Цитология. Функциональная ультраструктура клетки. Атлас

Эта книга была задумана как пособие для студентов, изучающих клеточную биологию, цитологию и гистологию в вузах медицинского, ветеринарного и биологического профиля, аспирантов, для которых морфология становится основной специальностью, а также всех, кто чувствует необходимость в знакомстве с ультраструктурой клетки. Это означает, что данный атлас совершенно не исключает соответствующие учебники. Более того, он может принести пользу только в том случае, если электронно-микроскопические представления о структуре клетки и ее важнейших функциях будут работать в последующем, при изучении курса общей и частной гистологии.

Традиционно в практическом курсе гистологии, который преподается в наших вузах, в качестве основных источников информации используются препараты, приготовленные для изучения в световом микроскопе. Это понятно, поскольку гистология, по определению, имеет дело с достаточно крупными объектами, представляющими не столько клетки, сколько структуры более высокого, тканевого, порядка организации. Однако вполне очевидно также, что без знания строения клетки и механизмов, обеспечивающих ее жизнедеятельность, т.е. общей цитологии, исследование тканей теряет смысл. Согласно одному из кардинальных постулатов клеточной теории деятельность клеток определяет функционирование систем более высокого порядка - тканевых конструкций, органов, систем органов и даже организма в целом. Более того, в основе любых патологических изменений в организме лежат нарушения нормальной жизнедеятельности клеток.

Удивительные достижения клеточной биологии, свидетелями которых мы сейчас являемся, служат хорошим подтверждением этого постулата. Становится очевидным, что полноценное образование врача, фармацевта, ветеринарного врача или биолога вряд ли возможно без понимания молекулярно-биологических событий, происходящих в клетке и за ее пределами. Однако успехи современной молекулярной биологии могут сопровождаться несколько парадоксальными, на наш взгляд, побочными эффектами.

Есть тонкие властительные связи
Меж контуром и запахом цветка.

В. Брюсов. Сонет к форме

В последние годы наметилась отчетливая тенденция использовать вместо электронной микроскопии современные методы световой микроскопической техники как более щадящие и доступные исследователю. Тем не менее все молекулярные события, которыми оперирует клетка, развиваются в определенном пространстве. Клеточное пространство имеет весьма организованную структуру, и эта структура, как результат длительной и сложной эволюции, определяет функционирование клетки как целого.

Конечно, это совсем не означает, что структура клетки является чем-то очень стабильным, жестко закрепленным и неизменным. Скорее, наоборот, она настолько динамична, что, используя такие высокоразрешающие методы, как электронная микроскопия, мы фактически останавливаем мгновение и на основании отдельных кадров пытаемся воспроизвести и понять живую клетку. Очень часто эти попытки напоминают создание виртуального видеофильма из статичных изображений.

Более того, жесткая обработка материала, которая необходима для приготовления электронно-микроскопических препаратов в общем-то оставляет нам не так много живого вещества для изучения. Нередко мы сами в процессе приготовления препаратов создаем картины (артефакты), которые имеют мало общего с живой реальностью. По-существу, мы можем видеть лишь контур цветка, понимая, конечно, что цветок гораздо богаче того, что видим мы.

Электронная микроскопия прошла большой и нелегкий путь, прежде чем исследователи научились различать «запах», который скрывается за этим контуром. И это понимание, так же как и завораживающие картины строения клетки, составляет золотой фонд классической цитологии.

Информация, полученная с помощью электронной микроскопии, уникальна, неоценима и не может быть замещена другими подходами. Да и сама электронная микроскопия не стоит на месте. Ее методы развиваются, совершенствуются и открывают возможности, сопоставимые с возможностями современных методов молекулярной биологии, а нередко и превосходящие их. Например, с помощью электронно-микроскопической иммуноцитохимии мы можем анализировать взаимодействие молекул в сложных комплексах, точно локализовать единичные молекулы в определенном компартменте клетки и даже на определенном участке мембраны. Электронная томография, привлекающая компьютерные технологии, позволяет получить с очень высоким разрешением (2-3 нм) трехмерные представления о структуре органелл и связях мембран в клетке и даже об организации комплексов молекул. Наконец, используя коррелятивные, взаимодополняющие подходы, можно сочетать изучение событий, происходящих в живой клетке, с последующим ее электронно-микроскопическим анализом. Некоторые примеры современных подходов, которые используются в электронной микроскопии, приведены в этой книге.

Осознание всех этих сложностей в какой-то мере определило структуру настоящего атласа. В его текстовой части мы отказались от традиционного описания органелл, но посчитали необходимым изложить (правда, несколько упрощенно) основные механизмы, которые определяют базовые клеточные функции. В каждой главе такое изложение предваряет собственно иллюстративный материал. В общем-то «картинки» должны говорить сами за себя. Однако смотреть - еще не означает видеть, и чем больше мы знаем, тем больше можем увидеть. Для морфолога (а любой индивидуум, изучающий цитологию и гистологию, обязательно морфолог) это утверждение является аксиомой. Именно поэтому описание функций предшествует рисункам. Чтобы не отвлекать внимание читателя от содержания, в тексте отсутствуют ссылки на рисунки. Названия структур (органелл, их деталей), т.е. того, что можно увидеть на рисунках, выделены в тексте жирным шрифтом. Все термины приведены в соответствии с последней редакцией гистологической номенклатуры (Terminologia Histologica. Международные термины по цитологии и гистологии человека с официальным списком русских эквивалентов. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009). Ключевые участники внутриклеточных событий (процессы, молекулы), важные для понимания клеточных функций, также не остались без внимания и выделены курсивом.

Однако чтобы научиться ориентироваться в электронно-микроскопических изображениях, одного отвлеченного знания мало. Именно поэтому мы сделали достаточно развернутые повествовательные подписи к рисункам. Почти на каждой электронной микрофотографии есть больше того, о чем говорится в соответствующей главе, а в подписях к рисункам (легендах) могут упоминаться структуры, о которых в данной главе еще ничего не было сказано. Это сделано вполне осознанно, чтобы читатель мог увидеть больше самых разнообразных, дополняющих друг друга картин (ведь объем книги ограничен) и получить более полное представление о предмете.

Перекрестные ссылки, которые довольно часто встречаются в подписях к рисункам, относятся не только к самим «картинкам», но и к содержанию легенд. Поскольку иллюстрации отражают детали строения и особенности функционирования клеток разных тканей, можно получить представление не только об органеллах, общих для всех клеток, но и о некоторых особенностях организации, характерной для клеток соответствующей ткани. Именно эти особенности, детали строения, определяют удивительное разнообразие специализированных клеток, например: экзо-кринных секреторных клеток поджелудочной железы, эпителия кишки, клеток сердечной мышцы, сперматозоида или нейрона.

Известно, как трудно запомнить аббревиатуры, используемые для обозначения той или иной структуры, и как утомительно и скучно все время обращаться к единому списку этих обозначений, приведенному где-то в начале или в конце книги. Несмотря на то что очевидные повторы несколько перегружают подписи к рисункам, расшифровка обозначений привязана к каждому рисунку и включена в подрисуночную подпись. Большая часть иллюстраций получена с помощью общепринятой трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии (ТЭМ), что и указано в подписях к рисункам. В части иллюстраций, менее привычных взгляду читателя, приводятся ссылки на другие методы (например, сканирующая электронная микроскопия - СЭМ), а также иные подходы (метод замораживания-раскалывания - криофрактография, ЭМ-иммуноцитохимия и т.д.). Во всяком случае, читатель всегда будет ориентирован, какой метод использован, и при необходимости сможет найти его краткое описание в главе 2.

Атлас прежде всего является учебным пособием, поэтому в тексте отсутствуют ссылки на научные публикации. Однако в последней главе приведены несколько современных источников, преимущественно учебники и руководства. В них читатель может найти дополнительную, более детальную информацию о клеточных функциях и молекулярных механизмах, их определяющих, а также познакомиться с изображениями, дополняющими иллюстрации, представленные в атласе.

К сожалению, лучшие из этих книг опубликованы не на русском языке.

Любой достаточно крупный проект не лишен недостатков. Есть они и в этой книге. Авторы будут признательны читателям за любые предложения, замечания и дополнения, которые могли бы улучшить качество изложения и иллюстраций.

Каждый, кто занимался получением систематизированного иллюстративного материала для монографии, учебника или атласа, знаком с трудностями такой работы. Мысль о создании такого атласа появилась при систематизации коллекции электронно-микроскопических изображений, которая за многие годы была собрана в лаборатории электронной микроскопии Российского государственного медицинского университета (2-го Московского медицинского института им. Н.И. Пирогова). Существенную часть этой коллекции составили наблюдения, сделанные первым руководителем лаборатории и нашим учителем профессором Ярославом Леонидовичем Карагановым. Талантливый ученый, скрупулезный методист, добросовестный и очень требовательный к себе человек, Я.Л. Караганов слишком рано ушел из жизни, и хотя прошло уже более 30 лет, нам всем его очень не хватает. При работе над атласом меня не покидало ощущение постоянного присутствия Ярослава Леонидовича, и, возможно, именно это чувство позволило довести работу до конца. Я абсолютно уверен, что, если бы профессор Я.Л. Караганов не ушел из жизни так рано, он непременно создал бы такой атлас сам и, конечно, сделал бы это лучше.

В. Банин Москва, 2016

Считаю своим долгом принести слова признательности людям, без усилий и доброй воли которых эта книга не могла быть создана.

Безусловно, в первую очередь это научные сотрудники, докторанты и аспиранты лаборатории электронной микроскопии РГМУ. Теперь, по прошествии уже достаточного количества лет, я хорошо представляю, насколько полезной и радостной может быть работа с умными, доброжелательными и неравнодушными людьми. Они оказали неоценимую помощь в подготовке иллюстративного материала и любезно разрешили использовать некоторые свои наблюдения в качестве иллюстраций. Их помощь, поддержка и живая заинтересованность были хорошим стимулом в работе над книгой и ее завершении. К сожалению, некоторых людей, которым я бесконечно признателен, уже нет среди нас.

Я приношу сердечную благодарность Г.А. Алимову, Т.И. Гармаш, М.Д. Донсковой, Л.М. Лихачевой, И.Д. Сенатовой, В.Б. Суслову. Моя признательность учителю и другу профессору Я.Л. Караганову неизменна, и я попытался ее высказать в предисловии.

Хотелось бы искренне поблагодарить технических ассистентов лаборатории - инженера В.В. Калашникова и доктора Н.Б. Странжу, которые в течение многих лет помогали нам и без самоотверженной работы которых была бы просто невозможна деятельность лаборатории. Огромную помощь в подготовке иллюстраций к печати оказали Т.И. Гармаш и В.Б. Суслов.

Искренняя признательность великолепным ученым и нашим добрым друзьям профессору А.А. Миронову и доктору медицинских наук Г.В. Безнусенко, любезно разрешившим использовать свои блестящие иллюстрации и сделавшим весьма полезные замечания, учтенные нами при написании окончательного варианта текста. Высоко ценю их мнение и дружеское расположение.

Работая над атласом, автор имел удовольствие пользоваться советами, замечаниями и рекомендациями умных и требовательных людей. Их искренняя заинтересованность в том, чтобы книга увидела свет, и готовность помочь оказались настолько сильными, что они взяли на себя труд выступить ее рецензентами. Приношу слова благодарности великолепному специалисту в области электронной микроскопии академику РАН профессору Н.Н. Боголепову, авторитетному гистологу и методисту, высокоэрудированному автору и доброжелательному рецензенту профессору В.Л. Быкову, а также профессору О.О. Фаворовой, чьи познания в области молекулярной биологии клетки всегда меня восхищали.

Я искренне благодарен профессору А.Н. Яцковскому, доброжелательная рецензия которого оказалась тем последним «штрихом», который позволил рекомендовать этот атлас в качестве учебного пособия.

И конечно, все мы весьма признательны нашей alma mater - Российскому государственному медицинскому университету им. Н.И. Пирогова (2-му Московскому медицинскому институту - 2-му меду), в стенах которого много лет работала наша лаборатория.

Посвящается всем, кто работал в лаборатории электронной микроскопии 2-го меда

Клетка - наименьшая структурно-функциональная единица живого, воспроизводящая все его основные свойства.

Организм человека состоит из более чем 250 типов клеток, существенно различающихся по форме, размеру, выполняемым функциям и источнику развития. Например, размер клеток может варьировать от нескольких микрометров (диаметр малых лимфоцитов - около 7 мкм) до сотен микрометров (диаметр зрелой яйцеклетки - около 300 мкм). Размер тел мотонейронов, расположенных в спинном мозге и иннервирующих мышцы конечностей, невелик. Однако эти клетки имеют чрезвычайно длинные отростки, за счет чего суммарный объем мотонейрона может быть существенно больше, чем объем яйцеклетки.

Форма клеток также может быть разнообразной. Например, эритроцит человека имеет почти правильную форму тороида - двояковогнутого диска с утолщенными и закругленными краями; гладкие мышечные клетки - веретеновидную форму; эпителиальные клетки клубочка почки (подоциты) и некоторые ассоциативные нейроны центральной нервной системы - небольшие клетки с множеством ветвящихся отростков. Очень распространена округлая форма клеток. Клетки, выстилающие полость тела или просвет сосудов (мезотелиальные, эндотелиальные), - плоские, а высота клеток столбчатого реснитчатого эпителия крупных бронхов в несколько раз превосходит их толщину. Многие клетки имеют относительно гладкую поверхность; рельеф поверхности других может быть очень сложным за счет многочисленных цитоплазматических выростов, складок, углублений (инвагинаций), микроворсинок и т.д.

Почти все клетки многоклеточного организма специализированы в отношении выполняемых функций, но имеют принципиально сходную ультраструктурную организацию. Тем не менее особенности их строения могут заметно различаться в зависимости от направления и степени дифференцированности (специализации) клеток и их функционального состояния. В соответствии со специализацией в клетках могут варьировать состав и выраженность органелл - структур, выполняющих те или иные задачи.

Традиционно в эукариотической клетке выделяют два основных компартмента (отсека) - ядро и цитоплазму. Они принципиально различны. Образно говоря (и, конечно, сильно упрощая), ядро знает, что нужно делать, и координирует действия, а цитоплазма и связанные с ней мембранные структуры эти действия выполняют.

Все истинные эукариотические клетки имеют ядро, которое содержит генетическую информацию и посредством ее реализации контролирует синтез белка. При делении клеток эта информация передается следующему поколению (дочерним клеткам). Вся совокупность генетической информации составляет генотип клетки. Пространство ядра называют также нуклеоплазмой (кариоплазмой). Часть ядерного содержимого выделяют в качестве ядрышка. Ядро занимает сравнительно небольшой объем клетки, например в клетках печени около 6%, в двигательных нейронах - почти в 1000 раз меньше. Большая часть клеточного объема занята цитоплазмой. В цитоплазме клетки содержатся органеллы и включения - продукты клеточной жизнедеятельности или вещества, попадающие в клетку извне и сохраняющиеся в ней (секреторные и пигментные гранулы, гликоген, липидные капли, некоторые кристаллы). Каждая клетка имеет органеллы общего назначения, которые обеспечивают ее нормальную жизнедеятельность (усвоение необходимых компонентов, клеточное дыхание, синтез собственных белков, размножение и т.д.). Многие клетки синтезируют белки, на основе которых строятся органеллы специального назначения, позволяющие клеткам выполнять специфические задачи в контексте многоклеточного организма. Синтез специфических белков (а также липидов и углеводов) и особенности клеточной морфологии, которые обеспечивают выполнение общих и специальных функций, определяют фенотип клетки.

Каждая клетка отграничена от внешней среды (внеклеточного пространства) клеточной мембраной, или плазмолеммой. Последняя обеспечивает целостность клетки, участвует в поддержании ее формы и осуществляет связь с внешней средой, в том числе и с другими клетками. Плазмолемма является важной клеточной органеллой. Многие органеллы клетки - мембранные органеллы, т.е. построены из биологических мембран. Строение внутренних мембран клетки принципиально такое же, как и строение внешней, клеточной, мембраны. К мембранным органеллам относятся: митохондрии, эндо-плазматическая сеть (эндоплазматический ретикулум) - гранулярная (ГЭС) или гладкая, агранулярная (АЭС), комплекс Гольджи, эндосомы, лизосомы и пероксисомы. Общая площадь внутриклеточных мембран может в 40-50 раз превосходить площадь плазмолеммы и достигать 100 000 мкм² . В строении других, немембранных, органелл - рибосом, центриолей, цитоскелета, миофибрилл - мембраны не участвуют. Такие органеллы, как реснички и жгутики, также построены не из мембран, однако заключены в выросты плазмолеммы.

Клеточное содержимое, которое не имеет отчетливой электронно-мироскопической структуры, принято обозначать как матрикс. Цитоплазматический матрикс (цитозоль) представляет собой сложный коллоидный раствор, содержащий различные биополимеры (белки, полисахара) и микромолекулы (ионы, простые органические и неорганические соединения). В ядерном матриксе присутствуют белки и нуклеиновые кислоты, которые участвуют в хранении, реализации и передаче генетической информации. Цитозоль относится к тиксотропным гелям, которые под воздействием внешних условий (температура, давление) или внутренних факторов (полимеризация-деполимеризация макромолекул) могут менять агрегатное состояние и переходить в менее вязкую фазу - золь.

В организме разные клетки постоянно взаимодействуют. Клетки с аналогичными чертами строения, общими функциями и, нередко, с общим источником развития формируют ткани (гл. 8). Определение ткани достаточно условно. Так, клетки соединительной ткани могут быть разного происхождения и разного фенотипа, но объединяться для выполнения общей поддерживающей и вспомогательной функции. Эпителиальная ткань может развиваться из различных источников - экто-, энто- и мезодермы. Однако и в организме в целом, и в пределах одной ткани характер взаимодействия клеток может быть различным. Клетки, разобщенные значительным расстоянием, взаимодействуют посредством сигнальных молекул через кровь или через межклеточное вещество (внеклеточный матрикс). Тесно прилежащие друг к другу клетки осуществляют связь посредством компонентов плазмолеммы (молекул адгезии, рецепторов), часто формируя специальные структуры - клеточные соединения или контакты. Клетки крови и фибробласты обычно живут как отдельные единицы, а эпителиальные клетки способны существовать только в составе многоклеточных структур - пластов или групп, в которых они связаны контактами с клетками-соседями. Одни клетки интенсивно делятся, другие очень быстро теряют эту способность к размножению.

Наверное, не будет большим преувеличением сказать, что многообразие клеток в многоклеточном организме позволяет найти любые мыслимые варианты строения и особенности функционирования. Однако при обсуждении этого многообразия следует принимать во внимание два принципиально важных момента. Во-первых, клетки не могут делать того, что противоречит законам термодинамики или природе составляющих их компонентов. Во-вторых, все многообразие функций и задач, которые выполняют клетки в составе многоклеточного организма, основано на некоторых ключевых или кардинальных функциях, которые можно обозначить как базовые функции. Без таких функций, присущих практически любому типу клеток, невозможно само существование клетки как единицы живого. К числу базовых функций можно отнести:

Некоторые базовые функции (например, энергопродукция) необходимы для жизнедеятельности и поэтому осуществляются постоянно. Напротив, такая функция, как размножение, выполняется лишь в определенные периоды жизненного цикла клетки или в определенные периоды развития организма. Хотя осуществление базовых функций связано с преимущественной деятельностью какой-либо органеллы или группы органелл, сами функции не являются элементарными. В каждом случае это сложный процесс, в который клетка вовлекается как целое и для участия в котором привлекаются все необходимые механизмы. Например, в клеточном движении участвуют не только компоненты сократительного аппарата (цитоскелет), развивающие необходимые усилия, но и плазмолемма, формирующая органеллы движения (ламеллоподии) и обеспечивающая прикрепление к субстрату, и митохондрии, снабжающие клетку энергией, и аппарат синтеза, поставляющий в необходимых случаях сократительные белки, и т.д. Тем не менее при обсуждении каждой базовой функции уместно сконцентрировать внимание на описании именно тех органелл, участие которых является решающим или безусловным.

Электронная микроскопия, особенно в ее современных модификациях, является действенным инструментом изучения не только морфологии клетки, но и ее функций. В любом случае анализ изображений служит той основой, на которой строятся заключения. Очевидно, что вопрос о том, как же получаются эти изображения и как их можно интерпретировать, является одним из ключевых вопросов исследования или обучения. Поэтому мы сочли необходимым предварить конкретное описание функциональной морфологии клетки небольшой главой, в которой приводится краткое описание методов электронно-микроскопического анализа.

Электронная микрофотография демонстрирует различия в форме клеток, которые можно видеть (с помощью трансмиссионной электронной микроскопии - ТЭМ) при изучении тонких срезов. Как правило, это случайные сечения клеток не всегда правильной геометрической формы, и они вряд ли могут воспроизводить реальные очертания. Тем не менее видно, что эндотелиальные клетки (ЭК) вены (верхняя часть рисунка) и посткапиллярной венулы (ПВ) - это плоские клетки. Ядросодержащие части эндотелиальных клеток, в которых сконцентрированы органеллы, заметно толще. Такая форма клеток характерна для плоского эпителия. Четыре эндотелиальные клетки, формирующие окружность стенки посткапиллярной венулы, связаны между собой плотными соединениями (см. гл. 3) (стрелки). В просвете поскапиллярной венулы находится нейтрофильный лейкоцит (ЛЦ) округлой формы. В его цитоплазме много различных гранул. Окружающие сосуды клетки - фибробласт (ФБ), перициты (ПЦ) - тоже плоские. Эритроциты (ЭР), фрагменты которых видны в просвете вены, деформируются в потоке крови и обычно имеют форму купола, а не двояковогнутого диска (тороида), как это описывают при изучении покоящейся (извлеченной) крови. У внутренней (люминальной) поверхности эндотелия вены видны два тромбоцита (ТЦ) овоидной формы. Поверхность эндотелия вены и тромбоцитов покрыта гликокаликсом (ГК) - наружной «опушкой» клеточной мембраны (гл. 3). С помощью молекул, формирующих гликокаликс, клетки взаимодействуют друг с другом. В нормальных условиях эндотелиальная выстилка сосудов обладает атромбогенными свойствами. При репарации повреждений эндотелиальной выстилки тромбоциты активно вовлекаются в процесс; их форма заметно изменяется (см. рис. 1-2).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) более результативна для изучения формы клеток. Она позволяет получить 3-мерное изображение поверхности.

В зоне повреждения эндотелиальной выстилки (стрелка) тромбоциты (ТЦ) активно взаимодействуют с обнажившимися субэндотелиальными структурами (базальной пластинкой, коллагеном III типа) и образуют пристеночный тромб, прикрывающий место повреждения. Ранее уплощенные овоидные клетки округляются, формируют длинные отростки (филоподии) и плотно прикрепляются к подлежащему субстрату и друг к другу. Изменение формы клеток связано с активацией цитоскелета (см. гл. 5) - микротрубочек и обширной сети актиновых филаментов, которая характерна для стимулированных тромбоцитов. Компоненты цитоскелета вовлекаются и в более позднюю фазу тромбообразования - сокращение (ретракцию) тромба, что позволяет частично восстановить или увеличить просвет поврежденного сосуда.

Жировые клетки (ЖК) белой жировой ткани (адипоциты), которые находятся в фазе накопления и сохранения жира, имеют форму правильных шаров, поскольку их цитоплазма почти полностью занята одной большой липидной каплей. Немногочисленные органеллы и уплощенные ядра оттесняются к периферии клеток. Эти так называемые однокапельные ЖК образуют большую часть жировой ткани в организме. В многокапельных адипоцитах бурой жировой ткани липидных капель несколько, они невелики, и форма клеток не такая правильная. При мобилизации жира из жировых депо (например, при голодании) липидные капли сильно уменьшаются в размере и клетки становятся менее округлыми.

На поверхности клеток, оплетая их и удерживая вместе, располагается сеточка из тонких коллагеновых (ретикулярных) волокон; ЭР - эритроциты, попавшие в ткань во время подготовки образца.

Эндотелиальные клетки, выстилающие просвет кровеносных сосудов, могут быть различной формы и размера. В значительной мере вариации форм зависят от гидродинамических условий потока крови, в частности, от сдвиговых усилий, которые испытывает поверхность клеток, соприкасающаяся с текущей кровью. В крупных артериях (например, в аорте, где давление крови велико и скорость потока максимальна) эндотелиальные клетки ориентированы вдоль оси сосуда - параллельно потоку крови. Как видно из приведенной иллюстрации, форма клеток близка к веретеновидной, во всяком случае в центральной их части, где локализуются ядро и основные органеллы. Периферические зоны эндотелиальных клеток, которые образуют контакты с клетками-соседями, более плоские. В сосудах с низким кровяным давлением и небольшой скоростью потока (в капиллярах, венах) эндотелиальные клетки, скорее, плоской формы, хотя ядросодержащие отделы цитоплазмы заметно выдаются в просвет сосуда.

Образец крови был приготовлен для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с тем, чтобы сохранить и выявить форму клеток. Форма эритроцита обычно описывается как тороид - двояковогнутый диск с утолщенным краем с перемычкой в центральной части (классическую форму тороида имеет наполненная воздухом автомобильная камера). Эта форма не случайна, поскольку при прочих равных условиях она определяет максимальное отношение площади поверхности клетки к ее объему, что важно для осуществления функции транспорта газов. Кроме того, при продвижении в мельчайших сосудах - капиллярах эритроциты под влиянием давления и вязкости среды деформируются, приобретая форму купола или парашюта. Вершина купола при этом ориентирована в направлении движения. Такая способность к деформации, обусловленная формой клеток, обеспечивает минимальное сопротивление даже при движении клеток в капиллярах, диаметр которых меньше диаметра эритроцита (7 мкм). Интересно, что относительная вязкость крови, движущейся в капиллярных сосудах, становится меньше ее вязкости в покое. Поведение эритроцита в потоке крови настолько необычно, что математически лучше всего описывается моделью жидкой капли, а не плотного тела.

Форма этой клетки необычна, причудлива и очень отличается от формы других эпителиальных клеток. От центральной части (тела клетки), содержащей ядро и большую часть органелл, отходят несколько первичных отростков (стрелки). В свою очередь, от них под прямым углом ответвляются вторичные отростки, которые переплетаются с вторичными отростками соседней ветви или соседней клетки. Такое чередующееся переплетение пальцевидных отростков клеток получило название «интердигитация». В целом вся разветвленная конструкция каждого подоцита оплетает соответствующий фрагмент эндотелиальной трубки капилляра и образует вместе с соседними подоцитами внешний эпителиальный слой всех капилляров почечного клубочка. Подоциты совместно с эндотелиальными клетками капилляров клубочка участвуют в формировании фильтрационного барьера почки (см. рис. 3-21).

Экзокринные клетки поджелудочной железы специализированы для синтеза и секреции белковых продуктов - ферментов, которые в конечном итоге поступают в просвет тонкой кишки и участвуют в пищеварении.

На представленной обзорной электронной микрофотографии видно, что ультраструктура ацинарной клетки демонстративно отражает ее специализацию. Комплекс соответствующих органелл и включений образует в совокупности синтетический конвейер, конечной ступенью которого является высвобождение продукта в просвет ацинуса (АЦ) - секреторной единицы железы. В ядре клетки (Я) преобладает активный эухроматин; отчетливо выражено ядрышко (ЯД). Неактивный, более плотный гетерохроматин концентрируется в основном на периферии ядра, у ядерной оболочки. Большая часть объема цитоплазмы занята гранулярной эндоплазматической сетью (ГЭС), которая функционально связана с комплексом Гольджи (КГ). Митохондрии (МХ) обеспечивают энергетические потребности клетки, а лизосомы (Л) участвуют в деградации старых органелл, ошибочно синтезированных белков или их избытка.

Секреторные (зимогенные) гранулы (СГ) концентрируются в апикальной (верхушечной) части клетки, в непосредственной близости от просвета ацинуса. Просвет ацинуса отграничен от остального межклеточного пространства зоной плотных контактов между соседними клетками. Обращает на себя внимание, что величина просвета ацинуса, в который поступают продукты синтеза, и площадь обращенной в просвет апикальной мембраны клетки очень невелики по сравнению с общим объемом секрета, накопленного в гранулах.

Нетрудно видеть, что эта клетка имеет несколько иную специализацию, чем ацинарная клетка поджелудочной железы (см. рис. 1-7), - если вообще термин «специализация» приложим к клеткам мезенхимы. Мезенхима - это малодифференцированная диффузная эмбриональная ткань. Она формируется из разных источников (зародышевых листков), и ее клетки обладают различными потенциями. Они способны дифференцироваться (давать начало) в клетки различных тканей организма, например в нервные клетки ганглиев, соединительнотканные клетки, клетки костной ткани, мышц и др.

В развивающейся плаценте клетки мезенхимы участвуют в формировании соединительнотканной основы (стромы) ворсинок и их сосудов. Они синтезируют внеклеточный матрикс (ВКМ) - коллагеновые и эластические волокна, основное вещество, и эта функция находит отражение в ультраструктуре клетки. Поскольку синтез разнообразных белков внеклеточного матрикса обычно происходит постоянно и не в таком объеме, как в секреторных клетках желез, гранулярная эндоплазматическая сеть (ГЭС) развита умеренно, но хорошо представлен комплекс Гольджи (КГ). Несколько причудливая форма клетки объясняется, возможно, тем, что клетка зафиксирована в момент ее движения. Об этом свидетельствует также эксцентричное положение ядра, которое оттеснено в хвостовую зону клетки. Мезенхимные клетки вообще отличаются способностью мигрировать на значительные расстояния. Возможно, для ориентации при движении в качестве своеобразных сенсоров клетка использует единичные реснички (Р), которые иногда встречаются в клетках соединительнотканного происхождения.

Фрагмент цитоплазмы эпителиальной клетки содержит некоторые органеллы, которые характерны не только для клеток эпителия. Это органеллы общего назначения, которые можно встретить почти во всех клетках организма. Формально эти органеллы можно разделить на мембранные (т.е. построенные из мембран) и немембранные. К мембранным органеллам относятся митохондрии (МХ), три фрагмента которых представлены на рисунке. Видно, что митохондрии построены из двух мембран - гладкой наружной и внутренней, которая формирует складки (кристы). Митохондрия в верхней части рисунка разрезана поперечно, и кристы в срез не попали. Лизосома (Л), небольшой фрагмент которой виден в левом нижнем углу рисунка, и аутофагосома (АФС) отграничены одиночными мембранами. Мембранные структуры, которые составляют содержимое аутофагосомы, представляют собой остатки какой-то мембранной органеллы, возможно митохондрии, которая подвергается деградации. Содержимое лизосомы относительно гомогенно. Ее мелкозернистый матрикс воспроизводит концентрированный раствор белков-ферментов. Цистерны эндоплазматической сети (ЭС) также образованы мембранами. Поскольку большая часть цитоплазматической поверхности цистерн покрыта рибосомами (РС), мы можем рассматривать эти цистерны как часть гранулярного ретикулума. Однако некоторые участки цистерн лишены рибосом (стрелки). Некоторые рибосомы, видимые на рисунке, не связаны с цистернами эндоплазматической сети, но образуют скопления, или розетки, свободно расположенные в цитозоле. Это - полирибосомы или полисомы (ПС). Они синтезируют цитозольные белки, некоторые белки митохондрий и пероксисом. Компоненты цитоскелета представлены двумя микротрубочками (МТ) и коротким фрагментом микрофиламента (актинового филамента - АФ). Различные пузырьки, мембранные трубочки и небольшие вакуоли также не являются случайными структурами. Они представляют собой часть единой транспортной системы клетки, обеспечивающей связь мембранных компартментов.

Электронный микроскоп был создан по аналогии со световым, и в конструкции обоих приборов можно найти принципиально подобные устройства. Основное требование, предъявляемое к электронной микроскопии, заключается в возможности получения более высокого разрешения, чем это возможно при световой микроскопии. Именно поэтому в электронном микроскопе вместо светового потока используется поток электронов. Известно, что разрешение объектива светового микроскопа (возможность различить две соседние точки как отдельные) зависит от длины волны падающего света и связано с ней простой зависимостью: d ~ 0,61λ/n sinα, где d - расстояние между соседними точками (разрешение), λ - длина волны, n - коэффициент преломления среды, α - угол между оптической осью объектива и наиболее далеко отклоняющимся от оптической оси лучом, который еще попадает в объектив (величину nsina называют еще нумерической апертурой объектива). При использовании ультрафиолетового света с наиболее короткой длиной волны теоретически можно получить разрешение, примерно равное 150 нанометрам (нм) (1 нм = 10^-9 м). На практике такое разрешение не достигается. При использовании видимой области спектра максимальное разрешение светового микроскопа не превышает 0,2-0,4 микрометра (мкм) (1 мкм = 10^-6 м). Разрешение современных лазерных конфокальных микроскопов, которые позволяют проводить наблюдение в условиях очень тонкого оптического среза, т.е. на строго определенной глубине объекта, приближается к теоретическому. В любом случае световой микроскоп может увеличить разрешающую способность глаза не более чем в 1000 раз.

В электронном микроскопе вместо потока света используется поток электронов, длина волны которых много короче длины волны фотонов. Более того, длина волны электронов зависит от их скорости, и при обычно используемых в биологии ускоряющих напряжениях (75-150 кВ) в трансмиссионном электронном микроскопе теоретически можно получить разрешение около 0,002 нм. На практике в лучших моделях электронных микроскопов разрешение достигает величин, примерно равных 0,1 нм, что близко к величине химических связей атомов в молекулах. Однако возможность получения такого большого разрешения требует определенных условий подготовки образца и самой микроскопии. Многолетний опыт электронной микроскопии позволил разработать свои, отличные от световой микроскопии, методические подходы и модификации. Они касаются конструкции микроскопов, условий подготовки образцов, возможности исследовать с большим разрешением поверхность объектов, причем нередко не сами биологические структуры, а их слепки или реплики.

Световой микроскоп можно использовать для изучения как фиксированных (мертвых) тканей, так и живых клеток. В электронном микроскопе изучаются только фиксированные объекты. Для получения высокого разрешения при изучении биологических объектов в трансмиссионной электронной микроскопии обычно используются очень тонкие (по сравнению со световой микроскопией) срезы. Они окрашиваются не цветными красителями, а солями тяжелых металлов. Изображение на экране или фотопластинке всегда черно-белое. Поскольку энергия электронов быстро рассеивается в воздушной среде, объект, предназначенный для электронно-микроскопического наблюдения, помещается в глубокий вакуум. В отличие от светового микроскопа с его стеклянными линзами в электронном микроскопе для ускорения электронов, фокусировки электронного пучка на объекте и создания изображения используются электромагнитные катушки (линзы). Изображение изучаемого объекта в электронном микроскопе проецируется не на сетчатку глаза наблюдателя, а на флюоресцирующий экран, фотопластинку или, в современных моделях, на светочувствительную матрицу, позволяющую работать с изображением в цифровом формате.

Существует два основных типа электронной микроскопии - трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия (ТЭМ) и сканирующая (растровая) электронная микроскопия (СЭМ). Остальные методы являются модификациями этих двух подходов и разработаны для визуализации структур или молекул в соответствии с конкретными задачами исследования. Так, при использовании техники замораживания-раскалывания исследуются не сами объекты, а металлические слепки (реплики), получаемые с поверхности разлома. Эти реплики, однако, изучаются в трансмиссионном электронном микроскопе. Как правило, в биологии ТЭМ применяется для исследования внутренних структур клеток и тканей (органелл, мембран, волокон) и обычно требуется изготовление срезов. В соответствии с этим изображение при ТЭМ 2-мерное. СЭМ используется преимущественно для изучения поверхностей биологических объектов, хотя это могут быть также поверхности органелл и других внутриклеточных структур, «обнаженные» в результате предварительных манипуляций. Сканирование таких поверхностей пучком электронов позволяет получить 3-мерное изображение.

Различных модификаций электронно-микроскопических методов много, однако с учетом задач настоящей книги в ней лишь кратко описаны основные моменты тех электронно-микроскопических подходов, которые были использованы для получения иллюстраций. Более детальное описание можно найти в соответствующих руководствах, часть из которых приведена в списке рекомендованной литературы.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Аналогия со световым микроскопом хорошо прослеживается в конструкции трансмиссионного (просвечивающего) электронного микроскопа. Источником эмиссии электронов служит катод - нагретая вольфрамовая нить. Пучок электронов фокусируется и ускоряется кольцевой электромагнитной линзой (анодом) и далее конденсорной линзой таким образом, чтобы быть максимально сфокусированным в плоскости исследуемого образца. Проходя через объект (например, тонкий срез ткани, окрашенный солями тяжелых металлов), электроны теряют энергию - поглощаются, рассеиваются или относительно свободно проходят через «электронно-прозрачные» области. Различия в энергии электронов, прошедших через объект, регистрируются в виде электронно-плотных и прозрачных участков.

Чем больше поглощение, тем больше плотность структуры, которая поглощает или рассеивает электроны. Поэтому, например, гидрофильные области клеточных мембран, которые хорошо связывают тяжелые металлы (и, следовательно, хорошо поглощают электроны), выглядят темными. Гидрофобные зоны мембран, с высокой концентрацией липидов, напротив, сравнительно прозрачны для электронов и кажутся светлыми или пустыми. Прошедшие через объект электроны фокусируются объективной линзой, которая, как и объектив светового микроскопа, определяет разрешение электронного микроскопа. Система проекционных линз направляет пучок электронов (первичное изображение) на флюоресцирующий экран, фотопластинку или светочувствительную матрицу, и наблюдатель может изучать изображение на экране с помощью встроенного вспомогательного микроскопа или же получить фотоотпечаток. В электронном микроскопе, как и в световом, для улучшения качества изображения используется система диафрагм, чтобы отсекать лишние (боковые) электроны, существенно отклоняющиеся от оптической оси.

Трансмиссионная электронная микроскопия тонких срезов

Изучение тонкого строения (ультраструктуры) клеток предъявляет более высокие, чем в световой микроскопии, требования к сохранности образцов. Как правило, это достигается тщательной фиксацией объектов. В качестве химических фиксаторов используются обычно забуференные растворы глютарового альдегида, формальдегида (параформальдегида) или их смеси. Фиксаторы денатурируют нативные белки и другие биомолекулы, образуют сшивки между ними и тем самым позволяют сохранить взаимное расположение и структуру органелл близкими к существующим в живой ткани. Образцы (маленькие кусочки ткани, взвесь клеток или клетки в культуре) можно фиксировать иммерсией, погружая их в достаточный объем фиксатора и выдерживая в нем необходимое время. При этом важно поддерживать физиологически оправданные изоосмолярность и рН среды. Дополнительная фиксация и контрастирование структур (особенно содержащих липиды) достигаются обработкой кусочков в растворе тетраоксида осмия. Хорошие результаты дает фиксация перфузией, при которой фиксаторы вводят в сосудистую систему животного. Химическая фиксация - процесс достаточно растянутый во времени и не всегда подходит для анализа быстро протекающих событий (например, преобразования клеточных мембран). Для быстрой фиксации нередко используют замораживание образцов (криофиксацию) при температурах, близких к температуре жидкого азота (-196 °С), с последующей криоультратомией (см. далее) или замещением химическими средами для заключения в смолы.

Парафин, который в световой микроскопии наиболее часто используется в качестве заливочной среды, не позволяет производить очень тонкие срезы, необходимые в электронной микроскопии. Для получения тонких срезов (ультратомии) кусочки ткани заключают чаще всего в водонерастворимые полимерные смолы (эпон, аралдит), что требует предварительной тщательной дегидратации образцов в последовательно возрастающих концентрациях этанола. Дегидратированные кусочки заключаются в смолу и после полимеризации могут долго храниться в виде блоков, из которых производятся тонкие срезы. Существуют и водорастворимые среды для заключения. Они чаще используются в электронной цитохимии и иммуноцитохимии, поскольку обеспечивают лучший доступ реагентов (например, антител) к активным группам молекул.

Обычно используемая толщина срезов для ТЭМ не превышает 50-60 нм, хотя в отдельных случаях можно использовать и толстые, почти гистологические срезы (например, при высоковольтной ТЭМ), или - в соответствии с задачами - более тонкие (12-14 нм) срезы. Для получения срезов применяют не металлические ножи, как в гистологии, а кромку разломанной стеклянной пластины или специальные алмазные ножи, которые в отличие от стекла используются многократно. Для получения серийных (последовательных) срезов блок с заключенным образцом затачивают в виде пирамидки с гранями разной площади и режут на специальном приборе - ультратоме. Получаемые срезы имеют форму трапеции, обычно они небольшой площади (около 0,25 мм² ). Срезы монтируют на металлические сеточки, окрашивают (контрастируют) солями тяжелых металлов и исследуют в микроскопе. Обычно, чтобы сориентироваться в препарате и получить тонкие срезы нужного участка ткани, перед формированием пирамидки и ультратомированием делают так называемые полутонкие срезы (толщиной около 1 мкм), которые окрашивают гистологическими красителями и изучают в световом микроскопе. Существуют различные модификации метода ТЭМ. Они очень отличаются друг от друга и разработаны с целью визуализации структур или молекул, которые не удается хорошо выявить при изучении обычных срезов.

Техника замораживания-раскалывания (freeze-fracture) образцов

Способ подготовки биологических объектов, получивший название «замораживание-раскалывание» (криофрактография), оказался очень эффективным при изучении внутреннего строения биологических мембран. Суть метода заключается в том, что образец ткани (обычно предварительно фиксированной и пропитанной криопротектором, например глицеролом) быстро замораживается при температуре, близкой к температуре жидкого азота (-196 °С). Чаще всего для замораживания используют так называемые вторичные криогены (например, жидкий фреон, охлажденный жидким азотом), поскольку сам жидкий азот образует на поверхности образца оболочку из испаренного газообразного азота, препятствующую дальнейшему быстрому замораживанию. Обработка криопротекторами и быстрое замораживание предотвращают образование кристаллического льда, который может повреждать клетки. Существуют и другие методы щадящего быстрого замораживания, например замораживание под высоким давлением.

После замораживания образец помещается в вакуумную охлаждаемую камеру и с помощью охлажденного металлического лезвия режется (раскалывается). Плоскость раскола, или разлома, обычно проходит через зоны наименьшего напряжения, которые часто соответствуют гидрофобным (внутренним) зонам мембран. На поверхность разлома с помощью специальной испаряющей пушки под углом, близким к 45°, напыляют платину так, чтобы получилась достаточно прочная металлическая пластинка - реплика толщиной около 2 нм. Такое напыление имитирует боковое освещение (например, освещение заходящим солнцем). Образец извлекается, биологические ткани растворяются в агрессивных средах, а металлический слепок поверхности (реплика) монтируется на сеточку и исследуется в трансмиссионном микроскопе. Поскольку напыление проводится обычно из определенного направления, рельеф поверхности разлома выявляется как чередование областей света и тени. Эти перепады плотности соответствуют расположению структур или частиц, выступающих над общим уровнем или, напротив, являющихся углублениями.

Металлическое покрытие оказывается более толстым и, следовательно, электронно-плотным со стороны напыления. Участки, в которых металлическая пленка отсутствует или очень тонка, выглядят как прозрачные для электронов зоны - светлой «тени». Интерпретация картин, получаемых с помощью техники замораживания-раскалывания, требует некоторого навыка. Особенно важно знать направление, в котором проводилось напыление. Для этого ориентируются на расположение теней, которые отбрасывают внутримембранные частицы - интегральные белки мембран. Они хорошо выявляются на относительно равномерном и гладком фоне реплики, покрывающей липиды.

Поверхности, образующиеся при расщеплении мембраны (например, плазмолеммы), являются артифициальными, т.е. созданными искусственно при обработке образцов. Они соответствуют внутренним поверхностям двух липидных слоев или листков, составляющих бислой мембраны. Эти поверхности, видимые при изучении реплик, несколько отличаются друг от друга, но комплементарны. Так, на поверхности, соответствующей внутреннему, цитоплазматическому, листку бислоя (протоплазменная, или Р-поверхность), внутримембранных частиц оказывается больше, поскольку интегральные белки «заякорены» со стороны цитоплазмы компонентами цитоскелета. На противоположной поверхности, т.е. поверхности наружного листка (экстраклеточная, или Е-поверхность), частиц меньше, но видны углубления - ямки, бороздки, которые соответствуют (комплементарны) частицам, видимым на Р-поверхности. Поскольку большинство мембран имеют существенную кривизну, разлом редко проходит вдоль большой площади одной и той же мембраны и обычно перескакивает на соседнюю. Таким образом, на одной реплике можно встретить обе поверхности (Р- и Е- поверхность), принадлежащие, конечно, разным мембранам или разным участкам одной мембраны. На участках клетки, лишенных мембран, или во внеклеточном пространстве, образец не раскалывается, а, скорее, режется.

Реплика при этом выглядит как подобие гистологического среза, с не очень рельефными структурами. Однако это бывает не часто. Кривизна и извитость мембран в клетке, как правило, не позволяют получать хрупкие металлические реплики большой площади.

Иногда для более эффективного выявления рельефа или глубжележащих структур используется возгонка - испарение в вакууме аморфного льда, маскирующего структуры разлома (техника freeze-etching). Таким образом можно выявить, например, элементы цитоскелета, которые расположены не на мембране, а в примембранных зонах цитоплазмы.

Электронно-микроскопическая ауторадиография

Давно известная и весьма эффективно применяемая в гистологии техника ауторадиографии адаптирована и для целей электронно-микроскопического исследования. Она используется для маркирования (мечения) определенных химических соединений с помощью радиоактивных изотопов. В качестве последнего часто используется тритий (³ Н), который испускает β-частицы с небольшой энергией и, следовательно, с небольшой длиной пробега в плотной среде. Вещество, в котором атомы водорода заменены на тритий (например, азотистое основание тимидин, которое используется клеткой в синтезе ДНК), вводится в организм или в клетку. Через определенный интервал времени образец фиксируется, и после обработки из него приготавливают тонкие срезы. Срезы покрывают тонким слоем специальной мелкодисперсной фотоэмульсии и выдерживают в темноте достаточно продолжительное время. Эмиссия β-частиц изотопом восстанавливает металлическое серебро в эмульсии над теми местами, где располагается введенное вещество (в нашем примере - тимидин). Результат такого восстановления можно наблюдать при микроскопии в виде электронно-плотных извитых треков, обрисовывающих пути β-частиц.

При соответствующих протоколах экспериментов можно наблюдать не только статичные картины локализации введенного вещества, но и проследить его временную динамику - выявить фазу синтеза нуклеиновых кислот в процессе клеточного деления, этапы синтеза и метаболизма биомолекул, оценить время жизни и проследить судьбу меченых клеток, белков, в которых содержатся меченые аминокислоты, а также других соединений, включающих радиоактивную метку и др. Ауторадиография на ультраструктурном уровне может быть использована не только при ТЭМ тонких срезов, но и при СЭМ, при изучении клеточной поверхности. Однако в этом случае восстановленное серебро эмульсии выявляется в виде ярких светящихся гранул, которые локализуются над структурами, содержащими изотоп (например, над ядром).

Электронно-микроскопическая цитохимия

Использование гистохимических реакций, так хорошо зарекомендовавшее себя в гистологии для анализа метаболических процессов, было адаптировано и для целей электронной микроскопии. Это позволило локализовать участников метаболизма уже в масштабе отдельной клетки и клеточных компартментов, т.е. изучать собственно цитохимию. Правда, электронно-микроскопическая цитохимия, в отличие от классической, имеет ряд ограничений. В первую очередь это связано с тем, что конечный продукт ферментативной реакции должен иметь достаточную электронную плотность, чтобы быть различимым на фоне окружающих клеточных структур, и плохую растворимость, чтобы оставаться на месте реакции, а не диффундировать в другие области клетки. Очевидно, что реакции, в результате которых образуются цветные продукты, хорошо различимые в световом микроскопе, здесь не подходят. В электронно-микроскопической цитохимии чаще используются реакции, конечным субстратом которых является диаминобензидин. Его окисление сопровождается образованием плотных нерастворимых продуктов, которые видны как мелкодисперсный осадок. Хорошим примером является пероксидазная реакция, позволяющая выявлять локализацию ферментов с пероксидазной активностью, т.е. способностью окислять H₂ O₂ .

Добавление в инкубационную среду этих двух субстратов (перекиси водорода и диаминобензидина) сопровождается появлением электронно-плотных преципитатов в области локализации изучаемых ферментов. Это обстоятельство открывает возможность использования ферментов с пероксидазной активностью в качестве маркера или белка-репортера. В частности, пероксидаза хрена и цитохром С (микропероксидаза) широко использовались для ультраструктурного анализа переноса белков через эпителиальные барьеры (например, через стенки капилляров). Поглощение клеткой пероксидазы или других веществ, меченных пероксидазой, помогает изучать пути эндоцитоза. В электронно-микроскопической иммуноцитохимии (см. ниже) перок-сидаза применяется в качестве маркера антител, используемых для выявления различных белков и других антигенов.

Электронно-микроскопическая иммуноцитохимия

Электронно-микроскопическую иммуноцитохимию можно определить как метод, позволяющий анализировать локализацию молекул с известной функцией и их взаимоотношения с клеточными органеллами. Прежде чем описывать принципы этого метода, подчеркнем одно обстоятельство. Успех цитохимического исследования, в том числе и иммуноцитохимии, зависит от доступности и сохранности реакционных групп взаимодействующих веществ (активных центров ферментов, проникновения субстратов и антител, сохранности антигенных детерминант и т.д.). С этой целью исследователи стараются проводить цитохимические реакции в живом объекте или в условиях, максимально обеспечивающих сохранность и доступность исследуемых взаимодействий. В частности, для выявления цитоплазматических или ядерных антигенов с помощью антител (которые, как известно, являются довольно крупными белками, не способными проходить через неповрежденную клеточную мембрану) необходимо обеспечить достаточную проницаемость мембран с помощью так называемых пермеабилизирующих агентов. Для получения тонких срезов, на которых удобно проводить иммуноцитохимические реакции, можно использовать заключение в водорастворимые полимерные смолы (например, в лавакрил), которые эффективно сохраняют антигенные детерминанты объекта. Хорошие результаты дает использование срезов быстрозамороженного образца (криосрезов), которое совмещает условия сохранности и быстрой фиксации материала, что особенно важно для изучения динамичных клеточных процессов. При использовании срезов оказываются доступными ранее скрытые антигенные детерминанты, доступ к которым открывается просто механическим обнажением. Обычно материал перед заключением в лавакрил или криотомией фиксируют в химических фиксаторах, хотя возможно использование и обратной процедуры - криофиксации с последующим замещением химическими фиксаторами.

В основе иммуноморфологических методов, в том числе и электронно-микроскопической иммуноцитохимии, лежат классические реакции Кунса (A. Coons), позволяющие выявить с помощью антител соответствующие антигены непосредственно в ткани. С этой целью срезы (или живые клетки в культуре) инкубируют в растворе антител, специфически реагирующих с этим антигеном (например, конкретным белком). Если антитела пометить хорошо различимой при микроскопии меткой, можно довольно точно выяснить локализацию комплекса антиген-антитело. Таким образом проводится так называемая прямая реакция Кунса. При проведении непрямой реакции, которая более предпочтительна, поскольку обеспечивает высокую специфичность и чувствительность, метят не первичные антитела, взаимодействующие с антигеном, а вторичные - антитела к первичным антителам или к их фрагментам (обычно к Fc-фрагменту). В электронно-микроскопической иммуноцитохимии в качестве электронно-плотной метки используются чаще всего пероксидаза хрена (и в световой микроскопии тоже) и частицы коллоидного золота. Последняя модификация имеет ряд преимуществ, поскольку можно конъюгировать антитела с частицами золота заданного размера (обычно не больше 5-15 нм, чтобы обеспечить свободный доступ меченых антител к месту реакции) и выявлять одновременно на одном и том же срезе не один, а несколько антигенов. Это бывает необходимо для выяснения колоколизации (совместного расположения) двух разных веществ в одном компартменте или в одной мембране. Частицы коллоидного золота хорошо видны на неокрашенных или слабо окрашенных тонких срезах в виде очень плотных точек или сфер. Техника золотого усиления, при которой золотая метка, уже существующая на препарате, служит центром осаждения золота из раствора, в котором инкубируются срезы, существенно повышает чувствительность метода. При этом образуются крупные, неправильной формы агрегаты коллоидного золота, без труда различимые даже на фоне хорошо окрашенных структур.

С помощью метода иммуноцитохимии можно выявить в клетке практически все вещества, к которым удается выработать специфические антитела. Разрешение метода настолько высоко, что удается локализовать, например, индивидуальные интегральные белки в соответствующей мембране, отдельные филаменты цитоскелета, молекулы РНК и др. Более того, поскольку в крупной молекуле, например в молекуле белка, антигенных детерминант (эпитопов) может быть несколько, с помощью иммуноцитохимии удается выявлять не только всю молекулу, но и ее часть, содержащую соответствующий эпитоп. При соответствующей организации эксперимента (введении временной шкалы) можно проследить пути перемещения веществ в клетке и за ее пределами или этапы метаболических превращений. Использование коллоидного золота, кроме того, позволяет при соответствующих условиях стандартизации проводить количественные сопоставления, т.е. косвенно судить о концентрации исследуемых веществ.

Сканирующая электронная микроскопия

В электронных микроскопах, предназначенных для СЭМ, с помощью специального детектора регистрируются не электроны, прошедшие через образец, как в ТЭМ, а вторичные излучения, которые возникают при бомбардировке образца пучком электронов. Эти вторичные излучения улавливаются соответствующими детекторами. В зависимости от энергии первичных электронов, состава анализируемого образца, его электропроводности и других факторов характер эмиссии (вторичного излучения) может быть различным (вторичные электроны, рентгеновское излучение, так называемые Оже-электроны и т.д.). Каждый вид излучения может быть использован для анализа образцов, в том числе и для спектрального анализа. В биологии, и в морфологии в частности, когда основным объектом исследования является поверхность биологической структуры, чаще всего используется регистрация спектра вторичных электронов, выбиваемых с поверхности объекта пучком первичных электронов, которые разгоняются ускоряющим напряжением. Поверхность образца, подлежащая изучению, сканируется сфокусированным пучком электронов синхронно с перемещением луча, который развертывает изображение на экране монитора.

Интенсивность вторичного излучения в каждой точке поверхности при таком сканировании интерпретируется соответствующими преобразователями как соответствующая яркость экрана монитора. Поскольку существует определенная, хотя и не линейная, зависимость между интенсивностью вторичного излучения и углом падения возбуждающего электронного луча (т.е. кривизной поверхности), различия в яркости, которые возникают при сканировании поверхности, дают в конечном итоге картину рельефа этой поверхности.

Разрешение в СЭМ зависит от многих факторов, среди которых можно отметить диаметр сканирующего луча (обычно около 5 нм), рабочее расстояние между объектом и источником электронов, интенсивность шумов, которые создаются детекторами и преобразователями, и др. Одним из важных условий является электропроводность образца, поскольку при низкой электропроводности объект заряжается, что вносит существенные искажения в получаемое изображение. Для повышения электропроводности объект плотно закрепляют на металлическом держателе и покрывают в вакуумной камере тонким слоем металла (золотом, платиной, палладием или их сплавами). Равномерное металлическое покрытие образца позволяет более полно стандартизовать условия генерации вторичного излучения, и в этом случае основным фактором, влияющим на его интенсивность, остается кривизна поверхности, т.е. рельеф. Толщина металлического покрытия, используемого в СЭМ, обычно не превышает 10-15 нм. Напылению металла на поверхность образца предшествует осторожное и тщательное его обезвоживание и высушивание, поскольку при микроскопии объект должен находиться в условиях высокого вакуума. Удаление воды, кроме того, способствует более полному выявлению структур поверхности, которые могли быть маскированы гидратированными участками. Одним из бесспорных преимуществ СЭМ является большая глубина фокуса, позволяющая получить резкое изображение очень неровной поверхности, по существу, 3-мерное ее изображение. Для лучшей проработки сглаженных деталей поверхности можно наклонять плоскость объектного столика синхронно с фокальной плоскостью электронного луча.

Методы, которые используются в ТЭМ (ауторадиография, цитохимия и иммуноцитохимия), были с успехом адаптированы и для целей СЭМ.

Техника сканирующей электронной микроскопии коррозионных препаратов используется для выявления формы объемных полых объектов (микрополостей, просвета сосудов и др.). После предварительной промывки просвет заполняется инъекционной массой (обычно такими полимерами, как метакрилат, латекс), и после ее полимеризации проводится травление тканей в растворах щелочей или кислот. Полученные слепки высушивают, напыляют металлом и изучают в сканирующем микроскопе. Понятно, что эта техника является модификацией коррозионного метода, который давно применяется в анатомических исследованиях.

Для изучения фибриллярных и других, устойчивых к коррозии, структур в клетке можно использовать технику детергентного экстрагирования. В основе ее лежит обработка ткани детергентами, например додецилсульфатом натрия или тритоном Х-100, которые разрушают липидные мембраны и делают доступными для исследования компоненты цитоплазмы. Метод позволяет изучать, например, 3-мерную организацию цитоскелета (микротрубочки, микрофиламенты и промежуточные филаменты).

Перечень возможных модификаций и методических подходов, используемых в электронно-микроскопических исследованиях, можно продолжить, но хотелось бы подчеркнуть главное - возможности электронной микроскопии зависят не столько от конструктивных особенностей самих микроскопов (что, безусловно, важно), сколько от техники подготовки образцов и методических приемов в соответствии с задачами исследования. Очевидно, что здесь ведущая роль принадлежит изобретательности и изощренности самих исследователей. На двух, на наш взгляд весьма перспективных, направлениях электронной микроскопии хотелось бы остановиться подробнее.

Электронно-микроскопическая томография

Электронно-микроскопическая томография (ЭМ-томография) - сравнительно новый, достаточно трудоемкий, но очень эффективный метод, предназначенный для воссоздания 3-мерной организации внутриклеточных структур, особенно мембранных органелл. В основе метода лежит использование срезов образцов, обычно заключенных в полимерные смолы. После фиксации кусочки ткани обрабатывают, как обычно для получения срезов, но толщина срезов, используемых в ЭМ-томографии, может быть существенно больше обычной и зависит от размера исследуемой структуры и необходимого уровня разрешения. Срезы монтируют на бленды (сетки с широкими ячейками или с большим окошком в центре), затем инкубируют в разведенном растворе коллоидного золота, чтобы его частицы служили в последующем реперными точками для компьютерного совмещения томографических срезов. Для целей ЭМ-томографии используются микроскопы, которые позволяют работать с цифровым изображением. После контрастирования и высушивания срезов бленды помещают в объектодержатель, совмещенный с гониометром, который позволяет изменять наклон образца в широком диапазоне. Последовательно наклон изменяют на 1-2° и в каждом положении фиксируют получаемое изображение. Разрешение в ЭМ-томографии определяется многими факторами, среди которых следует отметить толщину среза, величину угла между плоскостью среза и оптической осью и, конечно, используемое увеличение. Забранные изображения (обычно более 100) отсылаются в компьютер, который, ориентируясь на реперные частицы золота, выстраивает изображения вдоль одной оси и представляет результат в виде серии виртуальных срезов толщиной 2-3 нм. Конечное разрешение обычно близко к этой величине. С помощью специальных программ реконструируется 3-мерная модель, которая по желанию исследователя может быть представлена в псевдоцветах. Несмотря на трудоемкость, ЭМ-томография является, по-видимому, самым надежным методом для анализа реальной структуры мембранных компартментов - их формы, связей, динамики, поскольку она совмещает достоинства высокого разрешения с возможностью представления структур в 3-мерном пространстве.

Последнее, на чем хотелось бы остановиться, вряд ли можно считать методом или модификацией какого-либо метода электронной микроскопии. Скорее, это современная высокоэффективная методология микроскопического анализа клеточных функций, известная как коррелятивная световая и электронная микроскопия. Как следует из названия, при данном подходе последовательно используются световая микроскопия (обычно в ее современных высокоразрешающих модификациях) и те или иные электронно-микроскопические методы. Примером эффективного приложения этого подхода является изучение в условиях клеточной культуры путей транспорта веществ в клетке. Современные методы флюоресцентной микроскопии (например, лазерная конфокальная сканирующая микроскопия) позволяют с очень хорошим для светового микроскопа разрешением выявлять положение различных веществ в живой клетке. С этой целью используются принципиально те же методические приемы, что и при электронной микроскопии (цитохимия, иммуноцитохимия). Однако спектр цветных маркеров, используемых, например, для мечения антител, во флюоресцентной микроскопии неизмеримо более широк. Это позволяет выявлять сразу несколько веществ (и, следовательно, структур, в которых они локализованы), изучать непосредственно во время микроскопического наблюдения их динамику, концентрацию и пути перемещения. По завершении светооптического этапа переходят к соответствующему электронно-микроскопическому приему, например к иммуноцитохимии, на том же объекте. При соответствующей организации работы удается исследовать одну и ту же клетку и в световом и в электронном микроскопе. Преимущества такого подхода очевидны.

Коррелятивная микроскопия, таким образом, совмещает достоинства обоих микроскопических подходов - возможность исследования динамических процессов в живой клетке и получения дополнительной информации о точной локализации участников этих процессов в определенных клеточных структурах или компартментах. Понятно, что при этом сами участники хорошо известны, поскольку их идентификация основана на высокоспецифичных методах индикации. С помощью таких взаимодополняющих методических подходов, как коррелятивная микроскопия, были идентифицированы, например, многие резидентные (т.е. характерные для данной структуры) белки мембран, прослежена динамика и точная локализация секреторных белков, выяснены колокализация и совместное участие белков в передаче клеточных сигналов и другие взаимодействия, определяющие клеточные функции.

Принцип конструкции электронного (трансмиссионного) микроскопа аналогичен световому, только вместо пучка фотонов в нем используется пучок электронов с высокой энергией, а вместо стеклянных линз - линзы электромагнитные, точнее, электромагнитные катушки. В электронном микроскопе в качестве источника электронов используется раскаленная вольфрамовая нить (катод электронной пушки). Пучок электронов получает ускорение (и, следовательно, энергию), проходя через кольцевой анод. Величина энергии зависит от величины ускоряющего напряжения (обычно - 75-150 кВ), которое подается на анод. Конденсорная система (конденсорная линза) фокусирует пучок электронов на объект, а объектив (объективная линза) и окуляр (проекционная линза) посылают прошедшие через образец электроны на флюоресцирующий экран, фотопластинку или (в современных микроскопах) на светочувствительную матрицу. После проекции электронов конденсорной линзой на объект (например, тонкий срез ткани) электроны с ним взаимодействуют - отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменений. Прошедшие через объект электроны, которые могут потерять часть своей энергии вследствие взаимодействия с атомами объекта, фокусируются объективной линзой. Эта линза, как и в световом микроскопе, определяет основные его показатели, прежде всего разрешение. Первичное изображение увеличивается (растягивается) проекционной линзой и направляется на экран, фотопластинку или матрицу. Наблюдатель может видеть изображение на флюоресцирующем экране или на дисплее компьютера. Это изображение есть в конечном итоге оптический эквивалент распределения энергии, которой обладают электроны, прошедшие через объект. Участки среза, в которых электроны частично или полностью потеряли энергию (вследствие поглощения или отражения), выглядят темными (электронно-плотными), а участки, которые электроны прошли практически без потерь, - электронно-прозрачными. В электронном (трансмиссионном) микроскопе объект может быть увеличен в 50-100 тыс. раз, а при последующей фотопечати или компьютерной обработке - еще в 10-20 раз. Это увеличение, однако, не дает большего разрешения, чем первичное увеличение микроскопа, хотя и позволяет более удобно работать с иллюстрациями. В СЭМ пучок электронов после конденсорной линзы периодически отклоняется сканирующей обмоткой, причем частота развертки синхронизирована с частотой развертки луча на телевизионном экране. Вторичное излучение и отраженные электроны улавливаются детекторами, сигнал усиливается и подается на электронно-лучевую трубку. Таким образом, в СЭМ энергия вторичного излучения трансформируется в изображение. Как и в трансмиссионном микроскопе, в СЭМ возможны цифровая регистрация и хранение изображения. Современные СЭМ позволяют добиться разрешения 3-5 нм.

ТЭМ тонких (ультратонких) срезов показывает сечение клеток и их органелл, что делает возможным изучение внутренних структур клеток, их взаимоотношений между собой и с внеклеточными компонентами ткани.

На обзорной электронной микрофотографии представлен фрагмент поперечного сечения наружных отделов стенки тонкой кишки. Пустое пространство, занимающее верхний правый сектор, - это перитонеальная полость (ПП). Один тонкий слой мезотелиальных клеток (МК) составляет внешнюю границу стенки кишки. Группы черных точек под мезотелием (поперечно и частью - косо) - пересеченные пучки коллагеновых волокон (КОЛ). Даже при таком небольшом разрешении хорошо видны органеллы макрофага (МФ): ядрышко (ЯД), комплекс Гольджи (КГ), центриоль (Ц), лизосомы (Л), цистерны эндо-плазматической сети (ЭС) и др. В отличие от мембраны макрофага клеточная мембрана гладких мышечных клеток (ГМ), фрагменты которых видны глубже макрофага, имеет наружную «опушку» - базальную (наружную) мембрану (стрелки). Похожая базальная пластинка окружает также эндотелиальные клетки (ЭК) маленького артериального сосуда. В просвете артериолы находится плазма крови, видимая как мелкозернистый преципитат (ПЛ) и фрагменты эритроцитов (ЭР). Подобные обзорные иллюстрации удобны для изучения взаимоотношений клеток, но, конечно, для исследования деталей строения нужно большее увеличение микроскопа.

Фотография иллюстрирует принцип получения металлической реплики при использовании метода замораживания-раскалывания (криофрактографии). На поверхность раскола специально напылена достаточно грубая металлическая (платиновая) пленка, и поэтому многие детали не видны. Эта пленка (реплика) изучается в ТЭМ после удаления ткани, на которую она наносилась. Принцип метода станет более понятным, если обратить внимание на крупные шаровидные образования (секреторные гранулы). Напыление платиной производилось слева снизу (большая стрелка). Поверхности гранул, обращенные к источнику напыления, оказались покрытыми металлом, тогда как противоположные поверхности остались в тени, не имеют металлического покрытия и выглядят светлыми или даже белыми.

Подобным образом выявляются и более мелкие пузырьки в цитоплазме, а также рельеф поверхности в зоне контакта клеток (в центре). Стоит обратить внимание еще на одно важное обстоятельство. Гранулы 1, 3, 4 и 7 обращены к наблюдателю выпуклой поверхностью, поскольку разлом обнажил внутренний (для гранулы) листок мембраны (Е-поверхность). Напротив, на месте гранул 2, 5, 6, 8, 9 и 10 видны углубления, в которых металлом покрыта правая сторона. В этом случае разлом прошел через удаленную от наблюдателя поверхность шара и обнажился наружный листок бислоя (Р-поверхность). Таким образом, чтобы судить, какая поверхность перед нами (выпуклая или вогнутая), всегда нужно учитывать направление напыления реплики. В противном случае может создаться превратное представление, в чем читатель может убедиться сам, повернув фотографию на 180°.

Эти две фотографии хорошо иллюстрируют необходимость правильной интерпретации криофрактографических картин. Оба сюжета принадлежат эндотелиальным клеткам капилляров островков Лангерганса. Они сфотографированы при одном и том же увеличении микроскопа, и при производстве реплики напыление проводилось почти из одного и того же направления (большие стрелки). Капилляры островков относятся к фенестрированному типу, т.е. их эндотелиальные клетки имеют окошечки (фенестры), прикрытые тонкими диафрагмами (см. рис. 3-48, 3-49). На рис. 2-4, а эти фенестры представлены в виде однотипных ямок с плоским дном (диафрагма фенестры). Маленькие однородные структуры, видимые на поверхности разлома (стрелки), - это внутримембранные частицы, т.е. интегральные белки мембраны, встроенные в липидный бислой (см. гл. 3).

Они подсвечены только со стороны напыления; противоположная поверхность осталась в тени и выглядит светлой. Таким образом, для суждения о направлении напыления можно ориентироваться на освещенность внутримембранных частиц. Они всегда выступают над относительно ровной поверхностью окружающих липидов, а их темная сторона обращена к источнику напыления металла. Кавеолы (рис. 2-4, б), округлые углубления или инвагинации, которые также образованы мембраной эндотелиальной клетки, в отличие от фенестр, видны как выпуклые структуры (см. рис. 3-57). И в этом нам также помогают убедиться свет и тени внеутримембранных частиц. Если не обращать на это внимания и повторить поворот рисунка на 180°, впечатление будет прямо противоположным: выпуклые фенестры (на рис. 2-4, а), а вогнутые кавеолы (на рис. 2-4, б).

В данной главе отмечалось, что при выполнении замораживания-раскалывания разлом ткани обычно проходит по гидрофобной (внутренней) зоне липидного бислоя мембран клетки. При этом доступными для наблюдения могут оказаться обе внутренние поверхности расщепленной мембраны. Поскольку при развитии метода криофрактографии чаще обращали внимание на изучение клеточной мембраны (плазмолеммы), была предложена и соответствующая номенклатура криофрактографических поверхностей, т.е. поверхностей, искусственно получающихся в результате расщепления мембраны. Так, поверхность липидного листка, который прилежит к цитоплазме, получила название Р-поверхности (от англ. protoplasmic). Поверхность наружного листка клеточной мембраны называется Е-поверхностью (от англ. еxtracellular). То же справедливо и для мембран клеточных органелл, однако в этом случае нужно учитывать топологическое соответствие. Например, криофрактографическая поверхность листка мембраны эндоплазматической сети, прилежащего к цитоплазме, - это Р-поверхность. Поверхность листка, обращенного в просвет цистерн эндоплазматической сети, соответствует поверхности внешнего листка плазмолеммы и, следовательно, это Е-поверхность. Термин «внутримембранные частицы» был предложен до того, как эти структуры были идентифицированы в качестве интегральных белков мембран, точнее белков, вместе с прилежащими и тесно связанными липидами.

Видны три различающихся фрагмента двух мембран соседних печеночных клеток, связанных между собой щелевым (коммуникационным) контактом (см. рис. 3-40). На фотографии (внизу слева) представлена Р -поверхность одной печеночной клетки. Видно, что эта поверхность имеет много выступающих над поверхностью внутримембранных частиц. Известно, что интегральные протеины клеточной мембраны тесно связаны с элементами цитоскелета и закреплены этим цитоскелетом. Поэтому при расколе мембраны эти белки остаются ассоциированными преимущественно с внутренним, цитоплазматическим листком липидного бислоя. Ближе к середине фотографии частицы на Р -поверхности располагаются очень тесно, практически без промежутков. Они образуют обширный кластер, характерный для щелевого соединения (нексуса - Н). На Е -поверхности мембраны другой печеночной клетки (справа) внутримембранные частицы гораздо менее многочисленны и видны лишь в правом верхнем секторе. При этом внизу справа - множество плотно упакованных мелких ямок - вдавлений внутримембранных частиц. Это зона локализации того же щелевого соединения, но здесь все частицы остались связанными с другой Р -поверхностью - мембраны 2-го гепатоцита. Понятно, что эта поверхность в видимую плоскость разлома попасть не могла. От этих частиц на видимой нам Е -поверхности остались соответствующие ямки. Поэтому говорят, что поверхности, получающиеся в результате разлома мембраны, комплементарны, т.е. соответствуют друг другу, хотя и не идентичны.

Здесь, как и в последующем, направление напыления металла для получения реплики обозначено большой стрелкой.

Обзорная микрофотография показывает не совсем типичную и привычную для замораживания-раскалывания картину. Она напоминает гистологический срез, но с некоторыми элементами рельефа. Просвет расположенного в центре рисунка кровеносного капилляра вскрыт в двух участках (ПР). Поскольку клеток (и мембран соответственно) в просвете нет, он выглядит однородным. Аналогичным образом срез прошел через два ядра ацинарных клеток, видимые в нижней части рисунка (Я). В центральной зоне капилляра и вокруг просвета видны мембранные поверхности эндотелиальных клеток (ЭК) и, частично, сами рассеченные эндотелиальные клетки (стрелки). Многочисленные пластинчатые структуры, окружающие капилляр, - это цистерны гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС) экзокринных клеток с частично расщепленными мембранами. В левом нижнем углу видны округлые секреторные гранулы.

Металлические реплики такой площади обычно получаются редко, потому что расщепляющиеся мембраны имеют большую кривизну и плоскость разлома часто перескакивает на другие структуры.

Метод ауторадиографии в его электронномикроскопическом варианте, достаточно удобен для изучения процессов пролиферации клеток, синтеза рибонуклеиновых кислот, белков, полисахаридов и других веществ. С его помощью можно проследить судьбу разделившихся клеток, направление дифференцировки, миграцию и др.

Экспериментальному животному или в культуру клеток водится какой-либо предшественник исследуемого вещества, меченый радиоактивным изотопом. Для нуклеиновых кислот это могут быть азотистые основания, для белков - аминокислоты, для полисахаридов - какой-либо из сахаров. В этих предшественниках один или несколько атомов замещены радиоактивным аналогом. Изотопы подбираются таким образом, чтобы излучение не обладало большой энергией и частицы имели минимальную величину пробега в фотоэмульсии. Зерна восстановленного серебра, обладающие высокой электронной плотностью, прорисовывают путь каждой частицы в виде извитого трека или пятна. В основном, эти треки располагаются над тем местом, где находится меченый предшественник. В нашем примере это ³ Н-тимидин, который включается в синтезирующуюся молекулу ДНК в фазе S клеточного цикла. Видно, что локализация ³ Н-тимидина ограничена исключительно ядром клетки, и включается он, преимущественно, в участки, расположенные по периферии конденсированного хроматина (гетерохроматина).

Два трека (стрелки) пересекают границы ядра (ядерную оболочку), что можно объяснить некоторой погрешностью метода. β-частицы покидают источник излучения под разными углами и некоторые из них могут пробегать в толще фотоэмульсии достаточно большое расстояние, прежде чем покинут ее. При использовании импульсной (разовой) метки можно оценить примерную «концентрацию» предшественника в материнской клетке, а затем проследить судьбу дочерних клеток, в которых метка, конечно, будет «разводиться» с кратностью, равной 2 при каждом цикле деления. Это позволяет определить также и время, необходимое клеткам для вступления в новый цикл, и долю делящихся клеток, т.е. охарактеризовать интенсивность пролиферации всей клеточной популяции. Следует помнить, однако, что включение предшественников ДНК (синтез новых молекул ДНК) еще не означает, что клетка непременно должна разделиться. Дело может ограничиться лишь удвоением количества ДНК, т.е. образованием полиплоидной клетки. Такие клетки есть практически в любой клеточной популяции, и иногда они составляют довольно существенную ее фракцию.

Фермент пероксидаза, получаемый из корня хрена, широко используется в модельных экспериментах, например, при изучении проницаемости сосудов для белков средней молекулярной массы, а также в качестве электронноплотной метки антител при проведении иммуноцитохимических исследований. Объектом исследования были культивированные клетки линии NRK (normal rat kidney) - эпителий почечных канальцев крысы. Известно, что белки, синтезируясь на рибосомах гранулярной эндоплазматической сети, оформляются в виде конечного продукта в комплексе Гольджи (КГ) - необходимый этап так называемой посттрансляционной модификации для всех секретируемых клеткой белков и белков мембран (см. гл. 4). Гистохимическая реакция для выявления пероксидазы проводилась с использованием в качестве субстрата диаминобензидина (ДАБ), который дает, в конечном итоге, электронноплотный продукт.

С помощью антител, меченных пероксидазой хрена, выявлялся фермент комплекса Гольджи, маннозидаза II, который участвует в посттрансляционной модификации различных белков. Этот фермент при гликировании белков (присоединении к ним олигосахаридных групп) удаляет второй остаток маннозы. Процесс гликирования происходит последовательно и поэтому ферменты, в нем участвующие, расположены, как правило, в каком-либо определенном отделе КГ (см. гл. 4). Можно видеть, что маннозидаза II локализуется, преимущественно, в средних цистернах КГ, тогда как цистерны, расположенные проксимально (cis -полюс) и дистально (trans -полюс), не содержат продукта реакции. Иммуноцитохимия является, таким образом, очень эффективным методом, позволяющим локализовать в клетке различные белки с высокой точностью.

Электронная иммуноцитохимия обладает несравненно большим, чем другие методы, разрешением для выяснения вопросов точной локализации молекул в клетке. Эти молекулы (антигены) могут быть выявлены с помощью соответствующих антител, которые связываются с ними с высокой специфичностью. Чтобы образовавшийся комплекс антиген- антитело можно было увидеть при микроскопии, антитела метят каким-либо электронно-плотным маркером - ферритином, пероксидазой или, как в данном примере, коллоидным золотом. Непрямая реакция Кунса. С помощью соответствующих вторичных антител, меченных частицами коллоидного золота, выявлены сразу два белка - golgin-84 и GM-130. Поскольку антитела метились частицами золота разного (и всегда известного) размера, мы можем точно видеть локализацию каждого белка: golgin-84 (10 нм) и GM-130 (15 нм). Реакция связывания антител проводилась на срезах быстрозамороженных клеток печеночной линии HepG2 (криосрезах). Криофиксация - процесс очень быстрый, что позволяет практически зафиксировать прижизненную ситуацию и избежать изменений в локализации молекул, возможных при проведении более медленной химической фиксации альдегидами. Кроме того, криофиксация с последующей резкой образца в замороженном состоянии (криоультратомированием) лучше сохраняет антигенные детерминанты для реакции с антителами.

Срезы не окрашивались тяжелыми металлами, поэтому мембраны Гольджи выглядят светлыми, хотя и вполне отчетливыми. На неокрашенном срезе золотые метки видны очень хорошо. Это позволяет привязать каждый белок к определенному мембранному компартменту. Белок GM-130 является резидентным белком комплекса Гольджи (см. гл. 4) и, более того, локализуется исключительно в cis-компартменте (cis). Он часто используется как референтный белок - маркер cis-компартмента. Golgin-84, выяснение локализации которого, собственно, и служило задачей исследования, как можно видеть, колокализуется (располагается совместно) с белком GM-130 в тех же мембранах cis-компартмента комплекса Гольджи. Golgin-84 относят к матриксным белкам комплекса Гольджи, которые, с одной стороны, участвуют в стабилизации его структуры, а с другой - в процессах динамической трансформации этой органеллы.

Эта электронная микрофотография примечательна во многих отношениях. Она являет собой пример сочетанного использования цитохимии и электронной иммуноцитохимии на одном и том же объекте. Культивируемые клетки (фибробласты человека) были инфицированы вирусом везикулярного стоматита (VSV) и одновременно трансфектированы геном, который кодирует растворимую секретируемую пероксидазу хрена (ssHRP). Известно, что вирусные белки, в том числе и так называемый G-белок VSV, синтезируются клеткой-хозяином по той же схеме, что и собственные белки клетки. С другой стороны, трансфектируемый ген, кодирующий чужой белок, также встраивается в геном клетки-хозяина, и она начинает синтезировать этот белок наряду с собственными протеинами. Конечно, оба белка, ssHRP и VSV-G, не являются естественными белками фибробластов, но поскольку они синтезируются так же, как и собственные клеточные белки, то могут использоваться как модельные маркеры для характеристики синтеза и транспорта белков в клетке. Растворимая секретируемая пероксидаза, как свидетельствует название, является секретируемым, хорошо диффундирующим белком и, так же как и другие секретируемые клеткой протеины, находится в просвете цистерн эндоплазматической сети (ЭС). G-белок VSV, напротив, мембранный протеин и используется вирусом для проникновения в клетку-хозяина.

Пероксидаза выявлялась в цистернах эндоплазматической сети с помощью гистохимической реакции с диаминобензидином (ДАБ), а G-белок - с помощью антител P4D5, меченных коллоидным золотом. Но в этом случае проводили реакцию так называемого золотого усиления. Срезы после инкубирования с антителами дополнительно помещали в слабый раствор коллоидного золота. Исходные золотые метки антител (диаметром 5 нм) служили центрами осаждения коллоидного золота из раствора, что привело к увеличению размера меток и их лучшей выявляемости. Метод очень чувствителен, поскольку позволяет использовать при проведении иммунологической реакции низкие концентрации антител с очень небольшой исходной меткой. Это обеспечивает лучший доступ антител к антигенным детерминантам исследуемых белков.

СЭМ в биологии используется преимущественно для анализа рельефа поверхности и формы объектов. В нашем примере это рельеф апикальной (обращенной в просвет) поверхности эпителиальных клеток. Можно видеть, что этот рельеф сформирован многочисленными складками различной величины и формы, а также цилиндрическими выростами мембраны - микроворсинками (стрелки). Интересно, что при исследовании этой поверхности в трансмиссионном микроскопе были видны лишь выступающие в просвет микроворсинки. СЭМ, таким образом, позволяет получить уникальную информацию, которая вряд ли доступна при использовании иных методических подходов. В отличие от ТЭМ при СЭМ электроны, испускаемые катодом (источником), не поглощаются или рассеиваются тканью, а, соударяясь с ней, отражаются или вызывают вторичное излучение. В биологической практике это, как правило, вторичные электроны, которые выбиваются из каждой точки поверхности благодаря энергии электронов сканирующего луча. Поскольку в зависимости от рельефа соударение с поверхностью происходит под различным углом, энергия вторичных электронов также различается. Эта разница в энергии улавливается и интерпретируется специальными детекторами, которые представляют различия в энергии как различия в плотности изображения на экране монитора, т.е. как чередование света и тени.

По ряду причин необходимо стандартизовать условия взаимодействия сканирующего пучка электронов с поверхностью биологического объекта. Это достигается его осторожным высушиванием и напылением на поверхность объекта тонкой пленки какого-либо металла - меди, золота или платины. Несмотря на то что металлическое покрытие несколько снижает разрешающую способность метода, уже сейчас в СЭМ можно добиться разрешения в пределе 2-3 нм. Это достаточно высокое разрешение, если учесть, что толщина биологических мембран составляет 6-8 нм.

Этот методический подход является модификацией давно применяемой в анатомии коррозионной техники, адаптированной для СЭМ. Хотя увеличение микрофотографии сравнимо с величиной оптического увеличения и вообще невелико, классический метод световой микроскопии не позволяет получить таких впечатляющих объемных картин и такого чистого изображения. Эта чистота - результат более высокого (несмотря на равные увеличения) разрешения, которое достигается в электронной микроскопии.

Это объемное изображение демонстрирует не наружные поверхности сосудов - кровеносных капилляров (КК) и лимфатических сосудов (ЛС), а поверхность слепков их просветов. С целью получения этих реплик сосуды заполняются при соответствующем давлении быстро полимеризующейся эпоксидной смолой. После полимеризации и затвердевания массы биологические ткани образца растворяются в сильных реагентах (кислотах, щелочах). Реплика отмывается от остатков ткани и, как обычно, покрывается слоем металла. При СЭМ мы видим рельеф внутренней поверхности сосудов так, как он отпечатался на заполняющей сосуды смоле.

Например, на поверхности слепков лимфатических сосудов видны небольшие импрессии (вдавления), образовавшиеся в результате того, что ядросодержащие зоны эндотелиальных клеток заметно выступают в просвет сосуда (стрелки). Складки на некоторых участках соответствуют местам расположения клапанов (головки стрелок). Структуры неправильной формы, которые видны на двух участках препарата (звездочки), являются артефактами. Это скопления смолы, по-видимому, вышедшие в ткань из просвета сосудов, с поврежденной стенкой. В общем, любая манипуляция, связанная с подготовкой живого биологического объекта для морфологического исследования (например, фиксация), чревата опасностью появления артефактов - искусственно созданных морфологических структур или картин, которые могут быть интерпретированы как естественные структуры. Особенно велика эта опасность при проведении микроскопических исследований. Поэтому одно из основных умений любого морфолога - распознавать эти искусственно созданные структуры - артефакты. Несколько преувеличивая, можно сказать, что история микроскопии - это история «борьбы» с артефактами. Но именно это и есть один из мощнейших стимулов к совершенствованию микроскопической техники. Артефакты полезны.

Разрешение электронного микроскопа велико, но все же ограничено, и не всегда позволяет выяснить тонкие детали строения органелл. Одним из существенных ограничений является толщина срезов ткани. Чем тоньше срез - тем выше разрешение, но при этом существенно увеличивается неопределенность в 3-мерной организации объекта, поскольку на тонких срезах мы можем видеть лишь его сечение. В электронно-микроскопической томографии можно использовать более толстые (сотни нанометров), чем в обычной ТЭМ, реальные срезы ткани. Эти срезы окрашивают обычными методами и помещают в гониометр - устройство микроскопа, позволяющее наклонять образец вокруг фиксированной оси в широком диапазоне (-70 …​ +70°). При наклоне образца на каждый градус можно получить и сохранить в цифровом формате изображение, которое является оптическим, т.е. виртуальным, срезом. Разрешение на этом срезе существенно выше - обычно 2-4 нм, что позволяет выявлять детали, которые на обычных, реальных, срезах не видны. При сопоставлении виртуальных срезов становятся доказательными некоторые особенности строения, например наличие мембранных связей.

В приведенном примере на первых двух виртуальных срезах (рис. 2-13, а, б) небольшой мембранный пузырек (везикула) представляется свободным (стрелки), не связанным с близлежащими цистернами комплекса Гольджи. Как можно видеть на 3-м срезе (рис. 2-13, в; стрелка), эта кажущаяся свободной везикула в действительности просто расширение одной из цистерн, соединенное с ней тонким мостиком (тубулой). Напротив, видно, что внешняя цистерна, которая на срезе представлена фрагментированной (двойные стрелки) является, в действительности, сплошной (а, б). Большая коллекция виртуальных срезов (в нашем примере 140) может быть использована для 3-мерной компьютерной реконструкции изучаемой структуры в объеме всей толщины реального среза (рис. 2-13, г). Для наглядности программа позволяет представить структуры, принадлежащие разным цистернам или связанные с ними, в псевдоцветах. Метод электронно-микроскопической томографии достаточно трудоемкий, но весьма эффективен при анализе 3-мерной организации клеточных органелл.

Взаимодействие любой клетки с окружающей средой, в том числе и с другими клетками, - необходимое условие ее существования. Цель этого взаимодействия определяется двойственной природой самой жизни клетки в составе многоклеточного организма. Во-первых, клетка должна поддерживать свою жизнедеятельность, и постоянный обмен с окружающей средой является единственным механизмом обеспечения жизни. Во-вторых, осуществление специфических функций в многоклеточном организме требует координации деятельности различных клеток и, как следствие, постоянного общения каждой клетки с другими.

Целостность клетки как биологической единицы в условиях многоклеточности не только не исключает, но, безусловно, требует подчинения ее интересов интересам всего организма. С морфологической точки зрения целостность клетки обеспечивается существованием некой границы, которая, с одной стороны, действительно отделяет клетку от окружения, а с другой - позволяет осуществлять необходимые формы обмена или взаимодействия. Понятно, что это взаимодействие должно быть избирательным, т.е. регулируемым.

Клеточная мембрана (плазмолемма) и является такой границей. Эта важная органелла имеет определенный состав, строение и механизмы, обеспечивающие обмен веществ, получение клеткой необходимой информации, связь с клетками-соседями, внеклеточными компонентами ткани и др.

Основу структуры клеточной мембраны, как и всех биологических мембран клетки, составляет двойной слой (бислой) жирорастворимых молекул - липидов. Тот факт, что биологические мембраны построены именно из липидов, а не из молекул, растворимых в воде, вполне объясним и весьма целесообразен. Поскольку и клеточное содержимое, и окружающая клетку среда представляют собой водные (хотя и весьма сложные) растворы, естественной границей между ними могут быть лишь структуры, построенные из молекул, плохо растворимых в воде. Поэтому одной из основных функций биологических мембран, в том числе и плазмолеммы, является отграничение (выделение) в общей водной среде некоторых относительно автономных отсеков, или компартментов.

Клетка представляет собой такой компартмент, состав и структура которого отличны от состава и строения внеклеточного компартмента. Биологические мембраны, таким образом, позволяют поддерживать в клетке и ее частях существенные различия в концентрации веществ, создают благоприятные условия для протекания определенных биохимических реакций. Именно мембраны организуют общее пространство клетки как систему взаимодействующих, но отличающихся друг от друга компартментов (например, ядра и цитоплазмы). Различия в характере и типе биохимических реакций отражают специализацию ограниченных мембранами пространств и самих мембран, их разное значение для жизнедеятельности клетки. Такие специализированные компартменты клетки выделяются в качестве ее органелл. Сами мембранные органеллы могут также подразделяться на компартменты, например эндоплазматическая сеть - на гладкую и гранулярную. Существование немембранных органелл не опровергает это утверждение. Эти органеллы (рибосомы, центриоли, цитоскелет) представляют собой сложные, преимущественно белковые, комплексы и независимо от локализации не требуют для осуществления своих функций какого-либо отграничения от остального цитоплазматического пространства.

Современные представления о структуре и свойствах биологических мембран основаны на так называемой жидкостно-мозаичной модели. Существование и целостность самих липидных мембран в водной среде возможны благодаря уникальным свойствам молекул, образующих бислой. Эти молекулы (преимущественно фосфолипиды, гликолипиды, холестерол) обладают амфипатическими свойствами, т.е. способны взаимодействовать как с водной, так и с неводной (гидрофобной) средой. Головки мембранных липидов, как правило, полярны (гидрофильны) и диссоциируют в водном окружении. Напротив, жирнокислотные хвосты (обычно два у каждой молекулы) практически нерастворимы в воде (гидрофобны) и поэтому должны быть спрятаны в липидной фазе. Это достигается самосборкой липидного бислоя, при которой гидрофобные части молекул ориентируются друг к другу и избегают контакта с водной фазой. Липидная матрица биологических мембран в клетке всегда имеет строение бислоя, в котором полярные фрагменты молекул обращены наружу - к водной среде, тогда как жирно-кислотные хвосты обоих монослоев формируют общую гидрофобную зону в центре бислоя. Именно эта зона позволяет мембранам выступать в качестве барьеров, разграничивающих водные компартменты.

Хотя основа мембран состоит из двух слоев липидных молекул, при обычном электронно-микроскопическом исследовании мембраны выявляются как 3-слойные симметричные образования толщиной около 8 нм. Полярные группы липидов, связывающие тяжелые металлы, непроницаемы для электронов и выглядят как две темные полосы, разделенные светлым промежутком. Этот промежуток - общая для обоих слоев гидрофобная зона, в которой хвосты липидных молекул каждого слоя ориентированы параллельно друг другу и направлены к аналогичным хвостам другого слоя. Липидная матрица мембран представляет собой, по существу, 2-мерный раствор липидов в водной фазе, однако она достаточно прочна - два липидных монослоя и отдельные молекулы удерживаются вместе за счет гидрофобных взаимодействий хвостов и полярных (электростатических и водородных) связей между заряженными головками липидов. Гидрофобная природа центральной зоны мембраны исключает ее контакт с водой, поэтому в клетке все мембранные структуры представляют собой замкнутые пузырьки (везикулы), трубки или плоские мешочки - цистерны.

При использовании таких специальных методов подготовки образцов для электронной микроскопии, как замораживаниераскалывание (криофрактография) (см. гл. 2), мембраны расщепляются вдоль центральной гидрофобной зоны, и можно видеть внутренние поверхности каждого липидного монослоя. Эти поверхности обычно не гладкие. Они включают относительно крупные внутримембранные частицы, которые образованы белковыми глобулами (интегральными белками), расположенными в толще мембраны. Эти частицы более многочисленны на цитоплазматической поверхности скола (Р-поверхности), образованной внутренним листком мембраны, обращенным к цитоплазме. На Е-поверхности, которая соответствует гидрофобной зоне внешнего (экстраплазматического) монослоя липидов, внутримембранных частиц обычно мало, но зато выявляются углубления или борозды, комплементарные частицам соответствующей Р-поверхности.

Барьерные свойства липидного бислоя являются общими, неспецифическими для всех мембран клетки, хотя и могут варьировать в зависимости от принадлежности мембраны и ее состава. В плазмолемме, например, могут существовать липидные островки, или рафты, весьма специфического состава. С их существованием связывают осуществление клеткой некоторых весьма избирательных процессов, таких как эндоцитоз, перенос сигналов в цитоплазму и др. Однако выполнение специфических функций различных мембран (избирательной проницаемости, рецепции сигналов, ферментативной активности, контактов с другими мембранами) связано в первую очередь с наличием в их составе белков. Доля белков в мембранах может варьировать от 15-18% (в миелиновой оболочке нервных волокон) до 70-75% (во внутренней мембране митохондрий). Среднее содержание компонентов, типичное для многих биологических мембран, в том числе и для плазмолеммы, представлено в мембране эритроцитов. В этой мембране белки составляют по массе примерно 49%, а липиды - 44% (33% - фосфолипиды и другие формы, 11% - холестерол). Оставшиеся 7% приходятся на долю углеводов (олигосахаридов), цепочки которых обычно связаны с белками или липидами.

Мембранные белки погружены в липидный бислой или пронизывают его. Эти интегральные белки имеют достаточно протяженный трансмембранный фрагмент, который позволяет им удерживаться в гидрофобной зоне бислоя, и два внемембранных фрагмента, или домена, - внеклеточный и цитоплазматический. Трансмембранный фрагмент всегда имеет строение α-спирали с высоким содержанием неполярных (гидрофобных) аминокислот, которые ориентированы к окружающим белок липидам. Во внутреннем пространстве α-спирали обычно находятся полярные (водорастворимые) аминокислоты. Число спиралей, составляющих трансмембранный фрагмент, может быть различным. Связи интегральных белков с бислоем липидов настолько прочны, что белки можно выделить только после разрушения липидной матрицы.

Интегральные белки плазмолеммы и большинства внутриклеточных мембран (например, мембран комплекса Гольджи, лизосом) являются гликопротеинами, поскольку их внеклеточные фрагменты имеют олигосахаридные цепочки. В плазмолемме эти цепочки всегда обращены во внеклеточное пространство, что придает клеточной мембране определенную асимметрию. Отрицательно заряженные группы олигосахаридов и некоторые полярные фрагменты липидов и белков, ориентированные во внешнюю среду, создают в совокупности отрицательно заряженный слой на клеточной поверхности - гликокаликс. Этот слой связывает многие молекулы, растворенные во внеклеточной жидкости, что облегчает их узнавание (рецепцию), ферментативную модификацию и перенос в цитоплазму. Гликокаликс отчетливо выявляется при использовании положительно заряженных электронно-плотных красителей или крупных молекул (рутениевый красный, ферритин). Мембраны асимметричны также вследствие того, что состав липидов во внутреннем и наружном монослое может быть отличным. Так называемые периферические белки в состав мембран не входят, но удерживаются на их поверхностях за счет химических связей с полярными головками липидов (реже - с их гидрофобными сегментами) и с внемембранными фрагментами интегральных белков.

Гидрофобные взаимодействия липидов между собой и с интегральными протеинами допускают достаточную подвижность молекул в бислое и его деформируемость. Способность мембран к деформации позволяет клетке образовывать структуры различной конфигурации - выросты (микроворсинки, филоподии, ламеллоподии), углубления (инвагинации), везикулы (пузырьки), трубки и т.д. Эти структуры необходимы для осуществления многих клеточных функций.

И липиды, и белки могут перемещаться в плоскости мембраны на большие расстояния - феномен, известный как латеральная диффузия. Так, рецепторы в плазмолемме лимфоцитов могут мигрировать от одного полюса клетки к другому в пределах нескольких секунд. Скорость латеральной диффузии липидов еще больше - до2 мкм/с. Жидкостные свойства (текучесть) липидной матрицы зависят от температуры, состава липидов (точнее, жирных кислот, образующих их хвосты), содержания в бислое интегральных белков, двухвалентных катионов и особенно холестерола, который также является липидом. Его плоские молекулы встраиваются в гидрофобную зону бислоя и, в зависимости от концентрации и температуры, делают бислой более жидким или более твердым.

Одна из важнейших функций клеточной мембраны - рецепторная - специфическое узнавание и связывание различных молекул ( лигандов), находящихся во внеклеточном пространстве. Связывание сигнальных молекул (гормонов, нейротрансмиттеров, цитокинов, факторов роста) с внеклеточным фрагментом соответствующего интегрального белка-рецептора приводит к его активации: сигнал передается комплексу периферических белков, ассоциированных с цитоплазматическим фрагментом рецептора. Результатом взаимодействия этих белков является образование или активация в цитоплазме клетки так называемых вторичных мессенджеров (посредников) - ионов Са²⁺ , циклических нуклеотидов, некоторых липидов, оксида азота и др. Обычно система вторичных мессенджеров активируется в том случае, если достаточное количество рецепторов клеточной поверхности занято соответствующими лигандами. Благодаря образованию многих молекул вторичных мессенджеров (например, цАМФ) в ответ на одиночный стимул достигается многократная амплификация сигнала, усиливающая его эффект в сотни и тысячи раз. Вторичные мессенджеры способны изменять (стимулировать или, напротив, ингибировать) интенсивность клеточных функций - деления клеток, синтеза белка, движения, секреции продуктов, в том числе и других сигнальных молекул и т.д. Таким путем достигаются взаимодействие и согласованная работа многих клеток в пределах всего организма или небольшого тканевого района. Клетки не воспринимают сигналы пассивно, но могут регулировать собственную рецепторную активность, изменяя на клеточной поверхности количество рецепторов, доступных для соответствующих лигандов. Рецепторы сигнальных молекул могут располагаться не только в плазмолемме, но также в цитоплазме, ядре клетки.

Значительная часть рецепторов клеточной поверхности связывает не сигнальные молекулы, а вещества, которые могут быть использованы для клеточных нужд. К таким рецепторам относятся, например, рецептор трансферрина - белка, переносящего в клетки железо, рецепторы липопротеиновых комплексов, переносящих холестерол, и ряд других.

В этих случаях после связывания лиганда весь рецепторно-лигандный комплекс вместе с прилежащим фрагментом мембраны поглощается в цитоплазму (интернализуется). Этот механизм клеточной активности - рецептор-зависимый эндоцитоз - целесообразно обсудить при изложении другой, транспортной, функции плазмолеммы, поскольку он является специальной формой обмена клетки со средой.

Необходимость обмена со средой (поддержание концентрации ионов, поглощение нужных веществ, высвобождение продуктов специфического синтеза и метаболизма) определяет транспортную функцию плазмолеммы. Гидрофобная зона мембраны плохо проницаема для водорастворимых веществ, и поэтому свободная диффузия воды, ионов и небольших молекул по градиенту концентрации невелика. Для облегченной диффузии используются трансмембранные гидрофильные каналы и переносчики, образованные интегральными белками.

Ионные каналы являются, как правило, селективными и регулируемыми, т.е. переносят лишь определенные ионы и открываются только при некоторых условиях. Регулирующим фактором могут быть предварительное узнавание и связывание переносимого лиганда во внеклеточном домене канала. Очевидно, что в этом случае интегральный протеин совмещает и рецепторную и транспортную функции. Каналы могут открываться также вследствие изменения трансмембранного электрического потенциала, механического напряжения мембраны, повышения внутриклеточной концентрации ионов Са² + и др.

Белки-переносчики (транспортеры) специализированы в отношении переносимых через них веществ - сахаров, аминокислот, нуклеозидов. Эти транспортные пути, строго говоря, никогда не бывают полностью открытыми. В основе механизма переноса лежат конформационные изменения молекулы белка-транспортера, т.е. изменения его пространственной конфигурации. Так, транспортер глюкозы, широко представленный в мембранах многих клеток, связывает сахар во внеклеточном домене. Это связывание сопровождается изменением конформации белка, при котором открывается его цитоплазматический домен и глюкоза поступает в цитоплазму клетки. Направление транспорта может быть и противоположным - плазмолемма клеток печени, например, переносит глюкозу из цитоплазмы в кровоток.

Транспорт через мембрану может быть пассивным, т.е. не требующим затрат энергии непосредственно для осуществления самого акта переноса. Таким путем работают отмеченные выше каналы и переносчики. Перенос осуществляется по градиенту концентрации вещества. Вода также пересекает мембрану, как правило, пассивным образом, вслед за изменениями концентрации ионов или микромолекул. Довольно часто, однако, белки клеточной мембраны должны переносить вещества против градиента концентрации, т.е. поддерживать этот градиент. Такой перенос является энергозависимым и обозначается как активный транспорт. В этом случае транспортный белок имеет домен, который обладает аденозинтрифосфатазной (АТФазной) активностью, т.е. способен расщеплять молекулы АТФ, высвобождая энергию, необходимую для осуществления переноса.

Хорошим примером является широко распространенный транспортер, или ионный насос, - Na ⁺ /K ⁺ -АТФаза (аденозинтрифосфатаза). Этот белковый комплекс переносит последовательно три иона Na ⁺ из цитоплазмы во внеклеточное пространство и два иона K ⁺ извне в цитоплазму, расщепляя при этом одну молекулу АТФ. При переносе сам белок подвергается конформационным изменениям. Таким путем поддерживаются ионные градиенты, в которых концентрация натрия вне клетки оказывается почти в 10 раз выше внутриклеточной, а концентрация калия в цитоплазме, напротив, выше, чем во внеклеточной среде. Такое соотношение концентраций очень важно для поддержания осмотического и, следовательно, водного баланса между клеткой и средой. Поэтому Na ⁺ /K ⁺ -насосы в клеточных мембранах многочисленны и потребляют существенную часть энергии, производимой клеткой.

Кальциевый насос, работающий подобным образом, способен поддерживать в цитоплазме клетки очень низкие концентрации ионов Са²⁺ - почти в 1000 раз меньшие, чем вне ее. При низкой концентрации Са²⁺ многие биохимические реакции оказываются весьма чувствительными даже к небольшому ее повышению и активируются в присутствии этих ионов. Хорошим примером может служить, в частности, взаимодействие сократительных белков - актина и миозина. Процесс сокращения в мышечных клетках инициируется повышением концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме (см. гл. 5).

Активные ионные насосы и регулируемые каналы определяют специфическую функцию возбудимых мембран, в частности плазмолеммы нервных клеток и их отростков - нервных волокон. Быстрый транспорт ионов через эти мембраны приводит к деполяризации мембраны и генерации потенциала действия - нервного импульса. Потенциал распространяется вдоль мембраны за счет быстрого открытия регулируемых ионных каналов. Некоторые аксоны имеют специальную миелиновую оболочку, которая изолирует их от соседних волокон и поддерживает определенную концентрацию ионов во внеклеточной жидкости. Миелиновая оболочка образована несколькими концентрическими слоями плазмолеммы глиальной (вспомогательной) клетки. Эти слои упакованы очень плотно, и узкие щели между контактирующими внешними поверхностями мембран можно видеть только при очень большом разрешении электронного микроскопа.

Хорошо различимая при обычной электронной микроскопии большая плотная линия маркирует зону слияния внутренних (цитоплазматических) поверхностей. Контакт между наружными поверхностями виден как тонкая малая плотная линия. Области перехода плазмолеммы глиальной клетки в миелиновую оболочку видны как мезаксоны: внутренний - прилежащий к клеточной мембране нервного волокна и наружный - соседствующий с цитоплазмой глиальной клетки.

В клетках широко распространены протонные насосы, которые переносят ионы водорода Н⁺ против градиента концентрации. Эти насосы используются для различных нужд. Например, в лизосомах они поддерживают низкие значения рН, необходимые для оптимальной работы гидролитических ферментов; в клетках эпителия желудка они участвуют в секреции ионов Н+ в просвет органа, где также активно работают гидролазы. В митохондриях разница концентрации протонов по обе стороны внутренней мембраны используется как источник энергии для синтеза молекул АТФ (см. гл. 6).

Поддержание ионных градиентов через мембраны и вообще процессы активного переноса требуют больших энергетических затрат. Эпителиальные клетки, например, расходуют на эти нужды до 50-80% всей производимой энергии (т.е. количества молекул АТФ). Эти расходы, однако, вполне оправданны. Некоторые транспортные каналы клеточной мембраны используют энергию ионных градиентов для пассивного переноса других необходимых молекул - глюкозы, аминокислот. Так, ионы Na ⁺ , высокая концентрация которых вне клетки поддерживается активной работой Na ⁺ /К ⁺ -АТФазы, могут свободно диффундировать обратно в цитоплазму через соответствующий транспортер, и энергия, которая при этом высвобождается, используется для сочетанного транспорта сахара или аминокислоты. Для переноса этих веществ специальных затрат энергии уже не нужно. Такой вторичный активный транспорт может допускать перенос обоих веществ в одном направлении (симпорт) или в противоположном (антипорт). Понятно, что и в этом случае энергия все же расходуется, но лишь на 1-м этапе - для создания концентрационного градиента ионов Na ⁺ .

Многие клетки организма специализированы в отношении преимущественного выполнения транспортной функции. К таким клеткам относятся, в частности, клетки абсорбирующего (всасывающего) эпителия тонкой кишки и почечных канальцев, клетки эндотелия капилляров и роговицы, мезотелия и др. Очень часто эта «профессиональная ориентация» заключается в специализации различных отделов (доменов) клеточной мембраны - ведь именно через нее осуществляется перенос веществ между окружающей клетки средой и цитоплазмой. В таких случаях можно говорить о поляризации клеточной мембраны и в конечном итоге - всей клетки.

В эпителиальных клетках такая поляризация на апикальный и базолатеральный домены плазмолеммы приводит к различиям в содержании транспортных каналов и даже в конфигурации самой мембраны. Например, в апикальном (обращенном в просвет) отделе плазмолеммы концентрация транспортных каналов и переносчиков может быть чрезвычайно высокой. Более того, для увеличения абсорбирующей поверхности плазмолемма эпителиальных клеток образует на апикальной поверхности многочисленные цилиндрические отростки - микроворсинки. Их совокупность формирует микроворсинчатую, или щеточную, каемку, которая покрывает поверхность клетки, обращенную в просвет органа или его части (просвет кишки, выводного протока железы, нефрона). Стержень каждой микроворсинки образован пучком актиновых филаментов (микрофиламентов). Этот пучок посредством вспомогательных актинсвязывающих белков ( фимбрина и виллина) и специальной формы моторного белка миозина прикрепляется к внутренней поверхности плазмолеммы у вершины микроворсинки и вдоль ее длины. В цитоплазме клетки пучок микрофиламентов вплетается в ориентированное параллельно поверхности терминальное сплетение, состоящее из актиновых и промежуточных филаментов (см. гл. 5).

На поверхности каждой клетки абсорбирующего эпителия тонкой кишки может быть до 1000 микроворсинок диаметром около 0,1 мкм и длиной 1-2 мкм, что увеличивает поверхность всего эпителиального пласта в 20-30 раз. Заключительные этапы ферментативного переваривания белков, жиров и углеводов в кишке происходят в слое гликокаликса, который покрывает каждую микроворсинку, и конечные продукты расщепления (сахара, аминокислоты, жирные кислоты) тотчас транспортируются в цитоплазму клеток. Более длинные (до 5-7 мкм), но менее многочисленные микроворсинки - стереоцилии, увеличивающие клеточную поверхность, встречаются, например, в эпителии придатка яичка. Деформация стереоцилий волосковых клеток внутреннего уха, как полагают, приводит к генерации нервного импульса.

В абсорбирующем эпителии апикальная поверхность плазмолеммы, в которой концентрируются белки-транспортеры, отличается от базолатеральной поверхности. В мембране этого отдела много активных ионных насосов и каналов. Они переносят поступившие в цитоплазму клетки малые молекулы во внеклеточное пространство (внутреннюю среду) против градиента концентрации.

Естественной границей между апикальным и базолатеральным доменом клеточной мембраны являются плотные контакты. Они препятствуют латеральной диффузии интегральных белков и липидов в бислое, т.е. их перемешиванию. Таким образом поддерживаются различия в составе этих участков мембран и определяется полярность клеточной поверхности. Часто площадь базолатеральной поверхности клеток увеличивается за счет глубоких складок и выростов, образующих базальный лабиринт. Поскольку транспорт против градиента концентрации требует много энергии, в выростах цитоплазмы между складками мембраны концентрируются митохондрии.

Клетки, постоянно существующие в виде пластов или групп (например, клетки эпителия), или, напротив, подвижные клетки соединительной ткани, ведущие, образно говоря, свободный образ жизни, посредством рецепторов клеточной поверхности связываются с молекулами внеклеточного вещества - внеклеточного матрикса (ВКМ) или с другими клетками.

Эта группа рецепторов, которая получила общее название «молекулы адгезии», включает различные классы интегральных протеинов: интегрины, кадгерины, селектины, иммуноглобулины и др. Все они специализированы в отношении молекул-лигандов и поэтому участвуют в различных взаимодействиях. Так, иммуноглобулины, встроенные в мембраны некоторых лимфоцитов, узнают чужеродные антигены, кадгерины участвуют в образовании межклеточных контактов, а интегрины специфическим образом связываются с молекулами ВКМ - фибронектином, витронектином, ламинином, коллагеном.

Связи интегринов эпителиальных клеток с компонентами подлежащей базальной пластинки могут быть очень прочными и долгоживущими, тогда как фокальные контакты мигрирующих клеток соединительной ткани с субстратом, по которому они передвигаются, существуют лишь в течение нескольких секунд. Благодаря тому что мембранные белки-интегрины связаны в цитоплазме с компонентами цитоскелета, например с актиновыми филаментами, усилия, необходимые для движения, передаются на клеточную мембрану, что позволяет клетке «ползти» по субстрату. Пласты эпителиальных клеток, которые подвержены интенсивным механическим воздействиям (например, эпидермис кожи), образуют постоянные интегриновые контакты с подлежащей базальной пластинкой - полудесмосомы, которые подкрепляются со стороны цитоплазмы промежуточными (кератиновыми) филаментами (см. гл. 5).

Базальная пластинка, прилежащая к клеточной поверхности, различима лишь в электронном микроскопе и, наряду с фиброретикулярной пластинкой, входит в состав более толстой, светооптически различимой базальной мембраны. Фиброретикулярная пластинка является соединительнотканной структурой. Она содержит коллагеновые (ретикулярные) волокна и специальные фибриллы, построенные из коллагена VII типа, которые связывают базальную пластинку с подлежащей тканью. Интегринзависимые контакты клеток с внеклеточным матриксом модулируют каскад сигналов, которые влияют на активацию генов, связанных с клеточной дифференциацией, а также участвуют в миграции клеток, их пролиферации и сохранении жизнеспособности.

Термин «базальная мембрана» используется также для обозначения структур, которые, по существу, являются базальными пластинками, например: две слившиеся базальные пластинки в клубочке почки или внешние примембранные слои материала, различимые у таких клеток, как нейролеммоциты (шванновские клетки) или гладкие мышечные клетки.

Непосредственное (мембранное) взаимодействие с другими клетками является еще одной важной функцией клеточной мембраны. Для осуществления такого взаимодействия клетки формируют межклеточные соединения, или контакты. Клетки, живущие обособленно, обычно связываются с другими клетками временно, для выполнения определенной задачи. Например, в процессе распознавания чужеродного вещества (антигена) лимфоциты образуют простые адгезионные соединения с клетками, которые обрабатывают и представляют антиген (например, с макрофагами). Каких-либо специальных мембранных структур в зоне таких контактов не образуется, но в узнавании антигена принимают участие внеклеточные домены специальных рецепторов или иммуноглобулинов, встроенных в клеточные мембраны лимфоцитов.

Адгезионные белки обширного семейства иммуноглобулинов принимают участие также в эпизодах взаимодействия лейкоцитов с эндотелием при воспалении, формировании миелина, образовании связей между нейронами и других событиях. Конфигурации контактирующих поверхностей могут быть достаточно причудливыми, однако обычно выделяют только две формы простых контактов: зубчатые и пальцевидные соединения. Они часто встречаются на боковых поверхностях эпителиальных клеток, тесно прилежащих друг к другу.

Клетки, существующие и работающие совместно в составе клеточных ассоциаций, например эпителиальные клетки в пластах или мышечные клетки миокарда, формируют долговременные и более сложные мембранные связи.

В зависимости от основной задачи, которую они выполняют, специальные межклеточные соединения можно разделить на три категории. Отмеченное выше плотное соединение относится к категории замыкающих, или окклюдирующих (zonula occludens). Такие контакты перегораживают межклеточное пространство, препятствуя свободному перемещению веществ, в том числе и воды, между клетками. Замыкающие контакты встречаются только между клетками эпителия и в составе контактного комплекса располагаются ближе всего к апикальной поверхности клеток. При ТЭМ срезов плотные контакты выглядят как участки или зоны кажущегося слияния соседних мембран. В действительности никакого слияния нет, но межклеточное пространство перекрывается взаимодействующими внеклеточными фрагментами специальных мембранных белков - окклюдинов и клодинов. Эти белки принадлежат обширному классу белков адгезии и способны образовывать в межклеточном пространстве прочные связи.

Как показывают результаты изучения замыкающих контактов с помощью метода «замораживания-раскалывания» (см. гл. 2), внутримембранные частицы (белки адгезии) соседних мембран формируют в зоне контакта сеть из протяженных гребешков слияния (контактных фибрилл). Сложность и непрерывность этой сети могут быть различными, и полагают, что именно от этой сложности зависит проницаемость всего эпителиального пласта. Плотные контакты не обязательно бывают сплошными, опоясывающими всю клетку соединениями. В некоторых проницаемых эпителиях (например, в эндотелии кровеносных капилляров и посткапиллярных венул) они приобретают вид замыкающего пятна или замыкающей фасции (полоски).

К категории адгезионных контактов, механически связывающих мембраны соседних клеток, относится так называемый промежуточный контакт, или адгезионный поясок, опоясывающая десмосома (zonula adhaerens), десмосома (пятно адгезии - macula adhaerens). В формировании адгезионного пояска, который связывает мембраны соседних клеток по всей окружности, принимают участие адгезионные белки - Е-кадгерины. Ширина межклеточной щели в зоне промежуточного контакта составляет 15-20 нм. В этом пространстве взаимодействуют внеклеточные фрагменты кадгеринов.

Цитоплазматические домены этих белков связаны с белком катенином и некоторыми другими белками, которые образуют хорошо видимое внутриклеточное уплотнение (пластинку). В составе контактного комплекса в эпителии промежуточный контакт располагается тотчас ниже плотного контакта, у апикальной зоны клеток. Во внутриклеточное уплотнение вплетаются актиновые филаменты, которые передают механические усилия в зону контакта. Полагают, что в результате таких усилий образуются изгибы всего эпителиального пласта при эмбриональном развитии трубчатых структур (например, нервной трубки и первичной кишки).

Более ограниченные по протяженности промежуточные контакты, фасции, или ленты адгезии (fascia adhaerens), входят в состав вставочных дисков, связывающих между собой клетки сердечной мышцы - кардиомиоциты (см. гл. 5).

В образовании другого типа адгезионных мембранных контактов - десмосом - также участвуют белки семейства кадгеринов - десмоглеины и десмоколлины. Само название - пятно адгезии (macula adhaerens) - говорит о том, что эти контакты ограничены по протяжению. Многочисленные десмосомы, как «заклепки», механически связывают боковые поверхности клеток эпителиальных пластов, поверхности клеток эпидермиса кожи или чередуются с адгезивными фасциями в составе вставочных дисков миокарда. В десмосоме взаимодействующие внеклеточные фрагменты кадгеринов оринтированы друг к другу в относительно широкой (до 30 нм) межклеточной щели и образуют межклеточное десмосомное уплотнение с хорошо различимой плотной межклеточной линией. Со стороны цитоплазмы соединение подкрепляется внутриклеточным десмосомным уплотнением (пластинкой), в него в виде петель вплетаются промежуточные филаменты.

В зависимости от типа клеток промежуточные филаменты могут быть построены из разных белков (см. гл. 5). Например, десмосомы, связывающие эпителиальные клетки, подкрепляются кератиновыми филаментами, в десмосомах вставочных дисков сердечной мышцы находятся десминовые промежуточные филаменты, а филаменты десмосом эндотелиальных клеток построены из белка виментина. Очевидно также, что не следует считать описанные ранее соединения клеток с внеклеточным матриксом, полудесмосомы, только половинками десмосом - это различные и по составу, и по морфологии контакты. Десмосомы играют не только механическую роль, удерживая клетки вместе. Они также участвуют во внутриклеточной сигнализации, где выполняют роль своеобразных сенсоров, которые отвечают на сигналы клетки или окружения, изменяя свою организацию и модулируя ансамбль молекул, образующих соединение.

Третья категория специальных мембранных соединений отлична от двух предыдущих.

Это коммуникационные соединения - нексусы (nexus), или щелевые контакты. Данные соединения предназначены для связи клеток, точнее их цитоплазм, между собой и, следовательно, являются разновидностью каналов. В отличие от прочих трансмембранных каналов нексусы устанавливают сообщения не с внеклеточной средой, а с цитоплазмой соседней клетки.

Многочисленные нексусы связывают клетки эпителия, кардиомиоциты, нейроны, гладкие мышечные клетки и даже клетки разных типов, например эндотелиальные и гладкие мышечные клетки в стенке сосудов. Общая конструкция щелевых соединений однотипная: шесть трансмембранных белковых комплексов - коннексинов - формируют в каждой мембране полуканал - коннексон. Два полуканала соседних мембран устанавливаются точно напротив друг друга, образуя полный канал, напрямую связывающий цитоплазмы контактирующих клеток.

При использовании метода замораживания-раскалывания нексусы выявляются как группы (кластеры) внутримембранных частиц, расположенных, как правило, на Р-поверхности. Диаметр канала, сформированного из двух коннексонов соседних мембран, достаточен для прохождения небольших (до 1,5 нм) молекул - ионов, аминокислот, сахаров, внутриклеточных сигнальных молекул (например, циклического аденозинмо-нофосфата - цАМФ) и других аналогичных соединений. На этом основании полагают, что нексусы участвуют в электрической, метаболической и информационной интеграции клеток.

Проницаемость каналов нексуса может регулироваться составом белков-коннексинов и внутриклеточной концентрацией ионов Ca²+. Нексусы между возбудимыми мембранами (мембранами мышечных и нервных клеток) часто называют электрическими синапсами, поскольку они позволяют проводить потенциал действия непосредственно, изменяя концентрацию ионов в цитоплазме. Следует также отметить, что все категории межмембранных соединений, как и вообще любое взаимодействие мембран, являются Са²+-зависимыми. Их функции: межклеточная проницаемость, прочность связей между белками адгезии и проходимость каналов - регулируются содержанием кальция.

Особую категорию клеточных соединений между возбудимыми мембранами нервных и мышечных клеток составляют синапсы химические. Строго говоря, химические синапсы к мембранным контактам не относятся, поскольку соседние мембраны в них не имеют прямых связей и всегда разделены межмембранным пространством - синаптической щелью.

В химических синапсах различают пресинаптическую часть, образованную отростком одной клетки. В ней находятся синаптические пузырьки (везикулы), содержащие нейротрансмиттер - вещество, которое высвобождается пресинаптической мембраной в щель, разделяющую клетки, и возбуждает рецепторы, расположенные в постсинаптической мембране другой клетки.

Известно более 20 различных нейротрансмиттеров. Среди них наиболее распространены ацетилхолин, участвующий в передаче импульса через нейромышечное соединение, и норадреналин (адреналин), участвующий в нервной регуляции функций клеток внутренних органов (гладких мышечных клеток, секреторных клеток, кардиомиоцитов). Нейротрансмиттеры, среди которых есть и небольшие белки, обычно синтезируются в теле нервной клетки и переносятся к нервному окончанию механизмами аксонального транспорта (см. гл. 5). В синаптическую щель нейротрансмиттеры попадают чаще не через каналы в пресинаптической мембране, а посредством экзоцитоза (см. ниже).

Через белковые каналы клеточной мембраны могут транспортироваться лишь ионы и небольшие молекулы. Однако в некоторых случаях необходимо перемещение в цитоплазму или, напротив, в окружающую среду больших молекул белков или крупных частиц. О таком поглощении (интернализации) в цитоплазму рецептор-лигандных комплексов мы уже упоминали. Для подобных целей клетка использует механизм цитоза - формирования специальных мембранных структур (везикул, вакуолей, трубок), которые служат своеобразными контейнерами (переносчиками).

При эндоцитозе компоненты окружающей клетку среды, заключенные в мембрану, поступают в цитоплазму. Эндоцитоз осуществляется при использовании различных внутриклеточных и мембранных механизмов. Его принято (весьма условно) подразделять на следующие типы:

Поглощение клеткой небольших по объему квантов среды обозначается как пиноцитоз. Если клетка интернализует крупные частицы, например микробные тела, говорят о фагоцитозе.

Экзоцитоз используется для выведения из цитоплазмы синтезированных клеткой молекул (например, белкового секрета или компонентов клеточной мембраны), неиспользованных продуктов внутриклеточного пищеварения, для экспрессии рецепторов клеточной поверхности и для других целей.

Рецепторопосредованный эндоцитоз, о котором упоминалось выше, осуществляется с помощью так называемых окаймленных (покрытых) клатриновых везикул, мембраны которых со стороны цитоплазмы покрыты специальным белком - клатрином. Вначале рецептор-лигандные комплексы группируются в определенных зонах плазмолеммы - окаймленных ямках, которые углубляются и превращаются в инвагинации. Клатриновые ямки могут занимать до 2% площади плазмолеммы, а каждая ямка может концентрировать до 1000 рецепторов разных классов. Постепенно шейка инвагинации суживается, и при участии специального белка динамина, формирующего сократительное кольцо из актиновых филаментов вокруг шейки, образуется клатриновая везикула, которая поступает в цитоплазму.

Клатриновая оболочка собирается на цитоплазматической поверхности ямок в виде регулярной, геометрически правильной, гексагональной или пентагональной решетки при участии специальных белков-адапторов. Полагают, что клатриновая решетка важна для формирования инвагинации на месте ямки. Попадая в цитоплазму, везикула теряет клатриновое покрытие и поступает в компартмент так называемых ранних (сортирующих) эндосом. Эта совокупность мембранных пузырьков, вакуолей и трубочек обычно располагается в периферических, близких к поверхности зонах цитоплазмы. В несколько закисленной среде ранних эндосом (рН ~ 6,0) происходит разделение рецепторов и переносимых ими веществ-лигандов. Большая часть свободных рецепторов возвращается для нового цикла к плазмолемме в составе мембранных транспортных носителей, а лиганды, также заключенные в мембранные пузырьки, направляются к компартменту поздних эндосом/лизосом. Кислая среда в этом компартменте (рН ~ 5,5) оптимальна для деятельности лизосомных ферментов - гидролаз, которые расщепляют лиганды на более простые вещества для последующей утилизации клеткой. Мембранные компоненты транспортных везикул (или объектов фагоцитоза) также используются клеткой, поступая в виде мультивезикулярных телец в комплекс Гольджи (см. гл. 4). Возможно, мультивезикулярные тельца используются и для переноса поглощенного материала между компартментами ранних и поздних эндосом. Перемещение везикул и других мембранных переносчиков в цитоплазме клетки осуществляется по системе микротрубочек с помощью моторных белков - динеина и кинезина (см. гл. 5), а также по актиновым филаментам при участии белка миозина V.

Помимо рецепторопосредованного эндоцитоза существует и так называемый рецепторнезависимый эндоцитоз. Этот неизбирательный способ поглощения компонентов внеклеточной среды осуществляется с помощью инвагинаций клеточной поверхности - кавеол, в образовании которых участвует специальный белок - кавеолин. Для подобного поглощения жидкости из среды используются также ямки и везикулы без выраженного покрытия на цитоплазматической поверхности и, возможно, большие вакуоли - макропиносомы.

Одно из направлений транспорта из ранних (сортирующих) эндосом ориентировано к транс -полюсу комплекса Гольджи (см. гл. 4) и через него - в ретроградном направлении - к эндоплазматической сети. Транспорт в ретроградном направлении - через комплекс Гольджи, эндоплазматическую сеть и далее в цитозоль - имеет непосредственное отношение к путям проникновения некоторых лекарств и токсинов, в том числе бактериальных.

В некоторых клетках везикулы, образующиеся при неспецифическом эндоцитозе, минуют внутриклеточные компартменты. Они формируются у одного полюса (поверхности) клетки, апикального или базального, и перемещаются к противоположному, где сливаются с плазмолеммой, высвобождая содержимое во внеклеточную среду (экзоцитоз). Такой механизм сопряжении эндо- и экзоцитоза - трансцитоз, функционирует, как полагают, в эндотелиальных клетках капилляров, мезотелии серозных оболочек и заднем эпителии (эндотелии) роговицы. С его помощью обеспечивается, в частности, обмен питательных веществ, белков и продуктов клеточной жизнедеятельности между плазмой крови и окружающими тканями.

В специализированных зонах кишечного эпителия, в эпителии слюнных и молочных желез трансцитоз служит для направленной секреции иммуноглобулинов - антител IgA, в просвет кишки или в систему протоков. Особым случаем трансцитоза можно считать перенос иммунокомпетентных клеток (Т- и В-лимфоцитов) через так называемый высокий эндотелий посткапиллярных венул лимфатических узлов, тимуса и других лимфоидных органов. После специфического рецептор-зависимого узнавания лимфоцита крупные эндотелиальные клетки формируют большую транспортную вакуоль, в которой лимфоциты перемещаются из просвета сосуда в ткань лимфоидного органа. Плотные контакты между эндотелиальными клетками при этом остаются сохранными, и сам лимфоцит не претерпевает изменений.

С помощью фагоцитоза клетки, обычно специализированные для выполнения этой функции (макрофаги, нейтрофилы), поглощают крупные белковые комплексы, частицы, микробные тела и клеточный детрит. Фагоцитоз - это эффективный механизм защиты организма от чужеродных веществ, крупных частиц и бактерий. С его помощью организм избавляется от собственных больных, старых и умерших клеток. Объем фагоцитоза может быть очень большим. Например, макрофаги селезенки и печени поглощают в день до 10¹¹ старых эритроцитов.

Обычно фагоцитируемая частица связывается с клеточной поверхностью при помощи рецепторов, которые расположены в мембране клетки. Этому нередко предшествует адсорбция на поверхности поглощаемой частицы (например, микроорганизма) некоторых специальных белков - антител, белков комплемента, для которых имеются специальные рецепторы. Рецепторзависимое связывание стимулирует образование плазмолеммой клетки больших выростов (псевдоподий), которые окружают частицу по типу застежки-молнии и замыкаются, формируя крупную вакуоль - гетерофагосому. В цитоплазме клетки фагосома сливаются с лизосомами - мембранными органеллами, которые содержат гидролитические ферменты, оптимально работающие в кислой среде. Таким образом формируется гетерофаголизосома, в просвете которой и происходит переваривание поглощенной частицы или клетки. Небольшие молекулы - продукты деградации поглощенной частицы - транспортируются через мембрану фаголизосомы в цитоплазму для последующего включения в метаболизм, а непереваренные остатки выводятся из клетки путем экзоцитоза. Некоторые инертные и неперевариваемые продукты (например, углерод, пылевые частицы) могут сохраняться в цитоплазме макрофагов и других клеток в виде телолизосомы (остаточного, или резидуального, тельца) длительное время - месяцами и даже годами. При массивном разрушении мембранных компонентов, например миелина, остаточное тельце иногда приобретает вид многослойной структуры - пластинчатого тела. Особым случаем фагоцитоза является феномен аутофагии, в процессе которого в аутофагосомах разрушаются собственные органеллы, например митохондрии.

Таким путем происходит постоянное обновление клеточных органелл. Для образования аутофагосомы и в последующем аутофаголизосомы органелла, подлежащая разрушению, заключается в двойную мембрану эндоплазматической сети (см. гл. 4), и образовавшийся комплекс сливается с лизосомой, ферменты которой разрушают органеллу и одну из мембран (внутреннюю). Аналогичным образом в специальных структурах - кринофаголизосомах, сформированных на основе секреторных гранул, с помощью ферментов лизосом разрушаются секреторные белки, уже не требующиеся для нужд организма. Феномен кринофагии используется для регуляции сочетанной секреции гормонов в передней доле гипофиза, для прекращения лактации в молочной железе и в некоторых других ситуациях. Следовательно, лизосомы - это не только мешочки, заполненные гидролитическими ферментами. Это особый компартмент динамичных органелл, участвующих в различных клеточных функциях. Этот компартмент связан с тремя направлениями путем биосинтеза и секреции, эндоцитозным путем и с аутофагией.

Клетка может избирательно разрушать старые или ненужные ей белки в цитозоле с помощью специальных белковых комплексов - протеасом. Чтобы протеасомы могли распознать такой белок, он подвергается убиквитинированию, в процессе которого несколько молекул короткого пептида убиквитина присоединяются к остаткам лизина в белке, подлежащем разрушению. Цитозольная деградация молекул белка часто используется в осуществлении нормальных физиологических реакций клетки. Разрушению в протеасомах подвергаются, например, белки - участники метаболических регуляторных (сигнальных) путей, чтобы обеспечить дозированный по времени ответ на одиночный стимул.

Описанный выше эндоцитозный путь, с помощью которого поглощаются компоненты внеклеточной среды, интернализует в цитоплазму не только эти компоненты, но и фрагменты самой клеточной мембраны, которые расходуются на формирование транспортных переносчиков и фагосом. Объем поступающих в цитоплазму мембран может быть очень большим.

Активные макрофаги соединительной ткани, например, только при участии клатриновых везикул интернализуют за 1-2 ч площадь мембран, равную площади всей клеточной поверхности. Понятно, что постоянная убыль клеточной мембраны должна быть компенсирована возвратом ее фрагментов на поверхность. Частично это обеспечивается за счет рециркуляции мембран к плазмолемме из компартментов ранних и (реже) поздних эндосом. Однако часть поглощаемых мембран разрушается в клетке и восполняется за счет синтеза новых мембранных фрагментов в гранулярной эндоплазматической сети и комплексе Гольджи. Везикулы и другие переносчики, транспортирующие эти мембраны к плазмолемме, адресованы очень точно. Специальные белки слияния и адапторные белки, связанные с цитоплазматическими поверхностями транспортных контейнеров, узнают не только клеточную мембрану, но и ее различные домены - апикальный или базолатеральный. Лишь после такого узнавания мембрана переносчика сливается с мембраной-мишенью. Функционирование этого механизма, поддерживающего полярность клеток, подразумевает, что точный адрес мембраны-мишени учитывается еще при синтезе мембран транспортных контейнеров. Поглощение, транспорт, рециркуляция и обновление мембранных компонентов клетки свидетельствуют о существовании довольно сложного механизма внутриклеточной сортировки. Этот механизм связывает эндоцитозный путь транспорта веществ с экзоцитозным путем, который берет свое начало в аппарате синтеза белка.

Показаны клеточные мембраны двух соседних эндотелиальных клеток (ЭК₁ и ЭК₂). Каждая мембрана выглядит как трехслойное образование, состоящее из двух темных (электронно-плотных) листков (стрелки) и светлой зоны, разделяющей их. В соответствии с методом подготовки образцов для ТЭМ кусочек ткани инкубировали в растворе тетроксида осмия, что позволило лучше фиксировать и окрасить липидные компоненты. Тонкие срезы окрашивали солями тяжелых металлов (цитратом свинца и уранилацетатом). Поскольку металлы, которые связываются преимущественно с полярными головками липидных молекул бислоя, хорошо поглощают и отражают электроны, гидрофильные зоны мембран выглядят темными. Светлая полоска, разделяющая две гидрофильные поверхности, - это общая для двух монослоев (или листков) гидрофобная зона, в которой находятся жирнокислотные хвосты мембранных липидов. Локализацию интегральных белков в мембране можно предположить, если ориентироваться на тонкие разрывы, пересекающие липидный бислой (противостоящие стрелки).

Межклеточная щель, разделяющая ЭК₁ и ЭК₂ , резко суживается на двух участках (головки стрелок). Кажется, что на этих участках внешние липидные листки сливаются. Так выглядят поперечные сечения плотных (замыкающих) соединений (см. рис. 3-34), которые обычно связывают соседние эндотелиальные (и другие эпителиальные) клетки. Эти соединения перекрывают межклеточную щель и регулируют величину и пропускную способность сообщения между просветом сосуда (ПР) и окружающим капилляр интерстициальным пространством (ИП). В цитоплазме ЭК₁ находится округлый пузырек (везикула - В), также образованный мембраной. Везикула кажется свободной, т.е. не связанной с плазмолеммой клетки. Примерно половина окружности везикулы покрыта регулярно организованной клатриновой каемкой (звездочки); на другой половине каемка отсутствует (см. рис. 3-58). Устье кавеолы (КВ), инвагинации плазмолеммы, перекрыто со стороны просвета тонкой монослойной диафрагмой, которая не имеет строения клеточных мембран. Рыхлый флоккулярный материал, подстилающий клеточные мембраны со стороны интерстициального пространства, - это базальная пластинка (БП). Наличие последней характерно для пластов эпителиальных клеток, которые к ней прикрепляются. Взаимодействие эндотелиальных клеток с базальной пластинкой необходимо для переживания клеток, их способности к размножению и миграции в ситуациях, которые сопровождаются новообразованием сосудов.

На фрагменте справа - Р-поверхность (Р) внутреннего (цитоплазматического) листка мембраны эритроцита. Эта поверхность, видимая со стороны гидрофобной зоны мембраны, стала доступной для изучения вследствие расщепления липидного бислоя при подготовке образца (см. гл. 2). Множество округлых внутримембранных частиц (ВМЧ), видимых на этой поверхности и выступающих над уровнем липидов, - это интегральные белки мембраны. Несмотря на то что эритроциты специализированы для выполнения лишь одной функции - переноса дыхательных газов, их мембраны не являются пассивными структурами. Белки мембран эритроцитов выполняют функции рецепторов, водных каналов, транспортеров и др. Роль некоторых белков до сих пор не понятна. На фрагменте слева Е-поверхность (Е) мембраны соседнего эритроцита внутримембранных частиц существенно меньше. При расщеплении мембран большинство частиц остается на Р-поверхности, поскольку они удерживаются в цитоплазматическом листке элементами цитоскелета. В свою очередь, и сами белки мембран эритроцитов играют важную структурную роль - они закрепляют в узловых точках фибриллы цитоскелета у цито-плазматической поверхности плазмолеммы и тем самым участвуют в поддержании необычной формы клеток (см. рис. 1-6).

Интегральные белки клеточной мембраны могут перемещаться в плоскости липидного бислоя за счет латеральной диффузии. Однако их подвижность ограничена. Частично это объясняется довольно тесными связями с цитоскелетом. Кроме того, при взаимодействии мембранных протеинов с окружающими молекулами липидов могут формироваться локальные микродомены мембраны - островки, или рафты. Подвижность этих достаточно крупных молекулярных агрегатов существенно ограничена. Интересно, что липидный состав рафтов зависит от типа интегрального белка, его аминокислотного состава и конфигурации в мембране. Эти представления лежат в основе принятой мозаичной жидкокристаллической модели клеточных мембран.

Гликокаликсом называется слой, покрывающий внешние (внеклеточные) поверхности мембран клеток. Основу его составляют олигосахаридные цепочки интегральных мембранных белков (гликопротеинов) и гликолипидов внешнего листка бислоя. В плазмолемме эти цепочки всегда обращены во внеклеточную среду, в замкнутых мембранных компартментах клетки - в просвет компартмента, который топологически эквивалентен внешней среде.

Поскольку в составе олигосахаридных цепей много легкодиссоциирующих групп (преимущественно -СООН и -ОН), слой гликокаликса в целом заряжен отрицательно. Именно поэтому он хорошо окрашивается такими катионными красителями, как рутениевый красный (стрелки). Наличие заряженных групп в гликокаликсе и его волокнистая структура способствуют адсорбции других заряженных молекул (в том числе белков) и ионов из ближайшего клеточного окружения. В состав гликокаликса, кроме того, могут входить периферические (не интегральные) белки, связанные с липидным бислоем или внеклеточными участками интегральных белков. Некоторые периферические белки обладают ферментативной активностью и участвуют в метаболических превращениях непосредственно у клеточной поверхности. Такой (метаболически активный) гликокаликс покрывает, например, апикальные поверхности эпителиальных клеток, обращенные в просвет кишки (см. рис. 3-13) или в просвет капилляров центральной нервной системы, легких, печени. В глико-каликсе легочных капилляров находится, в частности, ангиотензинпревращающий фермент. Он конвертирует неактивный ангиотензин I в активную форму - ангиотензин II (один из самых действенных факторов, суживающих мелкие артерии и повышающих тем самым кровяное давление). Таким образом, биохимические реакции, которые происходят в гликокаликсе клеток, оказываются важными не только для метаболизма конкретной клетки, но и для всего организма.

Частицы коллоидного лантана размером 1-2 нм имеют положительный заряд и поэтому хорошо связываются с отрицательными группами гликокаликса. В отличие от рутениевого красного, который при больших концентрациях окрашивает весь сплошной слой гликокаликса (см. рис. 3-3), частицы лантана связываются с гликокаликсом в определенных сайтах - местах наибольшей концентрации отрицательно заряженных групп (стрелки). Можно видеть, что эти сайты распределены на люминальной поверхности эндотелиальной клетки (ПР - просвет капилляра), концентрируются в кавеолах (КВ) и эндосомах (ЭНД), а также выявляются как зернистый электронно-плотный материал базальной пластинки (БП), подстилающей эндотелий. В составе базальной пластинки, как известно, содержатся полисахариды (гликозаминогликаны) и гликопротеины, содержащие отрицательно заряженные олигосахаридные цепочки. Кавеолы эндотелиальных клеток и образующиеся из них везикулы участвуют в переносе веществ из просвета капилляра в окружающие ткани и обратно. Такой перенос сопряжен с предварительной адсорбцией материала на поверхности клетки, в гликокаликсе, и его концентрированием перед погружением кавеолы в цитоплазму. Транспорт посредством эндотелиальных кавеол является частным случаем эндоцитоза, совмещенного с экзоцитозом, без обработки материала в эндосомах (см. рис. 3-54).

На обзорной электронной микрофотографии представлен смешанный нерв, который располагается в соединительнотканном окружении среднего бронха. В составе нерва видны безмиелиновые (БНВ) и миелиновые (МНВ) нервные волокна. В отличие от миелиновых безмиелиновые нервные волокна формируются за счет объединения нескольких отростков нервных клеток (аксонов) одной клеткой-сателлитом - шванновской клеткой (нейролеммоцитом). Поскольку на срезах периферических нервов точная принадлежность отростков нервных клеток (аксонов или дендритов) не определена, всех их принято именовать аксонами. Миелиновая оболочка каждого миелинового волокна формируется на протяжении нервного проводника последовательностью отдельных миелинобразующих нейролеммоцитов. Каждая шванновская клетка (ШК) формирует миелин только для одного аксона. Ядро и часть цитоплазмы нейролеммоцита видны рядом с одним из миелиновых волокон. Заметим, что в центральной нервной системе взаимоотношения иные. Миелинобразующие глиальные клетки - олигодендроциты - посылают свои отростки к группе нервных проводников, которые расположены по соседству; таким образом, каждый олигодендроцит участвует в образовании миелиновых оболочек нескольких нервных волокон.

Миелиновые нервные волокна различаются не только диаметром аксонов, но и толщиной миелиновой оболочки. Оба эти параметра оказывают влияние на условия проведения нервного импульса по аксону. Эти условия зависят также от микроокружения нервных волокон. Поэтому сформированные нервные стволики, даже небольшого диаметра, окружены 2-3 слоями периневральных клеток (ПК), которые образуют полупроницаемый барьер между содержимым периферического нерва (эндоневрием) и окружающими тканями. Происхождение и природа этих эпителиоподобных клеток точно не известны, однако полагают, что их источником могут быть предшественники клеток соединительной ткани - фибробластов. Помимо клеток нервного волокна в эндоневрии можно встретить и клетки других типов - фибробласты, макрофаги (МФ), тучные клетки, а в более крупных нервах - и кровеносные сосуды. Эндоневральное пространство содержит также пучки коллагеновых волокон (стрелка), которые отличаются от коллагеновых волокон окружающей соединительной ткани (в эндоневрии волокна образованы коллагеном III типа).

Структура безмиелиновых нервных волокон в основном отличается от структуры миелиновых по двум аспектам. Во-первых, как свидетельствует название, аксоны (А) безмиелиновых нервных волокон не имеют миелиновой оболочки, и, во-вторых, каждая шванновская (глиальная) клетка (ШК), которая сопровождает аксоны, образует ложе не для одного отростка нервной клетки, а для нескольких (на данной иллюстрации таких отростков семь). Аксоны располагаются в углублениях (инвагинациях), образуемых шванновской клеткой (нейролеммоцитом). Между мембранами двух клеток (нервной и глиальной) сохраняется щелевидное пространство (стрелки). Как видно на рисунке, степень погружения аксонов в шванновскую клетку может быть различной. Аксон А₁ сравнительно большого диаметра и более мелкий аксон А₃ погружены полностью, и лишь узкие перешейки связывают инвагинации с окружением.

Дубликатура мембраны шванновской клетки, образующая этот перешеек, называется мезаксоном (МА). Аксоны 4, 5 и 7, напротив, располагаются в основном между мембраной нейролеммоцита и базальной пластинкой (БП), которая вырабатывается этой клеткой. Такое положение характерно для растущих отростков нейронов. Можно видеть и переходные варианты (аксоны 3 и 6). Электронно-плотные округлые тельца, видимые в цитоплазме нейролеммоцита и аксона А₁ - это митохондрии (МХ), которые разрезаны поперечно. Короткие палочковидные образования в цитоплазме аксона А₁ - косо срезанные микротрубочки (см. рис. 3-10). Безмиелиновое нервное волокно находится среди коллагеновых волокон (КВ) окружающей соединительной ткани и не отграничено от окружения периневральным барьером. Однако отростки расположенных рядом фибробластов (ФБ) формируют некоторое подобие границы.

Миелинобразующая шванновская клетка (ШК) формирует миелиновую оболочку (МО) только вокруг одного аксона (А). Миелиновая оболочка образуется за счет клеточной мембраны нейролеммоцита, окружающей погруженный в нее аксон. Формирование миелиновой оболочки представить достаточно просто, если допустить, что нейролеммоцит вращается вокруг продольной оси аксона и «наматывает» на него дубликатуру мембраны (мезаксон) в виде спирали. В формирующейся миелиновой оболочке можно видеть витки спирали, состоящие из двух тесно прилежащих мембран. Базальная пластинка (БП) нейролеммоцита в формировании миелиновой оболочки не участвует. Дальнейшее созревание миелиновой оболочки выражается в увеличении числа витков и их уплотнении. При этом цитоплазма шванновской клетки выдавливается из пространства между витками и мембраны тесно прилегают друг к другу. В сформированном миелиновом волокне островки цитоплазмы шванновской клетки сохраняются в так называемых насечках Шмидта-Лантермана и в паранодальной зоне (см. рис. 3-10). Образование витков мембраны нейролеммоцита вокруг аксона приводит к появлению двух мезаксонов: внутреннего, соединяющего мембрану нейролеммоцита, прилегающую к аксону, с первым витком дубликатуры, и наружного - место перехода последнего, внешнего, витка в плазмолемму собственно шванновской клетки (см. рис. 3-8). БНВ - безмиелиновые нервные волокна.

Поперечный срез миелинового волокна прошел на уровне ядросодержащей части нейролеммоцита (шванновской клетки - ШК). Сформированная миелиновая оболочка (МО) представляет собой плотно упакованные листки мембраны шванновской клетки, что придает оболочке характерную исчерченность. Миелиновая оболочка имеет два мезаксона - наружный (МА₁) и внутренний (МА₂). Видно, что внутренний мезаксон представляет собой дубликатуру мембраны, которая окружает отросток нервной клетки, - аксон (А). Наружный мезаксон соединяет миелиновую оболочку с клеточной мембраной нейролеммоцита. В безмиелиновых нервных волокнах (БНВ) тонкие ободки цитоплазмы шванновских клеток окружают несколько аксонов.

Нейролеммоциты и периневральные клетки (фрагмент одной из них виден слева) имеют хорошо выраженные базальные пластинки (БП). В цитоплазме аксонов видны поперечно пересеченные нейрофиламенты и микротрубочки. Эндоневральное пространство содержит коллагеновые волокна III типа (КВ). Поскольку миелиновая оболочка сформирована за счет клеточной мембраны нейролеммоцита, в ней преобладает липидный компонент (до 80-85% сухого веса). Наряду с фосфолипидами миелин содержит относительно редко встречающиеся сфинголипиды и гликолипиды. Благодаря высокой концентрации липидов миелиновая оболочка хорошо изолирует нервный проводник от окружения и обеспечивает более быстрое проведение нервного импульса. Скорость проведения импульса зависит также от диаметра аксона и толщины миелиновой оболочки.

Миелиновая оболочка не является сплошным слоем, но сформирована за счет плотно прилегающих витков дубликатуры клеточной мембраны шванновской клетки (см. рис. 3-7). На срезах она выявляется как слоистая структура, состоящая из пластин миелина. На рисунке таких пластин 32. Клеточная мембрана имеет две поверхности - внешнюю (внеклеточную) и внутреннюю (цитоплазматическую); эти поверхности при формировании миелиновых пластин взаимодействуют между собой неодинаково. Хотя детали этого взаимодействия не совсем понятны, полагают, что внутренние (цитоплазматические) листки соседних мембран сливаются и место их слияния выявляется как главная (большая) плотная линия (ГЛ). Наружные листки, соответствующие экстраклеточным поверхностям, не сливаются (возможно, этому препятствуют слои гликокаликса), а зона их тесного прилежания видна как малая плотная (или межпериодная) линия (МЛ). В стабилизации пластин миелина важную роль играет специфический белок, так называемый протеин zero.

Поскольку миелиновая оболочка в периферических нервных волокнах сформирована дискретными единицами - нейролеммоцитами (Шванновскими клетками, ШК), на протяжении нервного волокна она не сплошная, но прерывается на участках, где встречаются два соседних нейролеммоцита. Эти участки известны как узлы (лат. -nodus), прерывающие миелин или, более часто, как узлы Ранвье. Длина миелинизированного (межузлового) сегмента зависит от размеров ШК и обычно составляет 80-100 мкм. В зоне узла Ранвье миелиновая оболочка исчезает, и мембрана аксона (аксолемма) оказывается прикрытой лишь переплетающимися пальцевидными отростками соседних ШК (интердигитация -ИД) или только одним-тремя слоями базальной пластинки (БП) - образуется узловая щель. Слой миелина исчезает не сразу. Постепенно, начиная с внутренних пластин миелина, мембраны расходятся, и между ними образуются карманы, заполненные цитоплазмой ШК (звездочки). Эта паранодальная область миелиновой оболочки носит название терминальной пластинчатой манжетки. Сам отросток нервной клетки, аксон (А), также претерпевает изменения. Он заметно суживается в паранодальной зоне и, нередко, опять расширяется к середине узловой щели. Клеточная мембрана аксона в области узла Ранвье уплотняется вследствие концентрации в ней натриевых и калиевых каналов, которые и обеспечивают деполяризацию мембраны, т.е. генерацию и проведение нервного импульса. Высокая концентрация Na+- и К+-каналов в области узла Ранвье, как полагают, лежит в основе механизма сальтаторного проведения нервного импульса, характерного для миелиновых волокон. Более эффективный и быстродействующий механизм сальтаторного проведения включает резкое изменение амплитуды потенциала в области узла Ранвье и его переброс на соседний узел, минуя участки аксолеммы в межузловых сегментах.

В паранодальной области между плазмолеммой ШК, образующей карманы и микроворсинки, и прилежащей мембраной аксона формируются коммуникационные (щелевые) контакты (см. рис. 3-40) и гетеротипические аксоглиальные соединения. В их образовании принимают участие такие молекулы адгезии, как контактин (на мембране аксона) и нейрофасцин 155 (на мембране ШК). Между паранодальными петлями плазмолеммы ШК образуются и гомотипические соединения - плотные, адгезионные и щелевые контакты. На продольном срезе аксона, представленном на рисунке, хорошо видны ориентированные вдоль длинной оси нейрофиламенты (НФ) и микротрубочки (МТ). Эти фибриллярные структуры являются компонентами цитоскелета. Нейрофиламенты относятся к категории промежуточных филаментов и состоят из специального белка нейрофиламентов, а в построении микротрубочек принимает участие особая изоформа белка тубулина (см. главу 5). Нейрофиламенты и микротрубочки образуют каркас, придающий прочность тонкому и длинному отростку нервной клетки, а также используются для аксонального транспорта - перемещения веществ между телом нервной клетки и нервными окончаниями. С помощью аксонального транспорта перемещаются, в частности, митохондрии, мембраны ЭС и пузырьки, содержащие некоторые нейротрансмиттеры. Последние синтезируются в ЭС, расположенной в теле нейрона, затем упаковываются в везикулы в комплексе Гольджи и движутся к нервным окончаниям вдоль системы микротрубочек (стрелки). В цитоплазме аксона также можно видеть сохранную митохондрию (МХ), частично разрушенную митохондрию и аутофагосому (АФС).

Поверхность всасывающих эпителиальных клеток (энтероцитов), обращенная в просвет тонкой кишки (апикальная поверхность), покрыта множеством тонких пальцевидных выростов цитоплазмы. Эти отростки - микроворсинки, в форме довольно правильных цилиндров, длиной 1-2 мкм и толщиной всего 0,1 мкм. На поверхности одной клетки может формироваться 1000-3000 микроворсинок. В совокупности они образуют микроворсинчатую каемку (МК) (синонимы: щеточная, исчерченная каемка), которая увеличивает общую площадь всасывающей поверхности клеток примерно в 20 раз.

Показаны фрагменты апикальных поверхностей четырех эпителиальных клеток. Срез прошел таким образом, что просвет кишки виден как узкое пространство (стрелка), разделяющее обращенные друг к другу апикальные поверхности. Энтероциты связаны между собой контактными комплексами (КК). Каждый комплекс включает зону плотного соединения, адгезивный поясок и десмосомы (см. рис. 3-31). Боковые (базолатеральные) поверхности соседних клеток неровные. Они формируют взаимопроникающие пальцевидные складки - интердигитации. Контактный комплекс и интердигитации обеспечивают механическую связь клеток между собой и препятствуют свободному перемещению веществ из просвета кишки в межклеточное пространство, т.е. во внутреннюю среду организма.

В цитоплазме клеток у основания микроворсинок выявляется электронно-плотная полоса - терминальное сплетение (ТС). Оно образовано актиновыми и спектриновыми филаментами, составляющими поверхностную (кортикальную) часть цитоскелета (см. гл. 5). Пучки актиновых филаментов (микрофиламентов) терминального сплетения ориентированы параллельно клеточной поверхности и связаны с контактным комплексом на уровне адгезионного пояска (zonula adhaerens). В центре каждой микроворсинки также находится пучок актиновых филаментов (см. рис. 3-14), который вплетается в терминальное сплетение. Сокращение микрофиламентов терминального сплетения может изменять апикальный диаметр клеток и наклонять микроворсинки. Полагают, что движения такого рода способствуют более полному контакту поверхностей микроворсинок с питательными веществами в просвете кишки. Пальцевидные выросты цитоплазмы - микроворсинки - могут образовываться на поверхности многих клеток, однако регулярно организованная микроворсинчатая каемка встречается лишь в эпителиальных клетках, специализированных для всасывания, - энтероцитах и эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев почки. Так называемые стереоцилии - длинные, иногда ветвящиеся микроворсинки, которые встречаются в других тканях (например, в семявыносящих путях), - выполняют, скорее, механические функции, чем функцию всасывания.

Представлена в основном E-поверхность раскола мембраны энтероцита в его апикальной зоне. Вследствие небольшого диаметра микроворсинок (МВ) и, следовательно, большой кривизны их мембран раскол перескакивает с одной поверхности на другую, и можно видеть разные изображения микроворсинок - вогнутые и выпуклые. Непосредственно под микровосинками, в апикальной части клетки, хорошо видна сеть бороздок, которая соответствует сети фибрилл, образованных внутримембранными частицами на соответствующей (комплементарной) P-поверхности мембраны. Это - зона плотного (замыкающего) соединения (ЗС), перекрывающего сообщение между просветом кишки (ПР) и межклеточным пространством. Поскольку разлом прошел вдоль большого фрагмента поверхности энтероцита и даже включает часть поверхности соседней клетки (слева), хорошо видно, что плотный контакт образует сплошную, непрерывную полосу, опоясывающую апикальную часть клетки по всей окружности. Плотное соединение такого вида называется опоясывающим контактом (zonula occludens) в отличие от фрагментарного (fascia occludens) или локального (macula occludens) контакта.

На поперечном срезе щеточной каемки хорошо видно, что каждая микроворсинка образована клеточной мембраной (КМ), отграничивающей фрагмент цитоплазмы с электронно-плотным содержимым - пучком актиновых филаментов (см. рис. 3-14). Пространство между микроворсинками невелико и практически все заполнено гликокаликсом (ГК), который хорошо выявляется без дополнительной окраски.

Выраженность ГК в микроворсинчатой каемке всасывающих эпителиальных клеток имеет вполне определенный функциональный смысл. Конечная ступень пищеварения - расщепление олиго- и дисахаридов, дипептидов до их мономеров - осуществляется именно в слое ГК, в непосредственной близости от КМ, и конечные продукты ферментативного гидролиза (мономеры) тут же всасываются клеточной поверхностью. Эта резорбция осуществляется с помощью многочисленных трансмембранных белков-транспортеров, которые часто специализированы для переноса лишь одного мономера - определенной аминокислоты или сахара. Большая часть таких каналов использует механизм вторичного активного транспорта за счет энергии натриевого градиента через мембрану.

Этот градиент поддерживается Na ⁺ -/К ⁺ -АТФазой, которой также богата плазмолемма микроворсинок. Поступившие в клетку вещества выводятся из цитоплазмы через базолатеральную поверхность в интерстициальное пространство и далее - в кровь через фенестрированный эндотелий кровеносных капилляров (см. рис. 3-15).

Путь липидных продуктов - жирных кислот, моноглицеридов - более сложный. Они легко диффундируют через липидный бислой мембраны в цитоплазму энтероцита, где из них синтезируются крупные липидные агрегаты - хиломикроны. Локализация конечного этапа пищеварения в слое ГК, непосредственно около мембраны микроворсинок, имеет и другое функциональное значение. Поскольку мономеры после образования тут же резорбируются клеткой, это не приводит к их накоплению в пространствах между ворсинками. Таким образом предотвращается избыточное развитие кишечной флоры, поскольку микроорганизмы ассимилируют для питания в основном мономерные ингредиенты.

Аналогичный механизм резорбции аминокислот и сахаров из первичного фильтрата работает и в щеточной каемке проксимальных извитых канальцев почки (см. рис. 3-16).

Изображение аналогично представленному на рис. 3-13, однако хорошо видны поперечно разрезанные пучки актиновых филаментов (АФ), составляющие сердцевину каждой микроворсинки. Поскольку микроворсинка представляет собой длинный и тонкий цилиндр, окруженный податливой мембраной, ее прочность и форма поддерживаются своеобразным динамическим скелетом - пучком актиновых филаментов (микрофиламентов). У верхушки микроворсинки этот пучок прикрепляется к внутренней поверхности плазмолеммы с помощью специального актинсвязывающего белка виллина. Цитоплазматические концы микрофиламентов вплетаются в кортикальное терминальное сплетение (см. рис. 3-11), также образованное преимущественно актиновыми филаментами. На протяжении микроворсинки пучок филаментов стабилизирован вспомогательными белками (фасцином, фимбрином) и ассоциирован со специальной формой моторного белка - миозином I и кальмодулином, белком, способным временно связывать и освобождать ионы Ca²⁺ .

Таким образом, в самой микроворсинке существует своеобразная сократительная актино-миозиновая система. Взаимодействие актина и миозина I, которое инициируется ионами Ca² + (см. гл. 5), приводит лишь к незначительному укорочению и утолщению микроворсинки, поскольку пучок микрофиламентов фиксирован и к мембране, и в терминальном сплетении. Однако результатом такого сокращения являются стабилизация формы микроворсинки и придание ей прочности.

Актиномиозиновое взаимодействие - процесс регулируемый, и поэтому сами микроворсинки и щеточная каемка в целом приобретают удобное сочетание свойств: определенную ригидность и необходимую гибкость. Если учесть, что терминальное сплетение, в которое вплетаются микрофиламенты, в свою очередь связано с межклеточными контактами, можно полагать, что вся апикальная поверхность группы энтероцитов в механическом смысле представляет собой одно целое.

Эпителиальные клетки, выстилающие просвет кишки, как и многие другие клетки эпителиев, отчетливо поляризованы. Апикальные части клеток и плазмолемма, их ограничивающая, существенно отличаются морфологически и функционально от базолатеральной области. Очевидный результат такой поляризации проявляется в развитии микроворсинчатой каемки, предназначенной для интенсивного всасывания. Базолатеральные области эпителия кишки (ЭП) также имеют свои особенности, хотя и не столь очевидные. Клеточная мембрана этих зон специализирована для осуществления активного (т.е. АТФ-зависимого) транспорта поглощенных веществ из цитоплазмы клеток во внеклеточное, интерстициальное, пространство. Плазмолемма здесь часто образует складки, инвагинации и выросты, увеличивающие ее поверхность. Активный транспорт ионов во внеклеточное пространство повышает в нем осмотическое давление и вызывает пассивный приток воды через межклеточные контакты.

Поэтому на высоте пищеварения интерстициальное пространство (ИП) у базальных отделов энтероцитов расширено и заполнено жидкостью. В нем можно видеть также скопления липидных агрегатов - хиломикронов (ХМ). Вода, ионы и небольшие молекулы (аминокислоты, сахара) поступают в расположенные рядом кровеносные капилляры (КК), образованные фенестрированным эндотелием (см. рис. 3-48-3-50). Видно, что эндотелиальные клетки также поляризованы - истонченная фенестрированная зона цитоплазмы обращена к базальной поверхности эпителия. Хиломикроны в просвет кровеносных капилляров не поступают, а эвакуируются из интерстиция лимфатическими капиллярами.

Базальная пластинка, подстилающая эпителий (видна как тонкая линия - стрелки), и прилежащая к ней полоска соединительной ткани (фибро-ретикулярная пластинка; см. рис. 3-26) составляют базальную мембрану эпителиального пласта, которую можно увидеть и при световой микроскопии.

Проксимальные извитые канальцы почки являются начальными сегментами тубулярной части нефрона. Они принимают первичную мочу, которая образуется в почечном тельце и представляет собой ультрафильтрат плазмы крови. В нем содержатся ионы, аминокислоты, сахара и небольшие белки. Эти вещества резорбируются эпителием проксимальных извитых канальцев (трубочек) и возвращаются в кровь. Вслед за ионами и небольшими молекулами по осмотическому градиенту в межклеточное пространство поступает вода. Проксимальные трубочки резорбируют большую часть воды и NaCl первичного фильтрата (от 65 до 80%). Для эффективного поглощения ионов, микромолекул и белка из просвета канальца (ПР) апикальная поверхность клеток покрыта микроворсинчатой (щеточной) каемкой (МК), а в прилежащей зоне цитоплазмы активно функционирует аппарат эндосом. На рис. 3-16 эндосомы видны как перфорации различного диаметра (стрелки). Обращает на себя внимание очень неровный рельеф базолатеральных отделов клеток. Он сформирован многочисленными складками, выростами и инвагинациями, между которыми видны пустые пространства. СЭМ дает объемную картину этой зоны клеток, которая получила название базального лабиринта. Последний образуется как результат интенсивной секреции поглощенных веществ из цитоплазмы клеток в окружающее интерстициальное пространство (ИП).

ТЭМ открывает детали строения базального лабиринта. Такое строение базолатеральных отделов характерно для эпителиальных клеток, которые специализированы для всасывания и последующего выведения из цитоплазмы ионов и небольших молекул. Эти клетки формируют трубчатые эпителиальные структуры - извитые канальцы почки, сегменты протоков некоторых экзокринных желез (так называемые исчерченные протоки) там, где транспорт ионов и микромолекул сопряжен с перемещением больших объемов жидкости. Видно, что базальный лабиринт сформирован за счет чередования глубоких складок (инвагинаций) и выростов цитоплазмы и клеточной мембраны. Вследствие тесного прилежания складок плазмолеммы ее общая площадь в соответствующем клеточном объеме возрастает многократно. Секреция поглощенных клеткой ионов и небольших молекул в интерстициальное пространство осуществляется против градиента концентрации, и для этого используются активные транспортные каналы (насосы), которыми так богаты базолатеральные домены плазмолеммы. Для обеспечения энергетических потребностей АТФ-зависимых ионных каналов в складках мембраны, практически прилегая к ней, располагаются многочисленные удлиненные митохондрии (МХ). Параллельное расположение митохондрий и складок придает базальным отделам клеток характерную радиальную исчерченность, видимую и при световой микроскопии (отсюда и название - исчерченные протоки). Помимо митохондрий в узких прослойках цитоплазмы видны довольно крупные пустые пузырьки - вакуоли. Они, возможно, участвуют в выведении из клетки более крупных молекул, которые не могут переноситься в интерстиций с помощью трансмембранных каналов. Непосредственно под эпителием видна его собственная базальная пластинка (БП), а несколько кнаружи - базальная пластинка эндотелия кровеносного капилляра. Базальная пластинка эпителиальных клеток в складки плазмолеммы не заходит, а подстилает весь эпителиальный пласт. Предельно малая дистанция между базальной поверхностью эпителия канальца и стенкой капилляра способствует быстрой эвакуации секретируемых ионов и воды в кровь. Истонченные фенестрированные участки эндотелия (ЭК) кровеносного капилляра не создают заметного препятствия такой эвакуации, хотя фенестры здесь и прикрыты монослойными диафрагмами (см. рис. 3-49). Фенестрированный тип эндотелия вообще характерен для капилляров тех органов, в которых происходит перемещение больших объемов жидкости или секретируемых продуктов. В просвете капилляра видны эритроциты (ЭР).

Строение базального лабиринта представлено в криофрактографическом варианте. Разлом прошел почти полностью через плазмолемму одной клетки (ЭП₁) и частично вскрыл цитоплазму другой (ЭП₂). В базальной части клетки, обращенной к эндотелию кровеносного капилляра (ЭК), видны складки клеточной мембраны, окутывающие митохондрии (МХ). Некоторые митохондрии рассечены таким образом, что видно их содержимое (матрикс) и кристы. Другие видны как объемные продолговатые образования, прикрытые одним из листков (Е-поверхность) расщепленной наружной мембраны. Более шероховатые углубления аналогичной формы воспроизводят Р-поверхность наружной митохондриальной мембраны. В цитоплазме клетки, в том числе в зоне базального лабиринта, видны округлые вакуоли и пузырьки разного диаметра (стрелки), которые участвуют в переносе относительно крупных молекул. Узкая полоска ткани, разделяющая базальную поверхность эпителия и эндотелий кровеносного капилляра, соответствует интерстициальному пространству, отделяющему эпителий и эндотелий (см. рис. 3-16), однако базальные пластинки, подстилающие эпителиальные пласты, на препаратах, полученных с помощью метода замораживания-раскалывания, обычно не видны - они построены не из мембран.

Ранее было показано (см. рис. 3-17), что каждый из рядом расположенных эпителиальных пластов - и эпителий канальца, и эндотелий капилляра - имеет собственную базальную пластинку. Пласт эпителиальных клеток цитотрофобласта, который формирует внутреннюю выстилку ворсин плаценты, также имеет выраженную базальную пластинку. На рисунке видно, что базальная пластинка (БП) представляет собой слой филаментозного или войлокообразного материала, который связан с базальной плазмолеммой эпителиальных клеток (ЭП).

В базальной пластинке выделяют ее наружную, более плотную часть, плотную пластинку (lamina densa) (LD) и прилежащую к клеточной мембране разреженную, или прозрачную, пластинку (lamina rara или lamina lucida) (LR). Они различаются не только плотностью упаковки фибриллярных компонентов, но и составом. Основу базальной пластинки (l. densa) составляют агрегаты коллагена IV типа, который не образует фибрилл, но формирует 3-мерную решетку. Коллаген связан с матриксными белками: фибронектином, ламинином, энтактином и гепарансульфат протеогликанами (перлеканами). Фибриллы, которые протягиваются от клеточной мембраны через l. rara и вплетаются в l. densa, содержат в основном ламинин и фибронектин.

Связь плазмолеммы клеток с базальной пластинкой осуществляется посредством специальных трансмембранных белков - интегринов. Интегрины являются, по существу, рецепторами к белкам внеклеточного матрикса. Внеклеточные домены интегринов связываются с компонентами базальной пластинки специфическим образом. Противоположные, цитоплазматические, сегменты интегринов могут быть связаны с актиновыми филаментами кортекса, промежуточными филаментами или компонентами внутриклеточных сигнальных систем. Некоторые типы эпителиальных клеток сохраняют жизнеспособность только при условии их связи с базальной пластинкой или ее искусственными аналогами.

Эпителиальные пласты, которые подвергаются сильным деформациям, особенно сдвиговым (например, эпидермис кожи), образуют более прочные и сложные локальные интегринзависимые контакты с базальной пластинкой и подлежащей соединительной тканью - полудесмосомы (см. рис. 3-27). Напротив, клетки, достаточно свободно мигрирующие в тканях (см. рис. 5-13), формируют при движении весьма динамичные связи между интегринами клеточной мембраны и субстратом, по которому они передвигаются, - так называемые фокальные контакты.

Серия иллюстраций (рис. 3-20-3-25) посвящена описанию клеточных и внеклеточных структур, участвующих в организации фильтрационного барьера клубочка почки. Центральной и наиболее важной частью этого барьера является базальная мембрана. Она образована слиянием собственных базальных пластинок двух рядом расположенных эпителиальных пластов - эндотелия и висцерального листка клубочковой капсулы (капсулы Боумена). Начальным этапом образования мочи является фильтрация плазмы крови, которая осуществляется в гистологических конструкциях - клубочках почки. Основу клубочка составляет сеть довольно широких кровеносных капилляров (КК) с фенестрированным эндотелием. Каждая капиллярная трубка оплетена вторичными отростками своеобразных эпителиальных клеток - подоцитов (ПЦ). Необычная форма подоцитов хорошо видна при сканирующей электронной микроскопии (см. рис. 1-7). Между отростками подоцитов (цитоподиями) и эндотелием располагается базальная мембрана клубочка (стрелки). Таким образом, компоненты почечного фильтра, разграничивающего пространство крови (просвет капилляров) и мочевое пространство (МП), представлены эндотелием, базальной мембраной и отростками подоцитов (см. рис. 3-21).

Материал базальной пластинки синтезируется, вероятно, не только клетками эндотелия и подоцитами. Его можно видеть и в интерстициальном пространстве между капиллярами, где располагаются так называемые мезангиальные клетки (МК). Эти клетки (аналог перицитов, которые можно встретить в микрососудах других тканей) секретируют биологически активные вещества и, как полагают, играют роль своеобразных чистильщиков гломерулярного фильтра, поскольку обладают фагоцитарной активностью. Отростки мезангиальных клеток можно видеть в непосредственном контакте с базальной мембраной.

Эти две иллюстрации дополняют друг друга, и поэтому их целесообразно описывать совместно. На рис. 3-21, а показан, преимущественно, эндотелиальный компонент гломерулярного (клубочкового) фильтра. Эндотелиальные клетки (ЭК) заметно поляризованы - утолщенная ядросодержащая часть цитоплазмы резко переходит в крайне тонкую перфорированную зону клетки. Видно, что фенестры гломерулярного капилляра, в отличие, например, от фенестрированных капилляров кишки, не закрыты диафрагмами (см. рис. 3-22). На обоих рисунках видна толстая (до 300 нм) базальная мембрана (БМ), которая располагается между эндотелием и отростками эпителиальных клеток - подоцитов (ПЦ). Поскольку базальная мембрана сформировалась вследствие слияния двух базальных пластинок, эндотелия и эпителия, в ней различают центральный плотный слой - lamina densa и две разреженные пластинки - lamina rara externa и lamina rara interna, прилегающие, соответственно, к эндотелию и подоцитам. L. densa образована плотно упакованными фибриллами, диаметром около 3 нм, тогда, как в обеих lamina rara есть толстые (10 нм) фибриллы, которые достигают клеточных мембран. Состав базальной мембраны почечного клубочка подобен составу других базальных пластинок (см. рис. 3-19), но обилие дисульфидных связей, обеспечивающих поперечную сшивку компонентов, делает ее более плотной. Развитая гранулярная эндоплазматическая сеть и обилие свободных рибосом в цитоплазме подоцита (рис. 3-21, б) свидетельствуют о синтетической активности этих клеток. «Ножки» подоцитов (цитоподии), связь которых с телом клетки не всегда прослеживается на тонких срезах, несколько уплощаются у базальной мембраны. Узкие пространства между цитоподиями (фильтрационные щели) перекрыты монослойными щелевыми диафрагмами (стрелки), которые ограничивают свободный доступ в мочевое пространство (МП) и являются важной частью гломерулярного фильтра.

В просвете капилляра (ПР) на рис. 3-21, б виден фрагмент тромбоцита.

Эта электронная микрофотография выглядит несколько непривычно, поскольку срез прошел тангенциально - параллельно плоскости эндотелия клубочкового капилляра (ЭК). Хорошо видны фенестры (окошки) в истонченной части эндотелиальных клеток и базальная мембрана (БМ), окружающая эндотелий. Фенестры лишены диафрагм (на этом основании их называют также порами) и вследствие своей многочисленности и сравнительно больших размеров (70-90 нм) допускают вполне свободное перемещение веществ, даже крупных молекул, из просвета капилляра (ПР). Таким образом, единственное назначение эндотелия как компонента почечного фильтра - это ограничение перемещения клеток крови. Базальная мембрана, материал которой виден и в фенестрах, играет, по-видимому, самую важную роль в ограничении фильтрации крупных молекул. На таком срезе хорошо видна структура самой базальной мембраны: ее более плотная центральная зона (lamina densa - LD), а также разреженные пластинки, прилегающие к эндотелию (l. rara interna - LRI) и к отросткам подоцитов (l. rara externa - LRE). Длинные узкие отростки подоцитов, цитоподии (ЦП), прилежат к материалу базальной пластинки.

Хотя фенестрированные зоны эндотелия не могут ограничивать пассаж веществ, сами эндотелиальные клетки тем не менее связаны между собой плотными контактами (внизу справа, стрелка).

Использование метода замораживания-раскалывания (криофрактографии) дает дополнительную информацию об организации гломерулярного фильтра.

Многочисленные фенестры, видимые на Е-поверхности раскола как неглубокие кратеры с приподнятыми краями, почти правильной формы, группируются в кластеры. Видно, что эти кластеры занимают большую часть площади поверхности эндотелиальной клетки, и в совокупности площадь фенестр, т.е. сквозных отверстий через цитоплазму клеток, соизмерима с площадью оставшейся клеточной поверхности. На другой поверхности раскола мембран (Р-поверхность: фрагменты на рисунке справа) фенестры выглядят как пологие углубления с плоским дном.

Размер пор и доля площади, которую они занимают, позволяют заключить, что эндотелий клубочковых капилляров не является существенной преградой для фильтрации любых компонентов плазмы крови. Более того, он должен без помех пропускать огромные объемы жидкости (напомним, что объем фильтрата, т.е. первичной мочи, образующейся в почках человека за 1 сут, составляет около 120 л).

Коллоидный лантан является электронно-плотным веществом. Его частицы размером 1,5- 2,0 нм заряжены положительно и, связываясь с отрицательно заряженными химическими группами биологических молекул, могут маркировать участки (сайты), в которых такие группы находятся. Представлен фрагмент гломерулярного фильтра почки (препарат не окрашивался солями тяжелых металлов для лучшего выявления лантана). Видно, что частицы лантана связываются преимущественно с базальной мембраной, которая разделяет эндотелий капилляра (ЭК) и отростки подоцитов (ПЦ). Можно отметить также, что наиболее интенсивно маркируются периферические зоны базальной мембраны - ll. rarae, тогда как центральная часть (/. densa) содержит сравнительно меньше отрицательных зарядов. Отрицательно заряженные группы, принадлежащие в основном гликозаминогликанам, не распределены в базальной мембране равномерно, но концентрируются на дискретных участках (сайтах). Подобные сайты находятся и около мембран подоцитов, поскольку молекулы, содержащие негативные группы, входят в состав гликокаликса этих клеток.

Присутствие в гломерулярной базальной мембране отрицательно заряженных групп очень тесно связано с осуществлением функции фильтрационного барьера. Многие молекулы, растворенные в плазме крови, в частности белки, являются полианионами, т.е. имеют преимущественно отрицательный заряд. При фильтрации плазмы через базальную мембрану перемещение молекул ограничивается не только за счет механического препятствия, создаваемого фибриллярной, войлокообразной структурой базальной мембраны, но и за счет электростатического отталкивания одноименных зарядов. Фактически отрицательно заряженные сайты ограничивают доступ анионам в пространство между фибриллами матрикса базальной мембраны.

Электронно-плотные вещества - маркеры - часто используются в ультраструктурных исследованиях для демонстрации функциональных возможностей клеток и клеточных ансамблей. Слабые растворы таниновой кислоты, молекулы которой имеют массу 1700 Д, в ТЭМ применяются, как правило, на этапе обработки образцов для улучшения контраста клеточных мембран. Таниновая кислота легко диффундирует в биологических средах, но обычно в цитоплазму клеток не проникает. На рис. 3-25 видны компоненты почечного (гломерулярного) фильтра и пространства, которые он разделяет (для лучшего выявления маркера препарат был слабо окрашен солями металлов). Просвет капилляра клубочка, содержащий эритроциты (ЭР), заполнен плазмой, в которой диспергирована таниновая кислота. Видно, что маркер практически без ограничений проходит фенестрированный эндотелий капилляра (ЭК) и пропитывает базальную мембрану (БМ) клубочка. Примерно одинаковая электронная плотность маркера в просвете и базальной мембране свидетельствуют о том, что и сама базальная мембрана не является эффективным барьером для таниновой кислоты. Однако на следующем этапе, при проникновении через фильтрационные щели между ножками подоцитов (ПЦ), уже существуют серьезные ограничения для движения даже таких небольших молекул, как молекулы таниновой кислоты. Ее содержание в мочевом пространстве (МП) существенно меньше, чем в плазме крови.

Отчетливо видно, что щелевые диафрагмы ограничивают поступление маркера в мочевое пространство.

Таким образом, можно заключить, что гломерулярный фильтрационный барьер действует не только избирательно, но и дифференцированно - его компоненты последовательно ограничивают транспорт частиц и веществ в зависимости от размеров и заряда. В качестве рабочей схемы можно принять, что если эндотелий капилляров препятствует перемещению частиц (клеток крови), а базальная мембрана ограничивает транспорт преимущественно крупных заряженных молекул (белков), то диафрагмы, перекрывающие щели между цитоподиями, являются серьезным препятствием даже для небольших молекул.

Иллюстрируется еще один аспект использования таниновой кислоты в электронно-микроскопических исследованиях. Таниновая кислота не проникает в неизмененные клетки с сохранной клеточной мембраной, как это можно видеть на примере эндотелиальных клеток капилляра и ПЦ (расположенного справа). Однако при повреждении плазмолеммы и нарушении ее барьерных свойств таниновая кислота прокрашивает всю цитоплазму и ядро, делая почти неразличимым клеточное содержимое (клетка - вверху слева). Таким образом, с помощью таниновой кислоты при ультраструктурном анализе можно более обоснованно и уверенно судить о жизнеспособности или, по крайней мере, о возможном повреждении клеток.

В описании предыдущих рисунков были использованы два термина для обозначения одной и той же структуры: базальная пластинка и базальная мембрана. Последний термин фигурировал при описании гломерулярного фильтра. Базальная мембрана клубочка - это исторически сложившийся и сохраненный в современной номенклатуре термин, который обозначает внеклеточную структуру, образованную двумя слившимися базальными пластинками эндотелия и эпителия (подоцитов). Между тем в литературе и, что менее понятно, в учебниках и руководствах до сих пор можно встретить термин «базальная мембрана», обозначающий фактически базальную пластинку - структуру, видимую только в электронный микроскоп. В современной терминологии понятие «базальная мембрана», соответствующее светооптически видимой структуре, включает собственно базальную пластинку и подлежащий тонкий слой соединительной ткани - фиброретикулярную пластинку, которая связывает базальную пластинку эпителия с подлежащей соединительной тканью. Фиброретикулярная пластинка имеет свои особенности, отличающие ее от остальной соединительной ткани.

На рисунке (тангенциальный срез лучше выявляет взаимоотношения компонентов) представлена фиброретикулярная пластинка (ФРП), связывающая базальную пластинку эндотелиальной клетки капилляра (ЭК) с пучком коллагеновых фибрилл (КОЛ) окружающей соединительной ткани. Эти фибриллы образованы коллагеном III типа (редко - I типа), для которого характерна типичная периодическая исчерченность. Под углом к этому пучку и перпендикулярно к нему отходят более тонкие коллагеновые фибриллы с менее отчетливой периодичностью. Они вплетаются в материал базальной пластинки эндотелия (БП) и почти достигают клеточной поверхности. Эти тонкие, якорные, фибриллы построены из коллагена VII типа, характерного для фиброретикулярной пластинки. Коллаген VII типа связывается с ламинином базальной пластинки, с одной стороны, и с коллагеновыми и эластическими волокнами соединительной ткани - с другой.

Полагают, что тонкие (диаметром 2-10 нм) микрофибриллы (МФ), которые также участвуют в прикреплении базальной пластинки, состоят из белка фибриллина, аналогично микрофибриллам эластического волокна (см. рис. 3-28).

Эпителиальные пласты, которые подвергаются сильным деформациям и сдвиговым усилиям, имеют более прочные и специализированные связи с окружающим внеклеточным матриксом. Очевидным примером может служить соединение базального слоя эпидермиса кожи (ЭП). Помимо обычных связей клеточной мембраны с подлежащей базальной пластинкой (БП) (см. рис. 3-19) здесь формируются специализированные интегринзависимые контакты - полудесмосомы (стрелки).

Основу контакта составляют трансмембранные адгезионные белки интегрины (в основном интегрин α₆ β₄ ), которые концентрируются в зоне полу-десмосомы. Внеклеточные домены этих рецепторных белков связываются с ламинином - 5-й базальной пластинки. В свою очередь, базальная пластинка эпидермиса связана с коллагеновым каркасом дермы (КОЛ) посредством достаточно плотной фиброретикулярной пластинки (см. рис. 3-26).

В цитоплазме клеток полудесмосомы подкрепляются пучками промежуточных филаментов, построенных из белков кератинов 5-го и 14-го типа (см. гл. 5). Эти филаменты образуют толстые волокна - тонофибриллы, или тонофиламенты (ТФ), видимые в клетках эпидермиса и при световой микроскопии.

Соединение кератиновых филаментов с длинными цитоплазматическими хвостами β-интегринов осуществляется посредством интегринсвязанных белков - плектина и так называемого антигена пузырчатки-1 (bullouspemphigoid antigen-1). Генетический дефект, связанный с нарушением синтеза антигена пузырчатки-1, приводит к отслойке эпидермиса от базальной пластинки и возникновению обширных пузырей, в которых накапливается экссудат. Интегрины и интегринсвязанные белки, фиксирующие кератиновые филаменты, собственно, и формируют цитоплазматические пластинки и видимые утолщения мембраны, характерные для полудесмосом.

Одной из форм взаимодействия клетки с окружающей средой являются межклеточные соединения, или контакты, поскольку другие клетки также являются частью этой среды. Посредством межклеточных контактов модулируются многие клеточные функции, включая клеточное деление, и строятся разнообразные гистологические конструкции, которые обеспечивают специальные функции органов.

Контактные взаимодействия между клетками могут быть непродолжительными, функциональными и реализующими лишь кратковременные эпизодические эффекты. К таким контактам относятся, в частности, прямые взаимодействия между клетками иммунной системы (макрофагами, лимфоцитами), в процессе которых осуществляется распознавание антигенов с помощью специальных рецепторов, реализуются избирательные паракринные влияния и др. В качестве еще одного примера можно привести адгезионные взаимодействия эндотелиальных клеток с лейкоцитами в процессе их миграции в ткань или с тромбоцитами в начальных фазах формирования тромба. Возможны кратковременные связи и между клетками соединительной ткани. Как правило, в подобных контактах участвуют клетки разного происхождения или клетки, принадлежащие к различным специализированным субпопуляциям, например Т- и В-лимфоциты. Суперсемейство молекул адгезии обширно и включает различные интегральные белки и гликолипиды мембран. В частности, для осуществления временных контактов используются кадгерины, селектины, интегрины, иммуноглобулины, так называемые молекулы межклеточной адгезии (ICAM), а также рецепторы к этим веществам и компонентам гликокаликса.

Роль макрофагов (МФ) в обеспечении иммунной защиты не ограничивается поглощением чужеродных белков, микробных тел или фрагментов погибших клеток. Эти клетки также представляют Т-лимфоцитам чужие антигены для распознавания специальными клеточными рецепторами лимфоцитов (TCR) и стимулируют иммунокомпетентные клетки, вырабатывая различные цитокины. Таким образом индуцируется собственно иммунный ответ.

Плазматические клетки (ПК) являются конечной формой дифференцирования стимулированных В-лимфоцитов. Они синтезируют и секретируют антитела (иммуноглобулины), предназначенные для нейтрализации антигенов. Каждая плазматическая клетка вырабатывает только один вид антител, специфичных в отношении какого-либо одного антигена. Развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум (ГЭР) и обширный комплекс Гольджи (КГ) - отличительные черты клеток, интенсивно синтезирующих белок. Поскольку продукт синтеза выделяется из клетки постоянно (конститутивный тип секреции; см. гл. 4), секреторные гранулы не образуются. В цитоплазме плазмоцита и особенно макрофага видны лизосомы (Л). Я - ядро; МХ - митохондрии.

Простые адгезионные соединения, лишенные мембранных специализаций, образуются также между различными клетками, сосуществующими в составе единого клеточного ансамбля. Хорошо видны адгезионные связи (стрелки) между отростками эндотелиальной клетки (ЭК) и клетки Купфера (КК), печеночного макрофага. Оба типа клеток, хотя и принадлежат к разным популяциям, участвуют в образовании стенок синусоидов печени (см. рис. 3-51). В образовании межклеточных адгезионных соединений, помимо отмеченных ранее молекул адгезии (см. рис. 3-28), принимают участие некоторые изоформы рецепторных мембранных белков интегринов.

В отличие от интегринов, формирующих контакты с компонентами внеклеточного матрикса, эти интегрины специфически связываются с клеточной поверхностью, преимущественно с компонентами гликокаликса. ПР - просвет синусоида; Д - пространство Диссе (перисинусоидное пространство); Л - липидная капля в цитоплазме гепатоцита.

Мембранные поверхности соседних клеток могут связываться между собой не только посредством молекул адгезии, но и чисто механически, формируя соединения причудливой формы. В зонах, где эпителиальные пласты подвергаются существенным деформациям (например, в кишке, стенке кровеносных сосудов), между боковыми поверхностями клеток формируются так называемые интердигитации. Поверхности клеток образуют пальцевидные, несколько утолщенные на концах отростки и складки, которые проникают в комплементарные углубления соседней клетки. На представленной иллюстрации такие интердигитации образованы прилежащими поверхностями трех соседствующих энтероцитов (ЭЦ) (см. рис. 3-11). Понятно, что в 3-мерном пространстве контакт в форме интердигитации должен обладать огромной механической прочностью и клетки нельзя разъединить, не нарушив целостности мембран. Лишь активность самих клеток может изменить конфигурацию их поверхности. Интердигитации часто подкрепляются локальными адгезионными мембранными образованиями - десмосомами (стрелки) (см. рис. 3-44, 3-45).

Наиболее апикально, тотчас под микроворсинками (МВ), располагается замыкающий или плотный контакт (zonula occludens) (1). При ТЭМ он обычно выглядит как достаточно протяженный участок слияния внешних листков мембран без видимой щели между ними. Плотный контакт относится к категории замыкающих (окклюдирующих) соединений, поскольку его основной функцией является регуляция межклеточного транспорта веществ. В эпителии кишки ниже плотного контакта на уровне терминального сплетения (см. рис. 3-11) располагается адгезионный поясок (zonula adhaerens) (синонимы: адгезионный контакт, опоясывающая десмосома) (2). Он относится к категории адгезионных соединений, которые механически связывают соседние клеточные поверхности. Эта связь осуществляется посредством специальных адгезионных белков - кадгеринов (в основном Е- и N-кадгеринов). Видно, что в зоне адгезионного пояска мембраны соседних клеток несколько расходятся и ширина межмембранного пространства достигает 20-30 нм. Адгезионные контакты такого типа существуют не только в эпителии. В мышце сердца, например, менее протяженные адгезионные соединения (fascia adhaerens) участвуют в формировании вставочных дисков (см. рис. 3-42, 3-43). С цитоплазматической стороны плазмолеммы адгезионные контакты подкрепляются кадгеринсвязанными белками (плакоглобин, β-катенин, белокр120), которые образуют хорошо видимое цитоплазматическое уплотнение (пластинку). Сюда вплетаются актиновые филаменты терминального сплетения. Обычно рядом с пояском или фасцией адгезии располагаются несколько десмосом (macula adhaerens) (3). Более подробно строение и состав десмосом описаны далее (см. рис. 3-44-3-45). Нередко в составе контактных комплексов или рядом с ними встречаются коммуникационные контакты (щелевые соединения, или нексусы) (4). Структура и состав коммуникационных контактов более подробно рассматриваются далее (см. рис. 3-40, 3-41).

Наиболее адекватным подходом для изучения структуры замыкающих (плотных) соединений является метод замораживания-раскалывания. На поверхностях расщепленных мембран видно, что плотный контакт - это не слияние листков мембран, как полагали ранее, а сеть гребешков и комплементарных им бороздок на соседней мембране (см. рис. 3-33). Последние обычно выявляются на Е-поверхности раскола, как это видно на представленной иллюстрации. В эпителии, подобном эпителию кишки или желез, эта сеть достаточно густая, сплошная и расположена сразу под апикальной поверхностью. Поскольку столбчатый эпителий тонкой кишки имеет гексагональную упаковку, можно видеть также, что зона плотного контакта продолжается и на латеральные поверхности трех граничащих клеток (стрелка).

В отличие от латеральных участков плазмолеммы энтероцитов в мембранах микроворсинок (МВ) обнажилась Р-поверхность, на которой можно видеть множество внутримембранных частиц (интегральных белков мембраны).

На Р-поверхности (Р) раскола в зоне плотного контакта (нижняя часть рисунка) выявляется сеть, состоящая из анастомозирующих гребешков слияния (фибрилл). Гребешки, в свою очередь, сформированы линейно ориентированными и плотно упакованными внутримембранными частицами. Эти частицы, представлены интегральными белками окклюдинами и клодинами, которые составляют обширные (до 20 изоформ) классы специальных молекул адгезии. Полагают, что именно внеклеточные домены клодинов, взаимодействуя с аналогичными сегментами мембранных белков соседней клетки, образуют сетевидную конструкцию, перекрывающую межклеточное пространство. Окклюдины играют, по-видимому, вспомогательную роль, способствуя фиксации клодинов в липидном бислое и слипанию мембранных поверхностей.

Адгезионные белки плотного контакта связаны в мембране и цитоплазме клетки со вспомогательными белками, наиболее важными из которых являются так называемые белки zonula occludens - ZO-1, ZO-2, ZO-3 и др. (всего более 10 форм). Зона плотного контакта подкрепляется также актиновыми филаментами, которые могут модулировать функцию контакта (его проницаемость). Функции белка ZO-1 выходят за рамки его участия в плотном контакте. Он может действовать, в частности, как опухолевый супрессор, предотвращая малигнизацию эпителиальной ткани. Возможно, с этим связаны нарушения функции плотных контактов, которые нередки в эпителиальных опухолях.

Виден вскрытый просвет (ПР) ацинуса - секреторной единицы поджелудочной железы. Сплошная полоса замыкающих соединений (слева - бороздки на фрагменте Е-поверхности - Е) отграничивает просвет ацинуса от щелевидного пространства между боковыми поверхностями эпителиальных (экзокринных) клеток (стрелка). Крупные сферические углубления в апикальной цитоплазме клеток - секреторные гранулы (СГ), точнее их расщепленные мембраны.

Иллюзию выпуклости гранул (вверху справа) можно преодолеть, если учесть направление напыления реплики. Более темные зоны содержат напыленный металл; светлые бесструктурные области - тени, в которые металл не попал.

Плотные (замыкающие) контакты в эндотелиальной выстилке кровеносных и лимфатических капилляров имеют свои особенности и функционально относятся к протекающим контактам. По сравнению с контактами в других эпителиях они более проницаемы и способны довольно свободно пропускать не только ионы, воду и малые молекулы, но и белки небольшой молекулярной массы. Исключением являются замыкающие соединения в эндотелии капилляров мозга, которые обладают очень низкой проницаемостью даже по сравнению с проницаемостью эпителиальных контактов. Они существенно ограничивают диффузию ионов, малых молекул и транспорт воды и составляют наиболее важный компонент гематоэнцефалического барьера. Относительно высокая проницаемость эндотелия капилляров связана с тем, что сеть гребешков слияния, сформированная из адгезионных белков клодинов и окклюдинов, в эндотелиальных контактах довольно редкая и может прерываться (см. рис. 3-36).

При ТЭМ такие плотные контакты выглядят не как протяженные участки слияния мембран, а как очень ограниченные, точечные связи между мембранами соседних эндотелиальных клеток (ЭК), разделенные значительными расстояниями (стрелки). Иногда эти связи могут быть вообще единичными, т.е. сформированными одним гребешком. Чаще такие плотные контакты локализуются ближе к апикальной (обращенной к просвету капилляра - ПР) зоне межклеточной щели.

БП - базальная пластинка; ПВ - плазмолеммальные везикулы и кавеолы (см. рис. 3-53).

Проницаемость (диффузионная и гидравлическая проводимость) окклюдирующих (плотных) контактов в значительной мере зависит от густоты сети контактных гребешков, или фибрилл, которые обычно выявляются на Р-поверхности разлома мембран при использовании метода замораживания-раскалывания. На Е-поверхности выявляется сеть бороздок, комплементарных гребешкам слияния. Эта сеть бороздок полностью повторяет конфигурацию сети фибрилл на другой поверхности. В плотных контактах большинства эпителиев и в эндотелиальных соединениях капилляров центральной нервной системы контактная сеть обычно обширная, густая и сформирована множеством анастомозирующих гребешков (бороздок). Поскольку адгезионные белки мембран соседних клеток взаимодействуют во внеклеточном пространстве, такая организация сети существенно ограничивает транспорт ионов и малых молекул по межклеточной щели, что и обеспечивает барьерные свойства эпителиального пласта. Ионы и небольшие молекулы (сахара, аминокислоты) поступают в цитоплазму клеток посредством специализированных и регулируемых трансмембранных каналов, расположенных в апикальной плазмолемме, а затем секретируются в базолатеральные зоны межклеточной щели ниже зоны плотного контакта. Вода поступает в межклеточное пространство вследствие поддерживаемого таким образом осмотического градиента. Большинство плотных контактов хорошо проницаемы для воды.

Плотные контакты между эндотелиальными клетками кровеносных капилляров (за исключением капилляров мозга) обычно устроены менее сложно, чем замыкающие соединения других эпителиев. Сети контактных гребешков, формирующих плотный контакт, редки, и, что особенно важно, сами гребешки имеют перерывы, допускающие относительно свободное перемещение молекул по межклеточным щелям. Молекулы с массой около 40 кД и эффективным радиусом до 1,5 нм способны поступать из просвета капиллярных сосудов в окружающее интерстициальное пространство. Это имеет определенный функциональный смысл, поскольку механизм регуляции водного баланса в тканях, в соответствии с теорией Старлинга, включает изменения величин гидравлического и коллоидно-осмотического давления не только в просвете микрососудов, но и за их пределами. Концентрация таких белков, как альбумин, в плазме крови и в интерстициальном пространстве играет решающую роль. По современным представлениям об организации и функционировании плотных контактов они рассматриваются как динамичные структуры, в которых сложность сети гребешков слияния (контактных фибрилл) и, следовательно, проницаемость контакта могут регулироваться в зависимости от функциональных потребностей. Можно допустить, что в процессе такой перестройки находится одна из фибрилл, видимых на рисунке (внизу справа, стрелки). Р - Р-поверхность.

Пероксидаза из корня хрена (HRP) - это белок, фермент, который часто используется в экспериментальной работе для анализа путей перемещения небольших протеинов (до 40 кД) через стенки микрососудов. При ТЭМ электронную плотность приобретает собственно не сама HRP, а продукт реакции, который образуется при инкубации препаратов, содержащих пероксидазу, с субстратом - диаминобензидином.

На представленной иллюстрации электронно-плотный продукт реакции (ПХ) находится в просвете микрососуда (вместе с эритроцитом - ЭР), заполняет две межклеточные щели между эндотелиальными клетками (ЭК) и содержится, в гораздо меньшей концентрации, в интерстициальном пространстве (ИП) за пределами сосуда. Видно также, что два межклеточных соединения проницаемы для HRP в различной степени. Плотный контакт между ЭК₂ и ЭК₃ (стрелка) практически непроходим для пероксидазы, и ее концентрация около контакта не выше, чем на других участках интерстициального пространства. Напротив, соединение между ЭК₁ и ЭК₂ (слева) существенно более проницаемо для HRP и является основным путем перемещения белка из просвета сосуда в ткань. Такие различия в проницаемости плотных контактов нередки в сосудах капиллярного типа, и особенно в посткапиллярных венулах. Стенка этих мельчайших венозных сосудов вообще отличается более высокой проницаемостью для воды и белка, что делает посткапиллярные венулы основной мишенью для воздействия медиаторов в очаге воспаления.

Уже подчеркивалось, что плотные (замыкающие) соединения часто входят в состав контактных комплексов эпителия, отграничивающих просветы органов - кишки, желез и др. Апикальные (желчные) полюса эпителиальных клеток печени, гепатоцитов образуют стенки желчных канальцев - начальных отделов желчевыводящих путей (см. рис. 3-52). Как и в других эпителиях, плотные контакты, иногда множественные (стрелки), замыкают просвет желчного канальца, препятствуя поступлению желчи в межклеточные щели и, следовательно, в кровь, поскольку щели между латеральными поверхностями гепатоцитов сообщаются с пространством Диссе у сосудистого полюса клетки и через них - с кровью в просвете синусоидов (см. рис. 3-51). Латеральные поверхности печеночных клеток связаны коммуникационными соединениями (щелевыми контактами - ЩК, или нексусами), которые при ТЭМ выглядят как протяженные участки близкого прилежания мембран соседних клеток с очень узкой щелью между ними. Коммуникационные контакты обеспечивают метаболическую и, в возбудимых клетках, электрическую кооперацию между клетками. Они допускают прямой переход ионов и небольших, в том числе сигнальных, молекул из цитоплазмы одной клетки в соседнюю, координируя, таким образом, их совместную деятельность.

Желчь - продукт секреторной активности гепатоцитов, но образуется она лишь в просвете желчевыводящих путей. Печеночные клетки выводят в просвет желчных канальцев компоненты желчи - желчные кислоты (точнее, соли желчных кислот), холестерол и другие липиды, гликированный билирубин, ионы. В норме просвет желчного канальца имеет сложную щелевидную конфигурацию и заполнен микроворсинками (МВ). В цитоплазме у апикального полюса гепатоцитов можно видеть митохондрии (МХ), лизосомы (ЛС), аутофагосомы (АФС), липидные капли (Л) и пузырьковидные фрагменты гладкой эндоплазматической сети, в которых иногда встречаются частицы липопротеинов очень низкой плотности (головки стрелок) - белково-липидных комплексов, которые синтезируются клетками печени и используются в организме для транспорта холестерола.

Представлен криофрактографический инвариант картины, отображенный на рис. 3-38. Хорошо виден вскрытый на протяжении просвет желчного канальца, в котором находятся микроворсинки (МВ). На Р-поверхности (Р) расщепленной мембраны гепатоцита (слева вверху) вдоль просвета канальца располагается непрерывная сеть гребешков слияния (фибрилл), формирующих замыкающее соединение (стрелки). Плотный контакт изолирует на всем протяжении просвет желчного канальца (и, следовательно, его содержимое) от межклеточного пространства, образованного латеральными участками мембран печеночных клеток. На этих мембранах расположены два обширных щелевых соединения, которые при замораживании-раскалывании на Р-поверхности выглядят как кластеры плотно упакованных внутримембранных частиц (ЩК). Е - фрагмент Е-поверхности мембраны соседней клетки.

Щелевые контакты (нексусы) относятся к категории коммуникационных соединений. Их функция, как следует из названия, заключается в обеспечении прямых сообщений между цитоплазмами соседних клеток. По существу, каждый щелевой контакт - это более или менее обширный кластер каналов, которые формируются интегральными белками обеих контактирующих мембран и связывают напрямую цитоплазмы клеток. В каждой из соседних мембран образуется полуканал - коннексон, который представляет собой агрегат, состоящий из шести интегральных белков коннексинов. Коннексоны группируются в скопления (кластеры), которые при использовании метода замораживания-раскалывания выявляются как группы плотно упакованных внутримембранных частиц на Р-поверхности (Р) расщепленной мембраны. Правая половина кластера прикрыта Е-поверхностью (Е) мембраны соседней клетки. Можно видеть, что внутримембранным частицам Р-поверхности соответствуют комплементарные ямки Е-поверхности. Идентичный кластер полуканалов формируется на мембране соседней клетки, и при сближении мембран полуканалы благодаря адгезионным свойствам белков устанавливаются точно напротив друг друга, образуя, таким образом, группу полных каналов, связывающих цитоплазмы клеток. Просвет образующихся каналов достаточен для того, чтобы пропускать ионы и небольшие молекулы диаметром -1,5 нм. Среди этих молекул могут быть не только нутриенты (аминокислоты, сахара), но и малые сигнальные молекулы, например циклический аденозин-монофосфат (цАМФ). Благодаря этому достигается метаболическая и сигнальная кооперация клеток, что оказывается существенным фактором, организующим их совместную деятельность. В электрически возбудимых тканях (мышцы, нервная ткань) щелевые соединения рассматриваются как электрические синапсы, которые допускают перемещение ионов между клетками и, таким образом, способны напрямую, минуя синапсы химические (см. рис. 3-46), обеспечивать проведение возбуждения. Белки коннексины, формирующие полуканалы в каждой мембране, составляют довольно обширное семейство, насчитывающее около 20 изоформ. Они несколько различаются и способны комбинироваться в различных сочетаниях при образовании коннексонов. Полагают, что благодаря этим комбинациям достигаются тканевая специфичность щелевых соединений, их различная проводимость и возможность регулирования в зависимости от функциональных потребностей. Каналы щелевого контакта относятся к категории Са²⁺ -зависимых каналов - локальное повышение концентрации Ca²⁺ в непосредственном окружении коннексонов приводит к закрытию каналов и разобщению клеток.

Коммуникационные соединения многочисленны в мышце сердца, поскольку они обеспечивают здесь транспорт ионов и проведение возбуждения между соседними кардиомиоцитами. Мышца сердца, состоящая из отдельных мышечных клеток, должна сокращаться как одно целое, причем сокращения различных отделов миокарда (предсердий, желудочков) должны быть строго координированы. В масштабе всей сердечной мышцы эта координация обеспечивается деятельностью проводящей системы - иерархически организованной системы модифицированных мышечных клеток (волокон). Однако кооперативная деятельность кардиомиоцитов в каждом отделе сердца требует более тесного структурного и функционального сопряжения. Механическая интеграция сокращения мышечных клеток обеспечивается адгезионными контактами, находящимися в составе вставочных дисков (см. рис. 3-42, 3-43).

На латеральных поверхностях соседних кардиоми-оцитов формируются обширные щелевые соединения, так называемые анулярные нексусы. Благодаря спиралевидной структуре анулярных нексусов площадь мембран, занятая щелевым соединением, существенно увеличивается без явного увеличения площади латеральной поверхности. Анализ выделенных кольцевых нексусов миокарда in vitro заметно продвинул наше понимание состава и молекулярно-биологической организации коммуникационных контактов вообще. Ультраструктура анулярных нексусов типична для щелевых соединений. При ТЭМ видно, что мембраны соседних клеток в области контакта приближены настолько, что между ними остается лишь узкая (2-3 нм) щель, которая при обработке солями тяжелых металлов выглядит заполненной электронно-плотным материалом (стрелки). Фактически эта щель и материал, содержащийся в ней, представляют собой узкое извитое пространство между внемембранными сегментами сопряженных коннексинов двух соседних мембран и сами внеклеточные домены коннексинов.

Мышца сердца (миокард) образована отдельными мышечными клетками, которые, как и мышечные волокна скелетных мышц, имеют типичную поперечную исчерченность миофибрилл и сарко-мерную организацию (см. гл. 5). Форма мышечных клеток сердца, кардиомиоцитов, не очень правильная. Они имеют достаточно выраженные толстые отростки, которые соприкасаются друг с другом. В отличие от длинного скелетного мышечного волокна кардиомиоциты возбуждаются и сокращаются как отдельные сущности. Для достижения координированного и сочетанного сокращения между кардиомиоцитами формируются специальные контактные комплексы - вставочные диски. Вставочные диски локализуются у торцов мышечных клеток, в зоне прилежания отростков. Во вставочном диске различают поперечный отдел, связывающий торцевые поверхности клеток (1), и продольный отдел - зону прилежания боковых поверхностей отростков кардиомиоцитов (2). Поперечный отдел вставочного диска образован преимущественно контактами адгезионного типа - адгезионными фасциями (fasciae adhaerentes) и десмосомами (maculae adhaerentes), которые чередуются. В отличие от zonulae adhaerentes в эпителии (см. рис. 3-31), связывающих контактирующие клетки по всей их окружности, фасции адгезии (ФА) в миокарде короткие, не сплошные и представляют собой ленты (fascia), чередующиеся с десмосомами (см. рис. 3-43). Как и адгезионные пояски в эпителии, фасции со стороны цитоплазмы клеток подкреплены плотными цитоплазматическими пластинками (ЦП), в которые с обеих сторон контакта вплетаются параллельно ориентированные актиновые филаменты (АФ) миофибрилл - сократительных органелл мышечных клеток. Таким образом, адгезионные контакты выступают как своеобразные точки фиксации для сократительных структур двух соседних клеток, объединяющие их усилия при сокращении. Десмосомы (Д) связывают клеточные мембраны кардиомиоцитов между миофибриллами и подкрепляются промежуточными филаментами (более подробное описание - см. рис. 3-44, 3-45). Они обеспечивают механическое сцепление сокращающихся клеток.

В продольных отделах вставочного диска между латеральными поверхностями отростков кардиомиоцитов располагаются преимущественно коммуникационные соединения - нексусы, или щелевые контакты (ЩК). Их задачей является сопряжение электрического возбуждения мембран контактирующих клеток.

Мы уже имели возможность убедиться в том, что тангенциальные сечения, проходящие вдоль плоскости исследуемых структур или параллельно ей, могут быть дополнительным источником информации, особенно в том, что касается 3-мерной организации клеток. На продольном срезе (см. рис. 3-42) было видно, что в целом вставочный диск имеет вид зубчатой или, скорее, ступенчатой линии, в которой поперечные отрезки чередуются с продольными.

На представленной иллюстрации плоскость среза прошла почти параллельно поперечному отделу вставочного диска. Можно видеть, что граница между соседними мышечными клетками извитая, и на всем протяжении контактирующие мембраны связаны чередой фасций адгезии (ФА) и десмосом (Д). Цитоплазматическое уплотнение (пластинка) десмосом более четкое и электронноплотное, но у адгезионных фасций оно занимает большую площадь. Хотя картина не дает полной уверенности, но можно предполагать, что адгезионные ленты и десмосомы чередуются с регулярной последовательностью. В целом такая организация зоны слипания торцевых отделов двух соседних кардиомиоцитов должна обладать очень высокой механической прочностью. При сокращении кардиомиоцитов вставочные диски, играющие роль своеобразных точек фиксации, диффузно распределенных в миокарде, интегрируют усилия, которые развивают отдельные мышечные клетки. Следует учесть также, что многочисленные щелевые соединения, или нексусы (вверху справа - два фрагмента нексуса - Н), которые также входят в состав вставочных дисков, координируют возбуждение (и, следовательно, сокращение) кардиомиоцитов. Таким образом, благодаря вставочным дискам совокупность кардиомиоцитов превращается в мышцу сердца.

Десмосомы (Д), которые часто входят в состав контактных комплексов эпителиев и миокарда, могут формировать и самостоятельные контактные зоны или изолированные соединения. Они многочисленны на тех участках ткани, которые подвержены механическим деформациям, особенно сдвиговым усилиям или растяжению (на боковых поверхностях эпителия кишки и экзокринных желез, между клетками эпидермиса кожи, в миокарде и др.). Десмосомы (пятна адгезии - maculae adhaerentes) - это локальные адгезионные соединения, которые связаны с инертным компонентом цитоскелета - промежуточными филаментами (см. гл. 5).

Подобно заклепкам, они связывают базолатеральные поверхности клеток эпителия, укрепляя интердигитации (см. рис. 3-30), располагаются у концов клеточных отростков в эпидермисе или входят в состав вставочных дисков в миокарде. Промежуточные филаменты цитоплазмы (стрелки) вплетаются в виде петель в цитоплазматические уплотнения - десмосомные пластинки (ДП) и связывают между собой соседние десмосомы. В образовании десмосом принимают участие адгезионные белки семейства кадгеринов и ряд вспомогательных белков, входящих в состав внутриклеточного уплотнения (см. рис. 3-45).

При высоком разрешении показана структура десмосомы - локального адгезионного соединения (macula adhaerens). Хорошо видны две соседние клеточные мембраны (стрелки), которые в области десмосомы обычно сближаются так, что расстояние между наружными листками мембран составляет 12-15 нм. В межмембранном пространстве выявляется межклеточное десмосомное уплотнение, имеющее обычно вид застежкимолнии. Электронно-плотный материал в межмембранном пространстве воспроизводит видимый результат взаимодействия двух групп адгезионных белков - десмоглеинов и десмоколлинов. Эти белки, принадлежащие обширному семейству кадгеринов, как и прочие адгезионные белки, являются интегральными протеинами. Их внеклеточные домены взаимодействуют с аналогичными партнерами соседней мембраны, а цитоплазматические сегменты связываются со вспомогательными белками внутриклеточного уплотнения или десмосомной пластинки (ДП) - плакоглобином и плакофилином (от англ. plaque - пластинка, уплотнение). Последние через белок десмоплакин связаны с промежуточными, в данном случае кератиновыми, филаментами цитоплазмы (КФ). Промежуточные филаменты не заканчиваются во внутриклеточном уплотнении, но, закрепляясь в нем в виде петли, возвращаются обратно в цитоплазму.

Промежуточные филаменты, в отличие от актиновых филаментов и микротрубочек (см. гл. 5), являются относительно инертным компонентом цитоскелета (они, собственно, и есть скелет клетки). Следовательно, и десмосомы, благодаря стабильным белкам адгезии и связи их с промежуточными филаментами, представляют собой простые механические соединения клеточных мембран. В отличие от протяженных адгезионных контактов (fasciae adhaerentes, zonulae adhaerentes) десмосомы практически не принимают участия в морфогенезе эпителиальных структур.

Синапсы - это специализированные межклеточные соединения, которые формируются между нервными клетками или между окончаниями нейронов и иннервируемым субстратом (мышцами, реже - эпителиальными клетками). Различают две основные категории синапсов. Так называемые электрические синапсы есть не что иное, как подробно описанные ранее щелевые соединения, или нексусы. Химические, или везикулярные, синапсы, подобные представленному на иллюстрации, осуществляют передачу сигнала за счет высвобождения химического вещества - нейротрансмиттера (медиатора) из нервного окончания (пресинаптической части - ПЧ) в синаптическую щель (СЩ). Последующая деполяризация постсинаптической мембраны (ПМ) происходит с помощью расположенных на ней рецепторов к нейротрансмиттеру и ассоциированных с рецепторами ионных каналов. Химические синапсы - это небольшие по площади, достаточно стабильные и фиксированные в пространстве структуры, которые могут, однако, возникать, трансформироваться или исчезать при изменении функциональной активности (например, при обучении).

Нейротрансмиттер высвобождается в синаптическую щель из синаптических пузырьков, или везикул (СВ), посредством механизма экзоцитоза. Везикулы могут быть разных размера, формы и плотности, что зависит, как полагают, от химической природы содержащегося в них нейротрансмиттера. Видимые небольшие округлые прозрачные пузырьки характерны обычно для ацетилхолиновых или, скорее, глутаматных синапсов, которых много в коре головного мозга. Молекулярные «машины», осуществляющие экзоцитоз синаптических везикул через пресинаптическую мембрану, включают обширный комплекс белков, которые образуют так называемое пресинаптическое уплотнение, часто имеющее вид гексагональной решетки (стрелки). Полагают также, что в дозированном (квантами) высвобождении медиатора участвуют также материал синаптической щели и через него комплекс белков, образующих постсинаптическое уплотнение (ПУ) на внутренней поверхности постсинаптической мембраны. Важная роль в регуляции перемещения везикул из так называемого резервного пула (РП) в активную зону синапса принадлежит также компонентам цитоскелета - микротрубочкам, и особенно актиновым филаментам.

Матрикс, заполняющий пространство синаптической щели, удерживает попавший сюда нейротрансмиттер достаточно долго и в высокой концентрации, достаточной для того, чтобы сигнальные молекулы успели связаться со специфическими рецепторами постсинаптической мембраны. Химические синапсы представляют собой, по существу, регулируемые разрывы в сложных нейронных сетях, составленных из дискретных единиц. Если учесть также, что число синапсов на одной нервной клетке может быть чрезвычайно велико (до нескольких сотен тысяч), то функциональная сложность нейронных сетей мозга просто выходит за рамки представления.

Нервномышечное соединение (синоним - двигательная концевая пластинка) образуется между эфферентным окончанием аксонов двигательных нейронов и скелетным исчерченным (поперечнополосатым) мышечным волокном. Этот синапс представляет собой овальное тельце (40-60 мкм) и располагается, как правило, на середине длины каждого мышечного волокна. Перед формированием соединения аксон (А) теряет миелиновую оболочку и образует несколько расширений, которые погружаются в «карманы», образованные сарколеммой мышечного волокна, вплотную к базальной мембране сарколеммы (БМ). В этих расширениях («луковицах») можно видеть синаптические везикулы (СВ), округлые или плоские, и множество митохондрий (МХ). Везикулы содержат нейротрасмиттер ацетилхолин. В зоне прилежания нервного окончания сарколлема мышечного волокна образует многочисленные параллельные, часто ветвящиеся и анастомозирующие, контактные складки (КС), между которыми сохраняются узкие (20-50 нм) пространства, синаптические щели (СЩ), содержащие материал базальной мембраны. Саркоплазма в области прилежания нервного окончания лишена миофибрилл (МФ) и называется подошвенной пластинкой (ПП). Возбуждение, которое генерируется в сарколемме под влиянием освобождающегося в синаптические щели ацетилхолина, распространяется по системе Т-трубочек и достигает области триады, где инициируется мышечное сокращение (см. гл. 5, рис. 5-8). Фермент ацетилхолинэстераза, связанный с сарколеммой, нейтрализует ацетилхолин, восстанавливая, таким образом, способность к восприятию новой порции нейротрансмиттера.

Фенестрированный эндотелий капилляров почки, продемонстрированный ранее (см. рис. 3-22, 3-23), уникален тем, что его многочисленные фенестры открыты, т.е. не ограничены диафрагмами. Его можно отнести, скорее, к перфорированному эндотелию. Перфорации обеспечивают прямой доступ из просвета клубочковых капилляров почки к другим компонентам фильтрационного барьера (базальной мембране, щелевым диафрагмам подоцитов). В эндотелии большинства капилляров с эндотелием так называемого висцерального типа (капилляры кишки, экзокринных и эндокринных желез, а также капилляры, кровоснабжающие тубулярные отделы нефрона почки) трансэндотелиальные окошки перекрыты тонкими монослойными диафрагмами (стрелки). Можно видеть, что эти диафрагмы отличаются от клеточной мембраны, хотя и являются ее производными. Они представляют собой монослой, основу которого составляют липиды, и инкрустированы белковыми глобулами. Детали строения и состав диафрагм пока не очень ясны, хотя на поперечных срезах эндотелия, и особенно на тангенциальных срезах, видно, что в центре диафрагмы располагается утолщение - центральный узелок, от которого, подобно спицам в колесе, отходят восемь фибрилл. Более детальная препаровка образцов показала, что эти фибриллы участвуют в формировании узких (диаметром ~5 нм) каналов, связывающих просвет капилляра (ПР) с окружением. В целом октогональная радиальная симметрия диафрагм фенестр напоминает симметрию комплекса ядерной поры - сложной конструкции, которая способна пропускать даже крупные молекулы и молекулярные комплексы (см. гл. 4). Действительно, использование электронно-плотных маркеров показывает, что капилляры с фенестрированным эндотелием проницаемы для большинства малых и средних белков плазмы крови. Висцеральный эндотелий имеет вполне выраженную базальную пластинку (БП), которая, в отличие от базальной мембраны капилляров клубочка почки, не создает серьезного препятствия для транспортируемых веществ.

Рисунок еще раз подтверждает, что тангенциальные срезы, проходящие по касательной или параллельно плоскости изучаемых структур, могут быть весьма информативными. В данном случае срез прошел почти точно на уровне плоскости диафрагм некоторых фенестр в эндотелии капилляра поджелудочной железы. Эти капилляры, как и аналогичные микрососуды других экзокринных и эндокринных желез, сформированы из фенестрированных эндотелиальных клеток. На срезе хорошо видны центральные утолщения и радиально ориентированные тяжи - фибриллы (стрелки). Возможно, что эта радиальная симметрия, определяющая, по-видимому, транспортные свойства фенестр, влияет и на их геометрически правильную форму, и на достаточно стандартный размер (диаметр фенестр составляет обычно 70-80 нм).

Мембраны эндотелиальной клетки расщепились таким образом, что на сколе выявляются обе криофрактографические поверхности: Р-поверхность (Р), на которой фенестры видны как правильные циркулярные возвышения, отграниченные внутримембранными частицами, и два фрагмента Е-поверхности (Е), принадлежащие внешнему листку клеточной мембраны. Фенестры здесь выглядят как неглубокие кратеры с плоским или слегка выпуклым дном. Хорошо видно, что фенестры однородны по форме и размеру и сгруппированы в обширные кластеры, разделенные полосками цитоплазмы, лишенной фенестр.

Число фенестр в истонченном эндотелии висцеральных капилляров варьирует в зависимости от функционального состояния органа. Например, в капиллярах слизистой оболочки тонкой кишки (см. рис. 3-15) в фазу активной абсорбции на высоте пищеварения их нумерическая плотность может возрастать в 1,5-2,0 раза. Общая площадь кластеров фенестр в активно работающих висцеральных капиллярах достигает 30-40% всей эндотелиальной поверхности.

ПР - просвет капилляра; ЭП - базальный отдел эпителия проксимального извитого канальца почки (см. рис. 3-17).

Другая категория кровеносных капилляров, характерных для некоторых внутренних органов (костный мозг, селезенка, печень, лимфоидные органы, некоторые эндокринные железы), - это капилляры синусоидного типа или просто синусоиды. От других капилляров они отличаются существенно большей величиной просвета (>30-40 мкм) и, что более важно, особенностями строения эндотелия, которые позволяют обеспечить практически свободное сообщение между кровью и окружающим тканевым пространством. Вследствие большого диаметра синусоидов кровоток в них замедлен, что также способствует обмену с тканями. Синусоиды печени многочисленны и достаточно широки, так что общий объем, занимаемый циркулирующей кровью, вполне соизмерим с объемом, который приходится на паренхиматозные элементы печени - гепатоциты (ГЦ). Большие, не прикрытые диафрагмами отверстия (поры) в истонченном эндотелии (стрелки) связывают просвет синусоида (ПР) с пространством Диссе (ПД) - перисинусоидным пространством, которое существует между эндотелием и поверхностью печеночных клеток. Эта поверхность формирует микроворсинки (МВ), существенно увеличивающие ее площадь.

Таким образом, поверхность гепатоцитов, обращенная к синусоиду, представляет собой сосудистый полюс (или домен) печеночных клеток. Апикальный, или желчный, полюс участвует в образовании желчных канальцев (см. рис. 3-38, 3-39, 3-52).

Если принять во внимание многообразные функции печени в качестве экзо- и эндокринной железы и органа детоксификации, можно заключить, что оба полюса гепатоцитов являются секреторными. Сосудистый полюс используется для поглощения из плазмы крови различных нутриентов и возможных токсических продуктов, в том числе билирубина, и в такой же мере - для секреции в кровь синтезированных гепатоцитами белков и липидов (альбумина, факторов свертывания крови, липопротеинов, некоторых гормонов). Широкие поры в эндотелии обеспечивают этот интенсивный обмен, и фактически состав содержимого перисинусоидного пространства Диссе мало отличается от состава плазмы крови. В сосудистом домене гепатоцитов можно видеть многочисленные митохондрии (МХ), цистерны гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), гранулы гликогена. Детоксифицирующая функция печени связана с одним из необычных свойств стенки синусоидов - наличием в ее составе звездчатых макрофагов, более известных как клетки Купфера (КК). Эти отростчатые клетки встроены в эндотелиальную выстилку синусоидов, частично прилежат к люминальной поверхности эндотелия и связаны с ним простыми адгезионными контактами (см. рис. 3-29). Строение купферовских клеток типично для строения макрофагов - в цитоплазме находятся лизосомы (Л), различные модификации фаголизосом (ФЛС), транспортные везикулы и другие органеллы.

СЭМ позволяет анализировать не только поверхностно расположенные структуры, но и их взаимоотношения в глубжележащих отделах органов. При подготовке образца, фрагмент которого представлен на рисунке, кусочек лиофилизированной (высушенной в условиях вакуума) ткани печени разламывали и анализировали структуры, обнажившиеся при разломе.

На рисунке видны просветы трех синусоидных капилляров (один из них содержит эритроцит - ЭР), которые открываются в центральную вену (ЦВ) дольки печени. В эндотелиальной выстилке другого синусоида видны перфорации различных форм и размеров (стрелки). Сразу под эндотелием определяются микроворсинки (МВ), расположенные в пространстве Диссе.

Внизу - вскрытый просвет желчного канальца (ЖК), который формируется между двумя тяжами гепатоцитов (ГЦ). Желчный каналец не имеет собственной стенки, и его просвет ограничен плазмолеммами печеночных клеток. Вследствие обезвоживания образца при подготовке его к СЭМ желчный каналец представляется более широким и свободным, чем это можно видеть, например, при ТЭМ (см. рис. 3-38).

Эндотелиальные клетки так называемых соматических капилляров, или капилляров с непрерывным эндотелием, не образуют фенестр, пор или каких-либо иных перфораций в цитоплазме. Они типичны для мышечной, соединительной и нервной (включая, головной и спинной мозг) ткани, для легких и сердца.

Общим (но не исключительным) признаком соматических эндотелиальных клеток является обилие мембранных пузырьков (везикул - В) в цитоплазме и кавеол (К) - инвагинаций плазмолеммы, из которых, по-видимому, и формируются цитоплазматические везикулы. Полагают, что эти везикулы в качестве дискретных контейнеров участвуют в двустороннем переносе веществ между плазмой крови и интерстициальным пространством наряду с межклеточными контактами (см. рис. 3-54). Кавеолы, формирующиеся на люминальной (обращенной к просвету капилляра - ПР) или аблюминальной поверхности эндотелия, могут быть открытыми или прикрытыми диафрагмами, подобными диафрагмам фенестр (см. рис. 3-47). Пока неясно, являются эти формы кавеол последовательными фазами развития или представляют собой две независимые субпопуляции.

Базальная пластинка (БП) в капиллярах соматического типа обычно хорошо выражена. ЭР - эритроцит в просвете капилляра; ФБ - фрагмент фибробласта.

Пероксидаза хрена (HRP) - небольшой белок, который часто используется для анализа путей транспорта через эндотелий (см. рис. 3-37 и гл. 2). Видно, что электронно-плотный продукт реакции заполняет просвет капилляра (ПР), одну из люминальных кавеол (стрелка) и обнаруживается в везикулах, которые кажутся свободно расположенными в цитоплазме. Аблюминальные везикулы, открывающиеся в интерстициальное (внеклеточное) пространство (ИП) уже не содержат HRP вследствие того, что интервал времени с момента инъекции фермента в кровь до фиксации ткани (2 мин) был невелик. Считается, что везикулы, образующиеся из кавеол на одной из поверхностей эндотелиальной клетки, захватывают при этом часть внеклеточного содержимого (эндоцитоз). Затем они перемещаются через цитоплазму и открываются на другой поверхности, высвобождая содержимое во внеклеточное пространство (экзоцитоз). Такой процесс получил название трансцитоза. Помимо трансэндотелиального обмена в капиллярах трансцитоз используется в несколько модифицированной форме некоторыми эпителиальными клетками для переноса секреторных иммуноглобулинов (IgA) из интерстициального пространства лимфоидной ткани в просвет кишки, выводные протоки слюнных и молочных желез, канальцев яичка и др.

Под влиянием некоторых медиаторов воспаления, увеличивающих проницаемость стенки микрососудов (гистамин, брадикинин), везикулярный механизм переноса активируется настолько, что это дает основание некоторым исследователям говорить о существовании везикулярно-вакуолярной системы в эндотелиальных клетках, особенно в эндотелии небольших венул.

Результаты изучения эндотелия с помощью метода замораживания-раскалывания, а также реконструкций, полученных на основе очень тонких срезов (12-14 нм), свидетельствуют о том, что свободных (цитоплазматических) везикул в эндотелиальных клетках, по-видимому, не так уж и много, если они вообще существуют. Большая часть везикулярных профилей, видимых на обычных срезах как «свободные» везикулы, так или иначе связаны с кавеолами (стрелки) и, возможно, представляют собой фрагменты везикулярных цепочек (кластеров), подобных представленной на рис. 3-57. Если это так, то механизм везикулярного переноса через эндотелий (и аналогичные механизмы в других эпителиях) можно представить как временное образование пузырька-переносчика на вершине кластера у одной поверхности клетки и очень быстрое его слияние с кластером у другой поверхности. Таким образом может формироваться непрерывный трансэндотелиальный «везикулярный канал» или, что тоже вероятно, кратковременная «квазинепрерывная» связь двух поверхностей эндотелиальной клетки.

ПР - просвет капилляра; ИП - интерстициальное пространство; Я - Р-поверхность одной из расщепленных мембран ядерной оболочки.

Обычно в нормальных условиях или в очаге воспаления клетки крови мигрируют в ткань через межклеточные щели эндотелия, используя высокопроницаемые модификации плотных контактов (см. рис. 3-36) или нарушая их целостность. Возможно, единственным исключением является перенос лимфоцитов в лимфоидной ткани некоторых иммунокомпетентных органов (лимфатических узлах, пейеровых бляшках), в так называемых венулах с высоким эндотелием (ВВЭ). Действительно, эндотелий этих своеобразных сосудов (ЭК) напоминает, скорее, кубический эпителий, чем обычный плоский эндотелий. Он адаптирован к переносу довольно крупных клеток через цитоплазму, без нарушения целостности плотных соединений. Сохранение довольно жесткого гематотканевого барьера, основным компонентом которого являются окклюдирующие контакты, - одно из условий нормального функционирования лимфоидной ткани. Обращает на себя внимание тот факт, что в развитой цитоплазме эндотелиальных клеток ВВЭ отсутствуют плазмолеммальные везикулы, которые могли бы переносить в ткань белки (антигены), нарушая тем самым специфические и строго контролируемые условия, в которых происходят развитие и дифференцирование лимфоцитов.

Механизм транспорта лимфоцитов (ЛЦ) через цитоплазму эндотелиальных клеток в чем-то напоминает механизм фагоцитоза (см. рис. 3-61). Иммунокомпетентные клетки, Т- и В-лимфоциты достаточно точно узнают конкретный лимфоидный орган, в который они должны попасть, например лимфатический узел или пейерову бляшку. Это явление, известное как homing (нахождение дома), основано на адресной доставке клеток в соответствующий район. Молекулярные «машины», ответственные за это узнавание и последующий перенос лимфоцитов, довольно сложны и работают последовательно, обеспечивая рецепторзависимое прикрепление лимфоцитов к эпителиальной поверхности и их последующее перемещение через эндотелиальный пласт. Адгезия клеток к эндотелию индуцирует, очевидно, сигнал для формирования большой транспортной вакуоли, которая погружается в цитоплазму (эндоцитоз). При приближении к базальной или базолатеральной поверхности эндотелиальной клетки мембрана вакуоли сливается с плазмолеммой и клетки мигрируют в ткань (экзоцитоз). Возможные сообщения полости вакуоли с межклеточной щелью могут наблюдаться выше или ниже зоны плотного контакта (стрелки). Таким образом удается обойти плотные соединения, не нарушая целостности гематотканевого барьера.

Мы видели, что в эндотелиальных клетках капиллярных сосудов кавеолы, формирующиеся на клеточных поверхностях, участвуют в переносе веществ через эндотелий. В других клетках их задачи могут быть иными. Предполагается, что в гладких миоцитах относительно стабильные кавеолы (КВ), нередко формирующие грозди или цепочки сообщающихся пузырьков, выполняют функцию, аналогичную функции тубулярной системы (Т-системы) в исчерченных мышцах, т.е. проводят возбуждение по мембране клетки в более глубокие зоны цитоплазмы.

Более динамичные кавеолы в других клетках участвуют в эндоцитозе, погружая (интернализуя) в цитоплазму кванты окружающей среды. По составу и функционально мембрана кавеол отличается от остальной плазмолеммы. Она богата холестеролом и гликосфинголипидами. Цитоплазматическая поверхность кавеол покрыта белком кавеолином, который связывает холестерол и стабилизирует форму кавеолы. Кроме того, в мембране кавеол обнаружено несколько десятков различных рецепторов и сигнальных молекул. Предполагается даже, что кавеолы являются своеобразными центрами или платформами сигнальной активности клеток. Кавеолы связаны с динамином - небольшой гуанозинтрифосфатазой, которая рекрутирует из цитоплазмы актин для формирования перетяжки, отделяющей кавеолу от плазмолеммы и превращающей ее в транспортный пузырек - кавеосому. С мембраной кавеол ассоциированы также молекулярные «машины» слияния мембран, в частности SNARs (см. гл. 4).

Клатриннезависимый эндоцитоз связан с формированием в мембране клетки липидных островков - рафтов. Это динамичные, устойчивые к детергентам области плазмолеммы богаты холестеролом, гликосфинголипидами, белками, прикрепленными к гликозилфосфатидилинозитолу и некоторыми другими белками. Возможно, существуют разные типы рафтов, распределенных в плазмолемме. Предполагают, что их роль заключается в селективном отборе особенных компонентов мембраны (белков, липидов) для поддержания различий мембранных доменов, например апикальной и базолатеральной поверхности в эпителиальных клетках или полярности в мигрирующих клетках.

Один из важных путей поглощения веществ клеткой связан с функционированием так называемого клатринзависимого эндоцитоза. Этот механизм поглощения (интернализации) включает формирование на цитоплазматической поверхности плазмолеммы регулярной каймы, или опушки, (coat) из специального белка клатрина (КЛ). В получающейся клатриновой ямке концентрируются рецепторы для различных веществ-лигандов. Этот путь называют также рецепторопосредованным эндоцитозом, что не совсем точно, поскольку, по-видимому, все виды эндоцитоза связаны с рецептор-лигандными взаимодействиями. Посредством клатринзависимого эндоцитоза клетки получают необходимые питательные вещества (например, липопротеины очень низкой плотности, переносящие холестерол, или железо в комплексе с транспортирующим белком трансферрином), регулируют содержание рецепторов, каналов и других специальных белков в мембране, поглощают антигены для их последующей переработки и удаляют из внеклеточной среды старые и потенциально вредные вещества. Благодаря быстрой сборке клатриновой каймы при участии белков-адапторов и вследствие гексагональной упаковки своеобразных молекул КЛ (трискелионов) клатриновая ямка деформируется и формируется округлая структура - везикула. (Чтобы обеспечить правильную сборку каймы, на сферической поверхности среди клатриновых гексагонов встраиваются также пентагоны и гептагоны.) Везикула отделяется от плазмолеммы, вскоре теряет свою клатриновую кайму (см. рис. 3-1) и поступает в компартмент ранних эндосом. Таким образом, клатриновая кайма, как полагают, необходима для концентрирования рецепторов и лигандов на ограниченном участке клеточной мембраны, а также для ее деформации в процессе формирования везикулы. Окаймленные клатрином везикулы участвуют также в переносе ферментов и мембранных белков от комплекса Гольджи к лизосомам. ПР - просвет капилляра.

Эндосомы - это система мембранных пузырьков, небольших вакуолей и трубочек, которая участвует в сортировке, переработке и внутриклеточном транспорте материала, поглощенного эндоцитозом, и, как теперь уже становится очевидным, в процессах экзоцитоза. Различают компартмент ранних эндосом, расположенных в цитоплазме ближе к клеточной поверхности, и компартмент поздних эндосом/лизосом, локализующихся в околоядерной зоне (около клеточного центра и комплекса Гольджи) (см. рис. 3-60). Ранние эндосомы, в свою очередь, можно подразделить на сортирующие и рециклирующие эндосомы (везикулы), которые возвращают некоторые поглощенные компоненты клеточной мембраны (рецепторы, липидные рафты) к плазмолемме.

В сортирующих эндосомах содержимое несколько закислено (рН ~6), и в зависимости от характера поглощенного материала в них происходят отщепление лигандов от рецепторов, частичная переработка веществ, подлежащих последующей деградации в компартменте поздних эндосом/ лизосом, расщепление чужеродных белков-антигенов для связывания образующихся эпитопов с антигенпредставляющими белками класса MHC-II, упаковка материала в транспортирующие везикулы и т.д.

Одна из важных функций ранних эндосом - интернализация рецепторов и расщепление рецепторлигандных комплексов с последующим возвратом освобожденных рецепторов к плазмолемме. Такое рециклирование рецепторов является частью механизма регуляции их экспрессии на клеточной поверхности. От некоторых рецепторов, например от рецептора белка трансферрина, переносящего железо, отщепляется лишь железо, а комплекс рецептор-трансферрин возвращается к плазмолемме. Рецепторы, подлежащие возврату, концентрируются в тубулярных сегментах сортирующих эндосом (рис. 3-59 б; стрелки). Эндосомы - весьма динамичные структуры, которые способны трансформироваться в ответ на сигналы, связанные с эндоцитозом. Другой путь, помимо плазмолеммы, ориентирован к компартменту поздних эндосом/лизосом для деградации поглощенного материала с помощью ферментов лизосом. В последние годы внимание исследователей привлекает и 3-е направление - связь эндосом с комплексом Гольджи (см. гл. 4), поскольку посредством эндосом, ассоциированных с транс -Гольджи-сетью, возможно поступление в клетку некоторых токсинов (токсина холеры, токсина Шига и др.). Эндогенные белки и липиды (например, трансмембранный протеин TGN38/46 и сфингомиелин) также могут следовать этим путем.

Возможно, что процессы эндоцитоза наиболее демонстративно представлены в макрофагах, одной из важнейших функций которых, помимо деградации поглощенного материала, является представление антигенов иммунокомпетентным клеткам. В течение 1 ч макрофаг может интернализовать, благодаря постоянному и рецепторзависимому эндоцитозу, площадь мембран, которая примерно равна общей площади плазмолеммы. Понятно, что для поддержания формы и размера клетки необходимы постоянная рециркуляция мембранных фрагментов, их возврат к клеточной поверхности посредством экзоцитоза (секреции).

Так называемые млечные пятна серозных оболочек (брюшины, плевры) представляют собой небольшие островки лимфоидной ткани, включающие лимфоциты, макрофаги, плазматические и другие клетки. В совокупности они образуют диффузно распределенный периферический орган иммунной системы. В цитоплазме представленного на рисунке макрофага обращает на себя внимание развитая система мембранных мешочков, трубочек и пузырьков. Часть этих структур относится к аппарату синтеза и секреции: эндоплазматическая сеть (ЭС), комплекс Гольджи (КГ), множество транспортных везикул. Другие полиморфные образования обеспечивают процессы эндоцитоза. Среди последних следует отметить компартмент ранних эндосом (РЭ), и связанных с ним транспортных везикул, которые располагаются у клеточной поверхности. В составе этой группы структур видны и везикулы, покрытые клатрином (стрелки). Некоторые эндосомы близки к стопкам мешочков КГ. Топография поздних эндосом менее определенная, хотя известно, что они пространственно и функционально тесно связаны с лизосомами (Л), группа которых доминирует в правой части клетки.

Обилие разнообразных мембранных структур, очевидное даже при простом взгляде на подобную картину, свидетельствует о том, что в клетке существует развитая система внутриклеточного транспорта веществ и что этот транспорт реализуется посредством мембранных переносчиков. Эта система обеспечивает перенос веществ между мембранными компартментами клетки, их выведение наружу (экзоцитоз) и поглощение в цитоплазму (эндоцитоз). Можно полагать также, что процессы экзоцитоза и эндоцитоза, тесно связанные структурно и функционально, должны иметь и некоторые общие (или единые) пункты регуляции. Современные представления о механизмах внутриклеточного транспорта акцентируют внимание на КГ как центральной органелле, определяющей общую стратегию внутриклеточного массопереноса. Я - ядро; МХ - митохондрии.

Фагоцитоз - это специальная частная форма эндоцитоза, посредством которого поглощаются сравнительно крупные (до нескольких микрометров) частицы - микробные тела, погибшие и разрушенные клетки, инертные материалы, такие как соли кремния, углерод и др. Путь фагоцитоза замыкается на компартмент лизосом, часто минуя иные мембранные структуры. Кроме того, фагоцитоз материала клетками - «профессиональными» фагоцитами (макрофагами, нейтрофилами) - это рецепторзависимый и регулируемый процесс. Контакт фагоцита с материалом, подлежащим поглощению, через систему передачи сигнала активирует цитоскелет клетки, что ведет к образованию протяженных отростков, ворсин и складок клеточной поверхности (стрелки). Видно, что эти отростки макрофага (МФ) обволакивают клеточный детрит (Д) (в том числе и остатки мембранных структур). Поглощению фагоцитами микробных тел часто предшествует их опсонизация - адсорбция на поверхности специальных факторов (комплексов антиген-антитело, белков системы комплемента), которые узнаются рецепторами фагоцита и инициируют поглощение.

В последующем поглощенный материал замыкается в фагосому - сравнительно крупную вакуоль, мембрана которой часто сливается с мембранами эндосом. Фагосома некоторое время созревает и сливается с первичными лизосомами - транспортными пузырьками, которые переносят гидролитические ферменты и устойчивые к перевариванию мембраны от комплекса Гольджи. Так формируется фаголизосома, в которой, собственно, и происходит деградация поглощенного материала. Первичные лизосомы содержат до 40 различных гидролаз, а в их мембраны встроены протонные насосы, которые закисляют содержимое фаголизосомы (оптимум рН для работы гидролаз ~5). Разнообразие лизосом в клетке, которое можно видеть в макрофаге (см. рис. 3-62), связано в основном с вторичными лизосомами (фаголизосомами).

Несмотря на то что цитоплазма макрофага оккупирована различными фаголизосомами, клетка продолжает интенсивно работать - синтезировать белки (о чем свидетельствует активное ядрышко - ЯД), поглощать новые порции материала. Клетка вполне жизнеспособна. Полиморфизм фаголизосом, который часто наблюдается в активно работающих макрофагах, отражает не только разнообразие фагоцитированного материала, но и те формы, которые он может принимать в процессе деградации. Часто можно видеть пластинчатые или кристалловидные структуры, вакуоли, содержащие аморфный материал, липидные капли (Л) и др. На определенной стадии процесса бывает уже трудно понять, что именно подвергается перевариванию, хотя известно, например, что пластинчатые миелиноподобные образования - это, скорее всего, результат деградации клеточных мембран. Процесс разрушения биологического материала гидролитическими ферментами в фаголизосомах обычно завершается образованием простых молекул - аминокислот, сахаров, липидов.

Эти вещества транспортируются через мембрану фаголизосом в цитоплазму клетки для последующего использования. Недеградируемые материалы, например частицы угля, кремний, могут сохраняться в телолизосомах (остаточных тельцах) неопределенно долго - месяцы и годы. Процесс фагоцитоза - это нормальное биологическое явление, которое имеет значение не только в таких ситуациях, как воспаление или поглощение чужеродного материала. Например, активность макрофагов сопровождает весь жизненный путь эритроцита. В костном мозге макрофаги-«няньки» регулируют созревание эритроцитов, секретируя цитокины, фагоцитируют вытолкнутые ядра (см. рис. 7-22). Макрофаги селезенки и печени поглощают и разрушают старые эритроциты, закончившие свой жизненный цикл. Во многих тканях посредством фагоцитоза элиминируются поврежденные и старые клетки, а также клетки, подвергшиеся апоптозу (см. гл. 7).

Для поглощения и разрушения материала, поступившего из внеклеточной среды, в организме существуют специализированные клеточные популяции, которые часто именуют профессиональными фагоцитами (макрофаги, нейтрофильные лейкоциты). Практически во всех клетках, однако, наблюдается феномен аутофагии - пищеварительная деградация собственных компонентов клетки, которые по тем или иным причинам уже не способны выполнять свои функции. Аутофагия также происходит с участием гидролитических ферментов лизосом, и ей подвергаются ненужные белковые агрегаты, старые или поврежденные органеллы (например, митохондрии, как на приведенном рисунке) или избыточно наработанные секреторные белки (криноаутофагия). Как и в случае фагоцитоза, для внутриклеточного переваривания необходимо формирование аутофагосомы, отграничивающей содержимое от окружающей цитоплазмы. Материал, подлежащий деградации, окружается двойными мембранами (стрелки), происходящими, вероятно, из эндоплазматической сети (ЭС). Затем аутофагосома сливается с лизосомами, приносящими ферменты, мембранные протонные насосы, поддерживающие низкий рН в полости образующейся аутофаголизосомы, и, что не менее важно, специфические гликопротеины мембран, защищающие их от повреждения гидролазами.

В процессе переваривания разрушаются не только поврежденные органеллы, но и внутренние мембраны, отграничивающие аутофаголизосому. Собственные структуры клетки расщепляются ферментами практически полностью - до простых молекул (сахаров, аминокислот и жиров), которые транспортируются в цитоплазму для реутилизации. Постоянное обновление цитоплазматических белков также требует утилизации старых или поврежденных молекул. Деградация этих белков часто осуществляется не в лизосомах, а в специальных белковых комплексах - протеасомах. Хотя молекулярная масса этих комплексов превышает 2 млн Д, протеасомы обычно неразличимы при электронной микроскопии как отдельные органеллы. Перед разрушением в протеасомах белки связываются с несколькими молекулами небольшого белка убиквитина, что служит сигналом для их деградации в протеасомах. В протеасомах убиквитин высвобождается и возвращается в цитозоль. Средняя клетка может содержать до 30 000 протеасом. В цитоплазме клетки можно видеть также сохранные митохондрии (МХ), липидную каплю (Л), крупные везикулы, окаймленные клатриновой оболочкой (КЛ), и более мелкие мембранные пузырьки. Я - фрагмент ядра клетки.

О внеклеточном матриксе уже говорилось при описании базальной пластинки и базальной мембраны, подстилающих эпителиальные пласты (см. рис. 3-19, 3-24, 3-26). Это понятие имеет, скорее, функциональный чем морфологический смысл и включает все внеклеточные структурно определенные компоненты ткани, с которыми клетки взаимодействуют, - базальные пластинки, коллагеновые и эластические волокна, основное вещество. Видны поперечные сечения эластического волокна (Э), тонких коллагеновых фибрилл, группирующихся в коллагеновые волокна (КВ), и фрагмент активного фибробласта (ФБ), в цитоплазме которого выявляются компоненты синтетического аппарата.

Типичное эластическое волокно (эластическая ткань) включает микрофибриллярный компонент (МФ), который состоит преимущественно из белков фибриллинов в комплексе с гликопротеинами, и конгломераты белка эластина, инкрустирующие микрофибриллы. Оба компонента синтезируются клетками (фибробластами, хондроцитами, гладкими миоцитами), но эластическое волокно, как и коллагеновая фибрилла (см. рис. 3-65), собирается вне клетки. Образование эластического волокна инициируется микрофибриллами, и эластин организуется на микрофибриллярной матрице. Белок эластин имеет две специфические аминокислоты (десмозин и изодесмозин), которые ответственны за образование поперечных сшивок и собственно эластические свойства - способность растягиваться и возвращаться в исходное состояние. При ТЭМ эластин обычно выявляется как достаточно плотный аморфный материал, хотя в некоторых тканях (например, в сосудистой стенке) эластическая ткань может быть менее контрастной. Специфической модификацией эластической ткани являются окситалановые волокна, образующие эластическую связку хрусталика (zonula cili-aris) или связку перидонта. Эти волокна состоят в основном из фибриллина.

Представленные на рисунке тонкие коллагеновые фибриллы относятся к категории ретикулярных волокон, образованных коллагеном III типа. Вообще известно более 25 типов коллагена, которые различаются комбинацией и составом α- и β-полипептидных цепей, формирующих молекулу коллагена. Некоторые типы коллагена являются фибриллобразующими (широко распространенный коллаген I типа, коллагены II, III, V, VII и XI типа); другие коллагены фибрилл не образуют, но могут формировать 3-мерные решетки (коллаген IV типа в базальной пластинке) или участвовать в образовании коллагеновых волокон, связывая между собой отдельные коллагеновые фибриллы (коллагены IX, XII и XIV типа).

Фибриллы коллагена являются длинными (до сотен микрометров) супрамолекулярными комплексами. В тканях они группируются, образуя коллагеновые волокна и пучки волокон. Диаметр коллагеновых фибрилл варьирует от 20-30 до 100-200 нм в зависимости от типа коллагена (состава и комбинации полипептидных цепей), степени его зрелости и условий образования. Все фибриллы организуются по одному принципу, что придает им характерную поперечную исчерченность с периодом 67 нм. Видно, что эта исчерченность - результат чередования поперечных полос различной ширины и электронной плотности. В основе ее лежит способ сборки фибриллы из отдельных молекул коллагена (тропоколлагена).

При формировании фибриллы полярные молекулы тропоколлагена укладываются параллельными рядами (голова-к-хвосту) с некоторыми промежутками (щелями). Положение щелей в соседних рядах молекул сдвинуто на определенный интервал. При обработке ткани тяжелыми металлами для целей ТЭМ (см. гл. 2) соли металлов связываются прежде всего с материалом, заполняющим щели (гликозаминогликанами и гликопротеинами, минорными коллагенами). Таким образом, области щелей оказываются более электронно-плотными, чем сами молекулы коллагена. Поскольку фибрилла коллагена представляет собой множество параллельных рядов молекул, уложенных в 3-мерном пространстве, проекции тех участков, которые содержат больше щелей, выглядят более или менее электронно-плотными. Светлые полосы соответствуют проекции участков фибриллы, на которые пришлось больше молекул тропоколлагена, чем щелей. Поскольку длина молекул и протяженность щелей между ними - величины постоянные, период, с которым чередуются однотипные полосы, также является постоянной величиной (67 нм).

Практически все процессы в клетке, связанные с осуществлением ее функций, происходят при участии белковых молекул (протеинов или пептидов). Белки специфичны в отношении выполняемых функций и биохимических реакций, в которых участвуют. Эта специфичность основана на характерной для каждого белка последовательности аминокислот - его первичной структуре. Пептидные цепочки могут быть сравнительно короткими (олигопептиды) или длинными (полипептиды).

Последовательность аминокислот в пептидной цепи белка определяет в конечном итоге его вторичную (α-спираль, β-слой) и третичную (пространственная конфигурация) структуру. При объединении нескольких полипептидов в более сложные комплексы возникает четвертичная структура. Она открывает большие возможности для аллостерической или конформационной регуляции активности всего белкового комплекса. В таких комплексах, состоящих из нескольких однородных (гомо-) или разнородных (гетеро- ) субъединиц, могут появляться локальные участки - домены с совершенно новыми свойствами. Многие ферменты, транспортные каналы, белки-регуляторы и другие активные полипептиды представляют собой такие макромолекулярные комплексы.

Аминокислотные последовательности всех белков закодированы в виде определенной последовательности нуклеотидов в генах - участках молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Каждой аминокислоте соответствует триплет нуклеотидов, и вся пептидная цепочка кодируется триплетным кодом. Совокупность всех генов составляет геном клетки, идентичный во всех соматических (не половых) клетках организма. Гены, кодирующие пептидные цепи, называются структурными генами.

Полный синтез белковой молекулы включает определенную последовательность событий. Основными этапами этого синтезирующего конвейера являются:

Посттрансляционная модификация включает такие процессы, как формирование вторичной и третичной структур, ковалентное присоединение олигосахаридных и (или) липидных фрагментов, отщепление части пептидной цепи и др.

Два первых этапа происходят в ядре эукариотической клетки, последующие - в цитоплазме [в рибосомах, цистернах гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), в комплексе Гольджи]. Цитоплазматические белки синтезируются и модифицируются на свободных рибосомах (полисомах), рассеянных в цитозоле. Синтез и модификация белков, предназначенных на экспорт, лизосомальных и всех мембранных белков осуществляются в ГЭС и в комплексе Гольджи.

Ядро

Ядро - большой клеточный компартмент, который содержит хромосомы, включающие большую часть клеточного генома, и множество молекулярных «машин», предназначенных для организации генов и их экспрессии, т.е. реализации информации. В эукариотических клетках двойные спирали ДНК, связанные с белками, упакованы в виде хромосом в нуклеоплазме (кариоплазме). В соматических клетках человека обычно 46 хромосом (23 пары, или диплоидный набор); половые клетки имеют только один (гаплоидный) набор - 23 хромосомы. Степень компактизации хромосом может различаться в зависимости от фазы клеточного цикла (она максимальная в метафазе митоза) и синтетической активности клетки. Каждая хромосома представляет собой одну двойную спираль ДНК, связанную с гистонами - белками, которые обеспечивают и регулируют уровень компактизации. Наименьшие структурные единицы упаковки - нуклеосомы, чередующиеся с линкерными (связывающими) линейными участками ДНК, образуют подобие бусин на нитке. В каждой нуклеосоме вокруг сердцевины из восьми гистоновых субъединиц двойная спираль ДНК образует 1,8 оборота. Дальнейшие уровни компактизации достигаются посредством скручивания бус в суперспираль и образования петель. Независимо от степени компактизации различные участки хромосом занимают в пространстве ядра определенное место. Совокупность всех хромосом образует хроматин. В интервале между делениями, в интерфазном ядре клетки с умеренным синтезом белка, активные (транскрибируемые) участки хромосом менее плотные и образуют эухроматин. Неактивный, более компактный гетерохроматин может трансформироваться в эухроматин при интенсификации синтеза белка или при репликации ДНК перед делением клетки. Например, при интенсивном делении клеток, когда необходим быстрый прирост клеточной массы в промежутках между делениями, большая часть гетерохроматина превращается в активный эухроматин. Некоторая часть гетерохроматина (конституциональный, или структурный, гетерохроматин) не активируется вообще.

Событием, инициирующим синтетический конвейер, является активация транскрипции соответствующего гена с помощью белков-регуляторов (факторов транскрипции), содержащихся в ядерном матриксе - нехроматиновом компоненте нуклеоплазмы. Эти белки узнают участок нити ДНК, регулирующий транскрипцию (промотор), и активируют ферменты - РНК-полимеразы, с помощью которых вдоль цепочки нуклеотидов ДНК синтезируется комплементарная цепочка РНК. РНК-полимераза I катализирует синтез преимущественно рибосомной РНК (рРНК), РНК-полимераза II - матричной РНК (мРНК) и частично так называемой lincРНК, которая осуществляет в ядре регуляторные функции, а РНК-полимераза III - транспортной РНК (тРНК). Синтез рРНК осуществляется на матрице некоторых участков хромосом (у человека 13, 14, 15, 21 и 22-я хромосомы), которые в совокупности образуют область организации ядрышка. В интерфазном хроматине эти области группируются и транскрибируются совместно.

В активном ядрышке различают аморфную часть, ядрышковый хроматин, слабо окрашенную фибриллярную и гранулярную части. Фибиллярная часть ядрышка содержит транскрибируемые участки ДНК, кодирующие рРНК, и синтезированные ядрышковые РНК; гранулярная часть является зоной, в которой собираются рибосомные субъединицы (рибонуклеопротеины). Сборка предшественников субъединиц рибосом - не единственная функция ядрышка. В последние годы обсуждается его роль в созревании тРНК, в группировании и накоплении регуляторных белков ядерного матрикса и контроле клеточного старения. Структура ядрышка есть результат процессов, связанных с транскрипцией и процессингом пре-рРНК и сборкой предшественников малых и больших субъединиц рибосом. Поэтому архитектура ядрышка зависит от функционального состояния клетки и изменяется сочетанно с изменениями общей клеточной морфологии. В активном ядрышке фибриллярные и гранулярные компоненты нередко группируются в толстую нить - нуклеолонему.

Каждый ген и соответствующий мРНК-транскрипт содержат участки, несущие информацию для последующего построения пептидной цепи - экзоны, и неинформативные участки - интроны, которые вырезаются из первичного транскрипта при его превращении в зрелую мРНК. Доля интронов (суммарная длина в общей нуклеотидной последовательности) в первичном транскрипте может во много раз превышать длину зрелой мРНК, экспортируемой в цитоплазму. Например, размер гена белка тироглобулина, который синтезируется клетками щитовидной железы, - около 300 тыс. нуклеотидов, тогда как размер мРНК этого белка - лишь 8,7 тыс. нуклеотидов. Ген и соответствующий ему первичный транскрипт содержат 36 интронных последовательностей.

При процессинге (доработке) первичного транскрипта (пре-мРНК), который осуществляется в ядерном матриксе с участием небольших молекул ядерной РНК, из него вырезаются неинформативные участки (интроны), а оставшиеся экзоны сшиваются в единую нуклеотидную последовательность. Этот процесс получил название сплайсинга, а макромолекулярные комплексы, которые его осуществляют, - сплайсосом. Точки сшивок могут быть разной локализации, что позволяет клетке получить из одинаковых первичных транскриптов несколько мРНК, различающихся нуклеотидными последовательностями, - альтернативный сплайсинг. Таким путем удается синтезировать родственные, но различающиеся последовательностью аминокислот пептиды при транскрипции одного и того же гена. Белки, синтезированные на основе альтернативного сплайсинга, могут выполнять в организме различные функции. Некоторые интроны удаляются из первичного транскрипта самостоятельно, без участия сплайсосом.

Возможно, другая функция интронов, разделяющих смысловые последовательности в гене, связана с обеспечением возможности эволюционной пластичности генетического материала. Разведение в пространстве экзонов, кодирующих различные домены белка, позволяет формировать новые комбинации этих доменов, а значит, синтезировать белки с новыми свойствами.

Рабочие молекулы мРНК транспортируются через поры ядерной оболочки в цитоплазму клетки обычно в комплексе с белками, т.е. в виде рибонуклеопротеинов. Ядерная оболочка образована двумя ядерными мембранами - наружной и внутренней, между которыми выявляется узкое перинуклеарное пространство. Поверхность внутренней мембраны, обращенная к ядерному матриксу, служит для фиксации хромосом и покрыта фиброзной ядерной ламиной (пластинкой) - решетчатой структурой, сформированной промежуточными филаментами - белками ядерной ламины A, B и С (см. гл. 5).

К цитоплазматической поверхности наружной ядерной мембраны нередко прикрепляются рибосомы, что позволяет считать ядерную оболочку фрагментом ГЭС. Нередко можно видеть и прямые сообщения между цистернами ГЭС и перинуклеарным пространством. Рибосомы ядерной оболочки могут синтезировать как мембранные, так и секретируемые белки. Наличие ядерной оболочки приводит к относительному обособлению процессов синтеза белка и синтеза нуклеиновых кислот, что открывает возможности более полной регуляции генной активности, например, в виде синтеза специфических регуляторных белков не в ядре, а в цитоплазме. Отсюда регуляторные белки переносятся в компартмент ядра через поры ядерной оболочки.

Ядерная пора, ограниченная зоной слияния внутренней и наружной мембраны, представляет собой сложно устроенный канал. Совокупность структур этого канала - комплекс ядерной поры, построенный из белков нуклеопоринов, обеспечивает селективный транспорт веществ, например рибонуклеопротеинов, из ядра в цитоплазму и перенос других молекул (белков ядерного матрикса, рибосомных белков, рецепторов стероидных гормонов) в обратном направлении. Основу комплекса ядерной поры составляет цилиндрический канал диаметром около 125 нм. Перенос больших частиц через комплекс осуществляется механизмом активного транспорта с участием специфических рецепторных белков.

Белковые молекулы могут поступать в ядро лишь в том случае, если имеют сигнал локализации в ядре - определенную последовательность аминокислот, которая распознается рецепторами порового комплекса. Подобным же сигналом ядерного экспорта обладают рибонуклеопротеины, которые переносятся из ядра в цитоплазму. Максимальный размер частиц, которые могут проходить через ядерную пору, составляет 25 нм. Макромолекулы и их комплексы большего размера могут проскальзывать через ядерную пору, сильно деформируясь. Комплекс ядерной поры, точнее его компонент - ядерная корзинка, может работать как лепестковая диафрагма фотоаппарата - закрывается при отсутствии ионов кальция и открывается при его микромолярных концентрациях. Принимая во внимание структурную сложность и функциональное значение, комплексы ядерных пор можно было бы отнести к специальным органеллам клетки, регулирующим ядерно-цитоплазматический перенос веществ. Полагают, что поровые комплексы могут депонироваться в клетке в составе так называемых кольцевых ламелл, откуда они мобилизуются в ядерную оболочку по мере необходимости, например при оперативной интенсификации синтеза белка.

Рибосомы (полисомы), гранулярная и гладкая эндоплазматическая сеть (эндоплазматический ретикулум)

Три вида РНК - рибосомная, матричная и транспортная - участвуют в синтезе пептидной цепи на рибосомах: рРНК является структурным компонентом рибосомы, мРНК служит информационной матрицей, на которой синтезируется пептидная цепь, тРНК переносит аминокислоты к строящейся пептидной цепи. Каждую аминокислоту транспортирует собственная тРНК.

Органеллы синтеза белка - рибосомы - представляют собой сложные белково-рибонуклеиновые комплексы (у эокариот - 82 вида белков и 4 молекулы рРНК разного вида). Работающая рибосома собирается из двух субъединиц, большой и малой, после присоединения мРНК к малой субъединице. Обычно одна нить мРНК связывается с несколькими (в среднем около 15) рибосомами, что позволяет синтезировать на одной матрице одновременно несколько пептидных копий. Такие рибосомные комплексы, полисомы, могут быть распределены в цитозоле свободно. В этом случае они синтезируют цитоплазматические белки, которые используются для собственных нужд клетки, например для построения немембранных органелл.

Продукты синтеза полисом, прикрепленных к цитоплазматической поверхности цистерн гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС) или эндоплазматического ретикулума, включают секретируемые клеткой белки, предназначенные на экспорт, лизосомные белки и все интегральные протеины мембран. Эти продукты всегда оказываются заключенными или встроенными в мембранную оболочку. Мембраны ГЭС вместе с рибосомами осуществляют трансляцию и одновременно направленный транспорт синтезируемой пептидной цепи из цитозоля в просвет цистерн. Рибосомы прикрепляются к поверхности мембран ГЭС в определенных местах с помощью специальных белков, которые обеспечивают узнавание участка мембраны, фиксацию рибосомной частицы и перемещение синтезируемой пептидной цепи через липидный бислой мембраны ГЭС в просвет цистерны.

В клетках, активно синтезирующих и секретирующих белковые продукты (например, в клетках пищеварительных желез или в плазматических клетках - продуцентах антител), большая часть цитоплазмы может быть занята ГЭС, которую здесь часто называют эргастоплазмой. Помимо синтеза полипептидной цепи ГЭС участвует в контроле качества синтезируемого белка, в начальных этапах гликирования (присоединения сахаров к белкам-гликопротеинам), а также является основным депо Са² + в клетке.

Принципиально синтез белка в рибосомах ГЭС осуществляется так же, как и в цитозольных рибосомах, - на матрице мРНК путем последовательного присоединения аминокислот, которые транспортируются из цитозоля соответствующими тРНК. Более того, начальные этапы синтеза также происходят в цитозоле, до прикрепления рибосомы к мембранам ГЭС, и, как и в цитозоле, несколько рибосом синтезируют полипептидные цепочки, считывая информацию с одной и той же мРНК. Они образуют на поверхности мембран ГЭС полисомы, подобно тому, как это происходит со свободными рибосомами.

Однако есть и некоторые отличия. Для идентификации белка, который должен попасть в просвет цистерн ГЭС, еще в цитозоле начинает синтезироваться короткий пептид - сигнальная последовательность, которая узнается специальным рибонуклеопротеиновым комплексом - частицей, распознающей сигнал. Этот комплекс собирается в цитозоле и, связываясь с сигнальной последовательностью, останавливает дальнейший синтез пептида. На следующем этапе частица, распознающая сигнал, связывается с рецепторами на цитозольной поверхности мембраны ГЭС (докинг-белками), рибосома закрепляется на мембране, и синтез пептидной цепочки возобновляется. Одновременно с этим сигнальная последовательность, а за ней и синтезируемый пептид перемещаются в просвет цистерны через гидрофильный канал, расположенный в мембране рядом с докинг-протеином.

Пептидные цепочки растворимых (секретируемых) белков перемещаются в просвет цистерн полностью, тогда как белки другого типа, интегральные белки мембран, - только частично и оказываются замурованными в мембране ГЭС. Таким образом, мембранные белки встраиваются в липидный бислой в процессе синтеза пептидной цепи. Эти мембранные белки могут иметь лишь один сегмент (всегда в форме α-спирали), пересекающий липидный бислой, или несколько таких сегментов (так называемые многоходовые белки). Они имеют несколько аминокислотных стоп-последовательностей, временно блокирующих перемещение полипептидной цепи в просвет цистерны ГЭС, но не прекращающих синтез. Интегральные белки так и остаются связанными в липидном бислое в качестве собственных белков мембран ГЭС или направляются в последующем в составе специальных мембранных носителей к мембранам других клеточных органелл.

Процесс перемещения синтезируемого пептида через мембрану ГЭС (транслокация) осуществляется специальным белковым комплексом - транслоконом, компоненты которого являются эволюционно довольно старыми и сходными у про- и эукариот. Транслокон может функционировать и в обратном направлении, перемещая гликопротеины из эндоплазматической сети (ЭС) в цитозоль. Данные структурного анализа с высоким разрешением показывают, что транслокон имеет структуру, напоминающую пончик, с центральным гидрофильным каналом, диаметр которого при наличии рибосомы составляет 4-6 нм, а без рибосомы суживается до 0,1-1,5 нм.

Первые этапы посттрансляционной модификации пептидной цепочки - отщепление сигнальной последовательности и добавление некоторых сахаров к будущим белкам-гликопротеинам (гликирование), складывание (фолдинг) вторичной и третичной структуры белка - начинаются уже в просвете цистерны ГЭС ферментами, которые тесно связаны с транслоконом. Первичное гликирование происходит котрансляционно, т.е. еще в процессе синтеза пептидной цепочки. При этом на белковую молекулу переносится уже готовый олигосахаридный блок, который, с одной стороны, связывается с остатками аспарагиновой кислоты пептидной цепи, с другой - остается связанным со специальным липидом, долихолом, на внутренней, смотрящей в просвет поверхности липидного бислоя.

Фолдинг происходит с участием специальных белков - шаперонов. Правильный фолдинг и корректная сборка гликопротеинов постоянно отслеживаются механизмом контроля качества, который состоит из шаперонов, лектинов (таких, как кальнексин и кальретикулин), а также ферментов - гликозидаз и гликозилтрансфераз. Добавление некоторых сахаров (например, второй глюкозы в олигосахаридной цепи) является сигналом для складывания. Неправильный фолдинг может появляться в естественных условиях при высокой скорости синтеза или как следствие генных мутаций, а также при различных формах клеточного напряжения, таких как гипертермия, гипоксия, голод, ингибирование синтеза белка различными агентами и нарушение формирования дисульфидных мостиков.

В ответ на повышение температуры (тепловой шок) и некоторые другие неблагоприятные условия клетки быстро активируют комплекс специфических генов (генов теплового шока) и синтезируют специальные белки теплового шока. Эти белки, среди которых наиболее известны белки семейств hsp70 и hsp60, выполняют защитную функцию и действуют как шапероны, участвуя в правильном складывании белков. При тепловом шоке происходят фрагментация комплекса Гольджи, расширение и фрагментация цистерн ЭС, набухание и нарушение функций митохондрий, избыточное формирование микрофиламентов и стресс-волокон, концентрирование промежуточных филаментов около ядра (см. гл. 5). Механизмы индукции теплового шока и защиты активируются при многих патологических состояниях, таких как воспаление, ишемия и опухолевый рост.

Судьба неправильно сложенных белков может быть различной. В лучшем случае они возвращаются через транслокон в цитозоль и разрушаются до аминокислот в протеасомах после убиквитинирования (см. гл. 3). При неблагоприятных условиях белок агрегируется в просвете ГЭС. Поскольку такой белок не может ретранслоцироваться в цитозоль, он накапливается в цистернах и растягивает их. Обычно это приводит к неприятным для клетки последствиям. Механизм контроля качества может «запретить» действие ферментов фолдинга и шаперонов, что ведет к апоптозу - программированной смерти клетки (см. гл. 7). Для реализации другого ответа клетка использует внутриклеточную сигнальную систему, чтобы активировать некоторые факторы транскрипции, регулирующие синтез цитокинов, с последующим развитием воспаления или апоптоза.

Не все участки мембран ЭС покрыты рибосомами. Агранулярная (гладкая) эндоплазматическая сеть (АЭС) в синтезе белка принимает лишь косвенное участие. С помощью ферментов, связанных с мембранами этих фрагментов ЭС, осуществляется синтез липидов, в том числе мембранных, гликогена и липопротеинов, переносящих к клеткам холестерол и жирные кислоты. АЭС принадлежит важнейшая роль в детоксикации вредных для клеток веществ, которые могут образовываться как в самом организме, так и поступать извне. Для этого ферменты гладкой сети осуществляют конверсию вредных субстанций, переводя их в нетоксические или растворимые формы, которые могут выводиться из организма почками или легкими. АЭС регулирует также кальциевый гомеостаз в клетке, депонируя в цистернах избыток ионов Са²+ и высвобождая их в цитозоль по мере необходимости. В исчерченной мышечной ткани с помощью гладкой эндоплазматической сети (саркоплазматического ретикулума) осуществляется оперативная регуляция содержания в цитоплазме ионов Са²+, необходимых для инициации сокращения (см. гл. 5). Некоторые свободные от рибосом участки эндоплазматической сети являются местами выхода, в которых формируются транспортные контейнеры, переносящие синтезированные в ГЭС белки к комплексу Гольджи. Мембраны этих транспортных носителей покрыты белковыми комплексами, коатомерами, которые образуют так называемую COP-II-каемку (COP - coat protein).

Комплекс Гольджи

Посттрансляционная модификация пептидной цепи начинается уже в просвете цистерн ГЭС и продолжается в цистернах (мешочках) комплекса Гольджи (КГ). Эта модификация включает формирование вторичной структуры белка и структур более высокого порядка, последовательное присоединение различных сахаров к пептиду (гликирование), частичный гидролиз некоторых протеинов, который нередко приводит к их активации.

Многие белки клетки, как и секретируемые белки, являются гликопротеинами, т.е. имеют достаточно обширный олигосахаридный компонент. Специфические олигосахариды гликопротеинов участвуют в различных биологических функциях, таких как модуляция активности белков, взаимодействие клеток между собой и с внеклеточным матриксом, контроль качества белков и внутриклеточный транспорт. Например, активность такого важного гормона, как эритропоэтин, который необходим для регуляции продукции эритроцитов, строго зависит от корректного гликирования. Гликопротеины муцина, который образует защитный слой на поверхности эпителия пищеварительного, дыхательного и мочеполового пути, имеют много О-гликанов - олигосахаридных цепочек, связанных с аминокислотами серином или треонином. О-гликаны связывают воду и ионы, служат в качестве смазки и являются защитой против микробной инвазии. Синтез О-гликанов, в отличие от N-гликанов, начинается не в ЭС, а только в КГ.

Последовательный, ступенчатый характер процессов модификации белков во многом определяет строение КГ и способ его связи с другими компартментами клетки. Типичный КГ выглядит как несколько стопок (диктиосом), состоящих из уплощенных мембранных цистерн (мешочков) и ассоциированных с ними везикул и трубочек. Встречаются непрерывные тубулярные связи между различными стопками или между цистернами разного уровня в одной стопке. Обычно КГ (зона Гольджи) располагается около ядра вокруг клеточного центра (центриолей) и ассоциированного с ними центра организации микротрубочек (см. гл. 5). Такая локализация позволяет КГ связываться с различными отделами клетки. С помощью сети микротрубочек и моторных белков (динеина, кинезина) продукты синтеза, упакованные в мембранные носители, направляются к плазмолемме, системе эндосом, лизосомам и другим адресатам. Этот путь может быть очень длинным. Так, в двигательных соматических нейронах, иннервирующих мышцы конечностей, секреторные пузырьки, содержащие нейротрансмиттеры, транспортируются от КГ по аксону к нейромышечному соединению, находящемуся на расстоянии десятков сантиметров от тела нервной клетки. В перемещении транспортных везикул участвуют также и актиновые филаменты, функционально связанные с особой изоформой моторного белка миозина - миозином V.

Посттрансляционная модификация и транспорт синтезированных белковых продуктов - процессы векторные. Они предусматривают точное распознавание соответствующей мембраны-мишени и, следовательно, определенную ориентацию переноса. В связи с этим в КГ выделяют импортную зону (цис -полюс), получающую продукты синтеза из определенных участков ГЭС (места выхода), и экспортную зону (транс -полюс), направляющую готовые белки к адресатам. Группа центральных мешочков КГ (срединный компартмент) также обменивается белками и мембранами с цис- и транс- зонами. Некоторые везикулярные и тубулярные мембранные профили, предположительно участвующие в транспорте продуктов синтеза, относятся к категории COP-I-носителей - их покрытие формируется последовательным присоединением целого комплекса специальных белков.

Часть везикул, или мембранных носителей, которые отделяются от транс-полюса КГ, имеют клатриновую кайму (см. гл. 3). Эти везикулы транспортируют ферменты и мембраны лизосом. Поскольку в КГ модифицируются белки, предназначенные для разных целей, - секретируемые, мембранные и лизосомные, необходим эффективный механизм их сортировки. В частности, все лизосомные гидролазы, которые являются гликопротеинами, имеют фосфорилированный сахар - маннозу-6-фосфат (М-6-Ф), к которому на мембранах экспортного полюса КГ есть специальные рецепторы. Лизосомные ферменты в комплексе с рецепторами упаковываются в клатриновые везикулы и доставляются к компартментам ранних и поздних эндосом, в кислой среде которых они отщепляются от своих рецепторов.

После освобождения гидролаз рецепторы М-6-Ф в составе мембранных носителей возвращаются к КГ. Этот механизм включает участие адапторных белков и белкового комплекса, который называется ретромером. Лизосомные мембраны, которые содержат протонные насосы, накачивающие Н⁺ -ионы в просвет эндосом, и белки, переносящие конечные продукты деградации в цитоплазму, должны быть защищены от переваривания гидролазами. Структурные белки мембран лизосом, обычно обозначаемые аббревиатурами lamps, limps и lgps, являются гликопротеинами с высоким содержанием олигосахаридов, цепочки которых обращены в просвет лизосом и защищают их мембраны.

Интенсивный поток белка через КГ сопровождается сопряженным транспортом не только продуктов синтеза (карго), но и мембран. Структура КГ весьма динамична. Мешочки КГ вместе с содержимым собираются на цис-полюсе, постепенно перемещаются по направлению к транс -полюсу, где формируются мембранные носители к адресатам. По мере перемещения цистерн синтезированные пептиды и мембраны созревают, превращаясь в конечные продукты. Это созревание происходит при участии ферментов, состав которых в цистернах КГ различен. Сообщения, иногда непрерывные, между эндоплазматической сетью и КГ, а также между соседними цистернами КГ обеспечивают перенос продуктов не только в антероградном направлении (ЭС-цис-полюс-транс-полюс), но и ретроградно - от периферии к центру. Таким путем достигается, в частности, возврат ферментов, участвующих в модификации белков, в соответствующий компартмент синтетического пути.

Находящаяся в процессе сборки первая цистерна КГ представляет собой не гладкий мешочек, а, скорее, сетчатую конструкцию, состоящую из везикул и трубочек, - цис-сеть. На пути от ГЭС к КГ продукты синтеза и сами мембраны сортируются, причем зоны сортировки могут быть идентифицированы достаточно определенно как некоторый промежуточный компартмент, который имеет вид скоплений пузырьков и трубочек. Из материала этого компартмента, собственно, и строится первая цистерна КГ.

Разбирающаяся последняя цистерна КГ также представляет собой сетчатую мембранную структуру - транс-Гольджи-сеть (ТГС). От ТГС транспортные носители направляются преимущественно по трем адресам: к различным участкам плазмолеммы (непосредственно или через компартмент ранних эндосом), к ранним эндосомам и к поздним эндосомам(лизосомам).

В соответствии с предназначением мембраны носителей модифицируются. В них встраиваются рецепторы, транспортные каналы, протонные насосы и др. В распознавании мембраны-мишени, прикреплении к ней и слиянии участвуют растворенные в цитозоле специальные белки-адапторы и белки слияния, которые обычно обозначаются аббревиатурой SNAREs. Эти белковые комплексы собираются на цитоплазматических поверхностях мембран.

В КГ синтезируются также длинные неразветвленные полисахаридные цепи гликозаминогликанов (ГАГ), например гиалуроновой кислоты, имеющей несколько тысяч повторяющихся дисахаридных единиц. Многие ГАГ ковалентно связываются с белками для образования протеогликанов. ГАГ, протеогликаны и некоторые белкигликопротеины, входящие в состав основного вещества соединительной ткани и внеклеточного матрикса вообще, синтезируются и секретируются многими клетками организма.

В клетках, которые специализированы для производства белков и других веществ на экспорт (клетки экзокринных и эндокринных желез, бокаловидные клетки кишечного эпителия, синтезирующие слизистые продукты, - муциногены, тучные клетки и клетки крови, вырабатывающие различные биологически активные молекулы), продукты синтеза часто сохраняются в цитоплазме до начала секреции в виде секреторных гранул, или секреторных везикул. В случае так называемой регулируемой секреции, которая происходит под влиянием некоторого внешнего стимула, накапливающиеся в клетке секреторные гранулы могут занимать большой объем цитоплазмы. Прежде чем превратиться в секреторную гранулу, конденсирующая вакуоль, которая отделяется от транс -цистерн КГ, созревает - в ней изменяется концентрация ионов, уменьшается содержание воды, завершается модификация секреторных продуктов.

При нервной или эндокринной стимуляции содержимое зрелых секреторных гранул высвобождается из цитоплазмы в просвет органов или в выводные протоки желез путем экзоцитоза. Такой тип секреции обозначается как мерокринная секреция. Если конечный секреторный продукт включает не только белки, но и другие компоненты (например, липиды в молочной железе), последние выводятся в просвет протоков вместе с окруженным мембраной фрагментом цитоплазмы, который отрывается от апикальной зоны клетки, - апокринная секреция. В сальных железах кожи секреторные клетки накапливают в цитоплазме капли липидов, затем погибают вследствие апоптоза (см. гл. 7), и разрушенные их тела (собственно секрет) выводятся на поверхность эпидермиса кожи. В таких случаях говорят о голокринном типе секреции. Секреторные гранулы не являются органеллами, но, как и другие продукты или субстраты метаболизма и клеточной жизнедеятельности, расцениваются как относительно инертные цитоплазматические включения. Помимо секреторных гранул в клетке в виде включений могут находиться капли липидов, гранулы гликогена, пигментные гранулы (меланин, липофусцин, гемосидерин) и гранулы, содержащие кристаллоидные структуры.

Наряду с потоком белков и мембран от ТГС к другим компартментам клетки существует и обратный (ретроградный) перенос - от ранних и поздних эндосом к КГ. В этом направлении транспортируются лиганды после освобождения их из комплекса с рецепторами (см. гл. 3) или продукты расщепления фагоцитированного материала для их утилизации. Таким путем обеспечивается также постоянный возврат для клеточных нужд мембран, интернализованных в процессе эндоцитоза, - рециркуляция мембран. Мультивезикулярные тельца, содержащие мембранные компоненты, обнаруживаются в компартменте поздних эндосом и у ТГС.

Рециркуляция мембран особенно необходима при интенсивной секреции, когда суммарная площадь мембран, переносимых секреторными гранулами к апикальной зоне плазмолеммы, более чем на порядок превышает площадь всей клеточной мембраны.

Для материала, поглощенного эндоцитозом, транс -сторона КГ является импортной зоной, откуда вещества транспортируются через цистерны стопки КГ в направлении к цис-полюсу и даже в ЭС. Уже говорилось, что посредством этого ретроградного транспорта через КГ и далее в ЭС могут перемещаться некоторые токсины, которые оказывают свой повреждающий эффект в цитозоле. Таким образом, можно видеть, что секреторный и эндоцитозный пути перекрещиваются в КГ и, возможно, молекулы, следующие противоположными путями, встречаются в одной и той же цистерне. Внутриклеточный транспорт белка требует много энергии и прерывается на разных этапах, если нарушается снабжение клетки энергией. Например, экспорт белка из ГЭС подавляется, когда величина нормального содержания АТФ в клетке падает до 65%. Длительное ограничение в синтезе АТФ приводит к разборке КГ. Этот процесс обратим, и после возвращения уровня АТФ к нормальному структура КГ восстанавливается. Таким образом, в клетке существует сложная система транспорта, обеспечивающая двусторонний перенос продуктов и мембран между участниками синтетического конвейера и различными клеточными компартментами. Роль КГ как диспетчера и центральной сортировочной станции в этой транспортной системе представляется чрезвычайно важной.

В плаценте млекопитающих различают две части - материнскую, обеспечивающую доставку и отток крови в непосредственное окружение ворсин хориона, и плодную, которая состоит из ворсин, осуществляющих обмен газов, питательных веществ и продуктов метаболизма между кровью матери и собственной кровью плода. Плацентарные ворсины в своем развитии проходят ряд стадий:

Малодифференцированные полипотентные клетки мезенхимы мигрируют в сердцевину вторичной ворсины и продуцируют соединительнотканный матрикс (коллагеновые и эластические волокна и основное вещество), который используется в последующем для новообразования и роста капилляров. Их функции аналогичны функциям фибробластов в зрелой соединительной ткани, потому эти клетки часто называют эмбриональными фибробластами.

Представленная на рисунке клетка имеет морфологию типичной белоксинтезирующей клетки: крупное ядро с выраженным ядрышком (ЯД) и большой долей активного эухроматина (ЭХ); развитую гранулярную эндоплазматическую сеть (ГЭС), несколько расширенные цистерны которой содержат синтезированные продукты, и митохондрии (МХ), локализация которых среди цистерн ГЭС типична для синтезирующих клеток. Хорошо видно, что ГЭС сообщается с перинуклеарным пространством (стрелки), а на цитоплазматической поверхности наружной ядерной мембраны расположены рибосомы. Скудный флоккулярный материал, окружающий клетку, - это синтезированный внеклеточный матрикс.

ГХ - гетерохроматин, т.е. неактивный (нетранскрибируемый) в данный момент хроматин с характерной локализацей на периферии ядра.

Эта иллюстрация демонстрирует криофрактографический инвариант клетки, представленной на рис. 1-7 (см. гл. 1). Экзокринные клетки поджелудочной железы специализированы в отношении продукции различных белков (пищеварительных ферментов) в большом количестве. Основной объем их цитоплазмы оккупирован цистернами гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), поэтому эту часть цитоплазмы иногда называют эргастоплазмой - «занятой» плазмой. Раскол образца прошел таким образом, что расщепились лишь некоторые мембраны клетки - плазмолемма (ПЛ), ядерные мембраны (Я). Цистерны ГЭС разрезаны почти поперечно, и их мембраны видны частично, как параллельные слои. Типичной характеристикой клеток, интенсивно синтезирующих белки, является развитый комплекс Гольджи (КГ), который виден как скопление не очень регулярных мешочков и различных пузырьков. На одной из поверхностей расщепленной ядерной мембраны видны ядерные поры (ЯП).

В ядре интенсивно синтезирующей клетки преобладает активный (транскрибируемый) хроматин - эухроматин (ЭХ). Поскольку транскрипция связана с декомпактизацией хромосом, эухроматин выглядит как мелкогранулярный материал умеренной электронной плотности. Более плотно упакованный (нетранскрибируемый) гетерохроматин (ГХ) локализуется обычно на периферии ядра и в виде островков различной величины, распределенных среди эухроматина. Доля гетерохроматина варьирует в зависимости от функциональной активности клетки, однако даже в клетках, интенсивно синтезирующих белок, остается часть никогда не транскрибируемого гетерохроматина (конститутивный гетерохроматин). Хромосомы не случайно распределены в хроматине, но занимают определенные участки (домены). Небольшие скопления плотных и сравнительно крупных (20-25 нм) гранул, так называемые интерхроматиновые гранулы, представляют собой ультраструктурный эквивалент кластеров молекул, участвующих в сплайсинге. Более крупные (до 45 нм) перихроматиновые гранулы обсуждаются как участки концентрирования транспортных форм пре-мРНК. Таким образом, пространство ядра представляет собой достаточно дифференцированный и организованный компартмент с определенной или предпочтительной локализацией его компонентов. В клеточном ядре, активно участвующем в синтезе белка, хорошо выражены ядрышки (ЯД) (обычно 1-4 в клетках млекопитающих). Увеличение числа ядрышек расценивается как активация добавочных областей организации ядрышка. Ядрышки являются зонами синтеза и концентрирования будущих компонентов рибосом - рРНК, прерибосомных белковых частиц. В ядрышке различают несколько компонентов:

ФЦ, который, как полагают, служит местом депонирования белка, выглядит как сферическое тело, богатое плотным фибриллярным компонентом. Все компоненты ядрышка содержат растущие прерибосомные частицы: плотный фибриллярный - на ранней стадии, гранулярный - на поздней стадии их развития. Прерибосомные частицы могут концентрироваться и на других участках ядра. Время созревания большой рибосомной субъединицы - около 1 ч. В интенсивно функционирующих ядрышках синтезируется огромное число рибосом: 1500-3000 в минуту. В ядрышке может содержаться около 10⁵ предшественников рибосом. Помимо хроматина, ядрышка, продуктов синтетической активности и ядерной ламины (см. рис. 4-5, 4-6) некоторые исследователи выделяют в ком-партменте ядра (нуклеоплазме) так называемый ядерный матрикс - совокупность структурных белковых компонентов и факторов, участвующих в регуляции транскрипции.

В промежутках между делениями клетки интерфазное ядро окружено ядерной оболочкой (ЯО), состоящей из двух липидных мембран - наружной и внутренней. Узкое перинуклеарное пространство между ядерными мембранами сообщается с цистернами эндоплазматической сети, а на цитоплазматической поверхности наружной ядерной мембраны часто расположены рибосомы - ЯО считается частью гранулярного эндоплазматического ретикулума, в которой синтезируются белковые молекулы, необходимые в первую очередь компонентам самого ядра и его оболочки. Крупные розетковидные гранулы в пространстве, окружающем ядро, - это ß-гранулы гликогена (Г), состоящие из более мелких а-гранул. МХ - митохондрии; ЭС - одиночные цистерны эндоплазматической сети.

При активации синтеза белка и, следовательно, сборки субъединиц рибосом ядрышки клетки могут сливаться, образуя обширную ядрышковую сеть - нуклеолонему. Эта сеть сформирована из очень толстой рыхлой нити диаметром 100- 200 нм. В нуклеолонеме сохраняются все компоненты ядрышка (см. рис. 4-3), однако их топография несколько иная. Например, гранулярный компонент (ГК), который в основном состоит из более зрелых прерибосомных частиц, располагается не только вокруг всей нуклеолонемы, но и по периферии нити, ее формирующей. Аморфная и фибриллярная части концентрируются в центре нити.

ЯО - ядерная оболочка; ГЭС - цистерны гранулярной эндоплазматической сети.

Представленное изображение ядра плоской эндотелиальной клетки несколько необычно, поскольку в нем практически не определяется гетерохроматин. Последний обычно локализуется по периферии ядра и при ТЭМ маскирует структуру, прилежащую изнутри к внутренней мембране ядерной оболочки. Эта структура - фиброзная ядерная ламина (ЯЛ) - здесь видна как тонкий слой электронно-плотного материала. Ядро клетки, как обособленный и сложно организованный компартмент, имеет собственный скелет, ядерную ламину, помогающую поддерживать форму ядра и служащую местом прикрепления теломерных участков хромосом и конститутивного хроматина. Ядерная ламина толщиной 30-80 нм представляет собой плоскую ортогональную решетку, сформированную из специальной категории промежуточных филаментов (см. гл. 5). Белки фиброзной ядерной пластинки (ламины А, В и С) менее инертны, чем белки других промежуточных филаментов (кератины, виментин), и при фосфорилировании деполимеризуются, что приводит к разборке ядерной ламины в профазе митоза (см. гл. 7).

В просвете сосуда (ПР) содержится продукт пероксидазной реакции (см. рис. 3-37) и виден фрагмент эритроцита (ЭР).

При обработке клеток детергентами, например тритоном Х-100, разрушаются практически все липидные мембраны (и соответственно удаляется цитоплазма); единственными структурами, резистентными к такой обработке, остаются компоненты цитоскелета (промежуточные филаменты, микротрубочки и, в меньшей степени, актиновые филаменты). Они хорошо выявляются с помощью СЭМ. В плоских эндотелиальных клетках аорты помимо фибриллярных структур цитоплазмы видны чехлы ядер (Я), образованные фиброзными ядерными ламинами (пластинками). Плотная ядерная пластинка сохраняет почти неизменной удлиненную форму ядер. На некоторых участках видно также, что перинуклеарные промежуточные филаменты цитоплазмы (виментиновые филаменты) формируют мелкоячеистую сеть вокруг ядра (стрелки), фиксируя его, как в корзинке, в определенной части клетки.

В интерфазной клетке процессы, происходящие в ядре (транскрипция и процессинг мРНК, синтез и сборка компонентов рибосом и т.д.), являются начальными стадиями единого синтетического конвейера, который продолжается в цитоплазме, где в рибосомах происходит синтез полипептидных цепочек. Эта последовательность предусматривает двусторонний обмен исходных материалов и конечных продуктов между компартментами ядра и цитоплазмы. Кроме того, структурные белки ядра (например, белки ядерной ламины), факторы, регулирующие транскрипцию, и другие молекулы синтезируются в цитоплазме и для осуществления своих функций должны перемещаться в ядро. В равной мере это относится и к некоторым сигнальным молекулам (факторам роста и др.), которые связываются с рецепторами за пределами ядра, но реализуют свои регуляторные функции в компартменте ядра, стимулируя пролиферацию клеток или синтез белка.

Для осуществления этого двустороннего массо-переноса в оболочке ядра и при участии ядерной ламины формируются ядерные поры (ЯП). Они представляют собой регулярные перфорации ядерной оболочки (ЯО), которые ограничены смыканием внутренней и наружной ядерных мембран. В области поры периферический гетерохроматин (ГХ) и волокна ламины отсутствуют. Видно, что ядерные поры - это не свободные отверстия, но перекрыты довольно толстыми пластинками. Каждая пластинка представляет собой сложно устроенный комплекс ядерной поры (см. рис. 4-10, 4-11), который очень избирательно осуществляет перенос молекул между ядром и цитоплазмой. Со стороны цитоплазмы ядерные поры открываются в цитозоль, куда и поступают продукты транскрипции и предшественники рибосом. Похоже, что такой перенос зафиксирован в ядерной поре, расположенной справа. В левой части иллюстрации видны рибосомы, прикрепленные к цитоплазматической поверхности наружной ядерной мембраны (стрелки).

При подготовке образцов очень удачно расщепились мембраны ядерной оболочки (ЯО), что позволило воспроизвести объемное изображение почти половины поверхности ядра. В цитоплазме клетки раскол прошел таким образом, что мембраны (и структуры, сформированные из них) пересеклись почти поперечно. Подобные картины - не очень частая находка. Поскольку экзокриноциты поджелудочной железы специализированы для продукции больших объемов различных белков (см. рис. 1-7, 4-2), в цитоплазме можно видеть параллельно ориентированные цистерны гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), митохондрии (МХ) и везикулярные образования.

На криофрактографической поверхности одной из мембран (внутренней) ядерной оболочки видны многочисленные поры (стрелки). Число пор может существенно варьировать в зависимости от типа клеток и их метаболической активности. Например, в ядерной оболочке лимфоцита обычно около 400 пор, а в интенсивно синтезирующих клетках их число может достигать 4000-5000. По поверхности ядра поры размещаются более или менее равномерно, но их число резко падает в местах расположения конститутивного гетерохроматина, области организации ядрышка и прикрепления теломерных участков хромосом.

Представлено дальнейшее развитие сюжета предыдущего рисунка. В образце ткани расщепились обе мембраны (наружная и внутренняя), формирующие оболочку ядра экзокриноцита поджелудочной железы. Раскол образца прошел таким образом, что у наружной мембраны обнажилась Е-поверхность, т.е. криофрактографическая поверхность листка, прилежащего к перинуклеарному пространству (топологически это пространство, как и полости цистерн эндоплазматической сети, эквивалентно внеклеточному пространству). На этой поверхности сравнительно мало внутримембранных частиц (интегральных белков), а ядерные поры (ЯП) выглядят как углубления со слегка приподнятым дном. Это напоминает криофрактографические картины диафрагмированных фенестр в эндотелии капилляров (см. рис. 3-50), однако в отличие от последних обращают на себя внимание глобулярные частицы на дне ядерной поры. Эти глобулы принадлежат комплексу ядерной поры (см. рис. 4-11).

Другая поверхность (Р) кажется лежащей несколько глубже и принадлежит листку внутренней мембраны ядерной оболочки, прилежащему к компартменту ядра, т.е. к ядерной ламине. (При интерпретации криофрактографической картины нужно принять во внимание, что компартмент ядра топологически эквивалентен цитоплазме клетки.) На этой Р-поверхности внутримембранных частиц существенно больше, а выглядят как правильные цилиндрические возвышения или, напротив, углубления с ровным дном. Ц - цитоплазма клетки.

Эти два рисунка целесообразно обсуждать совместно, поскольку оба демонстрируют некоторые особенности строения комплекса ядерной поры (ЯП) и могут быть использованы при обсуждении его функций.

Рис. 4-10 показывает тангенциальный срез двух ядер печеночной клетки, причем у одного ядра срезалась лишь верхушка. Вследствие такого сечения ядерные оболочки не видны, а границы ядер представляются размытыми. Именно в этих зонах хорошо видны ЯП с их комплексами, представляющими собой правильные окружности с точечными уплотнениями в центре. В некоторых комплексах (например, слева) можно видеть и радиально расположенные спицы, идущие от центра к электронно-плотному кольцу. Диаметры поровых комплексов удивительно стандартны и составляют около 120 нм; они одинаковы у разных клеток и в клетках разных млекопитающих. Можно видеть также, что в электронно-плотном гетерохроматине (ГХ), расположенном по периферии ядер, на уровне пор формируются цилиндрические каналы, ведущие к комплексам ЯП.

Комплекс представляет собой сложно устроенный канал, который обеспечивает селективный и регулируемый транспорт ионов, небольших молекул, нуклеиновых кислот, белков и даже крупных рибонуклеопротеиновых комплексов между цитоплазмой и ядром. Суммарная молекулярная масса комплекса около 125 млн Д; комплекс содержит до 100 различных белков. Ионы и небольшие молекулы (до 50 кД) проходят комплекс поры довольно свободно в обоих направлениях через водные каналы диаметром около 9 нм. Для транспорта белков и РНК (обычно в связи с белками, т.е. в виде рибонуклеопротеинов) используются более широкие и строго регулируемые каналы, диаметр которых достигает 25 нм, - вполне достаточно для прохождения субъединиц рибосом.

Структура комплекса ЯП имеет октогональную симметрию, организованную вокруг частицы, расположенной в центре, - центрального транспортера (канала). Восемь спиц связывают центральный транспортер с двумя кольцами, расположенными на цитоплазматической и ядерной поверхности ядерной оболочки, формирующей пору. Каждое кольцо образовано восемью глобулярными белковыми частицами (рис. 4-11, стрелки). В центре некоторых комплексов видны также и центральные глобулы (транспортер).

От цитоплазматического кольца в сторону цитозоля отходят восемь цитоплазматических филаментов, а на ядерном кольце формируется корзина поры, которая может действовать как лепестковая диафрагма, изменяя диаметр центрального канала. Третье кольцо, среднее, образованное интегральными протеинами мембраны, фиксирует комплекс к ядерной оболочке в месте слияния наружной и внутренней ядерных мембран.

Селективный транспорт крупных молекул через поровый комплекс обеспечивается работой центрального транспортера. Для импорта белковых молекул из цитоплазмы в ядро (например, переноса синтезированных в цитозоле белков рибосом или факторов транскрипции) необходим специальный сигнал локализации в ядре. Обычно это определенная последовательность аминокислот, которая узнается цитозольным белком-рецептором - импортином. Одна из субъединиц импортина связывается с переносимым белком (карго), другая - с филаментами цитозольного кольца. При высокой концентрации (в компартменте ядра) комплекс импортин-белок распадается и импор-тин возвращается в цитозоль. Подобным образом осуществляется экспорт молекул из ядра. Для этого в аминокислотной последовательности белка выделяется сигнал экспорта из ядра, который узнается белком-экспортином, собственно и осуществляющим перенос.

Синтезированные в ядре пре-мРНК и мРНК связываются с белками, образуя класс гетерогенных ядерных нуклеопротеинов, которые могут переноситься в цитозоль. Рибосомные РНК поступают в цитоплазму вместе с белками субъединиц рибосом. Интересно, что так называемые малые ядерные РНК (snRNA), участвующие в процессинге молекул РНК, вначале транспортируются из ядра в цитоплазму, где связываются с активирующим их белком, а затем уже в виде рибонуклеопротеинов возвращаются обратно в ядро для выполнения своих функций.

Комплексы ядерных пор могут встречаться и в других мембранах клетки, в составе так называемых кольцевых ламелл (пластинок) или окончатых мембран, которые и являются некоторой формой резервирования готовых комплексов пор.

мРНК, поступающая в цитозоль из ядра, используется в качестве информационной матрицы для синтеза полипептидных цепочек белков в рибосомах (трансляция). Большая и малая субъединицы рибосом, содержащие рРНК и 75 различных белков, также собираются в ядре и переносятся через комплекс ядерной поры в цитоплазму. Синтез полипептидных цепей начинается только с момента сборки полной рибосомы из субъединиц на нити мРНК, которая вначале связывается с малой субъединицей. Таким образом, свободных рибосом, не синтезирующих пептидные цепи, в клетке нет. Более того, одна нить мРНК используется, как правило, для синтеза белка на нескольких рибосомах одновременно. Эти рибосомы, работающие с одной мРНК (обычно 12-15), группируются в розетковидные кластеры - полирибосомы (полисомы - ПС). Белки, предназначенные для использования в цитозоле и в структурах, с ним связанных (например, регуляторные белки, белки фибриллярных структур цитоскелета, большинство белков митохондрий и др.), синтезируются на рибосомах, расположенных в цитозоле свободно. Белки мембран клетки, ферменты лизосом и белки, предназначенные на экспорт, синтезируются на рибосомах гранулярной эндоплазматической сети (см. рис. 4-13-4-15). Они всегда оказываются заключенными в мембранные границы или находятся в составе мембран.

Представлен фрагмент кардиомиоцита, его околоядерная зона, свободная от сократительных структур (миофибрилл - МФ). Полирибосомы, расположенные в цитозоле этой зоны, синтезируют, вероятно, белки, из которых строятся миофибриллы (актин и актинсвязанные белки, миозин и т.д.). Интересно, что ядерные поры (стрелки) концентрируются на поверхности ядерной оболочки, обращенной к зоне синтеза белка. Энергия, необходимая для синтеза, поставляется митохондриями (МХ), которые в кардиомиоцитах отличаются обилием складок внутренней мембраны - крист (см. гл. 6). Виден также фрагмент диады (Д), конструкции, образованной мембранными органеллами кардиомиоцита, - саркоплазматическим ретикулумом и Т-системой (см. гл. 5).

Рибосомы, в которых синтезируются интегральные белки клеточных мембран, секреторные белки, белки лизосом и различных гранул, работают на цитоплазматической поверхности цистерн эндоплазматической сети. Этот субкомпартмент сети называется гранулярной эндоплазматической сетью (ГЭС). Это не означает, что все участки поверхности ГЭС покрыты рибосомами (стрелки). Можно видеть, что на протяжении цистерн существуют гладкие участки, которые расцениваются как места выхода синтезированных белков из ГЭС (экспортные сайты). Начало синтеза полипептидной цепи всех белков, которые будут в последующем синтезироваться в ГЭС, осуществляется в цитозоле, после сборки на нити мРНК свободных рибосом. Однако в отличие от цитозольных белков первой синтезируется специфическая цепочка аминокислот, сигнальная последовательность, которая распознается цитозольной частицей, блокирующей дальнейший синтез. Рибосома фиксируется на цитоплазматической поверхности цистерн ГЭС с помощью закрепляющих белков (докинг-протеинов), и после возобновления синтеза полипептидная цепь направляется через канал (транслокон) в мембране ГЭС в полость ее цистерны.

Транслокация пептидной цепи в полость (как и начальные фазы модификации белка) происходит параллельно с ее синтезом, т.е. котрансляционно. Цитозольные факторы (шапероны) поддерживают полипептидные цепочки в расправленном состоянии для последующего протаскивания через транслокон.

Клетки стенки сосудов (эндотелиальные клетки - ЭК, перициты - ПЦ), как и другие клетки организма, синтезируют белки для секреции во внеклеточное пространство и, конечно, белки собственных мембран. Однако в отличие от специализированных секреторных клеток объем продукции здесь невелик, и обычно обширная ГЭС не развивается. Распределенные в цитоплазме одиночные цистерны ГЭС и свободные полисомы (ПС) обеспечивают необходимые нужды. При активации клеток, например при новообразовании капилляров, а также в условиях опухолевой трансформации тканей, эндотелий может приобретать характерный секреторный фенотип.

Видна зона эндотелиоперицитарного (коммуникационного, или щелевого) контакта (ЩК); в просвете капилляра - эритроцит (ЭР); МХ - митохондрии; ФС - фаголизосома.

Эти два рисунка целесообразно обсуждать совместно, поскольку оба раскрывают детали организации гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС) в интенсивно синтезирующих и секретирующих белок клетках.

Ацинарные клетки околоушной слюнной железы (рис. 4-14), как и аналогичные клетки поджелудочной железы (см. рис. 1-8), специализированы в отношении синтеза и секреции больших объемов белка и классифицируются как серозные (белок-продуцирующие) железистые эпителиальные клетки - сероциты. Отличительной особенностью таких клеток является развитый синтетический аппарат, и прежде всего обширный гранулярный эндоплазматический ретикулум. В отличие от одиночных цистерн ГЭС, которые видны в других клетках (см. рис. 4-13), цистерны (Ц) эргастоплазмы весьма многочисленны и более упорядоченны в клеточном пространстве. Обычно это плоские и протяженные мешочки, которые концентрически укладываются вокруг ядра и разделяются узкими прослойками цитозоля. Содержимое цистерн (синтезированные продукты) выглядит несколько более плотным, чем матрикс цитозоля. Цитоплазматическая поверхность мембран, формирующих цистерны ГЭС, практически всюду покрыта прикрепленными рибосомами (РС), которые при ТЭМ на поперечных срезах видны как ряды небольших плотных телец, разделенных щелевидными промежутками (размер рибосом - около 12 нм в ширину и 25 нм в длину).

На тангенциальном срезе (рис. 4-15) представлено несколько расширенных цистерн ГЭС активно синтезирующего фибробласта. Хорошо видно, что рибосомы на поверхности цистерн, как и рибосомы цитозоля, группируются в кластеры - полирибосомы или полисомы. Эти розетковидные конструкции отчетливо распознаются на участках, где сечение прошло почти точно через плоскость мембран ГЭС. Там же, где полисомы кажутся расположенными в цитозоле (например, вверху справа), срез прошел несколько выше - через сами рибосомы. В отличие от цистерн сероцита, представленных на рис. 4-14, цистерны ГЭС фибробласта несколько расширены. Расширение цистерн ГЭС - не очень редкая находка при электронной микроскопии, однако причины подобного расширения и депонирования секреторных продуктов в полости цистерн не всегда ясны. Синтез и секреция компонентов внеклеточного матрикса (коллагена, молекул основного вещества и эластических волокон) фибробластами относятся к конститутивному типу, т.е. без предварительного концентрирования продуктов в секреторных гранулах. Однако при интенсивном синтезе белка последующая обработка полипептидных цепей (посттрансляционная модификация) может осуществляться медленнее, чем собственно синтез. Это может вести за собой временное депонирование незрелых секреторных продуктов в просвете цистерн ГЭС. МХ - митохондрия.

Единая эндоплазматическая сеть в цитоплазме клеток подразделяется на два субкомпартмента - гранулярную и агранулярную (гладкую) эндоплазматические сети (соответственно ГЭС и АЭС). Более упорядоченные и правильные по форме цистерны ГЭС, покрытые рибосомами, без отчетливой границы переходят в фрагменты АЭС (стрелки). В гепатоцитах и некоторых других клетках цистерны АЭС действительно формируют довольно причудливый и неровный лабиринт. В печеночных клетках на долю мембран АЭС приходится 10-15% всех мембран клетки, тогда как в экзокринных клетках поджелудочной железы - менее 1%. В клетках, синтезирующих стероидные гормоны (клетки коры надпочечников, некоторые клетки половых желез), АЭС преобладает. Различия в организации и форме цистерн гранулярной и гладкой сети могут быть связаны с их отношением к цитоскелету клетки. ГЭС локализована в более плотном матриксе. В гепатоцитах АЭС хорошо развита у желчного полюса клетки (см. рис. 3-38), поскольку она является основным продуцентом компонентов желчи (желчных кислот, фосфолипидов, холестерола). Здесь же происходит перевод токсичного билирубина (продукта деградации гемоглобина) в его нетоксичную, конъюгированную форму, которая выделяется с желчью. АЭС печени является основной органеллой, осуществляющей ее детоксифицирующую функцию. Например, при хронической нагрузке барбитуратами АЭС в гепатоцитах существенно гипертрофируется.

Примером тесных функциональных связей между гранулярным и гладким компонентами эндоплазматической сети является синтез липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), переносящих холестерол и другие липиды. Эти крупные частицы синтезируются и в ГЭС (белковый компонент), и в АЭС (липиды). Частицы ЛПОНП иногда видны в просвете мешочков АЭС (см. рис. 3-38), откуда транспортируются к комплексу Гольджи и выделяются в пространства Диссе у сосудистого полюса гепатоцита (см. рис. 3-51).

Тесные пространственные взаимоотношения между АЭС и гранулами гликогена (Г) подчеркивают их функциональные связи, поскольку АЭС участвует в метаболизме этого полисахарида. Гликоген является также основным сырьем для производства энергии митохондриями (МХ).

Основные события посттрансляционной модификации белков происходят в комплексе Гольджи. Эта органелла (единственная, которая носит имя своего открывателя К. Гольджи) является следующей и весьма важной ступенькой синтетического конвейера. В интенсивно синтезирующих белок клетках млекопитающих комплекс Гольджи (КГ) представлен, как правило, несколькими стопками уплощенных мешочков (цистерн), которые часто связаны между собой и имеют характерную топологию. Эти стопки (диктиосомы) расположены в пространстве клетки вокруг клеточного центра (пары центриолей и центра образования микротрубочек; см. гл. 5). Такая топология позволяет связать КГ со всеми отделами клетки. Микротрубочки, которые начинаются из клеточного центра (см. рис. 5-20), используются в качестве двусторонних транспортных путей для продвижения мембранных контейнеров, содержащих белки.

На рисунке можно видеть по крайней мере 5 диктиосом (КГ1-КГ5), а одна из центриолей клеточного центра (КЦ) служит базальным тельцем для одиночной реснички (Р). Можно видеть также характерную изогнутую форму диктиосом; их выпуклый cis -полюс является импортной зоной, куда приходят продукты синтеза из ГЭС. Одиночные цистерны ГЭС также выявляются в окружении КГ, причем не вся поверхность их мембран покрыта рибосомами. Такие зоны или участки служат местом выхода синтезированных продуктов из ГЭС (стрелки), но особенно демонстративна экспортная поверхность цистерны, расположенной в верхней части рисунка, обращена к импортному полюсу Гольджи (КГ2). С каждой стопкой Гольджи ассоциирована группа мелких (диаметром 50-60 нм) везикул, покрытых СОР-1-каймой (см. рис. 4-21), среди которых встречаются и более крупные, покрытые клатрином (КВ).

Крупные вакуоли, которые видны, как правило, у вогнутых поверхностей диктиосом, являются расширенными участками последних цистерн стопки, формирующих экспортный полюс Гольджи - trans -полюс, т.е., по существу, аналогом секреторных гранул, образующихся в транс- Гольджи-сети (см. рис. 4-18).

Подоциты клубочка почки (эпителиальные клетки висцерального листка капсулы клубочка) синтезируют и секретируют на поверхность белки собственных мембран, а также белки лизосом, компоненты базальной мембраны и, возможно, мезангиального матрикса (см. рис. 3-20). Продукты синтеза (карго) постоянно транспортируются к клеточной поверхности и лизосомам в составе мембранных носителей (конститутивный тип секреции), и секреторных гранул не образуется.

На рисунке можно видеть почти все этапы синтетического конвейера:

Некоторые короткие цистерны, трубочки и пузырьки, которые видны около cis-поверхности Гольджи, могут относиться к так называемому промежуточному компартменту (endoplasmic reticulum Golgy intermediate compartment - ERGIC). Полагают, что эта весьма динамичная тубуловезикулярная конструкция участвует в формировании cis-сети Гольджи, предшествующей первой цистерне. Слева одна из цистерн ГЭС, которая топографически связана с транс -Гольджи-сетью. Наличие таких цистерн хорошо документировано, однако функциональный смысл их своеобразной топологии остается неясным. Возможно, положение таких цистерн каким-либо образом связано с проникновением в эндоплазматический ретикулум некоторых веществ, поступающих в цитоплазму путем эндоцитоза (см. рис. 3-59).

Криофрактографический инвариант изображения комплекса Гольджи в секреторной клетке помогает уточнить особенности его организации, важные для понимания функции этой органеллы. Разлом замороженного кусочка ткани прошел таким образом, что частично расщепились лишь некоторые мембраны клетки, что позволяет наглядно документировать слоистую структуру комплекса Гольджи (КГ). Диктиосома (стопка) состоит из восьми уплощенных мембранных мешочков (цистерн) с минимальными цитоплазматическими прослойками между ними. У выпуклого импортного полюса (cis -полюса) стопки Гольджи видны фрагменты цис -сети (ЦС) - решетчатой тубулярной конструкции, из которой, как полагают, формируется первая (проксимальная) цистерна стопки. При наличии нескольких цистерн в диктиосоме (что типично для клеток млекопитающих) в ней выделяют компартменты - цис -цистерны, срединный отдел, транс-цистерны и транс-Гольджи-сеть (ТГС). Такое подразделение продиктовано функциональной асимметрией КГ.

Выделение полюсов не случайно и связано не только с тем, что один из них является импортной зоной (cis), а другой - зоной экспорта готовых продуктов (trans). Белки-карго, поступающие в КГ из гранулярной эндоплазматической сети (интегральные белки мембран, секреторные белки, ферменты лизосом), продвигаются по стопке Гольджи в антероградном направлении - от cis -полюса к trans -полюсу. По мере продвижения они модифицируются ферментами, локализованными в соответствующих компартментах, последовательным каскадным образом. Пострансляционная модификация белка включает его гликирование (добавление олигосахаридных цепочек), установление S-S и других связей в полипептидной цепочке, складывание в 3-мерную молекулу (фолдинг), отщепление части цепи и др. Все эти процессы катализируются соответствующими ферментами. Таким образом, в КГ совмещены процессы антероградного перемещения карго и поддержания специфического состава в каждом компартменте Гольджи (что предполагает ретроградное перемещение ферментов). Резидентные белки-ферменты, характерные для каждого компартмента, часто служат его маркерами (см. рис. 4-20). Со стопкой цистерн Гольджи ассоциированы небольшие везикулы, покрытые COP-I-комплексами (стрелки). Их роль в осуществлении антеро- и ретроградного переноса через КГ обсуждается ниже (см. рис. 4-21).

Большинство белков-карго, проходящих через комплекс Гольджи, являются гликопротеинами, т.е. имеют олигосахаридные цепочки, присоединенные к полипептиду. Гликирование протеинов начинается в эндоплазматической сети, но в основном осуществляется в комплексе Гольджи. Олигосахаридные цепочки могут строиться из разных моносахаров (N-ацетилглюкозамина, глюкозы, маннозы, фукозы, галактозы и др.), и в процессе построения конечного олигосахарида остатки сахаров могут присоединяться или удаляться из исходного блока. Для выполнения этих операций требуются свои специфические ферменты Гольджи. Ферменты работают каскадным образом, присоединяя каждый последующий сахар после предыдущего или убирая присоединенный ранее, по мере продвижения карго в антероградном направлении от cis-полюса Гольджи к trans-полюсу. Маннозидаза II удаляет два остатка маннозы после присоединения N-ацетилглюкозамина, что происходит в срединном компартменте Гольджи.

На представленном рисунке локализация фермента маннозидазы II в клетках линии NRK (клетки эпителия почки) выявлялась с помощью антител, меченных пероксидазой хрена. Можно видеть, что фермент оккупирует 2 цистерны срединного компартмента, а цис- и транс -цистерны стопки Гольджи практически свободны от продукта реакции. Маннозидаза II отсутствует также и в мелких COP-I-везикулах, которые ассоциированы со стопкой (стрелки). Подобная функциональная асимметрия характерна и для других ферментов, например, галактозилтрансфераза локализуется преимущественно в транс цистернах и в транс -Гольджи-сети. Cis- и trans - соответствующие полюсы комплекса Гольджи; МХ - митохондрии; ГЭС - цистерны гранулярной эндоплазматической сети. (Тонкий срез слабо окрашивался солями металлов - для более контрастного выявления плотного продукта пероксидазной реакции.)

Пострансляционная модификация белков ферментами комплекса Гольджи (КГ) осуществляется каскадным образом по мере продвижения синтезированных продуктов (карго) от cis-полюса к trans-полюсу КГ. Однако конкретные механизмы перемещения карго через КГ (впрочем, как и на предыдущем этапе, и после КГ) не очень понятны и в настоящее время активно обсуждаются. Хронологически наиболее ранняя и, видимо, наиболее распространенная везикулярная модель постулирует, что транспорт белков-карго через стопку цистерн КГ осуществляется с помощью небольших (диаметром 50-60 нм) везикул, покрытых COP-I-каймой (COP - coat proteins). Эти везикулы обычно видны в непосредственном окружении цистерн (стрелки). В соответствии с этой гипотезой СОР-I-пузырьки отделяются от цистерны вышележащего уровня и переносят карго в нижележащую цистерну (антероградно) для следующего этапа модификации. При таком переносе очевидно, что асимметричное распределение ферментов Гольджи (см. рис. 4-20) должно поддерживаться естественным образом. Модель созревания и прогрессии цистерн предполагает, что карго перемещаются вместе с цистерной по стопке Гольджи, и модификация белков осуществляется последовательно, по мере перемещения цистерны по направлению к trans-полюсу. Соответственно положению меняется и набор ферментов.

Для поддержания необходимого асимметричного распределения ферментов в этом случае могут использоваться те же COP-I-везикулы, которые ретроградно возвращают ферменты в вышележащий компартмент.

В чем-то компромиссная гипотеза созревания и прогрессии мембранного домена находит все больше доказательств. В соответствии с этой моделью продукты синтеза переносятся с помощью достаточно большого мембранного носителя (которым может быть, например, периферическая часть цистерны). Слияние этого мембранного домена с нижележащей цистерной индуцирует его отделение от вышележащей, а ферменты соответствующего компартмента работают в этом случае в мембранном носителе, не покидая полости или мембраны своей цистерны.

Эта модель может быть успешно адаптирована и для описания переноса в других сегментах экзоцитозного пути, например, от экспортных сайтов ГЭС (ГЭС) к КГ и или от Гольджи к адресатам (плазмолемме, эндосомам или лизосомам). Крупные, покрытые клатрином везикулы (КВ) расположены в зоне транс-Гольджи-сети. Они могут быть переносчиками ферментов и мембран лизосом или компонентами аппарата эндоцитоза, функционально и топографически связанными с КГ.

G-белок вируса везикулярного стоматита (VSV) - это один из пяти белков вируса, которые кодируются его собственной РНК. При попадании в клетку-хозяин из РНК вируса с помощью обратной транскрипции образуются ДНК-гены, которые встраиваются в геном инфицированной клетки, и клетка-хозяин начинает синтезировать белки вируса как свои собственные. G-белок, интегральный белок мембраны, используется вирусом для слияния с мембраной будущей клетки-хозяина и проникновения в цитоплазму. Этот небольшой гликопротеин (550 аминокислот) имеет две олигосахаридные цепочки, которые достраиваются в комплексе Гольджи. Поскольку G-белок синтезируется в гранулярной сети инфицированной клетки наряду с ее собственными трансмембранными белками, он часто применяется в качестве модельного вещества для изучения синтеза и транспорта интегральных белков.

Существуют устойчивые клеточные линии, инфицированные вирусом везикулярного стоматита, которые используются в экспериментальной работе. В нашем примере это клетки линии RBL (базо-фильная лейкемия крыс). G-белок выявлялся на криосрезах (см. гл. 2) с помощью антител, меченных коллоидным золотом (диаметр 15 нм). Можно видеть, что, как и положено интегральному белку, G-белок локализуется почти исключительно в мембранах комплекса Гольджи (КГ) вплоть до транс- Гольджи-сети (ТГС), где формируются мембранные носители к плазмолемме (срез не окрашивался солями тяжелых металлов, и поэтому мембраны выявляются как светлые линии). Небольшие размеры G-белка допускают его перемещение по мембранам с помощью латеральной диффузии.

Коллагены, белки внеклеточного матрикса (см. рис. 3-64), синтезируются и секретируются во внеклеточное пространство многими клетками мезен-химного происхождения (фибробластами, хондро-и остеобластами, гладкими миоцитами). Молекулы коллагена синтезируются в виде предшественника проколлагена, который проходит весь внутриклеточный конвейер и только вне клетки превращается в конечный продукт (например, тропоколлаген, из которого строятся коллагеновые фибриллы; см. рис. 4-25).

Показан фрагмент цитоплазмы фибробласта человека - зона комплекса Гольджи (КГ), включающего несколько диктиосом. Видны также многочисленные мелкие везикулы (COP-I-везикулы) и фрагменты трубочек (тубул), которые обычно ассоциированы со стопками цистерн. Молекулы проколлагена и их агрегаты, размер которых составляет 200-300 нм, слишком велики, чтобы транспортироваться небольшими пузырьками, диаметром около 50 нм. Хорошо видно, что частицы коллоидного золота, которыми помечены антитела, выявляющие проколлаген, локализуются в крупных мембранных носителях. Можно видеть также (и результаты ЭМ-томографии это определенно доказывают), что эти мембранные домены (мегавезикулы) не изолированные структуры, а часть расширенных периферических отделов цистерн или связаны с цистернами посредством коротких тубул (стрелки). В полости таких обширных мембранных доменов проколлаген достигает транс -Гольджи-сети и клетки транспортируется к плазмолемме (ПЛ).

Частицы коллоидного золота, маркирующие антитела, на этом рисунке не имеют точно стандартизованного диаметра, как, например, на предыдущем рисунке. В этой модификации метода (так называемое золотое усиление) антитела метили стандартными частицами минимального диаметра (5 нм), чтобы облегчить доступ антител к соответствующим эпитопам белка. Затем срезы помещали в слабый раствор коллоидного золота, в котором на первоначальной золотой метке осаждалось золото из раствора. Таким путем можно получить крупные, хотя и неодинаковые по размеру метки, которые существенно облегчают выявление искомых молекул.

Синтез и секреция белковых компонентов базальной пластинки (коллагена IV типа, ламинина, фибронектина), как и других белков внеклеточного матрикса, относятся к конституциональному типу. Продукты синтеза выделяются во внеклеточную среду постоянно и в нерегулируемой манере путем простого экзоцитоза. Секреторных гранул при этом не образуется. Представленный фрагмент эндотелиальной клетки содержит ядро (Я), несколько расширенные цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) и стопки комплекса Гольджи (КГ), расположенные около одной из центриолей (Ц). Продукты синтеза базальной пластинки (БП) выделяются во внеклеточное пространство и видны как флоккулярный электронно-плотный материал в щели, образованной базальными участками клетки. Некоторые везикулы, ассоциированные с КГ, также содержат плотный продукт и являются, возможно, фрагментами транспортных контейнеров, которые открываются на плазмолемме.

Секреция коллагенов различными клетками - еще один пример конституционального (нерегулируемого) типа секреции. Ретикулярные клетки - это своеобразная модификация фибробластов, присутствующих в паренхиматозных органах (печени, селезенке, лимфоидной ткани). Они синтезируют коллаген III типа, образующий тонкие коллагеновые фибриллы (20 нм), из которых формируются так называемые ретикулярные (аргирофильные) волокна диаметром от 0,5 до 2,0 мкм. Такое волокно (КВ) и синтезирующая его ретикулярная клетка (РК) представлены на иллюстрации. Волокно состоит из фибрилл с характерной для фибриллобразующих коллагенов исчерченностью, с периодом 67 нм (см. рис. 3-65). Ретикулярные волокна могут секретироваться и другими клетками; они встречаются в стенках сосудов, в нервах, мышечной и жировой ткани.

Образование коллагеновой фибриллы любой синтезирующей коллаген клеткой обычно описывают как многоэтапный процесс. Начальные этапы происходят в клетке, завершающие - во внеклеточном пространстве. Первые этапы - синтез полипептидных цепей предшественника коллагена (проколлагена), его посттрансляционная модификация (гидрирование аминокислот пролина и лизина и присоединение остатков сахаров - гликирование и др.) - происходят в цистернах гранулярной эндоплазматической сети (стрелки) и в комплексе Гольджи. Эти этапы завершаются образованием конечной молекулы - суперспирали, состоящей из трех спиральных полипептидных цепей. Концевые отделы этих цепей, препятствующие внутриклеточной самосборке фибрилл, не спирализованы. Молекулы проколлагена по мере синтеза и модификации не накапливаются в секреторных гранулах, а секретируются путем экзоцитоза во внеклеточное пространство в области специальных инвагинаций плазмолеммы. На последующем этапе, уже за пределами клетки, с помощью фермента проколлагенпептидазы, которая синтезируется и высвобождается той же клеткой, концевые участки молекулы проколлагена отщепляются, что инициирует самосборку коллагеновых фибрилл из протяженных спирализованных молекул тропоколлагена (см. рис. 3-65). Фибриллы коллагена группируются в волокна с помощью нефибриллобразующих коллагенов (V, XII, XIV типы) и некоторых гликированных белков матрикса. Ретикулярные волокна особенно богаты олигосахаридами, что в значительной мере определяет их аргирофилию. Я - ядро ретикулярной клетки с ядрышком; ЛБ - фрагмент незрелой лимфоидной клетки (лимфобласта); ЛЦ - лимфоциты.

Показан поперечный срез бокаловидной клетки на уровне комплекса Гольджи (КГ). Так называемые бокаловидные клетки являются одноклеточными экзокринными слизистыми железами. При накоплении секреторных гранул в апикальной части клетка принимает бокаловидную форму (см. рис. 4-31). Этот тип эпителиальных клеток широко распространен в эпителиальных покровах желудочно-кишечного тракта и воздухоносных путей, сформированных однослойным столбчатым эпителием. Клетка, представленная на рисунке, вставлена в пласт абсорбирующих эпителиальных клеток, энтероцитов (ЭЦ), с которыми она связана мембранными контактами, в частности десмосомами (Д).

Бокаловидные клетки синтезируют муциноген - смесь гликопротеинов и протеогликанов, в которой превалирует полисахаридный компонент. Муциноген секретируется на поверхность эпителия и превращается в муцин - слизистое вещество, которое, как одеяло, покрывает и защищает эпителиальную поверхность. Кроме того, муцин в просвете кишки абсорбирует пищеварительные ферменты и частицы пищи (химуса), так что пищеварительные реакции протекают более эффективно в вязкой среде, а не в пустой полости. Он содержит также антимикробные агенты, такие как дефензины, которые секретируются другими клетками эпителиального пласта (клетки Панета). На рисунке хорошо видно, что весьма развитый КГ, окруженный гранулярной эндоплазматической сетью (ГЭС), представляет собой почти непрерывную ленту, и транс -поверхность Гольджи (транс- Гольджи-сеть) обращена к центру клетки. Эта сеть является местом формирования секреторных вакуолей (СВ) - будущих секреторных гранул, в которые упаковываются компоненты слизи, предназначенные для выведения на эпителиальную поверхность. Созревая, секреторные гранулы накапливаются в апикальной цитоплазме и периодически (чаще - в ответ на стимул) высвобождают содержимое в просвет кишки или малого бронха (см. рис. 4-31 а, б). Образование секреторных гранул, концентрирующих и накапливающих продукты синтеза, - характерная черта клеток с регулируемым типом секреции.

Видны также митохондрии (МХ) и множество мелких везикул, ассоциированных с комплексом Гольджи.

Ацинарные клетки поджелудочной железы могут быть типичным примером экзокринных белок-продуцирующих клеток с регулируемым типом секреции. Разнообразные белки-ферменты, синтезируемые экзокриноцитами, упаковываются в транс -Гольджи-сети в секреторные гранулы, которые после созревания выводят содержимое в просвет секреторной единицы (ацинуса) посредством экзоцитоза (см. рис. 4-29). Поскольку экзоцитоз включает эпизоды слияния мембран, ограничивающих гранулы, с плазмолеммой, состав граничной мембраны конденсирующей вакуоли почти идентичен таковому апикальной клеточной мембраны.

Незрелые секреторные гранулы (конденсирующие вакуоли) формируются из расширений цистерн транс -полюса комплекса Гольджи. Упаковка секреторных белков в конденсирующие вакуоли сопряжена с их сортировкой, поскольку клетка одновременно может синтезировать разные белки (например, набор пищеварительных ферментов) и состав содержимого секреторных гранул зависит от метаболических потребностей. Регулируемый тип секреции подразумевает не только то, что клетка высвобождает содержимое, депонированное в секреторных гранулах, в ответ на внешний стимул, нервный или гуморальный, но и возможность изменения состава секрета, например соотношения различных ферментов в зависимости от состава пищи. В процессе созревания содержимое конденсирующих вакуолей уплотняется за счет дегидратации, секреторные белки часто образуют крупные агрегаты, небольшие вакуоли сливаются, формируя более крупные гранулы. Конденсирующие вакуоли (КВ) в ацинарной клетке поджелудочной железы отграничены собственными мембранами (стрелки) и расположены в цитоплазме среди цистерн гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС). Можно видеть, что содержимое вакуолей неоднородно - центральная часть (ядро) имеет плотный матрикс, который окружен менее плотным ободком (гало) с гидратированным содержимым. Процессы конденсации секреторного материала и дегидратации приводят к гомогенизации матрикса и исчезновению гало в гранулах экзокринных клеток, продуцирующих белковый секрет (см. рис. 4-30 а, б). Напротив, в гранулах эндокринных клеток, вырабатывающих пептидные гормоны, наличие светлого ободка является характерным признаком (см. рис. 4-33).

Ацинарные клетки поджелудочной и некоторых других экзокринных желез синтезируют и высвобождают в просвет железы белковый секрет, который концентрируется в секреторных гранулах. Эти гранулы часто называют зимогенными гранулами. Гранулы образуются в транс-Гольджи-сети комплекса Гольджи и созревают в цитозоле, продвигаясь к апикальным доменам цитоплазмы. Здесь они концентрируются и в ответ на соответствующий стимул (например, прием пищи) высвобождают содержимое в просвет (ПР) секреторной единицы железы - ацинуса. На рисунке, полученном с помощью метода замораживания-раскалывания, видны группы секреторных гранул (СГ) в трех экзокриноцитах, окружающих просвет ацинуса.

Раскол мембран, отграничивающих гранулы, прошел таким образом, что у некоторых гранул (1, 2 и 3) видны Е-поверхности той части мембраны, которая обращена к наблюдателю (выпуклые поверхности сфер). В других гранулах (4, 5 и 6) можно видеть Р-поверхности удаленных от наблюдателя частей мембран. (Напомним, что просветы самих гранул, содержащие секрет, топологически эквивалентны внеклеточному пространству.) Можно видеть также микроворсинки, выступающие из апикальных поверхностей клеток в просвет ацинуса (стрелки), межклеточные пространства (МП), образованные базолатеральными поверхностями, и пластинки мембран эндоплазматической сети (ЭС).

Секреторные (зимогенные) гранулы в таких экзокринных железах, как поджелудочная или околоушная слюнная, являются формой накопления продуктов синтеза, которые освобождаются при регулируемой секреции. Высвобождение содержимого гранул в просвет железы происходит при определенных метаболических запросах под влиянием нервных или гуморальных стимулов. Такие стимулы появляются, например, при приеме пищи.

Клеточные механизмы высвобождения содержимого гранулы во внеклеточное пространство (просвет ацинуса) можно идентифицировать как процесс экзоцитоза, при котором мембрана, отграничивающая гранулу, и апикальная плазмолемма клетки сливаются, формируя секреторную пору. Выброс содержимого гранулы в просвет ацинуса и реорганизация клеточной поверхности в области слившихся мембран происходят очень быстро, и, как полагают, ключевым моментом формирования поры является процесс слияния мембран. Последовательность событий при экзоцитозе секреторных гранул включает ряд процессов:

Специальный белок синаптогамин выполняет функции сенсора Ca²⁺ при экзоцитозе. Принципиально те же события происходят и при нерегулируемом эндоцитозе (конститутивной секреции). На рисунке видны просвет ацинуса поджелудочной железы и апикальные зоны двух ацинарных клеток, содержащие секреторные гранулы (СГ). Одна из гранул (слева) практически вплотную приблизилась к плазмолемме так, что две мембраны уже неразличимы. В просвете ацинуса видны содержимое гранул (секрет) и микроворсинки (МВ) апикальной поверхности. Просвет ацинуса отграничен от межклеточных пространств, образованных базолатеральными поверхностями клеток, плотными (замыкающими) соединениями (ПС) (см. гл. 3).

Иллюстрируется морфология одних и тех же клеток и даже идентичных участков ацинарных клеток околоушной слюнной железы, находящихся, однако, в различных функциональных состояниях (рис. 4-30, а, б). Околоушная слюнная железа является экзокринной серозной железой с регулируемым типом секреции. Ее ацинарные клетки производят белковый секрет (в том числе и пищеварительные ферменты), который накапливается и сохраняется в секреторных (зимогенных) гранулах (СГ) цитоплазмы до получения клеткой соответствующего нервного или гуморального стимула к секреции. Представлены апикальные зоны экзокриноцитов железы у животных, находящихся в состоянии голода (рис. 4-30, а) и через 5 мин после начала кормления (рис. 4-30, б). Чередованием режимов голода и регулярного кормления удается синхронизировать деятельность клеток околоушной (и поджелудочной) железы так, что почти все клетки начинают работать в одном ритме. Они накапливают секрет в голодном состоянии и освобождают его при кормлении. Сам факт приема пищи является мощным стимулом к секреции, поскольку инициирует возбуждение в соответствующих вегетативных нервных центрах и повышение уровня гуморальных факторов, регулирующих слюноотделение. В состоянии голода (рис. 4-30, а) секреторные гранулы концентрируются в апикальной цитоплазме у просвета (ПР) секреторной единицы железы - ацинуса. Цистерны гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС) несколько оттесняются в базальные зоны клеток. В комплексе Гольджи (КГ), который расположен достаточно близко к апикальному полюсу, видны секреторные пузырьки, накапливающиеся в транс-зоне. Просвет ацинуса, образованный апикальными доменами плазмолеммы двух клеток, представляет собой весьма тесное пространство, особенно по сравнению с суммарным объемом гранул, которые должны освободить свое содержимое.

Его величина не изменяется существенно и при кормлении (рис. 4-30, б), т.е. при интенсивной секреции. Практически одновременный выброс большого объема секрета в ограниченный объем просвета ацинуса позволяет создать высокое секреторное давление в начальных отделах протоковой системы железы, что необходимо для продвижения довольно вязкого серозного секрета. Это давление поддерживается фильтрацией жидкости и ионов из межклеточных (интерстициальных) пространств (ИП) в просвет ацинуса через плотные контакты (ПК) между ацинарными клетками. На апикальных участках цитоплазмы наряду с крупными зимогенными гранулами могут встречаться очень небольшие гранулы с менее плотным содержимым (см. рис. 4-30, а, стрелки). Они представляют собой пример так называемой минорной секреции, которая подобна секреции конститутивной (т.е. постоянному, нерегулируемому, экзоцитозу). Детальное изучение секреторного пути в околоушной слюнной железе показывает, что минорная секреция подготавливает места для прикрепления зимогенных гранул, обеспечивая быстрое слияние их мембран с плазмолеммой. В момент секреции более 2/3 исходного количества гранул освободили свое содержимое в просвет ацинуса через очень небольшую площадь апикальной поверхности клеток. Это означает, что за время секреции на апикальную мембрану пришли мембраны гранул, суммарная площадь которых во много раз превышает собственную площадь апикальной плазмолеммы. Тем не менее эта площадь практически не изменилась. Такой большой трафик мембран в апикальный домен клеточной мембраны при секреции должен быть компенсирован равным по площади эндоцитозом, т.е. возвратом фрагментов клеточной мембраны в цитоплазму клетки. Действительно, этот возврат мембран очень эффективно работает в секреторных клетках. Например, ацинарные клетки околоушной и поджелудочной железы за 1 ч секреции доставляют с секреторными гранулами на поверхность клетки мембраны, площадь которых почти в 2 раза превышает площадь всей клеточной поверхности. Различные механизмы эндоцитоза (см. гл. 3) полностью компенсируют этот приток мембран, интернализуя фрагменты плазмолеммы в цитоплазму. В целом ситуация весьма напоминает события, происходящие при эндоцитозе в макрофагах (см. рис. 3-60), но, естественно, с противоположным вектором. При регулируемой секреции количество вырабатываемых клеткой продуктов может превышать метаболические нужды. В этом случае избыток секрета (а следовательно, и секреторных гранул) элиминируется за счет механизма лизосомной деградации. Такая разновидность аутофагоцитоза носит название кринофагии. На рис. 4-30, б видна одна из аутофаголизосом (ФЛС), в которой содержатся продукты деградации секрета.

На рис. 4-31, а, б показана морфология бокаловидных клеток в разных фазах секреторного цикла. Бокаловидные клетки - одноклеточные экзокринные слизистые железы - широко представлены в слизистых оболочках пищеварительного тракта, воздухоносных путей и мочеполовой системы. Продукт их секреции, муциноген, представляет собой смесь гликопротеинов и протеогликанов, высокогликированных веществ, которые после секреции в просвет органов формируют защитный слой слизи (муцин), покрывающий эпителиальную поверхность. В бронхах толщина этого слоя достигает 5 мкм. Поскольку в составе олигосахаридных цепей компонентов слизи много легко диссоциирующих отрицательно заряженных групп, муцин интенсивно связывает воду (гидратируется), и толщина слизистого «одеяла» может быть достаточно большой. Гидратированная слизь хорошо абсорбирует частицы пыли, клеточный детрит и микробные тела, защищая эпителиальную поверхность от контакта с чужеродными веществами. Совместное и хорошо регулируемое взаимодействие бокаловидных клеток, секретирующих муцин, и клеток реснитчатого эпителия (РЭ; рис. 4-30, а), которые покрыты синхронно двигающимися ресничками (см. гл. 5), обеспечивает постоянное продвижение слизистого «одеяла» вдоль эпителиальной поверхности к ротовой части глотки (вверху слева - косо срезанные реснички и микроворсинки). Альвеолярный (респираторный) сегмент легкого лишен бокаловидных клеток (и следовательно, слизистого покрытия), но активность специальных легочных макрофагов здесь обеспечивает очищение полости альвеол (см. рис. 4-40). Миллионы макрофагов, поглотивших частицы пыли и другой «мусор», постоянно мигрируют из альвеол в малые бронхи и транспортируются далее с помощью слизи в вышележащие отделы бронхиального дерева. На рис. 4-31, а представлена бокаловидная клетка, которая находится в фазе синтеза секреторных продуктов. Большое эухроматичное ядро с отчетливым ядрышком и развитый КГ свидетельствуют об интенсивном синтезе белка, однако выраженность КГ связана не только с этим. В КГ происходят, как известно, основные реакции гликирования, что для формирования муциногенов не менее важно, чем синтез пептидного компонента.

Скопления гликогена (Г) в цитоплазме служат, очевидно, источником карбогидратов для гликирования. Готового продукта, судя по небольшому количеству секреторных гранул (СГ), в апикальной цитоплазме пока немного, и клетка имеет нехарактерный вид - базальные отделы существенно более толстые, чем апикальные. Многочисленные складки и длинные микроворсинки в базальной части бокаловидной клетки участвуют в формировании ее связей (интердигитаций) с соседними клетками реснитчатого эпителия. На рис. 4-31, б видно, что секреторные гранулы (СГ) оккупируют большую часть цитоплазмы и не только в ее апикальной части. По мере накопления гранул ядро и клеточные органеллы вместе с небольшим объемом цитоплазмы оттесняются в базальную область и на данной иллюстрации практически не попадают в плоскость среза. Более того, в этой фазе цикла непосредственно перед освобождением гранул синтетический аппарат клетки (гранулярная эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи) существенно редуцируется. Клетка ждет сигнала, который может инициировать секрецию. Таким образом, секреторный цикл бокаловидной клетки можно считать типичным примером регулируемого типа секреции, при котором фаза накопления продукта сопровождается заметным изменением морфологии клетки и ее активности. В отличие от гранул серозных (синтезирующих белки) клеток (например, ацинарных клеток поджелудочной или околоушной железы) гранулы, содержащие муциноген, менее правильной формы вследствие их плотной упаковки в цитоплазме и не так интенсивно окрашены. Их содержимое в процессе созревания не концентрируется, а, напротив, гидратируется за счет отрицательно заряженных групп олигосахаридов. Это приводит к существенному увеличению клеточного объема, так что расширенная (бокаловидная) часть клетки деформирует соседние клетки пласта (одна из них - вверху, также бокаловидная, но находится в фазе синтеза). По мере накопления секреторных гранул складки, образующие интердигитации с клетками-соседями, сглаживаются, однако клетка остается прочно фиксированной в эпителиальном пласте посредством контактных комплексов апикальной плазмолеммы. Р - поперечно разрезанные реснички; ЛС - лизосома.

Представлена криофрактографическая картина эндокринной инсулинпродуцирующей клетки (В-клетки) островка поджелудочной железы (островка Лангерганса). Подобные островки, состоящие из кластеров различных эндокринных клеток, распределены среди секреторных единиц экзокринной паренхимы (ацинусов), высвобождающих продукт секреции в просвет протоков. Эндокринные клетки островков, как и все эндокринные клетки, выводят секрет в межклеточное (интерстициальное) пространство (ИП), откуда он и поступает в кровь. Отсутствие протоковой системы в эндокринных железах (а каждый островок Лангерганса, независимо от его размера можно считать эндокринной железой) определяет некоторые особенности морфологии клеток, отличающие их от клеток экзокринных желез. Можно видеть, в частности, что многочисленные секреторные гранулы (СГ) эндокринной клетки не концентрируются у ее апикальной поверхности, а распределены достаточно равномерно в цитоплазме - вся поверхность клетки является ее секреторной поверхностью.

Виден также фрагмент ядра (Я) В-клетки с кратерообразными углублениями - ядерными порами (стрелки). Некоторые эндокринные клетки, включая В-клетки островков, синтезируют пептидные гормоны и, следовательно, имеют развитый аппарат синтеза белка. В околоядерной зоне клетки виден фрагмент комплекса Гольджи (КГ), который принимает активное участие в посттрансляционной модификации молекулы проинсулина (предшественник гормона).

Хотя В-клетки островков, как и другие эндокриноциты, накапливают продукт синтеза в секреторных гранулах, тип секреции в этих клетках можно определить как комбинированный. Наряду с регулируемой секрецией - массовым освобождением гормона в ответ на стимул (например, пищевую сахарную нагрузку) - железа постоянно (конститутивно) высвобождает в кровь некоторое количество инсулина, необходимое для удовлетворения базовых метаболических нужд.

Показаны фрагменты нескольких инсулинпродуцирующих В-клеток островка Лангерганса. Обращает на себя внимание обилие секреторных гранул в цитоплазме. Морфология этих гранул достаточно характерна для эндокринных клеток - центрально или несколько асимметрично расположенное плотное «ядро» и светлый ободок «гало», между сердцевиной и мембраной гранулы. Это пространство не является артефактом химической фиксации или обезвоживания образца в процессе его подготовки. Картины, полученные при использовании очень быстрой фиксации (криофиксации под повышенным давлением), подтвердили существование гало, хотя, безусловно, при альдегидной фиксации это пространство выглядит несколько более широким.

Молекула инсулина, как и многих других пептидных гормонов, синтезируется в гранулярной эндоплазматической сети в неактивной форме, в виде препроинсулина - полипептидной цепи, в которой различают сигнальную последовательность, центральную часть (С-пептид) и две боковые цепи - А и В. Сигнальная последовательность отрезается в гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС); ее расширенные цистерны видны на иллюстрации, и образовавшийся проинсулин поступает в комплекс Гольджи (КГ), где боковые А- и В-цепи связываются двумя дисульфидными мостиками. В транс -Гольджи-сети проинсулин упаковывается в секреторные вакуоли, в полости которых находится пептидаза, вырезающая центральный сегмент - С-пептид. Таким образом, в секреторых гранулах оказывается и сам зрелый димер инсулина, молекулы которого формируют плотную сердцевину, и вырезанные цепочки С-пептида, образующие светлый ободок (гало). Инсулин секретируется в интерстициальное пространство вместе с С-пептидом, функция которого до сих пор неясна.

Можно также видеть, что лишь ограниченные фрагменты клеточной поверхности находятся в близком контакте со стенкой фенестрированных капилляров (К), через которые осуществляется эвакуация гормона. Большая часть инсулина секретируется в очень узкие межклеточные щели (стрелки), по которым гормон должен диффундировать, чтобы попасть в перикапиллярное пространство. Это означает, что для эффективного транспорта гормона в интерстиции должен существовать некоторый градиент гидростатического давления (поток интерстициальной жидкости), направленный к стенке капилляров. Фенестрированные капилляры эндокринных желез, как и аналогичные капилляры других органов с относительно высоким обменом жидкости (кишка, почки), эффективно резорбируют интерстициальную жидкость и тем самым поддерживают необходимый градиент давления, способствующий транспорту гормонов.

Помимо эпителиальных клеток, формирующих экзокринные и эндокринные железы, в организме есть клетки иного происхождения, специализированные в отношении секреторной активности. Эти клетки синтезируют, накапливают в гранулах и высвобождают в интерстициальное пространство вещества, обладающие регуляторной биологической активностью.

Один из ярких примеров таких клеток - нейро-секреторные клетки супраоптического и паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Как и все нейроны, эти клетки - эктодермального происхождения (нейроэктодерма), однако в отличие от других нервных клеток они трансформируют нервные импульсы, получаемые из вышележащих отделов центральной нервной системы, в секреторную активность. Клетки синтезируют и освобождают через эфферентные нервные окончания гормоны - окситоцин и антидиуретический гормон (вазопрессин). Окситоцин стимулирует двигательную активность гладких мышечных клеток внутренних органов, особенно матки, а вазопрессин вызывает сокращение гладких миоцитов в стенке артериальных сосудов и, что особенно важно, модулирует проницаемость мембран клеток собирательных протоков почки так, что моча становится более концентрированной. Эти гормоны вырабатываются в телах нейронов, расположенных в ядрах гипоталамуса, и транспортируются по аксонам в заднюю долю (pars nervosa) гипофиза.

Нервные окончания (НО), содержащие характерные для эндокринных клеток гранулы с плотной сердцевиной, располагаются рядом со стенками капилляров (ЭР - эритроцит в просвете капилляра). Эндотелий этих капилляров имеет многочисленные диафрагмированные фенестры (Ф) (см. рис. 3-47). В цитоплазме нервных окончаний можно видеть, помимо секреторных гранул, мелкие синаптические везикулы (стрелки). Это свидетельствует о том, что нейро-секреторные клетки гипоталамуса сохранили, хотя бы частично, способность к проведению нервных импульсов и освобождению нейротрансмиттеров. Возможно также, что слияние этих небольших мембранных пузырьков с плазмолеммой нервного окончания облегчает экзоцитоз секреторных гранул, подобно минорной секреции в экзокринных клетках (см. рис. 4-30). Аналогичные синаптические пузырьки и микротрубочки (МТ) видны и в других фрагментах нервных отростков, окружающих капилляр и образующих между собой многочисленные небольшие синапсы. В нейрогипофизе секреторные гранулы, содержащие гормоны, могут освобождать содержимое не только в области нервных окончаний, но и на протяжении аксона или накапливаться в его расширениях, известных как тельца Герринга.

Еще один пример неэпителиальных клеток, обладающих секреторной эндокринной активностью, - мышечные клетки сердца (кардиомиоциты), расположенные преимущественно в предсердиях. Они синтезируют, накапливают в гранулах (СГ) и высвобождают в кровоток небольшие пептидные гормоны - предсердный натрийдиуретический пептид, атриопептин, кардиодилатин и кардионатрин. Эти гормоны участвуют в поддержании жидкостного и электролитного баланса в организме, а также в снижении уровня кровяного давления. Локализация этих клеток в предсердиях (особенно в правом) не случайна, поскольку изменение объема циркулирующей плазмы (в значительной мере зависящее от функции почек) влияет на величину притока к сердцу. Предсердные кардиомиоциты, регистрируя степень растяжения клеточной мембраны при изменении притока крови, способны отслеживать величину циркулирующего объема плазмы и высвобождать в кровь производимые ими гормоны.

Можно предположить, что секреторная специализация кадиомиоцитов предсердия должна сопровождаться снижением их сократительной активности. Действительно, сократительный аппарат этих клеток (миофибриллы - МФ) существенно редуцирован по сравнению с выраженностью органелл сокращения в других мышечных клетках сердца (см. рис. 5-2, 5-4). Меньше развиты и внутренние мембраны митохондрий (МХ), которые в сократительных кардиомиоцитах образуют очень многочисленные плотно упакованные кристы. В цитоплазме клеток видны также фрагменты гладкой эндоплазматической сети (саркоплазматического ретикулума - СР), которая в кардиомиоцитах (и других исчерченных мышцах) регулирует содержание ионов Ca² + в цитоплазме. Довольно резкое пороговое повышение концентрации кальция инициирует цикл сокращения в мышечных клетках (см. гл. 5). В секреторных клетках, включая и секреторные кардиомиоциты, освобождение Ca²⁺ в цитоплазму из депо (эндоплазматической сети) необходимо также для осуществления механизма секреции.

Тучные клетки (мастоциты) можно определить как одноклеточные железы с эндокриноподобным эффектом. Они, подобно клеткам эндокринных желез, освобождают свои продукты путем экзоцитоза в интерстициальное пространство. Однако в кровь попадают лишь следы веществ, производимых тучными клетками. Эти вещества реализуют в основном локальные эффекты, и их мишенями служат рядом расположенные клетки и структуры. В этом случае целесообразно говорить не об эндокринной, а о паракринной секреции. Подобным же образом функционируют клетки дисперсной эндокринной системы, которые развиваются в составе эпителиальных пластов желудочно-кишечного и респираторного тракта.

Происхождение тучных клеток до сих пор не очень понятно, но, похоже, они, как и базофилы крови, происходят от костно-мозгового предшественника. Однако в отличие от базофилов тучные клетки способны размножаться в местах локализации, т.е. в соединительной ткани. Тучные клетки (ТК) встречаются практически всюду, где есть соединительная ткань, но их предпочтительная локализация - у стенок кровеносных микрососудов, особенно венул. Именно эти сосуды принимают непосредственное участие в развитии воспалительной реакции. В довольно широком спектре биологически активных соединений, которые синтезируют и освобождают тучные клетки (см. рис. 4-37), есть гистамин и другие медиаторы, влияющие на проницаемость эндотелиальной выстилки (ЭК) микрососудов и их сократительную активность, а также хемоаттрактанты, привлекающие клетки крови в область воспаления. В соединительной ткани тучные клетки активно взаимодействуют с макрофагами (МФ), паракринные влияния которых могут модулировать секреторную активность тучных клеток.

КОЛ - коллагеновые волокна; ПЦ - перициты в стенке венулы.

Характерные гранулы тучных клеток различаются размером, плотностью и текстурой содержимого. Тучные клетки синтезируют и высвобождают в интерстициальное пространство соединительной ткани различные агенты, которые обладают биологической активностью: гистамин и медленно реагирующую субстанцию анафилаксии (SRS-A), повышающие сосудистую проницаемость, стимулирующие секрецию слизи и сокращение гладких мышц в бронхах; хемотаксические факторы для эозинофилов и нейтрофилов; гепарин, который известен как один из самых действенных антикоагулянтов, хондроитин сульфат - один из компонентов основного вещества соединительной ткани; нейтральные протеазы и другие ферменты. Эти вещества могут накапливаться в разных гранулах или депонироваться в одних и тех же. Присутствие сульфатированных гликозаминогликанов определяет метахроматическую (пурпурно-фиолетовую) окраску тучных клеток под воздействием на ткани толуидинового синего. Агенты, содержащиеся в гранулах, определяются как первичные медиаторы. Состав гранул может отличаться в различных субпопуляциях тучных клеток, которые имеют предпочтительную локализацию, например в стенках малых бронхов и в рыхлой соединительной ткани.

Способ секреции содержимого гранул в интерстиций также может быть различным. В нормальных, спокойных условиях некоторые низкомолекулярные агенты диффундируют через мембраны гранул в цитоплазму и далее через плазмолемму во внеклеточное пространство. Таким образом в ткани поддерживается некоторый фоновый уровень медиаторов, необходимый для поддержания ее нормальной жизнедеятельности. Вероятно, что часть гранул, которые на рисунке кажутся пустыми или заполненными тонкофибриллярным материалом, освободили содержимое именно таким способом, поскольку материал, который в них остался, отличается от основного вещества окружающей ткани. Другой способ секреции - это обычный механизм экзоцитоза, при котором мембраны гранул и плазмолемма сливаются и содержимое довольно быстро высвобождается во внеклеточное пространство. В этом случае, очевидно, содержимое просвета экзоцитозного пузырька и текстура внеклеточного пространства должны выглядеть примерно одинаково. Наконец третий способ секреции - дегрануляция (см. описание рис. 4-38) - связан с массивным выбросом содержимого почти всех гранул. При дегрануляции тучные клетки оперативно синтезируют и немедленно секретируют ряд вторичных медиаторов, которые принимают участие в развитии воспаления.

Массивное освобождение содержимого гранул тучной клетки происходит обычно под влиянием какого-либо провоцирующего стимула. Наиболее часто таким стимулом является повторная антигенная атака. При первой встрече с чужеродным белком (антигеном) иммунокомпетентные (плазматические) клетки синтезируют некоторое количество специфических антител, в том числе антитела класса Е (IgE). Эти антитела адсорбируются на поверхности тучных клеток с помощью рецепторов к Fc-фрагменту антител так, что специфическая, антигенсвязывающая область антитела обращена во внеклеточную среду. Сами тучные клетки при этом сенситизируются, т.е. становятся очень чувствительными к антигену. При повторной атаке антигены массово связываются с IgE на поверхности тучных клеток с образованием перекрестных связей. Это, в свою очередь, активирует так называемый фактор сочетания рецепторов и систему вторичных мессенджеров (см. гл. 3). Эффект этой активации проявляется как дегрануляция тучной клетки. При дегрануляции гранулы сливаются друг с другом и с клеточной мембраной, формируя причудливые широкие каналы, через которые содержимое гранул выбрасывается во внеклеточное пространство. На рисунке видны сечения таких каналов с деконденсированным содержимым гранул (Г) и узкие фрагменты цитоплазмы клетки (Ц). Поскольку при дегрануляции целостность клеточной мембраны сохраняется, тучные клетки, по-видимому, не гибнут и способны восстанавливать гранулярный компонент.

Активность тучных клеток в очаге воспаления сопровождается обычно оперативной секрецией ими вторичных медиаторов - производных арахидоновой кислоты (лейкотриенов, тромбоксанов, простангландинов) и цитокинов (интерлейкинов , брадикинина, фактора активации тромбоцитов и фактора некроза опухоли α). Эти вещества не накапливаются в гранулах, но сразу поступают в ткань. Массивный выброс провоспалительных факторов при дегрануляции большого числа тучных клеток может вызывать местную реакцию гиперчувствительности немедленного типа (обширное, быстро развивающееся острое воспаление, примером которого является феномен Артюса). Если реакция принимает системный характер (снижение кровяного давления, сокращение малых бронхов и др.), она определяется как шоковое состояние - анафилаксия, представляющая угрозу жизни пациента. Внизу слева - фрагменты разрушенного макрофага (МФ).

Мультитубулярные тельца (тельца Вейбеля- Палада) (ВП) - являются своеобразной разновидностью секреторных гранул эндотелиальных клеток небольших кровеносных сосудов. Они специфичны для эндотелия и накапливают синтезированный эндотелиальными клетками фактор фон Виллебранда (тканевый фактор), участвующий в системе свертывания крови. Фактор фон Виллебранда стабилизирует фактор VIII - один из важнейших факторов свертывания крови - и таким образом контролирует адгезию и агрегацию тромбоцитов в местах повреждения эндотелиальной выстилки. Фактор фон Виллебранда является специфическим маркером эндотелиальных клеток. Кроме того, в тельцах Вейбеля-Палада концентрируются эндотелин (самый мощный из известных вазоконстрикторов), интерлейкин 8 (один из весьма активных цитокинов) и Р-селектины (молекулы адгезии, которые контролируют прилипание лейкоцитов к эндотелию и их миграцию в ткань).

(Я) эндотелиальной клетки, заключены в корзинку из промежуточных (виментиновых) филаментов (ПФ) (см. гл. 5). Рисунок наглядно демонстрирует участие цитоскелета в организации внутреннего пространства клетки - органеллы не взвешены свободно в цитозоле, как может показаться на первый взгляд, но фиксированы в определенных локусах. Это не исключает довольно обширных перемещений органелл в цитоплазме, однако эти перемещения также осуществляются с помощью цитоскелета.

Представлен дыхательный (респираторный) отдел легкого, в котором реализуется еще один специальный тип синтетической активности клеток. Просвет заполненных воздухом альвеол (АЛ) ограничен межальвеолярными перегородками (МП), или септами, основу которых составляют кровеносные капилляры. Эти капилляры с очень тонким непрерывным эндотелием (ЭК) несколько отличаются от аналогичных микрососудов в других тканях, например в исчерченных мышцах. Они представляют собой короткие, несколько уплощенные сосудистые сегменты, которые формируют очень густую сеть в толще межальвеолярных септ. Как можно видеть, эта сеть капилляров является общей для соседних альвеол. В отличие от капиллярных сетей в других тканях соединительнотканные промежутки между соседними капиллярами легкого занимают существенно меньший объем, чем сами капилляры, поэтому такую конструкцию иногда образно называют капиллярной плевой, несущей почти сплошной слой крови в толще перегородок альвеол. Суммарный объем капилляров легких, по-видимому, сопоставим с общим объемом капилляров большого круга кровообращения, хотя, конечно, расчеты такого рода могут быть только приблизительными. Существенно большее значение имеет площадь эндотелиальной выстилки легочных капилляров (около 150 м² ), поскольку именно она определяет эффективность газообмена в легких. Огромная эндотелиальная поверхность капилляров легких используется и с другой целью.

На поверхности эндотелиальных клеток, обращенных в просвет капилляров, фиксирован ангиотензинпревращающий фермент, который конвертирует циркулирующий в плазме малоактивный белок ангиотензин I в его активную форму - ангиотензин II. Ангиотензин II является одним из самых мощных вазоконстрикторов, поддерживающих уровень кровяного давления, и, кроме того, активно участвует в регуляции водного и ионного баланса в почках. В обмене газов между кровью и воздухом в просвете альвеол, помимо эндотелия капилляров, участвуют плоские эпителиальные клетки - пневмоциты I типа (ПЩ), которые покрывают до 95% поверхности альвеол, хотя составляют лишь 40% всех эпителиальных клеток. Между стенками капилляров и ПЩ обычно располагается общая базальная пластинка - 3-й компонент аэрогематического барьера.

Другие эпителиальные клетки, пневмоциты II типа (ПЦП), имеют не плоскую, а, скорее, кубическую форму и выполняют иные функции. Они синтезируют и секретируют в просвет альвеол сурфактант, сложную белково-липидную смесь, которая тонкой пленкой покрывает поверхность межальвеолярных перегородок (см. рис. 4-41). Фосфолипидная пленка сурфактанта снижает поверхностное натяжение альвеол и препятствует их коллапсу. Кроме того, в этой пленке фиксируются пылевые частицы и бактерии, что облегчает деятельность легочных макрофагов (МФ). Эти уникальные клетки могут жить и выполнять свои функции на поверхности межальвеолярных перегородок, т.е. во внешней (воздушной) среде и по мере необходимости мигрировать в соединительнотканную интерстициальную ткань септы.

ЭР, Л и ТЦ - соответственно эритроциты, лейкоциты и тромбоциты в просвете капилляров.

Пневмоциты II типа (ПЦ II) синтезируют компоненты сурфактанта и накапливают их в секреторных гранулах - пластинчатых (или ламеллярных) тельцах (ПТ). Сурфактант состоит из фосфолипидов (в основном дипальмитоилфосфатидилхолина), холестерола и специальных белков. Содержимое ПТ выводится в просвет альвеол (АЛ) путем экзоцитоза и затем распределяется в виде монослоя фосфолипидов над водной гипофазой, непосредственно прилегающей к поверхности других эпителиальных клеток - пневмоцитов I типа (ПЩ). Поскольку фосфолипиды являются амфипатическими молекулами (см. гл. 3), их полярные головки обращены в водную среду, т.е. к эпителиальной поверхности, а жирнокислотные хвосты - в более подходящую гидрофобную среду, в воздух.

Слой сурфактанта уменьшает поверхностное натяжение АЛ и препятствует их спадению. Белки сурфактанта (A, B, C и D) также участвуют в формировании ПТ, в организации слоя сурфактанта на альвеолярной поверхности и в защите от микроорганизмов. Они покрывают поверхность бактерий (опсонизация), что облегчает их последующий фагоцитоз альвеолярными макрофагами не только в тканях альвеолярной перегородки, но и в полости АЛ, у их поверхности (см. рис. 4-40). Белки A и D оказывают и прямой антимикробный эффект, задерживая рост грамотрицательных бактерий.

Секреторные гранулы разных видов и форм, с помощью которых клетки накапливают продукты специфического синтеза и высвобождают их во внеклеточную среду, относятся к категории внутриклеточных включений. Хотя секреторные гранулы могут проходить ряд стадий в процессе своего созревания, при которых существенно модифицируется их содержимое, они не обладают собственной активностью, характерной для клеточных органелл.

Категория внутриклеточных (цитоплазматических) включений довольно обширна и объединяет структуры, которые могут быть самого различного строения и формы, с различными содержимым и границами. Хотя они, подобно секреторным пузырькам, являются относительно инертными компонентами клетки, их роль в обеспечении клеточных функций может быть весьма важной. Так, пигментные гранулы меланина, накапливающиеся в некоторых клетках, не предназначены для секреции, но выполняют функции своеобразного экрана, который абсорбирует световые потоки (ультрафиолетовое излучение) в коже.

Меланоциты кожи синтезируют гранулы меланина и размещают их в цитоплазме кератиноцитов, составляющих основную массу клеток эпидермиса. В сосудистой и внутренней оболочке глаза (в реснитчатом теле, сетчатке) пигментные клетки образуют почти сплошной слой и накапливают гранулы меланина (МГ), чтобы поглощать световые потоки, которые не падают непосредственно на светочувствительные элементы - палочки и колбочки сетчатки. Можно видеть, что пигментные гранулы, как правило округлой формы и разного размера, оккупируют существенную часть цитоплазмы клеток пигментного эпителия (ПЭ). Гранулы меланина, как и секреторные, окружены собственной мембраной. Поскольку срез прошел тангенциально по отношению к эпителиальной поверхности, в него попали и не пигментные клетки, например фибробласты (ФБ), секретирующие коллагеновые волокна (КОЛ). В отличие от ранее представленных иллюстраций коллаген здесь окрасился негативно, и волокна видны как светлые структуры на более темном фоне. Клетку (КЛ) в центре рисунка идентифицировать трудно. Ее цитоплазма плотно заполнена гранулами, которые напоминают гранулы муцинпродуцирующих клеток (см. рис. 4-31), однако в ней находятся и крупные гранулы пигмента. Мелкие гранулы характерны для более молодых эпителиальных клеток.

Каждая клетка синтезирует множество разных белков, иногда в огромных количествах. В процессе синтеза (трансляции, посттрансляционной модификации) могут, очевидно, появляться ошибки, приводящие к дефектным конечным продуктам или их избыточному синтезу. Такие неправильные белки, синтезированные в эндоплазматической сети, могут быть возвращены для коррекции ретроградным транспортом через комплекс Гольджи. Вместе с тем существующий в клетке механизм контроля качества синтеза, включающий шапероны - регуляторные белки, ответственные за складывание (фолдинг) 3-мерной структуры, останавливает синтез белка на этапе посттрансляционной модификации. Белки с морфологически неправильным фолдингом и агрегированные белки, синтезированные в цистернах эндоплазматической сети, могут накапливаться в их просвете в виде так называемых русселевских телец.

Дефектные цитозольные белки подлежат деградации с помощью специальных белковых комплексов, протеасом, сигналом для работы которых является связывание полипептида с убиквитином. Неполная или незавершенная деградация убиквитинированных полипептидов может приводить к формированию скоплений электронно-плотного материала в цитоплазме, которые получили название агресом (АС). Агресомы относятся к категории внутриклеточных включений. Они лишены мембранных границ и содержат, помимо белковых агрегатов, шапероны и протеасомы. Как правило, неправильные цитозольные белки концентрируются в виде агресом недалеко от клеточного центра, поскольку транспортируются сюда по системе микротрубочек в направлении к их (-)-концам (см. гл. 5).

ЛС - лизосомы; ЭС - цистерны эндоплазматической сети; МХ - митохондрии.

Все клетки способны к движению, и это движение может быть разным. Мы можем определить локомоцию как перемещение клеток в пространстве - это обычное поведение клеток, живущих как обособленные единицы (нейтрофилы, макрофаги, фибробласты, сперматозоиды). У эпителиальных клеток, существующих только в виде пластов или групп, в которых они прочно связаны с клетками-соседями и внеклеточным матриксом, движения ограничены, но эти клетки способны изменять свою форму, рельеф поверхности или поглощать вещества с помощью эндоцитоза.

Некоторые клетки (мышечные) специализированы для выполнения движения. Изменяя свою форму, они развивают напряжение, что позволяет выполнять механическую работу - перемещать части тела, изменять просвет полых органов или тонус их стенок. В клетках исчерченной, или поперечно-полосатой, мышечной ткани (в скелетных мышечных волокнах, клетках миокарда, пищевода) для выполнения этой работы существуют специальные органеллы - миофибриллы. Координированное биение других специализированных органелл движения, ресничек, покрывающих поверхность дыхательного эпителия и эпителия маточных труб, перемещает в пространстве не сами клетки, но окружающую их среду.

Практически все клетки осуществляют направленный перенос в цитоплазме транспортных контейнеров и органелл. Для нервных клеток, имеющих иногда очень длинные отростки (аксоны), этот вид движения выделяется как особый процесс - аксональный транспорт. Аппарат клеточного движения участвует в распределении хромосом при делении клеток, в разделении самой цитоплазмы. Перемещение больших масс клеток и их интенсивная миграция происходят в процессе эмбрионального развития, при осуществлении иммунологических реакций или при заживлении обширных ран.

Все клетки поддерживают свою, характерную для них и иногда весьма причудливую, форму. Это также требует участия аппарата клеточного движения - цитоскелета. Цитоскелет - это клеточная органелла, включающая различные фибриллярные, или филаментозные (нитчатые), структуры - актиновые и промежуточные филаменты, микротрубочки.

Собственно скелетные функции в клетке выполняют только промежуточные филаменты даметром 10-11 нм. Их сеть создает цитоплазматический каркас, в котором закрепляются клеточные органеллы и к которому фиксируются сократительные филаменты - актиновые филаменты и микротрубочки. На внутренней поверхности ядерной оболочки существует решетка - ядерная ламина, также образованная промежуточными филаментами. Параллельная ориентация промежуточных филаментов (нейрофиламентов) в длинных отростках нервных клеток придает им необходимую прочность и гибкость. Промежуточные филаменты построены из различных белков, названия которых часто зависят от принадлежности - белки нейрофиламентов, белки ядерной ламины, глиальные фибриллярные кислые белки астроцитов (глиальных клеток).

Тонофиламенты эпителиальных клеток, особенно демонстративные в клетках эпидермиса, образуются из белков кератинов. Клетки мезенхимного происхождения - фибробласты, лейкоциты, эндотелиальные клетки - содержат филаменты из белка виментина. Эти различия в составе промежуточных филаментов используются в медицинской практике для определения принадлежности и происхождения опухолевой ткани.

Все клеточные движения осуществляются на основе взаимодействия пар белков в двух различных механохимических системах. Одна система, актиновая, включает тонкие филаменты и использует в качестве 2-го компонента - моторного белка - белки семейства миозинов. В другой, тубулиновой, системе в качестве моторных выступают белки кинезины и динеины, которые взаимодействуют с микротрубочками. Моторные белки являются АТФазами, т.е. ферментами, способными расщеплять аденозинтрифосфат (АТФ) и, следовательно, высвобождать энергию, необходимую для движения. Очень важно, что при гидролизе АТФ изменяется конформация моторного белка, т.е. взаиморасположение его частей. Изменение конформации, собственно, и создает усилия, необходимые для совершения работы. Эти усилия передаются на актиновые филаменты или микротрубочки, смещают области их фиксации в цитоплазме или у клеточной мембраны и тем самым осуществляют движение.

Сами филаменты при этом не изменяют свою длину, но лишь скользят относительно друг друга или относительно других филаментов. Актиновые филаменты (АФ), или микрофиламенты, диаметр которых не превышает 6-7 нм, образованы белком актином. Актины могут несколько отличаться в разных клетках. В цитоплазме актин существует в двух формах - глобулярной и фибриллярной. Из мономеров глобулярного G-актина собирается фибриллярный полимер (F-актин). Две F-актиновые нити скручиваются в пологую двойную спираль, которая, собственно, и представляет собой актиновый филамент. Микротрубочки (МТ), внешний диаметр которых составляет 25 нм, собираются из тубулина, представляющего собой гетеродимерный глобулярный белок. Тубулин укладывается продольными рядами - протофиламентами параллельно оси микротрубочки так, что стенка полной МТ включает 13 протофиламентов. В клетке АФ и МТ тесно связаны с другими протеинами (актин- и тубулинассоциированными белками).

Модель скользящих нитей, описывающую механику клеточного движения, можно хорошо продемонстрировать на примере саркомера - двигательной единицы, организующей аппарат движения в исчерченных мышцах. Линейная последовательность саркомеров в этой мышечной ткани образует специальную органеллу - миофибриллу. Границами саркомеров являются зоны прикрепления тонких филаментов - Z-линии (телофрагмы), каркас которых образован актинсвязывающим белком α-актинином. Свободные концы АФ ориентированы к срединной М-линии (мезофрагме) - зоне фиксации хвостов молекул миозина, которые в этом случае упакованы в толстые миозиновые филаменты (М-филаменты), образованные моторным белком миозином II. Головки миозина, обладающие АТФазной активностью, выступают из толстого филамента с определенной периодичностью и обращены к соседним АФ. При связывании АФ с головками миозина в соответствующей фазе цикла сокращение-расслабление можно видеть временно существующие М-мостики. Гексагональная упаковка АФ вокруг миозиновой нити хорошо видна на поперечных срезах саркомера в зоне анизотропного диска или полосы А, где взаимодействуют тонкие и толстые филаменты. Цикл сокращения включает прикрепление головки миозина к ближайшему АФ, изменение величины угла между головкой и хвостом молекулы миозина (изменение конформации), гидролиз АТФ, за которым следует отделение головки от АФ и возврат белка в прежнее конформационное состояние. Такие циклы быстро повторяются, и множество головок миозина взаимодействуют с окружающими тонкими филаментами одновременно. Инициация цикла сокращения осуществляется ионами Са²+, которые связываются с АФ с помощью белкового комплекса тропонина. Саркоплазматическая сеть (гомолог гладкой эндоплазматической сети) в исчерченных мышцах регулирует цитоплазматическую концентрацию Са²⁺ в ответ на изменение заряда (деполяризацию) клеточной мембраны (сарколеммы).

Глубокие инвагинации сарколеммы в цитоплазму формируют так называемую Т-систему. Мембранные трубочки (Т-трубочки) внедряются в цитоплазму мышечного волокна и слепо заканчиваются у каждой миофибриллы на уровне границы между полосой A и полосой I (изотропным диском) - зоной, в которой АФ не перемежаются с толстыми филаментами, или на уровне Z-диска в мышечных клетках сердца. Саркоплазматическая сеть здесь образует два (в кардиомиоцитах - одно) расширения - цистерны, мембраны которых соседствуют с мембраной Т-трубочки. Так формируются характерные мембранные конструкции - триады (в кардиомиоцитах - диады). Каким образом сигнал с возбужденной клеточной мембраны (мембраны Т-трубочки) передается на мембраны цистерн саркоплазматической сети, не ясно, но результатом этого взаимодействия являются открытие кальциевых каналов в мембранах цистерн и быстрое поступление Са² + в цитоплазму. Суммарные усилия, которые развиваются при изменении конформации миозиновых молекул, тянут АФ к срединной линии. АФ скользят вдоль М-филаментов, что приводит к укорочению саркомера. Это хорошо видно по уменьшению ширины полосы I. Сокращение саркомеров в миофибрилле и всех миофибрилл в клетке происходит обычно синхронно. Концы миофибрилл прикрепляются к внутренней поверхности клеточной мембраны у полюсов клетки (например, в кардиомиоците - в зоне адгезивных фасций вставочного диска). Таким образом, сокращение саркомеров укорачивает клетку или волокно в целом.

Такой же принцип скольжения АФ используется при сокращении гладких мышечных и миоэпителиальных клеток, миофибробластов и других клеток с развитой системой актиновых филаментов. Однако в этих клетках нет упорядоченной саркомерной структуры. АФ образуют пучки, которые закрепляются в некоторых участках цитоплазмы в зоне плотных телец или на внутренней поверхности плазмолеммы (плотные пластинки). Сравнительно короткие молекулы миозина не формируют толстых волокон, но свободно располагаются между микрофиламентами. Концентрация ионов Са²⁺ в цитоплазме регулируется с помощью специального белка кальмодулина. Сокращение гладких миоцитов происходит медленнее, чем сокращение исчерченных мышечных клеток и волокон.

Свободно живущие клетки - фибробласты, клетки мезенхимы, макрофаги - при миграции и фиксации к субстрату также формируют временные пучки АФ - стресс-волокна. Однако их сокращение не является единственным механизмом, перемещающим клетку. Эти клетки используют также механизм амебоидного движения. В его основе лежит не скольжение АФ, а их быстрая полимеризация, приводящая к удлинению филаментов, преимущественно в кортикальной зоне цитоплазмы у лидирующего фронта клеток. АФ - динамичная структура. Он быстро собирается из мономеров актина, которые могут присоединяться к обоим концам нити. Этот АТФ-зависимый процесс может приводить к удлинению филамента со скоростью до 6-7 мкм/с. Столь же быстро может происходить деполимеризация АФ. Оба процесса регулируются так, что на одном, (+)-конце, сборка доминирует и филамент удлиняется в определенном направлении. Обычно (+)-концы АФ ориентированы в направлении движения мигрирующей клетки. За счет быстрой полимеризации филамента у лидирующего края клетки формируются выросты - ламмелоподии, продвигающие клетки в направлении движения, и филоподии, помогающие клетке ориентироваться в окружающей среде.

Гельзоль превращения цитоплазмы, характерные для амебоидного движения, связаны с полимеризацией и деполимеризацией АФ. Клетки фиксируются к субстрату, по которому они ползут, с помощью специальных рецепторов - трансмембранных белков интегринов. Интегрины специфически связываются с молекулами внеклеточного матрикса (см. гл. 3), создавая тем самым необходимую опору для перемещения клеточной мембраны и цитоплазмы. В хвостовой зоне клетки, противоположной лидирующему краю, АФ быстрее разбираются, чем собираются, и цитоплазматический пул мономерного G-актина вновь используется для полимеризации АФ у лидирующего фронта.

Амебоидное движение включает постоянную циркуляцию цитоплазмы и поток клеточной мембраны, которая перемещается от свободной поверхности к «подошве» для прикрепления к субстрату. По мере перемещения в направлении движения интегрины плазмолеммы в зоне хвоста теряют связь с матриксом. Кортикальная сеть АФ выражена не только у мигрирующих клеток. Ее расположение в зоне цитоплазмы около плазмолеммы позволяет АФ участвовать в механизмах секреции и эндоцитоза (см. гл. 3).

АФ, связанные в пучок параллельных нитей белками, ассоциированными с актином (виллином, фимбрином), образуют своеобразный скелет микроворсинок, покрывающих апикальные домены поверхности абсорбирующего эпителия (см. гл. 3). Иногда эта упаковка АФ может напоминать гексагональную упаковку филаментов в саркомере, но без центрально расположенной толстой нити миозина. В микроворсинке миозин немышечного типа (миозин I) прикрепляет АФ к клеточной мембране. Это придает определенную жесткость микроворсинкам и позволяет даже несколько изменять их высоту при интенсивном всасывании. Проксимальные концы АФ микроворсинки фиксируются в цитоплазме клетки в терминальной сети. Один из компонентов этой сети - пучки АФ, идущие параллельно поверхности клетки и прикрепляющиеся в пластинке адгезионного пояска (см. гл. 3). Сокращение этих пучков в соседних клетках, объединенных клеточными контактами, может приводить к изменению формы (кривизны) всего эпителиального пласта.

При движении реснички также используется принцип скольжения фибриллярных структур - микротрубочек (МТ). Сама ресничка покрыта плазмолеммой, и на этом основании ее иногда относят к производным клеточной мембраны. Однако это настоящая органелла движения. Внутренняя структура реснички - аксонема - представляет собой упорядоченный комплекс МТ и ассоциированных с ними белков.

Каждый из 9 дуплетов микротрубочек, расположенных по периферии, образован полной МТ, включающей все 13 протофибрилл (микротрубочка А), и тесно с ней связанной неполной МТ (микротрубочка В, 10 протофибрилл). В центре реснички расположены две отдельно лежащие синглетные, или центральные, МТ. Белковые комплексы (нексиновые мостики, тектин) связывают дуплеты между собой и с зоной центральных МТ. От микротрубочки А к микротрубочке В соседнего (по часовой стрелке) дуплета с регулярными интервалами протягиваются ручки, образованные молекулами моторного белка динеина. Головки динеина обладают АТФазной активностью и способны временно связываться с МТ. При этом молекулы динеина изменяют свою конформацию и тянут соседний дуплет, пытаясь сместить его вдоль оси реснички.

Если бы дуплеты МТ не были прикреплены через базальный корешок в основании реснички к базальному тельцу (центриоли), а также между собой и к центральным микротрубочкам, такое смещение было бы возможно. Это и происходит при добавлении АТФ к бесклеточной системе микротрубочек, выделенных из реснички. В аксонеме подвижной реснички дуплеты не смещаются, но изгибаются в определенном направлении в плоскости, проходящей через дуплеты 5-6, центр реснички и противолежащие дублеты. Такой синхронный изгиб (удар) множества ресничек, помещенных в вязкий муциновый (слизистый) слой внеклеточной среды, вызывает смещение этого слоя вдоль клеточной поверхности. Механизмы синхронизации биения ресничек на поверхности эпителиального пласта не очень ясны и, возможно, объясняются просто механическим взаимодействием с вязкой средой.

Для обеспечения последовательного перемещения среды в одном направлении (например, в дыхательных путях - в сторону глотки) фазы биения групп ресничек по времени несколько сдвинуты (десинхронизированы). Возврат реснички в прежнее положение связан с отделением головок динеина от соседнего дуплета и с восстановлением исходной конформации белка. Возвратное движение более сложное. Оно достигается изгибом реснички в направлении, обратном биению, и одновременным вращением свободного кончика органеллы.

При возвратном движении реснички перемещаются в менее вязком слое среды непосредственно у клеточной поверхности и поэтому не передвигают муциновый слой в обратном направлении. В целом цикл биение-возврат внешне напоминает движение пастушьего кнута. Синусоидальное движение жгутика сперматозоида у эукариот организуется подобным же образом, но в этом случае зона изгиба смещается вдоль оси жгутика.

Строение базального тельца реснички идентично строению центриоли. В этих органеллах на периферии расположены не дуплеты, а триплеты микротрубочек (добавляется неполная микротрубочка С), а центральные МТ отсутствуют. Триплеты микротрубочек в центриоли располагаются под некоторым углом друг к другу, в целом напоминая лопасти турбины. Центриоли являются основными «организаторами» системы микротрубочек не только в интерфазной клетке, но и при ее делении (см. гл. 7). Вся конструкция реснички (аксонема) развивается на матрице, роль которой выполняет центриоль. В последующем она превращается в базальное тельце. Роль самого базального тельца в развитой ресничке не очень понятна.

Помимо парных микротрубочек ресничек, характерных для некоторых эпителиальных клеток и жгутиков сперматозоидов, в клетках существует цитоплазматическая сеть, образованная одиночными МТ. Эта сеть имеет радиальную симметрию и простирается на периферию от клеточного центра (центросомы) - пары центриолей, ориентированных под углом друг к другу. В состав клеточного центра входят центросомный матрикс и так называемый сателлит центриоли (центр организации микротрубочек - ЦОМТ) - зона электронно-плотного фибриллярного материала без определенной структуры. Одна из центриолей, материнская, является полностью дифференцированной и имеет отростки, в которых закрепляются радиально отходящие цитоплазматические МТ. При необходимости (например, при формировании митотического веретена для деления клеток или при развитии ресничек) центриоли удваиваются, при этом каждая новая центриоль пары формируется под прямым углом к существующей материнской, которая используется как матрица для синтеза новой центриоли.

Цитоплазматическая сеть МТ динамична, она может реорганизовываться благодаря сборке и разборке МТ (полимеризации и деполимеризации димеров тубулина). При формировании сети ЦОМТ является центром нуклеации микротрубочек, где роль затравки выполняет специальная форма γ-тубулина. МТ, как и АФ, имеют (+)- и (-)-концы. Они закреплены в области клеточного центра своими (-)-концами, что позволяет оперативно изменять общую конструкцию сети за счет сборки-разборки (+)-концов. Эта способность микротрубочек к быстрой полимеризации-деполимеризации, которая лежит в основе функциональной перестройки всей сложной конструкции, определяется как динамическая нестабильность микротрубочек.

Помимо поддержания формы и прочности клеток и их отростков микротрубочки цитоплазматической сети исполняют роль своеобразных рельсов, по которым перемещаются многочисленные транспортные контейнеры (см. гл. 4) и другие органеллы (например, митохондрии в аксонах нервных клеток). В качестве моторных белков для генерации такого движения используются цитоплазматическая форма динеина и другие белки с АТФазной активностью - кинезины. Динеин перемещает пузырьки по направлению к (-)-концу МТ, кинезин - в противоположном направлении. Эти белки закрепляются своими хвостами (или ручками) на мембране транспортируемой органеллы, а сегменты их головки поочередно связываются с МТ. Изменяя угол между головкой и хвостом, белок шагает вдоль МТ и переносит контейнер с содержимым в соответствующем направлении. Таким путем достигаются двунаправленный транспорт и сортировка молекул практически во всей клетке. Подобным же образом в движении органелл могут принимать участие и актиновые филаменты. В качестве моторного белка в этом случае выступает одна из немышечных форм миозина - миозин V.

Участие сократительных филаментов - микротрубочек и актиновых филаментов - в механизмах клеточного деления описано в главе 7.

Исчерченная (синоним - поперечно-полосатая) мышечная ткань может быть связана со скелетом (и обеспечивать перемещение частей тела в пространстве) или входить в состав стенок внутренних органов (например, сердца, пищевода), обеспечивая их сокращение. В основе термина лежит строгая упорядоченность организации сократительных органелл - миофибрилл и миофиламентов, взаимодействие которых лежит в основе сокращения мышечных клеток. Миофибриллы (МФ) в скелетной мышце, как и в мышце сердца, уложены строго параллельными рядами и связаны между собой так, что соответствующие участки миофибрилл - светлые и темные полосы, или диски (СД и ТД), располагаются на одном уровне. Эта исчерченность выявляется на светооптических препаратах и особенно демонстративна при электронно-микроскопическом исследовании.

Исчерченные миоциты скелетных мышц представляют собой своеобразную модификацию клеток - синцитий. Это длинные многоядерные цилиндрические структуры (мышечные волокна), протягивающиеся обычно на несколько сантиметров или на всю длину мышцы. Скелетные мышечные волокна включают тысячи миофибрилл, которые через сухожилие прикрепляются к костям скелета или к другому сухожилию (например, при формировании апоневрозов). Такая организация сократительных структур, а также особенности иннервации позволяют миофибриллам мышцы сокращаться практически одновременно и развивать значительные усилия.

Хотя исчерченные мышечные клетки внутренних органов имеют свои особенности строения, несколько отличающие их от строения скелетных мышц, механизмы сокращения в разных типах исчерченной мышечной ткани практически идентичны. Более того, на их примере лучше всего обсуждать основной механизм, который лежит в основе любого клеточного движения, взаимодействие сократительных фибриллярных структур (микрофиламентов, микротрубочек) и так называемых моторных белков, которые, собственно, и развивают необходимое усилие.

В отличие от скелетных мышечных волокон исчерченные мышечные клетки сердца являются обычными клетками, хотя группы таких последовательно связанных клеток также нередко называют волокнами. Эти удлиненные клетки с несколькими отростками имеют 1-2 ядра, располагающиеся обычно в центральной зоне цитоплазмы. Здесь же, в околоядерной зоне и в зонах, прилежащих к плазмолемме, локализуется аппарат синтеза цитозольных белков - полирибосомы (см. рис. 4-12, 5-4). Гранулярная эндоплазматическая сеть развита довольно слабо, поскольку основную массу синтезируемых белков в кардиомиоците составляют белки миофиламентов и митохондрий, т.е. цитозольные протеины.

Как и в скелетном мышечном волокне, основной объем цитоплазмы кардиомиоцитов занят плотно упакованными сократительными органеллами - миофибриллами (МФ). Их темные и светлые участки и полосы, придающие клеткам исчерченный вид, также строго упорядочены и соответствуют друг другу. Вследствие больших энергозатрат, необходимых для обеспечения сердечных сокращений, соседние миофибриллы обычно разделяются рядами митохондрий (МХ), число и развитость которых в кардиомиоцитах существенно больше, чем в скелетных мышечных волокнах. Скопления митохондрий в околоядерных зонах обеспечивают энергетические нужды синтеза.

Кусочек ткани миокарда правого желудочка был деликатно обработан слабым раствором трипсина. Однако частичное разрушение мышечных клеток не привело к деструкции сократительных органелл - миофибрилл.

Каждая миофибрилла представляет собой упорядоченную последовательность регулярно повторяющихся участков, или зон. Они получили название полос, линий или (с учетом 3-мерности структуры) дисков. Наиболее плотная узкая полоса - это Z-линия (телофрагма), которая является местом фиксации (+)-концов тонких или актиновых филаментов (другое распространенное название - микрофиламенты). Совокупности этих филаментов, видимые как две светлые полосы по обе стороны от Z-линии, формируют общую полосу I (изотропный диск). Свободные сегменты актиновых филаментов простираются в широкую электронно-плотную зону - полосу А (анизотропный диск). В центре полосы А видна более светлая полоса H с плотной М-линией (мезофрагмой). М-линия - это участок, в котором фиксированы толстые филаменты (М-филаменты или миозиновые филаменты) на середине их длины.

Н-полоса соответствует отрезкам М-филаментов, лишенным головок миозина (см. рис. 5-5, 5-6). М-филаменты простираются по обе стороны М-линии, а их концы обращены к Z-линиям. Таким образом, большая часть полосы А (анизотропного диска) представляет собой зону, где перекрываются обращенные друг к другу сегменты тонких (актиновых) и толстых (миозиновых) филаментов. Степень перекрытия зависит от степени сокращения миофибриллы. Эта часть миофибриллы обладает свойством двойного лучепреломления (анизотропией). В I-полосе присутствуют только микрофиламенты, поэтому этот диск не способен вращать плоскость поляризованного света (изотропен). Строение миофибрилл и механизм сокращения идентичны для всех исчерченных мышечных тканей - скелетной, сердечной и висцеральной несердечной.

Повторяющийся сегмент миофибриллы, ограниченный с обеих сторон Z-линиями, называется саркомером (миомером). Его считают структурно-функциональной единицей исчерченной мышечной ткани. МХ - митохондрии.

Представлен саркомер - фрагмент миофибриллы сердечной мышечной клетки, зафиксированной в состоянии умеренного сокращения. Границами саркомера являются две электронно-плотные Z-линии, к которым прилежат половинки I-дисков, или полос. На этих участках видны параллельно расположенные актиновые филаменты (микро-филаменты). Их (+)-концы стабилизированы в зоне Z-линии с помощью некоторых актинсвязанных белков ( α-актинин, белок capZ, небулин). Актиновые филаменты простираются в направлении полосы А и располагаются в гексагональном порядке вокруг толстых (миозиновых) филаментов (см. рис. 5-6). Последние закрепляются на середине их длины в зоне линии М с помощью миозинассоциированных белков. Кроме того, очень длинные и эластичные молекулы белка титина связывают концы М-филаментов с Z-линией, стабилизируя их параллельную ориентацию и предохраняя саркомер от перерастяжения.

В основе сокращения лежит не укорочение сократительных нитей, а взаимодействие между актиновыми и миозиновыми филаментами, в процессе которого обе совокупности фибрилл скользят относительно друг друга и навстречу друг другу. Это перемещение достигается за счет усилий, которые развиваются при взаимодействии двух белков - актина и миозина (см. рис. 5-5, 5-6). Результирующее усилие, которое генерируется в каждом саркомере, пытается сместить Z-полосы навстречу друг другу, но поскольку полосы Z являются общими для последовательно соседних саркомеров, а все саркомеры сокращаются одновременно, конечный результат выражается в укорочении всей миофибриллы. Модель скользящих нитей считается достаточно универсальной и справедлива не только для исчерченных мышц, но и для гладких мышечных клеток, для актиномиозиновых систем немышечных клеток и даже для взаимодействия микротрубочек с моторными белками в таких структурах, как реснички (см. рис. 5-22). Видны также характерные для миокарда митохондрии (МХ), полирибосомы (ПС), плазмолемма клетки (в мышечных клетках она называется сарколеммой - СЛ) с клатриновой ямкой (КЛ) и везикулой, а также фрагмент эндотелиальной клетки кровеносного капилляра (ЭК), который очень тесно прилежит к кардиомиоциту. Следует обратить внимание на то, что и мышечная клетка, и эндотелиоцит имеют собственные базальные пластинки.

Эти два рисунка целесообразно обсуждать совместно, поскольку они демонстрируют разные аспекты одного сюжета - пространственных взаимоотношений (и взаимодействий) тонких (актиновых) и толстых (миозиновых) филаментов в зоне, где обе совокупности филаментов перекрываются, т.е. в зоне А-полосы.

На рис. 5-5 виден фрагмент саркомера, включающий Z -полосу - место прикрепления актиновых филаментов (АФ), и область А-полосы, где мио-зиновые и актиновые филаменты перекрываются. Свободные концы миозиновых филаментов (МФ) образуют границу полосы I. Можно видеть также, что между чередующимися тонкими и толстыми филаментами существуют поперечные связи (М-мостики), которые под углом протягиваются от миозиновой нити к соседнему АФ (стрелки). Эти мостики выявляются не всюду, поскольку они образованы головками миозиновых молекул, выступающими с определенной периодичностью по окружности МФ, а следовательно, не всегда попадают в плоскость среза.

АФ, видимые в зоне I-диска, представляют собой волоконца, каждое из которых образовано двумя пологими спиралями фибриллярного актина (F-актина). Эта полимерная форма белка образуется из мономеров глобулярного актина (G-актина). Длина образующейся нити F-актина регулируется кэпирующими (от англ. cap - шапочка) белками (например, белок capZ в Z-линии). Две цепи F-актина скручиваются в пологую суперспираль - АФ.

МФ образованы молекулами одной из изоформ миозина (миозина II). Эта молекула имеет довольно длинный хвост и головку, шейка которой ориентирована под углом по отношению к оси хвоста. Головки миозина обладают АТФазной активностью (способностью расщеплять АТФ с освобождением энергии) и сродством к активному центру (сайту) актина. При отсутствии АТФ формируются прочные связи между головками миозина и соседним АФ (эти связи и определяют окоченение мышц, которое развивается после смерти). Каждый МФ образован сотнями димеров миозина II, которые скручиваются своими хвостами. Головки молекул выступают по окружности нити с интервалом 60° в виде спирали с периодичностью около 14 нм. На рис. 5-6 при большом увеличении представлено изображение поперечного среза саркомера на уровне, который примерно соответствует пунктирной линии на рис. 5-5 (там, где филаменты перекрываются).

Обращает на себя внимание строго гексагональная ориентация тонких АФ вокруг МФ: каждая миозиновая нить окружена шестью актиновыми (в соответствии с положением головок миозина через каждые 60° по окружности). Эти головки выявляются в виде М-мостиков, протягивающихся в сторону актиновых нитей (стрелки). Цикл сокращения, который приводит к генерации механического усилия, необходимого для продвижения двух наборов филаментов друг относительно друга (скользящие нити; см. рис. 5-4), условно разделяют на 4-5 фаз. В основе цикла лежат конформационные изменения молекулы миозина, точнее, ее подвижного сегмента - шейки. Этот цикл включает:

Этот возврат к исходному состоянию молекулы миозина и есть, собственно, то эффективное событие, которое перемещает соседние нити актина и мози-на. Оно происходит уже на новом сайте актиновой нити, т.е. на расстоянии около 5 нм, и сопровождается освобождением АДФ. Затем цикл повторяется. Поскольку цикл сокращения осуществляется синхронно во множестве точек взаимодействия актина и миозина, актиновые и миозиновые филаменты скользят друг относительно друга, сокращается весь саркомер, миофибрилла и мышца в целом.

Агранулярная (гладкая) эндоплазматическая сеть в мышечных клетках, помимо участия в синтезе липидов и карбогидратов, выполняет еще одну важную функцию - регулирует содержание ионов кальция (Ca² +) в цитоплазме. В исчерченных мышечных клетках эта функция является доминирующей. Цикл сокращения (взаимодействия миозиновых и актиновых филаментов), который мы обсуждали ранее (см. рис. 5-5, 5-6), вызывается резким, на 2 порядка, подъемом концентрации Ca² + в цитозоле, и связыванием ионов кальция с белками, которые ассоциированы с актиновыми филаментами. Это внезапное повышение концентрации кальция обеспечивается выходом его из саркоплазматического ретикулума - агранулярной эндоплазматической сети мышечных клеток. Саркоплазматический ретикулум (СР) в скелетных, сердечных и других висцеральных исчерченных мышечных клетках представляет собой систему трубчатых элементов, которая в виде сети окружает каждый саркомер. Примерно на уровне Z-линии (Z) в кардиомиоцитах или на уровне границы между I- и А-полосами в скелетной мышце СР имеет уплощенные циркулярные расширения - цистерны (Ц). Эти цистерны тесно соседствуют с так называемыми поперечными Т -трубочками, которые представляют собой очень глубокие трубчатые инвагинации клеточной мембраны (сарколеммы). Связывание Ca² + с актинассоциированным белковым комплексом тропонином необходимо для того, чтобы освободить активный сайт на микрофиламенте и сделать его доступным для связывания с головкой миозина. Механизм такого освобождения не очень прост. Четыре иона Ca² + связываются с одним из трех компонентов тропонинового комплекса, тропонином С, что приводит к разблокированию ингибирующего компонента, тропонина I, и активации 3-го компонента, тропонина Т. Тропонин Т смещает длинную молекулу другого актинассоциированного белка, тропомиозина, из желобка суперспирали актиновой нити и тем самым освобождает сайт для связывания с головкой миозина. Ионы Ca² +, таким образом, являются триггером каждого единичного события сокращения и по завершении цикла должны диссоциировать из тропонинового комплекса, что возможно при уменьшении концентрации кальция в цитозоле. Саркоплазматический ретикулум активно откачивает ионы Ca²+ из цитозоля, восстанавливая, таким образом, их исходную фоновую концентрацию. Процесс весьма быстрый и длится около 30 мс. Для инициации следующего цикла необходим повторный выброс Ca²⁺ в цитоплазму клетки. МХ - митохондрии.

Саркоплазматический ретикулум (СР) в исчерченных мышцах регулирует содержание ионов Ca² + в цитозоле клетки таким образом, что резкое увеличение их концентрации инициирует единичный цикл сокращения и синхронизирует взаимодействия между актином и миозином одновременно во многих активных сайтах. Выброс кальция и его возврат осуществляются периодически, обеспечивая, таким образом, достаточно продолжительное сокращение мышцы в целом. Однако само открытие кальциевых каналов в мембранах саркоплазматической сети, ведущее к увеличению концентрации ионов в цитозоле, регулируется внешними событиями. Таким событием является потенциал действия (деполяризация) клеточной мембраны, который переносится глубоко в цитоплазму клеток по системе поперечных или Т-трубочек (Т) - глубоких инвагинаций сарколеммы, которые достигают практически каждого саркомера. Топографически Т-трубочки располагаются в очень тесном соседстве с уплощенными цистернами (Ц) саркоплазматического ретикулума. Поскольку в кардиомиоцитах для каждого саркомера существует только одна такая цистерна, она вместе с Т-трубочкой образует диаду - функциональный комплекс двух мембранных структур. Расстояние между мембранами Т-трубочки и цистерны составляет около 40 нм. Диада располагается на уровне Z-полосы. В скелетных исчерченных мышцах Т-трубочка лежит между двумя уплощенными цистернами СР, таким образом, вместо диады формируется трида. Она локализуется на уровне границы между I- и А-дисками, т.е. там, где расположены свободные концы толстых филаментов. Очевидных анатомических связей между Т-трубочкой и цистернами ретикулума нет, и точный механизм передачи импульса с одной мембраны на другую пока не ясен. МХ - митохондрии с плотно упакованными кристами; Р - рибосомы.

Гладкие мышечные клетки (ГМК) специализированы для генерации медленного, длительного и сильного непроизвольного сокращения. Они обычно не сокращаются как изолированные единицы, но работают совместно в составе мышечных пучков, пластов или слоев в стенке внутренних органов (кровеносных сосудов, кишки, матки, бронхиального дерева и т.д.). В их функциональном объединении принимают участие многочисленные щелевые соединения, или нексусы (см. рис. 3-39-3-41), которые в виде ограниченных кластеров связывают мембраны соседних клеток (стрелки). Роль скелетных структур в мышечном пласте выполняет сеть коллагеновых (КВ) и эластических (ЭВ) волокон, которая оплетает миоциты и интегрирует их совместное механическое усилие. Результат такой интеграции выражается в сокращении стенок внутренних органов, имеющих, как правило, форму трубки.

В отличие от тонкого строения скелетных и сердечных мышц структура сократительного аппарата гладких миоцитов менее упорядочена, а сами клетки больше напоминают обычные веретеновидные или отростчатые клетки соединительной ткани. Однако принцип организации сокращения (модель скользящих нитей), с определенными модификациями, выдерживается и в гладких мышечных клетках. Актиновые и миозиновые филаменты в цитоплазме ГМК не формируют повторяющиеся саркомерные конструкции. Пучки тонких филаментов перемежаются длинными молекулами миозиновых филаментов (миозин II), которые на всем протяжении, за исключением концов, имеют головки для связывания с соседними актиновыми филаментами. Актиновые филаменты с помощью ассоциированных белков (например, α-актинина) и белков промежуточных филаментов (десмина, виментина) прикрепляются в некоторых зонах цитоплазмы, которые известны как цитоплазматические уплотнения, или плотные тельца (ПТ), или в уплотнениях клеточной мембраны (плотных пластинках - ПП).

В своеобразных гладких мышцах пищевода птиц актиновые филаменты (А) упакованы не очень плотно, что позволяет проследить их ориентацию и прикрепление к плотным тельцам (ПТ) в цитоплазме. Результаты 3-мерной реконструкции показывают, что ПТ цитоплазмы непосредственно или через пучки промежуточных филаментов связаны между собой и с уплотнениями клеточной мембраны (плотными пластинками - ПП). Таким образом формируется единый внутренний скелет гладкой мышечной клетки (ГМК), который в целом можно рассматривать как аналог Z-полос в исчерченных мышцах. ПП, т.е. точки конечной фиксации актиновых филаментов, в виде ограниченных участков распределены по всей сарколемме. Микрофиламенты в гладких миоцитах ориентированы не вдоль длинной оси клеток, а в косом направлении, и при сокращении сами клетки не только укорачиваются, но и деформируются, так что клеточная поверхность приобретает фестончатый вид (см. рис. 5-12). ГМК отличаются от исчерченных мышечных волокон не только организацией сократительного аппарата, но и способом регуляции самого сокращения. Как и в исчерченных мышцах, это сокращение индуцируется увеличением концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме. Однако в ГМК отсутствует тропониновый комплекс, и ионы Са²⁺ связываются специальным белком кальмодулином. Комплекс кальмодулин - Са²⁺ активирует фермент киназу легкой цепи миозина, которая фосфорилирует миозин, позволяя ему связываться с актином для инициации цикла сокращения. Нефосфорилированный миозин неактивен. Белок кальдесмон, активность которого зависит от комплекса кальмодулин-Са²⁺ , влияет на тропомиозин, позволяя, таким образом, головке миозина связываться с активным сайтом на тонком филаменте. Процессы активации протекают гораздо медленнее, чем в исчерченной мышце, и цикл сокращения начинается не ранее чем через 200 мс после поступления кальция в цитозоль.

Кальций поступает в цитоплазму ГМК из двух источников (эндоплазматического ретикулума и внеклеточной среды) через потенциалзависимые кальциевые каналы сарколеммы или, как это происходит у многих ГМК, через так называемые лиганд-зависимые каналы. Эти каналы активируются гормонами или нейротрансмиттерами и регулируются одним из компонентов системы внутриклеточных вторичных посредников - инозитолтрифосфатом (см. гл. 3). Полагают, что многочисленные, часто разветвленные, кавеолы (К) сарколеммы, которые являются одним из отличительных признаков ГМК, участвуют в депонировании Са²⁺ наряду с относительно малоразвитым саркоплазматическим ретикулумом.

Образец был приготовлен для сканирующей электронной микроскопии, чтобы сделать видимым слой гладких мышечных клеток (ГМК) в стенке маленького артериального сосуда. В артериолах такого диаметра (до 100 мкм) присутствует обычно только один слой гладких мышечных клеток. Клетки веретеновидной формы располагаются последовательно, образуя спираль с плотно упакованными витками. В сосудах небольшого диаметра сокращение одного слоя гладких миоцитов бывает достаточным, чтобы существенно уменьшить или даже закрыть просвет. Противодействующее гидростатическое давление крови в таких сосудах невелико, а эластических элементов и коллагена, придающих стенке сосуда жесткость, немного.

Многочисленные складки и гребешки на поверхности миоцитов свидетельствуют о том, что клетки находятся в состоянии умеренного сокращения. Поскольку гладкие миоциты в стенке таких небольших сосудов практически прилежат к тонкой эндотелиальной выстилке, колебания гидростатического давления в просвете сосуда эффективно передаются на ГМК. Мембрана этих клеток имеет механорецепторы, чувствительные к растяжению, и в ответ на механический стимул клетки сокращаются. Этот механизм (эффект Бейлиса) лежит в основе вазомоций - периодических колебаний потока крови в тканях, зависящих от сократительной активности стенок небольших артериальных сосудов.

Обзорная электронная микрофотография (в дополнение к предыдущему рисунку) показывает взаимоотношения гладких миоцитов артериолы (ГМК) с эндотелиальной выстилкой сосуда (эндотелиальной клеткой - ЭК) и окружающей соединительной тканью. Мышечные клетки находятся в состоянии умеренного сокращения, о чем свидетельствуют два признака - неровный (гофрированный) внешний контур миоцитов и несколько выбухающие в просвет сосуда ЭК. Топографически и функционально сосуды такого диаметра (<100 мкм) тесно связаны с окружающей соединительной тканью и являются ее компонентом. Они ориентированы на метаболические нужды ткани. Артериолы регулируют локальный кровоток (микроциркуляцию), и сами находятся больше под воздействием местных факторов регуляции, чем центральных регуляторных факторов. Прямая синаптическая иннервация ГМК артериол практически отсутствует. Немногочисленные симпатические нервные волокна (НВ) (одно из них видно в верхнем правом углу) освобождают нейротрансмиттеры в окружающую ткань, создавая некоторый нейрорегуляторный фон, который, с одной стороны, модулирует базальный тонус миоцитов, с другой - метаболизм клеток самой ткани. Результирующий эффект фоновой сократительной активности артериол и мелких артерий фактически и определяет диастолическое артериальное давление. Для оперативной регуляции локального кровотока в тканевом регионе более важное значение имеют функциональные связи между эндотелием и гладкими мышцами в самой стенке сосуда. ЭК таких сосудов метаболически весьма активны и продуцируют ряд факторов, которые могут влиять на тонус соседних ГМК. К таким факторам относятся, в частности, оксид азота и простациклин (PG I), которые вызывают релаксацию сосудистой стенки (расслабление гладких мышц), а также самый мощный из известных натуральных вазоконстрикторов - эндотелин, эффект которого выражается в резком сокращении миоцитов. Полагают, что эти и другие эндотелийзависимые факторы регуляции могут передаваться непосредственно через многочисленные щелевые контакты, которые довольно часто формируются между эндотелиальными и гладкими мышечными клетками артериол. КВ - коллагеновые волокна; ЭВ - тонкие эластические волокна; ЭР - эритроциты.

В отличие от мышечных клеток, которые обычно связаны между собой и при сокращении только изменяют свои размеры и форму, многие клетки способны перемещаться в пространстве на значительные расстояния и с разной скоростью. Для такого перемещения (ползания) клеткам необходимо взаимодействовать с субстратом - внеклеточными компонентами ткани. Очевидными примерами таких блуждающих клеток являются фибробласты и макрофаги соединительной ткани, лейкоциты крови, проникающие в очаги воспаления, эмбриональные клетки, мигрирующие большими массами на значительные расстояния, чтобы сформировать дефинитивные ткани, и клетки злокачественной опухоли, движение которых часто приводит к распространению опухоли и образованию метастазов. Направление движения (длинная стрелка) может определяться градиентом концентрации веществ - хемоаттрактантов, привлекающих клетки определенного типа, или градиентом адгезии (прилипания) клеток к субстрату. Внутриклеточные механизмы, определяющие движение клеток, отличны от механизмов сокращения, хотя в обоих случаях центральная роль принадлежит актиновым филаментам. Для осуществления движения свободных клеток нужна строгая координация трех событий:

В зоне цитоплазмы у ЛК клетки актиновые филаменты интенсивно полимеризуются так, что растущие их концы толкают клеточную мембрану, образуя протяженные тонкие или плоские отростки. Специальные кэпирующие белки, аналогичные белкам, блокирующим полимеризацию свободных концов микро-филаментов в саркомере, могут ограничивать полимеризацию растущих филаментов ЛК, однако фосфатидилдифосфат, присутствующий в мембране клетки, способен отсоединять кэпирующие белки. Таким образом достигается регуляция роста актиновых филаментов в зависимости от напряжения в мембране ведущего края клетки. При движении другие органеллы (эндоплазматическая сеть - ЭС, комплекс Гольджи - КГ, лизосомы) обычно вытесняются в хвостовой сегмент цитоплазмы. Скорость миграции клеток зависит от степени адгезии к субстрату - она максимальна при средней адгезии, и клетки останавливаются, когда адгезия превосходит некоторую пороговую величину. Движение приостанавливается также при соприкосновении клеток (контактное ингибирование движения). В обеспечении адгезии к субстрату принимают участие рецепторные белки клеточной мембраны - интегрины, которые способны формировать временные или более постоянные связи с внеклеточными молекулами-лигандами (фибронектином, ламинином, коллагеном). При движении клетки эти контакты генерируют напряжение на мембране и в подлежащем субстрате. Когда напряжение превосходит адгезию, индуцируется ретракция (подтягивание) хвоста клетки - вначале пассивно, за счет эластичности, а затем и активно, за счет сокращения при участии миозина. Образуются сократительные пучки актиновых филаментов в клеточном хвосте (стрелки).

Миграция, т.е. перемещение клеток в пространстве, не ограничивается примерами свободно живущих клеток. В ограниченной степени это свойство присуще и клеткам, находящимся в составе эпителиальных пластов, а значит, связанным между собой межклеточными мембранными соединениями. Необходимость в такой миграции возникает, например, при репарации повреждений клеточного пласта. На рисунке: клетки эндотелиальной (ЭК) выстилки аорты движутся к области повреждения, покрытой тромбоцитами (ТЦ). Активация тромбоцитов, образующих временную выстилку над зоной повреждения, сопровождается выделением ряда веществ - аттрактантов, которые стимулируют миграцию эндотелия. Тело мигрирующей клетки становится менее плоским, а на лидирующем крае формируются длинные, часто уплощенные, отростки - ламеллоподии. С их помощью клетки частично восполняют дефект в пласте по крайней мере до тех пор, пока их число не возрастет за счет пролиферации (см. рис. 7-2). Мигрирующие клетки в составе пласта сохраняют контакты между собой и с клетками-соседями, расположенными на некотором удалении от зоны повреждения. Именно там, а не в зоне миграции, обычно отмечаются эпизоды клеточного деления. Возможно, напряжения, которые генерируются ползущими клетками, сохраняющими свои контакты, стимулируют пролиферацию.

Клетки, которые испытывают напряжение вследствие механической деформации, например эндотелиальные клетки артерий, закрепленные в составе единого пласта, или свободно живущие клетки типа фибробластов, которые по каким-либо причинам прочно прикреплены к субстрату, часто образуют в цитоплазме своеобразные сократительные структуры - волокна напряжения, или стресс-волокна (СВ). Это пучки актиновых филаментов, среди которых расположены молекулы миозина: они ориентированы в разных направлениях и прикрепляются к рецепторным белкам клеточной мембраны - интегринам. Вспомогательные белки, талин и винкулин, связывают цитоплазматические домены β-интегринов с актиновыми филаментами у концов стресс-волокон. Интегрины, в свою очередь, образуют достаточно прочные и долговременные связи (фокальные контакты) с компонентами подлежащего субстрата. Активным участником фокальных контактов является фермент киназа фокальной адгезии (FAK), которая фосфорилирует некоторые белки внутриклеточной сигнальной системы и, следовательно, участвует в механизме передачи механического сигнала на регуляторные системы клетки.

В отличие от α-актина, участвующего в сокращении мышечных клеток, актиновые филаменты немышечных клеток (фибробластов, эндотелиальных клеток) образованы другими изо-формами актина - β- и γ-актином. Стресс-волокна играют роль своеобразных активных цитоплазматических растяжек, поскольку взаимодействие актиновых нитей с миозином в стресс-волокнах не приводит к сокращению клетки, но генерирует напряжение в точках фиксации, т.е. в зоне фокальных контактов. Результатом такой трансформации сигнала может быть активация синтеза белка (например, коллагена в регенерирующей ране) или стимуляция пролиферации, направленной на замещение дефекта в эпителиальном пласте (см. рис. 5-14).

Я - ядро; ГЭС - цистерны гранулярной эндоплазматической сети; Л - липидная капля.

Своеобразной модификацией сократительных немышечных клеток являются миоэпителиальные клетки (МЭК) экзокринных желез. Они локализуются, как правило, на периферии секреторных отделов и вместе с эпителиальными секреторными клетками (ЭК) покоятся на общей базальной пластинке (БП). Миоэпителиоциты могут служить примером различных путей дифференцирования клеток, имеющих общее (в данном случае эктодермальное) происхождение. В цитоплазме МЭК отсутствуют секреторные гранулы, а органеллы, участвующие в синтезе белков на экспорт, развиты не более чем в гладких мышечных клетках. Цитоплазма МЭК очень похожа на цитоплазму гладких миоцитов, поскольку ее основной объем занят актиновыми филаментами, которые закреплены в плотных тельцах (стрелки) и уплотнениях клеточной мембраны. В отличие от гладких мышечных клеток миоэпителиоциты могут иметь достаточно толстые протяженные отростки, совокупность которых в виде корзинки охватывает секреторные отделы железы.

Своим сокращением МЭК участвуют в генерации секреторного давления, необходимого для продвижения секрета в просвете (ПР) железы и ее протоков. Сокращение миоэпителиоцитов, как правило, синхронизировано с секрецией, поскольку в регуляции их сократительной активности, как и в регуляции интенсивности секреции, участвуют одни и те же компоненты автономной нервной системы (нервные волокна - НВ).

Сравнительно невысокое разрешение деталей на приведенном рисунке связано с тем, что толщина данного среза несколько необычна для рутинной ТЭМ - около 1 мкм. Однако использование таких срезов, по существу светомикроскопических, может быть полезным для решения некоторых задач (см. рис. 8-3).

Клетки эндотелиальной выстилки аорты подверглись обработке детергентом - тритоном Х-100, при которой оказались разрушенными все мембранные структуры. Такая жесткая обработка позволяет выявить филаментозные компоненты цитозоля, совокупность которых образует цитоскелет. Это понятие традиционно объединяет актиновые филаменты (микрофиламенты толщиной -7 нм), микротрубочки (толщиной 25 нм) и промежуточные филаменты (толщиной -11 нм). Эти нити пронизывают цитозоль и в зависимости от принадлежности и функций формируют различные конструкции. О роли микрофиламентов в обеспечении клеточных движений разного рода, а также в поддержании формы и поверхности клеток уже говорилось ранее.

На рисунке видны преимущественно микротрубочки (МТ), ориентированные вдоль длинной оси эндотелиальных клеток, и промежуточные филаменты (ПФ), густая сеть которых не имеет такой преимущественной ориентации. Строго говоря, скелетные функции в клетке выполняют только ПФ, которые участвуют в клеточном движении пассивно. Но зато их роль в качестве опорных структур, поддерживающих форму клеток и фиксирующих положение различных органелл, очень значима; эта роль отмечалась при обсуждении ядерной пластинки (ламины), построенной из специфических белков ламинов (см. рис. 4-5, 4-6). Категория ПФ обширна и включает фибриллярные структуры, сформированные из различных белков (свыше 50). Так, в клетках эпителиальной природы такими белками являются кератины; филаменты, построенные из этих белков, принимают участие в стабилизации межклеточных соединений - десмосом (см. рис. 3-44, 3-45), а также соединений клеток с базальной пластинкой - полудесмосом (см. рис. 3-27). В цитоплазме клеток мезенхимного происхождения доминируют другие белки - виментин и десмин. Десмин входит в состав Z-полос и связывает актиновые филаменты соседних саркомеров. Белки нейрофиламентов образуют цитоскелет тел нейронов и особенно их длинных отростков, а некоторые клетки глии (астроциты) имеют филаменты, построенные из так называемого кислого фибриллярного белка астроцитов. Определение специфических для клеток белков промежуточных филаментов используется для иммуноморфологической диагностики происхождения клеток различных опухолей.

В клетках мезенхимного происхождения, к которым принадлежат, в частности, эндотелиальные клетки, гладкие миоциты и клетки белой крови, промежуточные филаменты (ПФ) построены из белка виментина. Несмотря на разнообразие полипептидных цепей белков, формирующих ПФ, последние имеют довольно стандартные тип организации и размер (диаметр -11 нм). Эта величина попадает в интервал диаметров микрофиламентов и микротрубочек, отсюда и название - промежуточные. В отличие от актиновых филаментов и микротрубочек (см. далее), которые полимеризуются из однородных мономеров (или димеров) с заданной полярностью, ПФ не полярны и не взаимодействуют с моторными белками типа миозин, кинезин и динеин. Они образуют в цитозоле довольно густую сеть - каркас, который организует внутреннее пространство клетки и закрепляет органеллы. Так, виментиновые филаменты соединяются с ядерной оболочкой и с клеточной мембраной, «подвешивая» ядро в определенной позиции. ПФ вследствие их основной, структурной, функции хорошо развиты в клетках, которые испытывают физические напряжения или деформации, - в эндотелии, эпителии кожи, длинных и тонких аксонах нервных клеток и др. Таким образом, они не только способствуют поддержанию формы клеток, но и придают им определенную прочность.

ПФ - не инертные структуры, хотя и не так мобильны, как микрофиламенты и микротрубочки. При определенных условиях, сопровождаемых фосфорилированием белков, их составляющих, они дезорганизуются, и белки переходят в растворимый пул. Такие события происходят, например, в профазе клеточного деления, когда фосфорилирование и распад ядерной ламины инициируют дезорганизацию всей ядерной оболочки. Аналогичным образом перестраиваются и виментиновые филаменты.

Я - ядро; ПР - просвет сосуда; ВП - мультитубулярное тельце (тельце Вейбеля-Палада) (см. рис. 4-39); ГМК - фрагмент гладкой мышечной клетки.

Помимо актиномиозиновой системы, непосредственно участвующей в сокращении, в клетке существуют еще одна механохимическая система, которая использует микротрубочки (МТ) в качестве фибриллярных структур, и иные, чем миозин, типы моторных белков. МТ диаметром -25 нм формируются из димеров белка тубулина (α- и β-тубулины), которые, укладываясь последовательно в ряды, образуют протофиламенты. Протофиламенты в форме пологой спирали образуют МТ - длинный цилиндр с центральной полостью диаметром 14 нм. На поперечном сечении полной МТ выявляются 13 протофиламентов. В формировании неполных МТ, входящих в состав дуплетов ресничек и жгутиков, а также триплетов центриолей, участвуют только 11 или 10 протофиламентов (см. рис. 5-22). В неделящейся (интерфазной) клетке существует разветвленная сеть МТ, посредством которой осуществляется внутриклеточное перемещение не отдельных молекул, а их комплексов или даже целых органелл.

В длинных и относительно тонких отростках нейронов, подобных представленному здесь, МТ ориентированы параллельно длинной оси аксона и используются в качестве своеобразных рельсов или направляющих для транспорта синаптических пузырьков, других транспортных контейнеров, митохондрий (МХ).

Перемещение по МТ - это вид клеточного движения, который несколько отличается от сокращения, но, так же как и в актиномиозиновой системе, здесь в качестве 2-го партнера, моторного белка, используются белки с АТФазной активностью. Один из таких белков, кинезин, имеет две головки, которые при освобождении энергии АТФ способны шагать вдоль МТ, с которой они последовательно связываются. Другой конец молекулы кинезина, хвост, обычно прикреплен к мембране органеллы, которую он переносит, например синаптического пузырька. МТ, как и актиновые филаменты, полярны, и их (+)-концы ориентированы, как правило, к периферии клетки. Большинство изоформ кинезинов движутся к (+)-концам, хотя есть кинезины, которые шагают по направлению к (-)-концу. С - синапсы между отростками нейрона; ГЭС - цистерны гранулярной эндоплазматической сети в теле нейрона.

Вскоре после деления и образования дочерних клеток в них формируется цитоплазматическая сеть микротрубочек (МТ) с отчетливой радиальной симметрией. Материалом для построения МТ служат димеры белка тубулина (α- и β-тубулины), который в избытке находится в цитоплазме после распада митотических МТ (см. гл. 7). Сеть МТ начинает формироваться от клеточного центра (центросомы), который включает пару центриолей, заключенных в аморфный перицентриолярный матрикс (М). Одна из центриолей (Ц) (материнская, см. рис. 5-21), срезанная под углом, видна на рисунке. Около ее конца в окружающем матриксе видны зоны уплотнения (так называемые субдистальные придатки), от которых начинаются МТ. Здесь локализуется специальная изоформа тубулина, γ-тубулин, который служит в качестве «затравки» или центра нуклеации образующихся микротрубочек. В целом эта зона цитоплазмы определяется как центр организации микротрубочек (ЦОМ). Сеть МТ в клетке стабилизирует форму клетки и придает ей определенную жесткость, а также используется в качестве направляющих для транспорта и перераспределения в клетке молекул и органелл, например, митохондрий (МХ).

Белки, синтезированные в эндоплазматической сети, упаковываются в комплексе Гольджи (КГ) в мембранные контейнеры - везикулы и более крупные мембранные носители, которые перемещаются по МТ к соответствующим адресатам, например к клеточной мембране (см. гл. 4). Существует и обратный, эндоцитозный, трафик мембранных контейнеров, который ориентирован к центру клетки. На рисунке видны эти мембранные структуры, часть из которых имеет белковую кайму. Стопки цистерн КГ расположены недалеко от ядра (Я) вокруг клеточного центра и вместе с ним образуют центральную сортировочную станцию, регулирующую внутриклеточный транспорт. Для перемещения контейнеров и органелл по сети МТ используются два моторных белка - кинезин и динеин. Оба они обладают АТФазной активностью, т.е. способны расщеплять АТФ и освобождать энергию, необходимую для движения. Динеин и кинезин перемещаются по МТ в противоположных направлениях. Таким образом, достигается двунаправленный регулируемый транспорт мембранных структур в цитоплазматическом пространстве клетки.

Похоже, что основная функция центриолей (клеточного центра) связана с формированием микротрубочек и пространственной организацией их конструкций (цитоплазматической сети, аксонемы ресничек и жгутиков, веретена деления) как в интерфазной клетке, так и в период клеточного деления (см. гл. 7).

Показано строение центриолей в интерфазной клетке: на рис. 5-21, а - видна пара центриолей, разрезанных параллельно их длинным осям примерно на середине диаметра, на рис. 5-21, б - поперечное сечение одной из центриолей, примерно на середине ее длины. Каждая из центриолей представляет собой цилиндр длиной около 0,2 мкм, стенка которого состоит из девяти триплетов микротрубочек. Плоскости триплетов ориентированы под углом наподобие лопастей турбины (см. рис. 5-21, б). В просвете центриоли содержится белок центрин, а микротрубочки триплетов, как и микротрубочки цитоплазматической сети, построены из димеров α- и β-тубулинов. Микротрубочки триплета неодинаковы: наиболее внутренняя из них (А-микротрубочка) - полная, содержит 13 протофибрилл; связанные с ней В- и С-микротрубочки неполные - в их составе только 10 протофибрилл, а недостающие заимствуются от соседней микротрубочки. Две центриоли расположены под тупым углом друг к другу и неидентичны. Одна из них, материнская (МЦ), считается более зрелой, другая - дочерняя (ДЦ), возникает как результат репликации (удвоения) материнской. Обе центриоли заключены в матрикс (М), в составе которого находятся связывающие микротрубочки белки и γ-тубулин, инициирующий сборку микротрубочек. Хотя в интерфазной клетке микротрубочки могут возникать вокруг обеих центриолей, микротрубочки веретена деления (см. гл. 7) образуются только у дистального конца материнской центриоли, где видны конденсации матрикса (субдистальные придатки - СП). На этом же конце центриоли, точнее - базального тельца, формируются дуплеты микротрубочек аксонемы реснички (см. рис. 5-22, 5-23).

В верхней части рис. 5-21, а видно стресс-волокно (СВ), образованное параллельно ориентированными актиновыми филаментами. ГЭС - гранулярная эндоплазматическая сеть.

Многократно реплицированные предшественники центриолей (организаторы процентриолей) образуют базальные тельца (БТ) многочисленных ресничек (Р) в клетках реснитчатого эпителия (например, в эпителии трахеи и бронхов, маточных труб). Строение БТ практически идентично строению центриолей. БТ можно рассматривать в качестве матрицы, на которой строится состоящая из микротрубочек конструкция аксонемы (АН) реснички, а также моторчиков, которые передают энергию АТФ на аксонему (многочисленные митохондрии (МХ), обеспечивающие реснички энергией, видны в апикальных зонах цитоплазмы клеток). БТ закрепляется в цитоплазме непосредственно под плазмолеммой при помощи корешка (К). Поперечный срез реснички, примерно на середине ее длины, показан на врезке (х10 000, увеличено при печати). В отличие от центриоли АН реснички построена не из триплетов микротрубочек, а из девяти периферических дуплетов, образованных микротрубочками А и В, развивающимися из соответствующих микротрубочек центриоли (микротрубочка В неполная и образована только десятью протофиламентами). Дуплеты микротрубочек аксонемы протягиваются вплоть до верхушки реснички, где одна из микротрубочек (В) исчезает. В центре реснички расположена пара отдельных, синглетных, микротрубочек, окруженная матриксом - центральным влагалищем (ЦВ). Такая формула организации аксонемы, [9(2)+2] микротрубочек, удивительно универсальна для ресничек и жгутиков независимо от типа и вида организма, органа или функции. От микротрубочки А каждого дуплета к центральному влагалищу протягиваются радиальные спицы (стрелки). Эти спицы вместе с эластическим белком нексином, связывающим соседние дуплеты, стабилизируют конструкцию аксонемы и участвуют в биении (наклоне) реснички.

От микротрубочки В к микротрубочке А соседнего дуплета направляются две изогнутые динеиновые ручки (ДР). Пары динеиновых ручек расположены с регулярными (24 нм) интервалами вдоль всей длины микротрубочки А. Моторный белок динеин, подобно миозину и кинезину, обладает АТФазной активностью и при расщеплении АТФ способен изменять свою конформацию. Связывание динеиновых ручек каждого дуплета микротрубочек с соседним дуплетом и последующее изменение конформации динеина должно бы приводить к скольжению дуплетов относительно друг друга. Это и происходит в бесклеточной системе изолированных дуплетов в присутствии АТФ. Однако, поскольку в АН реснички концы дуплетов фиксированы в области БТ и вся конструкция стабилизирована радиальными спицами и нексиновыми связками, скольжение трансформируется в резкий изгиб реснички (удар). Он направлен в одну сторону (например, в эпителии трахеи - к ротовой части глотки). Биение ресничек не сопровождается перемещением клеток, а приводит в движение внеклеточную среду - слой слизистого одеяла, покрывающий поверхность эпителиального пласта. Интересно, что вся популяция ресничек, расположенных на достаточно большой площади пласта, бьется синхронно, хотя механизмы такой синхронизации пока неясны. При расслаблении реснички возвращаются в исходное вертикальное положение и начинает сокращаться популяция ресничек соседней площади, более близкой к ротоглотке. В целом все это напоминает волнение хлебного поля при сильном ветре. Таким образом, достигается строго однонаправленное движение слизи (и соответственно адсорбированной в ней пыли, микроорганизмов и клеточного детрита) к выходу из бронхиального дерева.

Не все реснички с типичной конфигурацией аксонемы (9+2) являются органеллами движения. Немногочисленные или одиночные неподвижные реснички присутствуют, например, на апикальной поверхности клеток обонятельного эпителия носовой полости или волосковых клеток внутреннего уха. Они выполняют, скорее, рецепторные функции, чем функцию движения, и, как правило, лишены динеиновых ручек. Одиночные реснички могут формироваться и в неэпителиальных клетках, например в фибробластах соединительной ткани. Можно видеть, что функцию базального тельца здесь выполняет одна из центриолей, материнская (МЦ). Видно, что от микротрубочек этой центриоли начинаются микротрубочки периферических дуплетов аксонемы (АН) реснички. Такие реснички ориентированы обычно не перпендикулярно поверхности клетки, а, скорее, параллельно ей и достаточно хорошо выявляются лишь на тангенциальных срезах. При этом видны расположенные параллельно ресничке участки клеточной мембраны (ПЛ).

В соответствии с положением клеточного центра на рисунке можно видеть также цистерны комплекса Гольджи (КГ), радиально ориентированные фрагменты цитоплазматических микротрубочек (МТ) и многочисленные везикулы. Я - ядро.

Большинство физиологических процессов, происходящих в клетке, являются энергозависимыми. Клетка получает энергию за счет метаболической деградации карбогидратов, в основном углеводов и жирных кислот, и сохраняет ее в виде некоторой энергетической единицы - молекулы аденозинтрифосфата (АТФ). В этом соединении максимально энергоемкой является связь между последним (третьим) остатком фосфорной кислоты и аденозиндифосфатом (АДФ). Расщепление АТФ по этой связи и служит источником энергии при осуществлении энергозависимых процессов. Клетка постоянно расходует огромное количество АТФ, и его воспроизводство является жизненно необходимым. Синтез АТФ осуществляется в специальных органеллах - митохондриях, однако для обеспечения работы митохондрий используются разнообразные клеточные возможности.

Митохондрия - удивительная и весьма своеобразная мембранная органелла. Похоже, что для эукариотической клетки животных она не является родной. Ее далекими предками были, вероятно, микроорганизмы, которые использовали клетку как временного хозяина (так это делают некоторые современные внутриклеточные паразиты, например риккетсии). Постепенно совместное проживание стало взаимовыгодным - микроорганизмы, привлекая клеточные ресурсы, специализировались на производстве высокоэнергетических соединений, которые, в свою очередь, использовались клеткой-хозяином для собственных нужд.

Черты «пришельца» можно отчетливо проследить в митохондриях. Во-первых, они имеют свой собственный геном (кольцевые молекулы ДНК) и аппарат синтеза белка - рибосомные, матричные и транспортные РНК, что позволяет этим органеллам синтезировать 13 ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании. Большинство митохондриальных белков кодируются в хромосомах клеточного ядра и синтезируются на рибосомах в цитозоле. Затем они транспортируются в виде готовых полипептидных цепей в митохондрии. Такой трансмембранный перенос готовых белков необычен. Для осуществления этого переноса в мембраны митохондрий встроены специальные белковые комплексы - транслоказы, которые функционируют аналогично транслоказам гранулярной эндоплазматической сети. Чтобы пройти сквозь транслоказу, белок разворачивается в пептидную цепочку с помощью шаперонов и, попадая в митохондрию, восстанавливает свою 3-мерную структуру.

Во-вторых, митохондрия, подобно ядру клетки, имеет митохондриальную оболочку, построенную из двух мембран - наружной и внутренней, состав которых существенно различается. Мембраны разделены отчетливым межмембранным пространством, которое иногда прерывается участками межмембранных контактов. На этих участках происходит перенос белков, синтезируемых в цитозоле, в митохондриальный матрикс - замкнутое пространство, ограниченное внутренней мембраной. Можно предположить, что наружная мембрана митохондрии произошла от внешней клеточной мембраны и была интернализована в процессе эндоцитоза микроорганизма. Собственная мембрана бактерии впоследствии стала внутренней мембраной митохондрии. Содержание белка во внутренней митохондриальной мембране - основном рабочем поле митохондрии - достигает 80% общей массы мембраны. Эта мембрана образует многочисленные складки - митохондриальные кристы, существенно увеличивающие ее рабочую площадь. Число и плотность упаковки крист обычно указывают на величину энергозатрат в клетке. Наконец, митохондрии размножаются самостоятельно, используя, по-видимому, механизм простого деления или почкования. Процесс деления митохондрий не обязательно связан с делением всей клетки - число этих органелл может увеличиваться при возрастании энергетических потребностей. При митозе, в отличие от других мембранных органелл, которые на начальных фазах деления разбираются на отдельные пузырьки (см. гл. 7), митохондрии сохраняются и продолжают поставлять энергию делящейся клетке.

Митохондрии - демонстративный пример того, каким образом ультраструктура органеллы может определять организацию довольно сложной системы биохимических явлений. Кажущаяся простота структуры самих митохондрий обманчива. Начальные этапы окисления глюкозы и жирных кислот до трикарбоновых кислот происходят в цитозоле. Продукты окисления транспортируются затем в матрикс. Последующие окислительно-восстановительные реакции (цикл Кребса) протекают с участием ферментов, содержащихся в матриксе. Побочные продукты цикла (НАДН и ФАДН₂ ) служат источником высокоэнергетических электронов, которые затем транспортируются (парами) в цепи четырех белковых комплексов, локализованных во внутренней мембране митохондрии. Конечным акцептором переносимых электронов является молекулярный кислород, растворенный в матриксе. Белковые комплексы цепи транспорта электронов являются активными трансмембранными каналами (насосами). Они используют энергию, которая высвобождается при переносе электронов, для транспорта ионов водорода Н ⁺ (протонов) из матрикса в межмембранное пространство.

Поскольку внутренняя митохондриальная мембрана практически непроницаема для малых молекул и ионов, это исключает диффузию протонов обратно в матрикс. Концентрация Н ⁺ -ионов в межмембранном пространстве поддерживается на уровне, в 10 раз превышающем их концентрацию в матриксе. Эта разница концентраций (химический градиент) - форма кинетической энергии, которую тоже можно использовать. Более того, поскольку протоны - заряженные частицы, следует говорить об электрохимическом градиенте, где не только разница концентраций, но и разница зарядов (потенциал) может быть источником энергии. В соответствии с принятой теорией химиоосмотического сопряжения энергия электрохимического градиента ионов водорода используется непосредственно для синтеза молекул АТФ. Синтез АТФ осуществляет 5-й белковый комплекс (АТФ-синтаза), который также является интегральным белком внутренней мембраны. Он расположен рядом с компонентами цепи транспорта электронов. Таким образом, процесс синтеза АТФ - окислительное фосфорилирование - тесно сопряжен с процессом транспорта электронов. АТФ-синтаза работает как транспортный канал, позволяющий протонам диффундировать из межмембранного пространства обратно в матрикс по градиенту концентрации. Этот комплекс часто сравнивают с мельницей, поскольку при переносе ионов водорода некоторые компоненты АТФ-синтазы вращаются вокруг своей оси. Перенос протонов через АТФ-синтазу освобождает энергию для синтеза молекул АТФ из АДФ и неорганического фосфата, которые в избытке присутствуют в митохондриальном матриксе. Для синтеза одной молекулы АТФ достаточно энергии, освобождаемой при переносе четырех протонов из межмембранного пространства в матрикс. Любые агенты, которые нарушают сопряжение процессов транспорта электронов и окислительного фосфорилирования во внутренней мембране митохондрий, угнетают синтез АТФ и приводят к клеточной гипоксии. В условиях дефицита кислорода, который является конечным акцептором электронов, уменьшается величина градиента протонов через внутреннюю мембрану. АТФ-синтаза при этом начинает работать как обычная АТФаза, т.е. не синтезирует, а расщепляет молекулы АТФ. Очевидно, что эта инверсия функций фермента усугубляет недостаток энергии в клетке.

Митохондрии чувствительны к любому клеточному напряжению и играют ведущую роль в инициации программированной клеточной смерти - апоптоза (см. гл. 7). Один из компонентов митохондрий, белковый комплекс цитохром С, переходит из межмембранного пространства митохондрии в цитозоль и индуцирует серию протеолитических реакций с участием ферментов каспаз, которые приводят к апоптозу.

Ферментативные реакции, протекающие в матриксе и во внутренней мембране митохондрий, зависят от двухвалентных катионов Са² + и Mg² +. Электронно-плотные тельца - митохондриальные, или плотные гранулы, как полагают, накапливают эти катионы и освобождают их по мере необходимости.

В митохондриях клеток так называемой бурой жировой ткани энергия протонного градиента используется не только для синтеза молекул АТФ, но и для производства тепла. Такая ткань практически отсутствует у взрослых, но ее много у новорожденных, а также у некоторых животных, которые впадают в зимнюю спячку. Для производства тепла (термогенеза) во внутреннюю мембрану митохондрий встраивается специальный белок термогенин. Он является транспортным каналом, который позволяет ионам водорода диффундировать из межмембранного пространства в матрикс, в обход АТФ-синтазы, разобщая, таким образом, процесс транспорта электронов и окислительное фосфорилирование. В многочисленных митохондриях бурой жировой ткани общая масса термогенина может достигать 30% всей массы внутренней мембраны.

В клетках, которые интенсивно синтезируют стероидные гормоны и некоторые другие липиды (клетки коры надпочечников, половых желез), митохондрии специализированы не только для производства энергии, но и для участия в этом синтезе наряду с гладкой эндоплазматической сетью. Внутренняя мембрана таких митохондрий имеет не плоские, а так называемые тубулярные кристы (митохондриальные трубочки), которые на срезах выглядят как многочисленные мембранные пузырьки, плотно упакованные в матриксе. Эта структурная модификация крист может служить отличительным признаком стероидсинтезирующих клеток.

Обычно на тонких срезах, используемых в электронной микроскопии, форма митохондрий округлая или продолговатая. Объемные реконструкции клеток или исследование сравнительно толстых срезов показывают, что она может быть иной. Например, в исчерченных мышечных волокнах митохондрий может быть немного, но они очень большие и разветвленные. На обычных тонких срезах сечения таких митохондрий будут выглядеть как округлые мембранные профили, т.е. как небольшие овальные митохондрии.

Поскольку митохондрии используют различные субстраты (липиды, углеводы) для синтеза энергии, они часто располагаются в клетке таким образом, чтобы обеспечить, с одной стороны, энергетические потребности соответствующих органелл, а с другой - иметь доступ к субстратам окисления. В связи с этим топография митохондрий в клетках может быть весьма характерной. Так, в мышечных волокнах скелетной мускулатуры и в кардиомиоцитах параллельные цепочки митохондрий с плотно упакованными кристами расположены вдоль миофибрилл (см. гл. 5). В клетках печени и других желез митохондрии тесно прилежат к цистернам эндоплазматической сети, а в складках базолатеральной плазмолеммы, активно транспортирующей ионы против градиента концентрации (см. гл. 3), длинные продолговатые митохондрии создают характерную базальную исчерченность, видимую в световой микроскоп.

Помимо митохондрий в осуществлении многочисленных окислительных реакций в клетке существенную роль играют пероксисомы - округлые мембранные органеллы, внешне напоминающие лизосомы (см. гл. 3). Матрикс пероксисом содержит окислительные ферменты, с действием которых связана основная функция органелл.

Пероксисомы активно участвуют в метаболизме липидов. Ферменты пероксисом окисляют длинные ненасыщенные жирные кислоты, образуя ацетилкоэнзим А, предшественники желчных кислот, простагландинов и лейкотриенов, которые участвуют в регуляции различных функций и развитии воспаления. Конечным продуктом окислительных реакций с участием пероксисом является пероксид водорода. Он используется специальным ферментом пероксисом каталазой для окисления некоторых токсических продуктов (алкоголя, фенолов, альдегидов). Пероксисомы клеток печени участвуют также в метаболизме холестерола и синтезе гликогена. Каталаза пероксисом в клетках нервной системы осуществляет начальные реакции синтеза миелина. Окислительные ферменты пероксисом синтезируются не в гранулярной эндоплазматической сети, а на свободных полисомах в цитоплазме, а затем перемещаются через мембрану пероксисом в матрикс специальным механизмом, узнающим специфический сигнал локализации. Пероксисомы в клетках некоторых животных содержат фермент уриказу, при ее участии в матриксе пероксисом формируются характерные кристаллоидные включения.

Предполагают, что пероксисомы, как и митохондрии, могут численно увеличиваться простым делением, которое не связано с делением клетки. Происхождение пероксисом не известно. Некоторые авторы предполагают отпочковывание зрелых пероксисом от эндоплазматической сети, хотя современные данные свидетельствуют в пользу того, что предшественники мембран пероксисом существуют автономно в цитоплазме клетки и по мере импорта белков из цитозоля постепенно созревают в пероксисомы.

На этой стадии развития незрелые клетки сердца - кардиомиобласты - еще лишены сократительных филаментов и интенсивно делятся. Их цитоплазма заполнена преимущественно свободными рибосомами (Р), и энергетические нужды синтеза цитозольных белков обеспечиваются работой относительно просто устроенных митохондрий. Черты стороннего происхождения митохондрий проявляются, в частности, в том, что в отличие от остальных органелл митохондрии построены из двух мембран - наружной (НМ) и внутренней (ВМ), которые разделены узким (10-20 нм) межмембранным пространством (МП). Внутренняя митохондриальная мембрана, наиболее активная часть органеллы, образует длинные и плоские складки - кристы (К), которые существенно увеличивают ее площадь. В некоторых клетках кристы не плоские, а тубулярные (см. рис. 6-4). Внутреннее пространство митохондрий (матрикс - М) ограничено внутренней мембраной и представляет собой очень вязкий концентрированный раствор, в котором содержание белка превышает 50%. Как ранее самостоятельный микроорганизм, митохондрия сохранила часть своего собственного генома (циркулярную двухцепочечную ДНК) и аппарат для синтеза белка (мРНК, рибосомы, тРНК). Митохондриальная ДНК, однако, кодирует только 13 собственных белков митохондрии (около 5% всех белков), 2 рибосомные и 22 транспортные РНК. Остальные белки кодируются ДНК клеточного ядра и синтезируются на полисомах в цитозоле клетки.

Они, как и субстраты для синтеза АТФ, а также некоторые липиды мембран, должны быть импортированы из цитозоля в различные отделы митохондрии - в матрикс, в наружную и внутреннюю мембраны. Наружная мембрана митохондрий содержит водные каналы, порины, и достаточно хорошо проницаема для ионов и даже небольших белков (массой до 6-10 кД), поэтому состав межмембранного пространства близок к составу цитозоля. Липидный бислой внутренней мембраны, однако, практически непроницаем для ионов и молекул, возможно, вследствие необычного состава липидов. Например, встречающийся только во внутренней митохондриальной мембране липид кардиолипин имеет четыре жирнокислотных хвоста, вместо обычных двух. Импорт крупных молекул, особенно митохондриальных белков, осуществляется в области межмембранных контактов или контактных сайтов (КС), где две мембраны почти сливаются друг с другом. Здесь локализованы анионные каналы - трансмембранные белки-транслоказы. Синтезированные на рибосомах цитозоля белки проходят через каналы в виде расправленной полипептидной цепи, а затем, в зависимости от предназначения, попадают в межмембранное пространство, матрикс или встраиваются в соответствующую митохондриальную мембрану. Система белков-шаперонов (белки семейств Hsp70 и Hsp60) обеспечивает расправление белка в цитозоле непосредственно перед его транслокацией и последующее свертывание (фолдинг) после прохождения канала.

Митохондрии - весьма динамичные структуры. Они способны изменять свою форму, положение в клетке и, что отвечает их «стороннему» происхождению, способны размножаться независимо от клеточного деления. Как и в ядре клетки, делению митохондрий предшествует репликация кольцевой митохондриальной ДНК; для этого, правда, используется несколько иной фермент - γ-ДНК-синтетаза. На иллюстрации, с помощью метода ауторадиографии (см. гл. 2) показано включение радиоактивного предшественника ³ Н-тимидина в синтезирующуюся ДНК митохондрий (МХ). Извитые электронно-плотные треки β-частиц, излучаемых ³ Н-тимидином, локализуются в основном над матриксом митохондрий, где и располагается ДНК. После завершения репликации вновь образованная и материнская ДНК, а также РНК и рибосомы, распределяются примерно равномерно в объеме матрикса, и митохондрия делится, как полагают, простым делением, или «почкованием». Возможно, эпизод такого деления мы наблюдаем в одной из митохондрий (стрелка). Популяция митохондрий в интенсивно работающих клетках постоянно обновляется, поскольку время их жизни обычно не превышает 10 сут. Небольшие плотные тельца в матриксе митохондрий - митохондриальные гранулы (МГ), являются белково-липидными комплексами, которые способны депонировать Са² + и другие 2-валентные катионы и высвобождать их в цитозоль по мере необходимости. На иллюстрации видны также две пероксисомы (П) - органеллы, имеющие некоторые общие с митохондриями свойства, но выполняющие в клетке иные функции (см. рис. 6-7, 6-8).

Поскольку исходными субстратами для синтеза АТФ являются глюкоза и жирные кислоты, митохондрии (МХ) часто располагаются в зонах цитоплазмы, богатых сырьем. Глюкоза в клетках сохраняется в виде гликогена (Г), крупные гранулы которого (α-гранулы) и формирующие их более мелкие β-гранулы (стрелки) видны на рисунке. В митохондриях метаболические превращения одной молекулы глюкозы в присутствии кислорода позволяют синтезировать 32-34 молекулы АТФ (по сравнению с четырьмя молекулами в анаэробных условиях). В цикле трикарбоновых кислот (цикле Кребса), который осуществляется в матриксе митохондрий, образуются NADH и FADH₂ . При окислении этих соединений освобождается пара электронов, которая поступает в цепь переноса электронов - четыре белковых комплекса, расположенных во внутренней мембране митохондрий. Конечным акцептором этой цепи является молекулярный кислород, растворенный в матриксе. Перенос электронов сопровождается активным транспортом ионов водорода из матрикса в межмембранное пространство, в результате которого создается электрохимический градиент концентрации протонов через внутреннюю мембрану (концентрация Н+ в межмембранном пространстве в десять раз превышает концентрацию в матриксе).

В соответствии с химиоосмотической теорией, энергия градиента Н⁺ , которая освобождается при диффузии протонов из межмембранного пространства обратно в матрикс, используется для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Синтез происходит в пятом белковом комплексе, АТФ синтазе, который включает протонный канал и каталитическую часть. В целом, сопряженные между собой процессы переноса электронов и синтеза АТФ получили название окислительного фосфорилирования. Поток протонов через канал АТФ-синтазы вызывает вращение ее каталитической части, и, как полагают, это механическое движение обеспечивает превращение энергии диффузионного потенциала в метаболическую энергию синтеза. Образующийся АТФ используется для нужд самой митохондрии или переносится в цитозоль для энергетического обеспечения клеточных функций. АЭС - цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума; ГЭС - гранулярный эндоплазматический ретикулум; МГ - митохондриальные гранулы.

Синтез АТФ не является единственной функцией митохондрий. В некоторых клетках таких органов, как надпочечники и половые железы, митохондрии (МХ) участвуют в синтезе стероидных гормонов из холестерола. Строение таких митохондрий несколько необычно. В этих клетках внутренняя мембрана округлых митохондрий образует многочисленные кристы в виде тонких трубочек (тубул), которые на срезах видны как везикулярные профили (отсюда и название - тубуло-везикулярные кристы). Такие кристы имеют огромную площадь поверхности, которая используется для синтеза стероидов и АТФ; кроме того, содержащие холестерол мембраны, образующие эти кристы, могут служить дополнительным источником субстрата для синтезируемых гормонов. Процесс синтеза стероидов происходит в несколько этапов в различных компартментах клетки - не только в митохондриях, но и в цистернах гладкой эндо-плазматической сети.

Фрагменты этих цистерн (АЭС) видны в цитоплазме в непосредственной близости от митохондрий. В процессе синтеза промежуточные продукты переносятся из одного компартмента в другой. Крупные липидные капли (Л), содержимое которых используется в качестве источника сырья при синтезе гормонов и АТФ, часто видны в цитоплазме стероид-продуцирующих клеток. С учетом молекулярной массы веществ энергетическая ценность липидов примерно в 2,5 раза выше, чем сахаров в пересчете на один грамм массы вещества. Вследствие того что при гистологической обработке липиды часто экстрагируются из ткани, и на месте многочисленных липидных капель остаются пустоты, стероид-секретирующие клетки часто называют губчатыми клетками (спонгиоцитами).

Представлены фрагменты двух печеночных клеток (гепатоцитов) в зоне формирования желчных канальцев (ЖК) (см. рис. 3-38). Топография митохондрий (МХ), расположенных в этой зоне, отражает их тесную связь с гранулярной эндоплазматической сетью (ГЭС), а следовательно, участие в энергетическом обеспечении синтеза белков. Не менее тесные топографические и функциональные связи существуют у митохондрий с цистернами гладкого эндоплазматического ретикулума (АЭС). Этот сегмент сети вовлечен в формирование важнейших компонентов желчи - гликированной формы билирубина и желчных кислот. Следует отметить также закономерное положение митохондрий в зонах концентрации α-гранул гликогена (Г), который, в свою очередь, топографически близок к канальцам гладкой сети. (Поскольку α-гранулы содержат, помимо гликогена, ряд структурных белков и ферментов, их часто рассматривают как своеобразные органеллы - гликосомы). Клетки печени являются самым значительным депо гликогена (а следовательно, и глюкозы), не столько для собственных нужд, сколько для обеспечения потребностей других клеток организма. Весьма развитая гладкая эндоплазматическая сеть гепатоцитов (ее мембраны составляют до 16% всех клеточных мембран) участвует на заключительных этапах расщепления гликогена, поскольку содержит фермент глюкозо-6-фосфатазу, гидролизующую глюкозо-6-фосфат до глюкозы и свободного фосфата.

Локализация митохондрий около цистерн АЭС, таким образом, неслучайна. Во-первых, она обеспечивает им удобный доступ к обоим продуктам (глюкозе и фосфату), необходимым для синтеза АТФ (см. рис. 6-3). Во-вторых, высокий уровень АТФ ингибирует гидролиз глюкозо-6-фосфата и, следовательно, интенсивность продукции АТФ в митохондриях, т.е. контролирует по механизму обратной связи интенсивность расщепления гликогена. Наконец, митохондрии, расположенные непосредственно у цистерн гладкой сети, снабжают ее энергией, необходимой для детоксикации ксенобиотиков, синтеза липидов, карбогидратов и, что особенно важно в клетках печени, липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Эти белково-липидные комплексы транспортируют нейтральные жиры (триглицериды) из печени к другим клеткам тела. Они синтезируются и собираются в клетках печени из белков и липидов в цистернах АЭС, граничащих с гранулярной сетью, и видны в просвете этих цистерн и мешочков комплекса Гольджи (КГ) как довольно крупные (диаметром 50-80 нм) электронно-плотные частицы (стрелки).

Митохондрии исчерченных мышц, скелетной и особенно сердечной, представляют собой примеры наиболее активно работающих и наиболее развитых органелл. По сравнению с мышечными волокнами скелетных мышц постоянно и ритмично сокращающиеся мышечные клетки сердца, кардиомиоциты, практически не используют для обеспечения энергией креатинфосфат или гликолиз (анаэробное расщепление глюкозы). Они вынуждены поддерживать высокий уровень АТФ благодаря деятельности многочисленных митохондрий (МХ), которые занимают почти половину объема цитоплазмы. Эффективное использование гликогена, β-гранулы которого часто видны между миофибриллами или около митохондрий (стрелки) (см. рис. 5-4, 5-8), является основным источником энергии. Крупные продолговатые митохондрии, с интенсивно развитыми и плотно упакованными кристами, уложены в цепочки, разделяющие соседние миофибриллы. Таким образом достигается весьма быстрая и с минимальными потерями доставка синтезируемых молекул АТФ в участки актиномиозиновых взаимодействий (см. рис. 5-5, 5-6).

Интенсивно работающая сердечная мышца, точнее ее митохондрии, требует высокого содержания кислорода, доставка которого в ткань сердца осуществляется многочисленными кровеносными капиллярами (КК). Эти капилляры располагаются в тонких соединительнотканных прослойках между кардиомиоцитами и обычно ориентированы вдоль их длинной оси. Стенка капилляров, образованная лишь тонким эндотелием (ЭК), отделена от сарколеммы кардиомиоцитов двумя базальными пластинками (БП) и узким интерстициальным пространством. Дистанция для диффузии кислорода, таким образом, минимальна и сопоставима с толщиной аэрогематического барьера в легких. В кардиомиоцитах, так же как и в скелетных мышечных клетках, митохондрии иногда группируются в довольно обширные кластеры, насчитывающие до 10-20 органелл. Часть такого кластера видна на рисунке (внизу слева). Функциональный смысл этих скоплений не очень понятен.

Пероксисомы (раньше их называли микротельцами) в чем-то похожи на митохондрии, хотя и выполняют отличные от них функции. Они имеют одну ограничивающую мембрану и варьируют в размере (в гепатоцитах диаметром около 1 мкм), форме и электронно-микроскопической текстуре в разных клетках и у разных видов животных. Так, в клетках печени крыс пероксисомы могут иметь более плотную кристаллоидную сердцевину. У человека этой сердцевины нет, но в некоторых клетках все содержимое может иметь кристаллический вид (см. рис. 6-8). Содержимое пероксисом включает свыше 40 окислительных ферментов. Основная функция пероксисом (П) клеток печени связана с метаболизмом липидов. Ферменты пероксисом метаболизируют длинноцепочечные ненасыщенные жирные кислоты до ацетилСоА, участвуют в метаболизме холестерола и гликонео-генезе, а также окисляют промежуточные продукты желчных кислот и эйкозаноиды - лейкотриены и простагландины.

Подобно митохондриям окислительные ферменты пероксисом используют молекулярный кислород, что приводит к образованию пероксида водорода, который, в свою очередь, используется каталазой пероксисом для окисления таких субстратов, как алкоголь, фенол, формальдегид. Несмотря на сравнительно однородную структуру содержимого, в пероксисомах существует некоторая компартментализация, что выражается в определенной локализации различных ферментов. Мы уже могли убедиться в том, что участки цитоплазмы гепатоцитов, прилежащие к желчным канальцам (ЖК), являются весьма активными в метаболическом отношении зонами клеток. Здесь можно встретить, помимо пероксисом и сегментов эндоплазматической сети, разнообразные структуры, принадлежащие к компартменту поздних эндосом/лизосом, лизосомы (Л), мультивезикулярные тельца (МВТ). Стрелками указаны частицы липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) в просвете мешочков гладкой эндоплазматической сети.

В некоторых клетках, например в эндотелии капилляров, даже у человека могут встречаться пероксисомы (П) с отчетливым кристаллическим матриксом. Смысл такой текстуры содержимого пероксисом не очень ясен, но, очевидно, что она связана с особенностями организации матриксных белков органелл. Эти белки, как и ферменты, синтезируются в основном на свободных полисомах цитозоля и импортируются далее в пероксисомы, подобно импорту белков митохондрий. В отличие от последних они не подвергаются раскручиванию (дефолдинг), но распознаются специальными рецепторами мембраны пероксисом (пероксинами) и пересекают мембрану как готовые олигомерные протеины. Для такого распознавания матриксные и, возможно, мембранные белки пероксисом имеют специальные сигналы (последовательности аминокислот), специфические для каждого рода рецепторов. Хотя пероксисомы, в отличие от митохондрий, не имеют собственного генома, некоторые исследователи полагают, что, подобно митохондриям, эти органеллы способны размножаются простым делением или отпочковыванием.

В соответствии с другой концепцией предшественники пероксисом отделяются от цистерн эндоплазматической сети, и далее, по мере созревания, в них включаются матриксные белки и ферменты. Наконец, третья гипотеза предусматривает существование в цитоплазме клеток особенных препероксисомных мембранных структур (везикул), которые, однако, уже имеют в своих мембранах пероксины для распознавания и включения специфических пероксисомных белков, синтезируемых в цитозоле. На рисунке виден фрагмент активной в метаболическом отношении эндотелиальной клетки капилляра в зоне интенсивного ангиогенеза. Можно видеть расширенные цистерны гранулярной (ГЭС) и гладкой (АЭС) эндоплазматической сети, митохондрии (МХ), элементы цитоскелета - микротрубочки (МТ) и промежуточные филаменты (ПФ), а также базальные пластинки (БП) эндотелия и перицита.

Все клетки многоклеточного организма имеют ограниченное время жизни, однако это время может существенно различаться. Например, жизнь эпителиальной клетки кожи не превышает 30 дней, клетки печени человека делятся 1-2 раза в год, тогда как большинство нервных клеток и исчерченных мышечных волокон, появившихся еще в эмбриональном периоде, заканчивают свое существование в момент смерти организма. Эти клетки не делятся, специализируются (дифференцируются) необратимо и до конца жизни пребывают в интерфазе - периоде покоя между делениями.

Практически во всех клеточных популяциях существует некоторая доля клеток - пролиферативный пул, которые сохраняют способность к делению и участвуют в нем. Для некоторых клеток (стволовых, камбиальных) эта способность является конституциональной - заложенной в их природе и не зависящей от окружающих условий. Большинство клеток, которые обычно не делятся и находятся в интерфазе, при стимуляции могут восстанавливать способность к делению, т.е. переходить в пролиферативный пул. Такая ситуация характерна, например, при заживлении ран. Наконец, часть клеток дифференцируется необратимо и лишается способности к делению.

Хотя жизнь соматической клетки - процесс непрерывный, ее можно разделить на две неравных периода. В интерфазе клетки не делятся. После рождения они дифференцируются и выполняют свои специфические функции. Этот интервал времени обозначается как фаза G₁ (G - от англ. gap - щель, промежуток), или постмитотический интервал.

Он может занимать достаточно большой отрезок жизни клетки или продолжаться на всем ее протяжении. В последнем случае его часто называют фазой G₀. Однако фаза G₁ может быть и короткой. В условиях интенсивной пролиферации, например в эмбриогенезе, клетки успевают за это время лишь восполнить собственную массу между делениями. Период, в течение которого клетки готовятся к делению и делятся, много короче. Обычно он не превышает нескольких часов, однако в этот интервал времени происходят некоторые важные события, его, в свою очередь, подразделяют на три периода:

Все клетки, за исключением половых, делятся посредством специального процесса - митоза. Двухступенчатое деление половых клеток - мейоз - направлено на получение потомства, содержащего не диплоидный (2n), как у большинства соматических клеток, а гаплоидный (1n) набор хромосом.

Интервалы времени, соответствующие S-, G₂ - и M-фазам, довольно постоянны. Следовательно, общая продолжительность клеточного цикла определяется продолжительностью фазы G₁ . Ключевыми точками клеточного цикла являются переход от фазы G₁ к фазе S и вступление в митоз (переход G₂ -M). Наступление очередной фазы регулируется специальными белками циклинами и связанными с ними ферментами циклинзависимыми киназами. Концентрация и активность этих регуляторов достигает критического уровня в ключевых точках цикла. Переход к митозу является неизбежным и необратимым событием.

В течение S-фазы содержание ДНК в ядре удваивается (для большинства клеток становится равным 4n) за счет синтеза новых нитей ДНК, комплементарных предшествующим, - процесс репликации. Включение мономерных предшественников (нуклеотидов) в синтезирующиеся нити ДНК можно выявить при введении в организм или клеточную среду нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами (например, ³ Н-тимидином). В первую очередь реплицируется ДНК эухроматина, затем, по мере деконденсации гетерохроматина, - остальная ДНК. Отрезок двойной спирали ДНК, подлежащий репликации, - репликон, - раскручивается, и вдоль каждой нити ДНК с помощью ферментов, ДНК-полимераз, синтезируется комплементарная ей дочерняя нить. Одна нить (лидирующая) синтезируется в виде непрерывной нуклеотидной цепи, другая (запаздывающая) - отдельными фрагментами, которые затем сшиваются ДНК-лигазами. Начальные отрезки вновь синтезированных молекул ДНК - праймеры - построены из нескольких рибонуклеотидов, т.е. представляют собой короткие фрагменты РНК. Концевые (теломерные) участки хромосом реплицируются с помощью специальных ферментов теломераз.

Основными событиями фазы G₂ являются синтез белков (гистонов), участвующих в конденсации хромосом, и завершение репликации клеточного центра - центросомы. Синтез новых центриолей на матрицах прежних начинается еще в конце G₁ -фазы. Каждая пара центриолей и связанные с ними центры организации микротрубочек (см. гл. 5) определяют в последующем формирование веретена клеточного деления (митотического веретена) - системы микротрубочек, обеспечивающей ориентацию и движение хромосом при делении. Перед делением предшествующая цитоплазматическая сеть микротрубочек распадается, в течение митоза формируется новая конструкция - веретено, а после завершения деления на основе центросом в дочерних клетках организуется новая цитоплазматическая сеть.

Период собственно клеточного деления, митоз, продолжается в среднем около 1 ч. Весь сложный комплекс процессов, которые происходят при митозе, направлен в основном на получение дочерних клеток с идентичным генетическим материалом. Митоз можно разделить на два крупных события: кариокинез - деление ядра или, точнее, распределение хромосом между дочерними клетками и цитокинез - разделение цитоплазмы клеток. Кариокинез разделяют обычно на 4-5 фаз, не имеющих отчетливых границ.

В образовавшихся дочерних клетках из мембранных фрагментов реорганизуются эндоплазматическая сеть и КГ. Новые митохондрии, как полагают, возникают благодаря делению материнских, которые распределяются в цитоплазме дочерних клеток при цитокинезе.

Преобладающее большинство образовавшихся при делении клеток переходит в интерфазу и дифференцируется в клетки определенного фенотипа. Морфологически дифференцирование проявляется в развитии специфического набора органелл, что подавляет способность клеток к делению. Например, развитие сократительного аппарата в мышечных клетках означает переход их в фазу G₀ . Такие клетки в физиологических условиях не делятся. Направление и темпы дифференцирования клеток зависят от интенсивности синтеза специфических белков и контролируются экспрессией специальных генов дифференцирования. Стволовые (камбиальные) клетки, а также интенсивно делящиеся клетки эмбриона не дифференцируются и сохраняют фенотип бластных клеток с характерной морфологией - активное эухроматичное ядро с выраженным ядрышком, скудное развитие мембранных органелл и обилие свободных полисом в цитоплазме.

Чаще всего периоды жизненного цикла клеток последовательно сменяют друг друга. Однако по каким-либо причинам цикл может прерваться в некоторых точках. Так, завершение фазы S не обязательно приводит к клеточному делению. Таким путем возникают одноядерные полиплоидные клетки, в ядрах которых содержание ДНК может составлять k(2n), где к - число, кратное 2. В некоторых специализированных клетках, например в мегакариоцитах костного мозга с их гигантскими ядрами, плоидность ядра может достигать 64-128. Деление ядер (кариокинез), за которым не следует деление цитоплазмы, приводит к появлению двуядерных и многоядерных клеток (синцитиев). Понятно, что эти клетки также полиплоидны. В некоторых клеточных популяциях доля полиплоидных клеток может быть довольно большой. Их число увеличивается, например, при необходимости быстрой интенсификации синтеза белка. В нормально существующих синцитиях, например в исчерченных мышечных волокнах, много-ядерность объясняется необходимостью оперативно контролировать ядрами очень большой объем цитоплазмы.

Мышечные волокна в эмбриональном развитии появляются как результат слияния отдельных одноядерных клеток - миобластов. Однако в регенерирующей мышечной ткани они образуются путем многократного деления ядер клеток-сателлитов (стволовых клеток).

Многократная репликация ДНК, особенно в популяциях интенсивно пролиферирующих клеток, допускает возможность появления ошибок при синтезе новых молекул и их повреждения. В клетках существует сложная система контроля правильности чтения и репарации повреждений. Один из механизмов репарации предусматривает вырезание неверного участка нуклеотидной последовательности или отдельных оснований. Однако в некоторых случаях повреждения оказываются необратимыми и несовместимыми с нормальной жизнью клетки. Для исключения этих клеток из популяции в них активируется и реализуется генетическая программа своеобразного самоубийства - апоптоз. Хотя механизмы апоптоза сложны и не полностью изучены, известно, что его центральным инструментом является последовательная активация каскада специальных ферментов - каспаз. В большинстве случаев апоптоз - это нормальное физиологическое явление, которое тесно сопряжено с клеточным размножением. В его регуляции принимают участие те же факторы, которые контролируют деление клеток. Одним из важнейших факторов инициации программы апоптоза является специальный белок, продукт гена р53.

В отличие от некроза - гибели клеток в результате повреждения внешними агентами - апоптоз развивается в единичных клетках. Он проявляется на начальных стадиях характерной краевой конденсацией хроматина, которая отражает деградацию и фрагментацию молекул ДНК. Цитоплазма клеток также уплотняется, хотя клетки и органеллы еще сохраняют мембранные границы. На более поздних стадиях мертвые клетки фрагментируются и их остатки быстро (обычно в течение 1-2 ч) фагоцитируются клетками-соседями или макрофагами. Воспалительная реакция обычно не успевает развиться. Демонстративными примерами важности апоптоза как физиологического явления могут быть эпизоды развития или специализации сложных многоклеточных систем.

Например, при развитии нервной системы в эмбриогенезе посредством апоптоза элиминируются клетки, которые по каким-либо причинам не успели или не смогли установить нужных синаптических связей с другими клетками. В иммунной системе при «обучении» лимфоцитов в тимусе в массовом количестве (90%) путем апоптоза гибнут клетки, которые реагируют на собственные антигены организма. Апоптоз расценивается как I тип программированной клеточной смерти. При другом типе (II типе) основную роль играет аутофагия (см. гл. 3) и компоненты цитоплазмы деградируют раньше деструкции ядра. Существует функциональная связь между двумя типами программируемой смерти, и оба типа могут появляться одновременно в ткани и даже сосуществовать в одной и той же клетке.

Представлена клетка-предшественник эритроцита - эритробласт, расположенный среди гепатоцитов печени новорожденной крысы. У грызунов кроветворение в печени и селезенке сохраняется и после рождения и существует наряду с костномозговым кроветворением. Эритробласт - крупная клетка с минимальным набором органелл. В цитоплазме видны многочисленные полисомы (ПС) и митохондрии (МХ). Фаза синтеза, или репликации ДНК (S-фаза), наступает только тогда, когда клетка проходит точку рестрикции в конце G₁ -фазы жизненного цикла. В этой точке контролируются необходимый прирост массы клетки и влияние внешних сигналов (факторов роста), без которых подготовка к делению (и, конечно, само деление клетки) не начнется. Фаза синтеза ДНК хорошо выявляется с помощью метода ауторадиографии (см. рис. 2-7). Несмотря на довольно причудливую форму треков (распределения восстановленных зерен серебра), можно видеть, что включение радиоактивного предшественника (³ Н-тимидина) происходит в зонах деконденсированного хроматина. В процессе синтеза новых цепочек ДНК материнская двойная спираль расплетается и на ее комплементарных нитях синтезируются новые нити дочерних ДНК.

Вследствие огромной величины генома млекопитающих (3х10⁹ пар оснований) и относительно низкой скорости синтеза зоны синтеза (репликационные вилки) возникают одновременно на разных участках ДНК, а их общее число у человека может достигать 30 тыс. ДНК-полимераза синтезирует дочерние нити ДНК только в направлении от 5'-конца к 3'-концу матричной ДНК, и поэтому одна дочерняя нить (лидирующая) синтезируется непрерывно, а другая (запаздывающая) - в виде отдельных фрагментов (фрагментов Okazaki), которые затем сшиваются в непрерывную нить ДНК. Процесс синтеза довольно сложен и строго контролируется механизмом правильного чтения. Ошибки, которые возникают при работе ДНК-полимераз, не превышают включения 1 неверного основания на 10⁹ всех использованных. В зависимости от условий и типа клеток длительность S-фазы может варьировать, но в среднем для популяции быстро пролиферирующих клеток она составляет около 8 ч. К концу S-фазы количество ДНК в ядре удваивается по сравнению с предшествующей фазой цикла (в ядрах соматических клеток - соответственно 4n и 2n ), т.е. ядро клетки становится полиплоидным. ЯД - ядрышко.

При использовании в качестве основного метода СЭМ ауторадиографическая картина включения ³ Н-тимидина выглядит иначе, чем при ТЭМ. Зерна восстановленного серебра выявляются в виде ярко светящихся точек над ядрами, которые находятся в фазе синтеза ДНК, т.е. в S-фазе (стрелки). Конечно, этот методический подход отличается гораздо меньшим разрешением, однако он позволяет судить об общей доле клеток, находящихся в S-фазе, что бывает необходимо для оценки пролиферирующего пула (доли делящихся клеток) в данной клеточной популяции.

Показан фрагмент эндотелиальной выстилки аорты, расположенный к периферии от зоны ограниченного повреждения эндотелиального пласта. Клетки, находящиеся здесь, как правило, не мигрируют на участок повреждения для того, чтобы прикрыть дефект, во всяком случае не делают этого на ранних этапах репарации. Интенсивно мигрируют и распластываются эндотелиальные клетки, располагающиеся у края дефекта (см. рис. 5-14). Клетки, расположенные далее к периферии, интенсивно делятся, чтобы образовать достаточное число клеток, необходимое для полноценного закрытия дефекта. В нормальных условиях пролиферативный пул эндотелиальных клеток не превышает 0,1- 0,3%. При активации пролиферации, например, при повреждении стенки сосуда, доля делящихся клеток в зоне репарации эндотелиального пласта может возрастать в 10-100 раз. Примерно половина видимых на рисунке клеток находятся в S-фазе или прошли ее. Ядра (Я) остальных клеток не содержат ³ Н-тимидина. Правда, это не означает, что данные клетки не будут переходить в S-фазу клеточного цикла в последующем. В приведенном примере была использована так называемая импульсная метка - введение радиоактивного предшественника в течение короткого (несколько минут) интервала времени с последующей фиксацией материала. Такой протокол еще не свидетельствует о величине общего пролиферативного пула, но зато позволяет проследить дальнейшую судьбу клеток, ядра которых успели включить ³ Н-тимидин в течение этого интервала.

Видно, что радиоактивный предшественник локализуется не только в эухроматине ядра клетки, но и нередко на участках конденсированного хроматина (гетерохроматина). Это обстоятельство, а также более компактная форма метки, свидетельствуют о том, что печеночная клетка, по-видимому, уже закончила S-фазу и, возможно, готовится к вступлению в М-фазу. Если это допущение верно, мы должны заключить, что клетка находится в конце G₂ -фазы или в самом начале профазы - ядерная оболочка (ЯО) вполне отчетлива и мембранные органеллы сохраняют свою структуру и положение в цитоплазме. Хорошо различимы: гранулярный эндоплазматический ретикулум (ГЭС), комплекс Гольджи (КГ), митохондрии (МХ), лизосомы (Л), аутофагосома (АФС). Клетка еще продолжает выполнять свои функции. Другим возможным вариантом является допущение о том, что клетка не собирается вступать в фазу деления и после репликации ДНК функционирует с полиплоидным ядром (содержание ДНК кратно превышает 2n).

Полиплоидия в одноядерных (или многоядерных) клетках - не столь редкое явление для популяции клеток, интенсивно синтезирующих белки (например, гепатоцитов). Доля полиплоидных клеток в печени, особенно в растущей или регенерирующей, может превышать 25-30%. Такие клетки существенно крупнее прочих, поскольку параллельно с кратным увеличением генома возрастают объем цитоплазмы и число работающих органелл. Увеличенный геном позволяет одновременно экспрессировать существенно больше генов, кодирующих синтезируемые белки, и тем самым резко увеличить выход конечных продуктов. В организме есть некоторые типы нормально функционирующих клеток, для которых полиплоидное ядро является вполне закономерным. Например, мегакариоциты костного мозга, производящие кровяные пластинки (тромбоциты), имеют обширную цитоплазму и крупное дольчатое ядро, содержание ДНК в котором может достигать 64-128n.

Эта электронно-микроскопическая фотография демонстрирует дальнейшую судьбу клетки, которая уже включила радиоактивный предшественник в период синтеза ДНК. Точную принадлежность клетки определить трудно, но, судя по минимальному набору мембранных структур, это может быть эритробласт - клетка-предшественник эритроцитов. Ранее говорилось о том, что у грызунов печеночное кроветворение сохраняется и после рождения (см. рис. 7-1). Делящуюся клетку окружают печеночные клетки - гепатоциты (ГЦ). Можно видеть, что метка - грубые компактные зерна восстановленного серебра, - а следовательно и ³ Н-тимидин, локализуется не в ядре, которого уже нет, а в хромосомах (ХС), распределенных в цитоплазме клетки. Если ориентироваться на отсутствие ядерной оболочки и равномерное распределение хромосом в клеточном объеме, клетка находится в поздней профазе или ранней метафазе: хромосомы еще не выстроились у экваториальной плоскости и веретено деления не сформировано. ³ Н-тимидин отличается от естественного (нативного) основания лишь тем, что один из его атомов водорода замещен на радиоактивный изотоп - тритий. Такой тимидин функционирует абсолютно так же, как и нативный, и может сохраняться в клетке неопределенно долго.

Это обстоятельство позволяет использовать ауторадиографию для того, чтобы проследить судьбу клеток, включивших изотоп ранее, например происхождение клеток от эмбриональных предшественников, или пути распространения этих предшественников в организме. Очевидно, что с каждым последующим делением содержание радиоактивного изотопа в ядре будет снижаться примерно вдвое и соответственно будет уменьшаться число зерен восстановленного серебра (разведение метки). Возможно, в данном случае мы наблюдаем именно такую ситуацию - эта клетка претерпевает уже не первое деление, на что может указывать, в частности, сравнительно небольшое число зерен серебра над хромосомами (его можно сравнить, например, с количеством треков над ядром эритробласта, находящегося в S-фазе; см. рис. 7-1). Следует отметить также, что ауторадиографический анализ клеточной судьбы менее трудоемок и более эффективен в его свето-оптическом варианте и в элетронно-микроскопических исследованиях используется реже. Однако ауторадиографическая электронная микроскопия часто оказывается незаменимой для анализа внутриклеточных процессов, например синтеза и превращения белков, полисахаридов и других сложных молекул. С этой целью часто используют иные, чем тритий, радиоактивные изотопы. Они включаются в метаболизм клетки, как и их нерадиоактивные аналоги.

Цитотрофобласт - это внутренний листок внезародышевого органа, трофобласта, с помощью которого на ранних стадиях эмбрионального развития осуществляется доступ развивающегося эмбриона к материнской крови и, следовательно, его питание. В последующем трофобласт вместе с подлежащей соединительнотканной основой (пластинкой хориона) и сосудами формирует достаточно сложно организованный орган - плаценту. Внутренний слой трофобласта, цитотрофобласт (ЦТ), в отличие от наружного слоя, синцитиотрофобласта (см. рис. 7-21), имеет строение типичного однослойного кубического эпителия, клетки которого покоятся на хорошо развитой базальной пластинке (БП). Эти клетки связаны между собой и со синцитиотрофобластом (СТ), десмосомами (стрелки), возможно, плотными контактами. Однако это не мешает им активно делиться. На рисунке видно, что одна из клеток эпителиального пласта, делящаяся клетка (ДК), вступила в митоз и находится в самом его начале - в ранней профазе. Отличительными признаками этого интервала являются:

Эти признаки (за исключением последнего, поскольку центриоли не попали в плоскость среза) хорошо видны в делящейся клетке, особенно если сравнивать ее строение со строением других, покоящихся клеток. Можно видеть также, что на этой стадии клеточного деления оболочка ядра еще не разрушена, а сама клетка сохраняет десмосомные связи с клетками-соседями и со синцитиотрофобластом. Обширные светлые пространства в цитоплазме клеток цитотрофобласта - это «озера» гликогена (Г), который в эмбриональных тканях часто не выявляется в виде типичных гранул.

Основными признаками развитой профазы, как можно видеть на примере делящегося эритробласта, являются дезорганизация ядерной оболочки и завершение конденсации хроматина, который принимает вид типичных митотических хромосом (ХС). На некоторых участках клетки еще видны фрагменты оболочки ядра (ЯО), тогда как на большом протяжении сохраняются лишь его размытые контуры. Исчезновение ЯО начинается с разрушения ядерной ламины (пластинки) - каркаса, который построен из промежуточных филаментов и прилежит к ядерной поверхности внутренней мембраны оболочки ядра (см. рис. 4-5, 4-6). Ядерная ламина участвует в организации внутреннего пространства ядра и служит местом прикрепления хромосом в интерфазной клетке. Фосфорилирование белков-ламинов приводит к деполимеризации промежуточных филаментов ядерной пластинки и к ее распаду до исходных белков-димеров. Это событие служит триггером для дезорганизации самой ЯО, которая распадается на группы коротких цистерн и везикул. Эти мембранные структуры вместе с подобными остатками эндоплазматической сети и комплекса Гольджи оттесняются к периферии клетки.

После завершения клеточного деления они будут служить основой для реорганизации мембранных органелл в дочерних клетках. Интересно, что один из белков ядерной ламины - ламин В остается связанным с везикулярными мембранными структурами на протяжении всех фаз митоза и на его базе происходит реорганизация ядерной пластинки.

Конденсация хроматина становится вполне очевидной в развитой профазе. В этом процессе принимают участие конденсины, белковые комплексы, которые обеспечивают компактизацию хромосом - образование петель, суперспиралей и др. В митотических хромосомах хроматин оказывается конденсированным почти в 1000 раз (по сравнению с интерфазным хроматином). Митохондрии (МХ), в отличие от эндоплазматической сети, при митозе не разрушаются и делятся независимо от событий клеточного деления (см. гл. 6). Обращает на себя внимание обилие в цитоплазме свободных рибосом, на которых синтезируются цитозольные белки, преимущественно тубулины микротрубочек будущего митотического веретена.

В течение прометафазы происходит окончательное формирование митотического веретена, с помощью которого конденсированные хромосомы движутся к экваториальной плоскости клетки. Основу веретена составляет организованная система микротрубочек (МТ), которые, как и в интерфазной клетке, берут начало от клеточного центра (см. рис. 5-20), точнее, от двух центросом, которые уже сформировались к этому времени. Видимая на рисунке пара центриолей (Ц) составляет один из двух полюсов веретена. Видно также, что МТ начинаются от одной (материнской) центриоли. Полярные микротрубочки направляются от одного полюса к другому. Они не прикрепляются к хромосомам (ХС), но служат в качестве своеобразных направляющих при движении хромосом к экватору.

Кроме того, скольжение полярных МТ, начинающихся от одной центросомы, вдоль МТ, начинающихся от другой, приводит к расталкиванию полюсов в анафазе. Кинетохорные микротрубочки прикрепляются к центромерам хромосом (кинетохору) и собственно определяют их движение к экватору. Часть веретена, представленная на рисунке, составлена именно из полярных и кинетохорных МТ. Третий тип микротрубочек - астральные микротрубочки (АМТ) видны менее отчетливо. Они направляются от центросомы к клеточной мембране и при движении хромосом в течение анафазы способствуют растаскиванию полюсов, их сближению с плазмолеммой. Кроме того, астральные микротрубочки способствуют стабилизации положения центриолей (полюсов) при движении хромосом в метафазе.

При конденсации хромосом (ХС) две идентичные сестринские хроматиды прикрепляются друг к другу в области перетяжек - центромер. Центромеры обеспечивают сочетанное движение хроматид и их правильное установление в экваториальной плоскости. Центромеры состоят из специфических последовательностей ДНК и белков, которые в совокупности образуют кинетохор (КХ). С помощью КХ, белки которого действуют как молекулярные моторы, обеспечиваются прочное прикрепление хромосом к микротрубочкам (МТ) веретена, стабилизация этих МТ и последующее движение хроматид к полюсам клетки в анафазе. Микротрубочки, происходящие из разных полюсов, прикрепляются к соответствующим кинетохорам, расположенным с противоположных сторон центромеры. Таким образом, каждая хромосома (пара сестринских хроматид) оказывается прикрепленной посредством кинетохорных МТ к обоим полюсам веретена. Моторные белки кинетохоров каждой из сестринских хроматид продвигают их к (-)-концам МТ, т.е. по направлению к разным полюсам веретена. Таким образом, каждая хромосома испытывает действие противоположно направленных сил, и перемежающийся баланс этих сил приводит к челночному движению хромосом, их скольжению, вдоль полярных МТ. В конце концов хромосомы устанавливаются в экваториальной плоскости делящейся клетки. Моторные белки кинетохора, в том числе и одна из форм кинезина, действующая по направлению к (-)-концу МТ, обеспечивают расхождение хроматид к полюсам клетки в анафазе митоза. Митохондрии (МХ) обеспечивают энергией процесс перемещения хромосом.

К концу метафазы митоза конденсированные хромосомы (ХС), состоящие из связанных между собой сестринских хроматид, устанавливаются в экваториальной плоскости клетки (примерно в центре цитоплазмы). Плечи ХС ориентированы радиально так, что весь набор образует подобие звезды. Мы видим такую материнскую звезду (экваториальную пластинку). Немногочисленные органеллы эпителиальной клетки (митохондрии - МХ, лизосомы - ЛС, мембранные цистерны и везикулы, остатки ядерной оболочки, эндоплазматической сети и комплекса Гольджи - МС) оттеснены к периферии клетки. Положение этих мембранных структур на уровне экваториальной пластинки не случайно. В последующем, в ранней телофазе, они сливаются между собой и с клеточной мембраной, способствуя углублению борозды деления и тем самым разделению цитоплазмы материнской клетки на две дочерние (цитокинез, см. рис. 7-13, 7-14). В установившейся метафазе центральная зона цитоплазмы оккупирована системой микротрубочек митотического веретена. Поскольку срез препарата прошел почти в плоскости экватора (через экваториальную пластинку), поперечно пересеченные микротрубочки веретена видны в основном как мелкогранулярный материал вокруг ХС. Клетки цитотрофобласта - это эмбриональные эпителиальные клетки, которые вместе с расположенной на периферии клеточной массой - синцитиотрофобластом (СТБ) образуют функционально важную часть ворсинок будущей плаценты - трофобласт (см. рис. 7-21). Как и другие эпителиальные клетки, они покоятся на базальной пластинке (БП) и объединены в один непрерывный слой посредством многочисленных межклеточных соединений, в частности десмосом (стрелки). Можно видеть, что эти контакты сохраняются и у митотически делящейся клетки. Следовательно, несмотря на деление отдельных клеток в эпителиальном слое, целостность всего эпителиального пласта поддерживается в полной мере. Г - гликоген.

Этот рисунок несколько необычен. Представлен эритроцит эмбриона человека (Э), делящийся в просвете кровеносного капилляра третичной ворсинки плаценты. На ранних сроках внутриутробного развития эритроциты эмбриона, циркулирующие в его сосудах, как правило, ядерные и сохраняют еще свойства незрелых (бластных) клеток, в частности их способность к делению. Этот ранняя (внутрисосудистая или мезобластическая) фаза кроветворения сохраняется до 6-7 нед внутриутробного развития, после чего постепенно сменяется печеночной и селезеночной фазой, а затем окончательной - миелоидной или костно-мозговой. На этом основании ядерные эритроциты эмбриона иногда идентифицируют как эритробласты, хотя они в полной мере выполняют и основную свою задачу - перенос дыхательных газов. На этапах печеночного и костномозгового кроветворения эритроциты уже теряют способность к делению, и новые клетки образуются за счет деления их предшественников - эритробластов, которые не поступают в кровоток, но делятся на месте, в очагах кроветворения (см. рис. 7-1, 7-22). Делящийся эритроцит находится в конце метафазы митоза, и его хромосомы (ХС) формируют экваториальную пластинку. Но в отличие от рис. 7-9 здесь плоскость среза прошла перпендикулярно пластинке и видны радиально ориентированные плечи хромосом, которые связаны центральной суженной областью - центромером (ЦМ). Микротрубочки веретена не выявляются, поскольку цитоплазма эритроцита заполнена электронно-плотным гемоглобином. Цитоплазма эмбрионального эритроцита вообще бедна органеллами, и лишь очень малая их часть (например, митохондрии - МХ) остается в цитоплазме в процессе деления клеток. Просвет кровеносного капилляра, в котором находится делящийся эритроцит, образован несколькими эндотелиальными клетками (ЭК), к которым снаружи прилежит перицит (ПЦ). В третичной ворсине плаценты, т.е. в ворсине с развитыми капиллярами, последние расположены близко к трофобласту и вместе с ним формируют гематоплацентарный барьер. Через компоненты этого барьера осуществляется обмен между циркулирующей в капиллярах ворсины кровью плода и кровью матери, омывающей ворсины за пределами трофобласта. Клетки внутреннего (эпителиального) слоя трофобласта (цитотрофобласта - ЦТБ) являются источниками ядер для клеточной массы наружного слоя - синцитиотрофобласта (СТБ); часть его видна на рисунке (внизу справа). Процесс включения ядер ЦТБ в СТБ включает ряд стадий преобразования самих эпителиальных клеток. Можно видеть, в частности, что цитоплазма двух клеток цитотрофобласта (стрелки), которые выселяются из эпителиального пласта, заметно отличается от цитоплазмы соседних клеток.

БП - базальная пластинка.

После того как хромосомы к концу метафазы установились в экваториальной плоскости и появляется уверенность в том, что генетический материал будет распределен равномерно между двумя дочерними клетками, внезапно наступает следующая стадия митоза - анафаза. Основная ее характеристика - это разделение и расхождение сестринских хроматид (Х) к противоположным полюсам клетки. Один из делящихся лимфоцитов представлен на рисунке. Среди других клеток можно видеть малые и средние лимфоциты (ЛЦ) и большие лимфоциты (лимфобласты - ЛБ), находящиеся в интерфазе. Переход к анафазе жестко контролируется клеткой, поскольку именно в это время, по существу, и решается вопрос, будут ли дочерние клетки иметь идентичный набор хромосом, а следовательно, будут ли они сами идентичными. Перед началом расхождения собственно хроматиды лишаются прочного сцепления друг с другом в области центромера, поскольку белки-когезины, их удерживающие, фосфорилируются и разрывают связи. Механизм расхождения хромосом достаточно сложен и включает участие всех трех наборов микротрубочек митотического веретена (см. рис. 7-7, 7-8). В течение анафазы А хроматиды перемещаются к соответствующему полюсу клетки с помощью кинетохорных микротрубочек. В анафазе В участвуют моторные белки кинезины, которые связывают соседние, параллельно расположенные, полярные микротрубочки. Анафаза протекает по сравнению с другими фазами митоза очень быстро - обычно не более 1 мин. Поэтому ее не очень часто можно зарегистрировать при электронно-микроскопическом исследовании. Здесь виден, по существу, уже конец анафазы и переход к следующей фазе клеточного деления - телофазе. Об этом может свидетельствовать, в частности, начало формирования будущих оболочек ядер вокруг отдельных хромосом (стрелки). На рисунке виден еще один, очень важный для морфогенеза момент. При интенсивной пролиферации (в нашем примере вследствие антигенной стимуляции) часть новообразованных клеток по тем или иным причинам не соответствует необходимым требованиям и, следовательно, должна быть элиминирована из популяции. Как правило, это достигается за счет генетически запрограммированной клеточной смерти - апоптоза. Клетки, в которых индуцируется механизм апоптоза, погибают, обычно не разрушаясь, и их разрушение происходит уже в фаголизосомах макрофага. Три таких разрушающихся лимфоцита видны (внизу справа) в цитоплазме макрофага (МФ). Апоптоз - это процесс избирательный и, в отличие от некроза (см. рис. 7-19), ему часто подвержены отдельные клетки.

Демонстрируется одно из знаменательных событий клеточного деления, зафиксированное с помощью сканирующего электронного микроскопа, - образование двух дочерних клеток из материнской. Цитокинез (собственно деление клетки) является частью заключительной фазы митоза - телофазы. Он выражается в том, что на уровне экваториальной плоскости клетки, т.е. на том уровне, где в метафазе группировались хромосомы, появляется борозда деления (БД), которая постепенно углубляется до тех пор, пока движущиеся навстречу друг другу участки мембран не сольются. Формирование борозды деления связано с тем, что на экваторе образуется сократительное кольцо - пучок циркулярно ориентированных микрофиламентов, располагающийся преимущественно в кортикальной зоне цитоплазмы делящейся клетки. Сокращение этого кольца «сжимает» цитоплазму клетки, деля ее на две примерно равные части. Борозда деления достаточно узкая, и «основания» двух образовавшихся клеток плотно прилежат друг к другу. Видно, что клетки еще не разошлись и не приобрели свою окончательную веретеновидную форму. Более того, далее мы увидим (см. рис. 7-13, 7-14), что вплоть до конца телофазы дочерние клетки остаются связанными тонким цитоплазматическим мостиком, основу которого составляет срединное тельце. Можно видеть также, что поверхность делящейся клетки заметно отличается от поверхностей соседних, «спокойных», клеток - она образует много микроскопических складок, ворсинок и микропузырей. Хотя это типично для всех делящихся клеток, функциональный смысл таких преобразований плазмолеммы пока неясен. События, которые происходят в цитоплазме клетки в течение телофазы почти точное воспроизведение в обратной последовательности того комплекса процессов, который наблюдается в профазе: деградация системы микротрубочек митотического веретена, восстановление ядерной ламины и ядерной оболочки, деконденсация хромосом. Механизмы этой трансформации в значительной степени связаны с дефосфорированием белков, которые ранее, с наступлением митоза, были фосфорилированы. Дочерние клетки часто определяются как пост-митотические, поскольку не всегда ясно будут делиться далее (что часто происходит в интенсивно пролиферирующих клеточных популяциях) или перейдут в спокойное состояние и дифференцируются в специализированные клетки с необходимым набором органелл.

В конце телофазы, еще до завершения клеточного деления, будущие дочерние клетки некоторое время остаются связанными узким цитоплазматическим мостиком. Эта связь достаточно прочная, поскольку сердцевину такого мостика составляет пучок микротрубочек (МТ) - остатки полярных МТ митотического веретена. Темный, кажущийся бесструктурным материал, который располагается примерно на середине цитоплазматического мостика, плотно упаковывает МТ и включает актиновые филаменты сократительного кольца. Эти филаменты ориентированы в пучке с различной полярностью (см. гл. 5) и перемежаются с короткими филаментами миозина II. Существенные моменты в функционировании сократительного кольца остаются до сих пор интригующими. Во-первых, неясно, почему актиновое сократительное кольцо (а следовательно, и борозда деления) располагается точно в экваториальной плоскости. Во-вторых, кажется удивительным, что цитокинез, связанный с сократительной активностью актинового пучка и приводящий к делению клетки на две дочерние, не завершается до тех пор, пока расходящиеся хромосомы не достигнут соответствующих полюсов. Возможно, такая координация событий связана с деятельностью регуляторных ферментов - киназ, часть из которых регулирует одновременно сборку МТ веретена и актинового сократительного кольца. Наконец, не очень понятно, каким образом сокращающийся пучок актиновых филаментов в течение всего цитокинеза сохраняет неизменной свою толщину, хотя диаметр самого сократительного кольца уменьшается очень драматично. Интересно также, что само сокращение контрактильного кольца регулируется активностью миозина II, подобно тому, как это происходит при сокращении гладких мышечных клеток. Фолликулярные эпителиальные клетки яичника в процессе развития фолликула образуют многослойную оболочку вокруг яйцеклетки. Они активно делятся и для восполнения собственной массы в промежутках между эпизодами деления интенсивно синтезируют белки. Об этом свидетельствуют, в частности, обилие полисом (ПС) в цитозоле и фрагменты гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), которые сохраняются даже в делящейся клетке. По мере созревания фолликула продукты жизнедеятельности фолликулярных клеток (белки, гликозаминогликаны, вода) накапливаются в межклеточном пространстве (МП), формируют обширную полость (антрум), и фолликул в конце концов превращается в зрелый (граафов) пузырек, готовый к овуляции.

Показана делящаяся клетка эндотелиальной выстилки аорты (практически, уже две дочерние клетки, связанные, однако, срединным тельцем - СТ). Образующиеся клетки с характерной для митоза ворсинчатой поверхностью начинают расходиться (по сравнению с рис. 7-12), приобретают менее округлую форму, но не спешат завершить цитокинез. Это обстоятельство может свидетельствовать еще об одной, мало упоминаемой морфогенетической функции СТ. Эндотелиальные клетки (ЭК) аорты (и других крупных артерий) имеют в основном отчетливую веретеновидную форму и ориентированы вдоль оси сосуда, т.е. по направлению потока крови. Эта форма и ориентация клеток определяются характером напряжений на клеточной мембране, которые возникают вследствие существования трения между текущей кровью (плазмой) и клеточной поверхностью эндотелиального пласта. Ориентация вытянутых ЭК вдоль оси потока способствует минимизации этого напряжения и в то же время обеспечивает максимальную прочность эндотелиального пласта, находящегося в условиях высокого гидростатического давления. Перед наступлением митоза и в процессе его не только ЭК, но и многие другие клетки изменяют свою форму и становятся более округлыми. По завершении клеточного деления дочерние клетки должны приобрести фенотип, характерный для всей клеточной популяции. СТ, удерживая в течение какого-то времени расходящиеся дочерние клетки, способствует приобретению ими нужной веретеновидной формы и более прочной интеграции в общую эндотелиальную выстилку сосуда. В некоторых клеточных конструкциях, например в сперматогенном эпителии яичка, такой незавершенный цитокинез приводит к образованию синцития, в котором не отделившиеся друг от друга дочерние клетки (сперматогонии и сперматоциты) остаются связанными между собой тонкими цитоплазматическими мостиками, скелетную сердцевину которых составляют пучки микротрубочек. Такие мостики сохраняются вплоть до полного созревания сперматозоидов и отделения их от лишней цитоплазмы.

Этапы подготовки к клеточному делению и его реализация (митоз) не всегда приводят к финальному результату - образованию двух дочерних клеток. Например, после завершения фазы синтеза (S-фазы) количество ДНК в ядре удваивается, но клетка может и не перейти к следующей (G₂ ) фазе. Таким путем образуется тетраплоидное ядро, которое содержит вдвое большее, чем диплоидные ядра, обычных соматических клеток, количество ДНК (4с). В некоторых клетках S-фаза может повторяться многократно, после чего клетка переходит в G₁ -фазу и продолжает жить и функционировать в качестве специализированной клетки с большим полиплоидным ядром.

Довольно распространенным результатом незавершенного митоза, который прерывается после деления ядра, является образование двуядерных или (реже) многоядерных клеток. Такие клетки обычно крупнее одноядерных. В некоторых органах, например в печени и сердце, доля двуядерных и полиплоидных клеток может достигать 15-25% всей популяции. На рисунке показана так называемая гигантская многоядерная клетка (ГК) инородного тела. Эти клетки образуются в условиях продуктивного воспаления в соединительной ткани, которая формируется вокруг плохо разрушающихся инородных тел (частиц кремния, стекла, шовного материала). В ГК гранулем (клетках Лангханса), появляющихся при некоторых инфекционных заболеваниях (туберкулезе, лепре, бруцеллезе), число ядер может достигать 200. Хотя точный механизм образования гигантских многоядерных клеток не очень понятен, их источником часто являются клетки моноцитарного происхождения (предшественники макрофагов), и вполне вероятно, что многоядерные клетки образуются в результате незавершенного митоза.

В верхней части рисунка видна небольшая округлая электронно-плотная клетка, окруженная более светлым ободком цитоплазмы другой клетки (стрелки). Эта измененная клетка имеет морфологические характеристики, типичные для клеток, подвергшихся программированной смерти - апоптозу (АП). Большое ядро с разрушенным и частично конденсированным хроматином (Х), компактная масса которого асимметрично смещена к периферии, окружено плотной цитоплазмой, в которой видны остатки органелл и включения. Клетка окружена практически сохранной плазмолеммой и целиком находится в цитоплазме макрофага (МФ). Смерть клетки не повлекла за собой ее физического разрушения в тканях, и она была поглощена фагоцитом.

Клетки, которые не намерены превращаться в дифференцированные формы и продолжают участвовать в процессе размножения, после митоза вступают в G₁ -фазу клеточного цикла. В течение этого периода они интенсивно наращивают собственную массу для последующего деления и, вследствие активного синтеза цитоплазматических белков, приобретают морфологические характеристики так называемых бластных клеток, лишенных специфических черт, присущих дифференцированным клеткам данного вида. Справа - большой лимфоцит (БЛ) с активным ядром, выраженным ядрышком и обширной цитоплазмой, которая занята множеством свободных рибосом, придающих ей зернистую текстуру. Короткие фрагменты эндоплазматической сети, небольшие митохондрии и элементы цитоскелета представлены скудно и маскируются свободными рибосомами. Подобная морфология - активное ядро и цитоплазма, оккупированная рибосомами, - вообще характерна для активно пролиферирующих (бластных) клеток независимо от их принадлежности. Не все БЛ являются бластными клетками. Большая часть этой субпопуляции клеток отличается от средних и малых лимфоцитов (соответственно СЛ и МЛ) лишь размером. Хотя отчетливых морфологических различий между В- и Т-лимфоцитами не найдено, можно полагать, что представленные клетки являются В-лимфоцитами, поскольку располагаются в корковом веществе лимфатического узла. В иммунологической практике В- и Т-клетки, как и их подтипы, различают на основании анализа специфических антигенных маркеров, которые клетки экспрессируют на своей поверхности. ДК - отросток дендритной клетки.

О том, что интенсивно делящиеся (бластные) формы клеток морфологически весьма подобны, свидетельствует сравнение этого рисунка с предыдущим. Демонстрируются клетки эмбриональной закладки сердца цыпленка на 2-е сутки инкубации. На этой стадии развития клетки еще не способны к сокращению, поскольку лишены сократительных органелл (см. рис. 5-2). Клетки интенсивно делятся, наращивая массу будущего миокарда, а в их строении отчетливо проявляются черты недифференцированности. Как и в других бластных формах, наблюдаются активное эухроматичное ядро с выраженным ядрышком ( ЯД), множество полисом в цитоплазме, придающих ей зернистый вид, светлые, полупрозрачные митохондрии с неразвитыми кристами, фрагменты эндоплазматической сети (ЭС) и комплекса Гольджи (КГ) и несколько лизосом (ЛС). Единственным признаком органной специфичности можно считать множество локальных связей, которые кардиомиобласт поддерживает с клетками-соседями (стрелки). Однако эти связи еще не трансформировались в специализированные клеточные соединения, характерные для вставочных дисков миокарда (см. рис. 3-42, 3-43). Обширные межклеточные пространства также не характерны для развитой сердечной мышечной ткани. Можно полагать тем не менее, что клетка уже вступила на путь органоспецифической дифференциации, т.е. коммитирована в этом направлении. Многочисленные полисомы необходимы не только для усиленного синтеза белка с целью увеличения клеточной массы, но и для синтеза специальных цитозольных белков будущего аппарата сокращения (актина и миозина, а также ассоциированных с ними белков). Цистерны ЭС и КГ, как известно, участвуют в синтезе интегральных белков клеточных мембран, в частности белков межклеточных контактов (десмосом, адгезивных полосок и нексусов). При переходе клеток на аэробный тип дыхания митохондрии будут постепенно приобретать все более типичную для кардиомиоцитов структуру. Л - липидное включение в ядре.

Развивающееся сердце цыпленка является удобной моделью для анализа дифференцирования клеток, поскольку последнее происходит быстро, вполне отчетливо, и его сроки можно достаточно точно контролировать. На 4-е сутки инкубации эмбриона дифференцирующиеся кардиомиоциты уже существенно отличаются от «невыразительных» бластных клеток. В них пояляются миофибриллы с поперечной исчерченностью, которая связана с расположением электронно-плотных Z-линий (МФ). Большая часть миофибрилл, однако, еще не имеет преимущественной ориентации вдоль длинной оси клеток, характерной для дифференцированных клеток миокарда, и в самих миофибриллах преобладают актиновые филаменты - анизотропные диски практически не выявляются. Миофибриллы занимают довольно значительный объем цитоплазмы. Многочисленные митохондрии (МХ) с более развитыми, чем в кардиомиобластах, кристами начинают группироваться в цепочки вдоль МФ.

Светлая клетка, расположенная в центре, заметно отличается от клеток-соседей. В ней практически отсутствуют МФ, а в цитоплазме много мембранных структур - пузырьков, фрагментов цистерн и лизосом. Крестообразная фигура в центре - это одна из центриолей (Ц) с пучками микротрубочек, отходящих от нее. Эта клетка принадлежит к дифференцирующейся проводящей системе сердца. В отличие от сократительного миокарда основные функции клеток проводящей системы связаны не с сокращением как таковым, а с генерацией импульсов (установлением ритма), их проведением к рабочему миокарду и координацией сокращений в различных отделах сердца. Несмотря на существенные отличия от сократительных клеток, стимулирующие кардиомиоциты (клетки-пейсмейкеры) не имеют каких-либо специфических черт, которые свидетельствовали бы об их особенной специализации. Единственным признаком, исходя из понимания их функций, могли бы быть развитые связи с клетками-соседями. Действительно, можно видеть, что клетка формирует довольно протяженные, но простые соединения с сократительными кардиомиоцитами, и лишь в ограниченных участках начинают формироваться специализированные межмембранные контакты - десмосомы и, возможно, нексусы (стрелки). К указанному сроку развития клеточная масса, составляющая закладку сердца, уже обладает способностью к регулярному автономному сокращению с определенным ритмом, и этот ритм задается клетками-пейсмейкерами.

Мы уже обсуждали эпизоды программированной (генетически детерминированной) клеточной смерти - апоптоза, в процессе которого клетка фактически убивает себя. В ответ на внешние стимулы или угрожающие жизни состояния, например серьезные ошибки в репликации ДНК, включаются запрограммированные и в этом смысле вполне физиологические процессы, приводящие к клеточной гибели. Апоптотические клетки приобретают, как правило, характерную морфологию. Однако клетки могут гибнуть и от случайных причин, например от довольно часто встречающейся локальной или распространенной ишемии - недостатка кислорода. Клеточная смерть от случайных причин (ишемии, физических повреждающих факторов, цитотоксических ядов, воспаления и др.) называется некрозом.

Представленный кардиомиоцит подвергся длительной (45 мин) ишемии, поскольку сердце в течение этого срока переживало в трупе животного. Понятно, что в этих условиях некроз клеток миокарда будет повсеместным и клеточные повреждения будут проявляться в чистом виде. В живом организме, даже при ограниченном повреждающем воздействии, некрозу (в отличие от апоптоза) подвергаются обычно группы клеток, а не единичные клетки, и вследствие такого повреждения в тканях развивается выраженная воспалительная реакция. Как видно, смерть клетки сопровождается массивным повреждением митохондрий (МХ), лизисом миофибрилл (МФ) и характерными изменениями ядра (Я). Такое ядро называют пикнотичным, поскольку оно заметно уменьшается в размере, конденсируется и более интенсивно окрашивается гистологическими красителями. При некрозе, особенно в условиях переживания, обычно активируется лизосомный (ЛС) компонент клетки, и высвобождающиеся в цитоплазму гидролитические ферменты способствуют разрушению органелл.

Некротические проявления в клетке не всегда выражаются в разрушении мембранных структур, хотя деструкция органелл, как правило, присутствует обязательно. Очень часто некроз эпителиальных клеток принимает форму распространенной вакуолизации цитоплазмы, при которой мембранные органеллы (митохондрии, богатая эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи) превращаются в довольно однородные мембранные пузырьки, везикулы или вакуоли, так что принадлежность мембран к той или иной органелле выяснить уже не удается.

Видны фрагменты нескольких экзокриноцитов поджелудочной железы человека, причиной разрушения которых было длительное нарушение оттока секрета. Такая ситуация может возникнуть, в частности, при желчнокаменной болезни, в течение которой камень, образовавшийся в желчных протоках или желчном пузыре, перекрывает выходное отверстие дуоденального (фатерова) сосочка. В ампулу сосочка часто открываются оба протока - общий желчный и основной проток поджелудочной железы. Длительное нарушение оттока секрета поджелудочной железы приводит к повышению внутрипротокового давления, повреждению секреторных отделов железы и нередко к развитию угрожающего жизни состояния - панкреатиту. Некроз экзокринных клеток в этом случае мозаичного характера, с разной степенью повреждения клеток. На рисунке в экзокриноцитах видны разрушения различной интенсивности. В одних клетках практически все мембранные органеллы превратились в вакуоли (стрелка), в других можно видеть фрагменты еще относительно сохранной эндоплазматической сети (ЭС). В клетке, расположенной в центре, еще сохранились островки неповрежденной цитоплазмы, но ядро (Я) становится пикнотичным. Такая, вакуолярная, форма некроза клеток очень близка к некоторым видам программированной клеточной смерти, например к аутофагии. Полагают также, что при некоторых формах некроза в клетке могут экспрессироваться гены и появляются их продукты (в частности, ферменты каспазы), присутствие которых ранее расценивалось как характерный признак (маркер) апоптоза. Таким образом, наше разделение клеточной смерти на смерть вследствие повреждения, т.е. некроз, и генетически детерминированную смерть, например апоптоз, в значительной мере условно. Это утверждение кажется тем более справедливым, если учесть, что в некоторых случаях апоптоз, как и некроз, возникает в ответ на внешние повреждающие стимулы, а в развитии некроза участвуют также регуляторные клеточные механизмы апоптоза. Более того, и в нормальных морфогенетических процессах клеточные трансформации могут иметь внешние признаки некротического процесса (см. рис. 7-21).

При обсуждении клеток ворсин эмбриональной части плаценты, которые были представлены ранее (см. рис. 4-1, 7-10), говорилось о том, что эти ворсины являются динамичными структурами и в своем развитии проходят ряд стадий или фаз. Так называемые вторичные ворсины, помимо трофобласта, имеют соединительнотканную основу, но еще лишены капилляров, которые врастают в ворсину позднее. Вторичная ворсина, представленная на рисунке, сформирована двумя слоями трофобласта: наружным сплошным слоем синцитиотрофобласта (СТБ) и внутренним клеточным слоем - цитотрофобластом (ЦТБ). Соединительнотканная основа, строма ворсины, пока развита плохо, в ней можно видеть лишь единичные мезенхимные клетки (МК) и скудный внеклеточный матрикс; окружающее клетку пространство выглядит пустым. ЦТБ представлен одним слоем эпителиальных клеток (в данном случае плоским эпителием, который позднее трансформируется в типичный кубический однослойный, см. рис. 7-5). СТБ в отличие от ЦТБ - это сплошная цитоплазматическая масса, не разделенная на отдельные клетки, но имеющая множество ядер. С подобной формой организации мы уже встречались при обсуждении морфологии скелетной исчерченной ткани. В ней длинные мышечные волокна также не разделяются на отдельные отсеки, а многочисленные ядра локализуются на периферии, под клеточной мембраной. Синцитий можно рассматривать как одну гигантскую клетку с многочисленными ядрами. Единственным внешним отличием является отсутствие клеточных границ внутри единой цитоплазмы, участки которой обслуживаются соответствующим ядром. С этой точки зрения СТБ является поистине огромной многоядерной клеткой, поскольку этот синцитий покрывает всю поверхность ворсин плаценты, суммарная площадь которых превышает, по некоторым данным, 10 м² .

Формирование синцития может происходить разными путями. Скелетные мышечные волокна, как полагают, развиваются в эмбриогенезе за счет слияния отдельных нормальных клеток-предшественников - миобластов, и их ядра становятся ядрами общей цитоплазмы волокна. Образование СТБ менее понятно. Считают, что источником его ядер является ЦТБ, поскольку ядра СТБ не включают меченые предшественники азотистых оснований (³ Н-тимидин), а следовательно, не синтезируют ДНК и не делятся. Напротив, клетки ЦТБ делятся интенсивно, и эпизоды, характеризующие деление его ядер, уже были продемонстрированы (см. рис. 7-5, 7-9). Возможно, что в процессе перемещения ядер из пласта клеток ЦТБ в СТБ последний получает и часть цитоплазмы, поскольку трудно себе представить механизм, который позволял бы переносить изолированные ядра. Судя по некоторым картинам (см. рис. 7-10), клетки ЦТБ вытесняются из эпителиального пласта в СТБ, а их цитоплазма претерпевает определенную трансформацию и становится весьма похожей на цитоплазму СТБ. Эта трансформация очень напоминает вакуолизацию мембранных структур при некоторых разновидностях клеточной смерти. Да и сам механизм вытеснения клеток из ЦТБ в СТБ аналогичен механизму элиминации поврежденных и старых клеток из других эпителиальных пластов, например из эпителия, покрывающего поверхность кишечных ворсин. Однако при этом ядра ЦТБ и фрагменты цитоплазмы клеток сохраняют свою жизнеспособность. Возможно, такая частичная смерть клетки является некоторым вариантом генетически детерминированной клеточной смерти.

Оба рисунка (а, б) показывают очажок эритроидного кроветворения - эритробластический островок в селезенке мышей (у грызунов эритроидное кроветворение вне костного мозга сохраняется на протяжении всей жизни). Обычно такой островок включает клетку-няньку - большой макрофаг (МФ), вокруг которого группируются клетки эритроидной линии, находящиеся на разных стадиях дифференцирования и созревания. На рис. 7-22, а виден фрагмент полихроматофильного эритробласта (ПХЭБ), сравнительно большой клетки, с активным ядром и выраженным ядрышком. Полихроматофильные эритробласты сохраняют способность к клеточному делению; их строение достаточно типично для бластных клеток. Клетки следующей стадии дифференцирования, ортохроматофильные эритробласты (ОХЭБ), уже не делятся, а их морфология претерпевает определенные изменения - хроматин ядра конденсируется, цитоплазма становится более электронно-плотной вследствие накопления гемоглобина, и в ней сохраняются лишь некоторые органеллы - полисомы, митохондрии. Такие трансформации не случайны, поскольку в последующем ортохроматофильные эритробласты освобождаются от ядер и превращаются в ретикулоциты (РЦ). Последние отличаются от зрелых эритроцитов (ЭЦ) менее плотным содержимым и наличием в них остатков некоторых органелл - митохондрий, эндоплазматической сети. На рисунке представлен фрагмент одного из эритроцитов.

Механизм выталкивания (экструзии) ядра из ортохроматофильного эритробласта, по-видимому, аналогичен механизму голокринной секреции. Ядра вместе с прилежащим тонким слоем цитоплазмы отграничиваются участком клеточной мембраны и высвобождаются во внеклеточную среду. Такие мини-клетки быстро фагоцитируются макрофагом. На рисунке в цитоплазме макрофага можно видеть пять таких клеток (МК), которые претерпевают дальнейшие превращения.

Постепенно плазмолемма и цитоплазма, окружающие ядро, разрушаются, а хроматин становится более плотным. Эти превращения ядер с фрагментами цитоплазмы очень напоминают изменения морфологии клеток при апоптозе, и начинаются они еще на стадии ортохроматофильного эритробласта. Рис. 7-22, б показывает дальнейшую судьбу фагоцитированных ядер - их разрушение в фаголизосоме (ФЛС) макрофага. Макрофаги эритробластических островков не случайно называют клетками-няньками, поскольку они не только убирают вытолкнутые ядра, но и регулируют процессы пролиферации, дифференцирования и созревания клеток эритроидной линии, высвобождая некоторые цитокины в свое непосредственное окружение. Закономерные и строго регулируемые процессы дифференцирования и созревания эритроцитов можно обсуждать как своеобразный пример программированной клеточной смерти. Весь процесс эритропоэза в островке, начиная со стадии клетки-предшественника - проэритробласта вплоть до образования зрелого эритроцита, продолжается всего 4-5 дней. Однако умирание последней клетки (ортохроматофильного эритробласта) можно разбить на две фазы, которые разделены очень большим временным интервалом. Часть клетки, включающая ядро и небольшой фрагмент цитоплазмы, подвергается апоптозу, выталкивается из клетки и вскоре фагоцитируется рядом расположенным макрофагом. Оставшийся безъядерный мешочек с гемоглобином - эритроцит, циркулируя в крови, живет еще довольно долго (у человека в среднем 120 дней), стареет и разрушается макрофагами селезенки. По существу, в процессе дифференцирования, созревания и последующей жизни эритроцита используется механизм программированной клеточной смерти. Правда, окончательная смерть безъядерной клетки отсрочена, с тем чтобы она могла в этом состоянии более эффективно выполнять свои специфические и в чем-то даже уникальные функции.

До сих пор обсуждались базовые функции клеток и структуры, которые обеспечивают эти функции. В большей или меньшей степени базовые функции присущи всем типам клеток (а их в организме более 250). Именно поэтому при обсуждении структуры, функций и свойств клетки и ее органелл были использованы в качестве примеров специализированные клеточные формы. Ведь клетки вообще, т.е. некоей средней клетки, вообще не существует (прошу простить этот невольный каламбур). С определенным допущением можно было бы заключить, что превалирование, более интенсивное проявление той или иной функции, означает клеточную специализацию, т.е. формирование того или иного особенного типа клеток. Совершенно очевидно, однако, что такое заключение сильно упрощает и искажает реальную картину. Во-первых, отчетливое превалирование какой-либо особенной функции может быть в клетках, принадлежащих к совершенно разным клеточным типам. Например, интенсивный синтез белка (и развитие соответствующих органелл) существует как доминирующая функция в клетках секреторного эпителия и в активных фибробластах, которые к эпителию не принадлежат. Тем не менее строение этих клеток может быть очень похожим. Во-вторых, преимущественное выполнение какой-либо функции совсем не означает, что все клетки, которые этим занимаются, будут иметь подобную структуру. Очевидным примером различий в структуре могут быть исчерченные волокна скелетных мышц и гладкие мышечные клетки, хотя для обоих клеточных типов движение (сокращение) является доминирующей функцией. И наконец, не менее важен и тот факт, что клетки с подобными морфологическими особенностями и общей доминирующей функцией могут выполнять совершенно разные с точки зрения их специализации в организме задачи. Так, экзокринные (ацинарные) клетки поджелудочной железы и плазматические клетки (конечная форма развития В-лимфоцитов) имеют весьма сходную структуру и предназначены для синтеза больших объемов белка. Однако если эпителиальные клетки поджелудочной железы синтезируют пищеварительные ферменты, в плазматических клетках соединительной и лимфоидной ткани осуществляется синтез антител, т.е. белков с совершенно иными функциями. Более того, функциональная специализация проявляется здесь, наверное, в максимальной степени - каждая плазматическая клетка способна синтезировать антитела только против одного специального антигена. Вряд ли будет большим преувеличением, если мы допустим, что для образования необходимых специализированных клеточных форм организм многоклеточного животного использует почти неограниченные возможности. Точнее, его возможности ограничены лишь величиной и содержанием генома.

Онтогенетически образование клеток каждого особенного типа представляет собой дифференцирование их из недифференцированных (зигота, стволовые клетки) или малодифференцированных (клетки-предшественники) клеточных форм. В зависимости от используемого методического подхода процесс дифференцирования можно определить в разных, но взаимодополняющих понятиях. Для генетика это будет контролируемая определенная последовательность экспрессии тех или иных генов, для биохимика и молекулярного биолога, специалиста в области протеомики (если использовать современный термин) - динамика синтеза и функционирования определенного набора белков, для морфолога - формирование, развитие и функции тех органелл, совокупность которых позволяют отнести клетку к тому или иному особенному типу. Поскольку онтогенез клетки - процесс динамичный и непрерывный, в структуре клеточной популяции можно ожидать одновременное существование клеточных форм с различной степенью дифференцированности. Эту совокупность в различной степени дифференцированных клеток часто определяют как дифферон. Очень часто конечным этапом дифференцирования является необратимый выход из клеточного цикла или естественная клеточная смерть.

Если придерживаться иерархического принципа организации живого, то следующим за клеткой, более высоким уровнем организации, который самым непосредственным образом связан с многоклеточностью, должен быть уровень ткани - предмет изучения (и преподавания) такой науки, как гистология. Но при попытке понять, что такое есть ткань, возникают определенные (и часто игнорируемые) трудности. Существует много не очень сильно различающихся определений такого понятия, как ткань. Приведем лишь некоторые из них. Одно из первых определений, данное А. Колликером: «Ткань - это комплекс элементарных составных частей, объединенных в одно морфологическое и физиологическое целое» (Kolliker A. Handbuch der Gewebelehre des Menschen. 1852). Понятно, что недостаточно конкретные, общие термины, использованные в этом определении, не позволяют вообще заключить, о чем конкретно идет речь, хотя в общем контексте изложения материала содержание определения становится более ясным. В 1938 г. известный отечественный гистолог А.А. Заварзин предложил формулировку понятия «ткань», которая в той или иной модификации используется в большинстве учебников и руководств и в настоящее время: «Ткань есть филогенетически обусловленная система гистологических элементов, объединенных общей функцией, структурой и, часто, происхождением». Очевидная сложность в этом определении - термин «гистологический элемент». Во-первых, неясно, что за элемент имеется в виду, и, во-вторых, вряд ли можно определить сам объект через использование терминов, этот объект обозначающих; histos в переводе с греческого и означает «ткань».

В последнем издании популярного отечественного учебника (Гистология, цитология и эмбриология / Ю.И. Афанасьев и др. (ред.). М.: Медицина, 2004) приводится более современно звучащее определение: «Ткань - это возникшая в ходе эволюции частная система организма, состоящая из одного или нескольких дифферонов клеток и их производных, обладающая специфическими функциями благодаря кооперативной деятельности всех ее элементов». Определение кажется содержательным лишь на первый взгляд. Неясно, о какой «частной» системе идет речь, хотя очевидно, что эта система не принадлежит к категории тех, которые традиционно определяются как системы организма: пищеварительная, нервная, эндокринная, иммунная и др. Далее, трудно себе представить какую-либо из основных тканей (эпителиальную, соединительную, мышечную и нервную), состоящую из одного дифферона. Не менее трудно вообразить «кооперативную деятельность» таких производных соединительнотканных клеток, как коллагеновые или эластические волокна.

Возможно, пытаясь преодолеть неизбежные сложности в содержательном определении понятия «ткань», В.Л. Быков в своем учебнике ограничился очень простой формулировкой: «Ткань - система клеток и их производных, специализированная на выполнении определенных функций» (Цитология и общая гистология. СПб.: Сотис, 2002). Простота определения открывает самые разнообразные возможности. Так, под это определение попадают и сложные гистологические структуры, например печеночная долька, состоящая из клеток, принадлежащих разным тканевым типам.

Это кажется удивительным, но определение ткани, которое нам импонирует более всего, мы встретили на общеобразовательном сайте Badis® в разделе «Анатомия и физиология человека для школьников» (автор, к сожалению, не указан): «Совокупность клеток и межклеточного вещества, сходных по происхождению, строению и выполняемым функциям, называют тканью» (htt://badis.narod.ru/ home…​). Помимо простоты, вызывающей тем не менее мало возражений, в этом определении нам кажется очень важным использование глагола «называют» вместо традиционно используемых или негласно подразумеваемых сказуемых «представляет собой», «является» или «существует» («есть»). Тем самым подчеркивается сугубо гносеологический и, более того, дидактический характер понятия. В отличие от клеток, которые представляют собой реально существующие сущности (неизбежная тавтология), ткань не есть объект, которому присущи характеристики бытия, она не существует. Это понятие пригодно лишь для целей классификации, организации научного материала или преподавания.

В организме нет эпителиальной ткани вообще, а есть лишь клеточные ассоциации, которые мы относим к эпителию. Именно поэтому очень часто возникает необходимость говорить о разных эпителиальных или мышечных тканях, например о железистом и покровном эпителии, а последний, в свою очередь, делить еще на несколько подтипов. В стенке кишки, например, при микроскопическом исследовании мы можем увидеть лишь пласт подобных (эпителиальных) клеток, связанных между собой межклеточными соединениями, но не эпителиальную ткань или покровный эпителий. Косвенным подтверждением неясности в определении понятия «ткань» может быть и то, что этот термин часто используется (и в этой книге тоже) не для характеристики какой-либо ткани, а просто для маркировки соответствующего (микроскопического) уровня организации. И, если оставаться на этом тканевом уровне организации, мы должны признать, что при изучении образца ткани в световом или электронном микроскопе мы видим не сами ткани, а некоторые тканевые или гистологические структуры, образованные из клеток (и, конечно, их производных), имеющих общие черты строения и функционирования и часто - общее происхождение. Клетки могут иметь анатомические связи или располагаться на некотором отдалении друг от друга. В более сложном варианте гистологические структуры строятся из клеток, которые мы вообще относим к различным тканевым типам.

Формирование таких клеточных ассоциаций, или сообществ, объединенных для достижения общей цели (определенной функции), и есть основное свойство многоклеточности. И единственным средством поддержания многоклеточности (а следовательно, и жизни многоклеточного организма) являются клеточные взаимодействия и взаимодействия клеток с внеклеточным окружением. Формально мы можем объединить эти взаимодействия в три категории: контактные, коротко-дистантные и отдаленные. При контактных взаимодействиях клетки образуют временные или постоянные межклеточные (мембранные) соединения, которые мы обсуждали достаточно подробно в главе 3. К этой же категории следует отнести и химические синапсы, хотя в их структуре и нет непосредственного взаимодействия мембран. Понятно также, что в категорию контактных взаимодействий попадает и большая часть взаимодействий клеток с внеклеточным матриксом. При коротко-дистантных (паракринных) взаимодействиях клетки расположены достаточно близко, но все же отделены друг от друга довольно большим (до нескольких сотен микрометров) расстоянием и общаются посредством химических сигналов. Средой, в которой распространяются сигнальные молекулы, в этом случае выступает содержимое межклеточного (интерстициального) пространства, например основное вещество соединительной ткани. При значительном удалении клеток-продуцентов сигнальных молекул от клеток-мишеней в качестве посредника выступает уже циркулирующая кровь, и взаимодействия принимают характер эндокринных.

Все эти взаимодействия различаются не только скоростью ответа, но и избирательностью. Хотя выяснением конкретных механизмов клеточных взаимодействий исследователи занимаются давно и очень интенсивно, и в результате этих усилий уже начинает складываться достаточно содержательная картина, нам кажется, что описание фактов в этом случае мало поможет в понимании основных принципов жизни отдельных клеток в составе многоклеточного организма. Очень показательным, по нашему мнению, могло бы быть сравнение основных свойств и «устремлений» нормальных клеток и клеток, которые подверглись злокачественному перерождению (далее для простоты - опухолевые или раковые клетки). Результатом такого перерождения является потеря раковыми клетками ключевых характеристик, которыми отличаются клетки многоклеточного организма, и, напротив, приобретение ими свойств, характерных для одноклеточных организмов (что в общем-то одно и то же). Изучение свойств опухолевых клеток в значительной мере способствовало нашему пониманию социального поведения клеток нормальных, их жизни в многоклеточных ассоциациях.

Тело животного (и человека) можно определить как сообщество или экосистему клеток, которые воспроизводятся посредством клеточного деления и организованы во взаимодействующие ансамбли, или ткани.

В этом простом определении, которое мы с незначительными изменениями воспроизвели из руководства «The Cell» (Alberts B. et al., 2008) есть три ключевых положения. Во-первых, клетки, во всяком случае соматические клетки, должны при делении воспроизводиться, т.е. повторять в потомстве самих себя без изменений. Во-вторых, условием их функционирования как членов сообщества, или системы, является взаимодействие, причем имеющее своей целью выживание всего организма. И наконец, многоклеточный организм - это не просто сообщество, но экосистема, т.е. такая система, в которой все проявления клеточной жизнедеятельности сбалансированы и регулируются самими клетками естественным образом. Иными словами, результатом (и смыслом) клеточных взаимодействий являются контролируемые события рождения и смерти клеток, их жизнь в привычном, соответствующем для них окружении и на ограниченной территории, а также поддержание необходимого размера клеточной популяции.

Несколько опережая логику изложения и слегка утрируя смысл, можно полагать, что в таком сообществе клетки ориентированы, скорее, на самоубийство, чем на выживание. Каждая клетка является социально ответственным индивидуумом, и ее жизнь подчинена общему балансу сигналов, которые регламентируют основные проявления жизнедеятельности. Главная опасность в таком контексте - это возникновение молекулярного дисбаланса сигналов с точки зрения их генерации, восприятия и реализации эффектов. Такой дисбаланс может возникнуть в результате наследуемых мутаций, т.е. передаваемых в череде клеточных поколений изменений генома.

В теле человека более чем 10¹⁴ клеток, и биллионы из них мутируют ежедневно. Особенно опасны и совершенно необходимы для возникновения раковых клеток мутации, результатом которых является прогрессирование пролиферативной активности вследствие потери контроля над клеточным делением. Такие мутации ведут к возникновению растущего мутантного клона клеток, в котором повторяющиеся и разнообразные мутации накапливаются, а естественный отбор приводит к выживанию наиболее продвинутых в этом отношении клеток. Онкологи в этом случае говорят о прогрессе «от плохого к худшему». Этот прогресс в конце концов приводит к разрушению нормального клеточного сообщества - организма. Таким образом, опухоль - это клон одной аберрантной (ненормальной) клетки, и он подвергается клональной эволюции. Клетки злокачественной опухоли, во-первых, воспроизводят отклонения от нормальных ограничений клеточного деления и, во-вторых, с течением времени проникают на территории, предназначенные для других клеток, и заселяют их. Аберрации могут наследоваться генетически (т.е. в изменениях ДНК) и гораздо реже - эпигенетически: в структуре экспрессии неизмененного гена.

Одиночных мутаций недостаточно, чтобы получилась раковая клетка. Для прогрессивной аккумуляции мутаций, как правило, необходим дефект в механизме репарации ДНК, т.е. мутации в генах, чьи продукты (белки) необходимы для защиты генома от повреждения. Такие дестабилизирующие мутации помогают клеткам аккумулировать мутации много быстрее, чем клеткам-соседям. Появляются клетки с генетической нестабильностью. Однако сама по себе нестабильность еще не дает существенного прогресса, хотя и способствует ему, - необходимы мутации, которые приносят эволюционные преимущества (увеличивают выживаемость). Например, появление мутаций в механизмах индукции и контроля клеточной смерти существенно увеличивает выживаемость прогрессивно делящихся раковых клеток. Рак развивается стадиями, медленно из умеренно аберрантных клеток, и для его развития необходим длительный период воздействия мутагена (или спонтанного появления мутаций).

За жизнь нормального человека в его организме происходит около 10¹⁶ клеточных делений, причем мутации происходят с частотой 10^-6 на 1 ген за 1 деление. На самом деле это много, поскольку, как показывают расчеты, каждый ген в течение жизни должен мутировать 10¹⁰ раз. Кажется удивительным не то, что рак развивается часто, а, скорее, то, что он развивается так нечасто.

Клональная эволюция опухоли подобна эволюции организмов. Здесь важны те же факторы:

Чем больше клон, тем выше вероятность дополнительных мутаций. Мутации, которые ведут к увеличению численности клеток (контроль над пролиферацией, контроль над клеточной смертью), критичны для возникновения опухоли. Утрата способности к дифференцированию (мутации в генах, контролирующих программу дифференцирования) тоже критична - малодифференцированные клетки интенсивно пролиферируют, увеличивая размер клона.

Нормальные клетки переживают на своем месте (в своей экологической нише) благодаря сигналам из своего окружения. Когда они лишаются таких сигналов, наступает смерть вследствие апоптоза. Раковые клетки вследствие мутаций оказываются часто резистентными к апоптозу и могут переживать при отсутствии адекватных сигналов окружения. Это является несомненным и весьма прогрессивным для развития клона селективным преимуществом. При развитии опухоли это преимущество злокачественных клеток часто реализуется как формирование метастазов - дочерних отпрысков клона, клетки которого, попадая в кровь или лимфу, продолжают развиваться в несвойственном материнской опухоли окружении. Например, метастазы рака желудка в печень или в тела позвонков (костный мозг). Считают, что метастазирование - это редкое и неэффективное событие. Только одна клетка из тысячи или миллиона раковых клеток способна образовывать метастаз. Тем не менее при отсутствии лечения прогрессирование многих опухолей почти неизбежно приводит к метастазам.

Многие раковые клетки избегают генетически детерминированного лимита пролиферации, который существует, вероятно, для всех нормальных клеток организма. Так, у неизмененных фибробластов человека нормальное число удвоений в культуре не превышает 25-50. Трансформированные фибробласты способны удваивать свое число неограниченное количество раз - они превращаются в бессмертные клеточные линии. Подобным же образом многие линии злокачественных клеток бессмертны, поскольку способны делиться неограниченно. Ограничение числа репликаций клеток тоже можно рассматривать как существенное свойство многоклеточности, поскольку оно, как полагают некоторые исследователи, лежит в основе старения организма. Так ли это в нормальных тканях - не ясно. Возможно, клетки в течение жизни просто не успевают достичь установленного лимита репликации (репликативного покоя).

Пролиферативные ограничения для нормальных клеток действуют и в более короткой временной шкале. Так, клетки, пересаженные в искусственную среду (клетки в культуре), часто теряют некоторые черты дифференцированности и начинают интенсивно размножаться при наличии подходящих условий - субстрата для прикрепления и движения (подложки), факторов роста в культуральной среде и др. Однако вскоре, при достижении так называемого конфлюэнтного монослоя (рис. 8-1), когда свободной площади подложки для распространения становится мало, а общая плотность межклеточных связей достигает некоторой критической величины, клеточное деление останавливается. Этот феномен, известный как контактное торможение деления, не характерен для растущих в культуре раковых клеток - они продолжают делиться, наползают друг на друга и часто образуют многослойную культуру. Злокачественные клетки игнорируют сигналы, исходящие из клеток-соседей, и способны использовать для пролиферации практически любые субстраты.

Можно перечислить несколько ключевых свойств, характеризующих поведение раковых клеток:

Для прогрессивного опухолевого роста необходимы повторяющиеся мутации в нескольких из примерно 200 известных генов, которые считаются критичными для рака. Такие гены могут принадлежать к двум категориям. Протоонкогены кодируют белки, активность которых так или иначе способствует клеточному делению. Например, гены обширной группы Ras кодируют небольшие гуанинтрифосфатазы (ГТФазы), которые участвуют в переносе сигнала от рецепторов факторов роста, экспонированных на клеточной поверхности. Точечная мутация в этих генах может привести к гиперактивности белка Ras и последующей пролиферации даже при отсутствии сигнала (фактора роста). Мутации в генах Ras отмечаются примерно в 25% всех опухолей человека. Мутации в протоонкогенах обычно доминантны и превращают их в онкогены.

Ситуация с другой категорией генов, которые называются генами опухолевой супрессии (ГОС), более сложная. Эти гены кодируют белки-регуляторы, которые осуществляют надзор или контроль за пролиферацией и (или) активируют апоптоз. Деактивирующие мутации в этих генах обычно рецессивны и мало сказываются на контроле клеточного цикла при повреждении одного аллеля, поскольку сохраняется активность другого. Ситуация может резко ухудшиться, если в клетках уже существует наследуемая мутация одного из генов. Примером такого рода может служить ген Rb, мутации которого (делеция в хромосоме 13) приводят к развитию опухоли сетчатки глаза - ретинобластомы и часто наблюдаются при других опухолях. Белок Rb является регулятором прогресса через клеточный цикл, поскольку способен прерывать его. Существует так называемая наследуемая форма ретинобластомы, при которой одна из мутаций передается от родителей, и появление еще одной делеции в парной хромосоме почти неизбежно приводит к развитию опухоли. Огромную роль в возникновении и прогрессировании различных опухолей человека и животных играют мутации в гене, который кодирует белок р53. Этот белок обладает многими функциями, которые так или иначе связаны с контролем клеточного размножения и апоптоза. Его образно называют стражем или ангелом-хранителем генома. Даже одиночные мутации гена р53 могут быть критичными для возникновения опухолей. Мутации этого гена встречаются в 50-70% всех опухолей человека. Полный список протоонкогенов и генов опухолевой супрессии включает практически все гены, чьи продукты участвуют в регуляции социального поведения клеток. Особенно важной в контексте социального поведения (а это и есть многоклеточность) является способность адекватно отвечать на те сигналы от клеток-соседей, которые влияют на клеточное деление, дифференцирование и смерть.

Многие гены, продукты которых выступают в роли белков-регуляторов эмбрионального развития, также критичны для возникновения рака. Сигнальные механизмы, контролирующие эмбриональный морфогенез, работают и в нормальном взрослом организме. Развитие многоклеточного организма и поддержание его структуры во взрослом состоянии зависят от межклеточных коммуникаций, регулируемых процессов пролиферации и дифференцирования, клеточной смерти, способности клеток к движению и адгезии - всех тех аспектов клеточного поведения, нарушение которых характерно для злокачественной опухоли. В поведении раковых клеток часто реализуются особенности поведения малодифференцированных клеток-предшественников (например, базально-клеточная карцинома, развивающаяся из неподвижных клеток эпителиального пласта, метастазирует редко, а меланома - часто, поскольку предшественники меланоцитов в эмбриональном развитии мигрируют в составе мезенхимы на большие расстояния).

В качестве примера опухолевой ткани приводим электронно-микроскопическую картину ткани опухоли Вильмса (рис. 8-2) - одной из наиболее часто возникающих опухолей у детей. Некоторые особенно агрессивные и быстро растущие формы этой опухоли развиваются из нефробластомы - клеток эмбрионального зачатка, образующего почечный эпителий и канальцы почки. Это достаточно типичная картина интенсивно развивающегося опухолевого клона. Несмотря на некоторый полиморфизм, клетки недифференцированы и имеют довольно типичную морфологию бластных клеток. Опухоли самого различного происхождения весьма подобны, поскольку нет существенной разницы в конечном результате независимо от того, активируются ли вследствие мутаций онкогены или мутации приводят к деактивации генов опухолевой супрессии.

Возвращаясь к основной теме этой главы - свойствам и поведению нормальных соматических клеток в составе многоклеточного организма, теперь можно сформулировать ряд ключевых свойств, так сказать, от противного - как не присущих клеткам злокачественным. На наш взгляд, этот перечень невелик, но принципиально достаточен, и его всегда можно детализировать, так же как и иллюстрировать соответствующими примерами:

С точки зрения морфолога, любой достаточно протяженный и объемный фрагмент ткани формально можно рассматривать как хорошо организованную и сбалансированную клеточную систему, которая в многоклеточном организме проявляет себя как целое. Основанием этой целостности являются клеточные взаимодействия, которые в конечном итоге и определяют жизнь и деятельность клеток, образующих эту систему. Конечно, немаловажная роль принадлежит и клеточным производным (основному веществу, базальным пластинкам, коллагеновым и эластическим волокнам, интерстициальной жидкости и т.д.). Но все они - клеточные производные, т.е. продукты клеточной жизнедеятельности, и в этом качестве их можно рассматривать как форму проявления и реализации клеточных взаимодействий.

На рис. 8-3 представлен фрагмент подкожной соединительной ткани человека. Помимо различных клеток соединительной ткани и внеклеточного матрикса, мы можем видеть и кровеносные сосуды (капилляры), которые нередко относят к компонентам соединительной ткани. В просвете капилляров видны клетки крови - эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Формально эти клетки также относят к соединительной ткани, хотя и к ее специальному подтипу. Благодаря множеству разных клеток, которые живут и работают в таком микрорайоне, соединительная ткань должна быть очень строго и чутко сбалансированной системой, хотя внешне она и не несет явных признаков какой-либо геометрической упорядоченности, характерных, например, для эпителиальных конструкций или исчерченных мышц. Основная задача такой соединительной ткани, помимо очевидной механической или связующей функции, - это обеспечение деятельности других специализированных клеток. Это служение другим клеткам, деятельность для других и для целого является, возможно, наиболее ярким примером основного предназначения клеток в многоклеточном организме.

Для выращивания в искусственных условиях (в культуре) клетки высеваются в культуральную среду обычно в виде низкоконцентрированных суспензий. Многие клетки способны делиться только после прикрепления к подложке - субстрату, на котором осуществляется культивирование (например, материал сосуда для культивирования или, как в нашем примере, специальные субстраты - матриксы). По мере деления клетки, распространяющиеся по подложке или в 3-мерном матриксе, устанавливают между собой адгезионные или (реже) щелевые соединения и при достижении определенной плотности монослоя перестают делиться. Этот феномен давно известен как контактное торможение деления, однако его механизмы еще не очень понятны. Контактное торможение деления играет, очевидно, существенную роль и на ранних этапах онтогенетического развития многоклеточного организма, являясь одним из важнейших инструментов морфогенеза.

Злокачественные клетки, растущие в культуре и в опухоли, in situ обычно не подвластны контактному торможению. Даже по достижении конфлюэнтного монослоя трансформированные клетки продолжают делиться, формируя плохо упорядоченные клеточные массы без признаков какой-либо органной или тканевой специфичности (см. рис. 8-2). На рисунке видно, что фибробласты человека растут на поверхности и в толще деминерализованного костного матрикса (КМ). Подобные тканеинженерные конструкции используются (с переменным успехом) для восполнения дефектов механически поврежденной или больной кости. Можно видеть, что клеток сравнительно немного и, хотя они еще не образуют сплошного слоя, между клетками формируются многочисленные контакты, которые в условиях СЭМ выявляются как непрерывные клеточные мостики (стрелки).

В отличие от специализированных клеток, характерных для того или иного органа и ткани, опухолевые клетки теряют черты дифференцированности и, в соответствии с гипотезой клональной эволюции, становятся похожими на малодифференцированные бластные формы. Представленный рисунок может служить весьма демонстративным примером. Несмотря на определенный полиморфизм клеток, их трудно отнести к какой-либо определенной ткани, хотя известно, что опухоль Вильмса имеет эпителиальное происхождение или, более точно, развивается из зачатков промежуточной мезодермы, которые дают начало эпителиальным структурам почки. Видно, что клетки формируют малоупорядоченное скопление без видимых признаков эпителиальной дифференцированности. Об этом может свидетельствовать, в частности, явное отсутствие признаков клеточной поляризации, характерных для эпителиального пласта, и специализированных межклеточных соединений, необходимых для функционирования эпителиальных клеток в составе монослоя. Другой характерной для опухолевых клеток чертой является отсутствие признаков цитоплазматической дифференцированности: стандартный и скудный набор органелл, небольшая цитоплазматическая масса, в некоторых случаях - практически бесструктурная цитоплазма.

Отличительной особенностью почти всех клеток являются ядра, богатые активным эухроматином, которые лишь у некоторых клеток содержат минимальное количество более плотного и неактивного гетерохроматина, локализующегося, как правило, по периферии ядра. Отсутствие признаков эпителиальной специализации и плотная, не характерная для покровного эпителия упаковка клеток свидетельствуют о высокой степени прогрессии опухоли и, следовательно, о ее низкой дифференцированности и злокачественности. Для точной диагностики происхождения таких опухолей обычно используются иммуноцитохимические подходы, позволяющие выявить антигены (например, белки промежуточных филаментов), характерные для соответствующей ткани или эмбрионального зачатка. Таким образом, в прогрессирующей опухоли клетки приобретают все более отчетливые признаки недифференцированных (бластных) клеток, основной функцией которых становится неконтролируемое клеточное деление. Подтверждением высокой пролиферативной активности опухолевых клеток являются и фигуры митоза, которые довольно часто встречаются при электронно-микроскопическом исследовании. В дифференцированной ткани такие находки редки, поскольку при электронной микроскопии мы можем анализировать лишь небольшой фрагмент ткани, и вероятность нахождения фигур митоза невелика. Часть одной из таких делящихся клеток видна на рисунке (внизу слева).

Такие реконструкции совмещают в себе достоинства достаточно высокого разрешения микроскопа и большой площади среза, что недостижимо при изучении отдельных фотографий. Соединительная ткань отличается наибольшим разнообразием клеток. В типичной неоформленной соединительной ткани, которая составляет основу (строму) большинства органов, можно встретить фибробласты (ФБ), макрофаги (МФ), тучные клетки (ТК). Эти так называемые резидентные клетки постоянно или длительно живут в ткани. Они существуют как обособленные единицы и, как правило, не образуют между собой соединений, хотя и взаимодействуют посредством секретируемых сигнальных молекул. Клетки окружены внеклеточным матриксом (ВКМ), который включает различные волокна (коллагеновые, эластические, ретикулярные) и основное вещество, не имеющее определенной электронно-микроскопической структуры. ВКМ вырабатывается самими клетками соединительной ткани.

Соединительнотканный компонент органов содержит много кровеносных сосудов, которые служат для питания самой соединительной ткани и (в основном) паренхиматозных, т.е. специфических для органа, клеток. Клетки, образующие стенки сосудов (в данном примере - капилляров), тоже принадлежат соединительной ткани. Эндотелиальные клетки (ЭК) формируют внутреннюю выстилку капилляров и связаны между собой плотными контактами (стрелки). Во 2-м, наружном, слое капиллярной стенки находятся перициты (ПЦ). Они участвуют в регуляции роста и развития капилляров и, как полагают, при определенных условиях могут дифференцироваться в другие клетки мезенхимной природы. Возможно, что именно перициты являются теми весьма популярными мезенхимальными стволовыми клетками, которые в настоящее время широко используются в клеточных медицинских технологиях. В просвете микрососудов находятся клетки крови - эритроциты (ЭР), лейкоциты (ЛЦ) и тромбоциты (ТЦ). На электронно-микроскопических срезах эритроциты выглядят как темные гомогенные профили различных очертаний. Они, как и тромбоциты, лишены ядер. Лейкоциты, хотя и относятся к клеткам крови, выполняют свои функции в тканях, за пределами сосудов. Например, нейтрофильные лейкоциты поступают в ткань для выполнения функции противомикробной защиты, но после этого гибнут. Лимфоциты постоянно циркулируют между соединительной тканью, кровью и лимфоидными органами, обеспечивая иммунологический надзор и участвуя в иммунных реакциях. Макрофаги могут жить в соединительной ткани довольно долго (десятки лет), но происходят они из моноцитов крови, которые попадают в кровь из костного мозга, циркулируют в крови лишь несколько часов, а затем мигрируют в ткань, чтобы превратиться в различные типы фагоцитирующих клеток. Клетки, которые происходят из моноцитов или их предшественников, из соображений целесообразности объединены в общую гистогенетическую систему мононуклеарных фагоцитов.

Соединительная ткань представляет собой, таким образом, яркий пример хорошо организованного сообщества клеток различных типов. Эти клетки совместно формируют среду, в которой они живут и выполняют свои специальные функции. В целом эти функции объединены одной задачей - обеспечение специфической деятельности других клеток в многоклеточном организме.