Микробиом в медицине : руководство для врачей

Игорь Олегович Стома

Доктор медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней Белорусского государственного медицинского университета, практикующий врач-инфекционист. Приглашенный руководитель научной группы по изучению кишечного микробиома в Центре исследования микробов, воспаления и рака на базе Мемориального онкологического центра им. Слоуна-Кеттеринга (Нью-Йорк, США). Стипендиат Программы им. сенатора Фулбрайта. Председатель аффилированной Минской рабочей группы по инфекциям в гематологии, трансплантологии и онкологии при Европейском обществе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. Является консультантом по вопросам лечения и профилактики инфекционных осложнений у пациентов гематологического профиля и при трансплантации органов и тканей на базе Минского научно-практического центра хирургии, трансплантологии и гематологии.

Автор свыше 100 научных публикаций, из них более 30 работ опубликовано на английском языке в зарубежных изданиях, включая учебные пособия и монографии. Руководитель клинических исследований, зарегистрированных в международных реестрах, автор патентов на изобретения в области медицины. Является членом рабочей группы по инфекциям у иммунокомпрометированных пациентов Европейского общества по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Общества трансплантации, представителем рабочей группы по инфекционным заболеваниям Европейской гематологической ассоциации.

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-0483-7329 Web of Science Researcher ID: G-8688-2019

Эта книга посвящается моим родителям, всегда вдохновляющим и поддерживающим меня словом, делом и личным примером

Дорогие читатели! Вашему вниманию представлено первое комплексное руководство на русском языке на тему микрoбиoма в современной медицине. Прошедшее десятилетие было обозначено временем изучения микрoбиoма, а скорость появления новых знаний и технологий требует быстрой реакции врачебного сообщества. 2020 год ознаменовался новым вызовом для всего человечества, связанным с угрозой COVID-19, что еще раз доказывает значимость изучения микроорганизмов, и не только как возбудителей опасных заболеваний, но и в роли потенциальных союзников человека. Многим современникам стал неожиданно ясен очевидный факт теснейшей взаимосвязи человечества и микробного сообщества. Действительно, на протяжении многих лет микроорганизмы, проживающие в теле человека, оставались за границей пристального научного изучения, а ведь именно они составляют до 90% общего числа клеток в организме человека, при этом по составу своего микрoбиoма каждый из нас абсолютно уникален. И только на протяжении последних лет мы стали более осознанно представлять объемы и характер взаимного влияния мира микробов и мира людей.

Несомненно, новые мoлекулярнo-генетические методы исследования микробного сообщества внутри организма человека за прошедшие годы позволили ощутимо продвинуться в понимании того, насколько микробы и человек необходимы друг другу и как это взаимодействие можно использовать в медицине. В руководстве изложена информация, необходимая современному врачу, для того чтобы его лечение стало для пациента действительно персонифицированным, эффективным и безопасным. Считаю, что современная медицина невозможна без знаний о том, что происходит в микрокосмосе внутри нас, и надеюсь, что эта книга будет полезна самому широкому кругу специалистов!

Автор выражает искреннюю признательность рецензентам за ценные рекомендации, высокую оценку и всестороннюю поддержку при подготовке этой книги.

Игорь Олегович Стома июнь 2020 г.

^♠ - торговое название лекарственного средства и/или фармацевтическая субстанция

^ρ - лекарственное средство не зарегистрировано в Российской Федерации

^¤ - лекарственное средство в Российской Федерации аннулировано, то есть исключено из официального Регистра ЛС

БВ - бактериальный вагиноз

БГ - β-глюкан

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДП - дыхательные пути

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИКК - интерстициальные клетки Кахаля

КДАИ - C. difficile -ассоциированная инфекция

КЦЖК - короткоцепочечная жирная кислота

ЛПС - липополисахарид

ЛС - лекарственное средство

НПВС - нестероидное противовоспалительное средство

ОТЕ - операционная таксономическая единица

ПАМС - патоген-ассоциированные молекулярные структуры

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - ревматоидный артрит

РАС - расстройства аутистического спектра

РС - рассеянный склероз

РТПХ - реакция «трансплантат против хозяина»

СД - сахарный диабет

СРК - синдром раздраженного кишечника

ТГСК - трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

ТМА - триметиламин

ТМАО - триметиламин-N-оксид

ТФМ - трансплантация фекальной микробиоты

ФНО - фактор некроза опухоли

ЦНС - центральная нервная система

ЭНС - энтеральная нервная система

BDNF - мозговой нейрoтрoфический фактор (brain-derived neurotrophic factor)

CRISPR - особые участки бактериальной дезoксирибoнуклеинoвoй кислоты, короткие палиндрoмные кластерные повторы (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)

FODMAP - ферментируемые oлигo- димоносахариды и пoлиoлы (Fermentable OligoDi- MonoAnd Polyol)

ITS - внутренний транскрибируемый спейсер - некoдирующая нуклеoтидная последовательность ДНК, разделяющая повторяющиеся гены рибoсoмальнoй РНК

NCT - номер регистрации в международном реестре клинических исследований (ClinicalTrials.gov)

Мир внутри нас: действительно ли все болезни - инфекционные?..

Микробиом - весь комплекс генов микроорганизмов, которые проживают в теле человека, как в норме, так и при патологии. К ним относятся бактерии, грибы и вирусы, археи, простейшие.

Микробиом кишечника определяет здоровье человека, от него зависят устойчивость к инфекциям, работа иммунитета, метаболизм человека и даже его поведение.

Для формирования здорового иммунитета ребенку необходимо встречаться с микроорганизмами, которые тренируют иммунную систему. По сути, микробиом выполняет функцию калибровки иммунитета, поддерживает его эффективную работу. И уже имеются данные о том, что если ребенок растет в чрезмерно чистой среде, где отсутствуют бактерии, то его иммунной системе не на чем тренироваться, а это может приводить к аллергическим заболеваниям, бронхиальной астме, аутоиммунным заболеваниям.

Конечно, необоснованное использование антибиотиков - основной повреждающий фактор для микробиома. Поэтому каждый раз, когда вы собираетесь принимать антибиотики, проконсультируйтесь со специалистом. Среди других факторов, негативно влияющих на микробиом, - нездоровое питание с малым содержанием растительной клетчатки.

В экспериментальных работах показано, что существует физиологическая ось «микробиом кишечника-центральная нервная система (ЦНС)». И состав, и функции бактерий, проживающих в кишечнике, влияют на риск и течение ряда заболеваний ЦНС, в том числе аутизма и болезни Паркинсона. Существует даже девиз: «Приведя в порядок кишечный микробиом, вы наладите работу мозга». Более того, многие ученые иронично называют микробиом кишечника нашим «вторым мозгом».

На сегодняшний день мы можем точно сказать, что «классические», доступные в продаже пробиотики безопасны, но вопрос их эффективности открыт даже среди профессионалов. Дело в том, что все люди более чем на 99% отличаются друг от друга по составу кишечного микробиома, и крайне сложно предложить универсальный, полезный для всех пробиотик. Однако работы в этом направлении ведутся, и есть шанс, что будут предложены действительно эффективные методы влияния на микробиом.

Однозначно можно сказать, что бактерии нашего кишечника предпочитают растительную клетчатку, но также очень важно поддерживать разнообразие в питании, не довольствоваться одним типом продуктов, ведь чем разнообразнее питание, тем разнообразнее бактерии микробиома и тем лучше его защитная функция. Интересно, что в последние годы появляется все больше работ, подтверждающих пользу ферментированных продуктов, тех, что исторически входят в наш рацион, например квашеной капусты.

Одним из факторов, тесно связанных с кишечным микробиомом, является функция печени. С одной стороны, продукты распада веществ в кишечнике попадают в печень, а с другой стороны, при сниженной функции печени страдают «полезные» бактерии в кишечнике и их разнообразие. Поэтому токсические вещества, в том числе алкоголь, могут приводить к негативным последствиям для микробиома. Умеренная же физическая активность стимулирует перистальтику и нормальную функцию микробиома.

Переосмыслена роль микробиома в эффективности лекарств. И ранее было известно, что на одну и ту же дозу лекарства разные люди реагируют по-разному, и считалось, что это зависит в основном от генетики самого человека. Сейчас стало ясно, что эффективность многих лекарств зависит от того, какие именно бактерии живут в кишечнике у человека. Ведь эти бактерии часто первые метаболизируют таблетки, которые мы принимаем.

От состава микробиома кишечника во многом зависит масса тела человека. Один из ярких экспериментов в этой области показал, что если кишечный микробиом от пациентов с ожирением пересадить лабораторным животным, то эти животные начнут быстро набирать массу. И уже сегодня в отдельных странах врачи выполняют трансплантацию фекальной микробиоты, в основном для борьбы с опасными инфекциями.

Путь в тысячу ли начинается с первого шага.

Лао-Цзы

Сегодня мир переходит к медицине, основанной на принципах профилактики, персонификации, предиктивности и участия пациентов. Под профилактикой понимается комплекс мер, включающий не просто предотвращение конкретных заболеваний, но и распространение здорового образа жизни. Персонификация предполагает индивидуальную диагностику, индивидуальные подходы к лечению, в том числе к выбору лекарств, режимов дозирования и даже применение индивидуальных терапевтических препаратов. Что касается предиктивной медицины, то при использовании информации о генах конкретного человека или его микроорганизмов можно прогнозировать тяжелые заболевания и отсрочить их или даже предотвратить. И, наконец, участие пациентов предполагает такую форму организации медицины, которая способствует повышению ответственности человека за свое здоровье и приводит к сотрудничеству со специалистами. Именно знание характеристик микробиома конкретного человека позволит реализовать эти четыре направления современной высокотехнологичной медицины.

На протяжении последних двух десятилетий микробное сообщество (микробиота) организма человека признавали фундаментальным фактором, определяющим физиологию и патологию хозяина. Триллионы бактерий обитают в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) млекопитающих, в том числе и людей, значительно расширяя возможности генома хозяина [1]. Это означает, что c помощью микроорганизмов человек способен выполнять функции, которые не кодируются собственным геномом, такие как, например, защита от инвазивных патогенов, извлечение дополнительной энергии из пищи, синтез ключевых молекул для развития собственных клеток и тканей. Более того, данные функции микробиоты весьма специализированны и различаются в зависимости от локализации микроорганизмов в ЖКТ и других локусах тела человека [2-4]. Таким образом, сегодня одним из наиболее перспективных направлений исследований в медицине является изучение набора генов, ответственных за формирование микробиоты различных локализаций, а именно микробных сообществ ЖКТ, кожи, слизистых оболочек половых органов и др. Данные коллективные гены, которые охватывает микробиота человека, известны как микробиом человека. Он в подавляющем большинстве случаев превосходит кодирующую способность генома человека, составляя более 3 млн генов [1]. Несмотря на существование выраженных индивидуальных различий в структуре бактериальных видов, составляющих микробиом хозяина, многие микробные гены отвечают за аналогичные функции, что приводит к высокой функциональной избыточности микробиома. Данные перекрывающиеся функции и следует считать основными задачами микробиома, общими для здоровых людей [5, 6]. Среди данных задач - биодеградация ряда неперевариваемых полисахаридов, синтез незаменимых аминокислот и витаминов, детоксикации ксенобиотиков [7, 8]. Ассоциации спектра и характеристик микробиома уже доказаны в ряде инфекционных и неинфекционных заболеваний человека, а современные исследования вышли далеко за пределы классического понимания роли микроорганизмов в нормальной и патологической физиологии человека. Исследования микробиома теперь актуальны во многих областях науки, которые ранее считались никак не связанными с микроорганизмами, например: изучение циркадного ритма [9], нейрофизиология [10-12], онкология [13, 14], судебно-медицинская экспертиза [15, 16] и метаболические заболевания [17, 18]. Более того, современные направления исследований включают изучение связей на уровнях: ось «микробиом кишечника-головной мозг», ось «микробиом кишечника-печень», ось «микробиом кишечника-дыхательная система».

Уже подтверждено, что микробиом человека имеет серьезное значение для поддержания здоровья человека и профилактики болезней. Одна из наиболее изученных ролей микроорганизмов человека заключается в обеспечении защиты от бактериальных патогенов. Это особенно важно в условиях стационаров, чтобы предотвратить инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, вызываемые бактериями, происходящими из ЖКТ. Комменсальная микробиота пациента имеет возможность исключить данные высокоустойчивые патогены из состава микробного сообщества ЖКТ, а также противостоять колонизации de novo. Считается, что около 40% представителей микробиоты обитает в ЖКТ, 20% - в полости рта, 18-20% - на кожных покровах, 15-16% в ротоглотке и 2-4% в урогениатльном тракте у мужчин; у женщин же на вагинальный биотоп приходится в районе 10% представителей всей микробиоты организма. Схематическая иллюстрация соотношения клеток микробиоты и организма человека представлена на рис. 1.

Отметим, что микробиом является весьма вариабельной системой, которая не только влияет на своего хозяина, но и адаптируется к сигналам, информации, поступающей от человека, то есть это взаимодействие действительно обоюдно (рис. 2).

При определенных обстоятельствах у пациентов может сложиться ситуация с наличием недостаточно развитой, малодифференцированной микробиоты, которая будет не в состоянии защитить от колонизации экзогенными бактериями. Следовательно, такие пациенты становятся колонизированными внутрибольничным патогеном, зачастую устойчивым к антибиотикам, который затем может размножаться до высокой плотности, а ЖКТ будет служить важным резервуаром для опасных бактериальных патогенов. Данные процессы чреваты двумя серьезными проблемами. Во-первых, колонизированные пациенты служат резервуарами для передачи внутрибольничных патогенов другим пациентам, что способствует циркуляции возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи в стационарах. Во-вторых, колонизирующий кишечник патоген может вызывать потенциально опасное для жизни заболевание, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом. Именно поэтому изучение микробиома человека сможет определять стратегии защиты от колонизации опасными патогенами и тем самым предотвращать тяжелые инфекции. На данном этапе, несмотря на то что уже доказана роль микробиоты в предотвращении колонизации рядом патогенов, конкретные механизмы данной защиты еще не полностью определены и продолжают оставаться активной областью научных исследований. Время показало, что трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) уже вошла в рутинную практику онкологических, онкологических, гематологических и многопрофильных медицинских центров по всему миру. Следующим этапом является создание индивидуальных терапевтических средств на основе защитных факторов микробиоты, что мы надеемся увидеть в ближайшие годы.

Цель данной книги - обозначить современный уровень знаний в отношении микробиома человека, описать практические результаты внедрения микробиом-ассоциированных методов лечения, а также обозначить наиболее перспективные направления исследований в данной области.

В 2010 г. в журнале Nature была опубликована работа под названием «Наш другой геном» («Our "other" genome»). Именно тогда в контексте международных исследований начался активный пересмотр этиологии и патогенеза ряда инфекционных и неинфекционных заболеваний человека с учетом новых данных о микробиоме человека.

Важной инициативой является Проект микробиома человека - исследовательская программа Национального института здоровья США (NIH), цель которой - улучшение понимания характеристик микробиоты, связанной со здоровьем и заболеваниями человека. Начатая в 2008 г. первая фаза программы являлась пятилетним проектом, направленным на выявление объема и базовых характеристик микробиоты человека. Вторая фаза, известная как интегративный Проект микробиома человека, была запущена в 2014 г. с целью объединения ресурсов для выяснения роли микробов в поддержании здоровья и развитии конкретных заболеваний. Важными компонентами Проекта микробиома человека являются некультуральные методы оценки микробиоты, в частности метагеномика, а также секвенирование микробиома. В рамках проекта выполняется секвенирование 16S рРНК бактерий микробиоты человека [6].

Важно подчеркнуть, что, несмотря на различный видовой состав микробиома человека в различных локализациях [верхние и нижние дыхательные пути (ДП), верхние и нижние отделы ЖКТ, половые органы], метаболические пути бактерий остаются практически неизменными. Это в очередной раз подчеркивает значимость микробиома для биохимических и физиологических функций человека (рис. 3).

Большинство исследований микробиома основаны на определении последовательности вариабельных областей высококонсервативного гена, кодирующего 16S субъединицу рибосомальной РНК (16s рРНК) микроорганизмов. Этот ген повсеместно присутствует в бактериях, при этом отсутствует у млекопитающих и содержит девять гипервариабельных областей (V1-V9), что позволяет идентифицировать различные бактерии посредством таксономического сопоставления полученных последовательностей с эталонными геномами из международных баз данных (рис. 4). В зависимости от последовательностей и выбора баз данных идентификация может быть выполнена до видового уровня, но обычно она приводит к сочетанию видов, родов, типов организма. Для описания результатов такой идентификации обычно используется общий термин «операционная таксономическая единица» (ОТЕ), объединяющий расшифрованные последовательности 16S рРНК с 97% идентичностью, что обычно достаточно для понимания видовой принадлежности микробов. Вышеописанный процесс называется метатаксономикой, так как он описывает таксономический состав всего бактериального сообщества в биологическом образце. Важно помнить, что у метода имеется два нюанса: во-первых, вирусы и грибы не имеют гена 16S рРНК и, соответственно, не идентифицируются, хотя и являются неотъемлемой частью микробиома. Однако похожие молекулярно-генетические методы идентификации, основанные на вариабельности участков гена 18S рРНК, или спейсерной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (ITS), доступны и для грибов. Во-вторых, этот процесс не позволяет предоставить информацию о функции микробиоты, что может быть исследовано уже только с помощью методов метагеномики, метатранскриптомики и метаболомики. Более подробно ключевые термины, используемые в современных научных исследованиях, определены в табл. 1.

Если уточнить, то методология определения состава микробиома в образце, как правило, следующая. После экстракции и очищения от человеческой ДНК в каждом из биологических образцов выполняется ПЦР-амплификация V4-V5 региона (или других гипервариабельных регионов - например, V3-V4) гена 16S рРНК с помощью модифицированных универсальных бактериальных праймеров. Очищенные ПЦР-продукты секвенируются с помощью автоматической платформы. Филогенетическая классификация до видового уровня может выполняться на оcновании байесовской модели, а также различных баз данных, проверенных на химеризм генов 16S рРНК (например, Greengenes). Сиквенс-последовательности группируются в ОТЕ на основании 97% идентичности. Общее количество генов 16S рРНК, то есть мера бактериальной плотности, рассчитывается на 1 г биологического материала, с помощью количественного ПЦР, исходя из общего количества генетического материала [21]. Описанная методика определения гена 16S рРНК является наиболее широкодоступной и низкозатратной, но не во всех случаях позволяет достичь глубокой таксономической расшифровки микробиома.

При необходимости более глубокой расшифровки видов и даже штаммов микроорганизмов, присутствующих в микробиоме, применяют полногеномное секвенирование (метод дробовика, или shotgun), в котором происходит амплификация всего микробного генетического материала в образце (рис. 5).

Стоит понимать, что полученные в результате этого массивы данных настолько объемны, что обработать и систематизировать их с помощью стандартных статистических пакетов, как правило, невозможно. Для этого в команде исследователей необходимы специалист по анализу данных, программист или математик, способные создать и апробировать математическую программную модель для анализа. Обычно обработка и анализ обширного массива (big data) клинических, микробиологических и филогенетических данных выполняется с помощью программного кода. Код создается авторами применительно к данному исследованию в свободной программной среде вычислений с открытым исходным кодом. Сегодня для наиболее объемных и комплексных математических моделей все чаще применяются высокоуровневые языки программирования.

Среди сложных математических моделей, используемых в исследованиях микробиома, стоит отметить следующие. Линейный дискриминантный анализ размера эффекта (LEfSe) применяется для выявления филогенетических предикторов. Времязависимая регрессионная модель отношения рисков Кокса применяется для выявления рисков клинических исходов и нарушений микробиома. В регрессионных моделях часто применяется корректировка с помощью пенализированной вероятности Firth.

В целом современные научные технологии изучения микробиома можно отнести к группе омикс-технологий, включающих метаболомику, протеомику, транскриптомику, метагеномику и др. (рис. 6). Инструментом для обработки всех этих данных служат биоинформационные методы.

Читателю важно учесть тот факт, что классические микробиологические (культуральные) методы несостоятельны для исследования микробиоты человека. К сожалению, данные, полученные по результатам посевов на среды образцов стула, слюны, влагалищного отделяемого и т.д., не отражают реального состава и плотности микробиоты этих локализаций. Более того, они вводят в заблуждение некоторых врачей и многих пациентов, что чревато неверными решениями, беспочвенным назначением антибиотиков и других лекарственных средств (ЛС). В связи с этим современному врачу стоит исключить из своей лексики не известные в мире термины «дисбактериоз», «дисбиоз», основанные на неправомочных диагностических методах.

Примечательно, что большинство революционных результатов исследований микробиома были получены у мышей, даже несмотря на то, что микробиом человека и мыши несколько различается в плане родов микробов. Некоторые роды, такие как Prevotella, Faecalibacterium и Ruminococcus, более распространены у людей, тогда как другие, а именно Lactobacillus, Alistipes и Turicibacter, - у мышей [24]. Однако при идентификации ядра общих бактериальных таксонов становится ясно, что бактериальные сообщества кишечника мыши и человека очень похожи, особенно если проанализировать их с функциональной точки зрения (то есть определить метаболические пути бактерий) [25, 26]. Самое главное, что, например, стерильные от микробов мыши могут быть эффективно искусственно заселены микробными сообществами от людей, при этом будут воспроизводиться эффекты, которые наблюдались у донора микробиоты [27]. В подтверждение этих слов было показано, что заселение кишечника стерильных мышей микробами из кишечника пациентов с ожирением или, наоборот, с истощением приводило к соответствующим нарушениям в энергетическом метаболизме у лабораторных животных [28-31]. Вместе это демонстрирует то, что, несмотря на различия между видами, лабораторная мышиная модель является ценным инструментом для изучения микробиома человека.

БИОСЕНСОРЫ И ЛАБОРАТОРИИ НА ЧИПЕ

Лаборатория на чипе, или микросистемы полного анализа (англ. lab-on-a-chip, или micro total analysis systems), - миниатюрные приборы, позволяющие осуществлять один или несколько многостадийных биохимических процессов на одном чипе площадью от нескольких квадратных миллиметров до нескольких квадратных сантиметров и использующие микроили наноскопические количества образцов для пробоподготовки и проведения реакций. Для создания лабораторий на чипе используется микротехнология с применением 3D-принтеров, фотолитографии, микро- и нанофлюидики, прецизионного конструирования, наносенсорики и других приемов, применяемых в производстве микроэлектромеханических систем.

Биосенсор - аналитический прибор, в котором для определения химических соединений используются реакции этих соединений, катализируемые ферментами, иммунохимические реакции или реакции, проходящие в органеллах, клетках или тканях.

Обозначенные методы только недавно начали применяться в экспериментах по исследованию микробиоты, но уже появился термин «кишечник на чипе» (англ. gut-on-chip systems). Он объединяет экспериментальные модели, в которых изучается взаимодействие по крайней мере одного бактериального представителя кишечной микробиоты и не менее одной клетки организма хозяина. Одним из примеров является модель, предложенная H.J. Kim и соавт. для изучения взаимодействия между компонентами кишечника, иммунной системы и бактерии. Эта система на чипе не только способна имитировать функцию кишечника (механическая перистальтика и поток) и его тканевую архитектуру, но и воссоздавать воспалительные процессы, подобные таковым in vivo.

В рамках этой модели отрабатывались механизмы воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) с участием иммунных клеток, комменсальных и патогенных бактерий, бактериальных эндотоксинов, цитокинов и антибиотиков. Эти первые работы обозначили потенциал моделей «кишечник на чипе» для изучения и диагностики сложных процессов взаимодействия между комменсалами и патогенными бактериями в кишечном микробиоме [32, 33].

МИКРОБИОМ КИШЕЧНИКА

Эволюция микроорганизмов продолжалась в кишечнике животных длительное время, что привело к формированию сложной и богатой экосистемы. Кишечник млекопитающих густо заселен триллионами бактерий, принадлежащих к нескольким сотням различных видов [34]. Выделяют два вида разнообразия микробиоты человека: α-разнообразие (в пределах одного образца) и β-разнообразие (между отдельными образцами). Несмотря на значительное разнообразие видов микроорганизмов в составе микробиоты, большинство представителей принадлежат только к четырем типам в современной биологической систематике: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria. Типы Firmicutes и Bacteroidetes составляют более 90% бактериальной популяции в толстой кишке, где плотность микробиоты наибольшая. При этом представители типов Actinobacteria и Proteobacteria практически всегда присутствуют в составе микробиоты в относительно невысоком содержании [3, 35]. Ниже мы охарактеризуем более подробно представителей наиболее распространенных таксономических типов в составе микробиома человека.

Bacteroidetes

Тип Bacteroidetes представлен как анаэробными, так и аэробными неспорообразующими грамотрицательными бактериями, которые колонизируют практически все отделы кишечника. Род Bacteroides является одной из наиболее преобладающих групп в кишечнике в составе данного таксономического типа. Эти бактерии эффективно разлагают сложные полисахариды, устойчивые к пищеварительным ферментам человека. Биодеградация этих сложных углеводов дает на выходе набор короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), а именно ацетат, пропионат и бутират, которые реабсорбируются организмом хозяина и вовлекаются в биохимические энергетические процессы. Кроме того, КЦЖК участвуют в регулировке дифференциации эпителиальных клеток кишечника [36], созревании и стимуляции иммунной системы [37], а также ряда других важных биологических процессов.

Несмотря на то, что представители рода Bacteroides вносят важный вклад в метаболические процессы человека и в целом поддерживают комменсальные отношения с хозяином, некоторые представители обладают потенциалом патогенности при резком повышении их относительной плотности в просвете кишечника. Примером является Bacteroides fragilis, который обычно локализуется в нижних отделах кишечника и, как было ранее показано, оказывает благоприятное воздействие на организм человека, такое как стимулирование развития иммунной системы [38]. Однако в то же время Bacteroides fragilis является одним из наиболее частых облигатных анаэробов, вызывающих инфекционные осложнения. Наиболее частой клинической формой в таких ситуациях являются интраабдоминальные абсцессы и инфекции кровотока, особенно у пациентов с нарушением барьерной функции слизистой оболочки кишечника или ее перфорацией.

Большинство представителей рода Bacteroides, колонизирующих кишечник, не являются этиологическими факторами кишечных инфекций за одним исключением: энтеротоксигенные штаммы B. fragilis продуцируют токсин B. fragilis, который вызывает колит, а также ранее ассоциировался с риском развития опухолей толстой кишки [39, 40]. Кроме того, у представителей рода Bacteroides spp. отмечено наличие целого ряда механизмов антибиотикорезистентности и регистрируются наиболее высокие уровни устойчивости к антибиотикам среди всех облигатных анаэробов [41].

Firmicutes

Тип Firmicutes представлен как облигатными, так и факультативными анаэробными бактериями. Большинство представителей типа являются грамположительными бактериями и способны формировать эндоспоры, обеспечивая экологическое преимущество для выживания в неблагоприятных условиях. В форме эндоспор данные бактерии могут выживать при отсутствии питательных веществ, являются чрезвычайно устойчивыми к воздействию кислорода, ультрафиолетовому излучению, высыханию, экстремальным температурам и дезинфицирующим средствам. Данные формы позволяют представителям типа Firmicutes длительное время находиться в состоянии покоя и возвращаться к метаболически активному состоянию в благоприятных условиях.

Один из наиболее клинически значимых классов в составе типа Firmicutes - это класс Clostridia, который в связи с высокой гетерогенностью дополнительно разделен на кластеры. Именно среди представителей кластеров Clostridium XIVa и IV были выявлены полезные микроорганизмы, принимающие участие в функциях ЖКТ человека. Показано, что данные бактерии концентрируются в складках слизистой оболочки кишечника, поддерживая и регулируя функции кишечного эпителия [42]. Виды в составе данных кластеров так же, как и представители Bacteroides spp., продуцируют КЦЖК (бутират) в результате процессов ферментации, что способствует поддержанию функции кишечного эпителия. К тому же было показано, что представители этих кластеров поддерживают локальный иммунный гомеостаз кишечника посредством привлечения регуля-торных Т-лимфоцитов толстого кишечника [43].

Стоит подчеркнуть, что другие кластеры класса Clostridia включают важные патогены, которые могут вызывать инфекционные заболевания человека, а именно: представители кластера I - C. perfringens и C. tetani, а также кластера XI - C. difficile [44]. Наконец, еще один клинически значимый класс в составе типа Firmicutes - класс Bacilli. Известными представителями этого класса являются кислородоустойчивые бактерии Enterococcus spp. и Streptococcus spp., которые обычно определяются в кишечнике в низком относительном содержании, но обладают потенциалом к избыточному росту при различных патологических состояниях [45].

Actinobacteria

Тип Actinobacteria состоит как из аэробных, так и из анаэробных грамположительных бактерий, однако отличается от типа Firmicutes более высоким содержанием гуанина и цитозина в структуре ДНК. Bifidobacteria spp. являются наиболее распространенными обитателями ЖКТ в рамках данного типа [34]. Ранее было показано, что отдельные виды в пределах этого рода, в том числе B. longum, имеют пробиотические функции. В частности, данные микроорганизмы обеспечивали защиту от кишечных патогенов с помощью ряда процессов, а именно: прямой конкуренции, активности гидролазы желчных кислот, модуляции локального иммунного ответа и способности создавать высокую пристеночную концентрацию вблизи кишечного эпителия [2, 46].

Proteobacteria

Тип Proteobacteria включает широкий спектр грамотрицательных микроорганизмов. В то время как основную массу бактерий ЖКТ составляют облигатные анаэробы, представители типа Proteobacteria являются факультативными анаэробами. Несмотря на то, что протеобактерии являются естественными обитателями ЖКТ человека, как правило, они составляют меньшинство в структуре здорового, дифференцированного микробиома. В составе типа стоит отметить семейство Enterobacteriaceae (класс Gammaproteobacteria), в котором находятся многие возбудители инфекционных осложнений, а именно Escherichia coli и Klebsiella spp., которые обычно регистрируются в микробиоме ЖКТ в малом количестве, но имеют потенциал для чрезмерного роста и кишечного доминирования на фоне антибиотикотерапии и отдельных заболеваний [21, 45].

АНАТОМИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОМА

С точки зрения расположения микроорганизмов и условий локального биоценоза ЖКТ человека состоит из желудка, тонкой кишки, слепой кишки, ободочной кишки и прямой кишки. Имеется несколько важных показателей, претерпевающих изменения в среде вдоль этого тракта. Например, рН и концентрация кислорода значительно меняют свои уровни, начинаясь от кислой среды и аэробных условий желудка и перетекая в нейтральную и анаэробную среду толстой кишки. Кроме того, источники питательных веществ для колонизирующих микроорганизмов меняются на протяжении всей длины ЖКТ [47]. В частности, наиболее простые углеводы всасываются в терминальной подвздошной кишке и, следовательно, в отделах ЖКТ ниже илеоцекального клапана бактерии усваивают не переваренные хозяином углеводы, сложные молекулы, а также мукопротеины. В результате комбинации вышеописанных факторов бактерии имеют специфическое распределение в кишечнике человека. Общая плотность бактерий больше в толстой кишке, чем в тонком кишечнике. В целом в составе микробиома тонкой кишки преобладают представители Lactobacillales или Proteobacteria. Однако в толстом кишечнике уже Bacteroides и Clostridiales становятся доминирующими в составе микробиома [48].

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА МИКРОБИОМА У ДЕТЕЙ

Эволюция и созревание кишечного микробиома на ранних стадиях жизни являются важными факторами здоровья, а нарушения на ранних этапах формирования микробного сообщества у ребенка предрасполагает к развитию заболеваний как в младенчестве, так и в зрелом возрасте, что наиболее изучено в контексте аллергических заболеваний и метаболических синдромов.

Очень интересно то, что после родов естественным путем микробиота новорожденных заселяется бактериями родового канала матери, а у новорожденных после выполнения кесарева сечения микробиота заселяется в основном бактериями, населяющими кожу взрослого человека, при этом стрептококки становятся доминирующим видом в составе микробиоты у таких детей [49]. Было также высказано предположение, что это может служить фактором, предрасполагающим к последующим инфекциям в детском возрасте [49]. Весьма значимы результаты исследования, в котором авторы после кесарева сечения выполняли обработку кожных покровов новорожденных тампоном, смоченным в содержимом влагалища матери, что приводило к формированию адекватного состава микробиоты, сходного с характеристиками микробиоты детей после родов через естественные родовые пути [50].

Исследования, включающие тысячи детей, выявили ассоциацию между использованием антибиотиков в течение первого года жизни и риском развития бронхиальной астмы к 6-7 годам [51-54]. Более того, отдельные авторы демонстрировали данные о повышении риска развития бронхиальной астмы у детей дошкольного возраста, чьи матери получали антибиотики в III триместре беременности [55, 56]. Финскими исследователями было показано, что назначение макролидов у детей младшего возраста приводит к формированию особого профиля микробиоты, характеризующегося потерей представителей Actinobacteria и увеличением плотности Bacteroidetes и Proteobacteria, индукцией генов антибиотикорезистентности и снижением активности гидролаз желчных кислот. При этом данный профиль микробиоты положительно коррелировал либо с развитием впоследствии бронхиальной астмы, либо с увеличением индекса массы тела [57]. Ассоциация применения антибиотиков в первый год жизни и повышение индекса массы тела у мальчиков в возрасте 5-8 лет впоследствии было также показано в исследовании из Великобритании, где авторы подчеркивают роль микробиома в регуляции массы тела [58].

В дополнение к обсервационным исследованиям с участием людей имеются экспериментальные исследования о влиянии антибиотиков на микробиоту и заболевания у мышей. В частности, исследователями было показано, что введение антибиотиков новорожденным мышам приводило к выраженным изменениям состава микробиома и к развитию впоследствии осложненных астматических эпизодов после интраназальной нагрузки овальбумином, чего, однако, не наблюдалось при введении антибиотиков уже взрослым особям [59]. Важность вертикальной передачи микробиоты во время беременности подчеркивает публикация работы о наибольшем отрицательном эффекте введения малых доз пенициллина на состав микробиома именно в ранние сроки гестации [60]. Авторы в эксперименте на мышах показали, что у животных, получивших малые дозы пенициллина во время гестации, отмечалось впоследствии увеличение массы тела, повышение содержания жировой ткани в организме, а экспрессия генов, кодирующих отдельные важные белки (RegIIIγ, β-дефензины и ИЛ-17), была снижена.

Интересным примером со стороны животного мира является инстинкт употребления новорожденными жеребятами экскрементов матери, при этом данный инстинкт проявляется независимо от породы животных и географической зоны обитания (рис. 7). Долгое время в ветеринарии выдвигались предложения о восполнении таким образом дефицита отдельных нутриентов, однако в связи с внедрением молекулярно-генетических методов исследования сейчас вполне ясно, что это инстинктивный метод заселения микробиома кишечника и стимуляции иммунной системы, которая отмечается незрелостью механизмов у доношенных жеребят [61].

Таким образом, воздействие антибиотиков даже на короткие промежутки времени, особенно во время беременности и детского возраста, оказывает долговременное воздействие на микробиом, что может повышать риск развития целого ряда заболеваний впоследствии. Это, очевидно, имеет огромное значение для общественного здравоохранения и стратегии назначения антибиотиков в акушерстве и гинекологии, а также педиатрии.

Нормальная хронология созревания и заселения микробиоты кишечника у детей представлена на рис. 8-11 (пояснения в тексте). На первом этапе постнатального заселения бактериями (дни 3-84) микробиом кишечника у детей содержит ограниченный набор представителей типа Firmicutes. Второму этапу заселения предшествует увеличение количества представителей Proteobacteria (дни 92-100), что часто совпадает с ранее необъяснимыми эпизодами лихорадки у детей. Количество Actinobacteria и Proteobacteria увеличивается на втором этапе, а видовой состав Firmicutes на данном этапе выраженно отличается от первоначального. На третьем этапе формирования микробиома введение детского питания в дополнение к грудному молоку и приобщение к «взрослому» столу ассоциируется с увеличением количества Bacteroidetes (дни 172-297), что также продолжается и на четвертом этапе (дни 454-838), однако конкретные представители типа Bacteroidetes в микробиоме отличаются между этими двумя этапами.

Период выраженного перехода в структуре микробиома между третьим и четвертым этапами (дни 371-441) может быть обусловлен рядом факторов внешней среды, имеющих влияние на ребенка, например первым контактом с антибиотиками, исключением грудного молока и питательных смесей из рациона питания, введением коровьего молока и полноценной взрослой диеты. Интересно, что микробиом переходного периода, предшествующий четвертому этапу, содержит микроорганизмы, типичные для уже завершенного первого этапа, которые можно трактовать как следы неонатального микробиома.

Стоит отметить, что видовой состав микробиома у ребенка относительно стабилен на четвертом этапе: данная стабильность, подтвержденная анализом более 400 образцов [62], является показателем того, что кишечный микробиом ребенка достигает стабильного состояния именно на четвертом этапе. Введение в рацион питания продуктов с взрослого стола приводит к выраженному сдвигу в типовом составе микробиома, а также увеличивает абсолютное количество бактерий и КЦЖК в кишечнике ребенка. Резкое и устойчивое повышение уровня бактерий типа Bacteroidetes после начала регулярного прикорма ребенка вполне объяснимо: именно данные бактерии специализируются на ферментации сложных растительных полисахаридов [63], а в экспериментальных работах на мышах добавление растительных углеводов в состав схемы питания незамедлительно повышало уровень Bacteroidetes в составе кишечного микробиома [64]. В то же время высокая метаболическая активность данных бактерий прямо или косвенно приводит к увеличению продукции КЦЖК (ацетата, пропионата, бутирата) в кишечнике. Более того, было продемонстрировано, что низкое содержание Bacteroidetes в кишечном микробиоме ассоциируется с ожирением, что само по себе может наблюдаться на фоне диеты, бедной сложными растительными полисахаридами [65, 66]. Таким образом, вместе эти результаты подтверждают мнение о том, что диета с высоким содержанием продуктов растительного происхождения способствует созданию разнообразного и полноценного микробного сообщества кишечника, в том числе и у детей, а также адекватному производству энергетических субстратов и метаболитов, необходимых организму человека.

КЛЮЧЕВАЯ ИНФОРМАЦИЯ РАЗДЕЛА

Микробиом кишечника человека состоит из приблизительно 100 триллионов бактерий, принадлежащих нескольким сотням различных видов [34]. Микробиом включает четыре основных типа бактерий, охватывающих более 90% общей популяции микроорганизмов, а именно Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, а также ряд более редких типов (Verrucomicrobia и Fusobacteria). Соотношение и состав данных типов бактерий значительно варьирует вдоль ЖКТ, а также изменяется под влиянием различных факторов внешней среды и доступности питательных веществ [3]. Эволюция и созревание микробиома у детей проходит в четыре этапа и характеризуется как количественным, так и качественным изменением состава бактерий кишечника, происходящим под влиянием перемены рациона питания и внешних факторов.

ЭНТЕРАЛЬНАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА

Энтеральная нервная система как «второй мозг» человека

То, что ранее считалось простым набором нервных ганглиев в кишечнике, теперь признано сложным, интегративным мозгом в рамках энтеральной нервной системы (ЭНС).

Структурно и химически ЭНС - сложная сеть нервных микросвязей, управляемая большим количеством нейротрансмиттеров и нейромодуляторов, чем можно найти где-либо еще в периферической нервной системе. Это позволяет ЭНС выполнять многие из своих задач при отсутствии контроля со стороны ЦНС, что и определяет ее уникальность.

Сегодня уже признана важность изучения ЭНС в разработке эффективных методов лечения функциональных расстройств кишечника. Представьте, что кишечник - это «новое окно» в мозг человека, и станет понятно, почему изучение ЭНС определяет взгляды врачей как в неврологии, так и в гастроэнтерологии.

Структура энтеральной нервной системы

ЭНС удивительно похожа на наш мозг как структурно, так и функционально. Ее нейронные элементы представлены не шванновскими клетками и коллагеном, как в остальной периферической нервной системе, а клетками нейроглии, которые напоминают астроциты ЦНС. Эти глиальные клетки не обертывают отдельные аксоны, скорее, целые пучки аксонов встраиваются в инвагинации кишечных глиальных клеток. Таким образом, аксоны прилегают друг к другу так же, как и, например, в обонятельном нерве.

Структуры ЭНС также восприимчивы к тому, что обычно считается признаком поражения головного мозга, например тельца Леви, ассоциированные с болезнью Паркинсона, или амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, были найдены и в кишечнике пациентов с этими заболеваниями. Более того, возможно, что болезнь Альцгеймера, которую так трудно диагностировать, когда-нибудь будет подтверждаться при биопсии кишечника.

В дополнение к нейронам и глиальным клеткам ЭНС, стенка кишки содержит интерстициальные клетки Кахаля (ИКК), которые не содержат нейронные и глиальные маркеры, такие как нейрофиламенты или глиальные фибриллярные белки, и поэтому считается, что они представляют собой особый тип клеток.

Поскольку ИКК, как правило, расположены между нервными окончаниями и гладкомышечными клетками, Сантьяго Рамон-и-Кахаль считал, что они являются посредниками, которые передают сигналы от нервных волокон к клеткам гладких мышц. На какое-то время от этой концепции отказались, потому что было принято считать, что никаких посредников для этого процесса не требуется. Теперь, однако, концепция Кахаля пересматривается.

Считается также, что ИКК выступают в качестве пейсмейкера (водителя ритма), устанавливая ритм кишечных сокращений посредством их влияния на электрическую медленноволновую активность. Это предположение подтверждается следующими фактами:

Вся структура ЭНС организована в два ганглионарных сплетения (рис. 12). Более крупное, Ауэрбахово сплетение, или межмышечное нервное сплетение (лат. plexus myentericus), содержит нейроны, ответственные за моторику кишки, и опосредует таким образом экскрецию ферментов из смежных внутренних органов. Несколько меньшее, Мейсснерово сплетение, или подслизистое нервное сплетение (лат. plexus submucosus), содержит сенсорные клетки, которые взаимодействуют с нейронами межмышечного сплетения, а также двигательные волокна, которые стимулируют секрецию из эпителиальных клеток кишечных крипт (Либеркюновых желез) в просвет кишки. Подслизистое сплетение содержит меньше нейронов и более тонкие межганглионарные связи, а также имеет меньше нейронов на один ганглий. Электрические связи между гладкомышечными клетками позволяют нервным сигналам быстро изменять мембранный потенциал даже тех клеток, которые не имеют прямого контакта с нейронами, и это гарантирует то, что большие области кишечника, а не небольшие группы мышечных клеток, будут реагировать на нервную стимуляцию.

Стоит отметить, что энтерохромаффинные клетки желудочно-кишечного эпителия (клетки Кульчицкого) содержат более 95% всего серотонина в организме. Небольшое количество серотонина также выделяется интернейронами ЭНС. Серотонин в энтерохромаффинных клетках хранится в субклеточных гранулах, которые самопроизвольно высвобождают этот биогенный амин в прилежащую lamina propria слизистой оболочки. В ней же имеется по крайней мере 15 различных подтипов серотониновых рецепторов. Дополнительное количество серотонина выделяется, когда клетки стимулируются повышением внутрипросветного давления в кишечнике, вагусной стимуляцией, анафилактическими реакциями, закислением среды просвета двенадцатиперстной кишки или под воздействием норадреналина, ацетилхолина, холерного токсина и ряда других химических веществ. Например, у пациентов, получающих лучевую терапию в онкологии, избыток серотонина, высвобожденного из энтерохромаффинных клеток, активирует рецептор подтипа 5-HT₃ (мембранный рецептор 5-гидрокситриптамина), расположенный на внешних нервах, что быстро приводит к тошноте и рвоте. Эти симптомы могут быть заблокированы при назначении антагонистов, таких как ондансетрон, который является специфическим для 5-HT₃ рецепторов. Антагонист при этом не мешает другим серотонин-опосредованным функциям, таким как перистальтика, потому что они нуждаются в других подтипах 5-HT рецепторов.

Серотонинергические нейроны ЭНС достаточно быстро инактивируют биогенные амины. Процесс обратного захвата (reuptake) аналогичен описанному для ЦНС. При этом обратный захват серотонина может блокироваться как в ЭНС, так и в ЦНС антидепрессантами, такими как хлоропирамин, флуоксетин, пароксетин, сертралин, эсциталопрам, которые имеют сродство к транспортному белку серотонина. При отсутствии обратного захвата серотонин продолжает выделяться в направлении соседних нервных клеток, которые по очереди возбуждаются. В конце концов, однако, происходит десенсибилизация, и этот процесс останавливается. В экспериментах на животных было показано, что введение низкой дозы флуоксетина ускоряло перистальтические движения кишки, в то время как в более высоких дозах рецепторы 5-HT становились десенсибилизированными, кишечная моторика замедлялась и в конце концов останавливалась.

Очевидно, что эти данные имеют большое значение для врачей, которые регулярно назначают лекарства для коррекции настроения пациентов. Поскольку нейротрансмиттеры и нейромодуляторы, присутствующие в мозге, почти всегда присутствуют в кишечнике, препараты, предназначенные для воздействия на центральные синапсы, скорее всего, будут иметь и кишечные эффекты. Известно, что в начале курса приема антидепрессантов около 25% пациентов сообщают о тошноте или диарее. При более высоких дозировках или большей продолжительности терапии серотониновые рецепторы становятся десенсибилизированными, и может возникнуть запор. Эти эффекты являются предсказуемыми последствиями блокады транспортных белков, и если их не предвидеть и не объяснить тщательно пациенту, то они могут снизить приверженность и эффективность лечения [68].

С другой стороны, те же лекарства могут быть выбором для пациентов с функциональным расстройством кишечника. Более того, поскольку ЭНС быстро реагирует на изменения в доступности серотонина, пациенты с функциональным расстройством кишечника часто отмечают положительный эффект при дозировках намного ниже тех, которые используются в терапии депрессивных состояний.

Ось «кишечник-центральная нервная система»

При условии, что блуждающий нерв (nervus vagus) не поврежден, постоянный поток нервных импульсов сообщает мозг и кишечник.

Мы все испытываем ситуации, в которых наш мозг может заставить наш кишечник работать не вполне ожидаемо. Но на самом деле сообщения, которые приходят в мозг из кишечника, превосходят по объему встречный трафик в соотношении девять к одному. Чувство сытости, тошноты, рвоты, боли в животе - все это способы предупредить мозг об опасности от проглоченной пищи или инфекционных патогенов. И если в норме мозг быстро реагирует в соответствии с поступающими сигналами, то сама ЭНС может вступать в действие при необходимости, например когда связь утрачена (вагусный нерв поврежден).

Естественно, баланс сил между этими двумя нервными системами (ЦНС и ЭНС) является темой значительного научного интереса, а полный механизм взаимодействия между двумя системами все еще не до конца ясен [68].

Ясно, что многое было установлено с тех пор, как ЭНС считалась всего лишь набором ретрансляционных ганглиев. Хотя мы до сих пор не можем полностью связать такие сложные процессы, как моторика кишечника и секреция с отдельными нейронами, научная работа в этой области очень активна. Наконец, кажется неизбежным, что фундаментальные знания об ЭНС будут сопровождаться соответствующими клиническими предложениями.

РЕСПИРАТОРНЫЙ МИКРОБИОМ

За последнее десятилетие мы стали свидетелями экспоненциального увеличения количества исследований, связанных с микробиомом человека, начиная с цифры в районе 300 в 2006 г. до почти 8000 опубликованных исследований в 2016 г. Разработка некультуральных методов идентификации микроорганизмов и снижение затрат на платформы секвенирования позволило интенсифицировать исследования в этой захватывающей области, получить практические выводы и расширить наше представление о многих заболеваниях человека [69].

Однако даже в описанном нами ранее проекте микробиома человека изучение микробного сообщества дыхательной системы осталось несколько в стороне от активных исследований. Это произошло частично из-за проблем в методологии сбора образцов материала из нижних ДП, но также потому, что легкие традиционно считались стерильной средой, свободной от микробов. Наиболее актуальные исследования, однако, показали, что нижние ДП содержат достаточно плотное микробное сообщество, которое выявляется как у здоровых, так и у больных индивидуумов, что и привело к активизации ученых в контексте изучения микробиома легких человека [70, 71].

Характеристки микробиома дыхательных путей человека

С точки зрения экологии микробиома, дыхательная система человека - это последовательность ниш от ноздрей и рта к легким, в которых проживают различные бактериальные сообщества.

В 2010 г., в связи с широким внедрением некультуральных методов исследования микроорганизмов, произошла смена парадигмы «микробы - дыхательная система». Догма «здоровые легкие свободны от микробов» ушла в прошлое. На сегодняшний день постулаты знаний о респираторном микробиоме следующие:

Большинство исследований микробиома основаны на определении последовательности гена, кодирующего 16S субъединицу рибосомальной РНК (16S рРНК) микроорганизмов. Этот ген повсеместно присутствует в бактериях, при этом отсутствуя у млекопитающих, и содержит гипервариабельные области, что позволяет идентифицировать различные бактерии.

В недавней публикации исследователи продемонстрировали потенциальные эффекты процесса колонизации плода микроорганизмами, начиная с эмбрионального периода [56], а также интенсификацию этого процесса заселения микробами сразу после рождения, в основном за счет материнских бактерий, среди которых преобладают представители влагалищной и кишечной микробиоты. Более того, мы уже ранее отмечали, что данный процесс заселения резко различается у детей, рожденных естественным путем и с помощью кесарева сечения [49-50].

Состав микробиома легких определяется балансом трех факторов: микробной иммиграции в ДП, элиминации микробов из дыхательных путей и состояния местного роста воспроизводства представителей микробного сообщества, определяемых местными условиями. Характеристики экологических ниш микробиома ДП представлены в табл. 2.

Полость носа заселена относительно простым набором бактерий с небольшими различиями в составе между детьми и взрослыми. Представители Corynebacterium, Propionibacterium и Staphylococcus spp. являются первичными колонизаторами полости носа и сохраняют свое доминирование до взрослого возраста, когда к ним часто присоединяется род Moraxella. Профили микробиоты носа у детей сильно варьируют в зависимости от сезона, причем осенью/зимой часто преобладают Proteobacteria и Fusobacteria.

Микробиом носоглотки - динамичная экосистема, претерпевающая изменения и дифференцировку в процессе взросления, что может продолжаться до 2 лет, резко отличаясь от микробиома взрослых. Первоначально носоглотка заселяется представителями Corynebacterium и Staphylococcus spp., а впоследствии дополняется родом грамположительных бактерий Dolosigranulum (в особенности у детей на грудном вскармливании), родами Alloiococcus и Moraxella. У взрослых же разнообразие видов микробиома носоглотки обычно снижается, и Corynebacterium становится обычно доминирующим родом.

Ротоглотка является анатомическим барьером между ДП и ЖКТ, что приводит к наличию в ней наиболее вариабельной бактериальной экосистемы. В ротоглотке у здоровых взрослых описаны: Streptococcus spp. (в том числе S. pneumoniae и S. pyogenes), Haemophilus spp., Neisseria spp., Prevotella spp. , Veillonella spp. и Leptotrichia spp.

Состав микробиома нижних ДП у здоровых взрослых значительно коррелирует с аналогичным составом верхних ДП, особенно ротоглотки, но отличается гораздо более низкой плотностью бактерий.

Плотность бактерий меняется от 10⁵ бактерий на 1 мл в ротоглотке до 10¹ -10² бактерий в 1 мл бронхоальвеолярного лаважа. У детей, однако, дополнительно к снижению плотности отмечался больший вклад бактерий микробиома носоглотки в композицию микробиома легких.

Верхние ДП - экологическая ниша для патобионтов: S. pneumoniae, H. influenzae и S. aureus. До 93% детей до 2 лет колонизированы одним из патобионтов на уровне верхних ДП даже при оценке «классическими» культуральными методами. Таким образом, это фактически резидентные участники микробиома верхних ДП. Двойственная роль патобионтов в развитии респираторных заболеваний заключается в следующем:

Показано, что у пациентов с пневмонией отмечается более высокая плотность бактерий в нижних ДП в сочетании с меньшим разнообразием и равномерностью распределения видов. Как правило, резко доминирует один таксон с наибольшей частотой доминирования: Streptococcus spp., Haemophilus spp. или Moraxella spp.

У пациентов с более высоким содержанием в микробиоме кишечника бактерий, продуцирующих бутират (ингибиторная КЦЖК), снижен риск развития вирусных инфекций нижних ДП.

Подобно тому, как это происходит с микробиомом кишечника и кожи, ранняя колонизация микробами верхних ДП ребенка играет важную роль в созревании иммунной системы и калибровке иммунного ответа, что было отражено в исследованиях, где у стерильных мышей наблюдались высокий уровень эозинофилии в ДП и накопление инвариантных NK-клеток (натуральных киллеров), что не встречалось у колонизированных микробами мышей [289-291]. Стоит вспомнить, что инвариантные естественные киллеры (iNKT), также известные как классические NKT-клетки, или NKT I типа - это популяция Т-лимфоцитов, которые экспрессируют инвариантный αβ T-клеточный рецептор и определенные молекулы, общие с NK-клетками. Хотя iNKT редко встречаются в периферической крови, составляя всего 0,01-1% мононуклеарных клеток крови, они являются важными иммунорегулирующими элементами, производящими большие количества цитокинов, влияющих на все остальные клетки иммунной системы.

Перейдем в микробиому нижних ДП. Опубликованные исследования показали, что состав микробиома нижних ДП у здоровых взрослых значительно коррелирует с аналогичным составом верхних ДП, особенно ротоглотки, но отличается гораздо более низкой плотностью бактерий. Плотность бактерий меняется от 10⁵ бактерий на мл в носоглотке до 10¹ -10² бактерий в мл бронхоальвеолярного лаважа [72]. У детей, однако, дополнительно к снижению плотности отмечался больший вклад бактерий микробиома носоглотки в композицию микробиома легких [72]. Интересные данные были опубликованы о наличии двух разных пневмотипов на основе образцов бронхоальвеолярного лаважа: первый пневмотип, обогащенный бактериями из верхних ДП и встречающийся у 45% участников исследования, и второй пневмотип из фоновых бактерий [71-72]. Первый пневмотип был ассоциирован с субклиническим воспалительным процессом в легких, с повышенным ответом Т-хелперов-17, и может быть полезен для хозяина, что основано на экспериментах с животными моделями пневмонии, вызванной Staphylococcus aureus [71-72].

Антагонистические и мутуалистические взаимоотношения в составе респираторного микробиома представляют собой следующие взаимосвязи (рис. 13):

Итак, состав микробного сообщества в ДП в раннем детстве связан с последствиями для здоровья ДП в более позднем возрасте. Понимание процессов, которые приводят к нарушениям респираторного микробиома и, как следствие, к повышенной восприимчивости и тяжелому течению заболеваний органов дыхания, будет способствовать разработке новых терапевтических средств. До этого момента имеющиеся данные могли бы помочь нам стратифицировать потенциальные вмешательства, то есть нацелить наши действия на людей с более высоким риском респираторных заболеваний на ранних стадиях.

МИКРОБИОМ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

Известно, что характеристики микробиома влагалища во многом определяют женское репродуктивное здоровье. При этом эмпирическое понимание этого имелось у практикующих врачей еще до появления адекватных методов исследования, в том числе молекулярно-генетических. И сегодня оценка микробиоты как в физиологии женщин, так и при патологических состояниях открывает внушительные перспективы для новых методов лечения и профилактики [74].

В течение многих лет активных исследований с помощью традиционных микробиологических методов, а именно культивирования на питательных средах и микроскопии, изучали микробиоту влагалища. На основе этих ранних работ состав микробиоты оценивали как «здоровый», когда в нем преобладали перекись-продуцирующие Lactobacillus spp., и среди них с наибольшим вкладом Lactobacillis crispatus или комплекса Lactobacillus acidophilus. Внедрение молекулярно-генетических методов исследования за последнее десятилетие значительно углубило понимание структуры и вариаций микробиоты влагалища в норме и при патологии. Теперь ясно, что разнообразие бактериальных видов в ее составе намного сложнее, чем признавали в более ранних публикациях [74]. Среди функций микробиома влагалища достаточно давно известно поддержание низкого значения pH среды в районе 3,8-4,4, в том числе за счет выработки КЦЖК, которые покрывают слизистую оболочку влагалища практически сплошным слоем и препятствуют колонизации патогенами. Липотейхоевая кислота обеспечивает высокую адгезивную способность лактобактерий, пептидогликан клеточной стенки обладает иммуностимулирующими свойствами, а выработка лизоцима, ряда бактериоцинов и стимуляция фагоцитарной активности и образования интерферона завершает комплекс защитных свойств лактобактерий. При этом выработка перекиси водорода долгое время считалась одним из основных конкуретных механизмов противодействия другим микроорганизмам во влагалище. Стоит однако отметить, что бактерицидное действие лактобактерий микробиоты на другие бактерии связано преимущественно с молочной кислотой [75]. Устойчивость к колонизации патогенами определяется для лактобактерий как эстрогензависимая адгезия на влагалищном эпителии, в том числе с формированием биопленок (рис. 14).

Установлено, что микробиота влагалища в норме весьма индивидуальна и определяется рядом внешних и внутренних факторов женщины, в том числе этнической принадлежностью, возрастом, фазой менструального цикла, характером питания, образа жизни, особенностями гигиены и половой жизни, беременностью и сроком гестации. Известно, что влагалище женщин в репродуктивном возрасте заселено в основном лактобактериями, при этом определено их более 20 видов, но у основной массы женщин отмечается доминирование одного вида лактобактерий, и лишь у 8%, по данным R.F. Lamont и соавт., регистрируется большее разнообразие видов этих микроорганизмов [77].

Ведущая исследовательская группа из Хьюстона (США) и ряд других ученых доказали, что состав влагалищного микробиома индивидуально варьирует во время беременности [78-80], что способно влиять на плод и течение беременности. Достаточно давно было высказано предположение о том, что внутриутробные инфекции, такие как хорио-амнионит, являются следствием восхождения микробиоты из урогенитального тракта [81], а развитие опасных для новорожденного состояний, таких как неонатальный сепсис и некротизирующий энтероколит, ассоциировано с перемещением бактериальной флоры матери к новорожденному [82, 83]. Однако в наступающую эпоху микробиом-ассоциированной медицины эти догмы ставятся под сомнение, и начинают понимать, что многие так называемые «стерильные» ниши, особенно в женской репродуктивной системе (например, плацента), могут являться и в норме низкоактивными экологическими нишами для микроорганизмов, которые несут на себе ряд важных для человека функций [78].

Поразительно, что, например, доминирование лактобацилл в составе микробиома влагалища уникально для людей: в то время как относительное количество лактобактерий во влагалище у женщин обычно составляет >70%, у других млекопитающих лактобациллы редко составляют более 1% влагалищного микробиома [84]. Было предложено несколько гипотез, объясняющих такой уникальный влагалищный микробиом человека, включая его роль в репродуктивной физиологии, высокий риск развития заболеваний, передающихся половым путем, и высокий риск возникновения инфекционных осложнений, связанных с беременностью и родами.

В процессе исследования динамики состава микробиома влагалища во время нормально протекающей беременности исследователи из Великобритании показали, что к шестой неделе после родоразрешения доминирование Lactobacillus spp. снижалось, а разнообразие других видов микроорганизмов увеличивалось [85]. При дальнейшем изучении влагалищного микробиома у небеременных здоровых женщин репродуктивного возраста исследователи выделили пять бактериальных типов пейзажа микробиома [86] (рис. 15). Четыре из них характеризуются доминированием видов Lactobacillus spp., включая L. crispatus (тип I), L. gasseri (тип II), L. iners (тип III) и L. jensenii (тип V). В IV типе влагалищного микробиома отмечена низкая относительная плотность Lactobacillus spp., при этом выявлено высокое разнообразие видов анаэробных бактерий: Prevotella, Dialister, Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Megasphaera, Peptoniphilus, Sneathia, Finegoldia, и Mobiluncus (рис. 16). Последние из обозначенных видов микроорганизмов часто ассоциированы с клиническими симптомами бактериального вагиноза (БВ) - состояния с наличием неприятного запаха и влагалищного отделяемого у женщин, что к тому же было связано с риском развития преждевременных родов [87, 88] и гистологически подтвержденного хориоамнионита [89, 90]. Исследования, проведенные в США, показали, что в микробиоме влагалища у женщин азиатского происхождения и женщин европеоидной расы чаще преобладали Lactobacillus spp. (типы I, II, III и V), тогда как среди темнокожих и латиноамериканских женщин чаще встречали высокоразнообразный микробиом (тип IV), что связывают с генетическими различиями женщин, влияющими на его состав [86, 91]. Интересно также то, что отмечено незначительное повышение уровня pH влагалища у женщин латиноамериканского происхождения и темнокожих в сравнении с европейской и азиатской группами, что, однако, не вкладывается в идею о том, что pH влагалища здоровой женщины должно быть менее 4,5; вероятно, все-таки границы этого показателя более широкие в отдельных популяциях.

III бактериальный тип представляет интерес по причине наличия в нем доминирования вида L. iners, касательно которого имеются весьма дискуссионные научные данные. Известно, что L. iners не продуцирует пероксид водорода, а также способен адаптироваться к повышенным значениям pH влагалищной среды [93]. И это тот пример, когда при микроскопии мазка влагалищного отделяемого нахождения лактобактерий без их типирования может быть недостаточно для клинических выводов о нормальном микробиоме влагалища. Более того, были описаны факторы патогенности L. iners, а именно тиолзависимый гемолизин (инеролизин), а за последние годы появились клинические данные об ассоциации данной лактобактерии с преждевременными родами и преждевременным разрывом плодных оболочек [94, 95]. Известно, что Lactobacillus iners по своему геному значительно отличается от других лактобактерий, а продуцируемый им инеролизин, цитотоксин, подобен аналогичному у Gardnerella vaginalis (вагинолизину) [96]. Таким образом, считается, что вид L. iners не способен адекватно защищать среду влагалища от колонизации потенциальными патогенами.

Возвращаясь к теме нормальной влагалищной микробиоты у женщин, стоит обратить внимание на естественную динамику снижения микробного разнообразия в течение беременности с резким его нарастанием после родов (рис. 17), что требует более детальной клинической оценки.

Из рис. 17 видно, что микробиота влагалища у женщин уменьшается в разнообразии во время беременности, часто с увеличением относительной численности Lactobacillus spp. В послеродовом периоде у женщин отмечена фаза резкого увеличения разнообразия влагалищного микробиома и уменьшения относительной плотности Lactobacillus spp. Особенный интерес представляет факт, что обозначенные ранее различия этнического характера в составе влагалищной микробиоты вне беременности остутствовали в период беременности, что говорит о значимости доминирования лактобактерий во влагалище во время беременности вне зависимости от других индивидуальных факторов женщины [80].

Среди интересных работ, связывающих вагинальный и кишечный микробиом, опубликованы данные о микробиоте искусственно сформированного неовлагалища у транссексуалов, где чаще определялись L. gasseri и L. crispatus. При отсутствии специфической клеточной составляющей слизистой оболочки сформированного влагалища источником лактобактерий в этих случаях предполагался кишечный микробиом [97].

Показана возможность использования масс-спектрометрии для оценки микробиоты влагалища, обозначенным методом идентифицировано более 15 видов лактобактерий, и среди них три вида - L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri - были доминирующими. При этом анализ видового состава влагалищных лактобактерий, выделенных у беременных с абсолютным нормоценозом, стал основой для вывода о том, что доминирование вида Lactobacillus crispatus являтся показателем стабильности нормы микробиоты влагалища. Авторы этого исследования также опровергли представление о ведущей роли вида L. acidophilus в микроэкологии влагалищных лактобактерий [98]. Другое независимое исследование подтверждает, что L. crispatus является доминирующим видом вагинального биотопа здоровых женщин, а при дисбиозах часто определяются виды L. gasseri и L. iners [99].

Среди моделей устойчивости к колонизации патогенами в последнее время активно изучается опосредованная лактобактериями устойчивость к хламидийным инфекциям, а именно к инфекции, вызываемой Chlamydia trachomatis. Считается, что понимание теоретических основ барьерной защиты нормальной микробиоты может стать базой для обоснования новых методов профилактики инфекций, передаваемых половым путем. По данным экспериментального клеточного 3D-моделирования V.L. Edwards и соавт., лактобактерии, которые специфически продуцируют D(-) стереоизомер молочной кислоты, ассоциированы с долговременной защитой от инфекции C. trachomatis. При этом снижение защитного эффекта показано для L. iners, которая не продуцирует этот стереоизомер и ассоциирована со сниженной пролиферацией эпителиальных клеток в экспериментальной модели [100].

Таким образом, можно констатировать, что современные представления о роли комменсалов в акушерской и гинекологической патологии более сложные, чем 10 лет назад. Влагалищный микробиом значительно варьирует у женщин на протяжении всей жизни и ассоциирован с рядом состояний. Даже считавшиеся ранее стерильными органы женской репродуктивной системы содержат определенные количества бактерий, формирующих микробиом. Влияние применения антибактериальных препаратов на микробиом женщины еще предстоит более точно охарактеризовать, а системный анализ микробиома в аспекте репродуктивного здоровья, несомненно, прольет свет на наиболее значимые и запутанные нарушения этой сферы. Эта сложная область исследований, в сочетании с метагеномными технологиями, в будущем позволит ученым-репродуктологам разгадать тайны не только здоровья и болезней, но и, возможно, коэволюции микробов и людей.

Важно заметить, что методы диагностики, применяемые для оценки микробных сообществ влагалища, все еще являются весьма трудоемкими и требуют наличия высококвалифицированных лабораторий. В связи с этим необходимо внедрение быстрых, портативных, работающих в режиме реального времени, желательно недорогих инструментов оценки микробиоты, предпочтительно локализованных в месте оказания медицинской помощи. Наиболее близки к этому технологии новых поколений биосенсоров и лабораторий на чипе (микросистемы полного анализа) [101-104]. Биосенсор представляет собой аналитическое устройство, которое содержит биораспознающий компонент для отделения биомаркера и физико-химический преобразователь для превращения биологического сигнала в удобную для анализа форму. Благодаря возможности интеграции различных методов исследования, таких как микрогидродинамика (микрофлюидика), биосенсирование, электроника и прочее, на одном чипе, такие платформы могут быть использованы для полного анализа различных заболеваний, связанных с микробиотой влагалища, а также инфекций в акушерстве и гинекологии [33, 104, 105].

МИКРОБИОМ КОЖИ

Структурно кожа состоит из отдельных слоев: эпидермиса, дермы и подкожно-жировой клетчатки. Наружный слой (эпидермис) состоит из слоев дифференцированных кератиноцитов. Верхний, или роговой, слой состоит из окончательно дифференцированных энуклеированных кератиноцитов, которые сшиты химически для формирования защитного барьера кожи (рис. 18). Различные участки тела человека характеризуется разнообразной микроэкологией, которая зависит от воздействия ультрафиолетового света, pH, температуры, влажности, содержания кожного сала и расположения. На основании этих характеристик участки кожи могут быть сгруппированы в более общие категории: сальные (лицо, грудь и спина); влажные (локтевой сгиб, задняя часть колена и паховая область) и сухие (предплечье и ладонь) [106]. Считается, что микробные сообщества кожи у взрослых в основном стабильны во времени, несмотря на постоянные изменения в окружающей среде. У новорожденных же первичная колонизация кожи зависит от типа родоразрешения: дети, рожденные per vias naturales, приобретают бактерии, которые колонизируют влагалище матери, тогда как новорожденные, рожденные посредством кесарева сечения, приобретают микроорганизмы кожного микробиома матери [49]. Относительная плотность микроорганизмов кожи меняется в период полового созревания, когда повышенный уровень гормонов стимулирует функцию сальных желез. Таким образом, среда кожи в постпубертате способствует размножению липофильных микроорганизмов, таких как бактерии Propionibacterium spp. и Corynebacterium spp. и грибы Malassezia spp. В противоположность этому у детей до полового созревания на коже больше распространены Firmicutes (Streptococcaceae spp.), Bacteroidetes spp. и Proteobacteria spp. [107]. Описанная возрастная динамика микробиома кожи клинически значима, так как многие кожные заболевания имеют возрастные пики распространенности. Например, случаи стафилококкового атопического дерматита снижаются у детей к возрасту половой зрелости, тогда как разноцветный лишай, ассоциированный с видами Malassezia spp., чаще встречается у взрослых.

На микроэкологию участков кожи влияют функции потовых желез, волосяных фолликулов и сальных желез. Потовые железы, необходимые для терморегуляции, также подкисляют pH кожи, создавая условия, неблагоприятные для роста и колонизации определенных микроорганизмов. Кроме того, пот содержит антимикробные вещества, такие как свободные жирные кислоты и пептиды, которые снижают уровень микробной колонизации [108]. Связанные с волосяными фолликулами сальные железы выделяют богатое липидами кожное сало - гидрофобное покрытие, которое смазывает и обеспечивает антибактериальный щит для волос и кожи. По сравнению с более богатой питательной средой ЖКТ, в микробиоме кожи не хватает многих питательных веществ. Чтобы выжить в такой прохладной, закисленной и сухой микроэкологии, микробиота кожи приспособилась использовать энергетические ресурсы, которые присутствуют в поте, кожном сале и роговом слое эпидермиса. Например, факультативный анаэроб P. acnes питается в сальной железе с помощью протеаз, высвобождающих аминокислоту аргинин из белков кожи, и липаз, расщепляющих триглицериды кожного сала; при этом высвобождаются свободные жирные кислоты, способствующие росту и адгезии бактерий [109]. Известно, что уровни кожного сала в коже лица положительно коррелируют с плотностью Propionibacterium spp. [110]. Интересно, что у других млекопитающих, таких как мыши, крысы и собаки, у которых в коже вырабатывается гораздо меньше кожного сала, P. acnes обнаруживается в более низкой плотности [111]. Другим примером адаптации к микроэкологии кожной среды являются представители грибов Malassezia spp. В соответствии с недостатком углеводов и избытком липидов на коже грибы Malassezia spp. отличаются избытком генов липазы и снижением количества генов метаболизма углеводов по сравнению с геномами других секвенированных грибов. Таким образом, биохимия может объяснить, почему виды Malassezia spp. преобладают в микобиоме кожи взрослого человека [112]. И наконец, стафилококки выработали множество стратегий выживания на коже человека, в том числе способность выдерживать высокое содержание соли в поте и использовать мочевину, которая присутствует в поте, в качестве необходимого источника азота. В дополнение, адгезивные вещества стафилококков способствуют прикреплению к коже, а протеазы высвобождают для них питательные вещества из рогового слоя эпидермиса.

В зависимости от метода, используемого для отбора образцов микробиома кожи (мазок, биопсия, поверхностный соскоб или скотч-тейп), определяются те группы микроорганизмов, которые находятся на разной глубине слоев кожи [113]. Хотя большинство основных таксономических уровней бактерий идентифицируются одинаково независимо от метода отбора образцов, все же отдельные микроорганизмы отличаются на поверхности кожи и в более глубоких слоях [114]. В целом в большинстве исследований используются методы оценки микроорганизмов в пределах рогового слоя эпидермиса. Стоит отметить, что для качественной оценки микробиома кожи важно использовать данные, полученные одним методом отбора образцов, то есть на одной глубине кожи.

В сальных участках кожи преобладают липофильные виды Propionibacterium spp., тогда как бактерии, которые доминируют во влажных участках, относятся к Staphylococcus spp. и Corynebacterium spp. Считается, что по плотности бактериальный микробиом кожи превышает аналогичный грибковый компонент (рис. 19).

В отличие от бактерий, состав грибковых сообществ, как правило, одинаков на различных участках кожи. Представители рода Malassezia преобладают в центральных участках тела и на руках, тогда как стопы колонизированы более разнообразной комбинацией видов Malassezia spp. , Aspergillus spp. , Cryptococcus spp. , Rhodotorula spp. , Epicoccum spp. и др. [115].

Если говорить о вироме кожи, то имеются данные, что колонизация эукариотическими ДНК-вирусами весьма специфическая для каждого индивидуума и не зависит от анатомического участка. Поскольку ни один маркерный ген не является универсальным (общим) для вирусов, разнообразие вирома может быть выявлено только с помощью изучения очищенных вирусоподобных частиц или полногеномного секвенирования. Имеется еще одна сложность изучения вирома - РНК-вирусы могут быть изучены только с помощью РНК-секвенирования. На сегодняшний день нет данных об общих закономерностях вирома кожи индивидуумов, кроме наличия широко распространенных бактериофагов к Propionibacterium spp. и Staphylococcus spp. [116, 117].

Известно, что, например, S. aureus колонизирует кожу носа и слизистой оболочки ноздрей примерно 1/3 населения, а также показано, что его присутствие является фактором риска для последующей инфекции у отдельных категорий пациентов [118]. По некоторым данным, при инфекциях более 80% изолятов золотистого стафилококка из кровотока соответствуют идентифицированным в носу у пациента [119]. Поскольку S. aureus часто отличается устойчивостью к антибиотикам, а разработанные вакцины не показали свою эффективность, альтернативные стратегии подавления золотистого стафилококка, в частности с применением комменсальных микроорганизмов, являются перспективной областью медицины [120-122]. В исследовании A. Zipperer и соавт. было выявлено, что Staphylococcus lugdunensis ингибировал рост S. aureus за счет продукции природного антибиотика лугдунина, циклического пептида. И даже после нескольких поколений S. aureus не развивал устойчивость к антимикробному действию лугдунина [123]. Это резко контрастирует с традиционными антибиотиками, против которых организмы быстро развивают устойчивость, и подчеркивает, что новые препараты естественного микробного происхождения могут быть более эффективным средством для ингибирования оппортунистических патогенов. В другом исследовании коагулазонегативные стафилококки, S. epidermidis и S. hominis, продуцировали новые l-антибиотики, которые совместно с эндогенным антимикробным пептидом (кателицидин LL-37) ингибировали рост S. aureus [124]. Также было обнаружено, что некоторые виды Propionibacterium spp. могут вызывать агрегацию микробных клеток S. aureus и образование биопленки, что зависит от фазы роста бактерий и pH среды [125]. В экспериментах in vitro S. aureus менял свои свойства от вирулентного до комменсального при воздействии комменсальной бактерии Corynebacterium striatum [126] . Эта уникальная способность изменять свойства бактерий, не уничтожая их, открывает терапевтическую возможность модулировать их поведение в пользу человека (рис. 20)!

Известный советский физиолог, академик А.М. Уголев в работах по эволюции пищеварения предсказал и обозначил ряд закономерностей кишечного микробиома, при этом отсутствие на то время адекватных молекулярно-генетических методов изучения микробиома не помешало ему указать на важную роль микробных сообществ в здоровье человека. Уголев выделял три потока веществ, обусловленных деятельностью бактерий ЖКТ: первый поток - нутриенты, модифицированные бактериями (например, амины, возникающие при декарбоксилировании аминокислот), второй поток - продукты жизнедеятельности бактерий и третий поток - балластные вещества, модифицированные бактериями (моносахариды, жирные кислоты и др.). Балластные вещества, или пищевые волокна, являются не балластом, а эволюционно важным компонентом пищи. Поток таких модифицированных микрофлорой веществ необходим для нормального функционирования пищеварительного аппарата и организма в целом. При этом в этих трех потоках выделялись: полезные вещества (витамины, незаменимые аминокислоты), индифферентные вещества и токсические вещества, которые являются неизбежными спутниками экзотрофного питания. Потоки токсических веществ определенно являются физиологичными, когда они не превышают определенных границ. Такими веществами являются токсические амины (кадаверин, путресцин и др.), которые заметно влияют на состояние организма человека.

Уже тогда Уголев выделял индигенные (аутохтонные) группы микроорганизмов кишечника и случайные (транзиторные) бактерии. Таким образом, человек и высшие животные представляют собой не организмы, а надорганизменные системы, включающие в себя, кроме макроорганизма, микробиоту его ЖКТ - внутреннюю экологию, или эндоэкологию. Между организмом хозяина и микрофлорой его пищеварительного аппарата существуют положительные симбиотические отношения (Уголев А.М. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций: элементы современного функционализма. Л.: Наука, 1985).

Еще в середине XX в. было показано, что подавление микробиоты у лабораторных животных неблагоприятно воздействует на их здоровье. Сопоставление обычных и безмикробных (стерильных) мышей выявило, что последние в метаболическом, иммунологическом и неврологическом отношении дефектны и отличаются от обычных. Стерильные мыши имеют недоразвитую иммунную систему, более чувствительны к питанию с недостатком незаменимых аминокислот и витаминов [Валдьман, 1972; Freier, 1974; Barnard, 1977]. Также давно известны структурные различия в ЖКТ у безмикробных животных. В этом случае масса кишечника меньше, эпителий тоньше, а ворсинки более узкие (табл. 3).

Примечание: «+» - увеличение; «-» - снижение.

Итак, сосуществование микро- и макроорганизмов, вероятно, древнее эволюционное явление, которое отмечается уже на уровне простых многоклеточных организмов. Бактерии являются необходимым атрибутом существования макроорганизмов. Поэтому в метаболическом смысле академик Уголев и определял макроорганизм как надорганизм.

ФИЗИОЛОГИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОБИОМА

Функция клеток в их естественной среде обитания часто не может быть надежно предсказана на основании данных генома или физиологических исследований изолятов. Традиционные экспериментальные подходы к изучению функций таксономически и метаболически разнообразного микробиома часто ограничены их низким пространственным разрешением и пропускной способностью. Недавно разработанные технологии могут предоставить нам новое понимание клеточных функция в естественных и искусственных системах, а также новую информацию о том, как микроорганизмы взаимодействуют и формируют окружающую среду, в которой они обитают. Физиологические подходы нового поколения классифицируются как свободные от меток либо как зависимые от меток. Подходы без использования меток нацелены на врожденные свойства клеток и предоставляют ценную информацию о фенотипе клетки в неинвазивных условиях. Методы, основанные на метках, вводят химический маркер в клетку, который может обеспечить более полное или дополнительное представление о динамике клеточных процессов. Современные неповреждающие методы наблюдения за фенотипом клетки микробиоты:

Сегодня для глубокого понимания физиологии микробных сообществ микробиологам необходимо работать параллельно с исследователями за пределами привычной науки о микробиоме, включая химиков-аналитиков, химиков-синтетиков, биоинженеров и биохимиков. Огромные возможности существуют для специалистов-немикробиологов, которые способны выйти за пределы своей зоны научного комфорта и проникнуть в сферу понимания живых систем. Примеры таких новых воздействий извне на науку о микробиоме включают создание зондов для изучения клеточных функций и ферментов в неинвазивных условиях, адаптацию моделей лаборатории на чипе для оценки некультивируемых микроорганизмов, извлеченных из биообразцов, или разработку новых высокоскоростных устройств для фенотипической сортировки клеток. Принимая во внимание, что флуоресцентные микроскопы и инструменты цитометрии уже широкодоступны для большинства исследователей, в настоящее время начинается внедрение самых передовых методов (рамановской микроспектроскопии и криоэлектронной томографии), микрофлюидного и нанотехнологического оборудования. Есть мнение, что, получив широкое применение, эти физиологические подходы нового поколения будут в значительной степени способствовать переходу исследований в области микробиома от корреляционных исследований к выявлению причинно-следственной связи активности микроорганизмов и физиологии людей.

Актуальная область исследований из группы омикс-технологий, называемая метаболомикой, направлена на всестороннюю характеристику низкомолекулярных метаболитов в биологических системах. Метаболическая активность микроорганизмов до сих пор не полностью изучена (табл. 4). Мы нуждаемся в более ясном понимании биологических свойств микробных метаболитов и того, какие микробные ферменты и биохимические пути используются, а также как микробные метаболиты влияют на хозяина [128].

В то время как метагеномика и транскриптомика предоставляют ценную информацию о фенотипах и молекулярных механизмах, метаболомика обеспечивает представление в реальном времени динамических изменений с помощью количественного определения малых молекул. Малые молекулы играют значимую роль в клетке, обеспечивая функции мембранных структур (липиды), передачу сигналов (липидные медиаторы, нейротрансмиттеры) и структурную основу (аминокислоты). В метаболомике применяются платформы на основе методов масс-спектрометрии или ядерного магнитного резонанса. Было показано, что ядерный магнитный резонанс предлагает воспроизводимое количественное измерение приблизительно 125 малых молекул, включая углеводы, нуклеиновые кислоты, жирные кислоты [155]. Однако из-за относительно более низкой чувствительности ядерного магнитного резонанса платформы, основанные на масс-спектрометрии, стали более популярными в клинических и исследовательских лабораториях. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ (англ. MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) получила признание в современных лабораториях клинической микробиологии. Этот метод был разработан для идентификации бактерий, однако та же технология может быть использована для оценки протеомики и метаболомики бактерий в образцах микробиоты. Варианты метаболомики включают как целевой анализ известных метаболитов, так и метаболическое профилирование всего определяемого объема метаболитов.

Роль микробиоты в биохимических процессах хозяина неоценима. К примеру, изменения, наблюдаемые у безмикробных мышей или после введения антибиотиков, включают изменения в путях метаболизма аминокислот, полисахаридов, КЦЖК, желчных кислот, повышение креатинина. Следующим уровнем сложности является то, как метаболом связан с экспосомом (англ. exposome), то есть с экзогенными факторами, такими как поллютанты, средства гигиены и диета. Пока что одним из наиболее изученных факторов воздействия является диета. К примеру, диета с высоким содержанием клетчатки ассоциирована с повышением уровня КЦЖК как в кишечнике, так и свободно циркулирующих [156]. В целом дальнейшая интеграция методов определения состава микробиоты и методов определения ее функции станет основой для создания микробиом-ассоциированной медицины.

Непосредственная близость сконцентрированных популяций бактерий к слизистым и наружным покровам человека создает потенциальный риск инвазии, поэтому иммунная система наиболее тщательно контролирует бактерии, колонизирующие просвет кишечника. Однако, несмотря на строгий иммунный контроль, микробиота благополучно сохраняет за собой право на данную территорию, в том числе регулируя функции подлежащей ткани кишечника.

Экспериментальные работы в области иммунологии показали, что антибиотикотерапия осложняла течение колита у мышей (в модели индукции декстран-сульфатом натрия) посредством снижения количества микробных лигандов, ассоциированных с толл-подобными рецепторами (TLR), что обеспечивает в норме экспрессию медиаторов тканевого гомеостаза и восстановления поврежденных тканей [157].

Основные системы иммунитета человека полагаются на бактериальные сигналы для правильной работы, в частности для калибровки уровня ответа и поддержания напряженности иммунитета (рис. 21). Выделенный из микробиоты липополисахарид (ЛПС) поддерживает экспрессию базального уровня RegIIIγ (бактерицидный лектин C-типа) в эпителиальных клетках кишечника и клетках Панета. К примеру, RegIIIγ не обнаружен у стерильных (безмикробных) лабораторных мышей [158], и даже кратковременная антибиотико-терапия ухудшает его экспрессию у нестерильных мышей, что делает их восприимчивыми к инфекции, вызванной ванкомицинрезистентными энтерокококками, при этом данный дефект обратим при пероральном введении ЛПС [159]. Подобным образом флагеллин бактерий кишечника способствует поддержанию экспрессии RegIIIγ в клетках человека. Именно флагеллин посредством воздействия на рецепторы TLR5 дендритных клеток слизистой оболочки кишечника стимулирует выделение ИЛ-22 и последующую экспрессию RegIIIγ в эпителиальных клетках кишечника [160, 161].

Гранулоциты также контролируются сигналами бактерий-комменсалов, чьи медиаторы имеют эффект в том числе и на клетки костного мозга человека. В эксперименте NOD (Nod-подобные рецепторы - класс цитоплазматических клеточных рецепторов) опосредованное воздействие на мезодиаминопимелевую кислоту как часть пептидогликана

У изначально стерильных мышей мезодиаминопимелевая кислота появлялась в крови и костном мозге в течение 3 сут после колонизации E. coli в эксперименте, тем самым доказывая, что бактериальные лиганды из просвета кишечника характеризуются системным распределением и, следовательно, приводят к системным эффектам [162]. Кроме того, перинатальное введение антибиотиков в эксперименте отрицательно влияло на количество и функции нейтрофилов у мышей, ухудшая продукцию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и ИЛ-17, а также повышая риск сепсиса, вызванного E. coli или K. pneumoniae [163]. Таким образом, антибактериальная терапия приводила к нарушениям в базофильном ростке костного мозга и крови у мышей, реализуя отрицательный эффект посредством цепи Th2-ИЛ-4-IgE, что, в свою очередь, приводило к осложненным аллергическим синдромам [164]. Функция антиген-презентирующих клеток также зависит от бактерий микробиоты. К примеру, показано, что миграция дендритных клеток и продукция ИЛ-1β/ИЛ-18 нарушены у пролеченных антибиотиками мышей на фоне инфицирования их вирусом гриппа [165]. Логично, что в данном эксперименте уровни иммуноглобулинов, количество Т-клеток и продукция интерферона γ были также снижены, что привело к увеличению титров вируса. Весьма интересно, что введение в кишечник агонистов TLR-рецепторов восстанавливало иммунный ответ в дыхательной системе лабораторных животных в этом исследовании, указывая на то, что микробные сигналы из кишечника способны регулировать и восстанавливать системный иммунный ответ, в том числе опосредованный другими органами и тканями.

Опубликованы данные о том, что антибиотики нарушают иммунный ответ против вируса лимфоцитарного хориоменингита у мышей, снижая экспрессию антивирусных генов в макрофагах легочной ткани, что приводит к дефектам функции CD8⁺ Т-клеток, а также снижении продукции интерферона γ/фактора некроза опухоли α (ФНОα) и иммуноглобулинов класса G [166]. В другом исследовании сообщалось, что макрофаги селезенки у стерильных и пролеченных антибиотиками мышей теряли способность к адекватному взаимодействию с NK-клетками из-за недостатка хроматина в промоторной области генов, кодирующих важные цитокины, такие как интерфероны (α, β), ИЛ-6 и ФНОα [167]. Таким образом, в результате введения антибиотиков лабораторные животные не могли контролировать уровень вируса на фоне экспериментального инфицирования цитомегаловирусом мыши. Функция Т-лимфоцитов так же страдает при нарушении взаимодействия между иммунной системой и микробиотой, как и B-клеточное звено иммунитета. Действительно, было показано, что титры иммуноглобулинов ниже у мышей, получавших антибиотики до момента развития вирусной инфекции [165, 166]. Более того, продемонстрировано, что наличие ЛПС бактериальной природы необходимо для созревания B₁ -субпопуляции лимфоцитов в селезенке и для поддержания базального уровня циркулирующих иммуноглобулинов класса М, которые играют защитную роль в экспериментальных моделях сепсиса у мышей [168].

Неожиданным открытием стало то, что микроорганизмы кишечника способны модулировать результаты вакцинации. Опубликованные данные из исследований трехвалентной инактивированной вакцины против гриппа и других неадъювантных вакцин говорят о том, что вакцинация индуцирует продукцию иммуноглобулинов классов М и G посредством TLR-5-зависимого пути с помощью микробиоты у мышей и, возможно, у людей, что подтверждалось корреляцией уровней экспрессии TLR-5 на лейкоцитах и титров антител против вируса гриппа в группе после вакцинации [169]. Лабораторные животные после введения антибиотиков, а также c дефицитом TLR-5 характеризовались дефектами продукции антител после вакцинации, однако введение бактериального флагеллина в качестве агониста TLR-5 восстанавливало гуморальный ответ. Стимуляция TLR-5 влияла на плазматические клетки, увеличивая выживаемость, дифференцировку и продукцию антител, а также на макрофаги лимфатических узлов, что приводило к образованию важных факторов иммунного ответа: ФНОα, ИЛ-6 и белка APRIL (a proliferation-inducing ligand - лиганд, индуцирующий пролиферацию).

Описанные работы демонстрируют выраженное влияние микробиома кишечника на иммунный ответ организма человека. В настоящее время данная ассоциация исследуется в контексте различных патологических состояний и терапевтических подходов. В этой связи особенно перспективно применение препаратов микробиома кишечника для модуляции эффективности иммунотерапии рака, что сегодня становится областью активных научных исследований.

Набор генов микроорганизмов, который обеспечивает устойчивость к противомикробным препаратам, составляет резистом. Резистом кишечника может включать в себя как условных патогенов, так и комменсалов ЖКТ.

Основой для понимания комплексного характера данного понятия стал феномен чувства кворума (англ. Quorum Sensing) - способность микроорганизмов общаться и координировать свое поведение за счет секреции молекулярных сигналов. Долгие годы в классической микробиологии разумные взаимодействия между бактериями не рассматривались всерьез; каждая бактерия рассматривалась как отдельная клетка с независимым от других поведением. В работах E.P. Greenberg впервые были описаны механизмы взаимодействия бактерий друг с другом, а также в 1994 г. автором был предложен вышеобозначенный термин «quorum sensing» [170, 171]. Более того, новым научным направлением, изучающим сложную систему «общения» микроорганизмов, стала социо-микробиология [171, 172]. Биологическая роль чувства кворума бактерий заключается в том, чтобы эта система межклеточной связи позволила отдельным микроорганизмам понимать актуальную плотность сообщества и, таким образом, регулировать экспрессию определенных генов (увеличивать или уменьшать скорость размножения). Среди других вопросов этого нового научного направления находится проблема биопленок. Биопленки представляют собой организованные сообщества бактерий на основе внеклеточного матрикса собственного производства. Как следствие формирования биопленки, бактерии в ней существуют в гетерогенной среде, более того, бактерии в разных областях биопленки могут выполнять разные функции, что придает группе микроорганизмов признаки общества. Благодаря биопленке, часть субпопуляции бактерий защищена от неблагоприятных для них воздействий окружающей среды [170, 173]. На самом деле инфекции, ассоциированные с биопленками, весьма сложно лечатся антибиотиками. Поскольку такие типы инфекций являются весьма распространенными в современной медицине, отмечен и высокий научный интерес к разработке новых методов лечения, потенциально эффективных против бактерий, ассоциированных с биопленками. Примерами таких ситуаций являются инфекции имплантированных материалов (эндопротезов, сердечных клапанов и др.), проявления муко-висцидоза в легких, отдельные формы хронических инфекций среднего уха.

Возвращаясь к совокупности генов резистентности, то есть резистому, интересно заметить, что это явление не возникло в XX в. с появлением коммерчески доступных антибиотиков, а имеет весьма древнюю природу. При анализе ДНК, полученной из образцов вечной мерзлоты, уже были выявлены гены устойчивости бактерий против антибиотиков (гликопептидов, β-лактамов и тетрациклинов - классы антибиотиков) [174], то есть гены резистентности были в то время, когда антибиотики не использовались. Оказывается, у древних бактерий имелись защитные механизмы (модифицирующие ферменты и эффлюкс-помпы) для защиты от природных антибиотиков. Считается, что биосинтетический кластер генов, который отвечает за синтез бактериями природных антибиотиков, также содержит гены «противоядия» , которые обеспечивают устойчивость самих продуцентов к этим антибиотикам. Таким образом, многие компоненты резистома могли существовать задолго до того, как антибиотики стали применяться в медицине [175]. К тому же эти гены резистентности могут передаваться от бактерий окружающей среды к патогенам посредством механизмов горизонтального переноса генов. Поэтому и самым первым резервуаром генов резистентности к антибиотикам была окружающая среда и даже был описан термин «экологический резистом» , который вполне могли обеспечивать, например, бактерии почвы [176].

Таким образом, практически любая экологическая ниша, которая обеспечивает размещение большого количества разнообразных бактерий, потенциально может служить резервуаром генов резистентности к антибиотикам, и микробиом кишечника, кожи и других биотопов человека не исключение. Более того, описаны специальные термины, имеющие отношение к резистому, такие как «мобилом» (высокомобильная часть генома бактерий, участвующая в горизонтальном переносе генов); «парвом» (часть генома бактерий, кодирующая небольшие биоактивные молекулы, в том числе природные антибиотики); «гены проторезистентности» (гены, не кодирующие антибиотикоре-зистентность в исходной клетке, но проявляющие устойчивый фенотип резистентности в новой клетке после горизонтального переноса); «молчащие гены резистентности» (гены, кодирующие резистентность, которые не экспрессируются в исходной клетке, а начинают экспрессию только после горизонтального переноса к другой клетке).

Антибиотикорезистентность микроорганизмов делится на приобретенную (из-за точечных мутаций или горизонтального переноса генов) и природную (особенности клеточной структуры и физиологии). Также и резистом можно классифицировать как природный и мобильный, где последний представляет наибольшую угрозу из-за риска распространения при горизонтальном переносе. Для определения генов резистентности в микробиоме применяются как методы метагеномного секвенирования, которые зависят от баз данных генов резистентности, так и функциональная метагеномика.

Многие гены резистома, а именно гены резистентности к тетрациклину, ванкомицину, бацитрацину, цефалоспоринам, макролидам, линкозамидам, обнаруживаются по всему миру [177]. При этом многие из этих генов ассоциированы с комменсальными бактериями. Ген устойчивости к тетрациклину, кодирующий белок tetQ, является наиболее распространенным геном резистентности в мире, также весьма распространены гены устойчивости к ванкомицину [178, 179]. Было неоднократно показано, что потребление антибиотиков значительно влияет на обилие и разнообразие генов резистентости в микробиоме кишечника [177, 180, 181]. Интересно то, что гены резистентности к тетрациклину настолько повсеместно распространены в кишечнике людей по всему миру. Это кажется не совсем связанным с использованием тетрациклина в клинической практике, особенно редко применяемым в последние годы в связи с весьма узкими показаниями (то есть отмечается невысокий селективный прессинг антибиотика). Более того, гены устойчивости к тетрациклину были обнаружены даже в материале из вечной мерзлоты (30 000-летней давности)! Гипотеза, объясняющая такое распространение генов резистентности к тетрациклину в кишечном резистоме, заключается в следующем: возможно, первоначально эти гены выполняли другие функции, например отвечали за межклеточные сигналы, транспорт белков [182]. Вторым возможным объяснением этого может считаться селективный прессинг, вызванный наличием малых количеств тяжелых металлов в пище, особенно в морепродуктах, рисе и овощах, что может влиять на гены резистентности [183]. Еще одним интересным феноменом является высокая распространенность генов резистентности к ванкомицину, и, кстати, очень похожие гены были опять-таки обнаружены в образцах из вечной мерзлоты [178].

Высокая распространенность мобильного резистома и активность трансфера генов резистентности чаще всего наблюдаются у таксономического типа Proteobacteria, и, поскольку многие патогенные для человека бактерии принадлежат именно к этому типу, селективный прессинг антибиотиков в этом случае весьма высок [184], и в корреляционном анализе обилия генов резистентности были показаны ассоциации именно с антибиотиками из группы β-лактамов, а не тетрациклинов, что вписывается в понимание высокой роли генов протеобактерий в резистоме [180].

Итак, циркуляция генов резистентности возможна между объектами окружающей среды, людьми и животными. Первое упоминание о возможности передачи устойчивости к антибиотикам было опубликовано H.W. Smith в журнале Lancet в далеком 1969 г. Тогда было установлено, что фактор устойчивости к антибиотикам может передаваться от животных и людей к резидентной кишечной палочке в кишечнике другого человека [185]. Впоследствии многие другие исследования продемонстрировали факт передачи генов резистентности между людьми и животными [184, 186]. С практической точки зрения важно понимать, что по сравнению с использованием антибиотиков в медицине объемы применения антибиотиков у животных, особенно у домашней птицы, оказывают несравнимо большее влияние на обогащение резистома в человеческой популяции [179]. При этом, по некоторым прогнозам, ожидается, что мировое потребление противомикробных препаратов в животноводстве вырастет на 67% в период между 2010 и 2030 гг. [187]. Ситуацию усложняет то, что дикие животные, обнаруженные в непосредственной близости от загрязненных экосистем, также подвергаются воздействию генов резистентности и могут способствовать их дальнейшему распространению. Например, ген устойчивости к колистину (mcr-1) был выявлен как в мясе, так и у инфицированных пациентов больниц в Китае [188]. При дальнейшем анализе этого гена на основе баз данных был предложен механизм его распространения через пищевую цепочку к кишечным бактериям человека [189].

Не так давно были разработаны новые подходы для вмешательств на уровне переноса генов резистентности для предотвращения эволюции и появления новых микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам. При этом такие методы не подразумевают обязательное уничтожение микроорганизмов, что в противоположность делают антибиотики [190]. Среди них обсуждаются: ингибиторы проникновения, ингибиторы конъюгации и горизонтального переноса генов, ингибиторы встраивания и сохранения чужеродной ДНК в новой клетке; ферменты деградации антибиотиков в кишечнике. Последняя обозначенная стратегия основана на приеме внутрь специальных ферментов, которые разлагают антибиотики в кишечнике, не влияя при этом на уровень антибиотиков в крови пациентов. Одним из таких примеров является использование SYN004 (рибаксамазы) и пероральной β-лактамазы, предназначенных для одновременного использования с внутривенным цефтриаксоном, для того чтобы разрушить его во время экскреции в кишечнике и таким образом защитить кишечный микробиом, предотвратить распространение гена резистентности у пациента. Клиническая эффективность остается прежней, так как концентрация антибиотика в крови не меняется [191].

Таким образом, сегодня разрабатываются новые методы для изучения и воздействия на резистом. Можно предположить, что резистом кишечника человека станет наиболее активной сферой научных исследований в ближайшие годы.

УСТОЙЧИВОСТЬ К КОЛОНИЗАЦИИ ПАТОГЕНАМИ

Микробиота кишечника играет решающую роль в удалении из организма человека инородных бактерий и предотвращении избыточного роста потенциально опасных малочисленных бактерий, колонизирующих ЖКТ. Полезные функции бактерий, населяющих ЖКТ человека, обсуждались еще лауреатом Нобелевской премии Ильей Мечниковым, идеи которого послужили основой многим поколениям исследователей (рисунок 8 Приложения Б). Роль микробиоты в защите хозяев от кишечных патогенов была официально подтверждена в опубликованных исследованиях Bohnhoff и соавт., выходивших в англоязычной научной прессе с начала 1950-х гг. [192-194]. Коллектив авторов занялся изучением вопроса, почему у пациентов, проходящих лечение антибиотиками, часто развиваются вторичные инфекции. В эксперименте исследователи продемонстрировали, что мыши, получавшие перорально стрептомицин, имели пониженную плотность бактерий в кишечнике, а также отличались повышенной восприимчивостью к Salmonella enterica subsp. enteritidis. При этом восприимчивость к инфекции была практически в шесть раз выше, чем у не пролеченных антибиотиком особей. В нескольких последующих исследованиях авторами использовались сочетания различных экспериментальных моделей, патогенов и антибиотиков, что также приводило к повышенной восприимчивости к инфекционным агентам после антибиотик-ассоциированного повреждения микробиоты кишечника (рис. 22). По результатам данной работы был предложен термин «устойчивость к колонизации», который определял многогранную систему защиты от патогенов, реализуемую здоровой и дифференцированной микробиотой кишечника [195].

Поддержание эпителиального барьера

Слизистый слой покрывает и защищает кишечный эпителий, сохраняя таким образом пространственную границу между колониями бактерий и эпителиальным барьером человека [196]. Толщина слизистого слоя зависит от плотности микробиоты в кишечнике. К примеру, стерильные (безмикробные) мыши имеют более тонкий слой слизи над эпителием кишечника, который однако может вырасти до стандартного размера после искусственного введения веществ бактериального происхождения, то есть ЛПС или пептидогликана [197].

Однако ряд патогенов, таких как C. difficile, способны нарушать эпителиальный барьер кишечника, повреждая эпителиальные клетки и приводя к инвазивным формам инфекции. Внутриклеточный сигнальный путь NF-κB является основным механизмом восстановления эпителиального покрова кишечника. Ранее было показано, что активируемая NF-κB путем транскрипции уменьшает повреждения эпителиальных клеток и способствует восстановлению тканей [198, 199]. Бактерии здорового кишечного микробиома являются одним из факторов активации NF-κB-ассоциированной транскрипции в клетках кишечного эпителия и тем самым поддерживают целостность эпителиального барьера человека [157, 200]. Сигнальный путь NF-κB также индуцирует антиапоптотические факторы, стимулирует пролиферацию и усиливает межклеточные взаимодействия [199]. Опубликованы данные о том, что стимуляция бактериальным агонистом TLR-5 флагеллином в эксперименте улучшала выживаемость и снижала потерю веса в модели острой C. difficile -ассоциированной инфекции (КДАИ) у мышей посредством активации NF-κB сигнального пути. Таким образом, системное введение флагеллина значительно уменьшало уровень колонизации кишечника C. difficile, а также продукцию токсинов. Более того, патогистологическое исследование слепой и толстой кишки показало, что введение бактериального флагеллина защищало от C. dfficile -ассоциированного повреждения эпителиальных клеток, тем самым сохраняя структурную целостность стенки кишечника [201]. В результате сохраненный эпителиальный барьер не позволяет патогену привести к системной инфекции, а клетки иммунитета хозяина начинают концентрироваться в очаге скопления возбудителя.

Таким образом, современные данные молекулярной биологии свидетельствуют о том, что микробиота отвечает за базальную стимуляцию иммунных рецепторов человека, функция которых заключается в предупреждении массивного повреждения эпителиальных барьеров. Эти клетки хозяина обязаны реагировать на микробное повреждение эпителия путем продуцирования слизи, усиления процессов транскрипции, а также привлечения клеток иммунной системы в очаг воспаления.

Микробиом-ассоциированный метаболизм желчных кислот

В дополнение к взаимодействию с иммунной системой хозяина, представители микробиоты вступают в совместный метаболизм ряда биохимических веществ человека, в том числе с желчными кислотами, преобразовывая их в токсичные продукты распада, которые способны ингибировать рост патогенов, например C. difficile. Желчные кислоты продуцируются в печени и секретируются желчным пузырем в просвет ЖКТ с целью эмульгирования жиров в процессе пищеварения. Большинство из них реабсорбируются в терминальном отделе подвздошной кишки, однако небольшая оставшаяся часть попадает далее, в толстый кишечник, где множество бактерий микробиоты способно превращать их во вторичные желчные кислоты.

Первичные желчные кислоты, попавшие в толстый кишечник, проходят процесс деконъюгации с помощью многих видов бактерий, секретирующих гидролазы желчных кислот. Затем уже более ограниченное количество видов бактерий проводит дегидроксилирование неконъюгированных желчных кислот, что приводит к образованию вторичных желчных кислот [202]. Важно отметить, что желчные кислоты существенно различаются по влиянию на микроорганизмы. В то время как таурохолевая кислота (первичная желчная кислота) способствует прорастанию спор C. difficile в вегетативные клетки, вторичные желчные кислоты ингибируют рост вегетативных токсинпродуцирующих клеток возбудителя [203].

В одном из опубликованных исследований авторы применяли сложное математическое моделирование для определения видов комменсальных бактерий, участвующих во вторичной конверсии желчных кислот, что коррелировало с резистентностью к развитию КДАИ как в лабораторной модели на мышах, так и у госпитализированных пациентов. По результатам математического моделирования был выявлен защитный представитель микробиоты, комменсальный анаэроб - Clostridium scindens, который продемонстрировал выраженный защитный эффект. Стоит отметить, что C. scindens участвует в трансформации первичных желчных кислот во вторичные, в частности в дезоксихолевую и литохолевую кислоты. Эти вторичные желчные кислоты ингибируют рост C. difficile, причем отличаются дозозависимым эффектом. Интересно, что фермент 7α-гидроксистероиддегидрогеназа, ответственный за трансформацию первичных желчных кислот во вторичные, является частью индуцируемого желчной кислотой оперона, который был также идентифицирован в геноме C. scindens в процессе молекулярно-генетических исследований. Кроме того, секвестрация желчных кислот с помощью холестирамина нейтрализует ингибирующее действие C. scindens на рост C. difficile [204]. Итак, вместе данные опубликованные экспериментальные работы подтверждают, что защитная бактерия микробиома человека C. scindens препятствует размножению и токсинпродуцированию C. difficile с помощью процесса трансформации первичных желчных кислот человека во вторичные (рис. 23).

Продукция ингибиторных короткоцепочечных жирных кислот

В экспериментальных исследованиях на лабораторных животных уже было показано, что важнейшим защитным барьером на пути патогенов являются ингибиторные КЦЖК: ацетат, пропионат и бутират, которые продуцируются нормальными представителями дифференцированной кишечной микробиоты. Исследовательской группой из США было продемонстрировано, что данные жирные кислоты, будучи терминальными продуктами расщепления растительных пищевых волокон с помощью кишечных бактерий, являются противовоспалительными медиаторами кишечника и играют важнейшую роль в кишечном гомеостазе [206]. Более того, роль КЦЖК была обозначена в развитии бронхиальной астмы, аллергических и аутоиммунных заболеваний [207]. Именно поэтому создание терапевтических препаратов на основе данных кислот сегодня является активным научным направлением.

Характер питания оказывает большое влияние на состав, разнообразие и плотность кишечной микробиоты. Различные компоненты рациона питания определяют наличие определенных бактерий кишечника. Устоявшиеся пищевые привычки человека ведут к определенным сдвигам в его микробиоме, в частности повышенное потребление животных белков и жиров стимулирует рост представителей рода Bacteroides, а повышенное потребление растительных углеводов увеличивает численность рода Prevotella. Данные характерные микробные пейзажи, ассоциированные с пищевыми стереотипами, получили название «энтеротипы» [208]. С точки зрения влияния на микробиом принято разделять общество на популяции с «западным» и «традиционным» типами питания. Последние потребляют гораздо более высокие пропорции растительной клетчатки, и этот диетический компонент способствует разнообразию их микробиома. Ранее Sonnenburg и соавт. исследовали последствия недостатка растительной клетчатки в рационе питания у мышей, колонизированных человеческой микробиотой, и показали, что подобная диета привела к стойкому уменьшению микробного разнообразия, которое не возвращалось в норму даже при нормализации диеты [209].

Низкий уровень потребления растительной клетчатки приводит не только к уменьшению микробного разнообразия и продукции КЦЖК, но и к изменению микробиом-ассоциированного метаболизма в кишечнике, в частности происходит сдвиг к использованию менее эффективных энергетических субстратов, а именно эндогенных белков и мукопротеинов хозяина [210-212]. В одном из исследований добровольцам назначалась высокобелковая низкоуглеводная диета, что приводило не только к уменьшению продукции КЦЖК, и в особенности бутирата, но и к увеличению потенциально токсичных метаболитов, полученных в результате ферментации аминокислот, а именно: разветвленные жирные кислоты; аммиак; амины; N-нитрозосоединения; соединения на основе фенола, включая п-крезол; сульфиды; индольные соединения и сероводород [213]. Растительные волокна и КЦЖК (ацетат и бутират) стимулируют продукцию и секрецию слизи в кишечнике. Один из активных продуцентов ацетата и бутирата, Bacteroides thetaiotaomicron, способствует дифференциации бокаловидных клеток кишечника и экспрессии генов, ответственных за синтез муцина. С другой стороны, Faecalibacterium prausnitzii, потребитель ацетата и продуцент бутирата, снижает стимулирующий эффект ацетата на слизеобразование и предотвращает перепроизводство слизи, тем самым сохраняя гомеостаз кишечного эпителия [214]. К тому же отмечено, что волокна растительной клетчатки способны механически стимулировать выделение слизи эпителием кишечника [215]. Стоит напомнить также, что диета с высоким содержанием растительной клетчатки увеличивает плотность комменсальных бактерий микробиома и, таким образом, ограничивает доступ патогенных бактерий к кишечному эпителию. Опубликованные данные свидетельствуют о том, что КЦЖК могут также способствовать секреции иммуноглобулинов класса А, которые синтезируются В-клетками слизистой оболочки кишечника [216]. И наконец, КЦЖК играют особую роль в процессах репарации тканей кишечника, что наиболее важно при воспалительных заболеваниях, а также химиотерапии.

МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ МИКРОБИОМА К КОЛОНИЗАЦИИ ПАТОГЕНАМИ

Уже более 50 лет известно, что комменсальные анаэробы обеспечивают защиту от экзогенных патогенов [192]. Однако конкретные виды бактерий, способствующие устойчивости к колонизации кишечника различными патогенами в течение длительного времени, не были выявлены. Несмотря на то, что дифференцированный комплексный состав микробиома важен в плане профилактики инфекций и инвазий [217], со временем были получены убедительные аргументы в пользу того, что лишь ограниченное количество видов бактерий необходимо для защиты от таких патогенов, как C. difficile, ванкомицинрезистентные энтерококки и Listeria monocytogenes [204, 218, 219].

Данная идея подтверждается тем, что в экспериментах выполнялось сравнение микробиома мышей, резко восприимчивых к колонизации патогенами, и микробиома мышей, устойчивых к колонизации, и при этом было показано, что обе группы могут иметь микробиом с одинаково низким индексом разнообразия видов, однако специфические составы определенных таксонов варьируют значительно. Последующий анализ корреляции между восприимчивостью к возбудителям инфекций и распространенностью определенных бактерий микробиома как раз помог идентифицировать виды, которые определяют защиту от патогенов. Таким образом, эти основополагающие исследования привели к недавнему выявлению четырех представителей микробиома, которые при искусственном заселении даже стерильных мышей формировали устойчивость in vivo к развитию инфекции, вызванной Listeria monocytogenes [219].

Другим важным исследовательским прорывом явилось создание экспериментальной модели ампициллинрезистентной микробиоты, искусственное заселение которой приводило к отсутствию эффективности данного антибиотика. Этот подход позволил исследователям проанализировать изолированный защитный эффект отдельных бактерий микробиома на риск колонизации ванкомицинрезистентными энтерококками, что и привело к открытию четырехкомпонентного микробного сообщества, которое защищает кишечный микробиом от данных опасных патогенов [218]. Кроме того, целый ряд исследований выявил отдельные защитные группы бактерий против C. difficile, в том числе наибольший защитный эффект был продемонстрирован у семейства Lachnospiraceae [220-223].

Прямые механизмы устойчивости к колонизации

Прямые механизмы устойчивости к колонизации обеспечиваются способностью комменсальной микробиоты ограничивать экзогенную микробную колонизацию и предотвращать доминирование эндогенных потенциально опасных бактерий строго с помощью факторов межбактериального взаимодействия, независимо от регуляторных процессов хозяина [224]. Далее представлены классификация и краткие сведения о прямых механизмах устойчивости.

Наличие питательных веществ в кишечнике является важным источником энергии для членов микробиома и существенно влияет на его состав [225-227]. Среди углеводов кишечника имеются как простые моносахариды, так и сложные полисахариды. Ранее было выявлено, что отдельные патогены, например Citrobacter rodentium, ограничены в размножении строго избирательным использованием моносахаридов. Кроме того, было обнаружено, что некоторые члены кишечного микробиома, например комменсальные представители E. coli, характеризуются аналогичным избирательным использованием в пищу гликанов, то есть углеводных звеньев гликоконъюгатов - соединений, в которых сахара ковалентно связаны с белковой цепью. Напротив, другие виды комменсальных бактерий, например B. thetaiotaomicron, обладают широкими возможностями использовать в пищу как моносахариды, так и полисахариды. Ряд недавно опубликованных экспериментальных работ продемонстрировал две важные концепции в области микробиома. Во-первых, комменсальные защитные бактерии и патогены, которые имеют сходные предпочтения в плане питательных веществ, конкурируют за одну и ту же метаболическую нишу, что и защищает от колонизации и доминирования патогенов в кишечнике [228]. Во-вторых, комменсальные защитные бактерии с более широкими способностями к усвоению различных типов питательных веществ при определенных обстоятельствах могут конкурировать за более узкую метаболическую нишу с патогенами и таким образом тоже защищать хозяина.

Одно из интересных исследований показало, что комбинация двух комменсальных видов кишечной палочки смогла в процессе конкуренции исключить представителей потенциально опасной энтерогеморрагической кишечной палочки из ее метаболической ниши и тем самым предотвратить колонизацию кишечника этим видом бактерий [229]. Известно, что в слизистой оболочке кишечника имеется множество типов сахаров, используемых в пищу бактериями. Энтерогеморрагическая кишечная палочка способна использовать в пищу лишь пять типов из этих сахаров, что и определяет ее узкую метаболическую нишу [230]. Также известно, что два штамма комменсальной кишечной палочки, штамм E. coli Nissle 1917 и штамм E. coli O9:H4 (HS), способны использовать различные, но при этом перекрывающиеся комбинации определенных сахаров [229].

Важно то, что ни один из этих двух штаммов комменсальных бактерий по отдельности не мог использовать в пищу все пять типов сахаров, которые употребляет энтерогеморрагическая Escherichia coli. Однако комбинация этих двух комменсальных штаммов кишечной палочки уже конкурентно поглощает все пять типов сахаров, тем самым полностью занимая метаболическую нишу патогена, в данном примере - энтерогеморрагической E. coli.

В эксперименте у мышей, колонизированных только одним из вышеописанных защитных штаммов E. coli, не было возможности противостоять колонизации энтерогеморрагической E. coli. Однако колонизация уже двумя защитными штаммами E. coli успешно предотвращала колонизацию патогеном [229]. Этот эксперимент элегантно показал, что зачастую именно защитные комбинации бактерий необходимы для профилактики колонизации и инфекции опасными патогенами.

Другим механизмом является конкурентная борьба бактерий за сиаловую кислоту в кишечнике. Известно, что многие микроорганизмы используют сиаловую кислоту в качестве источника энергии, а также углерода и азота [231]. Однако для использования сиаловой кислоты бактериями прежде всего должно произойти ее высвобождение из состава муцина кишечника. Некоторые комменсальные бактерии, например Bacteroides thetaiotaomicron, выделяют фермент сиалидазу (нейраминидазу), который и высвобождает компонент сиаловой кислоты из муцина и, таким образом, обеспечивает важный источник питательных веществ для окружающего микробного сообщества [232]. Логично, что бактерии микробиома могут противодействовать патогенам, усваивая питательные вещества, например сиаловую кислоту, более эффективно. В эксперименте было установлено, что размножение C. difficile в кишечнике мышей коррелировало с концентрацией свободной сиаловой кислоты. При этом у лабораторных животных со здоровым разнообразным микробиомом отмечались более низкие уровни свободной сиаловой кислоты, что объясняется тем, что эта метаболическая ниша уже эффективно занята локальным микробным сообществом. Интересно то, что обработанные антибиотиками мыши имели более высокие уровни свободной сиаловой кислоты в кишечнике, что и способствовало избыточному росту C. difficile [233]. Вместе это доказывает, что бактерии здорового микробиома более эффективно, чем C. difficile, усваивают сиаловую кислоту, что и приводит к ограничению распространения C. difficile при попадании возбудителя в ЖКТ человека.

И наконец, было доказано, что C. difficile конкурирует за биохимические метаболиты нормального микробиома, а именно за сукцинат. В частности, B. thetaiotaomicron продуцирует значительное количество сукцината в качестве побочного продукта процесса обмена углеводов, являясь так называемым первичным ферментером. Среди бактерий выделяют также и вторичные ферментеры, в том числе C. difficile, которые конкурируют между собой за потребление сукцината. Напомним, что сукцинат является важным компонентом цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса), то есть центральной части общего пути катаболизма и ключевого этапа дыхания всех клеток, использующих кислород. В разнообразном, дифференцированном микробиоме концентрация сукцината, как правило, низкая; это, вероятно, связано с потреблением сукцината многими вторичными ферментерами микробного сообщества. Однако введение антибиотиков повышало концентрацию сукцината, вероятно, из-за антибиотик-ассоциированного повреждения этих комменсальных вторичных ферментеров. В итоге повышенное количество сукцината позволяет патогену, а именно C. difficile, увеличивать свою зону влияния в кишечнике [234, 235].

Таким образом, вместе эти описанные механизмы прямой конкурентной борьбы бактерий за питательные вещества в микробиоме кишечника и составляют один из наиболее изученных механизмов устойчивости человека к возбудителям инфекций.

Бактериоцины представляют собой микробные пептиды, которые активны против других конкурирующих бактерий и против которых сам продуцент имеет специфический механизм иммунитета. Недавний анализ метагеномных образцов из Проекта микробиома человека показал, что кластеры генов синтеза малых молекул, включая многие классы бактериоцинов, широко распространены в генетическом материале микробиома человека [236]. Это говорит о том, что эти антимикробные пептиды могут иметь значимое влияние на состав и поддержание стабильности микробного сообщества человека. Считается, что выделение бактериоцинов дает преимущество их продуцентам в плане колонизации уже занятых пространств в теле человека путем антагонизма и вытеснения родственных видов. Бактериоцины, продуцируемые грамотрицательными бактериями, объединяются под названием «микроцины», несмотря на то, что представляют собой различные классы пептидов. Микроцины обычно имеют узкий спектр активности, преимущественно против других грамотрицательных бактерий [237, 239]. Например, штамм бактерии E. coli Nissle 1917 продуцирует два микроцина, и оба участвуют в ограничении чрезмерного роста других бактерий семейства Enterobacteriaceae [240, 241].

Секреторные системы VI типа были обнаружены только у грамотрицательных бактерий и чаще всего опосредуют взаимодействия между отдельными грамотрицательными видами, находящимися в непосредственной близости. Эти системы выполняют контактный транспорт белков из донорской бактериальной клетки в клетку-реципиент [242]. Эффекторный белок часто является антимикробным токсином и используется в качестве контактного механизма бактериального антагонизма [243]. Целый ряд кишечных патогенов имеет секреторные системы VI типа, например Salmonella enterica, Citrobacter rodentium, Aeromonas hydrophila, и энтероагрегативная E. coli [244-248]. Комплексный математический анализ геномов представителей кишечного микробиома из отряда Bacteroidales показал, что более половины видов в его составе имеют гены секреторных систем VI типа [249]. Таким образом, эти системы весьма распространены и могут играть важную роль в локальной конкуренции между видами бактерий микро-биома, способствуя экологическому гомеостазу.

КОСВЕННЫЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ К КОЛОНИЗАЦИИ

Косвенные механизмы устойчивости к колонизации опосредованы регуляторными факторами хозяина, активирующими микробиом-ассоциированную защиту от экзогенных возбудителей [224].

Бактерии микробиома способны стимулировать иммунные рецепторы хозяина, что приводит к продукции в организме человека антимикробных пептидов. Антимикробные пептиды производятся в кишечнике клетками Панета и эпителиальными клетками [250]. Данные пептиды нацелены на структуры именно бактериальной клеточной стенки, включая мембрану и слой пептидогликана. Существует важная композиционная разница между бактериальными и эукариотическими клеточными мембранами, что антимикробные пептиды как раз и используют для избирательной борьбы с бактериями [251, 252]. Наиболее изученным примером антимикробного пептида является RegIIIγ, который уничтожает грамотрицательные бактерии путем связывания с пептидогликаном клеточной стенки и образования пор, нарушающих функцию клетки [158, 253]. Этот антимикробный пептид эффективно ингибирует рост кишечных патогенов, таких как ванкомицинрезистентный энтерококк и L. monocytogenes [159, 254]. Бактериальные лиганды, такие как ЛПС или флагеллин, могут воздействовать на специфические иммунные рецепторы кишечника, что запускает антибактериальный ответ, увеличивая экспрессию RegIIIγ.

Хотя RegIIIγ и является наиболее изученным примером антимикробных пептидов, он далеко не единственный из идентифицированных молекул. Дефензины представляют собой класс небольших пептидов, которые также повреждают клеточные мембраны бактерий. α-Дефензины экспрессируются исключительно клетками Панета в тонком кишечнике и являются одними из наиболее активных антимикробных пептидов в кишечнике человека [255]. Предполагается, что экспрессия α-дефензинов независима от микробных сигналов [256]. Ангиогенин-4 является другим антимикробным пептидом, исключительно экспрессируемым клетками Панета. Ангиогенин, принадлежащий к семейству рибонуклеаз, отличается антимикробным спектром в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Было обнаружено, что колонизация бактерией Bacteroides thetaiotaomicron усиливает продуцирование ангиогенина-4 клетками Панета [257].

Известно, что слизистый слой покрывает и защищает кишечный эпителий, поддерживая пространственное разделение между колониями бактерий и кишечным барьером хозяина [196]. Толщина слизистого слоя зависит в том числе и от плотности и состава кишечного микробиома. Микробиом обеспечивает базальную стимуляцию иммунным рецепторам, в функции которых находится поддержание активности как эпителиальных, так и иммунных клеток кишечника. Эти клетки человека моментально реагируют на повреждение эпителия патогенами путем продукции слизи, защиты эпителия и рекрутирования иммунных клеток в очаг воспаления [157, 197, 201, 258].

В дополнение к взаимодействию с иммунной системой хозяина микробиом взаимодействует с метаболитами хозяев, такими как желчные кислоты, превращая их в токсичные вещества, которые, например, ингибируют рост C. difficile и ряд других патогенов [202, 203].

МЕХАНИЗМЫ СЕЛЕКЦИИ ВЫСОКОУСТОЙЧИВЫХ ПАТОГЕНОВ В СОСТАВЕ МИКРОБИОМА

Устойчивые к антибиотикам бактерии сегодня являются основной угрозой мировой медицины. Тем более интересно, что гены устойчивости к антибиотикам распространены не только среди возбудителей инфекций, но и среди человеческих комменсальных бактерий микробиома. Одно из первых исследований показало, что значительная часть анаэробного сообщества в микробиоме здоровых людей устойчива к одному или нескольким антибиотикам, причем доля таких бактерий значительно увеличивается после лечения антибиотиками [259]. В более позднем метагеномном исследовании микробиома кишечника у здоровых субъектов было установлено, что на мультирезистентные виды бактерий приходится вплоть до 20% общей плотности микробиома [260]. Хорошо известно, что принимаемые антибиотики значительно способствуют накоплению генов антибиотикорезистентности. Удивительно, но гены антибиотикорезистентности были идентифицированы в микробиоме мумии из XI в., в замороженном осадке 30 000-летнего возраста, а также в пещере в Нью-Мехико, которая была изолирована в течение миллионов лет, так что ни один из этих образцов не мог ощутить влияния современных лекарств [174, 261, 262]. Более того, как последовательности ДНК, так и структурная организация оперонов генов, идентифицированных в этих древних бактериях, оказались очень похожими на те, которые переносятся в настоящее время устойчивыми микробами. Итак, резистом - это совокупность всех генов устойчивости к антибиотикам в пределах микробиома. Определяется резистом уже в раннем детстве, например у младенцев через 2 мес после рождения [263]. Более того, резистом расширяется с течением времени, поскольку количество генов антибиотикорезистентности в микробиоме положительно коррелирует с возрастом человека [264]. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что устойчивость к антибиотикам изначально присутствует в сообществах бактерий человека. Тем не менее экзогенное воздействие антибиотиков в результате медицинской практики или содержания их в продуктах способно повысить уровни устойчивости и распространенность устойчивых бактерий.

Таким образом, среди механизмов развития антибиотикорезистентности в контексте микробиома человека выделяют:

Интересно, что все три механизма горизонтального переноса генов применяются бактериями на фоне лечения антибиотиками: конъюгация, трансдукция и трансформация [265-267]. Таким образом, поскольку кишечник человека плотно заселен огромным разнообразием микробов, антибактериальная терапия может способствовать диффузии резистентных генов в пределах микробиома, что следует учитывать при назначении антибиотиков.

Для начала вспомним, что еще Луи Пастер и И.И. Мечников дали одно из первых определений пробиотикам как «живым микроорганизмам, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу для здоровья хозяина». С тех пор многочисленные публикации расширили полезные аспекты потребления пробиотиков при заболеваниях, состояниях, а также изменениях настроения и поведения человека [268-272]. В спектре наиболее употребляемых пробиотиков содержатся в основном лактобациллы, бифидобактерии, лактококки и стрептококки. Дрожжевые грибки, бациллы и некоторые непатогенные штаммы E. coli используются реже. За последние 20 лет научные исследования пробиотиков значительно увеличились в количестве. По состоянию на 2020 г. по ключевому слову «пробиотик» были проиндексированы более 27 тыс. международных англоязычных научных публикаций в сравнении с 760 аналогичными публикациями до 2001 г. В коммерческих масштабах рынок продажи пробиотиков составляет более 40 млрд долларов США, и, согласно прогнозам Global Market Insights, к 2023 г. он достигнет более 64 млрд долларов США [273]. Длительное время сохранялась путаница в отношении точных условий, необходимых для того, чтобы отдельный штамм микроорганизма или микробное сообщество могли претендовать на пробиотический эффект и считаться пробиотиком. Наконец, совместным консенсусом ООН и Всемирной организации здравоохранения были приняты принципы обозначения пробиотика, которые предусматривают необходимость наличия как исследовательских данных в отношении микробного штамма, так и по меньшей мере одного выполненного исследования его эффективности на человеке (хозяине) [274]. Однако долгое нечеткое использование этого термина привело к некоторой путанице, и в результате область пробиотиков получила компонент незаслуженного скептицизма со стороны профессионального мирового научного сообщества.

Итак, пробиотики - это препараты живых микроорганизмов, которые направлены на пользу здоровью организма человека при использовании в адекватных количествах [275]. В качестве пробиотиков чаще всего применяются бактерии родов Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp., Bacillus spp., отдельные штаммы E. coli и грибков рода Saccharomyces [276]. Пребиотики - вещества, которые приводят к специфическим изменениям в составе и/или функции микробиоты, направленным на пользу здоровью человека. К наиболее важным группам пребиотиков относят вещества из групп фруктоолигосахаридов и галактоолигосахаридов [277]. Комбинированные препараты, имеющие в своем составе как пробиотики (микроорганизмы), так и пребиотики (вещества), называются синбиотики [278]. Недавно появившийся термин «постбиотики» определяет биологически активные вещества, вырабатываемые в процессе ферментации (включая микробные клетки, клеточные компоненты и метаболиты), которые направлены на поддержание здоровья и благополучия человека [279]. В различных вариантах научной литературы этот общий термин может включать такие понятия, как метабиотики, или парапробиотики. Группы таких полезных метабиотических веществ включают: бактериоцины, КЦЖК, другие органические кислоты, белки, пептиды, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, полисахариды, пептидогликаны, другие молекулы клеточных поверхностей, плазмалогены, витамины, антиоксиданты, кофакторы, различные мессенджерные (сигнальные) молекулы [280, 281]. Среди широко известных полезных функций пробиотиков приводятся: поддержание устойчивости к колонизации, улучшение метаболизма и утилизации конечных продуктов распада энергетических субстратов, продукция веществ, необходимых для человека, регуляция местного иммунитета, улучшение метаболизма лекарств и ксенобиотиков, регуляция метаболизма желчных кислот.

При анализе принадлежности коммерческого препарата к пробиотикам стоит убедиться в том, что соблюдены следующие условия:

В составе коммерчески доступных препаратов пробиотический штамм, как правило, идентифицируется на уровне рода, вида и имеет буквенное, цифровое или буквенно-цифровое обозначение, например Lactobacillus casei DN-114 001 или Lactobacillus rhamnosus GG [282]. Важно отметить, что эффект может резко различаться в зависимости даже от конкретного штамма одного и того же вида микроорганизма. Пробиотики можно разделить на монокомпонентные и поликомпонентные.

Пробиотики могут быть зарегистрированы в качестве биологически активных добавок к пище или в качестве ЛС. Наиболее распространенной формой доставки пробиотиков в толстую кишку служат капсулы и микрокапсулы, изготовленные из синтетических, полусинтетических или натуральных полимеров, что обеспечивает сохранность микроорганизмов в кислотной среде верхних отделов ЖКТ [283-285].

Важным методом оценки эффективности того или иного пробиотика может быть вопрос: насколько долго данные введенные бактерии задерживаются в кишечнике или в другом биотопе человека? К примеру, были опубликованы данные о том, что отдельные лактобактерии при приеме внутрь сохраняются в кишечнике не более недели [279, 286, 287]. К тому же в связи с формированием стойких биопленок в очагах наружений микробиома зачастую пробиотики не способны оказать значимого влияния, а также внедриться в уже существующее микробное сообщество.

ДОКАЗАТЕЛЬНАЯ ОСНОВА ПРИМЕНЕНИЯ ПРОБИОТИКОВ

Собранная на сегодняшний день научная литература продемонстрировала, что пробиотики обладают широким спектром действия, хотя результаты исследований весьма противоречивы. За последние годы было опубликовано впечатляющее количество научных работ, которые оценивали эффективность пробиотиков при физиологических и патологических состояниях человека, таких как метаболические заболевания, состояния, ассоциированные с применением антибиотиков, Clostridioides difficile -ассоциированная инфекция, синдром раздраженного кишечника (СРК), запор, ВЗК - болезнь Крона и язвенный колит, химиотерапевтически-ассоциированная диарея, инфекции ДП, вентилятор-ассоциированная пневмония (у пациентов на искусственной вентиляции легких), неалкогольная жировая болезнь печени, печеночная энцефалопатия, депрессивные расстройства, БВ, инфекции мочевыводящих путей, панкреатит, инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, летальность при травмах, некротизирующий энтероколит у недоношенных детей [288].

Поскольку в настоящее время уровень доказательности результатов метаанализов признан наиболее высоким (рис. 24), объединяющим данные множества научных исследований, то в настоящем разделе будет представлен взгляд на эффективность пробиотиков именно с позиции метаанализов. Для четкого понимания иерарахии научной доказательности в клинических исследованиях приведем современые термины, необходимые для понимания практикующим врачам.

Систематический обзор - краткое изложение всей доказательной научно-медицинской литературы для критической оценки и объединения исследований, целью которых является ответ на один и тот же научный вопрос.

Метаанализ - систематический обзор, в котором используются количественные методы для обобщения результатов исследований по четко определенной тематике. Систематизированные данные по актуальным метаанализам в области клинического применения пробиотиков представлены в табл. 5 на основании работ с уровнем доказательности I и II (наличие рандомизированных клинических исследований), с адаптацией формата из Rondanelli M. и соавт. [288].

Примечание: ЛОР (от larynx, otos, rhinos) - имеющий отношение к зеву/гортани, уху и носу.

При детальном анализе качества включенных в метаанализы исследований в большинстве публикаций возникали серьезные претензии к дизайну, с чем можно ознакомиться в работах M. Rondanelli и соавт. [288, 291]. Таким образом, по результатам объединения данных метаанализов следует отметить, что некоторые эффекты пробиотиков весьма хорошо обоснованы научно, и поэтому их использование отдельно или в сочетании с другими видами терапии можно считать доказанным, например при антибиотик-ассоциированной диарее (у взрослых и детей), при Clostridioides difficile -ассоциированной инфекции. Однако при других клинических состояниях все еще крайне необходимы дальнейшие исследования, поскольку пока что имеющихся данных недостаточно, чтобы продемонстрировать доказательность высокого уровня в отношении имеющихся конвенциональных пробиотиков. При этом нельзя не отметить то, что у отдельных категорий пациентов (например, у пожилых пациентов с запорами) использование пробиотиков является наиболее удобным и безопасным выбором в амбулаторной практике.

ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКОВ И ПРЕБИОТИКОВ НА ВАГИНАЛЬНЫЙ МИКРОБИОМ

Как обсуждалось в предыдущих разделах, вагинальный микробиом, харкатеризуемый насыщенностью лактобациллами, считается признаком здоровья и встречается у большинства здоровых женщин. В ситуациях с нарушением данного условия в микробиоте влагалища, как правило, повышается риск различных заболеваний, в том числе инфекций половых путей. В таких случаях для поддержания здорового состава микробиоты влагалища могут рекомендоваться пробиотики, чаще всего представленные бактериями рода Lactobacillus spp. Имеются данные, что примерно в 82% случаев у женщин с дисбалансом микробиоты влагалища пищевые биодобавки с живыми L. fermentum и L. rhamnosus могут помочь в восстановлении вагинальной микробиоты. Важным преимуществом использования пробиотиков в таких ситуациях является то, что они могут безопасно использоваться в течение длительного времени, в том числе после проведенной антибактериальной терапии [292, 293]. Считается, что пробиотики помогают в поддержании здоровой среды влагалищного микробиома путем изменения его состава, способствуя размножению комменсальных микробных сообществ и путем предотвращения вагинальных инфекций, особенно в постменопаузе. Пробиотики также могут уменьшить интенсивность симптомов различных вагинальных инфекций (таких как выделения из влагалища, неприятный запах и т.д)., в комплексном лечении БВ [294]. Биодоступность и механизм действия пробиотиков перорального введения, используемых для воздействия на влагалищный микробиом, остается темой для дискуссий. Отдельные авторы обосновывают механизм действия пробиотических штаммов на влагалищный микробиом при таком пути введения за счет анатомической близости с прямой кишкой (механизм восхождения микробиоты) и ряда опосредованных иммунных механизмов [295]. В целом, хотя интравагинальные и пероральные пробиотики уже показали некоторый клинический потенциал, в том числе во время менопаузы, дополнительные клинические исследования являются обязательными для определения истинной эффективности микробиом-ассоциированной терапии в модуляции и восстановлении гомеостаза влагалища [296, 297].

Работы над созданием пробиотических препаратов, направленных на применение в гинекологии, ведутся достаточно давно. Среди первых предложенных пробиотических штаммов был Lactobacillus rhamnosus GR-1 (выделенный у здоровой женщины), затем был штамм Lactobacillus reuteri RC-14. Среди эффектов предложенных штаммов отмечалось подавление роста потенциальных уропатогенов, таких как E. coli, G. vaginalis и Candida albicans, в том числе вытеснение их из микробиома влагалища и уретры [298, 299]. Препарат, содержащий комбинацию данных штаммов, уже длительное время применяется в практике. Также на основе понимания положительной роли L. crispatus во влагалищном микробиоме были предложены пробиотические штаммы данного вида, в том числе L. crispatus CTV-05, который показал эффективность в ряде исследований в отношении БВ [300], рецидивирующих инфекций мочевыводящих путей [301], Среди других лактобацилл, изучавшихся в роли вагинальных пробиотиков, были штаммы Lactobacillus gasseri - L. gasseri ATCC 9857 и KS 120.1 [302], а также штаммы L. brevis и L. acidophilus [303].

Как уже было отмечено, пребиотики обладают способностью модулировать микробный состав и обладают локальными иммунными эффектами [304]. За последнее время было опубликовано несколько исследований in vitro и in vivo относительно концепции применения пребиотиков во влагалище. В частности, группы олигосахаридов, а именно фруктоолигосахариды и глюкоолигосахариды, показали стимуляцию роста L. jensenii, L. crispatus и L. vaginalis [305]. Более того, в синбиотических комплексах, когда пребиотики сочетаются с пробиотиками, они могут еще более поддержать их рост и улучшить продукцию бактериоцина [306].

Активно обсуждается роль приема пробиотиков в период беременности с целью предотвращения гестационных осложнений, влияния на протекание родов, здоровье новорожденного и метаболизм матери и ребенка [307]. Однако пока, по данным метаанализа, выполненного A. Jarde и соавт., нет убедительных доказательств того, что прием пробиотиков либо пребиотиков во время беременности увеличивает или уменьшает риск преждевременных родов или других неблагоприятных исходов беременности у детей и матерей [308].

Исследования пробиотиков велись на протяжении десятков лет, им было посвящено множество научных работ, но до сих пор четких доказательств влияния на здоровье нет. По сути, недостаточный объем фактических данных крупномасштабных исследований привел к невозможности выполнить строгие правила доказательности, чтобы юридически ассоциировать здоровье человека с пробиотиками [309].

Сегодня можно сделать вывод, что прямое личное потребление биологических добавок и даже лекарств на основе микроорганизмов вырастет вместе с повышением уровня самообслуживания в обществе, дальнейшим внедрением интегративной медицины, социальных кампаний и весьма агрессивной рекламы пробиотиков в СМИ [310, 311]. К примеру, объем рынка коммерческих препаратов штаммов лактобацилл был оценен в 1,2 млрд долларов США в 2017 г., в то время как по прогнозам роста объем рынка штаммов Bifidobacterium spp. увеличится почти на 6% к 2024 г., а объем рынка штаммов Bacillus spp. может превысить 180 млн долларов США к 2024 г. [312]. В завершение темы отметим, что хочется надеяться, что изложенные здесь фундаментальные принципы, которые основаны на строгом научном определении пробиотиков и тщательной оценке их фактической клинической эффективности, обеспечат большую ясность и будут способствовать более глубокому пониманию этой динамичной области медицины.

Антибиотики необходимы для лечения и профилактики широкого спектра потенциально опасных для жизни бактериальных инфекций. Бесчисленные жизни спасены с помощью антибиотиков по всему миру. Однако в последние годы исследования в области микробиома показали, что чрезмерное, длительное, неадекватное применение антибиотиков, а также их биохимические характеристики могут стать причиной опасных последствий для здоровья человека. Среди таких последствий: нарастание антибиотикорезистентности бактерий, появление доминирующих в микробиоме колонизаторов, кратковременная или стойкая потеря видового разнообразия микробиома, а также повышение восприимчивости к инфекционным заболеваниям [313-317]. В свете обозначенных проблем, подробное изучение фармакокинетических и фармакодинамических аспектов антибиотикотерапии позволит выполнять грамотную коррекцию препаратов и режимов дозирования в соответствии с данными о микробиоме человека.

Сегодня, несмотря на большой интерес к исследованиям в области микробиома, связь между микробиомом и современной фармакологией остается крайне недооцененной. Открытие того факта, что бактерии кишечника человека участвуют в метаболизме лекарств, произошло практически столетие тому назад [318]. Немецкий ученый, нобелевский лауреат Герхард Домагк исследовал антибактериальный эффект красителей на гемолитических стрептококках и обнаружил, что в экспериментах на клетках пронтозил не показывает антибактериальной активности, которая уже была отмечена в экспериментах с лабораторными мышами [319]. Этот сульфаниламидный антимикробный препарат, пронтозил (так называемый красный стрептоцид), был одним из первых коммерчески доступных антибактериальных средств. И действительно, он продемонстрировал, к удивлению ученых, весьма слабую антибактериальную активность in vitro [320]. Это оказалось связано с тем, что именно кишечные микроорганизмы активировали пронтозил посредством его азогруппы (химическая связь, состоящая из N = N), что давало клинический эффект лекарства у пациентов, но не позволяло препарату активно угнетать бактерии in vitro, будучи, по сути, пролекарством. Данная биотрансформация характерна для широкого спектра химических соединений, в том числе азокрасителей (самый многочисленный класс синтетических красителей), которые обычно используются в качестве добавок в пищевых продуктах [321], а также для сульфасалазина, который до сих пор широко используется в лечении язвенного колита и ревматоидного артрита (РА) [322, 323]. Вскоре после этих открытий стало ясно, что биотрансформация лекарств микробиотой кишечника является гораздо более частым явлением, чем ранее считалось, однако данные идеи изучались только частично из-за сложностей в анализе микробных сообществ кишечника с использованием традиционных культуральных методов микробиологии. Даже на сегодняшний день интересы фармакогенетики и фармакогеномики по-прежнему сосредоточены в основном на вариациях генома человека, а не на генах огромного количества микроорганизмов в составе микробиома. В связи с этим авторы подчеркивают роль микробиома кишечника в будущем фармакологии и персонифицированной медицины.

ВЛИЯНИЕ МИКРОБИОМА НА ФАРМАКОКИНЕТИКУ И ФАРМАКОДИНАМИКУ ЛЕКАРСТВ

Кишечные микроорганизмы способны воздействовать на ЛС с помощью различных механизмов, которые можно классифицировать как прямые и косвенные (рис. 25). Прямые механизмы включают биотрансформацию лекарств или их метаболитов в вещества с измененной активностью. Косвенные механизмы включают более сложные взаимодействия микроорганизмов с лекарствами и организмом хозяина, что приводит к изменению метаболических и транспортных путей человека для конкретного препарата.

Для понимания микробиом-ассоциированного метаболизма следует вспомнить, что биодоступность лекарств при приеме внутрь зависит от степени печеночного метаболизма («эффект первичного прохождения») еще до достижения системного кровотока [325]. Однако часто пероральные препараты впервые сталкиваются с микробиотой кишечника еще до взаимодействия с тканями человека, что является еще одним механизмом «эффекта первичного прохождения» (рис. 26). Фактически к настоящему времени уже имеются научные данные [324], полученные как in vitro, так и in vivo, подтверждающие микробный метаболизм более 50 лекарств (таблица приложения В). Данное число, вероятно, недооценивается, учитывая отсутствие на сегодняшний день каких-либо систематических научных работ о микробном метаболизме ЛС в кишечнике и обширное генетическое разнообразие микробиома человека [326]. Кроме того, информация о скорости всасывания лекарственных веществ, вероятно, будет косвенным показателем уровня микробного метаболизма, притом что плотность кишечной микробиоты резко возрастает, начиная с дистальных отделов тонкого кишечника в направлении к толстой кишке. Что немаловажно, лекарства и их метаболиты могут также повторно сталкиваться с микробио-той кишечника в процессе билиарной экскреции, в результате которой происходит реабсорбция и энтеропеченочная циркуляция биологически активных веществ.

Снижение концентрации лекарства

Несмотря на широкое химическое разнообразие в структуре лекарств, исследователями были выделены два главных метода микробного химического метаболизма: восстановление и гидролиз. Эти две реакции и отражают энергетические запросы микробиоты кишечника (рис. 27). Условия в кишечнике в основном анаэробные, поэтому микроорганизмы не могут полагаться на кислород в качестве акцептора электронов для процесса дыхания [327]. Взамен восстановительные процессы метаболизма ксенобиотиков способствуют анаэробному дыханию, расширяя спектр акцепторов электронов, доступных для дыхания. С другой стороны, процессы гидролиза непосредственно обеспечивают субстраты для роста микроорганизмов [328].

Общность этих двух типов химических реакций (восстановление и гидролиз) также может означать, что существуют основные виды бактерий или семейства генов, которые воздействуют на огромный диапазон малых молекул [329]. В таком случае выявление основных бактерий, метаболизирующих лекарства, могло бы служить основой для прогнозирования того, как новые препараты будут модифицироваться кишечной микробиотой. Такие знания смогут произвести революцию в фармакологии новых ЛС и персонифицированной медицине, подобно революции, которая последовала за открытием того факта, что ферменты системы цитохром P450 продуцируются в кишечнике и печени, где они метаболизируют множество ксенобиотиков [330, 331]. Химические функциональные группы новых лекарственных веществ в случае их участия в микробном метаболизме можно было бы устранять еще на этапе проектирования химического синтеза или же использовать для контроля доставки лекарств в нужный участок организма.

Ранее мы уже вспоминали об азосоединениях и эффекте микробных трансформаций пролекарств в примере с пронтозилом. Терапевтический эффект ряда пролекарств, содержащих азосвязи, требует биологической активации с помощью микроорганизмов кишечника. После перорального введения препарата азосвязь восстанавливается ферментами бактерий - азоредуктазами, которые высвобождают биологически активное соединение. Азоредуктазы широко распространены у множества таксономических типов бактерий, обнаруженных в кишечнике человека [333]. Кишечные микроорганизмы также могут инактивировать метаболиты азосоединений, например биологически активный компонент препарата сульфасалазин, 5-аминосалицило-вая кислота, инактивируется микробным ферментом ариламин-N-ацетилтрансферазой. Интересно то, что активность этих ферментов может варьироваться более чем в 10 раз в организмах различных людей [334], что и приводит к различиям в эффективности ЛС.

Еще одно важное семейство ферментов, влияющих на биологическую активность и токсичность широкого спектра ЛС, - β-глюкуронидазы, которые также ассоциированы с бактериями человеческого микробиома [335]. Опубликованные данные актуальных исследований выявили роль β-глюкуронидаз в определении степени токсичности противовоспалительных и онкологических препаратов. В описанных ситуациях бактерии кишечника вступают во взаимодействие с метаболитами лекарств, полученных в результате биохимического процесса детоксикации ксенобиотиков. Ферменты печени УДФ глюкуронилтрансферазы переносят гликозильные группы по УДФ-молекулам на другие гидрофобные молекулы. При этом образуются относительно индифферентные глюкурониды - хорошо растворимые в воде соединения, которые могут выделяться в кишечник с желчью. Эта биологическая трансформация снижает или приостанавливает биологическую активность лекарственных веществ и увеличивает их растворимость, тем самым позволяя удалять их с мочой или желчью (билиарная экскреция) [336]. Процесс билиарной экскреции предоставляет еще одну возможность для микробного метаболизма ЛС с помощью бактериальных β-глюкуронидаз, которые могут повторно активировать лекарства в кишечнике, вызывая повышение его токсичности. Примером этого явления служит метаболизм иринотекана - широко используемого пролекарства для лечения колоректального рака [337-339].

¹ Уридиндифосфат.

Подобный микробный механизм также отвечает за повышение побочных эффектов нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), включая диклофенак, индометацин и кетопрофен [340]. Известно, что до 70% пациентов, постоянно принимающих НПВС, имеют повреждение слизистой оболочки дистального отдела тонкого кишечника, язвы и, в редких случаях, даже перфорации. В печени НПВС подвергаются процессам детоксикации с помощью глюкуронилтрансфераз человека перед экскрецией с желчью в просвет кишечника. А далее микробные β-глюкуронидазы в кишечнике способствуют повторному метаболизму вещества и абсорбции его в энтероциты, при этом последующие метаболиты НПВС нарушают целостность слизистой оболочки и провоцируют воспалительные процессы в тонком кишечнике [339, 341].

Описанные примеры демонстрируют, как микробный метаболизм может усиливать побочные эффекты фармакотерапии. Показано, что β-глюкуронидазы широко распространены у многих видов в составе микробиома кишечника, включая представителей типов Proteobacteria, Firmicutes и Actinobacteria [342-346].

Микробиом человека может также влиять на биологическую доступность лекарств. Классическим примером этого явления служит сердечный гликозид дигоксин, применяемый в терапии нарушений ритма и сердечной недостаточности. Дозирование дигоксина является весьма сложным врачебным навыком из-за его чрезвычайно узкого терапевтического диапазона, что делает даже незначительные колебания в его концентрации клинически значимыми для пациента. Кроме того, известно, что примерно у 10% пациентов определяются высокие уровни неактивного метаболита дигокси-на, дигидродигоксина, что является результатом бактериального метаболизма (восстановления) ненасыщенного лактонового кольца препарата [347, 348]. В ряде случаев более 50% вводимого препарата инактивируется микробиотой кишечника, что существенно снижает системные концентрации и эффективность [349]. Целая серия исследовательских работ была посвящена выявлению микробного вида, ответственного за столь значимое снижение эффективности дигоксина, и в результате было показано, что, действительно, отдельные штаммы Eggerthella lenta (штамм DSM2243) имеют так называемый CGR-оперон («cardiac glycoside reductase»), индуцируемый сердечными гликозидами, что запускает биохимический каскад, ведущий к инактивации данных ЛС [329, 350-352]. Таким образом, современные исследования на стыке фармакологии и молекулярной биологии являются основой так называемой микробиом-ассоциированной медицины, то есть улучшения результатов лечения с помощью вмешательств в микробиом человека и прогнозирования эффективности новых ЛС в процессе метаболического и/или генетического скрининга микробиома [324].

Следует отметить также, что метформин, антидиабетический препарат с не полностью выясненным механизмом действия, изменяет состав микробиома кишечника. При комбинации данных метаболомики и полногеномного секвенирования крови и кишечного содержимого пациентов был сделан вывод о том, что метформин снижает плотность Bacteroides fragilis, уменьшая активность его фермента, гидролазы желчных солей и способствуя увеличению концентраций гликоурсодезоксихолевой кислоты в кишечнике. Далее на экспериментальной модели с лабораторными мышами было подтверждено, что животные на высококалорийной жирной диете, плотно колонизированные В. fragilis, были более предрасположены к тяжелым формам нарушения толерантности глюкозы, а метаболические лечебные эффекты метформина у них отсутствовали. Более того, гликоурсодезоксихолевая кислота была определена как антогонист кишечных фарнезоидных рецепторов (FXR - farnesoid X receptors), что повышало эффективность лечения метаболического синдрома в эксперименте. Таким образом, было установлено, что метформин воздействует на ось: кишечные фарнезоидные рецепторы (FXR) - B. fragilis - гликоурсодезоксихолевая кислота, и тем самым противодействует метаболическим нарушениям, включая гипергликемию. А гликоурсодезоксихолевая кислота подавляет функцию кишечных фарнезоидных рецепторов Х (FXR, farnesoid X receptor), что способствует развитию метаболических заболеваний, в частности ожирения [353, 354].

Исследования по изучению нецелевого влияния лекарств на микробиом продолжаются весьма активно. Недавно в журнале Nature были опубликованы результаты идентификации неантибиотических ЛС, которые, как оказалось, ингибируют рост определенных штаммов бактерий кишечной микробиоты [355].

Итак, химические реакции, опосредованные ферментами кишечного микробиома, связаны с фенотипом реакции пациента на лечение (рис. 28).

Таким образом, употребление лекарств, предназначенных для воздействия на клетки человека, а не микроорганизмов, таких как антидиабетические средства, ингибиторы протонной помпы, НПВС, атипичные антипсихотические средства, блокаторы кальциевых каналов, связано с изменениями кишечного микробиома пациентов [355].

Не менее важным направлением сегодня является развитие микробиом-ассоциированной диагностики, то есть разработки диагностических биомаркеров, которые необходимы для выбора оптимального лекарства и/или режима дозирования для конкретного пациента на основе данных о характеристиках его микробиома. По сути, это наиболее важный компонент системы персонифицированной медицины. На сегодняшний день уже можно использовать в клинической практике знания о микробных метаболитах, видах бактерий или семействах генов, связанных с многими ЛС. Далее мы приведем примеры наиболее изученных микробиом-ассоциированных врачебных решений (парацетамол, дигоксин, такролимус).

Наконец, косвенный диагностический подход может заключаться в определении маркеров клинически значимых представителей микробиома (белков, метаболитов или нуклеиновых кислот) в крови или моче, что позволило бы быстро стратифицировать пациентов в соответствии с их микробиом-ассоциированным лекарственным метаболизмом.

Наиболее актуальные данные относительно методов типирования или манипулирования микробиомом в фармакотерапии представлены в табл. 6.

ТИПИРОВАНИЕ МИКРОБИОМНОГО МЕТАБОЛИЗМА ЛЕКАРСТВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Современная медицина уже приблизилась к этапу фенотипирования пациентов для оценки риска и модулирования побочных эффектов лекарств на основе микробиома (рис. 29). Целью типирования является классификация пациентов на быстрых метаболизаторов и медленных метаболизаторов. Для пациентов, получающих препараты метаболизирующиеся глюкуронизацией, такие как иринотекан и НПВС, наличие быстрого метаболизма может быть основой повышения риска лекарственной токсичности.

Основные этапы микробиомного типирования пациентов на группы быстрых метаболизаторов и медленных метаболизаторов включают: сбор и подготовку популяционных данных для классификации, выбор ключевых характеристик классификации, которые определяют ее эффективность. Данные для классификации включают как результаты метагеномики, метаболомики, метатранскриптомики, так и результаты исследования генома индивидуума (рис. 29). Классификацию можно использовать в клинике для разделения пациентов на «метаботипы» быстрых метаболизаторов и медленных метаболизаторов на основе неинвазивного исследования кишечного содержимого отдельно или в дополнение к образцам, содержащим генетический материал хозяина. Пациенты типа быстрых метаболизаторов могут в дальнейшем получать модифицирующие вмешательства для модуляции микробиома и повышения эффективности и безопасности лечения (от пробиотиков и микробных коктейлей до фекальной трансплантации микробиоты).

ВЛИЯНИЕ АНТИБИОТИКОВ НА СОСТАВ И ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБИОМА

Результаты крупных исследований выявили весьма специфические изменения, которые происходят со временем в составе микробиома кишечника во время и после лечения антибиотиками. Было обнаружено, что отдельные антибиотики, достигшие кишечника, оказывают абсолютно разное влияние на плотность и разнообразие микробиома.

Например, сравнивались эффекты двух антибиотиков, используемых перорально для лечения КДАИ: метронидазола и ванкомицина [314]. Было показано, что ванкомицин весьма избирательно направлен на грамположительные бактерии, тогда как метронидазол преимущественно повреждает анаэробные бактерии. При этом общая бактериальная плотность микробиоты на фоне терапии метронидазолом не уменьшалась. Однако на фоне терапии ванкомицином отмечалось снижение плотности микробиоты, которое возвращалось к исходному уровню только через 2 нед после прекращения введения препарата. Важно отметить, что именно на фоне терапии ванкомицином, который практически не абсорбируется в кишечнике и поэтому накапливается в зоне нахождения микробиоты в значительных концентрациях, происходила потеря разнообразия микробиома и увеличение количества бактериальных таксонов, которые ранее присутствовали в низкой плотности, то есть были угнетены как потенциальные патогены [314, 317].

Аналогичные долгосрочные нарушения состава и разнообразия микробиома наблюдались при использовании ампициллина и клин-дамицина [361, 362]. Кроме того, именно в период антибиотик-ассоциированного сниженного разнообразия микробиома в эксперименте отмечалась повышенная восприимчивость к колонизации кишечника различными нозокомиальными патогенами [314, 317, 361, 362]. Итак, ко времени, когда антибиотик достигает кишечника, его эффект зависит от спектра антибактериальной активности в составе микробиома, а также степени абсорбции в кишечнике. Логично, что чем больше антибиотика абсорбируется, тем меньше остается его пристеночная концентрация в кишечнике. Например, и метронидазол, и клиндамицин нацелены на анаэробные бактерии и легко абсорбируются в тонком кишечнике, однако клиндамицин дополнительно повреждает грамположительные бактерии. Поэтому более широкий спектр активности клиндамицина может объяснить и более выраженный эффект клиндамицина в плане снижения микробного разнообразия кишечника. Кроме того, как ванкомицин, так и ампициллин отличаются более широким спектром активности и более низкой кишечной абсорбцией в сравнении с метронидазолом [363]; это может также объяснить, почему два первых антибиотика вызывают более глубокие и долговременные повреждения микробиоты.

Спектр активности антибиотика имеет большое значение и может быть фактором инициирования избыточного роста и доминирования патогенных бактерий в кишечнике. Например, лечение метронидазолом приводит к трехкратному увеличению риска развития доминирования энтерококков в кишечнике, тогда как внутривенное введение ванкомицина и бета-лактамных антибиотиков не увеличивает этот риск [21]. Метронидазол отличается более узким спектром и действует в отношении облигатных анаэробов, поэтому толерантные к кислороду энтерококки остаются интактны. А ванкомицин и бета-лактамные антибиотики характеризуются более широким спектром антимикробной активности и в том числе могут влиять на антибиотикочувствительные виды энтерококков, тем самым ограничивая их рост в составе микробиома. Таким образом, спектр активности антибиотика и абсорбция кишечника одновременно определяют характер и степень влияния препарата на состав микробиоты и восприимчивость человека к колонизации патогенами. Эти важные практические аспекты следует рассматривать при выборе антибиотика и прогнозирования его воздействия на кишечный микробиом.

Одно из исследований на когорте добровольцев показало, что даже при антибиотикотерапии в течение 1 нед и менее наблюдались выраженная потеря разнообразия микробиома, а также повышение активности генов антибиотикоустойчивости [364], и наблюдаемый эффект сохранялся от 6 мес до двух лет после окончания терапии. Одним из потенциальных объяснений продолжительности постантибиотического эффекта на микробиом in vivo является взаимозависимость различных бактериальных таксонов. Таким образом, вся архитектоника микробиома может страдать на фоне избирательного повреждения лишь некоторых бактериальных видов.

Фармакологические свойства отдельных антибиотиков в контексте эффекта на микробиом представлены в табл. 7.

Примечание. Среди путей введения указаны не только методы, которые широко используются в клинической практике; с целью упрощения ряд бактерий исключен из спектра активности антибиотиков; умеренная кишечная абсорбция равняется 40-60%, высокая - 61-100%; краткосрочные изменения (до 2 нед), долгосрочные (2 нед и более).

*Основной механизм клиренса.

АССОЦИАЦИЯ МИКРОБИОМА И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Недавно опубликованные результаты экспериментальных исследований показали неожиданные результаты: характеристики кишечного микробиома имеют влияние на химиотерапию онкологических и гематологических заболеваний, а также на терапию моноклональными антителами. К примеру, было показано, что антибактериальная терапия нарушает реакцию на цитостатический препарат алкилирующего типа оксалиплатин путем уменьшения активности ФНОα, ответа CD8⁺ Т-клеток, а также противоопухолевой активности миелоидных клеток. Более того, авторы выявили конкретные роды бактерий микробиома, которые ассоциировались с положительными (роды Alistipes и Ruminococcus) или отрицательными (род Lactobacillus) изменениями в противоопухолевом ответе [365].

Также было показано, что алкилирующий агент циклофосфамид вызывает повреждение и увеличивает проницаемость кишечного барьера в эксперименте, что способствует транслокации определенных бактерий в мезенхимальные лимфатические узлы и селезенку (в частности, бактерии L. johnsonii и E. hirae). В этом исследовании интерферон γ, продуцируемый Т-клетками как реакция на эти бактерии, определялся именно у животных, получавших циклофосфамид, но не в контрольной группе. В эксперименте при трансфузии данных специфических Т-клеток (Т-хелперы-17) сохранялась противоопухолевая реакция иммунной системы даже у мышей с нарушениями микробиома (группа, получавшая ванкомицин + циклофосфамид + трансфузия Т-хелперов-17). При отсутствии данных Т-хелперов (после введения ванкомицина) лабораторные животные не могли остановить рост опухоли, что указывает на то, что бактериально-ассоциированные Т-хелперы, полученные в результате лечения циклофосфамидом, в значительной степени отвечают за противоопухолевый эффект данного препарата [366].

В другом исследовании изучалась эффективность лечения меланомы анти-PD-1/PD-L1 препаратами (пембролизумаб, ниволумаб, атезолизумаб), в частности в эксперименте изучалось достижение контрольной точки блокады анти-PDL1 в результате трансфера отдельных представителей микробиома, а именно рода Bifidobacterium. По результатам авторов, комменсальные бактерии улучшали активность дендритных клеток, повышали экспрессию цитокинов, а также генов, связанных с активацией Т-клеток, таким образом индуцируя более сильный противоопухолевый CD8⁺ Т-клеточный ответ [367].

Еще одним инновационным препаратом для лечения метастатической меланомы является ипилимумаб, новый иммуномодулятор, блокирующий рецепторы CTLA4 на лимфоцитах и восстанавливающий противоопухолевый иммунный ответ. Аналогичным образом эффективность блокады рецепторов CTLA4 была резко снижена в эксперименте у стерильных мышей или мышей после антибиотик-ассоциированного повреждения микробиома. Далее в экспериментальных моделях (меланома, саркома, рак толстой кишки) было подтверждено, что терапия блокатором CTLA4-рецепторов индуцировала Т-клеточное повреждение кишечной стенки и изменения в микробиоме, а именно увеличение относительной плотности B. thataiotaomicron, B. uniformis и представителей семейства Burkholderiaceae. При этом при искусственном заселении кишечника стерильных мышей именно этими бактериями происходила нормализация ответа на терапию блокатором CTLA4-рецепторов, с запуском Т-клеточной продукции интерферона-γ. Интересно, что при заселении кишечника другими бактериями (E. coli, L. plantarum, B. diastonis, E. hirae) нормализации ответа на противоопухолевую терапию не происходило. Примечательно, что идентичные бактериально-ассоциированные Т-клетки выделяются у пациентов, а мыши в модели меланомы, заселенные биоматериалом стула человека, обогащенного вышеобозначенными защитными видами, показывали частую регрессию опухоли в эксперименте. И наконец, развитие колита как частого осложнения терапии ипилимумабом отмечалось значительно реже на фоне заселения кишечника бактероидами, а именно B. fragilis и B. crepacia [368]. Соответственно этим данным, недавно опубликованный анализ когорты пациентов с меланомой, получающих лечение ипилимумабом, показал, что относительная плотность бактерий типа Bacteroidetes было значительно выше у пациентов, у которых не развилось осложнение терапии в виде колита [369]. Более того, у пациентов без осложнений терапии отмечалась интенсификация транспорта полиаминов и биосинтеза витаминов группы B, что успешно использовалось исследователями в качестве высокочувствительных и специфичных молекулярных маркеров для прогнозирования риска развития у пациентов колита.

В целом результаты обозначенных исследовательских работ показывают, что микробиом человека влияет на эффективность противоопухолевых средств, а также на риск побочных реакций. Однако влияет ли на результат противоопухолевой терапии использование антибиотиков у онкологических/гематологических пациентов, остается по-прежнему важным и невыясненным вопросом.

Перемещение чужеродных антигенов сквозь кишечный барьер является нормальным физиологическим процессом, который в разумных пределах необходим для того, чтобы иммунная система ЖКТ повышала и поддерживала свою эффективность на основе постоянного взаимодействия с микробными веществами [370]. Значимость этого явления (транслокации) была давно показана на лабораторных моделях безмикробных животных, у которых нарушено созревание иммунной системы, что приводит к повышенной восприимчивости к инфекциям [371]. Однако транслокация через кишечник большого объема патоген-ассоциированных молекулярных структур (рус. ПАМС, или англ. PAMP, от Pathogen-associated molecular pattern) или даже жизнеспособных организмов может оказывать негативное влияние на хозяина в определенных ситуациях.

Известно, что при нарушениях состава микробиома кишечника страдает ряд биохимических процессов, в том числе процессы декарбоксилирования и дезаминирования, направленные на разрушение аминокислот. Избыток аминокислот в кишечнике служит питательной средой для многих бактерий, а их ферменты, в свою очередь, расщепляют этот избыток аминокислот, превращая их в амины, фенолы, индол, скатол, сероводород и другие токсичные для организма человека вещества. Фенол и крезол образуются из аминокислоты тирозина, индол и скатол - из триптофана. Было отмечено, что снижение потока крови, например при стрессе, из портального кровообращения печени в системный кровоток также сопровождается транслокацией эндотоксина, индола, скатола, фенола и крезола [372, 373].

Эндотоксин (например, ЛПС бактериального происхождения) связывается с толл-подобными рецепторами (англ. TLR - Toll-like receptors) TLR4 клеточных поверхностей и таким образом активирует иммунный ответ организма хозяина [374]. Дальнейший каскад процессов происходит с участием растворимого sCD14 и ЛПС-связывающего белка, а также провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL6, TNF) [373, 375]. Соотношение ЛПС-связывающего белка и sCD14 также весьма важно; более высокое соотношение ЛПС-связывающего белка/sCD14 способствует усилению воспаления [376]. Однако при нарастании объемов транслокации эндотоксина в кровь может отмечаться лихорадка как системная воспалительная реакция. Более того, при повышенной транслокации эндотоксина описаны возможности развития локальных воспалительных процессов с образованием атеросклеротических бляшек и нарушением работы эндокринных органов [373, 375, 377].

Интересно, что в случае с транслокацией из кишечника веществ грибкового происхождения, например β-глюканов (БГ), натуральных полисахаридов клеточной стенки дрожжевых грибов, распознавание происходит БГ с помощью рецептора дектина комплемента С3 и акцептора класса A, что и позволяет несколько снизить уровень свободно циркулирующего БГ. Интересно, что бактериальный ЛПС нейтрализуется быстрее, чем грибковый БГ, так как ЛПС быстро деацилируется ацилоксиацилгидролазой и дефосфорилируется щелочной фосфатазой, тогда как БГ просто связывается с поверхностными рецепторами [378- 380]. Ферментативная нейтрализация БГ отсутствует, возможно, из-за слабого БГ-индуцированного иммунного ответа. Действительно, ЛПС более иммуногенен, чем БГ, что и было продемонстрировано в эксперименте, где всего 1 нг/мл ЛПС стимулировал макрофаги к выделению в 100 раз больше цитокинов, чем при стимуляции БГ в концентрации даже 1000 нг/мл [381-383].

Известно, что при заболеваниях печени гораздо больший объем эндотоксина и других метаболитов попадают в кровоток. Это сопровождается развитием ряда патологических процессов, приводящих к проявлению СД, атеросклероза, нарушению почечной функции и повреждению нейронов головного мозга [372, 384]. Интересны работы о роли уровней ЛПС в крови в зависимости от возраста; более того, высказываются гипотезы о связи низких уровней эндотоксина в крови и вероятности превышения продолжительности жизни [372, 385, 386].

Показаны факты транслокации эндотоксина из кишечника в кровоток в экспериментальных моделях нарушений автономной регуляции кишечника, в частности при повреждении кишечных ветвей блуждающего нерва (n. vagus, Х пара черепных нервов). В целом важная роль функции блуждающего нерва по отношению к уровню эндотоксинемии обсуждалась в ряде работ [372, 387, 388]. Отметим, что еще до появления глубокого понимания биохимических процессов в кишечнике концепция проникновения бактериальных метаболитов в патогенезе различных состояний обсуждалась академиком А.М. Уголевым (рис. 30).

Отметим с позиции врача-клинициста, что действительно повышенный уровень бактериальных эндотоксинов в крови ассоциирован с так называемым синдромом «дырявого» кишечника, или синдромом «протекающего кишечника» (англ. leaky gut syndrome - LGS). Это состояние пока что не является официально признанным в медицине заболеванием, однако очень активно обсуждается в связи с различными заболеваниями и состояниями человека. Данное патологическое состояние, при котором усиливается проницаемость кишечного эпителия для крупных молекул, токсинов, бактерий, грибов, нерасщепленных молекул белка, которые в большем, чем обычно, объеме выходят в кровоток, что способствует избыточной активации иммунной системы. Однако из-за технически сложного анализа оценка уровня эндотоксина в крови в качестве биомаркера пока не используется в клинической медицине, а остается прерогативой специализированных научных лабораторий. Эти повышенные уровни эндотоксина поднимают клинико-ориентированный вопрос о том, является ли эндотоксин параллельным продуктом или же клинически значимым активным медиатором процесса транслокации через кишечник.

Не менее клинически важным является проникновение продуктов грибковых клеток через кишечник в кровоток. Системные данные о кандидемии, происходящей из кишечника, все еще ограниченны; однако известно, что грибы рода Candida spp. широко колонизируют ЖКТ человека как компонент резидентного микобиома. Недавно опубликована работа о том, что действительно пациенты с системной инфекцией кровотока, вызванной грибами рода Candida spp., перед этим событием имели резкие изменения в кишечном микобиоме с нарастанием доминирования в кишечнике патогенных видов Candida spp.; это доминирование проявлялось сложной динамической картиной с включением нескольких видов и подвидов, а также дальнейшей транслокацией дрожжевых грибов в кровоток [389].

Также известно, что кишечник содержит высокий уровень ПАМС, происходящих из компонентов клеточных мембран грибов Candida spp., включая (1→3)-β-D-глюкан (БГ). Маннан и галактоманнан являются компонентами грибковой клеточной стенки, которые также циркулируют у пациентов с инвазивными кандидозами, однако они не всегда обнаруживаются при системной инфекции, вызванной C. albicans [390, 391]. БГ представляет собой полисахарид, состоящий из мономеров D-глюкозы, которые связаны гликозидными связями; его универсальная атомная единица массы может варьироваться от ~6 до >600 кДа. БГ выделяется из клеточной стенки грибков во время роста или гибели грибков, что похоже на высвобождение ЛПС [392].

Кишечный барьер является основной линией защиты от ПАМС. Этот барьер состоит из: муцина - гидрофобного гелеобразного покрытия из высокомолекулярных гликопротеинов, которое предотвращает прикрепление бактерий к кишечному эпителию; антимикробных пептидов, которые ограничивают концентрацию микроорганизмов в просвете кишки; щелочной фосфатазы - фермента, секретируемого в тонком кишечнике, который поддерживает функцию энтероцитов и разрушает ЛПС; кишечных ПАМС-связывающих белков (например, ЛПС-связывающий белок) и двух путей «протекания» - околоклеточного пространства кишечной клетки и чресклеточного пути. В физиологических условиях транслокация с помощью чресклеточного пути позволяет перемещать молекулы с более высокими значениями атомной массы по сравнению с околоклеточным транспортом [393]. Более того, также возможно, что транслокация ПАМС из кишечника в кровоток происходит не путем чресили околоклеточных пространств, а через большие промежутки из-за значительного повреждения плотных контактов клеток и/или гибели самих энтероцитов (рис. 31).

Кишечный транспорт происходит через энтероциты двумя основными путями: околоклеточный путь, пассивное движение малых молекул (<600 Да) через соединения между соседними энтероцитами; и чресклеточный путь, который включает как активное, так и пассивное движение более крупных молекул через энтероцит посредством специфических транспортных каналов и эндоцитоза. Измененная барьерная функция определяется увеличением транслокации ПАМС. Апоптоз или гибель энтероцитов также могут способствовать повышению транслокации в кишечнике.

Фармакокинетические исследования с радиоактивно меченными БГ и ЛПС показали, что накопление этих молекул в печени и почках составляет приблизительно 60-85% и 9-15% соответственно [394, 395]. Поскольку считается, что молекулы менее 67 кДа (размер альбумина) могут свободно проходить через барьер клубочковой фильтрации в почках, то обнаружение ЛПС или БГ в моче при отсутствии инфекции мочевыводящих путей позволяет предположить, что эти молекулы фильтруются из крови. И действительно, мочевой БГ может быть обнаружен у пациентов с повышенным БГ в крови [396]. В противоположность этому циркулирующий бактериальный эндотоксин гораздо меньше выводится с мочой из-за стойкого связывания ЛПС с TLR4 и sCD14 на подоцитах и клетках проксимальных канальцев почки [397, 398]. Таким образом, принято считать, что бактериальный эндотоксин в моче возникает в основном из-за инфекции мочевыводящих путей [382, 399].

Итак, провоспалительные эффекты посредством механизмов повышения проницаемости кишечника могут иметь связь с широким спектром последствий для здоровья. Действительно, многие исследования показывают, как фунции микробиома и кишечного барьера связаны с рядом патологий. Возможно, стоит переосмыслить и роль диет, например средиземноморской диеты, китайских традиций чаепития, качества продуктов в торговых сетях, ритуалов приема пищи [372]. Более того, концепция «Leaky Gut, Leaky Brain», которая связывает целый комплекс клинических и субклинических нарушений работы ЦНС с функцией кишечника, возможно, откроет в будущем новый взгляд на качественную и продолжительную высокоинтеллектуальную жизнь человека [400].

C. DIFFICILE -АССОЦИИРОВАННАЯ ИНФЕКЦИЯ В КОНТЕКСТЕ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОМА

Clostridiodes difficile - грамположительный, анаэробный, цитотоксинпродуцирующий, спорообразующий возбудитель, который в настоящее время конкурирует за лидерство среди инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Хотя КДАИ не является новой проблемой и присутствует в больничной среде уже более 30 лет, сейчас она достигла масштабов эпидемии [401, 402] и обозначается Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC) как «непосредственная инфекционная угроза в связи с высоким потенциалом устойчивости к антибиотикам» [403]. На сегодняшний день КДАИ является основной причиной инфекционной диареи у госпитализированных пациентов. При экономическом анализе было выявлено, что диагностика и лечение КДАИ в США обходятся в сумму более 3,2 млрд долларов в год. Более того, распространенность тяжелых клинических форм и форм инфекции, резистентных к терапии, в последние годы увеличилась из-за диссеминации новых резистентных штаммов C. difficile [403-406].

Важно понимать то, что распространенность КДАИ значительно выше у пациентов с ослабленным иммунитетом, в особенности у реципиентов гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), в сравнении с общей популяцией [407-411]. Устойчивый рост заболеваемости КДАИ продолжается в течение последних десятилетий, активно выявляются устойчивые к антибиотикам штаммы, в том числе и у иммунокомпрометированных пациентов [412, 413]. Пациенты оказываются восприимчивыми к развитию КДАИ, вследствие антибиотик-ассоциированного повреждения кишечного микробиома, что приводит к потере устойчивости к колонизации и инфекции. Особенно опасной становится ситуация в условиях стационаров, где C. difficile легко распространяется на предметах внешней среды. Несмотря на то, что C. difficile - облигатный анаэроб, возбудитель способен сохраняться в окружающей среде и легко передаваться другим людям посредством формирования эндоспор. Споры C. difficile попадают в организм человека, после чего они могут прорастать в метаболически активные, вегетативные формы и размножаться в толстом кишечнике, где условия окружающей среды наиболее благоприятны для анаэробов. Вместе с этим бактерии начинают продуцировать токсины А и В, которые проникают в клетки кишечного эпителия и приводят к нарушению функции тесных межклеточных контактов эпителиального барьера кишечной стенки [414, 415]. Данные повреждения и обеспечивают дальнейший патогенез КДАИ, которая может проявляться в пределах от легкой диареи до псевдомембранозного колита с развитием потенциально опасного для жизни пациента токсического мегаколона [408, 416].

У госпитализированных пациентов особенно опасна рецидивирующая КДАИ, которая встречается на фоне применения антибиотиков в стационаре. Доказано, что в популяции здоровых людей устойчивость против C. difficile опосредована защитными механизмами кишечной микробиоты, и более того, ТФМ с лечебной целью внедрена в клиниках уже несколько лет [417, 418].

При более глубоком поиске защитных представителей микробиома исследователями было показано, что комменсальная бактерия Clostridium scindens может ингибировать рост Clostridiodes difficile за счет образования вторичных желчных кислот, а именно дезоксихолевой кислоты и литохолевой кислоты [204]. В эксперименте авторы продемонстрировали, что искусственное заселение кишечника одним видом C. scindens или же C. scindens в составе микробного коктейля защищало лабораторных животных от колонизации C. difficile и развития КДАИ на фоне введения антибиотиков. Более того, при проверке данной теории в человеческой популяции было обнаружено, что наличие C. scindens в составе микробиома снижало риск колонизации C. difficile у пациентов при аллогенной трансплантации ГСК (ТГСК) на фоне антибиотиков [204].

Важным практическим моментом клинических исследований микробиома стало выделение группой исследователей из США микробного сообщества, а именно трех таксономических групп бактерий микробиома, которые защищают от колонизации и инфекции C. difficile (рис. 32). При исследовании состава микробиома когорты из 234 пациентов, перенесших аллогенную трансплантацию ГСК, среди которых у 53 (22,6%) пациентов развилась КДАИ, было выявлено, что наличие трех различных бактериальных таксонов независимо коррелировало с защитой от C. difficile: тип Bacteroidetes, семейство Lachnospiraceae и семейство Ruminococcaceae [220]. Практическое значение этих научных результатов впечатляет! Подчеркнем, что сохранность в микробиоме данных таксономических групп к моменту приживления трансплантата снижала риск развития КДАИ на 60%, причем независимо от множества других включенных в анализ клинических и лабораторных факторов.

МИКРОБИОМ И ПНЕВМОНИИ

Несмотря на существенные различия в популяциях пациентов с пневмониями в исследованиях микробиома, сходные результаты описаны целым рядом независимых авторов. Показано, что у пациента с пневмонией отмечается более высокая плотность бактерий в нижних ДП в сочетании с меньшим разнообразием и равномерностью распределения видов. Как правило, резко доминирует один таксон с наибольшей частотой доминирования: Streptococcus spp., Haemophilus spp. или Moraxella spp. Особенно опасно и часто сочетается с общей потерей разнообразия респираторного микробиома доминирование Streptococcus pneumoniae, Burkholderia spp., Bacillales spp. и, в меньшей степени, Pseudomonadales spp. [419, 420]. Более того, на фоне пневмонии доминирование одного таксона, как правило, сохраняется при динамическом отслеживании микробиома легких и в особенности увеличивается при интубации пациента [421].

Что касается процедуры интубации и перевода пациента на искусственную вентиляцию легких, то этот фактор прослеживается как явление, ассоциированное со стойкими нарушениями микробиома легких во многих публикациях. Это отражает практическое применение гипотезы о том, что респираторный микробим основан на равновесии механизмов микроаспирации бактерий из верхних отделов ДП и механизмов их мукоцилиарного клиренса [420-423]. Таким образом, по данным многих исследователей, интубация является даже более опасным для микробиома фактором, чем антииотикотерапия, хотя разграничить эффекты этих двух процессов у пациента на искусственной вентиляции легких по поводу пневмонии очень сложно [71, 420, 424].

При дальнейших попытках выявить микробиомные предикторы пневмоний у взрослых было показано, что микробиом ротоглотки с преобладанием Lactobacillales (преимущественно Streptococcus spp.) ассоциировался с риском пневмоний [425].

Весьма интересная научная дискуссия развернулась при оценке влияния микробиома кишечника на инфекции нижних ДП, в частности пневмонии, вызванные Streptococcus pneumoniae, а именно: в опубликованной работе Schuijt и соавт. показали роль кишечного микробиома в качестве защитного медиатора при пневмококковой пневмонии, в частности микробиота кишечника усиливала функцию первичных альвеолярных макрофагов в эксперименте. К тому же при исследовании авторами оси «кишечник-легкие» была показана ассоциация состава кишечного микробиома и целой группы исходов (диссеминация бактерий, воспалительная реакция, повреждение органов и летальный исход). Интересно, что в модели пневмококковой инфекции у мышей исследователи выполняли ТФМ, что приводило к снижению количества бактериальных клеток в легочной ткани и нормализации уровней фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-10 через 6 ч после начала инфекции [426]. В ответ на публикацию данной работы Robert P. Dickson из университета Мичигана и Michael J. Cox из Имперского колледжа Лондона усомнились, что данный эффект опосредован именно за счет микробиома кишечника, а не респираторного микробиома, который также повреждается на фоне антибиотикотерапии [427]. В полемике представители Schuijt и соавт. заявили, что, к сожалению, оценка избирательной роли респираторного микробиома нижних ДП осложнена тем, что во множестве случаев образцы представлены контаминацией бронхоскопа при прохождении верхних ДП [428, 429]. При этом коктейль из антибиотиков (ванкомицин, метронидазол, неомицин и ампициллин), использованный в эксперименте Schuijt и соавт., отличается малой абсорбцией в кишечнике, а также не характеризуется известными эффектами на бактерии ДП [429]. Эта научная дискуссия еще раз демонстрирует то, что исследования микробиома различных локализаций выполняются во взаимодействии ученых и находятся сегодня на пике своей активности.

Одна из последних опубликованных работ в области микробиома открыла ассоциацию определенных защитных микроорганизмов и вирусных инфекций нижних ДП. В исследуемой когорте 360 пациентов с иммуносупрессией после аллогенной трансплантации ГСК авторами изучались изменения кишечного микробиома, предшествующие вирусным инфекциям, а точнее, определялись уровни ингибиторных КЦЖК и характеристики микробного сообщества в сочетании с клиническими данными пациентов [430]. Среди подтвержденных вирусных инфекций нижних ДП в работе B.W. Haak и соавт. были зарегистрированы аденовирусы, РС-вирусы (респираторно-синцитиальные вирусы), коронавирусы, метапневмовирусы, риновирусы, вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа. После выполнения мультивариантного анализа было установлено, что у пациентов с более высоким содержанием в микробиоме бактерий, продуцирующих бутират (ингибиторная КЦЖК), риск развития вирусной инфекции нижних ДП в течение 180 дней после трансплантации ГСК снижался в пять раз независимо от других клинических и лабораторных факторов (рис. 33).

ПЕРЕОЦЕНКА ВЗГЛЯДОВ НА ПАТОГЕНЕЗ БОТУЛИЗМА

В Восточно-Европейском регионе ботулизм остается актуальным заболеванием, однако факт, что основная масса случаев заболевания носит алиментарный характер, то есть связана с пищей, содержащей токсин, привел к тому, что патогенез заболевания рассматривается врачами только в контексте экзогенного инфицирования. Последние данные в области изучения микробиома человека позволили пролить свет на механизм развития ботулизма у пациентов, не имеющих пищевых факторов в эпидемиологическом анамнезе.

Ботулизм - нейропаралитическое заболевание, которое возникает в результате воздействия нейротоксина, продуцируемого Clostridium botulinum. Ботулизм может быть вызван употреблением в пищу токсина в составе продуктов (пищевой ботулизм), колонизацией ран C. botulinum (раневой ботулизм) или колонизацией C. botulinum ЖКТ младенцев (ботулизм детского возраста - до 12 мес) и взрослых (ботулиническая кишечная токсемия взрослых). Из них ботулиническая кишечная токсемия взрослых - редчайшая форма ботулизма, и считается, что ее развитие связано с анатомическими или функциональными аномалиями ЖКТ, а также с применением противомикробных средств, которые могут привести к изменениям нормальной кишечной микробиоты [431, 432].

Один из лабораторно подтвержденных случаев ботулинической кишечной токсемии у взрослых описан L. Parameswaran и соавт., где авторы с помощью Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC) продемонстрировали эндогенное происхождение токсинпродуцирующего штамма C. botulinum у пациента с клиникой ботулизма, развившейся после 2 мес госпитализации для выполнения аллогенной трансплантации ГСК [433]. Авторы подчеркивают, что пациент в течение нескольких недель до начала заболевания употреблял исключительно специальную низкомикробную больничную пищу для реципиентов ГСК, которая была тщательно приготовлена по строгим стандартам, и других случаев ботулизма в клинике выявлено не было. Раневой ботулизм также исключался в связи с отсутствием повреждений кожных покровов у пациента. Более того, молекулярно-генетическими методами в составе кишечного микробиома у пациента были обнаружены ботулинический нейротоксин типа A, жизнеспособные бактерии C. botulinum типа A, а также выделены гены продукции токсина типа А через 3 нед от появления первых симптомов заболевания.

Чтобы получить представление о составе кишечного микробиома у этого пациента, команда клиницистов и исследователей собрали и проанализировали образец стула непосредственно перед лечебным введением ботулинического антитоксина. Были выделены, упорядочены и классифицированы таксономические последовательности генов 16S рРНК. Важно то, что в составе микробного сообщества доминировали Enterococcus faecium и Streptococcus salivarius, что указывает на существенные нарушения микробиома кишечника [21]. И наиболее важно то, что сам этиологический микроб C. botulinum был также идентифицирован в биологическом образце пациента. Относительная плотность клостридий в микробиоме была невелика, однако стоит вспомнить, что ботулотоксин чрезвычайно активен, а наличие очень небольшого количества микроорганизмов может привести к заболеванию.

Ботулиническая кишечная токсемия взрослых до сих пор недостаточно изучена с точки зрения микромеханизмов развития. Наиболее вероятно, что наподобие ботулизма детского возраста продукция токсина происходит эндогенно в ЖКТ у человека, колонизированного C. botulinum. Известно, что споры C. botulinum регулярно попадают в организм людей из внешней среды и далее выводятся естественным путем, а сформированный кишечник взрослого человека в норме не поддерживает прорастание спор и продукцию токсина [432]. В ранее опубликованных другими авторами случаях ботулинической кишечной токсемии у взрослых все пациенты имели анатомические или функциональные аномалии кишечника из-за оперативных вмешательств, воспалительных заболеваний или антибиотик-ассоциированное повреждение микробиома кишечника [434-437]. В рамках этих знаний становится ясен потенциальный механизм развития эндогенного ботулизма у пациентов с алло-ТГСК, у которых вследствие химиотерапии и антибиотиков нарушения микробиома являются весьма частыми [438]. В международных публикациях описан еще один подтвержденный случай ботулинической кишечной токсемии у реципиента ГСК, а именно у трехлетней пациентки после аутологичной ТГСК, которая прошла процедуру селективной деконтаминации кишечника антибиотиками [439]. Противомикробные препараты широкого спектра действия и процедура деконтаминации кишечника действительно могут приводить к значительным нарушениям микробного сообщества кишечника: например, было обнаружено, что мыши, которые подвергались деконтаминации кишечника комбинацией эритромицина и канамицина, были более восприимчивы к колонизации C. botulinum [440].

Итак, по результатам обсуждения доказанных случаев эндогенного ботулизма стоит запомнить, что в практических ситуациях, когда у пациентов с затяжными симптомами нарушения функции ЖКТ на фоне длительных госпитализаций, включая госпитализации по поводу химиотерапии и трансплантации, имеется реальная возможность развития ботулизма, не связанного с пищей. Поскольку ранняя диагностика имеет определяющее значение в плане исхода для пациента, то при возникновении острых двусторонних нарушений функции черепно-мозговых нервов с прогрессией к мышечному параличу и дыхательным нарушениям врачу стоит рассмотреть возможность диагностики ботулизма с помощью молекулярно-генетических методов.

ИНФЕКЦИИ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ И МИКРОБИОМ

Вместе с внедрением передовых молекулярных методов исследования мочи догма о том, что моча стерильна, была опровергнута. Мочеполовой тракт не является стерильной средой. Вместе со знанием о том, что существует комплексная и четкая структура микробиома у многих локализаций в организме человека, первые результаты исследований позволили пролить свет на патогенез ряда урологических заболеваний, которые, как ранее полагали, не имели микробной этиологии [441].

Посев мочи на питательные среды по-прежнему считается «золотым стандартом» диагностики инфекций в урологии [442, 443], поскольку он позволяет идентифицировать быстрорастущие, аэробные уропатогены с хорошей диагностической точностью. Однако, как и прежде, обычные культуральные методы микробиологии не позволяют выявлять атипичные медленнорастущие, анаэробные и требовательные в плане питательных сред патогены, такие как, например, Corynebacterium и Ureaplasma. В то же время достижения в технологии секвенирования микробной 16S рРНК позволили обнаружить наличие богатой и разнообразной микробиоты мочевого пузыря у многих здоровых людей [444]. Важно то, что эти новые технические подходы были использованы для исследования состава микробиома мочевыделительной системы у пациентов с такими диагнозами, как интерстициальный цистит, ургентное недержание мочи и хронический простатит/синдром хронической тазовой боли [445-447]. Например, у пациентов при интерстициальном цистите было отмечено существенно более высокая плотность бактерий рода Lactobacillus (>90%) в сравнении с контрольной группой, что авторы ассоциировали с тяжестью симптомов [445, 448, 449].

В ряде исследований когорта женщин с ургентным недержанием мочи характеризовалась более высоким содержанием Gardnerella, а также более частым выявлением Lactobacillus gasseri, в то время как Lactobacillus crispatus обнаруживался чаще в контрольной группе [446, 450, 451]. Сегодня необходимы дополнительные исследования, чтобы получить более глубокие знания о том, как локальный микробиом влияет на течение обозначенных урологических заболеваний.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ФЕКАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ В ЛЕЧЕНИИ C. DIFFICILE- АССОЦИИРОВАННОЙ ИНФЕКЦИИ

Известно, что уже несколько десятилетий назад отдельные врачи-новаторы выполняли фекальные трансплантации от здоровых доноров, часто близких родственников, пациентам с рецидивирующими КДАИ и псевдомембранозным колитом [452]. Эффективность этого метода уже тогда впечатляла, при этом успех достигался примерно в 90% случаев [453, 454].

Стоит вспомнить, что рецидивы КДАИ могут быть очень тяжелыми, опасными явлениями, и ТФМ сегодня является наиболее эффективным методом их лечения [417, 418]. В то же время следует помнить об инфекционных рисках, которые несет в себе процедура. Один из способов ограничить риски ТФМ - тщательный скрининг доноров на предмет инфекционных и воспалительных заболеваний, которые могут быть связаны с кишечным микробиомом (табл. 8). При этом донорский биоматериал может длительно замораживаться без потери эффективности [455], а введение трансплантата может выполняться посредством назогастральной или назоэнтеральной трубки, гастродуоденоскопии, колоноскопии, гибкой сигмоидоскопии или клизм [456].

Выполнение ТФМ активно внедряется для лечения ВЗК, однако важно понимать то, что эффективность будет только тогда, когда микробиота реципиента носит провоспалительный характер, а донорская микробиота является строго противовоспалительной. Хотя многие виды бактерий микробиома уже идентифицированы, а их роль (воспалительная/противовоспалительная) определена, фекальные образцы от здоровых доноров могут быть очень сложны в плане состава видов, то есть содержать в себе неидентифицированные виды бактерий с неуточненной функцией. Таким образом, в настоящее время невозможно по анализу состава фекального трансплантата однозначно определить, будет ли эффект от трансплантации противовоспалительный или наоборот усилит воспаление в кишечнике у пациента [458].

Немаловажен риск передачи генов резистентности к антибиотикам вместе с трансплантатом. Широко обсуждалась ситуация в июне 2019 г., когда в США у двух взрослых пациентов с иммуносупрессией после ТФМ развились инвазивные инфекции, вызванные Escherichia coli -продуцентом β-лактамаз расширенного спектра, то есть бактериями, устойчивыми к антибиотикам, при этом один из пациентов погиб. Тогда управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) временно приостановило клинические испытания ТФМ для пересмотра аспектов безопасности [459]. Тогда же и были введены дополнительные меры скрининга при использовании ТФМ:

Другим важным практическим вопросом является создание более удобной формы доставки препарата с возможностью сохранения спор или самих защитных микроорганизмов в капсулах. Есть мнение, что в итоге, с дальнейшим развитием науки, ТФМ будет заменена введением комбинаций («коктейлей») полезных микробов.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ФЕКАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К КОЛОНИЗАЦИИ ПАТОГЕНАМИ

Полученный ранее вывод о том, что здоровый разнообразный кишечный микробиом устойчив к колонизации различными экзогенными патогенами, привел к выполнению исследований эффективности манипулирования микробными сообществами в качестве потенциальной терапии. Первоначальный подход заключался в передаче жизнеспособной микробиоты от здорового донора в ЖКТ реципиента, то есть выполнялась процедура ТФМ. Четкое доказательство преимуществ ТФМ в плане восстановления микробиоты реципиента было продемонстрировано известным рандомизированным клиническим исследованием, опубликованным в New England Journal of Medicine еще в 2013 г. [417]. Результат дуоденального введения подготовленного и очищенного раствора, полученного от здорового донора, был значительно более эффективным, чем традиционная антибактериальная терапия рецидивирующей КДАИ. Дополнительные экспериментальные исследования показали, что мыши после процедуры ТФМ успешно справлялись с колонизацией кишечника ванкомицинрезистентными энтерококками и Klebsiella pneumoniae [218, 459]. Более того, уже опубликованы данные об успешном опыте терапии инфекций, вызванных C. difficile и полирезистентной Klebsiella pneumoniae, с помощью ТФМ у пациентов после алло-ТГСК. В данное исследование были включены три пациента после алло-ТГСК, которым была выполнена ТФМ от родственного донора с целью терапии антибиотикорезистентного псевдомембранозного колита, ассоциированного с Clostridiodes difficile. Микробиота донора вводилась последовательно в двенадцатиперстную и слепую кишку, и в результате у всех пациентов после ТФМ отмечались появление микробиоты донора, эрадикация полирезистентной Klebsiella pneumoniae и Clostridioides difficile, а также купирование синдрома мальдигестии и мальабсорбции [460].

Однако, несмотря на свою доказанную эффективность, ТФМ по-прежнему остается комплексной и затратной процедурой, которая рутинно выполняется в редких центрах. Состав фекального трансплантата варьирует, является не полностью определенным и весьма сложным. Хотя в своем составе он и содержит защитные виды бактерий, однако в то же время он несет в себе некоторые риски, которые невозможно надежно обнаружить существующими технологиями. Эти риски зависят от состава микробиоты и генотипа реципиента и включают возможность передачи неидентифицированных патогенов и других микробов, ассоциированных с развитием многих расстройств, включая ожирение, метаболический синдром и аутоиммунные заболевания [458]. Следовательно, выделение и всестороннее описание конкретных защитных бактериальных видов, которые опосредуют устойчивость к колонизации и защищают от других заболеваний, помогут стандартизировать терапевтический эффект и уменьшить риск непредсказуемых результатов. Вместе это и является будущим микробиом-ассоциированной медицины.

ПАЦИЕНТЫ С ИММУНОСУПРЕССИЕЙ

Дифференцированный микробиом и его роль в защите от инфекционных заболеваний особенно важны у пациентов с ослабленным иммунитетом. Популяция пациентов с иммуносупрессией подвергается повышенному риску генерализации, то есть транслокации отдельных бактерий из ЖКТ в кровь с потенциальным формированием бактериальных отсевов [461-462].

Для понимания уровней иммуносупрессии при различных заболеваниях и состояниях принята к использованию классификация Американского общества инфекционных заболеваний [463]. В частности, к пациентам с наиболее глубокими приобретенными иммунодефицитами относятся:

Стоит отдельно отметить, что даже среди всей когорты пациентов с иммуносупрессией наибольшая глубина и длительность поражения иммунной системы, а также восприимчивость к инфекционным агентам отмечаются у пациентов на фоне химиотерапии опухолевых заболеваний кроветворной ткани (например, индукция ремиссии острых лейкозов), а также режимы кондиционирования (химиотерапии) при выполнении ТГСК (как периферических, так и костного мозга).

Современные показания к ТГСК включают следующие заболевания: острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, неходжкинские лимфомы, лимфома Ходжкина, миеломная болезнь [464].

В зависимости от источника получения клеток ТГСК подразделяют:

Забор ГСК может осуществляться из костного мозга, пуповинной или периферической крови. При заборе ГСК из костного мозга при ауто-ТГСК для его очистки от опухолевых клеток применяются химиотерапевтические, фотохимические, иммунологические методы, методы позитивной селекции. В последние годы чаще используют ГСК из периферической крови донора. ГСК из периферической крови донора получают методом лейкафереза с помощью клеточных фракционаторов после их мобилизации у пациентов. Мобилизация ГСК из периферической крови донора может выполняться с помощью различных режимов химиотерапевтических препаратов или колониестимулирующих факторов роста. Важным источником ГСК является пуповинная кровь, которая имеет ряд преимуществ: высокое содержание и пролиферативная активность ГСК и сниженная экспрессия HLA-антигенов в сравнении с клетками крови взрослого человека [465].

Перед проведением процедуры ТГСК пациенту назначают режим кондиционирования. Режим кондиционирования - это цитостатическая и лучевая терапия для эрадикации кроветворения реципиента и достижения максимальной иммуносупрессии, позволяющей добиться приживления вводимых ГСК. В настоящее время имеется ряд режимов кондиционирования различной степени интенсивности. Большинство авторов делят все режимы на две группы: миелоаблативные и немиелоаблативные. Основой такого разделения служат глубина иммуносупрессии и продолжительность цитопении. Считается, что при использовании миелоаблативных режимов практически у всех пациентов наступает необратимая панцитопения, естественное восстановление функции костного мозга маловероятно, что требует проведения ТГСК. Помимо уничтожения (абла-ции) костного мозга реципиента при миелоаблативных режимах достигается иммуносупрессивный эффект, который снижает вероятность отторжения донорских клеток. Немиелоаблативные режимы предполагают применение меньших доз химиотерапии и/или облучения, которых недостаточно для уничтожения костного мозга пациента. При их использовании снижаются продолжительность панцитопении и глубина иммуносупрессии, а также может наблюдаться положительный эффект «трансплантат против опухоли», что снижает риск рецидива опухоли. При применении немиелоаблативных режимов у пациента в ранние сроки после ТГСК может отмечаться состояние «смешанного химеризма», когда в костном мозге одновременно существуют как собственные клетки, так и клетки донора. Впоследствии при снижении доз иммуносупрессивных препаратов Т-клетки донора уничтожают остатки клеток костного мозга реципиента и индуцируют эффект «трансплантат против опухоли». Имеются данные о меньшей посттрасплантационной летальности при применении немиелоаблативных режимов у отдельных категорий пациентов, постепенно расширяются показания к проведению данного вида кондиционирования, особенно у пациентов из групп высокого риска. Отдельные авторы выделяют также режимы кондиционирования сниженной интенсивности, которые занимают промежуточное место между миелоаблативными и немиелоаблативными, вызывая панцитопению различной продолжительности с необходимостью проведения ТГСК, однако такая панцитопения все же может быть обратима [466].

Угнетение иммунной системы организма при химиотерапии онкогематологических заболеваний и кондиционировании при ТГСК приводит к нарушениям в целом комплексе системы защиты от инфекций. Среди них отметим нарушение функции фагоцитов, поражение кожных и слизистых барьеров, недостаток функции клеточного и гуморального звена иммунного ответа.

Повреждение слизистой оболочки внутренних органов при химиотерапии является наиболее ранним механизмом развития инфекционных осложнений. Цитотоксическая терапия оказывает прямое влияние на клетки с высоким митотическим индексом (эпителий полости рта и ЖКТ), что выражается клиническими проявлениями мукозита. Мукозит полости рта проявляется функциональными жалобами (боль при глотании) и морфологическими изменениями (отек, эритема, образование язв), мукозит ЖКТ сопровождается тошнотой, рвотой, диареей, болью в животе. При этом и происходит транслокация представителей микробиома ЖКТ в кровеносное русло. Режимы химиотерапии, содержащие мелфалан, этопозид, метотрексат, цитарабин и идарубицин, наиболее часто вызывают мукозит, который значительно осложняется при сочетании антрациклинов с тотальным облучением тела и циклофосфамидом в составе режима кондиционирования при ТГСК [467, 468]. Также одним из важных последствий мукозита является нарушение всасывания пероральных форм ЛС. Так, E.J. Johnson с соавт. установили снижение всасывания ципрофлоксацина у пациентов при мукозите и фебрильной нейтропении на фоне химиотерапии [469].

Интересно, что впервые связь между снижением уровня нейтрофилов в периферической крови и частотой развития инфекций в 1966 г. доказал доктор Gerald P. Bodey из Хьюстона, США [470]. При этом инфекции кровотока считаются основной клинической формой бактериальных инфекционных осложнений у взрослых пациентов при ТГСК [471, 472].

Клиницистам важно понимать, что инфекционная этиология лихорадки у пациентов с нейтропенией подтверждается микробиологически только в 30-50% случаев. Причинами данного явления являются резко сниженный имунный ответ (особенно отсутствие воспалительной реакции гранулоцитов), небольшое количество возбудителей в исследуемом биологическом материале, а также периодическая транслокация патогенов в кровь через поврежденные химиотерапией слизистые оболочки. По причине особого характера течения осложнений, сниженной иммунологической реактивности, а также невысокого уровня выделения возбудителя инфекций у иммунокомпрометированных пациентов на фоне химиотерапии в клинической практике был описан термин «фебрильная нейтропения» [313, 473]. Фебрильная нейтропения - однократно измеренная температура выше 38,3 °С или температура выше 38,0 °С на протяжении не менее 1 ч у пациента с абсолютным числом нейтрофилов (АЧН)<500 кл/мкл или у пациента с высокой вероятностью снижения АЧН ниже 500 кл/мкл в течение следующих 48 ч. Выбор антибиотика при фебрильной нейтропении проводится эмпирически и является решающим фактором успеха терапии [313, 474, 475]. Эмпирическая антибактериальная терапия - назначение антибактериальных препаратов до получения сведений о возбудителе и его чувствительности к данным препаратам. Поскольку антибактериальная терапия пациентов при ТГСК назначается в основном эмпирически, крайне важной с клинической точки зрения является возможность использования биологических маркеров сепсиса для уточнения диагноза инфекции кровотока у пациентов с фебрильной нейтропенией без микробиологического подтверждения [476, 477].

Важно отметить, что именно когорта иммунокомпрометированных пациентов онкологического, гематологического профилей, реципиенты ГСК являются наиболее изученными в контексте микробиома. Именно на модели иммуносупрессии при ТГСК и получены многие основополагающие данные о микробиоме человека и его клиническом значении, что представлено далее. В частности, одна из знаковых работ Y. Taur и соавт. на эту тему показывает достоверное снижение индекса биологического разнообразия микробиома (индекс Шеннона) у пациентов в динамике при проведении ТГСК (день 0 на графике), при этом четко отмечен негативный эффект антибиотиков и химиопрепаратов на многообразие микробиома (рис. 34) [21].

Более того, той же исследовательской группой на большой когорте трансплантационных пациентов был показан независимый эффект разнообразия микробиома на риск трансплант-ассоциированной летальности в течение нескольких лет после аллогенной ТГСК, работа была опубликована в знаменитом журнале Blood. Для исключения других потенциальных факторов, влияющих на исход трансплантации, в модель мультивариантного анализа общей и трансплант-ассоциированной летальности были включены следующие дополнительные переменные: возраст, пол, основной диагноз, индекс коморбидности ТГСК, статус основного заболевания, интенсивность режима кондиционирования, источник трансплантата, деплеция Т-клеток, срок в днях до приживления трансплантата, лечение препаратами урсодезоксихолевой кислоты, степень нарушения функции печени/почек, введение парентерального питания, времязависимое использование антибиотиков (ванкомицин, фторхинолоны, метронидазол, бета-лактамы). В результате авторы доказали, что у пациентов с исходно более низким разнообразием кишечного микробиома достоверно выше риск трансплант-ассоциированного летального исхода (рис. 35) [438]. Это означает, что разнообразие микробиома кишечника является независимым предиктором летального исхода при аллогенной ТГСК.

Одним из наиболее применяемых подходов для предотвращения бактериальных инфекций у пациентов на фоне химиотерапии - профилактическое введение антибиотиков. Однако при этом антибиотики могут оказывать селективное давление на микробиоту, приводя к отбору устойчивых к антибиотикам бактерий. Два наиболее частых вида микробиом-ассоциированных инфекционных осложнений у иммуно-компрометированных пациентов - это КДАИ и системные инфекции (сепсис), вызванные возбудителями, колонизирующими кишечник [414, 478]. Далее мы рассмотрим патогенез инфекций, возникающих как результат колонизации и доминирования микробиома ЖКТ.

ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫЕ ИНФЕКЦИИ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ КИШЕЧНИКА

Инфекции кровотока и сепсис, которые часто встречаются у пациентов с ослабленным иммунитетом, в значительном количестве случаев являются результатом нарушений кишечного микробиома и повреждения слизистой оболочки кишечника в условияx иммуносупрессии. Эти явления происходят из-за сочетания химиотерапии, лучевой терапии и широкого применения антибиотиков, что в итоге приводит к транслокации и генерализации некоторых кишечных бактерий. Наиболее распространенными бактериями, способными к кишечной транслокации, являются кислородоустойчивые микроорганизмы, в том числе ванкомицинрезистентные энтерококки, представители семейства Enterobacteriaceae, такие как E. coli и Klebsiella spp., и стрептококки группы viridans [476, 478-482].

Цитотоксическая химиотерапия остается одним из наиболее распространенных методов лечения различных видов рака. К этой группе относится множество лекарств, которые нарушают процесс клеточного размножения - митоза, тем самым преимущественно влияя на быстро делящиеся клетки, к которым и относятся раковые клетки. Однако раковые клетки - не единственная группа быстро делящихся клеток в организме человека. Клетки тканей ЖКТ и ГСК костного мозга также являются двумя важными клеточными популяциями, которые быстро делятся в здоровом организме. Таким образом, и эти клетки становятся восприимчивыми к антимитотическим коллатеральным эффектам химиотерапии [483, 484].

Специализированные стволовые клетки ЖКТ обычно восполняют потерю эпителиальных клеток слизистой оболочки для поддержания целостности барьера. Однако цитотоксическая химиотерапия помимо повреждения эпителиальных клеток выстилки кишечника инициирует микробиом-ассоциированную реакцию восстановления посредством активации фактора транскрипции (ядерный фактор NF-κB), причем не только в эпителиальных клетках, но и во всех окружающих клетках и тканях. Далее подключается продукция провоспалительных цитокинов, формируя патофизиологическую цепь с положительной обратной связью для усиления воспалительной реакции на первичном участке повреждения. Комбинация воспалительной реакции и апоптоза клеток слизистой оболочки ЖKT приводит к развитию болезненных ощущений у пациента, нарушению всасывания веществ и повреждению слизистого барьера. В комплексе эти процессы и являются мукозитом - весьма распространенным осложнением химиотерапии [485].

Kак мы уже отмечали, химиотерапия одновременно поражает ΓCK в костном мозге. Эти клетки являются исходным материалом всех типов клеток крови с наибольшим вкладом нейтрофилов. Нейтрофилы - наиболее распространенные, но недолговечные белые кровяные клетки, которые действуют как непосредственная первичная защита от инфекционных агентов [484]. Одними из ранних предшественников нейтрофилов являются промиелоциты, которые отличаются высокой активностью синтеза ДНK и, соответственно, очень уязвимы к антимитотическим эффектам химиотерапии. Их потомство составляют миелоциты - наиболее многочисленные пролиферирующие предшественники нейтрофилов, которые, следовательно, являются наибольшей популяцией клеток, повреждаемых химиотерапией. Все последующие клетки после миелоцитов не делятся.

Tаким образом, потеря именно миелоцитов костного мозга оказывает наибольшее влияние на нейтропению в периферической крови, а скорость восстановления клеток этой популяции в значительной степени определяет продолжительность нейтропении. Пациентам с глубокой и/или длительной химиотерапевтически-ассоциированной нейтропенией обычно назначаются профилактические антибиотики для предотвращения потенциально фатальных системных инфекций. Эти факторы вместе формируют цикл патогенеза инфекций, происходящих из кишечника (рис. 36).

Во-первых, нейтропения снижает способность пациента ограничивать локальный бактериальный процесс. Во-вторых, введение антибиотиков, как и химиотерапия, способствует нарушению состава микробиома кишечника и отбору антибиотикорезистентных колонизирующих бактерий. В-третьих, синдром мукозита создает «окно», то есть портал для проникновения кишечных бактерий в системный кровоток в связи с повреждением комплексного барьера ЖKT. При соблюдении этих условий колонизирующий микроорганизм проникает в кровоток и приводит к системной инфекции. При этом резервуар микроорганизма продолжает находиться в кишечнике и позволяет ему постоянно выходить в кровоток на фоне сниженных защитных механизмов пациента.

Итак, обсудив механизмы патогенеза инфекций у пациентов на фоне химиотерапии, перейдем к обсуждению понятия кишечного доминирования. По данным наиболее объемных опубликованных работ, бактериальные инфекции кровотока имеют высокую распространенность при аллогенной трансплантации ГСК, в пределах 20-34%, с существенными различиями между отдельными центрами и режимами кондиционирования [486, 487]. Более того, на протяжении последнего десятилетия грамотрицательные инфекции превалируют в этой сложной области медицины, составляя до 65% в общем спектре инфекций кровотока в Европе и США [488-490]. Высокие цифры летальности при этом поражают: например, при развитии инфекции, вызванной карбапенемрезистентной K. pneumoniae, уровень соответствующей летальности составил более 60% [491]. Данная актуальная проблема и послужила основой для выполнения объемного проспективного исследования по изучению микробиом-ассоциированных факторов развития инфекций кровотока и, в частности, оценки влияния факторов кишечного доминирования, результаты которого были опубликованы в ведущем мировом журнале Clinical Infectious Diseases [Stoma I. и соавт. Clin. Inf. Dis. 2020].

По результатам линейного дискриминантного анализа размера эффекта было показано, что наличие в кишечнике более 30% представителей типа Proteobacteria к пятому дню после TΓCK имеет прямую ассоциацию с развитием грамотрицательных инфекций кровотока. В регрессионном анализе было подтверждено, что предикторный эффект доминирования Proteobacteria реализуется в основном за счет видов E. coli и Klebsiella spp. , при этом его статистическая значимость сохраняется на всех таксономических уровнях. Важно подчеркнуть, что данная модель валидирована дополнительно тем, что кишечное доминирование строго специфично предшествует инфекции кровотока, вызванной тем же самым микроорганизмом, а случайный эффект других грамотрицательных инфекций исключен.

На рис. 37 представлены данные математического анализа сиквенс-последовательностей каждого из образцов стула у пациентов с грамотрицательными инфекциями кровотока. При этом ось абсцисс представляет собой временной отрезок наблюдения (от дня -10 до дня +15, где день 0 - это день трансплантации), на оси ординат представлена относительная плотность (от 0 до 1) грамотрицательных бактерий в биологическом образце, а каждый кружок на графике соответствует одному образцу. Линия аппроксимации демонстрирует тенденцию динамики относительной плотности грамотрицательных бактерий в образцах. При внимательном изучении графика становится очевидно, что относительная плотность грамотрицательных бактерий в кишечнике начинает нарастать в районе дня -3 до трансплантации (как правило, в это время пациент уже начал получать режим кондиционирования и антибиотикопрофилактику) и сохраняет высокие показатели вплоть до дня +10 после трансплантации. Именно в этот период и происходит основное количество грамотрицательных инфекций кровотока.

Примечательно, что, если в качестве дня отсечки оси абсцисс (день 0) взять первый день микробиологически подтвержденного эпизода грамотрицательной инфекции кровотока, станет очевидно, что увеличение относительной плотности грамотрицательных бактерий в кишечнике именно предшествует развитию данного типа инфекций в крови (рис. 38). На графике ниже линия аппроксимации наглядно демонстрирует, как нарастание кишечного доминирования в итоге приводит к развитию грамотрицательных инфекций у пациентов в крови.

Итак, с помощью математических и графических методов было показано, что кишечное доминирование представителями типа Proteobacteria является времязависимым предиктором возникновения последующей инфекции кровотока, при этом данный процесс является видоспецифичным, а его влияние прослеживается на всех таксономических уровнях кишечного микробиома.

Ранние исследования в области микробиома человека продемонстрировали, что разнообразный, высокодифференцированный состав кишечной микробиоты имеет защитный эффект против ряда инфекций, включая способность предотвращать колонизацию кишечника высокоустойчивыми патогенами, а также возбудителями кишечных инфекций [493, 494]. Интересно отметить, что воспалительные процессы были обозначены в исследованиях как факторы, ведущие к доминированию класса Gammaproteobacteria в кишечнике посредством создания селективного преимущества в проведении окислительного фосфорилирования для денитрифицирующих факультативных анаэробных микроорганизмов [495, 496]. Подробные же механизмы защиты от кишечного доминирования представителями типа Proteobacteria еще следует выяснить у человека, в то время как в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных уже показано, что важнейшим защитным барьером являются ингибиторные КЦЖК (ацетат, пропионат и бутират).

АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ ПРОФИЛАКТИКА У ПАЦИЕНТОВ НА ФОНЕ ХИМИОТЕРАПИИ С ПОЗИЦИИ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОМА

Дискуссия о клинической и микробиологической эффективности рутинной антибактериальной профилактики фторхинолонами у пациентов на фоне химиотерапии гематологических, онкологических заболеваний, а также трансплантации органов и тканей ведется во всем мире до настоящего времени, при этом часть центров выполняют ее рутинно, а часть отказалась от данной меры профилактики осложнений. К тому же вопрос о значении фторхинолонов в профилактике инфекционных осложнений сегодня требует пересмотра с учетом внедряемых новых методов изучения микробиома человека.

Дискуссия об эффективности и безопасности рутинной антибиотикопрофилактики фторхинолонами у пациентов в гематологии и при ТГСК все еще продолжается, особенно из-за повсеместного увеличения показателей устойчивости бактерий к фторхинолонам. Ранее Bucaneve и соавт. показали эффективность такой профилактики в условиях с уровнем устойчивости к фторхинолонам в 20%, что было позже принято в качестве возможного порога, при этом рутинная профилактика рекомендовалась в центрах с более низкими показателями устойчивости к этим антибиотикам [497]. Хотя в настоящее время большинство европейских и американских центров гематологии и трансплантации отмечают у себя уровень устойчивости бактерий к фторхинолонам выше 20%, решение о рутинном применении их в качестве профилактики по-прежнему остается предметом обсуждения в каждом центре. Основным ограничением обоснованного клинического решения для врачей является отсутствие фактических данных о влиянии профилактики на показатели общей летальности в условиях клинического центра, в то время как защитный эффект фторхинолонов против развития инфекций кровотока и сепсиса достоверно показан во многих публикациях. Интересно, что Chong и соавт. показали, что прекращение антибактериальной профилактики фторхинолонами у них в центре привело к увеличению частоты грамотрицательного сепсиса у пациентов после алло-ТГСК, включая даже инфекции, вызванные продуцентами β-лактамаз расширенного спектра [498]. Один из последних метаанализов для Европейской конференции по инфекциям при лейкозах (ECIL) включал результаты двух рандомизированных контролируемых исследований и 12 обсервационных исследований по проблеме антибактериальной профилактики фторхинолонами у пациентов с опухолями кроветворной системы и нейтропенией. Несмотря на то, что среди включенных исследований было всего два исследования с акцентом на аллогенную ТГСК, результаты метаанализа достоверно показали, что профилактика фторхинолонами ассоциирована с более низкой частотой инфекций кровотока, сепсиса и эпизодов фебрильной нейтропении. Важно еще то, что по результатам метаанализа отсутствовало влияние исходного уровня устойчивости бактерий к фторхинолонам в центре (то есть фон антибиотикорезистентности) на клиническую эффективность антибактериальной профилактики.

Системная антибактериальная терапия и химиотерапия являются известными факторами, влияющими на структуру кишечного микробиома у пациентов с иммуносупрессией. Как правило, на фоне данных факторов происходит избыточное размножение угнетенных в норме микроорганизмов, а именно Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, которые и являются наиболее значимыми бактериями в структуре этиологии сепсиса. Выявленный защитный эффект фторхинолонов против развития грамотрицательного сепсиса в гематологии вносит значимый вклад в дискуссию о клинической эффективности антибактериальной профилактики у пациентов с химиотерапевтически-ассоциированной нейтропенией. Ранее Bucaneve и соавт. показали, что в условиях уровня резистентности к фторхинолонам в 20% профилактика была клинически эффективна, что послужило основой для локальных протоколов многих центров [497]. В дополнение Chong и соавт. продемонстрировали, что отмена антибактериальной профилактики фторхинолонами у них в центре привела к увеличению частоты грамотрицательных инфекций, в том числе инфекций, вызванных продуцентами β-лактамаз расширенного спектра [498].

Имеется опубликованный анализ клинических факторов, ведущих к доминированию грамотрицательных бактерий в кишечнике [Stoma I. и соавт. Clin. Inf. Dis. 2020]. По причине наибольшего вклада в структуру инфекций в анализ в качестве микробиомного исхода был включен именно тип Proteobacteria. В состав Proteobacteria входят в том числе значимые нозокомиальные патогены, такие как E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, что и послужило причиной более пристального изучения именно данного сообщества микроорганизмов кишечника человека. Было показано, что риск развития клинически опасного доминирования Proteobacteria достоверно снижается на фоне приема антибактериальных ЛС из группы фторхинолонов, что и является основой медикаментозной профилактики инфекций в современной гематологии и трансплантологии. При этом важно подчеркнуть, что ассоциация кишечного доминирования Proteobacteria и риска развития сепсиса у пациентов на фоне химиотерапии была подтверждена в предыдущих разделах книги.

РОЛЬ СТЕРИЛЬНОЙ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ У ПАЦИЕНТОВ С ИММУНОСУПРЕССИЕЙ

Дебаты о том, как снизить риск инфекционных осложнений у пациентов с медикаментозной иммуносупрессией, развивались одновременно с прогрессом в лечении рака, гематологических заболеваний и трансплантологии. Различные научные школы по-разному оценивали вклад бактерий внешней среды в риск инфекций у иммунокомпрометированных пациентов. Логично предположить, что если для пациента будет создана практически стерильная защитная внешняя оболочка, то инфекций можно будет избежать. Однако в реальном мире все оказалось не так механистично устроено. Даже при внедрении защитных стерильных сред у пациента внутри организма остается массивное сообщество бактерий, грибов и вирусов, которые при определенных обстоятельствах начинают свою игру против хозяина. Таким образом, полной защиты не предвидится, а отмечается лишь изменение спектра и характеристик инфекций, что обсуждается в этой главе.

Дискуссия об экономической целесообразности и клинической эффективности защитной изоляции, создании изолированных стерильных защитных сред наглядно иллюстрируется опубликованной научной полемикой между двумя основоположниками современной онкологии - доктором Gerald P. Bodey из Онкологического центра им. М.Д. Андерсона Техасского университета в Хьюстоне и профессором Корнелльского университета, доктором Мемориального онкологического центра им. Слоуна-Кеттеринга в Нью-Йорке Donald Armstrong (рис. 39). Доктор Gerald P. Bodey одним из первых предложил и обосновал внедрение защитных изоляционных сред в клинике онкологии и гематологии и поддерживал данное направление c конца 1960-х гг. [499-502], в то время как профессор D. Armstrong обозначил не только экзогенный, но и эндогенный характер инфекций и таким образом усомнился в эффективности дальнейшего внедрения защитных сред [503].

Стоит отметить, что дискуссия продолжается активно и сегодня, однако новые методы изучения микробиома человека позволили поддержать идеи D. Armstrong об эндогенном характере многих инфекций в онкологии и гематологии, что несколько снизило практическое значение защитных сред на современном этапе.

В настоящее время производство защитных внешних сред продолжается и даже характеризуется многими инновационными внедрениями, в том числе созданы изолированные автономные внешние среды с высококачественной фильтрацией и ламинарным потоком воздуха. Опубликованные данные позволяют говорить об эффективности использования изолированных стационарных систем для профилактики развития высокоустойчивых инфекций госпитальной среды, в частности пневмоний. Однако поскольку состояние химиотерапевтически-ассоциированного мукозита формирует так называемое «окно» между микробиотой кишечника и кровью пациента, данные системы не могут защитить от энтерогенных инфекций кровотока, вызванных представителями семейства Enterobacteriaceaea spp. (E. coli, K. pneumoniae). Более того, полученные результаты соотносятся с последними данными о селективном прессинге в пользу энтеробактерий в кишечнике у пациентов на фоне антибактериальной и противоопухолевой терапии [506, 507]. Действительно, стоит отметить, что внедрение в гематологическую практику инновационных стационарных защитных сред позволяет сместить спектр инфекций у пациентов от наиболее опасных микроорганизмов госпитальной среды к комменсальным микроорганизмам кишечника, что при наличии адекватной системы назначения антибиотиков является гораздо менее угрожающим явлением.

РЕАКЦИЯ «ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА» И МИКРОБИОМ

Напомним, что среди ранних осложнений при проведении ТГСК описаны геморрагический цистит (частота 5-25%), веноокклюзионная болезнь печени (частота 3-54%), тромботическая микроангиопатия (частота 4-15%), диффузный альвеолярный геморрагический синдром (частота 1-21%), синдром повышенной проницаемости капилляров [475]. Опаснейшим осложнением ТГСК остается острая реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), которая может развиться у 40% пациентов, перенесших алло-ТГСК. Риск развития РТПХ выше у возрастных пациентов и в случае частичной совместимости или несовместимости донора с реципиентом по HLA-системе. Патогенез РТПХ обусловлен реакцией донорских Т-лимфоцитов против тканей организма реципиента. Клинические проявления РТПХ включают сыпь, холестатический гепатит, тошноту, рвоту, диарею [508, 509], а степень их выраженности может быть потенциально опасной для жизни пациента [479, 510, 511].

Изучение взаимосвязи кишечных форм РТПХ и нарушений состава микробиома всегда представляло собой одновременно увлекательную и сложную тему. Взаимное влияние РТПХ, кишечного воспаления и сдвига в характеристиках микробиома нередко приводило к тому, что исследователям непросто выделить первичный механизм данного комплексного нарушения.

Исследовательская группа из США в недавней публикации как на клинической, так и на экспериментальной модели аллогенной ТГСК подтвердила то, что воспалительные процессы при кишечной форме РТПХ однозначно ассоциированы с серьезными сдвигами в составе кишечного микробиома [512]. Микробиом, в свою очередь, способен регулировать интенсивность воспалительных процессов при РТПХ. В экспериментальных моделях РТПХ авторы наблюдали значительное снижение разнообразия видов микробиома, а также увеличение относительной плотности отряда Lactobacillales и резкое снижение плотности представителей Clostridiales. В то же время в эксперименте при искусственном удалении Lactobacillales из состава микробиома лабораторных животных усугубляло течение РТПХ, а введение некоторых наиболее массовых видов рода Lactobacillus индуцировало защитные механизмы против РТПХ.

Позже при исследовании микробиома кишечника у пациентов с кишечной формой РТПХ авторами были обнаружены те же характерные сдвиги, что описаны в эксперименте у мышей. Интересно также то, что у пациентов с повышенной хаотичностью состава микробиома в начале процедуры аллогенной трансплантации достоверно отмечался повышенный риск развития РТПХ в последующем. Важным практическим компонентом исследования является то, что авторы подтвердили, что применение антианаэробных антибиотиков имело повреждающий эффект на представителей Clostridiales микробиома и ассоциировалось с повышенным уровнем летальных исходов на фоне РТПХ [512, 513]. Вместе эти результаты предлагают основу для манипуляций с микробиомом пациентов при выполнении алло-ТГСК, что в перспективе позволит снизить частоту и проявления такого опасного осложнения, как РТПХ, и улучшить исходы трансплантации [315, 512].

Еще одна работа на эту тему продемонстрировала риск развития рецидива/прогрессии основного онкогематологического заболевания в течение двухлетнего периода наблюдения, то есть, по сути, неэффективность процедуры трансплантации была связана со структурой микробиома пациентов. В мультивариантном анализе исследователи показали, что более высокая плотность группы, состоящей в основном из Eubacterium limosum, уменьшала у пациентов риск рецидива/прогрессии основного заболевания [514]. И наконец, при попытке выявить конкретные защитные виды в составе микробиома человека, которые смогут снизить РТПХ-ассоциированную летальность, исследователи в различных когортах пациентов подтвердили защитные свойства важного члена класса Clostridia - кишечного комменсала вида Blautia [513]. Более того, при стратификации пациентов на группы с большей и меньшей плотностью Blautia летальность достоверно различалась между данными группами. Эта находка говорит о возможном применении препаратов, содержащих те или иные формы вида Blautia, с лечебной или профилактической целью в будущем.

МИКРОБИОМ У ПАЦИЕНТОВ С ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Было показано, что кишечный микробиом и его метаболиты способствуют воспалению и иммунной активации у ВИЧ-инфицированных взрослых, что, в свою очередь, способствует персистенции вируса, несмотря на антиретровирусную терапию [515-517]. Эти процессы связаны с нарушением целостности слизистой оболочки кишечника на фоне репликации ВИЧ в лимфоидной ткани кишечника (англ. gut-associated lymphoid tissue - GALT), которая сохраняется даже при многолетнем долгосрочном контроле вируса с помощью антиретровирусной терапии [518]. ЖКТ признан участком с наибольшей плотностью CD4⁺ Т-клеток в организме и поэтому является принципиально важной зоной для ранней репликации ВИЧ и наиболее вероятным резервуаром вируса [519]. Большинство исследований сходятся во мнении, что у людей с ВИЧ наблюдаются четкие изменения в микробиоме кишечника с уменьшением бактериального биоразнообразия, а также увеличением Prevotella spp. и уменьшением Bacteroides spp. по сравнению с неинфицированными взрослыми [520]. Действительно, было показано, что некоторые штаммы Prevotella spp. усиливают Th17-опосредованное воспаление слизистой оболочки кишечника, а некоторые штаммы Bacteroides spp. снижают уровень провоспалительных цитокинов [521, 522]. Пациенты из группы элитных контроллеров (нонпрогрессоры), которые самостоятельно контролируют репликацию ВИЧ без антиретровирусной терапии, сохраняя уровень CD4⁺ Т-клеток в слизистой оболочке кишечника, отличаются более низкой иммунной активацией и меньшим резервуаром ВИЧ [523, 524]. В одной из работ было обнаружено, что элитные контроллеры имеют более разнообразный кишечный микробиом с четко выраженным метаболическим профилем, сходным с таковым в общей популяции здоровых взрослых, и этот профиль совершенно отличается у пациентов с ВИЧ на антиретровирусной терапии [525].

Таким образом, хотя точный механизм взаимодействия ВИЧ-инфекции и микробиома не ясен, восстановление структуры и функции микробиома у пациентов с ВИЧ будет способствовать уменьшению воспаления в кишечнике, уменьшению размера резервуара вируса в организме, что имеет положительное значение в достижении лечебного эффекта.

Микробиом человека может способствовать развитию заболеваний с помощью целого ряда механизмов, включая продукцию токсичных веществ, способность к избыточному росту и поддержку воспалительных процессов. Многие факторы, такие как диета, воспалительные заболевания и нарушения состава микробиома, могут запускать как защитные, так и потенциально опасные функции бактерий в организме человека. На протяжении последних лет вместе с активизацией изучения темы микробов в организме человека стали появляться интереснейшие данные об ассоциации, как ранее казалось, неинфекционных заболеваний с микроорганизмами (табл. 9). В этом разделе мы обсудим актуальные данные о роли комменсальных бактерий в патогенезе неинфекционных заболеваний. В центре внимания ученых по всему миру находится вопрос о роли нарушений кишечного микробиома в развитии инсулинорезистентности, эндотелиальной дисфункции, дислипидемии, повышении артериального давления, ожирении. Практический акцент ставится на то, что для предотвращения кардиометаболических заболеваний, помимо реализации уже хорошо известных профилактических мероприятий, важно сохранение разнообразного состава кишечного микробиома [526].

МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СИНДРОМ

Метаболический синдром определяется как комплекс связанных на биохимическом и патофизиологическом уровне факторов, обусловливающих чрезвычайно высокий суммарный риск развития ишемической болезни сердца и других заболеваний, связанных с атеросклерозом. В составе метаболического синдрома выделяют следующие компоненты: абдоминальное ожирение, артериальную гипертензию, повышенный уровень глюкозы крови, нарушение липидного обмена (высокий уровень триглицеролов, низкий уровень липопротеидов высокой плотности в крови) [541, 542].

Диета сильно влияет на состав и функции кишечной микробиоты [226, 527], что может способствовать развитию этой опасной болезни. Например, было показано, что введение в пищу искусственных подсластителей у мышей и людей приводит к нарушению регуляции микробиоты кишечника с нарушением биодеградации гликанов, снижением толерантности к глюкозе и развитием преддиабетического состояния [543]. Недавно была продемонстрирована роль микробиома в регулировании гликемической реакции с помощью математической модели прогнозирования постпрандиальных (через 2 ч после еды) уровней глюкозы у пациентов на основе многих параметров, в том числе и состава микробиома [544]. Другими исследовательскими группами на основе метагеномного анализа была выявлена корреляция между отдельными бактериальными таксонами в кишечнике и СД 2-го типа [545, 546]. Интересно, что лечение пациентов метформином значительно влияло на состав микробных сообществ кишечника в когортах пациентов с диабетом [547].

Кишечный микробиом также играет ключевую роль в патогенезе ожирения. Действительно, эксперименты показали, что это состояние можно перенести от мышей или людей с ожирением к здоровым мышам посредством искусственного заселения (трансплантации) микробиоты биологических образцов [29, 528]. Эти исследования убедительно демонстрируют еще и то, что характер питания определяет выбор определенных штаммов комменсальных бактерий с улучшенной способностью к усвоению энергетических субстратов.

Среди прочего, исследователями из Токио было выявлено, что у лабораторных мышей с ожирением чаще присутствуют нарушения микробиома, а именно выраженное увеличение относительной плотности бактерий класса Clostridia, которые известны активной продукцией дезоксихолевой кислоты, что способствует воспалительным реакциям в печени, а также может предрасполагать хозяина к развитию рака печени [548]. В данной экспериментальной модели было также показано, что диета с низким содержанием жиров, антибактериальная терапия или фармакологическое ингибирование микробной трансформации первичных желчных кислот во вторичные оказывало защитное действие. Другой исследовательской группой в мышиной модели колоректального рака было установлено, что продуцируемый бактериями бутират усиливал пролиферацию эпителиальных клеток кишечника, а также частоту образования полипов в кишечнике и даже развитие опухолевых образований [549].

Кроме того, ряд недавних исследований показал связь между микробиомом и атеросклерозом. Фосфатидилхолин (фосфолипид), содержащийся во многих пищевых продуктах, и L-карнитин, содержащийся в красном мясе, трансформируются кишечной микробиотой в проатерогенный триметиламин (ТМА). Установлено, что диеты с добавками L-карнитина и фосфатидилхолина приводят к образованию атером и формированию атеросклеротических изменений в аорте у лабораторных животных, а интенсивность процесса может регулироваться назначением антибиотиков [150, 529, 550]. Также у людей было продемонстрировано, что назначение L-карнитина или фосфатидилхолина увеличивало уровни ТМА в плазме, а также увеличивало риск сердечно-сосудистых заболеваний; и наоборот, лечение антибиотиками уменьшало уровни ТМА [150, 529]. Любопытно, что у субъектов на вегетарианской диете отмечалась сниженная или отсутствующая способность продуцировать ТМА после добавления L-карнитина, и авторами было предложено, что бактерии микробиома, отобранные вегетарианской диетой, не обладали возможностью активно выполнять эту биохимическую конверсию [529]. В целом эти исследования убедительно демонстрируют важную роль микробиоты кишечника в патогенезе атеросклероза. Интересно, что следующая научная работа показала, что добавление в пищу мышам аналога холина, который ингибирует образование ТМА, позволило предотвратить быстрое развитие атеросклероза [551]. Таким образом, микробиом представляет собой весьма перспективную нишу для разработки фармакологических препаратов для лечения и профилактики атеросклероза.

СД 2-го типа представляет собой заболевание, в основе которого лежит как наличие резистентности к инсулину (невосприимчивости клеток к воздействию гормона), так и нарушение его секреции клетками поджелудочной железы. Ранее было показано, что воспалительные процессы при метаболических заболеваниях ассоциированы с изменениями микробиома кишечника [545, 552-554]. В последнее время связь между микробиомом и патофизиологией СД 2-го типа была изучена в двух независимых исследованиях, в которых сравнивались характеристики микробиома здоровых субъектов и пациентов с СД 2-го типа. При этом увеличение относительной плотности бактерии Clostridium clostridioforme и снижение плотности штамма бактерии Roseburia при СД были продемонстрированы независимо как в китайской, так и в европейской популяции [530, 546]. Соответственно, повышенные уровни бактерии Roseburia в микробиоме были связаны с улучшенной чувствительностью к инсулину после трансплантации микробиоты кишечника от здоровых доноров реципиентам с метаболическим синдромом [530]. Эти эффекты объяснялись разной продукцией КЦЖК у различных бактерий в микробиоме. В частности, показано, что пропионат и бутират (КЦЖК) уменьшают уровень воспаления, регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток и индуцируют высвобождение гормонов [531, 555-558]. Действительно, бутират, продуцируемый кишечными бактериями, по-видимому, играет важную роль в регуляции уровня глюкозы крови и метаболизме липидов, о чем свидетельствуют опубликованные исследования по фекальной трансплантации [530, 532]. Актуальные молекулярно-генетические работы продемонстрировали, что определенные составы микробиома с собственными профилями продукции КЦЖК оказывали разное воздействие на эпигенетическую регуляцию генов ожирения [559].

МИКРОБИОМ В СОВРЕМЕННОЙ ЭНДОКРИНОЛОГИИ

Еще Академик А.М. Уголев в своих работах по эволюции пищеварения показал, что эндокринные клетки ЖКТ продуцируют более 30 различных гормонов и гормоноподобных субстанций. Более того, помимо гормонов с локальным действием (секретин, гастрин, холецистокинин) в ЖКТ присутстуют также гормоны общего действия. Выключение в эксперименте гормональных функций ЖКТ приводило к развитию тяжелых форм патологии и во многих случаях - к смерти. Это означало, что для нормального функционирования организма необходим поток эндогенных гормонов, продуцируемых в ЖКТ.

Более того, было показано, что образующиеся при гидролизе белков пептиды в некоторых количествах могут поступать в кровь и участвовать в модуляции общего гормонального фона. Таким образом, А.М. Уголев предложил разделить энтеральный поток гормонов и физиологически активных веществ на эндогенный и экзогенный, где последний состоит из специфических веществ, образующихся при переработке пищи. Данные экзогенные гормо-ноподобные вещества, в отличие от истинных гормонов, было предложено назвать экзормонами.

Сахарный диабет 1-го типа

СД 1-го типа - аутоиммунное заболевание, характеризуемое недостаточной выработкой инсулина, что вызвано частичным или полным разрушением островковых β-клеток поджелудочной железы, опосредованным аутореактивными Т-клетками, с более высокой первичной заболеваемостью у детей и молодых взрослых [560]. Генетические факторы играют важную роль в развитии СД 1-го типа, и ряд ассоциированых с заболеванием генетических локусов уже известен [561]. Факторы окружающей среды также вносят значительный вклад в риск заболевания. Об этом свидетельствуют данные наблюдений о том, что менее чем у 10% генетически предрасположенных людей развивается заболевание, а также различна заболеваемость диабетом 1-го типа у монозиготных близнецов [562-564]. В последние годы кишечный микробиом был признан одним из ключевых факторов окружающей среды, связанных с развитием СД 1-го типа. Научные данные показали, что существуют значительные различия в профиле микробиома кишечника между пациентами с СД 1-го типа и здоровыми людьми, что указывает на тесную взаимосвязь между заболеванием и кишечными микроорганизмами [565]. Однако, являются ли эти микробные изменения причинами, следствиями или и тем, и другим, до сих пор не полностью выяснено. Далее мы более подробно остановимся на общих изменениях состава кишечного микробиома у пациентов с СД 1-го типа и рассмотрим имеющиеся данные, подтверждающие роль кишечного микробиома в возникновении и прогрессировании заболевания. Значительное число исследований было направлено на изучение ассоциаций, а не доказывало причинно-следственные связи, однако имеющиеся данные позволяют говорить о нарушениях микробиома при СД 1-го типа (табл. 10).

*Maturity Onset Diabetes of the Young или Сахарный диабет взрослого типа у молодых. ** Human Intestinal Tract Chip - Биочип ЖКТ человека.

Доказательства же, подтверждающие причинно-следственную связь кишечного микробиома в патогенезе СД 1-го типа, основаны пока что только на экспериментах с лабораторными животными, в основном потому, что кишечный микробиом в экспериментальной модели на животных может быть изменен в строго контролируемых условиях, чтобы минимизировать другие факторы воздействия окружающей среды. Генетическая модель мыши с диабетом, но без ожирения остается основной экспериментальной возможностью изучения темы, при этом эти животные обладают генами СД 1-го типа, а заболевание может манифестировать у них спонтанно [579].

Антибиотики в экспериментах меняли состав кишечного микробиома путем избирательного удаления определенных групп микроорганизмов. Сообщалось, что изменения состава микробиома в кишечнике, вызванные введением ванкомицина в раннем возрасте, значительно увеличивали частоту развития СД 1-го типа у лабораторных мышей [580, 581]. Два опубликованных исследования показали, что пероральное введение комбинации пробиотиков VSL#3 может предотвратить развитие СД 1-го типа у мышей при введении с четырехнедельного возраста [582, 583]. Эксперимент с пробиотиком Clostridium butyricum CGMCC0313.1 также продемонстрировал, что его применение снижает риск развития СД 1-го типа у мышей посредством увеличения плотности бактерий - продуцентов бутирата [584].

Исследования на животных также показали, что пищевые факторы, такие как глютен и растительная клетчатка, могут изменять риск возникновения СД 1-го типа посредством изменения состава кишечного микробиома. В частности, было показано, что безглютеновая диета снижает риск развития диабета у мышей, а также повышает плотность Akkermansia и уменьшает плотность видов Bifidobacterium spp., Tannerella spp. и Barnesiella spp. по сравнению с группой глютенсодержащей диеты. Примечательно, что добавление глютена в безглютеновую диету устраняло антидиабетический эффект в результате изменения состава кишечного микробиома [585]. Кроме того, появились данные о негативных эффектах пектиновых веществ и ксиланов, которые оказывают диабетогенное действие у мышей в эксперименте, значительно повышая плотность Bacteroides и снижая плотность бактерий, разлагающих муцин, таких как Verrucomicrobiales и Prevotellaceae [586]. Отметим, что недавнее исследование показало, что низкоэтерифицированный амидированный пектин - новая предложенная пищевая добавка - может снизить первичную заболеваемость диабетом у мышей в эксперименте посредством повышения плотности микроорганизмов, которые продуцируют КЦЖК [587]. Также сообщалось, что грудное вскармливание как независимый защитный фактор может привести к снижению заболеваемости СД 1-го типа [588], а кишечный микробиом детей на грудном вскарливании был более стабильным и характеризовался преобладанием бифидобактерий, в отличие от микробиома младенцев, получавших искусственные смеси [589].

Эксперименты на животных по изучению роли ТФМ для лечения СД 1-го типа также могут привести к практическим результатам. Известно, что у мышей с диабетом, но без ожирения в кишечнике больше диабетогенных микроорганизмов, чем у мышей, не страдающих ожирением и диабетом. Более того, одно из исследований показало, что выполнение ТФМ от мышей с диабетом, но без ожирения стандартным мышам вызывало у них активный аутоиммунный инсулит, то есть лимфоцитарную инфильтрацию в островках поджелудочной железы, приводящую к разрушению β-клеток [590]. Интересно, что перенос отдельных видов бактерий, например

Akkermansia muciniphila, способствовал задержке развития диабета у мышей в эксперименте. Это позволяет предположить, что даже отдельные представители микробиома могут играть потенциально важную роль в патогенезе СД 1-го типа [591].

Что является причиной, а что следствием в связи микробиома с диабетом, было частично выяснено в нескольких когортных исследованиях, авторы которых выявили, что изменения в составе микробиома кишечника произошли у пациентов еще до развития СД 1-го типа [568, 572, 573, 592]. Возможные механизмы, посредством которых кишечный микробиом влияет на развитие СД 1-го типа, включают нарушения иммунной регуляции и синдром повышенной проницаемости кишечника (англ. leaky gut) (рис. 40, 41).

Напомним, что микробиом ЖКТ считается крупнейшим органом иммунной системы [593], в том числе благодаря способности постоянно взаимодействовать с иммунными клетками [594]. Ранее уже было продемонстрировано, что у диабетических линий мышей имеются нарушения иммунитета слизистых оболочек еще перед развитием СД 1-го типа [595].

Нарушения кишечного микробиома могут привести к повреждению плотных межклеточных соединений, нарушая тем самым целостность кишечного барьера. Повышение кишечной проницаемости приводит к нерегулируемому прохождению микробных антигенов, которые через взаимодействие с антигенпрезентирующими клетками могут стимулировать продукцию аутореактивных Т-клеток, что впоследствии может способствовать разрушению островковых β-клеток поджелудочной железы у людей с генетической предрасположенностью.

В контексте иммунопатогенеза СД 1-го типа вспомним, что, согласно так называемой цивилизационной гипотезе (или гигиенической гипотезе), именно отсутствие микробной стимуляции в раннем детстве, обусловленное улучшенными санитарными условиями, ведет к росту распространенности нарушений, связанных с функцией иммунной системы [598], то есть у детей, которые с раннего возраста подвергаются воздействию различных микроорганизмов, вероятность развития аутоиммунных заболеваний впоследствии может быть значительно ниже [599, 600]. Эта гигиеническая гипотеза была также подтверждена исследованиями на мышах, например у диабетических линий мышей чаще развивался диабет, когда они содержались в практически стерильной окружающей среде, и, в свою очередь, инфицирование этих мышей различными бактериями в раннем возрасте могло предотвратить развитие у них СД 1-го типа [601, 602]. Таким образом, представляется, что опосредованное кишечным микробиомом созревание иммунной системы в раннем возрасте имеет решающее значение для предотвращения развития СД 1-го типа. И наоборот, нарушения микробиома могут привести к недостаточному созреванию иммунитета и в конечном итоге к повреждению β-клеток, секретирующих инсулин, и развитию СД 1-го типа у генетически предрасположенных людей [603, 604].

Итак, на сегодняшний день наиболее убедительным доказательством причинно-следственной связи между кишечным микробиомом и СД 1-го типа являются высококачественные интервенционные исследования на мышиных моделях. Эти исследования продемонстрировали эффективность пробиотических добавок, воздействие антибиотиков, ТФМ и коррекции диеты как факторов, влияющих на риск развития СД 1-го типа. Актуальные данные, рассмотренные в этом разделе, подчеркивают важность поддержания здорового кишечного микробиома и позволят в перспективе обосновать меры профилактики или лечения СД 1-го типа. Необходимы дальнейшие рандомизированные контролируемые исследования на объемных по численности когортах людей, чтобы помочь ответить на вопрос причинно-следственной связи и подтвердить эффективность микробиом-ассоциированных терапевтических подходов.

МИКРОБИОМ И ЗАБОЛЕВАНИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы являются наиболее распространенными органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями и поражают 2-5% населения. Микробные вещества, особенно КЦЖК, совместно с гормонами щитовидной железы могут усиливать дифференцировку энтероцитов и плотные межклеточные соединения в кишечнике [605]. Изменения состава кишечного микробиома могут способствовать развитию аутоиммунного заболевания щитовидной железы с помощью нескольких гипотетических механизмов, включая продукцию аутоантигенов путем посттрансляционной модификации белков, активацию ЛПС-индуцированного Toll-подобного рецептора 4 (TLR-4), смещения пула Т-хелперов 1-го типа (Th1) ко 2-му типу (Th2), нарушения плотных межклеточных соединений в кишечнике и индукции транскриптомных, протеомных и метаболических изменений.

Известные физиологические функции щитовидной железы включают поглощение йода, рециркуляцию гормонов, а также метаболизм некоторых лекарств, который функционирует во взаимосвязи с микробиотой (рис. 42) далее.

Микробиом может влиять на поглощение йода и энтерогепатический биохимический цикл гормонов щитовидной железы. Кроме того, существует влияние отдельных минеральных веществ на взаимодействие между хозяином и его микробиотой, в особенности Se, Fe и Zn. При клинически манифестированных заболеваниях щитовидной железы микробиом может влиять на поглощение лекарств (L-тироксина) и на эффективность лечения и токсичность. Была также показана ассоциация аутоиммунного заболевания щитовидной железы и аутоиммунного гастрита, что может быть обусловлено перекрестно реактивными антителами [606]. Чтобы получить больше информации о вкладе микробиома в аутоиммунные заболевания щитовидной железы, нужны клинические исследования с определением состава микробиома у пациентов с различными заболеваниями щитовидной железы. При этом пока что нет качественных данных о составе микробиома, специфичного для заболеваний щитовидной железы.

МИКРОБИОМ И ОСТЕОПОРОЗ

Остеопороз - системное метаболическое заболевание, характеризуемое снижением костной массы и микроструктурным разрушением костной ткани, что приводит к повышенной хрупкости костей и патологическим переломам. Первичная заболеваемость остеопорозом продолжет расти, чему уделяют все больше внимания исследователи. К примеру, частота связанных с остеопорозом патологических переломов была больше, чем инсультов, сердечных приступов и рака молочной железы ежегодно, что послужило причной финансовых затрат в США в 17 млрд долларов [607]. В течение последних лет исследователям стало ясно, что на патологический процесс остеопороза влияют кишечные микроорганизмы. Молекулярные механизмы остеопороза в основном включают:

Показано, что бактерии кишечного микробиома могут способствовать увеличению костной массы и снизить прогрессирование остеопороза, подавляя пролиферацию и дифференцировку остеокластов, уменьшая резорбцию кости или способствуя пролиферации и созреванию остеобластов [608]. Итак, нарушения состава и функций кишечного микробиома могут повысить проницаемость кишечного барьера, что вызывает поступление большего количества ЛПС бактериального происхождения в систему кровообращения. ЛПС активирует медиаторы воспаления [ИЛ-1, циклооксигеназу-2 (ЦОГ-2) и ФНО] в области метафиза кости. Кроме того, нарушения кишечного микробиома могут увеличить рН кишечника и таким образом уменьшить всасывание кальция, необходимого для костной ткани.

Роль ЛПС в метаболизме костной ткани демонстрировалась в экспериментах на животных. Гранулы с замедленным высвобождением ЛПС были имплантированы трехмесячным лабораторным крысам в модели хронического воспаления. В обеих группах с воздействием ЛПС в бедренной кости была отмечена потеря костной ткани, что позволяет предположить, что системное воздействие ЛПС может способствовать снижению плотности кости. В группе с высвобождением высоких доз ЛПС микрокомпьютерная томография показала, что объем губчатой кости проксимального отдела большеберцовой кости у животных уменьшается. Кроме того, повышение активности медиаторов воспаления (ИЛ-1, циклооксигеназы-2 и ФНО) было определено в области метафиза кости [609]. Схожие данные были получены и в других работах, например о том, что воздействие ЛПС значительно уменьшало объем трабекулярных костей и плотность костной ткани поясничных позвонков в эксперименте [610].

Механизм защитного действия КЦЖК на костную массу заключается в том, что КЦЖК регулируют дифференцировку остеокластов и ингибируют резорбцию кости in vitro и in vivo. В частности, пропионат и бутират могут вызывать метаболические изменения остеокластов путем окислительного фосфорилирования, что снижает экспрессию генов остеокластов, таких как TRAF6 и NFATc1 [611], что приводит к снижению дифференцировки остеокластов и замедлению резорбции кости [612].

В последние годы было также обнаружено, что микробиом кишечника оказывает важное влияние на нервную систему посредством регуляции гормонов и нейромедиаторов, таких как 5-гидрокситриптамин (5-НТ) или серотонин [613]. Было показано, что кишечные микроорганизмы влияют на синтез 5-НТ энтерохромаффинными клетками кишечника и регулируют высвобождение 5-НТ [614]. Считается, что система передачи сигналов с помощью 5-НТ играет важную регуляторную роль в развитии и поддержании плотности кости, в частности показано, что как остеобласты, так и остеокласты содержат серотониновые рецепторы, а повышенный уровень серотонина был связан с уменьшением костной массы у мышей в эксперименте [615, 616]. Другое исследование показало, что использование синтетических ингибиторов для снижения уровня 5-HT может предотвратить потерю костной массы, вызванную овариэктомией [617].

И все же терапевтическое действие кишечных микробов на остеопороз еще предстоит доказать. В настоящее время некоторые данные о влиянии кишечных микробов на остеопороз уже могут быть применены в клинической практике, включая раннюю диагностику и пробиотические вмешательства в характер течения остеопороза. Известно, что баланс кишечного микробиома может быть восстановлен путем изменения диеты, использования пробиотиков или их метаболитов, таких как КЦЖК, олигосахариды, углеводы и пищевые волокна. Эти вещества могут изменять состав кишечных микробных сообществ, стимулировать противовоспалительные реакции, а также способствовать всасыванию кальция в кишечнике, тем самым поддерживая костную ткань. Имеются работы, показавшие, что отдельные представители Lactobacillus spp. и Bifidobacteria spp. обладают противовоспалительным действием и могут усиливать всасывание витамина D, уменьшать дифференцировку остеокластов, тем самым предотвращая потерю костной ткани в экспериментах [618, 619].

МИКРОБИОМ В ДЕРМАТОЛОГИИ

Ряд известных кожных заболеваний связан с изменениями в микробиоме кожи. Наиболее изучен вклад микробиома в патогенез акне, экземы и хронических незаживающих ран. Считается, что эти кожные заболевания зависят как от отдельных видов микробиома кожи, так и от комплексных изменений в микробном сообществе [22].

Микроорганизмы, ассоциированные с акне

Это широко распространенное, особенно в подростковом возрасте, хроническое воспалительное заболевание кожи связано с известной бактерией Cutibacterium acnes (ранее Propionibacterium acnes) - широко распространенным микроорганизмом в кожном микробиоме здоровых взрослых людей [620, 621]. На функциональном уровне экспрессия генов этого микроорганизма различается между людьми с клинически проявляющимися акне и людьми без акне [622]. То обстоятельство, что почти все взрослые люди колонизированы C. acnes, но только у единиц развиваются акне, подчеркивает важность изучения этого заболевания в контексте генетики человека, иммунологических или барьерных дефектов кожи и нарушений микробиома. Известно, что повышенная секреция кожного сала имеет значение в патогенезе акне, так как уровень секреции коррелирует с выраженностью клинических симптомов [623]. С помощью флуоресцентной микроскопии для визуализации C. acnes в биоптатах кожи развитие акне было связано с наличием C. acnes именно в фолликулах, а также образованием биопленок [624]. Кроме того, весьма давно было показано, что прием цианокобаламина (Витамин В₁₂ ^♠ ) связан с развитием акне у некоторых людей [625, 626]. Недавно в исследованиях этот факт был обоснован тем, что на фоне приема цианокобаламина (Витамин В₁₂ ^♠ ) подавляется биосинтез цианокобаламина (Витамин В₁₂ ^♠ ) в самих бактериях C. acnes, что впоследствии увеличивает продукцию ими порфиринов, которые, в свою очередь, могут вызывать воспалительные явления в коже и развитие акне [622]. Интересно, что именно у тех штаммов C. acnes, которые более ассоциированы с клинически выраженными акне, были обнаружены более высокие уровни порфиринов [627].

Staphylococcus aureus в дерматологии

Золотистый стафилококк (S. aureus) весьма часто наблюдается на коже людей, страдающих атопическим дерматитом [628], а также существуют дополнительные факторы, которые поддерживают гипотезу, что кожный микробиом играет существенную роль в патогенезе этого заболевания. К примеру, атопический дерматит лечится смягчающими средствами, которые способствуют поддержанию целостности кожного барьера, а в случаях, когда имеются данные, указывающие на активность инфекционного процесса, или при стойком течении заболевания - антимикробными средствами (например, антибиотиками и локальными средствами). Эффективность антимикробных средств, как было показано, коррелирует с уменьшением относительной плотности S. aureus [629], однако в целом общая эффективность антимикробных средств при атопическом дерматите остается неясной [630]. В долгосрочных исследованиях у детей с атопическим дерматитом секвенирование гена 16S рРНК и полногеномное секвенирование показало, что относительная плотность Staphylococcus spp., особенно S. aureus и S. epidermidis, увеличивалась в период эпизодического обострения атопического дерматита по сравнению с состоянием кожного микробиома в ремиссии, а также что уровень стафилококков коррелировал с более тяжелым течением заболевания в обострении [629, 631]. Более того, при анализе на функциональном уровне было показано, что микробиом пациентов с атопическим дерматитом способен производить избыток аммиака, что и объясняет высокий уровень рН, который наблюдается у них на коже во время обострения заболевания [632]. Также в лабораторных моделях на животных было показано, что изменения в кожном микробиоме, характеризуемые чрезмерным ростом Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium bovis и S. aureus, именно предшествовали развитию атопического дерматита. При этом этиотропное лечение антибиотиками этих лабораторных животных было эффективно в устранении этих нарушений, а также кожного воспаления, таким образом демонстрируя причинно-следственную связь между нарушениями кожного микробиома, кожного барьера и атопическим дерматитом [633].

Микробиом в патогенезе хронических незаживающих ран

Известно, что микроорганизмы, колонизирующие кожу, влияют на процессы заживления хронических ран, широко распространенных в популяциях пожилых пациентов или у пациентов с СД или ожирением. Например, роль микроорганизмов хорошо изучена в патогенезе синдрома диабетической стопы. По различным оценкам, более 50% кожных повреждений при синдроме диабетической стопы инфицированы [634]. Секвенирование гена 16S рРНК показало, что состав микробиома кожных поражений при синдроме диабетической стопы ассоциирован с клиническими характеристиками и прогнозом заболевания [635]. Например, поверхностные быстрозаживающие язвы были связаны с большей плотностью Staphylococcus spp., особенно S. aureus, тогда как более глубокие и длительно не заживающие язвы отличались большим разнообразием микробиома с более высокой относительной плотностью анаэробных бактерий и грамотрицательных протеобактерий. Кроме того, недостаточный контроль уровня глюкозы крови у пациентов был ассоциирован с ощутимо большей плотностью колонизации язв Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. Грибковые микроорганизмы были выявлены в 80 из 100 проанализированных случаев синдрома диабетической стопы, при этом Cladosporium herbarum и Candida albicans были определены как наиболее распространенные виды, колонизирующие кожные повреждения. В хронических долго не заживающих ранах с неблагоприятными клиническими исходами, помимо высокого грибкового разнообразия, обнаруживались бактериальные и грибковые биопленки [636].

МИКРОБИОМ В НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ

За последние несколько лет был отмечен серьезный прогресс в характеристике взаимодействий между ЦНС, локальной нервной системой кишечника и самим ЖКТ. Серия революционных доклинических исследований показала важную роль микробиома кишечника во взаимодействиях с ЦНС. Основываясь на исследованиях с использованием стерильных от микробов мышей, исследователи выяснили, что микробиом способен влиять на эмоциональные реакции, системы регуляции стресса и болевых реакций, а также на нейромедиаторы в ЦНС. В то же время для формулировки однозначных выводов в отношении функционирования оси «микробиом-ЦНС» пока что не хватает объемных доказательных исследований на человеческой популяции [637].

Взаиморегуляция микробиома и ЦНС также опосредована нейротрансмиттерными системами [638]. Известно, что биогенные амины, которые имеют рецепторы на клетках как нервной, так и иммунной системы, являются ключевыми медиаторами этой взаиморегуляции. К примеру, роль серотонина, дофамина и нораденалина активно обсуждается в иммунопатогенезе рассеянного склероза (РС) [639, 640]. Давно известно, что биогенные амины участвуют в регуляции кишечной секреции и моторики. При этом представители кишечного микробиома могут не только опосредованно влиять на синтез нейротрансмиттеров путем воздействия на уровни метаболитов, необходимых для их продукции, но и самостоятельно синтезировать биогенные амины [641-644]. Известны и опредленные особенности видовой продукции биогенных аминов, к примеру Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. продуцируют g-аминомасляную кислоту; Escherichia spp., Bacillus spp. и Saccharomyces spp. - норадреналин; Candida spp., Streptococcus spp., Escherichia spp. и Enterococcus spp. - серотонин; Bacillus spp. - дофамин; Lactobacillus spp. - ацетилхолин [645].

Известно, что более 90% всего серотонина в организме человека вырабатывается именно в кишечнике, где присутствует более 10 разных типов серотониновых рецепторов. Показано, что продукция серото-нина свойственна для Rhodospirillum rubrum, B. subtilis и S. aureus [638, 646]. Также выявлено, что серотонин стимулирует рост некоторых бактерий, в частности отдельных комменсальных штаммов E. сoli, а также S. cerevisiae, которые могут быть использованы в качестве факторов устойчивости к колонизации кишечника патогенами [638, 647].

Катехоламины, а именно дофамин, норадреналин и адреналин, а также их предшественники, являющиеся важнейшими нейромедиаторами, также могут синтезироваться кишечным микробиомом. При этом известно, что катехоламины в кишечнике разрушаются кишечной моноаминоксидазой, предохраняющей организм от избыточного влияния чужеродных биологически активных моноаминов [648]. Представители кишечного микробиома продуцируют не только катехоламины, но и их предшественники. В частности, продуцируется диоксифенилаланин, который не подвержен действию моноаминоксидазы и может проникать в кровоток, а также проходить через гематоэнцефалический барьер. Также катехоламины кишечного микробиома могут воздействовать на рецепторы кишечных энтерохромаффинных клеток с последующей передачей серотонинергических афферентных импульсов.

Как уже было отмечено, кишечный микробиом не только продуцирует катехоламины. Также его представители обладают рецепторным аппаратом взаимодействия с этими биоактивными веществами. К примеру, у кишечной палочки имеются белковые рецепторы типа QseC, которые функционально схожи (несмотря на структурные отличия) c α-адренергическими рецепторами человека, потому что их взаимодействие с норадреналином и адреналином блокируется именно α-адреноблокаторами (например, фентоламином), но не β-адреноблокаторами (пропранолом и лабеталолом), как это было продемонстрировано P.P. Freestone и соавт. на следующих микроорганизмах - E. coli O157:H7, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica [649, 650]. Эти рецепторные системы кишечного микробиома могут выполнять две функции:

Эти катехоламины в кишечнике способны воздействовать на отдельных представителей микробиома, в том числе стимулировать формирование биопленок [652, 653].

Среди других значимых экспериментальных исследований взаимодействия микробиома кишечника с ЦНС стоит отметить работы, посвященные нейрорегуляции при функциональных расстройствах ЖКТ [654, 655], а также роли микробиома в патогенезе расстройств аутистического спектра (РАС) [656, 657], болезни Паркинсона [554], аффективных расстройств [657, 658], а также хронической боли [659]. Интересным направлением сегодня является изучение циркадных ритмов микробиоты. Известно, что жизнь на Земле диктуется циркадными изменениями в окружающей среде, вызванными вращением планеты вокруг собственной оси. При этом все формы жизни развили циркадные системы, чтобы адаптировать свою физиологию к суточным изменениям геофизических параметров. Важно понимать то, что бактерии микробиома кишечника также служат в качестве сигнального центра между хозяином и внешней средой. Например, недавно Thaiss и соавт. обнаружили, что микробиота подвергается суточным колебаниям в плане ее состава и функций и что эти колебания важны для поддержания метаболического гомеостаза хозяина [9, 660].

Тем не менее, несмотря на полученные экспериментальные лабораторные данные, сегодня необходимы тщательно разработанные клинические исследования для определения практического применения знаний о связи кишечного микробиома и ЦНС у людей. Эти исследования должны включать характеристику профилей и метаболической активности микробиома у крупных когорт пациентов с учетом генетики хозяина, привычек питания, использования лекарств, состояния здоровья и сопутствующих заболеваний по сравнению с тщательно подобранными группами контроля. Контролируемые интервенционные исследования также необходимы для тестирования потенциальных эффектов пробиотиков, антибиотиков, модификаций диеты и, возможно, ТФМ у пациентов с нарушениями ЦНС. Далее мы обозначим основные практические вопросы в области ассоциации микробиома и ЦНС человека.

В экспериментальных исследованиях на животных было выявлено, что изменения в составе микробиома приводили к изменениям молекулярных сигнальных взаимодействий в ЦНС, при этом отмечались половые различия [661, 662], однако поведенческие изменения не были зафиксированы. Половые различия могут иметь особое значение в заболеваниях психической сферы, поскольку женщины значительно чаще, чем мужчины, страдают от тревожных и депрессивных расстройств [663-665]. Задача будущих исследований - изучить потенциальные половые различия в поведении в ассоциации с нейробиологическими субстратами, в том числе микробиомом у людей.

Несколько опубликованных исследований показали связь между микробиомом, обучаемостью и памятью [666, 667]. В дальнейшем будет важно расширить эту область исследований, в частности изучить роль микробиома в процессе развития ЦНС и в нарушениях обучаемости у детей.

Использование антибиотиков у детей существенно влияет на характеристики микробиома [668], и все же ассоциация данных нарушений с процессом развития ЦНС неизвестна. Важно отметить, что детский возраст - период, когда структура и функция микробиома наиболее динамичны, и поэтому необходимо изучить, как взаимодействие мозга и комменсальных микроорганизмов может влиять на процесс развития ЦНС и риск психических заболеваний.

Несколько исследований сообщили об изменениях профилей микробиома у пациентов с РАС [669-673]. Хотя эта область исследований является принципиально новой и консенсус по оценке результатов исследований еще не установлен, это явно перспективное поле для клинических исследователей.

Активная исследовательская работа сегодня продолжается для решения вопроса, можно ли перенести выявленные в экспериментах на животных микробиом-ассоциированные нарушения функции ЦНС в клинику, особенно в группах пациентов с психиатрическими заболеваниями. Эти исследования помогут ответить на вопрос, как комменсальные бактерии влияют на характеристики личности у людей.

Далее мы обозначим современное состояние проблемы микробиома при отдельных неврологических заболеваниях.

Рассеянный склероз

РС - мультифакториальное, аутоиммунное, воспалительное, демиелинизирующее хроническое заболевание ЦНС, проявляющееся многоочаговой неврологической симптоматикой и имеющее в типичных случаях на ранних стадиях ремиттирующее течение [674].

На сегодняшний день имеется значительное количество весьма разнородных по дизайну и результатам исследований кишечного микробиома у пациентов с РС. Однако по меньшей мере два и более исследований сообщали о том, что в случаях РС имеется более высокая относительная плотность Akkermansia spp. и Methanobrevibacter spp., а также сниженная плотность Prevotella spp. , Bacteroides spp. (в основном видов coprophilus и fragilis) и Faecalibacterium prausnitzii в сравнении со здоровыми представителями контрольной группы [675-679]. Род Methanobrevibacter spp. представляет собой домен археи, является строгим анаэробом, продуцирующим метан, и неоднократно был обнаружен в повышенной плотности в микробиоме у пациентов с РС по сравнению с контролем [680]. В соответствии с этим и объясняется повышенная концентрация метана в выдыхаемом воздухе, наблюдаемая у пациентов с РС по сравнению со здоровыми людьми [677]. С другой стороны, повышенная плотность микроорганизмов - продуцентов метана также может быть ассоциирована с констипацией, что часто присутствует у пациентов с РС [680-682]. Akkermansia muciniphila также отличалась повышенной плотностью у пациентов с РС, при этом схожая ассоциация была выявлена и при болезни Паркинсона [683-686]. В связи с этим стоит отметить, что A. muciniphila вызывает провоспалительный T-клеточный лимфоцитарный ответ in vitro, однако исследования in vivo с использованием лабораторной модели животных с РС до сих пор не смогли уточнить это наблюдение [679]. Интересно также, что A. muciniphila, несмотря на предыдущие данные, может быть полезным микроорганизмом у пациентов с ожирением или метаболическим синдромом, поддерживая метаболическое здоровье и улучшая функцию кишечного барьера [687-689]. Отметим, что эти наблюдения подчеркивают сложность функций и состава кишечного микробиома, а также необходимость понимания его роли в патогенезе РС, при этом полученные данные пока что носят в основном характер ассоциации, а причинно-следственная связь не доказана. При сравнении биоразнообразия в группах с РС и в здоровой популяции было отмечено отсутствие значимых различий с использованием индексов α- или β-разнообразия [690].

Итак, на сегодняшний день пока недостаточно данных для точного определения характерных профилей микробиома у пациентов с РС [691]. Это может быть обусловлено разными вмешивающимися внешними факторами (пол, возраст, особенности питания и др.), среди которых особое значение может иметь терапия иммуномодулирующими препаратами, влияние которых на кишечную микробиоту только начинает изучаться [692, 693]. При этом имеющиеся данные позволяют предположить важное значение кишечно-мозговой оси в иммуно-регуляции при РС. Дальнейшие исследования позволят более точно определить причинно-следственную связь микробиома и РС, а также потенциальные микробиом-ассоциированные методы воздействия на течение заболевания.

Расстройства аутистического спектра

РАС представляют собой гетерогенную группу расстройств нервного развития, характеризующихся дефицитом в общении, социальном взаимодействии и познании. Не выявлено единой этиологии РАС, при этом современные теории предполагают влияние как генетической предрасположенности, так и факторов внешней среды. Генетические факторы считаются причинами примерно в 10-20% случаев РАС, что оставляет открытым вопрос о том, что именно может быть движущей этиологией развития этих расстройств [694]. Факторы внешней среды, которые, как считается, могут повлечь за собой повышенный риск рождения ребенка с РАС, включают загрязнение воздуха, воздействие пестицидов, инфекции или прием антибиотиков во время беременности [695-697]. Установлено, что нарушения иммунной системы и функции ЖКТ часто встречаются у людей с РАС, что также усугубляет особенности поведения, наблюдаемого при данном расстройстве [698, 699]. Новые данные об участии кишечного микробиома в нарушениях нервного развития позволили пока только предположить, что значительную роль в РАС могут играть комменсальные бактерии [700].

На сегодняшний день нет консенсуса в отношении различий в микробиоме при РАС в сравнении со здоровой популяцией, а метаанализ 15 исследований не смог объединить слишком противоречивые результаты [701].

Таким образом, связь между нарушениями микробиома, высокой частотой сопутствующей дисфункции ЖКТ и РАС недостаточно хорошо изучена; тем не менее ряд исследований показывает, что эти взаимоотношения существуют. Отдельные сообщения о том, что поведение пациентов с РАС улучшается после модификации состава и функции их микробиома, подтверждают гипотезу о том, что нарушения микробиома, их влияние на иммунную систему, а также метаболические продукты микробиоты непосредственно связаны с РАС [700]. Поэтому сегодня необходимы дополнительные исследования для выяснения механизмов влияния микробиома на мозг и поведение.

Болезнь Паркинсона

Болезнь Паркинсона - широко распространенное нейродегенеративное заболевание, характеризуемое как двигательными, так и недвигательными (немоторными) нарушениями [702]. Уже известно, что немоторные проявления болезни Паркинсона часто начинаются за годы до того, как выявляются двигательные симптомы. В качестве основного звена патогенеза болезни Паркинсона рассматривается формирование нейротоксических агрегатов небольшого пресинаптического белка α-синуклеина. Важно отметить, что по результатам аутопсии в группе с болезнью Паркинсона скопления α-синуклеина были обнаружены не только в черной субстанции (лат. substantia nigra) экстрапирамидной системы головного мозга, но и в ЭНС!

Поэтому профессором Heiko Braak с коллегами была предложена гипотеза о том, что патологический процесс, который приводит в конце концов к болезни Паркинсона, может первоначально развиваться в ЭНС за годы до развития двигательных нарушений у пациента. Действительно, при аутопсии у пациентов с болезнью Паркинсона скопления α-синуклеина были обнаружены не только в головном мозге, но и в Ауэрбаховом и Мейсснеровом сплетениях ЭНС. Эта концепция впоследствии получила название теории Браака [703]. Далее H. Braak и его коллеги выдвинули идею о том, что патологический процесс инициирует неизвестный микроорганизм, который проникает через эпителиальную выстилку кишечника и запускает патологическое образование α-синуклеина в нервных клетках подслизистых сплетений. После этого ретроградным аксональным и транснейрональным траспортом по блуждающему нерву (n. vagus, Х пара) патоген или его активные вещества способны проникать в подкорковые ядра головного мозга [704].

Позже в нескольких исследованиях на животных теория Браака была проверена; при этом выполнялась инъекция различных типов α-синуклеина в стенку кишечника лабораторных крыс. Результаты показали, что α-синуклеин действительно может транспортироваться ретроградным способом через блуждающий нерв к дорсальному двигательному ядру блуждающего нерва в стволе головного мозга, а также к pars compacta черной субстанции (substantia nigra), при этом была отмечена заметная потеря дофаминергических нейронов, что и составляет основное звено развития болезни Паркинсона [705-707]. Точные транспортные механизмы α-синуклеина из сплетений кишечника в головной мозг продолжают выясняться, однако уже есть данные об экзосомальном транспорте и нанотрубках [708] в процессе ретроградного перемещения α-синуклеина [709, 710]. Кроме того, некоторые из этих исследований показали, что ваготомия (рассечение блуждающего нерва) предотвращала ретроградно перемещение α-синуклеина из ЭНС к ЦНС, то есть из кишечника в головной мозг [706, 711, 712]. Эти работы объясняют, каким образом невропатологические изменения в ЭНС могут распространяться в головной мозг, но не до конца объясняют, какой процесс может быть инициатором этих поражений в ЭНС.

При этом, как известно, нарушения состава и функции кишечного микробиома могут привести к патофизиологическим изменениям не только в ЖКТ, но и в ЭНС, и даже в ЦНС. Считается, что эти микробиом-ассоциированные изменения в итоге могут вызывать потерю дофаминергических нейронов черной субстанции посредством различных механизмов, включая высвобождение нейротоксинов в системный кровоток, снижение продукции нейропротекторных факторов, а также вызывая системные воспалительные и аутоиммунные реакции [713-715]. Это и есть потенциальные точки изучения для новых клинических исследований с целью проверки микробиомных вмешательств, модифицирующих течение болезни Паркинсона, включая КЦЖК, пробиотики, антагонисты ФНО-α или грелин рекомбинантного происхождения.

Шизофрения

Шизофрения является тяжелым психическим расстройством, для которого характерны такие симптомы, как бред, галлюцинации, аберрантный поток мыслей, апатия и медлительность. Это заболевание затрагивает примерно 21 млн человек во всем мире [716]. Вклад фактора наследственности оценивается в ~80% на основе показателей заболеваемости у монозиготных близнецов [717], в то время как модели риска на основе аллелей генов, связанных с шизофренией, предлагают 7% вариабельности в предрасположенности к развитию шизофрении [718]. Таким образом, генетика не может полностью объяснить этиологию шизофрении, и поэтому необходимо изучить другие факторы, особенно факторы внешней и внутренней среды человека [719]. В числе активно изучаемых факторов находится микробиом, который, как известно, весьма динамичен, и на него, в свою очередь, влияют такие элементы образа жизни, как сон или стресс [720, 721].

На сегодняшний день уже имеется не одна работа, посвященная сравнению состава или биоразнообразия микробиома у пациентов с шизофренией с пациентами из здоровой популяции [722-727]. При этом между исследованиями есть значимые различия в дизайне, и соответственно, в полученных результатах, а именно нет консенсуса по части характерного для пациентов с шизофренией профиля микробиома [728]. Однако снижения биоразнообразия, как правило, все-таки у пациентов не наблюдалось. В одном из опубликованных исследований сообщалось, что среди пациентов с первым эпизодом шизофрении, которые в начале исследования по своему микробиому были сходны с контрольной группой здоровых людей, 70% выходили в состояние ремиссии в течение 12 мес, а в группе пациентов, резко отличающихся от здоровых по состоянию микробиома, - только 28% достигали ремиссии в течение этого срока. При этом выявленная ассоциация не была ослаблена включением показателя общей оценки функционирования (Global Assessment of Functioning - GAF) в качестве дополнительной переменной в анализе [722]. Что касается таксономических профилей микробиома при шизофрении, одно исследование показало, что данное заболевание ассоциировано с изменениями в Gammaproteobacteria на уровне класса, Enterobacterial на уровне порядка и Bacteroides fragilis на уровне вида [726], тогда как другое установило, что анализ микробной панели, состоящей из Aerococcaceae spp., Bifidobacteriaceae spp., Brucellaceae spp. , Pasteurellaceae spp. и Rikenellaceae spp. , является достаточным, чтобы отличить пациентов от группы контроля [725]. Что касается потенциального механизма вклада микробиома в патогенез заболевания, отметим, что воспалительные процессы уже давно ассоциированы с шизофренией, хотя эта взаимосвязь в деталях не изучена [729]. Шизофрения также ассоциирована с повышенными уровнями ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОα и сниженным уровнем противовоспалительного ИЛ-10 [730]. Кроме того, у пациентов был выявлен повышенный уровень антител к Saccharomyces cerevisiae, что авторы исследования приняли за маркер воспалительного процесса в кишечнике [731]. Это согласуется со знанием того, что патология ЖКТ является одним из наиболее распространенных сопутствующих заболеваний при шизофрении [732]. Известное при нарушениях микробиома повышение проницаемости кишечной стенки может также служить звеном в патогенезе заболевания. Действительно, повышенные уровни маркера бактериальной транслокации в крови (sCD14) наблюдались у пациентов с шизофренией [733]. Отдельно отмечена связь между иммунной системой и превращением триптофана в кинуренин [734]. Кинуренин является антагонистом метаботропных глутаматных рецепторов широкого спектра действия, что приводит к гипофункции N-метил-D-аспартатных рецепторов (NMDA-рецепторов), а это, в свою очередь, непосредственно связано с течением шизофрении [735]. Среди других интересных наблюдений в данном контексте стоит вспомнить мозговой нейротрофический фактор (англ. brain-derived neurotrophic factor - BDNF). BDNF является ключевым фактором, участвующим в развитии нервной системы, особенно в процессах обучения и памяти, а лабораторные модели изучения шизофрении часто включают изменения BDNF [736]. Интересно отметить, что в исследованиях на грызунах было обнаружено, что антибиотики широкого спектра значительно снижают экспрессию генов BDNF и TrkB (рецептор данного фактора) в гиппокампе мышей [737].

Тем не менее, несмотря на весь объем представленных лабораторных данных, доступные клинические исследования, как правило, не являются проспективными, что делает пока что не ясными причинно-следственные связи между микробиомом и шизофренией. Однако если будущие исследования подтвердят, что нарушения микробиома предсказывают развитие шизофрении, то это приведет к применению в практике целого ряда микробиомных маркеров, в том числе в комплексе с измененными уровнями BDNF и кинуренина. Несмотря на пока что ограниченные данные, есть перспектива использования пробиотиков в качестве вспомогательных средств, направленных на снижение побочных эффектов антипсихотиков или в дополнение к их действию.

Депрессия

Депрессия является одной из наиболее распространенных причин нетрудоспособности во всем мире: более 300 млн человек в настоящее время имеют диагностированную депрессию, что увеличивает заболеваемость более чем на 18% в период между 2005 и 2015 гг. [738].

Известно, что микробиом кишечника вовлечен в патогенез психических расстройств и в ряде клинических исследований уже изучен относительно депрессии [739], а выполнение ТФМ от пациентов с депрессией к лабораторным животным (крысам), как было показано, вызывает у них определенные поведенческие и физиологические особенности депрессивного фенотипа, а также нарушения метаболизма триптофана и функции иммунитета [740]. На сегодняшний день в большинстве работ показано изменение индекса биоразнообразия, то есть при воздействии фактора стресса меняется разнообразие представителей микробиома в различных таксонах. Интересным методологическим подходом является попытка представления изменений биоразнообразия в пределах различных таксономических уровней микробиома как оценка реакции на стресс (рис. 43).

Отметим, что в клинических исследованиях у пациентов с депрессией авторы обнаружили в крови значительно повышенные уровни ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α и С-реактивного белка, а также более высокое соотношение кинуренин/триптофан [741].

Итак, ось «кишечный микробиом-мозг» в настоящее время активно изучается для получения клинических данных о влиянии на когнитивные функции и поведение человека. Далее необходимо выявить ключевые точки приложения возможных лекарств при лечении психоневрологических расстройств на основе микробиома.

МИКРОБИОМ В ГЕПАТОЛОГИИ И ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИИ

Поскольку известно, что 70% крови поступает в печень из воротной вены (v. portae hepatis), которая собирает кровь от всех остальных непарных органов брюшной полости, вполне понятно, что и микробные токсины, и непосредственно микроорганизмы постоянно попадают в печень. Таким образом, функции печени могут зависеть от состава и характеристик кишечных микробов, и главным образом микробных метаболитов.

В нормальных условиях, когда небольшое количество бактерий или бактериальных токсинов попадает в печень, то большинство из них удаляются клетками Купфера. Однако в тех случаях, когда кишечный барьер поврежден воспалительными процессами, или, например, при портальной гипертензии гораздо большее количество бактерий может поступать в печень из кишечника и активировать клетки Купфера (специализированные макрофаги) и звездчатые клетки печени (клетки Ито). Одним из важных факторов патогенеза заболеваний печени является бактериальный ЛПС, который активирует вышеобозначенные клетки печени посредством связывания с TLR-рецептором на их поверхности [742]. После активации этих клеток печени начинается продукция провоспалительных цитокинов, которые и участвуют в повреждении ткани печени [743]. Следует отметить, что алкоголь, как было показано, нарушает плотные соединения кишечного эпителия и, соотвественно, нарушает функцию кишечного барьера, что приводит к бактериальной транслокации и увеличению проникновения метаболитов бактерий в портальную вену печени [744]. К тому же нарушение функции эпителиального барьера кишечника у пациентов с циррозом печени нередко приводит к очень опасному хирургическому осложнению - спонтанному бактериальному перитониту, что на фоне других сопутствующих печеночных нарушений может быть фатальным для пациента. Более того, нарушения перистальтики кишечника, повышенная проницаемость кишечного барьера и повышенная концентрация провоспалительных цитокинов в кишечнике, обнаруженные при циррозе печени с портальной гипертензией, оказывают дополнительное негативное влияние на печень [745]. Актуальные суммарные данные по изменениям кишечного микробиома при заболеваниях печени представлены в табл. 11.

Неалкогольная жировая болезнь печени сегодня является всеьма распространенным заболеванием во всем мире, что в том числе связано с ростом числа пациентов с ожирением и метаболическим синдромом. Считается, что около 10% пациентов с НЖБП имеют реальный риск прогрессии заболевания до неалкогольного стеатогепатита, а также цирроза печени и даже гепатоцеллюлярной карциномы (рака печени). Поскольку теперь стало очевидно, что микробиом кишечника играет важную роль в процессе переваривания пищи, метаболизме энергии и развитии ожирения [754], роль микробов кишечника в развитии и прогрессировании неалкогольной жировой болезни печени стала центром активных исследований.

Известно, что у пациентов с циррозом печени процессы сниженного выделения желчных кислот [755, 756] и портальная гипертензия [757] могут существенно влиять на состав и плотность микробиома кишечника. Более ранние исследования [747, 748] показали, что в микробиоме у пациентов с циррозом печени отмечена более высокая плотность патогенных бактерий, таких как Enterobacteriaceae spp. и Streptococcaceae spp., и более низкая плотность комменсальных бактерий, таких как Bifidobacteria spp. и Lachnospiraceae spp., в сравнении со здоровыми людьми из контрольной группы. Интересно, что независимо от этиологии цирроза печени, состав микробиома менялся сходным образом у большинства пациентов в сравнении со здоровой популяцией, что говорит о том, что микробиом все-таки зависит больше от патологических изменений в ткани и функции печени, чем от причины, их вызвавшей. Более того, наблюдалась положительная корреляция между оценками шкалы тяжести цирроза по Чайлду-Пью у пациентов и плотностью Streptococcaceae spp. в микробиоме, тогда как, например, плотность Lachnospiraceae spp. значительно снижалась у пациентов с циррозом и находилась в обратной корреляции с оценками шкалы Чайлда-Пью [747, 748]. Также важно, что более высокое содержание в микробиоме пациентов с циррозом Streptococcus spp. и Veillonella spp. по сравнению со здоровыми людьми патофизиологически объединяется тем фактом, что эти бактерии более характерны для микробиома полости рта, а не кишечника [749].

Печеночная энцефалопатия является серьезным осложнением, часто встречающимся у пациентов с прогрессирующим циррозом печени. При этом энцефалопатия характеризуется обратимым когнитивным расстройством, которое вызвано не повреждением головного мозга, а воздействием токсических веществ, продуцируемых микробиотой в кишечнике. Хотя и принято считать, что аммиак является основным фактором, вызывающим печеночную энцефалопатию, другие вещества, такие как меркаптаны, фенолы, коротко- и среднецепо-чечные жирные кислоты, а также соединения, подобные бензодиазепину, могут способствовать развитию такого состояния у пациентов с циррозом. Поскольку большинство этих факторов продуцируются или метаболизируются микробиотой кишечника, естественно, что анализ состава микробного сообщества будет важен как для понимания, так и для управления процессом развития печеночной энцефалопатии.

Не так давно Yoshimoto и соавт. [548] сообщили, что в экспериментах по канцерогенезу у мышей с ожирением наблюдались изменения микробиома кишечника, что приводило к увеличению продуцирования микробной дезоксихолевой кислоты в кишечнике, которая, как известно, способна вызывать повреждение ДНК. Повышенные уровни дезоксихолевой кислоты в процессе энтеропеченочной циркуляции индуцируют сенесцентный секреторный фенотип у звездчатых клеток Ито в печени, которые и начинают выделять провоспалительные и канцерогенные факторы. Для более полного восприятия процесса напомним читателю, что такое сенесцентные (старые) клетки. По версии профессора James L. Kirkland, директора Центра по изучению проблем старения в клинике Мейо (США), сенесцентные клетки - это «хорошие граждане, но плохие соседи». Так их называют, когда нужно объяснить, зачем разрабатывается терапия для устранения сенесцентных клеток из организма. Считается, что эти стареющие клетки поддерживают частичную функциональность, но разрушают свою микросреду. Эти сенесцентные клетки не могут делиться, зато они активно выделяют ряд медиаторов воспаления, в том числе цитокины, хемокины и протеазы благодаря так называемому сенесцентному секреторному фенотипу, ассоциированному с процессом старения. Число клеток с таким секреторным фенотипом увеличивается во многих тканях с возрастом [758-761].

Если вернуться к эксперименту Yoshimoto и соавт., то мы увидим, что у мышей с нарушениями состава микробиома, ожирением и сенесцентным секреторным фенотипом клеток Ито в печени быcтро развивался рак печени после нагрузки химическим канцерогеном, в отличие от контрольной группы [548]. Эти впечатляющие данные показывают, что бактериальные метаболиты кишечника могут способствовать развитию рака печени на фоне ожирения. Таким образом, прогресс в изучении микробиома в скором времени может не только внести коррективы в понимание патогенеза заболеваний печени, но и предложить эффективные микробные методы их коррекции.

СРК - распространенное функциональное расстройство гастроэнтерологического профиля, характеризуемое хронической периодической болью в животе, изменениями в функциях кишечника и такими симптомами, как вздутие живота и метеоризм. У пациентов с СРК нарушения микробиома кишечника ассоциированы с увеличенным болевым восприятием и повышенной проницаемостью слизистой оболочки, что вызывается недостаточным эпителиальным барьером слизистой оболочки, неадекватным иммунным гомеостазом кишечника. Вместе эти механизмы способствуют развитию воспалительных процессов в кишечнике и индуцируют локальные иммунные реакции. Кроме того, патогенез СРК связан с нарушениями моторики кишечника, изменениями в ЭНС и даже ЦНС [762-764]. Разрозненные и зачастую противоречивые метатаксономические данные свидетельствуют о том, что при СРК в микробиоме присутствует повышенная относительная плотность различных видов провоспалительных бактерий с большим вкладом Enterobacteriaceae spp. [764, 765]. В целом сегодня появляется все больше фактов, подтверждающих обоснованность терапевтических подходов при СРК на основе вмешательства в микробиом и ТФМ.

ВЗК представляют собой комплекс иммуноопосредованных воспалительных заболеваний, которые поражают ЖКТ человека. Двумя основными вариантами ВЗК являются болезнь Крона и неспецифический язвенный колит. Этиология ВЗК до сих пор не совсем понятна. Тем не менее несколько исследований подтверждают гипотезу, что его начало обусловлено сочетанием генетических факторов, иммунной дисрегуляции и внешних триггеров [766]. Современная теория патогенеза ВЗК заключается в том, что заболевание происходит из-за хронического воспаления кишечника, возникшего вследствие дизрегуляции локального иммунного ответа у генетически предрасположенных людей, чей кишечный микробиом претерпевает патологические изменения [767]. Большая распространенность ВЗК в странах Северной Америки, а также повышенный риск развития ВЗК у людей, иммигрироваших в эти страны, поддерживают наше понимание о корреляции между заболеваемостью ВЗК и западным типом питания [768]. Поэтому и считается, что основным внешним фактором, который индуцирует начало ВЗК, является диета. Результаты исследований, направленных на характеристику кишечного микробиома пациентов, страдающих ВЗК, несмотря на некоторые различия, указывают на общее уменьшение биоразнообразия микробиома [767], а также уменьшение содержания конкретных таксонов, включая Firmicutes spp., Bacteroidetes spp., Lactobacillus spp. и Eubacterium spp. [769]. У пациентов с ВЗК также наблюдается сокращение бактерий, продуцентов бутирата, КЦЖК, положительно влияющей на кишечный гомеостаз и снижающей активность воспалительных процессов [770, 771].

МИКРОБИОМ В ОНКОЛОГИИ

За очень короткое время иммунотерапия стала самой эффективной и быстрорастущей областью в онкологии. Многие онкозаболевания, которые еще десятилетие назад считались практически приговором, сегодня поддаются лечению с помощью иммуномодулирующих средств. Более того, есть мнение, что с вводом в клиническую практику новых иммунопрепаратов закончится эра массовой хирургической онкологии. Значимость иммунотерапии для человечества была признана Нобелевской премией по физиологии и медицине 2018 г., присужденной за открытие белка CTLA-4 (англ. cytotoxic T-lymphocyte-associated protein) James P. Allison и белка/лиганда PD-1/PD-L1 (англ. programmed cell death) - Tasuku Honjo [772]. Злокачественные опухоли используют пути PD-1/PD-L1 или CTLA-4 для обхода иммунной системы человека, у которой, как известно, имеется выраженный противоопухолевый эффект [773]. Разрушение этого пути с помощью целевого действия моноклональных антител может обеспечивать пациентам длительные ремиссии при различных онкологических заболеваниях. Иммунопрепараты, действующие по описанному механизму, одобрены и широко внедрены во всем мире для лечения меланомы, рака легких, уротелиального рака, плоскоклеточного рака головы и шеи, почечно-клеточного рака и лимфомы Ходжкина [774].

Результаты различных исследований предоставили убедительные доказательства важности комменсальных бактерий микробиома в определении эффективности лечения противоопухолевыми иммуно-препаратами. Кишечный микробиом стал рассматриваться как новый прогностический биомаркер, а также потенциальная терапевтическая цель воздействия для повышения эффективности иммунотерапии.

Установлено также, что микробиота кишечника может модулировать противоопухолевый иммунитет путем активации дендритных клеток в кишечнике и даже при транслокации из кишечника в другие области тела. Непосредственное перемещение кишечных бактерий к ткани опухоли или в лимфатические узлы, дренирующие опухоль, с последующей активацией цитотоксических Т-лимфоцитов предлагается как один из механизмов, связывающих кишечный микробиом с противоопухолевым иммунитетом [775]. Ткани вне ЖКТ, кстати, ранее считались стерильными (безмикробными). Недавнее исследование показало наличие жизнеспособных, комменсальных бактерий в тканях опухоли поджелудочной железы, что снизило эффективность химиотерапии гемцитабином посредством ускорения метаболизма препарата [776].

Важно отметить, что микробные белки, некоторые из которых достаточно похожи на опухолевые антигены, могут индуцировать противоопухолевый Т-клеточный ответ посредством антигенной мимикрии или перекрестной реактивности с помощью дендридных клеток. Т-клетки, активированые таким механизмом, могут затем перемещаться в отдаленные локализации опухоли и распознавать злокачественные клетки [777]. Экспериментальные исследования показали, что Т-клетки, специфические для некоторых видов кишечных бактерий, действительно усиливают противоопухолевый иммунный ответ. К примеру, передача Bacteroides fagilis -специфических CD4⁺ Т-клеток контролировала рост опухоли и увеличивала эффективность CTLA-4 иммунотерапии в эксперименте на стерильных мышах [778]. Появляющиеся результаты клинических исследований подтвердили связь между микробиомом и эффективностью иммунотерапии на основе ингибиторов иммунной контрольной точки (англ. immune checkpoint inhibitors, ICI). Пациенты, получавшие антибиотики в начале лечения анти-PD-1 иммунопрепаратами, показали более низкую выживаемость без прогрессирования, а также более низкую общую выживаемость [779]. Образцы кишечного микробиома от пациентов, которые ответили на терапию анти-PD-1 иммунопрепаратами, показали относительно высокую плотность Akkermansia muciniphila. Более того, прием пробиотического препарата, содержащего A. muciniphila, восстановил эффективность блокады PD-1 после ТФМ с использованием материала от неответчиков на иммунотерапию [779]. Выполнение ТФМ в эксперименте от пациентов-ответчиков на терапию ингибиторами иммунной контрольной точки к безмикробным мышам повышало эффективность этих иммунопрепаратов [780]. Также показано, что стерильные (безмикробные) мыши отличаются более низкой эффективностью лекарственной блокады CTLA-4, и эта эффективность лечения может быть восстановлена путем введения животным бактерий, широко представленных у мышей - ответчиков на лечение [778]. Что касается побочных эффектов лечения, то определены конкретные представители микробиома ЖКТ, связанные с развитием колита после блокады CTLA-4 [369].

Итак, ряд исследований показал, что антибиотики могут снижать эффективность иммунотерапии рака. В нескольких продолжающихся клинических исследованиях изучается влияние процедуры ТФМ на эффективность иммунотерапии у людей [781].

Одна из новаторских работ посвящена теме ТФМ пациентам с метастатической меланомой, устойчивой к лечению анти-PD-1. В качестве доноров материала были отобраны пациенты с метастатической меланомой, которые достигли длительного полного ответа на лечение анти-PD-1. Три пациента достигли частичного или полного ответа на лечение после ТФМ. Судя по предварительным данным, ТФМ у пациентов с метастатической меланомой безопасна и способна менять микробиом кишечника реципиента, так чтобы он соответствовал микробиому донора. Эти изменения могут приводить к индукции внутриопухолевой активности Т-клеток и обеспечивать клинико-рентгенологический положительный эффект у пациентов, ранее не ответивших на лечение [782].

МИКРОБИОМ В ХИРУРГИИ

Хотя современнные успехи в медицине значительно улучшили наши подходы к лечению хирургических заболеваний, остаются не до конца выясненными вопросы развития ряда патологических состояний. Можно предположить, что микробиом представляет собой недостающий ключ к выяснению патогенеза хиругических заболеваний брюшной полости. Дивертикулярная болезнь чрезвычайно распространена (по разным данным, до 80% пациентов зрелого и пожилого возраста [783]). Cчитается, что до 25% пациентов имеют риск развития острых или хронических хирургических осложнений [784]. Как правило, низкое содержание растительной клетчатки в пище, а также возраст пациента являются двумя основными факторами патогенеза дивертикулярной болезни. Вклад микробиома в патогенез дивертикулярной болезни только начинает изучаться, однако ассоциации между нарушениями кишечного микробиома и дивертикулитом уже обсуждаются в связи с процессом локального воспаления [785]. В отдельных работах было отмечено, что характер воспалительного процесса при дивертикулите имеет определенное сходство с ВЗК, болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом, в том числе и клиническое сходство в периодах обострения с последующими периодами ремиссии [786]. Воздействия на микробиом посредством пробиотиков пока не показали эффективности в хирургии, в частности недавний систематический обзор 11 исследований по влиянию пробиотиков на дивертикулярную болезнь не продемонстрировал их достаточной эффективности [787].

Несостоятельность кишечных анастамозов - серьезная проблема современной хирургии с потенциально опасными последствиями, которая является одной из ведущих причин хирургического сепсиса, приводит к увеличению пребывания в стационаре, а показатель летальности достигает 15% [788, 789]. Недавно начато изучение изменения нормального микробиома кишечника в ответ на хирургическое вмешательство. Например, в экспериментальных моделях с помощью секвенирования гена 16S рРНК были впервые даны характеристики изменений в микробиоме при частичной колэктомии и первичном анастомозе [790]. При этом было отмечено нарастание относительной плотности Enterococcus spp. , Shigella/Escherichia spp. в 500 и 200 раз соответственно в ткани анастомоза на седьмой день от операции в сравнении с днем оперативного вмешательства. Совсем недавно был установлен и молекулярный механизм несостоятельности кишечного анастомоза [791]. Было показано, что штаммы Enteroccus faecalis с высоким содержанием коллагеназы могут инициировать несостоятельность анастомоза посредством активации gelE/sprE (внеклеточные протеазы), вызывающих прямое разрушение коллагена на месте недавно созданного анастомоза, а также и косвенно путем индукции матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9; «желатиназа B») самого пациента. Эти исследования предоставляют пока что первое молекулярное доказательство того, как представители микробиома могут приводить к деградации ткани анастомоза.

Отметим, что знание микробиома человека в его связи с хирургическими заболеваниями имеет огромный потенциал, но пока находится на начальном этапе накопления данных. Принимая во внимание, что постулат Коха («один микроорганизм - одно заболевание») уже не всегда объясняет последствия сложных нарушений в микробной экосистеме, новые некультуральные методы исследования позволят предложить более детальную экологическую картину роли микробиома в хирургии.

МИКРОБИОМ В ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ

В области трансплантации солидных органов изучение микробиома только начинает активно развиваться, но уже ясно, что ряд исходов трансплантации, такие как риск инфекционных осложнений, отторжения органа и других иммунологических нарушений зависит от состава микробного сообщества реципиента, а зачастую и микроорганизмов донорского органа. Более того, имеются эмпирические данные о том, что чем больше плотность микроорганизмов в определенном органе или ткани человека, тем хуже долгосрочные исходы сохранения пересаженного органа.

Нарушения кишечного микробиома давно были описаны у пациентов с циррозом печени, особенно при декомпенсации цирроза и печеночной энцефалопатии [792]. Кроме того, есть данные о том, что трансплантация печени может быть связана с коррекцией нарушения кишечного микробиома [793]. В течение периода после трансплантации относительная плотность потенциально опасных таксонов, таких как Enterobacteriaceae (Escherichia spp., Shigella spp., Salmonella spp.), была снижена, в то время как относительная плотность потенциально полезных комменсалов Lachnospiraceae spp. и Ruminococcaceae spp. была увеличена [794].

При выполнении трансплантации почки те пациенты, которые вначале имели меньшее разнообразие кишечного микробиома, отличались большим риском развития диареи в течение первых 90 дней после трансплантации [795]. Реципиенты трансплантата почки, у которых развились инфекции мочевыводящих путей, вызванные энтерококками, предварительно отличались более высокой плотностью энтерококков в кишечном микробиоме [796].

МИКРОБИОМ В АКУШЕРСТВЕ И ГИНЕКОЛОГИИ

Начиная с XIX в. ученые использовали первые появляющиеся методы для изучения микроорганизмов в женских половых путях, например окрашивание по Граму, световую микроскопию, посевы на питательные среды и т.д. По мере развития технологий культуральные методы становились совершеннее, появился метод ПЦР, и специалисты смогли обнаружить и идентифицировать различные виды микроорганизмов, составляющих микробное сообщество влагалища. Современные некультуральные технологии, не зависящие от способности бактерий расти на искусственных питательных средах, выявили сложную экосистему, в которой доминируют лактобактерии, но также присутствуют и другие ранее не изученные микроорганизмы. Это понимание сложности и разнообразия бактериального микробиома влагалища стало возможно благодаря эволюции молекулярно-генетических методов, а именно секвенирования нового поколения в сочетании с метаболическими исследованиями [296, 797].

Сегодня известно, что нарушения микробиома влагалища могут способствовать целому ряду патологических состояний - от локализованных инфекций до угрожающих жизни заболеваний.

Бактериальный вагиноз

БВ является нарушением состава и функции микробиома влагалища, при котором нормальное сбалансированное микробное сообщество замещается анаэробными условно патогенными бактериями. При этом формируется ситуация, когда определенные бактерии (Gardnerella vaginalis, штаммы Prevotella и Mobiluncus, Atopobium vaginae и др.), присутствующие во влагалище, получают возможность наращивать свою плотность. БВ ассоциирован с некоторыми клиническими исходами, включая преждевременные роды, осложнения течения беременности [798], а также с повышенным риском инфекций, передаваемых половым путем (например, Chlamydia trachomatis, ВИЧ, Neisseria gonorrhoeae и вирусы простого герпеса-2) и другими расстройствами половой сферы [799, 800]. Стоит подчеркнуть, что сам БВ не считается инфекцией, передаваемой половым путем, потому что экзогенный патоген не участвует в патологическом процессе. Общими симптомами БВ являются белые выделения из влагалища, зуд, неприятный запах, боль и жжение [801]. Неприятный запах обусловлен особенностями анаэробного метаболизма, а именно продукцией летучих полиаминов и их производных (кадаверина, путресцина, спермидина, спермина). В целом БВ можно рассматривать как многофакторное заболевание, опосредованное сложным взаимодействием микробиомных факторов, факторов хозяина и окружающей среды. Данное патологическое состояние в основном происходит при более высоком рН влагалища (>4,5), повышении относительной плотности анаэробных бактерий во влагалище в сочетании со снижением плотности лактобактерий. У женщин как до, так и после менопаузы с БВ связан ряд других проблем в репродуктивной и половой сферах. При этом «классический» лабораторный признак БВ - ключевые клетки - представляют собой клетки поверхностного слоя эпителия с адгезированными на них микроорганизмами [802].

Одним из вопросов для обсуждения является роль Gardnerella vaginalis в патогенезе БВ, ведь именно эта бактерия долгое время считалась основной причиной данного состояния. При этом неоднократно отмечалось, что у значительного количества здоровых женщин, вплоть до 70%, в малых количествах данная бактерия определялась во влагалище [803, 804]. Известно, что G. vaginalis продуцирует ваголизин, цитолизин, приводящий к отслоению участков эпителия влагалища. Предлагалось рассматривать данную бактерию как первичного колонизатора слизистой оболочки влагалища, который акивно способствует образованию биопленок и создает таким образом «плацдарм» для размножения других, анаэробных микроорганизмов, например Atopobium vaginae. Показано, что дейтсвительно биопленки при БВ во многих случаях состоят в основном из этих двух микроорганизмов с небольшим участием некоторых видов лактобактерий [805, 806]. Именно форма биопленки позволяет многим сообществам условно патогенных бактерий длительно сосуществовать во влагалищном микробиоме и в том числе сохранять устойчивость к антимикробной терапии. Нельзя не отметить также роль ЛПС грамотрицательных бактерий, уровень которых повышается во влагалищной среде в ситуациях нарушений состава микробиома. Системные патофизиологические эффекты ЛПС включают целый комплекс иммунопатологических реакций и требуют дальнейшего клинического осмысления, в том числе при преэклампсии, бесплодии, невынашивании беременности, преждевременных родах и других акушерско-гинекологических заболеваниях [807].

Цитолитический вагиноз

Цитолитический вагиноз (цитолиз Додерлейна) также обозначается как синдром избыточного роста лактобактерий. Чрезмерный рост лактобактерий приводит к ситуации цитолитического вагиноза. При этом резкое доминирование лактобактерий вызывает лизис эпителиальных клеток влагалища, что приводит к зуду, раздражению влагалища, чувству жжения, другим воспалительным явлениям, дизурическим расстройствам и болезненному половому акту (диспареунии). Часто это состояние неверно трактуется как кандидозный вульвовагинит из-за схожести внешних симптомов. Имеются данные о том, что пациенты с СД более восприимчивы к развитию цитолитического вагиноза, а симптомы наиболее выражены во время высоких уровней прогестерона и эстрогена, то есть в лютеиновую фазу менструального цикла [296].

Кандидозный вульвовагинит

Кандидозный вульвовагинит является второй по распространенности локализованной вагинальной инфекцией после БВ и вызывается представителями дрожжевых грибов рода Candida spp. В отличие от БВ, кандидозный вульвовагинит ассоциирован с более низким значением рН влагалища (<4,5) [294]. В случаях, когда данное состояние вызвано Candida albicans, это трактуется как неосложненный кандидозный вульвовагинит и, как правило, приводит к легким и среднетяжелым формам локализованных инфекций влагалища, которые эффективно лечатся широким спектром противогрибковых средств. Кандидоз, вызванный non-albicans видами дрожжевых грибов из рода Candida spp., чаще представляет собой хронические и рецидивирующие формы.

При этом женщины детородного возраста, женщины в постменопаузе на фоне применения экзогенного эстрогена, а также женщины с иммуносупрессией более подвержены риску развития хронических и рецидивирующих форм кандидозного вульвовагинита [294, 296]. Общие симптомы кандидозного вульвовагинита включают воспаление, отек, творожистые выделения из влагалища, дизурические явления и зуд. Также известно, что повышение уровня эстрогена, СД, иммуносупрессия и длительное применение антибиотиков ассоциированы с этим патологическим состоянием.

Микробиом влагалища и ВИЧ-инфекция

Нарушения вагинального микробиома могут быть ассоциированы с повышенным риском инфицирования ВИЧ. Рядом исследователей было отмечено, что отдельные пейзажи микробиома влагалища, как и повышенная относительная плотность отдельных бактерий в микробиоме, связаны с повышенным риском заражения ВИЧ посредством нескольких потенциальных механизмов, например за счет воспаления, разрушения химических и физических барьеров для проникновения ВИЧ [808]. Кроме того, БВ, при котором вагинальный микробиом отличается повышенной плотностью различных анаэробных бактерий, также повышает риск инфицирования ВИЧ [809, 810].

Актуальное исследование показало, что молодые южноафриканские женщины с разнообразным вагинальным микробиомом имели в четыре раза большее количество активированных CD4⁺ лимфоцитов во влагалище, что, по выводам авторов, существенно повышало риск их заражения ВИЧ в сравнении с женщинами с L. crispatus -доминирующим вагинальным микробиомом. Кроме того, повышенная относительная плотность отдельных бактериальных таксонов (например, Sneathia sanguinegens, Mycoplasma spp., Prevotella melaninogenica, Prevotella bivia и Veillonella montpellierensis) также повышала риск инфицирования ВИЧ [808, 809, 811]. Также отмечалась роль других генетических и поведенческих факторов, ассоциированных с повышенным риском заражения ВИЧ посредством влияния на микробиом влагалища, например использование локальных средств, меняющих рН влагалища и, как сообщалось, ассоциированных с воспалительными процессами, нарушением эпителиального барьера и т.д. [812].

Микробиом и осложнения при беременности

Вполне признано, что влагалищный микробиом играет важную роль в поддержании общего здоровья женщин. Динамика микробиома влагалища в течение физиологических периодов всей жизни дает представление о мутуалистическом отношении между женщиной и ее влагалищной микробиотой. Например, общеизвестно, что микробные взаимодействия включены в патогенез бесплодия (при поражении маточных труб), но не совсем ясно, каким образом нарушения микробиома могут привести к бесплодию. Недавно опубликованные исследования в области репродуктивной медицины показали связь микробиома с результатами вспомогательных репродуктивных технологий. Авторы отмечают, что только влагалищный микробиом (и микробиом шейки матки) может быть надежно отобран без возможного риска контаминирования, поэтому результаты оценки микробного состава других участков женского репродуктивного тракта следует интерпретировать с осторожностью. При этом состав микробиоты влагалища до начала гормональной поддержки вспомогательных репродуктивных технологий, по-видимому, является прогностическим фактором эффективности методов экстракорпорального оплодотворения/экстракорпорального оплодотворения - интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов [813]. При этом состав именно влагалищного микробиома, а не микробиома семенной жидкости определяет эффективность процедур вспомогательных репродуктивных технологий [814]. В частности, R. Koedooder и соавт. показали, что женщины с низким содержанием Lactobacillus spp. в микробиоме влагалища имели меньше шансов на успешную имплантацию эмбрионов [815]. Кроме того, стабильность микробиома влагалища определяла более высокие шансы на успешную беременность в случае вспомогательных репродуктивных технологий [816]. По данным же K. Kitaya и соавт., именно микробиота эндометриальной жидкости, а не микробиота влагалища показала значительные различия между группой женщин с неудачной повторной процедурой имплантации эмбриона и контрольной группой [817].

Наиболее активно обсуждается вопрос, какие характеристики микробиома влагалища могуг быть предикторами преждевременных родов. Получены первые данные, например Hyman R.W. et al. показали, что беременные с более высокой плотностью лактобацилл во влагалище имели меньший риск преждевременных родов [818]. Аналогичные данные опубликованы в 2020 г. другой исследовательской группой из Великобритании, а именно было показано, что состав микробиома влагалища у женщин при невынашивании в I триместре беременности ассоциируется со снижением плотности Lactobacillus spp. [819]. В целом сегодня известно, что отдельные виды Lactobacillus spp. как защитные представители в микробиоме влагалища также являются защитой от невынашивания беременности, тогда как присутствие условно патогенных видов, таких как Prevotella spp., Mycoplasma spp., Sneathia amnii, считается фактором риска прерывания беременности и, в свою очередь, коррелирует с повышением уровня провоспалительных цитокинов во влагалищной среде [820-822]. Среди других изучаемых ассоциаций микробиома в последнее время обсуждается его роль в патогенезе преэклампсии [823].

Длительное время в медицине считали, что плацента является стерильным органом при нормально протекающей беременности, а присутствие бактерий по результатам микробиологического исследования было диагностическим признаком внутриутробной инфекции со значительным риском развития преждевременных родов [824]. Тем не менее все большим количеством исследователей признано несоответствие между исходом беременности и наличием бактерий в плаценте по результатам стандартных микробилогических культуральных методов исследования [825-831]. Присутствие в плаценте бактерий при отсутствии гистологических признаков инфекционного воспаления было обнаружено неоднократно за последние несколько десятилетий [824, 830, 832-834]. Это привело к пониманию необходимости смены устоявшихся догм о роли бактерий в развитии внутриутробных инфекций при беременности [78-79]. На сегодняшний день одна из самых актуальных дискуссий - имеет ли право на сущестование термин «плацентарный микробиом», что принципиально меняет взгляды, существовавшие десятилетиями, о стерильном «коконе» для плода во время беременности [835].

Известна существующая опасность попадания микробов полости рта в кровоток на фоне периодонтита или стоматологических процедур [836]. Многими авторами доказано, что периодонтиты у беременных ассоциированы с повышением риска наступления преждевременных родов [837-839]. На экспериментальных моделях животных показано, что бактерии из полости рта могут распространяться гематогенно в плаценту [840, 841] и могут быть связаны с осложнениями беременности [840, 842, 843]. Fusobacterium nucleatum является микроорганизмом полости рта, который наиболее часто выявляют в диагностических образцах биологического материала, взятого после преждевременных родов, при разрыве плодных оболочек и мертворождении [825, 844, 845]. Ряд авторов обнаружили Fusobacteria в достаточно высокой плотности в микробиоме плаценты и в пуповинной крови [78, 79, 846].

Стоит отметить, что до сих пор открыт вопрос о наиболее правильной экспериментальной модели исследований микробиома матки.

Если в отношении экспериментального исследования микробиома ЖКТ стандартом на сегодняшний день являются лабораторные мыши, в том числе безмикробные линии, то в отношении микробиома матки до сих пор не ясно, насколько микробиота матки молочных коров может быть сопоставимой моделью для изучения микробиоты женщин.

В одной из работ, где авторы приняли вышеобозначенную лабораторную модель микробиоты матки, были собраны образцы «маточного смыва» на 30-й день после родов у 13 здоровых коров, 5 коров с субклиническим эндометритом и 9 коров с клиническими признаками эндометрита. По результатам линейного дискриминантного анализа размера эффекта, у коров с клиническим эндометритом микробиота матки характеризовалась повышенной плотностью Fusobacterium и появлением в ее составе бактерий Trueperella и Peptoniphilus. У коров с субклиническим эндометритом микробиота матки характеризовалась обогащением Lactobacillus и Acinetobacter.

Также C.L. Haggerty и соавт. показали, что у женщин с воспалительными заболеваниями тазовых органов в образцах эндометрия выявляли специфические для данного заболевания бактерии, такие как Sneathia sanguinegens, Sneathia amnionii, Atopobium vaginae [804].

Итак, исследования, проведенные в рамках международного Проекта микробиома человека, продемонстрировали индивидуальное разнообразие микробиоты в организме человека. Действительно, микробиота влагалища уникальна тем, что у многих женщин чаще всего преобладают виды Lactobacillus. Однако у некоторых женщин отмечается сниженная плотность Lactobacillus spp. и влагалищная микробиота состоит из широкого спектра облигатных и факультативных анаэробов, что в целом коррелирует с повышенным риском развития инфекций, а также ассоциировано с неудачными репродуктивными и акушерскими исходами. Интересно, что уровень защиты от инфекций также может варьировать в зависимости от конкретных видов и даже штаммов Lactobacillus, а некоторые виды Lactobacillus, хотя и доминируют в составе влагалищной микробиоты, не обладают защитным эффектом. Это может влиять на риск развития инфекций, передаваемых половым путем и, возможно, на неблагоприятные репродуктивные исходы, такие как трубное бесплодие. Таким образом, состав и функция микробиоты влагалища играют важную роль в течении беременности и фертильности женщин, и новые знания откроют нам возможности клинической интерпретации и эффективных медицинских вмешательств в этой области.

То, что мы знаем сегодня о комменсальных бактериях в области акушерства и гинекологии, - гораздо более сложная и многогранная картина в сравнении с тем, как это оценивалось еще 10 лет назад. Влагалищный микробиом значительно варьирует от одной женщины к другой на протяжении всей жизни и ассоциирован с рядом состояний. Даже считавшиеся ранее стерильными органы женской репродуктивной системы, оказывается, содержат небольшие количества бактерий микробиома. Влияние антибиотиков на микробиом у женщин еще предстоит более точно охарактеризовать, а системный анализ микробиома в аспекте репродуктивного здоровья, несомненно, прольет свет на наиболее значимые и запутанные нарушения этой сферы. Эта сложная область исследований в сочетании с метагеномными технологиями в будущем позволит ученым-репродуктологам разгадать тайны не только о здоровье и болезнях, но и, возможно, пролить свет на коэволюции микробов и людей.

МИКРОБИОМ В РЕВМАТОЛОГИИ

Аутоиммунные заболевания представляют собой гетерогенную группу расстройств, характеризуемых самостоятельными, аутореактивными адаптивными иммунными реакциями, приводящими к повреждению иммуноопосредованного конечного органа пациента. Этиология этих заболеваний почти всегда не до конца известна, но считается, что сложное взаимодействие факторов генетического риска, окружающей среды и случайных явлений приводит к потере иммунологической толерантности и развитию аутоиммунных процессов [847]. Представим, что у конкретного пациента аутоиммунные реакции развиваются не изолированно, а во взаимодействии с микробиотой человека, то есть с триллионами микробных клеток, среди которых имеются бактерии, дрожжевые грибы, археи, простейшие и вирусы. Интересно, что концепция о том, что микроорганизмы могут инициировать аутоиммунные заболевания, не является новой. Задолго до современного понимания патогенеза аутоиммунных реакций бактерии уже были предложены как возбудители многих ревматических заболеваний, включая острую ревматическую лихорадку и РА. Хотя эти первые ранние исследования (более века назад) успешно определили Micrococcus rheumaticus (теперь это Streptococcus pyogenes) в качестве этиологического агента, вызывающего ревматизм («острый ревматизм») у восприимчивого хозяина, обнаружение патогена, относящегося к так называемому в то время хроническому ревматизму, не было успешным [848, 849]. Важно отметить, что длительный доклинический этап аутоиммунных реакций (например, в случае с РА) делает идентификацию соответствующих микробных видов на основе временной связи с исходом почти невозможной [850]. Точно так же модель «один патоген - одно заболевание» вряд ли применима к взаимодействиям между хозяином и микробиотой в патогенезе системных аутоиммунных заболеваний.

Современные достижения в технологиях секвенирования позволили провести исследования состава микробиома у большого числа пациентов, что послужило обоснованием нового взгляда на современную ревматологию.

Ревматоидный артрит

РА представляет собой системное аутоиммунное заболевание, характеризуемое воспалением синовиальной оболочки, эрозией суставов и наличием антител к циклическому цитруллинированно-му пептиду (anti-CCP) [851]. Роль бактерий в иммунопатогенезе РА была обозначена с момента появления теории о микроорганизмах, но попытки идентифицировать хотя бы один значимый вид не дали надежных результатов. Открытие же аллелей генетической предрасположенности (например, аллели гена HLA-DRB1), факторов риска окружающей среды (среди прочего, курение, периодонтит) и посттрансляционного цитруллинирования пептидов в качестве основных детерминант реактивности аутоантител предоставило механистическую основу для понимания вклада микроорганизмов в патогенез РА [852]. Некоторые участки слизистой оболочки были изучены в иммунологическом механизме возникновения РА, включая слизистые оболочки периодонта, легких, кишечника и мочеполовой системы [853]. За последнее десятилетие исследования, основанные на методах секвенирования, привели к новому пониманию роли конкретных участников микробиома в РА. В результате этих исследований в качестве потенциальных кандидатов - возбудителей РА были отмечены Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Prevotella copri [854-856].

Синдром Шегрена

Синдром Шегрена представляет собой системное заболевание соединительной ткани, характеризуемое продукцией аутоантител (чаще всего направленных против рибонуклеопротеинов TRIM21/Ro52/ SS-A, Ro60 и La/SS-B), аутоиммунным разрушением слезных и слюнных желез, а также широким спектром других нарушений желез внешней секреции [857]. Снижение продукции слюны и слезной жидкости, природных источников антимикробных белков и антител, приводит к изменению барьерной функции слизистых оболочек и может способствовать нарушению состава микробиома и их колонизации патобионтами [858]. Более того, в работе T.M. Greiling и соавт. у пациентов были выявлены микробные комменсальные ортологи Ro60 (то есть сходные гены, которые разошлись в результате видообразования). Эти гены были предложены в качестве возможных триггеров образования анти-Ro60 аутоантител при системной красной волчанке. Эти данные предоставляют основу для понимания роли микробиоты как триггеров аутоиммунной реакции при системных заболеваниях соединительной ткани. Интересно, что бактерия Corynebacterium amycolatum, которая активно колонизирует слезные протоки человека, также имеет Ro60 ортолог, что может быть причиной продукции антител против Ro60 при синдроме Шегрена [859]. Исследования показывают, что выраженность офтальмологических и системных проявлений синдрома Шегрена может быть ассоциирована с нарушениями микробиома кишечника. При этом наблюдаемые изменения барьерной функции слизистых оболочек при синдроме Шегрена, в свою очередь, могут способствовать колонизации патобионтами, которые могут запускать иммунные ответы на белки собственных тканей человека.

Системная склеродермия

Системная склеродермия - полиорганное системное заболевание соединительной ткани, характеризуемое васкулопатией и прогрессирующим фиброзом, наиболее интенсивно поражающее кожу, легкие и кишечник. Изменения в этих органах при этом могут серьезно изменить установившийся там микробиом. Неоднократно опубликованные исследования по изучению кишечного микробиома при системной склеродермии неизменно обнаруживали нарушения [860-862]. При изучении кишечного микробиома у 34 пациентов с системной склеродермией была показана более низкая относительная плотность комменсальных родов Bacteroides, Faecalibacterium и Clostridium [863]. При этом род Prevotella был более распространен у пациентов с системной склеродермией с тяжелыми желудочно-кишечными симптомами. Известно, что представители Prevotella spp. индуцируют Th17-опосредованный иммунный ответ, что в эксперименте было связано с развитием колита [864]. Дрожжевые грибы, распространенные в окружающей среде, Rhodotorula glutinis, отмечались в более высокой плотности на коже пациентов с системной склеродермией по сравнению с кожей у здоровых людей контрольной группы [865]. Rhodotorula glutinis имеет роль оппортунистического патогена для человека, однако в целом виды Rhodotorula spp. являются широко распространенными повсеместными грибами в окружающей среде, а также весьма часто контаминируют руки медицинского персонала [866].

Итак, микробиом может быть запускающим фактором ряда аутоиммунных заболеваний, и уже выявлены микроорганизмы, ассоциированные с конкретными заболеваниями, в частности P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans способны управлять процессом цитруллинирования аутоантигена в иммунопатогенезе РА. Бактериальные виды, экспрессирующие определенные гены, ортологи человеческого Ro60, могут индуцировать продукцию анти-Ro60 аутоантител в иммунопатогенезе системной красной волчанки и синдрома Шегрена по причине перекрестной реактивности.

МИКРОБИОМ В ПУЛЬМОНОЛОГИИ

Бронхиальная астма - хроническое воспалительное заболевание, которое проявляется приступами одышки, зачастую сопровождаемой кашлем с возможностью развития приступа удушья. Хотя многие аспекты патогенеза аллергической астмы уже хорошо известны медицинскому сообществу, новые данные о микробиоме позволили взглянуть на проблему с другой стороны. Экспериментальные модели бронхиальной астмы на мышах применяются уже более 100 лет для изучения ее иммунопатологии. За последние годы было показано, что человеческий микробиом является важным компонентом в развитии иммунной системы, в том числе исследована роль воздействия бактерий в раннем детстве на риск появления бронхиальной астмы впоследствии.

Бактериальные виды микробиома кишечника могут быть вовлечены в развитие бронхиальной астмы. В проспективном исследовании 117 детей, разделенных на группы по прогностическому индексу развития бронхиальной астмы, в составе микробиома у детей с положительным индексом в возрасте 3 нед была обнаружена более высокая плотность Bacteroides fragilis и других анаэробных бактерий, чем у детей с отрицательным индексом [867]. Настолько же активно исследуется микробиом дыхательной системы в контексте бронхиальной астмы. Преобладающие бактериальные сообщества респираторного микробиома, ассоциированные с развитием бронхиальной астмы, представлены группами бактерий, не являющихся типичными доминирующими членами микробиома этой локализации [868]. Представители типа Proteobacteria, в частности Haemophilus spp., чаще идентифицируются в респираторном микробиоме пациентов с патологией дыхательной системы. Конкретные семейства бактерий, наблюдаемые чаще в респираторном микробиоме у пациентов с бронхиальной астмой, включают Enterobacteriaceae spp. и Neisseriaceae spp. [868].

В последнее время появились исследования, в которых анализируется грибковая композиция индуцированных образцов мокроты, что показало некоторые различия в видовом составе мокроты у пациентов с бронхиальной астмой и контрольной группой здоровых людей [869]. Например, Malassezia pachydermatis, грибок, который ранее уже ассоциировался с развитием атопического дерматита, наиболее часто встречался в образцах пациентов с бронхиальной астмой. Однако для формулировки однозначных выводов в отношении влияния грибкового сообщества на риск бронхиальной астмы пока что не хватает объемных клинических исследований [870].

МИКРОБИОМ В ПАТОГЕНЕЗЕ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

ствительно может транспортироваться ретроградным способом через блуждающий нерв к дорсальному двигательному ядру блуждающего нерва в стволе головного мозга, а также Атопический дерматит является хроническим воспалительным заболеванием кожи, особенно распространенным у детей. Многофакторный патогенез этой болезни по-прежнему характеризуется многими вопросами, на которые пока не найден ответ. В развитие атопического дерматита вносят вклад наследственность, изменения характера врожденного и приобретенного иммунного ответа, дисфункция кожного эпителия, а также ряд факторов риска внешней среды [871]. Предполагается, что повышенная распространенность атопического дерматита в экономически развитых регионах мира обусловлена чрезмерной гигиеной, сопровождающей западный стиль жизни, что уменьшает образовательное воздействие микробов на иммунную систему ребенка [872, 873].

В частности, младенчество и раннее детство были определены учеными как важные и весьма уязвимые периоды становления микробиома кишечника, что и вносит вклад в склонность ребенка к атопическому дерматиту [874]. К примеру, у стерильных безмикробных лабораторных мышей отсутствует надлежащим образом развитая иммунная система, которая начинает развиваться только после заселения кишечника микроорганизмами [875]. Интерес к изучению оси «микробиом кишечника-кожа» возрос после того, как было показано, что введение определенных микроорганизмов мышам заметно меняло их кожный фенотип [876]. Результаты наиболее значимых исследований ассоциации микробиома и атопического дерматита представлены в табл. 12.

МИКРОБИОМ В НУТРИЦИОЛОГИИ И ДИЕТОЛОГИИ

Известно, что западный тип диеты, для которого характерно потребление большого количества красного мяса, полуфабрикатов и обработанных продуктов с высоким содержанием жиров и сахаров, оказывает сильное влияние на разнообразие и популяции микробиома [883]. На примере США можно проследить влияние смены типа диеты с традиционного на западный, а именно оценить риски развития метаболических заболеваний у иммигрантов в течение нескольких десятков лет после иммиграции. Имеющиеся эпидемиологические данные говорят о четырехкратном увеличении риска ожирения в течение 15 лет после иммиграции в США у людей из Азии в сравнении с населением, оставшимся в родной стране [884]. Кроме того, в недавнем исследовании было показано снижение биоразнообразия и функции микробиома в азиатско-американской когорте, состоящей из нескольких поколений, иммигрировавших в США [885]. В контексте же метаболических заболеваний, ожирения известно, что биоразнообразие видов в микробиоме кишечника находится в отрицательной корреляции с индексом массы тела, а также с триглицеридами и положительно коррелирует с защитными уровнями холестерина липопротеинов высокой плотности [886, 887].

Что касается таксономических изменений, представители рода Prevotella, чьи ферменты участвуют в переваривании растительной клетчатки, были вытеснены доминированием рода Bacteroides, что также коррелировало с продолжительностью проживания человека в США. При этом по результатам смены типа питания у иммигрантов соотношение Bacteroides/Prevotella увеличилось в 10 раз. Ранее метагеномные исследования позволили предложить несколько так называемых энтеротипов микробиома кишечника человека: первый энтеротип с высокой плотностью Bacteroides spp. и низкой плотностью Prevotella spp. характерен для людей с долгосрочным западным типом питания с высоким содержанием животных белков и насыщенных жиров [888, 889]. Второй энтеротип характеризуется высокой плотностью Prevotella spp. и низкой плотностью Bacteroides spp. и связан с растительной диетой, богатой клетчаткой, простыми сахарами и другими растительными соединениями. Третий потенциальный энтеротип с несколько повышенной плотностью рода Ruminococcus spp. в составе таксономического типа Firmicutes может ассоциироваться с ВЗК, более того, нарастание плотности отдельных видов Ruminococcus spp. в микробиоме кишечника совпадало по времени с обострениями ВЗК [890, 891]. В частности, Ruminococcus gnavus, который увеличивается в содержании при ВЗК, как установлено, секретирует сложный полисахарид - глюкорамнан (на основе L-рамнозы), который, в свою очередь, индуцирует ФНОα как основной провоспалительный цитокин [892].

Далее мы проанализируем современные знания о диетах и микробиоме.

На сегодняшний день доказано, что употребление большого объема углеводов наиболее тесно ассоциировано с уменьшением биоразнообразия кишечного микробиома: по данным одного из исследований, при этом нарастает плотность бифидобактерий, в то время как содержание бактерий родов Lactobacillus spp., Streptococcus spp. и Roseburia spp. уменьшается [886]. Индекс биоразнообразия Шеннона снижается в зависимости от уровня потребления углеводов, затем следует влияние сладких напитков, хлеба, пива, соленых закусок и, в меньшей степени, жиров и бобовых. С другой стороны, биоразнообразие микробиома увеличивается с употреблением фруктов, овощей и красного вина и в меньшей степени - чая. Отметим, что умеренное употребление красного вина было ассоциировано с повышенным содержанием в микробиоме F. prausnitzii [886], микроорганизма с описанными противовоспалительными свойствами, содержащегося в высокоразнообразном микробиоме [893]. Кофе, чай и красное вино богаты полифенольными соединениями, имеющими пребиотические и бифидогенные свойства [894-896].

Термин «FODMAP» происходит от английского сокращения: ферментируемые (Fermentable) олиго- (Oligo-), ди- (Di-), моно- (Mono-) сахариды и (And) полиолы (Polyol). Он применяется в нутрициологии для обозначения короткоцепочечных углеводов (олигосахаридов, дисахаридов, моносахаридов и близких по строению сахароспиртов - полиолов), которые не полностью всасываются в тонком кишечнике человека и приводят к повышенному газообразованию. Среди них отмечены углеводы из мономеров фруктозы (фруктаны) и галактозы (галактаны), дисахариды (лактоза, мальтоза), моносахариды (фруктоза, галактоза) и сахароспирты, такие как сорбитол, маннитол, ксилитол и мальтитол [897]. Употребление FODMAP в составе пищи привлекает жидкость в тонкий и толстый кишечник, вызывая растяжение просвета кишки, затем ферментация FODMAP-веществ кишечными бактериями и дрожжевыми грибами приводит к продукции водорода или газообразного метана. Было показано, что ограничение FODMAP-веществ в рационе помогает облегчить функциональные симптомы нарушений ЖКТ у пациентов с синдромом раздраженного кишечника (СРК), а именно вздутие живота, боли, послабление стула [898], но данных о достаточном эффекте данной диеты при ВЗК не поступало [897, 899]. Известно, что пшеница, рожь и ячмень содержат фруктаны и составляют значительную часть всех FODMAP, содержащихся в диете западного типа. Отметим, что долгосрочное применение диеты с низким содержанием FODMAP проблематично из-за ограничений в поступлении нормального рациона растительной пищи, а также того, что, по сути, FODMAP-вещества являются пребиотиками, которые поддерживают кишечную микробиоту. Яблоки, груши и косточковые культуры характеризуются высоким содержанием фруктозы и других FODMAP-веществ. Бобовые растения также имеют высокое содержание FODMAP, впрочем, как и такие овощи, как лук, чеснок и цветная капуста. При правильном ведении пациента квалифицированным диетологом диета со сниженным количеством FODMAP-веществ предназначена для контроля клинических симптомов и не должна быть жесткой и исключающей определенные продукты полностью. Начальная фаза диеты длится, как правило, 2-6 нед, чтобы получить контроль над симптомами ЖКТ. Однако важно понимать, что долгосрочное следование диете с низким содержанием FODMAP снижает разнообразие и качество потребляемых компонентов питания [900], что нежелательно, ведь известно, что разнообразие рациона приводит к более разнообразному микробиому и, как следствие, улучшению состояния здоровья человека [901].

Кетогенная диета - низкоуглеводная диета с высоким содержанием жиров и умеренным содержанием белков. В последнее время кетогенные и низкоуглеводные диеты стали популярным и эффективным средством для похудения, а также смогли улучшить показатели сердечно-сосудистых заболеваний в краткосрочной перспективе [902, 903]. Тем не менее продолжительные и объемные проспективные когортные исследования показывают, что именно качество диеты, а также источники белков и жиров могут в итоге определить ее эффект в отношении здоровья при низком (40% калорийности) углеводном рационе [251, 252]. В исследовании [904, 905], в частности, было обнаружено, что высокое потребление белков растительного происхождения действительно снижает отношение рисков развития СД 2-го типа, тогда как высокое потребление белков и жиров животного происхождения увеличивает риск СД 2-го типа [905]. Также в экспериментальной модели кетогенной диеты у грызунов было показано, что она приводит к уменьшению биоразнообразия кишечного микробиома [906]. В течение длительного исследования кетогенной диеты у пациентов с РС было показано, что общее количество и разнообразие бактерий микробиома уменьшились на фоне диеты в краткосрочной перспективе, но позже восстановились в течение 12-24 нед [678]. Эти неблагоприятные изменения в кишечном микробиоме, связанные с длительной кетогенной диетой, указывают на важность правильной разнообразной сбалансированной и качественной диеты [907].

Употребление большого количества углеводов как часть диеты западного типа с высоким содержанием рафинированных зерновых, крахмала и сахара отрицательно влияет на микробиом кишечника. В одном из актуальных исследований основным диетическим предиктором низкого бактериального разнообразия микробиома кишечника был высокий общий объем потребления углеводов, пива и хлеба [886]. Диеты с высоким содержанием углеводов и сахара коррелируют с увеличением содержания дрожжевых грибов рода Candida spp. в кишечнике, а также микроорганизмов, продуцирующих метан (метаногенов) Methanobrevibacter spp. (археи), плотность которых в микробиоме отрицательно коррелирует с уровнем потребления человеком аминокислот, белков и жирных кислот [908]. Один из представителей этих микроорганизмов из домена археи, Methanobrevibacter smithii, весьма распространен в кишечном археоме (часть микробиома, представленная доменом археи) человека и может составлять до 10% всех анаэробных микроорганизмов в кишечнике у здоровых взрослых. В экспериментальной модели на лабораторных животных было показано, что M. smithii усиливает процесс накопления жира у хозяина, стимулируя другие микроорганизмы, Bacteroides thetaiotaomicron, ферментировать растительные полисахариды (фруктаны) пищи до ацетата (КЦЖК) [909]. При этом энергетическая ценность бактериальной ферментации непереваренных пищевых полисахаридов в КЦЖК оценивается как 5-10% суточной калорийности рациона при типичной диете взрослого человека [910]. Повышенный уровень M. smithii также был определен у пациентов с СРК [911].

Что касается дрожжевых грибов рода Candida spp., то они в исследованиях у людей положительно коррелировали с долгосрочным потреблением углеводов и сахара, а также были тесно связаны по времени с недавним употреблением углеводов в пищу [908]. Кстати, интересно отметить, что пробиотический штамм L. rhamnosus GG, как было показано, содержит экзополисахарид, который препятствует росту Candida spp., формированию гиф и кишечной адгезии дрожжевого грибка [912].

Понятие о необходимости сокращения употребления крахмала и сахара для укрепления здоровья кишечника появилось еще в начале XX в., когда гастроэнтеролог S.V. Haas предложил лечить пациентов с целиакией, используя специфическую углеводную диету [913]. Позднее данная диета была популяризирована биохимиком Elaine Gottschall, которая рекомендовала ее для снижения избыточного роста микроорганизмов в кишечнике и даже предложила список полезных и неполезных с этой точки зрения продуктов [914]. Специфическая углеводная диета исключает зерновые (пшеницу, ячмень, овес, рис, кукурузу), картофель, обработанное мясо, сахара и дисахариды (лактозу, сахарозу), в то время как свежие, не консервированные фрукты, овощи и соки допускаются. Диета ограничивает молочные продукты маслом, яйцами и выдержанными сырами, содержащими минимальное количество лактозы. Пиво, сладкие вина, ликеры ограничены, как добавки и консерванты, такие как мальтодекстрин, пектин, гуаровая камедь и фруктоолигосахариды, мед является рекомендуемым подсластителем. В начале применения диеты соблюдается строгий трехмесячный срок для снижения роста бактерий и дрожжевых грибов в кишечнике, затем к рациону добавляются небольшие объемы бобовых культур. На фоне данной диеты у пациентов с ВЗК были зарегистрированы случаи длительной безрецидивной клинической ремиссии, в частности у пациентов с болезнью Крона [899, 915].

По результатам многих работ, искусственные пищевые ингредиенты связаны с изменениями состава микробиома кишечника. Мальтодекстрин (патока, E459) как полисахарид, полученный в результате неполного гидролиза крахмала, является широко распространенной пищевой добавкой. Мальтодекстрин способствует прикреплению инвазивных штаммов кишечной палочки к эпителиальным клеткам кишечника с формированием биопленки, способствуя воспалению кишечника [916]. Полисорбат-80 (Tween 80, Е433), эмульгатор, широко используемый в обработанных пищевых продуктах, как было показано, увеличивает транслокацию патогенных штаммов E. coli через клетки кишечника в системный кровоток [916]. В экспериментальных исследованиях на мышах низкие (0,1-1,0%) концентрации эмульгаторов полисорбата-80 и карбоксиметилцеллюлозы (Е466) вызывали воспалительные реакции, ожирение и нарушения метаболизма глюкозы, а также способствовали развитию колита у мышей, предрасположенных к этому патологическому состоянию. При этом выполнение ТФМ от этих грызунов к безмикробным мышам обеспечивало перенос и проявлений, что обозначало роль нарушений микробиома в этом процессе [917]. Эмульгаторы в пище снижали биоразнообразие микробиома, уровень отдельных защитных видов в составе Bacteroides spp., в то же время увеличивая количество Ruminococcus gnavus c муколитическими свойствами и провоспалительных протеобактерий. В группе животных, получавших пищу с эмульгаторами, также было отмечено уменьшение толщины слизистой оболочки кишечника наряду с проникновением бактерий в, как правило, стерильный внутренний слой слизистой оболочки. Вспомним, что у людей такие процессы связаны с риском ВЗК и метаболическим синдромом, а среднее бактериально-эпителиальное расстояние в кишечнике обратно коррелирует с индексом массы тела, уровнем глюкозы натощак и гликированным гемоглобином [918]. В целом такие работы указывают на опасность глобального употребления обработанных пищевых продуктов в эпидемии ожирения [919].

Известно, что чрезмерное потребление калорий с пищей приводит к тому, что жир накапливается в белой жировой ткани, а расход энергии происходит преимущественно во время несократительного термогенеза в бурой жировой ткани. Преобразование энергозапасающих белых адипоцитов в так называемый «бежевый» жир (энергорасходующий) является на сегодняшний день многообещающей стратегией лечения метаболических заболеваний [920]. Недавно в эксперименте интервальное голодание показало возможность избирательно индуцировать преобразование белой жировой ткани в «бежевую» у мышей. Лабораторные животные в режиме голодания через день суммарно имели ту же калорийность рациона, что и в контрольной группе, но при этом отличались микробиомом кишечника, увеличением продуктов ферментации ацетата и лактата, а также исчезновением ожирения, вызванного питанием [921].

По другим данным, интервальное голодание и имитирующие голодание диеты показали среди результатов улучшение барьерной функции кишечника, увеличение биоразнообразия микробиома, повышение активности антиоксидантных путей микробиома и даже снижение воспаления кишечника в моделях изучения ВЗК [922-924].

Кишечный микробный метаболизм холина и L-карнитина приводит к образованию ТМА и сопутствующему превращению в ТМА-N-оксид (ТМАО) (рис. 44). Уровень ТМАО в плазме крови человека определяется генетической предрасположенностью, диетой и составом кишечного микробиома. Многочисленные исследования продемонстрировали связь между уровнями ТМАО в крови и риском развития атеротромботических сердечно-сосудистых заболеваний [23]. Важной причиной вариабельности ТМАО в крови является диета. Пища, содержащая ТМАО или его предшественники, повышает уровень ТМАО в крови и моче. Красное мясо, яйца и молочные продукты богаты предшественниками ТМА и, следовательно, являются потенциальным источником ТМАО [925]. Кроме того, ТМА и ТМАО также могут быть получены человеком из рыбы и других морепродуктов. Тем не менее неясность в оценке фактора питания остается, поскольку результаты нескольких долгосрочных исследований не указывают на значимое влияние диеты на концентрацию ТМАО в плазме крови человека [926-928].

В табл. 13 представлены суммарные данные по эффектам диеты на кишечный микробиом и здоровье человека.

Таким образом, диета и состояние питания являются важными детерминантами в здоровье человека. Усилия по характеристике взаимосвязи между питанием и здоровьем сегодня сводятся к изучению влияния отдельных питательных веществ, режимов питания и конкретных диет [930, 931].

Корреляция между микробным разнообразием в кишечнике и здоровьем по результатам многих работ показывает важность высококачественной, сбалансированной диеты [886, 932], подтверждая мнение, что добавление отдельных питательных веществ не заменяет здоровую диету [933]. Данные о том, что отдельные продукты стимулируют рост определенных бактериальных таксонов, позволяют предположить, что кишечные бактерии действительно могут быть связаны с нашими пищевыми предпочтениями, чувствами аппетита и сытости [681, 934]. Воздействуя на обмен веществ и воспалительные процессы, подходы к питанию могут даже перевесить генетические факторы и другие факторы окружающей среды в определении здоровья человека при таких распространенных заболеваниях, как диабет, ожирение, СРК, ВЗК, колоректальный рак и депрессия [527, 932, 935, 936]. В конечном счете определение полного спектра взаимодействий между хозяином и микробиомом позволит достичь прогресса в персонифицированной медицине, точном питании и разработке пробиотиков нового поколения, адаптированных к конкретному индивидууму [937, 938].

МИКРОБИОМ В СУДЕБНОЙ МЕДИЦИНЕ И КРИМИНАЛИСТИКЕ

Известно, что состав микробиома человека варьирует у индивидуумов, что и было предложено в судебной медицине для идентификации людей в больших популяциях или с течением времени. Поразительно, что по результатам апробации математической модели, предложенной E.A. Franzosa и соавт., 80% людей могли быть однозначно идентифицированы по индивидуальному профилю кишечного микробиома вплоть до года от первичного исследования их биологического образца [15]. Более того, что касается индивидуального профиля кожного микробиома, то было показано, что ассоциированные с кожей человека бактерии могут быть легко восстановлены с поверхностей (включая компьютерные устройства) и что состав этих бактериальных сообществ может использоваться для определения объектов, с которыми работали конкретные люди, даже если эти объекты оставались нетронутыми до 2 нед при комнатной температуре [16].

Перспективным направлением современной криминалистики и судебной медицины является изучение танатомикробиома. Известно, что смерть не происходит мгновенно и органы не разлагаются с одинаковой скоростью или одинаковым образом. К примеру, небеременная человеческая матка и предстательная железа - последние внутренние органы, которые разрушаются во время посмертного разложения, однако микробная причина этого очень важного в судебной медицине наблюдения остается пока не уточненной. Недавние исследования установили, что состав и численность микроорганизмов в илеоцекальной зоне у человека имеет наибольшее посмертное значение, являясь источником бактерий, распространяющихся в печень, селезенку, а затем в сердце и головной мозг [939].

Итак, совокупность генов микробного сообщества, принадлежащая телу хозяина после его смерти, получила название «танатоми-кробиом» [940] в честь Танатоса - олицетворения смерти в греческой мифологии. Танатомикробиом («микробиом смерти») варьирует в зависимости от органа, а также изменяется в зависимости от времени и температуры. Посмертные изменения формируются под воздействием собственных микроорганизмов хозяина, а также микроорганизмов окружающей среды, что приводит к характерной post mortem динамике танатомикробиома, практически важной для судебной медицины, в том числе для определения времени предполагаемой смерти. Современные исследования танатомикробиома основаны преимущественно на секвенировании гена 16S РНК, так как этот метод подходит для большого количества образцов, хорошо отработан для продольного сравнительного анализа, а также менее затратен и требует меньше времени для анализа [941].

Установлено, что активность микроорганизмов после смерти хозяина имеет определенную хронологическую закономерность, которая влияет на очередность разложения человеческого трупа. Считается, что у здоровых людей отдельные внутренние органы, такие как мозг, сердце, печень и селезенка, относительно стерильны или маломикробны [942].

В течение 24 ч после смерти микроорганизмы начинают преобладать над оставшейся иммунной защитой и массивно размножаться во внутренних органах [939, 943]. Скорость и направление изменения состава микробиома post mortem зависит от несколько экзогенных и эндогенных факторов. Экзогенные факторы включают температуру, влажность, доступ кислорода, доступность тела для животных, наличие одежды, эндогенные - возраст, наличие ожирения, причину смерти, прижизненные заболевания (сепсис, СД), применение ЛС, целостность тканей тела [939]. Научное сообщество специалистов по судебно-медицинской экспертизе только недавно начало применять исследование с помощью секвенирования гена 16S рРНК для определения комплекса и характеристик микроорганизмов, населяющих разлагающуюся биомассу.

Постоянно наблюдаемая закономерность в очередности посмертных изменений микробиома - это непрерывное снижение относительной плотности представителей Bacteroidetes spp. и Lactobacillus spp., которые широко представлены в микробиоме живых людей [6] (табл. 14). Ряд исследований поддерживают идею о том, что посмертная динамика микробиома сильно зависит от доступа кислорода. Например, в исследованиях танатомикробиома переход от аэробных к анаэробным микроорганизмам во всех образцах ткани происходил по завершении стадии трупного вздутия, а самые обильные микроорганизмы составляли анаэробные Firmicutes spp. и Clostridium spp. [944-947].

Совсем недавно было продемонстрировано, что количество представителей Firmicutes spp. значительно повышается в почве вокруг трупа, так как бактерии тела человека после смерти начинают активно переноситься в окружающую почву [948]. Согласно данным K.L. Cobaugh и соавт., изменения микробиома почвы возле трупа человека включают явные изменения в своем составе и функции от более разнообразного микробиома, содержащего и Firmicutes spp., и Proteobacteria spp., и невысокое количество Acidobacteria spp., до микробиома почвы, в котором доминируют Firmicutes spp. (до 50,9%) и другие анаэробные таксоны. Ассоциированные с человеком бактерии, включая облигатные анаэробные Bacteroides spp., обнаруживались в высоких концентрациях в почве в течение всего процесса разложения трупа, вплоть до 198 дней после смерти, что важно для установления местонахождения тела человека [949]. Более того, кривая роста Firmicutes spp. в образцах почвы вокруг трупа, как было показано, способна предсказать время наступления смерти в летних условиях [948].

На сегодняшний день известно, что естественное разложение органов и тканей происходит в следующем порядке:

Транслокация и распространение бактерий из кишечника в процессе умирания организма может являться истинной причиной положительных результатов микробиологических исследований при вскрытиях, что зачастую неверно трактуется как свидетельство прижизненного инфекционного процесса [955]. Недавнее экспериментальное исследование показало, что брыжеечные лимфатические узлы являются первым органом, через который проникают бактерии при транслокации из ЖКТ в остальные ткани в течение 24 ч с момента смерти, а в течение этого дня остатки иммунной системы погибшего хозяина еще сопротивляются микроорганизмам [956]. Немаловажно, что продвижение области знаний о танатомикробиоме позволит также уменьшить риск отторжения и других неудач при трансплантации трупных донорских органов. Таким образом, специалисты в области судебной медицины и криминалистики в настоящее время сосредоточены на каталогизации профилей микробиома внутри и снаружи биоразлагающихся человеческих тел для заполнения пробелов в наших методах установления времени наступления смерти и даже местонахождения трупа [957].

Сегодня, когда уже накоплен определенный багаж знаний в отношении микробиома, обсуждается несколько вариантов лечебных вмешательств. Некоторые из них уже показали эффективность in vivo, некоторые все еще находятся в стадии разработки. Далее мы обозначим наиболее перспективные направления микробиом-ассоциированных лечебных и профилактических вмешательств.

МИКРОБНЫЕ КОКТЕЙЛИ

Введение пациенту подготовленной и очищенной смеси из полезных представителей микробиома позволит достичь эффективности, а также избежать рисков трансплантации всего комплекса бактерий кишечника. Кроме того, понимая, какие именно представители микробиома являются наиболее опасными, можно попытаться избирательно воздействовать именно на них. Среди наиболее перспективных коктейлей отмечают так называемое трио полезных групп микроорганизмов:

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЛИГАНДЫ

Введение бактериальных лигандов в случае снижения плотности и защитных функций микробиома способно защитить от развития инфекции. Было показано, что системное введение агониста TLR-5 бактериальной природы флагеллина или пероральное введение агониста TLR-4, бактериального ЛПС, восстанавливает устойчивость к инфекции, вызванной ванкомицинрезистентным энтерококком или C. difficile [160-162]. Кроме того, сообщалось, что R848, синтетический агонист TLR-7/8, введенный перорально, защищает от колонизации VRE [958]. Примечательно, что R848 уже вошел в клиническое применение, пока что для местного лечения папилломавирусных инфекций. Таким образом, контролируемое введение микробных лигандов является важным средством для восстановления врожденного иммунитета и защиты пациентов, длительно получающих антибиотики.

МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ

Современные высокоэффективные математические модели скрининга новых биологически активных веществ активно используются в поисках новых антимикробных молекул. Скрининг 2000 бактериальных геномов из Проекта микробиома человека позволил обнаружить биосинтетические кластеры генов, кодирующие тиопептиды, которые определяются также и в организме человека [237]. Лактоциллин, один из тиопептидов, кодируемый кластером генов L. gasseri, был синтезирован и продемонстрировал выраженную ингибирующую активность против распространенных патогенов, таких как S. aureus и G. vaginalis, но, что очень важно, не противодействовал росту комменсальных бактерий [237].

Более того, в процессе фармакологического скрининга малых молекул недавно был обнаружен ингибитор синтеза рибофлавина, получивший название «рибоцил», который воздействует на регуляторную некодирующую область мРНК микробного фермента синтазы. Присоединение рибоцила селективно ингибирует процессы трансляции в бактериях, например в E. coli, индуцируя клеточную гибель из-за дефицита рибофлавина. Было показано, что введение рибоцила значительно снижает количество бактерий в мышиной модели генерализованной инфекции E. coli, что подтверждает тот факт, что вновь синтезированные малые молекулы имеют многообещающий потенциал как антимикробные ЛС [959].

Признание повреждающего эффекта антибиотиков на состав и плотность микробиома привело ученых к поиску бактерицидных соединений более направленного действия. Например, было показано, что турицин-CD, бактериоцин, продуцируемый Bacillus thuringiensis, равен по эффективности ванкомицину или метронидазолу в отношении C. difficile, однако не повреждает кишечную микробиоту, в отличие от обозначенных антибиотиков [960]. Другими исследователями сообщалось, что бактериоцин авидоцин-CD, созданный для селективного воздействия на клинически значимый штамм C. difficile BI/NAP1/027, привел к исчезновению этого патогена при пероральном введении. Кроме того, авидоцин-CD, в отличие от антибиотиков, не снижал защитную способность микробиоты противостоять колонизации [961].

ТАРГЕТНАЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

В недавно опубликованном исследовании авторы смогли объединить химическим путем аналог антибиотика рифампицина и специфического антитела против золотистого стафилококкка (S. aureus), чтобы таргетно воздействовать на внутриклеточные формы метициллинрезистентного S. aureus (MRSA). Действительно, внутриклеточная среда представляет собой важный резервуар для этих патогенов, что еще и защищает MRSA от действия антибиотиков. Например, в эксперименте было показано, что лабораторные мыши, зараженные инфицированными MRSA клетками, в сравнении с инфицированием свободными внеклеточными бактериями, отличаются более тяжелыми инфекциями, даже несмотря на лечение ванкомицином [962]. В этом исследовании рифалог был конъюгирован с S. aureus-специфическим антителом с помощью расщепляемой связи, так что микроб после опсонизации и фагоцитоза подвергался избирательному повреждающему эффекту антибиотика, высвобожденного из этой связи ферментом протеазой. Важно отметить, что комплекс «антитело-рифалог» был более эффективным, чем антибиотики по отдельности в борьбе с инфекцией in vivo. Такой подход может быть в будущем высокоэффективен для борьбы с многими внутриклеточными патогенами.

CRISPR-CAS9 МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Сегодня использование методик CRISPR-Cas9 для направленного редактирования геномов является перспективным направлением в современной генной инженерии. CRISPR (англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) - особые участки бактериальной ДНК, короткие палиндромные кластерные повторы. Между этими идентичными повторами располагаются отличающиеся друг от друга фрагменты ДНК - спейсеры, многие из которых соответствуют участкам геномов вирусов, паразитирующих на данной бактерии. При попадании вируса в бактериальную клетку он обнаруживается с помощью специализированных Cas-белков (CRISPR-associated sequence), связанных с РНК CRISPR. Если фрагмент вируса соответствует коду в спейсере РНК CRISPR, то Cas-белки разрезают вирусную ДНК и уничтожают ее, защищая таким образом клетку от инфекции. Не так давно было установлено, что системы CRISPR-Cas могут работать не только в клетках бактерий, но и в клетках высших организмов, соответственно, CRISPR-Cas-системы дают возможность исправлять неправильные последовательности генов человека и лечить наследственные заболевания.

Cas9 - это фермент эндонуклеаза, связанный с адаптивной иммуной системой CRISPR у ряда бактерий, например у Streptococcus pyogenes. Недавно была предложена стратегия устранения выбранных бактериальных клеток, использующих систему CRISPR-CAS9. По сути, CRISPR-CAS9 представляет собой иммунную систему бактерий, которая может быть модифицирована методами молекулярной генетики для расщепления интересующих последовательностей ДНК. Исследователи разработали доставку генетического материала в бактериальную клетку с помощью фагов (фагемидов), что привело к эффективному уничтожению выбранных бактерий [963, 964]. Поразительно, что в бактериальном сообществе, состоящем из 2-3 изолятов бактерий одного вида (E. coli или S. aureus), фагемиды CRISPR-CAS9 уничтожали только бактерии, несущие целевой ген, сохраняя окружающие микроорганизмы в моделях in vivo. Таким образом, эта генно-инженерная система позволила выборочно уничтожать патогены, в том числе устойчивые к антибиотикам, при этом не влияя на окружающий микробиом [28].

На сегодняшний день бактериальный микробиом изучен достаточно глубоко, однако гораздо меньше нам известно о микобиоме и вироме. Как и бактерии, грибы и вирусы, очевидно, весьма разнообразны в кишечнике, и уже есть данные о том, что они также вступают во взаимодействие с иммунитетом хозяина [965-969]. При этом все еще не ясно, какие функции грибы и вирусы выполняют в поддержании гомеостаза хозяина и насколько они важны для здоровья человека. В некоторых ранних исследованиях уже были изучены микобиомы и виромы у пациентов с иммуносупрессией и обсуждалась их роль в ассоциации с противовирусной терапией и глубиной нарушений иммунитета [965, 970, 971]. Вероятно, на данном этапе уже стоит активизировать исследование сообществ вирусов и грибов, проживающих в организме человека, в особенности у пациентов со сниженным иммунитетом. Изучение этих групп может быть особенно эффективно для понимания роли микобиома и вирома, а также ассоциированных с ними рисков.

МИКОБИОМ В МЕДИЦИНЕ

Заболевания, вызываемые представителями царства грибов, поражают более 300 млн человек во всем мире ежегодно, при этом погибает более 1,6 млн человек [972]. Все больше пациентов подвержено рискам инвазивных грибковых инфекций, в том числе пациенты со злокачественными новообразованиями и после пересадки органов и тканей, получающие иммуносупрессивную или иммуномодулирующую терапию, люди, живущие с ВИЧ, и многие другие восприимчивые группы населения.

Известно, что культуральные методы недостаточно чувствительны и слишком задерживают время для диагностики грибковых инфекций [973, 974]. Их точность зависит от выбора биообразца, типа гриба, а также особенностей заболевания и иммунного статуса пациента. Например, пневмоцисты не способны вырасти на питательных средах [18], а выделение Aspergillus spp. в крови, как правило, малоэффективно и редко встречается в диагностике инвазивного аспергиллеза [974, 975]. Отметим, что в сравнении со спектром доступных антибактериальных средств всего четыре класса противогрибковых препаратов активно применяются в настоящее время: полиены, флуцитозин, азолы и эхинокандины.

Что касается современых молекулярно-генетических методов оценки именно микобиома, то наиболее часто выполняется секвенирование нового поколения ITS региона ДНК (англ. ITS - Internal transcribed spacer), расположенной между генами, кодирующими 18S и 23S субъединицы рРНК. Этот регион ДНК было предложено использовать в качестве универсального генетического грибкового штрих-кода, а праймеры, нацеленные на ITS, используются уже более десятилетия в нескольких масштабных проектах по изучению микобиома. Что касается роли полногеномного секвенирования для изучения грибковой части микробиома, то в настоящее время, похоже, низкое содержание грибков в пробах человека препятствует его широкому применению с учетом используемых методов выделения [976].

По отношению к бактериальной части, составляющей 99% от общего объема микробиома, грибковый компонент - микобиом - у человека менее разнообразен (обычно в районе 20 ОТЕ на образец материала) и присутствует в более низком объеме (в районе 0,1% общего объема микроорганизмов) [977]. Cеквенирование микобиома показывает, что дети колонизируются грибами вскоре после рождения, преимущественно представителями родов Candida spp., Saccharomyces spp., Cladosporium spp., Cryptococcus spp. и Malassezia spp. [978, 979]. В целом считается, что роды Saccharomyces spp., Malassezia spp. и Candida spp. являются ключевыми составляющими здорового микобиома в течение жизни.

Иммуный ответ к грибам поддерживается с помощью распознавания как их спор, так и компонентов клеточной стенки и включает Т-клеточное звено, которое отвечает и за толерантность к грибам своего микобиома, и за соответствующий иммунный надзор за грибами, попадающими в организм из окружающей среды [980]. Отметим, что иммунные реакции на грибковые антигены, с одной стороны, являются защитными, а с другой - при чрезмерной силе реакций проявляются в виде аллергий.

В то время как грибковые заболевания дыхательной системы в настоящее время широко распространены и вызывают растущее глобальное беспокойство, ситуацию усложняет отсутствие объемных данных в отношении микобиома легких, что также важно в контексте влияния грибов на хронические болезни дыхательной системы. По результатам секвенирования ITS региона ДНК сообщалось, что Ceriporia lacerata, Saccaromyces cerevisiae и Penicillium brevicompactum являются наиболее распространенными грибами в легких, а основным грибковым патогеном на этом уровне дыхательной системы является Aspergillus fumigatus [981, 982]. Также было показано, что в легких у пациентов при бронхиальной астме, ХОБЛ и муковисцидозе имеется меньшее грибковое разнообразие, которое в первую очередь связано с разрастанием отдельных родов/видов грибов и потерей ряда других представителей грибкового микробиома [983]. При бронхиальной астме в легких было отмечено более высокое содержание Psathyrella candolleana, Malassezia pachydermatis, Termitomyces clypeatus и Grifola sordulenta [976, 984].

В области изучения микобиома кишечника применение секвенирования ITS региона ДНК позволило обнаружить нарушения, свойственные пациентам с ВЗК, а именно повышение соотношения Basidiomycota/Ascomycota, вместе с более высоким содержанием C. albicans и сниженным уровнем S. cerevisiae [985]. При болезни Крона также подтверждается увеличение общей грибковой плотности микро-биома кишечника во время эпизодов обострения болезни с более высоким вкладом семейства Cystofilobasidiaceae spp. и вида C. glabrata. Хотя эти ассоциации и представляют интерес, пока что еще крайне необходимы более убедительные доказательства и механизмы этих явлений.

Аспекты взаимодействия грибковой части микробиома с бактериальной были изучены в новаторской работе B. Zhai и соавт., в которой изучался патогенез кандидемий, то есть инфекций кровотока, вызванных дрожжевыми грибами рода Candida у пациентов с иммуносупрессией [390]. Пациенты незадолго до развития этих опасных инфекций кровотока имели выраженное увеличение плотности, доминирование патогенных видов Candida spp. в кишечнике; это доминирование развивалось в результате сложного динамического взаимодействия между несколькими видами и подвидами грибов микобиома, а также было связано с существенной потерей бактериальной плотности и биоразнообразия, особенно в отношении анаэробных бактерий. Таким образом, одновременный анализ кишечного микобиома и бактериома смог идентифицировать нарушения в пределах двух таксономических царств (грибы и бактерии), которые приводили к транслокации кандид в кровоток и развитию тяжелой инвазивной инфекции.

Итак, применение подходов секвенирования в отношении грибковой части микробиома - микобиома - начало привлекать все больший исследовательский интерес, что со временем позволит делать и строгие клинические выводы в этой области.

ВИРОМ В МЕДИЦИНЕ

Вирусы являются наиболее распространенными биологическими объектами на Земле и также составляют часть микробиома человека [986]. Весь объем эукариотических и бактериальных вирусов (бактериофагов), населяющих человеческое тело, называется виромом человека. Виром включает двухцепочечные ДНК-вирусы, одноцепочечные ДНК-вирусы, а также РНК-вирусы. Бактериофаги - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки и клетки архей.

Вирусы обнаруживаются в многочисленных участках человеческого тела, при этом кишечник является самой обширной и изученной нишей. Кишечный виром достаточно многочисленный и разнообразный, тем не менее весьма стабильный и высоко персонифицированный, то есть имеет индивидуальные отличия у каждого человека [987, 988]. Считается, что кишечный виром появляется у человека в самый ранний период жизни, одновременно с колонизацией кишечника бактериями [989]. В неонатальном периоде виром состоит преимущественно из бактериофагов, с небольшим вкладом эукариотических вирусов и, подобно бактериальному микробиому, значительно различается у отдельных лиц [990]. Хотя большинство исследований сосредоточено на бактериофагах как представителях вирома, эукариотический виром также играет существенную роль в здоровье и патологии человека. Слизистая оболочка кишечника человека, как правило, заселяется эукариотическими вирусами в период от рождения до 2 лет и состоит из вирусов семейств Adenoviridae, Anelloviridae, Astroviridae, Parvoviridae, Picornaviridae и Picobirnaviridae. Это демонстрирует, что вирусы, которые обычно рассматриваются как патогены или оппортунисты для человека, часто заселяют его кишечник в норме и составляют кишечный виром [989]. Эти вирусы могут не иметь никаких проявлений для человека или могут оставаться скрытыми в течение длительного времени, даже отвечая за положительные эффекты для хозяина [991, 992].

В отличие от исследований бактерий и грибов, универсальный маркерный ген не применяется для изучения вирусов. Более того, большинство полученных генетических последовательностей по результатам секвенирования отсутствует в общедоступных базах данных из-за феномена так называемой вирусной темной материи [993, 994]. По аналогии с теоретической физикой, вирусная темная материя - это метагеномные последовательности, происходящие из вирусов, но не совпадающие с имеющимися эталонными вирусными последовательностями баз данных, то есть обнаруженные последовательности абсолютно не известных человечеству вирусов. В зависимости от образца вирусная темная материя может составлять 40-90% последовательностей по результатам секвенирования [993]. Именно поэтому наиболее применяемым методологическим подходом исследования вирома является метагеномика, то есть изучение набора генов всех микроорганизмов, находящихся в образце, с помощью полногеномного секвенирования.

Кишечник здорового человека является местом обитания примерно 10¹⁵ бактериофагов, что превосходит по численности бактерии кишечного микробиома примерно в 10 раз [5, 995], причем основу «фагеома» составляют двухцепочечные ДНК-вирусы из порядка Caudovirales (семейства Myoviridae, Podoviridae и Siphoviridae) и одноцепочечные ДНК-вирусы семейства Microviridae [996]. Недавнее исследование в 2014 г. выявило новый тип бактериофага, crAssphage, который был обозначен как наиболее распространенный вирус человека, на который приходится до 90% генетических вирусных последовательностей и около 22% всех генетических последовательностей в кишечном метагеноме [997]. Считается, что CrAssphage и ему подобные новые фаги ассоциированы с бактериями типа Bacteroidetes в кишечнике человека, а таксономически их предлагают отнести к Caudovirales [998, 999].

Итак, кишечный виром тесно связан с прокариотическими микробными сообществами, не только разделяя общую нишу обитания, но и внося вклад в динамику экосистемы, перемещая различные генетические элементы, такие как факторы вирулентности или гены устойчивости к антибиотикам [1000]. Соответственно, появляется все больше данных о том, что кишечный виром изменяется при проблемах в бактериальном микробиоме и может быть связан с такими состояниями, как ВЗК и колоректальный рак. По мере того, как исследования кишечного вирома станут более стандартизированными и массовыми, появятся и возможности изучить виромные подходы к лечению. Особенно важно это становится в период появления новых вирусных инфекций, например пандемии COVID-19, вызванной вирусом SARS-CoV-2 [1001]. Не менее практически значимым является адекватный скрининг фекального трансплантата на предмет наличия в кишечнике донора патогенных вирусов, в том числе SARS-CoV-2 [1002]. Подчеркнем, что микробиом как фактор иммунной защиты может быть полезен как для профилактики, так и для лечения опасных вирусных инфекций, как COVID-19, ведь известно, что 80% количества иммунных клеток содержится именно в кишечнике.

АРХЕОМ В МЕДИЦИНЕ

Археи - это отдельный домен живых организмов, отличающихся от бактерий и эукариотов [1003]. Несмотря на то, что археи морфологически похожи на бактерии по форме, размеру и одноклеточной организации, они обладают многими характеристиками эукариот, такими как механизмы репликации и репарации ДНК, транскрипции РНК и трансляции белка. Клеточные стенки архей не содержат пептидогликанов, а состоят из разнообразных структур, включая метанохондроитин и псевдомуреин [1004]. Первые выявленные археи были видами, проживающими в экстремальных суровых условиях внешней среды. В дальнейшем понимание человеческого археома ограничивалось только тремя представителями, идентифицированными в кишечных образцах человека: Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomassiliicoccus luminyensis и представителем слизистой оболочки полости рта Methanobrevibacter oralis [988]. В последнее время применение новых молекулярно-генетических методов позволило обнаружить большее число архей в образцах человека, что позволяет предположить, что археи являются важными составляющими комплексного микробиома человека [1005]. До сих пор потенциальная роль архей в здоровье и патологии человека остается невыясненным вопросом.

Здоровый и разнообразный микробиом приносит пользу хозяину с помощью ряда важных процессов: комменсальные бактерии помогают с перевариванием и использованием питательных веществ, предотвращают развитие инфекций, усиливают и регулируют функции иммунной системы. Нарушения микробиома связаны с различными заболеваниями, включая инфекции, аутоиммунные заболевания, ВЗК, СД, аллергические заболевания, ожирение и атеросклероз.

Многие применяемые антибиотики отрицательно воздействуют на полезных представителей микробиома, что ставит пациентов под угрозу развития ряда заболеваний. К ним относятся инфекции, возникающие на фоне колонизации пациентов антибиотикорезистентными патогенами, например ванкомицинрезистентными энтерококками, метициллинрезистентным золотистым стафилококком и чрезвычайно резистентными энтеробактериями. Понимая и признавая влияние антибиотиков на здоровый микробиом человека, врачи должны более обоснованно подходить к назначению этих ЛС. Потенциальные стратегии предотвращения неблагоприятного воздействия антибиотиков на микробиом включают: снижение необоснованного назначения антибиотиков, разработку и внедрение антибиотиков с наиболее узким спектром действия, раннюю деэскалацию антибактериальной терапии, ТФМ.

В будущем, возможно, в клиническую практику будут внедрены методы воздействия на микробиом пациентов с конкретными целями, как, например, профилактика атеросклероза или оптимизация ответа на лечение рака. Это может быть достигнуто в клинических условиях посредством таких вмешательств, как специализированные диеты, введение полезных микробных сообществ и индивидуализированная антибактериальная терапия. Уже сегодня разрабатываются новые стратегии, меняющие классическую антибиотикотерапию, целью которых является избирательное уничтожение возбудителей инфекций без повреждения остального микробиома или даже восстановление полезных микробных сообществ человека.

Исследования показывают, что практически все типы клеток в теле человека так или иначе связаны с комменсальными микробами. Даже физиология таких органов, как мозг или легкие, зависит от состава кишечного микробиома. Более глубокое понимание сети взаимодействий между хозяином и комменсалами в различных органах и тканях смогло бы обеспечить медицине цели для терапевтических вмешательств при многих болезнях.

Избранные представители микробиома связаны с различными заболеваниями, например атеросклерозом и раком. Это открывает путь для революционных внедрений в медицине, когда в будущем точечная антимикробная терапия против конкретных представителей микробиома поможет предотвратить или излечить многие заболевания.

В настоящее время КДАИ успешно лечится с помощью ТФМ. Однако передача такого биологического материала или же отдельных бактериальных сообществ может быть эффективна и против других кишечных инфекций. Мы прогнозируем, что в ближайшие годы будут предложены новые микробные кандидаты для борьбы с инфекционными угрозами.

Метаболические и тканевые предпочтения конкретных видов комменсальных бактерий до конца пока что не ясны. Понимание того, какие окружающие микробные сообщества и свободные молекулы способствуют росту и полезным функциям выбранных штаммов комменсала, поможет в дальнейшем разработке более эффективных методов лечения на основе переноса частей микробиома.

Еще в 400 г. до н.э. Гиппократ отмечал, что «смерть начинается в кишечнике». Сегодня мы начинаем понимать всю глубину этой мысли, основываясь на недавно полученных знаниях о микробиоме. И действительно, не только смерть, но и жизнь, а также здоровье человека находятся во взаимосвязи с невероятным объемом микроорганизмов, сопровождающих нас на протяжении всего нашего пути…​