Просветные фекалии забираются в одноразовый стерильный контейнер. Адекватное количество возбудителя для бактериологического исследования сохраняется виспражнениях при температуре +4-5⁰С в течении двух суток. Для более длительного хранения образцы кала замораживаются при -70⁰С. Замораживание даже при -20⁰С снижает цитотоксическую активность [65]! Образцы для проведения латекс-агглютинации замораживаться не должны.

Уровень убедительности рекомендаций B (уровень достоверности доказательств – II).

На этикетке контейнеров с материалом указывается: Ф.И.О., возраст пациента, тип биоматериала. В направлении необходимо указать: наименование учреждения/отделения, которое направляет биоматериал на исследования, Ф.И.О. обследуемого лица; возраст или дата рождения; пол; дату взятия биоматериала для лабораторного исследования; дату заболевания; предварительный клинический диагноз или повод к обследованию; степень тяжести заболевания; данные о применении антибактериальных препаратов (наименование и длительность приёма); Ф.И.О., должность, медицинского работника, отправившего биоматериал, дату отправки биоматериала и контактный телефон, по которому можно связаться с данным медицинским работником.

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – IV).

При транспортировке внутри одного здания, контейнеры с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. При длительной транспортировке образцы помещают в индивидуальный герметичный пакет с адсорбирующим материалом, упаковывают в общий герметичный пакет, и помещают в термоконтейнер. Транспортировка производится при температуре от +2⁰С до +8⁰С. Сопроводительные документы помещаются в индивидуальную упаковку отдельно от биологического материала и прочно прикрепляются снаружи контейнера. Полученные образцы транспортируются в герметичных пластиковых или стеклянных стерильных контейнерах. Транспортировка в лабораторию при комнатной температуре допускается не более двух часов. При невозможности быстрой транспортировки образцы должны быть помещены в транспортные среды для анаэробов.

Уровень убедительности рекомендаций B (уровень достоверности доказательств – II).

При доставки образца в лабораторию сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить правильность оформления направления на исследование, целостность контейнеров с биологическим материалом, зарегистрировать поступивший материал в рабочем журнале в бумажной или электронной форме. Нумерация образцов при регистрации должна быть идентична нумерации в бланках направлений на исследование.

Непригодными для исследования являются образцы:

В случае непригодности доставленного образца необходимо уведомить врача, назначившего исследование, и рекомендовать повторное взятие материала с соблюдением всех перечисленных правил.

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – IV).

Простой и доступный метод индикации ГДГ и токсинов А/В в образцах просветных фекалий посредством ИХА и ИФА. ИХА и ИФА позволяют получить быстрый ответ, но у каждой реакции есть свои достоинства и недостатки. ИФА обладает высокой специфичностью (до 95%), при низкой чувствительности (70-80%) обусловленной большим количеством ложноотрицательных результатов. ИХА при низкой специфичности показывает более высокую чувствительность по сравнению с ИФА [22].

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

ГДГ - фермент, превращающий глутамат в α-кетоглутарат. ГДГ присутствует в клетках у многих эукариот и прокариот включая некоторые виды рода Clostridium в том числе C. difficile. ГДГ кодируется геном Glud. ГДГ присутствует у всех штаммов C. difficile вне зависимости от выработки токсинов. Определение ГДГ имеет высокую прогностическую ценность при диагностике CDI. Специфичность данного теста снижается из-за наличия ГДГ у других представителей рода Clostridium (например, C. sordellii) и обуславливает перекрестное реагирование. Для определения ГДГ используют ИХА и/или ИФА.

Обнаружение ГДГ для диагностики CDI подходит в качестве первого этапа скрининговой индикации C difficile, при этом положительные результаты должны тестироваться на наличие токсинов другими методами [21; 25]. Определение ГДГ отсеивает отрицательные результаты. Себестоимость теста низкая.

Выпускаются коммерческие наборы реагентов для определения ГДГ C. difficile в кале. Положительный результат подтверждает наличие C. difficile, отрицательный результат указывает на её отсутствие.

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

Первым доступным коммерческим тестом для диагностики CDI была РАЛ. В основе РАЛ лежит связывание токсина А C. difficile, который присутствует в кале, со специфическими АТ, фиксированными на частицах латекса. РАЛ имела низкую стоимость, проста в применении, результаты исследования оцениваются через 30 минут. Положительная реакция наблюдается как с токсигенными, так и с не токсигенными штаммами C. difficile, а также некоторыми другими микроорганизмами вследствие того, что, АГ, распознаваемый РАЛ - ГДГ, присутствует у микроорганизмов многих видов.

ИХА предложен в начале 80-х годов. ИХА относится к реакциям с мечеными антителами. В качестве метки используют окрашенный латекс или частицы коллоидного золота. ИХ-тест представляет пластиковую пластину с окнами для внесения материала для учёта результата и для внутреннего контроля.

В ИХА используются специфические АТ к искомому АГ, иммобилизованные в виде полосы на хроматографическом носителе в окне для учёта результата (выше окна для внесения материала); АТ к тому же АГ, адсорбированные на микрочастицах золота или латекса (размещаются в окне для внесения материала). Внутренний контроль включает выявляемый АГ, нанесённый после окна для учёта результата (положительный контроль, контроль протекания всех этапов основной реакции). Антиглобулиновые АТ против меченых АТ, закреплённые в виде полосы на носителе (отрицательный контроль, контроль переноса ингредиентов по носителю, адекватность внесения материала); неспецифические АТ того же происхождения (контроль специфичности связывания АТ).

Исследуемый материал в небольшом количестве (5-7 капель) суспензируется в экстрагенте и вносится в стартовое окно тест-системы. Происходит взаимодействие АГ с АТ, адсорбированными на частицах, начинается движение образовавшихся иммунных комплексов за счёт капиллярности носителя. Дойдя до АТ, расположенных на носителе вокне учёта результата, иммунные комплексы связываются, при этом частицы латекса или коллоидного золота проявляются в виде линии голубого, зелёного или коричневого цвета. Поскольку частицы, нагруженные АТ, берутся в избытке, часть их движется дальше и связывается в окне (окнах) внутреннего контроля реакции. Полоса в этом окне свидетельствует о правильной работе тест-системы (рис. 1).

Достоинства ИХ-тест-систем: высокая скорость получения результата; доступность, простота интерпретации результата; не требуют специально обученного медицинского персонала. По чувствительности ИХ-системы уступают другим методам иммуноанализа, что позволяет применять их лишь в качестве скринингового теста.

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

ИФА основан на специфическом распознавании и взаимодействии АГ и АТ. Процесс образования иммунных комплексов носит равновесный характер и зависит от аффинности компонентов, их концентрации и других условий реакции. Для оценки их количества возможно прямое определение концентрации образующихся иммунных комплексов либо измерение оставшихся свободными мест специфического связывания. Второй общей стадией ИФА является формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания. Заключительным обязательным процессом в ИФА является трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый каким-либо физико-химическим методом (спектрофотометрическим, флуориметрическим и т. д.), что достигается путём измерения скорости превращения субстрата или количества продукта, образующегося за фиксированный промежуток времени. Достоинства ИФА высокая чувствительность, позволяющая детектировать до 10 пг/мл АГ, стандартность, воспроизводимость; возможность использовать минимальные объёмы исследуемого материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (срок годности составляет год и более); простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учёта; возможность автоматизации всех этапов ИФА (автоматические ИФА-анализаторы невилирующие человеческий фактор при интерпретации результатов); относительно низкая стоимость диагностических наборов и оборудования.

Определение ГДГ в образцах просветных фекалиях не позволяет судить о токсигенности C. difficile. Токсины А/В в стуле больных определяют в ИФА и/или ИХА, культуральным методом, с последующим определением токсигенности чистой культуры C. difficile в ПЦР или биологическим методом на культуре клеток по ЦПД [11].

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

ИФА для детекции токсинов быстр, не трудоёмок по сравнению с бактериологическим методом, но имеет низкую чувствительность. Чувствительность ИФА составляет 75-95%, специфичность 83-98% [53; 54]. Индикация токсинов C. difficile в образцах кала в ИФА получило широкое распространение. Коммерческие ИФА тест-системы хотя несколько различаются по чувствительности и специфичности, обладают высокой сходимостью результатов [66].

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

За рубежом разработан двухэтапный алгоритм позволяющий исключить наличие C. difficile без дополнительных исследований и отказаться от культурального метода в 92% случаях [27]. Данный алгоритм не позволяет определить чувствительность C. difficile к антибактериальным препаратам.

В большинстве зарубежных лабораторий для детекции токсинов А и В C. difficile используется ИФА [28]. Коммерчиские ИФА тест-системы позволяют определять токсин А, либо токсин В или оба токсина. Предпочтительнее использовать тест-ситемы, одновременно детектирующие оба токсина.

Встречаются токсигенные штаммы C. difficile, вызывающие заболевания и продуцирующие токсин А, который не детектируется серологическим методом. Такие штаммы имеют мутацию гена tcdA в 139-й позиции [68].

Золотым стандартом лабораторной диагностики CDI является выделение токсигенной культуры и определение её цитотоксичности в РН на культуре клеток. Чувствительность и специфичность метода превышает 97%. Культуральный метод позволяет идентифицировать возбудитель, определить его токсигенность, чувствительность к антибактериальным препаратам. Культуральный метод исследования используется для диагностики CDI и при проведении эпидемиологического надзора.

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

Комментарии: C. difficile ⎯ грамположительная спорообразующая палочка. По типу дыхания облигатный анаэроб. Впервые выделена в 1935 году Hall I.C. и O’Toole E. из фекалий здоровых новорожденных. В 1970 году Bartlett J. связал наличие этого возбудителя с возникновением колита, развившегося после применения клиндамицина [16].Изначально микроорганизм назван Bacillus difficilis на основании морфологии и трудности культивирования [27]. Для выделения C. difficile используется питательная среда CCFA.

Образцы просветных фекалий засеваются на CCFA, инкубируются в условиях строго анаэробиоза при температуре 35-370 С в течение 24-48 часов согласно стандартным лабораторным методам.

C. difficile на среде CCFA образует бело-жёлтые колонии диаметром 2-4 мм, плоские, округлой или неправильной формы, с неровным или ризоидным краем, матовые. Рост сопровождается появлением характерного запаха, подобного запаху р-крезола или лошадиного помета.

Использование для выделения возбудителя других питательных сред, например агара с циклосерином и маннитом, кровяного агара с циклосерином и маннитом, не имеет преимуществ перед CCFA.

Идентификация C. difficile проводится на основании культуральных, морфологических и тинкториальных, ферментативных, антигенных свойств. Определяют специфические рибосомальные белки методом MALDI-ToF MS, ПЦР и/или продукты метаболизма (жирные кислоты) методом ГЖХ.

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – Ib).

Изоляты C. difficile должны тестироваться на токсигенность in vitro. Для этого отбирают 4-6 колоний, которые культивируют в сердечно-мозговом бульоне в анаэробных условиях при температуре 35-37⁰ С в течении 24 час. Фильтраты суточной бульонной культуры тестируют на наличие токсина по ЦПД в культуре клеток, либо определяют ген токсина А, В или бинарного в ПЦР. Описаны штаммы C.difficile не вызывающие ЦПД в культуре клеток, продуцирующие токсин in vitro, хотя его титр у таких штаммов ниже, чем у штаммов, вызывающих ЦПД [69], что может объяснить расхождение между клиническими и лабораторными данными.

Изоляты C. difficile должны тестироваться на присутствие генов токсина А и В (tcdA и tcdB) с помощью различных методов, в том числе мультиплексной ПЦР при этом используется суспензия от 5 до 10 колоний [26].

Несмотря на длительность исследования (продолжительность 2-3 суток) культуральный метод является надёжным методом лабораторной диагностики. Многие лаборатории в России не имеют оборудования для работы с облигатными анаэробами. Это ведёт к некорректной диагностике, отсутствию мониторинга за антибактериальной резистентностью изолированных токсигенных штаммов и эпидемического надзора. Для решения данной проблемы требуется дополнительные капиталовложения.

Недостатком культурального метода диагностики является его трудоёмкость, необходимость наличия специальных навыков работы с культурой и оборудования для анаэробной бактериологии. Выделение токсигенной культуры C. difficile возможно только в хорошо оснащённых лабораториях, имеющих высококвалифицированный персонал и анаэробную бактериологическую технику.

У выделенных штаммов необходимо определять резистентность к антимикробным препаратам. Спектр противомикробных препаратов для лечения тяжёлой CDI ограничен.

Уровень убедительности рекомендаций В (уровень достоверности доказательств – II).

Комментарии: Штаммы C. difficile резистентные к ванкомицину и метронидазолу всё ещё сохраняют чувствительность к тайгециклину. Большинство изолятов C. difficile резистентны к цефалоспоринам, 83,3% к клиндамицину, 66,7% к хлорамфениколу, 19% штаммов к метронидазолу, 6% к ванкомицину.

Молекулярные методы позволяют детектировать присутствие генома C. difficile и его репликацию. К ним относятся: ПЦР, риботипирование, гель-электрофорез в пульсирующем поле, мультилокусный анализ и определение мультилокусной последовательности [25]. ПЦР ⎯ перспективный метод для диагностики CDI. Для детекции токсигенных штаммов C. difficile используется амплификация специфических участков генома возбудителя, кодирующих токсин А и/или В или бинарный токсин. Разработана методика, позволяющая амплифицировать специфический для C. difficile участок гена, кодирующий токсин А и не имеющий перекрестной реакции с фрагментом ДНК токсигенных штаммов C. sordellii [64]. В ПЦР определяется токсигенность C. difficile и наличие других факторов патогенности. ПЦР анализ просветных фекалий используется для определения источника возбудителя CDI [14].

Уровень убедительности рекомендаций B (уровень достоверности доказательств – II).

Комментарии: Известны различные модификации ПЦР, обладающие высокой чувствительностью - 95,5% и специфичностью - 99,0%. Корреляции между положительной детекцией и выделением токсигенного штамма C. difficile составляет 98,5% [31].

Применение антибактериальных препаратов способствует селекции штаммов резистентных микроорганизмов. Это лежит в основе появления бактерий с множественной лекарственной устойчивостью. Популяция C. difficile синтезирует токсин-индуцирующий мессенджер, относящийся к группе ТЛ, который накапливается во внеклеточной среде. При достижении популяцией C. difficile определённой плотности активируется двухкомпонентная система AgrC2A2. В результате этого усиливается транскрипция генов, кодирующих токсины. Детекция ТЛ методом ПЦР в образцах стула у пациентов c CDI показывает, что этот процесс, играет ключевую роль в патогенезе клостридиального колита.

Резистентность к антибиотикам вызывает растущее беспокойство здравоохранения, поскольку появляется много панрезистентных бактериальных штаммов, что затрудняет лечение, повышает смертность и расходы на здравоохранение [22; 23]. Выпускаются коммерческие наборы для оценки резистентности C. difficile к антибиотикам.

Детекция генов антибиотикорезистентности важна для диагностики и лечения CDI.

Принцип ПЦР ⎯ многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического фрагмента ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. ПЦР происходит в буферном растворе с участием термостабильной ДНК-полимеразы, четырёх типов нуклеотидов, двух синтетических олигонуклеотидных праймеров, каждый из которых комплементарен специфическому для выявляемого микроорганизма участку одной из цепей ДНК. ПЦР включает три циклически повторяющихся этапа: разделение (денатурацию) двуцепочечной молекулы ДНК на одиночные цепи; гибридизацию (отжиг) праймеров со специфическими участками своих цепей; полимеризацию - синтез ДНК-полимеразой новых цепей с присоединившихся праймеров и появлением новых двуцепочечных молекул ДНК. ПЦР проводится в программируемых термоциклерах (амплификаторах). В результате повторяющихся 30 - 45 циклов амплификации концентрация специфических фрагментов экспоненциально увеличивается и достигает 10⁹-10¹¹ копий. Детекция продуктов амплификации осуществляется одним из способов. При электрофоретическом способе детекции продукты ПЦР анализируются электрофорезом в агарозном геле. В лунки агарозного геля, помещённого в камеру с буферным раствором и интеркалирующим красителем, вносится аликвота продукта ПЦР. Электроды камеры подключаются к источнику постоянного тока, в поле которого в геле молекулы ДНК, заряженные отрицательно, движутся в направлении анода. Скорость движения зависит от длинны фрагмента ДНК. Присутствующий в растворе интеркалирующий краситель связывается с двуцепочечной ДНК и флуоресцирует оранжевым цветом в УФ. Наличие специфического продукта ПЦР в исследуемых образцах определяется по наличию флуоресцирующей полосы, расположенной в геле на одном уровне с продуктом амплификации положительного КО, содержащего нативный, либо рекомбинантный препарат ДНК выявляемого микроорганизма. При гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации ПЦР проводится в присутствии олигонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных специфическому участку ДНК микроорганизма, расположенному между праймерами. Зонды содержат флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции, которые при накоплении специфического продукта амплификации и гибридизации зонда обеспечивают появление и накопление флуоресцентного сигнала заданной длины волны. Для амплификации и детекции флуоресцентного сигнала используются приборы, позволяющие регистрировать флуоресцентный сигнал. Использование флуоресцентных меток с разной длинной волны испускания сигнала в составе гибридизационных зондов и нескольких пар праймеров, каждая из которых направлена на амплификацию своего специфического фрагмента, позволяет проводить в одной реакции амплификацию фрагментов ДНК одновременно нескольких микроорганизмов (мультиплексная ПЦР). В этом случае регистрация сигнала флуоресценции происходит по одному из нескольких каналов детекции. Существует два способа регистрации флуоресцентного сигнала – «по конечной точке» (ПЦР-КТ) или в «режиме реального времени» (ПЦР-РВ). В случае ПЦР-КТ регистрация флуоресцентного сигнала осуществляется после окончания реакции в флуоресцентном ПЦР-детекторе (согласно инструкции к прибору). Результаты ПЦР-КТ интерпретируются автоматически с помощью программного обеспечения прибора на основании отношения уровня флуоресцентного сигнала в исследуемом образце и уровнем фонового с игнала, в образце, не содержащем препарат ДНК. В случае ПЦР-РВ регистрация флуоресцентного сигнала(-ов) осуществляется в процессе реакции, после каждого цикла амплификации. Используются амплификаторы, имеющие модуль для регистрации флуоресцентного сигнала в режиме реального времени. При проведении мультиплексной ПЦР-РВ регистрация сигнала осуществляется по каждому из каналов детекции в соответствии с количеством выявляемых мишеней и длиной волны флуоресцентной метки. Появляющаяся в этом случае кривая, описывающая накопление флуоресцентного сигнала(-ов) отражает накопление специфических продуктов ДНК возбудителей. Результаты ПЦР-РВ анализируют на основании наличия/отсутствия кривой флуоресцентного сигнала, пересекающей линию порога базовой флуоресценции сопределением значения порогового цикла (Ct-цикла), при котором это пересечение происходит.

Биологический материал содержит вещества, ингибирующие ПЦР, ДНК, РНК находятся внутри клеток микроорганизмов, поэтому первым этапом ПЦР является получение НК, очищенных от ингибиторов ПЦР. Существует две группы методов очистки НК – методы сорбционной экстракции НК и методы термической обработки биоматериала. В основе методов сорбционной экстракции лежит лизис и денатурации компонентов биологического материала с помощью хаотропных агентов - высоко концентрированных растворов солей (гуанидин хлорид, гуанидин изоционат) с одновременной избирательной сорбцией НК на твёрдой фазе (частицах силикагеля, нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах). Отмывкой в спирте ингибиторы удаляются, а НК снимаются с твёрдофазных носителей путём растворения их в воде или низкосолевом буфере. Данные методы очистки высокоэффективны, как в отношении ДНК, так и РНК. За счёт высокой воспроизводимости результатов экстракции возможна количественная оценка содержания ДНК возбудителей в биологическом материале. Для наборов реагентов, включающих в составе сорбентов магнитные частицы или нитроцеллюлозные (нейлоновые) мембраны в составе микроколонок, разработаны автоматизированные варианты экстракции с использованием автоматизированных станций. При термической обработке биоматериала проводится нагревание и инкубация (от 5 до 15 мин) образцов биологического материала при температурах от 95⁰ до 100⁰С, в присутствии детергентов. В результате этого происходит разрушение мембран клеток, выход НК в раствор и инактивации (иногда обратимая и частичная) ингибиторов. Так как ингибиторы не удаляются из раствора, а некоторые из них, в первую очередь РНК- азы, устойчивы к нагреванию, данный способ не может использоваться для очистки и экстракции РНК. Данные методы относятся к экспресс-методам экстракции, поскольку просты в исполнении и позволяют за короткое время обработать большое количество образцов. В связи с тем, что количество не инактивированных ингибиторов может значительно варьировать от образца к образцу, эффективность очистки ДНК такими методами трудно стандартизовать, поэтому их не рекомендуется использовать в тех случаях, когда необходима количественная оценка содержания ДНК в биологическом материале. Препараты ДНК, полученные при сорбционной экстракции, можно хранить в течение 1 нед при температуре от 2⁰С до 8⁰С или в течение года при температуре -20⁰С. Препараты ДНК, полученные с помощью термической обработки следует хранить при температуре не выше -16⁰С. Для более длительного хранения образцы ДНК замораживают и хранят при -60⁰С.

При работах по выделению и очистке НК из биологического материала на всех этапах необходимо использовать расходные материалы (пластиковые пробирки, наконечники с фильтрами) только с маркировкой «DNase, RNase-free» («свободные от ДНК-аз, РНК-аз»). Очистку и выделения нуклеиновых кислот необходимо проводить с использованием КО. Внутренний КО - образец, содержащий рекомбинантный препарат НК в зависимости от типа исследуемой НК микроорганизма и особенностей методики. Внутренний КО добавляется в каждую пробу на этапе выделения НК, и проходит все этапы ПЦР в составе биологического образца. Назначение КО: служит для контроля потерь НК в процессе пробоподготовки, качества очистки ДНК/РНК от ингибиторов реакции амплификации.

Отрицательный КО – образец, заведомо не содержащий искомый возбудитель или его НК. Служит для контроля возможной контаминации во время выделения и очистки НК, при приготовлении амплификационных смесей.

Лабораторная диагностика CDI базируется на одном из методов микробиологической диагностики: микроскопическом, серологическом (определение ГДГ и токсинов в стуле пациента), культуральном (выделение токсигенной культуры), молекулярно-биологическом (ПЦР). Эти методы показали хорошую производительность [30; 31; 45; 46] и ряд недостатков: низкую чувствительность и специфичность, трудоёмкость, времязатратность. Их выбор осуществляется врачом-бактериологом.

Вобзоре Binnicker M.J. (2015 г.) сравнивается использование трёх коммерческих мультиплексных панелей (FilmArray GI панель [BioFire Диагностика, Солт-Лейк-Сити, штат Юта], Luminex xTag GI патоген панель [GPP] [Luminex Corporation, Торонто, Канада], Nanosphere Verigene кишечно-патоген [EP] тест [Nanosphere, Inc., Northbrook, IL]), которые одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) для детекции возбудителей желудочно-кишечных заболеваний из клинических образцов стула.

Каждая из мультиплексных панелей для диагностики CDI утверждена FDA в качестве дополнительного средства диагностики, их использование при скрининге у бессимптомных пациентов не утверждены и требуют дальнейшего изучения [30].

Существующие проблемы, связанные с интерпретацией результатов мультиплексных панелей, не позволяют использовать их для скрининга.

Вбудущем мультиплексные панели получат широкое распространение в лабораториях.

Несмотря на увеличение скорости исследования, удобства использования ПЦР, культуральный метод диагностики остаётся необходимым для определения чувствительности возбудителя к противомикробным препаратам и эпидемиологического надзора за CDI.

Важной, до сих пор нерешённой проблемой, является отсутствие в Российской Федерации единого подхода к лабораторной микробиологической диагностики CDI. Возникает порочный круг, что ведёт к запаздыванию в постановке диагноза и нерациональной терапии. Продолжительная лабораторная микробиологическая диагностика CDI обуславливает несвоевременное проведение профилактических и санитарно-эпидемиологических мероприятий. Это создает предпосылки к персистенции возбудителя и его широкому распространению, как в пределах отделения, так и в рамках ЛПУ.

Для лабораторной микробиологической диагностики CDI следует использовать несколько методов. Алгоритм лабораторной микробиологической диагностики CDI представлен в ФКР. Исследование начинается с определения ГДГ серологическим методом и заканчивается либо выделением токсигенного штамма C. difficile и определением его чувствительности к антибактериальным препаратам, либо отрицательным результатом, при котором возбудитель отсутствует или его этиологическая роль вызывает сомнение.

Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – III).

Взарубежных клинических рекомендациях предлагается комбинировать тесты в двух- или трёхэтапном алгоритме диагностики CDI. На первом этапе определяют ГДГ C. difficile. Многими авторами считается, что в случае отрицательного результата дальнейшее обследование больного не требуется, при положительном необходимо проведение тестов, подтверждающих наличие токсинов (ПЦР или ИФА) [28; 54].

Многоэтапная лабораторная микробиологическая диагностика является адекватной стратегией, при которой низкая стоимость скринингового исследования и быстрота его исполнения, а именно определение ГДГ в просветных фекалиях, используется на первом этапе, за которым следует определение токсинов А и В в просветных фекалиях. При наличии диареи и отрицательных тестов на ГДГ и токсины А и В необходимо исключить наличие бинарного токсина. Бинарный токсин детектируется методом ПЦР.

Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – III).

ВРоссии по данным Государственного реестра медицинских изделий и организаций (индивидуальных предпринимателей) осуществляющих производство и изготовление медицинских изделий (www.roszdravnadzor.ru/services/misearch), зарегистрировано четыре коммерческих ИФА тест-системы и одна ИХА тест-система для детекции токсинов А и В в фекалиях. Индикация токсигенных штаммов C. difficile продуцирующих бинарный токсин в ЛПУ возможна только с использованием ПЦР тест- систем. Регистрационное удостоверение выдано на единственную ПЦР - систему для анализатора GeneXpert DX, который также разрешён в установленном порядке к применению в РФ и имеет регистрационное удостоверите. Заключительный этап микробиологической диагностики CDI – выделение токсигенной культуры и определение её чувствительности к антибактериальным препаратам.

Нецелесообразно проводить повторные лабораторные исследований после курса антибиотикотерапии; при клиническом улучшении серологические реакции остаются положительными на протяжении 30 дней.

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – III).

При развитии у пациента клинической картины CDI лечение начинается до получения лабораторного подтверждения. Отрицательные результаты лабораторных тестов не исключают наличия возбудителя [19]. Необходимо лабораторное подтверждение и мониторинг за CDI.

Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – III).

Для проведения лабораторной микробиологической диагностики CDI оптимален трёхэтапный алгоритм лабораторного микробиологического исследования, включающий сочетание лабораторных методов для достижения максимально высокой чувствительности и специфичности исследования.

Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – II).

Разработанный диагностический алгоритм оценён по следующим параметрам:

Вкачестве методики сравнения («Золотого стандарта») использовались американские и европейские рекомендации по диагностики CDI.

Проведён анализ результатов исследований изучения 578 образцов просветных фекалий, полученных от пациентов, поступивших в стационар и пациентов с клинической картиной CDI (табл. 2).

Алгоритм характеризуется высокими значениями воспроизводимости результатов исследований, чувствительности и специфичности.

Трёхэтапный алгоритм исследования предназначен для лабораторной диагностики CDI. Использование трёхэтапного алгоритма исследования обеспечит правильную и своевременную диагностику, локальный микробиологический мониторинг и эпидемиологический надзор за CDI.

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – II).