Наследственные болезни

Диагностика наследственных болезней представляет значительные трудности, в то же время точный диагноз наследственной болезни - основа адекватного лечения и правильного медико-генетического прогноза будущего потомства в конкретной семье. Крупнейшие достижения современной генетики не только не упростили диагностику нозологической принадлежности наследственного заболевания, но потребовали внедрения дорогостоящих методов исследования и специальной подготовки медицинских кадров. Наиболее частой причиной диагностических ошибок служит фенотипическое сходство наследственных, приобретенных и мультифакториальных болезней (имитация менделизма). Наряду с клиническим полиморфизмом наследственные болезни отличаются выраженным полиморфизмом на генетическом уровне (так называемая генетическая гетерогенность). Например, при таком хорошо известном педиатрам заболевании, как фенилкетонурия (ФКУ), известно более 900 типов мутаций в одном и том же генном локусе (аллельная генетическая гетерогенность). Кроме того, известно еще несколько генов, мутации которых приводят к клиническим проявлениям ФКУ (локусная генетическая гетерогенность). Дети с ФКУ и другими наследственными дефектами обмена аминокислот наиболее часто поступают в клинику с диагнозом последствий родовых травм.

Имитируют наследственную патологию внутриутробные инфекции - токсоплазмоз, цитомегалия, краснуха, герпес.

Под маской остаточного или позднего рахита протекают наследственные рахитоподобные заболевания (фосфат-диабет, синдром Фанкони и др.).

Алкоголизм и наркомания расширяют базу для имитации менделизма (алкогольный синдром у нескольких членов семьи, сходство врожденных аномалий развития и др.), поскольку воздействие алкоголя и наркотиков на плод вызывает клинические изменения, сходные с наследственной патологией.

Успешная диагностика наследственных болезней базируется на знании и владении клинико-генеалогическим методом, использовании синдромологического подхода к диагностике наследственных болезней, на результатах параклинических исследований, основных признаках и особенностях клинических проявлений наследственной патологии, применении общих принципов клинической диагностики, на особенностях осмотра и физикального обследования пациентов и их родственников. Важнейшая роль в диагностике наследственных болезней (синдромов) принадлежит лабораторным исследованиям: цитогенетическим, молекулярно-генетическим, биохимическим и др.

Термин «синдром» в клинической генетике употребляется не только для обозначения совокупности симптомов, объединенных единым патогенезом, но и для болезней, составляющих самостоятельные нозологические единицы. Это обусловлено тем, что такие нозологические формы были первоначально описаны как симптомокомплексы без понимания их этиологии. Термины «болезнь» и «синдром» для наследственной патологии равнозначны. Например, болезнь Дауна и синдром Дауна равнозначны, хотя в настоящее время чаще стали применять термин «трисомия 21».

Любой вид патологии (инфекции, ожоги, травмы) имеет свои закономерности клинического проявления, в основе которого лежит взаимодействие повреждающего фактора с организмом. Знание этих закономерностей помогает врачу в диагностике заболеваний и лечении больных. Наследственная патология, несмотря на огромное нозологическое многообразие, имеет специфические черты, которые необходимо знать врачу в качестве ориентиров в диагностических поисках.

В основе клинических проявлений наследственной патологии лежат генетические закономерности действия и взаимодействия генов.

Ниже изложены общие признаки наследственных болезней, позволяющие врачу заподозрить роль наследственных факторов в этиологии и патогенезе заболевания.

Генеалогия в широком смысле слова - это родословная. Генеалогический метод - метод родословных, то есть прослеживание болезни (или признака) в семье или роду с указанием типа родственных связей между членами родословной. В медицинской генетике этот метод называется клинико-генеалогическим, поскольку речь идет о наблюдении патологических признаков с помощью клинического обследования.

Генеалогический метод относится к наиболее универсальным методам в медицинской генетике. Его широко применяют в целях медико-генетического консультирования для установления наследственного характера признака, при определении типа наследования и пенетрантности гена, анализе сцепления генов и картировании хромосом, изучении интенсивности мутационного процесса, расшифровке механизмов взаимодействия генов.

Суть генеалогического метода сводится к выявлению родословных связей и прослеживанию признака или болезни среди близких и дальних прямых и непрямых родственников. Технически он складывается из двух этапов: составления родословной и генеалогического анализа.

Составление родословной сопровождают краткой записью о каждом ее члене (легенда родословной).

При применении генеалогического метода в родословной важно отмечать обследованных на наличие признака (можно использовать сведения из объективного источника, например из истории болезни) и необследованных, сведения о которых почерпнуты из ответов пробанда или родственников, а также из анкет. Грубая ошибка - искусственное укорочение звеньев родословной из-за трудностей обследования лиц II и III степеней родства, особенно если не указывается, у кого из членов родословной действительно не было родственников, а у кого сведения не собраны.

Очень важно провести личный осмотр и дополнительное обследование родственников больного, если это необходимо.

При сборе семейного анамнеза желательно использовать и другие источники медицинской и генеалогической информации (выписки из истории болезни, домовые книги, записи отделов ЗАГС, опрос информаторов и т.д.).

Одна из распространенных ошибок в применении генеалогического метода - ограничение анализа только опросом родственников (или о родственниках). Помощь клинико-генеалогического метода в диагностике наследственной патологии очевидна. Так, если в родословной обнаружена наследственная болезнь и анализ показывает возможность ее передачи пробанду, то даже при стертой клинической симптоматике у пробанда (что и стало причиной подробного генеалогического обследования) можно установить диагноз данной наследственной болезни.

При дифференциальной диагностике наследственного заболевания на основании клинических признаков, по-видимому, можно использовать обобщающий подход, близкий к алгоритмической процедуре. Он представлен рядом ступеней.

Но назвать такой способ дифференциальной диагностики алгоритмом нельзя, так как он, являясь массовым, не характеризуется определенностью. Действительно, как составить по данному перечню признаков весь спектр сходных заболеваний; как разделить существенные признаки и несущественные и откуда их взять; как определить, что признаки носят общий существенный характер? Если бы удалось вполне определенно и понятно ответить на поставленные вопросы, то тогда описанный подход, вероятно, можно было бы назвать алгоритмом. Алгоритмы в дифференциальной диагностике появляются тогда, когда составлена точная опись признаков болезней и количественно оценен вероятный вес каждого из них, то есть когда на основе статистического анализа будут установлены количественные критерии для признаков сходных заболеваний.

Диагностика и дифференциальная диагностика могут быть успешными, если они базируются на достоверных и объективных данных. Для создания диагностических программ необходима, с одной стороны, детальная обработка медицинских данных, представление их в формализованном виде, с другой - сведения о частотности и удельном весе каждого из признаков заболевания. Поэтому важное значение приобретает соблюдение принципа группировки информации о больном и его болезни. Вся информация, получаемая врачом или исследователем о больном, может быть классифицирована по нескольким принципам.

Необходимой и патогномоничной информацией является, например, ЭКГ-признак - удлинение Q-T - при синдроме удлиненного интервала Q-T. Специфическая патогномоничная информация служит предпосылкой достоверного диагноза с использованием условно-категорического или простого категорического силлогизма.

Условно-специфическая - желтуха, рвота, отеки, эритроцитурия и т.п.

Условно-специфическая информация, а также неполные специфические синдромы служат предпосылками для дифференциальной диагностики и вероятного диагноза.

Неспецифическая информация не имеет большого диагностического значения. Эта информация является следствием патологического процесса, лежащего в основе болезни, но отражает она общие, неспецифические реакции организма. Сюда относятся следующие признаки: слабость, быстрая утомляемость, понижение аппетита, похудание, головная боль, плохой сон и др.

Случайная информация - признаки, не имеющие отношения ни к основной болезни, ни к сопутствующим заболеваниям: рвота при введении лекарства, непереносимость лекарства, тахикардия при волнении, обморок при виде крови и др.

Деление это условно, так как один и тот же симптом или лабораторный показатель при одной болезни может быть условно-специфическим, при другой - неспецифическим, при третьем - второстепенным или случайным; но он может входить в состав специфического наследственного синдрома.

В связи со сложностью дифференциальной диагностики наследственных болезней для ранней верификации патологии разрабатываются компьютерные программы.

Огромный спектр наследственных болезней и практическая потребность в диагностике многочисленных форм наследственных болезней и ВПР вызывают необходимость в сравнительном анализе данных литературы. В связи с этим уже на протяжении последних 20 лет стали создаваться компьютерные информационные базы данных и диагностические программы. Их назначение - ускорить и объективизировать выбор диагноза из множества генетически разнородных, но клинически сходных синдромов и болезней.

Каталоги необходимы для практической работы клинических генетиков. Они обеспечивают информацию или являются гидами к информации по диагнозу, лечению или генетическому консультированию. Поиски по отдельным признакам (симптомам) или комбинациям признаков могут генерировать перечень форм, в которых присутствуют эти признаки или их комбинации. Общий принцип диагностики с использованием компьютерных программ заключается в том, что симптомы, выявленные врачом, вводятся в компьютер и на их основе осуществляется компьютерный поиск наиболее вероятных диагнозов. После этого врач может обратиться за справкой в базу данных по выбранным диагнозам и получить описание синдрома (или болезни) и даже фотографии больных. Таким образом, врач принимает решение о диагнозе и выбирает способ его верификации, если в этом есть необходимость.

Компьютерная диагностика позволяет использовать накопленный опыт и научные знания о проявлениях патологического процесса на разных этапах его развития. В компьютерной памяти могут храниться сведения о клинических проявлениях и результатах обследования при самой редкой патологии. В настоящее время клиницисты-генетики уже не могут работать без справочно-диагностических систем.

Приводим наиболее известные компьютерные информационные базы данных и диагностические программы.

Менделевское наследование человека (Mendelian Inheritance in Man. V.A. McKusick, сокращенно - MIM). Интернет-версия On Line Mendelian Inheritance in Man - OMIM (адрес в Интернете: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) - информационно-поисковая мультимедийная система. Каталог содержит более 22 000 статей, и база его данных ежедневно пополняется. В каталоге представлены данные о молекулярных дефектах при менделирующих заболеваниях (перечень нарушений и перечень продуктов патологических генов); генетические карты человека (аутосомные, Х- и Y-хромосомные, митохондриальные); описание каталогов аутосомно-доминантных признаков и болезней, аутосомно-рецессивных, Х- и Y-сцепленных болезней и признаков; каталог митохондриальных генов; список литературы; предметный указатель. Каждый менделирующий признак имеет шестизначный номер (например, ФКУ - MIM 261600). За названием признака и синонимами следует лаконичное описание болезни и ее генетики. Статья заканчивается списком наиболее важных источников литературы по теме. Каталог снабжен полным предметным указателем.

Оксфордская медицинская база данных (Oxford Medical Database - OMD), которая имеет два подраздела - лондонскую базу данных (London Dysmorphology Database - LDDB), включающую сведения более чем о 2300 нехромосомных синдромах, и лондонскую нейрогенетическую базу данных (London Neurogenetics Database - LNDB), содержащую сведения более чем о 2200 наследственных заболеваниях центральной и периферической нервной системы. Адрес OMD в Интернете: http://dhmhd.mdx.ac.uk/LDDB/lddb.html.

В результате четкого описания симптомов, наблюдающихся у конкретного больного, указанные диагностические системы и базы данных позволяют из всего многообразия заболеваний выделить наиболее сходные синдромы по фенотипическим признакам. Врач получает возможность провести дифференциальную диагностику среди ограниченного перечня нозологий, выбрать оптимальный план дальнейшего обследования и лечения больного или использовать информацию для оценки генетического риска (прогноз заболевания). Диагностический уровень выявления наследственной патологии возрастет, если обеспечить обмен информацией через электронные средства связи всех пользователей этих систем.

Международное признание получила австралийская компьютерная система идентификациии наследственнных синдромов - POSSUM (Pictures of Standard Syndromes and Undiagnozed Malformations). Каждый из идентифицированных синдромов документирован рядом стандартных фотографий и описанием симптомов. Окончательный диагноз базируется на сравнительной оценке изображения больного и фотографии. Существует марсельская система диагностики наследственных болезней GENDIAG (Франция), основанная на базе симптомов и результатах функциональных проб. Она включает сведения о 3000 признаков. Диагноз отвергается, когда у пациента наблюдаются признаки, не перечисленные в списке симптомов рассматриваемой нозологической формы, и в противоположном случае.

Для пользования зарубежными системами необходимо знание иностранного языка, поэтому в нашей стране предпринимались попытки создания русскоязычных программ. Так, в Медико-генетическом научном центре РАМН была создана программа «СИНГЕН» - SYNGEN (синдромы генетические) - иллюстрированная, информационная диагностическая система примерно по 2000 синдромов ВПР человека. Были разработаны и другие программы: «ХРОНДИС» - CHRONDYS (хромосомные дисморфии) - информационно-поисковая система по нарушениям развития хромосомной этиологии. Она включает в себя данные о клинической картине каждого больного (более 2000 больных) с моно- и трисомиями; справочно-диагностическая компьютерная система «ДИАГЕН» для диагностики более 1500 наследственных синдромов и заболеваний в детском возрасте, работающая в диалоговом режиме; система «ГУГЕНОТ»; система автоматизированной диагностики остеохондродисплазий у детей (ЦИТО) при использовании специального «инструментального средства» центра искусственного интеллекта ИПС РАН SIMER+MIR для компьютерной диагностики и выбора тактики лечения больных с этими заболеваниями.

Имеющиеся компьютерные системы диагностики и базы данных оказываются весьма полезными при проведении медико-генетического консультирования и определения риска возникновения наследственного заболевания, а также могут использоваться в практической работе для диагностических целей.

Видимые отклонения в развитии органов и систем организма привлекают внимание врачей всех специальностей. Однако отклонения могут быть большими с нарушением функций органов и систем, или так называемые большие аномалии развития, или большие пороки, ВПР, и малыми - без нарушения функций, или малые пороки развития, которые чаще называют «морфогенетические варианты развития» или «микроаномалии развития» (МАР) (старое название «стигмы дизэмбриогенеза» не совсем удачный термин).

Малые аномалии развития обнаруживаются у 10% новорожденных детей.

В работах многих исследователей была установлена большая частота МАР по сравнению со здоровыми лицами (детьми и взрослыми) среди лиц с задержкой умственного развития, ВПР, с выраженными поведенческими нарушениями, при болезнях сердечно-сосудистой системы, почечных заболеваниях, заболеваниях кожи и др.

Аномалиями развития (малые пороки) чаще выступают пороки развития, не сопровождающиеся нарушениями функции органа (например, деформации ушных раковин, не обезображивающие больного и не отражающиеся на восприятии звуков).

Не следует относить к аномалиям отклонения от нормы, приобретенные после рождения (приобретенные пороки сердца и др.), а также не следует относить к аномалиям и такие из врожденных основных патологических процессов, как местное расстройство кровообращения, дистрофические, некротические и др., так как они являются либо преходящими, либо прогрессирующими.

Важно то, что микроаномалии могут эффективно использоваться с диагностической целью на долабораторном этапе обследования ребенка. При этом имеет значение как количество микроаномалий, так и их специфика и характер сочетаний.

Выявление микроаномалий целесообразно в общем комплексе клинического обследования, но обнаружение тех или иных МАР, как правило, не имеет самостоятельного значения в постановке диагноза.

МАР не являются синонимом микропризнаков наследственных болезней, так как микропризнак - это симптом заболевания, а аномалия развития - это отклонение в развитии органа или системы.

Микроаномалии, выявляемые у больных с врожденными и наследственными заболеваниями или синдромами, часто не ограничены одним органом или тканью. Они обнаруживаются в различных органах, развивающихся из разных зародышевых листков. Например, булавовидные фаланги и гипотрихоз; сросшиеся брови (синофриз) и микрогнатия; седая прядь волос и гипертелоризм и т.д. Большинство микроаномалий выявляются в периоде новорожденности, однако некоторые микроаномалии не являются статичными, с ростом и развитием ребенка они могут изменяться и даже исчезать.

Исследования показывают, что наличие 1-3 МАР встречается у здоровых лиц.

Микроаномалии приобретают диагностическую значимость тогда, когда их более трех, особенно в определенных сочетаниях, или встречаются такие микроаномалии, которые не встречаются у здоровых лиц. Для врача важно иметь в виду, что при наличии необычных МАР или повышенном их количестве необходимо динамическое наблюдение за ребенком для выявления врожденной и наследственной патологии. Например, поперечная борозда ладони встречается в популяции в 15% случаев, в то же время известно, что она довольно часто встречается при врожденных и наследственных заболеваниях. Поэтому необходимо осторожно оценивать патологическую значимость выявленной микроаномалии, особенно когда она определяется как единственное отклонение.

При правильной регистрации МАР (с учетом возраста, национальности, генеалогических сведений пробанда) их можно использовать для клинического скрининга врачами различных специальностей на первом этапе обследования детей на предмет диагностики врожденных и наследственных заболеваний и для последующего целенаправленного лабораторного (хромосомные болезни, генетические синдромы или болезни соединительной ткани) обследования.

Всего различают более 80 различных микроаномалий. По месту локализации МАР делятся на 7 групп: МАР глаз (гипертелоризм глаз, гипотелоризм, эпикант, телекант и др.); черепно-лицевые МАР (короткая шея, седловидной формы нос, плоский профиль лица, скошенный лоб, два затылка и др.); МАР ротовой области; МАР уха; МАР рук; МАР ног; МАР кожи и туловища.

МАР могут быть использованы в диагностике хромосомных заболеваний, генетических синдромов, наследственных болезней соединительной ткани и др. В то же время диагностическая значимость МАР невелика для больных с патологией обмена веществ.

Таким образом, диагностическая значимость МАР определяется с учетом трех параметров:

Проявления наследственных болезней весьма разнообразны по направленности и глубине изменений многих органов и систем, нередко перекрывающихся у разных нозологических форм. В связи с этим параклинические исследования занимают существенное место в диагностике наследственных болезней.

Уже в самом начале XX в., когда генетика человека еще только получила основы для своего развития, английский врач А. Гаррод применил биохимический анализ мочи для диагностики НБО - алкаптонурии. В 30-х годах ХХ в. норвежский врач И.А. Феллинг открыл метод диагностики ФКУ на основе реакции мочи с хлоридом железа (если в моче есть фенилпировиноградная кислота, появляется сине-зеленая окраска). Однако широкое применение параклинических методов для диагностики наследственных болезней началось с периода интенсивного развития клинической генетики (50-е годы XX в.).

В настоящее время для диагностики наследственных болезней и оценки состояния больного используют клинико-биохимические, гематологические, иммунологические, эндокринологические, электрофизиологические, рентгенорадиологические и другие, в том числе специфические для наследственной патологии, методы. Значение параклинических методов для клинической генетики трудно переоценить, но подробно описать их невозможно.

Приведем лишь отдельные примеры их использования в диагностических целях. Клинико-биохимические исследования проводят при МВ, семейной гиперхолестеринемии, ФКУ, болезни Вильсона-Коновалова. Гематологические исследования проводят для подтверждения гемоглобинопатий, наследственного гемохроматоза. Эндокринологические исследования назначают при врожденном гипотиреозе (ВГ), АГС, нанизме. Иммунологические исследования необходимы при первичных иммунодефицитах, атаксии-телеангиэктазии (синдром Луи-Бар). Электрофизиологические исследования проводят при нервно-мышечных заболеваниях, многих наследственных болезнях нервной системы. УЗИ обязательно назначают при врожденных пороках внутренних органов, аномалиях половой дифференцировки.

Рентгенорадиологические исследования необходимы при диагностике хондродистрофии, нейрофиброматоза.

Резюмируя, можно отметить, что по мере внедрения все более совершенных молекулярно-генетических, молекулярно-цитогенетических, биохимических, инструментальных методов верификации наследственной патологии углубляются наши знания относительно сущности того или иного наследственного заболевания, тем не менее клинико-генетические методы диагностики наследственных болезней сохраняют свое высокое значение, помогая врачу выбрать правильный диагностический путь, цель которого - ранняя диагностика, раннее лечение и профилактика генетически обусловленного заболевания.

В век молекулярной медицины биохимическая диагностика наследственных заболеваний приобретает особое значение. Это уникальная возможность сопоставить изменения в гене и нарушение функции определенного белка или метаболического пути. Методы секвенирования не заменяют, а во многих случаях только дополняют проводимые биохимические тесты. Анализ так называемого биохимического фенотипа имеет не только практическое значение, но и служит для понимания патогенеза заболеваний, анализа гено-фенотипических корреляций, взаимодействий между продуктами различных генов и отдельных метаболитов, а также является основой для создания методов терапевтической коррекции наследственных болезней.

Особое место характеристика «биохимического фенотипа» занимает при НБО. Во многом выделение НБО в отдельный класс моногенных наследственных болезней обусловлено именно их уникальными биохимическими характеристиками, наличием особых биохимических маркеров, которые позволяют установить диагноз на биохимическом уровне.

Биохимическими маркерами являются различные биомолекулы, начиная от простых (аминокислоты, молочная кислота, аммоний) и заканчивая сложными (гликосфинголипиды, гликозаминоликаны, белки), которые указывают на наличие процесса, связанного с клиническим проявлениями заболевания. В идеале биохимический маркер должен не только обладать высокой специфичностью и чувствительностью для конкретного заболевания, но и быть информативным до начала клинических проявлений и отражать изменения в процессе лечения. Именно анализ биохимических маркеров является основным в массовом скрининге новорожденных на некоторые наследственные заболевания.

При НБО наиболее часто биомаркерами служат ферменты, активность которых может значительно изменяться по сравнению с контролем, а также различные метаболиты, концентрация которых повышается или снижается в биологических жидкостях. Биохимические маркеры можно разделить на две группы: первичные и вторичные. К первичным относят ферменты, а также соединения, непосредственно связанные с блокированным биохимическим путем. Так, например, при ФКУ таким биомаркером является фенилаланин (ФА). Мутации в гене PAH приводит к нарушению активности фермента ФА гидроксилазы и повышению концентрации аминокислоты ФА, являющейся субстратом блокированной реакции, в биологических жидкостях. Диагностическая ценность измерения первичных биомаркеров, как правило, является высокой, и тест характеризуется близкой к 100% чувствительностью и специфичностью. Ко вторичным биомаркерам относят биомолекулы, изменения концентрации или, если речь идет о ферментах, активность которых непосредственно не связаны с первичным биохимическим блоком. Эти биомолекулы являются производными субстратов блокированной реакции, или их концентрация повышается вследствие воздействия на другие биохимические реакции накопленных субстратов или продуктов. Примером является повышение концентрации оротовой кислоты при нарушении активности одного из ферментов цикла мочевины - орнитинтранскарбомилазы (ОТС). Мутации в гене ОТС приводят к нарушению синтеза цитруллина из орнитина и карбамоил-фосфата. Избыток карбамоилфосфата используется клеткой для синтеза пиримидиновых нуклеотидов, а оротовая кислота является одним из продуктов этих реакций. Повышение ее концентрации в крови и моче является ценным биохимическим маркером нарушений цикла мочевинообразования. Активность фермента хитотриозидазы (вторичного маркера, отражающего активацию макрофагов) повышается в сотни раз при болезни Гоше, в десятки - раз при некоторых других лизосомных болезнях накопления (ЛБН). Следует учитывать, что специфичность и чувствительность тестов анализа вторичных биомаркеров могут быть различными и для некоторых заболеваний приближаться к 100%, а при других не превышать и 70%. Иногда определение концентрации вторичных биомаркеров может быть более информативным, чем анализ первичного биомаркера, как, например, при тирозинемии, тип 1, повышение тирозина в крови обладает меньшей специфичностью, чем повышение вторичного биомаркера - сукцинилацетона.

При нарушениях функции определенного фермента происходит повышение концентрации субстратов блокированной реакции и их производных. Эти вещества оказывают влияние на функцию клеток и органов и, в зависимости от их токсичности, скорости накопления, тканеспецифичности, приводят к развитию клинических симптомов в разные периоды жизни, обусловливают поражение различных систем органов и разное течение заболевания. Например, ЛБН обусловлены накоплением сложных биомолекул, обладающих определенной тканеспецифичностью (гликосфинголипидов, гликозаминогликанов), и для нарушения функции органов требуется определенное время, заболевания имеют медленно прогрессирующий характер течения и проявляются, как правило, в детском и подростковом возрасте. Такие вещества, как аммоний или органические кислоты, высокотоксичны, накапливаются быстро, поэтому клинические симптомы заболеваний из класса нарушений обмена цикла мочевины и органических ацидурий появляются в первые месяцы и даже дни жизни и болезнь носит острый характер с быстрым прогрессированием.

При ряде НБО (нарушениях энергетического обмена, обмена углеводов, нарушений цикла мочевины) анализ соединений общих для многих метаболических путей («ключевых» метаболитов) позволяет планировать дальнейшую тактику обследования. К этим соединениям относят глюкозу, молочную кислоту (лактат), пировиноградную кислоту (пируват), аммоний, кетоновые тела (3-гидроксибутират и ацетоацетат), мочевую кислоту. Концентрация этих соединений изменяется при многих из НБО, и их комплексная оценка позволяет разработать алгоритмы дальнейшей лабораторной диагностики (рис. 2-1, 2-2).

При анализе метаболитов предпочтение, безусловно, отдается методам, позволяющим проводить оценку множества соединений в одном образце. Для этих целей применяют различные виды хроматографии, во многих случаях - в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (тонкослойную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, газовую хроматографию, тандемную масс-спектрометрию) (табл. 2-1). Биологическим материалом для этих исследований обычно служит плазма или сыворотка крови и образцы мочи.

Важно отметить, что для многих групп НБО определение концентрации метаболитов, их полуколичественный, а иногда и качественный анализ являются первым этапом диагностического поиска и позволяют с высокой достоверностью заподозрить определенную нозологическую форму заболевания или группу болезней (табл. 2-2).

Простые методы анализа, такие как электрофорез гликоза-миногликанов на ацетат-целлюлозных пленках и изоэлектро-фокусирование трансферринов, дают возможность проведения дифференциальной диагностики таких обширных групп НБО, как мукополисахаридозы и врожденные нарушения гликозилирования соответственно (рис. 2-3).

Методические подходы к определению отдельных метаболитов включают тесты качественного химического анализа, спектрофотометрические и флуориметрические методы количественной оценки соединений.

Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике НБО. Современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относится и биологический материал. Для количественного анализа метаболитов при НБО успешно применяются такие хроматографические методы, как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография, а также хромато-масс-спектрометрия (ГХ, ВЭЖХ и ХМС соответственно). ГХ и ВЭЖХ являются универсальными методами разделения сложных смесей соединений, отличаются высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляется в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для ГХ подвижной фазой является газ-носитель, для ВЭЖХ - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксируется детектором прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что ГХ проводится, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения является термическая неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, так как в этом случае анализ проводится в мягких условиях. ХМС представляет собой комбинированную систему ГХ или ВЭЖХ с масс-селективным детектором, что позволяет получать не только количественную, но и качественную информацию, то есть дополнительно определять структуру соединений в анализируемой смеси.

В биохимической генетике термин «органические кислоты» относится к небольшим (молекулярная масса менее 300), растворимым в воде карбоновым кислотам, которые являются промежуточными или конечными продуктами метаболизма аминокислот, углеводов, липидов и биогенных аминов. В образце мочи можно обнаружить более 250 различных органических кислот и глициновых конъюгатов. Их концентрация зависит от диеты, приема лекарственных препаратов и некоторых других физиологических причин. Известно около 65 НБО, которые характеризуются специфичным профилем органических кислот. Относительно небольшое количество органических кислот являются высокоспецифичными, и наличие их в больших концентрациях в моче позволяет точно установить диагноз: сукцинилацетон при тирозинемии, тип I, N-ацетиласпартат при болезни Канавана, мевалоновая кислота при мевалоновой ацидурии. Однако в подавляющем большинстве случаев диагноз НБО на основании только анализа органических кислот мочи установить довольно трудно, и требуется проведение дополнительной, подтверждающей диагностики.

Интерпретация результатов анализа органических кислот мочи представляет определенные проблемы как из-за большого числа экскретируемых кислот и их производных, так и из-за наложения профилей некоторых лекарственных метаболитов. Концентрация органических кислот при НБО характеризуется достаточно широким диапазоном - от повышения их уровня в несколько сотен раз до незначительного превышения, близкого к нормальному. Например, при глутаровой ацидурии, тип 1 (уровень глутаровой кислоты у некоторых больных может находиться в пределах нормы), недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот (конценрация адипиновой, себациновой и субериновой кислот может быть в пределах нормы). Довольно часто аномальный профиль органических кислот мочи возможно обнаружить только у пациентов в стадии метаболической «декомпенсации». Особенно это характерно для доброкачественных, мягких форм заболеваний, которые, как правило, имеют поздний возраст манифестации. Совершенно непредсказуемый профиль экскретируемых органических кислот могут давать нарушения дыхательной цепи митохондрий (ДЦМ).

Одним из наиболее современных методов анализа, без которого невозможно себе представить биохимическую лабораторию, является тандемная масс-спектрометрия.

Метод тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) впервые был применен в 1970-х годах и нашел свое применение в химии, биологии и медицине. Масс-спектрометрия - аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию анализируемых молекул после их преобразования в ионы. Этот метод применяют как для выяснения структуры неизвестных веществ, так и для анализа комплексных смесей с минимальной очисткой образцов. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяется непосредственно масса молекул и их фрагментов. Результаты представляются графически (так называемый масс-спектр). Иногда невозможно анализировать многокомпонентные, сложные смеси молекул без их предварительного разделения. Разделить молекулы можно либо хроматографически (высокоэффективная жидкостная или газовая хроматография), либо использовать два последовательно соединенных масс-спектрометра (тандемная масс-спектрометрия).

Перед масс-спектрометрическим анализом необходимо превращение нейтральных частиц вещества в заряженные ионы, а также перевод их из жидкого состояния в газообразное. Для этой цели сначала применялся метод ионизации бомбардированием быстрыми атомами, в последнее время наибольшее предпочтение отдается методу ионизации в электроспрее. С появлением новых методов ионизации применение МС/МС в области аналитической биохимии стало более доступным. В 1993 году Дональд Чейз с коллегами адаптировал этот метод для анализа аминокислот в высушенных пятнах крови, сформировав, таким образом, основу для скрининга множества компонентов при НБО. В дальнейшем метод был адаптирован для проведения крупномасштабных анализов, необходимых для неонатального скрининга. На рис. 2-4 представлена одна из моделей тандемно-го масс-спектрометра, применяемая для массового скрининга новорожденных.

МС/МС-анализ наиболее эффективен для соединений, имеющих сходные дочерние ионы или нейтральные молекулы, например для анализа аминокислот и ацилкарнитинов. Необходимо также подчеркнуть возможность МС/МС-анализа различных химических групп в одном анализе за очень короткое время (~2 мин). Это обеспечивает широкий спектр анализов и высокую пропускную способность, что экономически выгодно для скрининга на большое число заболеваний. На основании повышения концентрации определенных ацилкарнитинов можно заподозрить заболевания из группы нарушений митохондриального β-окисления, по изменению профиля аминокислот - аминоацидопатии.

МС/МС также можно использовать для исследования других классов метаболитов. Так, разработан метод измерения тотального гексозмонофосфата в пятнах крови, маркера галактоз-1-фосфата, который можно использовать при скрининге на ГАЛ, детектировать метаболиты желчных кислот, очень длинноцепочечные жирные кислоты при дефектах биогенеза пероксисом (синдром Цельвегера, недостаточность пероксисомного бифункционального белка).

Для некоторых заболеваний известны определенные корреляции между уровнем экскретируемых метаболитов и клиническим фенотипом. Например, при метилмалоновой ацидурии, связанной с мутациями в гене MUT, концентрация метилмалоновой кислоты в моче, как правило, существенно повышена и составляет 1000-10000 мМ/Мкреатинина (норма до 2 мМ/Мкреатинина), а при нарушениях обмена кобаламина от 300-1000 мМ/Мкреатинина (норма до 2 мМ/Мкреатинина).

Применение методов анализа метаболитов не всегда дает возможность понять точную молекулярную причину болезни, поскольку многие из этих НБО чрезвычайно генетически гетерогенные, но в ряде случаев именно анализ метаболитов позволяет принять экстренные меры для помощи пациенту уже после получения результатов этих анализов.

Подавляющее большинство НБО (более 80%) обусловлено мутациями в генах, кодирующих определенные ферменты. В зависимости от типа мутационного повреждения ферменты могут сохранять определенную остаточную активность или практически ее не иметь. Для некоторых заболеваний описаны корреляции между активностью фермента и клиническим фенотипом. Например, при инфантильной форме болезни Помпе остаточная активность фермента кислой мальтазы (α-глюкозидазы) составляет менее 10% от нормы, при взрослой и поздней младенческой форме заболевания может достигать до 30% от нижней границы нормы.

Выбор биоматериала для определения активности ферментов и количественного определения других белков зависит от уровня их экспрессии в определенных тканях, стабильности при транспортировке и хранении, сложности диагностики и инвазивности метода для получения нужного биоматериала. Например, скрининг на ГАЛ во многих странах базируется на определении тотальной галактозы (Гал) и измерении активности фермента галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы. Фермент сохраняет свою стабильность при температуре 0-4 °С около семи дней, при комнатной температуре его активность резко снижается за первые три дня.

Оптимальным выбором для определения активности ферментов является культура кожных фибробластов, однако получение этой культуры сопряжено с проведением инвазивных процедур и длительным культивированием клеток перед определением активности ферментов.

Иммунохимические методы используются при дефектах белков, не являющихся ферментами, - например, для определения белков-активаторов или некоторых мембраносвязанных белков.

Для анализа активности ферментов используют хромогенные, флуорогенные или содержащие радиоактивную метку субстраты. Соответственно, для измерения активности ферментов применяют спектрофотометрические, флуориметрические и радиоактивные методы измерения.

Флуорогенные субстраты на основе 4-метилумбелиферона являются очень чувствительными, и, как показано в ряде работ, с их помощью возможно определять активность ферментов даже в микроколичествах биологического материала (пятнах высушенной крови). Общий принцип применения флуорогенных субстратов состоит в том, что субстрат представляет собой химическое производное флуорохрома, неспособное к флуоресценции в исходном состоянии, но под действием молекул соответствующих ферментов субстрат каталитически расщепляется с освобождением флуорохрома, флуоресценцию которого можно измерить. Имеется достаточно много флуорогенных субстратов для исследования различных ферментов: эстераз разной специфичности, пероксидаз, пептидаз, фосфатаз, сульфатаз, липаз и др.

Спектрофотометрические методы позволяют измерять поглощение продуктов ферментативной реакции, полученных после внесения хромогенных субстратов. Для многих ферментов (например, дегидрогеназ) образующиеся продукты реакции сами являются хромогенными (НаД^♠ Н, ФАД^♠ Н).

Радиоактивно меченные субстраты применяются в диагностике органических ацидурий, дефектов митохондриального β-окисления, при нарушениях метаболизма углеводов, ЛБН.

Одним из современных методов определения активности ферментов является применение технологии тандемной масс-спектрометрии. В пятне высушенной крови, что составляет менее 5 мкл цельной крови, с применением этой высокочувствительной технологии возможно определять активность лизосомных ферментов. Принцип метода в данном случае заключается в следующем: к пятнам крови добавляют субстраты, близкие по своему строению к натуральным, и после инкубации определяют на тандемном масс-спектрометре количество образовавшегося продукта. Если активность фермента снижена, концентрация продукта реакции будет низкой. К пробам также добавляют внутренний стандарт, что позволяет точно рассчитать активность фермента. Уже доступны наборы для определения активности ферментов лизосом при шести наследственных заболеваниях (болезни Помпе, Гоше, Фабри, Краббе, Ниманна-Пика А/В, МПС I), и в ближайшие годы эти тест-системы будут включать более 10 различных заболеваний.

Лабораторная диагностика на основании определения активности фермента может быть затруднена в силу разных причин. Одна из них - наличие так называемых аллелей «псевдонедостаточности», которые являются полиморфизмами, но приводят к изменениям структуры фермента и не позволяют белку адекватно расщеплять искусственный субстрат in vitro, при этом с естественным субстратом данный фермент не показывает снижения активности. Это явление наиболее хорошо изучено при ЛБН. Феномен «псевдонедостаточности» описан для арилсульфатазы А (метахроматическая лейкодистрофия), β-галактозидазы (GM1-ганглиозидоз), α-идуронидазы (мукополисахаридоз, тип 1), α-галактозидазы (болезнь Фабри), галактоцереброзидазы (болезнь Краббе). Эти заболевания довольно редкие, и аллели «псевдонедостаточности» также встречаются относительно редко в популяции, за исключением арилсульфатазы А (10-15%). Поэтому подтверждающая ДНК-диагностика метахроматической лейкодистрофии строго рекомендуется во всех случаях снижения активности фермента.

Кроме того, на результаты анализа может влиять присутствие изоферментов. Практически каждая клетка содержит свой набор ферментов, поэтому их распределение в тканях значительно варьирует. Многие ферменты представлены в тканях различными формами (изоферментами). В большинстве случаев это связано с наличием различных полипептидных субъединиц, которые, соединяясь, формируют разные изоферменты. Распределение этих изоферментов может варьировать от ткани к ткани. Примерами могут служить ферменты цикла мочевины и метаболизма фруктозы, которые содержатся только в печени. Для каждой ферментативной реакции необходимы определенные условия: рН и состав буферной смеси, специфический субстрат/субстраты, наличие активаторов и кофакторов, температурный режим и т.д. Для подавления активности изоферментов должны применяться специальные ингибиторы. Например, в лейкоцитах крови, кроме кислой мальтазы, присутствуют другие мальтазы (нейтральная) со сходной субстратной специфичностью, что затрудняет диагностику болезни Помпе, которая связана с недостаточностью этого фермента.

Вообще, полное отсутствие активности фермента (менее 10% от нормы), как правило, является подтверждением определенного диагноза, а нормальная активность фермента дает возможность исключить заболевание. Однако не следует забывать, что существуют очень редкие варианты болезней, связанные с дефектами белков-активаторов, явление «псевдонедостаточности» может привести к ложноположительным результатам.

Поэтому оценка результатов диагностики должна проводиться совместно с врачами, чтобы снизить число возможных ошибок.

Понимание биохимических причин заболевания позволяет правильно планировать не только стратегию дальнейшей диагностики, но и тактику лечения больного.

В общем виде тактика проведения диагностики НБО в каждом конкретном случае должна планироваться совместно с врачом-биохимиком и врачом-генетиком.

Универсального алгоритма лабораторной диагностики НБО не существует. Может быть предложена оптимальная тактика анализа биохимических, а затем и молекулярно-генетических маркеров для установления диагноза, переход от простых тестов к более сложным, от анализа на группы заболеваний к специфическим тестам для отдельной болезни. Но в большинстве случаев лабораторная диагностика - это длительный и кропотливый труд как сотрудников лаборатории, так и врачей. Без их тесного взаимодействия и взаимопонимания многие случаи НБО так и остались бы неразгаданными.

Генетический груз человечества связан с заболеваниями, возникновение и развитие которых является следствием изменения(й) в наследственном аппарате клеток. Более 70% патологий человека представлено мультифакториальными или полиэтиологическими болезнями. Это болезни, которые обусловлены в значительной степени как факторами окружающей среды, так и изменениями генетического материала. Особенностями данной группы болезней являются высокая популяционная частота, выраженный клинический полиморфизм, неменделевское наследование, зависимость проявлений болезни от факторов внешней среды, возраста и пола больного. С генетической точки зрения характерной чертой данной группы заболеваний является то, что факторами риска является носительство особых вариантов нескольких генов одновременно, что делает практически невозможным определение вероятности развития данной патологии у потомков и родственников пробанда. К наиболее частым мультифакториальным болезням относят СД, бронхиальную астму, ишемическую болезнь сердца, псориаз, шизофрению и многие другие.

До 10% наследственной патологии обусловлено изменениями числа или структуры хромосом. В настоящее время известно более 700 различных хромосомных заболеваний.

Восемнадцать процентов приходится на моногенные болезни. Причиной данной группы патологий являются изменения ДНК на уровне генов. Необходимым и достаточным условием возникновения клинического фенотипа моногенной болезни является наличие мутации в одном из генов человека. Однако клинические проявления болезни могут зависеть от пола, возраста больного, а манифестация заболевания может быть связана с неблагоприятными условиями внешней среды - травмой, переохлаждением, интенсивными физическими нагрузками. Данные болезни наследуются в соответствии с законами Г. Менделя и также называются менделирующими болезнями. На конец 2015 года в базе данных OMIM описано 8202 клинических фенотипа, для 4761 из них известен молекулярный дефект. Для большинства моногенных болезней характерна генетическая гетерогенность - за развитие одного и того же клинического фенотипа в неродственных семьях могут отвечать мутации различных генов. Среди моногенных болезней выделяют частые (встречаются с частотой более чем 1/10000) - ФКУ, МВ, АГС - и редкие (частота менее 1/100000). Каждый человек является носителем не менее пяти мутаций, не проявляющихся при наличии второй нормальной копии гена. Именно моногенные болезни являются основным объектом ДНК-диагностики.

ДНК-диагностика - это поиск генетической причины болезни на уровне изменений дезоксирибонуклеиновой кислоты. ДНК-диагностика направлена на поиск непосредственной причины наследственной болезни - мутации гена и является наиболее адекватным и точным исследованием при моногенной патологии. Проведение данной диагностики возможно, даже если неизвестен точный патогенез развития болезни, но известен ген, который ее вызывает.

В зависимости от поставленных задач различают следующие виды ДНК-диагностики.

В зависимости от методологии исследования выделяют косвенную и прямую ДНК-диагностику. При косвенной ДНК-диагностике исследуют не непосредственную причину заболевания, а определяют наследование в семье участка хромосомы, несущей предположительно мутантный ген по аллелям генетических маркеров, лежащих в непосредственной близости от этого гена (рис. 3-1). Точность данного типа ДНК-диагностики составляет 95-99%, однако для его применения необходима уверенность в правильности клинического диагноза и знание того, что за данный клинический фенотип могут быть ответственны мутации только одного гена. На сегодняшний день использование косвенной ДНК-диагностики становится редким, так как практически для всех наследственных заболеваний выявлена генетическая гетерогенность.

Прямая ДНК-диагностика направлена на поиск мутации, являющейся непосредственной причиной болезни. Точность такой диагностики составляет 100%. Возможно проведение прямой ДНК-диагностики при сомнительном диагнозе и при наличии нескольких локусов заболевания. Прямая ДНК-диагностика позволяет диагностировать носительство мутации в семьях с моногенной патологией даже при отсутствии материала больного.

Материалом для проведения ДНК-диагностики являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК, выделенные из ядерных клеток. Наилучшим материалом для исследования является цельная кровь в пробирке с антикоагулянтом или высушенная на фильтровальной бумаге. В связи с тем что некоторые химические элементы ингибируют работу фермента ДНК-полимеразы, для проведения ДНК-исследования подходят только антикоагулянты ЭДТА или цитрат натрия. Кроме того, ингибировать полимеразную цепную реакцию (ПЦP) может большое количество чужеродной, например бактериальной, ДНК. Выделение ДНК проводят различными методами в зависимости от типа предоставленного материала и метода молекулярно-генетического анализа, планируемого для исследования.

На сегодняшний день можно выделить две группы методов ДНК-диагностики: методы, позволяющие исследовать только конкретные, уже известные мутации, и методы, позволяющие найти практически любое изменение нуклеотидной последовательности ответственного за болезнь гена, в том числе и ранее не описанную мутацию.

Методы исследования уже известных мутаций возможно применять для болезней, гены которых хорошо изучены, определены частоты и спектры мутаций, выявлены мажорные мутации. Применение систем детекции частых мутаций позволяет удешевить и оптимизировать процедуру проведения ДНК-диагностики за счет снижения материально-технических и временных затрат. Системы детекции наиболее частых мутаций успешно применяются в молекулярно-генетической диагностике частых аутосомно-рецессивных заболеваний: спинальной мышечной атрофии, Мв, ФКУ, несиндромальной нейросенсорной тугоухости, АГС и других. На рис. 3-2 показан пример детекции в одной пробирке восьми наиболее частых мутаций гена PAH, ответственных за ФКУ.

Такая же система детекции мутаций может быть использована для выявления мутаций при ряде аутосомно-доминантных болезней, при которых показано наличие мажорной мутации. Например, причиной 99% случаев ахондроплазии является мутация Gly380Arg гена FGFR3, которая возникает в результате замены 1138 нуклеотида гуанина на аденин или цитозин.

Для поиска причин редких болезней и болезней, в генах которых не выявлено мажорных мутаций, применяются методы, позволяющие исследовать всю кодирующую последовательность и регуляторные области соответствующего гена. На сегодняшний день референсным методом такого исследования является прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру (рис. 3-3, см. цв. вклейку). Однако даже исследование всей последовательности гена в ряде случаев не позволяет найти мутацию, ответственную за заболевание, так как секвенированием невозможно детектировать некоторые типы мутаций, например протяженные делеции/инсерции, затрагивающие целые экзоны гена, или инверсии, не приводящие к изменению нуклеотидного состава фрагментов. Генетическая гетерогенность наследственных болезней и большой размер некоторых генов приводят к тому, что секвенирование всех ответственных за данный клинический фенотип нуклеотидных последовательностей является дорогостоящей и длительной процедурой. На сегодняшний день для таких заболеваний появилась возможность применения в диагностической практике технологий секвенирования нового поколения, позволяющих одномоментно получить массив данных, содержащий информацию о нуклеотидной последовательности десятков целевых генов или всего экзома.

Любой метод, применяемый в современной ДНК-диагностике, имеет ограничения по типу детектируемых мутаций. Разработка протоколов ДНК-диагностики базируется на знаниях о спектрах мутаций. Все методы ДНК-диагностики можно разделить на качественные и количественные. Качественные методы способны выявить точковое изменение нуклеотидной последовательности, короткие делеции и инсерции, протяженные делеции генов, имеющих в геноме одну копию (гены, локализующиеся на половых хромосомах мужчин), - к таким методам относятся анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, анализ полиморфизма длин амплификационных фрагментов, прямое автоматическое секвенирование и др. Количественные методы позволяют определить число копий гена в геноме. К таким методам относятся блот-гибридизация, ПЦР в реальном времени, количественная мультиплексная лигазная реакция. Использование данных методов необходимо при поиске протяженных делеций и дупликаций генов, лежащих на аутосомах, например детекции дупликаций/делеций гена PMP22, ответственного за наследственную моторно-сенсорную нейропатию 1А типа, но особенно важно при исследовании носительства заболеваний, мажорными мутациями которых являются делеции, например спинальной мышечной атрофии или мышечной дистрофии Дюшена-Беккера.

Показания для назначения ДНК-диагностики могут быть следующие.

В данном случае проведение ДНК-диагностики необходимо для подтверждения диагноза на молекулярно-генетическом уровне и выработки тактики профилактики наследственной патологии в семье.

Несмотря на то что некоторые диагнозы могут быть подтверждены на основании выявления типичных биохимических маркеров, например специфичного повышения концентрации ФА в сыворотке крови у больных ФКУ, проведение ДНК-диагностики позволяет выявить молекулярную причину заболевания, в сомнительных случаях даст ответ о верности диагноза, сделает возможным проведение в семье диагностики носительства и ПД. Существуют болезни, при которых выявляются характерные, но не специфичные биохимические изменения: например, повышение уровня креатинфосфокиназы и трансаминаз возможно как при ряде ненаследственных болезней, так и при моногенных заболеваниях - мышечных дистрофиях, кардиомиопатиях, изолированном повышении уровня КФК в сыворотке крови и др. В таких случаях ДНК-диагностика - единственный способ окончательно подтвердить диагноз, установить молекулярную природу болезни, определить тип наследования для изолированных случаев, определить риски рождения больного ребенка и выработать тактику профилактики патологии в отягощенных семьях. В некоторых ситуациях подтверждающая диагностика с использованием молекулярно-генетических методов проще, быстрее и дешевле, чем проведение комплекса диагностических мероприятий при подозрении на болезнь; например, при стойком повышении непрямого билирубина для диагностики синдрома Жильбера сегодня оптимально использовать поиск инсерции в промоторной области гена UGT1, в отличие от функциональных тестов с индукторами уридинфосфатглюкоронозилтрансферазы I в условиях стационара.

Проведение диагностики носительства моногенной патологии возможно только у совершеннолетних родственников пробанда при их желании. Проведение диагностики носительства у детей возможно только в исключительных случаях, например при наличии терапии, позволяющей предупредить или отодвинуть возраст манифестации заболевания или необходимости данного теста для определения статуса выявленных у больного члена семьи изменений в последовательности ДНК.

Высокая частота носительства многих других рецессивных заболеваний характерна лишь для представителей определенных популяций: например, носительство периодической болезни у евреев ашкенази и армян или рецессивного летального остеопетроза у чувашей. В таких популяциях при планировании беременности одному из будущих родителей можно рекомендовать обследоваться на носительство соответствующего мутантного гена для последующего выявления пар высокого риска и принятия своевременных профилактических мер.

После проведения ДНК-диагностики лабораторией выдается заключение, в котором указывается ген или конкретные мутации одного или нескольких генов, поиск мутаций в которых был проведен у пробанда, метод исследования и его результаты. Результатом диагностики может быть наличие или отсутствие изменений нуклеотидной последовательности исследованного гена.

При проведении ДНК-диагностики могут быть детектированы следующие виды изменений нуклеотидной последовательности: мутация, вариант нормы и вариант с неизвестной патогенностью.

Мутация является необходимой и достаточной причиной моногенной болезни. Выявление мутации у пробанда является однозначным подтверждением клинического диагноза на молекулярном уровне и дает возможность для проведения ПД и диагностики носительства членам семьи. Для подтверждения диагноза аутосомно-рецессивного заболевания необходимо выявление мутаций на обеих хромосомах в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии. Использование методов поиска известных мутаций не всегда позволяет детектировать обе мутации. В этом случае необходимо проведение анализа всего гена. Однако в ряде случаев типичная клиническая картина и наличие биохимических изменений позволяют врачу верифицировать диагноз без поиска второй мутации. Отсутствие детектированной второй мутации у пробанда при аутосомно-рецессивном заболевании снижает точность пренатальной ДНК-диагностики за счет необходимости использования косвенных методов для определения наследования поврежденной хромосомы с неидентифицированной мутацией.

Вариант нормы или полиморфизм - отличия в последовательности оснований ДНК в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) разных индивидов или между гомологичными участками гомологичных хромосом индивида. Это изменение нуклеотидной последовательности, не являющееся патогенетической причиной исследуемого моногенного заболевания. Генетические полиморфизмы являются основой внутри- и межвидового разнообразия. Ярким примером генетического полиморфизма является множественный аллелизм группы крови ABO.

Термин «вариант с неизвестной патогенностью» применяется при обнаружении в генотипе пробанда ранее не описанного изменения нуклеотидной последовательности. Для определения статуса этого изменения необходимо проведение дополнительных исследований: популяционный анализ частот замены, исследование сегрегации данной замены в семье, функциональный анализ замены с использованием биоинформационных методов и/или модельных систем.

Все детектированные варианты указываются в заключении в соответствии с международной номенклатурой. Изменение может быть записано с использованием последовательности кодирующей ДНК: c23G>C - в положении 23 кодирующей ДНК гена произошла замена гуанина на цитозин, или c92_94delGAC - в положении 92-94 кодирующей ДНК произошло выпадение трех нуклеотидов. Если обнаруженный вариант приводит к аминокислотной замене в белковой последовательности, изменение может быть записано с использованием последовательности аминокислот протеина: p.Trp26Cys - в положении 26 протеина произошла замена аминокислоты триптофан на цистеин. В некоторых случаях для удобства генетиков название мутации в соответствии с номенклатурой может быть продублировано традиционным названием данной мутации.

При отсутствии изменений нуклеотидной последовательности невозможно исключить генетическую природу заболевания у пробанда, так как:

При направлении больных на ДНК-диагностику необходимо учитывать, что это достаточно сложное и дорогостоящее исследование. Генетическая гетерогенность наследственных болезней диктует необходимость сбора как можно более полной клинической информации с целью выработки наиболее оптимальной последовательности исследования генов в каждой конкретной семье. До назначения ДНК-диагностики желательно провести максимально возможное обследование пробанда с использованием доступных физикальных, лабораторных и инструментальных методов. Необходимо собрать подробную родословную семьи и, при необходимости проведения дополнительных тестов, предоставить материал родственников пробанда.

Материалом для проведения ДНК-анализа может быть любая ткань человека, содержащая ДНК. Наилучшим материалом для исследования является цельная кровь, собранная в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, для большинства тестов допустимо использование сухих пятен крови на фильтровальной бумаге. В случае если больной член семьи недоступен, возможно проведение анализа с использованием различных биологических тканей после предварительного согласования с лабораторией. Материал для ДНК-диагностики не требует особых условий хранения и транспортировки, при температуре +4 °С жидкая кровь хранится в течение двух недель, высушенные пятна крови и замороженная кровь могут храниться более пяти лет. ПД может проводиться на любом материале плода: ворсинах хориона, амниотической жидкости, пуповинной крови - выбор обусловлен только сроками беременности и возможностью проведения инвазивной процедуры.

На сегодняшний день возможно проведение ДНК-диагностики практически любого заболевания, для которого известен ген, мутации в котором являются причиной заболевания. В РФ разработаны диагностические протоколы для поиска мутаций различных генов более чем 400 моногенных болезней. Задача консультирующего врача сегодня очень сложна - необходимо не только поставить клинический диагноз, но и определить оптимальную последовательность исследования генов. Только выявление непосредственной причины болезни - мутации в гене - дает возможность подтвердить диагноз на молекулярном уровне и провести диагностику носительства в семье и доимплантационную и/или ПД.

Хромосомным болезням отводится существенное место в структуре наследственной патологии человека. Аномалии хромосомного набора являются причиной ранней остановки развития и внутриутробной гибели в среднем 50-60% зародышей в первом триместре беременности. Примерно 5-7% мертворождений обусловлены хромосомным дисбалансом, а частота хромосомных нарушений у детей с множественными ВПР достигает 40%. Среди новорожденных частота хромосомных аберраций составляет 0,6-1,0%, при этом около половины из них составляют анеуплоидии. В постнатальном онтогенезе хромосомный дисбаланс играет заметную роль в этиологии умственной отсталости, бесплодия, привычного невынашивания беременности, в развитии злокачественных новообразований. Пациенты с такими формами патологии формируют группы риска и должны быть обследованы с помощью цитогенетических методов исследования. Основные показания для проведения цитогенетической диагностики:

Круг задач, с которыми приходится сталкиваться при проведении цитогенетического анализа в перечисленных ситуациях, отличается довольно большим разнообразием. Безусловно, в значительной степени это связано с широким спектром числовых и структурных аномалий хромосом, обусловливающих возникновение хромосомных болезней и требующих применения разнообразных методов детекции. Однако существуют и определенные трудности и ограничения при проведении цитогенетического анализа, связанные как с проблемами получения качественных препаратов хромосом, так и с уровнем разрешения световой микроскопии, ограничивающим идентификацию микроструктурных хромосомных аберраций. Соответственно, в каждом диагностическом случае возникает вопрос о выборе наиболее информативного способа исследования кариотипа. Целью настоящей главы является характеристика существующих методов цитогенетической диагностики хромосомных болезней, их областей применения, разрешающих возможностей и ограничений.

На современном этапе развития цитогенетики человека можно выделить два основных направления в методах цитогенетической диагностики. Первое, традиционное, связано с приготовлением препаратов метафазных хромосом. В этом случае проводятся стандартные процедуры цитогенетического анализа, связанные с культивированием клеток, получением хромосомных препаратов и исследованием рутинно или дифференциально окрашенных хромосом, либо метафазные пластинки становятся объектом более детального изучения с применением высокоразрешающих методов молекулярной цитогенетики. В случае же невозможности приготовления хромосомных препаратов и проведения классического метафазного анализа, цитогенетическая диагностика тем не менее остается возможной. Эту возможность обеспечивают методы молекулярно-цитогенетического, а в последнее время и молекулярно-генетического анализа, объектом исследования при применении которых становится уже не метафазная хромосома, а хроматин интерфазных ядер или вовсе молекула ДНК.

Золотым стандартом при проведении цитогенетической диагностики по-прежнему остается метафазный анализ хромосом, позволяющий идентифицировать все хромосомы в кариотипе человека по их морфологическим характеристикам. Традиционно препараты метафазных хромосом получают из культур активно пролиферирующих клеток или клеток с высоким митотическим индексом. Наиболее распространенным источником метафазных пластинок являются культуры лимфоцитов периферической крови человека. Кроме того, для получения метафазных хромосом могут быть использованы культуры фибробластов кожи, клеток амниотической жидкости, ворсин хориона, костного мозга.

Говоря о выборе материала для проведения цитогенетического анализа, следует подчеркнуть, что он далеко не ограничивается перечисленными типами клеток. Так, с развитием преимплантационной генетической диагностики возникает задача исследования кариотипа в отдельных бластомерах или полярных тельцах, то есть до наступления беременности или еще даже до оплодотворения. Несмотря на некоторые попытки получения метафазных хромосом из этих клеток, трудоемкость и невысокая эффективность предложенных методик заставляют обратить внимание на использование технологий молекулярно-цитогенетического исследования, не требующих приготовления хромосомных препаратов. Существуют трудности и при проведении цитогенетического анализа солидных злокачественных новообразований, когда практически невозможно получить качественные препараты метафазных хромосом. В тех же случаях, когда это удается сделать, - например, при использовании трансформированных клеточных линий, неизбежно встает вопрос о соответствии хромосомных аберраций в культуре и в нативной опухоли. Этот вопрос возникает вследствие возможности появления новых мутаций при трансформации и длительном культивировании клеток, а также вследствие их клональной селекции in vitro. Таким образом, для проведения цитогенетического исследования может быть использован достаточно широкий спектр биологического материала и типов клеток, однако его особенности определяют выбор наиболее адекватного метода анализа кариотипа.

Традиционно получение препаратов хромосом требует проведения нескольких стандартных процедур:

Непременным условием получения качественных препаратов хромосом с достаточным числом метафазных пластинок является высокая митотическая активность клеток. При использовании лимфоцитов периферической крови стимуляция клеточной пролиферации in vitro достигается с помощью фитогемагглютинина - белка бобовых растений. Некоторые клетки (фибробласты, амниоциты) способны к пролиферации в культуре без стимуляции клеточного деления. Ряд же других клеток, например цитотрофобласта ворсин хориона, обладая высокой митотической активностью, требуют краткосрочного культивирования для получения метафазных хромосом либо вовсе могут быть использованы для приготовления так называемых прямых препаратов хромосом без этапа культивирования.

Продолжительность культивирования также определяется индивидуальными свойствами клеток, и прежде всего длительностью их клеточного цикла. Так, для получения препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови, как правило, требуется их культивирование в течение 72 ч, когда число делящихся клеток в суспензионной культуре достигнет максимума. Культивирование фибробластов или амниоцитов, пролиферирующих на поверхности силиконизированного стекла или пластика, требует несколько дней до получения монослоя. По вполне очевидным причинам еще более продолжительным оказывается культивирование клеток внутриутробно погибших эмбрионов и плодов, требующее несколько недель до накопления достаточного количества активно пролиферирующих клеток.

Для культивирования используют среды (обычно RPMI 1640, DMEM, F10, F12, среда Игла), специфичные для определенных типов клеток, с добавлением пуповинной сыворотки крови человека или эмбриональной телячьей сыворотки. В некоторых случаях для улучшения клеточной пролиферации в культуры добавляют растворы витаминов и незаменимых аминокислот. Обычно культивирование проводят при 37 °С во флаконах или в чашках Петри в условиях 5% CO₂ . Накопление клеток в стадии метафазы достигается за счет добавления в культуры цитостатиков (колхицин, колцемид^♠ , демеколцин^♠ '), блокирующих веретено клеточного деления. В ряде случаев для увеличения доли митотических клеток может быть применена синхронизация культур.

Гипотоническая обработка является одним из важнейших этапов в получении качественных препаратов метафазных хромосом. Воздействие на клетки свежеприготовленным гипотоническим раствором калия хлорида или натрия цитрата приводит к значительному увеличению размеров, способствует разрыву межхромосомных связей и обеспечивает в конечном итоге хороший разброс хромосом в метафазной пластинке. Фиксация клеток, необходимая для сохранения морфологии хромосом, осуществляется с использованием охлажденного (4 °С) фиксатора Карнуа (метанол, ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Свежеприготовленная суспензия клеток может быть непосредственно нанесена на предметное стекло для микроскопирования либо может храниться в архиве (при -20 °С) весьма продолжительное время.

В зависимости от цели диагностического исследования используются различные методы окрашивания хромосом, которые в общем виде могут быть подразделены на методы рутинной и дифференциальной окраски. Последние, в свою очередь, подразделяются на методы, приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (Q-, G-, R-окраска), и на методы, обеспечивающие окрашивание специфических хромосомных структур (C-, NOR-, Т-окраска).

Исторически первым методом, используемым в цитогенетике человека, стало рутинное окрашивание хромосом. Оно достигается путем окрашивания хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азурэозином) без какой-либо предварительной обработки. Это приводит к сплошному прокрашиванию хромосом по всей их длине. Рутинное окрашивание позволяет установить лишь общее число хромосом в метафазной пластинке и провести некоторый анализ их морфологии, в частности определить размер хромосомных плеч, положение первичных и вторичных перетяжек, центромерный индекс. В настоящее время рутинная окраска практически не применяется для диагностики хромосомных заболеваний, однако она остается актуальной для анализа хромосомных аберраций при тестировании мутагенных факторов.

Разработка методов дифференциального окрашивания хромосом позволила существенным образом повысить разрешающие возможности цитогенетического анализа в идентификации прежде всего структурных хромосомных аберраций. Первым методом дифференциальной окраски стало Q-окрашивание, предложенное Касперссоном с коллегами в 1970 году. Q-окраска (от англ. Quinacrine - акрихин) выявляется на хромосомах в виде чередования ярко- и темно-флуоресцирующих сегментов после окрашивания хромосомных препаратов интеркалирующими в ДНК красителями - акрихинипритом, акрихин дигидрохлоридом или Hoechst 33258. Для анализа Q-окрашенных хромосом требуется применение люминесцентного микроскопа. Согласно Международной цитогенетической номенклатуре (ISCN 2016), Q-окраску, в зависимости от типа используемого красителя, принято обозначать как QFQ или QFH, где первая буква обозначает тип окраски (Q), вторая - основную применяемую методику (F - флуоресцентное окрашивание) и третья - используемый краситель (Q - акрихин, H - Hoechst 33258).

Наиболее распространенной на практике является G-окраска хромосом (G-banding, от англ. Giemsa - Гимза). Она выявляется благодаря обработке хромосомных препаратов трипсином с последующим окрашиванием красителем Гимза. В результате выявляется поперечная исчерченность хромосом, где темные полосы соответствуют, как правило, гетерохроматиновым, а светлые - эухроматиновым районам хромосом. На метафазных хромосомах возможна идентификация порядка 300-400 дифференциально окрашенных сегментов на гаплоидный геном. По цитогенетической номенклатуре G-окраска обозначается как GTG (G-bands by Trypsin using Giemsa).

Существует три основных способа R-окраски хромосом (от англ. reverse - обратная). Первый связан с использованием флуорохромов, имеющих сродство с ГЦ-богатыми участками ДНК. Второй основан на обработке хромосомных препаратов гидроксидом бария при высоких температурах (60 °С) с последующим окрашиванием красителем Гимза. И наконец, третий вариант связан с введением в клеточные культуры за несколько часов до фиксации 5-бромдезоксиуридина^♠ ' (BrdU), что приводит к его включению в средне- и позднореплицирующуюся ДНК. Хромосомные регионы, содержащие ДНК с включенным бромдезоксиуридином, более слабо окрашиваются красителем Гимза или акридиновым оранжевым. В то же время интенсивное окрашивание остальных районов указывает на полное отсутствие в них BrdU и завершение репликации. В результате на хромосомах проявляется поперечная исчерченность, характер которой противоположен наблюдаемой при G-окрашивании, - темноокрашенные полосы соответствуют эухроматиновым, а светлоокрашенные - гетерохроматиновым районам хромосом.

C-окраска (от англ. constitutive heterochromatin) получается после обработки хромосомных препаратов щелочью (обычно гидроксидом бария или натрия) с последующей инкубацией в растворе 2 SSC и окрашиванием красителем Гимза. В результате проявляются темноокрашенные сегменты конститутивного гетерохроматина, преимущественно в прицентромерных районах хромосом, тогда как эухроматиновые районы прокрашиваются очень слабо. В практике клинической цитогенетики С-окраска применяется преимущественно для уточнения происхождения хромосомных перестроек, в частности для идентификации маркерных хромосом. По Международной цитогенетической номенклатуре C-окраска имеет обозначение CBG (C-bands by Barium hydroxide using Giemsa).

NOR-окраска (от англ. Nucleolar Organizer Region - ядрышкообразующие районы) или Ag-окраска применяется для идентификации ядрышкообразующих районов, расположенных в коротких плечах акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22. Для их визуализации применяются различные модификации метода, основанные на использовании нитрата серебра. В результате на спутничных нитях акроцентрических хромосом выявляются черные зерна восстановленного серебра, причем размер этих зерен значительно варьирует - от практически полного отсутствия окраски до достаточно крупных блоков серебра. Такая вариабельность обусловливает Ag-полиморфизм хромосом человека.

T-окраска (от англ. telomere - теломера) используется для выявления теломерных районов хромосом. Метод основан на инкубации хромосомных препаратов в растворе фосфатного буфера (pH 5,1) при 87 °С в течение 20-60 мин с последующим окрашиванием красителем Гимза.

Кроме перечисленных методов, существует еще ряд способов визуализации определенных хромосомных структур. Среди них можно отметить культивирование лимфоцитов периферической крови в среде с низким содержанием фолиевой кислоты, которое используется для выявления ломких сайтов хромосом и широко применяется на практике для цитогенетической диагностики синдрома Мартина-Белл (или синдрома ломкой X-хромосомы) - наиболее частой формы Х-сцепленной умственной отсталости.

Введение в клеточные культуры в течение двух последовательных циклов репликации 5-бромдезоксиуридина^♠ ' дает возможность дифференциации сестринских хроматид. Хроматида, содержащая BrdU в обеих нитях ДНК, окрашивается более слабо по сравнению с хроматидой, в которой BrdU включен только в одну из цепей ДНК. Хроматидные обмены обусловливают формирование специфического рисунка метафазной хромосомы, состоящего из чередующихся светлых и темных полос. Увеличение частоты сестринских хроматидных обменов служит диагностическим признаком ряда заболеваний, обусловленных нестабильностью структуры хромосом (например, синдрома Блюма). Кроме того, анализ сестринских хроматидных обменов является классическим тестом в оценке уровня химического мутагенеза.

В целом использование стандартного метафазного анализа дифференциально окрашенных хромосом обеспечивает достаточно эффективную диагностику числовых аномалий хромосом и ряда структурных аберраций. Однако следует отметить, что такой подход обладает рядом ограничений, затрудняющих проведение цитогенетических исследований. Одно из принципиальных ограничений связано с разрешающими возможностями световой микроскопии: с ее помощью возможно идентифицировать порядка 250-400 сегментов на гаплоидный геном. Это затрудняет анализ происхождения маркерных и сверхчисленных хромосом, идентификацию сложных хромосомных транслокаций, диагностику микроделеционных и микродупликационных синдромов. Зачастую структурные хромосомные аберрации, описываемые идентично, реально могут отличаться друг от друга по локализации областей разрывов хромосом и размеру перестроенных участков, что неизбежно скажется на особенностях их клинического проявления. В некоторой степени отмеченное ограничение может быть преодолено при анализе менее конденсированных прометафазных хромосом, обеспечивающих уровень разрешения в среднем 850-1000 сегментов. Существует два основных метода получения таких хромосом. Первый связан с использованием синхронизации клеточных культур. Второй основан на применении различных ингибиторов конденсации хромосом (бромистый этидий, дактиномицин) при вступлении клетки в митотическое деление. В целом разработка протоколов получения прометафазных хромосом явилась заметным этапом в развитии цитогенетики человека, обеспечив возможность описания и диагностики ряда микроделеционных и микродупликационных синдромов.

Методы световой микроскопии позволяют довольно успешно определять числовые и структурные перестройки хромосом, затрагивающие участки размером не менее нескольких миллионов пар азотистых оснований. Аберрации меньшего размера находятся за границами разрешающих возможностей световой микроскопии и требуют применения специальных высокоразрешающих методов молекулярно-цитогенетического анализа.

В то же время разрешающая возможность световой микроскопии является далеко не единственным препятствием, ограничивающим качество и саму возможность проведения цитогенетического исследования. Так, успех в получении препаратов метафазных хромосом зависит от характера клеточной пролиферации в культуре. В частности, именно по этой причине большинство образцов солидных новообразований остаются недоступными для классического метафазного анализа. Еще одну проблему представляет хромосомный мозаицизм - ситуации, при которых в организме имеется два или более клеточных клона с различным набором хромосом. Присутствие небольшого процента клеток с ХА может иметь решающее значение в формировании патологического фенотипа. Однако минорный клеточный клон вполне может быть пропущен при анализе небольшой выборки метафазных пластинок. Более того, хромосомный мозаицизм может быть ограничен некоторыми типами клеток, недоступными для культивирования и проведения метафазного анализа. Все это диктует необходимость применения альтернативных методов цитогенетического исследования, обеспечивающих возможность изучения больших выборок клеток, в том числе без их предварительного культивирования. Такую возможность предоставляют методы молекулярно-цитогенетического анализа.

В основе большинства методов молекулярной цитогенетики лежит использование принципа гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Реакция флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) представляет собой комплементарное взаимодействие так называемых ДНК-зондов с участками ДНК исследуемого кариотипа, осуществляемое непосредственно на цитологических препаратах. Для гибридизации используют ДНК-зонды - любые клонированные последовательности ДНК (повторяющиеся или уникальные последовательности, фрагменты хромосом или целые хромосомы), комплементарные участку ДНК исследуемого кариотипа и маркированные специфическими молекулами, обеспечивающими ее выявление. В зависимости от размера фрагментов ДНК их клонируют в различных векторах: плазмидах, космидах, дрожжевых или бактериальных искусственных хромосомах. Для получения ДНК-зондов, кроме клонирования, используются также методы хромосомной микродиссекции и проточной сортировки хромосом. ДНК-зонды маркируют репортерными молекулами (например, биотином или дигоксигенином), имеющими высокое сродство с молекулами, окрашиваемыми впоследствии флуоресцентными красителями, например такими, как флуоресцеинизотиоцианат (FITC). В некоторых случаях мечение осуществляют непосредственно флуорохромами (FITC, тетраметилизотиоцианат - TRITC, Cy3, Cy5). Его проводят с использованием реакции ник-трансляции, в ходе которой в молекулу ДНК с помощью фермента ДНКазы вносятся одноцепочечные разрывы (ники, от англ. nick - разрыв) с последующим восстановлением структуры за счет имеющихся в реакционной смеси свободных нуклеотидов, в том числе и конъюгированных с репортерными молекулами (или флуорохромами). Кроме ник-трансляции, для мечения ДНК-зондов используются и другие технологии, в частности DOP-PCR (от англ. Degenerated Oligonucleotide Primer-Polymerase Chain Reaction - ПЦР с универсальным праймером).

Проведение FISH включает в себя ряд стандартных процедур. На первом этапе осуществляют обработку хромосомных препаратов РНКазой А для удаления фрагментов РНК и пепсином для более эффективного проникновения зонда к ДНК-мишени. Далее проводят денатурацию ДНК на хромосомном препарате, для чего выдерживают его в 70% растворе формамида при 70 °С в течение 2 мин. После этого проводят препарат по серии спиртов (70-80-96%) при -20 °С. Далее на препарат наносят гибридизационную смесь, в состав которой входят предварительно денатурированный ДНК-зонд, формамид, декстрансульфат для предотвращения испарения гибридизационной смеси в ходе реакции и не меченная флуорохромами конкурентная ДНК для супрессии высокоповторяющихся последовательностей ДНК и повышения специфичности гибридизации. Хромосомный препарат накрывают покровным стеклом, заклеивают по периметру полимерным клеем для предотвращения испарения гибридизационной смеси и помещают во влажную камеру при 37 °С. Продолжительность гибридизации варьирует в зависимости от типов ДНК-зондов и может составлять от нескольких часов для центромероспецифичных ДНК-проб до 15-18 ч для хромосомоспецифичных ДНК-библиотек и до 3 сут для геномных ДНК-зондов при проведении сравнительной геномной гибридизации.

После гибридизации проводят процедуру удаления неспецифически связавшихся ДНК-зондов с хромосомного препарата, для чего инкубируют его в денатурирующем 50% растворе формамида. Далее, в зависимости от способа мечения ДНК-зондов, используют прямую или непрямую детекцию флуоресецентных сигналов. В том случае, если ДНК-зонд маркирован непосредственно флуорохромом, хромосомный препарат окрашивают красителем, как правило DAPI, затем проводят микроскопирование на люминесцентном микроскопе с использованием специфических светофильтров.

При использовании ДНК-зондов, меченных репортерными молекулами, предварительно проводят дополнительный этап детекции сигналов, для чего на препарат наносят антитела, конъюгированные с флуорохромами. Более того, при непрямой детекции, например, в случае использования биотинилированного ДНК-зонда имеется возможность усиления (амплификации) сигнала за счет последовательной обработки препарата антиавидином (антителом, специфичным к авидину) и авидином, несущим флуорохромные молекулы (FITC). Визуализацию гибридизационных сигналов проводят на люминесцентном микроскопе, а регистрацию и документирование изображений ведут с использованием специального программного обеспечения.

В настоящее время для FISH-анализа используется целый арсенал ДНК-зондов, позволяющих идентифицировать тот или иной тип ХА. Среди многообразия применяемых ДНК-зондов необходимо отметить следующие основные типы.

Центромероспецифичные ДНК-зонды. В их основе лежат высокоповторяющиеся последовательности ДНК, комплементарные к центромерному гетерохроматину (α- и β-сателлиты) и обладающие полной или относительной специфичностью к центромерным районам хромосом. Такие зонды используются для анализа числовых нарушений хромосом, происхождения маркерных и сверхчисленных хромосом, при исследовании хромосомного мозаицизма и определения пола. Коммерчески доступные зонды имеют маркировку CEN (Centromere Enumeration Probes). Центромерные ДНК-зонды хорошо визуализируются не только на метафазных хромосомах, но и в интерфазных ядрах, что дало начало особому направлению в молекулярно-цитогенетической диагностике - интерфазной цитогенетике. Данный метод позволяет получать информацию о числе копий анализируемых хромосом непосредственно в интерфазных ядрах, избегая при этом необходимости получения препаратов метафазных хромосом, а также в тех случаях, когда получить качественные препараты оказывается невозможно. Так, например, именно на основе интерфазной цитогенетики осуществляется преимплантационный скрининг анеуплоидий в единичных бластомерах или полярных тельцах.

Вместе с тем применение центромероспецифичных ДНК-зондов имеет некоторые ограничения. Например, структурные перестройки хромосом не могут быть исследованы с помощью этих проб. Наличие дополнительного сигнала зонда в интерфазном ядре не позволяет однозначно дифференцировать случаи трисомии и присутствия маркерной хромосомы. Кроме того, некоторые зонды весьма чувствительны к условиям гибридизации, и при значительном изменении жесткости может наблюдаться перекрестная гибридизация (наличие флуоресцентных сигналов в центромерных районах других хромосом) либо, напротив, полное отсутствие сигналов. Явление гетероморфизма гомологов по числу копий альфоидной ДНК может сказываться на интенсивности сигналов на разных гомологичных хромосомах, затрудняя тем самым их подсчет. Особенно остро эта проблема встает при проведении ПД анеуплоидий, в связи с чем рекомендуется использовать ДНК-зонды, комплементарные уникальным, а не центромерным последовательностям ДНК.

Уникальные ДНК-зонды. Это клонированные уникальные последовательности ДНК, строго специфичные для определенных районов хромосом или отдельных генов (LSI - Locus-Specific Identifiers). Применяются такие зонды для диагностики синдромов, обусловленных микроделециями хромосом, например таких, как синдромы Смит-Магенис, Лангера-Гидеона, Вольфа-Хиршхорна, Прадера-Вилли, Энгельмана.

Теломерные и субтеломерные ДНК-зонды. Это меченые последовательности ДНК, комплементарные повторяющимся теломерным и уникальным субтеломерным последовательностям хромосом соответственно. Они находят применение для диагностики мелких хромосомных перестроек, главным образом микроделеций в теломерных областях хромосом у пациентов с множественными ВПР и идиопатическими формами умственной отсталости.

Хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки - совокупность уникальных последовательностей ДНК, покрывающих всю длину исследуемой хромосомы. В результате гибридизации хромосома оказывается полностью окрашенной в определенный цвет. Именно поэтому хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки называются также painting-пробами (окрашивающими пробами, WCP - Whole Chromosome Paints). Они применяются для идентификации целых хромосом и их фрагментов, для установления происхождения сложных транслокаций, инсерций и маркерных хромосом. Вариант FISH с использованием хромосомоспецифичных ДНК-библиотек получил название хромосомной супрессии in situ (CISS - Chromosomal in situ Supression). Принцип модификации заключается в использовании фракции не меченной флуорохромами высокоповторяющейся ДНК (C_o t1), получаемой из плаценты человека. Диспергированные повторяющиеся последовательности, присутствующие в составе хромосомоспецифичной ДНК-библиотеки, быстро гибридизуются (супрессируются) с C_o t1 ДНК и уже не участвуют в дальнейшем взаимодействии с хромосомной мишенью. Это в конечном итоге повышает специфичность связывания уникальных последовательностей в составе ДНК-зонда.

Геномные ДНК-зонды представляют собой тотальную фракцию геномной ДНК, выделенную из ядросодержащих клеток организма, опухолевых образцов, клеточных культур, меченную флуоресцентным красителем. Используются такие ДНК-зонды для проведения сравнительной геномной гибридизации.

Появление FISH-анализа положило начало развитию целого комплекса молекулярно-цитогенетических методов и их комбинаций. Зачастую диагностика сложного случая хромосомной патологии требует применения различных методов исследования, и при этом универсального алгоритма может и не быть. Рассмотрим некоторые примеры.

Как уже отмечалось выше, объектом изучения при проведении FISH-анализа может быть не только метафазная хромосома, но и хроматин интерфазного ядра. Интерфазный FISH-анализ занял заметное место в современной практике диагностики хромосомных болезней. Можно выделить несколько областей его применения. В первую очередь это диагностика числовых нарушений хромосом. Использование центромеро-специфичных ДНК-зондов позволяет определить число копий хромосом в клетке - заключение делается на основании подсчета числа флуоресцентных сигналов. В норме в интерфазном ядре должно визуализироваться два флуоресцентных сигнала (по одному для каждого гомолога), при трисомии - три, а при моносомии - один. На практике зачастую используется вариант гибридизации с применением двух центромероспецифичных ДНК-зондов, меченных флуорохромами разного цвета. Такой подход позволяет оценивать дисбаланс одновременно по двум парам хромосом, осуществлять ПД. Кроме того, двухцветная FISH оказывается удобным методом для регистрации три- и тетраплоидии в интерфазных клетках.

В настоящее время интерфазная цитогенетика заняла заметное место в преимплантационном генетическом скрининге анеуплоидий. Интерфазный FISH-анализ на отдельных бластомерах и полярных тельцах с использованием набора из 5 ДНК-проб (на хромосомы 13, 18, 21, X и Y), меченных разными флуорохромами, уже является стандартной процедурой. Выбор перечисленных хромосом для проведения диагностики вполне очевиден и определяется серьезной клинической значимостью возникающей по ним анеуплоидии. Наряду с этим необходимо отметить, что набор исследуемых хромосом не является исчерпывающим, поскольку анеуплоидия по другим хромосомам также оказывает негативное влияние на течение эмбрионального развития, имплантацию зародыша и наступление беременности в рамках циклов искусственного оплодотворения. Очевидно, что существуют определенные ограничения на одновременную идентификацию большего числа флуоресцентных сигналов в пределах интерфазного ядра. Эта проблема, как будет отмечено ниже, находит решение при применении сравнительной геномной гибридизации.

Неоспоримым преимуществом интерфазной цитогенетики является прежде всего отсутствие необходимости приготовления препаратов метафазных хромосом и культивирования клеток. Это снимает многие вопросы, связанные с появлением артефактов, присущих длительным культурам клеток (полиплоидизация in vitro, возникновение и клональная селекция клеток с аберрациями кариотипа, изменение пропорций клеточных клонов при хромосомном мозаицизме). Сама диагностика хромосомного мозаицизма становится более эффективной. Во-первых, для анализа оказываются доступными большие выборки интерфазных клеток. Во-вторых, появляется возможность исследования кариотипа клеток, недоступных для культивирования и получения метафазных пластинок, например клеток эпителия ротовой полости при диагностике межтканевого мозаицизма при синдроме Шерешевского-Тернера.

В отличие от числовых аномалий хромосом, диагностика структурных аберраций с помощью интерфазной цитогенетики более затруднительна. Тем не менее при знании структуры перестроенной хромосомы такая диагностика становится реальной. Одним из примеров служит выявление «филадельфийской хромосомы» (транслокации между хромосомами 9 и 22) в клетках костного мозга при хроническом миелоидном лейкозе. Эта транслокация приводит к слиянию последовательностей генов BCR и ABL1 с формированием химерного гена BCR-ABL, продукт которого обладает тирозинкиназной активностью, стимулирующей пролиферацию опухолевых клеток. Данная транслокация типична для 95% пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, является ранним маркером заболевания и имеет важное прогностическое значение.

Для ее диагностики в интерфазных ядрах клеток костного мозга предложен набор из двух уникальных ДНК-зондов, комплементарных последовательностям генов BCR (9q34) и ABL (22q11.2) и меченных флуорохромами зеленого и красного цвета соответственно. При проведении гибридизации в нормальных интерфазных ядрах выявляются два флуоресцентных сигнала, соответствующих ДНК-зонду на ген BCR (зеленое свечение), и два флуоресцентных сигнала красного цвета, соответствующих зонду на ген ABL. В случае транслокации будет зарегистрировано не четыре, а три гибридизационных сигнала - два специфичных нормальным гомологам хромосом 9 и 22 и один сигнал оранжевого цвета, образовавшийся от слияния последовательностей генов. Возможность проведения анализа на достаточно больших выборках интерфазных клеток костного мозга обеспечивает эффективную диагностику транслокации даже в небольшом проценте клеток. Следует отметить, что подобные принципы анализа транслокаций находят свое применение и при диагностике других форм лейкозов.

Наконец, интерфазный FISH-анализ в комбинации с микроядерным тестом на двухъядерных цитокинез-блокированных лимфоцитах нашел широкое применение в современных генотоксилогических исследованиях. Введение в клеточные культуры цитохалазина B блокирует прохождение цитокинеза и приводит к образованию двухъядерных клеток. Использование центромероспецифичных ДНК-зондов позволяет легко фиксировать события хромосомного нерасхождения и отставания, приводящие к формированию трисомных и моносомных клеток. Кроме регистрации анеугенных событий, такой подход позволяет проводить оценку кластогенных (структурных) нарушений хромосом, индикатором которых служит образование микроядер. Следует отметить, что микроядра, содержащие центромерный сигнал, являются маркером хромосомного отставания, тогда как центромеро-негативные микроядра содержат фрагменты хромосомного материала, не включившегося в основное ядро. Очевидно, что точная дифференциация центромеро-позитивных и центромеро-негативных микроядер возможна при применении проб на центромерные последовательности всех хромосом кариотипа человека.

«Обратная» гибридизация (Reverse Painting). Это вариант гибридизации in situ, используемый для быстрого анализа происхождения маркерных хромосом и хромосомных фрагментов, вовлеченных в перестройки. Он осуществляется в три этапа. На первом этапе проводят изоляцию маркерной хромосомы или фрагмента аберрантной хромосомы из метафазной пластинки с помощью методов механической или лазерной микродиссекции. На втором этапе осуществляют амплификацию и мечение ДНК изолированного фрагмента методом DOP-PCR. Далее полученный ДНК-зонд гибридизуют сначала с метафазными хромосомами пробанда для проверки его специфичности, а затем с нормальными метафазными хромосомами здорового индивида. По локализации сигналов гибридизации делают вывод о происхождении маркерной или аберрантной хромосомы.

Fiber-FISH. Вариант гибридизации in situ на деконденсированном хроматине или отдельных фибриллах ДНК. Разрешающая возможность такого метода составляет порядка 5-300 тыс. пар оснований, что позволяет проводить анализ даже внутригенных мутаций. Основные области применения: исследование структурных аберраций хромосом (микроделеций, микродупликаций, инверсий, транслокаций) и картирование генов путем непосредственного визуального определения порядка расположения отдельных участков ДНК в хромосоме относительно друг друга.

Технологии мультицветной FISH. Диагностика некоторых типов ХА, например таких, как сложные транслокации с вовлечением нескольких хромосом или идентификация маркерных хромосом, ставит задачу быстрого и эффективного анализа природы хромосомной перестройки. Одним из подходов к решению данной задачи может являться одновременное использование в одной реакции гибридизации нескольких ДНК-зондов, меченных разными флуорохромами. Однако такой вариант имеет определенные ограничения, связанные с проблемой корректной идентификации большого числа флуорохромов при микроскопировании, вследствие возможного перекрывания спектров их флуоресценции. Решение данной проблемы было найдено с использованием принципа комбинаторного мечения, заключающегося в комбинировании различных вариантов соотношения небольшого числа флуорохромов при мечении разных хромосомных ДНК-библиотек. Число возможных комбинаций из n флуорохромов определяется по формуле 2ⁿ - 1. Очевидно, что для идентификации каждой отдельной хромосомы набора достаточно использовать всего 5 флуорохромов. В 1996 году на основе этого принципа появились две технологии многоцветной гибридизации in situ: мультицветная FISH - Multicolour FISH (mFISH) и спектральное кариотипирование - Spectral Karyotyping (SKY).

При mFISH проводят детекцию каждого отдельного флуорохрома с использованием набора специальных фильтров, характерных для строго определенной длины волны, а суммарное изображение получают после компьютерной обработки всех индивидуальных изображений. Технология SKY не имеет принципиальных отличий от mFISH, за исключением способа детекции изображения, который в данном случае проводится с помощью интерферометра, позволяющего зарегистрировать интенсивность свечения всего набора флуорохромов одновременно в каждой точке изображения. В отличие от mFISH, спектральное кариотипирование обеспечивает одновременный анализ множества флуоресцентных проб и дает возможность использования проб с перекрывающимися спектрами флуоресценции. Кроме того, появляется возможность включения в анализ хромосом, находящихся в наложении на метафазных пластинках. Метод также позволяет выявлять числовые и структурные аномалии хромосом даже в интерфазных ядрах.

Многоцветное сегментирование хромосом. Мультицветная FISH, основанная на использовании только хромосомоспецифичных ДНК-библиотек, делает невозможным исследование внутрихромосомных аберраций (таких как инверсии, делеции и дупликации). Поэтому очевидно, что дальнейшее развитие технологии многоцветной гибридизации пошло по пути создания «многоцветных» ДНК-зондов, специфичных к плечам или даже сегментам отдельных хромосом. Современные методы многоцветного сегментирования хромосом с использованием сегмент-специфичных ДНК-библиотек, меченных различными комбинациями флуорохромов (mBAND), уже достигли уровня разрешения до 450-550 цветных сегментов на гаплоидный геном.

Сравнительная геномная гибридизация (Comparative Genomic Hybridization, CGH).

В 1992 году Анне Каллиониеми с коллегами предложила революционный во многих отношениях для цитогенетики человека метод сравнительной геномной гибридизации, позволяющий провести скрининг всего кариотипа на предмет числовых и несбалансированных хромосомных перестроек, не получая при этом препаратов хромосом из анализируемых образцов тканей. Первоначально CGH была разработана для анализа хромосомных аберраций в клетках солидных опухолей, не поддающихся успешному культивированию, и обеспечила серьезный прорыв в цитогенетике злокачественных новообразований. Однако вскоре метод нашел применение и в практике клинической цитогенетики, пренатальной и даже преимплантационной диагностики. В классическом варианте CGH представляла собой конкурентную гибридизацию in situ на нормальных метафазных пластинках здорового человека двух геномных ДНК-библиотек: одной - полученной из анализируемой ткани, второй - из контрольного образца, взятых в эквимолярных количествах и меченных разными флуорохромами. Современные модификации метода основаны на конкурентной гибридизации ДНК-библиотек на высокоразрешающих полногеномных ДНК-микрочипах, представленных наборами клонированных фрагментов ДНК или олигонуклеотидных последовательностей. Такой вариант гибридизации получил название «матричная CGH» (array CGH).

Источником анализируемой ДНК могут быть любые ядро-содержащие клетки организма: лимфоциты периферической крови, фибробласты, клетки амниотической жидкости, хориона, даже отдельные бластомеры или полярные тельца, образцы опухолевой ткани. Для исследования может быть доступен и архивный материал, зафиксированный в формалине и заключенный в парафиновые блоки. В качестве источника ДНК для контрольной библиотеки, как правило, используются лимфоциты периферической крови мужчины. Мечение геномных ДНК-зондов осуществляется непосредственно флуорохромами либо репортерными молекулами, детекция которых производится с помощью соответствующих антител. На практике в качестве метки для тестируемой ДНК выбираются флуорохромы, имеющие зеленое свечение (например, FITC), а для контрольного образца - красное свечение (например, TAMRA). Отношение интенсивности зеленого сигнала к красному вдоль каждой хромосомы (или в каждой точке микрочипа) отражает относительное содержание последовательностей ДНК в исследуемом образце по сравнению с контролем и обозначается как флуоресцентное отношение (в англоязычной литературе green/ red ratio). В норме, при отсутствии хромосомного дисбаланса, флуоресцентное отношение интенсивности зеленого сигнала к красному будет равно 1,0. Дупликация определенного региона или трисомия по какой-либо хромосоме набора в клетках тестируемой ткани приведет к увеличению флуоресцентного отношения, тогда как в случае делеции или моносомии будет зарегистрировано его уменьшение. Теоретически при трисомии флуоресцентное отношение должно составлять 1,5, а при моносомии - 0,5.

Очевидное преимущество CGH заключается в возможности молекулярного скрининга всего кариотипа на предмет числовых и несбалансированных хромосомных аберраций в течение одной реакции гибридизации. Кроме того, CGH-анализ не требует приготовления препаратов метафазных хромосом из анализируемой ткани, что открывает новые перспективы в исследовании хромосомного дисбаланса в клетках, неспособных к нормальной пролиферации в культуре. Для проведения исследования используется исключительно образец геномной ДНК из анализируемой ткани или клетки. В связи с этим в последнее время в отношении CGH и особенно ее варианта на микрочипах все чаще можно услышать новый для цитогенетики человека термин «молекулярное» или даже «виртуальное» кариотипирование. Матричная CGH позволяет диагностировать анеуплоидию хромосом, несбалансированные структурные аберрации, амплификации и делеции отдельных хромосомных регионов, внося заметный вклад не только в диагностику, но и в идентификацию новых микроделеционных и микродупликационных синдромов.

Среди ограничений CGH необходимо отметить следующие.

Отсутствие необходимости культивирования клеток, а также получение результатов в относительно короткое время обусловили возможность использования CGH для ПД ХА. Более того, продемонстрирована возможность успешного применения матричной CGH для ПД анеуплоидий с использованием в качестве источника анализируемой ДНК внеклеточной ДНК плода в периферической крови матери. Такой подход открывает новые перспективы в развитии процедур неинвазивной пренатальной диагностики (НИПД) хромосомных болезней. Учитывая, что ХА являются причиной ранней внутриутробной гибели более половины зародышей, CGH становится одним из эффективных инструментов и в диагностике причин невынашивания беременности, обеспечивая возможность полного скрининга хромосомного набора на предмет анеуплоидии. Результаты проведенных исследований демонстрируют наличие у внутриутробно погибших эмбрионов моносомий по аутосомам, двойных и тройных анеуплоидий, не выявляемых стандартными методами метафазного анализа вследствие низкой пролиферативной активности зародышевых клеток в культуре. Кроме того, применение матричной CGH дает возможность выявить в материале спонтанных абортов мелкие несбалансированные структурные аберрации хромосом, которые могут служить индикатором наличия хромосомного дисбаланса у родителей.

Одним из приоритетных направлений становится использование матричной CGH для преимплантационного скрининга анеуплоидий. Числовые аномалии хромосом являются доминирующим фактором, ограничивающим возможность успешной имплантации бластоцисты и наступления беременности в циклах искусственного оплодотворения. Использование ограниченного числа ДНК-зондов (как правило, на 5-9 хромосом) для диагностики анеуплоидий с помощью интерфазной FISH в одном или двух доступных для анализа бластомерах не позволяет полностью исключить присутствие дисбаланса по другим хромосомам у развивающегося зародыша. Получение препаратов метафазных хромосом из отдельных бластомеров также представляет серьезную методическую проблему. В связи с этим матричная CGH является альтернативным методом для преимплантационного генетического скрининга анеуплоидий. Однако она также оказывается ограниченной в возможности исключения хромосомного мозаицизма во всех бластомерах развивающегося эмбриона. Возможное решение данной проблемы может быть найдено с применением технологии бластоцентеза, основанного на использовании для молекулярно-цитогенетического анализа внеклеточной ДНК, содержащейся в полостной жидкости бластоцисты. Такая фракция ДНК происходит из клеток внутренней клеточной массы и трофэктодермы, вступивших в апоптоз, и может содержать интегральную информацию о кариотипе развивающегося эмбриона.

Одной из задач медико-генетического консультирования и ПД является идентификация несбалансированных структурных хромосомных перестроек, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение. Кроме того, хромосомная этиология ряда дисморфических нарушений и пороков развития связана со скрытыми хромосомными перестройками, например субхромосомными делециями, которые обычно не выявляются при стандартном цитогенетическом исследовании. Все эти типы хромосомных аберраций могут быть выявлены с использованием матричной CGH.

Завершая обзор современных методов диагностики хромосомных болезней, следует обратить внимание на исключительно широкий диапазон их диагностических возможностей. В настоящее время становится возможным проводить цитогенетическое исследование на различных уровнях организации хромосомного материала - от отдельных молекул ДНК (микрочипы) и деконденсированного хроматина (fiber-FISH) до хроматина интерфазных ядер (интерфазная цитогенетика) и суперспирализованных метафазных хромосом (FISH, CISS). ДНК-зонды, применяемые для диагностики ХА, могут быть комплементарными повторяющимся или уникальным последовательностям генома либо вовсе представлять собой всю геномную ДНК. Для проведения различных вариантов молекулярно-цитогенетического исследования могут использоваться цитологические препараты метафазных хромосом, интерфазных ядер или срезов тканей. Анализ возможен как для культивированных, так и для некультивированных клеток, в том числе и для клеток, вовсе неспособных к нормальной пролиферации in vitro. В некоторых случаях диагностика хромосомных аберраций может быть проведена с использованием образцов ДНК без получения препаратов метафазных хромосом. Анализ возможен как на свежеприготовленных препаратах, так и на архивном биологическом материале. Наконец, необходимо отметить, что для диагностики хромосомных мутаций в ряде случаев активно начинают использоваться методы молекулярно-генетического исследования, в частности количественная флуоресцентная ПЦР (QF-PCR), мультиплексная лигазная реакция (MLPA) и даже секвенирование нового поколения (NGS). С одной стороны, это может быть связано с более выгодными в экономическом плане составляющими мультиплексного молекулярно-генетического анализа по сравнению с таргетным FISH-методом. С другой стороны, технология NGS предложила абсолютно новое решение проблемы ПД хромосомных болезней в формате неинвазивной процедуры с использованием внеклеточной ДНК плода, циркулирующей в крови беременной женщины. Так или иначе, рассмотренное многообразие методов свидетельствует о серьезном технологическом прорыве в области клинической цитогенетики, обеспечивающем всестороннее исследование и диагностику хромосомной патологии у человека.

Можно сказать, что скрининг на ХА плода, включая синдром Дауна, за рубежом начался еще в конце 60-х годов прошлого века, когда всем женщинам 35 лет и старше проводили амниоцентез и исследовали кариотип плода, поскольку ассоциация между старшим возрастом беременной женщины и высокой частотой рождения у нее ребенка с синдромом Дауна была установлена задолго до открытия хромосомной природы этого заболевания. Синдром Дауна является самым частым хромосомным заболеванием и регистрируется у 1 из 600-700 новорожденных. В настоящее время показано, что трисомия по хромосоме 21 составляет 1 на 338-113 живорожденных новорожденных у женщин 35-39 лет и 1 на 84-30 у женщин 40-45 лет соответственно. С увеличением материнского возраста повышается риск не только по трисомии 21 у плода, но и риск анеуплоидии по другим хромосомам. Довольно долгое время традиционным показанием для проведения пренатальной цитогенетической диагностики являлся материнский возраст 35 лет и старше (в англоязычной литературе более предпочтительным является выражение «преклонный детородный возраст»), поскольку у женщин старшего репродуктивного возраста риск прерывания беременности вследствие проведения инвазивной диагностической процедуры становится меньше, чем риск наличия хромосомной патологии у плода. Однако удельный вес таких женщин в контингенте беременных составляет всего 5-10%, и только 20% детей с синдромом Дауна рождается у женщин старше 35 лет.

На сегодняшний день материнский возраст не является основным показанием для пренатальной цитогенетической диагностики в связи развитием биохимического и ультразвукового скринингов - неинвазивных по отношению к плоду тестов, позволяющих оценить риск трисомии у плода и формировать в популяции из всех, в том числе и молодых, беременных женщин так называемую группу высокого риска, требующую проведения дополнительного диагностического метода исследования. Стратегия неинвазивного пренатального скрининга в конечном счете направлена на снижение пренатальных потерь за счет уменьшения количества необоснованных диагностических инвазивных процедур, каждая из которых сопряжена с определенным риском прерывания беременности.

Тактика пренатального скрининга с целью формирования группы риска по трисомии у плода включает анализ определенных биохимических маркеров в сыворотке крови беременных женщин и оценку морфологии плода при УЗИ. Многофакторный анализ, при котором расчет риска основывается по всей совокупности доступных данных, таких как материнский возраст, уровни двух или более сывороточных маркеров и данные УЗИ плода, повышает эффективность скрининга. Каждый фактор, включая биохимические маркеры и толщину воротниковой зоны (ВЗ), оцениваются в MoM (Multiples of Median - кратность медиане). Автоматизированный расчет индивидуального риска трисомии у плода на основе совместной статистической обработки данных проводится с использованием специально разрабатываемых компьютерных программ. Скрининг-положительный (попадание в группу риска), как и скрининг-отрицательный (низкий риск трисомии) результаты вовсе не указывают на наличие или отсутствие трисомии у плода, а лишь классифицирует беременную женщину как имеющую повышенный или пониженный по сравнению с общепопуляционным риск рождения ребенка с ХА.

При проведении скрининга необходимо выбрать пороговое, пограничное значение риска (cut off), условно разделяющее скрининг-отрицательные и скрининг-положительные результаты. Пограничное значение риска может составлять от 1:100 до 1:300 в различных скрининговых программах.

Эффективность скрининга определяется его чувствительностью (уровнем выявления патологии) и специфичностью (уровнем ложноположительных результатов). Чем выше чувствительность скрининга, тем меньше количество «пропущенных» случаев патологии. В связи с тем что от уровня ложноположительных результатов скрининга зависит количество инвазивных процедур и, как следствие, возможных осложнений беременности после инвазивного вмешательства, показатель ложноположительных результатов крайне важен при оценке качества скрининга.

Проблема неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию сегодня - это выбор оптимального протокола проведения неинвазивного обследования.

Выделяют следующие виды скрининга.

Основным ограничением широкого и повсеместного использования этого вида скрининга является проблема точности и воспроизводимости УЗИ плода. В Великобритании при содействии Фонда медицины плода (Fetal Medicine Foundation - FMF) разработаны специальные правила по корректному и унифицированному измерению размера ВЗ и длины носовой кости плода и отмечено, что такое исследование должно проводиться только специально подготовленными и сертифицированными специалистами - врачами ультразвуковой диагностики при наличии высококлассного оборудования с постоянным внешним аудитом результатов измерения. Эта программа позволяет обеспечить контроль качества и поддержание профессиональных навыков врачей ультразвуковой диагностики и стандартизировать измерение эхографических маркеров с целью повышения эффективности этого скринингового теста.

Дебаты по поводу проведения интегрированного скрининга не прекращаются, поскольку его противники усматривают прямое нарушение этических принципов ПД, а именно лишение беременной женщины права принятия решения в случае, когда высокий риск анеуплоидии у плода обнаруживается уже в ранние сроки беременности.

Избежать проблемы потери специфичности позволяет так называемый ступенчатый последовательный скрининг, при котором тактика последующего ведения беременности основывается на результатах значений индивидуального риска при скрининге в I триместре. Беременным, попавшим в скрининг-положительную группу, проводится инвазивная диагностическая процедура с последующим кариотипированием плода. При низком риске проводится дополнительный скрининг II триместра беременности.

Эффективность различных видов неинвазивного пренатального скрининга на трисомию по хромосоме 21 представлена в табл. 5-1.

Следует отметить, что неинвазивный пренатальный скрининг эффективен не только для оценки риска по трисомии 21 у плода, но также и риска трисомии по хромосомам 13 и 18. Во многих центрах проводится рутинный скрининг на трисомию 18 у плода с использованием специальных протоколов.

Скрининг II триместра беременности при использовании тройного теста позволяет выявлять 60% беременностей плодом с трисомией по хромосоме 18 с очень высокой специфичностью - 0,2% ложноположительных результатов при границе риска ≥1:100, а при интегрированном скрининге чувствительность повышается до 90% с уровнем ложноположительных результатов 0,1%. Разработаны также протоколы комбинированного скрининга I триместра беременности для детекции трисомии 13 и 18.

Проведение неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию регулируется федеральным и региональным законодательством. Скрининговые программы могут быть эффективно реализованы только в том случае, если в них участвуют высококвалифицированные, сертифицированные специалисты как ультразвуковой, так и лабораторной диагностики и проводится регулярный внешний аудит для оценки качества проводимых исследований. В конечном итоге выбор вида пренатального неинвазивного скрининга зависит от обеспеченности медицинского учреждения надлежащими кадрами, современным ультразвуковым и лабораторным оборудованием и достаточным финансированием, чтобы иметь возможность внедрять новые технологии и протоколы.

УЗИ играет важную роль в ПД врожденных и наследственных заболеваний, и в частности ХА. Многие изолированные пороки развития, синдромы множественных ВПР, в том числе и хромосомной этиологии, сопровождаются фенотипическими отклонениями у плода, различимыми при УЗИ, - так называемые эхографические маркеры хромосомных аномалий (ЭГМ ХА). УЗИ плода не является диагностическим методом, а лишь позволяет при обнаружении ЭГМ ХА выделить среди плодов группу риска по ХА.

ЭГМ ХА принято разделять на пороки развития и так называемые мягкие признаки (soft signs). В отличие от пороков развития, мягкие признаки - это структурные изменения, не меняющие анатомию органа и не всегда носящие стойкий характер, которые могут быть как вариантами нормального развития, так и ассоциированы с анеуплоидией у плода.

Перечень ЭГМ ХА постоянно обновляется и пополняется новыми признаками. ЭГМ ХА в ранние и поздние сроки беременности существенно отличаются.

В I триместре беременности УЗИ проводится в основном в рамках неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию. Как уже отмечалось выше, при проведении УЗИ важное значение имеет измерение ВЗ у плода, поскольку расширенная ВЗ является одним из ЭГМ ХА в ранние (11-14 нед) сроки беременности. Чувствительность этого эхографического маркера при диагностике синдрома Дауна варьирует от 69 до 75% при 5-8,1% ложноположительных результатов.

ВЗ - весьма значимый и эффективный маркер для скрининга не только на синдром Дауна у плода, но и на такие частые анеуплоидии, как трисомия по хромосоме 18 и моносомия по хромосоме Х.

Помимо расширенной ВЗ, в настоящее время в ранние сроки беременности в качестве ЭГМ ХА у плода в клинической практике используются и другие мягкие признаки, такие как отсутствие носовой кости, отрицательный кровоток в венозном протоке, трикуспидальная регургитация, увеличенный лицевой угол.

Ультразвуковой скрининг II триместра беременности является важным звеном в ПД хромосомных болезней, поскольку это единственный метод, позволяющий получить более детальную информацию о фенотипе плода по сравнению с УЗИ в ранние сроки. В сроке беременности 20-23 нед всем беременным женщинам проводится детальное УЗИ, и большинство грубых структурных аномалий и пороков развития у плода могут быть выявлены при таком исследовании. Во II триместре беременности ЭГМ ХА очень разнообразны и многочисленны. Например, обнаружение голопрозэнцефалии у плода с высокой вероятностью ассоциировано с трисомией по хромосоме 13, неиммунная водянка плода - с моносомией по хромосоме X или трисомией по хромосоме 21, атрезия двенадцатиперстной кишки - с трисомией по хромосоме 21. Определенные дефекты развития почек часто ассоциированы с анеуплоидией у плода. При наличии порока сердца у плода примерно в 33% случаев диагностируются ХА. Кисты сосудистых сплетений являются мягким признаком, ассоциированным с трисомией по хромосоме 18. Мягкими признаками, наличие которых увеличивает риск по трисомии 21 у плода, могут быть гиперэхогенный кишечник, пиелоэктазия, вентрикуломегалия, укорочение длинных трубчатых костей, клинодактилия.

ЭГМ у плода часто регистрируются при редких ХА, к которым относятся трисомии, не вовлекающие хромосомы 13, 18, 21, X и Y, делеции, дупликации, сверхчисленные маркерные хромосомы и структурные хромосомные перестройки. Примерно половина всех случаев редких ХА, диагностированных у плода, сопровождается наличием ЭГМ ХА. Пороки развития сердца, головного мозга, внутриутробная задержка роста плода более часто ассоциированы с делециями, тогда как неиммунная водянка плода и увеличение ВЗ являются наиболее типичными ЭГМ трисомии и дупликаций. Конотрункальные пороки сердца характерны для микроделеции 22q11.2, а выявление при УЗИ надклапанного стеноза аорты может указывать на наличие для микроделеции 7q11.23 (синдром Вильямса-Бойрена) у плода.

Следует отметить, что при обнаружении изолированного эхографического признака вероятность ХА у плода существенно меньше, чем при наличии двух и более маркеров.

Идентификация пороков и/или аномалий развития при УЗИ является одним из абсолютных показаний для проведения инвазивной ПД и исследования кариотипа плода. Данные эхографического исследования плода во II триместре могут быть использованы для модификации априорного риска по анеуплоидии, полученного при проведении неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию. Отсутствие у плода ЭГМ ХА может значительно уменьшить этот риск. Однако для достоверного факта отсутствия или обнаружения ЭГМ ХА необходимо проведение УЗИ экспертного уровня, что требует определенных навыков и специальной подготовки врачей и возможно только в специализированных центрах.

В современных условиях, при наличии отчетливой социальной тенденции снижения толерантности к любым пренатальным потерям, особенно актуальной становится разработка, оптимизация и внедрение в клиническую практику неинвазивных методов ПД, позволяющих проводить анализ генетического статуса плода без ущерба для развивающегося плода и беременной женщины.

Во время беременности в материнском организме наблюдается удивительный феномен трансплацентарной миграции клеток и нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) плода, в результате которого их можно детектировать в периферической крови беременной женщины. Такая уникальная доступность генетического материала плода обусловила интенсивное развитие методов его исследования.

В последнее время достигнуты значительные успехи в развитии технологий, позволяющих выявлять наиболее частые анеуплоидии при исследовании ДНК плода, циркулирующей в материнском кровотоке.

Присутствие ДНК плода в плазме и сыворотке крови беременных женщин впервые было показано группой ученых из Гонконга во главе с Lo еще в 1997 году. Основным источником циркулирующей в материнской крови ДНК являются клетки трофобласта.

Позже установили, что ДНК плода в виде коротких фрагментов может находиться в материнской крови как в свободном состоянии, так и быть связанной с клеточной поверхностью - так называемая свободная, или внеклеточная, ДНК, которая, с одной стороны, является достаточно стабильной, что позволяет детектировать ее в материнской плазме, а с другой стороны, быстро элиминируется из крови женщины после родов, что делает ее специфичной только для данной беременности. Именно с выделением и анализом внеклеточной ДНК плода связано развитие методов НИПД генетических заболеваний у плода, обусловленных либо дефектами генов, унаследованных от отца, либо ХА, в частности анеуплоидией. Поскольку установление анеуплоидного статуса плода при исследовании внеклеточной ДНК в материнском кровотоке пока не является диагностическим методом и рассматривается в контексте пренатального скрининга, принято употреблять понятие «неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ)» - Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT).

Следует отметить, что детекция анеуплоидии при анализе внеклеточной ДНК плода, в противоположность НИПД моногенных заболеваний, основанной на различии геномов матери и плода, значительно осложняется тем фактом, что фрагменты ДНК-последовательностей хромосом плода неотличимы от материнских. Тем не менее было установлено, что в плазме женщин, беременных плодом с трисомией по хромосоме 21, отмечается более высокая концентрция ДНК-фрагментов хромосомы 21 по сравнению с таковой в плазме женщин, беременных нормальным, эуплоидным, плодом. Поэтому одним из подходов в НИПТ на анеуплоидию является определение количества фрагментов внеклеточной ДНК плода в общем пуле внеклеточной ДНК в материнской плазме. При таком количественном подходе внеклеточная ДНК, выделенная из плазмы беременной женщины, секвенируется и затем определяется принадлежность каждой молекулы к той или иной хромосоме на основании сравнения с референсным геномом человека. При наличии у плода трисомии по какой-нибудь хромосоме количество молекул, полученных от этой хромосомы, является более высоким, чем в референсном эуплоидном образце. Учитывая, что внеклеточная ДНК плода составляет всего лишь около 10% от всей материнской внеклеточной ДНК, требуется высокая точность анализа, чтобы определить ее действительный избыток. Метод цифровой ПЦР, изначально используемый для количественной оценки фрагментов ДНК плода, является довольно трудоемким и ограничен использованием праймеров, специфичных к сайтам связывания только определенных молекул ДНК. Технология массового параллельного секвенирвания генома является более эффективной при количественном анализе, поскольку позволяет идентифицировать и подсчитать несколько миллионов фрагментов ДНК от всех хромосом и обнаружить избыточную или недостаточную представленность любой хромосомы.

Независимые клинические исследования при использовании массового параллельного секвенирования в НИПТ, проведенные в группе беременных женщин с высоким риском по трисомии 21 у плода, продемонстрировали высокую чувствительность методов, близкую к 100% при уровне ложноположительных результатов менее 1%. Однако этот подход оказался менее чувствительным для детекции трисомии по хромосомам 13 и 18 у плода.

Альтернативным подходом к анализу внеклеточной ДНК при НИПТ на анеуплоидию является исследование однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), при которых определяют число копий хромосом путем поиска аллельных различий. Разработан статистический алгоритм анализа секвенированной внеклеточной ДНК плода, позволяющий просчитывать возможные варианты - «гипотезы» генотипа плода (моносомия, дисомия, трисомия), основанные на информации о частоте рекомбинации на хромосоме интереса, генотипах родителей, концентрации плодной фракции и количества копий этой хромосомы. Затем рассчитывают вероятность (доверительные интервалы) для каждой «гипотезы», и она считается подтвержденной, если вероятность превышает 98%.

По данным метаанализа, проведенного в 2014 году Gil et al., в котором объединены результаты большого количества проведенных исследований, было установлено, что при НИПТ на трисомию по хромосоме 21 чувствительность составляет 99%, специфичность - 99,92%, на трисомию по хромосоме 18 - 96,8% и 99,85% и на трисомию по хромосоме 13 - 92,1% и 99,8% соответственно. Следует отметить, что подавляющее большинство этих исследований проводилось в группе беременных женщин высокого риска по анеуплоидии у плода, чем, по-видимому, объясняется столь высокая эффективность данной технологии.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в НИПТ, связанные с внедрением высокотехнологичных методов исследования, широкое внедрение этой технологии ограничивается на сегодняшний день высокой стоимостью анализа. Кроме того, при количественном подходе к анализу внеклеточной ДНК большое значение имеет содержание ДНК плодного происхождения в материнской плазме, так называемая плодная фракция. Ложноотрицательные результаты могут быть получены в ранние сроки беременности, когда плодная фракция составляет менее 4%. На концентрацию внеклеточной ДНК в материнской плазме оказывает влияние также вес беременной женщины: повышение массы тела ассоциировано с уменьшением концентрации плодной фракции, вероятно, вследствие эффекта ее разбавления при увеличении объема циркулирующей крови. Причиной ложноположительных результатов могут быть ограниченный плацентой мозаицизм, резорбция двойни, наличие соматического мозаицизма или онкологического заболевания у самой беременной женщины. Концентрация плодной фракции также может увеличиваться при многоплодной беременности. Все эти факторы необходимо учитывать для корректной интерпретации результатов количественного анализа при проведении НИПТ на анеуплоидию.

В настоящее время внедрение методов НИПТ позволяет существенно менять стратегию неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию в целом. Коммерческая неинвазивная ДНК-детекция трисомии 21 с помощью массивного параллельного секвенирования стала доступна для беременных женщин, входящих в группу повышенного риска по анеуплоидии у плода. Предполагается, что проведение НИПТ может проводиться в качестве скринингового теста, поэтому основные исследования в настоящее время сфокусированы на оценке результатов неинвазивного тестирования в когорте беременных женщин с низким риском по анеуплоидии у плода.

С развитием технологий НИПТ стратегия неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию может осуществляться по трем основным сценариям.

В настоящее время несколько коммерческих компаний разрабатывают протокол НИПТ для отдельных микроделеционных синдромов, таких как синдромы делеции 22q11.2, Прадера-Вилли/Энжельмена, «кошачьего крика», Вольфа-Хиршхорна. Однако существуют определенные опасения, что высокий уровень ложноположительных результатов НИПТ на микроделеции у плода будет противоречить основному достоинству такой технологии в контексте неинвазивного пренатального скрининга - значительному снижению необоснованных инвазивных процедур.

Единственным методом диагностики кариотипа плода является стандартное цитогенетическое исследование хромосомных препаратов, полученных из клеток плода. Абсолютными показаниями для проведения пренатальной цитогенетической диагностики в настоящее время являются:

Для выполнения пренатального цитогенетического исследования необходимой предпосылкой является проведение инвазивной диагностической процедуры. Существует несколько способов получения необходимого для дальнейшего исследования количества плодных клеток. Выбор инвазивной процедуры зависит от срока беременности, клинического состояния женщины, показаний для пренатального исследования и квалификации врача-оператора и врача-цитогенетика. В клиниках с диагностической целью применяются аспирация ворсин хориона, амниоцентез, плацентоцентез и кордоцентез, которые выполняются под контролем УЗИ.

В I триместре беременности основной диагностической процедурой является аспирация ворсин хориона (АВХ) - получение хориальной ткани, которое может быть осуществлено трансцервикальным или трансабдоминальным путем.

Несомненное преимущество трансабдоминальной АВХ перед трансцервикальной АВХ - высокое качество полученного материала, которое заключается в чистоте ворсин и практически полном отсутствии примеси децидуальной ткани. АВХ может проводиться в интервале от 10 до 14 нед беременности. Основным фактором, определяющим нижнюю границу проведения инвазивных вмешательств в ранние сроки беременности, является осложнение в виде редукционных поражений конечностей плода. Оптимальный срок для проведения АВХ - интервал 10-12 нед, когда риск осложнений минимален, а в случае обнаружения тяжелых врожденных и наследственных заболеваний сохраняется возможность прерывания беременности путем медицинского аборта.

Во II триместре беременности для получения клеток плода используют:

Оптимальный срок проведения кордоцентеза - интервал 21-22 нед беременности. К этому времени пуповина достигает определенной толщины, что облегчает пункцию. Кроме того, объем получаемой крови (0,5-4,0 мл в зависимости от вида диагностируемой патологии) составляет лишь незначительную часть от фетоплацентарного объема кровотока и практически не оказывает отрицательного влияния на плод.

Частота проведения тех или иных видов инвазивных диагностических процедур различна и зависит от опыта врача-оператора, характера диагностируемых заболеваний и сроков обращения беременных женщин для проведения исследования. В большинстве случаев врачи стремятся проводить инвазивные процедуры в ранние сроки беременности и использовать технически наиболее простые процедуры - АВХ или амниоцентез. Кроме того, тактика неинвазивного пренатального скрининга направлена на как можно более раннее формирование среди беременных группы риска по наличию у плода ХА, чтобы своевременно определить показания к инвазивным вмешательствам, осуществить раннюю и точную ПД и в случае обнаружения патологии у плода принять взвешенное решение об исходе беременности до наступления периода жизнеспособности плода. На сегодняшний день в большинстве стран эта граница установлена в сроке 22 нед беременности, что также делает АВХ или амниоцентез более предпочтительными инвазивными процедурами в ПД.

Кордоцентез должен применяться в редких случаях, в частности при позднем обращении беременной женщины к врачу, а также при наличии определенных генетических показаний, когда точный диагноз можно поставить только при анализе образцов цельной крови плода или хромосомных препаратов культуры лимфоцитов пуповинной крови.

Риск самопроизвольного прерывания беременности после проведения процедуры составляет в среднем 1-2% и существенно варьирует в зависимости от опыта врача-оператора, вида процедуры, срока ее проведения, величины базового риска прерывания беременности и состояния плода в конкретном случае. Самым безопасным методом по-прежнему остается амниоцентез, поскольку частота прерываний беременности после него не превышает 1%. Тем не менее, при формировании показаний к проведению инвазивных исследований всегда нужно сопоставлять реальный риск потери беременности вследствие проведения инвазивной процедуры с риском рождения больного ребенка в семье.

Основной задачей цитогенетической ПД является информирование будущих родителей о хромосомном статусе плода.

После проведения инвазивной диагностической процедуры для последующего цитогенетического исследования могут быть получены различные образцы клеток плода. В зависимости от проведенной инвазивной процедуры, как правило, требуется 10-15 мл амниотической жидкости, содержащей эпителиальные клетки плода, 10-15 мг ткани ворсин хориона или плаценты, 0,8-1,0 мл пуповинной крови плода. С целью получения хромосомных препаратов из клеток плода и проведения стандартного цитогенетического исследования используются следующие методы.

Обязательным условием является тестирование взятого образца крови на принадлежность ее плоду. В качестве методов, позволяющих удостовериться в чистоте плодной крови, могут быть использованы любые методы, способные дифференцировать клетки крови плода от клеток крови матери (электрофорез на ацетат-целлюлозных фильтрах, гематологический анализ - тест Клейхауэра-Бетке и т.д.). Для последующего цитогенетического исследования используется только тестированная любым образом чистая кровь плода. Постановка культуры лимфоцитов плода, фиксация и приготовление хромосомных препаратов осуществляются по стандартному протоколу, и заключение о кариотипе плода может быть получено в течение 5-7 дней.

Анализ хромосом плода традиционно проводится при световой микроскопии с использованием рутинного или дифференциального (GTG) окрашивания.

«Прямые» и «полупрямые» хромосомные препараты, получаемые из клеток цитотрофобласта ворсинчатой ткани, при ряде методических преимуществ (возможность исследования кариотипа плода уже в I триместре беременности, быстрота исследования, экономическая доступность) обладают и некоторыми недостатками. Главные из них - ограниченное количество метафазных пластинок, пригодных для исследования, не всегда достаточно хорошая морфология хромосом из-за технических особенностей приготовления препарата и, как правило, плохое окрашивание хромосом дифференциальными красителями. Кроме того, при анализе таких хромосомных препаратов можно столкнуться с проблемой мозаицизма, ограниченного плацентой. Клетки цитотрофобласта относятся к внезародышевым оболочкам и обособляются от эмбриобласта в процессе эмбриогенеза очень рано. В клетках, формирующих цитотрофобласт, могут быть ошибки деления либо вследствие нерасхождения хромосом в дисомной зиготе, приводящие к формированию клона с анеуплоидией, либо при коррекции трисомии в зиготе с формированием нормальной клеточной линии. В результате кариотип клеток цитотрофобласта может не всегда соответствовать истинному кариотипу плода. Мозаицизм, ограниченный плацентой, встречается в 1,1% случаев при анализе «прямых» и «полупрямых» препаратов и может привести к ошибочному диагнозу. Избежать этой проблемы возможно при культивировании ворсин в течение 7 дней и более с использованием специальных питательных сред и при анализе хромосомных препаратов из клеток мезенхимального кора ворсины. Основным недостатком препаратов из культуры клеток амниотической жидкости являются проблемы длительного культивирования клеток, контаминация материнскими клетками, ограниченная диагностика истинного мозаицизма у плода из-за недостаточного количества метафазных пластинок и, в меньшей степени, мозаицизм, ограниченный клетками амниотической жидкости.

Культивированные лимфоциты плода наиболее оптимальны для проведения стандартного цитогенетического исследования, поскольку клетки крови плода являются производными эмбриобласта и наиболее полно отражают генотип плода, однако из-за отчетливой тенденции проведения ПД в как можно более ранние сроки беременности в настоящее время, как уже упоминалось выше, кордоцентез с целью кариотипирования плода проводится не столь часто.

Следует отметить, что одним из важнейших факторов, влияющих на выбор ткани плода для конкретного пренатального цитогенетического исследования, является показание, по которому беременной женщине рекомендована пренатальная цитогенетическая диагностика.

При семейном носительстве структурных хромосомных перестроек, а также при наличии у плода во II триместре беременности ЭГМ ХА рекомендуется осуществление пренатального цитогенетического исследования клеток амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови плода, которое позволяет провести надежный анализ на большом количестве метафазных пластинок с применением высокоразрешающей дифференциальной окраски хромосом.

Использование хромосомных препаратов из ворсин хориона/плаценты может быть рекомендовано при прочих, так называемых простых, показаниях, как то: рождение ребенка с анеуплоидией и положительный результат неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию (высокий риск), то есть при массовых пренатальных исследованиях в I триместре беременности.

Долгое время классическое цитогенетическое исследование являлось «золотым стандартом» в пренатальной цитогенетике, поскольку визуальный анализ всего хромосомного набора плода позволяет диагностировать не только числовые, но и структурные перестройки хромосом (несбалансированные и сбалансированные транслокации, инверсии, инсерции, сверхчисленные маркерные хромосомы и т.д.). Тем не менее в пренатальном кариотипировании существуют довольно серьезные проблемы. С одной стороны, они обусловлены не всегда удовлетворительным качеством хромосомных препаратов из ворсин хориона/плаценты, отсутствием или недостаточным количеством метафазных хромосом вследствие низкой пролиферативной активности клеток трофобласта, что требует проведения повторной инвазивной процедуры, усугубляющей риск прерывания беременности. Эти проблемы частично можно решить проведением цитогенетического исследования культивированных клеток амниотической жидкости, однако заключение о кариотипе плода в этом случае возможно сделать не ранее чем через две недели после проведения процедуры, что может неблагоприятно сказываться на психологическом состоянии беременной женщины, являясь дополнительным стрессовым фактором, особенно при наличии риска по ХА у плода.

Эти проблемы были решены при внедрении в пренатальное кариотипирование методов так называемой ускоренной, или быстрой, детекции анеуплоидии (БДА) у плода. Существует несколько молекулярных и молекулярно-цитогенетических подходов, позволяющих надежно и быстро (в течение 1-2 дней) детектировать наиболее частые анеуплоидии по хромосомам 13, 18, 21, X и Y, которые суммарно составляют около 80% от всех ХА, выявляемых у пациентов с умственной отсталостью и множественными врожденными аномалиями развития.

Традиционно для БДА используются такие методы, как флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) и количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (КФ-ПЦР).

FISH-метод позволяет идентифицировать специфические ДНК-последовательности определенных хромосом в большом количестве интерфазных ядер. Эта технология, часто называемая интерфазной цитогенетикой, основывается на факте, что каждая хромосома занимает определенный фокусный домен в интерфазном ядре и при FISH с соответствующими ДНК-зондами для каждой хромосомы могут быть получены дискретные гибридизационные сигналы, соответствующие числу копий определенной хромосомы. Как правило, используются коммерческие ДНК-зонды на центромерные районы хромосом X и Y и локус-специфичные ДНК-зонды на хромосомы 13 и 21, меченные различными флуорохромами, что позволяет одновременно оценить количество копий нескольких хромосом в одном интерфазном ядре. Преимуществом этого метода является то, что анализ проводится в препаратах из некультивированных клеток как амниотической жидкости, так и ворсин хориона и заключение о наличии или отсутствии анеуплоидии у плода может быть сделано в течение 24-48 ч после проведения инвазивной диагностической процедуры.

В основе метода КФ-ПЦР для детекции наиболее частых анеуплоидий у плода лежит мультиплексная ПЦР с использованием флуоресцентно-меченых праймеров, ограничивающих полиморфные короткие тандемные повторы (STR-локусы). На каждой исследуемой хромосоме анализируется несколько STR-локусов, что позволяет с высокой точностью выявлять изменение числа этих хромосом.

Показано, что чувствительность и специфичность обоих методов в пренатальной детекции наиболее частых анеуплоидий сопоставимы и близки к 100%. Каждый из них имеет определенные преимущества и недостатки. КФ-ПЦР является более дешевым методом по сравнению с FISH, а также позволяет выявлять контаминацию полученного образца ткани плода женского пола материнскими клетками, которая может возникать при проведении инвазивной процедуры. Преимуществом FISH-метода является возможность диагностики истинного мозаицизма по исследуемым хромосомам у плода, даже низкоуровневого, при анализе большого количества интерфазных ядер, в то время как метод КФ-ПЦР позволяет выявлять мозаицизм при содержании аномального клона, составляющем 15% и более.

Помимо традиционно используемых для БДА у плода, применяются и другие методы количественной оценки копий хромосом, такие как ПЦР в реальном времени (real-time PCR) и мультиплексная лигазная ПЦР (MLPA). При доказанной высокой эффективности как молекулярных, так и молекулярно-цитогенетических подходов в БДА предпочтительное использование каких-либо определенных методов не принципиально. Выбор метода БДА определяется исключительно техническими возможностями и оснащенностью каждой конкретной лаборатории.

Внедрение методов ускоренной детекции наиболее частых анеуплоидий у плода явилось значительным событием в неинвазивном пренатальном скрининге и поводом для широких дебатов об использовании такого подхода как самостоятельного, без стандартного кариотипирования, в пренатальной цитогенетической диагностике. Так, например, в Великобритании в программы скрининга на трисомию по хромосоме 21 у плода в настоящее время не включено исследование кариотипа плода и разрешено использование БДА в качестве самостоятельных диагностических методов, поскольку такой подход значительно снижает затраты на проведение ПД. В противоположность этому в США при реализации скрининговых программ с использованием тестов на БДА у плода необходимо обязательное последующее кариотипирование, поскольку известно, что 15-30% ХА, диагностируемых при стандартном цитогенетическом исследовании, не могут быть выявлены при таргетной БДА. Однако следует помнить, что все возможно диагностируемые при стандартном пренатальном цитогенетическом исследовании ХА могут иметь различную клиническую значимость.

Клинически значимыми являются ХА, сопровождающиеся множественными ВПР, высокой перинатальной смертностью и глубокой инвалидизацией в постнатальном онтогенезе. К этой группе относятся анеуплоидии по аутосомам, триплоидии, тетраплоидии и несбалансированные структурные хромосомные перестройки. Отдельно выделяют группу потенциально клинически значимых ХА, при которых фенотипические проявления в постнатальном периоде могут варьировать от нормы до относительно мягких аномалий развития. К таким ХА относят анеуплоидии по половым хромосомам и их мозаичные варианты, структурные перестройки половых хромосом, сбалансированные структурные аутосомные перестройки, возникшие de novo. Нужно отметить, что медико-генетическое консультирование в случаях обнаружения такого рода ХА у плода является крайне затруднительным, поскольку невозможно однозначно оценить исход беременности, что, в свою очередь, ставит перед семьей дилемму в принятии решения о судьбе данной беременности.

Длительный, 15-летний, опыт использования БДА в мировой клинической практике показал, что такой подход позволяет выявлять по меньшей мере 95% случаев клинически значимых ХА (наиболее частые анеуплоидии, триплоидию, тетраплоидию) у плода, а также потенциально клинически значимые анеуплоидии по половым хромосомам. Также установлено, что частота клинически значимых несбалансированных ХА, которые не могут быть выявлены при БДА, составляет всего 1:1000-1:1659. Кроме того, в большинстве случаев структурный хромосомный дисбаланс ассоциирован с различными пороками и аномалиями развития у плода, которые могут быть выявлены при УЗИ во II триместре беременности и сопровождаться проведением стандартного цитогенетического исследования. В любом случае, при использовании в лабораторной практике методов БДА в качестве самостоятельных, нужно четко понимать, что они должны проводиться только в рамках пренатального скрининга на анеуплоидию у плода с обязательным последующим УЗИ плода экспертного уровня.

Основные преимущества использования БДА определяются короткими сроками получения результата исследования. Проведение БДА особенно важно в тех случаях, когда при наличии высокого риска по частой анеуплоидии у плода срок беременности является пограничным для ее прерывания. Кроме того, снятие обеспокоенности, вызываемой длительным ожиданием результата при стандартном кариотипировании плода, значительно улучшает психологический статус беременной. Также отмечается, что БДА позволяет избежать излишней тревожности и обеспокоенности, которые могут возникнуть у беременной женщины в ситуации, когда при стандартной цитогенетической диагностике у плода обнаруживают потенциально клинически значимые ХА с неоднозначным исходом беременности, например сбалансированные хромосомные перестройки, возникшие de novo.

Расширение границ ускоренной детекции анеуплоидии у плода стало возможным с развитием технологии молекулярного кариотипирования Prenatal BACs-on-Beads (BoBs^TM ), которая позволяет проводить мультиплексный анализ для выявления наиболее частых анеуплоидий, затрагивающих хромосомы 13, 18, 21, X и Y, а также девяти микроделеционных синдромов c доминантным типом наследования и полной пенетрантностью клинических признаков: синдромы делеции 22q11.2, Ди Джорджи II, Вильямса-Бойрена, Прадера-Вилли/Энджельмена, Смита-Магенис, Вольфа-Хиршхорна, «кошачьего крика», Лангера-Гидеона, Миллера-Дикера. Диагностический набор представляет смесь микросфер, окрашенных двумя флуорохромами с различным спектром в различной концентрации, на поверхности которых иммобилизованы также меченые ВАС-клоны соответствующих фрагментов ДНК. При проточной цитометрии каждая микросфера считывается ридером с тремя лазерами, чтобы идентифицировать ее по спектральной характеристике и количеству сгибридизованной меченой опытной и референсной ДНК. Анализ осуществляется с использованием компьютерной программы при сравнении интенсивности гибридизации исследуемого образца ДНК плода с референсным (нормальным) образцом и оценке профиля гибридизации. Окончательный результат может быть получен уже через 36 ч после взятия образца ткани плода. Разновидностью технологии BoBs^TM является KaryoLite^TM BACs-on-Beads^TM , основанная на том же принципе. Отличительной особенностью является то, что в набор дополнительно включена клонированная ДНК теломерных и прицентромерных районов каждой хромосомы, что позволяет выявлять также сегментную анеуплоидию (частичные трисомии и моносомии) у плода. Использование данной технологии позволяет повысить информативность и эффективность ускоренной детекции ХА у плода, однако существенным ее недостатком является невозможность детекции полиплоидии, в частности триплоидии и полисомии по хромосоме X. Поэтому во всех случаях отсутствия хромосомного дисбаланса необходимо проведение таргетной FISH c любым аутосомным ДНК-зондом для установления плоидности.

В течение последнего десятилетия в постнатальной диагностике хромосомных болезней успешно используется высокоразрешающий метод хромосомного микроматричного анализа (ХМА), позволяющий дополнительно, в 15-20% случаев, выявлять геномный дисбаланс у пациентов с умственной отсталостью и множественными ВПР, c расстройствами аутистического спектра и нормальном кариотипе при стандартном цитогенетическом исследовании. Поэтому в алгоритме обследования таких пациентов ХМА является исследованием «первой линии».

Возможность широкого применения ХМА в ПД до сих пор является предметом обсуждения. Главными аргументами против использования этого метода являются проблемы, связанные с обнаружением у плода геномного дисбаланса в виде вариаций числа копий участков ДНК (copy number variation - CNV) неопределенной клинической значимости и CNV, ассоциированных с вариабельной экспрессивностью, неполной пенетрантностью и гетерогенностью клинических проявлений, особенно так называемых локусов предрасположенности (susceptibility loci - SL) к расстройствам нейропсихического развития. Выявление геномного дисбаланса такого рода в пренатальном онтогенезе значительно затрудняет медико-генетическое консультирование семьи, поскольку в таких случаях сложно однозначно прогнозировать исход беременности.

На сегодняшний день при обсуждении возможности использования ХМА в ПД большое внимание уделяется оценке разрешающего уровня метода, позволяющего достоверно выявлять патогенетические значимые CNV, определению показаний для проведения такого анализа, вопросам интерпретации результатов и проблемам медико-генетического консультирования.

Разрешающая способность ХМА определяется количеством (плотностью) олигонуклеотидов или фрагментов ДНК на микроматрице. В зависимости от геномной локализации и плотности проб ДНК на микроматрице выделяют таргентный и полногеномный ХМА. Чем больше таких проб, тем больше CNV может быть детектировано у плода. Полногеномный ХМА имеет высокую разрешающую способность, однако при использовании такого подхода высока вероятность обнаружения вариантов неопределенной клинической значимости и локусов предрасположенности к расстройствам нейропсихического спектра. При таргетном ХМА используются микроматрицы, позволяющие выявлять только ассоциированные с известными синдромами CNV. Однако эффективность диагностики при этом снижается, поскольку низкая разрешающая способность не позволяет выявлять другие клинически значимые CNV. В некоторых европейских странах и США при проведении ХМА в ПД руководствуются стандартами, определяющими его минимальную разрешающую способность от 400000 пар нуклеотидов.

Обязательным условием при проведении ХМА в ПД является тестирование родителей этим же методом при обнаружении CNV у плода, поскольку определение наследования является важным фактором в интерпретации результатов исследования, особенно в случаях вариаций числа копий неопределенной клинической значимости. Унаследованные от фенотипически нормальных родителей CNV могут интерпретироваться у плода как клинически незначимые, непатогенные.

Наиболее эффективным является использование ХМА в случаях выявления ЭГМ ХА у плода, то есть при заведомо высокой вероятности наличия хромосомного дисбаланса. Показано, что использование такого подхода позволяет дополнительно выявлять патогенетически значимые субмикроскопические CNV в 3,1-7,9% случаев у плодов даже с изолированными пороками развития и нормальным кариотипом, установленным при стандартном цитогенетическом исследовании. В настоящее время в Европе и США регламентировано использование ХМА при обнаружении ЭГМ ХА у плода, если при БДА наиболее частые анеуплоидии не выявлены и обеспечивается соответствующее, минимальное, время обработки результатов анализа; проведение такого исследования не рекомендовано при низком риске по анеуплоидии у плода.

ПД сегодня - это мультдисциплинарная область лабораторных, инструментальных и клинических исследований плода, направленных на профилактику рождения детей с наиболее частой врожденной и наследственной патологией - хромосомными болезнями и пороками развития различной этиологии. Высокая частота этих заболеваний среди новорожденных обусловила развитие подходов к массовой пренатальной профилактике хромосомных болезней. Основным принципом пренатального неинвазивного скрининга является проведение безопасного, доступного исследования для всех беременных женщин с целью выявления среди них группы с повышенным риском рождения ребенка с хромосомной патологией.

Такое тестирование должно быть добровольным и проводиться только в том случае, если беременная женщина будет проинформирована о преимуществах и недостатках скринингового теста, возможных результатах и предлагаемых вариантах диагностического исследования. При неизменной стратегии неинвазивного пренатального скрининга на анеуплоидию, направленной на уменьшение количества необоснованных инвазивных процедур, оптимизация протоколов проведения неинвазивного обследования позволила значительно повысить его эффективность.

Безопасность, надежность и высокая эффективность - главные критерии неинвазивного пренатального скрининга, которым полностью отвечает НИПТ. Имея более высокую чувствительность и специфичность детекции наиболее частых анеуплоидий, близкие к 100%, эта технология может в ближайшее время изменить установленную парадигму пренатального неинвазивного скрининга. На сегодняшний день стоимость такого исследования достаточно высока и не позволяет рассматривать его в качестве скринингового теста.

Следует помнить, что результаты скрининга имеют не диагностический, а вероятностный уровень значимости, позволяя формировать среди беременных группу высокого риска по анеуплоидии у плода, требующую этапа диагностического обследования при проведении цитогенетического или молекулярно-цитогенетического исследования разных клеток плода, полученных при инвазивных процедурах, осуществляемых в разные сроки беременности. Внедрение высокоразрешающего ХМА позволяет повысить чувствительность и эффективность цитогенетической ПД. Однако сложность интерпретации полученных результатов не позволяет в настоящее время широко использовать этот метод в ПД хромосомных болезней.

Проведение ПД с неизбежностью сталкивается с этическими принципами, так как получение максимально возможной информации о генетическом статусе плода при минимальной информации о его фенотипе может приводить к принятию спорных решений и возникновению этических дилемм. Поэтому выбор тактики ведения беременности при наличии у плода хромосомного заболевания должен осуществляться беременной женщиной после всесторонних консультаций ее и членов семьи врачами различных специальностей.

Сочетание вспомогательных репродуктивных технологий с современными методами молекулярной генетики и цитогенетики привело к развитию новой диагностической процедуры - предымплантационной генетической диагностике (ПГД). ПГД можно считать самой ранней формой ПД. Благодаря последним достижениям репродуктивной медицины стало доступным исследование эмбрионов, полученных путем ЭКО и/или разновидностью ЭКО - интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Анализируя ДНК одной: пяти клеток, взятых при биопсии in vitro, можно определить статус будущего плода еще до его имплантации в полость матки и переносить только те эмбрионы, в которых отсутствует генетический дефект. Сегодня существует не менее 40 центров ПГД в различных странах мира, включая США, Бельгию, Англию, Италию, Испанию, Австралию, Израиль, Россию, Белоруссию и др.

В настоящее время процедуры проведения предымплантационного анализа делят на две группы.

Первый шаг в процедуре ПГД/ПГС - это получение материала для генетического анализа. С этой целью проводят биопсию полярных телец, биопсию бластомеров (обычно одного) эмбрионов на стадии развития 6-10 клеток или биопсию эмбрионов на стадии бластоцисты.

С развитием возможностей молекулярной генетики все больший спектр методов применяют для проведения ПГД/ПГС. Известно, что около 5% эмбрионов человека на сроке беременности 10 недель являются анеуплоидными. Так как, по данным цитогенетических исследований, анеуплоидии по многим хромосомам летальны, неудивительно, что в эмбрионах на стадии до имплантации будет гораздо больше подобной патологии, чем в эмбрионах развивающихся беременностей. Оценено, что более 50% эмбрионов несут в одной или нескольких клетках аномальное количество хромосом.

Основными методами ПГД/ПГС являются:

Для проведения ПГС можно применять все перечисленные методы, каждый из которых обладает своими преимуществами и недостатками. Первые работы, связанные с выявлением анеуплоидий эмбрионов, проводили методом FISH на бластомерах, фиксированных на стеклах. Методика FISH включает фиксацию бластомера на стекле с последующей гибридизацией с зондами на интересующие пары хромосом. Первые исследования методом FISH на одной клетке были проведены в 1992 году для детекции половых хромосом. С тех пор количество коммерческих зондов значительно увеличилось, позволяя определять одновременно большее число хромосом. В настоящее время FISH продолжают применять во многих медицинских центрах мира с целью определения пола, для выявления числовых аномалий хромосом и хромосомных транслокаций. Тем не менее основным ограничением технологии FISH по-прежнему остается определение одновременно в одном образце анеуплоидий лишь небольшого количества хромосом (не более 5-7 пар). И хотя сейчас появились работы, позволяющие проводит FISH-анализ на все 23 пары хромосом одновременно, вряд ли в дальнейшем эта методика получит широкое распространение.

Метод ПЦР и ее модификации. Хотя этот метод является основным методом для диагностики наследственных заболеваний, его разновидности можно применять и для проведения ПГС. Первые опыты ПЦР с одной клетки были не очень удачными, так как получение достаточного количества ДНК с исходной матрицы ДНК одной клетки (6-7 pg) представляло собой определенную проблему. Малое количество ДНК требовало большего количества циклов ПЦР, что приводило к появлению неспецифических продуктов реакции. С накоплением опыта при проведении ПГД обозначились еще две технические проблемы: контаминация и неравномерная амплификация двух копий интересующего фрагмента - «нерепрезентативная ПЦР». Крайним проявлением «нерепрезентативной ПЦР» является потеря гетерозиготности [allele drop out (ADO) - ложное отсутствие аллеля при визуальной оценке результатов ПЦР]. Для максимального устранения контаминации, кроме соблюдения стандартных лабораторных правил, рекомендуется проведение процедуры ИКСИ и обязательное наличие отрицательного контроля на всех этапах исследования. Чтобы минимизировать неравномерность представленности ПЦР аллелей, приводящую к потере гетерозиготности, необходима оптимизация протоколов ПЦР. Хотя причины ADO остаются до конца неясными, известно, что потеря гетерозиготности зависит от следующих факторов: выбранного метода лизиса клеток, условий реакции амплификации, ДНК-последовательности интересующего фрагмента генома, конечного размера ПЦР-продукта, качества генетического материала бластомеров. Для решения проблем, связанных с ПЦР с ДНК одной клетки, был разработан ряд методов полной геномной амплификации (ПГА). Суть метода заключается в общем увеличении количества ДНК генома клетки перед проведением дальнейших исследований. Крайне важным в таких методах является равномерное увеличение генетического материала хромосом, что, к сожалению, остается труднодостижимым. Существуют две основные группы методик ПГА:

В практике для ПГД моногенных заболеваний в настоящее время применяют протоколы DOP-PCR, PEP-PCR, SDA.

Одной из разновидностей метода ПЦР является метод флуоресцентной ПЦР. В данной методике один из праймеров метят флуоресцентным красителем, а детекцию продуктов амплификации проводят на генетическом анализаторе с помощью лазера. Эта технология имеет преимущества перед стандартной ПЦР. Применение флуоресцентной ПЦР как более чувствительного метода позволяет уменьшить общее количество циклов ПЦР и значительно снизить частоту ADO. Метод флуоресцентной ПЦР с предварительной полной геномной апмлификацией можно применять для определения анеуплоидных эмбрионов. Метод является аналогом метода количественной флуоресцентной ПЦР (КФ-ПЦР). КФ-ПЦР с успехом применяется в зарубежной и отечественной практике ПД для определения хромосомных нарушений у плода. Метод основан на ПЦР коротких тандемных повторов (STR-локусов), присутствующих на каждой хромосоме человека. Для большей достоверности результатов необходимо анализировать не менее 5-7 STR-локусов (маркеров) на каждую пару хромосом. Кроме того, маркеры должны быть информативны, то есть отличаться по длине повторов на парах гомологичных хромосом. В случае ПГД нужно проводить сравнительный анализ маркеров родительской ДНК и ДНК материала эмбрионов. Более того, из-за возможной «нерепрезентативной ПЦР» варианты полуинформативных локусов, то есть когда один из маркеров матери совпадает с одним из маркеров отца, могут быть неправильно интерпретированы из-за того, что классическое соотношение 2:1, выявляемое обычно при исследовании нативной ДНК, таковым не будет. В зависимости от маркеров и методов ПГА соотношение таких маркеров может варьировать от 1:10 до 1:1. Поэтому в случае ПГД желательно, чтобы анализируемые маркеры были полностью информативны, то есть и у матери, и у отца должно быть по два различных по длине маркера. Данная ситуация встречается нечасто, поэтому метод КФ-ПЦР в применении ПГС имеет ограничения. Невозможность определения анеуплоидий, вызванных ошибками митоза или второго деления мейоза, является очевидным недостатком данного метода. Одно же из явных преимуществ метода КФ-ПЦР - это возможность дополнительного контроля над «отцовством» эмбриона и наличием контаминации чужеродной ДНК в пробирке. При сравнительном анализе большого числа маркеров родительской ДНК и ДНК эмбрионов вероятное несоответствие сразу будет очевидным.

Возможность одновременно определять количественные нарушения всех пар хромосом (22 аутосомы и половые хромосомы) вне зависимости от происхождения ошибок деления появилась при развитии методов сравнительной геномной гибридизации (CGH). В отличие от метода FISH, где зонды фиксируются только к определенному участку хромосом, и метода КФ-ПЦР, где анализируются локусы, лежащие также в определенных локусах хромосом, метод CGH позволяет анализировать всю длину хромосом и таким образом выявлять не только числовые нарушения хромосом, но и локальные изменения в их структуре. Недостатком данного метода является относительная дороговизна самого анализа и высокая цена оборудования, необходимого для его проведения. Кроме того, для получения достоверных результатов для CGH требуется достаточно большое количество матрицы, которое достигается предварительным проведением ПГА. Как уже обсуждалось выше, случаи «нерепрезентативной ПЦР» и потери гетерозиготности могут зачастую происходить и при ПГА. При феномене возможного ADO интерпретация результатов может быть так же затруднительна, как и при других методах, основанных на ПГА-ПЦР. Кроме того, определить принадлежность эмбрионов к данной супружеской паре и наличие чужеродной человеческой ДНК при данной методике невозможно, так как используемые при гибридизации зонды не являются специфичными. Безусловно, в каждой ЭКО-клинике и лаборатории необходим строгий контроль над процессом искусственного оплодотворения и контаминацией. Однако очевидно, что полностью застраховаться от возможных ошибок очень непросто, особенно в такой сложной и многоступенчатой процедуре, как ПГД/ПГС.

Разработанные фирмой Affymetrix микрочипы представляют собой подложки с фиксированными зондами размером 25 нуклеотидов. Зонды комплементарны участкам ДНК, содержащим 10000 однонуклеотидных полиморфизмов, и расположены на растоянии около 210 тыс. пар нуклеотидов друг от друга вдоль всех аутосом и Х-хромосомы. Гибридизация образца после ПГА на микрочипах с дальнейшей компьютерной обработкой данных позволяет выявлять количественные изменения хромосом.

Развитие новых технологий привело к появлению методов секвенирования нового поколения (NSG - new sequence generation). И хотя основные задачи NSG - это массивный анализа геномов и транскриптомов, метагеномика и др., недавно появились работы, связанные с определением анеуплоидий всех хромосом человека и других структурных перестроек хромосом, как для ПД, так и для ПГД. Кроме того, в случае ПГД, при применении NSG существуют возможности объединения исследования хромосомных и моногенных заболеваний в одном анализе. А также есть перспектива выявления отличия варианта сбалансированных транслокаций от варианта нормы. Насколько хорошо будет качество исполнения анализа и доступность цены этого метода для пациентов покажет время. Но, учитывая скорости развития технологических процессов в области молекулярной генетики, вероятность вытеснения всех перечисленных выше методик методом NSG весьма высока.

В период с июня 2010 года по декабрь 2015 года автором в сотрудничестве с семью ЭКО-клиниками Москвы, Уфы, Нижнего Новгорода и Твери было проведено в совокупности 390 ПГД/ПГС (табл. 6-1).

Как видно из табл. 6-1, группа ПГД «высокого риска» в сумме составляет лишь одну треть от группы ПГС. По данным нескольких научных статей, в зарубежной практике количество проводимых ПГС и ПГД в лабораториях практически одинаково. К сожалению, коммерциализация подобных исследований в нашей стране, недостаточная информированность семей, состоящих в группах высокого риска, а также отсутствие профессиональной медико-генетической консультации в клиниках ЭКО, приводят к не всегда оправданному сдвигу предымплантационной диагностики в сторону ПГС.

Для 31 семьи с различными наследственными заболеваниями были разработаны протоколы и выполнены ПГД (табл. 6-2).

До обращения в ЭКО-клиники большинство семей были консультированы в поликлиническом отделении и диагностированы в лабораториях генетики НБО- и ДНК-диагностики ФГБНУ МГНЦ.

Анализируя суммарные данные, представленные в табл. 6-2, можно сделать несколько выводов. Для любого наследственного заболевания с установленным генотипом возможно разработать оптимальный протокол проведения ПГД. Однако неверно ограничивать исследование только выявлением семейных мутаций. Имеет также смысл проводить и ПГС, по крайней мере на хромосомы 13, 16, 18, 21, X и Y. Согласно результатам исследований, трисомии встречаются реже, чем феномен ADO по различным хромосомам, скорее всего обусловленный качеством и, следовательно, жизнеспособностью эмбриона. Таким образом, «идеальный» для переноса эмбрион должен быть не только «здоровым» по семейному заболеванию и по хромосомному набору, но и иметь хорошие морфологические качества. И даже в случаях переноса таких эмбрионов беременность может не наступить. Очевидно, существуют иные малоизученные факторы, способствующие успешной имплантации и развитию беременности. Большим минусом в существующей в нашей стране структуре проведения ПГД является отсутствие обратной связи как между специалистами клиники и лаборатории, так и между пациентами и врачами. Как правило, после наступления желанной беременности пациентки не наблюдаются в клинике, а врачи клиник, имея огромный поток пациентов, не отслеживают ушедших пациентов. Отчеты профильных клиник об успешных ЭКО/ИКСИ основаны, как правило, на факте наступления беременностей, но не их исходах. Представленные в таблице данные исходов беременностей стали известны только благодаря тому, что семьи до ПГД обращались в лабораторию и непосредственно общались с сотрудниками.

Основная цель ПГД - оказать помощь супружеским парам, отягощенным наследственными заболеваниями или наличием хромосомных транслокаций, в рождении здорового ребенка, не только отбирая эмбрионы «без болезни», но и избегая возможных осложнений в процессе манипуляций с эмбрионами. Правовые и этические вопросы, возникающие в связи с внедрением ПГД в практику, не раз обсуждались на международных конференциях. Отношение к ПГД существенно отличается не только в разных частях мира и странах, но и внутри одной страны в связи с различными научными, культурными и религиозными взглядами. Успешно проведенные циклы ПГД, безусловно, позволяют уменьшить возможные риски, связанные с рождением ребенка в отягощенных семьях. Необходимо, чтобы перед проведением ПГД/ПГС супружеские пары получали грамотную консультацию врача-генетика, были проинформированы о природе генетического заболевания, типе наследования и рисках для потомства. Если речь идет о ПГС, следует разъяснять пациентам прямые показания, необходимость и целесообразность проведения такой процедуры. Супруги и врачи должны понимать необходимость доступности ДНК обоих родителей, а возможно, и других членов семьи, с тем чтобы создать надежную систему диагностических тестов. Консультирование также обязательно должно включать информацию об альтернативных методах ранней диагностики, возможных рисках и последствиях. Даже если ПГД более предпочтительна, с точки зрения генетика, не стоит забывать о необходимости оценки овариального резерва женщины и вероятности зачатия, связанных с возрастом супруги, состоянием ее яичников, гормональным профилем и качеством спермы супруга.

Станет ли со временем ПГД полноценной альтернативой ПД для семей, отягощенных генетическими заболеваниями? Анализируя опыт практического применения ПГД за последние десятилетия, становится очевидным, что такая диагностика остается технически сложной, многоступенчатой и трудоемкой процедурой, которая требует тесного сотрудничества и совместной работы специалистов различной профессиональной направленности. Непрерывно продолжаются работы по улучшению и упрощению протоколов ПГД, но недостатки сегодняшних технологий по-прежнему ограничивают более широкое применение этого метода диагностики. Ограничениями внедрения ПГД в практику также являются необходимость применения процедуры ЭКО, относительно низкая частота беременностей и родов, высокая стоимость полного цикла ПГД. Тем не менее для многих пар, отягощенных семейным анамнезом, проведенные ПГД оказалась успешными и привели к желанным исходам без нежелательных последствий. Учитывая положительные результаты, определенные этические аспекты и непрерывные тенденции технического прогресса, следует ожидать, что ПГД наследственных заболеваний войдет наряду (но вряд ли вместо) с ПД в широкую практику.

В данной главе мы будем использовать термин NGS или «геномное секвенирование». Под ним мы будем понимать совокупность технологий определения нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, отличающихся от классических методов секвенирования по Сэнгеру и Максаму-Гилберту, имеющих удельную стоимость сиквенса нуклеотида не более 10^-7 доллара США (к примеру, стоимость определения одного нуклеотида методом ПЦР составляет приблизительно 1 доллар США, а при секвенировании по Сэнгеру - 10^-2 доллара) и среднюю производительность одного прибора в интервале от 10⁶ до 10¹² нуклеотидов за запуск. Под такое широкое определение подходят все современные и даже перспективные секвенирующие платформы. В табл. 7-1 приводятся основные характеристики современных геномных секвенаторов.

Данный раздел не ставит перед собой целью описать все тонкости технологии геномного секвенирования. Для такого чтения мы рекомендуем русскоязычную литературу (Д.В. Ребриков, Д.О. Коростин, Е.С Шубина, В.В. Ильинский. NGS. Высокопроизводительное секвенирование. - М.: Бином, Лаборатория знаний. - 2015. - 232 с.), а также замечательный обзор технологий, проведенный Владимиром Витальевичем Зубовым (обзор доступен по ссылке http://qoo.by/dNO). Здесь же мы предлагаем краткое руководство по тому, какую платформу для секвенирования выбрать медицинскому учреждению или лаборатории по медицинской генетике, которая наилучшим образом подходит для решения поставленных перед ними задач. Чтобы лучше ориентироваться в выборе секвенатора для решения конкретной медико-генетической проблемы, предлагаем ознакомиться с табл. 7-2, в которой секвенаторы классифицируются по типу решаемых ими задач.

Различная пропускная способность приборов отражает сложившиеся форматы клинических NGS-исследований: полногеномного секвенирования (whole genome sequencing, WGS), полноэкзомного секвенирования (whole exome sequencing, WES) и секвенирования генных панелей. Так, чтобы обеспечить 50-кратное прочтение каждого нуклеотида одного генома, даже теоретически требуется получить в результате запуска не менее 170 млрд букв, а если учесть, что реальные прочтения (риды) не будут равномерно распределены по геному, эту цифру придется еще увеличить. В то же время одновременный анализ 20-30 генов, мутации в которых приводят к единому клиническому фенотипу, вряд ли потребует более нескольких десятков миллионов нуклеотидов, даже если есть основания подозревать у пациента мозаицизм в отношении носительства клетками мутации.

В текущей ситуации полногеномное секвенирование в клинике используется как альтернатива микрочиповой диагностики или полногеномной гибридизации для поиска крупных структурных изменений хромосом (не менее 100 тыс. пар нуклеотидов) и хорошо подходит для неинвазивного скрининга, пример которого приведен далее.

К полноэкзомному секвенированию в клинике чаще всего прибегают, когда остальные методы генетической диагностики себя исчерпали, хотя крупные медицинские центры, выполняющие десятки исследований в день, по достоинству оценили этот формат и применяют его рутинно. Он дает возможность создать единую технологическую цепочку для всех образцов, вне зависимости от диагноза у пациентов, в шесть раз меньшую стоимость исследования одного экзома в сравнении с одним геномом, быструю обработку и в пятнадцать раз более компактное хранение данных. Этот вид NGS-исследования сегодня набирает обороты и в ближайшем будущем будет основным инструментом поиска новых генов-кандидатов при различных патологиях.

Сегодня выявлена - хотя бы частично - генетическая природа приблизительно 3500 моногенных заболеваний, около 1900 заболеваний с доказанной наследственной природой не имеют генетического профиля, и еще почти столько же заболеваний могут иметь наследственный характер. Наиболее перспективный метод анализа, если генетическая природа неясна, - это экзомное секвенирование. И именно результаты анализа экзомов отдельных пациентов или когорт, подобранных по нозологиям, обобщение в единые базы хорошо клинически аннотированных данных позволят в ближайшие годы выявить новые генетические компоненты моногенных и многих других заболеваний. Пациент, которому было выполнено полноэкзомное секвенирование, сможет со временем вернуться к своим результатам, например, чтобы выяснить, может ли ему быть назначена та или иная терапия, исходя из обнаруженных у него полиморфизмов, влияющих на метаболизм лекарственных средств.

Причиной многих хорошо описанных наследственных заболеваний являются мутации, приводящие к изменению крупных белковых комплексов, затрагивающие отдельные звенья метаболических путей, сигнальных каскадов и т.д. Генные панели позволяют исследовать сразу все гены, мутации в которых вызывают клинически сходное поражение. В настоящее время такой формат является наиболее распространенным из-за относительной дешевизны, простоты выполнения, а также очевидного и относительно простого способа анализа полученных данных. Он нацелен на мутации в уже известных, пусть и очень многочисленных генах. Но необходимо учитывать рамки, накладываемые таким форматом тестирования. Ведь в панель включаются только гены, для которых уже доказана связь с исследуемым заболеванием. Можно ожидать, что со временем при снижении стоимости NGS-исследования, развитии популяционных и клинико-генетических баз данных исследование панелей генов будет постепенно заменено экзомным секвенированием. Следующим этапом при условии появления новых платформ станут варианты полногеномного исследования.

Секвенирование всех кодирующих последовательностей генома («полного экзома») становится все более популярным методом генетической диагностики. Это обусловлено, с одной стороны, адаптацией метода для клинических лабораторий благодаря развитию самой технологии и удешевлению индивидуального исследования, с другой - низкой эффективностью традиционного тестирования отдельных генов, когда наследственное заболевание является генетически гетерогенным.

Сегодня к полноэкзомному секвенированию прибегают, если других способов установить патогенную мутацию уже не осталось. По данным лаборатории патологии и лабораторной медицины Университета Калифорнии, даже в таких сложных случаях это исследование позволяет вскрыть генетическую причину заболевания в половине случаев и еще в 6% исключить ранее предполагавшийся диагноз. Гаплоидный геном человека содержит около 3,2 млрд пар нуклеотидов, из которых на последовательности нуклеотидов, кодирующих полипептиды и белки, приходится приблизительно 1%, но именно в этой части генома сосредоточено 85% описанных сегодня мутаций, являющихся причиной моногенных заболеваний. Поэтому секвенирование экзома имеет высокий шанс на успех, если мы пытаемся найти ген, мутация в котором привела к возникновению ранее неизвестного фенотипа предположительно моногенного заболевания.

Технология полноэкзомного секвенирования предполагает фрагментацию геномной ДНК, выделенной из образца, последующее обогащение кодирующими последовательностями за счет гибридизации с синтетическими пробами, комплементарными всем известным на текущий момент экзонам генов человека. При соблюдении технологии более 70-80% фрагментов ДНК из библиотек, поступающих на секвенирование, должны содержать вставки из экзонов и экзонно-интронных сочленений.

Полноэкзомное секвенирование не является стандартным клиническим исследованием, когда пациент обращается к врачу, врач назначает генетическое исследование, лаборатория его выполняет и возвращает врачу результат, который подтверждает или не подтверждает первоначальное диагностическое предположение. Результатом является не ответ «да» или «нет», а совокупность большого числа (от 50 до 100 тыс.) отклонений от последовательности золотого стандарта генома, которым для унификации исследований пользуются все исследовательские группы во всем мире. Связь с конкретной клинической картиной («клиническая релевантность») каждого такого варианта требует отдельного анализа. Поэтому выработка итогового заключения только начинается с отчета о секвенировании и возможна лишь при взаимодействии врачей и лаборатории. В тех учреждениях, где такое секвенирование является частью диагностического процесса, как правило, формируются специальные рабочие группы, включающие врачей-генетиков и биоинформатиков, для всестороннего обсуждения результатов каждого исследования и подготовки заключения, являющегося интерпретацией результатов экзомного секвенирования, соответствующего запросу врача.

Для направления пациента на экзомное секвенирование врач-генетик проводит медико-генетическое консультирование и изучает все доступные клинические и параклинические данные, а также результаты предыдущих генетических тестов пациента. На основании собранных данных врач-генетик подготавливает направление в лабораторию, в котором кратко излагаются результаты медико-генетического исследования и при возможности предположительный диагноз. Его направление потребуется при анализе и аннотации выявленных вариантов.

В ходе консультирования следует также максимально подробно рассказать пациенту и заинтересованным представителям его семьи о том, какие данные будут включены в отчет об исследовании, и получить информированное согласие на проведение исследования.

Назначение экзомного секвенирования целесообразно, если:

Отчет о проведении конкретного лабораторного исследования обычно содержит несколько блоков информации (при этом надо иметь в виду, что для врача-генетика, не говоря уже о врачах других специальностей, не все блоки информации одинаково важны, совершенно определенно в отчете должны быть таблицы с вариантами после применения различных фильтров).

При секвенировании экзома наиболее важными в заключении лаборатории для врага-генетика являются первичные находки.

Если пациент высказал свое согласие на проведение лабораторного исследования, то в отчет могут быть внесены сведения и о случайных находках, не связанных с генами заболевания пациента. Список таких генов установлен, например, Американским колледжем медицинской генетики и геномики в ACMG Recommendations for Reporting of Incidental Findings in Clinical Exome and Genome Sequencing (Robert C. Green et al.) и касается наследственных онкологических заболеваний, синдрома Марфана, синдрома Бругада, синдрома удлиненного интервала Q-T, некоторых кардиомиопатий.

Отчет может быть дополнен файлами промежуточной обработки данных:

Пусть не смущает врача кажущаяся сложность самих файлов, со временем обработка информации, содержащейся в них, станет дополнительным инструментом поиска генетических причин болезни. Необходимость передачи таких файлов объясняется тем, что врач может заказать их биоинформатическую интерпретацию в разных учреждениях. Иными словами, генерация данных секвенирования и анализ этих данных могут быть выполнены разными исполнителями (лабораториями, группами, компаниями).

Лаборатории, специализирующиеся на NGS-секвенировании, имеют собственное или коммерчески доступное программное обеспечение для анализа файлов таких форматов. Но и в открытом доступе существуют программы, которые могут быть использованы. Они могут оказаться полезными для поиска протяженных участков с низким покрытием и/или потерей гетерозиготности, для выявления ложнопозитивных вариантов, подтверждения гомо- и гетерозиготности варианта и т.д. В любом случае при заказе экзомного секвенирования врач-генетик должен иметь представление о том, какие данные должен предоставить оператор NGS в результате выполнения работы.

Если в ходе исследования не было обнаружено патогномоничных мутаций, то наиболее сложной частью полноэкзомного секвенирования является аннотация найденных вариантов и поиск среди них генетической причины заболевания.

Существует несколько подходов для решения этой задачи.

1. Поиск новых мутаций в генах, связанных с определенным заболеванием, и анализ вариантов в клинически релевантных генах.

Это наиболее часто использующийся подход, требующий применения различных фильтров и стратегий поиска.

Вначале из рассмотрения исключаются все часто встречающиеся варианты. По опыту проведения полноэкзомного секвенирования нами установлен эмпирический порог частоты встречаемости варианта, который составил 0,1%. Для расчетов используются популяционные частоты, приведенные в открытых базах данных, например:

На следующей стадии идет проверка наличия найденных мутаций в медицинских базах данных, оценка влияния аминокислотной замены на функцию белка либо нуклеотидной замены на эффективность сплайсинга. Оценка мутаций, происходящих в регуляторных/энхансерных областях генов, пока носит скорее характер НИР и не входит в перечень того, что имеет широкое распространение. Вот далеко не полный список баз данных, которые чаще всего используются при анализе:

Генетические базы данных развиваются очень динамично, поэтому желательно проводить регулярный мониторинг актуальных баз данных.

Как правило, на этом же этапе используются программы, позволяющие оттолкнуться от фенотипа и осуществить фенотип-ориентированный поиск в электронной медицинской литературе.

Однако в силу ограниченности современных данных о генетической природе заболеваний результатом поиска часто оказывается ранее не описанная мутация в гене, связанном с развитием рассматриваемого заболевания. Иногда ни найденный вариант, ни ген не описаны в литературе как причина заболевания, но белок участвует в нарушенном при данной патологии процессе (здесь существует неопределенность, связанная с недостатками в наших знаниях о патогенезе большинства заболеваний).

В этом случае проводится in silico анализ влияния новой мутации на структуру белка с помощью открытых программ, таких как Sorting Intolerant from Tolerant, PolyPhen, Mutation Taster, Mutation Assessor и т.д.

Рекомендации по оценке значения обнаруженных вариантов были ранее сформулированы несколькими группами.

Наиболее подробными в настоящее время являются Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.

В них представлены подходы для разделения вариантов на категории «патогенные», «вероятно патогенные», «варианты неясного значения», «вероятно доброкачественные», «доброкачественные» и возможная доказательная база для каждой категории.

Сегодня активно развиваются коммерческие программы, которые выполняют все варианты поиска в автоматическом режиме, увязывают информацию с обнаруженными у пациента вариантами, оценивают вероятность их патогенности и предоставляют дополнительные сервисы для аннотации, например информацию о процессах и сигнальных путях, в которых участвует продукт измененного гена, о возможности фармакологической коррекции и т.п.

2. Одновременный анализ образцов пациента и его родителей, так называемое трио.

Существенную помощь в интерпретации найденных мутаций у пробанда может оказать экзомное секвенирование его здоровых родственников. В табл. 7-3 приведен анализ работы лаборатории патологии и лабораторной медицины UCLA, сравнившей тестирование только пробанда (338 случаев), трио (410 семей) и пробанда с одним из родственников (66 семей).

*Секвенирование проводилось для подтверждения «вероятно патогенных» мутаций, выявленных ранее микроматричным кариотипированием.

Обследование трио дает информацию и о характере мутаций. Например, в 31% случаев получения молекулярно-генетического диагноза 50% были мутациями de novo, 20% пациентов были компаунд-гетерозиготами, 16% - гомозиготами, 8% - гемизиготами, 4% мутаций относились к аутосомно-доминантным заболеваниям с низкой или неизвестной пенетрантностью, а в 2% были констатированы изменение копийности или однородительская дисомия.

В табл. 7-4 приведены данные Геномного клинического центра Медицинской школы Давида Греффена Университета Калифорнии (Лос-Анджелес) о получении молекулярно-генетического диагноза при некоторых клинических фенотипах.

Совместный анализ пациента и его родителей позволяет существенно сузить круг мутаций-кандидатов. Приведем пример из практики работы ARUP лаборатории отделения патологии Университета Юты, представленный профессором Pinar Byerak-Toydemir в видеолекции по экзомному секвенированию в клинической практике (https://www.youtube.com/watch?v=Hw9c_UzDbA0).

Пациент 11 лет с задержкой психомоторного развития, низким ростом, нарушением питания, гипотонией, гипоплазией гениталий, воронкообразной деформацией грудной клетки, нарушением поведения, широкими большими пальцами, плоским лицом, ротированными назад ушными раковинами. Его родословная представлена на рис. 7-1, тип наследования признака аутосомно-рецессивный, так как родители при этом здоровы и не имели подобных пробанду признаков.

Данные молекулярного кариотипировании, FISH и метаболических тестов у пациента были в норме.

Было выполнено экзомное секвенирование, в результате которого было получено 56 928 вариантов, изменяющих структуру белка. Для анализа данных использовалось три модели мутаций: аутосомно-рецессивная, de novo, X-сцепленная - их параметры приведены в табл. 7-5.

Верхний предел популяционной частоты был определен в 0,1% для мутаций de novo и 1% для двух других моделей.

Таким образом, используя данные трио, можно более чем на 90% сократить объем вариантов, которые следует проанализировать.

В этом примере как патогномоничная была определена мутация de novo в гене ARID1B, приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона. По литературным данным, мутации такого типа были обнаружены у трех пациентов с синдромом Coffin-Siris, имевших аналогичный фенотип и не являвшихся родственниками.

При назначении экзомного секвенирования следует учитывать сегодняшние ограничения метода.

Программное обеспечение для анализа данных экзомного секвенирования быстро развивается. Например, сегодня поиск протяженных участков с низким покрытием и потерей гетерозиготности возможен только вручную, но нет сомнения, что в течение года или двух такая функция будет включена в большинство коммерческих программ для анализа данных секвенирования.

Приведем простой, но достаточно показательный пример из нашей практики, где диагностика методом экзомного секвенирования оказалась весьма эффективна (родословная семьи представлена на рис. 7-2). Надо отметить, что до выполнения этого теста пациентка была детально обследована в России и за рубежом, но, вопреки очевидной клинике, результаты генетических исследований были отрицательными.

Пациентка: девочка, 2,5 года, до 5 мес развивалась нормально, а потом наступило замедление в развитии. В возрасте 2,5 года девочка могла ползать на животе, не говорила. У нее были устойчивые биохимические изменения, характерные для недостаточности биотина: повышение 3-гидроксиизовалериановой кислоты в крови, карнитил-3-гидроксиизовалериановой кислоты и метилцитрата в моче. Но клинический ответ на биотин получен не был.

Старший брат здоров, старшая сестра имела такую же клинику и умерла в возрасте двух с половиной лет.

Недостаточность биотина - это очень редкое заболевание, которое возникает при мутациях в генах, кодирующих ферменты голокарбоксилазсинтетазу или биотинидазу, первый из которых активирует голокарбоксилазы, участвующие в синтезе и подавлении окисления жирных кислот, глюконеогенезе, метаболизме аминокислот и т.д., а второй обеспечивает рециркуляцию биотина (цикл метаболизма биотина представлен на рис. 7-3).

Но у этой пациентки активность биотинидазы была в норме (биохимический анализ), а ген синтетазы голокарбоксилаз имел только один, довольно частый полиморфизм (по результатам секвенирования по Сэнгеру всех экзонов гена).

В ходе экзомного секвенирования среднее покрытие составило 197х, протяженных участков потери гетерозиготности не было выявлено.

Обнаружено:

Исходя из семейной истории, первым было сделано предположение об аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания. Среди всего нескольких генов, несущих редкие парные мутации, приводящие к изменению структуры белка, был ген SLC5A6, кодирующий трансмембранный натрийзависимый канал, контролирующий поступление в клетку водорастворимых витаминов биотина, пантотеновой кислоты и липоата.

Обе missense мутации находились в высококонсервативных участках этого гена и по in silico расчетам программ, используемых для предсказания влияния на структуру белка, были «вероятно патогенными». Ресеквенирование по Сэнгеру ДНК, полученной из образцов крови родителей и сибса, позволило установить фазу сцепления для этих мутаций. Пациентка оказалась компаунд-гетерозиготой. Поскольку мутации возникли в гене, отвечающем за белок, обеспечивающий поступление биотина в клетку, неудивительно, что пациентка не отвечала на увеличенные дозы биотина. К слову, данный ген не входит ни в одну коммерчески доступную сегодня даже самую широкую «клиническую» панель генов, поэтому мог быть проанализирован только методом полноэкзомного секвенирования.

Таким образом, только экзомное секвенирование помогло выявить причину заболевания.

Ограничение на использование полноэкзомного секвенирования в клинике лежит сегодня не в лабораторной и биоинформатической областях. Наиболее трудоемким и сложным является поиск патогенных мутаций среди всего спектра найденных вариантов. Достижение значимого клинического результата возможно только при тесном взаимодействии между врачом-генетиком и лабораторией. Хотя и этот этап будет упрощен и ускорен со временем и накоплением новых данных. Все более широкое использование NGS в клинике позволит раскрыть причину тех генетических заболеваний, чья природа сегодня неизвестна.

Далее мы подробно рассмотрим неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови матери методом высокопроизводительного секвенирования, в связи с тем, что эта технология получает все большее распространение и имеет наибольшую социальную значимость.

В структуре причин репродуктивных потерь, неонатальной смертности и детской инвалидности одно из ведущих мест занимают хромосомные анеуплоидии. Анеуплоидии обусловливают не менее 30% спорадических неразвивающихся беременностей и выкидышей, а у новорожденных встречаются с частотой до 1:300. Одними из самых частых анеуплоидий, приводящих к рождению ребенка с пороками и задержкой развития, являются трисомии по 21-й, 18-й и 13-й хромосомам. Они встречаются в одном случае на 650-1000, 6000-8000 и 10000-16 000 новорожденных соответственно. Риск данных хромосомных нарушений у плода существенно возрастает с возрастом матери. Причиной синдромов Дауна, Эдвардса или Патау у детей также могут являться частичные анеуплоидии при наличии у клинически здоровых родителей сбалансированных перестроек (транслокаций), в которые вовлечены хромосомы 21, 18 и 13.

В настоящее время при массовом биохимическом скрининге с целью выявления хромосомных нарушений во II триместре беременности в группу риска попадает много женщин, вынашивающих здоровый плод. Так, после проведения скрининга маркеров сывороточных белков на сроке беременности 15-17 нед трисомия по 21-й хромосоме с помощью инвазивных методов подтверждается лишь примерно у 1 из 80 беременных. Это приводит к снижению доверия к результатам скрининга и, как следствие, к значительному количеству отказов от подтверждающей инвазивной диагностики в том числе среди пациентов, беременность которых заканчивается рождением больного ребенка. В частности, от инвазивной ПД отказываются около половины женщин, вынашивающих плод с трисомией по 21-й хромосоме, которые по результатам исследования сывороточных белков во II триместре были отнесены к группе высокого риска анеуплоидий.

В последние несколько лет в России все шире внедряется новый порядок пренатального обследования. Он базируется на результатах УЗИ и биохимических показателях в I триместре и на данных УЗИ для исключения поздно манифестирующих пороков развития во II триместре. Этот скрининг также основан на косвенных маркерах и имеет ограничение по чувствительности и специфичности, колебания биохимических показателей зависят как от хромосомного статуса плода, так и от гормонального статуса беременной женщины. В результате комбинированный скрининг I триместра (сочетание биохимических маркеров с данными УЗИ), даже при четком соблюдении сроков обследования, позволяет отнести в группу риска для последующего проведения инвазивной диагностики лишь около 80% беременностей плодами с трисомией по 21-й хромосоме.

Таким образом, имеется необходимость в разработке и внедрении в практическое здравоохранение более современных неинвазивных скрининговых методов, позволяющих выделять группу риска с более высокой точностью.

Наиболее перспективным в данном направлении является неинвазивный пренатальный метод скрининга анеуплоидий, основанный на анализе внеклеточной ДНК плода в крови матери (далее ДНК-скрининг, НИПД). Источником внеклеточной ДНК плода в кровотоке матери являются апоптотические клетки плодового происхождения. В большинстве случаев ДНК плода циркулирует в крови матери в количестве, достаточном для надежного анализа существующими в настоящее время методами, начиная с 10-11 нед беременности и не детектируется уже через сутки после родов. Это позволяет осуществлять ДНК-скрининг по крови матери, в том числе у повторно беременных женщин.

ДНК-скрининг по крови матери может проводиться с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования NGS. Высокопроизводительное секвенирование суммарной внеклеточной ДНК матери и плода с последующим статистическим биоинформационным анализом позволяет оценить количество фрагментов, приходящихся на каждую из хромосом, что дает возможность детектировать наличие или отсутствие анеуплоидий плода. Удельный вес хромосом в геноме человека составляет для 13-й хромосомы 3,8%, для 18-й хромосомы 2,6%, а для 21-й хромосомы 1,6%. К 12 нед беременности доля плодовой ДНК от общего количества свободно циркулирующей ДНК составляет 5-7%. Нетрудно рассчитать, что в случае трисомии плода по 21-й хромосоме можно ожидать увеличения общего количества свободно циркулирующей ДНК на 0,08%, что находится внутри статистической погрешности измерений, проведенных на больших (>4000) выборках беременных женщин (срок беременности 12 нед). Именно для того, чтобы разрешить проблему столь малых вариаций количества ДНК, используется метод полногеномного секвенирования с низкой плотностью. В результате высокопроизводительного секвенирования внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы крови матери, получают информацию о нуклеотидной последовательности 5-10 млн фрагментов. К примеру, при получении 6 млн фрагментов длиной 50 нуклеотидов среднее покрытие генома составляет 0,1х. В ряде зарубежных аналогов метода может применяться направленное секвенирование фрагментов генома, содержащих однонуклеотидные полиморфизмы. Каждый фрагмент анализируется на принадлежность к определенной хромосоме.

Данным образом устанавливается количество фрагментов внеклеточной ДНК (суммарно материнского и плодового происхождения), приходящееся на каждую из хромосом, что позволяет детектировать случаи анеуплоидий. Так, например, если доля ДНК плода равна 10% от суммарной внеклеточной ДНК, то при трисомии одной из хромосом будет наблюдаться увеличение общего количества фрагментов данной хромосомы на 5% по сравнению с нормой. В приведенном нами примере получения 6 млн ридов в случае нормы (46ХХ или 46XY) на 21-ю хромосому будет картироваться в идеальном случае 96 000 ридов, из которых 9600 ридов «происходят» из ДНК плода, а оставшиеся 86 400 ридов «происходят» из ДНК клеток матери. В случае трисомии по 21-й хромосоме мы увидим картирование 100 800 ридов при соотношении плод/мать? 14 400/86 400. Конечно же, секвенатор не может различать риды, «происходящие» от матери и плода, но при отнесении общего количества ридов на изучаемую хромосому к другим аутосомам возможна детекция изменения соотношения. Здесь же и проявляются определенные ограничения метода. К примеру, невозможно таким образом детектировать плод с кариотипом 69, поскольку соотнесение ридов любой изучаемой хромосомы к другим не будет давать количественного сдвига. Таким образом, необходимость значительного количества секвенированных фрагментов, помимо требований к высокой достоверности результатов анализа, обусловлена как небольшой долей ДНК плодового происхождения, так и малой долей каждой из хромосом в геноме.

Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови матери, в отличие от применяемых в настоящее время методов УЗИ и биохимического скрининга, является прямым методом исследования и может служить эффективным инструментом выявления хромосомных анеуплоидий плода у беременных женщин. По данным многочисленных исследований, метод обладает высокими диагностическими характеристиками и может применяться уже с 10-11 нед беременности, в том числе и у повторно беременных. Это позволяет рекомендовать применение ДНК-скрининга большинству беременных женщин для исключения анеуплоидий у плода.

Благоприятные результаты ДНК-скрининга позволяют с высокой вероятностью исключить анеуплоидии плода по исследуемым хромосомам в том числе при решении вопроса о пролонгировании беременности на ранних сроках у женщин с угрожающим и привычным выкидышем.

Внедрение ДНК-скрининга по крови матери как рутинного скрининга беременных может совершить прорыв в оказании помощи беременным женщинам, позволит снизить число проводимых инвазивных процедур, при этом существенно уменьшить частоту рождения детей с тяжелыми инвалидизирующими заболеваниями и перинатальную смертность.

Выше мы рассмотрели несколько случаев применения NGS в медицинской генетике. Большой проблемой внедрения NGS-технологий в отечественную медицинскую практику является отсутствие регистрационных документов Министерства здравоохранения РФ как на большинство зарубежных приборов (секвенаторов), так и на наборы реактивов, которые используются при проведении NGS-тестирования. Решение этой первоочередной задачи позволит медицинским центрам официально поставить NGS на службу пациента. Более того, необходимо создание общероссийских баз данных, которые бы объединили клинические показатели пациента (текущие и будущие) и его генетические данные. Интеграция медицинских историй сотен тысяч, а может, и миллионов пациентов, быть может, с использованием современной геномики и технологий big data станет важным направлением развития персонифицированной медицины в нашей стране.

Обозначим основные тенденции. Нам видится, что онкология и ПД станут самыми массовыми точками применения NGS в медицинской генетике в ближайшие два-три года. ПД - НИПД и ПГД (о которой мы не говорили в данной главе, но внимательный читатель сможет без труда найти информацию о методиках и показаниях к ПГД) могут стать скрининговыми методиками. Количество тестов НипД для группы риска в РФ, выявленной по результатам биохимического скрининга I и II триместров, оценивается в 100000 в год. Опыт западных стран, в первую очередь США, указывает на внедрение НИПД в качестве скрининговой процедуры для всех беременных женщин уже в среднесрочной перспективе. Применение NGS в онкологии имеет два вектора:

В случае создания отечественных баз данных соматических и герминальных мутаций, разумной цены и методической (лабораторной и биоинформационной) готовности лечебных учреждений к проведению таких тестов их количество можно оценить в 500000 в год.

В заключение стоит обратить внимание врачей-генетиков, что генетические тесты не могут быть оторваны от работы врача с пациентом, от внимательного анализа семейной истории. Генетическое тестирование, пусть даже такое совершенное, как проведенное с использованием технологии NGS, является не автоматической заменой консультации врага-генетика, а всего лишь мощным инструментом в его руках.

Наиболее важным направлением исследований в медицинской генетике является выяснение генетической основы наследственных болезней и болезней с наследственным предрасположением. Практическим следствием таких исследований является разработка методов профилактики и лечения заболеваний. В этой главе мы изложим феноменологию проявления генов моногенных наследственных заболеваний, то есть таких заболеваний, этиология которых обусловлена мутациями в отдельных генах. Установление типа наследования моногенных заболеваний подробно описано в основном тексте Национального руководства «Наследственные болезни», поэтому мы не будем останавливаться на этом предмете.

Моногенные наследственные болезни занимают особое место в патологии человека в силу лучшей изученности их природы по сравнению с другими типами наследственной патологии - хромосомной, или мультифакторной. Большинство из них встречается редко или даже очень редко, но суммарно, как следует из наших данных, основывающихся на широких генетико-эпидемиологических исследованиях, проведенных во многих популяциях европейской части России, распространенность моногенных наследственных болезней в российских популяциях может достигать 1% и более.

Предполагается, что в геноме человека содержится 22-23 тыс. генов. В настоящее время известна последовательность более 15 тыс. генов, соответственно, последовательность еще примерно 8000 генов пока не известна, но все понимают, что это дело времени, причем не очень продолжительного. На место традиционного метода выявления генов моногенных наследственных болезней с помощью доказательства их типа наследования и последующего генетического картирования, требовавшего большого по объему семейного материала, пришли новые производительные методы сиквенса генома, которые могут быть реализованы на очень небольшом семейном материале, что резко ускорило выявление «новых» генов менделирующих заболеваний. Этот подход реализует путь от гена к признаку в противоположность традиционному пути от признака к гену. При этом не требуется, чтобы признак был изменчивым по своим проявлениям.

До настоящего времени считается, что гены, мутации в которых приводят к развитию моногенных заболеваний, в большинстве случаев кодируют полипептидные цепи, или белки. ДНК таких генов составляет приблизительно 2% от ДНК всего генома. Эту часть генома называют экзомом, а сиквенс экзома является как раз тем подходом, который используется для выявления новых редких генов моногенных заболеваний, о чем сказано чуть выше в тексте.

Диагностика моногенных наследственных болезней, как, впрочем, и других типов наследственных болезней, начинается с их фенотипического описания, затем могут быть использованы биохимические методы диагностики для НБО или молекулярно-генетические методы, которые являются единственными методами этиологической диагностики этой группы наследственных болезней. Следует, однако, подчеркнуть, что фенотипическое описание продолжает оставаться не только важным приемом диагностики, но и основой для выяснения патогенеза моногенных наследственных заболеваний. Углубленное фенотипическое описание моногенных наследственных болезней получило свое развитие в международной программе Human Phenotype Ontology (http://human-phenotype-ontology.github.io/about.html), раздел которой, Phenomizer, может быть использован как подспорье в диагностике и дифференциальной диагностике моногенных наследственных болезней. В этом отношении интересна также серия статей, опубликованных преимущественно в 2009 году в 149 т. Am. J. Med. Genet. Part A, в которых под общим заголовком «Элементы морфологии» рассматривается рекомендуемая стандартная терминология для аномалий (пороков) развития различных частей тела, таких как нос и фильтр, губы, уши, руки и ноги и ряд других.

Моногенные наследственные болезни поражают все органы и системы органов человека, нередко поражение затрагивает одновременно различные органы и проявляется в виде синдрома.

Изменения (мутации) далеко не всех генов приводят к развитию моногенных наследственных болезней. Полная и постоянно обновляющаяся информация о генах, мутации в которых обусловливают развитие наследственных моногенных наследственных болезней, можно найти в таких базах данных, как Online Database of Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (http://www.biobase-international.com/product/hgmd). Анализ этих баз данных показывает, что из 13 тыс. расшифрованных генов человека мутации только примерно 1600 обусловливают возникновение различных моногенных заболеваний (в соответствующей статистике OMIM на конец ноября 2015 года было указано, что чуть больше 3000 генов отвечают за моногенные заболевания и нормальные признаки. Это составляет 12% от всех известных генов человека. Наши подсчеты показали, что в OMIM нормальные признаки и заболевания представлены примерно поровну). Предполагается, что процент генов, мутации в которых являются причиной моногенных заболеваний, вряд ли сильно изменится, когда будут найдены все гены человека. Одной из возможных причин этого феномена может быть дублирование функций многих генов, особенно так называемых генов «домашнего хозяйства», обеспечивающих поддержание структуры и функции всех клеток организма. Считается, что гены «домашнего хозяйства» составляют большую часть генов генома и они активны во всех клетках.

Еще одной причиной того, что мутации не во всех генах проявляются моногенными заболеваниями, может быть ранняя летальность носителей таких мутаций, не выявляемая обычными методами.

Гены по-разному проявляются в различных тканях и органах в соответствии с характером их дифференцировки, которую они в значительной мере и определяют. Хотя в каждой клетке организма содержится весь набор генов, в клетках с разными типами дифференцировки активны разные гены. Гены гемоглобинов, например, активно работают только в эритроцитах, и гемоглобины практически невозможно обнаружить в других тканях. Гены миелинов активны преимущественно в клетках периферических нервов, а гены кристаллинов активны в хрусталике. Таких примеров дифференциальной активности генов можно приводить очень много. В сущности, все наследственные болезни, проявляющиеся изолированным поражением отдельных органов, являются такими примерами. Однако есть гены, работающие не в одном органе или ткани, а во многих. В этих случаях гены кодируют белки, или особые интерферирующие РНК, выполняющие какие-либо общебиологические функции. Мутации в таких генах приводят к возникновению наследственных синдромов, причем спектр поражаемых органов и тканей определяется тем, где функция соответствующего гена является очень важной для нормального функционирования этих органов и тканей. Возьмем для примера аутосомно-рецессивный синдром атаксии-телеангиэктазии. Клинические проявления этого синдрома весьма разнообразны и включают низкий рост, телеангиэктазии на конъюнктиве глаз и на коже, бронхоэктазы, мозжечковую атаксию, гипогонадизм, гипоплазию тимуса и еще ряд симптомов, в частности склонность к малигнизации. Синдром обусловлен мутациями в гене АТМ, который картирован на хромосоме 11 в локусе 11q22.3 (OMIM 607585). Ген кодирует белок, который относится к семейству фосфатидилинозитол-3 киназ. Этот белок необходим для репарации повреждений ДНК, так как он фосфорилирует ключевые субстраты, участвующие в репарации ДНК и в контроле над протеканием клеточного цикла. С точки зрения функций белка гена АТМ ясны некоторые симптомы синдрома атаксии-телеангиэктазии, в частности поражение иммунной системы и склонность к малигнизации, так как в этих случаях репарация ДНК от повреждений является критически важным процессом. Вместе с тем другие клинические проявления синдрома, такие как мозжечковая атаксия, гипогонадизм или телеангиэктазии, в настоящее время трудно объяснить, но совершенно очевидно, что контроль над клеточным циклом, в котором участвует белок АТМ, очень важен для нормального формирования и функционирования соответствующих систем.

Еще одной особенностью действия генов, кроме места их действия, является время их действия в течение онтогенеза. Хотя большинство моногенных болезней проявляется достаточно рано в развитии (примерно 75-80%), известно значительное число таких болезней, которые манифестируют в юношеском, взрослом или даже в старческом возрасте. Примером последних является болезнь Альцгеймера, или старческое слабоумие, поздняя форма которой проявляется обычно после 65 лет. Некоторые гены бывают активны в нескольких фазах онтогенеза, в этом случае фенотипические эффекты таких генов могут быть совершенно различны в разных фазах.

К настоящему времени картирована, то есть установлена, локализация большого числа генов наследственных болезней, и для многих из этих генов охарактеризована их функция, то есть установлено, какие продукты они кодируют (число таких генов превышает 1500). В большинстве случаев это белки, играющие различные роли. Это и структурные белки, и рецепторы, и каналы, и транспортные белки, и ферменты и т.д. Распределение картированных генов по хромосомам человека неравномерное. Есть хромосомы, в которых локализовано большое число генов, например хромосомы 1, 2, 6, 11, или, напротив, относительно немного - 21, 18, Y. Положение картированных генов, в том числе генов моногенных заболеваний, во всех хромосомах человека можно найти в разных источниках, в том числе в OMIM.

Существует множество классификаций моногенных наследственных болезней, но основная базируется на типах менделевского наследования. Согласно этой классификации все моногенные наследственные болезни делятся на аутосомные доминантные и рецессивные, Х-сцепленные доминантные и рецессивные и Y-сцепленные заболевания. Некоторые авторы сюда же включают моногенные МБ. В каталоге наследственных признаков человека (OMIM) содержится описание более 5000 аутосомных заболеваний, доминантных и рецессивных примерно поровну, несколько сот Х-сцепленных заболеваний и относительно немного Y-сцепленных. Кроме того, известно более двух десятков моногенных митохондриальных заболеваний, обусловленных мутациями в генах митохондриальной ДНК.

Нередко наследственные болезни классифицируются по тому, поражение какого органа они обусловливают. На рис. 8-1 представлен пример такой классификации, построенной на основе анализа проявления 1658 генов, вызывающих преимущественно моногенные заболевания (76% в целом, гены доминантных заболеваний - 30%, рецессивных - 40%, гены, мутации в которых дают как доминантные, так и рецессивные заболевания, - 4%, гены Х-сцепленных заболеваний - 6%). Надо заметить, что это большая часть моногенных болезней, для которых на момент написания статьи был известен молекулярный дефект. Некоторые гены поражают больше чем один орган или ткань, но на рисунке эти болезни включены столько раз, сколько органов или тканей поражается. Все поражаемые системы организма представлены 17 категориями, из них две категории - нервная система и неонатальные заболевания - оказываются наиболее нагруженными наследственными болезнями. За ними по частоте следуют НБО и наследственные болезни, поражающие мышечную систему и скелет. Остальные органы и ткани страдают при наследственных заболеваниях примерно с одинаковой частотой (2-6%). То, что неонатально проявляющиеся наследственные болезни составляют значительную часть всей наследственной патологии, легко объясняется тем, что в раннем развитии любого организма необходима работа большей части генов генома человека. Понятно, что в этом случае значительно возрастают шансы, что мутации большого числа генов будут приводить к различным нарушениям онтогенеза. Известно несколько тысяч наследственных синдромов, проявляющихся, как правило, множественными пороками развития. Значительная часть этих синдромов наследуется моногенно. Высокая частота наследственных неврологических заболеваний также указывает на то, что в формировании и функционировании нервной системы принимают участие многие гены и их доля, вероятно, больше, чем доли генов, необходимых для дифференцировки и функционирования других органов.

Основой другой классификации моногенных наследственных болезней является то, какая из молекулярных функций нарушается в случае мутации в соответствующем гене. Число молекулярных функций у разных авторов варьирует, но в большинстве случаев к ним относят связывание с нуклеиновыми кислотами, ферментативные, транспортные, моторные, регуляцию транскрипции, сигнальную трансдукцию, структурную, связывание с лигандом, шаперонную, регуляцию активности ферментов и т.д. На рис. 8-2 (см. цв. вклейку) приведены результаты уже цитированного исследования, посвященного классификации генов человека. Для этого предварительно из разных источников была собрана информация о функции 12 221 гена человека, из которых 1430 генов, мутируя, обусловливают развитие заболевания. Следует отметить, что авторы цитируемого исследования используют χ2 и другие статистики для подтверждения надежности своих заключений. При сравнении этих двух групп генов выявляется, что моногенные заболевания возникают при мутациях генов всех функциональных классов. Однако представленность генов, вызывающих моногенные заболевания, в ряде случаев не совпадает с представленностью генов соответствующего функционального класса в общем пуле известных генов. Так, моногенные заболевания чаще встречаются при мутациях в генах ферментов, белков-транспортеров и структурных белков. В то же время гены белков, связывающихся с нуклеиновыми кислотами, среди тех, что вызывают наследственные болезни, оказываются недопредставленными.

Еще одной классификацией наследственных болезней является классификация, основанная на анализе того, какой биологический процесс нарушается при мутации в соответствующем гене. Как и в предыдущем случае, разные авторы по-разному классифицируют биологические процессы. Один из типов классификации включает следующие биологические процессы: транспорт, ответ на стресс, клеточный цикл, процессы развития, метаболизм, подвижность клеток, межклеточные сообщения, физиологические процессы, смерть. При такой классификации биологических процессов оказывается, что гены наследственных заболеваний чаще, чем ожидается, представлены в ответе на стресс и клеточной подвижности, а гены, продукты которых осуществляют коммуникацию между клетками, недопредставлены (рис. 8-3, см. цв. вклейку).

Следует оговориться, что результаты распределения наследственных болезней в рамках рассмотренных классификаций можно считать предварительными или условными. Они могут измениться по мере включения в анализ вновь изученных генов.

Чаще, чем ожидается, оказывается, что гены, продукты которых участвуют в выполнении таких молекулярных функций, как ферментативная и транспортная, наследуются аутосомно-рецессивно, а гены, участвующие в регуляции транскрипции, кодирующие структурные белки или белки сигнальной трансдукции, наследуются аутосомно-доминантно. Мутации в генах, участвующих в таких биологических процессах, как метаболизм и стресс, чаще приводят к рецессивным заболеваниям, а участвующих в контроле клеточного цикла, процессах развития или клеточной коммуникации - обусловливают доминантные заболевания.

Моногенные наследственные болезни обычно вызываются мутацией в гене, затрагивающей относительно небольшие отрезки ДНК. Наиболее частыми являются точковые мутации.

Точковые мутации затрагивают один нуклеотид, и если при этом пуриновое основание остается пуриновым, а пиримидиновое - пиримидиновым, то такие замещения называются транзициями, в противном случае замещения называются трансверсиями. В зависимости от того, как точковые мутации изменяют белковый продукт гена, их классифицируют на молчащие, миссенс, нонсенс, регуляторные и мутации, нарушающие процессинг РНК. Молчащие мутации обязаны вырожденности генетического кода. Например, валин кодируется следующими кодонами: GUU, GUA, GUC и GUG, и поэтому любое замещение третьего нуклеотида будет молчащей заменой. Миссенс-мутации обусловливают замещение одной аминокислоты на другую. Эти замещения могут приводить к изменению функции белка, и в этом случае можно ожидать развития патологии, а могут и не приводить к таким последствиям. Миссенс-мутации являются самыми частыми из точковых мутаций. Нонсенс-мутации приводят к возникновению стоп-кодона (UAA, UAG и UGA) в необычном месте гена, что обусловливает преждевременное прекращение трансляции. Обычно такая мРНК оказывается нестабильной и подвергается разрушению до начала трансляции. Регуляторные мутации обычно возникают в промоторе и других регулирующих активность гена элементах, таких как энхансеры, сайленсеры, или локус-контролирующих областях. Обычно мутации такого сорта приводят к снижению продукции мРНК, но в некоторых случаях, напротив, увеличивают уровень транскрипции (примером является регуляторная мутация при наследственной персистенции фетального гемоглобина). Мутации, нарушающие процессинг мРНК, либо изменяют сайт сплайсинга мРНК, либо нарушают 5'-кеппирование или 3'-полиаденилирование. Мутации сайта сплайсинга являются достаточно частой причиной наследственной патологии (например, мутация сайта сплайсинга в гене TCIRG1 при рецессивном летальном остеопетрозе, изученном нами в Чувашии).

Мутации, приводящие к развитию моногенного заболевания, могут быть классифицированы как мутации, ведущие к потере функции, и мутации, ведущие к приобретению функции. Первый тип мутаций характерен для рецессивных заболеваний. В норме продукты рецессивных генов синтезируются избыточно. Для многих НБО, которые наследуются рецессивно, типичной оказывается ситуация, когда сохранение активности мутантного фермента на уровне 10%, а иногда и ниже по сравнению с нормой оказывается достаточным, чтобы патологический фенотип был выражен слабо или даже не проявлялся. В то же время если доминантное заболевание обусловлено мутацией, приводящей к потере функции, то это означает, что одной дозы гена и, следовательно, половины продукта этого гена явно недостаточно для его нормального функционирования. Этот феномен называется гаплонедостаточностью.

Мутации, ведущие к приобретению функции, проявляются либо повышенной продукцией белка, кодируемого соответствующим геном, либо даже изменением качества этого белка. Такие мутации встречаются значительно реже, чем мутации, приводящие к потере функции. Наиболее яркими примерами мутаций, ведущих к приобретению функций, являются мутации в гене гентингтина, вызывающие хорею Гентингтона. В этом случае образуется избыточное количество белка, который формирует агрегаты в клетках, обладающие нейротоксическим эффектом. При ахондроплазии приобретение функции связано с тем, что возрастает активность рецептора фактора роста фибробластов (мутация в гене FGFR3, OMIM 134934), что ведет в конечном счете к торможению роста костей. Что касается появления белка с новыми качествами, то примером этого являются некоторые мутации в генах соматических клеток, которые приводят к образованию так называемых химерных генов, образующих новый белок, что наблюдается при некоторых формах рака.

Многие белки функционируют как димеры или даже мультимеры, и такие функциональные единицы могут быть продуктом не одного, а двух генов и более. В этом случае мутация одного гена может приводить к нарушению функционирования димера или мультимера и, таким образом, проявляется доминантно-негативный эффект, то есть нарушение функции одного гена мешает проявлению других генов. Многие структурные белки, транскрипционные факторы, сигнальные белки и белки, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами, функционируют в составе мультимерных структур, поэтому они наиболее чувствительны к доминантно-негативному эффекту. Может быть, наиболее показателен в этом отношении коллаген, образующий мультимерную структуру. Мутации в генах разных цепей коллагена обнаруживают четкий доминантно-негативный эффект, который выявляется при таких наследственных болезнях, как доминантные формы синдрома Элерса-Данлоса (EDS), при которых наблюдается поражение разных производных соединительной ткани, доминантные формы несовершенного остеогенеза, при котором нарушается костеобразование, и многих других наследственных болезнях.

На примере коллагенопатий, к числу которых относится синдром Элерса-Данлоса, будет рассмотрен такой феномен, как локусная генетическая гетерогенность наследственных болезней. Под локусной генетической гетерогенностью понимают феномен, когда сходные фенотипы являются результатом проявления разных генов, кодирующих сходные по своей функции белки. Локусная генетическая гетерогенность является естественным инструментом изучения генетической регуляции элементарных морфологических и физиологических (в широком смысле этого понятия) признаков. Локусная генетическая гетерогенность обнаруживает отдельные геноконтролируемые звенья в цепи становления таких признаков и позволяет установить их порядок. Именно такой подход был использован Бидлом и Тэтумом при создании биохимической генетики на Neurospora crassa в 40-50-х годах XX столетия.

Коллаген, основной белок соединительной ткани, представляет собой фибриллярный белок, основная форма которого, так называемый тропоколлаген, представляет собой самособирающуюся спираль, образованную тремя α-цепями (в настоящее время описано более 25 вариантов этой цепи). Известно более 19 форм, или типов, коллагена, отличающихся по первичной структуре полипептидных цепей, функциям и локализации. Наиболее распространенными являются первые три типа коллагена, составляющие до 95% всего коллагена организма. Типы коллагена принято обозначать римскими цифрами: I, II, III, IV и т.д. Гены коллагенов записываются арабскими цифрами, например COL1 - ген коллагена I типа; к этому символу приписывается буква А (обозначает α-цепь) и арабская цифра (обозначает вид α-цепи), например COL1A1 и COL1A2 - альфа-1- и альфа-2-цепи коллагена I типа).

Хотя гены коллагенов всех типов имеются в каждой клетке всех тканей и органов, коллагены разных типов по-разному представлены в разных тканях, что отражает в них дифференциальную активность разных генов коллагена. Это означает, что в одних тканях более активны одни гены коллагенов, а в других - другие. Так, коллаген I типа (гены COL1A1 и COL1A2 - OMIM 120150, 120160) наиболее представлен в коже, сухожилиях, кости, роговице, плаценте, артериях, печени и дентине; коллаген II типа (ген COL2A1 - OMIM 120140) - в хряще, межпозвоночных дисках, стекловидном теле и роговице; коллаген III типа (ген COL3A1 - OMIM 120180) - в артериях, матке, коже плода и строме паренхиматозных органов; коллаген IV типа (гены COL4A1-COL4A6 - OMIM 120130, 120190, 120070, 303361, 120131) - в базальных мембранах; коллаген V типа (гены COL5A1-COL5A3 - OMIM 120215, 120216, 120190) - в коже, роговице, кости, хрящах, межпозвоночных дисках и плаценте; коллаген VI типа (гены COL6A1-COL6A3 - OMIM 120220, 120240, 120250) - в хрящах, кровеносных сосудах, связках, коже, матке, легких и почках и т.д. Такая разная представленность разных форм коллагена в тканях и, соответственно, разная активность генов коллагена во многом объясняет разнообразие клинических форм синдрома Элерса-Данлоса и причину генетической гетерогенности этого синдрома. По классификации Villefranche выделяют 6 основных типов синдрома: классический (EDS I и EDS II, OMIM 130000), гипермобильный (EDS III, OMIM 130020), сосудистый тип (EDS IV, OMIM 130050), кифосколиотический тип (EDS VI, OMIM 225400), артрохолазический тип (EDS VIIA и VIIB, OMIM 130060) и тип dermatospraxis (EDS VIIC, OMIM 225410).

При EDS I наиболее заметны изменения кожи и гипермобильность суставов - как крупных, так и мелких, нередко наблюдаются скелетные деформации и другие ортопедические изменения. В 50% случаев наблюдаются преждевременные роды. Разрывы аорты или кишечника редки. Для EDS II характерны те же признаки, что и для EDS I, но выраженные в меньшей степени.

Генетический анализ EDS I показал, что эта клиническая форма является генетически гетерогенной. Установлено, что EDS I может быть обусловлен мутациями в гене COL5A1, картированном на хромосоме 9q34, или в гене COL5A2, картированном на хромосоме 2q31. Вероятно, что мутации в других генах также могут обусловить проявления EDS I. Напомним, что коллаген V типа наиболее представлен в коже, роговице, кости, хрящах, межпозвоночных дисках и плаценте, поэтому мутации в генах коллагена V типа объясняют основные клинические проявления EDS I.

Синдром EDS II обусловлен мутациями в тех же генах, что и при EDS I. Возможно, что более легкие клинические проявления при EDS II обусловлены вторым типом генетической гетерогенности, так называемой аллельной гетерогенностью, когда разные мутации в одном и том же гене могут обусловить разные клинические проявления заболевания или даже возникновение клинически иного заболевания. Об этом типе генетической гетерогенности еще будет сказано далее.

EDS IV называют сосудистым типом из-за нередко возникающих разрывов крупных артерий и кишечника. В то же время поражения кожи суставов при этом типе синдрома менее выражены. В частности, гипермобильность может наблюдаться только для межфаланговых суставов. Кожа хотя и не так растяжима, как при EDS I и II, но очень ранима, и при заживлении образуются типичные «папиросные» рубцы. Причиной EDS IV, как правило, являются мутации в гене COL3A1, который обнаруживает высокую активность в артериях, матке, коже плода и строме паренхиматозных органов. То есть в этом случае, как и при EDS I и II, поражается та ткань или орган, где мутантный ген обнаруживает высокую активность.

Выделяют две формы синдрома Элерса-Данлоса VII типа - А и В. Клинически эти формы плохо различимы, и основная симптоматика касается суставов. У больных с этим типом синдрома часто наблюдается двусторонний врожденный вывих бедра, подвывихи в других крупных суставах. В то же время изменения кожи выражены незначительно. Причиной этих двух форм синдрома являются мутации в генах COL1A1 и COL1A2 соответственно. Мутации, вызывающие этот синдром, изменяют в альфа-1- и альфа-2-цепях коллагена I типа сайт, который расщепляется протеазой. В результате тип I проколлагена не может превратиться в коллаген. Наиболее драматичным эффектом действия этих двух мутантных генов являются изменения в хрящевых поверхностях суставов, но спектр клинических проявлений синдрома значительно шире и может включать паховую грыжу, умеренную гиперрастяжимость кожи, скелетные изменения, в частности сколиоз и деформацию грудной клетки, низкий рост, и другие симптомы.

Продолжим обсуждение проблемы локусной генетической гетерогенности на примере несовершенного остеогенеза, ряд форм которого, как и при синдроме Элерса-Данлоса, связаны с мутациями в генах коллагена.

Несовершенный остеогенез I типа наследуется аутосомно-доминантно. Рост больных страдает незначительно, у взрослых возникает тугоухость, либо нейросенсорная, либо проводящая, наблюдается пролапс митрального клапана, переломы длинных трубчатых костей впервые возникают, когда ребенок начинает ходить, число их варьирует, после наступления половой зрелости частота переломов уменьшается, но затем вновь возрастает у пожилых, кожа тонкая, легкоранимая, склеры голубые. Мутации обнаруживаются обычно в гене альфа-1-цепи коллагена I типа (COL1A1).

Несовершенный остеогенез типа IIa также наследуется аутосомно-доминантно. Клинические проявления этого типа несовершенного остеогенеза значительно более тяжелые, чем I типа: дети рождаются с низким весом, наблюдается водянка плода, рост резко снижен, наблюдаются многочисленные врожденные переломы, сердечная и легочная недостаточность, склеры голубые, кожа тонкая, ранимая, нос клювовидный. Обычно дети с этим синдромом погибают до года. В то же время несовершенный остеогенез типа IIa может быть обусловлен мутациями в гене альфа-1-цепи коллагена I типа (COL1A1), то есть как и несовершенный остеогенез I типа. Правда, при несовершенном остеогенезе типа IIa нередко мутации находят в гене альфа-2-цепи коллагена I типа.

Несовершенный остеогенез III типа может наследоваться как аутосомно-доминантно, так и аутосомно-рецессивно. Карликовость, как и множественные переломы длинных трубчатых костей, обнаруживается при рождении, лицо у больных имеет треугольную форму, лоб нависает, заметна микрогнатия. У больных наблюдается несовершенный дентиногенез - как молочных, так и постоянных зубов, развивается тугоухость. Характерно базилярное вдавление. При этой клинической форме мутации наблюдаются в тех же генах, что и при несовершенном остеогенезе типа IIa, то есть в генах COL1A1 и COL1A2.

Несовершенный остеогенез IV типа наследуется аутосомно-доминантно. По клиническим проявлениям это более легкая форма, чем предыдущая: рост больных ниже 5 перцентилей, нередко развивается отосклероз и наблюдается тугоухость, число переломов варьирует, хотя они могут возникать и внутриутробно, после наступления половой зрелости их частота снижается, голубые склеры наблюдаются редко. Несовершенный дентиногенез также характерен не для всех больных. Мутации обнаруживаются в генах COL1A1 и COL1A2.

Итак, с генетической точки зрения все клинические формы несовершенного остеогенеза можно расценивать как одну нозологическую форму, поскольку их причиной являются одни и те же мутантные гены. Ситуация с этими генами коллагена ( COL1A1 и COL1A2) в действительности выглядит еще более сложной, если обратить внимание на то, что две формы синдрома Элерса-Данлоса VII типа - А и В - также обусловлены мутациями в генах COL1A1 и COL1A2. Природа генетической гетерогенности несовершенного остеогенеза отлична от той, что продемонстрирована для синдрома Элерса-Данлоса. При несовершенном остеогенезе разные мутации в одних и тех же генах дают разные клинические фенотипы. Такой тип генетической гетерогенности называется аллельной генетической гетерогенностью, и мы еще вернемся к нему далее.

Рассмотрим еще несколько состояний, которые можно отнести к наследственным коллагенопатиям. Это позволит нам еще раз подтвердить положение о том, что патология проявляется в тех органах и тканях, где соответствующие гены проявляют высокую активность. Различают несколько форм синдрома Альпорта, прежде всего по типу наследования. Наиболее частой является Х-сцепленная рецессивная форма, следующая за ней по частоте аутосомно-доминантная и наиболее редкая рецессивная форма синдрома. Для Х-сцепленной формы, кроме проявлений наследственного нефрита (микроскопическая гематурия, протеинурия, цилиндрурия, лейкоцитурия), характерны также нейросенсорная тугоухость, иногда поражение глаз (лентиконус, сферофакия, врожденная катаракта), тромбоцитопения и аномалия Мея Хеглина, ихтиоз, гипопаратиреоз, диффузный лейомиоматоз. Заболевание обусловлено мутациями в гене альфа-5-цепи коллагена IV типа (COL4A5). Гены этого типа коллагена проявляются в базальной мембране почечных канальцев, и с этой точки зрения другие плейотропные (множественные) эффекты мутантного гена не вполне понятны, в частности поражение органа слуха и глаз, а также ихтиоз.

Сейчас мы использовали впервые термин «плейотропные эффекты гена». Следует напомнить, что различают два типа плейотропных эффектов гена. Один из них называется первичной плейотропией и обусловлен тем, что ген независимо действует в разных тканях, но так как в клетках этих тканей наборы активных генов могут быть разными, то и проявления исследуемого гена также могут быть разными, потому что его продукты взаимодействуют с продуктами разных генов. Вторичная плейотропия объясняется патологическим процессом, который инициируется мутантным геном и представляет собой цепь взаимосвязанных патофизиологических событий. Плейотропия является, таким образом, одной из фундаментальных особенностей действия генов. Рассмотренные ранее коллагенопатии, такие как синдром Элерса-Данлоса и несовершенный остеогенез, демонстрируют практически для каждой отдельной нозологической формы плейотропные проявления действия мутантных генов. В большинстве случаев плейотропное действие генов при этих двух наследственных заболеваниях может быть отнесено к первичной плейотропии, связанной с независимым проявлением генов в разных тканях, но деформации скелета, как и сами переломы длинных трубчатых костей и даже тугоухость, можно рассматривать как проявление вторичной плейотропии.

Сходным образом в случае синдрома Альпорта поражение почек является первичным событием, а развивающаяся гематурия, протеинурия, гипертония и некоторые другие симптомы - проявлением вторичной плейотропии.

Для доминантной формы синдрома Альпорта также характерен нефрит, нефротический синдром, проявляющийся гематурией, гипофосфатемией, нефрокальцинозом, протеинурией и азотемией и, как при Х-сцепленной форме, поражением органа слуха (нейросенсорная тугоухость) и глаз (лентиконус, передняя полярная катаракта, миопия). Доминантная форма синдрома обусловлена мутациями в гене альфа-3-цепей коллагена IV типа. То, что в обеих формах синдрома, кроме почек, поражается и глаз и ухо, однозначно свидетельствует об участии коллагена IV типа в поддержании структур этих органов. Рецессивная форма синдрома Альпорта также проявляется нефритом, симптомом которого является гематурия. Кроме того, у больных с этой формой наблюдается тугоухость. Рецессивный синдром Альпорта обусловлен гомозиготностью или компаунд-гетерозиготностью (напоминаем, что это означает, что родители больного несут разные мутации в одном гене) по мутациям в генах альфа-3 или альфа-4 коллагена IV типа. Оба гена расположены в хромосоме 2q.

Еще одна форма наследственных коллагенопатий - это синдром Стиклера. Стиклер описал этот синдром, практикуя в клинике Мейо, на основе анализа большой родословной как аутосомно-доминантное состояние, включающее прогрессирующую миопию, которая начинается на первом десятилетии жизни и часто ведет к отслойке сетчатки и слепоте. У больных обнаруживаются также преждевременные дегенеративные изменения в суставах и ряд других клинических признаков, в частности марфаноподобный внешний вид, нейросенсорная тугоухость, лицевые аномалии, расщелина нёба; скелетные аномалии в целом можно характеризовать как умеренную спондилоэпифизарную дисплазию. Синдром Стиклера I типа обусловлен мутациями в альфа-1-цепи коллагена II типа (COLIIA1). Во многих отношениях сходная клиническая картина найдена при синдроме Стиклера II типа, при котором мутации найдены в гене альфа-1-цепи коллагена XI типа (COLXIA1).

Мутации в этом же гене являются также причиной синдрома Маршалла, которой по ряду признаков сходен с синдромом Стиклера, в частности по гипоплазии средней части лица, миопии, нейросенсорной тугоухости, но по ряду признаков четко выделяется в самостоятельный синдром: это низкий рост, утолщение костей черепа, отсутствие фронтальных синусов, короткий нос, толстые губы, ряд скелетных деформаций. Синдром Стиклера III типа отличается от двух предыдущих форм синдрома отсутствием глазной симптоматики. Он обусловлен мутациями в гене альфа-2-полипептидной цепи коллагена XI типа (COLXIA2).

Проблема плейотропного действия генов чрезвычайно важна для понимания патогенеза такой обширной группы моногенных заболеваний, как синдромы множественных ВПР. В существующих базах данных, таких как POSSUM (Австралия), СИНГЕН (Белоруссия), London Dysmorphology Data Base (Англия), или таком руководстве, как Наследственные синдромы по Дэвиду Смиту или Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование С.И. Козловой и Н.С. Демиковой, содержатся сведения о многих сотнях таких синдромов. Их диагностика и понимание патогенеза не могут быть полноценными без знания, какую роль играет первичная и вторичная плейотропия в клинических проявлениях синдромов множественных ВПР.

Мы уже коснулись проблемы аллельной генетической гетерогенности, при которой мутации в одном гене могут приводить к проявлению настолько разных фенотипов, что они клинически выделяются в отдельные нозологические формы с характерной для них клиникой (синдром Элерса-Данлоса VII типа и несовершенный остеогенез, различные формы несовершенного остеогенеза).

Может быть, одним из самых ярких примеров аллельной генетической гетерогенности являются наследственные ламинопатии. Ламины представляют собой структурные белки, которые являются компонентами ядерной ламины, представляющей собой белковую сеть, которая выстилает внутреннюю оболочку ядра клетки. Эта оболочка определяет форму ядра и его размеры. Ламины относятся к классу промежуточных филаментов.

В клетках млекопитающих описаны три типа ламинов - А, В и С. Ген ламинов А/С (LMNA) картирован на хромосоме 1 (1q21.2). Его кодирующая часть занимает 24 т.п.н. и состоит из 12 экзонов. Альтернативный сплайсинг в 10-м экзоне обусловливает образование двух типов мРНК, которые кодируют преламин А и ламин С. Ламины играют важную роль в поддержании взимодействия межу ядром и цитоскелетом клетки и, по-видимому, во многих других клеточных процессах, включая дифференцировку. Мутации в гене ламина А/С обусловливают возникновение разнообразной наследственной патологии (установлено, что они являются причиной по крайней мере 10 наследственных синдромов). Наследственные болезни, обусловленные мутациями в гене ламина А/С, могут быть классифицированы на 4 основных типа: болезни поперечно-полосатой мускулатуры и сердечной мышцы, синдромы липодистрофий, периферические нейропатии и синдромы преждевременного старения. К первой группе относятся мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса, поясно-конечностная мышечная дистрофия типа 1В, врожденная мышечная дистрофия, дилятационная кардиомиопатия и синдромы наследственных дефектов сердечной проводимости. Синдром липодистрофии включает частичную липодистрофию 2-го типа, при которой наблюдается региональная липодистрофия с прогрессирующей дегенерацией адипоцитов, резистентность к инсулину и СД, признаки мышечной дистрофии. Мутации в гене ламина А/С в некоторых случаях обусловливают невральную амиотрофию (болезнь Шарко-Мари-Тус, тип 2В1). Синдромы преждевременного старения, обусловленные мутациями в гене ламина А/С, прежде всего представлены аутосомно-доминантным синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда, который рано проявляется в развитии гипоплазией средней части лица, постнатальной задержкой роста, отсутствием подкожного жирового слоя, ранней ишемической болезнью сердца, инфарктами миокарда и некоторыми другими признаками. Нередко мутации в этом гене находят и при синдроме Вернера, еще одном из синдромов прогерии, и при других прогероидных синдромах. Мутации в гене ламина приводят также к возникновению рестриктивной дерматопатии, рецессивного летального синдрома, проявляющегося внутриутробной задержкой роста, пороками сердца, гипоплазией легких, кифосколиозом, контрактурами суставов, ригидной кожей и ее эрозиями, гипоплазией надпочечников, особенным лицом и рядом других клинических симптомов. Корреляционный анализ показал, что существует заметная связь между фенотипом и тем, в каком месте гена произошла мутация. Иными словами, если ген работает во многих тканях, то разные домены белка, который он кодирует, имеют в этих тканях разную функциональную значимость. Кроме того, как мы уже указывали, даже если ген кодирует только один продукт, то в разных тканях он взаимодействует с продуктами разных генов и вследствие этого конечные фенотипические признаки, зависящие от этого гена, в разных тканях могут быть совершенно различными. Это заключение имеет отношение к объяснению природы аллельной генетической гетерогенности в целом.

Рассмотренные нами наследственные болезни представляют собой замечательный пример особенностей проявления генов, кодирующих структурные белки, которые заключаются в том, что гены характеризуются определенным местом своего действия. Что касается времени действия гена, то это важная характеристика действия мутантного гена, которая учитывается в медико-генетическом консультировании при расчете риска повторного возникновения или проявления возрастзависимого заболевания.

Проявление мутантных генов описывается также такими феноменами, как пенетрантность и экспрессивность. Оба термина были предложены Н.В. Тимофеевым-Ресовским в 1925 году. Первый из этих феноменов означает долю особей, носителей соответствующего мутантного гена, у которых эти гены проявляются. Эта доля может варьировать от 100%, когда ген проявляется у всех носителей, до значений, близких к 0, когда, несмотря на носительство, проявлений гена не обнаруживается. В случае низкой пенетрантности того или иного гена возникает естественный вопрос о том, насколько велика роль этого гена в проявлении наследственного заболевания, - фундаментальный вопрос в генетике сложно наследуемых заболеваний. Неполная пенетрантность особенно типична для доминантных заболеваний. В родословной неполная пенетрантность проявляется так называемым пропуском поколения.

Примером генов с неполной пенетрантностью является ген BRCA1, мутации в котором обусловливают возникновение рака молочной железы и яичников. Установлено, что пенетрантность этого гена составляет около 80%, то есть риск заболеть для носителей мутантного гена в течение жизни составляет около 80%. Пенетрантность, как и возраст проявления заболевания, учитывается при расчете повторного риска в медико-генетическом консультировании.

Экспрессивность мутантных генов означает разную степень проявления генов, что с медицинской точки зрения означает более тяжелое или более легкое течение наследственного заболевания. Варьирующая экспрессивность характерна для многих, если не всех наследственных болезней, но наиболее отчетливо она проявляется для доминантных заболеваний.

Еще один феномен, требующий освещения в этой главе, - это феномен антиципации. Под антиципацией понимают более раннее и/или тяжелое проявление симптомов наследственного заболевания у детей по сравнению с больным родителем. Хотя существование антиципации предполагалось в генетике достаточно давно, но многие известные генетики человека считали, что это статистический артефакт, обусловленный особенностями сбора семей для анализа. Только относительно недавно был найден и проанализирован генетический механизм антиципации. Оказалось, что антиципация наблюдается достаточно часто при наследственных заболеваниях, обусловленных особым новым типом мутаций, связанных с так называемым расширением зоны тринуклеотидных повторов. Этот тип мутаций называют еще динамическими мутациями. Тринуклеотидные повторы встречаются в генах нередко. Они найдены в экзонах, интронах, в 5'- и 3'-нетранслируемых областях генов. Как следует из названия, тринуклеотидные повторы представляют собой повторяющиеся последовательности из трех нуклеотидов (например, CGG). Во многих случаях эти повторы не имеют каких-либо специфических проявлений, то есть бессимптомны. Однако в некоторых генах эти повторы во время мейоза могут расширяться, то есть число повторов увеличивается, что приводит к появлению наследственного заболевания. При этом число тринуклеотидных повторов должно превысить некий численный порог, разный для разных генов и, соответственно, заболеваний. Так, в гене миотонической дистрофии в норме содержится от 5 до 30 CTG повторов в 3'-нетранслируемой области гена DMPK (OMIM 605377). Если число повторов увеличивается до 50, могут появиться отдельные симптомы заболевания. При числе повторов, превышающем 100, миотоническая дистрофия начинает проявляться раньше, но все же у взрослых. При числе повторов 400 и больше заболевание начинает проявляться в детстве. Механизм, обусловливающий увеличение числа повторов в мейозе, остается неясным. В настоящее время феномен антиципации - хорошо установленный факт для целого ряда неврологических заболеваний, таких как хорея Гентингтона, миотоническая дистрофия, некоторые формы спиноцеребеллярных атаксий (СЦА) (все наследуются аутосомно-доминантно), синдром ломкой Х-хромосомы (наследуется Х-сцепленно), атаксия Фридрейха (наследуется аутосомно-рецессивно). Если тринуклеотидные повторы располагаются в части гена, кодирующей белок, то в результате их расширения образуется мутантный белок с приобретенной функцией. Это характерно, например, для хореи Гентингтона, когда расширение зоны тринуклеотидных повторов CAG приводит к удлинению полиглутаминового тракта в белке, который называют гентингтином, о чем уже упоминалось в этой главе. Если повтор присутствует в нетранслируемой области гена, то его расширение может повлиять на экспрессию гена, как это происходит при синдроме ломкой Х-хромосомы. Кроме тринуклеотидных повторов, расширение которых ведет к наследственной патологии, известны также наследственные болезни, обусловленные расширением зоны тетрануклеотидных повторов (CCTG при миотонической дистрофии 2-го типа) и пентануклеотидных повторов (АТТСТ при СЦА 10-го типа).

Проявление генов структурных белков обычно наблюдается в тех тканях и органах, где они активны. Мы отмечали это раньше. Однако это нехарактерно для генов НБО. Обмен веществ у человека представляет собой строго скоординированное взаимодействие большого числа метаболических путей. Мы различаем обмен углеводов, липидов, аминокислот, мукополисахаридов и т.д., которые состоят из цепей последовательных реакций превращения определенного субстрата, где каждая реакция осуществляется специальным ферментом. В метаболизме играют важную роль внутриклеточные органеллы, такие, например, как митохондрии, лизосомы или пероксисомы, белки, обеспечивающие транспорт внутри клеток, рецепторы, расположенные на поверхности клеток, и другие белки. НБО насчитывают сотни нозологических единиц, что в определенной степени отражает сложность генетического контроля метаболизма. Как уже отмечалось, большинство наследственных болезней обмена наследуется аутосомно-рецессивно, либо Х-сцепленно рецессивно, а мутации в генах, которые их обусловливают, относятся к мутациям, приводящим к утрате функции. При наследственных дефектах ферментов, многие из которых синтезируются в клетках печени, иногда невозможно предсказать, какая ткань или орган будут поражены. В качестве примера можно привести ФКУ, при которой в большей степени, чем остальные органы, страдает мозг и нервная система; до сих пор обсуждается вопрос, является ли причиной этого накопление в крови ФА и промежуточных продуктов его метаболизма. Сходным образом трудно объяснить симптомы такого наследственного заболевания, как «болезнь, при которой моча имеет запах кленового сиропа». Это рецессивное заболевание связано с дефектом мультимерного ферментативного комплекса, известного как декарбоксилаза альфа-кетокислот с разветвленной цепью. Комплекс кодируется по крайней мере четырьмя генами и участвует в метаболизме таких аминокислот, как валин, лейцин и изолейцин. В случае мутации в любом из генов в крови и моче повышается уровень этих аминокислот и моча начинает пахнуть кленовым сиропом.

У младенцев с этим заболеванием наблюдается дегидратация, анорексия и апатия, затем развиваются судороги и спастика. В отсутствие лечения нарастает коматозное состояние и наступает смерть. При НБО, когда возникает ферментативный блок на пути превращения того или иного субстрата, патогенетически значимыми оказываются накапливающиеся метаболиты и продукты их альтернативных превращений. Именно поэтому трудно предсказать, для каких тканей и органов эти накапливающиеся метаболиты будут токсическими, но чаще всего ими поражается головной мозг и нервная система.

В настоящей главе мы постарались осветить общие проблемы, касающиеся моногенных наследственных болезней, феноменологию проявления мутантных генов, вызывающих эти заболевания. Хотя мы приводили примеры ряда наследственных болезней, коротко описывая их клинику и возможный молекулярный патогенез, но главным было дать представление читателям о том, что характеризует действие мутантных генов, обусловливающих формирование вместе с другими генами, а также факторами окружающей и внутренней среды сложной картины клинического проявления моногенных наследственных болезней.

Поскольку ДЦМ находится под двойным генетическим контролем (часть белков, необходимых для ее работы, кодируется генами митохондриальной ДНК (мтДНК), часть - ядерными генами), для болезней из этой группы описаны разные типы наследования, в том числе и особый - митохондриальный, или цитоплазматический. При половом размножении митохондрии, как правило, наследуются исключительно по материнской линии. Яйцеклетка человека содержит сотни, в то время как сперматозоид только одну спирально закрученную митохондрию у основания жгутика. При оплодотворении митохондрия сперматозоида не попадает в яйцеклетку, и плод наследует исключительно материнскую мтДНК. Поэтому все заболевания, связанные с мутациями в мтДНК, передаются от матери детям, поражаются лица любого пола; больные отцы не передают болезнь своим детям.

Каждая соматическая клетка содержит от сотен до тысяч копий мтДНК. Количество мтДНК в клетке зависит от вида ткани и типа клетки, от уровня их метаболизма и потребности в энергии. В нормальных тканях все копии мтДНК одинаковы (гомоплазмия). Мутации мтДНК обычно поражают некоторые, но не все копии мтДНК в клетке или ткани, создавая смесь нормальных и мутантных копий мтДНК (гетероплазмия). В процессе клеточного деления молекулы мтДНК случайным образом распределяются по дочерним клеткам, поэтому возможна сегрегация как в пользу мутантных, так и нормальных мтДНК. Этот феномен, называемый митотической сегрегацией, объясняет, почему у некоторых пациентов с митохондриальными заболеваниями с возрастом меняется клинический фенотип - может наблюдаться как ухудшение состояния пациента, так и улучшение некоторых клинических симптомов.

Установлено, что мутации мтДНК не представляют опасности, пока пропорция мутантных молекул не достигнет определенного уровня (пороговый эффект). Этот порог различен для разных тканей организма и для разных мутаций.

Уровень гетероплазмии в клетках одной ткани может изменяться на протяжении всей жизни человека. Примечательно, что в постмитотических тканях (например, мышцы) митохондрии с поврежденной ДНК могут реплицироваться быстрее и получать репликативное преимущество, а в быстро делящихся клетках (например, кровь) процент мутантой мтДНК будет значительно ниже. В диагностике МБ именно мышечная ткань является предпочтительным объектом исследования. Клинический фенотип заболеваний (в частности, заболеваний, обусловленных точковыми мутациями) зависит от соотношения нормальных и мутантных копий мтДНК в различных тканях. Например, процентное содержание мутации m.8344A > G при синдроме MERRF коррелирует со степенью выраженности мозжечковой симптоматики.

В основу современной классификация митохондриальных заболеваний положен молекулярно-генетический принцип. МБ делят на три большие группы.

Поскольку особенности клиники МБ довольно подробно описаны во многих учебных пособиях и национальных руководствах по педиатрии и неврологии, остановимся только на общей клинической характеристике этих заболеваний.

Клинические проявления этой группы болезней исключительно разнообразны. МБ могут дебютировать в любом возрасте - от первых дней жизни до глубокой старости и проявляться патологией практически любой системы органов. Выделяют несколько синдромов, которые характеризуются определенными сочетаниями клинических признаков. Это синдромы LHON (аторофия зрительных нервов Лебера), NARP (нейропатия, атаксия, пигментная дегенерация сетчатки), MELAS (митохондриальная энцефалопатия, инсультоподобные эпизоды), MERRF (миоклонус-эпилепсия, наличие феномена «рваных красных волокон» в мышечном биоптате), LS (синдром Ли - некротизирующая энцефалопатия), KSS (синдром Кернса-Сейра - окулокраниосоматический синдром), CPEO (хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия). Некоторые из этих заболеваний генетически гетерогенные и могут быть обусловлены мутациями как ядерных генов, так и генов мтДНК. Краткое клиническое описание, данные по этиологии, генетике этих синдромов приведены в табл. 9-1. Эти синдромы, однако, не исчерпывают всего клинического разнообразия МБ. Кроме того, полный симптомокомплекс практически всех синдромов не всегда встречается у всех пораженных членов родословной, а часто представлен только у одного члена семьи. Большинство больных с мутациями мтДНК имеют различные «несиндромные» комбинации симптомов и признаков. Пораженные родственники больных по материнской линии могут быть практически бессимптомны или иметь минорную клиническую симптоматику в виде задержки роста, тугоухости, СД или мигренеподобных головных болей. Такие случаи очень трудны для диагностики, только тщательный сбор семейного анамнеза может помочь в установлении диагноза. Довольно часто симптоматика разных синдромов в значительной мере перекрывается друг с другом, образуя «комбинацию» из двух и даже трех клинических фенотипов (MELAS/KSS, MELAS/MERRF, MELAS/ LHON/LS). Кроме того, по мере прогрессирования заболевания и в силу эффекта гетероплазмии может наблюдаться «перетекание» одного синдрома в другой на клиническом уровне. Этот феномен распространен среди МБ. Например, описан переход клинического фенотипа болезни Пирсона в синдром Кернса-Сейра.

Клинический фенотип в каждом конкретном случае зависит от степени нарушения окислительного фосфорилирования и от потребности органов и тканей в продукции аденозинтрифосфорной кислоты. Тяжесть дефекта окислительного фосфорилирования определяется природой мутации и пропорцией мутантной мтДНК в клетке. Относительная потребность тканей в энергии окислительного фосфорилирования различна и убывает в ряду: ЦНС - скелетные мышцы - сердечная мышца - почки - печень - костный мозг - эндокринные железы. Поэтому наиболее частыми при МБ являются поражения мышечной, нервной и эндокринной систем. Как бы ни манифестировало заболевание у данного больного, практически всегда при МБ наблюдается присоединение патологии других органов по мере прогрессирования заболевания. В некоторых случаях заболевание может носить волнообразный характер, иногда ряд клинических симптомов может полностью исчезнуть. Например, описаны случаи полного восстановления зрения при LHON, восстановление функции клеток костного мозга при синдроме Пирсона.

К частым симптомам, которые встречаются у большинства пациентов с МБ, относятся:

Поражение подкорковых базальных ганглиев, которые чрезвычайно чувствительны к нарушениям энергетического обмена, - одно из характерных изменений, выявляемых при проведении магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга у пациентов с болезнью ДЦМ (рис. 9-1). Другие нарушения головного мозга - пороки развития, кистозная дегенерация, лейкоэнцефалопатия - также часто встречаются у пациентов с МБ.

Стоит отметить, что точковые мутации и крупные перестройки мтДНК в большей степени характерны для МБ, проявляющихся у детей старше 4 лет и у взрослых пациентов. Младенческие и ранние детские формы митохондриальных заболеваний обусловлены в основном мутациями в ядерных генах и имеют аутосомно-рецессивный или Х-сцепленный тип наследования. В раннем возрасте дебютируют синдром Ли, младенческая фатальная энцефаломиопатия; синдром Альперса, митохондриальная гепатоэнцефалопатия; синдром Пирсона. К патологии детского возраста (манифестация в 4 года и старше) относятся синдром Кернса-Сейра, синдром MELAS, синдром MERRF. Данные заболевания могут манифестировать и в более позднем возрасте, на 2-4-м десятилетии. В этом же возрасте проявляются симптомы при LHON и хронической прогрессирующей офтальмоплегии (CPEO).

Ввиду генетической гетерогенности, отсутствия высокоспецифичных и высокочувствительных биомаркеров, МБ представляют значительные трудности в лабораторной диагностике. В ряде случаев только сочетанная интерпретация лабораторных и клинических данных позволяет установить диагноз.

Любые нарушения дыхательной цепи заметно изменяют окислительно-восстановительный статус в цитоплазме клеток, нарушая функционирование цикла Кребса из-за избытка НАД^♠ Н по отношению к НАД+, приводя к вторичному увеличению концентрации лактата, увеличению молярного соотношения лактат/ пируват, увеличению кетоновых тел в крови. Молярное соотношение лактат/пируват в плазме (натощак и после еды) характеризует окислительно-восстановительный статус в цитоплазме; молярное соотношение кетоновых тел, 3-гидроксибутират/ацетоацетат (натощак и после еды) характеризует окислительно-восстановительный статус в митохондриях. Концентрация лактата, как правило, повышается у пациентов с МБ. Однако нормальная концентрация лактата не является критерием исключения митохондриальной патологии. Концентрация лактата может повышаться и при ряде других заболеваний, не относящихся к митохондриальной патологии (органические ацидурии, гликогенозы, нарушения глюконеогенеза).

Сравнительно недавно, в 2011 году, обнаружено, что фактор роста фибробластов 21 (FGF-21) является более чувствительным и специфичным биомаркером, чем лактат, при МБ с преимущественно мышечной патологией. FGF-21 играет важную роль в глюкозном и липидном обмене, в клеточном ответе на голодание. Концентрация FGF-21 в крови пациентов с МБ может повышаться в десятки раз. Однако биомаркер не является строго специфичным для МБ. На сегодняшний день измерение концентрации FGF-21 проводится больше в научных целях.

В 2014 году группа исследователей из Испании, изучая профиль экспрессии генов в мышцах пациентов с синдромом деплеции митохондриальной ДНК, вызванной мутациями в гене TK2, обнаружила повышение экспрессии фактора ростовой дифференциации 15 (GDF-15). Было показано повышение его концентрации в плазме крови у пациентов с МБ (синдромы MELAS, синдром Ли, синдром Кернса-Сейра).

Одним из морфологических признаков МБ является обнаружение в препаратах мышечной ткани так называемых рваных красных волокон (ragged red fibers, RRF), которые представляют собой скопления аномальных митохондрий под сарколеммой. Тяжесть мышечной патологии зависит от процента RRF. Присутствие RRF в мышечном биоптате больного с миопатией служит показателем митохондриальной природы заболевания, однако RRF не являются высокоспецифичными и при некоторых формах и стадиях болезни могут отсутствовать. Так, например, при мутациях в ядерном гене SURF1, обусловливающих развитие синдрома Ли, феномен RRF не описан.

Снижение активности ферментов обнаруживают не у всех пациентов, но в тех случаях, когда это снижение выявляется, оно служит основанием для постановки диагноза МБ. Резкое снижение активности одного из пяти комплексов ДЦМ чаще всего встречается при мутациях ядерного генома. Сочетанное поражение нескольких комплексов ДЦМ встречается у пациентов с синдромом СРЕО, Пирсона, заболеваниях, связанных с истощением мтДНК. В 2015 году описан ряд случаев комбинированной недостаточности комплексов ДЦМ при мутациях в ядерных генах, отвечающих за синтез и функциональные модификации митохондриальных транспортных РНК (например, в генах TARS2, AARS2, NARS2, MTO1).

Высокоразрешающая респирометрия (High-Resolution Respirometry) - метод, позволяющий на культурах клеток и в тканях (in vitro), в условиях, максимально приближенных к физиологическим, проводить измерение дыхательной функции митохондрий. Измеряя скорость потребления кислорода клетками и тканями (например, в фибробластах кожи или мышечных волокнах) с помощью сверхчувствительного электрода при последовательном добавлении различных субстратов/ингибиторов/разобщителей комплексов ДЦМ, можно оценить работу каждого комплекса ДЦМ.

Даже когда биохимический дефект установлен, не всегда возможно сделать однозначный вывод о причине данного нарушения. Это связано с генетической гетерогенностью МБ. Так, например, нарушение IV комплекса может быть обусловлено мутациями в структурных ядерных генах, мутациями в структурных генах мтДНК, мутациями митохондриальных генов тРНК и мутациями в ядерных генах, обеспечивающих межгеномное взаимодействие.

Биохимическая диагностика МБ усугубляется довольно сложными и кропотливыми методиками измерения активности комплексов и, кроме того, требуют проведения биопсии мышцы или кожи. Ферменты дыхательной цепи чрезвычайно чувствительны и очень быстро теряют свою активность, поэтому измерение необходимо провести в минимальные сроки после взятия материала.

Пациентам с хорошо известными митохондриальными синдромами, такими как MELAS, MERRF, LHON, NARP, проводят тесты на типичные для каждой из патологий точковые мутации мтДНК. Пациентам с подозрением на синдром KSS необходимо исключить крупные делеции мтДНК, самой частой из которых является делеция 4977 п.н. Однако, кроме частых мажорных мутаций, описано много более редких, и в некоторых случаях для подтверждения диагноза требуется полный анализ всей последовательности мтДНК. Так, по данным на 2016 год, в международной базе по мутациям мтДНК описано около 300 точковых мутаций и примерно столько же крупных перестроек (http://mitomap.org/MITOMAP). Интерпретация результатов полного анализа мтДНК осложняется ее чрезвычайной полиморфностью, описано более 500 однонуклеотидных замен в мтДНК, которые являются вариантами нормы, появляются данные о новых полиморфизмах, многие их которых встречаются только у определенных этнических групп. Поэтому необходимо проводить ряд дополнительных исследований при выявлении не описанной ранее замены в мтДНК для доказательства ее патогенности.

Серьезно затрудняет ДНК-диагностику феномен гетероплазмии и неравномерное распределение мтДНК по тканям. Так, в случаях синдромов KSS, MELAS, СРЕО самым информативным биологическим материалом оказывается мышечная ткань, а в клетках крови мутация может быть не обнаружена. В ряде работ недавно показано, что уровень гетероплазмии в клетках эпителия мочевого тракта близок к таковому в скелетной мышце, поэтому для анализа мутаций мтДНК стоит исследовать ДНК, выделенную из клеток мочевого осадка.

Для выявления точковых мутаций применяют как стандартные методы ПЦР-ПДРФ-анализа, так и более современный метод MLPA-анализа. С целью детекции делеций используют ПЦР протяженных участков мтДНК (Long PCR).

Особую трудность представляют варианты МБ, не имеющие четких клинических симптомов и не укладывающиеся в рамки определенного синдрома. Поэтому больные с симптоматикой, характерной для разных синдромов, а также с неполной симптоматикой определенного синдрома должны быть обследованы на все возможные мутации, начиная с наиболее частых. Появление современных методов высокопроизводительного секвенирования (NGS - next generation sequencing) позволило в некоторой степени упростить диагностику данной группы заболеваний. Применяется два основных подхода - таргетное секвенирование определенных генов (обычно это панель, включающая анализ от нескольких десятков до нескольких сотен генов) или секвенирование экзома. Таргетное секвенирование позволяет провести более тщательный анализ исследуемых генов, однако не дает возможности обнаружить новые гены, мутации в которых могут приводить к клинической картине МБ. При выборе этого подхода необходимо правильно сформировать критерии отбора пациентов для проведения анализа. Чем меньше генов исследуется, тем более строгими должны быть критерии отбора. При секвенировании экзома выше вероятность обнаружить молекулярный дефект, однако даже этот анализ не позволяет поставить диагноз всем пациентам, что во многом обусловлено трудностью интерпретации данных NGS.

Секвенирование экзома не может быть рекомендовано в качестве самостоятельного диагностического теста, так как при обнаружении новой мутации, для которой функционально не показано строгой ассоциации с заболеванием, необходимо проведение дополнительных исследований, доказывающих ее патогенность.

В настоящее время эффективных методов патогенетической терапии МБ не описано. Лечение основывается на симптоматической и антиоксидантной терапии. Пациентам назначают препараты, активирующие транспорт митохондриальных субстратов и снижающие лактатацидоз. Однако большинство этих препаратов используется врачами по исследовательским протоколам в метаболических центрах.

Терапевтическая схема для МБ подбирается индивидуально. При назначении витаминов и антиоксидантов важно сочетать их попарно [пример хороших окислительно-восстановительных пар: витамин Е и аскорбиновая кислота (витамин С); аскорбиновая кислота (витамин С) и коэнзим Q10]. С осторожностью рекомендуется назначать менадион в связи с его действием на свертывающую систему крови. Несколько независимых исследований показали хороший эффект в снижении лактата при одновременном приеме тиоктовой кислоты (альфа-липоевой кислоты), креатин моногидрата^℘ и коэнзима Q10.

На второй стадии клинических исследований сейчас находятся препараты EPI-743, MitoQ, характеризующиеся направленным действием на митохондрии.

Следует вести постоянный контроль за эффективностью лечения пациента с МБ и корректировать терапию при необходимости. Может понадобиться длительный подбор доз и комбинаций препаратов. Как правило, при отсутствии эффекта от проводимой метаболической терапии решается вопрос о ее прекращении. Ряд лекарственных препаратов оказывает угнетающее действие на ДЦМ. Пациентам с МБ противопоказаны такие препараты, как вальпроаты, аминогликозидные антибиотики, статины, эритромицин. Более подробный список нежелательных препаратов для пациентов с митохондриальной патологией можно найти на сайте международного общества пациентов с митохондриальными заболеваниями (IMP): http://www.mitopatients.org/.

В связи с особенностями генетики МБ представляют значительные трудности не только в процессе верификации диагноза, но и при медико-генетическом консультировании семей. Основная проблема связана с определением типа наследования заболевания. Как упоминалось ранее, МБ могут наследоваться не только по материнскому, но и по АР-, АД- и Х-сцепленному типу. Анализ родословной чаще всего не облегчает ситуацию: внутрисемейный полиморфизм не всегда позволяет правильно идентифицировать пораженных членов родословной, и митохондриальное наследование часто расценивается как аутосомно-рецессивное или Х-сцепленное. Поэтому на этапе верификации диагноза довольно сложно определить, с каких молекулярно-генетических тестов следует начать исследование. Тактика диагностики должна базироваться прежде всего на сочетании биохимических и молекулярно-генетических методов и тестировании на наиболее частые мутации как мтДНК, так и ядерных генов в зависимости от клинических проявлений болезни.

Консультирование семей с установленной мутацией после проведенных лабораторных тестов не представляет особых трудностей, если мутация выявлена в одном из ядерных генов, но при мутациях мтДНК оно представляет довольно сложную задачу для врача-генетика.

Во-первых, практически невозможно дать прогноз тяжести заболевания у членов родословной с выявленной мутацией мтДНК. Наличие мутации, особенно в состоянии гетероплазмии, не позволяет выстроить предположение о том, какие системы органов и как тяжело будут поражены; более того, не всегда является однозначным факт, что носитель мутации вообще будет иметь клинические проявления заболевания.

Во-вторых, существуют сложности с расчетом генетического риска для семей, имеющих больного ребенка и планирующих беременность. По данным литературы, если точковая мутация мтДНК обнаружена в крови у матери, рекомендуют проведение ее тщательного клинического обследования, поскольку риск повторного рождения больного ребенка у женщины с клиническими проявлениями МБ высокий и составляет 1:24. Если женщина клинически здорова и уровень гетероплазмии в крови не превышает 40%, то риск близок к общепопуляционному. Крупные делеции мтДНК возникают de novo, а семейные случаи заболеваний встречаются крайне редко.

В-третьих, не для всех отягощенных семей возможно провести ПД. В случаях мутаций в мтДНК дородовая диагностика строго не рекомендуется, так как не представляется возможным предсказать распределение мутантных копий мтДНК по тканям плода. Даже отсутствие мутации мтДНК в тканях ворсин хориона не позволяет гарантировать рождение здорового ребенка.

Семьям с МБ может быть рекомендовано применение современных репродуктивных технологий - ЭКО с использованием донорской яйцеклетки.

Одним из перспективных подходов может стать в будущем пересадка ядра из яйцеклетки матери в донорскую с последующим оплодотворением. Эта технология уже была отработана на животных моделях, но ряд этических и технологических трудностей пока не дает возможности применять ее для человека.

Хромосомные болезни занимают одно из ведущих мест в структуре врожденной и наследственной патологии человека (табл. 10-1).

Эти расстройства обусловлены числовыми и структурными аномалиями хромосом, большинство из которых приводят к летальным эффектам. Лишь сравнительно немногие варианты нарушений кариотипа совместимы с постнатальным развитием организма и ведут к хромосомным болезням. Перед характеристикой этой группы болезней целесообразно рассмотреть основные положения, касающиеся спектра, механизмов формирования и закономерностей проявления хромосомного дисбаланса. В общем виде все ХА разделяют на две группы - геномные и хромосомные мутации. К первым относят нарушения числа отдельных хромосом (анеуплоидия) и кратные изменения числа целых хромосомных наборов (полиплоидия). В категории хромосомных мутаций традиционно рассматривают структурные нарушения хромосом. По своему происхождению ХА могут быть наследуемыми и передаваться от родителей потомству (например, транслокации или инверсии хромосом). Нарушения кариотипа могут возникать и в ходе гаметогенеза de novo. Как правило, это числовые аномалии, являющиеся результатом ошибок мейотической сегрегации хромосом. Ряд структурных аберраций также может формироваться в гаметах, например, вследствие неаллельной гомологичной рекомбинации. Наследуемые и вновь возникшие гаметические мутации часто называют конституциональными хромосомными нарушениями из-за их присутствия во всех клетках организма. Кроме этого, ХА могут возникать и в соматических клетках. Если соматические мутации происходят на самых ранних этапах онтогенеза, например на стадии дробления бластомеров, то с высокой вероятностью они будут представлены во всех клетках организма. Если же мутация возникнет на более поздних стадиях развития, как правило уже после обособления зародышевых листков, то она будет присутствовать только в части клеток. В этом случае ХА будет находиться в мозаичном состоянии. Следует отметить, что хромосомный мозаицизм может возникать не только при изначально нормальном кариотипе зиготы, но и быть результатом коррекции хромосомного нарушения гаметического происхождения. Подобные ситуации отмечаются, например, при коррекции мейотической трисомии, когда в результате отставания дополнительной хромосомы в развивающемся организме формируются популяции дисомных и трисомных клеток.

Аномалии хромосом, связанные с нарушениями числа целых хромосомных наборов, представлены у человека триплоидией и тетраплоидией. Эти мутации являются летальными и, как правило, несовместимы с живорождением. Известны лишь единичные случаи рождения детей с множественными ВПР при носительстве полиплоидного кариотипа. Продолжительность жизни таких детей обычно невелика, а сам факт прохождения пренатального периода онтогенеза зачастую может быть объяснен присутствием в организме диплоидных клеток.

Триплоидия - это геномная мутация, при которой в кариотипе имеется три гаплоидных набора хромосом. У человека возможно существование трех вариантов триплоидных кариотипов: 69,XXX, 69,XXY и 69,XYY. Основным механизмом формирования триплоидии считается диспермное оплодотворение. Кроме того, триплоидия может возникнуть в результате слияния диплоидной и гаплоидной гамет, при этом появление диплоидии в гамете может быть следствием нерасхождения целых хромосомных наборов в мейозе. Диплоидия в ооцитах возникает преимущественно уже в первом делении мейоза. В очень редких случаях триплоидный кариотип формируется в результате эндорепликации одного из родительских геномов в диплоидной зиготе. Практически в 90% случаев дополнительный хромосомный набор в зиготе имеет отцовское происхождение, причем в 50-65% случаев он является результатом диспермии. Теоретически ожидаемое соотношение частот кариотипов 69,XXX, 69,XXY и 69,XYY, при условии формирования триплоидии за счет диспермного оплодотворения, должно составлять 1:2:1. В действительности оно стремится к соотношению 1:2. Это обусловлено тем, что кариотип 69,XYY обнаруживается очень редко в связи с его ранним летальным эффектом.

Фенотипические признаки триплоидии достаточно вариабельны. В одних случаях в материале спонтанных абортов обнаруживаются пустые плодные мешки, в других - патологические плодные мешки с остатками резорбирующегося эмбриона, в третьих - плоды с множественными пороками развития.

Известны редкие случаи рождения детей с триплоидным хромосомным набором. Такие новорожденные имеют небольшой вес, широкий задний родничок с недоразвитыми затылочными и теменными костями черепа, расщелину нёба, синдактилию 3-го и 4-го пальцев рук, пороки сердца. В большинстве случаев они являются триплоидно-диплоидными мозаиками.

При характеристике фенотипических проявлений триплоидии в эмбриогенезе человека важно подчеркнуть, что ее эффекты во многом связаны с родительским происхождением дополнительного хромосомного набора вследствие эффекта геномного импринтинга. В случае триплоидного кариотипа диандрогенетического происхождения формируется клиническая картина частичного пузырного заноса, сопровождающаяся гиперплазией клеток трофобласта и кистозной трансформацией ворсин хориона. В случае отсутствия материнского хромосомного набора и при наличии двух гаплоидных наборов отцовского происхождения развивается полный пузырный занос, характеризующийся более выраженными гиперпролиферативными изменениями трофобласта, отсутствием сформированного эмбриона и высоким риском трансформации в хорионэпителиому. В связи с этим своевременная цитогенетическая и молекулярно-генетическая диагностика пузырного заноса с целью дифференциации двух форм патологии имеет существенное значение для прогноза риска развития онкологических осложнений у женщины.

Тетраплоидия (присутствие в кариотипе четырех гаплоидных наборов хромосом) возникает преимущественно вследствие нарушений цитокинеза при дроблении бластомеров. Реже она является следствием объединения двух диплоидных гамет или оплодотворения яйцеклетки тремя гаплоидными сперматозоидами. Тетраплоидия - летальная мутация на организменном, но не на клеточном уровне. Так, например, известно, что ряд клеток (гепатоциты, кардиомиоциты, клетки эпителия мочевого пузыря и трофобласта плаценты) могут иметь не только тетраплоидный хромосомный набор, но и более высокие степени полиплоидизации. Фенотипически тетраплоидия часто ассоциирована с пустыми плодными мешками (анэмбрионии). Ее присутствие в бластомерах замедляет темпы дробления, приводит к нарушению их миграции внутрь бластоцисты, что в конечном итоге делает невозможным нормальное формирование и дифференцировку внутренней клеточной массы. Вместе с тем известны редкие случаи рождения детей с тетраплоидным хромосомным набором, в том числе и в чистой (немозаичной) форме. Для большинства из них характерны внутриутробная задержка развития, гипотония, лицевые аномалии (выступающий лоб, микрофтальмия, низко посаженные уши, расщелина нёба), пороки сердца, нарушения психомоторного развития.

Мозаичный вариант тетраплоидии имеет, как правило, более мягкое фенотипическое проявление, что может быть связано с присутствием полиплоидии только в части клеток или тканей.

Анеуплоидия является наиболее частой геномной мутацией у человека. Ее частота составляет около 5% среди всех клинически распознаваемых беременностей. В кариотипе она может быть представлена следующими формами:

Последние два варианта могут быть представлены вовлечением в анеуплоидию и большего числа гомологичных хромосом. Большинство анеуплоидий приводят к нарушениям внутриутробного развития и часто регистрируются в материале спонтанных абортов или в бластомерах при проведении преимплантационной генетической диагностики. Только немногие варианты анеуплоидий (трисомии по некоторым аутосомам и половым хромосомам, моносомия по Х-хромосоме) совместимы с живорождением и обусловливают формирование клинически хорошо очерченных хромосомных болезней.

Среди всех типов анеуплоидий трисомия по аутосомам является самой частой геномной мутацией у человека. У спонтанных абортусов I триместра беременности на ее долю приходится в среднем около 50% регистрируемых хромосомных нарушений. Частота трисомий по разным хромосомам существенно варьирует. Самой распространенной анеуплоидией является трисомия хромосомы 16, выявляемая у 30% спонтанных абортусов с трисомным хромосомным набором. Далее следуют трисомии по акроцентрическим хромосомам (13-15, 21 и 22) и хромосомам 2, 7, 18. Трисомии 1, 5, 19, напротив, являются чрезвычайно редкими и практически не обнаруживаются в материале спонтанных абортов, приводя к остановке развития на самых ранних этапах эмбриогенеза. Очевидно, что наблюдаемые различия в частоте трисомий отражают разную морфофункциональную значимость генного состава затрагиваемых анеуплоидией хромосом.

В основе возникновения трисомии лежат преимущественно ошибки сегрегации хромосом в мейотическом делении клеток, приводящие к формированию дисомных гамет. Среди таких ошибок выделяют нерасхождение гомологичных хромосом в первом делении или сестринских хроматид во втором делении мейоза, преждевременную сегрегацию хроматид в первом мейозе и нарушения кроссинговера, приводящие к ахиазматическому нерасхождению гомологов. Большинство ошибок возникает в первом делении мейоза у женщины. Более того, вероятность формирования анеуплоидных гамет заметно увеличивается с возрастом матери, что является одним из основных показаний для проведения ПД хромосомных болезней.

Двойные и тройные трисомии - редкий тип аномалий, формирующихся вследствие одновременного нерасхождения двух или трех хромосом. Их частота в материале спонтанных абортов составляет 0,2-2,8% и 0,025% соответственно. Имеются данные о более раннем прекращении развития зародышей с двойными трисомиями и о более старшем возрасте их матерей по сравнению с таковым при трисомиях по одной хромосоме. У живорожденных описаны двойные трисомии хромосом 13, 18, 21, X и Y. Тетрасомии известны по половым хромосомам, а также по хромосоме 21.

Моносомия - геномная мутация с очень ранним летальным эффектом. Элиминация большинства эмбрионов с аутосомными моносомиями происходит уже на преимплантационных этапах развития. Среди спонтанных абортусов частота моносомий по аутосомам составляет менее 1% от всех выявляемых нарушений кариотипа. Как правило, это моносомии акроцентрических хромосом, преимущественно 21 и 22. Следует отметить, что применение методов молекулярно-цитогенетического анализа (FlSH, CGH) для исследования кариотипа некультивированных клеток спонтанных абортусов позволило выявить более широкий спектр аутосомных моносомий. В частности, описаны моносомии по хромосомам 7, 9, 15, 16, 18, 19. Присутствуя, как правило, в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией, такие хромосомные нарушения оказываются совместимыми с прохождением ранних постимплантационных этапов развития. Более того, описано несколько уникальных случаев рождения детей с моносомией 21.

Единственной совместимой с жизнью является моносомия по Х-хромосоме, которая среди новорожденных встречается с частотой 0,04-0,07%. В 70-80% случаев единственная Х-хромосома наследуется от матери, а отцовские половые хромосомы теряются в гаметогенезе или на ранних этапах дробления. Наличие в кариотипе моносомии Х приводит к формированию синдрома Шерешевского-Тернера. Тем не менее летальность данного хромосомного нарушения все же велика и приближается к 100%. Большинство эмбрионов с моносомией Х погибает до 6 нед беременности. В 60% случаев такие зародыши представлены пустыми плодными мешками. Остальные эмбрионы не имеют видимых анатомических аномалий. На более поздних этапах развития формируется комплекс патоморфологических нарушений: генерализованный отек, билатеральная гигрома шеи, пороки сердца, аорты, мочеполовой системы, аномалии скелета, узловатый амнион, аплазия сосудов пуповины. Моносомия Х сопровождается нарушением формирования гонад, которое выражается в значительной редукции фолликулов и замене их соединительной тканью.

Нуллисомии по аутосомам регистрируются только у эмбрионов на преимплантационных этапах развития.

Хромосомные мутации представляют собой нарушения структуры хромосом. В основе их возникновения лежат разрывы сахарофосфатных связей в молекуле ДНК, затрагивающие либо одну, либо несколько хромосом. Воссоединение разорванных концов происходит с помощью ферментов репарации ДНК. Если концы фрагментов, принадлежащих к одной и той же хромосоме, воссоединятся без потери хромосомного материала и в прежней ориентации, то хромосома сохранит свою структуру. В случае же утраты хромосомного материала, изменения ориентации фрагмента или присоединения его к другим негомологичным хромосомам будут возникать структурные перестройки. Существует несколько типов структурных аберраций хромосом.

Делеция - это утрата части хромосомного материала. Она может затрагивать как концевые участки хромосом (терминальная делеция), так и внутрихромосомные регионы (интерстициальная делеция). Фенотипический эффект делеций обусловлен потерей хромосомного материала, содержащего определенный набор генов. Дополнительный вклад может вносить нарушение структурной последовательности гена, затронутого непосредственно разрывом хромосомы. Кроме того, при делеции может проявиться рецессивная мутация в гене на интактном гомологе. В некоторых случаях размер делеций может составлять всего несколько миллионов пар азотистых оснований (1-3 Мб), что значительно затрудняет их цитогенетическую диагностику с использованием дифференциально окрашенных препаратов метафазных хромосом и требует применения высокоразрешающих методов молекулярно-цитогенетического анализа. В процессе мейоза при конъюгации гомологичных хромосом, одна из которых несет интерстициальную делецию, интактный участок неповрежденной хромосомы не может найти в хромосоме с делецией гомологичной последовательности для взаимодействия. В результате образуется петлевая структура, которая будет мешать нормальному протеканию рекомбинации и в конечном итоге может привести к нарушению сегрегации хромосом. Таким образом, у носителей делеций высоковероятны нарушения мейоза, сопровождающиеся формированием несбалансированных или анеуплоидных гамет.

Дупликация - это хромосомная мутация, представленная удвоением участка хромосомы. Если он располагается непосредственно вслед за исходной последовательностью, то такая дупликация называется тандемной. Дуплицированный участок может быть развернут на 180° относительно исходной нуклеотидной последовательности. В таком случае дупликацию называют инвертированной. Фенотипический эффект дупликаций связан с увеличением копийности генов, расположенных в регионе мутации, а также может быть модифицирован разрывом кодирующей последовательности генов. Так же как и при делеции, хромосома с дупликацией не способна к нормальному взаимодействию с другим гомологом в ходе мейоза, что приводит к образованию петлевых структур и, как следствие, к нарушениям сегрегации и формированию несбалансированных гамет.

Инверсия - это поворот участка хромосомы на 180°. В зависимости от того, затрагивает ли инверсия одно или оба плеча хромосомы, различают парацентрические и перицентрические инверсии соответственно. Прохождение мейоза хромосом с инверсией значительно затруднено вследствие образования особых петлевых структур. В связи с этим носители инверсий, у которых она может не иметь никаких фенотипических проявлений, характеризуются нарушениями гаметогенеза из-за высокой вероятности возникновения несбалансированных гамет.

Инсерция представляет собой вставку фрагмента одной хромосомы в другой регион той же самой или другой негомологичной хромосомы. В первом случае образуется интрахромосомная, во втором - интерхромосомная инсерция. В случае если встраиваемый фрагмент хромосомы имеет терминальное или интерстициальное происхождение, то для возникновения инсерции требуется три или четыре хромосомных разрыва соответственно. В зависимости от ориентации встроенного фрагмента по отношению к центромере различают прямые и инвертированные инсерции. При инсерции не происходит изменений числа копий перестроенных участков хромосом, а фенотипический эффект может быть связан с эффектом положения, а именно с перемещением блока структурных генов из одного хромосомного окружения в другое. Поведение хромосом с инсерцией в мейозе в значительной степени зависит от размера встроенного фрагмента и характеризуется конъюгацией гомологичных хромосом при инсерциях небольшого размера либо формированием квадривалентов при значительных вставках. Результатом мейоза может стать появление гамет с сегментными анеуплоидиями. Именно поэтому носительство инсерций представляет серьезный репродуктивный риск.

Транслокация - это перенос участка одной хромосомы на другую хромосому. Наиболее часто в транслокацию вовлекаются две хромосомы, однако возможны перестройки с участием трех хромосом или более. В отдельный класс выделяют так называемые робертсоновские транслокации, образующиеся вследствие разрыва и воссоединения двух акроцентрических хромосом в области центромеры. В случае если при обмене не происходит потери хромосомного материала, то такие транслокации называются сбалансированными. Взаимный обмен участками двух разных гомологичных хромосом приводит к формированию реципрокной транслокации. Носительство в кариотипе реципрокных и робертсоновских транслокаций часто может не иметь каких-либо клинических проявлений. При несбалансированных транслокациях наблюдаются фенотипические нарушения, связанные с дисбалансом числа копий участка хромосомы, вовлеченного в перестройку. В таком случае в кариотипе возникают сегментные анеуплоидии, представленные частичной моносомией или частичной трисомией по хромосомному региону, вовлеченному в транслокацию.

Вследствие того что при транслокациях формируется хромосома, представленная участками двух разных хромосом, прохождение такой перестроенной хромосомой мейотического деления имеет свои особенности. Так, в конъюгации принимают участие уже не одна, а две пары гомологичных хромосом. Как результат, в ходе обмена формируется особая фигура, получившая название «транслокационный крест». Только один из шести возможных вариантов сегрегации хромосом, составляющих «транслокационный крест», ведет к формированию сбалансированных гамет. В связи с этим у носителей хромосомных транслокаций высока вероятность нарушений мейоза, формирования несбалансированных и анеуплоидных гамет, что может обусловливать бесплодие или невынашивание беременности.

Изохромосома представляет собой хромосому, формирующуюся вследствие аномального поперечного деления центромеры, что ведет к разделению короткого и длинного плеч. После дупликации одного из плеч возникает изохромосома по короткому или по длинному плечу. Фенотипический эффект у носителей таких перестроек связан как отсутствием хромосомного материала одного из плеч, так и с его дупликацией в другом плече.

Дицентрическая хромосома возникает в результате воссоединения двух поврежденных хромосом, сохранивших свои центромерные последовательности. В некоторых случаях появление дицентрической хромосомы является следствием неравного кроссинговера между сегментными дупликациями генома - блоками крупных повторов ДНК - размером 1-100 тыс. п.н. с высокой степенью идентичности нуклеотидных последовательностей - до 90-95%. Если сегментные дупликации находятся в инвертированном положении относительно друг друга и располагаются вблизи центромерных регионов хромосом, неаллельная гомологичная рекомбинация между ними может приводить к формированию изодицентрических хромосом - изохромосом с двумя центромерными регионами. Именно по такому механизму образуется одна из наиболее распространенных маркерных хромосом, обнаруживаемых у новорожденных с множественными ВПР, - изодицентрическая хромосома 15.

Кольцевая хромосома возникает при утрате обоих теломерных участков одной хромосомы с воссоединением ее концов. Кольцевая хромосома является нестабильной структурой и часто подвержена потере при клеточном делении. Фенотипический эффект таких перестроек может быть связан с утратой части хромосомного материала при формировании кольцевой хромосомы, а также с самой ее потерей в части соматических клеток.

В основу классификации хромосомной патологии может быть положено несколько принципов. Первый принцип (этиологический) связан с характеристикой типа мутации. Согласно ему, клиническая картина хромосомного заболевания складывается из двух основных составляющих. Во-первых, это то, какая хромосомная структура (сегмент, плечо или целая хромосома) вовлечена в аберрацию. Во-вторых, в чем состоит характер генетического нарушения (уменьшение или увеличение числа копий хромосомного материала).

Второй принцип связан с определением типа клеток, в которых возникла мутация: в гаметах или в соматических клетках на постзиготических этапах развития. Гаметические мутации формируются вследствие нарушений мейоза. Это могут быть геномные мутации, например нерасхождение хромосом в первом или втором мейотическом делении, приводящее к возникновению анеуплоидных гамет и впоследствии анеуплоидных (трисомных или моносомных) зигот. Структурные хромосомные аберрации также могут формироваться в мейозе вследствие нарушений конъюгации хромосом и генетической рекомбинации. В случае гаметической мутации конституциональное хромосомное нарушение будет присутствовать во всех клетках организма.

Наличие хромосомной патологии в зиготе может кардинальным образом нарушить всю программу развития. Показательна в этом отношении трисомия по хромосоме 8. Данная анеуплоидия представляет собой наглядный пример влияния происхождения ХА на развитие организма. Трисомия по хромосоме 8 мейотического происхождения - это летальная мутация, которая приводит к спонтанному прерыванию беременности. Если же эта трисомия возникает постзиготически, то она может быть совместима с пренатальным развитием и даже живорождением. Следует отметить, что большинство дифференцированных тканей человека толерантны к достаточно высокому уровню клеток с трисомией хромосомы 8. Так, у новорожденных детей эта аномалия может быть отмечена в 100% лимфоцитов. Предложен ряд гипотез, объясняющих такие эффекты трисомии. Одна из них предполагает, что данная анеуплоидия мейотического происхождения является одной из наиболее стабильных ХА и ее коррекция происходит сравнительно редко. Другая гипотеза допускает, что негативное воздействие трисомии по хромосоме 8 на течение развития может быть более сильным, если она затрагивает рано дифференцирующиеся ткани, к которым относится и трофобласт. Это возможно только вследствие мейотического происхождения мутации, которое ведет к наличию трисомии уже в зиготе. Предполагается, что трисомия по хромосоме 8 может ингибировать ключевые этапы дифференцировки трофобласта. Вероятно, что если эта мутация возникнет на более поздних стадиях онтогенеза, то ее эффекты не будут столь значительными.

Таким образом, соматические мутации могут возникать в зиготе, в период внутриутробного развития или в постнатальном онтогенезе. В результате соматических мутаций в организме присутствуют два или более клеточных клона с разными хромосомными наборами, при этом, как правило, один клон клеток имеет нормальный кариотип, а другой - аномальный. Такие варианты ХА называются мозаичными. В редких случаях комбинации клеток с разными типами хромосомных нарушений могут являться следствием не мозаицизма, а химеризма - объединения бластомеров, принадлежащих разным зародышам, на самых ранних этапах развития. Клиническое проявление мозаичных ХА зависит от сочетания множества факторов, в том числе от типа мутации, вовлеченной хромосомы или ее сегмента, частоты клеток с аномальным кариотипом, их распределения в различных тканях организма. Как правило, строгой корреляции между этими показателями и степенью выраженности клинических признаков при хромосомном мозаицизме не наблюдается.

Наконец, третий принцип классификации хромосомных болезней связан с установлением поколения, в котором возникла мутация: появилась ли она в гаметах здоровых родителей de novo (спорадические случаи), или родители уже являлись носителями данной ХА. О наследуемых хромосомных болезнях говорят в том случае, когда хромосомная мутация уже имеется в клетках одного из родителей и может быть передана потомству через гаметы. Обычно такие ситуации характерны для носителей структурных перестроек хромосом, например сбалансированных или робертсоновских транслокаций. Известны случаи семейного носительства хромосомных микроделеций и микродупликаций в ряду поколений без клинического проявления. Наследование хромосомного нарушения может быть также результатом гонадного мозаицизма - явления, при котором у здорового индивида с нормальным кариотипом в гонадах имеется клон клеток с хромосомной аберрацией. Как правило, это числовые хромосомные нарушения, сохранившиеся в зародышевой половой линии после коррекции анеуплоидии в соматических клетках развивающегося эмбриона. Другим фактором, приводящим к формированию гонадного мозаицизма, могут являться ошибки сегрегации хромосом, возникающие на стадии митоза в клетках-предшественницах гамет.

Таким образом, для диагностики хромосомного заболевания и прогноза его повторного возникновения в семье необходимо определить тип мутации и вовлеченную хромосому, форму мутации (полная или мозаичная), наличие в родословной (спорадический или наследуемый случай). Учитывая эти особенности, следует также отметить, что для точной постановки диагноза не всегда бывает достаточно обследования самого пациента, иногда требуется проведение цитогенетического исследования его родителей и сибсов.

В основе патогенеза хромосомных заболеваний лежат разные механизмы в зависимости от типа хромосомной мутации и ее происхождения. Так, проявление полных и сегментных анеуплоидий связано с дисбалансом по числу копий хромосомного материала, одновременно затрагивающим большое количество генов. Это в значительной степени затрудняет анализ ключевых механизмов развития болезни. При сбалансированных ХА (инверсии, реципрокные транслокации) вклад в формирование клинической картины заболевания могут вносить эффект положения или повреждение кодирующей последовательности гена в области разрыва. Микроделеции и микродупликации в области локализации импринтированных генов будут иметь различный клинический эффект в зависимости от родительского происхождения хромосомы, затронутой мутацией. Несмотря на достаточно хорошую клиническую изученность хромосомных синдромов и идентификацию определяющих их аномалий хромосом, конкретные механизмы развития заболеваний остаются понятными лишь в общих чертах. При оценке эффектов хромосомного дисбаланса обычно выделяют три типа генетических эффектов: специфические, полуспецифические и неспецифические.

Специфические эффекты связаны с изменением копийности структурных генов, число которых при трисомиях увеличивается, а при моносомиях, наоборот, уменьшается. Вполне ожидаемо, что вслед за изменением числа копий хромосомного материала должно изменяться и число кодируемых белковых продуктов. Тем не менее в действительности при анеуплоидии часто не происходит строго пропорционального изменения уровня экспрессии генов, что объясняется разбалансировкой сложных регуляторных процессов в клетке. Более того, при хромосомных синдромах происходит существенное изменение уровня и активности других белков, гены которых локализованы на хромосомах, не вовлеченных в аномалию.

Полуспецифические эффекты ХА могут быть обусловлены изменением числа высококопийных генов. К таким генам относятся гены рибосомных и транспортных РНК, гистоновых и рибосомных белков.

Неспецифические эффекты связаны с изменением числа гетерохроматиновых последовательностей, структурно-регуляторная функция которых хорошо известна.

С клинической точки зрения общим для всех хромосомных болезней является поражение множества систем органов. При каждом конкретном типе мутации может наблюдаться несколько различных фенотипических отклонений, часто перекрывающихся при разных синдромах. Лишь ограниченное число синдромов проявляется строго определенной комбинацией признаков. Множественность системных поражений при развитии хромосомной болезни объясняется наличием ХА во всех клетках организма начиная с самых первых этапов его развития. Присутствие мутации значительным образом изменяет всю программу онтогенеза, приводя к нарушению морфогенетических процессов в ключевые периоды внутриутробного развития.

В основе формирования клинической картины хромосомного заболевания лежит сочетание нескольких факторов:

Эти факторы определяют клинический полиморфизм хромосомных заболеваний. Вариабельность в фенотипическом проявлении геномных и хромосомных мутаций может быть достаточно широкой: от ранней эмбриональной гибели до рождения ребенка с хромосомной болезнью. Спектр эффектов конституциональных ХА можно ранжировать следующим образом:

С клинической точки зрения числовые нарушения аутосом характеризуются следующими основными признаками:

Хотя ни одна из этих четырех групп не является обязательной при том или ином хромосомном синдроме, умственная отсталость считается одним из наиболее типичных нарушений.

Синдром Дауна (трисомия хромосомы 21). Наиболее распространенное хромосомное заболевание. Его популяционная частота составляет 1:600-700 новорожденных. Это первый синдром, для которого была установлена хромосомная природа Джеромом Леженом с коллегами в 1959 году. Цитогенетические варианты синдрома Дауна разнообразны. Однако основную долю (до 95%) составляют случаи полной трисомии 21, возникающие вследствие нерасхождения хромосом в мейозе. Вклад материнского нерасхождения в эти гаметические формы болезни составляет 85-90%, а отцовского - только 10-15%, при этом примерно 75% нарушений возникает в первом делении мейоза у матери и только 25% во втором. Около 2% детей с синдромом Дауна имеют мозаичные формы трисомии 21. Примерно у 3-4% больных обнаруживается транслокационный вариант трисомии по типу робертсоновских транслокаций между акроцентрическими хромосомами (D/21 и G/21). Около одной четверти транслокационных форм наследуются от родителей-носителей, а три четверти транслокаций возникают de novo.

Основные клинические признаки синдрома: типичное плоское лицо, брахицефалия, аномалии глаз (монголоидный разрез глаз, эпикант, пятна Брушфильда, ранняя катаракта, миопия), открытый рот, аномалии зубов, короткий нос и плоская переносица, кожные складки на шее, короткие конечности, поперечная четырехпальцевая ладонная складка, широкий промежуток между первым и вторым пальцами стоп. Из пороков внутренних органов часто отмечают врожденные пороки сердца (дефекты межжелудочковой и межпредсердной перегородок, открытый артериальный проток) и желудочно-кишечного тракта (атрезия двенадцатиперстной кишки, расширение ободочной кишки), которые в значительной степени определяют продолжительность жизни пациентов с синдромом Дауна. Большинство больных имеет умеренную или тяжелую степень умственной отсталости. Более мягкие фенотипические признаки характерны для пациентов с мозаичными формами синдрома.

Синдром Патау (трисомия хромосомы 13). Хромосомная природа заболевания впервые была описана Клаусом Патау в 1960 году. Частота в популяциях составляет 1:7800-14 000. Возникает заболевание вследствие трисомии хромосомы 13, как правило, материнского происхождения. Развитие синдрома может быть также связано с транслокационными вариантами (робертсоновские транслокации), мозаичными формами, дополнительной кольцевой хромосомой 13, изохромосомами. Клинически синдром Патау проявляется микроцефалией, расщелинами верхней губы и нёба, низко посаженными деформированными ушными раковинами, микрогенией, гипотелоризмом, дисплазией сетчатки, полидактилией, поперечной ладонной складкой, множественными пороками внутренних органов (врожденными пороками сердца - дефектами перегородок и крупных сосудов, незавершенным поворотом кишечника, поликистозом почек, удвоением мочеточника). Наблюдается крипторхизм, гипоплазия наружных половых органов, удвоение матки и влагалища. Для детей характерна глубокая степень умственной отсталости. Продолжительность жизни составляет, как правило, 2-3 мес и редко достигает одного года.

Синдром Эдвардса (трисомия хромосомы 18). Впервые описан Джоном Эдвардсом в 1960 году. Популяционная частота составляет 1:6000-8000 случаев. Это второе по частоте встречаемости после синдрома Дауна хромосомное заболевание. Большинство случаев (90%) связано с полной формой хромосомы 18, возникающей вследствие ошибок первого деления мейоза у матери. Транслокационные варианты распространены крайне редко. Критическим регионом, ответственным за формирование основных клинических признаков синдрома, рассматривается сегмент 18q11. Новорожденные с синдромом Эдвардса имеют малую массу тела. Основными диагностическими признаками заболевания являются: долихоцефалия, гипертелоризм, низко посаженные уши аномальной формы, микрогнатия, микростомия, скошенный подбородок. Имеются аномалии развития конечностей, отсутствие дистальной складки на мизинце, гипоплазия ногтей. Из пороков внутренних органов характерными являются комбинированные пороки сердечно-сосудистой системы, незавершенный поворот кишечника, пороки развития почек, крипторхизм. Отмечается задержка психомоторного развития. Продолжительность жизни обычно не превышает 1 года.

Анеуплоидии по половым хромосомам, как правило, характеризуются более мягким клиническим проявлением по сравнению с дисбалансом числа аутосом. У человека они представлены моносомией по Х-хромосоме и различными вариантами полисомий по половым хромосомам.

Синдром Шерешевского-Тернера обусловлен моносомией по Х-хромосоме. Это единственный вариант моносомии, который совместим с живорождением и постнатальным развитием. Кроме моносомии, формирование синдрома может наблюдаться при делециях длинного и короткого плеч Х-хромосомы, изохромосомах и кольцевых Х-хромосомах. В 80-85% случаев единственная X-хромосома имеет материнское происхождение. Распространены и мозаичные формы заболевания с наличием в организме клеток с нормальным кариотипом. Популяционная частота синдрома составляет 1:3000-5000 новорожденных. Клиническими признаками заболевания являются: нанизм, крыловидные кожные складки на шее, короткая шея, бочкообразная грудная клетка, вальгусная девиация коленных и локтевых суставов, снижение зрения и слуха, отсутствие вторичных половых признаков. У больных отмечается первичная аменорея, бесплодие. Часто регистрируются врожденные пороки сердца и почек. Интеллектуальное развитие обычно находится в пределах нормы.

Синдром трипло-Х формируется при кариотипе 47,ХХХ. Частота заболевания составляет 1:1000 новорожденных девочек. Как правило, женщины с таким хромосомным набором в полной или мозаичной форме имеют нормальное физическое и интеллектуальное развитие, что в значительной степени обусловлено инактивацией двух дополнительных Х-хромосом. У пациентов может не отмечаться отклонений и в половом развитии, однако имеется повышенный риск спонтанных абортов вследствие формирования анеуплоидных гамет. Лишь у некоторых женщин отмечаются нарушения репродуктивной функции в виде вторичной аменореи, дисменореи, ранней менопаузы.

С дальнейшим увеличением числа Х-хромосом в кариотипе нарастают отклонения от нормы. У пациентов с тетра- и пента-сомией по Х-хромосоме имеются черепно-лицевые дисморфии, аномалии зубов, скелета, половых органов. Способность к деторождению может сохраняться, однако имеется повышенный риск рождения детей с нарушениями числа Х-хромосом.

Синдром Клайнфельтера объединяет случаи присутствия в кариотипе не менее двух Х-хромосом и не менее одной Y-хромосомы. Цитогенетические формы представлены следующими вариантами: 47,XXY, 48,XXYY, 48,XXXY, 49,XXXXY.

Наиболее распространенным вариантом является кариотип 47,XXY, обнаруживаемый с частотой 1:1000 новорожденных мальчиков. Особенности клинической картины заболевания во многом связаны с появлением дополнительной Х-хромосомы в кариотипе клеток организма мужского пола. Такой дисбаланс манифестирует в период полового созревания и выражается в недоразвитии половых органов (гипогонадизм и гипогенитализм, дегенерация герминативного эпителия, гиалиноз семенных канатиков) и отсутствии вторичных половых признаков. Для больных с синдромом Клайнфельтера характерна азооспермия или олигоспермия. Из других клинических признаков необходимо отметить высокий рост, телосложение по женскому типу, гинекомастию, слабое оволосение лица, подмышечных впадин, лобка. Уровень интеллекта, как правило, снижен.

Синдром дисомии по Y-хромосоме (47,XYY) встречается с частотой 1:1000 новорожденных мальчиков. Большинство носителей такого хромосомного набора имеют незначительные отклонения от нормального физического и интеллектуального развития. Обычно это индивиды с высоким ростом. Заметных нарушений полового развития и репродуктивной функции нет. У пациентов отмечают дефицит внимания, гиперактивность, импульсивность.

Это сравнительно большая группа заболеваний, клиническая картина которых обусловлена структурными перестройками хромосом, приводящими к избытку (частичная трисомия) или недостатку (частичная моносомия) материала отдельных районов хромосом. Такие аберрации возникают de novo вследствие потери или увеличения копийности тех или иных хромосомных сегментов в гаметогенезе либо на ранних стадиях эмбриогенеза. Предрасположенность к формированию делеций и дупликаций могут обеспечивать сегментные дупликации генома, неаллельная гомологичная рекомбинация между которыми приводит к реципрокным изменениям копийности хромосомного участка, фланкированного блоками повторов. Кроме того, несбалансированность по числу копий определенного хромосомного региона может формироваться в результате прохождения через мейоз сбалансированных хромосомных перестроек (например, транслокаций), имеющихся в кариотипе родителей. Среди множества возможных структурных аберраций значимыми в отношении возникновения определенного хромосомного синдрома обычно рассматривают только те, которые приводят к формированию сходной клинической картины у большинства пациентов.

Сегментные анеуплоидии, так же как и анеуплоидии по целым хромосомам, вызывают резкие отклонения в развитии организма. Однако в большинстве случаев они не повторяют клиническую картину анеуплоидий по целым хромосомам. В связи с этим заболевания, обусловленные сегментными анеуплоидиями, часто выделяют в самостоятельные нозологические формы. Частичное совпадение клинических фенотипов у пациентов с полными и сегментными анеуплоидиями возможно в том случае, если последние затрагивают критические для развития хромосомного синдрома регионы хромосом (например, при болезни Дауна). Для заболеваний, обусловленных сегментными анеуплоидиями, в значительной степени характерны общие клинические признаки всех хромосомных болезней: нарушения пре- и постнатального онтогенеза, ВПР, умственная отсталость, сокращенная продолжительность жизни. На особенности клинического проявления сегментной анеуплоидии может оказывать влияние размер вовлеченного участка хромосомы и локализация точек разрыва, что определяет состав затрагиваемых перестройкой генов. Тонкая детализация структуры сегментных анеуплоидий становится в настоящее время возможной с применением высокоразрешающих методов молекулярно-цитогенетического и молекулярно-генетического исследования (матричной сравнительной геномной гибридизации, секвенирования нового поколения), позволяющих приблизиться к пониманию фенокариотипических корреляций, а в некоторых случаях идентифицировать даже новые хромосомные синдромы. Ниже приведена краткая характеристика некоторых распространенных синдромов, обусловленных сегментными анеуплоидиями хромосом.

Синдром Вольфа-Хиршхорна возникает вследствие делеции дистального региона короткого плеча хромосомы 4 (4p16.3). Частота синдрома варьирует в диапазоне 1:200001:50000 новорожденных, при этом среди девочек заболевание встречается в два раза чаще, чем среди мальчиков. Большинство случаев возникает вследствие делеций de novo, около 10% обусловлено наследственными формами. Основные клинические признаки: задержка пре- и постнатального роста, нарушения психомоторного развития разной степени выраженности, низкая масса тела при рождении. Характерные черты лица и черепа: высокий лоб, микроцефалия, высокое надпереносье, клювовидный нос, гипертелоризм, выступающие глаза, короткий фильтр, микрогнатия, маленький рот с опущенными уголками рта, крупные оттопыренные уши. Часто встречаются расщелины губы и нёба. У мальчиков отмечаются гипоспадия и крипторхизм. Характерны пороки развития сердечно-сосудистой системы, поликистоз почек.

Синдром кошачьего крика является исторически первым хромосомным заболеванием, для которого в 1963 году Джеромом Леженом с коллегами была продемонстрирована этиологическая роль структурного нарушения хромосом. Заболевание обусловлено делецией короткого плеча хромосомы 5. Размер делеции может варьировать от 5 до 40 Mb, то есть делеция может быть небольшой, затрагивающей критический сегмент 5p15.2, а может быть представлена отсутствием практически целого короткого плеча. Популяционная частота синдрома составляет 1:15 000-1:50000 новорожденных. Среди пациентов с тяжелой степенью умственной отсталости (IQ <20) частота синдрома кошачьего крика составляет около 1%. Клинические признаки заболевания обусловлены гаплонедостаточностью большого числа генов. В критическом регионе 5p15.2 выделены гены, ассоциированные с формированием фенотипических черт синдрома. Это гены белков семафорина F (SEMAF) и β-катенина (CTNND2), вовлеченных в развитие мозга. Среди клинически значимых признаков синдрома наиболее часто отмечают: необычный крик или плач, напоминающий мяуканье кошки, связанный с аномалиями гортани и надгортанника, микроцефалию, антимонголоидный разрез глаз, лунообразное лицо, гипертелоризм, широкую переносицу, низко посаженные деформированные ушные раковины. На ладонях имеется поперечная складка, также характерна клинодактилия или синдактилия. Присутствует умственная отсталость сильной степени. Продолжительность жизни зависит от тяжести пороков внутренних органов.

Синдром трисомии 9p - одна из самых распространенных частичных трисомий. Впервые описан в 1970 году. Возникновение синдрома связано с дупликациями, изохромосомами по короткому плечу хромосомы 9, несбалансированными транслокациями. Основные признаки: антимонголоидный разрез глаз, гипертелоризм, микробрахицефалия, энофтальм, широкий и округлый кончик носа, выступающая верхняя губа и верхняя челюсть, низко посаженные ушные раковины с аномальным противозавитком и противокозелком, узкий слуховой канал, короткая шея с низкой линией роста волос, поперечная ладонная складка. Рентгенографически обнаруживают задержку костного возраста. У пациентов отмечается олигофрения. Прогноз жизни благоприятный: больные доживают до пожилого возраста.

Синдром моносомии 9p (синдром Альфи) впервые описан Альфи с коллегами в 1976 году. Возникает вследствие частичных делеций короткого плеча хромосомы 9, изохромосом по длинному плечу, несбалансированных транслокаций. Критическим регионом является сегмент 9p22. Основные клинические признаки: тригоноцефалия, резко выступающий лоб, монголоидный разрез глаз, эпикант, экзофтальм, гипертелоризм, уплощенная широкая переносица, маленький рот с большой верхней губой, высокое нёбо, асимметрия лица. Ушные раковины без мочки, или она недоразвита, со сглаженным завитком. Характерны короткая шея и гипертелоризм сосков. Пальцы рук и ног длинные. У девочек отмечается гипоплазия больших и малых половых губ, у мальчиков - гипоплазия мошонки и полового члена. Имеется глубокая степень умственной отсталости. Прогноз жизни благоприятный.

Синдром моносомии 13q (синдром Орбели) формируется при наличии в кариотипе кольцевой хромосомы 13 или делеций. Критическим регионом является сегмент 13q14. Основные признаки: низкий вес при рождении, микроцефалия, асимметрия лица, широкая выступающая переносица, отсутствие носовой вырезки, антимонголоидный разрез глаз, высокое нёбо. Отмечаются поражения опорно-двигательного аппарата: короткая шея, гипоили аплазия первого пальца кисти и пяточной кости, клинодактилия. Из пороков внутренних органов характерны пороки сердца, почек, головного мозга, заращение прямой кишки и заднепроходного отверстия. Характерна глубокая степень умственной отсталости.

Синдром трисомии 14q возникает вследствие несбалансированных транслокаций, дупликаций или изохромосом по длинному плечу хромосомы 14. Основные признаки: микроцефалия, луковицеобразный нос, тонкая верхняя губа, микростомия, опущенные углы рта, низко расположенные ушные раковины, высокое арковидное нёбо или его расщелина, короткая шея, клинодактилия, косолапость, пороки сердечно-сосудистой системы, отставание в физическом и психомоторном развитии.

Синдром моносомии 18p (синдром де Груши). Впервые описан в 1963 году. Частота составляет 1:50000 новорожденных. Основные признаки: умственная отсталость, задержка роста, аномалии лица и черепа, включая характерное круглое лицо, диспластичные уши, широкий рот, аномалии зубов, а также аномалии конечностей, гениталий, сердца, головного мозга. Отмечено, что характерное для неонатального периода круглое лицо в детстве может становиться вытянутым.

Синдром моносомии 18q возникает вследствие делеций длинного плеча хромосомы 18. Основные клинические признаки: микроцефалия, гипоплазия средней части лица, глубоко посаженные глаза, «рот карпа», плоский или вогнутый профиль лица, высокое нёбо или его расщелина, деформированные ушные раковины с атрезией или сужением слуховых проходов, аномалии конечностей (конические пальцы, клинодактилия V пальца, вальгусная деформация тазобедренного сустава). Характерны аномалии глаз, включающие нистагм, страбизм, эпикант, атрофию зрительных нервов. У мальчиков отмечен крипторхизм, гипоплазия полового члена и мошонки. У девочек наблюдается гипоплазия половых губ. Из пороков внутренних органов отмечаются пороки сердца и почек. Умственная отсталость, как правило, достигает глубокой степени.

Синдром моносомии 21q обусловлен делецией длинного плеча хромосомы, а также кольцевой хромосомой 21. Впервые описан Леженом в 1964 году. Основные признаки: низкая масса тела при рождении, микроцефалия, антимонголоидный разрез глаз, микрофтальмия, колобома радужки, катаракта, эпикант, выступающая широкая переносица, большие, низко посаженные уши с расширенным наружным слуховым каналом, микрогнатия, клинодактилия, сколиоз, мышечная гипертония, гипоспадия, крипторхизм, косолапость. Характерны пороки сердца и почек (агенезия, гидронефроз, удвоение почечных лоханок), а также задержка психомоторного развития.

Синдром кольцевой хромосомы 18 впервые описан в 1962 году. Основные клинические признаки заболевания: микроцефалия, гипертелоризм, страбизм, птоз, нистагм, «рот карпа», тонкая верхняя губа, высокое нёбо, часто с расщелиной, умственная отсталость, как правило, глубокой степени тяжести.

Синдром кольцевой хромосомы 22 как самостоятельная нозологическая форма впервые описан в 1972 году. Развитие заболевания может быть обусловлено не только собственно кольцевой хромосомой, но и делецией длинного плеча хромосомы 22. В 90% случаев подобные мутации возникают de novo. Основные клинические признаки: микроцефалия, птоз, эпикант, гипертелоризм, крупные выступающие глаза, расщелина языка и нёба, дисплазия тазобедренных суставов, клинодактилия и синдактилия. Умственная отсталость может быть легкой степени или представлять выраженную олигофрению. Для больных типичны легкая возбудимость, частая смена настроения, нарушения координации, глубокое недоразвитие речи, вплоть до ее отсутствия.

В эту группу входят синдромы, обусловленные незначительными, размером до 5 Mb, делециями или дупликациями определенных участков хромосом. Многие из этих синдромов первоначально были описаны как доминантные заболевания, обусловленные точечными мутациями генов, однако позднее с помощью молекулярно-цитогенетического анализа была установлена истинная этиология данных заболеваний. С использованием матричной сравнительной геномной гибридизации стало возможным обнаруживать делеции и дупликации хромосом протяженностью до одного гена, что позволило не только существенно расширить список микроделеционных и микродупликационных синдромов, но и приблизиться к пониманию генофенотипических корреляций у пациентов с микроструктурными аберрациями хромосом.

Одним из наиболее распространенных механизмов формирования микроделеций или микродупликаций является неаллельная рекомбинация гомологичных хромосом в регионах локализации сегментных дупликаций генома. Это особый класс низкокопийных повторов ДНК, представленный крупными блоками размером до 100 kb, имеющими высокую степень (90-95%) идентичности нуклеотидных последовательностей. Часто сегментные дупликации кластеризуются в прицентромерных и субтеломерных районах хромосом. В геноме человека такие блоки отмечены в хромосомах 7, 15, 17, 22 и Х. Неравный кроссинговер между блоками сегментных дупликаций приводит к возникновению микроделеций и микродупликаций, которые в зависимости от протяженности и числа затрагиваемых генов обусловливают формирование хромосомного или моногенного заболевания.

В основе развития микроделеционных и микродупликационных синдромов лежат изменения дозы генов в участке хромосомы, затронутом перестройкой. Однако пока не установлено, что именно составляет основу формирования большинства таких синдромов - отсутствие или избыток конкретного гена либо более протяженного участка, содержащего несколько генов. Кроме того, клиническая картина заболевания может быть модифицирована манифестацией рецессивной мутации, оказавшейся в результате микроделеции в гемизиготном состоянии на интактном гомологе.

Болезни, которые возникают вследствие микроделеций или микродупликаций участка хромосомы, содержащего несколько генных локусов, называют смежными генными синдромами. По своей природе смежные генные синдромы находятся на границе между менделирующими моногенными заболеваниями и хромосомными болезнями. Типичным примером такого заболевания является синдром Прадера-Вилли, возникающий вследствие микроделеции размером 4 Mb в регионе q11-q13 на хромосоме 15 отцовского происхождения. Микроделеция при синдроме Прадера-Вилли затрагивает 12 импринтированных генов (SNRPN, NDN, MAGEL2 и ряд других), которые в норме экспрессируются только с отцовской хромосомы. Точковые мутации в каждом из этих генов возможны, но для развития заболевания критичным является отсутствие экспрессии всего набора импринтированных генов в этом регионе.

Микроделеции и микродупликации одного и того же хромосомного региона, являясь по отношению друг к другу реципрокными продуктами неаллельной гомологичной рекомбинации между блоками сегментами дупликаций, ведут к так называемым синдромам реципрокных микроделеций и микродупликаций. Всего на настоящий момент известно о 60 таких хромосомных регионах, однако их список постоянно пополняется. Примерами заболеваний являются синдром Вильямса-Бойрена (del 7q11.23) и синдром дупликации 7q11.23; синдромы Смит-Магенис (del 17p11.2) и Потоки-Лупски (dup 17p11.2); синдром Миллера-Дикера (del 17p13.3) и синдром дупликации 17p13.3. В сравнительном аспекте пациенты с синдромами реципрокных микроделеций и микродупликаций по конкретному хромосомному сегменту могут иметь либо сходные, либо диаметрально противоположные клинические признаки (например, микроцефалию и макроцефалию), что в значительной степени определяется генным составом в области хромосомной перестройки, а также наличием дозозависимых генов. Кроме того, могут быть отмечены признаки, специфичные только для микроделеции или только для микродупликации конкретного хромосомного региона. Наконец, следует отметить, что изменения копийности определенных хромосомных сегментов не ограничиваются только микроделециями и микродупликациями, а могут быть представлены микротрипликациями (частичные тетрасомии) и даже тетрапликациями (частичные пентасомии).

Рассмотрим некоторые примеры синдромов реципрокных микроделеций и микродупликаций.

Синдром Вильямса-Бойрена и синдром дупликации 7q11.23. Оба заболевания вызваны реципрокными микроделециями и микродупликациями в сегменте 7q11.23. Частота синдрома Вильямса-Бойрена составляет 1:10000 новорожденных. Основные клинические признаки: умеренная микроцефалия, характерные лицевые дисморфии - «лицо эльфа» у детей, плоская переносица, маленький вздернутый нос, длинный фильтр, маленький подбородок; у взрослых - более грубые черты лица, широкий лоб, полный кончик носа, полные губы, преждевременная седина. До 70% пациентов имеют пороки сердца, наиболее распространенным из которых является надклапанный стеноз аорты.

Микродупликации 7q11.23 выявляются с частотой 1:1000 среди пациентов с нарушениями развития и умственной отсталостью. Основные клинические признаки синдрома микродупликации 7q11.23: умственная отсталость, расстройства аутистического спектра, беспокойство, агрессия, тяжелая задержка развития речи, черепно-лицевые дисморфии (широкий лоб, прямые брови, широкая переносица, короткий фильтр, тонкая верхняя губа). Так же как и для микроделеционного синдрома Вильямса-Бойрена, для пациентов с микродупликациями 7q11.23 характерны пороки сердца (надклапанный стеноз аорты, дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородки). Оба синдрома обусловлены изменениями копийности 25-30 генов, попадающих в регион микроделеций и микродупликаций. Минимальный критический регион имеет размер 1,5 млн п.н. В его составе выделяют кандидатный ген ELN, гаплонедостаточность которого приводит к аномалиям соединительной ткани и порокам сердца.

Синдромы частичной моносомии и частичной трисомии 17q21.31. Микроделеция 17q21.31 (синдром Кулена-Де Ври) выявляется с частотой 1:716 среди пациентов с умственной отсталостью. Клинически синдром характеризуется задержкой физического и умственного развития, выраженной неонатальной гипотонией, нарушением сосательного рефлекса и плохим вскармливанием, диспраксией, лицевыми аномалиями, среди которых отмечаются: вытянутое лицо, птоз, блефарофимоз, бульбообразный кончик носа, крупные и низко посаженные уши. Дружелюбное расположение и частые приступы смеха напоминают синдром Энгельмана.

Частота реципрокных микродупликаций 17q21.31 составляет 1:3268 среди пациентов с умственной отсталостью и ВПР. Основные клинические признаки синдрома: легкая степень умственной отсталости, расстройства аутистического спектра, нарушения речи, микроцефалия, лицевые дисморфии (дисплазия ушной раковины, короткий нос, короткий фильтр, готическое нёбо, выступающие резцы), микрогнатия, клинодактилия V пальца, синдактилия, низкий рост, гирсутизм.

Область 17q21.31 фланкирована низкокопийными повторами, детерминирующими возникновение реципрокных микроделеций и микродупликаций с размером 500-600 т.п.н. Аберрации затрагивают всего 5 генов, кандидатным из которых рассматривается KANSL1, кодирующий белок комплекса гистоновых ацетилтрансфераз. Показано, что делеция данного гена достаточна для формирования синдрома Кулена-Де Ври.

В отдельную группу микроделеционных синдромов выделяют заболевания, возникающие вследствие утраты субтеломерных участков хромосом. Диагностика таких перестроек с помощью стандартного метафазного анализа G-окрашенных препаратов достаточно затруднительна вследствие ограниченных разрешающих возможностей, накладываемых световой микроскопией. Однако внедрение в практику диагностики хромосомных болезней FISH-метода с использованием уникальных ДНК-зондов, комплементарных субтеломерным районам хромосом, а также применение микрочиповых технологий позволили уточнить цитогенетическую природу ряда патологических состояний, проявляющихся умственной отсталостью различной степени выраженности и множественными ВПР. В настоящее время известны хромосомные синдромы, обусловленные аномалиями субтеломерных регионов практически каждой хромосомы в кариотипе человека. Отметим некоторые из них.

Синдром частичной моносомии 1p36 является самым распространенным микроделеционным синдромом. Его частота составляет 1:5000 новорожденных. 95% делеций возникает de novo, из них 60% происходит на хромосомах материнского происхождения, а 40% - на хромосомах, наследованных от отца. Известны терминальные и интерстициальные формы делеций. Основные клинические признаки: задержка развития, умственная отсталость от умеренной до сильной степени тяжести, нарушения слуха, эпилептические приступы, гипотония, пороки сердца и ряд дисморфических черт лица, среди которых выделяются уплощенная переносица, глубоко посаженные глаза, гипертелоризм, гипоплазия средней части лица, заостренный подбородок. Кандидатными генами для данного синдрома рассматриваются протоонкоген SKI, ген β-субъединицы калиевого канала KCNAB2, а также ген матричной металлопротеиназы MMP23, вовлеченные, как предполагают, в патогенез лицевых дисморфических признаков, эпилепсии и краниосинтоза соответственно.

Синдром Питта-Роджера-Данкса обусловлен микроделецией 4p16.3, протяженностью менее 3,5 млн п.н. По существу, это клинически более мягкий вариант синдрома Вольфа-Хиршхорна. Характеризуется отставанием в росте, микроцефалией и умственной отсталостью.

Синдром Куррарино связан с микроделецией 7q36, приводящей к потере гомеобоксного гена HLXB9. Среди клинических признаков характерными являются крестцовый дисгенез и аноректальная атрезия.

Синдром Джекобсена, или синдром частичной моносомии 11q, обусловлен микроделециями субтеломерных сегментов q23, q24, q25 длинного плеча хромосомы 11. Клинически проявляется умеренной задержкой умственного развития и задержкой постнатального роста. Среди характерных признаков заболевания отмечаются тригоноцефалия, гипертелоризм, эпикант, птоз, короткий нос, длинный фильтр, ретрогнатия, аномалии конечностей, пороки сердца, тромбоцитопения.

Синдром α-талассемии, сцепленный с умственной отсталостью, или синдром ATR-16. Развитие данного смежного генного синдрома обусловлено микроделецией 16p13.3, ведущей к утрате α-глобиновых генов HBA1 и HBA2, а также гена SOX8, экспрессирующегося в головном мозге, с утратой которого связывают формирование умственной отсталости. Основными клиническими признаками синдрома являются лицевые аномалии (гипертелоризм, скошенные вниз глазные щели, широкая уплощенная переносица), α-талассемия, умственная отсталость.

В заключение следует подчеркнуть, что хромосомные болезни, обусловленные числовыми или структурными нарушениями хромосом, занимают заметное место в структуре врожденной и наследственной патологии человека. Накопленные в литературе данные свидетельствуют о том, что даже незначительные по протяженности аберрации тех или иных хромосомных регионов могут иметь выраженный патологический эффект, проявляющийся клинической картиной хромосомного заболевания. Таким образом, точная идентификация природы хромосомного дисбаланса является важным элементом в постановке диагноза, прогнозе повторного возникновения данного заболевания в семье и в установлении генофенотипических корреляций. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа позволяют провести такие исследования, а их применение в области пренатальной и преимплантационной генетической диагностики становится эффективным средством профилактики хромосомной патологии.

При обсуждении проекта «Геном человека» в 1980-е годы едва ли не самым важным аргументом в пользу его принятия звучало положение о том, что полученные знания по анатомии генома человека позволят решить многие важные вопросы патологии человека, и прежде всего тех болезней, которые принято называть социально значимыми и широко распространенными, многофакторными заболеваниями (МФЗ): опухолевые, сердечно-сосудистые, СД, бронхиальная астма, нейропсихические и др. Предполагалось, что, поняв молекулярно-генетическую природу этих болезней, удастся предложить клинической практике такие тесты (в том числе генетические), которые существенно улучшат качество медицинской помощи населению в отношении своевременного диагноза, прогноза и лечения. Но это удалось преимущественно в отношении менделевской (моногенной) патологии.

Наследственная природа широко распространенных заболеваний по-прежнему в значительной степени остается областью terra incognita. В ходе выполнения проекта развивались и укреплялись концепции геномной медицины, предложенные А. Боде (1999), и индивидуализированной (персонализированной) медицины, образно названной Б. Блумом (1999) «бутик-медициной». Таким образом, современная медицина представляет собой триединство социальной, геномной и персонализированной медицины. Несколько иной аспект проблемы просматривается в концепции четырех «П» в медицине, предложенной Л. Гуудом (2004) (предиктивная, персонализированная, превентивная и патисипаторная), в которой по каждой компоненте обсуждаются генетические аспекты.

С генетической точки зрения все МФЗ разделяют на две группы. МФЗ могут возникать внутриутробно (ВПР) или в любом периоде постнатального развития (болезни с наследственной предрасположенностью).

ВПР, такие как расщелина губы и нёба, анэнцефалия, гидроцефалия, косолапость, вывих бедра и другие, формируются внутриутробно к моменту рождения и, как правило, диагностируются в самые ранние периоды постнатального онтогенеза. Их развитие является результатом взаимодействия многочисленных генетических факторов с неблагоприятными материнскими факторами или факторами среды (тератогены) в период развития плода. Они встречаются в популяциях человека по каждой нозологической форме нечасто, но суммарно составляют 3-5%.

Другая группа - болезни с наследственным предрасположением - самая обширная группа МФЗ, развиваются во взаимодействии с факторами внешней среды в постнатальном онтогенезе. Эта группа включает социально значимые распространенные болезни: сердечно-сосудистые (инфаркт миокарда, артериальная гипертензия, инсульт), бронхолегочные [бронхиальная астма, хронические обструктивные заболевания легких (ХОБЛ)], психические (шизофрения, биполярный психоз), злокачественные новообразования, инфекционные болезни и другие.

Общая концептуальная модель причин (факторов) возникновения и развития МФЗ включает генетические, эпигенетические, средовые и стохастические факторы. Тенетигеский контроль развития болезни может быть в форме аддитивного действия многих генов с небольшим эффектом для каждого, либо один из них является главным, а остальные оказывают модифицирующее влияние на клинические проявления болезни. На формирование патологического фенотипа, обусловленного изменчивостью первичной структуры молекулы ДНК (мутации, полиморфизмы), также оказывает влияние эпигенетический контроль активности (экспрессии) генов. В этом случае наследуемые и обратимые изменения в геноме не сопровождаются изменениями самой структуры молекулы ДНК, а генная активность определяется вариациями статуса метилирования ДНК и/или вариациями структурной организации хроматина. Такие эпигенетические изменения способны передаваться не только в рамках клеточной наследственности в индивидуальном развитии, но и через половое размножение. Частота таких эпигенетических вариаций (эпимутаций) может на один-два порядка превышать частоту генных мутаций. Роль внешнесредовых факторов очевидна, но до сих пор остается слабо изученной проблема их взаимодействия с наследственными факторами (генно-средовые взаимодействия). Наши геномы, вероятно, плохо адаптированы, о чем свидетельствует «омоложение» многих МФЗ в условиях недавних глобальных изменений окружающей среды.

Прежде всего обозначим три основных источника наших представлений о наследственной природе широко распространенных заболеваний: генеалогическая генетика, генетическая эпидемиология и медицинская геномика. Они являются одновременно названиями этапов истории изучения генетики этой группы патологии у человека, но также и подходами к уяснению роли генетических факторов. Каждый из подходов интегрирует совокупность своих методов анализа наследственной компоненты предрасположенности к болезням. Однако такое разделение очень условно: индивидуально-семейный уровень (генеалогия), популяции (эпидемиология) и геном (геномика) тесно взаимосвязаны, выступая одновременно объектом исследования и методами анализа.

Кроме того, важно отметить, что сложные фенотипы МФЗ можно разделить на две категории - качественные и количественные признаки. Наличие или отсутствие болезни у пациента представляет собой качественный признак (дискретный). В то же время фенотип МФЗ характеризуется разнообразными количественными (меристическими) признаками, измеримыми физиологическими и биохимическими параметрами, например рост, индекс массы тела, уровень артериального давления и сахара крови, концентрация холестерина в крови и др. Именно разработка методов анализа роли генетических и внешнесредовых факторов в изменчивости таких количественных признаков, основанных на изучении корреляций по этим признакам между родственниками, а также формулирование концепции так называемой количественной наследственности и обоснование возможности использования моделей наследования количественных признаков в изучении наследственной предрасположенности МФЗ, развиваясь в аналитических деталях, до сих пор составляют основу понимания генетики МФЗ.

Термин «гены предрасположенности (подверженности)» широко используется в научной литературе и практике врачей. Он использовался нами на предыдущих страницах и будет употребляться далее для краткости. Однако нельзя не отметить определенную некорректность такого сочетания. Она состоит в предположении, что якобы такие гены встречаются только у больных или лиц из групп риска. Но на самом деле гены или набор генов у разных людей один и тот же, лишь некоторые варианты генов (аллели) определяют предрасположенность к болезням. Правильнее говорить: аллель гена, ответственный за развитие заболевания или определяющий (вовлеченный) в патогенез болезни. В этом контексте наследственная предрасположенность представляет индивидуальную комбинацию аллельных вариантов генов, делающих человека чувствительным к определенным заболеваниям. Предрасположенность не является строго причиной болезни. Она лишь повышает вероятность развития болезни.

Следует заметить, что любое МФЗ характеризуется большим числом фенотипических проявлений и анализ каждого из них в отдельности не позволяет судить о генетической детерминации процесса в целом, всего «конечного» фенотипа, собственно болезни. Обычным приемом генетических исследований является расчленение сложных признаков на отдельные фены (ведущие синдромы болезни или факторы риска болезни), каждый из которых может иметь собственную меру генетической детерминации. Как для многих болезней многофакторной природы, так и для их клинических проявлений идентифицированы аллели генов предрасположенности или устойчивости.

Систематическое накопление данных о связи полиморфных вариантов генов с МФЗ, анализ их воспроизведения в разных популяциях и этнических группах, обобщение всей известной информации о патогенетической и функциональной значимости конкретных генных вариантов являются современной задачей клинической генетики. Результаты этих исследований будут изложены кратко для некоторых хронических неинфекционных заболеваний, иммунозависимых и инфекционных болезней.

Системы здравоохранения разных стран все в большей степени начинают ориентироваться на персонализированное здравоохранение. Самой идее персонализированной медицины не менее двух тысяч лет. И она принадлежит римскому врачу Галену, заметившему: «Однако всегда нужно помнить, что ни одна внешняя причина не является эффективной сама по себе, если сам организм не обладает предрасположенностью. В противном случае внешние причины, действующие на одного, действовали бы на всех».

Конечно, клиническая медицина всегда искала, находила и использовала отдельные соматометрические, психологические или биохимические маркеры, по которым диагноз или прогноз у пациента индивидуализировался. Это была позиция отечественных клиницистов - М.Я. Мудрова, С.П. Боткина, Н.И. Пирогова. «Я вам скажу кратко и ясно: врачевание состоит в лечении самого больного», - утверждал М.Я. Мудров (1820). Из представителей западной медицины следует упомянуть выдающегося терапевта Уильяма Ослера (1892), который поддерживал идею индивидуального подхода к пациенту, подчеркивая нелегкость такой задачи: «Если бы не эта огромная вариабельность, медицина могла бы быть наукой, а не искусством».

Однако сегодня новый этап в развитии этого направления - клиническая медицина пытается оценить свою готовность к осуществлению персональных геномных услуг в отношении широко распространенных заболеваний человека. По этому поводу ведутся острые дискуссии, разделившие их участников на две полярные группы: на тех, кто отстаивает идею «контроля» и «запрета», особенно в отношении так называемого прямого, минуя медицинские учреждения, генетического тестирования, и тех, кто выбирает «интеллигентные и инновационные модели», полагающих, что общественное персональное партнерство может разрешить спорные вопросы.

Называют разные барьеры на пути к осуществлению персональных геномных услуг. Среди них: недостаточность современных знаний о межгенных и взаимодействиях «ген-среда», о взаимоотношениях генетической информации с эпигенетическими факторами; до сих пор известна малая доля идентифицированных наследственных факторов, различающих риски болезней; необходимость перестройки системы здравоохранения, включающей образование врачей и пациентов, автоматизацию идентификации геномной информации, экономические оценки перехода к осуществлению персональных геномных услуг и др.

Для преодоления разрыва между генетическими достижениями (новые знания и технологии) и их клинической обоснованностью и выгодой для применения в здравоохранении в США объявлено о создании GAPPNet (Genome Applications in Practice and Prevention Network) - сети, объединяющей Центр контроля и профилактики заболеваний, национальные институты здоровья, включая академии, представителей правительства, специалистов общественного здоровья, психологов, страховые компании, СМИ, бизнес, биотехнологию, фарминдустрию. Подобные структуры существуют в странах Европейского союза, но отсутствуют в отечественной медицине.

Генетигеское тестирование. Идентификация генов предрасположенности к болезням и разработка тестов, подтверждающих или предсказывающих наследственное предрасположение к болезням многофакторной природы, с энтузиазмом приветствуется научной общественностью. Вместе с этим внедрение генетических тестов в клиническую практику поднимает множество вопросов, касающихся правил их применения и этики.

Тестирование предрасположенности к МФЗ, как отмечено в рекомендациях Европейского общества генетиков человека (март, 2009), сегодня имеет ограниченное клиническое значение. Для этого есть по крайней мере две основные причины: существует значительное несоответствие между параметрами наследуемости (h² ) для конкретных заболеваний и идентифицированными вариантами генов подверженности им - то есть существует значительная доля «недостающей наследственности» (missing heritability); малые эффекты ассоциированных аллельных вариантов генов предрасположенности. Однако необходимо иметь в виду, что речь идет о популяционных оценках тестирования предрасположенности к МФЗ; соотношение генетического вклада и наследуемость - это измерения на популяционном уровне, которые неприемлемы по отношению к оценкам риска на индивидуальном уровне. Так, было бы ошибкой советовать женщине, получившей положительный результат по мутации 538 ins C в гене BRCA1, не воспринимать всерьез 80% вероятность возникновения рака груди только потому, что эта мутация объясняет всего 1,1% дисперсии риска рака груди, тем более что это содержательно разные риски.

В предиктивном (прогнозирующем) генетическом тестировании генетический материал анализируется для идентификации редких мутаций или полиморфизмов генов, которые увеличивают вероятность развития болезни. Предиктивное тестирование отличается от диагностического тестирования тем, что оно используется для оценки риска у тех индивидуумов, у которых нет симптомов болезни. Диагностическое тестирование применяют для подтверждения диагноза у тех, кто уже болен.

Внедрение предиктивного генетического тестирования в медицинскую практику не меняет фундаментальным образом обязанности врачей перед своими пациентами и не приводит к новым этическим дилеммам - нет четких значимых различий между генетическими и негенетическими тестами, оправдывающих различные подходы для тестирования клиницистами. Для обоих типов тестов все проблемы рассматриваются в континууме от благоприятных эффектов до вредоносных («польза-вред»). И в своих «вредных» последствиях для самих пациентов, их членов семьи и других родственников они достаточно сходны. Серьезный психологический вред (депрессия, беспокойство, навязчивый страх), дискриминационные последствия, переживания из-за необходимости изменения коренного стиля жизни сходны для лиц, получивших положительный результат на носительство ВИЧ, предрекающее развитие СПИДа; на туберкулиновую пробу, прогнозирующую развитие острого туберкулеза; высокие уровни артериального давления и холестерина, указывающие на повышенный риск развития сердечно-сосудистой патологии; детекцию мутаций в генах BRCA1/ BRCA, увеличивающую риск развития у женщин рака молочной железы или яичника. По всей видимости, генетическое тестирование находится в самом начале своего участия в персонализированной медицине. Но нет сомнений в неотвратимости этого подхода и важности продвижения его в практику.

На этом пути могут быть полезны следующие ориентиры.

Персональные геномы. Интерес к предсказанию фенотипа болезни по индивидуальному геному растет, снимаются ограничения по мере развития и удешевления технологий секвенирования, но центральной проблемой остается понимание эффектов многочисленных вариантов генов в нашем геноме, важные для клинической медицины.

Первая серьезная попытка интегрального анализа полного генома человека в клиническом контексте, убедительно показавшая, по мнению авторов исследования, что «полное секвенирование может дать клинически полезную информацию для конкретного пациента», была предпринята в Стэндфордском центре наследственных сердечно-сосудистых болезней.

Объектом исследования был 40-летний практически здоровый мужчина. В его родословной, охватывающей четыре поколения, отмечены случаи ранней КБ сердца, аневризмы абдоминальной аорты, остеоартрита и внезапной (аритмогенной) смерти. Геномная часть исследования (анализ 2,6 млн SNP и 752 CNV) включала три типа вариантов: новые мутации и редкие варианты в генах менделевских болезней; варианты, которые могут модифицировать ответ на лекарственные препараты; варианты, ассоциированные с риском МФЗ.

У пациента были обнаружены редкие варианты в трех генах, которые ассоциированы с внезапной кардиологической смертностью, - TMFM43, DSP и MYBPC3. Вариант в гене LPA был соотнесен с семейной отягощенностью по КБ. Пациент оказался гомозиготой по нулевой мутации CYP2C19, что предполагает вероятную резистентность к клопидогрелю, а также имел несколько вариантов, ассоциированных с положительным ответом на гиполипидемическую терапию, и вариантов в генах CYP4F2 и VKORC1, которые предполагают, что пациенту необходимы низкие начальные дозы при необходимости лечения варфарином. Кроме того, были выявлены потенциально опасные варианты в гене гемохроматоза и стоп-мутация в гене, вовлеченном в развитие гиперпаратиреоза и паратироидных опухолей. В связи с последними находками пациент был отправлен на диспансеризацию и специальное обследование.

Спустя два года, в 2012 году, в этом же центре впервые было проведено другое исследование 54-летнему пациенту - анализ, в котором были сконцентрированы профили геномики (полногеномное секвенирование), транскриптомики, протеомики и метаболомики. Это исследование получило название - iPOP (integrative Personal Omics Profile), «Интегративный профиль персональных омик», длилось оно 14 мес и включало 3 млрд измерений в 20 временных точках. Более того, полногеномное секвенирование было осуществлено и у матери пациента. Кроме важной научной информации, были получены полезные сведения о здоровье обследованного и намечены основные направления в коррекции зафиксированных метаболических отклонений и последующего динамического наблюдения.

Предстоит еще много сделать в разработке методов интеграции генетических и клинических данных (геном-информированная медицина), прежде чем будут использоваться персональные геномы в клинической практике.

Среди них называют следующие.

Готовы ли мировые системы здравоохранения к персонализированной медицине? Две ремарки по этому поводу.

В Северной Америке имеется около 2500 обученных генетических консультантов и 1100 клинических генетиков. Отечественное здравоохранение обладает значительно меньшим потенциалом. И далее - обычный человек может нуждаться в информации приблизительно о 100 генетических рисках, обнаруживаемых в его геноме. Даже если в среднем информация занимает 3 мин на болезнь, то процесс консультирования пациента будет занимать до 5 ч рабочего времени врача.

Данный класс заболеваний связан со значительной степенью экспансии тринуклеотидных повторов различной конфигурации, расположенных в некодирующих областях генов. Число копий тандемных повторов в мутантном аллеле может в десятки и сотни раз превышать нормальные значения, что сопровождается нарушением механизмов транскрипции и резким падением содержания продукта мутантного гена в тканях.

Данная группа заболеваний связана с экспансией микросателлитных повторов в нетранслируемых областях генов, причем патологически удлиненные РНК-транскрипты реализуют свой цитотоксический эффект за счет связывания и инактивации разнообразных регуляторных клеточных пептидов (Shin J. et al., 2009).

Полиглутаминовые заболевания представляют собой большую группу прогрессирующих нейродегенераций, при которых динамическая мутация затрагивает многокопийные тандемные повторы (CAG)_n в транслируемой области гена (Иллариошкин C.H., 2003; Paulson H.L., 1999). CAG-кодон является глутамин-кодирующим, поэтому на уровне белка нормальный и экспандированный аллели реализуются в виде полиглутаминовых цепей пропорциональной длины. При этом мутантный белок меняет свои свойства и конформацию, становясь цитотоксичным для определенных популяций нейронов (Orr H.T., Zoghbi H.Y., 2007).

Полиаланиновые заболевания обусловлены экспансией транслируемых последовательностей, кодирующих полиаланиновые тракты (Messaed C., Rouleau G.A., 2009). В норме полиаланины входят в состав различных регуляторных белков - факторов транскрипции, процессинга мРНК и др. (Lavoie H. et al., 2003). Экспансия полиаланиновых трактов сопровождается нарушением конформации мутантного белка, изменением его функции или клеточной локализации, что ведет к дизрегуляторной транскрипционной патологии и лежит в основе цитотоксичности.

Основным представителем группы полиаланиновых заболеваний является окулофарингеальная миопатия (MIM 164300). Она представляет собой позднюю форму прогрессирующей мышечной дистрофии, обычно манифестирующую на 6-м десятилетии жизни. В большинстве случаев тип наследования аутосомно-доминантный, но описаны и единичные семьи с аутосомно-рецессивной передачей болезни (Fardeau M., Tome F.M., 1994).

Ген окулофарингеальной миопатии на хромосоме 14q11.2-13 ответственен за синтез ядерного поли-А-связываюшего белка РАВРN1, служащего фактором полиаденилирования мРНК (Brais B. et al., 1998). У всех больных обнаруживается увеличение числа копий тандемных тринуклеотидных повторов (GCG)_n в 1-м экзоне PABPN1: в норме ген содержит 6 GCG-копий повторов, кодирующих полиаланиновый участок в N-терминальной области белка, тогда как у больных число повторов в мутантном гене увеличено до 8-13 копий (Brais B. et al., 1998; Mirabella M. et al., 2000). Удлинение полиаланинового участка белка РАВРN1 приводит к олигомеризации мутантных белковых молекул и образованию характерных внутриядерных включений. В нормальной популяции у 2% лиц на одной из хромосом обнаруживается «промежуточный» аллель гена, имеющий 7 повторов GCG, наличие которого в гетерозиготном состоянии не сопровождается какими-либо симптомами. Однако у гомозиготных носителей аллеля (GCG)₇ развивается клиника окулофарингеальной миопатии, причем в таких семьях имеет место аутосомно-рецессивный тип наследования болезни (Brais B. et al., 1998). Гомозиготность по более длинным, заведомо патологическим GCG-повторам характеризуется развитием более тяжелой клинической картины и более ранним дебютом симптомов (в среднем на 18 лет раньше, чем у гетерозигот по мутации) (Blumen S.C. et al., 1999).

Окулофарингеальная миопатия характеризуется развитием прогрессирующей слабости и атрофий проксимальных отделов конечностей, расстройствами глотания и фонации, птозом, нарушением движений глазных яблок. На поздней стадии присоединяется слабость лицевой мускулатуры. Заболеванию свойственно хроническое многолетнее течение. Патоморфологическая картина включает миодистрофические изменения указанных групп скелетных мышц и наличие патогномоничных РАВРN1-позитивных филаментозных внутриядерных включений в мышечных волокнах (Fardeau M., Tome F.M., 1994; Emery A.E., 1998). Клиническая диагностика окулофарингеальной миопатии базируется на характерном распределении мышечных симптомов и данных игольчатой ЭМГ, подтверждающих первично-мышечный тип поражения.

ДНК-диагностика окулофарингеальной миопатии предполагает обнаружение на электрофореграмме двух различных продуктов ПЦР, соответствующих нормальному (6 копий GCG-повторов) и экспандированному (≥8 копий) аллелям гена PABPNl. Выявление «промежуточного» ПЦР-продукта с 7 повторами GCG является диагностически значимым в том случае, если оба аллеля имеют такой размер либо второй аллель является заведомо мутантным (≥8 повторов GCG). При медико-генетическом консультировании указанным вариантам межаллельных взаимодействий уделяется первостепенное внимание, поскольку они определяют тип наследования и тяжесть заболевания.

Удлиненный полиаланиновый тракт может выявляться еще при нескольких заболеваниях человека, сопровождающихся разнообразными врожденными аномалиями развития: к ним относятся синполидактилия II типа, реберно-краниальная дисплазия, голопрозенцефалия 5-го типа, врожденный центральный гиповентиляционный синдром, Х-сцепленный гипопитуитаризм и др. (Messaed C., Rouleau G.A., 2009). Однако при всех этих синдромах идентифицированы и другие, «традиционные» типы мутаций (миссенс, нонсенс, сдвиг рамки, дупликации, делеции). Таким образом, в отличие от окулофарингеальной миопатии, при указанных дизэмбриогениях роль полиаланиновой экспансии остается не вполне ясной. Предполагается, что эти заболевания могут представлять собой не истинные «болезни экспансии», а результат неравного кроссинговера между двумя ложно ориентированными нормальными аллелями (Warren S.T., 1997; Utsch B. et al., 2002).

Список литературы

ВПР представляют значительную проблему для здравоохранения, так как они вносят существенный вклад в структуру детской смертности (15-20%), перинатальной смертности (2530%), младенческой смертности (25%). Частота ВПР среди новорожденных составляет 2-3%, пороков, выявляемых в более поздние сроки, - до 5%.

ВПР возникают внутриутробно в результате нарушений эмбрионального развития, которое определяется действием продуктов генов, взаимодействующих с клеточным и средовым окружением. Продукты генов включают регуляторы транскрипции, факторы диффузии и другие белки, направляющие клетки по специфическим путям развития.

В Международной классификации болезней применяются термины «врожденная аномалия» (congenital anomaly) или «врожденный дефект» (birth defect). По содержанию они включают в себя обширный круг патологических состояний:

ВПР в узком смысле слова (congenital abnormality) - это стойкие морфологические изменения органа или всего организма, выходящие за пределы вариаций их строения. Более полное определение звучит так: ВПР - это патологическое состояние, которое представляет собой стойкий структурный или морфологический дефект органа или его части, возникающий внутриутробно и нарушающий функцию пораженного органа.

Выделяют следующие типы пороков развития.

Проявления ВПР различной этиологии могут перекрываться. Например, порок развития сосудов может привести к дизрупции дистальных структур и пороку развития мочеполовой системы, в свою очередь вызывающему маловодье, приводящее к деформациям у плода.

Классификация ВПР в зависимости от частоты встречаемости (ВОЗ, 2002):

Частота всех ВПР - 600 на 10000 живорожденных (6%).

Классификация по тяжести проявления ВПР:

Классификация по проявлению ВПР:

Классификация по этиологии ВПР:

В зависимости от стадии пренатального онтогенеза, на которой начинает формироваться патология, различают гаметопатии, бластопатии, эмбриопатии и фетопатии.

Гаметопатии связаны с возникновением (или наличием) мутаций в половых клетках родителей; основное содержание гаметогенеза заключается в кодировании морфогенетической информации, в процессе реализации которой из зиготы развивается многоклеточный организм. Примерами гаметопатий являются наследственные синдромы.

Бластопатии - поражение бластоцисты (зародыша первых 15 дней после оплодотворения). Бластогенез обозначают как первый критический период, когда на зародыш действуют правила закона «все или ничего». Первые деления, дробления зародыша осуществляются за счет генетической информации, полученной ооцитом еще в период гаметогенеза. Зародыш человека обладает достаточным запасом белков, рибонуклеопротеиновых комплексов, необходимых для синтеза новых белков, а также питательных веществ и энергетических ресурсов, полученных от матери. Переключение индивидуальной генетической программы с материнской РНК на геном зародыша происходит постепенно, считается, что этот процесс начинается только со стадии 4-8 бластомеров. Следствием бластопатий могут являться двойниковые пороки, циклопия, сиреномелия. Возможно, что определенная часть моносомий и трисомий также является следствием бластопатий.

Эмбриопатии - поражение эмбриона (зародыша от 16-го дня до конца 8-й недели). Эмбриональный морфогенез включает гистогенез и органогенез, которые представлены в основном процессами размножения, миграции, дифференцировки и апоптоза клеток. Эти процессы контролируются сложным взаимодействием генетических, эпигеномных и внешних факторов, определяющих временную и пространственную последовательность экспрессии генов. «Включение» одних и «выключение» других генов происходит на протяжении всего эмбриогенеза. Нарушение любого механизма влечет за собой отклонение от нормального развития и может реализоваться в ВПР. Нарушение размножения клеток (снижение митотической активности) ведет к торможению пролиферативной активности клеток, даже к полной ее остановке. Например, гипоплазия или аплазия органа, дизрафии (расщелины губы и/или нёба, дефекты невральной трубки). Нарушение миграции клеток приводит к гетеротопии, агенезии органа и другим порокам. Программируемое перемещение клеток играет основную роль в развитии ЦНС, которая возникает из нервной трубки (цилиндра клеток, формирующегося в течение первых 4-5 нед эмбриогенеза). ЦНС строится волнами миграции клеток-предшественниц нейронов. Нейроны, заполняющие внутренние слои коры мозга, начинают мигрировать на более ранних стадиях развития, и каждая последующая волна нейронов, формируя очередной внешний слой, проходит через ранее заполненные внутренние слои. При наличии мутации в одной из копий гена L1S1 при синдроме Миллера-Дикера волны миграции кортикальных нейронов не происходят. В результате образуется плотная кора мозга с большим количеством клеток и плохо сформированными извилинами, что делает поверхность мозга гладкой (лиссэнцефалия). Дифференцировка клеток, происходящая в течение всего эмбриогенеза, может прекратиться на любом этапе развития, что повлечет за собой рост бесформенной массы недифференцированных клеток (ранние абортусы), агенезию или морфологическую незрелость органа, персистирование (сохранение) эмбриональных структур. Апоптоз - программируемая смерть клеток. Она происходит везде, где ткани должны перестраиваться в ходе морфогенеза, например при разделении пальцев, перфорации анальной мембраны, при создании сообщения между маткой и влагалищем. В основе некоторых форм врожденных заболеваний сердца также лежат дефекты апоптоза.

В сложном процессе эмбрионального развития принимают участие не только взаимодействующие между собой гены и их комплексы, но и среда, в которой эти наследственные факторы должны реализоваться. Такая пренатальная (внутренняя) среда формируется организмом матери и, естественно, зависит как от ее здоровья и питания, так и от воздействия на организм матери и плода факторов (химических, физических и др.) внешней среды. Более того, и в развивающемся зародыше создается определенная среда, которая может оказать модифицирующее действие на реализацию нормального или мутантного гена. Например, хорошо известны различия в пренатальном развитии генетически идентичных монозиготных близнецов, имеющих различную площадь бассейна плацентарного кровообращения. Точно так же определяются различия при ряде наследственно обусловленных пороков развития мочевой системы (двусторонние арении, атрезии уретры, тяжелые формы инфантильного поликистоза) в связи со значительным изменением условий развития зародыша. Подавляющее большинство ВПР, независимо от этиологии, образуется в этот период.

Фетопатии - повреждение плода в период от 9 нед до окончания беременности. ВПР этой группы сравнительно редки, так как они формируются после завершения основных процессов органогенеза. Например, сохранение первоначального расположения органов (крипторхизм, тазовая почка), пороки, вызванные СД матери, и другие метаболические фетопатии.

ВПР - этиологически гетерогенная группа нарушений, в происхождении которых играют роль как экзогенные, так и наследственные факторы. В ходе внутриутробного развития целый комплекс генов последовательно включается в работу, обеспечивая сложные процессы дифференциации тканей; таким образом, сбой механизма включения и выключения генов на любом этапе внутриутробного развития может привести к формированию ВПР различной степени тяжести. Действие генов, контролирующих морфогенез и раннее развитие зародыша человека, изучено недостаточно. Однако в настоящее время идентифицированы многие гены и генные семейства, которые играют важную роль в раннем периоде развития. Одним из представителей семейства эмбриональных генов являются гомеобоксные гены (Hox). Продукты этих генов - транскрипционные факторы осевой дифференцировки эмбриона. Морфогенетический белок SHH экспрессируется в раннем эмбриогенезе, и результатом его активности является активация экспрессии генов групп PAX. Транскрипционные факторы семейства SOX обнаружены в спинном и головном мозге плода, более детально их функция еще не изучена, хотя известны места их локализации: SOX-2 в 3-й хромосоме, SOX-3 в X-хромосоме, SOX-4 в 6-й хромосоме. Описан ген SOX-9 (17-я хромосома), мутации в котором ведут к камптомиелической дисплазии.

Таким образом, большинство генов эмбрионального развития ответственны за выработку белков, называемых транскрипционными факторами, которые могут активизировать или подавлять экспрессию генов, участвующих в координации таких эмбриологических процессов, как сегментация, индукция, миграция, дифференцировка клеток, апоптоз. Эти процессы, очевидно, определяются факторами роста, клеточными рецепторами и др. Мутации в определенных локусах могут нарушать процесс морфогенеза в эмбриональном и постэмбриональном развитии.

Суммарный вклад наследственных факторов в период раннего развития зародыша человека составляет примерно 20% от всего генома. По литературным данным, не более 5-10% всех генов активны в каждую стадию развития, остальные остаются репрессированными. На первых стадиях развития после формирования бластоцисты преимущественно происходит экспрессия тканеспецифических генов; в стадии органогенеза активизируются органоспецифические гены; к началу функционирования органов экспрессируются гены, регулирующие специфические функции специализированных клеток. Таким образом, гены, контролирующие раннее развитие, функционируют лишь на определенной стадии до достижения клетками или тканями определенных этапов дифференцировки. Нарушение любой из стадий этого процесса может привести к нарушению или прекращению дальнейшего развития зародыша.

Типы связей между ВПР. Возникновение множественных ВПР у больного может быть обусловлено различными причинами. Они могут выражать этиологическую или патогенетическую связь, а могут представлять случайные сочетания. Исходя из уровня наших знаний о причинах и механизмах их возникновения, в настоящее время для выражения типа связи существуют следующие понятия.

Синдром - комплекс множественных пороков и аномалий развития, этиологически и патогенетически связанных между собой. Это устойчивое сочетание двух и более не индуцированных друг другом пороков развития в разных системах органов. Примеры: синдром Дауна, синдром Марфана, синдром Тричера-Коллинза, синдром Смита-Лемли-Опитца и другие наследственные синдромы (всего более 4 тыс. нозологических единиц). В основе формирования синдрома лежит плейотропное (множественное) действие гена. Например, синдром бранхио-оторенальной дисплазии состоит из аномалий развития улитки и наружного уха, кист и фистул шеи, дисплазии почек и порока развития мочевыводящей системы. Этот синдром вызван мутацией в гене EYA1, кодирующем белок с функцией фосфатазы, которая также участвует в развитии как слухового аппарата, так и почек.

Следствие (синонимы: аномалад, вторичный порок) - комплекс пороков развития, возникающий вследствие действия одного врожденного порока или физического фактора, который вызывает каскад вторичных нарушений, то есть связь между пороками патогенетическая, а этиология их может быть различной. Примеры: миеломенингоцеле приводит к парезу нижних конечностей, атрофии мышц, косолапости, поражению почек. Маловодье приводит к аномаладу Поттера (причины маловодья могут быть различными). Аномалад Робена развивается вследствие того, что ограничение роста нижней челюсти до 9-й недели беременности заставляет язык лежать больше кзади, чем в норме, создавая помехи нормальному закрытию нёбных пластинок, вызывая расщелину нёба.

Ассоциации - неслучайное сочетание нескольких пороков и аномалий развития, неизвестных как синдром или следствие. Тип связи статистический. Причины возникновения таких комплексов неизвестны. По мере улучшений наших знаний о причинах и механизмах взаимосвязи между симптомами, входящими в ассоциацию, они выделяются как синдромы.

Примеры.

VATERL-ассоциация: дефекты позвоночника (V), атрезия ануса (А), трахеопищеводная фистула (ТЕ), аномалии развития почек и/или лучевых костей ®, дефекты конечностей (L). В связи с тем, что подавляющее большинство новорожденных с этими признаками рождаются от матерей, больных СД, появился термин «синдром VATERL-ассоциации».

CHARGE-ассоциация: колобома глаз (С), порок сердца (Н), атрезия хоан (А), отставание в росте и развитии ®, гипогонадизм (G), аномалии ушей и/или глухота (Е).

MURCS-ассоциация: аплазия мюллерова протока (MU), почечные аплазии ®, дефект шейно-грудных сегментов С5-Т1 ©, отсутствие влагалища и матки (S).

Таким образом, приведенные выше примеры иллюстрируют положение о том, что клиническая практика дисморфологии базируется на научном фундаменте биологии развития, знании об изменениях функции генов, нарушающих нормальное развитие, и их взаимодействии с окружающей средой.

Тератология - область медицины, изучающая причины происхождения, механизмы формирования и проявления различных нарушений роста и развития плода. Эти нарушения могут проявляться как сразу, так и через некоторое время после рождения. По статистике, примерно 30% всей патологии человека приходится дифференцировать между наследственными и ненаследственными заболеваниями, которые могут быть обусловлены тератогенными воздействиями. Тератогенным считается такое влияние, которое приводит к пороку развития эмбриона или плода, нормально развивавшегося до этого воздействия. Тератогенные факторы можно разделить на отдельные группы:

Существуют периоды во внутриутробной жизни человека и животных, в которых чувствительность к тератогенным факторам повышена, они называются критическими. Индивидуальное развитие представляет собой ряд последовательных этапов, различающихся скоростью развития органов или их систем. Наибольшая скорость развития наблюдается в критические, «узловые» периоды эмбриогенеза, такие как имплантация, образование плаценты, период активного органогенеза.

На ранних стадиях эмбриогенеза критические периоды относятся к развитию всего организма, позднее они выявляются в развитии отдельных органов или систем - тех, которые в данный момент претерпевают наиболее активные формообразовательные процессы. Внешние факторы, к которым организм (или отдельный орган) чувствителен в определенные периоды, могут существенным образом влиять на его развитие. Причем различные факторы, действующие в одном и том же периоде, могут вызывать сходные отклонения. И наоборот, один и тот же фактор, действующий на различных этапах, вызывает различные изменения.

Результаты классических исследований эмбриолога П.Г. Светлова (1960) указали на два критических периода в развитии плацентарных млекопитающих, связанных с периодами имплантации и плацентации. Однако в процессе закладки каждого органа также существуют особо чувствительные периоды, когда воздействие неблагоприятных факторов среды может вызвать то или иное отклонение в его развитии. В критические периоды зародыш или плод становится высокочувствительным к действию внешних факторов. Непосредственной причиной аномалии может послужить либо остановка развития той или иной системы организма в критический период, либо нарушение координации в скорости компенсаторных ответных реакций систем развивающегося плода. Краткосрочное возрастание чувствительности в эти периоды эмбриологи объясняют тем, что именно в данные моменты в зародыше происходят важнейшие формообразовательные процессы, определяющие судьбу зачатков отдельных органов или зародыша в целом. Это, например, первые деления дробления зиготы, имплантация, плацентация, начало образования нервной системы или закладка других крупных систем органов, что изображено на рис. 13-1.

Таким образом, в настоящее время принято считать, что:

Согласно современным представлениям, тератогены, действующие в периоды раннего эмбрионального развития, приводят либо к гибели зародыша, либо к аномалиям его строения. Антенатальная гибель у человека, вызванная нарушениями внутриутробного развития, по некоторым данным, достигает 70%, то есть из каждых десяти зачатий семь заканчиваются смертью зародыша. Большинство зародышей гибнет в первые дни своего существования в связи с патологией первых делений дробления зиготы и нарушения имплантации. ВПР возникают главным образом в период органогенеза, когда, согласно теории критических периодов, зачатки органов наиболее активно развиваются (когда происходят процессы дифференциации, миграции клеток, устанавливаются их форма, соотношение частей). Органогенез заканчивается в основных чертах примерно к началу третьего месяца беременности. Последующие месяцы также важны для нормального развития плода, однако тератогенные воздействия в плодном периоде приводят к различным функциональным отклонениям, в том числе к нарушениям обмена веществ и другим нарушениям, не носящим выраженный анатомический характер.

Известно, что выраженность тератогенного воздействия зависит:

Вероятно, для некоторых повреждающих факторов характерен широкий спектр тератогенного действия. В результате происходит поражение всех зачатков органов и тканей, находящихся в это время в стадии активного формирования. Примером такого воздействия может служить эмбриотоксическое действие тератогенов, приводящее к гибели зародыша.

В зависимости от того, на какой стадии закладки органов клетки получат альтернирующий сигнал (от лат. alteration - изменение), сродством с которым они обладают, будет поражен тот или иной орган и сформируется, соответственно, порок той или иной системы. Например, сигнал, влияющий на процесс закрытия нервной трубки, поступивший к клеткам в период формирования нервной системы, приведет к анатомическим дефектам нервной системы. Однако если этот же сигнал поступит к зародышу после смыкания нервных валиков, то анатомического дефекта не будет. На поздних сроках беременности, как уже отмечалось выше, плод иначе реагирует на тератогены. Анатомические aномалии у плода в это время не возникают, а альтернирующие воздействия приводят к небольшим функциональным нарушениям.

В большинстве случаев возникает прямая пропорциональная зависимость выраженности тератогенного эффекта от дозы и продолжительности воздействия тератогена. Однако этот принцип справедлив не для всех тератогенов. Один и тот же тератоген может проявлять на начальных сроках беременности только эмбриотоксическую активность, позднее - как эмбриотоксическую, так и тератогенную, причем иногда при очень небольшом изменении дозы. В ряде экспериментов с заведомыми тератогенами показано, что увеличение дозы в несколько раз вовсе не обязательно вызывает пропорциональное возрастание числа зародышей с ВПР. В то же время иногда возрастание концентрации тератогена лишь вдвое может привести к изменению эффекта от минимального до максимального. Примером может служить клинический полиморфизм фетального алкогольного синдрома. Дети матерей, принимавших во время беременности от 100 до 200 мл алкоголя ежедневно на протяжении всей беременности, могут иметь как функциональные изменения нервной системы, так и задержку физического развития, не всегда сочетающуюся с ВПР. Кроме того, выявлено, что только у 6% женщин, злоупотреблявших алкоголем во время беременности, дети имеют те или иные признаки истинного синдрома алкогольного плода. Такой феномен до конца не ясен, однако изучение этой проблемы позволяет определить пороговые дозы тератогена - предельную концентрацию, ниже которой он не будет вызывать уродства или гибель зародыша у конкретной женщины.

При формировании некоторых ВПР существенную роль может сыграть генетическая предрасположенность. Достоверно известно, что риск возникновения расщелины нёба повышается у плода курящих женщин. Проведенные исследования показали, что величина этого риска еще более возрастает у курящих женщин, которые являются носительницами определенных полиморфизмов в генах факторов роста. Еще одним примером может являться повышенный риск развития аминогликозид-индуцированной тугоухости у детей, матери которых имеют определенную мутацию митохондриального генома. В настоящее время известны 4 группы генов, мутации в которых повышают риск рождения детей с ВПР.

Во врачебной практике обычно встречаются три ситуации, когда можно заподозрить воздействие какого-либо тератогена.

В табл. 13-1 - 13-3 приводится характеристика наиболее распространенных тератогенных синдромов, вызванных различными вредными факторами окружающей среды.

На рубеже XX-XXI столетий произошел значительный прогресс в лечении наследственных болезней: созданы препараты для ферментной заместительной терапии (ФЗТ), разработаны и постоянно усовершенствуются формулы диетического питания, для ряда форм с успехом применяется трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), появился опыт в проведении трансплантаций органов, клеток и тканей, а также свои первые шаги сделала генотерапия. Это связано с прогрессом в области изучения механизмов патогенеза наследственных болезней и развитием новых технологий получения лекарственных препаратов, в том числе и с помощью генной инженерии. Однако клинический полиморфизм, низкая частота отдельных нозологических форм иногда не позволяют разрабатывать новые методы терапии для наследственных заболеваний и получить достаточный объем данных для оценки эффективности лечения.

Кроме того, стоимость уже созданных лекарственных препаратов для лечения некоторых наследственных заболеваний очень высока и требует особой государственной поддержки для того, чтобы пациенты имели возможность получать современное лечение, а фармакологические компании продолжали разработку препаратов для небольшой группы пациентов. В конце XX в. появились такие понятия, как «редкие заболевания» и «сиротские (?орфанные") препараты». По определению, принятому в странах Евросоюза, редкими считаются хронические, прогрессирующие, требующие пожизненной медицинской помощи состояния, распространенность которых составляет менее чем 5:10000 населения, в Российской Федерации менее чем 1:10000 населения. Практически все наследственные, многие онкологические заболевания, ряд инфекционных и мультифакториальных болезней относятся к этой категории. Во многих странах Европы, США, Великобритании приняты законодательные акты и специальные программы, направленные на улучшение качества медицинской помощи больным с редкими заболеваниями. Статус «орфанных» был присвоен многим препаратам, направленным на лечение наследственных заболеваний, некоторые из них зарегистрированы и на территории Российской Федерации (табл. 14-1).