Экстракорпоральное оплодотворение

Богданова Мария Александровна - эмбриолог отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Вартанова Ирина Владимировна - кандидат медицинских наук, врач - анестезиолог-реаниматолог отделения анестезиологии и реанимации ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», доцент кафедры анестезиологии и реаниматологии ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России

Гзгзян Александр Мкртичевич - доктор медицинских наук, заведующий отделом репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», профессор кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Глотов Андрей Сергеевич - доктор биологических наук, заведующий отделом геномной медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», заведующий лабораторией биобанкинга и геномной медицины Института трансляционной биомедицины ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Джемлиханова Ляиля Харрясовна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии медицинского факультета ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», врач - акушер-гинеколог отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Ефимова Ольга Алексеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории цитогенетики и цитогеномики репродукции отдела геномной медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Ищyк Мария Алексеевна - младший научный сотрудник лаборатории раннего эмбриогенеза отдела репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Коган Игорь Юрьевич (редактор) - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, директор ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», врач - акушер-гинеколог отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», профессор кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Комарова Евгения Михайловна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией раннего эмбриогенеза отдела репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродук-тологии им. Д.О. Отта»

Крихели Инна Отаровна - кандидат медицинских наук, врач - акушер-гинеколог отделения вспомогательных репродуктивных технологий, старший научный сотрудник отдела репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Лесик Елена Александровна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории раннего эмбриогенеза отдела репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Малышева Ольга Викторовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномики с группой биоресурсной коллекции отдела геномной медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Мекина Ирина Дмитриевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Мюллер Валерия Сергеевна - кандидат медицинских наук, врач - акушер-гинеколог отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Объедкова Ксения Владимировна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник отдела репродуктологии, врач - акушер-гинеколог отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Пендина Анна Андреевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории цитогенетики и цитогеномики репродукции отдела геномной медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Тапильская Наталия Игоревна - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела репродуктологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом детской гинекологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Толибова Гулрухсор Хайбуллоевна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией гистохимии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Траль Татьяна Георгиевна - кандидат медицинских наук, заведующая пато-логоанатомическим отделением ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Чиряева Ольга Гавриловна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией цитогенетики и цитогеномики репродукции отдела геномной медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Шпаков Александр Олегович - доктор биологических наук, заместитель директора по науке, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии и нейрохимии ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук»

Наш век поставил перед человечеством целый комплекс проблем, рисков и долгосрочных процессов, преодоление которых является условием сохранения и развития цивилизации. К таким «большим вызовам» современности относится демографический переход, проявляющийся снижением рождаемости, увеличением продолжительности и изменением образа жизни, старением населения, а также угрозой появления новых и возврата исчезнувших инфекций. Пандемия новой коронавирусной инфекции в первой половине 2020 г. в полной мере подтвердила такие прогнозы.

Нарушения репродуктивной функции (бесплодие, невынашивание беременности) вносят существенный негативный вклад в демографическую стабильность, и их значение в будущем только будет возрастать. Это обусловлено трансформацией репродуктивных установок в современном обществе, ростом частоты заболеваний цивилизации (ожирения, сахарного диабета, онкологических заболеваний), инфекционным фактором, а также экологической составляющей.

Безусловно, социальные решения в области демографии могут иметь положительный эффект, но, вероятнее всего, он не будет устойчивым и продолжительным. В этих условиях необходимо менять существующую парадигму, и одним из основных локомотивов медицины будущего, безусловно, будут разработка и внедрение биомедицинских технологий в области воспроизводства человека.

Целью настоящего руководства является эффективное, рациональное и безопасное рассмотрение одной из таких технологий - экстракорпорального оплодотворения. Для этого авторами представлены практические основы данной технологии, всех базовых ее этапов. Особое внимание уделено физиологическим основам фолликуло- и оогенеза в яичниках, механизмам действия гонадотропинов на яичники, морфофункциональным особенностям эндометрия. Большое место в руководстве занимают эмбриологические аспекты программы экстракорпорального оплодотворения, поскольку они главным образом определяют ее успех. Авторы не могли не затронуть вопросы предымплантационного генетического тестирования и перспектив омиксных технологий в оценке функций репродуктивной системы. Все это подчеркивает основные черты успешной реализации технологии экстракорпорального оплодотворения - ярко выраженную междисциплинарность и конвергенцию компетенций.

Все главы руководства написаны специалистами, полностью погруженными в практическую составляющую рассматриваемой темы и вместе с этим имеющими большой опыт педагогической и научной работы.

Авторы надеются, что издание будет полезным для врачей - акушеров-гинекологов, ординаторов, студентов медицинских вузов, и с благодарностью примут все предложения, замечания, касающиеся настоящего издания.

С уважением, И.Ю. Коган, член-корреспондент РАН, профессор, доктор медицинских наук

^♠ - торговое наименование лекарственного средства

^ρ - лекарственное средство не зарегистрировано в Российской Федерации

а-ГнРГ - агонисты гонадотропин-рилизинг-гормона

АД - артериальное давление

АМГ (AMH) - антимюллеров гормон (от англ. anti-Mullerian hormone)

анта-ГнРГ - антагонисты гонадотропин-рилизинг-гормона

ВБД - внутрибрюшное давление

ВБГ - внутрибрюшная гипертензия

ВКМ - внутриклеточная масса

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг-гормон

ГСПС (SHBG) - глобулин, связывающий половые стероиды (от англ. sex hormone binding globulin)

ГТ - гонадотропин

ГЭК - гидроксиэтилированный крахмал

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА - ингибиторы ароматазы

ИМТ - индекс массы тела

КАФ - количество антральных фолликулов

КОК - комбинированные оральные контрацептивы

КТ - компьютерная томография

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ЛОС - летучие органические соединения

МНО - международное нормализованное отношение

МРТ - магнитно-резонансная томография

НГ - нефракционированный гепарин

НМГ - низкомолекулярный гепарин

ОКК - ооцит-кумулюсный комплекс

ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром

ОЦП - объем циркулирующей плазмы

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПГС - предымплантационный генетический скрининг

ПГТ - предымплантационное генетическое тестирование

ПГТ-А - предымплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии

ПГТ-М - предымплантационное генетическое тестирование на моногенные заболевания

ПГТ-СП - предымплантационное генетическое тестирование у носителей структурных перестроек

ПР - прогестероновые рецепторы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭ - перенос эмбрионов

РКИ - рандомизированное контролируемое исследование

рЛГ - рекомбинантный лютеинизирующий гормон

РНК - рибонуклеиновая кислота

рФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон

СГЯ - синдром гиперстимуляции яичников

СЗП - свежезамороженная плазма

СПФ - синдром пустых фолликулов

СПЯ - синдром поликистозных яичников

СТГ - соматотропный гормон

СЭФР (VEGF) - сосудистый эндотелиальный фактор роста (от англ. vascular endothelial growth factor)

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЧД - частота дыхания

ЧМГТ - человеческий менопаузальный гонадотропин

ЭКГ - электрокардиография

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

ЭхоКГ - эхокардиография

ЭР - эстрогеновые рецепторы

AFC - число антральных фолликулов (от англ. antral follicle count)

AZF - фактор азооспермии (от англ. azoospermia factor)

ВMP - костный морфогенетический белок (от англ. bone morphogenetic protein)

CFTR - регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (от англ. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

DHT - дигидротестостерон (от англ. dihydrotestosterone)

DMSO - диметилсульфоксид (от англ. dimethyl sulfoxide)

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота (от англ. ethylenediamine-tetraacetic acid)

EGF - эпидермальный фактор роста (от англ. epidermal growth factor)

ERK - внеклеточная регулируемая киназа (от англ. extracellular signal-regulated kinase)

ESHRE - Европейское сообщество репродуктологов и эмбриологов (от англ. The European Society of Human Reproduction and Embryology)

FISH - флюоресцентная гибридизация in situ (от англ. fluorescent in situ hybridization)

GDF9 - фактор роста и дифференцировки 9 (от англ. growth differentiation factor 9)

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (от англ. granulocyte-macrophage colony stimulating factor)

GPCR - рецепторы, функционально сопряженные с гетеротримерными

G-белками (от англ. G protein-coupled receptors)

GRK - киназы рецепторов, связанных с G-белками (от англ. G protein-coupled receptor kinases)

CRP - С-реактивный белок (от англ. C-reactive protein)

ICSI - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку (от англ. intracytoplasmic sperm injection)

IGF - инсулиноподобный фактор роста (от англ. insulin-like growth factor)

IGFBP-1 - IGF1-связывающий белок-1 (от англ. insulin-like growth factor binding protein 1)

IL - интерлейкин (от англ. interleukin)

IMSI - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит после морфологической селекции (от англ. intracytoplasmic morphologically selected sperm injection)

KGF - фактор роста кератиноцитов (от англ. keratinocyte-growth factor)

KL - Kit-лиганд (от англ. Kit-ligand)

Leu - лейкоциты (от англ. leukocytes)

LIF - лейкемия-ингибирующий фактор (от англ. leukemia inhibitory factor)

MAR - реакция смешанной микроагглютинации (от англ. mixed agglutination reaction)

mTOR - мишень для рапамицина у млекопитающих (от англ. mammalian target of rapamycin)

PICSI - физиологическая внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку (от англ. physiological intracytoplasmic sperm injection)

PGDIS - Международное общество по предымплантационной генетической диагностике (от англ. Preimplantation Genetic Diagnosis International Society)

PR - прогрессивно-подвижные сперматозоиды (от англ. progressive motility)

PZD - частичная диссекция зоны (от англ. partial zona dissection)

SUZI - субзональное оплодотворение (от англ. subzonal insemination)

TESE - экстракция сперматозоидов из яичка (от англ. testicular sperm extraction)

TGF - трансформирующий фактор роста (от англ. transforming growth factor)

TNF - фактор некроза опухоли (от англ. tumor necrosis factor)

TUNEL - флюоресцентное мечение одно- и двунитевых разрывов ДНК (от англ. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabelling)

vWF - фактор фон Виллебранда (от англ. von Willebrand factor)

ZD - «сверление» зоны (от англ. zona drilling)

Физиологические механизмы регуляции функции яичников достаточно полно изложены в различных отечественных учебных изданиях. Именно поэтому в данном руководстве мы кратко остановимся только на тех аспектах фолликулогенеза и оогенеза, которые имеют наибольшее клиническое значение в работе репродуктолога. Понимание ряда положений этого раздела, безусловно, потребует наличия базовых знаний биологии и генетики, без которых практическая работа в настоящее время не может быть эффективной.

Хорошо известно, что яичники покрыты эпителием, образованным одним слоем кубических клеток (мезотелием). Под ним находится белочная оболочка (tunica albuginea), состоящая из плотной соединительной ткани. Под белочной оболочкой располагается корковый слой, в глубине - мозговое вещество яичника. Фолликулы разной степени зрелости присутствуют в основном в корковой зоне. Между фолликулами располагается строма яичника, представленная клетками соединительной ткани (фибробластами, фиброцитами), а также соединительнотканными волокнами. Соединительная ткань (строма) составляет также основу центральной, мозговой зоны яичника, в которой находятся кровеносные, лимфатические сосуды и нервы.

Стадии развития фолликула имеют несколько классификаций (Pedersen T., Peters H., 1968; Gougeon A., 1996; McNatty K.P. et al., 1983; Edson M.A. et al., 2009; Emori C., Sugiura K., 2014). Однако ни одна из них не является общепринятой, поскольку каждая имеет свои особенности, недостатки и преимущества. Одной из наиболее известных является классификация, основанная на размерах фолликулов и количестве клеток, которые входят в его состав (Pedersen T., Peters H., 1968). Она насчитывает 8 типов фолликулов (от I до VIII типа, полостного, в состав которого входит более 600 клеток). Классификация C. Emori и K. Sugiura (2014) учитывает размер фолликулов и наличие в них полости (5 типов фолликулов, от примордиального до антрального, граафова). В классификациях T. Pedersen и H. Peters (1968) и C. Emori и K. Sugiura (2014) не учитывается форма клеток и не определены гормонально зависимые этапы развития фолликула.

Gougeon A. (1996) выделил гормононезависимый (вступивший в рост фолликул, вторичный фолликул) и гормонозависимый периоды фолликулогенеза. Причем последний период развития включает 8 стадий развития фолликула, представленных в табл. 1-1.

M.A. Edson и соавт. (2009) также учитывали не только особенности строения фолликула, его роста, но и зависимость роста от гипофизарных гормонов (гормононезависимый и гормонозависимый периоды развития).

Таким образом, в соответствии с особенностями строения практически в любой классификации различают следующие типы овариальных фолликулов (они же являются последовательными стадиями их развития):

Примордиальные фолликулы образуются с 11-12-й недели внутриутробного развития плода и состоят из ооцита 1-го порядка, окруженного одним слоем плоских клеток прегранулезы и низкоорганизованного мезенхимального слоя текальных клеток (25-30 мкм) (рис. 1-1, см. цв. вклейку).

В процессе организации примордиального фолликула оогонии теряют способность к митотическому делению и вступают в профазу первого деления мейоза. Формируется ооцит 1-го порядка (Cohen P.E., Holloway J.K., 2010). На этом этапе происходят важные биологические явления, специфические для половых клеток, - конъюгация гомологических хромосом и кроссинговер - обмен участками между ними, что обеспечивает сбалансированную сегрегацию (расхождение) гомологичных хромосом при завершении метафазы I (Ottolini C. et al., 2015). В ооцитах 1-го порядка формируются характерные крупные ядра - герминальные пузырьки (GV, от англ. germinal vesicle). Подобно соматическим клеткам, ооцит 1-го порядка содержит диплоидный набор хромосом (2n4c). Развитие примордиальных фолликулов приостановлено, и ооцит «арестован» в фазе покоя - диктиотене профазы первого деления мейоза вплоть до периода полового созревания, когда инициируется фаза роста примордиального фолликула (Pepling M.E., 2006, 2012). К моменту формирования первичного яичника закладывается около 200-300 тыс. первичных фолликулов. Во время первого деления мейоза ооцитов число примордиальных фолликулов резко уменьшается на 90% (Pangas S.A., Rajkovic A., 2006). К моменту рождения у девочки в яичнике остается около 400 фолликулов.

Овариальный резерв определяется пулом жизнеспособных гамет, произведенных задолго до того, как они вступят в фазу финального созревания и будут востребованы. Следовательно, точность и стабильность каждого этапа образования примордиального фолликула необходимы для правильного завершения оогенеза и потенциала развития будущего эмбриона, который формируется из этого ооцита.

В первичных фолликулах ооцит 1-го порядка остается в стадии диктиотены и вступает в фазу малого роста. Он окружен одним слоем клеток гранулезы уже кубической формы (рис. 1-2, см. цв. вклейку). Размер ооцита в первичных фолликулах увеличивается, возрастают объем его цитоплазмы и содержание органелл. При этом ядерно-цитоплазматическое соотношение не нарушается. На этой стадии в ооците происходит активный синтез всех видов рибонуклеиновой кислоты (РНК) - рибосомальных, транспортных и матричных. Все эти типы РНК синтезируются преимущественно впрок, то есть для использования уже оплодотворенной яйцеклеткой.

Вокруг ооцита формируется прозрачная оболочка - блестящая зона (zona pellucida), состоящая из четырех типов гликопротеинов (ZP1-ZP4), синтезируемая ооцитом (Gupta S.K., 2018). Блестящая оболочка имеет особое функциональное значение в оплодотворении: отвечает за связывание сперматозоидов с ооцитом, индукцию акросомальной реакции, препятствует полиспермии, а также выполняет защитную функцию ооцита и раннего эмбриона в процессе развития до стадии бластоцисты. Разрыв ее (хэтчинг) происходит только на 5-е сутки развития эмбриона перед имплантацией.

В цитоплазме гранулезных клеток на стороне, обращенной к ооциту, хорошо развиты аппарат Гольджи с секреторными включениями, рибосомы и полирибосомы. На поверхности клеток видны два вида микроворсинок: одни проникают в блестящую зону, а другие обеспечивают контакт гранулезных клеток друг с другом. Подобные микроворсинки имеются и на мембране ооцита. Эти межклеточные контакты, так называемые щелевые контакты, позволяют производить обмен субстратом и сигнальными молекулами между ооцитом и клетками гранулезы. Формируется гранулезно-ооцитарная связь. Фолликулярные клетки секретируют факторы роста и дифференцировки: трансформирующий фактор роста β₂ (TGFβ₂ ), сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР, VEGF), лептин, фактор роста фибробластов-2 [ФРФ-2 (от англ. fibroblast growth factor, FGF2)], которые позволяют ооциту расти. Ооцит, в свою очередь, играет также важную роль в развитии фолликула: он выделяет паракринные факторы [фактор роста и дифференцировки 9 (от англ. growth differentiation factor 9, GDF9), факторы роста семейства TGFβ], способные стимулировать пролиферацию и дифференцировку окружающих соматических (гранулезных) клеток.

Строение вторичных фолликулов характеризуется наличием ооцита 1-го порядка, окруженного уже несколькими слоями (до 8) клеток гранулезы (рис. 1-3, см. цв. вклейку).

На данной стадии развития формируется соединительнотканная оболочка фолликула - тека, которая разделяется на два слоя - внутренний и наружный. Во внутреннем слое располагается обширная капиллярная сеть. Клетки внутренней теки, как и клетки гранулезы, после овуляции превращаются в клетки желтого тела. Наружный слой теки содержит гладкомышечные клетки, активность которых регулируется циклическим аденозин-3',5'-монофосфатом (цАМФ) и прогестероном. После созревания фолликула гладкомышечные клетки наружного слоя теки участвуют в овуляции. В частности, за счет их сокращения повышается давление в овулирующем фолликуле. Клетки грану-лезы от клеток текальных оболочек отделяет базальная мембрана фолликула, состоящая в основном из коллагена IV типа и ламинина.

Постепенно в связи с усилением секреторной активности гранулезных клеток между ними формируются пространства (лакуны), где начинает скапливаться фолликулярная жидкость. Блестящая оболочка утолщается, в нее проникают микроворсинки ооцита, которые обеспечивают его тесный контакт с клетками гранулезы. При этом ооцит с окружающими его фолликулярными клетками в виде яйценосного бугорка (cumulus oophorus) смещается к одному полюсу фолликула.

Вторичный фолликул в функциональном отношении принципиально отличается от предыдущих стадий развития. Во-первых, меняется система кровоснабжения фолликула. Формирование капиллярной сети в тека-оболочке обеспечивает тесный обмен между фолликулом и общей системой гемоцир-куляции. Во-вторых, в связи с усилением экспрессии рецепторов к гонадотропинам (ГТ) в гранулезных клетках фолликул становится чувствительным к их влиянию. В-третьих, постепенно начинает функционировать система синтеза половых стероидных гормонов («две клетки - два гонадотропина»). Так, в тека-клетках под действием лютеинизирующего гормона (ЛГ) происходит выработка андрогенов, а в клетках гранулезы под действием фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) - конверсия их в эстрогены.

Третичные фолликулы формируются из вторичных. Их отличительной чертой является наличие полости (antrum folliculare, антрум) с фолликулярной жидкостью. В образовании фолликулярной жидкости принимает участие сосудистое окружение текального слоя. Кровеносно-фолликулярный барьер определяет состав фолликулярной жидкости. Содержание низкомолекулярных компонентов аналогично содержанию в плазме, концентрация компонентов >100 кДа, и это ниже, чем в плазме. Глюкозаминогликаны и протеогликаны способствуют осмотическому потенциалу жидкости. ГТ, стероидные гормоны, факторы роста, ферменты и липопротеины также присутствуют в фолликулярной жидкости. При увеличении антрума ооцит располагается эксцентрично в составе так называемого яйценосного бугорка. Удлиненные отростки гранулезных клеток, окружающих ооцит в составе яйценосного бугорка, связанные с блестящей оболочкой, хорошо развиты и образуют лучистый венец (corona radiata). Гранулезные клетки яйценосного бугорка и блестящей оболочки составляют единый ооцит-кумулюсный комплекс (ОКК), который сопровождает ооцит во время овуляции. Во время пункции яичников получают ооцит в составе ОКК. Размер предовуляторного фолликула 17-22 мм (рис. 1-4).

Под воздействием значительно повышающихся концентраций ГТ, факторов роста, эстрогенов ооцит 1-го порядка вступает в третью, финальную фазу оогенеза - созревание. Процесс созревания включает координацию интегрированных, но независимых друг от друга событий, происходящих в ооците. Ядерное созревание связано с возобновлением процесса деления первого мейоза (MI).

Ядерная оболочка герминального пузырька разрушается, происходит смешение нуклеоплазмы с цитоплазмой, формируется веретено деления, завершается рекомбинация, и происходит сегрегация гомологичных хромосом. Первое мейо-тическое деление завершается с уменьшением числа хромосом (1n2c) и образованием первого полярного тельца. Цитогенетические исследования показали, что превалирующее большинство нарушений хромосомной сегрегации в ооците у женщин старшего репродуктивного возраста происходят в процессе разделения и расхождения сестринских хроматид в первом мейозе (MI) (Ottolini C. et al., 2015). Созревание цитоплазмы протекает с изменениями локализации ор-ганелл и установлением полярности ооцита. Увеличивается число митохондрий и рибосом. Происходит изменение мембранных транспортных систем, развивающийся аппарат Гольджи расширяется и мигрирует к периферии. В цитоплазме появляются органеллы, отвечающие за запасание и экспорт материалов: мембраносвязанные пузырьки, мультивезикулярные и кристаллиновые тельца, жировые включения и гликогеновые гранулы. Все процессы клеточного цикла контролируются ключевыми факторами и происходят строго последовательно.

Сразу после завершения первого мейотического деления запускается второе мейотическое деление с остановкой цикла в метафазе II, образуется ооцит 2-го порядка (MII), готовый к овуляции. Возобновление второго мейотического деления (1n1c) наступает после оплодотворения и называется активацией ооцита.

Схема стадий последовательного развития фолликула представлена на рис. 1-5.

Развитие фолликула от примордиального до зрелого третичного, предовуляторного составляет, по разным оценкам, несколько месяцев (120-300 сут). Весь этот длительный период подразделяют на следующие этапы:

Совершенно очевидно, что подобное разделение фолликулогенеза позволяет выделить этапы данного процесса, которые зависят от ГТ. Кратко изложим ключевые моменты каждого этапа.

Первичное рекрутирование фолликулов (прегонадотрофная стадия) представляет собой преобразование примордиального фолликула в первичный. Считается, что этот процесс не зависит от эндогенной гонадотропной стимуляции, а определяется только тесным функциональным взаимодействием ооцита, гранулезных клеток и стромы яичника. Так, например, в эксперименте доказано, что первичное рекрутирование фолликулов возможно при удалении гипофиза, а также у животных, нокаутных по гену, кодирующему β-субъединицу ФСГ (Дыбан А.П. и др., 1977). У человека первичный рекрутинг выявлен также у женщин с мутациями гена FSH-рецептора.

Можем ли мы повлиять на данный этап? К сожалению, в настоящее время ответ на этот вопрос отрицательный. Первичное рекрутирование фолликулов полностью определяется внутриовариальными факторами и не зависит от действия ГТ. Сегодня даже наши знания о физиологии данного этапа остаются неполными. Представленная далее информация о механизмах первичного рекрутинга пока имеет относительное клиническое значение.

Обнаружены факторы, которые могут способствовать росту примордиального фолликула. К ним относят: костный морфогенетический протеин (bone morphogenetic protein ВMP4/ВMP7/ВMP15); лейкемия-ингибирующий фактор (от англ. leukemia inhibitory factor, LIF); фактор роста кератиноцитов (от англ. keratinocyte-growth factor, KGF); ФРФ-2, Kit-лиганд (от англ. Kit-ligand, KL).

При этом следующие факторы препятствуют росту примордиального фолликула: фактор PTEN (от англ. tumor suppressor gene, или phosphatase and ten-sin homolog deleted on chromosome 10); антимюллеров гормон (АМГ) (от англ. anti-Mullerian hormone, AMH); белки семейства Foxo (forkhead box O) - Foxo3A, FoxI2; мультимолекулярный сигнальный комплекс, включающий mTOR (от англ. mammalian target of rapamycin).

Ежегодно появляются данные о новых факторах, задействованных в первичном рекрутировании, и новых точках приложения уже изученных веществ.

Гонадотропинчувствительная стадия фолликулогенеза представляет собой переход из стадии первичного фолликула к вторичному, а затем к малому антральному (2-5 мм).

На этом этапе также определяющее влияние оказывают внутрияичниковые факторы. Так, ВMP4/ВMP7/ВMP15, GDF9, ФРФ-2, а также андрогены имеют активирующее, а АМГ - ингибирующее влияние на процесс формирования вторичных и малых антральных фолликулов.

У вторичных фолликулов появляются рецепторы к ФСГ, действие которого необходимо для продукции гранулезными клетками фолликулярной жидкости и формирования полости (Gougeon A., 1996). Тоническая стимуляция эндогенного ФСГ достаточна для развития фолликулов диаметром до 5 мм. Их наличие хорошо видно при ультразвуковом исследовании (УЗИ) у девочек в подростковом возрасте. Однако для дальнейшего роста малых антральных фолликулов требуется усиление гонадотропного влияния, что обеспечивается только после формирования овариального цикла и включения в работу механизма положительной обратной связи между гипоталамо-гипофизарной системой и яичниками. По некоторым данным, в малых антральных фолликулах уже могут экс-прессироваться рецепторы к ЛГ.

Наиболее изученными являются действия ВMP4/ВMP7/ВMP15, GDF9, андрогенов, АМГ.

GDF9 относится к семейству β-трансформирующих факторов роста (TGFβ), продуцируется ооцитом; стимулирует пролиферацию гранулезных клеток, активируя их переход из G0/G1- в S- и G2/M-фазы клеточного цикла. У подопытных животных мутации гена приводят к нарушению фолликулогенеза, дифференцировке гранулезных клеток, инфертильности. У человека мутации гена данного фактора, нарушение его экспрессии могут быть ассоциированы с развитием некоторой гинекологической патологии (синдромом преждевременного истощения яичников, синдромом поликистозных яичников). Возможно, что GDF9 стимулирует рост фолликула посредством влияния на биосинтез тека-клетками андрогенов (тестостерона). GDF9 повышает также уровень экспрессии KL в клетках гранулезы, который, в свою очередь, оказывает влияние на клетки стромы и ооцит, так как на их поверхности есть рецептор к KL - ли-ганд c-Kit (рецептор фактора стволовых клеток). KL стимулирует рост ооцита и поддерживает блок мейоза (Knight P.G., Glister C., 2006).

ВMP15 также имеет отношение к семейству TGFβ; продуцируется ооцитом, является индуктором KL в клетках гранулезы, который, в свою очередь взаимодействуя с рецептором фактора стволовых клеток на тека-клетках, может оказывать влияние на синтез андрогенов.

GDF9 и ВMP15 обладают синергетическим действием по отношению к росту фолликула. Они влияют на клетки гранулезы через рецепторы типа I и II: GDF9 связывается с рецептором типа I (BMPRI); BMP15 - с рецептором типа II (BMPRII). При этом они регулируют продукцию друг друга с помощью локального механизма отрицательной обратной связи посредством системы c-Kit/KL. В культуре in vitro BMP15 и GDF9 также оказывают влияние на сам ооцит, способствуя его созреванию.

В последних исследованиях было показано, что BMP15 и GDF9 оказывают свое действие на клетки гранулезы не только на ранних этапах фолликулогенеза. Это обеспечивается изменением экспрессии внутриклеточных сигнальных белков SMAD (от англ. Similar to Mothers Against Decapentaplegic), посредством которых эти факторы действуют на гранулезу по мере развития фолликулов. Так, например, в первичных фолликулах экспрессируются SMAD2/3, в преан-тральных - SMAD2/3 и SMAD1/5/8, а в крупных фолликулах - SMAD1/5/8. Показано, что в фолликулах, которые впоследствии будут подвергаться атре-зии, уровень экспрессии мРНК-рецепторов к BMP I и II типов выше, чем в фолликуле, который станет доминантным. BMP15 и GDF9 оказывают влияние на клетки фолликула, окружающие ооцит, вызывая их дифференцировку в клетки кумулюса (Emori C., Sugiura K., 2014).

Описано несколько полиморфных вариантов аллелей гена GDF9 и BMP15, которые могут быть ассоциированы с нарушением репродуктивной функции и особенностями стимуляции яичников в протоколах ЭКО (табл. 1-2).

Примечание: сокращения, применяемые в таблицах, смотрите в списке сокращений и условных обозначений.

Система c-Kit/KL. KL известен как фактор, участвующий в росте и дифференцировке стволовых клеток. Что касается системы ооцит-гранулезатека, то он, взаимодействуя с рецептором на ооците, индуцирует рост и выход последнего из примордиальной стадии. Кроме этого, система c-Kit/KL принимает участие в дифференцировке клеток стромы яичника в тека-клетки.

Андрогены и андрогеновые рецепторы. В настоящее время получено достаточно экспериментальных (на грызунах, жвачных, свиньях, приматах) и клинических данных у человека, для того чтобы утверждать, что андрогены и андрогеновые рецепторы имеют большое значение в фолликулогенезе. Показано, что андрогеновые рецепторы экспрессируются во всех клетках фолликула (ооците, гранулезе, теке), строме яичника. Причем экспрессия андрогеновых рецепторов в гранулезных клетках усиливается по мере роста фолликула, достигая максимальной выраженности на антральной стадии. Андрогены усиливают экспрессию ФСГ-рецепторов в гранулезных клетках, их пролиферативную, ароматазную активность, синтез эстрадиола. Не исключается негативное влияние андрогенов на активность апоптоза клеток фолликула. Например, у человека в фолликулах диаметром 3-9 мм имеется положительная взаимосвязь между содержанием в фолликулярной жидкости тестостерона и мРНК рецепторов ФСГ. По данным J.M. Young и соавт. (2010), тестостерон даже способствует первичному рекрутированию фолликулов. Возможно, это влияние опосредованное, через выработку инсулиноподобного фактора роста 1 (от англ. insulin-like growth factor 1, IGF1), поскольку андрогеновые рецепторы в примордиальном фолликуле обычно не определяются.

Инсулиноподобные факторы роста. мРНК IGF1 выявлена в клетках гранулезы, клетках теки; IGF2 - только в клетках теки. В условиях in vitro показано, что IGF1 активирует уровень экспрессии рецепторов к ЛГ, синтез эстрадиола, прогестерона в мелких и крупных фолликулах, а также синтез андростендиона в крупных фолликулах.

АМГ - гликопротеид, относится к семейству TGFβ, продуцируется гранулезными клетками первичных, преантральных, небольших антральных фолликулов (менее 5-6 мм), а также клетками кумулюса. Можно предположить, что АМГ влияет на функцию яичников через угнетающее действие на рекрутирование примордиальных фолликулов и чувствительность к ФСГ.

Хорошо известно, что физиологическое действие того или иного фактора зависит от активации его рецептора. АМГ взаимодействует с соответствующими рецепторами 1-го и 2-го типов (АМГР 1 и АМГР 2). АМГР 2 локализован на гранулезных клетках фолликулов и является высокоспецифичным. Роль АМГР 1 пока не ясна. У плода человека АМГ начинает синтезироваться с 36-й недели гестации, что обеспечивает развитие из мюллеровых протоков матки, маточных труб и верхней трети влагалища и способствует деградации мюллерова протока в эмбрионах мужского пола.

Предполагается, что АМГ тормозит развитие фолликулов на прегонадотрофной и гонадотропинчувствительной стадиях развития. АМГ ингибирует ароматазу и продукцию эстрадиола в гранулезных клетках, снижает экспрессию рецепторов к ЛГ и чувствительность антральных фолликулов к ФСГ.

Нужно обратить внимание на тот факт, что по мере роста фолликулов продукция АМГ снижается вплоть до полного исчезновения в зрелом фолликуле. АМГ не продуцируется в примордиальных фолликулах, доминантном фолликуле (или ничтожно мало), атрезирующихся фолликулах, тека-клетках, клетках стромы, желтом теле. Концентрация АМГ в течение менструального цикла остается постоянной! Более того, содержание АМГ в крови прямо зависит от количества имеющихся в яичниках первичных, преантральных и малых ан-тральных фолликулов. Следовательно, уровень АМГ в крови является характеристикой овариального резерва, то есть количества фолликулов, потенциально способных к росту и развитию!

Колокализация первичных ооцитов, синтез АМГ и его рецептора, по-видимому, свидетельствуют об аутокринном механизме действия АМГ на клетки фолликула.

Ген, кодирующий АМГ, локализуется на участке хромосомы 19p13.3, а ген рецептора АМГ 2-го типа расположен на хромосоме 12q13 (Altmäe S. et al., 2011). Есть сведения о наличии нескольких полиморфных вариантов аллелей гена АМГ и его рецептора (табл. 1-3). Предполагается, что некоторые из них могут иметь значение в генезе синдрома поликистозных яичников (СПЯ), а также избыточном ответе яичников на гонадотропную стимуляцию. Анализируя возможную клиническую значимость генетических вариаций, можно выделить группу пациенток с тем или иным типом овариального ответа еще до начала лечения.

Примечание: AMH - антимюллеров гормон (от англ. anti-Mullerian hormone).

Гонадотропинзависимая фаза фолликулогенеза (циклическое рекрутирование фолликулов). Основное значение в заключительной стадии фолликулогенеза: росте и развитии когорты антральных фолликулов (2-5 мм), селекции доминантного фолликула, его созревании - играют ГТ - ФСГ и ЛГ.

Начало роста когорты антральных фолликулов обеспечивается возрастанием содержания ФСГ с конца лютеиновой фазы цикла. Этот период связан с регрессией желтого тела (лютеолизом), снижением уровня эстрадиола и ингибина. Рекрутируемые фолликулы представляют собой такую группу фолликулов в каждом из яичников, которые покинули примордиальный пул приблизительно в один и тот же период времени несколько месяцев назад (Fauser B., Van Heusden A., 1997). Именно поэтому они находятся на сходной стадии развития. Возрастание содержания ФСГ в конце лютеиновой и начале фолликулярной фазы цикла предотвращает атрезию данных фолликулов. Начало роста когорты фолликулов начинается только тогда, когда уровень ФСГ достигнет некоторого порогового уровня.

Однако в естественном менструальном цикле фолликулы, составляющие настоящую когорту, растут неодинаково (асинхронно), поскольку каждый из когорты имеет свою, индивидуальную чувствительность к ФСГ. Считается, что она определяется экспрессией ФСГ-рецепторов на клетках гранулезы. Число фолликулов, подвергающихся циклическому рекрутированию, зависит от возраста женщины (в среднем 11 в яичнике). ФСГ стимулирует деление гранулезных клеток, продукцию ими фолликулярной жидкости, активирует ароматазу и, соответственно, конверсию андрогенов (андростендиона) в эстрадиол. Обычно у одного фолликула экспрессия ФСГ-рецепторов достаточно высока, он имеет низкий порог чувствительности к ФСГ и поэтому растет быстрее остальных. Так происходит селекция (или выбор) доминантного фолликула из когорты растущих фолликулов (McNatty K.P., 1978). Как правило, это событие происходит на 7-8-й день менструального цикла.

По мере роста фолликулов содержание эстрадиола в крови постепенно повышается. Кроме этого, доминантный фолликул интенсивно секретирует ингибин В. Синтез ингибина В происходит в гранулезных клетках фолликула и контролируется ФСГ. Согласно результатам ряда исследований ингибин В стимулирует продукцию андрогенов в фолликулах, что, в свою очередь, вызывает усиление экспрессии ФСГ- и ЛГ-рецепторов, обеспечивая высокую чувствительность клеток к ГТ. Предполагается, что это является одним из механизмов селекции доминантного фолликула в естественном менструальном цикле (Andersen С., 2017). Согласно механизму отрицательной обратной связи ингибин В наряду с эстрадиолом угнетает секрецию ФСГ в середине фолликулярной фазы цикла. Наибольшие значения концентрации ингибина В наблюдаются в середине фолликулярной фазы цикла. Снижение уровня ФСГ в середине фолликулярной фазы цикла является важным биологическим событием, обеспечивающим у женщины монофолликулярный рост в натуральном цикле. Вследствие этих причин приблизительно с 7-8-го дня цикла начинается падение уровня ФСГ в крови.

Период времени, в течение которого уровень ФСГ превышает пороговый, необходимый для селекции и роста доминантного фолликула, называется ФСГ-окном. В естественном менструальном цикле ФСГ-окно обеспечивает селекцию одного доминантного фолликула.

Доминантный фолликул продолжает свое развитие и рост вплоть до овуляции, интенсивно продуцируя эстрадиол даже в условиях физиологического снижения уровня ФСГ. Считается, что это обеспечивается высокой чувствительностью клеток гранулезы доминантного фолликула не только к ФСГ, но также и к ЛГ. В ряде исследований было показано, что экспрессия ЛГ-рецепторов на гранулезных клетках достаточно высока, и это позволяет доминантному фолликулу продолжить развитие в среднюю и позднюю фолликулярные фазы цикла. Остальные фолликулы когорты подвергаются атрезии. Высокая чувствительность доминантного фолликула к ЛГ обеспечивается одной из важных функций ФСГ - индукцией экспрессии ЛГ-рецепторов на гранулезных клетках.

Постепенно уровень эстрадиола достигает порогового значения для включения уникального по своей природе механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом - когда повышение уровня эстрогенов не «угнетает», а стимулирует секрецию ГТ гипофизом. Положительная обратная связь начинает работать при повышении уровня эстрадиола в крови до 500- 800 пмоль/л обычно на 12-й день менструального цикла и функционирует в течение 2-3 дней (рис. 1-6). Реализация механизма положительной обратной связи абсолютно необходима для овуляторного пика ГТ и овуляции (рис. 1-7).

В процессе роста доминантного фолликула играют важную роль также интраовариальные факторы. К ним относят усиление в гранулезных клетках активности ароматазы, экспрессии IGF2, а также продукцию ооцитом факторов BMP15 и GDF9, которые могут быть ответственны в том числе за экспансию кумулюсных клеток (Juengel J.L. et al., 2002; Gueripel X. et al., 2006).

Известно, что действие ФСГ на гранулезные клетки осуществляется посредством его взаимодействия с соответствующим рецептором.

Рецептор ФСГ (678 аминокислот) состоит из экстрацеллюлярного N-концевого участка, ответственного за связывание с ФСГ, трансмембранной части и внутриклеточного С-концевого региона, который обеспечивает «поступление» сигнала в клетку. Ген, кодирующий рецептор ФСГ, локализуется на участке хромосомы 2p21 и состоит из 10 экзонов.

Пожалуй, в настоящее время его полиморфизм является наиболее изученным генетическим фактором, который может оказывать влияние на продуктивность стимуляции яичников. Описано более 1000 SNP гена рецептора ФСГ. Большинство из них локализованы в интронах и не оказывают влияния на активность рецептора; пять локализованы в кодирующем регионе и один - в промоторной зоне. «Экзонные» полиморфизмы находятся в 10-м экзоне (локализации 307, 329, 524, 665 и 680).

Большинство исследований посвящены полиморфизму двух замен в экзоне 10. Первый определяет замену аспарагина (Asn) на серин (Ser) в позиции 680 во внутриклеточном домене рецептора (Asn680Ser), второй - аланина (Ala) на треонин (Thr) в позиции 307 (Ala307Thr) во внеклеточном домене белка. Данные полиморфизмы находятся в непосредственной близости на хромосоме и наследуются вместе. Именно поэтому генотипирование одного из полиморфизмов позволяет делать выводы о другом. Аллели 307Thr и 680Asn относятся к «основным» («мажорным»), а 307Ala и 680Ser - к «минорным» аллелям (рис. 1-8).

Предполагается, что вышеперечисленные «генетические варианты» рецептора ФСГ вследствие изменения ряда молекулярных механизмов (фосфорилирования, гликозилирования) могут по-разному взаимодействовать с ФСГ и, таким образом, влиять на эффективность стимуляции яичников.

Еще один полиморфизм G/A в позиции -29 гена FSHR также может модулировать ответ яичников на гонадотропную стимуляцию.

Согласно данным F.J. Moron и A Ruiz (2010) вариант Asn680Ser (rs6166) является прогностическим фактором «бедного» ответа яичников на гонадотропную стимуляцию.

В последние годы активно изучается роль кисспептина в регуляции овуляторного цикла. Показано, что кисспептин способствует секреции гипофизом ΓТ (ΦСΓ и ЛΓ). Выявлена экспрессия кисспептина и его рецептора в нейронах гипоталамуса. Предполагается, что эстрогены способны связываться с α-эстрогеновыми рецепторами нейронов, экспрессирующих рецепторы кисспептина, и вызывают усиление секреции кисспептина и гонадотропин-рилизинг-гормона (ΓнРΓ) (Roa J. et al., 2008).

Свое регуляторное действие на клетку ΓТ осуществляют вследствие их специфического связывания с рецепторами ΦСΓ и ЛΓ/хорионический гонадотропин человека (ХΓЧ). С рецептором ЛΓ связываются как ЛΓ, так и ХΓЧ. Связывание рецептора с ΓТ приводит к активации сигнальных белков, что, в свою очередь, запускает сигнальный каскад в клетке. Φункциональный ответ клетки будет определяться рядом факторов: активностью сигнальных белков, функциональным состоянием рецептора, зависящего от его модификации (фосфорилирования, гликозилирования, ацилирования), а также от модификации самих ГТ посредством их N-гликозилирования (Шпаков А.О., 2017). Процесс N-гликозилирования катализируется ферментами (олигосахарилтрансферазой, гликозилтрансферазой). В результате данного процесса формируется олигосахаридная структура (N-гликан) ГТ с определенным типом ветвления и распределением заряда, что и обеспечивает правильное сворачивание его молекулы и определяет ее специфическую биологическую активность (Thaysen-Andersen M. et al., 2016). Разные по степени гликозилирования изоформы ГТ отличаются друг от друга по своей биологической активности и физико-химическим свойствам (кислотности). К настоящему времени получены данные о том, что на протяжении менструального цикла соотношение изоформ ФСГ и ЛГ, различающихся по степени гликозилирования, варьирует. Это, в частности, определяется зависимостью экспрессии ферментов, ответственных за процесс гликозилирования (например, гликозилтрансферазы), от уровня эстрадиола. В середине цикла повышается содержание слабо гликозилированных, слабокислых изоформ ФСГ с высокой биологической активностью.

Концентрация прогестерона в фолликулярную фазу цикла является низкой. Синтез прогестерона в доминантном фолликуле и, соответственно, его уровень в крови возрастают непосредственно перед овуляцией. Считается, что прогестерон играет важную, пермиссивную роль в инициации позитивной обратной связи между яичниками и гипоталамусом, способствуя овуляторному пику го-надотропинов. В некоторых работах было показано, что эффект прогестерона в этом случае может быть реализован только после адекватного воздействия на центральные структуры мозга эстрогенов. Имеются также экспериментальные данные, что под воздействием эстрогенов в гипоталамусе усилен локальный синтез прогестерона («нейропрогестерона»), который необходим для включения механизма положительной обратной связи (Messinis I.E., Templeton A.A., 1990; Micevych Р. et al., 2003). В последние годы появились сведения о возможном влиянии прогестерона не только на уровне центральной нервной системы, но также на «уровне» яичников. Так, в результате ряда экспериментальных работ выявлено, что гранулезные клетки фолликулов экспрессируют не прогестероновые рецепторы, а так называемый мембранный компонент-1 прогестеронового рецептора (PGRMC1, от англ. progesterone receptor membrane component-1), который способен связывать прогестерон, запуская каскад событий в клетках, влияющих на активность их пролиферации и/или апоптоза, а также стероидогенез.

Считается, что достаточное содержание ЛГ-рецепторов в гранулезных клетках имеется в фолликулах диаметром 14 мм и более. Именно поэтому данные фолликулы чувствительны к ЛГ и при наличии паразитарного (преждевременного) пика ЛГ могут овулировать преждевременно или подвергнуться преждевременной лютеинизации.

Каким образом предотвратить атрезию и «выход» в рост не одного, а нескольких фолликулов? Считается, что это достигается «расширением» ФСГ-окна. Действительно, введение препаратов, содержащих ФСГ, приводит к соответствующему увеличению концентрации последнего. Это вызывает рост и развитие не одного, а нескольких фолликулов (рис. 1-9)! Понимание теории ФСГ-окна необходимо для осуществления так называемой мягкой стимуляции - стимуляции низкими дозами ФСГ для получения небольшого количества фолликулов.

Важным аспектом рассматриваемой проблемы как с научной, так и с практической точки зрения является роль ЛГ в фолликулогенезе. ЛГ имеет следующие точки приложения:

Считается, что реализация вышеперечисленных функций ЛГ возможна, когда содержание этого гормона находится в некотором оптимальном коридоре значений. Каковы границы этого коридора? До сих пор ответ на этот вопрос не получен. По данным большинства исследований, посвященных указанной проблеме, уровень ЛГ должен находиться в пределах 0,5-3 МЕ/л.

Предполагается, что для обеспечения физиологического стероидогенеза в яичниках достаточно активации <1% ЛГ-рецепторов фолликулов. Именно поэтому количество эндогенного ЛГ в период десенситизации гипофиза агони-стами гонадотропин-рилизинг-гормона (а-ГнРГ) является достаточным для эффективной стимуляции препаратами ФСГ. Однако в отдельных работах было показано, что значительная супрессия синтеза ЛГ может быть ассоциирована со снижением эффективности протокола ЭКО, а также с повышением частоты невынашивания. Очень низкая концентрация ЛГ приводит к нарушению созревания и роста фолликулов, снижению синтеза в них андрогенов и эстрадиола, а высокая концентрация ЛГ - к атрезии недоминантных фолликулов, торможению пролиферации гранулезы, преждевременной лютеинизации, нарушению созревания ооцита.

В последние годы получены данные о том, что одиночные нуклеотидные полиморфизмы (инсерции либо делеции одного или нескольких оснований) в гене, кодирующем β-субъединицу ЛГ, могут иметь клиническое значение. Известно, что ЛГ является гетеродимерным полипептидом, состоящим из двух субъединиц - α и β. При этом структура первой одинаковая у ФСГ и ЛГ, а β-субъединица является гормонспецифичной, содержит рецептор-связывающий домен. Ген β-субъединицы ЛГ локализован в хромосомном регионе 11p13 и имеет три экзона. К сегодняшнему дню идентифицировано много полиморфизмов данного гена (179 SNP; www.snpper.chip.org). При этом три из них находятся в кодирующей зоне и приводят к снижению активности эндогенного ЛГ:

Варианты гена βЛГ достаточно широко распространены. Например, согласно отдельным исследованиям в Швеции частота их достигает 18%, в Финляндии - 40%.

Наличие вариантов β-субъединицы ЛГ может приводить к снижению эффективности стимуляции препаратами ФСГ, к использованию больших курсовых доз ФСГ у пациенток с нормальными показателями овариального резерва. Предполагается, что в этом случае может проявляться разная биологическая активность и/или фармакокинетика эндогенного ЛГ, обусловленная его разными генетическими вариантами. Назначение препаратов с ЛГ-активностью таким пациенткам в следующем протоколе снижает потребность в ФСГ (Alviggi С. et al., 2009).

Таким образом, фолликулогенез и оогенез представляют собой длительные, генетически детерминированные сопряженные физиологические процессы, в регуляцию которых вовлечены локальные (внутрияичниковые) и гормональные факторы.

Рост и развитие фолликулов под влиянием ГТ наблюдаются в течение заключительной, так называемой гонадотропинзависимой фазы фолликуло-генеза. При этом основную роль играет ФСГ, а на последних этапах развития - ЛГ.

В обычных условиях пороговый уровень эндогенного ФСГ обеспечивает рост до стадии предовуляторного, как правило, одного фолликула.

В протоколах ЭКО для обеспечения роста нескольких фолликулов необходимо увеличение периода времени, в течение которого уровень ФСГ превышает пороговый, требуемый для селекции и роста одного доминантного фолликула. Это достигается с помощью экзогенного введения препаратов, содержащих ГТ.

Лютеиновая фаза естественного менструального цикла. Желтое тело оказывает существенное влияние на фолликулогенез.

Так, в лютеиновую фазу цикла ингибин А и эстрадиол, синтезируемые желтым телом (у человека, приматов), супрессируют синтез ФСГ и, таким образом, блокируют рост антральных фолликулов диаметром более 4 мм. Согласно результатам гистологических исследований в яичниках в данный период содержатся в основном фолликулы на стадии атрезии (McNatty K.P. et al., 1983). Показано, что развитие фолликулов в течение лютеиновой фазы цикла возможно при энуклеации желтого тела или при введении экзогенных гонадотропинов.

Интересно, что в 7 из 9 случаев доминантный фолликул развивается в яичнике, контралатеральном по отношению к таковому, в котором в предыдущем цикле развивалось желтое тело (Chikazawa K. et al., 1986). Более того, было показано, что величина соотношения эстрадиол/андростендион в фолликулярной жидкости такого фолликула выше, чем аналогичный показатель в ипсилатеральном яичнике (Fukuda M. et al., 1996).

Φункционирование желтого тела влияет также на процесс селекции фолликула в течение так называемые вторых, третьих волн роста когорты антральных фолликулов, которые будут описаны ниже. Например, при наличии второй волны роста когорты фолликулов в середине лютеиновой фазы цикла селекции фолликула не происходит.

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О НАЛИЧИИ НЕСКОЛЬКИХ ВОЛН РОСТА КОГОРТЫ ФОЛЛИКУЛОВ

Выше мы рассмотрели традиционное представление о фолликулогенезе в яичниках, основанное на мнении о формировании одной когорты растущих фолликулов в конце лютеиновой - начале фолликулярной фазы менструального цикла. Однако к настоящему времени есть научно обоснованное мнение о том, что в течение менструального цикла имеет место не одна, а несколько волн роста антральных фолликулов (Baerwald A.R. et al., 2003, 2012). Новая парадигма пришла к нам из медицинской ветеринарии (Gougeon A., 1986; Baerwald A.R. et al., 2003). Волнами роста фолликулов называют синхронный рост группы (когорты) антральных фолликулов, наблюдающийся через определенный интервал времени (Ginther O.J. et al., 2004). При этом фолликулы, составляющие такую группу, в основном гомогенны по диаметру. Некоторые исследователи выделяют два типа волн: большую и малую. Инициация роста фолликулов, составляющих эти волны, начинается в один период. Однако в когорте фолликулов, составляющих большую волну, один из них становится лидирующим (через несколько дней), растет большими темпами (феномен девиации и селекции) и, в конце концов, овулирует. При этом остальные фолликулы, составляющие большую волну, подвергаются атрезии. В течение малой волны роста не наблюдается феномена девиации, селекции, овуляции лидирующего фолликула и все фолликулы подвергаются атрезии (Ginther O.J. et al., 2004).

Наличие таких волн роста фолликулов было зафиксировано у пациенток с помощью УЗИ. 75% женщин при этом имели две волны роста фолликулов, 32% - три волны. В менструальных циклах с присутствием двух или трех волн одна из них является овуляторной (развивается в фолликлярную фазу цикла), а другие, развивающиеся в лютеиновую фазу цикла, - ановуляторными. Так, у пациенток с двумя волнами первая волна роста начинается спустя день после овуляции. Она характеризуется отсутствием селекции доминантного фолликула (в этот период наблюдаются повышение концентрации прогестерона, блокирование пульсирующего выделения ЛΓ гипофизом), и все фолликулы этой малой волны подвергаются атрезии. Вторая же волна (большая) возникает в конце лютеиновой фазы цикла или в течение первых дней цикла (период низкого содержания прогестерона и возрастания частоты и амплитуды секреции гона-дотропинов) (Baerwald A.R. et al., 2003) - рис. 1-10.

Интересно, что роль желтого тела в динамике роста фолликулов в лютеиновую фазу цикла была изучена у человека и домашних животных. Нужно отметить, что, как показали исследования, ни размер, ни длительность функционирования желтого тела, ни уровень прогестерона и эстрадиола во вторую фазу цикла не отличались у пациенток с двумя, тремя волнами роста фолликулов (Baerwald A.R. et al., 2003, 2012).

Наличие малых («ановуляторных») волн роста когорты антральных фолликулов явилось основой стимуляции яичников во вторую фазу менструального цикла.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Дыбан А.П., Баранов В.С. Оогенез млекопитающих // Современные проблемы оогенеза / под ред. Т.А. Детлаф. Москва : Наука, 1977.

Шпаков А.О. Γликозилирование гонадотропинов как важнейший механизм регуляции их активности // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2017. Т. 103, № 9. С. 1004-1021.

Altmäe S., Hovatta O., Stavreus-Evers A., Salumets A. Genetic predictors of controlled ovarian hyperstimulation: whre do we stand today? // Hum. Reprod. Update. 2011. Vol. 17. P. 813-828.

Alviggi C., Clarizia R., Pettersson K. et al. Suboptimal response to GnRHa long protocol is associated with a common LH polymorphism // Reprod. Biomed. Online. 2009. Vol. 18, N 1. P. 9-14.

Andersen C. Inhibin-B secretion and FSH isoform distribution may play an integral part of follicular selection in the natural menstrual cycle // Mol. Hum. Reprod. 2017. Vol. 23, N 1. P. 16-24.

Baerwald A.R., Adams G.P. A new model for ovarian follicular development during the human menstrual cycle // Fertil. Steril. 2003. Vol. 80. Р. 116-122.

Baerwald A.R., Adams G.P., Pierson R.A. Characterization of ovarian follicular wave dynamics in women // Biol. Reprod. 2003. Vol. 69, N 3. P. 1023-1031.

Baerwald A.R., Adams G.P., Pierson R.A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review // Hum. Reprod. Updat. 2012. Vol. 18. P. 73-91.

Chikazawa K., Araki S., Tamada T. Morpological and endocrinological studies on follicular development during the human menstrual cycle // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1986. Vol. 62. P. 305-313.

Cohen P.E., Holloway J.K. Predicting gene networks in human oocyte meiosis // Biol. Reprod. 2010. Vol. 82, N 3. P. 469-72.

Edson M.A., Nagaraja A.K., Matzuk M.M. The mammalian ovary from genesis to revelation // Endocr. Rev. 2009. Vol. 30, N 6. P. 624-712.

Emori C., Sugiura K. Role of oocyte-derived paracrine factors in follicular development // J. Anim Sci. 2014. Vol. 85. P. 627-633.

Gupta S.K. The human egg?s zona pellucida // Curr. Top Dev. Biol. 2018. Vol. 130. P. 379-411.

Fauser B., Van Heusden A. Manipulation of human ovarian function: physiological concepts and clinical consequences // Endocr. Rev. 1997. Vol. 18. P. 71-106.

Fukuda M., Fukuda K., Anderson C.Y., Byskov A.G. Contralateral selection of dominant follicle favours pre-embryo development // Hum. Reprod. 1996. Vol. 11. P. 1958-1962.

Ginther O.J., Beg M.A., Gastal E.L., Gastal M.O., Baerwald A.R., Pierson R.A. Systemic concentrations of hormones during the development of follicular waves in mares and women: a comparative study // Reproduction. 2005. Vol. 130, N 3. P. 379-388.

Ginther O.J., Gastal E.L., Gastal M.O., Bergfelt D.R., Baerwald A.R., Pierson R.A. Comparative study of the dynamics of follicular waves in mares and women // Biol. Reprod. 2004. Vol. 71, N 4. P. 1195-1201.

Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results // Hum. Reprod. 1986. Vol. 1, N 2. P. 81-87.

Gougeon A. Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses // Endocrine Reviews. 1996. Vol. 17, N 2. P. 121-155.

Gueripel X., Brun V., Gougeon A. Oocyte bone morphogenetic protein 15, but not growth differentiation factor 9, is increased during gonadotropin-induced follicular development in the immature mouse and is associated with cumulus oophorus expansion // Biol. Reprod. 2006. Vol. 75. P. 836-843.

Hackeloer B.J., Fleming R., Robinson H.P., Adam A.H., Coutts J.R. Correlation of ultrasonic and endocrinologic assessment of human follicular development // Am. J. Obstet. Gynecol. 1979. Vol. 135. Р. 122-128.

Hsueh A.J., Kawamura K., Cheng Y., Fauser B.C. Intraovariancontrol of early folliculogenesis // Endocr. Rev. 2015. Vol. 36. P. 1-24.

Juengel J.L., Hudson N.L., Heath D.A., Smith P., Reader K.L., Lawrence S.B. et al. Growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep // Biol. Reprod. 2002. Vol. 67. P. 1777-1789.

Knight P.G., Glister C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development // Reproduction. 2006. Vol. 132. P. 191-206.

McNatty K.P. Cyclic changes in antral fluid hormone concentrations in humans // Clinics Endocrinol. Metab. 1978. Vol. 7. Р. 577-600.

McNatty K.P. Hormonal correlates of follicular development in the human ovary // Aust. J. Biol. Sci. 1981. Vol. 34. Р. 249-468.

McNatty K.P., Hillier S.G., van den Boogaard A.M., Trimbos-Kemper T.C., Reichert L.E. Jr., van Hall E.V. Follicular development during the luteal phase of the human menstrual cycle // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1983. Vol. 56. Р. 1022-1031.

Messinis I.E., Templeton A.A. Effects of supraphysiological concentrations of progesterone on the characteristics of the oestradiol-induced gonadotrophin surge in women // J. Reprod. Fertil. 1990. Vol. 88. Р. 513-519.

Micevych P., Sinchak K., Mills R.H., Tao L., LaPolt P., Lu J.K. The luteinizing hormone surge is preceded by an estrogen-induced increase of hypothalamic progesterone in ovariectomized and adrenalectomized rats // Neuroendocrinology. 2003. Vol. 78. Р. 29-35.

Moron F.J., Ruiz A. Pharmacogenetics of controlled ovarian hyperstimulation: time to corroborate the clinical utility of FSH receptor genetic markers // Pharmacogenomics. 2010. Vol. 11. P. 1613-1618.

Ottolini C., Newnham L., Capalbo A., Natesan S., Joshi H., Cimadomo D. et al. Genom - wide maps of recombination and Chromosome segregation in human oocytes and embryos show selektion for maternal recombination rates // Nat. Genet. 2015. Vol. 47, N 7. P. 727-735.

Pangas S.A., Rajkovic A. Transcriptional regulation of early oogenesis: in search of masters // Hum. Reprod. Update. 2006. Vol. 12, N 1. P. 65-76.

Pedersen T., Peters H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary // J. Reprod. Fert. 1968. Vol. 17. P. 555-557.

Pepling M.E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development // 2006. J. Genesis. Vol. 44. P. 622-632.

Pepling M.E. Follicular assembly: mechanisms of action // J. Reproduction. 2012. Vol. 143. P. 139-149.

Roa J., Vigo E., Castellano J.M., Gaytan F., García-Galiano D., Navarro V.M. et al. Follicle-stimulating hormone responses to kisspeptin in the female rat at the preovulatory period: modulation by estrogen and progesterone receptors // Endocrinology. 2008. Vol. 149, N 11. P. 5783-5790.

Sfakianoudis K., Simopoulou M., Maziotis E., Giannelou P., Tsioulou P., Rapani A. et al. Evaluation of the second follicular wave phenomenon in natural cycle assisted reproduction: a key option for poor responders through luteal phase oocyte retrieval // Medicina (Kaunas). 2019. Vol. 55, N 3. P. 68.

Thaysen-Andersen M., Packer H.P., Schulz B.L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and Its Regulation in Health and Disease // Mol. Cell. Proteomics. 2016. Vol. 15, N 6. P. 1773-1790.

Young J.M., McNeilly A.S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle // Reproduction. 2010. Vol. 140. P. 489-504.

Wang N., Wang Y., Chen Q., Dong J., Tian H., Fu Y. et al. Luteal-phase ovarian stimulation vs conventional ovarian stimulation in patients with normal ovarian reserve treated for IVF: a large retrospective cohort study // Clin. Endocrinol. (Oxf.). 2016. Vol. 84, N 5. P. 720-728.

Гонадотропины ЛГ и ФСГ, которые секретируются гонадотрофами передней доли гипофиза, и продуцируемый плацентой в I триместре беременности ХГЧ являются важнейшими регуляторами функций репродуктивной системы у женщин. Препараты ГТ природного происхождения и рекомбинантные формы этих гормонов широко используются во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ) для контролируемой индукции овуляции (Martins W.P. et al., 2013; Ezcurra D., Humaidan P., 2014; Casarini L. et al., 2016; Santi D. et al., 2017). Несмотря на общие черты в структурно-функциональной организации ГТ, их рецепторов и зависимых от ГТ внутриклеточных сигнальных каскадов, регуляторные влияния ФСГ, ЛГ и ХГЧ, а также различных их форм на ткани репродуктивной системы могут в значительной степени различаться. Вследствие этого эффективность и последствия применения различных препаратов ГТ для контролируемой индукции овуляции, а также риск развития нежелательных побочных эффектов при использовании этих препаратов сильно варьируют. Все вышесказанное свидетельствует о том, что изучение структурных особенностей ГТ, в первую очередь посттрансляционных модификаций их молекул, а также сигнальных механизмов их действия на клетку является одной из актуальных проблем современной эндокринологии и репродуктологии. Современному состоянию этой проблемы и посвящена настоящая глава.

ГОНАДОТРОПИНЫ И ИХ СИГНАЛЬНЫЕ КАСКАДЫ

Характерной особенностью всех ГТ является формирование ими αβ-гетеродимерного комплекса, имеющего молекулярную массу около 30 кДа. α-Субъединицы для всех ГТ одинаковы по первичной структуре, в то время как β-субъединицы в этом отношении вариабельны и специфичны для определенного типа ГТ (Hearn M.T., Gomme P.T., 2000; Fournier T. et al., 2015). ФСГ и ЛГ продуцируются специализированными клетками - гонадотрофами, расположенными в передней доле гипофиза, причем каждый из гормонов синтезируется гонадотрофами определенного типа. Следствием этого являются значительные различия посттрансляционных модификаций молекул ФСГ и ЛГ. Стабильность αβ-гетеродимерного комплекса обеспечивается скручиванием и перекрещиванием различных сегментов α- и β-субъединиц и формированием ими жесткой узловой структуры, которую называют цистиновым узлом (от англ. cystine-knot). Эта структура скрепляется внутримолекулярными дисульфидными связями, которые соединяют удаленные друг от друга сегменты α- и β-субъединиц. В гетеродимерах ФСГ, ЛГ и ХГЧ α- и β-субъединицы расположены симметрично по отношению друг к другу и имеют вытянутую форму, плотно прижимаясь друг к другу (Puett D. et al., 2007). Столь стабильная и компактная структура αβ-гетеродимерных комплексов обеспечивает относительно высокую устойчивость ГТ в кровотоке и в дальнейшем сохранение этой структуры при экскреции с мочой.

Синтез и секреция ФСГ и ЛГ стимулируются ГнРГ, который высвобождается гипоталамическими ГнРГ-продуцирующими нейронами. Наряду с ГнРГ продукция ГТ регулируется полипептидными факторами - активинами, ингибинами, фоллистатином и гонадотропин-ингибирующим гормоном и по механизму обратной связи стероидными гормонами (Jin J.M., Yang W.X., 2014). Синтез ХГЧ в основном осуществляется плацентой в I триместре беременности, причем его концентрация в крови в этот период многократно превосходит концентрацию ЛГ, структурного и функционального гомолога ХГЧ. Необходимо отметить, что ХГЧ может синтезироваться не только в плаценте, но и в гона-дотрофах гипофиза, причем ХГЧ гипофизарного происхождения, несмотря на сходство первичной структуры, по своей биологической активности существенно отличается от ХГЧ плацентарного происхождения.

Свое регуляторное действие на клетку ГТ осуществляют вследствие их специфического связывания с рецепторами ФСГ и ЛГ/ХГЧ, причем с рецептором ЛГ связываются, хотя и с различным сродством, как ЛГ, так и обе формы ХГЧ. Рецепторы ГТ относятся к обширному семейству гормональных рецепторов, которые функционально сопряжены с гетеротримерными G-белками (от англ. G protein-coupled receptors, GPCR). Все GPCR имеют трансмембранный канал, который формируется семью гидрофобными участками, пронизывающими плазматическую мембрану. Внутри канала в большинстве GPCR располагается участок для специфического связывания гормона. Поскольку ГТ являются значительными по размеру гликопротеинами, они не способны не только проникнуть в трансмембранный канал рецептора, но даже приблизиться к нему. Для связывания с ними рецепторы ФСГ и ЛГ/ХГЧ наделены большим внеклеточным доменом (эктодоменом), который по размеру составляет почти половину рецепторной молекулы (Ulloa-Aguirre A., Zariñán T., 2016). В отсутствие гормональной стимуляции эктодомен взаимодействует с внеклеточными участками рецептора и его трансмембранным каналом и стабилизирует, таким образом, неактивную конформацию рецептора. Связывание эктодомена с ГТ приводит к изменению пространственного расположения эктодомена по отношению к трансмембранному каналу и снимает его ингибирующее влияние на рецептор. В результате рецептор переходит в активированное состояние, в котором он способен стимулировать активность нижележащих сигнальных белков (Puett D. et al., 2007; Menon K.M., Menon B., 2012). Для активации рецептора важны обе субъединицы ФСГ, ЛГ и ХГЧ - β-субъединица ГТ отвечает за специфическое связывание с определенным типом рецептора, в то время как α-субъединица вклинивается между эктодоменом и трансмембранным каналом, нарушает их ассоциацию и обеспечивает переход рецептора в активированное состояние. Мономерные α- и β-субъединицы не способны активировать рецептор, функционируя как конкурентные антагонисты, мешающие активации рецептора и проведению сигнала. Вследствие этого целостность αβ-гетеродимерного комплекса является необходимым условием для специфичной активации ΓТ рецепторов ΦСΓ и ЛΓ/ХΓЧ.

В активированном состоянии рецепторы ΦСΓ и ЛΓ/ХΓЧ приобретают способность активировать сопряженные с ними гетеротримерные G-белки и регуляторные белки β-аррестины. Являясь ключевыми компонентами зависимых от ΓТ сигнальных каскадов, G-белки и β-аррестины определяют физиологический ответ репродуктивной системы на стимуляцию ΓТ. Установлено, что рецепторы ΦСΓ и ЛΓ сопряжены с тремя типами G-белков: Gs, Gi/o и Gq/11 (Шпаков А.О., 2009). Активация ΓТ Gs-белков приводит к стимуляции активности фермента аденилатциклазы, который катализирует образование универсального вторичного посредника цАМΦ. В результате повышается внутриклеточный уровень цАМΦ и, как следствие, активируются цАМΦ-зависимый фермент протеинкиназа А и цАМΦ-активируемые обменные факторы семейства Epac (Kara E. et al., 2006; Wayne C.M. et al., 2007; Choi J.-H. et al., 2009). Большинство функционально важных эффектов ΓТ на женскую репродуктивную систему, включая контроль стероидогенеза и фолликулогенеза, реализуются через цАМΦ-зависимые механизмы. Так, через цАМΦ-зависимые механизмы ΓТ контролируют экспрессию около 60-70% зависимых от них всех генов (Ulloa-Aguirre A. et al., 2011). Активация Gi/o-белков является короткой отрицательной обратной связью, с помощью которой подавляется вызванное ΓТ повышение активности аденилатциклазы, и внутриклеточный уровень цАМΦ возвращается в исходное состояние. Активация ΓТ еще одного типа G-белков - Gq/11 - вызывает стимуляцию фермента фосфолипазы С и повышение уровня внутриклеточного кальция вследствие его выхода из внутриклеточных депо, регулируя таким образом секреторную активность клеток репродуктивной системы, их дифференцирование и выживаемость. Необходимо отметить, что гиперстимуляция Gq/11-белков может приводить к повышенной продукции фактора роста эндотелия сосудов, мощного активатора ангиогенеза. Это является одной из основных причин развития синдрома гиперстимуляции яичников при использовании ΓТ для индукции овуляции. Активация сигнальных путей, регулируемых фактором роста эндотелия сосудов, также повышает риск развития злокачественных новообразований.

Значительный интерес представляет активация ΓТ β-аррестинов (Ulloa-Aguirre A. et al., 2011, 2013; Riccetti L. et al., 2017). Эти регуляторные белки приобретают способность взаимодействовать с рецепторами ΦСΓ и ЛΓ/ХΓЧ только после того, как активированные рецепторы будут подвергнуты фосфорилированию специфичными GPCR-протеинкиназами (GRK). Исключительно важно, какая форма GRK осуществляет фосфорилирование рецептора, поскольку от этого во многом зависит дальнейшая его судьба. Так, фосфорилирование рецептора ΦСΓ с помощью GRK 2-го типа приводит к образованию комплекса фосфорилированного рецептора с β-аррестином, в котором значительная часть молекул рецепторов подвергается рециклизации и, освободившись от ΦСΓ и β-аррестина, вновь возвращается на поверхность клетки.

В то же время комплекс β-аррестина с рецептором ΦСΓ, который был фосфорилирован GRK 5-го и 6-го типов, после интернализации подвергается деградации в лизосомах, что снижает число функционально активных рецепторов и вызывает резистентность ткани яичников к ФСГ. Важно подчеркнуть, что гиперстимуляция рецепторов, в том числе при длительном воздействии на них высокоактивных форм ГТ, неизбежно приводит к активации β-аррестиновых путей и быстрому снижению чувствительности репродуктивных клеток к регуляторному действию ГТ.

Несмотря на то что ЛГ и ХГЧ связываются с одним и тем же рецептором, они активируют разные сигнальные каскады, что приводит к различным физиологическим эффектам. Эти различия обусловлены тем, что наборы активированных конформаций рецептора ЛГ/ХГЧ при его связывании с ЛГ и ХГЧ различаются (Filicori M. et al., 2005; Casarini L. et al., 2012, 2016; Riccetti L. et al., 2017).

Целый ряд факторов определяет то, какой сигнальный каскад будет предпочтительно активироваться ГТ. Среди таких факторов - паттерн и функциональная активность сигнальных белков, которые взаимодействуют с рецепторами ФСГ и ЛГ/ХГЧ (различные типы G-белков, β-аррестины, протеинкиназы GRK-семейства), и функциональное состояние рецептора, которое зависит от его модификаций (фосфорилирование, гликозилирование, ацилирование), олигомеризации рецепторных комплексов, присутствия в его структуре активирующих или инактивирующих мутаций. При этом имеется и еще один, исключительно важный фактор, определяющий эффективность активации ГТ сигнального каскада и селективность сигнальной трансдукции, - это невероятное многообразие форм самих ГТ, которое является результатом их N-гликозилирования (Шпаков А.О., 2017).

Процесс N-гликозилирования катализируется ферментом олигосахарил-трансферазой, которая осуществляет перенос олигосахаридной части предшественника Dol-PP-GlcNAc2Man9Glc3, синтезируемого в эндоплазматическом ретикулуме, на остаток аспарагина белка-мишени. После присоединения олигосахаридной цепи к аспарагину уже в аппарате Гольджи происходит ее дальнейшая модификация, которая осуществляется с помощью множества ферментов, наделенных гликозидазной и гликозилтрансферазной активностью. В результате формируется «зрелая» олигосахаридная структура (N-гликан) с определенным типом ветвления и распределением заряда, что и обеспечивает правильное сворачивание белковой молекулы и определяет ее специфическую биологическую активность (Helenius A., Aebi M., 2004; Thaysen-Andersen M. et al., 2016).

Среди ферментов, контролирующих ветвление N-гликана, важную роль играют N-ацетилглюкозаминтрансферазы (GlcNAcТ), причем в процесс N-гликозилирования ГТ вовлечены пять типов этого фермента. В гонадотро-фах, где синтезируются ЛГ и гипофизарная форма ХГЧ, а также в синцитиотрофобласте, где синтезируется плацентарная форма ХГЧ, в значительных количествах присутствуют GlcNAcТ 1-го и 2-го типов, вследствие чего N-гликаны, модифицирующие α- и β-субъединицы этих гормонов, имеют низкую степень ветвления. Так, подавляющее большинство N-гликанов в ЛГ и ХГЧ являются гибридными или двухантенными. В гонадотрофах, где синтезируется ФСГ, в синтезе N-гликанов принимают участие также GlcNAcТ 4-го и 5-го типов, и результатом этого является преобладание в α- и β-субъединицах ФСГ трех-, четырех- и даже пятиантенных N-гликанов, в то время как слабо разветвленные их формы обнаруживаются в сравнительно небольших количествах. Таким образом, соотношение и активность различных типов GlcNAcТ определяют дифференциацию ΓТ по степени разветвленности их N-гликанов.

На заключительных стадиях формирования N-гликанов в ΓТ гонадотропинов происходит присоединение к концам олигосахаридных цепей отрицательно заряженных гликозильных остатков - сульфатированного N-ацетилгалактозамина и сиаловой кислоты. В первом случае сначала к концевым остаткам N-гликана с помощью фермента β1-4-N-ацетилгалактозаминилтрансферазы присоединяется остаток N-ацетилгалактозамина, который затем с помощью фермента N-ацетилгалактозаминил-4-сульфотрансферазы модифицируется отрицательно заряженной сульфатной группой, в результате чего N-гликан приобретает значительный по величине отрицательный заряд. В случае сиалирования к концам олигосахаридных цепей сначала с помощью β1-4-галактозилтрансферазы присоединяется галактоза, а затем с помощью α2-3-или α2-6-сиалилтрансферазы остаток галактозы модифицируется остатком сиаловой кислоты. Возможно также присоединение сиаловой кислоты к концевому N-ацетилгалактозамину, причем в этом случае реакция сиалирования катализируется только α2-6-сиалилтрансферазой.

Поскольку в клетках, где синтезируются ЛΓ и плацентарный ХΓЧ, паттерн и активность ферментов, катализирующих заключительные стадии синтеза N-гликанов, существенно различаются, то отмечается дифференциация этих ΓТ по суммарному отрицательному заряду N-гликанов и содержанию в них сульфатированного N-ацетилгалактозамина и сиаловых кислот. Так, α- и β-субъединицы ЛΓ обогащены сульфатированным N-ацетилгалактозамином, который содержится в 49-73% N-гликанов ЛΓ, в то время как расположенные на концах олигосахаридных цепей остатки сиаловых кислот в каждом сайте N-гликозилирования составляют 22-39% (Bousfield G.R. et al., 2006). В плацентарном ХΓЧ, несмотря на сходство с ЛΓ по степени разветвленно-сти N-гликанов, соотношение сульфатированного N-ацетилгалактозамина и сиаловых кислот обратное. Необходимо отметить, что в гипофизарном ХΓЧ, который синтезируется в тех же клетках, что и ЛΓ, доля сульфатированного N-ацетилгалактозамина также очень высокая. Так, в α- и β-субъединицах гипофизарного ХΓЧ удельное количество сульфатных групп в 2 и 7 раз выше, чем в соответствующих субъединицах плацентарного ХΓЧ. Напротив, степень сиалирования α- и β-субъединиц гипофизарного ХΓЧ, соответственно, в 1,5 и 2 раза ниже, чем в плацентарной форме гормона. Как и плацентарный ХΓЧ, α- и β-субъединицы ΦСΓ обогащены остатками сиаловой кислоты и содержат сравнительно мало сульфатированного N-ацетилгалактозамина. И это представляется вполне оправданным, поскольку при высокой степени разветвленности N-гликанов в ΦСΓ повышенное содержание сильно заряженных сульфатных групп привело бы к аномально высокому отрицательному заряду, что сделало бы ΦСΓ неактивным.

Таким образом, по степени разветвленности N-гликанов и содержанию в них концевых заряженных остатков все ΓТ сильно различаются, за исключением ЛΓ и гипофизарной формы ХΓЧ, синтезируемых в одной и той же популяции гонадотрофов. Необходимо подчеркнуть, что даже в близких по происхождению и локализации клетках - гонадотрофах, синтезирующих ЛГ и ФСГ, «машинерия» N-гликозилирования существенно различается. Не играет существенной роли сходство первичной структуры ГТ, поскольку N-гликозилирование идентичных по аминокислотной последовательности плацентарного и гипофизарного ХГЧ осуществляется совершенно по-разному.

Помимо различий в структуре N-гликанов, ГТ существенно различаются по степени N-гликозилирования. Относится это в большей степени к β-субъединицам, поскольку в общей для всех ГТ α-субъединице оба расположенных в ней сайта для N-гликозилирования, включающие остатки Asn⁵² и Asn7⁸, как правило, гликозилированы. Показано, что β-субъединица ЛГ, имеющая один сайт для N-гликозилирования (Asn³⁰), может быть либо не гликозилирована, либо модифицирована одним N-гликаном. Соответственно, гетероди-мерная молекула ЛГ может содержать два или три N-гликана. β-Субъединица ФСГ имеет два сайта для N-гликозилирования (Asn⁷ и Asn²⁴), вследствие чего для ФСГ имеются четыре различающиеся по степени гликозилирования формы. Эти формы различаются как по кислотности, поскольку чем больше отрицательно заряженных N-гликанов в молекуле ФСГ, тем она кислее, так и по молекулярной массе, поскольку каждый дополнительный N-гликан вносит свой вклад в молекулярную массу гормона (Bousfield G.R. et al., 2007; Davis J.S. et al., 2014). Выделяют одну слабокислую, дигликозилированную форму (оба N-гликана в α-субъединице, молекулярный вес β-субъединицы составляет 15 кДа), две среднекислые, тригликозилированные формы (три N-гликана, два в α-субъединице и один в β-субъединице - Asn⁷ или Asn²⁴, 21 или 18 кДа соответственно) и одну сильнокислую, полностью гликозилированную форму ФСГ (четыре N-гликана, 24 кДа).

Изучение N-гликанов в молекулах ФСГ позволило выявить не менее 50 различных их структур, которые были распределены на 11 семейств, представители каждого из которых составили не менее 4% общего числа N-гликанов. Это свидетельствует о большом разнообразии химических структур N-гликанов в ФСГ и об отсутствии преобладания какого-то определенного их типа (Bousfield G.R. et al., 2006, 2007, 2014). С учетом различий в степени N-гликозилирования ФСГ и случайного распределения структурно различных N-гликанов по сайтам для N-гликозилирования общее число возможных вариантов молекул ФСГ является огромным, на порядки превосходящим число Авогадро. Сходная картина наблюдается и для ЛГ, и ХГЧ. Каждая женщина имеет характерные для нее набор и соотношение гликозилированных форм ГТ. Гликозилирование ГТ - это своего рода «биохимические» отпечатки пальцев репродуктивной системы женщины.

Важно, что паттерн N-гликанов в молекулах ФСГ, которые секретируются гипофизом и циркулируют в крови, слабо отличается от такового для ФСГ, который выделен из мочи. Единственное различие состоит в том, что ФСГ из мочи в большей степени обогащен сильно разветвленными N-гликанами с тетраантенной структурой. На основании этого сделан вывод о том, что степень N-гликозилирования и структура N-гликанов в процессе секреции гормона из передней доли гипофиза, его циркуляции в крови и дальнейшей экскреции с мочой претерпевают небольшие изменения, из чего вытекают два важных с практической точки зрения следствия. Во-первых, по паттерну N-гликозилированных форм ΦСΓ в моче можно судить о процессе N-гликозилирования гормона в гипофизе, а следовательно, оценивать функциональную активность гонадотро-фов (Bousfield G.R. et al., 2015).

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ N-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕМ И АКТИВНОСТЬЮ ГОНАДОТРОПИНОВ

Степень гликозилирования ΓТ самым непосредственным образом влияет на их специфическую биологическую активность. Прослеживается следующая закономерность: чем в меньшей степени гликозилированным является ΓТ, тем в большей степени он активирует рецептор и нижележащие сигнальные каскады. Так, смесь двух тригликозилированных форм ΦСΓ (α-Asn⁵²+Asn⁷⁸/ β-Asn⁷ и α-Asn⁵²+Asn⁷⁸/β-Asn²⁴) обладала намного более высокой биологической активностью в сравнении как со смесью три- и тетрагликозилированных форм (α-Asn⁵²+Asn⁷⁸/β-Asn⁷ и α-Asn⁵²+Asn⁷⁸/β- Asn7+Asn²⁴), так и с очищенной тетрагликозированной формой ΦСΓ (Bousfield G.R. et al., 2014). Слабо гликозилированные формы ΦСΓ в среднем в три раза эффективнее связываются с рецептором по сравнению с высокогликозилированными формами гормона, и это обусловлено тем, что большое число разветвленных, отрицательно заряженных N-гликанов мешает нормальному сближению гонадотропина с рецептором (Davis J.S. et al., 2014). Важно и то, что обогащенные N-гликанами α- и β-субъединицы ΦСΓ способны экранировать эктодомены соседних рецепторов ΦСΓ, поскольку известно, что рецепторы ΓТ образуют кластеры и олигомерные комплексы, в которых гормонсвязывающие участки сближены в пространстве.

Зависимость биологической активности ΓТ от степени их N-гликозилирования является важной для регуляции овариального цикла. При этом большое значение имеют как изменения соотношения гликозилированных форм ΦСΓ и ЛΓ, так и характер их N-гликозилирования. Так, показано, что у двадцатилетних женщин, находящихся в активном репродуктивном возрасте, количество слабо гликозилированных форм ΦСΓ с высокой активностью преобладает над сильно гликозилированными формами с низкой активностью, в то время как у женщин в постклимактрическом периоде соотношение обратное и сильно гликозилированные формы составляют не менее 80% всего пула ΦСΓ (Walton W.J. et al., 2001; Bousfield G.R. et al., 2007, 2014). С увеличением возраста с 24 до 55 лет в гипофизе женщин отмечали снижение содержания Asn7-моногликозилированной формы β-субъединицы ΦСΓ и повышение содержания дигликозилированной ее формы, причем наиболее резкий подъем отмечали за 6 лет до наступления менопаузы и в постменопаузальном периоде (Bousfield G.R. et al., 2014). Возможным объяснением этого феномена являются возрастное ослабление интенсивности стероидогенеза в яичниках и снижение уровня эстрогенов в крови, что, как можно полагать, приводит не только к усилению продукции ΦСΓ гипофизом, но и к повышению активности системы N-гликозилирования в гонадотрофах (Randolph J.F. et al., 2011). В этой связи следует отметить, что с возрастом также повышаются продукция и степень N-гликозилирования ЛΓ.

Соотношение форм ΦСΓ и ЛΓ, различающихся по степени N-гликозилирования и содержанию заряженных концевых остатков в N-гликанах, существенно меняется в течение менструального цикла (Wide L., Eriksson K., 2013). Для ФСГ имеются два основных пика концентрации: первый - на 5- 7-й день и второй, существенно более выраженный, - в середине цикла (выше 6 IU/л). В дальнейшем уровень ФСГ постепенно снижается и на 24-й день цикла достигает значения 2,5 IU/л. При этом содержание полностью гликозилированных форм ФСГ с относительно низкой удельной активностью находится на высоком уровне с 5-го по 15-й день цикла, а затем начинает снижаться. В середине цикла резко повышается содержание слабо гликозилированных форм ФСГ с высокой активностью. На 13-15-й день цикла также отмечают значительный подъем концентрации ЛГ в крови, причем уровень дигликозилированной, высокоактивной формы гормона повышается в среднем в 10 раз, в то время как уровень полностью гликозилированной, менее активной формы ЛГ увеличивается только в 3 раза. В результате на стадии овуляции содержание дигликозилированной формы достоверно превышает таковое тригликозилированной формы, в то время как на других стадиях цикла слабо гликозилиро-ванная форма доминирует (Wide L., Eriksson K., 2013). В течение цикла также меняются степень сиалирования N-гликанов в ФСГ и ЛГ, удельное содержание в них сульфатированного N-ацетилгалактозамина и соотношение сиаловых кислот и сульфатированного N-ацетилгалактозамина, что также существенно влияет на биологическую активность ГТ.

Таким образом, происходящие в течение менструального цикла изменения N-гликозилирования ФСГ и ЛГ являются «биохимическими часами», ход которых определяет переход из одной фазы цикла в другую, и любые сбои в работе этих часов могут оказать влияние на реализацию репродуктивной функции.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация рецепторов полипептидных гормонов, содержащих LRR-повторы, и их взаимодействие с гетеротримерными G-белками // Цитология. 2009. Т. 51, № 8. С. 638-649.

Шпаков А.О. Гликозилирование гонадотропинов, как важнейший механизм регуляции их активности // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2017. Т. 103, № 9. C. 1004-1021.

Bousfield G.R., Butnev V.Y., Butnev V.Y., Hiromasa Y., Harvey D.J., May J.V. Hypo-glycosylated human follicle-stimulating hormone (hFSH(21/18)) is much more active in vitro than fully-glycosylated hFSH (hFSH(24)) // Mol. Cell. Endocrinol. 2014. Vol. 382, N 2. P. 989-997.

Bousfield G.R., Butnev V.Y., Walton W.J., Nguyen V.T., Huneidi J., Singh V. et al. All-or-none N-glycosylation in primate follicle-stimulating hormone β-subunits // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. Vol. 260-262. P. 40-48.

Bousfield G.R., Jia L., Ward D.N. Gonadotropins: chemistry and biosynthesis // Knobil and Neil’s Physiology of Reproduction. 3rd ed. / ed. J.D. Neill. Elsevier, 2006. P. 1581-1634.

Casarini L., Brigante G., Simoni M., Santi D. Clinical applications of gonadotropins in the female: assisted reproduction and beyond // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2016. Vol. 143. P. 85-119.

Casarini L., Lispi M., Longobardi S., Milosa F., La Marca A., Tagliasacchi D. et al. LH and hCG action on the same receptor results in quantitatively and qualitatively different intracellular signaling // PLoS One. 2012. Vol. 7, N 10. Article ID e46682.

Choi J.-H., Chen C.-L., Poon S.L., Wang H.-S., Leung P.C.K. Gonadotropin-stimulated epidermal growth factor receptor expression in human ovarian surface epithelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent exchange protein activated by cAMP pathway // Endocr. Relat. Cancer. 2009. Vol. 16. P. 179-188.

Davis J.S., Kumar T.R., May J.V., Bousfield G.R. Naturally occurring follicle-stimulating hormone glycosylation variants // J. Glycomics Lipidomics. 2014. Vol. 4, N 1. P. e117.

Ezcurra D., Humaidan P. A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology // Reprod. Biol. Endocrinol. 2014. Vol. 12. P. 95.

Filicori M., Fazleabas A.T., Huhtaniemi I., Licht P., Rao Ch.V., Tesarik J. et al. Novel concepts of human chorionic gonadotropin: reproductive system interactions and potential in the management of infertility // Fertil. Steril. 2005. Vol. 84, N 2. P. 275-284.

Fournier T., Guibourdenche J., Evain-Brion D. Review: hCGs: different sources of production, different glycoforms and functions // Placenta. 2015. Vol. 36, suppl. 1. P. S60-S65.

Hearn M.T., Gomme P.T. Molecular architecture and biorecognition processes of the cystine knot protein superfamily: part I. The glycoprotein hormones // J. Mol. Recognit. 2000. Vol. 13, N 5. P. 223-278.

Helenius A., Aebi M. Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum // Ann. Rev. Biochem. 2004. Vol. 73. P. 1019-1049.

Jin J.M., Yang W.X. Molecular regulation of hypothalamus-pituitary-gonads axis in males // Gene. 2014. Vol. 551, N 1. P. 15-25.

Kara E., Crépieux P., Gauthier C., Martinat N., Piketty V., Guillou F. et al. A phosphorylation cluster of five serine and threonine residues in the C-terminus of the follicle-stimulating hormone receptor is important for desensitization but not for beta-arrestin-mediated ERK activation // Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 20. P. 3014-3026.

Martins W.P., Vieira A.D., Figueiredo J.B., Nastri C.O. FSH replaced by low-dose hCG in the late follicular phase versus continued FSH for assisted reproductive techniques // Cochrane Database Syst. Rev. 2013. Vol. 3. CD010042.

Menon K.M., Menon B. Structure, function and regulation of gonadotropin receptors - a perspective // Mol. Cell. Endocrinol. 2012. Vol. 356, N 1-2. P. 88-97.

Nwabuobi C., Arlier S., Schatz F., Guzeloglu-Kayisli O., Lockwood C.J., Kayisli U.A. hCG: Biological functions and clinical applications // Int. J. Mol. Sci. 2017. Vol. 18, N 10. pii: E2037.

Puett D., Li Y., DeMars G., Angelova K., Fanelli F. A functional transmembrane complex: the luteinizing hormone receptor with bound ligand and G protein // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. Vol. 260-262. P. 126-136.

Randolph J.F. Jr., Zheng H., Sowers M.R., Crandall C., Crawford S., Gold E.B. et al. Change in follicle-stimulating hormone and estradiol across the menopausal transition: effect of age at the final menstrual period // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. Vol. 96, N 3. P. 746-754.

Riccetti L., Yvinec R., Klett D., Gallay N., Combarnous Y., Reiter E. et al. Human luteinizing hormone and chorionic gonadotropin display biased agonism at the LH and LH/ CG receptors // Sci. Rep. 2017. Vol. 7, N 1. P. 940.

Santi D., Casarini L., Alviggi C., Simoni M. Efficacy of follicle-stimulating hormone (FSH) alone, FSH + luteinizing hormone, human menopausal gonadotropin or FSH + human chorionic gonadotropin on assisted reproductive technology outcomes in the «per-sonalized» medicine era: a meta-analysis // Front. Endocrinol. 2017. Vol. 8. P. 114.

Thaysen-Andersen M., Packer N.H., Schulz B.L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease // Mol. Cell. Proteomics. 2016. Vol. 15, N 6. P. 1773-1790.

Ulloa-Aguirre A., Crepieux P., Poupon A., Maurel M.C., Reiter E. Novel pathways in gonadotropin receptor signaling and biased agonism // Rev. Endocr. Metab. Disorders. 2011. Vol. 12. P. 259-274.

Ulloa-Aguirre A., Dias J.A., Bousfield G., Huhtaniemi I., Reiter E. Trafficking of the follitropin receptor // Methods Enzymol. 2013. Vol. 521. P. 17-45.

Ulloa-Aguirre A., Zariñán T. The follitropin receptor: Matching structure and function // Mol. Pharmacol. 2016. Vol. 90, N 5. P. 596-608.

Walton W.J., Nguyen V.T., Butnev V.Y., Singh V., Moore W.T., Bousfield G.R. Characterization of human follicle-stimulating hormone isoforms reveals a non-glycosylated β-subunit in addition to the conventional glycosylated β-subunit // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. Vol. 86, N 8. P. 3675-3685.

Wayne C.M., Fan H.Y., Cheng X., Richards J.S. Follicle-stimulating hormone induces multiple signaling cascades: evidence that activation of Rous sarcoma oncogene, RAS, and the epidermal growth factor receptor are critical for granulosa cell differentiation // Mol. Endocrinol. 2007. Vol. 21, N 8. P. 1940-1957.

Wide L., Eriksson K. Dynamic changes in glycosylation and glycan composition of serum FSH and LH during natural ovarian stimulation // Ups. J. Med. Sci. 2013. Vol. 118, N 3. P. 153-164.

Эндометрий - важнейшая детерминанта, определяющая имплантацию и развитие эмбриона. Нормальная гистология эндометрия давно и полно описана в работах, ставших уже классическими (Топчиева О.И. и др. 1978; Noyes R.W. et al., 1975; Хмельницкий О.К., 1980; Mazur M.R., Kurman J., 2005; Кондриков Н.И., 2007).

Большой вклад в понимание циклической трансформации эндометрия внесли результаты электронной микроскопии (Ludwig H. et al., 1991; Garry R. et al., 2009), иммуногистохимического, иммунофлюоресцентного исследований (Lessey B.A. et al., 1988; Garcia E. et al., 1988; Bouchard P. et al., 1991; Fung H.Y. et al., 1994; Young S.L., 2013; Толибова Г.Х. и др., 2015). Эти методы выявили основные структурно-функциональные характеристики эндометрия при нарушениях эндокринной регуляции, а также гормональном воздействии при реализации ряда программ ВРТ.

Современный этап развития учения об эндометрии связан с развитием молекулярных исследований, омиксных технологий. Это обусловлено тем фактом, что гистологическая структура эндометрия не полностью отражает молекулярные механизмы его восприимчивости (рецептивности) по отношению к эмбриону.

ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕОБРАЗОВАНИЯХ ЭНДОМЕТРИЯ НА ПРОТЯЖЕНИИ НОРМАЛЬНОГО ОВУЛЯТОРНОГО МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА

Основные морфологические характеристики эндометрия в течение менструального цикла представлены в табл. 3-1. Особое внимание уделено описанию поверхностного эпителия, желез, стромы (клеток и межуточного вещества) и сосудов эндометрия.

ОСОБЕННОСТИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ ЭНДОМЕТРИЯ В СТИМУЛИРОВАННОМ ЦИКЛЕ

Гистологические особенности эндометрия в стимулированных циклах были описаны в 80-90-х годах прошлого века. Затем интерес исследователей к этой теме несколько угас в связи с развитием нового представления о так называемой рецептивности эндометрия и поиском новых факторов, определяющих этот процесс.

Уже первые исследования, изучающие влияние препаратов, используемых с целью стимуляции яичников в протоколах ЭКО (ГТ, Кломифена цитрата^♠), на развитие эндометрия, определили неблагоприятное воздействие данной процедуры (Wentz A.C., 1980; Keenan J.A. et al., 1989; Lessey B.A., Young S.L., 2013; Wira C.R. et al., 2014; Healy L.L., 2015).

Основное количество работ, описывающих гистологическое строение эндометрия, было проведено в протоколах ЭКО с а-ГнРГ (Bigsby R.M., 2002; Schatz F. et al., 2003; Paulson R.J., 2011; Толибова Г.Х. и др., 2018). Авторы оценивали соответствие полученных данных нормальной морфологической картине при спонтанном овуляторном менструальном цикле. При этом день пункции яичников считался эквивалентным 14-му дню естественного 28-дневного менструального цикла или пику уровня ЛГ (так называемые критерии Noyes R.W.). В 1950 году R.W. Noyes описал последовательные гистологические изменения эндометрия во время естественного цикла. Согласно данным автора гистологическое строение эндометрия характеризуется как не соответствующее фазе (out of phase, «не в фазе»), если полученные данные расходятся с днем цикла по разработанным критериям более чем на 2 дня. Это свидетельствует об отсутствии синхронизации между степенью развития эндометрия и эмбриона.

Нужно отметить тот факт, что в протоколах ЭКО наблюдается как преждевременное, так и синфазное созревание гистологических структур эндометрия. Так, например, согласно данным F. Ubaldi и соавт. (1997) у всех пациенток в протоколе ЭКО структура эндометрия в день пункции яичников имела черты «опережающего развития» (на 2±4 дня по сравнению с нормальной картиной). I. Noci и соавт. (1997) также обнаружили на 2-й день после пункции в 91% случаев преждевременный отек стромы и гипертрофию сосудов.

При оценке биопсий эндометрия, полученных в среднюю лютеиновую фазу цикла, часто обнаруживалась железисто-стромальная десинхронизация, проявляющаяся отставанием развития железистого компонента (Press M.F. et al., 1988; Bhurke A.S. еt al., 2016).

A.Tavaniotou и соавт. (2000) обнаружили опережение развития эндометрия на 1,8 дня в 100% случаев, а у половины пациенток без поддержки лютеиновой фазы отмечалась задержка созревания эндометрия. Кроме того, в эндометрии стимулированных циклов происходит асинхронное созревание желез и стромы, при этом строма более чем на 2 дня опережает созревание желез.

Данных о морфологическом строении эндометрия в протоколах с антагонистами ΓнРΓ (анта-ΓнРΓ) значительно меньше. Интересно, что сравнение анализов биопсий эндометрия, полученных в день проведения пункции фолликулов в циклах с применением а-ΓнРΓ и анта-ΓнРΓ, показало аналогичное развитие эндометрия с опережением на 2±4 дня. Однако отдельные работы указывают на возможно меньшую задержку развития эндометрия в середине лютеиновой фазы при применении анта-ΓнРΓ.

Следует отметить, что результаты опубликованных работ трудно сравнимы. Это определяется гетерогенностью групп обследованных пациенток (различный возраст, причины бесплодия, сопутствующая экстрагенитальная патология, овариальный резерв, ответ яичников на стимуляцию и др.), протоколов стимуляции яичников (разные препараты, дозы и длительность введения), вариантов посттрансферной поддержки, а также методов морфологического исследования биоптата эндометрия.

Тем не менее следует выделить основные возможные варианты морфофункциональных нарушений эндометрия в протоколах ЭКО:

Отдельного упоминания заслуживает вероятность обнаружения гиперплазии эндометрия. Данных о частоте ее возникновения мало.

Почему так происходит? В чем причина нарушений эндометрия в протоколах ЭКО?

К настоящему времени сформулировано мнение о том, что основными факторами в этом случае являются:

Несмотря на ограниченные возможности гистологического исследования для оценки рецептивных свойств эндометрия, этот метод остается базовым «золотым стандартом» диагностики его патологических процессов.

ЭКСПРЕССИЯ ЭСТРОГЕНОВЫХ И ПРОГЕСТЕРОНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ЭНДОМЕТРИИ В ТЕЧЕНИЕ ОВУЛЯТОРНОГО МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА

В связи с широким распространением в клинической практике иммунно-гистохимического исследования эндометрия в данном разделе представлена информация о динамике экспрессии в нем рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Эти данные базируются на обширной базе данных Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта.

Так, в раннюю стадию фазы пролиферации экспрессия эстрогеновых (ЭР) и прогестероновых (ПР) рецепторов как в железах, так и в строме эндометрия распределена равномерно и достигает 80-85% (рис. 3-1, 3-2, см. цв. вклейку).

В среднюю стадию фазы пролиферации экспрессия ЭР и ПР в структурных компонентах эндометрия (железах, строме) равномерная и достигает максимальных значений (рис. 3-3, 3-4, см. цв. вклейку).

В позднюю стадию фазы пролиферации в железах и строме эндометрия происходит неравномерное снижение экспрессии ЭР (до 50%), при этом отмечается высокая экспрессия ПР (до 100%) как в железах, так и в стромальном компоненте эндометрия (рис. 3-5, 3-6, см. цв. вклейку).

В раннюю стадию фазы секреции наблюдают максимальное снижение экспрессии ЭР в железах и строме эндометрия (от 40% до 0). Однако в экспрессии ПР сохраняется высокая равномерная экспрессия в железах и строме (до 100%) (рис. 3-7, 3-8, см. цв. вклейку).

В среднюю стадию фазы секреции экспрессия ЭР в железах и строме эндометрия начинает повышаться (до 35-40%). Причем распределение рецепторов носит неравномерный характер. В эпителии желез экспрессия ПР резко снижается вплоть до ее отсутствия. В то же время строма эндометрия характеризуется максимальной экспрессией (100%) и равномерным распределением ПР (рис. 3-9, 3-10, см. цв. вклейку).

В позднюю стадию фазы секреции под подавляющим влиянием прогестерона экспрессия ПР в эпителии желез практически полностью отсутствует, а в стро-ме, напротив, сохраняется высокой с равномерным распределением (рис. 3-11, 3-12, см. цв. вклейку). Угасание гормональной активности желтого тела яичника приводит к дистрофическим процессам в эндометрии, подготовке к фазе десквамации и новому менструальному циклу. Экспрессия ЭР равномерно повышается как в железах (до 40-45%), так и строме эндометрия (до 50-55%).

В течение полноценного овуляторного цикла рецепторы половых стероидных гормонов (ЭР и ПР) в эндометрии характеризуются следующими паттернами экспрессии:

Следует отметить, что в течение менструального цикла максимальному ремоделированию подвергается именно железистый компонент эндометрия. Стромальный компонент эндометрия является относительно стабильной структурой и характеризуется значительными колебаниями уровня экспрессии ЭР при относительно постоянном и высоком уровне экспрессии ПР в течение всех фаз менструального цикла, что связано с основной функциональной способностью эндометрия - инвазией бластоцисты и развитием беременности.

ЭКСПРЕССИЯ ЭСТРОГЕНОВЫХ И ПРОГЕСТЕРОНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ЭНДОМЕТРИИ СТИМУЛИРОВАННОГО ЦИКЛА

Данные об уровне содержания рецепторов к прогестерону и эстрогенам в тканях эндометрия в стимулированных циклах являются не однозначны. По результатам одних исследований не находят различий относительно нормального овуляторного цикла, по результатам других - выявляют снижение экспрессии рецепторов и к прогестерону, и к эстрогенам или только к эстрогенам или прогестерону. Снижение экспрессии ПР в стимулированных циклах было выявлено в периовуляторную, лютеиновую фазы цикла как в железах, так и строме эндометрия (Hadi F.H. et al., 1994; Bourgain C., Devroey P., 2003; Tavaniotou A. et al., 2000).

По данным E.G. Papanikolaou и соавт. (2005), в позднюю фолликулярную фазу в циклах с анта-ГнРГ имеет место более высокий по сравнению с натуральным циклом уровень прогестерона в крови и повышение экспрессии ПР как в строме, так и в железах эндометрия. При этом экспрессия ЭР в железах в это время ниже таковой в естественном цикле. Гистологических признаков секреторной трансформации при этом не наблюдалось. В 2009 году D. Kyrou и соавт. сообщили, что в фолликулярной фазе стимулированного цикла экспрессия ЭР в железистых и стромальных клетках эндометрия после первоначального увеличения далее значительно не изменяется, при этом экспрессия ПР продолжает увеличиваться. Противоречивость и фрагментарность данных объясняются различием системы оценок результатов, а также гетерогенностью клинических данных.

Результаты наших исследований показали, что в стимулированном цикле эндометрий на фоне применения гормональных препаратов характеризуется полиморфными вариантами трансформации:

Преждевременная секреторная трансформация эндометрия. Под влиянием гормональных препаратов (эстрадиола и прогестерона) возможен более ранний или экстремальный ответ рецепторного профиля с формированием преждевременного созревания эндометрия относительно дня физиологической трансформации эндометрия. Морфологическая картина преждевременной секреторной трансформации эндометрия характеризуется неравномерными секреторными изменениями желез, спиральных артерий и самой стромы с наличием фокусов секреторной и предецидуальной трансформации клеток. При этом экспрессия ЭР и ПР может соответствовать физиологической средней или даже началу поздней стадии фазы секреции (рис. 3-13, см. цв. вклейку). Экспрессия рецепторов ЭР в обеих гистогенетических структурах (железах и стромальном компоненте) неравномерно распределена и достигает средних значений. Известно, что эстрадиол стимулирует синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но и подавляет их, а также подавляет синтез рецепторов эстрадиола (Bouchard P. et al., 1991; Fung H.Y. et al., 1994; Snijders M.P. et al., 1992; Смирнов А.Н., 2005; Толибова Г.Х. и др., 2015).

Экспрессия рецепторов ПР в железах может снижаться до нулевых значений, при этом в стромальном компоненте эндометрия верифицируется равномерное распределение экспрессии с максимальными значениями до 100%. При наличии хронического эндометрита с формированием фолликулоподобных инфильтратов, фиброза и фибропластических изменений в строме экспрессия ЭР и ПР может быть неравномерно распределена и снижена.

Ультрасекреторная гиперплазия (децидуализация) эндометрия. Одним из проявлений экстремального (избыточного) ответа эндометрия на стимуляцию гормональными препаратами является формирование ультрасекреторной гиперплазии (децидуализации) эндометрия, сходной по гистологическому строению с эндометрием во время беременности. Строма эндометрия может быть представлена незрелыми или зрелыми децидуоцитами с участками отека и смешанной инфильтрацией стромы. Экспрессия ПР в строме при этом характеризуется равномерным распределением и высокими значениями (рис. 3-14, см. цв. вклейку).

При этом железистый компонент эндометрия может характеризоваться наличием желез пролиферативного и/или секреторного типа с соответствующими значениями экспрессии ЭР и ПР. Экспрессия рецепторов в железах пролиферативного типа характеризуется равномерным распределением и максимальными значениями до 100% (H-Score), в железах секреторного типа экспрессия ПР может достигать нулевых значений. При наличии хронического эндометрита может верифицироваться неравномерное снижение экспрессии ЭР и ПР в стромальном компоненте эндометрия.

Диссоциированное развитие эндометрия с железами пролиферативного и секреторного типа. В стимулированном цикле применение эстрогенов и гестагенов может привести к диссоциированному ответу эндометрия. Морфологическая структура эндометрия при этом характеризуется полиморфными проявлениями как в железистом, так и в стромальном компоненте эндометрия с нарушением дифференцировки. Железы эндометрия могут иметь черты стадии пролиферации, чередуясь с железами разных стадий фазы секреции. Отмечается преобладание стромы над железистым компонентом с разной степенью циклического созревания клеток от фазы пролиферации до фазы секреции. Подобные изменения также наблюдаются и со стороны сосудистого компонента от слабо сформированных клубков спиральных артерий до капилляров синусоидального типа. Экспрессия ЭР и ПР полностью отражает гистологическое строение эндометрия с невозможностью дифференцировки фазы цикла (рис. 3-15, см. цв. вклейку).

Экспрессия ЭР и ПР имеет разнонаправленный характер, верифицируется десинхроноз рецепторного профиля эндометрия - от максимальной экспрессии рецепторов в обеих гистогенетических структурах эндометрия с чередующимися снижением и/или резким снижением экспрессии рецепторов как в железах, так и стромальном компоненте эндометрия.

Гиперплазия эндометрия без атипии. Γистологическое строение эндометрия имеет характерные черты с повышенной или пониженной пролиферативной активностью желез и стромы эндометрия, неравномерным распределением и относительной полиморфностью формы желез, могут присутствовать кистозно расширенные железы. Сосудистый компонент эндометрия представлен синусоидальными капиллярами с неравномерным застойным полнокровием, больше выраженным в поверхностных отделах (рис. 3-16, см. цв. вклейку).

Экспрессия ЭР и ПР распределена равномерно и имеет высокие значения как в железах, так и в строме эндометрия (100%). При сочетании с хроническим эндометритом и наличием полипов эндометрия отмечается снижение экспрессии ЭР и ПР в стромальном компоненте эндометрия.

Смешанная форма гиперплазии без атипии - в соответствии с классификацией ВОЗ по опухолям женской репродуктивной системы (2014) понятие «смешанная форма гиперплазии эндометрия» упразднено. Однако врачам-клиницистам с практической точки зрения важна дифференцировка понятий гиперплазий эндометрия, поэтому, несмотря на отсутствие данной формы гиперплазии, при морфологическом исследовании часто верифицируется смешанная форма гиперплазии без атипии. Данная патология эндометрия подразумевает наличие, наряду с железами пролиферативного типа, желез с субнуклеарной вакуолизацией, имеющих черты желез раннесекреторного типа. Строма эндометрия имеет черты фазы пролиферации с очаговым отеком (рис. 3-17, см. цв. вклейку).

Экспрессия ЭР и ПР в железах пролиферативного типа распределена равномерно и характеризуется высокими значениями, в железах раннесекреторного типа могут отмечаться снижение экспрессии ER и максимальная экспрессия ПР. В стромальном компоненте эндометрия верифицируется разнонаправленный характер экспрессии ЭР и ПР. При сочетании с хроническим эндометритом также может отмечаться снижение экспрессии рецепторов в стромальном компоненте эндометрия.

Гипопластически-диспластический эндометрий. Наряду с экстремальным (избыточным) ответом эндометрия на гормональную стимуляцию в ряде случаев может отмечаться слабый ответ по типу гипопластически-диспластических изменений эндометрия с преобладанием стромального компонента эндометрия пролиферативного типа и наличием небольшого количества желез индифферентного или слабопролиферативного типа. При этом в эндометрии присутствует смешанно-клеточная инфильтрация. Экспрессия рецепторов половых стероидных гормонов распределена неравномерно и имеет черты фазы пролиферации (рис. 3-18, см. цв. вклейку).

Гипопластический эндометрий является следствием хронического эндометрита, и морфологическая картина свидетельствует об органическом повреждении эндометрия. Еще в 1926 г. гипопластический (атрофичный) эндометрий был подробно описан К.П. Улезко-Строгановой, которая указала, что причинами атрофического эндометрия являются расстройство кровоснабжения и рубцующаяся межжелезистая соединительная ткань (Улезко-Строганова К.П., 1926). Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона неравномерно распределена и снижена в стромальном компоненте за счет фиброза стромы, склероза сосудов и нарушения процессов ангиогенеза.

Гипопластический эндометрий с гиперплазией без атипии. Одним из морфологических проявлений нарушения морфофункционального состояния эндометрия в стимулированном цикле является гипопластический эндометрий пролиферативного типа с проявлениями повышенной пролиферативной активности желез и формированием гиперпластического процесса. В строме эндометрия присутствует неравномерно выраженный отек и смешанно-клеточная инфильтрация. Сосуды эндометрия представлены синусоидальными капиллярами (рис. 3-19, см. цв. вклейку).

Экспрессия ЭР и ПР в железах распределена равномерно и соответствует картине гиперплазии эндометрия без атипии. В стромальном компоненте может отмечаться снижение ЭР и ПР при сочетании с хроническим воспалительным процессом.

Лечебный патоморфоз - после неэффективного протокола ВРТ в течение первых циклов эндометрий может иметь черты асинхронного созревания желез и стромы относительно фазы менструального цикла. Такое гистологическое строение эндометрия соответствует медикаментозному (лечебному) патоморфозу эндометрия и является временным. Экспрессия рецепторов половых стероидных гормонов характеризуется десинхронозом, может иметь черты более сходные со слабовыраженной секреторной трансформацией или диссоциированным типом развития эндометрия (рис. 3-20, см. цв. вклейку).

Таким образом, функциональная полноценность эндометрия складывается из множества факторов, определяющих в целом не только его рецептивность, цикличность и специфичность, но и селективность по отношению к потенциально имплантируемому эмбриону. Немаловажным фактом остается исходное состояние эндометрия и влияние кофакторов, детерминирующих бесплодие у пациенток в стимулированном цикле.

Известно, что опосредованное или непосредственное патологическое влияние гормональных, воспалительных и механических воздействий на эндометрий вызывает в нем обратимые или условно обратимые структурные и функциональные перестройки, запуская патологический каскад реакций на тканевом и молекулярно-биологическом уровне, формируя эндометриальную дисфункцию, которую нельзя недооценивать у женщин с бесплодием различного генеза, планирующих ВРТ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Айламазян Э.К., Толибова Γ.Х., Траль Т.Γ. и др. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Верификация экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в течение менструального цикла // Молекулярная медицина. 2017. № 3. С. 27-31.

Кондриков Н.И. Патология матки. Москва : Практическая медицина, 2008. 334 с.

Смирнов А.Н. Молекулярная биология прогестерона // Российский химический журнал. 2005. Т. 49, № 1. С. 64-74.

Толибова Γ.Х., Траль Т.Γ., Айламазян Э.К., Коган И.Ю. Молекулярные механизмы циклической трансформации эндометрия // Журнал акушерства и женских болезней. 2019. Т. 68, № 1. С. 5-12.

Толибова Γ.Х., Траль Т.Γ., Клещев М.А. Эндометриальная дисфункция: алгоритм клинико-морфологического исследования. Санкт-Петербург, 2016. 44 с.

Толибова Γ.Х., Траль Т.Γ., Коган И.Ю и др. Молекулярные аспекты эндоме-триальной дисфункции. Методологические и прикладные аспекты нейроимму-ноэндокринологии // Молекулярная морфология. Москва : ШИКО, 2015. С. 239-252.

Топчиева О.И. Γистологическая диагностика по соскобам эндометрия. Ленинград : Медицина, 1978.

Топчиева О.И., Прянишников В.А., Жемкова З.П. Биопсии эндометрия. Москва : Медицина, 1978.

Улезко-Строганова К.П. Микроскопическая диагностика в гинекологии. Ленинград : Практическая медицина, 1926.

Хмельницкий О.К. Дифференциальная диагностика заболеваний эндометрия по соскобам на основе алгоритмизации гистологического исследования // Архив патологии. 1980. № 2. С. 55-59.

Bhurke A.S., Bagchi I.C., Bagchi M.K. Endometrial factors controlling implantation // Am. J. Reprod. Immunol. 2016. Vol. 75, N 3. P. 237-245.

Bigsby R.M. Control of growth and differentiation of the endometrium: the role of tissue interactions // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002. Vol. 955. P. 110-117.

Bouchard P., Marraoui J., Massai M.R. et al. Immunocytochemical localization of oestradiol and progesterone receptors in human endometrium: a tool to assess endometrial maturation // Baillieres Clin. Obstet. Gynaecol. 1991. Vol. 5, N 1. P. 107-715.

Bourgain C., Devroey P. The endometrium in stimulated cycles for IVF // Hum. Reprod. Update. 2003. Vol. 9, N 6. P. 515-522.

Fung H.Y., Wong Y.L., Wong F.W. et al. Study of oestrogen and progesterone receptors in normal human endometrium during the menstrual cycle by immunocytochemical analysis // Gynecol. Obstet. Invest. 1994. Vol. 38, N 3. P. 186-190.

Garcia E., Bouchard P., De Brux J. et al. Use of immunocytochemistry of progesterone and estrogen receptors for endometrial dating // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1988. Vol. 6. P. 80-87.

Garry R., Hart R., Karthigasu K.A. A re-appraisal of the morphological changes within the endometrium during menstruation: a hysteroscopic, histological and scanning electron microscopic study // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24. P. 1393-1401.

Hadi F.H., Chantler E., Anderson E. et al. Ovulation induction and endometrial steroid receptors // Hum. Reprod. 1994. Vol. 9, N 12. P. 2405-2410.

Healy L.L. Cronin J.G., Sheldon I.M. Polarized epithelial cells secrete interleukin 6 apically in the bovine endometrium // Biol. Reprod. 2015. Vol. 92, N 6. P. 151.

Keenan J.A., Herbert C.M., Bush J.R et al. Diagnosis and management of out-of-phase endometrial biopsies among patients receiving clomiphene citrate for ovulation induction // Fertil. Steril. 1989. Vol. 51. P. 964-967.

Kolibianakis E.M., Bourgain С., Platteau Р., Albano С., Van Steirteghem А. С., Dev-roey Р. Abnormal endometrial development occurs during the luteal phase of nonsup-plemented donor cycles treated with recombinant follicle-stimulating hormone and go-nadotropin-releasing hormone antagonists // Fertil. Steril. 2003. Vol. 80, N 2. P. 464-466.

Kyrou D., Kolibianakis E.M., Venetis C.A. et al. Steroid receptor expression in human endometrium during the follicular phase of stimulated cycles // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24, N 11. P. 2931-2935.

Lessey B.A., Killam A.P., Metzger D.A. et al. Immunohistochemical analysis of human uterine estrogen and progesterone receptors throughout the menstrual cycle // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1988. Vol. 67. P. 334-340.

Lessey B.A., Young S.L. Homeostasis imbalance in the endometrium of women with implantation defects: the role of estrogen and progesterone // Semin. Reprod. Med. 2014. Vol. 32, N 5. P. 365-375.

Ludwig H., Spornitz U.M. Microarchitecture of the human endometrium by scanning electron microscopy: menstrual desquamation and remodeling //Ann. N. Y. Acad. Sci. 1991. Vol. 622. P. 28-46.

Mazur M.R., Kurman J. Diagnosis of Endometrial Biopsies and Curettings: a Practical Approach. 2nd ed. New York : Springer-Verlag, 2005. 296 p.

Noci I., Borri P., Coccia M.E., Criscuoli L., Scarselli G., Messeri G. Hormonal patterns, steroid receptors and morphological pictures of endometrium in hyperstimulated IVF cycles // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 1997. Vol. 75, N 2. P. 215-220.

Noyes R.W., Hertig A.T., Rock J. Dating the endometrial biopsy // Am. J. Obstet. Gynecol. 1975. Vol. 122, N 2. Р. 262-263.

Papanikolaou E.G., Bourgain C., Kolibianakis E. et al. Steroid receptor expression in late follicular phase endometrium in GnRH antagonist IVF cycles is already altered, indicating initiation of early luteal phase transformation in the absence of secretory changes // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 6. P. 1541-1547.

Paulson R.J. Hormonal induction of endometrial receptivity // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96. P. 530-535.

Press M.F., Udove J.A., Greene G.L Progesterone receptor distribution in the human endometrium. Analysis using monoclonal antibodies to the human progesterone receptor // Am. J. Pathol. 1988. Vol. 131. P. 112-124.

Schatz F., Krikun G., Caze R. et al. Progestin-regulated expression of tissue factor in decidual cells: implications in endometrial hemostasis, menstruation and angiogenesis // Steroids. 2003. Vol. 68, N 10-13. Р. 849-860.

Snij ders M.P., de Goeij A.F., Debets-Te Baerts M.J. et al. Immunocytochemical analysis of oestrogen receptors and progesterone receptors in the human uterus throughout the menstrual cycle and after the menopause // J. Reprod. Fertil. 1992. Vol. 94, N 2. P. 363-371.

Tavaniotou A., Smitz J., Bourgain C., Devroey P. Comparison between different routes of progesterone administration as luteal phase support in infertility treatments // Hum. Reprod. 2000. Vol. 6, N 2. P. 139-148.

Ubaldi F., Bourgain C., Tournaye H. et al. Endometrial evaluation by aspiration biopsy on the day of oocyte retrieval in the embryo transfer cycles in patients with serum progesterone rise during the follicular phase // Fertil. Steril. 1997. Vol. 67, N 3. P. 521-526.

Wentz A.C. Endometrial biopsy in the evaluation of infertility // Fertil. Steril. 1980. Vol. 33. P. 121-124.

Wira C.R., Fahey J.V., Rodriguez-Garcia M. et al. Regulation of mucosal immunity in the female reproductive tract: the role of sex hormones in immune protection against sexually transmitted pathogens // Am. J. Reprod. Immunol. 2014. Vol. 72, N 2. P. 236-258.

Young S.L. Oestrogen and progesterone action on endometrium: a translational approach to understanding endometrial receptivity // Reprod. Biomed. Online. 2013. Vol. 27, N 5. P. 497-505.

Современные представления об основных сигнальных каскадах половых стероидных гормонов изложены в большом количестве соответствующих научных публикаций. Напомним, что сигнальный путь (или внутриклеточный сигнальный каскад) представляет собой строго определенную последовательность молекул, посредством которых информация от клеточного рецептора передается внутрь клетки. В этом общем определении заложено основное свойство данного процесса - универсальность. Именно это свойство позволяет «нанизывать» множество новых данных о сигнальных молекулах в общие «бусы» понимания механизма влияния гормона на клетку.

В этой интенсивно развивающейся области знаний каждый месяц приносит новую информацию, поэтому неоценимым источником знания здесь являются периодические научные издания. Данная тема сложна для врача и, на первый взгляд, имеет сегодня невысокое практическое значение. Много еще не изучено, не осмыслено, непонятно. Тем не менее нам показалось важным отразить некоторое вопросы данной проблематики.

Половые стероидные гормоны (эстрадиол, прогестерон) являются гидрофобными жирорастворимыми молекулами, а поэтому относительно свободно преодолевают клеточную мембрану с помощью механизма диффузии. После проникновения в клетку половые стероидные гормоны взаимодействуют со специфичными к ним рецепторами, которые расположены во внутриклеточном пространстве и до связывания с гормонами пребывают в неактивном состоянии. В активированном гормоном состоянии рецепторы эстрогенов и прогестерона приобретают способность транслоцироваться в ядро, где они активируют транскрипцию зависимых от стероидных гормонов генов. Таким образом, в клетках эндометрия (эпителия, стромы) меняются паттерн сигнальных и эффекторных белков и активность всей интегративной сети сигнальных каскадов, что является основным условием фазовой трансформации эндометрия, имплантации и развития эмбриона.

Основные эффекты эстрогенов на эндометрий определяются их взаимодействием с двумя ядерными рецепторами (ESR1/ERα и ESR2/ERβ), которые кодируются разными генами и существенно различаются по структуре функциональных доменов и механизмам их регуляции (Hewitt S.C. et al., 2016, 2018; Hantak A.M. et al., 2014; Vasquez Y.M., DeMayo F.J., 2013; Hewitt S.C., Korach K.S., 2018; Fuentes N., Silveyra P., 2019).

Эстрадиол, проникнув в цитоплазматическое пространство, специфически связывается с молекулой эстрогенового рецептора, который находится в комплексе с белком теплового шока HSP90 и потому не активен. Связывание с эстрадиолом меняет конформацию рецептора так, что он способен отсоединяться от HSP90-белка и образовывать прочный комплекс с еще одной молекулой эстрогенового рецептора. Такой димерный рецепторный комплекс преодолевает ядерную мембрану клетки и достигает молекулы ДНК, где эстрогеновый рецептор, наделенный активностью транскрипционного фактора, связывается со специфичным для него участком - так называемым ERE-сегментом. Этот сегмент располагается в промоторных участках большого числа генов, и связывание с ним димерного рецепторного комплекса способно как активировать, так и подавить транскрипцию генов (Fuentes N., Silveyra P., 2019). Важно отметить, что на протяжении всех вышеописанных процессов эстрадиол не покидает рецептор, поскольку его отсоединение тут же приведет к разрушению димерного рецепторного комплекса и прекращению его регуляторного воздействия на генную транскрипцию. Таким образом реализуется геномный эффект эстрогенов, для чего требуется определенное время. Функциональное значение рецепторов ESR1/ERα и ESR2/ERβ в матке установлено на основе экспериментальных исследований с нокаутными грызунами и/или на линиях клеток с экспрессированными в них эстрогеновыми рецепторами. Так, у мышей, нокаутных по ESR1/ERα, отсутствовал ответ матки на эстрогены, отмечались гипоплазия матки и нарушение имплантации (Lubahn D.B. et al., 1993).

Наряду с прямыми геномными эффектами, реализуемыми через ERE элементы, эстрогеновые рецепторы могут вызывать и непрямые геномные эффекты, в основе которых лежит взаимодействие активированного эстрадиолом димерного эстрогенового рецептора с другими транскрипционными факторами, в том числе со стимулирующим белком-1 (SP-1), фактором c-Jun и активирующим белком-1, активность которых при этом меняется (AP-1) (O’Lone R. et al., 2004; Marino M. et al., 2006). Предполагают, что через посредство фактора AP-1 эстрогеновый рецептор может усиливать экспрессию мощного митогена - инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF1), а также специфичного к нему рецептора IGF1, наделенного тирозинкиназной активностью. IGF1, связываясь со своим рецептором, активирует в клетках-мишенях сигнальный путь, включающий инсулинорецепторный субстрат-1 (IRS-1), фермент фосфатидилинозитол-3-киназу (PI-3K), катализирующую образование 3-фосфоинозитидов, и две серин/треониновых протеинкиназы - Akt-киназу и чувствительную к рапамицину киназу mTOR (Zhu L., Pollard J.W., 2007; Klotz D.M. et al., 2002; Hewitt S.C. et al., 2019). Наряду с этим IGF1 запускает в клетках-мишенях каскад митогенактивируемых протеинкиназ (MAPK), в наибольшей степени активируя один из его основных компонентов - ERK1/2-киназы. Поскольку PI-3K- и MAPK-пути отвечают за пролиферативную активность клеток и предотвращают их апоптоз, то этим во многом обусловлена способность эстрогенов активировать митотическую активность эпителия и повышать выживаемость эпителиальных клеток. Наряду с IGF1 эстрогены также повышают генную экспрессию других митогенов - представителей семейства факторов роста фибробластов (FGF), которые, подобно IGF1, активируют в клетке-мишени сигнальные пути PI-3K и MAPK. Показано, что эстрадиол в строме эндометрия в значительной степени повышает экспрессию фактора FGF9, относящегося к FGF-семейству, и усиливает тем самым пролиферативную активность эпителиальных клеток (Tsai S.J. et al., 2002) (рис. 4-1).

Регуляторные эффекты эстрогенов на клетки, в том числе на их митогенную активность, могут реализовываться не только через геномные, медленные, механизмы, но и через негеномные механизмы, которые осуществляются быстро, в течение десятков секунд - нескольких минут. Негеномные эффекты реализуются либо путем взаимодействия активированных эстрадиолом рецепторов ESR1/ERα и/или ESR2/ERβ с некоторыми внутриклеточными эффекторными белками, в том числе с локализованными в мембране рецепторными тирозинкиназами, либо через альтернативный путь, когда молекула эстрогена не проникает в клетку, а взаимодействует с расположенным в клеточной мембране рецептором эстрогена GREP-1, активируя через него внутриклеточный сигнальный каскад (Prossnitz E.R., Barton M., 2011, 2014; Hewitt S.C., Korach K.S., 2018; Fuentes N., Silveyra P., 2019). При этом основным сигнальным каскадом, который активируется через негеномные механизмы, является каскад MAPK, контролирующий процессы роста, дифференцировки, апоптоза, а также некоторые метаболические пути в клетках (Stefkovich M.L. et al., 2018). Показано, что MAPK-каскад, включающий ERK1/2-киназы, играет важную роль в обеспечении пролиферативной активности эпителия и в децидуализации клеток стромы эндометрия (Lee C.H. еt al., 2013).

Важную роль в обеспечении пролиферативной активности эпителия играет фактор, ингибирующий лейкемию (LIF, от англ. leukaemia inhibitory factors) (Roe C., 2017). Фактор LIF взаимодействует со специфичным к нему рецептором цитокинового типа, представляющим собой гетеродимер, состоящий из связывающей α-субъединицы и сигналпередающего белка gp130. Связывание с рецептором LIF приводит к фосфорилированию нерецепторной тирозинкиназы JAK2 с последующим фосфорилированием, димеризацией и активацией транскрипционного фактора STAT3 (Cheng J.G. et al., 2001; Song H., Lim H., 2006). Активированный фактор STAT3 транслоцируется в ядро и стимулирует экспрессию большого числа STAT3-зависимых генов. Наряду с этим фактор LIF может стимулировать и другие сигнальные каскады, включающие ERK1/2-киназы, компоненты 3-фосфоинозитидного и Wnt/β-катенинового путей (Rosario G.X., Stewart C.L., 2016). Установлено, что в эпителии желез эндометрия эстрогены являются одними из основных индукторов генной экспрессии фактора LIF, стимулируя LIF-зависимый сигналинг (Cha J. et al., 2012; Rosario G.X., Stewart C.L., 2016). Показано также, что вызываемое эстрогенами повышение экспрессии фактора LIF приводит к активации ERK1/2-киназ, что, в свою очередь, вызывает стимуляцию генной экспрессии фактора IHH (Indian hedgehog homolog) и его рецептора, которые ответственны за децидуализацию эндометрия (Pawar S. et al., 2015). Свои эффекты на экспрессию LIF эстрогены реализуют через активацию внутриклеточного рецептора ESR1/ERα (Pawar S. et al., 2015).

Регуляторные эффекты прогестерона на клетку, как и в случае эстрогенов, могут реализовываться как через два внутриклеточных прогестероновых рецептора - PR-A и PR-B, так и через мембранно-связанные формы прогестероно-вых рецепторов, в том числе через различные изоформы G-белок-сопряженного рецептора mPR (Garg D. et al., 2017; Boonyaratanakornkit V. et al., 2018; Wu S.P. et al., 2018). Рецепторы PR-A и PR-B кодируются одним геном, который у человека локализован в 11-й хромосоме, и получаются в результате альтернативного сплайсинга. Рецептор PR-B, в отличие от PR-A, имеет дополнительную последовательность длиной 164 аминокислотных остатка на N-конце молекулы (Bhurke A.S. et al., 2016). Прогестероновые рецепторы, как и внутриклеточные эстрогеновые рецепторы, расположены в цитоплазме и в неактивном состоянии находятся в комплексе с белками теплового шока. Поскольку по активности и регуляторным свойствам рецепторы PR-A и PR-B заметно различаются, а их активность сильно меняется при образовании гомодимерных (PR-A/PR-A, PR-B/PR-B) и гетеродимерных (PR-A/PR-B) комплексов, то функциональный ответ клетки на прогестерон во многом зависит от соотношения этих форм рецептора (Khan J.A. et al., 2012) (рис. 4-2).

Активируя рецепторы PR-В или PR-A, прогестерон реализует свои геномные, медленные, эффекты. Как и в случае эстрадиола, на первом этапе прогестерон внутри клетки связывается с прогестероновым рецептором, что вызывает его диссоциацию от белков теплового шока, димеризацию и поступление через ядерную мембрану в ядро клетки. Там активированный гормоном прогестероновый рецептор образует комплекс с активаторами транскрипции и специфично взаимодействует с промоторными участками генов, содержащими PRE-сегменты, активируя или, напротив, подавляя экспрессию определенных генов (Bhurke A.S. et al., 2016; Wu S.P. et al., 2018; DeMayo F.J. et al., 2020). Процесс прогестеронзависимой генной транскрипции является тканеспецифичным и зависит от соотношения PR-A и PR-B, поскольку эти рецепторы различаются по паттерну корегуляторных белков (Grimm S.L. et al., 2016).

Показано, что через геномные механизмы прогестерон существенно меняет экспрессию большого числа генов, которые кодируют сигнальные и эффекторные белки, участвующие в процессах преобразования эндометрия. Среди них белок IHH, вовлеченный в процессы пролиферации и клеточной дифференцировки (Indian hedgehog homolog) (Takamoto N. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2002; Lee K. et al., 2006); фактор роста BMP2 (bone morphogenetic protein-2), относящийся к семейству TGFβ с мощным митогенным потенциалом (Lee K.Y. et al., 2007; Li Q. et al., 2007); белки Wnt-семейства, в том числе белок WNT4, регуляторы катенинового пути Wnt/β (Angers S. et al., 2009; Jeong J.W. et al., 2009); гомеобокс-белки А10 и А11 (HOXA10, HOXA11), вовлеченные в регуляцию децидуализации эндометриальных стромальных клеток, а также ряд других белков и транскрипционных факторов - SOX17, HAND2, FOXO1 (Forkhead box O1), STAT3, GATA2 (Li Q. et al., 2011; Rubel C.A. et al., 2012; Lee J.H. et al., 2013). Наряду с этим прогестерон в эндометрии контролирует экспрессию и функциональную активность ряда других регуляторов сигнальных путей и генной экспрессии, включая IGF1-связывающий белок-1 (от англ. insulin-like growth factor binding protein 1, IGFBP-1) (Eswarakumar V.P. et al., 2005), белок C/EBPβ (от англ. CCAAT enhancer binding protein beta), белок PLZF (от англ. promyelocytic leukaemia zinc finger protein), белок MIG6 (от англ. mitogen-inducible gene 6 protein) (Brosens J.J. et al., 2006; Huyen D.V. et al., 2011; Yoo J.Y. et al., 2015), белок CRISPLD2 (от англ. cysteine rich secretory protein LCCL domain containing 2) (Yoo J.Y. et al., 2014).

Быстрые, негеномные эффекты прогестерона реализуются в основном через мембранные прогестероновые рецепторы mRP, которые сопряжены как с гетеротримерными G-белками, так и регуляторными белками β-аррестинами. При этом имеется несколько изоформ рецепторов mRP: изоформы mRP-α, mRP-β и mRP-γ, все они семь раз пронизывают плазматическую мембрану. После активации гормоном этих рецепторов они опосредуют стимуляцию аденилат-циклазы и цАМФ-зависимых сигнальных путей, активацию ERK1/2-киназ, компонентов каскада MAPK, а также влияют на 3-фосфоинозитидный путь и его основной эффекторный компонент Akt-киназу, активируемые через другие рецепторы и сигнальные каскады (Boonyaratanakornkit V. et al., 2001, 2018; Leonhardt S.A. et al., 2003; Boonyaratanakornkit V., Edwards D.P., 2007; Garg D. et al., 2017; Wu S.P. et al., 2018). Рецептор mRP-α обнаружен в матке (миометрии, эндометрии), плаценте и яичниках. Наряду с mRP-рецепторами охарактеризованы два близкородственных мембранных рецептора PGMRC1 и PGMRC2 (от англ. progesterone receptor membrane component 1/2), которые только один раз пронизывают мембрану и не сопряжены с G-белками и β-аррестинами (Thomas P., 2008). Функциональное значение и механизмы действия PGMRC, которые экспрессируются в тканях репродуктивной системы, остаются малоизученными (Garg D. et al., 2017; Wu S.P. et al., 2018). Показано, что PGMRC1 регулирует метаболизм стероидных гормонов и опосредует антиапоптотический эффект прогестерона в клетках гранулезы яичников. Необходимо отметить, что мембранные формы прогестероновых рецепторов могут активироваться не только прогестероном, но и некоторыми его метаболитами, сродство и активность которых к прогестероновым рецепторам, как правило, существенно ниже, чем прогестерона. Эти метаболиты могут модулировать активность прогестероновых рецепторов и конкурировать с прогестероном за связывание с ними. Некоторые клетки-мишени прогестерона экспрессируют ферменты 5α-редуктазу и 20α-гидроксистероиддегидрогеназу, которые метаболизируют прогестерон в его менее активные метаболиты и тем самым осуществляют дополнительный контроль прогестероновых сигнальных каскадов.

Экспрессия гена, кодирующего внутриклеточные прогестероновые рецепторы, стимулируется эстрогенами через активацию ими рецепторов ERα. Вследствие этого для обеспечения чувствительности ткани эндометрия к прогестерону необходимо оптимальное воздействие на него эстрогенов (Tsai S.J. et al., 2002). Напротив, экспрессия ERα ингибируется прогестероном посредством его взаимодействия с прогестероновыми рецепторами, как это показано в матке. Эти данные свидетельствуют в пользу наличия функциональной взаимосвязи и баланса между системами прогестерон/прогестероновые рецепторы и эстроген/эстрогеновые рецепторы, которые необходимы для реализации основной функции матки и эндометрия - имплантации и развития эмбриона.

Значительные уровни экспрессии прогестероновых рецепторов PR-A и PR-B выявлены во всех органах и тканях репродуктивной системы, в том числе во всех морфологических структурах эндометрия - эпителии желез, клетках стромы, сосудах. При этом соотношение экспрессии PR-A и PR-B зависит от типа клеток и их функционального состояния. Необходимо отметить, что количественная оценка экспрессии и распределения рецепторов PR-A и PR-B в разных клетках сопряжена с рядом трудностей, что обусловлено их значительным структурным сходством как продуктов одного и того же гена. Специфические антитела к PR-A отсутствуют, а мРНК-транскрипты для рецептора PR-A не могут быть идентифицированы с помощью количественной RT-PCR. Единственным подходом для оценки соотношения PR-A/PR-B является применение технологии полуколичественного вестерн-иммуноблоттинга. Именно поэтому основные сведения о соотношении PR-A/PR-B и его функциональном значении для прогестеронового сигналинга были получены при изучении генетически модифицированных клеток или нокаутных экспериментальных животных. Показано, что экспрессия PR-A и PR-B в клетках эпителия усиливается в течение первой фазы менструального цикла. Позднее, в секреторную фазу цикла, уровень экспрессии PR-A в эпителии падает, в то время как экспрессия PR-B сохраняется на одном и том же уровне, что свидетельствует об участии изофор-мы рецептора PR-B в регуляции секреторной активности желез. Стромальные клетки, напротив, экспрессируют в течение всего цикла преимущественно PR-A, что указывает на важную роль этой изоформы рецептора в регуляции прогестероном клеток стромы (Mote P.A. et al., 1999; Attiа G.R. et al., 2000).

Основные эффекты прогестерона на основные структуры эндометрия:

Специфические полиморфизмы PR были зарегистрированы у пациенток с идиопатическим привычным невынашиванием беременности (Su M.T. et al., 2011). Особый интерес представляет полиморфизм интрона G гена PR в 306 положении (Mojarrad M. et al., 2013).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Довжикова И.В., Луценко М.Т. Современные представления о роли прогестерона (обзор литературы) // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2016. № 60. С. 94-104.

Angers S., Moon R.T. Proximal events in Wnt signal transduction // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. Vol. 10. P. 468-477.

Attia G.R., Zeitoun K., Edwards D., Johns A., Carr B.R., Bulun S.E. Progesterone receptor isoform A but not B is expressed in endometriosis // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. Vol. 85, N 8. P. 2897-2902. DOI: 10.1210/jcem.85.8.6739.

Bahia W., Finan R.R., Al-Mutawa M., Haddad A., Soua A., Janhani F. et al. Genetic variation in the progesterone receptor gene and susceptibility to recurrent pregnancy loss: a case-control study // BJOG. 2018. Vol. 125, N 6. P. 729-735.

Bogdan A., Berta G., Szekeres-Bartho J. PIBF positive uterine NK cells in the mouse decidua // J. Reprod. Immunol. 2017. Vol. 119. P. 38-43.

Boonyaratanakornkit V., Edwards D.P. Receptor mechanisms mediating non-genomic actions of sex steroids // Semin. Reprod. Med. 2007. Vol. 25. P. 139-153.

Boonyaratanakornkit V., Hamilton N., Márquez-Garbán D.C., Pateetin P., McGowan E.M., Pietras R.J. Extranuclear signaling by sex steroid receptors and clinical implications in breast cancer // Mol. Cell. Endocrinol. 2018. Vol. 466. P. 51-72.

Boonyaratanakornkit V., Scott M.P., Ribon V., Sherman L., Anderson S.M., Maller J.L. et al. Progesterone receptor contains a proline-rich motif that directly interacts with SH3 domains and activates c-Src family tyrosine kinases // Mol. Cell. 2001. Vol. 8. P. 269-280.

Brosens J.J., Gellersen B. Death or survival - progesterone-dependent cell fate decisions in the human endometrial stroma // J. Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 36. P. 389-398.

Cha J., Sun X., Dey S.K. Mechanisms of implantation: strategies for successful pregnancy // Nat. Med. 2012. Vol. 18. P. 1754-1767.

Cheng J.G., Chen J.R., Hernandez L., Alvord W.G., Stewart C.L. Dual control of LIF expression and LIF receptor function regulate Stat3 activation at the onset of uterine receptivity and embryo implantation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 8680-8685.

DeMayo F.J., Lydon J. 90 years of progesterone: new insights into progesterone receptor signaling in the endometrium required for embryo implantation // J. Mol. Endocrinol. 2020. Vol. 65, N 1. P. T1-T14. DOI: 10.1530/JME-19-0212.

Eswarakumar V.P., Lax I., Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors // Cytokine Growth Factor Rev. 2005. Vol. 16. P. 139-149.

Fleisch M.C., Chou Y.C., Cardiff R.D., Asaithambi A., Shyamala G. Over expression of progesterone receptor A isoform in mice leads to endometrial hyper proliferation, hyperplasia and atypia // Mol. Hum. Reprod. 2009. Vol. 15. P. 241-249.

Franco H.L., Rubel C.A., Large M.J., Wetendorf M., Fernandez-Valdivia R., Jeong J.W. et al. Epithelial progesterone receptor exhibits pleiotropic roles in uterine development and function // FASEB J. 2012. Vol. 26. P. 1218-1227.

Ferreira L.M.R., Meissner T.B., Tilburgs T., Strominger J.L. HLA-G: at the interface of maternal-fetal tolerance // Trends Immunol. 2017. Vol. 38, N 4. P. 272-286.

Fuentes N., Silveyra P. Estrogen receptor signaling mechanisms // Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 2019. N 116. P. 135-170.

Fu B., Wei H. Decidual natural killer cells and the immune microenvironment at the maternal-fetal interface // Science China Life Sciences. 2016. Vol. 59, N 12. P. 1224-1231.

Ganesh V., Venkatesan V., Koshy T., Reddy S.N., Muthumuthiah S., Paul S.F.D. Association of estrogen, progesterone and follicle stimulating hormone receptor polymorphisms with in vitro fertilization outcomes // Syst. Biol. Reprod. Med. 2018. Vol. 64, N 4. P. 260-265.

Garg D., Ng S.S.M., Baig K.M., Driggers P., Segars J. Progesterone-Mediated Non-Classical Signaling // Trends Endocrinol Metab. 2017. Vol. 28, N 9. P. 656-668.

Gong H. et al. The regulation of ovary and conceptus on the uterine natural killer cells during early pregnancy // Reprod. Biol. Endocrinol. 2017. Vol. 15, N 1. DOI: 10.1186/s12958-017-0290-1.

Grimm S.L., Hartig S.M., Edwards D.P. Progesterone Receptor Signaling Mechanisms // J. Mol. Biol. 2016. Vol. 428, N 19-3849.

Hantak A.M., Bagchi I.C., Bagchi M.K. Role of uterine stromal-epithelial crosstalk in embryo implantation // Int. J. Dev. Biol. 2014. Vol. 58. P. 139-146.

Hewitt S.C., Korach K.S. Estrogen Receptors: New Directions in the New Millennium // Endocr. Rev. 2018. Vol. 39, N 5. P. 664-675.

Hewitt S.C., Lierz S.L., Garcia M., Hamilton K.J., Gruzdev A., Grimm S.A. et al. A distal super enhancer mediates estrogen-dependent mouse uterine-specific gene transcription of Insulin-like growth factor 1 (Igf1) // J. Biol. Chem. 2019. Vol. 294, N 25. P. 9746-9759.

Hewitt S.C., Winuthayanon W., Korach K.S. What’s new in estrogen receptor action in the female reproductive tract // J. Mol. Endocrinol. 2016. Vol. 56. P. R55-R71.

Huyen D.V., Bany B.M. Evidence for a conserved function of heart and neural crest derivatives expressed transcript 2 in mouse and human decidualization // Reproduction. 2011. Vol. 142. P. 353-368.

Jeong J.W., Lee H.S., Franco H.L., Broaddus R.R., Taketo M.M., Tsai S.Y. et al. Beta-catenin mediates glandular formation and dysregulation of beta-catenin induces hyperplasia formation in the murine uterus // Oncogene. 2009. Vol. 28. P. 31-40.

Jeong J.W., Lee H.S., Lee K.Y., White L.D., Broaddus R.R., Zhang Y.W. et al. Mig-6 modulates uterine steroid hormone responsiveness and exhibits altered expression in endometrial disease // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2009. Vol. 106. P. 8677-8682.

Khan J.A., Bellance C., Guiochon-Mantel A., Lombes M., Loosfelt H. Differential regulation of breast cancer-associated genes by progesterone receptor isoforms PRA and PRB in a new bi-inducible breast cancer cell line // PLoS One. 2012. Vol. 7. Р. e45993. DOI: 10.1371/journal.pone.0045993.

Klotz D.M., Hewitt S.C., Ciana P., Raviscioni M., Lindzey J.K., Foley J. et al. Requirement of estrogen receptor-alpha in insulin-like growth factor-1 (IGF1)-induced uterine responses and in vivo evidence for IGF1/estrogen receptor cross-talk // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 8531-8537.

Kurita T., Lee K.J., Cooke P.S., Lydon J.P., Cunha G.R. Paracrine regulation of epithelial progesterone receptor and lactoferrin by progesterone in the mouse uterus // Biol. Reprod. 2000. Vol. 62. P. 831-838.

Lee C.H., Kim T.H., Lee J.H., Oh S.J., Yoo J.Y., Kwon H.S. et al. Extracellular signalregulated kinase1/2 signaling pathways required for endometrial decidualization in mice and human // PLoS One. 2013. Vol. 8. Article ID e75282.

Lee J.H., Kim T.H., Oh S.J., Yoo J.Y., Akira S., Ku B.J. et al. Signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) plays a critical role in implantation via progesterone receptor in uterus // FASEB J. 2013. Vol. 27. P. 2553-2563.

Lee J.Y., Lee M., Lee S.K. Role of endometrial immune cells in implantation // Clin. Exp. Reprod. Med. 2011. Vol. 38, N 3. P. 119-125.

Lee K., Jeong J., Kwak I., Yu C.T., Lanske B., Soegiarto D.W. et al. Indian hedgehog is a major mediator of progesterone signaling in the mouse uterus // Nat. Genet. 2006. Vol. 38. P. 1204-1209.

Lee K.Y., Jeong J.W., Wang J., Ma L., Martin J.F., Tsai S.Y. et al. Bmp2 is critical for the murine uterine decidual response // Mol. Cell. Biol. 2007. Vol. 27. P. 5468-5478.

Leonhardt S.A., Boonyaratanakornkit V., Edwards D.P. Progesterone receptor transcription and non-transcription signal in mechanisms // Steroids. 2003. Vol. 68. P. 761-770.

Li J., Hong X., Mesiano S., Muglia L.J., Wang X., Snyder M. et al. Natural Selection Has Differentiated the Progesterone Receptor among Human Populations // Am. J. Hum. Genet. 2018. Vol. 103, N 1. P. 45-57.

Li Q., Kannan A., DeMayo F.J., Lydon J.P., Cooke P.S., Yamagishi H. et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2 // Science. 2011. Vol. 331. P. 912-916.

Li Q., Kannan A., Wang W., Demayo F.J., Taylor R.N., Bagchi M.K. et al. Bone morphogenetic protein 2 functions via a conserved signaling pathway involving Wnt4 to regulate uterine decidualization in the mouse and the human // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282. P. 31 725-31 732.

Lubahn D.B., Moyer J.S., Golding T.S., Couse J.F., Korach K.S., Smithies O. Alteration of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the mouse estrogen receptor gene // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 11162-11166.

Marino M., Galluzzo P., Ascenzi P. Estrogen signaling multiple pathways to impact gene transcription // Curr. Genomics. 2006. Vol. 7, N 8. P. 497-508.

Matsumoto H., Zhao X., Das S.K., Hogan B.L., Dey S.K. Indian hedgehog as a progesterone-responsive factor mediating epithelial-mesenchymal interactions in the mouse uterus // Dev. Biol. 2002. Vol. 245. P. 280-290.

Mote P.A., Balleine R.L., McGowan E.M., Clarke C.L. Colocalization of progesterone receptors A and B by dual immunofluorescent histochemistry in human endometrium during the menstrual cycle // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999. Vol. 84, N 8. P. 2963-2971. DOI: 10.1210/jcem.84.8.5928.

Mojarrad M., Hassanzadeh-Nazarabadi M., Tafazoli N. Polymorphism of genes and implantation failure // Int. J. Mol. Cell. Med. 2013. Vol. 2, N 1. P. 1-8.

Mulac-Jericevic B., Lydon J.P., DeMayo F.J., Conneely O.M. Defective mammary gland morphogenesis in mice lacking the progesterone receptor B isoform // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 9744-9749.

Mulac-Jericevic B., Mullinax R.A., DeMayo F.J., Lydon J.P., Conneely O.M. Subgroup of reproductive functions of progesterone mediated by progesterone receptor-B isoform // Science. 2000. Vol. 289. P. 1751-1754.

O’Brien J.E., Peterson T.J., Tong M.H., Lee E.J., Pfaff L.E., Hewitt S.C. et al. Estrogen-induced proliferation of uterine epithelial cells is independent of estrogen receptor alpha binding to classical estrogen response elements // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. P. 26683-26692.

Okada H., Tsuzuki T., Murata H. Decidualization of the human endometrium // Reprod. Med. Biol. 2018. Vol. 17, N 3. P. 220-227.

O’Lone R., Frith M.C., Karlsson E.K., Hansen U. Genomic targets of nuclear estrogen receptors // Mol. Endocrinol. 2004. Vol. 18, N 8. P. 1859-1875.

Patel B., Elguero S., Thakore S., Dahoud W., Bedaiwy M., Mesiano S. Role of nuclear progesterone receptor isoforms in uterine pathophysiology // Hum. Reprod. Update. 2015. Vol. 21. P. 155-173.

Pawar S., Laws M.J., Bagchi I.C., Bagchi M.K. Uterine epithelial estrogen receptor-alpha controls decidualization via a paracrine mechanism // Mol. Endocrinol. 2015. Vol. 29. P. 1362-1374.

Prossnitz E.R., Barton M. Estrogen biology: new insights into GPER function and clinical opportunities // Mol. Cell. Endocrinol. 2014. Vol. 389, N 1-2. P. 71-83.

Prossnitz E.R., Barton M. The G-protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease // Nat. Rev. Endocrinol. 2011. Vol. 7, N 12. P. 715-726.

Roe C. Unwrapping Neurotrophic Cytokines and Histone Modification // Cell. Mol. Neurobiol. 2017. Vol. 37, N 1. P. 1-4.

Rosario G.X., Stewart C.L. The multifaceted actions of leukaemia inhibitory factor in mediating uterine receptivity and embryo implantation // Am. J. Reprod. Immunol. 2016. Vol. 75. P. 246-255.

Rubel C.A., Franco H.L., Jeong J.W., Lydon J.P., DeMayo F.J. GATA2 is expressed at critical times in the mouse uterus during pregnancy // Gene Exp. Patterns. 2012. Vol. 12. P. 196-203.

Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. 2010. Vol. 63, N 6. P. 601-610.

Song H., Lim H. Evidence for heterodimeric association of leukemia inhibitory factor (LIF) receptor and gp130 in the mouse uterus for LIF signaling during blastocyst implantation // Reproduction. 2006. Vol. 131. P. 341-349.

Stefkovich M.L., Arao Y., Hamilton K.J., Korach K.S. Experimental models for evaluating non-genomic estrogen signaling // Steroids. 2018. Vol. 133. P. 34-37.

Su M.T., Lin S.H., Chen Y.C. Association of sex hormone receptor gene polymorphisms with recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96, N 6. P. 1435-1444.e1.

Sun Y., Liu W.Z., Liu T., Feng X., Yang N., Zhou H.F. Signaling pathway of MAPK/ ERK in cell proliferation, differentiation, migration, senescence and apoptosis // J. Recept. Signal Transduct. Res. 2015. Vol. 35, N 6. P. 600-604.

Takamoto N., Zhao B., Tsai S.Y., DeMayo F.J. Identification of Indian hedgehog as a progesterone-responsive gene in the murine uterus // Mol. Endocrinol. 2002. Vol. 16. P. 2338-2348.

Thomas P. Characteristics of membrane progestin receptor alpha (mPRalpha) and progesterone membrane receptor component 1 (PGMRC1) and their roles in mediating rapid progestin actions // Front. Neuroendocrinol. 2008. Vol. 29, N 2. P. 292-312.

Toth B., Zhu L., Karakizlis H., Weimer R., Morath C., Opelz G. NK cell subsets in idiopathic recurrent miscarriage and renal transplant patients // J. Reprod. Immunol. 2020. Vol. 138. DOI: 10.1016/j.jri.2020.103098.

Tilburgs T., Crespo Â.C., van der Zwan A., Rybalov B., Raj T, Stranger B. et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. Vol. 112, N 23. P. 7219-7224.

Tilburgs T., Evans J.H., Crespo Â.C., Strominger J.L. The HLA-G cycle provides for both NK tolerance and immunity at the maternal-fetal interface // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. Vol. 112, N 43. P. 13312-13317.

Tsai S.J., Wu M.H., Chen H.M., Chuang P.C., Wing L.Y. Fibroblast growth factor-9 is an endometrial stromal growth factor // Endocrinology. 2002. Vol. 143. P. 2715-2721.

Vacca P., Vitale C., Munari E., Cassatella M.A., Mingari M.C., Moretta L. Human innate lymphoid cells: their functional and cellular interactions in decidua // Front. Immunol. 2018. Vol. 9. P. 1897. DOI: 10.3389/fimmu.2018.01897

Vasquez Y.M., DeMayo F.J. Role of nuclear receptors in blastocyst implantation // Semin. Cell Dev. Biol. 2013. Vol. 24. P. 724-735.

Wetendorf M., Wu S.P., Wang X., Creighton C.J., Wang T., Lanz R.B. et al. Decreased epithelial progesterone receptor A at the window of receptivity is required for preparation of the endometrium for embryo attachment // Biol. Reprod. 2017. Vol. 96. P. 313-326.

Wu S.P., Li R., DeMayo F.J. Progesterone Receptor Regulation of Uterine Adaptation for Pregnancy // Trends Endocrinol. Metab. 2018. Vol. 29, N 7. P. 481-491.

Yoo J.Y., Kim T.H., Lee J.H., Dunwoodie S.L., Ku B.J., Jeong J.W. Mig-6 regulates endometrial genes involved in cell cycle and progesterone signaling // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2015. Vol. 462. P. 409-414.

Yoo J.Y., Shin H., Kim T.H., Choi W.S., Ferguson S.D., Fazleabas A.T. et al. CRISPLD2 is a target of progesterone receptor and its expression is decreased in women with endometriosis // PLoS One. 2014. Vol. 9. Article ID e100481.

Yudt M.R., Berrodin T.J., Jelinsky S.A., Hanna L.A., Brown E.L., Chippari S. et al. Selective and opposing actions of progesterone receptor isoforms in human endometrial stromal cells // Mol. Cell. Endocrinol. 2006. Vol. 247. P. 116-126.

Zhou J., Tian Z., Peng H. Tissue-resident NK cells and other innate lymphoid cells // Adv. Immunol. 2020. Vol. 145. P. 37-53.

Zhu L., Pollard J.W. Estradiol-17 beta regulates mouse uterine epithelial cell proliferation through insulin-like growth factor 1 signaling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. Vol. 104. P. 15847-15851.

Основной функцией эндометрия является обеспечение имплантации и развития эмбриона, а также формирование плаценты. Имплантация у человека возможна только во время короткого промежутка времени в течение менструального цикла (окно имплантации или «окно фертильности»), когда эндометрий характеризуется особыми свойствами (фаза рецептивности). Наступает данный период в среднем через 7 дней после овуляторного пика ЛГ в естественном цикле или в среднем через 5 полных дней применения прогестерона в циклах с заместительной гормональной терапией (Harper M.J. et al., 1992; Wilcox A.J. et al., 1999). Длительность фазы рецептивности индивидуальна. У большинства женщин репродуктивного возраста она составляет 12-48 ч, реже - до 3 дней. В это время эмбрион достигает стадии бластоцисты и готов к имплантации. Таким образом, достигается синхронизация развития эмбриона и эндометрия, что является необходимым условием начала имплантации у человека.

До 2/3 неудач имплантации обусловлены нарушением рецептивности эндометрия (Achache H. et al., 2006; Haouzi D. et al., 2012). Приблизительно у 25-30% пациенток фаза рецептивности эндометрия формируется раньше или позже обычного срока, у некоторых женщин она укорочена по времени. Это приводит к десинхронизации между функциональным состоянием эндометрия и зрелостью эмбриона и срыву процесса имплантации. Возможно, что у части пациенток эндометрий вообще не имеет фазы рецептивности, что также может явиться причиной бесплодия и неоднократных неэффективных протоколов ВРТ (рис. 5-1).

В фазу рецептивности в эндометрии происходят сложные изменения на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Формирование такого состояния эндометрия (переход из нерецептивного состояния в рецептивное) до сих пор мало изучено. Конечно, ключевую роль здесь играют воздействие овариальных стероидных гормонов на соответствующие рецепторы и активация сигнальных путей, что приводит к трансформации содержания в эндометрии множества факторов, участвующих в процессах адгезии клеток, инвазии, апоптоза, роста, ангиогенеза, протеолиза, дифференцировки и иммуномодуляции.

Какова утилитарная цель определения наличия фазы рецептивности эндометрия, времени ее наступления и, возможно, длительности? По нашему мнению, ответ на этот вопрос позволит решить следующие задачи:

Нужно сразу отметить, что УЗИ эндометрия и допплерометрия кровотока в сосудах матки не стали методами, которые смогли бы решить эту задачу.

Не было выявлено также четкой взаимосвязи между гистологической картиной эндометрия и комплексом его молекулярных характеристик, отражающих интересующую нас фазу. Не оправдало ожиданий в этой области и изучение с помощью электронной микроскопии пиноподий (микроворсинок) люминального эпителия.

Современным трендом изучения рецептивности эндометрия являются исследования в следующих областях:

Наибольший удельный вес занимают работы по идентификации мРНК и белков в эндометрии. При этом к началу XXI в. был получен достаточно большой объем информации о содержании в эндометрии отдельных белков (или их групп), вовлеченных в процесс имплантации бластоцисты. Наиболее изученными явились: молекулы адгезии (интегрины β1, β3, β4, кадгерины, селектины, муцины); циклины (в частности, Е); р27; факторы роста (СЭФР-А, ЭФР, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, протеины семейства Wnt); цитокины (LIF, IL-6, IL-8, IL-11, IL-17, IL-18, TNFα); пролактин; остеопонтин; гликоделин; IGFBP-1; компоненты внеклеточного матрикса (ламинин, коллаген IV типа, фибронектин, гепарина сульфат протеогликан). Основным материалом для исследования служил биоптат эндометрия, реже - смывы из полости матки, слизь из цервикального канала. Имелись также исследования, посвященные определению некоторых цитокинов и факторов роста (например, LIF) в сыворотке крови. Это был первый этап отработки диагностических подходов идентификации фазы рецептивности эндометрия, клиническое значение которых осталось невысоким (Yanaihara A. et al., 2005; Evans G.E. et al., 2012; Ulbrich S.E. et al., 2013).

Второй этап развития диагностических подходов охватывает последние 15 лет и связан с применением новых технологических платформ. В транскриптомных исследованиях использование микрочипов (Microarray-based expression profiling) и секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS) позволило одновременно оценивать изменения экспрессии нескольких сотен или даже тысяч генов в эндометрии. С 2003 по 2019 г. опубликовано более 20 значимых, крупных зарубежных работ, посвященных данной проблематике (Messaoudi S. et al., 2019).

Исследования, посвященные анализу транскриптома эндометрия, можно разделить на несколько групп:

Натуральный цикл. Период рецептивности, по сравнению с пререцептивной стадией, характеризуется изменением экспрессии сотен генов (по разным источникам, от 107 до 2878). Так, например, в работе S. Talbi и соавт. (2006) была определена дифференциальная экспрессия генов в пролиферативную, раннюю, среднюю и позднюю секреторные фазы цикла. Авторы показали, что в среднюю секреторную фазу (период предполагаемого окна имплантации) по сравнению с ранней секреторной фазой 1415 генов находятся в состоянии up -регуляции, а 1463 - в состоянии_down_ -регуляции.

Спектр анализируемых генов в разных работах значительно отличается, даже при анализе однородных групп пациентов. Так, в работах A. Riesewijk (2003), D. Haouzi и соавт. (2009), S. Mirkin и соавт. (2005) и S. Talbi и соавт. (2006) был проведен анализ изменения профиля экспрессии генов в эндометрии в раннюю (LH+2/3) и среднюю лютеиновую фазу (LH+7/8), причем в двух работах (Riesewijk A., 2003; Haouzi D. et al., 2009) были проанализированы парные образцы, полученные от нескольких пациенток в разные фазы цикла. Однако при сравнении данных, полученных разными группами исследователей, отмечается низкая воспроизводимость результатов: только два гена с повышенной экспрессией были выявлены во всех проведенных исследованиях. Это остеопонтин (SPP1, «secreted phosphoprotem-1», «секретируемый фосфопротеин-1») и цитокин IL-15. Еще 11 генов с повышенной и 1 ген с пониженной экспрессией были выявлены в 4 из 5 проанализированных работ (Haouzi D. et al., 2009).

Результаты исследований, конечно, не совпадают полностью. Однако можно сделать уже и некоторые заключения. Перечислить и обозначить изменение экспрессии и значение отдельных генов, а также возможные их взаимодействия практически невозможно, да и не имеет сегодня большого клинического смысла. Сегодня мы говорим не об анализе экспрессии одного, группы или десятков генов, а о проведении оценки «профиля экспрессии генов» или «индивидуального фенотипа эндометрия», характерной для той или иной фазы развития эндометрия. Практическим итогом исследований явилось создание первых диагностических тестов:

Наибольшую известность и распространение в настоящее время имеет тест ERA, который активно исследуют в ряде клиник во всем мире. Его используют для определения статуса эндометрия на момент биопсии, по результатам проведенного анализа состояние эндометрия может быть оценено как рецептивное, преили пострецептивное. Интересно, что состояние рецептивности/ нерецептивости по данным транскриптомных тестов слабо коррелирует с такими показателями, как толщина эндометрия при УЗИ и его гистологические характеристики. В настоящий момент не существует единого мнения относительно целесообразности назначения подобного теста, поскольку данные о клинических результатах весьма противоречивы.

Эндометрий в цикле стимуляции яичников. К настоящему времени получены данные о том, что транскриптом эндометрия в стимулированном цикле отличается от такового в натуральном цикле. Так, гены, находящиеся во время фазы рецептивности в натуральном овуляторном цикле в состоянии up -регуляции, в аналогичный период стимулированного цикла имеют пониженную экспрессию (Horcajadas J.A. et al., 2005). В обзоре D. Haouzi и совт. (2012) имеются сведения о том, что сдвиг транскриптомного профиля с пререцептивной к рецептивной фазе при нормальном овуляторном цикле и при стимулированном цикле характеризуется активацией ряда генов (632 и 416 генов соответственно); при этом только 361 из этих генов совпадают. Авторы данного исследования полагают, что витрификация эмбрионов и перенос их в следующих естественных циклах может приводить к более эффективной имплантации эмбрионов по сравнению с переносом в свежем стимулированном цикле вследствие более адекватного состояния эндометрия при отсутствии стимуляции.

Данные о преимуществах протоколов с а-ГнРГ и анта-ГнРГ остаются противоречивыми. Есть отдельные работы, свидетельствующие о более «физиологическом» профиле экспрессии генов в протоколах с анта-ГнРГ (Mirkin S. et al., 2004; Simon C. et al., 2005).

Эндометрий у пациенток с бесплодием. Очевидно, что не рецептивное состояние эндометрия может быть одной из причин идиопатического бесплодия или повторяющегося отсутствия имплантации в циклах ЭКО (по-английски термин обозначается как «repeated implantation failure», RIF). Следует отметить, что критерии RIF до сих пор четко не определены. Большинство авторов считают, что об отсутствии имплантации, связанном с функциональным состоянием эндометрия, можно говорить после трех неудачных попыток переноса эмбрионов хорошего качества и/или эуплоидных эмбрионов, а также после переноса 10 донорских эмбрионов хорошего качества.

После ряда транскриптомных исследований, выполненных на материале пациенток с повторным отсутствием имплантации (RIF) (Macklon N., 2017; Valdes C.T. et al., 2017; Koot et al., 2016; Sebastian-Leon et al., 2018), была предложена новая классификация этой патологии (рис. 5-2, по Sebastian-Leon et al., 2018). Так, повторяющееся отсутствие имплантации может быть вызвано двумя причинами - сдвигом или укорочением окна имплантации или неправильным, патологическим формированием окна имплантации. В случае если у пациентки программ ВРТ будет выявлено смещение нормально сформированного окна имплантации, ей может быть рекомендован персонализированный перенос эмбриона, раньше или позже стандартного срока. Патология окна имплантации может быть выявлена как изолированное нарушение, но также может развиваться в сочетании со cдвигом фазы цикла.

Причины появления таких фенотипов могут быть весьма гетерогенны и требуют дальнейшего изучения и разработки соответствующей терапии. Наконец, если у женщины с RIF мы не наблюдаем ни сдвига, ни патологии окна имплантации, могут быть заподозрены другие причины развития этой патологии (например, нарушения микробиома, иммунной системы, аномалии эмбрионов и т.д.).

Одним из наиболее многообещающих подходов к оценке рецептивности эндометрия является изучение состава гликокаликса эндометриального эпителия и бластоцисты (гликотипа), поскольку именно гликаны гликокаликса, составляют молекулярную границу между клетками и отвечают за межклеточные контакты, прикрепление, миграцию и инвазию клеток.

Доказано, что на поверхности трофэктодермы экспрессируются углеводсвязывающие белки - галектины, специфически взаимодействующие с гликанами (Зиганшина М.М. и др., 2017; Kimber S.J., 2000).

Многочисленные исследования паттерна гликозилирования эндометрия позволили выявить общую тенденцию, свидетельствующую, что экспрессия высокогликозилированных продуктов повышается в секреторную фазу цикла под воздействием прогестерона. Одновременно отмечается сокращение толщины апикальной части покровного эпителия (гликокаликса) и уменьшение общего отрицательного заряда клеточной поверхности, обусловленного анионными полимерами в структурах эндометрия (Gu J. et al., 2012).

Изменение паттерна гликозилирования в динамике менструального цикла у человека отражается не только в изменении представленности отдельных функциональных групп гликанов, которые являются составной частью сложных, разветвленных, комплексных структур, но и в изменении экспрессии конкретных высокогликозилированных белков, например синдеканов.

Постовуляторные изменения гликозилирования эндометриальных и секреторных белков мало изучены в репродуктивной медицине, но могут быть важной составляющей эндометриального паттерна, поскольку гликаны являются функциональной частью рецепторов, опосредующих межклеточные контакты, адгезию и процессы инвазии (Scott D.W., 2013).

Таким образом, оценка транскриптома эндометрия является стремительно развивающимся направлением репродуктивной медицины. Новые технологические платформы, в частности секвенирование нового поколения, биоинфор-матическое обеспечение получаемых результатов, контроль качества проведения и стандартизация исследований помогут имплементировать в недалеком будущем данную стратегию в практику центров ВРТ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Зиганшина М.М., Абдурахманова Н.Ф., Павлович С.В., Гвоздева А.Д., Бовин Н.В., Сухих Г.Т. Гликом эндометрия в менструальном цикле и рецептивность эндометрия // Акушерство и гинекология. 2017. № 12. С. 17-24.

Achache H., Revel A. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation // Hum. Reprod. Update. 2006. Vol. 12, N 6. P. 731-746.

Allegra A., Marino A., Coffaro F., Lama A., Rizza G., Scaglione P. et al. Is there a uniform basal endometrial gene expression profile during the implantation window in women who became pregnant in a subsequent ICSI cycle? // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24, N 10. P. 2549-2557.

Clemente-Ciscar M., Ruiz-Alonso M., Blesa D., Jimenez-Almazan J., Bahceci M., Banker M. et al. Endometrial receptivity analysis (ERA) using a next generation sequencing (NGS) predictor improves reproductive outcome in recurrent implantation failure (RIF) patients when compared to ERA arrays. 34th Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology // Hum. Reprod. 2018. Vol. 33, suppl. 1. P. i8.

Diaz-Gimeno P., Horcajadas J.A., Martinez-Conejero J.A., Esteban F.J., Alama P., Pellicer A. et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature // Fertil. Steril. 2011. Vol. 95, N 1. P. 50-60, e1-e15.

Enciso M., Carrascosa J.P., Sarasa J., Martinez-Ortiz P.A., Munné S., Horcajadas J.A., Aizpurua J. Development of a new comprehensive and reliable endometrial receptivity map (ER Map/ER Grade) based on RT-qPCR gene expression analysis // Hum. Reprod. 2018. Vol. 33, N 2. P. 220-228. DOI: 10.1093/humrep/dex370.

Evans G.E., Martinez-Conejero J.A., Phillipson G.T., Simon C., McNoe L.A., Sykes P.H. et al. Gene and protein expression signature of endometrial glandular and stromal compartments during the window of implantation // Fertil. Steril. 2012. Vol. 97. P. 1365-1373.e2.

Gaide Chevronnay H.P., Galant C., Lemoine P., Courtoy P.J., Marbaix E., Henriet P. Spatiotemporal coupling of focal extracellular matrix degradation and reconstruction in the menstrual human endometrium // Endocrinology. 2009. Vol. 150. P. 5094-5105.

Galliano D., Bellver J., Diaz-Garcia C., Simon C., Pellicer A. ART and uterine pathology: How relevant is the maternal side for implantation? // Hum. Reprod. Update. 2014. Vol. 21. P. 13-38.

Gomez E., Ruız-Alonso M., Miravet J., Simon C. Human endometrial transcriptomics: implications for embryonic implantation // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2015. Vol. 5, N 7. Article ID a022996.

Gu J., Isaji T., Xu Q., Kariya Y., Gu W., Fukuda T., Du Y. Potential roles of N-glycosylation in cell adhesion // Glycoconj. J. 2012. Vol. 29, N 8-9. P. 599-607.

Haouzi D., Assou S., Mahmoud K. et al. Gene expression profile ofhuman endometrial receptivity: comparison between natural and stimulated cycles for the same patients // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24, N 6. P. 1436-1445.

Haouzi D., Dechaud H., Assou S., De Vos J., Hamamah S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data // Reprod. Biomed. Online. 2012. Vol. 24, N 1. P. 23-34.

Haouzi D., Mahmoud K., Fourar M., Bendhaou K., Dechaud H., De Vos J. et al. Identification of new biomarkers of human endometrial receptivity in the natural cycle // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24, N 1. P. 198-205.

Harper M.J. The implantation window // Baillieres Clin. Obstet. Gynaecol. 1992. Vol. 6, N 2. P. 351-371.

Horcajadas J.A., Pellicer A., Simon C. Wide genomic analysis of human endometrial receptivity: new times, new apportunities // Hum. Reprod. Update. 2007. Vol. 13, N 1. P. 77-86.

Horcajadas J.A., Riesewijk A., Polman J., van Os R., Pellicer A., Mosselman S. et al. Effect of controlled ovarian hyperstimulation in IVF on endometrial gene expression profiles // Mol. Hum. Reprod. 2005. Vol. 11, N 3. P. 195-205.

Kimber S.J. Molecular interactions at the maternal-embryonic interface during the early phase of implantation // Semin. Reprod. Med. 2000. Vol. 18, N 3. P. 237-254.

Koot Y.E., van Hooff S.R., Boomsma C.M., van Leenen D., Groot Koerkamp M.J., Goddijn M., Eijkemans M.J., Fauser B.C., Holstege F.C., Macklon N.S. An endometrial gene expression signature accurately predicts recurrent implantation failure after IVF // Sci. Rep. 2016. Vol. 6. DOI: 10.1038/srep19411.

Labarta E., Martínez-Conejero J.A., Alamá P. et al. Endometrial receptivity is affected in women with high circulating progesterone levels at the end of the follicular phase: a functional genomics analysis // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26, N 7. P. 1813-1825.

Macklon N. Recurrent implantation failure is a pathology with a specific transcriptomic signature // Fertil. Steril. 2017. Vol. 108, N 1. P. 9-14. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2017.05.028.

Messaoudi S., Kasmi I., Bourdiec A., Crespo K., Bissonnette L., Le Saint C. et al. 15 years of transcriptomic analysis on endometrial receptivity: what have we learnt? // Fertil. Res. Pract. 2019. Vol. 5. P. 5.

Mirkin S., Nikas G., Hsiu J.G., Diaz J., Oehninger S. Gene expression profiles and structural/functional features of the peri-implantation endometrium in natural and gonadotropin-stimulated cycles // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004. Vol. 89, N 11. P. 5742-5752.

Riesewijk A. Gene expression profiling of human endometrial receptivity on days LH+2 versus LH+7 by microarray technology // Mol. Hum. Reprod. 2003. Vol. 9, N 5. P. 253-264.

Scott D.W., Patel R.P. Patel Endothelial heterogeneity and adhesion molecules N-glycosylation: Implications in leukocyte trafficking in inflammation // Glycobiology. 2013. Vol. 23, N 6. P. 622-633.

Sebastian-Leon P., Garrido N., Remohí J., Pellicer A., Diaz-Gimeno P. Asynchronous and pathological windows of implantation: two causes of recurrent implantation failure // Hum. Reprod. 2018. Vol. 33, N 4. P. 626-635. DOI: 10.1093/humrep/dey023.

Simon C., Oberye J., Bellver J., Vidal C., Bosch E., Horcajadas J.A. et al. Similar endometrial development in oocyte donors treated with either highor standard-dose GnRH antagonist compared to treatment with a GnRH agonist or in natural cycles // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 12. P. 3318-3327.

Talbi S., Hamilton A.E., Vo K.C., Tulac S., Overgaard M.T., Dosiou C. et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women // Endocrinology. 2006. Vol. 147, N 3. P. 1097-1121.

Taylor H.S., Daftery G.S., Selam B. Endometrial HOXA 10 expression after controlled ovarian hyperstimulation with recombinant follicle-stimulating hormone // Fertil. Steril. 2003. Vol. 80, N 2. P. 839-843.

Ulbrich S.E., Groebner A.E., Bauersachs S. Transcriptional profiling to address molecular determinants of endometrial receptivity - lessons from studies in livestock species // Methods. 2013. Vol. 59. P. 108-115.

Valdes C.T., Schutt A., Simon C. Implantation failure of endometrial origin: it is not pathology, but our failure to synchronize the developing embryo with a receptive endometrium // Fertil. Steril. 2017. Vol. 108, N 1. P. 15-18. DOI: 10.1016/j.fertns-tert.2017.05.033.

Van Vaerenbergh I., Fatemi H.M., Blockeel C. et al. Progesterone rise on HCG day in GnRH antagonist/rFSH stimulated cycles affects endometrial gene expression // Reprod. Biomed. Online. 2011. Vol. 22, N 3. P. 263-271.

Van Vaerenbergh I., Van Lommel L., Ghislain V. et al. In GnRH antagonist/rec-FSH stimulated cycles, advanced endometrial maturation on the day of oocyte retrieval correlates with altered expression // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24, N 5. P. 1085-1091.

Vitielle D., Kodaman P.H., Taylor H.S. HOX genes in implantation // Semin. Reprod. Med. 2007. Vol. 25, N 6. P. 431-436.

Wilcox A.J., Baird D.D., Weinberg C.R. Time of implantation of the conceptus and loss of pregnancy // N. Engl. J. Med. 1999. Vol. 340, N 23. P. 1796-1799.

Yanaihara A., Otsuka Y., Iwasaki S., Aida T., Tachikawa T., Irie T. et al. Differences in gene expression in the proliferative human endometrium // Fertil. Steril. 2005. Vol. 83. P. 1206-1215.

Развитие репродуктивной медицины многие годы было связано с изучением прежде всего физиологии и заболеваний женского организма. Это естественно и легко объяснимо. Однако по мере получения знаний в этой области оказалось, что примерно в половине случаев бесплодие связано или с изолированным, или с сочетанным мужским фактором (Brugh V.M. 3rd et al., 2003; Tiele-mans E. et al., 2002).

В США у 15% мужчин репродуктивного возраста отмечено нарушение фертильности. В то же время при анализе полноты обследования пар с бесплодием в США выяснилось, что у 18-27% половой партнер не был обследован (Eisenberg M.L. et al., 2013). По имеющимся данным, обращаемость мужчин по поводу бесплодия в России составляет 47 на 100 тыс. мужского населения (Андрология…​, 2007). Причем в основе мужского фактора бесплодия у 1-10% пациентов лежит соматическая патология. Этот факт явился мощным стимулом для изучения функции мужской репродуктивной системы. Однако в историческом развитии произошел один эпизод, который привел к парадоксальному временному снижению интереса к научным поискам в области андрологии, и связан он был, как ни странно, с успехами вспомогательной репродукции, а именно с развитием технологии внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов в яйцеклетку (ICSI, от англ. intra-cytoplasmic sperm injection). Первое сообщение об успешных родах после проведения ICSI в 1992 г. привело к временному застою в развитии фундаментальных работ в этой области, которые мотивировались тезисом: «Даже если имеется один сперматозоид, можно получить беременность». Это «головокружение от успехов» вскоре прошло, а интерес к изучению репродуктивной системы мужчин в последние два десятилетия переживает новый подъем.

В представленной главе будут рассмотрены основы регуляции функции тестикул, базовые сведения о сперматогенезе и последовательные этапы обследования пациентов с мужским фактором бесплодия.

Основы физиологии мужских гонад. Мужские гонады (яички, тестикулы) имеют две основные функции: продукция герминативных клеток - сперматозоидов и секреция половых стероидных гормонов, основным из которых является тестостерон. Каждой из описанных функций в структуре яичка соответствуют определенные морфологические субстраты. Сперматогенез происходит в семенных канальцах. Тестостерон и другие половые стероидные гормоны продуцируются интерстициальными клетками (клетками Лейдига). В состав интерстициальной ткани яичек, которая занимает около 12-15% общего объема яичка, также входят иммунокомпетентные клетки, фибробласты, рыхлая соединительная ткань, кровеносные и лимфатические сосуды. В среднем в яичке насчитывается около 200 млн клеток Лейдига. Регуляция гормональной функции яичек осуществляется на основе универсального принципа отрицательной обратной связи. В ответ на импульсную секрецию ГнРГ, вырабатываемого в аркуатных ядрах медиобазального гипоталамуса, в гонадотрофах передней доли гипофиза продуцируются ФСГ и ЛГ.

ЛГ играет основную роль в индукции секреции тестостерона интерстициальными клетками яичек. По механизму отрицательной обратной связи половые стероидные гормоны оказывают ингибирующее действие как на гипоталами-ческом уровне (синтез ГнРГ), так на гипофизарном уровне (рис. 6-1).

Тестостерон - наиболее значимый из андрогенов, продуцируемых яичками. Его роль велика не только в становлении и нормальном функционировании мужской репродуктивной системы, но и для полноценного существования организма в целом. Тестостерон запускает развитие вторичных половых признаков в пубертатном периоде, поддерживает сексуальную функцию взрослого мужчины и обеспечивает процесс сперматогенеза на его поздних этапах. Рецепторы к тестостерону выявляются практически во всех органах человеческого организма. Тестостерон является одним из мощнейших эндогенных анаболических факторов и поддерживает синтетические процессы в скелетной мускулатуре, костной ткани, органах кроветворения.

Действие тестостерона осуществляется как с помощью его непосредственного действия на рецепторы органов-мишеней, так и опосредованно - путем конверсии тестостерона под действием фермента 5α-редуктазы в дигидротестостерон (DHT), а также в эстрадиол.

После попадания в кровоток около 44% тестостерона связывается с глобулином, связывающим половые стероиды (ГСПС); 54% - с альбумином; около 2% тестостерона находится в циркуляции в свободном виде. Сродство тестостерона к этому ГСПС в несколько раз превосходит таковое к альбумину.

Биологический эффект тестостерона реализуется только его свободной фракцией.

Продукцию ГСПС стимулируют эстрогены. Кроме этого, она еще возрастает при снижении содержания андрогенов (тестостерона), гормона роста, а также у больных с хроническими заболеваниями печени (гепатитами, циррозом), гипертиреозом. Подавляющее действие на продукцию ГСПС оказывают андрогены, глюкокортикоиды, избыток гормона роста, гестагены. Продукция ГСПС снижается у больных с ожирением, гиперинсулинемией, нефротическим синдромом, а также при гипотиреозе.

Сперматогенез. Под термином «сперматогенез» понимают все процессы, связанные с продукцией мужских гамет. Сперматогенез происходит в семенных канальцах яичек. По объему канальцевый аппарат составляет около 60-80% всего объема яичек и состоит из герминативных клеток и двух типов соматических клеток (перитубулярных клеток и клеток Сертоли). Канальце-вый аппарат яичек представляет собой типичную железу внешней секреции, имеющую дольчатое строение, разделенное с помощью соединительнотканных перетяжек. Все яичко, таким образом, содержит 250-300 долек, каждая из которых состоит из 1-3 компактно скрученных и упакованных семенных канальцев. В целом в яичке мужчины может насчитываться около 600 семенных канальцев. Длина канальца в развернутом состоянии достигает 60-80 см.

Семенные канальцы покрыты оболочкой (lamina propria), состоящей из базальной мембраны, коллагенового слоя и перитубулярных клеток, представляющих собой миофибробласты, которые окружают канальцы, формируя концентрические слои, разделенные коллагеном. Это отличительная черта семенных канальцев человека, поскольку у других млекопитающих семенные канальцы окружены просто 3-4 слоями миофибробластов. Эти клетки продуцируют некоторые факторы, которые обеспечивают сокращение клеток.

Сперматозоиды, находящиеся в семенных канальцах, выталкиваются по направлению к выходу из канальца благодаря сократительной активности этих клеток.

Другой уникальной соматической клеткой, представленной в семенных канальцах, являются клетки Сертоли. Они располагаются на базальной мембране и доходят до просвета канальца. Эти клетки характеризуются очень плотными межклеточными соединениями, напоминающими кирпичную кладку. Таким образом, формируется плотный каркас семенных канальцев, составляющих основу гемато-тестикулярного барьера.

Кроме механической основы гемато-тестикулярного барьера, клетки Серто-ли секретируют большое количество биологически активных веществ: регуляторные белки, цитокины, ростовые факторы, опиоиды, стероидные гормоны, простагландины, регуляторы деления клетки и т.д. Таким образом, формируется среда семенных канальцев и герминативных клеток, которая значительно отличается от плазмы крови.

Клетки Сертоли составляют около 35-40% всего объема герминативного эпителия. В нормально функционирующем яичке в среднем содержится около 800-1200×10⁶ клеток Сертоли, или примерно 25 млн клеток Сертоли в 1 г яичка.

Основными функциями клеток Сертоли и гемато-тестикулярного барьера являются: во-первых, изоляция гаплоидных герминативных клеток во избежание контакта с иммунной системой макроорганизма и запуском иммунного ответа, что может приводить к аутоиммунному процессу с уничтожением герминативного эпителия; во-вторых, формирование специфичной среды для обеспечения мейоза и развития сперматозоидов.

Сперматогенез начинается с деления стволовых клеток и заканчивается формированием зрелого сперматозоида. Весь этот процесс можно разделить на четыре фазы:

Сперматогонии располагаются на базальной мембране семенного канальца и подразделяются на два типа: А и В. По своим цитологическим и физиологическим свойствам сперматогонии типа А имеют, в свою очередь, две разновидности: темные (Ат) и светлые (Ас). Темные сперматогонии Ат представляют собой стволовые клетки сперматогенного эпителия. Эти клетки характеризуются невыраженной митотической активностью. Их интенсивное деление происходит в случае резкого снижения популяции сперматогоний в результате какого-либо цитотоксического воздействия (например, радиоактивного излучения).

Сперматогонии Ас, напротив, делятся интенсивно и обеспечивают поддержание собственной популяции, а также диффернцируются в В-сперматогонии. Из последних образуются сперматоциты фазы прелептотены, где происходит усиленный синтез ДНК. В дальнейшем тетраплоидные сперматоциты проходят через различные фазы мейоза. В фазе пахитены мейотического деления происходит интенсивный синтез РНК.

В результате первого мейотического деления образуются сперматоциты 2-го порядка, содержащие сдвоенный гаплоидный набор хромосом, в результате второго мейотического деления эти сперматоциты делятся на сперматиды с гаплоидным набором хромосом. Профаза первого мейотического деления длится 1-3 нед, в то время как все остальные фазы 1-го мейотического деления и вся фаза 2-го мейотического деления занимает 1-2 дня. Полученные в результате мейоза сперматиды - митотически неактивные клетки, которые подвергаются значительным и сложным процессам трансформации, приводящим к появлению длинных сперматид и в последующем сперматозоидов.

Процесс выделения сперматозоидов в просвет семенного канальца может быть значительно изменен под воздействием гормональных, температурных факторов или токсинов. Сперматозоиды, которые не выделяются в просвет канальца, подвергаются фагоцитозу клетками Сертоли. Длительность всего процесса сперматогенеза составляет 70-75 дней.

Покидая семенной каналец, сперматозоиды в среде, произведенной клетками Сертоли, попадают в прямые канальцы, затем в систему более широких прямых трубочек - rete testis, после чего проникают в 12-18 эфферентных протоков, формирующих головку придатка яичка, и, наконец, формируется единственный каналец придатка.

Длительность пребывания сперматозоидов в придатке яичка - от 2 до 11 дней. В проксимальных отделах придатка происходит процесс «созревания» сперматозоидов, связанный с рядом физиологических, биохимических и морфологических изменений. Данные экспериментальных исследований показали, что сперматозоиды обладают большей оплодотворяющей способностью в зависимости от удаленности от головки придатка яичка.

Таким образом, яички человека продуцируют в норме 80-120 млн сперматозоидов в сутки, а в эякуляте содержится около 150 млн сперматозоидов.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ МУЖЧИН

I этап. При обращении пациента с проблемой бесплодия необходимо уточнить некоторые данные анамнеза:

II этап - клиническое обследование пациента. Включает оценку архитектоники тела (евнухоидные пропорции, распределение подкожной жировой клетчатки, гинекомастия), осмотр половых органов (величина полового члена, развитие кавернозных тел, фимоз, гипоспадии, определение размеров и консистенции яичек, варикоцеле). Осмотр пациента дает возможность оценить наличие косвенных признаков андрогенодефицита (евнухоидные пропорции, тип полового оволосения, гинекомастия), наличие, выраженность и тип ожирения. Осмотр половых органов также важен, поскольку позволяет определить нарушения развития или наличие образований наружных половых органов. Принципиально важен размер яичек, поскольку до 80% их объема составляет сперматогенный эпителий, а гипотрофия яичек, как правило, связана с выраженным снижением продукции сперматозоидов.

Необходимо особое внимание уделить выявлению маркеров хромосомных нарушений (расщепление твердого нёба и верхней губы, синдактилия, аносмия и др.).

Принципиальное значение имеет ректальное исследование, позволяющее оценить размеры и консистенцию предстательной железы, что может иметь скрининговое значение.

III этап - анализ эякулята (спермограмма). На сегодняшний день не существует достоверного метода оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов, который можно было бы применять в рутинной клинической практике. Тем не менее информацию о сперматогенезе человека можно получить с помощью спермограммы, то есть исследования макроскопических и микроскопических параметров эякулята, полученного путем мастурбации. Во всех подробностях этот метод будет описан в отдельной главе. Сейчас лишь отметим, что, безусловно не являясь истинным показателем фертильности человека, спермограмма отражает принципиальные характеристики эякулята: концентрацию сперматозоидов, их подвижность, морфологию, наличие аутоантител к антигенам сперматозоидов. Для составления какого-либо представления о сперматогенезе конкретного пациента проводят две спермограммы с интервалом не менее 2 нед. Это объясняется очень выраженной биологической вариабельностью параметров эякулята. Вместе с тем экспертами ВОЗ выработаны критерии нормальных референсных значений параметров спермограммы, которые основаны на данных спермограмм 1800 мужчин из восьми стран, расположенных на трех континентах, с подтвержденной беременностью у половых партнерш (WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen, 2010). Эти нормативы представлены в табл. 6-1.

Снижение количества сперматозоидов в эякуляте имеет следующие градации по степени выраженности:

*MAR-тест - количественное определение наличия/отсутствия антиспермальных антител класса G с использованием латексных частиц на поверхности сперматозоидов (от англ. mixed agglutination reaction).

По характеристикам подвижности и морфологии различают следующие варианты:

При наличии отклонений в двух спермограммах у пациентов с бесплодием показано дальнейшее обследование.

IV этап - лабораторные и инструментальные методы исследования

Определение гонадотропных гормонов в крови дает возможность локализовать уровень нарушений в гипоталамо-гипофизарно-гонадной системе.

При повышенном содержании ФСГ и ЛГ имеет место первично-тестикулярная патология (далее см. подраздел «Тестикулярные нарушения»), при пониженном их содержании - нарушение локализовано в гипоталамо-гипофизарной области (см. подраздел «Претестикулярные нарушения»).

В подавляющем большинстве случаев у пациентов с бесплодием при нарушениях сперматогенеза содержание ГТ, пролактина и тестостерона в крови находится в пределах референсных значений.

В последние годы разрабатываются новые диагностические тесты, позволяющие увеличить диагностическую ценность исследования эякулята. К ним относится исследование фрагментации ДНК сперматозоидов методом TUNEL (от англ. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-EndLa-belling), с помощью которого можно определить долю сперматозоидов с повышенной фрагментацией ДНК. Имеются данные о том, что у 5% мужчин с бесплодием при нормальных показателях спермограммы это единственная возможная этиологическая причина. У 25% мужчин с нарушениями сперматогенеза также выявляют повышенную долю фрагментированной ДНК. Часто являясь обратимой, повышенная доля фрагментации ДНК сперматозоидов может быть вызвана табакокурением, серьезной медицинской патологией (онкологические заболевания и другая системная соматическая патология), загрязнением воздуха, влиянием термического фактора, инфекционных агентов, химиопрепаратов, лучевого воздействия, варикоцеле. Однако на сегодняшний день этот тест не входит в стандарты обследования по бесплодию, поскольку доказательная база влияния повышенной доли фрагментированных ДНК сперматозоидов на их оплодотворяющую способность еще недостаточна. Изучение этого вопроса продолжается.

Повышенное содержание лейкоцитов в эякуляте (более 1 млн в миллилитре) является показанием для проведения микробиологического обследования с применением современных методов выявления возбудителей бактериальной или вирусной инфекции [полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, серологические маркеры и т.д.].

Некоторым пациентам дополнительно проводят генетическое исследование. Показаниями для генетического исследования пациента являются:

Биопсию яичек у пациентов с бесплодием проводят только при азооспермии. Разработано несколько способов выполнения биопсии тестикулов:

В настоящее время обязательным условием проведения биопсии яичка вне зависимости от выбранной методики является возможность криоконсервации полученного материала.

Тонкоигольную биопсию проводят специальной биопсийной иглой, позволяющей получить столбик ткани яичка, которую используют для поиска сперматозоидов. Обычно такую биопсию выполняют в нескольких участках яичка. Это позволяет получить одномоментно пробы ткани из нескольких участков и теоретически повысить вероятность нахождения спематозоидов. Однако были проведены исследования, которые убедительно показали, что частота атрофии яичка при такой процедуре может достигать 20% в течение последующих 3 лет. Это происходит вследствии развития аутоиммунного орхита из-за нарушения целостности гемато-тестикулярного барьера по причине множественной травматизации в местах проколов.

Открытая биопсия яичка, которая была введена в клиническую практику раньше, оказалась менее травматичной, однако также может быть причиной развития орхита и последующей гипотрофии яичка.

В последние годы была разработана методика проведения биопсии яичка с применением микрохирургической техники - micro-TESE. При этом достигаются хороший уровень гемостаза, детальная визуализация тканей яичка, выделение семенных канальцев и бережный забор тканей. Технология позволяет практически избегать последующей атрофии яичка, повышает вероятность получения сперматозоидов и, несомненно, является наиболее предпочтительной процедурой с точки зрения интересов пациента. Отрицательная сторона этой процедуры - высокая стоимость и длительность самой процедуры, которая может достигать 2-2,5 ч, что требует продленного анестезиологического пособия и более длительного пребывания пациента в клинике.

При правильном диагностическом поиске на современном уровне развития диагностических возможностей в андрологии можно установить причины развития нарушений сперматогенеза примерно у 60-70% пациентов. В 30- 40% случаев этиологический фактор остается неизвестным, и можно говорить об идиопатическом нарушении сперматогенеза.

Существует несколько классификаций, позволяющих систематизировать этиологичекие факторы мужского бесплодия на основе того или иного отличительного признака.

По локализации патологического процесса различают следующие виды нарушений:

Вышеприведенная классификация имеет клиническое значение, поскольку во многом определяет врачебную диагностическую и лечебную тактику.

ТЕРАПИЯ ПАЦИЕНТОВ С МУЖСКИМ ФАКТОРОМ БЕСПЛОДИЯ

Как уже упоминалось, в последние годы наметилась тревожная тенденция, заключающаяся в применении методов вспомогательной репродукции сразу после установления мужского фактора бесплодия. Несмотря на несомненные успехи методов ВРТ в лечении бесплодия, надо отметить безусловный вред такого подхода для пациентов с диагностированным нарушением фертильности. Дело в том, что бесплодие может быть первым симптомом достаточно грозных и часто угрожающих жизни заболеваний пациента. Лечение таких заболеваний необходимо прежде всего для сохранения здоровья пациента. К ним, например, относятся:

Во многих случаях успешное лечение или стойкая компенсация основного соматического заболевания приводит к улучшению или полному восстановлению репродуктивной функции. Именно такой подход нужно рассматривать в качестве приоритетного при ведении пациентов с мужским фактором бесплодия. Это же касается эндокринных факторов бесплодия внегонадной локализации.

Претестикулярные нарушения

Гипогонадизм, связанный с пониженной выработкой гонадотропных гормонов гипофизом, обычно диагностируется в детстве или в период полового созревания. Эти пациенты наблюдаются у эндокринологов и находятся на заместительной терапии препаратами тестостерона. При планировании беременности необходимо перевести пациентов на проведение заместительной терапии препаратами гонадотропинов. Предпочтительнее прием препаратов, содержащих активность как ФСГ, так и ЛГ: высокоочищенных мочевых гонадотропинов, рекомбинантных гонадотропинов в сочетании с препаратами ХГЧ или комбинированного рекомбинантного препарата, содержащего 150 МЕ рФСГ и 75 МЕ рЛГ. Длительность лечения может составлять от 2-3 мес до года. Проводят лечение до появления сперматозоидов в эякуляте и спонтанной беременности у партнерши. Возможно применение подкожных помп с ГнРГ, которые модулируют импульсную секрецию путем выделения доз ГнРГ (5-20 μg) каждые 120 мин. В России этот метод не применяется. После достижения желаемой беременности пациентов вновь переводят на заместительную терапию препаратами тестостерона ввиду большой стоимости лечения препаратами гонадотропных гормонов.

Гиперпролактинемию у мужчин диагностируют достаточно редко. Небольшое повышение уровней пролактина в крови может быть связано со стрессом. У особо впечатлительных пациентов сам факт взятия крови может провоцировать преходящее увеличение содержания пролактина в крови. Стойкая и выраженная гиперпролактинемия обычно связана с наличием пролактинсекретирущей аденомы гипофиза. Именно поэтому при выявлении уровня пролактина в крови при повторных определениях свыше 700 мМЕ/л показано проведение МРТ области турецкого седла с контрастированием. Другие объемные образования гипоталамо-гипофизарной области также могут проявляться гипер-пролактинемией, например краниофарингиома, что является дополнительным показанием для проведения лучевой диагностики этой области. Гиперпролактинемия может быть вызвана и приемом некоторых препаратов, содержащих бутирофенон, фенотиазин, имипрамин, метоклопрамид и другие, влияющие на обмен дофамина. Влияние гиперпролактинемии на репродуктивную функцию мужчины связано с нарушением импульсной секреции ГнРГ и, следовательно, на продукцию гонадотропных гормонов гипофизом. Лечение гиперпролактинемии проводит эндокринолог, и оно связано с применением агонистов дофамина: бромокриптином, каберголином. Обычно удается достичь адекватного уровня пролактина при применении этих препаратов и восстановить нормальную функцию гонадотрофов гипофиза.

Посттестикулярные нарушения

К таким нарушениям относят обструкции семявыносящих путей на всех уровнях, нарушения процесса эякуляции и эректильные расстройства.

Обструктивная азооспермия, при которой наблюдается полное нарушение проходимости семявыносящих путей, может быть врожденной и приобретенной. Относительная частота встречаемости этих состояний во многом зависит от распространенности применения вазэктомии с целью контрацепции в том или другом регионе. Распространенность обструктивной азооспермии, которая еще называется экскреторной, колеблется в пределах 25-40% всех случаев азооспермии.

Врожденное отсутствие семявыносящих протоков встречается при мутации в гене CFTR (от англ. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator - регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе), который находится на длинном плече 7 хромосомы (15% пациентов с обструктивной азооспермией); при мутации в данном гене сперматогенез в яичке может быть сохранен. У каждого десятого пациента причина обструктивной азооспермии не может быть установлена. С точки зрения прогноза по наступлению беременности в результате лечения обструктивная форма является достаточно перспективной. При обструктивной форме азооспермии могут иметь место различные уровни непроходимости: эпидидимис, семявыносящий проток, семявыбрасывающий проток.

Приобретенные формы обструктивной азооспермии связаны с внешними причинами сдавления семявыносящих протоков (опухоли, кисты), инфекционными факторами и травмами. Среди приобретенных форм наиболее частыми оказываются обструкции, связанные с заболеваниями, передаваемыми половым путем. Наиболее часто при воспалительной форме обструктивной азооспермии выявляют такие инфекции, как хламидийная, гонорейная, а также туберкулез. Менее чем в 10% случаев обструкция локализуется на уровне семявыбрасывающего протока. При обструктивной азооспермии, вызванной вазэктомией или постинфекционной обструкцией, рассматривают возможность микрохирургического восстановления проходимости семенных путей. Однако эффективность таких операций сильно колеблется - от 20 до 80%.

В случае отсутствия эффекта от хирургического лечения показано извлечение сперматозоидов при биопсии яичка или придатка яичка с последующим проведением ЭКО/ICSI.

Наличие антиспермальных аутоантител в эякуляте является самостоятельным фактором мужского бесплодия. Антиспермальные аутоантитела могут выявляться после перенесенной травмы яичка или после перенесенных инфекционных заболеваний, а также после проведения вазэктомии. Диагностику этого состояния осуществляют путем определения аутоантител в эякуляте по реакции смешанной микроагглютинации (MAR-тест). Влияние аутоантител связано с нарушением реакции капацитации сперматозоидов, акросомальной реакции и процесса пенетрации сперматозоида в яйцеклетку. На сегодняшний день не выработано эффективных методов коррекции этого состояния, и единственным эффективным методом лечения бесплодия, вызванного аутоантителами, является процедура ICSI в рамках программ ВРТ.

К посттестикулярным нарушениям репродуктивной функции относят также состояния, связанные с нарушениями копулятивной функции и процесса эякуляции. Эректильные расстройства являются отдельной и самостоятельной проблемой современной андрологии. Естественно, при эректильных расстройствах часто имеет место бесплодие, однако на современном этапе развития консервативного лечения и благодаря успешному применению ингибиторов фосфоди-эстеразы 5-го типа большая часть этих пациентов успешно справляются с проблемой эректильной дисфункции. Нарушения эякуляции могут быть связаны со спинальной травмой. Наиболее часто к эякуляторной дисфункции приводят травмы на уровне Т_IX -Т_XI или L_II -L_III , где расположены симпатические центры регуляции эякуляции. Аналогичная картина наблюдается при удалении симпатических ганглиев при радикальных хирургических вмешательствах на уровне Т_XII -L_II . Ретроградная эякуляция также относится к эякуляторной дисфункции и часто наблюдается у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа, а также после оперативных вмешательств на предстательной железе или мочевом пузыре. Расстройства эякуляции наблюдаются и при применении гипотензивных средств из групп α-адреноблокаторов и тиазидов, а также некоторых антидепрессантов и психотропных средств (Turek P.J., 2008).

Тестикулярные нарушения

При тестикулярной локализации патологического процесса различают врожденные и приобретенные заболевания.

Врожденные заболевания

Врожденная первичная тестикулярная недостаточность сопровождается повышенным содержанием гонадотропинов в крови. Одним из таких состояний является врожденное отсутствие гонад - анорхизм, который выявляют у 1 из 20 тыс. новорожденных мальчиков (рис. 6-2). Клиническая картина зависит от имевшей место продукции тестостерона в эмбриональном периоде наряду с продукцией АМГ. Если у этих пациентов продукция тестостерона имела место, то происходит различной степени выраженности дифференцировка пола по мужскому пути; при отсутствии секреции тестостерона наблюдается картина мужского псевдогермафродитизма [женские наружные половые органы при отсутствии гонад и производных мюллеровых протоков (маточные трубы, матка, верхняя треть влагалища) в сочетании с отсутствием производных воль-фовых протоков (эпидидимис, семявыносящий проток, семенные пузырьки)]. В первом случае проводят заместительную терапию препаратами тестостерона с пубертатного возраста. Во втором случае индивидуально решают вопрос о дальнейшей тактике с выбором пола в зависимости от наличия тех или иных клинических данных.

Дефекты опущения яичек. В зависимости от локализации яичка встречаются следующие варианты:

Частота встречаемости дефектов опущения яичек, за исключением ретрактильных яичек, составляет 0,5% взрослого населения.

Во всех случаях дефектов опущения хирургическое лечение необходимо проводить как можно раньше. Учитывая возможность спонтанного опущения яичек до полугодового возраста, оптимальным временем лечения является период с полугода до первого года жизни.

Ретрактильные яички не требуют лечения.

Наследственные нарушения сперматогенеза включают ряд генных и хромосомных синдромов.

Данное состояние может быть вызвано различными эндогенными и экзогенными факторами. Для него характерна азооспермия, и лечение, направленное на улучшение сперматогенеза, не показано, поскольку не эффективно. В некоторых случаях Сертоли-клеточный синдром имеет очаговое распространение, то есть наряду с участками полного отсутствия сперматогенного эпителия есть участки яичка с сохраненным сперматогенным эпителием и могут встречаться сперматозоиды. В таких случаях возможно получение беременности при извлечении таких сперматозоидов и дальнейшем использовании их в программах ЭКО/ICSI.

Приобретенные заболевания

Варикозное расширение вен яичка и семенного канатика (варикоцеле). Наиболее частая причина приобретенного нарушения сперматогенеза. При этом заболевании нарушение кровообращения и повышение температуры в яичках могут негативно влиять на сперматогенез. Это состояние наблюдается у 12- 15% мужчин с нормальными показателями спермограммы и у 25,4% мужчин с нарушениями, выявляемыми при спермограмме. В 98% случаев имеет место левосторонняя локализация (Smit M. et al., 2010).

Можно следовать следующей принятой клинической классификации:

Хотя большинство мужчин с варикоцеле способны к отцовству, имеются многочисленные данные, свидетельствующие о неблагоприятном влиянии этого состояния на мужскую фертильность. В то же время отсутствуют точные данные о связи варикоцеле и бесплодия. Существует несколько теорий возможного патогенетического влияния варикоцеле на сперматогенный эпителий. Наиболее популярная - это термический фактор, связанный с венозным застоем и увеличением температуры в мошонке, что теоретически может обладать гонадотоксическим действием. Есть предположения о наличии токсического действия метаболитов катехоламинов, которые могут забрасываться в венозную систему гроздевидного сплетения при ретроградном кровотоке из вен почки и надпочечника. При выраженном варикозном расширении вен может возникать локальная ишемия из-за отсутствия адекватного кровотока. Имеются сообщения о наличии оксидативного стресса при варикоцеле, что может влиять на повреждение ДНК сперматозоидов. Однако единого взгляда на патогенез влияния варикоцеле на фертильность до сих пор не выработано. Лечение ва-рикоцеле хирургическое (Giagulli V.A. et al., 2011). Было проведено множество рандомизированных контролируемых исследований (РКИ) для определения эффективности применения оперативного лечения для улучшения качества сперматогенеза. Хотя однозначных результатов получено не было, однако мета-анализ четырех таких исследований показал тенденцию в пользу оперативного лечения у больных с варикоцеле и олигозооспермией. В любом случае можно принять следующие рекомендации для клинической практики.

Оперативное лечение варикоцеле показано в случаях: варикоцеле определяется пальпаторно; имеется бесплодие; у половой партнерши не выявлено нарушений репродуктивной функции, или они потенциально могут быть преодолены медикаментозно (например, индукция овуляции); у пациента имеются нарушения сперматогенеза, препятствующие оплодотворению; оперативное лечение варикоцеле рекомендовано в подростковом возрасте при наличии прогрессивного нарушения развития яичек, подтвержденного при обследовании.

Орхит редко бывает изолированным. Чаще наблюдается орхоэпидидимит. Обычно имеет место вирусная этиология воспаления. Из возбудителей известны: вирус паротита, коксаки-вирус, вирус лимфоцитарного хориоменингита, арбовирусы группы В, вирус денге, зостер-вирус и некоторые другие. В яичках также может возникать воспалительный процесс вследствие нефрита, простатита, везикулита и эпидидимита чаще гонококковой или хламидийной этиологии. У детей описаны неспецифические орхиты, вызванные пневмококком или сальмонеллой. Специфический орхит вследствие туберкулеза или сифилиса в настоящее время встречается редко. Описан также аутоиммунный орхит.

Что касается терапии, то она сводится к лечению общих симптомов, влияние на сперматогенез при вирусной инфекции определяется сродством конкретного вируса к сперматогенному эпителию и является обычно непредотвратимым. Наибольшим сродством обладает вирус паротита. Избежать его разрушающего действия на яички можно только путем вакцинации. Относительно возбудителей бактериальной природы - необходимо применение антибиотиков, подбор которых осуществляют с учетом чувствительности конкретной бактериальной флоры. При наличии симптомов воспаления органов мочеполовой системы необходимо проведение комплексной противовоспалительной терапии с целью не допустить развития рубцово-спаечных процессов, которые могут вызывать непроходимость семявыносящих путей и, следовательно, экскреторное бесплодие.

Возраст рассматривается в качестве фактора риска в отношении снижения фертильности мужчины. Имеющаяся тенденция более позднего планирования семьи и реализации репродуктивной функции приводит к увеличению числа возрастных мужчин, планирующих рождение первого ребенка или планирующих ребенка во втором браке. Продукция общего тестостерона в возрасте 30-40 лет ежегодно теряется на 0,7-1,0%, еще более выражено снижение содержания свободного тестостерона на 1,2-1,4% ежегодно (Дедов И.И., Калинченко С.Ю., 2006). Имеются данные, подтверждающие прогрессивное снижение доли прогрессивно-подвижных сперматозоидов с возрастом, начиная с 30 лет (Zhu Q.X. et al., 2011).

Системные заболевания. При каждом системном заболевании, сопровождающимся значительным воздействием на общее состояние здоровья, наблюдается снижение репродуктивной функции мужчины, которое может быть связано с влиянием как на гипоталамо-гипофизарно-тестикулярную систему, так и на копулятивную функцию. При некоторых нозологиях это влияние может быть сочетанным. Так, при хронической почечной недостаточности имеет место комплексное снижение продукции тестостерона, повышение уровня пролакти-на в крови, снижение сексуальной активности и либидо (Turek P.J., 2008). При печеночной недостаточности, вне зависимости от причин, ее вызвавших, также наблюдается снижение продукции тестостерона, его повышенная конверсия в эстрадиол. Это сопровождается снижением либидо и сексуальной активности (Sartorius G.A., Handelsman D.J., 2010). Аналогичные эффекты описаны у пациентов с хроническим язвенным колитом и при болезни Крона. Механизм развития тестикулярной недостаточности в этих случаях связывают с влиянием хронического воспалительного процесса и прямым повреждающим действием цитокинов, в частности TNF, на сперматогенез.

Ожирение. В нескольких масштабных исследованиях было убедительно доказано, что избыток массы тела и ожирение являются самостоятельным фактором, определяющим снижение фертильности у мужчин с частотой на 50% выше, чем у пациентов с нормальной массой тела (Pauli E.M. et al., 2008). Основным механизмом отрицательного влияния на сперматогенез и секрецию тестостерона яичками считается повышенная конверсия тестостерона в эстрогены в жировой ткани, а также повышенная продукция лептина (Hofny E.R. et al., 2010; Schlegel P.N., 2012).

Травма яичка. Сперматогенный эпителий яичка представляет собой иммунологически превилигированную ткань организма, что обеспечивается гемато-тестикулярным барьером. Нарушение целостности этого барьера может приводить к возникновению аутоиммунного воспаления, которое, в свою очередь, может стать причиной существенных нарушений сперматогенеза. Масштабы этого процесса во многом зависят от интенсивности повреждающего фактора (Rowe P.J. et al., 2000).

Перекрут яичка. Ургентное состояние, угрожающее сохранности органа. Немедленное оперативное лечение способно восстановить кровоток и сохранить функцию яичка, однако сперматогенез может быть нарушен. Имеются обоснованные данные о возможных нарушениях сперматогенеза и в интактном яичке (Turek P.J., 2008). Основным патогенетическим фактором при перекруте яичка являются ишемия и последующая повышенная продукция свободных радикалов кислорода, что может приводить к нарушению целостности ДНК сперматозоидов, а также повышению интенсивности процесса апоптоза сперматогенных клеток. Хирургическое лечение, направленное на быстрое восстановление кровоснабжения поврежденного яичка, дает возможность избежать выраженных нарушений сперматогенеза в обоих яичках (Shimizu S. et al., 2011).

Влияние гонадотоксинов. Сперматогенный эпителий характеризуется высокой чувствительностью к влиянию ионизирующего излучения. Наиболее выражено это влияние на сперматогонии типа А. Патологическое действие радиации носит дозозависимый характер и зависит от кратности воздействия. Доза 0,15 Гр может приводить к временному снижению концентрации сперматозоидов. В то же время доза 2 Гр приводит к азооспермии. Доза выше 4 Гр может повлечь нарушение сперматогенеза, восстановление которого может длиться до 5 лет или быть необратимым. Клетки Лейдига менее чувствительны к радиации. Значимый повреждающий эффект достигается при дозе 30 Гр у взрослых мужчин, а у подростков - 20 Гр.

Ятрогенное воздействие также может приводить к значительному подавлению фертильности. Кетоконазол и спиронолактон влияют на стероидогенез и приводят к снижению продукции тестостерона. Циметидин действует как антагонист андрогенов (Turek P.J., 2008). Антигипертензивные средства способны снижать подвижность сперматозоидов и их способность к оплодотворению. В то же время группа этих препаратов оказывает влияние на снижение либидо и сексуальную функцию. Антибиотики эритромицинового ряда, нитрофураны, гентамицин и тетрациклины имеют прямое гонадотоксичное действие или опосредованно подавляют сперматогенез. Сульфасалазин приводит к обратимому снижению основных параметров сперматогенеза. Химиотерапевтические средства, применяемые в онкологии, уничтожают быстро делящиеся клетки, что оказывает выраженное влияние и на дифференцирующиеся клетки сперматогенеза. Циклофосфамид, хлорамбуцил, производные хлорэтиламина относятся к алкалирующим веществам с выраженным гонадотоксическим действием.

Экзогенное введение андрогенов приводит к подавлению секреции собственных гонадотропинов, таким образом вызывая снижение фертильности путем нарушения сперматогенеза.

Психотропные и наркотические средства также демонстрируют гонадотоксическое действие. Механизм их действия, скорее всего, имеет многоуровневый характер в отношении гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной системы.

Табакокурение имеет доказанное влияние на повышение частоты анеуплоидий в сперматозоидах. Отмечено негативное действие курения на концентрацию, прогрессивную подвижность, морфологию и жизнеспособность сперматозоидов (Vine M.F., 1996).

Применение многих пестицидов, почвенных фумигантов связано с воздействием на репродуктивную функцию человека. В отношении влияния на сперматогенез есть данные о широко применявшемся веществе дибромхлорпропане (DBCP). Его патологическое воздействие на сперматогенез связывали с повышенным эстрогеноподобным действием. Несмотря на то что его использование запрещено с 80-х годов прошлого столетия, в местах интенсивного применения этого вещества его концентрация оставалась достаточно высокой до последнего времени. Некоторые до сих пор применяющиеся пестициды, такие как хлоропрен, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, возможно также имеют гонадотоксическое действие.

Некоторые неорганические вещества (кадмий, свинец, ртуть, марганец), а также органические растворители тоже обладают гонадотоксическим действием.

Принимая во внимание тот факт, что сперматогенез представляет собой многоступенчатый сложный процесс развития зрелых гамет из стволовой соматической клетки, очевидно, что повреждающие воздействия внешних факторов на уровне герминативного эпителия семенных канальцев могут иметь усугубляющее и потенцирующее действие на основной этиологический фактор мужского бесплодия. Именно поэтому в андрологии особое внимание уделено минимизации или устранению внешних неблагоприятных факторов: курения, злоупотребления алкоголем, термического фактора (бани, горячих ванн). Одним из главных условий повышения оплодотворяющей способности сперматозоидов является употребление здоровой пищи. В диету необходимо включать углеводы, клетчатку, продукты, богатые фолатами, ликопином, фрукты, овощи, должно быть уменьшено потребление животных белков и жиров. Имеются данные, что такая диета (средиземноморская диета) приводит к улучшению фертильности (Vujkovic M. et al., 2010; Wong W.Y. et al., 2013). Другой принцип терапии нарушений сперматогенеза связан с его длительностью, которая составляет 70-75 дней, соответственно, курс лечения должен иметь длительность от 2,5 до 3 мес.

При снижении параметров спермограммы неясной этиологии, которое имеет место у достаточно большого числа пациентов, используется эмпирический подход к терапии.

При выраженной патоспермии (олигоастенотератозооспермия) у пациентов с нормальными уровнями гонадотропных гормонов в крови были попытки применять препараты хорионического гонадотропина или мочевых гонадотропинов.

Имеются сообщения о повышении наступления беременности у партнерш пациентов после проводимой терапии высокоочищенными менотропинами, однако эти результаты получены в ходе немногочисленных когортных исследований. До настоящего времени РКИ буквально единичные и не показали достоверного улучшения в отношении наступления беременности у бесплодных пар.

С появлением рекомбинантных препаратов было проведено несколько плацебо-контролируемых рандомизированных исследований, метаанализ которых позволил заключить, что применение этих препаратов способствует достоверному увеличению наступления беременности с частотой шансов 1,52 (0,95-2,44). Однако, учитывая, что курс такой терапии имеет высокую стоимость и после него из 14 пациенток только у одной наступает беременность, необходимы дальнейшие исследования, прежде чем рекомендовать применение рекомбинантных ГТ в качестве рутинного метода лечения идиопатической патоспермии.

Следующая группа препаратов, которая в последние годы стала использоваться в лечении мужского фактора бесплодия, - это ингибиторы ароматазы (летрозол, анастрозол). Действие препаратов связывают с обратимым подавлением активности ароматазы, что приводит к увеличению содержания тестостерона в крови и снижению уровня эстрадиола, оказывая стимулирующее действие на продукцию гонадотропинов гипофизом по механизму отрицательной обратной связи. По поводу эффективности этой группы препаратов пока не накоплен достаточный опыт и большие рандомизированные исследования не проводились.

Применяют также антиэстрогены (Кломифена цитрат^♠ , тамоксифен) в разных режимах, дозах и с разной длительностью. Было проведено несколько крупных рандомизированных исследований, в том числе организованных ВОЗ, в результате которых пришли к заключению о неэффективности этих препаратов у пациентов с идиопатическим нарушением сперматогенеза.

Использование препаратов тестостерона у этих больных также оказалось неоправданным. При отсутствии снижения выработки эндогенного тестостерона применение препаратов тестостерона может приводить к еще большему угнетению сперматогенеза вплоть до азооспермии, которая чаще всего является обратимой.

Для улучшения локального кровотока в половой системе мужчин пытались применить пентоксифиллин. Однако проведенные плацебо-контролируемые исследования не показали положительного эффекта этого препарата при лечении мужского фактора бесплодия.

С целью улучшения показателей сперматогенеза использовали многие антиоксиданты. Аскорбиновую кислоту, витамин Е, карнитин, коэнзим Q10, цинк, селен применяли как изолированно, так и в различных сочетаниях. Существуют разрозненные и противоречивые данные об эффективности этих веществ, однако убедительных, доказательных данных, полученных в результате РКИ, отражающих их положительное действие, получено не было.

При отсутствии эффекта от проводимой терапии нарушений сперматогенеза в течение полугода рекомендовано применение методов вспомогательной репродукции.

С точки зрения выбора тактики лечения отдельного рассмотрения заслуживает состояние, при котором сперматозоиды в эякуляте отсутствуют даже после центрифугирования, - азооспермия. Распространенность этого состояния - около 1% мужской популяции, если рассматривать контингент с бесплодием, то ее частота колеблется в пределах от 10 до 15%.

Азооспермия по своей природе делится на две большие составные части: обструктивная азооспермия и необструктивная азооспермия, или секреторная азооспермия, распространенность которой составляет 60-75% всех случаев азооспермии. Формы обструктивной азооспермии были рассмотрены выше в разделе о посттестикулярных нарушениях репродуктивной функции. Секреторная азооспермия классифицируется в зависимости от причин. К сожалению, примерно в половине случаев причины установить не удается. Генетические факторы выявляют у 10-15% пациентов. Одним из таких факторов является мутация в гене AZF(Azoospermia), который находится на длинном плече Y-хромосомы. При мутации в локусах AZFa, AZFb имеется тяжелое поражение сперматогенеза (остановка на ранних этапах или наличие только клеток Сертоли в ткани яичка). При мутации в локусе AZFc наблюдается тяжелая форма олигоастенозооспермии или азооспермия с интактным сперматогенезом. Другой причиной данной формы азооспермии (5-10% больных с необструктивной азооспермией) является синдром Клайнфельтера (47, XXY). Более редкими причинами необструктивной азооспермии могут быть инфекционный паротит, воспаление яичка (орхит), прием анаболических средств, лучевая или химиотерапия.

К этиологическим причинам секреторной азооспермии также относятся двусторонний крипторхизм, перекрут яичка, когда имеет место двусторонний перекрут или одно яичко уже повреждено.

При секреторной азооспермии единственным методом получения сперматозоидов является биопсия яичка (TESE). В последние годы разработана методика микрохирургической открытой биопсии яичка, что позволяет минимизировать послеоперационные осложнения. В основном речь идет о профилактике послеоперационного орхита, поскольку нарушение целостности гемато-тестикулярного барьера при операционной травме может приводить к развитию аутоиммунного орхита в течение последующего года.

Таким образом, можно кратко представить алгоритм диагностики и лечения пациентов с мужским фактором бесплодия (рис. 6-3). Он схематично отражает все вышеперечисленные этапы обследования и соответствующие методы лечения.

Заключение

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Андрология : клинические рекомендации / под ред. П.А. Щеплева, О.И. Аполихина. Москва : Медпрактика-М, 2007. 164 с.

Дедов И.И., Калинченко С.Ю. Возрастной андрогенный дефицит у мужчин. Москва : Практическая медицина, 2006. 240 с.

Beretta G. Iatrogenic infertility // Clinical Management of Male Infertility / eds G. Cavallini, G. Beretta. New York; Dordrecht; London : Springer, 2015. P. 145-151.

Brugh V.M. 3rd, Matschke H.M., Lipshultz L.I. Male factor infertility // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 2003. Vol. 32, N 3. P. 689-707.

Eisenberg M.L., Lathi R.B., Baker V.L., Westphal L.M., Milki A.A., Nangia A.K. Frequency of the male infertility evaluation: data from the national survey of family growth // J. Urol. 2013. Vol. 189, N 3. P. 1030-1034.

Giagulli V.A., Carbone M.D. Varicocele correction for infertility: which patients to treat? // Int. J. Androl. 2011. Vol. 34, N 3. P. 236-241.

Hofny E.R., Ali M.E., Abdel-Hafez H.Z., Kamal Eel D., Mohamed E.E., Abd El-Azeem H.G. et al. Semen parameters and hormonal profile in obese fertile and infertile males // Fertil. Steril. 2010. Vol. 94, N 2. P. 581-584.

Pauli E.M., Legro R.S., Demers L.M., Kunselman A.R., Dodson W.C., Lee P.A. Diminished paternity and gonadal function with increasing obesity in men // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 2. P. 346-351.

Rowe P.J., Comhaire F.H., Hargreave T.B., Mahmoud A.M.A. WHO manual for the standardized investigation, diagnosis and management of the infertile male. Cambridge : Cambridge University Press, 2000.

Sartorius G.A., Handelsman D.J. Testicular dysfunction in systemic diseases // Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction / eds E. Nieschlag, H.M. Behre, S. Nieschlag. Berlin; Heidelberg : Springer, 2010. P. 339-364.

Schlegel P.N. Aromatase inhibitors for male infertility // Fertil. Steril. 2012. Vol. 98, N 6. P. 1359-1362.

Shimizu S., Saito M., Dimitriadis F., Kinoshita Y., Shomori K., Satoh I. et al. Protective effect of ischaemic post-conditioning on ipsilateral and contralateral testes after unilateral testicular ischaemia-reperfusion injury // Int. J. Androl. 2011. Vol. 34, N 3. P. 268-275.

Smit M., Romij n J.C., Wildhagen M.F., Veldhoven J.L., Weber R.F., Dohle G.R. Decreased sperm DNA fragmentation after surgical varicocelectomy is associated with increased pregnancy rate // J. Urol. 2010. Vol. 183, N 1. P. 270-274.

Tielemans E., Burdorf A., te Velde E., Weber R., van Kooij R., Heederik D. Sources of bias in studies among infertility clients // Am. J. Epidemiol. 2002. Vol. 156, N 1. P. 86-92.

Turek P.J. Male infertility // Smith’s General Urology / eds E.A. Tanagho, J.W. McAninch. New York : McGraw-Hill, 2008. P. 684-716.

Vine M.F. Smoking and male reproduction: a review // Int. J. Androl. 1996. Vol. 19, N 6. P. 323-337.

Vujkovic M., de Vries J.H., Lindemans J., Macklon N.S., van der Spek P.J., Steegers E.A. et al. The preconception Mediterranean dietary pattern in couples undergoing in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection treatment increases the chance ofpregnancy // Fertil. Steril. 2010. Vol. 94. P. 2096-2101.

Wong W.Y., Zielhuis G.A., Thomas C.M., Merkus H.M., Steegers-Theunissen R.P. New evidence of the influence of exogenous and endogenous factors on sperm count in man // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2013. Vol. 110. P. 49-54.

World Health Organisation. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5^th ed. Geneva : WHO, 2010.

Zhu Q.X., Meads C., Lu M.L., Wu J.Q., Zhou W.J., Gao E.S. Turning point of age for semen quality: a population-based study in Chinese men // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96. P. 572-576.

В клинической практике основным методом исследования эякулята является стандартный спермиологический анализ, или спермограмма.

При направлении на спермограмму мужчине следует дать четкие инструкции, касающиеся сбора образца эякулята, что позволит минимизировать ошибки преаналитического этапа, связанные со сбором, транспортировкой и хранением образца.

При работе с образцами персоналу следует соблюдать необходимые меры безопасности, подробно описанные в приложении к руководству ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека (WHO, 2010).

МАКРОСКОПИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭЯКУЛЯТА

Первоначальную оценку эякулята проводят после его разжижения. В норме эякулят разжижается в течение 15 мин при комнатной температуре, хотя в некоторых случаях разжижение может занимать до 60 мин. При неразжижении эякулята, которое может затруднить его оценку, применяют механическое разжижение многократным пропусканием образца через шприц с иглой большого диаметра или химическое разжижение - добавление протеолитических ферментов, например бромелайна. В некоторых случаях разжижения образца можно добиться добавлением изотонического раствора натрия хлорида и многократным последующим пипетированием.

После разжижения эякулята можно оценить его вязкость. Вязкость образца оценивают, используя пластиковую пипетку или дозатор с наконечником большого объема. В норме эякулят должен выходить из пипетки небольшими дискретными каплями. Вязкость также можно оценить по длине нити, формирующейся после введения в образец стеклянной палочки. Вязкость считается аномальной, если длина нитей превышает 2 см в длину. Для снижения вязкости используют те же методы, что и для разжижения эякулята.

В норме цвет эякулята серый, серо-белый, слегка опалесцирующий. Цвет эякулята может меняться, например, в присутствии эритроцитов (гемоспер-мия) от розового до красного или в присутствии лейкоцитов (лейкоспермия, пиоспермия) - желто-зеленый.

Характерный запах эякулята приобретает при присоединении к нему секрета предстательной железы, содержащей спермин. Отсутствие характерного запаха указывает на то, что секрета предстательной железы в эякуляте нет. При длительном хранении в обычных условиях в эякуляте развивается микрофлора и появляется гнилостный запах, при гнойно-воспалительных процессах запах изменяется в зависимости от микрофлоры.

Основной объем эякулята составляют секреты семенных пузырьков (50- 60%) и предстательной железы (15-30%). Объем оценивают, используя мерный цилиндр или пробирку, гораздо реже - взвешивание. Причинами снижения объема (олигоспермии) или отсутствия эякулята (аспермии) могут быть обструкция семявыносящих протоков, воспаление предстательной железы, гормональный дисбаланс, ретроградная эякуляция, проблемы сбора спермы. Увеличение объема не является патологическим состоянием, но может указывать на воспалительные процессы придаточных желез. Минимальным референсным значением, согласно 5-му изданию Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, считается 1,5 мл (WHO, 2010).

В норме реакция спермы слабощелочная или щелочная (рН около 7,2). Определяют рН сразу после разжижения спермы с помощью индикаторных полосок с диапазоном значений между 6,0 и 10,0. Снижение рН эякулята при азооспермии указывает на ее обструктивный характер. Как правило, повышение рН образца наблюдается после эякуляции и не является диагностически значимым.

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭЯКУЛЯТА

Микроскопическое исследование эякулята на первом этапе включает оценку следующих характеристик сперматозоидов:

На втором этапе проводят:

При первоначальной микроскопической оценке эякулята могут наблюдаться агрегация и агглютинация сперматозоидов.

Агрегация сперматозоидов представляет собой слипание неподвижных сперматозоидов друг с другом либо подвижных сперматозоидов с нитями слизи, несперматогенными клетками, дебрисом.

В отличие от агрегации, агглютинация представляет собой склеивание подвижных сперматозоидов друг с другом.

Различают степени агглютинации:

Помимо преобладающего типа агглютинации, выраженного степенью, отмечают и область связывания сперматозоидов друг с другом: головка к головке; жгутик к жгутику; кончик жгутика к кончику жгутика; смешанная агглютинация, при которой присутствуют как агглютинаты, в которых сперматозоиды связаны жгутик к жгутику, так и головка к головке. Кроме того, выделяют беспорядочную агглютинацию, при которой головки и жгутики спутаны между собой. Следует отметить, что агглютинация сперматозоидов не всегда связана с иммунологическим бесплодием, однако может указывать на наличие анти-спермальных антител.

Помимо сперматозоидов, в эякуляте могут содержаться и другие клеточные элементы: эпителиальные клетки, а также лейкоциты и незрелые половые клетки. Последние два типа клеток объединяют в один тип - округлые клетки. Оценить их концентрацию можно как на влажных, так и на окрашенных препаратах. Если концентрация округлых клеток выше 1×10⁶ /мл (1 млн/мл), то, согласно рекомендациям ВОЗ, следует провести дополнительные тесты, позволяющие оценить концентрацию лейкоцитов, - например, тесты на перок-сидазную активность или тесты, направленные на поиск маркеров лейкоцитов.

Следует отметить, что, помимо сперматозоидов, клеточных элементов, отличных от сперматозоидов, эякулят содержит и неклеточные элементы. К таким элементам прежде всего относятся желатиновые тельца, амилоидные тельца, лецитиновые зерна и кристаллы Беттхера. Желатиновые тельца являются нормальным компонентом эякулята, не подвергаются разжижению и не имеют клинического значения. Амилоидные тельца представляют собой образования овальной формы с характерным слоистым строением, часто с мелкозернистой центральной частью, и образуются при застое секрета предстательной железы. Присутствие лецитиновых зерен отражает функцию предстательной железы. Охлаждение и высыхание образца эякулята сопровождаются появлением кристаллов Беттхера. Появление этих бесцветных, удлиненной формы кристаллов характерно и для воспаления предстательной железы.

КОНЦЕНТРАЦИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ

«Концентрация» и «общее количество» сперматозоидов не являются синонимами. Концентрация сперматозоидов определяется как количество клеток на единицу объема и выражается как количество сперматозоидов в миллионах на миллилитр эякулята. Для подсчета концентрации сперматозоидов рекомендовано использовать счетные камеры. Существует несколько типов счетных камер: с предварительным разведением эякулята - камера Горяева, гемоцито-метр Нейбауэра и без него - камера Маклера, камера Осипова, одноразовые камеры. Минимальным референсным значением для концентрации сперматозоидов, согласно 5-му изданию Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, принято 15×10⁶ сперматозоидов на миллилитр (15 млн/мл) (WHO, 2010).

Общее количество сперматозоидов в эякуляте представляет собой суммарное число сперматозоидов во всем объеме и вычисляется путем умножения концентрации сперматозоидов на объем эякулята. Минимальным референс-ным значением для общего количества сперматозоидов, согласно 5-му изданию Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, принято 39×10⁶ сперматозоидов в эякуляте (39 млн в эякуляте) (WHO, 2010).

Отмечена вариабельность концентрации и общего количества сперматозоидов в эякуляте у одного и того же пациента при проведении повторных анализов. Вариабельность показателей данных параметров может быть вызвана рядом причин, более того, наблюдается суточная, сезонная, возрастная и этно-географическая вариабельность.

Снижение общего числа или концентрации сперматозоидов определяют как олигозооспермию, при этом общее количество является более важным параметром по сравнению с концентрацией сперматозоидов. Увеличение концентрации сперматозоидов до 200 млн/мл и выше определяют как полизооспермию, оно не является патологическим. В случае когда после повторных оценок сперматозоиды не обнаружены, можно предполагать азооспермию, то есть отсутствие сперматозоидов в эякуляте. При этом термин азооспермия рекомендовано использовать только в случае отсутствия сперматозоидов в осадке после центрифугирования. При обнаружении сперматозоидов в осадке после центрифугирования применяют термин криптозооспермия.

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ

Различают следующие виды движения сперматозоидов:

Подвижность выражается как процентное содержание разных категорий сперматозоидов, различающихся по скорости перемещения. Рекомендована простая система градации подвижности сперматозоидов, согласно которой следует различать сперматозоиды с прогрессивным и непрогрессивным движением и неподвижные сперматозоиды. Подвижность каждого сперматозоида можно оценить следующим образом:

Ранее использовалась оценка подвижности сперматозоидов по следующим категориям:

Общую подвижность определяют суммой прогрессивно- и непрогрессивно-подвижных сперматозоидов. Минимальным референсным значением для общей подвижности (PR+NP), согласно 5-му изданию Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, является 40%, минимальным референсным значением прогрессивной подвижности (PR) - 32% (WHO, 2010). Снижение прогрессивной или общей подвижности обозначают термином астенозооспермия, отсутствие подвижных сперматозоидов - акинозооспермия.

МОРФОЛОГИЯ СПЕРМАТОЗОИДА

Вариабельность морфологических характеристик сперматозоидов затрудняет их оценку. Описание сперматозоидов, полученных из женских половых путей, в частности из цервикальной слизи после полового акта (Fredricsson B., Björk G., 1977; Menkveld R. et al., 1990), а также сперматозоидов, связанных с блестящей оболочкой ооцита (Menkveld R. et al., 1991; Liu D.Y., Baker H.W.G., 1992), помогло определить морфологию нормального сперматозоида, способного к оплодотворению. Строгое соблюдение критериев оценки морфологии позволило установить взаимосвязь между долей морфологически нормальных сперматозоидов и частотой наступления беременности in vivo и in vitro (Men-kveld R. et al., 1990, 1991; Van Waart J. et al., 2001; Garrett C. et al., 2003; Liu D.Y. et al., 2003). С учетом критериев оценки морфологии сперматозоидов, предложенных в 5-м издании Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека (WHO, 2010), в основу которых положена морфология способных к оплодотворению сперматозоидов из эндоцервикальной слизи, было показано, что диапазон варьирования морфологически нормальных сперматозоидов как у фертильных, так и у мужчин с нарушением фертильности составляет от 0 до 30%, при этом лишь в незначительном числе образцов доля морфологически нормальных сперматозоидов выше 25% (Menkveld R. et al., 1990, 1991).

Сперматозоид состоит из головки, шейки, средней части, основной и концевой частей хвоста (жгутика). Согласно критериям ВОЗ головка нормального сперматозоида должна быть овальной формы, гладкой, с четким контуром и иметь длину 4,0-5,5 мкм, ширину 2,5-3,5 мкм, отношение длины к ширине 1,5-1,75. Головка должна иметь четко выраженную акросомную область, занимающую 40-70% объема головки. Акросома не должна содержать большие и более двух маленьких вакуолей, которые занимают не более 20% объема головки. Постакросомная область должна иметь четкую ровную границу с акросомой, без вакуолей. Форма головки считается более важной характеристикой, нежели ее размеры, если они не чрезмерно аномальны. Средняя часть морфологически нормального сперматозоида должна быть тонкой, около 0,5-0,7 мкм в ширину и около 4,0 мкм в длину, четко выраженной, главная ось средней части должна совпадать с центральной осью головки. Допустимо наличие цитоплаз-матической капли в случае, если она не превышает трети размера головки сперматозоида. Основная часть жгутика должна иметь одинаковый диаметр по всей длине, быть тоньше шейки и составлять около 45 мкм в длину, что примерно в 10 раз больше длины головки, с отсутствием острых углов, указывающих на поломку хвоста. Сперматозоиды, соответствующие перечисленным критериям, считают морфологически нормальными, все остальные - аномальными.

Выделяют следующие категории дефектов:

Дефекты головки включают изменение ее размеров - большая и маленькая, а также формы - грушевидная, аморфная, вакуолизированная, удлиненная, круглая, с акросомой малого размера или крупной, с вакуолями в постакро-сомной области; также встречаются сперматозоиды с двойными головками и любыми комбинациями вышеперечисленных дефектов.

Под дефектами шейки и средней части подразумевают асимметричное прикрепление средней части к головке, утолщение, истончение, нерегулярное строение, сгибание и любые комбинации вышеперечисленных дефектов.

Уменьшение длины хвоста, изломы, шпильки, скрученность, множественность, нарушение ширины и регулярного строения, а также любые комбинации перечисленных дефектов относят к дефектам основной части хвоста.

Сперматозоид с избыточной резидуальной цитоплазмой размером более трети размера головки сперматозоида в сочетании с аномалиями средней части классифицируют как аномальный. Следует отличать избыточную резидуальную цитоплазму от цитоплазматической капли. Присутствие цитоплазматической капли считается нормальным для сперматозоида, при этом цитоплазматические капли осмотически чувствительны, что приводит к их повреждению в процессе высушивания при приготовлении препаратов из эякулята. Наблюдать цито-плазматические капли можно с помощью фазово-контрастного микроскопа, на окрашенных препаратах их эякулята цитоплазматические капли выглядят как небольшие расширения в средней части. Следует отметить, что зачастую морфологические дефекты сочетанны, в таком случае приоритет имею дефекты головки, затем средней части и хвоста.

В образце эякулята могут встречаться и особые дефекты сперматозоидов, которые также следует учитывать. Например, ацефалические формы, то есть с отсутствием головки или головки с отсутствием жгутика, а также сперматозоиды с головками без акросомы - глобозооспермия.

Анализ морфологии сперматозоидов является наиболее субъективным, при этом коэффициент внутри- и межлабораторных вариаций может достигать 50%, что, вероятнее всего, связано с использованием различных техник приготовления, фиксации и окрашивания препаратов, использования различных систем классификации, а также различного уровня подготовки персонала.

Попытки классифицировать сперматозоиды согласно их морфологии предпринимались с начала XX в.

Классификации ВОЗ 1980 и 1987 гг. описывали некоторые типы аномалий головок, средней части и хвоста.

В 1986-1990 гг. были предложены «строгие тайгербергские критерии», основанные на морфологии посткоитальных сперматозоидов, выявляемых на уровне внутреннего зева матки. Для сперматозоидов, прошедших цервикальную слизь, характерны лучшая морфология и оплодотворяющая способность по сравнению с нативным образцом. Суть строгих критериев заключалась в том, что авторы описали параметры морфологически нормального сперматозоида, а все пограничные формы и формы с нерезко выраженной патологией предложили отнести к патологическим, при этом пороговым значением морфологически нормальных форм считалось 14% (Kruger T.F. et al., 1986).

В 3-м издании ВОЗ 1992 г. для классификации сперматозоидов по морфологии использовались строгие критерии, однако минимальное референсное значение было основано на эмпирических данных и составляло 30%.

В 4-м издании ВОЗ 1999 г. строгие критерии рекомендовалось рассматривать как международный стандарт оценки морфологии сперматозоидов, при этом в связи с незавершенностью мультицентровых исследований минимальное референсное значение установлено не было. Минимальным референсным значением морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте, согласно 5-му изданию Руководства ВОЗ, считается 4% (WHO, 2010).

Часто морфологически аномальные сперматозоиды имеют множественные дефекты головки, средней части, хвоста или комбинацию перечисленных дефектов.

Для подсчета множественных дефектов сперматозоидов используют три индекса:

Индекс множественных аномалий выражает среднее число дефектов на число аномальных сперматозоидов. В таком случае учитывают все аномалии головки, средней части и хвоста. Морфологическим критерием оценки сперматозоидов служит критерий, предложенный в 1975 г. (David G. et al., 1975) и модифицированный в 2000 г. (Auger J. et al., 2000).

Индекс тератозооспермии сходен с индексом множественных аномалий, однако в данном случае рассчитывают лишь четыре дефекта на аномальный сперматозоид: один на головку, один на среднюю часть, один на жгутик и один для оценки резидуальной цитоплазмы, каким бы ни было действительное количество дефектов на один сперматозоид.

Индекс деформированности сперматозоидов рассчитывают по числу дефектов на общее число сперматозоидов. Учитывают несколько аномалий головки, одну аномалию средней части и одну - хвоста.

При подсчете последних двух индексов морфологическими критериями оценки сперматозоидов служат критерии, описанные в 5-м издании Руководства ВОЗ (WHO, 2010).

ОЦЕНКА ЛЕЙКОЦИТОВ В ОБРАЗЦЕ ЭЯКУЛЯТА

Лейкоциты, преимущественно полиморфноядерные лейкоциты, нейтрофилы, присутствуют в большинстве образцов эякулята человека.

Лейкоциты подсчитывают после гистохимической процедуры окрашивания, позволяющей идентифицировать фермент пероксидазу, который характеризует гранулоциты.

В настоящее время минимальное референсное значение для пероксидаза-положительных клеток в эякуляте фертильных мужчин отсутствует.

В качестве пороговой величины остается значение 1,0×10⁶ пероксидаза-положительных клеток на 1 мл эякулята. Число пероксидаза-положительных клеток у фертильных мужчин может варьировать от 0,5×10⁶ до 1×10⁶ полиморфноядерных лейкоцитов на миллилитр либо от 1×10⁶ до 2×10⁶ общего числа лейкоцитов на миллилитр.

Чрезмерное количество лейкоцитов в эякуляте (лейкоцитоспермия, пиоспермия) может быть связано с инфекцией, а общее число пероксидаза-положи-тельных клеток может отражать тяжесть воспалительного заболевания. Кроме того, считается, что лейкоциты могут вызывать снижение подвижности сперматозоидов, а также повреждение их ДНК вследствие окислительного стресса.

ОЦЕНКА НЕЗРЕЛЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК В ЭЯКУЛЯТЕ

Незрелые половые клетки в эякуляте представлены округлыми сперматидами и сперматоцитами, реже - сперматогониями. Незрелые половые клетки можно идентифицировать на окрашенных препаратах эякулята, однако достаточно часто их сложно отличить от дегенерирующих клеток.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИСПЕРМАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Антиспермальные антитела в эякуляте представлены иммуноглобулинами двух классов: IgA и IgG.

Иммуноглобулины класса M вследствие большого размера редко встречаются в эякуляте. Показано, что IgA имеют более важное клиническое значение, чем IgM, однако антитела обоих классов можно выявить как на сперматозоидах, так и в биологических жидкостях с помощью прямых и непрямых тестов соответственно.

Прямые тесты включают:

В отличие от смешанной антиглобулиновой реакции, которую выполняют на нативных образцах, тест с иммунными шариками используют для обработанных образцов. Тесты определяют отношение подвижных сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами, к общему количеству подвижных сперматозоидов. Антисыворотка связывает антитела на поверхности подвижных сперматозоидов и образует комплексы, которые можно наблюдать в микроскоп. Результаты обоих тестов хорошо согласуются друг с другом.

Непрямые тесты позволяют оценить присутствие антител в биологических жидкостях, таких как цервикальная слизь, семенная плазма, сыворотка крови. В этих тестах биологическая жидкость инкубируется с отмытыми от семенной плазмы сперматозоидами донора. При этом все антиспермальные антитела тестируемой жидкости будут связываться с донорскими сперматозоидами, которые затем оценивают прямыми тестами.

Наличие антител может препятствовать связыванию сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита и акросомной реакции, однако присутствия антител недостаточно для диагноза аутоиммунного заболевания, необходимо показать, что антитела серьезно повреждают функцию сперматозоидов, например, с помощью теста на пенетрацию сперматозоидами цервикальной слизи.

В 5-м издании Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека пороговое значение составляет 50% подвижных сперматозоидов, несущих антитела (WHO, 2010). Показано, что такие показатели, как прохождение цервикальной слизи и оплодотворение in vitro, снижаются, когда более чем 50% подвижных сперматозоидов имеют антитела на своей поверхности. Отмечено, что диагноз «иммунологическое бесплодие» ставят, когда более 50% подвижных сперматозоидов несут на своей поверхности антитела. При этом показано, что частицы, соединенные с кончиком хвоста сперматозоида, не связаны с нарушением фертильности и могут присутствовать и у фертильных мужчин.

ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ

Для оценки жизнеспособности проводят подсчет живых сперматозоидов с интактной мембраной. В том случае, когда доля неподвижных сперматозоидов превышает 40%, определение жизнеспособности сперматозоидов становится клинически важным. Оценка жизнеспособности позволяет дифференцировать некрозооспермию от акинозооспермии, обусловленной патологией жгутикового аппарата.

Жизнеспособность сперматозоидов можно оценить с помощью специальных красителей, при этом интактная мембрана живого сперматозоида не будет пропускать краситель в клетку, в отличие от мембраны мертвого сперматозоида. К таким красителям относятся эозин, эозин-нигрозин, трипановый синий. Оценить жизнеспособность клеток после окрашивания перечисленными красителями можно с помощью светового микроскопа. Для флюоресцентной микроскопии применяют флюоресцентные красители, например Хехст (Hoechst 33258).

Другим методом оценки жизнеспособности сперматозоидов является тест гипоосмотического набухания. Данный метод основан на способности живых клеток компенсировать недостаток воды в клетке вследствие разницы осмотического давления внутри и вне клетки. Таким образом, живые сперматозоиды всасывают внеклеточную воду, что приводит к закручиванию хвоста. Хвосты мертвых сперматозоидов остаются без изменений вследствие нарушения целостности их мембран и неспособности к осморегуляции. В результате гипо-осмотического теста сперматозоиды остаются пригодными для внутрицито-плазматической инъекции в ооцит. Минимальным референсным значением при оценке жизнеспособности сперматозоидов, согласно 5-му изданию Руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, принято 58% (WHO, 2010).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Auger J., Eustache F., David G. Standardisation de la classification morphologique des spermatozoides humains selon la mеthode de David modifieе // Andrologia. 2000. Vol. 10, N 4. P. 358-373.

David G., Bisson J.P., Czyglik F., Jouannet P., Gernigon C. Anomalies morphologiques du spermatozoïde humain. I. Propositions pour un système de classification // J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. (Paris). 1975. Vol. 4, suppl. l. P. 17-36.

Fredricsson B., Bjork G. Morphology of postcoital spermatozoa in the cervical secretion and its clinical significance // Fertil. Steril. 1977. Vol. 28. P. 841-845.

Garrett C., Liu D.Y., Clarke G.N., Rushford D.D., Baker H.W. Automated semen analysis: «zona pellucida preferred» sperm morphometry and straight-line velocity are related to pregnancy rate in subfertile couples // Hum. Reprod. 2003. Vol. 18. P. 1643-1649.

Kruger T.F., Menkveld R., Stander F.S.H., Lombard C.J., Van der Merwe J.P., van Jyl J.A. et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in-vitro fertilization // Fertil. Steril. 1986. Vol. 46. P. 1118-1123.

Liu D.Y., Baker H.W.G. Morphology of spermatozoa bound to the zona pellucida of human oocytes that failed to fertilize in vitro // J. Reprod. Fertil. 1992. Vol. 94. P. 71-84.

Liu D.Y., Garrett C., Baker H.W.G. Low proportions of sperm can bind to the zona pellucida of human oocytes // Hum. Reprod. 2003. Vol. 18. P. 2382-2389.

Menkveld R., Franken D.R., Kruger T.F., Oehninger S., Hodgen G.D. Sperm selection capacity of the human zona pellucida // Mol. Reprod. Dev. 1991. Vol. 30. P. 346-352.

Menkveld R., Stander F.S.H., Kotze T.J.W., Kruger T.F., van Zyl J.A. The evaluation of morphological characteristics of human spermatozoa according to stricter criteria // Hum. Reprod. 1990. Vol. 5. P. 586-592.

Van Waart J., Kruger T.F., Lombard C., Ombelet W. Predictive value of normal sperm morphology in intrauterine insemination (IUI): a structured literature review // Hum. Reprod. Update. 2001. Vol. 7. P. 495-500.

WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5^th ed. World Health Organization Press, 2010. 287 p.

Определение причины нарушения репродуктивной функции у мужчины основывается на комплексном обследовании с применением клинического и лабораторного исследований. Основные нарушения связаны с выработкой эякулята, снижением подвижности или функционированием сперматозоидов. Однако ни один из этих параметров эякулята не отражает качество генома мужской половой клетки. Одной из дискутируемых тем современной репродуктивной медицины является фрагментация ДНК сперматозоидов. Под фрагментацией ДНК подразумевается возникновение одно- и двуцепочечных разрывов в молекуле ДНК.

Очевидно, что нормальное эмбриональное развитие напрямую зависит от сохранности генома сперматозоида, оплодотворившего яйцеклетку (Simon L. et al., 2014). В ходе созревания сперматозоид теряет большую часть цитоплазмы, что делает его ядро более уязвимым для внешних факторов. Кроме того, в зрелом сперматозоиде не происходят процессы репарации. Чтобы защитить ДНК сперматозоида во время его прохождения из мужского репродуктивного тракта в женский, ДНК мужских гамет упаковывается отличным от соматических клеток образом: большая часть гистонов заменяется на маленькие положительно заряженные белки - протамины, архитектура хроматина состоит из тороидальных структур (рис. 8-1).

Дополнительно спермиоплазма содержит высокие концентрации антиоксидантов, которые минимизируют воздействие свободных радикалов на сперматозоиды (Koca Y. et al., 2003). Несмотря на такие превентивные механизмы, при аномальном повышении активных форм кислорода, которые в норме необходимы для пролиферации, дифференциации и функционирования мужских гамет, могут возникать повреждения в ДНК (Evenson D.P. et al., 2002). Важно также отметить, что гибель половых клеток в сперматогенезе осуществляется путем апоптоза и является нормальным постоянным процессом, имеющим физиологическое значение: ограничение сверхпролиферации сперматозоидов, а также селективная гибель аномальных гамет, в связи с этим разрывы ДНК могут быть следствием незавершенного апоптоза. Не стоит также исключать такие повреждающие факторы, как воздействие тепла, радиации, лекарственных препаратов и др. (рис. 8-2) (Agarwal A., Allamaneni S.S.R., 2005; Aitken R.J. et al., 2005).

За последние 30 лет был разработан ряд анализов для количественной оценки доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Среди них методы, позволяющие детектировать разрывы напрямую: Terminal deoxynucleotidyl trans-ferasemediated dUDP nick-end labelling (TUNEL) assay (рис. 8-3, см. цв. вклейку) (флюоресцентное мечение одно- и двунитевых разрывов ДНК), in situ nick translation assay (ник-трансляция in situ), Single cell gel electrophoresis assay (так называемый Comet assay; гель-электрофорез единичных клеток, метод ДНК-комет) и непрямые методы: Sperm chromatin structure assay (SCSA; исследование структуры хроматина сперматозоида) и Sperm chromatin dispersion (SCD; исследование дисперсии хроматина сперматозоида, так называемый Halo test). Данные методы также отличаются по сложности выполнения анализа, цене и типам детектируемых разрывов.

Вопрос о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и качество эмбрионов при использовании ВРТ остается спорным и является одной из наиболее часто обсуждаемых тем репродуктивной медицины.

Согласно данным некоторых исследователей, повреждение ДНК сперматозоидов влияет на ранние этапы эмбрионального развития, в особенности на формирование бластоцисты, что определяет частоту наступления беременности в циклах ЭКО/ICSI (Seli E., 2005; Simon L. et al., 2011; Dada R. et al., 2011).

Многие сходятся во мнении, что фрагментация ДНК сперматозоидов не снижает эффективности оплодотворения (Sanchez-Martin P. et al., 2013; Tom-linson M.J. et al., 2001; Henkel R. et al., 2004; Velez de la Calle J.F. et al., 2008). В то время как другие, напротив, считают, что при повышении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов эффективность оплодотворения снижается (Host E. et al., 2000; Huang C.-C. et al., 2005). Кроме того, нет единого мнения и о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на развитие эмбрионов. Некоторые исследователи полагают, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов качество эмбрионов, культивируемых in vitro, снижается (Zheng W.W. et al., 2018; Pregl Breznik B. et al., 2013; Gandini L. et al., 2004; Seli E. et al., 2004; Velez de la Calle J.F. et al., 2008). Однако существует и альтернативное мнение по данному вопросу (Zeyad A. et al., 2018; Bakos H.W. et al., 2008; Henkel R. et al., 2004). Вместе с тем существует точка зрения об отсутствии каких-либо ассоциаций между фрагментацией ДНК сперматозоидов и эффективностью оплодотворения или эмбриональным развитием, но предполагается связь с наступлением (Bungum M. et al., 2007; Frydman N. et al., 2008) или потерей беременности (Lin M.-H. et al., 2008). Более того, в некоторых исследованиях не обнаружено никаких побочных эффектов фрагментации ДНК сперматозоидов как при ЭКО, так и при ICSI (Gandini L. et al., 2004; Esberrt M. et al., 2011). М. Esbert и соавт. также не обнаружили влияния фрагментации ДНК на исход программ ВРТ как при использовании ооцитов от пациентов из бесплодных супружеских пар, так и от доноров ооцитов (Esberrt M. et al., 2011).

Некоторые факторы, такие как различные методы детекции повреждений ДНК сперматозоидов, отсутствие стандартизированных методик и разнообразие критериев включения пациентов в группы исследования, приводят к противоречию результатов.

Так, например, пороговый уровень доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК, который позволяет оценить влияние на развитие эмбрионов, сильно варьирует среди лабораторий - от 10 до 35% (Payne J.F. et al., 2005; Duran E.H. et al., 2002; Saleh R.A. et al., 2003; Benchaib M. et al., 2007; Greco E. et al., 2005; Tomlinson M.J. et al., 2001; Henkel R. et al., 2004).

В метаанализе, представленном Коллинзом и соавт. (Collins J.A. et al., 2008), показана ассоциация между фрагментацией ДНК сперматозоидов и результатами циклов ЭКО/ICSI, однако эта связь не обладает достаточной силой, чтобы обеспечить клиническую значимость для повсеместных исследований повреждения ДНК сперматозоидов при оценке бесплодия у мужчин (Zini A., Sigman M., 2009). Однако более поздние метаанализы поддерживают идею введения анализа уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в рутинную клиническую практику (Simon M. et al., 2017). В метаанализе M. Simon и соавт. показано, что фрагментация ДНК сперматозоидов является хорошим предиктором неудач при ВМИ и ассоциирована с беременностями после ЭКО и в меньшей степени после ICSI. Кроме того, фрагментация ДНК сперматозоидов негативно коррелирует с развитием эмбрионов, импланатацией и позитивно - с потерями беременностей. На основе этих данных становится очевидно, что фрагментация ДНК сперматозоидов связана с мужским бесплодием, однако анализ этой связи требует дополнительных исследований.

Несмотря на то что данные о влиянии фрагментации ДНК в сперматозоидах на результаты программ ВРТ остаются спорными, в литературе существует большое количество работ о способах снижения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. К ним относятся: антиоксидантная терапия (Greco E. et al., 2005; Tremellen K. et al., 2007; Zini A. et al., 2009), аспирация сперматозоидов из яичек (TESE) (Imamovic K.S., Pinter B., 2014; Hosen M.B. et al., 2015), короткое время воздержания (Sanchez-Martin P. et al., 2013), а также в качестве преодоления высокого уровня фрагментации ДНК в рамках ВРТ предлагают использование дополнительных методов селекции сперматозоидов (Kim G.Y., 2018).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Agarwal A., Allamaneni S.S.R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come // Fertil. Steril. 2005. Vol. 84, N 4. P. 850-853. URL: https://doi.org/10.1016/ j.fertnstert.2005.03.080.

Agarwal A., Virk G., Ong C., du Plessis S.S. Effect of oxidative stress on male reproduction // World J. Mens Health. 2014. Vol. 32, N 1. P. 1 - 17. URL: https://doi. org/10.5534/wjmh.2014.32.1.1.

Aitken R.J., Bennetts L.E., Sawyer D., Wiklendt A.M., King B.V. Impact of radio frequency electromagnetic radiation on DNA integrity in the male germline // Int. J. Androl. 2005. Vol. 28, N 3. P. 171-179. URL: https://doi.org/10.1111/j.1365-2605.2005.00531.x.

Bakos H.W., Thompson J.G., Feil D., Lane M. Sperm DNA damage is associated with assisted reproductive technology pregnancy // Int. J. Androl. 2008. Vol. 31, N 5. P. 518- 526. URL: https://doi.org/10.1111/j.1365-2605.2007.00803.x.

Benchaib M., Braun V., Ressnikof D., Lornage J., Durand P., Niveleau A. et al. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 3. P. 768-773. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/deh684.

Benchaib M., Lornage J., Mazoyer C., Lejeune H., Salle B., Francois Guerin J. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as a prognostic indicator of assisted reproductive technology outcome // Fertil. Steril. 2007. Vol. 87, N 1. P. 93-100. URL: https://doi. org/10.1016/j.fertnstert.2006.05.057.

Braude P., Bolton V., Moore S. Human gene expression first occurs between the four-and eight-cell stages of preimplantation development // Nature. 1988. Vol. 332, N 6163. P. 459-461. URL: https://doi.org/10.1038/332459a0.

Bungum M., Humaidan P., Axmon A., Spano M., Bungum L., Erenpreiss J. et al. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome // Hum. Reprod. 2007. Vol. 22, N 1. P. 174-179. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/del326.

Collins J.A., Barnhart K.T., Schlegel P.N. Do sperm DNA integrity tests predict pregnancy with in vitro fertilization? // Fertil. Steril. 2008. Vol. 89, N 4. P. 823-831. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2007.04.055.

Dada R., Mahfouz R.Z., Kumar R., Venkatesh S., Shamsi M.B., Agarwal A. et al. A comprehensive work up for an asthenozoospermic man with repeated intracytoplasmic sperm injection (ICSI) failure // Andrologia. 2011. Vol. 43, N 5. P. 368-372. URL: https:// doi.org/10.1111/j.1439-0272.2010.01045.x.

Duran E.H., Morshedi M., Taylor S., Oehninger S. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study // Hum. Reprod. 2002. Vol. 17, N 12. P. 3122-3128. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12456611.

Esbert M., Pacheco A., Vidal F., Florensa M., Riqueros M., Ballesteros A. et al. Impact of sperm DNA fragmentation on the outcome of IVF with own or donated oocytes // Reprod. Biomed. Online. 2011. Vol. 23, N 6. P. 704-710. URL: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2011.07.010.

Evenson D.P., Larson K.L., Jost L.K. Sperm chromatin structure assay: its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparisons with other techniques // J. Androl. 2002. Vol. 23, N 1. P. 25-43. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11780920.

Frydman N., Prisant N., Hesters L., Frydman R., Tachdjian G., Cohen-Bacrie P. et al. Adequate ovarian follicular status does not prevent the decrease in pregnancy rates associated with high sperm DNA fragmentation // Fertil. Steril. 2008. Vol. 89, N 1. P. 92-97. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2007.02.022.

Gandini L., Lombardo F., Paoli D., Caruso F., Eleuteri P., Leter G. et al. Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatin damage // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19, N 6. P. 1409-1417. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/deh233.

Ghaleno L.R., Valojerdi M.R., Hassani F., Chehrazi M., Janzamin E. High level of intracellular sperm oxidative stress negatively influences embryo pronuclear formation after intracytoplasmic sperm injection treatment // Andrologia. 2014. Vol. 46, N 10. P. 11181127. URL: https://doi.org/10.1111/and.12202.

Gharagozloo P., Aitken R.J. The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26, N 7. P. 1628-1640. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/der132.

Greco E., Iacobelli M., Rienzi L., Ubaldi F., Ferrero S., Tesarik J. Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment // J. Androl. 2005. Vol. 26, N 3. P. 349-353. URL: https://doi.org/10.2164/jandrol.04146.

Greco E., Romano S., Iacobelli M., Ferrero S., Baroni E., Minasi M.G. et al. ICSI in cases of sperm DNA damage: beneficial effect of oral antioxidant treatment // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 9. P. 2590-2594. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/dei091.

Henkel R., Hajimohammad M., Stalf T., Hoogendijk C., Mehnert C., Menkveld R. et al. Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy // Fertil. Steril. 2004. Vol. 81, N 4. P. 965-972. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2003.09.044.

Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M., Stalf T., Hoogendijk C., Mehnert C. et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology // Reprod. Biomed. Online. 2003. Vol. 7, N 4. P. 477-484. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pub-med/14656411.

Hosen M.B., Islam M.R., Begum F., Kabir Y., Howlader M.Z.H. Oxidative stress induced sperm DNA damage, a possible reason for male infertility // Iran. J. Reprod. Med. 2015. Vol. 13, N 9. P. 525-532. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26568756.

Host E., Lindenberg S., Smidt-Jensen S. The role of DNA strand breaks in human spermatozoa used for IVF and ICSI // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2000. Vol. 79, N 7. P. 559-563. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10929955.

Huang C.-C., Lin D.P.-C., Tsao H.-M., Cheng T.-C., Liu C.-H., Lee M.-S. Sperm DNA fragmentation negatively correlates with velocity and fertilization rates but might not affect pregnancy rates // Fertil. Steril. 2005. Vol. 84, N 1. P. 130-140. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2004.08.042.

Imamovic K.S., Pinter B. Review of clinical trials on effects of oral antioxidants on basic semen and other parameters in idiopathic oligoasthenoteratozoospermia // Biomed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. Article ID 426951. URL: https://doi.org/10.1155/2014/426951.

Kim G.Y. What should be done for men with sperm DNA fragmentation? // Clin. Exp. Reprod. Med. 2018. Vol. 45. P. 101-109. URL: https://doi.org/10.5653/cerm.2018.45.3.101.

Koca Y., Özdal Ö., Çelik M., Ünal S., Balaban N. Antioxidant activity of seminal plasma in fertile and infertile men // Arch. Androl. 2003. Vol. 49, N 5. P. 355-359. URL: https:// doi.org/10.1080/713828214.

Lin M.-H., Kuo-Kuang Lee R., Li S.-H., Lu C.-H., Sun F.-J., Hwu Y.-M. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 2. P. 352-359. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2007.06.018.

Liu W.-M., Pang R.T.K., Chiu P.C.N., Wong B.P.C., Lao K., Lee K.-F. et al. Sperm-borne microRNA-34c is required for the first cleavage division in mouse // Proc. Natl Acad. Sc. USA. 2012. Vol. 109, N 2. P. 490-494. URL: https://doi.org/10.1073/pnas.1110368109.

Ménézo Y., Dale B., Cohen M. DNA damage and repair in human oocytes and embryos: a review // Zygote. 2010. Vol. 18, N 4. P. 357-365. URL: https://doi.org/10.1017/ S0967199410000286.

Payne J.F., Raburn D.J., Couchman G.M., Price T.M., Jamison M.G., Walmer D.K. Redefining the relationship between sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay and outcomes of assisted reproductive techniques // Fertil. Steril. 2005. Vol. 84, N 2. P. 356-364. URL: https://doi.org/10.1016/ j.fertnstert.2005.02.032.

Pregl Breznik B., Kovačič B., Vlaisavljević V. Are sperm DNA fragmentation, hyperactivation, and hyaluronan-binding ability predictive for fertilization and embryo development in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection? // Fertil. Steril. 2013. Vol. 99, N 5. P. 1233-1241. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.11.048.

Saleh R.A., Agarwal A., Nada E.A., El-Tonsy M.H., Sharma R.K., Meyer A. et al. Negative effects of increased sperm DNA damage in relation to seminal oxidative stress in men with idiopathic and male factor infertility // Fertil. Steril. 2003. Vol. 79, suppl. 3. P. 1597-1605. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12801566.

Sanchez-Martin P., Sanchez-Martin F., Gonzalez-Martinez M., Gosálvez J. Increased pregnancy after reduced male abstinence // Syst. Biol. Reprod. Med. 2013. Vol. 59, N 5. P. 256-260. URL: https://doi.org/10.3109/19396368.2013.790919.

Schattman G.L., Esteves S., Agarwal A. Pathophysiology, Evaluation and Treatment. In Unexplained Infertility. 2015. URL: http://www.springer.com/us/book/9781493921393.

Seli E. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART // Hum. Reprod. Update. 2005. Vol. 11, N 4. P. 337-349. URL: https://doi.org/10.1093/humupd/dmi011.

Seli E., Gardner D.K., Schoolcraft W.B., Moffatt O., Sakkas D. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization // Fertil. Steril. 2004. Vol. 82, N 2. P. 378-383. URL: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2003.12.039.

Simon L., Castillo J., Oliva R., Lewis S.E.M. Relationships between human sperm protamines, DNA damage and assisted reproduction outcomes // Reprod. Biomed. Online. 2011. Vol. 23, N 6. P. 724-734. URL: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2011.08.010.

Simon L., Murphy K., Shamsi M.B., Liu L., Emery B., Aston K.I. et al. Paternal influence of sperm DNA integrity on early embryonic development // Hum. Reprod. 2014. Vol. 29, N 11. P. 2402-2412. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/deu228.

Simon L., Zini A., Dyachenko A., Ciampi A., Carrell D.T. A systematic review and meta-analysis to determine the effect of sperm DNA damage on in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection outcome // Asian J. Androl. 2017. Vol. 19, N 1. P. 80-90. URL: https://doi.org/10.4103/1008-682X.182822.

Tesarik J., Greco E., Mendoza C. Late, but not early, paternal effect on human embryo development is related to sperm DNA fragmentation // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19, N 3. P. 611-615. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/deh127.

Tomlinson M.J., Moffatt O., Manicardi G.C., Bizzaro D., Afnan M., Sakkas D. Interrelationships between seminal parameters and sperm nuclear DNA damage before and after density gradient centrifugation: implications for assisted conception // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16, N 10. P. 2160-2165. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11574509.

Tremellen K., Miari G., Froiland D., Thompson J. A randomised control trial examining the effect of an antioxidant (Menevit) on pregnancy outcome during IVF-ICSI treatment // Aust. N. Z. J. Obstet. Gynaecol. 2007. Vol. 47, N 3. P. 216-221. URL: https://doi.org/10.1111/j.1479-828X.2007.00723.x.

Treulen F., Uribe P., Boguen R., Villegas J. V. Mitochondrial permeability transition increases reactive oxygen species production and induces DNA fragmentation in human spermatozoa // Hum. Reprod. 2015. Vol. 30, N 4. P. 767-776. URL: https://doi.org/10.1093/humrep/dev015.

Velez de la Calle J.F., Muller A., Walschaerts M., Clavere J.L., Jimenez C., Wittemer C. et al. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as assessed by the sperm chromatin dispersion test in assisted reproductive technology programs: results of a large prospective multicenter study // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 5. P. 1792-1799. URL:https://doi. org/10.1016/j.fertnstert.2007.09.021.

Wright C., Milne S., Leeson H. Sperm DNA damage caused by oxidative stress: modifiable clinical, lifestyle and nutritional factors in male infertility // Reprod. Biomed. Online. 2014. Vol. 28, N 6. P. 684-703. URL: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2014.02.004.

Zeyad A., Hamad M., Amor H., Hammadeh M.E. Relationships between bacteriospermia, DNA integrity, nuclear protamine alteration, sperm quality and ICSI outcome // Reprod. Biol. 2018. Vol. 18, N 1. P. 115-121. URL: https://doi.org/10.1016/j.repbio.2018.01.010.

Zheng W.W., Song G., Wang Q.L., Liu S.W., Zhu X.L., Deng S.M. et al. Sperm DNA damage has a negative effect on early embryonic development following in vitro fertilization // Asian J. Androl. 2018. Vol. 20, N 1. P. 75-79. URL: https://doi.org/10.4103/aja.aja_19_17.

Zini A., San Gabriel M., Baazeem A. Antioxidants and sperm DNA damage: a clinical perspective // J. Assist. Reprod. Genet. 2009. Vol. 26, N 8. P. 427-432. URL: https://doi.org/10.1007/s10815-009-9343-5.

Zini A., Sigman M. Are tests of sperm DNA damage clinically useful? Pros and cons // J. Androl. 2009. Vol. 30, N 3. P. 219-229. URL: https://doi.org/10.2164/jandrol.108.006908.

Стимуляция яичников является фармакологической технологией, которая обеспечивает получение определенного количества ооцитов и, следовательно, эмбрионов в одном лечебном цикле.

Основными принципами стимуляции яичников являются:

Под безопасностью протокола подразумевается профилактика синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) и других осложнений.

Основным критерием эффективности протокола ЭКО является частота родов здоровым доношенным ребенком (так называемый показатель take home baby).

Пациентоориентированность лечения определяется длительностью стимуляции, количеством инъекций, болезненностью процедур, количеством визитов к врачу, а также стоимостью лечения. Указанные факторы могут существенно влиять на приверженность пациентов лечению бесплодия методом ЭКО.

Все перечисленные обстоятельства делают актуальным разработку персонифицированного подхода к протоколу ЭКО, в том числе стимуляции яичников. Идея подобного подхода к лечению не нова. Еще великий русский хирург Н.И. Пирогов в 1881 г. писал: «Современная наука нашла как будто более надежное средство против предубеждений в практической медицине - это медицинская статистика, основанная на цифре. И совести хирурга как будто сделалось легче решать без предубеждений. В конце концов, не трудно убедиться, что и эта, по-видимому, такая верная цифра только тогда будет иметь важное практическое значение, когда ей на помощь явится индивидуализирование - новая, еще непочатая отрасль знания».

Основой персонифицированного подхода к стимуляции яичников является выполнение следующих базовых правил:

Варианты протоколов стимуляции яичников. Выделяют следующие варианты стимуляции яичников в протоколах ЭКО:

Эффективность модифицированного естественного цикла и умеренной стимуляции является более низкой по сравнению со стандартным ЭКО. Данные протоколы в настоящее время используют при наличии особой клинической ситуации (низкого овариального резерва, нежелания пациентки применять стандартный протокол и др.).

Оценить риски развития избыточного ответа яичников и СГЯ необходимо уже на этапе подготовки к протоколу ЭКО. Группу риска составляют пациенты c:

Нужно сразу отметить тот факт, что протоколы стимуляции яичников имеют высокую степень стандартизации, а поэтому низкий риск нарушения ее проведения. Действительно, в большинстве случаев ответ яичников на введение гонадотропинов является прогнозируемым. Прогноз формируется уже на этапе обследования и подготовки к протоколу ЭКО. Основные его факторы хорошо известны: количество антральных фолликулов (КАФ) в яичниках и концентрация в крови антимюллерова гормона (АМГ).

КАФ определяется при трансвагинальном ультразвуковом сканировании на 2-3-й день менструального цикла. Это методически более оправданно, поскольку в данный период визуализации не мешает ни растущий доминантный фолликул, ни желтое тело. При этом осуществляют подсчет количества полостных (антральных) фолликулов диаметром 2-10 мм в обоих яичниках. У женщин репродуктивного возраста КАФ находится в пределах от 8 до 16. Наиболее высокое предиктивное значение в плане наступления беременности имеет количество фолликулов, диаметр которых не превышает 4 мм (Аta B. et al., 2012). КАФ, диаметр которых достигает 10 мм, несколько варьирует от цикла к циклу. Минимальная вариабельность от цикла к циклу КАФ имеет место при оценке фолликулов диаметром менее 6 мм (Deb S. et al., 2013). Конечно, оценка КАФ имеет определенную долю субъективизма. Она зависит от опыта исследователя, разрешающей способности ультразвукового прибора, а также индивидуальных условий визуализации (расположение яичников, наличие спаек в полости малого таза и др.). Неправильная форма фолликулов также снижает точность измерений. Вероятность погрешности в подсчете КАФ выше у пациенток, имеющих мультифолликулярные яичники (Аta B. et al., 2011).

Использование трехмерного ультразвукового изображения (3D-режим) для оценки КАФ еще не получило широкого распространения. Имеются отдельные работы по оценке этой технологии при осуществлении УЗ-мониторинга стимуляции яичников, в том числе с автоматическим анализом полученного изображения (SonoAVC-Sonography-based Automated Volume Count). В этом случае каждый фолликул кодируют отдельным цветом, производят шесть измерений, после чего осуществляется автоматический подсчет его среднего диаметра и объема (рис. 9-1, см. цв. вклейку).

Оценка содержания АМГ в сыворотке крови возможна в любой день менструального цикла, поскольку его величина не имеет значительных колебаний в разные его фазы. У здоровых женщин репродуктивного возраста содержание АМГ составляет обычно 1,0-2,5 нг/мл. На результат могут оказывать влияние некоторые методические, в том числе лабораторные, особенности осуществления данного анализа (разные тест-системы, разная длительность хранения образца, температура хранения и т.д.). Все это определяет возможный разброс значений уровня АМГ у одной и той же пациентки при выполнении анализа. Тест-системы для определения АМГ в мире совершенствуются (Rustamov O. et al., 2012; Helden J. et al., 2015).

В силу вышеперечисленных обстоятельств сочетанная оценка двух показателей является наиболее оптимальной для определения овариального резерва и прогноза ответа яичников на стимуляцию. Действительно, КАФ и уровень АМГ обладают наибольшей информативностью в отношении прогноза как гипер-ергического, так и «бедного» ответа (рис. 9-2).

Показателями, свидетельствующими о риске гиперергического ответа яичников и СГЯ, могут считаться (рис. 9-3):

Недостаточный ответ яичников на гонадотропную стимуляцию прогнозируют при следующих показателях:

Напомним, что в зависимости от количества полученных ооцитов целесообразно выделять следующие варианты ответа яичников: гиперергический (избыточный); нормальный; субоптимальный и «бедный» (табл. 9-1).

Стимуляция яичников при наличии предикторов «бедного» ответа излагается в отдельном разделе.

В «свежих» циклах ЭКО (то есть протоколах, которые завершаются переносом эмбрионов) частота родов является оптимальной при получении 10-15 ооцитов и более, низкой - при наличии менее 10 и более 20 ооцитов (Sunkara S.K. et al., 2011).

Почему именно 10-15 ооцитов считают оптимальным? Эта консенсусная позиция базируется на данных крупных исследований, в которых показано, что при получении именно этого количества яйцеклеток эффективность лечебного цикла с переносом эмбрионов является максимальной. Так, по данным S.K. Sunkara и соавт. (2011), частота родов максимальна при получении от 10 до 15 ооцитов и более низкая - при наличии менее 10 и более 20 ооцитов. Этот тренд наблюдался в разные исторические периоды развития технологии ЭКО и в разных возрастных группа (рис. 9-4). Возможно, это можно объяснить негативным влиянием интенсивной стимуляции яичников, экстремально высоким уровнем овариальных стероидов на ооциты, а также рецептивные свойства эндометрия. Необходимо сделать акцент на том, что эти работы касаются эффективности циклов ЭКО с переносом свежих эмбрионов. Авторы даже разработали номограмму, используя которую можно рассчитывать эффективность лечения методом ЭКО в зависимости от возраста пациентки и количества ооци-тов (рис. 9-5).

В практике довольно часто наблюдают ситуации, когда цикл не завершается переносом, а все эмбрионы витрифицируются (сегментация протокола). Перенос осуществляют уже в протоколах с переносом размороженных эмбрионов (рис. 9-6).

Основными показаниями для сегментации протокола являются:

Эта группа показаний определяется обеспечением безопасности лечебного цикла. Другие показания для сегментации протокола являются дополнительными. Это, конечно, нестандартные варианты стимуляции, проведение предымплантационной диагностики. Кроме этого, идеологией для подобного подхода может служить «эмпирическое обеспечение» оптимальной рецептив-ности эндометрия в криопротоколах. Таким образом, сегментация цикла может также осуществляться в следующих случаях (табл. 9-2):

Стратегия сегментации может быть также выбрана у пациенток с неоднократными неэффективными протоколами ЭКО (Shapiro B.S. et al., 2014; Magdi Y. et al., 2017). Вероятно, что перенос в криоциклах, когда удается избежать возможного негативного влияния на эндометрий избытка половых стероидов во время стимуляции, является более оптимальным подходом. Так, например, B.S. Shapiro и соавт. (2014; 2017) показали, что у 81 пациентки с неэффективными протоколами ЭКО в анамнезе частота клинической беременности при стратегии сегментации цикла составила 52%, а у 90 пациенток в цикле с переносом эмбрионов - 28%. Частота имплантации была 44,2 и 15,8% соответственно).

У пациенток со сниженным овариальным резервом, в том числе в старшем репродуктивном возрасте, сегментация может быть применена в следующих случаях:

Сегментацию цикла проводят также при нестандартном начале стимуляции яичников (старт стимуляции в конце фолликулярной или в лютеиновую фазу цикла).

При сегментированном цикле для описания показателей его эффективности используют величину кумулятивной частоты беременности и родов (рис. 9-7). В исследованиях последних лет было показано, что количество ооцитов имеет прямую зависимость от количества зрелых ооцитов (МII), числа полученных эуплоидных бластоцист, частоты криоконсервации эмбрионов и кумулятивной частоты беременности и родов (Briggs R. et al., 2015; Drakopoulos P. et al., 2016) (табл. 9-3, 9-4).

Показатели, которые могут быть использованы в настоящее время для оценки эффективности лечебного цикла, соответствующие консенсусу международных профессиональных сообществ по репродуктивной медицине (Zegers-Hochschild F. et al., 2017), представлены в табл. 9-5.

При обсуждении вопроса «количества» нужно сделать комментарий, касающийся возраста пациенток. Хорошо известно, что с увеличением возраста женщины повышается риск несбалансированных хромосомных перестроек у эмбриона. Так, по данным B. Аta и соавт. (2012), частота получения эуплоид-ных эмбрионов у пациенток до 35 лет в среднем составляет 60%, в 35-37 лет - 50%, в 38-40 лет - 37%, в 41-42 года - только 23%. Кроме этого, к сожалению, часть ооцитов в результате стимуляции яичников может оказаться незрелыми, у некоторых пациенток будут нарушения оплодотворения или произойдет остановка развития эмбрионов. Подсчитано, для того чтобы получить 1 эуплоидную бластоцисту у пациенток младше 35 лет, необходимо получить около 6 ооцитов; в 39-40 лет - около 10 ооцитов, в 42-43 года - около 16 ооцитов!

ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ЯИЧНИКОВ

Стимуляция яичников основана на использовании фармакологических препаратов, вызывающих рост, развитие фолликулов, а также созревание ооцитов.

Наиболее часто в протоколах стимуляции яичников используются ГТ, реже - другие препараты (антиэстрогены, ИА) (рис. 9-8).

ГT в настоящее время получают двумя способами:

ЧМГТ производят из мочи женщин, находящихся в постменопаузе. Современные технологии с использованием нанофильтрации и высокоаффинной хроматографии позволяют сохранить структуру и свойства человеческого ФСГ, устранить все вирусы, в том числе малые и некапсулированные, а также прионы. Особенностью ЧМГT является преобладающее содержание кислых изоформ ФСГ, которые представляются наиболее значимыми во время фолли-кулогенеза в I фазе естественного менструального цикла. Это обеспечивается сохранением видоспецифичной углеводной части молекулы ФСГ, составляющей около 30% ее молекулярной массы и определяющей ее кислотность.

В последние годы созданы препараты нового поколения менотропинов, в частности Мериоферт^♠ , в котором ЛГ-активность обеспечена плацентарным ХГЧ, имеющим более длительный период полураспада по сравнению с ЛГ и гипофизарным ХГЧ и тем самым обеспечивающим более длительное влияние на рецепторы ЛГ.

Синтез рГТ стал возможным после изоляции генов, кодирующих α- и β-субъединицы ФСГ, ЛГ и ХГЧ на клеточной линии яичников китайского хомячка, которую благодаря высоким показателям стабильности применяют уже в течение 30 лет для синтеза белков. Появление рекомбинантных препаратов дало возможность отказаться от использования биологического сырья (мочи менопаузальных женщин) и перейти на наиболее чистые препараты (99,9% чистоты действующего вещества). Tехнологические особенности получения рГT обеспечивают такие важные параметры производства, как отсутствие ограничений по объему выпуска препарата, жесткий контроль исходного материала, постоянство состава, содержания ФСГ и специфической активности.

В последние годы в клинической практике стал применяться рекомбинантный ФСГ пролонгированного действия - корифоллитропин альфа. Его формула состоит из α-субъединицы ФСГ и субъединицы, полученной на основе слияния β-субъединицы ФСГ с карбокситерминальным пептидом β-субъединицы ХГЧ. Это обеспечивает высокую биологическую активность и длительный период полувыведения гормона (69 ч). Однократная инъекция препарата в дозе 100 или 150 мг обеспечивает стимуляцию яичников в течение 7 сут.

ОСНОВНЫЕ (БАЗОВЫЕ) ПРОТОКОЛЫ СТИМУЛЯЦИИ ЯИЧНИКОВ

Во время стимуляции яичников гонадотропинами наблюдается рост нескольких фолликулов, что приводит к значительной продукции и росту концентрации эстрадиола. Концентрация эстрадиола достигает порога, необходимого для «включения» механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом значительно быстрее, чем в спонтанном менструальном цикле. Это приводит к преждевременному пику ЛГ, преждевременной овуляции и лю-теинизации незрелых фолликулов. Ранее было показано, что при применении ГТ без блокирования эндогенного ЛГ такая ситуация складывается в среднем в 20% циклов.

В настоящее время для предотвращения преждевременного пика ЛГ используют аналоги ГнРГ - а-ГнРГ и анта-ГнРГ. Основой классификации базовых протоколов стимуляции яичников является тип аналога ГнРГ, который применяют для предотвращения преждевременного пика ЛГ.

Анта-ГнРГ:

А-ГнРГ:

Среди а-ГнРГ наиболее часто используют формы для ежедневного введения (Диферелин^♠ , Декапептил^♠ ).

Хорошо известно, что действие а-ГнРГ складывается из двух фаз. В течение первых 12-14 сут применения препарат приводит к активации гипофиза, что сопровождается усилением секреции ФСГ, ЛГ и эстрадиола. При продолжающемся действии препарата происходит снижение функциональной активности и количества (потеря чувствительности, дeceнcитизaция) рецепторов к ГнPГ в клетках гипофиза. Это приводит к снижению уровня ГТ и эстрадиола в крови.

Антагонисты ГнPГ обладают высокой способностью связываться с рецепторами ГнPГ. Они вызывают быструю блокаду гипофиза (в течение 3-4 ч от момента введения, отсутствует фаза активации гипофиза).

Основными (базовыми) протоколами стимуляции яичников в программах ЭКО являются:

Протокол с анта-ГнРГ (рис. 9-9, 9-10). Введение ГТ производят с 2-3-го дня менструального цикла, ежедневно. Анта-ГнPГ начинают применять с 5-го или 6-го дня стимуляции ежедневно (при фиксированном варианте протокола) либо при достижении лидирующим фолликулом диаметра ≥13-14 мм (при гибком варианте протокола), в том числе в день назначения триггера. При достижении тремя фолликулами диаметра ≥17 мм вводят триггер финального созревания ооцитов (препарат ХГЧ или а-ГнPГ).

В процессе ультразвукового мониторинга стимуляции яичников возможна коррекция дозы ГТ (снижение, увеличение).

Эффективность фиксированного и гибкого вариантов протокола по частоте наступления беременности сопоставима (Al-Inany H.G. et al., 2011).

Наряду с ежедневными инъекциями ГТ в протоколах с анта-ГнPГ возможно использование рФСГ пролонгированного действия.

Протокол с рФСГ пролонгированного действия (рис. 9-11). Корифоллитропин альфа вводят однократно подкожно: женщинам с массой тела ≤60 кг - 100 мкг, с массой тела >60 кг - 150 мкг. Введение анта-ГнРГ должно быть начато на 5-й или 6-й день стимуляции в зависимости от ответа яичников, то есть числа или размера растущих фолликулов. Анта-ГнРГ вводят и в день назначения триггера. Через 7 сут после инъекции корифоллитропина альфа, если не достигнуты размеры фолликулов, соответствующие критериям назначения триггера, лечение продолжают с помощью ежедневных инъекций рФСГ. При этом суточная доза рФСГ зависит от ответа яичников. Если ответ нормальный, то рекомендуемая суточная доза составляет 150 МЕ. При достижении тремя фолликулами диаметра ≥17 мм вводят триггер финального созревания ооцитов (препарат ХГЧ или а-ГнРГ).

В России корифоллитропин альфа стали использовать в клинической практике с 2013 г. До регистрации препарата в нашей стране в мире проведены клинические исследования, оценивающие его эффективность и безопасность. Так, в систематическом обзоре A. Pouwer и соавт. (2012) (6 РКИ, 3753 пациентки, корифоллитропин альфа получали 2054 женщины) был сделан вывод о том, что частота наступления беременности и родов не различалась в группах, применяющих в циклах ЭКО корифоллитропин альфа и обычную стимуляцию фоллитропином бета.

Метаанализ семи РКИ S. Fensore и соавт. (2015), в который были включены такие крупнейшие исследования, как ENGAGE (2009) и ENSURE (2010) с общим количеством 2138 женщин, получавших пролонгированный рФСГ, показал, что корифоллитропин альфа эффективен, как и рФСГ, для ежедневного введения в отношении частоты живорождения. Однако после овариальной стимуляции корифоллитропином альфа было получено большее количество ооцитов.

B.Tarlatzis и соавт. (2012) установлено, что из 1705 пациенток, получавших корифоллитропин альфа, частота легкого, умеренного и тяжелого СГЯ составила 3,0; 2,2 и 1,8% соответственно, у пациенток в группе рФСГ - 3,5; 1,3 и 1,3% соответственно. Несмотря на более интенсивный овариальный ответ при применении корифоллитропина альфа по сравнению с рФСГ в течение первых семи дней стимуляции яичников частота СГЯ была одинаковой.

Применение рФСГ пролонгированного действия в протоколах с а-ГнРГ не получило широкого распространения, вероятно, в связи с отсутствием возможности замены триггера при гиперергической реакции яичников.

Протокол с а-ГнРГ (длинный) (рис. 9-12). На 20-21-й день менструального цикла назначают ежедневные (форма для ежедневного введения) инъекции а-ГнРГ либо а-ГнРГ вводят однократно (форму пролонгированного действия). С 2-3-го дня менструального цикла (момент совпадает с наступлением фазы десенситизации гипофиза) назначают ежедневные инъекции ГТ. При достижении десенситизации гипофиза можно снизить дозу а-ГнРГ в 2 раза (с 0,1 до 0,05 мг). При достижении тремя фолликулами диаметра ≥17 мм вводят триггер финального созревания ооцитов (только препарат ХГЧ).

В данном протоколе отсутствует возможность замены триггера а-ГнРГ.

В процессе ультразвукового мониторинга стимуляции яичников возможна коррекция дозы ГТ (снижение, увеличение).

Протокол с а-ГнРГ (короткий) (рис. 9-13). Введение ГТ и а-ГнРГ начинают одновременно с 2-3-го дня менструального цикла (либо а-ГнРГ назначают на пару дней раньше). При достижении тремя фолликулами диаметра ≥17 мм вводят триггер финального созревания ооцитов (только препарат ХГЧ). Назначение агонистов ГнРГ в первую фазу менструального цикла должно обеспечить дополнительную стимуляцию роста фолликулов вследствие активации гипофиза в первые дни назначения препарата (flare-up-эффект).

Ранее считалось, что такой протокол стимуляции яичников будет полезен пациенткам со сниженным овариальным резервом. Однако в последних исследованиях не доказаны преимущества данного протокола перед протоколом с антагонистами в этой группе пациенток.

В процессе ультразвукового мониторинга стимуляции яичников возможна коррекция дозы ГТ (снижение, увеличение).

Протокол с а-ГнРГ (супердлинный) (рис. 9-14). В течение 3-6 мес вводят форму а-ГнРГ пролонгированного действия, после чего переходят на ежедневные инъекции. ГТ начинают вводить в конце пролонгированного лечения а-ГнРГ. Вследствие возможной значительной супрессии яичников для обеспечения адекватного их ответа, особенно у пациенток с невысоким овариальным резервом, стартовая доза ГТ может быть достаточно высокой (до 300 МЕ).

Сравнение эффективности протоколов с анта-ГнРГ и а-ГнРГ. Согласно данным Кокрановского обзора (Al-Inany H.G. et al., 2011) в протоколах с анта-ГнРГ по сравнению с протоколами с а-ГнРГ достоверно ниже частота СГЯ (у пациенток с нормальным ответом яичников!). Эти данные были отмечены в более ранних систематических обзорах (Kolibianakis E.M. et al., 2006). При этом эффективность протоколов с антагонистами и а-ГнРГ в общей популяции больных с бесплодием сопоставима.

ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТОКОЛОВ С АНТАГОНИСТАМИ И АГОНИСТАМИ ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ-ГОРМОНА

Протоколы с анта-ГнРГ обладают рядом преимуществ:

Протоколы с а-ГнРГ имеют следующие преимущества.

Как «гомогенизировать» пул антральных фолликулов в протоколах с анта-ГнРГ и планировать начало лечения?

С помощью предварительного назначения эстрогенов, гестагенов или комбинированных оральных контрацептивов (КОК) возможно осуществление гомогенизации пула антральных фолликулов. Это достигается благодаря тому, что в период приема вышеперечисленных гормональных препаратов отсутствует рост концентрации ФСГ с конца лютеиновой фазы цикла (рис. 9-16-9-18). Тем не менее такой подход имеет свои особенности. Так, в систематическом обзоре (Smulders B. et al., 2010) показано, что назначение эстрадиола во вторую фазу цикла приводит к получению большего количества ооцитов, но увеличивает количество ГТ, а значит, стоимость лечения. КОК перед протоколом ЭКО несколько снижают частоту беременности, увеличивают количество ГТ и стоимость лечения. Имеются сведения о том, что предварительное назначение КОК может приводить к негативному влиянию на эндометрий (уменьшению толщины) и изменению содержания эндогенного ЛГ (снижению) в лечебном цикле (Kolibianakis E.M. et al., 2006). Именно поэтому необходимо взвесить преимущества (планирование цикла, синхронизация когорты фолликулов)

ВЫБОР ПРОТОКОЛА СТИМУЛЯЦИИ ЯИЧНИКОВ

Основным критерием выбора протокола стимуляции яичников служит прогноз ответа яичников на введение гонадотропных препаратов (табл. 9-6).

Примечание: ГнРГ - гонадотропин-рилизинг-гормон.

При прогнозируемом гиперергическом и нормальном ответе (при первом цикле ЭКО) яичников рекомендовано применение протокола с анта-ГнРГ.

При повторном цикле ЭКО у пациенток с прогнозом нормального ответа может быть использован протокол с а-ГнРГ, если в анамнезе не было СГЯ.

При наличии критериев «бедного» ответа яичников на стимуляцию возможно применение разных подходов, которые приведены в главе 10.

Использование протокола с анта-ГнРГ рекомендовано следующим группам пациенток:

Протоколы с а-ГнРГ возможны у пациенток с нормальным овариальным резервом и прогнозируемым нормальным ответом на стимуляцию. Однако необходимо помнить о том, что при избыточной реакции яичников на ГТ и развитии гиперергического ответа нельзя заменить триггер финального созревания ооцитов, что может привести к СГЯ. Использование протокола с а-ГнРГ у пациенток с высоким овариальным резервом не рекомендуется!

При прогнозе недостаточного («бедного») ответа яичников риск СГЯ отсутствует, и в этом плане протоколы с а-ГнРГ безопасны. Вместе с тем длительность лечения, инъекционная нагрузка при равной эффективности по сравнению с другими протоколами не позволяют считать их приемлемыми для пациенток данной группы.

Супердлинный протокол с а-ГнРГ можно использовать при необходимости длительной супрессии гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы (чаще всего у больных с генитальным эндометриозом; возможно - при СПЯ с высокими значениями ЛГ в сыворотке крови).

Согласно данным отдельных исследований при применении протоколов с а-ГнРГ пациентки с генитальным эндометриозом могут получить большее количество фолликулов, ооцитов, эмбрионов хорошего качества по сравнению с аналогичными показателями в протоколах с анта-ГнРГ.

ВЫБОР СТАРТОВОЙ ДОЗЫ ГОНАДОТРОПИНА

При нормальных параметрах овариального резерва и прогнозировании нормального ответа на стимуляцию стартовая доза препаратов ГТ составляет, как правило, 150-200 МЕ/сут.

При высоком овариальном резерве стартовая доза может быть снижена до 100-150 МЕ. Однако, как показывает практика, ГТ в низких дозах даже у пациенток этой категории не всегда обеспечивает рост и созревание адекватного количества фолликулов.

При низком овариальном резерве стартовая доза ГТ может достигать 300- 350 МЕ (как правило, не выше 450 МЕ).

Некоторыми исследовательскими группами разработаны номограммы для определения стартовой дозы ГТ (рис. 9-19; по La Marca A. et al., 2013). В качестве критериев, которые влияют на величину начальной дозы, предлагают следующие: возраст пациентки, КАФ, уровень АМГ в сыворотке крови, базальный уровень ФСГ (на 2-3-й день менструального цикла).

Доза препарата корифоллитропина альфа зависит от массы тела и возраста женщины. Однократное введение препарата в дозе 100 мкг рекомендуют у женщин с массой тела ≤60 кг в возрасте ≤36 лет. Однократное введение препарата в дозе 150 мкг рекомендуют у женщин: с массой тела >60 кг независимо от возраста; с массой тела ≥50 кг и старше 36 лет.

ВЫБОР ПРЕПАРАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ЯИЧНИКОВ

Существуют ли критерии выбора препарата ГТ для стимуляции яичников? Нужно сразу сказать о том, что в настоящее время отсутствуют жесткие критерии выбора типа гонадотропных препаратов.

ЧМГТ. Сравнению эффективности ЧМГТ и рГТ посвящены многие исследования. В большинстве работ показано, что при использовании рФСГ количество ооцитов больше, чем при использовании ЧМГТ. Именно поэтому бытующее, к сожалению, до сих пор мнение о более высокой частоте развития СГЯ при применении ЧМГТ не подтверждается ни теорией, ни практикой. Частота развития СГЯ при использовании рФСГ и ЧМГТ не различается.

Имеются отдельные работы, в которых показано, что применение ЧМГТ в протоколах стимуляции яичников может привести к получению эмбрионов хорошего качества, и это объясняется структурой ГТ, входящих в ЧМГТ («близкой» эндогенным изоформам ФСГ). Однако на сегодняшний день не существует объективных критериев оценки качества эмбриона. Научные заключения о курсовых дозах препарата, эффективности протоколов в плане частоты наступления беременности и родов продолжают оставаться неоднозначными.

В настоящее время большой объем международных и отечественных данных позволяет сделать вывод о равной эффективности препаратов в общей группе пациенток, о чем также свидетельствуют данные последних метаанализов, посвященных этой проблеме. Определенное значение при выборе в этом случае будут играть такие индивидуальные позиции, как стоимость лечения, удобство использования препарата, опыт применения, желание изменить тактику стимуляции при последующих протоколах.

Рекомбинантный ЛГ (рЛГ). Применение препаратов, содержащих ЛГ (с 1-го дня стимуляции), показано пациенткам с гипогонадотропной недостаточностью яичников (гипогонадотропный гипогонадизм) (синдром Шихана, синдром Кальмана и др.). В этих клинических ситуациях с целью стимуляции яичников могут быть использованы и ЧМГТ, обладающие необходимой в таких случаях ЛГ-активностью.

В общей группе пациенток необходимость рутинного добавления ЛГ остается предметом научных дискуссий. В большинстве исследований не доказаны преимущества добавления рЛГ.

Возможно, что применение ЛГ-содержащих препаратов может быть полезным в следующих группах:

Поскольку стимуляция роста доминантного фолликула в среднюю и позднюю пролиферативную фазы менструального цикла осуществляется как ФСГ, так и ЛГ (ΦCГ-, ЛГ-зависимый рост), то начинать инъекции рЛГ целесообразно с 5-6-го дня стимуляции (рис. 9-20). В 2014 г. были опубликованы данные о целесообразности применения рЛГ с 1-го дня стимуляции (Bosch T. et al., 2014) - рис. 9-21. По мнению авторов данного исследования, раннее введение рЛГ может оптимизировать стероидогенез в яичниках и улучшить качество ооцитов.

Почему ЛГ может быть полезен пациенткам старшего репродуктивного возраста? Возможно, это связано со снижением продукции андрогенов в яичниках, необходимых для адекватного фолликулогенеза. Как известно, ЛГ стимулирует стероидогенез и продукцию андрогенов в тека-клетках яичника. Кроме этого, у пациенток старшего репродуктивного возраста не исключено снижение числа функциональных ЛГ-рецепторов или биологической активности эндогенного ЛГ.

В некоторых работах показано, что пациенткам с низким овариальным резервом или при слабом ответе яичников при уровне ЛГ в плазме крови ниже 1,5 МЕ/л на 6-7-й день стимуляции целесообразно добавление ЛГ-содержащего препарата (150 МЕ). В то же время у пациенток с высоким овариальным резервом для атрезии мелких фолликулов и предотвращения гиперергического ответа яичников с 6-7-го дня стимуляции также целесообразно добавление ЛГ (75 МЕ) (Мамедова Н.P. и др., 2011).

УЛЬТРАЗВУКОВОЙ МОНИТОРИНГ СТИМУЛЯЦИИ ЯИЧНИКОВ

Мониторирование индуцированного цикла осуществляют с помощью динамического УЗИ. Pеже используют гормональный мониторинг. Основными задачами ультразвукового мониторинга являются:

Частота мониторинга определяется конкретной клинической ситуацией, опытом репродуктолога и, наконец, традициями клиники. Как правило, мониторинг осуществляют на 2-3-й день менструального цикла (оценивают КАΦ, полость матки, структуру яичников); на 5-6-й день стимуляции (для определения реакции яичников на выбранную стартовую дозу ГТ и возможной ее коррекции), далее - в период, предшествующий назначению триггера. В большинстве случаев трех визитов достаточно для адекватного ведения протокола стимуляции.

На 2-3-й день менструального цикла оптимальными условиями для начала стимуляции яичников являются следующие показатели: диаметр всех фолликулов <10 мм, толщина эндометрия <5-6 мм (при этом, если в клинике применяется гормональный мониторинг цикла, уровень эстрадиола в крови <50 пг/мл, а прогестерона <1,5 нг/мл).

Как было сказано, второе исследование проводят на 5-6-й день стимуляции. Это обусловлено тем, что именно к данному времени уровень ГТ в крови достигает порогового для роста фолликулов уровня. К этому дню стимуляции при достаточной реакции яичников на стартовую дозу ГT часть фолликулов достигает величины 10 мм и более. Оптимальным вариантом является ситуация, когда когорта растущих фолликулов имеет приблизительно одинаковый размер (синхронизированы). В случае если ни один из фолликулов через 5-6 дней стимуляции не достигает диаметра 10 мм, дозу ГT следует увеличить. Впоследствии нужно учитывать, что скорость роста фолликулов составит в среднем 2 мм/сут (от 1 до 3 мм/сут), и частоту мониторинга будут определять индивидуально (рис. 9-22).

Во время исследования необходимо обратить внимание на толщину и структуру эндометрия. К моменту окончания стимуляции яичников и назначения триггера толщина эндометрия должна быть не менее 8 мм. При этом эндометрий имеет «трехслойную» структуру. Отставание развития эндометрия можно выявить на 6-8-й день применения ГT (в этот период толщина эндометрия составляет, как правило, не менее 7 мм).

Возможные алгоритмы ультразвукового мониторинга в протоколе с применением коррифолитропина альфа и в длинном протоколе с а-ГнРГ представлены на рис. 9-23, 9-24.

ТРИГГЕРЫ ФИНАЛЬНОГО СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ

В естественном цикле овуляцию и финальное созревание ооцита обеспечивает пик ЛГ, то есть резкое возрастание концентрации гормона в крови в середине менструального цикла. Этот феномен обусловлен механизмом положительной обратной связи между гипоталамо-гипофизарной системой и яичниками. При этом изменение концентрации ЛГ в крови характеризуется в большинстве случаев тремя фазами общей продолжительностью около 48 ч: подъема (около 14 ч), плато (около 14 ч) и снижения (около 20 ч) (Hoff J.D. et al., 1983).

В протоколах ЭКО эндогенный пик ЛГ заблокирован аналогами ГнРГ (а-ГнРГ и анта-ГнРГ), и финальное созревание фолликулов и ооцитов обес-печиваетя введением препаратов.

В настоящее время в качестве триггера используют следующие группы препаратов:

Рекомбинантный ЛГ (15 000-30 000 МЕ), рЛГ, в качестве триггера не получил широкого распространения в связи с высокой эффективной дозой и высокой стоимостью.

В последние годы пристальное внимание исследователей привлекает роль кисспептина в регуляции репродуктивных процессов (Чернуха Г.Е. и др., 2017). В частности, показано, что кисспептин стимулирует выделение из гипоталамуса эндогенного ГнPГ и, соответственно, ЛГ и ΦCГ (Irwig M.S et al., 2004). Интенсивность такого индуцирования зависит, естественно, от индивидуального резерва ГнPГ и ГТ. Таким образом, предотвращается чрезмерное воздействие на яичники и развитие CГЯ. В 2014 г. опубликованы результаты использования кисспептина-54 у пациенток с нормальным овариальным резервом (Jayasena C.N. et al., 2013), в 2015-м - в группе повышенного риска CГЯ (Abbara А. et al., 2015). В последнем исследовании проведено сравнение эффективности различных доз препарата (3,2; 6,4; 9,6; 12,8 нмоль/кг; подкожное введение). Наиболее эффективной оказалась доза 9,6 нмоль/кг.

Cогласно большинству исследований критерием назначения триггера является наличие трех фолликулов и более ≥17 мм.

Введение триггера спустя 2 сут после выявления вышеперечисленных критериев снижает эффективность протокола.

Агонисты ГнPГ в качестве триггера применяют у пациенток:

B.S. Shapiro и соавт. (2008) для оптимизации эффективности цикла с переносом эмбрионов и предотвращения развития тяжелого CГЯ предложили методику «двойного триггера», которая заключается во введении а-ГнPГ и малых доз ХГЧ (1000 или 2500 МЕ) за 36 ч до пункции. Эффективность и безопасность подобного подхода стали предметом изучения. Cогласно последним данным эта методика, несмотря на позитивный эффект в отношении частоты наступления беременности, у пациенток групп риска CГЯ может стать причиной развития этого осложнения. Применение «двойного триггера» не рекомендовано при уровне эстрадиола в день введения триггера ≥4000 пк/мл.

Пункцию фолликулов производят через 36 ч после введения триггера.

Необходимо помнить о том, что замена триггера на а-ГнPГ возможна только в протоколах с анта-ГнPГ!

Особенности протокола при использовании а-ГнРГ в качестве триггера. ХГЧ имеет значительно больший период полувыведения по сравнению с ЛГ (более 24 ч по сравнению с 60 мин у ЛГ), более выраженную связь с рецепторами, обеспечивает более длительную поддержку желтых тел в посттрансферном периоде. Несомненным преимуществом а-ГнPГ в качестве триггера по сравнению с ХГЧ является профилактика CГЯ. Кроме этого, введение а-ГнPГ вызывает возрастание концентрации как ЛГ, так и ΦCГ. Предполагается, что пик ΦCГ может оказывать позитивное влияние на желтые тела (стимулирует синтез рецепторов к ЛГ на клетках гранулезы) и зрелость ооцитов (Oktay K. et al., 2010). Однако пик ЛГ при использовании а-ГнPГ отличается от такового как в натуральном цикле, так и в циклах стимуляции с применением ХГЧ. Повышение концентрации в крови ЛГ будет менее продолжительным (около 24 ч): период подъема длится около 4 ч, период снижения - около 20 ч, а период плато практически не наблюдается (Gonen Y. et al., 1990; Itskovitz J. et al., 1991). Таким образом, основными недостатками а-ГнРГ являются неадекватная по времени поддержка функции желтых тел и, соответственно, неадекватные изменения эндометрия, что требует усиленной посттрансферной поддержки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Мамедова Н.Р., Назаренко Т.А., Монахова И.В. Препараты, содержащие лютеинизирующий гормон, в программах ВРТ (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2011. № 3. С. 50-55.

Чернуха Г.Е., Табеева Г.И., Гусев Д.В., Шмаков Р.Г. Кисспептин и репродуктивная система // Доктор.Ру. 2017. № 3 (132). С. 73-78.

Abbara A., Jayasena C. N., Christopoulos G., Naгayanaswamy S., IzziEngbeaya C., Nijher G. M. et al. Efficacy of kisspeptin-54 to trigger oocyte maturation in women at high risk of ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS) during in vitro fertilization (IVF) therapy // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2015. Vol. 100, N 9. P. 3322-3331.

Al-Inany H., Azab H., El-Khayat W. et al. The effectiveness of clomiphene citrate in LH surge suppression in women undergoing IUI: a randomized controlled trial // Fertil. Steril. 2010. Vol. 94, N 6. P. 2167-2171.

Al-Inany H.G., Youssef M.A., Aboulghar M. et al. Gonadotrophin-releasing hormone antagonists for assisted reproductive technology // Cochrane Database Syst. Rev. 2011. Vol. 5. CD001750.

Ata B., Kaplan B., Danzer H. et al. Array CGH analysis shows that aneuploidy is not related to the number of embryos generated // Reprod. Biomed. Online. 2012. Vol. 24. P. 614-620.

Ata B., Tulandi T. Ultrasound automated volume calculation in reproduction and in pregnancy // Fertil. Steril. 2011. Vol. 95, N 7. P. 2163-2170.

Ata B., Yakin K., Balaban B., Urman B. GnRH agonist protocol аdministration in the luteal phase in ICSI-ET cycles stimulated with the long GnRH agonist protocol: a randomized, controlled double blind study // Hum. Reprod. 2008. Vol. 23. P. 668-673.

Ata B., Seyhan A., Reinblatt S.L., Shalom-Paz E., Krishnamurthy S., Tan S.L. Comparison of automated and manual follicle monitoring in an unrestricted population of 100 women undergoing controlled ovarian stimulation for IVF // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26, N 1. P. 127-133. DOI: 10.1093/humrep/deq320.

Bosch E. Comment on «Recombinant LH supple mentation to a standard GnRH antagonist protocol in women of 35 years old or older undergoing IVF/ICSI: a randomized controlled multicentre study» // Hum. Reprod. 2014. Vol. 29, N 3. P. 636-637.

Briggs R., Kovacs G., MacLachlan V., Motteram C., Gordon Baker H.W. Can you ever collect too many oocytes? // Hum. Reprod. 2015. Vol. 30, N 1. P. 81-87.

Broer S.L., Broekmans F.J.M., Laven J.S.E., Fauser B.C.J.M. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications // Hum. Reprod. Update. 2014. Vol. 20, N 5. P. 688-701.

Broer S.L., Dolleman M., van Disseldorp J., Broeze K.A., Opmeer B.C., Bossuyt P.M. et al. Prediction of an excessive response in in vitro fertilization from patient characteristics and ovarian reserve tests and comparison in subgroups: an individual patient data meta-analysis // Fertil. Steril. 2013. Vol. 100. P. 420-429.

Broer S.L., van Disseldorp J., Broeze K.A., Dolleman M., Opmeer B.C., Bossuyt P. et al. Added value of ovarian reserve testing on patient characteristics in the prediction of ovarian response and ongoing pregnancy: an individual patient data approach // Hum. Reprod. Update. 2013. Vol. 19. P. 26-36.

Deb S., Campbell B.K., Clewes J.S. et al. Intracycle variation in number of antral follicles stratified by size and in endocrine markers of ovarian reserve in women with normal ovulatory menstrual cycles // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013. Vol. 41, N 2. P. 216-222.

Drakopoulos P., Blockeel C., Stoop D., Camus M., de Vos M., Tournaye H. et al. Conventional ovarian stimulation and single embryo transfer for IVF/ICSI. How many oocytes do we need to maximize cumulative live birth rates after utilization of all fresh and frozen embryos? // Hum. Reprod. 2016. Vol. 31, N 2. P. 370-376.

Engmann L., DiLuigi A., Schmidt D., Nulsen J., Maier D. et al. The use of gonadotro-pin-releasing hormone (GnRH) agonist to induce oocyte maturation after cotreatment with GnRH antagonist in high-risk patients undergoing in vitro fertilization prevents the risk of ovarian hyperstimulation syndrome: a prospective randomized controlled study // Fertil. Steril. 2008. Vol. 89. P. 84-91.

Fensore S. Corifollitropin alfa compared to daily FSH in controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization: a meta-analysis // J. Ovarian Res. 2015. Vol. 8, N 1. P. 33-40.

Gonen Y., Jacobsen W., Casper R. Gonadotropin suppression with oral contraceptives before in vitro fertilization // Fertil. Steril. 1990. Vol. 53. P. 282-287.

Griffin D., Benadiva C., Kummer N., Budinetz T., Nulsen J. et al. Dual trigger of oocyte maturation with gonadotropin-releasing hormone agonist and low-dose human chorionic gonadotropin to optimize live birth rates in high responders // Fertil. Steril. 2012. Vol. 97. P. 1316-1320.

Helden J., Weiskirchen R. Performance of the two new fully automated anti-Mullerian hormone immune assays compared with the clinical standard assay // Hum. Reprod. 2015. Vol. 30, N 8. P. 1918-1926.

Hoff J.D., Quigley M.E., Yen S.S. Hormonal dynamics at midcycle: a reevaluation // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1983. N 57. P. 792-796.

Huirne J.A., Homburg R., Lambalk C.B. Are GnRH antagonists comparable to agonists for use in IVF? // Hum. Reprod. 2007. Vol. 22. P. 2805-2813.

Irwig M.S., Fraley G.S., Smith J.T. et al. Kisspeptin activation of gonadotropin releasing hormone neurons and regulation of KiSS-1 mRNA in the male rat // Neuroendocrinology. 2004. Vol. 80, N 4. P. 264-272.

Itskovitz J., Boldes R., Levron J. et al. Induction of preovulatory luteinizing hormone surge and prevention of ovarian hyperstimulation syndrome by gonadotropinreleasing hormone agonist // Fertil. Steril. 1991. Vol. 56. P. 213-220.

Jayasena C.N., Comninos A.N., Nijher G.M., Abbara A., De Silva A., Veldhuis J.D. et al. Twice-daily subcutaneous injection of kisspeptin-54 does not abolish menstrual cyclicity in healthy female volunteers // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2013. Vol. 98, N 11. P. 4464-4474.

Kolibianakis E.M., Papanikolaou E.G., Camus M. et al. Oral contraceptive pill pretreament on ongoing pregnancy rates in patients stimulated with GnRH antagonists and recombinant FSH for IVF. A randomized controlled trial // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 352-357.

La Marca A., Grisendi V., Giulini S. et al. Individualization of the FSH starting dose in IVF ICSI cycles using the antral follicle count // J. Ovarian Research. 2013. Vol. 6. P. 11-18.

Lehert P., Kolibianakis E.M., Venetis C.A., Schertz J., Saunders H., Arriagada P. et al. Recombinant Human Follicle-Stimulating Hormone (r-hFSH) Plus Recombinant Luteinizing Hormone versus r-hFSH Alone for Ovarian Stimulation during Assisted Reproductive Technology: Systematic Review and Meta-Analysis // Reprod. Biol. Endocrinol. 2014. DOI: 10.1186/1477-7827-12-17.

Magdi Y., El-Damen A., Fathi A.M., Abdelez A.M., Youssef M.A.E. et al. Revisiting the management of recurrent implantation failure through freeze-all policy // Fertil. Steril. 2017. Vol. 118. P. 72-77.

Obruca A., Schenk M., Tews G. et al.; The corifollitropin alfa ENSURE study group. Corifollitropin alfa for ovarian stimulation in IVF: a randomized trial in lower-body-weight women // Reprod. Biomed. Online. 2010. Vol. 21, N 1. P. 66-76. DOI: 10.1016/j.rbmo.2010.03.019.

Oktay K., Turkcuoglu I., Rodriguez-Wallberg K.A. GnRH agonist trigger for women with breast cancer undergoing fertility preservation by aromatase inhibitor/FSH stimulation // Reprod. Biomed. Online. 2010. Vol. 20, N 6. P. 783-788.

Pouwer A.W., Farquhar C., Kremer Jan A.M. Long-acting FSH versus daily FSH for women undergoing assisted reproduction // Cochrane Database Syst. Rev. 2012. Vol. 13, N 6. CD009577.

Rustamov O., Smith A., Roberts S.A., Yates A.P., Fitzgerald Ch., Krishman M., Nardo L.G., Pemberton Ph.W. Anti-Mullerian hormone: poor assay reproducibility in a large cohort of subjects suggests sample instability // Hum. Reprod. 2012. Vol. 27, N 10. P. 3085-3091.

Shapiro B.S., Daneshmand S.T., Garner F.C., Aguirre M., Hudson C. Freeze-all can be a superior therapy to another fresh cycle in patients with prior fresh blastocyst implantation failure // Reprod. Biomed. Online. 2014. Vol. 29, Issue 3. P. 286-290.

Shapiro B.S., Daneshmand S.T., Garner F.C., Aguirre M., Hudson C. Clinical rationale for cryopreservation of entire embryo cohorts in lieu of fresh transfer // Fertil. Steril. 2014. Vol. 102. P. 3-9.

Shapiro B.S., Daneshmand S.T., Garner F.C., Aguirre M., Thomas S. Gonadotropin-releasing hormone agonist combined with a reduced dose of human chorionic gonadotropin for final oocyte maturation in ffresh autologous cycles of in vitro fertilization // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 1. P. 231-233.

Shapiro B.S., Garner F.C. Recurrent implantation failure is another indication for the freeze-all strategy // Fertil. Steril. 2017. Vol. 108, N 1. P. 44. DOI: 10.1016/ j.fertnstert.2017.05.018.

Smulders B., van Oirschot S.M., Farquhar C. et al. Oral contraceptive pill, progestogen or estrogen pre-treatment for ovarian stimulation protocols for women undergoing assisted reproductive techniques // Cochrane Database of Syst. Rev. 2010. Vol. 1. CD006109.

Sunkara S.K., Coomarasamy A. Androgen pre-treatment in poor responders undergoing controlled ovarian stimulation and IVF treatment // Fertil. Steril. 2011. Vol. 95. P. 73-74.

Sunkara S.K., Rittenberg V., Raine-Fenning N. et al. Association between the number of eggs and live birth in IVF treatment: an analysis of 400 135 treatment cycles // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26, N 7. P. 1768-1774.

Tarlatzis B.C., Griesinger G., Leader A. et al. Comparative incidence of ovarian hyperstimulation syndrome following ovarian stimulation with corifollitropin alfa or recombinant FSH // Reprod. Biomed. Online. 2012. Vol. 24, N 4. P. 410-419. URL: http://dx.doi.org/10.1016/j.rbmo.2012.01.005.

Tesarik J., Hazout A., Mendoza-Tesarik R. et al. Beneficial effect of luteal-phase GnRH agonist administration on embryo implantation after ICSI in both GnRH agonistand antagonist-treated ovarian stimulation cycles // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 2572-2579.

Zegers-Hochschild F., Adamson G.D., Dyer S., Racowsky C., de Mouzon J. et al. The International glossary on infertility and fertility care // Fertil. Steril. 2017. Vol. 108, N 3. P. 393-406.

Zhao Z., Shi H., Li J., Zhang Y., Chen C., Guo Y. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved following the «ffreeze-all» strategy // Reprod. Biol. Endocrinol. 2020. Vol. 18, N 1. P. 14.

Пациентки с низким овариальным резервом и недостаточным («бедным») ответом на стимуляцию яичников, к сожалению, представляют наиболее многочисленную когорту в клиниках ЭКО.

С практических позиций среди них целесообразно выделить две клинические группы пациенток:

Протоколы ЭКО у данной категории пациенток отличаются следующими основными чертами:

Согласно статистическим данным для того чтобы достичь 75% шанса родов, пациентке 41-42 лет потребуется в среднем 16 протоколов ЭКО, тогда как в возрасте до 35 лет - в среднем 3 лечебных цикла! В качестве примера приведем также данные A. Weghofer и соавт. (2011): в группе пациенток ≤42 лет (средний возраст - 39 лет) с крайне низкими показателями АМГ (0,3 нг/мл) частота беременности на протокол составила 11,0%, частота родов - 10,0%; у пациенток старше 42 лет (средний возраст - 44 года, средний уровень АМГ - 0,2 нг/мл) - 3,7 и 1,7% соответственно.

Для прогнозирования «бедного» ответа яичников и достижения оптимальных результатов лечения в программах ЭКО необходим поиск наиболее информативных маркеров. Анализ ряда исследований продемонстрировал наличие в литературе 41 дефиниции для определения недостаточного овариального ответа на стимуляцию. Авторы справедливо задают риторический вопрос: «Есть ли свет в конце тоннеля для данной категории пациенток?».

В 2011 г. консенсусная группа ESHRE предприняла попытку стандартизации определения «бедного» ответа яичников. Согласно болонским критериям прогностический анализ недостаточного ответа яичников производится при соблюдении двух из нижеперечисленных условий:

Два эпизода «бедного» ответа яичников при использовании максимальных режимов стимуляции в предыдущих программах ЭКО также являются достаточными критериями для постановки данного диагноза.

Ряд авторов ставит под сомнение болонские критерии, аргументируя свои доводы тем, что для прогнозирования успеха программы ЭКО главную роль играет качество, а не количество полученных ооцитов и эмбрионов. Подвергается критике положение о произвольном пороговом значении возраста 40 лет в связи с высоким риском получения эмбрионов с несбалансированным хромосомным набором. Согласно современным представлениям наиболее информативным пороговым критерием эффективности программы ЭКО является возраст женщины 35-37 лет. Так, вероятность получения эуплоидных бластоцист у женщин до 35 лет составляет 60%, прогрессивно снижается до 30% в возрасте 40-42 лет и достигает критического показателя 15% у пациенток старше 42 лет.

При использовании болонских критериев не представляется возможным четкое разграничение между снижением овариального резерва и причиной «бедного» ответа. Для более детальной характеристики рассматриваемого вопроса необходимо упомянуть о таком понятии, как соотношение между количеством полученных ОКК при пункции яичников и КАФ (англ. follicular output rate, FORT). Величина, соответствующая 70%, при снижении показателей овариального резерва рассматривается как оптимальный ответ яичников на стимуляцию.

Нередко в практической деятельности мы сталкиваемся с недостаточным ответом яичников у женщин с сохраненным овариальным резервом. Данное явление может быть обусловлено полиморфизмом рецепторов ФСГ, ЛГ или наличием варианта LH β. Необходимо подчеркнуть, что отсутствие четких рекомендаций для стратегии преодоления «бедного» ответа является главным недостатком болонских критериев.

В 2016 г. для индивидуализации протоколов лечения была разработана классификация POSEIDON (Patient-Oriented Strategies Encompassing Individualized Oocyte Number), основанная на следующих позициях:

С учетом данных критериев авторами выделены четыре клинические группы пациенток (рис. 10-1).

Необходимо упомянуть о таком инструменте, как калькулятор ВРТ (ART-calculator), который позволяет рассчитать необходимое количество ооцитов для получения одной эуплоидной бластоцисты (http://www.groupposeidon.com).

Какие факторы могут оказывать решающее значение при индивидуальном подходе?

Перечислим те из них, которые имеют наибольшее практическое значение.

В настоящее время для повышения результативности программ ЭКО у женщин с недостаточным ответом яичников приоритетными направлениями являются:

На рис. 10-2 даны различные протоколы стимуляции яичников, которые применялись в практике ведения пациенток с «бедным» ответом.

Согласно данным проведенных метаанализов выбор типа аналога ГнРГ для предотвращения преждевременного пика ЛГ у женщин с недостаточным овариальным ответом в программах ЭКО не оказывает влияния на частоту наступления клинической беременности. Необходимо отметить, что применение а-ГнРГ в данной группе ведет к более высокому риску развития полной ре-фрактерности яичников к гонадотропной стимуляции, увеличивает стоимость и длительность лечения. Tаким образом, протоколы с анта-ГнРГ, по сравнению с длинными протоколами с а-ГнРГ, имеют явные преимущества у пациенток с «бедным» ответом.

Возрастание концентрации эстрадиола в сыворотке крови в день введения триггера овуляции и увеличение количества зрелых ооцитов, отмеченное рядом авторов на фоне десенситизации аденогипофиза а-ГнPГ, являются определенным преимуществом. В этом ключе в клинической практике целесообразно проведение стимуляции в коротком и длинном протоколах с микродозами а-ГнРГ. Cущность подобного подхода заключается в использовании низких доз а-ГнPГ [в 2-4 раза ниже стандартной дозы трипторелина (Диферелина^♠ или Декапеп-тила^♠ )]. Положительный эффект данного протокола связывают со снижением эффекта а-ГнPГ на рецепторный аппарат яичников и их супрессию. Протокол на практике используют нечасто.

Модифицированный протокол с анта-ГнРГ. В 1-3-й день менструального цикла вводят 250 мкг/сут анта-ГнPГ, затем стимуляцию проводят по схеме базового протокола с анта-ГнPГ. Pаннее назначение анта-ГнPГ обеспечивает синхронизацию роста фолликулов на старте стимуляции. Протокол используют нечасто.

Протокол с агонистами и антагонистами ГнРГ (long-stop-протокол). Агони-сты назначают с 19-21-го дня менструального цикла до 2-го дня следующего менструального цикла, после чего введение а-ГнPГ прекращают и назначают ГТ. При достижении лидирующим фолликулом диаметра 13-14 мм назначают анта-ГнPГ (до дня введения триггера включительно). Протокол используют в практике нечасто.

Высокие дозы ГТ оправданны, если планируется получение субоптимального числа ооцитов (более 3). В этом случае стартовая доза ГТ может составлять 300 МЕ. Вместе с этим возможно использование не только фиксированной дозы, но и step-down-подхода (стартовая доза - 450 МЕ, поэтапное снижение до 300-150 МЕ к концу стимуляции). Cогласно рекомендациям экспертов ESHRE повышение стартовой дозы ΦCГ более 300 МЕ нецелесообразно, так как сопровождается возрастанием активности образования прогестерона в яичниках, что способствует преждевременному созреванию эндометрия и негативно сказывается на процессе имплантации.

Женщинам старшего возраста со сниженным овариальным резервом яичников и «бедным» ответом в предыдущих попытках лечения E. Kolibianakis и соавт. (2015) назначали препарат корифоллитропин альфа в дозе 150 мкг и фоллитропин бета в дозе 450 МЕ в день. Не было разницы по числу полученных ОКК, хотя количество растущих фолликулов при применении корифоллитропина было большим.

Cтратегия использования больших доз ГТ у женщин с «бедным» ответом яичников в программах ЭКО ассоциирована со значительной медикаментозной нагрузкой, низкой приверженностью пациентов к терапии в связи с болезненностью инъекций и высокой стоимостью циклов лечения. В этом ключе целесообразно рассмотрение протоколов ЭКО в естественном и/или модифицированном менструальном цикле.

ЭКО в естественном цикле. Осуществляют мониторинг роста фолликула, толщины и структуры эндометрия в спонтанном менструальном цикле. Пунктируют единственный фолликул и получают один ооцит. Cпонтанный пик ЛГ может быть выявлен с помощью определения ЛГ, эстрадиола в сыворотке крови (двукратно в течение суток с 7-9-го дня менструального цикла), а также посредством менее точных мочевых тестов.

При таком варианте проведения протокола высока вероятность преждевременной овуляции и не исключена возможность ошибки в определении времени выполнения пункции. Недостатком такого подхода является невозможность планирования работы клиники. Cейчас на практике естественный цикл применяется очень редко, чаще - его модифицированный вариант.

Модифицированный естественный цикл. При достижении лидирующим фолликулом диаметра 17 мм и более назначают триггер финального созревания ооцита. Однако нужно помнить о том, что у пациенток старшего репродуктивного возраста и при сниженном овариальном резерве могут наблюдаться ускоренный рост фолликулов, а также ранняя лютеинизация. Именно поэтому некоторые авторы научных исследований считают целесообразным более раннее назначение триггера (при диаметре фолликула 16 мм).

Для предотвращения преждевременной овуляции при достижении фолликулом диаметра 14 мм в модифицированном цикле могут быть назначены ежедневные инъекции анта-ГнPГ. В качестве средства, препятствующего преждевременному пику ЛГ, может быть использован также индометацин (50 мг 3 раза в сутки со дня достижения лидирующего фолликула 14 мм в диаметре до дня пункции).

Cогласно проведенным метаанализам при данной модификации протокола ЭКО частота родов здоровым доношенным ребенком на лечебный цикл составляет лишь 2,6%. Использование протоколов ЭКО в естественном и/или модифицированном менструальном цикле наиболее эффективно у молодых женщин с недостаточным овариальным ответом и высоким риском развития рефрактерности яичников. Pяд исследователей полагают оптимальным проведение 3-5 лечебных циклов, так как дальнейшее увеличение количества протоколов ЭКО в естественном менструальном цикле не влияет на кумулятивную частоту беременностей.

Протокол с поздним началом введения ГТ (минимальная, «мягкая» стимуляция). При наличии небольшого количества фолликулов (2-3) с 7-го дня менструального цикла подключают ГТ. При достижении лидирующим фолликулом диаметра 13-14 мм назначают анта-ГнPГ (до дня введения триггера включительно). Необходимо отметить, что при сравнении модифицированного естественного цикла и протокола с минимальной стимуляцией не было получено статистически достоверных различий по частоте наступления клинической беременности.

Протоколы с добавлением рЛГ. При таком подходе возможно использование 1-2 ампул в сутки комбинированного препарата, содержащего рΦCГ и рЛГ [фоллитропинальфа + лутропин альфа (Перговерис^♠ ), 1 ампула содержит 150 МЕ ΦCГ и 75 МЕ ЛГ], с 1-го дня стимуляции. Другими вариантами стимуляции является добавление к рΦCГ 75-150 МЕ рЛГ ежедневно с 1-го или 6-го дня стимуляции рΦCГ до дня введения триггера. Назначение ЛГ преследует цель активации андрогенпродуцирующей функции тека-клеток фолликулов, оптимизации фолликуло- и оогенеза.

Протокол с добавлением небольших доз ХГЧ. В этом варианте у пациенток старшего репродуктивного возраста к рΦCГ (в длинном протоколе) ежедневно с начала стимуляции добавляют небольшие дозы ХГЧ (200 МЕ) вплоть до дня введения триггера. Cуществует другой подход - добавление ХГЧ в течение последних дней стимуляции до дня введения триггера в протоколах с анта-ГнРГ, при этом доза рФСГ может быть снижена или введение рФСГ прекращено.

Протокол с антиэстрогенами (Кломифена цитратом ^♠ ), в том числе с назначением ТТ. Кломифена цитрат^♠ применяют со 2-го по 6-й день менструального цикла, ГT - с 5-7-го дня стимуляции; при достижении лидирующим фолликулом диаметра 13-14 мм назначают анта-ГнРГ (до дня введения триггера включительно).

«Японский» протокол (рис. 10-3) относится к категории «мягкой» стимуляции. Кломифен (Кломифена цитрат^♠ ) назначают с 3-го дня цикла до дня, предшествующего введению триггера (50 мг/сут), с 8-го дня цикла - рФСГ или ЧМГT (человеческий менопаузальный гонадотропин) (150 МЕ через день). Tриггер (а-ГнРГ) вводят при наличии соответствующих критериев. Эффективность протокола была продемонстрирована в крупном ретроспективном исследовании (43 433 цикла). Основой такого подхода являются данные о том, что пролонгированный прием Кломифена цитрата^♠ приводит к блокированию позитивной обратной связи и овуляторного пика ЛГ, что, вероятно, может быть обусловлено эффектами его изомеров (в частности, энкломифена) на клетки гипофиза.

По эффективности и безопасности протоколы с антиэстрогенами, в том числе с назначением ГT, и монотерапия ГT не имеют различий.

Протокол с ИА, в том числе в сочетании с ТТ. ИА (например, летрозол в дозе 2,5-5 мг/сут) применяют со 2-го по 6-й день менструального цикла, ГT - с 5-7-го дня стимуляции; при достижении лидирующим фолликулом диаметра 13-14 мм назначают анта-ГнРГ (до дня введения триггера включительно). Исследований, посвященных эффективности данного протокола, мало. Предполагается, что оптимизация фолликулогенеза при использовании ИА обусловлена повышением уровня эндогенного ФСГ (следствие снижения содержания эстрогенов), а также усилением чувствительности рецепторов к ФСГ (следствие повышения уровня андрогенов в яичниках). Показано, что уровень в фолликулярной жидкости тестостерона у пациенток при использовании в протоколе стимуляции ИА в два раза выше по сравнению с таковым у пациенток без ИА (даже спустя неделю после прекращения приема ИА). Эксперты ESHRE ставят под сомнение применение протоколов с ИА в связи с использованием off-label и недостаточным опытом.

Создание криобанка эмбрионов у пациенток с «бедным» ответом является достаточно проблематичным из-за высокого процента неэффективной стимуляции и получения эмбрионов низкого качества.

Протокол с двойной стимуляцией яичников представлен на рис. 10-4. По предварительным результатам F.M. Ubaldi и соавт. (2016), этот подход позволяет увеличить количество получаемых эмбрионов хорошего качества, в том числе эуплоидных. Причем количество бластоцист во время второй стимуляции превышает величину таковых в течение первой стимуляции. Физиологической основой двойной стимуляции являются данные о наличии нескольких волн роста фолликулов у человека. Конечно, при этом протоколе необходима сегментация цикла, витрификация всех эмбрионов хорошего качества и их перенос в крио-протоколе.

«Шанхайский» протокол. Этот протокол (рис. 10-5) также является вариантом двукратной стимуляции яичников в течение одного менструального цикла. С 2-го по 5-й дни цикла назначают летрозол 2,5 мг/сут и Кломифена цитрат^♠ 25 мг/сут. С 6-го дня цикла прием летрозола завершается, подключают инъекции ЧМГT 150 МЕ через день. Прием Кломифена цитрата^♠ продолжается. Tриггер - а-ГнРГ (0,1 мг) назначают при соблюдении стандартных условий. Через 32-36 ч проводят первую пункцию фолликулов. Для профилактики преждевременной овуляции в день введения триггера и на следующие сутки назначают ибупрофен (0,6 г). Cпустя 1-2 дня после первой пункции стимуляцию продолжают с помощью летрозола (2,5 мг/сут) и ежедневных инъекций ЧМГТ (225 МЕ/сут). При достижении лидирующим фолликулом 12 мм прием летрозола прекращают. Медроксипрогестерона ацетат (10 мг/сут) присоединяют с 12-го дня в случае, если к этому времени имеются фолликулы диаметром >14 мм и требуется еще несколько дней для их созревания. Это делают для отсрочки менструации и проведения в этот период второй пункции. Критерии назначения триггера (а-ГнPГ 0,1 мг) являются стандартными. В день введения триггера и на следующие сутки применяют ибупрофен (0,6 г). Через 32-36 ч после введения триггера проводят вторую пункцию.

Cочетанное применение Кломифена цитрата^♠ и летрозола на первом этапе протокола обусловлено возможностью их потенцированного эффекта на рост фолликулов. Прием Кломифена цитрата^♠ до дня введения триггера обусловлено его способностью при длительном приеме к блокированию пика ЛГ. Применение летрозола на втором этапе протокола объясняется его возможностью повышать чувствительность гранулезных клеток фолликулов к ГТ.

Использование соматотропного гормона в схемах стимуляции яичников. В последние годы появились данные об использовании в протоколах стимуляции пациенток со сниженным овариальным резервом соматотропного гормона (CТГ). Применение CТГ основано на том, что данный гормон приводит к увеличению концентрации в фолликулярной жидкости IGF1, оказывающего позитивное влияние на пролиферацию гранулезных клеток, продукцию ими эстрадиола. Pядом исследователей было продемонстрировано улучшение овариальной чувствительности в ответ на экзогенное введение гонадотропинов при использовании гормона роста в протоколах ЭКО, а также увеличение частоты наступления клинических беременностей. Низкая концентрация CТГ в фолликулярной жидкости может быть ассоциирована с увеличением количества нежизнеспособных эмбрионов. C. Mendoza и соавт. (2002) показали, что у женщин с повышенной концентрацией CТГ в фолликулярной жидкости улучшается качество ооцитов и, следовательно, эмбрионов. Дальнейшие работы этой исследовательской группы подтвердили, что повышенная концентрация гормона роста наблюдалась в фолликулярной жидкости ооцитов, которые были выбраны для процедуры переноса эмбрионов, завершившейся наступлением беременности.

По мнению J.L. Yovich и J.D. Stanger (2010), гормон роста, скорее всего, влияет на качество яйцеклетки и эмбриона, а не на их количество.

В ряде исследований было показано, что при высокой концентрации IGF1 в сыворотке крови необходима меньшая доза гонадотропинов для получения адекватного ответа яичников на стимуляцию.

Многочисленные систематические обзоры свидетельствуют о проблеме гетерогенности протоколов стимуляции овуляции и разнообразных режимов дозирования CТГ. Так, в различных исследованиях гормон роста использовали в дозе от 0,5 до 24 МЕ в сутки.

В исследовании К.В. Объедковой (2018) при сравнении эффективности программ ЭКО у 50 пациенток с прогнозом «бедного» ответа были отмечены преимущества добавления рекомбинантного CТГ в дозе 4 МЕ/день (1,33 мг) с первого дня стимуляции до дня введения триггера в протоколах с анта-ГнPГ по сравнению со стандартным протоколом с анта-ГнРГ. Это касалось длительности гонадотропной стимуляции, эффективной дозы гонадотропинов, качества оплодотворения и количества эмбрионов хорошего качества. Автором была выявлена достоверная позитивная корреляция между уровнем IGF1 в фолликулярной жидкости и количеством эмбрионов хорошего качества в день переноса. Кроме этого, была доказана позитивная взаимосвязь между уровнем белка-3, связывающего IGF (IGFBP-3) в фолликулярной жидкости, а также сыворотке крови, и количеством полученных ооцитов, количественными показателями фертилизации и числом перенесенных в полость матки эмбрионов хорошего качества. В группе с сочетанным применением СТГ частота наступления беременности составила 21,7% (в данной работе беременность наступила только при применении протоколов с сочетанным введением СТГ).

Авторы большинства работ, включая аналитические обзоры, основанные на метаанализе клинических исследований, пришли к выводу, что использование гормона роста в программах ЭКО у пациенток со «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами повышает частоту наступления беременности.

В литературе также можно найти упоминание об использовании в протоколах стимуляции яичников пиридостигмина бромида (60 мг 2 раза в сутки со дня назначения ГТ до дня введения триггера), обладающего антихолинэстеразной активностью, усиливающего эффекты ацетилхолина, в том числе в центральной нервной системе (угнетение выработки соматостатина и усиление СТГ). Однако доказательной базы его применения нет.

«Андрогенный прайминг». Снижение ответа яичников на гонадотропную стимуляцию, в том числе у пациенток старшего репродуктивного возраста, возможно, обусловлено снижением продукции андрогенов в тека-клетках яичников. В экспериментальных работах показано, что андрогеновые рецепторы и андрогены имеют особое функциональное значение в фолликулогенезе, первичном рекрутинге фолликулов и их росте, пролиферации клеток гранулезы, ароматазной активности и продукции эстрогенов. В ряде клинических исследований было выявлено, что уровень в крови тестостерона (в пределах нормальных значений) имеет позитивную взаимосвязь с числом полученных ооцитов.

Андрогены обеспечивают своеобразную «подготовку» фолликула к действию ГТ.

В клинической практике существовало два подхода к организации андрогенного прайминга.

По данным Е.В. Крстич и соавт. (2010), в программе ЭКО с использованием стандартного длинного протокола овариальной стимуляции при исходном подтверждении ослабления андрогенсекретирующей функции яичников (концентрация в сыворотке общего тестостерона менее 1 нмоль/л) целесообразно дополнительно назначать тестостеронсодержащий препарат в периоде от начала применения а-ГнРГ (с 21-го дня предыдущего цикла) до момента перехода к овариальной стимуляции с помощью ГТ. При этом андрогенсодер-жащий препарат рекомендуется использовать 1 раз в сутки (по утрам) в дозе 2,5 г геля, содержащего 25 мг тестостерона (1/2 стандартного пакетика, содержащего 5 г геля).

Назначение перед протоколом КОК, эстрогенов, гестагенов. Информация о способе «гомогенизации» пула растущих фолликулов с помощью данных гормональных препаратов приведена выше.

В эмбриологической части протокола у пациенток с «бедным» ответом возможно оплодотворение методом ICSI либо проведение вспомогательного хэтчинга у женщин старшего репродуктивного возраста. Однако данные рекомендации являются весьма индивидуальными. В исследовании I.A. Sfontouris и соавт. (2015) при получении единственного ооцита не было получено статистических различий по проценту фертилизации, частоте получения эмбрионов хорошего качества и наступлению беременности в зависимости от вида оплодотворения (ЭКО; ЭКО/ICSI).

В табл. 10-1 наглядно представлены варианты оптимизации протоколов ЭКО при прогнозировании «бедного» ответа на стимуляцию.

Примечание: ГнРГ - гонадотропин-рилизинг-гормон; «+» - рекомендуемая тактика; «+/→> - возможный вариант тактики; «-» - не рекомендуемая тактика.

В отношении пациенток старшего репродуктивного возраста со сниженным овариальным резервом возможно придерживаться следующих стратегий ведения.

Нельзя забывать о том, что некоторые пациентки нуждаются в подготовке к протоколу ЭКО, лечении патологии, которая может негативно влиять на исход цикла. К ней, безусловно, относятся генитальный эндометриоз, воспалительные заболевания органов малого таза, ожирение. В последние годы были получены отдельные данные, свидетельствующие о важной роли достаточного содержания в организме витамина D, в том числе для осуществления репродуктивной функции.

В табл. 10-2 представлены варианты оптимизации протоколов ЭКО при прогнозировании «бедного» ответа на стимуляцию, согласно мнению экспертной группы POSEIDON.

Примечание: ГН - гонадотропин; ГнРГ - гонадотропин-рилизинг-гормон; ЛГ - лютеинизирующий гормон; ФСГ - фолликулостимулирующий гормон.

Проблема преодоления бесплодия при наличии предикторов слабого («бедного») ответа на стимуляцию, конечно, еще далека от своего научно-практического решения. Отсутствует, например, «идеальный протокол» стимуляции яичников, четко не обоснованы какие-либо подходы подготовки таких пациенток. Тем не менее представленные выше стратегии могут помочь оптимизировать лечение и его результат.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Крстич Е.В., Краснопольская К.В., Кабанова Д.И. Новые подходы к повышению эффективности ЭКО у женщин старшего репродуктивного возраста // Акушерство и гинекология. 2010. № 2. С. 48-53.

Мамедова Н.Р., Назаренко Т.А., Монахова И.В. Препараты, содержащие лютеинизирующий гормон, в программах ВРТ (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2011. № 3. С. 50-55.

Объедкова К.В. Адъювантная терапия препаратами рекомбинантного сомато-тропного гормона для оптимизации протоколов ЭКО у пациенток со «слабым» ответом яичников : автореф. дис. …​ канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 2018. 24 с.

Alviggi C., Clarizia R., Pettersson K. et al. Suboptimal response to GnRHa long protocol is associated with a common LH polymorphism // Reprod. Biomed. Online. 2009. Vol. 18, N 1. P. 9-14.

Ata B., Kaplan B., Danzer H., Glassner M., Opsahl M., Tan S.L. Array CGH analysis shows that aneuploidy is not related to the number of embryos generated // Reprod. Biomed. Online. 2012. Vol. 24. P. 614-620.

Barad D., Brill H., Gleicher N. Update on the use of dehydroepiandrosterone supplementation among women with diminished ovarian function // J. Assist. Reprod. Genet. 2007. Vol. 24. P. 629-634.

Barbosa M.W., Silva L.R., Navarro P.A. et al. Dydrogesterone vs progesterone for luteal-phase support: systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2016. Vol. 48, N 2. P. 161-170.

Bergh C., Hillensjo T., Wikland M. et al. Adjuvant growth hormone treatment during in vitro fertilization: a randomized, placebo-controlled study // Fertil. Steril. 1994. Vol. 62. P. 113-120.

Bosdou J.K., Venetis C.A., Dafopoulos K., Zepiridis L., Chatzimeletiou K., Anifandis G. et al. Transdermal testosterone pretreatment in poor responders undergoing ICSI: a randomized clinical trial // Hum. Reprod. 2016. Vol. 31. P. 977-985.

Bozdag G., Polat M., Yarali I., Yarali H. Live birth rates in various subgroups of poor ovarian responders fulfilling the bologna criteria // Reprod. Biomed. Online. 2017. Vol. 34. P. 639-644.

Choe S.A., Kim M.J., Lee H.J., Kim J., Chang E.M., Kim J.W. et al. Increased proportion of mature oocytes with sustained-release growth hormone treatment in poor responders: a prospective randomized controlled study // Arch. Gynecol. Obstet. 2018. Vol. 297. P. 791-796.

De Geyter C., Fehr P., Moffat R., Gruber I.M., von Wolff M. Twenty years' experience with the Swiss data registry for assisted reproductive medicine: outcomes, key trends and recommendations for improved practice // Swiss Med. Wkly. 2015. Vol. 145. Article ID w14087.

Demirol A., Gurgan T. Comparison of microdose flare-up and antagonist multiple-dose protocols for poor-responder patients: a randomized study // Fertil. Steril. 2009. Vol. 92. P. 481-485.

Dor J., Seidman D.S., Amudai E. et al. Adjuvant growth hormone therapy in poor responders to in-vitro fertilization: a prospective randomized placebo-controlled doubleblind study // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 40-43.

Duffy J.M., Ahmad G., Mohiyiddeen L., Nardo L.G., Watson A. Growth hormone for in vitro fertilization // Cochrane Database Syst. Rev. 2010. Vol. 1. CD000099.

Ebrahimi M., Akbari-Asbagh F., Ghalandar-Attar M. Letrozole + GnRH antagonist stimulation protocol in poor ovarian responders undergoing intracytoplasmic sperm injection cycles: an RCT // Int. J. Reprod. Biomed. (Yazd, Iran). 2017. Vol. 15. P. 101 108.

Eftekhar M., Mohammadian F., Davar R., Pourmasumi S. Comparison of pregnancy outcome after letrozole versus clomiphene treatment for mild ovarian stimulation protocol in poor responders // Iran. J. Reprod. Med. 2014. Vol. 12. P. 725-730.

Ferraretti A.P., Gianaroli L., Motrenko T., Feliciani E., Tabanelli C., Magli M.C. LH pretreatment as a novel strategy for poor responders // Biomed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. Article ID 926172.

Ferraretti A.P., La Marca A., Fauser B.C.J.M. et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria on behalf of the ESHRE working group on poor ovarian response definition // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26. P. 1616-1624.

Gallot V., Berwanger da Silva A.L., Genro V., Grynberg M., Frydman N., Fanchin R. Antral follicle responsiveness to follicle-stimulating hormone administration assessed by the follicular output RaTe (FORT) may predict in vitro fertilization-embryo transfer outcome // Hum. Reprod. 2012. Vol. 27. P. 1066-1072.

Gomaa H., Casper R.F., Esfandiari N., Chang P., Bent Y. Addition of low dose hCG to rFSh benefits older women during ovarian stimulation for IVF // Reprod. Biol. Endocrinol. 2012. Vol. 10. P. 55.

González-Comadran M., Duran M., Sola I. et al. Effects of transdermal testosterone in poor responders undergoing IVF: systematic review and meta-analysis // Reprod. Biomed. Online. 2012. Vol. 25, N 5. P. 450-459.

Goswami S., Das T., Chattopadhyay R., Sawhney V., Kumar J., Chaudhury K. et al. A randomized single-blind controlled trial of letrozole as a low-cost IVF protocol in women with poor ovarian response: a preliminary report // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19, N 9. P. 2031-2035.

Haadsma M.L., Groen H., Mooij T.M., Burger C.W., Broekmans F.J., Lambalk C.B. Miscarriage risk for IVF pregnancies in poor responders to ovarian hyperstimulation // Reprod. Biomed. Online. 2010. Vol. 20. P. 191-200.

Haahr T., Esteves S.C., Humaidan P. Individuilized controlled ovarian stimulation in expected poor-responders: an update // Reprod. Biol. Edocrinol. 2018. Vol. 16, N 1. P. 20.

Huirne J.A., Homburg R., Lambalk C.B. Are GnRH antagonists comparable to agonists for use in IVF? // Hum. Reprod. 2007. Vol. 22. P. 2805-2813.

Humaidan P., Chin W., RogoffD., D’Hooghe T., Longobardi S., Hubbard J. et al. Efficacy and safety of follitropin alfa/lutropin alfa in ART: a randomized controlled trial in poor ovarian responders // Hum. Reprod. 2017. Vol. 32. P. 544-555.

Kim C.H., Ahn J.W., Moon J.W., Kim S.H., Chae H.D., Kang B.M. Ovarian features after 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks transdermal testosterone gel treatment and their associated effect on IVF outcomes in poor responders // Dev. Reprod. 2014. Vol. 18. P. 145-152.

Kim C.H., Howles C.M., Lee H.A. The effect oftransdermal testosterone gel retreatment on controlled ovarian stimulation and IVF outcome in low responders // Fertil. Steril. 2011. Vol. 95. P. 679-683.

Kolibianakis E.M., Venetis C.A., Bosdou J.K., Zepiridis L., Chatzimeletiou K., Makedos A. et al. Corifollitropin alfa compared with follitropin beta in poor responders undergoing ICSI: a randomized controlled trial // Hum. Reprod. 2015. Vol. 30. P. 432-440.

Kolibianakis E.M., Venetis C.A., Diedrich K., Tarlatzis B.C., Griesinger G. Addition of growth hormone to gonadotrophins in ovarian stimulation of poor responders treated by in-vitro fertilization: a systematic review and meta-analysis // Hum. Reprod. Update. 2009. Vol. 15. P. 613-622.

Kotb M.M., Hassan A.M., Awad Allah A.M. Does dehydroepiandrosterone improve pregnancy rate in women undergoing IVF/ICSI with expected poor ovarian response according to the Bologna criteria? A randomized controlled trial // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2016. Vol. 200. P. 11-15.

Kuang Y., Chen Q., Hong Q., Lyu Q., Ai A., Fu Y. et al. Double stimulations during the follicular and luteal phases of poor responders in IVF/ICSI programmes (Shanghai protocol) // Reprod. Biomed. Online. 2014. Vol. 29. P. 684-691.

Kucuk T., Kozinoglu H., Kaba A. Growth hormone cotreatment within a GnRH agonist long protocol in patients with poor ovarian response: a prospective, randomized, clinical trial // J. Assist. Reprod. Genet. 2008. Vol. 25. P. 123-127.

La Marca A., Grisendi V., Giulini S. et al. Individualization of the FSH starting dose in IVF ICSI cycles using the antral follicle count // J. Ovarian Res. 2013. Vol. 6. P. 11-18.

Lambalk C.B., Banga F.R., Huirne J.A., Toftager M., Pinborg A., Homburg R. et al. GnRH antagonist versus long agonist protocols in IVF: a systematic review and meta-analysis accounting for patient type // Hum. Reprod. Update. 2017. Vol. 23. P. 560-579.

Lefebvre J., Antaki R., Kadoch I.J., Dean N.L., Sylvestre C., Bissonnette F. et al. 450 IU versus 600 IU gonadotropin for controlled ovarian stimulation in poor responders: a randomized controlled trial // Fertil. Steril. 2015. Vol. 104. P. 1419-1425.

Lensen S.F., Wilkinson J., Mol B.W.J., La Marca A., Torrance H., Broekmans F.J. Individualised gonadotropin dose selection using markers of ovarian reserve for women undergoing IVF/ICSI // Cochrane Database Syst. Rev. 2017. Vol. 6. CD012693.

Li X.L., Wang L., Lv F., Huang X.M., Wang L.P., Pan Y. et al. The influence of different growth hormone addition protocols to poor ovarian responders on clinical outcomes in controlled ovary stimulation cycles: a systematic review and meta-analysis // Medicine. 2017. Vol. 96. Article ID e6443.

Malchau S.S., Henningcen A.A., Loft A., Rasmussen S., Forman J., Nyboe Andersen A. The long-term prognosis for live birth in couples initiating fertility treatments // Hum. Reprod. 2017. Vol. 32. P. 1439-1449.

Massin N., Cedrin-Durnerin I., Coussieu C. et al. Effects of transdermal testosterone application on the ovarian response to FSH in poor responders undergoing assisted reproduction technique - a prospective, randomized, double-blind study // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 1204-1211.

Mendoza C., Ruiz-Requena E., Ortega E. et al. Follicular fluid markers of oocyte developmental potential // Hum Reprod. 2002. Vol. 17. P. 1017-1022.

Merviel P., Cabry-Goubet R., Lourdel E., Devaux A., Belhadri-Mansouri N., Copin H. et al. Comparative prospective study of 2 ovarian stimulation protocols in poor responders: effect on implantation rate and ongoing pregnancy // Reprod. Health. 2015. Vol. 12. P. 52.

Morgia F., Sbracia M., Schimberni M., Giallonardo A., Piscitelli C., Giannini P. et al. A controlled trial of natural cycle versus microdose gonadotropin-releasing hormone analog flare cycles in poor responders undergoing in vitro fertilization // Fertil. Steril. 2004. Vol. 81. P. 1542-1547.

Nagels H.E., Rishworth J.R., Siristatidis C.S., Kroon B. Androgens (dehydroepiand-rosterone or testosterone) for women undergoing assisted reproduction // Cochrane Database Syst. Rev. 2015. Vol. 11. CD009749.

Narkwichean A., Maalouf W., Baumgarten M., Polanski L., Raine-Fenning N., Campbell B. et al. Efficacy of Dehydroepiandrosterone (DHEA) to overcome the effect of ovarian ageing (DITTO): A proof of principle double blinded randomized placebo controlled trial // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2017. Vol. 218. P. 39-48.

Ob’edkova K., Kogan I., Krikheli I., Dzhemlikhanova L., Muller V. et al. Growth hormone co-treatment in IVF/ICSI cycles in poor responders // Gynecol. Endocrinol. 2017. Vol. 33, suppl. 1. P. 15-17.

Owen E.J., Shoham Z., Mason B.A. et al. Cotreatment with growth hormone, after pituitary suppression, for ovarian stimulation in in vitro fertilization: a randomized, double-blind, placebo-control trial // Fertil. Steril. 1991. Vol. 56. P. 1104-1110.

Poseidon Group; Alviggi C., Andersen C.Y. et al. A new more detailed stratification of low responders to ovarian stimulation: from a poor ovarian response to a low prognosis concept // Fertil. Steril. 2016. Vol. 105, N 6. P. 1452-1453.

Prizant H., Gleicher N., Sen A. Androgen action in the ovary: balance is key // J. Endocrinol. 2014. Vol. 222. P. R141-R151.

Sallam H.N., Ezzeldin F., Agameya A.-F., Abdel-Rahman A.F., El-Garem Y. The definition of «poor response»: bologna criteria // Hum. Reprod. 2012. Vol. 27. P. 626-627.

Schimberni M., Ciardo F., Schimberni M., Giallonardo A., De Pratti V., Sbracia M. Short gonadotropin releasing hormone agonist versus flexible antagonist versus clomiphene citrate regimens in poor responders undergoing in vitro fertilization: a randomized controlled trial // Eur. Rev. Med. Pharmасol. Sci. 2016. Vol. 20. P. 4354-4361.

Sfontouris I.A., Kolibianakis E.M., Lainas G.T., Navaratnarajah R., Tarlatzis B.C., Lainas T.G. Live birth rates using conventional in vitro fertilization compared to intracytoplasmic sperm injection in Bologna poor responders with a single oocyte retrieved // J. Assist. Reprod. Genet._2015. Vol. 32, N 5. P. 691-697.

Suikkari A., MacLachlan V., Koistinen R. et al. Double-blind placebo controlled study: human biosynthetic growth hormone for assisted reproductive technology // Fertil. Steril. 1996. Vol. 65. P. 800-805.

Sunkara S.K., Coomarasamy A. Androgen pre-treatment in poor responders undergoing controlled ovarian stimulation and IVF treatment // Fertil. Steril. 2011. Vol. 95. P. 73-74.

Sunkara S.K., Pundir J., Khalaf Y. Effect of androgen supplementation or modulation on ovarian stimulation outcome in poor responders: a meta-analysis // Reprod. Biomed. Online. 2011. Vol. 22. P. 545-555.

Sunkara S.K., Rittenberg V., Raine-Fenning N., Bhattacharya S., Zamora J., Coomarasamy A. Association between the number of eggs and live birth in IVF treatment: an analysis of 400135 treatment cycles // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26. P. 1768-1774.

Teramoto S., Kato O. Minimal ovarian stimulation with clomiphene citrate: a large-scale retrospective study // Reprod. Biomed. Online. 2007. Vol. 15, N 2. P. 134-148.

Ubaldi F.M. et al. Follicular versus luteal phase ovarian stimulation during the same menstrual cycle (DuoStim) in a reduced ovarian reserve population results in a similar euploid blastocyst formation rate: new insight in ovarian reserve exploitation // Fertil. Steril. 2016. Vol. 105, N 6. P. 1488-1495.

Vaiarelli A., Cimadomo D., Trabucco E., Vallefuoco R., Buffo L., Dusi L. et al. Double Stimulation in the Same Ovarian Cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis // Front. Endocrinol. 2018. Vol. 9. P. 317.

Weghofer A., Dietrich W., Barad D.H., Gleicher N. Live birth chances in women with extremely low-serum anti-Mullerian hormone levels // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26. P. 1905-1909.

Wiser A., Gonen O., Ghetler Y. et al. Addition of dehydroepiandrosterone (DHEA) for poor-responder patients before and during IVF treatment improves the pregnancy rate: a randomized prospective study // Hum. Reprod. 2010. Vol. 10. P. 2496-2500.

Xiao J., Chang S., Chen S. The effectiveness of gonadotropin-releasing hormone antagonist in poor ovarian responders undergoing in vitro fertilization: a systematic review and meta-analysis // Fertil. Steril. 2013. Vol. 100, N 6. P. 1594-1601.e1-e9.

Yeung T., Chai J., Li R., Lee V., Ho P.C., Ng E. A double-blind randomised controlled trial on the effect of dehydroepiandrosterone on ovarian reserve markers, ovarian response and number of oocytes in anticipated normal ovarian responders // BJOG. 2016. Vol. 123. P. 1097-1105.

Younis J.S., Ben-Shlomo I. The bologna criteria for poor ovarian response: a contemporary critical appraisal // J. Ovarian Res. 2015. Vol. 8. P. 76.

Yovich J.L., Stanger J.D. Growth hormone supplementation improves implantation and pregnancy productivity rates for poor-prognosis patients undertaking IVF // Reprod. Biomed. Online. 2010. Vol. 21. P. 37-49.

Техника пункции фолликулов в программах ЭКО за годы, прошедшие с первой удачной программы в 1970 г., значительно изменилась. Так, если в 70-х годах ХХ в. проводилась аспирация ооцитов с помощью лапароскопии и соответствующих инструментов, то в 1982 г. Сьюзан Ленц и Юрген Дж. Лауритсен опубликовали сообщение о проведении трансабдоминальной аспирации ооцитов уже с помощью пункционной иглы под ультразвуковым контролем. Через год, в 1983 г., они опубликовали данные о проведении забора ооцитов трансвагинальным доступом под ультразвуковым контролем с использованием абдоминального датчика.

В 1985 г. применили современную модификацию метода - трансвагинальную пункцию с использованием ультразвукового вагинального датчика. Трансабдоминальный доступ в настоящее время используется крайне редко. Основанием для выбора такого варианта вмешательства является обычно нетипичное расположение яичников, при котором имеется высокий риск повреждения органов малого таза при проведении трансвагинального доступа. Это может наблюдаться при значительном увеличении матки (миоме матки, аденомиозе); после ранее проведенной хирургической транспозиции яичников (например, перед проведением лучевой терапии); при выраженных формах спаечной болезни органов малого таза, а также аномалиях развития полового аппарата.

Пункционную иглу обычно прикрепляют к трансвагинальному ультразвуковому датчику.

На экране ультразвукового монитора устанавливают режим с наличием трассировки для определения положения пункционной иглы в полости малого таза. Необходимо отметить тот факт, что пункционная игла является гипер-эхогенным объектом, поэтому достаточно хорошо визуализируется и при отсутствии трассировки. При выполнении манипуляции необходимо внимательно следить за концом иглы.

Аспирационные иглы. Существует несколько вариантов аспирационных игл, отличающихся друг от друга следующими основными характеристиками:

Рекомендуются к использованию иглы длиной 25-35 см, толщиной 17-20 G при давлении аспирации 150-200 мм рт.ст. (Horne R., 1996; Клинические рекомендации …​ , 2018).

Процедуру пункции фолликулов планируют через 34-36 ч после введения триггера финального созревания ооцитов и начинают с этапа идентификации пациентки (фамилия, имя и отчество, номер карты, при наличии - идентификация с использованием сканирования электронных кодов на карте и лабораторных предметах).

Перед началом процедуры необходимо попросить пациентку опорожнить мочевой пузырь, после чего провести УЗИ для оценки состояния яичников, наличия предовуляторных фолликулов.

Обработка слизистой оболочки влагалища растворами антисептиков не рекомендована из-за опасения возникновения токсического влияния на полученные ооциты. Наиболее часто используют стерильный изотонический раствор натрия хлорида или стерильную воду; при необходимости применения антисептика в завершение тщательно удаляют остатки антисептика изотоническим раствором натрия хлорида (стерильной водой).

Техника пункции. Непосредственно процедура заключается во введении в верхний боковой свод влагалища ультразвукового датчика с проводником для иглы. При этом в типичном случае достигается максимальное приближение датчика к яичнику. Игла соединена с аспирационной помпой (ранее репродуктологи нередко использовали аспирацию в cтерильный шприц). После проведения иглы через ткани влагалища и ткань яичника начинают аспирацию фолликулярной жидкости.

Количество проколов в стенке влагалища и яичнике должно быть сведено к минимуму.

При технической возможности пункция всех фолликулов в одном яичнике может быть проведена без повторяющихся прохождений иглы через стенку влагалища и капсулу яичника.

Кончик иглы должен быть постоянно визуализирован на экране монитора при эхографии.

Фолликулярную жидкость помещают в специальные подогреваемые пробирки или контейнеры, в которых поддерживается температура 37 °С до доставки в эмбриологическую лабораторию.

Возможно проведение аспирации фолликулярной жидкости из всех фолликулов без параллельной оценки эмбриологом содержимого на предмет наличия ооцитов, или же фолликулярную жидкость каждого из 1-2 фолликулов осматривает эмбриолог, и репродуктолог получает информацию о присутствии ооцита.

Аспирация всей фолликулярной жидкости без немедленной констатации наличия ооцита не дает возможность проводить промывание полости фолликулов, но значительно сокращает длительность процедуры, уменьшая дозу использованных для обезболивания препаратов.

Важно обеспечить быструю и четкую доставку фолликулярной жидкости на стол эмбриолога.

Промывание полости фолликулов. Влияет ли промывание полости фолликулов на исходы программ ЭКО, определить трудно в связи с отсутствием исследований, построенных на анализе достаточного числа наблюдений, в то же время при оценке количества полученных ооцитов в зависимости от выполнения промывания полости фолликулов не получено достоверных отличий, как и по частоте побочных эффектов. При этом следует отметить, что в программах ЭКО в естественном цикле или при минимальной стимуляции промывание фолликулов позволяет получить большее количество ооцитов. Показано, что у женщин и с нормальным ответом, и при «бедном» ответе на стимуляцию применение двухпросветных игл с системой промывания фолликулов при трансвагинальной пункции не увеличивает число получаемых ооцитов, но длительность манипуляции возрастает (соответственно, увеличивается длительность анестезиологического пособия в случаях общей анестезии) (Von Horn K. et al., 2017), как и при проведении промывания полости фолликулов однопросветными иглами (Roque M. et al., 2012; Mok-Lin E. et al., 2013).

Антибиотикопрофилактика. Профилактическое применение антибиотиков при пункции фолликулов проводят в среднем половина репродуктологов. Возможно однократное внутривенное введение антибактериальных препаратов широкого спектра действия (полусинтетических пенициллинов, цефалоспоринов) во время процедуры пункции фолликулов или применение таблетиро-ванных форм в последующие после пункции дни (до дня переноса эмбрионов).

Осложнения. Ежегодно в мире проводят более 1 млн циклов ЭКО (Adamson G. et al., 2017). Трансвагинальная пункция фолликулов относится к категории малоинвазивных хирургических процедур, однако все-таки имеющей риски осложнений.

Согласно данным Европейской ассоциации репродуктологов и эмбриологов (2019) осложнения при трансвагинальной пункции фолликулов встречаются в 0,17% циклов, в том числе кровотечения (0,11%), инфекционные осложнения (0,013%) и другие (0,038%). Из трех описанных летальных исходов осложнений программ ВPТ ни один не был связан с процедурой трансвагинальной пункции. Наиболее тяжелые осложнения встречаются крайне редко и публикуются в виде клинических случаев (Kupka M.S., 2014).

Наиболее частые виды осложнений процедуры трансвагинальной пункции фолликула - это кровотечения (из стенки влагалища или внутрибрюшные).

Кровотечение из стенки влагалища описывают с различной частотой - от 8,6% (Bennett S.J. et al., 1993) или 2-3% (Ludwig A.K. et al., 2006) до 0,5-7,5% (Seyhan A. et al., 2014), при этом такое кровотечение останавливается в большинстве случаев спонтанно или после локальной компрессии и крайне редко требует наложения швов (в 0,008%, по данным Levi-Setti P.E. и соавт., 2018). Не диагностированные своевременно кровотечения из стенки влагалища могут приводить к формированию гематомы.

Частота внутрибрюшных кровотечений составляет 0,2% (Levi-Setti P.E. et al., 2018). В процессе проведения пункции фолликулов неизбежно происходит повреждение сосудов яичников, что сопровождается определенной кровопотерей. Кровопотеря при трансвагинальной пункции при неосложненном течении в среднем составляет 72 мл (от 8 до 162 мл) (Ragni G. et al., 2009). В то же время кровопотеря до 230 мл в течение 24 ч после процедуры встречается у значительного числа женщин. Pеже кровотечение из яичника может приводить к массивному внутрибрюшному кровотечению.

Кровотечение в полости малого таза описывают в 0,06-0,7% пункций (Bennett S.J. et al., 1993; Ludwig A.K. et al., 2006), при этом госпитализация требуется в 0,2% случаев, а хирургическое вмешательство - в 0,1% случаев (Levi-Setti P.E. et al., 2018). Кровотечение, как правило, возникает при повреждении сосудов яичников или при разрыве фолликулов и значительно реже - в результате травмы органов малого таза (матки, мочевого пузыря, кишечника). Pанение сосудов малого таза описано в 0,04% пункций (Bennett S.J. et al., 1993).

Pиск острого кровотечения из яичника существенно выше при СПЯ, СГЯ, у женщин с оперативными вмешательствами на органах малого таза в анамнезе.

Иногда кровотечение может быть ассоциировано с нарушениями коагуляции - при тромбоцитопениях, дефиците факторов коагуляции, в том числе при болезни Виллебранда, при приеме препаратов-антикоагулянтов.

Из редких видов осложнений, связанных с кровотечениями, описаны гематома мочевого пузыря, встречающаяся с частотой 0,03%, и гематома параметрия (Souza M.D.C.B. et al., 2019).

Для проведения первичной профилактики кровотечений при трансвагинальной пункции фолликулов необходимо оценивать состояние свертывающей системы крови, особенно у женщин, имеющих факторы риска. При выполнении манипуляции следует предусмотреть использование тонких аспирационных игл, минимальное число проколов стенок влагалища и яичников и возможность использования цветного допплеровского картирования для визуализации сосудов.

Воспаление в полости малого таза после проведения пункции фолликулов занимает второе место после кровотечений и описывается с частотой от 0,03 до 0,6% (Bennett S.J. et al., 1993; Dicker D. et al., 1993; Levi-Setti P.E. et al., 2018); в осложненных случаях может приводить к формированию септического состояния. Несмотря на низкую частоту, эти осложнения требуют госпитализации в 60% случаев и наибольшей длительности пребывания в стационаре (Levi-Setti P.E. et al., 2018). В основе данного осложнения может лежать контаминация вагинальным содержимым. К факторам риска воспалительных осложнений относят: воспалительные заболевания органов малого таза (в том числе наличие гидросальпинкса), тяжелые формы эндометриоза (в том числе наличие эндометриомы яичника), спаечную болезнь органов малого таза. Случайная перфорация пункционной иглой гидросальпинкса или стенки кишки может стать причиной развития септицемии. Наиболее частый симптом при развитии воспалительного процесса после пункции - болевой синдром (Recommendations …​ , 2019).

Формирование абсцесса яичника и признаки перитонита являются показаниями для оперативного вмешательства. Абсцесс яичника, как правило, описывают после проведения пункции эндометриоидных кист (Padilla S.L., 1993). Однако возникновение этого осложнения рассматривается и после проведения стандартной пункции (Ben Saad M. et al., 2010; Sharpe K. et al., 2006). Данное осложнение требует немедленного оперативного вмешательства, дренирования малого таза. Сохранение пораженного яичника является проблематичным. Большая часть случаев абсцесса после пункции фолликулов, представленных в периодической медицинской литературе, произошла у женщин с тяжелыми формами эндометриоза (Romero B. et al., 2013).

Профилактическое применение антибиотиков показано у женщин с наличием факторов риска развития инфекционных осложнений.

Несмотря на то что традиционная техника выполнения манипуляции позволяет постоянно визуализировать иглу, вводимую в полость малого таза, описаны редкие случаи ранений органов малого таза - в первую очередь мочевого пузыря (Jayakrishnan K., 2011; Modder J., 2006; Aisuodionoe-Shadrach O.I., 2010), реже - мочеточника (Ludwig A.K. et al., 2006; Grynberg M., 2011; Fiori O. et al., 2006; Gurbuz A.S., Cenker A., 2019λ Основной симптом при этих видах осложнений - гематурия, которая может появляться уже в первые часы после пункции или отсроченно - на 2-3-е сутки; в большинстве случаев оперативное вмешательство не требуется (Levi-Setti P.E. et al., 2018). Описан случай ранения мочеиспускательного канала с формированием гематомы влагалища.

Pанения органов малого таза в ряде случаев могут оставаться недиагно-стированными и приводить к формированию, в частности, мочеточниково-влагалищного свища; также описан случай острой обструкции мочеточника вследствие ранения, потребовавший экстренного стентирования (Miller P.B. et al., 2002).

К единичным редким осложнениям можно отнести перфорацию аппендикса (Akman M.A. et al., 1995).

Тромбоэмболические осложнения пункции фолликулов описаны только в случаях тяжелых форм синдрома гиперстимуляции яичников (Griesinger G. et al., 2011).

Частота осложнений, связанных с анестезиологическим пособием, составляет по разным оценкам от 0 до 0,36%. Осложнения анестезиологического пособия включают гипотензию, пневмоторакс, отек легких, аллергические реакции, тошноту. Описаны такие тяжелые формы, как фибрилляция предсердий, сердечная недостаточность (Ludwig A.K. et al., 2006, Levi-Setti P.E. et al., 2018).

Среди факторов риска развития осложнений пункции фолликулов, помимо описанных выше, следует указать большое количество пунктируемых фолликулов, значительную длительность процедуры и высокий показатель, вычисленный как среднее время пункции в расчете на один полученный ооцит, небольшой практический опыт хирурга, молодой возраст пациентки с низким индексом массы тела (Levi-Setti P.E. et al., 2018).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Клинические рекомендации (протокол лечения). Вспомогательные репродуктивные технологии и искусственная инсеминация. Москва, 2018.

Adamson G., De Mouzon J., Dyer S., Chambers G., Ishihara O., Banker M. et al. ICMART World Report 2013 // Hum. Reprod. 2017. Vol. 32. P. i64-i65.

Aisuodionoe-Shadrach O.I. Massive exsanguinating hematuria - a rare postoperative complication of transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval for in vitro fertilization // BJUI. 2010. Nov 25.

Akman M.A., Katz E., Damewood M.D., Ramzy A.I., Garcia J.E. Perforated appendicitis and ectopic pregnancy following in-vitro fertilization // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 3325-3326.

Ben Saad M., Attia L., Ben Temime R., Kilani M., Makhlouf T., Chachia A. et al. Ovarian abscess as a complication of assisted reproduction techniques: a case report // Tunis. Med. 2010. Vol. 88, N 4. P. 285-287.

Bennett S.J., Waterstone J.J., Cheng W.C., Parsons J. Complications of transvaginal ultrasound-directed follicle aspiration: a review of 2670 consecutive procedures // J. Assist. Reprod. Genet. 1993. Vol. 10. P. 72-77. DOI: 10.1007/BF01204444.

Cirillo F., Zannoni E., Scolaro V., Mulazzani G.E.G., Mrakic Sposta F., De Cesare R. et al. Successful pregnancy complicated by adnexal torsion after IVF in a 45-year-old woman // Gynecol. Obstet. Case Rept. 2016. Vol. 2. P. 4.

Coroleu B., Lopez Mourelle F., Hereter L., Veiga A., Calderón G., Martinez F. et al. Ureteral lesion secondary to vaginal ultrasound follicular puncture for oocyte recovery in in-vitro fertilization // Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 948-950.

Dicker D., Ashkenazi J., Feldberg D., Levy T., Dekel A., Ben-Rafael Z. Severe abdominal complications after transvaginal ultrasonographically guided retrieval of oocytes for in vitro fertilization and embryo transfer // Fertil. Steril. 1993. Vol. 59. P. 1313-1315.

Fiori O., Cornet D., Darai E., Antoine J.M., Bazot M. Uro-retroperitoneum after ultrasound-guided transvaginal follicle puncture in an oocyte donor: a case report // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 2969-2971.

Fugita O.E., Kavoussi L. Laparoscopic ureteral reimplantation for ureteral lesion secondary to transvaginal ultrasonography for oocyte retrieval // Urology. 2001. Vol. 58. P. 281.

Griesinger G., Schultz L., Bauer T., Broessner A., Frambach T., Kissler S. Ovarian hyperstimulation syndrome prevention by gonadotropin-releasing hormone agonist triggering of final oocyte maturation in a gonadotropin-releasing hormone antagonist protocol in combination with a «ffreeze-all» strategy: a prospective multicentric study // Fertil. Steril. 2011. Vol. 95. P. 2029-2033.e1.

Grynberg M., Berwanger A.L., Toledano M., Frydman R., Deffieux X., Fanchin R. Ureteral injury after transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval: a complication of in vitro fertilization-embryo transfer that may lurk undetected in women presenting with severe ovarian hyperstimulation syndrome // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96. P. 869-871.

Gurbuz A.S., Cenker A. Iatrogenic ureteral obstruction during transvaginal oocyte retrieval // Int. Braz. J. Urol. 2019. Vol. 45, N 2. P. 396-399. DOI: 10.1590/S1677-5538. IBJU.2018.0692.

Healy M.W., Hill M.J., Levens E.D. Optimal oocyte retrieval and embryo transfer techniques // Semin. Reprod. Med. 2015. Vol. 33. P. 83-91.

Horne R., Bishop C.J., Reeves G., Wood C., Kovacs G.T. Aspiration of oocytes for in-vitro fertilization // Hum. Reprod. Update. 1996. Vol. 2. P. 77-85.

Jayakrishnan K., Raman V.K., Vij ayalakshmi V.K., Baheti S., Nambiar D. Massive hematuria with hemodynamic instability - complication of oocyte retrieval // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96. P. e22-e24.

Kupka M.S., Ferraretti A.P., de Mouzon J., Erb K., D’Hooghe T., Castilla J.A. et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: results generated from European registers by ESHRE // Hum. Reprod. 2014. Vol. 29. P. 2099-2113.

Levi-Setti P.E., Cirillo F., Scolaro V., Morenghi E., Heilbron F., Girardello D. et al. Appraisal of clinical complications after 23,827 oocyte retrievals in a large assisted reproductive technology program // Fertil. Steril. 2018. Vol. 109, N 6. P. 1038-1043.e1.

Ludwig A.K., Glawatz M., Griesinger G., Diedrich K., Ludwig M. Perioperative and post-operative complications of transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval: prospective study of >1000 oocyte retrievals // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 3235-3240.

Miller P.B., Price T., Nichols J.E. Jr., Hill L. Acute ureteral obstruction following transvaginal oocyte retrieval for IVF // Hum. Reprod. 2002. Vol. 17. P. 137-138.

Modder J., Kettel L.M., Sakamoto K. Hematuria and clot retention after transvaginal oocyte aspiration: a case report // Fertil. Steril. 2006. Vol. 86. P. 720.e1-e2.

Mok-Lin E., Brauer A.A., Schattman G., Zaninovic N., Rosenwaks Z., Spandorfer S. Follicular flushing and in vitro fertilization outcomes in the poorest responders: a randomized controlled trial // Hum. Reprod. 2013. Vol. 28. P. 2990-2995.

Padilla S.L. Ovarian abscess following puncture of an endometrioma during ultrasound-guided oocyte retrieval // Hum. Reprod. 1993. Vol. 8. P. 1882-1883.

Ragni G., Scarduelli C., Calanna G., Santi G., Benaglia L., Somigliana E. Blood loss during transvaginal oocyte retrieval // Gynecol. Obstet. Invest. 2009. Vol. 67. P. 32-35.

Recommendations for Good Practice in Ultrasound: Oocyte Pick-up. Recommendations of the European Society of Human Reproduction and Embriology. 2019.

Romero B., Aibar L., Navarro L.M.D., Fontes J., Calderón M.A., Mozas J.M.D. Pelvic abscess after oocyte retrieval in women with endometriosis: a case series // Iran. J. Reprod. Med. 2013. Vol. 11, N 8. P. 677-680.

Roque M., Sampaio M., Geber S. Follicular flushing during oocyte retrieval: a systematic review and meta-analysis // J. Assist. Reprod. Genet. 2012. Vol. 11. P. 1249-1254.

Seyhan A., Ata B., Son W.Y., Dahan M.H., Tan S.L. Comparison of complication rates and pain scores after transvaginal ultrasound-guided oocyte pickup procedures for in vitro maturation and in vitro fertilization cycles // Fertil. Steril. 2014. Vol. 101. P. 705-709. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2013.12.011.

Sharpe K., Karovitch A.J., Claman P., Suh K.N. Transvaginal oocyte retrieval for in vitro fertilization complicated by ovarian abscess during pregnancy // Fertil. Steril. 2006. Vol. 86. P. 219.e11-e13.

Souza M.D.C.B., Souza M.M., Antunes R.A., Tamm M.A., Silva J.B.D., Man-cebo A.C.A. Bladder hematoma: a complication from an oocyte retrieval procedure // JBRA Assist. Reprod. 2019. Vol. 23, N 1. P. 75-78. DOI: 10.5935/1518-0557.20180086.

Von Eye Corleta H., Moretto M., D’Avila A.M., Berger M. Immediate ureterovaginal fistula secondary to oocyte retrieval - a case report // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 5. P. 2006.e1-e3. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2008.03.005.

Von Horn K., Depenbusch M., Schultze-Mosgau A., Griesinger G. Randomized, open trial comparing a modified double-lumen needle follicular flushing system with a single-lumen aspiration needle in IVF patients with poor ovarian response // Hum. Reprod. 2017. Vol. 32, N 4. P. 832-835. DOI: 10.1093/humrep/dex019.

Безопасность пациентки при проведении анестезии во время пункции яичников определяется предварительным осмотром с выбором оптимального метода обезболивания.

Адекватная анестезия должна:

ОСМОТР АНЕСТЕЗИОЛОГОМ

Осмотр анестезиологом включает оценку состояния пациентки: сбор анамнеза (аллергологического, наследственного, фармакологического и социально-психологического); исследование объективного статуса; анализ лабораторно-функциональных и специальных методов исследования.

При сборе анамнеза с целью оценки риска анестезии и операции особое внимание следует уделять вредным привычкам, наличию аллергических реакций на фармацевтические препараты, наследственной и сопутствующей патологии, принимаемой медикаментозной терапии.

Перечень лабораторно-функциональных методов прежде всего определяется возрастом и характером сопутствующих заболеваний. В любом случае необходимы общий анализ крови, мочи, определение группы крови. У больных старше 40 лет оценивают данные ЭКГ, содержание сахара в крови.

Пациенток с поливалентной аллергией после тщательного сбора как общего, так и аллергологического анамнеза целесообразно проконсультировать у аллерголога с обязательной проверкой на индивидуальную переносимость местных и общих анестетиков.

Противопоказаниями к проведению общей анестезии в амбулаторных условиях являются:

Состояние пациента определяют по шкале Американского общества анестезиологов (ASA physical status classification system).

Безопасно проводить амбулаторно анестезию только у пациенток, относящихся к I и II классу ASA (табл. 12-1).

Примечание: ИМТ - индекс массы тела; ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

Прием медикаментов утром в день пункции яичников. Прием таких препаратов, как стероидные гормоны, β-адреноблокаторы, антагонисты кальция, трициклические антидепрессанты, ингибиторы МАО, в большинстве случаев отменять нельзя. Хотя ингибиторы АПФ и блокаторы рецепторов ангиотензина II доказанно замедляют прогрессирование гипертонической болезни, повышают качество жизни и снижают летальность, использование данных препаратов в предоперационном периоде может быть связано с такими неблагоприятными явлениями, как гипотензия и послеоперационная почечная дисфункция. В связи с этим от утреннего приема блокаторов АПФ следует воздержаться (Ломиворотов В.В. и др., 2018). Пациентки с сахарным диабетом 1-го типа должны скорректировать дозу инсулина в связи с периоперационным голоданием; прием гипогликемических препаратов из группы бигуанидов утром перед операцией пропускают.

В ходе предоперационной беседы с пациентками следует провести психопрофилактическую подготовку: выяснить их отношение к предстоящему оперативному вмешательству, психоэмоциональное состояние, избавить от страха вниманием, разъяснением сути предстоящей анестезии, информировать обо всех возможных предстоящих ощущениях от момента постановки системы для внутривенных инфузий до пробуждения, убедить пациентку в безболезненном проведении операции и безопасности анестезии.

Режим питания. Питье воды следует разрешать вплоть до 2 ч до пункции (1А). Прием твердой пищи должен быть закончен за 6 ч до пункции (1А). Данные рекомендации распространяются на пациенток с ожирением, гастроэзофаге-альным рефлюксом, страдающих сахарным диабетом. После анестезии должно быть разрешено возобновить питье, как только пациентки пожелают (1А) (Smith I. et al., 2017).

Премедикация. С целью уменьшения послеоперационной сонливости премедикацию можно не проводить. Рутинное назначение атропина не рекомендовано, так как его использование способно вызвать тахикардию и создает опасность гипертермии. Если при индукции в анестезию развивается брадикардия (ЧСС ≤50), то атропин может быть введен внутривенно. Нет необходимости применять его и для предупреждения гиперсекреции. Исключение составляет анестезия кетамином.

Мониторинг. При проведении анестезии в амбулаторных условиях обязательно соблюдение стандарта минимального мониторинга с постоянным контролем оксигенации (пульсоксиметрия) и вентиляции (капнография), пульса и артериального давления (АД) (1 раз в 5 мин, при необходимости - чаще). Для контроля глубины седации и предотвращения эпизодов интранаркозно-го пробуждения целесообразно использовать BIS-мониторинг (Urfalioglu A. et al., 2017).

Инфузионная терапия. Все пациентки перед пункцией в той или иной степени дегидратированы. В первые часы без приема пищи и жидкости человек теряет воду в объеме примерно 3 мл/(кг ? ч). Если не компенсировать дефицит воды и электролитов, учитывая, что после операции возможны рвота и анорек-сия, то могут возникнуть неблагоприятные последствия в связи с усугублением дегидратации. Для компенсации потерь во время операции обычно достаточно инфузии раствора Рингера^♠ , 5% раствора Глюкозы^♠ , 0,9% раствора натрия хлорида либо других кристаллоидных растворов в объеме 2-4 мл/(кг ? ч). Если пациент не принимал жидкость 6 ч, то дефицит воды у него достиг 18 мл/кг. В связи с этим целесообразно к объему, необходимому во время операции, добавить половину исходного дефицита (9 мл/кг), то есть в течение первого часа необходимый объем инфузии должен составить до 12 мл/кг. Остальной дефицит может быть восполнен либо внутривенно в последующий час, либо через рот, если после пробуждения прием жидкости не сопровождается тошнотой и рвотой. В большинстве случаев больные хорошо переносят прием и обычной, и минеральной воды. Если прием воды провоцирует рвоту, то отпускать пациентку домой нельзя и следует продолжить внутривенную инфузию.

БОЛЬ ВО ВРЕМЯ ПУНКЦИИ ЯИЧНИКОВ

Степень дискомфорта пациентки и болезненности при пункции яичников определяется тремя факторами: психоэмоциональным состоянием, болевым порогом, а также техническими особенностями процедуры (количеством фолликулов и их «доступностью»). Часто процедуры ЭКО проводят многократно, что существенно влияет на психоэмоциональное состояние и уровень тревожности женщин (Ejaimi G.A. et al., 2016). Чувство дискомфорта (связанное с введением ультразвукового датчика во влагалище) они могут испытывать еще до начала пункции.

Боль возникает при пункции иглой через стенку влагалища и механической стимуляции яичников. Пункция яичников считается достаточно болезненной процедурой. Аспирация фолликулов уже не так болезненна. После окончания пункции и анестезии пациентка испытывает ощущения некоторой болезненности внизу живота, идентичные интенсивной менструальной боли.

Возникающий на фоне боли стресс-ответ организма повышает уровень кортизола, глюкозы, пролактина в сыворотке крови, что может оказать влияние на качество ооцитов и в целом на исход ЭКО (Kwan I. et al., 2013). Косвенно это подтверждает исследование H. van der Ven: при пункции яичников в условиях общей анестезии (тиопентал и альфентанил) общий уровень беременности составил 36% (n=86) по сравнению с 21% в группе контроля без анестезии (van der Ven H. et al., 1988).

ВЛИЯНИЕ АНЕСТЕТИКОВ НА ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ

Анестетики проникают в фолликулярную жидкость и могут оказывать неблагоприятное воздействие на оплодотворение яйцеклетки и эмбриональное развитие. Длительный период воздействия препаратов для общей анестезии может привести к снижению частоты беременности и родов. В связи с этим продолжительность фармакологического воздействия анестетиков должна быть минимальной, это уменьшает их проникновение в фолликулярную жидкость.

Оценка влияния конкретных анестетиков должна включать метод введения, дозы анестетиков, комбинацию с другими препаратами, сроки назначения и продолжительность воздействия. Например, местные анестетики имеют разные фармакокинетические профили при введении парацервикально, эпидурально или интратекально. Анестетики также по-разному влияют на неоплодотворен-ные ооциты и оплодотворенные эмбрионы. В связи с этим данные исследований влияния анестетиков на гаметы in vitro несопоставимы с их использованием in vitro во время пункции яичников. Кроме того, при гипопротеинемии концентрация, а следовательно, и возможное токсическое воздействие некоторых препаратов (например, бупивакаина) значительно выше.

Известно, что закись азота дезактивирует метионин-синтетазу, тем самым уменьшает количество тимидина, доступного для синтеза ДНК в делящихся клетках и оказывает отрицательный эффект на результат ЭКО. При применении закиси азота значительно реже развивается клиническая беременность (14,5%) по сравнению с результатами при эпидуральной анестезии (23,7%; р=0,018) или седации (25,8%; р=0,0074) (Wilhelm W. et al., 2002). Опиоидные анальгетики короткого действия не оказывают существенного влияния на успех ЭКО (Wilhelm W. et al., 1999). После изучения концентрации препаратов в фолликулярной жидкости I. Soussis и соавт. пришли к мнению, что мидазолам более безопасен для седации по сравнению с фентанилом и альфентанилом (Soussis I. et al., 1995). Однако N. Hadimioglu et al. (60 пациенток) изучали различные комбинации режимов седации (пропофол + фентанил, пропофол + альфентанил, мидазолам + фентанил и мидазолам + альфентанил) и не обнаружили существенной разницы во влиянии на качество ооцитов (Hadimioglu N. et al., 2002). I. Ben-Shlomo и соавт. при сравнении общей анестезии с фентанилом, пропофолом и изофлураном получили такой же показатель беременности, как и при седации мидазоламом и кетамином (Ben-Shlomo I. et al., 1999).

Таким образом, хотя многие из препаратов для анестезии были найдены в фолликулярной жидкости, в настоящее время не хватает веских доказательств их неблагоприятного воздействия на ооциты (Matsota P., Kaminioti E., Kos-topanagiotou G., 2015).

МЕТОДЫ АНЕСТЕЗИИ ПРИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОМ ОПЛОДОТВОРЕНИИ

По времени пункция яичников занимает от пяти минут до получаса, однако чаще всего около 10-20 мин. Обычно это амбулаторная процедура. В зависимости от состояния пациентки и принятых в клинике стандартов при ЭКО проводят общую анестезию (внутривенную либо ингаляционную), регионарную анестезию, седацию с сохранением сознания, контролируемую пациенткой аналгезию, комбинацию местной анестезии с седацией либо только местную анестезию (например, парацервикальную блокаду). Несмотря на многообразие методов, идеального варианта анестезии при ЭКО пока не существует.

Cедация в сознании легко осуществима и отлично подходит для амбулаторной анестезии. Кроме того, это лучший вариант для сохранения качества эмбрионов (Ioscovich A. et al., 2013). Препараты короткого действия хорошо переносятся, а их комбинированное применение приводит к более качественному обезболиванию (Lok I.H. et al., 2002; Fiebai P.O. et al., 2008). Наиболее часто используют комбинации внутривенного анестетика пропофола, бензодиазепина мидазолама и наркотического анальгетика фентанила. Внутривенная седация мида-золамом и фентанилом не только комфортно переносится пациентками, но и способствует развитию антероградной амнезии. Хорошо зарекомендовала себя и комбинация опиоидов с бензодиазепинами (Sharma A. et al., 2015).

Общая анестезия. Хотя большинство анестетиков, используемых при общей анестезии, были найдены в фолликулярной жидкости, в нескольких исследованиях общая анестезия признана наиболее безопасным вариантом. Этот вариант анестезии подходит для аспирации большого количества фолликулов, в отличие от седации. Продолжительность общей анестезии должна быть минимальной, чтобы избежать вредного воздействия этих препаратов на ооциты.

Используют как внутривенную, так и ингаляционную анестезию. Как правило, сохраняется самостоятельное дыхание, возможно его поддержание при помощи лицевой маски с инсуффляцией увлажненного кислорода.

Из внутривенных препаратов наиболее комфортные ощущения (легкое засыпание, спокойный сон и безмятежное пробуждение) обеспечивает пропофол. Используют как для индукции, так и для поддержания анестезии. Отсутствие у него анальгетических свойств компенсируется одновременным применением анальгетиков (фентанила, закиси азота, кетамина в микродозах, нестероидных противовоспалительных средств). Такие комбинации уменьшают нежелательные эффекты отдельных препаратов на систему кровообращения и являются более экономичными благодаря уменьшенному расходу входящих в них компонентов.

Однако следует учитывать, что все эти методики сопровождаются высокой вероятностью нарушения дыхания: при необходимости осуществляют восстановление проходимости дыхательных путей путем запрокидывания головы и выдвижения нижней челюсти вперед, ингаляцию О₂ через носоглоточный катетер или маску, при неэффективности - проводят вспомогательную или искусственную вентиляцию легких.

Пропофол использовать безопасно, так как он не влияет на качество ооцитов, оплодотворение яйцеклетки или эмбрион (Gardner D.K., Simon S., 2017). Однако есть вероятность того, что низкая концентрация пропофола в фолликулярной жидкости связана с короткой продолжительностью процедуры извлечения.

Кетамин обладает неоспоримыми достоинствами: сильным обезболивающим и анестезирующим действием, вызывает амнезию, минимально воздействует на дыхание, просто дозируется. Однако его использование часто сопровождается негативными галлюцинациями, возбуждением во время и после анестезии, неприятными воспоминаниями. Именно поэтому в настоящее время кетамин редко применяют изолированно. Кетамин часто используют в комбинации с пропофолом - 50% пропофола и 50% кетамина (5 мг/мл каждого). Эту комбинацию готовят ex tempore и называют «кетофол». Кетамин изменяет показатели гемодинамики в сторону гипердинамии, что проявляется учащением пульса и повышением АД. Диприван^♠ , наоборот, урежает частоту пульса и снижает АД. Комбинация обоих препаратов нивелирует их гемодинамические эффекты. «Кетофол» очень комфортен для пациентов, эффективно обезболивает и широко используется при анестезиях в амбулаторных условиях (Ejaimi G.A., Salama A.A., 2016). Данных относительно его применения при ЭКО все еще недостаточно.

Тиопентал натрия также можно использовать во время анестезии при пункции яичников. При сравнении репродуктивных результатов анестезии тиопенталом натрия с пропофолом (180 пациенток) несколько лучшие результаты получены при применении пропофола, однако различия были статистически не значимыми (Goutziometrou E. et al., 2015). Тиопентал натрия можно использовать у пациенток с аллергической реакцией на пропофол и/или куриный белок.

Противопоказан при порфирии, нежелательно применять у пациенток с хронической обструктивной болезнью легких, бронхиальной астмой, артериальной гипотензией, печеночной и/или почечной недостаточностью, сахарным диабетом, анемией, нервно-мышечными заболеваниями.

Тиопентал натрия несколько чаще вызывает тошноту и рвоту, а восстановление проходит медленнее по сравнению с пропофолом. Из других, наиболее часто встречающихся нежелательных явлений следует отметить снижение АД, аритмию, тахикардию, коллапс; со стороны дыхательной системы: кашель, чихание, гиперсекреция бронхиальной слизи, ларингоспазм, бронхоспазм; со стороны нервной системы: головная боль, мышечные подергивания, головокружение, заторможенность, атаксия; довольно частые аллергические реакции различной степени выраженности и местные реакции: болезненность в месте введения, спазм сосуда и тромбоз в месте инъекции, раздражение тканей в месте инъекции вплоть до некроза при внесосудистом попадании; поражение нервов, подходящих к месту инъекции.

Мидазолам, являющийся бензодиазепином короткого действия, обычно используют в сочетании с другими ингаляционными и внутривенными анестетиками. Характеризуется непродолжительным действием, вызывает ретроградную амнезию. В эксперименте на мышах даже дозы, в 500 раз превышающие клинические, не нарушали оплодотворение и развитие эмбрионов in vivo или in vitro (Swanson R.J., Leavitt M.G., 1992). В клинической практике, хотя небольшое количество мидазолама было обнаружено в фолликулярной жидкости, отрицательного эффекта он не оказывал (Jain D. et al., 2009).

Общая анестезия фентанилом, пропофолом и изофлураном приводит к аналогичной частоте беременности при сравнении с седацией кетамином и мидазоламом. Седация в сознании с использованием опиоидов в сочетании с бензодиазепинами оказалась безопасной и экономически эффективной. Комбинация пропофола, фентанила и мидазолама относительно безопасна и проста в использовании. При этом ни одна из комбинаций не имеет доказанных преимуществ: безопасность и комфортность для пациентки, а также показатели оплодотворения не имеют статистически значимых различий (Kwan I. et al., 2018).

Ингаляционная анестезия хорошо зарекомендовала себя при ЭКО. Из существующих на сегодняшний день препаратов наилучшим вариантом является севофлуран. Отсутствие резкого запаха и быстрое возрастание фракционной альвеолярной концентрации позволяют осуществить быстрое и комфортное усыпление пациентки. Проводят индукцию c предварительным заполнением дыхательного контура севофлураном в концентрации 8 об.% при сохраненном спонтанном дыхании и поддержание анестезии 2 об.%. Высокая скорость элиминации препарата гарантирует быстрое и предсказуемое пробуждение после прекращения подачи анестетика. При ингаляционной анестезии севофлураном восстановление в послеоперационном периоде происходит несколько быстрее, чем после внутривенной анестезии с применением пропофола, что позволяет добиться ранней активизации пациенток (Петрова М.В. и др., 2014). У севофлурана есть токсичный промежуточный метаболит - компаунд А, - который в эксперименте вызывал хромосомные аберрации (Eger E.I. et al., 1997). Хотя в ходе исследований было установлено, что даже при использовании минимального потока анестезии (0,5 л/мин) содержание компаунда А не увеличивается и не отмечено значимого неблагоприятного воздействия на функцию печени и почек (Фаизов И.И., 2014), для профилактики не рекомендуется подавать поток свежего газа меньше 2 л/мин. При сравнении четырех методов обезболивания при пункции яичников (крем EMLA, пропофол, тиопентал натрия, севофлуран) коэффициенты оплодотворения при изолированном использовании EMLA и севофлурана были сопоставимы, но значительно выше, чем при применении пропофола и тиопентала натрия (р <0,001) (Piroli A. et al., 2012).

Изофлуран и галотан не рекомендуют в связи с зарегистрированным эмбрио-токсическим действием (Chetkowski R.J., Nass T.E., 1988).

Закись азота дезактивирует метионин-синтетазу, тем самым уменьшая количество тимидина, доступного для синтеза ДНК в делящихся клетках. Теоретически возможно вредное влияние на результат ЭКО, однако закись азота плохо растворима в крови, время воздействия на ооциты короткое, а отрицательное влияние не доказано (Kwan I. et al., 2005). Тем не менее при применении закиси азота клиническая беременность наступала значительно реже (14,5%) по сравнению с эпидуральной анестезией (23,7%; р=0,018) и седацией (25,8%; р=0,0074) (Gonen O. et al., 1995).

Контролируемая пациентом аналгезия - это метод, позволяющий в определенных пределах саморегулировать потребление анальгетиков пациентом при помощи контролируемого электроникой инфузионного насоса (инфузомата). Инфузомат обеспечивает «фоновую» непрерывную инфузию анальгетика, а также подает определенное количество анальгетика (болюсы) каждый раз, когда пациент нажимает на кнопку. Количество болюсов, которые пациент может запросить в течение определенного периода времени, ограничено и программируется электроникой инфузомата: при превышении количества запросов анальгетика дальнейшая выдача болюсов инфузоматом блокируется на определенный срок во избежание передозировки. Наиболее распространенными в системах контролируемой аналгезии препаратами являются мощные неселективные опиаты со сравнительно коротким действием, например фентанил.

Пациентки, использующие контролируемую аналгезию, обычно предъявляют меньше жалоб на боль и считают аналгезию более комфортной по сравнению с получением постоянной непрограммируемой инфузии анальгетика или анальгетика от персонала по требованию при наличии жалоб на боль. Тем не менее общая доза анальгетиков при пациент-контролируемой аналгезии оказалась больше (Kwan I. et al., 2013).

Уровень наркотических анальгетиков в фолликулярной жидкости достаточно низкий (Sharma A. et al., 2015). При контролируемой анестезии на основе ремифентанила частота наступления беременности оказалась выше в сравнении с общей анестезией (Verhaak C.M. et al., 2007). К аналогичным данным пришли W. Wilhelm и соавт. (2002): выполнение пункции яичников на фоне контролируемой пациенткой аналгезии с ремифентанилом приводило к более высокой частоте беременности (30,6%), чем общая анестезия с использованием альфентанила и пропофола для индукции и изофлурана с пропофолом для поддержания анестезии (17,9%) (Wilhelm W. et al., 2002).

Как и у любого другого метода, есть определенные недостатки. Применение наркотических анальгетиков значительно увеличивает вероятность послеоперационной рвоты (40 против 4% у больных, не получавших наркотических анальгетиков). Кроме того, программируемые инфузионные насосы имеют высокую стоимость и, как любая техника, могут ломаться или неправильно функционировать. Режим дозирования анальгетика нередко устанавливается неправильно и слишком ограниченно, вследствие чего пациентки не получают достаточной аналгезии. Нередко сами пациентки могут быть против самостоятельного контроля аналгезии.

Нейроаксиальная анестезия. Различные исследования свидетельствуют о возможности применения нейроаксиальных методов обезболивания (спинальной и эпидуральной анестезии) при пункции яичников.

В Российской Федерации с этой целью применяют четыре анестетика: бупивакаин, ропивакаин, левобупивакаин и лидокаин. В настоящее время в связи с потенциальной локальной нейротоксичностью интратекальное введение лидокаина не рекомендуется. Использование этого препарата не противопоказано, но может сопровождаться большей частотой преходящих транзиторных неврологических нарушений. Бупивакаин, несмотря на свою эффективность, обладает кардиотоксическим действием, подтвержденным как в многочисленных экспериментальных работах, так и в клинической практике. Ропивакаин - амидный местный анестетик, структурно похожий на бупивакаин, со сходными фармакодинамическими и фармакокинетическими свойствами. Однако моторная блокада, создаваемая препаратом, оказалась менее интенсивной и продолжительной. Левобупивакаин обеспечивает более быстрое наступление действия и более выраженный сенсорный и моторный блок, чем ропивакаин. В эквивалентных дозах левобупивакаин, по данным ряда исследований, сопоставим с бупивакаином, но гораздо менее токсичен. Однако бупивакаин, ропивакаин и левобупивакаин относят к местным анестетикам длительного действия: примерная продолжительность действия бупивакаина - 3-12 ч, ро-пивакаина - 3-6 ч, лидокаина - 1-2 ч.

Есть данные, что спинальная анестезия на 27% увеличивает вероятность успеха оплодотворения по сравнению с общей анестезией (Aghaamoo S. et al., 2014). Однако C.M. Viscomi и соавт. при сравнении спинальной анестезии с седацией мидазоламом и фентанилом не нашли существенной разницы в репродуктивных результатах (Viscomi C.M. et al., 1997). К аналогичным выводам пришли G. Botta и соавт. при сравнении эпидуральной анестезии (44 пациентки) с внутривенной седацией пропофолом (104 пациентки): разницы в репродуктивных исходах не получено (Botta G. et al., 1995).

В эксперименте на мышах продемонстрировано, что лидокаин и тримекаин отрицательно влияют как на оплодотворение, так и на развитие эмбриона (Schnell V.L. et al., 1992). Напротив, бупивакаин вызывает побочные эффекты только при высокой концентрации (100 мг/мл).

Учитывая целый ряд осложнений при регионарной анестезии, включая системную токсичность местных анестетиков, возможные нарушения дыхания и кровообращения на фоне «высокого» спинального блока, различные неврологические осложнения, головную боль, а также сложное техническое исполнение и достаточно продолжительный период нарушения моторной функции нижних конечностей, рутинное использование регионарной анестезии нецелесообразно.

Парацервикальная и преовариальная блокада. При парацервикальной блокаде местный анестетик вводят в 2-6 участков на глубину 3-7 мм вдоль вагинальной части шейки матки в вагинальные своды. Это позволяет сделать последующий прокол свода влагалища безболезненным; по сути, именно этот прокол и является самым болезненным моментом при пункции яичников. Проведение ЭКО в условиях местной анестезии не устраняет неприятные ощущения, связанные с введением ультразвукового датчика во влагалище, а также с движениями иглы при заборе яйцеклеток из яичников. Именно поэтому парацервикальную блокаду дополняют преовариальным блоком. При преовариальном блоке местный анестетик инфильтрируется в стенку влагалища, а затем под ультразвуковым контролем между стенкой влагалища и поверхностью брюшины возле яичника. Различные исследования показывают возможность применения данных методов для обезболивания при ЭКО (Cerne A. et al., 2006). Однако при сравнении репродуктивных результатов при выполнении пункции яичников в условиях общей анестезии на основе пропофола и парацервикальной блокады не найдено различий между частотой оплодотворения (13,4 против 18,6%; р=0,10) (Christiaens F. et al., 1998). Кроме того, изолированная парацервикальная блокада без седации недостаточно эффективна (Atashkhoii S. et al., 2006), хотя и более эффективна, чем местное вагинальное использование лидокаина в виде геля (Tummon I. et al., 2004).

Изолированное применение местной анестезии возможно в случае отказа пациентки от других методов анестезии, а также в тех случаях, когда у пациентки существуют какие-либо противопоказания к другим методам. Как правило, все эти ощущения не приносят значительных беспокойств и переносятся пациентками удовлетворительно. Возможно выполнение пункции яичников в условиях комбинированной анестезии - проводят местную анестезию в сочетании с поверхностной седацией. Показания для комбинированной анестезии определяют состоянием здоровья пациентки и традициями конкретно взятого медицинского центра.

Электроакупунктура. Методика основана на активации эндогенной опиоидной системы путем повышения уровня бета-эндорфина. Она также оказывает антидепрессантное, анксиолитическое и симпатоингибирующее действие. Используется в сочетании с различными вариантами седации и парацервикальной блокадой. P. Humaidan и E. Stener-Victorin в проспективном рандомизированном исследовании с участием 200 женщин изучали роль электроакупунктуры как альтернативы общепринятому анальгетическому методу (премедикация бензодиазепином и болюсы по 0,25 мг альфентанила) (Humaidan P., Stener-Victorin E., 2004). Они обнаружили, что процедура хорошо переносилась в обеих группах, однако в группе с электроакупунктурой показатели боли были выше. В рандомизированном исследовании (160 женщин) установлено, что электроакупунктура не может быть рекомендована в качестве обезболивающего метода при пункции яичников, но может быть альтернативой для женщин, выбирающих нефармакологический метод обезболивания. В аналогичном исследовании Е. Stener-Victorin и соавт. пришли к выводу, что анальгетические эффекты, вызываемые электроакупунктурой, столь же хороши, как и эффекты, вызываемые обычными анальгетиками, и доза опиоидных анальгетиков в сочетании с электроакупунктурой ниже, чем при использовании только обычных анальгетиков (Stener-Victorin E. et al., 2003).

Послеоперационная тошнота и рвота являются распространенной проблемой после пункции яичников в условиях общей анестезии. Высокая частота этого неприятного осложнения связана с пиковым уровнем эстрадиола в плазме (Piroli A. et al., 2012). При сравнении общей внутривенной анестезии (про-пофол и альфентанил) с ингаляционной анестезией (сочетание закиси азота с инфлураном) частота послеоперационной тошноты и рвоты существенно различалась: 64% в ингаляционной группе и 39% в группе с общей внутривенной анестезией (Raftery S., Sherry E., 1992).

У пациенток с высоким риском тошноты и рвоты целесообразно в самом начале операции ввести внутривенно антагонист серотониновых 5-HT3 рецепторов ондансетрон. От введения метоклопрамида лучше воздержаться, так как он вызывает гиперпролактинемию с последующим ухудшением функции желтого тела (Kauppila A. et al., 1982).

Нестероидные противовоспалительные препараты. Парацетамол, нефопам, кетопрофен уменьшают послеоперационную боль и не влияют на результаты ЭКО (Mialon O. et al., 2011).

ПРОБУЖДЕНИЕ

При использовании пропофола первая сознательная реакция обычно появляется через 1,5-3 мин; восстановление ясного сознания - через 4-10 мин; восстановление двигательной активности - через 15-50 мин; восстановление исходного уровня сознания и мышления - через 40-60 мин после окончания анестезии. При продолжительности анестезии ингаляционными анестетиками менее 30 мин период пробуждения составляет 8-10 мин. Кетамин и наркотические анальгетики еще больше удлиняют период пробуждения.

Критериями, позволяющими пациентке безопасно покинуть клинику после пункции яичников (выписаться), являются: 1) стабильность витальных функций при наблюдении в течение 1 ч; 2) полное восстановление исходного уровня сознания и психического статуса; 3) восстановление двигательной активности (способность нормально ходить и стоять с закрытыми глазами, не шатаясь); 4) отсутствие тошноты, рвоты, сильной боли и кровотечения; 5) переносимость выпитой жидкости и способность мочеиспускания; 6) присутствие взрослого сопровождающего. Опыт показывает, что для этого необходимо 1-2 ч (в среднем 1 ч 30 мин) пребывания под наблюдением врача или медицинской сестры после операции.

Кроме этого, пациенток следует предупредить, что полная координация движений еще много часов будет нарушена. Рекомендуется воздерживаться от управления автомобилем, велосипедом и другими механизмами, а также от принятия решений, требующих ясного сознания в течение 30-36 ч.

Таким образом, роль анестезиолога при ЭКО заключается в обеспечении комфортной и безопасной анестезии при пункции яичников. Выбор метода анестезии определяется прежде всего сопутствующей патологией и особенностями психоэмоционального состояния пациентки. Естественно желание избежать потенциального эмбриотоксического действия препаратов, используемых при анестезии. Однако результаты многочисленных исследований противоречивы, что обусловлено различиями в дизайне и рандомизации (Guasch E. et al., 2019). Отрицательное влияние обнаруженных в фолликулярной жидкости препаратов на состояние ооцитов и развитие эмбрионов не доказано (Piroli A. et al., 2012). Для сокращения потенциально негативных эффектов анестезии следует по возможности минимизировать длительность самой процедуры и отдавать предпочтение короткодействующим и хорошо управляемым препаратам.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ломиворотов В.В., Ефремов С.М., Абубакиров М.Н. и др. Стоит ли отменять препараты, блокирующие активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, в периоперационном периоде? // Вестник анестезиологии и реаниматологии. 2018. Т. 15, № 3. С. 56-61.

Петрова М.В., Потиевская В.И., Ушаков И.Л. Анестезиологическое обеспечение в клинике вспомогательных репродуктивных технологий // Доктор.Ру. 2014. Т. 8, № 1. С. 39-41.

Фаизов И.И. Влияние отдельных анестетиков на состояние функции печени и почек при ингаляционной анестезии минимальным потоком на этапе специализированной помощи : дис. …​ канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 2014. 100 с.

Aghaamoo S., Azmoodeh A., Yousefshahi F. et al. Does spinal analgesia have advantage over general anesthesia for achieving success in in-vitro fertilization? // Oman Med. J. 2014. Vol. 29. P. 97-101.

Atashkhoii S., Abdollahi S., Dejani A.G. et al. Conscious sedation with and without paracervical block for transvaginal ultrasonically guided oocyte collection: A comparison of the pain and sedation levels, and postoperative side effects // Iran. J. Reprod. Med. 2006. Vol. 4. P. 51-56.

Ben-Shlomo I., Moskovich R., Katz Y. et al. Midazolam/ketamine sedative combination compared with fentanyl/propofol/isoflurane anaesthesia for oocyte retrieval // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14. P. 1757-1759.

Botta G., D’Angelo A., D’Ari G. et al. Epidural anesthesia in an in vitro fertilization and embryo transfer program // J. Assist. Reprod. Genet. 1995. Vol. 12. P. 187-190.

Cerne A., Bergh C., Borg K. et al. Preovarian block versus paracervical block for oocyte retrieval // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 2916-1221.

Chetkowski R.J., Nass T.E. Isofluorane inhibits early mouse embryo development in vitro // Fertil. Steril. 1988. Vol. 49. P. 171-173.

Christiaens F., Janssenswillen C., Van Steirteghem A.C. et al. Comparison of assisted reproductive technology performance after oocyte retrieval under general anaesthesia (pro-pofol) versus paracervical local anaesthetic block: a case-controlled study // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13. P. 2456-2460.

Eger E.I., Laster M.J., Winegar R. et al. Compound A induces sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells // Anesthesiology. 1997. Vol. 86. P. 918-922.

Ejaimi G.A., Alhindi M.E., Saeed S. Anesthesia and assisted reproductive technology: A literature review // Sudan Med. Monit. 2016. Vol. 11. P. 129-132.

Ejaimi G.A., Salama A.A. A prospective evaluation of «ketofol» (Ketamine/Propofol Combination) for deep sedation and analgesia in minor painful operations // Ann. Int. Med. Dent. Res. 2016. Vol. 2. P. 46-53.

Fiebai P.O., Ogunmokun A.A., Ajayi R.A. Experience with conscious sedation for oocyte retrieval in Nigeria // Affr. J. Reprod. Health. 2008. Vol. 12. P. 30-34.

Gardner D.K., Simon S. Handbook of in Vitro Fertilization. 4^th ed. Taylor Frankis Group, 2017. P. 110-113.

Gonen O., Shulman A., Ghetler Y. et al. The impact of different types of anesthesia on in vitro fertilization-embryo transfer treatment outcome // J. Assist. Reprod. Genet. 1995. Vol. 12. P. 678-682.

Goutziometrou E., Venetis S.A., Kolibianakis E.M. et al. Propofol versus thiopental sodium as anaesthetic agents for oocyte retrieval: a randomized controlled trial // Peprod. Biomed. Online. 2015. Vol. 31, N 6. P. 752-759.

Guasch E., Gómez R., Brogly N. et al. Anesthesia and analgesia for transvaginal oocyte retrieval. Should we recommend or avoid any anesthetic drug or technique? // Curr. Opin. Anaesthesiol. 2019. Vol. 32, N 3. P. 285-290.

Hadimioglu N., Aydogdu Titiz T., Dosemeci L. et al. Comparison of various sedation regimens for transvaginal oocyte retrieval // Fertil. Steril. 2002. Vol. 78. P. 648-649.

Humaidan P., Stener-Victorin E. Pain relief during oocyte retrieval with a new short duration electro-acupuncture technique - an alternative to conventional analgesic methods // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19. P. 1367-1372.

Ioscovich A., Eldar-Geva T., Weitman M. Anesthetic management for oocyte retrieval: An exploratory analysis comparing outcome in in vitro fertilization cycles with and without pre-implantation genetic diagnosis // J. Hum. Reprod. Sci. 2013. Vol. 6, N 4. P. 263-266.

Jain D., Kohi A., Gupta L. et al. Anaesthesia for in vitro fertilization // Indian J. Ana- esth. 2009. Vol. 53. P. 408-413.

Kauppila A., Leinonen P., Vihko R. et al. Metoclopramide-induced hyperprolactinemia impairs ovarian follicle maturation and corpus luteum function in women // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1982. Vol. 54. P. 955-960.

Kwan I., Bhattacharya S., Knox F. et al. Conscious sedation and analgesia for oocyte retrieval during IVF procedures. A Cochrane review // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 1672-1679.

Kwan I., Bhattacharya S., Knox F. et al. Pain relief for women undergoing oocyte retrieval for assisted reproduction // Cochrane Database Syst. Rev. 2013. Vol. 1. CD004829.

Kwan I., Wang R., Pearce E. Pain relief for women undergoing oocyte retrieval for assisted reproduction // Cochrane Database Syst. Rev. 2018. Vol. 5. CD004829.

Lok I.H., Chan M.T., Chan D.L. et al. Prospective randomized trial comparing patient-controlled sedation using propofol and alfentanil and physician-administered sedation using diazepam and pethidine during transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval // Hum. Reprod. 2002. Vol. 17. P. 2101-2106.

Matsota P., Kaminioti E., Kostopanagiotou G. Anesthesia related toxic effects on in vitro fertilization outcome: burden of proof // Biomed. Res. Int. 2015. Vol. 2015. Article ID 475362. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2015/475362.

Mialon O., Delotte J., Lehert P., Donzeau M., Drici M., Isnard V. et al. Comparison between two analgesic protocols on IVF success rates // J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. 2011. Vol. 40. P. 137-143.

Piroli A., Marci R., Marinangeli F. et al. Comparison of different anaesthetic methodologies for sedation during in vitro fertilization procedures: effects on patient physiology and oocyte competence // Gynecol. Endocrinol. 2012. Vol. 28. P. 796-799.

Raftery S., Sherry E. Total intravenous anaesthesia with propofol and alfentanil protects against postoperative nausea and vomiting // Can. J. Anaesth. 1992. Vol. 39. P. 37-40.

Schnell V.L., Sacco A.G., Savoy-Moore R.T. et al. Effects of oocyte exposure to local anesthetics on in vitro fertilization and embryo development in the mouse // Reprod. Toxicol. 1992. Vol. 6. P. 323-327.

Sharma A., Borle A., Trikha A. Anesthesia for in vitro fertilization // J. Obstet. Anaesth. Crit. Care. 2015. Vol. 5. P. 62-72.

Smith I., Kranke P., Murat I. Периоперационное голодание у взрослых и детей : рекомендации Европейского общества анестезиологов. 2017 // Тольяттинский медицинский консилиум. 2017. № 1-2. С. 37-52.

Soussis I., Boyd O., Paraschos T. et al. Follicular fluid levels of midazolam, fentanyl, and alfentanil during transvaginal oocyte retrieval // Fertil. Steril. 1995. Vol. 64. P. 1003-1007.

Stener-Victorin E., Waldenström U., Wikland M. et al. Electro-acupuncture as a peroperative analgesic method and its effects on implantation rate and neuropeptide Y concentrations in follicular fluid // Hum. Reprod. 2003. Vol. 18. P. 1454-1460.

Swanson R.J., Leavitt M.G. Fertilization and mouse embryo development in the presence of midazolam // Anesth. Analg. 1992. Vol. 75. P. 549-554.

Tummon I., Newton C., Lee C. et al. Lidocaine vaginal gel versus lidocaine paracervical block for analgesia during oocyte retrieval // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19. P. 11161120.

Urfalioglu A., Arslan M., Bakacak M. et al. Efficacy of bispectral index monitoring for prevention of anestheticawareness and complications during oocyte pick-up procedure // Turk. J. Med. Sci. 2017. Vol. 47. P. 1583-1589.

Van der Ven H., Diedrich K., Al-Hasani S. et al. The effect of general anaesthesia on the success of embryo transfer following human in-vitro fertilization // Hum. Reprod. 1988. Vol. 3, suppl. 2. P. 81-83.

Verhaak C.M., Smeenk J.M., Evers A.W. et al. Women’s emotional adjustment to ГVF: A systematic review of 25 years ofresearch // Hum. Reprod. Update. 2007. Vol. 13. P. 27-36.

Viscomi C.M., Hill K., Johnson J. et al. Spinal anesthesia versus intravenous sedation for transvaginal oocyte retrieval: reproductive outcome, side-effects and recovery profiles // Int. J. Obstet. Anesth. 1997. Vol. 6. P. 49-51.

Wilhelm W., Biedler A., Hammadeh M.E. et al. Remifentanil for oocyte retrieval: A new single-agent monitored anaesthesia care technique // Anaesthesist. 1999. Vol. 48. P. 698-704.

Wilhelm W., Hammadeh M.E., White P.F. et al. General anesthesia versus monitored anesthesia care with remifentanil for assisted reproductive technologies: effect on pregnancy rate // J. Clin. Anesth. 2002. Vol. 14. P. 1-5.

СИНДРОМ ПУСТЫХ ФОЛЛИКУЛОВ

Синдромом пустых фолликулов (СПФ) называют клиническую ситуацию, характеризуемую отсутствием ооцитов при проведении пункции яичников. Впервые СПФ был описан С.В. Coulam и соавт. в 1986 г.

СПФ встречается редко, по данным разных авторов, его частота сильно варьирует (от 0,02 до 7%).

Этиология синдрома пустых фолликулов

Рассмотрим вероятные причины такой ситуации в порядке убывания их частоты.

I группа. Наиболее распространенные причины, связанные с нарушением введения или «качеством» триггера финального созревания ооцитов:

II группа. Причины, связанные с техническими особенностями пункции фолликулов и аспирации фолликулярной жидкости. Как правило, такая ситуация встречается редко. Известно, что аспирация фолликулярной жидкости, содержащей ОКК, осуществляется по определенной методике. Какой яичник пунктировать первым? Опыт показывает, что целесообразно начинать с того яичника, который содержит наибольшее число фолликулов и расположен наиболее близко к датчику. При этом, как правило, в первую очередь пунктируют фолликулы, расположенные ближе к корковому слою яичника. Конец пункционной иглы во время аспирации находится в центральных зонах фолликула. По мере аспирации стенки фолликула спадаются. Переходить к следующему фолликулу необходимо только после абсолютного опорожнения пунктируемого фолликула, на что указывает полное спадание его стенок. Конец иглы можно перемещать в фолликуле, чтобы обеспечить получение всего объема фолликулярной жидкости. Далее пунктируют фолликулы, расположенные по ходу пункционной иглы.

Диаметр иглы не влияет на шансы получения ооцита. Процедура получения ооцита при использовании иглы с меньшим диаметром может потребовать большего времени, но имеет явные преимущества - меньшие риски послеоперационного кровотечения из места пункции.

Оптимальным считают давление в вакуум-аспираторе при применении игл диаметром 16 и 17 G от -80 до -200 mmHg (от -10,6 до -26,6 кПа соответственно). При этом объемный поток составляет 20-25 мл/мин. Эти параметры минимизируют риск повреждений ОКК. При использовании игл иного диаметра применяют другие режимы аспирации. Среднее оптимальное давление во время пункции составляет 20 кПа (-140…​-145 mmHg).

Во многих центрах ЭКО для повышения шансов получения ооцитов используют методику промывания фолликула. Промывание с помощью двухпросветной иглы увеличивает турбулентность потока жидкости в фолликуле, способствуя отхождению ОКК от стенки фолликула. Промывание могут делать и при применении однопросветных игл. Если для аспирации используют шприц, для увеличения турбулентности потока его поршнем проводят движение вперед-назад. Однако в недавнем систематическом обзоре не было показано преимуществ в эффективности протокола ЭКО данного подхода (Roque M. et al., 2012). По мнению некоторых авторов, это может привести только к увеличению длительности пункции (и даже негативно сказаться на частоте имплантации.

Иногда просвет иглы может быть окклюзирован тканевым дебритом во время пункции (избыток массы тела пациентки). Оператор сразу почувствует нарушение тока жидкости, невозможность аспирации или ее затруднение. При этом при ультразвуковом контроле на конце иглы определяют эхопозитивные массы. В таком случае лучше извлечь иглу, промыть и продолжить процедуру. Возможно также «вытолкнуть» тканевый детрит в полость фолликула, как при процедуре его промывания, а затем продолжить аспирацию.

III группа. Причины, связанные с индивидуальными особенностями пациентки.

Может ли явиться причиной СПФ тип триггера, который был использован в протоколе? Результаты клинических исследований дают отрицательный ответ на данный вопрос. Так, частота СПФ в циклах с использованием а-ГнРГ в качестве триггера составляет 0,6-3,5%, с ХГЧ - 0,1-3,1%. Это касается пациенток всех клинических групп (с «бедным», нормо- и гиперответом) (Castillo J.C. et al., 2012; Kummer N.E. et al., 2013)

Существует мнение, что в ряде случаев механизмы развития СПФ в циклах с разными типами триггера могут различаться. Так, при использовании а-ГнРГ в качестве триггера, причиной СПФ может явиться так называемая дисфункция гипофиза, например, при его выраженной десенситизации (Honnma H. et al., 2011). При такой ситуации введение а-ГнРГ не приводит к достаточному выбросу ЛГ. Однако это спорная позиция. Показано, что у большинства пациенток даже низкая амплитуда подъема ЛГ в этой ситуации, вероятно, достаточна для созревания ооцитов (Asada Y. et al., 2013). Альтернативным объяснением возможного развития СПФ после а-ГнРГ является наличие полиморфизма их рецепторов, а также рецепторов к ЛГ и ФСГ (Perez Mayorga M. et al., 2000; Piersma D. et al., 2007). В таком случае увеличение дозы а-ГнРГ может способствовать активации рецепторного аппарата.

В литературе описаны и казуистические случаи СПФ. Так, K. Stefunidis и соавт. (2002) не получили ооцитов в яичнике при его перекруте. Авторы предположили, что снижение кровоснабжения яичника, развитие локального венозного и лимфатического стаза могли стать причиной нарушения фолликулогенеза. J. Hirshfeld-Cytron и H.H. Kim (2008) наблюдали СПФ у пациентки, которой ранее была проведена пластическая операция в связи с ожирением. В этом случае СПФ мог быть обусловлен снижением абсорбции препаратов, в том числе ХГЧ, в связи с редукцией части подкожной жировой клетчатки.

Прогнозирование синдрома пустых фолликулов

Информативных прогностических критериев СПФ к настоящему времени не получено. М. Baum и соавт. (2012) при анализе 8292 циклов ЭКО определили, что такими факторами могут являться старший возраст пациенток (старше 37,7 года) и длительное бесплодие (более 8,8 года).

По данным A.G. Mulders и соавт. (2003), избыток массы тела и ожирение могут рассматриваться в качестве факторов риска СПФ. Отсутствие ооцитов при пункции фолликулов чаще обнаруживается также у пациенток с недостаточным ответом яичников на стимуляцию в предшествующих циклах ЭКО.

Диагностика синдрома пустых фолликулов

Общепринятым критерием диагностики СПФ в циклах ВРТ является отсутствие в аспиратах фолликулов ОКК или ооцитов (пустые комплексы).

В редких случаях при более тщательной микроскопии обнаруживаются ооциты с нарушенным строением.

Профилактика синдрома пустых фолликулов

Что делать, если во время пункции вы не получаете ооциты? К сожалению, универсальных советов нет.

Однако можно порекомендовать следующие практические шаги.

Во-первых, целесообразно использовать технику промывания фолликула. Количество таких промываний, как правило, не превышает 3-4.

Во-вторых, можно использовать методику «прерывания процедуры пункции на одном яичнике». Пункция второго яичника возможна через 24-36 ч после выяснения, имело ли место нарушение пациенткой режима введения триггера. Ряд исследователей советуют определить уровень ХГЧ в крови (Reichman D.E. et al., 2012). Однако имеет место чрезвычайно большой разброс величин этого показателя. Именно поэтому данный анализ не позволит ответить на вопрос: «Когда был введен триггер?» Чаще рекомендуют повторную инъекцию триггера с последующей аспирацией ооцитов через 24-36 ч. При этом существует риск повторения этой ситуации.

При планировании циклов стимуляции суперовуляции у женщин с СПФ в предыдущей программе следует предусмотреть замену препарата или применение комбинации препаратов; также обсуждается изменение времени от введения триггера до начала пункции фолликулов.

СТИМУЛЯЦИЯ ПРИ СИНДРОМЕ РЕЗИСТЕНТНЫХ ЯИЧНИКОВ

Синдром резистентных яичников (СРЯ) является редкой патологией. Описан в 1969 г. (Jones G.S., De Moraes-Ruehsen M., 1969). Для данной патологии характерны следующие клинико-лабораторные признаки:

Вопросы этиологии и патогенеза СРЯ остаются до настоящего времени полностью открытыми. Вероятно, что нарушение фолликулогенеза обусловлено дефектами взаимодействия гонадотропинов с соответствующими рецепторами.

Основными причинами подобной ситуации могут быть:

Общепринятых стратегий при СГЯ нет. Маловероятно, что для обеспечения чувствительности яичников к ФСГ у пациенток с СРЯ помогут упоминающаяся в литературе циклическая заместительная гормональная терапия перед протоколом ЭКО или высокие дозы гонадотропинов при стимуляции яичников.

Наиболее реальными подходами преодоления бесплодия при СРЯ является проведение процедуры IVM - in vitro maturation, дозревание ооцитов в условиях in vitro - или переход на программу с использованием ооцитов донора. Информация о рождении первого ребенка после процедуры IVM у пациентки с СРЯ была опубликована в 2013 г. (Grynberg M. et al., 2013).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Aittomaki K., Lucena J.L., Pakarinen P., Sistonen P., Tapanainen J., Gromoll J. et al. Mutation in the follicle-stimulating hormone receptor gene causes hereditary hypergonadotropic ovarian failure // Cell. 1995. Vol. 82. P. 959-968.

Aktas M., Beckers N.G., van Inzen W.G., VerhoeffA., de Jong D. Oocytes in the empty follicle: a controversial syndrome // Fertil. Steril. 2005. Vol. 84, N 6. P. 1643-1648.

Arici A., Matalliotakis I.M., Koumantakis G.E., Goumenou A.G., Neonaki M.A., Koumantakis E.E. Diagnostic role of inhibin B in resistant ovary syndrome associated with secondary amenorrhea // Fertil. Steril. 2002. Vol. 78. P. 1324-1326.

Asada Y., Itoi F., Honnma H., Shuji T., Fukunaga N., Hashiba Y. et al. Failure of GnRH agonist triggered oocyte maturation: its cause and management // J. Assist. Reprod. Genet. 2013. Vol. 30. P. 581-585.

Awonuga A., Govindbhai J., Zierke S., Schnauffer K. Continuing the debate on empty follicle syndrome: can it be associated with normal bioavailability of beta-human chorionic gonadotrophin on the day of oocyte recovery? // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13, N 5. P. 1281-1284.

Baum M., Machtinger R., Yerushalmi G.M., Maman E., Seidman D.S., Dor J. et al. Recurrence of empty follicle syndrome with stimulated IVF cycles // Gynecol. Endocrinol. 2012. Vol. 28, N 4. P. 293-295.

Castillo J.C., Garcia-Velasco J., Humaidan P. Empty follicle syndrome after GnRHa triggering versus hCG triggering in COS // J. Assist. Reprod. Genet. 2012. Vol. 29, N 3. P. 249-253.

Chiauzzi V., Cigorraga S., Escobar M.E., Rivarola M.A., Charreau E.H. Inhibition of follicle-stimulating hormone receptor binding by circulating immunoglobulins // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1982. Vol. 54. P. 1221-1228.

Chiauzzi V.A., Bussmann L., Calvo J.C., Sundblad V., Charreau E.H. Circulating immunoglobulins that inhibit the binding of follicle-stimulating hormone to its receptor: a putative diagnostic role in resistant ovary syndrome? // Clin. Endocrinol. 2004. Vol. 61. P. 46-54.

Conway G.S., Conway E., Walker C., Hoppner W., Gromoll J., Simoni M. Mutation screening and isoform prevalence of the follicle stimulating hormone receptor gene in women with premature ovarian failure, resistant ovary syndrome and polycystic ovary syndrome // Clin. Endocrinol. 1999. Vol. 51. P. 97-99.

Coulam C.B., Bustillo M., Schulman J.D. Empty follicle syndrome // Fertil. Steril. 1986. Vol. 46, N 6. P. 1153-1155.

Desai N., Austin C., AbdelHafez F. et al. Evidence of «genuine empty follicles» in follicular aspirate: a case report // Hum. Reprod. 2009. Vol. 24, N 5. P. 1171-1175.

Duru N.K., Cincik M., Dede M. et al. Retrieval of zona-free immature oocytes in a woman with recurrent empty follicle syndrome: a case report // J. Reprod. Med. 2007. Vol. 52, N 9. P. 858-863.

Escobar M.E., Cigorraga S.B., Chiauzzi V.A., Charreau E.H., Rivarola M.A. Development of the gonadotrophic resistant ovary syndrome in myasthenia gravis: suggestion of similar autoimmune mechanisms // Acta Endocrinol. 1982. Vol. 99. P. 431-436.

Flier J.S., Kahn C.R., Roth J., Bar R.S. Antibodies that impair insulin receptor binding in an unusual diabetic syndrome with severe insulin resistance // Science. 1975. Vol. 190. P. 63-65.

Grynberg M., Peltoketo H., Christin-Maitre S., Poulain M., Bouchard P., Fanchin R. First birth achieved after in vitro maturanion of oocytes from a women endowed with multiple antral follicles unresponsive to follicle-stimulating hormone // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2013. Vol. 98, N 11. P. 4493-4498.

Haller-Kikkatalo K., Salumets A., Uibo R. Review on autoimmune reactions in female infertility: antibodies to follicle stimulating hormone // Clin. Dev. Immunol. 2012. Vol. 2012. Article ID 762541.

Hirshfeld-Cytron J., Kim H.H. Empty follicle syndrome in the setting of dramatic weight loss after bariatric surgery: case report and review of available literature // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 4. P. 1199.е21-e23.

Honnma H., Hashiba Y., Asada Y., Endo T. Failure of triggering oocyte maturation with a GnRH agonist in polycystic ovary syndrome: two case reports // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2011. Vol. 157. P. 239-240.

Huhtaniemi I., Alevizaki M. Gonadotrophin resistance // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2006. Vol. 20. P. 561-576.

Inan M.S., Al-Hassan S., Ozand P. et al. Transcriptional profiling ofgranulosa cells from a patient with recurrent empty follicle syndrome // Reprod. Biomed Online. 2006. Vol. 13, N 4. P. 481-491.

Jones G.S., De Moraes-Ruehsen M. A new syndrome of amenorrhae in association with hypergonadotropism and apparently normal ovarian follicular apparatus // Am. J. Obstet. Gynecol. 1969. Vol. 104. P. 597-600.

Kummer N.E., Feinn R.S., Griffin D.W., Nulsen J.C., Benadiva C.A., Engmann L.L. Predicting successful induction of oocyte maturation after gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa) trigger // Hum. Reprod. 2013. Vol. 28, N 1. P. 152-159.

Lambert A., Weetman A.P., McLoughlin J., Wardle C., Sunderland J., Wheatcroft N. et al. A search for immunoglobulins inhibiting gonadal cell steroidogenesis in premature ovarian failure // Hum. Reprod. 1996. Vol. 11. P. 1871-1876.

Latronico A.C., Arnhold I.J. Gonadotropin resistance // Endocr. Dev. 2013. Vol. 24. P. 25-32.

Latronico A.C., Arnhold I.J. Inactivating mutations of LH and FSH receptors - from genotype to phenotype // Pediatr. Endocrinol. Rev. 2006. Vol. 4. P. 28-31.

Manley S.W., Bourke J.R., Hawker R.W. The thyrotrophin receptor in guinea-pig thyroid homogenate: Interaction with the long-acting thyroid stimulator // J. Endocrinol. 1974. Vol. 61. P. 437-445.

Meniru G., Craft I. Evidence from a salvaged treatment cycle supports an aetiology for the empty follicle syndrome that is related to terminal follicular developmental events // Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 2385-2387.

Mesen T.B., Yu B., Richter K.S., Widra E., DeCherney A.H., Segars J.H. The prevalence of genuine empty follicle syndrome // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96. P. 1375-1357.

Meyer W.R., Lavy G., DeCherney A.H., Visintin I., Economy K., Luborsky J.L. Evidence of gonadal and gonadotropin antibodies in women with a suboptimal ovarian response to exogenous gonadotropin // Obstet. Gynecol. 1990. Vol. 75. P. 795-799.

Mulders A.G., Laven J.S., Imani B. et al. IVF outcome in anovulatory infertility (WHO group 2)-including polycystic ovary syndrome - following previous unsuccessful ovulation induction // Reprod. Biomed. Online. 2003. Vol. 7, N 1. P. 50-58.

Ndukwe G., Thornton S., Fishel S., Dowell K., Al-Hassan S., Hunter A. Predicting empty follicle syndrome // Fertil. Steril. 1996. Vol. 66. P. 845-847.

Patrick J., Lindstrom J. Autoimmune response to acetylcholine receptor // Science. 1973. Vol. 180. P. 871-872.

Perez Mayorga M., Gromoll J., Behre H.M., Gassner C., Nieschlag E., Simoni M. Ovarian response to follicle-stimulating hormone(FSH) stimulation depends on the FSH receptor genotype // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. Vol. 85. P. 3365-3369.

Piersma D., Verhoef-Post M., Berns E.M., Themmen A.P. LH receptor gene mutations and polymorphisms:an overview // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. Vol. 260-262. P. 282-286.

Platia M.P., Bloomquist G., Williams R.F., Hodgen G.D. Refractoriness to gonadotropin therapy: how to distinguish ovarian failure versus pseudoovarian resistance caused by neutralizing antibodies // Fertil. Steril. 1984. Vol. 42. P. 779-784.

Roque M., Sampaio M., Geber S. Follicular flushing during oocyte retrieval: A systematic review and meta-analysis // J. Assist. Reprod. Genet. 2012. Vol. 29, N 11. P. 1249-1254.

Quintans C.J., Donaldson M.J., Blanco L.A., Pasqualini R.S. Empty follicle syndrome due to human errors: its occurrence in an in-vitro fertilization programme // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13. P. 2703-2705.

Reichman D.E., Greenwood E., Meyer L. et al. Can in vitro fertilization cycles be salvaged by repeat administration of intramuscular human chorionic gonadotropin the day after failed // Fertil. Steril. 2012. Vol. 98, N 3. P. 671-674.

Rogenhofer N., Pavlik R., Jeschke U., Wypior G., Ochsenkuhn R., Thaler C.J. Effective ovarian stimulation in a patient with resistant ovary syndrome and antigonadotrophin antibodies // Am. J. Reprod. Immunol. 2015. Vol. 73, N 2. P. 185-191.

Stefunidis K., Grammatis M., Pappas K. et al. Empty follicle syndrome associated with ovarian torsion in an in vitro fertilization program // JSLS. 2002. Vol. 6, N 3. P. 215-216.

Tsuiki A., Rose B., Hung T. Steroid profiles of follicular fluids from a patient with the empty follicle syndrome // Fertil. Steril. 1988. Vol. 49. P. 104-107.

Van Weissenbruch M.M., Hoek A., van Vliet-Bleeker I., Schoemaker J., Drexhage H. Evidence for existence of immunoglobulins that block ovarian granulosa cell growth in vitro. A putative role in resistant ovary syndrome? // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1991. Vol. 73. P. 360-367.

Vujisic S., Stipoljev F., Bauman R. et al. Pericentric inversion of chromosome 2 in a patient with the empty follicle syndrome: case report // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 9. P. 2552-2555.

Vutyavanich T., Piromlertamorn W., Ellis J. Immature oocytes in «apparent empty follicle syndrome»: a case report // Case Rep. Med. 2010. Vol. 2010. Article ID 367505.

Wunsch A., Sonntag B., Simoni M. Polymorphism of the FSH receptor and ovarian response to FSH // Ann. Endocrinol. (Paris). 2007. Vol. 68. P. 160-166.

Yariz K.O., Walsh T., Uzak A. et al. Inheritedmutation of the luteinizing hormone/ choriogonadotropin receptor (LHCGR) in empty follicle syndrome // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96, N 2. P. 125-130.

Zegers-Hochschild F., Fernande E., Mackenna A., Fabres C., Altieri E., Lopez T. The empty follicle syndrome: a pharmaceutical industry syndrome // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 2262-2265.

Качество яйцеклетки во многом определяет процесс оплодотворения, влияет на развитие эмбриона, течение беременности и, как показано в ряде современных исследований, на здоровье человека. Так, известно, что материнские факторы играют доминирующую роль в раннем развитии эмбриона, а свойства ооцита определяют ранние этапы дробления зиготы (до 4-8 клеток).

Вместе с этим до сих пор возможность оценки яйцеклетки очень ограниченна. Единственным подходом, который используется в практике, является микроскопический анализ, позволяющий изучить особенности строения ооцита, его морфологию. Однако морфология ооцита не всегда отражает его функциональные свойства, и, как хорошо известно, даже при нормальном строении ооцита не всегда происходит оплодотворение.

Согласно статистическим данным только менее 5% ооцитов, полученных в результате стимуляции яичников в циклах ЭКО, приводят к рождению ребенка. Причем этот показатель значительно снижается у пациенток старшего репродуктивного возраста (рис. 14-1) (Lemmen J.G. et al., 2016). В связи с этими обстоятельствами, наряду с качеством, важным параметром, который определяет эффективность протокола ЭКО, является количество ооцитов, полученных в ходе стимуляции яичников (Van Blerkom J., Henry G.H., 1992; Balaban B., Urman B., 2006).

Информация о значении количества ооцитов для прогноза эффективности протокола ЭКО представлена в главе 9.

В этой главе собраны данные о современных возможностях оценки строения ооцита и его функциональных свойств.

Функциональные взаимодействия в ОКК. К настоящему времени в мировой и отечественной науке и практике имеется достаточно большой массив результатов исследований, посвященных поиску маркеров, которые могли бы предоставить информацию о качестве яйцеклетки, прогнозе оплодотворения и раннего развития эмбриона. Все эти работы в основном были посвящены изучению физиологии фолликулогенеза и созревания яйцеклетки. Так, было определено, что процесс развития фолликулов яичников предполагает координацию роста и дифференцировки женских гамет с ростом и дифференцировкой соматических клеток гранулезы - клеток кумулюса (Hirshfield A.N., 1991; Gougeon A., 1996).

Клетки кумулюса непосредственно окружают яйцеклетку, образуя ОКК.

Секретируемые ооцитами факторы действуют на кумулюсные клетки, тем самым регулируют их специфические функции.

В связи с низкой гликолитической активностью ооцит получает энергию для своего роста (пируват или аминокислоты) от клеток кумулюса через межклеточные каналы (щелевые контакты), формируемые белками из семейства коннексинов.

После овуляторного пика ЛГ клетки гранулезы продуцируют овариальные EGF-подобные факторы (от англ. Epidermal Growth Factor, эпидермальный фактор роста). Эти мембраносвязанные белки служат паракринными медиаторами действия ЛГ на клетки кумулюса и на созревание ооцита (Ashkenazi H. et al., 2005).

Рецептор EGF экспрессируется на кумулюсных клетках и активирует ERK1/2-зависимые пути (от англ. extracellular signal-regulated kinase, внеклеточная регулируемая киназа). Сигнальный путь ERK (Ras-ERK, MAPK/ERK) является одним из ключевых и наиболее хорошо изученных сигнальных путей MAPK (от англ. mitogen-activated protein kinase, митогенактивируемая протеин-киназа). Свое название этот путь получил по центральной MAP-киназе ERK, которая представлена двумя близкими по структуре белками: ERK1 и ERK2. ERK-сигнальный путь играет важную роль в пролиферации кумулюса за счет накопления гиалуронового матрикса в межклеточном пространстве и в мейотическом созревании яйцеклеток.

Формирование веретена деления во время двух фаз мейоза (MI и MII) имеет важное значение для точной сегрегации хромосом и для последовательных асимметричных клеточных делений, необходимых для формирования малых полярных телец и самого ооцита.

Во время процесса оплодотворения гиалуроновый матрикс разрушается под действием сперматозоидсинтезированной гиалуронидазы, образующиеся мелкие гиалуроновые фрагменты способны активировать клетки кумулюса через TLR (от англ. toll-like receptor, toll-подобный рецептор), вследствие этого запускается синтез хемокинов в клетках кумулюса. Хемокины, в свою очередь, влияют на сперматозоиды, индуцируя капацитацию (обретение сперматозоидом оплодотворяющей способности).

TLR выполняет также защитную функцию. Система TLR активируется бактериальными липополисахаридами, тем самым защищает ооцит от проникновения инфекции.

Кроме того, были выявлены паракринные факторы, секретируемые ооцитами, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку гранулезных клеток. В частности, такими веществами являются GDF9 и BMP15. В эксперименте было показано, что уровни экспрессии мРНК GDF9 и BMP15 были тесно связаны с созреванием ооцитов, оплодотворением, качеством эмбриона и исходом беременности. Содержание мРНК GDF9 и BMP15 в клетках кумулюса рассматривается в качестве перспективного молекулярного маркера прогноза развития ооцитов (Li Y. et al., 2014).

В целом многочисленные исследования указывают на то, что клетки куму-люса выполняют следующие важные функции:

С приходом эпохи функциональной геномики и протеомики становится возможным определить транскриптом и протеом кумулюсных клеток с использованием высокопроизводительных технологий, таких как микрочип и высокоразделительный двухмерный электрофорез.

Нынешние ожидания таковы, что профилирование экспрессии генов кумулюсных клеток предоставит новые возможности для понимания составляющих качества компетентного ооцита и повышения эффективности протокола стимуляции яичников, а также поможет выявить надежные биомаркеры анеупло-идии ооцитов, прогноза развития эмбриона и исхода беременности.

Способы оценки ооцита. С определенной степенью условности, для удобства, все методы, позволяющие определить строение ооцита и его функциональные возможности (компетентность), можно разделить на несколько групп (Nagy Z.P. et al., 2009; Nel-Themaat L., Nagy Z.P., 2011; Patrizio P. et al., 2007; Rienzi L. et al., 2011; Braga D.P. et al., 2013):

Ниже мы рассмотрим основные морфологические маркеры качества/ жизнеспособности ооцитов и проведем анализ возможности их использования для прогнозирования имплантации эмбриона.

Оценка ооциткумулюсного комплекса (ОКК). Сразу после завершения пункции можно оценить качество и степень зрелости полученных ОКК. Степень зрелости ОКК оценивают по объему, плотности и состоянию окружающих ооцит клеток кумулюса и лучистого венца (табл. 14-1). Редко, если ооцит видно, можно определить присутствие 1PB, что указывает на то, что ооцит достиг стадии метафазы II (MII). Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию ОКК весьма субъективна.

Однако асинхронность в созревании клеток кумулюса, ядра ооцита и ооплазмы достаточно часто встречается в циклах стимуляции суперовуляции, и ОКК низкого качества могут содержать зрелый ооцит на стадии метафазы II (МII).

Несмотря на то что существует мало достоверных свидетельств наличия взаимосвязи между качеством ОКК и компетенцией ооцита, принята двухбалльная оценка микроскопии ОКК (ESHRE, 2011): 0 или 1.

ОКК хорошего качества определен как результат -1 и имеет экспонированный кумулюс, хорошо визуализируемые клетки лучистого венца.

Точно можно сказать: чем меньше в кумулюсе признаков апоптоза, тем лучше качество ооцита.

Морфологическая оценка ооцита. В практической работе до настоящего времени нет четких критериев оценки строения (морфологии) ооцитов. Не существует широко признанных систем такого анализа, есть только некоторые рекомендации по конкретным типам аномалий. Причем некоторые такие аномалии свидетельствуют о высокой вероятности отклонений и у эмбрионов, решение о переносе которых нужно принимать взвешенно.

Оценка морфологии ооцитов является сложной задачей, так как базовые механизмы, изменяющие внешний вид ооцитов, являются многофакторными и сложными.

В повседневной работе обычной эмбриологической лаборатории морфологическая оценка ооцитов в протоколе ЭКО является довольно поверхностной. Кроме этого, она ограничена присутствием кумулюсных клеток. Наиболее точную оценку ооцита возможно произвести при оплодотворении методом внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ICSI) или при подготовке ооцита к криоконсервации, которые требуют предварительного удаления кумулюсных клеток.

Основным критерием отбора ооцитов для оплодотворения является визуализация первого полярного тельца в перивителлиновом пространстве. Предполагается, что ооцит находится на стадии метафазы II (МII) (рис. 14-2, а).

Оценку ядерного созревания ооцитов выполняют непосредственно перед инъекцией сперматозоида, через 3-4 ч после извлечения яйцеклеток, при использовании инвертированного микроскопа с модуляционным контрастом Хофмана или Номарского, под 400-кратным увеличением.

В среднем 70-85% полученных ооцитов находятся на стадии MII (см. рис. 14-2, а). Приблизительно у 10% ооцитов в цитоплазме определяется ядро - герминальный пузырек (GV) и отсутствует первое полярное тельце, такой ооцит находится на стадии полового пузырька (стадия GV), то есть на стадии профазы первого мейотического деления (рис. 14-2, б), и 5-20% ооцитов, у которых уже не определяется герминальный пузырек и отсутствует первое полярное тельце, классифицируются как MI ооциты (метафаза первого мейотического деления) (рис. 14-2, в) (Rienzi L., Ubaldi F., 2009).

Полное физиологическое созревание ооцита требует ядерных и цитоплазматических изменений, которые должны быть скоординированы и завершены для обеспечения оптимальных условий клеточного развития. Сама по себе ядерная зрелость является условно достаточной для определения компетентности ооцита.

Некоторые ооциты, находящиеся на момент пункции в переходной стадии зрелости от MI в MII, могут успешно преодолевать процессы созревания в условиях in vitro, если это позволяет внутренний ресурс клетки.

Изучение веретена деления. Дополнительная информация о ядерном статусе ооцитов может быть получена с использованием поляризованной световой микроскопии в сочетании с программным обеспечением для обработки изображений. Этот неинвазивный метод позволяет визуализировать морфологию веретена деления и других двулучепреломляющих элементов ооцита, например зону пеллюцида. Веретено деления - это структура микротрубочек, которая участвует в сегрегации хромосом и, следовательно, имеет решающее значение в последовательности событий, ведущих к качественному завершению мейоза и правильному оплодотворению (Oldenbourg R., 1999).

Наличие веретена деления дает более точную информацию о стадии ядерной зрелости яйцеклетки. Некоторые яйцеклетки при исследовании с использованием поляризованной световой микроскопии, несмотря на сформированное первое полярное тельце, могут быть незрелыми и находиться на стадии ранней телофазы I. На данном этапе, по сути, существует контакт между ооплазмой яйцеклетки и формирующимся первым полярным тельцем и веретено деления находится между двумя разделяющимися клетками (рис. 14-3). Это состояние обычно длится 75-90 мин. Затем веретено деления исчезает в конце телофазы I, происходит его реформирование в течение следующих 40-60 мин. Пока веретено второго мейотического деления еще не визуализируется, такой ооцит нельзя считать полностью зрелым MII (Montag M. et al., 2011).

Однако следует подчеркнуть, что некоторые факторы, такие как субоптимальные условия культивирования in vitro: температурные колебания и химическое воздействие окружающей среды во время пункции - могут способствовать деструктуризации веретена деления (Rienzi L., Ubaldi F., 2009).

Наконец, процент ооцитов с визуализируемым веретеном деления также связан со временем, прошедшим после введения триггера, которое должно составлять не меньше 38 ч. В целом ожидается, что по меньшей мере 80% ооци-тов, извлеченных после стимуляции яичников, при исследовании с помощью поляризованной световой микроскопии являются зрелыми.

Нарушения морфологии ооцита (дисморфизмы). Считается, что сама по себе ядерная зрелость является достаточной для определения компетентности ооцита. Однако дефицит цитоплазматического созревания может поставить под угрозу все процессы, которые подготавливают яйцеклетку для активации, адекватного оплодотворения и развития эмбриона. Кроме того, нарушение или асинхронность этих двух процессов вызывает ухудшение качества ооцитов, что приводит к их различным дисморфизмам (Eichenlaub-Ritter U. et al., 1995; Kah-raman S. et al., 2000).

Большинство (60-70%) ооцитов, извлеченных из фолликулов в стимулированных циклах, проявляют аномальные морфологические характеристики.

Морфологические аномалии ооцитов принято классифицировать на:

Анализу подвергают следующие структуры:

Аномалии в перечисленных структурах можно соотнести со зрелостью ооцита. Так, например, мелкий ооцит, темная неравномерной толщины истонченная зона пеллюцида, увеличенное перивителлиновое пространство, включения в перивителлиновом пространстве, фрагментированное или увеличенное полярное тело, темная ооплазма, присутствие грубых гранул и вакуолей, агрегация эндоплазматического ретикулума (SERa) свидетельствуют о позднем созревании с признаками апоптоза.

Неполное выделение полярного тела (погруженное в оолемму), центральная грануляция цитоплазмы, большой объем ооцита являются признаками раннего созревания с незавершенными ядерными и цитоплазматическими процессами.

Следует учитывать суммарный эффект присутствия нескольких морфологических особенностей в ооците. При исследовании единичных аномалий и их совокупного множества в 65% случаев обнаруживалась прямая ассоциация с дальнейшим прогнозом оплодотворения, развития, имплантации эмбриона, наступления беременности и приводила к значимой корреляции с результатом, тогда как в 35% случаев не являлась прогнозирующим фактором (Rienzi L. et al., 2011).

Существуют опасения в отношении эмбрионов, развивающихся из «гигантских» ооцитов, так как по результатам цитогенетического анализа увеличивался шанс полиплоидии эмбриона, несмотря на нормальное оплодотворение - 2PN (Rosenbusch B. et al., 2002). Рекомендуют исключать гигантские ооциты из программы ЭКО, даже если они имеют нормальное число пронуклеусов. Специалисты в области ВРТ в данный момент не имеют четких рекомендаций по тактике использования ооцитов SERa+. Принятый ранее консенсус Alpha/ ESHRE 2014 г. о запрете использования ооцитов SER+ по причине появления различных пороков развития у детей, зафиксированных в литературе «от случая к случаю», был пересмотрен экспертами в 2017 г. Рекомендуют оплодотворять все зрелые ооциты, при этом предпочтение отдавать эмбрионам, которые развивались из ооцитов SERa-, а эмбрионы из ооцитов SERa+ рассматривать как резервный материал и использовать по согласованию с парой.

Критериями оценки влияния дисморфизмов на ооцит являются:

Влияние морфологических вариаций ооцита на развитие эмбриона и имплантацию, однако, не окончательно определено из-за методологических недостатков, присущих большинству исследований, представленных в литературе (Rienzi L. et al., 2011).

У ооцитов с цитоплазмическими и экстрацитоплазмическими аномалиями наиболее часто отмечают нарушение оплодотворения (Ebner T. et al., 2006; Rienzi L. et al., 2008).

Основные факторы, влияющие на морфологию ооцитов. Все морфологические вариации ооцита определяются двумя группами факторов (Patrizio P., Sakkas D., 2009; Garrido N. et al., 2011; Lemmen J.G. et al., 2016):

К основным внутренним факторам относят:

К внешним факторам относят:

Морфологические изменения ооцитов могут возникнуть в результате внутренних факторов - возраст и генетические дефекты - и внешних - контролируемая овариальная стимуляция, овариальный ответ на нее (Rashidi B.H. et al., 2005) и лабораторные техники.

Существуют исследования, которые определили, что агрессивная стимуляция яичников ведет к увеличению вероятности анеуплоидии эмбриона даже у пациентов моложе 35 лет, включая ошибки «материнской» сегрегации хромосом в ходе оогенеза и ошибки постзиготической сегрегации хромосом (Baart E.B. et al., 2007; Haaf T. et al., 2009), а также негативно влияет на поддержание геномного импринтинга в раннем эмбриогенезе (Denomme M.M., Mann M.R., 2012; Saenz-dе-Juano M.D. et al., 2016).

Анализ литературы показывает, что морфологические отклонения в ооците могут возникать после ICSI, но пока этот вопрос остается спорным (Balaban B. et al., 1998; Balaban B., Urman B., 2006; Yakin K. et al., 2007). При выполнении ICSI происходит перераспределение ооплазмы, могут быть нарушены ооплаз-матическая сегрегация органелл и структура цитоскелета ооцита.

Пункция фолликулов и качество ооцита. Точность измерения диаметра фолликулов во время ультразвукового мониторинга в протоколе стимуляции яичников и соблюдение четкого временного интервала между введением триггера финального созревания ооцитов и пункцией яичников являются важнейшими факторами получения ооцитов хорошего качества (ESHRE, 2017).

Известно, что время проведения пункции фолликулов по отношению к моменту введения триггера, как правило, находится в диапазоне 34-38 ч. В исследовании на 895 женщинах было установлено, что промежуток времени от введения триггера до пункции яичников более 36 ч по сравнению с таковым менее 36 ч приводит к увеличению количества зрелых яйцеклеток (Wang W. et al., 2011).

Важно во время пункции бережно относиться к целостности ОКК, так как процессы созревания ооцита еще не завершены и ооцит должен находиться в окружении клеток кумулюса в течение 3-4 ч. ОКК могут быть нарушены вследствие воздействия на них высокого давления в аспирационной системе. Так, в эксперименте было показано, что процентное содержание целостных ОКК и переносимых эмбрионов на извлеченные ооциты при 180 мм рт.ст. (69,7 и 23,8% соответственно) было достоверно выше, чем при 300 мм рт.ст. (46,2 и 12,8% соответственно). Частота развивающейся беременности на один цикл при 180 мм рт.ст. (30%) была достоверно выше, чем при 300 мм рт.ст. (4,3%).

Сегодня не существует определенной ясности относительно прогнозирующей ценности видимых морфологических особенностей ооцита МII. Успешное оплодотворение ооцитов в большой степени зависит от их «врожденных качеств». Полноценное созревание ооцита не может просто быть определено с использованием микроскопа, поскольку влечет за собой координацию многочисленных цитоплазматических процессов, которые невозможно оценить визуально.

Основной прогностический критерий оценки в условиях лабораторной работы эмбриолога - это морфологическая характеристика эмбрионов предымплантационной стадии. Потенциал, связанный с развитием полученного эмбриона, оценивают на основе надлежащей морфологии эмбриона независимо от качества ооцита, из которого он был получен. Однако тщательное наблюдение и продолжающиеся исследования ооцитов необходимы для дальнейшего улучшения методов эффективного оплодотворения с образованием двупронуклеарных зигот (2PN) и последующего успешного развития эмбрионов в оптимальных условиях культивирования. В будущем с большей вероятностью исход протоколов ЭКО будет зависеть от «исторических событий», связанных с созреванием ооцитов, который нелегко объяснить или предотвратить с помощью модификации лабораторных протоколов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Alpha Scientists in Reproductive medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting // Hum. Reprod. 2011. Vol. 26. P. 1270-1283.

Ashkenazi H., Cao X., Motola S., Popliker M., Conti M., Tsafriri A. Epidermal growth factor family members: endogenous mediators of the ovulatory response // Endocrinology. 2005. Vol. 146, N 1. P. 77-84.

Baart E.B., Martini E., Eijkemans M.J., Van Opstal D., Beckers N.G., Verhoeff A. et al. Milder ovarian stimulation for in-vitro fertilization reduces aneuploidy in the human preimplantation embryo: a randomized controlled trial // Hum. Reprod. 2007. Vol. 22. P. 980-988.

Balaban B., Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation // Reprod. Biomed. Online. 2006. Vol. 12, N 5. P. 608-615.

Balaban B., Urman B., Sertac A., Alatas C., Aksoy S., Mercan R. Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo quality and implantation rate after intracytoplasmic sperm injection // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13. P. 3431-3433.

Braga D.P., Setti A.S., Figueira R.C., Machado R.B., Iaconelli A. Jr., Borges E. Jr. Influence of oocyte dysmorphisms on blastocyst formation and quality // Fertil. Steril. 2013. Vol. 100. P. 748-754.

Denomme M.M., Mann M.R. Genomic imprints as a model for the analysis of epigen-etic stability during assisted reproductive technologies // Reproduction. 2012. Vol. 144. P. 393-409.

Ebner T., Sommergruber M., Moser M., Shebl O., Schreier-Lechner E., Tews G. Basal level of anti-mullerian hormone is associated with oocyte quality in stimulated cycles // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21. P. 2022-2026.

Eichenlaub-Ritter U., Schmiady H., Kentenich H., Soewarto D. Recurrent failure in polar body formation and premature chromosome condensation in oocytes from a human patients: indicators of asynchrony in nuclear and cytoplasmic maturation // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 2343-2349.

Feuerstein P., Cadoret V., Dalbies-Tran R., Guerif F., Bidault R., Royere D. Gene expression in human cumulus cells: one approach to oocyte competence // Hum. Reprod. 2007. Vol. 22. P. 3069-3077.

Garrido N., Bellver J., Remohi J., Simon C., Pellicer A. Cumulative live-birth rates per total number of embryos needed to reach newborn in consecutive in vitro fertilization (IVF) cycles: a new approach to measuring the likelihood of IVF success // Fertil. Steril. 2011. Vol. 96. P. 40-46.

Gougeon A. Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypothesis // Endocr. Rev. 1996. Vol. 17. P. 121-155.

Haaf T., Hahn A., Lambrecht A., Grossmann B., Schwaab E., Khanaga O. et al. A high oocyte yield for intracytoplasmic sperm injection treatment is associated with an increased chromosome error rate // Fertil. Steril. 2009. Vol. 91. P. 733-738.

Hashimoto S., Fukuda A., Murata Y. et al. Effect of aspiration vacuum on the developmental competence of immature human oocytes retrieved using a 20-gauge needle // Reprod. Biomed. Online. 2007. Vol. 14, N 4. P. 444-449.

Hirshfield A.N. Development of follicles in the mammalian ovary // Int. Rev. Cytol. 1991. Vol. 124. P. 43-101.

Kahraman S., Yakin K., Donmez E., Samli H., Bahce M., Cengis G. et al. Relationship between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome following intracytoplasmic sperm injection // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 2390-2393.

Lemmen J.G., Rodriguez N.M., Andreasen L.D., Loft A., Ziebe S. The total pregnancy potential per oocyte aspiration after assisted reproduction-in how many cycles are biologically competent oocytes available? // J. Assist. Reprod. Genet. 2016. Vol. 33. P. 849-854.

Li Y., Li R.Q., Ou S.B., Zhang N.F., Ren L., Wei L.N. et al. Increased GDF9 and BMP15 mRNA levels in cumulus granulosa cells correlate with oocyte maturation, fertilization, and embryo quality in humans // Reprod. Biol. Endocrinol. 2014. Vol. 12. P. 81. DOI: 10.1186/1477-7827-12-81.

Montag M., Köster M., van der Ven K., van der Ven H. Gamete competence assessment by polarizing optics in assisted reproduction // Hum. Reprod. Update. 2011. Vol. 17. P. 654-666.

Nagy Z.P., Jones-Colon S., Roos P., Botros L., Greco E., Dasig J. et al. Metabolomic assessment of oocyte viability // Reprod. Biomed. Online. 2009. Vol. 18. P. 219-225.

Nel-Themaat L., Nagy Z.P. A review of the promises and pitfalls of oocyte and embryo metabolomics // Placenta. 2011. Vol. 32. P. S257-S263.

Oldenbourg R. Polarized light microscopy of spindles // Methods Cell Biol. 1999. Vol. 61. P. 175-208.

Ouandaogo Z.G., Haouzi D., Assou S., Dechaud H., Kadoch I.J., De Vos J. et al. Human cumulus cells molecular signature in relation to oocyte nuclear maturity stage // PLoS One. 2011. Vol. 6. Article ID e27179.

Patrizio P., Fragouli E., Bianchi V., Borini A., Wells D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte // Reprod. Biomed. Online. 2007. Vol. 15. P. 346-353.

Patrizio P., Sakkas D. From oocyte to baby: a clinical evaluation of the biological efficiency of in vitro fertilization // Fertil. Steril. 2009. Vol. 91. P. 1061-1066.

Rashidi B.H., Sarvi F., Tehrani E.S., Zayeri F., Movahedin M., Khanafshar N. The effect of hMG and recombinant human FSH on oocyte quality: a randomized single-blind clinical trial // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2005. Vol. 120. P. 190-194.

Rienzi L., Ubaldi F. Oocyte retrieval and selection // Textbook of Assisted Reproductive Technologies: Laboratory and Clinical Perspectives. 3^rd ed. / eds D.K. Gardner, A. Weiss-man, C.M. Howles, Z. Shoham. London, UK : Informa Healthcare, 2009. P. 5-101.

Rienzi L., Ubaldi F.M., Iacobelli M., Minasi M.G., Romano S., Ferrero S. et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90. P. 1692-1700.

Rienzi L., Vajta G., Ubaldi F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature // Hum. Reprod. Update. 2011. Vol. 17, N 1. P. 34-45.

Rosenbusch B., Schneider M., Gläser B., Brucker C. Conventional chromosomal analysis of human oocytes // Reproduktionsmedizin. 2002. Vol. 18. P. 345-351.

Saenz-de-Juano M.D., Billooye K., Smitz J., Anckaert E. The loss of imprinted DNA methylation in mouse blastocysts is inflicted to a similar extent by in vitro follicle culture and ovulation induction // Mol. Hum. Reprod. 2016. Vol. 22. P. 427-441.

The Vienna consensus: report of an expert meeting on the development of art laboratory performance indicators. ESHRE Special Interest Group of Embryology Alpha Scientists in Reproductive Medicine // Hum. Reprod. Open. 2017. Vol. 2017, N 2. Article ID hox011.

Van Blerkom J., Henry G.H. Oocyte dismorphism and aneuploidy in meiotically mature human oocytes after ovarian stimulation // Hum. Reprod. 1992. Vol. 7. P. 379-390.

Wang W., Zhang X.H., Wang W.H., Liu Y.L., Zhao L.H., Xue S.L. et al. The time interval between hCG priming and oocyte retrieval in ART program: a meta-analysis // J. Assist. Reprod. Genet. 2011. Vol. 28. P. 901-910.

Yakin K., Balaban B., Isiklar A., Urman B. Oocyte dysmorphism is not associated with aneuploidy in the developing embryo // Fertil. Steril. 2007. Vol. 88. P. 811-816.

Расположение и инфраструктура лаборатории. Если предстоит создание новой клиники ЭКО, начинать следует с выбора места. Однако часто выбор места ограничен из-за того, что под отделение ВРТ выделяют помещение в существующем больничном комплексе или центре. В этом случае необходимо вписаться в существующие условия. Следует продумать дизайн и создать проект клиники, отвечающий взаимному расположению операционной, лаборатории эмбриологии (эмбриобокса), помещения для криоконсервирования и хранения, лаборатории андрологии и при необходимости помещения для подготовки материала для проведения доимплантационной диагностики. При этом очевидно, что эмбриобокс является центральным и самым основным помещением с наибольшими требованиями к чистоте, эргономике и расположению оборудования, а также перемещению персонала. Следует исключить возможность транзита через эмбриобокс транспортных сосудов Дьюара, газовых баллонов, термосов и другого оборудования, расходных материалов и упаковки, не используемых для работы в боксе. Расположение и оснащение эмбриологической лаборатории должны обеспечивать оптимальную и безопасную работу с эмбрионами человека, исключающую случайную контаминацию и нарушение условий культивирования.

В крупных городах основную проблему представляет собой загрязнение воздуха, поэтому по возможности следует избегать расположения лаборатории эмбриологии на первом этаже, вблизи крупных транспортных потоков, индустриальных зон и влажных подвалов. Основным классом загрязнений считают летучие органические соединения (ЛОС), включающие широкий класс соединений: углеводороды, альдегиды, спирты, кетоны, терпеноиды и др. Стандартно ЛОС измеряют в частях на миллион (parts per million, ppm). Для лабораторий ЭКО приемлемым можно считать уровень ниже 0,5 ppm, уровень ниже 0,2 ppm характеризует лаборатории высокой степени чистоты. Помимо внешних источников ЛОС, загрязнение воздуха лаборатории может быть вызвано отделочными материалами лаборатории, новым оборудованием (инкубаторы и микроскопы), расходными материалами (упаковочный картон) или некачественной газовой смесью. Поэтому необходимо использовать только протестированный и рекомендованный для ЭКО пластик и газовые смеси, а также при покупке нового оборудования не вводить его в лабораторное использование сразу. Рекомендуемое время «карантина» для инкубаторов - 3-5 мес. Следует также уделить внимание выбору средств очистки и дезинфекции лаборатории. Для эмбриологической лаборатории важен выбор щадящих и в идеале специальных средств для ежедневной и регулярной уборки. Если в смежных с лабораторией помещениях (чаще всего это операционные) применяют агрессивные средства очистки и дезинфекции, то необходимо исключить возможность попадания их в эмбриобокс. Для этого в эмбриологических помещениях поддерживают слабоположительное давление (5-20 Па), что обеспечивает вытеснение загрязнений в менее чистые смежные помещения при открывании дверей.

В воздухе также могут присутствовать микрочастицы (споры грибов и бактерий, пыльца и др.), неорганические молекулы (СО, N₂ O, SO₂ ), производные бензола, фенол и др. Поэтому наиболее грамотным выбором для обеспечения чистоты воздуха эмбриобокса является монтирование системы вентиляции и кондиционирования воздуха (HVAC, от англ. heating, ventilation, and air conditioning), которая может занимать целый этаж над лабораторией ЭКО. Эта система включает HEPA-фильтры (от англ. high efficiency particular air), задерживающие микрочастицы до 0,3 мкм; угольный фильтр (уголь и перманганат калия), задерживающий крупные частицы, газы, ЛОС. Также часто используют фотокаталитические камеры, разлагающие химические токсины до воды и СО₂ . Однако при неполном разложении крупные молекулы разлагаются до менее крупных и повышают уровень свободных радикалов. Кроме того, система HVAC поддерживает оптимальную температуру и слабоположительное давление в чистых помещениях.

Очевидно, что наиболее комфортная температура для роста эмбрионов 37 °С, и снижение ее даже на один градус приводит к нарушению веретена деления и нерасхождению хромосом. Однако поддержание такой температуры в эмбриобоксе невозможно - это приведет к нарушению работы оборудования и дискомфорту персонала. Принято поддерживать температуру порядка 22-26 °С. Конкретное значение следует выбирать, учитывая дополнительные условия. Так, в случае необходимости повысить степень чистоты эмбриобокса персонал обязан перейти на медицинскую одежду с длинным рукавом, и достаточно высокая температура воздуха будет некомфортной. Но надлежит помнить и о «комфорте» эмбрионов: значительно не снижать температуру помещения и следить за временем нахождения их вне условий инкубатора.

Освещение лаборатории также требует внимания. Для развития эмбрионов человека свет не нужен, он является стрессовым фактором. Требуется минимизировать воздействие света до разумного минимального уровня. Следует соблюдать баланс между сохранностью эмбрионов и комфортом, а также безопасностью работы специалистов. Самое большое воздействие света эмбрион получает при микроманипуляциях и визуальной оценке, находясь в стереоили инвертированном микроскопе, что является необходимым моментом работы. Работа на модельных объектах показала, что свет в красном спектре (620-750 нм) более комфортен для эмбрионов, чем свет в голубом спектре (445-500 нм), вызывающий апоптоз бластомеров и повышение уровня свободных радикалов, поэтому предпочтительнее выбирать осветители микроскопов, подсветку оборудования и общее освещение в теплом спектре. Для снижения стресса от света возможно лишь снизить общую освещенность в лаборатории, что в некоторых вариантах реализовано в виде отсутствия общего освещения и окон. Однако длительное нахождение эмбриолога в некомфортных условиях может снизить скорость и эффективность работы. В отношении окон, помимо опасности прямых солнечных лучей, необходимо учесть возможность дополнительного загрязнения помещения через фурнитуру оконных рам.

Оборудование. При приобретении и расстановке нового оборудования в эмбриобоксе следует учитывать физическое передвижение персонала, стараясь компактно расположить оборудование, минимизировать пересечение маршрутов и тем самым уменьшить возможность столкновений. Применение модульной системы расположения оборудования позволит лучше адаптировать лабораторию и провести перестановки оборудования при изменении систем культивирования и работы с гаметами и эмбрионами человека, а также при внедрении новых технологий. Необходимо обеспечить удобный и легкий доступ к оборудованию для каждого эмбриолога, поэтому наиболее удобны высокие лабораторные стулья, регулируемые по высоте, а также использование рабочих станций ЭКО с ламинарным потоком с изменением высоты рабочей поверхности. Высота расположения инкубаторов должна быть удобна для всех сотрудников - верхние полки инкубаторов большого объема менее доступны для невысоких эмбриологов. Следует продумать такие особенности, как открывание дверей инкубатора (правая или левая), расположение стереомикроскопов в рабочей станции ЭКО (центр или к краю), расположение, размер и количество контейнеров для сбора мусора и необходимость его сортировки. Следует оценить электрическую нагрузку оборудования эмбриобокса и обеспечить нужное количество розеток, а все важное оборудование подключать через источники бесперебойного питания. Вся клиника, а особенно операционные, эмбриобокс и криохранилище должны быть подключены к системе аварийного электроснабжения на случай отключения электроэнергии.

Базовое оборудование эмбриологической лаборатории

Используют несколько типов инкубаторов. Стандартные инкубаторы, работающие на углекислом газе, могут быть с увлажнением или без него. Инкубатор без увлажнения менее подвержен риску контаминации, но при некоторых вариантах культивирования (без добавления минерального масла) в таких инкубаторах при испарении будет меняться осмоляльность культуральной среды, что негативно сказывается на эмбрионах.

Во всех инкубаторах, помимо температурного датчика, устанавливают датчик контроля концентрации СО₂ (термокондуктометрический или инфракрасный датчик), концентрации О₂ (или датчик контроля подачи газа). Хорошо зарекомендовали себя инкубаторы, работающие на смеси газов. Это смесь трех газов - 5-6% СО₂ , 5% О₂ и 90% N₂ . Снижение концентрации кислорода с атмосферного 20% уровня до 2-7% понижает оксидативный стресс, что ближе к естественным условиям развития эмбриона.

Традиционно использовали инкубаторы объемом 150-210 л. Однако при большой вместимости этих инкубаторов частые открывания дверей приводят к значительному снижению концентрации газов на длительный период. Применение инкубаторов меньшего объема требует меньше времени на восстановление концентрации углекислого газа, и, соответственно, в них стабильнее условия культивирования (рН).

Условия внутри инкубатора с высокой и стабильной температурой при высокой влажности очень привлекательны для развития микроорганизмов, что повышает вероятность контаминации, поэтому важной функцией является возможность автостерилизации инкубатора (180 °С, 30-180 мин). Такой режим позволяет инактивировать бактериальные споры.

Следующей стадией развития стали настольные инкубаторы с индивидуальными камерами для культивирования, работающие в основном на трехгазовой смеси. Они продемонстрировали хорошие результаты как в плане стабильности условий культивирования, так и в скорости стабилизации условий после открывания, а также удобстве использования и эргономике расположения. В этом случае время восстановления концентрации газов и воздействие на соседние культуры эмбрионов минимальны.

Наконец, разработка инкубаторов с технологией time lapse (покадровой съемки) позволяет оценивать морфокинетические характеристики эмбриона с минимальным воздействием на него. За счет непрерывной фотосъемки и суммирования изображений можно оценивать морфологические особенности эмбриона, прослеживать динамику дробления и соответствие эмбриона дню развития. Использование этой технологии также исключает необходимость визуальной оценки эмбриолога, сопровождающейся нахождением эмбрионов в течение некоторого времени вне условий инкубатора. Однако у данной технологии, помимо очевидной - цена, существуют и другие ограничения: требуется специальный дорогостоящий пластик для индивидуального культивирования эмбрионов (с четким позиционированием эмбриона под камерой), использование исключительно одношаговой системы культивирования (чтобы избежать смены сред и дополнительного расхода культурального пластика), а также на начальном этапе применения технологии следует определить временные интервалы клеточных делений и скорости развития эмбриона в условиях данного эмбриобокса. Эти характеристики могут отличаться в значительной степени как из-за внутренних причин (качество получаемых гамет), внешних факторов (состав газовой смеси, температурный режим, чистота помещений и др.), так и из-за качества работы эмбриологов (соблюдение оптимального времени для оплодотворения, качество проводимых микроманипуляционных вмешательств и др.).

Для обеспечения стабильной работы инкубаторов требуется система газоснабжения и очистки газов. Газы и газовые смеси, используемые для инкубаторов, могут содержать различное количество примесей, отрицательно влияющих на развитие эмбрионов. Установка газовых фильтров с длительным сроком службы на газовую магистраль перед инкубатором предотвращает попадание ЛОС, химически активных соединений, бактерий, пыли в инкубатор. Иногда НЕРА-фильтры являются частью инкубатора и производят дополнительную очистку газов. Для обеспечения чистоты помещений и своевременной смены газовых баллонов систему газоснабжения обычно монтируют за пределами эмбриобокса, оснащая ее необходимыми редукторами, автоматическим переключателем с рабочего на резервный баллон и сигнализацией на случай отклонения от нужного давления. Подача газов в инкубаторы осуществляется по пластиковым, медным трубкам или трубкам из нержавеющей стали (лучший вариант).

Микроскопы. В настоящее время используют микроскопы следующих типов.

Дополнительное оборудование

На каждом рабочем месте должны находиться держатели для капилляров различного диаметра, пипетки Пастера или другие удобные для эмбриолога инструменты для работы с ОКК, ооцитами, эмбрионами, сперматозоидами, бластомерами, фрагментами трофэктодермы.

Рабочее место эмбриолога следует оснастить также требуемым количеством прямых пинцетов разных размеров, ножниц, корнцангов, нетоксичных маркеров, таймеров с функцией суммирования; камерой Маклера или другими счетными камерами, штативами для криовиал и пробирок. Выбор инструментария целиком зависит от предпочтений всех работающих эмбриологов и должен исключать необходимость прерывания работы.

Хорошей практикой в лаборатории эмбриологии является наличие системы онлайн-мониторинга для непрерывного внешнего контроля качества в лабораториях. Система измеряет как показатели условий лаборатории (загрязнения, температуру и влажность), так и параметры условий культивирования (концентрация газов, температура и рН культуральной среды), хранения расходников (холодильники для культуральной среды) и биоматериалов (криохранилища). Система фиксирует все случаи нарушения работы и отключения оборудования. Все показания записываются, и при необходимости есть возможность ретроспективно оценить качество работы эмбриобокса: стабильность оборудования и условий культивирования, а также влияние параметров условий лаборатории на рост культуры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Bento F., Esteves S., Agarwal A. Quality Management in ART Clinic: a Practical Guide. Springer Science and Business Media, 2012. 246 p.

Carson S., Alper M., Keck C. Quality Management Systems for Assisted Reproductive Technology - ISO 9001:2000. Taylor and Francis. 2004.

Esteves S., Varghese A., Worrilow K. Clean Room Technology in ART Clinics: a Practical Guide. CRC Press, 2016. 424 p.

Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs // Hum. Reprod. 2016. Vol. 31, suppl. 4. P. 685.

Talwer L.C.P. Manual ofAssisted Reproductive Technologies and Clinical Embryology. Jaypee Brothers Medical Publishers, 2012. 900 p.

The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine and the Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology. Revised guidelines for human embryology and andrology laboratories // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, suppl. 3. P. 45-59.

Микроманипуляционные техники основаны на использовании микроинструментов в поле зрения микроскопа. Изначально эти системы применялись только в исследовательских лабораториях, но с развитием технологий ВРТ они достаточно быстро вошли в рутинную практику. Для их проведения необходимо наличие инвертированного микроскопа с увеличением объективов не менее ×20, микроманипуляторов и стеклянных микроинструментов. Использование микроманипуляторов сначала ограничивалось работой с блестящей оболочкой, затем разработка и внедрение широкого спектра новых микроинструментов позволили работать с ооцитами и эмбрионами.

К микроманипуляционным техникам относят:

Коллапсирование бластоцисты с целью минимизации объема бластоцели в настоящее время применяют редко. Для коллапсирования можно применять как механический, так и лазерный способ воздействия. Иногда коллапсирование бластоцисты используют как метод оценки ее потенциала для решения вопроса целесообразности витрификации эмбриона. Считается, что бластоцисты, которые не способны коллапсировать в ответ на внешнее воздействие, обладают меньшим потенциалом к развитию и имплантации.

Дефрагментация эмбрионов представляет собой удаление отшнурованных фрагментов цитоплазмы, лишенных ядра. От применения этой технологии в большинстве клиник также отказались, так как не доказана ее эффективность при очевидной высокой стоимости и инвазивности.

Микроинструменты (микропипетки). Для проведения всех микроманипуляций подходят инструменты из боросиликатного стекла. На начальном этапе развития техник микроманипуляций инструменты эмбриологи изготавливали самостоятельно с использованием микрокузниц. В настоящее время производители предлагают широкий выбор инструментов с различными характеристиками и обеспечением необходимого уровня стерильности. Возможно также изготовление инструментов по индивидуальному запросу. Важное значение имеет «конструкция» упаковки микропипетки, поскольку она должна позволять извлекать инструмент быстро, без затруднений и безопасно.

Особенности крепления микроманипулятора на станину микроскопа почти всегда предполагают наличие угла наклона рабочего плеча к удерживающему плечу микропипетки. Этот угол составляет от 15 до 45°. Хотя в некоторых системах возможна работа и с прямым микроинструментом. При стандартном креплении обычно угол наклона составляет 35°. Однако возможно использование практически любых модификаций пипеток, если есть возможность подстройки микроманипулятора. Основное правило - рабочее плечо микроинструмента в капле с ооцитом или эмбрионом должно быть максимально горизонтально к поверхности (рис. 16-1).

Удерживающие микропипетки (холдеры) используют при любой манипуляции для удержания ооцита или эмбриона. Они имеют оплавленный край. Эти инструменты характеризуются большим внешним диаметром (от 80 до 180 мкм).

Внутренний диаметр подбирается в зависимости от объекта. Чем больше внутренний диаметр, тем лучше удерживается эмбрион или ооцит. Однако в случае с ооцитом слишком большой внутренний диаметр может быть причиной частичного всасывания его оолеммы и цитоплазмы внутрь пипетки с риском нарушения цитоскелета.

Внешний край удерживающей пипетки обычно плоский. Для проведения методик ICSI эта характеристика не важна, но при биопсии бластоцисты более плоский край имеет преимущества при проведении механического отрывания фрагмента трофэктодермы.

Инъекционные микропипетки (инжекторы) используют для инъекции сперматозоида в ооцит. Особенностью данного вида инструментов является их скошенная форма, облегчающая разрыв оолеммы для инъекции сперматозоида. Размер этого скоса может быть различным.

Инжекторы могут иметь различную длину плеча. Инструмент с более длинным плечом позволяет отбирать более одного сперматозоида в пипетку.

Модификацией инжекторной микропипетки может быть наличие шипа на конце. Он создает дополнительные условия для разрыва оолеммы. Однако при работе с тестикулярными сперматозоидами или при криптоспермии, когда в капле, наряду со сперматозоидами, присутствуют другие клеточные и неклеточные элементы, наличие шипа может усложнить работу по отбору сперматозоидов.

Внутренний диаметр инжекторов составляет от 4 до 6 мкм (соответствует размеру головки сперматозоида). Для работы с незрелыми сперматидами существуют пипетки диаметром до 7-8 мкм.

Стоит также отметить, что установка инжекторов требует особого внимания. Только для этих микроинструментов необходим небольшой угол наклона рабочего плеча ко дну капли для манипуляции в 3-5°. Такой угол дает возможность иммобилизовать сперматозоиды путем механического повреждения хвоста. Точная горизонтальная установка инструмента делает эту манипуляцию невозможной, а значительное увеличение угла наклона изменяет плоскость инъекции сперматозоида в ооцит.

Микропипетки для хэтчинга предназначены для надрезания блестящей оболочки эмбрионов и бластоцист путем частичной диссекции (механический хэтчинг). Эта микропипетка тупо запаяна и имеет острый кончик. Для механического хэтчинга ее используют самостоятельно, в техниках биопсии - совместно со второй пипеткой.

Микропипетку для хэтчинга также применяют при необходимости коллапсирования бластоцисты. Это самая простая процедура из всех микроманипуляционных, и выбор микроинструмента определяется скорее его ценой. В этом случае микропипетка для хэтчинга может быть заменена на инжекторную.

Микропипетки для биопсии (полярных телец, бластомеров, трофэктодермы и фрагментов дробящихся эмбрионов) в зависимости от объекта могут быть различного размера и конфигурации. Так, для биопсии полярного тельца выбирают наименьший размер (около 10 мкм), для биопсии бластомера на 3-й день развития эмбриона можно использовать инструмент большего диаметра (до 42 мкм). Однако четких критериев выбора инструмента не существует. Выбор определяется опытом эмбриолога. Для выбора микропипетки с прямым или скошенным кончиком можно дать только общие рекомендации. Применение механического хэтчинга дает тонкий разрез на блестящей оболочке эмбриона, поэтому микропипетка со скошенным краем будет легче проникать в эмбрион. Лазерная диссекция создает широкий, туннельный доступ в эмбрион (рис. 16-2), поэтому использование прямого или скошенного инструмента остается на выбор эмбриолога. При биопсии трофэктодермы бластоцисты более удобны пипетки с прямым краем, так как они дают возможность применять не только лазер, но и при необходимости механический отрыв фрагмента трофэктодермы эмбриона с использованием края удерживающей пипетки.

ВНУТРИЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ИНЪЕКЦИЯ СПЕРМАТОЗОИДА В ООЦИТ

Эволюция микроманипуляционных технологий включала применение следующих методик: ZD (от англ. zona drilling - «сверление» зоны), PZD (от англ. partial zona dissection - частичная диссекция зоны), SUZI (от англ. subzonal insemination - субзональное оплодотворение) и ICSI (от англ. intracytoplasmic sperm injection - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку).

ZD и PZD. Для оплодотворения сперматозоид должен проникнуть под блестящую оболочку и перивителлиновое пространство. Блестящая оболочка - неклеточная гликопротеиновая структура, обеспечивающая видоспецифичный барьер для предотвращения полиспермии и защиты эмбриона. Поэтому нарушение целостности оболочки должно облегчить процесс оплодотворения, которое происходит стандартным способом. Это можно обеспечить применением раствора Тироде, с помощью лазера (ZD), а также механическим способом (PZD). В 1988 г. была получена первая беременность с помощью этого метода. Тем не менее эффективность данной методики оказалась низкой и не отличалась от эффективности стандартного ЭКО при наличии мужского фактора (около 12-13%). Кроме этого, было показано, что методики ZD и PZD значительно повышают частоту полиспермии.

SUZI - второе поколение методов микроманипуляции. Метод заключается в помещении сперматозоидов в перивителлиновое пространство ооцита. В зависимости от морфологии под зону пеллюцида помещали от 3 до 6 сперматозоидов. Метод оказался малоэффективным (20% - эффективность оплодотворения, 10% - частота наступления беременности). Не исключена также возможность полиспермии.

ICSI. Следующим логическим шагом в развитии микроманипуляционных техник явилось непосредственное введение сперматозоида в цитоплазму ооцита. Хотя это и наиболее инвазивная техника, в этом случае полностью исключена возможность полиспермии.

На начальном этапе развития метода ICSI его эффективность составляла около 55%, но это был лучший показатель из существующих методик. Поэтому метод скоро стал рутинной практикой во всех лабораториях ВРТ. В дальнейшем развитие метода обеспечила оптимизация механических навыков его выполнения. В настоящее время эффективность метода достигла 75-80%.

Опасения вызывали возможность нарушения цитоскелета ооцита при инъекции и повреждение веретена деления. На сегодняшний день эти опасения не сняты полностью, и, кроме того, вызывают вопросы отсроченные эффекты, связанные с эпигенетическими процессами.

Основные этапы инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки

Процедура ICSI включает несколько этапов. Их можно разносить во времени или проводить сразу без остановки. Выбор будет зависеть от расписания работы эмбриологической лаборатории, сложности процедуры проведения ICSI, качества материала, дополнительных условий и удобства работы эмбриолога.

I этап - подготовка сперматозоидов для оплодотворения. Подготовку лучше начинать сразу после пункции яичников и получения ооцитов. Длительное воздействие спермиоплазмы может отрицательно сказаться на качестве сперматозоидов из-за наличия дополнительных клеточных элементов и дебриса. Подготовка сперматозоидов заранее тоже не рекомендуется, так как возможно изменение времени и даты пункции фолликулов. Выбор метода обработки эякулята зависит от качества и количества сперматозоидов (подробнее смотрите соответствующие главы).

II этап - подготовка ооцитов к оплодотворению. Она заключается в удалении клеток кумулюса и лучистого венца, что делает доступной блестящую оболочку ооцита для фиксации на удерживающей пипетке. Денудацию проводят с помощью фермента гиалуронидазы, являющейся компонентом акросомы сперматозоида и приводящей к расщеплению внеклеточного матрикса ОКК. Изначально использовали очищенную гиалуронидазу, полученную из тестисов быков. В настоящее время создан рекомбинантный фермент, отличающийся высокой степенью очистки и активности.

При денудации следует минимизировать время воздействия фермента на ОКК, очищенные яйцеклетки следует несколько раз промыть средой для манипуляций. В некоторых случаях клетки лучистого венца в небольшом количестве остаются связанными с блестящей оболочкой ооцита, в этом случае достаточно двух свободных поверхностей блестящей оболочки: для удержания ооцита и проведения инъекции.

Необходимо отметить, что наличие кумулюсных клеток на блестящей оболочке является отрицательной характеристикой и говорит о нарушении созревания ооцитов - отростки клеток лучистого венца остались связаны с блестящей оболочкой. После проведения денудации можно оценить морфологию ооцитов и отобрать клетки, для которых проведение ICSI нецелесообразно. Это незрелые ооциты на стадии полового пузырька, ооциты с признаками деградации, очень большим полярным тельцем (велика вероятность неравного расхождения хромосом в мейозе и анеуплоидии), партеногенетически активированные ооциты (с одним или двумя пронуклеусами).

Особое внимание следует также уделить «гигантским» ооцитам, значительно превышающим по размерам нормальные ооциты. Они содержат два мейотических веретена деления и, следовательно, диплоидный набор хромосом (рис. 16-3). Хотя эти ооциты после оплодотворения могут демонстрировать нормальное дробление и образование бластоцисты, все они триплоидны.

Особенности ооцитов, находящихся на стадии MII (вытянутая форма; вакуоли, агрегации эндоплазматического ретикулума, темные включения в цитоплазме; утолщенная, истонченная, «с карманом» блестящая оболочка), могут явиться неблагоприятными прогностическими признаками развития эмбриона и снизить эффективность протокола ЭКО. Эти особенности ооцита делают эмбрионы, полученные при их оплодотворении, эмбрионами не «первого выбора», однако не являются признаками исключения.

Ооциты, находящиеся на стадии MI, могут быть подвергнуты ICSI, хотя эффективность оплодотворения будет значительно ниже, с большей вероятностью анеуплоидии. В этом случае эффективнее отложить процедуру на несколько часов, предоставив возможность ооцитам дозреть в условиях in vitro.

III этап - установка микроинструментов. Выбор и установку микроинструментов лучше проводить непосредственно перед началом процедуры ICSI или отбором сперматозоидов, чтобы минимизировать возможность их загрязнения.

IV этап - подготовка чашки для инъекции. Этот этап напрямую связан с особенностями проведения процедуры ICSI. В общем случае используют небольшие чашки Петри (диаметр не менее 35 мм) или специальные чашки для ICSI с невысокими бортиками, чтобы микроинструменты не задевали края, но достаточными, чтобы можно было покрыть капли со сперматозоидами и ооцитами минеральным маслом для предотвращения быстрого падения температуры и изменения осмоляльности среды. Чем больший объем масла содержит чашка, тем стабильнее температура и больше допустимое время нахождения ооцитов вне условий инкубатора.

Ооциты можно поместить в среды для культивирования или среды, содержащие цвиттер-ионы (HEPES или MOPS), - в этом случае среда более стабильна вне инкубатора и время манипуляций может быть больше. Можно также использовать специальные среды для проведения ICSI, содержащие больше белка, что стабилизирует оолемму после инъекции.

Рекомендуется не затягивать процедуру более 10 мин. Среды для сперматозоидов содержат в своем составе PVP (поливинилпирролидон) - полимер, придающий дополнительную вязкость среде и этим замедляющий движение сперматозоидов и облегчающий работу с ними, предотвращая их «залипание» на дне чашки при иммобилизации.

Форму, расположение и наличие капель с дополнительными средами эмбриолог выбирает исходя из задач, своих навыков, количества и доступности гамет. Так, при ICSI с тестикулярными сперматозоидами их количество чаще всего ограниченно и отбор осложнен присутствием дополнительных клеточных и неклеточных элементов - в этом случае каплю со сперматозоидами делают достаточно большой.

V этап - выбор сперматозоида для инъекции. При стандартной методике ICSI отбор сперматозоидов проводят при увеличении микроскопа ×20-40, отдавая предпочтение сперматозоидам с нормальным прямолинейным вращательным движением и нормальной морфологией головки. При назначении процедуры ICSI пациентам без тяжелых нарушений сперматогенеза (патоспермии, использование тестикулярных сперматозоидов) или иммунологического бесплодия (положительный МАR-тест) такого способа отбора сперматозоидов достаточно для успешного оплодотворения.

Вопрос относительно критериев выбора сперматозоидов для ICSI (морфологические признаки, характер и скорость движения) остается предметом научно-практических дискуссий. Результаты исследований показывают, что морфологические аномалии могут быть связаны с нарушением хромосомного набора (аморфная головка, большая головка), повреждением ДНК (наличие вакуолей), а изменение характера движения или аномалии шейки могут определяться патологией центриоли.

VI этап - иммобилизация и захват сперматозоида. Обязательная процедура при ICSI. Иммобилизацию обычно проводят механически в верхней половине хвоста, и сперматозоид теряет подвижность. Инъекционной иголкой эмбриолог совершает 1-2 вращательных движения, при этом образование хвостом сперматозоида угла является гарантией разрыва мембраны, однако такой вариант необязателен. Необходимое условие для инъекции - наличие хвоста, хотя бы его верхней части. Инъецировать только головкой сперматозоида нельзя, так как центриоль сперматозоида, находящаяся в шейке, необходима для нормального оплодотворения.

Иммобилизация возможна также с использованием лазера, хотя в обычных условиях это менее распространенный вариант. Применение такого метода может быть рекомендовано при акиноспермии (неподвижные сперматозоиды в эякуляте), в этом случае «выстрел» лазером в терминальную часть хвоста у живых сперматозоидов вызывает сворачивание хвоста, аналогично тесту гипоосмотического набухания. У мертвых сперматозоидов такой реакции не происходит. Иммобилизованный сперматозоид аккуратно втягивают внутрь инжекторной пипетки.

VII этап - фиксация ооцита на удерживающей микропипетке. Фиксация происходит через блестящую оболочку. Традиционным способом ориентировки ооцита на удерживающей пипетке является ориентировка первого полярного тельца на 6 или 12 ч. После первого мейотического деления и выделения первого полярного тельца веретено деления находится поблизости от места отшну-ровки. Именно поэтому позиция инъекционной пипетки на 3 ч была предложена как самая безопасная для сохранности веретена деления, при этом позиции полярного тельца на 12 или 6 ч считались равнозначными. Однако при позиции полярного тельца на 6 ч открытый край инъекционной иглы будет находиться ближе к элементам веретена деления, которые при аспирации цитоплазмы с большой вероятностью могут быть повреждены. Кроме того, наблюдение в микроскоп с поляризованным светом, позволяющим визуализировать веретено деления, показывает, что расположение под первым полярным тельцем не является строгим правилом. Достаточно часто веретено деления расположено на 11/1 или в других положениях при ориентации полярного тельца на 12 ч.

Использование поляризационной микроскопии еще не получило широкого распространения в эмбриологических лабораториях, поэтому сложно однозначно выбрать лучшую позицию для инъекции сперматозоида, и в большинстве лабораторий придерживаются традиционного расположения ооцита на холдерной пипетке.

Некоторую сложность представляют ооциты, утратившие блестящую оболочку в ходе денудации (из-за особенностей строения блестящей оболочки или слишком агрессивной работы с ооцитом). Фиксация таких ооцитов на удерживающей пипетке требует особого внимания - следует найти тонкий баланс между удержанием ооцита и минимальным воздействием на оолемму, а также отсутствие полярного тельца не дает возможности правильно сориентировать ооцит. Тем не менее такие ооциты могут быть успешно оплодотворены, культивированы до стадии бластоцисты и использованы для переноса в полость матки или криоконсервированы. Однако отсутствие блестящей оболочки делает их более чувствительными к манипуляциям и нарушает относительное расположение бластомеров при дроблении эмбриона.

VIII этап - инъекция сперматозоида. Необходимым условием успешной инъекции сперматозоида в ооцит являются разрыв оолеммы и экспонирование сперматозоида к цитоплазме ооцита. Для обеспечения разрыва мембраны обычно применяют аспирацию цитоплазмы в инжекторную иглу. Сама аспирация не является гарантией разрыва цитоплазматической мембраны. Положительным признаком будет резкое увеличение подвижности цитоплазмы в инжекторной пипетке при стабильной силе натяжения. В некоторых случаях разрыв цитоплазмы затруднен и аспирация цитоплазмы происходит за пределы ооцита и дальше - до размеров диаметра ооцита. Однако признаком плохого прогноза для выживания ооцита после инъекции считают облегченный разрыв оолеммы, не требующий аспирации цитоплазмы. В этом случае также не наблюдаются образование и сохранение «воронки» от введения микропипетки, которая в ооцитах хорошего качества сохраняется до нескольких минут. При помещении сперматозоида в ооцит необходимо убедиться, что он остается за границами разрыва растянутой мембраной ооцита. В противном случае при затягивании «воронки» сперматозоид окажется вытолкнутым из ооцита. Для этого при введении сперматозоида в цитоплазму кончик инжекторной иголки чуть-чуть проталкивают вперед.

В классическом варианте ICSI инъекция сперматозоида проводилась только головой вперед. Для этого засасывание сперматозоида в инжекторную микропипетку начинали с хвоста, что, учитывая его утончение, вызывает некоторые сложности, особенно у начинающих эмбриологов. Такая позиция обеспечивает лучший контроль полного помещения сперматозоида в цитоплазму ооцита. Однако эффективность оплодотворения не изменяется при проведении ICSI «хвостом вперед». Таким образом, использование того или иного метода может определяться удобством работы и навыками эмбриолога.

Время проведения ICSI очень важно для обеспечения высокой эффективности оплодотворения. После получения ОКК путем трансвагинальной пункции их помещают в инкубатор на «дозревание». Основанием для этого служит соображение, что ооциты, находящиеся в фолликуле, еще не готовы к оплодотворению и должно произойти «дозревание» цитоплазмы и, возможно, завершение первого деления мейоза (если ооциты находились на стадии MI). В связи с этим в традиционном варианте ICSI оплодотворение проводили через 2-4 ч после получения ОКК. Нужно учитывать время пункции относительно введения триггера. Стандартно пункцию фолликулов проводят через 36 ч после триггера, но в некоторых случаях этот интервал уменьшен до 35 ч.

Многочисленные исследования по определению оптимального времени инъекции ооцитов не дали единого результата, но остаются в пределах 2-6 ч, хотя максимальное значение оптимального времени достигает у некоторых исследователей 9 ч.

Кроме того, встает вопрос о необходимости или допустимости разнесения во времени этапа денудации ооцитов и их инъекции. На сегодняшний день он также не решен однозначно. Денудацию ооцитов принято проводить не ранее чем через час после их получения. Решение проводить денудацию непосредственно перед инъекцией или оставить денудированные ооциты на какой-то период в инкубаторе эмбриолог принимает самостоятельно, исходя из расписания работы и собственных предпочтений. Но не стоит забывать, что денудированные ооциты - самая чувствительная стадия к неоптимальным условиям культивирования.

МОДИФИКАЦИЯ ICSI: IMSI

Необходимо отметить тот факт, что увеличение ×40 не дает полного представления о строении (морфологии) сперматозоида, поэтому был предложен метод IMSI (от англ. intracytoplasmic morphologically selected sperm injection - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит после морфологической селекции), при котором используют объективы ×63-100, дополнительные линзы и системы видеорегистрации изображения, что обеспечивает более чем 1000-кратное увеличение.

Увеличение объектива ×100 чаще всего требует использования иммерсионного масла и специальных чашек для ICSI со стеклянным дном или стеклянной вставкой в дно.

Метод IMSI оценивает сперматозоид по морфологическим особенностям шести субклеточных органелл: акросома, постакросомная пластинка, шейка, митохондрии, хвост и ядро.

Сперматозоиды, отбираемые для оплодотворения, должны иметь овальную форму, быть симметричны, с гладкой поверхностью, с соотношением длины и ширины 4,75±0,28 и 3,28±0,20 мкм соответственно (рис. 16-4).

Согласно этой методике для инъекции используют два класса сперматозоидов:

Сперматозоиды с грубыми морфологическими нарушениями (3-й класс) исключают из отбора (см. рис. 16-4).

Существующие данные о взаимосвязи морфологических особенностей сперматозоида (особенно головки) и его хромосомного набора и целостности его ДНК позволяют объяснить получение эмбрионов высокого качества, повышение частоты имплантации, наступления беременности, снижение частоты невынашивания при применении технология IMSI.

IMSI - очень трудоемкий процесс, поэтому, чтобы снизить время нахождения ооцитов вне условий инкубатора, отбор сперматозоидов и собственно их инъекция разнесены во времени.

На настоящий момент показания для IMSI не определены.

Следует отметить, что для применения этой технологии в эякуляте должно быть достаточно сперматозоидов, для которых можно провести такой строгий отбор.

МОДИФИКАЦИЯ ICSI: PICSI

Еще одной модификацией ICSI стал PICSI (от англ. physiological ICSI - физиологическая ICSI). Метод основан на способности сперматозоидов связываться с гиалуроновой кислотой. Для этих целей используют специальные чашки с нанесенным на дно гиалуронатом или раствором, содержащим гиалуроновую кислоту.

В естественных условиях гиалуроновая кислота является основным компонентом внеклеточного матрикса кумулюсных клеток и играет решающую роль в отборе сперматозоидов, способных к оплодотворению. Связывание с гиалуроновой кислотой характерно для сперматозоидов с лучшими морфофункциональными параметрами, меньшей вероятностью гетероплоидии, низким уровнем разрывов ДНК и остаточных гистонов, что указывает на успешное прохождение стадий мейоза и созревания хроматина. Качество сперматозоидов оценивают тщательно: сперматозоиды, несущие на своей поверхности сайты связывания с гиалуроновой кислотой, замедляют свое движение, останавливаются и фиксируются на чашке.

Использование гиалуроната для замедления движения сперматозоидов при отборе приближает процесс оплодотворения при ВРТ к более естественным условиям, и попадание небольшого количества гиалуроновой кислоты при ICSI внутрь яйцеклетки более физиологично, чем использование поливинилпирролидона.

Тем не менее к настоящему времени нет единого мнения о том, что применение PICSI приводит к улучшению качества эмбрионов, повышению частоты наступления беременности или снижению частоты невынашивания беременности, поэтому показания для этой методики не определены.

Считается, что использование данной технологии целесообразно в случае низкой доли связанных сперматозоидов при HBA-тесте (анализ связываемости сперматозоидов с гиалуроновой кислотой).

ПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ МЕТОДОМ ICSI

Показания для проведения процедуры можно условно разделить на три группы:

Мужской фактор

Методику ICSI разрабатывали для преодоления мужского фактора бесплодия. В настоящее время ее используют при следующих обстоятельствах, связанных с мужским фактором бесплодия.

Патоспермия. В эту группу можно отнести нарушение всех параметров качества эякулята.

Для получения беременности естественным путем достаточно, чтобы нижняя граница концентрации сперматозоидов соответствовала 15 млн/мл (общее количество сперматозоидов в эякуляте - 39 млн), а доля активно-подвижных сперматозоидов - более 32%.

Для процедур ЭКО рекомендованное соотношение - порядка 100 тыс. активно-подвижных сперматозоидов на одну яйцеклетку. Поэтому важное значение приобретают не столько конкретные параметры спермограммы, сколько способ и эффективность подготовки эякулята к оплодотворению. Если в результате процедуры swim up концентрация оплодотворения менее 100 тыс. сперматозоидов на одну яйцеклетку (особенно при большом количестве полученных ОКК), целесообразно рассматривать ICSI как способ оплодотворения. Кроме того, следует учитывать и объем культуральной среды, в которой планируется проводить оплодотворение методом ЭКО: микрокапли (порядка 50 мкл) или больший объем среды (0,5 мл).

Особого внимания заслуживают тяжелые случаи нарушения подвижности сперматозоидов - полное отсутствие видимых признаков движения. Причиной такой патологии может быть как акиноспермия (в этом случае сперматозоиды живые, но не способны к движению), так и некроспермия (сперматозоиды мертвые). Для отбора живых сперматозоидов для инъекции в ооцит прибегают к нескольким методам отбора. Главное условие - прижизненные способы отбора, поэтому все варианты окраски на жизнеспособность использовать нельзя.

Для прижизненного отбора применяют следующие методики: тест гипоосмотического набухания сперматозоидов; оценка гибкости хвоста, использование теофиллина (пентоксифиллина); лазерная иммобилизация сперматозоида; поляризационная микроскопия.

Морфологическая оценка сперматозоидов также имеет важное значение для принятия решения о возможности естественного зачатия или способе оплодотворения при ВРТ. Долгое время зависимости эффективности оплодотворения от морфологических особенностей сперматозоидов не придавали большого значения. Исследования Крюгера показали важность морфологической оценки и строгие критерии, при которых нормальным считается сперматозоид, идеально соответствующий параметрам, а все, даже незначительные, отклонения включают в группу аномальных сперматозоидов. Нормой приняли показатель 14%. По результатам исследований было показано, что при доле менее 5% нормальных форм сперматозоидов эффективность оплодотворения значительно снижалась. Эта граница была принята многими центрами ВРТ как показание для оплодотворения методом ICSI. Норма ВОЗ 2010 г. в очередной раз снизила пороговые значения процентного содержания нормальных сперматозоидов в эякуляте до 4%. Снижение доли морфологически нормальных сперматозоидов менее принятой сегодня границы нормы можно рассматривать как показание для ICSI. Но следует учитывать ряд дополнительных моментов. Во-первых, вероятность низкой квалификации лаборантов, проводящих морфологическую оценку, - возможно как завышение, так и занижение результатов исследования, а также варьирование параметров спермограммы. Поэтому при принятии решения о методе оплодотворения целесообразно опираться на результаты не старше 2-3 мес и/или проводить собственную оценку образца эякулята, предоставленного для оплодотворения. Во-вторых, существуют некоторые типовые морфологические аномалии сперматозоидов, носящие массовый характер. Так, при глобозооспермии у сперматозоидов отсутствует акросома, что делает невозможным естественное оплодотворение. Однако полная глобозооспермия (100% сперматозоидов имею круглую головку) встречается достаточно редко, и оплодотворение методом ICSI - единственный вариант. Чаще встречается частичная глобозооспермия, при которой большая часть сперматозоидов лишены акросомы, в этой ситуации эффективность оплодотворения будет ниже - из-за невозможности сперматозоидов без акросомы участвовать в акросомной реакции, разборке ОКК и неспособности активировать ооцит. Поэтому даже при неполной глобозооспермии и доле нормальных сперматозоидов порядка 3-4% лучше использовать ICSI и выбирать для инъекции сперматозоиды, содержащие акросому.

Использование сперматозоидов, полученных хирургическим путем. При азооспермии или других состояниях, когда получение сперматозоидов при помощи мастурбации невозможно, используют различные хирургические вмешательства. Сперматозоиды можно получить путем биопсии или аспирации яичка или его придатка. Очевидно, что при обструктивной азооспермии путем биопсии можно получить достаточное количество сперматозоидов, но получить концентрацию подвижных сперматозоидов, достаточную для оплодотворения методом ЭКО, очень сложно. Кроме того, сперматозоиды в яичке находятся еще на стадии дозревания и редко способны к активному движению. Именно поэтому для облегчения работы с суспензией тестикулярной ткани или придатка яичка часто используют теофиллин или пентоксифиллин. Эти соединения индуцируют подвижность сперматозоида за счет увеличения уровня внутриклеточного цАМФ.

При ретроградной эякуляции сперматозоиды можно отмыть от мочи (однако щелочная среда губительно действует на них), поэтому в этом случае также используют для оплодотворения метод ICSI. Кроме того, часто для исключения контакта сперматозоидов с мочой прибегают к хирургическим методам получения сперматозоидов.

Высокий титр антиспермальных антител. Для определения наличия в эякуляте антиспермальных антител существует несколько методов, но наиболее простой и широко распространенный - MAR-тест (от англ. mixed antiglobulin reaction - смешанная антиглобулиновая реакция). Доступны коммерческие наборы для определения иммуноглобулинов типов G и А (IgG и IgA). При агглютинации более 50% подвижных сперматозоидов говорят о иммунологической причине бесплодия и рекомендуют оплодотворение методом ICSI. Предполагается, что наличие антиспермальных антител в эякуляте нарушает механизмы транспорта сперматозоидов в женских половых органах, капацитацию сперматозоидов или акросомную реакцию, снижая эффективность оплодотворения, а также влияет на раннее эмбриональное развитие. Однако не все специалисты разделяют это мнение. Некоторые предлагают рассматривать агглютинацию в 30-50% случаев как иммунологическую составляющую бесплодия. Поэтому следует оценивать остальные параметры эякулята и при спорных случаях разумнее делать выбор в пользу ICSI.

Низкий индекс HBA. Тест на связывание сперматозоидов с гиалуроновой кислотой не стал обязательным, однако в некоторых клиниках его широко используют, иногда даже заменяя им морфологическую оценку сперматозоидов. Тем не менее слабое связывание сперматозоидов в гиалуроновой кислотой (менее 50%) указывает на сниженную способность взаимодействовать с блестящей оболочкой и может быть показанием для оплодотворения методом ICSI или PICSI.

Женский фактор

Нарушение нормального оплодотворения ооцитов в предыдущих циклах. Метод ICSI для оплодотворения был предложен в первую очередь для преодоления мужского бесплодия, но в некоторых случаях он может быть использован при снижении качества и нарушении механизмов оплодотворения, обеспечиваемых ооцитом. У такого рода показаний есть общий признак - отсутствие или нарушение оплодотворения методом ЭКО в предыдущем цикле. В этом случае применение ICSI возможно в следующем протоколе ЭКО. При сниженной эффективности оплодотворения методом ЭКО - менее 50% образования диплоидных зигот от числа полученных ОКК - также целесообразно применить ICSI как способ оплодотворения в следующем протоколе ЭКО.

Нарушение оплодотворения может быть связано с аномалиями блестящей оболочки. Поэтому ее истончение, растяжение или, наоборот, уплотнение, а также изменение цвета могут быть основанием для назначения ICSI как способа оплодотворения. Однако эти особенности ооцита визуализируются только после очистки от кумулюсных клеток, то есть при оценке оплодотворения.

Повышение частоты образования триплоидных зигот, очевидно, не связано с мужскими гаметами. Причиной является либо нарушение блока полиспермии, обеспечиваемого блестящей оболочкой (в этом случае могут образовываться также и тетра- и пентаплоидные зиготы), либо нарушение выделения второго полярного тела, обеспечиваемого яйцеклеткой. Если в первом случае применение ICSI в следующем цикле может решить проблему, то во втором случае ситуацию таким образом не исправить.

Небольшое количество ооцитов, «бедный» ответ. В этом случае выбор метода оплодотворения имеет важное значение, и часто эмбриологи находятся под большим психологическим давлением, так как нарушение оплодотворения приведет к отмене переноса эмбриона. Анализ имеющихся данных указывает, что в случае «бедного» ответа применение ICSI может увеличить частоту нормального оплодотворения. Однако частота наступления беременности не зависит от метода оплодотворения. Большинство эмбриологов склоняются к мнению, что качество эмбрионов в основном определяется качеством гамет, а не методом оплодотворения. Тем не менее во многих клиниках принимают во внимание тот факт, что у пациенток старшего возраста ограничен запас времени для повторных процедур, и прибегают к ICSI.

Применение специальных методик

К использованию ICSI как метода оплодотворения при нормальных показателях спермограммы и хорошем качестве ооцитов прибегают в трех случаях.

Если носителем вируса является супруг, то применение ICSI снижает вероятность передачи вируса эмбриону.

ПРОБЛЕМЫ МЕТОДА ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ICSI. ПРИЧИНЫ, ПУТИ РЕШЕНИЯ

Применение метода ICSI обеспечивает порядка 70-80% образования диплоидных зигот. До 10% составляют 1 или 3 пронуклеарные зиготы, а также ооциты без пронуклеусов. Доля ооцитов, деградировавших после ICSI, должна быть менее 5%. Значительные отклонения от таких соотношений могут быть вызваны как внешними причинами (техническими), так и внутренними (особенностью гамет).

Полное отсутствие оплодотворения (от агнл. total failed fertilization, TFF) характеризуется отсутствием формирования пронуклеусов: нет как диплоидных, так и гаплоидных зигот. Такая ситуация чаще происходит при оплодотворении методом ЭКО (от 3 до 20% циклов). Чаще всего причиной является неспособность сперматозоидов связываться с блестящей оболочкой, и очевидно, что в следующем цикле ВРТ у таких пар методом оплодотворения будет ICSI. Однако, чтобы не терять ооциты, полученные в текущем цикле, можно применить методику rescue ICSI («спасательное ICSI»), то есть провести ICSI в 1-й день - через 21-40 ч после пункции. Кроме очевидных преимуществ - возможности «спасения» текущего цикла ВРТ пары, этот метод имеет ряд ограничений и сложностей. Во-первых, эффективность оплодотворения значительно снижена, что, вероятно, связано с перезреванием яйцеклетки. Частота образования диплоидных зигот, по данным разных центров, - от 33 до 70%, причем существует зависимость от времени проведения повторного оплодотворения. Лучшие результаты показаны при применении ICSI во временной интервал менее 24 ч после пункции. Для этого необходимо проводить оценку оплодотворения - образования пронуклеусов - через 8-10 ч после добавления спермы в культуральную среду, или же можно оценить более ранние признаки - выделение второго полярного тела через 4-6 ч после оплодотворения. Соблюдение таких временных параметров требует специального подхода к формированию рабочего расписания эмбриологов и, возможно, увеличения количества штатных сотрудников.

Во-вторых, частота наступления беременности в подобных циклах значительно снижена (порядка 15%), что может быть вызвано десинхронизированием развития эмбриона и готовности эндометрия к имплантации. Отмечают, что стимуляция овуляции в программах ВРТ часто сопровождается опережением созревания эндометрия и задержка времени оплодотворения при rescue ISCI почти на сутки повышает риски упустить «окно имплантации». Поэтому в качестве решения подобной ситуации прибегают к криоциклу: криоконсервации эмбрионов хорошего качества и оптимизированию синхронизации эндометрия и развития эмбрионов.

В-третьих, снижение качества эмбрионов и остановка развития на 2- 3-й день, а также повышение частоты невынашивания при применении rescue ICSI могут быть вызваны перезреванием цитоплазмы ооцита, что увеличивает вероятность нарушения второго мейотического деления и сопровождается повышением частоты анеуплоидии. Этот факт может быть дополнительным показанием к применению доимплантационной диагностики.

В-четвертых, существует возможность неверной оценки. При низком качестве оптики или квалификации эмбриолога, а также сложностях оценки полярных телец оплодотворенные ооциты без визуализации пронуклеусов (запаздывание) или с фрагментированным полярным тельцем могут быть признаны неоплодотворенными, и rescue ICSI приведет к образованию триплоидных зигот. Для предотвращения таких ситуаций, помимо очевидного решения улучшения качества оптики и квалификации эмбриологов, необходимо применение поляризационной микроскопии, позволяющей визуализировать веретено деления и четко различать ооциты на стадии MII.

Таким образом, rescue ISCI при отсутствии оплодотворения является дорогостоящей процедурой со значительно сниженной эффективностью по сравнению со стандартным ICSI, к тому же повышающей риск гетероплоидии, что приводит к его ограниченному использованию в клиниках ВРТ.

Полное отсутствие оплодотворения при ICSI случается достаточно редко - 1-3% случаев. Активация ооцита после оплодотворения происходит по двухступенчатой схеме повышения концентрации ионов кальция. Первый этап после взаимодействия мембран сперматозоида и ооцита и через 30 мин вторая фаза характеризуются серией коротких всплесков концентрации кальция. Запуск осцилляции кальция обеспечивается находящимся в сперматозоидах фактором (PLCg), запускающим высвобождение кальция из внутриклеточных депо. Тем не менее яйцеклетка также участвует в активации механизма осцилляции, то есть отсутствие оплодотворения может быть вызвано неспособностью сперматозоидов активировать ооцит или неготовностью ооцита к активации из-за нарушения созревания или других причин.

Для диагностики причины отсутствия оплодотворения также можно применить метод гетерологичного оплодотворения сперматозоидами человека ооцитов золотистого хомячка или мыши. Конечно, данный метод имеет ряд недостатков, однако он дает возможность выявить, в каких гаметах (сперматозоидах или ооцитах) произошло нарушение. При этом в обоих случаях доступной стратегией преодоления будет искусственная активация ооцита (от англ. assisted oocyte activation, AOA).

На сегодняшний день известно несколько способов активации ооцитов:

В клинической практике наибольшее распространение получили ионофоры кальция. Воздействие ионофоров кальция после проведения ICSI обеспечивает нормальную эффективность оплодотворения (до 79%), развитие эмбрионов и наступление беременности. Однако не все исследователи считают эту методику полностью безопасной, поскольку долгосрочные последствия и эпигенетические эффекты полностью не изучены.

Низкая эффективность или отсутствие оплодотворения при ICSI могут быть вызваны техническими проблемами или невысоким уровнем компетентности эмбриолога. Хорошая работа системы микроманипулятора и микроскопа требует регулярной настройки микроинструментов, движения джойстиков, проверки гидравлической системы на герметичность и наличие воздуха.

Высокий уровень деградации ооцитов после ICSI, помимо низкого качества гамет, может быть связана с излишне интенсивной денудацией при маленьком диаметре наконечника или грубой работой инъекционной микропипеткой.

Повышение доли ооцитов без образования пронуклеусов также может быть вызвано действиями эмбриолога: затягиванием времени работы с ооцитами, недостаточным обездвиживанием сперматозоида, выходом сперматозоида после ICSI в перивителлиновое пространство.

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ ХЭТЧИНГ

Блестящая оболочка, окружающая ооцит после оплодотворения, уплотняется, обеспечивая блок полиспермии и облегчая прохождение через фаллопиевы трубы. Она также защищает эмбрион от микрофлоры и иммунных клеток. В условиях in vivo хэтчинг, или вылупление, происходит на стадии бластоцисты и, являясь важным этапом развития эмбриона, необходим для имплантации. Искусственный разрыв блестящей оболочки - вспомогательный хэтчинг - в качестве метода предложен в конце 1980-х годов для улучшения имплантации.

Действительно, у ооцитов некоторых пациентов или части ооцитов одного пациента блестящая оболочка может иметь морфологические особенности: изменение толщины, размера или цвета. Если истонченная зона пеллюцида опасна снижением своих защитных свойств, то ее утолщение может стать причиной нарушения естественного процесса вылупления. Есть мнение, что условия культивирования in vitro или криоконсервация эмбрионов снижают эластичность блестящей оболочки. Вылупление бластоцисты - энергозатратный процесс для эмбриона, и применение вспомогательного хэтчинга даст возможность эмбрионам со сниженным потенциалом (эмбрионы не лучшего качества) сэкономить ресурс для имплантации. Кроме того, предполагают, что созданное искусственно отверстие в блестящей оболочке облегчит обмен метаболитами и ростовыми факторами между эмбрионом и эндометрием.

Существуют три основных метода проведения вспомогательного хэтчинга.

Следует рассмотреть еще один вид вспомогательного хэтчинга - полное удаление блестящей оболочки. Удалить ее можно как механическим путем, создавая максимально большие надрезы на оболочке, а затем аккуратно пипетируя, так и с помощью лазера. В этом случае нужно вскрыть оболочку по окружности, затем аккуратно пипетированием удалить остатки. Но следует помнить о нагревании среды при использовании лазера и минимизировать количество импульсов. Можно применять химическое воздействие, но вместо раствора Тироде использовать фермент протеиназу, размягчающую и растворяющую блестящую оболочку. При этом способе также необходимо удалять остатки фермента промыванием эмбриона. Клиники, использующие этот метод, сообщают о повышении частоты наступления беременностей по сравнению со стандартными методами вспомогательного хэтчинга. Однако при таком способе важно, чтобы эмбрион был полностью компактизован (стадия морулы) или находился на стадии бластоцисты.

В мировой практике на сегодняшний день нет единого мнения об эффективности процедуры хэтчинга. Достаточно сложно оценить баланс между преимуществами и потенциальными рисками инвазивной для эмбриона процедуры.

Показания к проведению хэтчинга четко не определены. Способы выполнения хэтчинга, а также его модификации и методики исполнения могут в значительной степени различаться в разных лабораториях ВРТ. Это затрудняет проведение мультицентровых исследований и выработку консолидированного решения по вопросу его применения.

Согласно некоторым данным увеличение частоты имплантации при применении вспомогательного хэтчинга может иметь место у пациенток следующих групп:

БИОПСИЯ ЭМБРИОНА

Биопсия эмбриона является вспомогательной процедурой, осуществляемой для получения одной или нескольких клеток эмбриона, требуемых для проведения доимплантационной диагностики. Очевидная инвазивность и травматич-ность процедуры оправдываются необходимостью проведения генетической диагностики для выбора здорового эмбриона при наследственном заболевании у родителей или снижения риска анеуплоидии. В настоящее время разрабатываются неинвазивные (анализ культуральной среды) или малоинвазивные (анализ жидкости из бластоцели эмбриона на 5-6-й день развития) варианты диагностики, но эти методики еще далеки от широкого внедрения в лабораторную практику.

Процедуру биопсии можно разделить на два этапа:

Раскрытие зоны пеллюцида можно проводить любым способом вспомогательного хэтчинга, однако наиболее удобен метод лазерного хэтчинга, дающий возможность точно контролировать размер отверстия. При механическом хэтчинге удобнее использовать микроманипулятор с двойным держателем, у которого есть возможность одновременно крепить иголку для подрезания блестящей оболочки и микропипетку для биопсии. В противном случае процедуру придется проводить в два приема со сменой иглы, что значительно увеличит время работы. Химический хэтчинг применяют реже, так как после раскрытия блестящей оболочки процесс собственно биопсии затягивает время контакта эмбриона с химическим агентом, увеличивая эмбриотоксичность.

Биопсия полярных телец - наименее травматичная процедура для эмбриона. Полярные тельца расположены в перивителлиновом пространстве, и для биопсии достаточно небольшого отверстия в блестящей оболочке в верхней части ооцита/зиготы. Используют пару микропипеток: холдер для удержания ооцита/ зиготы и микропипетку для биопсии небольшого диаметра (13-15 мкм). Процедура может проводиться как одновременная биопсия двух полярных телец после оплодотворения, так и быть разнесена на два этапа: биопсия первого полярного тельца в день пункции и биопсия второго - после оплодотворения. Такой вариант дает более точную картину расхождения хромосом в мейоти-ческом делении, но повышает инвазивность процедуры. Среди плюсов такой диагностики, помимо наименьшей инвазивности, можно указать большой временной интервал для проведения диагностики (до 5 дней) и возможность переноса эмбриона в текущем цикле. Такой метод наиболее применим в странах, законодательство которых запрещает другие виды диагностики. Однако очевидны и ограничения такого подхода: доступность только материнского генетического материала не дает полного представления о геноме эмбриона, включая пол. Кроме того, полярные тельца быстро дегенерируют (особенно первое полярное тельце), что лимитирует время для биопсии и фиксации ядер, а также может повредить ДНК.

Биопсию бластомеров дробящихся эмбрионов проводят на 3-й день, когда эмбрион достигает стадии 6-8 клеток. При механическом способе необходимо провести раскрытие блестящей оболочки, используя две микропипетки: холдерную для удержания и микропипетку для биопсии, чтобы провести забор бластомера. На этой стадии развития при использовании оптики хорошего качества в бластомерах можно различить ядра. Лучше выбирать бластомер, содержащий хорошо видимое ядро, что указывает на нахождение бластомера в интерфазе. Если планируется диагностика методом FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization - флюоресцентная гибридизация in situ), то использование бластомера на стадии метафазы при фиксации может привести к потере части метафазной пластинки или одной хромосомы и искажению результатов. Кроме того, бластомер небольшого размера без видимого ядра может оказаться безъядерным фрагментом, и при диагностике методом FISH отсутствие ядра при фиксации вызовет необходимость повторной биопсии, а при использовании молекулярных методов, когда отсутствие генетического материала нельзя проверить в день биопсии, приведет к невозможности проведения диагностики для данного эмбриона.

При лазерном хэтчинге достаточно просто сориентировать эмбрион таким образом, чтобы выбранный бластомер, содержащий ядро, находился примерно на 3 ч, ближе к блестящей оболочке и чтобы при создании отверстия извлечение его было бы удобным. Кроме того, размер лазерного луча должен быть настроен таким образом, чтобы минимальным количеством выстрелов можно было сформировать отверстие нужного размера (в зависимости от выбранного диаметра микропипетки для биопсии) и не повредить бластомеры, которые должны остаться в эмбрионе. Незначительное касание бластомера, выбранного для биопсии, допустимо.

На рынке культуральных сред многие производители предлагают специальные среды для биопсии. Эти серды не содержат двухвалентные катионы, такие как кальций и магний, что ослабляет межклеточное взаимодействие бластомеров и облегчает процедуру биопсии.

На этапе дробления на 3-й день можно извлечь 1-2 клетки, но такая потеря может негативно отразиться на дальнейшем развитии эмбриона. Существуют доказательства, что биопсия на стадии 8 клеток может привести к задержке компактизации и бластуляции эмбриона и в конечном итоге к нарушению имплантации. Тем не менее такая процедура широко распространена, так как позволяет анализировать геном эмбриона, дает 2-3 дня на проведение диагностики, и возможно провести перенос эмбриона в полость матки в текущем цикле. Но и недостатки этой процедуры также существенны: высока вероятность ложноположительных и ложноотрицательных ответов вследствие мозаи-цизма эмбрионов. На стадии дробления достаточно часто могут происходить митотические нерасхождения хромосом, и эмбрион представляет собой мозаику, содержащую клетки разного хромосомного состава. Анализ одной клетки не дает полного представления о геноме эмбриона.

Биопсия бластомеров эмбриона на стадии морулы позволяет снизить проблему мозаицизма эмбриона, так как на этой стадии извлечь можно до 7 клеток. На 4-й день развития эмбрионы хорошего качества должны достигать стадии компактизованной морулы. Необходимая дополнительная процедура при проведении биопсии - декомпактизация. Для этого морулу в течение 15 мин выдерживают в среде для биопсии без кальция и магния, что ослабляет межклеточные связи. В дальнейшем процедуру проводят аналогично биопсии 3-го дня. После процедуры эмбрион отмывают от бескальциевой среды и возвращают в культуральную среду. Компактизация восстанавливается через 1-2 ч. Полученного материала достаточно для проведения как цитогенетической (FISH), так и любой молекулярной диагностики (PCR, qPCR, aCGH, NGS). Кроме того, при некоторых вариантах диагностики (FISH на 3-5 хромосом) биопсия на 4-й день оставляет возможность переноса эмбриона в полость матки в текущем цикле на 5-6-й день.

Биопсию трофэктодермы проводят на 5-й день развития эмбриона при достижении стадии бластоцисты. В этом случае для анализа берут фрагмент трофэктодермы эмбриона, содержащий 3-7 клеток. Для облегчения процедуры предварительно делают небольшое отверстие в блестящей оболочке, при увеличении размера бластоцисты часть клеток трофэктодермы выпячивается в это отверстие, образуя петлю. Эмбрион располагают так, чтобы петля находилась на 3 ч, и, удерживая его за противоположный край холдерной микропипеткой, микропипеткой для биопсии частично всасывают петлю. Затем, растягивая эмбрион в разные стороны, в 4-5 выстрелов лазера отделяют часть трофэктодермы. В этой методике есть ряд важных технических моментов.

Подход ко времени формирования отверстия в блестящей оболочке может быть различным, в зависимости от выбора эмбриолога и загрузки эмбриобокса. Если делать его на стадии бластоцисты, то выбирают часть эмбриона, противоположную месту формирования внутренней клеточной массы, чтобы избежать ее выпячивания в отверстие при росте размера бластоцисты. Однако формирование отверстия на стадии дробления или морулы и выбор места, где бластомеры расположены предельно далеко от блестящей оболочки, максимально сохраняет эмбрион от воздействия лазера, в отличие от стадии бластоцисты, когда перивителлиновое пространство практически отсутствует. Но в этом случае место формирования внутренней клеточной массы еще не обозначено и больше вероятность ее повреждения при биопсии.

Размер образованного отверстия в блестящей оболочке также очень важен. При отверстии большого диаметра бластоциста при растягивании ее микропипетками может не удержаться внутри зоны пеллюцида (к тому же на стадии бластоцисты зона пеллюцида начинает истончаться), что вызовет затруднения и дополнительные повреждения бластоцисты. В этом случае прибегают к механической процедуре обрыва фрагмента трофэктодермы об край холдерной микропипетки. Такой вариант не очень распространен, так как сопряжен с повышенной вероятностью повреждения бластоцисты во время процедуры и при прохождении цикла витрификации/размораживания. При очень маленьком отверстии может не происходить выпячивания петли трофэктодермы.

Сила аспирации в пипетке для биопсии также очень важна. Внутренний диаметр микропипеток, применяемых для биопсии, значительно больше, чем стандартная микропипетка для ICSI, и контролировать давление, создаваемое в гидравлической системе микроманипулятора, сложнее. При очень высоком давлении в микропипетке для биопсии повышается вероятность аспирации всей бластоцисты в микропипетку и ее гибели. Это также важно при биопсии бластомеров на 3-й или 4-й день - высокая скорость всасывания может привести к повреждению бластомера и потере ядра. Для замедления движений гидравлической системы часто используют дополнительный полимер высокой вязкости - диметилполисилоксан (им заправляют иголку для биопсии). В этом отношении пневматические системы более стабильны и не требуют применения дополнительных средств контроля давления.

После проведения биопсии эмбрион возвращают в среду для дальнейшего культивирования, а фрагменты трофэктодермы готовят для проведения генетической диагностики. Важно соблюдать чистоту в обработке материала. Так, для цитогенетической диагностики методом FISH пыль и частицы с рук эмбриолога могут загрязнить препарат, но не приведут к искажению результатов. При молекулярной диагностике такое загрязнение будет причиной неверного результата или отсутствия ответа для данного образца.

Для выполнения биопсии эмбрион должен иметь достаточное количество клеток трофэктодермы, чтобы при извлечении 3-5 из них иметь потенциал для дальнейшего развития. Целесообразно проводить биопсию эмбрионам, достигшим стадии не ниже 3ВВ (по классификации Гарднера). Если эмбрионы развиваются не синхронно, то лучше процедуру выполнять в несколько заходов, чем выбирать эмбрионы, состоящие из слишком малого числа клеток. Использование для анализа продвинутой стадии бластоцисты позволят провести изначальную селекцию по морфокинетическим параметрам эмбриона. Так, доля эмбрионов лучшего качества на 5-й день меньше, чем на стадии дробления на 3-й день. Это уменьшает количество эмбрионов, подвергнутых диагностике, позволяя выбирать только лучшие, и, соответственно, снижает нагрузку на генетическую лабораторию и стоимость самого анализа.

Диагностика на 5-й день имеет свои ограничения - слишком мало времени для анализа, и, соответственно, необходимы витрификация всех подвергнутых анализу эмбрионов и перенос эмбриона в криоцикле. Однако такая особенность может быть преимуществом - в криоцикле есть возможность достигнуть лучшей синхронизации стадии развития эмбриона и готовности эндометрия к имплантации.

Несомненно, биопсия трофэктодермы - одна из наиболее сложных лабораторных методик и требует специальных навыков эмбриолога, но в современных условиях она необходима для всех клиник ВРТ. Возможность разносить во времени этапы забора материала и проведения диагностики, а также хранить некоторое время биопсированный материал позволяет клиникам работать по транспортной схеме с любой генетической лабораторией.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит / под ред. В.И. Кулакова, Л.Н. Кузьмичева, Ю.Е. Мосесовой. Москва : МИА, 2007. 344 с.

Aktan T.M., Montag M., Duman S. et al. Use of a laser to detect viable but immotile spermatozoa // Andrologia. 2004. Vol. 36, N 6. P. 366-369.

Avalos-Duran G., Canedo-Del Angel A.M.E., Rivero-Murillo J. Physiological ICSI (PICSI) vs conventional ICSI in couples with male factor: a systematic review // JBRA Assist. Reprod. 2018. Vol. 22, N 2. P. 139-147.

Duran-Retamal M., Morris G., Achilli C. et al. Live birth and miscarriage rate following intracytoplasmic morphologically selected sperm injection vs intracytoplasmic sperm injection: An updated systematic review and meta-analysis // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2010. Vol. 99, N 1. P. 24-33.

Gardner D.K., Simon C. Handbook of In Vitro Fertilization. 4^th ed. CRC Press, 2017. 387 p.

Gardner D.K., Weissman A., Howles C.V., Shoham Z. Textbook ofAssisted Reproductive Techniques. 5^th ed.: Vol. 1: Laboratory Perspectives. CRC Press, 2018. 467 p.

Knez K., Branko Z., Tomazevic T. et al. The IMSI procedure improves poor embryo development in the same infertile couples with poor semen quality: a comparative prospective randomized study // Reprod. Biol. Endocrinol. 2011. Vol. 9. P. 123.

Martins W.P., Rocha I.A., Ferriani R.A., Nastri C.O. Assisted hatching of human embryos: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials // Hum. Reprod. Update. 2011. Vol. 17, N 4. P. 438-453.

Montag M. Polar body biopsy - Advantages of the Eppendorf micromanipulation system // Eppendorf Application Note. 2017. N 140. P. 1-6.

Practical Manual of In Vitro Fertilization: Advanced Methods and Novel Devices / eds Z.P. Nagy, A.C. Varghese, A. Agarwal. Springer, 2012. 703 p.

Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs // Hum. Reprod. 2016. Vol. 31, suppl. 4. P. 685.

Rink K., Delacrétaz G., Salathé R.P. et al. Non-contact microdrilling of mouse zona pellucida with an objective-delivered 1.48-microns diode laser // Lasers Surg. Med. 1996. Vol. 18, N 1. P. 52-62.

Rubino P., Viganò P., Luddi A., Piomboni P. The ICSI procedure from past to future: a systematic review of the more controversial aspects // Hum. Reprod. Update. 2016. Vol. 22, N 2. P. 194-227.

Settia A.S., Ferreirab R.C., de Almeida Ferreira Bragaa D.P. et al. Intracytoplasmic sperm injection outcome versus intracytoplasmic morphologically selected sperm injection outcome: a meta-analysis // Reprod. Biomed. Online. 2010. Vol. 21, N 4, P. 450-455.

Talwer L.C.P. Manual of Assisted Reproductive Technologies and Clinical Embryology. Jaypee Brothers Medical Publishers, 2012. 900 p.

The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine and the Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology. Revised guidelines for human embryology and andrology laboratories // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, suppl. 3. P. 45-59.

The Vienna consensus: report of an expert meeting on the development of ART laboratory performance indicators. ESHRE Special Interest Group of Embryology and Alpha Scientists in Reproductive Medicine // Reprod. Biomed. Online. 2017. Vol. 35. P. 494-510.

Thornhill A.R., de Die-Smulders C.E., Geraedts J.P. et al. ESHRE PGD Consortium. Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preim-plantation genetic screening (PGS) // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, N 1. P. 35-48.

Woodward B.J. Montgomery S.J., Hartshorne G.M. et al. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality // Reprod. Biomed. Online. 2008. Vol. 16. N 2. P. 232-238.

Zakharova E.E., Zaletova V.V., Krivokharchenko A.S. Biopsy of human morula-stage embryos: outcome of 215 IVF/ICSI cycles with PGS // PLoS One. 2014. Vol. 9, N 9. Article ID e106433.

Со времени создания и внедрения в практику технологий ВРT было предложено большое количество культуральных сред для эмбрионов, различающихся по составу и способу использования: от простых растворов солей до сложных систем культивирования. Но, несмотря на новую информацию о физиологии, биохимии и функционировании генома и эпигенома эмбрионов человека, до сих пор не существует однозначного решения об «идеальной» среде для культивирования in vitro.

Если говорить об историческом аспекте разработки сред и систем культивирования эмбрионов человека, то стоит остановиться на трех основных стратегиях подбора компонентов среды.

Исторически разработка сред началась для работы в области физиологии. Это были среды, моделирующие состав, близкий к сыворотке крови. Они содержали NaCl, KCl, CaCl₂ и низкие концентрации NaHCO₃ . Затем среды модифицировали, добавив Глюкозу^♠ , и такой раствор получил официальное название Рингера-Локе. Впоследствии в состав среды добавили NaHPO₄ и MgCl₂ . В варианте без Глюкозы^♠ , но с увеличенной до 25 мМ концентрацией NaHCO₃ раствор получил название KRB и использовался в условиях 5% CO₂ . Уэсли Уиттен (Whitten) модифицировал раствор KRB с добавлением Глюкозы^♠ , пенициллина, стрептомицина и бычьего сывороточного альбумина. На этой основе была создана среда М16, широко используемая в экспериментальной эмбриологии.

Другое направление развития культуральных сред получило название «назад к природе». В соответствии с этим принципом в основу состава среды легли исследования состава жидкости фаллопиевых труб и матки. Для человека эта среда получила название HTF (от англ. human tubal fluid - жидкость маточной трубы человека). Однако достаточно сложно утверждать, что такой подход реализован в полной мере. Это обусловлено тем, что состав жидкости в матке и трубах может быть различен при разных условиях и у разных пациенток. Кроме этого, забор жидкости производили у небеременных, что уже не отражает ситуацию при наступлении беременности. Сложно учесть также влияние микроокружения эмбриона, материнских тканей. Помимо трубной жидкости, в окружение эмбриона может попасть некоторое количество семенной плазмы, и ее влияние также оценить достаточно сложно.

Следующим этапом развития культуральных сред стал синтетический подход - подбор оптимальной концентрации необходимых компонентов для развития эмбриона. На основе среды M16 и CZB и других сред была предложена среда SOM (от англ. simplex optimization media - простая оптимизированная среда), способная обеспечивать развитие эмбриона мыши. Увеличение концентрации KCl с 0,25 до 2,5 мМ улучшило развитие до стадии бластоцисты - KSOM. А следующим шагом стала модификация KSOM-AA с добавлением аминокислот.

МОДЕЛЬНЫЕ ОБЪЕКТЫ В РАЗВИТИИ СРЕД И ЭМБРИОЛОГИИ

Большинство сред для культивирования разрабатывали чаще для модельных объектов. По очевидным причинам это было наиболее целесообразно, но стоит помнить не только о преимуществах, но об особенностях этих моделей, чтобы понять их ограничения и более адекватно выбирать тех или иных животных для определенных задач.

Грызуны. Начиная с 1950-х годов эмбрионы мыши являются наиболее востребованными моделями для эмбриологов. Тест на этих эмбрионах MEA (от англ. mouse embryo assay) применяют все производители сред для доказательства качества среды. Используют двухклеточные эмбрионы или зиготы и оценивают процент эмбрионов, достигших стадии бластоцисты. Нормой считается достижение стадии бластоцисты более чем 75% эмбрионов за 96 ч. Использование чистых высокоинбредных линий, как принято у мышей, имеет как преимущества (выровненный генетический фон), так и недостатки. Проблема блока на двуклеточной стадии эмбрионов мыши, вызвавшая сложности с разработкой и подбором состава сред, оказалась характерна для некоторых линий. Кроме того, в оплодотворении мыши не участвует центриоль сперматозоида, в отличие от человека, и в этом смысле мышь не является оптимальной моделью.

В филогенетическом отношении домашние животные ближе к человеку, чем грызуны. Кроме того, они более гетерогенны в генетическом плане, нежели мыши, и лучше отражают ситуацию в популяции людей. Из-за сельскохозяйственной значимости эмбриология и генетика этих объектов достаточно хорошо изучены. Более сходны с человеком длина цикла, количество созревающих фолликулов и количество эмбрионов, более близок клеточный цикл. Яичники и семенники могут быть доступны отдельно. Используя долгоживущих животных (лошадей), можно создать модель для женщин старшего репродуктивного возраста.

Нечеловекообразные приматы естественным образом еще ближе к человеку в филогенетическом плане. Чаще работают с резусами и бабуинами. Благодаря развитию технологий использование приматов возможно с минимальным нанесением вреда. Для них применяют более близкие схемы стимуляции.

Но следует помнить, что любая модель - только модель, тем более в области репродукции. Основное различие заключается в том, что пациентами клиник ЭКО становятся люди со сложностями в репродуктивном плане, у животных, тем более племенных и линейных, обычно таких проблем нет. Кроме того, различаются продолжительность клеточного цикла, частота деления, образование бластоцисты, время запуска транскрипции эмбрионального генома, скорость метаболизма, потребности эмбрионов, содержание жирных кислот (у домашних животных больше), а также имеются особенности состава цитоплазмы ооцитов.

СОСТАВ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕД

Соли. Практически все коммерческие среды содержат в своем составе шесть неорганических ионов солей. Это Na⁺ , K⁺ , Cl^- , Ca²⁺ , Mg²⁺ и SO₄ ^2- . Почти все они были в составе первых сред, разрабатываемых для культивирования. Часто также называют, кроме этих шести, и PO₄ ^2- .

Соли в растворе сразу диссоциируют, и поэтому целесообразнее учитывать конечную концентрацию ионов в среде, так как происхождение их может быть различным. Сравнивая составы сред, можно отметить их сходство по ионному составу, даже при различии состава солей (табл. 17-1). Суммарная концентрация всех растворенных частиц, или осмолярность, - важный показатель куль-туральной среды. Осмолярность жидкости фаллопиевых труб близка осмоляль-ности плазмы крови и составляет у человека 290. Однако в коммерческих средах осмолярность варьирует в достаточно широких пределах, до 50 единиц.

Неорганические вещества не единственные, кто принимает участие в контроле осмолярности. Среди органических осмолитов следует назвать аминокислоты, сахара (чаще выступающие и источниками энергии) и макромолекулы. Первым среди них был использован глутамин как участник сред KSOM и CZB.

Глицин, как и глутамин, связан с изменением концентрации NaCl и защищает клетку от повышения его концентрации. И нельзя говорить об оптимальной и единственно возможной осмолярности - это баланс, который может быть получен несколькими путями, и при высоком значении осмолярности для клетки развитие возможно за счет действия органических осмолитов и, наоборот, при отсутствии органических осмолитов дает возможность развиваться при низкой осмолярности.

Источники энергии. По мере своего развития эмбрион человека, двигаясь по трубе, меняет клеточное окружение и может изменять источники питания. Если за стадии развития от дробления до компактизации отвечают материнская мРНК и накопленные компоненты цитоплазмы, то при запуске собственного генома эмбриона (с 4-8 клеток) скорость метаболизма увеличивается в разы (на стадии зиготы и дробления скорость метаболизма сравнима с клетками мозга, при компактизации - с опухолевой тканью).

Эмбрион человека использует в своем арсенале четыре пути метаболизма, причем способен к их смене.

Пируваты и лактаты. Пируваты напрямую окисляются в митохондриях с образованием АТФ. Лактаты способны поддержать развитие с двуклеточной стадии. Они могут поддержать развитие эмбриона и без участия других источников. Однако избыток лактатов меняет и концентрацию пируватов в среде, поэтому важное значение придется их соотношению. Причем оно больше в среде, предназначенной для более ранних эмбрионов.

Глюкоза. Используется клетками животных как преимущественный источник энергии. Но существуют данные, что на стадии зиготы и двуклеточной стадии клетки не могут метаболизировать глюкозу. Напротив, с восьмиклеточной стадии глюкоза может быть единственным источником энергии. Глюкозу, а скорее скорость ее потребления, можно считать показателем хорошего развития эмбриона.

Аминокислоты. Жидкость фаллопиевых труб и матки содержит достаточное количество аминокислот, и эмбрион имеет специфический транспорт для них. Но их задача - не только энергетическая поддержка, но и работа в качестве осмолитов, антиоксидантов, регуляторов рН, хелаторов и источников для собственного синтеза белка. Композиции в различных средах могут быть различны. Но стоит помнить и об обратной стороне. Аминокислоты разлагаются с образованием аммония, токсичного для клеток. Отсюда следует сделать два замечания: помнить о правилах хранения сред и не допускать необоснованного нагревания, и можно рассматривать как преимущество последовательную или обновляемую систему культивирования.

Жирные кислоты. Жирные кислоты практически не встречаются как компоненты коммерческих сред. Однако в некоторые среды добавляют ВSА (от англ. bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин), а в его состав на 1 моль белка приходится 2-3 моля жирных кислот. Ооциты и эмбрионы содержат жирные кислоты в своем составе, причем их состав видоспецифичен. Метаболизм липидов участвует в гормональной регуляции, регулировании работы ионных каналов, ингибировании ДНК полимераз, экспрессии генов и формировании мембран.

Макромолекулы. Большая часть эмбриональных сред содержит дополнительные компоненты. Чаще это белковые добавки. Добавки использовали с самых ранних этапов развития культуральных систем. В 1980-1990 гг. были опробованы ВSА, сыворотка пуповинной крови человека, сыворотка семенной плазмы фертильных доноров и позднее - материнская сыворотка. В 1990 е годы немного отвлеклись от этой темы и больше внимания уделили системам кокультивирования. И на сегодняшний день почти все среды «готовые», то есть уже содержащие необходимые добавки. Однако производители предлагают и возможность самостоятельного обогащения сред белковыми компонентами, в качестве которых чаще используют HSA (от англ. human serum albumin - человеческий сывороточный альбумин) или SSS (от англ. synthetic serum substitute - синтетический заменитель сыворотки, он же serum substitute supplement - заменитель сыворотки).

Эти молекулы могут выполнять следующие функции.

Но у всех преимуществ есть и обратная сторона медали. Хотя на сегодняшний день не было получено доказательств передачи вирусов гепатита, прионных заболеваний при использовании сыворотки. Но такой риск не исключен, и известны случаи отзыва компаниями сред, в приготовлении которых мог быть использован материал ненадлежащего качества.

Кроме того, HSA - скорее смесь молекул и имеет довольно сложный состав, поэтому наблюдаются достаточно значимые варьирования состава как HSA, так и SSS (даже не между разными производителями, а между лотами одного производителя). Предполагается, что добавки часто содержат ростовые факторы, что может объяснять их положительный эффект. Кроме того, следует помнить, что добавление в среду HSA (чаще по объемным единицам 10-20%) может изменять значение рН и концентрации электролитов и осмолярность.

Кроме белковых компонентов, в качестве макромолекул в среде используют гиалуроновую кислоту. Являясь обязательным компонентом жидкости не только маточных труб, матки, но и кумулюсного комплекса, гиалуроновая кислота представляет собой естественное, физиологическое окружение эмбриона. Кроме того, гиалуронат формирует антивирусный и антииммуногенный слой вокруг эмбриона, а также участвует в начальных стадиях имплантации. Основываясь на этом факте, были созданы специальные среды для переноса эмбрионов, содержащие высокие концентрации гиалуроната. Гиалуроновая кислота не содержит белковых компонентов и может быть синтезирована в чистом виде, что исключает возможные проблемы загрязнения вирусными частицами и прионами.

Антиоксиданты и хелаторы. Активные радикалы кислорода негативно воздействуют на клетку, запуская процессы апоптоза, структурные и функциональные повреждения ДНК, липидов и протеинов. Кроме того, свой вклад вносит и пероксидазная активность. Эмбрион, находясь в условиях in vitro, что для него несвойственно, попадает в среду с более высоким содержанием кислорода (20 вместо 5%) и более уязвим для этих агентов, чем в естественном окружении. Однако некоторое количество активных радикалов кислорода все же необходимо - они являются компонентами клеточного сигналинга.

Антиоксиданты, способные инактивировать опасные молекулы, делятся на две основные группы: энзиматические и неэнзиматические. Они являются компонентами трубной и маточной жидкости модельных объектов и человека (пероксиддисмутаза и глутатионпероксидаза, витамин С и пероксидаза).

Хелаторы, имея две отрицательно заряженные группы, способны связывать ионы металлов, несущие положительный заряд. Они участвуют также в транспорте ионов металлов. Среди них наиболее известна этилендиаминтетрауксусная кислота (от англ. ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA). Она является компонентом большинства сред, как одноступенчатых, так и двухступенчатых систем культивирования. Она также была использована для преодоления блока двуклеточной стадии эмбрионов мыши. Показано, что ее присутствие важнее на более ранних (до компактизации) стадиях развития, однако часто она может быть компонентом сред и второй ступени.

Буферные системы. Баланс между внутри- и внеклеточной pH очень важен для эмбриона. Он обладает механизмами поддержания стабильности, однако на различных стадиях развития возможности контроля отличаются. Так, эмбрион на стадии морулы и бластоцисты способен более активно поддерживать внутренний рН, видимо, из-за обилия межклеточных контактов, а денудирован-ный ооцит обладает этой способностью в меньшей степени (лишенный кумулюсных клеток, выполняющих эту задачу в ОКК) и наиболее уязвим после ICSI. Снижение рН приводит к нарушению локализации филаментов митохондрий, нарушению локализации актиновых филаментов, а повышение - к увеличению гликолиза по фосфофруктокиназному пути, снижению окислительного метаболизма. Энергия, которая тратится на поддержание внутриклеточного рН (при изменении внешнего рН), снижает потенциал развития эмбриона. Однако точная оценка оптимального внутриклеточного рН требует постановки сложного эксперимента. По разным оценкам, на различных стадиях значение рН варьирует от 6,98 до 7,5. Чаще сходятся на цифре, близкой к 7,1.

Для поддержания равновесия между значениями внутри- и внеклеточного рН существуют буферные системы, удерживающие рН в этих пределах: бикар-бонатная и фосфатная; кроме того, белки также обладают свойствами буферов.

Стоит еще раз упомянуть, что состав сред подбирается таким образом, чтобы минимизировать стресс эмбриона при манипуляциях и создать среду, максимально приближенную к его естественной среде. В инкубаторах создают среду с определенной температурой, влажностью и концентрацией газов. Именно баланс концентрации СО₂ и бикарбоната в среде регулирует значение внешнего рН.

Для уравновешивания системы необходимо определенное количество времени, причем уравновешивание в сторону понижения происходит быстрее, поэтому изначальная концентрация СО₂ во флаконе среды часто 6%. Кроме того, ускоряет процесс эквилибрирования использование меньшего объема среды, меньшего количества минерального масла и большей площади поверхности. Выбор концентрации СО₂ в инкубаторе напрямую влияет на величину рН в среде, но, помимо него, тут играют роль протеины, а также расположение лаборатории над уровнем моря. Поэтому более адекватно в культуральный среде следить за величиной рН, а не за концентрацией СО₂ .

Какую величину рН считать правильной? Обычно рассматривают величину рН вне клетки чуть больше, чем внутри, это помогает восполнять потери анионов при метаболизме клетки и, возможно, имеет преимущество при оплодотворении, улучшая связывание с блестящей оболочкой. Существует даже теория «высоко-низко-высоко» (high-low-high). Суть ее состоит в том, что оптимальный рН при оплодотворении чуть повыше, при делениях дробления - пониже, а при образовании бластоцисты - снова повышен. В случае с большинством коммерческих сред рекомендован диапазон 7,2-7,4.

Вне инкубатора также важно поддерживать правильные показатели рН. Известно порядка 20 синтетических органических буферов на основе цвиттер-ионных аминокислот (молекулы несут одновременно и положительный, и отрицательный заряд). Для работы с клеточными культурами выбраны HEPES и MOPS как нетоксичные для клеток и имеющие величину рKа (константа диссоциации кислоты), близкую к требуемой.

Ростовые факторы. В процессе доимплантационного развития эмбрион подвергается также воздействию различных факторов роста и цитокинов, присутствующих в репродуктивных путях. Они играют роль в эмбриональном развитии и во взаимодействии эмбриона и эндометрия.

Изучение влияния инсулина и инсулиноподобного фактора роста (от англ. insulin like growth factor, IGF), участвующего в пролиферации клеток, показало положительный эффект на развитие эмбрионов: увеличение темпов пролиферации, образование бластоцисты и развитие внутриклеточной массы.

Помимо других, особое внимание уделяют гранулоцитарно-макрофагаль-ному колониестимулирующему фактору (от англ. granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), секретируемому клетками маточных труб и маткой и участвующему в пролиферации и дифференцировке клеток. Показано, что рецепторы к GM-CSF присутствуют в клетках бластоцисты как во внутриклеточной массе, так и в клетках трофэктодермы. Исследования на модельных объектах показывают, что присутствие в среде GM-CSF способствует формированию бластоцист, облегчает хэтчинг и имплантацию, улучшает формирование внутриклеточной массы, а также снижает экспрессию стресс-генов, компенсируя негативные эффекты культивирования in vitro. Использование GM-CSF в культуральных средах при ВРТ для эмбрионов человека также показывает положительный эффект.

Изучают возможное влияние и других ростовых факторов: трансформирующего фактора роста бета (от англ. transforming growth factor beta, TGFβ), эпи-дермального фактора роста (от англ. epidermal growth factor, EGF), LIF.

Не стоит забывать, что в репродуктивном тракте присутствуют различные ростовые факторы и выявление конкретных механизмов их участия в раннем эмбриональном развитии и имплантации осложняется дифференциальной экспрессией генов и их рецепторов. Существуют данные и о ингибирующем действии ростовых факторов на развитие эмбриона, что, вероятно, вызвано их взаимодействием и стадиеспецифичностью. Поэтому использование ростовых факторов ограничивается небольшим количеством исследований об их влиянии и взаимодействии на различных стадиях развития эмбрионов человека.

Минеральное масло. Применять минеральное масло начали с 1960-х годов. Оно позволяет снизить потребление среды, уменьшить флюктуации рН и осмолярности. Масло адсорбирует гидрофобную контаминацию и летучие органические вещества. Минеральное масло - производное сырой нефти, получаемое путем дистилляции, его также называют парафиновым маслом, легким или белым минеральным маслом. Согласно требованиям Американской фармакопеи оценивают вязкость, содержание серы, ненасыщенных и ароматических углеводородов, но нет жестких требований к стерильности и другим, вероятно токсичным для эмбриона, компонентам. Чаще всего это цинк, Triton X-100 и пероксиды. К тому же содержание этих веществ варьирует в зависимости от партии масла у одного производителя. Из-за потенциальной реактивности (возможности к приобретению токсичных свойств) масла его рекомендуют хранить при 4 °С без доступа света.

Системы культивирования. Исторически было принято культивировать эмбрионы сначала модельных объектов, а затем и человека до 3-го дня развития. Однако начиная с 1997 г. практикуют продленное культивирование до стадии бластоцисты - до 5-го дня. Причины этого очевидны: возможность более тщательного отбора эмбрионов и перенос меньшего количества эмбрионов лучшего качества и введение в практику предымплантационной генетической диагностики (ПГД), при которой необходимо дополнительное время для ее проведения.

Сейчас различают три основных типа протокола:

На нынешнем этапе более распространены в применении протоколы со сменой сред. Все производители сред имеют среды для такого способа культивирования.

Не все производители имеют среды для культивирования в одной среде. Это в основном вызвано четырьмя основными причинами, которые активно оспаривают сторонники одношаговых сред.

Эксперименты по сравнению двух протоколов культивирования не дают однозначных результатов. Так, в некоторых из них эмбрионы лучшего качества образуются при культивировании на такой простой моносреде (даже без обновления), как KSOM-AA.

Сравнительные характеристики использования трех вариантов протоколов представлены в табл. 17-2.

Использование моносреды сейчас становится более актуально в связи с развитием time-lapse-технологий, индивидуальным культивированием, применением более дорогих расходных материалов и риском утраты эмбриона при смене среды. Также следует отметить наличие дополнительного стресса для эмбрионов при смене среды на 2-е или 3-и сутки при последовательной системе культивирования.

Таким образом, каждая эмбриологическая лаборатория вправе выбирать культуральную среду, исходя из своего мнения и удобства работы.

ГРУППОВОЕ И ИНДИВИДУАЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

После решения о выборе протокола культивирования эмбриологической лаборатории предстоит выбрать способ культивирования: групповое или индивидуальное, выбрать культуральный пластик и определиться с объемами среды.

Преимуществами совместного культивирования:

Однако эти преимущества носят скорее предположительный характер и не подтверждены серией экспериментов, показывающих именно этот характер взаимодействия эмбрионов.

Следует отметить, что у человека обычно происходит овуляция одного ооцита, и маловероятно, чтобы такой тип коммуникации был свойствен эмбрионам человека.

Преимущества индивидуального культивирования:

Некоторые экспериментальные работы и наблюдение в клиниках ЭКО говорят о преимуществах группового культивирования, но чаще всего не обнаруживают никакой разницы. Единого мнения нет, но большинство лабораторий используют все же совместное культивирование, вероятнее всего из-за экономии и простоты организации.

Не следует забывать об особых случаях, когда индивидуальное культивирование необходимо, - предымплантационная диагностика. В этом случае возможен и комбинированный подход - сначала групповое культивирование, после биопсии - индивидуальное. При проведении специальных тестов и исследований по анализу профиля метаболизма эмбрионов и оценке потребления каких-либо веществ также используют индивидуальное культивирование. В этом случае важно строго соблюдать объемы среды.

Большую роль играет также соотношение количества эмбрионов и среды. Так, 5 эмбрионов в объеме 50 мкл имеют то же соотношение, что 1 эмбрион в 10 мкл. Существуют рекомендованные величины: соотношение эмбриона и среды не более 1:6,25 (иными словами, не больше 4 эмбрионов на 25 мкл среды, позже были рекомендованы увеличение количества среды и соотношение - не более 4 эмбрионов на 50 мкл среды).

Экспериментальная работа с ультрамикрокаплями порядка 1,5-2 мкл также показала сопоставимый процент беременности по сравнению со стандартными каплями 20-50 мкл. Если же используют микроциркуляционные платформы, то речь может идти о каплях объемом в нанолитрах.

СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ КИСЛОРОДА

Концентрация кислорода в маточных трубах - в пределах 2-8%, в то время как в атмосфере - порядка 20%. Очевидно, что снижение его до физиологического уровня - такой же важный аспект развития, как и любой компонент среды. Снижение концентрации кислорода сопровождается снижением уровня активных радикалов и оказывает влияние на липидные мембраны, белки, ДНК и метаболические процессы эмбриона. Тем не менее следует учитывать не только состав сред и концентрацию кислорода, но и качество воздуха в эмбриобок-се. Отклонение в этих параметрах может дать не мгновенный эффект - ухудшение развития эмбрионов, а будет иметь отсроченные последствия, приводя к увеличению замерших беременностей.

СОВМЕСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

При совместном культивировании, кроме среды и эмбрионов, участвуют еще дополнительные клетки - питающие. Этот способ моделирует взаимодействие с клетками выстилки труб. В качестве питающих клеток используют собственные эндометриальные клетки, фибробласты, кумулюсные клетки, а также Vero-клетки (клетки почки африканской зеленой мартышки) и эпителиальные клетки маточных труб различных животных.

Совместное культивирование применяют в некоторых клиниках. Монослои питающих клеток могут удалять двухвалентные катионы тяжелых металлов и ингибиторы метаболизма, а также снабжать малыми эмбриотрофными метаболитами и факторами роста. Возможно, питающие клетки обеспечивают снижение содержания кислорода до менее токсичных уровней. Однако точные механизмы влияния до сих пор полностью не изучены. По результатам мета-анализа увеличивается частота имплантации, наступления беременности и прогрессирования беременности. Наиболее веский аргумент против применения такого способа культивирования - риск контаминации.

СИСТЕМЫ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ

Просвет труб содержит жидкость, обеспечивающую сложные и многокомпонентные процессы: оплодотворение, эмбриональное развитие и транспорт эмбриона в матку. Скорость движения жидкости - порядка 6,5-29 мкм/с.

Работы, связанные с моделированием этой ситуации - механические компоненты развития эмбриона, - идут в разных направлениях.

Разработаны три типа систем:

Однако на данном этапе развития эти системы используют скорее в исследовательских целях, чем в обычной практике ВРТ.

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

В раннем эмбриогенезе происходят сложные эпигенетические процессы, обеспечивающие переход от состояния гамет к зиготе и функционированию нового организма. Вполне вероятно, что культивирование in vitro влияет на экспрессию генов, ремоделирование хроматина и паттерн метилирования ДНК. Очевидно, что сравнивать результаты развития in vitro и in vivo можно в основном на модельных объектах. Однако сравнение экспрессии генов из различных тканей детей, рожденных в результате применения ВРТ, показало значительные отличия от аналогичных данных детей, рожденных естественным путем. На модельных объектах не обнаружено изменения гистонового кода между эмбрионами, полученными in vivo и in vitro. Однако есть свидетельства различий в плане сайлесинга ретровирусов, инактивации Х-хромосомы и установления геномного импринтинга. В пользу этого предположения, кроме экспериментальных данных, говорит мультицентровой анализ результатов ЭКО. Обнаружено повышение частоты рождения детей с синдромами Ангельмана и Прадера-Вилли в результате нарушения работы центра импринтинга (71% случаев против 5% в популяции). К этой же проблеме можно отнести синдром крупного потомства - тоже нарушены центры импринтинга. Однако сложно утверждать, что подобные эффекты связаны только с условиями культивирования эмбрионов, стоит помнить, что цикл начинается с суперовуляции (гормональное воздействие). Выбор метода оплодотворения тоже имеет значение. Если метод ЭКО более приближен к естественным условиям, то применение

ICSI связано с микрохирургическим вмешательством в яйцеклетку, а также обходит естественные механизмы отбора сперматозоида. Таким образом, культивирование in vitro не является нормой, но это необходимый компромисс в ситуации преодоления репродуктивных проблем.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Biggers J.D., Summers M.C. Choosing a culture medium: making informed choices // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, N 3. P. 473-483.

Cohen J., Rieger D. Embryo Culture Methods and Protocols. New York : Springer, 2012. 432 p.

Quinn P. (ed.). Culture Media, Solutions, and Systems in Human ART. Cambridge University Press, 2014. 294 p.

Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs // Hum. Reprod. 2016. Vol. 31, suppl. 4. P. 685.

Sirard М.А. The influence of in vitro fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model // J. Dev. Orig. Health Dis. 2017. Vol. 8, N 4. P. 411-417.

Talwer L.C.P. Manual of Assisted Reproductive Technologies and Clinical Embryology. Jaypee Brothers Medical Publishers, 2012. 900 p.

The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine and the Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology. Revised guidelines for human embryology and andrology laboratories // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, suppl. 3. P. 45-59.

Морфологическая оценка является основным методом оценки эмбрионов. Работа эмбриолога, в сущности, и заключается в том, чтобы из гамет пациентов получить эмбрионы и сделать обоснованный выбор эмбриона оптимального качества для переноса.

Важнейшими параметрами для оценки эмбриона являются:

Эмбрион при стандартном подходе оценивают на следующих стадиях развития:

ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ЭМБРИОНА Количество клеток

Стадия делений дробления начитается с двух клеток и до стадии морулы, которая компактизуется из 8-16 бластомеров.

Количество бластомеров является наиболее важной характеристикой, коррелирующей с частотой наступления беременности. Часто в обозначении качества эмбриона вводят цифру количества бластомеров. Тем не менее более корректно говорить не просто о количестве бластомеров, а о морфокинетических характеристиках развития эмбрионов - динамике увеличения количества бластомеров в соответствии с днем развития эмбриона.

Для эмбрионов хорошего качества также важны кинетика и синхронность делений дробления. Развитие новых технологий культивирования - отслеживания развития эмбриона онлайн в условиях специальных инкубаторов, оснащенных камерой, - дало новую информацию о развитии эмбриона в условиях in vitro. Показано, что деления дробления происходят каждые 18-20 ч. Деления происходят с незначительной асинхронностью. Хотя не следует забывать о существовании естественной вариативности биологических процессов. В некоторых случаях возможно как ускорение, так и отставание от этого расписания. Очевидно, что нарушенные условия культивирования могут замедлять темпы дробления. Кроме того, особенности протокола гормонального стимулирования также могут отражаться на развитии эмбрионов. Эмбрионы, делящиеся слишком быстро или медленно, с большей вероятностью имеют метаболические или генетические патологии. Существует теория «спокойного эмбриона». Она отмечает преимущества эмбрионов с более «спокойным» уровнем метаболизма, оцениваемым по скорости потребления питательных веществ и кислорода. Этот феномен связывают с усилением метаболической активности эмбриона в ответ на стрессовые события (повышение концентрации активных форм кислорода). Кроме того, развитие in vitro лишь приближенно моделирует развитие in vivo. К примеру, развитие in vitro протекает быстрее, и бластоциста образуется уже к 4-му дню. Поэтому важным является выработка общих подходов и параметров оценки эмбриона.

На состоявшейся в 2010 г. в Стамбуле рабочей встрече пришли к соглашению о следующих временных параметрах значимых этапов развития эмбриона (табл. 18-1). Первое наблюдение относительно важности времени деления эмбриона было сделано еще Эдвардсом. Он отметил, что эмбрионы, достигшие через 55 ч после оплодотворения 8-клеточной стадии, имеют большую вероятность имплантации, чем эмбрионы, достигшие этой стадии по истечении 56 ч. Первое деление дробления происходит через 26-28 ч в зависимости от метода оплодотворения (см. рис. 18-1, б). После ICSI деление происходит быстрее, после ЭКО - с объяснимым запаздываем. Именно поэтому время так называемого раннего деления (early cleavage) - это первая и довольно информативная характеристика эмбриона. Соблюдение такого расписания является хорошим предиктором развития эмбриона до стадии бластоцисты, вылупления бласто-цисты и имплантации. Учитывая различную скорость вступления в первое митотическое деление зигот, оплодотворенных методом ЭКО и ICSI, временную характеристику можно брать вплоть до 29 ч после оплодотворения. Тот факт, что доля зигот с ранним делением у пациенток в молодой возрастной группе выше, чем в более старшей, позволяет говорить, что эта характеристика зиготы имеет материнское происхождение и не зависит от качества эякулята.

Таким образом, нормальным расписанием развития эмбриона человека принято считать достижение на 2-й день стадии четырех клеток (рис. 18-1, в), на 3-й день - стадии восьми клеток (рис. 18-1, г), на 4-й день - образование морулы (рис. 18-1, д) и образование бластоцисты на 5-й день развития (рис. 18-1, е) (см. табл. 18-1).

Фрагментация

Достаточно часто при митотических делениях происходит отшнуровка фрагментов цитоплазмы, не содержащих ядра. Размер и локализация таких ануклеарных фрагментов могут быть различны. Они могут располагаться как локально, на одном полюсе эмбриона, так равномерно распределены по всему объему. Кроме того, фрагменты могут абсорбироваться в течение интерфазы. Внедрение в практику постоянного мониторинга развития эмбриона позволило выделить существование двух типов фрагментов. Истинная фрагментация после образования стабильна и четко отличима от бластомеров, и псевдофрагментация образуется во время клеточного деления или сразу после него, далее абсорбируется бластомерами и не определяется при дальнейшем развитии.

Полное отсутствие фрагментации характеризует эмбрион наилучшего качества. Однако в ряде классификационных систем оценки допускают, что 10% фрагментация от объема всего эмбриона также является нормой и не влияет на дальнейшее развитие и имплантацию. Некоторые специалисты склонны увеличивать допустимую норму до 20%.

В определенных случаях бывает сложно отличить ануклеарные фрагменты от бластомеров, содержащих ядро, особенно при небольшом размере бластомеров. Было показано, что на 2-й день элементы менее 45 мкм и на 3-й день менее 40 мкм чаще всего не содержат ДНК, и было принято фрагментами считать элементы менее этих размеров. Однако следует учитывать вероятность неравномерного разделения цитоплазмы при цитокинезе и возможное образование очень мелких бластомеров. При оценке степени фрагментации также важно принимать во внимание трехмерное строение эмбриона. Если в одном ракурсе фрагментация может казаться локальной и незначительной, то в другом положении эмбриона визуальная оценка может показать распределенное расположение фрагментов. Именно поэтому важно, особенно при спорных случаях, проводить оценку в разных положениях эмбриона. Аккуратные встряхивания или работа микроинструментами могут помочь в этом.

Длительные наблюдения за развитием эмбрионов и исходами циклов ЭКО позволяют считать фрагментирование одним из наиболее значимых негативных маркеров. Показаны отрицательные корреляции между степенью фрагментации и долей образования бластоцист, частотой имплантации и рождения. В сочетании с количеством клеток на определенной стадии (характеристика клеточного цикла) фрагментацию рассматривают как диагностический критерий, отражающий вероятность хромосомной несбалансированности эмбриона. Тем не менее нельзя утверждать, что такие критерии наблюдения за делением эмбриона и наличием фрагментов могут стать абсолютными. Как обычно, мы имеем дело только с вероятностями и корреляциями. Порядка 30% анеуплоидных эмбрионов демонстрируют нормальные временные рамки делений дробления.

Показано, что одной из причин образования фрагментации в эмбрионах может быть нарушение условий культивирования. При снижении осмолярности среды эмбрион компенсирует это увеличением объема бластомеров и растяжением блестящей оболочки. Однако митотические деления происходят при определенном нуклеоцитоплазматическом соотношении, для корректировки объема отшнуровывают часть цитоплазмы (с белками, транскрипционными факторами и РНК). Являются ли такие нарушения условий культивирования причиной нерасхождения хромосом в митотических делениях и, соответственно, мозаичности эмбрионов, остается неподтвержденным фактом.

Если фрагментация эмбрионов является негативным фактором, может ли искусственная дефрагментация улучшить прогноз таких эмбрионов? Дефрагментацию проводят на стадии 4-8 клеток с использованием микроманипуляционных инструментов. Были проведены исследования, однако единого мнения не сложилось. Улучшает ли дефрагментация динамику развития эмбрионов, частоту бластуляции и наступления беременности? Положительным моментом при удалении фрагментов можно считать восстановление осей расположения бластомеров в эмбрионе. В качестве отрицательного - высокую инвазивность процедуры и формирование надреза бластоцисты. Сейчас клиники ВРТ редко применяют дефрагментацию из-за возможности травмирования эмбриона, высокой стоимости микроинструментов и недоказанной эффективности.

Размер бластомеров

Очевидно, что митоз приводит к образованию двух одинаковых по размеру дочерних клеток. Если деление асимметричное, один из бластомеров содержит больше цитоплазмы, протеинов, клеточных органелл и РНК. Однако эмбрион - организм, динамично изменяющийся, поэтому следует оценивать не просто размеры бластомеров, но и специфичность стадии. Например, равные размеры трех бластомеров не являются стадиеспецифичным параметром, одному бластомеру следует быть крупнее, так как он должен перейти на стадию митоза, тогда как два других уже находятся в фазе репликации ДНК (рис. 18-2). Если же при стадии развития 4, 8 клеток бластомеры неравного размера, это увеличивает вероятность, что некоторые бластомеры мультиядерны и гетероплоидны, и, соответственно, эмбрион имеет меньшую вероятность имплантации.

Количество ядер

Каждый бластомер должен иметь одно ядро. Однако дву- и многоядерный бластомеры встречаются с достаточной частотой. Их можно обнаружить на разных стадиях развития с 1-го по 3-й день. Многое зависит как от качества оптики (довольно мелкие структуры), так и от размеров и расположения бластомеров. Мультинуклеарным считают эмбрион, где хотя бы один бластомер имеет более одного ядра. Каковы причины формирования многоядерных бластомеров? Помимо очевидной причины - незавершенного митоза без цитокинеза - это могут быть нарушения анафазы митоза, аномалии формирования ядерной оболочки, асимметричный цитокинез, нарушение расхождения хромосом и образование микроядер. Именно поэтому достаточно часто ядра бластомера различны по размеру.

Принято выделять мульти- и бинуклеарные бластомеры. Бинуклеарные бластомеры имеют лучший прогноз развития по сравнению с мультинуклеарными. Существует вероятность того, что бинуклеарные, возможно, закончили кариокинез, но не закончили цитокинез и при завершении этого процесса с большей вероятностью дадут нормальный эмбрион. Мультинуклеарные следует исключать из возможного переноса, если есть эмбрионы лучшего качества. Однако известны случаи рождения здоровых детей и из таких эмбрионов, поэтому этот параметр не является признаком исключения (как, к примеру, трехпронуклеарные зиготы). К тому же двуядерность только коррелирует с повышенной частотой анеуплоидии, но не жестко с ней связана, а единственное ядро в каждом бластомере эмбриона еще не гарантия сбалансированности его генома.

Очевидно также, что мультинуклеарность коррелирует с таким признаком, как размер бластомера; нарушения митоза не могут не отразиться на размерах дочерних клеток.

Аномалии цитоплазмы

Образование неровностей небольшого диаметра скорее связно с особенностями культивирования и не имеет прогностического значения. Такие признаки, как потемнение цитоплазмы, образование кортикального гало, чередование гранулярных и просветленных зон, свидетельствуют о риске деградации эмбриона. Однако особенности цитоплазмы достаточно трудноразличимы начиная с 3-го дня развития из-за уменьшения размеров бластомеров.

Вакуолизация цитоплазмы возможна на любом этапе развития от ооцита до бластоцисты, причем в ВКМ они встречаются реже, чем в трофэктодерме. Возможны вариации количества и размеров, и если небольшие вакуоли не имеют практического значения, то значительные могут иметь генетическую природу и негативно сказываются на качестве эмбриона. В зиготе встречаются два типа вакуолей: связанные с созреванием ооцита - предсуществующие в яйцеклетке и искусственно созданные при нарушении технологии проведения ICSI.

В любом случае особенности цитоплазмы могут отражать индивидуальное развитие эмбрионов как одной пациентки, так и разных пациенток. На сегодняшний день не выявлено характеристик цитоплазмы, четко коррелирующих с эффективностью имплантации.

Ориентация бластомеров

Ооциты человека, как это принято у всех ооцитов, имеют поляризованную цитоплазму: анимальный и вегетативный полюсы. Хотя выраженность полярности отмечается в более слабой степени, чем у большинства модельных объектов. Первое митотическое деление происходит строго в меридиональной плоскости, сохраняющей полярность. У дочерних клеток второе деление совершается по-разному: экваториально и меридионально, приводя к типичному пирамидальному расположению бластомеров и разному составу цитоплазмы (см. рис. 18-1, в). Нарушение четкой ориентации веретена деления бластомеров приводит к образованию фигуры «клевера» или овоидной формы эмбриона.

Изменение полярности эмбриона становится причиной изменения состава цитоплазмы (транскрипционные факторы и эпигенетические метки) и отражается на дальнейшем развитии эмбриона - образовании бластоцисты, имплантации. Однако однозначных доказательств аномальности эмбрионов с пространственной дезорганизацией не получено.

Компактизация бластомеров. Процесс компактизации связан с миграцией Е-кадгерина из цитоплазмы на поверхность клеток, что, несомненно, контролируется геномом самого эмбриона и может служить отличным маркером его работы, а также дает хороший прогноз дальнейшего развития. Хотя на скорость и динамику этого процесса могут влиять и условия культивирования эмбриона. Морула образуется на 4-й день развития и должна состоять из 16-32 бла-стомеров, однако начальные стадии компактизации заметны уже на стадии 8 бластомеров или даже раньше. Плохим прогностическим признаком служит отсутствие компактизации на стадии 10 бластомеров.

По степени вовлеченности всех бластомеров в образование морулы построена классификация этой стадии. Часто используют классификацию, предложенную Тао (рис. 18-3). Возможно, что бластомеры, не вовлеченные в морулу, генетически аномальны (анеуплоидия), остановились в развитии (апоптоз) или потеряли состояние тотипотентности. Многие центры ЭКО не практикуют оценку эмбрионов на стадии морулы. Однако новые научные исследования показывают важность этой стадии. Клетки эмбриона занимают не случайные позиции, демонстрируют дифференциальную экспрессию геном на стадии, что определяет их дальнейшую судьбу: в составе внутриклеточной массы или трофэктодермы.

Образование бластоцисты. На стадии морулы начинается образование полости - кавитация. Это происходит в результате накопления жидкости (обычного осмоса): повышение концентрации соли путем изменения работы натриево-калиевых каналов. Давление воды, в свою очередь, увеличивает размеры бластоцисты. С этого момента два процесса происходят параллельно: увеличение размера бластоцели и истончение блестящей оболочки, что завершается ее разрывом (хэтчингом) и вылуплением бластоцисты. На этой стадии бласто-циста состоит из множества клеток - до 322. На одном из ее полюсов изнутри определяют скопление клеток - ВКМ, из которой развиваются зародыш, амнион, желточный мешок и аллантоис. Из наружного одноклеточного слоя бластоцисты формируется трофобласт (хорион) и в дальнейшем - плодовая часть плаценты.

Ниже приведены основные критерии для оценки бластоцисты.

Размер бластоцели является основным признаком, характеризующим стадию развития бластоцисты, ее возраст.

Стандартная схема классификации предложена Гарднером в 1999 г., она делит развитие бластоцисты на шесть стадий в зависимости от размера бластоцели и степени вылупления.

На I стадии размер бластоцели меньше половины объема эмбриона. Здесь сложность как раз в том, чтобы разграничить бластоцисту 1-го возраста и морулу с начальной кавитацией. В этом случае сложно описать ВКМ и трофэктодерму. Такие эмбрионы часто объединяют под названием «ранняя бластоциста».

На II стадии бластоцель занимает до 80% объема эмбриона.

На III стадии - это уже полная бластоциста, она увеличена в размерах, и бластоцель занимает более 80% объема.

На IV стадии - экспандированная бластоциста. Она значительно увеличена в размерах, и начинается истончение блестящей оболочки.

На V стадии начинается вылупление (хэтчинг), которое полностью заканчивается уже на VI стадии.

Оценивая степень вылупления, нужно иметь в виду микроманипуляционные процедуры, выполненные с эмбрионом. Если проводили доимплантационную диагностику, то от способа, каким делали надрезание блестящей оболочки (лазерный или механический), будет зависеть размер отверстия в ней, и вылупление, а скорее выдавливание, у такой бластоцисты будет происходить раньше, чем у интактных; и у таких эмбрионов сложнее оценить объем бластоцели. Кроме того, в некоторых наблюдениях было отмечено, что размеры бластоцели связаны с инактивацией Х-хромосомы. И эмбрионы, несущие Y-хромосому, чаще имеют большую бластоцель, чем равного им возраста эмбрионы с Х-хромосомой. Однако не следует полагаться на этот признак при необходимости отбора эмбрионов по полу.

Как уже отмечалось, бластоциста содержит две различные клеточные линии. Клетки ВКМ по качеству принято делить на три категории. Лучшие - качества 1, или А, - многочисленны, характеризуются плотной упаковкой. Категория 2, или В, - расположены редкими группами, клеток меньше. И категория 3, или С, содержит единичные клетки на значительном расстоянии. Наблюдения показывают, что большие размеры ВКМ характерны для эмбрионов с лучшим потенциалом к имплантации, что, вероятнее всего, связано с количеством клеток. Является ли диагностическим признаком форма ВКМ, пока не ясно. Оптимальная форма ВКМ - овальная, хотя встречаются и варианты: грибовидная, звездчатая и в форме полумесяца. В небольшом проценте случаев возможно образование второй ВКМ, причем есть мнение, что условия искусственного культивирования эмбрионов повышают вероятность такого сценария, что может объяснять увеличенную частоту зачатия диамниотической и дихориальной двойни.

Клетки трофэктодермы хорошо отличимы на бластоцистах начиная с III стадии развития. В дальнейшем эти клетки будут важными участниками имплантации и формирования хориона. Классификация сходна с таковой для клеток ВКМ. К другим характеристикам бластоцисты можно отнести наличие цитоплазматических мостиков между трофэктодермой и ВКМ, деградирующих клеток, вакуолизации или двух локусов хэтчинга (возможные последствия ICSI). Наличие апоптотических клеток - отрицательный признак.

Описанные морфологические особенности эмбрионов на различных стадиях развития важно расставить по приоритетности и на их основании вынести суждение о качестве эмбриона и вероятности наступления беременности - иными словами, создать классификацию.

Следует отметить, что в мировой практике существует много различных подходов к оценке качества эмбриона. Одни страны более продвинуты в этом вопросе: имеется единая национальная система, у других нет четких критериев, и практически каждая клиника вольна в своем выборе. Кроме того, существуют значительные внутри- и межлабораторные различия в оценке даже в рамках единой системы. Поэтому важным является создание единой, принятой всеми лабораториями системы классификации.

На прошедшей в феврале 2010 г. в Стамбуле рабочей встрече по выработке единых подходов в оценке качества эмбрионов была предпринята первая попытка унификации. Несомненно, эти предложения будут модифицироваться и дополняться или упрощаться, но на сегодняшний день это последнее соглашение.

Для дробящихся эмбрионов 2-го и 3-го дня была принята классификация, представленная в табл. 18-2. Помимо количества бластомеров, внимание уделяют степени фрагментации, стадиеспецифичности размеров бластомеров и наличию мультиядерных бластомеров.

Классификации морулы и бластоцисты в общем плане построены на классификации Тао и Гарднера с некоторым упрощением (табл. 18-3, 18-4).

В некоторых странах приняты единые национальные системы оценки эмбрионов. Так, в Великобритании общество HFEA (от англ. Human Fertilisation and Embryology Authority - Британская служба по оплодотворению человека и эмбриологии) поставило задачу снизить частоту рождения двоен до 10% и предпочтительно перейти на селективный перенос одного эмбриона. В связи с этим в 2008 г. выпущен протокол оценки качества дробящихся эмбрионов, учитывающий такие параметры, как количество бластомеров, относительный размер бластомеров и величина фрагментации. Для оценки качества бластоцист используют как основу классификацию Гарднера. С 2003 г. существует внутренняя система контроля и постоянных тренингов, с 2010 г. есть системы видеотренинга.

В Испании действует система ASEBIR (от англ. Association for the Study of Reproduction Biology - Ассоциация по изучению биологии репродукции) - ассоциация всех лабораторий, работающих в сфере ЭКО. Оценивают качество ОКК, зигот, дробящихся эмбрионов и бластоцист. Эта система на основании шести параметров (количество бластомеров, доли фрагментации, симметрии эмбрионов, наличие мультинуклеарных бластомеров, вакуолей и качество блестящей оболочки) выделяет четрые типа эмбрионов: от А (лучшего качества) до D (худшего качества). Следует отметить, что такая система одновременно является рекомендацией к переносу эмбрионов. Так, эмбрионы класса D не рекомендованы к переносу.

В США нет официальной единой системы классификации, но на практике с 2006 г. используют систему Общества вспомогательных репродуктивных технологий (от англ. Society for Assisted Reproductive Technology, SART). Эта система построена по сходной схеме: дробящиеся эмбрионы и бластоцисты делят по качеству на три группы.