Ранняя диагностика профессиональных заболеваний

Термин «биомаркер» (БМ) был предложен в 1989 г. Vasan R. S . Биомаркер - это измеряемый количественный биологический параметр (например, концентрация гормонов, активность энзимов и других биологических объектов), присутствующий в биологических субстанциях, который является индексом здоровья или относительного риска, диагностики заболевания [5].

Биомаркер - это индикатор риска и предиктор развития заболевания (а не только патологии), индикатор эффективности лечения, диагностики и прогнозирования болезни.

Биомаркеры включают почти любые измерения, отражающие взаимодействие между биологической системой и химической, физической, биологической опасностью. Измеренный ответ может быть функциональным, биохимическим, на клеточном уровне, физиологическим или результатом молекулярного взаимодействия.

БМ могут быть рентгенологические, физиологические, гематологические, биохимические, цитохимические, иммунологические, гистохимические, генетические и другие тесты, характеризующие состояние организма человека.

БМ позволяют выявить ранние признаки действия вредных факторов окружающей и производственной среды, оценить эффективность и токсичность лекарственного препарата, прогнозировать общий исход заболевания, предсказать эффективность лечения Идентификация специфических БМ может быть использована для диагностики и прогнозирования риска развития заболеваний.

Кроме этого, БМ используют для ранней диагностики, прогнозирования течения болезни, оценки эффективности лечения, биологических механизмов развития заболевания, а также для прогнозирования вероятности заболевания, планирования и оценки программы общественного здоровья.

Согласно Международной программе химической безопасности (JPCS) БМ делятся на 3 класса: воздействия, эффекта и чувствительности [5].

БМ воздействия - химические вещества, или их метаболиты, или продукты взаимодействия между химическим веществом и молекулами организма или клетками, которые измеряются в органах или тканях организма.

БМ эффекта - измеряемые биохимические, физиологические, поведенческие или другие изменения в организме, которые могут быть связаны с ухудшением здоровья или заболеванием.

БМ чувствительности - это индикаторы, указывающие на способность организма реагировать на воздействие вредных факторов.

БМ первых двух типов используют для профилактики, лечения, диагностики, прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности лекарственных средств.

В настоящее время генетический скрининг может быть использован как индикатор восприимчивости к производственной опасности или предиктор будущего здоровья.

Идеальными БМ считаются тесты, значения которых существенно возрастают при заболевании, БМ легко определяются в биологических средах, уровни их коррелируют с прогрессированием заболевания, определение БМ проводится быстро и не требует больших экономических расходов.

Идеальные БМ должны соответствовать следующим условиям:

Изменения уровней идеальных БМ должны существенно возрастать при заболевании, коррелировать с прогрессированием заболевания, легко и быстро определяться в организме Коррелирующий при прогрессировании заболевания БМ должен быть предиктором болезни, индикатором эффективности лечения и прогнозировать ход и течение болезни [5].

Методы определения БМ должны быть экономически выгодными и специфичными Диагностическая чувствительность (ДЧ) идеальных БМ должна быть выше 0,9; диагностическая специфичность (ДС) ≥0,9. БМ должны точно отражать основные симптомы и стадии болезни.

При применении БМ имеются и ограничения, которые определяются стоимостью анализа, длительностью проведения обследования, лабораторными ошибками, отсутствием избирательности, трудностью установления нормы.

При выборе информативных тестов в настоящее время важны данные о количественной мере информационной и экономической ценности лабораторных данных. Информационная оценка важна для определения значимости лабораторных исследований в диагностике отдельных форм патологии.

Для измерения клинической ценности наиболее существенны следующие критерии: диагностическая информативность тестов, надежность выдаваемой информации, своевременность получения информации Диагностическая информативность тестов зависит от патогномоничности, то есть от соответствия обнаруживаемого отклонения сущности патологического процесса, что позволяет устанавливать диагноз [6].

Для выбора наиболее значимых БМ оценивают их информативность, которую определяют по ДЧ и диагностической специфичности (ДС), диагностической эффективности (ДЭ), прогностической значимости (ПЗ⁺) или ценности и другим критериям [6, 7].

Для оценки диагностической значимости БМ предлагают рассчитывать чувствительность или диагностическую чувствительность и специфичность или диагностическую специфичность тестов.

Термины - «чувствительность» [8] и «диагностическая чувствительность» [6, 7], используемые в литературе разными авторами, отражают одно и то же понятие: долю больных, у которых уровень БМ выходит за границы нормы. Однако термин «чувствительность» давно применяется в аналитической химии для оценки аналитических свойств методик Поэтому использование его для оценки диагностической информативности БМ приводит к путанице Более четко отражает диагностические свойства БМ термин «диагностическая чувствительность».

Для оценки информативности БМ в литературе также применяются термины «специфичность» [8] и «диагностическая специфичность» [6, 7], которые характеризуют долю истинно отрицательных результатов у лиц контрольной группы Поскольку термин «специфичность» в аналитической химии используют для оценки избирательности методик, то для оценки информативности БМ целесообразнее применять термин «диагностическая специфичность».

ДЧ - вероятность того, что у больного будет получен положительный результат О ДЧ судят по доле (%) положительных результатов у пациентов с соответствующим заболеванием [6, 7].

ДС - вероятность того, что у здорового будет получен отрицательный результат О ДС судят по доле (%) отрицательных результатов у лиц, не страдающих соответствующим заболеванием.

При проведении аналитической валидации должны быть определены воспроизводимость и точность анализа, чувствительность метода и его специфичность, а также нижняя граница определения.

При оценке квалификации БМ определяют корреляцию между тяжестью заболевания и уровнем БМ.

Для интерпретации диагностической значимости лабораторных тестов может быть использована теорема Байеса. Для ее применения необходимо выполнить шесть основных требований:

1 - четкое определение болезни с помощью клинических, патологоанатомических, лабораторных и других критериев;

2 - демаркацию болезни (установление стадии в патогенезе заболевания);

3 - установление клинической (диагностической) чувствительности: частоту истинно положительных результатов у лиц с заболеванием на определенном этапе его болезни;

4 - установление «клинической специфичности» теста (частоты истинно отрицательных результатов у лиц без заболевания);

5 - установление доли лиц с заболеванием на определенной стадии патогенеза, которые в настоящее время имеются в популяции;

6 - знание клинической стоимости положительных и отрицательных диагнозов [9].

Диагностическая точность (Diagnostic Accuracy, DA) - это способность с помощью БМ отличить пациентов без заболевания и с заболеванием При изучении DA результаты тестов сравнивают с эталонным стандартом, полученным в этом же исследовании Для установления DA авторы предлагают выбрать серию пациентов с определенным заболеванием и провести у них определение изучаемого теста.

Информативность БМ определяют также с помощью операционной характеристики ROС (Receiver Operating Characteristic curve), которая иллюстрирует баланс между чувствительностью и специфичностью. Каждая точка на кривой ROС указывает на вероятность положительного результата Применение и оценка результатов определения БМ основана на применении байесовского подхода С помощью чувствительности и специфичности рассчитывают вероятность заболевания БМ для скрининга, диагностики или прогноза оценивают также, учитывая их дискриминацию, то есть способность БМ отличать лиц, у которых будет развиваться заболевание, от тех, у кого развития заболевания не ожидается.

ROС-кривая показывает зависимость верно диагностированного количества от числа неверно диагностированных отрицательных случаев Идеальный диагностический тест должен иметь Г-образную форму Чем ближе кривая к диагонали, тем меньше информативность теста.

Об информативности БМ можно судить и по площади под кривой ROС - AUC (Area Under Curve). При значении AUC равном 0,9-1,0 отмечается отличное качество, при AUC 0,8-0,9 - высокое качество, при 0,7-0,8 - хорошее, при 0,6-0,7 - среднее, при 0,5-0,6 - плохое [10].

Характеристические кривые позволяют наглядно сопоставить ДЭ различных методов исследования при обнаружении одного и того же патологического процесса. При анализе ROC-кривых придерживаются следующего принципа: чем ближе к левому верхнему углу координатной сетки расположена кривая, тем выше информативность исследуемого метода диагностики или лучше качество системы отображения данных. Если кривая прилежит к диагонали (или совпадает с ней), то информативность метода ничтожна.

Для сравнения результатов, полученных у больных, используют референтные значения.

Для разработки референтных значений уровни БМ определяют у здорового населения в зависимости от возраста, пола, этнической принадлежности Обследуют не менее 200 здоровых лиц Очень важно оценить характер статистического распределения БМ у населения и пациентов. Устанавливают референтный размах (интервал между минимальным и максимальным значениями) и используют дискриминантный лимит 95 или 97,5 перцентиля при выборе нормальных значений Устанавливают порог риска, то есть такой уровень, при котором риск заболевания начинает повышаться.

При поступлении в органы дыхания фиброгенной пыли установлены многочисленные изменения уровней молекулярных и клеточных показателей (табл . 2-1).

Из табл 2-1 видно, что при действии производственной пыли существенно изменяются уровни показателей окислительного метаболизма: активизируются процессы свободнорадикального окисления, антиоксидантной защиты, перекисного окисления липидов (ПОЛ). Происходят изменения иммунного статуса организма, активности многих ферментов, концентрации ряда металлов, нарушается белковый обмен, возникают воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы, активизируются процессы фиброзообразования.

Многие из приведенных в табл 2-1 показателей предложены для диагностики пылевых заболеваний органов дыхания: определение концентрации реактивных форм кислорода, активности антиоксидантных энзимов (СОД, КАТ, ГП, глутатонредуктаза), концентрации показателей ПОЛ (кетодиенов, диеновых конъюгатов, шиффовых оснований, МДА, изопростана), определение относительного и абсолютного числа СД3+, СД4+, СД8+, СД16+, СД95+. СД25+, лимфоцитов, сывороточных IgA, IgM, IgG, теста НСТ, неоптерина, фагоцитарной активности нейтрофилов крови, HLA-DR, IgG, IgE, CH50, фактора некроза опухоли α (ФНО-α), интерлейкинов (ИЛ) - ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-4. ИЛ-10, интерферона; меди, селена, цинка; факторов роста фибробластов FGF (от англ. Fibroblast Growth Factor), TGF (от англ. Transforming growth factor), PDGF; гаптоглобина и ОП; нейронспецифической энолазы, ферритина и др.

Применить все предлагаемые БМ на практике затруднительно из-за их многочисленности Провести обоснованный выбор наиболее информативных маркеров на основе большинства опубликованных материалов не представляется возможным, так как сведения о диагностической информативности тестов авторами не изучены Не установлено, на какой стадии развития заболевания начинаются достоверные изменения уровней маркеров, каковы значения ДЧ и как они изменяются в зависимости от тяжести заболевания, имеется ли связь изучаемого теста с патогенезом заболевания и др.

Многочисленные молекулярные и клеточные изменения в организме человека выявлены и при действии повышенных уровней производственной вибрации (табл. 2-2).

Из табл 2-2 видно, что в организме рабочих изменяются значения показателей оксидативного стресса, иммунной системы, периферической крови, кислотно-основного равновесия, гормонального статуса, липидного, углеводного обмена, свертывающей системы крови и др Многие тесты, приведенные в табл 2-2, рекомендованы для диагностики вибрационной болезни (ВБ). Однако в связи с отсутствием диагностических характеристик для большинства показателей применение их проблематично.

Известны многочисленные молекулярные и клеточные изменения в организме рабочих и при действии множества других вредных производственных факторов Однако в большинстве случаев применить их для раннего выявления вредного воздействия, приводящего к развитию профессионального заболевания, не представляется возможным, так как не установлены их диагностические характеристики В настоящее время для подавляющего большинства БМ отсутствуют данные о ДЧ, об изменениях уровней БМ у практически здоровых стажированных рабочих, не учитывается специфичность лабораторного теста, не выяснена патогномоничность и избирательность.

Для выбора наиболее информативных лабораторных тестов для раннего выявления воздействия вредных производственных факторов на организм работающих необходима обоснованная методология оценки диагностических характеристик БМ. Разработка методологии выбора информативных лабораторных показателей может быть основана на данных об особенностях (закономерностях) изменения уровней маркеров в биосредах организма человека, подвергающегося их действию.

Установлено, что при действии вредных производственных факторов на организм человека молекулярные и клеточные изменения подчиняются следующим закономерностям [3].

Закономерности изменений уровней БМ в организме человека при действии вредных факторов позволяют обосновать требования и разработать методические подходы к выбору информативных БМ и созданию диагностических комплексов для раннего выявления воздействия вредных производственных факторов.

Особенности (закономерности) изменения уровней лабораторных показателей в организме человека при воздействии вредных производственных факторов определяют требования, которые необходимы при оценке их диагностической информативности [3].

Для установления диагностических характеристик лабораторных показателей необходимо провести следующее.

Такая информация считается основанием для выбора наиболее информативных показателей раннего выявления нарушений в организме человека при том или ином вредном воздействии Получение материалов, которые необходимы при оценке диагностической информативности лабораторных тестов, возможно при изучении влияния вредных производственных факторов на организм работающих.

Для установления диагностических характеристик БМ, которые позволяют выявить наиболее ранние показатели, оценить вероятность развития профзаболевания, патогномоничность БМ, прогностическую ценность маркера, проводят исследования на рабочих, подвергающихся воздействию вредных производственных факторов Проводится медицинское обследование пациентов в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями и лабораторное исследование биоматериалов с применением методов, диагностическую информативность которых целесообразно изучить В основу выбора лабораторных показателей, которые предполагается изучить, могут быть положены данные литературы о патогенезе профзаболевания, новые тесты, результаты собственных наблюдений и др.

Аналитические характеристики лабораторных методик, которые предполагается изучить, должны соответствовать определенным требованиям.

Для того чтобы выявить диагностическую значимость лабораторных БМ при воздействии угольной пыли, использованы данные, полученные при обследовании шахтеров угольных шахт В результате медицинского обследования выделены следующие группы:

1 (контроль) - практически здоровые лица, не контактирующие с вредными производственными факторами;

2 - практически здоровые стажированные шахтеры;

3 - шахтеры с отдельными признаками пылевого заболевания;

4 - больные антракосиликозом (АСИ-1);

5 - больные АСИ-2-3.

Для изучения диагностической информативности лабораторных показателей выбраны маркеры оксидативного стресса, ПОЛ (МДА), антиоксидантной защиты (СОД, КАТ), показателей функциональной активности нейтрофилов [кислая фосфатаза нейтрофилов (КФн), тест-НСТ], субпопуляций лимфоцитов (Тл, Тх, Тс, Вл. Ол), Ig (А, G, M), воспалительно-деструктивных процессов (ГП), фиброзообразования (ОП), белкового обмена (общий белок).

Установлено, что наиболее рано в организме практически здоровых стажированных шахтеров изменяются уровни показателей оксидативного стресса: повышается активность СОД в эритроцитах, КАТ и МДА в сыворотке крови Существенно повышается уровень теста-НСТ и КФн При этом средние значения показателей клеточного и гуморального иммунитета и тестов, отражающих воспалительно-деструктивные процессы и фиброзообразование у практически здоровых шахтеров, достоверно не отличаются от контрольных уровней.

У рабочих с отдельными признаками АСИ изменения показателей свободнорадикального окисления становятся более выраженными Кроме этого, достоверно изменяются уровни некоторых показателей гуморального и клеточного иммунитета и ГП, отражающие развитие воспалительно-деструктивных процессов.

При заболевании АСИ-1 и АСИ-2-3 отмечается усугубление процессов оксидативного стресса и иммунитета Интенсивно повышаются воспалительно-деструктивные процессы и фиброзообразование [2].

Полученные результаты позволили рассчитать диагностические характеристики изучаемых показателей: ДЧ, ДЭ, ПЗ⁺ Данные, характеризующие ДЧ, приведены в табл. 4-1.

Из табл 4-1 видно, что у практически здоровых пациентов ДЧ ряда лабораторных БМ уже превышает 50% и достоверно отличается от контроля. У 51-72% рабочих повышены уровни СОДэр, КАТсыв, МДА, теста-НСТ, Тл, сыв свидетельствующие о влиянии вредного фактора на самой ранней стадии на оксидативный стресс и иммунитет. Уровни ГП, ФГ, IgG, IgM, КФн достоверно изменяются у 15-50% обследованных рабочих Значения ДЧ оксипролина в моче (ОПм), Тс, общего белка при этом достоверно не изменяются .

На рис. 4-1 показан характер изменения ДЧ БМ оксидативного стресса и теста-НСТ в биосредах в зависимости от выраженности заболевания АСИ.

Из рис 4-1 видно существенное повышение диагностической чувствительности показателей окислительного метаболизма (СОД, КАТ, МДА) и теста-НСТ по сравнению с контролем по мере возрастания выраженности воздействия пыли При этом СОД характеризуется наиболее высокими значениями ДЧ, несколько ниже ДЧ у теста-НСТ Даже у практически здоровых рабочих значения ДЧ показателей окислительного метаболизма превышают 50% Следовательно, примерно у половины практически здоровых стажированных шахтеров происходит активизация антиоксидантной защиты и нейтрофилов крови, повреждение клеточных мембран, дезоксирибонуклеиновой кислоты, рибонуклеиновой кислоты.

Изменения ДЧ показателей белкового обмена, воспалительно-деструктивных процессов, коллагено-образования и иммунологических тестов при воздействии угольной пыли представлены на рис. 4-2.

Из рис 4-2 видно, что уже у 60-70% практически здоровых рабочих активизируются показатели гуморального и клеточного иммунитета (в сыворотке крови повышаются значения ДЧ Тлимфоциты (Тл) и Ig А) и у небольшой части рабочих развиваются воспалительно-деструктивные процессы. ДЧ ГП и ОП в моче существенно повышается лишь у рабочих с подозрением на АСИ (группа 3), а у больных АСИ-1 и особенно АСИ-2-3 ДЧ повышена почти до 100% для всех тестов, кроме общего белка.

Анализ приведенных в табл 4-1 и на рис 4-1, 4-2 данных позволяет составить представление о последовательности молекулярных изменений в организме человека при действии угольной пыли На начальной стадии воздействия происходят существенные изменения процессов окислительного метаболизма (активизируются процессы свободнорадикального окисления, происходит дисбаланс в системе антиоксидантной защиты и возрастает ПОЛ). Отмечаются изменения в состоянии иммунной системы: развивается выраженный дисбаланс в соотношении иммунорегуляторных субпопуляций Тл. Возрастает бактерицидная активность нейтрофилов, увеличивается гемолиз эритроцитов. У небольшой части рабочих возникают воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы У шахтеров с отдельными признаками АСИ выраженность и диагностическая чувствительность воспалительно-деструктивных процессов резко увеличиваются, а у 54% активизируются и процессы коллагенообразования Изменения, происходящие в организме практически здоровых стажированных шахтеров, отражают, как ранние негативные стороны воздействия угольной пыли (образование перекисных соединений липидов), приводят к нарушению проницаемости клеточных мембран, повреждению дезоксирибонуклеиновой кислоты, так и активизацию защитных реакций организма (антиоксидантной защиты).

В группе лиц с АСИ наряду с характерной рентгенологической картиной на молекулярном уровне отмечается интенсификация процессов фиброзо-образования оксипролина в моче (ОПм), воспалительных и воспалительно-деструктивных процессов (ГП, фибриноген), нарушений окислительного метаболизма (КАТ, СОД, МДА, коэффициент ХЛ) и иммунного статуса, повышение проницаемости клеточных мембран и бактерицидной активности нейтрофилов.

Развитие патологических явлений на молекулярном уровне при воздействии пыли каменного угля происходит стадийно При проведении морфологических исследований также установлено, что любой вид и форма пневмокониоза - это стадийно прогрессирующий процесс с комплексом воспалительных и регенераторных реакций в легких и бронхиальном дереве [21]. В развитии любой формы пневмокониоза выделяют два периода: воспалительно-дистрофических нарушений и продуктивно-склеротических изменений Первый период длится до тех пор, пока преобладают тканевые нарушения первых трех стадий морфогенеза Для этого периода развития пневмокониоза характерна патогистологическая симптоматика различных форм воспаления и дистрофических изменений легких Второй период совпадает со стадией кониотического пневмофиброза, ее выявляют рентгенологически.

При морфометрических исследованиях легочной ткани практически здоровых шахтеров угольных шахт установлено, что в респираторной части легких, бронхах и артериях малого круга отмечаются дисрегенераторные, гипертрофические, склерозирующие процессы, развивающиеся одновременно Выявлены очаговые отложения угольной пыли, гранулемы из пыли, кониофагов, фибробластов, зоны бесклеточного фиброза, утолщение плевры, содержащей значительные скопления угольной пыли Толщина плевры у шахтеров была в 4 раза выше, чем в контроле Диаметр бронхов был сужен, а наружный диаметр артерий почти в 2 раза увеличен.

Возможно, что период воспалительно-дистрофических изменений, дисрегенераторных, гипертрофических, склерозирующих процессов, выявляемый с помощью патоморфологических исследований, и дорентгенологическая стадия воспалительно-деструктивных и продуктивных процессов, устанавливаемая в результате лабораторных исследований, соответствуют друг другу В таком случае диагностика ранней, дорентгенологической, стадии развития пневмокониозов может быть существенно упрощена Возможно, что повышение уровней ГП и ОП отражает морфологические изменения в органах дыхания Вместо исследования биопсийного материала тогда можно использовать определение комплекса информативных лабораторных показателей, определяемых в крови и моче.

Для выбора наиболее информативных лабораторных показателей проведен расчет ДЭ и прогностической ценности при всех стадиях развития АСИ (табл. 4-2, 4-3).

Из табл 4-2 видно, что у практически здоровых шахтеров наиболее высокие значения ДЭ получены для показателей оксидативного стресса (СОД, КАТ, МДА), иммунитета (IgА, Тл), нейтрофильных лейкоцитов (НСТ и КФн) При подозрении на АСИ ДЭ показателей окислительного метаболизма возрастает.

В этой же группе существенно увеличивается ДЭ ГП в крови и ОП в моче.

При заболевании АСИ существенно возрастает ДЭ показателей оксидативного стресса, иммунитета, воспалительно-деструктивных процессов и активизация нейтрофилов крови Самые низкие значения ДЭ установлены для общего белка в сыворотке крови При этом с возрастанием выраженности воздействия пыли ДЭ общего белка почти не изменяется.

Значения прогностической значимости лабораторных тестов приведены в табл. 4-3.

Из табл 4-3 следует, что высокая прогностическая значимость (больше 85%) при ранней стадии воздействия угольной пыли характерна для показателей оксидативного стресса (СОДэр, КАТсыв), КФн, иммунологических тестов (Тл, IgА, IgG), а также ФГ и ГП. У рабочих с подозрением на АСИ значение ПЗ⁺ перечисленных показателей увеличивается и существенно возрастает для ОП У больных выраженными стадиями АСИ наиболее высокая ПЗ отмечается (более 95%) для ОПм, ГП, ФГ и КФн. Наименьшее значение ПЗ⁺ (23-67%) установлено для общего белка в сыворотке крови.

Для оценки диагностической информативности лабораторных маркеров и выбора наиболее диагностически значимых тестов проведено сравнение их диагностических характеристик (табл. 4-4).

Из табл 4-4 следует, что значения ДЧ, ДЭ, ПЗ⁺, коэффициенты корреляции свидетельствуют о высокой диагностической информативности многих изучаемых лабораторных маркеров Уже на ранней доклинической стадии воздействия угольной пыли для многих показателей ДЧ выходит за границы нормы У практически более 50% здоровых шахтеров изменяются уровни показателей окислительного метаболизма (СОД, КАТ, МДА) и иммунитета (Тл, Тх, Ол (нулевые лимфоциты), IgA). Достоверного изменения концентрации ОПм (оксипролин в моче), не наблюдается, а общий белок понижается всего у 8% обследованных лиц.

У больных с выраженной стадией АСИ частота встречаемости случаев, когда значения ДЧ БМ превышают 70%, отмечается для СОД, МДА, иммунологических тестов (IgA, Ол, Тл), а также для ОПм, ГП, теста-НСТ и КФн (кислая фосфатаза нейтрофилов) ДЧ общего белка составляет всего 16%.

Коэффициент корреляции между выраженностью воздействия пыли и значениями ДЧ для большинства изучаемых тестов очень высок: от 0,95 до 0,99. Исключением является общий белок: r = -0,37.

Наиболее высокая ПЗ (более 90%) установлена для СОД, ГП, ОП, Тл, IgA, наименее низкая - для общего белка в сыворотке крови.

Полученные диагностические характеристики использованы для выбора наиболее информативных методов раннего выявления воздействия вредных факторов на организм работающих.

Для раннего выявления воздействия вредных производственных факторов на организм человека выбирают БМ, уровни и ДЧ которых начинают изменяться у практически здоровых стажированных рабочих.

Для дифференциации стадии развития заболевания используют тесты, уровни которых начинают изменяться у рабочих с подозрением на профзаболевание и лиц с профзаболеванием Использование такого комплекса маркеров позволяет с большей вероятностью выявить изменения в организме рабочего, установить стадию развития профзаболевания и прогнозировать его течение.

Наиболее информативные БМ для раннего выявления воздействия угольной пыли на организм рабочих включены в табл. 4-5.

Из приведенных в табл 4-5 данных видно, что уровни большинства избранных БМ (СОДэр, Тл, МДАсыв, IgA, ГП) начинают изменяться у практически здоровых рабочих Значения диагностической чувствительности даже на ранней стадии воздействия угольной пыли достаточно высоки (кроме ГП). Показатели тесно связаны с патогенезом заболевания (коэффициент корреляции ≥0,94). Все БМ характеризуются высокой прогностической значимостью - от 85 до 98% Перечисленные тесты характеризуют раннюю активизацию процессов окислительного метаболизма, иммунного статуса У небольшой доли рабочих отмечаются воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы, которые усугубляются при развитии АСИ При подозрении на АСИ заметно активизируются коллагенообразование и воспалительно-деструктивные процессы.

При выборе лабораторных БМ для ранней диагностики необходимо учитывать, что они, как правило, могут изменяться не только при воздействии какого-то одного фактора Поэтому прогноз, сделанный на основе данных об изменении уровней лабораторных БМ, носит вероятностный характер Так, множество факторов может привести к изменению уровней показателей оксидативного стресса, нарушению иммунитета При использовании одного показателя вероятность развития конкретного профзаболевания может быть недостаточно высокой Для повышения вероятности развития профессионального заболевания целесообразно использовать не один показатель, а комплекс наиболее информативных тестов, отражающих разные процессы, которые характерны для этой патологии Поэтому для раннего выявления изменений в организме шахтеров избраны БМ, отражающие основные процессы, подвергающиеся изменениям при воздействии вредных факторов При контакте с угольной пылью в настоящее время наиболее целесообразно выбрать показатели оксидативного стресса, иммунитета, тесты, участвующие в воспалительных, воспалительно-деструктивных процессах и коллагенообразовании.

В комплекс лабораторных методов для раннего выявления изменения процессов, характерных для развития пылевых заболеваний органов дыхания у шахтеров угольных шахт, включены следующие БМ: определение концентрации МДАсыв., IgА, Тл, активности СОДэр, концентрации ГП, фибриногена крови и ОП в моче.

Если изменений уровней этих БМ в биосредах шахтеров не наблюдается, следовательно, процессы окислительного метаболизма, иммунитета, воспалительно-деструктивные и коллагенообразования не нарушены Значит, с вероятностью 90% можно утверждать, что негативное воздействие угольной пыли отсутствует.

Если изменены уровни показателей только окислительного метаболизма и иммунитета, то возможно раннее воздействие угольной пыли При этом максимальная вероятность заболеть АСИ достигает 96%. Если наряду с перечисленными изменениями обнаружено повышение уровней ГП в крови и ОП в моче и их ДЧ, то в организме возникли воспалительно-деструктивные процессы и нарушено коллагенообразование При этом вероятность развития АСИ достигает 98% В таком случае даже при отсутствии рентгенологических изменений необходимо более тщательное обследование пациента и проведение реабилитационных мероприятий.

Аналогичные методические подходы были использованы и при выборе информативных лабораторных показателей при действии химического фактора В качестве примера выбора информативных методов для ранней диагностики химических веществ приведены материалы, полученные при действии свинца на организм человека.

Свинец относится к группе наиболее токсичных металлов. Производство и потребление этого металла и его соединений постоянно растет Свинец и его соединения широко применяются в машино- и приборостроении, радиоэлектронике, аккумуляторном, кабельном производствах, в черной металлургии, при производстве хрусталя, красок и эмалей и др. К опасным профессиям относятся плавильщики свинца, аккумуляторщики, составители шихты при производстве хрусталя, аппаратчики при производстве свинцовых пигментов, рабочие, занятые добычей и переработкой свинцовых руд, и др Встречаются случаи бытовых отравлений свинцом В настоящее время в Российской Федерации серьезную опасность представляет утилизация отработавших аккумуляторов На территории страны находится около 1 млн тонн отслуживших срок не утилизированных аккумуляторов, при разрушении которых свинец поступает в почву и подземные воды В связи с этим возникают новые производства по переработке отработавших аккумуляторов во многих областях Российской Федерации [24].

При профессиональном воздействии свинец в организм человека поступает преимущественно ингаляционным путем Возможно поступление его и через желудочно-кишечный тракт У населения свинец поступает в организм в основном c продуктами питания.

В настоящее время в среднем с воздухом у населения в организм свинца поступает около 15 мкг в сутки и задерживается в органах дыхания от 30 до 60% поступившего количества, с продуктами питания у населения - от 120 до 1300 мкг в день Из них в кровь всасывается 6-9%. Коэффициент резорбции свинца из желудочно-кишечного тракта в кровь у детей и беременных женщин значительно выше (25-50%) В развивающихся странах уровень свинца в крови у населения и в настоящее время много выше допустимых значений.

В России в связи с отсутствием единой системы биомониторинга свинца представить обобщенную картину динамики изменения уровней металла в крови населения не представилось возможным Однако, несмотря на некоторое снижение выбросов свинца в атмосферу в связи с падением производства, концентрация его в крови населения остается достаточно высокой В крови детей концентрация свинца варьирует от 5,2 мкг/дл (Липецк), до 19,5 мкг/дл (Санкт-Петербург). В крови сотрудников Государственной инспекции безопасности дорожного движения уровень свинца в крови достигает 68 мкг/дл, что значительно выше допустимых значений (50 мкг/дл в Российской Федерации и 30 мкг/дл в Соединенных Штатах Америки).

Находящийся в организме свинец может быть условно разделен на обмениваемую и стабильную (90%) фракции К обмениваемой фракции относят свинец крови и паренхиматозных органов (печень, почки и др.), содержание металла в которых находится в динамическом равновесии с уровнем свинца в крови В крови свинец ассоциируется преимущественно с эритроцитами В плазме крови содержится от 2,5 до 5% свинца, содержащегося в крови Из плазмы крови свинец очень быстро диффундирует в экстраваскулярные пространства и затем переходит в мягкие ткани Период полувыведения свинца из крови взрослого человека составляет 15-17 сут. Из крови определенные количества свинца постоянно переходят в скелет, волосы, ногти и зубы Концентрация металла в волосах населения варьирует от 2,9 до 17,6 мкг/г, в среднем 9,4 мкг/г К стабильной фракции относят свинец, содержащийся в костях скелета. Свинец - это остеотропный элемент, замещающий кальций в кристаллах гидроксиапатита Накопление металла в скелете идет в течение 50 лет, а в мягких тканях завершается к 10-18 годам жизни человека. Период полувыведения свинца из скелета человека варьирует от 2190 до 12 000 сут Концентрация свинца в скелете в 107 раз выше, чем в крови.

Выведение свинца, депонированного в организме, происходит преимущественно с мочой (около 75%) и через желудочно-кишечный тракт (около 15%). Скорость выведения свинца по отношению к количеству его в крови составляет от 2,4 до 3,1% У рабочих, контактирующих со свинцом в производственных условиях, скорость экскреции свинца по отношению к концентрации его в крови может достигать 7,8%.

Свинец относится к ядам политропного действия Ведущая роль принадлежит расстройствам биосинтеза порфиринов и гема в эритроците В крови при очень низких концентрациях свинца начинает снижаться активность дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты (АЛК-Д, ЕС 4 2 1 24) [2, 23] Снижение активности АЛК-Д способствует повышению ее содержания в моче, снижению активности декарбоксилазы копропорфирина (КП) и гемсинтетазы, которая регулирует присоединение двухвалентного железа к протопорфирину. Эти реакции обусловливают повышение экскреции КП с мочой, увеличение содержания свободного протопорфирина в эритроцитах и железа в сыворотке крови, эритробластах костного мозга.

Флуоресцирующий протопорфирин в эритроцитах крови пациентов, подвергающихся действию свинца, не свободен, а хелатирован цинком (цинк-протопорфирин, ZPP). Уровень протопорфирина в крови увеличивается при заболевании эритроцитарной профирией, а ZPP - при действии свинца и при железодефицитной анемии Предполагаемый химический механизм образования ZPP заключается в том, что в результате ингибирующего действия свинца на активность гемсинтетазы в молекулу свободного протопорфирина внедряется ион цинка вместо железа. В циркулирующих эритроцитах ZPP занимает места, связывающие гем. Значения ZPP у лиц, не контактирующих со свинцом, находятся в пределах 25-44 мкг/дл крови, а у рабочих могут повышаться до 400 мкг/дл. Другие металлы не влияют на концентрацию ZPP. Между концентрацией ZPP и содержанием свинца в крови установлена тесная связь (r = 0,91). Медленное повышение концентрации ZPP в крови начинается при содержании свинца в крови (Рвкр), равном 30 мкг/дл, а при концентрации Рвкр более 50 мкг/дл уровень ZPP резко возрастает (в 10 раз и более) [25, 26] В результате этих нарушений может развиться гипохромная сидеробластная анемия Свинец нарушает процесс утилизации железа и синтез глобина, действует непосредственно на эритроцит, что приводит к ускоренной гибели эритроцитов В ответ на это наблюдается компенсаторная активация эритропоэза и повышение содержания ретикулоцитов.

При действии свинца у человека наблюдается ослабление антиоксидантной защиты и развитие оксидативного стресса.

Свинец оказывает заметное ингибирующее действие и на эритроцитарную пиримидин 5-нуклеотидазу (ЭP5N), энзим катализирующий гидролитическую дефосфориляцию монофосфата пиримидин 5-рибозы (СМР). Дефицит эритроцитарной ЭP5N ассоциируется с гемолитической анемией, при которой характерно значительное повышение уровня эритроцитов с базофильной зернистостью.

При действии свинца увеличивается концентрация мочевины в моче и активность натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы, наблюдаются дегенеративные изменения нервных клеток Наиболее резкие изменения отмечаются в нервных клетках молекулярного слоя коры головного мозга Дистрофические процессы происходят и в периферических нервах, а также в интрамуральных ганглиях кишечника и солнечном сплетении, которые лежат в основе свинцовой колики В патогенезе изменений сердечно-сосудистой системы ведущая роль принадлежит расстройствам вегетативной нервной системы.

Свинец оказывает выраженное действие и на репродуктивную функцию человека и животных При сравнительно невысоких концентрациях свинца в крови (от 10 до 40 мкг/дл) отмечали достоверные изменения сперматогенеза, повреждающее действие на зачаточный эпителий, увеличение частоты сестринских хроматидных изменений.

Свинец обладает заметным нефротоксическим действием При повышенных уровнях свинца отмечали некроз эпителиальных клеток, канальцевую дилатацию и обструкцию, а также интерстициальный фиброз.

Исследования, проведенные в последние годы, показали, что даже более низкие концентрации свинца в крови небезопасны [24, 25].

Аналогичные методические подходы были использованы для выбора информативных лабораторных БМ при действии производственной вибрации и вибрации в сочетании с повышенными уровнями никеля на организм человека Исследования на рабочих, подвергающихся воздействию повышенных уровней вибрации, позволили установить диагностические характеристики лабораторных тестов на различных стадиях развития ВБ.

На рис 4-3 представлены значения диагностической чувствительности креатина в моче, холинэстеразы (ХЭ) в сыворотке крови и Ig A, M и G в зависимости от выраженности воздействия вибрации на организм человека.

Из представленных данных видно, что наиболее интенсивно изменяются ДЧ СОД и α-ТК. У практически здоровых рабочих значения ДЧ превышают уже 80% Несколько менее интенсивно повышаются уровни КАТ, миелопероксидазы и МДА при возрастании выраженности вибрационного воздействия.

На рис 4-4 представлены данные, характеризующие значения ДЧ для креатина в моче, ХЭ в сыворотке крови, Ig.

Из рис 4-4 видно, что на ранней стадии развития вибрационной патологии частота встречаемости практически здоровых рабочих, у которых изменены уровни креатина и IgА, наиболее высока. ДЧ IgM и IgG интенсивно повышается лишь у больных ВБ. Наиболее низкие значения ДЧ установлены для ХЭ сыворотки крови Даже при выраженной стадии заболевания ВБ значение ДЧ не превышает 20%.

Диагностическая чувствительность спонтанной агрегации тромбоцитов, активности КФн, перекисного гемолиза эритроцитов, объема эритроцитов, лютетропного гормона в сыворотке крови представлены на рис. 4-5.

Из рис 4-5 видно, что ДЧ практически здоровых рабочих, у которых изменяется объем эритроцитов, спонтанная агрегация тромбоцитов и уровень лютетропного гормона не превышают 20%, а при заболевании ВБ повышаются до 50-70%. Значительно более интенсивно повышается ДЧ перекисного гемолиза эритроцитов и КФн.

Значения диагностических характеристик лабораторных БМ (ДЧ, ДЭ, ПЗ⁺ и коэффициента корреляции) использованы для выбора наиболее информативных показателей, которые могут быть применены для раннего выявления вредного воздействия (табл. 4-12).

Изменение уровней СОДэр, МПн, МДАпл, α-ТК, креатина в моче и IgG, позволяет прийти к заключению, что в организме многих практически здоровых рабочих при контакте с повышенными уровнями вибрации нарушаются процессы окислительного метаболизма, иммунитета, происходит микротравматизация мышечной ткани Все эти БМ тесно связаны с патогенезом ВБ и характеризуются высокой прогностической ценностью (71-93%) и ДЧ.

Определение инсулина, уровень которого повышается лишь при ВБ-1 и ВБ-2, а у практически здоровых рабочих не изменяется, может стать вспомогательным критерием при диагностике стадии заболевания.

При воздействии вибрации в сочетании с повышенными уровнями никеля в зоне дыхания рабочих установлено более интенсивное изменение уровней СОД, МПн, МДА, КАТс, объема эритроцитов, IgG, IgM, а также выраженное снижение рО₂ у 100% больных ВБ.

Применение для диагностики вибрационной патологии ХЭ в сыворотке крови нецелесообразно из-за очень низких значений диагностических характеристик.

В главе 5 приведены методики определения некоторых БМ, включенных в комплекс информативных показателей для ранней диагностики профессиональных заболеваний. Преимущественно включены методики, которые редко публикуются в известных руководствах.

Ведущий фактор, определяющий функциональную активность клеток, - цепная реакция ПОЛ, которая возникает при взаимодействии гидроксильного радикала с липидами клеточной мембраны Первичные продукты ПОЛ оказывают повреждающее действие на белки, ферменты гликолиза, аденозинтрифосфорную кислоту и др Чрезмерная интенсификация процессов ПОЛ грозит ускорением развития патологических изменений в организме Перекиси липидов вызывают набухание митохондрий и разобщение окислительного фосфорилирования, изменяют проницаемость клеточных мембран Интенсификация ПОЛ появляется после истощения всех защитных сил организма.

При воздействии многих вредных производственных факторов отмечают раннюю и стойкую интенсификацию ПОЛ и истощение антиоксидантного статуса организма.

Иммунная система - относительно самостоятельная система организма, контролирующая клеточный и гуморальный иммунитет его биологических жидкостей и тканей Иммунологический статус и состояние неспецифических факторов защиты организма во многом определяют его чувствительность к воздействию чужеродных веществ (антигенов) и прежде всего - аллергенов Повышение активности иммунной системы сопровождается появлением в крови лимфоцитов средних и больших размеров Выделяют две основные популяции лимфоцитов: Ти В-лимфоциты Тл - тимусзависимые лимфоциты, ответственные за «клеточный иммунитет» Вл - эффекторы гуморального иммунитета Стимуляция Вл антигеном приводит к их трансформации в плазматические клетки, продуцирующие антитела, - специфические Ig: A, M, G, Е, D. Антигенная стимуляция приводит к секреции ЦК первого поколения: ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α, которые индуцируют синтез центральных регулирующих ЦК (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, интерферон-γ). Основные клетки, продуцирующие ЦК, - Т-хелперы и макрофаги, которые выполняют главные функции в поддержке приобретенного и врожденного иммунитета К регуляторам естественного иммунитета относятся и провоспалительные ЦК: ИЛ-1, ИЛ-6, интерферон-α, ФНО-α и др. Специфические иммунные реакции регулируют ЦК ИЛ-2, ИЛ-10, интерферон-γ. Исследование иммунного статуса проводится при частых инфекционных заболеваниях, хронической патологии желудочно-кишечного тракта, аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваниях и др. Иммунный статус нарушается и при воздействии на организм человека производственных факторов: пыли, вибрации, неорганических и органических веществ.

Определение иммунного статуса человека включает комплекс методов, дающих количественную характеристику клеточного и гуморального звена иммунитета.

Для оценки иммунного статуса организма используют определение лейкоцитов, лимфоцитов (Тл) и субпопуляций лимфоцитов (Тх, Тс, Ткилл., Вл и др.) крови. Тл (СД3⁺) отвечают за реакции клеточного иммунитета. Вл (СД20⁺) определяет гуморальный иммунитет крови. К показателям гуморального иммунитета относятся также Ig A, M, G и E. Кроме этого, к иммунологическим показателям относятся компоненты комплемента, фагоцитарная активность нейтрофилов крови, фагоцитарное число, циркулирующие иммунные комплексы в сыворотке крови и др.

Методы определения компонентов клеточного иммунитета широко освещены в литературе и поэтому они не приводятся в кратком руководстве.

Для определения Ig в настоящее время преимущественно используют три метода: радиальную иммунодиффузию по Манчини, турбодиметрию и иммуноферментный анализ (ИФА).

Классический метод Манчини самый наглядный и простой, однако очень продолжительный (1-4 сут). Недостатками этого метода считаются не очень высокая точность и визуальная оценка результатов.

Методы ИФА и турбидиметрический более точны и чувствительны.

Наборы реагентов, предлагаемые ЗАО «Вектор-Бест» для определения IgG, IgA, IgM, IgE, позволяют провести количественное определение с очень высокой чувствительностью и точностью. Чувствительность определения IgG, IgA, IgM, IgE методом ИФА составляет 0,2; 0,21; 0,032 и 2,5 мкг/мл. При температуре -20 °С пробы биологических жидкостей могут храниться в течение года. Метод ИФА прост, высокопроизводителен и чувствителен.

Определение может быть проведено как в ручном режиме, так и на автоматических анализаторах. Может быть использован отечественный анализатор «Архитект-8000» («Вектор-Бест», vector-best, ru).

Большое значение в реализации иммунного ответа имеют ЦК, продуцируемые клетками крови ЦК - это белково-пептидные факторы, осуществляющие короткодистанционную регулировку межклеточных и межсистемных взаимодействий Они вовлечены во все звенья клеточного и гуморального ответа ЦК участвуют в стимуляции роста и созревания незрелых кроветворных клеток (ИЛ-3, ИЛ-7), регуляции естественного иммунитета и неспецифической защите организма [интерферон-α, (ИЛ-1), ФНО-α, ИЛ-8], регулировании специфических иммунных реакций (ИЛ-2, ТФР), воспалительных реакций (ИЛ-5, ИЛ-10, интерферон-γ).

ЦК участвуют в ответных реакциях на патогенное воздействие Ряд исследований свидетельствует о существенном изменении уровней многих ЦК и при воздействии вредных производственных факторов (пыль, вибрация и др.) Однако имеющиеся литературные данные об особенностях изменения уровней многих ЦК крайне противоречивы Получение надежной информации о характере изменений ЦК при действии вибрации, производственной пыли и других вредных факторов имеет важнейшее значение как для ранней диагностики, так и для решения вопросов оптимального лечения и реабилитации больного.

Для количественного определения ЦК в настоящее время разработаны методы определения с помощью ИФА Метод ИФА характеризуется высокой чувствительностью, простотой, стабильностью, возможностью автоматизации всех этапов, сравнительно низкой стоимостью.

Для определения ФНО-α (TNF-α) предлагается тест-система ИФА ООО «Цитокин». Чувствительность определения 1 пг/мл, объем пробы 100 мкл, время анализа 4 ч, диапазон калибровочной кривой 5-250 пг/мл . Изготовители - ООО «Цитокин» (info@cytokine.ru), Санкт-Петербург, и фирма ЗАО «Вектор Бест» Российской Федерации.

В фирме ООО «Цитокин» также разработаны тест-системы для определения ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, интерферон-α, интерферон-γ, СОД.

В настоящее время для количественного определения концентрации ИЛ в биологических материалах используют готовые наборы реактивов.

Большое значение имеет определение фактора некроза опухолей (ФНО).

ОП - это аминокислота, которая входит в состав коллагена и эластина ОП не встречается больше ни в каких других белках, являясь специфической меткой коллагена 12-14% всех аминокислотных остатков коллагена составляет ОП Один из критериев оценки функционального состояния соединительной ткани (коллагеноза, опухоль костной ткани и др.) - оксипролиновый тест Экскреция ОП с мочой незначительно увеличивается у больных саркоидозом, при костных метастазах, у больных системным остеохондрозом, при болезни Пейрони, у лиц с ревматоидным артритом, у больных раком молочной железы. Любые факторы, изменяющие костный матрикс, различные эндокринные или метаболические нарушения проявляются повышением выведения ОП с мочой Сильно повышается экскреция ОП при коллагенозах Отмечается увеличение ОП и при пневмонии, особенно при II и III стадиях заболевания. Определение ОП в синовиальной жидкости рекомендуют при заболеваниях суставов Наиболее значительные изменения наблюдали при ревматоидном артрите Определение ОП в желудочном соке применяют для контроля за процессами рубцевания язвы желудка и двенадцатиперстной кишки Содержание ОП в моче увеличивается также при остеомаляции, миеломе, болезни Педжета и Пейрони.

При пылевых заболеваниях органов дыхания содержание ОП в биосредах организма достоверно повышается Во время обследования шахтеров Донбасса было определено, что у больных пневмокониозом содержание ОП в моче возрастает в 1,5-2 раза. У больных АСИ частота встречаемости лиц с повышенными значениями ОП в моче достигала 82%, у больных ХПБ - 64% и зависела от тяжести заболевания.

Воздействие вибрации на организм человека вызывает разнообразные сдвиги соединительнотканных, мышечных и сосудистых структур Полагают, что одной из причин повреждения нервно-мышечного аппарата при действии вибрации становятся нарушения в структуре и метаболизме соединительной ткани и особенно коллагеновых белков Содержание ОП в моче при действии вибрации и у больных ВБ в возрасте более 25 лет достоверно повышается Ермакова Г А и соавт., 1995, [94] предлагают использовать не только определение содержания ОП в моче, но и более информативный коэффициент: отношение концентрации ОП в моче (мкМ/ч) к показателю, характеризующему мышечную выносливость (с), значение которого у практически здоровых рабочих в возрасте более 25 лет составляет 0,31, у больных ВБ - 0,82 и в контроле - 0,22.

Нормальное значение содержания ОП в моче варьирует от 11,3 до 36,1 мг/сут и в среднем составляет от 19,4 до 21,9 мг/сут.

ГП относится к α₂-глобулинам. Основная его функция - связывание свободного гемоглобина в плазме при внутрисосудистом гемолизе Образующийся комплекс ГП-гемоглобин удаляют клетки ретикуло-эндотелиальной системы. Это белок, характеризующий происходящие в организме воспалительно-деструктивные процессы.

В сыворотке крови взрослого здорового человека концентрация ГП составляет 0,28-1,90 г/л. ГП входят в состав фракции α-глобулинов сыворотки крови. У новорожденных ГП, как правило, отсутствуют Они начинают появляться в возрасте 1-2 мес и достигают уровня взрослых к первому полугодию ГП связывают внеэритроцитарный гемоглобин, образуя с ним комплекс. Тем самым ГП выполняет в организме защитную функцию, например, при разрушении эритроцитов (гемолизе) При гемолизе ГП препятствует экскреции гемоглобина почками, предотвращая нарушение функции канальцев.

При воздействии угольной пыли содержание ГП начинает уже незначительно изменяться у стажированных здоровых шахтеров, однако частота встречаемости лиц с повышенным содержанием ГП в сыворотке крови невысока При заболевании различными формами ПЗОД частота встречаемости больных с абсолютными и повышенными значениями ГП резко увеличивается и достигает 94% при заболевании АСИ и 92% при хроническом пылевом бронхите (ХПБ) Этот показатель характеризуется очень высокой диагностической информативностью при действии угольной и кремниевой пыли.

Определение содержания гемоглобина может быть проведено и с помощью гематологического автомата Принцип определения основан на унифицированном гемоглобинцианидном методе Ход исследования соответствует инструкции, приложенной к прибору.

Принцип. Метод основан на инкубации цельной крови с избытком АЛК При этом под действием АЛК-Д, находящейся в крови, синтезируется порфобилиноген, который с парадиметиламинобензальдегидом образует окрашенное соединение Интенсивность окраски пропорциональна количеству порфибилиногена и измеряется при длине волны 555 нм По количеству порфибилиногена рассчитывают активность АЛК-Д.

Оборудование.

Реактивы и их приготовление.

Отбор проб и их хранение. Отбирают около 2 мл крови в пробирку с гепарином и обрабатывают не позднее чем через 3 ч Перед добавлением реактива Эрлиха допускается хранение в холодильнике в течение 3 сут.

Ход определения. Готовят гемолизат крови: к 1 мл крови добавляют 6,5 мл дистиллированной воды и из него берут по 1,5 мл в 3 центрифужные пробирки Одна из пробирок является контрольной В отдельную пробирку отмеряют 3 мл раствора АЛК Все пробирки термостатируют при 37 °С в течение 10 мин Затем в контрольную пробирку добавляют 1 мл раствора хлорида ртути, а в опытные - по 1 мл нагретого до 37 °С раствора АЛК Содержимое пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают в термостат при 37 °С на 60 мин Время инкубации рассчитывают с момента добавления АЛК Через 60 мин реакцию образования порфибилиногена останавливают добавлением во все пробирки по 1 мл раствора хлорида ртути Содержимое пробирок вновь тщательно перемешивают стеклянной палочкой Все пробы центрифугируют при 1500 об/ мин в течение 10 мин Затем жидкость отфильтровывают через фильтр «синяя лента» в соответственно промаркированные пробирки Из каждой пробирки отбирают по 1,5 мл фильтрата, к которому добавляют 1,5 мл реактива Эрлиха и перемешивают Через 5 мин определяют оптическую плотность растворов в опытных пробах против контроля при длине волны 555 нм и толщине оптического слоя 10 мм. Фотометрирование можно проводить в течение 1 ч после добавления реактива Эрлиха Для расчета активности АЛК-Д предварительно определяют гематокрит Рассчитывают по формуле:

где X - активность АЛК-Д, мкмоль/мин.л; 31,4 - коэффициент пересчета, учитывающий фактор разбавления, время инкубации, молярный коэффициент экстинкции; Г - гематокрит; Е - оптическая плотность пробы (среднее из двух значений).

Нормальные значения АЛК-Д находятся в пределах от 14 до 51 мкмоль/мин/л. Нижняя граница определения - 3,34 мкмоль/мин/л. Воспроизводимость методики ±6%. Другие ферменты крови определению не мешают В организме активность АЛК-Д снижается при поступлении не только свинца, но и ртути, бензола, окиси углерода, этилового спирта Этиловый спирт понижает активность АЛК-Д очень интенсивно, однако спустя 10 ч после приема алкоголя активность АЛК-Д в крови восстанавливается.

Tomokuni K и соавт. показано, что у рабочих, контактирующих со свинцом, и у лиц контрольной группы при инкубации проб крови при определении АЛК-Д при разных pH (6,0 и 6,8) соотношение активности энзима резко различается Отношение активности энзима у лиц контрольной группы составляет 1,72-3,02, а у рабочих - 0,39-1,38. Отношение активностей АЛК-Д, полученных при разных pH, тесно коррелирует с концентрацией Рвкр Автор считает, что специфичность диагностики негативного воздействия свинца при определении соотношений активности АЛК-Д, полученных при разных pH, сильно возрастает.

Принцип. Метод основан на фотометрическом определении пиррола, образующегося при взаимодействии АЛК с ацетилацетоном, после отделения АЛКм от примесей, которые сорбируются на активированном угле.

Оборудование.

Реактивы и их приготовление.

Отбор проб и их хранение. Для анализа отбирают 2 мл мочи, которую обрабатывают в тот же день При подкислении мочи до pH 6 возможно ее хранение в холодильнике в течение нескольких месяцев. Для этого к 10 мл мочи добавляют 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

Ход определения К 1 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взвести активированного угля в ацетатном буферном растворе и встряхивают в течение 1 мин. Фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента». В 2 пробирки отбирают по 2 мл фильтрата (контроль и опыт) В опытную пробирку вносят 0,05 мл ацетилацетона и перемешивают. Затем обе пробирки помещают на 20 мин на кипящую водяную баню После охлаждения проб и доведения объема растворов в пробирках до 2,0 мл ацетатным буферным раствором в пробирки добавляют по 2 мл реактива Эрлиха.

Одновременно строят калибровочный график с концентрациями АЛК 0,02; 0,06; 0,1; 0,14; 0,2; 0,4; 0,5; 0,8 мкг/мл в пробах Для этого берут рабочий стандартный раствор АЛК и добавляют 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 2; 3; 4 мл в серию пробирок, доливают до 5 мл ацетатным буферным раствором Из каждой пробирки отбирают по 2 мл и проводят определение АЛК, как изложено выше Одновременно в моче определяют концентрацию креатинина. Рассчитывают по формуле:

Х = (С × 500 × 7,58)/КР, где Х - концентрация АЛК в моче, мкмоль/г КР; С - количество АЛК в пробе, найденное по калибровочному графику, мкг; 500 - коэффициент пересчета; 7,58 - коэффициент пересчета в систему СИ; КР - концентрация креатинина в моче, мг, %.

Нижняя граница определения АЛК - 0,15 мкмоль/г КР, воспроизводимость методики ±4,8%. В норме концентрация АЛКм варьирует от 3,9 до 18,95 мкмоль/г КР (0,5-2,5 мг/г КР). Порфобилиноген и мочевина определению не мешают.

Для определения ZPP в настоящее время предлагается ряд методов: экстракционные, детергентное разбавление, гематофлуориметрические.

В 1995 г. Папковским Д. Б. и соавт. был получен патент «Способ определения нарушений порфиринового обмена, основанный на измерении концентрации ZPP в крови, на гематофлуориметрическом анализаторе». Сравнительная оценка трех методов определения ZPP: газожидкостной хроматографией (HPLC), спектрофлуориметрического и гематофлуориметрического - показала, что при использовании HPLC получаются более низкие результаты, чем при применении спектрофлуорметрического и гематофлуориметрического методов.

Protofluor Reagent System (Helena Lab) на основе гематофлуориметрического определения разработана тест-система, включающая набор реактивов и гематофлуориметр для определения ZPP в крови. Дается пошаговое описание методики.

При диагностике воздействия свинца на организм человека часто используют методики, основанные на анодной пульсовой вольтамперометрии (ASV-stripping voltammetry), плазменной масс-спектрометрии (ICA-MS - Inductively coupled Plasma Mass Spectrometry), и атомно-абсорбционные (AAS и GFAAS - Grafite furnace Atomic Absorption Spectrometry). При выборе методики важно учитывать ее чувствительность, точность и длительность определения Обычно предпочтение отдается атомно-абсорбционным методам.

Однако метод определения свинца в крови, моче, волосах, основанный на атомной абсорбции в пламени, характеризуется сравнительно невысокой чувствительностью (нижняя граница определения - 10 мкг/дл) Поэтому для анализа фоновых значений необходимо брать большие количества исследуемого материала. Чувствительность определения свинца методом ААS с графитовой кюветой значительно выше - менее 1-2 мкг/дл, что позволяет проводить определение свинца в минимальных объемах крови, взятой из пальца. Хорошей чувствительностью обладает метод ASV, который также характеризуется быстротой определения, низкой стоимостью анализа и небольшим объемом пробы (100 мкл).

Методики, основанные на использовании плазменной масс-спектрометрии, отличаются очень высокой чувствительностью (0,1 мкг/дл), быстротой определения, небольшим объемом проб Однако масс-спектрометрические методики относятся к наиболее дорогостоящим.

В 2006 г в Российской Федерации были утверждены методические указания по определению марганца, свинца, магния в пробах крови методом атомной абсорбции.

Оборудование.

Ход определения. Из локтевой вены берут кровь в силиконированные пробирки по 0,5 мл. Перед взятием проб крови за сутки должен быть исключен прием аспирина В первую пробирку наливают 2 мл раствора № 1, в другую - 2 мл раствора № 2. Центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Отбирают плазму, обогащенную тромбоцитами Под микроскопом подсчитывают количество тромбоцитов в обеих пробах Процент спонтанной агрегации тромбоцитов рассчитывают по формуле:

где K₁ - число тромбоцитов в пробе № 1; К₂ - число тромбоцитов в пробе № 2.

Определение спонтанной агрегации можно провести и колориметрическим способом Для этого определяют оптическую плотность растворов №№ 1 и 2 при зеленом светофильтре и рассчитывают по формуле (Д₁ /Д₂) × 100%.

У здоровых людей спонтанная агрегация тромбоцитов - 6,8%, у больных ишемической болезнью сердца - 35,6, при гипертонической болезни - 20,1, при сахарном диабете - 29%.

При патологических состояниях мышечной ткани обычно наблюдается креатинурия Повышенное выделение креатина с мочой отмечают при прогрессировании мышечной дистрофии, при миопатии, миастении, миозите, у больных паренхиматозными гепатитами, гипертиреозе, акромегалии, диабете и некоторыми другими заболеваниями Повышенные уровни содержания креатина в моче взрослых людей выявляют и при некоторых заболеваниях, связанных с обменом креатина (при авитаминозе Е, диабете), при значительных оперативных вмешательствах, после родов.

Креатин в моче здорового взрослого человека, как правило, отсутствует Однако у маленьких детей и подростков моча всегда содержит креатин.

При воздействии вибрации креатинурия наблюдается очень рано У практически здоровых рабочих креатинурию отмечали уже при стаже 1-5 лет в 80% случаев, а у больных ВБ частота встречаемости лиц с повышенными концентрациями креатина в моче достигала 89,4%. Повышение концентрации креатина в моче при действии вибрации по праву может быть отнесено к группе наиболее ранних показателей, характеризующихся высокой диагностической чувствительностью и информативностью.

Креатинурия и снижение гемолитической резистентности эритроцитов к пероксиду водорода тесно связаны с показателями Е-витаминной активности.