Медицинская генетика : национальное руководство

ВСТУПЛЕНИЕ

Термин «геном» на сегодняшний день является одним из самых популярных научных терминов в мире. Действительно, несмотря на большой размер генома человека и на его сложность как биологического объекта, с геномом научились проводить множество сложнейших манипуляций, среди которых секвенирование, редактирование и даже синтез генома de novo. Все это стало возможным в последнее десятилетие благодаря появлению различных молекулярных технологий.

Сам термин «геном» был предложен Г. Винклером в 1920 г. для обозначения совокупности всего генетического материала конкретного организма. Сегодня у всех эукариотических организмов и у человека, в частности, принято выделять ядерный и митохондриальный геномы. Ядерный геном человека состоит из 22 аутосом и двух половых хромосом и имеет размер в 3,2 млрд пар нуклеотидов. Митохондриальный геном имеет только одну митохондриальную кольцевую хромосому длиной 16 569 пар нуклеотидов.

История секвенирования генома человека поучительна. Сама идея прочитать геном человека родилась в 1986 г., и возглавил проект «Геном человека» один из открывателей двуцепочечной структуры ДНК Джеймс Уотсон. Стоимость проекта была оценена в 3 млрд долларов, а сам проект был рассчитан на 15 лет при участии в проекте целого ряда стран: США, Германии, Франции, Великобритании, Китая, Японии и др., в том числе и России. В программе «Геном человека» участвовали более 400 российских исследователей из 30 научных учреждений, ими были опубликованы сотни научных работ, описывающих те или иные участки генома человека и модельных животных. В базах данных российскими учеными было зарегистрировано более миллиона нуклеотидных пар фрагментов ДНК человека и многие сотни генетических маркеров, имеющих большое значение для детального анализа генома человека.

Основными целями проекта «Геном человека» были определение последовательности нуклеотидов всей ДНК человека, а также идентификация и картирование генов. Первая («черновая») версия генома человека была опубликована в 2001 г. в журнале Nature (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). В результате секвенирования были обнаружены и картированы последовательности 22 585 белок-кодирующих генов, которые суммарно занимали около 1,5% длины всего генома. Данные проекта были представлены в свободном доступе на сайте Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI).

Помимо генов, были идентифицированы и картированы другие элементы генома (рис. 1-1, см. цв. вклейку): интроны, регуляторные последовательности, уникальная некодирующая ДНК, различные типы повторяющихся последовательностей.

Сейчас мировая биологическая наука находится в эре геномного секвенирования, которое стало очень доступным инструментом исследования. На сегодняшний день на сервере NCBI доступны данные о последовательностях геномов 47 186 организмов, среди которых 9199 - эукариотические. Ежегодно это число увеличивается на тысячи. Однако секвенирование дает лишь общие представления о том, как реализуется генетическая информация. Функциональное исследование генетических элементов в норме и при патологии на сегодняшний день является самым важным и до конца не решенным вопросом.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНОМА

Исследование функционирования генома в виде отдельных генетических элементов или их совокупности эффективно реализуется при сравнительном анализе нормы и патологических состояний, что является основным направлением медицинской генетики. На сегодняшний день существует широкий спектр различных инструментов, позволяющих проводить такие исследования на молекулярном уровне для разных целей. Ниже будут рассмотрены основные подходы к исследованию генома.

Генетические карты

Одним из первых инструментов в исследовании генома были генетические карты. Генетическая карта - это схема взаимного расположения и относительных расстояний элементов генома, таких как гены или генетические маркеры. Она была придумана как инструмент, который должен облегчить картирование всех генов человека, особенно генов наследственных заболеваний.

При создании генетической карты генома человека использовались разные генетические маркеры, как полиморфные, так и уникальные. Самым распространенным, простым и удобным в использовании полиморфным маркером являются микросателлитные, или короткие, тандемные повторы (short tandem repeats - STR). Амплификация таких повторов методом ПЦР на уникальных фланкирующих праймерах давала информацию не только о наличии такого участка в исследуемом образце, но и о его аллельном состоянии. STR маркеры до сих пор активно используются в широком спектре задач медицинской генетики: при картировании генов наследственных заболеваний, идентификации личности, оценке генетического разнообразия.

STS маркеры (sequence tagged sites) представляют собой небольшие (100200 п.н.) уникальные участки генома человека, которые амплифицируются с помощью ПЦР. Они были разработаны и активно использовались во время проекта по секвенированию генома человека для создания физической карты генома, позволяя устанавливать корректное расположение контигов (фрагментов ДНК) друг относительно друга.

Генетические карты сцепления являются наименее точными из всех имеющихся типов генетических карт, и их можно рассматривать только в качестве первого приближения к реальным физическим картам. Тем не менее построение и использование генетических карт помогло за короткое время в геноме человека картировать тысячи генов.

Секвенирование по Сэнгеру

Метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 г. и по сей день является золотым стандартом исследования нуклеотидной последовательности генома (Sanger и др., 1977). Большая часть современной ДНК-диагностики, направленной на установление последовательности конкретного участка генома, осуществляется этим методом. С тех пор метод претерпел множество различных усовершенствований, и на сегодня он осуществляется на автоматических секвенаторах, где продукты реакции секвенирования с флуоресцентными метками разделяются с помощью капиллярного электрофореза. Единственным минусом этого метода является ограничение по длине фрагмента ДНК, который можно секвенировать за один раз. За одно «прочтение» можно определить последовательность длиной до 1000 нуклеотидов.

В 1977 г. был секвенирован первый геном бактериофага X174, длиной 5386 нуклеотидов (Sanger и др., 1977). В 1995 г. - первый полный геном клеточного организма - бактерии Haemophilus influenzae, вызывающей некоторые формы пневмонии и менингита, общей длиной 1 830 137 нуклеотидов (Fleischmann и др., 1995). В 1998 г. был секвенирован уже первый геном многоклеточного животного, круглого червя Caenorhabditis elegans, длиной 98 млн нуклеотидов (C. elegans Sequencing Consortium, 1998).

Для секвенирования геномов большого размера, включая геном человека, применялась следующая стратегия: геном разрезали на множество частей длиной примерно в 150 000 нуклеотидов с помощью двух или более рестриктаз. Эти частично перекрывающиеся фрагменты встраивали в искусственные кольцевые хромосомы (BAC - bacterial artificial chromosome), которые, в свою очередь, встраивали в бактерии. С помощью бактерий эти хромосомы размножаются, и в результате получается множество копий одного и того же фрагмента молекулы ДНК. Каждый такой фрагмент затем секвенировали отдельно, как правило, разбив его на еще меньшие по длине фрагменты. Прочитанные фрагменты наносили на карту хромосом, их последовательность устанавливали по перекрывающимся фрагментам. Данный подход был успешно реализован в ходе проекта «Геном человека».

Секвенирование методом «дробовика»

В связи с вышеописанными особенностями подхода, лежащего в основе проекта «Геном человека», сам проект реализовывался крайне медленными темпами. В то же время известный молекулярный биолог и генетик Крейг Вентер заявил, что его компания Celera Genomics, основанная в 1998 г., выполнит секвенирование генома человека раньше на 4 года, чем завершится международный проект. На проект потребуется всего 300 млн долларов, и реализован он будет с помощью новой технологии секвенирования «whole genome shotgun» - чтение случайных коротких фрагментов генома. Данное заявление вызвало бурную реакцию ученых и общественности, в частности еще и потому, что также было заявлено, что компания Celera Genomics собиралась заработать на проекте, создав базу данных последовательностей генома человека, которая была бы платной для коммерческих фармацевтических компаний.

Крейг Вентер сдержал озвученные им обещания, продемонстрировав вначале эффективность своего подхода при секвенировании генома плодовой мушки дрозофилы (Adams и др., 2000), а потом уже и при секвенировании генома человека. Появление такого коммерческого соперника подстегнуло и международный проект. В результате в 2001 г. было опубликовано сразу две версии предварительных вариантов генома человека (Venter и др., 2001; International Human Genome Sequencing Consortium, 2001).

NGS-секвенирование

Сейчас метод «дробовика» уже давно ушел в прошлое, и на смену ему пришли технологии секвенирования нового поколения (NextGen). За последние 10 лет они стремительно развивались в условиях активной конкуренции между ведущими коммерческими компаниями. Все это в результате привело к появлению современных NGS-секвенаторов, работающих на разных принципах, но быстро и качественно производящих огромное количество данных. С каждым годом, при существующей конкуренции производителей, стоимость секвенирования уменьшается, при этом качество и количество получаемых данных неуклонно растут. Это приводит к активному распространению технологий секвенирования для решения широкого спектра задач - от фундаментальных до прикладных, в частности в области медицинской генетики.

В основе технологий массового параллельного секвенирования лежит подход одновременного многократного прочтения ДНК матрицы. Многократность прочтения дает высокую точность получаемых данных. Так, на сегодняшний день принято получать данные при секвенировании полного генома с покрытием в 30 раз, то есть каждый нуклеотид в среднем должен быть просеквенирован и прочитан 30 раз.

Наиболее распространенными вариантами NGS-секвенирования являются более дешевые подходы по секвенированию панелей генов или экзома. Панели генов представляют собой набор генов, объединенных, как правило, какой-то одной нозологией или группой заболеваний. Например, существует совсем небольшая панель из двух генов для проведения анализа у пациентов с тубероз-ным склерозом или же, наоборот, огромная неспецифическая онкопанель, куда входят сотни различных генов, имеющих отношение к канцерогенезу. Экзом представляет собой самую большую универсальную панель генов, содержащую экзоны большинства генов человека. Экзом секвенируют со средним покрытием 60 раз, получая качественные данные, способные выявить варианты нуклеотидной последовательности в кодирующей части генов.

Биоинформатический анализ генома

Секвенирование генома уже стало решенной технической задачей, при этом получаются сотни гигабайтов информации. Для медицинской генетики основной задачей является поиск мутации в полученных данных при секвенировании ДНК пациента с наследственным заболеванием. Это весьма непростая задача, решением которой занимается относительно молодая наука «клиническая биоинформатика». Сейчас создаются и постоянно совершенствуются различные алгоритмы и программы, базы данных, серверы, кластеры, все то, без чего невозможен на сегодняшний день анализ генома после его секвенирования.

Биоинформатический анализ генома человека условно можно разделить на две следующие друг за другом задачи. Первая, техническая, когда полученные прочтения необходимо картировать на референсный геном человека и затем определить отличия в виде нуклеотидных замен или же протяженных делеций/инсерций. Это очень важная ресурсоемкая задача, правильность выполнения которой в большой степени определяет успех следующей, второй, задачи - интерпретации полученных данных.

Сейчас с помощью NGS-секвенирования патогенные варианты нуклеотидной последовательности находят в среднем в 40% случаев. Одна из причин этого кроется в большой вариабельности генома, его полиморфности. При секвенировании генома здорового человека можно обнаружить около 3 млн однонуклеотидных позиций, по которым он будет отличаться от любого другого человека. Большая часть из них не имеет никакого биологического смысла, зато другая часть определяет индивидуальность человека. Разобраться в функциональной значимости этих полиморфных позиций - очень непростая задача, которую ученые-генетики пытаются решить до сих пор. Сложная она потому, что многие проявления фенотипа определяются не одним геном, а, как правило, несколькими (многими), их комбинацией. Так, например, за форму носа отвечают аллели 4 генов, цвет глаз - аллели трех генов, и так далее.

Для поиска патогенных вариантов клинические биоинформатики применяют различные подходы, пытаясь фильтровать огромное количество полученных данных, используя различные критерии. Большая часть потенциально патогенных вариантов уникальна, поэтому поиск и интерпретация их требуют хорошего понимания как медицинских, так и молекулярно-биологических основ формирования фенотипа.

Индивидуальный геном

По завершении проекта «Геном человека» и при появлении современных NGS-секвенаторов наступила эра секвенирования индивидуальных геномов, которая активно продолжается и по сей день. Референсная последовательность генома человека была получена при секвенировании ДНК, выделенной из крови разных здоровых людей.

В 2007 г. был секвенирован первый полный индивидуальный геном Крейга Вентера (Levy et al., 2007). Анализ полученных данных показал наличие около 3 млн однонуклеотидных отличий, не считая большого количества крупных геномных вариаций. Год спустя был опубликован полный диплоидный геном Джеймса Уотсона, который содержал 3,3 млн однонуклеотидных замен по сравнению с референсным геномом человека (Wheeler et al., 2008). Более 10 000 замен были найдены в белоккодирующих генах и представляли собой миссенс-варианты.

После Вентера и Уотсона были секвенированы еще несколько индивидуальных геномов, и было достоверно показано, что в среднем два индивидуума отличаются друг от друга на 3 млн однонуклеотидных замен. Также значимой отличительной частью являются участки генома, присутствующие в разном числе копий и порядке (copy number variants - CNV). В целом у 2 индивидов 99,5% последовательности генома является одинаковой.

Сегодня число индивидуальных отсеквенированных геномов во всем мире уже перевалило за миллион. NGS-технология оказалась настолько мощной и чувствительной, что успешно удалось отсеквенировать более 1000 геномов древних людей, умерших много тысяч лет назад. Помимо секвенирования геномов, также запущены проекты по получению метаданных, позволяющих максимально полноценно описать как норму, так и патологические состояния. В результате накапливаются данные по секвенированию транскриптомов, эпигеномов, микробиомов, протеомов. Можно уверенно сказать, что генетика человека сейчас стоит на пороге вхождения в эру персонализированной медицины, что должно привести к совсем другому уровню понимания происходящих процессов в организме.

Проекты по секвенированию геномов

Секвенирование персональных геномов здоровых людей, безусловно, является интересной фундаментальной задачей для установления разнообразия человеческого вида, эволюционных механизмов и многих других. Однако эти данные также очень востребованы и в медицинской генетике, для того чтобы при анализе генома пациента исключать из рассмотрения частые варианты нуклеотидной последовательности, встречающиеся в популяции.

Для исследования генетического полиморфизма в начале 2008 г. был запущен международный проект «1000 геномов». Целью его было провести секвенирование минимум одной тысячи здоровых людей из различных популяций. В результате к 2015 г. были опубликованы данные о геномах 2504 человек, представляющих 26 разных популяций (Adam и др., 2015). В ходе данного проекта удалось охарактеризовать широкий спектр генетических вариаций, в общей сложности было найдено более 88 млн генетических вариаций, среди них 84,7 млн однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism - SNP), 3,6 млн коротких инсерций и делеций, 60 000 структурных вариантов. По оценкам данного проекта, было охарактеризовано более 99% SNP, встречающихся с частотой >1%.

Сейчас многие страны имеют аналогичные проекты по секвенированию геномов как здоровых, так и больных различными заболеваниями. Так, например, в Великобритании в конце 2018 г. был успешно закончен проект «100 000 Genomes Project» по секвенированию геномов больных и их здоровых родственников с редкими заболеваниями. В группу больных включены люди как с редкими заболеваниями, так и с некоторыми видами опухолей и инфекционных заболеваний.

В 2015 г. в России стартовал аналогичный проект «Российские геномы», целью которого было секвенирование 3000 геномов здоровых индивидуумов из разных этносов, проживающих на территории РФ. Как заявляют участники проекта, за 5 лет удалось просеквенировать и проанализировать всего 60 геномов.

Типы полиморфизмов

Как уже было сказано, два генома отличаются друг от друга несколькими миллионами SNP. В геноме человека в среднем один SNP встречается на 300 нуклеотидов. Такая частая встречаемость их в геноме сделала SNP самыми эффективными и широко распространенными генетическими маркерами. Важно отметить, что полиморфизмами принято считать такие варианты нуклеотидной последовательности, которые встречаются в популяции чаще, чем в 1% случаев. Если частота полиморфного варианта меньше, то его называют мутацией.

Очевидно, что большая часть полиморфизмов находится во внегенных областях. Долгое время считалось, что они не несут никакого функционального значения. Однако, как будет сказано ниже, в геноме существует множество разных регуляторных последовательностей, оказывающих влияние на экспрессию генов. Для многих полиморфизмов экспериментально было показано, что в ряде случаев их расположение в регуляторном регионе может влиять на уровень экспрессии регулируемого гена.

Совсем небольшая доля SNP попадает в регионы белок-кодирующих генов. В части случаев SNP может являться миссенс-заменой. В этих случаях миссенс-замена может приводить к небольшому изменению функции белка. Именно такое большое количество событий в разных генах (а также в их регуляторных участках) с небольшими эффектами и является одной из основ существующего фенотипического разнообразия популяции.

Поиск и исследование таких функционально значимых полиморфизмов являются одними из интересных задач генетики человека. Существует целое направление исследований, называющееся «полногеномный поиск ассоциаций» (genome-wide association studies - GWAS), связанное с исследованием ассоциаций между геномными вариантами и фенотипическими признаками. Наиболее известными полиморфизмами стали миссенс-варианты в генах, кодирующих ферменты биотрансформации I и II фазы (цитохром Р450, глюкуронилтрансфераза и др.), а также транспортеров лекарственных средств (ЛС) (ABCB1, SLCO1B1 и др.). Было показано, что носительство конкретных генетических маркеров влияет на эффективность и безопасность фармакотерапии, как правило, путем изменения фармакокинетики ЛС либо путем модуляции фармакодинамики ЛС. Все это привело к появлению новой области, сочетающей медицинскую генетику и клиническую фармакологию, - фармакогенетики.

Помимо отдельных нуклеотидов, в ДНК полиморфными также являются небольшие инсерции и делеции, а также изменение числа микросателлитных (1-6 п.н. STR - short tandem repeats) и минисателлитных (7-190 п.н. VNTR - variable number tandem repeats) тандемных повторов. О повторах отдельно будет сказано ниже.

Другим распространенным видом генетического полиморфизма является CNV. В этом случае в популяции наблюдаются вариации числа копий протяженных участков ДНК, которые могут нести в себе функциональные гены. Происходит это за счет несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации.

ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ ГЕНОМА

Проект ENCODE

Если секвенирование генома является вопросом относительно хорошо решенным, то его функционирование еще долгое время будет изучаться. В 2003 г. с этой целью был запущен международный проект ENCODE, который продолжается до сих пор. Название проекта расшифровывается, как энциклопедия ДНК элементов (Encyclopedia of DNA Elements).

Основная цель проекта ENCODE - определить роль белок-некодирующей части генома, большая часть которого традиционно рассматривалась как «мусорная ДНК». Уже первые пилотные результаты проекта ENCODE показали, что около 80% генома являются функциональными. Эти данные были восприняты научной общественностью с большим скептицизмом. Действительно, если участок генома проявляет какую-то активность, выявляемую различными экспериментами, то совсем еще не значит, что этот участок может быть действительно функционально важен для клетки или организма. Однако очевидно, что такие полномасштабные исследования функционального анализа генома необходимы не только для фундаментального понимания регуляции экспрессии генов, но и для поиска причин возникновения заболеваний.

При исследовании функционирования генома в проекте ENCODE применяются следующие методы:

Весь перечисленный арсенал методов применяется на большой коллекции из более чем 10 000 образцов различных тканей человека и клеточных линий. Что также важно, полученные данные находятся в открытом доступе. С помощью геномных браузеров удобно проводить анализ исследуемого региона для построения гипотез относительно его функционирования.

Регуляторные последовательности

У прокариот (архей и бактерий), как правило, существует линейная зависимость между размером генома и количеством генов. Однако у эукариотических организмов зависимости между размером генома и сложностью организма нет. Такая значительная избыточность некодирующих нуклеотидных последовательностей и изменчивость количества ДНК у близких видов названа С-парадоксом. Секвенирование геномов различных организмов привело к формулированию и другого явления - G-парадокса, описывающего несоответствие количества белок-кодирующих генов и сложности фенотипа. На основании этого возникла гипотеза, что «эволюционное качество» достигается не количеством генов, а их регуляцией.

Структура генов и их функции будут подробно рассмотрены в отдельной главе. Но стоит заметить, как уже было сказано выше, белок кодирующие гены занимают в геноме человека около 1,5%, при этом регуляторных последовательностей на порядок больше. Действительно, для «получения» и существования такого сложного многоклеточного организма, как человек, в котором насчитывается минимум 400 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям, необходимо иметь огромный потенциал в регуляции молекулярных и клеточных процессов. Этот потенциал реализуется на многих уровнях функционирования биомолекул в клетке, однако базовым является уровень генома, который изначально определяет доступность и возможность транскрипции генов.

Известно, что активность и экспрессия белок-кодирующих генов могут изменяться за счет различных регуляторных элементов ДНК, таких как промотор, транскрипционные регуляторные последовательности, области структуры хроматина, модификации гистонов.

Базовым регуляторным элементом является промотор. Это участок ДНК, который приводит к инициации транскрипции конкретного гена. Как правило, он располагается рядом с точкой инициации транскрипции (TSS - transcription start site) и может быть до нескольких тысяч нуклеотидов длиной. По данным ENCODE, промоторные последовательности РНК-полимеразы II в геноме человека составляют 4,2%.

Также в поиск и аннотирование промоторов большой вклад внес японский проект FANTOM5. В ходе его были получены данные о картированных TSS, полученных в коллекции из почти тысячи образцов первичных клеток человека, тканей и клеточных культур. В результате было получено более 100 000 TSS, которые свидетельствовали о существовании промоторов в этих участках. Детальный анализ показал, что для некоторых генов было найдено два или более промоторов, дающих тем самым альтернативные начала генов. Но для большой доли промоторов не было найдено генов, которые бы они регулировали, их еще предстоит найти и охарактеризовать.

Часто в последовательности промотора встречаются так называемые CpG-островки. Это участки ДНК, характеризующиеся высокой частотой динуклеотидов CG. В геноме человека их насчитывается около 31 000. Известно, что метилирование цитозина в положении 5 в островках CpG приводит к изменению уровня экспрессии гена. Такая регуляция экспрессии является широко распространенной и называется эпигенетической. Подробно она будет рассмотрена в отдельной главе.

На активность промоторов могут влиять другие регуляторные элементы - энхансеры, сайленсеры и инсуляторы. Энхансеры представляют собой небольшие участки ДНК (от 50 до 1500 нуклеотидов длиной), с которыми могут связываться белки ТФ и тем самым приводить к увеличению транскрипции конкретного гена. По данным ENCODE, в геноме человека таких последовательностей насчитывается более миллиона, и суммарно они занимают 15,9% всей длины генома. Аналогичным образом выглядят сайленсеры - последовательности ДНК, с которыми связываются факторы транскрипции, приводящие к понижению или к полному подавлению экспрессии гена. В геноме человека их насчитывается около 1,5 млн.

Влияние энхансеров или сайленсеров на промотор могут регулировать инсуляторы, также являющиеся цис-регуляторными элементами. Обычно их длина варьирует от 300 до 2000 п.н. Если инсулятор расположен между промотором и каким-то другим регуляторным элементом, то связывание определенных белков с последовательностью инсулятора может приводить к блокированию взаимодействия с промотором. Одним из самых известных инсуляторов является белок CTCF. По данным ENCODE, он активно связывается с множеством последовательностей в геноме, приводя к формированию петель хроматина. Суммарно таких участков в геноме насчитывается около 0,7%.

Все эти регуляторные последовательности оказывают влияние как на уровень экспрессии гена, так и на его профиль. Важно понимать, что наблюдаемая экспрессия гена является результирующей совокупности всех регуляторных взаимодействий. Для некоторых генов таких взаимодействий насчитывается около сотни. Эти взаимодействия различны в разных тканях и на разных стадиях развития организма, что и приводит к различной экспрессии регулируемых генов.

Повторяющиеся последовательности

Большую часть генома человека составляют повторяющиеся последовательности, или просто повторы. Они представляют собой последовательности ДНК, которые встречаются во множестве копий по всему геному. Такие последовательности присутствуют в геномах всех организмов в большом количестве. В геноме человека суммарно их насчитывается около 5 млн, и они покрывают собой половину генома.

Повторяющиеся элементы делят на разные типы в зависимости от их структуры и/или способа умножения. Первый тип - тандемные повторы, в котором повторяющиеся элементы расположены в массивах тандемно повторяющихся последовательностей. Тандемные повторы делят на три класса согласно длине повторяющейся последовательности: микросателлитные повторы содержат ДНК-повторы от 1 до 9 нуклеотидов, минисателлитные - от 10 до 100 нуклеотидов и макросателлитные - более 100 нуклеотидов.

Микросателлитные повторы (STR) являются высокополиморфными участками генома, так как из-за особенности их структуры ДНК-полимераза способна при репликации как увеличивать их число, так и уменьшать. Поэтому они являются широко распространенными молекулярными маркерами в генетических и геномных исследованиях, о чем уже было сказано выше.

Но в отдельных случаях изменение числа микросателлитных повторов может приводить к возникновению наследственных заболеваний, к так называемым болезням экспансии повторов. В зависимости от их местоположения в геноме реализуется различный молекулярный механизм патогенеза заболевания. Так, увеличение числа CGG-повторов до более 200 копий в 5'-нетранслируемой области гена FMR1 приводит к гиперметилированию данного гена и, как следствие, к отсутствию его экспрессии. Это приводит к возникновению синдрома ломкой Х-хромосомы, или синдрома Мартина-Белла. Другим известным примером является болезнь Гентингтона, вызванная гетерозиготной экспансией тринуклеотидных повторов CAG, кодирующих глутамин, в гене HTT, который кодирует белок гентингтин. При увеличении числа повторов свыше 37 образуется токсичный белок, приводящий к дегенерации нейронов.

Другие классы тандемных повторов также могут изменять свое число, приводя к возникновению наследственных заболеваний. Одним из известных примеров является мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина. Уменьшение числа макросателлитных повторов D4Z4 до 10 копий приводит к активации экспрессии располагающегося в них транскрипционного фактора DUX4, который запускает патогенетические процессы мышечной атрофии.

Другой тип повторов - диспергированные повторы, являющиеся по своей сути транспозонами. Их делят на 2 класса: ДНК-транспозоны и ретротранспозоны. Они являются мобильными генетическими элементами, способными перемещаться (транспозиция) в геноме и размножаться. Считается, что у человека транспозоны составляют до 45% всей последовательности ДНК.

Ретротранспозоны являются самым большим классом диспергированных повторов, в геноме человека они занимают 42% и способны самовоспроизводиться в геноме за счет реакции обратной транскрипции. Для этого вначале ретротранспозон может транскрибироваться в РНК, которая с помощью фермента обратной транскриптазы переводит РНК в комплементарную ДНК, способную встроиться в геном.

Ретротранспозоны делятся на несколько основных групп:

ДНК-транспозоны способны перемещаться по геному за счет вырезания и встраивания с использованием фермента транспозазы, которую они кодируют в своей последовательности. В геноме человека содержится около 300 000 копий ДНК-транспозонов, и они составляют около 3%. Среди семейств ДНК-транспозонов двумя основными являются MER1 и MER2, которые встречаются в геноме наиболее часто.

Существуют различные механизмы, которые подавляют активность транспозонов, препятствуя их перемещению и размножению. Однако технологии полногеномного секвенирования выявляют новые места встраивания транспозонов, которые иногда могут приводить к возникновению различных заболеваний. Так, в 2014 г. впервые были исследованы геномы 290 образцов опухолей и найдено порядка 3000 разных перестановок повторяющихся элементов из L1. Как было показано, в 2% случаев встраивание происходило в функционально значимые участки генома.

Другой масштабной работой являлся анализ данных почти 10 000 экзомов, полученных при секвенировании семей, состоящих из родителей с больными детьми с нарушением развития. В результате было определено, что в среднем каждый индивидуум имеет около 33 встраиваний транспозонов или процессированных псевдогенов относительно референсного генома. 11 таких событий оказались новыми (de novo), а в 4 случаях они затронули гены, которые часто связывают с пороками развития (ПР).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Геном человека сейчас является активно изучаемым объектом. Развивающиеся технологии массового параллельного секвенирования и биоинформатического анализа приближают нас к пониманию структуры и функционирования генома как в норме, так и при патологии. И сейчас видно, как они сложно устроены.

В начале 2000-х была очень популярной теория о существовании мусорной ДНК, которая говорила о том, что функционально важна только небольшая доля генома, представляющая белок кодирующие гены. Эта теория подтверждалась и экспериментами на мышах, которым делетировали протяженные участки генома, не содержащие гены, и мыши при этом оставались здоровыми.

Первые данные проекта ENCODE показали, что до 80% генома человека могут проявлять активность. И хотя эти данные были восприняты научным сообществом весьма критично, последующие данные этого и других проектов выявляют все больше и больше транскрибирующихся и регуляторных последовательностей. Однако их реальная функция будет исследоваться еще не один десяток лет.

Геном человека, как и любой другой, постоянно эволюционирует за счет рекомбинации и активных мутационных процессов. Несмотря на то что скорость накопления мутаций у разных эукариотических организмов самая низкая, как было показано, в каждом поколении возникает de novo около 80 вариантов нуклеотид-ной последовательности (Jakob M. Goldmann и др., 2016). Эти процессы являются источниками как популяционного разнообразия, так и причиной возникновения широкого спектра заболеваний.

Список литературы

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНА

Ген является самым известным и самым изучаемым элементом генома. Но, несмотря на это, на сегодняшний день мы пока мало знаем об основных характеристиках генов человека, об их структуре, функции, регуляции. Связано это со сложностью самого объекта как многоклеточного организма, где функционирование генома в сотнях различных типов клеток происходит по своему уникальному сценарию. И для исследования функционирования генов и генома человека науке еще предстоит потратить не один десяток лет.

Начнем с того, что как молекулярного объекта гена не существует, это понятие искусственное. Термин «ген» был предложен в прошлом веке в 1909 г. Вильгельмом Людвигом Иогансеном. На тот момент не было понимания природы наследственного материала, но идея дискретности единиц наследственности, высказанная Грегором Менделем, поддерживалась уже многими учеными того времени. Многочисленные эксперименты по скрещиванию, селекции и мутагенезу различных модельных организмов хорошо подтверждали эту теорию. Открытие природы двуцепочечной структуры молекулы ДНК и последующее формулирование Фрэнсисом Криком в 1957 г. центральной догмы молекулярной биологии также принесли свой вклад в общую концепцию. Поэтому и по сегодняшний день можно видеть во многих современных учебниках следующее определение: «Ген - это структурная и функциональная единица наследственности, контролирующая образование какого-либо признака, представляющая собой отрезок последовательности ДНК». Однако, как будет показано ниже, это определение на сегодня не способно полноценно описать сложность гена как молекулярного объекта.

В 2003 г. завершился крупнейший международный научно-исследовательский проект «Геном человека», инициатором и руководителем которого был Джеймс Уотсон. Целью проекта было определение последовательности нуклеотидов генома человека и идентификация генов. Проект был успешно выполнен, и в результате были обнаружены и картированы последовательности 22 585 белок-кодирующих генов. Однако с тех пор число генов постоянно изменялось и меняется и по сей день. Связано это с двумя основными факторами. Во-первых, постоянно увеличивается количество данных, получаемых при исследовании геномов, транскриптомов и протеомов человека. В результате появляются новые, ранее не описанные гены, а также исчезают некоторые «старые». Во-вторых, меняется само определение гена. Оба этих фактора очень существенно влияют на число генов человека. И сейчас мы разберем более подробно, как это происходит.

Для начала необходимо понимать, как на сегодняшний день находят гены. Раньше для обнаружения новых генов применяли методы, основанные на выявлении связи между определенным фенотипом и определяющим его геном с установлением типа наследования и картированием генов, которые играли важную роль на ранних этапах формирования генетики человека и медицинской генетики.

Сейчас генетика сначала выявляет последовательности нуклеотидов, отвечающих требованиям, предъявляемым к понятию гена, а уже на следующем этапе эту последовательность связывают с каким-то фенотипическим признаком. Важно сразу отметить, что этой задачей уже давно занимается отдельная наука - биоинформатика. Дело в том, что секвенирование ДНК и РНК любых биологических объектов сейчас стало широкодоступной рутинной операцией. Современные секвенаторы позволяют в течение нескольких дней получить данные генома и транскриптома любого доступного организма. На выходе экспериментатор имеет сотни гигабайт информации, представляющей множественные прочтения различных участков генома. Первой задачей биоинформатика является получение максимально возможно цельных последовательностей генома и транскриптома. Второй - картирование полученных молекул РНК на геном, в результате чего становится понятно, какие молекулы РНК с каких участков генома транскрибировались. Ну и, наконец, из картированных молекул РНК биоинформатики получают гены.

Разберем этот процесс на реальном примере. В 2014 г. вышла научная работа в журнале Science, в которой было проведено секвенирование генома самого известного в мире растения Coffea canephora, плоды которого многие употребляют в виде прекрасного напитка кофе. Также были отсеквенированы образцы РНК, выделенные из стебля, цветка, молодых и старых листьев. Важно отметить, что до этого момента практически никаких научных работ с данным объектом не проводилось. В результате из полученных при секвенировании данных был собран геном, транскриптомы и найдено 25 574 белок-кодирующих генов. Также важно подчеркнуть, что никаких других экспериментов, кроме описанных в этой статье, не проводилось.

Как же были найдены гены из полученной информации о геноме и транскрип-томах? Это очень важный и непростой вопрос. Биоинформатики создают свои алгоритмы для поиска разных генетических элементов на основе молекулярно-биологических знаний и имеющихся данных. И пока этих знаний и данных было немного, находить гены было задачей относительно несложной. Действительно, если представить, что на каком-то участке генома была картирована одна белок-кодирующая мРНК, то несложно такой участок назвать геном. Но сегодня на конкретные участки генома картируются порой сотни различных по структуре молекул РНК, которые могли быть получены из разных типов клеток, разных тканей. А транслируемые с них белки могут иметь разные последовательности и выполнять различные функции. Также в литературе описано, что транскрипция может затрагивать довольно протяженные участки, в результате чего получаются транскрипты, в которых присутствуют белок-кодирующие части нескольких генов [соединенные гены (conjoined)]. Другим известным примером являются гены, кодирующие микроРНК, которые могут располагаться как в интронах, так и в экзонах белок-кодирующих генов. В последнем случае это означает, что часть таких транскриптов транспортируется в цитоплазму для трансляции белок-кодирующего гена, а часть остается в ядре для дальнейшего процессинга в пре-miRNA.

Все это многообразие транскриптов сильно усложняет поиск генов, их аннотирование. Постоянно увеличивающееся количество данных и установление структуры и функции транскрибирующихся последовательностей приводит к тому, что само определение гена меняется довольно часто, и, соответственно, меняются алгоритмы их поиска.

После проекта «Геном человека» была реализована международная программа ENCODE (the ENCyclopedia of DNA Elements), задачей которой было проведение поиска всех функциональных элементов генома. В результате выполнения этой программы было сформулировано современное определение гена: «Ген - это совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов». Здесь важно отметить, что данное определение основывается на биологической функции транскрибирующихся последовательностей. Вторым важным моментом является то, что в это определение не входят аспекты, касающиеся регуляции транскрипции (Gerstein M.B. и др., 2007).

Современное определение гена выглядит очень расплывчатым, его сложно воспринимать буквально: что за совокупность? каких функциональных продуктов? Для понимания, как это определение применяется на практике, на рис. 2-1 (см. цв. вклейку) приведен его общий принцип. Но, очевидно, что так как у данного определения нет строгих границ, то каждый может его применять по-своему, исходя из своего понимания, как это можно сделать лучше, что и происходит на сегодняшний день. В мире существует много профессиональных биоинформатических коллективов, которые занимаются аннотацией генов (определением их структуры и местоположения на геноме), в том числе и человека. Информация о данных генах доступна в виде соответствующих баз данных. Среди них стоит выделить четыре: NCBI RefSeq genes, UCSC Genes, Ensembl Genes и GENCODE Gene. Безусловно, они отличаются друг от друга как количеством информации, так и качественными характеристиками. В одних базах данных генов больше, в других меньше, и очень часто сами гены проаннотированы по-разному. Так, в базе данных Refseq (v. 107) зарегистрированы 51 087 генов, в Ensemble (v. 84.38) - 57 364, в Gencode (v. 24) - 60 554. При этом, например, ген PECAM1, проаннотированный в Refseq как белок-кодирующий, отсутствует в базах данных Ensemble и Gencode, а в базе данных UCSC зарегистрирован как белок-некодирующий.

Это вызывает трудности в интерпретации и выборе наиболее релевантной модели. Можно с уверенностью сказать, что данная ситуация вряд ли разрешится в ближайшее время. Гены - это понятие искусственное, созданное в те годы, когда представление о функционировании генома отсутствовало. И на сегодняшний день практически невозможно поместить в рамки определения все наблюдаемое многообразие транскриптов и их функционирования.

В версии 31-й базы данных GENCODE приведена статистика числа генов человека:

ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА

В упрощенном виде белок-кодирующий ген можно представить как участок молекулы ДНК, содержащий как белок-кодирующие последовательности, так и регуляторные, необходимые для его экспрессии. У большинства генов кодирующие последовательности (экзоны) прерываются одной или несколькими некодирующи-ми областями (рис. 2-2, см. цв. вклейку). Эти промежуточные последовательности, называемые интронами, первоначально транскрибируются в ядре в составе пре-мРНК, но удаляются из зрелой мРНК с помощью процесса, называемого сплайсингом. Сплайсинг является очень сложным процессом и осуществляется с помощью большого комплекса, состоящего из РНК и белков - сплайсосомы. 5'- и 3'-концы интронов содержат высококонсервативные последовательности - сайты сплайсинга, по которым сплайсосома осуществляет вырезание интронов из последовательности пре-мРНК, соединяя экзоны в последовательность зрелой мРНК.

Кроме кодирующих экзонов, у большинства генов есть дополнительные последовательности, которые транскрибируются, но не транслируются, называемые 5'- и 3'-нетранслируемыми областями. Как правило, в 5'-нетранслируемых областях находятся последовательности, отвечающие за регуляцию трансляции, а в 3'-нетранслируемых областях - за регуляцию экспрессии, ее стабильность, транспорт.

После транскрипции первичная молекула РНК претерпевает «процессинг», в который, помимо сплайсинга, входят еще несколько важных модификаций. На 5'-конец РНК добавляется «кэп»-структура, которая защищает РНК от деградации и является необходимой для дальнейшей трансляции. На 3'-конце происходит расщепление транскрипта в определенной точке, после чего следует добавление полиА-хвоста к образовавшемуся 3'-концу РНК, который увеличивает стабильность получаемой полиаденилированной РНК. Все эти посттранскрипционные модификации происходят в ядре, как и процесс сплайсинга РНК. Зрелая мРНК затем транспортируется в цитоплазму, где и происходит трансляция.

На каждый ген в среднем приходится по 4 транскрипта, отличающихся друг от друга в первую очередь своей структурой. Самые частые отличия обусловлены альтернативным сплайсингом (АС): включение или отсутствие отдельных экзонов, изменение длины экзонов, удержание в составе мРНК интронов. Также транскрипты часто отличаются друг от друга за счет своих 5'- и 3'-концов. Существующие в геноме промоторы могут приводить к возникновению альтернативных точек инициации транскрипции. Как правило, это не влияет на белок-кодирующую часть гена, а является одним из механизмов регуляции экспрессии гена. Альтернативные 3'-концы транскриптов образованы за счет альтернативных сайтов полиадени-лирования. Они тоже, как правило, не влияют на белок-кодирующую часть гена, а определяют различные механизмы посттранскрипционной регуляции экспрессии гена.

Несмотря на разнообразие транскриптов, образуемых с одного гена, можно определить основные характеристики гена как геномного объекта, которые помогут составить о нем представление:

Гены находятся на всех хромосомах человека, и по их расположению можно выделять локусы, богатые генами и, наоборот, с низкой плотностью. Также важно учитывать ориентацию гена относительно его расположения на ДНК: примерно половина генов находится на одной цепи, а вторая половина транскрибируется с другой. В 30% случаев гены, расположенные на разных цепях, находятся в одном локусе, перекрываясь друг с другом по своим геномным координатам. И тогда про такие гены принято говорить, что они находятся в цис-антисмысловой регуляции по отношению друг к другу.

Гены также характеризуются по своей экспрессии и связанной с ней функции. Так, существует группа консервативных генов, без которых невозможно поддержание важнейших функций клетки и/или организма и которые экспрессируются во всех тканях примерно на одном уровне. Такие гены называют генами домашнего хозяйства. По данным проекта FANTOM5, их насчитывается 7523 (Nancy Yiu-Lin Yu и др., 2015). Остальные белок-кодирующие гены имеют более узкую специализацию, необходимую для определенной ткани или на определенных стадиях развития организма.

Семейства генов

Многие гены принадлежат к семействам, которые имеют общие схожие последовательности ДНК и кодируют полипептиды со схожими аминокислотными последовательностями. Члены двух таких семейств генов расположены в небольшом регионе на хромосоме 11 и иллюстрируют ряд особенностей, которые характеризуют семейства генов в целом. Одно небольшое и важное с медицинской точки зрения семейство состоит из генов, кодирующих белковые цепи гемоглобина. Считается, что кластер гена β-глобина на хромосоме 11 и кластер гена а-глобина на хромосоме 16 возникли путем дупликации гена первичного предшественника примерно 500 млн лет назад. Эти два кластера содержат несколько генов, кодирующих близкородственные глобиновые цепи, экспрессируемые на разных стадиях развития, от эмбриона до взрослого. Считается, что каждый кластер развивался в результате серии последовательных событий дуплицирования генов за последние 100 млн лет. Паттерны экзон-интрон функциональных глобиновых генов были хорошо сохранены в ходе эволюции; каждый из функциональных генов глобина имеет два интрона в одинаковых местах, хотя последовательности, содержащиеся в интронах, накапливали гораздо больше изменений нуклеотидных оснований с течением времени, чем кодирующие последовательности каждого гена.

Второе семейство генов - это семейство генов обонятельных рецепторов (OR). По оценкам, в геноме насчитывается до 1000 генов OR. Они отвечают за наше острое обоняние, которое может распознавать и различать тысячи структурно разнообразных химических веществ. Гены OR обнаружены во всем геноме почти в каждой хромосоме, хотя более половины обнаружены в 11 хромосоме, включая ряд членов семейства вблизи кластера β-глобина.

Механизмы образования и потери генов

Секвенирование большого числа геномов различных организмов, а также геномов древних людей помогает находить эволюционно новые гены, которые появились относительно недавно, а также гены, которые были утрачены в ходе эволюции. Эти события хорошо выявляются при сравнении геномов организмов, произошедших от общего предка. Однако наибольший интерес представляют эволюционные изменения, происходящие в популяции Homo sapiens, которые по идее должны отвечать за адаптацию к современным условиям. Такие гены были найдены в ходе проекта по секвенированию 83 геномов древних людей, проживавших на территории Европы десятки тысяч лет назад, и сравнению результатов секвенирования «древних» геномов с геномами нескольких тысяч современных людей.

Известно, что наши далекие предки, вышедшие из Африки и осевшие в Европе около 40 000 лет назад, имели темную кожу. Данные об охотниках-собирателях, живших в Испании, Люксембурге и Венгрии 8500 лет назад, также говорят о том, что они имели темную кожу. Проведенный анализ сравнения геномов выявил два гена, отвечающих за бледную кожу, SLC24A5 и SLC45A2. Они появились у некоторых людей, живших 7700 лет назад в Южной Швеции. Также был найден еще один новый ген, HERC2/OCA2, отвечающий за голубой цвет глаз и делающий вклад в светлую кожу и волосы.

Появление новых белок-кодирующих генов у человека в основном происходит за счет дупликаций уже существующих генов. В этом случае, как уже было описано выше, последовательности генов обладают высокой схожестью и тем самым формируют семейства. Однако дупликации, вызванные гомологичной рекомбинацией, могут приводить не только к появлению новых генов: последующие эффекты мутагенеза могут привести и к потере функциональности - образованию псевдогенов. Псевдогенами являются сегменты ДНК, произошедшие от генов и потерявшие как минимум часть их функций, связанных либо с экспрессией, либо со способностью кодировать белок. Существует три типа псевдогенов: единичные, дуплицированные (непроцессированные) и процессированные (рис. 2-3, см. цв. вклейку).

В геноме человека найдено 172 единичных псевдогена. Они образовались из-за различных мутаций (нонсенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки считывания), которые препятствуют нормальной транскрипции или трансляции гена. У таких псевдогенов нет дуплицированной копии, в геноме человека они уникальны. Находят их при полногеномном сравнении генома человека с геномами других организмов. Самым известным примером единичного псевдогена является псевдоген GULO человека, который представляет собой «сломанный» ген фермента глюконолактон-оксидазы, необходимого для синтеза аскорбиновой кислоты. У других млекопитающих GULO не является псевдогеном, а является работающим геном. Поэтому у них нет необходимости получать витамин C с пищей, они синтезируют его самостоятельно. Однонуклеотидная делеция, повредившая ген, возникла у предшественников приматов 58-63 млн лет и не была отсеяна отбором, а закрепилась, потому что наши предки употребляли достаточно растительной пищи, которая содержала витамин С.

Непроцессированных псевдогенов, образованных в результате дупликаций и последующей потери функции из-за мутаций, в геноме человека найдено 3272. Такие дуплицированные псевдогены обычно имеют все те же характеристики, что и оригинальные гены, включая интактную экзон-интронную структуру и регуляторные последовательности. Утрата функциональности дуплицированного гена обычно мало влияет на приспособленность организма, поскольку все еще существует целая функциональная копия.

Процессированных псевдогенов больше всего в геноме человека. Согласно проекту GENCODE, их насчитывается 14 739. Механизм их образования включает процесс ретротранспозиции. Ретротранспозоны эукариот кодируют обратную транскриптазу, которая используется ими для встраивания в геном хозяина подобно тому, как это происходит у вирусов. У высших эукариот, особенно млекопитающих, ретротранспозиция является довольно распространенным явлением, которое оказало огромное влияние на состав генома. Хотя ретротранспозоны обычно создают свои копии, было показано, что они также могут создавать ретротранспозированные копии случайных генов. В результате мРНК генов человека может быть транскрибирована обратно в последовательность ДНК и интегрирована в геном. Полученные процессированные псевдогены не имеют интронов, как правило, содержат поли-А-хвост и расположены в других хромосомах, чем гены, из которых они происходят.

Важно отметить, что ретротранспозиция не является процессом высокой точности, поэтому процессированные псевдогены накапливают многочисленные мутации, которые изменяют функцию кодируемого белка и регуляцию ретротран-скрибированного гена. Поскольку у процессированных псевдогенов отсутствуют промоторы и они экспрессируются с помощью других регуляторных элементов, их транскрипционная регуляция обычно отличается от регуляции их родительских генов. Результаты проекта ENCODE продемонстрировали, что около 20% процессированных псевдогенов человека способны транскрибироваться.

Псевдогенам уделяют много внимания по двум причинам. Во-первых, они часто затрудняют проведение ДНК-диагностики, и порой найденные мутации могут располагаться в последовательности псевдогена, а не самого гена. Во-вторых, в многочисленных исследованиях было показано, что транскрипционно активные процессированные псевдогены могут быть регуляторами экспрессии самих генов. Так, было показано, что потеря псевдогена PTENP1 при раке приводит к понижению экспрессии самого гена PTEN, являющегося геном-супрессором опухолевого роста. Оказалось, что из-за высокой схожести последовательностей гена и псевдогена одни и те же малые интерферирующие РНК способны взаимодействовать с ними, тем самым влияя на их уровень экспрессии. Поэтому понижение экспрессии одного из них приводит к понижению экспрессии другого из-за более активного подавления его экспрессии с помощью высвобождающихся молекул микроРНК.

БЕЛОК-КОДИРУЮЩИЙ ПОТЕНЦИАЛ ГЕНОВ

Вернемся к определению гена, в которое входит понятие функциональных продуктов. Как определить эту функциональность? Ранее считалось, что именно белок является основной конечной целью транскрипции генома, так как белки являются основными функциональными молекулами в клетке. Интересно, что с каждым годом число белок-кодирующих генов уменьшается. Если исходно их было найдено 22 585, то на сегодняшний день GENCODE проаннотировал только 19 975 таких генов. Почему так происходит? На самом деле, существование белок-кодирующего гена еще совсем не значит, что с его транскриптов будет происходить трансляция белка. Как мы помним из примера выше, при секвенировании растения Coffea canephora не было сделано ни одного протеомного исследования, только секвени-рование генома и транскриптомов. Сами гены и то, что они являются белок-кодирующими, было найдено и определено биоинформатически.

Действительно, невозможно сразу провести необходимые эксперименты для всех проаннотированных 25 574 генов. Для человека мы имеем аналогичную ситуацию. Исследование функции генов - это очень долгий процесс, для которого потребуется еще не одно десятилетие. Биоинформатические же подходы позволяют провести быструю оценку полученных данных на основе имеющегося молекулярно-биологического понимания. Однако эукариотические организмы устроены очень сложно, поэтому ошибки здесь неизбежны.

Согласно общемировой базе данных neXtProt, на 2019 г. зарегистрировано 17 694 белков, чье существование доказано экспериментально. Одна из больших сложностей в идентификации белков - их посттрансляционные модификации, которые являются обязательным этапом созревания многих белков, а также регулируют продолжительность их существования в клетке, ферментативную активность, взаимодействия с другими белками. На сегодняшний день известно более 200 вариантов посттрансляционной модификации белков, и, по всей видимости, модификациям подвергается подавляющее большинство белков. Известно, что посттрансляционные модификации сильно затрудняют идентификацию белков различными протеомными методами. Однако также возможно, что около 2000 белок-кодирующих генов на самом деле могут таковыми не являться.

Кодирующий потенциал транскрипта на сегодня определяется путем поиска открытой рамки считывания длинной более 300 нуклеотидов, начинающейся с кодона ATG и заканчивающейся одним из трех стоп-кодонов - TAA, TGA и TAG. У данного подхода есть много ограничений. Первое - он не позволяет находить белки, транслирующиеся не с кодона ATG. Есть много работ, свидетельствующих о том, что трансляция в эукариотических организмах может начинаться и с других альтернативных старт-кодонов. Поэтому для части белок-кодирующих генов после экспериментального исследования белки оказываются длиннее или короче ожидаемого размера.

Второй важный момент связан с длиной открытой рамки считывания. Совсем недавно было найдено множество коротких открытых рамок считывания, трансляция которых раньше была совсем не исследована. Впервые они были описаны в работе 2014 г., когда была предпринята попытка масс-спектрометрически охарактеризовать низкомолекулярную фракцию белков (≤30 кДа) из нескольких клеточных линий и тканей человека. В результате было найдено 237 пептидов с минимальной длиной в 8 аминокислот. Дальнейший анализ показал, что короткие открытые рамки считывания, которыми они кодируются, могут находиться в любом месте как белок-кодирующих транскриптов, так и в последовательностях длинных некодирующих РНК. Второй интересной особенностью таких пептидов оказалось, что только около 30% из них транслируются с кодона ATG, остальные 70% имеют около десяти других альтернативных старт-кодонов (ATA, AAG, AGG, ATT, CTG и другие).

С тех пор вышло много других работ, в которых было экспериментально выявлено суммарно несколько тысяч таких пептидов. При этом по биоинформатическим оценкам в транскриптоме человека может быть закодировано порядка 3 млн коротких открытых рамок считывания. Для некоторых пептидов уже показано, что они играют важную роль в различных молекулярных процессах, таких как апоптоз, репарация ДНК, деградация мРНК, метаболический гомеостаз.

Таким образом, изучение кодирующего потенциала генов - это фундаментальная высоковостребованная научная задача. Функция примерно половины белок-кодирующих генов хорошо изучена, и считается, что каждый год происходят функциональные исследования примерно сотни новых генов человека. Большинство белков состоит из более чем одного функционального домена, поэтому они способны выполнять различные функции, а мутации, возникающие в них, могут приводить к различным эффектам.

ГЕНЫ БЕЛОК-НЕКОДИРУЮЩИХ РНК

Число генов белок-некодирующих РНК уже не уступает белок-кодирующим. При этом они были открыты относительно недавно, и сейчас исследование их функции является одной из самых модных и интересных задач в молекулярной генетике человека. Среди них можно выделить три основных категории: гены длинных белок-некодирующих РНК, гены коротких белок-некодирующих РНК и гены домашнего хозяйства (рис. 2-4). Последняя категория наиболее известна, в нее входят рибосомальные РНК, транспортные РНК, малые ядрышковые РНК. В клетке они составляют около 95% всех РНК и необходимы для базовых клеточных процессов, таких как трансляция и транскрипция (сплайсинг). Структура и функция этих генов давно и детально изучены.

Короткие белок-некодирующие РНК стали широко известны после работы Эндрю Файера и Крейго Мелло (Seydoux и др., 1996), за которую в 2006 г. они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Работа была посвящена открытию и исследованию нового механизма регуляции экспрессии генов - РНК-интерференции. Данный механизм происходит при участии коротких интерферирующих РНК как на транскрипционном уровне, посредством деградации мРНК, так и на посттранскрипционном уровне за счет ингибирования трансляции. Происходит это при участии белкового комплекса RISC, который взаимодействует с короткими белок-некодирующими РНК. Образованный комплекс может взаимодействовать с молекулой мРНК, и при полной комплементарности с короткими белок-некодирующими РНК это приводит к разрезанию мРНК и последующей ее деградации. Если же взаимодействие транскриптов не полностью комплементарно, то образованный комплекс приводит к репрессии трансляции.

Данные короткие белок-некодирующие РНК могут образовываться двумя способами (рис. 2-5, см. цв. вклейка). Первый - за счет процессинга длинных двуце-почечных РНК, которые могут образовываться при транскрипции антисмысловых генов, или ретротранспозонов, или вирусов. Такие РНК распознаются белком DICER, который расщепляет их до коротких белок-некодирующих РНК. В результате получаются так называемые малые интерферирующие РНК, или короткие интерферирующие РНК (siRNA - small interfering RNA), обладающие следующими характеристиками: двуцепочечные РНК, длина - 21-25 п.н., на 5'-конце находится фосфатная группа, на З'-конце - 2 неспаренных нуклеотида.

Второй способ - это малые некодирующие РНК - микроРНК, которые также способны подавлять экспрессию таргетных генов с помощью РНК-интерференции. У них совсем другой биогенез, но механизм действия идентичен - за счет взаимодействия с комплексом RISC. По своей природе молекулам РНК свойственно образовывать двуцепочечные структуры. Оказалось, что транскрипты некоторых генов могут сворачиваться в шпильки, тем самым образуя протяженные двуцепочечные РНК. Такие участки могут быть распознаны ядерным комплексом белков (Drosha и Pasha), которые могут вырезать из цельной молекулы РНК участок с двуцепочечной структурой (как правило, это длинная шпилечная двуцепочечная РНК), тем самым из при-микроРНК получается пре-микроРНК. Далее такой фрагмент экспортируется из ядра в цитоплазму, где белок DICER из пре-микроРНК делает зрелые молекулы микроРНК, расщепляя длинную двуцепочечную РНК на малые.

На сегодняшний день у человека описано 2654 микроРНК. Они могут быть закодированы как в последовательностях интронов, так и в последовательностях белок-кодирующих зрелых мРНК. Исследования показали, что короткие белок-некодирующие РНК обладают длительным временем жизни, от 24 до 220 часов, и таким образом могут долго и эффективно регулировать экспрессию таргетных генов, определяя судьбу многих клеточных процессов.

Среди коротких белок-некодирующих РНК есть также и функционально иные классы молекул. Среди них наиболее известны пиРНК, одноцепочечные молекулы длиной в 24-30 нуклеотидов, взаимодействующие с белком Piwi (Piwi-interacting RNA, piRNA). Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам (в основном транспозонам), однако есть множество других пиРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны. Обычно на 5'-конце таких РНК располагается уридин, на 5'-конце монофосфат, а на 3' - O-метильная группа. пиРНК - самый большой класс малых РНК, экспрессируемых в клетках животных. У мыши известно более 50 000 уникальных последовательностей пиРНК, у Drosophila - более 13 000. Главная функция пиРНК - подавление активности мигрирующих генетических элементов. Сами пиРНК экспрессируются только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша.

Длинными белок-некодирующими РНК (Long non-coding RNA, lncRNA) считаются такие транскрипты, длина которых превышает 200 п.н., и они не содержат открытой рамки считывания. Считается, что это самый эволюционно молодой класс транскриптов. Действительно, 81% из них - это приматоспецифичные гены, 19% возникли более 90 млн лет назад, и лишь 3% (425) произошли более чем 300 млн лет назад. Если сравнивать гены таких транскриптов с классическими белок-кодирующими генами, то можно определить несколько особенностей. Последовательности длинных белок-некодирующих РНК, как правило, имеют низкую консервативность, в них часто встречаются повторяющиеся последовательности, и транскрибируются они в виде одной изоформы. Экспрессируются они преимущественно на более низком уровне, в нескольких тканях, и имеют, как правило, ядерную локализацию. Однако в ряде работ было показано, что данный класс биомолекул может выполнять регуляторную роль во многих молекулярных процессах. Ниже будет рассмотрено несколько примеров.

Самым известным геном, кодирующим длинный белок-некодирующий транскрипт, является ген XIST (X-inactive specific transcript). Он расположен на Х-хромосоме плацентарных млекопитающих и отвечает за ее инактивацию. Транскрипт гена XIST у человека имеет длину около 17 000 нуклеотидов, состоит из 6 экзонов и процессируется, как и любая обыкновенная мРНК. Экспрессируется он в женских клетках и только с одной хромосомы, что и приводит к ее полной инактивации - она сворачивается в плотную неактивную структуру, которая также называется тельцем Барра. Транскрипт гена XIST распределяется по эухро-матиновым участкам Х-хромосомы, привлекая белки комплекса PRC2, которые ремоделируют хроматин. Было также показано, что данный механизм является универсальным, и если ген XIST поместить на другую хромосому, то это приведет к аналогичной инактивации.

Другим интересным видом длинных белок-некодирующих РНК являются кольцевые РНК. Оказалось, что если сайты сплайсинга расположены в последовательности РНК в инвертированном порядке, то сплайсинг проходит с образованием кольцевой РНК. Такие события происходят довольно часто, и у человека найдено несколько тысяч таких транскриптов. Они экспрессируются во всех типах тканей человека и могут получаться как из частей белок-кодирующих генов, так и из некодирующих. Кольцевые РНК по сути становятся неуязвимыми для клеточных РНКаз и поэтому существуют в клетке гораздо дольше, чем другие транскрипты.

Первой кольцевой РНК человека, для которой была изучена функция, была РНК ciRS-7. Было найдено, что ее последовательность содержит 74 сайта связывания с микроРНК-7, 63 из которых консервативны. Изменение экспрессии такой кольцевой РНК определяло количество свободной микроРНК-7 и таким образом влияло на экспрессию многих генов, регулируемых данной микроРНК. ciRS-7 стали называть губкой для микроРНК из-за ее способности связывать большое число малых некодирующих РНК.

И еще один пример связан с функцией некодирующей РНК sno-lncRNA. Функция ее была исследована при изучении делетированного локуса q11-q13 отцовской хромосомы 15, что приводит к появлению синдрома Прадера-Вилли (СПВ). Долгое время в этом локусе не могли найти генетических причин среди белок-кодирующих генов. Оказалось, что там были найдены длинные некоди-рующие РНК, содержащие в себе последовательности snoRNA (small nucleolar RNA - малые ядрышковые РНК). Было найдено, что каждая sno-lncRNA содержит множество сайтов связывания с белком Fox2, регулятором АС. Поэтому делеция данного района способствовала появлению большого числа свободного белка Fox2, что приводило к нарушению прохождения сплайсинга большого числа транскриптов. Данные патогенетические события приводили к аномальному развитию и возникновению заболевания.

На сегодняшний день показано, что около тысячи длинных белок-некодирующих РНК ассоциированы с различными заболеваниями. Для большинства из них эта ассоциация представляет собой связь в виде экспрессионных маркеров, отображающих происходящие в клетке или организме процессы. Однако уже для 15 наследственных заболеваний детально исследован их патогенез, причиной которой являлись изменения в структуре или экспрессии генов длинных белок-некодирующих РНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Число генов, обнаруженных в геноме человека, будет еще многократно меняться. Чем производительнее и чувствительнее становятся методы исследования, тем больше информации выявляется о структуре, экспрессии и функционировании транскриптов человека. Очень важную роль здесь играют международные проекты, которые ставят перед собой фундаментальные задачи по глубокому всестороннему исследованию структуры и функционирования геномов. Так, например, по данным японского проекта FANTOM5, существуют десятки тысяч не проаннотированных на сегодняшний день точек инициации транскрипции у человека. То есть зафиксирован сам факт того, что в данном месте генома могут транскрибироваться РНК, но что это за молекулы, мы пока не имеем представления.

Вторая причина увеличения числа генов связана с существующей сложностью исследуемого объекта, человеческого организма. К примеру, проект FANTOM5 проводит свои исследования на одной из самых больших и верифицированных коллекций культур клеток человека, как первичных, так и иммортализованных. Однако в них представлены не все возможные ткани, они не учитывают вариабельность экспрессии, вызванную генетическим полиморфизмом в популяции, и тем более в них совсем не представлены культуры клеток от больных с огромным спектром различных заболеваний.

Также важным вопросом остается вопрос о функции генов, непосредственно связанный с их определением как объекта. Здесь интересно будет упомянуть об исследовании компанией «deCODE genetics» в 2015 г., в котором было выполнено секвенирование около 2500 геномов исландцев и генотипирование около 100 000 исландцев. Исландия является относительно изолированной страной, и поэтому генетический анализ ее популяции является весьма интересным для поиска ассоциаций генотипа с фенотипом. Одним из интересных результатов этого исследования было обнаружение 8041 индивидуумов, которые являлись либо гомозиготами, либо компаунд-гетерозиготами по мутациям с потерей функции (loss-of-function) с частотой минорного аллеля ниже 2% для 1171 генов. Здесь возникает вопрос о том, насколько данные белок-кодирующие гены ими являются, и вообще, насколько они функциональны, как и множество других белок-некодирующих генов.

На вопрос о функциональности отчасти отвечают недавние исследования по проведению массового нокаута генов в нескольких клеточных линиях и оценке последующих клеточных эффектов. Было найдено, что нокаут 829 белок-кодирующих генов приводил к уменьшению пролиферации всех пяти исследуемых клеточных линий, а для длинных белок-некодирующих генов - ни одной. В целом число важных для жизнедеятельности клетки белок-кодирующих генов исчислялось несколькими тысячами, для длинных белок-некодирующих их было найдено на порядок меньше. И наконец, нокаут длинных белок-некодирующих генов показал их относительно узкую тканеспецифичную функцию: они могли проявлять эффект, снижая пролиферацию только в одной конкретной клеточной линии.

Список литературы

В медицинской генетике вариации в геноме человека представляют собой один из самых важных вопросов для исследований. Последовательность генома человека вариабельна и характеризуется сложным генетическим разнообразием. Сегодня все генетическое разнообразие генома может быть описано двумя феноменами - полиморфизмом и мутациями. Между ними есть много общего, и поэтому провести четкую границу порой сложно.

Генетический полиморфизм является основным инструментом изучения генетической структуры популяций. ДНК-полиморфизму предшествовали другие виды полиморфизма, сначала фенотипический, затем белковый и далее - ДНК-полиморфизм. Полиморфизм определяют как разнообразие аллелей, при котором минимальная частота аллеля составляет 1% и более.

Более глубокое понимание генетического разнообразия генома человека пришло в ходе выполнения международного проекта «1000 геномов», целью которого было секвенирование геномов более тысячи здоровых людей из различных популяций. В результате удалось охарактеризовать широкий спектр генетического разнообразия - в общей сложности было найдено более 88 млн генетических вариаций.

При этом было показано, что распределение выявленных генетических вариаций неоднородно. Какие-то участки генома имеют высокую частоту встречаемости генетических полиморфизмов, другие, наоборот, обеднены, и в большинстве случаев это имеет свое молекулярно-генетическое обоснование. Также было выявлено, что различные популяции могут иметь свой уникальный профиль различных генотипов, организующихся в определенные гаплогруппы. Все это является объектом изучения популяционной генетики.

В данной главе будут рассмотрены основные элементы генетического разнообразия и их характеристики. А также современное представление их роли в медицинской генетике.

ПОЛИМОРФИЗМ

Полиморфизм ДНК встречается у всех живых организмов. Чаще всего он представляет собой генетический локус, в котором присутствуют 2 или более аллелей. У разных видов он имеет разную частоту. Так, например, для плодовой мушки Drosophila melanogaster полиморфные локусы ДНК встречаются в 10 раз чаще, чем у человека. Но главное, что именно полиморфизм ДНК является основой вариабельности фенотипического многообразия вида.

В начале 1970-х годов Г. Харрисом были впервые сформулированы основы современного генетического многообразия. Термин «полиморфизм» использовался для описания различных фенотипов в популяции с точки зрения конкретных характеристик ферментов или белков. Было показано, что биохимическая индивидуальность человека в большинстве случаев является доброкачественной и не приводит к развитию патологии. Открытие полиморфных генетических локусов позволило исследовать гетерогенность популяции на качественно новом уровне. Более того, анализ сцепления с использованием полиморфных генетических маркеров и их сегрегации в семьях с наследственной патологией являлся одним из основных подходов к идентификации новых генов, ассоциированных с моногенными заболеваниями у человека до развития методов высокопроизводительного секвенирования.

Сегодня известно, что большая часть полиморфизма в геноме человека нейтральна, но существуют полиморфизмы, которые могут иметь функциональное значение, влияя как на экспрессию, так и на функцию генов. Показано, что полиморфизм слабо влияет на молекулярные процессы в клетке, но из-за их огромного числа каждый индивидуум имеет уникальную комбинацию, которая будет по-своему отражаться на фенотипе.

В геноме человека встречаются следующие типы ДНК-полиморфизмов: одно-нуклеотидные, полиморфизмы инсерций и делеций, полиморфизмы инсерций мобильных элементов, вариации числа копий, полиморфизмы инверсий. Рассмотрим поподробнее каждый из них.

Однонуклеотидные полиморфизмы

Самым простым и наиболее распространенным из всех полиморфизмов ДНК являются SNP. В большинстве случаев SNP представляет собой однонуклеотидную замену в локусе, таким образом мы имеем два аллеля, соответствующих двум различным нуклеотидным основаниям в определенном положении локуса (рис. 3-1). В среднем SNP встречаются в геноме человека один раз на каждые 1000 п.н. Однако распределение SNP по геному неравномерно: гораздо больше SNP обнаружено в некодирующих частях генома, в интронах и в последовательностях, которые находятся на некотором расстоянии от известных генов. Тем не менее существует значительное количество SNP, которые встречаются в генах и других известных функциональных элементах генома.

Большая часть генетического разнообразия генома человека была выявлена в ходе выполнения международного проекта «1000 геномов». Полученные данные явились основой для большого количества различных исследований. Так, был запущен международный проект HapMap Project, который поставил цель - разработать карты гаплотипов генома человека для исследования ассоциаций с различными заболеваниями. В результате этого проекта удалось сократить число SNP для проверки на их ассоциации с заболеваниями с 10 млн до нескольких сотен тысяч.

В белок-кодирующих генах на сегодняшний день зарегистрировано более 100 000 экзонных SNP. Приблизительно половина из них не приводит к изменению аминокислотной последовательности кодируемого белка, и поэтому они называются синонимичными, тогда как вторая половина изменяет аминокислотную последовательность и является несинонимичной. Другие SNP могут приводить к образованию стоп-кодона или к его исчезновению, а третьи способны изменять последовательность сайта сплайсинга. Такие SNP могут быть функциональными и влиять на прохождение молекулярных процессов в клетке.

Для подавляющего большинства SNP вопрос влияния на здоровье является предметом текущих исследований. При этом необходимо понимать, что высокая частота SNP не исключает их функциональности, но подразумевает, что в большинстве случаев они слабо влияют на проявление фенотипа.

Полиморфизмы инсерций и делеций

Второй класс полиморфизма является результатом вариаций числа нуклеотидов от одного до приблизительно 1000, вызванных инсерцией или делецией (indels, или инделы). В литературе также описаны и крупные инделы. На сегодняшний день выявлено более миллиона инделов, суммарно затрагивающих сотни тысяч нуклеотидов в геноме. Примерно половина всех инделов называется «простыми», потому что они имеют только два аллеля, то есть характеризуются наличием или отсутствием вставленного или удаленного сегмента. Однако другие инделы являются мультиаллельными из-за различного количества сегментов ДНК, которые вставляются тандемно в определенном месте генома, тем самым образуя так называемый микросателлит. Более подробно про микросателлиты было рассказано в главе «Геном человека».

Полиморфизмы инсерций мобильных элементов

Почти половина генома человека состоит из повторяющихся элементов различных семейств, разбросанных по геному (см. Главу 1). Хотя большинство копий этих повторов являются стационарными, некоторые из них мобильны и вносят вклад в генетическое разнообразие человека посредством процесса ретротранспо-зиции. Данный процесс включает несколько этапов: транскрипцию последовательности мобильного элемента в РНК, обратную транскрипцию в последовательность комплементарной ДНК (кДНК) и встраивание (транспозицию) в другой сайт в геноме (более подробно механизм описан на примере процессированных псевдогенов в Главе 2).

Два наиболее распространенных семейства мобильных элементов - это семейства повторов Alu и LINE. В различных популяциях описано около 10 000 полиморфизмов, обусловленных встраиванием мобильных элементов. Каждый полиморфный локус в этом случае состоит из двух аллелей: один со встроенным мобильным элементом и один без него. Полиморфизмы мобильных элементов обнаруживаются на всех хромосомах человека. Большинство из них расположены во внегенных областях генома, но небольшая часть из них находится внутри генов, преимущественно в 3'-нетранслируемых областях. Часто повторяющиеся элементы можно обнаружить в последовательностях белок-некодирующих РНК генов. Считается, что по крайней мере 5000 таких инсерций мобильных элементов имеют частоту более 10% в различных популяциях.

Вариации числа копий

Другой важный тип человеческого полиморфизма включает CNV. CNV концептуально связаны с инделами и микросателлитами, но отличаются от них вариацией числа копий более крупных сегментов генома, размер которых варьируется от 1000 до многих тысяч пар оснований. Варианты числа копий размером более 500 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) обнаруживаются у 5-10% людей в общей популяции, тогда как варианты, охватывающие более 1 млн нуклеотидов, обнаруживаются у 1-2%. Самые большие CNV иногда обнаруживаются в областях генома, характеризующихся повторяющимися блоками гомологичных последовательностей, называемыми сегментными дупликациями.

CNV небольшого размера могут иметь только два аллеля, характеризуясь наличием или отсутствием сегмента, аналогично инделам. Более крупные CNV имеют тенденцию содержать множественные аллели из-за наличия разного количества копий сегмента ДНК в тандеме. Что касается геномного разнообразия между людьми, общее количество нуклеотидов в составе CNV значительно превышает количество, которое различается из-за SNP. Содержимое любых двух геномов человека может отличаться от 50 до 100 млн нуклеотидов из-за различий в количестве копий в локусах CNV.

Примечательно, что вариабельный сегмент во многих локусах CNV может включать от одного до нескольких десятков генов, и, таким образом, CNV могут часто влиять на признаки, которые зависят от дозы генов. Поэтому важно принимать во внимание изменения числа копий, наблюдаемые у пациентов, для корректной интерпретации наблюдаемого фенотипа. Как и в случае со всеми полиморфизмами ДНК, значение различных аллелей CNV для здоровья и восприимчивости к болезням является предметом интенсивных исследований.

Полиморфизмы инверсий

Последняя группа обсуждаемых полиморфизмов - это инверсии, которые могут иметь размер от нескольких пар оснований до нескольких миллионов и при этом иметь различную ориентацию в геномах разных людей. Большинство инверсий характеризуются областями гомологии последовательностей на краях инвертированного сегмента, что подразумевает участие гомологичной рекомбинации в происхождении инверсий. В их сбалансированной форме инверсии, независимо от ориентации, не включают в себя приобретение или потерю участков ДНК, а инверсионные полиморфизмы (с двумя аллелями, соответствующими двум ориентациям) могут достигать значительных частот в общей популяции.

МУТАЦИИ

Понятие мутации как события, вызвавшего изменение структуры генетического материала, возникло в начале прошлого века (Де Фриз, 1904), а в 1932 г. Г. Меллером была предложена их первая классификация:

На сегодняшний день наиболее распространенный вариант классификации мутаций основан на принципе структурной организации генома, делящем мутации в зависимости от уровня организации генетического материала на геномные, хромосомные и генные мутации. Ниже они будут подробно рассмотрены.

Геномные мутации

Геномными мутациями являются мутации, изменяющие число хромосом в клетке. К ним относятся полиплоидии - изменения числа хромосом в клетке, кратного числу хромосом в гаплоидном наборе (23 хромосомы у человека), и анеуплоидии - изменения набора хромосом на одну или более хромосомы. При потере хромосомы возникает моносомия по данной хромосоме, а приобретение дополнительной хромосомы приводит к развитию трисомии. Основной механизм развития геномных мутаций связан с нарушением расхождения хромосом в мейозе.

Хромосомные мутации

К хромосомным мутациям, или хромосомным аберрациям, относятся изменения структуры хромосом: делеции (утрата участка хромосомы), дупликации (удвоение участка хромосомы), реципрокные и нереципрокные транслокации (перенос участка одной хромосомы на негомологичную хромосому), инсерции и инверсии (пара- и перицентрические). Некоторые из хромосомных мутаций (например, делеции) являются результатом гомологичной рекомбинации между сегментами ДНК с высокой гомологией последовательностей, расположенными более чем в одном сайте в области хромосомы. Хромосомные транслокации и некоторые инверсии происходят по другому механизму - в местах спонтанных двуцепочеч-ных разрывов ДНК. Как только разрыв происходит в двух местах в любом месте генома, то два свободных конца могут быть соединены даже без какой-либо очевидной гомологии в последовательности (подробнее этот материал представлен в главе «Хромосомные болезни»).

Возникновение хромосомных мутаций связано с возникновением двунитевых разрывов ДНК, которые могут возникать в клетке спонтанно или под действием различных мутагенных факторов (ионизирующее излучение, химические и биологические мутагены). Также было показано, что существуют горячие точки (ГТ) таких разрывов, по которым часто происходят хромосомные мутации. Например, наличие ломкого сайта в локусе Xq27.3 долгое время использовалось в диагностике синдрома Мартина-Белла. Природа данного явления на сегодняшний день до конца не ясна. Возможно, это связано с физической доступностью ДНК, а именно меньшей плотностью компактизации хроматина в различных участках генома.

Генные мутации

Генные мутации - это изменения структуры ДНК в пределах одного гена. Данные мутации подразделяются на точечные мутации, или однонуклеотидные замены (SNV - single nucleotide variation), делеции и дупликации одного нуклеотида или более, инверсии и инсерции. Генные мутации могут возникнуть в результате двух основных биологических процессов - ошибок, возникающих при репликации ДНК и при репарации ДНК. Рассмотрим их более подробно.

Несмотря на высокую точность работы ДНК-полимеразы человека по копированию геномной ДНК, она все же совершает одну ошибку каждые 10 млн п.н. Системы репарации затем исправляют более 99,9% этих ошибок. Таким образом, общая частота мутаций на одно основание в результате ошибок репликации является очень низкой - 1×10^-10 на деление клетки, то есть меньше одной мутации на геном при делении клетки.

Помимо ошибок репликации, от 10 000 до 1 млн нуклеотидов на клетку человека в день повреждается спонтанными химическими процессами, такими как депу-ринизация, деметилирование или дезаминирование. Эти повреждения вызваны взаимодействием ДНК с химическими мутагенами (природными или иными) в окружающей среде, воздействием ультрафиолетового или ионизирующего излучения. Большая часть из этих повреждений устраняется системами репарации в клетке, но не все.

Недавно была проведена точная оценка скорости мутаций по всему геному. Она была выполнена с помощью полногеномного секвенирования трио, состоящего из ребенка и обоих родителей, при этом искали новые мутации у ребенка, которые отсутствовали в последовательности генома родителей. Общая частота de novo мутаций, усредненная между материнскими и отцовскими гаметами, составляет приблизительно 1,2 ×10^-8 мутаций на пару оснований на поколение. Таким образом, каждый человек может получить примерно 75 новых мутаций в своем геноме, возникших в гаметах родителей. Также было показано, что частота отцовских de novo мутаций увеличивается с возрастом отца, поскольку ДНК сперматозоидов подвергается гораздо большему количеству циклов репликации, чем ДНК яйцеклеток. Интересно, что данная скорость появления новых мутаций с учетом роста и динамики популяции указывает на то, что в нынешней мировой популяции, насчитывающей 7 млрд человек, должно быть огромное количество относительно новых (и, следовательно, очень редких) мутаций.

Однонуклеотидные замены

СИНОНИМИЧНЫЕ ЗАМЕНЫ

Широко известно свойство вырожденности генетического кода, когда несколько кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту. Следовательно, некоторые однонуклеотидные замены не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка. Такие однонуклеотидные замены называются синонимичными. Несмотря на то что большая часть синонимичных замен считаются нейтральными и не подвергаются действию отрицательного отбора, многие синонимичные замены могут являться причиной развития наследственных и онкологических заболеваний. Синонимичные замены могут нарушать нормальное прохождение транскрипции, ко-транскрипционного фолдинга белков, изменять стабильность мРНК и влиять на сплайсинг пре-мРНК, нарушая как важные экзонные цисрегуляторные элементы, так и создавая новые криптические сайты сплайсинга в экзонах.

МИССЕНС-ЗАМЕНЫ

Однонуклеотидные замены, приводящие к замене одной аминокислоты на другую в полипептидной цепи, называются миссенс-заменами. Не все миссенс-замены влияют на функцию белка, многие из них являются нейтральными. Выявленные патогенные миссенс-варианты могут приводить к широкому спектру молекулярных событий, среди которых неправильный фолдинг белка, ускоренная деградация, изменение внутриклеточной локализации, нарушение функции белка.

Около 50% всех описанных патогенных мутаций, приводящих к наследственной патологии у человека, являются миссенс-мутациями. Интересно, что для некоторых наследственных заболеваний человека, таких как β-талассемия, CADASIL и др., преимущественно миссенс-мутации являются причиной развития патологии. Более того, так же как и синонимичные замены, миссенс-мутации могут нарушать сплайсинг пре-мРНК. По современным оценкам, от 10-20% всех описанных патогенных миссенс-мутаций в действительности не приводят к изменению на белковом уровне, но нарушают сплайсинг.

НОНСЕНС-ЗАМЕНЫ

Точечные замены, приводящие к изменению белок-кодирующего кодона на один из трех стоп-кодонов (TAA, TGA, TAG), называются нонсенс-заменами (от английского nonsense - бессмысленный). Так как трансляция мРНК прекращается при достижении стоп-кодона, то при замене белок-кодирующего кодона на стоп-кодон происходит преждевременная терминация трансляции в кодирующей области гена. При формировании преждевременного стоп-кодона дальше чем на 50 нуклеотидов от последней экзон-экзонной границы на мРНК в большинстве случаев происходит деградация транскрипта вследствие активации механизма нонсенс-опосредованной деградации РНК (NMD - nonsense mediated decay). В ряде случаев, даже если молекула мРНК, содержащая преждевременный стоп-кодон, не деградирует, образующийся в результате трансляции укороченный белок, как правило, является нестабильным и быстро деградирует в клетке. В результате из аллеля, содержащего нонсенс-замену, не образуется никакого белкового продукта.

В некоторых случаях однонуклеотидные замены могут изменять существующий стоп-кодон, расположенный в конце кодирующей области мРНК (stop loss). В таких случаях нарушается нормальная терминация трансляции, и трансляция белка продолжается в 3'-нетранслируемую область, что приводит к формированию белка с измененным и удлиненным С-концевым фрагментом. Такие белки могут являться токсичными для клетки или нарушать регуляторные последовательности, расположенные в 3'-нетранслируемой области, отвечающие за стабильность или транспорт мРНК.

ИНСЕРЦИИ, ДЕЛЕЦИИ И СТРУКТУРНЫЕ НАРУШЕНИЯ

К генным мутациям также относятся инсерции, делеции нуклеотидов и различные структурные нарушения, включающие инверсии, транслокации отдельных участков гена. В одних случаях инсерции и делеции могут затрагивать один или несколько нуклеотидов, тогда как в других данные изменения могут включать большую часть гена или даже весь ген. В зависимости от размера и природы нарушения различные молекулярно-генетические методы используются для выявления того или иного нарушения. К примеру, маленькие инсерции, делеции могут быть рутинно выявлены с помощью прямого секвенирования по Сэнгеру, тогда как крупные изменения копийности ДНК чаще диагностируются с помощью метода мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA - Multiplex ligation-dependent probe amplification).

Когда делеции или инсерции происходят в кодирующей области гена и их размер не кратен трем (не кратен размеру кодона), происходит сдвиг рамки считывания, начиная с позиции инсерции/делеции. Такие мутации называются мутациями со сдвигом рамки считывания (frameshift mutation). В результате сдвига рамки считывания получается другая последовательность кодонов, кодирующая другие аминокислоты и чаще всего приводящая к формированию преждевременного стоп-кодона в смещенной рамке, что в итоге приводит к образованию нефункционального белка.

В случае если делеция или инсерция кратна трем, сдвига рамки считывания не происходит, и трансляция мРНК не нарушается. В результате образуется белок, в котором либо отсутствует аминокислотная последовательность, либо существует дополнительная вставка (в зависимости от типа мутации). Сказать, как отразится такая мутация на функции белка, в большей части случаев невозможно без проведения экспериментальных исследований.

Особым вариантом инсерции являются инсерции мобильных генетических элементов, таких как LINE-повторы (long interspersed nuclear elements), в результате ретротранспозиции. LINE-повторы составляют более 20% генома человека, и, по современным оценкам, около 100 копий данных повторов способны к ретро-транспозиции. Данные повторы могут встроиться в любую область генома, в том числе в белок-кодирующую область гена, и приводить к сдвигу рамки считывания. Данный механизм описан, в том числе, для некоторых случав гемофилии А. Встраивание мобильного элемента в некодирующую последовательность интро-нов генов также может приводить к патологии в результате нарушения сплайсинга или встраивания мобильного элемента в состав мРНК (экзонизация мобильного элемента).

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЗАМЕНЫ

Замены не только в кодирующих областях гена могут приводить к развитию наследственной патологии. С использованием методов полногеномного секвени-рования все чаще выявляются мутации, расположенные в некодирующих участках генома. Данные замены могут располагаться в любой области гена (промотор, 5'- и 3'-нетранслируемые области гена, интроны), а также на огромном расстоянии от гена вплоть до нескольких миллионов нуклеотидов. Данные замены в первую очередь влияют на процессы транскрипции, процессинга и трансляции мРНК.

Замены в промоторной области гена могут приводить к снижению связывания РНК полимеразы с промотором и, таким образом, - к снижению общего уровня транскрипции. Замены, расположенные в 5'-нетранслируемой области, могут приводить к созданию или разрушению малых открытых рамок считывания (uORFs - upstream open reading frames), регулирующих уровень трансляции основной рамки считывания. Такой механизм, в частности, описан для гена PAX6, мутации в котором приводят к врожденной аниридии. Мутации в 3'-нетранслируемой области могут приводить к образованию сайтов связывания с малыми интерферирующими РНК (миРНК), что приводит к посттранскрипционному снижению уровня экспрессии гена по механизму РНК-интерференции.

Важной группой регуляторных мутаций являются мутации, влияющие на сплайсинг матричных РНК (мРНК). По современных оценкам, около 20% всех патогенных мутаций, описанных у человека, влияют на сплайсинг. Данные замены могут затрагивать как высококонсервативные динуклеотиды донорных и акцепторных сайтов сплайсинга, так и располагаться в экзонах и глубоко в интронах. Спектр нарушений сплайсинга включает и пропуск целых экзонов, и укорочение или удлинение экзонов вследствие активации криптических сайтов сплайсинга. Расположенные глубоко в интронах мутации могут приводить к включению псевдоэкзонов в состав мРНК, многие из которых содержат стоп-кодоны. На сегодняшний день биоинформатические программы предсказания не могут с высокой точностью предсказать эффект мутации на сплайсинг, и для подтверждения эффекта таких замен золотым стандартом является исследование структуры мРНК с помощью полимеразной цепной реакции, совмещенной с транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Также описаны и случаи, когда генетические изменения, расположенные на большом удалении от самого гена, могут стать причиной развития наследственного заболевания. Мутации, нарушающие последовательности энхансеров, сайлен-серов или инсуляторов, приводят к изменению уровня транскрипции регулируемого ими гена. Несмотря на множество описанных патогенетических механизмов реализации регуляторных мутаций, на 2020 г. в базе данных HGMD (Human Gene Mutation Database) описаны лишь 4723 регуляторные мутации, что составляет чуть более 1,5% общего количества описанных мутаций (289 346). Такая недо-представленность регуляторных мутаций, вероятнее всего, связана со сложностью в интерпретации данных замен и с отсутствием рутинных методов валидации их молекулярного эффекта.

«ДИНАМИЧНЫЕ МУТАЦИИ», ИЛИ ЭКСПАНСИИ ПОВТОРОВ

Особым классом мутаций являются так называемые «динамичные мутации», или экспансии повторов (более подробно они будут рассмотрены в отдельной главе руководства). В данном случае наблюдается увеличение копий простых повторов, таких как (CAG)n, (CCG)n, (CCTG)n и др. Данные повторы могут располагаться в кодирующей области (хорея Гентингтона), в нетранслируемых областях гена (миотоническая дистрофия 1-го типа) и в интронах (атаксия Фридрейха). Увеличение числа повторяющихся элементов в повторе происходит в гаметогенезе, и для заболеваний, связанных с экспансиями повторов, часто характерен феномен антиципации - развития более тяжелой клинической картины и более раннего дебюта заболевания, связанного с увеличением количества повторов, при передаче из поколения в поколения.

При экспансии повтора в кодирующей части может образоваться удлиненный белок, обладающий токсичным эффектом. Экспансии в некодирующих частях могут нарушать транскрипцию, процессинг мРНК и трансляцию. Показано, что для некоторых заболеваний характерно увеличение количества повторов при прохождении мужского (хорея Гентингтона) или женского мейоза (синдром Мартина-Белла). Такие отличия могут быть обусловлены определенными фундаментальными различиями между оогенезом или сперматогенезом. Другой возможной причиной может быть наличие отрицательного отбора по отношению к различным гаметам с удлиненными повторами.

Вариации индивидуальных геномов

Сегодня происходит обширная инвентаризация количества и типов вариаций, исходящая из прямого анализа индивидуальных диплоидных геномов человека. Впервые индивидуальный геном был секвенирован в 2007 г. Сейчас уже известны последовательности миллионов отдельных геномов, получаемых, как правило, в рамках крупных международных исследовательских консорциумов, изучающих генетическое разнообразие человека в отношении здоровья и заболеваний.

Какую степень вариации генома можно обнаружить в таких исследованиях? Индивидуальные геномы человека обычно несут от 5 до 10 млн SNP, из которых десятки тысяч являются редкими и новыми. Это говорит о том, что количество SNP, описанных для нашего вида, все еще неполное, хотя, предположительно, доля таких новых SNP будет уменьшаться по мере того, как все больше и больше геномов из все большего и большего числа популяций будут отсеквенированы.

Среди этих вариаций находятся варианты с известным, вероятным или предполагаемым клиническим значением. На основании исследований, проведенных на сегодняшний день, каждый геном несет до 10 вариантов, ассоциированных с известными наследственными заболеваниями. Кроме того, каждый геном несет тысячи несинонимичных SNP в белок-кодирующих генах, при этом некоторые из них могут изменять функцию белка.

Каждый геном также несет от 200 до 300 мутаций, способных приводить к потере функции. Некоторые из них присутствуют в обоих аллелях генов у конкретного человека.

Интересным и неожиданным аспектом индивидуального секвенирования генома является то, что в референсной сборке генома человека все еще не хватает значительной доли недосеквенированной и неаннотированной ДНК, которая обнаруживается буквально в каждом отдельном секвенируемом геноме. Эти «новые» последовательности обнаруживаются только при секвенировании дополнительных геномов. Таким образом, полная коллекция всех последовательностей генома человека, которые можно найти в нашей нынешней популяции из почти 8 млрд человек, по оценкам, на 20-40 Мб больше, чем существующая эталонная.

Каким бы впечатляющим ни был текущий перечень генетического разнообразия человека, очевидно, что мы все еще находимся в режиме открытий; без сомнения, еще предстоит раскрыть миллионы дополнительных SNP и других вариантов. Ниже приведены числа генетических изменений, которые может содержать любой индивидуальный геном:

СОВРЕМЕННАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

Сегодня среди генетиков широко распространено упрощенное видение двух основных вышерассмотренных объектов - полиморфизм и мутация. Под полиморфизмом понимают частые генетические вариации в геноме, встречающиеся чаще 1% в популяции и не имеющие патогенных свойств. Мутация, наоборот, - редкое событие и, как правило, патогенное. Такое мнение можно встретить в большинстве современных учебников и научных статей. При этом все больше накапливается знаний, что и частые полиморфизмы могут быть патогенными, и, наоборот, большая часть так называемых мутаций не имеет функционального значения. В качестве примера можно привести самую частую мутацию, приводящую к развитию муковисцидоза, - p.Phe508del, которая, согласно популяционной базе данных GnomAd, в европейской популяции имеет частоту носительства 1,238%.

Исходя из этого, была предложена альтернативная классификация, в которой все генетические изменения называются вариантами нуклеотидной последовательности. Каждый вариант имеет свои характеристики, такие как частота встречаемости, функциональная значимость, патогенность и другие. Научным сообществом Human Genome Variation Society были разработаны подробные правила номенклатуры названий различных типов генетических вариантов, с которыми можно ознакомиться на их сайте https://varnomen.hgvs.org. Единые правила по обозначению генетических вариантов являются необходимой основой всей медицинской генетики.

Вторым важным шагом в отношении генетических вариаций является создание рекомендаций по оценке патогенности вариантов нуклеотидной последовательности. Как уже говорилось выше, при секвенировании персонального генома человека можно обнаружить множество однонуклеотидных замен и других более сложных генетических изменений. Очень непростой, но востребованной задачей является оценка их патогенности. Так как большая часть выявляемых вариантов является новой, ранее не описанной, проведение такой оценки часто бывает очень непростой, а иногда и невыполнимой задачей.

Общими принципами такой оценки являются сбор и оценка различных характеристик у обнаруженных вариантов генетической последовательности, чтобы максимально объективно отнести вариант к одной из 5 существующих категорий: доброкачественный, вероятно доброкачественный, неизвестного клинического значения, вероятно патогенный, патогенный. Правила, по которым происходит оценка патогенности вариантов нуклеотидной последовательности, были впервые опубликованы Американским колледжем медицинской генетики (ACMG). В России существуют свои версии рекомендаций, разработанные российскими генетиками в 2017 и 2019 гг. Так как описанные в данных руководствах критерии не являются универсальными для всех генов человека, в последние несколько лет для отдельных нозологических групп и генов выходят адаптированные рекомендации и даже отдельные рекомендации по использованию отдельных критериев.

Отчасти из-за этих сложностей классификации на сегодняшний день ДНК-диагностика имеет относительно невысокую эффективность поиска причин заболевания. Медицинская генетика сейчас проходит этап накопления знаний о генетическом разнообразии и их функциональном значении. И здесь большую роль играют как популяционные исследования, описывающие генетическое разнообразие здоровых людей, так и создание профессиональных баз данных с описанием вариантов нуклеотидных последовательностей, выявленных у больных с различной патологией. Третьим важным компонентом являются научные исследования, проводимые как с целью изучения молекулярно-генетических основ патогенеза заболеваний, так и для функционального анализа выявляемых генетических вариантов.

Существующая тенденция перехода количества накапливаемых знаний в качество интерпретации патогенности вариантов нуклеотидной последовательности позволяет надеяться, что в ближайшие 10-15 лет эффективность проводимой ДНК-диагностики сильно увеличится. Об этом свидетельствует широко распространенная практика переанализа данных, полученных несколько лет назад, которая выявляет в 5-10% случаев патогенные варианты, не выявленные ранее.

Список литературы

Введение

Практически вся история развития биологии проходит под знаком огромного интереса к человеку как биологическому объекту. В результате после разработки новых методов им сразу находили применение в исследованиях, посвященных изучению человека. В этом отношении цитогенетика до 1956 г. представляла редкое исключение. Первые описания хромосом датированы еще 70-ми годами XIX в. Хромосомы были обнаружены в виде окрашиваемых структур, образующихся при клеточном делении. Их первые описания, представленные в литературе, были сделаны Страсбургером и Флемингом. Вскоре после этого было замечено, что при слиянии гамет число хромосом удваивается, а в ходе клеточного деления они расщепляются продольно и расходятся в дочерние клетки. Уже в 1882 г. Флеминг пришел к выводу о постоянстве числа хромосом в клетках одного вида. Годом спустя Ру, наблюдая за их особенностями, высказал предположение об участии этих образований в передаче наследственных признаков.

Дальнейшее развитие этой идеи Вейсманом, опиравшимся на полученные к тому времени данные об организации и поведении хромосом, легло в основу хромосомной теории наследственности. На этом этапе развития биологии изучение морфологии и поведения хромосом явно опережало развитие генетики как науки. Годом рождения последней считают 1866 г., когда Грегор Мендель опубликовал главный труд своей жизни. К сожалению, он не был достойно оценен современниками, и законы наследственности были открыты заново де Фризом, Корренсом и Чермаком только в 1900 г.

Имея такую многолетнюю фору, цитологи оказались хорошо подготовленными к моменту принятия научным сообществом основных законов передачи наследственной информации. Им потребовались лишь один-два года для проведения необходимых исследований и наглядной демонстрации соответствия поведения хромосом ожидаемому от гипотетических частиц наследственности. Учитывая очевидное различие в числе генов и хромосом, Саттон в 1903 г. дал структурно-морфологическое объяснение феномену сцепления генов, ранее открытому Корренсом. Описание непарной хромосомы и ее правильная идентификация как половой хромосомы показали значение последней в определении пола. Это обеспечило материальную базу для объяснения феномена сцепления генов с полом, открытого в 1906 г.

Прогресс в исследованиях и анализе полученных в те годы результатов, острота мысли биологов того времени поражают и сегодня. Уже в 1904 г. в гипотезе Саттона-Бовери достаточно полно и точно была определена связь хромосом с элементами наследственности. Вероятно, именно представление этой гипотезы можно считать той точкой в развитии биологии, начиная с которой изучение хромосом неразрывно связано с генетическими исследованиями, а цитогенетика стала отдельной, самостоятельной областью биологии.

В последующие годы успешное развитие цитогенетики было во многом обусловлено удачным выбором объектов исследования, в число которых человек, к сожалению, не входил. Многочисленные работы проводили на политенных хромосомах плодовой мушки Drosophila melanogaster, которая к тому времени уже стала одним из излюбленных объектов исследований генетиков. Активному изучению подверглись мейотические хромосомы амфибий. Несмотря на большой интерес к хромосомам млекопитающих, исследования в этой области в течение длительного времени были менее интенсивными и успешными, что связано с отсутствием полноценных методов анализа.

Путь, пройденный цитогенетикой млекопитающих к настоящему времени, условно можно разделить на четыре этапа.

Первый этап был посвящен главным образом поиску адекватных подходов к разработке соответствующих методик для исследования морфологии хромосом. Значительный вклад в развитие цитогенетики на этом этапе внесли такие выдающиеся отечественные исследователи, как П.И. Живаго, А.Г. Андрес и М.С. Навашин.

Началом второго этапа заслуженно считают 1956 г. - год опубликования работ, в которых были впервые представлены метафазные хромосомы человека. Это позволило правильно подсчитать их число и дать детальное описание их морфологии. Число хромосом в диплоидной клетке человека оказалась равно 46, а не 48, как полагали ранее. Это исследование было выполнено в Институте генетики г. Лунда (Швеция). Joe-Hin Tjio и Albert Levan провели его на клетках культуры, полученной из эмбриональной печени человека, благодаря усовершенствованию метода приготовления препаратов метафазных хромосом. Следует отметить, что работы в этом направлении со сходными результатами выполняли и ранее. В 1954 г. Eva и Yngve Melander, также работавшие в Институте генетики г. Лунда, определили число хромосом человека как 46. Joe-Hin Tjio и Albert Levan упоминают эти результаты в своей знаменитой статье. Eva и Yngve Melander работали с давлеными препаратами ткани эмбриональной печени. К сожалению, полученные ими результаты были недостаточно убедительными. Фотография метафазной пластинки с 46 хромосомами человека, представленная в качестве решающего аргумента в вопросе о числе хромосом человека, была сделана Joe-Hin Tjio 22 декабря 1955 г. в 2 ч ночи по местному времени. В те годы днем Институт генетики был активно функционирующим учебным институтом. Исследовательскую работу начинали вечером и часто заканчивали поздно ночью. Эту фотографию с пометкой в нижнем левом углу «Human cell with 46 chromosomes observed 1955 on December 22nd at 2.00 am» Joe-Hin Tjio разослал своим друзьям и коллегам по всему миру. Сегодня в память об этом факте у главного входа в институт висит мемориальная доска (рис. 4-1). Статья, подготовленная Joe-Hin Tjio и Альбертом Леваном, была представлена в журнал Hereditas 26 января 1956 г. и опубликована в апрельском номере этого журнала. Высокое качество препаратов и фотографий, анализ 265 метафаз, из которых лишь в четырех число хромосом отличалось от 46, устранили всякие сомнения в том, что более 30 лет число хромосом человека, считавшееся равным 48, было неверным. В том же году Чарльз Е. Форд и Джон Л. Хамертон подтвердили полученный их коллегами результат. Этот этап развития цитогенетики характеризуется интенсивными исследованиями морфологии митотических и мейотических хромосом млекопитающих и началом работ, посвященных изучению структурно-функциональной организации хромосомы. В это же время были проведены первые исследования репликации хромосом и их отдельных районов, разработаны методы введения в ДНК хромосом радиоактивных предшественников, а также методы радиографии хромосомных препаратов. Были описаны первые примеры хромосомных нарушений у человека, показано значение изменений хромосомного баланса, и возник такой раздел науки, как медицинская цитогенетика.

Начало следующего этапа (конец 60-х - начало 70-х годов) было обусловлено созданием методов дифференциального окрашивания хромосом, идентификации как целых хромосом, так и их отдельных районов. Развитие этих методов принципиально изменило ситуацию не только в цитогенетике, но и в генетике человека в целом. Немного раньше разработки методов дифференциального окрашивания хромосом были получены первые гибриды соматических клеток, а затем и клоны гибридных клеток, содержащих наряду с полным набором хромосом мыши отдельные хромосомы человека. Описание хромосомного состава линий гибридных клеток и определение присутствующих в них генов человека положило начало картированию его генома. Локализацию генов определяли сначала с точностью до целой хромосомы, затем, используя перестроенные хромосомы человека, - с точностью до хромосомного района, позже, анализируя соматические гибриды, индуцированные облучением перестроенные хромосомы человека, определяли порядок генов в хромосоме и относительное расстояние между ними.

Развитие лазерной микротехники в 1970-х гг. позволило приступить к изучению принципов организации хромосом человека в интерфазном ядре не на модельных объектах, а в прямых экспериментах. В первых исследованиях для индукции микроповреждений хромосом в интерфазе использовали микролуч лазера. Изучение изменений проводили спустя несколько часов, анализируя метафазные хромосомы. Полученные результаты привели к формированию представлений о существовании внутри интерфазного ядра территорий, занятых материалом отдельных хромосом. В дальнейшем при изучении принципов пространственной организации хромосом в интерфазном ядре успешно использовали гибриды соматических клеток, но настоящий прорыв в этой области стал возможен лишь благодаря огромным успехам в развитии молекулярной биологии и микроскопической техники в конце XX и начале XXI в.

Четвертый этап характеризуется широким внедрением в практику хромосомного анализа молекулярно-цитогенетических методов. Во многом его успешное развитие оказалось обусловлено разнообразным использованием гибридизации нуклеиновых кислот. В настоящее время можно выделить три основных направления в развитии современной цитогенетики.

Таким образом, обнаружение хромосомных нарушений стало возможным в отсутствие препаратов хромосом пациента. Секвенирование генома человека и стремительное развитие методов молекулярной биологии и биоинформатики поставило вопрос, где находятся границы между цитогенетикой, молекулярной генетикой и молекулярной биологией. Первый проект, непосредственно посвященный изучению генома человека, стартовал в 1990 г. под руководством Джеймса Уотсона под эгидой Национальной организации здравоохранения США. Существовавшая в то время методическая база предполагала, что решение задачи секвенирования генома человека займет десятилетия. Однако уже в 2000 г. был выпущен первый рабочий черновик структуры генома, а сборка почти полного генома была представлена в 2003 г. Правда, следует заметить, что статус почти завершенной сборки генома человека сохранился до настоящего времени. Секвенирование персональных геномов показало их большое разнообразие как по SNP, вариациям по числу копий различных участков, так и по другим вариантам организации. Высокая эффективность современных методов секвенирования позволила решать задачи изучения геномов десятков и сотен тысяч людей, принадлежащих различным группам населения. Целью международного проекта (HapMap), стартовавшего в 2002 г., являлись изучение и систематизация генетических особенностей геномов людей. 2-го сентября 2010 г. была опубликована карта вариаций генома человека третьего поколения, в которой одна SNP в среднем приходилась на 279 пар оснований. Проект 1000 Genomes Project (1KGP) был начат в 2008 г. В 2015 г. в журнале Nature были представлены результаты реконструкции геномов 2504 человек из 26 популяций. Было выявлено более 88 млн различных вариаций (84,7 млн SNP, 3,6 млн инсерций и делеций, 60 000 структурных вариантов). То есть суммарно SNP встречаются каждые 30 п.н. В Великобритании в 2013 г. был запущен проект 100,000 Genomes Project. К 1 октября 2018 г. уже были секвенированы 87 231 персональных геномов. Выявленные различия геномов включают, среди прочих, отличия в присутствии в них участков геномов других видов древних людей. Также стоит упомянуть, что в настоящее время остаются почти не вовлеченными в анализ районы структурного гетерохроматина хромосом человека, что может представлять отдельный и большой интерес в связи с их значительными вариациями по размеру в 1, 9, 16-й и Y-хромосомах. Более того, относительно недавно была выявлена интенсивная транскрипция ДНК некоторых районов структурного гетерохроматина на определенных стадиях онтогенеза и в фазах клеточного цикла. Вариабельность качественного и количественного состава повторенных последовательностей ДНК С-положительных районов хромосом, районов, которые остаются несеквенированными до настоящего времени, требует разработки принципиально новых подходов к их изучению.

Следует отметить, что, помимо анализа SNP, массовое параллельное секвениро-вание и другие современные методы, базирующиеся на анализе последовательностей нуклеотидов, используются для анализа в геноме числа отдельных хромосом и хромосомных районов. Вероятно, такие и все другие исследования, посвященные анализу хромосом и хромосомных районов, имеет смысл отнести к разделу современной цитогенетики, признав, что сегодня значительная часть цитогенетических работ и цитогенетической диагностики проводится без использования препаратов митотических или мейотических хромосом.

Выявление обширного полиморфизма различных участков в геноме человека и принципиальная, а часто и техническая возможность диагностики, обеспечивающей детальную информацию о практически любом хромосомном районе, остро поставило вопрос о разграничении нормы и патологии при проведении такого детального анализа хромосом. Уже показано огромное значение для формирования фенотипа вариабельности по числу копий определенных последовательностей ДНК. Решение этой задачи осложняется различиями проявления различных структурных и количественных вариантов хромосомной организации на различном генетическом бэкграунде. Во многом загадочным остается значение различий по локализации и размерам кластеров дуплицированных последовательностей, широко представленных в хромосомах человека. Несмотря на многочисленные исследования метилирования ДНК и модификации гистонов, мы и в этой области находимся лишь в начале пути. Стремительный рост знаний позволяет детализировать и расширять представления о структурно-функциональной организации хромосом, но с еще большей скоростью он вскрывает новые проблемы, ставит новые вопросы и открывает новые направления.

Сегодня цитогенетика человека является разделом биологии, в котором исследователи как заняты решением фундаментальных проблем структурно-функциональной организации генома человека, так и принимают непосредственное участие в разработке и использовании новых методов анализа в диагностических целях. Цитогенетика служит неотъемлемым элементом современной медицины, без которого уже невозможно представить доимплантационную, пре- и постнатальную диагностику и диагностику онкологических заболеваний.

Номенклатура хромосом человека

Развитие любой области науки всегда связано с формированием и развитием ее специального языка, возникновением новых терминов и правил их использования. Эта проблема особо остро встала перед цитогенетикой в связи с необходимостью описания хромосом человека. К ее решению приступили сразу после разработки методов приготовления препаратов метафазных хромосом человека. Результаты, полученные в 1956 г., вызвали резкое увеличение числа исследований, посвященных хромосомам человека. Уже к 1959 г. были предложены различные классификации хромосом, но их многообразие только осложнило общение исследователей, работающих в этой области. Разработка общей системы описания хромосом стала насущной необходимостью. По предложению Чарльза Форда в г. Денвере (Колорадо, США) собрались 14 исследователей и трое консультантов, представлявших все лаборатории, которые к тому времени опубликовали результаты анализа кариотипа человека и описания хромосом. На этом собрании, более известном как Денверская конференция (1960), была предложена система описания хромосом, озаглавленная A Proposed Standard System of Nomenclature of Human Mitotic Chromosomes. Заложенные принципы описания хромосом, несмотря на многочисленные дополнения, обусловленные интенсивным развитием новых методов хромосомного анализа, до настоящего времени остались неизменными.

Спустя три года, на лондонской встрече (1963), организованной по инициативе С. Пенроуза, было официально введено разделение хромосом человека на семь групп, обозначенных буквами от A до G. Ранее оно было предложено К. Патау еще в 1960 г. Следующее значительное событие произошло в 1966 г. в г. Чикаго на III Международном конгрессе по генетике человека. Анализ результатов исследований хромосом человека, накопившихся к этому времени, позволил сформулировать правила краткого описания набора хромосом человека в норме и при патологических изменениях. Эти правила прошли проверку временем и для хромосом человека при рутинной окраске остались неизменными до настоящего момента.

В 1968 г. произошло событие, определившее развитие цитогенетики на долгие годы. Торнбьерн Касперсон и соавт. показали, что окраска растительных хромосом акридиновым оранжевым дает дифференциальное окрашивание по длине хромосомы. Этот способ немедленно применили для анализа хромосом человека, и уже в 1970 г. был опубликован первый кариотип дифференциально окрашенных хромосом, в котором каждая из них получила свой номер. Вскоре был предложен еще ряд методов дифференциальной окраски хромосом, дающих сходные результаты. Анализ и обобщение результатов дифференциального окрашивания требовали систематической работы, поэтому в 1971 г. в Париже на IV Международном конгрессе по генетике человека пришли к заключению о необходимости создания комитета для разработки номенклатуры хромосом человека. Его первое заседание под председательством Джона Хамертона состоялось в Эдинбурге в январе 1972 г. В результате был принят документ, имеющий огромное значение для дальнейшего развития цитогенетики человека. В нем были сформулированы принципы описания не только целых хромосом человека, но и их отдельных районов. В 1976 г. в Мехико на V Международном конгрессе по генетике человека был избран первый международный постоянно действующий комитет по номенклатуре хромосом человека (International Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature). Это был первый постоянно действующий орган с широким международным и географическим представительством. Он работал под председательством Яна Линдстена. Результатом его работы стало создание первой официальной номенклатуры хромосом человека - An International System for Human Cytogenetic Nomenclature(ISCN, 1978).

Следующим шагом в развитии номенклатуры хромосом стала ее адаптация к результатам исследований хромосом человека, выполненных на высоком уровне разрешения. Если ISCN (1978) описывала в хромосомах человека около 400 сегментов, то номенклатура, предложенная комитетом под председательством Бернарда Дютрилё, давала возможность описания хромосом с разрешением в 550 и 850 сегментов на гаплоидный набор (1981). Следующая версия ISCN (1985) была подготовлена в 1984 г. комитетом под председательством Дэвида Хардена. В дальнейшем она была усовершенствована для более точного и однозначного описания хромосомных перестроек, обнаруживаемых при онкологических заболеваниях (ISCN, 1991). Следующая номенклатура была принята 9-13 октября 1994 г. на заседании комитета в Мемфисе (ISCN, 1995). В отличие от предыдущих вариантов, в ней были учтены проблемы описания результатов, полученных при использовании FISH. Десять лет она успешно служила цитогенетике, и лишь в декабре 2004 г. на конференции в Ванкувере были уточнены некоторые ее положения. В ISCN (2005) были представлены G- и R-дифференциально окрашенные хромосомы на высоком уровне разрешения, добавлены новые идиограммы на уровне 300 и 700 бэндов, расширен раздел, касающийся гибридизации in situ, включены дополнительные примеры редких вариантов хромосомных перестроек и введена базовая номенклатура хромосом для сравнительной геномной гибридизации со следующими изменениями и дополнениями: введены новые схемы дифференциально окрашенных хромосом на всех уровнях разрешения; пересмотрена номенклатура в случаях неоплазий и введено использование специальной терминологии для обозначения основных и сопутствующих клеточных клонов при описании клональной эволюции; в большинство глав включены новые примеры для описания сложных и уникальных ситуаций; представлена краткая и полная номенклатура для описания результатов микроэррей диагностики, включающая все существующие в то время платформы; представлена номенклатура для описания результатов MLPA-диагностики.

Дальнейшее совершенствование ISCN было связано главным образом с разработкой и введением описания результатов исследований, полученных с использованием методов полногеномного анализа. Они нашли отражение в ISCN (2013) и ISCN (2016). Более того, в 2016 г. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (Международная система цитогенетической номенклатуры) получила новое название - An International System for Human Cytogenomic Nomenclature (Международная система цитогеномной номенклатуры). В последней версии ISCN основные изменения затронули главы «Микроматричный анализ» и «Районоспецифичные анализы», а также была включена новая глава «Технологии, основанные на секвенировании». Идиограммы хромосом представлены для пяти уровней разрешения (300, 400, 550, 700 и 850), как это было введено в ISCN (2013). В сравнении с предыдущей номенклатурой появился ряд новых символов и сокращений, а также исчезли некоторые сокращения. Нововведения в ISCN (2016) недавно были систематизированы и рассмотрены в статье Антоненко и Шиловой (2018).

В настоящее время номенклатура ISCN (2016) обязательна для использования исследователями и сотрудниками медицинских учреждений, работающими в области цитогенетики человека.

Хромосомы человека, несомненно, представляют особый случай, что связано с тем вниманием, которое было уделено созданию их номенклатуры. Разработанные принципы рекомендованы для построения номенклатур других видов млекопитающих. Сегодня ISCN (2016) представляет собой и словарь, и грамматику языка цитогенетика. Изложить ее в настоящей главе даже в кратком варианте не представляется возможным. В ISCN (2016) включены разделы, в которых приведены правила описания кариотипа, хромосом и хромосомных районов, различных хромосомных аномалий и хромосомного полиморфизма. В настоящей главе будет представлена только та минимальная информация, без которой будет очень сложно говорить об организации хромосомы и диагностике хромосомных нарушений.

Идентификация и описание основных ориентиров, районов и бэндов хромосом

В номенклатуре хромосом человека каждой хромосоме присвоен номер, а при описании конкретного места на хромосоме указывается, в состав какого плеча, района, бэнда, суббэнда и субсубэнда оно входит. Таким образом, положение на хромосоме описывается 6 символами. Необходимо отметить, что в номенклатуре все хромосомы человека рассматривают как непрерывные серии бэндов и суббэндов. При этом бэндом, а затем и суббэндом, считают участок хромосомы, отличающийся от соседних по интенсивности окрашивания соответствующими методами. Согласно ISCN (2016), бэнды отражают структурно-функциональную организацию генома, обусловливающую регуляцию репликации ДНК, репарацию, транскрипцию и генетическую рекомбинацию. Бэнды - крупные структуры размером 5-10 млн п.н., которые могут включать сотни генов. Молекулярная основа дифференциального окрашивания хромосом - нуклеотидный и белковый состав, а также функциональная организация участков генома, соответствующих бэндам. G-позитивные бэнды (R-негативные) содержат АТ-богатую (относительно соседних бэндов), поздно реплицирующуюся ДНК, бедную генами, тогда как G-негативные бэнды (R-позитивные) богаты GC, обогащены генами, их ДНК реплицируется в начале S-фазы клеточного цикла.

Для описания места на хромосоме используется следующий порядок записи: первым указывается номер хромосомы, затем плеча, район в составе плеча, бэнд в составе района, суббэнд в составе бэнда и на самом высоком уровне разрешения - субсуббэнд в составе суббэнда. Например, 1p36.31 означает участок хромосомы, находящийся в первом субсуббэнде третьего суббэнда шестого бэнда третьего района короткого плеча первой хромосомы человека (рис. 4-2). Стоит обратить внимание, что суббэнды отделены от бэндов точкой, и произносится такая запись следующим образом «первая хромосома, короткое плечо, три, шесть, точка, три, один». Ни число районов в плече хромосомы, ни бэндов в районе, ни суббэндов в бэнде, ни субсуббэндов в суббэнде не может быть двухзначным.

Для обозначения коротких и длинных плеч хромосом, а также районов и бэндов, расположенных в них, используют следующие символы: p - короткое плечо хромосомы (от французского petite - маленький), q - длинное плечо (от английского queue - очередь, хвост). Плечи разделяет центромера, обозначаемая символом «cen», но для обозначения ее части, прилежащей к р-плечу, применяют символ «р10», а прилежащей к q-плечу, - символ «q10». Район хромосомного плеча, ближайший к центромере, обозначают цифрой 1, следующий - цифрой 2 и т.д. Нумерация бэндов внутри района также проводится в направлении от центромеры к теломере. То же правило действует для суббэндов и субсуббэндов. Для описания суббэндов в составе бэнда после номера последнего ставят точку, а затем номер соответствующего суббэнда. Суббэнды в пределах бэнда также нумеруют в направлении от центромеры к теломере. Так, в бэнде 1р31 выделяют три суббэнда: 1р31.1, 1р31.2 и 1р31.3, из которых 1р31.1 - проксимальный, а 1р31.3 - дистальный. Если суббэнды подразделяются на части, то их также нумеруют цифрами, но уже без использования пунктуации. Например, 1р31.11 означает «проксимальный элемент суббэнда 1р31.1».

Важными элементами в номенклатуре хромосом являются четко видимые ориентиры, представленные постоянными и отчетливыми морфологическими особенностями хромосом и делящие их на районы. К таким ориентирам относят концы хромосомных плеч, центромеры и определенные, наиболее четко видимые бэнды. Бэнды, используемые в качестве ориентиров, полностью входят в состав дистального района. Перечень и описание бэндов, используемых в номенклатуре хромосом человека в качестве ориентиров, приведены в ISCN (2016). GTG-дифференциально окрашенные хромосомы человека и идиограмма GTG-дифференциально окрашенных хромосом с обозначением номеров бэндов представлены на рис. 4-3 и 4-4 (см. цв. вклейку).

Общие принципы описания кариотипа

В данном разделе будут рассмотрены общие принципы и правила описания кариотипа. По требованиям к точности их исполнения они напоминают языки машинного программирования. Пропуск символа или пробела может полностью изменить весь смысл приводимого описания.

Первым пунктом в описании кариотипа указывается общее число хромосом, включая половые хромосомы. Данное число отделяется от остальной части записи запятой (,). Следом записываются половые хромосомы. Аутосомы расписываются лишь в случае наличия аномалий и приводятся в порядке возрастания их номеров. Ниже приведены записи нормальных кариотипов:

При наличии численных и/или структурных хромосомных аномалий первыми записываются аномалии половых хромосом, затем аномалии аутосом в порядке возрастания номеров независимо от типа аномалии. Каждая аномалия выделяется запятыми. Знаки плюс (+) или минус (-) перед хромосомой указывают на приобретение дополнительной хромосомы или на потерю хромосомы:

Единственным исключением из этого правила являются конститутивные аномалии половых хромосом, которые описываются без использования знаков (+) или (-). Например:

Наличие в описании численных аномалий половых хромосом знаков (+) и (-) указывает на приобретенный характер аномалий. Например:

При замещении в кариотипе нормальной хромосомы перестроенной, нормальная хромосома не указывается как потерянная:

Для обозначения множественного числа копий используется знак умножения, но он может быть использован только для обозначения множественных копий перестроенных хромосом. Его использование в случае нормальных хромосом недопустимо. Символ ставится после описания хромосомы:

При наличии, кроме хромосом с делециями, двум нормальных хромосом кариотип должен быть описан следующим образом:

Описание объектов, содержащих разные клоны клеток

При описании объектов, содержащих разные клоны клеток, приводятся кариотипы всех клонов, разделенные косой чертой (/ ). В квадратных скобках после описания кариотипа указывается абсолютное число клеток данного клона, выявленное в проведенном исследовании. Указывается также причина наличия разных клонов. Символы mos (мозаик - различные клеточные линии произошли из одной зиготы) или chi (химера - различные клеточные линии произошли из разных зигот) приводятся перед общим описанием. При перечислении кариотипов нормальный кариотип всегда указывается последним. Если выявлено несколько аномальных клонов, то порядок их перечисления определяется долей их представленности. Первым приводится наиболее часто встречаемый. Затем по нисходящей. Последним указывается нормальный клон. Например:

В случае наличия двух нормальных клонов первым указывается клон, имеющий большее представительство:

Следует заметить, что правила описания гетерогенных клеточных популяций при диагностике онкологических заболеваний отличаются.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ХРОМОСОМ

Материнское или отцовское происхождение аномальной хромосомы обозначается символами mat и pat соответственно. Эти символы располагаются непосредственно после описываемой аномалии. Если хромосомы родителей нормальны, а у ребенка выявлена аномалия, то она рассматривается как возникшая de novo, и для ее описания используется символ (de novo).

При определении присутствия обоих гомологов хромосомы, происходящих от одного родителя (унипарентная дисомия), используется символ (upd):

В ISCN (2016) предусмотрено обозначение варианта, когда перестройка унаследована от родителей, но неизвестно, от отца или матери. В этом случае используется символ inh (inherited).

Описание аномальных хромосом человека

СТРУКТУРНЫЕ АНОМАЛИИ

Буквы и сокращения, используемые при описании хромосомных аномалий [при описании хромосом используются только буквы и сокращения, принятые в ISCN (2016)], означают тип реорганизации хромосомы. Номер хромосомы, задействованной в перестройке, приводится сразу за символом перестройки в круглых скобках, например:

Если в перестройку вовлечены 2 или более хромосом, они разделяются точкой с запятой (;). Порядок их перечисления подчиняется тому же правилу, что и перечисление аномальных хромосом в кариотипе, а именно X и Y, а затем аутосомы по возрастанию номеров, например:

Исключением из этого правила являются перестройки с тремя точками разрывов, когда имеет место инсерция фрагмента одной хромосомы в район другой хромосомы. В этом случае номер хромосомы-реципиента приводится первым. Например, запись ins(5;2) означает инсерцию фрагмента хромосомы 2 в хромосому 5.

В случае сбалансированных транслокаций, затрагивающих три хромосомы с одной точкой разрыва в каждой из них, первой приводится половая хромосома или хромосома с самым маленьким номером. Следующим записывается номер хромосомы, являющейся реципиентом для ее района, а последним приводится номер хромосомы-донора для хромосомы, записанной первой. Этот принцип распространяется и на сбалансированные транслокации, вовлекающие большее число хромосом.

Для описания хромосомных перестроек ISCN предполагает использование краткой или полной системы их описания. При использовании краткой системы указывается только тип хромосомных перестроек и точки разрывов. Иногда она не дает возможности однозначного описания сложных хромосомных перестроек, которые выявляются при анализе неоплазий. В этом случае состав аномальной хромосомы описывается в терминах бэндов, входящих в состав ее районов.

В краткой системе описания структурных хромосомных аномалий указывается тип хромосомной перестройки, а следом за его символом в круглых скобках указывается локализация точек разрывов.

При описании хромосомных перестроек с двумя точками разрывов в одной хромосоме первой указывается точка разрыва в р-плече или, если они локализованы в одном плече, то проксимальная точка разрыва:

Точки разрывов, локализованные в одной хромосоме, не разделяются какими-либо знаками. При локализации точек разрывов на двух хромосомах первой указывается либо половая хромосома, либо хромосома с меньшим номером:

Исключением из правила, определяющего последовательность записи хромосом, являются перестройки хромосом с тремя точками разрывов, когда происходит вставка в хромосому-реципиент фрагмента хромосомы донора. Такой случай уже был рассмотрен выше. Хромосома-донор всегда стоит на последнем месте, даже если это половая хромосома или хромосома с более низким номером:

Если подобная перестройка затрагивает только одну хромосому, то сначала указывается бэнд вставки, затем, в случае прямой инсерции, - более близкая к центромере точка разрыва фрагмента инсерции и, наконец, - дистальная точка разрыва этого фрагмента:

Для транслокаций, в которые вовлечены три хромосомы при одной точке разрыва в каждой из них, существует следующий порядок перечисления хромосом:

Запись 46,XX,t(9;22;17)(q34;q11;q22) означает, что фрагмент хромосомы 9, соответствующий району, дистальному относительно 9q34, перенесен на хромосому 22 с точкой разрыва-соединения в 22q11, фрагмент хромосомы 22, соответствующий району, дистальному относительно 22q11, перенесен на хромосому 17 с точкой разрыва-соединения в 17q22, и, наконец, фрагмент хромосомы 17, соответствующий району, дистальному относительно 17q22, перенесен на хромосому 9 с точкой разрыва-соединения в 9q34. Этот принцип применим для перестроек и с большим числом точек разрывов. В качестве примера ниже приведен кариотип с транслокациями, затрагивающими 4 хромосомы, и кариотип с реципрокными транслокациями 2 интерстициальных фрагментов хромосом:

Следует заметить, что несбалансированные перестройки приводят к появлению как минимум одной производной хромосомы, обозначаемой символом der (derivative chromosome). Обычно такие перестройки не удается однозначно описать с помощью краткой системы записи кариотипа. При использовании полной системы описания структурных хромосомных аномалий описание перестроенной хромосомы начинается с конца р-плеча или ближайшего к нему бэнда и продолжается до конца q-плеча. Бэнды указываются в том порядке, в котором они располагаются в хромосоме. Если перестроенная хромосома содержит материал одной хромосомы, то номер хромосомы при обозначении бэндов не повторяется. Такое описание требует, кроме точного обозначения участка хромосомы, введения символов, обозначающих точку разрыва, соединения участка хромосомы, расположенного между двумя обозначенными участками. Для решения этой задачи были введены следующие обозначения:

При описании точки разрывов указываются район, бэнд или суббэнд ее локализации. Если район, в котором была локализована точка разрыва, включает два соседних бэнда, то они приводится оба, разделенные символом (or), например: 1q23 or q24. Если район локализации точки разрыва включает больше бэндов, то при ее описании указывается район или районы хромосомы, например, 1q2 or q3.

Для упрощения восприятия описанной хромосомной перестройки в ISCN используется указание на ее конкретный тип, для чего введены сокращения типов хромосомных перестроек. Дупликации хромосомных районов обозначаются как dup. Они могут быть прямыми или инвертированными, что отражается в порядке перечисления точек разрыва, либо могут быть подчеркнуты символами dir (прямая дупликация) и inv (инвертированная дупликация), которые раньше приводились перед символом dup. Однако так как обычно для однозначного описания дупликаций использование символа dir не требовалось, он был исключен из ISCN (2016). Примерами записи дупликаций могут служить описания следующих перестроек:

Следует заметить, что только полная система дает возможность однозначного описания инвертированных дупликаций.

При описании трипликаций (trp) только полная система дает возможность однозначного описания ориентации дополнительных районов. Примером могут служить следующие записи:

Различные варианты возможны и при инсерциях хромосомного материала. Район может сохранять исходную ориентацию или менять ее на противоположную. При записи это отражается в порядке перечисления точек разрыва, либо инвертированное положение может быть подчеркнуто символом inv. Стоит напомнить, что прямой инсерцией считается инсерция, в результате которой проксимальный конец района инсерции оказывается в проксимальном положении относительно второго конца, а инвертированная инсерция представляет собой инсерцию, при которой проксимальный конец района инсерции оказывается в дистальном положении. Примеры:

При описании хромосомных аномалий цитогенетики часто встречаются с хромосомами, возникшими в результате перестроек, затрагивающих две или более хромосом, а также являющихся результатом множественных перестроек одной хромосомы. Такие хромосомы называются производными (дериватными) хромосомами. Номер производной хромосомы соответствует номеру хромосомы, чей центромерный район входит в состав производной хромосомы. При описании производной хромосомы, возникшей в результате более чем одной перестройки, аберрации перечисляются в порядке очередности точек разрывов в производной хромосоме.

Примеры описания производных хромосом:

Производные хромосом-дицентриков обозначаются номерами обеих хромосом, например:

В случае если происхождение центромеры производной хромосомы не установлено, для ее обозначения используется знак вопроса. Например:

Для описания хромосом-дицентриков, в формировании которых не было никаких дополнительных перестроек, кроме перестроек, обусловивших дицентричность, используется символ (die).

Описание хромосом-трицентриков проводится по тем же правилам, что и хромосом-дицентриков. Порядок перечисления хромосом определяется следующим образом: первой приводится концевая хромосома с меньшим номером, а остальные - в порядке прикрепления к ней. Для обозначения хромосом-трицентриков используется символ (tre):

Изохромосомы представляют собой хромосомы, состоящие из двух идентичных плеч, т.е. точки разрывов, имевших место при их формировании, локализованы в центромерных бэндах p10 или q10:

В тексте статей и книг возможно краткое обозначение изохромосомы, например: i(17q), что следует понимать, как i(17)(q10). Для изопроизводных (изодериватных) хромосом используется символ ider (изохромосома, плечо которой состоит из производной хромосомы). Примеры таких и изодицентрических хромосом (idie) приведены ниже:

В отличие от обычных хромосом кольцевые хромосомы (r) представляют собой структуры, замкнутые в кольцо, у которых обычно отсутствуют теломерные районы. Они могут состоять из материала одной или нескольких хромосом, например:

или

Особое место в номенклатуре хромосом человека занимают маркерные хромосомы. Они являются аномальными хромосомами, у которых не идентифицирован ни один из их районов. В случае идентификации какого-либо района этой хромосомы она переходит в разряд «производная хромосома» (der). Примеры записи маркерных хромосом приведены ниже:

Если маркерные хромосомы могут быть отличены одна от другой, то им присваиваются номера: mar1, mar2, mar3 и так далее.

Основные принципы описания хромосомных перестроек применимы и для описания транслокаций. Рассмотрим примеры реципрокных транслокаций, начиная с транслокаций с разным числом точек разрывов.

Реципрокные транслокации с 2 точками разрывов:

Реципрокные транслокации с 3 точками разрывов:

Реципрокные транслокации с 4 точками разрывов и более:

Транслокации целых хромосомных плеч могут быть однозначно описаны указанием точек разрывов в центромерных бэндах p10 и q10. При сбалансированных транслокациях для половой хромосомы или хромосомы с более низким номером точка разрыва обозначается р10:

Необходимо обратить внимание на разницу данной записи и записи, приведенной ниже:

В случае несбалансированных транслокаций хромосомных плеч перестроенная хромосома обозначается как производная (der). Из приведенной же ниже записи ясно видно отсутствие двух нормальных хромосом:

В данном кариотипе присутствуют по одной копии нормальных хромосом 1 и 3, а также der(1;3). То есть имеет место моносомия длинного плеча хромосомы 1 и короткого плеча хромосомы 3. В следующем примере производная хромосома тоже состоит из короткого плеча хромосомы 1 и длинного плеча хромосомы 3, однако в кариотипе присутствуют две нормальные хромосомы 1, что приводит к трисомии по короткому плечу хромосомы 1 и моносомии по короткому плечу хромосомы 3:

Запись присутствия в сходном случае двух нормальных хромосом 3, одной хромосомы 1 и одной der(1;3) приведена ниже. Следует обратить внимание на порядок перечисления хромосом. Он соответствует правилам, рассмотренным выше:

Робертсоновские транслокации представляют собой особый тип транслокаций, возникающих в результате центрических слияний длинных плеч акроцентриче-ских хромосом (хромосомы 13-15 и 21, 22), обычно сопровождающихся одновременной потерей коротких плеч этих хромосом. Так как эти транслокации являются несбалансированными, для их описания используется символ (der), точки разрывов указываются в бэндах q10 соответствующих хромосом:

«Jumping» транслокации представляют собой транслокации одного и того же хромосомного района в разные хромосомы в разных клеточных клонах. Для их описания используются стандартные правила. Пример описания «jumping» транслокации приведен ниже:

Для описания разделения хромосомы по центромерному району используется символ fis (fission). Такое разделение приводит к появлению двух производных хромосом, каждая из которых состоит из плеча исходной хромосомы. Кариотип, возникший в результате такой хромосомной перестройки, описывается следующим образом:

Далеко не всегда проведение цитогенетического анализа позволяет идентифицировать все хромосомы или все районы возникших перестроенных хромосом. В ряде случаев, особенно при анализе хромосом раковых клеток, не удается точно определить даже число хромосом. В этом случае ярко проявляется основной принцип, заложенный в ISCN для описания хромосомных аномалий. Он заключается в том, что точно описываются результаты проведенного анализа. В случае если исследователь не смог определить или сомневается в своих заключениях, это находит свое отражение в записи кариотипа, индивидуальной хромосомы или геномного анализа. При проведении цитогенетического анализа не всегда удается получить препараты метафазных хромосом высокого качества. Особенно часто это случается при цитогенетической диагностике при онкологических заболеваниях. В книгах, посвященных хромосомному анализу раковых клеток, можно встретить фразы, утверждающие, что их хромосомы печально известны своим ужасным качеством. Не всегда удается идентифицировать даже целые хромосомы, или остаются сомнения в их целостности. Такие сомнения могут быть обозначены несколькими способами, например, знаком вопроса перед элементом, вызывающим сомнение:

Для описания неопределенности в известных пределах может быть использован символ (~ ). Он применим как к районам, так и к числу хромосом:

В случае существования альтернативных интерпретаций полученного результата они разделяются символом or:

Знаки (+) и (-) также могут быть использованы для обозначения увеличения и уменьшения определенных хромосомных районов за счет материала неизвестного происхождения. В этом случае они ставятся непосредственно после символа соответствующего района. Знаки (+) и (-) в случае их нахождения после символа плеча (4p+, 5q-) хромосомы означают увеличение длины этого плеча. Такое использование этих символов возможно в тексте, но не при описании кариотипа. Так, 19р+ в тексте статьи указывает на удлинение р-плеча хромосомы 19 за счет дополнительного материала неизвестного происхождения, но запись кариотипа с такой хромосомой будет выглядеть следующим образом:

Символ add (от латинского additio) используется для указания на дополнительный материал неизвестного происхождения, добавленный к хромосомному району или бэнду. В полной системе записи такой кариотип будет описан следующим образом: 46,XX,add(19)(?::p13→qter). При описании хромосом с дополнительным материалом в p- и q-плечах перед номером хромосомы следует поставить символ der, например, 46,XX,der(5)add(5)(p15)add(5)(q23).

Если дополнительный материал выявлен в интерстициальном районе хромосомы, т.е. имела место инсерция фрагмента хромосомы неизвестного происхождения, то для описания используются символы ins. В случае инсерции неизвестного происхождения в интерстициальном районе запись будет выглядеть следующим образом: 46,XX,ins(5;?)(q13;?) в краткой системе записи и 46,XX,ins(5;?)(pter→q13::?::q13→qter в полной системе. Такие записи означают инсерцию фрагмента хромосомы неизвестного происхождения в бэнд q13 хромосомы 5.

Достаточно часто подобные изменения хромосом записываются как t(19;?) - транслокация хромосомы 19 и материала неизвестной хромосомы. Различия между записями с использованием символов add и + и записью, подобной t(19;?), заключается в том, что символ t, в отличие от символов add и +, предполагает формирование хромосомной перестройки в результате транслокации.

В одной главе невозможно привести все варианты описания хромосомных аномалий. В ней приведены только наиболее часто встречающиеся случаи хромосомных патологий. Для корректного описания хромосомных аномалий цитогенетику необходимо иметь ISCN (2016) на своем столе и уметь ею пользоваться. В завершение рассмотрения описания случаев хромосомных аномалий, выявленных традиционными цитогенетическими методами, мы кратко коснемся описания случаев с double minutes. Double minutes (сокращение dmin) представляют собой специальный тип маленьких ацентрических структур, выявляемых в некоторых клетках. В связи со сложившейся исторически практикой в статьях их часто называют DM-хромосомы. Однако они не попадают под определение «хромосома», так как не содержат центромеры, поэтому при описании кариотипа их число не учитывается при подсчете общего числа хромосом, например:

Заметим, что число dmin в раковых клетках может достигать нескольких десятков. Обычно они содержат ДНК амплифицированных онкогенов.

Отметим, что в настоящей главе полностью отсутствует рассмотрение правил описания как хроматидных, так и хромосомных повреждений, описания хромосомных аномалий при неоплазиях. Мы ограничимся лишь приведением используемых для их описания сокращений.

ХРОМАТИДНЫЕ АБЕРРАЦИИ

Хроматидный пробел (chtg) (chromatid gap) - неокрашиваемый район хрома-тиды, обусловливающий ее минимальное нарушение.

Хроматидный разрыв (chtb) (chromatid break) - разрыв одной хроматиды с явным ее нарушением.

Хроматидный обмен (chte) (chromatid exchange) - реорганизация материала хроматид одной (intrachange) или разных хромосом (interchange), являющаяся следствием двух или более хроматидных повреждений, проявляющихся в виде разрывов и соединений в новых вариантах.

Сестринские хроматидные обмены (sce) (s ister c hromatid e xchange) - обмены гомологичными районами хроматид одной хромосомы, могут быть детектированы только с использованием специальной техники окрашивания. Символ (sce) несколько выпадает из общих принципов обозначения повреждений хромосом, так как он был введен еще до принятия ISCN (1995). Однако он включен в современную номенклатуру хромосом человека.

При более точном определении района аберрации хроматидные повреждения могут быть описаны с указанием конкретного района и типа повреждения. Примеры таких записей:

ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ

При хромосомных аберрациях (ehr) в формирование аномалии вовлекаются обе хроматиды одного и того же хромосомного района. Как и среди хроматид-ных повреждений, среди хромосомных выделяют хромосомные пробелы (ehrg) (chromosome gap), хромосомные разрывы (chrb) (chromosome break), хромосомные обмены (chre) (chromosome exchange).

(chrg) - неокрашиваемые районы хроматид в одном и том же районе хромосомы, обусловливающие ее минимальное нарушение.

(chrb) - разрывы обеих хроматид хромосомы в одном и том же районе, приводящие к появлению ацентрического фрагмента и аномальной моноцентричной хромосомы.

(chre) - результат разрывов хромосомных районов и их соединения в новых вариантах (формирование реципрокных транслокаций, дицентриков и т.д.).

(min) - ацентрические фрагменты, длина которых меньше ширины отдельной хроматиды. Они могут быть одинарными или двойными. В особых случаях присутствия двойных ацентрических фрагментов в клонах злокачественных клеток для их обозначения используется термин double minutes (сокращение - dmin).

(pvz) (pulverization) - хромосомные аномалии, при которых разрывы хроматид и хромосом не поддаются подсчету, но остальные хромосомы сохраняют нормальную морфологию, например: pvz(1) означает распад хромосомы 1 на мелкие фрагменты.

(pcd) (premature centromere division) - преждевременное расхождение центромер в метафазе, pcd может затрагивать одну или несколько хромосом.

МЕЙОТИЧЕСКИЕ ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА В ISCN

Биваленты поздней профазы/первой метафазы могут быть разделены на группы в соответствии с их размером, а бивалент 9 иногда может быть идентифицирован. При анализе хромосом на этих стадиях информативны методы Q- и С-дифференциального окрашивания. Биваленты аутосом проявляют окрашивание, сходное с бэндингом соматических хромосом. Наиболее эффективно последовательное использование Q- и С-методов.

Для обозначения стадий мейоза используются следующие сокращения:

В описании кариотипа следом за указанием стадии мейоза приводится общее число отдельных хромосомных элементов, отделенное запятой. Половые хромосомы в случае их ассоциации записываются (XX) или (XY). Если половые хромосомы не ассоциированы, они разделяются запятой (X,Y). Любой дополнительный, потерянный или аномальный элемент приводится после половых хромосом в круглых скобках, при этом перед ним римскими цифрами указывается, является ли он унивалентом (I), бивалентом (II), тривалентом (III) или тетравалентом (IV). Отсутствие элемента обозначается знаком минус (- ). Знак плюс (+ ) используется только для описания первой метафазы и только в случаях, когда дополнительная хромосома не вошла в состав мультивалента. Хромосомы, вовлеченные в перестройки, перечисляются в скобках, разделенные точкой с запятой (; ).

Для обозначения хиазм используется сокращение (xma). Общее число хиазм на клетку указывается двузначным числом в скобках совместно с сокращением (xma) и знаком равенства (= ). (xma=52) и (xma=09) означает 52 и 9 хиазм на клетку соответственно. Число хиазм в биваленте (или мультиваленте) указывается однозначным числом, например: (xma=4).

Ниже приведены примеры записи мейотических кариотипов:

Мейотические хромосомы сперматоцитов на стадии пахитены имеют хромо-мерную структуру. Хромомеры соответствуют G-позитивным бэндам, выявляемым при GTG-дифференциальном окрашивании. Сравнение идиограмм митотических и пахитенных хромосом приведено на рис. 4-5.

ОПИСАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИАГНОСТИКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

В случае проведения стандартной цитогенетической диагностики результаты, полученные с помощью FISH, представляются в виде дополнения к обычной записи. Это дополнение должно быть отделено от нее точкой и пробелом, за которым следует символ ish. За ним после пробела записывается результат полученного исследования. В случае если стандартное цитогенетическое исследование не проводилось, то запись содержит только результаты, полученные с помощью FISH. Так как в этом случае отсутствуют данные о числе хромосом, в записи оно не указывается. В записи указываются не только выводы проведенных исследований, но и использованные в исследовании ДНК-пробы. Если невозможно указать название клонированного фрагмента ДНК, использованного в качестве ДНК-пробы, то приводится обозначение локуса в соответствии с геномными браузерами Калифорнийского университета в Санта-Круз (University of California Santa Cruz - UCCSC) или Ensembl (www.genome.ucsc.edu и www.ensembl.org). Порядок записи локусов сохраняется, как и в стандартной цитогенетической номенклатуре, от pter к qter. Если неизвестно и название локуса, то возможно использование названия гена, принятого в номенклатуре HUGO (www.hugo-international.org). При использовании протяженных ДНК-проб, включающих несколько локусов, локу-сы отделяются знаком (/). Следует отметить, что обозначение бэндов хромосом, содержащих эти локусы, должно соответствовать современной версии UCSC браузера. В случае выявленной хромосомной перестройки ее символ записывается за символом ish после пробела. За ним следует номер соответствующей хромосомы в круглых скобках, точки разрывов и названия соответствующих локусов. Знаки наличия (+ ) или отсутствия (-) локуса(ов) приводятся в тех же скобках. При выявлении нормальной хромосомы ее номер после символа ish приводится не в скобках. Также указываются район, бэнд, суббэнд локализации тестированных локусов, а после знака х приводится число зарегистрированных сигналов. Примером таких записей могут служить записи анализа Х-хромосомы, приведенные ниже:

При описании результатов исследований, проведенных методами микроматричного анализа, выявляющих нарушение баланса участков хромосом или их вариации по числу копий, учитываются рекомендации Human Genome Variation Society (HGVS). При записи аномалии дается указание на версию сборки генома, как это показано в приведенном примере: arr[GRCh38] Xp22.31(6467202_8091950)x0 mat, означающем, что микроматричный анализ выявил у пациента потерю суббэнда Xp22.31.

Более детальное знакомство с номенклатурой, использующей методы микроматричного анализа мультиплексной лигазозависимой амплификации (MLPA), цифровой ПЦР, ПЦР в реальном времени, анализ на сферических биочипах, требует внимательного изучения главы «Районоспецифичные анализы» в ISCN (2016). В ISCN (2016) включена новая глава (Глава 16 «Анализы, основанные на секвенировании»). В настоящее время она нередко вызывает вопросы у пользователей и, вероятно, в следующей версии ISCN будет существенно доработана. В настоящее время она достаточно подробно рассмотрена в статье Антоненко и Шиловой (2018), поэтому мы не будем рассматривать ее в данной главе. Отметим только, что при написании этого раздела ISCN (2016) были учтены рекомендации HGVS.

Стремительное развитие молекулярно-генетических методов хромосомного анализа, вероятно, приведет к необходимости подготовки следующей версии ISCN, в которой не только будут улучшены правила описания хромосомных патологий, выявленных методами, вошедшими в ISCN (2016), но и разработаны принципы описания результатов исследований, использующих такие методы, как karyomapping и другие технологии молекулярного анализа, позволяющие проводить детальное кариотипирование индивидуальных клеток.

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Рассмотрение вопросов, связанных со структурно-функциональной организацией хромосом человека, требует обсуждения укладки ДНК. На стандартной иллюстрации обычно демонстрируется пространственная организация ДНК, начиная с двойной спирали и заканчивая формированием хроматид метафазной хромосомы (рис. 4-6, см. цв. вклейку).

Эта схема, несомненно, полезна для создания первых представлений о строении материала хромосомы, но крайне упрощена и показывает один из ее элементов в определенный момент клеточного цикла. Это относят даже к классической двойной спирали ДНК и нуклеосомной организации. Известно, что ДНК не всегда располагается в этой форме, и не везде сохраняется нуклеосомная организация хроматина. При завершении секвенирования генома человека, когда определена последовательность нуклеотидов в ДНК большей части генома и частично расшифрован язык, на котором записана генетическая информация, приходится признать, что часто наши представления ограничены понятиями об одномерном геноме - длинной строке, содержащей четыре символа. Кроме того, в лучшем случае учтены сайты метилирования. Информация о пространственной организации генома, ее изменении во времени, при дифференцировке, модификации гистонов и взаимодействии ДНК с различными белками существенно менее полная и более сложна для анализа.

Центромерный район хромосомы

Исходно центромерой считали место первичной перетяжки хромосомы. В настоящее время это положение входит во многие определения, которые можно найти в статьях, словарях и в интернете («место первичной перетяжки в хромосоме»; www.mhhe.com). Кроме того, можно найти множество других определений.

Центромера - специализированный район конденсированного хроматина в каждой из хромосом, в котором во время митоза сохраняется контакт хроматид, создающий Х-образную форму хромосомы. Центромеру сложно секвенировать (www.wordnetweb.princeton).

Центромера - обычно расположенный недалеко от центра хромосомы район ДНК, в котором сестринские хроматиды находятся в контакте. Он вовлечен в клеточное деление и выступает в качестве места прикрепления митотического веретена (www.en.wikipedia.org).

Центромера - район эукариотической хромосомы, где собирается кинетохор.

Центромера - район первичной перетяжки, включающий микротрубочки веретена и ответственный за движение хромосом во время митоза и мейоза (www. biology.usgs).

Центромера - перетяжка в хромосоме, делящая ее на плечи и служащая местом соединения сестринских хроматид и прикрепления нитей веретена (www. biologylessons.sdsu).

Центромера - место на хромосоме, где соприкасаются хроматиды и крепятся микротрубочки (www.knowledgerush.com).

Центромера - район перетяжки, соединяющий две сестринские хроматиды и обусловливающий Х-форму хромосомы; место формирования кинетохора (www. biology-online.org).

Большинство этих определений вызывает улыбку, некоторые - грустную, например, утверждение, что центромера обычно располагается около центра хромосомы. Тем не менее следует признать, что дать полное и точное определение центромеры не так просто. Очень коротко понятие «центромера» сформулировали Шулер и Салливан (2006): «Центромера - локус, состоящий из хроматина, необходимого для правильной сегрегации хромосом». Или более подробное определение: «Центромера - место сборки кинетохора - белковой структуры, присутствующей на всех хромосомах, координирующей их прикрепление и движение вдоль микротрубочек». В 2009 г. Подгорная и соавт. описали центромеру более развернуто: «Центромера - структура, обеспечивающая удержание хромосом, правильность их выстраивания в метафазной пластинке и прикрепление к веретену; участок, ответственный за контроль наступления анафазы». Вероятно, было бы правильнее сказать, что центромера участвует во всех этих процессах. Кроме того, в этом определении сохраняется большая свобода в трактовке того, какие элементы входят в состав этой структуры, а какие - взаимодействуют с центромерой. Наглядно проблемы определения центромеры демонстрирует ее описание, приведенное в словаре на сайте www.academic.ru. В нем центромера определена как «участок хромосомы, характеризующийся специфической последовательностью нуклеотидов и структурой. Центромера играет важную роль в процессе деления клеточного ядра и контроле экспрессии генов». Далее сообщается, что «у большинства эукариот центромера не имеет определенной, соответствующей ей нуклеотидной последовательности».

Вероятно, наиболее просто было бы определить центромеру как участок ДНК, на котором происходит сборка кинетохора. При этом следует отметить, что последовательность нуклеотидов этого участка не является ни достаточным, ни необходимым элементом для проявления функциональной активности центромеры. Во избежание затруднений с терминологией ниже приведены несколько определений, предложенных Шулером и Салливаном, связанных с центромерой или описывающих часть ее элементов.

Кинетохор - белковая структура, собранная на центромерном хроматине и связывающая ДНК центромеры с протеинами, которые управляют движением хромосомы и определяют ее прикрепление к микротрубочкам веретена.

Центромерный район - район, включающий различные домены, которые располагаются рядом с центромерным локусом и имеют соответствующие функции.

α-Сателлит - семейство сателлитной ДНК, основанное на повторении единицы размером 171 п.н., которая представлена в центромере у всех изученных видов приматов.

Мономер - наименьшая по размеру единица повторенной сателлитной ДНК.

Повтор более высокого порядка - единица повторенной сателлитной ДНК, состоящая из набора копий сателлитных мономеров.

Центромерный хроматин - специализированный хроматин в центромерном районе, служащий основой кинетохора.

В результате многочисленных исследований было показано, что центромерный район имеет сложную структурную и функциональную организацию и представлен мультидоменным локусом. Примечательно, что наряду с высоким консерватизмом белков кинетохора последовательности нуклеотидов в центромере эволюционно лабильны. Общая черта ДНК центромер разных видов - присутствие в них тандемных повторов соответствующих семейств. Мономерный α-сателлит был идентифицирован в 21 из 24 хромосом человека. Во всех хромосомах он входил в состав повтора более высокого порядка, который в центромерном локусе мог воспроизводиться сотни и тысячи раз, распространяясь на 0,3-5 млн п.н. Секвенирование генома человека показало различие последовательностей центро-мерных локусов в разных хромосомах. Последовательности мономеров α-сателлитов часто прерываются вставками LINE-ов, SINE-ов и LTR-(long terminal repeat) ретро-транспозонов. Такие разрывы тандемно повторенных α-сателлитов могут сопровождаться изменениями их ориентации. Схема организации центромерной ДНК представлена на рис. 4-7 (см. цв. вклейку). Последовательность α-сателлитной ДНК у человека варьирует от хромосомы к хромосоме. Источником разнообразия, вероятно, служит неравный кроссинговер. В результате неравных обменов возникают 4-6-кратные различия гомологичных участков повторенной ДНК по протяженности.

Центромерный район включает функционально значимые белковые домены, определяющие кинетохорную функцию и формирование гетерохроматина. У эукариот нить ДНК взаимодействует с гистонами Н2А, Н2В, Н3 и Н4, формируя нуклеосомы. В центромерном хроматине гистон Н3 заменен на CENP-A, идентичный гистону Н3 в его центральной части и отличающийся по N- и С-концам. Центромерный хроматин также содержит CENP-В и CENP-С - обязательные компоненты кинетохора. Они формируют прекинетохорный комплекс, служащий предшественником зрелого метафазного кинетохора. Блоки гетерохроматина фланкируют центромерный хроматин с одной или двух сторон. Несмотря на то что центромерный хроматин и гетерохроматин формируются независимо, оба играют важную роль в организации правильной сегрегации хромосом и поддержании хромосомной стабильности.

Центромерный хроматин, содержащий специализированные протеины, отвечает за формирование кинетохора. Следует отметить, что у высших эукариот оно не зависит от последовательности нуклеотидов. В этот процесс вовлечены эпигенетические механизмы, детали которых остаются неизвестными и сегодня. Несмотря на значительную дивергенцию центромерной ДНК, центромерные протеины (CENP-А, CENP-В и CENP-С) или их гомологи представлены у большинства эукариот. Как было сказано выше, для них характерно сходство центральной коровой части и различия по N- и С-концам. Центральным в сборке центромеры считают CENP-А, так как именно он инициирует формирование центромеры в месте своей локализации. Он необходим для вовлечения в структуру организации центромерного района других белков центромеры и кинетохора. Исключением служат белки, специфичные для гетерохроматинового домена, например, HP1 (heterochromatin protein 1). Кроме того, CENP-А, в противоположность гистону Н3, который входит в состав хроматина в S-фазе, во время репликации, наследуется полуконсервативно. Нуклеосомы, содержащие CENP-А, в дальнейшем не удаляются и не замещаются. Вновь синтезированный CENP-А включается в нуклеосомы центромер в G2-фазе, используя механизм, не зависящий от репликации. Одна из гипотез предполагает, что в G2-фазе, когда начинается конденсация хроматид, гистон Н3, находящийся в хроматине центромеры, замещается CENP-А. «Старый» CENP-А используется как маркер для определения позиций, в которые должен встать CENP-А, заменив гистон Н3. Сходный процесс замещения коровых гистонов происходит в местах специализированного активного хроматина по замене гистона Н3 на гистон Н3.3.

Рассмотрению вопроса о составе ДНК центромерного района и формировании белкового комплекса центромеры посвящены многочисленные обзоры. В них описана сборка на нуклеосомах, содержащих CENP-А проксимального протеинового комплекса (NAC). Последний состоит из шести компонентов (CENP-С, CENP-М, CENP-N, CENP-T, CENP-U, CENP-H), которые вместе с CENP-I формируют внутреннюю пластину кинетохора (см. рис. 4-7). Комплекс (CENP^)-(NAC) служит для присоединения следующего протеинового комплекса внутренней части кинетохора, включающего CENP-K, CENP-L, CENP-O, CENP-Q CENP-R, CENP-S (комплекс CAD). Комплекс CAD не связывается непосредственно с CENP-А. Детально взаимодействие этих и других белков кинетохора описано в 2009 г. Валдивиа и соавт. Именно поэтому в этой главе не имеет смысла анализировать данную проблему более подробно. Стоит напомнить, что антитела, специфичные к CENP-А, позволяют легко и надежно детектировать центромеру, а благодаря присутствию в центромерных районах хромосом человека комбинаций различных типов альфоидной ДНК FISH с соответствующими ДНК-пробами позволяет идентифицировать центромеры индивидуальных хромосом человека. В последние годы этот способ практически не используют, так как были получены ДНК-пробы, специфичные последовательностям прицентромерной ДНК индивидуальных хромосом. Они показали свою высокую эффективность при анализе как численных, так и структурных хромосомных аномалий.

На фоне разнообразной информации о сложной организации центромеры, требующей рассмотрения специфических взаимодействий ДНК-белок, белок-белок и целых белковых комплексов, вызывает удивление организация неоцентромер. Неоцентромеры - эктопические центромеры, возникающие вне центромерных районов хромосом. Описаны неоцентромеры различных районов более двух третей хромосом человека. Их число уже превысило сотню. Несмотря на отсутствие центромерной α-сателлитной ДНК, неоцентромеры способны формировать функционально активный кинетохор и первичную перетяжку. Возникновение в хромосомах человека неоцентромер часто связано с задержками и аномалиями развития. Кроме того, их обнаруживают при некоторых формах онкологических заболеваний. Возникновение конституционных неоцентромер обычно ассоциировано с такими хромосомными перестройками, как инвертированные дупликации, интерстициальные делеции и маркерные хромосомы. Предпочтительные места локализации неоцентромер - С-негативные, G-позитивные и AT-богатые районы. В интерфазном ядре они локализованы на поверхности хромосомных территорий. Последовательности нуклеотидов в разных неоцентромерах различаются и сходны с таковыми в ДНК этих районов до формирования неоцентромеры. Митотическая стабильность неоцентромерных хромосом несколько снижена, вероятно, в связи с неоптимальным функционированием кинетохора и отсутствием фланкирующего неоцентромеру гетерохроматина.

Анализ эволюции центромерной ДНК, проведенный путем сравнения ее последовательности у различных видов, дал неожиданные результаты. Несомненно, что без правильного функционирования центромеры невозможно нормальное клеточное деление, но последовательности ДНК в центромере эукариот оказались очень разными. Этот удивительный факт нашел свое отражение в выражении «центромерный парадокс». Пока не удалось дать ему полноценного объяснения.

В заключение стоит отметить, что, согласно номенклатуре хромосом, любой фрагмент ДНК остается фрагментом независимо от его размера, если в нем отсутствует активная центромера. Существует только одно исключение - двойные микрохромосомы (DM-хромосомы - double minute chromosomes) - парные экстрахромосомные элементы, не имеющие центромеры. DM-хромосомы - результат амплификации генетического материала, ответственного за возникновение лекарственной устойчивости, либо хромосомные фрагменты, содержащие онкогены (например, онкоген С-myc). Происхождение названия этих элементов имеет исторические корни и только подтверждает, что не бывает правил без исключений, даже при разработке номенклатуры хромосом.

Теломерный район

Основная функция теломер - сохранение целостности хромосомы и обеспечение ее полной репликации. Стабильность генома во многом зависит от способности клеток поддерживать размер теломерного района в необходимых пределах. Структурно-функциональная организация теломеры позволяет обеспечить защиту конца хромосомы, замаскировав имеющийся двунитевой разрыв. Нарушения организации в теломерных районах приводят к хромосомным перестройкам. Они могут возникать при репликативном старении клеток, клеточной трансформации и апоптозе. Феномен репликативного старения клеток, вызванного концевой недо-репликацией ДНК, был предсказан Алексеем Оловниковым в 1971 г. За биохимическое доказательство и развитие его идеи американские исследователи Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак в 2009 г. получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

У человека, как и у других видов млекопитающих, теломеры представлены в основном двунитевыми некодирующими повторами (ТТАГГГ)п, заканчивающимися 3'-однонитевым участком. В теломере размер двунитевого участка варьирует от 4 до 12 т.п.н., однонитевого - от 100 до 200 п.н.

Необходимые компоненты теломеры: белки, связанные с теломерной ДНК, - TRF1/TRF2 (ТТАГГГ Repeat binding Factor 1/ТТАГГГ Repeat binding Factor 2) и POT1 и ассоциированные с ними белки RAP1, TPP1 и TIN2 (рис. 4-8, см. цв. вклейку). TRF1 и TRF2 связываются с двунитевой теломерной ДНК, а РОТ1 - с одиночной нитью, которая выступает за пределы двунитевой ДНК. TIN2 связывает TRF1 и TRF2 и через TPP1 вовлекает в формирующийся комплекс POT1. RAP1 включается в белковый комплекс через связь с TRF2. Сформированная таким образом нуклеопротеиновая структура защищает конец хромосомы от его соединения с концами других хромосом или двунитевыми разрывами и воздействия экзонуклаз. Помимо кэпирования конца хромосомы, белки теломеры участвуют в формировании t-петли (см. рис. 4-8, цв. вклейка). Теломерные протеины также участвуют в контроле размера теломеры. Так, TRF1 вовлечен в этот контроль через «счетный механизм». Кроме того, взаимодействие РОT1/TPP1 с TRF1 позволяет устанавливать взаимодействие двунитевой ДНК, теломеразы с 3'-однонитевым участком ДНК теломеры. Фермент теломераза, обеспечивающий репликацию теломерной ДНК, был выделен в 1984 г. Теломераза - РНК-зависимая ДНК-полимераза. Используемая ею в качестве матрицы РНК входит непосредственно в состав ферментативного комплекса. Для осуществления теломеразной активности в клеточном лизате достаточно присутствия каталитического компонента тело-меразы (hTERT) и теломеразной РНК (hTR). Поскольку hTR есть в большинстве соматических клеток, то для демонстрации теломеразной активности в стареющих клетках обычно достаточно введения в них hTERT. Это может приводить к увеличению числа делений до достижения барьера Хэйфлика либо к иммортализации клеток. Резкое уменьшение активности теломеразы и укорочение теломер обычно сопутствуют клеточной дифференцировке. Часто отмечают зависимость размера теломеры от возраста человека.

Кроме регуляции активности теломеразы, существуют и другие, альтернативные способы контроля размера теломер. Исследования, проведенные на трансформированных и опухолевых клеточных линиях человека, показали, что более чем в трети активно пролиферирующих in vitro клеточных линий и в 10-15% опухолей теломеразная активность отсутствует. Теломеры в таких клетках значительно различаются по размеру. Чаще всего они достаточно длинные - от 20 до 80 т.п.н., но в некоторых случаях в одних и тех же клетках описаны как длинные, так и очень короткие теломеры, размер которых не превышает 2 т.п.н., т.е. он меньше, чем длина теломер стареющих клеток. Установлено, что изменение размера теломер в таких линиях происходит одномоментно или, по крайней мере, достаточно быстро. Обнаруженные альтернативные механизмы поддержания размера тело-мер получили название ALT - Alternative Lengthening of Telomeres. Кроме вышеперечисленных, характерными признаками ALT-клеток считают присутствие в них специальных ядерных структур - ALT-ассоциированных промиелоцитных лейкемических телец (APB). Для этих клеток характерны пострепликативные межхроматидные теломерные обмены. Как правило, APB содержат кольцевую теломерную ДНК, PML-белок, теломероассоциированные белки TRF1 и TRF2, а также ряд факторов репарации и рекомбинации ДНК. В некоторых клеточных линиях, кроме изменений в самих теломерах, наблюдают модификации субтеломерных районов. Например, последовательности ДНК субтеломерных районов одной хромосомы могут присутствовать в терминальных районах других хромосом. Несмотря на существующие различия в биологии теломер человека и дрожжей, данные о структуре теломер последних в клонах, выживших в условиях отсутствия теломеразной активности, оказались важными для понимания происхождения ALT-теломер у человека. Альтернативные механизмы поддержания размера теломер наиболее детально были изучены на примере нескольких видов дрожжей: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis и Candida albicans. У Saccharomyces cerevisiae было показано существование двух возможных путей поддержания размера теломер в отсутствие теломеразы, основанных на гомологичной и негомологичной рекомбинации ДНК. У дрожжей выделяют два типа поддержания размера теломеры. Удлинение теломер по типу I проходит в основном в результате амплификации Y'-субтеломерных элементов, представленных несколькими субтеломерными повторами размером 6,7 т.п.н. В этом случае Y'-элементы оказываются разделенными короткими вставками теломерных повторов размером от 50 до 150 пар оснований. Следует отметить, что для поддержания размера теломерного района по типу I требуется активность факторов Rad54, Rad51, Rad55, Rad57, Rad52 и Exo1. Молекулярный механизм их взаимодействия друг с другом и с ДНК хорошо согласуется с данными, полученными при изучении рекомбинации, индуцированной двунитевыми разрывами на границе теломерных и субтеломерных повторов. Удлинение теломер по типу II приводит к амплификации в основном теломерных повторов. Как и в первом случае, для этого требуется рекомбинация, на что указывает потребность в постоянной активности Rad52. Показано, что консервативный и многофункциональный комплекс протеинов MRX, включающий Mre11, Rad50 и Xrs2, связывается с теломерой, где взаимодействует с одной из трех протеинкиназ: ATM, Tel1 или Mec1. Комплекс MRX действует как нуклеазно-геликазный комплекс, который вместе с 5'-3'-экзонуклеазой Exo1 формирует одиночную 3'-нить, которая может обеспечивать организацию репликации в варианте «катящегося кольца» либо «катящейся петли». Оба гипотетических механизма ALT включают рекомбинацию ДНК, причем она может быть как гомологичной, так и негомологичной, приводить как к увеличению, так и к уменьшению размера теломер, в основном за счет изменения числа копий теломерного повтора. В процессе поддержания размеров теломер как по I, так и по II типу в результате гомологичной рекомбинации может формироваться кольцевая теломерная ДНК.

Заметно сходство между структурой ALT-теломер в клетках человека и клонах дрожжей, дефицитных по активности теломеразы. Хотя точный механизм формирования теломер и субтеломерных последовательностей в ALT-клетках человека пока не выяснен, в настоящее время предполагают, что ALT-теломеры у человека могут образовываться по механизмам, сходным с вышеописанными. Предполагают, что может существовать несколько вариантов реализации ALT, в том числе и те, которые не описаны у дрожжей, а также дополнительные механизмы, связанные с межхромосомными и межхроматидными сестринскими тело-мерными обменами (T-SCE). T-SCE сейчас рассматривают как надежный маркер ALT-клеток.

В ряде исследований было показано, что в условиях отсутствия теломеразной активности у гомозигот по мутации в гене теломеразной РНК соматические и даже стволовые клетки мыши оказались способны после этапа некоторого укорочения теломер решить проблему стабилизации их размера. В процессе формирования новых теломер отмечали признаки хромосомной нестабильности, выражающиеся в слияниях хромосом, амплификации теломерных и нетеломерных последовательностей. В результате были сформированы функционирующие теломеры особой структуры, в которых теломерные повторы перемежались с нетеломерными. Такие теломеры имели признаки теломер хромосом Saccharomyces cerevisiae, сформированных в отсутствие теломеразной активности. В таких хромосомах трудно провести границу между собственно теломерой и субтеломерным районом.

Проблема нестабильности теломер непосредственно связана со слияниями хромосом, присутствием в них интерстициальных теломерных повторов и выяснением роли последних в эволюции хромосом. Предполагают, что районы локализации интерстициальных теломерных повторов могут быть местами эволюционных слияний и разделений. Число и локализация теломерных повторов, вероятно, могут во многом определять направление хромосомной изменчивости и оказывать большое влияние на структурно-функциональную организацию интерфазного ядра клеток человека.

Дисфункцию теломер, связанную в том числе с их укорочением и выражающуюся в нарушении кэппинга, в настоящее время рассматривают как механизм, запускающий теломерные слияния хромосом. Неоднократно было показано, что нарушение кэппинга теломер приводит к распознаванию конца хромосомы как разрыва, который должен быть репарирован. Это ведет к теломера-теломерному слиянию хромосом, образованию дицентрических хромосом или мостов. Разрывы в дицентриках, как правило, приводят к новым хромосомным перестройкам, при этом в сайтах слияния сохраняются блоки теломерной ДНК. Такой цикл обозначают как «разрыв-слияние-мост». Как правило, он сопровождается амплификацией ДНК и крупными терминальными делециями. Образование даже одного конца хромосомы без теломеры либо с предельно укороченной теломерой может послужить причиной длительной геномной нестабильности и генерировать разнообразные типы хромосомных аберраций.

Важный момент стабилизации генома - формирование в районах разрывов полноценных теломер. В настоящее время установлено множество факторов, влияющих на кэппинг теломер. Среди них можно назвать фактор TRF2, а также компоненты, необходимые для гомологичной и негомологичной рекомбинации при репарации двунитевых разрывов ДНК, в том числе комплекс Rad50/Mre11, который, связываясь с TRF2, помогает образованию Т-петли. В ряде случаев механизм влияния факторов репарации и рекомбинации на стабильность хромосом не совсем ясен. Например, показано, что белок Ku86 играет большую роль в функционировании теломер, предотвращая их слияния независимо от длины теломерного повтора и наличия одноцепочечного 3'-конца молекулы ДНК. У Кu86-дефицитных мышей отсутствует укорочение теломер или деградация одноцепочечного 3'-конца, но происходят теломерные слияния с сохранением в сайтах последнего крупных блоков теломерной ДНК.

Изучение распределения теломерных повторов в хромосомах показало, что они могут находиться не только в теломерных районах. Теломерная ДНК была обнаружена в интерстициальных районах хромосом (ITS - interstitial telomeric sites) более чем 100 видов позвоночных разных классов и отрядов. В хромосомах человека было обнаружено более 50 ITS, причем в гомологичных районах хромосом других видов приматов их обычно также обнаруживали. Показано, что локализация значительной части ITS совпадала с районами слияний или разрывов хромосом, случавшихся в эволюции хромосом млекопитающих. Известно, что хромосомы индийского мунтжака образовались в результате тандемных слияний конец в конец предковых хромосом. В районах слияний были обнаружены теломерные и субтеломерные сателлитные повторы.

Клонирование интерстициальных теломерных последовательностей из хромосом человека позволило идентифицировать в них два типа кластеров теломерных повторов. Один из них состоял из прямых теломерных повторов, другой - из повторов, ориентированных голова к голове. Предполагают, что возникновение первого типа кластеров связано с участием теломеразы в репарации двунитевых разрывов в процессе реорганизации хромосом. Сходным способом, по-видимому, возникли ITS, расположенные в районах конститутивного гетерохроматина и в ядрышкообразующих районах. Было показано, что для образования новых кластеров теломерных последовательностей с участием теломеразы в местах разрывов достаточно последовательности из 3-4 нуклеотидов, гомологичных тело-мерному мотиву. Кластеры второго типа, вероятно, связаны с теломерными слияниями хромосом. Они обнаружены у человека в районе 2q13, представляющем собой место слияния двух предковых хромосом. Дополнительное доказательство теломерного слияния в этом районе - данные о локализации в нем последовательностей гомологичных ДНК субтеломерных районов соответствующих хромосом человекообразных обезьян. Такое же происхождение, возможно, имеет ITS в бэнде q41 хромосомы 1 человека.

Детальное исследование состава других ITS и их фланкирующих последовательностей в геноме человека, а также их ортологов в геномах приматов показало, что большинство из них образовалось 5-40 млн лет тому назад в результате репарации двунитевых разрывов вследствие негомологичной рекомбинации, которая, вероятно, происходила с участием теломеразы. Возможно, эти ITS представляют «рубцы», маркирующие места двунитевых разрывов ДНК в ломких сайтах хромосом герминальных клеток. В большинстве ITS теломерная ДНК, вероятно, не несет какой-то определенной функции, но она, как и любые другие микросателлиты, может способствовать увеличению частоты негомологичной рекомбинации в этих районах и, таким образом, способствовать возникновению хромосомных аномалий. К схожему выводу пришли исследователи ITS хромосом китайского хомячка. Они установили, что у него блоки теломерных последовательностей размером 29-126 т.п.н. фланкированы АТ-обогащенными последовательностями. Известно, что последние нестабильны и присутствуют в ломких сайтах хромосом млекопитающих, служащих ГТ спонтанных и радиационных разрывов, а также сайтами с повышенной частотой рекомбинаций. Независимо от того, каким образом сформировались ITS, они могут быть не только ГТ разрывов в эволюции хромосом, но, что важно, и основой для возникновения новых теломер. При разрывах в области ITS или субтеломер интактные и дегенерированные теломерные последовательности могут способствовать теломеризации разорванных концов хромосом. Описан случай образования в клетках культуры индийского мунтжака новых хромосом в результате фрагментации хромосом по районам локализации ITS и последующей амплификации находящихся там теломерных повторов. Эти данные могут иметь значение при изучении хромосомной нестабильности в малигнизированных клетках человека.

Если структуру и функцию теломер в настоящее время исследуют интенсивно, и этой проблеме посвящено множество экспериментальных и теоретических работ, то структура и назначение субтеломерных районов пока остаются в тени.

С очень большим упрощением можно сказать, что классическая организация конца хромосомы включает район теломерных повторов, за которым следуют район субтеломерных повторов и, наконец, эухроматиновый район, в состав которого входят транскрипционно активные участки ДНК.

В действительности концы хромосом организованы намного сложнее. В большинстве случаев не существует четких границ между теломерными, субтеломерными и эухроматиновыми районами хромосом. На границе теломерных и субтеломерных районов обнаруживают чередование теломерных и субтеломерных повторов, а последние присутствуют в эухроматиновых прителомерных районах, для которых характерно присутствие кластеров дуплицированных последовательностей. Следует отметить некоторые особенности эухроматиновых районов, прилежащих к терминальным районам хромосом. Для них характерны повышенное содержание CpG-островков, более высокая концентрация генов и частота рекомбинации. Вполне возможно, что это имеет отношение не к структурно-функциональной организации теломеры как отдельного элемента хромосомы, а к принципам строения и функционирования хромосомы как таковой, или даже связано с оптимизацией пространственной организации всего интерфазного ядра.

У человека и приматов субтеломеры насыщены интактными и дегенерирован-ными теломерными последовательностями, короткими прямыми и инвертированными повторами, получившими название «теломеро-ассоциированные повторы», и AT-богатыми участками. Особенность субтеломерных районов человека - высокая концентрация сегментных дупликаций. Они содержат около 40% всех сегментных дупликаций генома, половина из которых образовалась относительно недавно. Примером сегментных дупликаций, локализованных в субтеломерах, могут служить дупликации, содержащие члены семейства генов обонятельных рецепторов. Блоки, содержащие по три гена из этого семейства, обнаружены в субтеломерах 14 хромосом человека.

Молекулярный анализ сегментных дупликаций показал, что большинство из них образовалось в результате повторных актов негомологичной и гомологичной рекомбинации, а также транслокаций в терминальных районах хромосом. Субтеломерные районы - наиболее быстро эволюционирующие участки генома, для которых характерна высокая скорость нуклеотидных замен и дупликаций небольших районов. Предполагают, что циклы изменения степени полиморфизма в субтеломерах чередуются с крупными геномными перестройками в них. Сравнение результатов секвенирования геномов человека и мыши показало, что 53% сайтов, в которых нарушена синтения, содержат сегментные дупликации, что в 3 раза превышает среднюю частоту нарушения таковой в других районах генома. Такая организация субтеломерных районов хромосом может иметь большое значение в структурно-функциональной организации всей хромосомы.

Неудивительно, что ее изменения могут приводить к различным нарушениям развития. Наиболее интригующий пример - одна из форм аутосомной доминантной мышечной дистрофии (FSHD), ассоциированной с районом 4qter. Этот участок у нормальных индивидуумов содержит кластер полиморфного повтора D4Z4 размером от 11 до 150 т.п.н. У больных он не превышает 11 т.п.н. В датской популяции он был также обнаружен при 10qter-анализе. Для этой популяции была продемонстрирована высокая частота мейотических (20%) и митотических обменов между 4qter и 10qter.

Возможно, причиной высокой частоты мейотических обменов в субтеломерах негомологичных хромосом служит участие терминального хромосомного домена в формировании хромосомного букета на стадии перехода из лептотены в зиготену. Известно, что с теломер начинается конъюгация хромосом в мейозе. Обычно мейотическая рекомбинация происходит позже, после конъюгации гомологов, но незаконная рекомбинация, вероятно, начинается на более ранних этапах - при возникновении пространственного сближения и установлении контактов между хромосомными районами. Это может приводить к расселению субтеломерных последовательностей по негомологичным хромосомам и обмену материала негомологичных плеч хромосом. Косвенный аргумент в пользу такой возможности - вышеприведенные данные о структуре субтеломер у человека. Кроме того, такой взгляд находит подтверждение в модели организации субтеломер хромосом человека, предложенной Флинтом и соавт. Согласно этой модели, субтеломерный район разделяется дегенерированными теломерными повторами на два субдомена. Дистальный субдомен содержит повторенные последовательности, которые взаимодействуют с концами всех хромосом, тогда как проксимальный - только те, которые взаимодействуют с последовательностями гомологичных хромосом. Несмотря на явную упрощенность таких представлений, они отражают тот факт, что чем ближе субтеломерный сайт расположен к теломере, тем чаще в нем могут происходить рекомбинационные события между негомологичными хромосомами.

Ядрышкообразующие районы хромосом

Ядрышкообразующие районы хромосом (ЯО-районы) локализованы в коротких плечах акроцентрических хромосом человека: 13, 14, 15, 21 и 22. На препаратах метафазных хромосом активные ЯО-районы представлены вторичными перетяжками, окрашиваемыми азотнокислым серебром. Наряду с генами 45S рРНК - предшественника 5.8S, 18S, 28S, ЯО-районы содержат межгенные спей-серы и различные микросателлитные последовательности. Транскрипция генов рРНК - необходимое условие поддержания нативности ядрышек, которое может служить маркером здоровья клетки. Ингибирование синтеза рРНК ведет к деградации ядрышка, повышению количества р53 и индукции апоптоза. В ряде работ полуколичественную оценку активности ЯО-районов используют в качестве показателя состояния клетки и прогностического критерия. В среднем на геном человека приходится около 400-500 копий генов рРНК (по 40-50 на один ЯО-район). Их общее число в геноме разных индивидуумов может значительно варьировать (от 200 до 700). Количество копий генов рРНК в ЯО-районах разных хромосом также может значительно меняться. Редкий вариант - акроцентрические хромосомы с двумя ЯО-районами в коротком плече. Неравномерна и транскрипционная активность генов рРНК в разных кластерах. В настоящее время неизвестно, чем определяется функциональный статус каждого конкретного гена. Возможным фактором, влияющим на транскрипционную активность генов рРНК, может быть вариабельность регуляторных участков, входящих как в состав повторяющихся единиц рДНК, так и участков ЯО-районов, примыкающих к кластерам рДНК. Собственно, ЯО-районы фланкированы участкам хромосом, обогащенным повторенными последовательностями.

На примере белков, характерных для ядрышка, была продемонстрирована функция хромосом в качестве перевозчиков ядерных белков во время митоза. При вхождении клетки в метафазу по крайней мере некоторые белки ядрышка переходят на поверхность хромосомы, а после телофазы при формировании ядер участвуют в образовании новых ядрышек. Такое использование хромосом в качестве клеточных извозчиков значительно упрощает решение проблемы сборки новых ядер после клеточного деления, обеспечивая правильную исходную пространственную локализацию ядерных белков.

Кластеры дуплицированных последовательностей

Секвенирование генома человека позволило взглянуть на хромосомы под новым углом зрения. Анализ распределения дуплицированных последовательностей показал, что более чем половина пограничных участков, разделяющих эухроматиновые районы и прицентромерный гетерохроматин, содержит дуплицированные сегменты. Индивидуальные дупликации происходят из различных участков генома и включают фрагменты известных генов, в которых могут присутствовать как экзоны, так и интроны. Многочисленные дуплицированные последовательности в этих и в подобных им районах собираются вместе конец к концу, формируя большие блоки, которые по размерам могут превышать миллион пар оснований. Вероятно, они играют роль буферных зон между участками хромосом, состоящих из плотно упакованных тандемных сателлитных повторов и районов, содержащих транскрипционно активную ДНК. Сравнительный анализ близкородственных видов приматов указывает, что формирование таких кластеров дуплицированных последовательностей проходило в течение последних 30 млн лет. При этом паралогичные сегменты, содержащие дуплицированные последовательности и варьирующие по размеру, оказались распространенными вдоль всех хромосом, от прицентромерных до субтеломерных районов (рис. 4-9, см. цв. вклейку). Например, в хромосоме 21 размер проксимального кластера, локализованного в прицентро-мерном районе, достигает 1 млн п.н., а самого дистального в субтеломерном районе - 130 т.п.н. В хромосоме 22 размеры этих кластеров составляют 1,5 млн п.н. и 50 т.п.н. соответственно.

Следует отметить, что крупные кластеры обычно содержат преимущественно межхромосомные дупликации. Отдельные дуплицированные последовательности, входящие в них, значительно варьируют по размерам (от менее 1 т.п.н. до 85 т.п.н.). Обычно дуплицированные последовательности ДНК представлены в нескольких кластерах. Например, дуплицированные фрагменты гена NF1, локализованного в 17q11.2, также были обнаружены в 14q11, 15q11, 22q11, 2q21, 18q11, 21q11, 12q12, 1q32 и 20q11. Большинство дупликонов в прицентромерных районах не вовлечено в транскрипцию. Они представлены лишь фрагментами исходных транскриптомов, и в этих кластерах отсутствуют необходимые регуляторные последовательности. Тем не менее было обнаружено несколько примеров мРНК и EST-последовательностей, соответствующих копиям дупликонов из прицентро-мерных районов. Правда, в большинстве случаев транскрипция была ограничена стволовыми и трансформированными клетками, а также эмбриональными тканями.

Анализ последовательностей, фланкирующих прицентромерные дупликации, показал, что они представлены несовершенными полипиримидиновыми или полипуриновыми (CAGGG, GGGCAAAAAGCCG, GGAA) последовательностями и HSREP522-элементами. Многие из них имеют сходство с теломерными повторами, субтеломерными последовательностями и последовательностями, определяющими перестройку иммуноглобулиновых генов. Кластеры повторяющихся CAGGG, GGGCAAAAAGCCG и HSREP522 могут способствовать формированию особой конфигурации ДНК, стимулирующей негомологичные обмены, и таким образом приводить к интеграции дупликонов в районы, граничащие с прицентромерным гетерохроматином. Вероятно, такой механизм не единственный при формировании сегментных дупликаций, так как известны примеры дупликаций, не имеющих на своих границах подобных повторенных структур.

Сравнение сегментных дупликаций из разных хромосом (2p11, 10p11, 16p11 и 22q11) обнаружило их сходство, позволившее предложить двушаговую модель формирования сегментных дупликаций (рис. 4-10, см. цв. вклейку). На первом этапе предполагается внедрение дубликатов различных уникальных последовательностей в прицентромерный район. На втором этапе происходят дупликация фрагмента из протяженного комплекта ранее дуплицированных последовательностей и его встройка в новое положение.

Существование сегментных дупликаций в хромосомах человека имеет ряд последствий. Одно из них - возникновение нового фактора геномной нестабильности. Спаривание в мейозе паралогичных сегментов может приводить к неравному кроссинговеру и в результате - к микродупликациям и микроделециям. Действительно, многие из районов, для которых характерна повышенная частота внутрихромосомных перестроек, приводящих к различным заболеваниям или обнаруживаемых при онкологических болезнях, активно участвуют в процессе формирования прицентромерных сегментных дупликаций. Паралогичные сегментные дупликации, находящиеся на одной хромосоме, могут быть причиной или следствием инверсий. Это относится к перицентрической инверсии в хромосоме 9 - одному из наиболее распространенных вариантов хромосомного полиморфизма у человека. Результаты FISH-анализа указывают на высокую степень гомологии в бэндах 9р12 и 9q13, соответствующих точкам разрыва при инверсии. Инверсия в хромосоме 2 имеет границы в 2р11 и 2q13. В этих районах присутствуют протяженные участки сегментных дупликаций со степенью гомологии 98%.

Завершая рассмотрение сегментных дупликаций, следует отметить, что их существование и полиморфизм в районах локализации могут усложнять молекулярно-цитогенетическую диагностику хромосомных нарушений человека вследствие обнаружения гомологичных последовательностей, представленных в различных сегментных дупликациях.

Ломкие сайты хромосом

В 70-х годах XX в. в культуре клеток некоторых индивидуумов был обнаружен феномен повышенной ломкости хромосом. Он существовал либо в клетках обычной культуры, либо возникал только при определенных воздействиях на нее. Для него характерна повышенная частота хромосомных разрывов. Как правило, последняя или пробелы хроматид в конкретных хромосомных участках не связаны с какими-либо заболеваниями, но существование ломких сайтов может сопровождаться развитием различных аномалий. Так, в 1969 г. у больных с синдромом Мартина-Белла, сопровождающимся умственной отсталостью, был обнаружен специфический цитогенетический маркер-ломкий сайт в дистальной части длинного плеча хромосомы Х, позже локализованный в суббэнде Xq27.3 (FRAXA). Основные диагностические признаки заболевания: умственная отсталость, прогнатизм, широкое лицо с чертами акромегалии, большие оттопыренные уши, макроорхидизм в постпубертатном периоде, аутизм, гиперкинезы, плохая концентрация внимания и дефекты речи, более выраженные у детей. Отмечают также аномалии соединительной ткани с повышенной растяжимостью суставов и пролапсом митрального клапана. Относительно полный спектр клинических признаков обнаруживают только у 60% мужчин с ломкой хромосомой Х; 10% больных не имеют лицевых аномалий, у 10% присутствует только умственная отсталость без других признаков, а у 30% пациентов отсутствует макроорхидизм.

Синдром ломкой хромосомы Х имеет высокую частоту встречаемости (один случай на 1500-3000 человек) и необычное наследование. Клинические признаки заболевания обнаруживают только у 80% мужчин-носителей мутантного гена. Остальные 20% пациентов как клинически, так и цитогенетически нормальны, но могут иметь внуков, рожденных от дочерей-носителей мутантного гена, с клиническими симптомами синдрома. Мужчины-носители мутации, не имеющие клинических признаков, служат передатчиками неэкспрессированного мутантного гена (трансмиттерами), который может манифестировать в последующих поколениях. Среди женщин, гетерозиготных по мутантному гену, выделяют два типа:

Молекулярный механизм наследования и передачи мутации был выяснен в 1991 г. Было установлено, что развитие синдрома связано с мутацией в гене FMRl (Fragile site Mental Retardation l - ломкий участок хромосомы, связанный с развитием умственной отсталости первого типа). В первом экзоне гена FMRl отмечают многократное увеличение числа копий простого тринуклеотидного повтора CGG. В норме оно варьирует от 5 до 52. У пациентов с синдромом Мартина-Белла их число составляет 200 и более. Феномен резкого увеличения числа копий CGG-повторов (экспансии числа тринуклеотидных повторов) зависит от пола потомка. Такая экспансия - постзиготическое событие, происходящее на ранних стадиях эмбриогенеза у эмбрионов женского пола.

В настоящее время в дистальном районе длинного плеча хромосомы Х найдено еще несколько ломких участков: FRAXE, FRAXF и RFAXD. FRAXE и FRAXF не связаны с аномалиями развития. RFAXD располагается рядом с FRAXA. Его обнаруживают у нормальных индивидуумов с частотой около 1-2%, что создает затруднения при диагностике синдрома Мартина-Белла. Возможно, ломкие районы хромосом также вовлечены в процесс клеточной трансформации, возникающий при онкологических заболеваниях.

Сестринские хроматидные обмены

Впервые сестринские хроматидные обмены (СХО) были описаны много лет назад. Несмотря на огромные успехи современной цитогенетики и широкое использование СХО в оценке мутагенности и онкогенности различных факторов, их механизм остается неизвестным. Одно из наиболее полных определений СХО включает следующие положения: «Обмен гомологичных сегментов генетического материала между сестринскими хроматидами хромосомы: между сестринскими хроматидами мейотических тетрад или между сестринскими хроматидами дуплицированных соматических хромосом. Частота обменов увеличивается в результате повышенной хромосомной ломкости. Она обусловлена наследственными факторами или влиянием окружающей среды, таким как ультрафиолетовое, ионизирующее облучение и другие мутагенные агенты. Особенно высока частота СХО при синдроме Блюма». Метод обнаружения и подсчета СХО в большинстве хромосомных районов достаточно прост и описан выше. К делящимся клеткам добавляют 5-бромдезоксиуридин. После двух клеточных циклов в одной из хроматид он присутствует в обеих нитях ДНК, а в другой - только в одной. Отличать их позволяют специальные методы окрашивания. Более сложен учет СХО в терминальных районах хромосом. Последние известны как ГТ мейотических рекомбинаций и дву-нитевых разрывов. Проведенные оценки показали, что 17% всех СХО приходится на теломерные и субтеломерные районы, представляющие лишь 0,1% материала всех хромосом. Частота встречаемости СХО в них в пересчете на нуклеотиды (один СХО на 1600 пар оснований) в 160 раз выше, чем где-либо еще в геноме человека. Для оценки частоты в теломерных районах были использованы специальные методы, такие как CO-FISH (chromosome orientation fluorescence in situ hybridization).

Невысокую частоту СХО в клетках человека (от 3 до 8 СХО на метафазу при использовании стандартных методов) считают нормой. Она может значительно увеличиваться при воздействии некоторых мутагенов, что делает определение частоты СХО эффективным тестом на мутагенность. Она также значительно повышена при ряде наследственных заболеваний человека. При синдроме Блюма число СХО на метафазу может достигать 100-160. Частота СХО зависит как минимум от двух факторов - частоты возникновения двунитевых разрывов ДНК и эффективности репарационной системы клетки. В связи с этим связь наследственных нарушений, снижающих эффективность репарационной системы, и мутагенных воздействий с увеличением частоты СХО кажется очевидной. Простая логика говорит, что если часть двунитевых разрывов после репарации приводит к СХО, то воздействие мутагенов, вызывающее образование разрывов ДНК, должно приводить к увеличению числа СХО. С другой стороны, увеличение количества сбоев при репарации разрывов также должно вызывать повышение частоты обменов гомологичными участками сестринских хроматид. Снижение эффективности репарационной системы ограничено традиционными представлениями об увеличении времени репарации разрыва двойной нити ДНК в одной хроматиде и, как следствие, увеличении вероятности разрыва ДНК второй хроматиды с последующим лигированием ДНК разных хроматид. В этом случае приходится допустить рост вероятности возникновения неравных СХО, приводящих к мутациям.

В результате даже такого поверхностного рассмотрения проблемы возникает ряд вопросов. Отличаются ли СХО, возникающие при нормальном клеточном делении, от индуцированных мутагенами или служащих следствием различных наследственных нарушений? Каким образом клетка решает проблему нескольких СХО, в норме возникающих в каждом клеточном цикле? Чтобы попытаться найти ответы на эти вопросы, полезно рассмотреть процесс конденсации хроматина хромосом в митозе. После репликации ДНК сестринские хроматиды, удерживаемые когезиновым комплексом, расположенным интервалом около 10 т.п.н., остаются рядом. При переходе клетки в митоз когезин уходит, а с ДНК связываются кон-денсины, что приводит к компактизации хроматина. На этом этапе начинается разделение материала хроматид. Сложно представить, что две нити ДНК могут без затруднений сформировать две отдельные хроматиды. Считают, что сестринские хроматиды на ранних стадиях митоза удерживаются за счет районов, из которых еще не ушли молекулы когезина, но можно предположить, что наряду с этим хроматиды удерживаются рядом и за счет «перепутывания» ДНК сестринских хроматид в некоторых участках хромосом. В этих местах должно возникать дополнительное напряжение. Похоже, что решение проблемы завершения полного разделения сестринских хроматид невозможно без разрывов (энзиматической рестрикции) ДНК в них и их последующей репарации. Высокой эффективности восстановления целостности ДНК в ее исходном виде можно достичь посредством участия в формировании разрыва рестриктаз, под действием которых образуются липкие концы ДНК. Пространственная близость гомологичных участков ДНК сестринских хроматид позволяет допустить возможность возникновения разрывов в гомологичных сайтах двух хроматид с последующим лигированием нитей ДНК, принадлежащих разным хроматидам. Таким образом обеспечивается успешное расхождение хромосом с небольшим побочным эффектом - возникновением нескольких СХО на геном, при этом абсолютная точность при проведении обменов практически гарантирована. Это только гипотеза. Механизм формирования СХО остается неизвестным.

Тем не менее стоит рассмотреть возможные следствия из приведенных выше предположений. Если увеличение числа СХО обусловлено множеством разрывов двунитевой ДНК, возникших под воздействием мутагенов, естественно предположить, что они будут происходить не точно в гомологичных сайтах сестринских хроматид. В этих случаях возникновение СХО должно сопровождаться формированием мутаций. Таким образом, СХО, возникающие под воздействием мутагенов, могут принципиально отличаться от СХО, вызванных нормальным расхождением хроматид.

Механизмы увеличения числа СХО при различных наследственных нарушениях, вероятно, различаются, при этом могут быть затронуты различные этапы процесса репликации или репарации ДНК. Так, например, при синдроме Блюма мутации возникают в гене, кодирующем геликазу. Известно более десятка мутаций, характерных для анемии Фанкони. Продукты большинства генов, на которые влияют мутации, участвуют в формировании комплекса, осуществляющего лигазную активность. Таким образом, подобные мутации могут значительно увеличивать время лигирования ДНК при репарации двунитевого разрыва. Увеличение времени лигирования повышает вероятность пространственного разобщения концов ДНК, возникших при двунитевом разрыве, и, как следствие, последующего лигирования концов, исходно принадлежащих ДНК разных хроматид или даже различных хромосом. Действительно, у пациентов с анемией Фанкони увеличивается не только частота СХО, но и количество межхромосомных обменов.

Разнообразие механизмов формирования СХО, вероятно, - одна из основных причин того, что они остаются неизвестными до настоящего времени.

ГОРЯЧИЕ ТОЧКИ ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК

При анализе реорганизации хромосом человека были обнаружены районы, в которых разрывы и воссоединения происходят с более высокой частотой, чем в среднем в геноме. Анализ ДНК в ГТ хромосомных перестроек при врожденных хромосомных аномалиях и канцерогенезе показал присутствие в них различных типов повторенных последовательностей. Особое значение имеют районоспецифичные низкокопийные повторы (Low Copy Repeats - LCRs) и дупликоны, которые часто фланкируют сайты ДНК, вовлеченные в перестройки. Реорганизация хромосом, опосредованная рекомбинацией между разными копиями таких повторов, в зависимости от их ориентации приводит к делециям, дупликациям, инверсиям или U-образным обменам. В проксимальной части q-плеча хромосомы 15 обнаружено четыре ГТ. ГТ1, ГТ2 и ГТ3 задействованы более чем в 95% микроделеций в этом районе. Обычно точками разрывов служат дистальная (ГТ3) и одна из проксимальных ГТ (ГТ1 или ГТ2).

Делеции в проксимальном участке длинного плеча q11-q13 хромосомы 15 представляют классический пример вовлечения в реорганизацию хромосомных районов, подвергнутых импринтингу. В зависимости от того, какой из гомологов хромосомы 15 (матери или отца) несет делецию, у носителя формируется либо СПВ, либо синдром Энжельмена (СЭ). СПВ впервые описали в 1956 г. в Швейцарии. Частота встречаемости составляет 1: 12 000-15 000 живорожденных. При этом синдроме делеция располагается на отцовской хромосоме. Делеция в материнской хромосоме приводит к развитию СЭ. Гены этого района в зависимости от происхождения хромосомы экспрессируются в разных тканях и в разное время: в одних - только отцовские, в других - только материнские. В результате и делеция выражается по-разному. Лишь около 70% случаев СПВ обусловлено делецией в отцовской хромосоме. В остальных случаях его причиной служит материнская дисомия хромосомы 15, при этом, как и при делеции 15q11-q13 в отцовской хромосоме, в клетках индивидуума отсутствуют отцовские гены этого района.

Синдром Энжельмена впервые описали в 1965 г. Гарри Энжельмен представил истории болезни трех пациентов с выраженной умственной отсталостью. Учитывая своеобразие поведения и фенотипа пациентов, он назвал этот синдром «puppet children» - «дети-куклы». Окончательное название он получил в 1982 г.

Помимо делеции 15q11-q13 в материнской хромосоме, к развитию СЭ приводит отцовская дисомия хромосомы 15. Всего в настоящее время описано четыре механизма возникновения заболевания: делеция de novo в локусе 15q11-q13 (70-80% всех случаев), отцовская дисомия (5% случаев), дефект центра импринтинга (ЦИ) (5%) и мутация материнской копии гена, кодирующего убиквитинпротеинлигазу (ген UBE 3A).

Поскольку в структурные перестройки обычно вовлекаются участки ДНК, обогащенные повторенными последовательностями, достаточно типичными считают перестройки с точками разрывов в районах прицентромерного гетерохроматина. Примерами таких перестроек могут быть робертсоновские транслокации акроцентрических хромосом и изохромосомы по плечам хромосом. Формирование двуплечей хромосомы из длинных плеч акроцентриков при сохранении их нормального числа практически не сказывается на фенотипе носителя. Из изохромосом, состоящих из плеч аутосом, совместимой с жизнью считают только изохромосому по короткому плечу хромосомы 18.

Хромосомные аномалии и их анализ

Первые результаты диагностики хромосомных нарушений были получены вскоре после определения числа хромосом человека. Уже в 1958 г. была опубликована статья, содержащая описание нарушения числа хромосом при синдроме Дауна (Lejeune et al., 1958), а на следующий год были описаны изменения при синдроме Кляйнфельтера (Jacobs, Strong, 1959) и Тернера (Ford et al., 1959). Уже в следующем году была обнаружена первая структурная аномалия хромосом: в клетках периферической крови у больных с хронической миелолейкемией описана филадельфийская хромосома. Ситуация принципиально изменилась после внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. Благодаря последним стало возможным описание структурных хромосомных аномалий. В то же время диагностика нарушений, связанных с небольшими хромосомными районами, оставалась проблематичной и ненадежной. Это особенно касалось хромосомного анализа при онкологических заболеваниях. Хромосомы раковых клеток были и остаются печально известными своей отвратительной морфологией. Основные трудности удалось решить введением в практику диагностики методов молекулярной цитогенетики: определение числа хромосом, делеций и транслокаций конкретных районов стало возможно при анализе, проводимом не только на мета-фазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах. Мощным инструментом обнаружения хромосомных транслокаций стала 24-цветная FISH. Нарушение баланса хромосомных районов CGH можно определить даже на архивном материале. Получение ДНК-проб из аномальных хромосом с последующим FISH-анализом c нормальными хромосомами и многоцветным бэндингом дает возможность разобраться с самыми сложными случаями комплексных хромосомных перестроек, возникающих при онкологических заболеваниях (рис. 4-11, см. цв. вклейку).

Показательным является прогресс в диагностике малых сверхчисленных маркерных хромосом (достаточно распространенный вариант хромосомных аномалий). Частота их встречаемости варьирует от 0,65 до 1,5 случая на 1000 человек. Она несколько ниже, если учитывать результаты только постнатальной диагностики (0,14-0,72 случая на 1000 человек). Многие из них не влияют на формирование фенотипа. По некоторым оценкам, семейные маркерные хромосомы составляют до 40% всех обнаруженных маркерных хромосом. Отсутствие клинических признаков подобного нарушения кажется вполне логичным, так как такие хромосомы не содержат эухроматиновых сегментов и функционально активных генов. Тем не менее формирование маркерных хромосом может указывать на повышенную хромосомную нестабильность и необходимость проведения более тщательного цитогенетического анализа. Обнаружение множественных маркерных хромосом разного происхождения хорошо согласуется с этим предположением.

Около 80% маркерных хромосом представлено изохромосомами по коротким плечам акроцентриков и некоторых двуплечих хромосом. Наиболее высокой частотой встречаемости (около 40% случаев) среди них характеризуется inv dup(15). На втором месте стоит хромосома inv dup(22). В их образовании участвуют те же ГТ хромосомных перестроек, что и в возникновении делеций. Так, inv dup(15) может быть результатом перестройки по ГТ1, ГТ2, ГТ3, а также ГТ, локализованной дистальнее последней (дистальная ГТ). Предполагают, что она содержит другой тип повторенных последовательностей. Таким образом, конкретная inv dup(15) может представлять один из четырех вариантов изохромосомы. Различие маркерных хромосом по составу входящих в них эухроматиновых районов определяет разнообразие клинических признаков.

Перестройки в районе 22q11, подобно перестройкам в 15q11→q13, обусловлены рекомбинациями, связанными с районоспецифичными низкокопийными повторами. Микроделеции в районе 22q11 обнаруживают с частотой 1 случай на 4000 новорожденных. Хромосомы inv dup(22): 22pter→cen→q11.2::q11.2→cen→ 22pter обнаруживают несколько реже. Низкокопийные повторы хромосомы 22 варьируют по размеру от 40 до 350 т.п.н. с уровнем гомологии 97-98%. Они были обнаружены в районах локализации трех ГТ хромосомных перестроек в 22q11, а также еще в 6 локусах, расположенных в пределах 6,5 млн п.н. от основных ГТ. Микроделеции и дупликации в районе 22q11 связаны с дистальной и проксимальной ГТ. Около 90% делеций имеют размер 3 млн п.н., а 7% - 1,5 млн п.н. Они же задействованы в формировании большинства хромосом inv dup(22). Различие маркерных хромосом по составу входящих в них эухроматиновых районов определяет различные клинические признаки.

Из-за более низкой частоты встречаемости других маркерных хромосом детальное изучение механизма их формирования затруднительно. Тем не менее стоит рассмотреть случаи возникновения множественных маркерных хромосом. В одном из них число последних варьировало от 1 до 6. Все они имели разное происхождение (хромосомы 2, 5, 6, 12, 14 и 22). Одновременное образование нескольких маркерных хромосом указывает на нестабильность хромосом у пациента. Механизм ее формирования неизвестен.

Отдельную проблему представляют маркерные хромосомы с неоцентромерой. Механизм перестроек, приводящих к их образованию, неясен. В связи с относительно небольшим числом исследований маркерных хромосом с неоцентромерами сложно говорить о молекулярной организации районов, входящих в их состав. Следует лишь отметить, что некоторые такие хромосомы включают материал хромосомных сегментов, содержащих низкокопийные повторы, например сегмент 15q26. Возможно, последние участвуют в формировании и этого типа маркерных хромосом.

Большинство маркерных хромосом, ассоциированных с врожденными пороками развития (ВПР), характеризуются существованием эухроматиновых сегментов, независимо от того, представляют ли они бисателлитные, кольцевые или другие варианты хромосом. Таким образом, в этих случаях обнаружение эухроматиновых сегментов и идентификация их состава - основная задача цитогенетической диагностики. Идентификация относительно крупных маркерных хромосом, таких как i(5p), i(9p), i(12p), i(18p), благодаря их значительным размерам не представляет особых затруднений даже для традиционных методов хромосомного анализа. Их присутствие приводит к тетрасомии по большому числу генов и, как следствие, к формированию многочисленных аномалий развития. Из них совместимой с рождением живого ребенка оказалась только i(18p).

Значительно более сложной считают оценку клинического значения маркерных хромосом, содержащих небольшие эухроматиновые сегменты. В случае их формирования из прицентромерных районов и прилежащих к ним эухроматиновых сегментов значение имеют не только определение происхождения маркерной хромосомы, но и идентификация материала сегментов, входящих в ее состав. Задача диагностики сводится к обнаружению локализации точек разрывов, происходящих при образовании маркерной хромосомы. Именно ее решение позволяет дать достаточно обоснованный прогноз. К сожалению, и в этом случае он носит вероятностный характер, что может быть обусловлено присутствием различных аллелей генов, входящих в состав маркерной хромосомы, ее мозаицизмом и однородительской дисомией (ОРД) по хромосоме, из которой возникла маркерная хромосома.

Важный фактор формирования маркерной хромосомы - момент ее возникновения. Если перестройка произошла в клетках эмбриона или взрослого организма, то несущие ее клетки могут составлять лишь небольшую долю всех клеток организма. Формирование маркерной хромосомы на предмейотических стадиях или во время мейоза может привести к присутствию такой хромосомы уже в зиготе. Тем не менее мозаицизм по маркерной хромосоме нельзя рассматривать как доказательство ее постзиготического происхождения. Известны примеры семейных маркерных хромосом, которые и у матери, и у ее потомства были обнаружены лишь в части исследованных клеток. Механизм потери маркерных хромосом в соматических клетках неизвестен.

Формирование маркерной хромосомы в результате U-образного обмена приводит к возникновению и последующей потере ацентрического фрагмента, т.е. один из гомологов хромосомы должен быть замещен маркерной хромосомой. Такие примеры известны только для половых хромосом (46,X,+mar, где mar - дериват хромосомы Х или Y). Моносомия по большей части районов аутосомы невозможна, так как она приводит к гибели плода уже на ранней стадии развития. Все конститутивные маркерные хромосомы, дериваты аутосом, считают сверхчисленными. Было предложено несколько возможных механизмов их возникновения. В случае хромосомных перестроек в ходе гаметогенеза возможно формирование гамет, содержащих маркерные хромосомы либо вместо, либо в дополнение к нормальной хромосоме. Для объяснения коррекции числа нормальных хромосом при формировании маркерной хромосомы были предложены следующие механизмы.

Функциональная коррекция трисомии. В результате ошибки в мейозе одна из гамет несет две копии хромосомы. При образовании зиготы это приводит к трисомии по данной хромосоме. К этому же результату может приводить нарушение митоза на постзиготической стадии. Реорганизация одной из трех копий хромосомы завершается образованием маркерной хромосомы и переходом полной трисомии в частичную.

Постзиготическая редупликация. Возникновение маркерной хромосомы происходит в процессе гаметогенеза или непосредственно в мейозе. Одна из гамет несет маркерную хромосому вместо нормальной. Зигота, полученная при слиянии с такой гаметой, - моносомик по большей части соответствующей хромосомы. Редупликация нормальной хромосомы переводит частичную моносомию в частичную трисомию, ассоциированную с ОРД.

Комплементация гамет. Одна из гамет несет две копии нормальной хромосомы, вторая - маркерную хромосому.

Следует отметить, что функциональная коррекция трисомии может с высокой вероятностью приводить к ОРД, а постзиготическая редупликация - к ОРД в 100% случаев. Действительно, исследования носителей сверхчисленных маркерных хромосом показали, что их возникновение часто сочетается с ОРД. Это обусловливает некоторые дополнительные проблемы, связанные с хромосомным импринтингом, возникновением гомозиготности по аутосомным рецессивным мутациям, а также с их комбинациями. Из 19 случаев ОРД, обнаруженной у пациентов с маркерными хромосомами, описанных к настоящему времени, 4 были эпизодами отцовской ОРД, остальные - материнской ОРД. По одному случаю ОРД было найдено для хромосом 1, 6, 7, 9, 10, 12, 20 и 22. 11 случаев было описано для хромосомы 15. У 8 пациентов с ОРД по хромосоме 15 был обнаружен СПВ, у 3 - СЭ. В одном из случаев ОРД по хромосоме 15 маркерная хромосома возникла из хромосомы Х. Суммарный анализ организации различных маркерных хромосом указывает на существование различных механизмов формирования сверхчисленных маркерных хромосом.

До разработки методов молекулярной цитогенетики из всех малых маркерных хромосом было возможно идентифицировать только i(18p). В остальных случаях просто констатировали факт существования маркерной хромосомы, иногда - с уточнением ее возникновения из одного из акроцентриков. Затем анализ состава альфоидной ДНК центромерного района маркерной хромосомы, FISH-исследование ДНК-проб, специфичных прицентромерным и прителомерным районам хромосом, и PRINS прицентромерных и теломерных последовательностей ДНК позволили определять их происхождение. CISS-гибридизация WCP c мета-фазными хромосомами пациента, включая 24-цветную FISH, и CGH открыли путь к анализу эухроматиновых районов маркерных хромосом. Их чувствительность и точность значительно увеличились в связи с использованием в диагностике метода микродиссекции метафазных хромосом и FISH клонированных фрагментов ДНК. В последних работах использовали высокоразрешающие чипы CGH или гибридизацию ДНК-проб маркерных хромосом с соответствующими микрочипами. При этом определение локализации точек разрыва, возникающих при образовании маркерной хромосомы, проводят с точностью, близкой к таковой методов молекулярной биологии.

Хромосомный анализ при экстракорпоральном оплодотворении

Одной из задач при проведении экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является выбор наиболее перспективных бластоцист, культивируемых in vitro. Еще относительно недавно в связи с жесткими временными рамками кариотипирование проводилось на стадии 8 бластомеров. Для этого выделялся 1 бластомер, из него готовили препарат, распластывая ядро на предметном стекле, и анализировали число копий 13, 18, 21-й, Х- и Y-хромосом. Выбор хромосом для анализа был обусловлен тем, что при анеуплоидии по этим хромосомам возможно рождение живого ребенка. Для оценки числа копий проводили FISH ДНК-проб, дающих в интерфазном ядре одиночные интенсивные сигналы на соответствующих хромосомах, которые могли быть надежно детектированы. В течение длительного времени такой анализ проводился в большинстве лабораторий мира при оценке качества бластоцист для их дальнейшего использования.

Однако уже в 1993 г. был выявлен хромосомный мозаицизм в преимплантационных эмбрионах. Было показано, что не все клетки эмбриона имеют один и тот же хромосомный состав (Delhanty et al., 1993). Многочисленные исследования, посвященные изучению этого вопроса, обнаружили высокую частоту мозаицизма. В разных исследованиях она варьировала от 15% (Harper et al., 1995) до 90% и более (Daphnis et al., 2005). Причем процент мозаиков зависел от числа хромосом, вовлеченных в анализ. Стало очевидно, что для оценки перспективности использования эмбриона необходимо проводить полное кариотипирование как минимум нескольких клеток. То есть анализ должен быть проведен на более поздних стадиях эмбриогенеза, и желательно определение числа копий всех хромосом человека. Соответствующие методы, позволяющие проводить такую диагностику, были разработаны.

В 1990 г. была показана возможность заморозки и последующей разморозки эмбриона, что открывало возможность его использования в последующих циклах реципиента. В 2009 г. была опубликована целая серия статей, в которых проводилось сравнение эффективности витрификации и медленной заморозки эмбриона. Была показана высокая эффективность витрификации и возможности забора клеток и ДНК эмбриона из его различных частей для проведения их кариотипи-рования.

Почти в это же время успешно создавались и совершенствовались технологии молекулярно-цитогенетического анализа, получившие название Сomprehensive Chromosome Screening (CCS). К ним относятся сравнительная геномная гибридизация на метафазных хромосомах и микрочипах, количественная ПЦР, анализ на микрочипах, базирующийся на анализе SNP, а также на анализе гаплотипов SNP (karyomapping). Кроме того, развитие методов массового параллельного секвени-рования позволило использовать эту технологию для проведения кариотипирова-ния индивидуальных клеток.

Более того, оказалось, что karyomapping позволяет не только проводить одновременный анализ всех 24 хромосом человека, но и, выявляя информативные локусы и анализируя гаплотипы родительских и прородительских хромосом в хромосомах «пациента», определять для каждой хромосомы ее состояние (моно-сомия, трисомия, норма) (http://dx.doi.org/10.1136/jmg.2009.069971).

Нужно отметить, что преимплантационная генетическая диагностика (PGD)/ преимплантационный генетический скрининг (PGS), применяемые уже более 25 лет, имели «врожденный» дефект: анализ хромосомных нарушений и диагностика моногенных заболеваний были несовместимы. Однако karyomapping позволяет путем сборки унаследованных хромосомных сегментов одновременно и проводить анализ хромосомных нарушений, и определять унаследованные родительские и прородительские гаплоблоки. Полученные результаты позволяют дать описание гомологичных хромосом, кроссинговера, наличия интересующего участка хромосомы, используя анализ сцепления, а также наряду с анализом хромосомных аномалий осуществить анализ наследования интересующих исследователя мутаций, отслеживая гетерозиготные SNP и определяя интересующие локусы. То есть karyomapping позволяет одновременно анализировать анеуплоидии, мозаицизм и индивидуальные гены, ответственные за развитие патологий; в 2018 г. около 1000 клиник по всему миру использовали эту технологию, опираясь на ~20 диагностических лабораторий. Технология использовалась в ~2500 случаях. Необходимо, однако, упомянуть, что этот подход не позволяет выявлять случаи постзиготической трисомии.

Оценивая эффективность описанной технологии, можно рассмотреть результаты анализа анеуплоидии в эмбрионах от родителей с моногенными заболеваниями и эффективность одновременного детального кариотипирования эмбрионов выявления генов, ответственных за развитие моногенных заболеваний при проведении PGD. В одном из исследований с ноября 2014 по апрель 2017 г. было проведено исследование эмбрионов от 36 пар - носителей генов моногенных заболеваний. Технология «Karyomap gene chip» была использована для анализа бластоцист, полученных от этих пар, и для выбора нормальных эмбрионов для дальнейшего использования. Всего выполнено 43 полных цикла PGD с кариотипированием и анализом индивидуальных генов. Получено 687 ооцитов и протестировано 186 бластоцист. В результате 175 бластоцист были охарактеризованы, 117 из 175 (66,8%) были отнесены к нормальным, или непатогенным (silent carriers), 58 из 175 (33,2%) - к анормальным, или патогенным. Выявлено 40 (22,9%) анеуплоидных эмбрионов. Среди эмбрионов, нормальных по моногенным заболеваниям, анеуплоидным был 31 (26,5%) эмбрион.

Пять лет назад при проведении PGD началось использование CCS на основе технологий секвенирования нового поколения. Уже опубликованы протоколы, основанные на массовом параллельном секвенировании, для скрининга анеуплоидии у преимплантированных эмбрионов человека. Одной из проблем использования этих технологий является то, что большинство реагентов, необходимых для проведения таких исследований, маркировано «for research use only», т.е. не может быть использовано при проведении диагностики. Все процедуры для нового варианта PGD должны быть протестированы на аналитическую чувствительность, специфичность, устойчивость, точность, на лимиты выявления, воспроизводимость, а также пройти необходимые процедуры лицензирования. Кроме того, для интерпретации данных и постановки диагноза требуется разработка новых критериев и определения соответствия аналитических результатов клиническим потребностям.

Хромосомы в интерфазном ядре

Длительное время хромосомы человека были доступны для прямого наблюдения только в митозе и мейозе. В ходе этих исследований сложились представления, что в митозе конденсация хромосом приводит к уменьшению их длины в несколько раз. Они верны, если уточнить, что меняется длина хромосом на цитологическом препарате, а не в клетке. Аккуратное сравнение размеров хромосомы в метафазе и G2 интерфазы показало, что значительных изменений не происходят, и едва ли стоит говорить об изменении длины хромосомы (рис. 4-12, см. цв. вклейку).

Если кратко описать пространственную организацию хромосом человека в интерфазе, то можно сказать, что каждая из них занимает в ядре свою территорию, которая не перекрывается с территориями других хромосом. Это утверждение верно для плеч хромосом и, в определенной степени, для хромосомных районов. Указания на существование отдельных хромосомных территорий возникли несколько десятилетий назад на основании данных по индукции хромосомных аберраций тонким лучом лазера. Затем были разработаны методы, позволяющие обнаруживать материал индивидуальной хромосомы непосредственно в интерфазном ядре. Чаще всего для этого используют 3D-FISH с последующей трехмерной микроскопией. Многочисленные эксперименты в этой области позволили обнаружить некоторые закономерности локализации хромосом в интерфазном ядре. Хромосомы, содержащие больше активно работающих генов, имеют тенденцию располагаться во внутреннем компартменте ядра, в отличие от хромосом, несущих больше транскрипционно неактивного материала. Тем не менее далеко не всегда в ядре просто выделить внутренний компартмент. Например, в плоских ядрах фибробластов большинство хромосомных территорий находится в контакте и с нижней, и с верхней ядерной мембраной. В связи с этим более правильно будет провести анализ локализации в ядре транскрипционно активного и транскрипционно неактивного хроматина.

Изучение локализации рано и поздно реплицирующейся ДНК показало, что в контакте с ядерной пластиной находится поздно реплицирующаяся ДНК, т.е. хроматин, не несущий активно работающих генов. Материал хромосом с активно работающими генами всегда находится на некотором расстоянии от ядерной ламины. Обобщая гипотезы, рассматривающие пространственную организацию хромосом в качестве фактора, участвующего в регуляции транскрипционной активности генов, можно сказать, что транскрипционно активный материал должен располагаться в той части хромосомной территории, где он доступен для ферментов, осуществляющих транскрипцию и сплайсинг. Очевидно, что такие условия существуют на границе хромосомной территории и в ее приграничной части, характеризующейся низкой степенью компактизации хроматина. Результаты определения положения активных и неактивных генов в хромосомных территориях хорошо согласуются с такими представлениями о локализации активно работающих генов у поверхности интерфазной хромосомы. Логичным следствием, вытекающим из этого правила, служит предположение о более высокой концентрации таких генов в терминальных районах хромосом и микрохромосомах. Именно такое увеличение числа генов показано в Т-бэндах хромосом человека. В норме микрохромосомы у человека отсутствуют. Они характерны для кариотипов птиц, и именно там находится ДНК, гомологичная ДНК Т-бэндов хромосом человека. Организация хромосомы в интерфазе имеет еще ряд особенностей, связанных с локализацией транскрипционно активного и транскрипционно неактивного хроматина. ДНК С-позитивных районов хромосом обычно находится в контакте с ядерной оболочкой, G-бэндов - либо в контакте с оболочкой ядра, либо с инвагинациями ядерной ламины, либо располагается на границе ядрышка (рис. 4-13, см. цв. вклейку). ДНК R-бэндов локализована на некотором расстоянии от этих структур.

Сегодня рассмотрение вопросов об организации интерфазного ядра невозможно без использования таких понятий, как хромосомная территория и меж-хроматиновое пространство. Именно поэтому стоит подробнее рассмотреть, что означают эти термины. Простое заключение о том, что, так как материал разных хромосом в ядре не перемешан, пространство, которое занимает хромосома, считают хромосомной территорией, а пространство, свободное от него, - межхроматиновым пространством, оказывается не совсем верным. Существует различие между семантическим определением и тем, что имеют в виду современные биологи, используя эти термины. Термин «хромосомная территория» сегодня относят к той части интерфазного ядра, которая окрашивается 3D-FISH хромосомоспецифичной ДНК-пробой. Рассмотрение этого определения приводит к двум выводам:

Это наглядно продемонстрировали исследования по локализации в интерфазном ядре конкретных фрагментов ДНК из короткого плеча хромосомы 11 человека. Часть ДНК, как и следовало ожидать, оказалась в пределах территории 11р, определенной по результатам 3D-FISH соответствующей ДНК-пробы, но часть располагалась за ее пределами (рис. 4-14, см. цв. вклейку). Объяснить эти результаты очень просто: отдельная петля ДНК в интерфазном ядре не может быть обнаружена, если для 3D-FISH используют хромосомоспецифичную ДНК-пробу, в то время как ДНК-проба, приготовленная на базе клонированного фрагмента ДНК, в интерфазном ядре дает четкий сигнал.

Таким образом, из хромосомных территорий в межхроматиновое пространство выходят отдельные петли ДНК. Показано, что их размер может достигать нескольких миллионов пар оснований. В состав ДНК такой петли входят гены, часть которых активно транскрибируется. Уходя за пределы хромосомной территории в межхроматиновое пространство, они попадают в идеальные условия для взаимодействия с ферментами транскрипции и сплайсинга. Именно здесь находятся макромолекулярные комплексы, обеспечивающие синтез новой иРНК. Есть еще одно большое преимущество такого синтеза в межхроматиновом пространстве - служит не только местом локализации таких фабрик синтеза иРНК, но может функционировать и в качестве магистральных путепроводов, позволяющих генным продуктам быстро добраться до оболочки ядра, а затем через ядерную пору перейти в цитоплазму, где они будут использованы по прямому назначению. Петер Фрезер предложил называть такие макромолекулярные комплексы «фабриками транскрипции». Было показано, что одна такая «фабрика» может одновременно работать с ДНК из разных районов одной хромосомы или разных хромосом (рис. 4-13, см. цв. вклейку), причем расстояние между генами, локализованными в одной хромосоме, может превышать 20 млн п.н.

Районы хромосом, материал которых локализован на периферии хромосомных территорий или в межхроматиновом пространстве, - места локализации функционально активных генов. Подобное их расположение не обеспечивает включение гена, но дает шанс на это. Правдоподобно выглядит гипотеза о том, что при дифференцировке клеток формируется необходимый вариант пространственной организации хромосомных территорий, определяющий спектр генов, которые могут быть допущены к работе. Окончательная настройка и определение того, какие из этих генов будут активными, зависит от других, привычных для молекулярного биолога механизмов. Возможно, для полного описания структурно-функциональной организации хромосомы ее рассмотрения даже в четырехмерном пространстве (трехмерное пространство + время) окажется недостаточно. Значение имеет и отдаленная история хромосомы, выражающаяся в импринтинге соответствующих хромосомных районов. При абсолютно идентичных геномах (с точки зрения нуклеотидных последовательностей) возможно возникновение различных нарушений в развитии их обладателей. Примером может служить небольшая делеция в проксимальном районе длинного плеча хромосомы 15 человека, которая приводит либо к СПВ, либо к СЭ.

Хромосомы в клеточном цикле

Клеточный цикл включает четыре фазы: G1, S, G2 и М. G1-фаза - интервал между митозом и началом репликации ДНК. Для нее характерны высокая метаболическая активность и увеличение размера клетки. В S-фазе происходит основная репликация ДНК. G2 - фаза подготовки к митозу, продолжения синтеза белков и роста клетки. В М-фазе происходят непосредственная подготовка и собственно деление клетки. Митоз включает начальную стадию конденсации хроматина (профаза), ее продолжение, разборку ядерной оболочки, начало формирования клеточного веретена и прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом (прометафаза), выстраивание хромосом в экваториальной части клетки, завершение прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом (метафаза), расхождение сестринских хроматид (анафаза), формирование ядерных оболочек и цитокинез, что обеспечивает деление клетки (телофаза). Клетка может выйти из этого цикла и надолго задержаться в G0-фазе. Возвращение в клеточный цикл и последующий переход в в S-фазу требуют прохождения R-точки (restriction point). Это событие зависит в основном от присутствия в окружении клетки специальных индукторов - факторов роста. Например, фибробласты кожи могут выйти из стадии покоя под действием тромбоцитарного фактора роста (PDGF), образующегося в зоне повреждения кожи при свертывании крови.

Регуляцию клеточного цикла в основном осуществляют циклинзависимые киназы (Cdk) и циклины. У человека Cdk1, Cdk2, Cdk4 и Cdk6 непосредственно участвуют в регуляции клеточного цикла, поэтому их называют Cdk-активирующими киназами. Сdk - каталитические субъединицы протеинового комплекса. Для их активации требуется присутствие соответствующих циклинов. Регуляция активности Сdk происходит путем изменения количества в определенные фазы клеточного цикла. В активной форме комплексы циклин-Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие течение этой фазы.

Чтобы обеспечить надежную передачу генетической информации дочерним клеткам, в процессе участвует целый набор контролирующих механизмов, определяющих прохождение клетки через контрольные точки клеточного цикла (checkpoints - сверочные точки). Такая система контроля предотвращает размножение клеток, в которых произошли или могут произойти хромосомные нарушения, вследствие чего клетка не готова к корректному прохождению очередного этапа. В настоящее время описаны четыре контрольные точки во всех фазах клеточного цикла.

Поскольку основное требование к клетке для перехода в S-фазу - целостность ее ДНК, то в контрольной точке в G1 происходит проверка интактности ДНК. Показано, что клетки, подвергшиеся воздействиям, вызывающим разрывы ДНК, останавливаются в G1. Вход в S-фазу для них запрещен, так как до того, как начнется репликация ДНК, должна завершиться репарация всех имеющихся к этому моменту повреждений. Необходимо отметить, что остановку в фазе G1 вызывают не только повреждения ДНК, но и другие нарушения, в дальнейшем приводящие к нарушению числа хромосом и образованию микроядер. Остановка в G1 может быть как временной (до момента решения возникшей проблемы), так и необратимой. В контрольной точке в S-фазе проверяются правильность и полнота репликации ДНК. Клетка может задержаться в S-фазе, например, при снижении эффективности репликации в результате недостатка предшественников синтеза ДНК. В контрольной точке в G2-фазе клеточного цикла также идет проверка ДНК на интактность, но, кроме этого, оценивается и завершенность ее репликации. Клетки, в которых репликация не завершена, не могут войти в митоз. Контрольная точка сборки веретена деления обеспечивает прикрепление всех кинетохоров к микротрубочкам веретена. До завершения этого процесса клетка остается в метафазе. Контроль осуществляется по присутствию в клетках кинетохоров, не прикрепленных к микротрубочкам веретена. В экспериментах, в ходе которых лучом лазера разрушали такие кинетохоры, клетки переходили из метафазы в анафазу, что приводило к отставанию хромосом и формированию микроядер. Основную роль в контроле перехода клетки из метафазы в анафазу играют изменения во взаимодействии белков BUB1, BUBR1, MAD1 и MAD2, ассоциированных с кинетохорами. Задержка клетки в контрольных точках дает ей возможность завершить репарацию ДНК, ее репликацию или обеспечить нормальное прохождение клеточного деления. Если клетке не удается завершить необходимые для прохождения контрольной точки процессы и устранить существующие нарушения, то включается механизм программируемой клеточной гибели - апоптоз.

В случае успешного прохождения всех контрольных точек хромосомы демонстрируют удивительное постоянство своей организации и положения относительно друг друга. Даже миграция в экваториальную часть клетки в метафазе и последующее расхождение в дочерние клетки не приводят к их глобальному перемешиванию в новом ядре, хотя некоторые изменения все-таки происходят. В клеточном цикле также происходит некоторая трансформация пространственной организации индивидуальных хромосом, причем она связана не только с их компактизацией в митозе. Как было упомянуто выше, в интерфазной хромосоме хроматин рано реплицирующихся и транскрипционно активных районов хромосом тяготеет к межхроматиновому пространству и внутреннему компартменту ядра, тогда как хроматин поздно реплицирующихся и транскрипционно неактивных районов локализован преимущественно у ядерной оболочки, инвагинаций ядерной пластины и на границе ядрышка. Таким образом, относительно своей оси хромосома организована несимметрично. Можно сказать, что в сферических ядрах на хромосомной территории материал С- и G-бэндов локализуется у ядерной оболочки, далее располагается материал R-бэндов, а еще дальше в межхрома-тиновое пространство выходит наиболее активно транскрибируемый материал.

Такое распределение материала хромосомы в ядре может нарушаться в S-фазе, когда происходит репликация ДНК С- и G-бэндов. Перемещение материала хромосомного района, связанного с репликацией его ДНК, было наглядно продемонстрировано на клетках китайского хомячка. Ганг Ли и соавт. удалось проследить за положением в ядре 90 млн п.н. гетерохроматинового района на протяжении всего клеточного цикла. Большую часть времени в интерфазе этот район хромосомы находился на периферии ядра рядом с ядерной мембраной. Лишь на время репликации ДНК он перемещался во внутренний компартмент ядра, и в это же время происходила деконденсация его хроматина. После завершения репликации ДНК хроматин этого района опять становился компактно организованным и возвращался на периферию ядра. Происходят ли подобные перемещения материала нормальных С- и G-бэндов, неизвестно, но с уверенностью можно сказать, что во время репликации их ДНК степень компактизации хроматина уменьшается.

Репликация ДНК в хромосомах человека, как и у других высших эукариот, начинается сразу во множестве мест. В них формируется протеиновый комплекс (ORC - origin recognition complex), что приводит к формированию репликатив-ного комплекса. Происходит это следующим образом. Два дополнительных протеина (Cdc6p и Cdt1p) и сложный протеиновый комплекс MCM2-7 связываются с ORC, формируя пререпликативный комплекс (pre-RC). Его созревание происходит после привлечения дополнительных факторов, включая Cdc45 и Sld3. Затем подключаются ДНК-полимеразы, и начинается синтез нитей ДНК, который протекает в двух направлениях. Этот процесс запускается соответствующей комбинацией Cdk и циклина. Кроме инициации репликации, циклинзависимые киназы ингибируют начало повторной репликации участка ДНК, предотвращая формирование нового pre-RC. После репликации ДНК сестринские хроматиды плотно удерживаются друг с другом, вплоть до расхождения в митозе. Этот феномен, называемый когезией сестринских хроматид, осуществляет когезиновый комплекс протеинов.

Когезин содержит основной комплекс гетеродимеров, состоящий из двух протеинов семейства SMC (Structural Maintenance of Chromosomes): Smc1 и Smc3. SMC-протеины оказались очень консервативным семейством. У прокариот был обнаружен только один SMC-протеин, тогда как у эукариот их было найдено 6 (SMC1-SMC6). Вступая во взаимодействия с другими протеинами, они участвуют в самых разных процессах в хромосомах. SMC-протеины состоят из 1000-1500 аминокислот и имеют на N- и С-конце глобулярные домены. N-конец содержит мотив Walker A, С-конец - Walker B. Соединяясь вместе, они формируют сайт с АТФ азнойкаталитической активностью. Взаимодействие Smc1 и Smc3 происходит через петлевой домен. Этот димер через свои глобулярные домены связывается с протеином Scc1, который соединен с четвертой субъединицей когезина Scc3. Сформированный таким образом когезиновый комплекс связан либо с нереплицированной хроматидой (от телофазы до момента репликации ДНК), либо с сестринскими хроматидами (от момента репликации ДНК до разделения ДНК хроматид в митозе, когда протеолиз открывает кольцо, позволяя ДНК сестринских хроматид разойтись).

На рис. 4-15 и 4-16 (см. цв. вклейку) приведены гипотетические модели организации когезина и его связи с ДНК. Когезин принимает участие в работе контрольной точки, определяющей переход клетки в S-фазу. В ней происходит проверка целостности ДНК. Так, ее повреждение при облучении активирует ATM-киназу, которая фосфорилирует SMC1 в когезине, что приводит к формированию нового комплекса, отличающегося от когезина присутствием в нем протеинов NBS1, BLM и BRCA1. Последние связаны с ответом на повреждение ДНК (рис. 4-17, см. цв. вклейку). Фосфорилирование SMC1 в когезине - принципиальный момент для запуска механизма контрольной точки, которая задерживает репликацию ДНК до завершения репарации возникших повреждений.

Другой интригующий момент реорганизации хромосом в клеточном цикле - разделение материала сестринских хроматид и формирование типичных метафазных хромосом. Для этого необходимы освобождение сестринских хроматид от когезина и решение топологических проблем в локализации их ДНК. В профазе основная часть когезина удаляется его фосфорилированием Polo-подобной киназой, которое, вероятно, снижает аффинность когезина к ДНК. На хромосоме его остается около 5% с преимущественной локализацией в прицентромерном районе. Этот когезин участвует как в удержании вместе сестринских хроматид, так и в биполярной ориентации хромосом. После прикрепления всех кинетохор к веретену посредством деградации циклина В запускается переход к анафазе. Освобождение от остатков когезина происходит в результате расщепления сепаразой Scc1. До начала анафазы вследствие связи с секурином она остается неактивной (рис. 4-18, см. цв. вклейку).

Решение топологических проблем связано с компактизацией материала индивидуальных хроматид. Выяснение механизма этого процесса шло одновременно с изучением роли негистоновых протеинов в поддержании структурно-функциональной организации хромосомы. Хромосома приблизительно на треть состоит из нуклеиновых кислот, на треть - из гистонов и на треть - из негистоновых протеинов. Эксперименты по количественному удалению из хромосомы гистонов показали, что именно негистоновые протеины ответственны за структурную организацию митотических хромосом. Она представлена каркасом и отходящими от него петлями ДНК. Выделяют два основных компонента хромосомного каркаса, получивших название ScI- и ScII-протеины. ScI был идентифицирован как топоизомераза II, а ScII оказался членом семейства SMC-протеинов. Белки хромосомного каркаса - SMC2 и SMC4. Проведенные исследования показали, что функционально активен комплекс, включающий, кроме SMC2/SMC4, еще три протеина (CAP-D2, CAP-H, CAP-G), не относящиеся к семейству SMC. Он способен поддерживать конденсированное состояние хроматина и был назван конденсином (конденсином I). Позже у позвоночных был открыт второй комплекс конденсина (конденсин II). В его состав входят те же SMC2/SMC4, а также CAP-D3, CAP-H2 и CAP-G2. Гипотетическая модель организации конденсиновых комплексов приведена на рис. 4-18. Анализ взаимодействия конденсина с ДНК показал, что он вызывает ее суперспирализацию, а в присутствии топоизомеразы II формируются хиральные узелки. В настоящее время предложено несколько моделей взаимодействия конденсина с молекулами ДНК (см. рис. 4-18), суть которых заключается либо в суперспирализации ДНК, либо в формировании ее специфического сворачивания.

Детальный анализ локализации конденсина I и конденсина II показал, что в интерфазе первый локализуется преимущественно в цитоплазме, а второй - в ядре. Взаимодействие конденсина I с хромосомным материалом становится возможным только после разборки ядерной оболочки. Начиная с метафазы, комплексы конденсина I и II располагаются вдоль оси хромосом, вероятно, сменяя один другого. Хромосомным районом, в котором явно преобладает конденсин II, считают район центромеры. Недостаток конденсина приводит к нарушению структурно-функциональной организации кинетохора и, как следствие, к нарушениям расхождения хромосом. До настоящего времени широко распространено представление, что когезин связан с ДНК хромосом с телофазы до метафазы, обеспечивая когезию сестринских хроматид. С начала прометафазы он начинает вытеснять когезин, приводя к компактизации хроматина. Ранее считали, что сохранения связи его небольшого количества с ДНК сестринских хроматид, вплоть до метафазы, достаточно для удержания рядом в основном сформированных хроматид. Лишь после расщепления сепаразой Scc1 хроматиды оказывались полностью свободными и могли быть разведены в дочерние клетки. Открытие конденсина II заставляет частично пересмотреть эти представления. Он присутствует в интерфазном ядре и, возможно, участвует в частичной компактизации неактивного хроматина уже в интерфазе. В профазе количество конденсина II, связанного с хроматином, должно возрастать, что позволяет при фиксации клеток на этой стадии видеть неоднородно окрашенное ядро с многочисленными точечными вкраплениями более ярко окрашенного материала, а профазные хромосомы - с компактно расположенными G-позитивными суббэндами. После разборки ядерной оболочки хроматин становится доступным конденсину I, и в результате его взаимодействия с ДНК начинаются активное вытеснение когезина и компактизация хроматина. Последняя - следствие изменения конформации ДНК в результате суперспирализации и формирования хиральных узелков. Возможно, конденсины имеют большее сродство к АТ-обогащенной ДНК, что определяет порядок компактизации ДНК элементарных структурных элементов хромосомы и последовательное формирование прометафазных, ранних метафазных и поздних метафазных хромосом, отличающихся по степени компактизации их индивидуальных участков. К сожалению, динамика связи конденсинов с различными районами хромосом пока не изучена, и вышеизложенный механизм формирования метафазной хромосомы остается гипотетическим. Результаты некоторых исследований указывают, что конденсины необходимы для поддержания конформации компактного хроматина, но сама компактизация может происходить и без их участия. Насколько это справедливо и существуют ли другие факторы, необходимые для перехода интерфазной хромосомы в метафазную, предстоит выяснить в будущем.

Хромосомы IN VIVO, IN VITRO и IN SILICO

Отдельный интерес представляет сравнение результатов исследований хромосом непосредственно в живой клетке, предварительно фиксированных и хромосом in silico. Характерно, что во всех типах исследований хромосому удается представить в виде набора структурно-функциональных единиц. Теломерные, центромерные и районы ядрышкового организатора уже были рассмотрены выше. В настоящем разделе будут подробнее проанализированы эухроматиновые районы хромосом. Важный момент в формировании представлений о принципах организации хромосом человека - определение ее базовых элементов. При попытках установления размера такого элемента учитывали самые разные параметры: дифференциальное окрашивание хромосомных районов, время их репликации, соотношение АТ- и ГЦ-пар, обогащение различными типами повторов, концентрацию и состав генов, а также организацию хроматина. В результате исследований было показано, что размер такой единицы близок к млн п.н., а хромосому можно представить как их последовательность. В ряде работ по изучению структурно-функциональной организации хромосомы для этого базового элемента используют термин «1 млн п.н. субструктура». Эти элементы имеют общую регуляцию репликации, степень конденсации хроматина и, как следствие, некий общий уровень организации, определяющий возможности транскрипционной активности генов, входящих в их состав.

Секвенирование генома человека открыло возможности контекстного анализа последовательности нуклеотидов в различных районах хромосом. Казалось бы, надо только взять известную последовательность нуклеотидов, определить границы, разделяющие ДНК R- и G-бэндов, и in silico будет получен вариант чередования R- и G-бэндов в анализируемой хромосоме. Исследования были проведены, и полученные данные наглядно показали, что хромосома, построенная in silico, при использовании простых критериев обогащенности ДНК ГЦ-парами имеет очень мало общего с хромосомой in vitro. На рис. 4-19 (см. цв. вклейку) приведены результаты такого анализа, выполненного для хромосом человека 21 и 22.

Несмотря на тенденции обогащения R-бэндов ГЦ-парами и короткими диспергированными повторами, представленные данные едва ли можно считать убедительным подтверждением распространенных представлений об АТ/ГЦ-составе ДНК R- и G-бэндов. Такое несоответствие можно объяснить несколькими причинами. Одна из них заключается в далеко не полном соответствии R- и G-бэндов на схеме хромосомы и данных по секвенированию ДНК. Тем не менее оказалось, что даже этой информации достаточно, чтобы на основании результатов секвенирования построить схему расположения R- и G-бэндов внутри хромосомы. Для этого потребовалось правильно сформулировать критерии для определения ГЦ-богатых участков хромосом. Попытки определить пограничное значение процента ГЦ-пар для всех R- и G-бэндов хромосомы не дали положительного результата.

Схемы R- и G-бэндов, полученные на основании анализа процента ГЦ-пар, совпали с таковыми из номенклатуры хромосом человека, когда обогащенность ГЦ-парами оценивали относительно соседних районов. Процент ГЦ-пар определяли для участка хромосомы размером 2,5 млн п.н. и сравнивали с относительным числом ГЦ-пар в участке размером 9,3 млн п.н., внутри которого он находится. На рис. 4-19 черная линия показывает процент ГЦ-пар в участке 2,5 млн п.н., а красная линия - в участке 9,3 млн п.н. При построении графиков центр этих районов перемещали с шагом 10 т.п.н. Районы, в которых процент ГЦ-пар в участке 2,5 млн п.н. был выше, чем в участках размером 9,3 млн п.н., считали ГЦ-богатыми и относили к R-бэндам. Районы, в которых процент ГЦ-пар для участка 2,5 млн п.н. был ниже, чем для участков размером 9,3 Мb, считали ГЦ-бедными и относили к G-бэндам. В этом случае in silico окраска хромосом совпадала со схемами, основанными на результатах дифференциального окрашивания (см. рис. 4-19). Вероятно, необходимо объяснить выбор исследователями районов размерами 2,5 млн п.н. и 9,3 млн п.н. Он объясняется достаточно просто: сравнение окраски хромосом in silico проводили с идиограммой хромосом человека, содержащей 750 бэндов. Таким образом, средний размер бэнда близок к 4 МЬ. В этом случае анализ участков размером 2,5 млн п.н. должен давать достаточно хорошее представление о среднем значении процента ГЦ-пар в отдельных бэндах, а участок размером 9,3 млн п.н. должен включать, кроме этого бэнда, либо соседний бэнд, либо большие участки двух соседних бэндов. Такой анализ, по мнению авторов, позволяет провести сравнение ГЦ-состава в соседних бэндах. Вывод: важна не просто степень обогащения бэнда ГЦ-парами, а обогащение относительно соседних районов. Авторы полагают, что их данные достаточно хорошо согласуются с очень популярной гипотезой организации метафазной хромосомы, предложенной Saitoh и Laemmli в 1994 г.

В 1994 г. с помощью специфического окрашивания им удалось обнаружить последовательно расположенные матрикс/скэфолд-ассоциированные районы (MAR/SAR) в метафазной хромосоме индийского мунджака. В результате такой обработки было показано, что существует чередование районов, в которых MAR/ SAR формируют спираль и расположены почти параллельно оси хромосомы. На основании этого была предложена модель, в которой G-бэнды представляют районы хромосом с плотно упакованным хроматином, расположением MAR/SAR по спирали и уменьшенным размером петель 30 нм хроматина (рис. 4-20), в то время как в R-бэндах петли хроматина больше по размеру, а MAR/SAR расположены в линию практически параллельно оси хромосомы. Таким образом, плотность материала хромосомы в G-бэндах выше, чем в R-бэндах.

Известно, что MAR/SAR, несмотря на отсутствие конкретного мотива в их последовательностях, обогащены АТ-парами (около 70%), поэтому можно ожидать существования связи между ГЦ/АТ-составом ДНК хромосомных районов и обнаружением G- и R-бэндов в митотической хромосоме. Многие факты, касающиеся организации хромосомы, согласуются с этой гипотезой, рассматриваемой в качестве наиболее правдоподобной в большинстве учебников и монографий. К сожалению, всю сложную картину структурно-функциональной организации хромосомы и формирования ее имиджа на цитологическом препарате едва ли возможно объяснить в рамках таких простых представлений. Даже в самой работе Saitoh и Laemmli (1994) участки хромосомы индийского мунджака, в которых MAR/SAR располагались почти параллельно оси хромосомы и были рассмотрены в качестве R-бэндов, вероятно, соответствовали местам эволюционных слияний предковых хромосом, которые привели к образованию огромных хромосом у индийского мунджака.

Эффективность анализа хромосомных районов in silico во многом зависит от того, насколько точно можно отнести определенные последовательности нуклеотидов к конкретным элементам структурно-функциональной организации хромосомы. Многочисленные данные указывают на то, что размер базового элемента хромосомы близок к 1 млн п.н., в то время как точность локализации конкретного района или события на препаратах митотических хромосом значительно превышает эту величину. Тем не менее результаты некоторых исследований позволяют провести детальное сравнение индивидуальных соседних бэндов и пограничного района. Это можно сделать на примере района хромосомы, прилежащего к гену NF1. На рис. 4-21 представлены результаты исследования Клаудии Шмегнер и соавт., показывающие процент ГЦ-пар на участке хромосомы человека размером 500 т.п.н., в состав которого входит ген NF1. Этот район хромосом человека представляет часть G-бэнда, переходную зону и часть R-бэнда. Часть G-бэнда соответствует ГЦ обедненной ДНК, а часть R-бэнда - ГЦ богатой ДНК, а переходная зона размещается в участке размером 5 т.п.н. Доказательство того, что переход от ГЦ бедной к ГЦ богатой ДНК служит границей между G- и R-бэндами, было получено в тщательно выполненных экспериментах, показавших, что именно в этом месте происходит задержка репликации ДНК. Действительно, можно считать доказанным, что по крайней мере некоторые соседние G- и R-бэнды отличаются по содержанию АТ-и ГЦ-пар. Исследование Клаудии Шмегнер и соавт. наглядно показало, что в настоящее время можно провести корректное сравнение структурно-функциональной организации конкретного выбранного района на всех уровнях - in vivo, in vitro и in silico. К сожалению, такой район составляет менее 1/10 000 гаплоидного генома человека и около 1/100 самой маленькой хромосомы. Именно поэтому еще предстоит пройти большой путь от гипотез, описывающих структурно-функциональную организацию хромосомы, до надежной теории, без которой секвенирование даже 100 000 персональных геномов человека не даст завершенной картины и оставит множество острых вопросов, стоящих перед медицинской генетикой, открытыми.

Список литературы

Митоз - основной способ репродукции клеток, обеспечивающий возможность осуществления ряда ключевых процессов формирования и функционирования организма: морфогенез, физиологическую и репаративную регенерацию и др. Современные представления о морфологии, цитофизиологии, цитохимии и патологии митоза остаются неполными. Между последовательными делениями клеток существует период интерфазы, характеризующийся различными процессами, регулирующими развитие, дифференцировку, выполнение специфических (в зависимости от типа клеток) функций. Длительность процесса митоза для каждого типа клеток - своя, но является относительно короткой (от 30 мин до 3 ч). В интерфазе протекает синтез - репликация ДНК, механизм которой заключается в синтезе новых, дочерних полинуклеотидных молекул на существующих матрицах. Жизненный цикл клетки разделяют на несколько периодов: митоз (М), пресинтетический период (G1), период синтеза ДНК (S), постсинтетический период (G2), период G0 (не всеми принимаемый). В постсинтетический период G2 может протекать синтез общих белков и РНК. Подчеркивают, что продолжительность жизненного цикла и периодов клеточного цикла в клетках и тканях разного типа (в том числе в половых, опухолевых) различны и зависят от ряда внутритканевых и внутриклеточных параметров. Универсальность митоза обеспечивает формирование генетически равноценных клеток и сохраняет преемственность наследственных структур - хромосом в ряду клеточных поколений.

Стадия профазы митоза характеризуется конденсацией хромосом (после синтеза в них ДНК) и формированием митотического аппарата в форме непрерывных и хромосомных волокон веретена деления, локализованных на них центриолей (клеточных центрах), поляризующих (соединяющих) оба полюса, исчезновением оболочки ядра, ядрышка. Между двумя разошедшимися к полюсам центриолями формируются непрерывные волокна веретена деления; хромосомные волокна веретена деления соединяют центриоль одного из полюсов с центромерой одной из хроматид хромосомы. Хромосомы, состоящие из двух сестринских хроматид, соединенных в области центромеры (кинетохора), перемещаются в область экватора клетки (процесс метакинеза, в прометафазе), и наступает стадия метафазы. Хромосомы прикрепляются в области центромер к хромосомным волокнам веретена деления (Алов, 1972). В метафазе по экваториальной плоскости веретена деления (ядра) клетки формируется метафазная пластинка хромосом (на равном расстоянии от обоих полюсов) вследствие их перемещения и формирования экваториальной пластинки хромосом, после чего делящаяся клетка переходит на стадию анафазы митоза. В анафазе в хромосомах вначале разъединяются центромеры (кинетохоры), затем - сестринские хроматиды, и каждая из них перемещается (в норме - практически синхронно для всех хромосом) с помощью хромосомных волокон веретена деления, прикрепленного к центромерам, к противоположному полюсу митотического аппарата клетки. При достижении полюса хромосомы окружаются ядерной оболочкой (т.е. в области полюсов формируются дочерние ядра), митотический аппарат разрушается, и вокруг дочерних реконструирующихся ядер концентрируется цитоплазма, которая затем окружается клеточной оболочкой. То есть наступает телофаза, происходят реконструкция ядер, разделение цитоплазмы (цитотомия, между двумя дочерними клетками), установление интеркинеза в ядрах. Интеркинез характеризуется декон-денсацией хромосом, реконструкцией ядрышка и ядерной мембраны, реорганизацией веретена деления, цитотомией.

В растительных клетках митоз в среднем протекает 2-3 ч, в клетках животных - 30-60 мин, в дробящихся зиготах - 10-40 мин. Темп митотического деления зависит как от внутренних, так и от внешних (для делящейся клетки) факторов окружающей среды (Алов, 1972). Таким образом, в митозе редупликация ДНК хромосом и равное распределение хроматид между дочерними клетками обеспечивают сохранение преемственности генетических структур и генетической информации в дочерних клетках в ряду клеточных поколений. Митоз сопровождается циклическими изменениями как структур ядра, так и структур цитоплазмы: митохондрий, элементов эндоплазматического сети, рибосом и др.

Патология митоза

Нарушение процесса митоза приводит к нарушению распределения хромосом между дочерними клетками и тем самым - к развитию клеток с несбалансированными кариотипами, т.е. к формированию хромосомных мутаций.

Формы патологии митоза (Алов, 1972).

Процесс митоза дифференцирующихся гоноцитов обеспечивает формирование пула оогониев и сперматогониев, после чего гаметы переходят на этапы дифференцировки через многостадийный и длительный процесс мейотического деления, происходящего только в ПК.

Мейоз и его генетическое значение

Мейоз (греч. μείωσις - уменьшение), или редукционное деление половой клетки, - деление ядра эукариотической клетки с уменьшением числа хромосом в два раза. При развитии ПК число хромосом в зрелых гаметах уменьшается наполовину, т. е. у человека и сперматозоид, и ооцит имеют по 23 хромосомы, и этот важный биологический процесс происходит в два этапа: мейоз I и мейоз II (редукционный и эквационный этапы мейоза), с короткой интерфазой между ними.

Профаза I мейоза - профаза первого деления мейоза - длительная и сложная, состоит из 6 стадий при сперматогенезе и 7 стадий - при оогенезе. Прелептотена профазы I мейоза. Прелептотенная конденсация хромосом заключается в переходе хромосом в состояние их полной конденсации в плотные (компактные) глыбки (в прохромосомы, по количеству, равному диплоидному числу хромосом для вида).

Обсуждают время последней, домейотической репликации ПК. Одни исследователи считают, что синтез ДНК происходит до этой стадии конденсации хромосом. Другие ссылаются на доказательства прохождения премейотического, последнего синтеза ДНК (в гаметах) на стадии после последующей деконденсации прохромосом, отмеченной в женских ПК (Гапиенко, Маркелова, 1976) и не наблюдаемых (стадия деконденсации прохромосом) в сперматогенезе.

Лептотена профазы I мейоза - развивается конденсация ДНК хроматина с образованием хромосом в виде тонких нитей (хромосомы укорачиваются).

Важнейшими событиями лептотены являются следующие.

Зиготена профазы I мейоза - происходит постепенный синапсис (конъюгация, соединение) гомологичных родительских хромосом, между которыми формируется уникальная трехполосная структура - синаптонемный комплекс (СК). При этом осевые элементы хромосом становятся боковыми элементами СК, которые соединяются с помощью поперечных структур наподобие застежки «молния».

СК представляет собой сложную белковую структуру, которая образуется в ПК в процессе мейоза I у эукариот и которая необходима для синапсиса и генетической рекомбинации между гомологичными хромосомами (рис. 5-1, см. цв. вклейку). Боковые элементы СК образуются в лептотене, а центральный элемент - в зиготене, деградация СК происходит в диплотене. СК можно увидеть с помощью светового микроскопа с использованием окрашивания серебром или с помощью методов иммунофлуоресценции, которые маркируют белки SYCP3 и SYCP2, либо с помощью электронной микроскопии. СК имеет вид трехкомпонентного комплекса, состоящего из двух боковых (латеральных) элементов и центрального элемента, располагающегося между ними на всем протяжении. Боковые элементы в основном состоят из белка SYCP3 и в меньшей степени из белка SYCP2, а центральный элемент - из SYCP1. Центральный регион, располагающийся между двумя боковыми элементами, содержит «поперечные нити» и образован в основном белком SYCP1. Гомологичные хромосомы прикрепляются к боковым элементам с помощью ассоциированных с латеральными элементами последовательностей повторов (LEARS). Концы латеральных элементов прикреплены к ядерной оболочке адгезионной пластиной.

Петли конъюгирующих гомологичных хромосом связаны с латеральными (боковыми) элементами СК, соединенными поперечными элементами наподобие «застежек». Центральный регион располагается между двумя боковыми элементами. Между латеральными элементами продольно располагается центральный (осевой) элемент СК. Рекомбинационный узелок - участок рекомбинации (на рис. 5-1 указан желтым овалом).

Пары хромосом, соединенные с помощью СК, называются мейотическими бивалентами. На стадии зиготены происходит постепенная репарация DSBs ДНК.

Пахитена профазы I мейоза - самая длительная стадия. К началу пахитены завершаются репарация DSBs ДНК и синапсис гомологичных хромосом с образованием бивалентов. Только после этого начинается активная транскрипция хроматина аутосом. В ядрах сперматоцитов инактивированными остаются частично асинаптированные половые (Х и Y) хромосомы, которые формируют «половое тельце». В каждом биваленте формируются хиазмы. В них происходит кроссинговер - обмен участками между гомологичными родительскими хромосомами с последующей репарацией разрывов. Кроссинговер не только обеспечивает генетическое разнообразие потомства. В точках хиазм гомологичные хромосомы остаются связанными вплоть до их расхождения на стадии анафазы I мейоза. Таким образом, именно хиазмы обеспечивают правильное расхождение хромосом в дочерние клетки.

Диплотена профазы I мейоза - происходит частичная деконденсация хромосом, при этом часть генома может работать, что проявляется процессом транскрипции (образование РНК), гомологичные хромосомы остаются соединенными между собой. На стадии диплотены функционирует чекпойнт (контрольно-пропускной пункт), контролирующий сложный, многоступенчатый процесс десинапсиса гомологичных хромосом. Это наименее исследованный контрольно-пропускной пункт мейоза.

Диктиотена профазы I мейоза характеризуется как функционально активная стадия, с неравномерно деконденсированными хромосомами типа ламповых щеток.

Кариосферогенез. Во время развития и созревания ооцита на стадии диплоте-ны (диктиотены) перед диакинезом в ооците происходит процесс формирования кариосферы - отсоединение от ядерной оболочки и конденсация хромосом, их объединение и локализация компактно вокруг области ядрышка. Образование кариосферы (хроматиновой массы) впервые было выявлено и описано в начале ХХ в. Активная конденсация хроматина приводит к прекращению синтеза РНК, к ранней реорганизации экстрахромосомного материала и морфологически оформленных ядерных телец, к активному синтезу белков. Анализ синтеза белка и РНК в ооцитах на этапе кариосферы из крупных полостных фолликулов человека подтверждает гетерогенность их популяции и свидетельствует о том, что в здоровых ооцитах на этом этапе их развития продолжает включаться 3Н-уридин, и метка накапливается в области кариосферы. Предполагают, что именно в оогенезе осуществляется накопление значительной морфогенетической информации и макромолекул (их депонирование), необходимых для развития будущего эмбриона, формируется белоксинтезирующая система, функционирующая на ранних стадиях эмбриогенеза, создается ооплазматическая сегрегация, лежащая в основе первичной дифференцировки клеток (Боголюбов, 2008; Почукалина, 1998).

Диакинез - ДНК вновь максимально конденсируется, синтетические процессы прекращаются, растворяется ядерная оболочка; гомологичные хромосомы остаются соединенными между собой в точках хиазм. К концу профазы I мейоза центриоли разделяются и мигрируют к противоположным полюсам клетки, формируются непрерывные нити (микротрубочки) веретена деления, исчезают ядерная мембрана и ядрышки.

Метафаза I мейоза - бивалентные хромосомы выстраиваются по экватору клетки, формируя экваториальную метафазную пластинку хромосом.

Анафаза I мейоза - микротрубочки веретена деления сокращаются, биваленты разделяются, и хромосомы расходятся к полюсам (т.е. происходит редукционное деление мейоза). Важно отметить, что из-за конъюгации гомологичных родительских хромосом в зиготене к полюсам расходятся целые хромосомы, состоящие из двух хроматид каждая, а не отдельные хроматиды, как в митозе. То есть в процессе анафазы I мейоза каждая материнская и отцовская хромосома имеют равновероятные возможности отойти к тому или иному полюсу. Поэтому первое деление мейоза называется редукционным, в его результате к каждому полюсу направляется половина хромосомного набора (1n), каждая хромосома при этом состоит из двух хроматид (1n, 2с).

Телофаза I мейоза - хромосомы деконденсируются, формируется ядерная оболочка, развиваются цитотомия, цитокинез.

Второе деление мейоза следует непосредственно за первым, без выраженной интерфазы: S-период отсутствует, т.е. перед вторым делением мейоза не происходит репликации ДНК.

Профаза II мейоза - во время этой короткой фазы происходит конденсация хромосом, клеточный центр (центриоль) делится, и продукты его деления расходятся к полюсам ядра, разрушается ядерная оболочка, формируется веретено деления.

Метафаза II мейоза - унивалентные хромосомы (состоящие из двух хроматид каждая) располагаются на «экваторе» (на равном расстоянии от полюсов ядра) в одной плоскости, образуя метафазную пластинку. Поэтому второе деление мейоза называют эквационным.

Анафаза II мейоза - униваленты делятся, и хроматиды расходятся к противоположным полюсам.

Телофаза II мейоза - хромосомы деконденсируются, появляется ядерная оболочка, развиваются цитотомия, цитокинез.

Расположение бивалентов по экваториальной пластинке веретена деления в метафазе I и хромосом в метафазе II определяется случайным образом. Последующее расхождение хромосом в анафазе (к противоположным полюсам) приводит к образованию новых комбинаций аллелей в гаметах.

В оогенезе (у многоклеточных организмов), при развитии яйцеклеток, на стадии телофазы, в первом и втором делениях мейоза распределение объема цитоплазмы между двумя формирующимися дочерними клетками крайне неравномерное. В результате формируется одна гаплоидная яйцеклетка (с большим объемом ооплазмы) и два гаплоидных, так называемых редукционных (полярных) тельца (с малым количеством цитоплазмы), абортивные дериваты первого и второго делений мейоза, дегенерирующие. В сперматогенезе после двух последовательных делений мейоза из одного сперматоцита формируются 4 гаплоидные сперматиды, равные по объему.

В мейозе, как и в митозе, хромосомные белки - когезины и конденсины принимают участие в организации ДНК в хроматине и хромосомах. В митотически делящихся клетках когезины соединяют сестринские хроматиды и удерживают их до расхождения в анафазе. Комплекс когезинов присутствует в хромосомах также и при мейозе. У млекопитающих одними из когезинов являются белки: REC8, STAG3, SMC1-b. Они участвуют в формировании осевых элементов хромосом, а на стадиях зиготены и пахитены профазы 1 мейоза на них агрегируют мажорные белки, участвующие в превращении осевых элементов лептотенных хромосом в латеральные элементы СК. Оси хромосом, как застежка «молния», соединяются попарно с помощью белка SCP1. Субмикроскопические нити, состоящие из этого белка, протягиваются между ними. В «зрелом» СК на стадии пахитены спаренные оси представляют собой латеральные элементы СК. Поперечные белковые нити представляют собой противоположно направленные «полумостики» между латеральными элементами СК и выполняют роль зубцов застежки «молния». Между двумя латеральными элементами СК формируется центральный элемент СК. К латеральным элементам СК крепятся элементарные фибриллы хроматина (состоящие из ДНК, гистонов и других хромосомных белков) - латеральные петли хроматина (в действительности - хроматиды гомологичных хромосом). Т.е. СК выравнивает параллельно расположенные гомологичные родительские хромосомы и сохраняет между ними центральное пространство СК, где между гомологами происходят гомологичная рекомбинация ДНК, формирование хиазм. Ферменты вызывают двунитевые разрывы ДНК в горячих точках рекомбинации. Они локализуются в ранних мейотических узелках в центральном пространстве СК. Иногда выявляют отсутствие формирования СК в ядре сперматоцитов или наличие редких коротких фрагментов СК, что приводит в анеуплоидии в гаметах и вызывает блок сперматогенеза.

Генетическое значение мейоза. 1. У эукариот в результате редукционного деления ПК получают гаплоидный (n) набор хромосом. В результате оплодотворения (после слияния ПК) образуется зигота, несущая диплоидный набор хромосом (2n), свойственный особям данного вида. 2. В процессе анафазы I мейоза каждая материнская и отцовская хромосома имеют равновероятные возможности отойти к тому или иному полюсу. Вероятность того, что к одному полюсу отойдут материнские хромосомы, а к другому только отцовские - мала. В результате образовавшиеся гаметы содержат новое сочетание генов по сравнению с гаметами, давшими начало данному организму. 3. Процесс кроссинговера при мейозе доводит перекомбинацию генов в образующихся гаметах практически до бесконечности. 4. Мейоз выполняет ведущую роль в репарации (восстановлении) повреждений двунитевой ДНК не только после кроссинговера, но и вообще в данной гамете, имеющей какие-либо нарушения в ее ДНК до вступления клетки в мейоз (т.е. осуществляется защитная роль мейоза, обеспечивающего стабильность генома).

Нарушение фертильности вследствие мейотических мутаций

Помимо прочих причин и факторов, нарушение гаметогенеза, репродуктивной функции и фертильности у мужчин и женщин может быть вызвано мутациями в генах, контролирующих мейоз, генетическую рекомбинацию, созревание ПК, ранние этапы развития эмбриона.

К настоящему времени описано более сотни аутосомных генов, контролирующих эти процессы, необходимые для прохождения мейоза и мейотической рекомбинации (табл. 5-1). Их патогенные варианты могут приводить к нарушению созревания ПК, снижать фертильностный потенциал гамет, приводить к бесплодию, прекращению развития беременности на ранних этапах.

Белковые продукты этих генов являются составной частью СК либо задействованы в процессах конъюгации и образования пар гомологичных хромосом, их синапсиса, возникновения и репарации двуцепочечных разрывов ДНК (ДЦР) и других процессов, необходимых для мейотической рекомбинации и сегрегации хромосом. Другие гены необходимы для формирования различных цитоструктур мужских и женских гамет, для оплодотворения или реализации ранних этапов эмбрионального развития (табл. 5-1). Следует отметить, что не во всех из этих генов у человека выявлены патогенные варианты. Мутации ряда генов, контролирующих мейоз и гомологичную рекомбинацию (H2AX, SPO11, BOULE), выявлены и описаны у мышей и не обнаружены у человека.

Мутации генов SYCP3 и SYCE1 были выявлены у человека. Они имеют низкую частоту и являются редкой генетической причиной бесплодия. Нарушения фертильности, вызванные патогенными вариантами гена SYCP3, имеют аутосомно-доминантный тип наследования, возможно, и аутосомно-рецессивный, а мутации гена SYCE1, ведущие к потере его функции, характеризуются аутосомно-рецессивным типом наследования. У мужчин мутации генов SYCP3 и SYCE1 приводят к блоку сперматогенеза в профазе I мейоза (Spermatogenic failure 4, SPGF4; OMIM 270960, и Spermatogenic failure 15; SPGF15, OMIM 616950 соответственно) и, как следствие, к необструктивной азооспермии и бесплодию. Мутации в гене SYCP3 обнаружены у пациенток с привычным невынашиванием в I триместре беременности (Pregnancy loss 4 - RPRGL4). Описаны делеция 4 п.н. в интроне 7 (-16delACTT), которая привела к пропуску экзона 8, а также замена тимина на цитозин в положении 657 (c.657T/C), являющегося последним нуклеотидом экзона 8, которая привела к нарушению сплайсинга и сохранению в зрелой мРНК интрона 8. Обе мутации приводили к образованию аномального СК и, по-видимому, нарушению сегрегации хромосом в ооцитах, увеличивая частоту анеуплоидии.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК

Первичные половые клетки (ППК) у млекопитающих располагаются среди клеток проксимального участка эпибласта (эмбриональной эктодермы). Высказано несколько гипотез об источниках происхождения ППК. ППК - единственный тип клеток организма, через которые сохраняется и передается генетическая и эпигенетическая информация последующим поколениям, обеспечивающая их развитие и функционирование. С конца 3-й недели развития эмбриона человека ППК начинают миграцию к половым валикам (закладкам гонад) пассивно по кровеносным сосудам или активную миграцию с помощью хемотаксиса. При заселении половых валиков в ППК начинают экспрессироваться новые гены, специфичные для гамет. В период размножения (митозом) ПК, при заселении ими половых валиков, ПК определяют как гоноциты или гонии. Прекратившие делиться митозом женские ПК из оогониев переходят в ооциты 1-го порядка, они проходят период роста (поступление в клетку питательных веществ извне, от фолликулярных клеток, путем пиноцитоза), повышается синтетическая активность в ооците. Женские ПК проходят значительную часть дифференцировки через стадии профазы I мейоза в антенатальный период. У эмбрионов мужского пола митозы гоноцитов блокируются геном SCP3. Дифференцировку по стадиям профазы I мейоза и дальнейшие этапы развития мужские гаметы проходят при наступлении половой зрелости.

Ооцит. Примерно через сутки после подъема в крови женщины уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ) происходят набухание и разрыв мембраны ядра ооцита, возобновляется мейоз, после прохождения метафазы I и анафазы I мейоза, в телофазе I мейоза отделяется 1-ое полярное тельце. При овуляции ооцит на стадии метафазы II, окруженный клетками «лучистого венца» из гранулезных (фолликулярных) клеток яйценосного бугорка, попадает в ампулярную часть яйцевода, где обычно происходит оплодотворение. Оболочки овулировавшей яйцеклетки представлены блестящей (прозрачной) оболочкой и плазматической (вителлиновой) мембраной, прилегающей к ооплазме. Блестящая оболочка имеет преимущественно мукополисахаридную природу. Она является продуктом и ооцита, и его фолликулярных клеток. Блестящая оболочка снабжена специфическими белками - гликопротеинами ZP1, ZP2, ZP3, ответственными за видовую специфичность оплодотворения.

У большинства видов млекопитающих ядро спермия после его проникновения в ооцит остается в ооплазме неизмененным, пока ооцит не достигнет дефинитивных размеров, не завершит стадий профазы I мейоза и не перейдет ко 2-му делению мейоза. Лишь в конце 2-го деления мейоза ооцита (яйцеклетки) ядро спермия преобразуется в мужской пронуклеус. То есть мейоз завершается после активации яйцеклетки спермием, снимающим блок (арест) мейоза.

Сперматозоид. В передней части головки зрелого сперматозоида локализована акросома, пузыревидная структура (преобразованная из лизосомы), содержащая ферменты, способствующие лизису оболочек яйцеклетки, проникновению в ее цитоплазму и внесению таким образом генома и центриоли (центросомы) спермия в яйцеклетку. Для ее оплодотворения необходимо прежде всего успешное проникновение спермия в яйцеклетку, чему способствует уникальная специализация мужских ПК, в том числе - протаминизация.

Оплодотворение. В сперматозоиде устанавливается способность к оплодотворению после его пребывания в течение нескольких часов в женских половых путях. Во время продвижения спермия по яйцеводу происходит удаление с его наружной плазматической мембраны защитных белков, мукополисахаридов (и фактора декапацитации) и холестерина. В результате реакции капацитации изменяется электрический заряд его наружной мембраны, возрастают потребление кислорода и подвижность спермия. Отмечают, что in vivo места оплодотворения в яйцеводе достигают несколько спермиев. Допускают, что спермии сохраняют способность к оплодотворению от нескольких дней до 1 нед. Главными биологическими барьерами на пути проникновения спермия в овулирующую яйцеклетку являются клетки: лучистого венца (corona radiata), блестящей (zona pellucida) и плазматической (вителлиновой) оболочек (оолеммы) яйцеклетки. Проникновение через клетки лучистого венца осуществляется при активном передвижении спермия и вследствие растворения и разжижения межклеточного мукополисахаридного матрикса гиалуронидазой, выделяемой акросомами погибших спермиев. Пройдя через слой клеток лучистого венца, спермий вступает в контакт с поверхностью блестящей оболочки. Происходит акросомная реакция: в результате разрушения наружной мембраны акросомы спермия освобождается состав литических ферментов (гиалуронидаза, акрозин, нейраминидаза), обеспечивающих проникновение спермия через блестящую оболочку - наиболее трудный естественный барьер, требующий для проникновения через него наличия интакт-ной нормально сформированной акросомы. Примерно через 10-15 мин после этого значимого процесса происходит контакт постакросомного участка спермия с микрофиламентами вителлиновой оболочки яйцеклетки. Путем пиноцитоза, без разрушения целостности наружной мембраны яйцеклетки, спермий погружается в ооплазму. Присоединение (контакт) спермия к плазматической мембране сопровождается ответной важной реакцией яйцеклетки - кортикальной реакцией, или реакцией активации, распространяющейся по поверхности яйцеклетки от места проникновения спермия. Начало этой реакции индуцирует локальное повышение (нарастание) концентрации ионов Са²⁺ , стимулирующих распад локализованных в кортикальном слое яйцеклетки лизосомоподобных структур - кортикальных гранул, ферменты которых (протеиназы, пероксидазы, нейраминидазы) достигают вначале плазматической, затем - блестящей оболочки. Развивается сокращение кортикального слоя ооплазмы, что приводит к формированию перивителлинового пространства между блестящей и плазматической оболочками. В самой блестящей оболочке происходит разрушение рецепторных гликопротеинов, что делает невозможным контакт и проникновение в яйцеклетку других спермиев (т.е. функционирует блок полиспермии). Реакция активации (кортикальная реакция) приводит к снятию блока мейоза, завершению 2-го деления созревания (мейоза) яйцеклетки и выделению в перивителлиновое пространство 2-го полярного тельца. Головка спермия в ооплазме и гаплоидный набор хромосом яйцеклетки преобразуются соответственно в мужской и женский пронуклеусы. Оплодотворение, не превышающее 24 ч, завершается. Начинается развитие нового организма.

Дофолликулярный этап оогенеза у человека и млекопитающих

Хроматин ПК на разных стадиях профазы I мейоза представлен различной структурой - от крайней степени конденсации хроматина (в прелептотене) до наиболее деконденсированной формы. Такие изменения обеспечиваются посттрансляционными модификациями гистонов, энергозависимыми процессами ремоделирования хроматина, мобилизующими или изменяющими структуру нуклеосом, динамическими вставками новых гистонов в нуклеосомы и выходом из них, химическими модификациями ДНК и гистонов (ацетилирование, убиквитинилирование, фосфорилирование, сумоилирование и др.). Среди модификаций особо выделяют, вследствие их высокой частоты в гаметогенезе, метилирование ДНК, направляющую роль малых некодирующих РНК. Среди факторов контроля гаметогенеза, репродуктивной системы в целом важную роль играют эпигенетические механизмы регуляции. При этом разные эпигенетические механизмы работают во взаимодействии. Эпигенетические механизмы регулируют дифференцировку клеток, многие ключевые функции, обеспечивающие стабильность генома, наследуемость изменений в генной экспрессии. К ним относят: участие в инициации репликации ДНК, репарации и рекомбинации ДНК, защите теломер хромосом, перемещении хромосом (с помощью центромер) в митозе и мейозе, сегрегации гомологичных хромосом в мейозе, действие некодирующих РНК и др. Самые ранние предшественники ПК возникают и обособляются (в эпибласте) в результате получения сигнальных молекул из клеток экстраэмбриональных линий, в том числе - клеток будущей плаценты. Развитие ПК регулируется генетически, определяя их эпигенетическую программу таким образом, что генные продукты, необходимые соматическим клеткам, репрессированы в гаметах. Репрессия соматической программы развития генов Blimp является основной особенностью специализации ППК. Геномный импринтинг - эпигенетический процесс, дифференциально маркирующий в гаметогенезе материнские и/или отцовские гены (в геноме организма), что обусловливает моноаллельную экспрессию импринтированного гена на определенных этапах онтогенеза. Многие импринтированные гены вовлечены в регуляцию развития эмбриона или плаценты. Одним из механизмов импринтирования (репрессии) аллелей является метилирование ДНК по цитозиновым основаниям в СрG-динуклеотидных регуляторных элементах гена, приводящее (как правило, но не всегда) к подавлению проявления аллеля. Эти дифференциально метилированные (импринтированные) гены регулируются через последовательности ДНК, называемые «регионы контроля импринтинга». Их метилирование стирается в ПК развивающегося эмбриона при заселении ими половых валиков в раннем эмбриогенезе и вновь устанавливается в гаметах (для разных генов в разные сроки онтогенеза), согласно полу развивающегося эмбриона. Образцы метилирования цитозина поддерживаются при делении клеток с помощью ДНК метилтрансферазы (DNMT-1); установление метилирования de novo контролируется белками DNMt3a, DNMt3b, DNMt3L.

Оогонии, их пролиферативная активность. Прекратившие делиться митозом женские ПК, оогонии, в яичнике представляют ооциты 1-го порядка (рис. 5-2, см, цв. вклейку, табл. 5-2). Некоторые исследователи по ультраструктурным и гистохимическим характеристикам - наличию или отсутствию гликогена и активности кислой фосфатазы - допускали сосуществование в половой железе, по крайней мере до 10-12 нед внутриутробного развития плодов человека, одновременно и гоноцитов, и гониев. В исследовании ранних стадий развития женских ПК человека показано, что гоноциты, в отличие от разных типов соматических клеток человека, имеют деконденсированный хроматин без хромоцентров и инактивированного полового хроматина. После прохождения женских ПК через покровный эпителий в половые валики происходят изменения ядерных структур ПК. В отличие от гоноцитов, в оогониях хроматин преобразуется из мелкозернистого в тонкофибриллярный, происходит инактивация одной Х-хромосомы. Оогонии обладают высокой митотической активностью. У млекопитающих после нескольких митотических делений оогоний вступает в профазу I мейоза (и уже является ооцитом 1). Пул женских ПК в яичниках млекопитающих формируется вследствие активной пролиферации оогониев митозом во внутриутробный период и достигает своей конечной величины. Например, при нормально развивающейся беременности у 4-месячного плода человека женского пола должен сформироваться резерв (пул) ПК - 3-7 млн, единичные из которых после рождения и наступления полового созревания к каждому сроку овуляции овулируют (из фолликулов) и могут участвовать в оплодотворении. В мужском организме пул ПК постоянно пополняется с периода полового созревания, постнатально.

Ооциты на стадии прелептотенной конденсации хромосом (в прохромосомы), сменяющейся стадией прелептотенной деконденсации, последним, пре-мейотическим синтезом ДНК отмечены на всех сроках внутриутробного развития эмбриона и плода женского пола, но в наибольшем их количестве - в сроки от 8-й до 22-й недели. Первые ооциты на стадии лептотены и зиготены выявлены у плодов после 10-й недели, а ооциты в пахитене и диплотене - после 11-й недели развития плода. Информация о премейотическом синтезе ДНК в ооцитах на стадии прелептотенной деконденсации хроматина (прохромосом) свидетельствует о принадлежности ооцитов в прелептотене к профазе I мейоза. Стадия лептотены завершается сближением деконденсированных гомологичных родительских хромосом и их конъюгацией (синапсисом) на стадии зиготены профазы I мейоза с помощью СК, специфической для мейотических хромосом структур.

Нами впервые в мире количественным методом определено, что именно вокруг ооцитов на стадии диплотены (не ранее) фолликулярные клетки образуют 1 слой, формируя таким образом примордиальные фолликулы (у всех изученных нами видов - человека, коровы, крысы, мыши). Таким образом, формирование гемато-фолликулярного барьера происходит лишь по завершении сложного, важного процесса в мейозе - кроссинговера.

Переход оогониев в мейоциты и прохождение женскими гаметами стадий профазы I мейоза у некоторых видов млекопитающих происходят во внутриутробный период жизни, у других видов - незадолго до или сразу после рождения.

Период 23-26 нед характеризуется нарастанием числа ооцитов в зиготене и пахитене, а также дальнейшим интенсивным вступлением ооцитов в стадию диплотены профазы I мейоза. Количество оогониев неуклонно снижается (см. табл. 5-2).

В яичниках 27-33-недельных плодов человека вследствие нарастания процесса дегенерации ооцитов относительное количество гамет уменьшается. Основную их часть составляют ооциты на стадиях профазы I мейоза. В период 35-40 нед внутриутробного развития плода женского пола большинство ПК находится в диплотене (62,5%) и диктиотене (14,5%), заключены в фолликулы и заполняют корковое вещество яичника вплоть до покровного эпителия. Ооциты в лептотене, зиготене и пахитене немногочисленны, они не заключены в фолликулы, так же как и клетки на стадиях прелептотенной конденсации хромосом и их деконденсации. Последние, как и единичные оогонии, встречаются лишь в островках ПК в зоне мозгового вещества гонады.

В период с 14-й по 26-ю недели развития плода человека на фоне снижения общего числа оогониев остается высоким их митотический индекс (5,3-6,5%). Анализ фаз митоза свидетельствует о задержке (блоке) митоза в метафазе вследствие развития в подавляющем большинстве делящихся клеток патологических форм митозов. Эти данные свидетельствуют о том, что пул гамет у человека накапливается за период с 6-ю по 22-ю недели развития, когда дегенерирующие оогонии в митозе и интерфазе по-прежнему единичны.

У плодов человека после 26-й и до 40-й недели развития оогонии составляют незначительную часть гамет (12,2-8,2%) (табл. 5-3) и располагаются преимущественно в островках ПК. Единичные из них митотически делятся, большинство - с нарушением митоза.

Вступив в стадию диктиотены, ооцит млекопитающих находится в состоянии покоя длительное время. В постнатальный период, после наступления полового созревания, из пула примордиальных фолликулов данный фолликул и ооцит вступают в период большого роста и созревания, который длится 3-4 (менструального, для животных - эстрального) цикла. Эти события заканчиваются либо атрезией, либо, реже, - овуляцией ооцита. Незадолго до овуляции (по общепринятому мнению) ооцит из стадии диктиотены переходит в диакинез, вслед за которым могут развиваться 1-е и 2-е деления мейоза (созревания). Деконденсированные хромосомы на стадии диктиотены активно синтезируют иРНК и рРНК. При вступлении ооцита (как и фолликула) в рост происходят изменения прежде всего в количестве и распределении его цитоплазматических структур. Увеличиваются в числе элементы комплекса Гольджи, которые смещаются группами к периферии клетки. Повышается число митохондрий и элементов эндоплазматического ретикулума. Блестящая оболочка ооцита начинает формироваться при переходе примордиального фолликула в первичный. От фолликулярных клеток к поверхности ооцита или внутрь его через блестящую оболочку проходят различного размера цитоплазматические выросты, контактирующие с мембраной ооцита.

Формирование кариосферы происходит в ооцитах полостных фолликулов, при этом уровень синтеза РНК на хромосомах значительно снижается, а метаболизм белка - активен. На этом важном этапе оогенеза выполняется уникальная функция - в ооците формируется запас определенных соединений для эмбриогенеза.

СПЕРМАТОГЕНЕЗ

Морфогенез и функционирование органов мужской половой системы человека и других видов млекопитающих, дифференцировку мужских ПК (сперматогенез) через серию стадий их развития и функционирования контролируют генетические и эпигенетические механизмы регуляции. ПК обладают уникальной возможностью - передавать информацию о генетической программе развития самих ПК и развивающегося после оплодотворения нового организма следующим поколениям по двум направлениям: генетическому и эпигенетическому. В имеющейся на сегодня литературе, посвященной эпигенетическим событиям в мужских ПК, внимание исследователей в основном сконцентрировано на уникальности изменений, касающихся ремоделирования хроматина с заменой гистонов на протамины при дифференцировке сперматид в сперматозоиды. Фрагментарна информация о каких-либо иных изменениях хроматина, гистонов и других компонентов генетической и эпигенетической регуляции на других стадиях развития и функционирования мужских гамет. В то же время в длительной и многостадийной дифференцировке мужских ПК четко различают ряд этапов по модификации морфологии клетки, ядра, хромосом и других компонентов, а также по экспрессии определенных генов на разных стадиях сперматогенеза. Такие изменения позволяют строить предположения и об их связи с эпигенетической регуляцией этих стадий.

Продукт гена мыши blimpl запускает дифференцировку пре-ППК среди иных типов клеток проксимального участка эпибласта. Механизм действия белка Blimp1 проявляется в подавлении активности продуктов, регулируемых гомеобоксными генами семейства Hox и генами, продукты которых участвуют в регуляции клеточного цикла и метилирования ДНК в соматических клетках. Полагают, что для дальнейшей дифференцировки ППК необходима активация гена Fragilis, контролирующего синтез интерферонзависимого трансмембранного белка Fragilis, участвующего в формировании клеточных контактов при миграции ППК и регуляции контроля клеточного цикла в группе ППК. Подчеркивают многофункциональность одного из активных маркеров ППК - тирозинкиназного рецептора С-kit (Kit), участвующего в направлении миграции ППК. Большинство генов в сформированных спермиях оказываются локализованными в высококонденсированном (с помощью протаминов) хроматине, в то время как гены спермиев, потенциально необходимые для начальных стадий развития нового организма, ассоциированы с гистонами, представляющими форму эпигенетического маркирования. Но малая информация имеется о других белках (кроме гистонов и протаминов), ассоциированных с хроматином спермиев и также выполняющих эпигенетическую роль. Транзиторные белки подготавливают хроматин для ассоциации с протаминами, влияя на конденсацию ДНК. Протамины имеют низкое содержание лизина, и более чем 50% их остатков - аргинин. Возможно, это отражает эволюционное изменение протаминов из Н1 гистонов, протамины приобрели высокое содержание аргинина, которое, в свою очередь, изменило свойства конденсации хроматина. Мужские ПК имеют необычно большое число вариантов гистонов, обеспечивающих уникальные реакции для дифференцировки и функционирования гамет.

ПК в составе сперматогенного эпителия половозрелых млекопитающих включены в процесс сперматогенеза, который представляет собой серию цитологических преобразований, приводящих к формированию из относительно мало-дифференцированного диплоидного сперматогония высокоспециализированной гаплоидной клетки - сперматозоида, все органеллы которого видоизменены таким образом, чтобы обеспечить его перемещение, нахождение, узнавание и оплодотворение яйцеклетки для передачи своего генома развивающемуся новому организму (рис. 5-3). Сперматогенез может быть подразделен на три этапа: сперматоцитогенез, в котором происходит пролиферация ПК, формируется пул сперматогониев, которые затем трансформируются в сперматоциты I, вступающие в I деление мейоза, после чего становятся сперматоцитами II и завершают II деление мейоза с формированием из одного сперматоцита I четырех сперматид, претерпевающих спермиогенез, заканчивающийся формированием сперматозоидов. Сперматогенез (см. рис. 5-3) начинается с деления сперматогониев типа А₁ , предшественниками которых являются стволовые клетки - сперматогонии типа A₀ , характеризующиеся наиболее продолжительным клеточным циклом и устойчивостью к действию повреждающих факторов. В результате ряда последовательных делений наблюдают смену сперматогониев типа A₁ сперматогониями типов А₂ , А₃ , А₄ , промежуточного типа и типа Б. Период сперматогониального размножения завершается делением сперматогониев типа Б, в результате которого образуется новый тип клеток - покоящиеся, или прелептотенные, сперматоциты. Затем ПК вступают в следующую фазу дифференцировки - мейоз (в половозрелом организме).

С помощью количественного метода мы провели анализ хронологии и динамики дифференцировки мужских ПК человека в развивающихся яичках на всех последовательных сроках внутриутробного периода развития (табл. 5-4). Число просперматогониев возрастает в первые 4-5 нед после рождения. Определенное число ПК у детей после рождения вступает в дегенерацию, что отражает естественную селекцию гамет. В яичках формирование определенного пула ПК и вступление части из них в мейоз, формирование гемато-тестикулярного барьера наступают в период полового созревания. Длительность сперматогенеза человека - 74±4-5 дней. Детальное исследование возрастных характеристик структур постнаталь-ного яичка у человека было выполнено А.Ф. Астраханцевым (1996).

В яичках эмбрионов человека 6-7 нед развития, сразу после половой дифференцировки гонад, половые тяжи составлены из 2-3 рядов клеток Сертоли. Популяция ПК представлена просперматогониями, составляющими 3,7±0,5% общего числа подсчитанных половых и соматических клеток половых тяжей (яичек). Они крупнее соматических клеток, имеют округлое центрально локализованное ядро, заполненное тонкой сетью хроматина и 1-2 ядрышками. Около 8,4% просперматогониев делятся митозом, из числа которых 26,2±11,3% отнесены к патологическим формам. Около 2,5±0,8% ПК (см. табл. 5-2) по степени конденсации хромосом в компактные глыбки (прохромосомы) отнесены к гаметам на этапе прелептотенных преобразований хроматина. В их ядрах отчетливо прослеживаются хроматиновые глыбки неправильной формы, соединенные между собой тонкими волокнами, присутствие которых является одним из признаков, четко отличающих этап прелептотенной конденсации (спирализации) хромосом от метафазных митотических хромосом. Число ПК с признаками дегенерации незначительно (см. табл. 5-2) (Хилькевич, Курило, 1992). У эмбрионов-плодов человека 7,5-9 нед развития число ПК увеличивается вдвое. У 10-11-недельных плодов продолжается развитие яичек и возрастает число просперматогониев в них; количество гамет с формированием глыбок хромосом (прохромосом) в их ядрах составляет максимальное значение относительно этого показателя на всех сроках внутриутробного периода развития человека. Уровень митотической активности просперматогониев снижается. В период 14-16 нед внутриутробного развития возрастает число ПК, достигая своего максимального значения. Преобладающее количество просперматогониев располагается в семенных канальцах прибазально. На этих и последующих сроках развития плодов человека митотическая активность ПК незначительна. Количество ПК с прохромосомами (прелептотенной конденсацией хроматина) в ядрах несколько снижается и достигает 2,6-3,0% у плодов мужского пола 24-й и 32-й недель внутриутробного развития (см. табл. 5-2) (Хилькевич, Курило, 1992).

Популяция мужских ПК начинает формироваться в плодный период, но регулярное, непрерывное ее пополнение и дифференцировка через стадии мейоза происходят постнатально, при наступлении полового созревания. Митозы в мужских ПК возобновляются после рождения, и вступление гамет в мейоз (в прелептотену профазы I мейоза) начинается с периода полового созревания. Цикл развития от сперматогония до сперматозоида мужские гаметы проходят в половозрелом организме.

Наблюдаемое нами наличие мужских гамет с формированием прохромосом в их ядрах, без признаков дегенерации, свидетельствует о реальности формирования клеток этой стадии и в сперматогенезе и о том, что они не могут быть отнесены к дегенерирующим гаметам. Отмечают, что путем перехода хромосом гамет в состояние их полной конденсации обеспечивается переключение программы ПК от митотических циклов на мейоз. Предполагаем, что такое ремоделирование хромосом в ПК перед важными мейотическими событиями обеспечивает гаметам возможность прохождения процессов, уникальных только для ПК: конъюгации и кроссинговера, либо способность (при эпигенетических механизмах регуляции) пройти дважды деления мейоза (при одном этапе синтеза ДНК). Решение этих важных в биологии развития вопросов ждет своих исследователей. В яичках половозрелых мужчин сперматоциты I проходят все стадии профазы, метафазу, анафазу и телофазу I мейоза, затем все стадии II мейоза. Вследствие двух делений созревания (I и II мейоза) из одного сперматоцита I формируются вначале два сперматоцита II, а затем из каждого из них - по две сперматиды (т.е. формируются четыре равноценные сперматиды), претерпевающие затем период мужского гаметогенеза (спермиогенез), во время которого гаплоидные клетки дифференцируются в сперматозоиды. Сперматозоиды млекопитающих относят к жгутиковому типу. Зрелая мужская ПК большинства видов млекопитающих состоит из трех отделов: головки (содержащей акросому с ферментами и ядро), соединительного отдела (шейки), где расположены дистальная и проксимальная центриоли и митохондрии, и собственно жгутика. В процессе спермиогенеза можно выделить следующие основные события.

Сперматогенные клетки позвоночных развиваются в окружении соматических (поддерживающих) клеток Сертоли, локализованных на базальной мембране стенки извитых семенных канальцев.

Специализированные соединения (контакты) между клетками Сертоли, располагающиеся над сперматогониями и сперматоцитами на стадии прелептотены, рассматриваются как наиболее эффективный компонент гематотестикулярного барьера. Однако этим далеко не ограничивается функциональное значение поддерживающих клеток. Отсутствие митозов в клетках Сертоли определило то, что число их на срезе извитого семенного канальца характеризуется строгим постоянством, и они играют важную роль в установлении внутренней структуры канальцев (Franca еt а1., 2016).

В гормональном контроле сперматогенеза ключевую роль играют два основных гонадотропных гормона, секретируемых передней долей гипофиза, - ЛГ и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). Органами-мишенями для гонадотропных гормонов являются клетки Сертоли и клетки Лейдига. Основным источником тестостерона в яичках являются клетки Лейдига, располагающиеся в интерстициальной соединительной ткани. Гипоталамус - главный центр регуляции функционирования мужской репродуктивной системы. Получая информацию от центральной нервной системы (ЦНС) и яичек, гипоталамус регулирует образование и секрецию гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) в пульсирующем режиме, что является необходимым звеном стимуляции синтеза и секреции гонадотропных гормонов. Гонадотропные гормоны образуются также в яичках. Тестостерон, продукт внутренней секреции яичка (клетками Лейдига), является главным ингибитором секреции ЛГ гипофизом у мужчин.

Контроль сперматогенеза некодирующими РНК

Помимо белок-кодирующих генов различные биологические процессы, в том числе сперматогенез, регулируются некодирующими РНК. Их классифицируют в зависимости от длины нуклеотидной последовательности и функций различных типов этих РНК. Piwi-взаимодействующие РНК (piRNAs) имеют длину молекул 24-30 н., в яичках млекопитающих формируют комплекс с белками Piwi. Эти РНК формируются при незрелой иммунной системе, направляя транспозоны к ДНК-метилированию во время сперматогенеза. Различные классы pi-РНК экспрессируются в эмбриональных ПК. Действие других некодирующих РНК на успешное протекание мейоза показано для процессов в профазе I мейоза. В предпахитенных стадиях развития сперматоцитов I piRNA связаны, главным образом, с ретротранспозонами и необходимы для их ингибирования; piRNAs находят и в митотически делящихся ПК, таких как сперматогонии.

С накоплением информации о результатах исследования эпигенетических событий в гаметогенезе становится очевидным, что эпигенетические механизмы регулируют многие ключевые функции, обеспечивающие стабильность генома, наследуемость изменений в генной экспрессии. Эпигенетическая «пластичность» хромосом при прохождении митоза и мейоза необходима для компенсации происходящих изменений нуклеотидной последовательности и хромосомных перестроек, которые связаны с видообразованием. Для некоторых этапов сперматогенеза, эмбриогенеза описаны события с влиянием или еще только предполагаемым влиянием эпигенетических факторов. Таким образом, исследование при комплексном медико-генетическом обследовании причин патологии органов половой системы, репродукции свидетельствует о том, что таковыми могут быть генетические (генные или хромосомные мутации) и эпигенетические механизмы, либо проявляющиеся только на уровне субклеточных структур (в гаметах или в разных типах соматических клеток), но затрагивающие репродуктивную функцию в целом, либо отражающиеся на уровне ПК, половых желез или органов половой системы, либо входящие в состав симптомокомплекса определенного синдрома.

Cписок литературы

Введение

Проблема реализации генетической информации на разных стадиях онтогенеза продолжает рассматриваться как центральная проблема современной биологии.

Драматичные события разворачиваются уже на ранних стадиях онтогенеза. При оплодотворении формируется индивидуальный геном, обеспечивающий дальнейшее развитие организма. Происходит селекция генетически неполноценных особей. Большие успехи достигнуты в изучении эпигенетического репрограммирования генома, в понимании программы индивидуального развития, включая процессы первичной эмбриональной дифференцировки, имплантации и плацентации. Их краткий обзор и является задачей настоящей главы.

Наряду с современными представлениями о контролирующих механизмах ранних стадий эмбриогенеза человека, в главе приведены данные о роли дефектов наследственного аппарата и некоторых мутаций в возникновении врожденных аномалий и наследственных болезней. Кратко рассмотрены новые методы и гипотезы последних лет, открывающие пути для дальнейших исследований генетики развития человека, значение которых для фундаментальной науки и прикладное значение для медицинской генетики трудно переоценить.

Новые подходы и методы в генетике развития

Прогресс любой науки - это прежде всего прогресс ее методов. Бурное развитие генетики привело к расшифровке генома человека и положило начало функциональной геномике, имеющей решающее значение для медицинской генетики в изучении вклада дефектов генетического аппарата в патологию человека. Подобные исследования особенно актуальны во внутриутробном периоде, когда активно происходят процессы морфогенеза, а ошибки генома особенно часто подвергаются естественному отбору.

Несомненный прогресс в понимании сложных механизмов развития достигнут благодаря появлению новых подходов, существенно расширяющих возможности исследования зародышей человека на разных стадиях развития. Благодаря программам вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) стало реальным непосредственно исследовать гаметы и эмбрионы человека до имплантации, анализировать динамику развития эмбриона и его отдельных органов. Ценная информация о генетике развития человека получена и в исследованиях на эмбриональных стволовых клетках (ЭСК), а также в экспериментах на биологических моделях наследственных болезней.

Принятые во многих странах законодательные акты не позволяют культивировать зародыши человека после стадии бластоцисты. Между тем такие важные этапы эмбриогенеза, как гаструляция (2-я фаза), нейруляция и закладка осевого комплекса органов по времени у зародыша человека совпадают с периодом имплантации (7-1 д.б.) и практически недоступны для прямого анализа. В 2016 г. появились сообщения и комментарии об успешном культивировании in vitro зародыша человека до 14-го дня развития, то есть до стадии первичной полоски и первых сердцебиений. Для этого были разработаны специальные питательные среды и особые условия культивирования. Созданная модель позволила детально проследить in vitro развитие человека в течение первых 13 дней и получить принципиально новые данные. Было установлено, что со стадии зиготы зародыш человека представляет собой автономную развивающуюся систему, способную уже на стадии бластоцисты к самоорганизации и формированию главной осевой структуры тела (первичной полоски) и провизорных органов. Были получены ответы на классические вопросы эмбриологии человека, касающиеся механизмов формирования желточного мешка и амниона. Установлено, что первый образуется за счет разрастания внезародышевой энтодермы, а второй формируется поляризованными клетками эпибласта.

В ходе оживленной дискуссии многие ведущие ученые поддержали эти исследования, отмечая необходимость пересмотра ограничений на культивирование полученных in vitro эмбрионов человека до 14-го дня в научных целях. Основным аргументом было признание очевидного факта, что культивируемые in vitro зародыши ранних стадий являются уникальной моделью для изучения патогенеза многих тяжелых нейропсихических заболеваний (аутизма, шизофрении), механизмов повреждающего действия химических и инфекционных тератогенов (например, вируса Зика), первичного патологического звена всех генных и хромосомных заболеваний и врожденных аномалий развития. Кроме того, они представляют интерес для прямых исследований процессов имплантации, нарушение которых сопряжено с развитием осложнений беременности (например, преэклампсии, угрожающей жизни плода и даже матери). Существующие отечественные постановления, регламентирующие работу с ранними зародышами человека в центрах ВРТ РФ, также требуют пересмотра.

Благодаря программам ВРТ стало возможным не только получать и исследовать гаметы человека на любой стадии их развития, но и изучать биохимические, молекулярные и цитологические особенности эмбрионов. Особенно важный прогресс в этой области достигнут благодаря разработкам и внедрению методов PGD в семьях высокого риска и PGS. Конечной целью обоих подходов является выяснение полноценности эмбрионов в отношении хромосомных аномалий и/или генных мутаций. Для анализа в настоящее время широко используются клетки трофэктодермы (ТЭ), полученные от эмбрионов на стадии бластоцисты. Основными методами скрининга хромосомных аномалий стали микроматричная геномная гибридизация (aCGH) и секвенирование нового поколения (NGS). Полногеномные варианты этих молекулярных методов позволяют обнаружить как анеуплоидии по любым хромосомам набора, так и количественные изменения (делеции, дупликации) менее протяженных последовательностей ДНК (вплоть до отдельных нуклеотидов).

Детальный морфологический анализ доимплантационных зародышей, дополненный современными методами исследования, позволяет получить новую информацию о влиянии генных и хромосомных мутаций на процессы индивидуального развития, уточнить критерии отбора для пересадки эмбрионов в матку.

Значительный прогресс в эмбриологии и генетике человека достигнут также благодаря использованию новых методов и подходов постимплантационной ПД. Разработаны и широко используются эффективные алгоритмы обследования плода, включающие различные варианты биохимического, ультразвукового и комбинированного скрининга, различные инвазивные методы получения биообразцов от плода на разных стадиях развития. В последние годы распространение получают методы неинвазивного пренатального тестирования (НИПТ) хромосомных нарушений у плода, основанные на секвенировании внеклеточной ДНК плода в плазме крови беременной. Плоды с хромосомными аномалиями после прерывания беременности могут быть использованы для детального патоморфологического и гистохимического анализа. Данный подход, широко применяемый в исследованиях по цитогенетике развития, детально рассмотрен в литературе.

Используя современные методы молекулярно-генетического анализа, на клетках, тканях и органах плода возможно изучение экспрессии генов. В настоящее время создано много «экспрессионных» баз данных всего зародыша, его отдельных органов и тканей, например, 3-мерная модель развивающегося мозга. Экспрессия генов исследуется также с помощью иммуногистохимии на гистологических срезах, в первичных культурах органов и тканей (кардиомиоциты, клетки печени, поджелудочной железы и др.). Разработаны также методы полногеномного анализа экспрессии генов и их метилирования, позволяющие проводить анализ транскриптома индивидуальных клеток.

Специального внимания заслуживают ЭСК, которые способны in vitro к спонтанной дифференцировке и самоорганизации в виде эмбриоидных телец, содержащих клетки всех трех зародышевых листков, но не воссоздающих типичную для стадии гаструлы трехмерную структуру. Эмбриональные тельца послужили моделью для изучения механизмов клеточной спецификации и дифференцировки ЭСК. Анализируя экспрессионные профили, идентифицируя гены, поддерживающие состояние плюрипотентности и направляющие клеточно-специфическую дифференцировку, удалось получить важную информацию о генетических механизмах раннего эмбриогенеза человека. Предпринимаются попытки получения эмбриоидов, пригодных для изучения ключевых этапов морфогенеза в раннем постимплантационном эмбриогенезе человека, включая образование амниона и амниотической полости. Пока не решены проблемы получения и поддержания культур стволовых клеток трофобласта (ТБ) из ТЭ, которые позволили бы прояснить механизмы дифференцировки клеток ТБ в периоды имплантации и плацентации. Стволовые клетки ТБ и ЭСК с эмбриональным и внеэмбриональным потенциалом могут быть полезными инструментами для создания организованных структур, включающих как эмбриональные, так и экстраэмбриональные линии.

Еще один важный подход к анализу контролирующих механизмов эмбриогенеза человека касается исследований на биологических моделях. Направленное выключение генов (нокаутные мыши), создание трансгенных животных, отработка методов редактирования генома открывают широкие возможности для моделирования наследственных болезней человека.

Наконец, важной парадигмой в исследованиях генетических механизмов онтогенеза являются методы молекулярно-цитогенетического анализа, которые применяются для изучения структурно-функциональной организации хромосом (районов ядрышковых организаторов, конститутивного гетерохроматина) и эпигенетических модификаций (хроматина и метафазных хромосом), они представлены в отечественной литературе.

Таким образом, генетика человека последних лет существенно обогатилась целым арсеналом новых эффективных методов молекулярно-генетического исследования, которые в сочетании с достижениями ВРТ и клеточными технологиями открывают широкие перспективы для углубленного анализа генетических (геномных) механизмов эмбриогенеза человека.

Доимплантационное развитие

Общие представления

Индивидуальное развитие человека начинается с оплодотворения, т.е. слияния овулировавшей яйцеклетки и эякулированного сперматозоида. Каждая гамета является продуктом длительных и сложных морфогенетических процессов (закладка гонад, процессы оогенеза и сперматогенеза), которые начинаются еще во внутриутробном периоде развития и продолжаются вплоть до полового созревания. При этом образование женских ПК начинается еще внутриутробно, тогда как сперматогонии вступают в мейоз только с наступлением половой зрелости.

Период доимплантационного развития у человека занимает 6-7 дней и начинается с формирования мужского и женского пронуклеусов (мужской пронуклеус - результат трансформации головки сперматозоида, женский - гаплоидного набора хромосом после 2-го мейотического деления). Процесс длится около 12 ч, при этом мужской пронуклеус образуется примерно на 3-4 ч раньше женского. Пронуклеусы практически равны по размеру, но существенно отличаются конфигурацией хроматина.

Вскоре после образования пронуклеусов в них появляются хроматиновые нити, которые образуют скопления (узелки), так называемые топологически ассоциированные домены (ТАД) [19]. В мужском пронуклеусе многочисленные ТАД расположены группами (компартментами) вблизи ядерной мембраны (ТАД-А). В женском их число заметно меньше, они реже объединяются, содержат мало активных генов (ТАД-В). Считается, что ТАД-компартменты отражают особенности структурно-функциональной организации генома зародыша. Они определяют пространственное расположение функциональных доменов, способствуют сближению энхансерных и промоторных последовательностей ДНК структурных генов, определяют программу начальных этапов работы генома. Возможность изучать паттерны ТАД и динамику экспрессии их генов уже на самых ранних стадиях эмбриогенеза открывает большие перспективы для понимания этиологии и патогенеза хромосомных болезней, поиска путей их профилактики и лечения.

Примерно через 9 ч после оплодотворения в обоих пронуклеусах начинается синтез ДНК, т.е. репликация хромосомного материала. Через 20 ч они перемещаются к центру яйцеклетки, ядерные оболочки растворяются, а их гаплоидные наборы хромосом объединяются в метафазной пластинке. В результате 1-го деления дробления (примерно через 24 ч после оплодотворения) возникают два равных по величине бластомера, последующие деления дробления происходят примерно каждые 18 ч.

В течение 3 первых делений дробления все бластомеры имеют округлую форму, идентичны по морфологии и ростовым потенциям. На стадии морулы (3-5-й дни развития, когда зародыш состоит из 8-16 бластомеров) начинается процесс компактизации, сопровождающийся поляризацией бластомеров. При этом бластомеры, расположенные снаружи, приобретают свойства эпителиальных клеток, между ними возникают тесные межклеточные контакты (десмосомы), а внутри образовавшегося пузырька накапливается жидкость. Через 4,5-5 дней после оплодотворения возникает бластоциста - небольшой пузырек, заполненный жидкостью, стенка которого состоит из одного слоя крупных клеток ТЭ, изнутри к которому в одном месте прилежит небольшая группа клеток эмбриобласта (внутренняя клеточная масса - ВКМ). Общее число клеток на этой стадии более 60. Образование 2 типов клеток (ТЭ и ВКМ) называют первичной эмбриональной диф-ференцировкой, а сам процесс - первичной эмбриональной индукцией. Первичная эмбриональная дифференцировка у млекопитающих и человека соответствует 1-й фазе гаструляции.

Клетки ВКМ активно размножаются и в дальнейшем дают начало всем тканям и органам эмбриона, а также мезенхимным производным внезародышевых частей плодного яйца (хориона, плаценты, желточного мешка, аллантоиса, амниона).

Клетки ТБ на протяжении всей беременности размножаются, дифференцируются и осуществляют множество функций, являясь основной составляющей плаценты. Они обеспечивают непосредственный контакт зародыша со стенкой матки, участвуют в процессах имплантации и плацентации, играют важную барьерную роль и обеспечивают трофическую функцию.

В ходе дробления зародыш продвигается по маточной трубе в направлении матки как за счет тока жидкости, так и вследствие перистальтических сокращений мускулатуры и движения эпителиальных ресничек. На 5-6-й день бластоциста попадает в матку.

Генетические и эпигенетические факторы раннего развития

Известно, что первые деления дробления у человека осуществляются за счет генетической информации, накопленной еще в период оогенеза. Зародыш человека обладает достаточным запасом готовых рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов, необходимых для синтеза новых белков, а также питательных веществ и энергетических ресурсов, чтобы полностью обеспечить начальные этапы эмбриогенеза. Начальный синтез белков происходит на матрицах РНК, возникших в результате экспрессии материнских генов в оогенезе. Отсюда ее название - материнская РНК.

Считается, что активация эмбрионального генома человека происходит на стадии 4-8 бластомеров, т.е. после 2-3 делений дробления. Морфологические особенности пронуклеусов согласуются с особенностями хромосом в метафазе первого деления дробления. Хромосомы мужского пронуклеуса мало спирализованы, нитевидные и резко отличаются от коротких, сильно спирализованных «материнских» хромосом. Наблюдаемая гетероцикличность хромосом в 1-м делении дробления, скорее всего, свидетельствует о более ранней функциональной активности генов отцовского генома. Действительно, методом полногеномного секвенирования недавно подтверждена активация сотен генов отцовского генома уже на стадии зиготы.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

В 2015 г. в Великобритании впервые были официально разрешены эксперименты на культивированных зародышах человека с целью изучения молекулярно-генетических механизмов доимплантационного развития. Прямые доказательства участия генома в контроле начальных стадий эмбриогенеза человека были получены при анализе экспрессии генов. В частности, установлено, что в период от зиготы до стадии 4 бластомеров транскрибируется 32 гена, а в период от 4 до 8 бластомеров их число возрастает до 129. Значительную часть этих «ранних» генов составляют гомеобоксные RGFX, CPHX1, CPHX2, DPRX, DUXA, DUXB, LEU, TXF, в 5'-последовательностях которых найдены регуляторные мотивы, включающие Alu-элементы [33], а также гены «стволовости» (гены стволовых клеток) OCT4, NANOG, SOX2.

У дробящихся эмбрионов человека показана дифференциальная экспрессия 51 гена, которые регулируют движение и размножение клеток. Глобальное исследование профиля экспрессии генов от зиготы до стадии бластоцисты позволило идентифицировать главные ТФ, регулирующие первые деления дробления (HNF1A, FXA2, EP300), формирование морулы и бластоцисты (SOX2, KLF4, JUN), ремоделирование хроматина (EP300). Исследованы экспрессионные профили 11 ТФ, включающих экспрессию многих структурных генов. Используя технологию редактирования генома CRISPR/Cas9, было проведено направленное выключение гена OCT4 и исследованы особенности развития зародышей после прекращения экспрессии этого гена. Путем полногеномного секвенирования, дополненного введением иРНК, удалось проследить эпигенетическую транзицию (функциональный переход) от материнского генома оплодотворенной яйцеклетки к геному самого зародыша, обусловленную динамическими структурными изменениями хроматина.

Установлено, что при дроблении зиготы происходит активация гетерохро-матина, которая сопровождается экспрессией находящихся в нем транспозонов (мобильных вирусоподобных фрагментов генома). Предполагают, что экспрессия транспозонов, особенно ретротранспозона LINE1, необходима для инициации работы генома после оплодотворения, а реструктурирование хроматина в пронуклеусах - для активации процессов транскрипции.

В процессе ремоделирования хроматина и деления бластомеров нередко происходят повреждения хромосом, которые репарируются с помощью специальных белков. Дефекты восстановления целостности ДНК и нарушения эпигенетического репрограммирования генома вызывают остановку развития и гибель зародыша.

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ГЕНОМА

Важные эпигенетические изменения генома зародыша разворачиваются уже на стадии пронуклеусов. При помощи бисульфитного секвенирования и иммуно-цитохимии проанализированы эпигенетические изменения, связанные с метилированием и гидроксиметилированием ДНК, изменениями гистонов и пространственной организацией хроматина.

Основной механизм эпигенетического репрограммирования генома касается метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков, которые регулируют состояние хроматина. Эти изменения хроматина, как известно, типичны для геномного импринтинга, который определяет различное функциональное состояние генов в зависимости от их родительского происхождения. Эпигенетический профиль мужских и женских гамет формируется еще в гаметогенезе и поддерживается за счет специальных белков (Zinc finger protein 57). Эпигенетическое репрограммирование генома - это, по сути, замена профиля импринтинга гамет на паттерн импринтинга хромосом зародышевых клеток. Ошибки импринтинга, возникающие в гаметогенезе или в зиготе, нередко являются причинами нарушения эмбрионального развития, включая задержку развития и спонтанное прерывание беременности.

Эпигенетическое репрограммирование генома включает две последовательные фазы: деметилирование и реметилирование ДНК. Процессы деметилирования в мужском пронуклеусе запускаются сразу после замены протаминовых белков хроматина сперматозоидов на гистоновые и осуществляются ферментами деметилазами. В женском пронуклеусе деметилирование происходит преимущественно пассивно, т.е. без участия этих ферментов.

В серии исследований с использованием специфических антител к метилцито-зину (5mC) и гидроксиметилцитозину (5hmC) показаны различия между отцовским и материнским пронуклеусами и гомологичными хромосомами в метафазе 1-го деления дробления. На стадии метафазы 2-го деления дробления для хромосом характерно асимметричное распределение 5mC и 5hmC в сестринских хроматидах (гемиметилирование), которое с каждым делением дробления становится менее выраженным за счет снижения уровня 5mC. С 8-клеточной стадии до стадии бластоцисты хромосомы постепенно приобретают сегментспецифичный рисунок дифференциальной исчерченности. В уровне (гидрокси)метилирования между эмбрионами «низкого» и «хорошего» качества выявлены различия, особенно заметные на 3-4-й дни развития.

Таким образом, начиная со стадии 8 бластомеров, генетическая программа онтогенеза нового организма уже включена.

ПЕРВИЧНАЯ ЭМБРИОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА

Уже на стадии 8 бластомеров гистохимически выявляются клетки, богатые РНК, и клетки, где содержание РНК заметно снижено. Бластомеры этих зародышей различаются и по скорости деления. Имеются данные о различиях гистоновых модификаций в бластомерах уже на 4-клеточной стадии. Эти изменения непосредственно предшествуют процессам компактизации, которые происходят на стадии морулы и знаменуют начало первичной эмбриональной дифференцировки, то есть образование клеток ТЭ и выделение ВКМ.

В последние годы исследования репрограммирования генома сосредоточены на изучении единичных клеток и выяснении роли индивидуальных генов, контролирующих этот процесс. Согласно современным представлениям, первые изменения, связанные с первичной эмбриональной дифференцировкой, то есть появлением ВКМ и ТЭ, происходят уже на стадии 4 бластомеров. Ключевую роль в этом играет транскрипционный фактор SOX2, продукт которого связывается с ДНК. В зависимости от наличия или отсутствия аминокислоты аргинина в гистоне 3 (H3R26) прочность и продолжительность такого связывания варьируют. При длительном контакте клетки начинают экспрессировать фактор транскрипции SOX21, который подавляет дифференцировку бластомера. Такие клетки в дальнейшем становятся клетками ВКМ и формируют все ткани эмбриона. Клетки с коротким временем транзиторного контакта с ТФ SOX2 начинают дифференцировку и превращаются в клетки ТЭ. Фермент CARM1, ответственный за метилирование гистона Н3, включает процесс первичной эмбриональной дифференцировки. Факторы индукции синтеза этого ключевого фермента неизвестны. Предполагается, что таковым может быть продукт гена DUX4, который начинает экспрессироваться еще в зиготе и, как показали опыты с его направленным выключением, активирует работу генома зародыша. Удивительно, что ген DUX4 уже давно идентифицирован как главный ген, мутации которого приводят к тяжелому нервно-мышечному заболеванию - лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии.

Генетические факторы патологии ранних зародышей

Нарушения доимплантационого развития могут быть следствием генетической неполноценности гамет, нарушений процесса оплодотворения либо ошибок экспрессии генов, контролирующих раннее развитие.

Наиболее частыми нарушениями развития на доимплантационных стадиях являются отсутствие или задержка дробления, полиспермное оплодотворение, фрагментация и гибель бластомеров.

Есть основание предполагать, что основной вклад в патологию доимплантационного развития человека вносят хромосомные аномалии. Вместе с тем многочисленные исследования позволили высказать, а в дальнейшем и подтвердить предположение о том, что анеуплоидия у доимплантационных зародышей человека представляет собой нормальное явление. Так, методом FISH с ДНК-зондами на 9-12 хромосом, включая X и Y-хромосомы, было установлено, что хромосомные нарушения встречаются почти у 70% дробящихся эмбрионов 3-го дня развития. С помощью методов aCGG и NGS показана высокая частота хромосомных аномалий у 5-7-дневных эмбрионов.

Типичными нарушениями кариотипа у эмбрионов являются трисомии хромосом, спектр которых на доимплантационных стадиях развития гораздо разнообразнее, чем на постимплантационных. Для ранних эмбрионов характерны также двойные и множественные трисомии по разным хромосомам и даже моносомии аутосом, которые за малым исключением после имплантации вообще не встречаются. Частота многих трисомий у дробящихся эмбрионов человека увеличивается с возрастом матери и обусловлена в основном ошибками сегрегации хромосом в 1-м делении мейоза в оогенезе. Однако в более 25% случаев анеуплоидия возникает после оплодотворения в результате аномальной сегрегации хромосом в делениях дробления. Эти митотические ошибки могут происходить при дроблении зигот как с исходно нормальным, так и с аномальным наборами хромосом и не зависят от возраста матери. Аномальную сегрегацию хромосом объясняют отсутствием контроля клеточного цикла в первых делениях дробления, которые характеризуются резкими изменениями размеров клеток и временными параметрами клеточного цикла, особенностями состава кинетохоров, их ориентацией к полюсам деления. Основными механизмами возникновения анеуплоидии в мейозе и раннем эмбриогенезе человека считается отставание хроматид в анафазе и, реже, истинное нерасхождение хромосом. Значительное число (70%) доимплантационных зародышей человека являются мозаиками. Выделяют 4 основные группы мозаичных эмбрионов: анеуплоидные мозаики (нет ни одной эуплоидной клетки), анеуплоидные/эуплоидные (сочетание анеуплоидных и эуплоидных клеток), миксоплоидные (сочетание гаплоидных, ди-, три- и тетраплоидных клеток), хаотичные (каждый бластомер имеет случайный набор хромосом).

Помимо нарушений числа хромосом, сравнительно часто (в среднем в 7,5%) у доимплантационных эмбрионов отмечаются сегментные анеуплоидии (таким образом есть дупликации/делеции участков хромосом различной протяженности и локализации). Сегментные анеуплоидии могут быть мозаичными (так называемый сегментный мозаицизм) и сочетаться с мозаицизмом по целым хромосомам. Установлено, что сегментные анеуплоидии могут иметь как мейотическое, так и зиготическое происхождение и чаще затрагивают хромосомы групп А, В и С (хромосомы 1-12). ГТ их образования ассоциированы с известными ломкими сайтами хромосом либо специфичны для гаметогенеза и/или эмбриогенеза.

Общая частота мозаиков с полными и частичными формами анеуплоидии по разным хромосомам на стадии морулы варьирует в широких пределах (15-90%), а на стадии бластоцисты составляет в среднем около 30%. Вариации в частоте объясняются разной чувствительностью методов хромосомного анализа и особенностями исследуемых клеток. Поэтому информация о наличии и уровне мозаицизма, определенная при анализе нескольких соседних клеток ТЭ, не может быть использована для суждения о кариотипе клеток ВКМ. Аналогичные выводы были сделаны при исследовании образцов внеклеточной ДНК из полости бластоцисты (бластоцеля), источником которой служат клетки ТЭ и ВКМ.

Установлено, что избирательная селекция анеуплоидных клеток более свойственна клеткам ВКМ, чем ТЭ, и, по-видимому, является основным механизмом «самокоррекции» анеуплоидии у эмбрионов человека до имплантации и причиной ограниченного плацентой мозаицизма на постимплантационных стадиях. Гибель анеуплоидных клеток может приводить к задержке формирования бластоцисты, но их наличие в ТЭ не только не препятствует имплантации, но, возможно, способствует инвазии ТБ в стенку матки.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИМПЛАНТАЦИИ И ФОРМИРОВАНИЕ ПЛАЦЕНТЫ

Имплантация - сложный морфогенетический процесс, во время которого устанавливается тесный контакт между маточным эндометрием (децидуальными клетками) и клетками ТБ, зародыш погружается вглубь маточной стромы, развивается гемохориальная плацента ворсинчатого типа, которая в дальнейшем обеспечивает все метаболические процессы между матерью и плодом.

Как уже упоминалось, зародыши человека периода имплантации практически недоступны для исследования. Поэтому основные сведения о генетических механизмах этого процесса получены в исследованиях, выполняемых в рамках программ ВРТ, на материале спонтанных и индуцированных (медицинских, социальных) абортов, а также в экспериментах на биологических моделях (мыши, крысы, обезьяны). Важные сведения получены в экспериментах на ЭСК. Широкие возможности для анализа функции генома зародыша открывают методы анализа генома и его экспрессии в индивидуальных клетках.

Напомним, что зародыш человека попадает в матку на стадии морулы - ранней бластоцисты - примерно на 5-й день после оплодотворения. Непосредственный контакт бластоцисты с клетками эндометрия, выстилающими полость матки, служит сигналом к «хэтчингу» - выходу (вылуплению) бластоцисты из блестящей оболочки, началу активной экспрессии многих генов как в клетках ТЭ, так и в клетках децидуального слоя эндометрия матки для подготовки так называемого окна имплантации. Клетки ТБ вступают в непосредственный контакт со слизистой оболочкой матки и с помощью литических ферментов разрушают вначале эпителий, а затем и несколько подлежащих слоев децидуальных клеток (рис. 6-1). Постепенно зародыш оказывается полностью погруженным в стенку матки. Продолжительность имплантации у человека от момента прикрепления плодного яйца до ее полного погружения в эндометрий составляет около 40 ч.

Сам процесс имплантации требует строгой синхронизации программ развития клеток зародыша и стенки матки, регулируемых с помощью половых гормонов. Любые нарушения в самом зародыше или связанные с дефектами эндометрия, а также с десинхронизацией ритмов развития зародыша и стенки матки неминуемо ведут к нарушению имплантации и прерыванию беременности. Сложные, скоординированные во времени и пространстве морфогенетические процессы, находящиеся под взаимным контролем многих генов ТЭ и материнского организма (гены гормонального контроля, воспалительной реакции, пролиферации и инвазии ТЭ), объясняют высокую чувствительность имплантации к повреждающему действию как эндогенных, так и экзогенных факторов. Это дало основание рассматривать процесс имплантации как первый критический период развития зародыша человека.

После разрушения блестящей оболочки клетки ТЭ превращаются в клетки ТБ и начинают активно синтезировать гормон - хорионический гонадотропин, а также различные лизирующие ферменты, вызывающие гибель прилежащих к ним клеток эндометрия, что провоцирует локальную воспалительную реакцию. Клетки ТБ приобретают инвазивные свойства, обеспечивают гистиотрофное питание зародыша и сам процесс имплантации, то есть проникновение зародыша вглубь стенки матки.

Различают 2 типа ТБ: ТБ, который формирует ворсины, внутренний слой состоит из активно делящихся клеток, а наружный, сливаясь, образует синцитий (цитотрофобласт и синцитиотрофобласт соответственно); межворсинковый ТБ, образованный слоями неполяризованных клеток, выполняющих основную инвазивную роль при имплантации и формировании плаценты.

Молекулярно-генетические механизмы имплантации

Становление клеток ТЭ и их превращение в клетки ТБ, ограничивающие полость бластоцисты (бластоцель), находится под контролем ТФ основного каскада Cdx2-Eomes-Elf5 и сопровождается быстрым угнетением активности ключевых генов плюрипотентности - OCT4 и SOX2, которые включают каскад новых ТФ, таких как FGF4 (ростовой фактор фибробластов) и ВМР4 - ростовой фактор, необходимый для дифференцировки клеток ТЭ. Он также индуцирует экспрессию генов-ТФ GATA2, GATA3, AP2 (TFAP2), включает гены-ТФ, ответственные за синтез хорионического гонадотропина человека (ХГЧ, hCG), HLA-G, а также гены прогестерона, эстрадиола (ETS2) и цитохрома CYP11.

Экспрессия генов, контролирующих имплантацию, происходит уже после первых делений дробления, то есть значительно раньше «хэтчинга». Несколько условно в связи с многообразием и наличием сходных или даже перекрывающихся функций гены имплантации и контролируемые ими продукты можно разделить на несколько групп.

ГЕНЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ТРОФОБЛАСТА

У зародыша человека уже со стадии 8 бластомеров активируются гены и синтезируются ростовые факторы, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и его рецептор (EGF-R), фактор роста фибробластов (FGF4), трансформирующий ростовой фактор-α (TGF-α) и ростовой тромбоцитарный фактор (PDGF-A) и его рецептор. На стадии морулы-бластоцисты активируется и ген инсулиноподобного ростового фактора-II (IGF-II). Продукты этих генов контролируют пролиферацию и дифференцировку клеток ТБ, они особенно активны при формировании ворсин хориона. Кроме того, они стимулируют экспрессию генов гелатиназы A (одного из типов матриксной металлопротеиназы - ММР-2) и гена TIMP-1 - ингибитора металлопротеиназ, ферментов, регулирующих инвазивные свойства ТБ. Пролиферацию клеток вневорсинкового ТБ хориона активно стимулирует также васкулярный эндотелиальный ростовой фактор (VEGF), продуцируемый децидуальными макрофагами, а синтез мембранных рецепторов к нему контролируется геном VEGF-R.

Интересно отметить, что гены рецепторов плацентарных ростовых факторов (EGF-R) и цитокинов (с-fms и LIF-R - рецептор фактора ингибирования лейкемии) активируются одновременно или даже раньше, чем гены соответствующих им продуктов.

В клетках ТБ, контактирующих непосредственно с децидуальными клетками эндометрия, важную роль играют гены интегринов, продукты которых обеспечивают контакт зародыша с внеклеточным матриксом. В зависимости от расположения в бластоцисте клеток ТБ и их функций спектр интегринов может меняться. Так, клетки проксимальных отделов ТБ начинают экспрессировать ген антигена гистосовместимости G (HLA-G) - мажорный антиген 1-го класса, который обеспечивает толерантность матери по отношению к плоду. Показано, что HLA-G-позитивные клетки ТБ секретируют больше ферментов гелатиназ и меньше фибронектина, чем HLA-G-негативные клетки. Нарушение экспрессии интегриновых генов ведет к поверхностной имплантации, что в конечном счете может быть причиной преэклампсии (гестоза).

ГЕНЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ИНВАЗИЮ ТРОФОБЛАСТА

Уже через 48 ч после оплодотворения in vitro отмечается экспрессия цитоки-новых генов, таких как интерлейкины (IL-II, IL-VI), TGFβ, а также гена фактора некроза опухоли α (TNFα). При этом высокая концентрация продукта IL-1α, как показывает опыт работы клиник ВРТ, является прогностически благоприятным признаком удачной трансплантации после оплодотворения in vitro. Другим благоприятным признаком является активация генов простагландинов (E2 и PAF). Важной для имплантации и поддержания беременности на всем ее протяжении является активация ТФ, сцепленного с Х-хромосомой, гена ХГ, который стимулирует продукцию прогестерона желтым телом.

Продукты цитокиновых генов принимают активное участие в инвазии эндометрия. Так, IL-1β включает гены семейства матриксных металлопротеиназ (MMP 1-9) - ферментов, обладающих выраженными лизирующими свойствами. Последние синтезируются в виде проферментов, которые активируются только на поверхностной мембране клеток ТБ и разрушают коллагеназу IV внеклеточного матрикса базальной эндометриоидной мембраны, облегчая процесс инвазии. Помимо IL, к генам «инвазии» относят также инсулиновый ростовой фактор-II (IGF-II), гены семейства связывающих белков (ген BPs), ген эндотелина (ET-1), активно стимулирующего инвазию ТБ в I триместре беременности.

Активация в ТБ гена сериновой протеазы (плазминогенного активатора урокиназного типа uPA) включает протеиназный каскад [uPA - плазмин - гены семейства матриксных металлопротеиназ (ММР 1-9)], следствием чего являются дальнейшее локальное разрушение межклеточного матрикса и лизис децидуальных клеток.

ГЕНЫ, ЛИМИТИРУЮЩИЕ ИНВАЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ТРОФОБЛАСТА

Единственным геном ТБ, который препятствует процессам инвазии, является ген TIMP-3, продукт которого в ТБ блокирует действие металлопротеиназ (ММР 1-9), разрушающих межклеточный матрикс.

Другие гены этого семейства (TIMP-1, TIMP-2) экспрессируются клетками эндометрия. Их продукты полностью блокируют процесс инвазии, формируя стабильные комплексы с активными формами коллагеназ (ММР 1-9). Пролиферация клеток ТБ и его инвазия полностью блокируются ферментом гена TGF -β, а также цитокином LIF, блокирующими протеиназную активность клеток ТБ.

ГЕНЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ

Включают ген фактора активации тромбоцитов (PAF), ген простагландина Е2, ген колониестимулирующего фактора (CSF), а также провоспалительные цитокины IL-1 и IL-6.

Все вышеприведенные сведения о генетических механизмах имплантации были получены главным образом путем анализа продуктов экспрессии соответствующих генов в образцах питательной среды, в которой культивировали оплодотворенные яйцеклетки человека. Оставалось, однако, неясным, образуются ли продукты соответствующих генов под контролем генома зародыша, или они синтезируются на матрицах РНП-комплексов, синтезированных еще в процессе оогенеза, то есть имеют материнское происхождение. Этих недостатков лишена другая экспериментальная модель - ЭСК человека. Такие клетки свободны от продуктов экспрессии материнских генов, так как их получают при культивировании ВКМ или ТЭ. Их неограниченное количество в культуре позволяет проводить прямой молекулярно-генетический анализ работающих генов.

Транскрипционный профиль дифференцирующихся стволовых клеток трофобласта

Важные успехи, связанные с пониманием генетических механизмов дифференцировки клеток, были достигнуты в опытах с ТБ. При культивировании in vitro такие клетки агрегируют с образованием сфер - «эмбриоидных телец», напоминающих размерами и формой бластоцисты. Введение в такие пузырьки специфических малых РНК (siRNA) позволяет направленно выключать определенные гены соответствующих метаболических цепей и изучать их влияние на дифференцировку.

Так, выключение генов тотипотентности OCT4, SOX2, NANOC и одновременная активация генов BMP4, CDX2, CGA, CGB, EOMES, GCM1, GATA2, ID2 в ЭСК человека определяют начало их дифференцировки в клетки ТЭ. Важная роль в выборе «трофобластического» пути дифференцировки ЭСК отводится гену ростового фактора BMP4.

Другим критическим геном дифференцировки клеток ТБ, определяющим их пролиферацию и тотипотентность, оказался ген ростового фактора фибробластов - FGF2, который также индуцирует включение генов инсулиноподобных ростовых факторов IGF2 и IGF β. Последовательность включения генов ТБ зависит от содержания кислорода.

Формирование ворсин хориона и плаценты

Для эмбриогенеза человека характерно очень раннее обособление провизорных органов. Уже во время имплантации возникает внезародышевая мезодерма, выстилающая полость бластоцисты и участвующая в образовании хориона. Многочисленные ворсинки хориона на поверхности плодного яйца глубоко врастают в стенку матки, разрушая сосуды эндометрия. В децидуальной ткани возникают лакуны с материнской кровью, в которых плавают трофобластические тяжи, образующие первичные ворсинки. Врастание в трофобластические тяжи внезародышевой мезодермы ведет к образованию вторичных ворсин (13-14-й день развития). Клетки наружного слоя ТБ образуют синцитий, а внутренний слой представлен камбиальными клетками цитотрофобласта (клетки Лангханса). Именно эти клетки, сохраняющие митотическую активность на протяжении всей беременности, используются для пренатального кариотипирования на препаратах из хориона, приготовленных прямым методом.

Образование ворсин хориона, их васкуляризация и ветвление контролируются VEGF и геном ростового фактора плаценты (PLGF). Первый функционирует преимущественно на ранних сроках беременности с пиком активности на 12-13-й неделях беременности, второй - во II триместре. Для ангиогенеза ворсин важно также наличие факторов ангиопоэтина и ангиостатина. Первые васкуляризированные ворсинки хориона появляются на 5-6-й неделях беременности, что по времени совпадает с появлением зоны диастолической плотности, соответствующей месту локализации будущего плацентарного диска. Транскрипция генов VEGF и PLGF индуцируется кислородным голоданием.

Методом полногеномного секвенирования в сочетании с экспрессионным анализом идентифицированы новые гены и изучены экспрессионные профили генов плаценты на разных стадиях эмбриогенеза человека. Так, при сравнении экспрессионных профилей клеток плаценты с таковыми 20 других тканей организма были выявлены 54 гена, резко отличающиеся по своей активности от других тканей либо экспрессирующиеся преимущественно в плаценте (CDKN1L, PAPP-A, SPARC, CAV1, TIMP3, HIF2x, IGF2, GPC3). Дальнейшие исследования позволили существенно расширить и уточнить этот «репертуар». Были идентифицированы такие плацентоспецифичные гены, как Tpbp, Plac1, Syncytin, целые семейства плацентарных генов (Gcm1, Mash2, Rhox, Esx16, Cathepsin, PAG, TKDP, Psg, Siglec), гены плаценты, экспрессия которых тесно связана с активностью входящих в их структуру или в регуляторные зоны ретротранспозонов (Peg10, Rtl1, Endothelin B receptor, Leptin, Insl4, Midline1, Pleiotrophin).

Идентифицирован X-сцепленный ген PLAC1, определяющий синтез специфического мембранного белка плаценты, Plac1, который накапливается в клетках цитотрофобласта и синцитиотрофобласта.

Любопытно, что ретротранспозоны и эндогенные ретровирусы, индуцирующие экспрессию многих генов плаценты, неметилированы в клетках ТБ. Особый интерес среди генов плаценты вызывают гены семейства Syncytin (Syncitin 1/HERV-W и Syncitin2/HERV-FRD), белковые продукты которых способствуют слиянию клеток цитотрофобласта с образованием синцитиотрофобласта и тесному контакту последних с клетками эндометрия матки.

Среди других генов плаценты с транспозонрегулируемой экспрессией особый интерес представляют ген PEG10 с пиком экспрессии на 11-12 неделе беременности и ген ароматазы (CYP19), регулирующий обмен эстрогенов. Плацентоспецифический промотор этого гена представлен терминальным ретротранспозоном. Таким образом, ретротранспозоны играют решающую роль не только в активации эмбрионального генома, но и на более поздних стадиях, а их экспрессия важна для регуляции процессов морфогенеза как эмбриональных тканей, так и тканей плаценты.

Некоторые эпигенетические особенности имплантации и плацентации

Характерной особенностью клеток ТБ является выраженная гипометилированность межгенных областей, в частности, ДНК-повторов и районов перицентромерного гетерохроматина. Гипометилированное состояние этих районов приводит к активации находящихся в них ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Продуцируемые ими малые РНК поступают из ТЭ во ВКМ, где блокируют экспрессию генов клеточной дифференцировки, поддерживая, наряду с другими ТФ (OCT4, SOX3, NANOG), тотипотентное состояние клеток эмбриобласта. Гипометилирование генома в клетках ТБ, по-видимому, важно для нормальной имплантации.

Эпигенетические нарушения, возникающие при имплантации и плацентации, нередко являются причиной патологии беременности. Так, гипометилирование генов плаценты PLANGL1 и KCNQ10T1 на материнских хромосомах в клетках цитотрофобласта и мезенхимы ворсин почти в 10% случаях ассоциировано с невынашиванием беременности ранних сроков. Причиной такой патологии, как биродительский полный пузырный занос и хорионкарцинома, является аберрантное гипометилирование генов плаценты NLRP7 и PEG3 соответственно.

Сравнительный анализ паттернов метилирования более 800 генов плаценты позволил обнаружить различия метилирования в 34 локусах при раннем гестозе, в 5 локусах при задержке внутриутробного развития и не обнаружил различий в метилировании генов плаценты контрольной группы и генов плацент с поздним гестозом. Наиболее четкая корреляция с ранним гестозом обнаружена для гена TIMP3, гипометилированный промотор которого указывает на экспрессию этого гена в плаценте. Напомним, что продукты гена TIMP3 ведут к угнетению ферментов семейства металлопротеиназ, определяющих инвазивные свойства ТБ, и, соответственно, препятствуют нормальной имплантации и плацентации, что приводит к гипоперфузии плаценты. Другие гены, мутации или гипометилированное состояние которых ассоциированы с развитием раннего гестоза, включают гены STOX1 и ген-ингибитор плацентарной сериновой протеазы SERPINA3. Различия метилирования CpG-островков отмечены также для генов CAPG, GL12, KRT13, однако их действие на экспрессию генов металлопротеиназ и VEGF значительно менее выражено, чем продукта гена TIMP3. Важно отметить, что гипометилированное состояние промоторных районов генов SERPINA3 и особенно гена TIMP3 можно определить при исследовании ДНК плода в крови матери. Имеются данные об ассоциации гестоза с метилированием промоторной области гена TUSC-3.

ГАСТРУЛЯЦИЯ, НЕЙРУЛЯЦИЯ, ЗАКЛАДКА ОСЕВОГО КОМПЛЕКСА ОРГАНОВ

Во время имплантации и раннего постимплантационного периода главные морфогенетические процессы разворачиваются в ВКМ. Основные этапы дифференцировки клеток ВКМ и ее производные на ранних стадиях развития приведены на схеме (рис. 6-2).

Путем деляминации (расслоения) ВКМ на эктодерму и энтодерму вначале образуется двухслойный, а затем, после формирования первичной полоски, гензе-новского узелка и появления мезодермы, - трехслойный эмбриобласт, возникают желточный мешок и амнион, соответственно появляются амниотическая полость и полость желточного мешка. Зародыш человека во время имплантации (рис. 6-3) представлен мощно развитыми внезародышевыми частями (ТБ, внезародышевая мезенхима, амнион, желточный мешок, амниотическая ножка) и лишь небольшой полоской клеток (дно амниотического пузыря и крыша желточного пузырька), из которой в дальнейшем образуется тело собственно зародыша. Согласно классическим представлениям, формирование первичной полоски (2-я фаза гаструляции) происходит на 15-17-й день развития, главный осевой орган будущего скелета - хорда - закладывается на 17-20-й день развития, тогда же возникает и зачаток будущей ЦНС - нервная пластинка.

Зародыши человека на этих стадиях пока недоступны для прямых экспериментальных исследований. Появившаяся в последнее время технология длительного культивирования зародышей человека до 13-14-го дня (стадия первичной полоски и первых сомитов) делает принципиально доступными для прямых геномных и транскриптомных анализов зародышей человека на этих критических стадиях развития.

До настоящего времени основная информация об имплантирующихся зародышах была получена преимущественно на лабораторных животных (преимущественно мышах). Экстраполяция экспериментальных данных на человека, учитывая выраженные видовые различия процессов морфогенеза у разных млекопитающих, требует большой осторожности. Видовые различия касаются особенностей активации эмбрионального генома и дифференцировки клеток ТБ, механизмов имплантации и плацентации, типа гаструляции (раннее выделение внезародышевой мезодермы), способов формирования основных полостей зародыша и др. В этой связи считаем целесообразным привести в данном разделе только те сведения о механизмах эмбрионального развития во время имплантации и на ранних постимплантационных стадиях, которые уже известны для человека и твердо установлены в экспериментах на разных млекопитающих.

Гены развития внутренней клеточной массы

Решающая роль в процессах раннего морфогенеза принадлежит генам, обеспечивающим синтез сигнальных молекул (их также называют индукторами диффе-ренцировки, или цитокинами), и генам ТФ.

Гены сигнальных молекул представлены 5 основными семействами: SHH, TGF -β, FGF, EGF и IGF.

Ген SHH (Sonic Hedgehog - «Шумный ежик») первоначально обнаружен у дрозофилы (Hh). Причиной названия послужила мутация, которая приводит к появлению личинок дрозофилы, покрытых кутикулярными выростами - колючками. У млекопитающих и человека семейство генов Hedgehog играет важную роль в регуляции процессов гаструляции, нейруляции и закладки осевого комплекса органов. Продукты экспрессии этих генов встречаются уже в клетках ген-зеновского узелка и в первичной полоске, участвуют в дифференцировке нервной системы, внутренних органов (легкие, гонады) и почек конечностей.

Гены семейства трансформирующих ростовых факторов (всего около 30, включая основные TGF-β1, TGF-β5) контролируют процессы дифференцировки как до, так и после рождения. В частности, они ответственны за индукцию мезодермы на стадии гаструлы, пролиферацию миобластов, формирование зачатков сердца. Для продуктов экспрессии генов этого семейства характерны сходная первичная молекулярная структура и посттрансляционный процессинг, в результате которого возникают биоактивные дисульфидные димерные белки. К этому суперсемейству относятся гены, контролирующие такие сигнальные белки, как activin (индукция мезодермы), антимюллеровский фактор (регрессия мюллеровых каналов), Vg1 (индукция мезодермы и первичной полоски), BMP1-BMP4 (индукция нервной пластинки, развитие скелета), Nodal (образование мезодермы, первичной полоски, асимметрии тела), GCNF (нейротрофический фактор глиальных клеток), Lefty (фактор асимметрии тела).

Гены FGF-cемейства (более 10) - факторы роста фибробластов, контролируют индукцию зачатка печени (FGF-1, FGF-8), рост апикальной части (эктодермальной шапочки) почек, конечностей (FGF-2, FGF-4, FGF-8, FGF-10), формирование извитых почечных канальцев (FGF-2), развитие органов чувств, зубов, половых желез (FGF-3, FGF-4, FGF-5).

Гены EGF контролируют гены, ответственные за дифференцировку эпидермального слоя кожи. Гены инсулиноподобного фактора роста (IGF) регулируют уровень энергетического обмена, являются важнейшим компонентом сигнального пути обмена глюкозы (hGH-INS/IGF-r-IGF), определяющего не только активность пролиферативных процессов, но и продолжительность жизни человека.

ТФ гаструляции и нейруляции. Представлены группой гомеобоксных генов, в структуре которых присутствует консервативная последовательность из 180 нуклеотидов (гомеобокс), кодирующая консервативную пептидную последовательность (гомеодомен) из 60 аминокислот, пространственно организованную по типу спираль-петля-спираль (helix-loop-helix). На стадии гаструляции и нейруляции активируется несколько групп гомеобоксных генов: HOX, PAX, SOX, а также гены гомеодоменных белков, относящихся к ТФ.

Семейство HOX включает 38 генов, сгруппированных в 4 кластера (A, B, C, D), расположенных на разных хромосомах (у человека это хромосомы 7, 17, 12 и 2 соответственно). Каждый кластер имеет сходную организацию и включает 13 идентичных позиций (рис. 6-4). Активность генов НОХ вдоль переднезадней оси тела зародыша соответствует положению этих генов в кластере. Так, ареал экспрессии гена НОХА-1 находится в области передней части головы, НОХ-5 - в грудном отделе, НОХ-7 - в поясничном, НОХ-9-12 - в задних отделах туловища.

Семейство РАХ насчитывает 9 генов, белковый продукт которых, помимо гомеобокса и консервативной октапептидной последовательности, содержит парный домен из 128 аминокислот, связывающийся с ДНК. Гены PAX контролируют развитие органов чувств, играют важную роль в закладке осевого комплекса органов, развитии мозга, мезенхимы, производных нервного гребня. Основные характеристики генов РАХ приведены на рис. 6-5.

Семейство SOX имеет более 20 генов, в том числе ген SRY, направляющий развитие по мужскому типу. Характерной особенностью белковых продуктов генов SOX является наличие домена HMG (high mobility group), благодаря которому эти ТФ связываются с ДНК, что приводит к ее конформационным изменениям, это существенно влияет на работу соседних генов. Еще одной особенностью генов SOX является формирование комплексов с другими ТФ при индукции экспрессии специфических структурных генов дифференцировки. Например, комплекс двух ТФ SOX2-OCT3/4 важен для развития ВКМ, SOX2/EF3 контролирует развитие хрусталика глаза; SOX/Collagen II factor - развитие хряща, SOX9/Steroidogenetic Factor 1 - развитие половых валиков.

Другие ТФ эмбрионального развития включают гены семейства POU, которые, помимо гомеобокса, содержат другую последовательность ДНК (75 аминокислот), связывающуюся с ДНК по типу спираль-петля-спираль. Примером такого ТФ являются гены OCT3-4, контролирующие состояние тотипотентности, гены большого семейства гомеодоменных Lim-белков, гены T-box (содержат консервативную последовательность T-box, контролируют развитие конечностей), DLX гены, функционально тесно связанные с генами семейства НОХ.

Образование зародышевой мезодермы (2-я фаза гаструляции)

Главным событием является появление 3-го зародышевого листка - мезодермы, возникновению которой предшествует формирование гензеновского узелка (ГУ) и первичной полоски (ПП), положение которых вместе с зачатком хорды (нотохорды) маркирует переднезаднюю ось зародыша. Зачаток хорды, находящийся непосредственно под первичной полоской, представляет собой первичный организатор, клетки которого продуцируют ТФ, обеспечивающие дифференцировку собственно органов и тканей зародыша (рис. 6-6).

Сигнальные молекулы и ТФ, принимающие участие в контроле 2-й фазы гаструляции, хорошо изучены в эксперименте (рис. 6-7), но молекулярно-генетические механизмы этих процессов у человека только начинают изучаться.

К генам сигнальных молекул, определяющих начало формирования ПП у млекопитающих и, возможно, у человека, относятся Chordin, Nodal и VG1. По мере удлинения ПП за счет пролиферации и миграции клеток эпибласта (первичная эктодерма) на ее переднем конце обособляется группа клеток, дающая начало ГУ, который рассматривают как главный первичный организатор.

В клетках ГУ экспрессируются такие важные морфогены, как Shh, activin, Goosecoid и HNF-3β (hepatic nuclear factor). Продукт гена HNF-3β индуцирует рост нотохорды, индуктора нервной пластики и закладки всего осевого комплекса органов. Функция гомеодоменного ТФ Goosecoid до конца не ясна, но его экспрессия показана в области первичного организатора у разных позвоночных. Возможно, он также принимает участие в активации синтеза сигнальных молекул Chordin и Noggin, которые совместно с продуктом генов SHH вовлечены в становление праволевой асимметрии тела.

До стадии гаструляции (фаза 2) зародыш сохраняет билатеральную симметрию. Однако уже на стадии ПП срабатывают генетические механизмы, приводящие к последующей асимметрии тела и внутренних органов (сердце, кишечник, селезенка, печень, доли легких). Источником асимметрии является неслучайное левостороннее колебание микроворсинок клеток ГУ, направляющее поток главных ТФ (SHH и FGF-8) ГУ в левую часть зародышевого щитка, где создается их более высокая концентрация по сравнению с правой (рис. 6-8, см. цв. вклейку). На 3D-модели эпибласта, полученной из эмбриональных СК человека, установлено, что асимметрия ПП в действительности является следствием запрограммированной экспрессии гена BMP4 и не зависит от действия стимулов материнского организм или экстраэмбриональных тканей [30].

Два гена - T и Nodal - играют важную роль в генезе мезодермальных клеток ПП. Экспрессия этих генов активируется генами ТФ HNF-3β и Goosecoid. Продукты генов T и Nodal регулируют миграцию мезодермальных клеток через ПП и ГУ. Клетки мезодермы, смещаясь в область передней висцеральной энтодермы (гипобласта), дают начало прехордальной пластинке (ПрПл) и нотохорде. Под действием ТФ HNF- 3β в клетках нотохорды активируются гены сигнальных молекул Noggin и Chordin, которые блокируют экспрессию гена ТФ BMP4 и вместе с продуктами генов SHH индуцируют превращение расположенных над нотохордой клеток дорсальной эктодермы в нервные клетки. Те же гены контролируют образование и ПрПл, состоящей из мезодермальных клеток и прилежащих к ним клеток висцеральной энтодермы (гипобласта). ПрПл играет важную роль в развитии лицевого черепа и рассматривается как организатор головы (head organizer). Ее образованию предшествует репрессия ТФ BMP-4 и активация генов Lim1 и Cereberus-related 1, мутации которых, как показывают опыты на мышах, приводят к рождению потомства без головы.

В центре ПП экспрессируется и ген Otx2, контролирующий развитие передних отделов мозга. Клетки ПП совместно с клетками передней висцеральной энтодермы задействованы и в формировании парных зачатков сердца.

Нейруляция и образование сомитов

На этой стадии происходят обособление зародыша от его внезародышевых частей, образование нервных валиков, их смыкание в нервную трубку, возникают первые сомиты, начинаются сегментация и дифференцировка осевой мезодермы (рис. 6-9). Процессы образования нервной пластинки и смыкания нервной трубки контролируются многими семействами ТФ и сигнальных молекул, экспрессирующихся в клетках нотохорды. В самих клетках нейроэктодермы важная роль в процессах формирования нервной трубки принадлежит генам семейства кадхеринов E-CAM и N-CAM, мембранные белки которых обеспечивают адгезию клеток.

Важная роль в сегментации параксиальной мезодермы, образовании сомитов и их дифференцировке принадлежит ТФ SHH, PAX-1, PAX-9. Под действием продуктов гена WNT-1, секретируемых клетками нервных валиков, и генов SHH клеток хорды дорсальная часть эпителиальных клеток сомитов дифференцируется в дерматомиотом, клетки которого начинают экспрессировать собственные ТФ - РАХ1 и РАХ7, paraxis и Noggin. Медиальная часть дерматомиотома вскоре обособляется в миотом, дающий в дальнейшем мышцы спины. Развитие миотома, пролиферация и дифференцировка миобласта направляются генами MyoD, Mef5, Desmin, Mef2.

Часть клеток миотомов в результате экспрессии ТФ РАХ3, рецепторного гена c-met, а также гена ростового фактора печени (HGF) мигрирует из миотомов в сторону будущих почек конечностей. Наконец, внутренний сегмент эпителиальных клеток сомитов под действием ТФ SHH, РАХ1 и РАХ9, а также гена ВМР-4 дифференцируется в клетки склеротома, дающего начало костной ткани позвоночника.

Начальные этапы органогенеза

Основы любой наследственной патологии закладываются и нередко реализуются еще во внутриутробном периоде развития. В настоящее время накоплен обширный материал по генетике развития каждой ткани, системы и органа человека. Для многих из них установлены главные гены и выявлены сигнальные пути, которые определяют и контролируют процессы морфогенеза и функциональное состояние. Современными высокопроизводительными молекулярно-генетическими методами идентифицированы тысячи генов, экспрессирующихся в разных тканях и на разных стадиях развития. Созданы специальные базы данных полногеномной экспрессии генов мозга, других органов (Gene Expression Omnibus, http://www,ncbi,nih.gov/projects/geo). Детально изучаются спектры метилирования генома и отдельных генов в эмбриогенезе человека. Подробная сводка результатов таких исследований с акцентом на их генетическую составляющую приведена в многочисленных монографиях, посвященных нормальному и патологическому эмбриогенезу человека. Генетические механизмы контроля этих процессов представлены в изданиях. Наиболее полная сводка этих данных приведена в существенно дополненном 4-м издании фундаментального руководства по генетике человека В. Фогеля и А. Мотульского.

В данном разделе сделана попытка обобщить известные данные о генетическом контроле органогенеза, выделить, насколько это возможно, главные (ключевые) морфогены, рассмотреть особенности их фенотипического проявления в норме и при некоторых формах патологии.

Основные характеристики эмбрионального периода развития

Эмбриональный период развития включает периоды раннего (20-35 д.р.) и позднего (35-90 д.р.) органогенеза. Хронология этого периода и особенности эмбрионального развития различных тканей, органов и систем зародыша человека подробно освещены в литературе. Быстро накапливается информация и о генетических механизмах контроля развития человека, его отдельных органов и систем.

Рассмотрим некоторые, наиболее изученные в плане генетики развития, системы эмбриона человека и результаты генетических исследований ряда врожденных аномалий и наследственных болезней.

Особенности фенотипического проявления мутаций регуляторных генов

Гены ТФ и гены СМ, рассмотренные в предыдущем разделе, продолжают выполнять ведущую роль по реализации общей программы онтогенеза, канализации путей развития тканей и органов, процессов индукции и дифференцировки.

Результатом экспрессии генов семейства НОХ являются генопродукты, контролирующие формирование осевого скелета и многих внутренних органов в переднезаднем направлении оси тела, Так, гены кластера НОХА активно экспрессируются в задних отделах мозга, в нервной трубке и в тканях мезодермы, регулируют процессы гемопоэза, а также развитие костей конечностей, почек, сердца и мочеполовой системы. Однако мутации гомеобоксных генов у человека приводят к задержке развития и к многочисленным аномалиям дыхательной, сердечно-сосудистой, костной и гемопоэтической систем. Мутации гена НОХD13 зарегистрированы у пациента с синдактилией, нарушением костей стопы; мутация гена НОХА13 вызвала сложный синдром с поражением костей руки, ноги и нарушениями пола (hand-foot-genitalia syndrome), а мутация гена НОХА11 была идентифицирована при синостозе лучевой и локтевой костей в сочетании с нарушениями гемопоэза.

Столь же многообразна экспрессия гомеобоксных генов других классов и семейств (PAX, ZIC, SOX, ZNE, FOX и ТВХ). Известны врожденные синдромы и аномалии развития в случае мутаций 27 различных гомеобоксных генов. Наиболее частые приведены в табл. 6-1.

Очень полиморфны в своем фенотипическом проявлении и гены СМ. Проиллюстрируем это на примере генов известного семейства Hedgehog. Ген SHH (Sonic Hedgehog) рассматривается как один из самых важных регуляторов эмбрионального развития у млекопитающих и человека. Ген начинает экспрессироваться уже на стадии нейрулы в клетках будущей нервной пластинки. Его белковый продукт образует комплекс с холестерином, соединяется с мембранами клеток-мишеней, в которых активирует ТФ Gli, который поступает в ядро и, связываясь с ДНК, индуцирует активность многих генов. Фенотипический эффект комплекса Shh-холестерин определяется его концентрацией в ткани-мишени, стадией развития и эффектами других ТФ. Важная роль SHH доказана в отношении дифференцировки нервной трубки, переднего мозга, нейронов радужки глаза, мезодермы и ее производных, конечностей, сердца. Доминантные мутации гена SHH приводят к тяжелой аномалии - голопрозэнцефалии, при которой нарушается разделение переднего мозга на 2 полушария, отмечаются циклопия и другие аномалии развития головного отдела. Экспрессия SHH в зоне роста почек конечностей приводит к активации другого ТФ - Gli3, нарушение которого является причиной полидактилии (синдромы Крейга и Паллистера-Холл). Продукт гена SHH активирует другой сигнальный белок семейства TGF - Nodal, запускает каскад генов, детерминирующих право-левую асимметрию зародыша. Нарушение этого процесса может быть причиной серьезных аномалий развития сердца.

Таким образом, в период активного органогенеза гены ТФ и СМ продолжают играть важную роль в определении общего плана строения зародыша, его отдельных систем и органов. Фенотипический эффект их продуктов характеризуется исключительным разнообразием, обусловленным их концентрацией в тканях-мишенях, стадией эмбриогенеза, действием других ТФ и СМ.

Генный контроль развития некоторых органов и систем зародыша человека в период органогенеза

НЕРВНАЯ СИСТЕМА

Морфологически, структурно и функционально нервная система, безусловно, самая сложная из всех систем организма. Считается, что ее развитие и функции обеспечиваются экспрессией более 10% генов генома, то есть в два раза большим числом генов, чем любого другого органа. Естественно, что иерархия генных цепей морфогенеза нервной системы достаточно сложна, а число генов ТФ и СМ, обеспечивающих программу развития нервной системы и мозга, велико. Полногеномный транскриптомный и протеомный анализ мозга человека в норме и патологии - одно из важных, стремительно развивающихся направлений современной генетики человека и медицинской генетики.

Головной и спинной мозг развиваются из нервной трубки, клетки нервного гребня (лежащие между нервной пластинкой и эктодермой кожных покровов) дают начало вегетативной нервной системе. Дифференцировка переднего отдела нервной трубки и формирование мозговых пузырей контролируются генами Otx-2 (передний и средний мозг) и Gbx2 (задние отделы мозга). Дополнительные индукционные стимулы дифференцировки среднего и заднего отделов мозга создаются диффундирующими в эти отделы ТФ FGF-8 и Wnt1. Дифференцировка заднего отдела головного мозга на ромбомеры контролируется гомеобоксными генами семейств HOX. Главными генами нейральной индукции считаются гены Noggin, Notch, Wnt, Dorsalin.

Нарушения формирования нервной трубки, миграции нейробластов и клеток нервного гребня вызывают различные аномалии ЦНС у 0,5-1% всех новорожденных. Наиболее известным геном, мутации которого вызывают дефекты заращения нервной трубки у человека, является ген MTHF. Функционально ослабленный (термолабильный) Т-аллельный вариант этого гена встречается почти в 10% случаев.

Большая группа болезней нервной системы обусловлена мутациями генов, контролирующих миграцию нервных клеток (табл. 6-2), формирующих нервные ганглии, вегетативную нервную систему. Более обстоятельные сведения о генетических факторах развития мозга и нейрогенеза можно найти в соответствующих обзорах и монографиях.

КОСТНАЯ СИСТЕМА

Процессы оссификации. Зачатки костной системы появляются на стадии осевого комплекса органов, где они представлены склеротомом [мезенхимные клетки внутренней части сомитов дают начало осевому скелету (позвоночный столб, ребра, грудина, череп), латеральным листкам соматоплевры (кости конечностей и таза) и клеткам эктодермального нервного гребня (лицевой череп)] (рис. 6-10). Формирование костной ткани может происходить либо по типу эндохондральной оссификации и включать промежуточную стадию хряща, либо по типу интрамембранозной оссификации, когда мезенхимные клетки трансформируются непосредственно в остеобласты.

Позвоночник. Решающая роль в эмбриогенезе осевого скелета человека принадлежит гомеобоксным генам семейства (класса) HOX, при этом развитие каждого позвонка контролируется сразу несколькими различными генами HOX (от 2 до 9 генов). Такой «перекрывающийся» контроль обеспечивает высокую надежность программы развития. Тем не менее ошибки в ней встречаются, как, например, при синдроме Клиппеля-Фейля, когда наблюдается уменьшение числа шейных позвонков. Такой дефект, скорее всего, является результатом сбоя в работе HOX- генов, обусловленного их мутациями или повреждающим действием внешних факторов, например, действием ретиноевой кислоты.

Современные данные о генетике развития конечностей, главных внутренних органов (сердце, печень, почки) и органов чувств ранее подробно рассмотрены нами в главе IV 1-го издания Национального руководства по наследственным болезням. Более детальная информация о генетическом контроле развития этих и других органов и систем, а также подробные списки мутаций, ведущих к наследственной патологии у человека, приведены в соответствующих фундаментальных монографиях (например [9, 13, 16]), в обзорах [23, 34] и представлена в Интернете (http://www,ncbi,nih,gov/projects/geo).

ГЕНОМНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ОНТОГЕНЕЗА

Последние 20 лет после расшифровки генома человека отмечены бурным развитием всех разделов генетики человека и медицинской генетики. Благодаря появлению новых эффективных технологий полногеномного секвенирования, транскриптомики, протеомики, метаболомики достигнут существенный прогресс и в понимании молекулярных механизмов индивидуального развития организма, то есть в решении центральной проблемы современной биологии. Немало способствовало этому широкое внедрение молекулярных методов в диагностику наследственных болезней на постимплантационных и особенно - на доимплантационных стадиях. Важно подчеркнуть, что развитие и совершенствование репродуктивных технологий не только имели и имеют важное практическое значение для лечения различных форм бесплодия, но и позволили впервые начать прямые исследования зародышей человека на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Благодаря таким исследованиям впервые получена информация об особенностях функции генома человека на разных стадиях развития (от зиготы до бластоцисты), выяснены молекулярные механизмы первичной эмбриональной дифференцировки и механизмы геномного импринтинга, процессы репрограммирования генома ранних зародышей и отмечен вклад геномных нарушений в патологию репродуктивной функции человека, впервые проведено направленное редактирование генома оплодотворенной яйцеклетки.

Большинство перечисленных морфогенетических процессов связано с процессами реализации генетической информации и касаются контроля экспрессии индивидуальных генов, на долю которых, по современным оценкам, приходится не более 1,5-2% генома человека. Между тем факторы, контролирующие работу всего генома, в настоящее время представляются значительно более сложными и многообразными. К ним относятся повторяющиеся последовательности ДНК, эпигенетические изменения (метилирование ДНК и «гистоновый код»), регуляторные интерферирующие (малые) РНК.

Повторяющиеся последовательности ДНК

Повторяющиеся последовательности ДНК относятся к так называемой факультативной части генома, на долю которой приходится более 50% всей ДНК клетки. Помимо дупликаций генов, псевдогенов и хромосомных сегментов (CNV), значительная часть факультативной ДНК занята некодирующими повторяющимися последовательностями (SINE, LINE, Alu, LTR) - ретро-транспозонами, сходными по структуре с РНК-содержащими ретровирусами, а также тандемными повторами прицентромерной сателлитной ДНК, различными по протяженности и составу, и короткими TTAGGG-повторами, расположенными в теломерных и интерстициальных районах хромосом. Ретровирусные элементы генома человека и октамерная коровая последовательность TTAGGG играют важную роль в регуляции экспрессии генов. Так, ретроэлементы типа SINE (длина 500 п.н., число около 10 000 на геном) располагаются преимущественно в богатых генами областях хромосом, нередко вблизи промоторов генов (CpG-островках), имеют в своем составе сайты связывания для ТФ и для транскрипционного комплекса TFIIIC2. Известно, что все ретроэлементы генома (SINE, LINE, LTR, ALU), а также коровые октамерные повторы TTAGGG важны для обеспечения пространственной организации хромосомной структуры в ядре, для поддержания хромосомных территорий и регуляции экспрессии генов.

В свете дальнейших рассуждений важно обратить внимание на такие характеристики ретроэлементов генома человека, как их высокая концентрация в области перицентромерного хроматина, способность к экспрессии с образованием собственных РНК-копий, а также их связь с процессами эволюции млекопитающих.

Высокое содержание ретротранспозонов в области перицентромерного гетерохроматина хромосом млекопитающих и человека - факт, который пока не имеет достаточно обоснованного научного объяснения.

Имеются данные, что ретротранспозоны могут играть важную роль на начальных стадиях эмбриогенеза. Так, высокие концентрации ретротранспозонных последовательностей были обнаружены в транскриптоме ооцитов и в дробящихся мышиных зародышах первого дня развития. Эта удивительная находка сотрудников Джэксоновской лаборатории (США) позволила предположить, что эндогенные ретротранспозоны могут участвовать в репрограммировании генома оплодотворенной яйцеклетки и регулировать экспрессию многих генов на начальных стадиях эмбриогенеза мышей и, возможно, человека.

В настоящее время считается, что высокое содержание и большое разнообразие различных по длине и составу ДНК повторяющихся и ретровирусных последовательностей необходимы для обеспечения нормальной функции генома. Недавно установлено, что при дроблении зиготы происходит активация гетерохроматина, которая сопровождается экспрессией находящихся в нем транспозонов. Предполагают, что экспрессия транспозонов, особенно ретротранспозона LINE1, необходима для инициации работы всего генома после оплодотворения, а реструктурирование хроматина в пронуклеусах - для активации процессов транскрипции.

Таким образом, особенности экспрессии генов определяются не только эффективностью механизмов транскрипции и трансляции, но зависят от их положения в геноме относительно различных повторяющихся последовательностей и ретро-транспозонов.

Эпигенетические механизмы развития

Исследование эпигенетических (не связанных с первичной структурой ДНК) механизмов регуляции функций генома - одно из бурно развивающихся направлений современной генетики, тесно связанное с решением медицинских проблем. Эпигенетическая регуляция может осуществляться путем метилирования цитозиновых нуклеотидов ДНК, модификаций хромосомных белков-гистонов либо воздействием на транскриптом клетки различных видов регуляторных РНК.

Метилирование цитозина CpG-островков промоторных районов - наиболее универсальный способ эпигенетической регуляции генной экспрессии. Метилирование ДНК контролируется комплексом ферментов - метилтрансфераз DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L. Процесс репрограммирования генома (изменение паттерна метилирования) начинается еще в гаметах, продолжается на ранних стадиях эмбриогенеза (тотальное деметилирование генома зародыша), завершается на стадии морулы-бластоцисты, когда запускается процесс метилирования de novo и по мере дифференцировки клеточных клонов устанавливается свой, характерный для каждой ткани паттерн метилирования. Особенностью метилирования в эмбриогенезе человека является гипометилирование генома цитотрофобласта хориона и плаценты по сравнению с геномом эмбриона. Считается, что такие эпигенетические различия, существенно влияющие на функции генов, важны для нормальной имплантации и плацентации.

Интригующим феноменом эпигенетической регуляции функции генома является геномный импринтинг - аллельные различия функции генов, связанные с их родительским происхождением, то есть получены они зародышем с геномом сперматозоида или яйцеклетки.

С процессом метилирования ДНК тесно связан и другой эпигенетический феномен - изменения гистонов, белков, составляющих протеиновый остов хромосомы и формирующих глобулы [на которые наматывается двойная спираль ДНК (1-й уровень компактизации ДНК)]. При этом эпигенетические изменения гистонов более разнообразны, чем модификации ДНК. Помимо метилирования, аминокислотные остатки гистонов могут подвергаться ацетилированию, фосфорилированию, убик-витинированию. Ацетилирование гистонов характерно для активного состояния гена, а деацетилирование - для репрессированного. Известно более 50 маркеров аминокислотных остатков гистонов, что позволяет предполагать в клетках эукари-от, наряду с эпигенетическим кодом (метилирование ДНК), наличие и гистонового кода. Остается неизвестным, как работает этот код? Какова его структура? Каково место в иерархии контролирующих генетических механизмов онтогенеза?

Малые (микро) РНК (miRNA)

Феномен РНК-интерференции в настоящее время привлекает большое внимание. Его основу составляют небольшие по размеру (20-40 п.н.) одноили двуцепочечные некодирующие молекулы РНК, вызывающие направленную деградацию мРНК генов-мишеней, содержащих комплементарную им последовательность нуклеотидов и, таким образом, блокирующих синтез соответствующих белков на уровне трансляции. Отсюда их второе название - короткие интерферирующие РНК (short interfering RNA - siRNA). В настоящее время известны сотни различных siRNA, многие из которых уже применяются в исследованиях, требующих направленного выключения генов. Некоторые siRNA проходят клинические испытания в качестве возможных противоопухолевых препаратов. Отметим, что siRNA могут не только блокировать, но и при определенных условиях стимулировать транскрипцию генов. Механизм РНК-интерференции рассматривается как главный регулятор экспрессии генов, определяющих ответ клетки на эндогенные и экзогенные воздействия. Роль siRNA в нормальном эмбриогенезе человека остается неизученной. Нельзя, однако, не обратить внимания на то, что по конечному результату действия и многообразию фенотипических эффектов малые РНК напоминают продукты генов ТФ. Более того, siRNA, присоединяясь к ДНК, служат молекулярными маркерами для ДНК-метилирования de novo (РНК-зависимого метилирования ДНК).

Таким образом, экспрессия гена на уровне целого генома представляет собой сложный, многоэтапный и многоуровневый процесс, конечный результат которого зависит не только от эффективности транскрипции и трансляции, но и от модифицирующих воздействий на уровне всего генома, которые связаны с наличием ретровирусных последовательностей, эпигенетических изменений ДНК и гистонов, а также от действия главного регулятора генной экспрессии - интерферирующих микро-РНК. Существенно, что во многих точках онтогенеза эти надмолекулярные пути пересекаются или оказываются комплементарными, создавая глобальную общегеномную сеть регуляции генной активности.

Гетерохроматин и функции генома

Рассматривая геномные, в том числе надмолекулярные механизмы регуляции генной экспрессии, нельзя не обратить внимания на такую сложную по структуре и малопонятную по функциям часть генома, как гетерохроматин. Принято различать конститутивный и факультативный гетерохроматин. Конститутивный гетерохроматин присутствует в центромерных районах всех хромосом человека и представлен особенно крупными блоками в прицентромерных районах длинных плеч хромосом 1, 9 и 16. Классическим примером факультативного гетерохроматина является инактивированная Х-хромосома.

Начиная с 2002 г. появляются данные, указывающие на транскрипционную активность конститутивного гетерохроматина у дрожжей, дрозофилы, мышей, в опухолевых клетках человека, в клетках стареющих клеточных культур и в клеточных культурах, подвергавшихся тепловому шоку. Отмечено, что такие транскрипты сателлитной ДНК размерами от 2000 до 5000 п.н. образуются во всех клетках зародыша мыши (особенно активно в закладках нервной системы на 12,5 д.р.).

В настоящее время перицентромерному гемохроматину (ПЦГХ) отводится важная роль в регуляции функций генома. В пользу такого заключения свидетельствуют следующие данные:

Все приведенные данные, касающиеся функции ПЦГХ, послужили основой для гипотезы «Главной программы развития» (ГПР). Согласно этой гипотезе, ПЦГХ является главным регулятором программы индивидуального развития, а ее основной функциональной единицей являются специфические генерационные ключи развития - протяженные последовательности ДНК, представляющие собой комплекс ДНК ретровирусных элементов и фрагментов первичных транскриптов геномных генов. ПЦГХ - это набор многочисленных специфических генерационных ключей развития, обеспечивающий не только программу онтогенеза, но и сохранение уникальной информации о филогенезе каждого вида. Решающими аргументами в пользу справедливости гипотезы ГПР явились бы идентификация специфических генерационных ключей развития в ПЦГХ и выяснение точных молекулярно-генетических механизмов их воздействия на геном. К сожалению, столь логичная и яркая гипотеза пока не получила дальнейшего развития. Отчасти это связано с методическими проблемами изучения сателлитных ДНК, так как все современные технологии, включая варианты методов секвенирования, не пригодны для молекулярной характеристики полиморфных и хромосомоспецифичных повторяющихся последовательностей. Поэтому прицентромерные районы хромосом остаются «белыми пятнами» или «черными дырами» в геноме человека, и их функции до сих пор загадочны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспрессия отдельных генов человека происходит в мужском пронуклеусе, однако геном зародыша становится функционально активным и начинает контролировать развитие со стадии 4-8 бластомеров. Выделены и частично охарактеризованы семейства генов, контролирующих дробление, первичную дифференцировку, процессы имплантации и плацентации.

Методами полногеномного секвенирования, анализа экспрессионных профилей и паттерна метилирования идентифицированы многие гены, определяющие закладку, дифференцировку и формирование отдельных органов, тканей и систем. Программа активации/репрессии индивидуальных генов реализуется в соответствии с более общей программой эпигенетического репрограмирования генома зародыша, которая включается вскоре после оплодотворения. Генетический контроль процессов онтогенеза реализуется как на уровне индивидуальных генов, так и всего генома. Если на генном уровне этапы реализации генетической информации становятся понятными, то изучение геномной регуляции значительно сложнее. Помимо ТФ и генов CM (индукторов), она представлена повторяющимися последовательностями ДНК, включая вирусоподобные последовательности - ретротранспозоны, эпигенетическими изменениями на уровне ДНК (метилирование цитозина), модификациями гистонов («гистоновый код») и регуляторными интерферирующими (малыми) РНК. Выяснения регуляторных молекулярно-генетических механизмов эмбриогенеза человека имеет важное значение для понимания первичного звена хромосомных и генных болезней человека, их профилактики, ранней диагностики и лечения.

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Термин «эпигенетика» был предложен в 1942 г. эмбриологом Конрадом Халом Уодингтоном, объединившим два других термина - «эпигенез» и «генетика» с целью показать, что генотип реализуется в фенотип благодаря включению многих модифицирующих факторов. Термин «эпигенез» ранее применялся в эмбриологии для описания постепенного формирования органов и тканей из недифференцированной массы клеток, но он не учитывал влияния всего разнообразия генетических факторов. Уодингтон подчеркивал, что «эпигенетический фон лежит в основе развивающегося организма и представлен всем комплексом взаимодействий между ДНК, белками, внешними и внутренними стимулами». По его определению, «эпигенетика - раздел биологии, который изучает причинно-следственные взаимодействия между генами и их продуктами, и как они реализуются в определенные фенотипы». В то время вряд ли кто-то мог представить, насколько интересной и плодотворной окажется эта новая наука.

В настоящее время совершенно очевидно, что геном человека содержит информацию двух видов - генетическую и эпигенетическую. Генетическая информация - руководство по созданию живого организма, а эпигенетическая - данные о том, как, где и когда она должна быть реализована. Эпигенетика исследует изменения в экспрессии определенных ДНК-последовательностей, которые нельзя объяснить классическими мутациями и/или структурными нарушениями. Таким образом, эпигенетику можно рассматривать как более высокий уровень генетической организации и регуляции, который нельзя объяснить в рамках «центральной догмы» молекулярной биологии.

Сейчас эпигеномика представляет собой одну из самых сложных и комплексных областей биологии: метилирование ДНК, и не только СрG, но и CpH; модифицированные цитозины - 5hmC, 5fC, 5caC; гистоновый код; метилчувствительные и нечувствительные ТФ и модифицирующие белковые и РНП-комплексы; метилирование 6mA (ApH) и редактирование РНК, транскрипционно индуцированный сплайсинг, РНК-интерференция и несметное количество некодирующих РНК, которые осуществляют взаимосвязь и регуляцию всех эпигенетических компонентов. Все перечисленные факторы принимают участие в регуляции работы генов в онтогенезе и ответе на внешние и внутренние стимулы, а исследования все углубляются, и трудно себе представить, какие новые эпигенетические факторы будут выявлены и какую роль в жизнедеятельности организма они играют.

Основные эпигенетические механизмы, регулирующие экспрессию генов

В последнее время показано, что развитие патологических процессов могут определять не только генетические, но и эпигенетические факторы. Среди них - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидной последовательности. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов включают: метилирование цитозина в CpG-динуклеотидах, посттрансляционную модификацию гистонов, обмен гистонов и их вариантов, АТФ-зависимый ремоделинг хроматина и различные типы некодирующих РНК, участвующих в инактивации и экспрессии генов (табл. 7-1). Выделяют три основных эпигенетических механизма регуляции экспрессии генов: метилирование ДНК, модификации гистонов и РНК-интерференцию. Эти механизмы вовлечены в регуляцию экспрессии и инактивации генов на уровне транскрипции посредством плотности упаковки ДНК и гистонов в хроматин. Экспрессия генов тесно связана с состоянием хроматина. Для активного хроматина (эухроматина) характерны свободное расположение нуклеосом, присутствие факторов ремоделирования хроматина, более свободный доступ эндонуклеаз к ДНК, репликация локуса ДНК в начале S-фазы и пространственное перемещение (выпет-ливание) хроматина в районах конститутивного гетерохроматина. Неактивный хроматин (гетерохроматин) обладает противоположными характеристиками.

Эпигенетические метки, такие как метилирование ДНК и модификации гистонов, могут копироваться в S-фазе, и, следовательно, эпигенетическую информацию можно передать через ряд последовательных клеточных делений. Не следует забывать, что эпигенетическая регуляция - крайне сложный комплексный процесс, во время которого все три основные составляющие взаимодействуют. Так, метилирование ДНК может вызвать деацетилирование и метилирование (деметилирование) гистоновых белков. Метилирование (деметилирование) гистонов может привести к метилированию ДНК. Некодирующие РНК сами по себе и в составе сложных белковых комплексов могут вызывать метилирование ДНК и модификацию гистонов, а также напрямую инактивировать тот или иной ген посредством РНК-интерференции (блокирование трансляции или деградация мРНК).

Метилирование/деметилирование ДНК

Метилирование ДНК остается первым и одним из основных факторов регуляции экспрессии генов, чей диагностический и прогностический потенциал раскрыт еще не полностью. В 1948 г. Rollin Hotchkiss выделил 5-метилцитозин в составе ДНК из тимуса теленка, хотя пятый нуклеотид, 5-метилдезоксицитидин, был впервые описан в ДНК из туберкулезной бациллы в 1925 г. Российский ученый Б.Ф. Ванюшин еще в 1959 г. определил природу метилируемых последовательностей ДНК у разных видов организмов и предположил, что «метилирование ДНК контролирует все генетические процессы в клетке». Robin Holliday в 1975 г. обосновал роль метилирования ДНК в регуляции работы гена и предложил термин «эпимутация», а в 1979 г. определил вклад метилирования ДНК в процесс канцерогенеза.

Метилирование - обратимая ковалентная модификация ДНК, при которой цитозиновый остаток в CрG-динуклеотиде метилируется в позиции С5 пиримидинового кольца. Метилирование цитозиновых остатков происходит с помощью ДНК-метилтрансфераз (DNMT), переносящих метильную группу S-аденозилметионина. Такая модификация стабильно поддерживается в ряду клеточных делений. Последнее обеспечивает целое семейство ДНК-метилтрансфераз. Метилирование de novo осуществляют DNMT3a и DNMT3b. Поддерживающее метилирование выполняет DNMT1, которая метилирует СрG-динуклеотиды комплементарной неметилированной цепи ДНК, превращая гемиметилированную ДНК в гомометилированную.

Мишенью метилирования в ДНК является цитозин, входящий в состав CpG-динуклеотидов. В геноме существует два типа распределения CpG-динуклеотидов: рассеянные CpG, присутствующие в виде одиночных динуклеотидов и составляющие около 80% их общего числа, и районы обогащения CpG, называемые CpG-островками (рис. 7-1).

Одиночные CpG чаще всего обнаруживают в межгенных и реже - в транскрибируемых последовательностях. CpG-островки располагаются вблизи структурных генов, преимущественно в 5'-районах, и содержат регуляторные последовательности, характерные для промоторных областей. CpG-островки присутствуют в промоторных районах 60% генов и составляют от 0,5 до 1,5 т.п.н. Содержание С+G превышает 60%, а соотношение CpG/GpC не должно быть ниже 0,6. За редким исключением (импринтированные гены) CpG-островки промоторных районов в нормальных тканях неметилированы, что свидетельствует о функциональном состоянии гена. Как показали недавние исследования, CpG-островки, подвергающиеся дифференциальному метилированию при патологии, могут иметь не только каноническую локализацию, но и располагаться в межгенных областях, первых экзонах и интронах генов. Тканеспецифические гены, как правило, не имеют в своих промоторах CpG-островков. В них присутствуют одиночные CG-динуклеотиды, степень метилирования которых варьирует в широких пределах в разных клетках и тканях и препятствует локальному связыванию факторов транскрипции, хотя существуют ТФ, которые не чувствительны к метилированию и могут связываться с промоторными районами генов, повышая их экспрессию.

В последнее время выяснилось, что метилирование цитозина в стволовых, нейрональных и некоторых других типах клеток возможно не только в CpG, но и в СрН, где Н может быть любым нуклеотидом, кроме G. Вполне вероятно, что такое метилирование тоже функционально, так как оно консервативно в различных тканях и негативно коррелирует с экспрессией гена. Кроме того, метилсвязывающий белок MeCP2, которому достаточно одного метилированного CpG для связывания, реагирует также и на СрН. Относительная аффинность MeCP2 с тСрА схожа с mCpG, но значительно ниже с mСрТ и mСрС. Метилирование осуществляется теми же DNMT.

Вплоть до 2009 г. было непонятно, как происходит деметилирование ДНК, как пассивное, так и активное, пока не было обнаружено семейство белков ТЕТ. Белки ТЕТ получили свое название за счет ten-eleven translocation - t(10;11)(q22;q23), обнаруженной в отдельных случаях миелоидной и лимфоцитарной лейкемии и приводящей к образованию химерного гена MLL1/TET1. Белки ТЕТ1, ТЕТ2, ТЕТ3 являются Fe²⁺ и 2-оксоглютарат-зависимыми диоксигеназами, окисляющими 5-mC. Они могут последовательно окислять 5-метилцитозин до 5-гидроксиметил-цитозина (5hmC), затем до 5-формилцитозина (5fC) и далее до карбоксилцитозина (5caC). 5fC и 5caC могут быть вырезаны тимидин-ДНК-гликозилазой и заменены на цитозин с помощью механизма эксцизионной репарации (рис. 7-2, а). Другими возможными механизмами деметилирования являются: 1) декарбоксилирование 5саС; 2) опосредованное DNMT удаление гидроксиметильной группы с 5hmтС и 3) деаминирование 5hmС цитидиновыми деаминазами AID и APOBEC до 5hmU, который может вырезаться SMUG1 - урацил-ДНК-гликозилазой. Такой вариант относится к активному деметилированию. В то же время существует механизм пассивного деметилирования (рис. 7-2, б). После репликации метилированной ДНК образуется две цепи, одна из которых остается метилированной, а дочерняя цепь не метилирована. Обычно дочерняя цепь метилируется с помощью поддерживающей метилирование DNMT1. Необходимый для этого процесса белок UHRF1 связывается с полуметилированной ДНК и привлекает DNMT1 для метилирования второй цепи ДНК.

Однако UHRF1 не узнает и не может связаться с 5hmС, а следовательно, DNMT1 не может метилировать дочернюю цепь. В результате в последующих актах репликации цитозин также не будет метилирован, что приводит к постепенному снижению метилирования ДНК.

В то же время окисленные формы 5тС, видимо, имеют какое-то функциональное значение. Их значительно меньше в геноме, чем mCpG (80-90%), так, 5hmC составляет 1-30%, а 5fC и 5caC - 8-10%, в зависимости от типа клеток. 5hmC обычно обнаруживают в районах энхансеров и сайтах гиперчувствительности к ДНКазе I, 5fC - в межгенных районах, в экзонах и неработающих энхансерах, 5caC - в районах, обогащенных большими сателлитными повторами, но все они, в большей или меньшей степени, окружают районы связывания белков с ДНК. В частности, MeCP2 и THA11 могут связываться с 5hmC, а FOXK1, FOXK2, FOXP1, FOXP4 и FOXI3 активно взаимодействуют с 5fC. Все это свидетельствует в пользу их функциональной значимости.

Аналогично метилированию ДНК происходит метилирование аденозина мРНК, тРНК или длинных некодирующих РНК в позиции N6 (6mA). Установлено, что процесс метилирования/деметилирования РНК очень динамичный, осуществляемый комплексом РНК-метилтрансфераз и РНК-деметилазами, которые могут окислить 6mA до 6hmA и 6fA. Нокдаун генов этих ферментов приводит к уменьшению размеров клеток, к их ремоделированию или гибели. Также удалось определить ряд белков, которые взаимодействуют с 6mA. Такая модификация мРНК, по-видимому, играет важную роль в регуляции экспрессии генов, процессах развития, клеточного роста, метаболизма, выживания и межклеточных контактов. Функциональную значимость 6mA, 6hmA и 6fA еще предстоит выяснить.

Обнаружение зависимости между снижением (выключением) экспрессии гена и метилированием его промоторной области является веским доводом в пользу того, что такая модификация ДНК может служить эпигенетическим механизмом регуляции экспрессии генов. Метилирование включает и другие механизмы, способствующие более полной инактивации экспрессии гена.

Структура хроматина и эпигенетически значимые модификации гистонов

ГИСТОНОВЫЙ КОД

Основная структурная единица хроматина - нуклеосома. Она представлена белковым октамером, образованным двумя молекулами каждого из коровых гистонов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4), с которым связан участок ДНК длиной 147 пар нуклеотидов. Структура коровых гистонов эволюционно консервативна, но их N-концевые «хвосты», выходящие за пределы ядра нуклеосомы, могут претерпевать многочисленные посттрансляционные модификации, включая ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и др. (рис. 7-3, см. цв. вклейку). Тип ковалентной модификации гистонов может влиять на структурную динамику нуклеосомы, изменяя степень доступности ДНК. Ацетилирование гистонов ослабляет межнуклеосомное взаимодействие, а также взаимодействие нуклеосомы с линкерной ДНК, что приводит к большей доступности ДНК. Метилирование гистонов не изменяет суммарный заряд нуклеосомы, но обе эти модификации играют важную роль в привлечении белков, которые регулируют различные процессы, требующие доступа к ДНК. Модификации гистонов, их качественный состав и специфический набор (гистоновый код) определяют активацию или инактивацию гена(ов) или создают дополнительный уровень регуляции экспрессии генов. Под гистоновым кодом подразумевают разнообразный набор модификаций гистоновых «хвостов», определяющий функциональное состояние гена. Гистоновый код - второй эпигенетический механизм, с помощью которого пишется программа каскадного включения-выключения генов, передающаяся по наследству от клетки к клетке. При этом информация о белках, записанная в самой ДНК, остается в сохранности.

Посттрансляционная модификация гистонов может модулировать структуру хроматина, ослабляя взаимодействие гистонов с ДНК, и тем самым активировать транскрипцию. Модификации гистонов могут происходить последовательно или в комбинации друг с другом и, таким образом, привлекают хроматинсвязывающие белки для выполнения специфических задач. Вместе с метилированием ДНК ковалентные модификации гистонов определяют эпигенетическое поддержание и контроль экспрессии генов.

МЕТИЛИРОВАНИЕ/ДЕМЕТИЛИРОВАНИЕ ГИСТОНОВ

Метилирование гистонов и ДНК создает основу для долговременного эпигенетического поддержания уровня экспрессии генов. Наиболее распространенный тип метилирования гистонов - метилирование лизина. Образование гетерохроматина происходит в результате одновременной работы гистонлизиновых метил-трансфераз (НК-МТ) и деацетилаз гистонов (HDAC) и включает модификацию лизина 9 гистона Н3 (H3K9). Триметилирование H3K9me3 стабилизирует нуклеосомы, привлекает гетерохроматиновый белок Н1, необходимый для плотной упаковки хроматина, что приводит к отсутствию транскрипции. Н3К9me3 коррелирует с инактивацией Х-хромосомы и конденсированным состоянием хроматина (структурный и факультативный гетерохроматин). Кроме того, маркером факультативного гетерохроматина служит триметилированный лизин 27 гистона Н3 (H3K27me3). Метилирование лизина 20 гистона Н4 (Н4К20) ингибирует ацетилирование лизина 16 гистона Н4 (Н4К16). Это свидетельствует о том, что метилирование Н4К20 действует как эпигенетическая метка репрессии. Таким образом, метилирование Н3К9, Н3К27 и Н4К20 - основная модификация гистонов, соответствующая гетерохроматину и крупномасштабной репрессии транскрипции. Кроме того, при согласованном метилировании Н3К9 и ДНК может сохраняться долговременный статус негативной регуляции транскрипции (рис. 7-4, см. цв. вклейку).

Метилирование определенных остатков гистонов в эухроматиновых районах противодействует многочисленным механизмам инактивации генов в эукариотической клетке. Метилирование лизина 4 гистона Н3 (Н3К4) специфично нарушает опосредованное Suv39h1 метилирование Н3К9, закрывая, таким образом, основной путь образования гетерохроматина. Образованию дополнительных гетерохроматиновых районов также препятствует метилирование лизина 79 гистона Н3 (Н3К79). Оно предотвращает ассоциацию инактивирующих белков Sir с активно экспрессирующимися генами. Таким образом, Н3К4 и Н3К79 участвуют в установлении эухроматинового состояния, поскольку их метилирование препятствует распространению гетерохроматиновых районов. Метилирование лизина 36 гисто-на Н3 (Н3К36) обнаружено в районах, где транскрипция благополучно идет или только что завершена. Триметилирование Н3К4 сохраняется до 5 ч после элонгации транскрипции, создавая некую форму кратковременной транскрипционной памяти о недавно транскрибированных генах. Таким образом, метилирование определенных остатков гистонов участвует в кратковременном и долговременном поддержании транскрипционного статуса генов, а уровень метилирования может вносить вклад в их регуляцию.

АЦЕТИЛИРОВАНИЕ/ДЕАЦЕТИЛИРОВАНИЕ ГИСТОНОВ

Ацетилирование - обратимая модификация лизинов в N-концевых доменах коровых гистонов. Известно, что N-концевые домены гистонов участвуют в инактивации генов с образованием суперконденсированных нитей хроматина, тогда как их ацетилирование приводит к локальной деконденсации хроматина, необходимой для процессов, связанных с переупаковкой ДНК: транскрипции, репликации, репарации, рекомбинации. Например, ацетилирование Н4К16 регулирует структуру хроматина и его взаимодействие с белками. Усиление ацетилирования гистонов стимулирует транскрипцию, а деацетилирование приводит к полной инактивации генов (см. рис. 7-4 на цветной вклейке). Ацетилирование/деацетилирование может быть прямо связано с отдельными стадиями транскрипции генов через взаимодействие с комплексами, ремоделирующими хроматин. Совместное функционирование деацетилаз и ацетилаз (HAT) гистонов сопровождается динамическими переходами хроматина из одной структуры в другую и приводит к переключению активных и неактивных состояний.

При определенном паттерне распределения сайтов ацетилирования гистонов нарушается пространственная структура нуклеосомной нити, что увеличивает доступность хромосомных доменов для регуляторных белков. В результате белки системы транскрипции получают доступ к промоторам и могут инициировать транскрипцию. Показано, что транскрипция матриц с гиперацетилированными нуклеосомами происходит быстрее, чем на матрицах без таковых.

Если суммировать сведения, то к маркерам активации гистонов, которые связаны с эухроматином и повышением генной экспрессии, можно отнести ацетилирование лизинов в гистонах H2A, H2B, H3, Н4: ацетилирование лизина 9 (H3K9), лизина 14 (H3K14), лизина 5 (H4K5) и лизина 16 (H4K16); метилирование лизинов H2BK5, H3K4, H3K36 и H3K79; фосфорилирование треонина 3 в гистоне H3 (H3T3), серина 10 в H3 (H3S10), серина 28 (H3S28) и серина 1 в гистоне Н4 (H4S1) и убиквитинилирование лизина 120 гистона Н2В (H2BK120). К гистоновым маркерам, которые коррелируют с гетерохроматином и репрессией генов, относятся: низкий уровень ацетилирования гистонов; метилирование H3K9, H3K27 и H4K20; убиквитинилирование лизина 119 гистона Н2А (H2AK119); сумоилирование лизина 126 гистона Н2А (H2AK126), лизинов 6 и 7 гистона Н2В (H2BK6/ H2BK7).

ВЛИЯНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК НА СТРУКТУРУ ХРОМАТИНА

Фактором, в значительной степени определяющим структуру и функции хроматина, считают модификацию его компонентов: ацетилирование гистонов приводит к деконденсации и активации, а метилирование ДНК ведет, напротив, к конденсации и инактивации. Таким образом, характерные черты активного хроматина - гиперацетилирование гистонов и отсутствие 5-метилцитозина в ДНК, а неактивного - гиперметилирование цитозина и деацетилирование гистонов.

Реализация эффектов метилирования ДНК происходит через процесс ингибиро-вания транскрипции генов с использованием следующих механизмов. Во-первых, метильные группы могут напрямую препятствовать связыванию ТФ (например, таких, как AP-2, E2F, c-MYC, ATF/CREB-подобных белков, цАМФ-зависимого активатора и NF-kB) с их сайтами узнавания - цАМФ-зависимыми элементами. Второй механизм реализуется через связывание специфических репрессоров транскрипции (метилспецифических белков MeCP2, MBD1-4) с метилированной ДНК. МеСР2 способен связаться с ДНК, содержащей единичный метилированный CpG-динуклеотид. В то же время способность к кооперативному взаимодействию молекул МеСР2 обеспечивает распространение участка связывания МеСР2 за пределы сайта метилированных СрG в результате присоединения все новых молекул. В итоге возникают стерические препятствия к взаимодействию конденсированного хроматина с аппаратом транскрипции. Непосредственный механизм деацетилирования гистонов заключается в том, что МеСР2, связанный с метилированными основаниями, привлекает корепрессорный комплекс mSinЗА/ НDАС, который и осуществляет деацетилирование гистонов. В результате последние приобретают положительный заряд и, соответственно, способность прочно взаимодействовать с витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы компактизуются и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции (рис. 7-5, см. цв. вклейку).

Таким образом, метилирование ДНК и деацетилирование гистоновых белков - взаимодополняющие процессы, участвующие в изменении структуры хроматина определенного хромосомного локуса и приводящие соответственно к отсутствию экспрессии генов без их структурных нарушений. Процессы метилирования и деацетилирования могут происходить как последовательно, так и параллельно.

Необходимо упомянуть еще один вариант состояния хроматина. Исследования хроматина на глобальном уровне, в определенных локусах и в конкретных районах локализации генов, регулирующих процессы развития, показали, что многие нетранскрибирующиеся гены в ЭСК имеют хроматиновые метки, которые обычно ассоциированы с активно транскрибирующимися генами, представленные высоким уровнем ацетилирования гистонов H3 и H4, а также ди- и триметилированием лизина 4 гистона H3. Удивительно, но промоторы этих генов обогащены и репрессирующей транскрипцию меткой, представленной триметилированием лизина 27 гистона H3 (рис. 7-6, см. цв. вклейку). Практически получается, что активирующие и инактивирующие транскрипцию эпигенетические метки хроматина присутствуют в одном и том же месте в одно и то же время.

Такая необычная бивалентная структура хроматина преимущественно возникает в промоторных районах высококонсервативных генов в ЭСК, включая семейства ТФ Sox, Fox, Pax, Irx и Pou. Уникальный паттерн модификации гистонов в ЭСК поддерживает их плюрипотентность и инактивацию тканеспецифических генов за счет доминирующего эффекта метилирования Н3К27 по сравнению с метилированием Н3К4. Таким образом, гены, которые контролируют процессы дифференцировки в ЭСК, расположены в относительно «доступной» конформации области хроматина, которая поддерживается за счет баланса метилирования Н3К27 и Н3К4. Метилирования Н3К9 в районах хроматина, содержащих бивалентную метку, как правило, не обнаруживается, так как оно более характерно для структурного гетерохроматина. Когда ЭСК начинают дифференцироваться, репрессирующая модификация гистона Н3 снимается и экспрессия генов запускается. Необходимо отметить, что ряд генов, которые осуществляют начальные этапы дифференцировки ЭСК, не имеют бивалентной хроматиновой метки, хотя располагаются в районах доступного хроматина и временно инактивированы. В дифференцированных и прогениторных клетках триметилирование H3K27 присутствует в промоторных районах многих нетранскрибирующихся генов, но меток активного хроматина уже не обнаруживается. Это вариант регуляции генов в плюрипотентных клетках, где многие тканеспецифические регуляторные гены эпигенетически помечены для последующей экспрессии, но в ЭСК находятся в состоянии «низкого старта».

Некодирующие РНК и РНК-интерференция

Некодирующие РНК (нкРНК), долгое время считавшиеся транскрипционным шумом, уже более 10 лет признаны одним из механизмов транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Описано участие нкРНК во многих клеточных процессах, необходимых для нормального функционирования организма, кроме того, нарушение их экспрессии характерно для целого ряда заболеваний. К настоящему времени нкРНК обнаружены в клетках всех эукариот, причем их количество коррелирует с биологической сложностью организма. Так, гены нкРНК покрывают более 70% генома человека против всего 2% белок-кодирующих генов. Широкая представленность, межвидовая консервативность и локализация генов нкРНК в активной части генома указывают на функциональную значимость нкРНК. В зависимости от длины транскриптов выделяют короткие нкРНК (20-200 нуклеотидов), из которых наиболее известны микроРНК и длинные нкРНК (от 200 нуклеотидов). Кроме того, некоторые нкРНК домашнего хозяйства, такие как малые ядерные и малые ядрышковые РНК, малые РНК, происходящие из транспортной РНК, способны выполнять регуляторные функции в клетке, что позволяет относить их одновременно к обеим группам нкРНК.

РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ И МикроРНК

Обширный класс регуляторных РНК млекопитающих составляют очень короткие (19-25 нуклеотидов) молекулы, получившие название микроРНК (miРНК), и короткие интерферирующие РНК (siРНК). Предшественниками miРНК являются эндогенные короткие шпилечные структуры, а их мишени - другие локусы со сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью, где miРНК вызывают репрессию трансляции. siРНК образуются из более длинных двунитевых РНК или длинных шпилек, часто экзогенного происхождения. Их обычные мишени - гомологичные последовательности в том же локусе либо в другой части генома. miРНК и siРНК разрушают мРНК таргетных последовательностей, переводя соответствующие гены в инактивированное состояние. Это явление называют РНК-интерференцией (РНКи). Различие между miРНК и siРНК несколько скрадывается вследствие того, что те и другие образуются посредством одних и тех же метаболических путей и имеют сходные механизмы действия. Получены убедительные данные о том, что miРНК и siРНК могут подавлять трансляцию мРНК (в случае неполной комплементарности) и расщеплять РНК-мишени (в случае полной комплементарности). Показано, что miРНК активно участвуют в процессах онтогенеза, метаболизма жира, секреции инсулина, гемопоэзе, развитии мышц, самообновлении и дифференцировке стволовых клеток, а также в канцерогенезе. Напротив, siРНК изначально рассматривали как систему противовирусной защиты и репрессии транспозонов, действующую по механизму РНКи. Результаты исследований позволяют предположить, что этот класс РНК принимает значительное участие в регуляции работы генов и генома.

У млекопитающих miРНК имеют некоторые уникальные свойства. Около 50% их локализуется внутри интронов генов и транскрибируется совместно из того же промотора, остальные - из интронов и экзонов генов мРНК-подобной, но некодирующей РНК. Координированная экспрессия связана с тонкой регуляцией miРНК трансляции мРНК гена. Большинство гшРНК кластерировано в геноме человека и экспрессируется совместно, что свидетельствует о необходимости более чем одной miРНК для регуляции экспрессии конкретного гена. Большинство miРНК консервативно и располагается в районах, вовлеченных в структурные перестройки хромосом, или в ломких сайтах. Установлено, что это имеет значение в развитии ряда генетических и онкологических заболеваний у человека.

Процессинг miРНК - двухступенчатый процесс расщепления более длинных первичных транскриптов (в том числе антисмысловых), представленных обычными пре-мРНК и некодирующими РНК (рис. 7-7, см. цв. вклейку). Было показано, что первичные транскрипты (длина - 100-1000 нуклеотидов), содержащие miРНК, синтезируются при участии РНК-полимеразы II, полиаденилируются и кэпируются. Процессинг этих транскриптов осуществляет белковый комплекс, состоящий из РНКазы III Drosha и белка DGCR8, связывающего двунитевую РНК. Он расщепляет шпильки РНК, содержащие большие (≥10 нуклеотидов) концевые петли, и вырезает предшественников длиной 65-75 нуклеотидов, называемых пре-miРНК. Затем пре-mi’РНК экспортируются из ядра переносчиком Exportin 5 и Ran-GTP и подвергаются процессингу цитоплазматической РНКазой III (эндонуклеазой Dicer), распадаясь на несовершенные дуплексы размером около 22 пар нуклеотидов с двунуклеотидными З'-выступающими концами.

siРНК также образуются из двунитевых предшественников путем процессинга нуклеазой Dicer, но Drosha не участвует в этом процессе. Возможно, предшественники образуются эндогенно (например, из смысловых-антисмысловых транскриптов). Они могут быть и экзогенного (вирусного) происхождения, как было установлено при открытии siРНК. Они катализируют разрушение эндогенных РНК с полностью комплементарной нуклеотидной последовательностью, что в настоящее время служит широко распространенным приемом изучения функций генов с помощью индуцированного siРНК адресного нокдауна гена.

После расщепления нуклеазой Dicer короткий дуплекс гшРНК раскручивается с помощью хеликаз и одна из его цепей встраивается в состав РНК-зависимого комплекса репрессии (RISC), включающего в качестве основного компонента эндонуклеазу семейства Argonaute (Ago2) и связывающий белок TRBP. Мутации генов белков Argonaute нарушают самые разнообразные процессы развития, такие как созревание ПК, пути дифференцировки стволовых клеток, а также участвуют в развитии рака и аномалий развития у человека. В RISC из прошедшего процессинг дуплекса остается только одна цепь РНК. Выбор одной из двух цепей определяется относительной стабильностью разных концов дуплекса: предпочтение отдается той цепи, 5'-конец которой конъюгирован менее прочно, а комплементарная цепь (гшРНК*), как правило, деградирует. Тем не менее в случае некоторых гшРНК обе цепи объединяются с комплексом RISC, и в таком случае их обозначают как «5p» и «3p» в зависимости от того, с какого конца шпильки они транскрибировались. Комплекс RISC, содержащий функциональную цепь гшРНК, связывается с 3'-нетранслируемым районом (3'-НТР) гомологичной мРНК гена-мишени. Результат зависит от степени комплементарности между участком 2-8 нуклеотидов на 5'-конце гшРНК и З'-НТР мРНК. Полная комплементарность приводит к деградации мРНК посредством РНК-интерференции, наличие 2-3 неспаренных нуклеотидов - к репрессии ее трансляции. Эндонуклеазная активность внутри комплекса RISC опосредована РНКаза-Н-подобным доменом (piwi) в белке Argonaute. Процессинг мРНК заканчивается в Р-тельцах, где она распадается на нуклеотиды.

В качестве механизмов репрессии трансляции служат: 1) блокирование инициации трансляции; 2) блокирование элонгации трансляции; 3) деаденилирование и разрушение мРНК; 4) протеолиз вновь синтезированного белка. Для гшРНК и siРНК характерен еще один способ инактивации экспрессии генов - они могут индуцировать метилирование CpG-островков промоторных районов генов.

Другие малые некодирующие РНК также имеют вполне определенные функции.

Транспортные РНК величиной 76-90 нуклеотидов осуществляют трансляцию мРНК в белок. Стресс-активируемая рибонуклеаза Angiogenin может разрезать зрелую тРНК в антикодоновой петле, что дает две половинки, которые представляют собой tiРНК, несущие информационную функцию. Дальнейший процессинг приводит к получению tRF-3s и tRF-5s (17-18 нуклеотидов), которые ассоциированы с сайтами инициации транскрипции и выполняют функцию гшРНК (рис. 7-8, см. цв. вклейку).

Малые ядерные РНК (snРК), или сплайсосомные РНК, длиной 100-150 нуклеотидов являются ключевой составляющей процесса сплайсинга мРНК - 14 различных вариантов выполняют свою функцию в составе белковых комплексов.

Малые ядрышковые РНК - snoРНК (70-120 нуклеотидов) участвуют в метилировании и псевдоуридилировании рРНК, тРНК, snРНК, дифференциально экспрессируются в различных тканях, осуществляют регуляторные функции.

Малые РНК, обнаруженные в тельцах Кахала, scaРНК, участвуют в процессинге теломеразной РНК.

PIWI-взаимодействующая РНК, piРНК (26-30 нуклеотидов) - эпигенетически и посттранскрипционно инактивирует транспозоны преимущественно в ПК, экспрессируется в мозге.

SpliРНК - РНК, ассоциированная с сайтами сплайсинга (17-18 нуклеотидов), участвует в распределении нуклеосом и/или организации хроматина.

PASRs - малые РНК, ассоциированные с промоторами. РНК-опосредованная инактивация/активация транскрипции.

TSSa-РНК - малые РНК, ассоциированные с сайтом старта транскрипции. РНК-опосредованная инактивация/активация транскрипции.

PROMPTS (promoter upstream transcripts) - предпромоторные транскрипты. РНК-опосредованная инактивация/активация транскрипции.

РОЛЬ ДЛИННЫХ НЕКОДИРУЮЩИХ РНК В ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ

Длинные некодирующие РНК (днРНК) - самый многочисленный класс нкРНК, включающий транскрипты длиной более 200 нуклеотидов с ограниченной способностью кодировать белки или совсем без нее. Как правило, длина днРНК гораздо больше 200 нуклеотидов, а у 2482 днРНК человека превышает 1000 нуклеотидов. За последнее десятилетие в ходе полногеномного анализа идентифицировано огромное количество новых днРНК. На данный момент в геноме человека описано 58 648 генов днРНК, и их число постоянно возрастает.

Несмотря на термин «некодирующие», в ряде исследований показано, что некоторые днРНК содержат короткую открытую рамку считывания (ОРС) и транслируются с образованием пептидов длиной до 100 аминокислотных остатков. К ним относится недавно обнаруженный белок SPAR (small regulatory polypeptide of amino acid response), синтезируемый с днРНК LINC00961. SPAR консервативен у человека и мыши, а подавление его экспрессии вызывает активацию mTORC1, что, в свою очередь, стимулирует мышечную регенерацию. Другая специфичная для мышечной ткани днРНК - DWORF - кодирует функционально активный белок из 34 аминокислотных остатков. днРНК обладают и другими чертами сходства с мРНК. Помимо короткой ОРС, транскрипции РНК-полимеразой II и 5'-концевого кэпа, днРНК также могут состоять из нескольких экзонов, поэтому возможен их сплайсинг с образованием нескольких изоформ с разными функциями. Около 60% генов днРНК млекопитающих транскрибируются с тех же участков, что и белок-кодирующие гены, но в противоположном им направлении, иногда с общего промотора, что обеспечивает их взаимную регуляцию. днРНК могут подвергаться альтернативному З'-концевому процессингу, и тогда они имеют разную структуру. Иногда в клетке присутствуют обе формы днРНК - и полиаденилированная, и неполиаденилированная, например, как у днРНК NEAT1 и MALAT1.

днРНК действуют как регуляторные элементы во многих сложных процессах, включая рост клеток и их дифференцировку, апоптоз, репрограммирование стволовых клеток, контроль клеточного цикла, ответ на тепловой шок, поддержание целостности клеточной структуры, а также в таких базовых процессах, как транскрипция, сплайсинг и трансляция. Кроме того, днРНК участвуют в эпигенетических механизмах - при дозовой компенсации Х-хромосомы, импринтинге, контроле структуры и модификаций хроматина.

днРНК обнаруживаются в ядре, цитоплазме или в обоих компартментах, и их субклеточная локализация отчасти определяет функции в клетке. Так, ядерные днРНК участвуют в модификации гистонов или прямо регулируют транскрипцию генов, в то время как днРНК, сконцентрированные в основном в цитоплазме, часто содержат короткую ОРС и способны к ограниченной трансляции.

Многообразие функций днРНК определяется не только их структурной гетерогенностью и локализацией в разных субклеточных компартментах, но и способностью образовывать такие вторичные и третичные структуры, как петли и шпильки, что приводит к посттранскрипционным модификациям и обеспечивает взаимодействие днРНК с белками и хроматином. Часть днРНК функционирует самостоятельно как рибозимы или рибосвитчи. Однако в большинстве случаев они действуют вместе с белками, образуя РНП-комплексы. Причем разные днРНК проявляют разную степень специфичности. Так, например, белок TERT может образовывать комплекс только с одним партнером - теломеразной РНК (TR), в то время как белки гетерогенных ядерных РНП (гяРНП), PRC2 (Polycomb repressive complex 2) и FUS (Fused in Sarcoma) связываются в клетках с тысячами РНК.

Взаимодействие РНК с белками происходит с использованием нескольких основных механизмов. днРНК могут функционировать как молекулярные каркасы, объединяющие белки в комплексы и инициирующие разные биологические процессы, как проводники, направляющие белки к местам их функционирования, или как ловушки, связывающие белки и препятствующие их присоединению к генам-мишеням. В случае образования хроматином петель днРНК могут действовать как транскрипционные энхансеры.

днРНК действуют как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно. На уровне транскрипции днРНК привлекают факторы транскрипции или эпигенетические модификационные комплексы, действуя при этом in cis или in trans, в зависимости от расположения относительно сайта транскрипции генов-мишеней (рис. 7-9, 1).

Посттранскрипционно днРНК могут регулировать трансляцию мРНК, а также модулировать АС и деградацию мРНК (рис. 7-9, 5 и 6).

Находясь в ядре, днРНК может регулировать экспрессию генов, взаимодействуя с факторами транскрипции и рекрутируя их на специфические участки генома. Благодаря вторичной структуре днРНК взаимодействуют как с геномной ДНК, так и с факторами модификации хроматина. Таким образом, они способны связывать белки и предотвращать их взаимодействие с регуляторными элементами или, наоборот, доставлять их к ДНК и стабилизировать.

Один из наиболее ярких примеров длинных некодирующих транскриптов, играющих важную роль в направленной модификации структуры хроматина, - днРНК, участвующие в подавлении экспрессии гомеозисных, или HOX, генов. Кодируя факторы транскрипции, контролирующие формирование органов и тканей, гены HOX определяют процессы роста и дифференцировки тканей организма. Транскрипция отдельных HOX-генов впервые активируется на ранних стадиях эмбрионального развития и поддерживается эпигенетически белками комплексов Polycomb (репрессорная гистонметилаза, специфичная к H3K27me3, PcG) и Trithorax (активирующая гистонметилаза, специфичная к H3K4me2, TrxG), которые подавляют или активируют экспрессию гомеозисных генов соответственно.

В качестве примера днРНК, регулирующих гены HOX, можно привести HOTAIR (HOX antisense intergenic RNA), которая транскрибируется в обратном направлении с локуса HOXC и вызывает репрессирующее метилирование гистонов в локусе HOXD in trans, рекрутируя Polycomb-зависимый репрессорный эпигенетический комплекс PRC2. днРНК HOTAIR служит молекулярным каркасом по меньшей мере для двух различных гистон-модифицирующих комплексов: 5'-домен HOTAIR связывается с PRC2, в то время как 3'-домен взаимодействует с комплексом LSD1/CoREST/REST. Способность связывать два отдельных комплекса позволяет осуществлять опосредованное РНК соединение PRC2 и LSD1 и координировать взаимодействие PRC2 и LSD1 с гистоном H3 для одновременного метилирования лизина 27 и деметилирования лизина 4 гистона Н3. В комплексе с факторами модификации хроматина обнаружены не только HOTAIR, но и еще более 20 других днРНК, что подтверждает значимую роль днРНК в направленном эпигенетическом программировании генома.

днРНК также принимают участие в геномном импринтинге - эпигенетическом регуляторном механизме, который обеспечивает дифференциальную экспрессию материнских и отцовских аллелей. К настоящему времени описано более 200 таких днРНК. Одна их них - Air связывается с гистон-метилтрансферазой G9a и направляет ее к промотору Slc22a3, вызывая, таким образом, эпигенетический сайленсинг in cis трех импринтированных генов Slc22a3, Slc22a2 и Igf2r.

Некоторые днРНК, такие как Kcnq1ot1 и AIRN, осуществляют непрямой контроль метилирования ДНК, рекрутируя ДНК-метилтрансферазы или другие белки, задействованные в процессах метилирования, к нужным участкам хромосомы.

Основные функции днРНК в цитоплазме - контроль трансляции и стабилизация мРНК. Большая часть этих днРНК связана с полисомами.

Кроме того, как в ядре, так и в цитоплазме днРНК не только выполняют свои основные функции, но и часто служат предшественниками коротких нкРНК, таких как микроРНК и piwiРНК (рис. 7-9, 3). Например, H19, которая участвует в геномном импринтинге, является предшественником miR-675-3p и miR-675-5p, Pvt1 - предшественником miR-1207-5P, а HuR модулирует экспрессию miR-133b, стабилизируя и защищая linc-MD1 от процессинга белком Drosha.

И наоборот, днРНК может служить так называемой губкой для микроРНК (рис. 7-9, 4), если содержит комплементарные им последовательности, что позволяет связывать микроРНК, препятствуя взаимодействию с геном-мишенью. Например, мышечноспецифичная linc-MD1 регулирует экспрессию генов MAML1 и MEF2C путем связывания и подавления активности miR-133 и miR-135, что может приводить к развитию мышечной дистрофии Дюшенна, а днРНК XIST, ингибирующая супрессорную miR-200c, может вносить вклад в развитие рака мочевого пузыря.

Нарушение функционирования днРНК способствует развитию различной патологии. Установлено что нокаут днРНК может приводить к аномалиям развития и когнитивным нарушениям. Предполагается, что днРНК связаны с развитием более 200 заболеваний, среди которых ишемическая болезнь сердца (ИБС), псориаз, болезнь Альцгеймера и различные злокачественные опухоли.

Если к основным эпигенетическим механизмам регуляции экспрессии генов относятся метилирование ДНК, гистоновый код и РНК-интерференция, хотя, на сегодняшний день, РНК-интерференция представляет собой лишь частный случай регуляции экспрессии с использованием различных нкРНК, то в таблице 7-1 «Уровни эпигенетической регуляции: РНК (эпитранскриптом)» указаны еще и другие эпигенетические механизмы, а именно: регуляторные мотивы пре-мРНК, альтернативный сплайсинг, цис- и транс-сплайсинг, индуцированный транскрипцией. Альтернативный сплайсинг и сплайсинг, индуцированный транскрипцией с образованием химерных транскриптов, также относятся к эпигенетическим механизмам, так как эти процессы происходят без нарушения структуры ДНК, но приводят к появлению новых сплайс-вариантов белков и химерных белков с новыми функциями, в том числе и регуляторными, влияющими на физиологию клетки. В связи с этим, ниже более подробно описаны механизмы указанных процессов и их результаты.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ мРНК

АС является эволюционно консервативным механизмом, позволяющим получить несколько белковых изоформ из одной транскрипционной единицы в результате различных вариантов сплайсинга, и достаточно обычен в клетках млекопитающих. Около 95% генов человека могут подвергаться АС, что вносит значительный вклад в разнообразие протеома и объясняет несоответствие между количеством генов (около 23 341) и количеством белков человека (более 90 000). Первичный транскрипт может иметь несколько районов АС, и в результате различных комбинаций ген может кодировать от десятков до сотен различных изо-форм, которые необходимы для таких процессов, как половая дифференцировка, процессы развития различных органов и тканей, апоптоз, для приобретения клетками и тканями их специфических особенностей и для оперативной реакции на изменения окружающей среды. В то же время аберрантный сплайсинг может привести к аномалиям развития, наследственным заболеваниям или раку.

Деление эукариотических генов на экзоны и интроны имеет явные эволюционные преимущества. Однако сложная архитектура гена требует более сложной системы управления сплайсингом, которая состоит из множества регуляторных последовательностей РНК, комплексов РНК-белок и факторов сплайсинга. Хотя сплайсинг состоит из довольно простого набора реакций, задача поиска подлинных 5'-сайтов сплайсинга (5'-сс) и 3'-сс усложняется по следующим причинам. Во-первых, 5'-сс и 3'-сс пары нуклеотидов должны быть точно идентифицированы, особенно в кодирующих областях, где ошибка в один нуклеотид часто приводит к сдвигу рамки считывания, появлению стоп-кодона и последующему распаду бессмысленного транскрипта. Во-вторых, структура гена млекопитающих усложняет и без того трудную задачу выбора правильного сайта вследствие обширного набора альтернативных сайтов сплайсинга, которые могут быть задействованы на разных этапах онтогенеза. В-третьих, экзоны часто бывают небольшими (около 80% экзонов <200 п.н.) и маскируются большими по длине интронными последовательностями. В-четвертых, сплайсинг - это, прежде всего, котранскрипционный процесс, который модулируется скоростью считывания транскрипта РНК полимеразой II (РНК Pol II), поэтому требуется несколько регуляторных механизмов, чтобы должным образом взаимодействовать с процессом транскрипции и обеспечить выбор правильного сайта сплайсинга.

Сложные задачи идентификации сайтов сплайсинга и самого процесса сплайсинга решаются с помощью двух исключительно динамичных макромолекулярных комплексов: большой (U2-зависимой) и малой (Ш2-зависимой) сплайсосом (рис. 7-10, см. цв. вклейку). Каждая сплайсосома содержит пять малых ядерных рибонуклео-протеинов (мяРНП): U1, U2, U4, U5 и U6, содержащих U-богатые мяРНК, входят в большую сплайсосому, которая обрабатывает около 95,5% всех интронов, а мяРНП U11, U12, U4, U5 и U6 входят в малую сплайсосому, аномальная регуляция которой может приводить к патологии развития, нейродегенерации и раку.

Распознавание сплайсосомами элементов консенсусной последовательности в 5'-сс, 3'-сс, сайте ветвления (СВ) и полипиримидинового тракта, расположенного немного выше 3'-сс, является критическим этапом в процессе сплайсинга и модулируется множеством цисдействующих экзонных и интронных энхансеров сплайсинга (ЭЭС и ИЭС соответственно) и экзонных и интронных сайленсеров сплайсинга (ЭСС и ИСС соответственно), которые распознаются вспомогательными факторами сплайсинга, включая Ser/Arg-обогащенные (SR) белки и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (гяРНП). В конечном счете эта сложная сеть взаимодействий РНК и белков приводит к рекрутированию компонентов сплайсосомы с последующим ремоделированием мяРНП, активацией сплайсосом, катализом и образованием сплайсированной РНК.

Наиболее частые SNP/мутации, которые нарушают процесс сплайсинга, располагаются либо в консенсусных последовательностях (5'-сс, 3'-сс и СВ), либо в элементах, которые регулируют рекрутирование сплайсосом, включая ЭЭС, ЭСС, ИЭС и ИСС. Мутации в этих регуляторных элементах хорошо известны при различных заболеваниях. Одной из первых описанных мутаций сплайсинга была точковая мутация, которая создает альтернативный 3'-сс в HBB, кодирующем β-глобин, что приводит к снижению уровня белка, анемии и, соответственно, к β+-талассемии. Мутации в сайтах сплайсинга гена дистрофина приводят к делеци-ям целых экзонов, потере функции дистрофина и мышечной дистрофии Дюшенна. Полиморфные UG- и U-тракты вблизи 3'-сс экзона 9 гена CFTR могут изменять тяжесть проявлений муковисцидоза. Мутации ЭЭС, ЭСС и 5'-сс экзона 10 гена MAPT вызывают лобно-височную деменцию с паркинсонизмом (FTDP-17). В отличие от вышеупомянутых мутаций при моногенных заболеваниях, мутации нескольких последовательностей, важных для сплайсинга в LMNA, гене, кодирующем ламинины A, C, Δ10 и C2, приводят к множественным патологическим фенотипам. Ламинопатии включают гетерогенную группу заболеваний, включая кардиомиопатии, наследственные периферические невропатии, липодистрофии, мышечные дистрофии и синдромы преждевременного старения, всего не менее 14.

Высокопроизводительное секвенирование транскриптома показало, что АС подвержено порядка 90-95% мультиэкзонных генов. АС добавляет еще один уровень сложности с множеством вариантов сплайсинга, которые необходимы на различных стадиях онтогенеза; они представлены альтернативными первым и последним экзонами, сохраненным интроном, кассетным экзоном, взаимоисключающими экзонами и альтернативными 5'- и 3'-сайтами сплайсинга (рис. 7-11, см. цв. вклейку). Кроме того, в процессе АС в 5'- и 3'-нетранслируемых районах могут добавляться или делетироваться ключевые элементы, которые нарушают локализацию, стабильность и трансляцию мРНК.

Пропуск кассетного экзона является наиболее распространенным вариантом АС, но последние исследования показывают, что сохранение интрона встречается почти в 75% мультиэкзонных генов и является посттранскрипционным механизмом для снижения уровня определенных транскриптов/белков на определенных стадиях развития. Взаимосвязь целого набора цисрегуляторных элементов и трансдействующих РНК-связывающих белков позволяет предположить, что АС контролируется «кодом сплайсинга», который необходим в процессах онтогенеза и при изменениях окружающей среды.

Если SNP больше относятся к структурным изменениям ДНК, затрагивающим важные элементы и приводящим к аномальному сплайсингу, то «код сплайсинга» содержит все возможные механизмы эпигенетической регуляции, такие как метилирование ДНК, ремоделирование хроматина и некодирующие РНК. АС также регулируется самим механизмом транскрипции: изменения в скорости транскрипции Pol II повышают или снижают вероятность включения экзонов.

Недавно стало понятно, что организация хроматина, эпигенетические маркеры и выпетливание хроматина также являются регуляторами АС. На уровне ДНК экзоны имеют более высокую плотность нуклеосом по сравнению с фланкирующими интрона-ми, а специфические модификации гистонов маркируют экзоны и интроны. Скорость транскрипции посредством Pol II замедляется перед нуклеосомами, соответствующими экзону, и таким образом регулируется возможность включения отдельных экзонов. Модификации гистонов, которые специфичны для «экзонных нуклеосом», обеспечивают сайты связывания белков, которые рекрутируют факторы сплайсинга именно в эту область хроматина, или белков, которые снижают скорость транскрипции.

Метилирование ДНК также влияет на АС; определена положительная корреляция между метилированием гена и уровнем его транскрипции. Оказалось, что уровни метилирования ДНК экзонов выше, чем интронов, даже если они имеют равноценное содержание CG по сравнению с фланкирующими последовательностями интронов. Таким образом, метилирование ДНК помогает отличать экзоны от интронов.

В настоящее время известно, что три белка передают информацию, закодированную в метилированной ДНК, механизму сплайсинга. Связывание CTCF с ДНК снижает скорость считывания Pol II и способствует включению экзона. В одном из исследований было показано, что не менее 100 альтернативных экзонов, которые содержат сайты связывания CTCF, регулируются именно снижением скорости транскрипции Pol II, что приводит к их включению в мРНК. Но если ДНК метилирована, связывание CTCF невозможно, что приводит к исключению экзона. MeCP2 связывается с метилированной ДНК и снижает скорость транскрипции, что приводит к включению экзона. Еще один механизм заключается в том, что метилирование ДНК индуцирует метилирование лизина 9 гистона Н3 (H3K9me3). Гетерохроматиновый белок hP1 связывается с H3K9me3 и несколькими факторами сплайсинга. На уровне хроматина HP1 накапливается в районах альтернативных экзонов, а факторы сплайсинга, которые связываются с HP1, влияют на включение/исключение этих экзонов.

Если CTCF и MeCP2 модулируют скорость транскрипции Pol II и регулируют АС экзонов, расположенных вблизи их сайтов связывания, то HP1 влияет на связывание факторов сплайсинга с хроматином; они могут связываться с пре-мРНК и таким образом регулировать АС. Вариант регуляции CTCF наиболее ограничен, поскольку напрямую зависит от последовательности ДНК, тогда как MeCP2 и HP1 являются более лабильными регуляторами. Метилирование ДНК достаточно специфично для определенной ткани или стадии развития, а дифференциально метилированные локусы обнаруживаются во многих регуляторных областях по всему геному. Метилирование ДНК влияет на включение около 22% альтернативно сплайсирующихся экзонов в ЭСК мыши. Было установлено, что нокдаун MeCP2 затронул сплайсинг нескольких тысяч альтернативных экзонов. Около 20% регуляции АС экзонов, подверженных метилированию, можно объяснить механизмом, обусловленным HP1. Совокупное количество альтернативных экзонов, на которые воздействуют механизмы CTCF, MeCP2 и HP1, вероятно, представляет только часть всех экзонов, регулируемых метилированием. Существует много других белков, содержащих метил-CpG-связывающий домен, таких как MBD1, MBD2, MBD4 и др., и их влияние на АС еще предстоит выяснить. В районах ряда альтернативных экзонов в 5'- и З'-сайтах сплайсинга располагаются CpG, которые подвергаются метилированию, именно они могут быть важны в определении точек АС. Метилирование ДНК оказывает существенное влияние на сплайсинг альтернативных экзонов, но незначительное - на сплайсинг конститутивных экзонов, хотя нельзя исключить, что и они могут подвергаться АС.

Роль днРНК в процессах АС, таких как H19, XIST, SRA1, EVF2, и MALAT1, впервые была выявлена в 2004 г. днРНК обычно не очень эффективно сплайсируются и экспрессируются значительно слабее, чем кодирующие РНК, но они могут влиять на сплайсинг в результате взаимодействий с факторами сплайсинга, выступать в качестве молекулярных каркасов и/или губок либо активировать/инактивировать другие РНК, вовлеченные в этот процесс.

Было показано, что множество днРНК могут напрямую регулировать AC а механизмы тонкой регуляции распространяются на все стадии экспрессии генов, включая эпигенетический контроль транскрипции, посттранскрипционных процессов, созревание гшРНК и стабильность белка. днРНК, такие как MALAT1, PVT1, XIST и PANDAR, могут взаимодействовать со специфическими факторами сплайсинга - белками SR или гяРНП комплексами. Например, MALAT1 способен взаимодействовать с SR-белками, изменяя уровень их фосфорилирования и/или 3D-структуру генома для индукции процессов, связанных с что приводит к изменению всего профиля AC. В случае повышенной экспрессии днРНК MIAT может связываться с несколькими факторами сплайсинга - SF1, SRSF1, QKI и др., нарушая их обычную функцию, и подавлять АС. Ген MIAT расположен в локусе хромосомы 22q12.1, связанном с шизофренией; он не экспрессируется в мозге людей с этой патологией. В свою очередь, ядерная днРНК MIAT, ассоциированная с инфарктом миокарда, связывает несколько факторов сплайсинга in vitro, в том числе QKI, который является РНК-связывающим белком, регулирует сплайсинг, экспорт мРНК из ядра, стабильность мРНК, трансляцию белка, представлен несколькими вариантами транскриптов и играет роль в генезе шизофрении.

Существует еще два варианта механизма АС: рекрутирование РНК-связывающих белков (РСБ) в регулируемые сайты сплайсинга и связывание с рибосомными и/или сплайсинговыми комплексами. В частности, днРНК SPA может накапливаться и связываться с РСБ, такими, как TDP43, RBFOX2 и гяРНП M, что приводит к изменению АС при СПВ. днРНК INXS может связывать модулятор сплайсинга Sam68 и вызывать сдвиг в АС от BCL-XL к BCL-XS, что приводит к каспазоза-висимому апоптозу в раковых клетках. Было подтверждено, что LINC-HELLP связывает сплайсосомные компоненты или рибосомы и является важнейшим регулятором АС. днРНК могут образовывать РНК-РНК дуплексы с молекулами пре-РНК, чтобы влиять на AC Одним из примеров является SAF (Fas-antisense), которая может образовывать дуплекс с пре-мРНК FAS и при взаимодействии с SPF45 способствовать исключению экзона 6 в FAS. Это приводит к накоплению белка FasΔEх6 (sFas), который предотвращает апоптоз, индуцированный FasL.

Обычно 5'-НТР ZEB2 сплайсируется, сохраняя структуру района, которая не позволяет сканирование рибосомами и, следовательно, предотвращает трансляцию белка ZEB2. Однако транскрипционный фактор SNAIL1 способствует транскрипции антисмысловой последовательности, кодируемой комплементарной цепью локуса Zeb2, прикрывая сайт сплайсинга ZEB2 в 5'-НТР. По-видимому, антисмысловой транскрипт ZEB2 предотвращает распознавание сайта сплайсинга сплайсосомой в результате образования РНК-РНК-дуплекса, и такая конформация способствует включению интрона, расположенного в 5'-НТР ZEB2. Этот интрон содержит внутренний сайт связывания с рибосомой, расположенный рядом с сайтом начала трансляции; распознавание этого сайта рибосомами способствует трансляции ZEB2.

днРНК lincRNA-uc002yug.2 аналогичным образом модулирует AC прикрывая сайт распознавания SRSF1/MBNL1 для более эффективного AС пре-мРНК RUNX1.

Еще одна днРНК, модулирующая AC была обнаружена при болезни Альцгеймера. Pol III-зависимая антисмысловая днРНК 17A начинает транскрибироваться из 3 интрона гена GPR51, кодирующего рецептор GABAB R2, и индуцируется провоспалительными белками. Экспрессия 17А регулирует AС GPR51, приводит к появлению изоформы белка GABAB R2, не имеющей возможности передачи сигнала, но зато с очень сильной способностью инактивации экспрессии канонического полноразмерного варианта GABAB R2, что полностью нарушает передачу сигналов GABAB. Экспрессия 17А повышена в мозге пациентов и, возможно, регулирует сплайсинг GPR51 для сохранения функции мозга.

днРНК могут также рекрутировать белки, которые ремоделируют хроматин, в определенные локусы для регуляции AС генов-мишеней. Локус FGFR2 кодирует не только FGFR2, но и эволюционно консервативную ядерную антисмысловую днРНК asFGFR2, которая стимулирует АС FGFR2, специфичный для эпителия. asFGFR2 может рекрутировать белки группы Polycomb и гистоновую деметилазу KDM2a для создания такой структуры хроматина, которая недоступна для репрессивного адаптивного комплекса сплайсинга хроматина, который необходим для специфического мезенхимального сплайсинга FGFR2.

В клетках человека существует несколько вариантов неканонического сплайсинга, включая межгенный сплайсинг, повторный или рекурсивный сплайсинг (постепенное укорочение протяженного интрона) и сплайсинг, приводящий к образованию кольцевых РНК (кРНК). В кРНК З'-конец экзона лигируется с 5'-концом предыдущего экзона, образуя замкнутое кольцо. Первоначально считалось, что кРНК функционируют как «губки» для микроРНК, а затем было установлено, что они могут взаимодействовать с мяРНП U1. Хотя кРНК преимущественно располагаются в цитоплазме, было показано, что группа кРНК с сохраненными интронами, называемая экзонинтронная кРНК (эикРНК), локализована в ядре и участвует в регуляции транскрипции родительских генов. эикРНК взаимодействуют с U1 мяРНП и Pol II посредством спаривания их комплементарных последовательностей, тем самым усиливая транскрипцию родительского гена. Большое количество эикРНК локализуется именно в участках транскрипции. кРНК может функционировать в качестве регулятора транскрипции, будучи каркасом для белков в ядре. Другая функция кРНК заключается в инактивации сплайсинга мРНК. Поскольку кРНК часто состоит из экзонов, которые также включены в мРНК, очевидно, что кРНК может нарушать сплайсинг мРНК. Канонический сплайсинг пре-мРНК может конкурировать с циркуляризацией экзонов, и этот механизм достаточно консервативен. Родительский ген может регулировать биогенез его кРНК: второй экзон фактора сплайсинга MBL/MBNL1 закольцован и у дрозофилы, и у человека. кРНК, происходящая из пре-мРНК MBNL1, может препятствовать связыванию РСБ с другими транскриптами или конкурировать с каноническим сплайсингом пре-мРНК, что приводит к изменению состава зрелых мРНК, в том числе и MBNL1. Изменение уровня MBL значительно влияет на образование - эффект, зависящий от сайтов связывания MBL. Кроме того, обратный сплайсинг может генерировать кРНК и соответствующую линейную РНК, в то же время образование кРНК может нарушать целостность зрелой линейной РНК и не допускать ее трансляции - явление, известное как «ловушка мРНК».

Малые нкРНК (мнкРНК), полученные из предшественников днРНК, представляют собой молекулы размером менее 50 нт. С момента открытия РНК интерференции с использованием miРНК и siРНК были выявлены и другие типы малых РНК с множеством функций - небольшие фрагменты РНК из тРНК (tsРНК) и из малых ядрышковых snoРНК (sdРНК). Показано, что они регулируют экспрессию генов с помощью множества механизмов, таких как расщепление определенных мРНК, трансляционная или транскрипционная репрессия, ловушка для мРНК, производство вторичных мнкРНК и ограничение трансляции белка. Во время транскрипционной инактивации генов мнкРНК могут запускать процесс формирования гетерохроматина в определенных последовательностях ДНК.

Недавние исследования выявили присутствие зрелых гшРНК в ядре, что свидетельствует о том, что у них в ядре имеются свои функции в дополнение к уже известным цитоплазматическим; был показан активный перенос mi’РНК из цитоплазмы в ядро. Хотя их ядерные функции еще недостаточно изучены, но уже показано их участие в ряде процессов, таких как регуляция нкРНК, инактивация/ активация транскрипции, а это требует участия AGO (белок Argonaft с РНК-азной функцией). Анализ взаимодействий miРНК-мРНК-AGO показал существенное накопление комплекса AGO-miРНК в районах сплайсинга интронов.

По-видимому, как и днРНК, miРНК могут регулировать АС. Их возможное участие согласуется с данными о высокой консервативности последовательностей, примыкающих к альтернативным сайтам сплайсинга, у различных видов. Было показано, что расположение сайтов сплайсинга можно легко изменить как в культуре клеток, так и in vivo, введением антисмысловых малых РНК, что может быть со временем многообещающим подходом к генотерапии миодистрофии, некоторых других наследственных болезней человека, вызванных мутациями сайтов сплайсинга, и потенциально злокачественных новообразований.

Cплайсинг, индуцированный транскрипцией

Необходимо упомянуть такое явление, как сплайсинг, индуцированный транскрипцией (transcription induced chimerism - TIC). Явление межгенного сплайсинга или химеризма, обусловленного транскрипцией, установлено не так давно.

Выделяют два вида сплайсинга: транссплайсинг подразумевает наличие двух различных молекул РНК генов, находящихся на разных хромосомах, циссплайсинг - результат слияния РНК двух близкорасположенных генов в одну объединенную молекулу мРНК (рис. 7-12, см. цв. вклейку).

Хотя транссплайсинг является обычным явлением у некоторых одноклеточных организмов, в митохондриях низших эукариот и в хлоропластах некоторых растений, он оценивается многими исследователями как достаточно распространенный механизм образования химерных и неколинеарных РНК у высших животных. Например, было обнаружено, что РНК человека KLK4 содержит как смысловые, так и антисмысловые последовательности, а некоторые варианты РНК эстроге-нового рецептора ERa и транскрипционного фактора SpI несут дуплицированные экзоны.

Первоначально предполагали, что в образовании химер могут участвовать не менее 400 генов, но их число стало стремительно увеличиваться - от 2 до 5% всех генов может быть вовлечено в процесс межгенного сплайсинга. В 2020 г. уже известно о 39 405 слитных (химерных) транскриптах у человека, которые верифицированы с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, количественной ПЦР, РНКseq и массспектрометрии. А количество химерных длинных некодирующих РНК, играющих определенную регуляторную роль в норме и при патологических процессах, пока оценить невозможно.

Слитные транскрипты, которые не являются продуктом структурных изменений в ДНК, формируются на уровне РНК в результате двух основных механизмов: циссплайсинга и транссплайсинга. Цисслияние транскриптов, таких как транскрипционно-индуцированные химеры (TIC), тандемные РНК-химеры, транскрипционно-индуцированные слияния генов (TIGF), транскрипты «считывания» (readthrough) и циссплайсинга между соседними генами (cis-Splicing of Adjacent Genes - cis-SAGe), являются результатом последовательной транскрипции соседних генов, которые лежат на одной хромосоме, одной нити ДНК и в одинаковой ориентации. Один первичный транскрипт (пре-мРНК) формируется двумя (или более) соседними генами, которые подвергаются циссплайсингу для получения зрелого транскрипта. Трансслияние транскриптов происходит, когда два отдельных транскрипта пре-РНК соединяются вместе путем транссплайсинга. Другими словами, цисслияние транскриптов (cis-SAGe) является межгенным сплайсингом слитной пре-мРНК, транскрибируемой из соседних генов. Транскрипция - первый шаг в экспрессии генов, во время которой фрагмент ДНК копируется в мРНК с помощью РНК-полимеразы, фермента, способного связываться с определенной последовательностью ДНК-промотором. Промотор направляет РНК-полимеразу для идентификации стартового участка транскрипции и инициации синтеза РНК. В большинстве случаев транскрипция заканчивается в регулируемой конечной точке, чтобы избежать прочтения РНК-полимеразой следующего гена. Пространство между соседними генами, называемое межгенным районом, обычно не транскрибируется в пре-мРНК. Во время формирования cis-SAGe сигнал окончания транскрипции игнорируется, межгенная область транскрибируется в пре-мРНК, а затем сплайсируется, как обычный интрон, с образованием слитной мРНК. Необходимыми условиями для формирования cis-SAGe являются: активная транскрипция вышестоящего гена, обход границ транскрипции гена, образование единственной пре-мРНК, содержащей последовательности обоих генов и межгенного района, а также сплайсирование (вырезание интронов и межгенного района) химерной мРНК, которая будет содержать только экзоны обоих генов. Регуляторные аномалии этого молекулярного механизма на всех вышеупомянутых стадиях влияют на конечный результат cis-SAGe.

Еще в 1998 г. появилось сообщение о первой человеческой химерной РНК, GALT-IL11Ra, полученной в результате межгенного сплайсинга двух соседних генов. Родительские гены, галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза (GALT) и α-цепь интерлейкина-11-рецептора (IL-11Ra), расположены в районе хромосомы 9p13. Этот транскрипт представляет собой результат cis-SAGe, состоящий из 22 экзонов, в результате АС между предпоследним экзоном вышележащего гена и вторым экзоном гена, расположенного ниже. Транскрипция мРНК GALT-IL11Ra начинается с промотора первого гена, кодирующего GALT, но первый из двух сигналов полиаденилирования (окончания транскрипции) игнорируется, чтобы продолжить транскрипцию и второго гена. Анализ экспрессии этого транскрипта показал высокие уровни в клеточных линиях LT5, LT6 и костном мозге плода человека, что подтвердило наличие GALT-IL11Ra в нормальных клетках человека. Транскрипт кодирует белок с несколькими доменами, который расположен на клеточной мембране, а его структура содержит часть GALT, присоединенную к аминокислотной последовательности белка IL-1lRa. Функция слитного белка неизвестна и, видимо, отличается от родительских белков, его экспрессия обнаружена в норме в толстой кишке, адипоцитах, яичнике и яичке.

Еще один химерный транскрипт, HHLA1-OC90, обнаруженный в клеточных линиях тератокарциномы человека, представляет собой слияние между вышележащим геном HHLA1, функция которого неизвестна, и ниже расположенным геном OC90, которые локализованы на хромосоме 8q24.22. В физиологических условиях родительские гены транскрибируются со своих промоторов, в то время как транскрипция HHLA1-OC90 индуцируется промотором длинного терминального повтора эндогенного ретровируса человека, расположенного в интроне. Скрининг 50 человеческих тканей и клеточных линий показал, что высокий уровень экспрессии обнаруживается только в линиях клеток тератокарциномы Teral и NTera2D1.

В 2001 г. в 11 тканях человека был идентифицирован химерный транскрипт P2Y11-SSF1 (он же PPAN-P2Y11), гены которого расположены на хромосоме 19p13.1; все экзоны вышерасположенного гена соединяются с последним экзо-ном нижерасположенного. Его экспрессия наблюдалась во всех тканях, но увеличивалась в клетках HL-60 после индукции дифференцировки гранулоцитов. Секвенирование транскриптома позволило выявить его специфическую экспрессию в сердце, щитовидной железе, надпочечниках, яичниках, предстательной железе и яичке.

Существуют и другие химерные РНК в клетках человека, которые не связаны со структурной перестройкой в геноме, такие как CCND1-Trop2, FAS-ERa, CYP3A43-CYP3A4, CYP3A43-CYP3A5 и Yq12-CDC2L2, а также химерная РНК ACTAT1, содержащая последовательности хромосом 1 и 7. Более сложный случай - это 7 вариантов мышиной РНК Msh4, которые все вместе включают последовательности четырех различных хромосом, а некоторые из них содержат как смысловые, так и антисмысловые последовательности одного из геномных локусов.

Химерные РНК обеспечивают дополнительные функциональные возможности генома без соответствующего увеличения числа генов. Химеры, обычно присутствующие во многих тканях, могут представлять собой набор функциональных единиц, участвующих в фундаментальных клеточных механизмах, общих для всех клеток. Например, подвижность клеток и их пролиферативная жизнеспособность страдают в отсутствие химерных транскриптов C15orf57-CBX3 или ADCK-NUMBL.

Целый ряд химерных транскриптов, таких как C21orf59-TCP10L, ARL10-HIGD2A, C15orf57-CBX3, TMED6-COG8, обнаруживаются во множестве тканей и, вполне вероятно, выполняют какие-то специфические функции в различных типах клеток. Химерная РНК ZC3HAV1L-CHMP1A достаточно часто встречается в различных тканях человека и в норме, и при патологии.

ADCK4-NUMBL - химерный транскрипт, который является продуктом цис-сплайсинга между соседними генами. Нокдаун ADCK4-NUMBL с использованием siРНК приводит к полной инактивации химерного транскрипта в клеточной культуре RWPE-1, в то время как экспрессия ADCK4 не изменяется, а NUMBL не определялась изначально. В результате наблюдалось значительное снижение скорости пролиферации и подвижности клеток. Похожий эффект наблюдался в культуре клеток астроцитов в отношении подвижности, но уровень пролиферации не изменился. Вполне вероятно, что этот химерный транскрипт немного по-разному функционирует в различных типах клеток.

Межхромосомная химерная РНК, C15orf57-CBX3, является результатом слияния второго экзона C15orf57 (CCDC32), расположенного на хромосоме 15, с первым экзоном CBX3, расположенным на хромосоме 7. Нокдаун химеры в культуре клеток RWPE-1 и астроцитов привел к значительному снижению пролиферации и подвижности, в то же время экспрессия родительских генов изменена не была.

Когда-то считавшиеся уникальной особенностью неоплазий химерные РНК часто обнаруживаются в нормальных клетках. Именно поэтому появилась точка зрения, что некоторые химерные РНК могут быть функциональными предшественниками генов и что формирование химерной РНК на транскрипционном уровне может быть «пробным» механизмом, прежде чем функциональный элемент закрепится в геноме. Была обнаружена химерная РНК HNRNPA1L2-SUGT1 (H-S), последовательность которой очень похожа на последовательность «псевдогена» MRPS31P5. H-S химерная РНК состоит из первых пяти экзонов HNRNPA1L2 и последних 12 экзонов SUGT1. MRPS31P5 имеет последовательность, аналогичную первым пяти экзонам HNRNPA1L2 и 3-4-му экзонам SUGT1, в то же время MRPS31 не имеет гомологии с MRPS31P5 после 6-го экзона. Анализ показал, что транскрипт MRPS31P5 более похож на химерную РНК H-S, чем его «родительский» ген MRPS31. Эволюционно H-S предшествует MRPS31P5, поскольку он есть у мармозеток (низшие обезьяны), у которых в геноме еще нет MRPS31P5. У человека H-S экспрессируется минимально (в основном в яичниках), а MRPS31P5 экспрессируется достаточно сильно во всех тканях. Инактивация с использованием siРНК H-S в фибробластах мармозетки приводит к такому же фенотипу, как инактивация MRPS31P5 в фибробластах человека, - снижению пролиферации, накоплению клеток на стадии G0/G1, остановке клеточного цикла на стадии G1/S и усилению апоптоза. Кроме того, анализ транскриптома и последующая валидация потенциальных мишеней, расположенных ниже, выявили сигнальные пути, общие для обоих транскриптов. Интересно, что H-S не удалось восстановить фенотип, вызванный инактивацией MPRS31P5 в клетках человека и макака-резуса, тогда как MRPS31P5 может, хотя бы частично, восстановить фенотип, вызванный инактивацией H-S в клетках мармозетки. Экспериментальные данные подтверждают, что MRPS31P5 является не псевдогеном MRPS31, а скорее, функциональным потомком химеры H-S, и в дальнейшем эволюционировал в самостоятельную транскрипционную единицу. H-S - результат циссплайсинга между соседними генами, в то время как MRPS31P5 явился результатом структурной перестройки генома.

Ответ на вопрос, что собой представляет обусловленный транскрипцией химеризм, остается пока неразрешенным. Предполагается, что TIC является физиологическим процессом, характерным для нормальных тканей, поддерживающим эволюционные механизмы, или же это новый патологический механизм, лежащий в основе некоторых нервно-мышечных, гематологических или онкологических заболеваний. К настоящему моменту понятно, что сплайсинг, индуцированный транскрипцией, более широко распространен в геноме человека, чем предполагалось ранее, и формирует дополнительный уровень белковой вариабельности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в организме человека всеобъемлюща как в норме, так и при патологии. Следует помнить, что существует огромное количество мультифакторных заболеваний, где эпигенетические факторы регуляции также играют очень важную роль. Метилирование ДНК, модификации хроматина, многочисленные некодирующие РНК и их регуляторные взаимодействия присутствуют во всех вариантах патологии, в том числе играют очень значительную роль в возникновении, прогрессии, ответе на лечение и прогнозе развития мультифакторных заболеваний (онкологических, иммунных, атопических, эндокринных, кардиологических и др.).

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Мутационная изменчивость - неотъемлемое и фундаментальное генетическое свойство всех живых организмов. Мутации могут возникать как в половых, так и в соматических клетках на любом из этапов индивидуального развития. Передача генетических изменений через линию зародышевых клеток классически определяет появление и проявление наследственных болезней человека. Что же касается мутаций в соматических клетках, то на протяжении длительного периода времени их ассоциировали исключительно с развитием злокачественных новообразований. Вместе с тем в последние годы с появлением высокоразрешающих технологий геномного секвенирования, включая глубокое секвенирование единичных клеток, стала накапливаться информация о патогенетической значимости соматического мутационного процесса, выходящего далеко за границы индукции онкологических заболеваний. По некоторым оценкам, объем накопленных данных о спектре и частоте соматических мутаций только за последние 5 лет превысил объем знаний за предшествующие полвека. Рост числа сообщений о болезнях человека, обусловленных мутациями в соматических клетках, постепенно приводит если не к трансформации, то к существенному дополнению в традиционном определении генетического заболевания. Становится очевидным, что генетические болезни перестают быть синонимом исключительно наследственных заболеваний. В ряде случаев они могут быть вызваны ненаследуемыми в череде поколений мутациями, возникающими в соматических клетках в разные периоды онтогенеза. В настоящей главе будут рассмотрены основные генетические закономерности соматического мутационного процесса и обсуждены примеры и особенности заболеваний, обусловленных соматическими мутациями.

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СОМАТИЧЕСКОГО МУТАЦИОННОГО ПРОЦЕССА

Описание генетических свойств соматических мутаций целесообразно начать с оценки их распространенности в онтогенезе. Следует отметить, что в настоящий момент эти оценки еще не совсем однозначны, поскольку, с одной стороны, они уже опираются на некоторые экспериментальные данные, а с другой - еще во многом основаны на экстраполяции частот, характерных для мутационного процесса в герминативной линии клеток. Тем не менее если принять во внимание, что тело взрослого человека состоит примерно из 10¹³ -10¹⁴ клеток, то число клеток, образуемых в течение жизни, превышает 10¹⁶ . Каждое деление соматической клетки несет риск мутационного события, которое для замен оснований ДНК оценивается на уровне 10^-7 -10^-6 на локус в репродуктивном периоде, с некоторым увеличением с возрастом. Это значение на 1-2 порядка превышает частоту герминативных мутаций. Таким образом, для диплоидного генома человека, содержащего примерно 6,6×10⁹ нуклеотидов, число соматических мутаций в онтогенезе может составить: 6,6×10⁹ ×10¹⁶ ×10^-7 =10¹⁸ однонуклеотидных замен, исключая делеции, инсерции, вариации в числе копий участков ДНК (CNV) и другие генетические варианты. Если допустить, что патогенетическую значимость имеет только 1% мутаций в кодирующей области генома, составляющей, в свою очередь, 1% всей длины ДНК, то число возникающих в ходе индивидуального развития организма одно-нуклеотидных замен ДНК составит 10¹⁸ ×10^-2 ×10^-2 =10¹⁴ .

Безусловно, кроме однонуклеотидных замен, соматические мутации могут быть представлены всеми известными типами мутаций - делециями, инсерциями, инверсиями и т.д. Соматические мутации не ограничиваются изменениями на уровне отдельных генов, а точно так же, как и герминативные мутации, существуют в виде мутаций микросателлитных локусов ДНК, динамических мутаций, числовых и структурных нарушений хромосом, CNV. Соматические изменения могут затрагивать не только структурную, но и эпигенетическую организацию генома, приводя к возникновению так называемых эпимутаций и заболеваний, связанных с эпигенетическим мозаицизмом. Типичным примером таких заболеваний могут служить мозаичные формы некоторых болезней геномного импринтинга (синдромы Прадера-Вилли, Энжельмена, Беквита-Видеманна, Сильвера-Рассела, Темпла и ряда других), возникающие вследствие аномалий дифференциального метилирования импринтированных локусов генома в соматических клетках.

Возникновение соматического мутационного (или эпимутационного) события в любом случае есть результат дисбаланса между ошибками репликации ДНК или действия какого-либо индуцирующего мутагенного фактора на клетку и способности различных репарационных систем исправить вызванное нарушение (рис. 8-1, см. цв. вклейку). Соответственно, в ряде случаев источником повышенной частоты соматических мутаций могут быть наследственные дефекты в генах систем репарации ДНК. В такой ситуации границы между соматическими и герминативными мутациями как этиологическими причинами развития генетического заболевания размываются. Примерами являются так называемые «болезни репарации ДНК». В этом случае соматические мутации, возникающие в клетках организма, являются следствием унаследованных генетических дефектов.

Вместе с тем причины соматических мутаций не всегда могут быть очевидны, и в большинстве случаев достаточно сложно однозначно определить, что именно стоит за наблюдаемым мутационным событием в соматической клетке. Необходимо подчеркнуть, что аналогичная ситуация характерна для так называемых первичных и вторичных эпимутаций. Первичные эпимутации представляют собой результат спонтанных изменений характера метилирования ДНК или других эпигенетических модификаций хроматина. Вторичные же эпимутации, напротив, являются следствием структурных мутаций в генах, контролирующих эпигенетические феномены (ДНК-метилтрансферазы, деметилазы, ацетилазы и деацетилазы гистонов и т.д.), и обусловлены, таким образом, унаследованными генетическими вариантами.

Несмотря на универсальность вариантов герминативных и соматических мутаций, последние в некоторых случаях могут иметь и уникальные особенности. Так, возникновение соматических делеций в генах NF1 и DMD при нейрофиброматозе 1-го типа и миотонической дистрофии соответственно может происходить в результате неаллельной митотической рекомбинации между блоками низкокопийных повторов ДНК (сегментных дупликаций). При этом интересно, что обмены в митозе и мейозе происходят между разными блоками повторов, определяя разную протяженность делеций, что, в свою очередь, влияет и на возраст манифестации, и на тяжесть течения заболевания. Таким образом, эволюционно сложившаяся структурная организация генома может программировать возникновение разных мутационных событий в зародышевых и соматических клетках.

В отличие от герминативных мутаций, которые копируются из зиготы во все клетки организма, постзиготические мутационные события формируют генетические гетерогенные популяции клеток. Подавляющее большинство соматических мутаций уникально для конкретной клетки, и чтобы их детектировать, нужно, чтобы мутантная клетка была способна к дальнейшему клональному размножению и имела определенное селективное преимущество. Кроме того, необходимы высокочувствительные системы детекции мутационных событий в единичных клетках. Именно поэтому с появлением таких систем высокопроизводительного секвенирования прогресс в изучении генетики заболеваний, связанных с мутациями в соматических клетках, стал особенно заметен.

Генетическим следствием соматического мутационного процесса является мозаицизм. Под мозаицизмом принято понимать наличие в организме, развившемся из единственной зиготы, двух или более клеточных клонов с различным генотипом или кариотипом. Мозаицизм следует отличать от химеризма, который возникает вследствие объединения зигот с различными генотипами или кариотипами. Мозаицизм, точно так же, как и сами соматические мутации, может существовать на генном, хромосомном или, как уже упоминалось, на эпигенетическом уровне. Следует подчеркнуть, что мозаицизм - это всегда постзиготическое событие, в отличие от самих мутаций, которые находятся в мозаичном состоянии. Последние по своему происхождению могут быть как герминативными, так и соматическими. Важно отметить, что для соматических мутаций известен и обратный мутационный процесс, получивший название «ревертантный мозаицизм», который может привести к коррекции генетического нарушения. Примеры таких процессов наиболее изучены на цитогенетическом уровне. Например, коррекция трисомии мейотического происхождения вследствие хромосомного нерасхождения или отставания в части соматических клеток на постзиготических этапах развития приведет к формированию хромосомного мозаицизма с наличием двух типов клеток - с трисомией и с нормальным кариотипом (либо с ОРД по хромосоме, изначально вовлеченной в анеуплоидию). Аналогичная картина - сочетание трисомных и дисомных клеток может сформироваться и при постзиготическом de novo возникновении трисомии вследствие хромосомного нерасхождения в клетке с нормальным кариотипом. В обоих случаях возникнет хромосомный мозаицизм, представленный комбинацией анеуплоидных и эуплоидных клеток. Более подробно эти процессы описаны в главе «Хромосомные болезни».

Биологическая значимость мозаицизма, равно как и его влияние на клиническое проявление заболевания, остается предметом дискуссий. Предполагается, что тяжесть течения болезни может коррелировать с частотой клеток, несущих соматическую мутацию. Однако в действительности такие строгие корреляции не наблюдаются. В одних случаях достаточно небольшого числа мутантных клеток, чтобы в организме проявились клинически значимые изменения. В других случаях более высокий уровень клеток может оказаться клинически нейтральным.

Здесь, однако, следует подчеркнуть ограниченность наших знаний о распространенности соматических мутаций в разных клетках и тканях пациента, недоступных для молекулярно-генетической диагностики. Как правило, распределение клеток с соматическими мутациями в организме зависит от множества факторов, в том числе от стадии развития, на которой происходит мутационное событие, от частоты прямых и обратных мутаций, от пролиферативной активности клеток с новыми генетическими вариантами, их способности к нормальной дифференцировке и функционированию.

В некоторых случаях появление новых генетических вариантов является онтогенетически детерминированным феноменом, и возникающая клеточная гетерогенность является нормальным физиологическим явлением. Существует несколько хорошо известных примеров так называемого физиологического и локус-специфичного мозаицизма в соматических клетках. Пожалуй, наиболее ярким из них являются запрограммированные соматические реорганизации в генах иммуноглобулинов (Ig) и T-клеточных рецепторов в созревающих B- и Т-лимфоцитах. Такие генетические перестройки обеспечивают формирование расширенного репертуара иммунной системы для эффективного ответа на максимально разнообразные внешние стимулы. Другой хорошо известный пример - укорочение длины теломер в серии соматических клеточных делений, ограничивающее репликационный потенциал клетки и формирующее гетерогенную популяцию делящихся и стареющих клеток. Еще один пример физиологического мозаицизма - митохондриальная гетероплазмия, возникающая на фоне отсутствия строгих механизмов контроля за распределением молекул митохондриальной ДНК (мтДНК) при делении этих клеточных органелл.

Наряду с этим существует еще ряд более редких, а точнее, более труднодоступных для регистрации феноменов, которые могут быть добавлены в этот список. Среди них - микрохимеризм, который представляет собой явление, когда в организме присутствуют клетки или даже смесь клеток с разными генотипами, происходящими от других организмов. Одним из примеров микрохимеризма могут являться циркулирующие клетки плода в организме матери (рис. 8-2, д, см. цв. вклейку). По некоторым оценкам, от 15 до 50% женщин имеют в своем кровотоке циркулирующие клетки плода, сохранившиеся от предшествующей беременности. В отличие от мгновенно разрушающейся после родов внеклеточной плодной ДНК, клетки плода могут сохраняться десятилетиями, попадая с материнским кровотоком в новый организм при последующей беременности. Принимая во внимание, что по своему происхождению такой микрохимеризм является физиологическим явлением, с медико-генетической точки зрения он несет определенные генетические риски для здоровья последующего плода (или плодов), если в геноме предыдущего имелась какая-либо наследственная мутация или хромосомная патология. Другим источником микрохимеризма может являться трансплантация стволовых клеток.

Еще один пример - мозаицизм по анеуплоидиям или крупным структурным перестройкам, регистрируемый на преимплантационных этапах развития в условиях культивирования эмбрионов in vitro при проведении процедур ЭКО. На протяжении долго времени такой мозаицизм был дилеммой при интерпретации результатов преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТ-А). Однако в последние 5 лет стала активно накапливаться информация о рождении здоровых детей с нормальным кариотипом после переноса в рамках циклов ЭКО мозаичных эмбрионов с низким уровнем анеуплоидных клеток.

Эти наблюдения дают основания сформулировать гипотезы о наличии особых механизмов самокоррекции эмбрионального кариотипа в ходе раннего развития как одного из вариантов ревертантного мозаицизма либо о компартментализации анеуплоидных клеток в ТЭ, формирующей плаценту и не вносящей вклада в развитие собственно эмбриональных структур. Вполне вероятно, что индукция хромосомного мозаицизма на преимплантационных этапах развития может оказаться нормальным генетически детерминированным явлением, обеспечивающим инвазивные и пролиферативные свойства клеток ТЭ, необходимые для успешной имплантации бластоцисты. Данные вопросы более подробно обсуждаются в главе «Преимплантационное генетическое тестирование».

Другой пример физиологического соматического мозаицизма - полиплоидия в гепатоцитах. Полиплоидные клетки обычно концентрируются в центральных зонах долей печени, а их частота увеличивается с возрастом или на фоне заболеваний, сопровождающихся повреждением печени, что требует индукции регенерационных процессов. Основным механизмом возникновения полиплоидии является блокада цитокинеза после репликации ДНК. Высказываются гипотезы, что полиплоидизация гепатоцитов может иметь некоторые преимущества в условиях действия на орган генотоксических агентов и быстрых циклов клеточного деления при регенерации. Действительно, за счет увеличения копийности генома полиплоидное состояние создает своего рода «генетический буфер», в условиях которого дополнительные копии генов защищают клетку от последствий мутаций, связанных с потерей функции гена (loss-of-function mutations). В отличие от полиплоидии наличие анеуплоидных клеток в печени пока остается дискуссионным вопросом. Вместе с тем анеуплоидные клетки призваны обеспечить ту же роль - регенерацию повреждений. Интересно, что у пациентов с циррозом печени были описаны de novo соматические мутации в генах PKD1, KMT2D и ARID1A, продукты которых, как было показано на мышиных моделях, обеспечивают клональную регенерацию печени.

Наконец, еще один пример внутриорганного соматического мозаицизма - это анеуплоидия и относительно протяженные CNV в нейронах головного мозга. Исследования единичных нейронов с использованием методов глубокого секвенирования демонстрируют, что каждая нейрональная клетка содержит в своем геноме свыше 1000 структурных вариантов (SNV), а от 13 до 40% нейронов имеют постзиготические CNV размером не менее 1 млн п.н. Высказываются гипотезы, что такая структурная соматическая вариабельность также может быть частью генетической программы нормального развития головного мозга. Исследования на мышиных моделях подтверждают это мнение, демонстрируя индукцию соматических CNV за счет генерации двуцепочечных разрывов ДНК в нейрональных стволовых клетках и клетках-предшественниках. При этом удивительно, что локализация таких зон генерации CNV оказывается, по всей видимости, неслучайной и захватывает гены клеточной адгезии и синаптических функций, критически значимые для нормального нейрогенеза.

И еще один пример - это физиологический возрастзависимый процесс потери Y-хромосомы (LOY, mosaic loss of the Y-chromosome). LOY - одна из самых ранних цитогенетических находок, длительное время считавшаяся артефактом вследствие возможной потери хромосомы при приготовлении хромосомных препаратов. Однако совсем недавно этот феномен получил подтверждение современными технологиями секвенирования. Исследование свыше 200 000 образцов ДНК мужчин из биобанка Великобритании показало, что LOY затрагивает от 2,5% мужчин в возрасте 40 лет до 43,6% мужчин в возрасте 70 лет. Это неожиданно делает потерю Y-хромосомы самой распространенной de novo соматической мутацией на протяжении онтогенеза. Значимость такого явления окончательно не ясна, однако частота LOY оказалась ассоциирована с меньшей продолжительностью жизни, повышенным риском онкологических заболеваний (многие опухолевые клетки демонстрируют потерю Y-хромосомы), болезнью Альцгеймера, иммунодефицитами, сердечно-сосудистыми заболеваниями, диабетом и другими возрастзависимыми заболеваниями. Кроме того, возникновение LOY оказалось ассоциированным с курением.

Безусловно, кроме нормального физиологического мозаицизма, существует категория соматических мутаций, приводящих к развитию генетических заболеваний. Патогенетические эффекты таких мутаций во многом определяются собственно их типами, а также стадиями онтогенеза, на которых происходит мутационное событие (рис. 8-3, см. цв. вклейку).

Чем раньше возникнет мутация в развитии организма, тем более вероятно, что клетки, ее несущие, будут присутствовать в большинстве тканей и органов. Соответственно, по своему происхождению и патогенетической значимости соматические мутации могут быть классифицированы следующим образом:

Кроме онтогенетического аспекта, важным фактором, который следует учитывать при характеристике эффектов соматических мутаций, является наличие или отсутствие сопутствующих аллельных герминативных изменений. В соответствии с этим болезни, связанные с соматическими мутациями, могут быть классифицированы на 3 группы:

Остановимся на краткой характеристике и примерах генетических заболеваний каждой из этих 3 групп.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ, СВЯЗАННЫЕ С МУТАЦИЯМИ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ

Болезни, обусловленные соматическими мутациями

В данную категорию болезней попадают генетические заболевания, связанные с соматическими доминантными активирующими мутациями (gain-of-function mutations). Примером является синдром CLOVES (Congenital Lipomatous Overgrowth with Vascular, Epidermal and Skeletal anomalies, OMIM 612918), проявляющийся гиперпролиферативными изменениями адипоцитов, сосудистыми, эпидермальными и скелетными аномалиями, ВПР внутренних органов (рис. 8-4, см. цв. вклейку). Первые клинические описания пациентов с синдромом CLOVES датируются 2007 г., а уже в 2012 г. с использованием методов экзомного секвенирования было показано, что развитие заболевания связано с активирующими соматическими мутациями в протоонкогене PIK3CA, кодирующем каталитическую α-субъединицу фермента фосфатидилинозитолкиназа. Частота мутаций у пациентов с синдромом CLOVES варьирует в производных разных зародышевых листков от 2 до 31%, являясь максимальной в клетках жировой ткани (рис. 8-5, см. цв. вклейку).

Протоонкоген PIK3CA хорошо известен своим участием в этиологии многих онкологических заболеваний, включая опухоли молочной железы, яичников, немелкоклеточный рак легкого, колоректальный рак и рак желудка, поэтому его роль в развитии незлокачественных новообразований оказалась в некоторой степени неожиданной. Вместе с тем с течением времени оказалось, что разные мутации в данном гене могут быть ответственны за развитие целой серии заболеваний неонкологической природы, напоминающих по особенностям клинической картины синдром CLOVES и также сопровождающихся гиперпролиферативными процессами (PIK3CA-related overgrowth syndromes) - гемигипертрофия с множественным липоматозом (HHML), синдром Клиппеля-Треноне (KTS), синдромы мегалэнцефалии и макроцефалии с сосудистыми мальформациями или с врожденной телеангиэктазией (M-CAP, M-CM, M-CMTC) и ряд других (рис. 8-6, см. цв. вклеку).

Среди заболеваний, обусловленных соматическими мутациями, можно также отметить: синдром Протея (OMIM 176920, активирующие мутации в протоонко-гене AKT1), синдром Маффуччи (OMIM 166000, мутации в гене PTHR1) и болезнь Оллье (OMIM 614569, соматические мутации в генах IDH1, IDH2), синдром Шиммельпеннинга-Фейерштейна-Мимса (OMIM 163200, соматические мутации в протоонкогенах NRAS (1p13.2), HRAS (11p15.5), KRAS (12p12.1), окулоэктодермальный синдром (OMIM 600268, также соматические мутации в протоонкогене KRAS), синдром Стерджа-Вебера (OMIM 185300, соматические мутации в генах GNAQ, GNA11) и ряд других, так или иначе связанных с индукцией гиперпролиферативных процессов в различных типах соматических клеток. Однако в списке болезней, связанных с соматическими мутациями, обращают на себя внимание и «классические» моногенные заболевания с аутосомно-доминантным типом наследования, возникновение которых в ряде случаев может быть связано с соматическим мозаицизмом. Так, например, мозаичные соматические делеции в гене NF1 описаны у пациентов с сегментным нейрофиброматозом 1-го типа (OMIM 162200). При этом делеции у пациентов ограничены фибробластами из пораженных участков кожи с пятнами цвета «кофе с молоком» и не обнаруживаются в нормальных фибробластах и лимфоцитах периферической крови. Здесь, однако, необходимо отметить, что источником соматических мутаций в таких случаях могут являться биаллельные мутации в генах мис-матч репарации (MLH1, MSH2), которые клинически сопровождаются ранним возникновением злокачественных опухолей и мягкими проявлениями нейрофиброматоза 1-го типа. Как уже отмечалось выше, данный пример затрудняет интерпретацию этиологических основ подобных заболеваний. С одной стороны, болезнь вызвана соматическими делециями NF1, а с другой - источником таких делеций являются унаследованные герминативные мутации в генах мисматч репарации ДНК.

Другие известные примеры представлены нейрофиброматозом 2-го типа (OMIM 101000, соматические мутации гена NF2 в нейронах), пароксизмальной ночной гемоглобинурией (OMIM 300818, соматические мутации гена PIGA в лимфоцитах), синдромом Блоха-Сульцбергера или синдромом недержания пигмента (OMIM 308300, соматические мутации гена NEMO в клетках кожи, глаз, зубов, ЦНС), постзиготической экспансией тринуклеотидных CAG-повторов в гене HTT при болезни Гентингтона (OMIM 143100) и рядом других моногенных заболеваний.

Болезни, обусловленные комбинацией аллельных герминативных и постзиготических мутаций

В эту категорию входят три группы заболеваний, отличающиеся по онтогенетическим аспектам возникновения соматических мутационных событий и их патогенетическим следствиям.

Первую составляют наследственные формы онкологических заболеваний, развитие которых объясняет «двухударная гипотеза» Альфреда Кнудсена, являющаяся в настоящее время фундаментальной основой молекулярной онкологии. Согласно данной гипотезе, предложенной А. Кнудсеном в 1971 г. для объяснения природы семейных форм ретинобластомы (РБ) (злокачественной опухоли сетчатки глаза), развитие злокачественного процесса есть результат двух мутационных событий, или «двух ударов», в пределах одного опухолесупрессорного гена. В качестве «первого удара» выступают унаследованные герминативные мутации в одном из аллелей опухолесупрессорного гена. Это могут быть точковые мутации, делеции или любые другие структурные варианты, которые наследуются всеми клетками организма и присутствуют в них в гетерозиготном состоянии. Вторая мутация, или «второй удар», происходит в аллеле дикого типа опухолесупрессорного гена на стадии стволовых клеток или клеток-предшественников. Вторая мутация также может быть представлена любым структурным нарушением последовательности гена либо эпигенетической модификацией, например, аберрантным метилированием ДНК в его регуляторной области. Возникшая соматическая мутация приводит к так называемому феномену «потери гетерозиготности (ПГ)» (LOH, Loss of Heterozygosity), характеризующемуся полной инактивацией опухолесупрессорного гена. Шанс единственной мутации во втором аллеле, как правило, выше вероятности двух последовательных соматических мутаций в одном опухолесу-прессорном гене, характерных для спорадических форм рака. Это объясняет доминантный характер наследования семейных форм онкологических заболеваний, их более раннюю манифестацию и более тяжелое течение по сравнению со спорадическими случаями. Наиболее известными примерами являются наследственные формы опухолей молочной железы и яичников (мутации в генах BRCA1, BRCA2); наследственный неполипозный колоректальный рак (мутации в генах мис-матч репарации ДНК - MSH2, MSH6, MLH1, MLH3, PMS1 и PMS2, сопровождающиеся феноменом микросателлитной нестабильности); синдром Ли-Фраумени (мутации в гене TP53). Важно отметить, что расшифровка молекулярно-генетических основ наследственных форм рака обеспечила не только эффективную диагностику, но и профилактику этой группы болезней как на уровне тестирования носительства высокопенетрантных герминативных вариантов, так и через пренатальное, а в последние годы и преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ).

Вторая группа болезней, представленных комбинацией герминативных и соматических мутаций, возникает в соответствии с принципами парадоминантного наследования, изложенными в работах Рудольфа Хэппла по соматическому мозаицизму при заболеваниях кожи (синдром МакКьюна-Олбрайта, линии Блашко, пигментные невусы Беккера). Сущность парадоминантного наследования заключается в том, что развитие заболевания становится возможным при комбинации унаследованных мутаций с соматическими изменениями в тех же самых генах на ранних стадиях эмбрионального развития. Такие фенотипы оказываются ненаследуемыми, поскольку вызваны в конечном итоге мутациями не в половых, а в соматических клетках. В то же время в некоторых случаях заболевания могут обнаруживаться у нескольких членов в пределах одной родословной, симулируя аутосомно-доминантный тип наследования, что и послужило основанием назвать данный тип наследования «парадоминантным».

Гетерозиготные по парадоминантной мутации индивиды имеют нормальный фенотип и передают мутантный аллель через несколько поколений без каких-либо проявлений. Гомозиготные мутации, возникающие в момент оплодотворения, являются при этом летальными. Признак или заболевание проявляется только в том случае, если мутация в нормальном аллеле возникнет в части соматических клеток на очень ранних стадиях эмбриогенеза, когда происходят формирование и закладка кожных покровов (рис. 8-7, см. цв. вклейку). Парадоминантное наследование напоминает, но не соответствует упомянутой выше «двухударной гипотезе» А. Кнудсена, согласно которой, вторая мутация может произойти в любой момент времени в постнатальном онтогенезе и не является летальным событием.

Феномен парадоминантного наследования, впервые обозначенный Р. Хэпплом в 1986 г., позднее, в 1994 г., в предисловии к 11-му изданию «Каталога наследственных болезней» был назван Виктором МакКьюсиком «интригующей гипотезой», относящейся к категории неменделевского наследования, подчеркивая тем самым определяющую роль соматических мутационных событий в развитии ряда заболеваний. Первоначально явление парадоминантного наследования было описано для фенотипов, проявляющихся патологией кожных покровов, - синдром МакКьюна-Олбрайта (OMIM 174800, парадоминантные мутации в импринтированном гене GNAS), пигментные невусы Беккера с гипертрихозом (OMIM 604919, соматические мутации в гене АСГВ), врожденная треугольная алопеция, встречающаяся при различных синдромальных ассоциациях (синдромы Клиппеля-Треноне, LEOPARD и ряд других). Позднее доказательства парадоминантного наследования были приведены и для локальных нарушений васкулогенеза, ангиогенеза и лимфангиогенеза (рис. 8-8, см. цв. вклейку).

Наконец, третью категорию заболеваний составляют некоторые варианты классических моногенных болезней, возникающие вследствие комбинации мутаций герминативного и постзиготического происхождения (табл. 8-1).

Болезни геномной нестабильности

В эту группу заболеваний включаются синдромы, характеризующиеся повышенной частотой соматических мутаций, возникающих вследствие унаследованных герминативных изменений в генах репарации и репликации ДНК, а также в генах контроля клеточного цикла (табл. 8-2). Тип наследования таких мутаций - рецессивный. Возникающие при этом формы геномной нестабильности в соматических клетках отличаются широким разнообразием и включают изменения, затрагивающие как число копий целых хромосом (мозаичные анеуплоидии), так и структурные перестройки. В результате клиническая картина во многом напоминает фенотипические особенности хромосомных заболеваний, проявляющихся нарушениями физического и интеллектуального развития, лицевыми дисморфиями, аномалиями черепа и конечностей, врожденными пороками внутренних органов, иммунодефицитными состояниями. Также в эту категорию можно отнести заболевания, связанные с мозаичными нарушениями эпигенетической организации генома. Примером таких заболеваний являются мозаичные формы болезней геномного импринтинга и некоторые формы биродительского полного пузырного заноса, обусловленные герминативными мутациями генов, продукты которых вовлечены в установление и поддержание моноаллельной экспрессии импринтированных локусов генома.

Примечание. АР - аутосомно-рецессивный.

Молекулярно-генетическая диагностика заболеваний, связанных с мутациями в соматических клетках

Молекулярная диагностика болезней, обусловленных наследственными дефектами в генах различных систем репарации ДНК, не имеет принципиальных отличий от диагностики практически любого классического моногенного заболевания. В то же время для выявления типичных соматических мутационных событий в клетках пациентов с «болезнями репарации ДНК» в ряде случаев могут потребоваться некоторые специфические цитогенетические тесты. Так, например, для подтверждения высокой частоты сестринских хроматидных обменов у пациентов с синдромом Блума необходимо будет провести окраску хромосомных препаратов с использованием бромдезоксиуридина (BrdU). В целом имеющийся арсенал методов классического цитогенетического анализа, разработанных в 60-70-е годы прошлого столетия для оценки эффектов химического и радиационного мутагенеза, сохраняет свою актуальность для подтверждения повреждающего действия вновь описываемых мутаций на генетический аппарат клетки.

Иная ситуация складывается для диагностики именно соматических мутаций (и эпимутаций), представленных, как правило, в небольшом проценте клеток и требующих использования высокочувствительных методов детекции мутационных событий. При этом следующие принципиальные факторы должны приниматься во внимание при организации поиска соматических вариантов (по Forsberg et al., 2017, с дополнениями):

Наконец, молекулярно-генетический анализ должен проводиться с использованием высокоразрешающих методов детекции, максимально чувствительных к соматическому мозаицизму низкого уровня. Наиболее отвечающими такому требованию являются современные модификации методов массового параллельного секвенирования с максимальным числом прочтений последовательности ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Соматические мутации представляют собой важный, но, по всей видимости, пока еще не до конца оцененный источник генетической изменчивости в ходе онтогенеза. В одних случаях такая изменчивость является генетически детерминированным событием, в других же ситуациях она становится новым или дополнительным этиологическим компонентом в возникновении генетического заболевания. Длительное время исследование соматических мутаций ограничивалось преимущественно областью молекулярной онкологии. Однако с развитием современных высокоразрешающих систем детекции мутационных событий, с накоплением информации о высоком уровне соматического мутационного процесса в определенные периоды онтогенеза, прежде всего в преимплантационном периоде развития, с расшифровкой молекулярных механизмов индукции и коррекции соматических мутаций, формируются представления о том, что такие мутации играют существенную роль в развитии генетических заболеваний. На этом фоне происходит если не трансформация, то расширение самого понятия «генетическое заболевание». Становится очевидным, что генетическая болезнь может теперь рассматриваться не только как результат унаследованных патологических генетических вариантов, но и как следствие постзиготических мутационных событий.

Список литературы

Большинство глав руководства написаны с точки зрения индивидуального уровня организации - в них рассматриваются индивидуумы с их заболеваниями и геномами. При анализе генетической изменчивости на популяционном уровне организации материи индивидуум перестает быть единицей наблюдения: вместе с другими людьми он составляет популяцию, в которой действуют уже иные, популяционно-генетические процессы: мутации, отбор, миграции и дрейф генов. Изучение этих процессов помогает ответить на вопросы: «Отчего наследственные болезни чаще возникают в одних популяциях и отсутствуют в других? Как, исходя из знания особенностей популяции, прогнозировать груз наследственной патологии в ней?» Для ответа на эти вопросы необходимо обратиться к истории популяций и их географической изменчивости. Это позволит понять закономерности распространения всех генов, составляющих генофонд популяции, в том числе и генов, определяющих наследственные болезни человека.

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ

Популяционная генетика человека изучает структуру генофонда, его внутри- и межпопуляционное разнообразие, генетические процессы, приводящие к изменениям популяционных генофондов, историю их формирования и пространственные закономерности их изменчивости.

Генофонд популяции можно определить как совокупность индивидуальных геномов, входящих в состав популяции.

Генофонд обладает свойством изменяться в поколениях. Даже одно и то же поколение в период своего рождения и в период ухода из жизни по генетическому составу не тождественно само себе. Причина этого состоит в связи жизнеспособности людей с их генотипами: обладатели разных генотипов при прочих равных условиях имеют неравную вероятность дожить до одного и того же возраста. Лишь в случае внутриутробной гибели и ранней детской смерти эта связь становится зримой, но чаще ее регистрируют лишь статистически. Именно поэтому методы одномерной и многомерной статистики столь важны в популяционной генетике, а понятие вероятности является в ней базовым: например, исходный параметр - популяционная частота гена - означает вероятность, с которой данный ген можно встретить в популяции.

Еще большие изменения в структуру генофонда вносит неравная рождаемость - разная вероятность для различных генотипов воспроизвести себя в поколениях. По параметрам рождаемости отличаются разные семьи даже в одной популяции, отличается городское население от сельского, отличаются разные районы страны друг от друга, отличаются разные народы. Различия в интенсивности урбанизации, миграций, в экономических условиях, образе жизни, традициях культуры и структуре браков вызывают неравный прирост разных частей генофонда и тем самым меняют общие характеристики генофонда от поколения к поколению. Изменения в составе генофонда следуют за всеми другими, в том числе за изменениями в социально-экономической и культурной сфере жизни населения.

Поэтому важно подчеркнуть, что хотя генофонд популяции несет на себе печать исторического процесса, но генофонд сам не направляет и не детерминирует этот исторический процесс. Гены, как щепки, несущиеся в потоке истории генофонда, указывают, где находится ее основное русло, водовороты и заводи, но они сами не определяют ход истории, как щепки не задают направление реки. Изменения частот генов, соотношения гомозигот и гетерозигот - лишь очевидная поверхность тех глубинных генетических процессов, которые приводят к становлению, развитию или гибели генофонда.

Основная цель популяционной генетики человека - изучение структуры, истории, пространственной изменчивости и динамики генофонда популяций человека.

Структура генофонда - это генетические характеристики популяции: частота генов, соотношения гетерозигот и гомозигот, различия между субъединицами подразделенной популяции и наиболее общие закономерности изменчивости генофонда в пределах его ареала, возникшие под давлением факторов популяционной динамики (миграции, дрейф генов, мутации и отбор).

Для описания генетической структуры популяции используют два основных инструмента:

Распределение частот полиморфного гена в популяциях несет важную информацию о суммарном действии факторов популяционной динамики. Анализ различий генных частот (дополненный расчетами генетических расстояний, главных компонент и других мер многомерной статистики) - основной инструмент, используемый в большинстве работ по популяционной генетике. Соотношение гомозигот и гетерозигот - это проявление генетического разнообразия популяций и интенсивности инбридинга в ней. Это соотношение важно для прогноза груза наследственной патологии. Генетическое разнообразие популяций описывают с помощью двух дополняющих друг друга характеристик - внутрипопуляционного (гетерозиготности популяций) и межпопуляционного разнообразия (генетических различий между популяциями).

Мерой генетического разнообразия популяции служат не характеристики отдельных генетических маркеров, а показатели, усредненные по их множеству. Средний показатель дифференциации генофонда (F_ST ) позволяет количественно оценить суммарное действие двух важнейших факторов популяционной динамики - дрейфа генов и давления миграций. Сравнение средней дифференциации F_ST с дифференциацией по отдельным (i) генам F_ST(i) помогает оценить направление и интенсивность действия на конкретный ген третьего фактора популяционной динамики - отбора. Изучение распределения частот генов и генотипов, генетического разнообразия и генетических процессов, протекающих в популяции, позволяет обнаружить наиболее общие черты в структуре и изменчивости генофонда и в дальнейшем перейти к прогнозу груза наследственной патологии. Е.К. Гинтер отмечал: «Зная особенности генетической структуры популяции, можно надежно предсказать величину груза наследственных болезней. Генетическая структура влияет не только на количественную характеристику груза наследственных болезней, но и на качественную, представленную спектром наследственных болезней».

Факторы популяционной динамики можно рассматривать как механизмы, запускающие такие генетические процессы в популяции, которые могут привести к изменению структуры генофонда - изменению частот генов и генотипов, увеличению или уменьшению разнообразия и, следовательно, к изменению груза наследственной патологии. К основным факторам популяционной динамики относят мутации, дрейф генов, миграции и отбор. Поскольку каждый из них подробно рассмотрен в специальных разделах этой главы, здесь будут приведены лишь краткие определения.

Мутации - события, приводящие к возникновению нового варианта фрагмента(ов) ДНК, - создают основу всего генетического полиморфизма популяций. Это первый шаг для возникновения генетического разнообразия как внутри популяций, так и между ними. Мутационные события обычно скрыты от глаз исследователя. Исключение составляют доминантные мутации, например, доминантные наследственные нарушения, сразу подставляющие мутации de novo под действие отбора. Мутации, вызывающие рецессивные наследственные болезни, скрыты от отбора и манифестируют лишь тогда, когда по воле случая встречаются с такими же мутациями в генотипе одного индивидуума. До такого печального события могут пройти многие поколения, в течение которых велика вероятность потери мутации. Поскольку для изучения популяций обычно используют полиморфные генетические маркеры (с частотой не менее 1%), то становится очевидным: чтобы мутантный маркер достиг такой частоты, ему должны помочь три других, много более мощных фактора популяционной динамики, - дрейф генов, отбор и миграции.

Дрейф генов - случайные изменения частоты гена в популяциях - процесс, не имеющий направления. С равной вероятностью он может случайно увеличить или уменьшить частоту генетического маркера. Интенсивность дрейфа генов полностью зависит от размера популяции: чем меньше ее размер, тем меньше гамет передается следующему поколению и тем больше вероятность, что у потомков пропорции частот генов будут отличаться от пропорций в родительском поколении. Наиболее яркие проявления дрейфа генов - «эффект основателя» и «бутылочного горлышка». Они оба связаны с резким сокращением и последующим ростом численности популяции. Разница между ними состоит в том, что «эффект основателя» предполагает малую численность популяции в период ее возникновения, поэтому большинство ее современных членов - потомки небольшой группы предков («основателей»). При эффекте «бутылочного горлышка» сокращение численности происходит уже в течение жизни популяции, но приводит к тому же результату: большинство членов современной популяции являются потомками нескольких предков, которые уцелели во время резкого сокращения численности популяции. Оба варианта приводят к сокращению генетически эффективного размера популяции N_e (см. «Факторы популяционной динамики: дрейф генов и миграции») и мощному действию дрейфа генов. Своеобразие ситуации состоит в том, что хотя современная популяция может быть очень большой по общей численности, но ее генетически эффективный размер будет немногим больше того размера, какой был в период резкого сокращения ее численности. Именно поэтому обнаруживаются последствия дрейфа генов: в результате сокращения численности популяции в тот или иной исторический период современные популяционные частоты генов могут резко отличаться от частот генов как в предковых, так и в родственных популяциях.

Миграции - второй мощный фактор популяционной динамики, но по эффекту он противоположен дрейфу генов. Например, если рассмотреть несколько небольших дочерних популяций, произошедших от одной предковой, то дрейф генов будет создавать различия между ними, а обмен генами в результате миграций будет сокращать эти возникающие межпопуляционные различия. И тогда степень генетических различий между популяциями будет зависеть от соотношения интенсивности этих двух противодействующих факторов - дрейфа генов и миграций. Как и в случае размера популяции, важны не тотальные, а генетически эффективные миграции М_е (см. «Факторы популяционной динамики: дрейф генов и миграции»). Например, если массовая миграция, зафиксированная историей или демографией, не оставила потомков в популяции, то генетически эффективная миграция М_е будет равна нулю. Именно поэтому популяционная генетика рассматривает только те миграции, которые оставляют свой генетический след в популяции. Точно так же генетическая эффективность (М_е ) интенсивных миграций между генетически сходными популяциями невелика, в то время как даже для небольших миграций из далеких или своеобразных популяций (М_е ) она может оказаться значительной.

Оба противодействующих фактора - дрейф генов и миграции - действуют на все гены одинаково, безотносительно к их адаптивной ценности. Именно поэтому дрейф генов и миграции называют селективно-нейтральными факторами в противовес отбору - селективно значимому фактору.

Отбор - третий мощный фактор популяционной динамики, приводящий к изменению генофонда популяции и созданию ее адаптивной (селективной) структуры. В отличие от селективно-нейтральных факторов (миграций и дрейфа генов), отбор действует не на все гены сразу, а избирательно на каждый ген в зависимости от его адаптивной ценности. На индивидуальном уровне отбор приводит к снижению или повышению приспособленности индивидуума, что выражается в том, сколь многочисленное потомство он может оставить. На популяционном уровне отбор выражается в изменении генетических различий между популяциями по конкретному гену F _ST(i) . При действии дифференцирующего отбора размах межпопуляционных различий по гену F _ST(i) выше, чем среднее по всем генам межпопуляционное разнообразие F_ST (F_STffl >F_ST ). При действии стабилизирующего отбора размах межпопуляционных различий по конкретному гену F _ST(i) ниже, чем среднее межпопуляционное разнообразие F _ST (F <F _ST ). Таким образом, по характеру отклонения F _ST(i) от F _ST можно судить о типе отбора (дифференцирующий или стабилизирующий) и интенсивности его действия на данный ген. Совокупность оценок интенсивности и типа отбора, полученная для репрезентативной выборки генов, позволяет оценить селективную структуру генофонда.

Ген и генофонд. Полное изучение индивидуального генома все еще остается дорогостоящим, поэтому нереально напрямую изучить весь генофонд, т. е. всю совокупность индивидуальных геномов популяции. Однако для описания структуры генофонда, к счастью, можно использовать не весь геном, а репрезентативные наборы генетических полиморфизмов, которые называют генетическими маркерами, а краткое описание дано в разделе «Генетические маркеры». С помощью панелей (совокупностей) тех или иных генетических маркеров исследуют структуру всего генофонда.

Реально существующая, но недоступная непосредственному наблюдению структура генофонда проецируется во множество картин изменчивости отдельных генетических маркеров, поэтому по отдельному генетическому маркеру нельзя судить о генофонде в целом: описание отдельного генетического маркера дает лишь одну из частных проекций - своеобразную точку зрения на генофонд. Для описания структуры генофонда необходимо изучить изменчивость многих генов (генетических маркеров), обобщить эти данные во избежание случайностей и искажений частного видения и получить общие характеристики генофонда. Такие общие параметры можно получить по той или иной панели генетических маркеров, если их выборка из генома репрезентативна.

Поскольку каждая такая панель маркеров описывает один и тот же генофонд, то обобщенные показатели самого важного параметра структуры генофонда - межпопуляционного разнообразия - по любым панелям аутосомных маркеров должны быть одинаковы. Благодаря этому феномену исследователи получают инструмент для верификации оценок изменчивости генофонда - полисистемный подход: если показатели межпопуляционного разнообразия по двум и более независимым системам маркеров оказываются сходными, это означает, что обобщенные характеристики этих систем маркеров дают правильное описание структуры генофонда (см. «Генетические маркеры»).

Ясное понимание соотношения изменчивости отдельных генов и генофонда в целом - ключевой момент в популяционной генетике. Изучая полиморфизм отдельных генов, популяционная генетика определяет характеристики генофонда популяции и познает генетические процессы, его сформировавшие. Такое знание позволяет перейти к пониманию особенностей формирования груза наследственной патологии.

Популяция человека - относительно обособленная группа населения, которая исторически сложилась на определенной территории, воспроизводит себя в границах этого исторического ареала из поколения в поколение и обменивается генами в большей или меньшей степени с такими же окружающими ее популяциями.

Это определение подчеркивает, что популяция - не эфемерная группа людей, а особый, исторически сложившийся и стабильный суперорганизм, живущий в рамках конкретного времени и географического пространства. В них же существует и генофонд популяции, и если жизнь индивидуума измеряют в числе прожитых лет, то жизнь популяции и ее генофонда - в числе прошедших поколений (длина одного поколения - около 25-30 лет). Для того чтобы констатировать рождение новой популяции, должно смениться как минимум 3-4 поколения, т.е. век: только в таких временных масштабах - веках, а не годах - можно изучать популяции.

Единственный критерий, который может претендовать на точность, - относительная обособленность популяции. Этот критерий определяет, что большая часть браков (более 50%) должна быть заключена в ее пределах (между ее членами). Именно поэтому не только выражение «популяция роддома № 6» с точки зрения популяционной генетики абсурдно, но и Москву нельзя считать в строгом смысле популяцией, поскольку из всех браков, заключаемых в ней, менее половины заключаются между людьми, рожденными в этом городе. Лишь при включении Подмосковья и даже близлежащих областей эту огромную совокупность населения можно будет рассматривать как популяцию. В то же время небольшой горный аул в Дагестане, где традиционно разрешены близкородственные браки, и поэтому практически все браки заключаются между уроженцами этого селения, является популяцией.

Важнейший атрибут популяции - ее ареал.

Ареал популяции - жизненное пространство популяции и важный фактор ее изменчивости. Ареал либо создает условия для формирования генетических различий, либо фиксирует их, если они возникли по иным причинам.

Например, ареал московской популяции включает территорию всего Подмосковья, а ареал горного аула - не только сам аул, но и его жизненное пространство, т.е. территории, на которых выше вероятность встретить его жителей, а не жителей соседних аулов.

Практически все популяции человека очерчены в пространстве и имеют свой географический ареал, географические и историко-культурные границы. Они, конечно же, не представляют непроходимые заборы - сквозь них проходят миграционные потоки генов, но они не столь интенсивны, как внутри ареала популяции. Эти границы плывучи, текучи и неоднозначны, но при этом абсолютно реальны: их можно обнаружить и зафиксировать, например, изучая структуру брачных миграций. Оказывается, даже генофонды мегаполисов, где огромные массы населения перемешиваются на небольшом участке земли, не только в прошлом, но и сейчас обладают географической подразделенностью (Курбатова, 2004, 2013, 2018, 2019). Тем более она была характерна для сельского русского населения, где брачные традиции («хоть за курицу, но на соседнюю улицу») приводили к генетическим различиям даже между географически близкими популяциями.

Геногеографические карты. Поскольку ареал - неотъемлемый атрибут популяции, то геногеографическая карта, показывающая пространственное распределение параметров генофонда, становится важным источником информации о популяциях. Она представляет собой компьютерную географическую карту, в каждой точке которой указано значение того или иного генетического показателя: частоты генетического маркера в конкретной точке пространства; внутриили межпопуляционного разнообразия; корреляции с широтой, долготой, параметрами среды или другими маркерами; генетического расстояния от значения в указанной точке карты до заданного параметра (например, региональной частоты); обобщенных характеристик генофонда (например, значения главных компонент изменчивости генофонда) и целого ряда других. При этом карта служит не просто иллюстрацией, а инструментом количественного анализа. Серии карт можно складывать и находить среднее значение между ними, проводить с картами, как с обычными цифровыми матрицами, любые статистические преобразования и расчеты.

Поскольку карты создают с помощью компьютерного моделирования, это позволяет создать математически точный образ пространства и передать его без искажений всем читателям карты. Именно поэтому геногеографические карты - универсальный канал передачи информации между специалистами разных областей науки. Такие карты демонстрируют различия между популяциями, помогают реконструировать основные генетические процессы, которые эти различия сформировали, и позволяют продемонстрировать основные феномены популяционной генетики. Например, карты генетических расстояний от средних этнических частот до каждой точки ареала этноса оказались одинаковыми и для полиморфных генетических маркеров, и для наследственных заболеваний.

Ареал некорректно представлять лишь в двухмерном пространстве географической карты. Популяционный ареал, как правило, содержит и иные измерения. Это может быть не только третье измерение физического пространства (высотное). В качестве иных измерений могут выступать любые факторы культуры (конфессиональные, лингвистические, этнографические и др.) или среды (опосредованной через хозяйственно-культурные типы взаимодействия со средой). Например, в характеристике хозяйственно-культурных типов (степные кочевники, охотники-оленеводы, охотники на морского зверя и др.) звучит то дополнительное измерение ареала, которое свойственно этой популяции и обусловливает устойчивость ареала. Весь исторически сложившийся облик обрядности, одежды, норм морали, пищи, домостроительства, множества этнографических, лингвистических, конфессиональных особенностей создает границы между популяциями, географически занимающими один и тот же ареал.

Подразделенные популяции и демы. Возникновение генетических различий между популяциями приводит к тому, что исходно единая популяция подразделяется на несколько дочерних. Большинство крупных популяций являются подразделенными и состоят из множества популяций разных иерархических уровней, вложенных друг в друга, как матрешка в матрешку. Ареалы этих субпопуляций также следуют «принципу матрешки». Например, ареал популяции далекого села Суры, родины св. праведного Иоанна Кронштадтского, входит в ареал пинежских популяций, тянущихся лентой вдоль реки Пинеги. Они входят в ареал популяций Архангельской области, вместе с ними - в ареал популяций Русского Севера, затем - в ареал русского народа и далее - восточных славян, Восточной Европы, Европы, Евразии и мира.

Именно подразделенные популяции - основной объект изучения популяционной генетики, поскольку подразделенность - наиболее распространенное состояние популяций человека. Элементарные популяции, далее не делимые, называют локальными или, реже, демами. Они служат «атомами» популяционной системы, несмотря на то что их размеры могут чрезвычайно различаться - от небольшого аула до огромного мегаполиса. Тем не менее именно элементарные популяции с наибольшей вероятностью могут соответствовать понятию идеальной популяции, в которой действует один из базовых законов популяционной генетики - закон равновесия Харди-Вайнберга.

Генетические процессы в популяциях. Закон Харди-Вайнберга гласит, что в бесконечном ряду поколений популяционные частоты генов и генотипов не будут меняться, если на популяцию не действует ни один из факторов популяционной динамики. Например, для двуаллельного гена неизменные частоты аллелей p и q (p+q=1) будут задавать неизменные частоты генотипов: для гомозигот - p² и q² , для гетерозигот - 2pq, причем p² +2pq+q² =1. Такая идеальная популяция - столь же полезная абстракция, как, например, понятие идеального газа в физике. Идеальная популяция Харди-Вайнберга обладает бесконечно большим размером, иначе в ней начнет действовать фактор дрейфа генов. Она панмиксна, т. е. браки в ней заключаются случайно по отношению к генотипам. В ней не возникают новые мутации, на нее не влияют миграции и не действует отбор. Иными словами, в идеальной популяции все факторы популяционной динамики - дрейф генов, мутации, миграции и отбор - бездействуют. Понятие идеальной популяции дает инструмент для обнаружения генетических процессов в популяции. В идеальной популяции Харди-Вайнберга действует лишь один процесс - передача генов в поколениях. Если же обнаруживают, что реальность отличается от идеала, что в реальной популяции частоты генотипов отклоняются от ожидаемых из равновесия Харди-Вайнберга (p² , 2pq, q² ), это указывает на то, что в популяции действуют иные мощные генетические процессы. По направлению и степени отклонений можно предполагать, какие именно генетические процессы и с какой интенсивностью протекают в популяции.

Интенсивность этих процессов должна быть довольно велика для того, чтобы сместить равновесие Харди-Вайнберга. В большинстве популяций человека генетические процессы не столь мощны, чтобы вызвать достоверные отклонения наблюдаемых частот генотипов от ожидаемых в идеальной популяции. Именно поэтому современная популяционная генетика использует целый арсенал иных методов, позволяющих определить структуру генофонда и происходящие в ней генетические процессы. В него входят такие эффективные и наглядные методы многомерной статистики, как многомерное шкалирование (демонстрирует взаимное расположение популяций в генетическом пространстве), дендрограммы (обнаруживают кластеры генетически близких популяций), главные компоненты (выявляют ведущие закономерности в изменчивости популяций), оценки различий между популяциями на разных уровнях иерархической популяционной системы (Nei, AMOVA), филогеография (родство популяций, определяемое с помощью нерекомбинирующих признаков) и др. В дальнейших разделах главы некоторые из этих методов будут использованы для демонстрации действия генетических процессов в популяциях, но основной технологией будет геногеография, позволяющая оценивать изменчивость генофондов в географическом пространстве.

Подразделенные популяции и инбридинг. Степень различий между популяциями в пределах общей (подразделенной) популяции можно измерить несколькими способами, причем они позволят перейти к оценке инбридинга, играющего столь важную роль в манифестации рецессивно наследуемой патологии.

Во-первых, можно сравнить различия между популяциями, т. е. то, насколько субпопуляции генетически отличаются друг от друга. Для этого используют два показателя, которые в большинстве случаев примерно равны друг другу (F_ST ≈G_ST ).

Чтобы их рассчитать, нужно лишь знать частоты генов в каждой из субпопуляций и вычислить величину генетических различий между ними, т. е. определить нормированную дисперсию частоты гена в субпопуляциях:

где σ² _q =k^-1 ∑(q_j -q)² , а среднюю частоту аллеля q в подразделенной популяции, состоящей из k субпопуляций (j=1, 2, …​, k), рассчитывают как q=k-¹ ∑q_j . Понятно, что если популяция значительно подразделена, то ее субпопуляции изолированы друг от друга (между ними заключается мало браков, и поток генов невелик), частота гена в них значительно варьирует, и дисперсия частот будет велика. Второй способ измерить подразделенность состоит в расчете гетерозиготности, т. е. измерении различий внутри субпопуляций и популяций (H_T , H_S ). Как известно из правила Харди-Вайнберга, в панмиксной популяции с частотой аллеля q гетерозиготность H_T составляет 2q(1-q). В подразделенной популяции с той же средней частотой аллеля q гетерозиготность всегда будет меньше (эффект Валунда), причем ее снижение тем больше, чем выше степень подразделенности популяции. Именно поэтому, сравнивая среднюю гетерозиготность субпопуляций (H _S[1]) с теоретически ожидаемой гетерозиготностью тотальной популяции (H_T ), можно вычислить степень подразделенности популяции, обозначаемой как G_ST . Формула расчета очень проста:

Показатель H_T оценивает общее генетическое разнообразие, накопленное всей тотальной популяцией. Он включает различия между популяциями (D_ST ) и индивидуумами внутри популяций (H_S ). Показатель H_S оценивает различия внутри популяции, потому его называют показателем гетерозиготности популяции. Он оценивает, насколько генетически похожи друг на друга индивидуумы из одной популяции. Все показатели связаны между собой следующими соотношениями:

где q_ij - частота аллеля i в субпопуляции j (j=1, 2, …​ , k); k - число субпопуляций; q_i - средняя частота аллеля i в тотальной популяции.

Оба способа расчета - и через дисперсию, и через снижение гетерозиготности - измеряют одну и ту же подразделенность. Именно поэтому при условии использования корректного математического аппарата эти две величины оказываются равны друг другу.

Третий и самый очевидный способ оценки генетических различий между популяциями - с помощью генетических расстояний. Есть множество мер генетических расстояний, и все они сравнивают, насколько различаются частоты аллелей в двух популяциях. Если необходимо сравнить не две, а сразу несколько популяций, то надо просто рассчитать генетические расстояния между каждой парой популяций и затем усреднить все попарные различия. В результате будет получена общая характеристика всей рассматриваемой системы популяций, т. е. то, насколько все входящие в нее популяции генетически отличаются друг от друга. Легко заметить, что по смыслу это та же степень подразделенности, которая была описана для первого случая с помощью других мер различий (F_ST ~ G_ST ). Этот - уже третий - способ расчета подразделенности приведет к получению того же числа, той же величины подразделенности, что и два других способа расчета (через дисперсию частоты аллеля в субпопуляциях и снижение гетерозиготности). Именно поэтому разные меры генетических расстояний часто служат одновременно и мерами подразделенности.

Четвертый способ расчета генетических различий между популяциями (использован в разделах «Генетические маркеры» и «Время и пространство генофонда») напрямую связывает подразделенность популяции с генетическим дрейфом и миграциями. Популяционный смысл этой связи в том, что генетические различия между субпопуляциями возникают и растут за счет дрейфа генов, но уменьшаются за счет миграций между субпопуляциями. Подразделенность (F_e ) рассчитывают по формуле:

где N_e - генетически эффективный размер популяции, задающий интенсивность дрейфа; M_e - генетически эффективные миграции.

Пятый способ позволяет выразить то же разнообразие, но в терминах, более привычных для медицинской генетики, - инбридинга и эндогамии.

Эндогамия - доля браков, заключаемых внутри популяции. В определении популяции было указано, что ее эндогамия должна быть больше 0,5. Эндогамия ниже этой критической величины свидетельствует о коллапсе популяции, т.е. если более половины браков заключают вне популяции, то она растворяется в иной, более крупной популяции. Например, среди изученных в 2010 г. эвенков Забайкалья не удалось обнаружить ни одного (!) брака между ними, так как все эвенкийские женщины предпочли мужчин иных этносов. Это означает, что их эндогамия равна нулю, и популяция этой группы эвенков сошла с исторической сцены. В табл. 9-1 приведены показатели эндогамии и инбридинга для народов Кавказа - от самых западных (шапсуги, абхазы, черкесы) до самых восточных (народы Дагестана). Таблица 9-1 демонстрирует, что на Кавказе сохраняется традиционная брачная структура, поддерживающая высокую степень эндогамии и, как следствие, высокий уровень инбридинга. Например, кубанские казаки проживают среди шапсугов и черкесов, ходят в одни школы и магазины, но при этом остаются разными популяциями: у кубанских казаков инбридинг в 10 раз меньше, чем у черкесов, и в 50 раз меньше, чем у шапсугов. Из табл. 9-1 следует, что даже в горном изоляте Швейцарии (F_r =0,51) и религиозном изоляте мормонов (F_r =0,19), служащих классическими примерами изолированных популяций, инбридинг значительно ниже, чем в среднем среди популяций Кавказа.

* Оценки эндогамии для этнической группы.

** Средние оценки эндогамии для административных районов.

*** Средние оценки эндогамии для аулов (деревень).

Инбридинг - эффект близкородственных браков в пределах одной популяции. Общий показатель инбридинга (F_IT ) складывается из двух составляющих - случайного (F_ST ) и неслучайного инбридинга (F_IS ), которые соотносятся следующим образом:

где F_IT - общий коэффициент инбридинга индивидуума (I) относительно тотальной (T) популяции; F_IS - коэффициент неслучайного инбридинга индивидуума (I) относительно субпопуляции (S), к которой он принадлежит; F_ST - коэффициент случайного инбридинга субпопуляции (S) относительно тотальной (T) популяции.

Инбридинг составляют браки между близкими и дальними родственниками, которые можно обнаружить с помощью изучения родословных. Неслучайный инбридинг возникает, если в популяции существует традиция заключения ассортативных браков между родственниками. Случайный инбридинг возникает вследствие ограниченности размера популяции, при этом со временем все ее члены становятся в какой-то степени родственниками, не подозревая о своем родстве.

В зависимости от традиционной брачной структуры ведущей является либо одна, либо другая составляющая инбридинга. Например, в популяциях Западного Кавказа (шапсуги, черкесы, абхазы) тщательно, вплоть до восьмого поколения избегающих родственных браков, основную роль играет случайный инбридинг (в табл. 9-1 он рассчитан на основе данных о фамилиях с помощью коэффициента изонимии). В популяциях же Дагестана (кубачинцы, даргинцы, аварцы, ботлихцы, андийцы, тиндалы, лакцы, лезгины), традиционно практикующих близкородственные браки, основную роль играет неслучайный инбридинг (в табл. 9-1 рассчитан на основе родословных).

Показатель F_ST , который с пяти разных точек зрения оценивает подразделенность популяции, одновременно служит оценкой случайного инбридинга.

Генетические маркеры

Популяционная генетика оперирует полиморфными генами, т. е. такими, которые распространены в популяциях не в одном, а в разных вариантах (аллелях), причем каждый аллель встречается с заметными частотами. Каждый из аллелей является результатом мутаций гена, обычно произошедших в далеком прошлом и передающихся в цепи поколений. При этом если варианты гена, определяющие наследственные заболевания, как правило, очень редки, то для целей популяционной генетики важно, чтобы аллельные варианты были достаточно частыми: согласно разным критериям полиморфизма, аллели гена должны встречаться в популяции с частотой не менее 1% или даже не менее 5%.

Генетический маркер - любой полиморфный признак, по характеру проявления которого у конкретного индивидуума можно однозначно опознать определенный вариант определенного участка ДНК. Такой признак не обязательно является геном, но он должен нести точную информацию о конкретном фрагменте ДНК. Только в этом случае признак рассматривают как генетический маркер, поскольку он однозначно маркирует конкретный участок ДНК. Если такая связь неоднозначна, то признак не относят к генетическим маркерам. Непосредственно выявляемые полиморфные варианты ДНК также относят к генетическим маркерам.

В современной популяционной генетике генетические маркеры принято делить на два класса - классические и ДНК-маркеры.

Классические маркеры

Первоначально термин «генетический маркер» обозначал признаки, которые сейчас чаще называют классическими маркерами. Гены тогда можно было изучать только через анализ их внешних (фенотипических) проявлений, и было важно различать, какие из них маркируют гены, а какие - нет.

Например, свертывание крови в присутствии определенных антител однозначно свидетельствует о присутствии в ней антигена, а его существование - о наличии у индивидуума определенного аллеля этого гена. Влажная или сухая консистенция ушной серы однозначно указывает на существование соответствующего аллеля другого гена. Множество других особенностей внешнего облика человека (например, кожные узоры пальцев или цвет глаз), несмотря на их высокую наследуемость, не имеют однозначной связи с конкретным вариантом того или иного гена и поэтому не могут быть генетическими маркерами.

Среди классических маркеров выделяют три основных подтипа, которые перечислим в историческом порядке их применения.

Физиологические маркеры - физиологические признаки, проявление которых контролирует один ген (например, цветовая слепота, вкусовая чувствительность к фенилтиокарбамиду или тип ушной серы).

Иммунологические маркеры - белки иммунной системы, определяемые иммунологическими (серологическими) методами (например, группы крови AB0 и резусфактор).

Биохимические маркеры - ферменты (обычно сыворотки или эритроцитов крови), определяемые такими биохимическими методами, как электрофорез и изоэлектрофокусирование.

ДНК-маркеры

Анализ ДНК-маркеров - прямой анализ изменчивости структуры самой ДНК. Именно поэтому практически все ДНК-маркеры служат генетическими маркерами. Однако можно привести пример мультилокусной пробы (ДНК-фингерпринт), где гены, соответствующие полосам фореграммы, остаются неизвестными, поэтому ДНК-фингерпринт не относят к генетическим маркерам.

ДНК-маркеры, используемые в популяционной генетике, имеют несколько разных критериев классификации, а сами классификации частично перекрывают друг друга.

Диаллельные и мультиаллельные ДНК-маркеры. Среди диаллельных ДНК-маркеров обычно выделяют три типа: точечные замены SNP, обычно называемые снипами, инсерции (например, вставки мобильных элементов - Alu-повторы) и делеции (см. «Факторы популяционной динамики: мутации и отбор», где описано распространение делеции в гене CCR5, определяющей устойчивость к синдрому приобретенного иммунодефицита).

В популяционной генетике из мультиаллельных ДНК-маркеров обычно изучают минисателлитные и особенно микросателлитные (STR - short tandem repeats) маркеры.

У STR-маркеров аллели отличаются друг от друга количеством повторов одного и того же мотива. У минисателлитных маркеров мотив относительно длинный, а у микросателлитных он состоит из сочетания всего нескольких нуклеотидов (обычно - 2, 3 или 4), но оно многократно и монотонно повторяется. Аллели STR-маркеров обозначают по числу повторов. Мутации в таких маркерах накапливаются быстро, и у ребенка нередко становится на один повтор больше или меньше, чем у родителей. Именно благодаря повышенной скорости мутаций эти маркеры и важны для популяционной генетики. Так, например, их используют как «минутную» стрелку при датировке происхождения гаплогрупп Y-хромосомы, а медленно мутирующие SNP-маркеры - как «часовую» стрелку.

Вторая важная для популяционной генетики человека классификация подразделяет ДНК на аутосомные маркеры и на «однородительские» (uniparental).

Аутосомные и «однородительские» ДНК-маркеры

К однородительским маркерам относятся маркеры мтДНК, передающиеся в цепи поколений только по материнской линии, и маркеры нерекомбинирующей части Y-хромосомы (NRY), передающиеся в цепи поколений только по отцовской линии. К аутосомным относят все остальные маркеры, содержащиеся у индивидуума в двух вариантах - один получен от отца, другой - от матери, поэтому они подвержены рекомбинации. У однородительских маркеров отсутствует рекомбинация, ведь дети получают генетическую информацию только от одного из родителей. Именно поэтому весь генетический текст, записанный в мтДНК или нерекомбинирующих участках Y-хромосомы, целиком и без перемешивания передается в цепи поколений. Генетический текст, целиком переданный либо от матери (мтДНК), либо от отца (NRY), называют соответственно гаплотипами мтДНК и гаплотипами Y-хромосомы.

Если бы гаплотипы всегда передавались неизменными во всей череде поколений, то все дочери Евы были бы одинаковы по мтДНК, а сыновья Адама - по Y-хромосоме. Тем не менее время от времени в обоих типах ДНК происходят мутации. Каждая из них, благодаря отсутствию рекомбинации, создает новый гаплотип, причем можно указать, какой гаплотип был предковым, а какой - дочерним. Группы родственных гаплотипов, восходящих к общему предку, но уже накопивших некоторые различия между собой, называют гаплогруппами. Знание того, какие гаплогруппы предковые, а какие относительно них дочерние, позволяет воссоздать всю цепь генетических преобразований на протяжении всей истории человека, реконструировав «родословные» мтДНК и Y-хромосомы для всего человечества.

В целом картина похожа на генеалогическое древо древнего и знатного рода, но есть два отличия. Во-первых, это генеалогия всего человеческого рода, а во-вторых, она проще обычных генеалогий, поскольку на этом древе отражается происхождение либо только по материнской линии (мтДНК от Евы ко всем ее нынешним дочерям), либо только по отцовской линии (Y-хромосома от Адама ко всем его нынешним сыновьям). Много проще она и тем, что на таком генеалогическом древе записаны не имена, а только мутации, а они случаются нечасто. Зато корни древа уходят на огромную глубину - на все время существования человечества. Знание таких иерархических классификаций мтДНК и Y-хромосомы, а также скоростей мутаций позволяет определить время происхождения гаплотипов и отдельных популяций (см. «Время и пространство генофонда»).

Подтипы классических и ДНК маркеров различаются лишь техническими параметрами - методом тестирования гена, способом наследования или мутирования. Суть анализа генетических маркеров по мере развития технологий оставалась неизменной - необходимо установить, какой именно вариант конкретного фрагмента ДНК присутствует у определенного индивидуума.

Полногеномные панели ДНК-маркеров. Параллельно с внедрением новых методов увеличивалась и пропускная способность анализа, чему в последние годы особенно способствовало развитие NGS-технологий. Тем не менее стоимость полного прочтения одного генома человека (3 млрд нуклеотидов) еще долго будет слишком велика, чтобы секвенировать хотя бы по 100 человек из каждой популяции земного шара.

Альтернативой полному прочтению индивидуального генома становится анализ тысяч или сотен тысяч SNP-маркеров - так называемый полногеномный анализ (genome-wide genotyping). Действительно, панели в сотни тысяч снипов покрывают весь геном как плотной сеткой, но ими геном не исчерпывается: между снипами, входящими в панель, остаются фрагменты генома, информацию о которых этот метод не позволяет получить. Технологии чипов достаточно развиты и, хотя тоже дорогостоящи, позволяют анализировать сотни и тысячи образцов.

Важно при этом помнить специфику популяционной генетики. Анализ одного генома ничего не дает, и, чтобы получить характеристику одной популяции, нужно проанализировать примерно 100 геномов. Необходимо также изучить такое же число геномов из многих других популяций: ведь, чтобы понять особенности и происхождение интересующей популяции, нужно сравнивать ее с другими. Простое увеличение количества генов, анализируемых для каждого человека из конкретной популяции, приводит лишь к необходимости закупки все более мощных компьютеров для обработки растущего массива данных. Чтобы это количество начало переходить в качество или хотя бы позволило получать более точные и интересные результаты, чем при классическом анализе немногих генов, надо научиться собирать многомерную картину генофонда из ее множества проекций - отдельных генетических маркеров. О том, как этого достичь, пойдет речь в следующих разделах главы.

Негенетические и квазигенетические маркеры

Наряду с генетическими маркерами популяционная генетика использует целый ряд иных типов признаков, которые несут информацию о структуре генофонда, но не маркируют определенный участок ДНК (например, фамилии, кожные узоры, археологические, лингвистические, антропологические или демографические признаки).

Для большинства перечисленных признаков генетическая предрасположенность вообще отсутствует (например, фамилии, названия рода, демографические параметры). Они не имеют не только генетической, но и биологической природы, поэтому их и называют квазигенетическими (псевдогенетическими). Тем не менее, несмотря на такое название и то, что они не определяются генами (фамилия - явление языка и культуры, а не биологии), квазигенетические маркеры порой ведут себя почти так же, как и настоящие гены. Благодаря исторически возникшей связи «псевдогены» обнаруживают высокую корреляцию с настоящими генами и потому позволяют анализировать структуру генофонда.

Наиболее популярный квазигенетический маркер - фамилии, каждая из которых служит аналогом одного из многих тысяч аллелей одного гена. Показано, что даже для русских фамилий, исторически возникших недавно, связь с ДНК-маркерами Y-хромосомы, рассчитанная на популяционном уровне изменчивости, велика (r=0,6). Еще больше она для тех народов, где фамилии унаследовали знаки родовой принадлежности (Кавказ, Центральная Азия, Сибирь, Дальний Восток). При этом фамилии обладают важным преимуществом: в отличие от настоящих генетических маркеров, это «бескровный» и дешевый маркер, который можно изучать не для малой выборки из популяции, а для всей популяции в целом. Эти достоинства и существование высокой корреляции с истинно генетическими маркерами делают фамилии незаменимым инструментом для анализа структуры генофонда, случайного инбридинга и груза наследственной патологии.

Требования к выборке маркеров для изучения генофонда

Если изучается не весь геном, а только выборка генов из него, то неизбежно возникает вопрос: сколько и каких маркеров надо включить в анализ, чтобы получить надежные характеристики генофонда? Как убедиться, что по данным о нескольких маркерах можно делать обоснованные выводы о генофонде в целом?

Сравнение показателей разнообразия генофонда F_ST . Такие доказательства дает сравнение разных выборок генов. Принцип доказательства следующий: если при проведении нескольких исследований, каждое из которых основано на независимой выборке генов, будут получены одинаковые характеристики генофонда, то можно утверждать, что каждая из этих выборок характеризует основные черты генофонда. Было проведено множество таких сравнительных исследований, позволивших утверждать, что для классических маркеров достаточно собрать случайную выборку из 20-30 генов (в сумме - около 50 полиморфных аллелей), чтобы получить достоверную характеристику межпопуляционного разнообразия генофонда (F_ST ≈G_ST ).

Классические маркеры определяются не прямо по фрагментам ДНК, а по их белковым продуктам, которые подвержены более интенсивному отбору, чем просто последовательности ДНК. Именно поэтому с наступлением эры ДНК-маркеров широко распространилось утверждение, что ДНК-маркеры, свободные от давления отбора, будут фиксировать большее генетическое разнообразие генофонда, чем классические маркеры. Однако такое утверждение может быть справедливо лишь в том случае, если на все классические маркеры будет действовать только один вид отбора - стабилизирующий (уменьшающий различия между популяциями), но это предположение не соответствует действительности. Еще до получения результатов исследования ДНК-маркеров теоретически было показано, что оценки дифференциации генофонда по классическим и ДНК-маркерам должны быть одинаковыми, если выборка маркеров случайна и достаточно велика. Первые же результаты подтвердили этот прогноз.

В табл. 9-2 приведены четыре ряда независимых оценок разнообразия мирового генофонда, различающихся по всем исходным параметрам (число изученных народов мира и их состав, число генных маркеров и их состав), и даже сами меры межпопуляционного разнообразия различны. Общими для этих работ были лишь охват всего мирового разнообразия в целом и проведение исследования на едином (этническом) уровне популяционной системы. При этом оценки межпопуляционного разнообразия F_ST оказались чрезвычайно устойчивыми и индифферентными к методическим расхождениям авторов. Характер маркеров - белковые продукты генов или ДНК-полиморфизм - также не сказался на показателях разнообразия F_ST и H_S .

Полученный результат - важнейшее свидетельство устойчивости средних оценок разнообразия генофонда. Множество аналогичных сравнительных исследований других генофондов также обнаружило совпадение оценок F_ST по классическим и ДНК-маркерам при условии, что их выборки достаточно велики и случайны по отношению к отбору.

Например, для максимальной корректности сравнения народов Восточной Европы для анализа были отобраны только те этносы, которые изучены по обширным панелям как классических, так и аутосомных ДНК-маркеров. В результате были получены следующие оценки межпопуляционного разнообразия: по классическим маркерам F_ST =2,69, по аутосомным ДНК маркерам - F_ST =2,58. Совпадение оценок F_ST свидетельствует о том, что обе системы признаков - классических и ДНК-маркеров - дают объективную картину генофонда народов Восточной Европы; его важнейшая характеристика - межпопуляционная изменчивость (F_ST ) - составляет около 2,6.

Можно ожидать, что и полногеномные исследования дадут ту же оценку дифференциации популяций, что и анализ классических маркеров.

Сравнение генетических и квазигенетических маркеров

Еще более убедительно тождество оценок, полученных, с одной стороны, по генетическим маркерам, а с другой - по данным, не имеющим отношения к биологии: о фамилиях (коэффициент изонимии) или демографических показателях миграций Me и размера популяции Ne. Теоретическое равенство популяционной генетики F_ST ≈F_e =1/(4N_e M_e +1) утверждает, что оценки разнообразия по данным генетики и демографии должны совпадать. Они действительно оказываются очень близкими (табл. 9-3), вопреки всем допущениям и погрешностям оценок N_e и M_e . Такое же совпадение обнаруживают при сравнении генетических и исторических дат (см. «Время и пространство генофонда»). Все эти сравнения подтверждают возможность анализа генофонда по относительно небольшой случайной выборке генетических маркеров.

* Данные, источники информации, методы, доверительные интервалы и характеристика генных маркеров (наборы которых существенно отличаются друг от друга) приведены в цикле работ, выполненных коллективом под руководством Ю.Г. Рычкова, и кратко сведены в разных работах (Рычков, 1984; Рычков, 1986; Рычков, Балановская, 1990).

** Данные по адыгейцам (Балановская и др., 1999).

Картографический анализ разных типов маркеров

Оставался нерешенным вопрос: если перейти от среднестатистических оценок разнообразия F_ST к конкретным популяциям и их ареалам, сохранится ли сходство между классическими и ДНК-маркерами? Ответить на этот вопрос позволяют обобщенные карты генофонда.

Например, в первом варианте картографирования аутосомных ДНК-маркеров карта первой компоненты изменчивости генофонда Восточной Европы по своему общему паттерну соответствовала картам антропологии и классической генетики, но с одним существенным отличием: экстремум на ДНК-карте был явно смещен на северо-восток. Когда и число изученных аутосомных ДНК-маркеров, и число изученных популяций возросло почти вдвое, новый вариант карты по ДНК-маркерам значительно приблизился к картам антропологии. Можно надеяться, что когда по ДНК-маркерам будут изучены не 30 популяций, как сейчас, а те же 600 популяций, что и по антропологии, то их карты совпадут полностью. Таким образом, молекулярная генетика не меняет картину мира, а лишь по мере собственного совершенствования постепенно приближается к картине, уже известной по данным антропологии и классическим маркерам.

Наиболее надежные результаты дает комплексное применение картографического и статистического (F_ST ) анализа одного и того же генофонда. При этом F_ST -анализ позволяет получить характеристику лишь одного, хотя и самого важного параметра генофонда, в то время как картографический анализ позволяет дать целый ряд характеристик генофонда, причем обнаруживая их изменчивость во всем ареале популяции. Благодаря этому картографический анализ оказывается более тонким и точным инструментом для определения структуры генофонда, чем анализ F_ST . Более того, компьютерные карты генофонда позволяют проводить любые виды статистического анализа: каждая из карт представляет матрицу, позволяющую использовать их в любых видах одно- и многомерной статистики. В том числе они позволяют не только оценить F_ST генофонда (как в статистическом анализе), но и картографировать изменчивость этого важнейшего показателя в пределах ареала генофонда.

Геногеографические карты не только выявляют основные тенденции в пространственной изменчивости населения, но и позволяют обойти основное препятствие - различную изученность населения по разным типам признаков. Иными путями это препятствие непреодолимо, так как набор изученных популяций просто несопоставим. Например, для населения Восточной Европы не оказалось ни одной популяции, изученной по всему спектру классических маркеров. В еще большей степени такие расхождения характерны для разных систем признаков - фамилий, антропологии или ДНК-маркеров. Поскольку многомерные методы статистики требуют, чтобы все популяции были изучены по всем признакам, только картографический подход позволяет максимально полно сравнивать разные системы признаков и оценивать основные параметры генофонда.

Сравнение аутосомных и однородительских маркеров

Следует подчеркнуть, что при сравнительном анализе межпопуляционного разнообразия F_ST используют только аутосомные маркеры. Это связано с тем, что ДНК-маркеры с «однородительским наследованием» (по материнской линии - мтДНК; по отцовской линии - Y-хромосома) отличаются своеобразными показателями межпопуляционного разнообразия.

Генетически эффективный размер (N_e ) по однородительским генам в 4 раза меньше, чем для аутосомных маркеров, поэтому однородительские маркеры подвержены значительно большему влиянию дрейфа генов, что приводит к возрастанию F_ST . С другой стороны, однородительские маркеры также более подвержены изменчивости, обусловленной особенностями миграционных потоков. Межпопуляционные различия по маркерам Y-хромосомы отражают миграции мужской части населения, а по маркерам мтДНК - миграции женской части населения. Именно поэтому для популяций с патрилокальной традицией, когда жены переезжают в популяцию мужа, F_ST Y-хромосомы намного (на порядок) выше, чем F_ST аутосомных маркеров, а F_ST мтДНК лишь незначительно превышает изменчивость аутосомных маркеров. Благодаря значительным различиям между популяциями (F_ST ) возможности Y-хромосомы в реконструкции миграций значительно выше, чем мтДНК и аутосомных маркеров.

Например (рис. 9-1), при расчете строго для одних и тех же популяций изменчивость украинцев по Y-хромосоме (G_ST =1,1) оказалась в 2-3 раза выше, чем по мтДНК (G_ST =0,5) и аутосомным ДНК-маркерам (G_ST =0,4). Изменчивость восточных славян по Y-хромосоме (G_ST =1,4) почти в 5 раз выше, чем по мтДНК (G_ST =0,3) и аутосомным ДНК-маркерам (G_ST =0,3). Изменчивость славян по Y-хромосоме (G_ST =5,0) уже в 20 раз выше, чем по мтДНК (G_ST =0,2) и аутосомным ДНК-маркерам (G_ST =0,2).

Однако для популяций с матрилокальной традицией (мужья переезжают в популяцию жены) или традицией кровнородственных браков (и женщины, и мужчины остаются в популяции) межпопуляционная изменчивость мтДНК также оказывается высокой. Именно поэтому по оценкам F_ST однородительских маркеров нельзя судить о межпопуляционной изменчивости генофонда в целом. Тем не менее однородительские маркеры служат уникальным инструментом для решения иной задачи - выявления миграционных потоков.

Именно поэтому, исходя из знания особенностей изменчивости каждого класса генетических маркеров, выбирают и стратегию анализа популяций. Например, для измерения изменчивости генофонда в целом можно опираться только на аутосомные маркеры. При реконструкции миграций наиболее эффективны однородительские маркеры Y-хромосомы и мтДНК. Они позволяют не только фиксировать время и источники миграций, но и отличать события мирного взаимодействия генофондов (отражающегося в патрилинейных популяциях, главным образом через миграции женщин и, следовательно, в паттерне мтДНК) от влияния военных походов (отраженных в паттерне Y-хромосомы).

Картографический анализ позволяет использовать однородительские маркеры для определения разнообразия генофонда: обобщенные карты и однородительских, и аутосомных маркеров демонстрируют одну и ту же пространственную изменчивость генофонда. Иными словами, различия в размахе межпопуляционной изменчивости не сказываются на «картографическом портрете» генофонда. Этот вывод крайне важен для медицинской генетики, поскольку, несмотря на крайне низкие показатели F_ST , для наследственной патологии обнаруживают тот же основной паттерн географической изменчивости, что и для полиморфных генетических маркеров (и аутосомных, и однородительских). Именно поэтому картографическое исследование генофонда имеет столь большое значение для генетической эпидемиологии: исследуя полиморфные генетические маркеры, можно получить прогноз географической изменчивости груза наследственных болезней.

Полисистемный подход

Приведенный обзор генетических маркеров и их анализа позволяет ответить на вопрос: будут ли столь различные системы маркеров (физиологические, иммунологические, биохимические, ДНК аутосомные, однородительские, STR, SNP и др.) давать одну и ту же характеристику генофонда? Ведь если каждая система генетических маркеров будет описывать свою долю генома и генофонда, то получаемые «портреты» генофонда будут не похожи один на другой, и исследователи не смогут узнать, какова же истинная структура генофонда.

Вопрос объективности «портрета» генофонда, получаемого по той или иной системе признаков, - решающий для популяционной генетики. Все системы признаков - классические и ДНК-маркеры генетики, антропологические признаки, фамилии и даже археологические характеристики - несут в своей изменчивости ту или иную информацию о генофонде. Именно поэтому основным средством определения объективного «портрета» генофонда является полисистемный подход - параллельный анализ одного и того же генофонда по разным системам признаков.

Он состоит в прямом - статистическом и картографическом - сопоставлении тех картин, которые дают разные системы признаков. Статистическое сравнение проводят через анализ показателей межпопуляционного разнообразия F_ST , картографическое - через анализ обобщенных карт генофонда.

Хотя полисистемный подход может опираться на сравнение показателей межпопуляционного разнообразия F_ST , он наиболее информативен при использовании следующей стратегии картографического изучения генофонда.

На первом этапе одним и тем же методом строят карты для каждого признака.

На втором этапе создают обобщенные карты для каждого типа признаков (физиологические, иммунологические, биохимические, квазигенетические, антропологические, ДНК аутосомные, однородительские, STR, SNP и др.). Каждая такая карта претендует на отражение структуры генофонда.

На третьем этапе проводят сравнительный анализ обобщенных карт. Его итогом служит геногеографический синтез данных разных наук: выявление искомой «общей модели» генофонда, т.е. тех структурообразующих элементов, которые обнаружены на картах большинства типов признаков.

После выявления «общей модели» можно перейти к следующим этапам и, например, рассмотреть, что нового внес каждый тип признаков в описание структуры генофонда населения и каковы особенности отдельных признаков при описании различий между популяциями.

Важный шаг на этом пути - одновременное использование данных по мтДНК и Y-хромосоме. Обе эти системы очень похожи: они гаплоидны, не рекомбини-руют, их анализируют с помощью одних и тех же филогеографических методов, обе наиболее уязвимы для действия дрейфа генов и чувствительны к различиям в миграции мужчин и женщин. Это может привести к одинаковым искажениям реконструируемой картины миграций. Именно поэтому следующий шаг - расширение спектра анализируемых генетических систем за счет аутосомных ДНК и классических маркеров, а также включения информативных квазигенетических систем, таких как фамилии, антропологические, археологические и лингвистические признаки. Когда картины мира совпадают вопреки тому, что они обрисованы совершенно разными свидетелями, можно быть уверенным, что генетические следы миграций и других событий в истории формирования генофонда реальны и достоверны.

По этим причинам для интерпретации географического распределения ДНК-фрагментов, связанных с наследственными нарушениями, желательно иметь данные по всем трем типам генетических маркеров (аутосомные, мтДНК и Y-хромосома), что позволит дать объемную картину формирования популяций и наиболее корректно объяснить географическое распределение наследственных заболеваний.

Использование многих систем - полисистемный подход - не только позволяет достичь нового уровня надежности результатов генетических исследований, но и открывает путь к реальному синтезу знаний об истории популяций человека, полученных самыми разными науками.

ФАКТОРЫ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ДИНАМИКИ: МУТАЦИИ И ОТБОР

В настоящее время твердо установлено, что все человечество восходит к единому корню, единому генофонду. Каким же образом возникла многоликость современного человечества? Факторы популяционной динамики во всех популяциях человека одинаковы (мутации, отбор, дрейф генов и миграции), но их удельный вес различен и в разных популяциях человека, и для разных генов.

Исходный запускающий механизм - мутации, благодаря которым возникают новые варианты структуры ДНК. Дальнейшее увеличение частоты нового варианта или его элиминацию может контролировать отбор. Частота возникшей мутации может случайно возрасти под действием дрейфа генов. Кроме того, миграции могут занести новые варианты ДНК из других популяций (см. «Факторы популя-ционной динамики: дрейф генов и миграции»).

Мутации изменяют структуру ДНК, в то время как остальные факторы популяционной динамики (отбор, миграции и дрейф генов) изменяют только частоты вариантов структуры ДНК. Тем не менее эффект мутаций оказывается настолько слабее дрейфа генов и миграций, что на популяционном уровне его уловить очень сложно. Исключение составляют однородительские маркеры мтДНК и Y-хромосомы, именно поэтому ставшие ведущими генетическими маркерами в современной популяционной генетике человека. Восстановление исторической последовательности мутаций мтДНК и Y-хромосомы создает уникальную возможность установления исторической последовательности мутационных и миграционных процессов.

Оценка скорости мутаций

Определение скорости мутаций представляет собой непростую задачу. Продемонстрируем возникающие сложности на примере оценки скорости мутаций на Y-хромосоме. Это очень важный показатель для популяционно-генетических, медико-генетических и эволюционно-генетических исследований, а также для прикладных областей - генетической генеалогии и криминалистики. Обычно возникающие здесь мутации эволюционно нейтральны (безразличны для отбора) и не зависят одна от другой. Это делает Y-хромосому крайне перспективным инструментом для измерения времени по «молекулярным часам». Но для работы молекулярных часов необходимо знать скорость, с которой Y-хромосома мутирует на один нуклеотид (или один локус) за год или за поколение.

Длину поколений, которая на практике довольно постоянна во времени и пространстве, обычно принимают за 31 год у мужчин и за 25 лет для женщин. Принято считать, что три поколения укладываются в столетие. Хотя от древних времен к современным увеличивались продолжительность жизни и, соответственно, длина поколения, в предыстории ее оценивают величиной 28,1±0,7 года - что совпадает со средней между мужской и женской длиной поколения сегодня. Хотя сегодня в один и тот же промежуток времени укладывается меньшее число поколений (что снижает количество мутаций), это компенсируется большим возрастом отца (что увеличивает количество мутаций).

ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ СКОРОСТИ МУТАЦИЙ

Для датировки по Y-хромосоме используются два вида генетических маркеров. Первый - это маркеры SNP - замены нуклеотидов в изменчивых участках генома; они возникают медленно, это «часовая стрелка» на молекулярных часах. Второй - короткие тандемные повторы, или микросателлиты (STR), возникающие гораздо быстрее (это «секундная стрелка»). STR служат для этой цели уже пару десятилетий, в то время как применение SNP стало возможным лишь с распространением технологий полного секвенирования (NGS).

Существует три основных подхода для измерения скорости мутаций, основанных: на генеалогии, на калибровке по историческим событиям и на изучении древней ДНК.

Первый подход состоит в прямом подсчете мутаций в какой-то линии наследования (в простейшем случае - от отца к сыну); число мутаций делят на число поколений и получают скорость мутирования на поколение, а поделив ее на длину поколения, - скорость мутирования в год. Это так называемая генеалогическая скорость, ее же называют скоростью мутаций de novo. Она основана на прямом подсчете мутаций, хотя для применения к популяционным событиям приходится вводить ряд предположений.

Второй подход представляет собой калибровку молекулярных часов по историческим событиям в популяциях, дата которых известна. Она носит название эволюционной, или филогенетической, скорости мутаций. Для ее вычисления нужна популяция с известным временем формирования и наличием специфической для популяции гаплогруппы.

Третий подход использует филогенетические линии, чья эволюция остановилась много лет назад. Они остались в палеоДНК. В древних образцах у ДНК было меньше времени накопить мутации, чем у современной ДНК. Следовательно, число отсутствующих в ней (пропущенных) мутаций пропорционально возрасту образца, который часто известен по радиоуглеродной датировке. Эту скорость, вычисленную по древней ДНК, также называют эволюционной.

Оба типа скорости мутаций, и генеалогическая, и эволюционная, могут использовать как SNP-, так и STR-маркеры, так что всего получается четыре разновидности скорости. Конечно, STR-маркеров на Y-хромосоме всего около 4500, а SNP - несколько миллионов. Но поскольку STR-мутации более быстрые, в конечном итоге число тех и других мутаций сравнимо: у индивида возникает примерно одна STR-мутация и одна SNP-мутация каждые 3-4 поколения. Рассмотрим четыре варианта оценки Y-SNP скорости мутаций.

Y-SNP СКОРОСТЬ МУТАЦИЙ

Y-SNP генеалогическая скорость мутаций. Для нее пока в мировой литературе получены три оценки: для китайцев - 1,0×10^-9 на нуклеотид в год; для исландцев - 0,89×10^-9 и для казахов - 0,78×10^-9 .

Y-SNP эволюционная скорость по калибровке по историческим событиям. Для америндов (коренное население Америки) в предположении, что они расселились по Америке 15 000 лет назад, скорость мутаций оценена в 0,82×10^-9 на нуклеотид в год. Для жителей Сардинии, ориентируясь на археологические данные о ее неолитическом населении, получены две оценки: на образцах с низким покрытием секвенирования - 0,53×10^-9 , с высоким покрытием - 0,68×10^-9 .

Y-SNP эволюционная скорость мутаций по древней ДНК Для полного генома человека верхнего палеолита Сибири (Усть-Ишим) получена оценки скорости мутаций 0,76-0,78×10^-9 на нуклеотид в год; для палеоиндейца Анцик - 0,73-0,82×10^-9 ; для палеоэскимоса Саккак - 0,89×10^-9 ; при совместном анализе верхнепалеолитических образцов - сибиряка Усть-Ишим и европейца Лошбор - 0,71×10^-9 . Наиболее приемлемой эволюционной скоростью по древней ДНК считается величина 0,75×10^-9 .

Рис. 9-2 (см. цв. вклейку) суммирует эти оценки Y-SNP скорости с доверительными интервалами. Доверительные интервалы генеалогической скорости (показаны зеленым) перекрываются в меньшей степени, чем доверительные интервалы эволюционной скорости (показаны голубым). А Y-SNP генеалогическая скорость оказывается примерно на 20% быстрее, чем Y-SNP эволюционная скорость мутаций. Главным фактором, влияющим на Y-SNP скорость мутаций, является величина покрытия секвенирования, ее увеличение минимизирует ошибки. Высокое покрытие снижает ложнонегативные ошибки, то есть пропуск присутствующих в образце мутаций.

Y-STR СКОРОСТЬ МУТАЦИЙ

Хотя скорость мутаций у разных STR-маркеров Y-хромосомы различается на два порядка (от 3,8×10^-4 до 7,4×10^-2 на локус на поколение), для популяционных исследований обычно используют те же стандартные панели из 17 и 23 STR-маркеров, что и в криминалистике.

Y-STR генеалогическая скорость мутаций. Оценку генеалогической скорости получают при прямом подсчете мутаций в огромном массиве пар «отец-сын» (большинство изучено при определении отцовства) и используют в криминалистике: на локус на поколение она составляет от 2,1×10^-3 до 3,99×10^-3 ; на локус в год - от 8,6×10^-5 до 12,5×10^-5 .

Y-STR эволюционная скорость мутаций. Она получена в единственном исследовании и только по семи Y-STR-маркерам: для популяции маори на основе сведений об их прибытии в Новую Зеландию 800 лет назад, для вариации гаплотипов у древних римлян и для сравнения Y-STR-вариации с аутосомными STR. Усреднив все три разные оценки, оценили скорость STR-мутаций - 2,8×10^-5 на локус в год, или 6,9×10^-4 на локус на поколение. При учете быстро и медленно мутирующих локусов оценка возросла до 8,2×10^-4 на локус на поколение.

РАСХОЖДЕНИЕ МЕЖДУ ДВУМЯ Y-STR-СКОРОСТЯМИ МУТАЦИЙ

Как мы видим, генеалогическая и эволюционная скорость по Y-STR-маркерам различаются в три раза. Поэтому при использовании этих скоростей и время жизни общего предка будет различаться в три раза. Разные исследователи выбирают либо одну, либо другую скорость, но при этом возраст исторических событий различается в три (!) раза. Хотя показано, например, что для населения Кавказа (Balanovsky et al., 2011) именно генеалогическая, а не эволюционная скорость дает адекватные датировки генетических кластеров, хорошо коррелируя с датировками возраста ветвления языков, однако разница в двух типах Y-STR-скоростей вызывает бурные научные и околонаучные дебаты.

Сравнение оценок Y-SNP- и Y-STR-скоростей для одних и тех же гаплогрупп в одних и тех же индивидуальных образцах выявило что Y-STR-оценки в разной степени пригодны для гаплогрупп разного возраста. Для гаплогрупп, возраст которых, по данным об Y-SNP, менее 7000 лет, генеалогическая Y-STR-скорость мутаций дает результат, согласующийся с истинным возрастом или немного преуменьшающий его, в то время как эволюционная Y-STR-скорость завышает возраст втрое. Для гаплогрупп, возраст которых находится в интервале от 7000 до 15 000 лет, ни один тип Y-STR скоростей неприемлем, так как не дает правильного результата. Для гаплогрупп старше 15 000 лет, напротив, более правильно работает эволюционная Y-STR-скорость мутаций, указывая верный или лишь немного завышенный возраст.

ПУТИ К КОНСЕНСУСНОЙ СКОРОСТИ МУТАЦИЙ Y-ХРОМОСОМЫ

Так какую же скорость надежнее использовать? Есть три возможных ответа на этот вопрос: формальный ответ, ответ с позиций здравого смысла и сопряженный с большим риском.

В зависимости от того, какая скорость будет использована - по древней ДНК или генеалогическая, будут даны разные оценки того, связаны ли или нет датируемые генетические события с распространением популяций банту в Африке, ямной культуры в Евразии или миграции индоевропейцев в Индию. Но какая бы скорость ни была выбрана, обязательно надо учитывать и доверительный интервал скорости мутаций - это повышает вероятность того, что реальное время общего предка попадает в полученный интервал.

Перспективы. Каждый изученный древний геном мужчин открывает потенциальную возможность для уточнения оценки Y-SNP эволюционной скорости мутаций при условии качественного секвенирования и точной радиоуглеродной датировки. Накапливание объема данных по современным геномам, включая родственные, позволит более точно вычислять генеалогическую Y-SNP скорость. Вряд ли более точные оценки далеко сдвинут существующий сейчас диапазон Y-SNP, но они могут сузить их и сделать оценки точнее. Опыт приложения этих скоростей к реальной истории популяций может помочь с выбором конкретной скорости в том или ином случае.

Статистический анализ отбора: селективная структура

Отбор и мутации действуют на каждый ген в отдельности, в отличие от дрейфа и миграций, которые влияют на все гены одинаково.

Селективно-значимый процесс, в котором участвует естественный отбор (natural selection), и селективно-нейтральный процесс различаются не только по силе воздействия на генофонд человека, но и по характеру воздействия на его гены. В исторический процесс все гены населения вовлечены в равной степени, независимо от их функции в организме (если, например, некоторые популяции ирландцев переселяются в Америку, то они несут туда всю совокупность своих генов, т.е. весь генофонд переселяющейся популяции). В микроэволюционный процесс отбора гены вовлекаются «индивидуально», лишь в меру своей значимости для адаптации популяции к условиям среды. Именно поэтому для селективно-значимых генов на действие исторических сил накладывается влияние эволюционной силы отбора.

Проявление отбора на популяционном уровне можно зафиксировать по отличиям уровня генетических различий между популяциями по конкретному гену F _ST(i) (i - селективно-значимый ген) от селективно-нейтрального уровня Fe=F_ST . Такое сравнение позволяет распределить гены по классам селективной структуры генофонда (табл. 9-4).

По сравнению с одинаковым для всех генов селективно-нейтральным уровнем F_e =F _ST(i) размах изменчивости селективно-значимого гена F _ST(i) может увеличиться (F _ST(i) >Fe), если на него действует дифференцирующий отбор (например, в разных частях ареала имеют селективное преимущество разные аллели). В этом случае ген попадает в класс DIFF селективной структуры (см. табл. 9-4). Если же размах изменчивости селективно-значимого гена F _ST(i) меньше селективно-нейтрального (F _ST(i) <Fe), то можно предполагать действие стабилизирующего отбора, выравнивающего частоты во всех популяциях. В этом случае ген попадает в класс STAB селективной структуры (см. табл. 9-4). Поскольку оба селективно-значимых класса и селективно-нейтральный класс NEUTRAL имеют свои доверительные интервалы, между ними для большей корректности анализа выделяют буферные зоны N-DIFF и N-STAB, которые при менее строгом анализе объединяют с селективно-нейтральным классом NEUTRAL.

Факторы популяционной динамики: дрейф генов и миграции

СЛУЧАЙНЫЙ ДРЕЙФ ГЕНОВ

Наиболее известный закон популяционной генетики (равновесие Харди-Вайнберга) гласит, что если ни один из факторов популяционной динамики (мутации, отбор, миграции и дрейф генов) в популяции не действует, то частоты генов и генотипов во всей череде поколений неизменны. Первые три фактора очевидны, но пояснения требует фактор, называемый в мировой литературе дрейфом генов, а в российской науке - также генетико-автоматическим процессом.

Одно из условий существования идеальной популяции Харди-Вайнберга - бесконечно большой размер популяции. Если он ограничен, то случайные события могут легко исказить популяционную частоту гена при передаче из поколения в поколение. Чем меньше размер популяции N_e , тем больше вероятность того, что в поколении потомков возникнут отклонения от родительского генофонда по частотам генов. Когда такие отклонения накапливаются не в одном или двух, а в долгой цепи поколений, то ее крайние звенья становятся не похожими друг на друга. Процесс случайных отклонений в частотах генов, происходящих при передаче из поколения в поколение и связанных с ограниченным размером популяции, называют случайным дрейфом генов. Это название говорит и о том, что изменения происходят случайным образом (частота «дрейфует», как льдина), и о том, что в результате таких чисто случайных отклонений генофонды постепенно удаляются друг от друга. Они, как осколки льдины, «отдрейфовывают» и друг от друга, и от материнской льдины, от которой они откололись, т.е. от прапопуляции. Генетически эффективный размер популяции в рамках этих понятий - аналог размера льдины. Понятно, что популяции малого размера быстро отдрейфуют от предкового генофонда, а популяции очень большого размера будут мало чем отличаться по частотам генов от предкового генофонда. Если когда-то две популяции разделились, а затем под действием дрейфа генов генетически удалились друг от друга, то генетическое расстояние между ними (расстояние, на которое они отдрейфовали) будет зависеть от двух величин - генетического размера популяций (N_e ) и времени их раздельного существования (t). Значит, в генетических различиях между популяциями в скрытом виде присутствует время (возможность определения генетических дат показана в разделе «Время и пространство генофонда»).

Итак, дрейф генов - ошибка выборки из генофонда, совершаемая не исследователем, а самой историей в ряду поколений. Ошибка тем больше, чем меньше генетически эффективный размер N_e - та часть популяции, которая должна передать генофонд следующему поколению. Чем меньше размер популяции N_e , тем больше ошибка, тем сильнее случайный разброс в частотах гена от поколения к поколению, тем мощнее дрейф генов. Важно подчеркнуть, что дрейф генов - процесс ненаправленный, так как колебания частот аллелей в поколениях случайны и хаотичны.

Генетически эффективный размер популяции N_E

Поскольку каждый аутосомный ген содержится у индивидуума в двух копиях, то, казалось бы, генетический размер популяции, т.е. общее число генов в ней, можно считать в 2 раза большим, чем число людей в популяции. Но для изучения популяции важно знать не просто ее численность, а то, сколько генов будет передано следующему поколению. Следовательно, в подсчет уже нельзя включать гены стариков (генетического прошлого популяции) и детей (генетического будущего популяции): их или учитывали поколение назад, или они будут учтены в следующем поколении. Однако и оставшиеся гены людей репродуктивного возраста различны по своим судьбам. С точки зрения популяционной генетики важно, что они оставляют разное число потомков. Это означает, что одни половозрелые члены популяции передадут меньшее, а другие - большее число копий своих генов следующему поколению. Чем больше в популяции семьи различаются по своему размеру, тем меньше будет генетически эффективный размер популяции N_e . Но и это еще не все: необходимо, чтобы дети (носители родительских генов) достигли репродуктивного возраста, обзавелись своими семьями и оставили потомков, т.е. чтобы не прервалась передача генов по цепи поколений. Для оценки генетически эффективного размера популяции важно учесть еще и соотношение полов в популяции. Неравное соотношение означает, что гены не всех мужчин и женщин будут переданы следующему поколению.

Обычно в генетически стабильной популяции (с равной численностью полов и небольшими различиями между семьями по числу потомков) генетически эффективный размер популяции N_e составляет около 30% общего числа генов в популяции. Это значит, что из всех генов популяции на каждый момент времени лишь треть связана с формированием генофонда следующего поколения. Генетические свойства нового поколения начинают зависеть от того, насколько полно (или неравномерно) были представлены в этой трети гены родительского поколения.

Генетически эффективные миграции M_e

Обмен генами между популяциями называют миграцией генов, независимо от того, что привело к проникновению «чужих» генов в популяцию: веками устоявшаяся структура брачных связей между соседними популяциями (поток генов через брачные миграции), случайные браки с пришельцами из других популяций или же массовые перемещения целых групп населения.

Количественной характеристикой фактора миграций служит скорость притока генов за поколение, обозначаемая М_е . При оценке М_е учитывают не только общее количество «прибывших» генов, но и степень их новизны для популяции, несхожести с ее собственным генофондом: чем «неожиданней» прибывший с миграцией вариант гена, тем больше генетическая эффективность миграции. «Новизну» прибывшего гена может определять не только географическая, но и культурно-историческая разобщенность популяций.

Представим, что в русской глубинке поселилась небольшая группа приезжих эфиопов и столь же немногочисленная группа переселенцев-белорусов. Поначалу и к тем, и к другим будут относиться как к чужакам, но потом с ними станут заключать браки, и со временем обе приезжие группы растворятся в местном населении. Однако будущим популяционным генетикам будет куда легче обнаружить миграцию эфиопов, чем след переселения белорусов: за счет резкого отличия мигрантов и принимающей популяции генетический эффект миграции эфиопов будет намного сильнее. Следовательно, генетическая эффективность миграции эфиопов значительно больше, чем родственного народа - белорусов.

Миграция генов - социальный по своей первопричине процесс, который противостоит дрейфу генов и предотвращает утрату генетического сходства между популяциями в результате дрейфа генов. Любая популяция, таким образом, оказывается вовлеченной в оба противодействующих процесса - дрейф генов (N_e ) и миграцию генов (M_e ). Их устойчивое противодействие задает предел для генетического расхождения популяций:

Благодаря потоку генов предел различий между популяциями F_e оказывается гораздо меньше единицы (ожидаемый предел при дрейфе генов в условиях полной изоляции). Конкретную величину предельного значения F_e определяет соотношение интенсивности дрейфа генов и интенсивности миграций между популяциями. Это справедливо для взаимодействия не только разных популяций, но и между частями одной популяции, особенно если она расселена на большой территории.

Оценить величину M_e непросто. Для этих целей разработаны математические модели, с которыми можно ознакомиться в основных монографиях по популяционной генетике.

Островная модель рассматривает два варианта миграций M_e , не зависящих от расстояния между популяциями:

Модель изоляции расстоянием предполагает существование огромной популяции, индивидуумы которой непрерывно и равномерно распределены в столь большом ареале популяции, что расстояние, в пределах которого заключаются браки, намного меньше ареала. Рассматривают два варианта модели - одномерный (линейный, например, миграции вдоль побережья моря или реки) и двухмерный (миграции равновероятны в любом направлении на плоскости). В такой популяции, в отличие от островной, интенсивность миграций M_e зависит от расстояния.

Ступенчатая модель (stepping stone) - промежуточная между островной и изоляцией расстоянием.

Реально существующие миграции в популяциях M_e обычно промежуточны между этими моделями.

Реконструкция миграций по аутосомным маркерам затруднительна. Использование однородительских маркеров (мтДНК и Y-хромосома) воплотило, казалось бы, несбыточную мечту - «адресно» выявлять следы давних миграций в современных генофондах. Выше были показаны возможности мтДНК, решившей давний спор: саамы - европейцы или азиаты? Возможности Y-хромосомы на порядок шире, чем мтДНК, поскольку изменчивость популяций по Y-хромосоме на порядок больше, чем по мтДНК и аутосомным маркерам. Эти возможности продемонстрированы ниже при отслеживании миграций на примере поиска в современном генофонде Ливана генетических следов крестоносцев. Выявление миграций, оставивших след в генофонде, важно для медицинской генетики, поскольку позволяет сформулировать ожидаемый спектр наследственных нарушений.

Время и пространство генофонда

Время, в котором протекают генетические процессы в популяциях, исчисляется поколениями. От поколения к поколению накапливаются генетические изменения, и популяции, имеющие единое происхождение, начинают генетически удаляться друг от друга.

Понятно, что проследить ход генетических процессов во времени весьма затруднительно для исследователя: вся его исследовательская жизнь слишком коротка и укладывается между двумя-тремя взмахами маятника, отмеряющего время жизни популяции.

Тем не менее благодаря принципу эргодичности - взаимозаменяемости времени и пространства - можно вести отсчет от обратного: регистрировать ход генетического процесса по тем его итогам, которые оказались запечатленными в географическом пространстве. По словам Э. Реклю (1906), «География по отношению к человеку есть не что иное, как История в пространстве, подобно тому, как История является Географией во времени». Это ясное и элегантное выражение взаимозаменяемости пространства и времени как нельзя лучше отражает особенность популяционной генетики, где геногеография свидетельствует об истории и структуре генофонда.

Почти все происходящее на Земле во времени оставляет свой след в географическом пространстве, и изменения в генофонде популяций - не исключение: их след остался в неоднородном распределении генов в ареале генофонда.

Анализ аутосомных маркеров: генохронология

Рассмотрим возможности генетики в реконструкции расселения человека по планете. Для этого используем одно из самых важных для понимания изменчивости генофонда равенство:

Для расчета времени t, за которое возникло ныне наблюдаемое разнообразие генофонда (F_ST ), генохронология использует простую формулу:

Левая часть равенства рассчитывается по генетическим маркерам: F_t =F_ST оценивается нами как средняя F_ST =L^-1 ∑F_ST по данным о L множестве i-х генов, каждый из которых может быть подвержен тому или иному типу отбора. Это означает, что генофонд исследуемой группы населения был изучен по широкому спектру (i) генетических маркеров. Для каждого из них были получены свои оценки (F _ST(i) ) дифференциации популяций в пределах генофонда данной группы населения. Далее оценки F _ST(i) были усреднены по всей совокупности i-х генов, и для этого генофонда получена средняя оценка F_ST , которая селективно-нейтральна, т.е. уже не зависит от действия отбора.

Правую часть равенства рассчитывают по демографическим данным. Она содержит искомое время t, размер популяций N_e и миграции генов М_е (см. «Факторы популяционной динамики: мутации и отбор»).

На основании этого равенства рассчитывают время в поколениях t, прошедшее от исходного исторического события до времени изучения генофонда. Если время в поколениях t умножить на среднюю величину поколения (25 лет), то можно перейти к более привычным датам, измеряемым в годах.

Исторические события, которые были подвергнуты генохронологическому изучению (табл. 9-5), рассеяны почти по всему мыслимому диапазону времени человеческой истории - от десятков (хотоны) до десятков тысяч лет (коренное население Сибири и Америки). Сопоставление исторических дат, полученных по данным истории и археологии (левый столбец), с генетическими датами, полученными по данным об изменчивости современного генофонда (правый столбец), показывают, что все генетические даты для самых разных народов соответствуют историческим.

*По данным на 80-е годы XX в. (Рычков, 1984, 1986).

Столь полное совпадение датировок во всем временном диапазоне открывает возможность анализа древней истории населения по данным о его современном генофонде и генетической дифференциации ныне живущих популяций. Приведенные в табл. 9-5 результаты получены по классическим маркерам, когда приходилось анализировать каждый маркер в отдельности. При современном переходе к полногеномному анализу использование подходов генохронологии создает совершенно новые возможности в датировке событий истории (конечно, в том случае, когда оно сопровождается тщательными оценками демографических параметров генетически эффективных размеров популяции N_e и миграций М_е ).

Результаты как генохронологии, так и изучения этапов становления генофондов коренного населения столь разных регионов, как Европа, Сибирь и Америка, свидетельствуют о том, что генофонд представляет не хаотическую массу генов, а исторически стратифицированную систему, в слоях которой содержится память о событиях и этапах развития генофонда на протяжении всей его истории.

Анализ однородительских маркеров: филогеография

Проверим вышеуказанное утверждение с помощью филогеографии - датировки и отслеживания событий генетической истории с помощью однородительских маркеров.

Только что рассмотренный метод вычисления времени расхождения популяций по накопившимся между ними генетическим различиям в частотах генов (генохронология) применим к аутосомным маркерам. Поскольку они подвержены рекомбинации, сцепление между ними отсутствует, и расчет межпопуляционных различий проводят для каждого маркера в отдельности, а затем величины изменчивости F_ST(i) усредняют.

Для однородительских маркеров (мтДНК и Y-хромосома) благодаря отсутствию рекомбинации возможна совершенно иная технология датировки событий в истории генофондов - филогеография, основанная на анализе гаплотипов. В этом случае через накопившееся разнообразие также оценивают время, полагая, что чем большее разнообразие накопилось, тем большее время должно было пройти. Но если при анализе аутосомных маркеров рассчитывается разнообразие в частотах генов, накопившееся под действием факторов дрейфа генов и миграций, то при анализе однородительских маркеров в первую очередь оценивают разнообразие в спектре вариантов гена, накопившееся под действием фактора мутаций.

Отсутствие рекомбинации делает однородительские маркеры (всю мтДНК или нерекомбинирующую часть Y-хромосомы) как бы одним огромным маркером.

Именно поэтому можно увидеть каждую мутацию на ветвящемся древе гапло-типов мтДНК или Y-хромосомы и подсчитать время, прошедшее между анализируемыми мутациями. Исключение составляют лишь мутационные события, утраченные в результате дрейфа генов или иных событий истории, - ветви древа, не оставившие потомков в современности, невозможно восстановить по современному генофонду.

OUT-OF-AFRICA. Обратимся к самым первым шагам в развитии популяционной системы анатомически современного человека. Если окажется, что с помощью филогеографии можно реконструировать самые древние этапы, это даст уверенность в возможности исследования и более близких к нам событий, приведших к формированию и разнообразия современного генофонда, и груза наследственной патологии в популяциях.

Обнаружив в Африке наибольшее (по сравнению с другими континентами) разнообразие генетических вариантов однородительских маркеров и зная вслед за Вавиловым, что на прародине сохраняется наибольшее генетическое разнообразие, современная генетика утверждает, что именно Африка была колыбелью человечества. На чем же основано это утверждение?

На рис. 9-3 (см. цв. вклейку) представлены основные ветви родословного древа человечества, полученного по данным о мтДНК: они отражают самые первые шаги в микроэволюции Номо sapiens sapiens. Приведены генетические датировки ветвления древа мтДНК: на шкале слева указана временная шкала (тысяч лет) от современности (0 - наше время, 200 - 200 000 лет назад). Очевидно, что 140 000 лет назад произошло важное событие: разделение древа на два крупных ствола - койсанов (также известных в российской литературе как бушмены и отмеченных голубым цветом - Khoisan) и все остальное человечество. Независимые данные лингвистики тоже противопоставляют койсанские языки таковым всего остального человечества. Антропология также выделяет койсан в особый расовый тип, объединяющий в себе зародышей всех будущих крупных рас - негроидов, европеоидов, монголоидов - и свои собственные неповторимые черты. Таким образом, и другие науки подтверждают выводы генетики о необычайно древнем отделении койсан от всего остального человечества.

Как же дальше росло древо популяций человечества? Рисунок показывает, что практически все крупные ветви гаплогрупп мтДНК и ныне живут в Африке. На рис. 9-3 (см. цв. вклейку) они обозначены сине-фиолетовым цветом и обозначены Out-of-Africa. Но где же все остальное человечество? Видны лишь две тощие веточки на африканском стволе, обозначенные красным: это и есть гаплогруппы населения всех остальных континентов - Евразии, Австралии и обеих Америк. В эти две скромные веточки и уместилось все остальное человечество. Получается, что очень немногие африканцы покинули свою родину, чтобы заселить остальной мир.

Это древо хорошо иллюстрирует общий принцип филогеографии: расселяющиеся популяции, оторвавшиеся от исходного массива, забирают с собой в путь лишь малую часть ветвей, т.е. имеющегося генетического разнообразия. Дальнейшая микроэволюция приводит к росту новых вторичных ветвей (субгаплогрупп) в разных регионах, позволяя прослеживать все более поздние миграции.

Прямой анализ древней ДНК

Выше отмечено, что мутационные события, утраченные в результате дрейфа генов или иных событий истории (ветви древа, не оставившие потомков в современности), невозможно восстановить по современному генофонду. Воссоздать всю полноту истории человечества помогает анализ палеоДНК.

Идея анализа древней ДНК (палеоДНК) проста: вместо того чтобы на основании данных о современных популяциях догадываться, какими были генофонды их предков в былые эпохи, можно изучать генофонд древности напрямую, проанализировав ДНК из древних костных останков. При этом для исследования древней ДНК используют те же методы и статистического анализа, и осмысления результатов, что и в палеоантропологии: изучают те же самые останки древних людей, сравнивают их друг с другом и современным населением и делают выводы о миграциях популяций.

Особенность анализа древней ДНК состоит в необходимости решения трех проблем:

Таким образом, преимущества и ограничения при анализе древней ДНК и при анализе современных генофондов противоположны. При анализе современной ДНК доступно множество данных, но неизвестно, в какую эпоху сформировались те ли иные черты генофонда. А для анализа древней ДНК доступны прямые данные о генофонде конкретных эпох, но на первый план выходит проблема ограниченности исходных данных. Именно поэтому необходим комплексный анализ современной и древней ДНК, позволяющий взаимно компенсировать их недостатки.

Возможности палеоДНК будут рассмотрены также на примере заселения Северной Европы.

Заселение Северной Европы: мезолит. Оленеостровский могильник, расположенный в южной Карелии, - ведущий памятник мезолита лесной зоны Восточной Европы. Не утихают споры о степени монголоидности оставившего этот памятник населения и, соответственно, о силе, направлении и географическом размахе миграций в Северной Евразии 8000-6000 лет тому назад. По результатам прямого исследования древней ДНК у мезолитического населения обнаружены следующие гаплогруппы мтДНК: U4, C, U2, U5, J и H. Наиболее частая гаплогруппа - U4 - сейчас распространена по всей Западной Евразии, достигая максимальных частот в Уральском регионе, причем по обе стороны хребта - как в Приуралье, так и в Западной Сибири. Обнаружение гаплогруппы U4 в древних образцах свидетельствует, что примерно та же география была свойственна ей и 7000 лет назад. С другой стороны, высокую частоту U4 можно рассматривать как косвенное указание на генетическую связь мезолитического населения Карелии с современным населением Уральского региона. Вторая по частоте гаплогруппа С - типичная сибирская гаплогруппа, и обычно ее наличие рассматривают как свидетельство потока генов из-за Уральского хребта. Остальные четыре гаплогруппы мезолитического могильника (U2, U5, J, H) характерны для современного населения Восточной и Западной Европы. Таким образом, анализ древней ДНК показывает промежуточное положение населения, оставившего Оленеостровский могильник. Принадлежа в целом к западно-евразийскому генетическому стволу, оно несет в своем генофонде следы миграций с Урала и из Сибири. Карта генетических расстояний демонстрирует степень генетического родства этой древней популяции с современным населением Евразии. Популяции, генетически сходные с оленеостровцами, обнаружены только в Западной Сибири. Это позволяет (хотя весьма гипотетически) говорить о Западной Сибири как о возможной прародине мезолитического населения Восточной Европы.

Заселение Северной Европы: неолит. Вторая веха - население, оставившее около 3500 лет назад могильник на севере Кольского полуострова. Для него характерен совсем иной профиль гаплогрупп мтДНК: C, U5, D, Z, U4 и T (в порядке убывания частоты). Как и у мезолитического населения, в этом перечне мирно соседствуют типичные европейские и сибирские варианты, но в неолите Кольского полуострова именно последним принадлежат лидирующие места, причем, кроме С, появляются и другие, отсутствовавшие в мезолите, типично сибирские гаплогруппы D и Z. Все это заставляет сделать вывод о том, что в популяции, оставившей могильник на Кольском полуострове, сибирский генетический компонент преобладал над европейским. Это предполагает новую, более позднюю миграционную волну с востока, причем, вероятно, не из ближайших к Уралу регионов, а из более отдаленных внутренних областей Сибири.

Однако эта миграция из Сибири угасла, не оставив значимого следа в современном генофонде: ни в одной из современных популяций Европы (за исключением тундровых ненцев - недавних пришельцев из Сибири) не обнаружены столь высокие частоты сибирских гаплогрупп. Не установлена и генетическая преемственность между неолитической популяцией Кольского полуострова и современными саамами, проживающими на той же территории.

Результаты исследований мезолитического и неолитического населения заставляют с большим вниманием отнестись к наличию сибирских гаплогрупп D и Z у саамов. Сейчас они встречаются у саамов с очень низкими частотами, но их распространенность у древнего населения позволяет выдвинуть гипотезу, что сибирские гаплогруппы были более часты у предков саамов, но затем утеряны в результате дрейфа генов. Однако по аутосомным маркерам интенсивность дрейфа генов намного меньше (см. «Генетические маркеры»), и, следовательно, в аутосомном генофонде коренного населения Северной Европы можно ожидать более явного влияния миграций из-за Урала. Таким образом, и спектр наследственных нарушений у северных европейцев может нести черты влияния древнего населения Сибири.

Еще один пример анализа древней ДНК - изучение одной из первых неолитических (земледельческих) популяций Европы, культуры линейно-ленточной керамики. Вопрос о том, было ли это население мигрантами с Ближнего Востока (родина земледелия) или же местными популяциями, усвоившими навыки земледелия от соседей без значительной миграции, является одним из наиболее широко обсуждаемых в популяционной генетике человека. Он составляет суть давнего спора между сторонниками теории демической диффузии Аммермана и Кавалли-Сфорца и приверженцами гипотезы культурной диффузии. Карта генетических расстояний от древнего генофонда этой популяции (рис. 9-4, см. цв. вклейку) показывает, что генетически наиболее сходные популяции расположены на Ближнем Востоке. Это позволяет сделать вывод, что имела место миграция ранних земледельцев с Ближнего Востока в Европу.

Геногеография и наследственная патология

Полученные результаты важны для анализа груза наследственной патологии. Столь значительная гетерогенность русского народа не позволяет оперировать понятием средней частоты патологии для русских популяций, а требует отдельного анализа северных и южных популяций, для которых можно прогнозировать резкие различия в спектре наследственных заболеваний.

Обнаруженное в целой серии исследований региональное деление русского генофонда должно стать основой для научного прогнозирования распределения отдельных наследственных заболеваний. Полученные карты инбридинга (гаплотипического разнообразия), как будет показано ниже, указывают на ожидаемую величину общего груза наследственной патологии в ареале русского народа и Восточной Европы в целом.

Казалось бы, изученные селективно-нейтральные гаплогруппы Y-хромосомы могут быть важны для прогноза наследственных заболеваний только косвенно, через общую структуру генофонда. Тем не менее показано, что геногеография гаплогрупп Y-хромосомы позволяет перейти к прямому прогнозу.

Примером служит тесная ассоциация делеций, вызывающих мужское бесплодие, и гаплогруппы Y-хромосомы N1c1, распределение которой в Европе приведено на рис. 9-5. Пилотное исследование, проведенное совместно с лабораторией проблем нарушений репродукции Медико-генетического научного центра РАМН (руководитель - профессор Л.Ф. Курило), показало, что среди мужчин Восточной Европы (главным образом русских), страдающих бесплодием в результате делеции b2/b3 AZF региона Y-хромосомы, около 80% - носители гаплогруппы N1c1, около 10% - гаплогруппы N1b, и лишь 5% - носители гаплогруппы R1a1 (еще 5% приходится на остальные гаплогруппы). При этом в русских популяциях наблюдается совершенно иное распределение этих гаплогрупп: популяционная частота R1a1 в 10 раз выше и составляет 50%, а не 5%, как у носителей делеции; популяционная частота N1c1 составляет 15%, а не 80%; частота N1b - 1%, а не 10%. Если учесть, что большинство больных происходят из средней полосы и южных районов России, где значительно выше плотность населения и ниже частоты N1c1 и N1b, то различия между выборкой больных и популяционными частотами окажутся еще разительнее. Таким образом, геногеографические карты гаплогрупп N1c1 и N1b могут стать основой для оценки риска отягощенности населения Европы микроделециями AZF-региона.

Установленная зависимость частоты встречаемости микроделеций AZFc-региона Y-хромосомы (вызывающих мужское бесплодие) от гаплогруппы Y-хромосомы подводит к одной из фундаментальных проблем генетики развития: связи между ключевыми генами, генетическим окружением (контекстом) и мужской фертильностью. Дальнейшие исследования позволят оценить вклад генетического контекста гаплогрупп Y-хромосомы в возникновение ее микроструктурных перестроек в одном из наиболее сложных участков генома человека - AZFc-регионе. Он отвечает за мужскую фертильность и подвержен наиболее высокой частоте мутационных изменений, вызывающих нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин. Следует учитывать обе стороны этой связи.

Во-первых, делеции, вызывающие частичное бесплодие, стабильно наследуются в составе одного или нескольких гаплотипов Y-хромосомы, время возникновения и географическое распространение которых хорошо известны из популяционно-генетических работ (см. рис. 9-5).

Во-вторых, мутации, возникающие de novo, в том числе вызывающие полное бесплодие, и следовательно, не наследуемые, также в ряде случаев возникают у носителей определенных гаплотипов Y-хромосомы. Это может пролить свет на механизм возникновения делеций в зависимости от генетического контекста.

Важно подчеркнуть, что отсутствие рекомбинации на большей части Y-хромосомы приводит к тому, что происхождение обнаруживаемых ассоциаций принципиально отлично от таковых в классическом понимании. Речь идет не столько о «функциональных» ассоциациях (зависимость фенотипа от гена может свидетельствовать о причинной связи между ними), сколько об ассоциациях «по происхождению», когда фенотип (делеция) возник на той Y-хромосоме, которая уже имела некоторые отличительные черты, функционально никак не связанные с этой делецией. Некоторое исключение могут составлять лишь мутации de novo, где о причинной связи можно говорить в терминах повышения мутабельности в данном контексте Y-хромосомы.

Эта особенность Y-хромосомы открывает перспективу использования для изучения генетических факторов бесплодия новых методов филогеографии и обширных данных, полученных этим бурно развивающимся направлением, не только о русском генофонде, но практически обо всех народах России и сопредельных стран.

Гаплотипическое разнообразие и груз наследственной патологии

На примере генофонда саамов видно, что мтДНК оказалась самым чувствительным маркером, обнаружив и действие дрейфа генов, и историю генофонда. Еще более информативна карта гаплотипического (внутрипопуляционного) разнообразия мтДНК для населения всей Восточной Европы (рис. 9-6, см. цв. вклейку): она выявляет закономерное убывание степени разнообразия с юга на север - от южных популяций Причерноморья до берегов Северного Ледовитого океана.

Данные по мтДНК согласуются с данными по другим системам генетических маркеров: сходное убывание внутрипопуляционного разнообразия к северу и востоку показано и по аутосомным маркерам. Для популяционной генетики снижение внутрипопуляционного разнообразия - важный индикатор действия дрейфа генов, особенно сильного в небольших по размеру и частично изолированных популяциях. По однородительским маркерам картина четче, что связано с их большей чувствительностью к эффектам дрейфа генов.

Как показано в разделе «Основные термины популяционной генетики», уменьшение внутрипопуляционного разнообразия прямо связано с увеличением инбридинга в популяциях и ростом генетических различий между ними.

Исследование русского генофонда подтвердило эту закономерность: на юге обнаружены небольшие различия между генофондами разных районов, в то время как генетические отличия между районами Архангельской области очень велики. Дополнительный аргумент - сходство тренда гаплотипического разнообразия с картой плотности населения: оба показателя имеют максимальные значения в южных областях, промежуточные - в центральных, минимальные - в северных областях Восточной Европы.

Таким образом, возникает единая и закономерная картина взаимосвязанных изменений от юга к северу сразу нескольких параметров: географической широты (возрастает), продуктивности среды (падает), плотности населения (убывает), эффективного размера популяции (убывает), изоляции субпопуляций (возрастает), дрейфа генов (возрастает) и гаплотипического разнообразия мтДНК (снижается). Эти параметры перечислены в порядке предполагаемой причинно-следственной цепи.

Для медицинской генетики важным аспектом служит добавление в ту же цепь еще одного показателя: заболеваемости населения. Работами, выполненными сотрудниками Медико-генетического научного центра, убедительно показана взаимосвязь груза наследственных нарушений (следствие) с генетической структурой популяции, в частности с уровнем случайного инбридинга (причина). Поскольку инбридинг прямо связан с действием дрейфа генов, который резко уменьшает гаплотипическое разнообразие мтДНК, можно ожидать связь между уровнем гаплотипического разнообразия мтДНК и величиной груза наследственных болезней.

Для оценки величины этой связи были сопоставлены величины обоих показателей в одних и тех же популяциях (табл. 9-6). К настоящему времени методом тотального скрининга населения определены величины генетического груза для 11 популяций России (Зинченко, Гинтер, 2008). Из них для 7 популяций есть данные об изменчивости мтДНК. В анализ была включена также восьмая популяция (Брянская область), в качестве генетической пары к которой были взяты данные по популяциям юга Смоленской области (районы, пограничные с Брянской областью).

*Оценки генетических нарушений приведены по Зинченко, Гинтер (2008).

Как и следовало ожидать, коэффициент корреляции гаплотипического разнообразия мтДНК оказался наибольшим для аутосомно-рецессивной патологии (r =0,4), поскольку наиболее прямая связь с инбридингом и генетическим дрейфом характерна именно для рецессивных генов (сочетание которых в гомозиготе в результате инбредного брака обусловливает манифестацию наследственного заболевания).

Величина корреляции (r =0,4) значима, хотя и не очень высока. Она служит нижней оценкой существующей связи, поскольку реальный уровень наследственной патологии чрезвычайно трудно поддается количественному определению: интенсивность скрининга, неизбежно различная в разных областях, обусловливает разную частоту обнаружения имеющихся в популяции больных с наследственными заболеваниями. При статистических сравнениях это приводит к повышенному уровню информационного шума, снижающего величину коэффициента корреляции. Более того, корреляции такого уровня (r =0,4) при сравнениях связи между признаками различной природы традиционно рассматривают как информативные. Например, положение об информативности фамилий в качестве квазигенетического маркера, общепризнанное в настоящее время, первоначально было обосновано А.А. Ревазовым и соавт. на коэффициенте корреляции r =0,3. Вывод Rosser и соавт. о зависимости распределения гаплогрупп Y-хромосомы в Европе от географических факторов основывался на той же величине корреляции r =0,3.

Важно подчеркнуть, что гаплотипическое разнообразие мтДНК оказывается весьма информативным инструментом для изучения связи между генетической структурой популяций и грузом наследственной патологии и (совместно с другими генетическими и квазигенетическими маркерами) может использоваться для прогноза груза наследственной патологии в популяциях, по которым нет прямых генетико-эпидемиологических данных.

Заключение

Знание факторов популяционной динамики (мутаций, отбора, миграций и дрейфа генов) и анализ механизмов их взаимодействия важны для понимания пространственного распределения груза наследственных заболеваний и прогнозирования регионов с повышенным риском их возникновения.

Многочисленные работы научной школы академика Е.К. Гинтера убедительно показали связь между уровнем инбридинга и грузом наследственной патологии. Самый чувствительный инструмент - геногеография - обнаружил удивительное сходство в распределении «нормальных» генов и наследственных заболеваний. Карты генетических расстояний (удаленность генофондов районов от средних показателей генофонда народа) оказались почти тождественны по обеим системам признаков: коэффициент корреляции составил r =0,7. Различия касались лишь абсолютной величины расстояний: по грузу наследственной патологии они, как и следовало ожидать из низких частот заболеваний, были на три порядка ниже, чем расстояния для генофонда в целом. Однако при этом пространственные распределения «нормального» генофонда и наследственных заболеваний оказались практически идентичными.

Это означает, что исследование генофонда позволяет дать прогноз распределения общего груза наследственной патологии. Изучение роли отдельных факторов - миграций, дрейфа генов и отбора - позволяет строить модели распределения отдельных наследственных заболеваний. В этом и состоит роль популяционной генетики в рамках медицинской генетики: помогать пониманию механизмов распределения и накопления генов наследственной патологии, прогнозировать регионы повышенного риска.

Список литературы

Предмет и задачи фармакогенетики

Фармакогенетика - наука, изучающая место и роль генетических факторов в формировании ответа организма человека на ЛС. Закономерности, обнаруживаемые фармакогенетикой, позволяют врачу в некоторых случаях индивидуально подходить к выбору как собственно ЛС, так и их доз у конкретного пациента, обеспечивая максимально эффективную и безопасную фармакотерапию.

Предмет изучения фармакогенетики - особенности генетической конституции, которые ассоциированы с изменениями фармакологического ответа (генетически детерминированный фармакологический ответ). Фармакогенетика - смежная дисциплина, располагающаяся на стыке фармакологии и генетики. Хотя роль наследственности в формировании индивидуального ответа на ЛС известна давно, понимание механизмов, связывающих генетические особенности пациента с изменением эффективности и безопасности фармакотерапии, стало возможным лишь к настоящему времени. Это связано с развитием соответствующих методов молекулярной генетики и реализацией международной программы «Геном человека».

Генетические факторы, а по сути, генетические особенности пациента, как правило, представлены полиморфными участками генов, продукты которых участвуют в осуществлении различных фармакокинетических и фармакодинамических процессов. Термин «полиморфные» означает, что в конкретных местах генома нуклеотидная последовательность может отличаться у различных людей (если участок находится внутри гена, то говорят о существовании альтернативных аллелей или аллельных вариантов). Подобные альтернативные варианты могут быть ассоциированы с различными нарушениями работы гена (например, с отсутствием синтеза белка, синтезом белка со сниженной или повышенной активностью, снижением или повышением уровня экспрессии и др.). Таким образом, с изменением фармакологического ответа могут быть ассоциированы альтернативные аллельные варианты генов, продукты которых принимают участие в фармакокинетике и фармакодинамике ЛС.

К первой группе относят гены, кодирующие ферменты биотрансформации и транспортеры, которые осуществляют всасывание, распределение и выведение ЛС из организма. В настоящее время активно изучают роль генов, контролирующих синтез и работу ферментов биотрансформации ЛС, в частности изоферментов цитохрома Р-450 (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5) и ферментов второй фазы биотрансформации (N-ацетилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы). Особый интерес вызывает изучение взаимосвязи аллельных вариантов генов-транспортеров с изменением фармакокинетики соответствующих ЛС (ABCB1, SLCO1B1).

Во вторую группу входят гены, кодирующие молекулы-мишени ЛС или функционально связанные с этими структурами белки (рецепторы, ферменты, ионные каналы, G-белки и т.д.). В нее включены также гены, продукты которых участвуют в различных патологических процессах (факторы свертывания крови, аполипо-протеины и др.), против которых направлена соответствующая фармакотерапия(рис. 10-1).

Врач, ознакомившись с инструкцией по медицинскому применению Государственного реестра лекарственных средств (https://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx), может самостоятельно прогнозировать, полиморфные варианты каких генов могут быть ассоциированы с изменением фармакологического ответа и, следовательно, с изменением эффективности и безопасности ЛС. Для этого необходимо обращать внимание:

Стоит отметить, что некоторые полиморфные маркеры, связанные с изменением фармакологического ответа на ЛС, зачастую бывают ассоциированы с различными заболеваниями (онкологические болезни, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, атеросклероз и др.), поэтому фармакогенетические исследования способствуют более широкому пониманию их этиологии и патогенеза.

Клиническая классификация генетически детерминированных изменений фармакологического ответа

Генетически детерминированные изменения фармакологического ответа с клинических позиций можно классифицировать следующим образом (Скакун Н.П., 1981):

Клиническая характеристика полиморфизма, ассоциированного с изменением фармакокинетических процессов

Все фармакокинетические процессы (всасывание, распределение, биотрансформация или метаболизм, а также выведение) - результат скоординированной работы соответствующих генов, кодирующих ферменты биотрансформации ЛС, транспортеры ЛС, транспортные белки плазмы крови и др.

Генетический полиморфизм характерен как для генов, кодирующих ферменты первой фазы биотрансформации (изоферменты цитохрома Р-450, дигидропири-мидиндигидрогеназа, бутирилхолинэстераза, параоксоназа), так и второй фазы метаболизма (N-ацетилтрансфераза, тиопурин-S-метилтрансфераза, эпоксидги-дролаза). Генетический полиморфизм может обусловливать синтез ферментов с измененной активностью, что, в свою очередь, способно послужить причиной изменения скорости биотрансформации ЛС. Генетически детерминированные различия в скорости биотрансформации ЛС, которую можно оценить по отношению концентрации ЛС-субстрата к содержанию его метаболита в плазме крови или моче (метаболическое отношение), позволяют выделить группы индивидуумов, различных по активности того или иного фермента биотрансформации.

Экстенсивные метаболизаторы (extensive metabolizers - ЕМ) - люди с нормальной скоростью биотрансформации определенных ЛС. Как правило, такие люди гомозиготны по нормальным (в функциональном плане) аллелям гена, кодирующего соответствующий фермент. К ЕМ принадлежит большинство населения.

Медленные метаболизаторы (poor metabolizers - РМ) - люди со сниженной скоростью биотрансформации определенных ЛС. Обычно такие люди гомозиготны по функционально-дефектному аллелю гена, кодирующего соответствующий фермент. Иногда выделяют промежуточных метаболизаторов (intermedium metabolizers - IM), к которым относят гетерозигот по функционально-дефектному аллелю. У таких индивидуумов происходит синтез дефектного фермента либо вообще отсутствует соответствующий фермент биотрансформации, в результате чего ферментативная активность снижается или отсутствует. У этой категории пациентов регистрируют высокое отношение концентрации ЛС к содержанию его метаболита. При этом у медленных метаболизаторов ЛС накапливается в организме в высокой концентрации, что приводит к возникновению выраженных неблагоприятных побочных реакций, вплоть до интоксикации. Именно поэтому для медленных метаболизаторов необходим тщательный подбор дозы ЛС, которая должна быть меньше, чем для ЕМ. Если в качестве ЛС выступает пролекарство, т.е. действует не само ЛС, а его активный метаболит, образующийся из исходного препарата в ходе биотрансформации, то у медленных метаболизаторов образуется меньше активного метаболита, что может привести к неэффективности лечения. В таких случаях требуется увеличение дозы.

Сверхактивные, или быстрые, метаболизаторы (ultraextensive metabolizers - UM) - люди с повышенной скоростью биотрансформации определенных ЛС. Часто в их генотипе присутствуют аллели, кодирующие изоформу соответствующего фермента с аномально высокой активностью, либо аллельные варианты, образованные дупликацией (амплификацией) функционально нормальных аллелей. У этой категории пациентов регистрируют низкое значение отношения концентрации ЛС к содержанию его метаболита. Вследствие этого формируется недостаточная для достижения терапевтического эффекта концентрация ЛС в крови. Для сверхактивных метаболизаторов доза препарата должна быть выше, чем для активных метаболизаторов. Если в качестве ЛС применяют пролекарство, то у сверхактивных метаболизаторов образуется больше активного метаболита, что может привести к развитию нежелательных реакций (НР). Таким пациентам требуется меньшая доза ЛС-пролекарства, чем ЕМ.

Если ген, кодирующий соответствующий фермент биотрансформации, обладает полиморфизмом, то распределение индивидуумов по скорости метаболизма ЛС-субстратов фермента приобретает бимодальный (при двух типах метаболизаторов) или тримодальный (при трех типах метаболизаторов) характер (рис. 10-2).

На основании знаний о том, каким изоферментом метаболизируется ЛС, а также какой транспортер участвует во всасывании, распределении или выведении ЛС (такая информация часто содержится в инструкциях по медицинскому применению), можно предполагать, что присутствие в генотипе пациента аллелей генов, кодирующих эти структуры, будет ассоциировано с изменением фармакоки-нетики ЛС, а значит, с его эффективностью и безопасностью.

Ниже перечислены наиболее значимые полиморфные маркеры, ассоциированные с изменением фармакокинетики соответствующих ЛС и располагающиеся в генах, кодирующих ферменты первой (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, CES1, дигидропиримидиндигидрогеназа, бутирилхолинэстераза) и второй фазы биотрансформации (ацетилтрансфераза, глюкуронилтрансфераза, тиопурин-S-метилтрансфераза), а также транспортеры ЛС (Р-гликопротеин, транспортеры органических анионов и катионов).

Генетический полиморфизм изофермента цитохрома Р-450 2D6

Цитохром Р-450 CYP2D6 метаболизирует около 20% всех известных ЛС, в том числе антипсихотические препараты, антидепрессанты, β-адреноблокаторы, антиаритмические, некоторые противоопухолевые (тамоксифен), противорвотные β-блокаторы, блокаторы H₁ -рецепторов и некоторые другие ЛС. Ген CYP2D6 обладает высоким полиморфизмом. Еще в 1977 г. некоторые авторы обращали внимание на различие гипотензивного эффекта у больных с артериальной гипертензией, применявших дебризохин^ρ , - препарат из группы α-адреноблокаторов. Тогда же было сформулировано предположение о различии в скорости метаболизма (гидроксилирования) дебризохина^ρ у разных индивидуумов. У медленных метаболизаторов препарата его гипотензивный эффект был наиболее выражен. Позднее было показано, что у медленных метаболизаторов дебризохина^ρ медленнее протекает метаболизм и некоторых других ЛС, в том числе фенацетина^ρ , нортриптилина, фенформина^ρ , L-спартеина сульфата^ρ , энкаинида^ρ , пропранолола, гуаноксана^ρ и амитриптилина. Дальнейшие исследования показали, что медленные метаболизаторы по CYP2D6 имеют в своем генотипе функционально-дефектные аллели гена CYP2D6. Это приводит:

С каждым годом число обнаруженных аллельных вариантов гена CYP2D6, которые ассоциированы с изменением активности CYP2D6, растет. Медленные метаболизаторы по CYP2D6 среди представителей европеоидной расы часто имеют в генотипе функционально-дефектный аллельный вариант CYP2D6*4, среди монголоидов - CYP2D6*10, среди представителей негроидной расы - CYP2D6*17. У пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена CYP2D6 за счет снижения скорости биотрансформации ЛС-субстратов CYP2D6 отмечают более высокую максимальную концентрацию и площадь под фармакокинетической кривой (AUC) ЛС, что может иметь клинические последствия (табл. 10-1). Так, например, частота аллельного варианта CYP2D6*4 среди пациентов, у которых регистрировали НР трициклических антидепрессантов (гипотензия, седативный эффект, тремор, кардиотоксичность), была почти в 3 раза выше (20%) по сравнению с пациентами, у которых лечение этими препаратами протекало без осложнений (7%). Кроме того, известно, что некоторые функционально-дефектные аллельные варианты гена CYP2D6 ассоциированы с развитием индуцированных нейролептиками экстрапирамидных нарушений. Есть данные о том, что у медленных метаболизаторов по CYP2D6 подобранные дозы β-адреноблокаторов (метопролол, бисопролол) меньше (по частоте сердечных сокращений) при ИБС и артериальной гипертензии. У данной группы пациентов необходимо выбирать ЛС, не метаболизирующиеся CYP2D6, или ЛС-субстраты CYP2D6 в минимальных дозах (в соответствии с инструкцией по медицинскому применению).

Обнаружена ассоциация функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6 с развитием НР при лечении атомоксетином детей с синдромом дефицита концентрации внимания с гиперактивностью. Результаты генотипирования позволяют прогнозировать развитие НР и более тщательно контролировать безопасность терапии при обнаружении функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6, соответствующем контроле концентрации препарата в плазме крови и коррекции его дозы в соответствии с последней.

Существование в генотипе пациента функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6 может сопровождаться не только увеличением риска развития НР при применении ЛС, метаболизируемых этим изоферментом. Как было указано выше, в случае если в качестве ЛС используют пролекарство, а активный метаболит образуется именно под действием CYP2D6, эффективность препарата у больных будет низкой. Так, у пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена CYP2D6 менее выражен анальгетический эффект кодеина. Этот феномен объясняют ослаблением О-деметилирования препарата, во время которого образуется морфин. Обезболивающее действие трамадола также обусловлено активным метаболитом О-деметилтрамадолом, образующимся под действием CYP2D6. У пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена CYP2D6 образование О-деметилтрамадола снижено, что приводит к недостаточному аналгезирующему эффекту. Гомозиготы по функционально-дефектным аллельным вариантам гена CYP2D6 не отвечают на лечение трамадолом в 2 раза чаще, чем пациенты, не имеющие этих аллелей (46,7% против 21,6% соответственно). Аналогично тамоксифен (активный метаболит эндоксифен образуется с участием CYP2D6) менее эффективен у женщин с раком молочной железы (РМЖ) - медленных метаболизаторов по CYP2D6.

Обнаруженные ассоциации функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6, сопровождающиеся изменениями фармакологического ответа на различные ЛС, представлены в табл. 10-1. Следует отметить, что в настоящее время определение функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6 рекомендовано в некоторых странах (США, Великобритания) для выбора трициклических антидепрессантов (рис. 10-3), антипсихотических ЛС (рис. 10-4), а также режимов их дозирования.

У быстрых метаболизаторов CYP2D6 (дупликация функциональных аллелей CYP2D6) при применении ЛС-субстратов CYP2D6 отмечают снижение терапевтической эффективности последних за счет ускорения биотрансформации, приводящей к уменьшению концентрации этих препаратов в плазме крови (см. табл. 10-1). Например, противорвотное ЛС ондансетрон у больных, являющихся быстрыми метаболизаторами по CYP2D6, не предотвращает рвоту во время химиотерапии. Именно поэтому таким пациентам необходимо назначение ЛС-субстратов CYP2D6 в больших дозах.

Следует отметить, что для множества ЛС-субстратов CYP2D6 ассоциация полиморфных маркеров гена CYP2D6 с изменением их фармакокинетики и развитием соответствующих фармакологических эффектов (развитие НР или неэффективность лечения) нехарактерна или полученные в различных исследованиях результаты носят противоречивый характер. Например, есть данные об ассоциации функционально-дефектных аллелей CYP2D6 с высокими значениями максимальной концентрации β-адреноблокаторов бисопролола, карведилола и небиволола (метаболизируются CYP2D6), но неизвестно, существует ли связь между какими-либо полиморфными маркерами гена CYP2D6 и изменением частоты развития НР или параметров эффективности этих препаратов у пациентов с артериальной гипертензией. Аналогичную ситуацию отмечают и для некоторых других ЛС-субстратов CYP2D6, таких как блокатор H₁ -рецепторов хлорфенирамин^ρ ,

В настоящее время в ряде стран разрешено использовать генотипирование по CYP2D6 для персонализации применения антидепрессантов, антипсихотических ЛС, атомоксетина (препарата для лечения дефицита внимания и гиперактивности у детей), пергексилина^ρ (антиангинального препарата метаболического действия, зарегистрированного только в Австралии и Новой Зеландии).

Генетический полиморфизм изофермента цитохрома Р-450 2С9 (CYP2C9)

CYP2C9 - основной фермент метаболизма антикоагулянтов (варфарина, аценокумарола), принимаемых внутрь, многих нестероидных противовоспалительных средств (за исключением ацетилсалициловой кислоты), в том числе селективных ингибиторов циклооксигеназы-2, ингибиторов ангиотензиновых рецепторов (лозартана и ирбесартана), сахароснижающих ЛС (производных сульфонилмочевины), фенитоина, флувастатина и др.

CYP2C9 обладает генетическим полиморфизмом. В настоящее время наиболее хорошо изучены SNP гена CYP2C9 - функционально-дефектные аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3. У пациентов, имеющих их в своем генотипе, отмечают уменьшение активности CYP2C9, что приводит к снижению скорости биотрансформации ЛС, метаболизируемых этим изоферментом, и повышению их концентрации в плазме крови. Именно поэтому гетерозиготы CYP2C9*1/*2, CYP2C9*1/*3 и гомозиготы CYP2C9*2/*2, CYP2C9*3/*3, CYP2C9*2/*3 фактически являются медленными метаболизаторами по CYP2C9. У этой категории пациентов чаще всего регистрируют НР при применении ЛС, метаболизируемых CYP2C9. У них отмечают также снижение общего клиренса оральных антикоагулянтов варфарина и аценокумарола, что способствует увеличению риска развития чрезмерной гипокоагуляции и кровотечений при длительном применении этих ЛС по стандартному режиму дозирования. Таким пациентам для достижения терапевтического уровня гипокоагуляции, как правило, необходимы более низкие дозы вышеуказанных препаратов. Существует предположение, что генетический полиморфизм CYP2C9 в большей степени ассоциирован с изменением фармакокинетики и профиля безопасности варфарина, чем аценокумарола, что связано с различиями в биотрансформации этих двух средств. В настоящее время разработаны алгоритмы выбора режима дозирования варфарина на основе результатов генотипирования пациентов по CYP2C9 и ряду других генов (в частности, гену VKORC1). Индивидуальный режим дозирования варфарина в соответствии с результатами фармакогенетического тестирования можно рассчитать с помощью online-калькулятора (www.warfarindosing.org; рис. 10-5) или по аналогичному алгоритму с помощью модуля «Фармакогенетика» российской программы PharmSuite (бесплатно скачать программу можно на сайте www. pharmsuite.ru). Подобный подход к дозированию варфарина может способствовать ускорению подбора дозы для достижения целевых значений международного нормализованного отношения, снижению риска возникновения геморрагических осложнений и частоты эпизодов чрезмерной гипокоагуляции. Некоторые эксперты рекомендуют при наличии показаний у пациентов - медленных метаболизаторов по CYP2C9 (особенно при сочетании с носительством «проблемных» аллелей гена VKORC1) воздержаться от применения варфарина и назначить один из так называемых новых оральных антикоагулянтов (дабигатрана этексилат, ривароксабан, апиксабан).

Полиморфизм гена CYP2C9 также ассоциирован с изменением фармакокинетики нестероидных противовоспалительных средств, метаболизируемых этим изоферментом (диклофенак, ибупрофен, пироксикам, лорноксикам, теноксикам, флурбипрофен, целекоксиб). Есть данные о связи полиморфизма генов CYP2C9 и CYP2C8 с развитием желудочно-кишечных кровотечений при применении нестероидных противовоспалительных средств (за исключением ацетилсалициловой кислоты), но также известны результаты других исследований, не подтверждающие ее существование. Ряд авторов показали, что у здоровых добровольцев с генотипами CYP2C9*1/ CYP2C9*2 и CYP2C9*1/CYP2C9*3 замедлен метаболизм таких сахароснижающих ЛС, как глибенкламид, толбутамид, натеглинид, глимепирид, что манифестирует снижением клиренса, увеличением AUC этих препаратов и в конечном итоге приводит к повышению риска развития гипогликемии. Это было продемонстрировано и у больных сахарным диабетом 2-го типа. Известно об ассоциации полиморфизма гена CYP2C9 с изменением фармакокинетики гиполипидемического средства из группы статинов флувастатина. У пациентов, имеющих в генотипе функционально-дефектные аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3, отмечают снижение общего клиренса петлевого диуретика тора-семида. Это приводит к более интенсивному выведению калия, натрия и хлора с мочой. Обнаруженные ассоциации аллельных вариантов гена CYP2C9 с изменениями фармакологического ответа при лечении различными ЛС представлены в табл. 10-1. Полиморфизм гена CYP2C9 ассоциирован с изменением фармакокинетики антагониста ангиотензиновых рецепторов ирбесартана, что выражается в более выраженном снижении диастолического артериального давления при применении этого препарата у пациентов с артериальной гипертензией, являющихся медленными метаболизаторами по CYP2C9. Очевидно, что для повышения безопасности лечения таким больным необходимо либо подобрать ЛС, в метаболизме которых не принимает участие CYP2C9, либо назначить меньшую дозу соответствующего препарата. Исключением служит антагонист ангиотензиновых рецепторов лозартан (пролекарство), который под действием CYP2C9 превращается в печени в активный метаболит Е3174, обладающий антигипертензивным действием. Именно поэтому у таких пациентов регистрируют менее выраженный антигипертензивный эффект при применении лозартана.

Генетический полиморфизм изофермента цитохрома Р-450 2С19 (CYP2C19)

CYP2C19 метаболизирует 8,3% всех известных ЛС, в том числе антидепрессант имипрамин, транквилизатор диазепам, барбитураты, вальпроевую кислоту и противомалярийные препараты. Кроме того, CYP2C19 - основной фермент метаболизма ингибиторов H⁺ , К⁺ -АТФазы, антиагреганта клопидогрела. Он участвует в метаболизме тамоксифена, фенитоина, тиклопидина и некоторых психотропных средств (трициклические антидепрессанты).

Для CYP2C19 характерен генетический полиморфизм. Медленными метаболизаторами среди представителей европеоидной расы чаще всего бывают люди, в генотипе которых присутствует функционально-дефектный аллель CYP2C19*2. Распространенность медленного метаболизма по CYP2C19 среди европеоидов составляет 2-5%, а среди представителей монголоидной расы - 15-20%. Применение у медленных метаболизаторов по CYP2C19 препаратов-субстратов этого изофермента может приводить к более частому возникновению неблагоприятных побочных реакций. Это особенно справедливо при применении таких ЛС с узким терапевтическим диапазоном, как трициклические антидепрессанты, диазепам и некоторые барбитураты (гексобарбитал). У медленных метаболизаторов по CYP2C19 применение противомалярийного препарата гидроксихлорохина (Плаквенила^♠ ) (применяется также для базисной противовоспалительной терапии при системных заболеваниях соединительной ткани, в частности, системной красной волчанке) неэффективно, поскольку он превращается в активную форму при участии CYP2C19. Существуют данные о более высоком риске развития злокачественных новообразований головы и шеи у больных с медленным метаболизмом по CYP2C19. Кроме того, при применении тамоксифена у больных РМЖ длительность периода ремиссии заболевания больше у пациентов, в генотипе которых присутствует аллель CYP2C19*2. Был продемонстрирован более выраженный антиагрегантный эффект при применении тиклопидина у медленных метаболизаторов по CYP2C19, но различий в фармакокинетике препарата найдено не было.

Наибольшее число исследований посвящено связи полиморфизма гена CYP2C19 с изменением фармакокинетики и фармакодинамики блокаторов ингибиторов Н⁺ ,К⁺ -АТФазы. Фармакокинетические исследования у здоровых добровольцев показали, что AUC, значения максимальной концентрации омепразола, лансопразола и рабепразола достоверно выше у гетерозигот и особенно гомозигот по функционально-дефектному аллелю гена CYP2C19. Кроме того, обнаружено, что более выраженное подавление желудочной секреции при применении этих препаратов отмечено у больных с язвенной болезнью и рефлюкс-эзофагитом, являвшихся гетерозиготами и гомозиготами по этому же аллелю. Вместе с тем частота возникновения НР при использовании ингибиторов H⁺ -, К⁺ -АТФазы не зависела от генотипа по CYP2C19. В настоящее время разработан алгоритм выбора режима дозирования лансопразола на основе генотипирования пациентов по CYP2C19: при генотипе CYP2C19*1/*1 препарат рекомендуют назначать по 30 мг 3 раза в сутки, CYP2C19*1/*2 - по 15 мг 3 раза в сутки, CYP2C19*2/*2 - по 15 мг 2 раза в сутки. Подобный подход может способствовать повышению эффективности эрадикационной антихеликобактериальной терапии с применением лансопразола у больных с язвенной болезнью до 96%.

Полиморфизм гена CYP2C19 связан с изменением фармакокинетики и анти-агрегантного действия пролекарства клопидогрела (активный метаболит 2-оксаклопидогрел образуется из клопидогрела под влиянием CYP2C19). У пациентов, в генотипе которых присутствовал функционально-дефектный аллельный вариант CYP2C19*2, отмечают угнетение образования активного метаболита клопидогрела, следствием чего служит менее выраженный антиагрегантный эффект. Есть данные, что у больных с острым коронарным синдромом и у пациентов после стентирования коронарных артерий аллельный вариант CYP2C19*2 ассоциируется с более плохим прогнозом развития тромботических осложнений, в том числе и фатальных. В настоящее время в инструкции по медицинскому применению клопидогрела указана необходимость при решении вопроса о начале лечения препаратом принимать во внимание полиморфизм гена CYP2C19. Некоторые авторы рекомендуют при обнаружении у больного аллельного варианта CYP2C19*2 анти-агреганты из группы блокаторов Р2Y12-рецепторов тикагрелора или прасугрела. Есть данные, что применение подобного подхода снижает частоту сердечно-сосудистых осложнений и является экономически обоснованным.

В онкогематологической практике перспективно использование генотипирования по CYP2C19 для персонализации режима дозирования противогрибкового препарата вориконазола (используется для лечения тяжелых микозов в условиях иммуносупрессии), что повышает эффективность и безопасность терапии, особенно у детей.

Также был обнаружен аллельный вариант CYP2C19*17, ассоциированный с ускорением метаболизма ЛС-субстратов CYP2C19 (аллельный вариант повышенной активности). Его частота у шведов и эфиопов составляет 18%, а у китайцев - 4%.

Генетический полиморфизм бутирилхолинэстеразы (псевдохолинэстеразы)

Физиологическая функция бутирилхолинэстеразы - гидролиз ацетилхолина. Кроме того, этот фермент катализирует реакцию гидролиза деполяризующего миорелаксанта суксаметония йодида, широко применяемого в анестезиологии. С начала 50-х годов XX в. были получены сообщения о повышенной чувствительности к препарату, которая обусловлена сниженной активностью бутирилхолинэстеразы. Такой фермент в литературе часто называют атипичной псевдохолинэстеразой. В те же годы были описаны случаи продолжительной остановки дыхания (апноэ) при применении суксаметония йодида: вместо апноэ в течение 2-3 мин у пациентов с парадоксальной реакцией оно продолжалось 2 ч и более. В начале 70-х годов ХХ в. было высказано предположение о возможности аутосомнорецессивного моногенного наследования низкой активности бутирилхолинэстеразы. Генетические исследования последних лет позволили обнаружить ряд альтернативных аллелей гена бутирилхолинэстеразы. Повышенную чувствительность к суксаметония йодиду регистрируют только у гомозигот. Наиболее распространен аллельный вариант, кодирующий фермент со сниженной активностью. Он образован однонуклеотидной заменой, в результате которой синтезируется фермент атипичная бутирилхолинэстераза 1. У него в положении 70 аспарагинат заменен глицином. Гомозиготы по этому аллелю демонстрируют повышенную чувствительность к суксаметония йодиду. Распространенность подобных людей среди белого североамериканского населения составляет 1:3000. Другой аллель, приводящий к синтезу бутирилхолинэстеразы с резко сниженной активностью, образован инсерцией нуклеотидной последовательности в положении 117, в результате чего при транскрипции синтезируется укороченный белок, состоящий только из 22% длины аминокислотной последовательности нормальной бутирилхолинэстеразы. Подобную изоформу в литературе называют тихой бутирилхолинэстеразой. Гомозиготы по этому аллелю также обладают повышенной чувствительностью к суксаметония йодиду. Распространенность гомозигот среди белого североамериканского населения - 1:100 000. Еще один аллель кодирует фермент с активностью, сниженной вследствие замены Thr243Met. В литературе такую изоформу называют фторрезистентной бутирилхолинэстеразой 1. Гомозиготы по этому аллелю демонстрируют повышенную чувствительность к суксаметония йодиду, но период апноэ у них меньше - около 30 мин. Распространенность гомозигот среди белого североамериканского населения - 1:150 000. Частота обнаружения гетерозигот и гомозигот по аллелям, кодирующим различные изоформы бутирилхолинэстеразы со сниженной активностью, среди европейского населения составляет 2-4%. Фенотипирование фермента для определения его сниженной активности осуществляют с помощью так называемого дибукаинового теста, основанного на подавлении активности бутирилхолинэстеразы дибукаином в стандартных условиях. Результат теста представляют в виде дибукаинового числа - степени подавления фермента, выраженной в процентах. У людей с нормальной активностью бутирилхолинэстеразы оно равно 80%. У гомозигот по аллелям, кодирующим бутирилхолинэстеразу со сниженной активностью, дибукаиновое число равно 20%, у гетерозигот - 60%. Генотипирование по бутирилхолинэсте-разе пока используют только в научных исследованиях. Более широкое внедрение этого метода в клиническую практику позволит точнее обнаруживать пациентов с повышенной чувствительностью к суксаметония йодиду и, таким образом, обеспечит высокую безопасность применения препарата.

Ассоциации аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты первой фазы биотрансформации, с неблагоприятными фармакологическими ответами представлены в табл. 10-1.

Генетический полиморфизм глюкуронилтрансферазы

Изоферменты глюкуронилтрансферазы также обладают генетическим полиморфизмом. Давно известно о существовании наследственных нарушений глюкуронирования билирубина. К ним относят синдром Жильбера и синдром Криглера-Найяра. Синдром Жильбера - заболевание, наследуемое по аутосомно-рецессивному типу. Его распространенность среди населения составляет 1-5%. Причина развития синдрома Жильбера - существование в генотипе функционально-дефектных аллелей гена UGT1, образованных точечными мутациями (как правило, однонуклеотидными заменами), при этом образуется УДФ-глюкуронилтрансфераза, активность которой составляет 25-30% нормальной. Изменение глюкуронирования лекарственных препаратов у больных с синдромом Жильбера недостаточно изучено. Есть данные о снижении у них клиренса толбутамида, парацетамола и рифампицина. Была изучена также зависимость частоты возникновения побочных эффектов цитостатического препарата иринотекана от синдрома Жильбера. Иринотекан (СТР-11) - высокоэффективный цитостатик, ингибирующий топоизомеразу I и применяемый при колоректальном раке, резистентном к лечению фторурацилом. В печени под действием карбоксиэстераз он превращается в активный метаболит 7-этил-10-гидроксикамптотецин (SN-38). Основной путь метаболизма SN-38 - глюкуронирование с помощью UGT1A1. Показано, что частота развития НР иринотекана, в частности диареи, достоверно выше у больных с синдромом Жильбера. В настоящее время доказано, что аллельные варианты UGT1A1*1B, UGT1A1*26 и UGT1A1*60 ассоциированы с более частым возникновением гипербилирубинемии при применении иринотекана, что сопровождается низкими значениями AUC глюкуронида SN-38. В настоящее время определение аллельных вариантов гена UGT1A1 для выбора режима дозирования иринотекана одобрено Федеральным агентством США по контролю за продуктами и лекарственными препаратами (FDA). При обнаружении аллельного варианта UGT1A1*28 рекомендовано начинать лечение с минимальных доз препарата.

Есть данные о связи функционально-дефектных аллельных вариантов других генов, кодирующих изоферменты глюкуронилтрансферазы, с изменением фармакокинетики и фармакодинамики различных ЛС. У пациентов, в генотипе которых присутствует аллельный вариант UGT2B15*2, отмечают снижение клиренса лоразепама, что сопровождается более выраженным седативным эффектом. Генотип СС по полиморфному маркеру С802Т гена UGT2B7 ассоциирован с низкой скоростью глюкуронирования морфина, что сопровождается снижением концентраций морфин-6-глюкуронида и морфин-3-глюкуронида у больных с выраженным болевым синдромом. Тем не менее изменения обезболивающего действия морфина в зависимости от генотипа не описаны. Есть данные о том, что у пациентов с хронической сердечной недостаточностью и стенокардией напряжения, в генотипе которых присутствуют аллельные варианты UGT1A1*6, UGT2B7*3, отмечено ослабление глюкуронирования карведилола. Описано также уменьшение клиренса фуросемида у здоровых добровольцев с генотипом СС по С/Т полиморфизму в 3 интроне гена UGT1A1 и генотипом ТТ по полиморфному маркеру А-276Т гена UGT1A9.

Генетический полиморфизм N-ацетилтрансферазы

N-ацетилтрансфераза катализирует реакцию ацетилирования ряда ЛС, в том числе изониазида, сульфаниламидов, прокаинамида, гидралазина и др. Выделяют два изофермента N-ацетилтрансферазы:

Изофермент NAT1 ацетилирует небольшое количество ариламинов, и для него не описано каких-либо альтернативных изоформ. Таким образом, основной фермент ацетилирования в организме человека - изофермент NAT2. Полиморфизм ацетилирования описан в 1960 г. в виде различия между пациентами по скорости ацетилирования противотуберкулезного ЛС изониазида. Тогда же было отмечено, что у людей с медленным ацетилированием в связи с накоплением (кумуляцией) изониазида чаще регистрируют полиневриты и гепатотоксичность. У пациентов с медленным ацетилированием период полувыведения препарата составляет 3 ч, в то время как при быстром ацетилировании - 1,5 ч. Развитие полиневритов связано с тем, что изониазид тормозит переход пиридоксина в активный кофермент дипиридоксинфосфат, который, в свою очередь, необходим для синтеза миелина. Индивидуальная скорость ацетилирования существенно не влияет на режимы дозирования ЛС при ежедневном приеме, но может уменьшать эффективность лечения при прерывистом применении изониазида. При его назначении в составе комбинированной терапии для лечения туберкулеза у больных с медленным ацетилированием закрытие полостей в легких происходит быстрее. Позднее было показано, что полиморфизм ацетилирования характерен не только для изониазида, но и для гидралазина, сульфаниламидов (в том числе сульфасалазина) и левосимендана. В дальнейшем было установлено, что в этот список входят несколько десятков других ЛС. Применение прокаинамида и гидралазина у больных с медленным ацетилированием значительно чаще вызывает поражение печени (гепатотоксичность). Есть данные о том, что у людей с быстрым и медленным ацетилированием ряд заболеваний протекает по-разному. У больных с медленным ацетилированием течение пневмонии и дизентерии более тяжелое и длительное, чем при быстром ацетилировании, что предполагает различный подход к проведению фармакотерапии. Подобные различия отмечают и при некоторых заболеваниях сердечно-сосудистой системы, гинекологических и глазных болезнях. Распространенность медленного ацетилирования варьирует от 10-15% у монголоидов до 50% у представителей европеоидной расы. Только с конца 1980-х годов начали идентифицировать функционально дефектные аллельные варианты гена NAT2, ассоциированные с медленным ацетилированием. На сегодняшний день известно около 15 функционально дефектных аллелей гена NAT2.

Тип ацетилирования определяют как методами фенотипирования, так и генотипирования пациентов по NAT2. В качестве маркерных субстратов ацетилирования широко используют дапсон, сульфадимидин и изониазид. Отношение концентрации моноацетилдапсона к концентрации дапсона в плазме крови через 6 ч после введения препарата менее 0,35 характерно для больных с медленным ацетилированием, а более 0,35 - для пациентов с быстрым ацетилированием. Если в качестве маркерного субстрата используют сульфадимидин, то присутствие менее 25% сульфадимидина в плазме через 6 ч и менее 70% в моче, собранной через 5-6 ч после введения препарата, свидетельствует о фенотипе медленного ацетилирования.

В настоящее время определение типа ацетилирования в некоторых странах рекомендовано больным с туберкулезом и высоким риском развития НР при использовании противотуберкулезных ЛС (гепатотоксичность, нейротоксичность). При обнаружении фенотипа медленного ацетилирования или соответствующего ассоциированного с ним генотипа рекомендуют более тщательно контролировать безопасность лечения изониазидом и пиразинамидом, начиная его с минимальных доз указанных ЛС (для изониазида начальная доза не должна превышать 200 мг/сут).

Генетический полиморфизм тиопурин-S-метилтрансферазы

ТРМТ (тиопурин-S-метилтрансфераза) - фермент, катализирующий реакцию S-метилирования производных тиопурина - основного пути метаболизма цитостатических средств из группы антагонистов пурина: меркаптопурина, тиогуанина и азатиоприна. Меркаптопурин широко используют в составе комбинированной химиотерапии миелобластного и лимфобластного лейкозов, хронического миелолейкоза, лимфосаркомы и саркомы мягких тканей. Тиогуанин применяют в основном при острых лейкозах. Активность ТРМТ довольно вариабельна: 88,6% людей имеют высокую активность фермента, 11,1% - промежуточную, а у 0,3% активность ТРМТ весьма низкая или вовсе отсутствует. При этом известно, что у людей с низкой активностью ТРМТ обнаруживают повышенную чувствительность к меркаптопурину, тиогуанину и азатиоприну, которая манифестирует опасными для жизни гематотоксическим (лейкопения, тромбоцитопения, анемия) и гепатотоксическим эффектами. В условиях низкой активности ТРМТ метаболизм меркаптопурина идет по альтернативному пути - до высокотоксичного соединения тиогуанина нуклеотида. Чем меньше активность ТРМТ, тем больше концентрация последнего в плазме крови и тем сильнее выражены НР меркаптопурина. Низкую активность ТРМТ наследуют по аутосомно-рецессивному типу, причем гомозиготы обладают низкой активностью фермента, а гетерозиготы - промежуточной. Обнаружен ряд функционально-дефектных аллельных вариантов гена ТРМТ, кодирующих изоформы с низкой активностью. Распространенность гомозигот по аллельным вариантам гена ТРМТ среди европеоидов составляет 3,7%, а среди представителей негроидной расы - 4,6%. Повышенная чувствительность к тиопуринам отмечена не только у гомозигот, но и у гетерозигот по функционально-дефектным аллельным вариантам гена ТРМТ. Таким образом, для обеспечения безопасности проводимой химиотерапии перед назначением тиопуринов необходимо определять активность фермента в эритроцитах пациента (фенотипирование ТРМТ) или генотип пациента по ТРМТ. Проведение фенотипирования и генотипирования пациентов по ТРМТ уже рекомендовано в некоторых странах. Разработана коррекция дозирования меркаптопурина в зависимости от активности ТРМТ или генотипа, при этом безопасные дозы для пациентов с низкой активностью фермента должны быть в 10-15 раз ниже среднетерапевтических. Аналогично этому рекомендована коррекция режима дозирования азатиоприна (применяют в качестве базисного противовоспалительного ЛС для лечения больных с системными заболеваниями соединительной ткани).

Ассоциации функционально-дефектных аллельных вариантов других генов, кодирующих ферменты второй фазы биотрансформации, с неблагоприятными фармакологическими ответами представлены в табл. 10-2.

Генетический полиморфизм Р-гликопротеина (P-GP)

Активность Р-гликопротеина зависит от множества факторов, основной из которых - полиморфизм кодирующего его гена ABCB1. В настоящее время активно изучают клиническое значение нескольких однонуклеотидных замен в этом гене. Исследования последних лет показали, что наибольшее клиническое значение имеет полиморфный маркер С3435Т. Частота аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С3435Т значительно варьирует в различных этнических группах. Так, генотип ТТ обнаруживают с частотой от 4% у кенийцев до 36% у португальцев (у русских - 24%). Подобная однонуклеотидная замена не изменяет структуру белка, но снижает стабильность мРНК. Показано, что у индивидуумов с генотипом ТТ отмечено снижение концентрации Р-гликопротеина в двенадцатиперстной кишке, CD56-Т-лимфоцитах и почках. Очевидно, что это может приводить к более полному всасыванию и замедленному выведению ЛС-субстратов Р-гликопротеина и повышению частоты развития неблагоприятных побочных реакций. В результате у пациентов с ТТ-генотипом можно обнаружить более высокие концентрации ЛС-субстратов Р-гликопротеина в плазме крови. Показано, что у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий и генотипом ТТ, длительно принимавших дигоксин, его равновесная концентрация в плазме крови повышена, что сопровождается увеличением риска развития дигиталисной интоксикации.

В настоящее время проходят исследования по изучению связи полиморфного маркера С3435Т гена ABCB1 с изменением фармакокинетики и фармакодинамики иммуносупрессоров циклоспорина и такролимуса. Некоторые авторы обнаружили, что после пересадки сердца у пациентов с генотипом ТТ AUC циклоспорина была достоверно выше, чем у больных с генотипами СТ и СС. Циклоспорин и такролимус, обладающие иммунодепрессивным действием, применяют в трансплантологии для профилактики отторжения трансплантата и реакции «трансплантат против хозяина» после пересадки почки, печени, костного мозга и сердца. Известно, что особенности фармакокинетики циклоспорина и такролимуса - значительная индивидуальная вариабельность биологической доступности и узкий терапевтический индекс. Гликопротеин-Р принимает участие в процессах всасывания и выведения этих препаратов. Именно поэтому в настоящее время идут интенсивные исследования клинического значения полиморфного маркера С3435Т гена ABCB1 при лечении циклоспорином и такролимусом. Было показано, что у пациентов с генотипом ТТ AUC циклоспорина была достоверно выше, чем у пациентов с генотипами СТ и ТТ, поэтому именно у первых больных доза циклоспорина, необходимая для поддержания оптимальной концентрации препарата в плазме крови (1000 мкг/л), должна быть снижена в 2 раза по сравнению с пациентами, имеющими генотип СС. Аналогичные данные были получены и для такролимуса.

Субстрат Р-гликопротеина - лоперамид. Основное показание для применения этого препарата - симптоматическое лечение острой и хронической диареи. Механизм действия лоперамида связан с возбуждением опиатных рецепторов гладких мышц кишечника. Фармакокинетику препарата характеризует низкая биодоступность, связанная с плохим всасыванием (Р-гликопротеин энтероцитов способствует выведению лоперамида в просвет кишечника) и эффектом первого прохождения через печень (активная секреция Р-гликопротеином в желчь и биотрансформация). Проникновение препарата через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) затруднено функционированием Р-гликопротеина эндотелиоцитов, выкачивающим его обратно в просвет сосуда. Тем не менее НР лоперамида (сонливость, головокружение, миоз и др.) связаны именно с его проникновением в ЦНС. Оказалось, что у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с индивидуумами с генотипами СТ и СС максимальная концентрация лоперамида достоверно выше. Кроме того, авторами было обнаружено, что именно у пациентов с генотипом ТТ был зарегистрирован более выраженный миоз при применении препарата (морфиноподобный эффект). Усиление проникновения ЛС через ГЭБ у носителей определенных генотипов по полиморфным маркерам гена ABCB1 может приводить не только к повышению риска развития НР со стороны ЦНС, но и, в случае если мишени ЛС расположены в головном мозге, - к повышению эффективности лечения. Показано, что эффективность терапии шизофрении при применении нейролептика бенперидола выше у пациентов, имеющих генотип ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена ABCB1, что, по-видимому, связано с более эффективным проникновением препарата через ГЭБ. Этим же феноменом, а не только изменениями фармакокинетики, объясняют большую эффективность противосудорожных и противорвотных ЛС у больных c генотипом ТТ, а также большую частоту развития НР со стороны ЦНС при применении антидепрессантов (ортостатическая гипотензия) и антипсихотических препаратов (экстрапирамидные расстройства) у этой категории пациентов. Есть данные, что у пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена ABCB1 отмечают более высокую степень проникновения ЛС-субстратов Р-гликопротеина через плацентарный барьер, что может объяснить более высокий риск развития врожденных аномалий челюстно-лицевой области (волчья пасть, заячья губа) у детей матерей с генотипом ТТ, которым в ранние сроки беременности назначали ЛС-субстраты Р-гликопротеина.

В последние годы большое внимание уделяют роли полиморфизма гена ABCB1 в изменении эффективности противовирусных ЛС из группы ингибиторов ВИЧ-протеиназы, применяемых при инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Показано, что генотип ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена ABCB1 ассоциирован с более выраженным снижением числа вирусных частиц при применении нелфинавира.

Следует отметить, что результаты ассоциативных исследований по изучению полиморфизма гена ABCB1 противоречивы и неоднозначны, поэтому генотипирование по ABCB1 не регламентировано в инструкциях по медицинскому применению ЛС и типичных клинико-морфологических статьях. Выяснение значения полиморфизма гена ABCB1 для индивидуализации фармакотерапии требует проведения дополнительных клинических исследований. Тем не менее на основании результатов уже проведенных испытаний можно предположить, что при обнаружении функционально-дефектных аллельных вариантов гена ABCB1:

Таким образом, изучение генетического полиморфизма Р-гликопротеина может оказаться перспективным методом индивидуализации фармакотерапии.

Генетический полиморфизм транспортеров органических анионов и катионов

В настоящее время наиболее хорошо изучена связь генетического полиморфизма SLCO1B1 с изменением фармакокинетики и фармакодинамики гиполипидемических ЛС из группы статинов. В связи с угнетением захвата гепатоцитами статинов у пациентов с аллелями С и G по полиморфным маркерам A388G, Т521С и Т1628G соответственно при их применении отмечают ослабление гиполипидемического эффекта и одновременно увеличение риска поражения поперечнополосатой мускулатуры (рабдомиолиза). Кроме того, доказано, что определенные аллельные варианты гена SLCO1B1, кодирующего полипептид С (транспортер органических анионов SLCO1B1), ассоциированы со снижением его активности, приводящим к увеличению периода полувыведения, AUC и снижению клиренса ряда статинов (питавастатина, правастатина, розувастатина), сахароснижающего препарата репаглинида, а также нового гиполипидемического ЛС эзетимиба и его глюкуронида (активный метаболит).

Обнаруженные ассоциации аллельных вариантов генов - транспортеров ЛС с неблагоприятным фармакологическим ответом представлены в табл. 10-3.

В настоящее время происходит активное изучение связи полиморфизма генов, кодирующих транспортеры органических анионов и катионов, с профилями эффективности и безопасности противоопухолевых ЛС.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА, АССОЦИИРОВАННОГО С ИЗМЕНЕНИЕМ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ

Полиморфные маркеры в генах, кодирующих белки, которые служат фармакологическими мишенями для ЛС (рецепторы, ферменты, ионные каналы и др.), часто ассоциированы с изменением фармакодинамики этих препаратов. В качестве примера можно указать полиморфизм генов, кодирующих β₁ - и β₂ -адренорецепторы, ионные каналы, и генов, ответственных за синтез компонентов ренинангиотензин-альдостероновой системы, - ангиотензинпревращающего фермента и ангиотензиногена. К этой же группе фармакогенетических феноменов относят развитие гемолиза при применении некоторых ЛС у пациентов с недостаточностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и так называемую злокачественную гипертермию при применении средств для наркоза и миорелаксантов.

Генетический полиморфизм β₂-адренорецептора

Хорошо изучен полиморфный маркер Gly16Arg гена β₂ -адренорецептора. По сравнению с гомозиготами GlyGly, у гомозигот ArgArg в 5 раз, а у гетерозигот GlyArg в 2 раза чаще отсутствует бронхолитический эффект при применении короткодействующих агонистов β₂ -адренорецепторов (альбутерол^ρ , сальбутамол) для устранения бронхоспазма. Это объясняют связью этого маркера с предрасположенностью к снижению плотности β₂ -адренорецепторов в бронхах на фоне применения их короткодействующих агонистов. Распространенность гомозигот по этому полиморфному маркеру высока и в некоторых европеоидных популяциях достигает 40%, поэтому лечение бронхообструктивного синдрома у таких пациентов представляет серьезную проблему. Показано, что препараты выбора у таких больных - длительно действующие (пролонгированные) агонисты β₂ -адренорецепторов (салметерол, формотерол), с изменением бронхолитического эффекта которых полиморфный маркер Gly16Arg гена β₂ -адренорецептора не ассоциирован.

Генетический полиморфизм β₁ -адренорецептора

Полиморфизм гена, кодирующего β₁ -адренорецептор (ADRB1), ассоциирован с изменением фармакодинамики β-адреноблокаторов. В настоящее время подобного рода исследования проведены у пациентов с артериальной гипертензией и хронической сердечной недостаточностью. Существуют две неравноценные замены в кодирующем регионе гена ADRB1.

Полиморфный маркер Gly49Ser локализован во внеклеточной частиβ₁ -адренорецептора, а полиморфный маркер Gly389Arg - во внутриклеточной части, т.е. в центре связывания с G-белком. Частота обнаружения аллеля 49Gly приблизительно равна 15% и не имеет расовых различий.

Активно изучают связь полиморфного маркера Gly389Arg с изменением гипотензивного действия β-адреноблокаторов у больных с артериальной гипертензией. У пациентов, имеющих в генотипе аллель Arg389, отмечено более интенсивное снижение систолического и диастолического артериального давления как при однократном, так и при длительном применении β-адреноблокаторов. У больных с хронической сердечной недостаточностью присутствие в генотипе аллеля 389Arg ассоциировано с изменением эффективности β-адреноблокатора метопролола. У таких больных в большей степени повышается фракция выброса левого желудочка, уменьшается конечный систолический и диастолический объем, а также снижается смертность.

Генетический полиморфизм ангиотензинпревращающего фермента (ACE)

Полиморфизм гена ACE связан с присутствием [вставка - insertion (I)] или отсутствием [выпадение - deletion (D)] фрагмента из 287 п.н. и получил название I/D-полиморфизма. Наибольшая активность ACE в плазме крови отмечена у людей с генотипом DD, наименьшая - у пациентов с II-генотипом. Пациенты с ID-генотипом занимают промежуточное положение. Данные об ассоциации I/D-полиморфизма с изменением антигипертензивного действия ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента и блокаторов ангиотензиновых рецепторов противоречивы, как и информация об ассоциации I/D-полиморфизма с изменением эффективности ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента у больных с хронической сердечной недостаточностью. Есть данные о том, что ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента не оказывают положительного влияния на функцию почек (нефропротективный эффект) при недиабетических заболеваниях почек у больных с DD-генотипом, но эффективны у больных с II- и ID-генотипом. Известно также об ассоциации I/D-полиморфизма с изменением эффективности ЛС других групп. Установлено, что достоверное увеличение фракции выброса левого желудочка, а также снижение конечного систолического и диастолического объема у больных с хронической сердечной недостаточностью на фоне длительного лечения с включением спиронолактона происходит только у пациентов с генотипами II и ID, но не DD. В другом исследовании было показано, что в группе больных, не принимающих β-адреноблокаторы, смертность была выше у пациентов с генотипом DD. В группе пациентов с хронической сердечной недостаточностью, принимающих β-адреноблокаторы, смертность была ниже по сравнению с группой пациентов, не принимающих эти препараты, и не различалась в зависимости от генотипа по ACE. У больных с ИБС с генотипами II и ID флувастатин достоверно лучше вызывал регресс коронарографических изменений по сравнению с пациентами с генотипом DD. У больных с эректильной дисфункцией и генотипом DD эффективность силденафила достоверно ниже, чем у пациентов с генотипами ID и II. Окончательное значение I/D-полиморфизма для фармакотерапии требует серьезного уточнения.

Генетический полиморфизм ионных каналов

Идиопатический синдром удлиненного интервала Q-T - моногенное наследственное заболевание. В его основе лежит генетический полиморфизм ионных каналов, характеризующийся удлинением интервала Q-T на электрокардиограмме и случаями внезапной смерти вследствие развития пируэтной желудочковой тахикардии, которая часто может быть спровоцирована приемом некоторых ЛС. В зависимости от наличия или отсутствия глухоты и типа наследования в настоящее время различают две наследственные формы синдрома удлиненного интервала Q-T: синдром Романо-Уорда и Джеруэлла-Ланге-Нильсена. Синдром Романо-Уорда не сопровождается нарушением слуха и характеризуется аутосомно-доминантным типом наследования. Для синдрома Джеруэлла-Ланге-Нильсена характерны двусторонняя нейросенсорная тугоухость и аутосомно-рецессивный тип наследования. Распространенность синдрома Романо-Уорда составляет 1:10 000-1:15 000. Синдром Джеруэлла-Ланге-Нильсена регистрируют крайне редко; точных данных о его распространенности в литературе не обнаружено. Синдром удлиненного интервала Q-T ассоциируется с функционально-дефектными аллельными вариантами генов, кодирующих калиевые каналы и некоторые другие белки, а также регулирующих трансмембранные токи ионов калия и натрия (KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1, NOS1A5, NDRG4, GINS3, PLN, RNF207, LITAF, LIG3, RFFL).

ЛС, перечисленные в табл. 10-4, способны удлинять интервал Q-T и таким образом вызывать повышение риска возникновения опасных для жизни аритмий у больных с синдромом удлиненного интервала Q-T. Именно поэтому они абсолютно противопоказаны таким пациентам. По-видимому, особенно опасно применять отдельные ЛС только при определенных вариантах синдрома удлиненного интервала Q-T. Показано, что применение у больных с синдромом Джеруэлла-Ланге-Нильсена хинидина, цизаприда и терфенадина достоверно повышает риск возникновения пируэтной желудочковой тахикардии. К факторам риска развития полиморфной желудочковой тахикардии при применении ЛС у этой категории пациентов относят:

Генетический полиморфизм системы HLA

В настоящее время активно изучают связь полиморфизма генов системы HLA (человеческий лейкоцитарный антиген) с развитием аллергических реакций при использовании различных ЛС. Аллельный вариант HLA-B*1502 в монголоидных этносах ассоциируется с развитием синдрома Стивенса-Джонсона при применении противосудорожного препарата карбамазепина. В США в инструкции по медицинскому применению карбамазепина указано: больным, принадлежащим к монголоидной расе, рекомендовано фармакогенетическое тестирование, направленное на обнаружение аллельного варианта HLA-B*1502. Его результаты позволяют идентифицировать больных с очень высоким риском развития синдрома Стивенса-Джонсона при использовании препарата, что служит основанием для отказа от его применения.

Другой аллельный вариант HLA-B*5701 ассоциируется с развитием гиперчувствительности замедленного типа при применении ингибитора ВИЧ-протеиназы абакавира. Результаты фармакогенетического тестирования позволяют идентифицировать больных с очень высоким риском развития гиперчувствительности замедленного типа при применении абакавира, что служит основанием для отказа от применения этого ЛС. Все это регламентировано в инструкции по медицинскому применению препарата. Кроме того, есть данные, что аллельный вариант HLA-B*5701 также связан с развитием аллергического гепатита при применении антибиотика пенициллинового ряда флуклоксациллина.

Полиморфизм генов, кодирующих факторы свертывания крови

С точки зрения фармакогенетики наибольшее клиническое значение имеет полиморфный маркер гена G1691A, кодирующего фактор свертывания V (мутация типа Лейден), который ассоциирован с высоким риском тромбозов и тром-боэмболий (в том числе тромбоэмболии легочной артерии) при применении комбинированных оральных контрацептивов. Есть основания полагать, что женщинам с тромботическими осложнениями в анамнезе и (или) отягощенным семейным анамнезом по тромбозам рекомендовано проведение фармакогенетического тестирования с целью определения генотипа по полиморфному маркеру G1691A гена фактора свертывания V. Его результаты позволяют обнаружить женщин с очень высоким риском развития тромботических осложнений при применении комбинированных оральных контрацептивов, что служит основанием для отказа от их применения.

Фармакогенетика злокачественной гипертермии

Злокачественная гипертермия - заболевание, возникающее при применении местных анестетиков, средств для ингаляционного наркоза и суксаметония йодида. Для нее характерен аутосомно-доминантный тип наследования. Клиническая картина злокачественной гипертермии складывается из лихорадочного синдрома, сопровождаемого нарушениями ритма сердца и острой почечной недостаточностью, а также некротических изменений поперечнополосатой мускулатуры. В основе патогенеза заболевания лежит увеличение концентрации внутриклеточного кальция, индуцированное вышеперечисленными ЛС. В последнее время стало известно, что с возникновением злокачественной гипертермии связаны некоторые аллельные варианты гена, кодирующего рианодиновые рецепторы первого типа (RYR1) и расположенного в локусе 19q13.1. На сегодняшний день обнаружено более 40 аллельных вариантов гена RYR1, ассоциированных с развитием злокачественной гипертермии. Обсуждается вопрос о целесообразности идентификации этих аллелей у всех пациентов, у которых предполагают применение местных анестетиков, средств для ингаляционного наркоза или суксаметония йодида.

ИЗМЕНЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА ПРИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Еще одна задача клинической фармакогенетики - изучение изменений фармакологического ответа при генетических (наследственных) заболеваниях. Характерные примеры последних - недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, порфирия и врожденные метгемоглобинемии.

Недостаточность (дефицит) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Полиморфные маркеры генов, кодирующих ферменты, ответственные за защиту от окисления сульфгидрильных групп белков клеточных мембран (например, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу) под действием некоторых ЛС, могут приводить к изменению фармакодинамики этих препаратов. У пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена в результате дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при применении некоторых ЛС возникает гемолиз эритроцитов (табл. 10-5). Для понимания этого явления необходимо представлять физиологическую роль глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Этот фермент катализирует переход глюкозо-6-фосфата в фосфоглюконат. Коферментом реакции выступает никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), превращающийся в восстановленный НАДФН⁺ . НАДФН⁺ - важный донор электронов в реакции превращения окисленного глутатиона в восстановленный под действием глутатионредуктазы. Образующийся восстановленный глутатион - активный антиоксидант, защищающий белки клеточных мембран от окисления. В условиях недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы образование НАДФН⁺ снижено, и следовательно, возникает дефицит восстановленного глутатиона. В связи с этим при применении ЛС, обладающих окислительными свойствами (см. табл. 10-5), вследствие отсутствия защиты от окисления сульфгидрильных групп белков клеточных мембран эритроцитов происходит их гемолиз. У больных с недостаточностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы он возникает не только при использовании ЛС, но и при употреблении некоторых продуктов питания, в частности конских бобов (Vicia faba). Именно поэтому подобное заболевание называют фавизмом. Наследование функционально-дефектных аллелей гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, обусловливающих ее недостаточность, сцеплено с полом. Обнаружено более 50 подобных аллелей, но можно выделить две основные формы недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы:

Негроидная форма характеризуется ускоренным разрушением глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, поэтому гемолизу подвергаются только старые эритроциты (возраст более 55 дней). Острый гемолиз отмечают только при первом применении ЛС длительностью несколько дней. При продолжении его использования возникает лишь хронический слабовыраженный гемолиз эритроцитов. Средиземноморская форма характеризуется существованием дефектной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы со сниженной активностью. В этом случае гемолизу подвергаются как молодые, так и старые эритроциты. При этой форме заболевания отмечают выраженный гемолиз эритроцитов, возникающий при первом приеме ЛС и продолжающийся в течение всего периода его применения. Распространенность недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы варьирует в различных популяциях от 1-15 до 30-40% (Азербайджан). В европейских популяциях недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы регистрируют крайне редко.

Изменение фармакологического ответа при порфирии

Порфирия - наследственное заболевание, в основе которого лежит повышение активности синтетазы δ-аминолевуленовой кислоты, что сопровождается избыточной продукцией этой кислоты и порфобилиногена. Различают три формы порфирии, которые наследуются по аутосомно-доминантному типу. Клиническая картина обострения заболевания складывается из резких абдоминальных болей, полиневрита, психических нарушений и эпилептических припадков. Некоторые ЛС могут провоцировать обострение порфирии (табл. 10-6). Механизм этого феномена, по-видимому, связан с повышением активности синтетазы δ-аминолевуленовой кислоты под действием таких препаратов, как барбитураты, сульфаниламиды, эстрогены и гризеофульвин. Именно поэтому фармакотерапию больных с порфирией следует проводить с особой осторожностью.

Таблица 10.6. Опасные и безопасные лекарственные средства для больных с порфирией

Фармакогенетическое тестирование в клинической практике

Фармакогенетический тест - идентификация конкретных генотипов, ассоциированных с изменением фармакологического ответа. В основе таких тестов лежит ПЦР. В качестве источника ДНК (генетического материала) используют кровь больного или соскоб буккального эпителия. Сбор биологического материала у больного не требует предварительной подготовки. Результаты фармакогенетического теста представлены идентифицированными генотипами больного по тому или иному полиморфному маркеру. Как правило, врач клинический фармаколог интерпретирует результаты фармакогенетического теста, т.е. формулирует рекомендации по выбору ЛС и его режима дозирования для конкретного пациента. Применение таких тестов позволяет заранее прогнозировать фармакологический ответ на применение препарата. Это позволяет подойти к выбору ЛС и режима его дозирования индивидуально, а иногда и выбрать тактику ведения пациентов. Предполагают, что внедрение новых технологий тестирования, основанных на микрочипах (ДНК-чипы), позволит определять не отдельный полиморфизм конкретного гена, а проводить тотальный скрининг всех или почти всех аллельных вариантов в геноме человека, ассоциированных с изменением фармакологического ответа на прием ЛС, что, собственно, и является задачей фармакогеномики. При этом станет возможным составление так называемого генетического паспорта пациента. С этих позиций фармакогенетику, а в будущем и фармакогеномику в литературе рассматривают как перспективные направления персонализированной медицины будущего. В совокупности с другими «омиксными» технологиями (фармакотранскриптомикой, фармакопротеомикой, фармакометаболомикой) внедрение фармакогеномики в клиническую практику способствует приближению к прецизионной медицине.

В настоящее время фармакогенетическое тестирование в клинической практике целесообразно проводить в следующих ситуациях:

В настоящее время фармакогенетика - активно развивающаяся наука: примерно на 50% всех применяемых в клинической практике ЛС уже есть генетическая информация; в отношении них проведены исследования ассоциаций. Создан крупнейший интернет-ресурс по клинической фармакогенетике (www.pharmgkb.org), на котором собраны результаты всех проведенных фармакогенетических исследований. Их удобный поиск возможен как по международному непатентованному названию ЛС, так и по названию гена.

Тем не менее далеко не всякая генетическая информация о ЛС может лечь в основу фармакогенетического теста, который можно будет применять в клинической практике. Для этого тест должен отвечать нижеперечисленным требованиям.

Формирование у врачей (в том числе и медицинских генетиков) знаний в области фармакогенетики позволит им использовать результаты фармакогенетических исследований или тестирования в будущей профессиональной деятельности для проведения эффективной и безопасной фармакотерапии. Преимущества использования некоторых фармакогенетических тестов перед традиционными подходами доказаны в рандомизированных исследованиях, т.е. можно говорить о доказательной фармакогенетике. Применение в клинической практике индивидуального подхода к выбору ЛС и режимов их дозирования - не только возможность увеличения эффективности и безопасности фармакотерапии. Это реальный инструмент для повышения приверженности больного лечению и, в какой-то степени, доверия к лечащему врачу.

Список литературы

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ

Введение

Иммуногенетика - наука, изучающая генетические основы иммунной системы организма. Иммунная система предназначена для защиты организма от внешней (инфекционные агенты) и внутренней (онкологическое перерождение клеток) биологической агрессии. Для этого на протяжении эволюции сформировались структуры и механизмы, обеспечивающие распознавание чужеродных и собственных измененных макромолекул (антигенов), удаление антигенов и содержащих их клеток из организма и запоминание контакта с определенными антигенами (иммунологическая память), что обусловливает их ускоренное удаление при повторном проникновении в организм.

Изложить генетические основы иммунитета невозможно, не остановившись на особенностях организации и функционирования иммунной системы человека. Структурно она представлена комплексом специализированных лимфоидных органов и диссеминированных клеток, выполняющих иммунологические функции. Защитная реакция организма на присутствие несвойственных ему макромолекул определяется двумя взаимодействующими составными частями иммунной системы. К первой относят компоненты естественного (врожденного) иммунитета - клетки и молекулы, ответственные за воспалительные реакции с ограниченной специфичностью распознавания чужеродных или собственных молекулярных структур - паттернов. Концепция естественного иммунитета была предложена в XIX в. И.И. Мечниковым и дополнена в конце ХХ в. C. Janeway и Р. Меджитовым открытыми ими толл-подобными рецепторами (Toll-like receptors, TLR) клеток. Вторая составная часть системы иммунитета определяет высокоспецифические иммунные реакции, направленные против конкретных антигенов (специфический иммунитет). Последний формируется, как правило, в ответ на агрессию, поэтому его называют адаптивным иммунным ответом. При патологических состояниях, однако, реакции иммунной системы могут носить дисадаптивный характер и проявляться аутоиммунными нарушениями, иммунологической недостаточностью, жизнеугрожающим сепсисом.

Считается, что за исключением нескольких признаков (некоторые клеточные популяции и белки плазмы) 20-40% имеющихся межиндивидуальных различий признаков, относящихся к иммунной системе, могут быть отнесены к наследственным факторам (Liston et al., 2016). При этом генетическая предрасположенность выражена сильнее в отношении параметров врожденного иммунитета, чем адаптивного (приобретенного, специфического) (Brodin et al., 2015; Patin et al., 2018). Предполагается, что этому способствует меньшая продолжительность жизни клеток врожденного иммунитета по сравнению с клетками адаптивного иммунитета, и врожденные эффекты наиболее заметны, в то время как факторы внешней среды имеют больше возможностей воздействовать на более длительно живущие клетки (Daffy et al., 2020).

Естественный (врожденный) иммунитет

Важная роль воспалительной реакции состоит в привлечении к месту внедрения чужеродного агента клеток иммунной системы и их активации (реакция воспаления). Макрофаги, моноциты, дендритные клетки, естественные киллерные клетки (ЕКК) и другие клетки естественного иммунитета блокируют, поглощают посредством фагоцитоза и разрушают микробные и опухолевые клетки. В ходе воспалительной реакции активируются гуморальные системы защиты, среди которых особенно важна система комплемента. Ее белки могут разрушать микроорганизмы, перфорируя их мембраны. Кроме того, ее компоненты, покрывая поверхность микробной клетки, обеспечивают взаимодействие с фагоцитирующими клетками с последующим фагоцитозом бактерий.

Огромное значение для понимания механизмов естественного иммунитета приобрело открытие толл-подобных рецепторов у мышей, а вскоре и у человека. Высококонсервативные толл-подобные структуры впервые были обнаружены в 1988 г. у D. melanogaster. Обнаружение первого гомолога этих молекул - толл-подобных рецепторов TLR4 у человека и первые доказательства того, что эти молекулы способны распознавать молекулы патогенных микроорганизмов (Medzhitov R., Janeway C.A., 1997), явились революцией в иммунологии. В этом же году обоими авторами была развита концепция паттернраспознающих рецепторов (структурораспознающих, образраспознающих рецепторов - в русских вариантах вольных переводов четкого термина pattern - особенность). Через год были открыты еще четыре молекулы (TLR1, -2, -3, -5), также структурно аналогичные толл-подобным рецепторам плодовой мушки, - в настоящее время уже известно 13 таких молекул (TLR1-13) у человека. Некоторые молекулы - TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10 - у человека экспрессированы на клеточной мембране, другие - TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 - во внутриклеточных эндосомах, для удобства распознавания внутриклеточных РНК и ДНК преимущественно бактерий и вирусных нуклеиновых кислот (Vijay K., 2018). Биологический эффект стимуляции TLR инициируется взаимодействием с лигандами - наиболее часто бактериальными продуктами (в скобках указаны соответствующие рецепторы): триацил-липопептидом (TLR1), диацил-липопептидом (TLR6), флагеллином (TLR5), липополи-сахаридами (TLR4), фрагментами двуцепочечной и одноцепочечной РНК (TLR3 и TLR7/8 соответственно), фрагментами ДНК, обогащенными остатками цитидина и гуанидина - CpG (TLR9). В результате взаимодействия лиганда с рецептором запускаются сигнальные механизмы, в результате которых синтезируется провоспалительный транскрипционный фактор - NFkB1, контролирующий экспрессию провоспалительных генов - TNF, IL-1 и IL-6, активирующих фагоцитирующие клетки, включая дендритные клетки, а также Т- и В-клетки иммунной системы, и запускающих синтез других цитокинов.

Полиморфизм генов (нередко - в интронных областях) TLR ассоциируется с воспалительными заболеваниями - как инфекционными, так и неинфекционными, включая онкологические болезни. Известны ассоциативные связи генетически полиморфных форм TLR c проказой, туберкулезом, средиземноморской лихорадкой, лейшманиозом, диабетом I типа, коронарным рестенозом у взрослых, инфекциями мочевыводящих путей, вызванными грамотрицательными бактериями, энтеровирусным миокардитом или кардиомиопатией, язвенным колитом, болезнью Грейвса, риском туберкулеза, развитием полиорганных нарушений при сепсисе и другими патологическими состояниями. Истинное значение этих ассоциаций, однако, пока трудно оценить вследствие недостаточного объема исследований, гетерогенности популяций и механизмов патологических состояний, относительно низких уровней значений отношения шансов OR, которые не позволяют однозначно судить об их значимости сегодня как прогностических маркеров, готовых к внедрению в практику здравоохранения. Пока остается надеяться, что накапливающиеся данные смогут в обозримом будущем существенно повысить потенциал прогностической ценности таких маркеров в случае их использования в комбинациях с другими, негенетическими биомаркерами (БМ).

Адаптивный иммунный ответ

Неспецифические факторы иммунитета обусловливают включение адаптивной реакции лимфоцитов, особенность которой состоит в вовлечении в иммунный ответ только тех клонов лимфоцитов, которые несут рецепторы, распознающие несвойственные организму антигены. Нативный антиген распознают только иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов. Т-лимфоциты, составляющие, наряду с ними, основу адаптивного иммунного ответа, определяют только антиген или его фрагменты, аффинно встроенные в специализированные молекулы поверхности клеток - молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC - Major Histocompatibility Complex) классов I и II. Эти молекулы присутствуют на поверхности практически всех клеток организма. В норме молекулы МНС класса I связываются с процессированными в протеасомных структурах клетки фрагментами белков - пептидами длиной 8-11 аминокислотных остатков. Такой комплекс мигрирует к поверхности клетки, представляющей антиген, - макрофага или дендритной клетки (профессиональной антигенпредставляющей клетки), и представляет пептид вовне для распознавания рецепторами Т-клеток. Если молекулы антигенов - собственные белки организма, то в норме они не индуцируют развитие иммунного ответа (существует иммунологическая толерантность, неотвечаемость на «свои» антигены). Если же пептид образуется в результате протеолиза чужеродного антигена, он распознается рецептором цитотоксических Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности маркерные белки CD8, и стимулирует их реакции - активацию, пролиферацию, распознавание фрагментов клеточной мембраны, несущих такие же пептиды в составе таких же молекул МНС, на поверхности клеток-мишеней, с последующим разрушением последних (рис. 11-11). Так распознаются и уничтожаются чужеродные клетки трансплантата, клетки организма, в которых реплицируются вирусы, или некоторые внутриклеточные бактерии, антигены которых представляются для распознавания антигенспецифическим Т-клеткам.

Молекулы MHC класса II связывают более длинные пептиды - 9-20 аминокислот, которые распознаются в ассоциации с МНС антигенспецифическими рецепторами других Т-клеток - Т-хелперов, несущих свой маркер на клеточной поверхности - молекул CD4. Такие клетки помогают В-клеткам дифференцироваться в антителообразующие клетки при повторной встрече с антигеном, распознаваемым иммуноглобулиновыми рецепторами В-клетки. Таким образом, слаженная работа CD4-положительных Т-хелперов, В-клеток и CD8-положительных киллер-ных клеток обеспечивает полный спектр адаптивного (специфического) иммунитета - стимулируется продукция антител и происходит накопление в организме антигенреактивных Т-клеток, одни из которых, продуцируя соответствующие цитокины - IL-4 и IL-6, способствуют дифференцировке В-клеток по пути антителопродуцентов, а другие - обеспечивают санацию организма от клеток, зараженных вирусами или бактериями.

Более подробный анализ генов главного комплекса гистосовместимости, роль в патологии человека полиморфизма генов МНС - ключевые разделы иммуногенетики, и им посвящена отдельная глава.

Генетическая основа синтеза иммуноглобулинов

В ходе иммунного ответа В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, которые секретируют антитела. Антитела - молекулы Ig, представленные растворимой формой антигенраспознающего рецептора В-лимфоцитов. Главная часть мембранного рецептора для антигена В-лимфоцитов - молекула Ig. Она состоит из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) цепей, которые построены из гомологичных участков, называемых доменами. N-концевые домены цепей обоих типов, называемые V-доменами, отличаются высокой вариабельностью. Другие домены (один в легкой цепи и несколько - в тяжелых цепях) называют константными (С). Они отвечают за связывание с компонентами комплемента и рецепторами на клеточных мембранах, а также выполняют другие функции. Константные домены также определяют основные типы тяжелых и легких цепей.

Существует пять типов тяжелых цепей - γ, μ, α, δ и ε, определяющих соответственно пять основных классов Ig - IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Незрелые В-лимфоциты продуцируют только IgM, но во время их созревания происходит перестройка генов тяжелых цепей, в результате которой образуются четыре оставшихся класса Ig. Все они отличаются аминокислотной последовательностью, зарядом и содержанием углеводных остатков. Каждый из классов Ig в основном локализуется в определенных частях тела и реагирует на определенный тип инфекционного агента. Гены, кодирующие Н-цепи, локализованы на хромосоме 14.

Для легких цепей Ig характерны два типа - κ и λ, гены которых находятся в хромосомах 2 и 22 соответственно.

Перед изложением событий, происходящих с генами Ig при созревании В-лимфоцитов, необходимо сделать два замечания. Во-первых, перестройка и другие изменения этих генов происходят в соматических клетках организма (В-клетках) и не затрагивают клетки зародышевого пути (генетика соматических клеток). Во-вторых, в процессе этих превращений происходит количественное и качественное изменение генома лимфоцитов, что отличает их от других соматических клеток организма человека, геном которых на протяжении индивидуального развития количественно не изменяется.

Как уже отмечено, в геноме человека обнаружено три кластера генов, определяющих структуру Ig. Два кластера детерминируют κ- и λ-цепи, а третий кластер - тяжелые цепи Ig. Каждый кластер включает несколько групп генов: серию V (вариабельных) генов (несколько сотен для Н- и κ-цепей), серию D (разнообразных) генов в кластере генов для Н-цепей, которая находится на расстоянии примерно 10 т.п.н. от З'-конца серии V-генов, серию J (соединяющих) генов и, наконец, С (постоянные) гены.

В кластерах генов для κ- и λ-цепей присутствует по одному С-гену, а в кластере генов для Н-цепей - серия С-генов, определяющих основные классы Ig.

Все три кластера генов содержатся в соматических клетках и не способны обеспечить синтез Ig, прежде чем не произойдет их перестройка, которая приведет к созданию зрелых генов Ig. В норме она происходит только при созревании лимфоцитов. На рис. 11-2 представлена схема перестройки в кластере генов Ig, приводящей к созданию зрелых V-генов.

Во время перестройки для легких цепей отбирается специфическая комбинация из отдельных V- и J-сегментов, а для тяжелых цепей Ig - из V-, J- и D-сегментов кластеров. Это сопровождается делецией последовательностей ДНК, разделяющих отдельные V-, J- и D-сегменты, прежде чем они транскрибируются в мРНК. Делетирование, по крайней мере частично, обеспечивают рекомбиназы. Их кодируют гены RAG1 и RAG2. Они инициируют разрывы в двойной нити ДНК в специфических последовательностях, которые фланкируют V- и D-сегменты. После делеции остается по одному V-, J- и D-сегменту, которые соединяют лигазы. Процесс вырезания и соединения сегментов генов Ig называют соматической рекомбинацией. Последовательность событий перестройки генов Ig показана на рис. 11-3. Перестройка генов сначала идет в одной хромосоме. Если она прошла успешно, то во второй хромосоме процесс блокируется, благодаря чему достигается аллельное исключение, т.е. присутствие в одной клетке только одного типа Ig. В том случае, когда в результате перестройки образуются V-гены с неправильной рамкой считывания, перестройка генов происходит в другой хромосоме. Поскольку возможны различные комбинации отдельных V-, J- и D-сегментов, в результате перестройки возникает большое число различных зрелых V-генов и соответственно молекул антител. В процессе сборки V-, J- и D-генов возникают небольшие вариации в позициях соединяемых генов. Кроме того, возможна делеция некоторого числа нуклеотидов или, наоборот, их добавление в местах соединения сегментов. Это еще больше увеличивает разнообразие аминокислотных последовательностей антител.

После того как чужеродный антиген простимулирует В-лимфоциты, происходит их вторичная дифференциация за счет возникающих с высокой частотой соматических мутаций в генах Ig в каждом митотическом делении лимфоцитов. Это вызывает небольшие вариации в последовательности нуклеотидов ДНК, кодирующей Ig, и следовательно, в их способности связывать пептиды. Разнообразие антител, продуцируемых зрелыми В-лимфоцитами, возрастает еще больше.

Дальнейшее увеличение разнообразия происходит в результате случайного комбинирования тяжелых и легких цепей в процессе сборки Ig. Все перечисленные механизмы увеличения спектра антител суммарно обеспечивают существование 10¹⁰ -10¹⁴ разных типов антител, продуцируемых В-лимфоцитами.

Генетика рецепторов т-клеток

Если гуморальный иммунитет обеспечивают В-лимфоциты, то клеточный - Т-лимфоциты. Как и В-лимфоциты, эти клетки проходят начальные этапы дифференцировки в костном мозге. Для дальнейшей дифференцировки они должны попасть в тимус. Т-лимфоциты отличаются заметным разнообразием. Как было сказано ранее, для образования цитотоксических Т-лимфоцитов необходимо, чтобы фрагмент антигена, связанный АПК с молекулой МНС (макрофаги, В-лимфоциты, дендритные клетки), был представлен Т-лимфоцитам. Распознавание антигена обеспечивает клоноспецифический рецептор неиммуноглобулинового происхождения, который экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов. В результате распознавания чужеродного антигена последние активируются и дифференцируются в несколько типов хелперных клеток - Th1 и Th17 (продуцируют цитокины усиления иммунитета), Th2 (продуцируют цитокины воспаления), а также регуляторные клетки - Treg и эффекторные (ЕКК). Основные структуры Т-лимфоцитов, распознающие чужеродный антиген, - их рецепторы. Рецепторы Т-лимфоцитов должны связываться с разнообразными чужеродными пептидами в ассоциации с молекулами МНС. Приблизительно в 90% случаев рецепторы представлены гетеродимерами α- и β-цепей, в 10% - гетеродимерами γ- и δ-цепей. Гены, кодирующие α- и δ-цепи, локализованы на хромосоме 14, а гены β- и γ-цепей - на хромосоме 7. Образование рецепторов Т-лимфоцитов во многих отношениях сходно с таковым тяжелых и легких цепей Ig. Для каждой цепи рецепторов в зародышевых клетках существуют множественные копии V-, D- и J-генов, между которыми при созревании Т-лимфоцитов происходит соматическая рекомбинация. В результате вариации позиций, занимаемых генами, и дополнительного синтеза коротких нуклеотидных последовательностей в местах соединения сегментов также возникает изменчивость. Во время митотических делений Т-лимфоцитов гипермутабельность генов, кодирующих рецепторы, отсутствует. Вероятно, это следствие требования к Т-лимфоцитам, состоящего в том, чтобы их рецепторы не реагировали на пептиды собственного организма, представленные молекулами МНС.

С рецептором Т-лимфоцитов нековалентно связан комплекс CD3⁺ , участвующий в передаче внутрь клетки сигнала о связывании рецептора с антигеном. Кроме того, при действии антигена с рецептором устанавливает связь комплекс CD4⁺ или CD8⁺ , который обладает сродством к МНС II класса и МНС I класса соответственно. CD4⁺ -комплекс более характерен для Т-хелперов, а CD8⁺ - для Т-киллеров.

На начальных этапах иммунного ответа АПК взаимодействуют с Т-хелперами. Последние, распознав антигенсодержащий комплекс, входят в контактное взаимодействие с АПК. Это обеспечивает дополнительную стимуляцию Т-хелперов. Кроме того, АПК выделяют ряд цитокинов. Все это обусловливает активацию Т-лимфоцитов, их активную пролиферацию и созревание в эффекторные клетки. Т-киллеры для созревания должны получить стимуляцию от Т-хелперов и цитокинов. Цитотоксические лимфоциты способны распознать чужеродные или собственные измененные клетки и осуществить их иммунный цитолиз. Следует подчеркнуть, что после специфического распознавания чужеродного антигена немногочисленная группа неактивных лимфоцитов активируется, размножается и дифференцируется в эффекторные клетки, способные убивать или удалять клетки-носители антигена.

Наследственные иммунодефицитные состояния

Различают несколько типов наследственных иммунодефицитных состояний. Один из них связан с нарушением функций фагоцитоза иммунокомпетентными клетками. Пример нарушения подобного рода - хроническая гранулематозная болезнь, наследуемая по Х-сцепленному или аутосомно-рецессивному типу. При этом заболевании фагоциты захватывают микроорганизмы, но не могут их переварить, в связи с чем образуются гранулемы, а больные страдают частыми повторными инфекционными заболеваниями.

Самый известный пример наследственного нарушения функций компонентов комплемента - наследственный ангионевротический отек. Это заболевание, наследуемое по аутосомно-доминантному типу, обусловлено недостаточностью ингибитора первого компонента системы комплемента (C1-INH). Оно манифестирует повторными приступами отека кожи, дыхательных путей и кишечника и плохо поддается лечению. Ряд других примеров первичных иммунодефицитных состояний, а также иммунодефицитов, служащих частью наследственных синдромов, приведен в табл. 11-1.

Примечание. XP - Х-сцепленный; АР - аутосомно-рецессивный.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Группы крови АВ0

Компонентами иммунной системы также считают антигены, располагающиеся на поверхности эритроцитов. Они могут обусловливать иммунную реакцию при переливании крови, несовместимость матери и плода и, как следствие, развитие гемолитической анемии у ребенка.

Известно четыре основные группы крови системы АВ0: А, В, АВ и 0. Они представляют продукты трех кодоминантных аллелей одного гена - Н, А и В (I⁰ , I^A , I^B ). Продукты аллелей А и В - химические модификации антигена Н. Фенотип 0 соответствует экспрессии на поверхности эритроцитов антигена Н и отсутствию экспрессии антигенов А и В, фенотип А - экспрессии антигена А (у гетерозигот А0 экспрессируются антигены А и Н), фенотип В - экспрессии антигена В (у гетерозигот В0 экспрессируются антигены В и Н). У людей с группой крови АВ экспрессируются антигены А и В, а у людей с определенным антигеном на поверхности эритроцитов синтезируются антитела против всех остальных антигенов системы АВ0. Они, вероятно, образуются в результате представления антигенов различных микроорганизмов, идентичных антигенам А и В. У лиц с группой крови 0 эритроциты не содержат антигенов А и В, но в их крови присутствуют антитела против этих антигенов. Именно поэтому переливание им крови трех остальных групп (А, В и АВ) вызовет агглютинацию эритроцитов перелитой крови, которая может быть фатальной. Аналогичным образом пациентам с группой крови В нельзя переливать кровь А и АВ, пациентам с группой крови А - кровь В и АВ. Больным с группой крови АВ можно переливать кровь любой группы, так как у них нет антител против антигенов А и В. Таких людей считают универсальными реципиентами, в то время как людей с группой крови 0 - универсальными донорами. Обычно переливают относительно небольшое количество крови по сравнению с объемом циркулирующей крови у реципиента, поэтому реакцией антител перелитой крови с антигенами эритроцитов реципиента можно пренебречь, но если количество переливаемой крови велико, то следует прибегнуть к переливанию только одногруппной крови.

Группы крови АВ0 - типичная полиморфная генетическая система. Ее одной из первых стали использовать для изучения межиндивидуальной и популяционной генетической изменчивости у человека.

Молекулярно-генетическая основа полиморфизма групп крови АВ0. Прошло немногим более 90 лет со времени открытия К. Ландштейнером групп крови АВ0, когда появилась новая информация о молекулярно-генетической основе этой полиморфной системы (Yamamoto F. et al., 1990). Известно, что ген, кодирующий гликозилтрансферазу, определяет полиморфизм системы АВ0. Этот фермент катализирует превращение углеводов в антиген Н. Белки, кодируемые аллелями А и В, минимально отличаются друг от друга по аминокислотной последовательности, но катализируют превращения разных углеводов (N-ацетилгалактозамина или галактозы), и в результате возникают А- или В-антигены. Ген группы крови АВ0 у человека картирован в 9q34. Он содержит семь экзонов, а кодирующая последовательность составляет более 18 т.п.н. геномной ДНК. Самым большим считают седьмой экзон. Последовательность нуклеотидов в А-аллеле отличается от таковой в аллеле 0 делецией 258 гуанина. Делеция сдвигает рамку считывания, в результате чего белок, кодируемый аллелем А, значительно отличается от того, который кодирует аллель 0. Гликозилтрансферазы А и В отличаются по четырем аминокислотным остаткам, что обусловлено четырьмя однонуклеотидными заменами в кодирующей последовательности генов.

Использование метода ПЦР и электрофореза в денатурирующем градиентном геле (Johnson P.H., Hopkinson D.A., 1992) позволяет быстро и эффективно определить генотипы АА, А0, ВВ, ВО, АВ и 00 групп крови системы АВ0 посредством единственной амплификации. Метод позволяет обнаружить прежде неизвестные полиморфизмы. Yip (2002) обобщил данные по ДНК-генотипированию и ДНК-секвенированию гена АВ0 гликозилтрансферазы. К этому времени было найдено множество полиморфизмов, включая 21 SNP в интроне 6 гена. В настоящее время насчитывают почти 90 аллелей АВ0.

Система АВ0 давно является генетическим маркером для ассоциативных исследований с различными инфекционными заболеваниями (оспой, чумой, гепатитом В, геморрагической лихорадкой Денге, малярией, норо- и ротавирусными инфекциями). Недавние исследования выявили связь другой пандемии - заболеваемости новой коронавирусной инфекцией (COVID-19) с системой групп крови АВ0. Проведение в европейских пандемических центрах COVID-19 - Италии и Испании - полногеномного исследования 1980 пациентов с тяжелой новой коронавирусной инфекцией, сопровождающейся выраженной дыхательной недостаточностью, и 2205 контрольных добровольцев без признаков болезни позволило картировать локус генетической предрасположенности к заболеванию в кластере генов 9q34.2, совпадающий с локусом группы крови AB0. В этом исследовании более высокий риск был характерен для носителей группы крови A (отношение шансов 1,45; 95% доверительный интервал 1,20-1,75; P=1,48×10^-4 ), а защитный эффект - для обладателей группы крови 0 (отношение шансов 0,65; 95% доверительный интервал 0,53-0,79; P=1,06×10^-5 ) по сравнению с пациентами с другими группами крови (Ellinghaus D. et al., 2020). Как и в других подобных исследованиях, низкие уровни отношения шансов свидетельствуют о пока далекой от практики трактовке результатов, что тем не менее не умаляет интереса к таким исследованиям, и они продолжаются. И система АВ0 продолжает оставаться распространенным генетическим маркером ассоциативных исследований неинфекционных МФЗ и комплексных патологических состояний, прежде всего - сердечно-сосудистых, инфекционных и онкологических заболеваний (Franchini et al., 2015; Chen et al., 2016).

Систему резус (Rh) кодируют два тесно сцепленных и гомологичных локуса, расположенных на коротком плече хромосомы 1. Один из них называют D. Второй локус, вероятно, в результате механизма АС образует два антигена - С и Е. С практической точки зрения наибольший интерес представляет локус D, так как он ответствен за резус-несовместимость матери и плода, манифестирующую гемолитической болезнью новорожденного. У людей с генотипом DD или Dd на поверхности эритроцитов присутствует Rh-антиген (резус-положительные люди). У людей с генотипом dd на поверхности эритроцитов Rh-антигена нет, и их называют резус-отрицательными. Образование анти-Rh-антител начинается после переливания резус-положительной крови резус-отрицательным людям или у женщин во время беременности резус-положительным плодом. Это может произойти в браке резус-положительного мужчины с резус-отрицательной женщиной. Среди европейского населения такие браки составляют примерно 15%. У мужчин с генотипом DD все потомство будет резус-положительным, а при генотипе Dd резус-положительными будут в среднем половина детей. Обычно во время первой беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом осложнения у плода не возникают, так как относительно небольшое количество его клеток преодолевает плацентарный барьер, но во время родов в кровоток матери поступает большое число эритроцитов плода, несущих Rh-антиген. Они стимулируют образование анти-Rh-антител, которые сохраняются в крови матери в течение длительного времени. Во время следующей беременности резус-положительным плодом анти-Rh-антитела матери проникают в кровоток плода и разрушают его эритроциты. Вследствие этого развивается анемия плода и происходит массированный выброс в его кровь эритробластов (эритробластоз плода). Анемия плода может быть причиной спонтанного аборта или мертворождения. Если этого не происходит, то анти-Rh-антитела, сохраняясь в кровотоке новорожденного, продолжают вызывать гемолиз эритроцитов, что приводит к возникновению гипербилирубинемии и желтухи у новорожденного. Без замещающей гемотрансфузии резус-отрицательной крови новорожденный может умереть или у него развиваются такие серьезные осложнения, как детский церебральный паралич, умственная отсталость и тугоухость. Средство профилактики резус-несовместимости матери и плода - введение резус-отрицательной матери во время и после беременности Rh-Ig, содержащего анти-Rh-антитела. Они разрушают эритроциты плода до того, как стимулируют продукцию собственных материнских антител. Такую профилактическую процедуру повторяют во время каждой беременности.

Молекулярная организация гаплотипов эритроцитарной системы RH. Наиболее распространенные резус-антигены (D, C, c, E, e) составляют семейство не гликозилированных, а пальмитированных трансмембранных белков, определяемых как Rh-полипептиды. Последние формируют восемь генных комплексов, или RH-гаплотипов (Huang C.-H. et al., 1996). С молекулярных позиций доказано существование на коротком плече хромосомы 1 в районе р34-36 двух гомологичных генов D и СЕ у резус-положительных и только одного гена СЕ у резус-отрицательных людей (Colin Y. et al., 1991). Таким образом, анализ тонкой генетической структуры системы резус свидетельствует о двухгенной модели локуса RH. Механизмом кодирования одним геном двух полипептидов С/с и Е/е, вероятно, служит АС. Полипептид D отличается от полипептидов С/с и Е/е по 36 аминокислотным остаткам. NH₂ - и COOH-концы всех полипептидов практически одинаковы. Гены, вероятно, возникли в результате дупликации гена-родоначальника. Белки Rh0 и не-D обнаруживают гомологию на 92%. Гены RHD и RHCE расположены тандемно. За С/с-специфичность в гене RHСЕ отвечает полиморфизм Ser103Pro, а за Е/е-специфичность - Pro226Ala.

Популяционные исследования показали, что среди населения европейского происхождения делецию всего гена RHD обнаруживают с частотой около 40%. Несколько исследований показали, что RHD-положительные и RHD-отрицательные индивиды отличаются по чувствительности к неблагоприятным последствиям курения, паразитарных инфекций, старения (Novotna et al., 2008; Flegr J. et al., 2012). Сопоставление частот гомо- и гетерозиготности по RHD и заболеваемости в 65 странах позволило выявить, что повышенным частотам Rh-отрицательных индивидов (гомозиготам) в популяциях соответствуют увеличенная, а повышенным частотам гетерозигот - сниженная смертность от сердечно-сосудистых заболеваний, что свидетельствует в пользу гипотезы о селективных преимуществах гетерозигот, что поддерживает полиморфизм в популяции; обращается внимание на то, что увеличение частоты гомозигот по RHD в популяции сопровождалось соответствующим увеличением гетерозигот (Flegr J., 2016).

Система группы крови MNSs

Система MN была открыта Ландштейнером и Левиным в 1927 г. при изучении антител, образовавшихся в результате иммунизации кролика. В дальнейшем было показано, что антиген N - вещество-предшественник, а так называемый ген N - аморфный фактор, который контролирует постоянство антигена N. В то же время ген М в гетерозиготе превращает часть антигена N в М. В 1947 г. были обнаружены серологические факторы S и s. Оказалось, что генетические факторы M и N, а также S и s тесно сцеплены между собой. Исследованиями было установлено, что серию фенотипов локуса MNSs определяют четыре кодоминантных генных комплекса: MS, Ms, NS и Ns. Дальнейшее подробное изучение генетической структуры системы MNSs позволило установить существование более редких многочисленных разновидностей в пределах каждого из четырех антигенов. Следующий аллель, определяющий отсутствие обоих факторов, S и s, получил наименование S^u , он распространен среди африканского населения. Локусы групп крови системы MNSs картируются на хромосоме 4 в районе q28-31. В настоящее время идентифицировано 46 антигенов системы групп крови MNS. Они кодируются гомологичными генами GYPA и GYPB, расположенными на хромосоме 4. В системе MNS есть третий гомологичный ген, GYPE, но его белковый продукт неизвестен (Quraishy N., Sapatnekar S., 2019). Продуктами системы групп крови MNSs являются α- и δ-гликофорины (А и В) эритроцитарных мембран человека. Гликофориновые полипептиды - продукты аллелей MN и Ss - αМ- и αN-гликофорины, они отличаются заменами аминокислотных последовательностей. Полиморфизмами GYPA, которые определяют экспрессию M/N, являются 59C/T, 71G/A и 72T/G, которые вместе кодируют две замены аминокислот. Полиморфизм GYPB, который определяет экспрессию S/s, - это 143T/C, который кодирует замену аминокислоты (Quraishy N., Sapatnekar S., 2019).

Данные о возможных ассоциациях групп крови MNS с рядом злокачественных новообразований, шизофренией, болезнями сердечно-сосудистой системы и псориазом немногочисленны.

Группы крови Келл-Челлано

Интенсивные поиски необычных антител в сыворотке крови (особенно у матерей и их новорожденных с гемолитической анемией) привели к обнаружению в 1946 г. антигена К, а позднее - фактора k системы Келл-Челлано (Kell-Cellano -Kk). Белок группы крови Kell представлен неприлизином М13 из семейства цинковых эндопептидаз. Открытие дополнительных антигенов, входящих в систему Келл [Kp(a), Kp(b), Js(a), Js(b), K8-K22, Kp(c)], свидетельствует о ее высокой степени полиморфизма. Локус групп крови Келл картирован в области q33 на хромосоме 7 (Zelinski T. et al., 1991). Имеется 11 аллелей, все редкие, кроме K(K1) и k(K2). Другие аллельные антигены в системе Kell включают Kp^A a, Kp^A b, Js^A a, Js^A b и Ko (гомозиготы по Ко не экспрессируют антигены Kell) (Kanchan Т., Krishan К., 2016).

Kell-антигены обладают высокой антигенностью и иногда служат причиной развития посттрансфузионных и акушерских осложнений. Антитела анти-K приводят к тяжелой неонатальной анемии, но титры материнских антител и уровни амни-отического билирубина не являются хорошими маркерами тяжести заболевания (van der Schoot C.E. et al., 2014).

Группы крови Даффи

Группы крови системы Даффи (Duffy - Fy) Fy(a) и Fy(b) были открыты в 1950-1951 гг. С помощью соответствующих антител удалось идентифицировать фенотипы Fy(a+), Fy(a-), Fy(b+) и Fy(b-). Как и в случае изучения других серологических систем, локус Даффи оказался более сложным по своей генетической структуре, чем предполагали первоначально. Позднее был обнаружен фактор Fy(x). Используя все имеющиеся антисыворотки для обнаружения факторов Даффи, можно обнаружить следующие четыре фенотипа этой системы: Fy(a+b-), Fy(a-b+), Fy(a+b+) и F(a-b-).

Ген ACKR1, кодирующий группу крови Даффи, расположен на хромосоме 1 в локусе 1q23.2. Эта группа крови оказалась весьма интересной для этнической антропологии и экологической генетики. Так, частота обнаружения аллеля Fy*A (FY*01) в европейских популяциях колеблется в пределах 60-70%. Среди коренного населения Восточной Азии, Австралии и американских индейцев его частота достигает своей фиксации, составляя 100%. Другой полюс образуют коренные жители Африки к югу от Сахары, среди которых частота обнаружения аллеля Fy*A составляет лишь 10-26%. Известно, что фенотип Fy(a-b-) регистрируют крайне редко, за исключением негроидной популяции. Напротив, в определенных популяциях Африки частота этого фенотипа достигает 90-99% (Mourant et al., 1976). На основании ряда исследований было установлено (Miller L.H. et al., 1975), что даффи-негативные эритроциты с фенотипом Fy(a-b-) оказываются резистентными к инвазии Plasmodium knowlesi (in vitro) и Plasmodium vivax (in vivo). Для внедрения малярийных плазмодиев в эритроциты человека необходимо присутствие на эритроцитарных мембранах антигенных рецепторов Fy(a) и Fy(b) (Zimmerman P.A. et al., 2013). Ферментная обработка трипсином или нейраминидазой эритроцитов крови пациентов с фенотипом Fy(a-b-), резистентных к внедрению малярийных плазмодиев, снижает их сопротивляемость паразитарной инвазии (Mason S.J. et al., 1977). Естественный отбор, связанный с давлением малярии Malaria tertiana, несомненно, способствовал широкому распространению этого фенотипа системы Даффи в большинстве африканских популяций.

Молекулярный полиморфизм групп крови системы Даффи определяет различие между двумя кодоминантными аллелями FY*A и FY*B, которое обусловлено заменой единственного нуклеотида в положении 131: гуанин представлен в случае FY*A, тогда как при FY*B в этом положении находится аденин, что приводит к замене глицина на аспарагиновую кислоту.

Антиген Даффи находят не только на эритроцитах. Его обнаружили на клетках эпителия в почках, сердце, легких, поджелудочной железе, эндотелиальных клетках капилляров и посткапиллярных венул. Показано, что он с высокой аффинностью связывает хемокины CXC и CC (IL-8, GRO-alpha/CXCL1) и определяет возможность нейтрофилов трансмигрировать через эндотелий, способствуя тем самым воспалению (Lee J.S. et al., 2003; Pruenster M.et al., 2009). Возможное значение генетического полиморфизма FY для заболеваний, патогенетически связанных с воспалением (а это практически все социально значимые заболевания и многие другие), еще только предстоит определить.

Группы крови системы Диего

Группа крови системы Диего (Diego - Di). Новый антиген Di(a) идентифицирован в 1953 г. в одной из семей в Венесуэле по антителам, которые вызвали гемолитическую болезнь у новорожденного. Он оказался характерным для американских индейцев. Di(a) обнаружили более чем у половины представителей изолированных племен Южной Америки. В последующих популяционных работах показано, что фактор Диего также определяют у японцев, китайцев и коренных народностей Сибири. Три года спустя система Диего перестала быть системой одного фактора Di*a с двумя фенотипами Di(a+) и Di(a-). В результате обнаружения антител противоположной генетической направленности она стала истинной двухаллельной генетической системой. Вновь обнаруженные антитела получили наименование анти-Di(b). В результате существуют три разных фенотипа этой системы: Di(a+b-), Di(a-b+) и Di(a+b+). Антигены группы крови Диего определяются геном SLC4A1, картированным в локусе 17q21-q22. Ген контролирует синтез белка, ответственного за обмен молекул углекислого газа в эритроцитах и анионов в тубулярных клетках почек. SNP SLC4A1 являются результатом генных мутаций (миссенс-, нонсенс-мутации и со сдвигом рамки считывания), определяют развитие тубулярного ацидоза почек или сфероцитоза эритроцитов (Figueroa D., 2013). Как правило, эти два заболевания взаимоисключающие вследствие разных мутаций. Однако две мутации в гетерозиготном состоянии - E522K и G701D - приводят к полному дистантному тубулярному ацидозу и тяжелой наследственной форме сфероцитоза, ассоциирующимся с локализацией димерных молекул E522K/G701D в цитоплазме, а не в плазматической мембране (Chang Y.-H. et al., 2009).

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

Комплемент - обобщенное обозначение комплексной системы белков сыворотки крови, обладающих единой биологической функцией. Белки сыворотки крови играют защитную роль при воспалительных процессах, других патологических состояниях и проникновении в организм возбудителей инфекционных болезней посредством особого взаимодействия с чужеродными антигенами. Каскадный механизм их активации запускается при взаимодействии антигена с антителом.

В соответствии с механизмами активации комплемента сыворотки крови различают:

Количественная недостаточность многих компонентов комплемента играет существенную роль в клинической медицине. Молекулярное разнообразие компонентов комплемента, а также иммунодефицитные состояния находятся под генетическим контролем.

С точки зрения популяционной и экологической генетики наиболее значимо рассмотрение генетических полиморфизмов двух компонентов комплемента - C3 и пропердина (BF).

Система третьего компонента комплемента (С3), или посттрансферрина (Pt). Третий компонент комплемента (С3) имеет особое значение, поскольку он занимает главенствующее функциональное положение во всем каскаде компонентов. Этот многофункциональный белок возник свыше 700 млн лет назад. C3 - наиболее изученный компонент комплемента, и в нем первым был обнаружен генетически обусловленный полиморфизм.

Белок C3 обладает молекулярной массой 180 кДа и имеет наибольшую из всех других компонентов комплемента концентрацию в сыворотке крови, которая в среднем составляет 1200 мг/л. Именно поэтому полиморфизм белка C3 легко идентифицировать на электрофореграммах при обычном окрашивании на белок (например, с помощью окрашивания «Кумасси»). Все остальные компоненты комплемента идентифицируют с применением дорогостоящих специфических иммунных антисывороток методом иммуноэлектрофореза с последующей иммунофиксацией или иммуноблоттингом.

Таким образом, с помощью методов электрофоретического анализа исследователи впервые показали существование генетически обусловленного полиморфизма в области β₁ -глобулинов, не связанного со всеми ранее известными сывороточными системами. Гезерик, Бундшу и Розе (1968), изучая типы трансферрина среди жителей Берлина, обратили внимание на зоны, характеризующиеся подвижностью, промежуточные между трансферрином и гаптоглобином типа НР 1-1. Поскольку эти фракции располагались непосредственно после области TF, они получили название посттрансферринов (Pt). В результате было обнаружено пять типов этого белка (А, АВ, В, ВС, АС), обусловленных тремя аутосомными кодоминантными аллелями (Pt*A, Pt*B и Pt*C).

Сходство систем Pt и СЗ находит свое отражение не только в электрофоретической локализации их фракций, но и в аналогии значений частот основных аллелей и фенотипов в популяциях, что свидетельствует об их идентичности. В ходе исследований, проведенных среди различных групп населения, было обнаружено большое число редких аллелей Pt (C3), помимо трех основных.

Популяционные данные свидетельствуют о том, что наиболее распространенный аллель этой системы - Pt*B (C3*S). Частота его обнаружения колеблется среди различных групп населения Земли в пределах 0,75-0,99. Аллель Pt*A (C3*F) также довольно часто обнаруживают в европейских популяциях (частота варьирует от 0,02 до 0,25). Частота фактора Pt*C (комплекс С3*F0.8, С3*F0.5 и C3*F0.6) редко достигает полиморфных величин.

Молекулярная характеристика полиморфизма третьего компонента системы комплемента (С3). Интерес к изучению наследственной изменчивости С3 постоянно возрастает в связи с медико-генетической значимостью этого фактора. Ген третьего компонента комплемента картирован в локусе 19р13.3-13.2 и состоит из 41 экзона. Экзоны 1-16 кодируют β-цепь, а экзоны 16-41 - α-цепь. Аллель С3F возник в результате точковой мутации в кодоне 1216, превращающей дезокси-аденозин в дезоксигуанозин. Результат этой точковой мутации на трансляционном уровне приводит к замене аспарагинового остатка в C3S на остаток аспарагиновой кислоты в C3F. Недавно обнаружен еще один полиморфизм, тесно сцепленный с вышеуказанным, определенный с помощью моноклональных антител HAV 4-1 и также обусловленный заменой одного основания. Наследственно обусловленная недостаточность С3-компонента комплемента ассоциирована с рядом патологических состояний. Однонуклеотидный генетический полиморфизм С3 ассоциируется с шизофренией (Zhang et al., 2018), повышенным риском дегенерации сетчатки в пожилом возрасте, приживляемостью трансплантата легких (Kardol-Hoefnagel et al., 2019), одной из форм липодистрофии, прогрессированием нефропатии, связанной с IgA (Ibrahim et al., 2020). Генетический вариант C3 (rs2230199) непосредственно определяет снижение продукции или активности компонента С3 комплемента, а в комбинации с полиморфизмами других компонентов комплемента - факторов B (rs641153) и H (rs800292), образующих своеобразный комплотип, это снижение 6-кратно (Harris et al., 2012).

Система пропердина (BF). Фактор В пропердиновой системы (BF) - важный компонент альтернативного механизма активации системы комплемента. Этот белок имеет относительную молекулярную массу 93 кДа, а его концентрация в сыворотке крови в среднем составляет 200 мг/л. Генетический полиморфизм фактора ВF впервые был идентифицирован C.A. Alper и соавт. в 1972 г. При электрофоретическом разделении определяют три фенотипа BF: FF, SS и FS. При использовании метода изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле продукт аллеля BF*F разделяют на два компонента - FA и FB. Таким образом, полиморфизм генетически обусловленной системы BF расширяется до шести основных фенотипов, а также относительно редких определяемых аллелей BF*FA, BF*FB, BF*S, BF*F1, BF*S07, BF*S03 и BF*Svar. Следует подчеркнуть, что гемолитическая активность белков, определяемых аллелем BF*F, оказывается несколько большей по сравнению с продуктами экспрессии аллеля BF*S (Прокоп О., Геллер В., 1991). Отсюда следует некоторая функциональная неравнозначность генетических разновидностей пропердиновой системы.

Генный локус системы BF расположен на коротком плече хромосомы 6 (Rittner Ch., 1976). Близкое сцепление локусов BF и HLA, вероятно, определяет корреляцию полиморфизма пропердина с такими заболеваниями, как сахарный диабет 1-го типа, идиопатическая мембранная нефропатия, псориаз и гломерулонефрит (Прокоп О., Геллер В., 1991).

Дискретные генетические разновидности, присущие другим компонентам комплемента, обнаруживают редко, однако и они могут иметь значение в популяционных исследованиях при изучении рисков развития заболеваний.

Генетический полиморфизм субкомпонента C1R первого компонента комплемента (C1R). Генетический полиморфизм C1R субкомпонента первого компонента комплемента впервые был описан M.I. Kamboh и R.E. Ferrel (1986) при использовании метода изоэлектрофокусирования с последующим иммуноблоттингом. Первоначально в структурном локусе C1R было идентифицировано два аутосомных аллеля: C1R*1 и C1R*2. При направленной обработке образцов сыворотки крови нейраминидазой было установлено существование дополнительных аллелей C1R*3, C1R*4, C1R*5, C1R*6 и C1R*7. Дальнейшее изучение генетической вариабельности этой системы в азиатских популяциях позволило обнаружить четыре новых аллеля C1R*8-C1R*11 в популяциях японцев (Kido A. et al., 1991). Этническая и антропологическая специфичность распределения факторов C1R свидетельствует о том, что указанная генетическая система представляет исключительный интерес в антропологическом и популяционно-генетическом отношении.

Антигены тромбоцитов

Собственные антигены тромбоцитов (у них также обнаруживают антигены групп крови АВ0 и антигены класса I системы HLA) достаточно многочисленны. В настоящее время определено 24 тромбоцитоспецифических антигена, из них 12 антигенов группируются в шесть биаллельных систем (НРА-1, -2, -3, -4, -5 и -15). Для оставшихся 12 антигенов второй аллель пока не установлен. Наиболее значимы антигены НРА-1а и НРА-1b, которые связаны с гликопротеином GP IIIa (второе название - интегрин β3; ген картирован в 17q21.32). Этот гликопротеин - β-субъединица рецепторного комплекса GP IIb/IIIa, расположенного на мембране тромбоцитов. α-Субъединицу комплекса кодирует ген ITGA2B, также картированный в 17q21.32. Недостаточность антигена HPA-1 и соответственно гликопро-теинов GP IIIa и GP IIb - причина возникновения тромбастении Глянцманна, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу, и неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, возникающей вследствие несовместимости матери и плода по тромбоцитарным антигенам. Антитела против тромбоспецифических антигенов могут служить причиной резкого сокращения времени жизни тромбоцитов перелитой донорской крови при несовместимости ее с кровью реципиента. Они также могут являться причиной возникновения аллоиммунной неонатальной пурпуры вследствие трансплантационного перехода антител из сыворотки крови матери в кровь плода.

Цитокины (белки, полипептиды или гликопротеиды) - биологически активные молекулы, растворимые медиаторы, способные влиять на процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и контролировать функциональную активность клеток врожденного и приобретенного иммунитета. Цитокины играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа и участвуют практически во всех этапах аллергического воспаления, ответов на инфекцию, аутоиммунных реакций, отторжения трансплантированной ткани. Благодаря уникальной способности клеток иммунной системы к миграции, определяющей их способность проникать и накапливаться в самых разнообразных компартментах организма, возможно локальное создание высоких концентраций цитокинов, воздействующих на микроокружение (паракринный эффект). Способность клеток окружающих тканей реагировать на цитокины лежит в основе многих патологических процессов воспалительной природы, порой приобретающих ключевое значение для существования организма, как например, при жизнеугрожающих критических состояниях, таких как сепсис, септический шок, острый респираторный дистресс-синдром, тяжелые формы пневмонии. Способность цитокинов к аутокринной регуляции (рецепция собственных цитокинов) еще более усиливает их роль как регуляторов нормальных и патологических процессов в норме и при развивающихся патологических состояниях, включая многие заболевания, этиология или патогенез которых связаны с острым или хроническим воспалением, включая онкологические болезни. Некоторые формы иммунологической недостаточности могут быть напрямую связаны с особенностями продукции цитокинов или их рецепторов; на разных этапах развития онкологических заболеваний цитокины прямо или опосредованно, через клетки иммунной системы, могут вмешиваться в процессы роста опухоли. Поэтому столь значимы исследования генетических основ функционирования цитокино-вых сетей, включающих собственно цитокины, хемокины и их рецепторы.

Изменчивость генетических областей, кодирующих и регулирующих продукцию цитокинов и их рецепторов, лежит в основе генетического полиморфизма системы цитокинов. Эта система достаточно велика; роль этой системы в патологии человека до сих недостаточно систематически обобщена вследствие многоуровневой сложности, в том числе - благодаря гетерогенности экспрессии генов цитокинов и их рецепторов в разных клетках организма, которая не ограничивается только клетками врожденного (макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, клетки-киллеры) или приобретенного (Т-клетки, В-клетки) иммунитета.

Полиморфизм генов цитокинового комплекса IL-1.

Противовоспалительный цитокин - IL-1 - принимает участие в активации цитотоксических T- и B-клеток и макрофагов. Семейство IL-1 состоит из двух форм (IL-1α и IL-1β), играющих основную роль в запуске любой иммунной реакции, а также антивоспалительного агента, антагониста рецептора IL-1 - 1RA, блокирующего иммунные реакции. IL-RA конкурирует с IL-1α и IL-1β в связывании с рецептором IL-1 и служит ингибитором активности IL-1.

Молекулы гликопротеидов IL-1α, IL-1β и IL-1RA кодируют гены, локализованные в форме кластеров на хромосоме 2 (2q13-14). Описано три полиморфизма для гена IL-1A, пять полиморфизмов для гена IL-1B и восемь - для гена IL-1RA. Идентифицировано множество ассоциаций полиморфизмов генов комплекса IL-1 с различными аутоиммунными, хроническими воспалительными, нейродегенеративными, сердечно-сосудистыми и опухолевыми заболеваниями.

Гены IL-4 и α-цепи рецептора IL-4 (IL4Ra). IL-4 играет ключевую роль в развитии аллергического воспаления. Основные продуценты IL-4 - Тh2-лимфоциты, а также тучные клетки и B-клеточные линии. IL-4 - основной фактор, обусловливающий дифференцировку CD4⁺ -лимфоцитов в направлении Th2, пролиферацию и дифференцировку B-лимфоцитов, а также секрецию CD23⁺ - низкоаффинного рецептора для IgE, потенцирующего его выработку. Эти эффекты, а также способность IL-4 поддерживать пролиферацию серозных тучных клеток имеют прямое отношение к развитию аллергических реакций.

Ген IL-4 локализован в области 5q31. Он состоит из четырех экзонов и трех интронов общей протяженностью 10 т.п.н. Полный сиквенс гена IL-4, включая интроны и фланкирующие области, обнаружил 16 полиморфных вариантов.

IL-4 оказывает действие на клетки-мишени посредством связывания со специфическими рецепторами, расположенными на их поверхности. Рецептор IL-4 представлен трансмембранным комплексом, состоящим из высокоаффинной связывающей α- (IL4Ra) и γ-цепи, общей для рецепторов нескольких IL. Наиболее функционально значимой считают α-цепь. Кодирующий ее ген IL4Ra картирован на коротком плече хромосомы 16 в области 16p12.1 и состоит из 12 экзонов, содержащих 51 т.п.н. геномной ДНК.

Ген IL-13. IL-13 синтезируют активированные Т-лимфоциты типа Th2. Он влияет на функции моноцитов и B-лимфоцитов, усиливая экспрессию некоторых мембранных молекул и повышая антигенпрезентирующую активность клеток. IL-13 - фактор роста В-лимфоцитов. Он гомологичен IL-4 и сходен с ним по некоторым функциональным эффектам, хотя во многом отличается от последнего и может действовать независимо от других Тh2-цитокинов при развитии многих аллергических реакций.

Ген IL-13 локализован в области 5q31.1, состоит из четырех экзонов и имеет протяженность 2938 т.п.н.

Ген IL-18. IL-18 (IFN-индуцирующий фактор) - провоспалительный цито-кин, тесно связанный и имеющий схожее строение и свойства с семейством IL-1. IL-18 - важный фактор Тh1-иммунного ответа, что связано с его способностью индуцировать продукцию интерферона (IFN). Он также может индуцировать Th-цитокины IL-13, IL-10 и IL-4 и способствовать развитию воспаления.

Ген IL-18 картирован на длинном плече хромосомы 11 в области 11q22.2-22.3 и состоит из шести экзонов и пяти интронов общей протяженностью 19,5 т.п.н. Его активность регулируют два альтернативных промотора, расположенные соответственно перед первым и вторым экзоном.

Ген интерферона -γ (IFNG). Важнейшая функция интерферона-γ - участие в опосредовании взаимосвязей лимфоцитов с макрофагами, а также в регуляции соотношения клеточной и гуморальной составляющих иммунного ответа. Будучи основным продуктом Тh1-лимфоцитов, IFNG снижает секреторную активность Тh2-лимфоцитов и супрессирует синтез IgE. Ген IFNG локализован на длинном плече хромосомы 12 в области 12q24.1, состоит из четырех экзонов, включает почти 5 т.п.н. геномной ДНК и содержит неспецифический энхансерный элемент в первом интроне. Показана положительная корреляция степени продукции интерферона-γ с существованием аллеля IFNG*2, отличающегося VNTR-полиморфизмом первого интрона этого гена.

Гены хемокинов. Хемотоксичные цитокины (хемокины) принадлежат к семейству небольших сигнальных белков, влияющих на накопление воспалительных клеток в слизистых оболочках при различных заболеваниях. CC-хемокины - RANTES (regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted) - и семейство эотаксинов влияют на активность эозинофилов, служащих основными факторами тканевого повреждения при аллергических заболеваниях.

Гены семейства эотаксинов (эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3). Эотаксины - активные эозинофильные хемоаттрактанты, влияющие на мобилизацию эозинофилов и Тh2-лимфоцитов в процессе аллергического воспаления. TNFα и IL-4 стимулируют транскрипцию эотаксинов в легочных фибробластах и эпителиальных клетках дыхательных путей.

Ген эотаксина (CCL11) локализован на хромосоме 17 в области q21, охватывает около 3 т.п.н. геномной ДНК и состоит из трех экзонов. Его гомологи - ген эотак-син-2 (CCL24) и эотаксин-3 (CCL26), имеющие по три экзона каждый, картированы на хромосоме 7 в области q11.23 и q11.2 соответственно. Эотаксин и эотаксин-2 обладают подобными свойствами, тогда как эотаксин-3 демонстрирует гораздо меньшую активность. Показана ассоциация полиморфных локусов эотаксинов с развитием атопических реакций и концентрацией IgE.

TNF представлен двумя клеточными медиаторами - катехином (TNFα), продуцируемым макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами, и лимфотоксином (TNFβ), продуцируемым лимфоцитами. Лимфотоксин и катехин имеют близкое сходство по структуре и биологической активности. Эти провоспалительные цитокины играют важную роль в регуляции дифференцировки, роста и метаболизма различных клеток, а также выступают в роли медиаторов патологических иммуновоспалительных процессов при разных заболеваниях человека. Биологическую активность TNFα опосредует связывание со специфическими мембранными рецепторами (TNF-R) двух типов (I и II). Связывание TNFα с соответствующими рецепторами приводит к активации факторов транскрипции, которые, в свою очередь, регулируют активность нескольких генов, кодирующих синтез провоспалительных цитокинов и других медиаторов воспаления. Кластер генов TNF располагается на хромосоме 6 (6p23-q12) между районами генов HLA класса I и III. Такая локализация обусловила связь генов TNF с этиологией и/или патогенезом заболеваний, ассоциированных с генами HLA, особенно тех, развитие которых связано с процессами воспаления - инфекционной или аутоиммунной природы. Многочисленные данные об ассоциации генетического полиморфизма TNF с МФЗ, патогенетически связанными с нарушениями функционирования иммунной системы, указывают на перспективность дальнейших пилотных и валидирующих исследований в этой области. Немногие из таких данных приведены в качестве примера ниже.

Недавно проведенный метаанализ (пять исследований, 474 пациентов и 805 контрольных доноров в исследованиях) выявил, что мутация гуанина в аденин в сайте -238TNF G/A (rs361525) ассоциирована с большей предрасположенностью к заболеваемости вирусом гриппа A (H1N1) (аллельная модель, OR=2.; 1,10, 5,52) (Li Y., 2020). Для SNP rs1800750 характерна доминантная модель чувствительности, определяемая наличием аденина: AA + GA vs. GG (OR=2,42; 1,24, 4,71). Интересно, что ассоциация с аллелем А в сайте 238 TNF G/A (rs361525) была характерна только для европейской популяции, но не для мексиканской (Li Y., 2020). В других исследованиях были установлены ассоциации генетических вариантов TNF и таких заболеваний, как первичный нефротический синдром, хронический гепатит, инфаркт миокарда, инсульт, рассеянный склероз; таких состояний, как желудочно-кишечное кровотечение, тяжелая пневмония, связанная с искусственной вентиляцией легких, периодонтит. Ряд исследований, посвященных изучению ассоциаций течения аутоиммунного заболевания - ревматоидного артрита с генетически полиморфными вариантами TNF, обосновал возможность фармакогенетического подхода к лечению иммуномодулирующими препаратами, основанному на ингибиции провоспалительных нежелательных эффектов молекул TNF, избыточная продукция которых вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых и ревматоидных заболеваний, при которых ключевым патогенетическим звеном является воспаление. Продукция TNF относится к самым первым и мощным провоспалительным сигналам, вызываемым инфекционными и неинфекционными стимулами при повреждении тканей (собственные лиганды TLR, такие как ядерные белки, и прежде всего - HMGB1, мтДНК и т.д.). С другой стороны, именно TNF инициирует каскад продукции воспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-18, хемокинов), вызывающих активацию провоспалительных ТФ, в особенности - NFkB, усиливающего экспрессию множества генов воспалительных реакций. Запускаемая таким образом амплифицируемая воспалительная реакция в тканях может выходить из-под контроля сдерживающих воспаление цитокинов, таких как IL-10, и тогда необходимо фармакологически прерывать такие процессы. Оказалось, что снижение биологических эффектов TNF путем блокировки самих молекул или рецепторов TNF оказалось перспективной терапевтической стратегией при ревматоидных аутоиммунных заболеваниях. Однако высокая вариабельность терапевтических ответов при использовании имеющихся сегодня в арсенале лечения ингибиторов TNF - моноклональных анти-ТNF-антител (инфликсимаб, адалимумаб, голимумаб) и фьюжн (fusion-белков, ингибирующих рецептор TNF (этанерцепт, сертолизумаб^ρ ), ограничила клиническую эффективность стратегии. Поиски повышения эффективности лечения ингибиторами привели к трансферу исследований генетического полиморфизма TNF на это клиническое «поле» (Morales-Lara et al., 2012; Murdaca et al., 2014; Swierkot et al., 2015). Промоторный полиморфизм, ассоциированный с количественным показателем продукции самого цитокина, наиболее часто использовали в клинических исследованиях этого направления. Оказалось, что пациенты с генотипом TNFα-308 G/G лучше отвечали на лечение анти-TNFα, чем пациенты генотипов A/A или A/G. Метаанализы показали, что наличие G в этом сайте (-308G/A rs 1800629) связано с успешностью лечения этанерцептом (Jancic et al., 2015). В этом исследовании была еще одна находка: пациенты с двойным вариантом - IL-6-174GG/TNFα-308GG (rs1800795 и rs1800629 соответственно) оказались наиболее чувствительными к лечению. Для пациентов именно этих генотипов была характерна наиболее низкая продукция и TNF, и IL-6 по сравнению с соответствующими альтернативными генотипами. При изучении блокаторов рецепторов показано, что пациенты генотипа TNFR1 36 A/A лучше отвечали на лечение.

Такие же подходы - с учетом генетического полиморфизма и конкретного генотипа - были успешно применены при лечении лейкоза препаратами анти-CD20. Арсенал препаратов для лечения ревматоидного артрита пополнился ингибиторами IL-6 и его рецептора (этанерцепт и тоцилизумаб соответственно) и IL-1 (ритуксимаб), которые также стали применять в фармакогенетических клинических испытаниях. Обнаружили, что rs12083537 A/A ассоциировался с лучшим клиническим эффектом при применении тоцилизумаба (анти-IL-6R), а при использовании этанерцепта (анти-IL-6) наилучший терапевтический эффект наблюдали у пациентов IL-6-174 G/G по сравнению с пациентами - носителями аллеля С. Недавние исследования выявили ассоциацию генотипов FCGR2A 9541ТТ и FCGR3A 10,872 G с лучшими клиническими эффектами при лечении ревматоидного артрита ритуксимабом, а пациентов с редкими гаплотипами IL-1α (+4845) - IL-1β (+3954) - анакинрой (оба препарата анти-IL-1) (Pallio et al., 2020).

Недавняя попытка связать генетическую вариабельность с заболеванием посредством анализа экспрессии локусов количественных признаков (eQTL) оказалась особенно удачной: авторы проделали уникальный биоинформатический анализ доступных баз данных с результатами полногеномных исследований (GWAS) и имеющихся данных eQTL по локусам 314 цитокинов человека и их рецепторов (Salnikova L.E. et al., 2020). Анализ включал данные по генам 170 цитокинов, 46 генам хемокинов, 65 генам рецепторов цитокинов, 24 генам рецепторов хемокинов и некоторым другим генам. Экспрессия 27 генов не ассоциировалась с каким-либо полиморфизмом. Наибольшее количество генетически полиморфных вариантов было обнаружено у пяти генов: C1QTNF4, GHR, IL20RB, IL34 и CCR1 (Salnikova L.E. et al., 2020). Важным методическим выводом было также то, что наиболее значимые ассоциации генетического полиморфизма и генной экспрессии были получены при исследовании транскриптома в тканях, патогенетически значимых для развития заболевания, но не в цельной крови или ее производных. Это свидетельствует об определенных ограничениях в исследованиях, связанных с коррелятивными исследованиями генной экспрессии и генетического полиморфизма, при которых наиболее доступным и распространенным является использование для анализа транскриптома гранулоцитов или мононуклеаров крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой главе представлена лишь часть проблем, связанных с иммуногенети-кой, но и из представленных материалов следует, что иммуногенетика - один из полноценных разделов генетики человека. С другой стороны, иммуногенетика рассматривается и в качестве ключевой составной части иммунологии, предметом которой является анализ механизмов защиты организма от неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды (инфекционных агентов, мутировавших клеток, аутоантигенов и аллергенов и др.). Настоящее время характеризуется экспоненциальным ростом числа разработок в области иммуногенетики. Сейчас картирована и определена молекулярная организация генов главного комплекса гистосовместимости, различных Ig, компонентов комплемента, интерферонов, IL и TNF, имеющих непосредственное отношение к иммунитету. Все эти системы характеризуются выраженной изменчивостью, что находит отражение в генетическом полиморфизме. Последний, во-первых, определяет доминирование или дефект какого-либо компонента иммунной системы, а во-вторых, позволяет вести исследования по пути разработки кандидатных генетических БМ риска различных заболеваний, патологических состояний, развития осложнений, прогноза исходов. Возникновение и эпидемическое распространение таких относительно новых инфекционных болезней, как ретровирусные заболевания (ВИЧ), прионные инфекции (губчатый энцефалит), новая коронавирусная инфекция (COVID-19), ассоциированы с уникальным разнообразием полиморфных генов. Задача дальнейших исследований - установление надежных, высокоинформативных связей между полиморфными структурами иммуногенетических систем человека и молекулярными механизмами патологии человека, продуктами генов микробиоты нашего организма.

Список литературы

В главе «Иммуногенетика» были обсуждены основные механизмы генетической регуляции иммунного ответа. В настоящей главе мы рассмотрим ключевую систему генов, вовлеченных в эффективное развитие защитной реакции. Действительно, генетические законы наследования, сформулированные еще в XIX в. Грегором Менделем и Теодором Бовери, оказались в равной степени применимы и к простым «менделирующим» признакам, и к таким сложным, многокомпонентным физиологическим системам организма, как иммунитет.

Основы «генетического направления» в иммунологии были заложены еще в 1915 г., когда профессором Тиззером (Tyzzer E.E.), проводившим эксперименты с инбредными линиями японских танцующих мышей (Mus bactrianus), была высказана мысль о решающей роли наследуемых факторов в формировании предрасположенности к определенным типам опухолей. Аналогичные идеи получили развитие в ряде работ по исследованию иммуногенетической предрасположенности животных и человека к инфекционным заболеваниям. Так, Хейдельбергер и Эйвери в 1923 г. показали, что специфичность, а также вирулентность различных типов пневмококков определяются по крайней мере двумя полисахаридами, входящими в состав их оболочки. Таким образом, авторы исследования впервые постулировали связь между химической структурой антигенов и особенностями иммунного ответа. Далее в разделе, посвященном процессингу и презентации антигенов, мы увидим, насколько точным было это предположение.

Позже Питером Горером была опубликована работа по результатам экспериментов с перевиваемыми опухолями, проведенных на мышах. В ходе исследования он выделил три антигена, каждый из которых был специфичен определенной линии мышей. В дальнейшем при пересадке опухолей он выяснил, что один из антигенов (антиген II) достоверно ассоциирован с устойчивостью животных к развитию опухоли. В ходе дальнейших исследований антисыворотка к антигену II была использована для определения трех аллелей кодирующего антигены локуса, названного 2 локусом гисто-совместимости (H2). Открытие аналогичной системы у человека в 1958 г. Жаном Доссе, Йоном ван Рудом и Роуз Пейн позволило получить весомое подтверждение наследуемости иммунных признаков.

По сути, авторы в своей работе провели реакцию генотипирования в абсолютно физиологической системе. Генотипирующими реагентами в данном случае стали антитела, образующиеся в организме женщин в ходе беременности. Основой этого подхода стало предположение Ж. Доссе о том, что плод, несущий гены обоих родителей, должен нести чужеродные для организма женщины антигены и тем самым стимулировать у матери выработку антител. Это предположение подтвердилось на следующей модели. В реакции гемагглютинации с одними и теми же образцами лейкоцитов было протестировано значительное число образцов сывороток многорожавших женщин. Положительная реакция была получена для нескольких образцов сывороток. Доссе сделал заключение о том, что они содержат идентичные антитела к одному и тому же антигену. Ж. Доссе обозначил его как МАС-1. Это открытие, отмеченное в 1980 г. Нобелевской премией, привлекло широкое внимание исследователей и позволило создать международную группу лабораторий, приступивших к использованию указанной схемы для получения новых типирующих сывороток, обмена ими и установления новых антигенов. Эти антигены получили название HLA (Human Leukocyte Antigens), а контролирующие их гены соответственно - гены HLA. Эти названия, формально обозначающие лишь метод их первичного определения, сохранились до настоящего времени.

Дальнейшее развитие представлений о структуре и функции системы генов HLA неразрывно связано с трансплантологией. Уже в 50-е годы ХХ в. ученые, исследовавшие возможность пересадки тканей и органов, столкнулись с проблемой, без решения которой это направление биомедицинской науки не могло найти клинического применения. В экспериментах на животных наилучшим образом приживались собственные трансплантаты (аутотрансплантаты) либо трансплантаты от однояйцевых (генетически идентичных) близнецов. Далее же в ряду потомков совместимость значительно уменьшалась, что приводило к увеличению риска отторжения трансплантата (рис. 12-1, см. цв. вклейку). При проведении возвратных скрещиваний удавалось получить четкое расщепление по признаку приживления (рис. 12-2). Данные результаты хорошо укладывались в теорию наследования признаков. Очевидно, что гены тканевой совместимости, связанные с отвечаемо-стью на антиген, наследуются от родителей (50% от каждого родителя), поэтому сибсы имеют между собой больше совпадающих по последовательности генов, чем связанные менее тесным родством или неродственные особи, однако у каждой пары сибсов шансы на идеальное совпадение все же составляют лишь 25%. Таким образом, чем меньше совпадение по генам HLA между двумя особями, тем больше вероятность того, что иммунная система реципиента атакует донорские клетки.

За последующие 20 лет были заложены основные представления о структуре и полиморфизме системы HLA. Именно в период 1960-1980 гг. были выполнены фундаментальные исследования, посвященные функции HLA-антигенов, а также определена их роль в трансплантации тканей. Следует отметить, что с момента открытия Ж. Доссе до первой половины 1980-х гг. непосредственным объектом исследований при установлении HLA-генотипов были не гены, а белковые молекулы HLA. При этом уровень полиморфизма, т.е. количество определяемых специфичностей, составляло 138. Именно на основании HLA-типирования по указанному числу антигенов были выполнены ключевые для иммуногенетики работы в таких направлениях, как «HLA и заболевания», «HLA и репродукция», «HLA и популяционная генетика». В те же годы, благодаря работам Памелы Бьеркман. была установлена трехмерная структура белков комплекса MHC класса I. Это пролило свет на тонкие механизмы взаимодействия иммуногенных пептидов и молекул HLA. Стало понятно, что для развития иммунного ответа на тот или иной пептид в антигенсвязывающей бороздке контактирующей с ним молекулы HLA должны находиться специфические участки, закрепляющие эту связь. Именно необходимость надежной связи молекулы HLA с огромным числом антигенов определяет целесообразность сохранения высокого уровня полиморфизма генов системы HLA.

Важной частью, недостающей для формирования общей картины биологической роли HLA, было определение фундаментального смысла существования столь сложной в генетическом плане системы. Одна из наиболее ранних идей в этой области была высказана Лоуренсом еще в 1959 г. Он предположил, что молекулы HLA формируют внутриклеточные комплексы с инфекционными агентами и стимулируют экспрессию распознающего их рецептора на поверхности лимфоцита. Таким образом, полиморфизм напрямую связан с процессом презентации антигенных детерминант. Эта идея нашла развитие в работах швейцарского иммунолога Рольфа Цинкернагеля и его австралийского коллеги Питера Доэрти. В 1974 г. ими был установлен феномен «двойного распознавания» чужеродных иммуногенных пептидов. В серии цитотоксических тестов по оценке ответа на инфицирование вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCHV) была показана зависимость иммунного ответа от молекул MHC класса I. Было установлено, что рецепторы Т-клеток специфически взаимодействуют как с иммуногенным пептидом, так и с самой молекулой HLA.

Естественно, что к настоящему моменту многие из этих представлений были значительно расширены. В первую очередь это произошло благодаря переходу в конце 80-х годов XX в. на молекулярно-генетическое типирование, ознаменовавшее новый этап в изучении иммуногенетики человека. Толчком к развитию этого этапа послужило удостоенное Нобелевской премии (1993 г.) открытие Кэри Мюллисом ПЦР. Широкая презентация метода ПЦР с использованием сиквенс-специфичных олигонуклеотидных зондов (PCR-SSOP) как нового подхода к типированию HLA впервые была проведена в рамках программы XI Международного рабочего совещания по гистосовместимости (1985-1989). Кроме того, были представлены и другие молекулярные подходы к ДНК-типированию HLA, в том числе обратный дотблот, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP), формирование ПЦР-гетеродуплексов, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP).

Однако дальнейшее развитие фундаментальных концепций иммунологии требовало перехода на «геномный» уровень исследований с привлечением данных о генетических основах регуляции иммунных реакций, изменчивости генов иммунного ответа и способе наследования иммуноассоциированных признаков. Новые возможности в данной области открылись с завершением проекта «Геном человека» в 2001 г. Одним из результатов реализации этой международной программы стало формирование представлений о масштабе генетического полиморфизма на уровне SNP. На сегодняшний день в наиболее известной и полной базе данных dbSNP сервера NCBI (National Center for Biotechnology Information) содержится информация более чем о 380 млн полиморфных участков в геноме человека (по данным сайта www.ncbi.nlm.nih.gov/snp, сборка № 151). При этом наиболее ярким примером данного типа полиморфизма являются гены иммунного ответа, в первую очередь система генов HLA.

В настоящее время прогресс в изучении системы HLA связывают с развитием технологий высокоэффективного параллельного секвенирования или секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS). За последние 20 лет эти технологии стали значительно доступнее, а новые разработки в области секвенирования позволили повысить точность прочтения и длину анализируемых последовательностей. Минимальным требованием для включения в самую обширную базу данных последовательностей HLA IPD-IMGT/HLA по-прежнему остаются экзоны 2 и 3, поскольку они кодируют пептидсвязывающий домен молекулы HLA. Однако захват более протяженных фрагментов позволяет включить в анализ псевдогены. Это дублирующиеся фрагменты экспрессируемых генов, и, хотя их функциональная роль до конца не выяснена, NGS-анализ позволит исключить ошибочное определение псевдогенов как экспрессируемых аллелей.

Переход с серологических на молекулярно-генетические методы изучения системы HLA привел к значительному прогрессу в иммуногенетике. Так, за последующие 40 лет, во многом благодаря внедрению молекулярно-генетических методов типирования, число вариантов HLA возросло с 260 специфичностей до 27 980 аллелей (по данным сайта www.hla.alleles.org на июнь 2020 г.). На рис. 12-3 представлена динамика накопления данных о полиморфизме системы HLA начиная с 1987 г.

Кроме того, применение молекулярно-генетических методов позволило уточнить структуру комплекса генов HLA. Гены, кодирующие антигены HLA, находятся в пределах области MHC длиной около 4 млн п.н., расположенной на 6 хромосоме. MHC является областью генома всех челюстноротых позвоночных и кодирует основные компоненты иммунной системы. HLA - это MHC человека. В соответствии с современной номенклатурой гены комплекса делятся на классические, неклассические, неэкспрессируемые, гены АТФ-связывающего кассетного транспортера, гены, связанные с цепью класса I, и класс-I-подобные гены (рис. 12-4, см. цв. вклейку). Расширенная область включает 5 субрегионов, находящихся в непосредственной близости друг от друга. В направлении от теломеры к центромере 6 хромосомы она делится на гены расширенного класса I (от GABBR1 до ZFP57), класса I (от HLA-F до MICB), класса III (от PPIAP9 до BTNL2), класса II (от HLA-DRA до HLA-DPA3), расширенного класса II (от COL11A2 до KIFC1) и также включает ген HFE.

Гены HLA стабильны по своей структуре и организации и, что немаловажно, экспрессируются кодоминантно. То есть экспрессируются гены, расположенные на обеих гомологичных хромосомах. Гены HLA чрезвычайно полиморфны, то есть представлены огромным числом вариантов. Полигенность, кодоминантная экспрессия и полиморфизм обеспечивают, таким образом, возможность ускоренной адаптации защитной системы организма к изменяющимся условиям окружающей среды.

Каждая из альтернативных форм гена носит название аллеля. Термин «аллель» в данном случае относится к конкретной комбинации точечных мутаций, инсерций и делеций, присущих данному локусу. На сегодняшний день название аллеля HLA включает как минимум четыре цифры и разделяется двоеточиями. Цифры, расположенные до первого двоеточия, как правило, обозначают группу аллелей, кодирующих антиген, определяемый серологическими методами. Второй набор цифр призван отличать аллели, различающиеся несинонимичными (приводящими к замене аминокислот) заменами нуклеотидов. Аллели, отличающиеся только синонимичными (не влияющими на аминокислотную последовательность белка) заменами, определены третьим набором цифр. Четвертый набор цифр определяет аллели, различающиеся последовательностью 5'- и 3'-некодирующих областей, а также интронов. Дополнительно к цифровым обозначениям часто используют буквенные суффиксы, отражающие экспрессионный статус (нульаллели - N, аллели, экспрессирующиеся в пределах плазматической мембраны, - L, аллели, экспрессирующиеся за ее пределами, - S, аллели, экспрессирующиеся в цитоплазме, - С). В случае возникновения сомнений в экспрессионном статусе аллели маркируют суффиксами A (aberrant) или Q (questionable).

Основная функция генов HLA заключается в продукции белков, которые связываются с антигенными пептидами и представляют их Т-лимфоцитам. Основной функцией генных продуктов HLA класса I (HLA-A, -B и -C) является представление эндогенных пептидов CD8⁺ -Т-клeткам, в то время как молекулы HLA-DR, -DP и -DQ класса II представляют экзогенные пептиды CD4⁺ -хeлпeрным Т-клеткам.

Область III класса, в свою очередь, содержит гены, кодирующие иммунорегулятор-ные молекулы, например, TNF, факторы C3, C4 и C5 белков комплемента и белки теплового шока.

Гены HLA класса I характеризуются высокой степенью гомологии. Они содержат 8 экзонов. Первый экзон кодирует сигнальную последовательность; 2, 3 и 4-й - домены α1, α2 и α3 молекулы HLA. Пятый экзон кодирует трансмембранный участок цепи, экзоны 6 и 7 - цитоплазматический участок, а экзон 8 (3’VT) - третий нетранслируемый участок. Межэкзонные различия между генами локусов A, В и С состоят в том, что HLA-A- и B-гены содержат втрое больше нуклеотидов (1080) в 5-м экзоне по сравнению с генами локуса HLA-C.

В дополнение к классическим локусам HLA-A, -B и -C, к I классу также относят гены HLA-E, -F и -G. Продукты генов HLA-E, -F и -G участвуют в регуляции физиологического процесса репродукции человека и, взаимодействуя, обеспечивают защиту плода от цитотоксического воздействия ЕКК. Их обнаружение вне беременности - генетический фактор риска развития онкологического процесса.

К HLA-генам класса I относят также гены локуса MIC (MIC-A и MIC-B). Сокращенное название генов MIC происходит от MHC class I chain-related genes. Эти гены локализуются на хромосоме 6 в непосредственной близости от HLA-B. Продукты генов MIC участвуют в активации взаимодействия Т-клеточного рецептора (ТКР) с молекулой HLA в развитии цитотоксичности, опосредованной Т-клетками, и активности ЕКК, тем самым играя роль в обеспечении противоопухолевого иммунитета. Таким образом, продукты генов MIC по своей физиологической значимости приближаются к таковой, установленной для классических антигенов HLA класса I. В частности, они участвуют в развитии реакции отторжения аллогенных трансплантатов, в первую очередь костного мозга и кроветворных стволовых клеток (КСК), и служат генетическими маркерами ряда заболеваний.

Молекулярно-генетический анализ также позволяет разделить регион HLA класса II на отдельные локусы. Внутри локуса HLA-DR располагаются относительно неполиморфный ген α-цепи - DRA (три аллельных варианта) и несколько генов β-цепи - DRB1-DRB9. Из генов β-цепи экспрессируются DRB1, DRB3, DRB4 и DRB5. Количество DRB-генов на этой хромосоме зависит от DR-специфичности гаплотипа. Внутри HLA-DQ и DP-региона располагаются два гена α- и два гена β-цепи, но экспрессируются только DQA1, DQB1, DPA1 и DPB1.

В высокополиморфном регионе HLA-DRВ полиморфизм установлен как на уровне экспрессирующихся генов, так и псевдогенов. Наиболее полиморфный из генов HLA-DRB - HLA-DRB1 к настоящему времени насчитывает более 760 аллельных вариантов.

DQ-локус содержит по две пары генов А и В. Хотя DQA-2 и B2-гены транскрибируются, их белковые продукты еще не установлены, поэтому в настоящее время принято считать, что единственный экспрессирующийся ген Dq - А1 и В1. В отличие от DR-локуса, полиморфизм DQ-локуса связан с генами HLA DQ-A и -В. DQ-полиморфизм в значительной степени связан с DRB-полиморфизмом, причем эта связь значительно более выражена для DQ-A, чем для DQ-B.

Третий из хорошо изученных локусов HLA класса II - DP-регион, в котором располагаются два экспрессирующихся гена - DPA1 и DPB1. Гены DPA2 и DPB2 считают псевдогенами. Исследование сиквенса DPA-генов к 2010 г. позволило установить существование 28 аллелей, а в регионе DPB1 - 138. Для части этих аллелей установлено соответствие с определенными HLA-DP-антигенами, обнаруженными в тесте типирования праймированных лимфоцитов (PLT).

Помимо классических генов HLA класса II, в регионе HLA-D определены новые гены HLA. В первую очередь стоит рассмотреть гены HLA-DOB, HLA-DNA и особенно HLA-DM (DMA и DMB), LMP и TAP. Три последних локуса обеспечивают такие важнейшие функции, как процессинг и экспрессия HLA-антигенов на поверхности клеток. Подробнее о них будет сказано в разделе, посвященном представлениям о процессинге и экспрессии антигенов HLA. Гены HLA-DOB обнаружены в библиотеке ДНК, полученной из В-лимфобластоидных линий. При этом была установлена нуклеотидная гомология с генами DRB, DQB и DPB, достигающая 70%. Гены HLA-DOB картированы между DQ и DP, а их экспрессия на уровне мРНК найдена в В- и Т-клеточных линиях, стимулированных интерфероном-γ.

Гены HLA класса III занимают на хромосоме пространственное положение между генами HLA класса I и II и выполняют целый ряд важнейших биологических функций. До последнего времени этот регион был изучен относительно мало по сравнению с генами класса I и II. Один из генов HLA класса III, привлекающих наибольшее внимание исследователей, работающих в области изучения структуры системы HLA и темы «HLA и болезни», - CYP21. Его продукт - HLA-антиген HLA-B42. Его основная функция - регуляция активности энзима цитохрома Р-450.

Ген В (Bf) функционирует одновременно с геном С2, принимая участие в запуске каскада комплемента, регулируя активацию его С3- и С5-компонентов, кодируемых генами, находящимися вне системы HLA. Как С2, так и Bf-гены полиморфны. Наибольшая распространенность среди аллелей С2 принадлежит С2С. Самые частые аллели Bf - F и S. Дефицит белка С2 - наиболее распространенная форма недостаточности системы комплемента у человека (частота гомозигот по отсутствию С2 - 1:10 000). У 40% больных с системной красной волчанкой обнаружен дефицит С2. Его отсутствие связано не с делецией участка ДНК, а с нарушением транскрипции мРНК.

Сиквенс генов TNF свидетельствует о 35% гомологии TNFα и β. Эти гены являются плейотропными, т.е. способны оказывать влияние на несколько феноти-пических признаков. Оба белка, секретируемые активированными макрофагами и Т-лимфоцитами, действуют на различные клеточные типы, включая разные субпопуляции лимфоцитов, нейтрофилы и эпителий сосудов. Указанные механизмы действия белков TNF, их влияние на воспалительный процесс, а также опосредованный ими цитолитический и цитотоксический эффект против раковых клеток обеспечивают важнейшие регуляторные функции TNF в поддержании гомеостаза организма человека.

На расстоянии 92 т.п.н. от С2 в сторону, противоположную центромере, находится локус генов теплового шока 70 (HSP 70), состоящий из двух генов, входящих в семейство размером 70 т.п.н. Продукты локуса HSPO играют определенную роль в интрацеллюлярном транспорте пептидов, вызывают развертывание белка перед преципитацией антигена и обеспечивают развитие цитотоксического эффекта, в том числе направленного на уничтожение чужеродных клеток.

Для того чтобы лучше представить соотношение белковых молекул системы HLA и кодирующих их генов, целесообразно обратиться к рисунку, предложенному Р. Вассмаусом и удачно отражающему взаимоотношения указанных параметров (рис. 12-5).

Наиболее важный участок молекулы HLA - пептидсвязывающая бороздка - место, где располагается иммунодоминантный пептид, инициирующий развитие иммунного ответа. Каждый пептид, представляемый молекулой HLA, имеет два вида связи с молекулой HLA: «заякоривание» в так называемых карманах молекулы и специфическую связь между конкретными пептидсвязывающими сайтами молекулы HLA и специфичным для них аминокислотным мотивом пептида.

Таким образом, развитие иммунного ответа на тот или иной иммунодоминантный пептид определяется присутствием в конкретной молекуле HLA сайтов, соответствующих мотивам пептидов. В свою очередь, их существование зависит от конкретного генотипа HLA. Следует отметить, что эти различия реализуются на уровне аллельных вариантов генов HLA, которые могут отличаться заменами нескольких аминокислотных остатков. Этот механизм справедлив как для молекул I, так и II класса. Таким образом, специфичность молекулы HLA определяется в первую очередь регионом антигенсвязывающей бороздки. С физической точки зрения на связь с пептидом оказывают влияние электростатический заряд, гидро-фобность и пространственная организация бороздки. Благодаря этому пептидсвя-зывающие молекулы, кодируемые определенными аллельными вариантами HLA, могут захватывать уникальный набор иммунодоминантных пептидов. Пептиды, связывающиеся с конкретным аллотипом молекулы HLA, имеют тенденцию использовать один и тот же мотив аминокислотных последовательностей, формирующий доминантные якорные сайты для связывания с уникальным сайтом пептидсвязывающей бороздки молекулы HLA.

Некоторые неклассические молекулы HLA (HLA-E и HLA-G) служат лигандами для ЕКК, функцией которых считают уничтожение клеток, потерявших экспрессию I класса. Некоторые ЕКК также распознают классические молекулы HLA (например, HLA-B и HLA-C). Таким образом, можно считать, что молекулы HLA-E обеспечивают систему «контроля качества» по принципу презентации антигенов HLA. Этот процесс скринирования, вероятно, особенно важен для уничтожения опухолевых и инфицированных вирусом антигенпрезентирующих клеток (АПК), где потеря экспрессии молекул HLA класса I - наиболее распространенная причина ухода из-под иммунного надзора.

Молекулы HLA-антигенов класса I экспрессированы на всех ядросодержащих клетках организма, в то время как молекулы класса II - лишь на клетках, принимающих участие в развитии иммунного ответа. Это позволяет осуществлять взаимодействие всех клеточных элементов организма, естественно, несущих одинаковые антигены HLA. Весьма важным считают следующее обстоятельство. Помимо самого факта присутствия молекул HLA на поверхности клеток, значение имеет и уровень их экспрессии. Так, если значительно повышена экспрессия HLA класса II, то это ведет к развитию аутоиммунной агрессии (например, к возникновению сахарного диабета 1 типа). Напротив, снижение или полное отсутствие их экспрессии - один из важнейших механизмов развития онкологических заболеваний, что связано с ускользанием этих клеток из-под контроля системы HLA.

Как было сказано ранее, в структуре системы HLA, помимо классических генов, присутствуют так называемые новые, или неклассические, гены. Среди них особая роль принадлежит генам, обеспечивающим процессинг и презентацию иммуно-доминантных пептидов молекул HLA. При этом следует отметить, что собственно этот процесс имеет как общие, так и различающиеся механизмы для молекул HLA I и II класса.

Процессинг и презентация антигена молекулами hla

Принципиальная схема представления пептидов антигенами HLA классов I и II приведена ранее. Общим для антигенов класса I и II считают следующее. АПК осуществляет свое специфическое действие, представляя пептид в контексте собственной молекулы HLA, идентичной таковой на клетке, воспринимающей информацию.

Роль новых генов HLA-DM, LMP и TAP представлена на рис. 12-6.

Первыми в систему процессинга антигенов эндогенного происхождения (вирусы, собственные измененные и даже неизмененные антигены) включаются продукты локуса LMP (гены LMP2, LMP7), активируемые интерфероном-γ и затем инкорпорируемые в протеосомы. Четыре входящих в систему HLA гена LMP2, LMP7, RING4 и RING11 составляют кластер генов, ответственный за индукцию интерферонов, и именно с этим связан механизм действия генов LMP2 и LMP7, сопряженный с активацией протеосом. Аббревиатура «LMP» происходит от «large multifunctional protease», а «RING» - от «really interesting new genes». Ген LMP2 находится в неравновесном сцеплении с геном ТАР1. Впервые их описали и картировали в регионе хромосомы 6, находящемся между генами ТАР. Возможный механизм действия продуктов генов LMP2 и LMP7 - замена ими под влиянием индукции γ-интерферона двух протеосомных субъединиц Y и X.

Молекулы HLA класса I синтезируются в цитозоле клетки, где до проникновения соответствующего пептида находятся в связи с так называемым тирозинкал-ретикулиновым комплексом. После связывания с пептидом происходят высвобождение молекул HLA и транспорт на поверхность клеток, кодируемых в пределах системы генов HLA пептидных насосов ТАР (от транспортеров, ассоциированных с антигенным процессингом). Эти гены также известны как RING4, RING12, PSF1 и PSF2 соответственно. Сокращение «PSF» происходит от «peptide supply factor». Последнее название отражает функцию этих молекул, которая состоит в том, что они регулируют размер и специфичность пептидов, приводя их в соответствие со связывающими сайтами молекул HLA класса I.

ТАР1 и ТАР2 - гетеродимеры, участвующие в окончательной сборке молекул антигенов HLA класса I и презентации ими эндогенных пептидов. Молекулы, кодируемые геном ТАР2, находятся в неравновесном сцеплении с антигенами HLA-DR, и между генами ТАР1 и ТАР2 существует высокая частота рекомбинаций. Установлено, что некоторые мутации в районе генов HLA-TAP ведут к потере презентирующей функции антигенов тканевой совместимости класса I.

Механизм антигенного процессинга и представления пептидов молекулами II класса HLA отличен от такового у молекул I класса. Молекулы HLA II класса в основном связывают пептиды, произведенные в эндоцитозном компартменте (включая лизосомы), при этом значительная фракция их происходит из цитоплазмы. Эндосомы - связанные с мембраной везикулы, которые перемещают белки между вакуолярными отделами клетки и отделены от цитоплазмы двойным липидным слоем. Экзогенные антигены усваиваются (интернализируются) с помощью эндоцитоза и транспортируются в эндосомы и лизосомы - структуры клеток, содержащие протеолитические энзимы. Таким образом, значительная часть пептидов, представленных молекулами II класса, - производные экзогенных антигенов.

Первый этап сборки молекул II класса происходит в эндоплазматическом ретикулуме, где они связываются мономорфным белком, называемым инвариантной цепью (Ii). Каждый комплекс класса II αβ/Ii - трансмембранный белок, состоящий из девяти субъединиц и содержащий три αβ-гетеродимера, ассоциированных с гомодимером Ii-цепи. Инвариантная цепь предотвращает загрузку антигенпрезентирующей щели молекулами HLA II класса, происходящими из эндоплазматического ретикулума, а также сопровождает вновь синтезированные молекулы в специализированный эндосомальный компартмент (MCII). MCII компартмент - сайт загрузки большинства пептидов молекул HLA II класса. По достижении окисленного эндосомального компартмента инвариантная цепь последовательно деградирует под действием катепсинопосредованного протеолизиса для создания ассоциированной с пептидом II класса инвариантной цепи CLIP, которая вновь связывается со щелью молекул II класса.

Для окончательной загрузки молекул HLA II класса пептидами, которые будут представлены ТКР, необходим еще один этап, который обычно выполняет молекула HLA-DM. Она включает продукты двух генов HLA-DM - A и В, кодируемых регионом II класса главного комплекса тканевой совместимости. Считают, что HLA-DM прямо взаимодействует с молекулами II класса, катализирует диссоциацию CLIP и способствует загрузке иммунодоминантного пептида как в кислотном эндосомальном, так и рециклирующем компартментах. Эту активность HLA-DM может регулировать другая связанная с классом II молекула, названная HLA-DO, которая при некоторых условиях синергезирует с DM, но при определенной концентрации может нарушать функцию DM. HLA-DO в основном экспрессирована в В-лимфоцитах. HLA-DM также может изменять конечную конформацию результирующего комплекса HLAII/пептид. Результат изменений комплекса «HLA-пептид» - распознавание большинства пептидов, связываемых молекулой II класса, имеющих длину около 8-15 аминокислот и служащих производными активности протеаз эндосом (лизосом), особенно катепсинов.

Как было указано ранее, одна из основных функций молекул HLA класса II - презентация иммунодоминантных пептидов для их распознавания ТКР. Именно благодаря последнему ТКР контролируют весь спектр различных комплексов «HLA-пептид», которые постоянно презентируются на клеточной поверхности. Существует два различных семейства генов, кодируемых либо αβ-, либо γδ-ТКР. αβ-ТКР экспрессируются на 95% всех Т-клеток и демонстрируют большую вариабельность по сравнению с γδ-ТКР. Именно поэтому далее вопрос о взаимодействии ТКР будет сфокусирован на αβ-рецепторах. Их вариабельность определяется случайной генной реорганизацией, комбинаторным разнообразием и делецией или добавлением N-регионов, возникающих в различных сегментах генов ТКР, которые реорганизуются во время развития в тимусе. Гены β-цепи ТКР составляют кластер множественных V-регионов, разнообразных сегментов (D) и примыкающих областей (J), которые беспорядочно создают различные VDJ-комбинации. Гены α-цепи ТКР также составляют кластер множественных V-регионов и примыкающих областей (J), которые создают различные VJ-комбинации. Предположительный потенциальный репертуар уникальных ТКР (10¹⁵ ) намного превосходит реальное количество человеческих Т-лимфоцитов (10^и -10¹² ).

ТКР сам по себе - чрезвычайно неустойчивая полиморфная структура со сложным молекулярным механизмом генерации гигантского репертуара αβ-ТКР. Разумеется, это позволяет адаптивной Т-клеточной системе предоставлять значительное число возможных рецепторов для распознавания сравнительно большого ряда чужеродных антигенов (в том числе возбудителей широкого спектра инфекционных заболеваний как в нативной форме, так и в составе вакцин). Несмотря на видимый прогресс в понимании структурно-функциональных отношений между молекулами HLA и ТКР, существует множество спорных вопросов, касающихся Т-клеточного распознавания комплексов «HLA-пептид», которые еще не решены. Неясно, как организованы ко-рецепторы CD4⁺ и CD8⁺ при ко-распознавании комплексов «МНС-пептид», и недостаточно изучены механизмы, с помощью которых сигналы передаются внутрь Т-лимфоцита. В самом деле более высокая организация трехмерной структуры антигенспецифического ТКР в комплексе с инвариантными сигнальными компонентами CD3⁺ пока не доказана, несмотря на все усилия. Видимо, решение этих и многих других проблем способно прояснить не только работу иммунной системы, но и более общие принципы, управляющие комплексами клеточных взаимодействий. Когда будут определены молекулярные решения распространенных проблем распознавания, можно будет разработать стратегии вмешательства в его предсказуемые отрицательные последствия (например, аутоиммунитет или иммунная дисфункция) или, напротив, способы преодоления «неотвечаемости» на конкретный иммунодоминантный эпитоп, что особенно важно при разработке эффективных вакцин.

Важнейшей функцией HLA является регуляторная. Она выражается в поддержке клона Т-клеток, получившего сигнал на выживание. Остальные клоны практически неизбежно гибнут. Смысл данной селекции состоит в выбраковке клонов, специфичных к комплексам аутологичных пептидов с аутологичными молекулами HLA, т.е. потенциально аутоагрессивных клонов, которые подвергаются апопто-зу. Селекцию осуществляют клетки стромы тимуса. Считают, что эпителиальные клетки несут ответственность за положительную селекцию лимфоцитов, а дендритные клетки тимуса - за отрицательную.

Выжившие в результате селекции клоны Т-лимфоцитов несут рецепторы, способные распознавать чужеродные пептиды в комплексе с аутологичными молекулами HLA. Их специфичность определяет вторичный антигенраспознающий репертуар лимфоцитов, т.е. специфику реакций зрелых лимфоцитов на антигены. Созревающие В- и Т-лимфоциты γδ-типа подвергаются селекции, несколько отличающейся по содержанию от вышеописанных процессов.

Таким образом, система HLA закладывает и осуществляет контроль и регуляцию иммунного ответа человека, с одной стороны, препятствуя аутоагрессии, а с другой - осуществляя надзор за проникновением в организм чужеродных клеток.

Наиболее хорошо изученный аспект регуляторной роли HLA в иммунном ответе - его адаптивный компонент. Это объясняется тем, что собственно развитие проблемы биологической роли HLA началось с клинической трансплантологии, где естественно превалирует адаптивный иммунитет, а также тем, что всю вторую половину XX в. внимание иммунологии было сосредоточено на адаптивном иммунитете. Тем не менее уже в 1980-х гг. в рамках исследования регуляторной роли HLA большое внимание уделяли развитию направления «HLA и качество иммунного ответа». С современных позиций его следует рассматривать как «HLA и показатели врожденного иммунитета», поскольку основными объектами изучения иммунного ответа послужили классические факторы врожденного иммунитета: фагоцитоз, активность ЕКК-ответа на поликлональные митогены и концентрация Ig в крови.

Таким образом, уникальное строение генома и протеома HLA обеспечивает функционирование важнейших регуляторных механизмов в организме человека. Из числа наиболее важных следует отметить следующие:

Нарушение указанных биологических функций лежит в основе целого ряда заболеваний человека, включая онкологические, аутоиммунные, атопические и инфекционные.

hla и устойчивость или чувствительность к заболеваниям

Варианты генов иммунного ответа формируют уникальный для данного человека иммуногенетический профиль и ассоциированы с индивидуальными особенностями функционирования иммунной системы. Функция генетического контроля иммунного ответа является сформировавшимся в течение веков продуктом воздействия факторов окружающей человека среды. Таким образом, полиморфизм генов, испытывающий на себе регулирующее воздействие внешних факторов, является основным механизмом адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и во многом определяет различия в индивидуальной реакции на то или иное воздействие.

В связи с этим уже в середине 1970-х гг. начало формироваться новое направление в изучении медико-биологической роли системы HLA. Оно получило название «HLA и заболевания» и сконцентрировано на установлении ассоциаций между специфичностями HLA и теми или иными заболеваниями человека. Принципиальная роль генетического фактора в патогенезе иммуноассоциированных нарушений подтверждается исследованиями степени генетической конкордантности у близнецов. Так, например, показатель конкордантности по сахарному диабету 1-го типа значительно выше у МБ по сравнению с дизиготными, что свидетельствует о значительной роли генетической составляющей в развитии этого заболевания (табл. 12-1).

Ранее основное внимание в области исследования генетических основ заболеваний было сосредоточено на изучении моногенных нарушений (менделирующие болезни), однако в соответствии с современными представлениями большая часть распространенных заболеваний, несущих в своей основе генетический компонент, зависит от совместного влияния аллелей, расположенных в нескольких генах (мультифакториальные заболевания). Показать достоверную взаимосвязь генотипа с предрасположенностью к таким заболеваниям значительно сложнее. Во многом созданию целостной картины препятствует неоднозначность получаемых данных. Причиной возникновения неточностей является недостаточная изученность межпопуляционных отличий в распределении маркеров и структуре сцепления генома. Кроме того, важным параметром, практически не поддающимся оценке, но, тем не менее, влияющим на риск развития заболевания, является воздействие факторов окружающей среды (курение, инфекционные заболевания, стресс, неправильное питание и т.д.). Тем не менее установление генетической вариации, которая может послужить надежным маркером того или иного признака (заболевания), позволяет оценить, насколько риск развития заболевания для данного человека выше или ниже среднего риска для популяции.

На сегодняшний день установлена корреляция между наличием или отсутствием определенных аллелей (или гаплотипов) HLA и предрасположенностью ко многим инфекционным и аутоиммунным заболеваниям. Кроме того, установлены ассоциации между риском и тяжестью иммунозависимых заболеваний с полиморфизмом генов, расположенных в пределах региона HLA, но не выполняющих антигенпрезентирующей функции (например, TNF, белки системы комплемента, белки теплового шока и др.).

Одним из наиболее изученных аутоиммунных заболеваний, ассоциированных с полиморфизмом генов HLA, является сахарный диабет 1-го типа. Это заболевание на сегодняшний день считают наиболее тщательно изученным (в том числе в рамках исследований по программам Международных рабочих совещаний по изучению HLA) из числа социально значимых патологических состояний аутоиммунной этиологии. Именно на основании результатов исследований сахарного диабета 1 типа в период с 1989 по 2005 г. сформулированы не только современные представления по иммуногенетике аутоиммунных заболеваний, но и намечены основные направления дальнейших исследований.

При исследовании иммуногенетических основ диабета показана достоверная ассоциация аллелей DRB1*03 и DRB1*04 с развитием данного заболевания. Продукты генов HLA класса II, в частности DRB1, DQA1 и DQB1, высокополиморфны и играют роль как в презентации антигена CD4-Т-хeлпeрам, так и в формировании иммунологической толерантности. Высокая степень сцепленности между DRB1-DQA1-DQB1 сделала задачу определения этиологического маркера довольно сложной. Однако дальнейшие исследования показали, что аллели DRB1*03 и DRB1*04 являются частью гаплотипов DRB1*03-DQB1*02-DQA1*05:01 (DR3) и DRB1*04-DQB1*03:02-DQA1*03:01 (DR4), ассоциированных с заболеванием у европеоидов (и в особенности у гетерозигот DR3/4). Повышение риска у гетерозигот, вероятно, связано с формированием транс-DQ-димeров между HLA-DQA1- и HLA-DQB1-аллeлями, расположенными на гомологичных хромосомах. Ассоциация HLA с сахарным диабетом 1-го типа показана также для представителей азиатской популяции. Так, в японской и корейской популяциях существует достоверная ассоциация заболевания с HLA-DR4 (DRB1*04:05-DQB1*04:01) и HLA-DR9 (DRB1*09:01-DQB1*03:03).

На эффект отдельных аллелей генов HLA-DR и HLA-DQ может влиять их окружение (полиморфизм сцепленных локусов, эпигенетические факторы). Так, например, в пределах HLA-DQB1 действие аллелей может варьировать от выраженного протективного (HLA-DQB1*0602) до негативного (HLA-DQB1*0302).

Кроме того, регион HLA играет одну из основных ролей в развитии таких заболеваний, как рассеянный склероз и системная волчанка. Открытие ассоциации HLA-DR2 (гаплотип HLA-DRB1*15:01-HLA-DQB1*06:02) с рассеянным склерозом до сих пор не потеряло своей значимости. Существует предположение, что HLA-DRB1*15:01 и тесно связанный с ним аллель HLA-DRB1*15:03 достоверно ассоциированы с заболеванием у афроамериканцев и, вероятно, у европейцев. Кроме того, есть основания предполагать наличие независимой от гаплотипа HLA-DRB1*15:01-HLA-DQB1*06:02 ассоциации с аллелями HLA класса I (HLA-A*02:01, HLA-A3 и HLA-Cw05), а также с аллелем HLA-C1_3_2*354 (микросателлит), тесно сцепленным с HLA-DR3.

Наиболее достоверная связь с развитием системной волчанки показана для аллелей HLA класса II - DRB1*03:01, *14:01, *15:01 и *05:01, однако оценка относительного вклада этих аллелей в развитие заболевания требует дальнейшего уточнения. Ниже приведена таблица, обобщающая данные по ассоциации аллелей HLA класса II с развитием основных иммунозависимых заболеваний (табл. 12-2).

В пределах региона HLA расположены также гены, не участвующие непосредственно в презентации антигена, но играющие важную роль в реализации этой функции. Это в первую очередь гены TAP и LMP, ответственные за процессинг антигенов. Продукты генов LMP2 и LMP7 входят в состав протеасом, обеспечивающих процессинг пептидов, благодаря чему достигается соответствие размеров пептидного фрагмента и связывающего сайта молекулы HLA I класса. Функция продуктов генов TAP1 и TAP2 также связана с регуляцией размера пептидных фрагментов, презентируемых молекулами HLA I класса. Нарушение функций генов TAP1 и TAP2 может быть связано с предрасположенностью к онкологическим и аутоиммунным заболеваниям, в том числе к сахарному диабету.

К аутоиммунным заболеваниям, в этиологии которых важную роль играет система HLA, следует включить целый ряд иммунозависимых заболеваний. Так, в 2010 г. на Конференции Европейской федерации иммуногенетиков во Флоренции (Италия) Итальянским обществом иммуногенетиков (AIBT) были представлены рекомендации по изучению HLA-ассоциаций с заболеваниями. Материалом для исследований служили данные 16 итальянских центров, занимающихся HLA-типированием, общий годовой объем генотипирования в которых превышает 23 000 образцов. Среди изученных заболеваний можно отметить анкилозирующий спондилит, увеит, болезнь Бехчета, ревматоидный артрит, юве-нильный артрит, реактивный артрит, целиакию, сахарный диабет 1 типа, псориаз, миастению гравис, нарколепсию, а также HLA-ассоциированную лекарственную гиперчувствительность. В представленных рекомендациях была обоснована необходимость унификации методов генотипирования и анализа данных.

Открытие механизма иммунного распознавания Т-лимфоцитами вирусных антигенов в комплексе с молекулами MHC позволило предположить, что полиморфизм генов HLA может играть решающую роль в эффективности и интенсивности иммунного ответа на инфекцию. Впоследствии эта догадка нашла подтверждение во многих исследованиях. В табл. 12-3 приведены данные по ассоциации аллелей и гаплотипов HLA с генетически обусловленной устойчивостью и предрасположенностью к распространенным инфекционным заболеваниям.

Интересно, что целый ряд возбудителей инфекционных заболеваний человека имеют общие антигенные детерминанты с определенными участками конкретных HLA-специфичностей. Таким образом, при повторном инфицировании, в результате нормального противоинфекционного иммунного ответа, происходит атака не только на болезнетворный агент, но и на собственные клетки организма. Этот феномен получил название «антигенная мимикрия». Иммунный ответ, запускаемый подобным образом, может заканчиваться развитием аутоиммунного процесса, где мимикрирующие антигены выступают в роли индукторов заболевания.

В дополнение к указанному механизму в запуске аутоиммунной реакции участвуют и молекулы, относящиеся к неклассическим HLA-специфичностям (см. выше). Нарушение функций этих молекул лежит в основе целого ряда заболеваний, в том числе и сахарного диабета 1 типа, при котором нарушаются нормальный процессинг иммунодоминантных пептидов, а также экспрессия вновь открытых HLA-специфичностей, участвующих в процессинге и презентации. Эти молекулы (в частности, HLA-DO и CLIP) экспрессируют ауто-HLA-пeптиды на клеточных мембранах, что служит одной из причин развития аутоиммунного процесса.

Как было сказано ранее, система HLA - наиболее полиморфная генетическая система человека. Кроме того, ей принадлежит еще одно важнейшее свойство - аллели и гаплотипы HLA по-разному представлены в различных популяциях. Это одно из ключевых направлений иммуногенетики человека, носящее название «HLA и популяционная генетика». В целом процесс формирования полиморфизма является наглядным отображением эволюционной роли мутационного процесса. Однако, с другой стороны, принимая во внимание полигенный и мультифакториальный характер наследования большинства признаков, следует отметить, что при определенных условиях позитивный эффект, связанный с носительством определенного генотипа, может быть нивелирован или даже перекрыт негативным эффектом, сказывающимся на ином этапе биохимической реакции или ином биологическом пути.

Так, некоторыми авторами высказывается мнение, что гаплотип HLA-A1-B8-DR3, распространенный в настоящее время среди европеоидов, сыграл положительную роль во время средневековых пандемий. Носители этого гаплотипа имели преимущество в выживании, поскольку его наличие связано с показателями врожденного иммунитета, играющими важную роль в защите от инфекционных агентов. Однако в изменившихся с тех пор условиях окружающей среды данный гаплотип демонстрирует достоверную ассоциацию с заболеваниями аутоиммунного генеза, включая сахарный диабет 1-го типа и ряд других эндокринных патологий. Этот пример является весьма показательным для определения роли окружающей среды в развитии иммуноассоциированных заболеваний. Так, новые типы внешних воздействий, накладываясь на уникальный для данной популяции набор генетически детерминированных признаков, могут стать причиной достаточно быстрого с эволюционной точки зрения распространения заболеваний среди носителей определенного генотипа.

В связи с этим межэтнические популяционные различия необходимо учитывать практически во всех аспектах прикладного использования результатов HLA-генотипирования. Естественно, это касается таких направлений, как «HLA и трансплантация» и «HLA и болезни». Более перспективным при подборе тканесовместимых пар донор-реципиент считают использование HLA-совместимых доноров той же этнической принадлежности, что и реципиент. Необходимое условие определения генетических маркеров предрасположенности (устойчивости) к заболеваниям - использование в качестве контроля представителей той же этнической группы, что и больные. Альтернативой могут служить достоверные данные об идентичности HLA-распределения в группе, используемой в качестве контроля, по сравнению с таковым в этнической группе, к которой принадлежит больной.

В последнее время стало ясно, что при использовании молекулярно-генети-ческого HLA-типирования высокого разрешения, позволяющего обнаружить аллельные варианты генов HLA, вышеуказанные принципы в ряде случаев должны реализоваться и внутри отдельных этнических групп. Это справедливо по крайней мере в случаях, когда речь идет о больших этносах, проживающих на значительных территориях и в течение столетий взаимодействующих с представителями других этнических групп.

Заключение

Данные, представленные в настоящей главе, не только позволят читателю составить представление о текущем уровне развития иммуногенетики человека, современных методах генетического анализа, но и дадут возможность использовать в генодиагностике при установлении риска развития иммунозависимых заболеваний. В настоящее время получили интенсивное развитие новые перспективные направления иммуногенетики человека. Одно из них - установление вероятности развития осложнений, связанных с проведением медикаментозного лечения, у пациентов, несущих конкретные аллельные варианты генов HLA. Наиболее яркий пример - ассоциация между аллелем HLA*B5701 и непереносимостью абакавира. Этот препарат - одно из наиболее эффективных средств для лечения ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита. Введение абакавира вызывает тяжелые, в том числе летальные, осложнения у больных, в генотипе которых присутствует указанный аллельный вариант гена HLA. Следует отметить, что его не относят к редко встречающимся. Естественно, что эта ситуация требует обязательного HLA-генотипирования всех ВИЧ-инфицированных и больных синдромом приобретенного иммунодефицита. Этот пример - наиболее яркий, но не единственный, и можно ожидать, что в дальнейшем число терапевтических агентов, непереносимость которых ассоциирована с определенными HLA-специфичностями, будет увеличиваться.

Следует отметить, что понятие «иммуногенетика человека» в последнее время расширилось, и возникла новая формулировка «не-HLA-гены иммунного ответа». Она стала официально признанной только в 2010 г., когда на XXIV Конгрессе Европейской федерации иммуногенетиков это направление было выделено в отдельную секцию. Речь идет в первую очередь о генах, контролирующих цитокины, которые регулируют процесс генерализации иммунного ответа. Последняя, в свою очередь, служит фазой иммунного ответа, наступающей вслед за распознаванием чужеродного агента и существенным образом влияющей на его результаты.

Развитие этого направления стало возможным благодаря возможности изучения генного полиморфизма на уровне одиночных нуклеотидных замен. Современные технологии типирования и секвенирования уже сегодня позволяют получить практические данные о генетической основе целого ряда социально значимых заболеваний иммунной этиологии, в том числе аутоиммунных, онкологических и инфекционных. Более того, в настоящее время для многих заболеваний уже установлены варианты генов, ассоциированные с предрасположенностью или, напротив, устойчивостью к широкому спектру заболеваний, начиная от онко-гематологических и заканчивая синдромом приобретенного иммунодефицита. До последнего времени большим препятствием к практическому использованию этого подхода было отсутствие данных о тех показателях активности исследуемых генов, которые можно считать нормой. Первое исследование, в котором были изучены параметры клинически значимых полиморфизмов 14 генов, контролирующих важнейшие IL, которые обеспечивают развитие иммунного ответа, было выполнено при обследовании русской популяции. Это делает более доступным и эффективным использование этих методов на практике.

Список литературы

Введение

Генетические заболевания, несмотря на их редкость, в совокупности вносят весомый вклад в заболеваемость, смертность и инвалидизацию населения, создавая значительные проблемы для конкретной семьи и системы здравоохранения в целом. Врожденные аномалии (большинство из которых связано с генетическими нарушениями) встречаются примерно у 5-8% живорожденных детей. Своевременная идентификация признаков, указывающих на возможность их генетической природы, может ускорить процесс диагностики, улучшить выбор подходящих, экономически эффективных диагностических тестов и проведение генетического консультирования по таким вопросам, как прогноз здоровья потомства, планирование семьи и своевременное направление к специалистам. Успешность диагностики наследственных болезней определяет всю последующую цепь событий, обеспечивая продуктивность взаимодействия врача с пациентом и членами его семьи, направленного на оказание своевременной и эффективной организационной, медицинской и психологической помощи.

Диагностика наследственных болезней основана на знании принципов клинической диагностики, общих характеристик и основных признаков наследственных болезней, особенностей возникновения клинических проявлений наследственных нарушений, осмотре и обследовании пациентов и их родственников, владении клинико-генеалогическим методом, использовании синдромологического принципа в диагностике.

Нередко первыми жалобами при наследственных заболеваниях, заставляющими обратиться за медицинской помощью, являются неспецифические проявления, такие как отставание в физическом или психоэмоциональном развитии, проблемы с вскармливанием, раннее ожирение, трудности социализации и адаптации ребенка или врожденные аномалии развития. В других случаях настороженность вызывают утрата ранее приобретенных навыков, повторные инфекции, необычная или извращенная реакция на пищевые продукты, нарушения пигментации кожных покровов, необычный запах тела или мочи и так далее. В старших возрастных группах и во взрослом периоде характер жалоб часто соответствует клинической картине широко распространенных заболеваний, таких как ИБС, гипертоническая или язвенная болезнь, псориаз, психические нарушения и т.д. Чаще всего первыми специалистами, у которых возникают подозрения на наследственный характер заболевания, являются педиатры и специалисты общей врачебной практики, однако наследственная патология может встречаться в любой медицинской специальности.

Для того чтобы заподозрить или исключить наследственное заболевание, необходимо уже на долабораторном этапе диагностики определить пути или методы лабораторного подтверждения предполагаемой природы патологии. Тщательный сбор и содержательный анализ анамнеза заболевания, клинико-генеалогической информации, результатов осмотра больного и членов его семьи, а также учет общих особенностей наследственных заболеваний, реализующихся в конкретной семье, позволяют с определенной степенью надежности заподозрить наследственную патологию у пациента.

Несмотря на многообразие клинической картины наследственных заболеваний, можно выделить их общие черты, которые врач должен использовать в качестве ориентиров в диагностическом поиске, что в конечном итоге позволяет выявить генетическую патологию у обследуемого. Основой формирования общности клинических характеристик различных форм наследственных болезней является генетический контроль ключевых звеньев обмена веществ и морфогенетических процессов.

Таким образом, врачебный осмотр, клинико-генеалогический метод и знание клинических особенностей остаются важнейшими подходами долабораторного этапа диагностики наследственной и врожденной патологии.

ОСОБЕННОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПАТОЛОГИИ

Время клинической манифестации

Для большинства наследственных болезней характерны врожденный характер или ранняя манифестация. Более 75% наследственных заболеваний клинически проявляются непосредственно после рождения ребенка, то есть имеют врожденный характер. Это связано с тем, что симптомы значительной части моногенно обусловленных наследственных болезней и хромосомных нарушений формируются внутриутробно. Тем не менее следует подчеркнуть, что врожденность патологических проявлений не всегда свидетельствует о наследственной природе патологии. Среди врожденных, но ненаследственных болезней выделяют так называемые тератогенные синдромы, возникновение которых обусловлено действием повреждающих агентов внешней среды во время эмбрионального развития. Примерно 15% наследственных болезней манифестирует в «доречевом» периоде, т.е. до трехлетнего возраста (ранняя манифестация), и к концу пубертатного периода. Таким образом, примерно 90% наследственных болезней клинически манифестирует в детском возрасте. Около 10% составляют наследственные заболевания, для которых клинически значимые проявления возникают во взрослом возрасте (как правило, болезни с наследственным предрасположением и некоторые нейродеге-неративные, в том числе некоторые моногенные формы заболеваний). Известны наследственные заболевания, для которых время манифестации соответствует пожилому и старческому возрасту (хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз). Представленные различия во времени манифестации наследственных заболеваний можно объяснить снижением в течение жизни вклада наследственных факторов в их этиологическую структуру. С возрастом падает частота моногенных и хромосомных болезней и увеличивается доля заболеваний, для проявления которых необходимо участие факторов среды.

Семейный характер заболевания

Для значительного числа наследственных заболеваний характерны повторные случаи клинически сходной патологии у членов одной семьи или рода в ближайших или отдаленных поколениях. В отличие от инфекционных или профессиональных заболеваний, при наследственных заболеваниях отмечаются характерное для каждого типа наследования распределение больных в родословной, специфическое соотношение числа больных и здоровых, распределение больных в семье по полу и в поколениях. Если врач при обследовании больного получает сведения о сходных случаях заболевания в семье, это может указывать на их возможную наследственную этиологию. Однако нужно помнить, что повторные случаи заболевания в семье могут быть обусловлены воздействием средовых факторов. Например, если патогенный фактор действовал на женщину во время всех ее беременностей (прием антиконвульсантов при эпилепсии), то у нее могут родиться несколько детей с одинаковыми врожденными аномалиями. Действие одних и тех же внешних факторов (профессиональных, бытовых и т.д.) на нескольких членов родословной способно также вызывать у них сходные заболевания. Таким образом, если исключается действие сходных внешних факторов, а для представителей разных поколений оно исключается с большей вероятностью, то можно думать о наследственном характере заболевания.

В то же время случаи, когда заболевание обнаружено только у одного члена родословной (так называемый изолированный или спорадический случай), не исключает наследственного характера нарушения, поскольку оно может быть результатом вновь возникшей доминантной мутации у одного из родителей; гетерозиготности обоих родителей по рецессивной болезни; рецессивной Х-сцепленной патологии или явлением неполной пенетрантности доминантного аутосомного гена.

Знание семейной истории является первым шагом для анализа любого заболевания, независимо от природы его возникновения, поскольку она может быть определяющей в диагностике, позволяет оценить риск для других членов семьи, нуждающихся в обследовании или профилактике.

Прогредиентность и хроническое течение

Прогредиентным течением называется течение заболевания с постоянным ухудшением общего состояния и с нарастанием негативных симптомов у пациента. Для большинства наследственных болезней обмена веществ характерно постепенное, по мере роста ребенка, нарастание тяжести клинических проявлений патологического процесса. Например, при первом типе МПС (болезни Гурлер) примерно с 6-месячного возраста развивается тугоподвижность суставов, нарастают изменения лицевого черепа, возникают и нарастают симптомы психомоторного отставания, формируется сердечно-легочная недостаточность, приводящая к летальному исходу. При анемии Кули (гомозиготная форма β-талассемии) в результате нарастающей анемизации (результат неэффективного эритропоэза) постепенно формируется компенсаторная гиперплазия костного мозга, приводящая к гепато-спленомегалии, аномалиям костной и иммунной систем.

Для абсолютного большинства наследственных болезней характерно хроническое течение, источником которого является постоянно функционирующий на протяжении всей жизни мутантный генотип. Например, мутантный аллель может приводить к формированию качественно или количественно измененного либо полному отсутствию первичного продукта мутантного гена, обусловливая развитие декомпенсированных состояний. Хроническая пневмония с бронхо-эктазами формируется у детей с легочной формой муковисцидоза. Длительные расстройства пищеварения возникают при целиакии (глютеновой энтеропатии), кишечной форме муковисцидоза и дисахаридазной недостаточности. Хроническое течение характерно и для хромосомных заболеваний, обусловленных аномалиями хромосомного набора (трисомия 21, структурные аномалии аутосом). Многие формы наследственных болезней были выявлены при обследовании пациентов с хроническим течением заболевания.

Хронизация, прогредиентность и рецидивирующее течение одного и того же заболевания могут быть по-разному выражены у различных больных, что объясняется уникальностью генетической конституции человека и специфичностью ответов организма на воздействие факторов внешней среды.

Множественность патологических изменений

Известно, что при более чем 60% наследственных заболеваний в патологический процесс вовлекается более одной системы органов. Именно в этой связи вовлечение в патологический процесс множества органов или систем позволяет думать о наследственной этиологии заболевания. Например, при синдроме Марфана поражаются опорно-двигательный аппарат, сердечно-сосудистая система и органы зрения. У больных с синдромом Дауна выявляются симптомы поражения сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, опорно-двигательного аппарата, нервной, дыхательной и иммунной систем.

При моногенных болезнях большинство мутантных генов, вызывающих наследственные болезни, оказывают плейотропный эффект, в результате чего в процесс вовлекаются многие органы. Под плейотропным действием гена понимают независимое или автономное проявление гена в различных тканях и органах. Другими словами - влияние одного уникального гена на формирование нескольких признаков, в том числе патологических. По механизмам действия различают первичную и вторичную плейотропию. Первичная плейотропия обусловлена патогенетическими эффектами продукта мутантных аллелей - мутантного белка-фермента. Например, при аутосомно-рецессивном заболевании - болезни Вильсона-Коновалова мутации гена ATP7B, кодирующего АТФазу-7В, вызывают нарушение обмена меди, приводящее к избыточному накоплению ее в клетках печени (от гепатита до цирроза), головного мозга (различные неврологические расстройства), роговице (кольцо Кайзера-Флейшера) и других органах. Вторичное плейотропное действие гена - механизм формирования симптомов наследственных заболеваний, основанный на общих закономерностях развития патологических процессов и по существу не различающийся от способов формирования симптомов ненаследственных заболеваний, определенное академиком Е.К. Гинтером как «родословная причин». Например, при муковисцидозе нарушен синтез трансмембранного белка, обеспечивающего транспорт ионов Na⁺ и Cl^-, что приводит к формированию густой слизи в альвеолах и бронхах, густого секрета в экзокринных железах, в частности в экзокринных клетках поджелудочной железы. Закупорка выводных протоков влечет за собой развитие воспалительных процессов, нарушение переваривания пищи и развитие вторичных воспалительных процессов.

«Резистентность» к терапии

Одной из особенностей наследственных болезней является неэффективность или малая эффективность лечения. Прежде всего это связано с трудностями коррекции патогенетического звена заболевания, даже если известен первичный продукт мутантного гена. В результате при генетически обусловленных заболеваниях как применение терапевтических лечебных средств, так и хирургическая коррекция дефектов в большинстве случаев не оказывают положительного эффекта. Например, попытки исправления скелетных нарушений (деформация грудной клетки) при дисплазиях соединительной ткани, к сожалению, неэффективны и часто заканчиваются рецидивом. Однако об абсолютной резистенции к лечению наследственных болезней в настоящее время говорить уже не приходится. Хорошие результаты достигнуты в лечении конкретных нозологических форм определенных групп наследственных заболеваний, в частности, в лечении наследственных болезней обмена веществ ферментозамещающими препаратами. В настоящее время с терапевтическими целями все шире применяется трансплантация генетически модифицированных стволовых клеток пациента или трансплантация стволовых клеток, полученных от здоровых доноров (чаще всего здоровых родственников пробанда). На стадии разработок или клинических испытаний находятся новые инновационные подходы к коррекции генетических дефектов с использованием молекулярно-генетических методов регуляции экспрессии генов, таких как антисмысловые РНК, малые интерферирующие РНК и другие.

Во врачебной практике встречаются ситуации, когда отдельные симптомы наследственных форм патологии расцениваются врачами как клинические проявления распространенных, но не наследственных заболеваний. В подобных случаях, когда общепринятые терапевтические подходы, рекомендованные лекарственные препараты или их стандартные дозы оказываются малоэффективными для достижения положительных результатов, подобная «неэффективность» заставляет врачей усомниться в правильности первоначального диагноза. Например, в случае кожных проявлений в виде пузырьков, рубцов, гиперпигментации лечение подобный «экземы», которая является кожным проявлением протокопропорфирии, оказывается лечением одного из симптомов наследственного заболевания, в то время как для данного заболевания разработаны надежные методы терапии и профилактики, основанные на закономерностях его патогенеза. При нераспознанном синдроме Костмана (наследственная нейтропения) интенсивная антибиотикотерапия гнойничковых поражений слизистых оболочек не спасает ребенка от прогрессирующего течения заболевания, проявляющегося в виде фурункулов, абсцессов подкожной клетчатки, тяжелых стоматитов, блефаритов и т.д.

Симметричность поражений

Для наследственных заболеваний характерным является вовлечение в патологический процесс парных симметричных органов в отличие от несимметричных поражений (заболевание одного глаза, аномалии одной почки, ПР одной конечности и т.д.), что чаще наблюдается при заболеваниях, обусловленных средовыми факторами. В этом случае феномен «симметричности поражения» предполагает однотипность структурных и функциональных изменений, идентичность тканевых и внутриклеточных нарушений. Например, при одной из форм несиндромальной аутосомно-рецессивной сенсоневральной потери слуха оба уха демонстрируют идентичную аудиометрическую картину поражения, в частности, схожесть потери частотного диапазона, отличающую данную форму от других сенсоневральных форм потери слуха. При наследственно обусловленном поражении одного из парных органов ожидается и возникновение идентичных нарушений другого симметричного органа. Например, при аутосомно-доминантной слоистой (зонулярной) катаракте вслед за поражением одного глаза в скором времени развивается аналогичная патология другого глаза. Данный клинический феномен обусловлен генетической идентичностью клеток и тканей, формирующих парные органы.

Разноплановый характер поражения симметричных органов свидетельствует, скорее, о различной природе их возникновения. Например, при ультразвуковом исследовании (УЗИ) пациента обнаружены патологические изменения обеих почек: выраженная гипоплазия левой почки и значительное увеличение размеров правой. Скорее всего, гипоплазия левой почки является врожденным пороком развития, а увеличение правой почки - физиологический результат компенсаторной реакции организма (викарная гиперплазия).

Несмотря на то что наследственные заболевания имеют свои специфические особенности, ни одну из рассмотренных характеристик и особенностей нельзя рассматривать как абсолютное свидетельство наследственной причины заболевания: только совокупность перечисленных особенностей и характерных черт позволяет предположить наследственную природу патологии у пациента. Тем не менее знание общих характеристик наследственных заболеваний, которые могут указывать на наличие генетического синдрома, поможет врачам в верификации природы заболевания у пациента.

Клинико-генеалогический метод

Одной из главных особенностей процесса диагностики генетических заболеваний является семейный анализ заболевания, позволяющий выделить спорадические и семейные случаи болезни, оценить характер распределения болезни в родословной. Метод изучения родословных человека, с помощью которого прослеживается распределение признака (болезни) в семье или в роду с указанием типа родственных связей между членами родословной, называется клинико-генеалогическим методом. Сущность метода заключается в сборе и оценке клинических данных больного и его родственников с последующим составлением и анализом родословной пробанда. Пробанд - лицо, с которого начинается изучение родословного дерева. В медицинской и клинической генетике пробандом, как правило, является больной человек или лицо, обратившееся за медико-генетической помощью.

Истоками зарождения генеалогического метода явились описания родословных членов царствующих семей или знатных родов, служивших основой формирования династических линий, то есть выполнявших социально-политическую роль. Помимо этого, история знает примеры родословных выдающихся представителей своего времени (художников, поэтов, музыкантов). Семейные хроники подчас содержали описание, как правило, редких, но очевидных ПР или заболеваний, передававшихся из поколения в поколения. Применение семейного анализа к заболеваниям человека в ХVIII-XIX вв. можно рассматривать как предпосылки формирования клинико-генеалогического метода. Дальнейшее развитие клинико-генеалогического метода было связано с совершенствованием приемов составления родословных и применения новых методов генетико-статистического анализа данных.

В настоящее время клинико-генеалогический метод, являясь одним из основных методов медицинской и клинической генетики человека, представляет собой наиболее универсальный метод, поскольку может быть применен и в этой связи востребован не только врачами-генетиками, но и с успехом применяться в любой клинической специальности.

Задачи, решаемые клинико-генеалогическим методом, условно можно разделить на академические: оценка пенетрантности гена; анализ сцепления генов; картирование генов; изучение интенсивности мутационного процесса; изучение механизмов взаимодействия генов, и на прикладные: выяснение природы заболевания; установление наследственного характера признака; определение типа наследования заболевания или признака; проведение диагностики и дифференциальной диагностики болезней; оценка риска рождения больного потомства; выбор адекватных и оправданных методов дородовой диагностики; назначение безопасных для больного методов лечения и профилактики заболеваний. В некоторых случаях он является единственным методом, с помощью которого можно оценить прогноз течения заболевания; прогноз здоровья потомства или прогноз жизни; предложить оправданные рекомендации пациенту или здоровому консультирующемуся при медико-генетическом консультировании.

Этапы и содержание проведения клинико-генеалогического метода

При проведении клинико-генеалогического метода выделяют два содержательно связанных этапа: первый этап посвящен сбору и представлению полученной информации; второй этап - генетический анализ родословной.

В практике использования клинико-генетического метода содержание первого этапа сводится к сбору генеалогической, медицинской и иной информации, существенной для решения конкретных задач, и графическому изображению родословного древа с подразделами «Условные обозначения» и «Легенды» родословной.

СБОР ГЕНЕАЛОГИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ И СОСТАВЛЕНИЕ РОДОСЛОВНОЙ

Источниками информации могут служить сведения, полученные при опросе пробанда, его родственников, данные семейных архивов, в том числе фотографических альбомов, семейные предания и легенды, информация домовых или хозяйственных книг, церковных записей и т.д. Источником информации часто служат данные, полученные при врачебном осмотре, результаты психологических, параклинических тестирований и других методов обследования членов родословной; данные медицинских документов (выписки из историй болезни, заключения специалистов, данные лабораторных и инструментальных методов исследований).

Сбор и составление родословной начинаются со сбора сведений о семье пробанда. Таким образом, пробанда можно определить как ключевое звено при построении родословного древа, с которого начинается сбор информации о родословной. Чаще всего, как было отмечено выше, это больной или носитель изучаемого признака. Однако за медико-генетической консультацией могут обращаться и здоровые индивиды. В этом случае используется термин «консультирующийся». В графическом изображении родословной пробанд должен всегда отмечаться стрелкой, идущей к элементу снизу вверх, слева направо. Дети одной родительской пары (братья и сестры независимо от пола и порядка рождений) называются сибсами. Если сибсы имеют только одного общего родителя, они называются полусибсами. Различают единоутробных (общая мать) и единокровных (общий отец) сибсов. Ядерной семьей называют родительскую пару и их детей (полных сибсов). Семьей в узком смысле называют родительскую пару и всех их детей, но иногда и более широкий круг родственников, хотя в последнем случае лучше использовать термин «род».

В зависимости от цели исследования родословная может быть полной или ограниченной; она может отражать либо клинические признаки (наличие /отсутствие заболевания, отдельных симптомов или признаков), либо генетический статус членов родословной. В каждом конкретном случае нужно стремиться к наиболее полному составлению родословной по восходящему, нисходящему и боковым направлениям. Чем больше поколений вовлекается в родословную, тем больше полезной информации она может содержать.

В случае неоднозначности или противоречивости генеалогической информации возникает необходимость уточнения сведений из «независимых» источников. Часто пациенты плохо информированы о болезнях родственников, нередко они скрывают семейные случаи из-за ложного стыда или, наоборот, «открывают» их у брачного партнера или его родственников, стараясь переложить «вину» за возникновение болезни у ребенка.

Как правило, внимание врача или исследователя сосредоточено на одном конкретном заболевании или признаке, поэтому обычно родословная составляется по одному или по ограниченному числу признаков. Однако часто существенное значение приобретают дополнительные признаки (симптомы), сопутствующие основному. В подобных случаях из большого количества разнообразных признаков нужно остановиться на наиболее значимых и важных, поскольку на практике выявить и проследить передачу большего числа признаков затруднительно. Ошибки идентификации признаков (в том числе врожденных морфогенетических вариантов развития) могут негативно повлиять на объективность выводов и заключений, сделанных на основе родословной. Желательно собирать сведения, касающиеся не только конкретного заболевания или патологического признака в семье, но и информацию обо всех случаях заболеваний, встречающихся среди членов семьи. Важно получить информацию о спонтанных абортах, мертворождениях и ранней детской смертности. Они могут иметь прямое отношение к существу вопроса и сыграть важную роль при оценке прогноза. Всегда нужно стремиться к получению данных как по отцовской, так и материнской линии вне зависимости от предполагаемого типа наследования заболевания или анализируемого признака. Очень важно провести личный осмотр пробанда и его родственников. Вместе с тем чем «глубже» генеалогический поиск, тем точнее и ценнее получаемая информация.

Во многих случаях даже подробного опроса родственников (или о родственниках) бывает недостаточно для точного определения их статуса, и необходимо провести более углубленное обследование: клиническое, инструментальное, параклиническое или лабораторно-генетическое. Это, безусловно, потребует дополнительных материальных и временных затрат. В связи с этим план такого обследования членов родословной нужно тщательно продумать с генетической точки зрения, исходя из принципа разумной достаточности - «меньше нельзя, а больше не нужно».

ГРАФИЧЕСКОЕ ИЗОБРАЖЕНИЕ И СОСТАВЛЕНИЕ ЛЕГЕНДЫ РОДОСЛОВНОЙ

Для наглядного представления и анализа собранной генеалогической информации используют графическое изображение родословной. Графически правильно выполненное изображение родословного древа позволяет однозначно идентифицировать родственные связи, в том числе кровнородственные браки, и с высокой вероятностью определить тип наследования заболевания в конкретной родословной - информацию, необходимую для проведения эффективного медико-генетического консультирования. Правила графического представления полученных данных и условные обозначения элементов родословного древа подробно изложены в главе «Медико-генетическое консультирование: организационные принципы и методические основы» настоящего издания. Однако в зависимости от задач, целей и особенностей родословных составитель вправе использовать оригинальные (собственные) обозначения с обязательным их объяснением в разделе «Условные обозначения».

При графическом изображении родословного древа должны строго соблюдаться определенные правила: каждое поколение обозначается римскими цифрами, обычно они ставятся слева от родословной. Последнее поколение предков, по которому доступна информация, обозначается римской цифрой I как первое поколение родословной.

Арабскими цифрами нумеруются все представители одного поколения (весь ряд) последовательно, слева направо. Таким образом, каждый член родословной имеет свои координаты, отраженные бинарной символикой. Все индивиды одного поколения должны располагаться по горизонтальной линии строго в один ряд. Братья и сестры располагаются в родословной в порядке рождения - от старшего к младшему. «Подвешивание» символов между рядами поколений является грубой ошибкой,

На рис. 13-1 приведена родословная по двум заболеваниям, поясняющая правила составления родословных.

Обязательной частью первого этапа является раздел «Легенда родословной», в котором приводится информация обо всех членах родословной, существенная для понимания или объяснения содержания родословной. Легенда родословной обычно включает: описание жалоб, состояния здоровья (данные физикального обследования) пробанда; описание состояния здоровья или заболеваний любого члена родословной, информация о котором важна для понимания характера и типа наследования заболевания; описание оригинальных методик, условий проведения тестов (как правило, параклинических), другой содержательной информации; возраст начала и характер течения заболевания у пораженных; исходы заболевания; причину смерти и возраст на момент смерти члена родословной; описание методов диагностики и идентификации заболеваний; перечень источников медицинских и других сведений. Весьма полезными могут оказаться сведения о возникающих осложнениях в ходе течения болезни; ответы организма больного на терапию и т.д.

При применении генеалогического метода в родословной важно отмечать лично обследованных на наличие признака (к этому также можно приравнять получение сведений из объективного источника, например, истории болезни) и необследованных, сведения о которых получены из ответов пробанда или родственников, а также из анкет.

Вторым этапом клинико-генеалогического метода является генетический анализ полученных данных с целью установления генетических закономерностей в конкретной родословной и их клиническая интерпретация.

Генетический анализ при моногенно обусловленных формах заболеваний часто направлен на установление типа наследования заболевания, что является решающим в постановке правильного диагноза.

В случаях, когда в родословной обнаружена наследственная болезнь, а анализ клинико-генеалогических данных показывает возможность передачи ее пробанду или другому родственнику (то есть унаследованный вариант), это позволяет врачу даже при стертой клинической симптоматике поставить диагноз данной наследственной болезни. Так, у 18-летнего юноши, направленного в нейрохирургическое отделение по поводу риноликвореи, при осмотре были выявлены незначительно выраженные признаки черепно-лицевого дизморфизма: брахицефалия, необычная форма носа, гипертелоризм. При анализе родословной пробанда оказалось, что его мать страдала синдромом Крузона (аутосомно-доминантный краниофаци-альный дизостоз), при котором описаны случаи ринореи. На основании вышеизложенного у больного был диагностирован синдром Крузона.

Определение типа наследования в конкретной родословной всегда является серьезной генетической задачей, хотя на первый взгляд она может показаться довольно легкой. Для решения сложных генетических задач по анализу родословных врач должен иметь специальную подготовку. Именно поэтому, когда необходим углубленный анализ клинико-генеалогической информации, врач общей практики направляет семью в медико-генетическую консультацию к врачу-генетику. Вместе с тем врачу общей практики надо знать основные критерии разных типов наследования, каждый из которых имеет свои характерные особенности.

Проблемы диагностики в клинической генетике

При оказании медико-генетической помощи больному и членам его семьи первым этапом является клиническая диагностика наследственных болезней, результаты которой во многом определяют всю последующую тактику ведения больного и оказания помощи семье. Сложность выполнения диагностического поиска генетически обусловленных заболеваний определяется главным образом несколькими основными феноменами.

Одним из наиболее значимых факторов является широкий клинический полиморфизм, присущий большинству наследственных заболеваний. Под клиническим полиморфизмом понимают разнообразие клинической картины, которое наблюдается в рамках одной нозологической формы, приводя к серьезным диагностическим проблемам. В силу плейотропного действия гена в патологическую картину заболевания могут вовлекаться различные органы, тяжесть поражения которых будет формировать основные жалобы пациента, на которых будет фокусироваться внимание врача. Так, например, при синдроме Марфана основными жалобами могут являться изменения со стороны костно-мышечной системы у одних больных и нарушения сердечно-сосудистой системы у других, формируя основное направление дифференциально-диагностического поиска. Кроме того, у части больных с синдромом Марфана изменения сердечно-сосудистой системы могут проявляться различными нарушениями: в некоторых случаях в виде дисфункции левого желудочка в форме дилатационной кардиомиопатии, в других - расслаивающей аневризмы аорты или пролапса митрального клапана; патология органов зрения может проявляться миопией слабой степени или подвывихом хрусталика, или патологией роговицы, или ранней катарактой, или различными сочетаниями перечисленных симптомов и т.д.

Клинический полиморфизм проявляется и различной степенью выраженности патологии, то есть тяжести и исходов патологического процесса: от очевидных максимально выраженных симптомов заболевания до стертых или даже субклинических проявлений. Например, аутосомно-рецессивное заболевание муковисцидоз может проявляться угрожающим жизни мекониальным илеусом у новорожденных, у детей старшего возраста - развитием хронического воспалительного процесса в легких или выраженной панкреатической недостаточностью и стертыми формами, протекая во взрослом возрасте под видом синуситов, хронической обструктивной болезни легких, мужского бесплодия. Крайней степенью фенотипического полиморфизма служат ситуации, когда при одной и той же унаследованной генной мутации могут развиться различные клинические формы (патологические фенотипы), проходящие под разными клиническими диагнозами. Примером может служить ситуация, когда у двух родных братьев из одной и той же семьи, страдающих наследственным аутосомно-доминантным синдромом Холта-Орама (синдром «рука-сердце»), на начальном этапе предполагаются различные заболевания: у одного из них - порок развития левой верхней конечности (лучевая косорукость) и минимальная степень вовлеченности сердечно-сосудистой системы в виде «функционального» систолического шума, а у другого сибса - тяжелый комбинированный порок сердца и минимальное вовлечение костной системы в виде проксимального смещения и незначительной гипоплазии I пальца левой кисти.

Другим значимым фактором, привносящим проблему в диагностику наследственных болезней, является генетическая гетерогенность, под которой понимают различную генетическую основу клинически сходных заболеваний. Генетическая гетерогенность, обусловленная разными мутациями одного гена (аллельная гетерогенность) или мутациями разных генов (локусная гетерогенность), присуща большинству наследственных заболеваний. Яркими примерами аллельной гетерогенности являются такие заболевания, как муковисцидоз или болезнь Вильсона-Коновалова, каждая из которых может быть обусловлена гомозиготностью или компаунд-гетерозиготностью по тысячам различных мутаций. Примером локусной гетерогенности являются такие заболевания, как пигментный ретинит, наследственная тугоухость, которые могут быть обусловлены мутациями генов, локализованных в различных хромосомах, и соответственно наследоваться как аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный или Х-сцепленный признак.

Еще одним фактором, осложняющим диагностику, является существование фенокопий - изменение фенотипа, копирующее клиническую картину наследственного заболевания, но возникающее под влиянием факторов среды (как правило, тератогенов), нарушающих эмбриональное развитие, но не связанное с изменениями генотипа. Примером фенокопии является клиническая картина варфариновой эмбриофетопатии, развивающаяся при приеме варфарина на сроке 6-12 нед беременности, напоминающая одну из наследственных форм точечной хондродисплазии (поражение эпифизов длинных костей и суставов), или талидомидная фетоэмбриопатия, сходная с клинической картиной аутосомно-рецессивного синдрома Робертса (псевдоталидомидного синдрома).

Другими затрудняющими диагностику факторами являются: 1) большое число наследственных заболеваний (более 5000 моногенных и сотни форм хромосомных болезней), что затрудняет приобретение собственного диагностического опыта у отдельного врача; 2) большое число генетически различающихся, но со сходной симптоматикой болезней, например, умственная отсталость как наиболее клинически значимое проявление наблюдается более чем при 850 различных наследственных болезнях, а также 3) низкая частота наследственных заболеваний, в силу этого малоизвестных. Кроме того, трудности диагностики могут быть связаны с некоторыми генетическими феноменами, существенно влияющими на формирование клинического фенотипа и характеристики наследования: мозаицизм, динамические мутации, ОРД, геномный импринтинг и другие факторы.

Синдромологический подход в диагностике наследственных болезней

В клинической генетике синдромологический анализ - это обобщенный анализ всех фенотипических признаков с целью выявления самостоятельной нозологической единицы, представляющей собой совокупность различных симптомов, объединенных общей этиологией и патогенезом. Успешное использование синдромологического анализа, с одной стороны, определяется знанием врачом основных понятий и положений клинической генетики, знанием тех дефиниций, которые используются при описании фенотипических проявлений наследственных болезней, наличием клинических навыков. Но, с другой стороны, несомненно, существует элемент интуиции, что в сочетании с опытом и знаниями определяет эффективность диагностического процесса.

Алгоритм синдромологического анализа, проводимого врачом-генетиком, принципиально не отличается от работы врача других специальностей, однако методика осмотра и постановки диагноза наследственного заболевания характеризуется некоторыми специфическими особенностями.

Выявление симптомов, характерных для наследственной патологии, предусматривает «поэтажное» (сверху вниз) обследование организма пациента: лицо, голова, шея, плечевой пояс и верхние конечности, грудная клетка и область живота, позвоночник, тазовый пояс и нижние конечности, наружные половые органы. Из выявленных при «поэтажном» обследовании пробанда симптомов выделяют выраженные признаки болезни и малые аномалии развития. К первым, являющимся основной причиной нарушения здоровья пациента и его жалоб, относятся грубые нарушения морфогенеза, как правило, представленные значительными отклонениями от анатомо-функциональных вариантов нормы. Например, пропорциональная и диспропорциональная низкорослость, макросомия, ожирение, скелетные аномалии, отставание в умственном и физическом развитии, нарушение обмена веществ. Нарушения роста, асимметрия строения тела, диспропорциональное развитие отдельных частей скелета часто являются облигатными или специфическими признаками наследственных болезней. Для диагностики наследственных болезней полезными оказываются следующие антропометрические сведения: рост, масса тела, особенности телосложения, длина конечностей и их частей, окружность груди, форма и размеры черепа, соотношение лицевого и мозгового черепа, соотношение отдельных частей организма. Таким образом, антропометрия выступает как важный элемент обследования больного с клинико-генетической точки зрения. Антропологические показатели пациента сравниваются с половозрастными нормами. Если они далеко «выходят» за пределы допустимых вариаций (перцентилей, стандартных отклонений), то являются диагностическими признаками. Обнаружение таких признаков позволяет «выстроить» дифференциально-диагностический ряд состояний, среди которых с наибольшей вероятностью может находиться предполагаемое заболевание у обследуемого пациента.

Следует подчеркнуть, что среди многих различных симптомов, используемых в диагностических целях, большинство не являются уникальными, а встречаются при разных заболеваниях, что определяет сложности диагностического поиска.

Голубые склеры, например, обнаруживаются при несовершенном остеогенезе и ряде других болезней соединительной ткани. Достаточно редкий признак - вывих хрусталика глаза - встречается при аутосомно-доминантной эктопии хрусталика, при которой он присутствует в 100% случаев, гомоцистинурии (75%), синдроме Вейля-Марчезани (65%), синдроме Марфана (45%). В таком случае диагноз должен основываться не на одном симптоме, а на их сочетании.

Дальнейший поиск проводится в выделенной группе заболеваний на основании выявления специфических аномалий, позволяющих из группы клинически сходных заболеваний выбрать наиболее вероятное и определить специфические методы лабораторной диагностики для подтверждения предполагаемого диагноза. Наличие специфических, необычных симптомов является отличительной чертой некоторых наследственных болезней обмена веществ. От нелеченых больных с ФКУ исходит специфический, так называемый «мышиный» запах; от мочи больных с лейцинозом исходит запах «кленового сиропа» (отсюда и второе название болезни); а биологические выделения больных с триметиламиноурией имеют запах рыбы. При обнаружении при офтальмологическом исследовании симптома, известного как симптом «вишневой косточки» (макулярная дегенерация сетчатки), в первую очередь в диагностическом поиске необходимо рассматривать вероятность болезни Тея-Сакса. Обнаружение у новорожденного ребенка чрезвычайно редкой формы центральной или мезоаксиальной полидактилии является характерным специфическим клиническим проявлением синдрома Паллистера-Холла.

Серьезную проблему в диагностике наследственных заболеваний представляет наличие у ребенка множественных признаков дизморфогенеза. При осмотре пациентов наряду с выявлением крупных ВПР необходимо обращать внимание на вариации строения какого-либо органа или его части. Вместе с тем не всегда значимые клинически, но этиологически связанные с действием мутантного гена или генотипа симптомы во многих случаях помогают в правильной диагностике наследственной патологии.

Раздел клинической генетики, изучающий происхождение морфологических вариантов и структурных дефектов, а также их информативную значимость в диагностике наследственных заболеваний, называется дизморфологией. Существенной частью ее исследований являются выявление и классификация различных аномалий и их комбинаций. С практической точки зрения точное описание выявляемых у пациента дизморфий является важным инструментом диагностического процесса, предшествующим другим медицинским и лабораторным исследованиям. Правильная интерпретация и оценка значимости обнаруженных дизморфологических признаков в конечном итоге направляют ход диагностического процесса по правильному пути, определяя тактику дальнейших исследований. Постановка обоснованного клинического диагноза позволяет целенаправленно искать генетическую причину заболевания с целью получить более точную оценку повторного риска и, следовательно, повысить эффективность генетического консультирования, спрогнозировать и провести своевременные вмешательства для предотвращения различных осложнений, осуществить выбор наиболее приемлемой терапии и реабилитации.

Ребенок с дизморфиями вызывает беспокойство у родителей и является причиной настороженности врача-неонатолога и педиатра. Дизморфии характерны для многих наследственных синдромов как хромосомной, так и генной природы. К настоящему времени известно и значительное число наследственных болезней обмена веществ, для которых характерен дизморфологический фенотип. Это побуждает врачей включать метаболический скрининг в план обследования новорожденных с ВПР или детей с необычным фенотипом. Известным примером метаболического расстройства, которое сопровождается не только черепно-лицевыми аномалиями, но и многими ПР (постаксиальная полидактилия, ПР сердца и почек, аномалии половых органов и другие) является синдром Смита-Лемли-Опица. Другим примером является группа наследственных нарушений гликозилирова-ния, которым часто сопутствуют врожденные дефекты. Недавним неожиданным открытием было нарушение метаболизма пуринов у пациентов с постаксиальным акрофациальным дизостозом Миллера, у которых основными симптомами являются гипоплазия скуловых костей, микрогнатия, колобома нижнего века, дефекты сегментации позвоночника, аномалии пальцев кистей/стоп и отсутствие пятых пальцев. Таким образом, на долабораторном этапе оценка «дизморфологического статуса» пациента, основанная на тщательном и внимательном осмотре больного, крайне важна.

Дизморфологический анализ подразумевает оценку значимости малых аномалий развития у ребенка с необычным фенотипом. Напомним, что к малым аномалиям развития относятся незначительные отклонения, которые не вызывают нарушения функции органа и не требуют какой-либо коррекции. Эти отклонения встречаются в популяции с низкой частотой, однако у детей с синдромальными состояниями частота их значительно выше. Так, горизонтальная складка ладони встречается в популяции с частотой 5-6%, а при синдроме Дауна ее частота достигает 30%. Некоторые частые микроаномалии развития, встречающиеся в разных системах, приведены в табл. 13-1. Более 70% всех регистрируемых микроаномалий локализуются в области головы, шеи и конечностей.

Некоторые малые аномалии развития, называемые микроформами крупных ПР, по сути, являются минимальными проявлениями известных ВПР. Они всегда локализуются в области расположения крупного порока. Например, видимые только на рентгенограмме костные изменения небного сегмента, раздвоение язычка, асимметрия крыльев носа расцениваются как микроформы врожденного порока развития челюстно-лицевой области - расщелины губы и/или нёба. Другим примером микроформы другого известного порока является скрытое расщепление позвоночника (spina bifida occulta). В ряде случаев оно проявляется ограниченным втяжением участка кожи (обычно в пояснично-крестцовой области), гемангиомами и локальным гипертрихозом (усиленным ростом волос). В других случаях вышеперечисленные симптомы могут отсутствовать, а скрытое расщепление позвоночника выявляется случайно только при рентгенографическом исследовании в виде незаращения дужек позвонков (но без каких-либо клинических проявлений). И в первом, и во втором случаях такое отклонение в развитии расценивают как микроформы грубого порока развития - спинномозговой грыжи.

В медицинской литературе малые аномалии развития часто обозначаются такими терминами, как стигмы дизэмбриогенеза, микропризнаки, микропроявления, врожденные морфогенетические варианты. Они могут представлять собой унаследованные морфогенетические варианты нормы либо отражать небольшое случайное отклонение в гомеостазе эмбрионального развития («онтогенетический шум»), но могут быть также и неспецифическими признаками эмбрионального дизморфогенеза или частью общего патологического фенотипа, обусловленного мутацией. В последнем случае вариант развития представляет собой специфический признак (т.е. симптом), как правило, ассоциированный с другими симптомами заболевания.

Идентификация малых аномалий развития особенно важна для диагностики наследственных синдромов с варьирующей экспрессивностью, а также для выявления носителей, поскольку обнаруженный признак может быть единственным фенотипическим проявлением действия гена. В то же время надо помнить, что выявление подобного признака у человека не является абсолютным свидетельством носительства какого-либо патологического гена.

Оценка диагностической значимости малых аномалий развития должна проводиться в совокупности с другими данными физикального обследования и клинико-генеалогического анализа. Так, например, гипертелоризм, выявленный у матери пробанда с гипоспадией, дисфагией и гипертелоризмом, должен быть расценен как часть патологического фенотипа, обусловленного мутацией, а у ребенка можно подозревать Х-сцепленный рецессивный синдром Опица-Фриаса. Такой подробный семейный фенотипический анализ позволяет дифференцировать унаследованные случаи наследственных заболеваний от спорадических, обусловленных свежими мутациями, а также от эффекта тератогенного воздействия, что существенно влияет на генетический прогноз.

Следует подчеркнуть, что у ребенка, имеющего необычные признаки или внешние особенности, повышен риск серьезных нарушений или ПР. Как было показано в различных исследованиях, существует корреляция между числом малых аномалий и вероятностью выявления крупной аномалии развития (табл. 13-2). В таких случаях рекомендуется проведение дополнительных инструментальных исследований, таких как эхокардиография, УЗИ органов брюшной полости, офтальмологическое обследование, нейросонография и др.

Малые аномалии играют важную роль в синдромологическом анализе. Основной подход клинического распознавания синдромов базируется на выявлении неслучайных комбинаций больших и малых аномалий развития. Причем крупные ПР далеко не всегда бывают основными детерминирующими признаками для диагностики синдрома. Например, наличие серьезного порока сердца не позволяет определить синдром только по этому признаку. Так, стеноз легочной артерии встречается более чем в 100 синдромах. Однако наличие этого порока в комбинации с другими аномалиями, такими как гипертелоризм, птоз, эпикант, антимонголоидный разрез глаз, короткая и широкая шея, невусы, крипторхизм, позволяет выделить из этого достаточно большого дифференциально-диагностического ряда синдром Нунан, в котором сочетаются перечисленные крупные и малые аномалии развития.

Значение клинического этапа диагностики наследственных синдромов не снижается и в современное время, характеризующееся бурным развитием и внедрением в практику лабораторных методов, в частности молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических, безусловно, расширивших возможности диагностики, в том числе редких наследственных синдромов. Тем не менее именно результаты долабораторного обследования могут определять рекомендации по лабораторному обследованию пациента, сокращая сроки исследования и, что немаловажно, экономические затраты. Для иллюстрации приведем пример из практики. У ребенка с выраженной задержкой психомоторного развития, прогрессирующей микроцефалией, резистентными к терапии судорогами при осмотре были выявлены особенности внешнего вида, включавшие гипертелоризм, широкую переносицу, короткий нос, тонкие губы с опущенными углами, низко расположенные ушные раковины. Наряду с этими довольно часто встречающимися признаками было обращено внимание на необычный рост волос по типу ирокез и на многочисленные пятна цвета портвейна на коже туловища и конечностей, представлявшие собой капиллярные ангиодисплазии. По совокупности всех выявленных фенотипических признаков был предположен диагноз редкого недавно описанного аутосомно-рецессивного синдрома микроцефалии с капиллярными мальформациями (OMIM 614261). Причиной синдрома являются мутации в гене STAMBP в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии. Учитывая выявленную характерную для этого синдрома комбинацию как грубых отклонений развития, так и малых аномалий, было решено провести поиск мутаций методом прямого автоматического секвенирования гена STAMBP. В результате были выявлены две патогенные мутации гена STAMBP, что подтвердило клинический диагноз.

Таким образом, наличие малых аномалий может указывать на специфический синдром. Однако малые аномалии развития имеют разную диагностическую значимость. Среди них можно выделить признаки с низкой диагностической значимостью или неспецифические признаки, которые встречаются при многих синдромах, например, сандалевидная щель, клинодактилия, гипертелоризм, эпикант. Но выделяют и специфические и даже уникальные признаки, наличие которых позволяет предположить с высокой вероятностью диагноз конкретного синдрома (табл. 13-3).

Учитывая устойчивое сходство внешних проявлений некоторых наследственных синдромов у разных больных, в синдромологическом подходе к диагностике наследственных болезней используется метод портретной диагностики. В таких случаях у ребенка распознается сочетание признаков, которые встречаются при определенных заболеваниях (распознавание образов). Этот метод называют еще гeштальт(gestalt)-диагностикой, означающей, что врач распознает сразу комбинацию признаков без необходимости описания отдельных особенностей. Конечно, это можно сделать, только если у врача есть достаточный опыт оценки фенотипов детей с врожденными аномалиями.

В большинстве случаев после сбора всей информации перед врачом встает проблема поиска синдрома на основании выявленных фенотипических признаков. Для облегчения поиска и верификации предполагаемого диагноза созданы базы данных, содержащие сведения о наследственных синдромах, а также различные компьютерные диагностические программы. Базы данных по дизморфологии помогают врачам проводить дифференциально-диагностический поиск для пациента с выявленным набором признаков. Наиболее широко используемой базой является OMIM (интернет версия Online Mendelian Inheritance in Man), представляющая собой постоянно обновляющийся каталог наследственных моногенных заболеваний человека и генов, участвующих в развитии различных признаков и заболеваний. По последним данным, в нем содержатся сведения о более чем 5500 моногенных заболеваний и признаков. Среди диагностических компьютерных программ известна Оксфордская медицинская база данных (Oxford Medical Database - OMD), имеющая два подраздела - London Dysmorphology Database, включающий сведения о более чем 2300 нехромосомных синдромов и London Neurogenetics Database, содержащий сведения более чем о 2200 наследственных заболеваниях центральной и периферической нервной системы. Менее распространена австралийская компьютерная система идентификации наследственных синдромов - POSSUM (Pictures Of Standard Syndromes and Undiagnosed Malformations). База данных POSSUM содержит информацию о более чем 4000 синдромов, включая множественные ПР, хромосомные аномалии, тератогенные синдромы, нарушения обмена веществ, иллюстрируемые более чем 30 000 изображений, включающих фотографии, рентгеновские снимки, диаграммы и описания гистологической картины. Известны и другие диагностические и информационные ресурсы, посвященные наследственным синдромам и заболеваниям (GeneReviews, Phenomizer, Orphanet и др.).

Надо подчеркнуть, что для эффективного использования диагностических программ большое значение имеет правильное описание фенотипических признаков пациента с использованием соответствующих определений и терминов. Ошибочное использование терминологии в описании фенотипа больного может повести диагностический поиск в неверном направлении. Для унификации терминов в обозначении были разработаны стандарты терминологии, опубликованные в 2009 г. в American Journal of Medical Genetics, а также такой ресурс, как Human Phenotype Ontology, словарь симптомов наследственных болезней, который используется в настоящее время во многих базах данных, включая OMIM, Orphanet и многие другие.

Таким образом, знание основных признаков наследственных болезней, владение особенностями осмотра и обследования пациентов и их родственников, клинико-генеалогическим методом и использование синдромологического подхода к диагностике позволяют врачу оказывать эффективную и своевременную медицинскую помощь, а также определять пути и методы профилактики наследственных болезней. Именно врачебный осмотр должен предварять применение всех других методов диагностики. Он позволяет заподозрить наследственную болезнь у пациента и проводить в дальнейшем «прицельное» обследование, поскольку подробный анализ фенотипа больного подчас является единственным и решающим подходом в диагностике. В условиях широкого развития и внедрения современных лабораторных диагностических методов долабораторный этап обследования больного с наследственным заболеванием приобретает еще более важное значение для выбора адекватного метода исследования пациента. В заключение хотелось бы напомнить выражение известного специалиста в области дизморфологии Raoul Hennekam о том, что «внимательное изучение семейной истории и тщательное физикальное обследование пациента по-прежнему остаются важнейшими инструментами современного врача».

Список литературы

В век молекулярно-генетических технологий биохимические методы не потеряли своей актуальности. Прежде всего они применяются для диагностики обширного класса моногенных заболеваний - наследственных болезней обмена веществ (НБО), и именно биохимические методы являются основными при проведении массового скрининга новорожденных и тестирования групп риска на наследственные болезни (селективный скрининг). Кроме того, биохимические тесты позволяют оценить функциональную значимость вариантов последовательности нуклеотидов с неизвестным клиническим значением, найденных при секвенировании. Наконец, с появлением новых методов терапии наследственных заболеваний именно анализ биохимических маркеров становится необходимым для оценки эффективности лечения некоторых наследственных болезней.

Биологические маркеры при наследственных болезнях

БМ - биологические молекулы, различные по своей структуре и свойствам, от простых метаболитов (аминокислоты, аммоний) до сложных макромолекул (гликосфинголипиды, белки), участвующие в биологическом процессе, связанном с клиническими проявлениями заболевания. Поиску новых БМ и их применению в клинической практике в последнее время уделяется большое внимание.

С биохимической точки зрения БМ при наследственных болезнях можно разделить на следующие категории: метаболиты, ферменты и другие белки, которые не являются ферментами.

Также принято по функциональному принципу выделять «первичные» БМ, которые напрямую связаны с патологическим процессом. Например, повышение уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина (HbA1c) является прямым БМ сахарного диабета. При ФКУ первичным БМ является уровень фенилаланина, при МПС - гликозаминогликанов (ГАГ). Диагностическая ценность измерения первичных БМ, как правило, является высокой, и тест на эти маркеры характеризуется близкой к 100% чувствительностью и специфичностью.

Кроме того, известно большое число «вторичных» БМ, в этих случаях связь между первичным биохимическим дефектом и БМ является косвенной. Например, образующиеся при первичном биохимическом блоке вещества могут влиять на другие ферментные реакции, ингибируя или, наоборот, активируя их, что приводит к накоплению «вторичных» метаболитов. Накопление нерасщепленных субстратов в клетке может приводить к активации компенсаторных процессов, используемых клеткой для поддержания гомеостаза, и вторичные БМ быть производными первичных БМ. Иногда изменение концентрации «вторичных» БМ происходит вследствие не всегда известных патофизиологических процессов. В ряде случаев вторичные БМ могут оказаться более информативными, чем прямые, предоставляя более полную информацию о биохимическом дефекте и его последствиях для метаболизма. Например, концентрация оротовой кислоты повышается при нарушениях активности одного из ферментов цикла мочевины - орнитинтранскарбамилазы (ОТС). Мутации в гене ОТС приводят к нарушению синтеза цитруллина из орнитина и карбамоилфосфата. Избыток карбамоилфосфата используется клеткой для синтеза пиримидиновых нуклеотидов, а оротовая кислота является одним из продуктов этих реакций. Повышение ее концентрации в крови и моче является ценным БМ нарушений цикла мочевины. Другим примером этой категории БМ является хитотриозидаза (хитиназа), секретируемая активированными макрофагами, когда они накапливают глюкоцереброзид. При болезни Гоше и других лизосомных болезнях накопления (ЛБН) ее активность значительно превышает норму. Производными первичных БМ являются оксистеролы (производные холестерина) при болезни Ниманна-Пика типа С. Следует учитывать, что специфичность и чувствительность тестов, предназначенных для анализа вторичных БМ, различны, и для некоторых заболеваний приближаются к 100%, а для других не превышают и 70%.

Методы определения биомаркеров и их характеристика. методы биохимической генетики

Многие из известных в настоящее время первичных БМ для наследственных болезней были выделены благодаря пониманию патогенеза заболевания - первичного биохимического дефекта. В то время как большинство вторичных БМ были обнаружены при исследовании протеома, метаболома или анализа экспрессии генов при наследственной патологии.

Метаболиты - основные БМ, играющие ведущую роль в диагностике НБО. Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, МПС, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и др. Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в анализе метаболитов. Современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым, в том числе, относят и биологический материал.

Для количественного анализа маркеров-метаболитов при НБО успешно применяют такие хроматографические методы, как газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография, а также хромато-масс-спектрометрия (ХМС). Также довольно широко применяется для анализа и метаболитов тандемная масс-спектрометрия (МС/МС). При этом для проведения анализа длительная подготовка проб не требуется (как, например, для газовой хроматографии), а время исследования занимает несколько минут.

Определение активности ферментов в биологических жидкостях и тканях - золотой стандарт диагностики ЛБН, а также гликогенозов, митохондриальных болезней, некоторых органических ацидурий, дефектов митохондриального β-окисления, нарушений обмена пуринов и пиримидинов. Некоторые из этих методов довольно сложны и требуют проведения биопсии мышечной или печеночной ткани. Для определения активности ферментов применяют различные методы в зависимости от применяемых субстратов - флюориметрические, спек-трофотометрические, радиоизотопные (в последние годы практически не используется), а также масс-спектрометрические.

Следует отметить, что определение активности ферментов при наследственных заболеваниях - процедура, проводимая только в специализированных лабораториях. Измеряют активность ферментов в лейкоцитах крови, культуре кожных фибробластов, ворсинах хориона и даже в пятнах высушенной крови.

Для анализа белков, не являющихся ферментами, применяют различные методы гистохимического анализа, определение концентрации с применением антител (иммуноферментный анализ), а также методы масс-спектрометрии: ВЭЖХ-МС/МС (высокоэффективная жидкостная хроматография масс-спектрометрия) и метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI). Иммуноферментный анализ, например, традиционно используется для неонатального скрининга адреногенитального синдрома и врожденного гипотиреоза.

ДИАГНОСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП ЗАБОЛЕВАНИЙ

В идеале диагностика наследственного заболевания должна охватывать исследования метаболитов, анализ белка и далее выявление мутации, но на практике при многих заболеваниях более важную роль играет анализ метаболитов, например при аминоацидопатиях, при других - ферментов, например, при ЛБН. Для многих наследственных болезней пока БМ не найдено, или их определение затруднительно.

В качестве иллюстрации приводим примеры применения биохимических методов в диагностике пяти групп наследственных заболеваний.

Органические ацидурии

Органические кислоты (ОК) выступают в качестве промежуточных метаболитов в различных внутриклеточных метаболических путях, таких как катаболизм аминокислот, митохондриальное β-окисление жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот и биосинтез холестерина и жирных кислот (рис. 14-1).

Органические ацидурии (также известные как органические ацидемии, нарушения метаболизма органических кислот) представляют собой группу нарушений обмена, характеризующихся повышенной экскрецией органических кислот (кроме аминокислот) с мочой.

Группа органических ацидурий включает около 150 заболеваний, которые обусловлены недостаточностью ферментов, участвующих в метаболизме коэнзима А (КоА) - активированных карбоновых кислот. Эти нарушения приводят к накоплению ОК, которые сами по себе являются токсичными или метаболизируются с образованием токсичных метаболитов. Концентрацию ОК в моче определяют методом ХМС, а некоторых - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Накапливающиеся эфиры ОК (ацил-КоА) связываются с карнитином, образуя соответствующие ацилкарнитины, которые можно детектировать методом МС/МС.

Спектр и концентрация ОК могут изменяться у пациентов с различными метаболическими заболеваниями, включая наследственные нарушения обмена аминокислот, жирных кислот, углеводов, нейротрансмиттеров, витаминов, пуринов и пиримидинов, стеролов и митохондриальные болезни. Почки эффективно выделяют ОК, поэтому моча является предпочтительным типом биоматериала для исследования при подозрении на органические ацидурии. В моче человека присутствует более 500 различных ОК. При органических ацидуриях концентрация определенных ОК, как правило, в десятки и даже сотни раз превышает норму.

На рис. 14-3 представлены результаты биохимической диагностики метилмалоновой ацидурии.

Нарушения, которые могут быть выявлены или предположены с высокой вероятностью в результате анализа ОК мочи, включают классические органические ацидурии, связанные с нарушением метаболизма аминокислот [изовалериановую ацидемию (MIM 243500), метилмалоновую ацидемию (различные фенотипы), пропионовую ацидемию (MIM 606054), глутаровую ацидемию типа I (MIM 231670)], а также другие нарушения обмена аминокислот [фенилкетонурию (MIM 261600), тирозинемию типа I (MIM 276700), алкаптонурию (MIM 203500), 3-метилглу-таконовую ацидурию типа I (MIM 250950), болезнь с запахом кленового сиропа мочи (MIM 248600)]. Нарушения в спектре ОК могут также выявляться при дефектах цикла мочевины (повышение оротовой кислоты), окисления жирных кислот [дефиците ацил-КоА-дегидрогеназы с короткой цепью (MIM 201470), дефиците ацил-КоА-дегидрогеназы средней цепи (MIM 201450), множественном дефиците ацил-КоА-дегидрогеназы (MIM 231680)], энергетического обмена [дефиците пируватдегидрогеназы, дефиците фумаразы (MIM 606812), дефиците SUCLA2 (MIM 603921)], метаболизма пуринов и пиримидинов [дефиците уридин-монофосфатсинтетазы (MIM 613891), дефиците дигидропиримидиндегидрогеназы (MIM 274270)], болезни Канавана и т.д.

Клинические показания для проведения анализа ОК мочи разнообразны и включают неврологические нарушения: задержку психомоторного развития, умственную отсталость, нарушения сознания, судороги, атаксию, мышечную гипотонию, а также острую печеночную недостаточность, метаболический ацидоз с дефицитом оснований; гипераммониемию, лактат-ацидоз, необычный запах мочи или тела.

Аминоацидопатии

Аминоацидопатии включают более 70 заболеваний, связанных с нарушениями ферментов, участвующих в катаболизме аминокислот. В отдельную группу выделяют болезни, обусловленные нарушением цикла мочевинообразования. Аминоацидопатии относятся к наиболее частым НБО. Как правило, эти нарушения называют по веществу, накапливающемуся в наибольших концентрациях в крови (-емии) или моче (-урии). К наиболее распространенным нарушениям обмена аминокислот относятся: ФКУ, цитруллинемия, тирозинемия, гиперглицинемия, цистиноз и другие.

Многие аминоацидопатии характеризуются ранним началом и сопровождаются симптомами острой интоксикации, для них характерны неврологические нарушения - угнетение сознания, судороги, поскольку происходит накопление большого количества токсичных органических кислот (нарушения цикла мочевины, болезнь с запахом кленового сиропа мочи, гиперглицинемия). Некоторые из аминоацидопатий сопровождаются преимущественным поражением печени (тирозинемия типа 1, нарушения цикла мочевины) или почек (цистиноз). Также они могут протекать с задержкой психомоторного развития и прогрессировать относительно медленно (ФКУ). Большинство из аминоацидопатий хорошо поддаются диетотерапии (табл. 14-1, рис. 14-4).

При этом необходимо отметить, что изменение концентрации аминокислот не всегда является высокоспецифичным и может наблюдаться у недоношенных детей, при хронических заболеваниях, воспалительных процессах. Например, повышение тирозина может наблюдаться не только при тирозинемии, но и при других заболеваниях, связанных с поражением печени.

Благодаря высокой чувствительности, специфичности и пропускной способности МС/МС играет основную роль как в текущей диагностике этой группы заболеваний, так и в массовом скрининге новорожденных.

Нарушения β-окисления жирных кислот

Жирные кислоты входят в состав клеточной мембраны, ферментов и гормонов и являются наиболее важным источником энергии для многих организмов. Существует несколько типов окислительной деградации жирных кислот в клетке, а именно α-, β-и ω-окисление, которые происходят в митохондриях и пероксисомах. Самый известный путь - это β-окисление, происходящее в матриксе митохондрий. В β-окислении жирных кислот принимают участие по меньшей мере 25 ферментов и специфических транспортных белков. Показано, что расстройства работы 18 из этих ферментов вызывают заболевания, которые называются нарушениями митохондриального β-окисления жирных кислот, или дефектами окисления жирных кислот. Клиническая картина данных заболеваний крайне разнообразна. Считается, что около 1-3% синдромов внезапной детской смерти младенцев вызваны дефектами окисления жирных кислот. Показания к обследованию на дефекты окисления жирных кислот сходны с таковыми при органических ацидуриях и аминоацидопатиях, но также следует назначать исследование пациентам с гипогликемическими состояниями, детям с кардиомиопатией, взрослым и подросткам с признаками рабдомиолиза и эпизодами миоглобинурии.

*Анализ проводится в ФГБНУ МГНЦ, Москва.

Диагностика дефектов окисления жирных кислот затруднена тем, что вне острого криза биохимические показатели у пациентов могут быть в норме. На сегодняшний день самым высокочувствительным и специфичным тестом для диагностики дефектов окисления жирных кислот является определение свободного карнитина и ацилкарнитинов методом МС/МС.

Лизосомные болезни накопления

ЛБН - группа наследственных метаболических заболеваний, связанных со снижением активности лизосомных гидролаз или нарушением системы транспорта белков и субстратов в лизосомы. Около 50 заболеваний относят к группе ЛБН, каждое из которых встречается крайне редко, но их суммарная частота составляет примерно 1:7000 живых новорожденных. Для некоторых из них существуют БМ - метаболиты, которые можно определять в крови и тканях. К метаболитам относятся, например, ГАГ при МПС, лизосфинголипиды при сфинголипидозах.

Показано, что в тканях пациентов со многими сфинголипидозами наблюдается накопление лизосфинголипидов (производных сфинголипидов, содержащих свободную аминогруппу), играющих различную патофизиологическую роль. В последние годы благодаря развитию МС/МС стало возможным их определение в различных биологических жидкостях, и практически для каждого заболевания из группы сфинголипидозов описан свой лизосфинголипид в качестве БМ для диагностики и контроля лечения. Так, при болезни Фабри повышается глоботриаозилсфингозин (lysoGb3), при болезни Гоше - гликозилсфингозин (GlcSph, или lysoGL1), при болезни Краббе - галактозилсфингозин (психозин, или GalSph), лизосфингомиелин (LysoSM) - при болезни Ниманна-Пика типов А/В и лизосфингомиелин-509 (LysoSM-509) - при болезни Ниманна-Пика типа С. Измерение этих БМ возможно и в плазме крови, и в пятнах высушенной крови.

Также необходимо отметить, что повышение концентрации lysoGb3 может быть единственным диагностическим маркером у женщин-носительниц болезни Фабри (БФ). У пациенток с БФ активность фермента может быть в норме, поэтому при диагностике БФ у женщин рекомендуют на первом этапе определять одновременно активность фермента и концентрацию метаболитов, а затем проводить ДНК-диагностику.

Для МПС проводят количественное определение ГАГ в моче и их качественный анализ методом электрофореза. Количество ГАГ в моче определяют спектрофото-метрическим методом с использованием диметиленового синего (DMB). Следует отметить, что уровень ГАГ - возрастзависимый показатель, поэтому необходимо ориентироваться на возрастные референсные значения. При МПС IV и VI типов концентрация ГАГ у пациентов может быть и в пределах нормы, поэтому нормальные значения этого показателя не позволяют исключить диагноз МПС.

В настоящее время разрабатываются подходы для определения ГАГ в крови и моче с помощью МС/МС, что позволит одновременно проводить и количественный, и качественный анализ.

Ферментная диагностика - определение активности ферментов лизосом - является золотым стандартом лабораторной диагностики ЛБН. Современные технологии позволяют определять активность ферментов лизосом в лейкоцитах крови, культуре кожных фибробластов, ворсинах хориона и пятнах высушенной крови. Для этого применяются два основных методических подхода - флуориметрический метод и определение активности ферментов с применением МС/МС.

Метод МС/МС завоевал большую популярность, поскольку является высокочувствительным и производительным и требует небольшого количества биологического материала. Тест является высокоспецифичным для каждого конкретного заболевания, поскольку применяются субстраты, близкие по своему строению к натуральным. Вторым немаловажным плюсом метода является возможность одновременного определения активности нескольких ферментов, что позволяет проводить исследование на ряд ЛБН. В данное время разработаны тест-системы для анализа 6 лизосомных ферментов, но следует ожидать, что через несколько лет появится возможность определять активность 10 и более ферментов в одном пятне крови. Хроматографическое разделение продуктов реакции для определения активности 6 лизосомных ферментов представлено на рис. 14-5 (см. цв. вклейку).

Пероксисомные болезни

Пероксисомные болезни - гетерогенная группа наследственных болезней обмена веществ, затрагивающих одну или несколько функций пероксисом.

Известно около 20 нозологических форм пероксисомных болезней, которые подразделяют на две подгруппы. Первую составляют заболевания, связанные с нарушением биогенеза пероксисом. При этих болезнях наблюдаются дефекты формирования органелл, снижение числа или полное отсутствие пероксисом в тканях. К настоящему времени идентифицировано 14 белков-пероксинов, мутации в которых приводят к нарушению биогенеза пероксисом у человека. Вторая подгруппа - это изолированная недостаточность отдельных белков пероксисом, что приводит к нарушению определенной биохимической функции. При нарушениях биогенеза пероксисом выявляют нарушения α- и β-окисления жирных кислот, фитановой кислоты и синтеза плазмалогенов.

Диагностическими БМ этой группы болезней являются прежде всего метаболиты: очень длинноцепочечные жирные кислоты - гексакозановая (С26), гексакозеновая (С26:1), тетракозановая (С24) и докозановая (С22) кислоты, а также соотношение концентраций кислот С24/С22 и С26/С22. Их концентрация и соотношения повышаются при большинстве пероксисомных болезней. Но следует отметить, что концентрации кислот С22 и С24 в ряде случаев могут быть в норме. Ложноположительные результаты при определении концентрации очень длинноцепочечных жирных кислот могут наблюдаться у пациентов, находящихся на кетогенной диете.

В связи с появлением методов высокопроизводительного секвенирования потребность в проведении тестов по выявлению дефекта определенного пероксина отпала, однако при выявлении мутаций в этих генах проведение биохимических тестов является необходимым для подтверждения диагноза.

Одним из БМ, который потенциально может применяться для скрининга новорожденных на адренолейкодистрофию, является 1-гексаноил-2-лизо-sn-3-глицеро-фосфорилхолин (С26:0-лизоФХ). Недавно был разработан метод для одновременного определения С26:0-лизоФХ, аминокислот, ацилкарнитинов, сукцинилацетона в одном сухом пятне крови, что позволит одновременно проводить тестирование не только на нарушения обмена аминокислот, органических кислот, дефекты митохондриального β-окисления, но и пероксисомную патологию.

Введение

Некоторая часть генетического груза вида Homo sapiens sapiens связана с заболеваниями, возникновение и развитие которых являются следствием изменения(й) в наследственном аппарате клеток. Более 70% патологий человека представлено мультифакторными, или полиэтиологическими, болезнями - это болезни, которые обусловлены как влиянием окружающей среды, так и изменениями генетического материала. Особенностями данной группы болезней являются высокая популяционная частота, выраженный клинический полиморфизм, неменделевское наследование, зависимость проявлений болезни от факторов внешней среды, возраста и пола больного. С генетической точки зрения характерной чертой данной группы заболеваний является то, что генетическим фактором риска является носительство вариантов нескольких (многих) генов одновременно, что делает практическое определение вероятности развития данной патологии для конкретного индивида весьма неточным. К наиболее частым мультифакторным болезням относят сахарный диабет, бронхиальную астму, ИБС, псориаз, шизофрению и многие другие.

До 10% наследственных патологий обусловлено изменениями числа или структуры хромосом. В настоящее время известно более 5 000 различных заболеваний, связанных с геномными и хромосомными мутациями.

18% приходится на моногенные болезни. Причиной данной группы заболеваний являются изменения ДНК на уровне генов. Необходимым и достаточным условием возникновения клинического фенотипа моногенной болезни является наличие мутаций в причинном гене. Однако клинические проявления болезни могут зависеть от пола, возраста больного, а манифестация заболевания - быть связана с неблагоприятными условиями внешней среды - травмой, переохлаждением, интенсивными физическими нагрузками. Данные болезни наследуются в соответствии с законами Менделя и также называются менделирующими болезнями. На середину 2021 г. в базе данных OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) описано 5872 клинических фенотипов, для 4106 из них известен молекулярный базис. Для большинства моногенных болезней характерна генетическая гетерогенность - за развитие одного и того же клинического фенотипа в неродственных семьях могут отвечать мутации различных генов. Среди моногенных болезней выделяют частые, встречающиеся с частотой более чем 1/10 000, - ФКУ, муковисцидоз, адреногенитальный синдром, и редкие - частота менее 1/100 000. Каждый человек является носителем в среднем пяти рецессивных мутаций, не проявляющихся при наличии второй нормальной копии гена. Именно моногенные болезни являются основным объектом ДНК-диагностики.

ДНК-диагностика - это поиск генетической причины болезни на уровне изменений ДНК. ДНК-диагностика направлена на поиск непосредственной причины наследственной болезни - патогенных вариантов гена и является наиболее адекватным и точным исследованием при моногенной патологии. Проведение данной диагностики возможно, даже если неизвестен точный патогенез развития болезни, но известен ген, который ее вызывает.

В зависимости от поставленных задач различают следующие виды ДНК-диагностики:

В зависимости от объекта исследования выделяют косвенную и прямую ДНК-диагностику. При косвенной ДНК-диагностике исследуют не непосредственную причину заболевания, а определяют наследование в семье участка хромосомы, несущей предположительно мутантный ген по генетическим маркерам, лежащим в непосредственной близости от этого гена (рис. 15-1, см. цв. вклейку). Точность данного типа ДНК-диагностики составляет 95-99%, однако для его применения необходимы уверенность в клиническом диагнозе и знание того, что за данный клинический фенотип могут быть ответственны мутации только одного гена. Так как практически для всех заболеваний описана генетическая гетерогенность, использование косвенной диагностики как единственного метода нецелесообразно. На сегодняшний день возможно ее применение в семьях с точно установленной генетической причиной болезни для повышения точности пренатальной или преимплантационной генетической диагностики.

Прямая ДНК-диагностика направлена на поиск мутации, являющейся непосредственной причиной болезни. Точность такой диагностики составляет 100%. Возможно проведение прямой ДНК-диагностики при сомнительном диагнозе и при наличии нескольких локусов заболевания. Прямая ДНК-диагностика позволяет диагностировать носительство мутации в семьях с моногенной патологией даже при отсутствии материала больного.

Методы молекулярно-генетической диагностики

Материалом для проведения диагностики являются нуклеиновые кислоты, выделенные из ядерных клеток. Наиболее удобным материалом для исследования является цельная кровь в пробирке с антикоагулянтом или высушенная на фильтровальной бумаге. В связи с тем, что некоторые химические элементы ингибируют работу фермента ДНК-полимеразы, для проведения ДНК-исследования подходят только антикоагулянты этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или цитрат натрия. Кроме того, ингибировать ПЦР может большое количество чужеродной, например, бактериальной ДНК. Выделение ДНК производят различными методами в зависимости от типа предоставленного материала и метода молекулярно-генетического анализа, планируемого для исследования.

Можно выделить две группы методов ДНК-диагностики: методы, позволяющие исследовать только конкретные уже известные мутации, и методы, позволяющие найти любое изменение нуклеотидной последовательности ответственного за болезнь гена, в том числе и ранее не описанную мутацию (методы чтения нуклеотидной последовательности). По типам детектируемых вариантов можно выделить качественные (выявление наличия/отсутствия генетического варианта у обследуемого) и количественные методы (определение количества копий исследуемого фрагмента в геноме) (рис. 15-2).

Большинство методов, применяемых на сегодняшний день, использует свойство фермента ДНК-полимеразы обеспечивать многократное избирательное копирование целевого участка ДНК, ограниченного искусственно синтезированными последовательностями нуклеотидных затравок (праймеров), - ПЦР.

Наиболее распространенные методы, применяемые для поиска известных мутаций

Методы исследования уже известных мутаций возможно применять для болезней, гены которых хорошо изучены, определены частоты и спектры мутаций, выявлены мажорные мутации. Применение систем детекции частых мутаций позволяет удешевить и оптимизировать процедуру проведения ДНК-диагностики за счет снижения материально-технических и временных затрат. Системы детекции наиболее частых мутаций успешно применяются в молекулярно-генетической диагностике частых аутосомно-рецессивных заболеваний: СМА, муковисцидоза, ФКУ, несиндромальной нейросенсорной тугоухости, адреногенитального синдрома и других. На рис. 15-3 показана система детекции в одной пробирке восьми наиболее частых мутаций гена РАЯ, ответственного за ФКУ.

Такая же система детекции мутаций может быть использована для выявления мутаций при ряде аутосомно-доминантных болезней, при которых показано наличие мажорной мутации. Например, причиной 99% случаев ахондроплазии является мутация Gly380Arg гена FGFR3, которая возникает в результате замены 1138 нуклеотида гуанина на аденин или цитозин.

Принцип метода: исследование разницы длин целевого фрагмента после амплификации с использованием разделения по длине с помощью электрофореза в различных типах гелей.

Область применения.

Принцип метода основан на свойстве эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) «узнавать» строго определенную нуклеотидную последовательность (сайт рестрикции) и разрезать молекулы ДНК в местах узнавания. Фермент подбирается таким образом, чтобы исследуемый вариант нуклеотидной последовательности изменял сайт узнавания рестриктазы. После обработки продукта ПЦР эндонуклеазой проводится исследование разницы длин полученных фрагментов.

Область применения. Поиск известных вариантов нуклеотидной последовательности.

Принцип метода: основан на свойстве фермента Pfu-лигазы высокоспецифично сшивать нуклеотидные разрывы комплементарных матрице последовательностей. Для детекции точковых мутаций создаются нуклеотидные конструкции (пробы), комплементарные норме или варианту нуклеотидной последовательности. При этом в каждую пробу вводят различную по длине маркерную последовательность, чтобы различать отдельные аллели по длине, а концы проб замыкают универсальными праймерами. В результате амплификации лигированных проб получают набор продуктов с длинами, соответствующими различным аллелям. На рис. 15-4 (см. цв. вклейку) представлена принципиальная схема метода. Аллельспецифичная лигаза-зависимая амплификация проб является быстрым высокоспецифичным методом. Основным преимуществом данной методики детекции вариантов нуклеотидной последовательности является возможность мультиплексирования, т.е. детекции в одной пробирке 10 вариантов нуклеотидной последовательности и более, независимо от их положения в геноме друг относительно друга. Использование в системе флюоресцентно меченного праймера позволяет детектировать результаты реакции с использованием капиллярного электрофореза и сочетать, при необходимости, в одной пробирке детекцию точковых вариантов и количественный анализ.

Область применения. Поиск известных точковых замен нуклеотидной последовательности.

Методы количественного анализа

Все методы ДНК-диагностики можно разделить на качественные и количественные. Качественные методы способны выявить точковое изменение нуклеотидной последовательности, короткие делеции и инсерции, протяженные делеции генов, имеющих в геноме одну копию (гены, локализующиеся на половых хромосомах мужчин), - к таким методам относятся анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, анализ полиморфизма длин амплификационных фрагментов, прямое автоматическое секвенирование и другие. Количественные методы позволяют определить число копий гена в геноме. К таким методам относятся блотгибридизация, ПЦР в реальном времени, количественная мультиплексная лигазная реакция. Использование данных методов необходимо при поиске протяженных делеций и дупликаций генов, лежащих на аутосомах, например, детекции дупликаций/делеций гена PMP22, ответственного за наследственную моторно-сенсорную нейропатию 1А типа, но особенно важно при исследовании носительства генов заболеваний, мажорными мутациями которых являются делеции, например спинальной мышечной амиотрофии или мышечной дистрофии Дюшенна-Беккера.

Принцип метода основан на детекции продукта ПЦР во время экспоненциальной фазы ПЦР в режиме реального времени с использованием специфичных флюоресцентных зондов или интеркалирующих красителей, которые способны флюоресцировать при наработке продукта амплификации. Метод позволяет произвести количественную оценку содержания искомой матрицы в образце. Использование зондов с различными флюорофорами позволяет анализировать несколько вариантов последовательности ДНК в одной пробирке.

Область применения: поиск известных точковых вариантов нуклеотидной последовательности, анализ протяженных делеций, инсерций, исследование экспрессии генов.

Принцип метода: количественное определение продукта ПЦР со сшитых лигазой специфически-гибридизованных проб. Так как фермент лигаза обладает высокой специфичностью, метод позволяет достоверно различать генотипы «2:2» и «2:3», «2:3» и «2:4», например, при определении числа копий генов локуса SMN. Метод позволяет анализировать для одного тестируемого образца ДНК до 50 проб, комплементарных разным участкам генома в одной пробирке.

Область применения: поиск протяженных делеций и дупликаций в геми, гомо- и гетерозиготном состоянии, анализ анеуплоидий, определение числа копий генов и псевдогенов на геном.

Принцип метода заключается в полногеномной амплификации с последующей гибридизацией на чипах-матрицах, содержащих различное количество целевых точек, относительно равномерно распределенных по геному. Разрешающая способность метода зависит от плотности распределения точек и их числа. Позволяет анализировать CNVs в ДНК тестируемого образца по сравнению с эталонным образцом.

Область применения: выявление несбалансированных хромосомных аномалий.

Выявление микроделеций/микродупликаций, размер которых превышает разрешающую способность чипа (обычно 50 000-100 000 п.н., для ХМА экзонного уровня разрешающая способность составляет 2-3 экзона гена на уровне последовательности ДНК).

Методы, позволяющие исследовать всю последовательность гена

Для поиска причин редких болезней и болезней, в генах которых не выявлено мажорных мутаций, применяются методы, позволяющие исследовать всю кодирующую последовательность и регуляторные области соответствующего гена, некоторый набор генов (панель) или весь геном.

На сегодняшний день является референсным методом определения нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК.

Принцип метода. Исследуемый фрагмент нуклеотидной последовательности выступает матрицей для синтеза новой цепи с использованием фермента ДНК-полимеразы. Кроме обычных дезоксинуклеотидтрифосфатов, в реакционную смесь добавляют «терминаторы» - флюоресцентно-меченные дидезоксину-клеотидтрифосфаты, случайным образом обрывающие синтез цепи при присоединении к комплементарному нуклеотиду. Полученное в результате сиквенсовой реакции множество фрагментов детектируется с использованием капиллярного электрофореза (рис. 15-5, см. цв. вклейку)

Область применения: поиск вариантов нуклеотидной последовательности в фрагментах конкретных генов, референсный метод для валидации изменений, выявленных массовым параллельным секвенированием.

Генетическая гетерогенность наследственных болезней и большой размер некоторых генов приводят к тому, что секвенирование всех ответственных за данный клинический фенотип нуклеотидных последовательностей является дорогостоящей и длительной процедурой. На сегодняшний день для таких заболеваний появилась возможность применения в диагностической практике технологий массового параллельного секвенирования (секвенирования следующего поколения, высокопроизводительного секвенирования, NGS), позволяющих одномоментно получить массив данных, содержащих информацию о нуклеотидной последовательности нескольких целевых генов или всего экзома и генома.

Методы массового параллельного секвенирования можно разделить на две большие группы: методы с предварительной клональной амплификацией фрагментов ДНК и методы секвенирования одиночных молекул ДНК.

Секвенирование с использованием клональной амплификации библиотек на сегодняшний день широко используются. Среди технологий, предполагающих амплификацию фрагментов ДНК, можно выделить следующие.

Секвенирование одиночных молекул ДНК является перспективным подходом, позволяющим получить длинные прочтения до 100 000 п.н., что необходимо при сборке ранее неизвестных геномов или прочтении повторяющихся областей. На сегодняшний день развиваются следующие технологии: секвенирование синтезом с использованием обратимо-терминирующих нуклеотидов без этапа создания клональной библиотеки; регистрация изменений ионного тока, вызванных прохождением молекул ДНК через нанопоры под действием электрического тока; детекция спектра комбинированного рассеяния света с использованием атомного микроскопа и другие. Несмотря на то что пока разработчикам не удалось добиться высокой точности при определении нуклеотидного состава одиночных молекул ДНК, секвенирование протяженных последовательностей востребовано и используется для сборки новых геномов, а в области медицинской генетики - для изучения областей повторов.

Последовательность массового параллельного секвенирования включает следующие этапы.

Особенность методов массового параллельного секвенирования заключается в огромном вкладе биоинформатических методов в процесс получения конечного результата молекулярно-генетического анализа. Результатом всех приведенных выше действий является несколько миллионов коротких прочтений, которые необходимо собрать в длинные последовательности и провести анализ. Приборы для секвенирования в качестве входящего сигнала получают оптический или электрический сигнал, соответствующий определенному нуклеотиду, который преобразуют для исследователя в последовательность нуклеотидов с приписанным каждому из нуклеотидов значению достоверности полученного результата. Данные значения прибор сохраняет в файл определенного типа, наиболее распространенным из которых является формат FASTQ.. Расчет вероятности ошибки в каждой из позиций проводят на основании данных о секвенировании известных последовательностей. Калибровку для каждого типа приборов проводит производитель по собственной технологии.

В области медицинской генетики нет необходимости собирать заново каждый прочтенный геном, достаточно картировать полученные прочтения на референсный геном человека. Хотя картирование является не столь простой задачей: необходимо учитывать наличие в прочтенной последовательности множества отличий, связанных с особенностями конкретного индивида и ошибками прочтений генома, разработано множество математических алгоритмов и программ для выравнивания успешно с ней справляющихся. Для того чтобы отфильтровать случайные ошибки детекции нуклеотидов, каждое место генома прочитывается многократно в обе стороны. После картирования и выявления вариаций генетической последовательности в образце исследуемого человека необходимо их правильно «назвать», т.е. привязать к конкретной геномной координате и оценить патогенность выявленных изменений. На первом этапе проводится автоматический поиск выявленных вариантов в различных генетических базах данных (аннотация): dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), OMIM (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim), gnomAD (https://gnomad.broadinstitute.org/), COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) и т.д. В результате аннотирования файлов исследователь получает файл в формате VCF, который содержит информацию обо всех выявленных отличиях исследуемого образца от референсной последовательности, геномные координаты, сведения о числе прочтений (ридов), на которых встретилось данное изменение, и т.д.

Большинство используемых на сегодняшний день сервисов для анализа данных массового параллельного секвенирования проводит оценку патогенности с использованием программ-предсказателей патогенности: SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg/), PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php) и др. и ранжируют выявленные варианты.

На завершающем этапе исследования оценку патогенности и возможной взаимосвязи с фенотипом больного выявленных в результате анализа и автоматической фильтрации вариантов проводит врач лабораторный генетик с использованием дополнительных баз данных, программ предсказания и клинической информации, предоставленной для проведения исследования. Все варианты нуклеотидной последовательности интерпретируются в соответствии с Руководством по интерпретации данных последовательностей ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования, редакция используемых рекомендаций указывается в заключении. Обобщением результата анализа является заключение по результатам массового параллельного секвенирования. Необходимо отметить, что количество информации о генетических причинах менделирующих заболеваний постоянно растет, поэтому данные NGS могут быть многократно проанализированы по мере накопления новых знаний.

К сожалению, полное секвенирование геномов остается достаточно дорогостоящим методом исследования, поэтому в практической медицинской генетике наиболее распространено исследование панелей генов различной величины.

Для того чтобы выделить и прочитать только целевые последовательности некоторого набора генов (панели), набора генов, при которых описаны фенотипы болезней (клинического экзома), или всех кодирующих последовательностей генома (экзома), существуют технологии целевого обогащения библиотек фрагментов ДНК. Наиболее распространенными являются подходы на основе мультиплексной ПЦР с праймерами на целевые фрагменты генома и подходы на основе гибридизации с последующей ПЦР. Предпочтительная технология обогащения выбирается в зависимости от поставленной задачи, размера таргетного региона, предполагаемого количества и качества исходной ДНК, сложности процесса пробоподготовки и так далее.

При выборе методов на основе массового параллельного секвенирования в качестве диагностических необходимо помнить об ограничениях.

Любое секвенирование панели генов не позволяет выявлять инсерции и делеции длиной более 20% длины прочтения (при длине прочтения 75 п.н. - это 15 пар оснований), мутации в интронных областях (за исключением канонических сайтов сплайсинга), вариации длины повторов (в том числе экспансии триплетов), а также мутации в генах, у которых в геноме существует близкий по последовательности паралог (псевдоген). Метод не предназначен для определения цис-, транс-положения пар гетерозиготных мутаций [однако цис/транс-положение может быть определено в случае близкого (на длине одного прочтения) расположения вариантов], выявления хромосомных перестроек, полиплоидии, выявления мутаций в состоянии мозаицизма. Кроме того, многие технологии массового параллельного секвенирования имеют погрешности при исследовании гомополимерных областей.

Используя секвенирование генома, возможно проводить анализ числа копий генов (CNV), сложных структурных перестроек, а в некоторых случаях - и анализ числа повторов.

Методы секвенирования одиночных последовательностей позволяют прочитать длинные повторяющиеся последовательности, но пока обладают высоким числом ошибок определения нуклеотидной последовательности.

Показания для назначения молекулярно-генетической диагностики

Результаты молекулярно-генетического анализа и их интерпретация

После ДНК-диагностики лабораторией выдается заключение, в котором указывается ген или конкретные варианты одного или нескольких генов, которые были исследованы у пробанда, метод исследования и результат диагностики. В случае исследования методами массового параллельного секвенирования приводятся сведения о качестве исследования.

При проведении ДНК-диагностики могут быть выявлены следующие виды изменений нуклеотидной последовательности: патогенный вариант, вероятно патогенный вариант, вариант неопределенного клинического значения, вероятно доброкачественный вариант, доброкачественный вариант. Патогенность варианта определяется в соответствии с критериями патогенности и может быть пересмотрена при накоплении дополнительной информации: косегрегации варианта и заболевания в семье, статуса de novo, цис-, транс-положения вариантов при рецессивном заболевании, появлении результатов функционального анализа, данных о популяционных частотах варианта и встречаемости в выборках больных.

В заключение молекулярно-генетического анализа должны выноситься только патогенные, вероятно патогенные и варианты неопределенного клинического значения. Согласно рекомендациям по интерпретации данных геномных исследований, ПД можно проводить только в отношении патогенных и вероятно патогенных вариантов. Для подтверждения диагноза аутосомно-рецессивного заболевания необходимо выявление патогенных/вероятно патогенных вариантов на обеих хромосомах в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии.

Доброкачественные варианты - отличия в последовательности оснований ДНК в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) разных индивидов или между гомологичными участками гомологичных хромосом индивида. Это изменение нуклеотидной последовательности, не являющееся патогенетической причиной исследуемого моногенного заболевания. Доброкачественные варианты нуклеотидной последовательности являются основой внутри- и межвидового разнообразия. При выявлении варианта неопределенного значения необходимо проведение дополнительных исследований для определения его связи с заболеванием: популяционного анализа частот замены, исследования сегрегации данной замены в семье, функционального анализа замены с использованием биоинформационных методов и/или модельных систем.

Все детектированные варианты указываются в заключении в соответствии с международной номенклатурой (http://varnomen.hgvs.org/). Изменение может быть записано с использованием геномной последовательности: chr10:g.90770499C>T (hg19) - в позиции 90770499 хромосомы 10 сборки генома 19 произошла замена цитозина на тимин; последовательности кодирующей ДНК: NM_005051.2:c23G>C - в23 положении кодирующей ДНК транскрипта NM_005051.2 гена произошла замена гуанина на цитозин или ENST00 000361445.4:c92_94del - в положении 92-94 кодирующей ДНК транскрипта ENST00000361445.4 произошло выпадение трех нуклеотидов. Если обнаруженный вариант приводит к аминокислотной замене в белковой последовательности, изменение может быть записано с использованием последовательности протеина: p.Trp26Cys - в положении 26 протеина произошла замена аминокислоты триптофан на цистеин. В некоторых случаях для удобства генетиков название мутации в соответствии с номенклатурой может быть продублировано традиционным названием данной мутации. Для обозначения цис/транс-положения выявленных вариантов применяются следующие символы: NP_003997.1:p.[Ser68Arg;Asn594del] - аллель содержит два разных варианта белковой последовательности, т.е. аллели находятся в цис-положении; NP_003997.1:p.[Ser68Arg];[Ser68=] - один аллель содержит вариант белковой последовательности, а второй аллель дикого типа; NP_003997.1:p.(Ser68Arg)(;)(Asn594del) - выявлено два варианта белковой последовательности, но неизвестно, в цисили транс-положении они находятся; NP_003997.1:p.[Ser68Arg];[Asn594del] - выявлено два варианта белковой последовательности в компаунд-гетерозиготном состоянии; NP_003997.1:p.(Ser68Arg) (;)(Ser68Arg) - вероятно гомозиготное состояние варианта последовательности белка, однако нельзя исключить компаунд-гетерозиготное состояние с протяженной делецией.

При отсутствии изменений нуклеотидной последовательности невозможно исключить генетическую природу заболевания у пробанда, так как: 1) в гене может быть мутация, не детектируемая использованным методом или не попавшая в систему детектируемых наиболее частых мутаций; 2) мутация может локализоваться в далеких от кодирующих последовательностей неисследованных регуляторных областях гена вследствие генетической гетерогенности наследственных болезней; 3) мутация, ответственная за данный клинический фенотип, локализуется в другом гене.

Общие рекомендации при проведении молекулярно-генетической диагностики

При направлении больных на молекулярно-генетическую диагностику необходимо учитывать, что это достаточно сложное и дорогостоящее исследование. Генетическая гетерогенность наследственных болезней диктует необходимость сбора как можно более полной клинической информации с целью выработки оптимальной последовательности исследования генов в каждой конкретной семье. До назначения диагностики желательно провести максимально возможное обследование пробанда с использованием доступных физикальных, лабораторных и инструментальных методов. Необходимо собрать подробную родословную семьи и при необходимости проведения дополнительных тестов предоставить материал родственников пробанда.

Материалом для проведения ДНК-анализа может быть любая ткань человека, содержащая ДНК. Наилучшим материалом для исследования является цельная кровь, собранная в пробирку с антикоагулянтом этилендиаминотетраацетатом, для большинства тестов допустимо использование сухих пятен крови на фильтровальной бумаге. В случае если больной член семьи недоступен, возможно проведение анализа с использованием различных биологических тканей после предварительного согласования с лабораторией. Материал для диагностики, как правило, не требует особых условий хранения и транспортировки, при температуре +4 °С жидкая кровь хранится в течение 2 нед, высушенные пятна крови и замороженная кровь могут храниться более 5 лет. ПД может проводиться на любом материале плода: ворсинах хориона, амниотической жидкости, пуповинной крови - выбор обусловлен только сроками беременности и возможностью проведения инвазивной процедуры.

В последнее десятилетие технологии секвенирования нового поколения (NGS) стали неотъемлемой частью медицинских генетических исследований по всему миру. В число лидеров в производстве оборудования и реагентов для NGS в 2018 году вошла китайская компания MGI, представившая линейку инновационных секвенаторов DNBSEQ®.

Запатентованная технология линейной клональной амплификации библиотек без этапа ПЦР позволяет исключить накопление ошибок ДНК-полимеразы и снизить риск количественного искажения библиотек. Готовые библиотеки представляют собой клубки из повторяющихся участков одноцепочечной ДНК (DNA Nano Ball, DNB).

Технология секвенирования MGI coolMPS® является новейшей разработкой в сфере NGS. В данном подходе используются нативные нуклеотиды и флуоресцентно меченные нуклеотид-специфичные моноклональные антитела. Использование антител позволяет в разы увеличить интенсивность сигнала и существенно повысить чувствительность приборов.

Разработка принципиально новых подходов в NGS и конкуренция между производителями обеспечивают стремительный прогресс технологий, упрощение биоинформатического анализа и снижение стоимости данных. Благодаря этому есть надежда, что в скором времени NGS-исследования - секвенирование генома, экзома, НИПТ, ПГД и другие востребованные типы исследований - станут доступны широкому кругу пациентов.

На правах рекламы

Заключение

На сегодняшний день возможно проведение ДНК-диагностики практически любого заболевания, для которого известен ген. В РФ разработаны диагностические протоколы поиска мутаций различных генов более чем 400 моногенных болезней, поводится исследование таргетных панелей, экзомов и геномов. Задача консультирующего врача сегодня очень сложна - необходимо не только поставить клинический диагноз, но и определить оптимальную последовательность молекулярно-генетических анализов. Любой метод, применяемый в современной ДНК-диагностике, имеет ограничения по типу детектируемых мутаций. Алгоритм выбора методики молекулярно-генетического анализа в зависимости от генетической гетерогенности и преобладающего типа генетических вариантов представлен на рис. 15-6.

Для поиска вариантов, являющихся причиной болезни, а также для оценки их патогенности в современную практику медицинской генетики внедряются различные методы анализа РНК, методы функционального анализа и анализа экспрессии генов.

Только выявление непосредственной причины болезни - мутации в гене - дает возможность подтвердить диагноз на молекулярном уровне, определить риски рождения больного ребенка, провести диагностику носительства в семье и ПД.

Список литературы