия сопутствующих заболеваний аутоиммунного генеза. В работу не включались пациенты, которым требовалось назначение иммуносупрессивной терапии или глюкокортикоидных препаратов, из-за возможного их влияния на протекание АИТ.

Повышенный титр антител к ТГ чаще наблюдался у пациентов без аутоиммунных болезней. Достоверная разница (p <0,05) была получена при визитах № 2, 3, 4. Средний титр антител к ТГ в группах сравнения был выше нормальных значений, однако достоверно ниже уровень данных аутоантител был отмечен у пациентов, имевших заболевания аутоиммунного генеза, по сравнению с лицами без них (p <0,05).

При всех визитах большинство больных с заболеваниями аутоиммунного генеза имели титр антител к ТПО выше нормальных значений. Однако количество пациентов с повышенным титром антител к ТПО, не страдавших аутоиммунными заболеваниями, колебалось. Вероятно, поэтому достоверной разницы в отношении повышенного титра антител к ТПО у больных АИТ с наличием или отсутствием заболеваний аутоиммунного генеза не получено при визитах № 1, 2, 4 (р >0,05). Исключение составляет визит № 3, где у пациентов с аутоиммунными заболеваниями достоверно чаще (р <0,05) встречались повышенные антитела к ТПО. В отношении высоты титра антител к ТПО наблюдалась обратная тенденция по сравнению с уровнем антител к ТГ. Титр данных антител был достоверно выше (р <0,05) у больных с сопутствующими заболеваниями аутоиммунного генеза.

Нам кажется, что наличие повышенного титра антител к тиреоглобулину является результатом компенсаторных механизмов организма, так как его количество зависит от числа стимулированных рецепторов к ТТГ, а, по данным литературы, увеличение ТГ в рамках компенсаторной реакции на йодную недостаточность отмечено в эндемичных зонах. Наши результаты также подтверждают эту теорию. Мы обнаружили, что повышенный титр антител к ТГ достоверно чаще обнаруживался именно у пациентов без гипотиреоза. Интересен и тот факт, что у наблюдаемых нами пациентов с сопутствующими аутоиммунные заболевания имелся более низкий титр антител к ТГ, а именно у таких пациентов достоверно чаще встречался и гипотиреоз.

Развитие увеличенных размеров ЩЖ при АИТ, возможно, тоже является компенсаторным механизмом для предотвращения гипотиреоза. При гистологическом исследовании гипертрофической формы ЩЖ обнаруживают очаги компенсаторной регенеративно-гиперпластической метаплазии фолликулярных структур, также появляются очаги гипертрофии, гиперплазии, сосочковой пролиферации тиреоцитов. В литературе существует много указаний, что уровень антител к ТГ зависит от массы ЩЖ, поэтому вполне логично, что гипертрофическая форма АИТ сочетается с повышенным титром антител к ТГ, что выявлено в нашей работе.

В процессе течения АИТ происходит формирование так называемых псевдоузлов в ткани ЩЖ, которые являются доброкачественными коллоидными узлами.

Мы обнаружили, что формирование узлов достоверно чаще отмечено у пациентов с повышенным титром антител к ТГ и при наличии сопутствующих аутоиммунных заболеваний.

Наличие узлов по сравнению с их отсутствием достоверно чаще ассоциировалось с повышенным титром антител к ТГ. Разница была статистически достоверна при всех визитах к врачу (р <0,05). Повышенные антитела к ТПО более часто встречались при АИТ без узлообразования. Разница была достоверна при визитах № 1, 3, 4 (p <0,05). Отсутствие достоверности может быть вызвана малым количеством больных в группах. Полученные нами результаты также аналогичны исследованию J. Takamatsu, который выявил корреляцию между уровнем антител к ТГ и узлообразованием в ЩЖ.

Наличие антител к ТПО в плазме больного АИТ, по данным литературы, коррелирует со степенью повреждения ЩЖ. Результаты нашей работы также позволили предположить, что наличие антител к ТПО является показателем активности деструктивных процессов в ЩЖ. Мы обнаружили, что у пациентов с повышенным титром данных антител чаще развивается гипотиреоз, причем достаточно быстро. В группе наблюдаемых нами больных у 63 из 85% произошло развитие гипофункции ЩЖ в течение трех лет.

С данным тезисом согласуется и тот факт, что при увеличенном титре антител к ТПО достоверно чаще наблюдается неизмененный объем ЩЖ, тенденция к уменьшению ее размеров, чем при гипертрофии железы. Однако разницы между пациентами с неизмененным объемом ЩЖ и лицами, имеющими тенденцию к ее атрофии, не была получена. Возможно, это связано с тем, что мы наблюдали пациентов недостаточно долго и, возможно, у лиц с повышенным титром антител к ТПО патологический процесс не привел еще к уменьшению размеров ЩЖ.

В пользу предположения, что антитела к ТПО являются отражением деструктивных процессов, протекающих в ЩЖ при АИТ, говорят и следующие результаты нашей работы. Мы обнаружили, что более высокий титр антител достоверно чаще встречается при наличии сопутствующих заболеваний аутоиммунной природы. Именно у больных с такими заболеваниями достоверно чаще встречается гипотиреоз при неизмененном объеме ЩЖ или с тенденцией к уменьшению ее размеров.

В нашей работе мы получили результаты, которые позволили нам думать, что наличие сопутствующих аутоиммунных заболеваний является плохим прогностическим признаком. Данное предположение основано на том, что у пациентов с такого рода болезнями достоверно чаще встречался гипотиреоз и происходило узлообразование в ЩЖ. Более того, мы обнаружили, что у подавляющего большинства пациентов с гипотиреозом (более чем 90% пациентов) имелись различные заболевания аутоиммунного генеза. В то же время увеличенный объем ЩЖ наблюдался у пациентов, не страдающих сопутствующими заболеваниями аутоиммунного генеза, также у данных пациентов реже развивался гипотиреоз.

Наличие заболеваний, которые не имеют аутоиммунной природы (в нашей работе это артериальная гипертензия нескольких степеней тяжести и стадий, имеющая различный генез; ишемическая болезнь сердца и язвенная болезнь желудка), не влияет на исход АИТ, то есть на формирование гипотиреоза, образование узлов или изменение объема ЩЖ.

Нам кажется, что выявление факторов прогноза протекания АИТ имеет большое клиническое значение. Данные знания позволят врачам прицельно наблюдать и контролировать функцию ЩЖ у лиц, имеющих неблагоприятные факторы прогноза. По результатам нашей работы такими факторами являются наличие сопутствующих заболеваний аутоиммунного генеза и повышенный титр антител к ТПО.

До последнего времени профилактикой избыточного натяжения были различные способы мобилизации краев операционной раны, перемещения лоскутов и свободная пересадка кожи или свободная пересадка лоскута на микрососудистых анастомозах. Большое внимание также уделялось математическому, векторному расчету при формировании лоскута с учетом топографической особенности строения сосудов в области пересадки.

Степень натяжения краев операционной раны при ушивании напрямую зависит от опыта хирурга и его таланта в отношении «чувства тканей». Были проведены попытки сравнительной оценки силы натяжения краев раны при ушивании с помощью динамометра при работе различных хирургов. Однако до настоящего времени нет объективной оценки степени натяжения краев операционной раны.

Для решения этой задачи мы провели ряд экспериментальных исследований, позволивших дать определение термина «избыточное натяжение краев операционной раны» в качестве одной из причин атипичного (патологического) рубцевания, а также выявить положительное воздействие препарата Meso-Wharton P199 на заживление операционной раны, активными составляющими которого являются дермахил, лифтин, ЕDР-3, IDP-5, реджулин.

При измерении исходного или базового микрокровотока у всех животных средний показатель составил 12±1,7 у.е. (условная единица микрокровотока). Предоперационное исследование микрокровотока проведено на 200 точках измерения.

После определения базового микрокровотока проводили рассечение кожи и подкожной жировой клетчатки до мышечной фасции. Сразу после разреза отмечали увеличение значений микрокровотока на 2,7±0,3 у.е. После точечной коагуляции накладывали лигатуру в центре латерального края раны и проводили натяжение края операционной раны до снижения уровня исходного микрокровотока, кратного 1 у.е. (табл. 3-11).

Натянутый латеральный край операционной раны, нависающий над медиальным краем, отсекали по границе медиального края. При этом из-за различной силы натяжения краев получали раны различной ширины (рис. 3-3).

Рану ушивали отдельными узловыми швами Пролен 4.0 через край до полного сопоставления без дополнительной мобилизации краев операционной раны.

Изучение микроциркуляции в краях операционной раны при заживлении и формировании рубца в задачу эксперимента не входило.

После наложения швов рану обрабатывали асептическим раствором, накладывали стерильную повязку. Животных из эксперимента не выводили и наблюдали в сроки до 2 мес.

В ходе наблюдений при проведении эксперимента было отмечено, что при снижении значений исходного микрокровотока на коэффициент, равный 1,2, заживление операционной раны первичным натяжением не происходило (р ≤0,5), то есть при исходном значении микрокровотока 12±1,7 у.е. значение критической ишемии, при котором невозможно заживление первичным натяжением, составило — 12 у.е. (±1,7) : 1,2 = 10 у.е. ( ±1, 7) (рис. 3-4, 3-5).

В послеоперационном периоде отмечали расхождение краев операционной раны и прорезывание швов. Этим животным после более широкого удаления волосяного покрова проводилось местное лечение с пластырными стягивающими повязками.

Получение патологических рубцов в эксперименте практически невозможно, поэтому мы изучали только тот аспект, заживет рана или нет.

Следует отметить, что мы старались распределить различные по площади иссечения операционные раны у разных животных. У одного животного было 4 послеоперационные раны, заживающие вторичным натяжением. Длина разреза составила 2 см; расстояние между разрезами — 1 см.

После заживления операционной раны вторичным натяжением в сроки до 2 мес формировались атрофические рубцы, малозаметные после восстановления окружающего рубец оволосения.

Таким образом, экспериментальным путем было получено значение критической ишемии края операционной раны, при котором заживление раны невозможно первичным натяжением. Коэффициент снижения микрокровотока составил 1,2 (р ≤0,5). К примеру, если исходное значение микрокровотока составило 12 у.е., избыточным натяжением краев раны будет усилие, снизившее микрокровоток до 10 у.е. и более. Ушивая рану при таком натяжении, получить первичное заживление раны не представляется возможным.

Предложенный способ измерения исходного микрокровотока и микрокровотока в результате натяжения краев операционной раны позволяет охарактеризовать значение (критерий) степени избыточного натяжения. Избыточное натяжение — это натяжение, снижающее исходный микрокровоток на коэффициент, равный 1,2.

Проведенная экспериментальная работа явилась начальным этапом изучения избыточного натяжения краев операционной раны как главной «хирургической» причины патологического рубцевания.

Результаты предварительного введения в 1/2 длины зоны последующего разреза раствора препарата Meso-Wharton P199 изучали, наблюдая за заживлением послеоперационной раны первичным натяжением (100 наблюдений; группы животных: 1–5). К 7–9-м суткам после операции, после снятии швов, макроскопически отмечали различие в качестве формирующегося рубца. В той половине операционного рубца, куда был введен раствор препарата Meso-Wharton P199, отмечался более тонкий, нежный и бледный рубец по сравнению с другой частью рубца, куда пептиды введены не были.

Подтвердив положительное влияние препарата Meso-Wharton P199 на заживление раны в эксперименте, было решено изучить механизмы воздействия пептидов на клеточные структуры кожи человека, анализируя результаты с помощью гистологического и гистохимического методов, о чем будет сказано ниже.

Таким образом, проведенный эксперимент на кроликах показал высокую информативность лазерной доплерометрии аппаратом «Лазма» при определении степени избыточного натяжения краев операционной раны и доказал возможность улучшения процесса заживления с помощью использования пептидов.

В доступной медицинской литературе нам не удалось найти исследований, посвященных нормам значений микроциркуляции в различных анатомических областях человеческого тела. Множество факторов (возраст, пол, экологическая обстановка места проживания, курение, сопутствующие заболевания и др.) определяют значение микроциркуляции в данной конкретной анатомической области у данного конкретного больного. Вот почему индивидуальная лазерная доплерометрия в данной конкретной области позволяет, получив значения исходного кровотока, прогнозировать послеоперационное рубцевание.

В клинической практике мы изучили изменение микрокровотока во время операции на различных отделах туловища. Исследование проведено у 9 больных, госпитализированных в отделение микрохирургии РНЦХ за период с 01.01.2012 по 01.01.2016 с вентральной грыжей и абдоминоптозом. По окончании операции абдоминопластики фиксировали датчик «Лазма» на коже, отступив 1,5–2 см от края раны в средней части. Измеряли значение микроциркуляции. Накладывали временную лигатуру на середину краев операционной раны. На рис. 3-6 - 3-8 показаны этапы измерения микрокровотока.

В отдаленном периоде у всех больных отмечен нормотрофический рубец.

Задачей данного раздела работы явилось практическое подтверждение высказанной гипотезы о связи келоидного рубца с гипотиреозом.

Для решения этой задачи были проанализированы отдаленные результаты изолированной хирургической коррекции келоидных и гипертрофических рубцов у 173 пациентов (1-я группа больных), находившихся на лечении в отделении микрохирургии РНЦХ. Период наблюдения — 22 года (1990–2012). Была составлена анкета-опрос, предусматривающая приглашение больных на обследование в клинику. В случае невозможности приезда мы просили подтвердить адрес места жительства, электронную почту для более плотного контакта с больным и для проведения дистанционной консультации. В случае уточнения диагноза «гипотериоз» после согласования с лечащим врачом по месту жительства рекомендовали разработанную нами схему лечения и наблюдали результаты по электронным фотографиям.

Учитывая тот факт, что высказанная нами гипотеза «келоид–симптом» датируется 2012 г., с этого времени перед лечением келоида мы проводили лекарственную коррекцию гипотиреоза и АИТ (2-я группа больных). Также перед любой операцией, проводимой в отделении микрохирургии, мы обследовали больных на предмет этих двух состояний (заболеваний) и при их наличии корригировали состояние в предоперационном периоде. В результате этого мы не отметили патологического рубцевания операционной раны ни в одном из наблюдений в отдаленном послеоперационном периоде с 2012 г.

R.R. Hall в результате экспериментальных исследований обнаружил, что кровопотери при электрорезекции печени уменьшаются на 40% по сравнению с теми операциями, когда для разрезания ткани использовали стальной скальпель. О хорошем гемостазе при электрохирургических способах оперирования известно с середины прошлого века. Электрокоагуляция применяется и в современной эстетической медицине. Наряду с достоинствами данного метода оперирования существуют и недостатки. Ясно, что во многих случаях добиться хорошего гемостаза только путем электрокоагуляции бывает невозможно и зияющие сосуды среднего и более крупного калибра необходимо перевязывать во избежание вторичных кровотечений. Вторичные кровотечения могут быть вызваны повышением кровяного давления, отторжением коагулированной ткани, рассасыванием тромба. Они могут возникать на 2-й и даже 3-й неделе после операции. Другим авторам также не всегда удается получить надежный гемостаз во время операции при использовании электрохирургических аппаратов.

Существуют и другие проблемы в электрохирургии: возможность воздействия электрического тока на органы и ткани, удаленные от места приложения активного электрода, ожоги при слабом контакте между кожей и электродом, отсутствие возможности осуществлять контроль за глубиной повреждения тканей, отсутствие видимой границы между коагулированными и необработанными тканями, осаждение коагулированных тканей на рабочей поверхности электрода, искрение электрического тока на концах электродов, которое может вызвать взрыв в операционной при насыщении ее газообразными веществами, невозможность эффективного проведения одновременно резания и коагуляции при обработке обширных раневых поверхностей.

Неоднозначные мнения об электрохирургических аппаратах подтверждают отсутствие полной удовлетворенности от их применения, что подталкивает, с одной стороны, к продолжению работ по улучшению этих приборов, а с другой — на поиски более эффективных физических способов диссекции и коагуляции.

Наиболее перспективным направлением совершенствования таких аппаратов является увеличение максимального рабочего высокочастотного напряжения с обычных 2 до 5–7 кВт, что позволяет реализовать режимы струйной коагуляции (spray coagulation). Созданы аппараты Erbotom АСС фирмы Erbe (Германия), Aspen Excalibur, Concept 9900, Valleyab Force (США) и др. Однако, несмотря на повышение эффективности коагуляции, при струйных режимах сохраняются весьма существенные недостатки.

Не так давно появилась технология аргоноусиленной коагуляции (АУК), которая представляет собой усовершенствованный метод струйной коагуляции за счет пропускания потока аргона вокруг разрядной траектории прохождения коагулирующего высокочастотного тока. Как и в других электрокоагуляторах, ток высокой частоты коагулирует и разрезает, а поток аргона устраняет кровь и частицы тканей, загрязняющих рану во время электрокоагуляции.

Благодаря своей инертности аргон не вызывает в тканях изменений, устраняет из них кислород, препятствуя сгоранию и обугливанию тканей во время коагуляции. Инертный газ подается со скоростью 2–7 л/мин одновременно с электрическим током. Высокочастотное электрическое напряжение (или же электромагнитные волны), проходя через аргоновое пространство, вызывает ионизацию атомов аргона. При этом наблюдается голубое свечение. Некоторые ошибочно считают этот инструмент аргоновым лазером. На самом же деле коагуляция и рассечение являются результатом действия электрического тока. Струя аргона препятствует обугливанию тканей и очищает рану во время коагуляции, позволяя уменьшить участок некроза. При этом улучшается видимость тканей во время резекции и коагуляции и тем самым снижается опасность повреждения магистральных сосудов. Данным методом качественно коагулируются сосуды диаметром меньше 2 мм.

На данный момент в мире производят 3 типа электрохирургических аппаратов с режимом АУК: Birtcher Argon Coagulator (США), Beacon Beamer (США), Erbe Beamer One (Германия). И даже такая передовая техника, как АУК-системы, не лишена ряда недостатков, среди которых следует отметить следующие: несинхронное начало обдува раневой поверхности аргоном и момента появления коагулирующего высокочастотного тока, то есть в течение определенного отрезка времени газ обдувает открытые сосуды без одновременной их коагуляции, что может привести к газовой эмболии; метод АУК не может обеспечить рассечения тканей и эффективной деструкции патологических тканей; при работе АУК-системы поток аргона может способствовать распространению опухолевых клеток и вирусов.

Из-за указанных недостатков аргоновый коагулятор не получил широкого распространения и используется в основном как вспомогательное средство в целях коагуляции при других способах выделения анатомических структур или патологических образований.

Наиболее широкое распространение в различных областях хирургии получило применение энергии лазера. При взаимодействии лазерного излучения с биологическими тканями наблюдается целый ряд эффектов: термический — благодаря избирательному поглощению квантов света; возникновение волн сдавления и упругого удара в среде; действие сильных электромагнитных полей, которыми сопровождается в ряде случаев лазерное излучение.

Термический эффект имеет важное значение в характеристике повреждения биологических тканей из-за высокого содержания в них воды, особенно при действии излучения в красной и инфракрасной областях спектра, так как поглощение в этой части спектра зависит от содержания воды в ткани.

Благодаря высокой температуре лазерного излучения межтканевая и внутриклеточная жидкости быстро испаряются, а затем сгорает сухой остаток. Дистрофические изменения тканей при воздействии различных видов лазерного излучения зависят как от их спектральных данных, так и от суммарной энергии (продолжительности воздействия) излучения. При небольших воздействиях разрушению подвергаются лишь поверхностные слои тканей. Последовательное увеличение времени действия излучения приводит к росту объема поврежденных тканей вплоть до перфорации органа. Перенос лазерного луча в продольном или поперечном направлении ведет к испарению тканей и формированию линейного разреза органа. В области термического некроза наблюдается коагуляция стенок сосудов и крови с образованием коагуляционного тромба, который закрывает просвет сосуда, ответственного за нормальный гемостаз.

Современная лазерная хирургическая техника предоставила возможность выбирать длину волны рабочего излучения и временной режим работы (непрерывный, импульсный или импульсно-периодический), которые позволяют поднять эффективность рассечения и абляции, а также оказывать максимально щадящее воздействие на мягкие ткани.

Наибольший практический интерес представляют аппараты, работающие на излучении с длиной волны 0,97 мкм, которые способны проникать в ткани на глубину около 2 мм и обеспечивать оптимальное сочетание режущих и коагулирующих свойств. Именно такие аппараты в настоящее время активно применяют в пластической хирургии и косметологии.

А.С. Каспаров в своем исследовании обнаружил, что излучение диодного лазера с длиной волны 1,9 мкм и мощностями 1, 2, 3 Вт при воздействии на слизистую оболочку рта вызывает в основном абляционный эффект. Происходит поверхностный некроз эпителиального слоя с вовлечением верхнего слоя мышечной ткани. Подобное действие оказывает диодный лазер при работе с длиной волны 0,97 мкм в импульсно-периодическом режиме с мощностью 2 Вт. Было найдено, что воздействие излучения диодного лазера при длине волны 0,97 мкм в непрерывном режиме с мощностью 4 Вт и в импульсно-периодическом режиме при частоте 1000 мс с мощностью 4 Вт оптимально. Достигался эффект скальпеля с образованием резаной раны, которая заживала к 10-м суткам от начала эксперимента.

С эрбиевым лазером активно работают в эстетической медицине. Обнаружено, что энергия эрбиевого лазера поглощается водой более эффективно, чем, например, энергия углекислого лазера, что позволяет регулировать в большем диапазоне глубину коагуляции и, следовательно, предоставлять более широкий спектр процедур.

К сожалению, лазерные технологии имеют не только положительные характеристики, но и недостатки, поэтому широкого применения для рассечения кожи они пока не получили. Одной из них является техническое несовершенство данных аппаратов: они громоздки, обладают малой маневренностью, имеют неудобный жесткий световод. Для работы с ними необходимо использовать дополнительное оборудование, требуются специальная электропроводка и водоснабжение. Стоимость таких лазерных установок большая. Все это приводит некоторых авторов к заключению о технической ненадежности лазерных установок данного типа и сдерживает внедрение лазеров в широкую хирургическую практику.

На основании данных литературы можно заключить, что непрерывное совершенствование лазерных аппаратов, разнообразные способы их применения, поиски наиболее оптимальных вариантов воздействия существующих лазеров на различные органы, создание новых типов лазерных приборов, а также противоречивая информация об эффективности и целесообразности применения лазеров в хирургии, несмотря на многолетнее их использование, свидетельствуют о том, что многие проблемы в этом разделе хирургии еще не решены и требуют дальнейшего изучения.

Интересные сообщения о плазменных потоках стали появляться с середины 1980-х гг. Это стало реальностью после создания специальных аппаратов — микроплазмотронов, в которых путем воздействия электрического поля на инертный газ получают плазменную струю. Она позволяет осуществлять как разрез, так и коагуляцию тканей. Первые экспериментальные работы по использованию энергии физической плазмы в хирургии были начаты в 1960-е гг. в США. Тогда же созданы установки (плазмогенераторы) типа Mark. «Плазменные скальпели» предназначались для использования в хирургии, но из-за малой мощности приходилось долгое время действовать плазменным потоком на ткани для получения желаемого эффекта, что вызывало сильный тепловой перегрев и разрушение тканевых и клеточных структур. По этой причине методы плазменной хирургии не использовались активно в клинической практике.

Все плазменные аппараты, применяемые в хирургии, подразделяются на 2 группы: с 2-электродной схемой построения плазмотрона и 3-электродной схемой. Имеются и другие существенные различия в технических характеристиках: в температуре и мощности плазменной струи, по расходу плазмообразующего газа, диаметру выходного отверстия сопла плазмотрона и др. Именно эти отличия позволяют по-разному воздействовать на ткани. Изучение возможности применения плазменных потоков в хирургии выявило 3 вида воздействия их на ткани: диссекцию, деструкцию и коагуляцию.

Механизм диссекции и деструкции один и тот же — это испарение участка тканей, но разница состоит в том, что при диссекции испаряется узкая полоска тканей, как правило, не более 0,3–1,5 мм, а в процессе деструкции испарение носит более значительный характер и по площади участка тканей может представлять собой патологический очаг (метастазы, паразитарные кисты, туберкулезные очаги и т.д.). Главным преимуществом перед другими физическими способами рассечения и коагуляции, по мнению авторов, является тот факт, что кровь, имеющаяся в ране, не является препятствием для воздействия плазменного потока на ткани. Наиболее наглядно это видно при операциях на паренхиматозных органах.

Впервые струйный скальпель был предложен D.N. Papachristou, и он успешно применяется в некоторых клиниках. В основе его работы лежит подача струи жидкости под большим давлением (8–300 кг/см²) через трубку с небольшим диаметром (0,1–0,5 мм). Под действием этой струи клетки отрываются от сосудистого остова. Сосуды диаметром меньше 0,2 мм рвутся, более крупные сосуды открепляются без повреждения. Мелкие сосуды коагулируются, а крупные соединяются. Для воздействия на нормальную паренхиму достаточно давления струи в 12–20 кг/см².

Использование ультразвука занимает особо значимое место среди физических методов диссекции и коагуляции. Ультразвуковые волны начали применять в качестве скальпеля с конца 1970 г. Многие авторы отмечали хороший гемостатический эффект при применении ультразвукового скальпеля и его меньшую травматичность по сравнению с традиционными методами. Ряд авторов предлагали снизить усилие, прилагаемое для резания, в 6–9 раз, замечая увеличение производительности диссекции в 8–12 раз.

По мнению В.А. Полякова и В.С. Борисова, главное достоинство ультразвуковых хирургических методов заключается в их универсальности и биологической целесообразности, так как они могут быть использованы для рассечения и соединения всех тканей живого организма. Подавляющее большинство приведенных выше сведений о результатах применения ультразвуковой техники при выполнении оперативных вмешательств основаны на экспериментальных данных. Клинических исследований по рассматриваемому вопросу явно недостаточно, и полученные данные порой противоречивы. Так, ряд исследований показывает, что по сравнению с лазером и электрокоагулятором при работе ультразвуком значительно уменьшаются кровопотери. В противоположность этой информации в литературе имеются данные о том, что эта разница несущественна.

Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что единого мнения о морфологических изменениях тканей в зоне операции и течении репаративных процессов нет. Взгляды расходятся по глубине зон повреждения, выраженности воспалительных изменений, формирования демаркации нежизнеспособных тканей и времени заживления. Например, глубина повреждения при рассечении стенок желудка или кишки с помощью электроножа, по данным разных авторов, достигает от 250–300 мкм до 1470 мкм, а в отдельных случаях — до 2500 мкм.

Точных данных о глубине действия ультразвукового скальпеля не приводится. Есть информация о морфологических изменениях, которые имеют картину коагуляционного некроза. В.А. Поляков и Е.С. Борисов отмечают отсутствие какого-либо разрушительного ультразвукового воздействия на ткани до патологических изменений в них.

При использовании лазерного скальпеля существует подобная разница в оценках величины зоны коагуляционного некроза. Некоторые авторы сообщают о повреждении, равном всего лишь диаметру 2 клеток. По данным Ю.М. Гаина, коагуляционный некроз происходит на глубину от 35 до 180 мкм.

Подобные изменения в лазерной ране, имеющие, как правило, однонаправленное развитие, позволили некоторым авторам дать более точную характеристику второй зоны повреждения и назвать ее зоной бокового некроза. Эти данные проясняют тактику как во время операции, так и в послеоперационном периоде. Наличие выраженного воспаления со значительной лейкоцитарной инфильтрацией тканей при использовании электроножа и ультразвукового скальпеля отмечается многими авторами. Причем такие изменения происходят долгое время (от 30–60 сут до 5–6 мес) и создают препятствие на пути репарации.

С.Е. Кулешов и K.G. Tranberg объясняли появление демаркационного вала и лейкоцитарной инфильтрации микробным обсеменением тканей нежизнеспособной зоны, которая появляется к концу 1-й недели после операции за счет длительных нарушений кровообращения. Подобные результаты были получены и А.И. Нечаем, который видел лейкоцитарную инфильтрацию в лазерных ранах на 6–9-е сутки.

Высокотемпературный плазменный поток не приводит к возникновению ран с резко выраженными и продолжительными воспалительными изменениями. Это объясняется более локальным термическим повреждением по сравнению с другими физическими способами воздействия.

По мнению некоторых авторов, особенностью течения процессов заживления лазерных ран, а также ран, полученных при использовании плазменного потока, является не отторжение, а постепенное прорастание и замещение коагуляционного струпа. При этом быстрый рост новых клеток отмечают на 4–5-е сутки после операции.

Не все авторы наблюдали спокойную картину регенерации. На фоне воспалительных процессов в области операции в некоторых случаях отторгались некротические массы в первые 4–7 сут. Порой это сопровождалось образованием микроабсцессов в этой зоне. Восстановительные процессы начинались только после лизиса некротических масс, а зрелая соединительная ткань появлялась только к 45–60-м суткам.

W.L. Maness и F.W. Roeber в ходе изучения воздействия на живые ткани электрической энергией разной частоты в 1978 г. обнаружили, что максимально эффективной частотой использования электротока при разрезах и коагуляции биологических тканей является частота в 3,8 МГц. И поскольку на данной частоте (волне) работает радио, приборы, создающие частоту радио и использующиеся в хирургии, стали называть радиоволновыми.

Радиоволновые инструменты выделяются из целого ряда высокотехнологичных скальпелей положительными характеристиками: минимальное поражение тканей в области разреза, активное заживление ран без образования грубых рубцов, коагулирование мелких сосудов, а также сокращение сроков хирургического вмешательства.

Механизм действия радиоволны на биологическую ткань представляется современными авторами следующим образом: радиоволна высокой частоты, исходя из генератора через активный электрод, направляется к нейтральному электроду — антенне, где встречает сопротивление клеток, мгновенно увеличивает в них давление и нагревает их. На следующем этапе внутриклеточная жидкость вскипает и разрывает клеточную мембрану. При кипении формируются мелкие пузырьки пара, которые, раздвигая ткань перед радиоволной, реализуют коагулирующий эффект. Радиоволны уже при приближении к поверхности ткани начинают свое действие практически бесконтактно.

Важной особенностью радиоволновых приборов является их температура — во время операции электрод остается холодным, что отличает его от лазерного луча и электрохирургического скальпеля. Именно это обстоятельство позволяет не вызывать заметного ожога окружающих тканей и тем самым способствует хорошему и быстрому заживлению раны.

Наиболее часто радиоволновая энергия применяется в челюстно-лицевой хирургии. Наличие нескольких режимов работы позволяет выполнить самые разные хирургические манипуляции. Для проведения поверхностных операций используют режим «Разрез». И хотя данный режим не позволяет коагулировать сосуды, он сохраняет стерильность раны и абластичность вмешательства. Режим «Коагуляция» применяют для остановки кровотечений, а «Разрез + коагуляция» используют при проведении операций в глубоко расположенных тканях и образованиях.

Радиоволновые хирургические приборы могут генерировать 4 вида волн.

Режимы могут использоваться как последовательно в ходе одной операции, так и как самостоятельный метод хирургии. Важно знать и помнить, что при всех используемых монополярных режимах обязательно применение нейтрального электрода-антенны, который представляет собой изолированную в пластике металлическую пластину. Ее кладут под одежду пациента или под пеленку на операционный стол под область оперирования (под лопатку, ягодицу, бедро, голень).

Многие авторы отмечают следующие положительные качества радиоволновых приборов: простоту работы на аппаратах, легкую обучаемость хирурга, небольшую стоимость аппаратуры (радиоволновый излучатель стоит на порядок меньше лазерного), сокращение времени проведения лечения, отсутствие необходимости в специальном оборудовании операционной, высокую безопасность использования как для больного, так и для персонала.

Противопоказанием к лечению с помощью радиоволн является наличие у пациента кардиостимулятора, который при радиоволновой нагрузке может менять ритм работы сердца. В таких случаях необходима консультация кардиолога.

Широкое применение радиоволновая технология нашла в дерматологии и косметологии. Дерматологи, которые удаляют доброкачественные новообразования лица и тела, отмечают, что радиоволновая хирургия является наиболее прогрессивным методом при этой патологии. Она может применяться амбулаторно, обеспечивает максимальную безопасность при отличных косметических результатах. Кроме того, радиоволновая методика удаления опухолей кожи малотравматична, вызывает быструю регенерацию тканей и заживление с минимальным рубцеванием.

Авторы считают, что для удаления доброкачественных новообразований кожи радиоволновая методика является предпочтительной в сравнении с обычным скальпелем, лазером, электрокаутером и криовоздействием, так как она не вызывает сильных повреждений окружающих разрез тканей, уменьшает частоту послеоперационных осложнений и число рецидивов заболевания.

Недавно появился революционный метод безоперационной подтяжки кожи и лечения морщин лица и шеи с помощью радиоволны. В его основе лежит разогревание слоев кожи и расположенной глубже соединительной ткани. Для работы используют специальные насадки на аппарат «Сургитрон DF120 S5». После воздействия радиоволн кожные складки на лице становятся менее глубокими и незаметными. Такой лифтинг применяется с целью эстетической коррекции.

Радиоволновая хирургия нашла применение и в челюстно-лицевой хирургии. Так, в работе В.А. Макуха предложено использовать радиоволновой скальпель в сочетании с подкожным введением и фракционным диализом перфторана, что позволяет после операции накладывать на вторично-гнойные раны лица первичные, первично-отсроченные или ранние вторичные швы, приводящие к заживлению первичным натяжением с образованием тонкого незаметного рубца, обеспечивая тем самым достижение прекрасных косметических и функциональных результатов лечения.

Морфологическое исследование состояния ран в челюстно-лицевой хирургии с использованием простого и радиоволнового скальпелей обнаружило преимущества использования последнего: более слабое травматическое повреждение тканей, небольшая воспалительная реакция в области раны и образование нежного соединительнотканного рубца.

Как видно из приведенных данных, радиоволновая хирургия является перспективным направлением и может применяться в различных областях медицины.

Для сравнения воздействия на кожу различных радиоволновых приборов были проведены экспериментальные исследования.

Экспериментальную часть работы проводили на базе кафедры патологической анатомии имени академика А.И. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

В нашем исследовании использовали радиоволновые приборы, представленные сегодня на российском рынке:

Для получения абсолютно объективных данных было запланировано двойное слепое исследование по изучению степени воздействия радиоволн различной частоты на кожу и мягкие ткани крыс с гистологической оценкой степени повреждения тканей и сроков заживления раны. С этой целью каждый тип хирургического ножа был закодирован для исследователей.

Эксперимент осуществили на 45 крысах породы Vistar весом 250–300 г (средний вес — 274,6±19,3 г). Животных разделили на 3 группы по 15 крыс, группы пронумерованы в зависимости от типа хирургического ножа: 1-я, 2-я, 3-я.

Перед операцией животных обезболили подкожным введением 10% кетамина и 2% ксилазина в соотношении 3/1 в дозе 0,2 мл/100 г массы тела. Крыс фиксировали и в стерильных условиях выполняли по 4 разреза кожи и подкожной клетчатки длиной 1,5 см в определенных зонах поверхности спины. С помощью высокочастотных радиоволновых ножей разных производителей выполняли 3 разреза и 1 разрез — скальпелем, затем все раны зашивали викрилом 4/0.

Через 3, 7 и 14 сут по 5 животных в каждой группе выводили из опыта передозировкой наркорена. Для проведения гистологического исследования области кожи и подкожной клетчатки с ранами вырезали участки размером 2×3 см и помещали в 10% раствор нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического заключения.

Для иммуногистохимического исследования готовые срезы переносили на высокоадгезивные стекла и сушили при температуре 37 °С в течение 18 или 2 ч при температуре 50 °С. После снятия парафина со срезов с помощью ксилола анализируемые образцы тканей регидратировали последовательно в спиртах 95, 80, 70°, выдерживая в каждом растворе по 3 мин. Антигенную активность восстанавливали инкубацией срезов в PT Link (Dako) при температуре 97 °С в течение 15 мин в 10-мм цитратном буфере рН 6,0. Затем срезы охлаждали в буфере PBS в течение 20 мин и помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов), где проводили 15 мин реакцию с 3% раствором перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы.

Для проведения реакции с антикрысиными антителами к коллагену I и III типов проводили дополнительное выдерживание срезов в ферментном растворе Pronase reagent (Gene Tex, USA) в течение 10 мин при комнатной температуре. Кроме того, для блокирования неспецифического белкового взаимодействия на срезы наносили белковый блок (Thermo scientific, USA) на 10 мин. Затем, не промывая срезы буфером, проводили реакцию с первичными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре.

В работе были задействованы антитела к Ki-67 (1:100) — кроличьи антикрысиные моноклональные, клон SP6 (Abcam, UK), CD34 (1:100) — кроличьи антикрысиные моноклональные, клон EP373 Y (Abcam, UK), Col I (1:200) — мышиные антикрысиные моноклональные, клон COL-1 (Abcam, UK), Col III (1:600) — мышиные антикрысиные моноклональные, клон FH-7A (Abcam, UK). Чтобы увидеть места связывания антител с антигенами, выбрали набор Histofine Simple Stain Rat MAX PO(MULTI) (Nichirei Biosciences Inc., Япония), созданный для проведения иммуногистохимического (ИГХ) анализа ткани крыс. Конечным продуктом проведения ИГХ-реакций было появление водонерастворимого осадка коричневого цвета, который образовывался в результате окисления субстрата 3,3-диаминобензидина пероксидазой хрена.

Для адекватной трактовки результатов ИГХ-анализа проводили положительные и отрицательные контрольные реакции. Отрицательными контролями служили образцы исследуемых срезов, которые проходили стандартную методику ИГХ-анализа, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. ИГХ-анализ завершали контрастированием срезов гематоксилином и заключением их в синтетическую среду Shandon mount^TM (USA).

Гистологические изменения в ткани крыс, произошедшие во время заживления ран, оценивали на срезах, которые были окрашены гематоксилином и эозином, по следующим критериям: во-первых, выраженность повреждения в виде некроза ткани; во-вторых, кровоизлияние; в-третьих, воспалительная реакция на рассечение (лейкоцитарная инфильтрация); в-четвертых, неоангиогенез; в-пятых, репарация эпителия и соединительной ткани.

Данные изменения давали возможность понять, на какой стадии репаративного процесса находилась кожная рана, а именно:

Репаративные процессы были проанализированы также с помощью ИГХ-методов на серийных парафиновых срезах. Сопоставление уровней экспрессии белков коллагена I и III типов, а также других гистоморфологических параметров (наличие воспалительной реакции, ангиогенез и т.д.) проводили с помощью полуколичественного метода оценки интенсивности окрашивания препаратов (бальная система счета) диаминобензидином. При слабой окраске экспрессия маркера оценивалась в 2 балла, при умеренной — 4, при высокой — 6, при очень высокой — 8. Для оценки уровня экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67 в тканях в зоне регенерации раны считали процент положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток в нескольких полях зрения. Для полного анализа полученных данных результаты обрабатывали с помощью статистических методов для малых выборок с помощью критериев Манна–Уитни и Стьюдента.

Операции проводили при помощи радиоволнового хирургического аппарата «Сургитрон ЕМС».

«Сургитрон ЕМС» производства фирмы Ellman International (США) был сертифицирован и разрешен к применению в России с 1995 г. Прибор может работать в 4 режимах: «Разрез», «Коагуляция», «Разрез + коагуляция», «Фульгурация» для рассечения и коагуляции мягких тканей. Активным электродом служили проволочные петли в виде кольца, треугольника, вытянутой петли, шариковый коагулятор. Прибор состоит из собственно генератора, панели управления, нейтрального электрода-антенны и набора активных электродов. Режимы работы прибора зависят от целей воздействия на ткань. Необходимо отметить, что частота радиоволны всегда постоянна и составляет 3,8 МГц, тогда как мощность волны на выходе различна и может меняться от 35 до 90 Вт (рис. 5-1).

Основные режимы работы аппарата «Сургитрон EMC»

Режим «Разрез» — полностью выпрямленная и фильтрованная волна, является непрерывным потоком высокочастотных волн, позволяющих ровно рассекать ткани с легкой поверхностной коагуляцией (на которую используется около 10% мощности). Этот режим рекомендован при разрезах или расслоении слоев кожи и слизистой оболочки, удалении новообразований на тонкой ножке, гиперкератозов, при пластических и косметических операциях на лице и шее (рис. 5-2).

При этом режиме работы прибора радиоволна производит мало вторичного бокового тепла и практически не вызывает нагревания окружающих тканей. В качестве активного электрода обычно используется тонкая вольфрамовая проволока в виде иглы, овала, кольца, треугольника или ромба.

Режим «Разрез + коагуляция» — полностью выпрямленная волна (ректифицированная форма волны), помимо ровного разреза коагулирует капилляры и другие мелкие сосуды, что позволяет делать разрезы мягких тканей практически в «сухом операционном поле» (рис. 5-3).

Этот режим полезен для проведения глубоких разрезов ткани (кожа, слизистая оболочка, подкожная жировая клетчатка, мышцы, апоневрозы), рассечения хрящей носовой перегородки, гортани, ушной раковины, перешейка ЩЖ, отсечения аденоидной ткани, миндалины, при операциях на мягком нёбе. В качестве активного электрода используется скальпель с острым наконечником, петли различной формы, игла (Vary-Tip).

Режим «Коагуляция» — частично выпрямленная форма волны, которая применяется для остановки кровотечений как в ходе операций (прямая и непрямая коагуляция), так и в случае травматических повреждений тканей, при удалении телеангиэктазий (рис. 5-4).

Режим «Фульгурация» — переменный ток высокой частоты (волна искрового промежутка). Этот режим вызывает точечный ожог и обезвоживает мягкие ткани, что приводит к их разрушению и остановке кровотечения (рис. 5-5).

Используемые при этом шариковые или игольчатые электроды легко касаются кровоточащих участков и их коагулируют. В этом режиме возможно разрушение поверхностных кожных образований (базалиома, бородавка, кератома).

Обязательно применение нейтрального электрода-антенны при всех монополярных режимах. При биполярной методике воздействия (например, пинцетом с двумя изолированными браншами) нейтральный электрод-антенна не нужен. Один и тот же процесс может быть выполнен с помощью различных режимов работы прибора. Так, коагуляцию кровоточащего сосуда в ране можно осуществить путем прикосновения активного электрода в режиме «Коагуляция» (прямая коагуляция) или «Разрез + коагуляция».

В исследовании использовали радиочастотные ножи, представленные на российском рынке: высокочастотный радионож (1-я группа), широкополосный (2-я группа) и низкочастотный радионож (3-я группа).

Проведено гистологическое исследование заживления кожных ран на 3-и, 7-и и 14-и сутки со времени нанесения разрезов во всех 3 группах животных.

На серийных парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, рассматривали морфологические изменения по следующим параметрам:

Заживление кожных ран на 3-и сутки после разреза

На 3-и сутки после разреза морфологические изменения в ранах, полученных при использовании разных радионожей, имели отличительные черты. У животных 1-й группы (С) рана состоит из молодой грануляционной ткани с полнокровием сосудов, порой до возникновения кровоизлияний и обнаруживается лейкоцитарная инфильтрация в прилежащих тканях и начало эпителизации (рис. 5-6).

У животных 2-й группы (ФТ) рана выполнена сгустком крови, который заполняет тканевой дефект в зоне некроза тканей с перифокальной лейкоцитарной инфильтрацией и небольшими участками новой грануляционной ткани (рис. 5-7).

У животных 3-й группы (РС) наблюдали разнообразные морфологические изменения: у 80% рана состояла из новой грануляционной ткани с остатками сгустка крови и с началом эпителизации, а у 20% крыс этой группы рана была заполнена сгустком крови (рис. 5-8).

Особенности состояния раны в 1-й группе (С) животных отличаются меньшим повреждением тканей, прилежащих к краям разреза, менее выраженной сосудистой реакцией, характеризующейся лишь полнокровием сосудов и, как следствие, нежным или отсутствующим сгустком крови в ране к 3-м суткам восстановления ткани, что и делает возможным наступление более быстрой регенерации.

Заживление кожных ран на 7-е сутки после разреза

Морфологическая картина ран на 7-е сутки после рассечения ткани различными скальпелями у выведенных из эксперимента животных 1-й группы (С) характеризовалась тем, что рана состояла из зрелой грануляционной ткани, которая замещалась рубцом с малым количеством клеточных элементов и сосудов. Кроме того, поверхность ран была покрыта многослойным плоским эпителием (рис. 5-9). У животных 2-й (ФТ) (рис. 5-10) и 3-й (РС) (рис. 5-11) групп рана имела признаки очищения от сгустка крови и некротической массы. Образовалась молодая грануляционная ткань с неоангиогенезом и лейкоцитарной инфильтрацией.

Заживление кожных ран на 14-е сутки после разреза

Во время эксперимента на 14-е сутки после разреза у животных 1-й группы (С) чаще наблюдали признаки ремоделирования рубцовой ткани, которая была в виде очень тонких тяжей без образования грубого рубца (рис. 5-12). У животных 2-й (ФТ) и 3-й (РС) групп к этому сроку рана представляла собой зрелую грануляционную ткань, поверхность которой была покрыта многослойным плоским эпителием (рис. 5-13 - 5-14).

Проведение сравнительного морфологического анализа выявило, что у животных 1-й группы (С) репарация тканей после операции происходит наиболее полно и быстро. На 3-и сутки после операции репаративные процессы соответствуют 2-й стадии восстановления ткани с признаками эпителизации раны, через 7 сут происходит замещение зрелой грануляционной ткани и формирование рубца с полной эпителизацией раневой поверхности (3-я стадия репарации), через 14 сут восстановление завершается ремоделированием рубцовой ткани, оставляя едва заметный фиброзный тяж (см. рис. 5-12). Процессы репарации у животных 2-й (ФТ) и 3-й (РС) групп запаздывают и к 14-м суткам представлены формированием зрелой грануляционной ткани с полной эпителизацией, то есть находятся на 3-й стадии репаративного процесса (табл. 5-1).

Результаты иммуногистохимического исследования

Проведенные ИГХ-реакции на ткани крыс дали возможность лучше понять тонкости репаративных процессов после воздействия на них различных радионожей.

Маркер пролиферативной активности тканей — Ki-67, по процентному содержанию которого рассчитывали индекс пролиферации. Маркер выявляли в миофибробластических клетках, эндотелии новообразованных сосудов и клетках эпителия. Самые высокие показатели маркера (до 86% клеток) в зоне репарации найдены в ранах животных 1-й группы (С), заполненных новой грануляционной тканью с признаками эпителизации (рис. 5-15, а—в). У животных 2-й (ФТ) и 3-й (РС) групп Ki-67 был ниже (рис. 5-16 - 5-18).

Исследование уровня экспрессии маркера эндотелия новообразованных сосудов CD34 в грануляционной ткани в зоне репарации в ране после волнового воздействия позволило выявить интересные факты. Так, наиболее высокие показатели маркера в этой области были в ранах животных 1-й группы (С) на 3-и, 7-и и 14-и сутки после оперативного воздействия (рис. 5-18, а—в). У животных 2-й (ФТ) и 3-й (РС) групп уровень экспрессии CD34 был ниже (рис. 5-19 - 5-20).

Коллаген III типа (Col-III) начинает экспрессироваться в ткани крыс в зоне репарации после радиоволнового действия ножа в основном спустя 7 сут после операции и в большей степени у животных 1-й (С) и 2-й (ФТ) групп. Синтез коллагеновых волокон происходит в зрелой грануляционной ткани, прежде всего со стороны границ ран (см. рис. 5-5 - 5-7).

Коллаген I типа (Col-I) образуется в ране позже, чем коллаген 3-го типа и в основном к 14-м суткам (см. рис. 5-8 - 5-9).

Проведенные морфологические и ИГХ-исследования приводят к выводу, что у животных 3-й группы имелись статистически достоверные отличия как в сроках, так и в механизмах заживления раны.

Особенности регенерации ткани в области раны в 1-й группе (С) включают в себя меньшее повреждение ткани вокруг разреза, наличие менее выраженной сосудистой реакции, что выражалось в отсутствии сгустка крови в ране к 3-м суткам регенерации. Отсутствие кровяного сгустка является профилактикой вторичной инфекции. Все это позволило быстро восстановить поврежденную ткань.

Животные 1-й группы имели более короткие сроки заживления послеоперационной раны. Во 2-й и 3-й группах даже к 7-м и 14-м суткам эксперимента еще была стадия грануляционной ткани и начала роста эпителия на ране, в то время как в 1-й группе рана фактически зажила.

Результаты ИГХ-реакций на ткани крыс также подтверждают более эффективно протекающую регенерацию у животных 1-й группы. Обнаружено, что самые высокие значения уровня экспрессии маркеров Ki-67 (табл. 5-2) и CD34 (табл. 5-3, 5-4) в раневой зоне регистрируется уже на 3-и сутки после операционного вмешательства, тогда как к 14-м суткам индекс пролиферации резко падает и равен таковому в зрелых тканях кожи. Ремоделирование соединительной ткани в ране происходит быстрее в 1-й группе, что находит подтверждение в накоплении в ткани не только коллагена III типа, но и коллагена I типа (см. табл. 5-4).

Таким образом, проведенное исследование доказало значительное преимущество по сравнению с другими радиохирургическими ножами прибора «Сургитрон EMC», проявляющееся в виде отсутствия кровяного сгустка в ране после рассечения, наличия минимального некроза операционной раны и прилежащих тканей. Более того, расширив диапазон применяемых методов исследования, а именно — используя ИГХ-реакции, обнаружили наличие ранней (начиная с 3-х суток) репарации и эпителизации тканей, наступление ремоделирования соединительной ткани по содержанию в них коллагенов, уровню ангиогенеза и уровню пролиферации клеток в зоне регенерации.

За период с 2005 по 2015 г. мы обследовали и прооперировали 406 пациентов с различными 413 новообразованиями кожи шеи, век, лица и волосистой части головы (рис. 5-29 - 5-31). Наибольшее количество пациентов (165 человек) имели невусы кожи лица, 64 — папилломы век, 48 — кератомы лица, 36 — невусы кожи шеи, 32 — атеромы волостистой части головы, 4 — атеромы шеи, 4 — кожный рог, 3 — липомы лица, 3 — капиллярную гемангиому (табл. 5-5). Особое внимание мы уделили пациентам с ринофимой (54 человека) (рис. 5-32, 5-33).

Пациентов с ринофимой выделили в отдельную группу в связи с тем, что данное новообразование имеет широкое основание и при удалении образуется рана большой площади. Из литературы и практики известно, что традиционная хирургия при лечении ринофимы не дает прекрасного эстетического результата, использование радиоволнового скальпеля позволяет добиться заживления раны без грубого рубцевания. Широкая раневая поверхность, которая образуется после удаления ринофимы, позволяет максимально оценить преимущества работы радиоволновым скальпелем на коже лица. Именно поэтому проводили клиническую оценку послеоперационного течения заболевания у пациентов с ринофимой.

Все больные проходили перед операцией клиническое и лабораторное обследование. Анализы соответствовали возрастным изменениям. Операции проводились в амбулаторных условиях с использованием местной анестезии растворами Ultracaini 4%, Ubistezini 4% (рис. 5-36).

Эмпирическим путем было установлено, что наиболее оптимальным режимом иссечения является радиоволновое излучение «Разрез + коагуляция». В процессе манипуляции мощность аппарата подстраивалась для получения максимального эффекта. Начинали иссечение с относительной мощности в 2,5–3,0 ед. Если активный электрод как бы «прилипал» к ткани, то мощность постепенно увеличивали на 0,2–0,3 ед. Было замечено, что превышение мощности, достаточное для разрезания тканей, выражалось в активном искрении электрода и сильном парообразовании. Данный процесс был нежелательным из-за обжигания края раны, что могло привести к осложнениям при заживлении.

Обнаружили, что мощность излучения от 2,5 до 3,5 ед. была оптимальной и опухоль удаляли одним медленным движением электрода.

Все операции проводили под бинокулярным увеличением в 1,8 раза. Использование увеличения при манипуляциях на лице позволяет осуществлять хороший визуальный контроль за границей разреза и дифференциацией здоровой ткани.

Проволочная петля или треугольник с диаметром 3 или 5 мм применяли в качестве активного электрода. Если опухоли достигали больших размеров и широкого основания, использовали остроконечный радиоволновый скальпель, которым иссекали основание в пределах окружающих здоровых тканей.

В режиме работы прибора «Разрез + коагуляция» проводили послойную декортикацию. Ринофиму удаляли начиная с неизмененной здоровой кожи. В процессе операции нос преображался, приобретая надлежащую форму и величину. Во время операции гемостаз осуществляли одновременно с рассечением ткани, а также путем прямой (шариковый электрод) и непрямой коагуляции в режиме прибора «Разрез + коагуляция» или «Коагуляция» (рис. 5-37).

Обозрение операционного поля было достаточным благодаря практически бескровной процедуре удаления новообразования. Удаленные ткани проходили гистологическое исследование, а мазки брали для посева на микрофлору (рис. 5-38).

Так как радиоволна не нагревала ткани, она давала возможность проводить довольно тонкие манипуляции в ране, с одной стороны, не повреждая подлежащие ткани, с другой — достигая максимального эстетического и функционального эффекта. В послеоперационном периоде назначали пациентам антибактериальную мазь на 7–10 дней, а затем рану вели в сухом режиме. Динамику этого периода лечения оценивали по следующим критериям: боль, отек, гиперемия, лимфорея, эпителизация.

В 1-е сутки после операции у всех пациентов наблюдали отек, гиперемию, лимфорею в послеоперационной зоне, кроме того, пациенты жаловались на боли. На 3-и сутки воспалительные процессы уменьшались в большинстве случаев. У 23 пациентов мы наблюдали лимфорею, у 16 отмечали гиперемию и у 14 — небольшую отечность. Жалобы на боль присутствовали у 41 пациента. На 7-е сутки только у 50 пациентов отмечалась лимфорея, 2 пациента жаловались на небольшие боли. К 10-м суткам у 12 пациентов наблюдали признаки эпителизации раневой поверхности в виде молодой грануляционной ткани. Наблюдение на 14-е сутки показало значительную положительную динамику. Эпителизация появлялась через 10–18 дней и практически всегда результатом был ровный физиологической окраски рубец. Лечение не было осложнено воспалениями (рис. 5-39).

Через 1 год после операции провели контрольные осмотры. Признаков рецидива заболевания не было ни в одном из случаев. Однако через 4–5 лет после операции во время контрольного осмотра выявили возникновение на отдельных участках носа рецидивов у 3 пациентов (все мужчины). Им провели повторные операции по той же методике. Особо следует отметить, что объемы образования были существенно ниже, чем первоначальные, поэтому и повторные вмешательства были незначительными и не вели к грубому рубцеванию. Возможно, что причиной появления рецидивов было недостаточно радикальное удаление первоначальной опухоли.

У пациентов с другими новообразованиями кожи наблюдали положительную послеоперационную динамику. Раны заживали без воспалительных явлений и в более короткие сроки, чем после удаления ринофимы из-за меньших площадей раневой поверхности. Раневая поверхность эпителизировалась в срок от 7 до 14 сут, в зависимости от площади оперируемой поверхности. Рубец формировался в течение 3–4 нед. Развитие келоидного рубца отсутствовало во всех случаях.

Пациент 53 лет обратился в клинику с жалобами на эстетический дефект носа, неудобство в приеме пищи, затрудненное носовое дыхание. После клинического осмотра и сбора анамнеза был поставлен диагноз «гландулярная форма ринофимы». Пациенту назначили стандартные анализы. После сбора всех анализов определили день операции и пациента прооперировали.

Операцию по иссечению новообразования носа проводили под проводниковой и инфильтрационной анестезией Sol. Ultracaini 4%. Выполнили послойную декортикацию и полное иссечение новообразования в режиме работы прибора «Разрез + коагуляция». Рану обработали раствором KMnO4. Удаленную ткань отправили на гистологическое исследование.

В послеоперационном периоде назначили пациенту обработку раствором Н₂О₂ и смазывание раневой поверхности тетрациклиновой 1% мазью 2 раза в сутки в течение 7–10 дней.

Осмотр на 14-е сутки после операции выявил эпителизацию раны без признаков воспаления. Заключение гистологического исследования подтвердило клинический диагноз — гландулярную форму ринофимы. Контрольный осмотр через 1 год после операции продемонстрировал гладкую (без образования рубцов) поверхность кожи носа (рис. 5-41, 5-42).

Радиоволновая хирургия — это атравматичный метод «холодного разреза» и коагуляции мягких тканей без их разрушения. Эффект разреза достигается при помощи тепла, которое образуется при сопротивлении тканей проникновению высокочастотных радиоволн. Радиосигнал от активного электрода вызывает дегидратацию клеток и, вследствие этого, рассечение тканей или их коагуляцию (в зависимости от формы волны), при этом сам электрод не нагревается.

При применении радиоволнового хирургического прибора «Сургитрон ЕМС» следует особо выделить следующие положительные моменты:

Таким образом, радиоволновая хирургия является более удобным, быстрым и менее дорогим методом по сравнению с лазерной хирургией и другими хирургическими воздействиями. Использование радиоволновой хирургической техники значительно облегчает, ускоряет и улучшает проведение оперативного лечения. Наличие у прибора регулировки мощности позволяет аккуратно контролировать глубину разрушения ткани.

Работа на приборе «Сургитрон ЕМС» помогает избежать неприятных послеоперационных последствий, таких как боль, отек, инфекция, тризм и послеоперационный шок от потери крови, которые часто проявляются после применения традиционных методов хирургического вмешательства.

В ИГХ-исследовании использовали антитела к Ki-67, CD34, Col-I и Col-III. ИГХ-реакции подтвердили, что более быстро и полно протекает регенерация у тех животных, у которых для рассечения ткани использовали аппарат «Сургитрон ЕМС». Наиболее высокая пролиферация клеток (экспрессия маркера Ki-67 (рис. 5-43 - 5-45) и значения CD34 в раневой зоне регистрировали уже на 3-и сутки после операции.

Таким образом, проведенное исследование показало высокую эффективность радиоволновой хирургии при рассечении кожи и последующем улучшении заживления операционной раны.

На сегодняшний день наиболее широко распространенным методом получения золотых частиц с размерами в пределах 8–70 нм для медико-биологических приложений остается метод цитратного восстановления золотохлористоводородной кислоты, или тетрахлороаурата (III) водорода. Суммарную реакцию цитратного восстановления можно выразить следующим уравнением:

2AuCl₃ +3Na₃ C₆ H₅ O₇ →2Au+3Na₂ C₅ H₄ O₅ +3CO₂ +3NaCl+3HCl.

В наиболее простом виде получаемые НЧЗ состоят из кристаллического ядра _m , на поверхности которого адсорбированы ионы AuCl₄ (^– ), определяющие отрицательный заряд коллоидной частицы золота. Ионы AuC_l4 (^– ) составляют внутренний слой двойного ионного (электрического) слоя и определяют величину потенциала адсорбции. Ионы Н⁺ находятся в интермицеллярном растворе (одна часть располагается в адсорбционной области, а другая — в диффузионной области двойного электрического слоя). Условно мицеллу золота можно представить следующим образом:

_m — ядро мицеллы (m — число атомов золота), n — количество адсорбированных ионов AuCl₄ (^– ) (n<<m), δ ₀ — толщина адсорбционного слоя, d — толщина диффузионной части двойного электрического слоя (Weiser, 1933).

В последующем для стабилизации полученных НЧЗ их распределяли в гидрогелевом субстрате, состоящем из ГК, таурина и глицина. Состав полученных композиций представлен в табл. 6-1.

Ниже приведены результаты физико-химических характеристик исследуемых гидрогелевых композиций: распределение НЧЗ по размерам (определяли методом динамического рассеяния света) (рис. 6-3.); спектр НЧЗ в видимой области (рис. 6-2); результаты ТГА-исследований (термогравиометрические измерения) количества ГК, адсорбированных на НЧЗ (рис. 6-3), и результаты просвечивающей электронной микроскопии (рис. 6-4).

Стабильность золей подтверждена спектрофотометрическими измерениями. На спектрах композиций хорошо заметны максимумы поглощения на длине волны 520–530 нм, соответствующие локализованному плазмонному резонансу НЧЗ, характерному для сферических частиц золота диаметром около 20 нм (рис. 6-3). На спектрах, записанных через разные интервалы времени после синтеза, не определены дополнительные максимумы на больших длинах волн. Это свидетельствует об отсутствии процессов агрегации НЧЗ (даже спустя три месяца никаких изменений спектра не обнаружено). Все полученные спектры полностью идентичны первоначальным, записанным непосредственно после приготовления гидрогелевых композиции.

Проведены исследования количества ГК, необратимо адсорбирующейся на поверхности НЧЗ в зависимости от соотношения ГК/Au (рис. 6-3). Показано, что при изменении соотношения в диапазоне от 0,375/1 до 3/1 это количество увеличивается с 0,8 до 2,3 масс.%.

Установлено, что полученные композиции достаточно стабильны — спустя 3 мес после приготовления не наблюдалось признаков агрегации НЧЗ (образцы предварительно подвергались стерилизации при температуре 120 °С в течение 1,5 ч, затем хранились на свету в комнатных условиях). Более того, введение в образцы 0,1 М раствора хлорида натрия в физиологических концентрациях также не привело к какому-нибудь заметному изменению спектральных характеристик исследуемых образцов. Таким образом, был сделан вывод, что полученные композиции стабильны в течение длительного времени.

Целью токсикологических исследований являлись моделирование и оценка в эксперименте использования полученных конъюгатов НЧЗ с ГК при заведомо завышенных концентрациях исходных компонентов. Были проведены следующие испытания:

Схема эксперимента включала 2-кратные подкожные инъекции препарата лабораторным животным в высшей разовой дозе (200 мг/кг) с интервалом 7 дней, далее через 1 нед внутрибрюшинное введение в той же дозе.

Изучение общетоксического, раздражающего и сенсибилизирующего действия образцов материала проводили в условиях субхронического эксперимента на беспородных белых крысах-самцах массой тела 200–270 г по 6 особей в опыте при контроле подкожных (2 в дозе 200 мг/кг или 0,25 мл препарата на кг) и внутрибрюшинных инъекций геля с использованием внутрикожной провокационной пробы. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили 0,9% NaCl в том же объеме.

Наблюдение за животными проходило через 30 мин после введения разрешающей дозы. Через 24 ч эксперимента не было выявлено наличия аллергической реакции — гиперчувствительности замедленного типа. При обследовании животных с помощью лабораторных методов исследования изменений гематологических и биохимических показателей не выявлено. По результатам эксперимента с использованием провокационной внутрикожной пробы сенсибилизирующего действия вытяжки из образца, о наличии которого судили по реакции дегрануляции тучных клеток, и раздражающего действия на кожу не обнаружено. Реакция дегрануляции тучных клеток составила 0,2% при значении показателя 10–15%, рассматриваемого как слабая реакция.

При вскрытии подопытных животных макроскопически не выявлено патологических изменений внутренних органов и тканей. Образцы материала заключены в тонкие прозрачные соединительнотканные капсулы без признаков воспаления. Весовые коэффициенты масс внутренних органов опытных животных, в том числе иммунокомпетентных (тимус, селезенка), не имеют статистически достоверных отличий от аналогичных показателей контроля. Вытяжка из образца не проявила гемолитического действия в опытах с изолированными эритроцитами кроликов: гемолиз — 0,07% при допустимом значении показателя менее 2%.

Результаты обследования животных, которым вводили препарат «Голдгиал», с помощью лабораторных методов исследования приведены в табл. 6-2 - 6-4.

Как следует из результатов, приведенных в таблицах, обследование животных с помощью методов лабораторного исследования не выявило отличий в показателях у опытных крыс по сравнению с контролем.

Значения относительной массы внутренних органов опытных и контрольных крыс приведены в табл. 6-4.

Согласно результатам проведенных исследований, нет различий в показателях органов и систем, отвечающих за детоксикационную функцию печени и выделительную функцию почек, у животных при воздействии исследуемых препаратов. Анализируя все показатели, по которым оценивали сенсибилизирующее действие гелевых материалов с НЧЗ (отрицательная провокационная внутрикожная проба; значения показателя дегрануляции тучных клеток, равные 0,2 и 2,5; отсутствие отличий от контроля весовых коэффициентов тимуса/селезенки и соотношения показателей весовых коэффициентов тимуса/селезенки), был сделан вывод, что исследуемые материалы не обладают аллергенным действием.

Экспериментально на мини-свиньях породы «светлогорская» изучали резорбцию и тканевую реакцию при внутрикожном введении гелей ГК с НЧЗ (контроль — нативная ГК). Сроки наблюдения — 1-е, 3-и, 5-е сут. Электронно-микроскопическое исследование проводили на 3-и сутки после введения гелей ГК. При изучении ультраструктуры кожи в местах инъекции гелей ГК определяли относительную электронную плотность видимых объектов, размеры, функциональное состояние, взаимное расположение и ориентацию клеточных и волокнистых элементов. Отмечали наличие или отсутствие признаков патологических изменений структуры кожи.

В интактной коже мини-свиньи видны относительно редкие капилляры, артериолы и венулы. При этом в сосочковом слое этих элементов больше, чем в сетчатом. В дерме видны также волосяные фолликулы и располагающиеся вблизи фолликулов сальные железы. Клеточные элементы в дерме кожи свиньи малочисленны. Они представлены в основном фибробластами, имеющими веретеновидную либо звездчатую форму (рис. 6-7). В сосочковом слое, кроме фибробластов, обнаруживаются немногочисленные лимфоциты, макрофаги (гистиоциты) и тучные клетки. Все эти клеточные элементы располагаются в основном вблизи сосудов.

В сосочковом и сетчатом слоях дермы вокруг точки вкола во всех случаях имело место очаговое разрыхление коллагеновых волокон. В области разрыхления волокон видны небольшие скопления пролиферирующих фибробластов, а также макрофагальная реакция. На месте введения препарата сформированы небольшие ячейки с повышенным содержанием вокруг них макрофагов и нейтрофилов, участвующих в резорбции ГК (рис. 6-8). В некоторых участках дермы, близких к месту введения, отмечаются очаги макрофагальной инфильтрации и начинающейся пролиферации фибробластов. При этом обнаруживается достаточно большой очаг нерезорбированного геля сетчато-ячеистой структуры (рис. 6-9).

На 5-е сутки после введения отмечаются немногочисленные и небольшие по размеру очаги, где видна пролиферация фибробластов и рост сосудов (рис. 6-10), что говорит о реваскуляризации дермы. Следует отметить, что общее количество фибробластов в дерме увеличено.

Как и в обычных гистологических препаратах в полутонких срезах (толщина — 1–1,5 мк), у животных, которым внутрикожно вводились препараты с НЧЗ, были обнаружены участки изменений. Они располагались в сосочковом слое дермы и на границе сосочкового и сетчатого слоев. В этих участках имелись пустые тонкостенные ячейки, крупные макрофагальные клетки, участвующие в резорбции геля, пролиферирующие активные фибробласты и тучные клетки со специфической зернистостью в цитоплазме (рис. 6-11). В этих же участках значительно увеличивается присутствие новообразованных капиллярных сосудов. Выявляются очаги сохраненного геля, там же обнаруживается большее число пролиферирующих фибробластов.

При электронно-микроскопическом исследовании биоптатов кожи свиньи на 3-и сутки после внутрикожной инъекции гелей были подтверждены данные, полученные при световой микроскопии. Так, установленное при гистологическом исследовании повышенное содержание РНК в цитоплазме фибробластов, активно пролиферирующих в очагах резорбции, отражено и ультраструктурными признаками повышенного синтеза белка: хорошо развитым гранулярным эндоплазматическим ретикулумом и комплексом аппарата Гольджи.

В сравнении с контрольным опытом введения нативной ГК препарат на основе ГК + НЧЗ более активно стимулирует пролиферацию фибробластов в коже. Эти результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными, полученными на хондроцитах, когда в хрящевую ткань лабораторным животным (крысам) при лечении суставных патологий вводили ГК + НЧЗ (Хабаров и др., 2014; Хабаров, Бойков, 2015).

Результаты проведенных исследований позволяют сделать следующие выводы.

В предыдущем разделе была показана стимуляция пролиферации фибробластов в дерме и хондроцитов в хрящевой ткани на моделях экспериментальных животных при введении в ткани комплекса НЧЗ + ГК. Однако необходимо отметить, что на подобных моделях не представляется возможным оценить раздельный вклад в пролиферативную активность стрессовых факторов, возникающих при повреждении уколом тканей и собственно от введения препарата. Здесь нельзя исключать возможного как аддитивного, так и синергического действия этих составляющих в условиях физиологической или патологической регенерации тканей. Исследование влияния препарата «Голдгиал» на модели эмбриогенеза цыпленка позволяет отчасти исключить стресс-факторы и провести опыты в условиях активной пролиферации клеток при эмбриогенезе.

Предметом проведенного исследования являлось изучение влияния ГК и НЧЗ на экспрессию генов, отвечающих за развитие мышечных волокон эмбриона и за их морфологические характеристики. Эксперимент проводили на 4 группах куриных яиц (по 40 штук в каждой): без введения добавок (контрольная группа), с введенными НЧЗ (группа «НЧЗ»), гиалуронанового гидрогеля (группа «ГК») и препарата «Голдгиал» (группа «НЧЗ + ГК»).

В ходе работы были проведены исследования с использованием следующих методов.

После окрашивания по методу Ван-Гизона были зафиксированы отличия в структуре пекторальных мышц эмбрионов контрольной и исследуемой групп образцов (см. рис. 6-12). В контрольной группе мышечные волокна имели более компактную структуру и поверхность индивидуальных мышечных пучков была меньше, чем в «обработанной» группе. В группе «НЧЗ» распределение мышечных волокон было более плотным, а соединительные клетки между мышечными пучками более развиты. После введения ГК наблюдалось формирование ярко выраженной структуры соединительных клеток, соединяющих мышечные пучки. Волокна при этом были гомогенны. Также наблюдали увеличение расстояния между узлами волокон. Более того, волокна с наибольшим диаметром наблюдались в группе с введенным препаратом «Голдгиал» («НЧЗ + ГК») (табл. 6-5).

При анализе поперечных срезов образцов обнаружено, что структура пекторальных мышц различна для разных исследуемых групп (рис. 6-12).

Мышцы эмбрионов контрольной группы характеризовались большим расстоянием между клетками, а сами клетки имели более округлую форму. Внутри клеток можно заметить цилиндрические миофибриллы. При этом в клетках контрольной группы они расположены более редко. Также для образцов из этой группы наблюдались следующие эффекты и компоненты: деградация миомеров и актиновых нитей, гомогенный миозин, слабая связь соединительных клеток. Мышцы из группы «НЧЗ» характеризовались малым числом коллагеновых нитей и большим количеством капель жира. В группе «ГК» обнаружены развитые плотные мышечные волокна, малое число клеток-спутников и недостаток капель жира. В группе «НЧЗ + ГК» обнаружено, что митохондрии располагаются более концентрированно и число белых вакуолей уменьшено по сравнению с контрольной группой.

Результаты количественных исследований показали, что в группе «НЧЗ» сформировалось большое количество мышечных клеток, по сравнению с контрольной группой. В группе «ГК» и «НЧЗ + ГК» число мышечных клеток значительно превышало соответствующее значение для контрольной и «НЧЗ» групп (см. табл. 6-5).

Результаты морфометрических измерений приведены на рис. 6-13. Было определено общее количество ядер и PCNA-положительных ядер. Для групп «ГК» и «НЧЗ + ГК» отношение числа PCNA-положительных ядер к суммарному числу ядер было существенно выше, чем в других группах (см. табл. 6-5). При этом присутствие НЧЗ не влияло на содержание PCNA-положительных ядер. Среднее число ядер в 1 мкм² в пучках мышечных волокон на микрофотографии поперечного среза значительно выше в группе «ГК» и «НЧЗ + ГК», чем в контрольной и «НЧЗ» группах.

Результаты исследований экспрессии FGF-2 и PCNA в пекторальных мышцах позволили установить, что нативная ГК значительно снижает экспрессию FGF-2 и PCNA на уровне матричной РНК (мРНК) по сравнению с контрольной группой (см. табл. 6-5, рис. 6-14).

PCNA — ядерный антиген пролиферирующих клеток; FGF-2 — основной фактор роста фибробластов. FGF-2 способен действовать внутриклеточно как активатор пролиферации; ANOVA — параметрический дисперсионный анализ.

К 20-му дню инкубации мышечные волокна эмбрионов полностью сформированы. На этом этапе можно с уверенностью детектировать влияние введения препаратов на микроструктуру пекторальных мышц. После введения НЧЗ мышцы характеризовались большим числом капель жира, которые могут быть использованы в качестве дополнительного источника энергии для роста мышц и активности эмбриона. При введении ГК были обнаружены развитые и плотные мышечные волокна, развитые соединительные клетки, уменьшенное число клеток-спутников, недостаточное количество жирных капель и увеличенное количество мышечных клеток (см. рис. 6-15 и табл. 6-6).

Интересно, что ни введение НЧЗ, ни нативная ГК не приводили к увеличению диаметра мышечных волокон. При этом их одновременное введение в виде препарата «Голдгиал» значительно увеличивало диаметр мышечного волокна. Возможно, увеличение толщины волокон связано со встраиванием вводимых НЧЗ в структуру клеток.

Ранее на модели взрослых животных (мини-свиньи) было установлено, что гиалуронан, особенно комплекс «ГК + НЧЗ», активирует размножение фибробластов на фоне физиологической регенерации кожи. Модель эмбрионального развития цыпленка показывает, что эти препараты ускоряют пролиферацию клеток соединительных тканей (эндомизий и перимизий) и в эмбриогенезе на фоне высокой активности клеточного деления.

Таким образом, получены убедительные доказательства обновления популяций клеток соединительных тканей с помощью препарата «Голдгиал». Дополнительная стимуляция препаратом пролиферации различного типа клеток подтверждает вывод о том, что комплекс «ГК + НЧЗ» является универсальным стимулятором размножения клеток. С помощью этого препарата возможно активное обновление популяции клеток и омоложение тканей.

Несмотря на заметный прогресс последних лет в биологии фибробластов, источники пополнения популяции фибробластов в постэмбриональном периоде в различных областях кожи все еще являются предметом дискуссии. Традиционно считалось, что обновление или увеличение популяции фибробластов/ миофибробластов при поддержании гомеостаза соединительной ткани или заживлении раны достигается за счет резидентной популяции фибробластов. Однако в последнее время при заживлении ран и фиброзе была показана возможность пополнения пула фибробластов из различных источников (McAnulty, 2007).

После открытия мультипотентных мезенхимных клеток в специализированных соединительных тканях — сухожилиях (Bi et al., 2007; Xu et al., 2015) гипотеза о мезенхимальном происхождении фибробластов получила наибольшее признание. В подтверждение этой гипотезы сравнительно недавно было показано, что ростовой фактор соединительной ткани (connective tissue growth factor, CTGF; известный как CCN2) достаточен в качестве стимула для дифференцировки МСК костного мозга в фибробласты (Lee et al., 2010).

CTGF-стимулированные МСК теряли поверхностные мезенхимальные эпитопы, начинали экспрессировать маркеры фибробластов, включая коллаген I типа и тенасцин С. Также в качестве источника фибробластов дермы рассматриваются клеточные элементы, ассоциированные с периваскулярными пространствами в дерме, экспрессирующие маркер перицитов NG2 и маркер МСК и гемопоэтических клеток CD34 (Woо et al., 2016; Tschumperlin, 2013).

В качестве предшественников фибробластов могут выступать стволовые клетки сосочка дермы волосяного фолликула (Woо et al., 2016). Пул фибробластов также может пополняться через эпителиально- и эндотелиально-мезенхимальный переход, то есть через дедифференцировку эпителия/эндотелия с последующей дифференцировкой в фибробластоподобные клетки. Важную роль в качестве предшественников фибробластов играет фракция резидентных МСК, которая может активироваться, пролиферировать и мигрировать при таких процессах, как заживление ран, фиброз (Tschumperlin, 2013).

Выше уже говорилось, что запуск процесса дифференциации дермальных МСК в кератиноциты или фибробласты (Orza et al., 2011; Ilie et al., 2012) можно реализовать in vitro, используя специфические белковые добавки в качестве факторов роста, задающих для МСК нужное направление дифференцировки. Но гораздо более заманчивой выглядит реализация возможности стимулировать такую дифференциацию in vivo, непосредственно в дерме. Исследовательские работы последних лет, на которые мы уже ссылались ранее (Choi et al., 2015; Ko et al., 2015), установили способность НЧЗ стимулировать дифференциацию (превращение) стволовых клеток в другие типы клеток организма.

В данном разделе представлены результаты совместных научных исследований по стимуляции МСК препаратом «Голдгиал», проведенных АНО «Научно-исследовательский центр гиалуроновой кислоты» и НИИ Общей патологии и патофизиологии РАН (Хабаров, Московцев, 2017).

В качестве объекта исследования был предоставлен разрабатываемый ООО «МедСайенс» препарат «Голдгиал». Для всех экспериментов препарат либо предварительно растворяли в ростовой среде непосредственно перед каждым экспериментом, либо (для высоких концентраций) добавляли в ростовую среду к клеткам.

Исследования были выполнены на линии МСК, полученных из крайней плоти трехлетнего ребенка (Lorenz et al., 2008), клетки были получены из банка Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии, Санкт-Петербург). Клеточная культура паспортизирована, прошла контроль видовой специфичности (во всех случаях проведен кариотипический анализ) и контаминации (бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены).

Характеристики полученной культуры соответствовали заявленным в паспорте: среднее время одного удвоения клеточной популяции около 30 ч; активный рост клеток начинался не позднее 2–3 сут после пересева. Данная культура имеет ограниченный срок жизни, но до 50 удвоений клеточной популяции не наблюдается снижения пролиферативной активности. С помощью проточной цитофлуориметрии была подтверждена экспрессия этими клетками поверхностных антигенов, характерных для МСК: CD44, CD73, CD90, CD105 и HLA-ABC; при этом экспрессии антигенов CD34 и HLA-DR не наблюдалось.

Для экспериментов клетки рассеивали в полной питательной среде с 10% сывороткой с определенной плотностью в 96-луночные планшеты для проведения МТТ-теста (теста для оценки митохондриальной активности клеток). Через 24 ч к клеткам добавляли препарат в различных концентрациях. Клетки культивировали далее в присутствии препарата 24, 72 и 96 ч, а также в течение 14-дневного временного интервала с регулярной заменой среды (с препаратом).

Жизнеспособность клеток оценивали методом исключения витального красителя трипанового синего. Аликвоту суспензии объемом 20 мкл от каждого образца смешивали с равным объемом 0,4% раствора красителя трипанового синего и помещали в камеру рабочего слайда для анализа на автоматическом счетчике клеток Countess™ (Invitrogen, США). Каждый исследуемый образец клеток был подсчитан в дуплете.

Цитотоксичность препаратов и влияние на метаболическую активность определяли с помощью MTT-теста. Для этого клетки инкубировали с препаратом в различных концентрациях в 96-луночном планшете в течение обозначенных временных интервалов. После инкубации в каждую лунку вносили по 10 мкл раствора МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий). Развитие окраски регистрировали путем измерения оптической плотности при длине волны 540 нм, референс-волна — 620 нм с помощью фотометра Hidex Chameleon (Hidex Oy, Финляндия).

Анализ экспрессии генов

Суммарную РНК выделяли из клеток с использованием реагента тризол. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop®ND-1000 (NanoDropTechnologies Inc., США). Для оценки качества (целостности) выделенной суммарной РНК проводили электрофорез в 1,2% агарозном геле.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием рендом-праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV (без активности РНКазы H) в составе набора RevertAid TH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва) в соответствии с протоколом производителя.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Реакцию проводили с использованием набора реактивов Maxima SYBR Green/ROXqPCRMasterMix (2X) (Fermentas, Литва), включающего интеркалирующий краситель Sybr Green на амплификаторе CFX96TM Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Регистрация интенсивности флуоресценции красителя Sybr Green, связанного с двухцепочечной ДНК, и пассивного референсного красителя ROX проходила автоматически в конце стадии элонгации каждого цикла по каналам FAM/Sybr Green и ROX. Для подтверждения специфичности реакции после последнего цикла снимали кривую плавления.

Расчет уровня матричной РНК (мРНК) генов Col-I, Vim и CD105 проводили с использованием алгоритма 2-ΔΔCt, в основу которого положены относительные изменения пороговых циклов (Ct) исследуемого гена и «гена домашнего хозяйства», в опытных и контрольных образцах. Для нормирования использовали «ген домашнего хозяйства» GAPDH. Обработанные данные представляли в виде среднего значения, выраженного в относительных единицах, ± стандартное отклонение по выборке.

Обработка данных проводилась с использованием критерия Стьюдента с коррекцией на множественное сравнение с помощью программного обеспечения Statistica, построение графиков осуществлялось в программной среде Origin Pro 9.0, аппроксимация кривых проводилась с использованием пакета нелинейного фитинга зависимости «доза–ответ».

В работе были проанализированы in vitro метаболическая активность, кинетика роста и экспрессия мРНК-маркеров фибробластов проколлагена I, виментина, а также маркера МСК CD105 (эндоглина) МСК кожи при действии препарата «Голдгиал».

Инкубации клеток во временном интервале 24, 72 и 96 ч в диапазоне концентраций 4,0–0,032 мг/мл показали, что препарат имеет умеренную токсичность, достоверно проявляющуюся лишь на самой высокой концентрации (4 мг/мл) во всех временных точках. Высокие концентрации препарата, не являющиеся терапевтическими, могут оказывать ожидаемо неспецифическое ингибирование клеточных функций за счет коллигативных свойств высококонцентрированного раствора ГК. Можно предположить также снижение скорости диффузии газов в ростовой среде с растворенным препаратом, что, вероятно, могло бы иметь меньшее значение в условиях in vivo в связи с наличием активного транспорта, осуществляемого сосудистой системой.

Уже во временном промежутке 24 ч (рис. 6-15, табл. 6-6) наблюдается тенденция к повышению метаболической активности МСК для концентраций препарата 2, 1, 0.25 и 0,125 мг/мл. Можно предположить метаболическую активацию мезенхимальных клеток. Интересно, что эффект более выражен для концентраций выше критической реологической точки препарата (entanglement point), то есть 1 мг/мл. Следует отметить также нелинейную зависимость эффекта от концентрации препарата.

При 72-часовой инкубации (рис. 6-16, табл. 6-7) для концентрации 0,25 мг/мл обнаруживается достоверное увеличение оптической плотности. Интересно отметить, что этот пик соответствует лишь части наблюдавшейся тенденции к повышению оптической плотности на 24 ч при концентрациях 2, 1, 0,25 и 0,125 мг/мл. Стимуляции МСК не наблюдается при концентрациях гиалуронана выше критической реологической точки препарата, то есть концентрации, при которой макромолекулярные клубки гиалуронана начинают перехлестывать друг друга и при которой, вероятно, начинает образовываться трехмерная сеть молекул гиалуронана (Хабаров и др., 2012).

Во временном промежутке 96 ч не наблюдали достоверных стимулирующих эффектов препарата, что, очевидно, связано с выходом культуры из фазы логарифмического роста и неоптимальной посадочной плотностью для данного интервала инкубации.

Представление данных в виде кривых роста (рис. 6-18) и сопоставление с прямым подсчетом клеток указывает на пролиферацию МСК на 72 ч.

Следует отметить, что значительная вязкость растворов гиалуронана приводит к разбросу данных и снижению воспроизводимости результатов. На отфильтрованном наборе данных, отображающем дозовую зависимость метаболической активности МСК, видно, что стимулирующий эффект гиалуронана на 72 ч, вероятно, выражен в большем диапазоне концентраций: 0,25–0,06 мг/мл. Вместе с тем стимулирование на 24 ч в этом диапазоне (рис. 6-19) концентраций ГК выражено в меньшей степени, чем для концентраций 1 и 2 мг/мл.

Как видно из рис. 6-20, в результате 14-дневной инкубации с препаратом экспрессия мРНК коллагена I типа выросла в среднем в 1,8±0,4 раза, тогда как экспрессия виментина составила 1,3±0,2 раза по сравнению с контролем. Экспрессия мРНК маркера МСК CD105 несколько упала и составила 0,7±0,02 раза.

Выводы

Макромолекулярный комплекс «ГК + НЧЗ» (препарат «Голдгиал») in vitro стимулирует метаболизм МСК, выделенных из дермы кожи человека. При этом активируется пролиферация клеток, а также инициируется дифференцировка стволовых клеток в фибробласты. О дифференцировке МСК под влиянием препарата свидетельствует появление в клетках маркеров, характерных для дермальных фибробластов: активация гена коллагена I типа (ген COL1A1), виментина и транскрипции соответствующих мРНК. Коллаген I типа является белком для формирования межклеточного матрикса дермы кожи, а белок виментин необходим для формирования внутриклеточного матрикса фибробластов. Таким образом, препарат «Голдгиал» стимулирует обновление популяций стволовых клеток и молодых фибробластов кожи. Такие уникальные свойства препарата позволяют восстанавливать молодость кожи.

Результаты проведенных клинических испытаний препарата «Голдгиал»

В процессе клинического исследования было проведено 59 процедур мезотерапевтического введения препарата «Голдгиал»: 30 процедур с использованием препарата «Голдгиал» 0,8% и 29 процедур с использованием препарата «Голдгиал» 1,6%. Ожидаемые побочные эффекты были аналогичны таковым при выполнении любых инъекционных внутрикожных методов — гиперемия, незначительный отек, петехии. Отсроченных побочных эффектов, аллергических реакций, общесоматических явлений зарегистрировано не было.

Препараты можно считать безопасным для клинического использования, что в сочетании с положительным клиническим результатом, проявившимся в улучшении качественных характеристик кожи, делает соотношение рисков и пользы при использовании «Голдгиал» 0,8% и «Голдгиал» 1,6% благоприятным для рекомендаций их к клиническому применению. Почти все участники клинического исследования отметили улучшение внешнего вида и были удовлетворены полученными результатами. Введение препаратов «Голдгиал» 0,8% и «Голдгиал» 1,6% усиливает антивозрастной (в отношении кожи) эффект от проводимого лечения.

Проведенное клиническое исследование показало, что сравнительная оценка показателей профилометрии, кутометрии, корнеометрии до начала работ и после их завершения через 60 дней от начала проведения процедур с использованием препаратов «Голдгиал» выявила определенное увеличение средних значений показателей кутометрии (на 2,5%) и корнеометрии (на 61%). Средние значения размеров морщин (длина, ширина) до начала исследований и после их завершения через 60 дней от начала работ, различались несущественно, при этом глубина морщин уменьшилась на 37%. Для определения уровня значимости, статистической достоверности и сравнения между собой полученных результатов по показателям кутометрии, корнеометрии, профилометрии до начала работ и через 60 дней применения препаратов «Голдгиал» с целью выявления различий проводили вычисления с помощью парного t-критерия Стьюдента при сравнении связанных совокупностей. При этом было показано следующее.

Таким образом, показатели кутометрии (эластичность) и корнеометрии (влажность) через 60 дней от начала проведения процедур с использованием препаратов «Голдгиал» показали увеличение средних значений показателей кутометрии (на 2,5%) и корнеометрии (на 61%). Выявленные изменения являются статистически значимыми (p <0,05).

Дальнейшие клинические исследования могут быть направлены на изучение влияния препаратов линии «Голдгиал» на различные патологические процессы в коже и дерматологические заболевания (акне, розацеа, алопеция, нарушения пигментации, трофические нарушения и т.д., а также в реабилитационном периоде после проведенных операционных разрезов).

Для подтверждения клинического эффекта препаратов с наночастицами золота на клеточные механизмы старения были проведены исследования одного из наиболее важных регулирующих белков клетки SIRT6 (сиртуины — семейство эволюционно консервативных НАД-зависимых белков, обладающих деацетилазной или АДФ-рибозилтрансферазной активностью) и транскрипционный фактор Р53, регулирующего клеточный цикл. [Сиртуины вовлечены в регуляцию важных клеточных процессов и метаболических путей: процессов старения, транскрипции, апоптоза и сопротивляемости стрессу. Регуляция метаболизма и клеточные защитные механизмы, в которых участвуют сиртуины, могут быть использованы для увеличения продолжительности жизни. Последнее десятилетие наиболее активно изучается белок из семейства сиртуинов — SIRT6, который по результатам многочисленных исследований ассоциирован с увеличением продолжительности жизни млекопитающих и является регулятором транскрипции стабильности генома, теломерной целостности, репарации ДНК и метаболического гомеостаза. P53 — белок-супрессор образования злокачественных опухолей, кодируемый геном TP53 . При активном делении и/или воздействии на клетку стрессовых факторов (температура, осмотическое давление, ионизирующее излучение, гипоксия и др.) происходит накопление активной формы p53 . Присоединение p53 к специфическим сайтам приводит к увеличению экспрессии соответствующих генов. Это, в свою очередь, приводит к образованию ряда белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, и итогом активации p53 является временная остановка клеточного цикла (на время репарации ДНК), или апоптоз. Это предотвращает накопление мутаций в клеточной популяции и обеспечивает генетическую стабильность. Таким образом, р53 является важным маркером старения (Zhang et al., 2016).

Гистологические и иммуногистохимические исследования проводили на биоптатах кожи человека в сравнении с интактной кожей. Для этого у пациентки в процессе плановой блефаропластики были взяты на исследование биоптаты после курса процедур, состоящего из 3 сеансов внутридермальных инъекций препарата 1 раз в неделю в кожу верхнего века. Образцы для исследования представляли собой кожный лоскут, который покрыт многослойным плоским ороговевщим эпителием типичного строения с сохранением всех слоев. Эпидермис покрыт очень тонким слоем кератина. Дерма тонкая, с очаговым отеком, очаговой, местами выраженной моноцитарной инфильтрацией, умеренное количество волосяных фолликулов, сальные железы мелкие, единичные потовые железы. Сосуды артерио-венозного русла типового строения.

Результаты проведенных исследований представлены на рис. 6-21 - 6-24, табл. 6-9.

На фотографиях, представленных на рис. 6-19 - 6-22, визуально трудно увидеть разницу в интенсивности флуоресценции, которая характеризует экспрессию маркеров Р53 и SIRT6, поэтому применяли цифровую микроскопию (морфометрию) и представляли результаты измерений в цифровом виде в табл. 9.

Контрольный образец сравнения

Исследуемый образец кожи с введенным препаратом

Контрольный образец сравнения

Полученные статистически достоверные значения результатов роста экспрессии маркеров Р53 и SIRT6 в биоптатах кожи с введенным препаратом с наночастицами золота позволяют сделать важные выводы о том, что усиление апоптоза может говорить об усилении клеточного обмена, а усиление экспрессии сиртуина свидетельствует об уменьшении процессов старения кожи.

При изучении биоптатов кожи 50-тилетней пациентки после проведения пластической операции (блефаропластики) в рамках проведения плановых клинических испытаний препарата «Голдгиал» изучали с помощью нейроиммуноэндокринных маркеров кожи [Смирнова и др., 2005]. Проведенные исследования показали [Хабаров, 2017; Хабаров и др., 2017], что экспрессия маркеров синтетической активности клеток — коллагена первого и третьего типов (сравнивали показатели относительной площади экспрессии маркеров коллагена I и III) усиливается в среднем на 15–25% для образца кожи с введенным препаратом (образец «S») в сравнении с контролем (образец «D») (рис. 6-25, 6-26). Установлено, что каскад биохимических реакций запускается еще с предшественника коллагена — проколлагена, экспрессия которого повышена в образце «S» по сравнению с «D». Экспрессия матриксных металлопротеиназ, отвечающих за ремоделирование тканей и разрушение поврежденного коллагена, преобладает в образце «S» (рис. 6-27 - 6-28). Так, относительная площадь экспрессии маркера ММР-9 в образцах кожи с введенным препаратом в 2,7 раза выше, чем в контрольном образце.

Проведенные исследования свидетельствуют, что метаболические, синтетические и репаративные процессы выражены статистически достоверно сильнее в биоптатах кожи человека с введенным препаратом гиалуроновой кислоты с наночастицами золота. Таким образом, установлено, что в качестве молекулярных мишеней действия материала «Голдгиал» выступают матриксные металлопротеиназы и проколлаген.