Клиническая лабораторная диагностика

Иммунная система защищает внутреннюю среду организма от чужеродных и собственных антигенов, приобретающих признаки чужеродности в силу различных обстоятельств. Способность поддерживать собственные антигены жидкостей, клеток и тканей позволяет человеку сохранить свою антигенную (иммунохимическую) индивидуальность. В защите от «чужого» участвуют клетки органов и систем, а также гуморальные продукты жизнедеятельности этих клеток. Факторы иммунной защиты подразделяют на две категории: врожденные (антиген-неспецифические) и приобретенные (антиген-специфические).

Врожденные механизмы иммунитета препятствуют проникновению чужеродных антигенов в организм, нейтрализуют, разрушают и выводят из организма чужеродные для него субстанции и клетки, не «запоминая» их строения и не «узнавая» при повторных контактах с ними. Врожденный иммунитет обеспечивается клетками фагоцитарной системы, соединительной и пограничных тканей, тромбоцитами, тучными, NK-клетками и т.д. В его поддержании участвуют гуморальные факторы защиты: белки (острофазные, катионные и системы комплемента), медиаторы воспаления, цитокины, рецепторы клеток и др. Врожденные факторы иммунной защиты вызывают ранние реакции на чужеродные агенты при первичных и даже вторичных контактах с ними. По изменению их содержания и активности судят о ранней реакции организма на чужеродные агенты.

Увеличение в крови содержания полиморфноядерных лейкоцитов и накопление юных форм этих клеток - ранняя реакция фагоцитов на инфекционные агенты. Возрастает функциональная активность, которую оценивают по фагоцитарной способности, а также по изменению активности некоторых ферментов (миелопероксидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) и увеличению концентрации в крови белков, продуцируемых полиморфноядерными лейкоцитами (лизоцим, прокальцитонин и др.). Полиморфноядерные лейкоциты особенно значимы в качестве антимикробных агентов при инфекциях, вызываемых бактериями и грибами, а также при защите от капсульных микроорганизмов и возбудителей пиогенных инфекций. При дефектах развития нейтрофильных лейкоцитов меняется их содержание в крови, возникают морфологические и функциональные нарушения (табл. 16-1 и 16-2). В основе отклонений - ферментопатии, нарушения созревания клеток, синтеза адгезивных молекул, разнообразных рецепторов и др.

Таблица 16-1. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся нейтрофилией (количество нейтрофилов превышает 8×10⁹/л крови)

Таблица 16-2. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся нейтропенией (количество нейтрофилов в крови менее 1,5×10⁹/л)

Увеличение в крови количества эозинофилов и накопление продуктов их метаболизма (главный основной и эозинофильный катионный белок, эозинофильные нейротоксин и пероксидаза) характерно для аллергических заболеваний, паразитарных инфекций и опухолей (табл. 16-3). Эозинофилы при этой патологии активно осуществляют свои эффекторные функции.

Таблица 16-3. Основные заболевания и состояния, при которых возможна эозинофилия (количество эозинофилов в крови превышает 0,45×10⁹/л)

Моноциты крови и тканевые макрофаги участвуют в противоинфекционной защите при хронических инфекционных процессах, а также при инфекциях, возбудители которых облигатные или факультативные внутриклеточные паразиты (вирусы, хламидии, риккетсии, микоплазмы и др.). Для этих заболеваний характерно увеличение концентрации в крови моноцитов, возрастание их фагоцитарной активности, способности в больших количествах продуцировать цитокины, оксид азота, неоптерин и др. медиаторы воспаления (табл. 16-4).

Таблица 16-4. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся моноцитозом (количество моноцитов в крови более 0,75×10⁹ /л)

Дендритные клетки (ДК) миелоидного происхождения находятся в пограничных тканях (клетки Лангерганса, интерстициальные-дермальные ДК) - важный фактор врожденного иммунитета. Наряду с фагоцитарными функциями, они способны обрабатывать захваченные антигены и представлять их фрагменты T- и B-лимфоцитам, NKT-клеткам, запуская антиген специфический иммунный ответ. Антигенпредставляющие ДК могут стимулировать лимфоциты, направлять дифференцировку антигенактивированных лимфоцитов в хелперные и регуляторные клетки разных типов. Таким образом, ДК определяют характер иммунного ответа на антиген (клеточный и/или гуморальный иммунный ответ).

Рецепторы фагоцитов реагируют на макромолекулы чужеродных клеток. Лиганды для этих рецепторов - консервативные макромолекулы, синтезируемые вирусами и клетками микроорганизмов, грибов и простейших. Они широко распространены среди представителей мира микроорганизмов, но отсутствуют на клетках высших животных и человека. Антитела, комплемент, пентраксины и другие лиганды, к которым у «профессиональных» фагоцитов имеются соответствующие рецепторы, обеспечивают избирательную активность клеток фагоцитарной системы. Различные дефекты фагоцитов приводят к нарушению функции этого звена врожденного иммунитета.

NK-клетки (англ. natural killer - естественный убийца) обладают цитотоксической активностью в отношении антигенно измененных собственных клеток. Морфологически они представлены большими гранулярными лимфоцитами. Количество NK-клеток в крови у взрослых достигает 15% лимфоцитов; они присутствуют в костном мозге, лимфоидных органах, печени, легких и др.

Среди NK-клеток различают две субпопуляции: классические NK-клетки и NKT-клетки. NKT-клетки имеют антигенраспознающий рецепторный комплекс (TCR⁺CD₃), сходный с таковым у Т-лимфоцитов. Набор антигенов, с которыми могут взаимодействовать NKT-клетки, ограничен липидными и липопротеидными антигенами микроорганизмов. NK- и NKT-клетки способны продуцировать TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, IL-12, они же индуцируют апоптотическую гибель клеток-мишеней.

NK-клетки с высокой цитотоксической активностью отличаются большим содержанием мембранных CD16 белков, а продуцирующие цитокины - экспрессией CD56 поверхностных молекул. Цитотоксическая активность NK-клеток в норме подавлена, активируются они при утрате ингибирующих их активность сигналов. Пролиферацию, дифференцировку и функцию NK-клеток поддерживают IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, TNF-α, IFN-γ и др. цитокины, а подавляют IL-10 и TGF-β. Содержание В- и NK-клеток с учетом возраста представлено в табл. 16-5.

Таблица 16-5. Содержание B-лимфоцитов и NK-клеток в крови лиц разного возраста

Дефицит содержания или функциональная несостоятельность NK-клеток характеризуется высокой чувствительностью человека к вирусам и тяжестью течения таких вирусных инфекций, как цитомегаловирусная, опоясывающий лишай, простой герпес, инфекционный мононуклеоз и др.

Белки системы комплемента - важный гуморальный фактор врожденного иммунитета. Эти белки присутствуют в сыворотке крови в неактивной форме и приобретают иммунобиологическую активность в результате последовательной активации компонентов системы комплемента. Образующиеся при этом комплексы из нескольких белков системы комплемента и фрагменты белковых молекул способны не только лизировать клетки микроорганизмов, паразитов, вирусные частицы, соматические и др., но и в качестве эффекторных и регуляторных факторов участвуют в воспалительных реакциях и антиген-специфическом иммунном ответе.

Отдельные белки системы комплемента обозначают латинской буквой С и цифрами (С1, С2), субъединицы белков и продукты их расщепления или активации - дополнительно малыми латинскими буквами (например, C1q, C1r, C3а).

Известны три главных пути активации системы комплемента: классический, альтернативный и лектиновый (маннанопосредованный).

При классическом пути активация системы инициируется C1q субкомпонентом комплемента в результате взаимодействия C1q с Fc-фрагментом конформационно измененных IgM и IgG или с пентраксинами. В естественных условиях конформационные изменения Fc-фрагментов IgM и IgG возникают при взаимодействии иммуноглобулинов с антигенами. Фиксированный на Ag-IgM и Ag-IgG комплексах C1q взаимодействует с С1r и C1s субкомпонентами комплемента. Последний активируется и, обладая активностью эстеразы, расщепляет С4 и С2. Образующиеся С4b и С2а фрагменты в виде димерных молекул фиксируются на иммунных комплексах и как протеазы способны взаимодействовать с С3 плазмы, а затем и расщеплять его на С3а и С3b субкомпоненты. Трехкомпонентный комплекс С4b2а3b способен взаимодействовать с С5 плазмы и, благодаря пептидазной активности, расщеплять С5 на субкомпоненты С5а и С5b. С образования С5b запускается активация компонентов, атакующих мембраны клеток. Эти белки комплемента, последовательно взаимодействуя друг с другом, образуют мультимолекулярный мембраноатакующий комплекс (МАК), способный атаковать липидные мембраны разнообразных клеток и, встроившись в них, нарушать целостность клеточных мембран и соответственно вызывать лизис клеток. Сборка МАК начинается с С5b. Фиксированная на мембране клетки молекула С5b имеет участок, взаимодействующий с белком С6. В результате такого взаимодействия образуется эквимолекулярный комплекс С5bС6, который взаимодействует с С7, образуя трехмолекулярный комплекс С5bС6С7. С7 плазмы крови характеризуется амфофильными свойствами, и при взаимодействии с С5bС6 гидрофобный участок С7 обеспечивает прочную фиксацию всего трехмолекулярного комплекса на фосфолипидах наружной клеточной мембраны.

Фиксированный на клетке С5bС6С7 трехмолекулярный комплекс служит рецептором для циркулирующего в крови С8. В результате фиксации на мембране клетки С8 приобретает способность связывать циркулирующие в крови С9 и неэнзиматически катализировать их полимеризацию, после чего изменяется конформация молекул этого белка, увеличивается число участков взаимодействия комплекса с фосфолипидами мембраны и образуется полимерная белковая структура, по форме напоминающая воронку или цилиндр. Такой цилиндр погружается в липидный бислой наружной мембраны клетки-мишени. Снаружи стенки цилиндра образованы гидрофобными, а внутренняя его сторона - преимущественно гидрофильными аминокислотами полипептидов комплекса. Благодаря этому, вода смачивает внутреннюю поверхность стенок цилиндра и через отверстие в нем может легко поступать из окружающей среды внутрь клеток, вызывая их гибель.

Мишенями для МАК комплемента могут быть клетки бактерий, грибов и простейших, вирусные частицы, липосомы и другие структурированные образования, а также собственные соматические клетки организма. Для активации комплемента классическим способом против поверхностных антигенов клеток и частиц необходимы иммунные или естественные антитела в виде иммуноглобулинов класса IgG и IgM.

Лектиновый путь активации комплемента отличается от классического лишь начальным инициирующим этапом. В крови у людей и животных циркулирует протеин, способный взаимодействовать с маннозой гликопротеинов и полисахаридов (англ. MBL - mannose binding lectin ). Манноза в больших количествах содержится в полисахаридах и гликопротеинах микроорганизмов и растений. При внедрении микроорганизмов в макроорганизм MBL фиксируется на маннозных остатках поверхностных полисахаридов и гликопротеинов. С иммобилизированным MBL взаимодействует сериновая протеаза крови, получившая название MBL-ассоциированная протеаза (MASP). Протеаза в комплексе с MBL активируется и приобретает способность расщеплять С4 и С2. В дальнейшем активация системы комплемента осуществляется в той же последовательности и с образованием тех же продуктов, что и при классическом пути.

Альтернативный путь активации системы комплемента также отличается начальными этапами. Активация альтернативным способом осуществляется без участия антител. Инициаторными молекулами выступают компоненты поверхностных структур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, липополисахариды, тейхоевые кислоты клеточных стенок, полисахариды и клеточные стенки дрожжей и грибов, некоторые вирусы и вирусинфицированные клетки, клетки простейших.

С3 - компонент комплемента, который инициирует альтернативную активацию всей системы и может подвергаться медленному спонтанному гидролизу тиоэфирной связи молекулы. С3 с измененной тиоэфирной связью не расщепляется на С3а и С3b субкомпоненты, но приобретает свойства, делающие его тождественным С3b. Гидролизованный С3 (С3-гидро), как и С3b, взаимодействует с поверхностными структурами чужеродных клеток.

Взаимодействие C3b с клетками отличается определенной избирательностью и легко осуществляется благодаря высокому сродству C3b к поверхностным структурам микроорганизмов, липополисахаридам клеточных стенок бактерий, зимозану клеточных стенок дрожжей, полисахаридам чужеродных клеток. Высокое содержание сиаловых кислот на мембране клеток человека и других млекопитающих защищает соматические клетки от фиксации на их поверхности C3b и альтернативной активации комплемента. Избирательность в фиксации C3b на мембранах чужеродных клеток, сопровождающаяся активацией системы комплемента альтернативным способом, обеспечивает в организме примитивное распознавание чужеродных (микробных) антигенов.

Каждый из путей активации системы комплемента регулируется в организме относительно самостоятельно. Регуляцию активности системы осуществляют молекулы, способные связать или инактивировать отдельные белки системы комплемента или, напротив, пролонгировать их пребывание в организме в активном состоянии (пропердин).

В процессе активации системы комплемента образуется множество субкомпонентов - продуктов расщепления отдельных белков. Эти субкомпоненты, оставаясь на мембране клетки или поступая в циркуляцию, обладают высокой иммунобиологической активностью. Рецепторы к субкомпонентам белков системы комплемента есть в основном у клеток, участвующих в воспалительных процессах и в иммунном ответе на антигены. Таким образом, образующиеся при активации комплемента белковые субмолекулы - важные эндогенные регуляторы иммунного ответа.

У новорожденных гемолитическая активность комплемента НС50 и содержание С3 и С4 составляет 50-75% взрослых людей, однако содержание в крови С8 и С9 не превышает 10% взрослых. К 3-месячному возрасту гемолитическая активность комплемента в крови сопоставима с таковой у взрослых.

Врожденные или приобретенные дефекты синтеза отдельных компонентов комплемента характеризуются высокой чувствительностью к пиогенным и капсульным инфекциям и склонностью к возникновению аутоиммунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания при дефиците С4, С2 и С3 компонентов развиваются из-за нарушения выведения из циркуляции иммунных комплексов, в том числе комплексов аутоантиген-аутоантитело (табл. 16-6). Повышенная активность комплемента, обусловленная дефектом ингибитора первого компонента комплемента (C1inh), проявляется развитием ангионевротического отека, решающим фактором в патогенезе которого служат накапливающиеся в результате гиперактивации комплемента С3а и С5а анафилатоксины.

Таблица 16-6. Заболевания, ассоциирующиеся с недостаточностью белков системы комплемента и их рецепторов

Нарушения синтеза таких ингибиторов системы комплемента, как DAF (англ. decay accelerating factor - фактор, ускоряющий разрушение), HRF18 и HRF65 (англ. homology restriction factor - фактор гомологической рестрикции), приводят к повышенной активности комплемента в отношении аутологичных эритроцитов, что клинически фиксируют у больных ночной пароксизмальной гемоглобинурией. Именно поэтому лабораторное исследование белков системы комплемента рекомендуют проводить у лиц с системными аутоиммунными заболеваниями, при хронических инфекциях, отеках и васкулитах неясного генеза.

С-реактивный белок и декамерный протеин РТХЗ - пентраксины, являются представителями гуморального врожденного иммунитета. С-реактивный белок - представитель «коротких» белков семейства пектраксинов (м.м. 115 kDa), его синтезируют гепатоциты под влиянием провоспалительных цитокинов IL-6, IL-1, TNF-α. С-реактивный белок накапливается в крови и тканевых экссудатах больных при острых и хронических инфекциях, травмах и других заболеваниях. У практически здоровых людей содержание С-реактивного белка в крови не превышает 4 мг/л; при остром воспалении его уровень быстро возрастает в течение первых часов. При бактериальном сепсисе, легионеллезе и тяжелых васкулитах концентрация С-реактивного белка в крови превышает 300 мг/л; при бактериальных инфекциях, острых васкулитах, некоторых лимфомах уровень С-реактивного белка в крови варьирует в пределах 100-300 мг/л. При инфекционном мононуклеозе, цитомегаловирусной, герпетической и аденовирусной инфекциях, артритах, ревматоидной полимиалгии и большинстве лимфом содержание С-реактивного белка в крови не превышает 100 мг/л. При большинстве вирусных инфекций уровень С-реактивного белка в крови больных существенно не меняется. Концентрация С-реактивного белка в крови больных отражает изменения в развитии болезни за последние 6-8 ч.

С-реактивный белок способен взаимодействовать с остатками фосфорилхолина в молекулах полисахаридов, лецитина, сфингомиелина, а также со свободной ДНК разного происхождения, образуя мультимолекулярные комплексы. В них С-реактивный белок взаимодействует с C1q компонентом комплемента и активирует комплемент классическим способом, а также опсонизирует объекты фагоцитоза и стимулирует активность NK-клеток.

РТХЗ - представитель длинных пентраксинов, декамерный протеин с М.м. 440 kDa, продуцируется активированными моноцитами и дендритными клетками, способен взаимодействовать с маннозой гликопротеинов микробного и иного происхождения. РТХЗ обладает опсонизирующей активностью, фиксируясь на объектах фагоцитоза, а также в комплексе с полисахаридами взаимодействует с С1q белком комплемента и активирует комплемент классическим путем.

Таким образом, клеточные и гуморальные факторы врожденного иммунитета обладают разнообразными средствами, позволяющими им противостоять чужеродным агентам и участвовать в защите от внедрения, размножения и распространения в организме «чужого». Клетки врожденного иммунитета активно взаимодействуют друг с другом и с клетками приобретенного иммунитета, что делает процесс защиты высокоэффективным и надежным. Гуморальные факторы врожденного иммунитета нейтрализуют и разрушают чужеродные агенты, способствуя их быстрому выведению из крови и организма.

Главные исполнители антиген-специфического иммунного ответа - лимфоциты (гетерогенная популяция клеток). Они, не различаясь морфологически, существенно отличаются набором мембранных белков и функциональной активностью. Количество их в крови может существенно меняться в зависимости от патологии (табл. 16-7). Лимфоциты подразделяют на три большие популяции: Т-лимфоциты (тимусзависимые), В-лимфоциты (костномозговые или бурсальные) и NK (натуральные киллерные клетки).

Таблица 16-7. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся лимфоцитозом

Примечание. Количество лимфоцитов в норме имеет возрастные особенности. После второго «возрастного» перекреста в лимфоцитарной формуле за лимфоцитоз принимают увеличение абсолютного числа лимфоцитов в крови от 4,0×10⁹/л и более. Абсолютный лимфоцитоз бывает значительно реже относительного, встречающегося при гранулоцитопении.

Среди Т-лимфоцитов различают клетки Т-хелперные (Тh), Т-регуляторные (Тr) и Т-цитотоксические (Tс). Они фенотипически могут быстро меняться и трансформироваться в Т-клетки с разными функциями. Тr обеспечивают регуляцию антиген-специфического иммунного ответа и функциональной активности иммунной системы в целом. Эти клетки, продуцируя множество цитокинов, отвечают за взаимодействие иммунной системы с другими системами организма.

Современные методы идентификации Т-лимфоцитов и определения их принадлежности к тем или иным субпопуляциям основываются на исследовании мембранных белков. Мембранные белки, иммунохимически охарактеризованные в качестве маркеров тех или иных клеток, получили обозначение CD (от англ. cluster of differentiation - скопление дифференцировочных детерминант). Различные субпопуляции Т-лимфоцитов отличаются друг от друга и от В-лимфоцитов набором CD-протеинов, многие из которых - рецепторы клеток к различным лигандам. Отдельные CD-протеины обозначают цифрами, например CD1, CD2, CD3 и т.д.

Распознавание антигенов Т-клетками происходит с помощью рецепторов, способных специфически взаимодействовать с антигенными детерминантами и одновременно с молекулами HLA, в комплексе с которыми находятся антигенные детерминанты. В зависимости от строения антигенраспознающих рецепторов (TCR), все Т-лимфоциты подразделяют на две субпопуляции: αβТ- (90-95%) и γδТ-клетки (5%). По расчетным данным, набор антигенных детерминант, с которыми могут взаимодействовать αβТ-клетки, достигает 10¹⁸ вариантов молекул; γδТ-лимфоциты могут реагировать на антигенные детерминанты относительно ограниченного репертуара (белки теплового шока, некоторые антигены микроорганизмов).

Т-клетки не реагируют на свободно циркулирующие антигены и могут взаимодействовать с ними только в том случае, если антигены подверглись обработке в других клетках, а отдельные олигопептиды (детерминанты) обработанного антигена представляются Т-лимфоцитам на поверхности вспомогательных клеток (дендритных, макрофагов, В-лимфоцитов и др.). Фрагменты антигена на мембране вспомогательных клеток представляются Т-клеткам посредством белков главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса для цитотоксических лимфоцитов или II класса для хелперных-регуляторных лимфоцитов (МНС-белки от aнгл. major histocompatibility complex). У человека белки МНС обозначены как HLA-белки (англ. human leukocyte antigens). Таким образом, Т-лимфоциты человека реагируют на чужеродные антигены, только если эти антигены ассоциированы с HLA-белками на мембранах любых клеток организма.

Кроме αβ или γδ полипептидных цепей, специфически взаимодействующих с антигенной детерминантой, в построении антигенраспознающих рецепторов Т-клеток участвует также несколько дополнительных полипептидых цепей. Их принято обозначать как СD3 рецепторный комплекс. СD3 белки в антигенраспознающем рецепторе Т-лимфоцитов выполняют несколько вспомогательных функций, в том числе проводят сигнал от взаимодействующего с антигеном рецептора клетки в ядро Т-лимфоцита. Принадлежащие к разным клонам Т-лимфоциты отличаются строением наружных концевых участков у αβ и γδ гетеродимеров, что позволяет каждой Т-клетке с помощью TCR взаимодействовать лишь с определенной, чаще какой-либо одной, антигенной детерминантой. Принципиально важно, что в доантигенной дифференцировке Т-лимфоцитов в тимусе формируется TCR с широким спектром специфичностей к антигенам, с которыми, вероятно, встретятся Т-клетки на периферии.

В процесс контакта Т-клеток с антигеном с помощью TCR-CD3 рецепторного комплекса вовлекаются также другие мембранные белки клетки, обозначаемые как корецепторы CD4 и CD8. У зрелых Т-клеток экспрессия этих белков альтернативная, клетки либо CD4⁺CD8^- или CD4^-CD8⁺. CD4⁺ белки обнаруживаются у хелперных и регуляторных Т-лимфоцитов, CD8⁺ молекулы - у цитотоксических Т-клеток. CD4 белок на мембране Тh-лимфоцитов способствует более прочному связыванию антигенраспознающего рецептора лимфоцита с нагруженными антигеном белками II класса HLA (HLA-D, -DR, -DP, -DQ) вспомогательных клеток. Белки II класса HLA в достаточных количествах, а также В-лимфоциты, экспрессируются преимущественно на мембранах антигенпредставляющих клеток иммунной системы (дендритные клетки, макрофаги). Они фагоцитируют чужеродные антигены, в эндосомах клеток расщепляют их до олигопептидов из 13-18 аминокислот и образуют комплексы из олигопептидов антигена и белков HLA II класса. Такие комплексы затем встраиваются в мембрану вспомогательных клеток и, обладая высокой иммуногенностью, представляются CD4 Т-лимфоцитам.

Полипептид CD8⁺ обеспечивает более прочное взаимодействие антиген-специфического рецептора Tc-лимфоцитов с антигеном, расположенным на поверхности какой-либо соматической клетки в ассоциации с белками HLAI класса (HLA-A, -В, -С). Поскольку белки HLA-A, -В, -С как трансплантационные антигены находятся на мембранах практически всех клеток организма, любая клетка может представить антиген CD8⁺ Т-лимфоцитам в виде комплекса из олигопептида антигена и белков HLA-A, -В, -С. В этом случае расщепление молекулы (частицы) антигена до олигопептидов происходит в протеосомах цитоплазмы любой инфицированной антигеном соматической клетки. Там же, в цитоплазме, образуется высокоиммуногенный комплекс из коротких пептидов антигена (8-10 аминокислотных остатков) и белков HLA I класса. На поверхности ядросодержащих клеток содержание белков HLA I класса достигает 105 молекул, так что каждая соматическая клетка может представлять множество антигенных олигопептидов и вызывать против этих детерминант и себя ответ цитотоксических CD8 Т-лимфоцитов.

Таким образом, в антигенной активации CD4⁺ и CD8⁺ субпопуляций Т-лимфоцитов участвуют разнообразные клетки организма. Показано, что взаимодействие CD8⁺ или CD4⁺ на поверхности Т-лимфоцитов соответственно с HLA белками I или II класса вспомогательных клеток способствует образованию на мембранах Т-лимфоцитов полимерных комплексов из TCR-СD3 белков и проведению сигнала для активации Т-клеток. Несмотря на большое принципиальное сходство в строении TCR-CD3 белков, у αβТ- и γδТ-клетки эти субпопуляции существенно различаются функционально. У большинства γδТ-клеток редко или вовсе не экспрессированы белки CD4 и CD8. Эти клетки могут распознавать антиген в комплексе с белком CD1 на поверхности антигенпредставляющей клетки. У человека описано пять вариантов белков CD1, которые способны образовывать комплексы и представлять γδТ-лимфоцитам ограниченные наборы антигенов. γδТ-клетки цитотоксически активны, в качестве интраэпидермальных и интраэпителиальных лимфоидных клеток в наибольших количествах представлены в коже, слизистой оболочке тонкого кишечника и урогенитального тракта.

У Т-лимфоцитов имеются разнообразные адгезивные молекулы и рецепторы к хемокинам. Посредством этих молекул клетка получает сигналы для направленной миграции и взаимодействует с белками внеклеточного матрикса, с эндотелиальными клетками сосудов лимфатических узлов и мукозных лимфоидных органов, с клетками крови и белками комплемента. Адгезивные молекулы и рецепторы к хемокинам обеспечивают накопление Т-лимфоцитов в очагах воспаления (гранулемы), лимфоклеточную инфильтрацию тканей, взаимодействие лимфоцитов друг с другом и с клетками и молекулами врожденного иммунитета.

Большинство циркулирующих в крови Т-лимфоцитов находится в состоянии покоя, но при контакте с соответствующим антигеном или под влиянием других стимулов они активируются. Активированные лимфоциты отличаются от покоящихся клеток возросшим содержанием в цитоплазме свободных ионов Са⁺⁺, возросшим кислородным метаболизмом, повышенным синтезом РНК и белков, появлением на мембранах клеток новых белков и изменением содержания ранее представленных. Все это приводит к превращению покоящегося малого лимфоцита в бластную клетку, которая затем делится 4-5 раз, воспроизводя все фенотипические особенности исходной материнской клетки. При этом дочерние клетки приобретают высокую иммунобиологическую активность, проявляя себя в качестве регуляторных или эффекторных Т-клеток. Мембранные маркеры активированных Т-клеток - CD25, CD54 (TCAM-1), CD69, CD70, CD71, белки HLAII класса и некоторые другие молекулы. При активации на поверхности Т-клеток увеличивается содержание CD2 и CD3. Из характерных для активированных Т-лимфоцитов молекул выделяют: CD25 - α-цепь рецептора к IL-2, CD54 - интегрин, обеспечивающий взаимодействие активированного Т-лимфоцита с другими клетками иммунной системы, CD69 - ранний маркер активации разнообразных лейкоцитов, CD71 - рецептор к сывороточному трансферрину.

Накопившиеся после антигенной активации иммунные лимфоциты по набору мембранных белков отличаются от так называемых наивных покоящихся Т-клеток, которые, поступив из тимуса в кровь и лимфоидные органы, еще не имели контакта с соответствующими антигенами. Маркеры наивных CD4⁺ или CD8⁺ Т-лимфоцитов - экспрессированные на мембране клеток CD45RA и CD62-L белки. Белок CD45RA - изоформа тирозинфосфатазы с М.м. 205-220 kDa. У иммунных Т-лимфоцитов другая изоформа фермента - CD45RO с М.м. 180 kDa. Важную роль в антигенной активации Т-клеток играет CD45, поскольку при его отсутствии на поверхности клеток Т-лимфоциты не способны отвечать на антигенный стимул.

CD62L - L-селектин - обеспечивает узнавание наивными Т-лимфоцитами вторичных лимфоидных органов и накопление их там. При антигенной активации наивных Т-лимфоцитов важны костимулирующие сигналы, подаваемые клетке через CD28 мембранный белок, посредством имеющихся белков CD80 и CD86 у антигенпредставляющих клеток. Наивные Т-клетки без антигенной активации редко делятся, а продолжительность их жизни составляет от нескольких недель до 10 лет. Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов в крови с учетом возраста представлено в табл. 16-8.

Таблица 16-8. Содержание в крови Т-лимфоцитов основных фенотипов у лиц разного возраста

При антигенной активации наивных и иммунных Т-лимфоцитов связывание антигена с TCR-CD3 белками лимфоцита должно быть дополнено сигналами, подаваемыми Т-клетке через дополнительные костимулирующие рецепторы. У наивных Т-лимфоцитов такой рецептор представлен CD28, а также рецепторами к цитокинам и некоторым другим лигандам. Эти дополнительные команды могут усиливать или угнетать пролиферацию Т-лимфоцитов или регулировать направление их дифференцировки.

Популяция CD4⁺ Т-лимфоцитов человека неоднородна, ее подразделяют на несколько субпопуляций регуляторных и хелперных Т-клеток. Среди последних, в зависимости от их способности продуцировать те или иные наборы цитокинов, различают Тh0-, Тh1- и Тh2-, Th-17 и Tfh-клетки.

В крови у здоровых и неиммунизированных людей среди Тh-лимфоцитов антиген-специфического клона преобладают Тh0-клетки. При вакцинации наивные Тh0-клетки быстро превращаются в иммунные эффекторные Тh1- или Тh2-лимфоциты. Маркерными цитокинами Тh1-клеток служат продуцируемые ими IFN-γи IL-2, а Тh2-лимфоцитов - IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13. Дифференцировку Тh0-клеток в Тh1- или Тh2-клетки определяют многие факторы и условия взаимодействия наивных Тh0-лимфоцитов с антигеном. Важнейшее значение этой дифференцировки придают цитокинам, в особенности IL-12. Он определяет дифференцировку Тh0-клеток в Тh1-лимфоциты, лишь в его отсутствие возможна дифференцировка клеток в Тh2-лимфоциты. Продуцирование Тh1- и Тh2-лимфоцитами тех или иных цитокинов определяет роль этих клеток в регуляции антиген-специфического ответа.

Тh1-лимфоциты ответственны за клеточный антиген-специфический иммунный ответ и функцию клеток фагоцитарной системы и NK-клеток, участвуют в регуляции экспрессии генов IgM и IgG2 в В-клетках. Цитокины, продуцируемые Тh2-лимфоцитами, поддерживают в организме биосинтез IgЕ и некоторых других иммуноглобулинов, участвуют в аллергическом воспалении, активируя тучные клетки (IL-9) и эозинофилы (IL-5). Синтезируемый Тh1-лимфоцитами IFN-y подавляет функцию и продукцию цитокинов Тh2-клетками, а продуцируемые Тh2-лимфоцитами IL-4 и IL-5 угнетают синтез цитокинов Тh1-лимфоцитами и макрофагами. Таким образом, эти две популяции Тh-лимфоцитов находятся в реципрокных отношениях, каждая из них, поддерживая один оптимальный вариант антиген-специфического ответа, угнетает другой.

В противовес Тh1- и Тh2-лимфоцитам в крови обнаруживают несколько популяций Т-лимфоцитов, негативно регулирующих функцию врожденных и приобретенных клеточных факторов иммунной системы. Tr-клетки угнетают пролиферацию CD4⁺ Т-лимфоцитов. Супрессия достигается как при прямом контактном взаимодействии Тr-лимфоцитов с клетками, так и благодаря способности этих клеток продуцировать иммуносупрессорные цитокины (TGF-(3, IL-10). Tr-клетки, наряду с лимфоцитами, угнетают функцию дендритных клеток и других клеток врожденного иммунитета. Среди Тr-клеток различают две субпопуляции. Первая представлена натуральными клетками тимического происхождения (nТr), вторая - адаптивными Т-клетками (аТr).

Tr-лимфоциты подавляют иммунный ответ на аутоантигены, опухолевые, трансплантационные и некоторые инфекционные антигены. При их недостаточности в организме развиваются аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз, аутоиммунный полигландулярный синдром, диабет I типа и др.), аллергии и лимфопролиферативная патология.

К эффекторным Т-клеткам крови относят Tc. Они вызывают лизис любых клеток организма, несущих на поверхности антигенные детерминанты, к которым у Tc-клеток имеется рецепторный комплекс TCR CD3⁺. Среди Tc-лимфоцитов преобладают CD4^-, CD8⁺ и αβТ-лимфоциты. Количество их в крови у взрослых людей может достигать 25% общего числа Т-лимфоцитов крови.

Около 4% CD4^-CD8^-Т-лимфоцитов крови имеют TCR-молекулы, построенные с участием γ- и δ-пептидных цепей. Эти клетки также обладают цитотоксической активностью, но представление антигена клетками-мишенями в этом случае осуществляется посредством CD1 белков. γδТ-клетки способны быстро синтезировать цитокины, вызывающие воспалительную реакцию.

При антигенной активации цитотоксических Т-лимфоцитов вторые подтверждающие активационные сигналы - сигналы, подаваемые Tc-лимфоцитам через рецептор к IL-2. Источником IL-2 в этом случае служат участвующие в иммунном ответе на этот же антиген Тh-лимфоциты (того же антиген-специфического клона). Именно поэтому Tc-лимфоцитам для своей активации необходимо взаимодействие с Тh-клетками. При получении активирующих и костимулирующих сигналов антиген-специфический клон Tc-лимфоцитов вступает в пролиферацию и приобретает способность в качестве эффекторных клеток убивать клетки-мишени, несущие антиген. Такой механизм иммунного цитолиза важен для противовирусного иммунитета, поскольку обеспечивает гибель любых клеток, несущих на мембране вирусы или вирусные антигены в ассоциации с белками МНС I класса или CD1 мембранными белками клеток.

Цитотоксические лимфоциты активно участвуют в противоопухолевом и транс плантационном иммунитете, а также в защите от собственных клеток, несущих белки теплового шока или гликолипидные микробные антигены. Тс-лимфоциты осуществляют гибель клеток-мишеней путем выделения в их сторону цитотоксических белков (лимфотоксинов). К таким лимфотоксинам относят перфо рин (цитолизин) и некоторые сериновые протеазы. Перфорины напоминают белки мембрано атакующего комплекса комплемента: встраиваясь в мембрану клетки-мишени, они образуют в ней поры, через которые в клетку-мишень из Тс-лимфоцитов поступают гранзимы, активирующие каспазы. Последние разрушают внутриклеточные мембраны, активируют эндонуклеазы и индуцируют гибель клетки-мишени путем апоптоза.

Таким образом, для системы Т-лимфоцитов характерно исключительное разнообразие образующих ее клеток, которые отличаются не только структурой антигенраспознающих рецепторов, но и наборами ассоциированных с мембранами белков и рецепторов, спектром продуцируемых цитокинов и многими другими признаками, а следовательно, разнятся функционально.

Показано, что набор экспрессируемых Тh-лимфоцитами фенотипических маркеров может быстро меняться (при культивировании _in vitro_через 3-4 сут), клетки могут нести фенотипические маркеры оппозитной популяции Тh-клеток. Поэтому при лабораторном анализе лимфоидной системы больных возрастает необходимость проведения повторных анализов и осуществления иммунологического мониторирования пациентов.

Дифференцировка В-клеток происходит в костном мозге и предназначена для формирования антигенсвязывающего рецептора В-лимфоцитов (BCR). BCR состоит из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей, образующих молекулу мембранного иммуноглобулина (mIg). На мембране клетки с молекулами mIg связаны по две молекулы Igα- и Igβ-полипептидных цепей, предназначенных для проведения сигнала от BCR в ядро клетки после контакта с антигеном. BCR распознает только одну антигенную детерминанту. Весь пул В-клеток обладает широ ким диапазоном специфичностей к антигенам (до 10⁹ антигенных детерминант). Главный механизм формирования разнообразия специфичностей BCR - реаранжировка (перестановка) вариабельных и константных участков генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, постоянно происходящих у незрелых В-клеток в костном мозге. Случайная реорганизация генов иммуноглобулинов приводит к появлению рецепторов, специфичность которых направлена против не только чужеродных антигенов, но и собственных молекул. Удаление таких аутореактивных В-клеток происходит посредством апоптоза в костном мозге в процессе негативной селекции, когда незрелые В-лимфоциты взаимодействуют с аутоантигенами организма.

Каждый этап дифференцировки клеток гемопоэтического ряда, в том числе В-лимфоцитов, сопровождается экспрессией или исчезновением функциональных молекул, которые могут служить маркерами стадии дифференцировки клеток и их состояния. Важный маркер всех клеток-предшественников и периферических В-лимфоцитов - CD19 (на плазматических клетках он отсутствует) (см. табл. 16-5). Он участвует в активации и пролиферации В-клеток. CD19 экспрессируется на всех неопластических клетках при острых лейкозах В-клеточного происхождения.

В-лимфоциты способны непосредственно взаимодействовать с антигенами. Индуцируемая таким взаимодействием пролиферация и дифференцировка зрелых В-клеток происходит в фолликулах и герминативных центрах вторичных лимфоидных органов, а также в лимфоидных тканях слизистых оболочек. После контакта с антигеном в процессе размножения антиген-специфических В-лимфоцитов повышается специфичность антигенсвязывающих рецепторов, а затем и переключение клеток с биосинтеза антигенраспознающих рецепторов в виде молекул IgM и IgD на иммуноглобулиновые рецепторы иных классов (IgG, IgA, IgE). Антигенная специфичность рецепторов возрастает. Переключение В-клеток на синтез рецепторов в виде иммуноглобулинов иных классов осуществляется под влиянием различных цитокинов, продуцируемых Th-лимфоцитами при кооперации с В-клетками. Так, IFNγ обеспечивает синтез В-клетками IgG₂ или IgG₃, TGFβ- IgA, IL-4 - IgE. В дальнейшем при дифференцировке лимфоцитов в плазматические клетки сохраняется способность продуцировать те же иммуноглобулины, что и их клетки-предшественники. В большинстве случаев плазматические клетки живут в течение 2-3 нед, хотя описана популяция долгоживущих плазматических клеток, сохраняющих жизнеспособность в течение года.

Среди зрелых В-клеток различают две субпопуляции. В₁-клетки маркированы CD5⁺ белками, а на В₂-клетках CD5 отсутствует. В₁-клетки по своим характеристикам близки к клеткам врожденного иммунитета. Они локализуются в брюшной и плевральной полостях и слизистых оболочках. В₂-клетки составляют основной пул циркулирующих в кровотоке и пребывающих в периферических лимфоидных органах В-лимфоцитов.

Активированные антигеном В-лимфоциты способны дифференцироваться не только в плазматические клетки, но и в В-клетки - носители иммунологической памяти. Они могут сохраняться в организме в течение 8-10 лет.

С возрастом внутри пула периферических В-клеток происходит снижение числа наивных В-лимфоцитов с пропорциональным увеличением В-клеток памяти (CD27⁺). В связи с этим ответ антител на новый антиген у лиц пожилого и старческого возраста оказывается слабым и непродолжительным. По мере старения в крови у людей возрастает спектр разнообразных аутоантител, представленных, однако, в невысоких титрах.

Иммуноглобулины - белки, обладающие активностью антител, сходные по хими ческой структуре и по иммунохимической специфичности. Главными клетками-продуцентами иммуноглобулинов считают плазматические клетки. Активность антител выражена в способности иммуноглобулинов к высокоспецифичному взаимодействию с антигеном с образованием мультимолекулярных комплексов «антиген-антитело». Антитела обладают вторичными иммунобиологическими свойствами и способны фиксироваться на клетках, взаимодействовать с белками системы комплемента, усиливать активность макрофагов и цитотоксическое действие NK-клеток, регулировать функцию лимфоцитов и др. Эндотелиальные клетки, циркулирующие и резидентные макрофаги (в особенности печени и селезенки) активно выводят из циркуляции, захватывают и разрушают комплексы «антиген- антитело». Взаимодействуя с антигенами, токсинами и ферментами, антитела блокируют их активные центры, нейтрализуют токсичность и угнетают энзиматическую активность этих молекул. Микроорганизмы и паразиты с фиксированными на них антителами утрачивают подвижность, если антитела взаимодействуют с их жгутиками. Антитела против возбудителей препятствуют их прикреплению и вне дрению в различные клетки макроорганизма, в том числе в клетки пограничных тканей, обеспечивая устойчивость к инфекционному заражению. Антительная агрегация возбудителей на поверхности пограничных тканей препятствует переносу инфекта через слизистые покровы. В большинстве случаев антитела оказывают на возбудителей микробостатическое действие. Иммобилизованные на антигене антитела изменяют свою конформацию, что позволяет им фиксировать и активировать белки системы комплемента, стимулировать активность фагоцитов и цито токсичность NK-клеток. Фиксированные на тканевых клетках антитела при взаимодействии с антигеном обеспечивают подачу клеткам активационных сигналов, вовлекая соответствующие клетки в реакцию, направленную против чужеродного агента. Фактически антитела в организме человека обеспечивают избирательное разрушение и нейтрализацию различными факторами иммунитета чужеродных антигенов - молекул и клеток.

Иммуноглобулины человека подразделяют на пять групп или классов, обозначаемых IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Иммуноглобулины разных классов различаются содержанием углеводов, молекулярной массой, первичной структурой, электрофоретической подвижностью, продолжительностью жизни и скоростью обновления в организме, способностью к трансплацентарному переносу, иммунобиологической активностью (табл. 16-9).

Таблица 16-9. Некоторые свойства иммуноглобулинов человека

Иммуноглобулины классов G, D и Е представлены в крови мономерными молекулами. IgM - молекула, состоящая из пяти мономерных молекул, удерживаемых вместе посредством специальной полипептидной J-цепочки. IgA могут быть в виде двух молекулярных форм - мономерной и димерной. В последнем случае две молекулы IgA удерживаются вместе также посредством J-полипептидной цепочки. Несмотря на различия в свойствах, все мономерные иммуноглобулины и субъединицы в полимерных молекулах характеризуются единообразием организации. Все они симметричны и состоят из двух тяжелых - «Н» (heavy- тяжелый) и двух легких - «L» (light - легкий) полипептидных цепочек, удерживаемых друг с другом посредством дисульфидных связей. Тяжелые полипептидные цепочки у иммуноглобулинов разных классов обозначены соответствующими греческими буквами: у-цепочки у IgG, ц-цепочки у IgM.

Отличающиеся строением вариабельные домены (VH- и VL-домены) у различных молекул иммуноглобулинов не только взаимодействуют с разными антигена ми, но и сами несут признаки аутоантигенной специфичности. Именно поэтому против иммуноглобулинов могут накапливаться аутоантитела, реагирующие с VH- и VL-доменами других антител как с новыми для организма антигенными детерминантами. Под влиянием протеаз мономерные молекулы иммуноглобули нов расщепляются на три фрагмента. Два из них идентичны и образованы легкими цепями и частью тяжелой цепи молекулы (Fab-фрагменты), а третий образован дисульфидными остатками тяжелых цепей иммуноглобулина (Fс-фрагмент). Исследование активности фрагментов иммуноглобулинов, полученных при их ферментативном расщеплении, позволило выявить роль отдельных фрагментов и доменов молекулы в обеспечении различных проявлений иммунобиологической активности антител. Так, за способность антител взаимодействовать с антигеном ответственен Fab-фрагмент молекулы. Строение и доступность для взаимодействий Fc-фрагмента молекулы определяет цитофильную активность антител, их способность опсонизировать и фиксировать белки системы комплемента, активировать NK-клетки и В-лимфоциты.

Способность нативных иммуноглобулинов к вторичной иммунобиологической активности возрастает при конформационных изменениях структуры Fc-фрагмента, когда скрытые константные участки доменов тяжелой цепи оказываются на поверхности молекулы и доступны для взаимодействия. Такие конформационные изменения иммуноглобулинов в естественных условиях возникают в результате взаимодействия их Fab-фрагментов с соответствующими антигенами. В комплексах с антигеном иммуноглобулины приобретают способность к побочной иммунобиологической активности, стимулируя различные клетки организма и взаимодействуя с разнообразными гуморальными факторами иммунитета.

Клетки, взаимодействующие с Fc-фрагментами иммуноглобулинов, имеют соответствующие Fc-рецепторы (Fc-R). Описано три варианта клеточных рецепторов к Fc-фрагментам IgG, которые представлены на разных клетках человека и отличаются молекулярной массой и регуляторными свойствами. У моноцитов-макрофагов обнаружен FcγI-гликопротеин (CD64). Этот рецептор с высокой аффинностью может взаимодействовать с субклассами IgG₁ и IgG₃ и менее активно с IgG₄, не взаимодействует с IgG₂.

Fcγ-RII (CD32) обнаруживают у макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, В-лимфоцитов и тромбоцитов. Этот рецептор эффективно взаимодействует только с конформационно измененными Fcγ-фрагментами преимущественно IgG₁ и IgG₃. Сигналы через этот рецепторный белок усиливают фагоцитарную активность, агрегацию и дегрануляцию тромбоцитов и подавляют пролиферацию и дифферен цировку В-лимфоцитов. Fc-RII нейтрофилов взаимодействуют не только с IgG, но и с IgA.

Fcγ-RIII (CD16) - гликопротеин, который определяют у NK-клеток, нейтро фильных лейкоцитов, макрофагов и Т-лимфоцитов. У этого рецептора низкая аффинность, он взаимодействует преимущественно с IgG₁ и IgG₃. Показано участие Fcγ-RIII в усилении фагоцитарной активности клеток и в реакциях антителозависимого цитолиза. Генетические нарушения экспрессии этого рецептора на клетках описаны у больных с пароксизмальной ночной гемоглобинурией, что, как полагают, приводит к сниженной активности соответствующих клеток и к повышенной чувствительности больных к инфекции и к замедленному удалению из крови иммунных комплексов.

У взрослых при вторичном иммунном ответе основные антитела - IgG, состав ляющие 75% сывороточных иммуноглобулинов. Они наиболее медленно обновляемые: период полураспада их в крови составляет 23 сут. IgG человека подразделяют на четыре субкласса (обозначают IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄), отличающиеся первичной структурой Н-цепей в шарнирной области. Способность IgG разных субклассов фиксировать комплемент классическим путем убывает в следующей последовательности: IgG₃ > IgG_l > IgG₂. IgG₄ могут активировать комплемент аль тернативным путем, а не классическим.

В ответ на белковые антигены разного происхождения вырабатываются антитела субкласса IgG_l и в меньшей степени IgG₃ и IgG₄. Полисахаридные антигены (например, капсульные полисахариды микроорганизмов) вызывают образование антител преимущественно субкласса IgG₂. Вирусы вызывают образование антител преимущественно субкласса IgG₁ и IgG₃, а антигены паразитов - IgG₄-антитела.

Врожденные дефекты биосинтеза иммуноглобулинов у людей могут распространяться как на весь класс IgG, так и на отдельные субклассы. Дефект биосинтеза IgG₂ у детей выражается отсутствием или низким уровнем антител против полисахаридов капсульных микроорганизмов, в результате чего для них характерны хронические рецидивирующие инфекции дыхательных путей, возбудители которых - микроорганизмы, образующие полисахаридные капсулы (в частности, пневмококки и Haemophilus influenzae).

Содержание IgM в крови взрослых достигает 10% общего количества иммуноглобулинов. Антитела класса IgM накапливаются преимущественно при первичном иммунном ответе, в начале продукции антител. Комплекс «IgM-антиген» наиболее активно взаимодействует с C1qи э ффективно активирует систему комплемента классическим путем. IgM играют важную роль в антибактериальном иммунитете.

Синтез IgM зависит от кооперации В-клеток с Тh-лимфоцитами в меньшей степени, чем при продукции иммуноглобулинов других классов. Мономерные молекулы IgM, будучи встроенными в мембраны В-лимфоцитов, служат, наряду с IgD, антигенраспознающими рецепторами наивных В-клеток.

Содержание IgD в крови составляет 0,1-0,2% сывороточных иммуноглобулинов. Показано, что антитела против некоторых аутоантигенов (нуклеопротеины, антигены щитовидной железы) - IgD, которые являются протективными антителами при некоторых паразитарных инфекциях.

Содержание IgA в крови составляет 2,0 г/л (0,3 г/кг массы тела). В различных секретах и в смывах с неповрежденной кожи доминируют секреторные IgA (sIgA). Основную массу IgA, циркулирующих в крови, продуцируют плазматические клетки в костном мозге, а с секретами выделяются синтезируемые плазмоцитами в лимфоидных органах подслизистых желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. Все внутриклеточные, мембранные и большинство циркулирующих в крови молекул IgA представлены в мономерной форме, а секретируемые слизистыми оболочками IgA представлены димерными молекулами (150-600 kDa). Секреторный фрагмент в sIgA не только обеспечивает трансэпителиальный перенос полимерных IgA из подслизистых в полости, но в дальнейшем защищает их от действия протеаз хозяина и микробных протеаз на поверхности слизистых оболочек.

У IgA описаны два субкласса - IgA₁ и IgA₂. Первый составляют около 80% циркулирующих IgA, они преобладают среди sIgA, секретируемых эпителиальны ми клетками слизистых оболочек дыхательных путей легких и верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Большую их концентрацию наблюдают в секрете слизистых оболочек генитального тракта женщин и дистального отдела ЖКТ.

Содержание IgE в крови у здоровых индивидуумов составляет около 0,004% общего количества сывороточных иммуноглобулинов. Базофильные лейкоциты и тучные клетки обладают высокоаффинными рецепторами к Fc-фрагменту IgE, поэтому даже при низком содержании IgE в крови эти клетки несут на поверхности IgE, удерживаемый Fcε-R. При контакте фиксированных на клетках IgE с соответствующим антигеном конформационно изменяется структура IgE, агрегируются рецепторы к ним, что обеспечивает раздражение и дегрануляцию несущих IgE базофилов и тучных клеток. При этом освобождаются гистамины и другие компоненты содержимого гранул - медиаторы аллергических реакций. IgE участвуют в антипа разитарном иммунитете, накапливаются при гельминтозах и других паразитозах.

Поликлональные иммунные сыворотки и различные препараты нормальных иммуноглобулинов давно и успешно используют в клинической практике. Так, гомо- и гетерологичные иммунные сыворотки (антитела) применяют для лечения и профилактики интоксикаций и инфекций, вызываемых различными микробами и вирусами. Внутривенно вводимые препараты иммуноглобулинов оказались неза менимыми при терапии врожденных или приобретенных дефектов их синтеза, при острых и хронических бактериальных и вирусных инфекциях, развивающихся на фоне нарушений функций иммунной и кроветворной систем. Иммуноглобулины, назначаемые внутривенно в особенно высоких дозах, проявляют иммунорегуляторную активность. Они оказались эффективным средством лечения некоторых аутоиммунных заболеваний (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная гемолитическая анемия, полиомиозит, апластическая анемия), гиперактивации макрофагальной системы (эндотоксический шок, токсическое воспаление).

Таким образом, приобретенные факторы иммунитета накапливаются и активируются при поступлении в организм соответствующих антигенов. Приобретенные факторы иммунной защиты отличаются исключительно высокой специфичностью и обеспечивают реакции иммунной системы строго на определенные антигенные детерминанты. Приобретенный иммунитет может сохраняться в течение 8-10 лет, для его пожизненного поддержания необходима персистенция антигена в организме или реиммунизация. Формирование приобретенного иммунитета осу ществляется кооперативно при взаимодействии вспомогательных клеток (клетки врожденного иммунитета) с Т- и В-лимфоцитами. Поэтому недостаточность приобретенного иммунного ответа может быть связана не только с дефицитами антиген-специфических клонов Т- и/или В-лимфоцитов, но и с нарушениями кооперативного взаимодействия между клетками иммунной системы. Иммунная система саморегулируется, для достижения ее нормального функционирования крайне важны соотношение и активность не только эффекторных, но и регуляторных антиген-специфических клеток.

Первичными иммунодефицитами называют дефекты иммунной системы, возникающие вследствие генетических поломок. В Международной классификации болезней выделено в качестве нозологических единиц 36 первичных иммунодефицитов. Вместе с тем, по данным ВОЗ, существует более 70 первичных иммунодефицитных состояний. Для многих из них определен молекулярно-генетический дефект. Членами Консультативного совета и Европейского общества по иммуноде фицитным заболеваниям ESID были разработаны и одобрены к распространению рекомендации по первичным иммунодефицитным состояниям.

Настораживающие признаки:

Первичные иммунодефициты - обычно очень серьезные заболевания, но далеко не всегда фатальны, в большинстве случаев их лечение возможно. Диагноз первичного иммунодефицита можно поставить только при специальном обследовании с использованием иммунологических, генетических и молекулярных методов анализа. Это очень важно сделать как можно раньше, чтобы предотвратить тяжелые последствия заболевания.

Основные синдромы иммунодефицитов:

Инфекционный синдром характеризуется тяжелыми рецидивирующими мультифокальными инфекциями, не отвечающими адекватно на проводимое лечение. Это могут быть инфекции, вызванные бактериями, вирусами, грибами и паразитами. Входными воротами инфекции служат кожа, слизистые оболочки верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного и урогенитального трактов.

Аллергический синдром характеризуется кожными поражениями по типу экссудативного диатеза, атопического дерматита, нейродермита, повторными бронхитами с астматическим компонентом. При аутоиммунном синдроме характерны симптомы ревматоидного артрита, васкулита, склеродермии и других системных заболеваний соединительной ткани, аутоиммунной тромбоцитопении, аутоиммунного тиреоидита, сахарного диабета.

Пролиферативный синдром встречается в виде лимфо- и миелопролиферативных заболеваний. Он связан с опухолевой трансформацией клеток иммунной системы (лимфомы, лимфосаркомы, лимфогранулематоз, острый и хронический лимфолейкоз).

Недостаточность фагоцитов составляет 10-15% всех первичных иммунодефицитов. Она обусловлена нарушением пролиферации, дифференцировки, хемотаксиса нейтрофилов и макрофагов и собственно нарушением процесса фагоцитоза (табл. 16-10).

Таблица 16-10. Некоторые врожденные нарушения клеток фагоцитарной системы

Клинически недостаточность фагоцитов отмечают со 2-го года жизни, но может впервые диагностироваться существенно позже. Выраженная недостаточность полиморфноядерных лейкоцитов приводит к развитию генерализованной бактериальной инфекции. Больные с дефектом системы фагоцитов нуждаются в длительном антибактериальном, противомикотическом и симптоматическом лечении.

Изолированный дефект Т-системы иммунитета составляет 5-10% всех первичных иммунодефицитов. Характерны вирусные и микотические инфекции, которые отмечают с первых дней жизни. Лечебные мероприятия при Т-клеточном иммунодефиците определяются ведущим синдромом. Трансплантацией фетального тимуса и введением тимических факторов корригируют Т-клеточные нарушения, связанные с гипотрофией тимуса. В обобщенном виде патогенез, клиническая картина, иммуно- и дифференциальная диагностика представлены в табл. 16-11 и 16-12.

Таблица 16-11. Некоторые первичные иммунодефициты Т-лимфоцитов

Таблица 16-12. Дифференциальная диагностика первичных иммунодефицитов Т-лимфоцитов

Недостаточность системы комплемента выражена в дефектах эффекторных контролирующих белковых систем, характерно нарушение опсонизации фагоцитоза и разрушение микроорганизмов. Клиническая картина дефектов комплемента - иммунокомплексные заболевания, повышенная чувствительность организма к гнойным инфекциям, а также особая предрасположенность к инфекциям, вызываемым двумя видами Neisseria (N. gonorrhoeae и N. meningitidis). Наиболее тяжелые последствия при нарушении функции комплемента (связано с недостаточностью ингибитора С1 компонента комплемента), развивается наследственный ангионевротический отек (табл. 16-13).

Таблица 16-13. Некоторые наследственные дефекты белков системы комплемента

Недостаточность гуморального иммунитета составляет около 60% всех первичных иммунодефицитов и характеризуется нарушением продукции антител. Клинические проявления В-клеточных иммунодефицитов отмечают со второй половины первого года жизни, когда утрачиваются трансплацентарные IgG матери. Больные с общим дефектом В-клеточной функции подвержены рецидивирующим пиогенным инфекциям (табл. 16-14 и 16-15) и нуждаются в пожизненной заместительной терапии антителосодержащими препаратами иммуноглобулинов для внутривенного введения, которую проводят как в дозе насыщения, так и в режиме поддерживающей иммунотерапии.

Таблица 16-14. Первичные нарушения созревания и функций В-лимфоцитов

Таблица 16-15. Дифференциальная диагностика врожденных нарушений адаптивного гуморального иммунитета

Комбинированная недостаточность гуморального и клеточного иммунитета составляет 20-25% всех первичных иммунодефицитов. Дефекты функционирования Т-клеток могут быть причиной развития группы заболеваний, получившей общее название «Тяжелые комбинированные иммунодефициты». Многогранное участие Т-лимфоцитов в специфическом реагировании делает их ведущим компонентом всей иммунной системы. Именно поэтому поражение Т-клеток приводит к особо тяжелым формам иммунодефицита, при котором иммунная система не способна сформировать адекватную специфическую защиту ко многим инфекционным агентам. Больные с комбинированным иммунодефицитом обычно погибают в первые два года жизни. В табл. 16-16 и 16-17 систематизированы данные по патогенезу, клинике, диагностике и дифференциальной диагностике комбинированных иммунодефицитов.

Таблица 16-16. Основные комбинированные (В- и Т-клеточные) иммунодефицитные состояния

Таблица 16-17. Дифференциальная диагностика комбинированных (В- и Т-клеточные) иммунодефицитных состояний

Вторичные иммунодефициты обусловлены экзогенными факторами, характеризуются стойкими клиническими и лабораторными признаками нарушения функций иммунной системы, количественными и функциональными нарушениями гуморального и клеточного иммунитета.

По клиническим признакам и лабораторным показателям вторичные и первичные иммунодефициты сходны. Принципиальное различие в том, что дефект иммунной системы при вторичных иммунодефицитах - приобретенный.

Причины вторичных иммунодефицитов.

Вторичные иммунодефициты разделяют по степени тяжести:

Инфекционный синдром в «чистом виде» встречают в 50% случаев вторичного иммунодефицита. Инфекционный анамнез ориентирован на определение у пациента:

Клинико-лабораторное обследование пациентов помогает оценить количественные и качественные характеристики, отражающие состояние иммунной системы, выявить иммунодефицит и определить степень тяжести нарушений в иммунной системе. Однако окончательный диагноз базируется, прежде всего, на клинических проявлениях. Выбор лечения и прогноз его эффективности зависит от комплексного подхода к такой патологии, как иммунодефицит.

В инфекционной клинике иммунологические обследования больных используют в основном с целью:

При благоприятном течении заболевания у больных формируется защитный иммунитет. Динамика его выработки и роль факторов иммунной защиты при разных инфекциях (и даже на разных этапах болезни) существенно различаются. Именно поэтому схемы и объем иммунологического обследования больных разными инфекциями должны отличаться.

Антиген-неспецифические факторы иммунной защиты представлены клетками пограничных тканей (кожа, слизистые оболочки дыхательных путей, пищеварительного и урогенитального тракта), резидентными клетками разных органов и тканей, эндотелиоцитами, а также клетками крови, различными циркулирующими и выделяемыми с секретами водорастворимыми молекулами. Характеристика основных врожденных антиген-неспецифических факторов иммунной защиты представлена в табл. 16-18.

Таблица 16-18. Антиген-неспецифические факторы иммунитета в противоинфекционной защите

Неповрежденные пограничные ткани - надежная преграда на пути проникновения инфектов внутрь организма. В слое эпителия слизистых оболочек дыхательных путей и ЖКТ обнаружены М-клетки (от англ. microfold- микрозагонщики), способные захватывать из слизи кишечника или дыхательных путей водорастворимые антигены, вирусы и бактерии и в неизменном виде переносить их в подслизистые. М-клетки со стороны подслизистых оболочек экспрессируют на мембране переносимые антигены и обеспечивают взаимодействие с ними дендритных клеток и макрофагов подслизистых. В свою очередь, последние не только захватывают чужеродные антигены и микроорганизмы, но и убивают их, подвергают ферментативному расщеплению до олигопептидов, образуют комплексы пептидов с внутриклеточными белками и представляют комплексы лимфоцитам в высокоиммуногенной форме. При первичном попадании антигенов в организм дендритные клетки захватывают и убивают инфекционных агентов. Захват антигена стимулирует дифференцировку дендритных клеток и их миграцию из пограничных тканей с током лимфы к ближайшим лимфатическим узлам.

Таким образом, дендритные клетки осуществляют не только внутриклеточную обработку антигенов, но и доставку их из пограничной ткани в лимфоидные органы. При первичном иммунном ответе в лимфоидных органах дендритные клетки представляют антиген-специфическим наивным Т- и В-лимфоцитам низкомолекулярные фрагменты процессированного антигена в ассоциации с белками HLA II класса, инициируя антиген-специфический иммунный ответ.

Проникновение микроорганизмов через пограничные ткани активирует резидентные клетки, которые включаются в локальный воспалительный процесс и продуцируют хемотаксические вещества, цитокины, эйкозаноиды и другие медиа торы воспаления, запуская каскад воспалительных реакций.

На ранних этапах развития воспаления с инфекционными агентами и продукта ми их жизнедеятельности взаимодействуют антиген-неспецифические гуморальные факторы. Образующиеся при активации системы комплемента субкомпоненты служат важными эндогенными эффекторами и регуляторами иммунной системы. Фрагменты молекул белков системы комплемента - эндогенные опсонины, усиливающие захват и завершенность фагоцитоза. Субкомпоненты комплемента C1s, СЗа, С4а и С5а способны активировать тучные клетки и базофилы, вызывая их дегрануляцию, активацию синтеза и секрецию медиаторов аллергического воспаления. Субкомпоненты СЗа и С5а вызывают сокращение гладкой мускулатуры и повышают проницаемость сосудистой стенки, что позволяет называть их анафи лотоксинами.

Все клетки крови в той или иной степени участвуют в защите от чужого в каче стве эффекторных факторов иммунных реакций. Фагоцитарная система крови представлена гранулоцитами и моноцитами. Среди гранулоцитов фагоцитарная активность особенно выражена у нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов. Нейтрофилы способны захватывать, убивать и переваривать разнообразные внеклеточно размножающиеся инфекционные агенты. Умерщвление захваченных гранулоцитами и моноцитами микроорганизмов осуществляется за счет прямого действия на них радикалов кислорода и множества дезинфектантов, образующихся в фагоцитах при кислом рН и в присутствии галогенов хлора и йода с участием миелопероксидазы (хлорноватистая кислота, надйодная кислота, хлорамин и др.). Для гранулоцитов характерна также экзоцитарная активность, в результате которой лейкоциты выделяют в сторону микробной клетки и других объектов содержимое внутриклеточных гранул. В их гранулах содержатся разнообразные антимикробные продукты и активные гидролитические ферменты, а также гистамин (базофилы), цитокины и другие медиаторы воспаления. Способность базофилов продуцировать и при дегрануляции выделять гистамин, а также наличие у них рецепторов к IgE делают базофилы, как и тучные клетки, важнейшими участника ми аллергического воспаления.

Моноциты определяют исход хронического воспаления и освобождают организм от внутриклеточно паразитирующих микроорганизмов. В отличие от полиморфноядерных лейкоцитов моноциты фагоцитируют инфицированные микробами соматические клетки, прерывая размножение внутриклеточных инфектов. Например, при хламидийной инфекции первая реакция иммунной системы в месте внедрения возбудителя обязана нейтрофильным лейкоцитам, а в случае хронизации инфекции уничтожение возбудителя осуществляют моноциты, фагоцитирующие инфицированные клетки. Недостаточность фагоцитарной активности моноцитов - главная причина хронического течения хламидийных инфекций. При вирусных инфекциях решающая роль в уничтожении инфицированных вирусами клеток также принадлежит моноцитам.

При хронических гранулематозных инфекциях моноциты крови в инфицированных органах дифференцируются в многоядерные эпителиоидные клетки, кото рые образуют вокруг возбудителя гранулемы. Гранулема ограничивает размножение возбудителя, удерживает его в одном локусе и препятствует диссеминации инфекта в организме. Нарушение способности моноцитов образовывать гранулему (в частности, при ВИЧ-инфекции) делает больного беззащитным в отношении микобактериальных инфекций.

Повышенное общее количество нейтрофильных лейкоцитов, появление в крови юных форм этих клеток свидетельствует об остром воспалительном процессе. Выявление нейтрофилов с токсической зернистостью или патологически измененных клеток в крови больных указывает на серьезные изменения и даже на несостоятельность этого важного механизма иммунной защиты. Увеличение в крови содержания моноцитов может быть связано с вирусной или какой-либо другой инфекцией, вызываемой внутриклеточными паразитами, и может свидетельствовать о хроническом патологическом процессе. Для диагностики врожденных заболеваний фагоцитарной системы (например, хроническая гранулематозная болезнь) или для прогнозирования течения гнойных инфекций информативным считают исследование миелопероксидазной активности фагоцитов - тест с гранулами нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Активность фагоцитарной системы крови зависит от опсонизирующей или, наоборот, угнетающей фагоцитоз способности сыворотки крови больного. Накопление в крови эозинофилов может быть следствием аллергической патологии, гельминтозов, онкологического процесса, аутоиммунных заболеваний, врожденных иммунодефицитов и др.

К антиген-неспецифическим факторам иммунной защиты относят NK-клетки крови. Основные мишени для них - клетки, инфицированные вирусами, опухолевые клетки, клетки с размножающимися внутриклеточно микробами. У таких клеток-мишеней подавлена экспрессия и изменена пространственная конфигурация ассоциированных с мембранами антигенов HLA (трансплантационные антигены), что и активирует против них NK-клетки. Участие NK-клеток в защите от инфекции особенно значимо в первые дни заболевания, когда у больного еще не сформировались антиген-специфические иммунные реакции. Для оценки функции NK-клеток разработаны специальные тесты, получившие название реакций антителозависимого клеточного цитолиза. В этой реакции цитолитическую гибель клеток-мишеней осуществляют NK-клетки, а также соучаствующие в реакции моноциты, эозинофилы и нейтрофилы, несущие Fc-R к IgG.

Антиген-специфические факторы иммунитета распознают и запоминают особенности молекулярной структуры чужеродных антигенов и, благодаря этому, узнают антиген при повторных контактах с ним. Антиген-специфические компоненты иммунной системы - Т- и В-лимфоциты и антитела. Именно они обеспечивают формирование приобретенного иммунитета к инфекционным агентам. Из всех клеток иммунной системы только лимфоциты способны распознавать антиген, взаимодействовать с ним и обеспечивать формирование иммунологической памяти. Антигенная активация лимфоцитов предполагает обязательное взаимодействие нескольких клеток разного типа - антиген-представляющих (А-клетки), Т- и В-лимфоцитов. При первичном иммунном ответе в качестве А-клеток выступают дендритные клетки, эффективное взаимодействие иммунокомпетентных клеток происходит только во вторичных лимфоидных органах (лимфатические узлы, селезенка, миндалины, пейеровы бляшки и др.). В первичном ответе участвуют наивные Т- и В-лимфоциты, ранее не имевшие контакта с антигеном и потому весьма требовательные к условиям, в которых осуществляется представление антигена и ответ на него. В результате взаимодействия с антигенами и пролиферации наивных лимфоцитов соответствующего клона накапливаются иммунные лимфоциты, которые затем распределяются по всему организму. При повторной иммунизации они могут взаимодействовать и отвечать на антиген не только во вторичных лимфоидных органах, но и в любых других органах и тканях. Всякий раз большая доля клеток размножившегося клона лимфоцитов спустя некоторое время погибает апоптозом, но часть из них может дифференцироваться в малые лимфоциты (клетки - носители иммунологической памяти), способные без деления сохраняться в организме в течение нескольких лет. Вся последующая иммунизация стимулирует быструю дифференцировку и деление соответствующих иммунных антиген-специфических лимфоцитов и поддерживает сохранение в организме иммунных лимфоцитов антигенреактивного клона (табл. 16-19). Приобретенный иммунитет сохраняется до тех пор, пока имеется повышенное содержание малых Т- и В-лимфоцитов антигенреактивного клона.

Таблица 16-19. Иммунобиологическая активность антиген-специфических компонентов иммунной системы (приобретенные факторы иммунной защиты)

Популяция Т-лимфоцитов исключительно гетерогенна. Различают СD4-Тh- и CD8-Tc-лимфоциты. Tc-лимфоциты имеют рецепторы к антигенам. Взаимодействие с ними активирует Т-лимфоциты и стимулирует их пролиферацию и дифференци ровку. Активированные Tc-лимфоциты, как и NK-клетки, выделяют в сторону клетки с антигеном перфорины и гранзимы, в результате чего в клетке-мишени образуются отверстия или включается программа их самоубийства (апоптоза). Для накопления в организме Tc-лимфоцитов необходимо определенное время, поэтому они включаются в процесс уничтожения инфицированных клеток позднее, чем NK-клетки или другие антиген-неспецифические факторы иммунной защиты. Именно эти клетки обеспечивают высокоспецифическую иммунную реак цию Т-лимфоцитов при вторичном иммунном ответе.

Т-лимфоциты прямым взаимодействием со вспомогательными клетками и с другими лимфоцитами, а также посредством продуцируемых ими цитокинов управляют иммунным ответом. Популяция CD4⁺ Т-лимфоцитов также весьма неоднородна. В зависимости от того, какие наборы цитокинов они продуцируют, среди Тh-лимфоцитов различают субпопуляции клеток Тh0, Тh1, Тh2 и Тh17 (Tr1) и Tr-лимфоциты. Дифференцировка Тh0 в иной тип Тh-клеток зависит от многих условий: свойств клеток, представляющих антиген Тh-лимфоцитам; соотношения антигенпрезентирующих А-клеток и Тh-клеток; количества антигена на поверхности А-клеток; набора цитокинов, воздействующих на Тh-клетку; характера костимулирующих сигналов, передаваемых Тh-клеткам; клеток микроокружения при взаимодействии А-клеток и Тh-лимфоцитов.

Антигенная активация В-лимфоцитов приводит к их пролиферации и дифференцировке в плазматические клетки или малые В-лимфоциты памяти. Плазматические клетки живут в течение 2-3 нед. Плазматическая клетка может продуцировать иммуноглобулины любого, но только какого-либо одного класса. Исключение - начальный этап дифференцировки наивных В-лимфоцитов в плазмоциты, когда клетки вначале синтезируют IgM, а затем переключаются на синтез IgG. Некоторое время такие плазматические клетки могут одновременно синтезировать антитела против того же антигена, но классов IgM и IgG. Выбор класса иммуноглобулинов, которые будет продуцировать плазматическая клетка, определяют Тh-лимфоциты, секретирующие разные иммунорегуляторные цитокины. Эти цитокины воздействуют на В-лимфоциты, включая в них гены, контролирующие синтез какого-либо определенного класса иммуноглобулинов.

При инфекционных заболеваниях накапливающиеся в крови антитела обладают множественной иммунобиологической активностью (табл. 16-20). Антитела при взаимодействии с микробными или иными антигенами-токсинами способны нейтрализовать их токсичность, а также обезвредить другие факторы патогенности бактерий и вирусов. Взаимодействуя с чужеродными антигенами, антитела способны образовывать мультимолекулярные иммунные комплексы из антигена и антител, которые быстро выводятся из циркуляции.

Таблица 16-20. Участие антител в противоинфекционном иммунитете

В зависимости от свойств возбудителя, количества микроорганизмов, их способности размножаться и противостоять механизмам противоинфекционного иммуни тета исход заболевания определяет прежде всего активность эффекторных факторов иммунной защиты, играющих при данной инфекции решающую роль. Так, уничтожение возбудителей гнойных инфекций, патогенов, размножающихся внеклеточно, осуществляют, главным образом, нейтрофильные полиморфноядерные лейкоциты (табл. 16-21). Нейтрофильные лейкоциты играют решающую роль в уничтожении большинства капсульных микроорганизмов. Полисахариды капсул, в свою очередь, угнетают фагоцитарную активность микро- и макрофагов и, таким образом, позволяют микробам-возбудителям избегать фагоцитоза и гибели в организме хозяина. Нейтрализовать ингибирующую фагоцитоз активность капсульных полисахаридов могут антитела к ним. Однако исключительное разнообразие строения капсульных полисахаридов, даже у микроорганизмов одного и того же вида, затрудняет способ ность антител защищать макроорганизм от различных серовариантов возбудителя. Именно поэтому активность нейтрофильных лейкоцитов и опсонизирующих фак торов сыворотки (антитела, комплемент, С-реактивный белок и др.) определяет эффективную защиту от размножающихся внеклеточно инфектов.

Таблица 16-21. Факторы иммунитета, играющие решающую роль в исходе инфекционных заболеваний

Возбудители группы внеклеточных патогенов с помощью разнообразных механизмов угнетают фагоцитоз, даже при захвате микроорганизмов фагоцитами противостоят действию микробицидных факторов лейкоцитов. Так, поверхностный М-белок и продуцируемые стрептококками А-стрептолизины О и S угнетают фагоцитарную активность лейкоцитов, а лишенные М-белка штаммы стрептококков отличаются низкой вирулентностью. У некоторых экзотоксинов стафилококков проявляются свойства суперантигенов, они могут активировать 5-25% Тh-лимфоцитов крови больного. Такая олигоклональная активация Тh-лимфоцитов приводит к гиперпродукции цитокинов и последующей гиперактивации моноцитов, что клинически выражено симптомокомплексами токсического шока.

Антитела и другие опсонины играют важную роль в защите от внеклеточных возбудителей инфекций. При нейссериальных инфекциях антитела к поверхностным белкам и капсульным полисахаридам обеспечивают опосредованную компле ментом гибель микроорганизмов. За благоприятный исход пневмоний, бронхитов и диссеминированных инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae, во многом ответственны антитела против полисахаридных капсул. Чувствительность к инфек ции обратно коррелирует с уровнем бактерицидных антител. Наследственные дефекты синтеза lgG₂ создают условия для возникновения хронических инфекций респираторного тракта.

Многие патогенные микроорганизмы (нейссерии, гемофильная палочка), чтобы уменьшить антибактериальную активность антител, продуцируют про теазы, расщепляющие IgA-молекулы. Псевдомонады вырабатывают эластазу, которая инактивирует С3а и С5а, снижая локальное воспаление. Важную роль в регуляции функциональной активности клеток пограничных тканей и нейтро фильных лейкоцитов крови играют лимфоциты Тh17, продуцирующие IL-17. Несостоятельность СD4⁺ Тh17 может способствовать высокой чувствительности больных к возбудителям инфекций и хроническому течению заболевания.

Таким образом, при пиогенных и других инфекциях, вызываемых внеклеточно паразитирующими возбудителями, прогноз развития заболевания и его исход определены активностью нейтрофильных лейкоцитов, уровнем антимикробных антител и комплемента и других сывороточных опсонинов. В этих случаях целесообразно исследовать приведенные факторы иммунной защиты.

Вторую группу инфекций составляют риккетсиозы, хламидиозы, легионеллезы, микоплазмозы. Возбудители этих инфекций размножаются внутриклеточно и, поступая в разных формах из инфицированных клеток в окружающую среду, инфицируют новые клетки. При заражении защиту от инфекции в местах внедрения возбудителя осуществляют нейтрофильные лейкоциты. Однако при ее недостаточности возбудитель распространяется и накапливается в соматических клетках. Уничтожение инфицированных клеток и находящихся в них возбудителей осуществляют в основном циркулирующие и тканевые макрофаги. Оказавшиеся в макрофагах возбудители стремятся выжить, подавляя у фагоцитов образование фаголизосом (риккетсии, хламидии) и продукцию супероксида (хламидии). При несостоятельности макрофагальной системы возбудители этой группы инфекций размножаются в фагоцитах. Все это приводит к развитию хронического инфекционного процесса. Микробные Т-суперантигены способны фиксироваться на поверхности вспомогательных клеток с помощью HLA-белков II класса и одновременно взаимодействовать с β-полипептидной цепью антиген-распознающих рецепторов Тh-лимфоцитов. Взаимодействие Тh-лимфоцитов с Т-суперантигенами антиген-неспецифично, с каждым Т-суперантигеном могут реагировать 5- 25% клонов Тh-клеток. Следствие такой активации - повышенная продукция в организме Тh-цитокинов, которые, в свою очередь, вызывают гиперактивацию с накоплением у больных провоспалительных цитокинов. Клинически это выражено синдромом токсического шока. Олигоклональная активация Тh-лимфоцитов может приводить к развитию аутоиммунных процессов (синдром Рейтера) или к апоптотической гибели активированных лимфоцитов. Свойствами Т-клеточных суперантигенов обладают не только белки микоплазм, хламидий, иерсиний, но и пирогенные экзотоксины стрептококков и стафилококков, а также вируса бешенства и Эпштейна-Барр, цитомегаловируса.

Некоторые микробные белки способны взаимодействовать с иммуноглобулинами человека (но не с активным центром антител). Такие белки были названы В-суперантигенами. Взаимодействуя с фиксированными на соматических клетках иммуноглобулинами (тучные клетки, базофилы), В-суперантигены активируют их и стимулируют синтез и высвобождение из этих клеток IL-4, IL-13, которые обеспечивают дальнейшее развитие аллергического воспаления (например, крапивницы). Свойствами В-суперантигенов обладают белок gp₁₂₀ ВИЧ, L-протеин клеточных стенок Peptostreptococcus magnus, А-белок стафилококков. Вирусы гепа тита А, В, С и Е индуцируют в гепатоцитах синтез и секрецию сиалопротеина FV, который может взаимодействовать с Н- и L-цепями иммуноглобулинов разных классов. Связывание FV-белка с фиксированными на тучных клетках и базофилах IgE приводит к освобождению из клеток гистамина и других медиаторов аллергического воспаления и имитирует развитие у больных аллерген-опосредованных реакций. Способность возбудителей инфекций продуцировать В-суперантигены привносит в клиническую картину заболевания симптомы, характерные для аллергического воспаления.

При инфекциях, возбудители которых активно продуцируют экзотоксины (анаэробные инфекции, дифтерия), течение и исход заболевания зависят от способности лимфоидной системы продуцировать антитоксические антитела. Такие антитела, главным образом класса IgG, нейтрализуют токсины и обеспечивают благоприятный исход заболевания. Однако формирование антитоксического иммунитета не гарантирует освобождение макроорганизма от носительства, поскольку для устранения бактерионосительства необходимо формирование специфического иммунитета к поверхностным структурам бактерий, ответственным за их колонизацию.

Спирохеты, некоторые патогенные грибы и бактерии способны паразитировать как внутриклеточно, так и внеклеточно. Вирусы размножаются только внутри-клеточно, но могут длительное время пребывать и снаружи, и внутри клеток, не оказывая цитопатогенного действия. У некоторых вирусов обнаружены гены, продукты которых обладают антиапоптотическим свойством и способствуют дли тельной переживаемости инфицированных клеток и продукции вирусных частиц. В уничтожении возбудителей инфекций этой группы участвует весь арсенал как врожденных, так и приобретенных факторов иммунной защиты. Значимость антиген-специфических механизмов противоинфекционного иммунитета возрастает по мере прогрессирования заболевания, без участия эффекторных антиген-специфических Тh- и Tc-лимфоцитов выздоровление не наступает.

Особую группу заболеваний представляют инфекции, хроническое течение которых сопровождается образованием гранулем вокруг жизнеспособных возбудителей. К таким гранулематозным инфекциям относят туберкулез, лепру, кокцидиоидный микоз и др. Эти инфекции отличает длительная, часто пожизненная персистенция возбудителей внутри образующихся гранулем. Стенки гранулем образованы эпителиоидными или многоядерными клетками и препятствуют диссеминации возбудителя. Предшественники эпителиоидных клеток гранулем - активированные макрофаги. Возбудители инфекций, будучи захваченными макрофагами, не погибают, поскольку способны подавлять образование фаголизосом и противостоять действию микробицидных агентов в макрофагах. В стенке гранулемы в больших количествах представлены активированные Тh1- и Tc-лимфоциты. Цитокины, продуцируемые Тh₁-лимфоцитами (INF-γ, IL-12) и макрофагами (IL-12), поддерживают высокую активность антиген-специфического Т-клеточного иммунитета и обеспечивают ремиссию заболевания. Несостоятельность макрофагов и Т-лимфоцитов сопровождается обострением инфекции, диссеминацией возбуди телей и стимуляцией антиген-специфического гуморального иммунного ответа. Антитела при этом выступают в основном как свидетели контакта иммунной системы хозяина с возбудителем, не оказывают протективного действия и мало влияют на течение и исход заболевания. При кокцидиоидном микозе снижение активности Т-клеточного иммунитета (положительные пробы в реакции повышенной чувствительности замедленного типа с кокцидоидином) и накопление циркулирующих антител против гриба служат предвестниками скорой смерти больного. При обследовании больных гранулематозными инфекциями прогно стическое значение имеют показатели клеточного иммунного ответа: количество и активность антиген-специфических Тh₁- и Tc-лимфоцитов, содержание локальных и циркулирующих Тh₁-цитокинов, активность NК-клеток и макрофагов.

При острой инфекции первую линию защиты образуют антиген-неспецифические механизмы иммунитета. Так, при вирусной инфекции активное размножение вируса обеспечивает быстрое накопление вирусных частиц в крови (виремия), предшествующее противовирусной реакции иммунной системы. При ранней реак ции иммунной системы характерна активация в инфицированных клетках синтеза INF-α/β, которые поступают в кровь и обеспечивают защиту еще не инфицирован ных клеток. В эти же сроки в крови накапливаются активированные NK-клетки, способные к умерщвлению соматических клеток, несущих на своей поверхности измененные вследствие нападения вирусов HLA-антигены I класса. Накопление в крови антиген-специфических Tc-лимфоцитов и противовирусных антител наблюдают позднее, их максимальное вовлечение в противовирусную защиту по времени совпадает с уменьшением виремии или даже с полным исчезновением вируса. При благоприятном исходе заболевания через 2,5-3 мес после заражения количество Tc-лимфоцитов в крови снижается до исходного уровня, тогда как противовирус ные антитела могут определяться еще в течение нескольких месяцев.

При многих острых бактериальных и вирусных инфекциях антиген-специфические резидентные и циркулирующие клеточные и гуморальные факторы обеспечивают устойчивость к заражению, тогда как исход возникшего заболевания зависит от активности формируемого приобретенного антиген-специфического иммунного ответа.

При вирусном гепатите С и ВИЧ-инфекции хороший прогностический пока затель - накопление в остром периоде заболевания Т-лимфоцитов, специфич ных в отношении многих эпитопов поверхностных и внутренних белков вируса. Накопление Т-клеток, даже в очень больших количествах, но реагирующих с ограниченным числом эпитопов белков возбудителя, наоборот, свидетельствует о недостаточности противовирусной защиты и предвещает хроническое течение болезни.

Высокая иммунная реакция при вакцинации делает организм устойчивым к заражению. Эффективность вакцинации возрастает, если применяют вакцины, вызывающие формирование необходимого для данного заболевания клеточного и/или гуморального иммунного ответа. Современные молекулярно-генетические вакцины, в которых используются носители, доставляющие протективные антигены и активирующие определенные популяции регуляторных лимфоцитов, открывают новые возможности для специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Таким образом, при различных заболеваниях и на разных стадиях инфекционного процесса прогностическое значение имеют исследования состояния опреде ленных антиген-неспецифических и антиген-специфических факторов иммунной защиты, а их оценка в динамике позволяет контролировать эффективность проводимой терапии.

Активность эффекторных механизмов иммунной защиты при инфекциях может нарушаться не только вследствие их собственной несостоятельности, но и в результате дисфункции регуляторных механизмов. Иммунная система располагает множеством ауторегуляторных механизмов. Существенную роль среди них имеют регуляторные Тh-лимфоциты и дендритные клетки, представляющие им антигены. Посредством цитокинов и прямыми межклеточными взаимодействиями Тh-лимфоциты обеспечивают развитие антиген-специфического клеточного и/ или гуморального иммунного ответа, а также регулируют активность и участие в противоинфекционном иммунитете разнообразных антиген-специфических факторов. Особенности представляющих антиген дендритных клеток и условия их взаимодействия с Тh-лимфоцитами определяют тип первичного иммунного ответа на соответствующие антигены (клеточный или гуморальный). При повторном контакте с антигеном в ответе участвуют ранее накопившиеся Тh1- или Тh2-лимфоциты памяти. Представление антигена Тh-клеткам при вторичном иммунном ответе может осуществляться не только дендритными клетками, но и любыми клетками, экспрессирующими белки HLA II класса.

Таким образом, при лабораторном обследовании больных инфекционными заболеваниями прежде всего необходимо оценить состояние эффекторных антиген-неспецифических и антиген-специфических механизмов иммунитета, играющих решающую роль в уничтожении возбудителей данной инфекции. Лишь после этого исследуют содержание и активность регуляторных клеток и набор продуцируемых ими цитокинов. Для прогнозирования течения инфекционного процесса важно не однократное, а мониторинговое обследование больного с оценкой состояния тех компонентов антиген-неспецифической и/или антиген-специфической иммунной защиты, которые при данном заболевании на данном этапе болезни играют решающую роль в уничтожении и выведении из организма возбудителей инфекции.

В воспалительных процессах разной этиологии участвуют как антиген-неспецифические, так и антиген-специфические факторы иммунной защиты. Обычно иммунный ответ при воспалениях протекает субклинически и обеспечивает нейтрализацию антигена и удаление его из организма без формирования клинически выраженных повреждений. В некоторых случаях характер и сила иммунной реакции на антиген могут не соответствовать патогенетической активности антигена, при поступлении в организм абсолютно безвредных антигенов формирующаяся антиген-специфическая иммунная реакция может приводить к развитию тяжелых воспалительных процессов, сопровождающихся локальными и генерализованными повреждениями тканей. Такие варианты гиперергических воспалительных процессов принято называть иммунными воспалениями. За патогенез таких воспалений ответственны как антитела разных классов, так и эффекторные Т-лимфоциты. Различают четыре типа иммунопатологических процессов. I тип гиперергических иммунопатологических реакций обязан накапливающимся у пациентов IgE антителам к антигенам-аллергенам. От иммуноглобулинов других классов IgE отличает высокая цитофильность. IgE фиксируются на клетках, взаимодействуя с IgE-специфическими Fcε-R. Описано два типа таких рецепторов, отличающихся аффинностью взаимодействия с IgE. Если молекулы антигена взаимодействуют с фиксированными на клетках несколькими молекулами IgE, то происходит агрегация рецепторов к IgE, их конформация, активация связанных с рецепторами протеинтирозинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируют и этим активируют внутриклеточные сигнальные молекулы.

В развитии IgE-опосредованных реакций гиперчувствительности I типа различают две фазы - раннюю и позднюю. Ранняя реакция развивается сразу после вве дения антигена-аллергена и обязана высвобождению из активированных тучных клеток гистамина, триптазы и других медиаторов. При локальной аллергической реакции через 4-6 ч после контакта с аллергеном развивается поздняя фаза реакции (происходит инфильтрация очага воспаления эозинофилами, нейтрофилами и, в меньшей степени, моноцитами, лимфоцитами и базофилами). Симптоматика поздней реакции обязана медиаторам, высвобождаемым из активированных эозинофилов и других клеток крови. При бронхиальной астме поздняя фаза продолжается в течение 1-3 сут. Активированные эозинофилы играют ключевую роль в симптоматике поздней фазы аллергического воспаления. В это время количество эозинофилов в инфильтрате достигает 30% всех локально аккумулированных клеток крови. Под влиянием хемотактического фактора тучных клеток, цитокинов и других медиаторов эозинофилы активируются, экспрессируют Fc-R к IgE и IgG, рецепторы к цитокинам, компонентам комплемента и другим медиаторам. Активированные эозинофилы синтезируют и секретируют свойственные им основные белки, ферменты, цитокины и другие молекулы. Активное вовлечение эозинофилов в поздней фазе аллергического воспаления I типа придает реакции некоторые специфические особенности, обязанные повреждению клеток тех или иных тканей продуктами жизнедеятельности активированных эозинофилов. Наряду с эозинофилами в патогенезе поздней фазы реакции участвуют нейтрофилы, количество которых может достигать 30% клеток инфильтрата. Накопление нейтрофилов обязано хемотактическому действию на них нейтрофильного хемотактического фактора и IL-8, продуцируемых активированными тучными клетками. В свою очередь нейтрофилы становятся источником разнообразных гидролаз, лейкотриенов, цитокинов и других биологически активных молекул.

При бронхиальной астме наблюдаемые на ранней фазе вазодилатация и отек обязаны гистамину, PGD₂ и LTD₄; бронхоконстрикция и секреция слизи - LTC₄ и PGD₂, высвобождаемые, главным образом, при дегрануляции тучных клеток. Инфильтрация слизистых оболочек бронхов клетками крови в поздней фазе реакции происходит в результате активации эндотелиальных клеток интерлейкинами IL₄, TNF-α, LTC₄. Миграцию лейкоцитов из сосудов в слизистые оболочки вызывают PAF, IL-5, IL-8, LTB₄, а активацию клеток в инфильтрате - IL-4, IL-5 и TNF-α. Источником всех этих медиаторов поздней фазы служат как тучные клетки, так и активированные эпителиоциты, эндотелиоциты и лейкоциты.

Накапливаемые в очагах гиперактивности лимфоциты представлены преимущественно Т-клетками, причем главным образом Тh₂-фенотипа. Взаимодействие активированных В-лимфоцитов с антигеном, опосредованное IgE, фиксированными на Fcε-RII (CD23), усиливает эндоцитоз антигена и способность В-клеток представлять антиген Т-лимфоцитам, но угнетает пролиферацию В-клеток и синтез IgE. Фагоциты активно синтезируют оксид азота при взаимодействии CD23 молекул лимфоцитов с CD11_b/с моноцитов.

При протеолизе CD₂₃ внеклеточная часть рецептора может циркулировать в крови в виде солюбилизированного sFcε-RII, который сохраняет способность взаимодействовать с CD21 и mIgE на мембране В-лимфоцитов. Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию В-клеток, в особенности клонов клеток, продуцирующих IgE. Таким образом, сигналы, подаваемые клеткам через низкоаффинные рецепторы к IgE, оказывают регуляторное воздействие на лимфоциты и клетки фагоцитарной системы.

Опосредованная IgE гиперреактивность клинически может проявляться в виде локальных и генерализованных патологических процессов. Пример генерализованной реакции I типа - анафилактические реакции. IgE-опосредованные анафилактические реакции возникают в результате взаимодействия с антигеном аллергеном имеющихся у пациентов IgE-антител против некоторых медикаментов, чужеродной сыворотки крови, морских продуктов, орехов, яда пчел, продуктов ужаливания ос, шершней, москитов, и т.д. Генерализованные анафилактические реакции характеризуются сосудистым коллапсом, изменением тонуса гладкой мускулатуры бронхов, сосудов, сфинктеров, отеками и в случае запоздалого или неправильного лечения могут привести к летальному исходу.

Иммунное воспаление II типа обязано накоплению в организме антител, способных запускать процессы цитотоксического повреждения собственных клеток организма. Примерами такого типа иммунных повреждений могут служить лекарственная гемолитическая анемия и посттрансфузионные реакции при переливании несовместимых эритроцитов. Некоторые антибиотики (бензилпенициллин, стрептомицин, цефалоспорины) в организме адсорбируются на эритроцитах, вызывая против себя гуморальный иммунный ответ с продукцией антител класса IgM и IgG. Антитела взаимодействуют с лекарственным препаратом на поверхности эри троцитов, образовавшиеся иммунные комплексы фиксируют и активируют белки системы комплемента. В результате происходит опосредованный комплементом лизис эритроцитов (гемолитическая анемия). Повторный контакт пациента с теми же или антигенно сходными веществами поддерживает сформировавшийся иммунно патологический процесс.

Антигены, аналогичные группоспецифическим антигенам эритроцитов, часто присутствуют у микроорганизмов кишечника человека. Против них у человека вырабатываются антитела, чаще класса IgM, взаимодействующие с группоспецифическими антигенами эритроцитов. Против антигенов собственных эритроцитов, даже если микроорганизмы кишечника несут аналогичные антигены, иммунный ответ не развивается, сохраняется иммунологическая толерантность. При переливании эритроцитов несовместимой группы крови циркулирующие изогемагглютинины пациента взаимодействуют с ними и обеспечивают комплементопосредованный гемолиз. Повторные трансфузии могут усиливать иммунный ответ и стимулировать накопление изогемагглютининов класса IgG.

Клинически посттрансфузионные реакции могут развиваться немедленно или отсроченно - через 2-6 сут. Немедленные реакции обычно обязаны анти-АВО группоспецифическим IgM антителам. Отсроченные реакции обычно связаны с иммунным ответом против других эритроцитарных антигенов и обеспечиваются изогемагглютининами класса IgG. При немедленных реакциях лизис эритроцитов происходит в просвете сосудов, сопровождаясь гемоглобинурией и накоплением в крови свободного гемоглобина. Отсроченные реакции, в которых участвуют анти эритроцитарные антитела класса IgG, менее активно связывают комплемент, чем антитела IgM, поэтому лизис эритроцитов не бывает столь катастрофическим и может сопровождаться фагоцитозом частично поврежденных эритроцитов во внесосудистых пространствах. Гемолитическая болезнь новорожденных, развивающаяся в результате вынашивания резус-негативной матерью резус-положительного плода, также обязана антиэритроцитарным антителам класса IgG.

Третий тип иммунопатологических процессов формируется в результате образования в организме иммунных комплексов «антиген-антитело». В зависимости от массы, размера агрегируемых в комплексы молекул, а также от места депонирования комплексов в организме могут развиваться локальные или генерализованные патологические процессы. Антитела в иммунных комплексах способны фиксировать и активировать белки системы комплемента, приводить к гиперпродукции C3а, С4а, С5а, С5b и других субкомпонентов комплемента. Некоторые из этих продуктов обладают активностью анафилотоксинов и способны повышать проницаемость сосудов, другие активируют эндотелиоциты и оказывают хемотаксическое и активирующее действие на нейтрофильные лейкоциты. В результате зоны фиксации иммунных комплексов оказываются инфильтрированными нейтрофилами, которые, в свою очередь, фагоцитируют иммунные комплексы, выделяют в окружающую среду гидролитические ферменты и цитотоксические продукты. При поступлении антигена через пограничные ткани иммунные комплексы образуются в субмукозном и дермальном слое, так что активация там комплемента приводит к вовлечению в патологический процесс тучных клеток.

Циркулирующие иммунные комплексы могут оседать на базальных мембранах кровеносных сосудов и гломерул почек. Более мелкие по размерам иммунные комплексы проникают через базальные мембраны и локализуются в суббазальных слоях. При фиксации иммунных комплексов базальные мембраны подвергаются атаке активированными нейтрофилами и комплементом. Это приводит к повреждению как клеток базальных мембран, так и близлежащих тканевых клеток. Активация комплемента может индуцировать агрегацию тромбоцитов, высвобождение факторов свертывания крови и образование микротромбов.

Подкожное или внутрикожное введение антигена, против которого присутству ют циркулирующие антитела в высоких титрах, сопровождается образованием в месте введения иммунных комплексов с развитием в течение 4-6 ч местного воспаления (феномен Артюса). Тяжесть воспаления может варьировать от локальной гиперемии и отека до некроза тканей. Гиперергическая реакция типа феномена Артюса может развиться в легких при поступлении антигенов (споры грибов и бактерий, протеины животных и птиц) с вдыхаемым воздухом. В этом случае воспаление затрагивает альвеолы и приводит к развитию аллергического альвеолита.

Поступление в кровь антигена вызывает образование в больших количествах циркулирующих иммунных комплексов. Циркулирующие комплексы антиген-антитело накапливаются на синовиальных мембранах суставов, в стенках сосудов и гломерулах почек. Клинические проявления - васкулиты, артриты и гломерулонефриты. В качестве антигенов, вызывающих продукцию антител в высоких титрах и образование иммунных комплексов, выступают микроорганизмы, простейшие, аутологичные и чужеродные белки и нуклеиновые кислоты. Именно поэтому генерализованные иммунопатологические процессы III типа характерны для аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка, ревматоидный артрит), лекарственной аллергии (например, к бензатина бензилпенициллину и сульфаниламиду), инфекционных заболеваний (гепатиты, инфекционный мононуклеоз, менингит, малярия) и сывороточной болезни. Сывороточная болезнь развивается у пациентов, которым с лечебной целью вводили лошадиные иммуноглобулины против микробных токсинов. Внутримышечно введенные белки чужеродной сыворотки поступают в кровь, где взаимодействуют с имеющимися или вновь синтезируемыми антителами. В последнем случае заболевание может развиться через 6-14 сут после пассивной иммунизации пациента. Для сывороточной болезни характерны повышение температуры, лимфоаденопатия, эритема, артриты, генерализованные васкулиты и отеки, иногда гломерулонефриты.

В отличие от предыдущих вариантов иммунопатологических процессов, IV тип гиперреактивности обязан формированию в организме клеточного иммунного ответа против антигена, в частности накоплению антиген-специфических Тh1- и CD8⁺ Тc-лимфоцитов. В местах повторного поступления в организм антигена накапливаются и активируются иммунные антиген-специфические Т-лимфоциты. Активированные Тh1 клетки продуцируют и секретируют IL-2, IFN-γ, факторы, ингибирующие миграцию макрофагов, и другие цитокины. Под влиянием цитокинов в очаге накапливаются и активируются макрофаги, в свою очередь секретирующие ферменты, NO, цитотоксические продукты и др. медиаторы воспаления. Высвобождение этих продуктов приводит к локальному повреждению и некрозу клеток тканей. Эта иммуновоспалительная реакция развивается через 48-72 ч, поскольку требуется время для инфильтрации места введения антигена иммунными лимфоцитами и моноцитами и для их активации. В отличие от гиперергических реакций III типа, в патогенезе которых участвуют нейтрофилы, реакции IV типа обязаны в основном мононуклеарным клеткам. Реакции IV типа имеют особое значение в защите организма от внутриклеточно размножающихся микроорганизмов, вирусов и паразитов. В случае если макрофаги и Tc-лимфоциты не в состоянии уничтожить инфицированные клетки и самих возбудителей, моноциты в очаге могут трансформироваться в эпителиоидные клетки (основной клеточный элемент гранулем).

Гиперергические реакции IV типа лежат в основе патогенеза контактных дерматитов, развивающихся в результате повторных контактов пациентов с различными химическими веществами и растительными белками (формальдегид, тринитрофенол, никель, лаки для волос, компоненты косметических средств и др.). Будучи малыми молекулами, эти вещества поступают транскутанно, образуют комплексы с белками кожи, захватываются дендритными и другими иммуновспомогательными клетками и вызывают Т-клеточную антиген-специфическую иммунную реакцию. Повторное поступление этих молекул в организм вызывает инфильтрацию места их введения иммунными Т-лимфоцитами и макрофагами.

При внутрикожном введении антигена развитие замедленной (через 24-96 ч) гиперергической реакции свидетельствует о наличии у пациента антиген-специфических Т-лимфоцитов, т.е. пациент ранее уже имел контакт с соответствующим антигеном и ответил на него клеточной иммунной реакцией. Внутрикожные тесты с микробными белками используют в клинике для выявления инфицированных ими ранее иммунизированных пациентов и для оценки антиген-специфического клеточного иммунитета у больных.

Объем и качество иммунологического лабораторного обследования больных должны быть достаточными для подтверждения диагноза, прогнозирования развития заболевания и контроля эффективности проводимой терапии.

Наиболее широко диагностические иммунолабораторные тесты используют для выявления в биологических материалах от больных патогенетически значимых антигенов или для оценки специфической реакции иммунной системы пациента (накопление антиген-специфических лимфоцитов и антител на такие антигены, как опухолевые, трансплантационные, аллергены, рецепторы, гормоны и др.).

При первичном контакте с инфекционным антигеном в крови пациентов накапливаются антитела - IgМ. При повторном контакте с инфекционным агентом накапливаемые в крови антитела - IgG.

Методы определения антигенов и антител к ним отличаются исключительно высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет в биологических материалах выявлять исследуемые молекулы, представленные в пико- и нанограм мовых количествах. Простота и относительная дешевизна серологического обследования больных обеспечили в современной клинике широкое распространение лабораторных методик. Динамика накопления в крови антител к различным антигенам возбудителей инфекций позволяет прогнозировать течение заболевания и его исход.

Наиболее трудоемко и объемно исследование состояния и диагностика заболеваний самой иммунной системы. Алгоритм проведения таких исследований определяют клиническая картина заболевания и симптомокомплексы, характерные для тех или иных нарушений функций иммунной системы. На первом этапе таких обследований целесообразны скрининговые исследования, позволяющие выявить количественные и качественные отклонения в состоянии основных компонентов врожденного и приобретенного иммунитета больного (табл. 16-22).

Таблица 16-22. Скрининговые иммуно-лабораторные тесты в диагностике нарушений иммунной системы

По данным клиник США, эффективность скрининговых исследований заболеваний иммунной системы достигает 75%, при этом стоимость их проведения и трудовые затраты намного ниже, чем при осуществлении дополняющих исследований.

Иммунная система рано реагирует на самые разнообразные, особенно неблагоприятные воздействия на организм. Именно поэтому у больных степень участия в реакции отдельных врожденных или приобретенных компонентов иммунной защиты способствует постановке диагноза и прогнозированию развития патологического процесса (табл. 16-23).

Таблица 16-23. Факторы иммунитета, исследуемые при различных клинических проявлениях нарушений иммунной системы

^* Для диагностики аллергических заболеваний также оценивают реакции больного на различные аллергены.

О вовлечении иммунной системы в острый процесс можно судить уже при рассмотрении результатов общего клинического анализа крови. На это указывает увеличение в крови количества полинуклеарных лейкоцитов, повышение доли юных клеток и ускоренная реакция оседания эритроцитов. Повышение в крови содержания С-реактивного белка и других белков острой фазы, лизоцима, про кальцитонина также указывает на острое воспаление, причем накопление в крови прокальцитонина особенно характерно для системных бактериальных инфекций и бактериального сепсиса.

На вирусную природу острого воспаления указывает увеличение в крови содер жания NK-клеток и моноцитов, при котором моноциты отвечают на вирусы еще и накоплением в крови неоптерина. Хронические инфекции, в особенности вызываемые внутриклеточно размножающимися микроорганизмами или возбудителями гранулематозных инфекций, также сопровождаются активацией и накоплением моноцитов.

При наличии у больных симптомокомплексов, характерных для нарушений приобретенного иммунитета, лабораторное обследование больных начинают со скрининговых исследований, включающих оценку у больного общего количества лимфоцитов, а также исследование содержания Т- и В-клеток. На скрининговом уровне достаточно исследовать в крови у больных содержание Т-клеток с фенотипическими маркерами CD3⁺, CD4⁺ (хелперные и регуляторые клетки), CD8⁺ (цитотоксические клетки).

О состоянии В-клеточного звена иммунитета можно судить косвенно по содержанию в сыворотке крови обследованных иммуноглобулинов, изогемагглютининов и антител к антигенам вакцин, ранее вводимых обследуемому.

Для уточнения причин и механизмов нарушения функций иммунной системы больного необходимо проведение аналитических диагностических тестов. Анализы этого уровня предполагают оснащение лаборатории оборудованием и обеспечение реагентами, позволяющими в автоматическом режиме исследовать клетки крови больного по многим показателям и осуществить функциональные тесты, оценивающие активность соответствующих клеток.

Аналитические исследования позволяют оценить у больного не только содержание клеток определенного фенотипа, охарактеризовать их функциональную активность, но и определить состояние центральных органов иммунной системы и ассоциированной со слизистыми оболочками лимфоидной ткани (выход в кровь наивных Т- и В-лимфоцитов) (табл. 16-24).

Таблица 16-24. Аналитические тесты в диагностике нарушений иммунной системы

При углубленном (аналитическом) исследовании лимфоидной системы оценивают содержание в крови наивных и иммунных, покоящихся и активированных клеток, хелперных, регуляторных и цитотоксических лимфоцитов, долгоживущих клеток памяти и клеток, реализующих программу апоптоза.

При лабораторном исследовании лимфоидной системы возможно не только определить содержание соответствующих клеток в крови и других биоматериалах, но и оценить выраженность экспрессии на клетках соответствующих маркеров. Оба этих показателя исследуют при анализе пула клеток с помощью набора моноклональных антител против мембранных молекул клеток с использованием проточного цитофлюориметра.

Уточнение причин и механизмов врожденной и приобретенной несостоятельно сти иммунной системы больного может потребовать постановки in vitro функциональных клеточных тестов, в которых оценивают способность различных клеток иммунной системы реагировать на митогены, антигены и др. агенты, активируясь, пролиферируя и дифференцируясь, продуцируя цитокины, хемокины, адгезивные молекулы и экспрессируя разнообразные рецепторы к ним.

Ведущий патогенетический механизм развития аутоиммунных заболеваний - иммунный ответ по отношению к компонентам нор мальной человеческой ткани и органов. Для классификации аутоиммунных процессов применяют медико-биологические критерии (табл. 17-1), но их сложно использовать в клинической практике, поскольку для их понимания требуется большой объем научных данных. В то же время аутоиммунные заболевания (АИЗ) обладают рядом четких клинических характеристик, к которым относятся следующие:

Таблица 17-1. Основы критериев аутоиммунных заболеваний (Rose-Bona,1993)

Примечание. SCID - severe combined immunodeficiency (англ. - «тяжелый комбинированный иммунодефицит»).

Аутоантитела, направленные против собственных молекул организма, зачастую не связаны с непосредственным повреждением ткани. Чаще всего они являются «свидетелями» аутоиммунного процесса. Поэтому определение аутоантител при аутоиммунных заболеваниях служит важным инструментом в установлении и последующем ведении потенциальных пациентов. Особое значение приобретает обнаружение аутоантител на ранних этапах заболевания, когда морфологические признаки разрушения ткани еще отсутствуют.

Наиболее известная классификация подразделяет АИЗ на органонеспецифические и органоспецифические (табл. 17-2). Специфические АИЗ поражают конкретные органы или ткани, это происходит при тиреоидите Хашимото или сахарном диабете I типа. Органонеспецифические иммунные реакции могут поражать несколько систем органов, как это происходит при ревматических заболеваниях. В последнем случае нередко клиницисты определяют аутоиммунный ответ как «системный», примером которого служит системная красная волчанка (СКВ).

Таблица 17-2. Классификация аутоиммунных заболеваний

По мере понимания механизмов развития аутоиммунных заболеваний эта классификация постепенно утрачивает свое значение, так как не отражает современно го представления об АИЗ.

АИЗ относят к редким патологиям, хотя их встречаемость достигает 10-20% всех общетерапевтических заболеваний. К частым АИЗ, которые поражают 0,1-1% популяции, относят диффузный токсический зоб, тиреоидит, ревматоидный артрит, аутоиммунный гастрит, псориаз. Более редкие АИЗ встречаются у 0,001-0,01% популяции: системные ревматические заболевания, первичные гломерулонефриты, рассеянный склероз, витилиго, миастения, аутоиммунные заболевания печени, аутоиммунная тромбоцитопения, пернициозная и гемолитическая анемия, инсулин-зависимый диабет, саркоидоз, идиопатические увеиты. Ряд клинических синдромов с классическим аутоиммунным патогенезом отмечают менее чем у 0,001% населения. Последняя группа представлена болезнью Аддисона, синдромом Гудпасчера, синдромом Гийена-Барре.

АИЗ могут возникать в любом возрасте, хотя для каждой нозологической формы имеются свои пики заболеваемости. Отдельно выделяют синдромы, которые возникают у новорожденных от матерей с АИЗ, обусловленные трансплацентарным переносом патогенных аутоантител из организма матери. К таким транзиторным состояниям относят врожденный гипертиреоз, неонатальную миастению и неонатальную красную волчанку. Примечательно, что женщины чаще болеют АИЗ, составляя, по разным оценкам, более 75% всех больных. Несмотря на множество существующих теорий, причина выраженной половой предрасположенности оста ется малопонятной.

Дать строгое определение термину «аутоантитело» далеко не так легко, как кажется. Это связано с тем, что как направленность аутоиммунной реакции, вызывающей синтез аутоантител, так и методы обнаружения аутоантител имеют ряд условностей. С иммунологической точки зрения, «аутоантителами» являются иммуноглобулины человека, способные специфически связывать антигенные эпитопы молекул собственного организма. Иммунный ответ, который лежит в основе этой реакции, направлен на антигены вирусов, бактерий, экзогенных веществ, а эпитопы собственных молекул становятся мишенями лишь в силу антигенного сходства. Таким образом, сложно точно отделить аутоиммунный ответ от естественных реакций иммунной системы.

Данный парадокс еще больше усложняется тем фактом, что для обнаружения аутоантител в лаборатории в большинстве случаев используют антигены, отличающиеся от антигенов человеческого происхождения. Так, в качестве антиген-содержащего субстрата применяют ткани или очищенные антигены животных, перевиваемые клеточные линии и рекомбинантные белки, полученные на основе человеческих генов в различных системах экспрессии белка. По своей антигенной структуре рекомбинантные антигены значительно отличаются от нативных белков тканей человека. Это обусловлено их третичной структурой, гликозилированием, а также присутствием аминокислотных последовательностей для эффективного синтеза белка и его очистки. Именно поэтому одновременно с «аутоантителами» при применении иммунологических методов часто определяют и иммуноглобулины, реагирующие с чужеродными эпитопами. Более совершенным подходом при выявлении аутоантител считают использование модельных «дизайнерских» антигенов, структура которых основана на изучении иммунодоминантных молекул аутоантигенов человека. В этом случае они могут сильно отличаться от исходных мишеней. Наиболее революционным примером служит создание циклического цитруллинированного пептида для диагностики ревматоидного артрита. Используемый в качестве антигена цитруллиновый пептид был выбран в ходе скрининга случайных пептидных библиотек, которые не имели ничего общего с исходной последовательностью белка филлагрина, изучение которой позволило установить характеристики иммунодоминантного эпитопа антицитруллиновых антител. Для создания тест-системы все шире используют рекомбинантные модельные белки, аминокислотная последовательность которых состоит из чередования иммунодоминантных эпитопов антигена. В этом случае серологическая реакция иммуноглобулина человека с таким «модельным» исскуственным антигеном уже не является аутоантителом в полном смысле этого слова. Поэтому термин «аутоантитело» подразумевает определенную «серологическую» реакцию, присущую тому или другому аутоиммунному заболеванию. Результат этой серологической реакции зависит от используемых лабораторных методов, каждый из которых имеет свои особенности и ограничения.

Благодаря тому, что аутоантитела связываются с молекулами сходной структуры или молекулами в составе одной ткани, клетки, органеллы или молекулярного комплекса, их подразделяют на семейства. В большинстве случаев АИЗ, сопровождающиеся образованием аутоантител одного семейства, имеют сходную клиническую симптоматику и патогенез. Например, семейство антител к антигенам цитоплазмы нейтрофилов направлено на разнородные по структуре и свойствам белки гранул цитоплазмы лейкоцитов. В то же время большинство конкретных разновидностей аутоантител этого семейства встречаются при системных васкулитах. Наличие аутоантител на фоне АИЗ указывает на участие аутоантител в механизмах аутоиммунной реакции. Однако прямое участие аутоантител в развитии патофизиологических процессов, характерных для данного АИЗ, не всегда представляется доказанным. В таком случае принято говорить об аутоантителах как «свидетелях» иммунологических реакций.

Большинство разновидностей аутоантител сравнительно часто может быть обнаружено у клинически здоровых лиц. К аутоантителам, которые могут стать случайной находкой у клинически здоровых лиц, относят антинуклеарный фактор (3%), ревматоидный фактор (3%), антитела к тиреопероксидазе (4%), антитела к кардиолипину (1%), антитела к миокарду (5%), антитела к скелетной мускулатуре (3%). Частота встречаемости многих аутоантител нарастает с возрастом. Аутоантитела образуются на фоне инфекций, травмы и при новообразованиях, которые не сопровождаются аутоиммунными проявлениями. В этом случае аутоантитела могут нести самостоятельную иммунную функцию, например участвовать в клиренсе тканевых антигенов. Антинуклеарный фактор часто диагностируют при болезни «трансплантат против хозяина» и солидных опухолях, что можно объяснить аллоиммунным или противоопухолевым иммунным ответом. Это доказывает, что в определенном смысле аутоантитела - компонент естественного иммунного ответа, участвующий в удалении из системы циркуляции «состаренных» белков.

Высокое содержание аутоантител не всегда сопровождается высокой клинической активностью АИЗ. Это указывает на то, что ряд характеристик аутоантител, в том числе аффинность, количество, присутствие тканевого воспаления и других реакций иммунной системы, крайне важны для проявления патогенетического действия аутоантител. С другой стороны, при АИЗ может наблюдаться ситуация, при которой антитела постепенно исчезают из сыворотки с увеличением длительности болезни. Так, антитела к островковым клеткам поджелудочной железы у большинства больных сахарным диабетом I типа исчезают через 1 год после клинического дебюта заболевания.

Для доказательства принципиальной роли аутоантител в развитии АИЗ необходимо соблюдение ряда формальных условий. Предполагают, что в пораженной ткани можно обнаружить иммунные комплексы, состоящие из аутоантитела и соответствующего аутоантигена. При моделировании заболевания на экспериментальных животных сыворотка из организма больного животного или человека, перенесенная здоровому животному, или аутоантитело, полученное иммунизацией аутоантигеном, приводит к изменению структуры и функции, схожему с таковыми при оригинальном АИЗ. Аутоантитело должно оказывать действие на клетки клеточных культур или изолированной ткани ex vivo. И, наконец, должна существовать корреляция между титрами аутоантитела и активностью заболевания. Далеко не для всех аутоантител могут быть соблюдены все эти требования. Изученные механизмы участия аутоантител в иммунопатогенезе АИЗ представлены в табл. 17-3.

Таблица 17-3. Патогенетические механизмы действия аутоантител при аутоиммунных заболеваниях

Ряд особенностей отличают методы обнаружения аутоантител от оценки содержания других биологических молекул в биологических жидкостях. Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgG, IgA, IgM, специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул человеческого организма. Образование аутоантител представляет собой нормальный биологический феномен, а связывание иммуноглобулинов с собственными антигенами можно зафиксировать в сыворотке любого человека. В норме существует охарактеризованная популяция CD⁵⁺ В-клеток, синтезирующая полиреактивные низкоаффинные иммуноглобулины, способные связываться со многими антигенами. Роль аутоантител в норме и причина их появления изучена недостаточно. Вероятнее всего причиной образования аутоантител является перекрестная реактивность иммуногенных эпитопов между антигенами инфекционных агентов и собственными молекулами организма. Спектр антигенных стимулов, окружающих человека, постоянно меняется, что ведет к образованию низкоаффинных непатогенных аутоантител.

Аутоантитела обнаруживают при инфекционных и онкологических заболеваниях, воспалительных процессах различного генеза, хронических интоксикациях (алкоголизме) либо на фоне приема лекарственных препаратов. Наличие ревматоидного фактора при вирусном гепатите С, антимиокардиальных антител при вирусных миокардитах указывает на большое значение инфекции в генезе аутоиммунных процессов. Встречаемость АНА несколько возрастает у пациентов с онко логическими заболеваниями, причем индукция АНА на фоне опухоли указывает на лучший прогноз у онкологических больных. Встречаемость ряда аутоантител, в частности ревматоидного и антинуклеарного фактора, нарастает в пожилом возрасте. Однако титры аутоантител, присутствующих в норме, низки и сравнительно нестойки.

Возможность использования конкретной разновидности аутоантител в качестве диагностического показателя определяется их встречаемостью при аутоиммунном заболевании. Встречаемость тех аутоантител, которые используются для клинической диагностики, обычно составляет более 60-70% при патологии, менее 1% в норме и при других заболеваниях. Хорошие клинико-лабораторные параметры многих разновидностей аутоантител позволяют рассматривать их в качестве лабораторных маркеров этих заболеваний, т.е. высокоспецифичных лабораторных тестов, обладающих исключительной диагностической информативностью. Высокоспецифичными серологическими маркерами называют те разновидности аутоантител, которые встречаются исключительно при этом заболевании. Так, к высокоспецифичным серологическим маркерам относят анти-дсДНК и анти-Sm при СКВ, антитела к Scl-70-антигену при склеродермии. Некоторые аутоантитела могут быть высокоспецифичными маркерами одновременно нескольких групп заболеваний. Например, антитела к цитоплазме нейтрофилов образуются как при гранулематозных васкулитах, так и при воспалительных заболеваниях кишечника. Ряд аутоантител, характерных для аутоиммунных заболеваний, сравнительно часто регистрируют у здоровых лиц без признаков аутоиммунного заболевания, что значительно ограничивает их диагностическое использование. К примеру, клиническое использование антител к скелетным мышцам при миастении или антител к миокарду ограничено, поскольку они могут часто встречаться в норме либо при неиммунных заболеваниях.

Обычно появление высоких титров специфических аутоантител у клинически здоровых лиц рассматривается в качестве фактора риска развития аутоиммунного заболевания. Аутоантитела в сыворотке крови могут обнаруживаться за несколько месяцев до первых клинических проявлений заболевания. Так, при ревматоидном артрите антицитруллиновые антитела могут быть обнаружены за 1,5 года до дебюта артрита, обнаружение антинейтрофильных антител предваряет развитие гломерулонефрита на несколько месяцев.

Клиническое значение обнаружения аутоантител отчасти зависит от титров содержания аутоантител в сыворотке обследуемого. Обычно высокое содержание антител указывает на высокую аффинность последних. Это, в свою очередь, характеризует специфичность и выраженность иммунного ответа. Обнаружение высоких титров антител, как правило, указывает на аутоиммунное заболевание, в то время как низкие титры часто отмечаются в норме и не специфичны. В отсутствие иммуносупрессивного лечения при аутоиммунных заболеваниях содержание аутоантител обычно сохраняется на высоком уровне в течение длительного времени. При наличии антител на фоне инфекции или неиммунного воспаления титры антител обычно нестойки. Аутоантитела могут быть индуцированы воспалительным, инфекционным, онкологическим процессом или спровоцированы назначением определенных препаратов. Для того, чтобы отличить транзиторную индукцию аутоантител от хронического присутствия аутоантител при аутоиммунном заболевании, может потребоваться проведение повторного исследования. Учитывая, что время полужизни сывороточных иммуноглобулинов составляет около 3 мес, минимальное время между повторными исследованиями должно превышать полгода.

В то же время продукция аутоантител при аутоиммунных заболеваниях не является постоянной величиной. Встречаемость аутоантител может нарастать с увеличением длительности аутоиммунного заболевания, как это происходит при ревматоидном артрите, или снижаться ниже порога детекции в течение первого года заболевания при сахарном диабете. Аутоантитела синтезируются в составе нормального пула иммуноглобулинов сыворотки крови плазмоцитами костного мозга, лимфатических узлов и селезенки, однако в ходе иммунного ответа при аутоиммунном процессе продукция антител в очаге воспаления может приобретать особые характеристики, например может измениться клональность иммуноглобулинов. Например, при рассеянном склерозе отмечается выраженное увеличение местного синтеза антител и иммунный ответ в ликворе становится олигоклональным, а при смешанной криоглобулинемии в состав криоглобулинов сыворотки входит моноклональный ревматоидный фактор.

Хотя большинство аутоантител служат свидетелями аутоиммунного воспаления и их содержание не коррелируют с активностью заболевания, обнаружение определенных типов аутоантител при ревматических заболеваниях указывает на характерные особенности клинического течения. Так, у пациентов, имеющих в сыворотке специфический набор антител, наблюдается особенное течение заболевания, отличное от симптоматики больных, не имеющих этих антител. При СКВ, сопровождающейся образованием антител к Ro/SS-A, гломерулонефрит встречается реже, чем у больных, имеющих высокий титр антител к дсДНК, но имеется определенный риск развития поражений кожи и склонность к повышенной фоточувствительности. В связи с этим определение антинуклеарных антител (АНА) позволяет врачу предсказать, а иногда и предотвратить развитие осложнений. Динамика титра определенных видов антител в ходе заболевания имеет прогностическое значение. Увеличение концентрации антител к дсДНК предшествует вспышке СКВ, и ранняя патогенетическая терапия может уберечь больного от развития клинических симптомов или уменьшить их остроту.

Выделение больных с тем или иным типом аутоантител в отдельную, часто клинически гомогенную, группу подтверждается обнаружением определенного HLA-генотипа у больных с конкретным типом АНА. К примеру, пациенты с дерматомиозитом, у которых в сыворотке крови обнаруживают антитела к Jo-1, характеризуются исключительно HLA-DR3 (DRw17) и HLA-DRw52-генотипом. Таким образом, результаты исследования содержания аутоантител и их спектра указывают на особенности функционирования иммунной системы и отражают ее особую предрасположенность к формированию аутоиммунных ответов.

Благодаря единому патогенетическому механизму индукции аутоантител, конкретные их разновидности могут быть сгруппированы в семейства, реагирующие с мишенями одного рода. Например, все представители семейства АНА реагируют с рибонуклеопротеиновыми антигенами ядер; аутоантитела, относящиеся к семей ству антинейтрофильных цитоплазматических антител, реагируют с набором антигенов, локализованных в азурофильных гранулах цитоплазмы нейтрофилов. Каждая разновидность аутоантител, даже направленная к одному антигену, представляет собой поликлональную популяцию антител, представленную молекулами иммуноглобулинов с разными физико-химическими свойствами. Это обусловлено тем, что поликлональные антитела реагируют с разными эпитопами на поверхности молекулы-антигена, причем сила связи каждой молекулы антитела с антигеном (аффинность) различна. Естественно, что в идеале иммунологический лабораторный метод должен позволять установить не одну разновидность молекул (как это происходит в большинстве традиционных лабораторных тестов), а спектр аутоантител, направленных на разные антигены. Причем каждое антитело значительно отличается от других по заряду, молекулярной массе и силе связывания с антигеном, которая зависит от условий реакции. Такого идеального метода не существует. На практике для точного описания спектра аутоантител используют несколько методов, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. В результате интерпретация результатов исследования одного лабораторного показателя зависит от метода, с помощью которого он определен.

Особенности обнаружения аутоантител приводят к тому, что один тест может иметь до 10 вариантов ответов, включающих наличие аутоантитела, его титр, а также несколько разнообразных типов связывания антител с субстратом. Обычно на первом этапе тестирования применяют метод, обладающий максимальной чувствительностью, в котором присутствует максимально широкий спектр антигенов. Уточнение специфичности обнаруженных аутоантител возможно при использовании подтверждающих тестов, назначенных по результатам первичного тестирования.

Еще одной особенностью практического обнаружения аутоантител, вытекающей из биологической природы этого феномена, является то, что не существует абсолютно корректного подхода к измерению содержания аутоантител. Дело в том, что большинство иммунологических тестов построено на связывании аутоантитела и антигена-мишени. Результат теста зависит как от концентрации аутоантител, так и от аффинности аутоантитела и антигена. При аутоиммунных заболеваниях специфические антитела обычно обладают большой аффинностью. Однако большая концентрация низкоаффинных аутоантител может дать сигнал более сильный, чем малая концентрация высокоаффинных специфических ауто антител. У больных с СКВ, у которых в результате поликлональной активации В-клеток синтезируется большое количество полиспецифичных антител, наблюдают ложноположительные реакции в серологических тестах для обнаружения анти тел к вирусу гепатита С. В то же время при волчаночном нефрите с нефротическим синдромом в результате неселективной протеинурии утрачивается сывороточный IgG. В результате при низком содержании IgG тесты по обнаружению аутоантител могут быть ложноотрицательны. Обнаружение неспецифического и перекрестного связывания аутоантител в некоторых иммунологических тестах, наличие низких титров аутоантител в норме нередко требует выделения «серой зоны», или «зоны сомнительных результатов».

В случае невысоких титров аутоантител, которые могут быть обусловлены неспецифическим связыванием аутоантител или присутствием специфических серологических маркеров, но в низкой концентрации, интерпретация результата зависит от постановки клинической задачи. Если речь идет об исключении ревматической природы заболевания в дифференциальной диагностике неревматической патологии, то результат может быть интерпретирован как отрицательный. В случае, когда тест используют для подтверждения ревматического заболевания у больного с другими клиническими признаками ревматической патологии, результат теста должен рассматриваться как положительный.

Несмотря на определенные трудности в интерпретации результатов иммунологического обследования, а также большой объем информации, который необходимо принимать во внимание при анализе результатов обследования, информативность иммунологических тестов очень высока. Особенности постановки диагностической задачи и планирования иммунологического обследования приведены в табл. 17-4.

Таблица 17-4. Постановка и решение задач лабораторной диагностики аутоиммунных заболеваний с помощью иммунологических методов

Планирование серологического обследования зависит от клинической задачи, которую требуется решить клиницисту. В свою очередь, назначение конкретных тестов зависит от их клинико-лабораторных параметров.

Для скрининга используют тесты, отрицательный результат которых с большой вероятностью позволяет исключить заболевание. Обычно такими параметрами обладают методы, позволяющие одновременно определять антитела к антигенам одного семейства. Так, назначение антинуклеарного фактора (АНФ) целесообразно на этапе скрининга ревматических заболеваний, поскольку обычно диффузные заболевания соединительной ткани сопровождаются обнаружением АНА. Отрицательный результат выявления АНФ делает диагноз СКВ или системной склеродермии маловероятным.

Часто уже на этапе скрининга необходимо выполнять комбинации тестов, параллельное назначение которых значительно снижает вероятность ошибочного исключения диагноза. К примеру, в диагностике ревматоидного артрита уже в дебюте этого заболевания рационально назначать определение ревматоидного фактора (РФ) и антицитруллиновых антител.

Дифференциальная диагностика требует проведения тестов, обладающих большей специфичностью. Например, при обнаружении низких титров АНФ выявление антител к дсДНК указывает на диагноз СКВ. Не менее важен вопрос о результатах тестов, которые находятся в «серой зоне». В случае скринингового теста результат, находящийся в «серой зоне», следует интерпретировать как неспецифический, в то время как у пациента с уже определенным диагнозом тот же результат следует отнести к низкой, но значимой концентрации аутоантител. При решении задач дифференциальной диагностики комбинации тестов делают результат обследования более убедительным. Так, диагностика антифосфолипидного синдрома (АФС) с помощью антифосфолипидных антител должна расширяться за счет параллельного обследования для диагностики СКВ.

Комбинированное тестирование несомненно улучшает информативность обсле дования пациентов. Комбинированное тестирование, включающее параллельный скрининг разных аутоиммунных заболеваний, имеющих общие черты, крайне информативно при дифференциальной диагностике системных ревматических заболеваний. Такой подход позволяет рекомендовать наборы тестов и комплексные алгоритмы обследования, что в итоге приводит к росту числа диагностических находок.

В диагностике аутоиммунных заболеваний к функциональным тестам относят те, при которых измерение аутоантител основано на влиянии аутоантител на биологическую реакцию. Присутствие биологической активности антител представляет собой объективный показатель, в меньшей степени подверженный артефактам иммунометрических тестов. Недостатком функциональных методов является плохая стандартизация и низкая воспроизводимость, трудоемкость и короткий срок годности компонентов тест-системы. В результате практически всегда функциональные тесты с течением времени заменяются на более простые и надежные иммунометрические и серологические методы.

Классическим функциональным тестом детекции аутоантител считают обнаружение АНА с помощью метода выявления LE-клеток (клеток красной волчанки). LE-клетки представляют собой лейкоциты крови, фагоцитировавшие ядра лимфоцитов. В основе этого феномена при СКВ лежит несколько механизмов. Прежде всего при СКВ лимфоциты периферической крови претерпевают ускоренный апоптоз, который рассматривается как попытка восстановления утраченной иммунотолерантности при этом заболевании. Фагоцитоз ядер лимфоцитов лейкоцитам обусловлен наличием АНА в сыворотке крови больных, которые опсонизируют фрагменты ядер лимфоцитов для их поглощения лейкоцитами. Присутствие в тесте сыворотки больного, содержащей АНА, является принципиальным для обнаружения LE-клеток, что позволяет рассматривать этот тест среди других методов диагностики АНА.

Еще в начале XX в. в пунктатах костного мозга больных с СКВ были описаны гиалиновые тельца в цитоплазме фагоцитирующих клеток и лейкоциты периферической крови, нагруженные клеточным материалом. Этот феномен был смоделирован in vitro, что привело к созданию лабораторного теста по определению LE-клеток. Учет LE-клеток осуществлялся в мазке крови с помощью светового микроскопа и гематологических красителей. За счет простоты и дешевизны со временем этот метод получил широкое распространение. Однако не существует единого рекомендуемого протокола обнаружения LE-клеток; из-за низкой чувствительности и сложности стандартизации не рекомендуется его выполнение в клинических целях. Учитывая низкие аналитические параметры метода, отсутствие LE-клеток при повторных анализах не может рассматриваться в качестве повода для исключения возможного диагноза диффузной болезни соединительной ткани. Выявление АНА с помощью АНФ полностью исключает необходимость использования этого устаревшего теста.

В середине прошлого века был описан сывороточный фактор, ответственный за образование LE-клеток и стимулирующий фагоцитоз ядер клеток мононуклеарами крови. Активность фактора наблюдалась во фракции гаммаглобулинов сыворотки крови. Это позволило для выявления АНА применить реакцию непрямой иммунофлюоресценции или метод Кунса с использованием тканей человека в качестве субстрата. Этот модифицированный тест на сегодняшний день считают основным методом обнаружения АНФ в клинической практике. Несмотря на то, что в аутоиммунной диагностике используют единичные функциональные тесты, их роль остается значительной в исследовании патогенетического действия аутоантител.

Определение АНФ - самое часто выполняемое лабораторное исследование в практических иммунологических лабораториях, что отражает его значение для диагностики аутоиммунных заболеваний. АНФ - семейство аутоантител, связывающихся с рибонуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями соединительной ткани, такими как СКВ, системный склероз (СС), смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ), синдром Шегрена (СШ) (табл. 17-5). Представители этого семейства аутоантител могут быть обнаружены при инфекционных, воспалительных и онкологических заболеваниях. Разнообразие патологий, сопровождающихся появлением АНФ, заставляет заподозрить единство иммунологических реакций в их патогенезе. В то же время встречаемость АНФ достигает 1-5% у клинически здоровых лиц и несколько возрастает в пожилом возрасте.

Таблица 17-5. Краткий перечень заболеваний, сопровождающихся наличием антинуклеарного фактора

Общее содержание АНА в сыворотке крови больных обозначается как «антинуклеарный фактор». Учитывая высокую чувствительность метода обнаружения АНФ, нередко проводят равенство между присутствием АНА в крови больных определенными заболеваниями и положительным результатом обнаружения АНФ. Однако традиционно под названием «АНФ» подразумевают положительный результат иммунофлюоресцентного теста для обнаружения АНА. Другие методы обнаружения АНА, например ИФА, значительно уступают непрямой иммунофлюоресценции по чувствительности. Не рекомендуется называть термином «антинуклеарный фактор» показатели, определяемые другими методами.

Основным механизмом индукции АНА, по-видимому, является патологический апоптоз кератиноцитов, лимфоцитов и других клеток, который возникает при диффузных заболеваниях соединительной ткани. Апоптотические тельца, содержащие в своем составе антигены АНА, напоминают по структуре вирусные частицы и способны индуцировать специфические иммунные ответы. Антитела могут иметь патогенетическое значение, что показано по отношению к антителам к дсДНК при СКВ с поражением почек, но большинство разновидностей АНА является, скорее, вторичным феноменом по отношению к деструкции ткани при аутоиммунных заболеваниях.

К настоящему времени описано более 100 разновидностей АНА, направленных против нуклеиновых кислот, гистонов, белков ядерной мембраны, компонентов сплайсосомы, рибонуклеопротеинов, белков ядрышек и центромер. Антитела к цитоплазматическим антигенам, диагностируемые при поли- и дерматомиозите взрослых, также причисляют к АНА, так как они направлены против рибопротеиновых структур, и в их возникновении предположительно участвуют сходные патогенетические механизмы. Разнообразие типов АНА и уточнение клинико-лабораторных корреляций позволило использовать АНА как показатель, позволяющий клиницисту уточнить прогноз, течение и, зачастую, предупредить обострение заболевания.

Для обнаружения АНА применяют ряд показателей, которые могут измеряться при помощи разных методов (табл. 17-6).

Таблица 17-6. Показатели и методы определения антинуклеарных антител

Присутствие в сыворотке крови АНФ обусловливает обнаружение в крови клеток красной волчанки (LE-клеток). Таким образом, LE-клетки можно рассматривать в качестве вторичного показателя, указывающего на наличие АНА. Низкая чувствительность и плохая воспроизводимость тестов, используемых для обнаружения LE-клеток, не позволяет им конкурировать с АНФ, постепенно эти тесты полностью вытесняются серологическими методами обнаружения АНА.

Определение АНФ - основной метод обнаружения АНА. Результатом определения АНФ является факт присутствия аутоантител в диагностическом титре, конечный титр разведения сыворотки, отражающий аффинность и концентрацию аутоантител, а также тип свечения ядра клетки. Характеристики конкретной мето дики зависят от субстрата, который может варьировать от криосрезов (крысиных печени или почки) до культивируемых пролиферирующих клеточных линий (Kb, HeLa), а также метода фиксации ткани, который может влиять на сохранность ряда ядерных антигенов АНА.

Криосрезы тканей крысы в качестве субстрата непрямой иммунофлюоресценции для обнаружения АНФ позволяют получить полуколичественный результат, определяющий максимальный титр разведения сыворотки пациента, при котором сохраняется свечение ядер. Это основной тест, который использовался для обнаружения АНА в клинической практике в течение многих лет, наряду с обнаружением LE-клеток. Основным недостатком использования данного метода считают отсутствие в тканях грызунов ряда антигенов человека, что снижает чувствительность теста. В последнее время его вытеснил ИФА.

Последующая модификация метода обнаружения АНФ связана с использованием в качестве субстрата человеческой перевиваемой эпителиоидной клеточной линии HEp-2. Эта клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на пластике и стекле. Крупные ядра и присутствие человеческих антигенов сделали метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обнаружения АНФ. В англоязычной литературе отсутствует единое название для этого метода, иногда его для краткости обозначают как FANA (Fluorescent AntiNuclear Antibody detection), в нашей стране сохраняется название этого показателя - АНФ.

В качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линия НEр-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Ее применение улучшает чувствительность теста за счет яркой флюоресценции даже при значительных разведениях сыворотки больного, а большое, богатое эухроматином ядро позволяет точно описать тип свечения. Кроме того, применение клеточной линии HEp-2 способствует обнаружению антител Ro/SS-A, а также антител к антигенам ядрышка, которые не выявляются при использовании ткани лабораторных животных. Среди преимуществ HEp-2 - высокая частота деления клеток, позволяющая определять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения, что характерно для гистологических срезов.

При использовании тканей лабораторных животных диагностический титр АНФ составляет 1:8-1:10, в случае применения клеточной линии НЕр-2 рекомендуется использовать исходный титр 1:40-1:80. При работе с такими титрами частота встречаемости слабоположительных результатов у клинически здоровых лиц составит не более 5% и в то же время не позволит пропустить значимые титры АНА у больных диффузными болезнями соединительной ткани. На фоне обострения ревматических заболеваний отмечают титры АНФ более 1:640, при ремиссии титры снижаются до 1:160-1:320.

Существуют рекомендации по балльной оценке результатов выявления АНФ, указывающей содержание «в крестах». Это позволяет лабораториям экономить реактивы и уменьшить трудозатраты на выполнение исследований. Однако конечный титр имеет более важное значение по сравнению с количеством связавшихся с субстратом аутоантител, так как непосредственно связан с аффинностью их взаимодействия с антигеном. Желательно установить конечный титр у всех «положительных больных», что позволяет уточнять присутствие в сыворотке высокоаффинных аутоантител, которые более тесно связаны с активностью процесса. Необходимо определять АНФ класса IgG, поскольку выявление АНФ, пред ставленных другими классами иммуноглобулинов, не имеет самостоятельного диагностического значения.

Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявления АНФ. Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра АНА, присутствующих в исследуемой сыворотке. Однако для практической лаборатории достаточно различать 6 основных вариантов свызывания аутоантител с антигенсодержащими структурами клетки.

Выделяют гомогенный, периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический тип свечения ядра. Каждому типу свечения присущи характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого, а также набор антигенов, с которыми реагируют аутоантитела в сыворотках больных. Описание типов свечения представляет ценную клиническую информацию само по себе, кроме того, тип свечения может указывать на необходимость проведения определенных лабораторных тестов в дальнейшем (табл. 17-7).

Таблица 17-7. Тип свечения при непрямой иммунофлюоресценции и наличие антинуклеарных антител

Гомогенный тип свечения - аутоантитела реагируют с теми антигенами, кото рые распределены в ядре диффузно, т.е. входят в состав хроматина. Характерно, что при обнаружении гомогенного типа свечения в делящихся клетках ярко окрашиваются конденсированные хромосомы. Основными структурными единицами хроматина являются нуклеосомы - комплексы ДНК и гистонов. Таким образом, гомогенный тип свечения предполагает наличие антител против нуклеосом, дсДНК и антител к гистонам. Он встречается у больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных со склеродермией. Обычно обнаружение высокого титра АНФ с гомогенным типом свечения свидетельствует о диагнозе СКВ.

Периферический тип свечения часто выделяют отдельно, хотя он является разновидностью гомогенного типа свечения. Его обнаружение - артефакт фиксации клеток, который приводит к перераспределению хроматина в ядре на периферию. Важно отличать периферический тип свечения от окрашивания ядерной мембраны, которое встречается при аутоиммунных заболеваниях печени. Периферический тип свечения характерен для больных с антителами к двуспиральной ДНК и отмечается преимущественно у больных с СКВ.

Гранулярный тип встречается наиболее часто, но он неспецифический. Иногда этот тип свечения называют «крапчатым» или «сетчатым». Название «гранулярный» более точно отражает этот феномен, поскольку в этом случае аутоантитела реагируют с гранулами в ядре, представляющими надмолекулярные нуклеопротеиновые комплексы. Такие комплексы белков и нуклеиновых кислот осуществляют в ядре ряд функций, необходимых для нормальной жизнедеятельности клетки. К таким комплексам, в частности, относят сплайсосомы, которые осуществляют посттранскрипционную перестройку мРНК, необходимую для синтеза белка на рибосомах. В составе присутствует множество различных нуклеопротеинов, что обусловливает многообразие антигенных мишеней при обнаружении гранулярного типа свечения. К основным аутоантигенам, антитела к которым приводят к визуализации гранулярного типа свечения, относят Sm, U₁-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA. Клетки в процессе деления утрачивают большинство сформированных нуклеопротеиновых комплексов, поэтому митотические фигуры в клеточной линии при гранулярном типе свечения не окрашиваются.

Гранулярный тип свечения ядра отмечается у больных СКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ, РА и при ряде других аутоиммунных заболеваний. Низкие титры АНФ с гранулярным типом преобладают в сыворотках крови у клинически здоровых лиц с АНФ без признаков системного заболевания.

Ядрышковый тип флюоресценции бывает в тех случаях, когда антигены ядрышка выступают в качестве мишеней АНА. Ядрышковый тип свечения характерен для склеродермии и ее разновидностей. Ядрышковый тип флюоресценции определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка, таким как РНК-полимераза 1, NOR, U₃RNP, PM/Scl.

Центромерный тип флюоресценции наблюдают при образовании антител к центромерам хромосом, он обнаруживается только в делящихся клетках. Присутствие данного типа флюоресценции характерно при CREST-варианте скле родермии.

Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-синтетазам, в частности к Jo-1, которые образуются при полимиозите. Кроме того, он выявляется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы клетки: антитела к актину при аутоиммунном гепатите, антитела к митохондриям при первичном билиарном циррозе.

Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, к примеру мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Более того, часто в низких разведениях преобладает один тип свечения, например гранулярный, а при дальнейших разведениях проявляется гомогенный или центромерный тип флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного различных видов АНА. Хотя тип свечения дает врачу определенные данные в пользу того или иного диагноза, необходимо принимать во внимание сравнительно низкую его специфичность и разнообразие встречающихся феноменов, что требует проведения дальнейшего лабораторного обследования.

Обнаружение АНФ - основа для использования других лабораторных тестов, уточняющих спектр АНА в крови больных. Учитывая крайнюю информативность этого теста, дальнейшее тестирование и анализ результатов последующего обследования должны интерпретироваться в зависимости от результатов оценки типа свечения и титра АНФ.

При использовании тканей лабораторных животных, таких как почка или печень крысы, у 10% больных СКВ АНА не определяются или титры их очень низки. Этих больных условно относят к группе «АНФ-негативной СКВ», для уточнения диагноза у таких больных требуется дальнейшее обследование, прежде всего определение антител к SS-A антигенам. Эти антигены обладают хорошей растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток. Применение в качестве субстрата клеточной линии HEp-2 сокращает численность данной категории пациентов, но не более чем на 5%. Необходимо учитывать, что при использовании традиционной метанол-ацетоновой фиксации клеточной линии SS-A-антиген может диффундировать в цитоплазму клетки, в результате чего титры АНФ значительно снижаются.

Для устранения этих недостатков была создана трансгенная клеточная линия НЕр-2000, в генотип которой был искусственно внесен ген SS-A антигена. За счет этого в ее ядре отмечается гиперэкспрессия SS-A-антигена, что несколько увеличивает чувствительность выявления АНА. Однако даже использование трансгенных клеточных линий не позволяет окончательно избавиться от проблемы «АНФ-негативной СКВ». Даже при максимально скрупулезном обследовании до 2-3% пациентов с клинически очевидной СКВ не имеют диагностических концентраций АНФ.

Номенклатура конкретных разновидностей АНА зависит как от ядерных мише ней аутоантител, так и от методов, с помощью которых их определяют. Отдельно выделяют АНА, реагирующие с нуклеиновыми кислотами, прежде всего ДНК; антитела к водорастворимым антигенам, которые могут быть экстрагированы водно-солевыми растворами, - антитела к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА); антитела к нерастворимым в воде антигенам, а также конформационные антигены, которые разрушаются при препаративном выделении из ядра клетки. Уточнение антигенных мишеней АНА зависит от антигенного субстрата, который применяется в иммунологических тестах. Антигенсодержащий субстрат может быть нативным, т.е. полученным при минимальной очистке, либо высокоочищенным. Белки-антигены могут быть получены методами генной инженерии либо получены химическими методами пептидного синтеза. Использование того или другого метода очистки или синтеза аутоантигена зависит от его биохимической природы и особенностей связывания с ним аутоантител. Рекомбинантные белки и синтетические пептиды более удобны в работе, так как методы их получения легко стандартизируются. Однако чем менее очищен антиген, тем больше он сохраняет третичную структуру, поэтому взаимодействие аутоантитела более приближено к условиям взаимодействия in vivo.

Большинство видов АНА направлено к сложным комплексам рибонуклеиновых кислот и белков. Изучение АНА зачастую опережало открытие функциональных белков и рибопротеиновых комплексов, что привело к возникновению двойной номенклатуры при описании некоторых видов АНА, включающей как общепринятое название аутоантитела, так и указание конкретного ядерного белка. Обычно тип АНА получал название, в основе которого лежит имя пациента, у которого данная разновидность АНА была впервые обнаружена. В основе более современной номенклатуры лежат клеточные мишени аутоантител, с которыми они взаимодействуют. Так, антитела к антигену Ro/SS-A (Ro- по фамилии больного, Robair, SS-A - Sjogren’s Syndrome A antigen) направлены против белков массой 52 и 60 кДа, связанных с Y₁-Y₅ РНК в составе сплайсосомы, а антитела к антигену La/SS-B (La - по фамилии больного, Lapiere, Sjogren’s Syndrome B antigen) направлены против белка, связанного с РНК-полимеразой 3. Номенклатура аутоантител, основанная на фамилиях пациентов, постепенно уходит в прошлое, в современной литературе доминирует название антигенов с указанием молекулярной массы, например SS-A антиген молекулярной массы 52 и 60 кДа.

Может сложиться ситуация, что в одной сыворотке одновременно обнаруживают антитела разных специфичностей, направленные к нескольким антинуклеарным антигенам. Некоторые антитела часто определяются совместно, например антитела к SS-A и SS-B либо U₁-RNP и Sm-антигенам. Эти ассоциации обусловлены тем, что антигены входят в состав одного белкового комплекса, с которым реагируют аутоантитела. Некоторые разновидности АНА могут часто встречаться совместно за счет того, что они имеются при одном заболевании или при перекрестных синдромах.

В состав ЭНА входит фракция растворимых ядерных белков, которые могут быть получены из ядра клетки. В его состав входит 6 основных рибонуклеопротеиновых антигенов АНА, таких как SS-A, SS-B, Sm, U₁-RNP, Scl-70 и Jo-1, а также ряд других минорных антигенов.

Использование ЭНА в методах «двойная иммунодиффузия» и «контрэлектрофорез» может быть применено для скрининга этих специфичностей аутоантител. Скрининговые методы с использованием ЭНА низкочувствительны и при сопоставлении с АНФ позволяют диагностировать только 50-60% положительных сывороток. Тем не менее высокая специфичность методов позволяет использовать их в качестве методов сравнения по отношению к другим, более чувствительным тестам.

Обычно обнаружение антител к ЭНА проводят совместно с определением АНФ для того, чтобы не пропустить случаев «АНФ-негативной СКВ». Необходимо отметить, что ИФА тест-системы позволяют проводить скрининговое обследование для обнаружения антител к ЭНА у ревматологических больных. Отличие тест-систем для скрининга состоит в том, что в инкубационную лунку помещается смесь антигенов, и положительный результат теста указывает на наличие у больного одной или одновременно нескольких разновидностей АНА.

С учетом большой чувствительности метода ИФА в целом его применение более оправдано для скрининга АНА, однако необходимо помнить о большой частоте развития неспецифических реакций при его применении. Существует 2 основные разновидности ИФА для скринингового обнаружения антител к ЭНА. В одном случае в лунку вносят тотальный ядерный экстракт, а в другом - смесь рекомбинантных очищенных белков, представляющих собой основные разновидности рибонуклеопротеиновых антигенов. Использование смеси рекомбинантных белков делает обследование более специфичным и улучшает стандартизацию выявления аутоантител. В то же время далеко не все антигены АНА могут быть нанесены на ИФА-планшет, в результате чего комбинированные тесты пропускают до 40% положительных результатов.

При СКВ антитела к двуспиральной ДНК (дсДНК) могут быть обнаружены у 40-50% больных, они характеризуются гомогенным типом свечения ядра НЕр-2-клеток при выявлении АНФ. Причиной их образования служит сенсибилизация к компонентам ядерного материала, высвобождающегося из ядер клеток в ходе апоптоза. Обнаружение антител к дсДНК способно «предсказать» развитие СКВ еще до проявления развернутой картины заболевания. Так, при проспективном наблюдении СКВ развивается в течение одного года после обнаружения антител к дсДНК в радиоиммунном тесте у 70% пациентов, и только 15% таких пациентов остаются здоровыми через 5 лет.

Антитела к дсДНК направлены на фосфодиэфирный скелет молекулы, связывание антител не зависит от ее конформации и нуклеотидной последовательности. Взаимодействие основано на электростатических связях, которые чрезвычайно чувствительны к рН и концентрации солей в растворе. В то же время антитела к дсДНК (нативной) перекрестно реагируют с осДНК (денатурированной), что затрудняет интерпретацию результатов теста, если в качестве антигена выступает дсДНК, загрязненная осДНК. Низкоспецифичные антитела к осДНК, встречающиеся при различных аутоиммунных и инфекционных заболеваниях, включая СКВ, лекарственную волчанку, ревматоидный артрит, хронический активный гепатит и инфекционный мононуклеоз, распознают денатурированные одноцепочечные фрагменты дсДНК. Их способность связываться со свободными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями в составе дсДНК приводит к тому, что антитела к осДНК нередко определяют в тестах, направленных на определение антител к дсДНК. Поэтому для обнаружения антител к дсДНК, которые встречаются только при СКВ и входят в число наиболее специфичных маркеров этого заболевания, требуется использовать тесты, которые позволили бы выявлять связывание антител только с дсДНК.

Для определения антител к дсДНК методом ИФА сложно сохранить нативную структуру молекулы. Молекула дсДНК несет отрицательный заряд и не может быть непосредственно нанесена на отрицательно заряженный пластик иммуноферментного планшета. Для того, чтобы нанести дсДНК на дно лунок, необходимо использовать положительно заряженный белок протамин. С другой стороны, облучение дсДНК позволяет сделать ее более реактоспособной и сенсибилизировать ИФА-планшеты. Оба этих метода сенсибилизации приводят к деспирализации дсДНК с образованием значительного числа односпиральных молекул. Это приводит к тому, что большинство твердофазных иммуноферментных систем для обнаружения антител к дсДНК оказываются относительно неспецифичными. Практическим ревматологам необходимо знать об этой особенности выявления антител к дсДНК и с осторожностью интерпретировать низкие титры данного показателя.

Для решения проблемы специфичности обследования были разработаны методы НРИФ и радиоиммунный метод, которые обладают значительно более высокой специфичностью.

Метод НРИФ основан на использовании клеток простейшего жгутикового микроорганизма Crithidia luciliae, которые содержат неизмеренную молекулу дсДНК. Этот микроорганизм относится к роду трипаносом, он неприхотлив и хорошо поддается культивированию в лабораторных условиях. В основании жгутика имеется кинетопласт, состоящий из гигантской митохондрии, содержащей плотно упакованную кольцевую ДНК. Эта молекула митохондриальной дсДНК без ассоциированной РНК и нуклеопротеинов - идеальный субстрат для непрямой иммунофлюоресценции. При наличии у больного антител к дсДНК определяется яркая флюоресценция в основании жгутика. Наличие гистонов в составе ДНК кинетопласта может привести к ложноположительному результату у больного, имеющего антитела к гистонам. Как и другие иммунофлюоресцентные методы, тест с использованием C. lucilia позволяет получить только полуколичественный результат, поэтому его целесообразно комбинировать с методом ИФА.

Наилучшим методом обнаружения антител к дсДНК считают метод радиоиммунного анализа, известного как тест Фарра (Farr test). Метод Фарра относится к классическим методам, с помощью которых исследуют аффинность связывания антитела с антигеном. Реакция связывания антител с дсДНК, меченной радиоактивным изотопом, протекает в растворе, что позволяет предотвратить деспирализацию ДНК. Образовавшиеся иммунные комплексы дсДНК и анти-дсДНК-антител осаждаются с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. Преципитат многократно отмывается, и содержание радиоактивной метки считывают в счетчике радиоактивности. Результат теста выражают либо в процентном отношении связывания дсДНК, либо в единицах радиоактивности. Благодаря высокой точности, тест Фарра применяют в качестве «золотого стандарта» количественного определения антител к дсДНК. Большая часть исследований, указывающих на роль концентраций антител к дсДНК в мониторинге активности заболевания, выполнена с помощью радиоиммунного теста Фарра, но не всегда эти результаты могут быть полностью подтверждены при использовании других тестов.

Новое поколение ИФА тест-систем для выявления антител к дсДНК позволяет отчасти преодолеть проблему деспирализации молекул. К примеру, для сенсибилизации планшетов используют биотинилирование кольцевых плазмидных дсДНК, в то время как дно планшетов покрывают авидином. Другой подход заключается в обработке планшетов S₁-экзонуклеазой, разрушающей односпиральные участки ДНК. Эти подходы позволяют добиться специфичности, близкой к 90-95%. Методы ИФА имеют чувствительность около 45%, в то время как положительный тест Фарра отмечается у 30% обследуемых, а НРИФ на C. lucilia положителен менее чем у 20% пациентов. Ряд практических лабораторий использует ИФА для скрининга аутоантител, а специфичность связывания подтверждается посредством НРИФ.

Антитела к дсДНК участвуют в патогенезе развития волчаночных васкулитов и люпус-нефрита. Титры антител к дсДНК тесно коррелируют с концентрацией IgG-содержащих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови больных СКВ. Исследования элюатов из почечных клубочков больных, умерших от СКВ, указывают на большую концентрацию антител к дсДНК в элюате по сравнению с их концентрацией в сыворотке. Это позволило заподозрить значение иммунных комплексов, содержащих антитела к дсДНК, в патогенезе поражения почек при СКВ. Обнаружение способности дсДНК связываться с базальной мембраной клубочка способствовало укреплению теории об иммунокомплексном поражении почки при СКВ, приводящем к образованию иммунных комплексов в клубочке in citu с активацией комплемента, потреблением его сывороточных резервов и формированием воспалительных инфильтратов. У большинства больных с активными почечными формами СКВ имеются антитела к дсДНК. Для определения риска поражения почек рекомендуется обследование всех больных СКВ на предмет выявления антител к дсДНК и гипокомплементемии.

Аффинность антител к дсДНК в сыворотке представляет собой постоянно меняющуюся величину. Так, при обострении гломерулонефрита содержание высокоаффинных антител в сыворотке больного весьма незначительно, однако в элюатах из почечных клубочков содержание высокоаффинных антител очень высоко. Во время ремиссии титры высокоаффинных антител к дсДНК в сыворотке постепенно возрастают, их уровни максимальны непосредственно перед вспышкой гломерулонефрита. Поэтому динамике концентрации антител к дсДНК придают большее прогностическое значение даже по сравнению с их абсолютным содержанием. Нарастание титра антител к дсДНК (удвоение титра в течение 3 мес) и гипокомплементемия предшествуют развитию гематурии и протеинурии в 90% наблюдений. При выполнении биопсии почек у таких больных почти всегда обнаруживают наличие значительных иммуноопосредованных изменений даже при отсутствии клинических признаков обострения. Увеличение титра анти-дсДНК-антител в течение нескольких недель служит предвестником вспышки СКВ. Раннее распознавание таких состояний и активная стероидная/иммуносупрессивная терапия играют существенную роль в снижении смертности и инвалидизации среди больных с поражением почек при СКВ.

У пациентов с СКВ с высоким содержанием низкоаффинных антител в методе ИФА чаще отмечается поражение центральной нервной системы.

Антитела к осДНК встречаются при СКВ даже чаще, чем антитела к дсДНК, и могут быть обнаружены приблизительно у 70% больных с СКВ. Хотя они неспецифичны для СКВ, их обнаружение в элюатах больных, умерших от гломерулонефрита, может свидетельствовать о роли антител к осДНК в патогенезе поражения почек при волчаночном нефрите. При других заболеваниях соединительной ткани их наличие диагностируют с похожей частотой. Антитела к осДНК могут быть обнаружены при множестве других патологических состояний, массивной травме, инфекциях и у клинически здоровых лиц. Высока встречаемость антител к осДНК у онкологических пациентов, получающих цитотоксическую терапию. Неспецифичность обнаружения этих аутоантител в значительной степени ограничивает их применение в клинической практике.

Определение в сыворотке больного антител к осДНК класса IgM имеет значение для диагностики дискоидной красной волчанки. При кожной форме волчанки, сопровождающейся образованием антител к осДНК, отмечается высокая частота развития системного заболевания в виде генерализованной формы СКВ. Приблизительно 20% больных с кожной формой волчанки, негативных по АНФ при проведении непрямой иммунофлюоресценции, имеют значительный титр антител к осДНК класса IgM. Таких пациентов относят к группе «АНА-негативной СКВ».

Эти антитела реагируют с протеиновыми составляющими нуклеосом ДНК-протеиновых комплексов. Антитела к гистонам реагируют с хроматином, диффузно распределенным в ядре клетки, что приводит к гомогенному типу свечения ядра при использовании клеток линии НЕр-2. Каждая нуклеосома состоит приблизительно из 140 пар оснований ДНК, обернутой вокруг ядра, из белков-гистонов Н_2А, Н_2В, Н₃ и Н₄; Н₁ покрывает ДНК в промежутках между нуклеосомами. У 70% больных СКВ аутоантитела направлены на гистоны Н₁ и Н_2В, в то время как АНА к другим типам гистонов встречаются значительно реже.

Высокие титры антител к гистонам характерны для лекарственной волчанки, хотя эта зависимость не абсолютная. Они могут быть обнаружены совместно с антителами к осДНК и использованы в целях ее диагностики, однако определение антител к гистонам не входит в число распространенных лабораторных тестов. Лекарственно-индуцированная волчанка является результатом побочного действия фармацевтических препаратов. Список препаратов, при которых была описана лекарственная волчанка, достаточно широк. Наиболее часто синдром лекарственной волчанки отмечается на фоне приема фенитоина, хинидина, гидралазина, метилдопы, прокаинамида, хлорпромазина и изониазида. Синдром характеризуется развитием люпоидноподобного заболевания с лихорадкой и полисерозитом. Лекарственно-индуцированная волчанка протекает, как правило, без поражения почек. Лишь при приеме D-пенициллинамина^ρ описано развитие гломерулонефрита, поражение кожи и появление антител к дсДНК. Для больных лекарственной СКВ характерны очень высокие титры АНА, и почти у всех пациентов имеются антитела к гистонам. Отмена лекарственного препарата приводит к постепенному снижению титров аутоантител и их исчезновению из сыворотки крови в течение 6 мес. Это позволяет рекомендовать при дифференциальной диагностике лекарственной СКВ исследование парных титров АНФ в течение полугода после отмены препарата. Необходимо учитывать, что проявления васкулита при лекарственных реакциях также могут быть обусловлены индукцией антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА).

Антитела к гистонам в высоком титре диагностируют у больных со склеродермией, а также у пациентов с аутоиммунным гепатитом. В низких титрах возможно их обнаружение при ревматоидном и юношеском артрите, первичном билиарном циррозе, инфекции вирусом Эпштейна-Барр, шизофрении, сенсорных нефропатиях, моноклональных гаммапатиях и злокачественных новообразованиях. Они часто встречаются у пожилых людей. Клинических особенностей у больных с этой разновидностью АНА не обнаружено.

Нуклеосомы представляют собой универсальные структуры хроматина и являются основной формой хранения эукариотической ДНК. Значительное содержание циркулирующих нуклеосом обнаруживается у больных с онкологическими заболеваниями при цитостатической терапии, при септических состояниях, а также у больных СКВ. Предполагается, что в основе этого явления лежит индукция клеточного апоптоза. При СКВ установлен факт избыточного апоптоза ряда клеток, в частности лимфоцитов периферической крови, эндотелиальных клеток и кератиноцитов. При апоптозе эндонуклеазы разрывают ДНК в промежутках между нуклеосомами, последние выделяются в кровоток. Свободная дсДНК обнаруживается в периферической крови только в составе нуклеосом. В настоящее время нуклеосомы рассматривают в качестве основного иммуногена, стимулирующего иммунный ответ Т- и В-клеток при СКВ. Из пула лимфоцитов периферической крови больных можно выделить CD4⁺ клоны Т-клеток, специфичные к нуклеосомальным антигенам. Установлен ряд иммунодоминантных пептидов в составе гистонов, индуцирующих пролиферативные ответы и секрецию цитокинов в куль турах лимфоцитов из крови больных СКВ. При контакте антиген-специфичных CD4⁺ лимфоцитов с В-клетками в культурах in vitro наблюдается продукция специфических антинуклеосомальных антител и антител к дсДНК. Антигены некоторых вирусов способны ассоциироваться с нуклеосомами с образованием иммуногенных комплексов, которые могут индуцировать бласттрансформацию в культурах лимфоцитов периферической крови больных СКВ. Иммунизация нуклеосомами лабораторных животных приводит к образованию АНА, антител к ДНК, антифосфолипидных антител и появлению ряда морфологических признаков волчаночного нефрита.

Антитела к нуклеосомам встречаются у 70% больных СКВ. Сравнительно редко их обнаруживают у больных СШ и при СЗСТ (5-8%). Этот тип АНА не диагностируют у больных другими заболеваниями соединительной ткани и здоровых доноров, что позволяет отнести антинуклеосомные антитела в разряд высокоспецифических маркеров СКВ. Высокие титры антинуклеосомных антител характерны исключительно для больных активной СКВ, сопровождающейся нефритом, их уровень положительно коррелирует с показателями активности заболевания. При мониторинге их содержания было установлено, что титры антител к нуклеосомам увеличиваются непосредственно перед вспышкой заболевания параллельно с развитием гломерулонефрита. Нуклеосомы, находящиеся в крови, обладают высокой аффинностью к гепарансульфату базальной мембраны клубочков и способны откладываться на ней, приводя к связыванию антинуклеосомальных антител и антител к дсДНК с последующим развитием гломерулонефрита.

При использовании ИФА тест-систем к нуклеосомам чувствительность составляет 50-60% при специфичности более 95%. Для диагностики СКВ у больных с высокими титрами АНФ можно рекомендовать сочетанное обнаружение антител к дсДНК и антител к нуклеосомам.

Антитела к рибонуклеопротеинам (реагируют с комплексами полипептидов и РНК) представляют собой подсемейство АНА, включающие анти-Sm, анти-snRNP (U₁-RNP), анти-Ro/SS-A, анти-La/SS-B. Все эти белки входят в состав сплайсосом - надмолекулярных комплексов, осуществляющих перестройку мРНК. Эти разновидности АНА суммарно встречаются при СКВ чаще, чем антитела к дсДНК. Для всех АНА к рибонуклеопротеинам характерен гранулярный тип свечения АНФ на клетках линии НЕр-2.

Концентрация антител к рибонуклеопротеинам в сыворотке больных диффузными болезнями соединительной ткани (ДБСТ) необычайно высока. Если антитела к дсДНК выявляются высокочувствительными методами, такими как иммунофлюоресценция, радиоиммунопреципитация и иммуноферментный метод, то антитела к рибонуклеопротеинам определяются специфичными, но нечувствительными методами иммунодиффузии и контрэлектрофореза. В сыворотке больных антитела к рибонуклеопротеинам могут присутствовать как изолированно, так и наряду с антителами к дсДНК. Клиническое значение антител к рибопротеинам сложно переоценить в связи с их прогностическим значением. Они определяют группу больных СКВ, у которых ведущим клиническим симптомом является поражение кожи. Хотя поражения почек у этих больных не исключены, но частота волчаночного гломерулонефрита в этой группе больных гораздо ниже, чем при анти-дсДНК позитивной волчанке. Обнаружение рибонуклеопротеиновых АНА при СШ указывает на вероятность экстрагландулярных симптомов заболевания, а наличие U₁-RNP позволяет отнести пациентов в группу смешанного заболевания соединительной ткани.

В 1966 г. Tan и Kunkel описали систему Sm-антигенов, реагирующих с антитела ми из сыворотки больной с фамилией Smith. Sm-антиген образует около 9 белков, составляющих ядро snRNP (small uclear ribonucleoprotein) - рибопротеиновых комплексов, включающих молекулы малой ядерной РНК (snRNA), и 10 ассоциированных белков. Ядро комплекса, в которое входит Sm-антиген, покрыто белками U₁-RNP-антигена. Антитела к белкам Sm-антигена (В/В', D) встречаются изолиро ванно, в то время как антитела к белкам U₁-RNP (70 кДа, А, С) могут встречаться совместно с антителами к Sm. Как для антител к Sm, так и антител к U₁-RNP харак терен гранулярный тип свечения АНФ, который требует определения конкретных мишеней АНА с помощью уточняющих тестов.

Антитела к Sm-антигену представляют высокоспецифичный, но сравнительно редко встречающийся маркер СКВ (20-30% больных СКВ). Антитела к Sm обнаруживают у 30-40% пациентов - представителей африканской и азиатской расы, в европейской популяции встречаемость среди больных СКВ не выше 20%. Важность обнаружения антител к Sm-антигену при СКВ обусловлена их абсолютной специфичностью, что явилось причиной включения этой разновидности АНА, наряду с антителами к дсДНК и LE-клетками, в классификационные критерии СКВ Американской ассоциации ревматологов. Клиническими признаками, связанными с наличием Sm-антител, являются прежде всего более агрессивное течение заболевания, поражение ЦНС, волчаночные психозы и относительная сохранность функции почек. Вопрос о необходимости мониторинга для прогнозирования обострения заболевания окончательно не решен, но в связи с низкой встречаемостью антител к Sm практически не выполняется.

Антитела к snRNP направлены против белков А, C и 70 кДа, входящих в состав рибонуклеопротеина, содержащего U₁-малую ядерную РНК. Антитела к snRNP встречаются приблизительно у 30% больных СКВ (табл. 17-8), причем они обычно встречаются совместно с антителами к Sm-антигену. Изолированное обнаружение высоких титров этих антител характерно для гетерогенной группы больных с при знаками прогрессивного СС, СКВ и дерматомиозита. Это заболевание носит название СЗСТ (mixed connective tissue disease) или синдром Шарпа. Клиническая картина при СЗСТ представлена разнообразными признаками склеродермии, включая синдром Рейно, склеродактилию, нарушением моторики пищевода и фиброзирующим поражением легких, миозитом, напоминающим таковой при полимиозите, недеформирующим артритом и полисерозитом. СЗСТ характеризуется редкостью поражения ЦНС и сохранностью функции почек, хорошим ответом на низкие дозы глюкокортикоидов и, в целом, благоприятным прогнозом. СЗСТ представля ет собой частный случай так называемых перекрестных синдромов, сочетающих клиническую картину различных заболеваний соединительной ткани.

Таблица 17-8. Диагностическое значение антител к sn-RNP (U₁-RNP)

Существует несколько диагностических критериев СЗСТ, основным из которых является обнаружение антител к snRNP в сыворотке крови. Однако большинство исследователей склоняются к тому, что клинические признаки большей части больных с антителами к snRNP удовлетворяют классификационным критериям СКВ, однако у них наблюдаются своеобразные клинические формы ее течения. Характерно, что у 30-50% больных СЗСТ отмечается позитивный тест волчаночной полоски (ТВП) при иммунофлюоресцентном обследовании биопсий кожи. Этот тест высокоспецифичен для СКВ, что лишний раз подчеркивает родство СЗСТ и классической СКВ. У больных СКВ с антителами к snRNP обычно присутствует синдром Рейно, признаки миозита и склеродактилия. Приблизительно у 5-10% больных с классическими признаками прогрессивного СС и некоторых больных с полимиозитом также присутствуют антитела к snRNP. У snRNP-позитивных матерей наблюдается высокий риск рождения ребенка с кожными признаками врожденного люпоидного синдрома и врожденной AV-блокады. Поражение почек также может встречаться у больных СКВ с антителами к snRNP, хотя ее встречаемость значительно ниже, чем частота поражения почек, у больных с антителами к дсДНК.

По всей видимости, СЗСТ - некий этап в развитии заболевания, после чего про исходит трансформация в определенную клиническую форму. Антитела к snRNP могут встречаться у больных с клинической картиной диффузной склеродермии или полимиозита. Так, при воспалительных миопатиях антитела к snRNP обнаруживают приблизительно у 10% больных. У этих пациентов заболевание может начаться с субфебрилитета, артрита и синдрома Рейно, в дальнейшем наблюдается постепенная его прогрессия с развитием полимиозита. Схожая картина наблюдается у больных ПМ при наличии антител к Ro/SS-A, что сопровождается клинической картиной полимиозита, несущего черты СКВ и СШ.

В свою очередь, у больных с диагнозом СЗСТ имеются антитела к осДНК, гистонам и антикардиолипиновые антитела с частотой, соответствующей таковой при СКВ. РФ встречается приблизительно у 30% этих пациентов.

Тесты, направленные на обнаружение антител к snRNP, следует выполнять всем больным, позитивным в иммунофлюоресцентном тесте, особенно с крупногранулярным типом свечения. Поскольку нет данных, свидетельствующих об изменении их концентрации при обострении заболевания, определение их титра в динамике не имеет важного клинического значения. Совместно с антителами к snRNP в 50% случаев выявляются РФ и реже - антитела к другим рибонуклеопротеинам, таким как Sm, SS-A и SS-B, а также антитела к дсДНК и к центромерам хромосом.

Антитела к snRNP способны проникать внутрь живых клеток и связываться с внутриклеточными мишенями in vivo. При использовании метода проточной цитометрии было показано, что антитела к snRNP способны проникнуть в ядра половины живых клеток периферической крови, причем этот процесс не является обычным захватом сывороточного IgG и зависит от сохранности Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина. Аутоантитела могут проникать внутрь клетки путем нарушения проницаемости клеточной мембраны либо в результате микропиноцитоза иммуноглобулинов, связавшихся с антигенами, экспонированными на поверхности клетки. В любом случае этот еще не изученный механизм проникновения антител в живые клетки, доказанный также в отношении антител к топоизомеразе-1 при склеродермии, по-видимому, играет определенную роль в иммунопатогенезе ДБСТ.

Сывороточный фактор у больных с СШ, связывающийся с экстрактами слюнных и слезных желез, был идентифицирован под названиями Ro и La, в соответствии с именами больных, у которых антитела были впервые выделены. Согласно современной номенклатуре, эти разновидности антител получили названия SS-A и SS-B (Sjogren’s syndrome A and B antigens). Антитела Ro/SS-A направлены против ядерных рибонуклеопротеинов 60 и 52 кДа, с которым связаны Y₁-Y₅ цитоплазматические РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой III. Антиген SS-A присутствует в большинстве клеток человеческого организма, однако в наибольших количествах в лимфоидных тканях, таких как тимус и селезенка. Антитела к Ro/SS-A могут быть диагностированы всеми стандартными тестами, применяемыми для обнаружения АНА. Контрэлектрофорез превосходит другие методы по чувствительности (в том числе ИФА) и специфичности, которая достигает 100%, и представляет собой оптимальный метод для выявления этой разновидности АНА в клинической практике. Если субстратом для определения АНФ служат криосрезы печени или почек крыс, то большинство больных с антителами к Ro/SS-A будут негативны при проведении непрямой иммунофлюоресценции, что входит в понятие «АНФ-негативная СКВ».

Антитела к Rо/SS-A имеются приблизительно у 50% больных СКВ, 70% больных дискоидной красной волчанкой (ДКВ), 60% больных с СШ и примерно 30-40% больных РА. Диагностически значимые титры этих антител могут встречаться у 1% здоровых женщин в возрасте 20-45 лет. Антитела к антигену массой 60 кДа сравнительно чаще выявляют у больных СКВ, тогда как при СШ определя ют антитела против обоих антигенов массами 60 и 52 кДа.

Антитела к Ro/SS-A обычно встречаются в популяции больных СКВ с выраженной симптоматикой фотосенситивных кожных проявлений, близких ДКВ, что обусловливает целесообразность активного поиска антител к Ro/SS-A при обследовании больных с предполагаемой СКВ с выраженными проявлениями фоточувствительности (табл. 17-9). Часто такие больные описывают ожоги «сквозь оконное стекло», что свидетельствует о фоточувствительности к низкоэнергетическим длинноволновым ультрафиолетовым волнам. Клинические проявления при классической СКВ, сопровождающейся присутствием антител к Ro/SS-A, включают симптомы фоточувствительности, вторичный СШ у 10% больных, поражение легких, лимфопению, реже - нефрит, тромбоцитопению и наличие РФ. Отмечено, что антитела к Ro/SS-A встречаются при сравнительно позднем начале развития СКВ после 50 лет, протекающей с вторичным СШ. Эта разновидность заболевания характеризуется поражением легких, нейропсихическими проявлениями и реакциями фоточувствительности на фоне нормальной функции почек.

Таблица 17-9. Клинические формы системной красной волчанки, сопровождающиеся образованием антител к Ro/SS-A массой 60 кДа

При классической ДКВ антитела к Ro/SS-A обнаруживают в 75% наблюдений. У таких пациентов поражения кожи располагаются преимущественно в местах, подвергшихся инсоляции. Они представляют собой небольшие эритематозные папуллы или бляшки, либо замкнутые циркулярные эритематозные высыпания. У больных ДКВ отмечают наличие мышечно-суставного синдрома, проявляющегося артралгиями либо артритом.

Антитела к Ro/SS-A определяют у 98% матерей, дети которых страдают синдромом врожденной волчанки. В основе этого заболевания лежит проникновение в кровь новорожденного через плаценту антител к Ro/SS-A. Основным признаком врожденной волчанки является дерматоз, напоминающий ДЛЕ, и множество системных и гематологических синдромов, включающих врожденную поперечную AV-блокаду, гепатит, гемолитическую анемию и тромбоцитопению. Среди клинических манифестаций врожденная атриовентрикулярная блокада - самое тяжелое и необратимое осложнение, требует установки искусственного водителя ритма непосредственно после рождения ребенка. Другие внесердечные проявления носят транзиторный характер и разрешаются после 6 мес, что соответствует времени истощения пула материнскогo IgG в крови ребенка. В эксперименте человеческий иммуноглобулин, содержащий антитела Ro/SS-A, обладает прямым кардиотоксичным действием в животных моделях ex vivo.

Около половины матерей детей с врожденной волчанкой обычно асимптомны во время рождения ребенка или лишь изредка имеют проявления СШ, СКВ или СЗСТ. После рождения детей у большинства асимптомных матерей через некоторое время разворачивается картина того или иного заболевания соединительной ткани. Таким образом, все беременные с подозрением на системное заболевание соединительной ткани должны быть лабораторно обследованы для выявления группы риска врожденной красной волчанки.

Установлено, что у больных СШ, имеющих антитела к Ro/SS-A, больных с позд ним началом СКВ, сопровождающимся наличием Ro/SS-A-антител и признаками вторичного СШ, а также у больных с подострой кожной волчанкой отмечается повышенная частота встречаемости определенных аллельных форм генов главного комплекса гистосовместимости, в частности HLA-В8, DR3, DQ1/2, что может указывать на общность генеза этих заболеваний.

Антитела к SS-B-антигену встречаются приблизительно у 10-15% больных с СКВ и примерно у 50% больных с СШ. Антитела к La/SS-В направлены на белки массой 48 и 43 кДа, связанные с транскриптами РНК-полимеразы 3. La/SS-В-макромолекула связывает Ro/SS-A-ассоциированные Y_1-5 РНК, т.е. в ряде случаев La/SS-B и Ro/SS-A представляют собой один антиген. Для антитела к La/SS-B характерен крупногранулярный тип флюоресценции АНФ на линии НЕр-2. Антитела к La/SS-B в подавляющем большинстве случаев наблюдаются совместно с антителами к Ro/SS-A, в то время как последние могут встречаться изолированно. Совместное обнаружение этих видов АНА является основой лабораторной диагностики СШ и обладает высокой специфичностью при данном заболевании.

СШ - ревматическое заболевание, поражающее слюнные и слезные железы, приводящее к ксеростомии и ксерофтальмии. Его встречаемость у лиц 50-70-летнего возраста достигает 5% всей популяции, в подавляющем большинстве СШ поражает женщин. Часто СШ сопровождается экстрагландулярными проявлениями, такими как васкулиты, а также на его фоне нередко отмечается развитие лимфом. Первичный СШ встречается изолированно, но признаки СШ обнаруживаются при РА, СКВ и других аутоиммунных заболеваниях в виде сочетания ксеростомии и ксерофтальмии.

Предполагается, что антигены Ro/SS-A и La/SS-B концентрируются на поверхности клеток эпителия конъюнктивы и желез у больных СШ. Сходное распределение этих антигенов отмечается в клетках перевиваемых линий, пораженных ретровирусами, что позволяет с определенной уверенностью предполагать вирусную этиологию данного заболевания. У больных с антителами к La/SS-B отмечается выраженная инфильтрация слюнных желез иммуноглобулин-секретирующими В-клетками, синтезирующими аутоантитела. Хотя данных за непосредственное цитопатическое действие АНА при СШ не получено, слюнные железы, без сомнения, являются основным местом продукции аутоантител, участвующих в образовании ЦИК и развитии иммунокомплексной патологии.

Если антитела к Ro/SS-A встречаются при разных аутоиммунных заболеваниях, то La/SS-B обычно указывают на наличие у больного СШ. Антитела к La/SS-B крайне редко встречаются при СКВ, протекающей с выраженными проявлениями вторичного СШ и сравнительной сохранностью функции почек. Комбинация Ro/SS-A и La/SS-B нередко отмечается в сочетании с высокими титрами РФ, гипер-гаммаглобулинемией и криоглобулинемией. Для больных с антителами к Ro/SS-A и La/SS-B характерно раннее начало и большая длительность заболевания, выраженное увеличение околоушных слюнных желез и значительная степень лимфоцитарной инфильтрации слюнных желез. Титр антител к Ro/SS-A и La/SS-B коррелирует со степенью лимфоцитарной инфильтрации малых желез. Их обнаружение у больного СШ может прогнозировать развитие таких экстрагландулярных проявлений заболевания, как васкулит, лимфаденопатия, спленомегалия, анемия и лейкопения. Таким образом, антитела к Ro/SS-A и La/SS-B отражают выраженность патологического процесса при СШ и риск развития экстрагландулярных проявлений. Однако обнаружение Ro/SS-A и La/SS-B при СШ характеризуется сравнительно низкой чувствительностью.

Существенное значение в диагностике СШ играет определение антител к протокам слюнных желез, которые встречаются у 50-90% больных СШ. Эти антитела реагируют с цитоплазмой эпителиальной клетки. Для их обнаружения применяют метод НРИФ с использованием в качестве субстрата аутопсийных человеческих тканей. Обычно у больного СШ, наряду с антителами к протокам, имеются антитела к Ro/SS-A, La/SS-B, РФ и другие разновидности АНА.

Среди признаков аутоиммунного процесса при СШ характерно наличие антител к париетальным клеткам слизистой оболочки желудка, нейтрофильным цитоплазматическим антигенам и антител к митохондриям, что связано с поликлональной активацией В-клеточного звена иммунитета, индуцирующей образование аутоа-грессивных клонов плазмоцитов. Гиперстимуляция В-клеток при СШ является причиной частого возникновения лимфопролиферативной патологии. Признаки моноклональной В-клеточной пролиферации в виде образования моноклонального иммуноглобулина отмечают у 60% больных с экстрагландулярными проявлениями СШ и практически у всех больных обнаруживают свободные легкие цепи иммуноглобулинов в моче.

Антитела к PCNA-1 (proliferating cell nuclear antigen 1) взаимодействуют с белком циклином массой 36 кДа, участвующим в контроле клеточного цикла. Этот белок появляется в клетке перед митозом и подвергается деградации после деления. Антитела при СКВ дают характерное гранулярное окрашивание митотических клеток и характерную линию иммунопреципитации в геле. В экспериментах in vitro антитела к PCNA способны ингибировать синтез ДНК в митотических клетках, что указывает на их возможное патогенетическое значение при СКВ.

Данную группу антител обнаруживают у 3-5% больных СКВ. Они могут встре чаться при РА, при других ревматических заболеваниях их не диагностируют. У больных СКВ с антителами к PCNA, наряду с типичными признаками волчанки, выявляется диффузно-пролиферативный гломерулонефрит, поражение ЦНС и тромбоцитопения. Характерно, что у больных с нейропатией и антителами к PCNA-1 нет антител к дсДНК. Мониторинг содержания антител показал, что увеличение титра антител к PCNA-1 сопутствует обострению гломерулонефрита, стероидная терапия снижает их титр. У больных волчанкой отмечают увеличение экспрессии PCNA-1 на мононуклеарах крови, преимущественно на СD⁴⁺ и CD⁸⁺-клетках. Процентное соотношение PCNA-1-позитивных клеток коррелирует с активностью заболевания.

Рибосомы являются цитоплазматическими органеллами, однако антитела к ним причисляют к семейству АНА. Рибосомы - органеллы, состоящие из комплексов белков и нуклеиновых кислот, их основная функция заключается в синтезе белка на основании последовательности матричной РНК. При СКВ основными антигенами служат фосфопротеиновые компоненты рибосом, прежде всего рибосомальные белки Р₀, Р₁ и Р₂. Антитела к рибосомам могут выявляться при использовании флюоресцентного теста и характеризуются типичным свечением цитоплазмы клетки. Иногда цитоплазматическое свечение может быть пропущено, больные могут попадать в группу «АНФ-негативной СКВ», что требует более детального обследования для обнаружения этой разновидности АНА.

Антитела к рибосомальному белку Р высокоспецифичны для СКВ, имеются у 10-20% больных. Антитела к рибосомам часто встречаются совместно с антителами к Sm-антигену. Антирибосомальные антитела обнаруживают преимущественно у больных с обострением СКВ, с поражением ЦНС, особенно при волчаночном психозе и депрессии, встречаемость антирибосомальных антител при этих состояниях составляет 50-80%. В диагностике поражения ЦНС при СКВ выявление антител к рибосомальному белку Р целесообразно дополнять исследованием ликвора для обнаружения олигоклонального IgG, который отражает иммуноопосредованное воспаление в ЦНС. Определение этих антител позволяет отличить поражение ЦНС на фоне СКВ от психоза, вызванного приемом высоких доз кортикостероидных гормонов.

Другие клинико-лабораторные взаимосвязи между обнаружением антител к рибосомам и клинической картиной СКВ включают развитие дискоидных высыпаний, фоточувствительность и афтозный стоматит, поражение печени у пациентов с высокими титрами антирибосомальных антител.

Антитела к Ku (Ki) взаимодействуют с белками ядерного матрикса массой 70 и 80 кДа. Они были впервые обнаружены у больных с перекрестным синдромом с проявлениями полимиозита и склеродермии. Эти антитела встречаются у 10-40% населения европейской популяции больных СКВ, причем в высоких титрах, превышающих 1:10 000. Их наличие диагностируют при СЗСТ, склеродермии и значительно реже - при полимиозите, РА, СШ, болезни Грейвса (30%) и первичной легочной гипертензии (20%). Антитела к МАт направлены на нуклеарный кислый антиген, чувствительный к протеолизу под воздействием трипсина, но устойчивый к РНКазе и ДНКазе. Эта разновидность АНА встречается у 3-18% больных СКВ, возможно, у больных с более активным течением заболевания.

При СС основной разновидностью АНА являются аутоантитела против антигена Scl-70. Эти антитела имеют основной мишенью топоизомеразу-1 массой 70 кДа. Топоизомераза представляет собой один из ферментов, участвующих в механизмах деспирализации суперскрученной ДНК, необходимой для транскрипции генов. Антигенная структура топоизомеразы хорошо изучена, основным антигеном, который используют в методах ИФА и иммуноблота, является рекомбинантный белок. Любой метод, применяемый для обнаружения антител к Scl-70, может быть подтвержден непрямой иммунофлюоресценцией на клетках HEp-2, благодаря характерному двойному типу свечения, включающему мелкогранулярный и ядрышковый тип флюоресценции. Это обусловливает целесообразность определения АНФ в качестве скринингового теста перед определением антител к Scl-70.

Антитела к Scl-70 представлены иммуноглобулинами классов IgG и IgA, однако рутинные лабораторные тесты позволяют обнаружить преимущественно антитела класса IgG. Антитела к топоизомеразе встречаются при диффузной склеродермии с поражением внутренних органов (СС), однако их наличие не исключает присутствия перекрестных синдромов склеродермии с СКВ или СШ. Антитела к Scl-70 присутствуют у 70% больных СС, у 30% больных диффузной склеродермией и у 10% больных с локализованными формами этого заболевания. В единичных случаях могут встречаться у онкологических больных без признаков СС или склеродермии. У больных с диффузной склеродермией с антителами к Scl-70 чаще встречаются рубцовые изменения на коже пальцев, развитие центрального склероза и поражение почек и сердца.

Основным антигеном является центромерный белок CENP-В, который входит в состав центромер - частей хромосомы эукариот, необходимых для образования веретена деления при митозе. Ткани лабораторных животных слабо экспрессируют антигены центромерных антител, поэтому АНФ на клеточной линии НЕр-2 является основным методом обнаружения этих антител в клинической практике. Антитела к центромерам хорошо визуализируются на НЕр-2-клетках благодаря свечению в делящихся клетках, в которых хромосомы компактны. Если хромосомы находятся в стадии спирализации, в ядре клетки флюоресцируют мелкие гранулы либо наблюдается картина веретена деления, подчеркнутого свечением центромер. Антицентромерные антитела обнаруживают в высоких титрах при использовании линии НЕр-2, для которых типична большая частота клеточных делений. Иммуноблоттинг имеет лишь незначительные преимущества в связи с большей объективизацией результатов теста. Антитела к центромерам и антитела к Scl-70 редко встречаются совместно. Иммуноблоттинг показывает, что в 10% случаев у больных с Scl-70 также имеются антицентромерные антитела. Часто у этих больных диагно стируют Ro/SS-A и La/SS-B, PM-Scl, антимитохондриальные антитела.

Антитела к центромерам являются серологическим маркером CREST-синдрома, представляющего собой сравнительно доброкачественную форму диффузной склеродермии, которая характеризуется подкожными кальцинатами, синдромом Рейно, эзофагитом, склеродактилией и телеангиэктазиями на коже туловища. Титры антител к центромерам не отражают активности заболевания. Антитела к центромерам выявляют у 50% больных с CREST, у 20% больных с СС и у 10% больных с изолированным синдромом Рейно. В этой группе пациентов присутствуют типичные клинические признаки CREST-синдрома: отсутствие рубцовых контрактур пальцев, более выраженный отек пальцев (по сравнению со склерозом), кальциноз фасций и сухожилий. Больные с антителами к центромерам старше, длительность заболевания у них обычно больше, чем у больных со склеродермией без этих антител. Это связывают с тем, что у таких больных реже отмечается поражение внутренних органов, реже встречаются атрофические процессы на коже, но часто присутствует кальциноз и ишемическая гангрена пальцев кисти. Практически у всех больных с антицентромерными антителами имеется выраженный синдром Рейно.

Антицентромерные антитела присутствуют в сыворотке 20% больных с идиопатическим синдромом Рейно, сопровождающимся артралгиями. У половины из них через несколько лет развивается полная клиническая картина склеродермии. Таким образом, антицентромерные антитела могут служить предвестником склеродермии и могут быть использованы при дифференциальной диагностике синдрома Рейно. Антицентромерные антитела не выявляют у здоровых лиц даже в низких титрах, что позволяет рассматривать их обнаружение как предиктор развития заболевания. Патогенетическая роль аутоантител при склеродермии остается под вопросом, изменения их титра не отражаются на активности аутоиммунного процесса, однако указывают на определенные клинические проявления этого заболевания.

Антитела к центромерам изредка встречаются при ряде других заболеваний, сопровождающихся синдромом Рейно: СКВ, РА, тиреоидите Хашимото, первичном билиарном циррозе.

АНА, направленные против компонентов ядрышка, таких как PM-Scl, U₃-RNP (фибрилларин), РНК-полимераза I, NOR90, часто обнаруживают при СС. Основным методом обнаружения этих разновидностей АНА является прицельное определение АНФ с ядрышковым типом свечения.

Антитела к РМ-Scl-антигену обнаруживают при сочетании клинических признаков СС и ПМ. Эта разновидность АНА направлена к антигенной системе ядрышка, включающей более 16 белков с молекулярным весом от 20 до 110 кДа. В случае наличия антител к PM/Scl приблизительно у 50% больных имеет место сочетание миозита и СС, реже антитела встречаются на фоне классической картины ПМ или СС. Это сочетание получило название «склеромиозит», характеризующийся миозитом и миалгиями в сочетании с кожными признаками дерматомиозита (периорбитальным отеком и папулами Готрона), наряду с синдромом Рейно, склеродактилией и интерстициальным пневмонитом. У больных с антителами к PM-Scl высок риск идиопатической легочной гипертензии, что приводит к быстрой декомпенсации пациентов, поэтому такие больные требуют особого внимания при оценке функции легких.

Антитела к РНК-полимеразам I, II и III встречаются у 20% больных с СС, CREST и другими перекрестными синдромами. В иммунофлюоресцентном тесте отмечают своеобразный точечный ядрышковый тип свечения. Их обнаруживают изолированно, без антител к центромерам и Scl-70. Антитела к полимеразам связаны с диффузным поражением кожи и внутренних органов, в том числе сердца и почек.

Антитела к фибриллярину (U₃snoRNP) - одному из основных ядрышковых рибонуклеопротеинов - диагностируют у 6-8% больных склеродермией. Иммунофлюоресценция фиксирует антиядрышковый тип свечения со значительной конденсацией и интенсивным свечением хроматина в клетках, находящихся в процессе митоза. Антитела к фибриллярину встречаются у больных с агрессивным прогрессирующим системным склерозом с вовлечением внутренних органов, в том числе с поражением тонкого кишечника, легочной гипертензией, миозитом, и указывают на неблагоприятный прогноз.

Антитела к РНКазе (RNAse MPR, Th snoRNP) направлены на один из ядрышковых рибонуклеопротеинов, связанных с процессингом митохондриальной РНК. Они встречаются у 4-11% больных склеродермией. Их присутствие в сыворотке типично для поражения тонкого кишечника, гипотиреоза, артрита и локализованной кожной формы склеродермии.

Антитела к NOR90 взаимодействуют с белком массой 90 кДа, компонентом ядрышкового организатора, участвующим в сборке ядрышка после митоза. При выявлении АНФ в ядре обнаруживают 10-20 мелких дискретных точек, причем интенсивность окраски меняется в зависимости от фазы жизненного цикла клетки. Этот тип АНА неспецифичен при склеродермии и встречается при СКВ, РА, некоторых формах онкологических заболеваний.

Заболевания, характеризующиеся воспалительным миозитом, представляют полиморфную группу, характеризующуюся цитотоксическим ответом к компонентам поперечнополосатой мускулатуры. Их часто объединяют под названием «вос палительные миопатии». Среди наиболее часто выявляемых заболеваний, относящихся к воспалительным миопатиям, выделяют классический дерматомиозит, миозит в рамках перекрестных синдромов, полимиозит и паранеопластический полимиозит, а также миозит с внутриклеточными включениями.

Конкретные разновидности АНА при ПМ/ДМ условно подразделяют на миозитспецифичные и миозит-ассоциированные, т.е. АНА, которые встречаются также при других формах ДБСТ в рамках перекрестных синдромов. Классификация аутоантител при миозите приведена в табл. 17-10. При воспалительных миопатиях миозит-специфические антитела могут быть обнаружены в 40% случаев, в то время как миозит-ассоциированные АНА обнаруживают у 20-30% больных. Общая частота встречаемости АНА даже при развернутых формах с классической картиной полимиозита не превышает 60%.

Таблица 17-10. Классификация антинуклеарных антител при воспалительных миопатиях

К семейству миозит-спефицифических АНА относят 3 основные разновидности аутоантител: антитела к аминоацил-тРНК-синтетазам, антитела к белку Mi-2 и антитела к компонентам сигнал-распознающей частицы SRP.

Антисинтетазные антитела - наиболее обширное семейство миозит-специфических аутоантител, насчитывает 5 основных представителей: Jo-1, PL-7, PL-12, EJ и OJ, которые совместно встречаются у 20-30% больных ДМ/ПМ. Антитела, взаимодействующие с Jo-1-антигеном, обнаруживают в несколько раз чаще, чем другие антисинтетазные антитела. Эти антитела реагируют с гистидил-тРНК-синтетазой; остальные антисинтетазные антитела направлены против 4-х различных типов тРНК-синтетаз: треониновой, аланиновой, глициновой, изо лейциновой. Антитела Jo-1 выявляют при использовании контрэлектрофореза и ИФА, что позволяет широко применять определение этого типа АНА в лабораторной практике. Контрэлектрофорез обладает достаточной чувствительностью и специфичностью для рутинной работы. Хотя антисинтетазные антитела не включены в классификационные критерии ДМ, их обнаружение при соответствующей клинической картине с высокой достоверностью подтверждает диагноз и, в ряде случаев, делает ненужной биопсию ткани. Поскольку антитела к тРНК-синтетазам обладают низкой чувствительностью при ДМ/ПМ, их отсутствие не может опровергнуть диагноз ДМ или ПМ. Антитела к Jo-1 имеются у 15-20% больных ДМ/ ПМ. Предполагают, что более широкое внедрение тестирования в отношении дру гих антисинтетазных антител может удвоить эту цифру.

У всех больных с антисинтетазными антителами наблюдают очень сходную клиническую картину, что привело к выделению особой клинико-лабораторной рубрики - так называемого антисинтетазного синдрома, одной из разновидностей перекрестных синдромов. Он характеризуется клинической картиной дерматомиозита, но протекает более активно и требует назначения активной иммуносу-прессивной терапии. Около 90% больных с антисинтетазным синдромом страдают симметричным полиартритом, часто отмечается синдром Рейно. Для этих больных характерна особая форма поражения кожи, так называемая рука механика, с гиперпигментацией, гиперкератозом и трещинами по латеральным и пальмарной поверхностям пальцев, напоминающая забитые грязью складки на коже рабочего. Интерстициальное поражение легких или фиброзирующий альвеолит присутствуют у 50-75% больных с антителами к тРНК-синтетазам. Приблизительно у 1/5 больных с антисинтетазными антителами отмечают признаки другого заболевания соединительной ткани. Больные с антисинтетазными антителами хуже поддаются терапии, и у них чаще возникают обострения при снижении доз иммуносупрессивных препаратов.

Антитела к Mi-2-антигену реагируют с ядерным антигеном, входящим в состав ЭНА. Антитела к Mi-2 являются наиболее специфичным серологическим маркером ДМ, а также встречаются при ювенильном ДМ. Эта разновидность АНА может быть обнаружена благодаря гомогенному типу свечения АНФ. Данный тип АНА обнаруживают у 10-20% больных ДМ с выраженными признаками поражения кожи. У таких больных наблюдают в целом благоприятное течение заболевания и хороший ответ на иммуносупрессивную терапию.

Первым методом обнаружения антифосфолипидных антител стал серологический тест для диагностики сифилиса, который был разработан Вассерманом в 1906 г. Основным антигеном экстракта бычьих сердец, требуемым для проведения реакции Вассермана (РВ), является фосфолипид, который выделен и назван кардиолипином. Активное внедрение РВ для серодиагностики сифилиса привело к тому, что была выделена категория пациентов с положительной реакцией, однако признаков сифилиса у них не отмечалось. В то же время у этой категории лиц с ложноположительным серологическим тестом была отмечена повышенная частота встречаемости аутоиммунных заболеваний, прежде всего ДБСТ и СШ. Этот феномен получил название «биологически ложноположительный тест на сифилис».

Одновременно с ложноположительной РВ при СКВ в крови этих пациентов был обнаружен сывороточный фактор, который препятствовал свертыванию крови и получил название «волчаночный антикоагулянт». Волчаночный антикоагулянт (ВА) отсутствовал в плазме больных сифилисом и часто отмечался у пациентов с СКВ. У больных с ВА был установлен характерный набор клинических признаков, среди которых ведущими являются тромбозы артерий и вен, повторные выкидыши и тромбоцитопения, составляющие симптомокомплекс антифосфолипидного синдрома (АФС). Интерес к диагностике этого аутоиммунного заболевания значительно возрос в связи с разработкой тестов для выявления антифосфолипидных антител (АФА).

АФС представляет собой аутоиммунное нарушение коагуляции, составляющее основную причину тромбозов у молодых людей и одну из ведущих причин привычного невынашивания беременности. В основе АФС лежит образование АФА, представляющих собой гетерогенную популяцию иммуноглобулинов, взаимодействующих с отрицательно заряженными, реже - с нейтральными фосфолипидами. Эти антитела in vitro нарушают образование протромбинового комплекса (протромбиназы), который состоит из фактора X, фактора V, фосфолипидов и кальция, что приводит к гипокоагуляции и удлинению времени основных коагуляционных тестов. При этом in vivo у больных АФС имеет место усиленное тромбообразование.

Нарушение функции протромбинового комплекса ведет к развитию тромботического состояния с изменением сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и хроническим потреблением факторов коагуляции, напоминающего ДВС-синдром. При АФС тромбоз происходит на фоне обезвоживания, инфекции или венозного застоя. Помимо коагулопатии, АФС сопровождается нарушениями микроциркуля ции, проявляющимися язвами кожи, микроангиопатией почек, кожным ливедо.

Название «антифосфолипидные антитела» не отражает самой сущности взаимодействия антифосфолипидных антител со своими антигенами, в котором наряду с фосфолипидами важную роль играют белковые кофакторы этих аутоантител, одним из которых является β₂-гликопротеин-I (β₂-ГП). Другими белковыми кофакторами фосфолипидов могут быть протромбин, тромбомодулин, протеины С и S, фактор XI, аннексин V, кининоген, мембранные белки тромбоцитов и эндотелиоцитов. Кроме того, антикардиолипиновые антитела (АКЛА) перекрестно реагируют с фосфатидилсерином и другими отрицательно заряженными фосфолипидами, антителами к тромбоцитам, антителами к окисленным липопротеидам низкой плотности и с протромбином. Таким образом, АФА реагируют с гетерогенной группой фосфолипидов и белковых антигенов сосудистого русла.

Предпочтительным тестом для обнаружения АКЛА служит метод ИФА. При детекции АКЛА обязательным является наличие в тестируемом фосфолипидном субстрате β₂-ГП, который представляет собой белковый кофактор. Обычно он присутствует в составе буферов для разведения сыворотки больных. С методической точки зрения, метод определения АКЛА для диагностики АФС более корректно было бы называть «β₂-ГП-зависимые антикардиолипиновые антитела», поскольку действительной мишенью аутоантител является неоантиген, образующийся при взаимодействии кардиолипина и β₂-ГП.

АКЛА имеют несомненное патогенетическое значение в развитии коагулопатии. В культурах АКЛА стимулируют выработку внутреннего фактора макрофагами. АКЛА реагируют с тромбоцитами с их активацией, являются причиной тромбоцитопений у большинства больных АФС. АКЛА активируют эндотелиальные клетки с экспрессией факторов адгезии. Под действием АКЛА снижается антикоагулянтная активность протеина С. Наконец, АКЛА увеличивают частичное тромбопластиновое время in vitro - феномен, известный под названием «волчаночный анти коагулянт». В качестве антигена могут быть использованы другие отрицательно заряженные фосфолипиды, в частности фосфатидилсерин или фосфатидилино зитол. Кардиолипин (дифосфатидил-глицерол) имеет значительную структурную гомологию с другими фосфолипидами, поэтому в случае, если отсутствуют АКЛА, обычно отсутствуют другие АФА. Целесообразность определения антител к другим представителям фосфолипидов (фосфатидилэтаноламину и протромбину) в практической диагностике пока не доказана.

Определение АКЛА более стандартизовано по сравнению с другими АФА: созданы стандарты сывороток, содержащих АКЛА. Иногда эти стандарты называют стандартами Harris, по имени ученого, который разработал единицы GPL для АКЛА класса IgG и единицы MPL для АКЛА IgM. Одна единица представляет связывающую активность 1 мкг аффинно очищенных поликлональных АКЛА. Вторичный стандарт калибруется против первичных стандартов. Аутоантитела каждого класса можно определять независимо друг от друга. Результаты обследования интерпретируют с помощью градации на низкие (менее 40 единиц), средние (от 40 до 80 единиц) и высокие (более 80 единиц) титры антител. АКЛА могут быть обнаружены как в сыворотке, так и в плазме крови. Положительный результат определяется при среднем или высоком их титре, т.е. при титре более 40 GPL и MPL единиц. Наличие гетерогенных поликлональных АКЛА от различных пациентов в стандартах приводит к различиям между коммерческими наборами. Инактивация комплемента нагреванием может приводить к получению ложно положительных результатов, а повторное замораживание приводит к снижению титров аутоантител. Согласно лабораторным классификационным критериям АФС, пациент должен быть «положительным» как минимум по одному из тестов (кардиолипину, β₂-ГП-1 или ВА) при повторном определении по меньшей мере через 12 нед. Наличие постоянно повышенных АКЛА в титре более 60 GPL может предсказать присутствие у пациента ВА и положительных результатов при исследовании на наличие антител к β₂-ГП-1.

Подавляющее число тест-систем для обнаружения АКЛА на отечественном рынке по-прежнему калибровано в единицах Harris. Очевидны недостатки единиц Harrisдля стандартизации тест-систем. Фактически реактивы разных производителей представляют собой разные методы, результаты которых сложно сопоставить друг с другом. Для преодоления этих расхождений были предложены новые стандарты АКЛА, основанные на моноклональных очеловеченных антителах HCAL и EY2C9.

АКЛА в низких и средних титрах определяют у 30-40% пациентов с СКВ, что позволяет использовать их в качестве одного из серологических маркеров этого заболевания. Их выявление не коррелирует с возрастом больных, длительностью заболевания или особыми чертами его течения, включая наличие полиартрита, серозита или васкулита. В то же время наличие высоких титров АКЛА указывает на риск развития вторичного АФС у больного СКВ. Однако СКВ не единственное ревматологическое заболевание, сопровождающееся АКЛА. Сравнительно часто АКЛА диагностируют у больных СС, васкулитами и васкулитоподобными состояниями, например при синдроме Бехчета и болезни Крона. При отсутствии ДБСТ заболевание рассматривают как первичный АФС.АКЛА, относящиеся к изотипу IgG₂, как правило, имеют максимальный титр непосредственно перед развитием тромбоза и несколько снижаются сразу после его возникновения, что свидетельствует об их потреблении в процессе коагуляции. Увеличение титра АКЛА при развитии клинической картины тромбоза указывает на АФС. В то же время АКЛА являются одними из наиболее распространенных аутоантител, присутствующих у клинически здоровых лиц. Частота их обнаружения значительно выше частоты обнаружения АФС. Значимые концентрации АКЛА возникают на фоне широкого ряда инфекционных заболеваний. Среди наиболее частых индукторов АКЛА известны инфекции вирусами гепатита С, ВИЧ, Эпштейна-Барр, парвовирусом В₁₉, аденовирусом, стрептококком, спирохетами, хеликобактером, сальмонеллами, лептоспирами, токсоплазмой. Обычно при инфекциях появляются АКЛА класса IgM в низком титре, который плавно снижается после выздоровления. Это требует повторных определений АКЛА с перерывом в 1,5 мес, что соответствует времени обновления пула иммуноглобулинов сыворотки. Онкологические заболевания, хронические интоксикации, в том числе алкоголизм, индуцируют образование АКЛА, что обусловливает сложность интерпретации этого показателя. При этом не находят антител к β₂-ГП-1 и не бывает зафиксировано тромбозов.

β₂-ГП-1 представляет собой гликозилированный белок плазмы крови, содержа ние которого в норме составляет 150-300 мкг/мл. Он обладает антикоагулянтной активностью, способен связываться с апоптотическими тельцами и участвует в их клиренсе из кровотока. Определение антител к β₂-ГП-1 было в 2006 г. включено в лабораторные классификационные критерии АФС. β₂-ГП-1 обладает непрямой антикоагулянтной активностью за счет ингибирования протромбинового комплекса и подавления активации тромбоцитов. Большую роль отводят β₂-ГП-1 в фагоцитозе апоптотических клеток и окисленных липопротеинов. При иммунизации лабораторных животных β₂-ГП происходит образование АФА, в результате часто возникает резорбция плода, тромбоцитопения и увеличение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ).

Антитела к β₂-ГП-1 распознают исключительно человеческий белок и встречаются у 70-80% больных с АФС. Антитела к β₂-ГП-1 низкоаффинны, их содержание обычно невелико. Связывание β₂-ГП-1 на пластике ИФА-планшета приводит к экспозиции скрытых эпитопов. Одной из основных проблем использования этого маркера являются недостаточно сопоставимые результаты обследования, связанные с отсутствием стандартизованных калибраторов. Коммерческие наборы калибруются собственными калибраторами производителей, и результаты выражаются в произвольных единицах. Несмотря на отсутствие стандартизации, в выявлении антител к β₂-ГП наблюдается лучший межлабораторный консенсус относительно точности этой методики по сравнению с определением АКЛА. На сегодняшний день определение антител к β₂-ГП-1 - полноправный лабораторный метод диагностики АФС.

АФА индуцируют тромбозы in vivo, но in vitro они приводят к замедлению фосфолипид-зависимых коагуляционных тестов, прежде всего АЧТВ, и, в меньшей степени, протромбинового времени. Выявление ВА - функциональный тест, кото рый позволяет оценить действие антител на каскад коагуляции, которые, в свою очередь, предупреждая коагуляцию in vitro, сами ассоциируются с тромбозом.

Коагулогические тесты для обнаружения ВА подразделяют на скрининговые, коррекционные и подтверждающие. Крайне важно соблюдение точности на преаналитическом этапе методики, поскольку присутствие тромбоцитов в исследуемой плазме (они являются эндогенным источником фосфолипидов) может привести к получению ложноотрицательных результатов теста.

В качестве скрининговых тестов используют АЧТВ с фосфолипид-зависимым субстратом, коалиновое время свертывания и тест с ядом гадюки Рассела. Положительным результатом считают удлинение фосфолипид-зависимого времени свертывания крови свыше нормы. Необходимо использование, по крайней мере, двух коагуляционных тестов. В случае, если оба или хотя бы один из них указывает на наличие ВА, необходимо выполнить коррекционный (смешанный) тест, т.е. повторить тест с добавлением плазмы здорового донора в соотношении 1:1. Если удлинение времени свертывания есть результат недостаточности факторов коагуляции, оно будет скорректировано до нормальных значений, в то время как при наличии ВА коррекции не произойдет. Отсутствие коррекционного действия плазмы здорового донора на время свертывания позволяет отличить действие ВА от дефицита факторов свертывания.

Присутствие у больного специфического ВА, зависимого от фосфолипидов, и отсутствие в сыворотке других ингибиторов коагуляции проводят подтверж дающим тестом с добавлением избытка фосфолипидов. В качестве источника фос фолипидов применяют разрушенные повторным замораживанием-оттаиванием отмытые тромбоциты, либо модифицированный aPTT-реагент, в котором содержится нейтральный фосфолипид в гексагональной форме, специфически связывающий ВА.

Имеются значительные межлабораторные вариации в выполнении данного типа исследований, поэтому референсные значения должны быть установлены для каждого метода определения ВА и для каждого коагулометра. Независимо от выбранных методов тестирования при определении ВА важно проведение внутреннего лабораторного контроля качества с положительным и отрицательным ВА-контролем для каждой партии реагентов. Стандартизация определения ВА - насущная потребность, которую предполагается решить с разработкой моноклональных антител либо приготовлением референтных стандартов из лиофилизированной плазмы больных. Как и в случае обнаружения АКЛА, необходимо подтвердить стойкое присутствие ВА в сыворотке больного АФС во времени, так как ВА может подавляться на фоне вирусных и бактериальных инфекций либо под действием ряда лекарственных препаратов.

Проводимая терапия антикоагулянтами, прежде всего гепарином^♠, ведет к удлинению АЧТВ и других скрининговых тестов. Это затрудняет выявление ВА у пациентов, у которых антикоагулянтная терапия была начата по жизненным пока заниям. В данном случае большую специфичность при диагностике АФС имеют серологические тесты, основанные на определении анти-(β₂-ГП-1-(зависимый ВА). Этот тест признают в качестве наиболее перспективного подхода для оценки риска тромбоза по сравнению с классическими методами определения ВА.

При РА может быть обнаружено до 50 различных видов аутоантител, кото рые встречаются с различной частотой (табл. 17-11). Первой разновидностью аутоантител, обнаруженных при РА, стал РФ. Основной мишенью РФ является эпитоп Ga, расположенный в С₂-С₃ районе тяжелой цепи молекулы IgG подклассов IgG₁, IgG₂, IgG₄, недалеко от сайта связывания со стафилококковым про теином А. К РФ причисляют антитела против IgG, представленные основными классами иммуноглобулинов - IgG, IgM и IgA. Хотя РФ может быть представлен любым классом иммуноглобулинов, однако турбидиметрические и агглютинационные тесты помогают обнаружить в основном IgM-РФ. В латексном тесте агрегированный человеческий IgG прикреплен к латексным частицам, которые агглютинируют в присутствии РФ. Это быстрый легковыполнимый тест, однако он дает большое количество ложнопозитивных результатов. Среди агглютинационных тестов классический тест Ваалера-Розе, основанный на пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитов барана, покрытых антиэритроцитарной сывороткой крови кролика, до сих пор не утратил своего значения. По сравнению с латексным и другими агглютинационными тестами положительный тест Ваалера-Розе является более специфичным для РА, поскольку аллотипические антитела, образующиеся при беременности или после гемотрансфузий, не взаимодействуют с кроличьим IgG. В ряде случаев, тем не менее, гетерофильные антитела к эритроцитам барана, встречающиеся при инфекционном мононуклеозе и ряде других острых инфекций, способны привести к получению ложнополо жительного результата этого теста.

Таблица 17-11. Аутоантитела в лабораторной диагностике ревматоидного артрита

Нефелометрическое и турбидиметрическое определение РФ - наиболее точный аналитический метод. Рассеивание света на формирующихся комплексах «антиген-антитело» позволяет установить их концентрацию в сыворотке крови. Этот тест является наиболее стандартизированным среди всех иммунологических тестов, его применение позволяет быстро и точно получить результат в IU/мл. Результаты нефелометрического определения РФ хорошо согласуются с традиционным латексным тестом. Точное определение класса иммуноглобулинов, которым представлен РФ, может быть выполнено с помощью метода ИФА. Убедительных данных о целесообразности определения классов РФ в клинической практике нет. Тем не менее отмечают, что IgG-РФ встречается при васкулитах, сопутствующих РА и синдрому повышенной вязкости крови, поскольку он может участвовать в образовании самоассоциирующихся иммунных комплексов. Для больных с IgA-РФ характерно быстро прогрессирующее течение заболевания.

Для стандартизации тестов по обнаружению РФ ВОЗ разработан международный стандарт сыворотки WHO1066, содержащий 100 IU/мл (international units) РФ. Существующие стандарты сыворотки учитывают РФ класса IgM, таким образом, в международных единицах (IU/мл) может быть получен ответ для РФ, представленного этим классом антител. В качестве популяционной нормы рекомендовано рассматривать концентрации РФ ниже 20 IU/мл. Частота встречаемости концентраций РФ, превышающих 20 IU/мл, у здоровых людей среднего возраста составляет около 3% и увеличивается до 10-15% у пожилых старше 65 лет. Концентрация РФ в сыворотке крови больного, превышающая 40 IU/мл, должна рассматриваться как высокая и является высокоспецифичной для диагностики РА. Обнаружение титров РФ более 40-50 IU/мл указывает на высокий риск развития эрозивного артрита. У тех лиц, у которых был обнаружен высокий титр РФ, отмечают значительный риск развития РА, так как обнаружение диагностических титров РФ может предшествовать на несколько лет клиническим проявлениям заболевания.

Определение РФ до сих пор является основным лабораторным методом диагностики РА и служит основанием для выделения двух его основных клинико-иммунологических разновидностей: серонегативного и серопозитивного РА. Более того, отсутствие РФ при ряде воспалительных артритов позволяет выделить клиническую группу серонегативных спондилоартропатий.

РФ обладает достаточно высокой чувствительностью и имеется у 60-80% боль ных РА. Однако в дебюте заболевания, на раннем этапе, РФ обнаруживают менее чем у 25% больных, что существенно снижает его значение для ранней диагностики этого заболевания. Однократного определения РФ на ранней стадии РА с отрицательным результатом недостаточно для того, чтобы исключить серопозитивную клинико-иммунологическую форму РА. Если диагноз РА подозревают или даже он клинически подтвержден, при отрицательном результате теста по определению РФ требуются повторные определения его титра каждые 6 или 12 мес. Этот срок приблизительно соответствует времени обновления пула плазматических клеток, способных синтезировать аутоантитела. Если же будет получен положительный результат, то нет реальных предпосылок повторять определение РФ с течением времени, поскольку титры аутоантител плохо отражают активность заболевания. Значение повторных определений содержания РФ для контроля над течением заболевания имеет несравненно меньшее значение, чем мониторинг острофазового ответа. Снижение титра РФ в плазме крови при успешной терапии может отчасти объясняться цитостатическим эффектом применяемых препаратов. Тем не менее у больных РА возможна сероконверсия как в одну, так и в другую сторону в зависимости от активности и длительности заболевания, а также от проводимого лечения. Сероконверсия из серопозитивной в серонегативную группу встречается редко и обычно сопутствует полной клинической ремиссии заболевания.

Кроме низкой встречаемости РФ в дебюте заболевания, очевидным недостатком РФ в качестве маркера РА является его сравнительно низкая специфичность, кото рая не превышает 60% (табл. 17-12). Фактически это означает, что каждый 3-4-й положительный тест обнаруживается у больного без РА. Так, частота выявления концентраций РФ, превышающих 20 МЕ/мл, у здоровых людей среднего возраста составляет около 3% и увеличивается до 10-15% у пожилых лиц старше 65 лет. Диагностические уровни РФ часто встречаются при СШ, гранулематозе Вегенера, аутоиммунных поражениях печени, СКВ, криоглобулинемии, реже - при других аутоиммунных заболеваниях, а также при хронических инфекциях (подостром септическом эндокардите, туберкулезе, вирусном гепатите С). Хотя РФ входит в классификационные критерии РА, его обнаружение не позволяет доказать наличия РА при атипичной клинической картине, а отсутствие РФ в сыворотке больного не позволяет исключить диагноз РА.

Таблица 17-12. Частота встречаемости ревматоидного фактора при различных заболеваниях

^* - более 25 МЕ/мл.

Антицитруллиновые антитела (АЦА), или антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду (АЦЦП), направлены против антигенных эпитопов, содержащих аминокислоту цитруллин, которые возникают в белках синовиальной оболочки под действием воспалительных ферментов нейтрофилов. Это семейство активно расширяется, что обусловлено эффективностью АЦЦП для диагностики РА.

Антифилаггриновые антитела (АнФА) исторически выделяют среди АЦА, к которым относят антиперинуклеарный фактор (АПФ) и антикератиновые антитела (АКА), - показатели, определение которых основано на НРИФ. Основной антигенной мишенью АнФА является белок профилаггрин, который синтезируется в виде фосфорилированного полипептида, содержащего около 10 филаггриновых повторов. Белок хранится в гранулах и подвергается ограниченному протеолизу, после чего положительно заряженные полипептиды филаггрина участвуют в сборке цитокератинового скелета эпителиоцита. АнФА связываются с разными антигенными мишенями, содержащими аминокислоту цитруллин, образующуюся при дезаминировании аргинина с помощью фермента пептидиларгининдезаминазы (ПАД). К таким мишеням относят филаггрин, виментин, а также Sa-антиген, выделенный из ткани плаценты, антитела к которому также причисляют к семейству АЦА. Высокая активность ПАД наблюдается в воспаленной синовиальной оболочке, что было показано при исследовании ее биоптатов у больных РА и на моделях этого заболевания у лабораторных животных. Основным источником ПАД в синовиальной оболочке могут быть полиморфноядерные лейкоциты, содержащие этот фермент в цитоплазме, которые в значительном количестве появляются в синовиальной жидкости при РА. Их разрушение приводит к высвобождению свободного фермента и его активации в присутствии ионов кальция. Наличие цитруллинированных белков особенно характерно для воспалительно-измененной синовиальной оболочки при РА, где они выступают и в качестве основной мишени АЦА. В качестве основного индуктора образования АЦА рассматривают α- и β-цепи дезиминированного фибрина, которые в большом количестве накапливаются в воспаленной синовиальной оболочке и локализуются с отложениями цитруллинированных белков.

Антиперинуклеарный фактор (АПФ) был первым исследованным аутоантителом, относящимся к семейству АФА. Эта разновидность аутоантител получила название из-за способности к связыванию с кератогиалиновыми гранулами в цитоплазме клеток эпителия щеки человека, расположенными перинуклеарно. Основным методом выявления АПФ служит НРИФ. Оптимальным тест-субстратом для обнаружения АПФ считают эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки человека, в которых присутствует специфическое свечение крупных округлых гранул (3-8 на клетку), расположенных вокруг ядра. Выявление АПФ сопряжено с рядом технических сложностей, что ограничивает широкое практическое применение этого метода. Прежде всего, лишь около 5-10% здоровых лиц обладают достаточным содержанием кератогиалиновых гранул в клетках эпителия щеки, и для стандартизации метода необходим подбор подходящего донора. Кроме того, кератогиалиновые гранулы быстро утрачивают свою антигенность при длительном высушивании клеток, большинстве типов химической фиксации, обработке ферментами и детергентами.

Антикератиновые антитела (АКА) - другой представитель семейства антифилаггриновых антител. Их также определяют при помощи НРИФ, они реагируют с роговым слоем многослойного плоского ороговевающего эпителия средней трети пищевода крысы. При использовании пищевода крысы в НРИФ выявляется несколько типов окрашивания эпителия. Может визуализироваться окрашивание клеток базального слоя эпителия, наблюдаться сетчатое окрашивание неорого вевающих слоев эпителия, а также гранулярное окрашивание stratum corneum. Для АКА характерен особый, линейный, тип окрашивания ороговевающих слоев эпителия пищевода крысы, в то время как остальные типы окрашивания специфического диагностического значения не имеют. Необходимо учитывать, что на пищеводе могут быть также обнаружены аутоантитела к десмосомам и антитела к базальной мембране, которые являются специфическими маркерами буллезных дерматозов. Эти антитела также способны интерферировать с выявлением АКА и должны быть дифференцированы от АКА.

Со времени первого описания АКА при РА, их диагностическое значение неоднократно подтверждалось. Встречаемость АКА в сыворотке крови больных РА составляет около 45% при серопозитивном и 30% при серонегативном результате, при специфичности, близкой к 100%. Несколько чаще обнаруживается АПФ, его встречаемость составляет 45-61%. По сравнению с РФ для АКА и АПФ характерна более высокая специфичность, которая составляет 88-99%, при более низкой чувствительности, не превышающей 60%. Полагают, что АПФ менее специфичен по сравнению с АКА и чаще встречается при других ревматологических заболеваниях. Содержание АКА и АПФ у больных РА не коррелирует с титрами РФ, что позволяет рассматривать эти антитела в качестве независимых серологических маркеров заболевания. АФА встречаются у пациентов с серонегативным РА, что значительно сокращает группу больных РА, у которых не выявляются специфические серологические маркеры заболевания.При РА описаны еще 2 представителя АФА - антитела к очищенному филаггрину и антитела к Sa-антигену.

Антитела к филаггрину могут быть определены при помощи иммуноблоттинга с использованием нативных экстрактов человеческого или животного филаггрина. Однако содержание цитруллина в антигенных экстрактах филаггрина значительно различается, что обусловливает их антигенную гетерогенность и не позволяет стандартизировать тесты для выявления АФА.

Антитела к Sa-антигену встречаются при РА приблизительно у 40% больных. Их специфичность составляет 98%, что сближает их с АКА. Sa-антиген представляет собой белок с молекулярной массой 48-50 кДа, встречается в экстракте человеческой плаценты, а также в тканях селезенки и ревматоидного паннуса. Установлено, что Sa-антигену соответствует цитруллин-содержащая форма виментина - компонента цитоскелета клетки. В связи с этим антитела к Sa-антигену стали относить к группе антицитруллиновых антител.

Значительным достижением в изучении роли цитруллин-содержащих антигенов при РА стало описание линейных иммунодоминантных пептидов филаггрина, содержащих цитруллин. Всего было проанализировано 40 цитруллинированных пептидов, результат исследований позволил выделить основной иммунодоминантный пептид cfc1, в состав которого входит 19 аминокислот (306-324, Arg₃₁₂ →Cit). За счет замены серина на цистеин был создан cfc1-cyc - пептид, содержащий цистеиновый мостик, или циклический цитруллинированный пептид (cyclic citrul-linated peptide - CCP), более точно отражающий конформационную структуру нативного белка, что увеличило сродство АЦЦП к этому антигену. Это позволило использовать данный «неоантиген» для обнаружения АЦЦП. Этот случай стал одним из первых примеров разработки диагностических антигенов для серодиагностики. В действительности циклический цитруллиновый пептид в организме больного РА отсутствует, однако аутоантитела из сыворотки больного связываются с ним in vitro. Второе поколение тест-систем было создано с использованием случайных пептидных библиотек, которые облегчили отбор цитруллинированно го антигена с улучшенными свойствами. Эти исследования позволили разработать иммуноферментную тест-систему для выявления АЦЦП.

Иммуноферментные тест-системы второго поколения стали золотым стандартом определения АЦА в клинических лабораториях. Особенностью всех тест-систем для обнаружения АЦЦП служит то, что антиген доступен коммерчески. Это стандартизирует выявление АЦЦП, результаты международных программ внешнего контроля качества, а также исследования, посвященные сопоставлению тест-систем АЦЦП разных производителей, указывают на высокую сходимость параметров.

Метод второй генерации для выявления АЦЦП практически не уступает по чувствительности РФ и позволяет обнаружить антитела у 70-75% пациентов с РА. Таким образом, по чувствительности этот метод сопоставим с определением РФ, однако он значительно превосходит последний благодаря специфичности, составляющей около 95%. Специфичность АЦЦП крайне высока, так как при других воспалительных артропатиях и ревматических заболеваниях АЦЦП встречается не чаще чем в 2-3% случаев. Среднее содержание у здоровых доноров крови в 10 раз меньше, чем рекомендуемая производителем граница нормы в 5 U/мл.

Большим преимуществом АЦА является их образование до клинических симптомов заболевания. Популяционные исследования, посвященные времени появления аутоантител АЦЦП в ходе РА, показали, что АЦЦП могут быть обнаружены задолго до развития клинических симптомов заболевания. Этот феномен был впервые отмечен для АКА и позже подтвержден для АЦЦП. До появления клинических симптомов заболевания в 34% случаев были обнаружены АЦЦП. У 19% здоровых на момент обследования людей был обнаружен РФ класса IgM, причем в нескольких случаях наличие антител предсказывало РА за 20 лет до появления первых симптомов заболевания. Частота обнаружения антител значительно нарастала к моменту, соответствующему 1,5 годам до постановки диагноза РА. После определения минимального диагностического титра содержание антител обычно увеличивалось вплоть до срока постановки диагноза. Ко времени постановки диагноза раннего РА частота обнаружения АЦЦП и IgM-РФ сравнялась и достигла 70%. АЦЦП не только обнаруживаются на ранних стадиях РА, но и отмечаются у больных РА с быстрым рентгенологическим прогрессированием. АЦЦП позволяют предсказать развитие деструкций приблизительно у 80% пациентов с РА и в сочетании с РФ представляют важный инструмент для раннего распознавания больных РА с неблагоприятным прогнозом заболевания уже на этапе постановки диагноза.

Основным конкурентом АЦЦП в лабораторной диагностике РА является другой представитель семейства АЦА - антитела к модифицированному цитруллинированному виментину (АМЦВ), или anti-MCV. Тесты основаны на рекомбинантном белке виментине, одном из промежуточных цитофиламентов клетки. Цитруллинирование виментина in vitro приводит к образованию большого количества иммунодоминантных эпитопов, число которых теоретически обеспечивает лучшее связывание аутоантител и большую чувствительность тест-системы.

Тест-системы для обнаружения АМЦВ имеют чувствительность для выявления РА 85%, что несколько превосходит чувствительность выявления РА с использованием АЦЦП. Последующие исследования различных групп ревматологических больных с использованием АМЦВ обнаружили, что данные антитела встречаются у 15-25% больных с системными заболеваниями, отмечаются у 5-10% больных псориатическим артритом, могут встречаться у 20% пожилых лиц без признаков РА. Таким образом, реальная специфичность при исследовании смешанных попу ляций для АМЦВ составляет не более 85-90%. Проблему низкой специфичности можно отчасти решить при увеличении границы нормы тест-системы до 25-30 U/мл при заявленной производителем норме в 20 U/мл. При таком изменении специфичность обследования возрастает до 90-92%, однако чувствительность снижается до 60-70%. Таким образом, по основным клинико-лабораторным параметрам anti-MCV близки АЦЦП, однако несколько менее специфичны, чаще встречаются при других формах артритов.

Для антител к RA-33 антигеном являются белки гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNP). Эти белки входят в состав сплайсосом наряду с антигена ми других рибонуклеопротеиновых АНА, в частности Sm и RNP. Антитела к RA-33 встречаются при РА в 30% случаев, а также отмечаются при СКВ и СЗСТ с частотой 10-15%. При СКВ и СЗСТ практически всегда они присутствуют совместно с анти телами к U₁-RNP. При других ревматических заболеваниях антитела к RA-33 практически не обнаруживают. В НРИФ при использовании клеток НЕр-2 они обычно характеризуются мелкогранулярным окрашиванием ядра, неотличимым от других разновидностей АНФ. Определение АНФ не является надежным методом обнаружения данных аутоантител, так как антитела к RA-33 часто имеются в сыворотках, в которых АНФ отсутствует. Оптимальным методом диагностики антител к RA-33 считают иммуноблоттинг, причем этот тип АНА содержится в сыворотке крови больных в невысоких титрах (1:100), однако данные антитела могут быть выявлены с помощью ИФА с использованием очищенного антигена.

Они присутствуют в сыворотке крови приблизительно у 20-30% больных с серонегативным РА независимо от других серологических маркеров. Антитела к RA-33 отмечаются на этапе раннего РА, могут встречаться до появления клинических признаков РА. При РА наличие этой разновидности АНА не зависит от длительности заболевания, возраста и пола больных, а также от эффективности проводимой терапии. Имеются данные, что у больных РА с антителами к RA-33 заболевание течет менее агрессивно и характеризуется лучшим прогнозом, что позволяет использовать присутствие этих антител в прогнозировании исхода РА.

Под аутоиммунными васкулитами понимают заболевания, связанные с воспалительным процессом в сосудистой стенке, без инфекционной или токсической причины. Васкулиты подразделяют на первичные и вторичные, которые возникают на фоне другого аутоиммунного заболевания. Общепринятой является международная классификация первичных васкулитов, которая дала определение 10 формам первичных васкулитов и подразделила их в соответствии с калибром поражаемых сосудов (табл. 17-13).

Таблица 17-13. Классификация васкулитов Chapel-Hill Consensus Conference (1994)

Патогенез васкулитов крупных и средних сосудов опосредован преимущественно Т-клетками, абсолютно специфических серологических маркеров при этих заболеваниях не описано. Антиэндотелиальные антитела с различной частотой встречаются при аортоартериите Такаясу и болезни Кавасаки, а также при ряде васкулопатий, таких как гемолитико-уремический синдром, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Бехчета. Васкулиты крупных и средних сосудов сопровождаются выраженным воспалением, выявление которого представляет основную задачу лабораторных методов диагностики.

В соответствии с иммунопатогенезом васкулиты мелких сосудов могут быть подразделены на гранулематозные и иммунокомплексные.

Гранулематозные васкулиты мелких сосудов, включающие синдром Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросс, имеют ряд общих черт, к которым относят поражение почек по типу олигоиммунного экстракапиллярного гломерулонефрита с полулуниями, полиневрит и легочный капиллярит. Основным методом серологической диагностики гранулематозных васкулитов является обнаружение АНЦА. Антитела этого семейства реагируют с белками азурофильных гранул нейтрофильных гранулоцитов. Значение АНЦА в патогенезе и диагностике гранулематозных васкулитов позволило выделить отдельную группу, обобщенную под названием «АНЦА-ассоциированные васкулиты». К ним относят гранулематоз Вегенера, синдром Черджа-Стросс, микроскопический полиартериит, быстропрогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями. К этой группе заболеваний иногда причисляют синдром Гудпасчера, так как АНЦА могут отмечаться у 10-15% пациентов с этим заболеванием, совместно с антителами к базальной мембране клубочка, выявление которых - основной лабораторный метод его диагностики. Хотя синдром Гудпасчера не относится к системным васкулитам, он характеризуется геморрагическим альвеолитом и быстропрогрессирующим гломерулонефритом, который сложно отличить от АНЦА-ассоциированного поражения почек. В связи с этим определение АНЦА и антител к базальной мембране обычно используют совместно.

Иммунокомплексные васкулиты обусловлены образованием иммунных комплексов между аутоантителами и их антигенами в крови и сосудистой стенке. Иммунные комплексы, которые можно обнаружить в сыворотке крови, называют циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК). Предполагается, что снижение растворимости ЦИК приводит к их отложению в сосудистой стенке и развитию воспаления. Снижение растворимости при замедлении скорости кровотока и температуры приводит к тому, что иммунными комплексами поражаются преимущественно капилляры, прежде всего капилляры кожи. Криоглобулинемический васкулит сопровождается появлением в крови особой разновидности ЦИК, которая требует особых методических подходов для их обнаружения.

Отдельно выделяют методы, позволяющие обнаружить отложения иммунных комплексов и комплемента непосредственно в пораженной ткани. Обнаружение отложений иммунных комплексов позволяет объективизировать иммунокомплексный процесс и обладает большей достоверностью по сравнению с методами определения ЦИК.

Антиэндотелиальные антитела (АЭТА) составляют гетерогенную группу анти тел, направленных к антигенным детерминантам эндотелиальных клеток. АЭТА были впервые обнаружены у больных СКВ при использовании метода непрямой иммунофлюоресценции на тканях лабораторных животных. При СКВ частота встречаемости АЭТА составляет от 30 до 80%, в зависимости от используемого метода и категорий больных. Методология обнаружения АЭТА далека от стандартизации. Основные методы: непрямая иммунофлюоресценция на кратковременных культурах клеток эндотелия пуповины (HUVEC), а также методы ИФА и иммуноблот.

АЭТА были обнаружены при многих первичных васкулитах и васкулопатиях. Сравнительно часто их выявление связывают с болезнью Кавасаки, гранулематозными васкулитами, пурпурой Шенлейна-Геноха и вторичными васкулопатиями, в частности с облитерирующим тромбангиитом (болезнь Бюргера), гемолитической тромбоцитопенической пурпурой, антифосфолипидным синдромом. Наличие АЭТА сравнительно неспецифично для определенной формы васкулита и рассматривается в качестве общего диагностического маркера васкулитов и васкулопатий. Целесообразность детекции АЭТА в клинической практике определяется их выявлением только на фоне выраженной клинической активности заболевания, что позволяет ориентироваться на их содержание для определения фазы заболевания. Они могут играть определенную роль в патогенезе васкулитов в связи с тем, что способны модулировать экспрессию эндотелиальных молекул адгезии и факторов воспаления. АЭТА, обнаруженные в сыворотке крови больных СКВ, способ ны усиливать высвобождение IL-6 из эндотелиоцитов, таким способом участвуя в патогенезе системной воспалительной реакции.

АЭТА имеются у большинства больных с активной формой АНЦА-ассоциированных васкулитов. У детей с пурпурой Шенлейна-Геноха наличие АЭТА класса IgA коррелирует с частотой поражения почек. Показано, что АЭТА служат надежным маркером активности процесса при облитерирующем тромбангиите. При синдроме Бехчета они встречаются у 50% больных, особенно у больных с выраженным кожным васкулитом.

Васкулиты и васкулопатии на фоне системных заболеваний соединительной ткани также сопровождаются высокими титрами АЭТА. У больных СКВ при выявлении высоких титров АЭТА чаще отмечают кожные признаки васкулита и тяжелый синдром Рейно. У большинства больных с волчаночным нефритом и гипокомплементемией имеются высокие титры АЭТА, что, по всей видимости, обусловлено способностью аутоантител непосредственно взаимодействовать с эпителиальными клетками почечного клубочка. Содержание АЭТА снижается при успешной иммуносупрессивной терапии.

Склеродермия обычно сопровождается признаками генерализованной васкулопатии. Предполагают, что одной из причин развития микроангиопатии при склеродермии могут являться АЭТА, отмечающиеся у 40-60% больных. Антиэндотелиальные антитела при диффузных формах склеродермии ассоциированы с высоким риском поражения легких, характеризующимся развитием интерстициального фиброза и легочной гипертензии. У больных с АЭТА часто отмечается выраженная ишемия пальцев и сосудисто-некротические изменения кожи кисти.

Существует определенная связь между антифосфолипидными и антиэндотелиальными антителами. АЭТА часто диагностируют у больных с АФС, невынашиванием беременности и идиопатическим ливедо. Антигены АКА, в частности комплексы фосфолипидов и β₂-ГП-1, способны связываться с поверхностью эндотелиальных клеток, что ведет к повреждению эндотелия. У женщин с повторными выкидышами в анамнезе и предполагаемым АФС также обнаруживают АЭТА. Наличие АЭТА характерно для вторичных ангиопатий: диабетической микроангиопатии, сосудистого отторжения трасплантата.

Таким образом, АЭТА могут служить неспецифическим маркером ангиопатий различного генеза, мониторинг их содержания в сыворотке крови больного с тече нием времени позволяет установить активность патологического процесса.

Впервые в цитоплазме нейтрофилов антитела были обнаружены у больного с быстропрогрессирующим гломерулонефритом. Затем АНЦА были идентифицированы в качестве наиболее специфичного и чувствительного лабораторного маркера гранулематоза Вегенера, что привело к активному изучению этого семейства аутоантител и определению клинического значения их выявления при системных васкулитах. Было обнаружено, что в качестве антигенов АНЦА выступают ферменты азурофильных гранул нейтрофилов. К известным антигенным мишеням АНЦА относят протеиназу-3, миелопероксидазу, лактоферрин, эластазу, белок BPI и катепсин G.

Хотя механизм индукции АНЦА остается неизвестным, доказано, что связывание антинейтрофильных антител с соответствующими мишенями на активирован ных гранулоцитах приводит к преждевременной дегрануляции клеток. Это нарушает трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов из сосудистого русла и ведет к образованию воспалительной гранулемы, составляющей основу морфологической картины гранулематозных васкулитов.

Основным методом определения АНЦА является метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием нейтрофилов донора, фиксированных этанолом, что позволяет дифференцировать основные типы свечения аутоантител. По аналогии с диагностикой АНФ, при флюоресцентной микроскопии для обнаружения АНЦА можно отметить несколько типов свечения цитоплазмы клеток. Каждому из типов свечения соответствуют свои антигенные мишени. Диагностическим титром АНЦА считают обнаружение антител при разведении сыворотки 1:40 и более. Учитывая, что содержание АНЦА коррелирует с активностью заболевания, в методе непрямой иммунофлюоресценции должен быть определен конечный титр. При обострении гранулематозных васкулитов обычно отмечаются титры АНЦА, превышающие 1:320. Одновременно с титром должен быть установлен тип свечения цитоплазмы клетки.

Выделяют два основных типа свечения АНЦА - цитоплазматический и перинуклеарный. Цитоплазматический тип АНЦА (цАНЦА) получил название благодаря флюоресценции гранул, локализующихся в цитоплазме клетки между долями ядра лейкоцита. При выявлении перинуклеарного типа свечения (пАНЦА) свечение как бы очерчивает доли ядра лейкоцита, оставляя неокрашенным ядро клетки. Обнаружение пАНЦА представляет собой последствие фиксации нейтрофилов этанолом, которая ведет к прераспределению гранул в цитоплазме клетки, в результате чего положительно заряженные антигены гранул притягивают отрицательно заряженную ДНК ядра. Похожее свечение обнаруживается в присутствии АНА, прежде всего антител к дсДНК и гистоновых белков. Нейтрофилы обладают большинством антигенов АНА и являются субстратом для обнаружения АНФ. Для того, чтобы отличить АНФ от специфического свечения АНЦА, необходимо параллельно тестировать все сыворотки, положительные по антинейтрофильным антителам в отношении АНФ, что обеспечивает большую специфичность выявления антинейтрофильных аутоантител. Кроме двух основных типов свечения могут быть отмечены атипичные варианты окрашивания клетки, которые обозначают как Х-АНЦА. Обнаружение атипичных вариантов свечения АНЦА используют в диагностике воспалительных заболеваний кишечника. Атипичные варианты АНЦА описаны при язвенном колите (70%), болезни Крона (10%), аутоиммунном гепатите (50%), первичном склерозирующем холангите (40%), первичном билиарном циррозе (5%) и васкулитах при РА (5-10%).

Антигенная специфичность АНЦА может быть установлена не во всех сыворотках, содержащих антинейтрофильные антитела, обнаруженные при помощи непрямой иммунофлюоресценции. В соответствии с рекомендациями Интернационального консенсуса (Savige, 1999), целесообразно определение специфичности АНЦА только после определения аутоантител с помощью непрямой иммунофлюоресценции, что обеспечивает максимальную чувствительность определения антинейтрофильных антител (табл. 17-14).

Таблица 17-14. Антигенная специфичность основных типов антинейтрофильных цитоплазматических антител и приблизительная частота их обнаружения

Антитела к протеиназе 3 (ПР-3) преимущественно обнаруживаются при цАНЦА-типе свечения. ПР-3 представляет собой сериновую протеиназу массой 29 кДа, которая локализуется в азурофильных гранулах нейтрофила наряду с другими сериновыми протеиназами. Редко при выявлении цАНЦА-типа свечения отмечаются антитела к другим ферментам гранул, прежде всего к белку BPI. цАНЦА/анти-ПР-3 антитела являются основной разновидностью антинейтрофильных антител в сыворотке больных гранулематозом Вегенера. При этом заболевании титр цАНЦА связан с его клинической активностью, и успешная иммуносупрессивная терапия гранулематоза приводит к снижению содержания антител ниже порога детекции.

Антитела к миелопероксидазе (МПО) определяются при перинуклеарном типе иммунофлюоресценции. МПО - основной микробицидный фермент азурофильных гранул, генерирующий кислородные радикалы. МПО обладает выраженным положительным зарядом, что обусловливает ее перераспределение к ядру при фиксации нейтрофилов этанолом. Кроме того, при перинуклеарном типе флюоресценции часто отмечают образование АНЦА, направленных против других ферментов нейтрофильных гранул, таких как лактоферрин, эластаза и катепсин G. Антитела к МПО были впервые описаны у больных с идиопатическим быстро прогрессирующим олигоиммунным гломерулонефритом с полулуниями, который представляет собой клиническую разновидность микроскопического полиангиита. В отличие от антител к ПР-3, пАНЦА/анти-МПО не обладают высокой специфичностью для диагностики какого-либо конкретного васкулита и выявляются при всех АНЦА-ассоциированных васкулитах и родственных им заболеваниях. Антитела к MПO встречаются у большинства больных идиопатическим некро тизирующим васкулитом с полулуниями, при микроскопическом полиангиите, а также при герпесвирусах без антител против ПР-3/цАНЦА.

При СКВ, благодаря высокой аффинности ДНК к МПО, циркулирующие в крови рибонуклеиновые кислоты из разрушенных клеток способны связываться с МПO-субстратом в иммуноферментных тестах для определения пАНЦА, что приводит к высокой частоте ложноположительных результатов.

Антинейтрофильные антитела к BPI (bactericidal permeability increasing protein) диагностируют у 60% пациентов с муковисцидозом, при иммунофлюоресценции они обладают цАНЦА-типом свечения. В качестве основного индуктора антител к BPI рассматривают псевдомонадную инфекцию, которая часто сопутствует муковисцидозу.

Антитела к лактоферрину и катепсину G встречаются при васкулитах на фоне РА, СКВ и при васкулитах при хроническом гранулематозном воспалении в случае заболеваний кишечника. Высокая встречаемость антител к лактоферрину наблюдается у больных с аутоиммунными заболеваниями печени, такими как аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз. АНЦА, которые встречаются у 30-40% больных с первичным склерозирующим холангитом, обусловлены присутствием антител к лактоферрину.

Антитела к нейтрофильной эластазе обнаруживают при СКВ, особенно при неврологических проявлениях этого заболевания, а также они имеются у больных РА и у больных с неспецифическим язвенным колитом.

Антитела к базальной мембране клубочка направлены против неколлагенового участка α₃-цепи коллагена IV типа, антиген которого может быть обнаружен в почках, легких, хрусталике, улитке, мозге и яичке. Коллаген IV типа является основным компонентом базальных мембран альвеол и клубочка почки, что обусловливает специфическую клиническую картину синдрома Гудпасчера, сочетающую гломерулонефрит и геморрагический альвеолит. Поражение почек обычно преобладает в клинической картине, что позволяет выделять лимитированную форму синдрома Гудпасчера, сопровождающуюся развитием быстропрогрессирующего гломерулонефрита.

Антитела к базальной мембране непосредственно участвуют в патогенезе поражения почек при этом заболевании, их введение лабораторному животному приводит к развитию экстракапиллярного гломерулонефрита. Их высокие титры могут быть обнаружены в элюатах из почек, а содержание антител в сыворотке коррелирует с клинической активностью заболевания. При иммунофлюоресцентном исследовании биопсий почек при синдроме Гудпасчера аутоантитела могут быть обнаружены в виде линейных отложений иммуноглобулинов на базальной мембране клубочков.

Основным методом определения антител к базальной мембране является ИФА с использованием очищенного антигена. Обнаружение антител является диагностическим для этого заболевания и позволяет дифференцировать от других причин легочных кровотечений и гломерулонефрита. Раннее обследование больных с синдромом Гудпасчера крайне важно для прогноза больных с этим заболеванием, поскольку только назначение специфической терапии позволяет сохранить функцию почек, а зачастую предотвратить гибель больного. Высокие титры антител к базальной мембране могут сохраняться на этапе клинической ремиссии и постепенно снижаются в течение нескольких месяцев. Пересадка почки может быть рекомендована только серонегативным пациентам, так как при сохранении значимых титров антител к базальной мембране сохраняется высокий риск рецидива заболевания в трансплантате.

Антитела к базальной мембране почки могут сочетаться у пациентов с антителами к МПО; клинически - с быстропрогрессирующим гломерулонефритом и системными васкулитами.

Кожа, благодаря ее обильной васкуляризации и мелкому калибру сосудов, поражается иммунокомплексными, лейкоцитокластическими васкулитами, названными васкулитами гиперчувствительности. Морфологическими признаками лейкоцитокластического васкулита являются фибриноидный некроз стенок сосуда с инфильтрацией полиморфноядерными нейтрофилами, которые разрушаются с образованием характерного ядерного дебриса. Разновидность лейкоцитокластических васкулитов - лимфоцитокластический вариант, при котором преобладает лимфоцитарная инфильтрация.

Обычно лейкоцитокластический васкулит развивается на фоне другого аутоиммунного заболевания или представляет собой реакцию гиперчувствительности в отношении экзогенного агента. Все эти состояния характеризуются появлением в сыворотке крови больного ЦИК, оседающих на стенках мелких сосудов. Образование иммунных комплексов - часть нормальных процессов взаимодействия антитела с антигеном. Появление экзогенного антигена в крови и гуморальный иммунный ответ служат основной причиной формирования ЦИК. В то же время иммунные комплексы могут состоять исключительно из иммуноглобулинов, например, при криоглобулинемиях и болезни Шенлейна-Геноха, что обусловлено нарушением синтеза антител при этих заболеваниях.

Связывание экзогенного антигена со специфическими антителами приводит к образованию иммунных комплексов, которые могут захватываться рецепторами к Fc-фрагментам молекул иммуноглобулинов и к комплементу на клетках ретикулоэндотелиальной системы, обеспечивающих клиренс иммунных комплексов. Иммунокомплексный васкулит может быть следствием образования избыточного количества ЦИК, нарушения нормального клиренса ЦИК, а также сниженной растворимости образующихся иммунных комплексов. В результате этого ЦИК откладываются в стенке мелких сосудов, что приводит к активации системы комплемента, синтезу анафилотоксинов и цитокинов и к последующему образованию лейкоцитарного инфильтрата.

Существует много лабораторных тестов, направленных на обнаружение ЦИК (табл. 17-15), но оптимального пока не существует. Это связано с полиморфизмом иммунных комплексов, состав, масса и заряд которых непостоянны. Кроме того, стандартизация ряда биологических тестов затруднена, в связи с чем чаще используют менее информативные физико-химические и биохимические методы. Хотя выявление ЦИК признано полезным дополнительным лабораторным параметром при СКВ и РА, использование конкретных тестов затруднено из-за их плохой воспроизводимости, трудоемкости и низкой специфичности. В нашей стране в подавляющем числе лабораторий применяют метод осаждения ЦИК при помощи полиэтиленгликоля. Это грубый тест, позволяющий установить присутствие в сыворотке комплексов большой молекулярной массы. Наилучшим тестом для обнаружения ЦИК считают реакцию связывания C1q-компонента комплемента.

Таблица 17-15. Методы определения циркулирующих иммунных комплексов

Недостаточная надежность методов определения ЦИК в сыворотке приводит к определенному скепсису использования этих методов. Кроме того, высокое содержание ЦИК может обнаруживаться у клинически здоровых людей.

Альтернативным вариантом определения ЦИК является морфологическое исследование биоптата ткани с помощью прямой иммунофлюоресценции для обнаружения отложений иммуноглобулинов и компонентов комплемента. Если в развитии заболевания подозревается иммунокомплексный процесс, то следует рекомендовать проведение биопсии ткани с прямым иммунофлюоресцентным исследованием.

Определение криоглобулинов стоит особняком среди других методов обнаружения ЦИК, поскольку является надежным методом диагностики криоглобулинемий с развитием иммунокомплесного васкулита.

Криоглобулины представляют собой ЦИК, состоящие исключительно из иммуноглобулинов и способные образовывать нерастворимые конъюгаты при температурах ниже температуры ядра человеческого тела. Их преципитация в мелких сосудах кожи приводит к клинической картине криоглобулинемии, характеризующейся геморрагическим васкулитом на конечностях, слабостью и артралгиями. Реже при криоглобулинемиях наблюдается гломерулонефрит, лимфаденопатия и спленомегалия, периферическая нейропатия и синдром Рейно. Наиболее часто этот вид патологии встречается у 40-50-летних людей, причем женщины болеют в 3 раза чаще мужчин.

Определение криоглобулинов следует проводить в сыворотке, а не в плазме крови, чтобы избежать возможной ошибки при обнаружении криофибриногена, особого типа фибриногена, коагулирующего при низких температурах. Кровь должна быть получена от больного непосредственно в лаборатории для того, чтобы не допустить ее охлаждения; образование кровяного сгустка и центрифугирование осуществляют при температуре 37 °С. Для обнаружения выпавшего криопреципитата в сыворотке крови требуется более 48 ч. Преципитация криоглобулинов 3 типа может занять до 5 дней. Поскольку даже нормальная сыворотка способна за такое время образовывать нерастворимые преципитаты, то после обнаружения криопреципитата необходимо достичь его растворения путем повторного нагревания до 37 °С. Результат преципитации криоглобулинов не всегда очевиден. Агрегация криоглобулинов может происходить с образованием кристаллов белка, хлопьев, геля. Для унификации содержания криоглобулинов после образования осадка, преципитат необходимо отцентрифугировать в стандартных условиях, что позволяет полуколичественно оценить объем криоглобулинов в виде криокрита. Оценка криокрита может быть использована при контроле эффективности терапии криоглобулинемии.

Выделяют 3 типа криоглобулинемий. Криоглобулины первого типа характеризуются присутствием в плазме моноклонального иммуноглобулина, обычно IgM или IgG. Основными причинами его возникновения являются лимфопролиферативные заболевания, прежде всего миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, хронический лимфоцитарный лейкоз и различные формы лимфом. Криоглобулины имеются у 40% больных с миеломой, однако только у половины больных с криоглобулинемией первого типа отмечают клинические проявления, связанные прежде всего с увеличением вязкости крови, такие как головные боли, нарушения зрения, геморрагии сосудов сетчатки и синдром Рейно.

При втором типе описывают криоглобулины смешанного состава, включающие моноклональный компонент, обычно РФ класса IgM, и поликлональный IgG. Этот тип криоглобулинемий часто встречается изолированно, представляя собой эссенциальную (смешанную) криоглобулинемию. Реже смешанная криоглобулинемия является вторичной находкой у больных с вирусными инфекциями, заболеваниями соединительной ткани, лимфопролиферативными процессами и скрытыми инфекциями. Основным инфекционным агентом, приводящим к развитию смешанной криоглобулинемии, является гепатит С. Среди больных вирусным гепатитом С с экстрапеченочными проявлениями значимые титры криоглобулинов обнаруживаются у 42% больных, у подавляющего большинства из них в сыворотке отмечают ся диагностические титры РФ. Криоглобулины диагностировали преимущественно у больных с цирротической стадией вирусного гепатита. У 50% обследуемых с криоглобулинемией отмечали клинические признаки геморрагического васкулита, у 10% больных - мочевой синдром. Таким образом, смешанная криоглобулинемия характеризуется тяжелыми клиническими проявлениями, напоминающими системный васкулит с триадой, сочетающей разнообразные поражения кожи - от пурпуры до геморрагического некроза кожи, боли в суставах и гломерулонефрит, встречающийся у 50% больных с криокритом, превышающим 3%.

Криоглобулинемия третьего типа является наиболее часто встречающейся разновидностью данной патологии и представлена смешанными иммунными комплексами поликлональных криоглобулинов, в составе которых обычно отмечается поликлональный РФ класса IgM. Третий тип встречается у больных с ДБСТ, в частности с СКВ, РА, СШ, аутоиммунными заболеваниями ЖКТ, постстрептококковым гломерулонефритом, подострым бактериальным эндокардитом, цитомегаловирусными инфекциями, инфекционным мононуклеозом. Особенно часто ее обнаруживают у больных с хроническими вирусными гепатитами. Картина васкулита, сопровождающаяся обнаружением криоглобулинов третьего типа, может стать первым симптомом этого заболевания.

Прямая иммунофлюоресценция позволяет обнаруживать отложения иммунных комплексов в ткани органов-мишеней. В диагностических целях наиболее часто используют биопсию почек и/или биопсию кожи. Исследование биоптатов ткани имеет четкое диагностическое значение и зачастую оказывается единственным методом подтверждения диагноза при неоднозначной клинической и серологической картине. При прямом иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов кожи при диффузной болезни соединительной ткани (ДБСТ) наблюдают 3 основных типа отложений иммуноглобулинов и комплемента: АНА in vivo, волчаночную полоску и отложения в стенках сосудов дермы. Феномен обнаружения АНА, фиксированных непосредственно в ткани, обозначают как «антинуклеарные антитела in vivo». АНА in vivo обычно представлены иммуноглобулинами класса IgG, окрашивают ядра клеток эпидермиса кожи. Постоянно этот феномен встречается при СКВ и СС.

В основе АНА in vivo лежит способность проникновения аутоантител в живую клетку, что характерно именно для рибонуклеопротеиновых аутоантител. По аналогии с выявлением АНФ может быть исследован тип флюоресценции. Тип флюоресценции дает дополнительные сведения: гранулярный тип свечения отмечается при всех аутоиммунных заболеваниях, нуклеолярный тип свечения отмечается только при склеродермии, а гомогенный тип свечения наблюдают преимуществен но при СКВ. Обнаружение АНА в эпидермисе обычно связано с присутствием антител к рибонуклеопротеинам, но не антител к дсДНК. При СШ характерный тип нуклеарных/цитоплазматических депозитов IgG сопровождается наличием аутоантител к Ro/SS-A и La/SS-B. Несмотря на то, что определение АНА в ткани позволяет заподозрить СКВ, встречаемость этого феномена очень низка и не превышает 10% при исследовании биоптатов кожи.

Другим крайне характерным и постоянным признаком, который может быть обнаружен при иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов кожи, являются крупно-гранулярные отложения иммуноглобулинов и комплемента под базальной мембраной эпидермиса. Обнаружение этого феномена в материале биопсий клинически здоровой кожи больных СКВ носит название «тест волчаночной полоски» (от англ. lupus band test) и отмечается только при СКВ. Благодаря частой встречаемости и высокой специфичности ТВП прямое иммунофлюоресцентное исследование биоптатов кожи при СКВ рекомендуется широко использовать для диагностики этого заболевания.

ТВП представляет собой накопление иммунных комплексов in situ. Апоптоз кератиноцитов при СКВ рассматривают в качестве источников иммуногенного апоптотического материала, вызывающего гуморальный иммунный ответ. Апоптотические тельца, которые образуются при разрушении базальных слоев кератиноцитов, через базальную мембрану эпителия поступают в дерму, где они связываются с аутоантителами, циркулирующими в крови. При окрашивании ткани античеловеческой антисывороткой к иммуноглобулинам и факторам комплемента, меченной флюоресцентной меткой, при микроскопии выявляется яркая прослойка крупных гранул иммунных комплексов.

Набор иммуноглобулинов в составе ТВП варьирует, более часто фиксируют отложения IgM, реже - IgG и IgA. Факторы комплемента, прежде всего С₃ компонент, отмечаются чаще с отложениями IgM. Выраженность результатов ТВП непостоянна и неоднородна на разных участках кожи. Частота выявления положи тельного ТВП выше при биопсии кожи открытых участков тела, подвергающихся действию солнечных лучей, таких как предплечье, плечо и грудь. Рекомендуется биопсировать неизмененную кожу, поскольку воспаление и рубцевание затрудняют описание ТВП.

Положительный ТВП чаще отмечается у больных СКВ, и его чувствительность достигает 98% в диагностике тяжелых системных форм этого заболевания. Выраженность депозитов IgG коррелирует с общей тяжестью заболевания, титром антител к дсДНК и поражением почек. При дискоидной волчанке и формах СКВ с преимущественным поражением кожи частота встречаемости ТВП ниже и составляет 50-60%, что превышает частоту обнаружения АНФ при дискоидной волчанке. Морфологическая достоверность, легкость получения материала и высокая специфичность этого метода делают его очень привлекательным для клинического использования. При диагностике ДКВ ТВП оказался более чувствительным по сравнению с обнаружением АНФ. В 70% случаев основным иммуноглобулином, который составляет ТВП, оказывается IgM, реже выявляют IgG и IgA.

Наличие ТВП в редких случаях следует отличать от специфических отложений IgA при герпетиформном дерматите Дюринга, который представляет собой разновидность буллезных дерматозов и отмечается преимущественно у пациентов с целиакией. При этом заболевании имеют место гранулярные отложения IgA под базальной мембраной эпидермиса, располагающиеся на вершине сосочков дермы.

При исследовании биоптатов кожи при ревматических заболеваниях могут быть обнаружены гранулярные отложения иммуноглобулинов в стенках сосудов, которые могут располагаться как в поверхностных, так и в глубоких сосудах. Отложения иммуноглобулинов и факторов комплемента в сосудах дермы возможны при пурпуре Шенлейна-Геноха, герпетиформном дерматите Дюринга, лейкоцитокластическом и криоглобулинемическом васкулите, СКВ и дерматомиозите.

При дерматомиозите метод прямой иммунофлюоресценции позволяет обнаружить отложения мембраноатакующего комплекса (МАК) комплемента, представленного отложениями терминальных компонентов системы комплемента (С_5b-9) в микроциркуляторном русле кожи. По диагностической значимости МАК в капиллярах кожи под базальной мембраной может сравниться с ТВП при СКВ, обладая специфичностью, достигающей 90% при сопоставимой чувствительности. Сходные отложения МАК при дерматомиозите определяют в сосудах скелетных мышц. Гистологическая картина поражения мышечной ткани при дерматомиозите характеризуется выраженным васкулитом с периваскулярными инфильтратами, состоящими из CD⁴⁺-лимфоцитов. Некроз миоцитов происходит по периферии мышечных волокон и возникает на фоне поражения сосудов. В мышечной ткани отложения МАК характерны для зон с сохраненной гистологической структурой мышечной ткани, в которой протекает активный воспалительный процесс. В районах тотального фиброза мышцы отложения МАК не выявляются. По всей видимости, разрушение капилляров под действием компонентов комплемента приводит к склерозированию и разрушению мышечной ткани. Причиной образования МАК при дерматомиозите в сосудах кожи и мышц могут быть комплемент-связывающие антиэндотелиальные антитела, которые диагностируют у 50% больных дерматомиозитом. Образование МАК и антиэндотелиальных антител с антигенами на поверхности эндотелиоцитов ведет к развитию васкулита в сосудах кожи и мышц.

Помимо АЭТА, в качестве неспецифического маркера васкулитов разной этиологии применяют исследования факторов, продуцируемых поврежденной клеточной стенкой в ответ на иммунное поражение. С этой целью используют мониторирование содержания фактора VIII (фактора Виллебранда), тромбомодулина и фибронектина - сывороточных белков, синтезируемых эндотелиоцитами в ответ на повреждение. Практически у всех больных с активными формами васкулитов отмечают повышенные уровни этих маркеров, что позволяет использовать их с диагностической целью, нарастание их содержания в плазме крови свидетельству ет об активности васкулита.

Содержание фактора Виллебранда отражает непосредственное повреждение эндотелиальных клеток. Однако результаты его определения у больных с васкулитами оказались неопределенными. Показано, что высокие уровни отмечаются при активном заболевании и могут сохраняться в последующем, несмотря на клиническое улучшение. Последующие эксперименты in vitro показали, что фактор высвобождается как поврежденными, так и интенсивно делящимися эндотелиоцитами. Это в какой-то степени объясняет неоднозначные клинические результаты.

Фибронектин представляет собой высокомолекулярный гликопротеин матрикса соединительной ткани, включающийся в состав иммунных комплексов и участвующий в их клиренсе. Его высокое содержание фиксируют при васкулитах, связанных с РА, СКВ, синдроме Кавасаки, васкулите при синдроме Бехчета, оно отражает разрушение сосудистой стенки. Содержание фибронектина плазмы снижено при эссенциальной смешанной криоглобулинемии, что говорит о его свя зывании в составе криоглобулинов.

Тромбомодулин - мембранный гликопротеин эндотелиоцита, и его выделение в кровоток сопутствует повреждению сосудистой стенки. В качестве маркера активности СКВ тромбомодулин превосходит растворимые молекулы адгезии, sIL-2R, сывороточные IL-6, IL-10, антитела к дсДНК, острофазовые белки, СОЭ, комплемент и иммуноглобулины, креатинин и АНА. Его высокое содержание в плазме крови отмечается при пурпуре Шенлейна-Геноха, СЧШ и других АНЦА-ассоциированных васкулитах.

Растворимые формы адгезионных молекул являются также продуктами эндотелиальных клеток. Они выделяются при активации эндотелиальных клеток при воспалении и потенциально могут использоваться в качестве показателей активности васкулитов и близких васкулитам состояний. ICAM-1 - одна из основных межклеточных молекул адгезии, осуществляющих взаимодействие лейкоцитов и эндотелиоцитов. Ее экспрессия на мембране эндотелиоцита индуцируется при воспалении. Кроме того, при активации клетки происходит слущивание этих молекул с мембран клеток, приводящее к образованию растворимой формы sICAM-1. Повышенные уровни sICAM-1 в сыворотке наблюдают при височном васкулите, пурпуре Шенлейна-Геноха, АНЦА-ассоциированных и лейкоцито-кластических васкулитах, активной СКВ, синдроме Бехчета, септическом шоке, злокачественных новообразованиях и инфаркте миокарда. Васкулит, сопровождающий системные заболевания соединительной ткани, также приводит к увеличению содержания sICAM-1. У больных РА диагностируют значительно увеличенное содержание sICAM-1 в сыворотке крови, особенно высокие концентрации sICAM-1 наблюдались у больных с клинической картиной иммунокомплексного васкулита.

Антитела к гладким мышцам (АГМА) реагируют с миофиламентами в цитоплазме гладкомышечных клеток. Существует несколько видов антител к гладким мышцам, в том числе к фибриллярному (F) актину, тубулину и десмину. Среди них только антитела к F-актину являются маркером аутоиммунного гепатита, в то время как антитела к тубулину, десмину и виментину встречаются при ревматических заболеваниях и вирусных инфекциях и самостоятельного клинического значения не имеют.

Актин - глобулярный белок массой 46 кДа, который относят к микрофиламентам. Актин может существовать как в мономерной (М), так и в полимеризованной фибриллярной (F) форме. Связывание аутоантител зависит от конформации эпитопов в составе F-формы, поэтому выделение F-актина в нативном виде затруднено. Это объясняет необходимость использования в НРИФ минимально фиксированных криосрезов и сложность в разработке иммунохимических методов для выявления аутоантител.

Стандартом выявления АГМА служит НРИФ на тройном субстрате, включающем криосрезы желудка, почки и печени крысы. Антитела к актину окрашивают цитоплазму мышечных волокон, включая наружные мышцы желудка, lamina muscularis mucosae, межгландулярные мышечные пучки слизистой оболочки, стенки сосудов в подслизистом слое и почке, мезангиальные клетки клубочков. Характерно, что антитела к актину обычно представлены классом IgG и встречаются в титре, равном или более 1:80. Актиновые филаменты плохо экспрессиро ваны в HЕp-2 клетках, поэтому цитоплазматический тип свечения при наличии антител к актину определяют редко. В отличие от него, филаменты виментина и десмина обычно видны на НЕр-2 клетках и встречаются в титрах 1:20-1:40.

Для подтверждения антигенной специфичности антител к актину могут быть использованы дополнительные субстраты, в том числе культуры фибробластов или фибробластоподобных клеточных линий, обработанных винбластином, который разрушает «неактиновые» филаменты.

Антитела к гладким мышцам с помощью НРИФ были обнаружены у пациентов с хроническим активным гепатитом; у этих больных часто выявляют и другие маркеры системных заболеваний - LE-клетки, АНФ, гипергаммаглобулинемию. Определение АГМА позволило отделить эту форму гепатита от системных ревма тических заболеваний и дать название «аутоиммунный гепатит». На сегодняшний день АГМА, направленные против F-актина, рассматривают в качестве наиболее чувствительного маркера аутоиммунного гепатита I типа, хотя их встречаемость при этом заболевании составляет только 55-70%.

Антитела к микросомам печени/почек (liver-kidney microsomal autoantibodies - LKM) образуются на фоне аутоиммунного гепатита II типа. Эта разновидность аутоантител реагирует с проксимальными канальцами почки и цитоплазмой гепатоцитов. В зависимости от антигенной мишени и связи с заболеванием LKM разделяют на 3 типа, хотя в подавляющем большинстве случаев необходимым и достаточным является определение основных аутоантител 1 типа. Антигенной мишенью LKM-1 служит микросомальный цитохром системы р450 2D6. Антитела 2 и 3 типов крайне редко встречаются при лекарственно-индуцированных и вирус ных гепатитах и самостоятельного клинического значения не имеют. Их антигенными мишенями также являются цитохромы и микросомальные ферменты.

Рекомендуемый метод обнаружения LKM-1 - НРИФ на тройном субстрате, включающем криосрезы почки, печени и желудка крысы. На тканевом субстрате крысы LKM-1 антитела связываются с проксимальными канальцами почки и клетками печени, однако, в отличие от митохондриальных антител, не реагируют с эпителиальными клетками слизистой оболочки желудка и не окрашивают дистальные канальцы почки. Кроме того, при сравнении с антителами к митохондриям LKM-1 более выраженно связываются с тканью печени. Существуют методы определения LKM-аутоантител с помощью ИФА и иммуноблоттинга.

Антитела к LKM-1 - основной серологический маркер аутоиммунного гепатита II типа, которым болеют преимущественно дети старше 1 года и подростки. АИГ-2, в отличие от АИГ I, чаще отмечается у девочек, заболевание протекает более активно, чаще ведет к циррозу и нередко сопровождается другими аутоиммунными заболеваниями, в том числе диабетом, витилиго и аутоиммунными тиреопатиями. Нередко фиксируют фульминантное начало, течение с периодами обострения и затухания, в течение 2 лет развивается цирроз. В анализах крови характерно умеренное повышение трансаминаз, снижение IgA сыворотки.

По сравнению с другими аутоантителами, которые используют для диагностики аутоиммунных заболеваний печени, антитела к LKM-1 встречаются сравнительно редко. Крайне редко антитела к LKM встречаются при вирусном гепатите С (1-4%) и гепатите D. Совместно с антителами к LKM-1 при аутоиммунном гепатите II типа обнаруживают антитела к цитозольному антигену печени (LC-1). Эти антитела направлены к одному из белков цитоплазмы гепатоцита массой 230 кДа. Для их определения может использоваться НРИФ на тройном субстрате тканей крысы, однако антитела против LC-1 очень сложно обнаружить на фоне высоких титров анти-LKM-1 антител. Для диагностики этой разновидности аутоантител в практической работе целесообразно использовать метод ИФА и иммуноблоттинг.

Для диагностики АИГ используют еще один редко встречающийся, но очень специфичный серологический маркер, который представляет собой антитела к растворимому печеночному антигену (soluble liver antigen - SLA). Аутоантитела к SLA отмечаются в 10-20% всех случаев АИГ, при их наличии АИГ хуже поддается иммуносупрессивному лечению.

Аутоантитела к митохондриям - семейство антимитохондриальных антител, направленных против ферментов окислительного фосфорилирования внутренней мембраны митохондрий, впервые описаны при первичном билиарном циррозе (ПБЦ). Основным антигеном является E₂-cубъединица 2-оксодегидрогеназного комплекса, который участвует в цикле трикарбоновых кислот и синтезе жирных кислот. Большинство митохондриальных аутоантигенов расположено на внутренней митохондриальной мембране эукариотических и прокариотических клеток. В процессе эволюции ферменты окислительного каскада не изменялись, что позволяет использовать антигены крысы и скота в тестах для определения антимитохондриальных антител (АМА). Субъединица Е₂ - общая для нескольких гликолитических ферментов (PDC, BCOADC, OGDC), в ее аминокислотной после довательности выделено 3 линейных иммунодоминантных эпитопа АМА, характерных для ПБЦ. Пируват-декарбоксилазный комплекс осуществляет расщепление липидов и подвержен действию многих гепатотоксичных веществ. Его антигенная модификация играет ведущую роль в развитии аутоиммунного ответа при ПБЦ. В то же время роль АМА в патогенезе заболевания не установлена, так как иммунизация антигеном лабораторных животных не приводит к развитию ПБЦ.

Основным методом определения АМА является НРИФ на тройном субстрате, включающем почку, желудок и печень крысы. При использовании тройного тканевого комплекса митохондриальные антитела окрашивают все богатые митохондриями структуры - клетки канальцев почки и слизистой оболочки желудка, а также цитоплазму гепатоцитов. Обработка мочевиной срезов слизистой оболочки желудка уничтожает антигены митохондрий, что позволяет дифференцировать АМА от антител к обкладочным клеткам желудка, которые также реагируют со слизистой оболочкой.

Цитоплазма Hep-2-клеток богата митохондриями, поэтому уже на этапе выявления АНФ можно заподозрить присутствие АМА. Гранулярный тип свечения АНФ отмечается у 30% больных с ПБЦ и может затруднять обнаружение цитоплазматического свечения. Для определения антигенной специфичности АМА используют ИФА и иммуноблот.

Исторически выделяют 9 разновидностей аутоантител к антигенам митохондрий, причем каждая разновидность обладает особенностями связывания с гистологическими структурами на тройном тканевом субстрате (табл. 17-16). Антигены митохондриальных антител разнообразны по природе. Так, АМА-М₁ представляют собой АФА, которые реагируют с внутренней мембраной митохондрий, богатой кардиолипином.

Таблица 17-16. Антитела к митохондриям

Для первичного билиарного цирроза наиболее характерны антитела к М₂, М₄, М₈ и М₉. Среди них АМА-М₂ отмечаются у большинства больных билиарным циррозом, поэтому обнаружение других антител представляет только научный интерес. АМА-М₂ обычно определяется в высоких титрах. Высокая диагностическая специфичность АМА обеспечивается их редким обнаружением при других аутоиммунных заболеваниях, причем при ревматических процессах титры АМА не превышают 1:80. АМА-М₇ встречаются при миокардитах.

Существует ряд минорных серологических маркеров ПБЦ, которые относят к семейству АНА, в том числе sp100 и PML, а также gp210. Антитела к sp100 и PML являются антигенами АНФ со свечением точек в ядре, которые часто отмечаются при ПБЦ. Антитела к gp210 реагируют с порами ядерной мембраны, в методе НРИФ на НЕр-2 клетках обусловливают периферический тип свечения ядра. Эти аутоантитела имеются у 10-30% больных ПБЦ.

Аутоиммунный гастрит (тип А) относится к частым аутоиммунным заболеваниям ЖКТ. В 30% случаев он сопутствует аутоиммунным процессам в щитовидной железе, алопеции и витилиго, хотя может встречаться самостоятельно. Аутоиммунный гастрит протекает субклинически и редко является поводом для обращения пациентов к врачу. В его основе лежит аутоиммунная реакция, направленная против обкладочных (париетальных) клеток желудка. Обкладочных клеток больше в теле желудка, поэтому обычно аутоиммунный гастрит характеризуется атрофией фундальных отделов по сравнению с антральным гастритом при хеликобактерной инфекции. Антитела к обкладочным клеткам желудка (АПКЖ) отмечаются у 90% больных с атрофическим гастритом и пернициозной анемией.

Обкладочные клетки желудка вырабатывают соляную кислоту и внутренний фактор Кастла, необходимый для всасывания витамина В₁₂ в кишечнике. Аутоантитела являются комплемент-фиксирующими и непосредственно участвуют в разрушении популяции обкладочных клеток и развитии атрофического гастрита. Уничтожение популяции обкладочных клеток ведет к гипоацидному гастриту, мальабсорбции, железодефицитной и пернициозной анемиям. Не отмечается взаимосвязи между обнаружением аутоантител к париетальным клеткам желудка и антральным гастритом. Титры аутоантител не коррелируют с тяжестью атрофии слизистой оболочки желудка, поэтому их мониторинг нецелесообразен.

Для выявления АПКЖ используют метод НРИФ на криосрезах фундальной части желудка крысы или мыши. Антитела реагируют только с обкладочными клетками желудка и проявляются характерным цитоплазматическим окрашиванием, которое соответствует расположению внутриклеточных канальцев. Основной антиген АПКЖ - β-субъединица Н⁺, К⁺-АТФазы, которая участвует в закислении содержимого желудка. Рекомендуется использовать начальный титр сыворотки 1:40. Слизистая оболочка желудка богата митохондриями, поэтому она окрашивается антимитохондриальными антителами. Для дифференцировки АПКЖ и АМА целесообразно параллельно использовать в качестве субстрата почку крысы, с которой связываются только АМА. Существует метод с использованием 2М рас твора мочевины, которая, разрушая антигены АМА, позволяет дифференцировать их от АПКЖ на слизистой оболочке желудка крысы.

Внутренний фактор (фактор Кастла) представляет собой гликопротеин массой 72 кДа, который секретируется в просвет желудка и служит для связывания и транспорта в стенку кишки витамина В₁₂. Аутоантитела к внутреннему фактору способны вызывать нарушение его функции за счет блокады его связывания с витамином, таким образом препятствуя адсорбции комплекса в тонком кишечнике. Антитела к внутреннему фактору являются более специфичными по сравнению с АПКЖ при диагностике пернициозной анемии и дефицита витамина В₁₂. Основным методом определения антител к внутреннему фактору является ИФА.

Антитела к эндомизию (АЭА) используются при диагностике целиакии; это основной метод серологической диагностики целиакии, более надежный, чем определение антител к глиадину. Основным антигеном АЭА служит тканевая трансглутаминаза (ТкТГ), которая представляет собой кальций-связывающий фермент. Основной функцией ТкТГ является образование перекрестных связей между белками за счет реакции между глутамином в одном белке и лизином - в другом. Существует 8 изоформ этого фермента, которые различаются по тканевой локализации. В желудке преимущественно экспрессируется 2 тип ТкТГ. Мишенью антител при герпетиформном дерматите, который тесно связан с целиакией, является 3 тип ТкТГ, который экспрессируется в коже. В норме активность этого фермента максимальна в клетках базального слоя кишечного эпителия, а также в под слизистом слое. У больных целиакией отмечается повышенная экспрессия ТкТГ во всех слоях слизистой оболочки кишечника. α-Глиадин на 60% состоит из аминокислоты глутамина, который подвергается дезаминированию под действием ТкТГ. Дезаминирование глиадина приводит к образованию неоэпитопов, содержащих отрицательно заряженную аминокислоту глутамат и имеющих высокое сродство к HLA-DQ₂ и DQ₈, носительство которых предрасполагает к развитию целиакии. Тем не менее генотип HLA-DQ₂ присутствует у 25-30% европейцев, однако далеко не у всех развивается целиакия.

ТкТГ дезаминирует ряд белков соединительной ткани в составе эндомизиальных и ретикулиновых волокон. Таким образом, иммунный ответ на экзогенный антиген ведет к образованию антител к α-глиадину, а также аутоантител против аутоантигенов эндомизия, ретикулина и ТкТГ.

АЭА могут быть определены с помощью НРИФ на множестве антигенсодержащих субстратов. Могут использоваться криосрезы пищевода, печени, желудка, стенки мочевого пузыря обезьяны, крысиные почки и тонкая кишка. Еще одним субстратом для обнаружения АЭА являются криосрезы человеческой пуповины. Стандартным субстратом для НРИФ считают криостатные срезы пищевода обезьяны. Обычно используют разведение сыворотки 1:5 и антисыворотку класса IgA. Сыворотки с высокими титрами АЭА дают типичное окрашивание, которое напоминает пчелиные соты. Первоначально в ИФА-системах для определения антител к ТкТГ использовали антигены животных. Однако низкий уровень очистки белка, а также наличие видоспецифичных эпитопов снижали специфичность теста. Второе поколение ИФА было основано на рекомбинантной ТкТГ человека. За счет высоких аналитических параметров эти ИФА-тесты в значительной степени вытеснили метод НРИФ для диагностики АЭА. Высокая чувствительность ИФА тест-систем улучшает диагностику целиакии, однако тест-системы многих производителей имеют низкую специфичность, особенно при дифференциальной диагностике целиакии и других заболеваний ЖКТ. Изучение антигенной структуры молекулы ТкТГ показало, что основной эпитоп антител при целиакии является конформационным и образован ядром молекулы фермента. Аутоантитела к ТкТГ, характерные для целиакии, подавляют активность фермента. В то же время антитела к ТкТГ, встречающиеся у больных с аутоиммунным гепатитом, циррозом, вирусными инфекциями, направлены к внешним доменам молекулы ТкТГ. Этим может объясняться меньшая специфичность антител к ТкТГ по сравнению с определением АЭА.

Для лабораторной диагностики целиакии применяют определение антител к ТкТГ классов IgA и IgG. Наиболее специфичен тест для выявления антител к ТкТГ класса IgA, которые имеются у 95% больных с дебютом целиакии. Аутоантитела класса IgA могут быть обнаружены в крови, а также в других биологических жидкостях, в том числе в слюне и желчи. Определение аутоантител класса IgG менее специфично, так как они встречаются при других воспалительных заболеваниях ЖКТ, однако они могут быть использованы для диагностики целиакии у лиц с селективных дефицитом IgA.

Антитела к глиадину были основным методом иммунологической диагностики целиакии. Строго говоря, глиадин не является аутоантигеном, однако иммунная реакция против глиадина запускает каскад иммунных реакций, в результате кото рых образуются аутоантитела, и развивается аутоиммунное заболевание.

Глиадин представляет собой алкогольрастворимую фракцию глютена, кото рый, в свою очередь, является компонентом глютенопектина злаковых. Глютен обеспечивает эластичность мучного теста и, благодаря этому свойству, широко используется для приготовления многих пищевых продуктов. В состав глютена злаковых входит более 50 различных глиадиновых белков, которые подразделя ются на α, β, γ и со фракции. В связи с высоким содержанием пролина глиадины сравнительно устойчивы к энзиматическому разрушению в ЖКТ. Изучение молекулярной структуры белков в составе глютена привело к идентификации общей для них линейной иммунодоминантной аминокислотной последовательности QPEQPFP. Последний остаток глутамина в этой структуре служит мишенью для фермента тканевой трансглутаминазы, под действием которой он превращается в глутамат. Изменение заряда молекулы приводит к лучшему связыванию ее с HLA-DQ_2/8 и стимуляции иммунного ответа.

Для определения антител к глиадину используют метод ИФА. Антиген получа ется из алкогольрастворимой фракции глютена зерновых культур. В состав этой фракции входит множество различных белков и последовательностей глиадина. Значительные вариации в белковом составе, а также разнообразие антигенов объясняют отличия тест-систем различных производителей и низкую специфичность этих тестов. Это ведет к тому, что антитела к глиадину значительно уступают по клинико-лабораторной информативности АЭА и антителам к тканевой транс-глутаминазе. Для диагностики целиакии применяют определение антител к глиадину классов IgA и IgG. Антиглиадиновые антитела класса IgG чувствительны, но очень неспецифичны, и их можно рассматривать как показатель, отражающий воспаление в ЖКТ. Антитела класса IgA имеются у 30-40% больных с целиакией. Концентрация антител к α-глиадину прогрессивно снижается после назначения и соблюдения безглютеновой диеты.

Сравнительно недавно появились коммерческие тест-системы, основанные на «модельном» антигене, содержащем многократно повторенные линейные иммунодоминантные последовательности глиадина. Предполагается, что такой подход значительно повысит диагностическую специфичность антител к глиадину и улучшит стандартизацию определения этого показателя.

В основе патогенеза болезни Крона лежит утрата толерантности к антигенам пищи, в результате чего развивается иммунный ответ на антигены пищи и антигены содержимого кишки. Для диагностики болезни Крона используют определение антител к пекарским дрожжам Saccharomyces cerevisiae (ASCA), которые являются естественным антигеном. Помимо антител к антигенам пекарских дрожжей, при болезни Крона образуются антитела к мембранному белку OmpC кишечной палочки и Pseudomonas fluorescens. При болезни Крона обнаруживают антитела к полисахаридным последовательностям, входящим в состав клеточной стенки многих организмов. Полисахаридные антитела называют ALCA, AMCA и ACCA. Их объединяют термином «антигликановые антитела». Встречаемость каждого из этих маркеров не превышает 20%, поэтому их использование в диагностике болезни Крона малоэффективно.

Основными иммуногенными эпитопами ASCA являются также компоненты полисахаридов, в том числе маннотетроза и маннотриоза. Наличие ASCA может объясняться перекрестной реакцией с распространенным дрожжевым грибком C. albicans. Характерно, что C. albicans чаще высевают у больных воспалительными заболеваниями кишечника и членов их семей. Основным методом определения ASCA служит НРИФ на клетках дрожжей, хотя также могут быть использованы тест-системы, основанные на методе ИФА.

Независимо от географического района и расовой принадлежности, обследуемых антитела к дрожжевым грибкам выявляют при болезни Крона с одинаковой частотой, составляющей около 50% (40-70%). Характерно, что антитела к ASCA чаще встречаются у родственников больных воспалительными заболеваниями кишечника (20-25%), по сравнению с частотой показателя в здоровой популяции (0-5%), и больных с неспецифическим язвенным колитом (НЯК) (10-15%). Антитела могут быть представлены IgG или IgA, обладая общей специфичностью 93%. При болезни Крона у пациентов с ASCA заболевание протекает тяжелее, что связано с частыми эпизодами кишечной непроходимости, а также лучше отвечает на терапию блокаторами TNF-α.

Антитела к бокаловидным клеткам (АБК) являются серологическим маркером НЯК. Бокаловидные клетки кишечника производят муцин, который состоит из осевого белка, покрытого полисахаридами. Его функция заключается в увлажнении слизистой оболочки и обеспечении водно-солевого баланса. Муцин - основной антиген АБК, причем иммунодоминантные эпитопы обнаружены как в полисахаридных остатках, так и в осевом белке муцина.

Антитела могут играть определенную роль в патогенезе НЯК, так как распространение воспалительного поражения кишечника при НЯК отражает анатомическое распределение бокаловидных клеток в кишечнике. Их число минимально в двенадцатиперстной кишке и увеличивается по направлению к прямой кишке, где их число максимально. НЯК поражает прямую кишку и распространяется вверх при увеличении активности заболевания. В норме бокаловидные клетки преобладают в криптах кишечника, а именно - в абсцессах крипт, очень характерных для этого заболевания. В то же время АБК отмечаются не у всех больных НЯК, поэтому их рассматривают как вторичный феномен.

Стандартным методом диагностики АБК считают НРИФ на тонком кишечнике приматов или новорожденных обезьян. Применение тонкого кишечника крысы более чувствительно, однако приводит к увеличению числа ложноположительных результатов. Характерное окрашивание проявляется дымчатыми «облачками» на фоне слизистой оболочки кишечника. В качестве антигена может использоваться перевиваемая клеточная линия муцин-продуцирующих бокаловидных клеток HT29-18-N.

Встречаемость АБК при НЯК составляет 30-60% в зависимости от типа субстрата. При использовании совместно с АНЦА диагностическая чувствительность достигает 60-70%.

Тиреоидная пероксидаза (ТПО) - основной фермент гормоногенеза щитовидной железы, изначально описана под названием «микросомальный антиген». До сих пор существует название «антитела к микросомальной фракции щитовидной железы», которое интерпретируется как антитела к слабо очищенной ТПО, хотя микросомальная фракция содержит также белки митохондрий и ряд цитоплазматических разновидностей АНА. В современных тест-системах используют высокоочищенный белок или рекомбинантную ТПО.

Пероксидаза находится на апикальной поверхности тиреоидных фолликулярных клеток. Она представляет собой основную антигенную мишень при тиреоидите Хашимото, против которой направлено большинство клеточных ответов при этом заболевании.

До развития клинической картины заболевания в щитовидной железе можно обнаружить выраженную клеточную инфильтрацию. Мононуклеарные инфильтраты содержат большое количество В-клеток, Т-клеток и макрофагов. Формирование инфильтратов сопровождается постепенной деструкцией этих фолликулов и «попытками» железы регенерировать, что приводит к ее диффузному или узловому увеличению и появлению зоба. Показана связь между антителами к ТПО и клиническими особенностями заболевания: антитела чаще обнаруживают у субъектов с узлами по сравнению с пациентами без узлов щитовидной железы.

Характерно, что аутоантитела к ТПО продуцируются главным образом лимфоцитарными инфильтратами щитовидной железы и только в малой степени - клетками регионарных лимфатических узлов и костного мозга. Именно поэтому аутоантитела к ТПО коррелируют с гистологической тяжестью тиреоидита и увеличенными размерами железы на ранних стадиях заболевания. У больных с высокой активностью аутоантител отмечается склонность к гипотиреозу. Титр аутоантител к ТПО соотносится с продукцией в воспалительном инфильтрате классических провоспалительных цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, которые могут быть связаны с повреждением щитовидной железы. Большинство антител к ТПО относится к IgG₁-субклассу, который считают хорошим активатором комплемента; продемонстрирована комплементопосредованная цитотоксичность на изолированных тиреоидных клетках. Найдены отложения компонентов комплемента в щитовидной железе больных, обусловленные его активацией под действием антител к ТПО.

В подавляющем числе лабораторий для определения аутоантител к ТПО используют ИФА и иммунохимические методы. Основным показанием к обследованию считают диагностику аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. По сравнению с антителами к тиреоглобулину антитела к ТПО более чувствительны и специфичны, поэтому существует мнение, что дополнительное выявление антител к тиреоглобулину только увеличивает цену обследования, не добавляя диагностической информативности. Антитела присутствуют у 75-90% пациентов с тиреоидитом Хашимото, у 60% пациентов с послеродовым тиреоидитом и примерно у 75% пациентов с болезнью Грейвса. Поскольку ТПО-антитела обнаруживают при всех формах аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, то они не могут быть использованы для дифференциальной диагностики аутоиммунного тиреоидита и болезни Грейвса.

Другим показанием к определению этих антител является исключение аутоиммунного гипотиреоза во время беременности. Примерно 2% беременностей протекает при пониженной тиреоидной функции. Беременность может «предъявлять» повышенные требования к тироксину, поэтому субклинический гипотиреоз обычно проявляется на ее фоне. Повышение уровня тиреостимулирующего гормона или понижение свободного Т₄ во время I триместра беременности может сочетаться с нарушением нейропсихологического развития плода. Присутствие антител к ТПО во время беременности указывает на увеличение риска развития клинически значимого гипотиреоза и может рассматриваться как показание к выполнению повторных измерений тиреостимулирующего гормона. Наличие аутоантител к ТПО также увеличивает риск послеродовой тиреоидной дисфункции. Послеродовой гипотиреоз наблюдается примерно у 5% рожениц и характеризуется наличием аутоантител к ТПО. Это нарушение обычно наблюдают в первые месяцы после родов, часто оно начинается с тиреотоксической фазы, сменяемой пролонгированным гипотиреозом. Он может персистировать в течение многих месяцев и примерно в 30% случаев может стать перманентным. Женщины с антителами к ТПО во время беременности имеют 50% вероятность развития послеродовой тиреоидной дисфункции в сравнении только с 2% вероятностью у женщин с негативными результатами исследования. Если антитела к ТПО выявляют в III триместре беременности, то риск послеродовой тиреоидной дисфункции увеличивается и достигает 80%.

Достаточно противоречиво определение аутоантител для оценки субклинического тиреоидита и гипотиреоза. Так же, как другие часто встречающиеся аутоантитела, например АНФ или РФ, антитела к ТПО часто обнаруживают у клинически здоровых лиц, преимущественно у женщин среднего и пожилого возраста. Частота таких находок варьирует в зависимости от возраста, географического и демографического состава популяции. Ряд исследователей указывают на встречаемость аутоантител у 20% женского населения. Этот феномен предлагается использовать для выявления лиц с предрасположенностью к тиреоидиту и гипотиреозу. Наличие антител к ТПО у клинически здоровых лиц может быть использовано как показание для обследования с целью диагностирования субклинического гипотиреоза, характеризуемого повышенным уровнем тиреостимулирующего гормона при нормальной концентрации свободного Т₄. Имеются результаты популяционных исследований, указывающих на то, что ежегодный риск развития гипотиреоза у здоровых субъектов значительно увеличивается в присутствии аутоантител к ТПО. Эти индивидуумы могут иметь повышенный риск развития явного гипотиреоза и/или кардиоваскулярных болезней. В связи с этим нужно проводить регулярное исследо вание функции щитовидной железы у лиц с высоким содержанием антител к ТПО.

Методов первичной профилактики тиреоидита не существует, а целесообразность регулярных гормональных обследований у лиц без клинических признаков гипотиреоза представляется сомнительной с финансовой точки зрения, учитывая естественную динамику функции щитовидной железы с течением времени.

Антитела к ТПО часто находят у больных другими аутоиммунными заболеваниями, такими как СКВ, РА, сахарный диабет I типа и болезнь Аддисона. Гипофункция щитовидной железы присутствует примерно у 15% больных, получающих кордарон, и наличие антител к ТПО увеличивает риск развития гипотиреоза. Кроме того, наличие антител к ТПО является фактором риска развития гипотиреоза на фоне терапии литием.

Исследования аутоиммунной реакции против тиреоглобулина (ТГ) в значительной степени определили понимание патогенеза всех аутоиммунных эндокринных заболеваний. Доказано, что иммунизация кроликов, морских свинок или собак очищенным ТГ того же вида или даже того же животного способна вызывать лимфоцитарный тиреоидит и образование аутоантител к ТГ. Аутоантитела к тиреоглобулину были найдены у больных с болезнью Грейвса, тиреоидитом Хашимото, раком щитовидной железы, некоторыми другими аутоиммуными заболеваниями, а также они были обнаружены у значительного числа здоровых людей.

ТГ - главный компонент коллоида фолликул щитовидной железы. Он играет основную роль в фиксации железой атомарного йода и синтезе йодированных тиреоидных гормонов тироксина (Т₄) и трийодтиронина (Т₃). В норме йодируется не более 25% тирозиновых остатков в составе тиреоглобулина.

Доказано, что йод пищи играет роль в модулировании аутоиммунного тиреоидита, что базируется на клинических и эпидемиологических доказательствах и экспериментальных исследованиях на животных, склонных к тиреоидиту. Содержание йода в тиреоглобулине зависит от его поступления с пищей. У экспериментальных животных повышенное содержание йода в диете увеличивает тяжесть тиреоидита. Роль йода в качестве одного из факторов развития аутоиммунного процесса связана с его способностью менять конформационную структуру белка. Высокойодированный ТГ представляется более антигенным, чем тиреоглобулин с меньшим количеством йода.

Аутоантитела к ТГ рассматривают как непатогенные, главным образом, потому, что введение сыворотки больных лабораторным животным не приводит к тиреоидиту. Титр антител к тиреоглобулину обычно не коррелирует со степенью тиреоидной дисфункции. В то же время сыворотка, содержащая антитела к ТГ, может переносить заболевание при специальных условиях. Инъекция иммунной сыворотки в щитовидную железу здоровых кроликов способна переносить аутоиммунный тиреоидит. По всей видимости, разрушение части клеток под действием антителозависимой цитотоксичности способно привести к аутоиммунизации организма собственным ТГ.

Аутоантитела к ТГ представлены иммуноглобулином IgG и распределены среди всех его 4 субклассов. Антитела класса IgG₂ доминируют при тиреоидите Хашимото, в то время как антитела класса IgG₄ в большем объеме представлены при болезни Грейвса, нетоксическом зобе и дифференцированной карциноме щитовидной железы. Исторически антитела к ТГ измеряли многими иммунологическими методами, однако в настоящее время иммунохимические тесты и прежде всего ИФА вытеснили все другие подходы.

Аутоантитела к ТГ чаще всего используют для подтверждения клинического подозрения на тиреоидит Хашимото, их обычно определяют вместе с антителами к ТПО. Антитела к ТГ менее постоянны и ниже титром, чем антитела к ТПО. Поскольку у всех больных тиреоидитом Хашимото в присутствии антител к ТГ отмечаются и антитела к ТПО, последние являются наилучшим тестом для диагностики тиреоидита. Чувствительность метода составляет 95-98%, поэтому негативные результаты имеют высокое отрицательное предсказательное значение и позволяют исключить диагноз тиреоидита.

Антитела к ТГ обладают низкой специфичностью. Они присутствуют в 40-50% случаев болезни Грейвса, 20% случаев нетоксического зоба и при раке щитовидной железы, а также у здоровых индивидуумов, особенно у пожилых женщин, у которых встречаемость аутоантител доходит до 10% случаев. Антитела были найдены при нетиреоидных аутоиммунных болезнях, таких как СШ, миастения, целиакия, сахарный диабет I типа. Косвенно эти данные подтверждают, что тиреоидная аутоиммунность - более распространенное явление, чем тиреоидит Хашимото. Действительно, антитела к ТГ могут позволить оценить риск развития аутоиммунного тиреоидита. Когортное 20-летнее исследование, проведенное в Англии, показало, что наличие тиреоидных антител является ведущим фактором риска при идентификации лиц, которые имеют риск тиреоидита. Риск заболевания тиреоидитом в случае наличия аутоантител составляет около 3-5%. Кроме того, антитела к ТГ полезны для определения риска развития послеродового тиреоидита.

Узкой областью клинического применения исследования на наличие антител к ТГ является постоперационный мониторинг пациентов с дифференцированным раком щитовидной железы. После тиреоидэктомии и абляции радиоактивным йодом больных рецидив заболевания сопровождается увеличением свободного тиреоглобулина в сыворотке. Поскольку тиреоглобулин - тканеспецифичный белок, экспрессируемый исключительно тиреоидными клетками, повышенная концентрация тиреоглобулина после операции указывает на рецидив рака или метастазы. В этом случае антитела к ТГ приводят к заниженным концентрациям свободного тиреоглобулина.

Рецептор тиреотропного гормона (рТТГ) экспрессируется преимущественно на поверхности тиреоидных фолликулярных клеток, но также на лимфоцитах, адипоцитах и фибробластах. Тиреотропный гормон (ТТГ) является регулятором активности щитовидной железы. Сигнал от рТТГ запускает продукцию тиреоидных гормонов и рост тиреоидных фолликулярных клеток. Избыточная активация рТТГ при болезни Грейвса объясняет наличие тиреотоксикоза и зоба при этом заболевании. Молекула рТТГ состоит из двух (А и Б) субъединиц гликопротеина. Эффект связывания аутоантител с рТТГ может быть разнонаправленным. Так, экстрацеллюлярная А-субъединица рецептора распознается тиреоидными стимулирующими антителами, в то время как антитела, распознающие субъединицу Б, локализованную вблизи клеточной поверхности, действуют как функционально блокирующие антитела.

Стимулирующие антитела составляют основу болезни Грейвса - диффузного токсического зоба. Блокирующие антитела связываются с рецептором, но не вызывают его конформационных изменений, требуемых для сигнальной трансдукции. Они препятствуют связыванию ТТГ с рецептором, в результате чего возникает снижение тиреоидной функции. Блокирующие антитела были обнаружены у пациентов с атрофическим тиреоидитом Хашимото и у больных с болезнью Грейвса, протекающей с офтальмопатией. Блокирующая активность аутоантител может отчасти объяснить колебания тиреоидной функции, наблюдаемой у пациентов с болезнью Грейвса, и отсутствие корреляции между титром антител к рецептору тиреотропина и тиреоидной функцией. Блокирующие антитела могут проходить сквозь плаценту и вызвать транзиторный врожденный гипотиреоз. Наконец, установлены нейтральные аутоантитела к рТТГ, которые связываются с рецептором, но блокируют связывание тиреотропина или других рецепторных антител. Нейтральные антитела определяют у пациентов с болезнью Грейвса. Их патогенетическое значение остается неустановленным.

Нет сомнения в том, что антитела к рецептору являются патогенетически значимыми. Действительно, болезнь Грейвса - одно из немногих аутоиммунных заболеваний, при котором имеются прямые доказательства его аутоиммунной природы. Эти доказательства происходят от способности аутоантител переносить болезнь. D. D. Adams, который обнаружил эти антитела, продемонстрировал повышение функции собственной щитовидной железы после инъекции себе плазмы от пациентов с болезнью Грейвса. Опосредованный перенос болезни Грейвса антителами доказан также в перинатальном периоде, когда матери, страдающие болезнью Грейвса, передавали ее новорожденным, у которых транзиторно развивались зоб и тиреотоксикоз.

Для определения аутоантител к рТТГ применяют радиоиммунный, ИФА и иммунохимический методы. Ни один из этих методов не позволяет уточнить присутствие в сыворотке крови стимулирующих или блокирующих антител. Для этой цели был разработан функциональный тест на культурах тиреоцитов животных, или LATS-тест (от англ. long acting thyroid stimulator). В его основе лежит увеличение концентрации цАМФ в тиреоцитах под действием сыворотки больного, добавляемой в культуральную среду. В связи с трудоемкостью и сложностью стандартизации метод LATS используют только в исследовательских лабораториях.

Существует 4 возможных клинических показания для определения антител к рецептору тиреотропина:

Антитела к рТТГ высокоспецифичны, они крайне редко встречаются у здоровых людей. Клиническая чувствительность составляет около 80%, то есть негативный результат определения аутоантител не позволяет исключить заболевание. Низкая чувствительность методов связана с тем, что аутоантитела к рецептору присутствуют в сыворотке в очень малой концентрации, на несколько порядков ниже, чем уровни аутоантител к ТГ и ТПО.

Антитела к островковым клеткам (АОК) были впервые обнаружены у больных сахарным диабетом I типа (СД I) методом НРИФ на криостатных срезах аутопсийной поджелудочной железы человека с 0 группой крови. Этот метод для определения антиостровковых антител (от англ. islet cell antibodies- ICA) имеет хорошую чувствительность и специфичность для СД I, но значительную межлабораторную вариацию. Поэтому был разработан стандарт сыворотки JDF (Juvenile Diabetes Foundation), который стали использовать для стандартизации всех методов выявления АОК.

АОК представляют собой гетерогенную группу антител, реагирующих с различными аутоантигенами в островковых β-клетках. Антигенами АОК является обширная группа мембранно-ассоциированных и цитоплазматических белков островковых клеток, причем ряд антигенов - общие для эндокринной и нервной ткани. В семействе АОК изучено несколько основных антигенов, таких как глутамат-декарбоксилаза (ГДК), эндогенный инсулин, тирозиназа (IA-2), и около 20 минорных антигенов.

Непосредственная роль АОК в разрушении островковых клеток при сахарном диабете остается спорной, однако была подтверждена способность антител фиксировать комплемент на островковых клетках, а также нарушать высвобождение инсулина. В то же время АОК могут быть обнаружены у 0,5-2% контрольной популяции. Терапевтический плазмаферез не оказывает действия на выработку эндогенного инсулина в дебюте диабета. У новорожденных от матерей, больных СД I, в крови которых присутствуют АОК, диабет не развивается.

Определение АОК - наиболее чувствительный серологический тест в диагностике впервые выявленного СД I. Островковые антитела находят в 75-85% случаев СД I во время установления диагноза. Встречаемость значительно снижается с увеличением возраста дебюта заболевания. Примерно 5-10% пациентов с симптоматикой СД II могут иметь АОК на фоне инсулинозависимой формы диабета взрослых, которая является разновидностью аутоиммунного диабета.

АОК могут служить важным предиктором заболевания для родственнников первой степени больных СД I. Среди них 2-5% оказываются положительными по АОК, в то время как в контроле всего 0,4% испытуемых. Риск заболевания брата или сестры максимален в течение 5 лет от момента заболевания пробанда.

Антитела к инсулину у пациентов с СД I, не получавших экзогенный инсулин, долгое время казались случайной находкой. Для диагностики СД I они были впервые использованы у детей с впервые выявленным СД I до начала инсулинотерапии. Антитела к инсулину у больных, уже получающих препараты инсулина, не являются специфичными для СД I, поскольку в этом случае антигенные эпитопы эндогенного и экзогенного инсулина несколько отличаются. Экзогенный человеческий инсулин - плохой иммуноген, однако рекомбинантный инсулин, который вводят в смеси с протамином или цинком, выраженно иммуногенен и быстро вызывает образование антител.

Аутоантитела, определяемые до назначения препаратов инсулина, т.е. к эндогенному инсулину, присутствуют у 20-40% больных с клиническим дебютом СД I. Титр антител обратно пропорционален возрасту и уменьшается по мере разрушения β-клеток. В отличие от других аутоантител к островковым антигенам, значение антител к инсулину максимально в возрасте до 10 лет, после чего аутоантитела обнаруживают крайне редко. Антитела к инсулину присутствуют у большинства детей до 5 лет, но только у 4% при начале СД I после 19-летнего возраста. Высокий титр у малолетних детей связывают с тем обстоятельстом, что у них заболевание протекает более агрессивно, с быстрым развитием зависимости от экзогенного инсулина. При прогнозировании заболевания у близких родственников больных отмечается слабая корреляция между определением антител к инсулину и риском развития СД I, но она увеличивается, если они выявляются в комбинации с другими антителами к островковым антигенам. Антитела к инсулину находят при аутоиммунных полиэндокринопатиях, при других аутоиммунных заболеваниях и при назначении препаратов, содержащих тиоловое кольцо, таких как пеницилламин.

Долгое время основным методом обнаружения антител к инсулину был радиоиммунный метод. Широкое внедрение ИФА привело к разработке соответствующих тест-систем, однако результаты сравнения методов показали, что радиоиммунный метод имеет значительные преимущества, благодаря сохранению нативной конформации белков.

Нейроэндокринный антиген IA-2 (ICA512) стал последним из обнаруженных островковых антигенов, аутоантитела к которому используют в диагностике и про гнозировании сахарного диабета. Распространенный в нейроэндокринной ткани белок IA-2 и его гомолог IA-2β (белок фогрин) принадлежат к энзиматически неактивным представителям семейства тирозинфосфатазы, участвующим в регуляции секреции инсулина. Обе молекулы локализуются в секреторных гранулах нейроэндокринных клеток и регулируют секрецию инсулина. Определение антител к IA-2 используют в прогнозировании развития СД I у родственников больных. Основным методом выявления аутоантител к IA-2 служит иммунопреципитация с ³⁵S-метионин-меченого рекомбинантного человеческого IA-2 или конкурентный радиоиммунный анализ. Метод ИФА малоспецифичен и не рекомендован для клинического применения.

Аутоантитела к глутамат-декарбоксилазе (ГДК) были впервые обнаружены у пациента с редким неврологическим заболеванием и СД I. Это неврологическое заболевание носит название «синдром скованного человека» (англ. stiff-person syndrome). Оно характеризуется прогрессирующей ригидностью нижних конечностей. Болезненные спазмы мышц при этом синдроме вызываются внезапными стимулами, 10% больных страдают эпилепсией. Методом иммунопреципитации антитела к ГДК были обнаружены в сыворотке у больных СД I, а также у экспериментальных животных с диабетом. Антитела к ГДК были найдены при других неврологических заболеваниях, таких как церебральная атаксия, рефрактерная к лекарствам эпилепсия, небный миоклонус и болезнь Баттона. Кроме того, антитела к ГДК обнаружили при тиреоидите Хашимото и диффузном токсическом зобе, целиакии, болезни Аддисона и аутоиммунных полиэндокринопатиях.

Глутамат-декарбоксилаза - фермент, участвующий в синтезе γ-оксибутировой кислоты, которая контролирует высвобождение инсулина из секреторных гранул β-клеток поджелудочной железы. ГДК не является специфичной для β-клеток поджелудочной железы, поскольку присутствует в нервной системе и семенных железах. Фермент присутствует в организме в двух изоформах: растворимая форма - ГДК 67 (67 кДа) - распространена главным образом в нейронах, а нерастворимая - ГДК 65 (65 кДа) - присутствует в β-клетках поджелудочной железы.

ГДК65 - основная мишень аутоантител у пациентов с СД I, латентным аутоим мунным диабетом у взрослых, диабетом беременных и при синдроме скованного человека. Помимо того, что она вызывает развитие гуморального иммунного ответа, ГДК65 является мишенью для Т-клеточных ответов, обнаруживаемых как у заболевших людей, так и на экспериментальных моделях диабета. Деструкция β-клеток при диабете обусловлена активностью цитотоксических Т-клеток, чьи антиген-специфичные рецепторы распознают β-клеточные пептиды, происходящие из ГДК65.В начале заболевания (при ювенильном начале) СД I 70-90% пациентов положительны по антителам к ГДК65. Распространенность антител к ГДК при диабете беременных составляет 0-50% в разных исследованиях. Встречаемость аутоантител в общей популяции составляет 1-2%, при этом у детей без клинических признаков СД встречаемость аутоантител составляет до 4%. Определение антител к ГДК в сыворотке может быть применено для идентификации лиц с риском развития СД I и для дифференциальной диагностики СД I и СД II.

Остается неясным, действительно ли наличие антител к ГДК у пациентов с СД II влияет на клиническое течение заболевания. В некоторых исследованиях не было найдено связи между антителами к ГДК и диабетическими осложнениями, в том числе со стадией или тяжестью ретинопатии. Несколько исследований пациентов с СД I и латентным аутоиммунным диабетом взрослых показали, что антитела к ГДК после начала заболевания сохраняются в крови заболевших в течение 12 лет и более. Снижение титров антител с течением времени отражает прогрессивную потерю функции островковых клеток и снижение аутоиммунной реакции. Низкий уровень аутоантител указывает на большую давность заболевания с меньшей агрессивностью аутоиммунного процесса. Высокая концентрация антител к ГДК65 у пациентов с латентным аутоиммунным диабетом указывает на высокий риск раз вития инсулиновой зависимости. Предсказательное значение антител для диагноза инсулиновой зависимости в пределах 6 лет наблюдения от начала заболевания варьировало от 34% у лиц старше 55 лет до 84% у лиц моложе 34 лет. У родственников первой степени больных СД I частота обнаружения антител к ГДК65 варьи рует от 4 до 13%. В то же время предсказательное значение выявления аутоантител при определении риска развития СД I не очень надежно: у родственников первой степени родства оно варьирует от 20 до 60%. В крайнем варианте за 12-летнее наблюдение за неидентичными близнецами в случае обнаружения антител к ГДК65 риск развития СД I составил 88%.

Идентификация и молекулярное клонирование ГДК65 привели к разработке метода определения антител к ГДК, который был стандартизован под руководством Immunology of Diabetes Society (IDS) и Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Разработан стандарт сыворотки ВОЗ для сравнения результатов в разных лечебных учреждениях. Наилучшие параметры имеет конкурентный радиоиммун ный метод, использующий ³⁵S- или ¹²⁵I-меченую человеческую рекомбинантную ГДК65; появились конкурентные иммунометрические системы для определения антител к ГДК.

Аутоиммунная болезнь надпочечников может развиваться как изолированная форма болезни Аддисона или быть частью аутоиммунного полиэндокринного синдрома. Серологическим маркером поражения надпочечников являются аутоантитела, реагирующие с ферментами стероидогенеза коры надпочечников. Ферменты стероидогенеза относят к микросомальной фракции. Они обеспечивают окисление гормональных предшественников и локализуются в цитоплазме клеток всех трех слоев коры надпочечников. Основным методом определения антител к коре надпочечников является НРИФ на нефиксированных криостатных срезах надпочечников человека и животных. Эти антитела представлены иммуноглобулинами IgG и способны фиксировать комплемент. Мишенью антител к коре надпочечников является 21-гидроксилаза. Инкубация сыворотки пациентов с болезнью Аддисона с очищенной рекомбинантной 21-гидроксилазой человека приводит к потере реактивности аутоантител к коре надпочечников. Разработаны методы радиоиммунопреципитации и иммуноблоттинга, однако их использование ограничено исследовательскими лабораториями, а для клинической диагностики их результаты сопоставимы с результатами НРИФ. Чувствительность серологического исследования при болезни Аддисона в зависимости от длительности заболевания оценивают примерно в 60-80%, а специфичность - в 98-100%. Определение антител к стероидной 21-гидроксилазе у больных с дебютом болезни Аддисона чаще дает положительный результат, чем у больных с длительным течением заболевания. Кроме того, антитела к коре надпочечников и антитела к 21-гидроксилазе выявляют при аутоиммунных полиэндокринопатиях 1 и 2 типа.

При применении НРИФ аутоантитела к коре надпочечников встречаются в 61% наблюдений среди пациентов с аутоиммунной болезнью Аддисона разной длительности заболевания, у 6,7% пациентов с надпочечниковой недостаточностью в результате туберкулеза и у 0,6% здоровых людей.

Особое значение имеет определение аутоантител у пациентов с полиэндокринопатиями для прогнозирования развития надпочечниковой недостаточности. Может быть рекомендовано выявление аутоантител к коре надпочечников у боль ных СД I моложе 10 лет, у родственников первой степени родства лиц, страдающих болезнью Аддисона, и у больных с первичной недостаточностью яичников. Повышенный титр аутоантител к коре надпочечников, наличие хронического кандидоза кожи и слизистых оболочек и/или гипопаратиреоза указывают на высокий риск развития надпочечниковой недостаточности как компонента полиэндокринопатии 1 или 2 типа. У этих пациентов необходимо регулярно обследовать функцию коры надпочечников с интервалами каждые 6-12 мес для того, чтобы предупредить жизнеугрожающие адреналовые кризы и вовремя начать заместительную терапию.

Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам - это иммуноглобулины класса IgG, реагирующие с цитоплазматическими микросомальными антигенами стероидпродуцирующих клеток. Окислительные ферменты, которые участвуют в метаболизме стероидных гормонов, состоят из различных субъединиц цитохрома р450. Всего выделяют 3 фермента, которые являются мишенями аутоантител: р450с21 (21-гидроксилаза), а также р450с17 (17-гидроксилаза) и р450scc (табл. 17-17).

Таблица 17-17. Основные аутоантитела к ферментам стероидогенеза в эндокринных тканях

Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам могут играть определенную роль в патогенезе аутоиммунных эндокринопатий. Так, сыворотки пациентов с аутоиммунной боленью Аддисона, содержащие аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам, способны вызвать комплемент-зависимую цитотоксичность при воздействии на текальные клетки яичников in vitro. Гистологическое исследование яичников пациентов с аутоантителами к стероидпродуцирующим клеткам позволяет обнаружить оофорит с лимфоцитарными инфильтратами.

Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам реагируют с цитоплазмой Лейдиговских клеток яичек, текальных клеток яичников, синцитиотрофобластами плаценты, а также с желтым телом. Все позитивные сыворотки реагируют также с корой надпочечников, которая содержит все разновидности стероидных ферментов.

Антитела к стероидпродуцирующим клеткам находят в 100% случаев у больных с нормальным хромосомным набором и первичной аменореей (гипергонадотропный гипогонадизм) или вторичной аменореей в сочетании с аутоиммунной болезнью Аддисона. Аутоантитела можно изредка обнаружить у лиц с вторичной аменореей без признаков болезни Аддисона. Однако у этих больных обычно выявляют аутоантитела к коре надпочечников, которые указывают на высокий риск развития аутоиммунной болезни Аддисона. Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам у мужчин, направленные к р450scc, применяют для диагностики аутоиммунной тестикулярной недостаточности и задержки полового развития.

Основным подходом к определению аутоантител к стероидпродуцирующим клеткам в практических лабораториях является НРИФ. Методом точной идентификации молекулярной мишени аутоантител служит радиоиммунопреципитация и вестерн-блот. Оба этих метода используют преимущественно в научных лабораториях. Помимо р450c17 и р450scc был описан ряд других аутоантител к антигенам половых желез, но ни одно из них не имеет клинического или диагностического значения.

При отсутствии болезни Аддисона у больных с идиопатической первичной недостаточностью яичников аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам определяются крайне редко. Если они определяются, то это может служить предиктором развития болезни Аддисона в дальнейшем. Кроме того, антитела к р450c17 связаны с типом 1 полиэндокринопатий, протекающих с болезнью Аддисона, гипопаратироидизмом и слизистокожным кандидозом. Антитела к р450c21 присутствуют при 2 типе полиэндокринопатии, клиническая картина которого включает поражение щитовидной железы, надпочечниковую недостаточность и аутоиммунный сахар ный диабет. Антитела к р450scc являются общим маркером задержки полового развития и гипергонадотропного гипогонадизма. Обнаружение аутоантител у лиц в группах риска позволяет использовать аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам для оценки риска развития эндокринопатии. У больных с различными эндокринными заболеваниями, у которых были обнаружены аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам надпочечника, имеется высокий риск развития недостаточности половых желез и болезни Аддисона. У 35-40% женщин при обнаружении аутоантител к р450c17 и р450scc развивается недостаточность функции яичников, что требует определения гормонсинтетической функции половых желез в динамике.

Рассеянный склероз (РС) - наиболее частое аутоиммунное заболевание ЦНС. В основе его патогенеза лежит выраженная активация забарьерной иммунной системы, которая приводит к появлению фокусов инфильтрации в белом веществе головного и спинного мозга с демиелинизацией нервных проводников и глиозом (склерозом). Очаги глиоза могут быть обнаружены магнитнорезонансной томографией. Заболевание имеет разнообразную клиническую симптоматику, типичным признаком которой является быстрая динамика неврологических проявлений, по мере прогрессирования процесса нарастает необратимый неврологический дефицит. Системная воспалительная реакция при РС отсутствует, поэтому для оценки иммунного воспаления необходим анализ цереброспинальной жидкости (СМЖ). Особенностью воспаления при демиелинизирующих заболеваниях является то, что оно протекает за гематоэнцефалическим барьером (интратекально). Интратекальный иммунный ответ сопровождается рядом иммунологических феноменов, в том числе изолированным синтезом иммуноглобулинов, появлением неспецифических серологических реакций против распространенных вирусов, а также синтезом олигоклонального иммуноглобулина.

Анализ СМЖ явлется основой для диагностики аутоиммунных и воспалительных заболеваний ЦНС (табл 17-18). Анализ СМЖ должен быть проведен в срок до 3 ч с момента взятия биоматериала. Для полноценной иммунологической оценки необходимо получение парной пробы СМЖ и периферической крови.

Таблица 17-18. Лабораторные показатели при иммунологическом анализе цереброспинальной жидкости

^* Л/М/Н/П - тип преобладающих клеток в ликворе (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, плазматические клетки).

Первым признаком наличия интратекального воспаления считают умеренное увеличение общего белка СМЖ, обусловленное увеличением местной продукции иммуноглобулинов. Увеличение количества общего белка нередко не превышает верхней границы нормы (>900 мг/л), поэтому требует использования более чувствительных диагностических методов.

Поликлональная и олигоклональная активация синтеза иммуноглобулинов является одной из форм подострого иммунного ответа, однако при большинстве аутоиммунных заболеваний (СКВ, СШ и т.д.) она имеет системный характер. При РС продукция иммуноглобулинов обусловлена неспецифической стимуляцией В-клеток, значительное содержание которых отмечают при цитологической оценке состава СМЖ. Важным признаком, отражающим локальную индукцию гуморального ответа в СМЖ при РС, является одновременное образование IgG-антител к антигенам распространенных вирусов. Для обнаружения этой реакции используют определение антител к антигенам вируса кори, герпеса зостер и вирусу ветряной оспы. Этот феномен получил название «MZV-реакция» (от первых букв английских названий вирусов). Эти агенты могут рассматриваться в качестве этиологической причины РС, однако одновременное появление антител против них при отсутствии вирусов в организме указывает на анамнестическую реакцию иммунной системы при неспецифической активации. Обнаружение MZV-реакции многими исследователями рассматривается в качестве наиболее специфичного лабораторного теста при РС, который положителен у 94% больных. Для оценки MZV-реакции рекомендовано одновременное определение инфекционной серологии в парных пробах СМЖ и сыворотки периферической крови, что позволяет рассчитать индекс активности антител. Положительный результат оценивают как индекс, указывающий на преобладание антивирусных антител в СМЖ по сравнению с сывороткой (>1,5). Сложности интерпретации реакции как положительной могут возникать, если обнаруживаются антитела лишь к одному возбудителю. Несмотря на ценность данного теста, сложности в его выполнении и интерпретации затрудняют его широкое распространение для практической диагностики, он остается вспомогательным методом даже в высокоспециализированных лабораториях.

Более простой и надежный метод оценки неспецифической активации интратекального гуморального ответа - определение относительных параметров секреции иммуноглобулинов СМЖ. Метод изучения интратекальной продукции иммуноглобулинов СМЖ основан на общих иммунологических принципах исследования проницаемости гематотканевых барьеров, определяющих местный иммунитет.

Для оценки состояния гематоэнцефалического барьера применяют измерение альбумина ликвора и сывороточной его концентрации. Коэффициент проницаемости Q_альб. определяют как отношение содержания альбумина в СМЖ к его концентрации в сыворотке крови. Использование расчетного коэффициента обусловлено необходимостью нормализации концентраций альбумина СМЖ в связи со значительной биологической вариацией уровней альбумина сыворотки. Этот коэффициент позволяет оценить проницаемость тканевых барьеров и стандартизировать определение локального синтеза других молекул воспаления, прежде всего иммуноглобулинов. Нормальное значение этого показателя зависит от возраста, составляет менее 5×10^-3 в возрасте 20 лет и увеличивается до 8×10^-3 в 60 лет. Для РС изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера не характерны, и Q_альб. не превышает 10×10^-3. Увеличение показателя Q_альб. отмечают при ряде вос палительных заболеваний, таких как гнойный бактериальный менингит, острый нейроборрелиоз, синдром Гийена-Барре. Умеренное увеличение проницаемости характерно для вирусных менингитов и полинейропатий.

В отличие от альбумина, иммуноглобулины могут синтезироваться как внутри ЦНС, так и вне ее. Для определения интратекального синтеза иммуноглобулинов используют расчет коэффициентов для основных классов иммуноглобулинов (Q_IgG, Q_IgA, Q_IgM) на основе их концентраций в сыворотке крови и СМЖ. На практике достаточным является определение Q_IgG, в то время как определение других индексов самостоятельного значения не имеет. Для оценки локального синтеза IgG применяют номограммы зависимости Q_альб. и Q_IgG, основанные на математиче ской модели проницаемости гематоэнцефалического барьера. Номограмма позволяет отнести результаты определения Q_альб. и Q_IgG к одному из 4 вариантов, которые соответствуют норме, локальному синтезу IgG, нарушению функции барьера и комбинации нарушений. РС обычно сопровождается выраженным увеличением локального синтеза IgG при сохранности функций гематоэнцефалического барьера. Выраженный локальный синтез IgG можно обнаружить у 70% больных с РС. Очевидным преимуществом этого подхода к оценке местного иммунитета ЦНС является его доступность для практических биохимических лабораторий, оснащенных анализаторами с возможностью турбидиметрии и нефелометрии.

По мере хронизации любой специфический иммунный ответ из поликлонального становится олигоклональным, что отражает клональную природу иммунной системы с увеличением аффинности иммуноглобулинов по мере персистенции антигена. Большая концентрация иммуноглобулинов плазмы крови маскирует олигоклональные иммуноглобулины в периферической крови, хотя очевидно, что олигоклональный синтез возникает при всех вариантах хронического или подострого воспаления. В редких случаях олигоклональный IgG можно обнаружить в γ-фракции при электрофорезе белков крови при появлении трех и более моноклональных пиков.

Значительно чаще олигоклональный иммунный ответ обнаруживают при анализе биологических жидкостей с низкой концентрацией иммуноглобулинов. Так, он может быть идентифицирован в слезной жидкости и в слюне больных с СШ, в синовиальной жидкости при реактивных артритах. Сужение спектра иммунного ответа возникает под действием хронической аутоантигенной стимуляции на фоне аутоиммунного воспаления. Антигенная направленность олигоклональных иммуноглобулинов остается плохо изученной.

Метод изоэлектрофокусирования с последующим иммуноблоттингом - золотой стандарт иммунологической диагностики РС, признанный большинством международных экспертов. Хорошие аналитические параметры этого теста делают его наиболее удобным и надежным методом диагностики демиелинизирующих заболеваний. В его основе определения клональности иммуноглобулинов СМЖ методом электрофоретического изофокусирования лежит разделение белков в соответствии с их изоэлектрической точкой в градиенте амфолитов - веществ, которые под действием электрического тока формируют непрерывный градиент рН. Молекулы фокусируются в формируемом градиенте, что позволяет отличить молекулы одной молекулярной массы с небольшой разницей в заряде. Молекулы человеческого IgG обладают зарядом в пределах от 6 до 9 единиц рН, который определяется количеством остатков сиаловых кислот на Fc-домене молекулы. Поскольку молекулы IgG, синтезируемые одним клоном плазмоцитов, идентичны, они накапливаются в одной тонкой полосе. При олигоклональном или моноклональном синтезе количество идентичных молекул настолько велико, что полоску можно различить на поликлональном фоне. Для детекции фокусированного IgG применяют метод иммуноблота с окраской антисывороткой к IgG человека. Иногда для лучшей визуализации типа синтеза может быть использована окраска на κ- и λ-легкие цепи.

Результат выявления олигоклонального IgG при рассеянном склерозе с помощью изоэлектрофокусирования: в сыворотке крови определяется нормальный поликлональный IgG, в ликворе отмечается выраженный олигоклональный иммунный ответ, сопровождающийся синтезом олигоклонального IgG.

Тест является качественным, так как подсчитать число полос при олигоклональном типе крайне затруднительно, но это число не имеет клинического значения. Важной дополнительной информацией может служить изучение парной пробы сыворотки крови. Результат оценивают на основании описания типа синтеза в каждой из парных проб. Всего выделяют 5 вариантов синтеза иммуноглобулинов. Для РС наиболее характерен 2-й тип синтеза, в то время как 3-й тип может встречаться на фоне других аутоиммунных заболеваний, затрагивающих ЦНС, с минимальной системной продукцией олигоклонального IgG (табл. 17-19).

Таблица 17-19. Типы синтеза IgG в цереброспинальной жидкости и сыворотке в дифференциальной диагностике демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы

Примечание. РС - рассеянный склероз, СКВ - системная красная волчанка, ГЭБ - гематоэнцефалический барьер.

Олигоклональный IgG имеется у 93-98% больных с РС, его отсутствие с высокой вероятностью исключает диагноз. Особенностью феномена олигоклонального IgG является его стабильность. Ни характер, ни число олигоклональных полос не меняются с течением времени, поэтому мониторинг не требуется. Тест может быть отрицательным у единичных больных с глубоким залеганием очагов демиелинизации. Олигоклональный IgG обнаруживают у органиченного числа больных с другими заболеваниями ЦНС.

Паранеопластические энцефалиты - группа редких синдромов, при которых онкологические процессы (рак яичника, легкого) приводят к иммуноопосредованному энцефалиту, не связанному с объемным процессом и протекающему как мозжечковая атаксия, энцефалит, радикулоневропатия. Хотя эти заболевания редки, эффективная их диагностика позволяет обнаружить опухоль на ранних стадиях развития. У 70% больных неврологическая симптоматика опережает диагноз онкологического заболевания. В основе образования аутоантител при опухоли лежит перекрестная экспрессия опухолью антигенов нервной ткани. Аутоантитела синтезируются местно, за гематоэнцефалическим барьером, поэтому в дебюте заболевания титры аутоантител в СМЖ выше, чем в сыворотке крови. Антитела обладают цитотоксическим действем, с чем может быть связано выявление инфильтратов нервной ткани, а также дистрофия мозжечка и других отделов мозга. В то же время экспрессия невральных антигенов в опухоли далеко не всегда сопровождается паранеопластическим синдромом, что указывает на наличие других факторов, определяющих аутоиммунную реакцию. Так, антитела к клеткам Пуркинье мозжечка (Yo-1) присутствуют только у женщин.

Среди аутоантител к нейронам наиболее часто встречаются Yo, Hu и Ri-аутоантитела (табл. 17-20). К другим часто встречающимся «паранеопластическим» антителам относят антитела к кальциевым каналам при синдроме Ламберта-Итона и антитела к скелетным мышцам при миастении на фоне опухоли тимуса.

Таблица 17-20. Аутоантитела к нейронам при паранеопластических нейропатиях

Для определения нейрональных антител используют НРИФ либо иммуно-гистохимическую технику на криосрезах мозжечка обезьяны. Антитела дифференцированно связываются с нейронами разных отделов нервной системы. Так, антитела к ядрам нейронов 1 типа (анти-Hu) направлены против ядер нейронов центральной и периферической нервной системы, однако не окрашивают ядрышко и не реагируют с ядрами астродендроглии. Антитела к ядрам нейронов 2 типа (анти-Ri) очень похожи на анти-Hu, однако реагируют только с ядрами нейронов центральной нервной системы. Антитела к Yo-1-антигену окрашивают цитоплазму гигантских грушевидных нейронов мозжечка (клеток Пуркинье).

Для комплексной оценки паранеопластических аутоантител рекомендуется использовать тканевой комплекс, включающий мозжечок обезьяны, желудок и печень крысы. При оценке окрашивания желудка необходимо обращать внимание на реакцию аутоантител с клетками мезентериального нервного сплетения, которая очень характерна для Hu-антител. Печень крысы используется для выявления АНА, которые затрудняют исследование антител к ядрам нейронов.

После получения положительного результата НРИФ-теста можно рекомендовать выполнение иммуноблота, который позволяет подтвердить наличие паранеопластических аутоантител. Анти-Hu-антитела реагируют с РНК-связывающим белком HuD. Мишенью анти-Ri-антител является белок массой 55 кДа - Nova-антиген. Антигеном Yo-1 антител служит гидрофобный цитоплазматический белок массой 62 кДа, однако при лимфогранулематозе образуются антитела к цитоплазме клеток Пуркинье, направленные против других белков цитоплазмы (не Yo-1).

Гликолипидная оболочка миелинизированных нервных волокон служит мишенью антител к ганглиозидам, которые являются серологическими маркерами воспалительных полиневритов (табл. 17-21). Антитела к ганглиозидам направлены против гликофосфолипидов, состоящих из липида церамида и полисахаридной части 1-5 остатков гексоз, хотя бы одна из которых несет остаток сиаловой кислоты. Именно остаток сиаловой кислоты позволяет отнести данный гликолипид к ганглиозидам. Церамид заякорен в мембране клетки, в то время как гидрофильная полисахаридная часть направлена кнаружи от клеточной мембраны. В организме человека насчитывается 15 основных разновидностей ганглиозидов. Спектр ганглиозидов разный в ЦНС и периферических нервах. Ганглиозиды GM₁ и GD_1a экспрессированы на моторных нервах и аксонах. На черепно-мозговых нервах много ганглиозида GQ_1b, сенсорные нервы богаты GD_1b. Ганглиозиды выполняют множество функций, кроме того, они служат рецепторами для ряда микроорганиз мов, в том числе для токсина холеры (GM₁), энтеротоксина Campylobacter (GM₁), Haemophilus influenzae (GA₂/GM₁).

Таблица 17-21. Антитела к ганглиозидам при острых и хронических демиелинизирующих поражениях периферической нервной системы

Несмотря на значительный объем экспериментальных данных, вопрос об участии антител к ганглиозидам в патогенезе нарушений нервной проводимости остается открытым. Далеко не у всех больных с типичной клинической картиной полиневритов и изменениями при нейромиографии обнаруживают антитела к ганглиозидам, иногда антитела могут выявляться у лиц без полинейропатии. Тем не менее значение серологического ответа в патогенезе острых полирадикулоневритов подчеркивается клинической эффективностью плазмафереза и использования человеческого иммуноглобулина для лечения при этом заболевании. В экспериментальных моделях аутоантитела к ганглиозидам блокируют проводимость в изолированных препаратах нервов.

Синдром Гийена-Барре относится к группе острых воспалительных полирадикулоневропатий, часто разрешающихся спонтанно. Это заболевание развивается на фоне или после перенесенной респираторной или кишечной инфекции в течение 10-14 дней с момента ее начала, поэтому образование аутоантител часто рассматривают как компонент первичного иммунного ответа против возбудителя инфекции. После достижения ремиссии заболевания титры антител постепенно снижаются и нарастают в случае повторного обострения.

Синдром Гийена-Барре характеризуется демиелинизацией и аксональной дегенерацией моторных, сенсорных, автономных нервов и нервных корешков спинного мозга. В него включают острую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, острую моторно-аксональную нейропатию и острую моторно-сенсорную аксональную нейропатию. Синдром Миллера-Фишера часто выделяют из группы синдрома Гийена-Барре по причине особых клинических проявлений, включающих атаксию, арефлексию и офтальмоплегию. Аутоантителами чаще сопровождаются аксональные нейропатии и синдром Миллера-Фишера, в то время как при классической демиелинизирующей форме антитела диагностируют редко.

При острых полирадикулоневропатиях и синдроме Миллера-Фишера выявляют антитела к ганглиозидам GM₁ и GQ_1b класса IgG. Антитела класса IgM могут встречаться, однако их титры низки. Предполагается, что в силу особенностей иммунного ответа возникает переключение классов тяжелой цепи иммуноглобулинов с синтезом патогенного IgG. Исследование генов тяжелых цепей иммуноглобулина G, направленных против GM₁-ганглиозида, показало высокую частоту соматических мутаций, что указывает на антиген-специфическую дифференцировку иммунного ответа.

В качестве основной причины сенсибилизации иммунной системы к антигенам ганглиозидов при острых полинейропатиях предполагается перекрестная иммунная реакция с липополисахаридами бактерий ЖКТ. Синдрому Гийена-Барре часто предшествует энтерит, вызванный Campylobacter jejuni. Липополисахарид C. jejuni содержит ганглиозидподобную структуру, напоминающую по структуре молекулу ганглиозида GM₁, которая способна стимулировать аутоиммунные ответы. Другими известными индукторами синдрома Гийена-Барре являются цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, Mycoplasma pneumoniae и Haemophilus influenzae.

При хронических периферических нейропатиях антиганглиозидные антитела представлены преимущественно IgM. Часто аутоантитела входят в состав моноклонального IgM-компонента на фоне «моноклональной гаммапатии неясного значения». Моноклональный компонент может не обнаруживаться с помощью электрофореза белков сыворотки, однако может быть определен при использовании более чувствительного изоэлектрофокусирования.

Так называемый парапротеинемический нейропатический синдром, возникающий на фоне парапротеинемии IgM, характеризуется клинической картиной сенсорной полиневропатии с атаксией и офтальмоплегией. Невропатия является основным клинически значимым признаком «моноклональной гаммапатии неясного значения» и может отмечаться у 5-20% больных. Хроническая сенсорная невропатия при этом заболевании схожа с симптоматикой синдрома Миллера-Фишера. При парапротеинемической невропатии отмечается присутствие в сыворотке моноклонального IgM, направленного против ряда ганглиозидов, включая GD_1b, GQ_1b и GT_1b, других гликолипидов, а также против миелин-ассоциированного гликопротеина. Парапротеинемическая невропатия может сочетаться с пароксизмальной ночной гемоглобинурией, обусловленной образованием антител к сиаловым остаткам гликолипидных антигенов эритроцитов (холодовыми агглютининами).

Мультифокальная моторная невропатия с блоком проведения также относится к редким хроническим полинейропатиям и сопровождается антителами к ганглиозиду GM₁ класса IgM в 50% случаев. Характеризуется асимметричным полиневритом с характерной нейромиографической картиной фокального нарушения проводимости по моторным нервам.

Хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (CIPD) представляет собой аналог хронического синдрома Гийена-Барре и только в 20% случаев сопровождается антителами к GM₁-ганглиозиду класса IgM.

Основным методом детекции антител к ганглиозидам является ИФАг. В качестве более точного исследовательского метода может применяться тонкослойная хроматография. Определение антиганглиозидных антител характеризуется низкой чувствительностью, причина кроется в составе антигена. Примеси жирных кислот в препаратах ганглиозидов повышают чувствительность тестов. Общепризнанных стандартов антигена и стандартов аутоантител не существует, поэтому тесты различаются между собой.

Антитела к ганглиозидам можно рассматривать как одну из разновидностей «антител к гликолипидам». Гликолипиды (точнее, гликосфинголипиды) представляют собой обширное семейство мембранных молекул. Гликолипиды имеют множество функций, в том числе ими представлены антигены групп крови, факторы адгезии клеток, упаковка структуры миелина. Среди этой большой группы антигенов при полиневритах обнаруживают антитела к сульфатированному глюкуронил параглобозиду (SGPG), сульфатиду и галактоцереброзиду, которые не являются ганглиозидами по химическому строению. Антитела к сульфатиду встречаются при диабетической нейропатии, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии и парапротеинемической сенсорной нейропатии. Антитела к SGPG класса IgM встречаются при парапротеинемической сенсорной нейропатии. По структуре полисахаридного остатка SGPG близок к миелин-ассоциированному гликопротеину (MAG), поэтому антитела к двум молекулам часто диагностируют вместе при парапротеинемической нейропатии.

Системные аутоиммунные заболевания - немаловажная причина развития воспалительных полиневритов. Среди них выделяют системные ревматические заболевания, васкулиты, АФС, аутоиммунные эндокринопатии, аутоиммунный гастрит, парапротеинемии. Лабораторная и серологическая диагностика основного заболевания - один из методов постановки диагноза.

Нарушение нервно-мышечной передачи при миастении обусловлено аутоанти-телами, которые связываются с рецептором ацетилхолина на постсинаптической мембране нервно-мышечного окончания (моторной пластинки). Никотиновый (N-) ацетилхолиновый рецептор (АхР) является олигомерным трансмембранным ионным каналом, который состоит из 6 субъединиц. При связывании ацетилхолина на двух α-субъединицах рецептора открывается ионный канал, который позволяет катионам (прежде всего натрию) поступать внутрь мышечной клетки. Ток ионов обеспечивает возбуждение мембраны клетки, снижение трансмембранного потенциала, открытие кальциевых каналов и, в конечном итоге, сокращение мышечного волокна.

При миастении антитела непосредственно участвуют в патогенезе заболевания. Введение сыворотки, содержащей антитела к АхР, лабораторному животному воспроизводит клиническую картину миастении. У ряда лабораторных животных можно воспроизвести заболевание путем их иммунизации очищенным АхР. Новорожденные от матерей, больных миастенией, в большинстве случаев переносят транзиторную неонатальную форму заболевания, которая проходит в течение месяца после истощения пула материнских антител к АхР.

Антитела к АхР снижают количество АхР нервно-мышечного окончания за счет нескольких механизмов. Отмечается комплемент-опосредованный лизис пост-синаптической мембраны со снижением числа моторных пластинок на мышце. Под действием антител происходит димеризация и интернализация рецептора, что сокращает его мембранный пул. В небольшой степени аутоантитела способны связываться с α-субъединицей АхР, приводя к его функциональной блокаде. Эпитоп антител к АхР является конформационным, и хотя он локализован на α-субъединице, только небольшое число аутоантител направлено на сайт связывания ацетилхолина.

Основным методом определения антител к АхР служит радиоиммунопреципитация, основанная на способности меченного ¹²⁵I α-бунгаротоксина связываться с ацетилхолиновым рецептором скелетной мышцы. Источником человеческого АхР является оперативный материал или клетки перевиваемых клеточных линий рабдомиосаркомы TE671, которая содержит фетальный АхР. Несмотря на значительную гомологию гена АхР, достаточную чувствительность тестов обеспечивает использование АхР человека или высших приматов. Тесты, основанные на методе ИФА, не обеспечивают нативную укладку АхР, а потому недостаточно чувствительны.

У 15% больных миастенией антитела к АхР не обнаруживают. В то же время у большинства серонегативных больных плазмаферез и иммуносупрессия оказываются высокоэффективными. Несмотря на отсутствие антител к АхР, введение сыворотки крови этих больных лабораторным животным приводит к проявлениям миастении. Это позволяет предположить присутствие в этих сыворотках еще не изученных аутоантител, также влияющих на нервно-мышечную передачу. Сравнительно недавно была обнаружена новая мишень аутоантител при серонегативной миастении - MUSK-рецептор. Аутоантитела к MUSK-рецептору являются показателем выбора при подозрении на серонегативную миастению. Для их определения применяют метод радиоиммунного анализа.

Миастения - аутоиммунное заболевание, имеет два возрастных пика, один из которых приходится на 15 лет, а другой начинается после 40. В 15% случаев отмечается окулярная форма миастении, которая редко прогрессирует в генерализованную форму. В остальных 85% случаев течение заболевания варьирует от окулярной до генерализованной формы. Нередким симптомом миастении являются миастенические кризы, возникающие в результате инфекции или приема препарата, с развитием острой мышечной слабости.

Антитела к АхР диагностируют у 80-85% больных миастенией, они обладают высокой специфичностью. Содержание аутоантител к АхР снижается параллельно эффективной терапии, уменьшение на 50% обычно соответствует выраженному клиническому улучшению. У больных в стадии ремиссии могут сохраняться титры антител выше диагностических. У 15% пациентов можно обнаружить опухоль тимуса, а гиперплазия тимуса отмечается в 30-40% случаев. Тимэктомия является операцией выбора при миастении в случае плохого ответа на иммуносупрессивную терапию и в большинстве случаев улучшает клиническое течение заболевания. Более 95% больных с тимомой имеют антитела к АхР, кроме того, в 30-50% из них можно обнаружить антитела к скелетным мышцам. При рецидиве тимомы отмечается нарастание титров антител к АхР и скелетным мышцам.

Еще одним нервно-мышечным заболеванием, имеющим паранеопластический генез, является миастенический синдром Ламберта-Итона. Как и миастения, это заболевание характеризуется мышечной слабостью, сухостью во рту, однако, в отличие от миастении, при нагрузке наблюдается «врабатывание» с уменьшением мышечной слабости. Основной причиной развития этого миастенического синдрома являются опухоли легких, молочной железы и яичников. Нарушение нервно-мышечной проводимости обусловлено образованием антител к вольтажзависимым кальциевым каналам нервной ткани на пресинаптической стороне нервно-мышечного окончания. Вольтажзависимые кальциевые каналы относят к трансмембранным белкам, состоящим из нескольких субъединиц. Выделяют несколько субтипов и классов кальциевых каналов. При синдроме Ламберта-Итона имеют место антитела к P/Q-типам каналов, которые контролируют высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечном окончании, а также каналам N-типа, которые участвуют в нейротрансмиссии в пределах ЦНС. Последние встречаются почти исключительно на фоне мелкоклеточного рака легкого.

Антитела к P/Q-каналам - маркер синдрома Ламберта-Итона, который обладает чувствительностью около 95%. Они замедляют выделение ацетилхолина в нервно-мышечном окончании, что нарушает работу моторной пластинки. Метод определения антител к кальциевым каналам - радиоиммунный анализ экстрактов нервной ткани с лигандом, меченным радиоактивной меткой. Техническая сложность метода ограничивает его клиническое применение.

Антитела к ионным каналам могут встречаться совместно с другими паранео-пластическими антителами. В 20-30% случаев антитела к кальциевым каналам P/Q-типа обнаруживают при боковом амиотрофическом склерозе, однако их роль при этом заболевании не установлена.

Хотя антитела к скелетным мышцам и миокарду обнаруживают при разных патологических процессах, основными антигенами выступают сократительные белки и поверхностные рецепторы поперечнополосатой мускулатуры. Обе разновидности аутоантител обладают выраженной перекрестной реактивностью и требуют сочетаного определения.

Антитела к скелетным мышцам при миастении были впервые описаны как комплемент-фиксирующие антитела, направленные против сократительных элементов скелетной мышцы. Исследование молекулярных мишеней аутоантител показало их значительную гетерогенность. Аутоантитела связывают множество сократительных белков, включая актин, актинин, миозин, титин (коннектин), а также рианодиновый рецептор, представляющий собой кальциевый канал сарко-плазматического ретикулума.

Появление аутоантител к скелетной мышце связано с аутоиммунной реакцией против клеток тимуса. Поликлональные сыворотки и моноклональные антитела, синтезированные на основе антительного спектра при миастении, связываются как с антигенами скелетных мышц, так и с миоэпителиальными клетками тимомы. Эта разновидность низкодифференцированных клеток тимуса сохраняет миоидные элементы в цитоплазме, а также экспрессирует фетальный АхР. Экспрессия α-субъединицы АхР возрастает при тимоме, причем ее синтез отмечается в кортикальных эпителиальных клетках, окруженных незрелыми тимоцитами. Именно нарушение цитоархитектоники тимуса с дефектом негативной селекции незрелых CD1⁺ Т-клеток и их постоянный контакт с миоэпителиальными клетками могут лежать в основе возникновения аутоиммунных ответов при тимоме.

Основным методом определения антител к скелетным мышцам является НРИФ на криосрезах мышц грызунов или человека. Другие методы обнаружения аутоантител не позволяют охватить широкий спектр антигенов, поэтому используются лишь для подтверждения. Определение конкретных мишеней аутоантител в клинической диагностике в настоящее время не применяют. Показано, что антитела к титину являются наиболее специфичным маркером паранеопластической миастении, а антитела к рианодиновому рецептору указывают на тяжелое течение и плохой прогноз заболевания.

Антитела к скелетным мышцам диагностируют методом НРИФ у 30-40% боль ных с классической миастенией, при паранеопластической миастении и на фоне тимомы они встречаются у 70-80% пациентов. Результат теста является положительным при обнаружении характерного окрашивания сократительных элементов скелетной мышцы в титре более 1:20.

В пожилом возрасте встречаемость аутоантител постепенно нарастает, в то время как у молодых больных миастенией антитела к скелетным мышцам регистрируют редко (<10%). Поскольку при миастении существует надежный и чувствительный серологический маркер, такой как антитела к АхР, то антитела к скелетным мышцам имеют вспомогательное значение и используются только в серодиагностике тимомы. Высокая чувствительность этих аутоантител позволяет использовать их для диагностирования тимомы на фоне миастении. Отрицательный результат серологического теста позволяет с большой вероятностью исключить тимому у лиц в возрасте 20-60 лет. Антитела к скелетным мышцам обнаруживают у части пациентов с хронической болезнью «трансплантат против хозяина» при пересадке костного мозга.

Антитела к миокарду отмечаются при поствирусных миокардитах, дилатационной кардиомиопатии, синдроме Дресслера и ревмокардите. Спектр антигенов антимиокардиальных антител по своей широте сопоставим с разнообразием антигенов и антител к скелетным мышцам. Основными антигенами являются α- и β-изоформы тяжелой цепи сердечного миозина, тропомиозин, ряд митохондриальных антигенов, в том числе белок-переносчик аденина (ANT) и ферменты синтеза жирных кислот (BCKD). Рецепторный аппарат миокарда также становится мишенью антител. Выявляют антитела к β₁-адренорецепторам и М₂-мускариновым рецепторам.

Ведущая роль вирусной инфекции в патогенезе аутоиммунного поражения мио карда многократно подтверждена. Помимо результатов множества клинических исследований, посвященных определению нуклеиновых кислот и антигенов в мио карде, разработано несколько животных моделей вирусиндуцированного миокардита и дилатационной кардиомиопатии. Классическая модель миокардита, вызываемого вирусом Коксаки В₃, сопровождается индукцией аутоантител к миозину. При ряде бактериальных инфекционных заболеваний, таких как болезнь Чагаса и стрептококковая инфекция, наблюдают образование перекрестно реагирующих антител к соединительной ткани и миозину сердца.

Участие аутоантител в патогенезе миокардитов и миокардиопатии остается спорным. Большая часть антигенов аутоантител является внутриклеточными, поэтому они недосягаемы для циркулирующих аутоантител. Вероятным патогенетическим механизмом представляется стимуляция кардиомиоцитов через β₁-адренорецептор, что приводит к нарушению их сократительной функции и развитию тахиаритмий. Частота встречаемости антител к β₁-адренорецептору выше у носителей HLA-DR4, носительство которого ассоциировано с развитием идиопатической дилатационной кардиомиопатии.

Основным клиническим методом обнаружения антител к миокарду считают непрямую иммунофлюоресценцию на миокарде грызунов или человека. Выявление титров более 1:20 указывает на наличие клинически значимых аутоантител. Аутоантитела по-разному реагируют с миокардиальной тканью, поэтому выделяют 2 типа окрашивания: сарколеммный и миофибриллярный. Антитела к скелетной мышце, часто встречающиеся у пожилых лиц, при НРИФ также реагируют с сократительными белками миокарда и неотличимы от антимиокардиальных антител. Целесообразно параллельное использование двух субстратов (мышцы и миокарда) для дифференцировки этих специфичностей.

Аутоантитела к миокарду встречаются часто, чувствительность при дилатационной кардиомиопатии достигает 90%. Однако встречаемость аутоантител у здоровых доноров крови может достигать 10-20%, что затрудняет использование аутоантител к миокарду в качестве подхода к дифференциальной диагностике миокардиопатий.

Отсутствие коммерчески доступных тест-систем для определения антител к миокардиальному миозину, ANT и β-адренорецептору не позволяет использовать эти потенциально более специфичные маркеры в клинической практике.

Различают простую (вульгарную), листовидную, эритематозную и вегетирующую форму пузырчатки. В основе заболеваний этой группы пузырчатки лежит образование внутриэпидермальных пузырьков, причиной которых является антитело-опосредованное разрушение десмосом - межклеточных структур, которые объединяют между собой клетки кожи. Десмосомы представляют собой плотные межклеточные контакты, разрушение которых приводит к образованию интраэпителиальных полостей и отделению клеток друг от друга (акантолитические клетки). Особенностью аутоантител при пузырчатке является способность активировать систему комплемента, в результате чего антитела имеют прямое цитотоксическое действие.

При выполнении прямой РИФ в биоптатах кожи отмечаются интраэпидермальные отложения IgG и С₃-компонента комплемента по межклеточным контактам (десомомам) эпителиоцитов базальных слоев. Эти отложения напоминают ячейки рыболовной сети, они обычно линейные, на большом увеличении можно отметить мелкую гранулярность, которая соответствует морфологическому распределению «плотных контактов» эпидермиса. Прямая РИФ является золотым стандартом, поскольку позволяет обнаружить аутоантитела у всех пациентов с пузырчаткой, в то время как НРИФ имеет чувствительность, не превышающую 90%. Биопсию целесообразно проводить в области непораженной кожи на границе или рядом с высыпным элементом. В биоптатах клинически не пораженной кожи часто отмечают интраэпидермальные полости с акантолитическими клетками, цитоплазма которых особенно ярко окрашена иммуноглобулином.

Среди антигенов антидесмосомальных антител наиболее хорошо изучены гликопротеины десмосом: десмоглеин 1 и 3. Пациенты с листовидной пузырчаткой имеют антитела против десмоглеина 1. При вульгарной пузырчатке и при ее гипер пролиферативном варианте (вегетирующая пузырчатка) образуются аутоантитела к десмоглеину 3. Отличия в морфологии и клинической картине листовидной и вульгарной пузырчатки обусловлены различиями в экспрессии двух основных антигенов. Так, локализация пузырьков между верхними слоями эпидермиса при листовидной и нижними слоями при вульгарной пузырчатке обусловлена экспрес сией десмоглеина 3 в преимущественно верхних слоях эпидермиса. В то же время десмоглеин 1 отсутствует в эпидермисе слизистых оболочек, что обусловливает отсутствие высыпаний на них при листовидной пузырчатке.

При пузырчатке выявляют широкий спектр аутоантител других специфичностей, в том числе десмоколлины 1-3, десмоплакины I и II, плакоглобин, аннексины, Е-кадхерин и коллаген XVII. Перспективными аутоантигенами при пузырчатке могут быть ацетилхолиновые рецепторы кератиноцитов. Ряд исследований показывает принципиальную роль этих антител в воспроизведении экспериментальных моделей пузырчатки.

Два редких пузырных заболевания кожи связаны с интраэпителиальными отло жениями IgA. К ним относят субкорнеальный пустулярный дерматоз и интраэпидермальный нейтрофильный дерматоз. При этих заболеваниях основными антидесмосомальными антигенами являются десмоглеины 1, 3 и десмоколлин 1. Антитела класса IgA могут быть выявлены с помощью НРИФ на пищеводе обезьяны в 50% случаев.

Пемфигоид представляет собой группу буллезных заболеваний кожи, включаю щую собственно буллезный пемфигоид, а также пемфигоид слизистых оболочек, пемфигоид беременных, IgA-пемфигоид. В отличие от пузырчатки, при пемфигоиде образуются антитела к гемидесмосомам базального слоя. Эти структуры связывают между собой эпидермис и дерму. Как и при пузырчатке, антитела обладают способностью фиксировать комплемент. В результате при разрушении гемидесмосом полости образуются на границе эпидермиса и дермы. Поскольку структуры эпидермиса не нарушены, акантолитические клетки отсутствуют.

При прямой РИФ в биоптатах кожи отмечаются линейные отложения IgG по базальной мембране кожи. Основными антигенами служат 2 белка гемидесмосом массой 230 и 180 кДа, которые получили название BPAG1 и BPAG2 (от англ. bullous pemphigus antigen). Вопрос о патогенетическом значении аутоантител не решен, хотя показана возможность пассивного переноса пемфигоида животным с помощью введения аутоантител человека. Тем не менее для образования субэпидермальных полостей необходимо нейтрофильное воспаление с синтезом протеазных ферментов. Вероятно, основной ролью аутоантител к антигенам гемидесмосом является привлечение воспалительных клеток. Антитела к базальной мембране кожи не коррелируют с активностью заболевания, поэтому их мониторинг не осуществляется.

Для определения антител в сыворотке крови применяют метод НРИФ на криосрезах пищевода обезьяны. Положительное окрашивание базальной мембраны кожи проявляется в виде яркой линии под клетками базального слоя. Серологически обнаруживаются антитела у 75% больных с пузырными дерматоза ми, в то время как у большинства больных с начальными формами и поражением слизистых оболочек антитела в крови отсутствуют.

Основной класс иммуноглобулинов при пемфигоиде - IgG (IgG₁ и IgG₄). При более редкой разновидности - линейном IgA буллезном пемфигоиде - основным классом является IgA. При этой форме редко можно обнаружить аутоантитела в крови, поэтому основой диагностики стало исследование биоптатов кожи.

Отложения IgG отмечаются при буллезной форме многоформной эритемы. Антигенными мишенями являются белки гемидесмосомы десмоплакины. Они служат основными конститутивными элементами десмосом и образуют внутриклеточную плотную десмосомальную пластину. Больные с антителами к десмоплакинам страдают от повторных высыпаний на слизистой оболочке рта и гениталий, а также от обострений конъюнктивита. Антитела реагируют с эпитопом белка, ответственным за связь с цитокератинами клетки.

При многоформной эритеме циркулирующие антитела обнаруживают не более чем в 50% случаев; биопсия кожи является основой диагностики. Для уточнения характера отложений используют «расщепление» кожи под действием высокой концентрации NaCl (1М). При многоформной эритеме отложения IgG остаются на эпидермальной части эпидермиса.

Буллезный эпидермолиз является заболеванием с преимущественным поражением слизистых оболочек. Основной антиген - коллаген VII типа, который связывает плотную пластинку гемидесмосом базального слоя эпидермиса с глубокими слоями дермы. В сыворотке аутоантитела встречаются нечасто, поэтому для диагностики применяют биопсию кожи. При использовании «солевого расщепления» отложения иммуноглобулинов при буллезном эпидермолизе остаются на дермальной части эпидермиса.

Герпетиформный дерматит (болезнь Дюринга) обычно характеризуется везикулопустулезной сыпью на фоне скрытых форм целиакии. При выполнении прямой РИФ отмечают крупногранулярные отложения IgA в вершинах сосочков кожи. В отличие от других буллезных дерматозов, при которых характер окрашенных структур идентичен при прямой и непрямой РИФ, при герпетиформном дерматозе при проведении НРИФ не выявляют антитела к антигенам кожи, но определяют антитела к эндомизию и ретикулину. Еще одной специфической мишенью аутоантител при герпетиформном дерматите служит эпидермальная трансглутаминаза, антитела к которой могут иметь перекрестную специфичность с другими трансглутаминазами.

Витилиго - еще одно распространенное аутоиммунное заболевание кожи, сопровождающееся появлениями аутоантител против антигенов кожи. Поскольку витилиго часто сочетается с рядом аутоиммунных эндокринопатий, при этом забо левании можно обнаружить также аутоантитела к антигенам щитовидной железы, надпочечникам, обкладочным клеткам желудка.

Аутоантитела к меланоцитам, циркулирующие в крови больных витилиго, обладают цитотоксическим действием на культуры меланоцитов и способны активировать комплемент. Установлен ряд мишеней аутоантител, среди них наибольшее значение имеет 40 кДа-антиген витилиго (VIT40) и тирозиназа (69 кДа),участвующая в синтезе меланина. Учитывая очевидную клиническую картину этого заболевания и простоту постановки диагноза, серологическая диагностика витилиго не разработана.

Основной серологический тест в иммунологическом обследовании больных с подозрением на заболевание соединительной ткани - определение АНФ с помощью метода НРИФ. При подозрении на ДБСТ на первом этапе лабораторного обследования должен быть определен титр АНФ на перевиваемой клеточной линии НЕр-2. Более чем у 95% пациентов с обострением ДБСТ отмечают диагностические титры этого показателя. Хотя встречаемость АНФ варьирует при диагностике конкретных системных заболеваний, она превышает 90% при СКВ, СШ и диффузных формах склеродермии, включая CREST-синдром. Несколько реже АНФ обнаруживают при дискоидной красной волчанке, кожных формах склеродермии. Частота встречаемости АНФ при воспалительных миопатиях, таких как дерматомиозит и полимиозит, не превышает 50%.

При диагностике СКВ, СЗСТ, СШ и склеродермии отсутствие диагностических титров АНФ или низкие титры, составляющие 1:40-1:80, делают диагноз ДБСТ маловероятным. Принимая во внимание особенности метода обнаружения АНФ, необходимо учитывать, что ряд распространенных антигенов АНА, прежде всего антигены SS-A-антител, могут утрачиваться из ядра клетки в ходе фиксации. Поэтому рекомендуется дополнительное обследование антител к экстрагируемому ядерному антигену методом ИФА или диффузии в геле. В качестве альтернативно го варианта можно использовать селективные тесты, направленные на выявление антител к SS-A антигену.

За счет высокой чувствительности ИФА-методов обнаружения антител к ЭНА при совместном использовании с АНФ отрицательный результат такого тестирования позволяет исключить диагноз СКВ, СШ и диффузных форм склеродермии с вероятностью около 98%.

Определение АНФ на клеточных линиях позволяет уточнить тип свечения ядра клетки. Выявление высоких титров АНФ с гомогенным типом свечения ядра клетки в большинстве случаев указывает на диагноз СКВ. Основным антигеном при гомогенном типе свечения является дсДНК. Гомогенный тип свечения может отмечаться при диффузной склеродермии и часто обусловлен наличием антител к Scl-70 антигену. Титры гомогенного свечения АНФ при склеродермии обычно ниже титров, отмечающихся при обострении СКВ.

Среди всех типов свечения при выявлении АНФ у лиц, обследуемых по поводу ДБСТ, преобладает гранулярный тип. Он отмечается при СКВ, СШ, СЗСТ, склеродермии, РА и других артропатиях. При СКВ и СЗСТ преимущественно устанавливают крупногранулярный тип свечения ядра, связанный с обнаружением антител к рибонуклеопротеиновым антигенам, таким как Sm и RNP. Поскольку СКВ и СШ характеризуются выраженной гипергаммаглобулинемией, титры АНФ с гранулярным типом свечения обычно выше, чем при других заболеваниях. Обнаружение умеренных титров АНФ с гранулярным типом свечения может отмечаться у лиц без признаков ДБСТ.

Наличие ядрышкового и центромерного типа окрашивания ядра характерно для различных форм склеродермии. Антитела к центромерам, которые являются маркером CREST-синдрома, отмечают в очень высоких титрах, обычно превышающих 1:2560. Диффузные формы склеродермии, протекающие с поражением внутренних органов, практически в 100% случаев сопровождаются высокими титрами АНФ. При локализованной склеродермии АНФ встречается у 30% больных, чаще отмечается на фоне линейной склеродермии (40%), преимущественно у детей. При бляшечной склеродерме встречаемость диагностических титров АНФ составляет только 15%, причем антитела обнаруживают преимущественно у взрослых.

Цитоплазматический тип свечения описывают реже других, обычно он присутствует в невысоких титрах. Нередко ложноотрицательные результаты определения антител к антигенам цитоплазмы связаны с тем, что цитоплазматический тип свечения имеет место наряду с более выраженным окрашиванием ядра клетки. Большинство антигенов, определяющих цитоплазматический тип окрашивания ядра, в частности рибосомы, диффузно распределены в ядре клетки, что затрудняет их обнаружение. Большинство положительных результатов обнаружения цитоплазматического типа свечения обусловлено антителами к митохондриям, которые представляют собой крупные органеллы, хорошо различимые среди других структур цитоплазмы.

Тестирование на определение конкретных разновидностей АНА целесообразно проводить только при получении положительного результата выявления АНФ или антител к экстрагируемому ядерному антигену. Вероятность обнаружения диагностических титров конкретных разновидностей АНА при отсутствии или низких титрах АНФ очень низка. Основными разновидностями АНА, которые отмечаются при низких титрах АНФ, являются антигены SS-A и SS-B. Таким обра зом, использование уточняющих тестов целесообразно только при обнаружении высоких титров АНФ (более 1:160) и/или антител к ЭНА, которые указывают на присутствие антител к SS-A и SS-В.

Среди всего многообразия АНА у больных ДБСТ рекомендуется определение антител к наиболее часто встречающимся разновидностям АНА, выявление которых имеет четкое диагностическое значение. Минимальный набор включает SS-A, SS-B, Sm, U₁-RNP, Scl-70 и Jo-1.

Наиболее объективные и специфичные результаты обследования могут быть получены при использовании двойной иммунодиффузии и контрэлектрофореза. Однако эти методы крайне трудоемки и требуют хорошо обученного персонала. Метод ИФА для обнаружения этих разновидностей АНА является очень чувствительным, что может приводить к получению ложноположительных результатов. За счет своей дешевизны, простоты и надежности в большинстве иммунологических лабораторий метод лайн-блота постепенно вытеснил другие методы обнаружения АНА. Определение антител к дсДНК может быть рекомендовано только пациентам с СКВ, причем вероятность обнаружения этих антител выше при гомогенном типе свечения АНФ. При других системных заболеваниях обнаружение антител к дсДНК не показано. Учитывая высокую встречаемость АКА у больных СКВ, обнаружение низких титров АФА может быть использовано в качестве дополнительно го диагностического маркера при этом заболевании.

Все пациенты с ДБСТ должны хотя бы однажды быть обследованы для уточнения спектра АНА. Титры всех аутоантител не являются постоянной величиной и могут значительно меняться с течением времени, что справедливо по отношению к АНА, присутствующих в сыворотке больных ДБСТ. Повторное обследование для обнаружения АНФ и других АНА рекомендовано только при СКВ. При других ревматических заболеваниях титр АНФ не коррелирует с активностью их течения; данных, свидетельствующих о целесообразности повторных измерений АНФ у больных с другими ДБСТ, не существует. Даже если у больного с типичной клинической картиной ДБСТ был обнаружен высокий титр АНФ, то совсем не обязательно, что дальнейшее иммунологическое обследование позволит установить конкретную разновидность АНА. Это связано с разнообразием АНА и несовершенством используемых методов их определения.

Среди всех форм ДБСТ реже всего АНА встречаются при воспалительных миопатиях. Отсутствие АНФ не исключает наличия антител к синтетазам и другим цитоплазматическим мишеням АНА. Результаты выявления АНФ при подозрении на воспалительные миопатии следует интерпретировать с осторожностью. Независимо от результатов обнаружения АНФ всем пациентам с ПМ/ДМ необходимо провести специфические тесты, направленные на выявление антисинтетазных и других характерных разновидностей АНА.

Практически у 25% больных с диагнозом ДБСТ клиническая картина не укладывается в классическое описание конкретного заболевания, и у них одновременно отмечают признаки нескольких заболеваний соединительной ткани. Такие заболевания рассматривают как перекрестные синдромы, которые не могут быть классифицированы на основании клинических критериев. Их прототипом является СЗСТ или синдром Шарпа, речь о котором шла при обнаружении антител к U₁-RNP и который сочетает признаки всех основных заболеваний соединительной ткани. Обнаружение у больного совокупности разнородных клинических признаков в сочетании с выявлением одновременно иммунологических маркеров нескольких ревматологических заболеваний заставляет предположить диагноз перекрестного синдрома.

Тот факт, что при наличии определенных разновидностей АНА с большой частотой отмечаются определенные клинические признаки и формы системных заболеваний, послужил толчком к пересмотру определений и классификации ряда нозологических форм. Существующие исследовательские данные однозначно указывают на то, что аутоантитела связаны с иммунопатогенезом системных заболеваний и отражают особенности иммунного ответа. Это позволяет более точно очерчивать клинические синдромы, характеризующиеся единым патогенезом. Так, на серологических показателях основано выделение ряда перекрестных синдромов, в частности антисинтетазного синдрома, склеромиозита (табл. 17-22). В основе современной классификации воспалительных миопатий лежит определение миозит-специфичных аутоантител.

Таблица 17-22. Серологические маркеры перекрестных синдромов в ревматологии

Системные заболевания соединительной ткани, сопровождающиеся образованием АНА, представляют собой единое поле, объединяющее специфическую клиническую симптоматику, иммунопатогенез и серологические маркеры. Это характерно и для других аутоиммунных заболеваний, в частности аутоиммунных эндокринопатий, при которых часто обнаруживается общность клинической картины и совпадают иммунологические маркеры. В то же время АНА могут обнаруживаться при заболеваниях как имеющих ревматическую природу, так и не имеющих таковой. К последним относятся заболевания печени, вирусные гепатиты, шизофрения, васкулиты, аутоиммунные тиреоидиты и болезнь Грейвса, поликистоз, РС, пурпура Шенлейна-Геноха, юношеский РА, атопический дерматит, миастения, паранеопластические синдромы, гиперэозинофильный синдром, беременность, вирусные и бактериальные инфекции.

Таким образом, системные заболевания соединительной ткани объединяются иммунологическими и, нередко, клиническими проявлениями с другими аутоиммунными заболеваниями, что позволяет проследить единые патогенетические закономерности аутоиммунной патологии.

Встречаемость СКВ составляет 1:5000 женщин от 15 до 45 лет, что делает ее одним из наиболее частых ДБСТ. Полиморфная клиническая картина, отсутствие абсолютно патогномоничных морфологических и инструментальных критериев этого заболевания позволяют рассматривать иммунологическое обследование в качестве основного метода подтверждения диагноза СКВ. При использовании клеточной линии HЕp-2 АНФ выявляет АНА более чем у 98% больных с этим заболе ванием, что позволило использовать обнаружение АНФ в качестве самостоятельного классификационного критерия СКВ. Серологические показатели, в том числе антитела к дсДНК и антитела к Sm-антигену, благодаря высокой специфичности также являются критерием этого заболевания.

При применении человеческих клеточных линий в качестве субстрата для обна ружения АНА почти у всех больных СКВ фиксируют значительные титры АНА (>1:160). При обострении отмечают крайне высокие титры АНФ на клеточной линии НЕр-2, составляющие в среднем 1:1280-1:2540. Зачастую у больных СКВ титры могут превышать 1:100 000. При успешной терапии титры АНФ снижаются, составляя в среднем 1:320-1:640.

Отсутствие значимых титров АНФ у отдельных больных, имеющих типичные клинические симптомы СКВ, является «яблоком раздора» между ревматологами и сотрудниками лаборатории, что заставляет выделять условную группу пациентов с «АНФ-негативной СКВ». При использовании тканей лабораторных животных, таких как почка или печень крысы, до 10-15% больных, удовлетворяющих критериям для диагноза СКВ, не имеют диагностических титров АНФ в сыворотке крови. Одной из основных разновидностей АНА, которые обнаруживают у таких пациентов, являются антитела к SS-A-антигенам. Эти антигены обладают хорошей растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток.

Хотя применение в качестве субстрата клеточной линии HEp-2 значительно сокращает численность этой категории пациентов, серонегативными остаются до 5% больных. Необходимо учитывать, что при использовании метанол-ацетоновой фиксации НЕр-2-клеток SS-A-антиген может диффундировать в цитоплазму клетки, в результате чего титры АНФ значительно занижаются.

Для устранения этих недостатков была создана трансгенная клеточная линия НЕр-2000, в генотип которой был искусственно внесен ген SS-A-антигена. За счет этого в ее ядре отмечается гиперэкспрессия SS-A-антигена, что увеличивает чувствительность выявления АНА. Однако даже использование трансгенных клеточных линий не позволяет окончательно избавиться от проблемы «АНФ-негативной СКВ». Ложноотрицательные результаты определения АНФ могут быть получены в присутствии АНА к антигенам цитоплазмы - рибосомальным антигенам и антисинтетазным антигенам (Jo-1), а также в случае присутствия антител к фосфолипидам. Существует еще одна группа больных СКВ, у которых не отмечается АНФ. Люди с врожденной недостаточностью компонентов комплемента (С₂ и С₄) могут страдать кожным волчаночноподобным заболеванием с выраженной фоточувствительностью. При лабораторном обследовании у них отсутствуют сколько-нибудь значимые титры АНФ и антитела к дсДНК, хотя в ряде случаев у них могут быть обнаружены антитела к Ro/SS-A.

Определение типа свечения АНФ играет большую роль в определении прогноза при СКВ. Встречаемость конкретных типов свечения зависит от обследуемых контингентов пациентов. При обследовании смешанных популяций, включающих как кожные, так и системные формы заболевания, гомогенный и гранулярный тип свечения отмечаются с одинаковой частотой.

Гомогенный тип свечения обусловлен присутствием антител к дсДНК и характе ризуется более агрессивным течением и большей вероятностью поражения почек. Наряду с антителами к дсДНК, при гомогенном типе свечения обнаруживают антитела к нуклеосомам и антиэндотелиальные антитела, которые также участвуют в патогенезе волчаночного нефрита.

Выделяют 2 основные разновидности гранулярного типа свечения у больных СКВ. Крупногранулярный тип свечения присутствует у пациентов с антителами к компонентам сплайсосом Sm и RNP. Наличие этих вариантов АНА сопровождается тяжелым течением заболевания с большой вероятностью поражения ЦНС, цитопениями, выраженным синдромом Рейно. Мелкогранулярный тип свечения обусловлен присутствием антител к SS-A и SS-B-антигенам, характеризуется преимущественно кожными формами заболевания с выраженной фоточувствительностью.

Тест волчаночной полоски высокоспецифичен для системных форм СКВ и преимущественно отмечается у пациентов с поражением почек и вторичным АФС. В то же время обнаружение антител к фосфолипидам при СКВ не всегда сопутствует клинической картине АФС. Низкие титры АКА зафиксированы у 40-50% больных СКВ и представляют собой дополнительный диагностический критерий этого заболевания.

Для оценки активности заболевания могут быть использованы титры АНФ, антител к дсДНК, антител к нуклеосомам, антиэндотелиальных антител, содержание сывороточных иммуноглобулинов и гаммаглобулинемия, содержание компонентов системы комплемента, изменение уровней ЦИК и СОЭ. В отличие от других заболеваний, концентрации С-реактивного белка при СКВ обычно лежат в пределах нормы. Увеличение концентраций С-реактивного белка при СКВ указывает на присоединение инфекционного процесса и требует активного поиска очагов скрытой инфекции.

АФС - аутоиммунное заболевание, поражающее преимущественно женщин молодого возраста, проявляется рецидивирующими тромбозами, привычным невынашиванием беременности, тромбоцитопенией и стойким наличием антифосфолипидных антител. Диагноз АФС устанавливают на основании соответствия клинических и лабораторных находок диагностическим критериям этого заболевания. В Сиднее в 2006 г. произошел последний пересмотр критериев этого заболевания. На основе австралийских критериев в настоящее время строится практическая диагностика АФС (табл. 17-23).

Таблица 17-23. Критерии антифосфолипидного синдрома, 2006 г.

Примечания экспертов к тексту критериев

* Необходимо избегать установки диагноза АФС, если положительные лабораторные результаты и клинические проявления разделяют менее 12 нед или более 5 лет.

** Присутствующие врожденные или приобретенные факторы риска тромбоза не являются причиной исключения АФС у больного. Однако рекомендуется выделять отдельные группы пациентов в зависимости от (a) отсутствия и (b) наличия дополнительных факторов риска тромбоза. Такими факторами риска являются возраст (>55 у мужчин, >65 у женщин), наличие любых установленных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (гипертензии, диабета, повышенного холестерина ЛНП или низкого холестерина ЛВП, курения, наследственности, указывающей на раннее начало сердечно-сосудистых заболеваний в семье, индекса массы тела более 30 кг/м², микроальбуминурии, снижения СКФ, врожденных тромбофилий, приема пероральных контрацептивов, нефритического синдрома, опухоли, иммобилизации и хирургической патологии).

*** Эпизод тромбоза в прошлом может рассматриваться как положительный критерий, если он был объективно подтвержден клинически.

**** Тромбоз поверхностных вен не включен в клинические критерии.

***** Общепринятые признаки плацентарной недостаточности включают (1) отрицательные признаки жизнедеятельности плода, (2) плохие формы кривой допплерограммы сосудов, указывающие на признаки гипоксемии плода, (3) олигогидрамнион с индексом амниотической жидкости менее 5 см, (4) постнатальный вес плода менее 10 перцентиля срока гестации.

****** Эксперты рекомендуют отдельно классифицировать больных АФС на следующие категории: (1) присутствует более 1 лабораторного критерия в любой комбинации, (2а) изолированный волчаночный антикоагулянт, (2b) только антитела к кардиолипину, (2c) только антитела к β₂-ГП.

Выделяют несколько классификационных форм АФС. Прежде всего это первичный или идиопатический АФС, возникающий у лиц моложе 45 лет. После этого возраста большинство случаев АФС рассматривают как вторичный процесс по отношению к основному заболеванию. Вторичный АФС развивается на фоне СКВ, СШ, склеродермии, опухолей, ВИЧ и ВГС, приема лекарственных препаратов. Еще одной разновидностью заболевания является катастрофический АФС, который протекает как первая фаза ДВС с развитием полиорганной недостаточности. В случае катастрофического ДВС диагноз часто ставят посмертно, в результате обнаружения крайне высоких титров АКЛА. В то же время серонегативный АФС характеризуется отсутствием АКЛА при характерной клинической картине. В случае перенесенного эпизода тромбоза целесообразно проводить измерение АКЛА и антител к β₂-ГП через 3 нед, поскольку тромботический эпизод может быть связан с потреблением больших количеств аутоантител.

Основу клинических признаков АФС составляют повторные венозные тромбозы, локализуемые наиболее часто в глубоких венах голеней, что может осложняться тромбоэмболией легочной артерии. Однако тромбозы могут развиваться также в поверхностных венах и в любом другом венозном бассейне. Артериальные тромбозы проявляются гангреной конечностей, инсультами, окклюзией аорты с асептическим некрозом головок бедренной кости, инфарктом миокарда, почек и других внутренних органов. Тромбы могут образоваться на клапанах и в полостях сердца. Кожные проявления заключаются в язвах на голенях, кровоизлияниях в подногтевом ложе и сетчатом ливедо. Сетчатое ливедо в виде поверхностной синеватой венозной сеточки на голенях и бедрах особенно хорошо видно после охлаждения.

Необъяснимые спонтанные аборты на ранних сроках или внутриутробная гибель плода во II-III триместрах могут возникнуть при АФС без или на фоне тяжелой преэклампсии. Тромбоцитопения при АФС умеренная, редко приводит к осложнениям и не требует назначения лечения. Однако идиопатическая тромбоцитопения, как и гемолитическая анемия, служат показанием к назначению лабораторных тестов, направленных на выявление антифосфолипидных антител. Клинический спектр симптомов, которые связывают с АФС, достаточно широк (табл. 17-24), большинство их них не были включены в итоговые критерии диагностики АФС (2006), но активно обсуждаются в литературе.

Таблица 17-24. Клинические признаки антифосфолипидного синдрома

Отдельную клиническую форму АФС представляет собой катастрофический АФС, или синдром Асерсона (Asherson’s syndrome), характеризующийся острой полиорганной недостаточностью из-за внезапного развития множественных тромбозов в микроциркуляторном русле различных органов. Опасность развития катастрофического синдрома выше у женщин с патологией беременности во время инфекционных заболеваний, травм, в том числе после даже нетяжелых хирургических вмешательств. Летальность при катастрофическом синдроме достигает 50% и существенно выше при таких осложнениях, как синдром диссеминированной коагуляции и/или системный воспалительный ответный синдром, которые наблюдают в 15-20% случаев при данной форме заболевания. В терапии катастрофического синдрома используют прямые антикоагулянты, обменные переливания замороженной плазмы, введение иммуноглобулина, высокие дозы стероидов, антибиотиков, анти-CD20 моноклональные антитела. Для профилактики осложнений при хроническом АФС назначают непрямые антикоагулянты, главным образом варфарин, для поддержания МНО в пределах 2,0-3,0, что уменьшает риск развития рецидивирующего венозного тромбоза на 80-90% независимо от наличия антифосфолипидных антител. У лиц, перенесших инсульт, с единственным положительным тестом ацетилсалициловая кислота и варфарин оказались одинаково эффективны в предупреждении повторных инсультов. Риск развития новых тромбозов умеренно увеличен до 10% в год у женщин с повторными потерями плода и оказывается более 10% у пациентов с венозными тромбозами, прекративших принимать антикоагулянты.

Серодиагностика АФС остается сложной проблемой. Положительные результаты определения АКЛА нередко отмечаются у клинически здоровых лиц, в том числе пожилого возраста, при нормально протекающей беременности и при воспалительных заболеваниях. В подавляющем большинстве подобных случаев присутствие антител в невысоком титре - преходящий феномен, не ведущий к формированию АФС, в этих случаях эпитоп отличен от эпитопа, типичного для АФС. Тесты АКЛА, антитела к β₂-ГП 1 и ВА предпочтительно выполнять совместно, так как в случае положительного результата всех тестов увеличивается прогностическая значимость обследования в отношении повторных тромбозов. Строгая значимая связь обнаружена в нескольких ретроспективных исследованиях между тромбозом и положительными результатами всех тестов (АКЛА, антитела к β₂-ГП 1 и ВА) по сравнению с больными, которые оказались положительными в отношении одного или двух тестов. Кроме того, имеются наблюдения, что пациенты с положительными результатами нескольких тестов сохраняют повышенные значения при повторных исследованиях, что повышает вероятность у них диагноза АФС. Проблема современной лабораторной диагностики заключается в том, что не все тесты в равной степени стандартизованы и чувствительны, недостаточно и качество межлабораторных и внутрилабораторных стандартов. Назначение антикоагулянтов препятствует обследованию пациентов. Так, АЧТВ нельзя использовать для скрининга ВА, если больной получает антикоагулянты по поводу имеющегося тромбоза.

Для иммунологического подтверждения АФС требуется в каждом случае проведение более одного теста, уровень антител должен был высоким, эти значения должны сохраняться при повторном исследовании через 12 нед. Однако имеются исключения. Так, при привычном невынашивании беременности с прогностической целью достаточно определения антител к кардиолипину. Важно, что, согласно существующим критериям диагностики АФС, для подтверждения этого аутоиммунного заболевания требуется обязательное сочетание хотя бы одного иммунологического и одного клинического признака.

Обнаружение антител к фосфолипидам и развитие вторичного АФС - сравнительно частое явление у больных СКВ. До 50% больных с волчанкой в стадии обострения имеют повышенное содержание АФА в крови. Высокие титры АФА обнаруживают у 20% больных СКВ, их присутствие сопровождается клиническими проявлениями АФС: повышенной частотой тромботических осложнений, значительным риском развития неврологических проявлений заболевания, синдрома Рейно и сетчатого ливедо. У больных СКВ, имеющих положительный ВА и АКЛА, наблюдают высокую частоту выкидышей, венозных и артериальных тромбозов, тромбоцитопении и анемии, легочной гипертензии и эндокардита Либмана-Сакса, сетчатого ливедо с или без кожных изъязвлений. Высокие титры АФА служат основой включения больного СКВ в группу риска по развитию тромботических осложнений.

В подавляющем числе случаев серологические маркеры АФС обнаруживают при СКВ, они относятся к случаям вторичного АФС при системных заболеваниях. Распространенность первичного АФС в популяции до настоящего времени не уточ нена и должна быть скорректирована в связи с неспецифичностью обнаружения АФА. У некоторой части пациентов формирование АФС может предшествовать появлению признаков первичного соединительнотканного заболевания, как СКВ, так и склеродермии, смешанного соединительнотканного заболевания, РА. Нужно включать определение АНФ в качестве обязательного серологического теста при обследовании пациентов с предполагаемым АФС. Частота поражения органа зрения при соединительнотканных заболеваниях требует включить в обследование на АФА для исключения данного синдрома больных с внезапными тромботическими поражениями сосудов глаз. Однако даже позитивные результаты выявления АФА требуют исключения других причин тромбоза, особенно в случае наличия других факторов риска, в том числе курения, гиперлипидемии, атеросклероза, варикозной болезни, приема пероральных контрацептивов.

РА представляет собой наиболее часто встречающееся воспалительное заболевание суставов. В североевропейской популяции его встречаемость достигает более 1%. РА представляет системное аутоиммунное заболевание, основным признаком которого является воспаление синовиальных оболочек суставов, характеризуется неумолимым прогрессирующим течением, хотя периоды ярких клинических проявлений чередуются с периодами относительного улучшения. Последствиями РА является деградация суставного хряща с последующей эрозией кости, приводящие к значительному разрушению сустава с потерей его функции. Помимо клинической картины деформирующего артрита, у 20% больных отмечают внесуставные проявления заболевания. Диагноз РА устанавливают на основании клинических данных, иммунологические тесты включены в качестве одного из 7 пунктов классификационных критериев РА Американского колледжа ревматологов (табл. 17-25).

Таблица 17-25. Классификационные критерии ревматоидного артрита 1988 г.

Классификация основывается на 7 критериях. Для постановки диагноза РА требуется 4 из 7 перечисленных критериев. Критерии 1-4 должны персистировать не менее 6 мес.

Иммунологическое обследование особенно актуально на ранних стадиях болез ни, когда оно является единственным доступным методом объективизации клинических предположений. Часто нетипичная клиническая картина в начале заболевания, например олигоартрит и отсутствие костных эрозий, несмотря на длительность жалоб пациента, а также тот факт, что применение активной терапии в дебюте заболевания может замедлить быстрое развитие деформаций суставов, делает лабораторные тесты чрезвычайно ценным инструментом дифференциальной диагностики. Корректный диагноз РА, поставленный на раннем этапе, служит основой эффективной иммуносупрессивной терапии.

Дешевизна и доступность определения РФ по-прежнему делают его первым серологическим тестом в обследовании пациентов с заболеваниями суставов. Определение РФ в клинических лабораториях основано на использовании методов латексагглютинации и турбидиметрии. Хотя турбидиметрия представляет собой более чувствительный метод, однако ее сравнительно высокая чувствительность снижает специфичность обследования. Целесообразно использовать в качестве скрининга латексный метод определения РФ, что значительно удешевляет обследование больных. При этом чувствительность латексного теста должна составлять не более 20-25 МЕ/мл. Положительные результаты латексных тестов необходимо подтвердить количественными турбидиметрическими методами.

Отсутствие РФ при первом обследовании не исключает диагноза серонегативного РА. Однократного определения РФ на ранней стадии РА, принесшего отрицательный результат, недостаточно для того, чтобы исключить ранний РА. Если диагноз РА подозревают или он даже клинически подтвержден при отрицательном результате теста по определению РФ, требуется повторное определение его титра через 12 мес для определения серопозитивной формы этого заболевания. Этот срок приблизительно соответствует времени обновления пула плазматических клеток, способных синтезировать аутоантитела. Если же будет получен положительный результат, то нет реальных предпосылок повторять определение РФ с течением времени.

Благодаря высокой специфичности наилучшими параметрами для ранней диагностики обладают АЦЦП, так как их выявление имеет высокий фактор риска, т.е. обнаружение повышает вероятность заболевания в 13 раз. В то же время максимальной чувствительностью обладают АМЦВ, поэтому они могут быть рекомендованы для скрининга РА и исключения диагноза при неясной клинической картине.

Хотя данные о применении RA33 в прогнозировании мягкого течения РА требуют дальнейшего подтверждения, антитела к RA33 могут быть использованы для диагностики серонегативного РА. Совместное использование антител RA33 и АМЦВ при серонегативном РА позволяет добиться чувствительности 81%.

Для оценки прогноза используют определение АКА, которые «предсказывают» развитие деструктивного процесса в суставах. Пациенты с высокими титрами АКА требуют более активной иммуносупрессивной терапии. Среди других методов оценки прогноза РА - исследование РФ класса IgA методом ИФА. Большое время полужизни сывороточного иммуноглобулина, а также постоянство иммунных ответов не позволяет использовать серологические маркеры для мониторинга течения заболевания.

Исходом РА является прогрессирующее снижение функциональной способности суставов, инвалидизация и сопутствующее снижение продолжительности жизни пациентов. Средняя продолжительность жизни больных РА, не получавших эффективного лечения, значительно меньше средней продолжительности жизни в сопоставимой популяции. В то же время агрессивность и скорость прогрессирования РА широко варьируют. Общепризнано, что это заболевание весьма гетерогенно - оно может протекать щадяще, в течение десятилетий не приводя к значимым деструкциям, у одних больных, в то время как у других анкилоз суставов и инвалидизирующие деструкции развиваются за несколько первых лет заболевания.

На утрату функции сустава влияет степень местного воспаления и возникновение признаков деструкции суставов. Персистирующее воспаление в суставной полости является основной причиной развития костных изменений. Важным прогностическим фактором считают раннее назначение базисной терапии, подавляющей специфические иммунные ответы и местное воспаление в суставах, а также препятствующее формированию органических изменений. Характерно, что с течением времени лабораторная и клиническая активность заболевания снижаются у большинства больных, в то время как выраженность костных изменений в суставах нарастает.

Причина такой гетерогенности определяется генетическими факторами и связана с определенным набором генов иммунной системы. Среди больных с РА отмечается высокая частота встречаемости гомозигот по HLA-DR4 и DR1-аллелям МНС, особенно B1*0401. Было обнаружено, что в генах HLA, ассоциированных с развитием РА, присутствует определенная последовательность аминокислот, так называемый общий эпитоп (shared epitope), которая входит в вариабельную петлю 3 (VR₃) β-цепи HLA II. Определение этого эпитопа может быть использовано в диагностике РА. Появление специфических аутоантител при РА определяется особенностями иммунной системы пациента и тесно связано с HLA-генотипом больного. Имеется тесная взаимосвязь между встречаемостью аллелей HLA-DR (DR4) и выявлением РФ, АЦЦП и антифилаггриновых антител. Аллель HLA-DRB1 04*01 обладает высокой аффинностью к цитруллинированным эпитопам филаггрина, что указывает на тесную связь между генотипом MHC и образованием АФА.

В то же время патогенетическая роль аутоантител при РА остается спорной. Существование серонегативных форм заболевания, значительные вариации в содержании аутоантител у больных не позволяют сделать однозначного заключения об их значении в поражении суставов. Тем не менее гуморальный иммунитет тесно связан с патогенезом РА, аутоантитела отражают определенные особенности патогенеза заболевания. Одним из наиболее «элегантных» доказательств важности гуморального иммунитета в патогенезе РА стал успешный опыт лечения больных РА с помощью ритуксимаба (МАБТЕРА) - терапевтического гуманизованного антитела, направленного против CD²⁰-маркера В-клеток. Элиминация В-клеток вызывает клинико-лабораторную ремиссию у 60% больных РА. Кроме того, наблюдалось снижение уровней аутоантител (РФ и АФА) в сыворотке крови, что тесно коррелировало с динамикой и активностью заболевания, и рецидив заболевания сопровождался увеличением титров сывороточных аутоантител.

Этот факт указывает на важность определения сывороточных концентраций аутоантител для оценки клинических и иммунопатогенетических особенностей заболевания. Наличие аутоантител при РА может отражать специфическую реактивность иммунной системы, серологический статус больного может определять особенности заболевания и указывать на его исход. Это делает возможным использование аутоантител для выделения группы больных с неблагоприятным прогнозом.

Общепризнанно, что серопозитивный по РФ РА характеризуется более тяжелым поражением суставов и чаще сопровождается экстрасуставными проявлениями по сравнению с серонегативным РА. Обнаружение РФ при РА в концентрации более 40 IU/мл в дебюте заболевания - один из факторов неблагоприятного прогноза РА, связанный с более ранним развитием суставных деструкций и инвалидизацией пациента, в то время как у серонегативных больных заболевание протекает более легко. Ревматоидные узелки и другие проявления васкулита отмечают исключительно у серопозитивных пациентов. Более того, инвалидизация и смертность от РА выше именно в группе серопозитивных больных. Все же частая встречаемость деструктивного полиартрита у пациентов без РФ указывает на недостатки использования РФ в качестве единственного маркера тяжести течения РА.

АЦЦП, по-видимому, присущи основные характеристики антифилаггриновых антител: они обнаруживаются на ранних стадиях РА и в целом более типичны для подгруппы больных с быстрым рентгенологическим прогрессированием. АЦЦП позволяют предсказать развитие деструкций приблизительно у 2/3 пациентов с деструктивным процессом и в сочетании с РФ представляют важный инструмент для распознавания больных РА с неблагоприятным прогнозом заболевания уже на этапе постановки диагноза.

Другим важным фактором является раннее назначение базисной терапии, получившее название «перевернутой терапевтической пирамиды», при которой более активные препараты назначают раньше. Время начала базисной терапии от момента возникновения симптомов заболевания является одним из основных факторов, влияющих на дальнейшее формирование деструкций суставов. Ранняя «агрессивная» терапия невозможна без достоверной диагностики РА. Базисные препараты небезопасны, их назначение связано с большим числом побочных эффектов. В то же время традиционно используемые критерии РА Американского колледжа ревматологов недостаточно чувствительны для диагностики раннего РА. Высокая встречаемость и прогностическое значение АЦЦП позволили включить их в разрабатываемые критерии раннего РА. Применение этих критериев позволяет как поставить диагноз РА, так и установить прогноз развития деструкций суставов, причем антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду обладают наибольшим удельным весом для диагностики эрозивного артрита. Таким образом, серологические тесты - одна из основных возможностей объективизации диагноза, они могут служить основой для раннего назначения высокоэффективной базисной терапии.

Ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА) представляет отдельную группу ревматических заболеваний. Основными маркерами ЮРА, особенно поли- и олигоартикулярной формы, служат РФ и АНФ. Серопозитивная по РФ полиартритическая форма ЮРА наиболее близко напоминает РА взрослых. При полиартритической форме ЮРА диагностические титры АНФ отмечают у 25% больных.

При олигоартикулярной форме ЮРА, особенно при раннем начале заболевания, АНФ встречается гораздо чаще, и его встречаемость достигает 70-80%. Эта форма заболевания возникает преимущественно у младенцев женского пола и сопровождается артритом и высоким риском развития аутоиммунного иридоциклита. Определение АНФ может быть использовано при дифференциальной диагностике гематогенного остеомиелита и олигоартикулярной формы ЮРА. Если увеличение сывороточных уровней острофазовых маркеров С-реактивного белка в сочетании с выраженной лихорадкой свидетельствует, скорее, о септическом поражении сустава у детей, то затяжное течение артрита с низким острофазовым ответом является показанием к определению АНФ. Наряду с АНФ и РФ при подозрении на ЮРА необходимо определять иммуноглобулины сыворотки, поскольку гипергаммаглобулинемия является независимым маркером ЮРА.

Спондилоартропатии представляют группу заболеваний, характеризующуюся поражением суставов осевого скелета. Совокупная встречаемость этих заболеваний в популяции составляет около 2%, что позволяет отнести их к одним из наиболее часто встречающихся ревматических заболеваний. Спондилоартропатии у детей и взрослых требуют иммуногенетического обследования для обнаружения антигена HLA-B27. Наиболее тесно ассоциированы с HLA-B27 анкилозирующий спондилит (95%), синдром Рейтера (80%) и недифференцированные спондилоартропатии (70%). При артритах на фоне воспалительных заболеваний кишечника, псориатическом артрите и реактивном артрите встречаемость HLA-B27 не превышает 30%.

Большинство спондилоартропатий возникает на фоне воспалительного поражения слизистой оболочки и кожных покровов, что ведет к увеличению объемов антигенного материала, поступающего из внешней среды. В основе иммунопатогенеза всех состояний лежит нарушение иммунологической толерантности при презентации антигенов, опосредованной HLA-B27. Присутствие генетической предрасположенности к заболеванию приводит к возникновению аутоиммунного артрита даже тогда, когда индуцирующий фактор уже перестал действовать.

Под аутоиммунными васкулитами понимают заболевания, связанные с некротизирующим воспалительным поражением сосудистой стенки без инфекционной или токсической причины. Васкулиты подразделяют на первичные и вторичные, которые возникают на фоне другого аутоиммунного заболевания. Хотя существует ряд удобных клинических классификаций васкулитов, общепринятой является международная классификация первичных васкулитов, разработанная в Чапелл-Хилл в 1994 г. Эта классификация дала определение 10 формам первичных васкулитов и подразделила их в соответствии с калибром поражаемых сосудов (см. табл. 17-13).

Однако, помимо морфологического значения, данная классификация предоставляет ключ к диагностике этих заболеваний с помощью иммунологических тестов (рис. 17-1). До недавнего времени отсутствие других диагностических подходов, кроме клинических и морфологических, в значительной мере затрудняло их выявление. Это нередко приводило к диагностическим ошибкам в связи с полиморфной клинической картиной и сходством симптоматики с системными заболеваниями соединительной ткани и другими неревматическими заболеваниями. Проведение иммунологического обследования на раннем этапе позволяет сократить время постановки окончательного диагноза и избавить от анализа зачастую неоднозначных клинических данных.

Рис. 17-1. Алгоритм использования иммунологических тестов в диагностике системных васкулитов

Абсолютно специфических серологических маркеров при этих заболеваниях не описано. Патогенез васкулитов крупных и средних сосудов опосредован преимущественно Т-клетками. Антиэндотелиальные антитела с различной частотой встречаются при аортоартериите Такаясу и болезни Кавасаки, а также при ряде васкулопатий, таких как гемолитико-уремический синдром, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Бехчета. Васкулиты крупных сосудов сопровождаются выраженным воспалительным ответом, установление которого представляет основу лабораторных методов их диагностики, наряду с морфологическим и инструментальным обследованием. Васкулиты сосудов среднего кали бра, прежде всего узелковый полиангиит, являются инфекционно зависимыми и не сопровождаются образованием специфических аутоантител. В соответствии с иммунопатогенезом васкулиты мелких сосудов могут быть подразделены на гранулематозные и иммунокомплексные.

Гранулематозные васкулиты мелких сосудов, включающие синдром Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросс, имеют ряд общих черт, к которым относят поражение почек по типу олигоиммунного экстракапиллярного гломерулонефрита с полулуниями, полиневрит и легочный капиллярит. Основным методом серологической диагностики гранулематозных васкулитов служит обнаружение АНЦА. Антитела этого семейства реагируют с белками азурофильных гранул нейтрофильных гранулоцитов. Значение АНЦА в патогенезе и диагностике гранулематозных васкулитов позволило выделить отдельную группу, обобщенную под названием «АНЦА-ассоциированные васкулиты». К ним относят гранулематоз Вегенера, синдром Черджа-Стросс, микроскопический полиартериит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями. К этой группе заболеваний иногда причисляют синдром Гудпасчера, поскольку АНЦА могут отмечаться у 10-15% пациентов с этим заболеванием совместно с антителами к базальной мембране клубочка, определение которых - основной лабораторный метод его диагностики. Хотя синдром Гудпасчера не является системным васкулитом, он характеризуется геморрагическим альвеолитом и быстропрогрессирующим гломерулонефритом, который сложно отличить от АНЦА-ассоциированного поражения почек. В связи с этим обнаружение АНЦА и антител к базальной мембране почек обычно используют совместно.

Иммунокомплексные васкулиты обусловлены образованием иммунных комплексов между аутоантителами и их антигенами в крови и сосудистой стенке. Иммунные комплексы, которые можно обнаружить в сыворотке крови, называют ЦИК. Предполагается, что снижение растворимости ЦИК приводит к их отложению в сосудистой стенке и развитию воспаления. Снижение растворимости при замедлении скорости кровотока и температуры приводит к тому, что иммунными комплексами поражаются преимущественно капилляры, прежде всего капилляры кожи. Криоглобулинемический васкулит сопровождается выходом в кровь особой разновидности ЦИК, которая требует специальных методических подходов для их обнаружения.

Отдельно выделяют методы, позволяющие обнаружить отложения иммунных комплексов и комплемента непосредственно в пораженной ткани. Определение отложений иммунных комплексов позволяет объективизировать иммунокомплексный процесс и обладает большей достоверностью по сравнению с методами выявления ЦИК.

В основе патогенеза васкулитов крупных сосудов, к которым относят аортоартериит Такаясу и височный артериит, а также ревматическую полимиалгию, лежит поражение сосудистой стенки, что обусловливает большую площадь вовлеченного эндотелия. Синтез эндотелием провоспалительных цитокинов, прежде всего TNF-α и IL-6, приводит к формированию выраженного острофазового ответа, исследование которого используют в диагностике васкулитов крупных сосудов. Так, при аортоартериите Такаясу, височном артериите и ревматической полимиалгии отмечают чрезвычайно высокие уровни С-реактивного белка и значительно повышенные значения СОЭ.

Диагноз ревматической полимиалгии и гигантоклеточного артериита ставят на основе обнаружения значительно повышенной СОЭ (до 100 мм/ч) при использовании метода Вестергрена и увеличения С-реактивного белка более 40 мг/мл. При височном артериите и ревматической полимиалгии только у 1% больных, не получавших специфической терапии, СОЭ и С-реактивный белок находятся в пределах нормы. СОЭ больше 30 мм/ч имеет место у 95% больных в активную фазу этих заболеваний и у 20% больных вне активности заболевания. На фоне иммуносупрессивной терапии уменьшение значений острофазовых реактантов происходит с различной скоростью. К примеру, при лечении височного артериита кортикостероидными гормонами уровни фибриногена и С-реактивного белка снижаются быстрее всего, у 70% больных они достигают нормальных значений в течение 2 нед от начала терапии. Изменение СОЭ происходит значительно медленнее, у половины больных этот показатель нормализуется через 2 нед после начала лечения. Нормальные значения СОЭ наблюдают через 5 нед у 75% больных. Скорость снижения СОЭ наиболее точно соответствует снижению активности височного артериита и ревматической полимиалгии, что позволяет использовать значения СОЭ для мониторинга активности заболевания и контроля терапии.

Узелковый полиартериит - редкая форма системных васкулитов. Он может развиться в течение 1 года после перенесенного вирусного гепатита В. Обычно происходит самоизлечивание, рецидивирует заболевание крайне редко. Несмотря на то что морфологически узелковый полиартериит проявляется гранулематозным воспалением, сходным с гранулемами при микроскопическом полиангиите, АНЦА и другие специфические серологические маркеры при классическом узелковом полиартериите отсутствуют. Обычно его обострение сопровождается гипокомплементемией, а также увеличением концентраций острофазовых белков. В сыворотке крови пациентов обычно обнаруживают признаки текущей ВГВ-инфекции в виде HBsAg и HBeAg.

Болезнь Кавасаки поражает преимущественно детей до 10 лет. Клинические симптомы включают лихорадку, лимфаденопатию, кожную сыпь, характерное покраснение языка и слизистой оболочки рта, а также васкулит, поражающий коронарные артерии. Большая часть случаев болезни Кавасаки возникает спорадически, однако описаны вспышки этого заболевания, которые указывают на ее инфекционный характер. Антиэндотелиальные антитела при этом заболевании отмечаются сравнительно часто и коррелируют с его активностью.

Гранулематозные васкулиты - группа заболеваний, морфологическая картина которых представлена образованием тканевых гранулем, ассоциированных с мелкими сосудами, а также поражением клубочка в виде некротизирующего олигоиммунного гломерулонефрита с полулуниями. Тесная взаимосвязь между обнаружением АНЦА и основными формами гранулематозных васкулитов и значение АНЦА в их патогенезе позволили обобщить их в виде группы АНЦА-ассоциированных васкулитов.

Цитоплазматический тип свечения АНЦА, обусловленный образованием антител к протеиназе-3, является чувствительным и специфичным маркером гранулематозного васкулита (ГВ), тяжелого заболевания, проявляющегося триадой с гранулематозным поражением носоглотки, дыхательных путей, легких и почек. Высокие титры антител к ПР-3/цАНЦА встречаются у 95% больных с развернутой картиной активного ГВ с поражением почек, в то время как локализованные формы ГВ, поражающие верхние дыхательные пути, реже сопровождаются аутоантителами. Встречаемость АНЦА при локализованных формах ГВ не превышает 50-60%. Несмотря на высокую специфичность выявления АНЦА при ГВ, цАНЦА могут встречаться при паранеопластическом и лекарственном васкулите.

Титры цАНЦА при ГВ являются клинически значимыми и коррелируют с актив ностью заболевания. Высокий титр служит основанием для патогенетической иммуносупрессивной терапии. Титр антител увеличивается в среднем за месяц до начала очередного обострения заболевания. У больных в фазе ремиссии титры антител очень низки или вообще не определяются. Ежемесячный мониторинг содержания цАНЦА может быть использован для предсказания рецидива заболевания, и патогенетическая терапия может предупредить развитие заболевания. Показано, что терапия, проводимая на основании мониторинга цАНЦА, способна эффективно предотвращать возникновение рецидивов ГВ.

Снижение титра аутоантител может занять до полугода, С-реактивный белок лучше отражает уменьшение активности аутоиммунного воспаления на фоне эффективной терапии. У пациентов с ГВ, у которых сохраняются высокие титры АНЦА, несмотря на проводимую иммуносупрессивную терапию, высок риск повторного обострения заболевания.

Преобладающей формой васкулитов у больных с пАНЦА/анти-МПО считают микроскопический полиангиит. По гистологической картине микроскопический полиангиит сходен с узелковым полиартериитом, но не сопровождается образованием гранулем и поражает сосуды мелкого калибра. Клинически он характеризуется сочетанным поражением легких и почек, представленным легочным капилляритом и экстракапиллярным гломерулонефритом с полулуниями. Кроме того, приблизительно у 1/3 больных с антителами к МПО отмечается изолированный олигоиммунный гломерулонефрит с полулуниями, который не сопровождается внепочечными проявлениями.

Как и в случае ГВ, титр пАНЦА/анти-МПО максимален во время активно протекающего гломерулонефрита. Затихание процесса или подавление активности васкулита при эффективной цитостатической терапии приводит к элиминации антител у 95% больных, причем у 75% больных сероконверсия происходит в тече ние ближайших 6 мес после достижения клинической ремиссии процесса.

Другая клиническая форма гранулематозных васкулитов, которая сопровождается пАНЦА/анти-МПО, - это синдром Черджа-Стросс. Клиническая симптоматика этого заболевания представлена легочным васкулитом с эозинофильными инфильтратами, астмой и гиперэозинофилией. Антитела к МПО выявляют у 75% больных. Помимо АНЦА, при этом заболевании часто обнаруживают антиэндотелиальные антитела и повышенные уровни эозинофильных катионных белков (ECP) в сыворотке крови.

Изолированный быстропрогрессирующий васкулит без признаков внепочечной патологии представляет отдельное заболевание в структуре гранулематозных васкулитов. Его следует дифференцировать от гломерулонефрита при синдроме Гудпасчера, при котором отсутствует образование гранулем.

Морфологически эти две формы полулунного гломерулонефрита очень схожи, однако при синдроме Гудпасчера присутствуют линейные отложения IgG по базальной мембране почек, которые соответствуют отложениям антител к базальной мембране клубочка. При АНЦА-ассоциированном гломерулонефрите, напротив, отложений иммуноглобулинов в клубочке не наблюдается, поэтому его называют олигоиммунным. АНЦА обнаруживают приблизительно у 75% пациентов с изолированным быстропрогрессирующим гломерулонефритом и у 15% больных также отмечают антитела к базальной мембране клубочков.

Как пАНЦА/МПО, так и цАНЦА/ПР-3 встречаются при быстропрогрессирующем гломерулонефрите с приблизительно одинаковой частотой. У небольшой категории больных с олигоиммунным гломерулонефритом с полулуниями антител к МПО и ПР-3 не обнаруживают, однако могут встречаться антитела к нейтрофильной эластазе.

Основным показанием для определения АНЦА в ревматологической и нефрологической практике принято считать подозрение на системный гранулематозный васкулит. Совокупная частота обнаружения основных разновидностей АНЦА при васкулитах представлена в табл. 17-26.

Таблица 17-26. Частота обнаружения антинейтрофильных цитоплазматических антител при гранулематозных васкулитах

Очевидно, что не существует абсолютной специфичности того или иного типа АНЦА при конкретных формах васкулитов. Замечено, что изолированные формы быстропрогрессирующего гломерулонефрита, сопровождающегося антителами к ПР-3, в целом протекают более агрессивно. В частности, наблюдается более быстрое снижение функции почек, чаще диагностируют экстраренальные проявления васкулита, в том числе образование тканевых гранулем. Также чаще отмеча ют обострения заболевания.

Показания к обследованию на АНЦА представлены в табл. 17-27.

Таблица 17-27. Диагностический алгоритм по применению определения антинейтрофильных цитоплазматических антител в клинической практике

После получения положительного ответа в методе непрямой иммунофлюоресценции должен быть выполнен иммуноферментный тест для установления конкретной специфичности АНЦА. Целесообразно одновременное исследование на АНФ и АНЦА, в случае высоких титров АНФ нужно проводить дифференциальную диагностику ДБСТ.

Развернутое серологическое обследование пациентов должно включать определение АНЦА, АНФ, а также антител к базальной мембране клубочка. При обнаружении АНЦА во флюоресцентном тесте необходимо выполнить подтверждающие тесты, включающие обнаружение антител к МПО и ПР-3. Обследование на АНФ позволяет избежать получения ложноположительных результатов пАНЦА, а также исключить наличие системного ревматического заболевания. Определение антител к БМК у больного с быстропрогрессирующим гломерулонефритом с изменениями на рентгенограмме легких или гемофтизе позволяет поставить диагноз в пользу синдрома Гудпасчера и назначить патогенетическую терапию.

Существует два возрастных пика развития быстропрогрессирующего гломерулонефрита, на 3-й и 7-й декаде. Синдром Гудпасчера с одинаковой частотой поражает женщин и мужчин, однако поражения легких чаще отмечают у мужчин. Среди больных с синдромом Гудпасчера 10-15% пациентов имеют пАНЦА.

Выявление аутоантител во многом определяет как терапевтическую тактику ведения пациентов с быстропрогрессирующим гломерулонефритом, так и общий прогноз заболевания. Худший прогноз относительно сохранности функции почек имеет место при обнаружении АНЦА к ПР-3, сравнительно лучший - при обнаружении антител к МПО.

Поскольку все гранулематозные васкулиты протекают с продромальным перио дом, который длится от нескольких месяцев до одного года, диагностика АНЦА, АНФ и антител к БМК должна входить в число лабораторных тестов для дифференциальной диагностики лихорадок неясного генеза. На продромальном этапе в клинической картине гранулематозных васкулитов лидирует полиневрит, который обнаруживают у 70-80% пациентов. Быстрое развитие почечной недостаточности и кровохарканье составляют основу клинической картины при обострении систем ных васкулитов и синдроме Гудпасчера. Часто клиническая симптоматика может развиваться более смазанно, включая появление легочных инфильтратов, гематурии, анемии и одышки. У пожилых пациентов отмечают плавное нарастание уремии. У больных с почечно-легочными синдромами необходимо проводить дифференциальную диагностику с другими формами вторичных гломерулонефритов, таких как постстрептококковый гломерулонефрит, пурпура Шенлейна-Геноха, СКВ и смешанная криоглобулинемия.

Возможно использование быстрых тестов для обнаружения антител к БМК, МПО и ПР-3 методом лайн-блота. Ряд хроматографических тестов позволяет получить результат в течение 15 мин непосредственно у постели больного. Эти тесты предназначены только для исключения заболевания в сомнительных случаях. Недостаточные показатели их специфичности и чувствительности требуют использования независимого развернутого лабораторного тестирования. Целесообразность их использования определяется важностью раннего начала терапии, так как в отсутствие лечения системных васкулитов и синдрома Гудпасчера смертность превышает 75%. В случае развития олигурии почечная функция восстанавливается редко, даже несмотря на эффективную иммуносупрессивную терапию. Быстрая диагностика синдрома Гудпасчера позволяет рано назначить плазмаферез, который является основой лечения этого заболевания. Если удалось добиться ремиссии синдрома Гудпасчера и исчезновения антител к базальной мембране клубочка, то заболевание редко рецидивирует. Среди пациентов с легочно-почечным синдромом менее чем в 20% случаев обнаруживают антитела к базальной мембране клубочка, у большинства определяют антитела к МПО и ПР-3.

Иммунокомплексные васкулиты поражают ткани с наибольшим капиллярным руслом, прежде всего капилляры кожи. При патоморфологическом исследовании при иммунокомплексных васкулитах имеет место выраженная лейкоцитарная инфильтрация дермы, что обычно описывается морфологами как лейкоцитокластический васкулит. Наиболее часто лейкоцитокластический васкулит характеризуется геморрагической пурпурой, разрешающейся с образованием характерной пигментации кожи, которая позволяет отличить ее от других разновидностей кож ных высыпаний. Другой формой иммунокомплексных кожных высыпаний является панникулит, или васкулит, протекающий в подкожной жировой клетчатке. Эта форма проявляется узловатой эритемой, ревматическими узелками, узелками Рандю-Ослера, Габердена.

Первичные иммунокомплексные васкулиты представлены тремя основными нозологическими формами, в том числе пурпурой Шенлейна-Геноха, криоглобулинемическим васкулитом и лейкоцитокластическими васкулитами. Большая часть лейкоцитокластических васкулитов является вторичной, возникает на фоне заболеваний, сопровождающихся поступлением в кровяное русло больших количеств экзогенного антигена. Этиологические причины лейкоцитокластических васкулитов чрезвычайно разнообразны (табл. 17-28).

Таблица 17-28. Основные причины вторичных иммунокомплексных васкулитов

Поражение микроциркуляторного русла кожи иммунокомплексными васкулитами обусловлено медленным кровотоком в капиллярах кожи, механической нагрузкой и снижением температуры. Все эти факторы способны нарушать растворимость иммунных комплексов и приводят к их преципитации на стенке сосудов. Иммунокомплексные васкулиты часто поражают сосуды нервов, что ведет к моно- или полиневриту. В тяжелых случаях может развиться поражение почек, причиной которого является избыточное содержание ЦИК в крови. Классические формы иммунокомплексного поражения почек - IgA-нефропатия при пурпуре Шенлейна-Геноха и мезангиокапиллярный гломерулонефрит при эссенциальной криоглобулинемии. При обследовании больших контингентов больных с острым иммунокомплексным васкулитом было установлено, что у 40% из них отмечаются изменения в мочевом осадке, у 30% - артралгии, у 5% - абдоминальный синдром. Воспалительная симптоматика, включая лихорадку и миалгии, присутствует только у 10% больных.

Пурпура Шенлейна-Геноха поражает преимущественно детей и подростков, однако ее признаки могут появиться в любом возрасте. Основным патогенетическим механизмом в развитии этого заболевания служит синтез аномального IgA, обладающего способностью к самоагрегации. В результате в мезангии клубочка и стенках мелких сосудов почки наблюдают выраженные отложения полимерного иммуноглобулина и комплемента. Обнаружение ЦИК при данном заболевании неинформативно. Основной метод диагностики пурпуры Шенлейна-Геноха - анализ биоптатов ткани с иммунофлюоресцентным исследованием, которое позволяет обнаружить отложения иммунных комплексов. В биоптате почки отмечается мембранозный гломерулонефрит с мезангиальными отложениями IgA и C3-компонента комплемента. Исследования биоптата кожи позволяют обнаружить гранулярные отложения IgA в стенках сосудов дермы.

Чаще всего выраженный лейкоцитокластический васкулит отмечается при эссенциальной смешанной криоглобулинемии, связанной с появлением в сыворотке крови криоглобулинов 2-го типа с активностью РФ. Основная причина эссенциальной криоглобулинемии - гепатит С, который часто протекает субклинически. Частота развития криоглобулинемии у больных гепатитом С составляет 10-15%. Персистенция вируса гепатита С в клетках ретикулоэндотелиальной системы ведет к поликлональной стимуляции иммунной системы и синтезу аутоантител. При эссенциальной смешанной криоглобулинемии РФ практически всегда присутствует в составе криопреципитата, как правило, в высоких титрах. Это позволяет использовать выявление РФ в качестве метода скрининга криоглобулинемии.

При эссенциальной криоглобулинемии имеется поражение кожи в виде пурпуры, преимущественно локализованной на коже нижних конечностей. Классическим клиническим признаком криоглобулинемии является триада Мельтцера, котораявключает пурпуру, артралгию и слабость, к ним нередко присоединяется гломерулонефрит и периферическая невропатия. Выраженность клинических признаков не зависит от абсолютного содержания криоглобулинов, так как даже незначительное количество криоглобулина может приводить к характерной клинической симптоматике. Динамика содержания криоглобулинов позволяет оценить эффективность проводимой патогенетической терапии, которая включает иммуносупрессивные и противовирусные препараты. Плазмаферез снижает количество криоглобулинов, однако не может быть использован в качестве монотерапии.

В диагностике иммунокомплексных васкулитов применяют и другие иммунологические тесты, в том числе определение содержания иммуноглобулинов сыворотки, компонентов комплемента и острофазовых реактантов. Нормальные показатели этих тестов не позволяют исключить диагноз иммунокомплексного васкулита.

Наблюдение за динамикой содержания ЦИК может быть использовано при оценке клинической активности иммунокомплексных заболеваний, поэтому должно выполняться периодически, наряду с определением СОЭ, С-реактивного белка. При СКВ и РА содержание ЦИК достоверно коррелирует с активностью процесса и может применяться с целью мониторинга состояния пациента. Одновременно с содержанием ЦИК необходимо выполнять тесты, оценивающие систему комплемента, такие как CH50, C3 и C4. Потребление комплемента, наряду с увеличением содержания ЦИК, служит признаком текущей активности иммунокомплексного васкулита и требует принятия активных мер.

Хотя аутоиммунные заболевания печени (АЗП) встречаются реже, чем вирусные гепатиты, вероятность наличия АЗП необходимо предполагать у каждого пациента, у которого отсутствуют серологические маркеры вирусных гепатитов или отмечается тяжесть клинической симптоматики, которая не характерна для обычной клинической картины вирусного гепатита. Другой причиной обследования для обнаружения серологических маркеров АЗП является дифференциальная диагностика с другими невирусными заболеваниями печени, в том числе с метаболическими поражениями и онкологическими заболеваниями желчевыводящих путей.

Основным серологическим методом диагностики АЗП принято считать НРИФ с использованием «тройного субстрата», который включает криосрезы печени-почки-желудка крысы. В иностранной литературе его часто назвают LKS-субстрат, по первым буквам английских названий органов «liver-kidney-stomach». Нередко поставщики предлагают все три субстрата для НРИФ в одном криосрезе, что облегчает визуализацию положительных реакций.

Комбинированный метод LKS-субстрата позволяет провести в одной реакции скрининг наиболее часто встречающихся аутоантител, поэтому может быть использован для первичного обследования больных с разными АИЗ. В случае применения этого метода в одной реакции можно выявить, включая АНФ, антитела к гладким мышцам, антитела к митохондриям, антитела к LKM и антитела к обкладочным клеткам желудка. Другой причиной использования комбинированного субстрата является удобство идентификации аутоантител. Действительно, антитела к митохондриям и антитела к обкладочным клеткам желудка практически идентично реагируют со слизистой оболочкой желудка. В то же время антитела к митохондриям реагируют с богатыми митохондриями клетками канальцев почки и гепатоцитами, а антитела к обкладочным клеткам эти клетки не окрашивают (табл. 17-29). Тестирование на LKS-субстрате целесообразно дополнять другими серологическими тестами для определения аутоантител (рис. 17-2).

Рис. 17-2. Алгоритм обследования больных с подозрением на аутоиммунное заболевание печени

Таблица 17-29. Использование криосрезов LKS-субстрата тканей крысы в методе непрямой иммунофлюоресценции для обнаружения аутоантител при а утоиммунных заболеваниях печени

Аутоиммунный гепатит (АИГ) 1-го типа - редкое заболевание с популяционной частотой около 0,01%, встречается у лиц возраста 15-40 лет, носителей HLA-B8 и DR3, несколько чаще - у женщин. Иногда АИГ сочетается с другими аутоиммунными заболеваниями, в том числе с НЯК, РА, вторичным «сухим синдромом» и аутоиммунными полиэндокринопатиями. АИГ 1-го типа протекает с выраженной поликлональной активацией иммунной системы, которая встречается при ограниченном числе заболеваний, включая СКВ и СШ. Иммунологическая диагностика основана на определении АНФ, АГМА и повышенных концентрациях IgG сыворотки. Поскольку эти маркеры встречаются чаще всего, их выявление называют «диагностической триадой» АИГ (табл. 17-30).

Таблица 17-30. Диагностические критерии аутоиммунного гепатита

^* - при выявлении хотя бы одного аутоантитела в титре выше диагностической границы присваивается 2 балла.

Клиническая картина этого заболевания развивается постепенно, с появлением дурноты, слабости, потери аппетита, миалгиями, желтухой и кожными высыпаниями. Клинические симптомы сопровождаются значительным увеличением активности трансаминаз и высокими иммуноглобулинами сыворотки крови. В гистологической картине АИГ 1-го типа присутствует лимфоцитарная инфильтра ция портальных трактов, некрозы в центре печеночных долек. Характерно хроническое течение с частыми обострениями, которые без лечения приводят к развитию цирроза. Обычно АИГ быстро и эффективно контролируется стероидными гормонами, поэтому при ранней диагностике имеет хороший прогноз. На фоне адекватной иммуносупрессивной терапии титры АГМА постепенно снижаются, однако мониторинг этого показателя не рекомендован.

ПБЦ поражает женщин в 10 раз чаще, чем мужчин, причем частота заболевания растет с увеличением возраста. В связи с отсутствием эффективной терапии и быстрой прогрессией заболевания ПБЦ остается основной причиной пересадки печени в европейских странах. У подавляющего числа больных ПБЦ (95%) в сыворотке крови можно обнаружить АМА-М2, направленные к пируват-декарбоксилазному комплексу. Очень небольшое количество больных ПБЦ являются серонегативными, что делает АМА одним из наиболее надежных методов диагностики этого заболевания. Урсодезоксихолиевая кислота (Урсофальк), которую используют для лечения ПБЦ, несколько снижает титры АМА. АНФ определяют у 60-80% больных ПБЦ, причем в 1/3 случаев он обладает характерным типом свечения «точек в ядре». Антигенами этой разновидности АНФ являются белковые антигены sp100 и PML.

Первичный склерозирующий холангит (ПСХ), в отличие от ПБЦ, поражает преимущественно мужчин среднего возраста. Нередко холангит развивается на фоне НЯК, что роднит оба заболевания. Как и при язвенном колите, при ПСХ обнаруживают АНЦА, которые можно зафиксировать у 60-70% пациентов. Для диагностики ПСХ может быть использовано выявление АНФ и АНЦА, которые отмечаются у 50-60% больных.

Использование метода НРИФ на тройном LKS-субстрате позволяет также выявлять случаи аутоиммунного гастрита, который сопровождается аутоиммунными эндокринопатиями. Обнаружение антител к фактору Кастла у больного с высоким титром антител к париетальным клеткам желудка может указывать на высокий риск развития В₁₂-дефицита с характерными гематологическими и неврологическими признаками.

Целиакия - иммуноопосредованная непереносимость α-глиадина - белка, который является основным белком клейковины злаковых культур. Наряду с дефицитом лактазы и пищевыми аллергиями целиакия является наиболее частой причиной пищевой непереносимости. Целиакия сопровождается рядом кожных проявлений, в том числе герпетиформным дерматитом.

Высокая чувствительность ИФА тест-систем для определения антител к ТТГ позволила значительно улучшить диагностику целиакии, особенно ее асимптоматичных форм. Популяционные исследования показали, что в Северной Европе 0,5-1% населения имеют стертые признаки этого заболевания. Действительно, у многих больных целиакией отсутствует типичная клиническая картина, включаю щая диарею, повышенное газообразование, запор, однако большинство проблем связано с мальабсорбцией, в том числе с железодефицитом, остеопенией, плохой эмалью зубов и рядом других расстройств метаболизма. С повышенной частотой целиакия отмечается у больных с эндокринными заболеваниями, такими как СД I, аутоиммунный тиреоидит, а также при селективном IgA-дефиците и синдроме Дауна.

Для первичной диагностики целиакии рекомендуется сочетанное выявление анти-ТТГ класса IgA, а также определение сывороточной концентрации IgA для установления лиц с IgA-дефицитом. В связи с большей специфичностью АЭА после положительного результата анти-ТТГ IgA теста целесообразно определение АЭА. Положительный результат обоих тестов почти со 100% вероятностью указывает на целиакию. В случае отрицательного АЭА-теста результат рассматривают как сомнительный, и может быть рекомендовано определение генотипа HLA-DQ2/8. Определение антител к ТТГ класса IgG целесообразно только у больных с IgA-дефицитом, так как у лиц c нормальным уровнем IgA в крови результаты этого теста малоспецифичны. У большинства лиц с предрасположенностью к целиакии, не ограниченных в потреблении глиадин-содержащих продуктов, появление антител к ТТГ происходит в возрасте 4-5 лет.

Антитела к глиадину IgA/G остаются тестом резерва, поскольку обладают большим числом ложноположительных результатов. Одним из вариантов их клинического использования может быть диагностика целиакии в возрасте моложе 5 лет, до образования антител к ТТГ и АЭА.

После серологической оценки у серопозитивных пациентов необходимо выполнение биопсии тонкого кишечника. У небольшого числа лиц с анти-ТТГ и АЭА признаки хронического воспаления могут отсутствовать, что служит основанием для диагностики у них «скрытой целиакии» и долгосрочного мониторинга. У большинства серопозитивных людей аутоантитела могут быть обнаружены за несколько лет до развития клинической симптоматики.

Безглютеновая диета остается основным методом лечения целиакии. Ее соблюдение в течение года приводит как к исчезновению симптоматики, так и к выраженному снижению титров аутоантител.

Контроль диетотерапии несколько удобнее проводить с помощью аТТГ, поскольку тесты имеют количественный результат. Целесообразность определения антител класса IgG диктуется высокой частотой встречаемости целиакии у лиц с селективным дефицитом продукции IgA. В этой группе (1:400-1:1000 популяции) снижена или отсутствует продукция IgA, поэтому необходимо определение антител других классов.

Герпетиформный дерматит представляет собой заболевание, часто возникающее на фоне целиакии. Его ведущим симптомом являются зудящие везикулярные высыпания на разгибательных поверхностях. При выполнении пРИФ на биоптатах кожи больных герпетиформным дерматитом отмечают отложения IgA на вершинах сосочков кожи. В сыворотке крови больных герпетиформным дерматитом можно обнаружить все характерные для целиакии антитела, включая глиадиновые, ретикулиновые, эндомизиальные и антитела к тканевой трансглутаминазе.

Распространение диабета в развитых странах быстро растет. Согласно данным Международной диабетической федерации (IDF), в настоящее время 194 млн (5,1%) взрослых лиц 20-79 лет страдают диабетом, и к 2025 г. это число возрастет до 280 млн человек. Наибольшая распространенность зафиксирована в США (7,9%) и Европе (7,8%). СД II типа (СД II) составляет 85-95% всех случаев диабета. Примерно 49 млн больных имеют СД I, в том числе дети и подростки. Эти данные определяют огромную важность лабораторной диагностики и определения прогноза этого тяжелого заболевания. Хотя основное внимание фокусируется на росте заболеваемости СД II, параллельно растет и число случаев СД I. Зачастую дифференциальная диагностика между СД I и СД II не представляет проблемы. Однако, наряду с типичными проявлениями СД I в виде острого начала и похудания, чаще отмечается стертая картина у полных людей и пациентов с медленным развитием симптоматики. Распространение ожирения в развитых странах приводит к росту заболеваемости СД II как у подростков, так и у детей. Именно поэтому клиническое значение диабетических аутоантител с течением времени только нарастает.

Клинические признаки СД I являются исходом аутоиммуно-обусловленного разрушения β-клеток без видимых повреждений соседних эндокринных островковых клеток. К началу заболевания уже разрушено 80-90% β-клеток. При диабете концентрации всех разновидностей аутоантител максимальны к моменту клинического дебюта. Встречаемость аутоантител значительно снижается в течение 1 года заболевания, что соответствует прогрессивной аутоиммунной деструкции островков. Феномен исчезновения аутоантител с прогрессией заболевания при сахарном диабете уникален для всех АИЗ, при которых титры аутоантител обычно повышаются с увеличением активности и длительности заболевания. Этот феномен плохо исследован, и исчезновение аутоантител сложно объяснить. Несомненно, что снижение титров АОК характеризуется снижением остаточной функции β-клеток. В то же время на фоне заболевания показана способность островков к саморегенерации и синтезу небольшого количества эндогенного инсулина в течение заболевания у большинства больных.

Аутоиммунный диабет имеет выраженный наследственный компонент. Так, риск развития диабета у однояйцевого близнеца составляет 30%, риск развития диабета при заболевании близкого родственника - 10%. Использование аутоантител позволяет уточнить риски развития заболевания и является основой исследований для предупреждения развития СД I.

Для прогнозирования развития диабета применяют комбинированное определение АОК, ГДК65, IА-2 и инсулина. Аутоантитела против островковых аутоантигенов имеют специфичность около 100% с чувствительностью 60-80%, в зависимости от исследуемой популяции и возраста. В отличие от других аутоантител, встречаемость островковых аутоантител выше у детей и подростков и значительно снижается к 20-летнему возрасту. Более чем у 95% детей находят, по меньшей мере, одну разновидность аутоантител в дебюте диабета, и более 90% из них имеют несколько типов аутоантител. Обнаружение у ребенка нескольких разновидностей островковых аутоантител прогнозирует приблизительно на 50% риск развития СД I в пределах 5 лет и 80% в пределах 10 лет.

Наиболее широко используемой скринирующей стратегией для уточнения риска у родственников больного СД I - сестер, братьев и детей - является определение у последних аутоантител к ГДК65 и IA-2. Если один из этих скринирующих тестов оказывается позитивным, определяют антитела к инсулину и островковые аутоантитела, а также толерантность к глюкозе. Такой подход позволяет предсказать развитие СД I с точностью до 90% в пределах 5-10 лет. Было показано, что родственники первой линии, позитивные только по одному аутоантителу, имели риск развития СД I примерно 10-20% в течение 5 лет. В исследовании DPT-1 98% родственников первой степени родства, у которых развился СД I, имели одно антитело или более, и 80% имели два и более типа аутоантител. Таким образом, 2 обнаруженных аутоантитела свидетельствуют о 5-летнем риске около 70%, а 3 аутоантитела указывают на 100% 5-летний риск развития СД I.

Островковые аутоантитела, определяемые при родах у женщин, уточняют риск развития СД после родов. Риск СД I после родов прогрессивно увеличивается с 17% для одного типа аутоантител до 61% для двух и, наконец, до 84% для трех типов аутоантител. На ранних стадиях заболевания обнаруживают антитела к ГКД65 и инсулину.

Успешный метод исследования для предупреждения развития СД I пока не обнаружен. На сегодняшний день нет успешных результатов превентивного лечения СД I у человека, несмотря на разработку ряда эффективных методов в экспериментах на животных. Продолжаются исследования, направленные на первичную профилактику диабета у ближайших родственников. Работа в этом направлении также должна помочь установить факторы внешней среды и предложить превентивные мероприятия для всех АИЗ.

Полиэндокринопатии (ПЭП) представляют собой сочетание одной аутоиммунной эндокринопатии с другой или с ассоциированным аутоиммунным заболеванием. Выделяют несколько типов ПЭП, которые иногда делят на ПЭП детей (1 тип) и ПЭП взрослых (2 и 3 типы). В основе ПЭП 1-го и 2-го типов лежит комбинация недостаточности коры надпочечников с тиреопатией или СД I. Однако ПЭП 1 и ПЭП 2 отличаются между собой по возрасту дебюта (до 20 и после 20 лет соответственно), комбинации синдромов и типов наследования. Эти заболевания также носят название синдромов Шмидта и Карпентера. Наиболее частый, 3 тип, ПЭП включает другие сочетания эндокринопатий между собой и эндокринопатий с другими аутоиммунными заболеваниям, такими как целиакия, витилиго, алопеция, аутоиммунный гастрит, АИГ. Характерно, что их реальная частота в десятки раз превосходит расчетную, основанную на случайном сочетании эндокринопатий. Так, встречаемость антител к тиреопероксидазе у больных СД I составляет около 10%, с ежегодным риском развития тиреоидита - 10-20%.

Помимо поражения надпочечников, СД I и тиреопатии, ПЭП 1 характеризуется клинической картиной кандидоза, гипопаратиреоидизма и гипогонадизма. Иммунодефицит, который приводит к рецидивирующему кандидозу слизистых оболочек, обычно дебютирует первым, после чего присоединяется гипопаратиреоидизм.

До 1% людей в европейской популяции имеют ПЭП, преимущественно 3 тип заболевания. Пик заболеваемости ПЭП 2 и 3 приходится на 3-4-ю декаду жизни, и преобладают они у женщин. При ПЭП взрослых дебюты отдельных эндокринопатий могут быть разделены несколькими годами, что затрудняет клиническую диагностику.

Существует выраженная наследственная предрасположенность к развитию всех типов ПЭП, которая связана с генами иммунного ответа. Хотя ПЭП взрослых имеет полигенный характер, гены HLA играют основную роль в наследованииэтого заболевания. В отличие от взрослой формы, ПЭП 1-го типа является моногенным заболеванием с аутосомно-рецессивным вариантом наследования.

Наиболее часто синдромы ПЭП диагностируют на фоне СД I. Среди больных СД I до 1/4 пациентов имеют клинические признаки другого эндокринного или аутоиммунного заболевания. Наиболее частые сочетания эндокринопатий представлены СД I и тиреопатиями (15%), тиреопатиями, витилиго и аутоиммунным гастритом (10%). Реже отмечаются сочетания СД I и витилиго, тиреопатий и надпочечниковой недостаточности, гипогонадизма и алопеции и, наконец, СД и надпочечниковой недостаточности.

Диагностика синдромов ПЭП основана на серологическом исследовании и оценке функции соответствующих эндокринных желез. Обнаружение аутоантител у пациентов, а также их родственников с любой формой эндокринопатии позволяет предсказать развитие заболевания и уточнить группы риска. Повторное тестирование каждые 3-5 лет позволяет обеспечить достаточную уверенность. Перечень серологических маркеров для клинического использования приведен в табл. 17-31.

Таблица 17-31. Лабораторное обследование при аутоиммунных полиэндокринопатиях

Примечание. ТТГ - тиреотропный гормон, АКТГ - адренокортикотропный гормон, ФСГ - фолликулостимулирующий гормон, ЛГ - лютеинизирующий гормон, ГГТП - γ-глутаматтранспептидаза.

Диабет дебютирует до надпочечниковой недостаточности. Детей с СД I целесообразно обследовать на предмет наличия антител к тканевой трансглутаминазе и эндомизию, чтобы уточнить наличие субклинической формы целиакии. При надпочечниковой недостаточности целесообразно повторное тестирование на антитела к ТПО, ГДКА65, АОК. В случае обнаружения аутоантител к островковым антигенам может быть рекомендовано проведение глюкозотолерантного теста даже при нормальных показателях глюкозы натощак. Встречаемость антител к обкладочным клеткам желудка отмечается у больных с тиреоидитом и составляет 20-40%, что позволяет использовать этот тест для скрининга ПЭП у больных с аутоиммунными эндокринопатиями.

Для иммунологической диагностики заболеваний, поражающих разные отделы нервной системы, используют широкий спектр тестов (табл. 17-32). РС и другие демиелинизирующие поражения ЦНС обусловлены иммунной реакцией, протекающей за гистогематическим барьером. В этом случае иммунный ответ протекает местно, что делает невозможным его обнаружение в периферической крови. При этом заболевании наблюдается повышенный синтез иммуноглобулинов за гистогематическим барьером, кроме того, вновь синтезируемые иммуноглобулины приобретают новые свойства, прежде всего они становятся олигоклональными, что отличает их от поликлональных иммуноглобулинов, синтезирующихся в норме или при остром воспалительном ответе. Выявление олигоклонального IgG в СМЖ позволяет проводить дифференциальную диагностику демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы. Иммунологический анализ СМЖ - основа диагностики воспалительных процессов за гематоэнцефалическим барьером.

Таблица 17-32. Диагностика аутоиммунных неврологических заболеваний

Антитела к нейронам встречаются в системной циркуляции при редких паранеопластических поражениях ЦНС. В этом случае за счет перекрестной реакции системный противоопухолевый иммунный ответ поражает нервную ткань. Другим вариантом аутоантител, направленных против компонентов нервной ткани, являются антитела к ганглиозидам. Разрушая миелиновую оболочку нервов, они приводят к развитию демиелинизирующих полирадикулоневропатий и периферических полиневритов. При обследовании пациентов с полиневритами следует использовать иммунологические тесты для диагностики ДБСТ и васкулитов, так как ревматические заболевания нередко дебютируют с картины периферического моно- или полиневрита.

Миастения - нервно-мышечное заболевание, при котором аутоантитела к АхР и другим антигенам скелетной мышцы приводят к нарушениям нервно-мышечной передачи. В отличие от миастении, при воспалительных миопатиях в циркуляции можно обнаружить ряд АНА.

Среди аутоиммунных состояний с поражением кожи можно выделить 4 основные группы (табл. 17-33): системные заболевания с преимущественным поражением кожи, реакции против интраэпидермальных антигенов, буллезные дерматозы с реакциями против антигенов базальной мембраны кожи, заболевания с реакциями против антигенов дермы.

Таблица 17-33. Классификация аутоантител при поражениях кожи на фоне аутоиммунных заболеваний

Примечание. BPAG - bullous pemphigoid antigen (англ.) - антиген буллезного пемфигоида.

Из-за большой поверхности кожи и ее богатого сосудистого русла поражения кожи возникают при многих АИЗ и васкулитах. Кожа часто поражается при волчанке, склеродермии, дерматомиозите и васкулитах. Апоптоз клеток кожи является одним из индукторов аутоиммунных реакций, связанных с образованием АНА. Именно поэтому большинство разновидностей АНА при системных заболеваниях имеют взаимосвязь с различными кожными проявлениями.

Большую группу заболеваний кожи составляют пузырные дерматозы. Деление на пузырчатку (pemphigus) и пемфигоид основано на локализации пузырьков в толще эпидермиса или по базальной мембране, что обусловливает ряд морфологических и клинических феноменов, характерных для этих заболеваний. К буллезным дерматозам с субэпидермальной везикуляцией причисляют также многоформную эритему, буллезный эпидермолиз и herpes gestationis, который представляет собой кожное проявление целиакии. Еще одно аутоиммунное заболевание, сопровождающееся изолированной иммунной реакцией против эпителиальных клеток, - это витилиго.

Аутоантитела встречаются при всех АИЗ с поражением кожи, что определяет их значение в диагностике. В состав лабораторно-клинического обследования больных с кожными заболеваниями должна входить биопсия кожи с прямой РИФ (пРИФ). Благодаря легкости получения материала и четкому морфологическому строению, изучение отложений иммуноглобулинов и факторов комплемента в биоптатах кожи очень информативно и должно проводиться в комплексе с серологическим исследованием.

пРИФ биоптатов непораженной кожи в диагностике пузырных дерматозов обладает почти 100% чувствительностью и является золотым стандартом обследования. Оно весьма информативно, так как позволяет обнаружить изменения, характерные для основных АИЗ кожи. Исследуют уже существующие отложения иммуноглобулинов и комплемента в структурах кожи. В отличие от морфологической оценки высыпного элемента с помощью световой микроскопии, для пРИФ необходим участок с полностью сохраненной морфологией кожи. Рекомендуется взятие биопсии при помощи одноразовых дерматологических «пробойников» диаметром 3-4 мм, при использовании которых косметический дефект минимален. Биопсию доставляют в лабораторию в специальной транспортной среде Михаэлиса, содержащей стабилизаторы иммуноглобулинов.

При иммунофлюоресцентном исследовании биопсии кожи могут быть обнаружены антитела к межклеточным контактам (пузырчатка), базальной мембране (пемфигоид, пемфигоид беременных, линейный IgA-дерматоз, пемфигоид слизистых оболочек, буллезный эпидермолиз), IgA в сосочках при герпетиформном дерматите Дюринга, «волчаночная полоска» IgM/IgG по базальной мембране, отложения IgA в сосудах дермы при пурпуре Шенлейна-Геноха. Основные диагностические находки при биопсии кожи перечислены в табл. 17-34.

Таблица 17-34. Основные диагностические феномены при проведении реакции прямой иммунофлюоресценции биоптата кожи

Лабораторные иммунологические тесты охватывают весь спектр клинических задач, касающихся вопросов диагностики, назначения терапии и прогноза аутоим мунных заболеваний (табл. 17-35). Однако ни один тест, как клинический, так и лабораторный, не может рассматриваться изолированно, в отрыве от совокупной клинико-лабораторной картины заболевания.

Таблица 17-35. Клиническое применение иммунологических лабораторных тестов

Информативность и надежность данных иммунологического теста во многом зависят от взаимодействия клинициста и сотрудника лаборатории. Врач должен знать основы лабораторных методов, их недостатки и преимущества. Тесная связь между клиницистом и врачом клинической лабораторной диагностики позволяет улучшить точность диагностики, установить «слабые места» лабораторной службы и способствовать их устранению. Только активное сотрудничество с иммунологической лабораторией способно обеспечить клиницисту надежные, осознанные результаты анализов и повысить эффективность их использования в клинической практике.

Иммуногематология - учение об антигенах клеток крови и антителах к ним. Клетки крови и плазма характеризуются огромным разнообразием антигенов: антигены лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, нейтрофилов, плазменных белков; набор у каждого человека строго индивидуален. Поэтому в клинических ситуациях, подразумевающих возможность контакта человека с чужеродными для него антигенами других людей, иммуногематологические знания необходимы. Антигенную совместимость надо учитывать в трансфузиологии при переливании крови или гемокомпонентов, в трансплантологии - при пересадке органов и тканей, в акушерстве - при беременности.

Абсолютно идентичных индивидуумов не бывает (исключение - однояйцовые близнецы), поэтому любая трансфузия, трансплантация, беременность сопровождаются сенсибилизацией теми или иными антигенами. Конечный результат сенсибилизации - выработка антител к чужеродным антигенам. Взаимодействие антител и антигенов приводит к активации, инактивации или гибели клеток, несущих соответствующие антигены. Клиническими проявлениями подобных реакций являются посттрансфузионные реакции и осложнения, отторжение трансплантата, гемолитическая болезнь плода и новорожденного и другие патологические состояния. В связи с этим выполнение любого вида гемокомпонентной терапии или аллогенной трансплантации органов и тканей должно сопровождаться соответствующими иммуногематологическими исследованиями крови доноров и реципиентов. Такие же исследования необходимо выполнять при каждой беременности и родах для крови матери и ребенка.

Полный спектр антигенов клеток крови определить невозможно, что вносит ограничения для иммуногематологической апробации крови донора и реципиента, включающей только те антигены и антитела, клиническим значением которых пренебречь невозможно. Прежде всего это антигены эритроцитов, несовместимость по которым может стать причиной серьезных гемолитических конфликтов - мать-плод или реципиент-донор.

Изучение антигенов эритроцитов и анализ иммуногенных свойств показали их различную способность к сенсибилизации в процессе трансфузий или при беременности. Расположив частоту встречаемости антител к антигенам эритроцитов в убывающем порядке, получили шкалу иммуногенности антигенов эритроцитов, которую также можно назвать шкалой приоритета трансфузионно опасных эритроцитарных антигенов. В настоящее время шкала с учетом только основных клинически значимых антигенов систем AB0, Резус и Келл выглядит следующим образом: А, В > D > K > c > C > E > e.

Система АВ0 состоит из двух основных компонентов - антигенов А и В, пред ставленных на эритроцитах как по одному, так и вместе - группы А (II), B (III), AB (IV); отсутствие антигенов на мембране эритроцитов обозначают символом «0» - группа 0 (I). Уникальное свойство системы AB0 - наличие в норме антител к отсутствующим антигенам. Эти антитела называют изогемагглютининами анти-А, анти-В (или устаревшее обозначение α и β). Сочетание антигенов А и В на эритроцитах и антител к ним в сыворотке крови человека определяет его принадлежность к четырем основным группам крови (табл. 18-1).

Таблица 18-1. Основные группы крови человека системы AB0

Антигены А и В представляют собой неоднородные структуры, определяющие наличие большого количества вариантов антигенов системы AB0. Так, структуру антигена А описывают более чем 30 вариантами: А₁, А₂, А₃, А₄ …​ А₂₇, А_х, А_end и др.

На эритроцитах могут быть представлены только некоторые из перечисленных вариантов антигена; при этом возможна выработка антител к отсутствующим частям антигенной мозаики. Наиболее иммуногенна часть А₁; при ее обнаружении

на эритроцитах человека говорят о второй А(II) или четвертой АВ(IV) группе крови. Диагностика подгруппы А₂ возможна только при использовании специаль ного реагента - анти-А₁. В случаях наличия антигена А без выявления варианта А₁ - обобщенный вариант А₂, обозначается подгруппой А₂ (II) или А₂ В(IV) соот ветственно. Выявляемые антитела к отсутствующим частям антигена А(А₁) называют экстрагглютининами и обозначают как анти-А₁ или α₁.

Возможное присутствие у реципиентов с подгруппой А₂ экстрагглютинина анти-А₁ обусловливает назначение им гемокомпонентов с обязательным исключением антигена А. Реципиентам с А₂ (II) назначают эритроцитсодержащие гемокомпоненты группы 0(I), а реципиентам с А₂ В(IV) - группы B (III) или 0(I). При невозможности выбора указанных гемокомпонентов трансфузии эритроцитсодержащих сред группы крови А(II) или АВ(IV) проводят, только используя метод индивидуального подбора.

Система состоит из 75 антигенов, каждый из которых имеет различное клиническое значение. Выделяют 5 наиболее важных антигенов системы Резус (Rh): D, C, c, E, e. Самый сильный иммуноген системы - антиген D. Термины «резус-положительный» и «резус-отрицательный» относят к наличию или отсутствию антигена D на мембране эритроцита индивидуума. Распространенность антигена Rh (D) в европейской популяции составляет 85%. Rh(D)-отрицательное население России составляет 15%. В связи с тем что антиген D системы Резус обладает сильными антигенными свойствами, его определение обязательно как для доноров, так и для реципиентов гемокомпонентов, наряду с определением группы крови системы AB0. В отличие от системы AB0, в норме к отсутствующим антигенам системы Резус (в том числе и антигену D) антитела не вырабатываются. Для выра ботки антител обязательно должен произойти контакт клеток иммунной системы с чужеродным антигеном (сенсибилизация), что возможно при трансфузии несовместимой по этому антигену крови или антиген-конфликтной беременности. При повторном контакте с антигеном, вызвавшим сенсибилизацию, вырабатываются антитела, приводящие к серьезным гемолитическим посттрансфузионным осложнениям и гемолитической болезни плода и новорожденного. Реципиентам с антигеном D обычно переливают Rh(D)-положительные гемокомпоненты, хотя с учетом всех клинически значимых антигенов системы Резус (С, с, Е, е) возможно использование и Rh(D)-отрицательных трансфузионных сред. Rh (D)-отрицательным реципиентам для предотвращения иммунизации и последующих тяжелых осложнений назначают трансфузии только Rh(D)-отрицательных гемокомпонентов.

Несмотря на то, что определение антигена D в клинической практике используют уже давно, в некоторых случаях возможны затруднения. Обычно такие отклонения в определении антигена D обозначают специальным термином D^u. Основные причины появления антигена D^u: несовершенство реагентов и методов определения, генетически обусловленная неоднородность антигена.

Эпитопы нормального антигена D :

В некоторых случаях анти-D-антитела находят у небольшого числа Rh(D)-положительных субъектов; показано, что в таких ситуациях эритроциты несут только часть эпитопов антигена D. При этом к утраченным эпитопам могут вырабатываться антитела; анти-D-аллоантитела реагируют практически со всеми эритроцитами Rh(D)-положительных индивидуумов, имеющих нормальный (полный) антиген D. Продукция анти-D-антител индивидуумами с частичным антигеном D - достаточно редкие случаи, тем не менее это является причиной серьезных клинических осложнений, включая гемолиз после гемотрансфузии и тяжелую гемолитическую болезнь новорожденных. Соответственно все варианты антигена D^u должны быть обнаружены в случаях, когда его присутствие может вызвать иммунологическую угрозу.

Доноры гемокомпонентов. Гемокомпоненты доноров с антигеном D^u маркируют как Rh(D)-положительные в связи с тем, что при их переливании Rh(D)-отрицательным индивидуумам может произойти стимуляция выработки антител и развиться посттрансфузионные осложнения. В то же время при внесении данных о групповой (AB0) и резус-принадлежности в документ донора с антигеном D^u рассматривают как потенциального реципиента, в связи с чем его резус-принадлежность в этом случае маркируют как Rh(D)-отрицательную.

Беременные. Определение антигена D^u следует проводить для беременных, одновременно выполняя скрининг антител. Женщины, имеющие слабый антиген D, не нуждаются в дородовых и послеродовых инъекциях иммуноглобулина анти-резус(D).

Новорожденные Rh(D)-отрицательных матерей. Определение антигена D^u должно быть выполнено у новорожденных Rh(D)-отрицательных матерей. Если новорожденный имеет антиген D^u , то Rh(D)-отрицательной матери назначают иммунопрофилактику иммуноглобулином анти-резус. Определение антигена D^u для беременных и новорожденных Rh(D)-отрицательных матерей связано исключительно с назначением иммуноглобулина анти-резус (D). Как реципиентов гемокомпонентов их считают Rh(D)-отрицательными. Для реципиентов определение антигена D^u необязательно. Если Rh(D)-принадлежность больного определена как Rh(D)-отрицательная стандартными методами, то тест для выявления антигена D^u не проводят, так как переливать будут Rh(D)-отрицательные гемокомпоненты. Это предотвращает сенсибилизацию по антигену D, но не является гарантией безопасности по другим эритроцитарным антигенам.

В стандартных случаях нет необходимости в широком типировании антигенов эритроцитов для доноров и реципиентов гемокомпонентов. В норме к антигенам всех эритроцитарных систем, за исключением системы AB0, антител быть не должно. По этой причине принцип безопасности трансфузий эритроцитсодержащих гемокомпонентов возможно осуществлять за счет выявления предшествующей сенсибилизации, что достигается обязательным для всех доноров и реципиентов скринингом антиэритроцитарных антител. Антитела к антигенам эритроцитов принято классифицировать с учетом их клинического значения. Под клинически значимыми антителами подразумевают антитела, способные вызывать in vivo разрушение эритроцитов, имеющих на мембране соответствующий антиген. С существованием этих антител связаны механизмы развития гемолитической болезни новорожденных, посттрансфузионных гемолитических реакций, осложнений или укорочение времени выживания перелитых эритроцитов. При отсутствии антител у реципиента (отрицательный результат скрининга) эритроцитсодержащие среды выбирают только с учетом группы крови по системе AB0 и Rh(D)-принадлежности. Положительный результат скрининга говорит об «опасном» реципиенте; трансфузии гемокомпонентов осуществляют только по индивидуальному подбору, с обязательным исключением антигена, к которому выявлена сенсибилизация.

Реципиентам с запланированными многократными трансфузиями гемокомпонентов (пациенты гематологических и онкологических стационаров, на гемодиализе, реципиенты органов и тканей) целесообразно выполнять типирование эритроцитов по антигенам С, с, Е, е системы Резус, антигену К системы Келл и другим для точных рекомендаций по выбору гемокомпонентов для трансфузий. Индивидуальный подбор таким реципиентам проводят не только с учетом выявления предшествующей сенсибилизации, но и с обязательным учетом фенотипа эритроцитов для исключения при выборе гемокомпонентов антигенов, способных стать причиной появления клинически значимых антител.

Для определения антигенов системы AB0 изначально использовали реагенты, полученные из сыворотки крови доноров с установленной групповой принадлежностью. Это были проверенные и специальными способами окрашенные поликлональные реагенты, содержащие антитела к отсутствующим у данного донора антигенам системы AB0. Такие диагностикумы называют стандартными изогемагглютинирующими сыворотками. Для получения реагента, позволяющего определять резус(D)-принадлежность, долгое время использовали поликлональные реагенты, приготовленные из сыворотки крови резус(D)-отрицательных доноров добровольцев, иммунизированных резус(D)-положительными эритроцитами других доноров. В конце 80-х гг. XX в. альтернативой реагентам, полученным из крови человека, стали моноклональные антитела - продукт биотехнологического произ водства, позволивший получить стандартные реагенты к антигенам эритроцитов. Моноклональные антитела выпускают под различными торговыми названиями (наиболее распространены в РФ «Цоликлоны», «Медиклоны», «Трансклоны»). Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки и моноклональные антитела работают в реакции прямой агглютинации, образуя с эритроцитами, несущими соответствующий антиген, агглютинаты - комплексы, видимые невооруженным глазом. Для поликлональных антител при определении резус(D)-принадлежности, как правило, необходимы дополнительные реагенты для проявления результатов неспецифического (33% раствор полиглюкина, 10% раствор желатина) или специфического (антиглобулиновый реагент) взаимодействия антигенов и антител.

Для полноценного определения группы крови по системе AB0 необходимо, наряду с определением антигенов, выявлять существующие в норме антитела к отсутствующим антигенам. Для определения антител используют консервированные стандартные эритроциты доноров группы А (II) и B(III). Определение антигенов эритроцитов системы AB0 стандартными изогемагглютинирующими сыворотками или моноклональными антителами называют прямой реакцией для определения группы крови. При применении совместно с ними стандартных эритроцитов (обратная реакция) говорят о перекрестном методе определения. Диагностика подгруппы А₂ возможна только с использованием специального реа гента анти-А₁.

Определение резус(D)-принадлежности с поликлональными и моноклональными реагентами проводят различными методами. При этом выявление вариантов антигена D^u требует дополнительного тестирования.

Наиболее точный метод диагностики антител к антигенам эритроцитов - непрямой антиглобулиновый тест (НАГТ). Важная составляющая адекватного скрининга антител - использование образцов стандартных эритроцитов группы 0 (I), типированных по всем клинически значимым системам эритроцитов.

В настоящее время, наряду с серологическими методами диагностики антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител (самый точный из которых - метод агглютинации в геле), используют и молекулярно-биологическую диагностику. Применение этих методов ограничено ввиду трудоемкости и высокой стоимости.

Для всех доноров крови или ее компонентов, необходимы иммуногематологиче ские исследования; при их проведении всех исследуемых рассматривают как доноров гемокомпонентов. При внесении данных о групповой и резус-принадлежности в удостоверение личности или иной документ донора рассматривают как реципиента гемокомпонентов.

Всем пациентам, которым может потребоваться переливание крови или ее компонентов, должны быть выполнены иммуногематологические исследования.

Индивидуальный подбор эритроцитсодержащих гемокомпонентов - это предтрансфузионные пробы на совместимость сыворотки (плазмы) крови реципиента с эритроцитами донора (или доноров) гемокомпонентов, выполненные в условиях специализированной лаборатории адекватными методами. Такой подбор может быть рекомендован всем реципиентам гемокомпонентов. Группы пациентов, для которых индивидуальный подбор эритроцитсодержащих гемокомпонентов обязателен при каждой плановой трансфузии эритроцитсодержащих гемокомпонентов:

Индивидуальный подбор осуществляют из совместимых с реципиентом по группе крови (AB0), резус-принадлежности (D) образцов крови доноров, отрицательных по антигену, к которому в данный момент или ранее были выявлены антитела у пациента.

Исследования образцов крови доноров и реципиента при выполнении индивидуального подбора в специализированной лаборатории:

Результаты исследований фиксируют в журнале индивидуального подбора крови. Ответ выдают на бланке индивидуального подбора с обязательным указанием фамилии, имени и отчества, группы крови (AB0), резус-принадлежности (D), специфичности выявленных и ранее обнаруженных антител реципиента. Также в нем отражают сведения об идентификационных номерах, группах крови (AB0), резус-принадлежности (D) и фенотипе по соответствующему антигену всех подобранных образцов крови доноров гемокомпонентов с обязательным указанием методов индивидуального подбора, даты и подписи врача, осуществлявшего исследование.

Для трансфузий используют только гемокомпоненты, совместимые по антигенам эритроцитов. Несовместимость в ходе индивидуального подбора - противопоказание к трансфузии гемокомпонента от данного донора. Бланк индивидуального подбора передают в ЛПУ вместе с гемокомпонентом и вклеивают в историю болезни реципиента при осуществлении трансфузии данного гемокомпонента.

Перед трансфузией гемокомпонентов по индивидуальному подбору врач, осуществляющий трансфузию, обязательно определяет групповую принадлежность крови доноров и реципиента. Убедившись в том, что они совпадают с данными истории болезни и бланка индивидуального подбора, врач проводит биологическую пробу на совместимость и осуществляет трансфузию гемокомпонентов.

Лабораторные исследования при подозрении на посттрансфузионное осложнение (ПТО) должны быть направлены, с одной стороны, на подтверждение диагноза гемолитической реакции, с другой - на выявление причин и подбор совместимых гемокомпонентов для последующих трансфузий.

К первой группе относят тесты, подтверждающие гемолиз: определение концентрации гемоглобина и гематокрита. Показатели острого внутрисосудистого гемолиза - гемоглобинурия, гемоглобинемия и гипербилирубинемия за счет неконъюгированного билирубина.

Вторая группа тестов направлена на выяснение причины иммуногематологической несовместимости, приведшей к ПТО. Здесь необходимо тщательное исследование образцов крови донора и реципиента, причем для реципиента дополнительно изучают образец крови, взятый до переливания. Во всех трех образцах крови проводят повторное определение групповой (AB0) и резус(D)-принадлежности, фенотипирование эритроцитов, скрининг и идентификацию аллоантител. Для этих исследований используют НАГТ, непрямую реакцию Кумбса. Кроме этого, из образца крови больного после трансфузии проводят прямой антиглобулиновый тест (ПАГТ, прямую пробу Кумбса); исследование используют для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов.

Проведение прямой пробы Кумбса показано при следующих состояниях:

Для определения специфичности антител используют элюат с поверхности сен сибилизированных эритроцитов. Если в образце крови больного, взятом до переливания, обнаружены антитела, их специфичность совпала с полученной в элюате, при этом у больного не выявлен антиген (или антигены), к которому определены антитела, то диагноз ПТО подтвержден и причина установлена (специфичность антигена). В случае подозрения на посттрансфузионное осложнение гемолитического типа для последующих трансфузий такому реципиенту необходимо выбирать эритроцитсодержащие гемокомпоненты только по индивидуальному подбору в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой реакции Кумбса) с обязательным исключением в донорской крови антигена - причины ПТО.

Гемолитическая болезнь плода или новорожденного - патологическое состояние, обусловленное несовместимостью матери и плода (новорожденного) по антигенам эритроцитов. Подобная несовместимость может быть вызвана практически любым антигеном, унаследованным ребенком от биологического отца, при условии отсутствия этого антигена у матери. Выработка антител (за исключением антител к антигенам системы AB0) происходит при контакте чужеродного антиге на с клетками иммунной системы матери, что возможно только при беременности или трансфузии. При этом сенсибилизация происходит при первой беременности (трансфузии), а антитела вырабатываются при повторном контакте с данным антигеном. По этой причине первая беременность обычно протекает без клинических признаков конфликта. Механизм иммунизации чужеродным для матери антигеном запускается в результате трансплацентарных геморрагий, характерных для любой беременности и обычно составляющих не более 1 мл. Количество крови плода, достаточное для иммунизации, может попасть в кровь матери в момент родов или при плодоразрушающих процедурах. Риск иммунизации высок при амниоцентезе или кордоцентезе. В процессе внутриутробного развития антигены эритроцитов формируются довольно рано; так, антигены системы AB0 плода полностью сформированы уже к 8-9-й неделе беременности. При несовместимости по антигенам системы AB0 гемолитическая болезнь новорожденных может возникнуть даже во время первой беременности в связи с тем, что антитела к этим антигенам постоянно присутствуют в крови матери.

Гемолитическая болезнь плода наиболее вероятна для конфликта мать-плод по антигену D системы Резус. Для несовместимости по другим антигенам эритроцитов характерно развитие гемолитической болезни новорожденного. Клиническая картина болезни определяется интенсивностью гемолиза эритроцитов. У плода развивается гемолитическая анемия, в тяжелых случаях приводящая к сердечной недостаточности, водянке и внутриутробной гибели. Снижение гематокрита в образце крови плода до 18% и менее, а также совокупность других критериев оценки его состояния - показание для внутриутробного переливания эритроцитсодержащих гемокомпонентов. Для переливания в этом случае выбирают отмытые, лейкофильтрованные и облученные эритроциты группы 0(I), совместимые по антигенам эритроцитов с сывороткой крови матери в непрямом антиглобулиновом тесте. При необходимости такие трансфузии повторяют каждые 2-3 нед.

Гипербилирубинемия у плода, как правило, не возникает, так как билирубин свободно проникает через плаценту и выводится организмом матери. У новорожденного, напротив, наибольшую опасность представляет гипербилирубинемия, поскольку она может привести к билирубиновой энцефалопатии.

При несовместимости по антигенам эритроцитов сразу после рождения определяют группу крови (AB0), резус(D)-принадлежность, уровень гемоглобина и билирубина в пуповинной крови. После внутриутробного заменного переливания резус-принадлежность крови новорожденного может быть определена как Rh(D)-отрицательная из-за присутствия в кровеносном русле большого количества перелитых донорских эритроцитов. С эритроцитами новорожденного проводят прямую пробу Кумбса; при положительной пробе определяют, к каким эритроцитарным антигенам направлены антитела. При гипербилирубинемии (уровень билирубина более 20 мкмоль/л у доношенных и 12-16 мкмоль/л у недоношенных) применяют светолечение и заменное переливание крови. Для светолечения используют ультрафиолетовый спектр, способствующий превращению билирубина в водорастворимые продукты. Эритроциты, покрытые антителами, в некоторых случаях разрушаются медленно, что может привести к анемии при отсутствии гипербилирубинемии даже через 3-6 нед после рождения.

Гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы AB0, может возникнуть даже у ребенка, рожденного от первой беременности. Иногда в первые сутки жизни появляется желтуха, причем гемолиз бывает выражен интенсивнее, чем при несовместимости по антигенам системы Резус. Прямая проба Кумбса с эритроцитами новорожденного отрицательна или слабо положительна. Антитела, элюированные с эритроцитов новорожденного, агглютинируют эритроциты доноров с группами крови A(II) или B(III) и AB(IV). В мазке крови новорожденного выявляют сфероциты, иногда фрагментированные эритроциты. Гемолитическую болезнь новорожденных, вызванную несовместимостью по антигенам системы AB0, бывает трудно отличить от наследственного микросфероцитоза. Если необходимо заменное переливание, то используют эритроцитсодержащие гемокомпоненты группы 0 (I), индивидуально подобранные по сыворотке крови матери, и плазму группы АВ (IV). Интенсивное раннее лечение позволяет снизить риск осложнений.

Риск иммунизации антигеном D системы Резус в процессе беременности существенно снижается, если резус-отрицательной матери с отсутствием антител вводят иммуноглобулин анти-резус(D). Первично его назначают в конце II триместра беременности, второй раз - в первые 72 ч после рождения резус(D)-положительного ребенка. Антирезусный иммуноглобулин также необходимо вводить после аборта и амниоцентеза.

Иммуногематологические исследования в акушерстве и неонатологии играют большую роль как для обеспечения безопасности гемокомпонентного лечения, так и для диагностики гемолитических процессов. Их правильное и своевременное выполнение дополнит и подтвердит клинический диагноз, а также позволит проконтролировать адекватность лечебных мероприятий. Все беременные должны проходить плановые иммуногематологические исследования с целью выявления конфликта по эритроцитарным антигенам между матерью и плодом, определения риска развития гемолитической болезни плода и новорожденного и возможной профилактики резус-сенсибилизации. Определение группы крови по системе AB0 перекрестным методом и резус(D)-принадлежности выполняют два раза в процессе беременности (рис. 18-1). Обязательно выявление слабых вариантов антигена D (D^u). При обнаружении слабых вариантов антигена D^u резус-принадлежность беременных считают отрицательной, но назначение иммуноглобулина анти-резус (D) противопоказано. Скрининг аллоиммунных антител к антигенам эритроцитов производят независимо от резус-принадлежности беременной не реже 1 раза в триместр. Скрининг анти-эритроцитарных аллоантител проводят в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой реакции Кумбса). Обязательно проведение скрининга антител перед назначением иммуноглобулина анти-резус Rh(D)-отрицательным женщинам, как в процессе беременности, так и после родов и абортов. При обнаружении антител специфичности анти-D назначение иммуноглобулина анти-резус (D) противопоказано. Обнаружение антиэритроцитарных аллоантител - показание к определению их титра и назначению повторных исследований (не реже 1 раза в месяц) в течение беременности для определения динамики титров антител и прогноза развития гемолитической болезни плода и новорожденного. Если обнаружена несовместимость крови беременной и биологического отца ребенка по антигенам системы AB0 и есть указания на наличие гемолитической болезни новорожденного по системе AB0 в анамнезе, то целесообразно определение титров иммунных антител (IgG) системы AB0 в динамике по аналогичной схеме (см. рис. 18-1). Важно учитывать, что гемолитическая болезнь новорожденного при несовместимости по системе AB0 характерна не только для новорожденных от матерей группы 0 (I), но и от матерей группы А (II) и В (III). При несовместимости, когда мать и отец имеют группу А (II) и В (III), отмечают преобладание тяжелых степеней гемолитической болезни новорожденного, требующих срочного заменного переливания для лечения.

Рис.18-1. Антенатальный скрининг антител

Наличие антиэритроцитарных аллоантител - признак возможного конфликта матери и плода по антигенам эритроцитов, а увеличение титра антител определен ной специфичности в динамике с большой вероятностью указывает на иммунологический конфликт при данной беременности. При этом необходимо учитывать не абсолютную величину титра антител, а только динамику. Титром антител называют последнее разведение сыворотки, в котором обнаруживают антитела. Соответственно такие разведения, полученные в различных лабораториях и различными методами, могут существенно различаться. Это зависит прежде всего от чувствительности и специфичности используемых лабораторных методик. Сравнивать можно только значения титра, полученные в одном и том же методе определения, но с учетом того, что определенная ошибка может находиться и в пределах погрешности метода. По этой причине достоверным изменением величины титра принято считать его снижение или увеличение более чем на две ступени.

В случае выявления аллоиммунных антител, при выполнении заменных трансфузий индивидуальный подбор по антигенам эритроцитов необходим беременной и плоду (новорожденному). При необходимости внутриутробных переливаний плоду выбирают эритроцитсодержащие гемокомпоненты группы 0 (I), совместимые в индивидуальном подборе по антигенам эритроцитов с сывороткой матери, даже если предварительному исследованию на группу крови (AB0) подвергался образец крови плода, полученный методом кордоцентеза. Антитела системы AB0 у новорожденных могут частично или полностью отсутствовать. В этих случаях заключение о групповой принадлежности делают по антигенам эритроцитов. Верификацию подгруппы антигена А у детей до 18 мес. не производят. При обнаружении слабых вариантов антигена А у новорожденных для трансфузий выбирают эритроцитсодержащие гемокомпоненты без антигена А.

Во избежание ошибок при определении групповой (AB0) и резус-принадлежности новорожденных из образца пуповинной крови необходимо исключить химеризм по антигенам эритроцитов (наличие двух популяций эритроцитов, одна из которых принадлежит матери, а другая - ребенку). Если выявляют химеризм, то определение необходимо повторить из образца крови, взятого непосредственно у новорожденного. Определение антител, фиксированных на эритроцитах (прямая реакция Кумбса), выполняют новорожденным при подозрении на гемолитическую болезнь. Положительный результат прямой реакции Кумбса подтверждает гемолитический конфликт, отрицательный же его не исключает. Скрининг аллоиммунных антител к антигенам эритроцитов проводят для установления причин гемолитической болезни и разработки точных рекомендаций по выбору гемокомпонентов для возможных трансфузий. Одновременно необходимо определять антитела в сыворотке крови матери. Обнаружение антиэритроцитарных аллоантител - показание к определению их специфичности (идентификации). В этом случае новорожденный нуждается в индивидуальном подборе эритроцитов для заменных переливаний по сыворотке матери и собственной сыворотке крови.

В норме время жизни эритроцитов составляет 90-120 дней. При гемолизе, связанном с повреждением эритроцитов, оно укорачивается. Причинами гемолиза могут быть как дефекты эритроцитов, так и внешние воздействия. Диагноз гемолитической анемии основан на совокупности клинических данных и лабораторных показателей: содержание гемоглобина; гематокрит; количество ретикулоцитов; морфология эритроцитов; концентрация билирубина, гаптоглобина; активность лактатдегидрогеназы; определение времени жизни эритроцитов. Иммуногематологические исследования помогают определить, имеет ли гемолиз иммунную природу, а при ее подтверждении отнести иммунную анемию к определенному типу. Иммунный гемолиз обусловлен выработкой антител к эритроцитарным антигенам с последующим разрушением эритроцитов фагоцитозом или за счет активации комплемента. Иммунный гемолиз может быть вызван антителами как аллогенной, так и аутологичной природы, а в некоторых случаях - антителами к лекарственным препаратам. Другие причины гемолиза, которые важны при дифференциальной диагностике иммунных гемолитических анемий: врожденные дефекты мембраны эритроцитов; механическое повреждение эритроцитов (напри мер, при микроангиопатии); инфекции; врожденная недостаточность ферментов эритроцитов (гемоглобинопатии). Типичные примеры аллоиммунных гемолитических анемий - посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа, гемолитическая болезнь плода и новорожденного.

Аутоиммунные гемолитические анемии - заболевания, при которых аутоантитела к антигенам эритроцитарной мембраны укорачивают время жизни как собственных, так и перелитых эритроцитов. Причины выработки аутоантител к эритроцитам:

В зависимости от антиэритроцитарных аутоантител выделяют три группы этого заболевания: тепловую аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь холодовых агглютининов и пароксизмальную ночную гемоглобинурию.

В лабораторной диагностике аутоиммунных процессов большую роль играют иммуногематологические исследования, связанные с выявлением и определением характеристик аутоантител. Эти исследования, конечно, не могут объяснить природу аллоиммунизации, но их с успехом в течение многих лет применяют совместно с клиническими данными для определения типа аутоиммунной гемолитической анемии и выбора оптимальной тактики лечения. В табл. 18-2 обобщены основные виды иммуногематологических исследований, применяемых для диагностики аутоиммунного гемолиза.

Таблица 18-2. Иммуногематологические особенности аутоиммунных гемолитических анемий

При выполнении иммуногематологических исследований обязателен ежедневный внутрилабораторный контроль качества, а также участие во внешнем контроле качества выполняемых исследований.

Прямая реакция с моноклональными антителами (изогемагглютинирующими сыворотками).

Перекрестный метод с моноклональными антителами (изогемагглютинирующими сыворотками) и стандартными эритроцитами А₁, В, 0.

Прямая и/или перекрестная реакция в гелевом тесте.

Прямая и/или перекрестная реакция в микропланшетной технологии.

Реакция прямой агглютинации с моноклональными антителами анти-D.

Реакция с универсальным реагентом анти-резус (D).

Реакция конглютинации с 10% раствором желатина.

Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса).

Реакция с моноклональными антителами в гелевом тесте.

Реакция с моноклональными антителами в микропланшетной технологии.

Реакция прямой агглютинации с моноклональными антителами соответствующей специфичности.

Реакция конглютинации с 10% раствором желатина и антителами соответствующей специфичности.

Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса).

Реакция с моноклональными антителами в гелевом тесте.

Реакция с моноклональными антителами в микропланшетной технологии.

Непрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика) с панелью стандартных эритроцитов, состоящей не менее чем из трех видов клеток, типированных по всем клинически значимым антигенам. Применение пула (смеси) случайных образцов эритроцитов для скрининга антиэритроцитарных антител не допускается.

Непрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика) с панелью стандартных эритроцитов, состоящей не менее чем из десяти видов клеток, типированных по всем клинически значимым антигенам.

Типирование антигена (или антигенов) эритроцитов реципиента, к которому предположительно обнаружены антитела.

Идентификацию антител считают завершенной при соответствии результатов реакций с панелью эритроцитов результатам фенотипирования эритроцитов исследуемого образца крови.

Непрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика) со стандартными типированными эритроцитами А₁ и/или В после разрушения естественных антител 5% раствором унитиола или прогреванием при 70 °С.

Прямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика).

Тромбоциты - носители антигенов системы AB0, системы HLA(Human Leukocyte Antigens) I класса, а также специфических тромбоцитарных антигенов системы HPA (Human Platelet Antigens).

HLA-система человека - комплекс гликопротеиновых молекул, которые экс-прессируются на поверхности большинства ядросодержащих клеток; это наиболее полиморфная из всех известных антигенных систем. HLA-антигены локализованы на гликопротеинах клеточной мембраны, кодированных тесно сцепленными генами, расположенными в сегменте p21.3 короткого плеча хромосомы 6. Комплекс состоит из нескольких классов, разделенных более чем на 250 локусов (генов и псевдогенов), 21 из которых прямо связаны с трансплантацией. Локусами кодиру ются около 900 аллелей I и II классов. Антигены HLA играют важнейшую роль в регуляции иммунного ответа на чужеродные антигены и сами являются сильными антигенами.

В настоящее время широко используют две номенклатуры системы HLA: старая основана на результатах иммунологических реакций, таких как серологическое типирование или смешанная культура лейкоцитов in vitro; новая использует молекулярно-биологические данные о специфических последовательностях нуклеотидов в аллелях.

Иммунологическая номенклатура включает название системы (HLA); локус, к которому принадлежит данный антиген, обозначают большими буквами латинского алфавита (А, В, С, DR, DP, DQ); цифра обозначает непосредственно антиген (HLA-A₂, HLA-B₇).

Подобрать донора, полностью совместимого с реципиентом по антигенам системы HLA, очень сложно, поскольку число комбинаций, составленных более чем из 100 антигенов этого семейства, чрезвычайно велико. Вероятность найти полностью совместимого донора составляет от 1:1000 до 1:1 000 000 в зависимости от распространенности того или иного антигена HLA. Вероятность подбора полностью совместимого донора среди родных братьев и сестер составляет 1:4; это связано с тем, что гены HLA наследуются по законам Менделя.

Система НРА диаллельна; имеет аллели «а» и «b» и состоит из 16 локусов - НРА-1-НРА-14w, 15, 16w. В настоящее время изучено молекулярное строение всех 32 генов НРА, входящих в новую номенклатуру, в то время как антигенов системы НРА открыто только 22. Это связано с тем, что в локусах НРА-6w-НРА-14w, 16w серологически можно определить только редко встречающиеся антигены аллеля «b»; к часто встречающимся антигенам аллеля «а» антисыворотки до настоящего времени не получены. Расшифровка молекулярной структуры генов НРА стала возможной благодаря использованию метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Популяционные различия людей по антигенам систем HLA и НРА способствуют аллоиммунизации пациентов при проведении трансфузионного лечения компонентами крови, прежде всего тромбоцитами. Переливание концентрата тромбоцитов - эффективный метод лечения и профилактики геморрагических осложнений, обусловленных снижением числа тромбоцитов в периферической крови вследствие аплазии кроветворения или их дисфункцией. Отсутствие скорректированного посттрансфузионного прироста тромбоцитов через 18 ч после их трансфузии называют рефрактерностью. Рефрактерность может быть обусловлена как иммунологическими, так и неиммунологическими причинами. Неиммунологическая рефрактерность связана с повышенным потреблением тромбоцитов, неадекватно пополняемым при их переливании, что происходит при кровотечениях различной локализации, лихорадке, тромбофлебите, сепсисе, спленомегалии. Иммунологическая рефрактерность к трансфузиям концентрата тромбоцитов обусловлена антителами, выработанными в результате несовместимости по антигенам систем AB0, HLA и HPA реципиентами в ответ на переливание соответствующих антигенов доноров. Аллоиммунизация пациентов, являясь основной причиной развития иммунологических реакций негемолитического типа, в том числе и иммунологической рефрактерности, может привести к полному отсутствию клинического эффекта от переливания тромбоцитов. К счастью, состояние иммунологической рефрактерности возникает редко.

Основной метод профилактики - соблюдение принципа совместимости концентрата тромбоцитов с реципиентом по системе AB0. При этом желательно учитывать также резус(D)-принадлежность крови, из которой были получены тромбоциты. Наличие в тромбоконцентрате примеси эритроцитов может привести к аллоиммунизации и выработке антител к антигену D. Наибольшую роль в разви тии рефрактерности отводят антигенам системы HLA. Полагают, что возникновение признаков рефрактерности при переливании AB0-совместимых тромбоцитов обусловлено в первую очередь аллоантителами специфичности анти-HLA (А) или (В). При этом обеспечение реципиента концентратом тромбоцитов от доноров, совместимых по этим антигенам, позволяет добиться желаемого эффекта от транс фузий. Достаточно часто встречают и сочетанную аллоиммунизацию антигенами систем HLA и HPA. Лишь малая толика в развитии иммунологической рефрактерности к трансфузиям концентрата тромбоцитов принадлежит несовместимости собственно по антигенам тромбоцитов системы HPA.

Ввиду трудности подбора совместимых доноров при развитии рефрактерности к трансфузиям концентрата тромбоцитов целесообразно осуществлять плановое HLA- и HPA-типирование доноров тромбоцитов для создания банков данных. Подобные данные являются подчас единственной возможностью для больного с рефрактерностью найти совместимого донора концентрата тромбоцитов.

Цитокины - эндогенные полипептидные и белковые медиаторы межклеточного взаимодействия, регулирующие эмбриональное развитие, некоторые нормальные физиологические функции организма, защитные реакции при внедрении патогенов и при развитии опухолей, формирование аллергических, аутоиммунных и иных иммунопатологических процессов и восстановление поврежденных тканей при травмах. Именно поэтому совершенно очевидно, что цитокиновая регуляция имеет огромное значение и в норме, и при патологии. Известно более 200 индивидуальных веществ, принадлежащих к семейству цитокинов: интерфероны, интерлейкины с исторически сложившимися порядковыми номерами, ростовые и колониестимулирующие факторы, хемокины, медиаторы из группы фактора некроза опухолей, трансформирующие ростовые факторы и некоторые другие молекулы.

Современное учение о цитокинах имеет четыре независимых источника.

Первый и наиболее важный источник - учение о лимфокинах. Это направление активно развивалось в середине 1960-х гг., когда было показано, что белки, продуцируемые лимфоцитами, регулируют рост и функцию различных лейкоцитов. Начало учению о лимфокинах было положено исследованиями, демонстрирующими способность супернатантов, полученных от сенсибилизированных лимфоцитов после их стимуляции специфическим антигеном, угнетать миграцию нормальных макрофагов. Фактор, ответственный за это, был назван фактором угнетения миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor). В дальнейшем был введен термин «лимфокин», означающий растворимые клеточные факторы, которые продуцируются сенсибилизированными лимфоцитами во время их взаимодействия со специфическим антигеном и ответственны за развитие клеточно-опосредованных иммунологических реакций. Примером классического лимфокина может быть интерлейкин-2 (IL-2), играющий центральную роль в регуляции роста и функции Т-клеток. Затем показано, что лимфоциты могут продуцировать один или несколько митогенных факторов для других лимфоцитов. Так, митоген-активированные мононуклеары человека продуцируют фактор, поддерживающий рост Т-лимфоцитов. Этот фактор в настоящее время известен как IL-2. Однако вскоре выяснилось, что моноциты также являются источником белков (монокинов), которые могут модулировать функции лейкоцитов. Первый цитокин моноцитарно-макрофагального происхождения - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor - TNF). Кроме прямого цитотоксического эффекта по отношению к некоторым опухолевым клеткам in vitro, TNF обладает множеством других биологических эффектов в отношении различных лейкоцитов и тканевых клеток. Среди первых цитокинов моноцитарного происхождения был описан фактор активации лимфоцитов (lymphocyte activating factor ), известный в настоящее время как интерлейкин-1 (IL-1). Другие исследователи описали этот же фактор под такими названиями, как митогенный белок, лейкоцитарный пироген, эндогенный пироген, фактор, активирующий В-клетки, эндогенный медиатор лейкоцитов и др.

Второй источник - учение об интерферонах. Интерферон впервые был описан как фактор, который продуцируется вирусиндуцированными клетками, способными вызывать клеточную резистентность к вирусным инфекциям. Затем был открыт вирус-ингибирующий белок (_interferon gamma - IFNγ), продуцируемый митоген-активированными Т-лимфоцитами. IFNγ, продуцируемый Т-клетками и естественными киллерами, по структуре полностью отличается от большого семейства IFNα/β, продуцируемого множеством различных клеток: моноцитами, естественными киллерами, В-лимфоцитами, различными негемопоэтическими клетками. Интерфероны были определены как факторы роста и дифференцировки клеток иммунной системы и клеток других систем организма человека. В результате граница между лимфокинами/монокинами и интерферонами стала размытой, сегодня понятно, что интерфероны - это цитокины.

Третьим источником являются факторы роста гемопоэтических клеток (колониестимулирующие факторы; colony-stimulationg factors - CSF). Их основной функ цией является обеспечение пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток, а название отражает способность формировать гранулоцитарные или моноцитарные колонии. Эти факторы также регулируют некоторые функции зрелых клеток, что размывает границы между ними и лимфокинами/монокинами.

Наконец, четвертым источником являются факторы роста негемопоэтических клеток: фактор роста, продуцируемый тромбоцитами (platelet-derived growth factor - PDGF), эпидермальный (epidermal growth factor - EGF) и фибробластный (fibroblast growth factor - FGF) факторы роста, трансформирующий фактор роста (transforming growth factor β - TGFβ).

Как упоминалось выше, лимфокинами называют продукты сенсибилизированных лимфоцитов при воздействии на них специфического антигена. Однако в связи с тем, что со временем способность продуцировать аналогичные факторы была обнаружена и у других типов клеток, термин «лимфокины» было предложе но заменить на «цитокины». Кроме того, в 1979 г. на Втором международном совещании по лимфокинам был утвержден термин «интерлейкины» для растворимых белков, обеспечивающих взаимодействие между различными популяциями лейкоцитов. В качестве первого шага на Совещании были приняты IL-1 и IL-2, которые ранее имели множество различных названий. Несмотря на то, что множество цитокинов относятся к семейству интерлейкинов, часть факторов сохраняют свои старые названия, отражающие лишь одну из функций этих плейотропных агентов: CSF, IFN, TNF и т.д. Таким образом, цитокины - регуляторные белки, секретируемые лейкоцитами крови и другими клетками организма человека, плейотропные эффекты которых включают регуляцию клеток иммунной системы и модуляцию воспалительной реакции.

Цитокины имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, отличающих их от других классов регуляторных молекул, среди которых важнейшими считаются следующие: характерные биохимические свойства (цитокины представляют собой белки или полипептиды с молекулярной массой от 5 до 50 кДа), проявление биологической активности в пикограммовых концентрациях, отсутствие тканевой и антигенной специфичности, плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети. В связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержа ния гомеостаза, причем все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.

В табл. 19-1 представлены отличительные признаки гормонов и цитокинов.

Таблица 19-1. Отличительные признаки гормонов и цитокинов

Как следует из вышесказанного, цитокины и гормоны имеют много общего, однако между ними есть существенные отличия. Классические гормоны продуцируются специализированными клетками: например, инсулин продуцируется β-клетками поджелудочной железы, гормон роста - гипофизом, паратгормон - паращитовидными железами и т.д. Цитокины, наоборот, выделяются менее специализированными клетками. Кроме того, различные типы клеток могут синтезировать один и тот же цитокин. Например, IL-1 продуцируют моноциты, макрофаги, мезангиальные клетки, естественные киллеры (NK-клетки), Т- и В-лимфоциты, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, мышечные клетки, фибробласты, астроциты, клетки микроглии. Однако существуют исключения: IL-2, IL-5 и лимфотоксин продуцируются исключительно Т-лимфоцитами. Одно из основных отличий цитокинов от гормонов - это наличие у цитокинов, имеющих структурное сходство, принципиально различных биологических эффектов (например, TNF-α и TNF-β; IL-1β и IL-1β). Кроме того, один и тот же цитокин проявляет многообразные биологические эффекты по отношению к различным клеткам-мишеням (табл. 19-2).

Таблица 19-2. Основные характеристики действия цитокинов

Несмотря на некоторые различия, цитокины, факторы роста и гормоны формируют большое семейство внеклеточных сигнальных молекул со сходным механиз мом действия. Так, рецепторы для некоторых цитокинов и гормонов [IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), эритропоэтин, пролактин, гормон роста] имеют сходную структуру. Также структурная гомология была описана для рецепторов к PDGF и макрофагальному колониестимулирующему фактору (M-CSF). Более того, сходные механизмы обеспечи вают передачу сигнала от рецепторов (к гормонам, факторам роста, цитокинам) к клеточному ядру и приводят к сходным биологическим эффектам.

Роль цитокинов в регуляции функций организма может быть разделена на 4 основные составляющие:

Экспрессия генов отдельных цитокинов происходит стадиоспецифически на определенных этапах эмбрионального развития. Факторы стволовых клеток, трансформирующие ростовые факторы, цитокины семейства TNF и хемокины регулируют дифференцировку и миграцию различных клеток и закладку органов иммунной системы. После этого синтез некоторых цитокинов может не возобновляться, тогда как другие продолжают регулировать нормальные физиологические процессы или участвуют в развитии защитных реакций.

Несмотря на то, что большинство цитокинов являются типичными индуцибельными медиаторами и в постнатальном периоде не синтезируются клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа, некоторые из этих веществ не подпадают под это правило. В результате конститутивной экспрессии генов часть из них синтезируется постоянно и в достаточно больших количествах находится в циркуляции, регулируя пролиферацию и дифференцировку отдельных типов клеток в течение всей жизни. Примером такого типа физиологической регуляции функций цитокинами может быть постоянно высокий уровень эритропоэтина и некоторых CSF для обеспечения гемопоэза.

Цитокины, в первую очередь, регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. На тканевом уровне цитокины ответственны за развитие воспаления, а затем регенерации тканей. При развитии системной воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза. Попадание цитокинов в циркуляцию, безусловно, означает, что местная защита не справилась с патогеном, требуется включение системной воспалительной реакции для предотвращения его распространения и развития сепсиса. Регуляция защитных реакций организма цитокинами происходит не только в рамках иммунной системы, но и на уровне целостного организма, где цитокины осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и другими системами и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию единой защитной реакции.

Цитокины играют ключевую роль в регуляции врожденного иммунитета. Не менее важное значение цитокины имеют в формировании и развитии реакций специфического иммунитета, прежде всего связанных с регуляцией пролиферации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов. Сейчас не вызывает сомнения разделение популяции Т-лимфоцитов на два принципиально разных класса: Т-хелперы и цитотоксические Т-лимфоциты. Благодаря дальнейшим исследованиям функций активированных антигеном Т-лимфоцитов хелперов выяснилось, что эта популяция клеток также неоднородна и может быть разделена на подклассы по функциональной активности. Эта активность связана, главным образом, с синтезируемыми цитокинами. Оказалось, что Т-хелперы различаются между собой именно набором продуцируемых цитокинов. Активация Th1, секретирующих IL-2 и IFNγ, ведет к стимуляции, главным образом, функций Т-лимфоцитов и макрофагов и к развитию клеточного типа ответа, тогда как синтез Тh2 IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13 стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета. Защита организма от внутриклеточных патогенов происходит с помощью формирования клеточного иммунитета, зависимого от Th1, тогда как внеклеточные патогены нейтрализуются и выводятся из организма благодаря гуморальному иммунитету, поддерживаемому Th2.

Направление антигензависимой дифференцировки Т-лимфоцита хелпера зависит от присутствия в межклеточном пространстве цитокинов, синтезируемых, главным образом, антигенпредставляющими клетками и определяющими путь дифференцировки активированных антигеном наивных Т-лимфоцитов в разные типы Th-клонов. У человека описаны, по крайней мере, 3 типа Th-клонов, из них клоны Th1 и Th2 почти полностью соответствуют аналогичным клонам Т-лимфоцитов мышей. Дифференцировка Th1 индуцируется IL-12, который синтезируется макрофагами и дендритными клетками после взаимодействия молекулярных структур патогенов с толл-подобными рецепторами (toll-like receptors) данных клеток. IL-12 взаимодействует со своими специфическими рецепторами на Th0 и запускает активацию сигнального пути с участием транскрипционного фактора T-bet, являющегося основной внутриклеточной молекулой для дифференцировки Th1.

Th2 дифференцируются, главным образом, под действием IL-4, который может синтезироваться базофилами и тучными клетками в ответ на проникновение в ткани аллергенов, а также под действием цитокина ТСЛП (тимический стромальный лимфопоэтин), синтезируемого эпителиальными клетками в коже и легких и активирующего функции миелоидных дендритных клеток (ДК), в свою очередь активирующих Th2. Интересно, что сам IL-4, синтезируемый Th2, является основ ным фактором в определении дифференцировки стимулированных антигеном наивных CD4⁺ (CD - cluster of differentiation) Т-клеток в Th2.

Изучение активации Т-лимфоцитов хелперов человека привело к появлению более сложной схемы развития Th-клонов. Выяснилось, что IL-23, еще один цитокин семейства IL-12, ответственен за дифференцировку особого типа Th-клонов, продуцирующих IL-17 и получивших название Th17. Вместе с IL-23 в дифференцировке Th17 принимают участие IL-6, IL-1α и IL-1β. Цитокины семейства IL-17 стимулируют синтез ряда провоспалительных цитокинов макрофагами и за счет этого усиливают воспалительную реакцию, изначально вызванную патогеном. В последнее время описаны также клоны Th человека, дифференцирующиеся под действием третьего члена семейства IL-12 - IL-27 и синтезирующие преимущественно IL-10. Значение дифференцировки этих клонов при встрече с антигеном может заключаться в негативной регуляции активации клонов Th1, Th2 и Th17 и в подавлении воспалительной реакции любого типа. Кроме того, существуют клоны Th, относящиеся к естественно встречающимся регуляторным Т-лимфоцитам, экспрессирующим поверхностные маркеры CD4, CD25 и транскрипционный фактор FoxP3. Дифференцировка этого типа Th, по-видимому, происходит в тимусе под влиянием тимического стромального лимфопоэтина, секретируемого клетками эпителия медуллярной зоны тимуса, а также IL-2, синтезируемого как в тимусе, так и на периферии, хотя окончательная ясность в схеме дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов отсутствует.

Изучение системы цитокинов как in vivo, так и in vitro проводится в зависимости от конкретных задач, стоящих перед лабораторией, и включает следующие основные подходы.

Все перечисленные методы могут быть разделены на три основные группы, появившиеся в следующем порядке по мере развития исследований системы цитокинов и развития методологических подходов в целом:

Первые эксперименты, приведшие к открытию и начальной характеристике цитокинов, были связаны с изучением их биологической активности. Так, на основании изучения противовирусной активности в культурах зараженных вирусами фибробластов, был открыт интерферон. Несомненно, биологические методы измерения уровня цитокинов являются очень ценными для исследователей. Эти методы отличаются достаточно высокой чувствительностью и, с биологической точки зрения, являются более правильными, поскольку измеряют только биологически активные формы цитокинов, а следовательно, наиболее адекватно отражают работу системы цитокинов in vivo. В связи с этим уже в первые годы изучения цитокинов были разработаны несколько тестов с использованием первичных культур клеток для оценки разнообразных биологических функций. Однако определение биологической активности цитокинов с использованием первичных культур клеток не соответствовало одному из главных требований - стандартизации методик анализа. Именно поэтому вскоре для биологического тестирования многих цитокинов были получены длительно культивируемые трансформированные линии клеток, отвечавших на действие цитокинов изменением пролиферации, дифференцировки или функциональной активности (табл. 19-3). Тем не менее во всех случаях стандартизация обеспечивается сравнением биологического действия изучаемого цитокина с международными стандартными образцами, выпускаемыми Международной лабораторией биологических стандартов ВОЗ в Национальном институте биологической стандартизации и контроля (Великобритания), которая выпускает и рассылает по запросу охарактеризованные по биологической активности стандартные образцы цито кинов человека.

Таблица 19-3. Клеточные линии и первичные культуры клеток для оценки биологической активности цитокинов (Meager, 2006, с дополнениями)

Как следует из табл. 19-3, большинство используемых в биологических тестах клеточных линий не обладают строгой специфичностью в отношении одного цитокина, а могут отвечать на действие еще некоторых медиаторов, что существен но снижает специфичность определения биологической активности цитокинов в культуральных средах и биологических жидкостях, где обычно одновременно содержится несколько десятков цитокинов. В то же время эти клеточные линии могут быть идеальным инструментом для оценки биологической активности рекомбинантных цитокинов. Во многих лабораториях производят искусственные клеточные линии, отвечающие на отдельные цитокины, путем трансфекции клеток генами рецепторов данных цитокинов. Трансфецированные клетки приобретают способность специфически отвечать на действие низких концентраций нужных цитокинов. Однако многие клетки экспрессируют рецепторы большого числа цитокинов, поэтому метод не в состоянии обеспечить абсолютную специфичность тестирования.

Клеточные линии, используемые для оценки уровня цитокинов человека, имеют различное происхождение. Большинство таких линий получены от пациентов с лейкемией либо при лабораторно индуцированной лейкемии. Некоторые цитокины человека не являются видоспецифичными, и для их изучения можно использовать клеточные линии мышиного происхождения. Уровень цитокинов в образцах оценивается в основном по их способности стимулировать или ингибировать пролиферацию клеток. Существует несколько способов измерения пролиферации клеток:

Альтернативой радиоизотопным методам служат методы оценки клеточного метаболизма как индикатора пролиферации, основанные на восстановлении различных солей тетразолия.

Кроме измерения пролиферативной активности для оценки уровня некоторых цитокинов, таких как TNF, используют методы, основанные на цитотоксической активности цитокинов. Здесь с помощью витальных красителей оценивают цитотоксический эффект по отношению к некоторым клеточным линиям. Для оценки интерферонового статуса используют методы, основанные на антивирусной активности интерферонов. При этом используются различные клетки-мишени, зараженные вирусом, на которых оценивается антивирусная активность интерферонов путем визуальной оценки жизнеспособности клеток или с помощью витальных красителей. Для оценки биологической активности хемокинов, в частности IL-8, применяют методы хемотаксиса, где определяют их способность привлекать клетки, измеряя при этом количество клеток, мигрировавших через мембрану Бойдена, либо длину пробега клеток в агаре.

В целом все методы оценки биологической активности цитокинов in vitro могут быть объединены в 5 основных групп.

Несмотря на очевидные достоинства, биологические методы имеют и ряд существенных недостатков:

Биологическая оценка активности цитокинов обладает целым рядом ограничений в области специфичности, воспроизводимости и точности (табл. 19-4). В связи с этим определение уровней цитокинов в различных биологических средах чаще всего проводят с использованием иммунохимических методов, основанных на применении поликлональных, а в настоящее время, главным образом, моноклональных антител, специфически взаимодействующих с молекулами цитокинов.

Таблица 19-4. Сравнительный анализ методов определения цитокинов