Клиническая лабораторная диагностика

Формирование диагноза и определение лечебных мер для конкретного пациента в сознании врача происходит в результате анализа информации о пациенте и его состоянии: сбора анамнеза заболевания, данных врачебного осмотра, включая аускультацию, перкуссию и другие субъективные методы, динамическое наблюдение. Если заболевание имеет типичные проявления, совпадающие с классическими описаниями соответствующей формы патологии, этой информации оказывается достаточно для установления диагноза и назначения лечения. Однако в большинстве случаев врач нуждается в более полных сведениях о состоянии функций и структур организма пациента. Выдающийся канадский клиницист XIX в. Вильям Ослер писал: «Медицина - это наука неопределенности и искусство вероятности. Одной из главных причин этой неопределенности является возрастающая вариабельность проявлений любой болезни». Эту неопределенность призваны были уменьшить объективные методы исследования организма пациента.

Еще врачеватели древности обратили внимание на исследование таких биоматериалов, как выделения больных. Органолептически - на цвет, прозрачность, запах и даже на вкус - оценивали мочу пациентов (болезнь «сладкой мочи», впоследствии названную сахарным диабетом, описал в VI веке до нашей эры индийский врач Сашрута). Широко применяли уроскопию: рассматривание лечащим врачом сосуда с пробой мочи пациента одновременно с подсчетом пульса. Степень прозрачности и цвет этого биоматериала сравнивали с так называемым колесом уроскопии - эмпирической шкалой, на которой цвет и характер мочи сопоставлялся с перечнем болезней.

Предпосылки научного периода изучения жидкостей человеческого организма химическими методами зародились в XV-XVI вв. в лабораториях алхимиков, а затем в трудах Кузанциса и Парацельса, которые пытались использовать химические представления в медицинской практике.

Середина XVII в. стала переломным периодом в отношении способов исследования биологических жидкостей больных - временем перехода от органолептического их исследования врачом при осмотре больного к объективным методам. Создание голландским естествоиспытателем Левенгуком первого оптического прибора - микроскопа - позволило разглядеть клетки крови, корпускулярные компоненты мочи, некоторые микроорганизмы и тем самым расширить способность человека визуально изучать эти объекты, неразличимые простым глазом. В конце XVII в. английский ученый Роберт Бойль опубликовал исследования крови человека с помощью доступных в ту пору химических методов дистилляции, став, тем самым, одним из основоположников клинической химии. Вслед за тем Лангриш описал изменения крови больных с лихорадкой. Очевидно, подобные работы дали М.В. Ломоносову основание заявить: «Врач без довольного знания химии совершенен быть не может».

Понадобился еще примерно двухвековой путь, чтобы на основе общего развития естественных наук возникла система объективных методов исследования. Знаковыми событиями на этом пути стали создание Ю. фон Либихом в 1840 г. первой аналитической лаборатории, издание им фундаментального труда «Химия животных», а в 1842 г. создание его учеником И. Шерером в больнице г. Вюрцбурга (Германия) «клинической химической лаборатории». В 1838 г. были опубликованы таблицы по микроскопии осадка мочи, а в 1844 г. - курс микроскопии для медицинских исследований (А. Донне). В 1843 г. вышла в свет основанная на клиническом материале монография И. Шерера «Химические и микроскопические исследования при патологии», явившаяся практически первым руководством по клинической лабораторной диагностике. С 1843 г. под редакцией И. Симона стал издаваться один из первых журналов по лабораторной диагностике «BeitragenfurphysiologischeundpathologischeChemieundMikroscopie», а с 1847 г. - «ArchivfurphysiologischeundpathologischeChemieundMikroscopie». В 1848 г. Г. фон Фелинг разработал тест для определения глюкозы. В 1870 г. Ж. Дюбоск предложил колориметр, ставший на долгие годы одним из основных инструментов клинической химии. Эти события ознаменовали собой начало существования клинической лабораторной диагностики как самостоятельной отрасли медицины.

Лабораторные исследования стали первыми объективными диагностическими технологиями в истории развития медицины, а лабораторная специальность - первой по объему информации среди профессий специалистов по объективным методам диагностики - рентгенологов, электрокардиографистов, эндоскопистов, специалистов по ультразвуковой диагностике. Уже в первые годы существования клинических лабораторий Вильям Ослер сравнил их роль со значением скальпеля для врача. За полтора века клинико-лабораторная специальность постоянно находилась в процессе развития аналитических возможностей на основе восприятия все новых и новых открытий и изобретений в области биологии, химии, физики, а также их прикладных медико-биологических дисциплин - биохимии, цитологии, микробиологии, иммунологии, молекулярной биологии и др. (табл. 1).

Таблица 1. Вехи развития лабораторной диагностики в XIX-XX вв. (по Дати, Метцманн, 2007)

Существенно расширился диапазон технологий, составляющих содержание практической деятельности в лабораториях. Микроскопия биологических жидкостей и простые химические методы, с которых начиналась лабораторная деятельность в середине ХIX в., составляют в настоящее время едва лишь десятую часть диапазона аналитических приемов клинической лабораторной аналитики. В распоряжение специалиста современной лаборатории предоставлена широкая гамма разнообразных фото-, флюоро-, люминометрических, электрохимических, лигандных, хроматографических, масс-спектрометрических, молекулярно-биологических методов исследования. К концу ХХ в. доступными для качественной и количественной оценки стали практически все клеточные и химические компоненты биологических материалов, которые позволяют с той или иной степенью точности характеризовать состояние органов и физиологических систем организма человека и, следовательно, представляют определенный клинический интерес.

Широко распространены и быстро развиваются исследования гормонов, гемостаза, иммунной системы, молекулярной генетики. Полностью преобразился приборный парк современной клинической лаборатории, как по видам инструментов, так и по степени автоматизации. На службу лабораторной диагностике постоянно поступают все более мощные технические средства, обладающие высокой чувствительностью, стабильностью, оснащенные роботизированными устройствами, автоматикой, компьютерами. Расширение рамок лабораторно-аналитической деятельности, благодаря разнообразию как самих технологий, так и применяемой аппаратуры, привело к значительному увеличению объема специальных знаний и умений, которыми должен в настоящее время обладать лабораторный специалист. В свою очередь, существенно расширился объем и повысилась информативность тех объективных сведений о состоянии организма обследуемого пациента, которые лабораторная медицина готова предоставить лечащему врачу. В настоящее время лабораторные исследования для удовлетворения клинических потребностей получили прочный научный фундамент лабораторной медицины, а их практическое выполнение приобрело характер системы лабораторного обеспечения медицинской помощи, осуществляемого в различных формах и объеме, соответствующих нуждам и возможностям системы здравоохранения.

Настоящее издание, направленное в первую очередь на клиническую аудиторию, призвано дать представление о современном состоянии лабораторной медицины, помочь лечащим врачам в подборе наиболее информативных и клинически значимых лабораторных анализов и обеспечить их диагностическую интерпретацию. В то же время в руководстве приводятся и методические материалы, которые предназначены для специалистов практических клинико-диагностических лабораторий. Такой комплексный подход позволяет рассмотреть представляемый материал с разных сторон и представить материал как справочно-аналитический.

Главные редакторы

Докт. мед. наук В.В. Долгов Чл.-корр. РАЕН, докт. мед. наук В.В. Меньшиков

Долгов Владимир Владимирович - д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Меньшиков Вадим Владимирович - д-р мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАЕН, зав. лабораторией проблем клинико-лабораторной диагностики НИЦ ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова»

Алексеева Марина Леонидовна - канд. биол. наук, ст. научн. сотр. научно-диагностической лаборатории ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России», Москва

Арсенин Сергей Леонидович - канд. мед. наук, руководитель лабораторного направления ООО «МК», Москва

Базарный Владимир Викторович - д-р мед. наук, профессор кафедры клинической лабораторной и микробиологической диагностики ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург

Байдакова Галина Викторовна - ст. научн. сотр. лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Белохвостов Александр Сергеевич - д-р мед. наук, профессор, руководитель генетической службы НПЦ медицинской помощи детям, заведующий лабораторией молекулярной онкологии и генетики ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Минздравсоцразвития России, Москва

Букина Анна Михайловна - научн. сотр. лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Букина Татьяна Михайловна - канд. биол. наук, ст. научн. сотр. лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Вавилова Татьяна Владимировна - д-р мед. наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Северо-Западный Государственный медицинский университет», Санкт-Петербург

Венгеров Юрий Юзефович - д-р биол. наук, профессор, вед. научн. сотр. лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Воскобоева Елена Юрьевна - канд. мед наук, вед. научн. сотр. лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Герштейн Елена Сергеевна - д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Гильманов Александр Жанович - д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ», Уфа

Дементьева Инна Иосифовна - д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией экспресс-диагностики ГУ «Российский научный центр хирургии РАМН», Москва

Джангирова Татьяна Владимировна - канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Ельчанинова Светлана Александровна - д-р биол. наук, профессор, зав. кафедрой биохимии и лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет», Барнаул

Еремин Серафим Кузьмич - ст. научн. сотр., ст. преподаватель кафедры аналитической и судебно-медицинской токсикологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова»

Ермакова Марина Александровна - канд. мед. наук, ассистент кафедры медицинской генетики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Зайко Виктория Витальевна - канд. биол. наук, мл. научн. сотр. лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Захарова Екатерина Юрьевна - канд. мед. наук, зав. лабораторией наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Зурочка Александр Владимирович - д-р мед. наук, профессор, зав. курсом клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия»

Иванец Татьяна Юрьевна - канд. мед. наук, заведующая научно-диагностической лабораторией ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России», Москва

Изотов Борис Николаевич - д-р хим. наук, профессор, зав. кафедрой аналитической и судебно-медицинской токсикологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова»

Калиненкова Светлана Георгиевна - канд. биол. наук, зав. лабораторией генетики МОНИКИ им. Владимирского, Москва

Касоян Карине Тимуровна - канд. мед. наук, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Кишкун Алексей Алексеевич - д-р мед. наук, профессор кафедры медицинской биохимии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Козлова Светлана Ивановна - д-р мед. наук, профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Колупаев Всеволод Евгеньевич - канд. мед. наук, менеджер по продукции ООО «БИО-РАД лаборатория», Москва

Кузмичева Нелли Алексеевна - канд. биол. наук, доцент кафедры медицинской генетики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Кушлинский Николай Евгеньевич - д-р мед. наук, профессор, член-корреспондент РАМН, зав. лабораторией клинической биохимии РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН; зав. кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет»

Луговская Светлана Алексеевна - д-р мед. наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Любимова Нина Васильевна - д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Малахов Владимир Николаевич - д-р биол. наук, профессор, руководитель отдела стандартизации и контроля качества клинической лабораторной диагностики ФГУ ГНИЦ профилактической медицины, генеральный директор НП «Центр внешнего контроля качества», Москва

Мамаев Андрей Николаевич - д-р мед. наук, зав. лабораторией гемостаза МУЗ «Городская больница № 11», г. Барнаул, ст. научн. сотр. Алтайского филиала ГУ «Гематологический научный центр РАМН»

Миронова Ирина Ивановна - канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Наумова Елена Владимировна - канд. мед. наук, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Новик Виктор Иванович - д-р мед. наук, профессор, руководитель группы онкоцитологии ФГУ НИИ онкологии, Санкт-Петербург

Первушин Юрий Владиславович - канд. мед. наук, профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики Института последипломного и дополнительного образования ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия»

Погорелов Валерий Михайлович - д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией гемоцитологии Гематологического научного центра РАМН, Москва

Почтарь Маргарита Евгеньевна - канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Прищепа Михаил Иванович - канд. техн. наук, президент ЗАО «Аналитика»

Ракова Наталья Геннадьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Ройтман Александр Польевич - канд. мед наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Романова Людмила Андреевна - канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Рытикова Наталья Станиславовна - канд. биол. наук, руководитель направления иммуноферментного анализа ЗАО «БиоХимМак», Москва

Селиванова Анна Владимировна - канд. мед. наук, врач-эндокринолог ГКБ им. С.П. Боткина, Москва

Сергеева Наталья Сергеевна - д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией прогноза эффективности консервативного лечения опухолей ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена»

Симбирцев Андрей Семенович - д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией фармиммунологии Государственного НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России, Санкт-Петербург

Скуинь Людмила Михайловна - канд. мед. наук, доцент кафедры иммунологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Соболева Татьяна Николаевна - канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет», Москва

Старовойтова Татьяна Авенировна - д-р мед. наук, врач высшей категории, зав. клинико-диагностической лабораторией НУЗ Центральная клиническая больница № 1 ОАО «Российские железные дороги», Москва

Стериополо Ника Александровна - канд. биол. наук, врач высшей категории, заведующая клинико-диагностической лабораторией ФГУ «Клиническая больница» Управления делами Президента РФ, Москва

Суплотов Сергей Николаевич - д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия»

Тарасенко Ольга Анатольевна - канд. мед. наук, зам. главного врача ФГУЗ «Головной центр гигиены и эпидемиологии» ФМБА России, Москва

Тотолян Арег Артемович - д-р мед. наук, профессор, зам. директора ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»

Тумбинская Лидия Викторовна - канд. биол. наук, зам. директора по развитию ЗАО НПФ «ДНК-технология», Москва

Фанченко Николай Дмитриевич - д-р биол. наук, профессор, консультант научно-диагностической лаборатории ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России», Москва

Хайдуков Сергей Валерьевич - д-р биол. наук, зав. лаб. физиологии и патологии иммунной системы ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава; специалист по проточной цитофлуорометрии ООО «Бекмен Культер», Москва

Цвиренко Сергей Васильевич - д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой лабораторной и микробиологической диагностики ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург

Чухловин Алексей Борисович - д-р мед. наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова Росздрава»

Шабалова Ирина Петровна - д-р мед. наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», Москва

Шапиро Наум Абрамович - д-р мед. наук, профессор, заслуженный врач РФ, лаборатория цитологии Центральной клинической больницы №1 ОАО «Российские железные дороги», Москва

Шевченко Ольга Павловна - д-р мед. наук, профессор, зам директора ФГУ «Научный центр трансплантологии и искусственных органов», Москва

Шехтер Ольга Владимировна - канд. хим. наук, ст. научн. сотр. лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Национальные руководства - первая в России серия практических руководств по медицинским специальностям, включающих в себя всю основную информацию, необходимую врачу для практической деятельности и непрерывного медицинского образования. В отличие от большинства других руководств в национальных руководствах равное внимание уделено профилактике, диагностике, фармакотерапии и немедикаментозным методам лечения заболеваний.

Почему необходимы национальные руководства? Динамичное развитие медицинской науки, быстрое внедрение в клиническую практику новых высокотехнологичных методов диагностики и лечения требуют от врача непрерывного повышения профессионализма и обновления знаний на протяжении всей его профессиональной жизни. Данная задача решается системой последипломного образования и периодической сертификацией специалистов лишь частично. Быстро возрастающий объем научной медицинской информации предъявляет особые требования к качеству используемых учебных и справочных руководств, особенно с учетом внедрения в широкую клиническую практику достижений медицины, основанной на доказательствах. Имеющиеся на сегодня руководства для врачей и фармакологические справочники не в полной мере отвечают современным потребностям врачебной аудитории.

Ниже приведено описание требований, которые были разработаны при подготовке Национального руководства по клинической лабораторной диагностике, и мероприятий по лабораторному обеспечению медицинской помощи.

Для работы над проектом была создана группа управления в составе руководителя и менеджеров проекта.

Для разработки концепции и системы управления проектом его руководители провели множество консультаций с отечественными и зарубежными специалистами - руководителями профессиональных обществ, ведущими разработчиками аналитических и диагностических методов, клинических рекомендаций, организаторами здравоохранения, представителями компаний, производящих лабораторное медицинское оборудование и другие средства клинического лабораторного анализа.

В результате разработана концепция проекта, сформулированы этапы, определены их последовательность и сроки исполнения, выработаны требования к этапам и исполнителям; утверждены инструкции и методы контроля.

Обеспечить врача всей современной информацией в области клинической лабораторной диагностики, необходимой для непрерывного медицинского образования, что позволит значительно повысить качество специализированной медицинской помощи в Российской Федерации.

Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике предназначено врачам клинической лабораторной диагностики, врачам различных клинических специальностей, интернам, ординаторам, студентам медицинских образовательных учреждений. Составители и редакторы привели авторские материалы в соответствие с условиями специализированной клинической практики в России.

Создание команды управления и команды разработчиков, составление концепции, выбор тем, поиск литературы, разработка авторских материалов, экспертиза, редактирование, независимое рецензирование с получением обратной связи от рецензентов (специалисты, практикующие врачи, организаторы здравоохранения, производители средств лабораторного анализа, медицинского оборудования и др.), публикация, внедрение, получение обратной связи и дальнейшее улучшение.

Как и все книги серии, Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике включает в себя описание клинико-анатомических форм различных заболеваний, методов их диагностики и лечения.

Всем специалистам были предоставлены описание проекта, формат статьи, инструкция по составлению каждого элемента содержания, источники информации и инструкции по их использованию, пример каждого элемента содержания. В инструкциях для составителей указывалась необходимость подтверждать эффективность (польза/вред) вмешательств в независимых источниках информации, недопустимость упоминания каких-либо коммерческих наименований. Приведены международные (некоммерческие) названия лекарственных препаратов, которые проверялись редакторами издательства по Государственному реестру лекарственных средств (по состоянию на 1 июля 2010 г.). В требованиях к авторам-составителям было подчеркнуто, что материалы должны кратко и конкретно отвечать на клинические вопросы. После редактирования текст согласовывали с авторами.

Со всеми разработчиками руководитель проекта и ответственные редакторы поддерживали непрерывную связь по телефону и электронной почте с целью решения оперативных вопросов.

Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике в удобной и доступной форме содержит всю необходимую информацию для практической деятельности и непрерывного медицинского образования.

В инструкциях для авторов, научных редакторов и рецензентов подчеркивалась необходимость использовать при работе над национальным руководством только достоверные источники информации, не зависящие от мнения производителей средств лабораторного анализа и медицинской техники, что в конечном счете обеспечило отсутствие информации рекламного характера в авторских материалах руководства.

В рамках проекта «Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство» также подготовлена электронная информационно-образовательная система «Консультант врача. Клиническая лабораторная диагностика» (на компакт-диске). Система содержит текст национального руководства, стандарты, утвержденные Минздравсоцразвития России, и другие дополнительные материалы. Программа снабжена уникальной системой поиска. Информацию об электронной информационной системе «Консультант врача. Клиническая лабораторная диагностика» можно получить по тел.: (495) 921-39-07; по электронной почте: bookpost@geotar.ru, а также на интернет-сайте: http://www.geotar.ru.

Замечания и пожелания по подготовке книги «Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство» можно направлять по адресу: г. Москва, ул. Садовническая, д. 9, стр. 4; электронный адрес: info@asmok.ru. Таким образом, Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике в удобной и доступной форме содержит всю необходимую информацию для практической деятельности и непрерывного медицинского образования по клинической лабораторной диагностике. Все приведенные материалы рекомендованы Научным обществом специалистов клинической лабораторной диагностики и ведущими научно-исследовательскими институтами. Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике будет регулярно пересматриваться и обновляться не реже одного раза в 3-4 года. Дополнительную информацию о проекте «Национальные руководства» можно получить на интернет-сайте: http://nr.asmok.ru.

^♠ - знак лекарственного средства, не имеющего международного непатентованного названия

^р - лекарственное средство не зарегистрировано в Российской Федерации

^Θ - лекарственное средство в Российской Федерации аннулировано, т.е. исключено из Государственного реестра лекарственных средств

11-ДГТ - 11-дегидротромбоксан

ACT/ВСКа - activated clotting time, время свертывания цельной крови при активации контактной фазы

aPCR - activated protein C resistance, резистентность фактора V к активированному протеину C

aPTT/АЧТВ - activated partial thromboplastin time, активированное частичное тромбопластиновое время

BNP - мозговой натрийуретический пептид

BЕ - bases excess, избыток буферных оснований

CD - кластер дифференцировки

CDKI - cyclin-dependent kinase inhibitor, ингибитор циклин-зависимых киназ

Cler - внепочечный клиренс

Clr - почечный клиренс

Clt - общий клиренс

Cssmax - максимальная равновесная концентрация

Сssmin - минимальная равновесная концентрация

С₀ - кажущаяся начальная концентрация

CTAD - цитрат натрия, аденозин, теофилин и дипиридамол

CTAP-III - connective tissue-activating peptide III, пептид, активирующий соединительную ткань

DDU - D-dimers unit, единицы D-димераd

RVVT - diluted Russel Viper Venom Test, тест с разведенным ядом гадюки Рассела

E2 - эстрадиол

E3 - эстриол

F - биодоступная молярная доля

FEU - fibrinogen equivalent units, фибриногеновые эквивалентные единицы

GP - гликопротеин

GRP - гастрин-рилизинг-пептид

HbO₂, НbСО, МетНb - фракции гемоглобина: окси-, карбокси-, метгемоглобин

НbА_1с - гликированный гемоглобин

hs-СРБ - уровень С-реактивного белка, определенный высокочувствительным методом

Ig - иммуноглобулин

ISTH - Исследовательская группа по ВА и фосфолипидзависимым антителам

Ka - константа скорости абсорбции

KCT - kaolin clotting time, каолиновое время

Kel - константа скорости элиминации

MAPK - система митоген-активируемых протеинкиназ

РАI-1/ИАП-1 - plasminogen activator inhibitor 1, ингибитор активатора плазминогена 1

PB - белковосвязывающая молярная доля

PBP - platelet basic protein, основной пептид тромбоцитов

PC - protein C, протеин C

PCT - прокальцитонин

PCT - platelet crit, тромбокрит

PDGF - platelet-derived Growth Factor, фактор роста тромбоцитарный

PDW - platelet distribution width,_ ширина гистограммы по объему тромбоцитов, степень тромбоцитарного анизоцитоза

proBNP - прогормон мозгового натрийуретического пептида

PT/ПВ - prothrombin time, протромбиновое времяр

О₂рСО₂ - напряжение кислорода, углекислого газа

RIA - radioimmunoassay, радиоиммунный анализ

RVV - Russel Viper Venom, яд гадюки Рассела

SCC - антиген плоскоклеточного рака

SHBG - секс-стероидсвязывающий глобулин

SSCP - single strand conformation polymorphism, конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ДНК

SВ - стандартный избыток оснований

sО₂, s_vO₂, s_aO₂ - насыщение крови (венозной, артериальной) кислородом

TF - tissue factor, тканевой фактор

tPA - tissue plasminogen activator, тканевой активатор плазминогена

UBC - Urinary Bladder Cancer_, опухоль мочевого пузыря

Vd - объем распределения

α-ГБДГ - α-гидроксибутиратдегидрогеназа

АпоА-1 - аполипротеин А-I

АпоА-II - аполипротеин А-II

АА - апластическая анемия

АВС - активированное время свертывания

АДГ - антидиуретический гормон

АДФ - аденозиндифосфат

АИГА - аутоиммунная гемолитическая анемия

АИТ - аутоиммунный тиреоидит

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АЛТ - аланинаминотрансфераза

Анти-рец.ТТГ, α-RTSH - антитела к рецептору ТТГ

АПГ - анализатор показателей гемостаза

АПТИ - аспирационная пункция тонкой иглой

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент

АСА - аргинин-янтарная ацидурия

АСК - анализатор свертывания крови

АСЛ-О - антистрептолизин-О

АСТ - аспартатаминотрансфераза

АТ - антитромбин

АТФ - аденозинтрифосфат

АТППК 1 - аминотерминальные пропептиды проколлагена I типа

АТ-ТГ - антитела к тиреоглобулину

АТТК 1 - аминотерминальные телопептиды коллагена I типа

АФА - антифосфолипидные антитела

АФП - α-фетопротеин

АФС - антифосфолипидный синдром

АХЗ - анемия хронических заболеваний

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж

БГЛ - большие гранулярные лимфоциты

БОЕ-Э - бурстобразующие единицы эритропоэза

БТП - бедная тромбоцитами плазма

БТЦ - болезнь тяжелых цепей

ВА - волчаночный антикоагулянт

ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз

ВОК - внешняя оценка качества

ВПР - врожденные пороки развития

ВПЧ - вирус папилломы человека

ВС - водные стандарты

ВСК - время свертывания цельной крови

ВФ - внутренний фактор Касла

ВЦР - видеоцифровая регистрация

ВЭЖХ - высокоэффективная газовая хроматография

Г-6-ФД - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГАГ - гликозаминогликаны

ГАЛК - галактокиназа

ГАЛТ - галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза

ГАЛЭ - уридилдифосфогалактозо-4-эпимераза

ГГА - гипоталамо-гипофизарно-адреналовая

ГГТ - γ-глутамилтранспептидаза

ГЖХ - газово-жидкостная хроматография

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГнРГ - гонадолиберин

ГОЛ - галактозилоксилизин

ГСПГ - глобулин, связывающий половые гормоны

ГТТ - глюкозотолерантный тест

ГФА - гиперфенилаланинемия

ГХ - газовая хроматография

ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия

ГХ/ПИ - газовая хроматография/плазменная ионизация

ГЦР - гепатоцеллюлярный рак

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы

ДГЭА-С - дегидроэпиандростерон-сульфат

ДО₂ - доставка кислорода

ДПИД - дезоксипиридинолин

ДТ - детектор термоионный

ДТЗ - диффузно-токсический зоб

ДТП - детектор теплопроводности

ДУ - дискриминационный уровень

ДЭА - дегидроэпиандростерон

ДЭЗ - детектор по захвату электронов

ЖДА - железодефицитная анемия

ЖЖЭ - жидкость-жидкостная экстракция

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ЖХ-МС - жидкостная хроматография-масс-спектрометрия

ЖХВР - жидкостная хроматография высокого разрешения

ИАП - ингибитор активности плазминогена

ИБС - ишемическая болезнь сердца.

ИВЛ - искусственная вентиляция легких

ИГХ - иммуногистохимический

ИЛ - интерлейкин

ИМА - индекс множественных аномалий

ИМЛ - исследования по месту лечения

ИОХ - ионно-обменная хроматография

ИРТ - иммунореактивный трипсиноген

ИСН - индекс созревания нейтрофилов

ИСЭ - индекс созревания эритрокариоцитов

ИТЗ - индекс тератозооспермии

ИФ - иммунофлюоресценция

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста 1

ИХА - иммунохимический анализ

ИХЛ - иммунохемилюминесцентный анализ

КДЛ - клинико-диагностическая лаборатория

КК - креатинкиназа

КЛ - кардиолипин

КОД - коллоидно-осмотическое давление плазмы

КОЕ - колониеобразующие единицы

КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитопоэза

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица грануломоноцитопоэза

КОЕ-ГЭММ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-мегакариоцитарная

КОЕ-Э - колониеобразующие единицы эритроидного ряда

КОС - кислотно-основное состояние

КРР - колоректальный рак

КСФ - колониестимулирующий фактор

КТ - компьютерная томография

КТА - клинико-токсикологический анализ

КТППК 1 - карбокситерминальные пропептиды проколлагена I типа

КТР - копчико-теменной размер

КТТК 1 - карбокситерминальные телопептиды коллагена I типа

КФ - кислая фосфатаза

КЩФ - костный изофермент щелочной фосфатазы

ЛА - латекс-агглютинация

ЛБН - лизосомные болезни накопления

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛИС - лабораторная информационная система

ЛП - липопротеин

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

ЛУ - лимфатические узлы

МА - моноклональные антитела

МАО - моноаминооксидаза

МДС - миелодиспластический синдром

МИЧ - международный индекс чувствительности

МКРЛ - мелкоклеточный рак легких

ММП - матриксные металлопротеиназы

МНО - международное нормализованное соотношение

МОД - минутный объем дыхания

МПО - миелопероксидаза

МС - детектор масс-селективный

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НБО - наследственные болезни обмена веществ

НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

НО - нормализованное отношение

НСЕ - нейроспецифическая енолаза

НТЖ - насыщение трансферрина железом

НФХ - нормально-фазовая хроматография

НХЛ - неходжкинская лимфома

ОДН - острая дыхательная недостаточность

ОЖСС - общая железосвязывающая способность

ОИМ - острый инфаркт миокарда

ОК - остеокальцин

ОЛ - острый лейкоз

ОЛЖН - острая левожелудочковая недостаточность

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОМ - опухолевые маркеры

ОМЛ - острый миелолейкоз

ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения

ОП - оптическая плотность

ОПр - оксипролин

ОтП - отношение правдоподобия

ОПеН - острая печеночная недостаточность

ОПЖН - острая правожелудочковая недостаточность

ОПН - острая почечная недостаточность

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ОСН - острая сердечная недостаточность

ОФК - обращенно-фазовая хроматография

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПАБК - парааминобензойная кислота

ПАСК - парааминосалициловая кислота

ПВ - протромбиновое время

ПДТ - первичный документ теста

ПДФ - продукты деградации фибрина

ПДФ/ПДф - продукты деградации фибрина и фибриногена

ПИД - пиридинолин

ПНГ - пароксизмальная ночная гемоглобинурия

ПО - протромбиновое отношение

ПО₂ - потребление кислорода

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПОН - полиорганная недостаточность

ПрS - протеин S

ПРЛ - пролактин

ПСА - простатоспецифический антиген

ПСМА - простатоспецифический мембранный антиген

ПТГ - паратиреоидный гормон

ПФИА - поляризационный флюороиммунологический анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - рецептор андрогенов

РА - рефрактерная анемия

РАИБ - рефрактерная анемия с избытком бластов

РАКС - рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами

РГ - рецептор глюкокортикоидов

РДС - респираторный дистресс синдром

РИА - радиоизотопный анализ

РМЖ - рак молочной железы

РМП - рак мочевого пузыря

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП-плазма - референтная нормальная пулированная плазма

РП - рецептор прогестерона

РПГА - реакция прямой гемагглютинации

РПЖ - рак предстательной железы

РСК - реакция связывания комплемента

РТК - рак толстой кишки

РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы

РЦМД - рефрактерная цитопения с многоростковой дисплазией

РШМ - рак шейки матки

РЭ - рецептор эстрогенов

РЭА - раково-эмбриональный антиген

РЭС - ретикулоэндотелиальная система

РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста

РЯ - рак яичников

СД - сахарный диабет

СЖ - синовиальная жидкость

СЖК - свободные жирные кислоты

СИ - сердечный индекс

СКВ - системная красная волчанка

СКК - стволовые кроветворные клетки

СКФ - скорость клубочковой фильтрации

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

СРБ - С-реактивный белок

СТГ - соматотропный гормон

СЦК - средний цитохимический коэффициент

Т3 - трийодтиронин

Т4 - тироксин

ТБГ - трофобластический глобулин

ТВ - тромбиновое время

ТВП - толщина воротникового пространства

ТГ - тиреоглобулин

ТГ - триглицериды

ТКПБ - тонкоигольная капиллярная биопсия

ТЛМ - терапевтический лекарственный мониторинг

ТМБ - тетраметилбензидин

ТПО - тиреопероксидаза

Тр - тропонин

ТРГ - тиреотропин-рилизинг-гормон

ТСАt - тиреоид-стимулирующие антитела

ТСГ - тироксинсвязывающий глобулин

ТСИ - тиреоид-стимулирующий иммуноглобулин

ТСПА - тироксинсвязывающий преальбумин

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТТГ - тиреотропный гормон

ТТП - тромботическая тромбоцитопеническая пурпура

ТФР - трансформирующий фактор роста

ТЭСГ - тестостерон-эстрадиолсвязывающий белок

УЗИ - ультразвуковое исследование

УО₂ - утилизация кислорода

ФАБ-классификация - Франко-Американо-Британская классификация

ФВ - фактор фон Виллебранда

ФДК - фолликулярные дендритные клетки

ФИ - фосфатидилинозитол

ФК - фолиевая кислота

ФКУ - фенилкетонурия

ФМ - фибрин-мономеры

ФНО - фактор некроза опухоли

ФПИА - флюоресцентно-поляризационный иммуноанализ

ФС - фосфатидилсерин

ФСВОК - Федеральная система внешней оценки качества

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ФСК - фактор стволовых клеток

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ФЭУ - фотоэлектронные умножители

ХГАБ - холодовая гемагглютининовая болезнь

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз

ХМ - хиломикроны

ХМЛ - хронический миелолейкоз

ХММЛ - хронический миеломоноцитарный лейкоз

ХМПЗ - хронические миелопролиферативные заболевания

ХМС - хроматомасс-спектрометрия

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ХС-ЛПВП - холестерин липопротеидов высокой плотности

ХЭ - холинэстераза

ЦБ - центробласты

ЦВД - центральное венозное давление

ЦИМ - цитологическое исследование мокроты

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦНС - центральная нервная система

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

ЭПО - эритропоэтинэ

ЭПО - эндогенный эритропоэтин

β-ТГ - β-тромбоглобулин

Практическая деятельность врача любой специальности связана с потребностью в сведениях о состоянии процессов жизнедеятельности отдельных органов и тканей, а также организма пациента в целом. Уменьшить имеющуюся неопределенность призваны объективные методы исследования, которые активно внедряются в клиническую практику. Выполнение таких исследований, как правило, требует специального оборудования, профессиональной подготовки персонала, особой организации работы в учреждении здравоохранения. В настоящее время многочисленные виды объективных исследований консолидированы в три направления: лучевую (интраскопическую), функциональную и клиническую лабораторную диагностику. Последнюю все чаще определяют как лабораторную медицину, что, с одной стороны, подчеркивает масштаб и значимость этого направления в современной практике, с другой - очерчивает область исследований in vitro, включая микробиологические, токсикологические, генетические и другие виды исследований, выполняемые вне человека с материалами от него.

Предмет лабораторной медицины - получение и предоставление для клинического использования информации о составе (химическом и клеточном) биоматериалов и изменениях, доказательно связанных причинно-следственными взаимоотношениями с определенными патологическими процессами и состояниями в организме человека. Эта информация необходима для решения важнейших медицинских задач:

Лабораторная медицина открывает широкие возможности для точного и раннего обнаружения признаков патологических процессов и заболеваний, в ней используются качественные и количественные показатели, поддающиеся контролю. Ее методы доступны для большинства учреждений здравоохранения по финансовым и иным критериям. Лабораторные данные приобретают все большую значимость как доказательства при решении социальных и юридических вопросов. Общепризнан вклад лабораторной диагностики в развитие доказательности в медицине. Неотъемлема роль современной лаборатории в обеспечении высоких медицинских технологий, внедрение которых принято как часть программы модернизации здравоохранения России.

В настоящее время лабораторная информация используется при принятии до 70% медицинских решений практически во всех клинических дисциплинах. Лабораторные исследования включены в программу диспансеризации, в стандарты медицинской помощи при большинстве форм патологии. Высокая востребованность лабораторных исследований демонстрируется ежегодным приростом их количества по стране. Согласно статистическим данным Минздравсоцразвития Российской Федерации, только лаборатории учреждений здравоохранения министерского подчинения (без ведомственных, частных) в течение года выполняют свыше 3 млрд анализов. На одного больного в стационаре в 2008 г. приходилось в среднем 38,9 анализа, на 100 амбулаторных посещений - 122 анализа. Лабораторные исследования составляют 89,3% общего количества объективных диагностических исследований. Анализ отчетов по регионам однозначно свидетельствует о росте количества исследований и увеличении технологичных исследований. В ведомственных учреждениях здравоохранения обеспечение анализами пациентов заметно выше, чем в среднем по стране. Это, а также быстрый рост объема исследований, выполняемых в коммерческих лабораториях, позволяет говорить о неполном удовлетворении реальной потребности в данном виде медицинских услуг, причем как специализированных, так и массовых рутинных.

Лабораторная информация основана на обнаружении и/или измерении в образцах биоматериалов определенных компонентов (аналитов), которые функционально или структурно связаны с нарушенной функцией или с пораженным органом, отражают наличие патологического процесса и характеризуют его причину, механизмы развития, выраженность и индивидуальную картину заболевания. Для обеспечения ценности получаемой информации лабораторная медицина решает следующие задачи:

При решении этих задач лабораторная медицина:

Соответственно в рамках лабораторной медицины можно выделить патобиологию как ее теоретическую основу, лабораторную (клиническую) аналитику - как совокупность средств и способов выполнения исследований и собственно клинико-лабораторную диагностику - как совокупность доказательств информативности лабораторных показателей для конкретных медицинских задач. Эти три раздела гармонично связаны между собой, причем не только в масштабах отрасли знаний, но и в рамках практической деятельности конкретных лабораторий и учреждений, что реализуется через соответствующую профессиональную подготовку кадров (знания и компетенции), техническое и материальное оснащение, а также анализ клинического материала.

Лабораторная медицина - медицинская специальность, в которой как никакой другой активно используют достижения фундаментальных наук для клинической медицины, способствуя применению фундаментальных разработок в практическом здравоохранении.

Биоматериалы человека (биологические жидкости, ткани и экскреты) представляют собой сложные системы - смеси различных веществ и клеток. Эндогенные компоненты биоматериалов, играя определенную функциональную роль, изменяются при нарушениях физиологических процессов под воздействием на организм патогенных факторов, а также в ходе формирования защитных и компенсаторных реакций. Именно поэтому исследование эндогенных компонентов может способствовать выявлению или подтверждению наличия патологических процессов, установлению их характера. Что касается экзогенных компонентов биоматериалов (бактерий, вирусов, грибов, паразитарных организмов и продуктов их жизнедеятельности), то они обычно играют причинную роль в развитии патологических процессов.

В аналитике компоненты системы подразделяют на аналиты, конкомитанты и растворители; последние два вида компонентов обозначают как матрицу. Аналит - компонент пробы, указанный в названии исследуемого свойства или измеряемой величины.

В клинической лабораторной диагностике аналитами могут быть (табл. 1-1):

Таблица 1-1. Виды эналитов - объектов клинических лабораторных исследований

Соответственно характеру и свойствам исследуемых аналитов и особенностям применяемых аналитических процедур клинические лабораторные исследования подразделяются на химико-микроскопические, биохимические, гематологические, коагулологические, иммунологические, изосерологические, цитологические, генетические, молекулярно-биологические, бактериологические, вирусологические, паразитологические, микологические, токсикологические, лекарственный мониторинг. Номенклатура клинических лабораторных исследований постоянно пополняется соответственно развитию медицинской науки.

Клинические лабораторные исследования выполняются с применением аналитических технологий (методов исследования). Клинико-лабораторная аналитическая технология основана на взаимодействии используемых для анализа физических, химических или биологических факторов с искомым аналитом (табл. 1-2), что приводит к генерации сигнала, который регистрируется измерительным прибором. Методика лабораторного анализа проб биоматериалов включает следующие процедуры:

Таблица 1-2. Основные принципы аналитических технологий, применяемых в клинической лабораторной аналитике

В процессе лабораторного исследования применяют изделия для диагностики in vitro, предназначенные для выполнения определенных процедур:

В настоящее время разработаны и широко применяют полуавтоматические и автоматические устройства, называемые автоанализаторами. Различные конструктивные варианты этих устройств предусматривают выполнение в одном приборе препаративных, дозировочных и измерительных процедур, сопоставления результатов с референтными пределами, встроенного контроля качества, выдачи результатов исследований в обработанном виде.

Другое направление развития средств лабораторного анализа представляют медицинские изделия для самотестирования и исследований in vitro вне лаборатории - портативные аналитические устройства, предназначенные для выполнения определенных исследований образцов биологических материалов человека вне лаборатории, в том числе самим пациентом.

Лабораторные исследования проводятся специально организованными и оснащенными подразделениями медицинских организаций - клинико-диагностическими лабораториями. Заказчиком исследований является лечащий врач или врач, организующий диспансерное обследование. Именно врач определяет круг исследований и организует сбор и взятие биоматериала. Ответственность за соблюдение правил подготовки больного к исследованию, правил взятия, хранения и доставки материала в лабораторию несет персонал клинических подразделений, за исключением случаев взятия крови из пальца. На основе применения разнообразных средств лабораторного анализа сложились три формы организации лабораторного обеспечения медицинской помощи.

Традиционная форма, которую можно назвать локальной, возникла с началом существования лабораторной медицины как самостоятельной сферы медицинской деятельности. Многое из достигнутого лабораторной медициной было получено в лабораториях больниц и поликлиник. Лаборатории изначально создавались как одно из диагностических подразделений медицинского учреждения, что дало право рассматривать лабораторную диагностику как клиническую дисциплину. Такое положение лаборатории в составе учреждения позволяет ее работникам не только выполнять лабораторные исследования, но и участвовать во всем лечебно-диагностическом процессе, дает им возможность как реализовывать и совершенствовать свои медицинские знания, так и влиять на оказание медицинской помощи пациентам. Такая связь способствует организации лабораторного обследования в интересах решения клинических задач и более глубокой интерпретации лабораторных результатов применительно к каждому случаю заболевания. Лаборатории функционируют в составе примерно 80% государственных и муниципальных учреждений здравоохранения страны (табл. 1-3) в соответствии с положением, утвержденным Министерством здравоохранения и социального развития РФ.

Таблица 1-3. Количество лабораторий учреждений здравоохранения России в 2008 г.

В лабораториях трудятся специалисты с высшим и средним специальным образованием (табл. 1-4), профессиональная подготовка которых осуществляется в установленном порядке в соответствии с образовательными стандартами, а должностные обязанности определены положениями, утвержденными Министерством здравоохранения и социального развития РФ.

Таблица 1-4. Персонал государственных клинико-диагностических лабораторий (по данным за 2002 г.)

Клинико-диагностические лаборатории выполняют широкий круг лабораторных тестов (табл. 1-5) в соответствии с номенклатурой, утвержденной федеральным органом исполнительной власти в сфере здравоохранения. Перечень исследований, выполняемых в конкретной лаборатории, должен соответствовать лицензионному уровню учреждения, утверждается главным врачом и обеспечивается материально-техническими ресурсами.

Таблица 1-5. Количество анализов, выполняемых в государственных клинико-диагностических лабораториях (по данным за 2008 г.)

Удаленная форма лабораторного обеспечения развивается на основе централизованного выполнения наиболее сложных видов лабораторных исследований и внедрения автоматизированных аналитических систем. Положительные стороны работы крупных автоматизированных лабораторий: значительное повышение производительности, повышение качества результатов, сокращение удельной стоимости анализов за счет их выполнения в больших сериях. Однако при этом нельзя не видеть ослабления связи лабораторного персонала с процессом оказания медицинской помощи конкретному больному, тенденцию к превращению централизованных лабораторий в «фабрики лабораторных анализов», к углублению разрыва между достижениями аналитики и их освоением в клинической практике.

Мобильная форма лабораторного обеспечения медицинской помощи получила распространение за счет разработки, производства и использования портативных аналитических устройств, свойства которых позволяют их применение по месту лечения пациента или оказания неотложной помощи нелабораторным персоналом, а также самими пациентами на дому (табл. 1-6).

Таблица 1-6. Основные принципы аналитических технологий, используемые в средствах анализа вне лаборатории

Несомненный выигрыш при таком способе выполнения лабораторных исследований - резкое сокращение сроков получения лабораторной информации клиницистами. Лабораторное исследование становится частью непосредственного оказания помощи пациенту. Однако при проведении таких исследований необходимо сохранять контроль со стороны традиционных стационарных лабораторий для обеспечения качества и надежности результатов (ГОСТ Р ИСО 22870 «Исследования по месту лечения. Требования к качеству и компетентности»).

Информация о состоянии внутренней среды пациента, получаемая в результате клинических лабораторных исследований, имеет реальную клиническую ценность только при условии ее предоставления в сроки, позволяющие принять необходимые лечебные меры. В зависимости от характера и темпа патологического процесса, от цели назначения лабораторного теста потребность в лабораторной информации может быть:

Требования к своевременности получения лабораторной информации должны определяться протоколом диагностики и лечения соответствующей болезни с учетом аналитических возможностей и организации лабораторного обеспечения в данной медицинской организации. Форма обеспечения лабораторных исследований (табл. 1-7) в медицинской организации (выполнение анализов в лаборатории учреждения, централизованной лаборатории, экспресс-лаборатории, лаборатории приемного отделения или «по месту лечения») должна удовлетворять клиническим потребностям диагностики и лечения больных в данном учреждении в соответствии с его медицинским профилем.

Таблица 1-7. Формы лабораторного обеспечения в медицинских организациях различной мощности

Сроки получения результатов лабораторных анализов клиницистом, заказавшим исследования, обозначаются периодом оборота лабораторного теста и зависят от следующих факторов:

В зависимости от мощности учреждения здравоохранения предусмотрена различная организация его лабораторного обеспечения: численность и уровень подготовки лабораторного персонала, оснащение лабораторным оборудованием, объем исследований, выполняемых непосредственно в учреждении, и т.д. Поскольку аналитические возможности части учреждений не охватывают всего спектра анализов, которые могут оказаться необходимыми пациенту, предусмотрена возможность выполнения таких анализов в более крупных лабораториях.

На основе учета факторов, влияющих на сроки получения результата лабораторного исследования, в медицинском учреждении разрабатываются требования к срокам выполнения лабораторных исследований, результаты которых имеют жизненно важное значение для пациентов, находящихся в критических состояниях. Такие требования должны содержать:

Таблица 1-8. Перечень исследований, результаты которых имеют жизненно важное значение для пациентов в критических ситуациях, с указанием срока выполнения теста

Соблюдение сроков выполнения неотложных исследований подлежит строгому контролю со стороны руководства медицинской организации. Порядок и сроки выполнения исследований, потребность в результатах которых является систематической и плановой, определяются руководством медицинской организации и закрепляются соответствующим внутренним распорядительным документом.

Содержание деятельности клинико-диагностических лабораторий определяется рядом распорядительных и нормативных документов. Общий перечень лабораторных тестов содержится в периодически обновляемой «Номенклатуре лабораторных исследований» (табл. 1-9).

Таблица 1-9. Количество тестов в «Номенклатуре клинических лабораторных исследований»

Примечание . Не приведено количество микробиологических тестов, поскольку для идентификации одного и того же микроорганизма необходимо выполнить несколько исследований (культуральных, биохимических, микроскопических).

В 2004 г. Минздравсоцразвития РФ утвердил реестр медицинских услуг, в котором приведено значительное количество лабораторных тестов. Этот реестр использован при разработке в 2005-2007 гг. и в новой редакции 2010 г. стандартов медицинской помощи при различных формах патологии.

Стандарты медицинской помощи представляют собой перечни диагностических и лечебных услуг (включая лабораторные услуги), признанных ведущими специалистами соответствующей отрасли медицины минимально необходимыми и достаточными для оказания медицинской помощи пациенту при определенной форме патологии в ее типичных вариантах. Стандартам медицинской помощи придано значение официальных документов. Каждый из них утверждается приказом Минздравсоцразвития Российской Федерации. Они имеют единую структуру, включающую характеристику модели пациента, формы оказания медицинской помощи и таблицы медицинских услуг в периоды диагностики и лечения болезни. Стандарт медицинской помощи является государственным документом, в котором федеральный орган исполнительной власти в сфере здравоохранения формулирует перечень медицинских услуг, необходимых для оказания медицинской помощи при определенной форме патологии. Другими словами, стандарт представляет собой форму конкретизации прав гражданина на оказание помощи при определенном заболевании, что гарантировано Конституцией Российской Федерации и Основами законодательства Российской Федерации по охране здоровья граждан. Наряду с этим стандарты медицинской помощи являются для Фонда обязательного медицинского страхования обоснованием минимально необходимого объема медицинских услуг, оплачиваемых из средств Фонда.

Введение коэффициентов частоты предоставления отдельных услуг дает учреждениям здравоохранения свободу для маневра, необходимость которого может быть продиктована медицинскими, организационными и экономическими условиями оказания медицинской помощи. Например, известно явление биологической вариации: в зависимости от влияния многих факторов - генетических, экологических, образа жизни - разные люди по-разному реагируют на один и тот же болезнетворный агент. Некоторые случаи заболевания могут требовать более широкого, чем указано в стандарте, перечня медицинских услуг как для точного установления диагноза болезни и состояния пациента, так и для успешного лечения. Такие случаи требуют согласованных мер со стороны лечебно-диагностических подразделений и организационно-финансового руководства учреждения. С другой стороны, не оправданные клиническими потребностями услуги не должны оказываться, потому что они не могут принести ни необходимой информации, ни реальной пользы больному.

Обеспечение медицинской помощи в полном объеме, предусмотренном федеральным стандартом, является целью, к которой обязаны стремиться служба здравоохранения каждого региона и каждое медицинское учреждение. Существенным шагом в этом направлении стало выполнение Национального проекта «Здоровье», в рамках которого учреждения здравоохранения были оснащены большим количеством разнообразного медицинского оборудования.

При всем разнообразии практических форм лабораторного обеспечения медицинской помощи, определяемых конкретными условиями в данном медицинском учреждении, существуют общие принципы организации деятельности лабораторных структур, поставляющих клинически важную информацию о состоянии внутренней среды пациентов. Эти принципы сформулированы в международных и национальных стандартах. Стандарт ГОСТ Р ИСО 15189 «Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности» устанавливает основные требования к системе менеджмента качества и технические требования ко всем сторонам деятельности клинико-диагностических лабораторий.

Стандарт ГОСТ Р ИСО 15189 включает следующие разделы.

Из приведенного перечня разделов стандарта следует, что он затрагивает все ключевые стороны организации работы клинико-диагностических лабораторий (КДЛ). Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития рассматривает положения ГОСТ Р ИСО 15189 как основу тех требований, которые должны предъявляться при добровольной сертификации процессов выполнения лабораторных исследований. Способствовать внедрению положений этого основополагающего нормативного документа в отечественную лабораторную практику призваны материалы стандарта ГОСТ Р ИСО 22869.

Стандарт ГОСТ Р 52905-2007 (ИСО 15190-2003) «Лаборатории медицинские. Требования безопасности» содержит комплекс требований к обеспечению в деятельности лабораторий мер безопасности по отношению ко всем видам опасности, начиная с биологической.

Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии утверждены национальные стандарты РФ по медицинским лабораторным технологиям. Положения этих стандартов коррелируют с основными положениями ГОСТ Р ИСО 15189 и конкретизируют применение его требований к различным сторонам процесса клинического лабораторного исследования.

Ряд положений этих стандартов рассмотрен в главе «Обеспечение и контроль качества клинических лабораторных исследований».

Для управления лабораторным процессом и разработки мероприятий по развитию лабораторий могут быть применены критерии эффективности, основанные на положениях вышеупомянутых стандартов. Несмотря на существенные различия в масштабах, оснащенности, обеспеченности кадрами и в других параметрах отдельных лабораторий, критерии для них универсальны.

Соответствие каждому из критериев зависит от успешности решения задач по контролю влияющих факторов, главным образом от профессионального уровня кадров, особенно специалистов клинической лабораторной диагностики.

Меньшиков В.В. Исследования вне лаборатории. Средства, технологии, условия применения. - М.: Агат-Мед, 2008.

Кишкун А.А., Гузовский А.Л. Лабораторные информационные системы и экономические аспекты деятельности лаборатории. - М.: Лабора, 2007.

Сущность лабораторного исследования - анализ пробы биоматериала, взятой у пациента, с целью обнаружить или измерить содержание в ней компонентов, имеющих доказанную причинно-следственную связь с предполагаемым патологическим процессом. Информация о данных компонентах, представленная в описательной или количественной форме, составляет результат проведенного исследования. Потребителю (назначившему данное исследование врачу или заказавшему анализ пациенту) важно, чтобы представленная информация обладала следующими свойствами:

Лабораторное исследование можно рассматривать как процесс, имеющий вход и выход. Продукт на выходе данного процесса - информация об исследованных аналитах. Характер входа зависит от точки отсчета. Ранее за вход в процесс исследования принимали поступление образца биоматериал в лабораторию и начало собственно аналитических процедур. Однако со временем стало ясно, что для качества лабораторной информации крайне важны этапы, которые предшествуют поступлению исследуемого образца в лабораторию, начиная с момента назначения исследования врачом.

Согласно современной концепции, в процессе клинического лабораторного исследования выделяют три этапа:

Преаналитический этап включает:

На результаты лабораторных исследований могут влиять следующие факторы преаналитического этапа:

Аналитический этап включает комплекс необходимых для выполнения исследования аналитических процедур, объединяемых методикой исследования и завершающихся получением результата в числовой или описательной форме в зависимости от вида и метода исследования. Основные процедуры методик клинических лабораторных исследований заключаются в создании условий для выделения аналита из многообразия других компонентов биоматериала, идентификации аналита на основе детекции его специфических свойств и (в некоторых случаях) в количественной оценке его содержания. В процессе лабораторного исследования используют химические или биологические реагенты, которые избирательно взаимодействуют с аналитом, преобразуя его в ту форму, которая генерирует соответствующий сигнал и позволяет осуществить его идентификацию, детекцию или измерение. Принцип исследования и детали аналитических процедур зависят от особенностей состава, структуры и свойств определяемого аналита. Регистрация результата анализа осуществляется на основе субъективной (визуальной) или объективной (приборной) оценки.

В рамках аналитического этапа клинического лабораторного исследования на его результат оказывают влияние условия выполнения анализа и компоненты аналитической системы:

Выполнение исследований клиническим персоналом вне лаборатории с применением портативных аналитических устройств требует систематического контроля со стороны компетентного лабораторного персонала за качеством выполнения внелабораторных процедур с помощью обучения клинического персонала правилам выполнения исследований средствами анализа по месту лечения, способам контроля качества и сопоставления результатов исследований, выполненных вне лаборатории, с лабораторными результатами.

Постаналитический этап включает:

Обязательное условие правильного использования лабораторной информации в клинической диагностике - обоснованная интерпретация результатов исследований с учетом влияния биохимических и физиологических механизмов.

При интерпретации результатов лабораторного исследования должны быть приняты во внимание следующие физиологические и метаболические аспекты:

При оценке возможных механизмов отклонения результатов лабораторных исследований от параметров, свойственных состоянию здоровья, следует учитывать влияние патологических факторов:

На постаналитическом этапе отрицательное влияние на использование лабораторных результатов в клинических целях могут оказать:

Сравнительная частота ошибок, вызванных факторами различных этапов лабораторного исследования, приведена в табл. 2-1.

Таблица 2-1. Сравнительная частота лабораторных ошибок, вызванных факторами различных этапов клинического лабораторного исследования (P. Boninietal., 2002)

При неточности лабораторных данных риск клинических затруднений достигает 26-30%, а риск неоправданных действий врача составляет 7-12%.

Следовательно, важное условие обеспечения качества клинических лабораторных исследований - учет всех факторов, способных оказать влияние на содержание изучаемых аналитов в организме пациента, содержание аналита в образце биоматериала, организацию собственно аналитического процесса и на интерпретацию полученного результата. С этой целью разработаны индикаторы качества для всех этапов исследования, систематическое использование которых позволяет отслеживать и предотвращать влияние факторов, способных извратить результаты и вызвать неправильные действия врача.

Современные представления о способах обеспечения качества любого процесса выражены в понятиях системы менеджмента качества.

Менеджмент - скоординированная деятельность по руководству и управлению процессом.

Менеджмент качества - скоординированная деятельность по руководству и управлению процессом применительно к качеству, которая обычно включает разработку политики в области качества, планирование качества, управление качеством, обеспечение качества и улучшение качества.

Система менеджмента - система для разработки политики и целей и достижения данных целей.

Система менеджмента качества - система менеджмента для руководства и управления организацией применительно к качеству.

На рис. 2-1 представлена схема системы менеджмента качества

Система менеджмента качества применительно к деятельности клинико-диагностических лабораторий установлена в стандарте ГОСТ Р ИСО 15189 «Лаборатории медицинские. Требования к качеству и компетентности».

Аналитическая надежность клинических лабораторных исследований характеризуется свойствами методов, с помощью которых их выполняют:

Целевой параметр аналитической надежности клинических лабораторных исследований - их способность достоверно разграничивать свойственные состояниям здоровья и патологии значения содержания определенных аналитов в составе биоматериалов. При дифференциации результатов лабораторных исследований, характерных для состояния здоровья или патологии, следует учитывать, что данные исследований проб биоматериалов отражают содержание искомых веществ или клеток в организме обследуемого с некоторой степенью неопределенности, т.е. с дисперсией численных значений. Именно поэтому для выявления патологических отклонений (патологической вариации) они должны быть дифференцированы от колебаний результатов, вызванных другими причинами (табл. 2-2).

Таблица 2-2. Вариации лабораторных результатов, вызванные непатологическими факторами

Для уверенного выявления отклонений, обусловленных патологией и называемых патологической вариацией, они должны быть дифференцированы от аналитической вариации.

Биологическая вариация - основной фактор неопределенности лабораторных результатов, который по своему характеру принципиально отличается от аналитической вариации. Другими словами, изменения состава биоматериалов человека, отражающие протекание в организме процессов жизнедеятельности, характеризуются сочетанием устойчивости в определенных рамках постоянства внутренней среды (гомеостаза) и динамических колебаний вокруг точки гомеостаза. Персональная биологическая вариация отражает колебания проявлений физиологических функций вокруг гомеостатических точек у обследуемого. Межиндивидуальная, или групповая, биологическая вариация, подчиняющаяся статистическим закономерностям, представляет собой интервалы колебаний гомеостатических точек групп людей, объединенных по определенному признаку (полу, возрасту, этнической или профессиональной принадлежности).

Преаналитическая вариация - проявления биологической вариации, отражающие реакцию организма на различные факторы внешней среды, условия подготовки обследуемого к лабораторному тесту и на взятие образца биоматериала. Ятрогенная вариация отражает различного рода диагностические и лечебные воздействия на пациента перед проведением лабораторного теста.

Влияние преаналитических и ятрогенных факторов вариации может быть минимизировано или точно охарактеризовано с помощью стандартизованных правил ведения преаналитического этапа клинических лабораторных исследований (ГОСТ Р 53079.4 «Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований». Часть 4. Ведение преаналитического этапа). Степень влияния аналитической вариации может быть охарактеризована и сведена до допустимого уровня при выборе методов исследования компонентов с проверенной аналитической надежностью (точностью, чувствительностью, специфичностью) [ГОСТ Р 53022.2 «Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований». Часть 2. Правила оценки аналитической надежности методов исследования (точности, чувствительности, специфичности)], соблюдении правил внутрилабораторного контроля качества методов клинических лабораторных исследований (ГОСТ Р 53133.2 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований». Часть 2. Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов) и применении пределов погрешностей измерений в клинико-диагностических лабораториях (ГОСТ Р 53133.1 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований». Часть 1. Пределы допустимых погрешностей результатов измерения аналитов в клинико-диагностических лабораториях).

В качестве основы для оценки точности различения патологической и аналитической вариаций и для установления единых требований применительно к каждому аналиту принято имеющее естественную фундаментальную основу свойство состава биоматериалов человека - биологическая вариация в различных комбинациях ее компонентов, внутрииндивидуальной и межиндивидуальной.

Точность (правильность и прецизионность) количественных клинических лабораторных исследований (измерений), как и любых измерений, характеризуется размерами случайной и систематической погрешности результатов. Разработка объективно обоснованных требований к точности клинических лабораторных исследований заключается в установлении предельно допустимых значений аналитических погрешностей количественных методов исследований (измерений) физических величин (состава и свойств компонентов биологических материалов) в образцах биологических материалов, взятых у пациентов. В соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 при оценке точности измерений каждый результат измерений рассматривают как сумму трех составляющих:

у = m ± B ± е, (1)

где у - результат измерения; m - общее среднее значение (математическое ожидание); B - лабораторная составляющая систематической погрешности в условиях повторяемости; е - случайная составляющая погрешности каждого результата измерения в условиях повторяемости.

Общее среднее значение совокупности результатов измерений или принятое опорное значение используются в условиях, когда истинное значение измеряемой физической величины (эталонное значение измеряемой величины в узаконенных единицах) не может быть установлено из-за отсутствия необходимого эталона. Оно может быть получено как теоретическое или установленное значение, основанное на научных принципах, или как приписанное (согласованное) или аттестованное значение, основанное на экспериментальных работах, согласно ГОСТ 8.315-91, а также как среднее значение заданной совокупности результатов измерений. Систематическая погрешность (разность между математическим ожиданием результатов измерений и истинным или принятым опорным значением) характеризует правильность измерений, т.е. степень близости результата к истинному значению измеряемой величины, а на практике - к принятому опорному значению. Лабораторная составляющая систематической погрешности (смещение) при использовании конкретного метода измерений в реальных условиях измерений в клинико-диагностической лаборатории относится к общему среднему результату или к установленному, аттестованному значению.

Случайная составляющая погрешности результата измерения характеризуется прецизионностью - степенью близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных регламентированных условиях. Она не имеет отношения к истинному или установленному, аттестованному значению измеряемой величины.

Для количественных методов исследований разрабатываются требования к характеристикам повторяемости и прецизионности, отражающим размер случайной погрешности, проявляющейся в дисперсии результатов однородных измерений и выражаемой среднеквадратичным отклонением, или коэффициентом, вариации. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 устанавливает значения неопределенностей оценок стандартных отклонений прецизионности (сходимости и воспроизводимости) и систематической погрешности метода измерений и его реализации в данной лаборатории, которые приводятся в таблицах указанного стандарта.

При расчете базового (желательного) уровня математически ожидаемого значения случайной аналитической погрешности (при бесконечно большом количестве измерений) исходят из того, что предельно допустимая аналитическая погрешность, характеризуемая коэффициентом вариации, должна составлять:

CV_A <0,5 × CV_i, (2)

где CV_A - коэффициент аналитической вариации; CV_i - коэффициент биологической внутрииндивидуальной вариации.

Коэффициент вариации результатов исследований не должен превышать 50% показателя внутрииндивидуальной вариации.

Требования к правильности, т.е. степени отклонения определяемого значения величины от его истинного значения, основаны на расчете математически ожидаемого (при бесконечно большом количестве исследований) значения систематической аналитической погрешности (Bias - В). При расчете базового (желательного) уровня требований к правильности исследований исходят из того, что предельная допустимая систематическая аналитическая погрешность, характеризуемая относительным аналитическим смещением, должна составлять:

В (%) <0,25× [(CV_i)² +(CV_G)²]^(1/2), (3)

где В (%) - относительное аналитическое смещение; CV_i - коэффициент биологической внутрииндивидуальной вариации; CV_G - коэффициент биологической межиндивидуальной (групповой) вариации.

Рассчитанные на основании данных зависимостей значения предельных допустимых погрешностей представляют базовый (желательный) уровень требований к точности лабораторных исследований. Реальные аналитические возможности методов исследований ряда аналитов и характеристики точности доступных измерительных приборов в одних случаях не позволяют обеспечить базовый уровень точности результатов клинических лабораторных исследований. В иных случаях вотношении других аналитов базовый уровень точности легко превышается. Исходя из этого во многих случаях в действующих нормативных документах допускается использование дифференцированных, биологически обоснованных критериев прецизионности и правильности исследований с применением коэффициентов, повышающих или понижающих уровень требований аналитической точности.

При повышенном (оптимальном) уровне точности применяют коэффициент 0,25 (вместо 0,5) для расчета общей аналитической вариации и коэффициент 0,125 (вместо 0,25) - для относительного аналитического смещения [см. уравнения (1) и (2)]. При пониженном (минимальном) уровне точности используют коэффициент 0,75 (вместо 0,5) для расчета общей аналитической вариации и коэффициент 0,375 (вместо 0,25) - для относительного аналитического смещения.

Требования к аналитической точности следует устанавливать с учетом клинических потребностей. Принимая во внимание особенности требований к правильности результатов исследований, предназначенных для целей диагностики, и их прецизионности при мониторинге течения заболеваний, рекомендуют варианты расчетов предельных допустимых значений погрешностей.

Для диагностических целей предельные значения систематической погрешности клинико-лабораторных измерений должны соответствовать неравенству:

В <0,25×[(СV_I)²+(CV_G)²]^(1/2), (4)

а предельные значения случайной погрешности - неравенству:

СVА<0,58×[(СV_I)²+(CV_G)²]^(1/2), (5)

При исследованиях, предназначенных для целей мониторинга заболеваний, предельное значение систематической погрешности (∆SE) должно соответствовать неравенству:

∆SE<0,33×СV_I, (6)

а предельное значение случайной погрешности (СV_А) - неравенству:

СV_А <0,5×СV_I, (7)

Допустимая разница результатов между двумя методами, используемыми для исследования одной и той же величины в одной лаборатории (например, в отделении реанимации и интенсивной терапии и в центральной КДЛ), не должна превышать ¹/₃ размера внутрииндивидуальной вариации для данного аналита (допускаемая разница <¹/₃ СV_I).

Требования по качеству при исследовании лекарственных препаратов в процессе лекарственного терапевтического мониторинга с использованием простой теории фармакокинетики должны соответствовать неравенству:

СV_А (%)<0,25×[(2^(T/t)-1)/(2^(T/t)+1)]×100, (8)

где T - интервал между введением доз препарата; t - период полураспада препарата.

Контроль качества аналитического этапа клинических лабораторных исследований осуществляется в двух взаимодополняющих формах - внутрилабораторном контроле и внешней оценке качества.

Комплексная система контроля качества клинических лабораторных исследований осуществляется с помощью:

Наличие системы внутрилабораторного контроля качества - условие получения достоверной аналитической информации. Организация и обеспечение внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований - обязанность заведующего лабораторией или сотрудника, ответственного за обеспечение качества лабораторных исследований. Внутрилабораторный контроль качества клинических лабораторных исследований выполняют сотрудники каждой КДЛ в целях поддержания стабильности аналитической системы. Внутрилабораторный контроль качества обязателен в отношении всех видов количественных исследований, выполняемых в лаборатории, для которых разработаны контрольные материалы. Если для количественного метода контрольные материалы недоступны, рекомендуют другие способы контроля качества с использованием проб пациентов - метод оценки воспроизводимости измерений аналита по дубликатам и ежедневным средним значениям.

Статистическая основа оценки погрешностей при внутрилабораторном контроле качества количественных методов лабораторных исследований - допущение, что частотные распределения результатов многократного измерения одного и того же контрольного материала одним и тем же аналитическим методом имеют вид нормального распределения. Для оценки случайных и систематических погрешностей измерения используют статистические характеристики нормального распределения.

Среднеарифметическое значение (X):

(9)

где x_i - результат i-го измерения из n выполненных; n - количество измерений; - сумма результатов измерений x₁, x₂ …​ x_n.

Среднеквадратичное отклонение (S):

где - сумма квадратов отклонений результатов измерений x₁, x₂ …​x_n от X.

Коэффициент вариации (CV):

(11)

Среднеквадратичное отклонение (S) и коэффициент вариации (CV) характеризуются случайными погрешностями и используются для оценки повторяемости и прецизионности измерений.

Среднеарифметическое значение (X) используется при расчете смещения (B) в установочной серии измерений. Смещение (B) определяется близостью среднеарифметического значения результатов установочной серии измерений контрольного материала (X) к аттестованному значению (АЗ) измеряемой величины и может быть выражено в абсолютных или относительных величинах.

Относительная систематическая погрешность или смещение (B) рассчитывается по формуле:

(12)

В полученном результате обязательно указывается знак числа (+/-).

Выявление недопустимых случайных погрешностей выполняют с помощью оценки повторяемости и прецизионности результатов измерения аналитов в контрольном материале (по результатам установочной серии измерений), а систематических погрешностей - с помощью оценки относительного смещения.

Систематическое выполнение процедур оперативного контроля качества позволяет на основании контрольных правил и установленных контрольных пределов для каждого аналита выявить недопустимые погрешности и провести работу по их устранению.

Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества для каждой выполняемой в лаборатории количественной методики исследования состоит из трех последовательных стадий:

После выполнения 10 аналитических серий из 10 полученных результатов измерения для каждого контрольного материала следует рассчитать значения CV₁₀ и B₁₀ и сравнить с предельно допустимыми пределами. Если полученные значения CV₁₀ и B₁₀ превышают допустимые, выявляют источники погрешностей и проводят работу по их устранению, затем измерения повторяют. Если полученные значения не превышают установленных норм, выполняют следующие 10 аналитических серий.

Указанный расчет по 10 измерениям аналита в контрольных материалах следует проводить для предварительной оценки погрешностей в установочной серии измерений (табл. 2-3).

Таблица 2-3. Последовательность процедур при ведении внутрилабораторного контроля качества (установочная серия измерений)

Время последовательных измерений

Рис. 2-2. Пример контрольной карты

Контрольное правило включает контрольный предел (Χ±1S, Χ±2S, Χ±3S) и количество контрольных измерений в аналитической серии. Контрольные правила обозначаются символами типа A_L, где А - количество контрольных результатов; L - контрольный предел.

Рис. 2-3. Пример неудовлетворительного результата измерения. Одно значение находится вне области доверительного интервала результата лаборатории

Аналитическая чувствительность исследования - способность метода выявлять наименьшее различие между двумя концентрациями анализируемого компонента. Она характеризуется степенью зависимости изменения значения результата от сигнала, который должен быть измерен, и измеряется отношением разницы измеренных значений к единице концентрации анализируемого компонента. Аналитическая чувствительность также может быть количественно выражена наклоном точного калибровочного графика и отношением прироста значений измерения на единицу анализируемого компонента в диапазоне линейности калибровочного графика. Линейность метода представлена интервалом значений, в котором ожидаемое и действительное значение различаются случайным образом.

Нижний предел чувствительности метода характеризуется концентрацией вещества или активностью аналита в отдельной индивидуальной пробе, при которой исследуемая проба может быть дифференцирована с высокой степенью вероятности от холостой пробы.

Количественным выражением нижнего предела чувствительности может быть значение измерения холостой пробы по формуле:

Χ_пр =Χ+3S, (13)

где Χ_пр - предельная величина нижнего порога концентрации вещества или активности аналита; Χ - значение измерения холостой пробы; S - среднеквадратичное отклонение для серии из 20 измерений.

Диапазон измерения метода - интервал значений измерений от нижнего предела чувствительности на протяжении всего линейного участка калибровочного графика.

При клинических лабораторных исследованиях анализ исследуемого (искомого) компонента осуществляется в образце биологического материала, представляющем собой сложную смесь веществ и клеток.

Аналитическая специфичность метода - способность метода обнаруживать только искомый компонент. Аналитическая специфичность по отношению к анализируемой величине (компоненту биоматериала) оценивается по степени влияния различных примесей или матрицы биоматериала на результат анализа. Для проверки специфичности метода используют примеси, которые могут служить источником аналитической погрешности. В области верхней и нижней калибровочных точек для исследуемого компонента проводят сравнение между должным и действительным значением исследуемого компонента при различных концентрациях примесей. В качестве сравнительного интервала в верхней и нижней трети диапазона используют соответствующее значение среднеквадратичного отклонения в серии, умноженное на коэффициент 2,1 для 95% доверительного интервала или 2,88 - для 99% доверительного интервала. Превышение абсолютного значения разницы между должным и действительным значением анализируемого компонента характеризуется воздействием данной концентрации примеси на аналитическую специфичность метода исследования.

Для полуколичественных методов оценка прецизионности может быть выражена как пропорция ожидаемых результатов по принятой их классификации - «отрицательные», «1+», «2+», «3+». Данные пропорции имеют 95% доверительный интервал, рассчитываемый на основе статистических таблиц. При сопоставлении групп с низкой («1+») или среднеповышенной («2+») концентрацией аналитов могут быть получены более точные результаты, чем при сопоставлении с группой с высокой концентрацией аналитов («3+»), которая не имеет четко ограниченного верхнего предела.

Правильность исследований оценивается на основе градации отрицательных и положительных результатов с установлением порога обнаружения и порога подтверждения (на основе сравнения с результатами, полученными при параллельных исследованиях количественным методом). Приемлемая правильность определений с помощью полуколичественных тест-полосок характеризуется долей ложноположительных результатов на уровне менее 10% при пороге обнаружения и долей ложноотрицательных результатов также на уровне менее 10% при пороге подтверждения. В серой зоне (между порогами обнаружения и подтверждения) доля ложноотрицательных результатов должна сохраняться на уровне менее 30%.

Требования к аналитической надежности неколичественных методов должны разрабатываться с учетом специфики их аналитических принципов, биологических и морфологических характеристик (особенностей) изучаемых компонентов биологических материалов. В отношении визуальных неколичественных методов применяется оценка по частоте обнаружения с их помощью искомых компонентов биоматериалов, включая компоненты, характерные для специфических форм патологии, для диагностики которых предназначен соответствующий вид исследования.

При разработке требований к аналитической надежности визуального метода в качестве ориентира должны использоваться результаты исследования образцов биоматериалов, проведенного исследователем, имеющим большой опыт визуального изучения изображений (не менее 5000 исследований), правильного обнаружения и классификации исследуемых компонентов биоматериалов.

Информативность клинических лабораторных тестов определяется степенью уменьшения неопределенности представления о физиологическом процессе, состоянии органа или организма в целом на основе результатов данных тестов. Для клинической диагностики лабораторная информация представляет ценность в следующих отношениях:

Информационная ценность результатов лабораторных тестов определяется характером исследуемых компонентов биоматериалов и возможным информационным содержанием получаемых с их помощью результатов исследований (табл. 2-4).

Таблица 2-4. Примеры информационного содержания результатов лабораторных тестов

Клиническая информативность - способность лабораторного теста на основе информации, полученной в результате исследования определенного аналита в биологическом материале, характеризовать состояние внутренней среды организма у обследуемого пациента и выявлять патологические отклонения.

Порог клинического решения - числовое значение определенного аналита, принятое на основании экспериментальных данных в качестве критерия наличия или отсутствия существенных сдвигов в состоянии внутренней среды и соответствующих клинических проявлений у обследуемого человека, и объективного основания для принятия решения об оценке состояния пациента и применении лечебных мер. Для более точной диагностики клинических состояний могут быть выделены несколько порогов решения.

Основная задача при оценке клинической информативности клинических лабораторных исследований - установление достигаемой с их помощью степени точности разграничения исследуемых и сопоставляемых состояний организма пациента или исследуемых групп пациентов (здоровье или болезнь, реакция на лечение или отсутствие такой реакции, благоприятный или неблагоприятный прогноз).

Составляющими решения этой задачи являются:

Значения, свойственные состоянию здоровья, могут быть охарактеризованы референтными интервалами. Они определяются дисперсией значений аналитов, определенных в группе здоровых референтных индивидуумов. Референтные интервалы, установленные в здоровой популяции, отражают групповую биологическую вариацию и обычно применяются для разграничения патологии от состояния здоровья.

Референтные интервалы ограничены референтными пределами, за которые при 96% вероятности обычно принимают 2,5 и 97,5 процентили. Возможно применение других процентилей в качестве референтных пределов, но это должно быть оговорено в условиях определения соответствующего референтного интервала.

Наряду с унивариантными и не зависящими от времени популяционными референтными интервалами предусмотрена возможность установления:

При нормальном распределении референтные значения характеризуются среднеарифметическим значением (Χ) и среднеквадратичным отклонением (S); последнее позволяет оценить разброс данных, т.е. дисперсию. При нормальном распределении часть площади между -1S и +1S охватывает 68,3% всех вариантов, от -2S до +2S - 95,5% всех вариантов, от -3S до +3S - 99,7% всех вариантов. Центральные 95% находятся в пределах Χ±1,96S. Именно поэтому для получения 95% референтного интервала необходимо найти среднее значение и две точки, соответствующие Χ-1,96S и Χ +1,96S. При этом одно значение из 20 будет выходить за пределы референтного интервала.

Для расчета точности определения границ референтного интервала могут быть определены их доверительные интервалы - интервалы значений, в которых с определенной вероятностью находится значение данного параметра. Так, при применении параметрического метода Гаусса доверительный интервал с 90% вероятностью рассчитывают по формуле:

, (14)

где А - значение границы референтного интервала (нижней или верхней).

Проверка совпадения полученного распределения с нормальным может быть проведена графически с помощью построения гистограммы. При этом оценивают наличие асимметрии, т.е. увеличение частоты значений в левой (положительная асимметрия) или правой (отрицательная асимметрия) половине ряда.

Один из способов оценки распределения - выявление эксцессов по характеру пиков. Слишком острый пик называют положительным эксцессом, слишком плоский - отрицательным. Наличие двух пиков свидетельствует о бимодальности распределения, отражающей, скорее всего, недостаточно однородный состав референтной группы (по полу, возрасту, физиологическому состоянию).

В качестве математических методов оценки характера распределения используют статистический тест Lilliefors - адаптированный тест Колмогорова-Смирнова, тест хи-квадрат. Возможно также математическое преобразование распределения путем замены полученных значений их логарифмами.

При расчете референтных интервалов для аналитов, которым свойственны распределения значений в референтных группах здоровых людей, отличающиеся от нормального распределения, применяют непараметрические методы, в частности ранговый метод. При использовании рангового метода все результаты исследований располагают по порядку увеличения их численных значений, каждой величине присваивают номер от единицы до n, соответствующего числу вошедших в ряд значений.

Значение нижней границы 95% референтного интервала (2,5 процентиля, или 0,025 фрактиля) соответствует значению, порядковый номер которого определяют по формуле:

(15)

где r - порядковое место (ранг) величины; n - численность группы.

Соответственно значение верхней границы 95% референтного интервала (97,5 процентиля, или 0,975 фрактиля) равно значению, порядковый номер которого 0,975×(п+1). Доверительные интервалы для верхней и нижней границ референтного интервала определяют по специальным таблицам. Пользуясь такой таблицей, можно определить минимальную численность обследуемой группы с 90% доверительным интервалом не менее 120 человек. Поскольку биологическая вариация аналитов может быть довольно велика, численность референтных групп должна быть большей.

При обследовании референтной группы значения отдельных результатов могут оказаться в стороне от основной массы численных значений. Такие результаты называют выпадающими из ряда (outliers). Для проверки, действительно ли данное значение выпадает из ряда, применяют следующий критерий: самое большое или самое маленькое значение может быть отброшено, если расстояние между ним и ближайшим в ряду значением превышает ¹/₃ всего ряда значений.

новый результат = старый результат × коэффициент + интерсепт.

При этом следует учитывать степень взаимного перекрывания распределений значений данного аналита у здоровых людей и у страдающих определенной болезнью, а также используемую в данном случае отсечную точку. Наблюдаемое значение может характеризоваться низким, средним или высоким положением в референтном распределении.

Также возможен расчет наблюдаемой величины по отношению к среднеарифметическому значению и среднеквадратичному отклонению по формуле:

Z=(x_i - Χ)/s, (16)

где Z - положение наблюдаемой величины в распределении; Χ - среднеарифметическая величина; x_i - наблюдаемая величина, s - среднеквадратическое отклонение.

Для более точной характеристики определяемого значения можно использовать не только процентили 2,5 и 97,5, но и 5 и 95, 10 и 90, 15 и 85, 20 и 80, 25 и 75 и т.д. Расчет процентильной оценки определенного значения результата исследования возможен с использованием уравнения регрессии, что может обеспечить более стабильные результаты и возможность получения всех желаемых процентилей.

Выход значений содержания аналита у обследуемого пациента за референтные пределы обычно принято считать признаком патологии. Универсальность такого подхода может быть ограничена особенностями индивидуальных свойств аналитов - размахом вариации результатов их определений. Для аналитов с малым размахом вариации в состоянии здоровья вероятность выхода патологической вариации за популяционные референтные пределы меньше, чем для аналитов с большим размахом вариации. Эти особенности аналитов можно охарактеризовать количественно с помощью расчета их индекса индивидуальности, представляющего собой соотношение коэффициентов внутри- и межиндивидуальной вариации аналитов:

II=CV_I/CV_G, (17)

где II - индекс индивидуальности; CV_i - коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации; CV_g - коэффициент межиндивидуальной биологической вариации.

Диагностическая чувствительность теста тем выше, чем больше значение индекса индивидуальности.

В простейшем случае (использование одного лабораторного теста и возможное наличие одной формы патологии) присущие группе здоровых и группе больных с определенной формой патологии результаты лабораторного теста формируют две кривые, частично накладываемые друг на друга (рис. 2-4). Соотношение площади, описанной каждой кривой, с их накладываемыми частями даст количественную характеристику дискриминирующей (различающей) способности теста по отношению к изучаемой патологии.

Рис. 2-4. Гипотетическое распределение результатов теста среди здоровых и больных

При интерпретации результатов лабораторных исследований полученные значения классифицируют как положительные (подтверждающие патологию) и отрицательные (не подтверждающие патологию). Под влиянием факторов биологической и аналитической вариации может наблюдаться взаимное перекрытие значений результатов исследований между интервалами, свойственными группам больных и здоровых людей, что приводит к классификации части полученных значений как ложноположительных или ложноотрицательных. Истинно положительный результат подтверждает действительно имеющуюся патологию, истинно отрицательный результат исключает патологию при действительном ее отсутствии.

Ложноотрицательный результат исключает болезнь при ее действительном присутствии. Ложноположительный результат подтверждает патологию, несмотря на ее отсутствие в действительности. Соотношения данных групп полученных значений используют для количественной оценки клинической информативности лабораторных тестов на основе расчетов вероятности определенной категории значений при состоянии здоровья или болезни, а также при дифференциации нескольких заболеваний.

При дифференциации нескольких болезней сопоставляют кривые, образованные значениями лабораторных результатов, полученными соответственно при обследовании пациентов, страдающих данными формами патологии. Сочетание этих кривых образует многомерное пространство, в котором математически могут быть определены области, соответствующие определенным видам патологии. Критерий дискриминирующей способности теста может быть определен расстоянием координат наибольшей частоты показателей теста при данной патологии от центра области пространства, присущего другой патологии. Поскольку в этой системе важную роль играет реальная вероятность патологии, для обоснования численных значений вероятности привлекают данные клинической эпидемиологии, полученные с помощью принципов доказательной медицины. Они должны быть основаны на результатах рандомизированных контролируемых клинических исследований, проведенных на опытной и контрольной группах обследуемых, отобранных случайным образом, но при строгом соблюдении критериев включения, исключения и равенства по факторам, влияющим на исход заболевания.

Практически данные характеристики лабораторных тестов определяются на основании статистического анализа массивов результатов исследований и математически характеризуются патогмоничностью лабораторного показателя для диагностики заболевания. В результате накопления данных о реальном применении лабораторных тестов в группах здоровых людей и пациентов, заведомо страдающих определенным видом патологии, формируются 4 класса значений результатов исследований данного аналита:

Математические соотношения этих групп лабораторных результатов служат основанием для характеристики параметров клинической информативности лабораторного теста:* клинической чувствительности;

Клиническая (диагностическая) специфичность лабораторного теста характеризуется количеством людей, правильно классифицированных по результатам исследования, как не находящихся в определенном состоянии, деленное на число всех людей, не находящихся в данном состоянии (табл. 2-5).

Таблица 2-5. Критерии оценки диагностической ценности лабораторного теста

Оценка чувствительности и специфичности важна при выборе лабораторного теста для его применения в определенных клинических целях. Чувствительность теста отражает вероятность его положительного результата при наличии патологии. Высокая чувствительность теста позволяет выявлять с его помощью больных в общей популяции. Специфичность теста отражает вероятность отрицательного результата при отсутствии патологии, что при высокой специфичности позволяет отсеивать здоровых из популяции с предполагаемой патологией.

Комбинация клинической чувствительности и клинической специфичности теста характеризует диагностическую эффективность теста. При интерпретации лабораторных тестов вероятность действительного наличия патологии при положительном результате или надежность исключения патологии при отрицательном результате оценивается на основе определения предсказательной ценности положительных или отрицательных результатов.

Предсказательная ценность (посттестовая вероятность болезни у пациента) результата лабораторного теста зависит от распространенности болезни в популяции (табл. 2-6), которую иначе можно рассматривать как претестовую вероятность наличия болезни у пациента.

Таблица 2-6. Взаимосвязь распространенности болезни в популяции и предсказательной ценности положительного результата лабораторного теста

Взаимозависимость пре- и посттестовой вероятности болезни при определенной чувствительности и специфичности теста представлена в табл. 2-7.

Таблица 2-7. Взаимозависимость пре- и посттестовой вероятности патологии у пациента при использовании лабораторного теста с чувствительностью 90% и специфичностью 90%

Для вычисления вероятности болезни (посттестовой вероятности) на основании положительного или отрицательного результата теста используют отношение правдоподобия (ОтП), которое обобщает ту же информацию, что и показатели чувствительности и специфичности. ОтП для конкретного результата диагностического теста - отношение вероятности получения данного результата у пациентов с заболеванием к вероятности получения такого же результата у людей без заболевания. ОтП показывает, во сколько раз выше или ниже вероятность получения данного результата теста у больных по сравнению со здоровыми людьми.

ОтП позволяет выйти за рамки грубой оценки результатов лабораторного теста (норма или патология) в случае характеристики точности диагностического теста на основе только понятий чувствительности и специфичности при единственной точке разделения. В подобных ситуациях положение точки разделения (cut-off) на непрерывном переходе между нормой и патологией устанавливается произвольно. ОтП можно определять для любого количества результатов теста по всему диапазону допустимых значений. Наличие заболевания более вероятно при крайнем отклонении результата теста от нормы, чем в случае результата, близкого к границе нормы. При данном подходе формируется информация о степени отклонения от нормы, а не только о факте наличия или отсутствия болезни.

При вычислении ОтП внутри некоторого диапазона значений результатов теста под чувствительностью понимают уверенность врача при использовании конкретного результата теста для идентификации пациентов с заболеванием, а не с той или иной степенью отклонения от нормы. Аналогичный подход применяют при определении специфичности.

Интерпретация результатов вычисления ОтП:

С использованием приведенных показателей может быть осуществлен количественный расчет информативности лабораторного теста (J):

(18)

где претестовая вероятность - вероятность болезни в популяции; посттестовая вероятность - предсказательная ценность результата лабораторного теста.

(19)

где R - ОтП; р - претестовая вероятность.

Для точной оценки значимости различия между значениями двух последовательных измерений аналитов у одного и того же пациента применяют коэффициент критической разницы (референтное различие значений).

Расчет данного критерия основан на зависимости:

(20)

где RCV - коэффициент критической разницы или референтное различие значений; К - константа, зависящая от размера риска (при размере риска 0,5 константа составляет 2,77); CV_I - коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации; CV_A - коэффициент аналитической межсерийной вариации.

Классификация значений результатов как истинных или ложных зависит от выбора отсечной точки - границы раздела между значениями, характерными для здоровых и больных индивидуумов.

Поскольку от количественных соотношений различных классов значений результатов зависит оценка клинической чувствительности и специфичности, выбор отсечной точки должен определяться характером патологического процесса и вытекающими из установленного диагноза медицинскими последствиями.

На примере рис. 2-4 при выборе в качестве отсечной точки А тест имеет 100% чувствительность в отношении наличия патологии и низкую специфичность. Наиболее информативны отрицательные результаты теста с такой чувствительностью, поскольку при этом исключаются здоровые индивидуумы из общей популяции. Рекомендуют на ранних стадиях диагностики для сужения рамок исследуемой популяции.

Выбор в качестве отсечной точки С придает тесту 100% специфичность и снижает чувствительность. Наиболее информативны положительные результаты такого теста, поскольку они позволяют выявить в обследуемой популяции больных и подтвердить предположительный диагноз. Свойства теста позволяют предотвратить вред ложноположительного результата.

Для большинства клинических ситуаций в качестве отсечной выбирают точку В как предел референтного интервала, т.е. диапазона значений результатов теста у здоровых людей, характеризуемого среднеарифметическим значением и интервалом, ограниченным среднеквадратичными отклонениями в каждую сторону. Выход результата за референтные пределы, свойственные здоровым людям, может свидетельствовать о патологии.

При оценке точности разграничения обследуемых групп по результатам лабораторного теста используют его диагностическую эффективность (дискриминирующую способность), которая зависит от соотношения диагностической (клинической) чувствительности и специфичности. Лабораторный тест может иметь множество пар чувствительности и специфичности и должен быть описан полным спектром их соотношений для установления точек разделения (уровней решений, диагностических порогов). Соотношение между чувствительностью и специфичностью теста, разбросы результатов которого в двух альтернативных группах обследуемых (здоровые и больные) взаимно перекрываются, зависит от критерия разделения этих групп. Смещение точки разделения в ту или иную сторону приводит к изменению соотношения чувствительности и специфичности в противоположном направлении.

Для установления точки разделения с учетом последствий ложных решений используют характеристическую кривую (Receiver Operating Characteristic, Relative Operating Characteristic - ROC-curve) - кривую взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов (чувствительности и специфичности).

ROC-кривая - графическое представление полного спектра чувствительности и специфичности, поскольку на ней могут быть отображены все возможные пары «чувствительность-специфичность» для конкретного лабораторного теста. Поскольку частота истинно положительных и ложноположительных тестов может быть вычислена исходя из результатов в двух группах (здоровые и больные) отдельно, ROC-кривая не зависит от распространенности заболевания.

В зависимости от точек разделения и степени их наложения ROC-кривая имеет разные форму и положение. Желательное соотношение между чувствительностью и специфичностью теста достигается выбором точки разделения. Наиболее четкое разграничение между больными и здоровыми обследуемыми достигается при использовании тестов, которые имеют характеристическую кривую результатов, сдвинутую в сторону левого верхнего угла графика (рис. 2-5).

Рис. 2-5. ROC-кривая

Для идеального теста график проходит через верхний левый угол, где доля истинно положительных тестов составляет 100%, или 1 (идеальная чувствительность), а доля ложноположительных равна 0 (идеальная специфичность). Именно поэтому чем ближе кривая к верхнему левому углу, тем выше диагностическая эффективность (точность) теста, и наоборот, чем меньше изгиб кривой и чем ближе она расположена к прямой, проходящей под углом 45°, тем менее эффективно диагностическое исследование. Точки на такой диагонали соответствуют отсутствию диагностической эффективности.

Метод оценки ROC-кривых - оценка площади под кривыми. Теоретически площадь изменяется от 0 до 1, однако, поскольку диагностически полезные тесты характеризуются кривой, расположенной выше положительной диагонали (на рис. 2-5 она обозначена пунктирной линией), обычно говорят об изменениях от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1 (максимальная эффективность теста). Данная оценка может быть получена непосредственно вычислением площади под многогранником, ограниченным справа и снизу осями координат и слева вверху - экспериментально полученными точками. При визуальной оценке ROC-кривых расположение относительно друг друга указывает на их сравнительную эффективность. Кривая, расположенная выше и левее, свидетельствует о большей диагностической эффективности лабораторного теста.

Внешняя оценка качества (ВОК) исследований, выполняемых в КДЛ, - важнейший элемент системы обеспечения качества клинической лабораторной диагностики. ВОК направлена прежде всего на обеспечение правильности результатов исследований биологических материалов в КДЛ и соответственно сопоставимости результатов, получаемых в разных лабораториях. Кроме того, внешняя оценка служит объективным инструментом оценки соответствия лабораторных результатов установленным нормативам качества.

Зарубежный опыт построения систем ВОК показал серьезные преимущества крупных общенациональных систем по сравнению с небольшими региональными системами. Именно на общенациональном уровне организованы системы ВОК во многих развитых странах (Австралии, Великобритании, США, Финляндии, ФРГ, Франции). Некоторые из этих систем стали приобретать черты транснациональных, привлекая к участию клинические лаборатории других стран.

Создание крупной общенациональной системы ВОК позволяет привлечь к ее осуществлению ведущих специалистов страны, что необходимо для достижения высокого научного и методического уровня системы, соответствующего той ответственной роли, которую ВОК играет в медицине. Контроль качества лабораторных исследований составляет специальную область знаний, включающую, помимо методических аспектов лабораторной медицины, современную методологию контроля качества аналитических систем, основы теории ошибок, метрологию и математическую статистику. Ввиду специфики этой области количество работающих в ней специалистов ограничено, что делает возможность объединения их усилий в таких системах довольно уникальной, недостижимой в других условиях.

Корректная аттестация контрольных образцов (основы любой системы ВОК), прежде всего получение достоверных референтных значений, специфичных для каждого отдельного метода лабораторного анализа и каждой отдельной серии контрольного образца, возможна только при наличии в системе большого количества клинических лабораторий. Для получения достоверных референтных результатов необходимо минимум 30, желательно более 70 участников в методспецифичных группах. Реализация других подходов к аттестации контрольных образцов в сети аккредитованных экспертных и/или референтных лабораторий, созданной на базе лучших клинико-диагностических и аналитических лабораторий страны, также доступна только для общенациональных систем ВОК. Ввиду возможности выделения больших по численности групп лабораторий, использующих идентичные средства лабораторной диагностики, крупные системы ВОК позволяют получать статистически достоверные данные по сравнительной характеристике качества разных наборов реактивов, стандартных образцов, измерительных устройств и т.п.

Привлекая к участию большое количество клинических лабораторий, такие системы позволяют получать информацию, которая может быть эффективно использована на разных уровнях принятия управленческих решений. Участвующие в подобных системах клинические лаборатории получают объективные данные о качестве выполняемых исследований, на основе которых они принимают решения о необходимости пересмотра используемых методов, наборов реагентов и средств измерения, внедрения внутрилабораторных систем обеспечения качества и их совершенствования. Большой объем данных по используемым в лабораториях методам, наборам реагентов и средствам измерения позволяет оценивать состояние материально-технической и методической базы лабораторной службы, определять наиболее актуальные проблемы ее улучшения. Сравнение показателей качества исследований, выполняемых в группах лабораторий, использующих одни и те же методы, наборы реагентов и средства измерения, позволяет выделять методы, требующие целенаправленной проверки качества. Получаемые при этом данные могут быть использованы соответствующими надзорными органами.

Важное обстоятельство - возможность снижения себестоимости ВОК в расчете на одну участвующую лабораторию: при большом количестве участников стоимость контрольных материалов существенно ниже при их изготовлении или закупке большими партиями. Это же обстоятельство определяет наличие в крупной системе возможности закупать контрольные образцы, специально приготовленные для системы «на заказ» и отвечающие целям конкретного цикла ВОК.

Серьезное преимущество общенациональных систем ВОК заключается в возможности организации регулярной проверки силами компетентных (экспертных) лабораторий качества коммерческих контрольных материалов, предполагаемых для использования в ВОК, без чего невозможно обеспечить правильность оценки качества исследований в клинических лабораториях.

Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК) была создана в нашей стране в 1994-1995 гг. Основные цели ФСВОК:

С самого начала своей деятельности ФСВОК работает не как административно-разрешительная система, а как часть лабораторной службы страны, позволяющая выявлять ошибки, возникающие в КДЛ, и оказывать помощь в устранении их источников. Для обеспечения объективности получаемых из КДЛ результатов анализа направляемых им контрольных образцов, имитирующих реальные клинические пробы, и в целях исключения подмены административными санкциями помощи, необходимой лабораториям в обеспечении качества выполняемых исследований, в ФСВОК соблюдается конфиденциальность результатов оценки качества исследований конкретной лаборатории. Результаты направляют только ее заведующему под кодом данной лаборатории. Ответственность за использование результатов внешней оценки качества и принятие по ним решения несет непосредственно только заведующий КДЛ.

Работа ФСВОК направлена на выявление реальных погрешностей, присутствующих в рутинной работе лабораторий при анализе реальных проб. С этой целью в ФСВОК принимаются меры для обеспечения условий, в которых участвующие лаборатории не видели бы необходимости в создании «особых условий» при исследовании получаемых контрольных образцов, а также по недопущению каких-либо прямых административных санкций по результатам оценки качества анализов. Это обеспечивается, в частности, анонимностью конкретной лаборатории: все лаборатории кодируются, информация о качестве исследований в лаборатории сообщается только ее заведующему. В тех случаях, когда такая информация сообщается главному лаборанту региона или ведомства, строго выполняется требование использовать указанную информацию только конфиденциально и только для определения лабораторий, наиболее остро нуждающихся в оказании им методической помощи. Такой подход стимулирует лаборатории представлять честные результаты исследований контрольных образцов, выполненные в тех же условиях, что и анализы проб пациентов, чтобы самим оценить реальную ценность выдаваемой врачу диагностической информации.

В то же время нормативные документы Минздравсоцразвития РФ обязывают каждую клиническую лабораторию к ежегодному участию в ФСВОК. Предъявление свидетельств об участии в ФСВОК в прошлые годы и письма, подтверждающего участие в текущем году, необходимо при лицензировании и инспекционных проверках лабораторий. Нормативные документы Минздравсоцразвития РФ обязывают региональные и ведомственные органы управления здравоохранения и главных врачей лечебных учреждений обеспечивать возможность ежегодного участия подведомственных лабораторий в ФСВОК.

Работу ФСВОК обеспечивает Центр внешнего контроля качества клинических лабораторных исследований совместно с территориальными организационно-методическими и контрольными центрами по клинической лабораторной диагностике, Научно-методическим центром по клинической лабораторной диагностике и экспертными группами ФСВОК.

За годы работы ФСВОК количество ее участников выросло более чем в 4 раза и к 2010 г. превысило 7000 лабораторий, представляющих все субъекты РФ. ФСВОК охватывает все виды рутинных клинико-лабораторных исследований и состоит из более 77 разделов.

Три цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови на двух уровнях концентрации АЛТ, альбумина, α-амилазы общей, α-амилазы панкреатической, АСТ, белка общего; билирубина, билирубина прямого, глюкозы, гаммаГТ, железа, ОЖСС, калия, кальция общего, кальция ионизированного, кислой фосфатазы, креатинина, креатинкиназы, ЛДГ, липазы, магния, мочевой кислоты, мочевины, натрия, триглицеридов, фосфора, хлоридов, холестерина, холинэстеразы, щелочной фосфатазы. (Цикл - рассылка контрольных образцов участвующим лабораториям, сбор и обработка результатов их исследования, сообщение лабораториям заключений о качестве выполненных исследований. Указано количество ежегодно выполняемых циклов активности и массы МВ-креатинкиназы, миоглобина, тропонинов I и Т.)

Свойства контрольных образцов должны максимально соответствовать свойствам реальных проб, исследуемых в клинических лабораториях, и при этом оставаться однородными и стабильными в процессе транспортировки и хранения. В ряде случаев одновременное выполнение всех требований нереально, и это накладывает известные ограничения на методологию внешней оценки качества, делая невозможным охват всех стадий подготовки пробы и аналитического процесса. В ФСВОК применяют следующие виды контрольных образцов:

Во многих разделах применяют контрольные образцы промышленного изготовления. В этих случаях конкретный производитель (поставщик) контрольных образцов определяется на конкурсной основе, к конкурсу приглашаются ведущие отечественные и зарубежные производители. Один из критериев отбора - степень соответствия свойств контрольного образца свойствам реальных проб, исследуемых в клинических лабораториях. В разных разделах ФСВОК в наборы входят от 1 до 20 контрольных образцов, отражающих разнообразие исследуемых в клинических лабораториях реальных проб, в том числе нормальные и патологические пробы.

Наборы закодированных контрольных образцов с сопроводительной документацией, в которой изложен порядок исследования образцов, бланками для записи полученных результатов и другой необходимой для оценки качества информацией доставляют из Центра внешнего контроля качества в лаборатории почтой или курьерской службой. Исследования контрольных образцов должны быть выполнены в рутинной серии исследований обычных проб, поступающих в лабораторию на анализ, в тех же условиях, с теми же реагентами и на том же оборудовании. Результаты выполненных по заданной схеме исследований контрольных образцов, внесенные в соответствующие бланки (формы), направляют в ФСВОК для последующей оценки.

Полученные из лабораторий данные изучают сотрудники Центра внешнего контроля качества, при этом проверяют их соответствие установленной схеме анализа контрольных проб, правильность использованных единиц измерения и т.п., на основе чего делают заключение о возможности их ввода в компьютер и последующей обработки.

Схемы и алгоритмы внешней оценки качества зависят от формы представления результата исследования. Результаты количественного анализа, выраженные в виде числа из непрерывной шкалы измерений (в таких разделах, как «Биохимия крови», «Глюкоза», «Гемоглобин», «Гемоцитометрия», «Анализ мочи», «Коагулология», «Гормоны и витамины», «Газы крови», «Липиды и аполипопротеины» и др.), оценивают с использованием статистики, основанной на распределенииГаусса. Для каждого контрольного образца устанавливают целевые значения по каждому из определяемых в нем показателей. В качестве целевого значения может быть выбрано среднее значение результатов участников, использующих один и тот же аналитический метод, среднее значение всех участников, определяющих один и тот же показатель любым методом, за вычетом 5% крайних результатов, или же референтное значение, установленное методом высшего порядка точности (например, в разделе «Глюкоза» - концентрация глюкозы, определенная в водном стандартном растворе по навеске чистого вещества). Индивидуальные целевые значения по каждому методу устанавливают только в тех случаях, когда имеются достоверные различия между средними значениями, заложенные в природе самих методов. При этом лаборатория, корректно использующая свой метод, не может нести ответственность за его систематическую погрешность относительно других методов.

Для оценки приемлемости систематической погрешности результата измерения вокруг целевого значения откладывают диапазон допустимых значений, который в большинстве случаев составляет ±l,64s (s - межлабораторное стандартное отклонение), что соответствует 90% доверительному интервалу вокруг среднего значения. В разделах «Биохимия крови» и «Глюкоза», «Электрофорез белков сыворотки крови» и «Коагулология» эксперты ФСВОК установили фиксированные нормы точности на основе достигнутых в лабораториях аналитических характеристик и с учетом требований, вытекающих из биологической вариации данных показателей в популяции. Помимо систематической погрешности для результатов количественного анализа, проводят оценку допустимости случайной погрешности по величине относительного размаха между двумя параллельными измерениями одного образца. В качестве нормы точности для воспроизводимости установлены либо фиксированные критерии, либо величина 2,46R (R - средний относительный размах в оцениваемой совокупности лабораторий), соответствующая верхней 95% отрезной точке распределения размахов. Данная схема оценки имеет преимущества перед рядом зарубежных схем внешней оценки качества, в которых оценку проводят по единственному результату анализа контрольного образца, поскольку позволяет выявить источник аналитической погрешности - случайной или систематической. По результатам одного измерения это сделать невозможно. Вместе с тем эксперты ФСВОК в разделах «Биохимия крови» и «Глюкоза», «Электрофорез белков сыворотки крови» и «Коагулология» установили нормы точности также и для ошибки единичного измерения - для случаев, когда лаборатория представляет только один результат анализа.

Помимо методов количественного анализа, для оценки которых применяют известные статистические методы, в рамках ФСВОК разработаны оригинальные схемы внешней оценки качества методов лабораторной диагностики, в которых результат исследования не может считаться измерением. Для оценки результатов полуколичественного анализа мочи с помощью диагностических полосок, у которых каждое последующее деление шкалы в несколько раз превышает предыдущее, используют критерии, основанные на степени точности применяемой дискретной шкалы: медиана результатов участников, использующих один и тот же тип диагностических полосок, должна укладываться в пределах ±1 деление шкалы измерения.

Подходы к оценке качества методов обнаружения веществ, антигенов, антител, микроорганизмов и т.п. основаны чаще всего на заранее известных свойствах контрольного образца (дефинитивная оценка). В ряде случаев используют контрольные панели с контрольными образцами различной степени нагруженности (см. разделы «ИФА-выявление HB_sAg», «Микроскопическое выявление микобактерий с окраской по Цилю-Нильсену», «Культуральное выявление микобактерий туберкулеза», «ПЦР-выявление микобактерий туберкулеза»), что позволяет оценить диагностические чувствительность и специфичность методики. В тех случаях, когда используют контрольные образцы с заранее неизвестным содержанием компонента, подлежащего обнаружению (качественный анализ мочи), для оценки качества используют методы непараметрической статистики: не более 20% крайних результатов признают неудовлетворительными, остальные - правильными.

В ряде разделов ФСВОК лаборатории заранее не сообщают, какое задание ей предстоит выполнить. Например, в разделе «Микробиология» требуется определить до рода и вида бактериальный штамм из государственной коллекции микроорганизмов, а также его спектр лекарственной чувствительности, а в разделе «Цитология» - дать диагностическое описание цитологического препарата. Оценкой качества такого заключения служит сравнительное заключение комиссии экспертов, изучивших данный препарат.

Три цикла оценки качества определения глюкозы в сыворотке/цельной крови на двух уровнях концентрации. Для лабораторий, определяющих только этот биохимический показатель крови.

Три цикла оценки качества исследований в моче на двух уровнях концентраций. Количественное определение α-амилазы, белка, глюкозы, креатинина, альбумина, мочевой кислоты, мочевины, калия, кальция, натрия, рН, фосфора, хлоридов.

Полуколичественное определение: диагностическими тест-полосками - белка, билирубина, гемоглобина, глюкозы, pH; химическими методами - белка, глюкозы, рН.

Качественное определение белка, билирубина, гемоглобина, глюкозы, рН, нитритов.

Три цикла оценки качества исследований на двух уровнях концентраций: белка, рН, глюкозы - любыми методами, кроме определения на приборе «Эксан»; нитритов, гемоглобина, удельного веса - диагностическими тест-полосками; кетоновых тел - качественными и полуколичественными (например, тест-полосками) методами.

Три цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови на двух уровнях концентраций АКТГ, витамина B₁₂, ДГЭА-сульфата, инсулина, кальцитонина, кортизола, лютеинизирующего гормона, паратиреоидного гормона, С-пептида, прогестерона, 17 α-ОН-прогестерона, пролактина, тестостерона, свободного тестостерона, тиреотропного гормона, Т₃, свободного Т₃, Т₄, свободного Т₄, соматотропина, α-фетопротеина, фолиевой кислоты, фоллитропина, общего β-ХГЧ, эстрадиола, свободного эстриола.

Три цикла оценки качества определения рС0₂, рО₂ и рН крови на двух уровнях концентраций.

Два цикла оценки качества определения концентрации гликозилированного гемоглобина крови на двух уровнях концентраций.

Два цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови активности креатинкиназы, активности и массы МВ-креатинкиназы, миоглобулина, тропонина J и T.

Три цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови на двух уровнях концентраций СА 15-3, СА 19-9, СА 125, пролактина, ПСА общего, ПСА свободного, РЭА, тиреоглобулина, α-фетопротеина, ферритина, общего β-ХГЧ.

Два цикла оценки качества количественного иммунохимического определения в сыворотке/плазме крови концентраций α₁-кислого гликопротеина, α₁-антитрипсина, α₂-макроглобулина, антистрептолизина-О, β₂-микроглобулина, С-реактивного белка, церулоплазмина, С3- и С4-компонентов комплемента, гаптоглобина, IgA, IgE, IgG, IgM, легких цепей каппа и лямбда, преальбумина, ретинолсвязывающего белка, ревматоидного фактора, трансферрина, ферритина.

Три цикла оценки качества определения в сыворотке крови двух концентраций альбумина, α₁-глобулинов, α₂-глобулинов, β-глобулинов суммарных, β₁-глобулинов, β₂-глобулинов, γ-глобулинов.

Два цикла оценки качества определения аполипопротеинов А-I и В, ЛП(а), триглицеридов, общего, ЛВП- и ЛНП-холестерина в сыворотке/плазме крови на двух уровнях концентраций.

Три цикла оценки качества определения двух концентраций галактозы, иммунореактивного трипсина, 17-оксипрогестерона, тиреотропного гормона и фенилаланина в крови новорожденных.

Три цикла оценки качества определения двух концентраций биохимических маркеров наследственных заболеваний плода; а-фетопротеина, хорионического гонадотропина и свободного эстрадиола в крови беременных.

Два цикла оценки качества определения на гемоцитометрах гематокрита, гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, среднего значения содержания гемоглобина в эритроците, концентрации гемоглобина в эритроците, среднего объема эритроцита (8 показателей, два уровня).

То же, что в разделе «Гемоцитометрия-8», с добавлением среднего объема тромбоцита, показателя гетерогенности эритроцитов, абсолютного и относительного количества лимфоцитов, средних клеток и гранулоцитов, определяемых на «З-diff» гематологических анализаторах AbacusJunior, Aduia 60, Bc 3000-series, CoulterA с Tdiff, ErmaPCE-210, MEK 6400/6410, MedonicCA 620/530, MedonicM-series. Micros 60, Mythic 18, SwelabAC 920/970E 0+, SysmexKX-21 (16 показателей, 2 уровня).

Лейкоцитарная формула

Два цикла оценки качества подсчета лейкоцитарной формулы в препаратах крови.

Три цикла оценки качества определения гемоглобина на двух уровнях концентраций.

Три цикла оценки качества определения протромбинового и тромбинового времени, процента протромбина по Квику, МНО, АЧТВ и фибриногена на двух уровнях концентраций.

Три цикла оценки качества определения протромбинового и тромбинового времени, процента протромбина по Квику, МНО, АЧТВ, фибриногена, активности факторов VIII, IX, XIII, фактора фон Виллебранда (ристоцетин-кофакторной активности), антитромбина III, протеина С, плазминогена, ингибитора плазмина (α₂-антиплазмина) и общей системы фибринолиза (XIIa-зависимого фибринолиза) на двух уровнях.

Два цикла оценки качества выявления волчаночного антикоагулянта.

Два цикла оценки качества определения АЧТВ и тромбинового времени в гепаринизированной плазме.

Два цикла оценки качества определения группы крови, резус-принадлежности, выявления ауто- и аллосенсибилизации, основанных на типировании антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител.

Два цикла оценки качества определения общего IgE крови.

Два цикла оценки качества определения ревматоидного фактора количественными, полуколичественными (в том числе агглютинация частиц латекса) и качественными методами.

Два цикла оценки качества определения антинуклеарного фактора методом непрямой иммунофлюоресценции с определением титра и типа свечения ядра, а также антител к экстрагируемому ядерному антигену методом ИФА.

Два цикла оценки качества определения антител к двуспиральной ДНК количественными и качественными методами ИФА.

Два цикла оценки качества определения антител к фосфолипидам, антител IgG и IgM к кардолипину, антител IgG к β₂-гликопротеину методом ИФА.

Два цикла оценки качества иммунохимических тестов определения антител к тиреоидпероксидазе и тиреоглобулину.

Два цикла оценки качества иммуноферментных тестов определения антител IgG к Helicobacter pylori в сыворотке крови.

Два цикла оценки качества идентификации возбудителей гнойно-септических заболеваний, внутри- и внебольничных инфекций и определения их чувствительности к антибиотикам.

Два цикла оценки качества микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий в препаратах мокроты.

Два цикла оценки качества микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий в препаратах мокроты с окраской флюорохромами.

Один цикл оценки качества выявления микобактерий культуральными методами. Десять контрольных образцов. Доставка курьерской почтой.

Один цикл оценки качества определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу.

Один цикл оценки качества выявления микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу и пиразинамиду на жидких средах.

Два цикла оценки качества выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР.

Один цикл оценки качества выявления мутационных изменений ДНК микобактерий туберкулеза, приводящих к их устойчивости к изониазиду и рифампицину.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов осадка мочи.

Три цикла оценки качества микроскопического выявления возбудителей трихомониаза.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования возбудителей гонореи.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов кала.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования микрофлоры вагины при вагинозах и вагинитах.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов периферической крови при анемиях, гемобластозах и реактивных состояниях.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов мокроты.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов ликвора.

Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов эякулята.

Три цикла оценки качества микроскопического выявления C. trachomatis в препаратах соскобов слизистой урогенитального тракта методом РИФ.

Два цикла оценки качества микроскопического выявления C. trachomatis в препаратах, имитирующих соскобы слизистой урогенитального тракта методом РИФ.

Два цикла оценки качества выявления специфических антител к Treponema pallidum с использованием фазных серологических методов и тест-систем.

Два цикла оценки качества первичного и подтверждающего выявления HBsAg методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу гепатита B и определение концентрации методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу гепатита С методом ИФА в скрининговом исследовании и антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита С методами ИФА или иммуноблота (подтверждающие тесты).

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу гепатита А.

Два цикла оценки качества серологической диагностики ВИЧ методом ИФА при скрининговом исследовании.

Два цикла оценки качества выявления серологических маркеров ВИЧ методами ИФА в скрининговом и подтверждающем исследованиях с постановкой иммуноблота.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к C. trachomatis методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgA к C. trachomatis методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к роду Chlamydia методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу простого герпеса I типа методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к цитомегаловирусу (ЦМВ) методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к Candida albicans методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления IgG к Mycoplasma hominis методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к Toxoplasma gondii и определение их концентрации методом ИФА.

Два цикла оценки качества выявления антител IgG к Ureaplasma urealyticum методом ИФА.

Два цикла оценки качества определения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител, меченных флюорохромами.

Два цикла оценки качества выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР.

Два цикла оценки качества количественного определения концентрации ДНК вируса гепатита В методом ПЦР.

Два цикла оценки качества выявления РНК вируса гепатита С методом ПЦР.

Два цикла оценки качества количественного определения концентрации РНК вируса гепатита С методом ПЦР.

Два цикла оценки качества выявления РНК вируса иммунодефицита человека методом ПЦР.

Два цикла оценки качества выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum методом ПЦР.

Два цикла оценки качества выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae методомПЦР.

Два цикла оценки качества выявления ДНК вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска методом ПЦР.

Два цикла оценки качества микроскопических исследований, имитируемых на экране компьютера:

Обеспечивается возможность просмотра множественных полей зрения препарата, а для препаратов мочи и кала, помимо этого, изменение фокусировки, а также просмотр виртуальных препаратов с увеличением 100, 200, 400, 1000, управление «виртуальным» препаратоводителем, что позволяет выбирать зону для детального исследования и переключать на большие увеличения.

Два цикла оценки качества определения сперматозоидов разных категорий подвижности. Лаборатория получает компакт-диск с четырьмя видеофрагментами нативных препаратов спермы.

Один цикл оценки качества цитологической диагностики доброкачественных и злокачественных патологических процессов. Используются окрашенные препараты, подобранные в соответствии с характером цитологических исследований и методами окрашивания препаратов в лаборатории, а также цифровые микрофотографии с окрашенных препаратов, приготовленных из биоматериала определенной локализации.

Один цикл оценки качества цитологической диагностики с использованием цифровых фотографий пяти микроскопических полей зрения каждого из двух препаратов, приготовленных из следующего биоматериала:

Один цикл оценки качества идентификации хромосом человека в целях определения кариотипа. Три контрольных препарата лимфоцитов периферической крови.

Один цикл оценки качества идентификации хромосом человека в целях определения кариотипа. Три контрольных препарата костного мозга.

Один цикл оценки качества патогистологических исследований. Используются контрольные окрашенные препараты срезов тканей биопсийного и операционного материала.

Лаборатория пересылает в ФСВОК определенные количества приготовленных и исследованных ею рутинных препаратов, где их исследуют эксперты. Результаты, полученные экспертами, заключение о качестве препаратов и рекомендации по повышению качества исследований направляют в лабораторию (по указанию лаборатории препараты ей возвращают).

Выявление трихомонад в отделяемом слизистой урогенитального тракта с окраской метиленовым синим или по Романовскому-Гимзе.

Выявление гонококков в отделяемом слизистой урогенитального тракта с окраской по Граму.

Выявление кислотоустойчивых микобактерий с окраской по Цилю-Нильсену. Цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови и костного мозга, G-окрашивание.

Особенности обработки результатов лабораторий для оценки их качества приведены в табл. 2.8.

Таблица 2-8. Особенности обработки результатов количественных исследований в разных разделах ФСВОК (ЦЗ - целевое значение, s - стандартное отклонение)

Лаборатория представляет 20 выделенных ею культур микобактерий туберкулеза на среде Левенштейна-Иенсена и результаты определения их чувствительности к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу методом абсолютных концентраций. Культуры повторно исследуют в экспертных лабораториях ФСВОК, на основании полученных результатов делают заключение о качестве исследования лекарственной чувствительности в испытуемой лаборатории.

Непременным условием обеспечения единства результатов измерений в клинической диагностике является доступность полноценной эталонной базы для всех клинико-диагностических лабораторий страны. В России, как и в других странах, для лабораторных исследований такой базы пока не создано, поэтому обеспечить единство измерений для всех лабораторных показателей на практике не представляется возможным. Тем не менее, даже в отсутствие необходимого метрологического обеспечения лабораторных измерений, в КДЛ имеется возможность получения объективных и сопоставимых результатов за счет внедрения в практику стандартизованных методик, а также внутрилабораторного контроля качества (ВКК) и внешней оценки качества (ВОК) клинических лабораторных исследований.

Программы ВКК и ВОК имеют существенные различия в методологии и целях. При оценке и контроле аналитического качества они друг друга не заменяют, а дополняют.

В методологии любой программы ВКК предполагается, что лабораторная методика изначально имеет коэффициент вариации CV и смещение B в пределах допуска, что, таким образом, является гарантией получения правильных результатов. Пределы допустимых значений CV и B декларируются на основе опыта исследований биологических вариаций лабораторных показателей, вариаций аналитического процесса лабораторных исследований и характеристик изделий медицинского назначения (включая приборы, реактивы, вспомогательные технологии и др.). Пока CV и смещение B сохраняют свои изначальные значения в течение контролируемого периода, нет оснований считать получаемые результаты неправильными. Поэтому основной целью любого ВКК является именно контроль во времени над стабильностью этих двух аналитических характеристик для каждого количественного лабораторного теста.

Целью любой программы ВОК является предоставление возможности КДЛ проверить то, что лабораторная методика действительно имеет значение смещения B в пределах допуска. Именно поэтому необходимо регулярное участие КДЛ в программах ВОК. Если результаты исследования лабораторией образцов контрольного материала находятся в пределах контрольных границ, установленных в данной программе ВОК на базе среднегруппового значения аналогичных результатов всех лабораторий-участников, то считается, что смещение В данной методики находится в пределах допуска. Чем стабильней будут располагаться результаты исследований лабораторией контрольных материалов относительно среднего показателя группы участников, тем более сопоставимыми будут результаты исследований этой же КДЛ проб пациентов в динамике. Чем уже будет распределение контрольных результатов в группе лабораторий - участников данной программы ВОК, тем выше будет степень сопоставимости результатов исследования проб пациентов между лабораториями.

Методология контроля аналитического качества в КДЛ России регламентируется ГОСТ Р 53133.2-2008. ГОСТ разработан для нормативного обеспечения повседневных процедур ВКК, направленных на выявление недопустимых случайных и систематических погрешностей на аналитическом этапе клинических лабораторных исследований, выполняемых количественными методами с помощью контрольных материалов. Стандарт исходит из того, что КДЛ без использования контрольных материалов не может обеспечить аналитическое качество результатов и, соответственно, их достоверность.

Из ГОСТ следует, что ВКК обязателен в отношении всех видов количественных исследований, для которых доступны контрольные материалы с аттестованными значениями. Положения стандарта требуют, чтобы уровни исследуемых компонентов в контрольном материале соответствовали значениям показателей в нормальном и патологическом диапазонах и для повышенных, и для пониженных значений. Следовательно, при ведении ВКК для количественного лабораторного показателя должны обязательно использоваться контрольные материалы и с нормальными, и с патологическими значениями. Для каждого такого контрольного материала лаборатория должна проводить установочную серию измерений с целью определения собственных среднеарифметических значений и значений CV. В соответствии с общемировой практикой, ВКК должен обеспечивать контроль аналитического качества результатов лабораторных исследований и в нормальном, и в патологическом диапазонах. Кроме того, стандарт устанавливает, что контрольные материалы с нормальными и патологическими значениями должны исследоваться так же, как и пробы пациентов, в одних и тех же аналитических сериях.

Особо следует отметить, что ГОСТ запрещает использовать контрольный материал одновременно и в качестве калибровочного, и в качестве контрольного для одной и той же методики. Стандарт допускает, что для одного и того же лабораторного показателя в паспорте на контрольный материал может быть указано несколько значений, соответствующих разным методам измерения или разным аналитическим системам. ГОСТ также устанавливает, что аттестованное значение контрольного материала не предназначено для использования в качестве среднеарифметического значения при построении контрольной карты. Среднеарифметическое значение и CV для построения контрольных карт измерительной методики получают в результате проведения установочной серии измерений контрольного материала.

Оперативный контроль качества с использованием контрольного материала должен выполняться в течение достаточно длительного времени с использованием одного и того же контрольного материала, т.е. с использованием образцов из одного и того же лота. Для биохимических исследований ГОСТ рекомендует использовать один тот же контрольный материал на протяжении не менее 200 серий, а для гематологических исследований - на протяжении не менее 40 серий. В таких условиях существенно возрастает актуальность внедрения в КДЛ средств автоматизации ведения ВКК - компьютерных программ.

Современная клинико-диагностическая лаборатория (КДЛ) - сложная производственная система, в которой реализуются сотни технологических процессов. Использование лабораторных информационных систем (ЛИС) в целях создания современной технологии управления КДЛ, гарантирующей высокое качество результатов лабораторных исследований при минимальных затратах, - единственный конструктивный путь и один из ключевых инструментов, позволяющих достичь поставленной цели. ЛИС предназначены для комплексной автоматизации деятельности КДЛ, поэтому их называют системами управления лабораторной информацией. Управление современной КДЛ предусматривает деятельность по организации непосредственно технологического процесса производства лабораторных анализов и целого комплекса других процессов, таких как материальное обеспечение, экономическая и клиническая эффективность. ЛИС позволяют не только решать многочисленные задачи ввода и хранения лабораторных данных, но и на базе новейших информационных технологий интегрироваться с другими системами автоматизации для участия в решении задач всего лечебно-профилактического учреждения.

ЛИС состоит из технических средств (центрального процессора, устройств ввода-вывода, запоминающих устройств, интерфейсов, автоанализаторов) и программного обеспечения (компьютерных программных средств, обеспечивающих работу технических средств и обработку информации).

В функции ЛИС входят:

Одной из основных функций ЛИС является обеспечение специалистов лаборатории информацией об исследуемой пробе (данные о пациенте, время взятия материала, перечень исследований, которые нужно выполнить, диагноз, лечащий врач, специалист, проводивший взятие биоматериала) на всех этапах единого технологического процесса производства анализов. Потоки лабораторной информации при традиционном лабораторном исследовании должны идти практически параллельно с движением пробы по различным технологическим процессам и операциям производства анализов.

Второе направление информатизации деятельности лаборатории - решение проблемы взаимодействия лабораторий с клиническими отделениями стационара (поликлиники) на базе единой компьютерной информационной системы учреждения - включает автоматизацию процессов оформления заявок на лабораторные исследования, составления списков пациентов для взятия биоматериала, а также передачу результатов анализов в отделения. Кроме того, единая информационная система учреждения должна иметь не только базу справочных данных (инструкции для взятия биоматериала, информацию по оценке результатов анализов, перечень исследований, выполняемых лабораторией, и т.д.), но и доступ к другим информационным системам справочного или обучающего характера (например, Интернет). В рамках этого направления решаются следующие задачи:

Главной целью информатизации этого направления является уменьшение количества необоснованных назначений исследований, сокращение времени получения результатов анализов, более аргументированная интерпретация результатов и контроль их использования для оказания качественной медицинской помощи пациенту. В целом лабораторные информационные системы, которые предназначены для комплексной автоматизации деятельности КДЛ, позволяют достичь следующих преимуществ:

Ориентированная на технологию ЛИС оказывает благоприятное воздействие практически на все аспекты технологического процесса производства лабораторных анализов: устраняется множество рутинных операций, возрастает эффективность использования современных лабораторных анализаторов, упрощается документооборот, обеспечивается принципиально новый уровень информационного взаимодействия с заказчиками лабораторных исследований, позволяет управлять качеством результатов лабораторных анализов. Потоки информации на различных этапах технологического процесса производства лабораторных анализов представлены на рис. 3-1.

Рис. 3-1. Потоки информации на различных этапах технологического процесса производства лабораторных анализов (схема)

В настоящее время КДЛ (особенно централизованные) все больше превращаются в самостоятельные предприятия. Соответственно КДЛ должны демонстрировать свою экономическую эффективность. В связи с этим ЛИС становятся мощным инструментом КДЛ, обеспечивая конкурентоспособное преимущество перед другими лабораториями, экономя время и деньги. ЛИС коренным образом улучшают взаимодействие КДЛ и клиентов, как физических, так и юридических лиц. В отношении физических лиц первая и главная задача КДЛ - качественное обслуживание пациентов. Пациентами процесс обслуживания оценивается по наличию очереди в процедурный кабинет, качеству взятия проб крови, по тому, насколько быстро и четко организован прием и насколько удобно для него получение результата. Эти запросы пациентов должна помочь решить современная ЛИС. Главной целью информационной поддержки взаимодействия с медицинскими учреждениями является обеспечение максимально быстрого и комфортного для клиента процесса приема заявок на исследования и выдачи результатов. Ускорение приема заявок достигается за счет тесной интеграции составляющих процесса приема заказа: регистрации заявок на исследования, забора проб биоматериала.

Изменения условий деятельности КДЛ требуют создания четко отлаженной системы учета оказанных лабораторией медицинских услуг с выдачей результатов в виде журналов или с периодической передачей сведений в страховую систему медучреждения либо непосредственно в страховую компанию в электронном виде. Внутри самой лаборатории возникла необходимость учитывать услуги в денежном выражении с периодическим выставлением счетов страховым компаниям и корпоративным клиентам. Медицинские учреждения (особенно коммерческие) предъявляют достаточно жесткие требования к исполнителю лабораторных исследований. Наиболее важные из них следующие.

С учетом различного уровня информационного обеспечения медицинских учреждений современная ЛИС должна поддерживать два способа взаимодействия с ними: традиционный прием пакета заказов и выдачу результатов в бумажном виде, обмен информацией в электронном виде.

Для регистрации заказов, поступающих в виде бланков-заявок, ЛИС должна иметь механизмы пакетной и многостадийной регистрации, которые позволяют очень быстро провести первичную регистрацию заказов, достаточную для передачи большого количества проб на исследования. Дальнейшую регистрацию заказов можно выполнять параллельно с исследованиями. Данный механизм позволяет одному регистратору передавать на исследования несколько тысяч проб в час.

Обмен данными с медицинскими учреждениями в электронном виде может осуществляться способом, наиболее подходящим конкретному клиенту: на магнитных носителях, по электронной почте и через Интернет. Для первых двух случаев клиенту необходимо установить специальное программное обеспечение, позволяющее самостоятельно регистрировать заказы и передавать их в виде файлов вместе с пробами на магнитных носителях или по электронной почте, затем таким же образом получать файлы с результатами и выводить их на печать. При взаимодействии через Интернет клиент регистрирует заказы и просматривает результаты непосредственно на сайте лаборатории с помощью веб-интерфейса. ЛИС должна обеспечивать учет оказанных лабораторией медицинских услуг с выдачей результатов в виде журналов или с периодической передачей сведений в страховую систему медучреждения либо непосредственно в страховую компанию в электронном виде. По результатам работы с медицинскими учреждениями за отчетный период ЛИС должна выдавать полный комплект документов, необходимых для расчета по договорам.

На современном этапе КДЛ из технологического подразделения в составе предприятия становится самостоятельной структурой или отдельным предприятием в составе ЛПУ. В связи с этим экономическая эффективность становится важнейшей составляющей функционирования лаборатории. Сам факт существования КДЛ определяется экономическим расчетом. Новая функция КДЛ - экономически целесообразное существование на рынке лабораторных услуг. С этой точки зрения ЛИС обеспечивает получение всех необходимых данных для эффективного управления деятельностью КДЛ, включая:

Реальное решение перечисленных задач возможно только при использовании ЛИС. По своей экономической сущности ЛИС обеспечивает создание прозрачной модели производства лабораторных исследований в КДЛ для осуществления оперативного контроля над формированием переменных затрат, к которым в лаборатории относятся наборы реактивов, калибраторы, контрольные и расходные материалы (кюветы, моющий раствор, чистящий раствор, разводящий раствор и т.д.). Именно уровнем развития информационных технологий в КДЛ определяются в настоящее время эффективность обеспечения реактивами, расходными материалами, бесперебойность снабжения, учета расходования материалов, необходимых для производства анализов, и соответственно себестоимость анализов и экономический успех лаборатории.

Современная ЛИС в состоянии обеспечить как безопасность баз данных и пользовательских функций, так и конфиденциальность данных клиента и результатов исследований. Каждый пользователь ЛИС должен иметь строго определенные полномочия по работе только с определенными группами данных в ЛИС - это важнейшее требования по безопасности. В итоге пользователь имеет возможность выполнять разрешенные ему функции только с теми данными, к которым он допущен.

Информационные компьютерные технологии находят наибольшее применение в первую очередь там, где имеется большой объем выполняемой рутинной работы. КДЛ ежедневно выполняют огромное количество различных видов исследований. Объем обрабатываемой при этом информации достаточно велик. Типичная средняя КДЛ насчитывает 15 пользователей (специалистов лаборатории), исследующих примерно 10 000 проб в год и выполняющих по каждой пробе в среднем 5 тестов с определением 4 параметров в каждом. В крупных лабораториях одновременно может быть задействовано до 100 пользователей и более, поэтому информатизация деятельности КДЛ приносит более ощутимую практическую выгоду. Для КДЛ современная ЛИС является таким же незаменимым производственным инструментом для выполнения лабораторных анализов, как и автоматические анализаторы.

В регистрации результатов биохимических, иммунохимических и других лабораторных исследований доминируют фото- и рефлектометрические системы, что обусловлено значительным парком фотометрических приборов, отработанными методическими схемами их применения и производственными мощностями для производства этого оборудования.

Однако одной из очевидных тенденций модернизации лабораторной диагностики является все более широкое внедрение компьютерных и информационных технологий, в частности замена традиционных систем регистрации на комплексы, базирующиеся на подходах видеоцифровой регистрации (ВЦР). Масштабному внедрению видеоцифровых систем способствуют многие факторы, среди которых постоянно улучшающиеся технические характеристики приборов получения изображений - видеокамер и сканеров, их экономическая доступность, развитие и массовое использование информационных и коммуникационных технологий.

Помимо факторов, связанных с общими достижениями научно-технического прогресса, существуют и конкретные аналитические преимущества ВЦР перед традиционной фотометрией, которые позволяют получать дополнительную информацию об изучаемых объектах, совершенствовать имеющиеся и создавать новые лабораторные методики.

Эти преимущества в общем виде проиллюстрированы на рис. 3-2, где представлена схема, сопоставляющая в общем виде возможности технологии видеоцифровой регистрации и обычных фотометрических методов.

Рис. 3-2. Видеоцифровая регистрация и фотометрия применительно к однородным и неоднородным объектам

Системы ВЦР дают возможность получать изображение образца, представляющее собой совокупность количественно измеряемых сигналов, отвечающих большому количеству точек - пикселей аналитического объекта (например, лунки микропланшета или иммунохроматографической тест-полоски). При ВЦР на один объект приходится большое количество (от сотен до нескольких тысяч) регистрируемых цифровых характеристик, которое определяется пространственным разрешением соответствующего устройства. В случае однородных объектов при ВЦР эти характеристики усредняются (обычно берется не менее тысячи значений) и вычисляется оптическая плотность или коэффициент светоотражения, как и при обычной фотометрии.

Для неоднородных объектов ВЦР позволяет численно охарактеризовать получаемую картину по степени дисперсии (неоднородности) или другим параметрам, отражающим интенсивность прохождения аналитической реакции с последующим представлением результатов в зависимости от поставленных задач. Таким образом, возможность анализа изображения объекта позволяет либо установить наличие и исключить влияние артефактов - неоднородностей в однородном образце, либо, если неоднородность несет диагностически значимую информацию, получить ее аналитические характеристики, выраженные в численном виде.

Помимо этого, ВЦР обеспечивает сохранение первичного изображения, фиксирующего полную информацию об объекте в конкретный, определяемый лабораторной методикой момент времени, которое может быть названо первичным документом теста (ПДТ), что имеет самостоятельную ценность. Такое документирование и архивирование результатов обеспечивают возможность ретроспективного контроля выполненного исследования, что повышает ответственность персонала, может придать юридический статус исследованию и ставит барьер на пути ошибок и фальсификаций. Возможность возвращаться к ПДТ через некоторое время позволяет отслеживать динамику изменения лабораторных параметров, консультироваться при неоднозначных результатах, оценивать эффективность лечения, сравнивая непосредственно результаты. Немаловажное значение имеет и возможность передачи первичной информации (ПДТ) через Интернет, в том числе и при проведении анализов у постели больного и в полевых условиях, когда в неясных случаях соответствующими специалистами выносится компетентное заключение.

В качестве аппаратной части систем ВЦР могут использоваться два типа устройств - цифровые видеокамеры и сканеры. Каждое из этих устройств имеет свои достоинства и недостатки.

Видеоцифровые камеры компактны, позволяют получать качественные изображения, обеспечивают высокую скорость съемки, дают возможность конструировать малогабаритные мобильные с автономным питанием и более универсальные, чем сканеры, приборы. К недостаткам систем с видеокамерами относятся небольшое поле зрения и сложность создания равномерного освещения исследуемого объекта.

Сканеры являются готовым промышленным изделием, доступны по ценам, дают изображения высокого разрешения, обладают хорошей цветопередачей. Вследствие больших размеров и требований к электропитанию их используют в основном только как стационарное оборудование. Существенным достоинством сканерных систем является возможность работы с широко распространенными лабораторными тестами, проводимыми в 96-луночных планшетах.

На рис. 3-3 показаны варианты адаптированных к различным аналитическим объектам видеоцифровых систем получения изображения. Система на основе видеоцифровых камер «Рефлеком» (а) позволяет регистрировать результаты иммунохроматографических тестов (ИХ-тестов) в режиме отражения. Система «Рефлеком-Микро» (в) предназначена для работы с ИХ-тестами в полевых условиях. Система «Эксперт-Лаб» (б) создана на основе промышленного сканера.

Рис. 3-3. Модификации регистрирующих видеоцифровых устройств на основе видеоцифровой камеры: а - «Рефлеком&»; б - многофункциональная лабораторная система «Эксперт-Лаб»; в - анализатор «Рефлеком-Микро»

Программное обеспечение (ПрО) для систем ВЦР разрабатывается на основе универсальной схемы построения интерфейсов вне зависимости от типа устройства получения изображения. Алгоритмы обработки информации создаются в соответствии с характеристиками конечных результатов (изображений аналитических объектов) для конкретных типов реакций с выдачей результатов с учетом специфических требований практических лабораторий. На основе единых принципов построения ПрО удается создать многофункциональные устройства - программно-аппаратные комплексы, способные обеспечивать достоверную и объективную регистрацию результатов различных лабораторных исследований.

В практике лабораторной диагностики можно выделить два типа аналитических объектов и исследований, требующих различных подходов при регистрации прохождения реакции. Это исследования, проводимые на тест-полосках (ИХ-тесты, тесты «сухой химии»), и исследования, проводимые в матричном формате (иммунохимические тесты в 96-луночных микропланшетах и планшетах других форматов, исследования на основе микроматриц - микрочипов).

При использовании ИХ-тест-полосок результатом исследования является появление нескольких линий: контрольной, обозначающей пригодность теста, и тестовых, обозначающих наличие или отсутствие определяемого аналита. При применении полосок «сухой химии» в ходе исследования регистрируется изменение цвета расположенных на тест-полоске реагентных зон.

Для ИХ-тестов и полосок «сухой химии» аналитическими зонами (зонами интереса), в которых необходима оценка интенсивности реакций с помощью ПрО, являются линии и окрашенные зоны, которые несут значимую информацию.

На рис. 3-3а показано выделение аналитически значимой зоны ИХ-полоски и представление в рабочем окне этой программы гистограмм интенсивности линий на полоске после проведения теста. Интегральная интенсивность линий используется для автоматического определения положительных или отрицательных результатов теста. ПрО для ИХ-тестов предусматривает сохранение всей аналитической информации в цифровом виде в памяти компьютера, включая исходное изображение аналитической зоны тест-полосок, которое в данном случае является ПДТ. ПрО является универсальным и может быть адаптировано к любым иммуно-хроматографическим полоскам.

Тесты «сухой химии» для биохимического анализа крови и мочи широко используются в клинической лабораторной диагностике и являются традиционным объектом регистрирующих приборов на основе обычной рефлектометрии. Для этих объектов ВЦР обладает рядом преимуществ. Каждая зона интереса и изображение каждой полоски могут обрабатываться одновременно. Это дает системам ВЦР преимущества перед традиционными рефлектометрическими методами, такие как сохранение первичного изображения тест-полоски (ПДТ); возможность работать с произвольным количеством независимых каналов регистрации, т.е. анализировать несколько полосок одновременно; применимость этого подхода к различным типам тестов в режиме конечной точки и кинетическом режиме. Таким образом, гибкое ПрО для полосок «сухой химии» обеспечивает объективную интерпретацию результатов и получение информации в виде концентраций соответствующих аналитов.

Для исследований в матричном формате (аналитические объекты - микропланшеты или матрицы точек на мембране, стекле и других планарных носителях) зонами интереса являются отдельные лунки, или элементы, матрицы. Получение изображений 96-луночных планшетов из-за их значительных размеров и трехмерной (неплоскостной) геометрии возможно с помощью сканерной системы «Эксперт-Лаб». После получения изображения для каждой из лунок микропланшета или точек матрицы с помощью разработанных алгоритмов можно в численной форме определить или оптическую плотность содержимого лунки, или интенсивность окрашивания индивидуального пятна. По этим численным значениям можно определить концентрации соответствующих аналитов и представить их в любом необходимом виде.

Более сложные математические процедуры необходимы в тех случаях, когда в результате иммунологических реакций возникают неоднородные объекты. Такие реакции, как пассивная гемагглютинация, латекс-агглютинация, агглютинация эритроцитов, приводят к формированию в лунках осадков, характерных для каждого типа исследования, по наличию или отсутствию которых и определяется положительный или отрицательный результат реакции. Для каждого варианта таких исследований используется свой алгоритм обработки изображения.

Для оценки иммунохимических реакций (реакции «антиген-антитело» или более широко - реакции специфического связывания) разработаны и используются специализированные аналитические технологии, которые условно можно разделить на три группы.

Из этих методов наиболее востребованы в медицинской лабораторной практике иммуноферментный анализ, латекс- и гемагглютинация, турбидиметрия и нефелометрия. Во всех этих технологиях используются планшеты для микротитрования. ВЦР позволяет регистрировать результаты этих исследований с использованием одной многофункциональной лабораторной сканерной системы. Система позиционирования обеспечивает строгое пространственное расположение планшета и жестко фиксирует положение зон интереса после настройки. Все настройки сканера, соответствующие геометрическим характеристикам объекта и другим параметрам анализа, устанавливаются однократно и сохраняются в памяти компьютера для данного вида анализа.

Сканерная система «Эксперт-Лаб» является универсальным устройством и может обеспечивать документирование, объективизацию и интерпретацию результатов латекс-агглютинационных, гемагглютинационных, изосерологических исследований, а также применяться в качестве иммуноферментного ридера. ПО для всех этих методов построено по единому принципу и обеспечивает:

Единый принцип построения рабочего интерфейса программных модулей проиллюстрирован на рис. 3-4. Показаны варианты сохраняемых изображений всего планшета после проведения различных типов реакций.

Рис. 3-4. Схема основного рабочего окна программ сканерной системы «Эксперт-Лаб»

Диагностические системы на основе латекс-агглютинации широко распространены в лабораторной диагностике благодаря простоте и быстроте проведения анализа. Разработаны методы получения латексных частиц различного состава, размеров, цвета и свойств, а также способы сенсибилизации латексов разнообразными антигенами и антителами, что позволяет сконструировать практически любой диагностикум. Биологическая инертность латекса позволяет снизить возможность перекрестных неспецифических реакций, а также обеспечивает длительную сохранность готовых реагентов. Однако латексные тесты имеют ряд существенных недостатков, обусловленных быстрым протеканием и нестабильностью результатов реакции во времени. Необходимость визуальной регистрации результатов через строго определенное время, часто составляющее не более 2-3 мин, приводит к субъективности оценки результатов. Эти факторы ограничивают ценность и сужают область применения латексных тестов.

Задачи документирования результатов тестов ЛА через определенное время и объективизации интерпретации результатов могут быть решены с привлечением методов ВЦР. Удобным объектом постановки реакции с применением сканерной регистрации являются крышки планшетов для титрования с нанесенными на них конденсационными кольцами, которые представляют собой упорядоченную матрицу из 96 микролунок. Максимальный объем такой лунки составляет 30 мкл.

Соотношение реагент/образец определяется производителем и соответствует максимальной линейности системы. Именно поэтому необходимо подобрать объем реагента, не меняя данное соотношение. Оптимальным является общий объем 20 мкл (при эквивалентном соотношении 10 мкл образца/10 мкл реагента), так как при меньших объемах возникают трудности при пипетировании, а при больших объемах возможна кросс-контаминация соседних лунок.

Реакцию ЛА в крышках проводят следующим образом. В лунки помещают по 10 мкл латексного реагента и образца (контрольных сывороток, цельных и разведенных сывороток пациентов). Для полуколичественного определения концентрации аналита готовят серию двукратных разведений тестируемой сыворотки физиологическим раствором. Концентрация определяется как самое большое разведение тестируемой сыворотки с положительной реакцией (титр сыворотки), умноженное на чувствительность реагента (например, 6 мг/л - для СРБ).

Тщательно перемешивают и наблюдают отсутствие или наличие агглютинации при круговом покачивании крышки. Через заданный промежуток времени крышку помещают в позиционер сканирующего устройства. Полученное первичное изображение всей крышки сохраняется в памяти компьютера и служит основой для последующих цифровых операций с конкретными зонами интереса (контрастирования, увеличения, математической обработки).

Результаты расчета количества агглютинатов в образцах могут быть выражены с помощью числа, которое тем выше, чем больше обнаруженное количество конгломератов. Математический расчет и численное представление интенсивности агглютинации дают возможность количественной оценки результата реакции агглютинации и определения порогового значения для автоматической дискриминации положительных и отрицательных образцов.

Компьютерная программа позволяет также ввести и сохранить протокол анализа (расположение контрольных, тестируемых образцов, их разведения и дублирования). На рис. 3-5 показан вариант заполнения протокола анализа.

Рис. 3-5. Заполнение протокола анализа контрольных и калибровочных образцов, цельных проб, дублей, разведений исследуемых сывороток пациентов

На рис. 3-6 представлены результаты цифровой обработки изображения нескольких лунок с положительными и отрицательными образцами сывороток при определении СРБ: контрастирование и последующее визуальное отображение количества конгломератов (агглютинатов) в тестируемых образцах, рассчитанное с помощью математических методов.

Рис. 3-6. Лунки с тестируемыми положительными (А8) и отрицательными (А9) сыворотками:а - до программной обработки; б - после контрастирования; в - визуальное представление результатов математической обработки, отражающее количество конгломератов

Информация о наличии или отсутствии агглютинации для конкретного образца с помощью системы ВЦР фиксируется в строго определенное, соответствующее инструкции время и представляется и сопоставляется многократно в различных видах:

Получение объективных цифровых характеристик интенсивности реакции латексной агглютинации позволяет вести внутрилабораторный контроль этого типа исследований, что принципиально невозможно при традиционной визуальной регистрации. Применяются рассчитанное целевое значение интенсивностей в контрольных материалах и стандартный набор контрольных правил: предупредительный критерий - l_2s, далее - l_3s, 2_2s, R_4s, 4_ls, l0_x. Пример контрольной карты для СРБ показан на рис. 3-7.

Контрольная карта для определения СРБ методом ЛА с ВЦР

Рис. 3-7. Контрольная карта определения СРБ методом латекс-агглютинации с ВЦР

Реакция пассивной гемагглютинации широко используется в серодиагностике, по чувствительности этот метод сопоставим с иммуноферментным анализом. Хотя существуют наборы РПГА различной специфичности (для определения антител к возбудителю кори, иерсиниоза, бруцеллеза и некоторых других инфекций), однако наибольшее распространение имеют системы определения антител к Treponema pallidum для серодиагностики сифилиса, используемые многими лабораториями как основной тест. Эти системы, как и другие наборы РПГА, предполагают визуальный учет результатов, что является их существенным недостатком.

Автоматизированный учет результатов диагностики сифилитической инфекции методом РПГА обеспечивает повышение диагностической специфичности и чувствительности, позволяет исключить субъективный подход к интерпретации результатов.

Реакция РПГА основана на регистрации формирования агрегатов сенсибилизированных эритроцитов («зонтика») в лунках круглодонного планшета при наличии в сыворотке пациента специфических антител.

Программа «Эксперт-Лаб-РПГА» лабораторного комплекса позволяет осуществить дискриминацию результатов по стандартной 4-крестовой шкале. На рис. 3-8 показано соответствие внешнего вида агглютинации образца и заданного значения шкалы (составленные по данным экспертной оценки врачей КДЛ, данным литературы и инструкции производителя тест-систем).

Исследование проводят согласно инструкции производителя эритроцитарного диагностикума. Для получения воспроизводимых результатов необходимо учитывать результаты реакции через строго заданное время инкубации (для РПГА при определении антител к Tr. pallidum оптимально - 1 ч).

Так же как и для латексных тестов, наличие численной характеристики выраженности агглютинации позволяет определить воспроизводимость тестирования и на основании рассчитанных целевых значений проводить внутрилабораторный контроль качества.

Существуют разновидности реакции пассивной агглютинации, где вместо эритроцитов используются искусственно созданные желатиновые частицы с сорбированным на них соответствующим антигеном/антителом.

ПО «Эксперт-Лаб-РПГА» адаптировано к серии тест-систем на основе этого принципа с разработкой варианта программного обеспечения «Эксперт-Лаб Serodia». На рис. 3-9 представлены положительные, сомнительные и отрицательные результаты реакции агглютинации желатиновых частиц.

Рис. 3-9. Изображения положительных (), отрицательных (-) и сомнительных (/-) результатов определения антител к Tr. pallidum, HCV и HTLV в тесте агглютинации желатиновых частиц фирмы Serodia

Предложенный алгоритм оценки интенсивности гемагглютинации (образование «зонтика») может быть использован и для регистрации результатов других лабораторных методов, где в качестве индикаторных частиц используют эритроциты, например реакции торможения агглютинации (иначе - реакции нейтрализации вирусов).

В случае изосерологических анализов (определения группы крови) регистрируется агглютинация эритроцитов крови пациента в присутствии специфических антител, причем для каждого образца ставится несколько реакций с антителами к групповым антигенам А и В, резус-фактору.

Изосерологические исследования остаются одной из самых консервативных технологий в клинической лабораторной аналитике, что обусловлено их высокой значимостью. До сих пор нет однозначного решения вопросов визуализации и документирования этих тестов. По-прежнему самыми распространенными способами проведения этих исследований в нашей стране остаются ручные методы. Их известно три: 1 - на плоскости, 2 - в пробирках, 3 - в планшетах для микротитрования.

К недостаткам агглютинации на плоскости следует отнести невозможность определения слабых антигенов эритроцитов и низких титров гемагглютининов в сыворотке пациента; для некоторых исследований используют пробирочный метод и практически никогда - микропланшетную технологию. Во многом это связано со сложностью визуальной интерпретации агглютинации в этом формате, отсутствием специальных сканирующих устройств, более длительным временем проведения исследования, необходимостью предварительной обработки эритроцитов для приготовления суспензии.

В то же время микропланшетная технология имеет следующие преимущества:

Для регистрации результатов изосерологических исследований в круглодонных планшетах разработана программа «Эксперт-Лаб-Изосерология». Программа позволяет автоматически фиксировать наличие/отсутствие агглютинации при взаимодействии тестируемых эритроцитов с цоликлонами в каждой лунке и соответственно определять группу крови для каждого пациента. Видеоцифровая регистрация позволяет избежать стадии центрифугирования.

По результатам исследований оптимальным следует признать алгоритм проведения изосерологических исследований по системе АВ0 и Rh в микропланшете с видеоцифровой регистрацией. Описан вариант постановки, включающий типирование перекрестным методом (со стандартными эритроцитами).

В случае унифицированного расположения цоликлонов в планшете возможна автоматическая интерпретация группы крови для конкретной пробы крови. Используют алгоритм, приведенный на рис. 3-10. Показаны увеличенные изображения с выбором зоны интереса в лунках при определении различных групп крови с использованием цоликлонов в круглодонном планшете.

Рис. 3-10. Гемагглютинация в лунках круглодонного планшета при определении групп крови спомощью цоликлонов

Коммерчески доступный сканер может быть использован в качестве вертикального фотометра 96-луночных микропланшетов для ИФА. Большинство используемых в настоящее время тест-систем в качестве ферментной метки имеют пероксидазу хрена, субстрат - раствор 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ), содержащий перекись водорода. Образующиеся окрашенные продукты в кислой среде имеют максимальное поглощение при 450 нм.

Иммуноферментные исследования проводят согласно инструкциям производителя. ПО универсально и позволяет настраивать систему регистрации и дискриминации результатов в соответствии с любыми требованиями методик. Обеспечиваются варианты в режимах измерений оптической плотности, дискриминации по уровню «cut-off», рассчитываемому по различным формулам, количественных измерений по калибровочной кривой.

На рис. 3-11 показано окно регистрации результатов в режиме измерений по калибровочной кривой. Программа «Эксперт-Лаб-ИФА» позволяет вводить значения калибраторов, строить калибровочную кривую (могут быть использованы различные алгоритмы: линейно-кусочный, сплайн, линейная регрессия и др.) и выводить на экран значения концентраций исследуемых веществ.

Рис. 3-11. Калибровочная кривая и значения концентрации общего ПСА, рассчитанные при использовании линейно-кусочной аппроксимации

Помимо оптической плотности, сканерное изображение несет значительное количество дополнительной информации, недоступной при фотометрировании. При постановке ИФА возможны ошибки, связанные с неправильным заполнением лунок, наличием пузырьков, случайных загрязнений, выпадением в осадок субстрата в отдельных лунках. Для их исключения рекомендуют перед измерением просмотреть ИФА-планшет. Анализ сканерного изображения позволяет по наличию негомогенности окрашивания автоматически выявлять и маркировать такие лунки, что дает возможность идентифицировать образцы, требующие повторной постановки. Эта опция принципиально нереализуема для обычных анализаторов.

Сохранение и возможность повторного анализа изображения планшета дают возможность ретроспективного анализа неясных случаев и исправления ошибок интерпретации результатов, что выгодно отличает систему ВЦР от традиционных ридеров, которые после измерений сохраняют только по одной цифре - значению оптической плотности для каждого образца.

Применение ВЦР открывает возможности миниатюризации тест-систем и проведения мультианалитических исследований. Достаточно большое разрешение сканерной системы позволяет без труда зафиксировать наличие и оценить интенсивность агглютинации или прохождения других реакций в малых объемах. Разработаны специальные 12-луночные носители с объемом лунки не более 15 мкл, форматом матрицы аналитических зон 3x4, шагом, совпадающим с таковым стандартных микропланшетов. Для реакции ЛА в этих микропланшетах используется всего по 3 мкл образца и реактива. Исследования, проводимые в микропланшетах такого формата, с одной стороны, не требуют дополнительных приспособлений, с другой - значительно экономят дорогостоящие реактивы.

На рис. 3-12 показан такой 12-луночный микропланшет после проведения реакций ЛА. Программную обработку результатов проводят по тем же принципам, что и для 96-луночного микропланшета. При сохранении всех преимуществ и аналитических характеристик тестов удается снизить потребление реагентов более чем на порядок.

Рис. 3-12. Внешний вид 12-луночного микропланшета формата 3x4 с проведенной реакцией латексной агглютинации

Дальнейшие перспективы миниатюризации тест-систем предполагают уменьшение количества реагентов и образцов до десятых долей микролитров. С уменьшением объема образцов и реагентов встает проблема нанесения микроколичеств вещества, тем более что с переходом к количественным тестам требуется более высокая степень точности дозировки жидких объектов и позиционирования нанесенных линий или точек на носителе, а также высокая воспроизводимость этих параметров. Для таких целей обычные пипетки неприменимы, требуются специальные приспособления. В этом плане перспективной является технология пинового нанесения, т.е. перенос микрокапли, сформировавшейся на пине (микростержне) после погружения в образец, на носитель, где и протекает реакция. Подбором пинов удается добиться малого разброса объема микрокапель (CV - 0,8-7,8% для различных пинов). Рационально объединять одиночные пины в многопиновые системы - мультиаппликаторы.

Для различных лабораторных исследований в объемах реакционной смеси менее 1 мкл разработан полный аналитический комплекс, включающий систему позиционирования-смешивания и видеоцифровые регистрирующие устройства с программным обеспечением («Эксперт-Лаб» или «Рефлеком»), так как учет результатов реакции может быть выполнен только с помощью ВЦР. В данном случае визуальная регистрация неприменима.

Система позиционирования-смешивания состоит из аппликаторов для реагентов и образцов, соответствующих им микропланшетов и позиционера, обеспечивающего фиксированное положение микропланшетов, и носителя, на котором проводится реакция. При использовании системы после соответствующих аналитических реакций на носителе формируются матрицы точек формата 5×6, каждая из которых соответствует отдельной пробе. Далее проводят компьютерную обработку результатов по заданным алгоритмам. В подобном миниатюризированном формате могут быть проведены различные биохимические и иммунохимические тесты.

Возможны два варианта использования системы позиционирования-смешивания для различных лабораторных исследований.

Первый вариант - предполагается только нанесение образца на носитель. Носитель может содержать реагенты, которые вступают в реакцию с исследуемым веществом («сухая химия»), либо происходит иммобилизация образца на мембрану для дальнейших, например иммунохимических, исследований (иммунодотанализ). В этом варианте 30 капель одного объема (менее 0,5 мкл) одномоментно наносят на мембрану, формируя матрицу аналитических точек образца, имеющих фиксированное геометрическое положение на носителе.

Например, серийное измерение глюкозы в сыворотке крови с матричным дот-нанесением образцов проводят следующим образом. В микропланшет вносят образцы сывороток и калибраторы по 10 мкл в каждую лунку. Планшет и носитель с мембраной помещают в соответствующие отделения системы позиционирования. С помощью аппликатора капли образца переносят на мембрану, содержащую иммобилизованные реагенты для проведения глюкозооксидазной ферментативной реакции с формированием цветного пятна, время проявления которого составляет около 60 с. После этого носитель сразу же помещают в сканер для регистрации результатов. Вся процедура (после заполнения планшета) занимает не более 3 мин, причем результаты, представленные в электронной форме, сохраняются в базе данных или их можно распечатать.

Для регистрации результатов дот-анализа в микроматричном формате используют пакет ПО «Эксперт-Лаб-Видеодот» с автоматической геометрической фиксацией зон интереса, соответствующих матрице точек, формируемой с помощью системы позиционирования. Применяется система расчета интенсивности отраженного света от точек объекта для каждой зоны. Принцип «многозонного анализа» позволяет одновременно регистрировать результаты определений в каждой отдельной зоне независимо. Принцип организации основного окна ПО «Эксперт-Лаб-Видеодот» показан на рис. 3-13 на примере определения глюкозы. Калибровочная кривая отражает обратно пропорциональную зависимость средней интенсивности отраженного света для анализируемой зоны интереса и концентрации аналита. Концентрации глюкозы, рассчитанные по калибровочной кривой, представлены в таблице результатов.

Рис. 3-13. Окно программы «Эксперт-Лаб-Видеодот» после построения калибровочной кривой и введения пороговой величины

Интерфейс предполагает заполнение протокола для каждой серии исследований и каждого отдельного теста: задается расположение исследуемых образцов, контролей и калибраторов. На экране отображаются данные автоматической интерпретации результатов по заданному референсному интервалу.

Другой вариант применения системы позиционирования-смешивания - проведение реакций со смешиванием нескольких реагентов в геометрически фиксированных точках на поверхности носителя. Этот вариант позволяет разработать новые модификации методов для обнаружения аналитов с помощью реакции латексной агглютинации или для изосерологических исследований.

В ходе реакции из микропланшета аппликатором переносят капли реагента на носитель, с помощью позиционера фиксируя их положение. Такую же операцию проводят и с каплями образца. В результате каждая капля образца смешивается с каплей реагента, уже находящейся на носителе. Реакция проводится во всех 30 аналитических зонах одновременно, причем объем реакционной смеси не превышает 1 мкл.

Система позиционирования-смешивания позволяет варьировать объемы наносимых капель за счет использования аппликаторов с разными размерами пинов и изменять соотношения и количество реагентов, что открывает новые перспективы применения этого варианта микроматричного анализа в мультиплексном режиме для различных методов биохимии и иммунологии.

Примером варианта применения системы позиционирования-смешивания со смешиванием реагентов является проведение реакции латексной агглютинации для серийного определения С-реактивного белка в сыворотке крови. В соответствующие микропланшеты вносят по 10 мкл сыворотки и латексной суспензии. Затем аппликаторами последовательно переносят капли образцов и реагента на носитель, перемешивают и фиксируют результаты реакции с помощью анализатора. Результаты реакции учитывают с помощью ПО «Эксперт-Лаб-АгглютинацияМикро». Принципы построения пользовательского интерфейса и основного окна аналогичны описанным выше для программы «Эксперт-Лаб-Агглютинация».

Изучение аналитических характеристик миниатюризированных систем, основанных на применении мультиаппликаторов в различных исследованиях методом ЛА, показало, что они полностью соответствуют параметрам макрометодов, сохраняя все преимущества, которые дает ВЦР.

Видеоцифровая регистрация благодаря гибкости подходов при разработке регистрирующих систем, единым принципам построения программного обеспечения для объектов различных форматов позволяет решать практически любые задачи лабораторной диагностики. Для сканерных систем дальнейшее развитие состоит в увеличении разнообразия проводимых исследований в 96-луночных планшетах. Это иммунотурбидиметрические и биохимические исследования с вертикальной фотометрией, микробиологические тесты. Также будут развиваться уже используемые варианты цифровой регистрации разнообразных исследований на тест-полосках в формате иммуноблота: например, Вестерн-блот или Лайн-блот (с нанесением реагентов в виде полос).

Системы с видеокамерами развиваются в направлении миниатюризации регистрирующих устройств с разработкой мобильных и даже так называемых карманных форматов с использованием иммунохроматографических тестов для проведения анализов «в месте оказания врачебной помощи» или домашних условиях. В этой сфере развивается тенденция к использованию встроенных в мобильные телефоны видеокамер. Для таких внелабораторных систем особую важность приобретают сохранение первичной информации (ПДТ) - изображения аналитического объекта и возможность дистанционного консультирования, так как исследования будут проводить люди, не обладающие профессиональными навыками лабораторных работников.

Развитие подходов ВЦР гармонично вписывается в концепцию бурно развивающейся телемедицины. Это связано с тем, что аналитическая информация при использовании ВЦР уже имеется в компьютерном виде и легко может передаваться по современным коммуникационным системам - через Интернет или с помощью мобильной телефонии. С использованием подобного алгоритма могут быть организованы профильные лабораторные сети с вертикально интегрированной системой контроля качества. И в этом случае очевидна важность передачи и сохранения ПДТ.

Кроме того, возможность передачи первичного изображения аналитического объекта позволяет перейти на следующую ступень, обеспечиваемую развитием информационных технологий, - дистанционную обработку изображений. При этом подходе на месте проведения исследования (в полевых условиях, возле постели больного) получается только изображение аналитического объекта, которое передается на сервер, где происходит его обработка и получается результат, который, в свою очередь, передается обратно, к месту проведения исследования. В этом случае может быть обеспечена передача информации и консультативной помощи из единого центра. Применение современной аналитической технологии - видеоцифровой регистрации - предоставляет специалистам новые возможности совершенствования качества лабораторного обследования.

Проточная цитометрия - высокотехнологичный метод быстрого измерения характеристик клеток. Проточная цитометрия основывается на арсенале флюоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и внутриклеточных процессов. Этим методом исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов. В свою очередь, от классической биохимии и молекулярной биологии цитометрию отличает возможность анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры для каждой клетки. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. В клинической практике наиболее часто проточную цитометрию используют для исследования клеток крови и костного мозга, их антигенного состава, функциональной активности, количества ДНК и РНК, определения уровня продукции цитокинов.

Существуют два направления: проточная цитометрия и проточная цитометриясортировка. Первое представляет аналитический подход, второе позволяет отобрать интересующие исследователя субпопуляции клеток, основываясь на аналитических возможностях первого, и в дальнейшем проводить работу с отобранными субпопуляциями. В последнее время позиции проточных цитометров как сортировщиков поколебались за счет появления магнитной сепарации, но целый ряд научных исследований невозможен без их использования. К таким исследованиям можно отнести сортировку индивидуальных хромосом, получение тетраном и др.

Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики. Во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, а при использовании ДНК-цитометрии - и по генотипу входящих в них клеток. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано с анализами именно такого рода. Во-вторых, это возможность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10^-5-10^-7, что стало возможным благодаря огромной производительности. Современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 10 тыс. клеток в секунду.

Области применения проточной цитометрии сегодня весьма разнообразны. Первоначально интенсивно развивались способы количественного анализа внутриклеточных компонентов, таких как ДНК и РНК. Работа в данном направлении привела к созданию методов анализа параметров клеточного цикла. В свою очередь, это послужило фундаментом для разработки методик анализа делящихся клеток и клеток с аномальным содержанием ДНК. Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволила судить о морфологических характеристиках клеток (размере, соотношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток).

Развитие гибридомной технологии привело к тому, что появился такой инструмент, как моноклональные антитела (МА). МА предоставили возможность типировать клетки не только по морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для строго определенных клеток и их функционального состояния. В различных лабораториях мира были получены МА к одним и тем же антигенам, авторы присвоили им свои собственные названия. Это привело к тому, что возникла путаница, исследователи говорили об одних и тех же антигенах клеточной поверхности, но называли их по-разному. Во избежание этого в начале 1980-х гг. было созвано Международное рабочее совещание по антигенам лейкоцитов человека и предложено объединить МА в группы, или кластеры, исходя из того, какую антигенную структуру на клеточной поверхности они распознают. Таким образом, первоначальный смысл понятия «кластер дифференцировки» (Cluster of Differentiation - CD) - это набор моноклональных антител, которые распознают одну и ту же структуру на клеточной поверхности независимо от эпитопной специфичности. Со временем это понятие видоизменилось, и многие исследователи понимают под CD саму структуру на клеточной поверхности. Исходя из изложенного выше становится понятно, что для эффективного использования МА должны быть кластеризованы, т.е. внесены в реестр известных МА и отнесены к определенному кластеру дифференцировки. Для этого каждые МА должны пройти проверку в нескольких независимых лабораториях, где должно быть показано, что они взаимодействуют с определенными клетками и распознают определенную структуру на их поверхности. В настоящее время известно более 350 основных кластеров дифференцировки клеток человека. Использование МА изменило подходы к иммунофенотипированию клеток. Меченные флюорохромами МА позволяют проводить как качественный, так и количественный анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов.

Как отдельное направление развивается исследование активности внутриклеточных ферментов. Это направление получило название «проточная цитоэнзимология». Разработан ряд реагентов, представляющих собой синтетические субстраты для измерения активности внутриклеточных ферментов. Новые флюорогенные субстраты позволяют оценить активность большего количества ферментов по сравнению с доступными ранее субстратами. Преимущество данного подхода в том, что при сопоставлении уровня активности ферментов нормальных клеток с уровнем активности клеток, вовлеченных в патологический процесс, могут быть обнаружены различия, позволяющие идентифицировать поврежденные клетки и исследовать процессы, протекающие в них.

Сочетание различных флюорохромов сделало возможным количественное и качественное исследование таких физиологических внутриклеточных параметров, как рН (флюоресцеин и 7-гидроксикумарин), концентрация свободных ионов кальция (Fura-2, Indo-1, Fluo-3), уровень окислительных процессов, активация митохондрий, потенциал наружной мембраны клеток, процессы, связанные с апоптозом, и т.д. Достижения в различных областях молекулярной биологии, биохимии и медицины позволяют изучать с помощью проточной цитометрии содержание секретируемых цитокинов в сыворотке крови с помощью мультиплексного анализа, локализацию антигенспецифичных клонов клеток с помощью тетрамер. Существуют методы, позволяющие с помощью проточной цитометрии измерять функциональные показатели, такие как фагоцитарная активность, апоптоз, экспрессия цитокинов и др. Все это создает предпосылки для современных исследований всего комплекса внутриклеточных процессов на уровне отдельных клеток.

Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью и высоким уровнем автоматизации, простотой эксплуатации и имеют небольшие размеры - все это позволяет рассматривать их не только как исследовательские, но и как клинико-диагностические инструменты.

В основе проточной цитофлюориметрии лежат фотометрические и флюоресцентные измерения отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света (рис. 3-14).

Рис. 3-14. При пересечении лазера потоком клеток регистрируются прямое, боковое светорассеяние и спектр эмиссии, испускаемый флюоресцентным красителем

Методом проточной цитометрии можно измерять следующие параметры.

Фотометрические каналы используются для оценки размеров клетки и внутриклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размеру, по-разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с размерами частиц, характер рассеивания меняется, световая волна огибает частицу, взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на небольшой угол - малоугловое (1-19) или прямое (FS или FSC) светорассеяние (рис. 3-15). Такой тип рассеяния при взаимодействии света с поверхностью клеток позволяет оценить их размер.

Рис. 3-15. Схема канала прямого светорассеянияЕсли размер частиц меньше длины волны облучающего монохроматического света лазера (например, внутриклеточные структуры), существенное количество света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние, SS или SSC) (рис. 3-16).

Рис. 3-16. Схема канала бокового светорассеяния

При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния можно выделить все клеточные популяции лейкоцитов. В этом случае удается определить физические свойства каждой неокрашенной клетки (размер и сложность структуры), таким образом разделить анализируемую клеточную популяцию на отдельные субпопуляцииОсновной формой отображения результатов в процессе накопления данных являются двухпараметрические гистограммы распределения. Чаще всего именно на гистограммах отмечается гейт (от англ. gate - ворота). Гейт - это логическое ограничение, используемое для селекции событий при анализе по нескольким скоррелированным параметрам. Параметры клеток, попавших внутрь отмеченного гейта, будут отображаться на других гистограммах и цитограммах, а данные о клетках, не попавших в гейт, будут проигнорированы.

Флюоресцентные каналы применяют для изучения клеточных маркеров, для чего используют моноклональные антитела (МА), меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток. После окрашивания клеток МА происходят специфическое связывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Техника регистрации состоит в следующем. При облучении меченых клеток лазером с длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того, флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету. Как правило, регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускаемый флюоресцентный сигнал всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения. В проточной цитофлюориметрии применяют множество флюоресцентных красителей. Моноклональные антитела, меченные различными флюорохромами, различаются как по специфичности их молекулярного связывания, так и по оптическим характеристикам: по спектрам поглощения и соответственно возбуждения флюоресценции, величинам молекулярных коэффициентов экстинкции, спектрам и квантовым выходам флюоресценции. В зависимости от того, какими лазерами укомплектован прибор, подбирают флюоресцентные красители (табл. 3-1).

Таблица 3-1. Флюорохромы, наиболее часто используемые для прямой конъюгации с моноклональными антителами

Количественный анализ интенсивности иммунофлюоресценции служит для точного подсчета количества определенных молекул внутри клетки или на ее поверхности. Разработана группа методов, основанных на детекции исследуемых молекул с помощью меченых моноклональных антител. Количественный анализ некоторых маркеров раскрывает полезную клиническую информацию. Например, опухолевые клетки, относящиеся к предшественникам В-лимфоцитов, можно дифференцировать от нормальных предшественников и зрелых В-лимфоцитов по высокой плотности экспрессии CD10 или CD38 соответственно и низкой экспрессии CD24 и CD45; высокая экспрессия CD10 клетками острого В-клеточного лимфобластного лейкоза является полезным признаком для выявления минимальной остаточной болезни. Количественный анализ флюоресценции - косвенная мера определения количества антигенных структур, способных связаться с определенным меченым антителом. Калибровка интенсивности флюоресценции связывает интенсивность сигнала флюоресценции с количеством меченых моноклональных антител, присоединившихся к клетке.

Учитывая, что интенсивность флюоресценции от каждой конкретной клетки зависит от количества меченых моноклональных антител, связавшихся со специфическими антигенами на поверхности лимфоцитов, средняя интенсивность флюоресценции популяции клеток (MFI - Mean Fluorescence Intensity) может служить количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) на клетках.

С помощью современных проточных цитофлюориметров можно одновременно измерить спектр эмиссии до десяти различных флюорохромов. Результаты измерений по каналам флюоресценции, как правило, отображаются в виде двухпараметрических гистограмм. При анализе двухпараметрического графика по каналам флюоресценции оценивают процент клеток, несущих тот или иной маркер, одновременную экспрессию на клетках двух и более различных антигенов, а также по средней интенсивности флюоресценции меченых антител, соединенных с клеткой, можно судить о плотности экспрессии клеточных антигенов (рис. 3-17).

Рис. 3-17. Периферическая кровь больного хроническим лимфолейкозом. Слева точечный график, отражающий события в лимфоцитарном гейте, характеризующий экспрессию В-клеточного антигена CD20, меченного фикоэритрином (РЕ), и CD43, меченного флюоресцеинизотиоционатом (FITC). В верхнем левом квадранте отображены клетки, которые несут только РЕ, меченные CD20, - это нормальные В-лимфоциты, их 4,84%. В правом нижнем квадранте - клетки, экспрессирующие только CD43, - это Т-лимфоциты, их 12,46%. В правом верхнем квадранте находятся события, позитивные по РЕ и FITC, - это клетки, ко-экспрессирующие CD20 и CD43 (опухолевые клетки В-клеточного хронического лимфолейкоза), их 82,36%. Следует обратить внимание, что средняя интенсивность флюоресценции CD20 РЕ опухолевой популяции значительно ниже, чем популяции нормальных В-лимфоцитов, что также характерно для В-клеточного хронического лимфолейкоза

Материалом для анализа методом проточной цитофлюориметрии могут служить любые микрочастицы, находящиеся в суспензии. Наиболее часто объектом исследования являются клетки крови и костного мозга. Также могут быть изучены клетки выпотных жидкостей, бронхоальвеолярного смыва, ликвора, гомогенизированные образцы тканей, клеточная суспензия, полученная при аспирационной тонкоигольной пункции лимфатических узлов и селезенки, а также хромосомы и бактерии. Возможно исследование цитокинов в сыворотке крови и тканях.

Предпочтительнее для исследования клеток крови и костного мозга использовать пробирки с калиевыми солями ЭДТА либо, при необходимости исследования функциональной активности клеток, гепарин. Существенным этапом подготовки проб для анализа является выделение из образца только тех клеток, которые интересуют исследователя. Первое, что может помешать анализу чистой лейкоцитарной популяции, - это эритроциты. С помощью лизирующих растворов либо выделения лейкоцитарной фракции на градиенте плотности происходит удаление эритроцитов из образца, и для анализа становятся доступны только ядросодержащие клетки крови или костного мозга. При исследовании костного мозга и гомогенизатов тканей важно, чтобы анализу не мешали конгломераты клеток соединительной ткани, - для этого используют специальные фильтры. При иммунофенотипировании клеток костного мозга и периферической крови у больных с парапротеинемиями важно снизить неспецифическое связывание меченых антител белками плазмы крови, - для этого используют дополнительное отмывание клеток фосфатно-солевым буфером.

Метод проточной цитофлюориметрии позволяет одновременно оценивать до миллиона клеток. Позитивной считается область, насчитывающая не менее 50 событий. Таким образом, чувствительность метода проточной цитофлюориметрии - 1 на 20 000 клеток. Метод многоцветовой проточной цитометрии позволяет детектировать до 18 параметров клетки одновременно со скоростью до 10 000 тысяч клеток в секунду. Современные цитометры, как правило, оборудованы тремя и более ФЭУ (от 3 до 10), что позволяет в одном образце периферической крови проанализировать экспрессию основных маркеров практически всех клеток крови и костного мозга. Чем большее количество меченых моноклональных антител, связавшихся с клеткой, можно проанализировать в одном образце, тем выше специфичность метода. Все это привело к формированию многопараметрического анализа в цитометрии.

Основным преимуществом проточной цитометрии перед морфологическими методами исследования является возможность оценки большого количества клеток за короткий промежуток времени. Кроме того, проточная цитофлюориметрия дает возможность выявлять иммунофенотип различных субпопуляций, лимфоцитов, линейную принадлежность бластов, прогностические маркеры, определять аберрантный фенотип опухолевых клеток, чего невозможно добиться при классическом морфологическом исследовании клеток.

По сравнению с иммуноцитохимическими и иммуногистохимическими исследованиями проточная цитофлюориметрия является менее трудоемким, более информативным методом, также преимуществом является быстрота исполнения (1-3 ч). Кроме того, проточная цитометрия существенно экономичнее иммуногистохимии и иммуноцитохимии.

В сравнении с молекулярными методами диагностики преимущества проточной цитометрии - скорость исследования и экономичность. Также при определении минимальной остаточной болезни проточная цитометрия дает возможность детектировать только жизнеспособные клетки и исключать из зоны анализа мертвые клетки, в то время как методы молекулярной диагностики применительно к диагностике минимальной остаточной болезни основаны на выявлении ДНК независимо от того, принадлежит она погибшим или еще жизнеспособным клеткам.

Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии позволяет охарактеризовать клетки с помощью МА или каких-либо других флюоресцентных зондов и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию набора клеточных маркеров и происходящих в них процессах. Однако многие маркеры могут экспрессироваться на различных типах клеток, и определять их наличие следует в режиме не менее чем двухцветного анализа.

Важной проблемой является отсутствие стандартных диагностических панелей, поэтому не всегда при постановке первичного диагноза в одной лаборатории оценку минимальной остаточной болезни при гемобластозах можно провести в другой.

Проточная цитометрия уступает в чувствительности и специфичности молекулярно-генетическим методам исследования в дифференциальной диагностике Т-клеточных опухолевых заболеваний и при оценке минимальной остаточной болезни при острых лейкозах миелоидной направленности и Т-клеточной линейности.

Для оценки плотности рецепторов существуют коммерческие наборы для калибровки приборов, однако они дают возможность оценить только один флюорохром и очень дорого стоят. При этом оценка плотности экспрессии отдельных антигенов повышает информативность метода проточной цитофлюориметрии в диагностике и дифференциальной диагностике гемобластозов. Интенсивность флюоресценции от каждой конкретной клетки зависит от количества меченых моноклональных антител, связавшихся со специфическими клеточными антигенами, следовательно, средняя интенсивность флюоресценции популяции клеток (MFI) может служить количественным критерием, характеризующим плотность клеточных рецепторов. Однако средняя интенсивность флюоресценции, детектируемая прибором, зависит не только от количества меченых моноклональных антител, присоединившихся к клетке, но и от собственной интенсивности свечения флюорохромов, интенсивности лазеров и чувствительности детекторов. Следовательно, оценку плотности рецепторов по MFI можно использовать лишь как сравнительный метод, применяемый только на одном приборе в условиях конкретной лаборатории.

В клинической практике проточную цитофлюориметрию применяют:

Успехи фундаментальной иммунологии, основанные на достижениях молекулярной биологии и генной инженерии, позволили уточнить иммунопатогенез аллергических, аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний. В то же время возросшие возможности проточной цитометрии расширили представления о необходимом перечне популяций лимфоцитов, исследование которых целесообразно при оценке клеточного звена иммунитета.

Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции или какие-либо другие воздействия сопровождается значительными изменениями субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к изменению абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуляций, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных молекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров. Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции является модуляция экспрессии функционально значимых молекул. Не менее важным является и изменение абсолютного количества иммунокомпетентных клеток в периферической крови.

Определение субпопуляционного состава, или фенотипа, лимфоцитов как одной из основных популяций иммунокомпетентных клеток в настоящее время является важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов, происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий дифференцировки, пролиферации, активации или программируемой клеточной гибели (апоптоза). Абсолютное и относительное количество клеток, имеющих тот или иной фенотип, является конечным результатом иммунофенотипирования.

Разработка современных цитометров, успехи в химии флюоресцентных красителей, открытие новых CD-маркеров, усовершенствование программного обеспечения позволили проводить анализ фенотипа иммунокомпетентных клеток как рутинную процедуру и получать наиболее полную и достоверную информацию.

Это позволяет локализовать и отследить процессы, протекающие в организме, изучить их, а значит, адекватно на них реагировать. Как следствие, разрабатываются новые подходы к коррекции активности патологически измененных клеток и процессов, которые они определяют.

В течение последних 20 лет в практике КДЛ определение показателей, отражающих количественное содержание пяти основных популяций лимфоцитов в периферической крови (Т-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, В-клеток и NK-клеток), проявило недостаточную их информативность. С другой стороны, интенсивное изучение патогенеза различных заболеваний выявило ключевую роль активированных лимфоцитов, регуляторных Т-клеток, субпопуляций В- и NK-клеток. В связи с этим для оценки иммунного статуса при иммунофенотипировании лимфоцитов наряду с основными пятью популяциями целесообразно расширить анализ за счет малых субпопуляций лимфоцитов и пулов активированных клеток. Технические и методические возможности для этого у практических лабораторий появились. Так, если ранее для определения цитотоксических Т-лимфоцитов считалось достаточным использовать только один маркер - CD8, согласно современным представлениям необходимо одновременное исследование четырех маркеров - CD8, CD4, CD3 и CD45. Реализация такого подхода возможна только при использовании многоцветового цитометрического анализа. Однако появление новых лабораторных показателей, их внедрение в рутинную практику требует стандартизации протокола определения показателей и значений нормы.

Популяцией лимфоцитов, отвечающей за продукцию антител, являются В-клетки. Каждый лимфоцит, относящийся к В-клеткам, запрограммирован на продукцию антител одной-единственной специфичности, и эти антитела присутствуют на его поверхности в качестве рецептора для соответствующего антигена. Один В-лимфоцит несет на своей поверхности примерно 10⁵ идентичных молекул антител. Данные антитела называют поверхностными, или мембранными, иммуноглобулинами.

Основной формой мембранных иммуноглобулинов являются иммуноглобулины класса М (IgM). Они экспрессируются на мембране всех зрелых В-лимфоцитов, которые не имели контакта с антигеном. Однако на поверхности В-клеток, дифференцировка которых уже завершилась, присутствуют и иммуноглобулины класса D (IgD). В процессе формирования иммунного ответа происходит переключение изотипов мембранных иммуноглобулинов на IgG, IgA, IgE.

Кроме мембранных иммуноглобулинов, В-лимфоциты экспрессируют целый ряд мембранных маркеров, которые, во-первых, необходимы для формирования В-клеточного рецептора и играют важную роль в передаче сигнала в процессе распознавания антигена, во-вторых, являются маркерами линейной принадлежности B-клеток, что особенно полезно при идентификации данной популяции лимфоцитов. К таким маркерам прежде всего относятся CD19 и CD21. Данные молекулы формируют ко-рецепторный комплекс, в который вовлечен также и CD81.

CD19-антиген, так же известный как B4, представляет собой мембранный гликопротеин с молекулярной массой 95 кДа. CD19 участвует в регулировании развития B-лимфоцитов, активации и их дифференцировке. Эта молекула экспрессируется на всех нормальных B-клетках, включая про-B-лимфоциты, но исчезает у плазматических клеток. Молекула CD19 отсутствует на мембране нормальных T-, NK-клеток, моноцитов и гранулоцитов. В связи с этим данный антиген рекомендуют для количественной оценки общей популяции B-клеток.

CD21-антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 145 кДа. Он принадлежит к семейству белков, регулирующих активность комплемента. CD21 (CR2) является рецептором для C3d-компонента комплемента и вируса Эпштейна-Барр. Данный антиген присутствует на зрелых B-лимфоцитах и отсутствует на T-лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах. Молекула CD21 вовлечена в активацию и пролиферацию B-лимфоцита.

Кроме перечисленных выше структур, к пан-В-клеточным антигенам относят такие молекулы, как CD20 и CD22.

CD20-антиген (Bp35) является интегральным негликозилированным мембранным белком с четырьмя трансмембранными доменами. Существуют три изоформы CD20 в зависимости от молекулярной массы (33, 35 и 37 кДа), которые являются результатом дифференцированного фосфорилирования внутри цитоплазматических доменов. Данная молекула является Са²⁺-каналом и участвует в активации и пролиферации В-клеток за счет регуляции трансмембранной проводимости ионов Ca²⁺. Молекула CD20 присутствует на всех нормальных B-лимфоцитах периферической крови, лимфатических узлов, селезенки, миндалин и костного мозга, но отсутствует на плазматических клетках. Хотя CD20 первоначально был описан как B-клеточный линейный маркер, оказалось, что небольшая субпопуляция Т-клеток человека экспрессирует CD20 в низкой плотности, причем B-клетки экспрессировали CD20 в высокой плотности (CD20^bright), а T-клетки - в низкой (CD20^dim) и составляли 2,4±1,5% лимфоцитов периферической крови. Хотя оценка экспрессии CD20 полезна при характеристике B-клеток, необходимо достаточно осторожно подходить к интерпретации получаемых результатов. Особенно это относится к случаям иммунофенотипирования клеток костного мозга. Сходная проблема может возникнуть при изучении клеток периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом. Молекула CD20 является мишенью для терапии неходжкинских В-клеточных лимфом.

CD22-антиген (BL-CAM) - трансмембранный гликопротеин, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов. Данная молекула экспрессируется в виде двух изоформ: α-формы (130 кДа) и β-формы (140 кДа). CD22-антиген экспрессируется в цитоплазме B-клеточных предшественников и на поверхности зрелых B-лимфоцитов. Экспрессия CD22 исчезает после активации B-клеток предшествующей стадии созревания плазматической клетки. Молекула CD22 отсутствует на T-лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах периферической крови.

В настоящее время среди В-лимфоцитов выделяют три основные субпопуляции: В-1, В-2 и В-клетки памяти. Достаточно важная роль при данном делении отводится молекуле CD5.

Кроме роли, связанной с передачей сигналов при активации, молекула CD5 расценивается как возможный маркер B-лимфоцитов, позволяющий различать их субпопуляции: CD5⁺ B-клетки (B-1-клетки) и обычные CD5^- B-клетки (B-2-клетки). B-1-клетки вызывают значительный интерес вследствие ассоциации с продукцией аутоантител, а также с аутоиммунной патологией. Значительная роль B-1-клеток была отмечена при ревматоидном артрите, системной красной волчанке (СКВ) и синдроме Шегрена. Увеличение количества CD5⁺ B-лимфоцитов наблюдали у пациентов, страдающих миастенией, инсулинозависимым диабетом и тиреоидитом Хашимото. В табл. 3-2 приведен список заболеваний, при которых определение относительного уровня В-1-лимфоцитов является диагностически значимым (рис. 3-18).

Таблица 3-2. Заболевания, при которых определение относительного уровня В-1-лимфоцитов является диагностически значимым

Рис. 3-18. Гистограмма распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферической крови. Субпопуляции В-1-лимфоцитов у пациента с аутоиммунным тиреоидитом: а - до лечения; б - в процессе лечения

Следующей субпопуляцией В-лимфоцитов являются так называемые В-клетки памяти. Идентификация CD27 как маркера B-клеток памяти позволила надежно и эффективно идентифицировать в периферической крови нативные В-клетки (IgM⁺CD27) и B-клетки памяти (CD27⁺).CD27-антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин в виде гомодимера из двух мономеров с молекулярной массой 55 кДа, связанных дисульфидными мостиками. CD27 принадлежит к семейству генов-рецепторов фактора некроза опухоли. CD27 антиген найден на медуллярных тимоцитах, периферических T-лимфоцитах, активированных B-лимфоцитах и NK-клетках. Его лигандом является молекула CD70. Взаимодействие CD27 с его лигандом CD70 на T-клетках является одним из условий дифференцировки B-клеток в плазматические клетки. Отсутствие IgDCD27⁺ B-клеток памяти в значительной степени объясняет нарушение продукции иммуноглобулинов, несмотря на функциональную передачу сигналов молекулой CD40 у пациентов с X-связанным гипер-IgМ-синдромом.

Гуморальный иммунный ответ играет важную, а порой и критическую роль в устранении внутри- и внеклеточных патогенов. Этот процесс осуществляется за счет дифференцировки зрелых B-клеток в плазматические клетки, которые секретируют большие количества иммуноглобулинов. Однако большинство антигенов вызывают иммунную реакцию лишь при наличии и участии Т-лимфоцитов. Это относится к белковым и клеточным антигенам, а также к вирусам, которые объединяют в понятие «Т-зависимые антигены». Лишь небольшое количество антигенов способно вызывать иммунный ответ без участия Т-клеток. Некоторые бактериальные липополисахариды при достаточно высокой концентрации способны к поликлональной активации значительной части популяции В-лимфоцитов, т.е. для такой стимуляции антигенная специфичность роли не играет. Линейныеантигены,медленно распадающиеся в организме и имеющие организованную определенным образом и часто повторяющуюся детерминанту (полисахарид пневмококков, полимеры D-аминокислот, поливинилпироллидон), также способны непосредственно стимулировать В-лимфоциты. Индуцируемый Т-независимыми антигенами иммунный ответ практически не сопровождается формированием клеток памяти. При иммунном ответе на Т-независимые антигены вырабатываются IgМ и эффективность Т-независимого ответа во много раз ниже. В свою очередь, Т-зависимые антигены при отсутствии Т-клеток лишены иммуногенности. При ответе на эти антигены требуется подключение Т-лимфоцитов. Т-зависимые антигены обеспечивают и определяют кооперативное взаимодействие В- и Т-клеток, в результате чего происходит переключение синтеза с IgM на IgG.

Выделяют два пути образования различных фракций антител: T-зависимый путь в герминальных центрах и T-независимый путь вне герминальных центров. Точная функция второго пути и генерирование IgM⁺ CD27⁺ B-клеток в настоящее время окончательно не выяснены. Однако IgM⁺ CD27⁺ B-клеток играют важную роль в гуморальном ответе против T-независимых патогенов, например инкапсулированные бактерии.

Активация зрелых B-клеток с T-зависимым антигеном приводит к образованию плазматических клеток двумя независимыми путями дифференцировки. Активированные B-клетки могут войти в экстрафолликулярные пролиферативные центры, где они быстро дифференцируются в короткоживущие плазматические клетки, секретирующие IgM. С другой стороны, активированные B-клетки могут попасть в герминальный центр, где происходят различные молекулярные перестройки: соматические гипермутации, переключение изотипов иммуноглобулинов и отбор высокоаффинных вариантов. Антигенселективные В-клетки герминального центра являются предшественниками двух типов клеток: высокоаффинных В-клеток памяти и долгоживущих плазматических клеток, которые отвечают за долгосрочную гуморальную устойчивость.

Помимо перечисленных молекул рецепторного и ко-рецепторного комплекса, на поверхности В-клеток экспрессируются антигены главного комплекса тканевой совместимости класса II (HLA-DR). Эти молекулы принимают участие в представлении антигенов, а В-клетки являются антигенпредставляющими клетками. Однако HLA-DR-антигены также представлены на активированных Т- и NK-клетках, что объясняется несовпадением относительного количества CD3CD19⁺ В-клетки и CD3-HLA-DR⁺-клетки при некоторых патологиях.

Оценка относительного количества В-клеток является одним из важных диагностических признаков. При воспалительных заболеваниях наблюдается значительное снижение количества В-клеток. Особенно ярко это выражено при остром панкреатите, хроническом пародонтите и тонзиллите, гнойном осложнении травм. Противоположный эффект наблюдается при острых и хронических формах гепатитов B и C.

Развитие и протекание иммунологических процессов в популяции В-клеток сопровождается количественными и качественными процессами. Активация В-клеток сопровождается изменением экспрессии антигенов CD80 и CD86.

CD80-антиген (B7, BB1) является высокогликозилированным одноцепочечным белком, его внеклеточная область состоит из двух иммуноглобулиноподобных доменов. Эта молекула имеет молекулярную массу 60 кДа, и лигандами для нее служат две структурно-подобные молекулы, экспрессируемые на T-лимфоцитах, а именно CD28 и CD152 (CTLA-4). При активации B-лимфоцитов in vitro антиген CD80 экспрессируется после 24-часовой стимуляции и достигает максимального уровня к 48-72 ч. Данный антиген не экспрессируется на большинстве покоящихся B-клеток периферической крови, но определяется на отдельных субпопуляциях активированных B-клеток. Антиген CD80 также экспрессируется на HTLV-1 трансформированных T-клетках и активированных моноцитах. Контакт CD80 с лигандами обеспечивает проведение ко-стимуляторных сигналов при активации T-клеток.

CD86-антиген (B7-2, B70) - также трансмембранный одноцепочечный гликопротеин, по своей структуре подобный CD80. Его молекулярная масса составляет 80 кДа. Внеклеточная область состоит из иммуноглобулиноподобных доменов: одного V-типа и одного C-типа, на которых находятся 8 потенциальных сайтов для N-гликозилирования. Цитоплазматический конец CD86 имеет 3 участка для фосфорилирования протеинкиназой C. CD86 взаимодействует с теми же самыми ко-рецепторами на T-клетках, что и молекулы CD80, CD28 и CD152 (CTLA-4). Однако взаимодействие CD86 с CD152 в 20-100 раз более высокоаффинно, чем с CD28. Молекула CD86 экспрессируется в низкой плотности дендритными клетками периферической крови и очень высокой плотности на моноцитах. На лимфоцитах CD86 появляется как антиген активации B-клеток, экспрессируется в основном B-клетками памяти и B-клетками герминального центра, но полностью отсутствует на плазматических клетках. Его экспрессия может быть повышена путем активации через поверхностные иммуноглобулины, CD40, молекулы MHC(главного комплекса гистосовместимости) класса II или действием PMA (ацетата фарболмиристата) в присутствии иономицина.

При СКВ продукция аутоантител находится в зависимости от T-клеток. Для надлежащего взаимодействия T- и B-клеток необходима передача сигналов ко-стимуляторными молекулами на этих клетках. Было показано, что экспрессия CD80 на CD19⁺ B-клетках низкая и не коррелирует с тяжестью болезни, тогда как количество CD19⁺ B-клеток, экспрессирующих CD86, увеличено и коррелирует с тяжестью заболевания. С другой стороны, продукция аутоантител В-клетками при СКВ в присутствии активированных Т-клеток может быть подавлена антителами против CD86, но не против CD80. Таким образом, наиболее полную характеристику относительного количества B-клеток и их субпопуляционного состава можно получить при следующей комбинации моноклональных антител: CD5/CD19/CD27/CD45 (рис. 3-19). Использование морфологических параметров (малоуглового светорассеяния - FS, рассеяния света под углом 90° - SS) для локализации пула лимфоцитов достаточно часто приводит к получению некорректных результатов. Это связано, как правило, с неполным лизисом эритроцитов, попаданием базофилов в зону лимфоцитов и т.д. Для определения состояния иммунной системы и ее аномалий более корректной представляется локализация лимфоцитов на основе экспрессии панлейкоцитарного антигена CD45. При многоцветовом цитофлюориметрическом анализе (более трех цветов) и многостадийном выборе зоны лимфоцитов с использованием CD45 исключается попадание клеток другой этиологии (не лимфоцитов) в конечный результат исследования. Таким образом, при иммунофенотипировании В-лимфоцитов предпочтительнее использование именно CD45 для выбора зоны анализа лимфоцитов.

Рис. 3-19. Гистограммы распределения CD19, CD5 и CD27 на лимфоцитах периферической крови: а - выбор зоны анализа по СD19-позитивным клеткам; б - распределение СD19-позитивных клеток. Квадрант Е1 - В-1-лимфоциты (CD19⁺CD5⁺); квадрант Е4 - В-клетки памяти (CD19⁺CD27⁺)

В связи с тем что молекула CD19 представляет собой специфический маркер В-клеток и не встречается на других популяциях клеток периферической крови, данный антиген рекомендуют для количественной оценки общей популяции B-клеток. Дополнительное логическое ограничение по СD19-позитивным клеткам позволяет четко локализовать как В-1-клетки (CD19⁺CD5⁺), так и В-клетки памяти (CD19⁺CD27⁺).

Таким образом, оценка и характеристика В-клеточной популяции лимфоцитов является не только важной задачей с точки зрения научных интересов, но и позволяет практикующему врачу подтвердить или снять диагноз аутоиммунного процесса. В свою очередь, качественная оценка изменения количества В-клеток позволяет не только выявить степень активности процесса воспаления и его адекватности, но и оценить активность самих В-клеток в ходе иммунной реакции. В то же время современные подходы позволяют оценить эффективность уже сформировавшегося ответа по наличию В-клеток памяти. Расширение потенциальных возможностей современной проточной цитометрии значительно увеличивает вероятность и точность оценки всех этих диагностически значимых моментов. Многоцветовое окрашивание и многоэтапное гейтирование позволяют провести многопараметрический анализ клеток периферической крови с высокой точностью и достоверностью в одной пробе крови пациента. Данный подход значительно облегчает интерпретацию полученных результатов анализа и позволяет судить о функционировании В-клеточного звена иммунной системы пациентов при разнообразных патологических состояниях.

Многие микроорганизмы, обитая внутри клеток организма-хозяина, недоступны для гуморального иммунитета, т.е. антител. В частности, вирусы способны размножаться только внутри клеток, используя репликационную систему клеток хозяина. Факультативно внутриклеточные микроорганизмы, такие как микобактерии и лейшмании, могут размножаться как в клетках, главным образом в макрофагах, так и вне клеток, но внутриклеточный способ существования для них более предпочтителен, поскольку обеспечивает защиту от иммунной системы. Против внутриклеточных микроорганизмов в организме действует особый механизм приобретенного иммунитета, а именно клеточный иммунитет. Он обеспечивается отдельной субпопуляцией лимфоцитов - Т-клетками. В отличие от В-клеток они дифференцируются в тимусе, откуда и их название. Т-лимфоциты специализируются на уничтожении клеток организма-хозяина, которые инфицированы внутриклеточно размножающимися возбудителями инфекции. Т-лимфоциты играют важную роль в элиминации опухолевых клеток, в реакциях «трансплантат против хозяина» и «хозяин против трансплантата», гиперчувствительности замедленного типа и других реакциях организма, направленных на поддержание гомеостаза.

Оценка как относительного, так и абсолютного количества Т-клеток и их основных субпопуляций широко распространена в лабораторной практике. При иммунофенотипировании лимфоцитов эти данные являются диагностически значимыми при различных патологических состояниях, включая первичные и вторичные иммунодефициты. Динамика изменения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов при некоторых патологиях представляет значительную ценность для контроля эффективности терапии, прогноза течения заболевания.

К маркерам, характеризующим линию T-лимфоцитов, в первую очередь относится T-клеточный рецептор (T-cell Receptor - TcR). TcR - поверхностный специфический рецептор для распознавания антигена, является гетеродимером, состоящим из двух цепей с молекулярной массой 40-50 кДа, которые не являются продуктами генов иммуноглобулинов. Существует два вида TcR, каждый из которых ассоциируется с разными типами T-лимфоцитов. TcR1, состоящий из γ- и δ-цепей, появляется на ранних стадиях онтогенеза. TcR2 состоит из α- и β-цепей. Каждая цепь образует два домена: один из них имеет относительно неизменную структуру, гомологичную характерной укладке цепи иммуноглобулинов, а другой обладает большей структурной изменчивостью, поскольку по своему строению напоминает вариабельные домены иммуноглобулинов (Fab-фрагмент).

Примерно 81,4-98,4% T-лимфоцитов представляют собой вариант αβ-TcR и обозначаются как αβ-T-клетки. Остальные 1,6-8,9% T-лимфоцитов несут на своей поверхности γδ-TcR и обозначаются как γδ-T-клетки.

αβ-T-клетки подразделяются на две различные неперекрывающиеся субпопуляции. Клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном способствуют осуществлению иммунного ответа или индуцируют его. Эта субпопуляция получила название T-хелперов. T-клетки другой субпопуляции несут маркер CD8 и обладают преимущественно цитотоксической активностью.

Небольшая часть αβ-T-клеток и большинство γδ-T-клеток, циркулирующих в периферической крови, не экспрессируют CD4 и CD8. Однако некоторые из них все же экспрессируют молекулы CD8. Напротив, большая часть γδ-T-клеток в тканях экспрессируют CD8. Кроме молекулы CD8, γδ-T-клетки на своей поверхности могут экспрессировать CD56, CD94, CD161. В свою очередь, цитотоксическую активность γδ-T-клеток возможно стимулировать через CD122 (β-цепь рецептора интерлейкина-2).

Одной из особенностей γβ-T-клеток в отличие от αβ-T-клеток является то, что они распознают непептидные антигены, полученные из микробных патогенов, независимо от главного комплекса гистосовместимости (MHC - major histocompatability complex). Эта субпопуляция выполняет ряд важных функций, так как они могут усиливать иммунный ответ, производя большие количества интерферона γ (IFN-γ), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и хемокинов. Кроме этого, γδ-T-клетки имеют эффекторную (цитотоксическую) активность. С эволюционной точки зрения γδ-T-клетки занимают уникальное место между высокоспецифичными αβ-T-клетками и врожденной иммунной системой для выполнения защиты организма от патогенов. Доказана существенная роль γδ-T-клеток в устойчивости организма против целого ряда микроорганизмов, так, функциональную значимость γδ-T-клеток отмечали в устойчивости к Mycobacterium, Borellia, Francisella tularensis, Salmonella и вирусам, включая ВИЧ. Кроме того, γδ-T-клетки играют важную роль и в противоопухолевом ответе, описано значительное увеличение этих клеток у пациентов с некоторыми видами лимфом. γδ-T-клетки также участвуют в восстановлении эпителия и поддержании гомеостаза. С другой стороны, γδ-T-клетки могут быть вовлечены в патогенез некоторых иммунопатологических состояний, таких как сахарный диабет, аутоиммунные расстройства, болезнь Бехчета, бронхиальная астма.

Содержание γδ-T-клеток в периферической крови может варьировать, существуют половые и возрастные различия. Их количество увеличивается с момента рождения до половозрелости и в дальнейшем постепенно снижается. У женщин количество γδ-T-клеток несколько выше и высокий уровень сохраняется значительно дольше, чем у мужчин.

В ответ на действие специфического антигена γδ-T-клетки обладают быстроначинающейся (после 4-6 дней), высокой (в 200 раз) и длительной (более 7 мес) пролиферативной способностью. Кроме того, в течение иммунного ответа антигенспецифические γδ-T-клетки могут составлять до 48-98% общего количества циркулирующих γδ-T-клеток. Таким образом, обнаружение увеличенной циркулирующей субпопуляции γδ-T-клеток позволяет предположить недавнюю или текущую хроническую антигенную стимуляцию, особенно на слизистых оболочках или участках кожи, что, в свою очередь, позволяет практикующим врачам заподозрить медленно прогрессирующее заболевание инфекционной природы (табл. 3-3).

Таблица 3-3. Изменения относительного количества γδ-T-клеток при различных заболеваниях

На клеточной поверхности и αβ-, и γδ-антигенраспознающие рецепторы T-клеток расположены непосредственно рядом с полипептидным комплексом, имеющим групповое название CD3. Это соседство и ассоциация с CD3 являются необходимым условием для экспрессии всего рецепторного комплекса на поверхности клеток.

Антиген CD 3 представляет собой комплекс 5 инвариантных полипептидных цепей: γ, δ, ε, ξи η, молекулярные массы которых составляют соответственно 25-28, 21, 20, 16 и 22 кДа. Полипептидная цепь ξнаходится в CD3-комплексе как гомодимер, связанный дисульфидным мостиком, или как гетеродимер с η-цепью. Комплекс CD3, в свою очередь, является частью значительно большего комплекса, который включает TcR. Этот комплекс экспрессируется зрелыми T-лимфоцитами и тимоцитами. Активация T-клеток может быть вызвана за счет взаимодействия TcR с антигенпредставляющими клетками, несущими процессированный чужеродный антиген в комплексе с антигенами MHC I и II класса.CD3ξ-цепь экспрессируется также NK-клетками и большинством (более 90%) клонов клеток, являющихся производными децидуальных гранулярных лимфоцитов, которые CD3-отрицательны.

Приведенные факты свидетельствуют в пользу более полной характеристики Т-клеток пациента, анализ следует проводить не только по такому линейно-специфическому маркеру, как CD3, но и по наличию субпопуляций αβ-T-клеток и γδ-T-клеток. Определение последних важно для целого ряда заболеваний, в первую очередь к ним относятся ВИЧ-инфекция, вторичные и первичные иммунодефицитные состояния, сопровождающиеся длительной персистенцией микроорганизмов в организме человека на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы. Особенно важным определение γδ-T-клеток становится при оценке общего количества Т-клеток в тех случаях, когда от их количества зависит доза препаратов, например назначение антиретровирусной терапии ВИЧ-инфицированным пациентам. Количественный анализ T-клеток является наиболее востребованным исследованием для иммунологического контроля состояний приобретенного иммунодефицита, мониторинга за пациентами после трансплантации костного мозга и эффективности иммунодепрессивной терапии. Стандартные протоколы иммунофенотипирования, использующие 4 цвета, позволяют проводить идентификацию субпопуляций T-лимфоцитов в одном образце. Этот анализ представляет исследователю намного больше информации, но до последнего времени она находилась вне зоны внимания врачей-клиницистов.

При использовании комбинации моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45 при обычном анализе периферических T-клеток достаточно часто наблюдается бимодальное распределение экспрессии CD3, которое предполагает наличие двух субпопуляций T-клеток. Помимо молекул CD3, антигенспецифический T-клеточный рецептор является другим пан-T-клеточным маркером, который необходимо использовать при анализе данных пациентов с иммунологическими расстройствами. Как было описано выше, существует два различных типа TcR: αβ-TcRи γδ-TcR, различающихся по онтогенезу и функциональным свойствам. В медицинской практике, как правило, внимание врачей-клиницистов сосредоточено прежде всего на αβ-T-клетках, составляющих большую часть T-лимфоцитов. Оставшиеся около 5% γδ-T-клеток, как правило, выпадают из зоны внимания врачей-клиницистов, их рассматривают исключительно при исследовании иммунитета слизистых оболочек и в тимусе.

Однако γδ-T-клетки играют значительную роль в защите организма от различных типов инфекций, знание об их количественном составе должно быть неотъемлемой частью анализа иммунного статуса пациентов.

Комбинация моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45 дает не только основную информацию о наличии Т-клеток и их основных субпопуляций, но и позволяет обратить внимание на неоднородность распределения CD3-молекулы, если она есть. В этом случае необходимо проверить контрольную сумму CD3-позитивных клеток (CD4⁺+CD8⁺ должно равняться общему количеству CD3⁺). В случае если контрольная сумма не совпадает с общим количеством CD3⁺-лимфоцитов, следует проверить субпопуляционный состав Т-клеток на наличие αβ-TcR и γδ-TcR. Данный этап необходим, так как большинство γδ-T-клеток, циркулирующих в периферической крови, дважды отрицательны. Другая их особенность заключается в том, что они имеют более высокую плотность экспрессии молекулы CD3 на своей поверхности CD3^bright (рис. 3-20). Все эти признаки характерны для γδ-T-клеток.

Рис. 3-20. Однопараметрические гистограммы распределения Т-лимфоцитов по плотности CD3 на их поверхности: а - распределение CD3-позитивных Т-клеток у здорового донора; б - распределение CD3-позитивных Т-клеток у пациента с вирусом Эпштейна-Барр

Для выявления γδ- и αβ-T-лимфоцитов, как правило, используют комбинацию моноклональных антител αβ-TcR/γδ-TcR/CD3/CD45 (рис. 3-21).

Рис. 3-21. Примеры двухпараметрических гистограмм распределения Т-лимфоцитов, полученные в результате многоцветового анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейна-Барр

Таким образом, для наиболее полной фенотипической характеристики T-лимфоцитов и правильного назначения химиотерапевтических препаратов, направленных на восстановление нормального функционирования защитных систем организма, необходимо проводить анализ не только линейно-специфического маркера T-клеток CD3, но и определять субпопуляционный состав T-клеток по экспрессии Т-клеточного рецептора, а именно γδ- и αβ-TcR. Для этих целей следует использовать многоцветовой анализ и следующие комбинации моноклональных антител: CD3/CD4/CD8/CD45 и αβ-TcR/γδ-TcR/CD3/CD45.

Помимо описанных выше популяций Т-клеток, в крови человека можно локализовать как наивные Т-клетки, так и Т-клетки памяти, различающиеся между собой по функциональным и фенотипическим признакам. Жизненный цикл Т-клеток в организме делится на две фазы: независимую от чужеродного антигена стадию дифференцировки Т-клеток и стадию, связанную с присутствием чужеродного антигена. Первая завершается появлением в кровотоке зрелых наивных Т-лимфоцитов, каждый из которых способен отвечать только на «свой» антиген. Стимулированные антигеном в ходе первичного ответа Т-клетки проходят дальнейшую дифференцировку.

Все Т-клетки памяти появляются в результате дифференцировки активированных антигеном наивных предшественников в ходе нормального развития первичного иммунного ответа in vivo. Экспрессия на клеточной поверхности различных изоформ молекулы CD45 позволяет разделить CD4⁺ Т-лимфоциты человека на наивные Т-клетки и Т-клетки памяти. Принято относить субпопуляцию CD4⁺ CD45RA^-CD45R0⁺ Т-лимфоцитов к Т-клеткам памяти и соответственно CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0^- - к наивным Т-клеткам. Подобное разделение основано исключительно на способности CD4⁺ CD45RA^-CD45R0⁺ Т-клеток, а не наивных Т-лимфоцитов, интенсивно отвечать на повторный контакт с антигеном in vitro. В свою очередь, быстрый и усиленный ответ Т-клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функциональным отличием от наивных предшественников.

Покоящиеся CD4⁺ Т-лимфоциты памяти также отличаются от наивных предшественников системой внутриклеточной сигнализации, приводящей к резистентности к действию Са²⁺ ионофоров. Чувствительная к действию Са²⁺ ионофоров популяция CD4⁺ Т-клеток человека составляет основную часть покоящихся наивных CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0^- Т-лимфоцитов. В свою очередь, большинстворезистентных к действию ионофоров CD4⁺ Т-клетки являются покоящимися CD4⁺ CD45RA^- CD45R0⁺ Т-лимфоцитами памяти.

Основная методическая сложность в исследованиях процесса дифференцировки CD4⁺ Т-лимфоцитов в периферической крови связана с тем, что активированные клетки составляют лишь незначительную часть. Как правило, в крови здоровых доноров доля активированных CD4⁺ Т-клеток составляет менее 10% общего количества CD4⁺ Т-лимфоцитов.Однозначным фенотипическим признаком дифференцировки покоящихся наивных CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0^- Т-лимфоцитов человека в покоящиеся Т-клетки памяти принято считать появление на поверхности клеток молекул CD45R0 взамен изоформы CD45RA. Данная особенность позволяет выявить три субпопуляции CD4⁺ Т-лимфоцитов человека: покоящиеся наивные CD45RA⁺ CD45R0^- T-клетки, покоящиеся CD45RA^- CD45R0⁺ T-клетки памяти и активированные CD45RА⁺ CD45R0⁺ Т-клетки. Зрелых CD4⁺ CD45RA^- CD45R0^- Т-лимфоцитов в периферической крови человека не существует. Все активированные CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0⁺ Т-лимфоциты появляются в процессе стимуляции наивных клеток антигеном in vivo. Определение относительного количества CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0^- и CD4⁺ CD45RA^- CD45R0⁺-лимфоцитов полезно для диагностических целей. При развитии инфекции или при хирургическом вмешательстве происходит накопление доли CD4⁺ CD45RA^- CD45R0⁺ клеток и снижение CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0^-. Для более точной идентификации этих субпопуляций T-клеток, как правило, используют многоцветовой анализ и комбинацию моноклональных антител CD4/CD45RA/CD45R0/CD45 (рис. 3-22).

Рис. 3-22. Распределение лимфоцитов условно здорового человека (а и в) и пациента в послеоперационный период (б и г). На гистограммах в и г анализ лимфоцитов проводили только с гейтированием по CD45. На гистограммах а и б анализировали клетки при помощи многоэтапного гейтирования по CD45 и CD4

Появление молекул CD69 считают основным фенотипическим признаком наиболее ранней (первые часы) стадии активации наивных CD4⁺ Т-лимфоцитов. Как правило, в крови здоровых доноров не удается обнаружить присутствие более чем 1-4% CD4⁺ CD69⁺ Т-клеток.

Экспрессия молекул CD25 на поверхности CD4⁺ Т-лимфоцитов обычно рассматривается как специфический признак стадии, зависимой от антигена интенсивной пролиферации активированных Т-клеток. Отсутствие в крови здоровых доноров зрелых CD4⁺ CD69⁺ CD25⁺ Т-клеток позволяет корректно разграничить данную стадию активации Т-клеток от предыдущей.

Популяция CD4⁺ CD25⁺ Т-лимфоцитов человека гетерогенна по функциональным свойствам и фенотипическим признакам. Она включает популяции пролиферирующих CD4⁺ CD45RA⁺ CD45R0⁺ CD25^low Т-клеток и регуляторных (T-reg) CD4⁺ CD45R0⁺ CD25^high Т-лимфоцитов. Являясь супрессорами, они играют ведущую роль во многих иммунологических процессах (таких как аутоиммунные заболевания, трансплантационный иммунитет, противоопухолевый ответ и иммуногомеостаз): регулируют Т-клеточный гомеостаз, предотвращают аутоиммунные заболевания, аллергии, гиперчувствительность, реакции «трансплантант против хозяина». Однако регуляторные T-клетки снижают противоопухолевый иммунитет и иммунитет к инфекциям.

T-reg-клетки имеют фенотип CD3⁺ CD4⁺ CD25^highCD45R0⁺ CD95⁺, но наиболее важным их маркером является FOXP3, который кодирует фактор транскрипции и является главным регулирующим геном для развития и функционирования CD4⁺ CD25^high регуляторных T-клеток. В настоящее время самым точным маркером для идентификации T-reg-клеток является фактор транскрипции FOXP3. Однако идентификация этого маркера требует пермеабилизации клеток, что затрудняет работу по идентификации T-reg-клеток.

Экспрессия CD127 на T-reg-клетках снижена или отсутствует. В экспериментах in vitro показано, что экспрессия CD127 после активации Т-клеток резко снижается. CD127 представляет собой α-цепь гетеродимерного рецептора IL-7, который состоит из CD127 и общей γ-цепи, которая представлена и у других рецепторов цитокинов (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R и lL-2lR). CD127 экспрессируется на тимоцитах, T- и B-предшественниках, зрелых T-клетках, моноцитах и некоторых других лимфоидных и миелоидных клетках. Доказано, что IL-7R играет важную роль в пролиферации и дифференцировке зрелых T-клеток.

Таким образом, окончательный фенотип T-reg-клеток будет выглядеть следующим образом: CD3⁺ CD4⁺ CD25^bright CD127^dim-to-neg FOXP3⁺, но для их определения можно использовать фенотип T-reg без выявления FOXP3. Для более точной локализации T-reg-клеток предпочтительнее использовать многоцветовой анализ и многоэтапное гейтирование с использованием набора моноклональных антител CD45/CD4/CD25/CD127.

К одной из наиболее важных популяций иммунокомпетентных клеток относятся NK-клетки. Среди больших гранулярных лимфоцитов (Large Granular Lymphocytes - LGL) выделяют отдельную популяцию клеток, получившую название естественных киллеров, или NK-клеток (Natural Killer). За счет цитолитической активности против клеток-мишеней и способности продуцировать цитокины NK-клетки являются важным компонентом врожденной иммунной системы. Первоначально они были описаны на основании их функциональной способности уничтожать клетки некоторых опухолей гемопоэтического происхождения без предшествующей стимуляции. Таким образом, одной из основных функций данной субпопуляции иммунокомпетентных клеток является защита организма от видоизмененного своего.

NK-клетки являются носителями двух основных функций: первая - лизис опухолей и клеток, инфицированных вирусами, вторая - регуляция врожденного и адаптивного иммунных ответов с помощью секреции хемокинов (CCL3, CCL4, CCL5 и XCLl) и цитокинов (GM-CSF, TNF-α и IFN-γ).

Способность NK-клеток взаимодействовать и ликвидировать опухолевые клетки возможна за счет нескольких специализированных рецепторов, распознающих молекулы MHC класса I. Эти рецепторы формируются на NK-клетках при ассоциации молекул CD94 с молекулами семейства NKG2 (CD159).

В свою очередь, NK-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов, наиболее чувствительной к физиологическим и психологическим стрессам. Доказано выраженное воздействие высоких физических нагрузок на NK-клетки. Их цитолитическая активность увеличивается при нарастании физической нагрузки и уменьшается после ее окончания в течение нескольких часов. Это отражается главным образом на распределении NK-клеток с небольшими изменениями их цитотоксической активности.

В периферической крови NK-клетки составляют 5-20% циркулирующих лимфоцитов. В табл. 3-4 приведены примеры взаимосвязи изменения активности и количества NK-клеток с клиническими признаками или увеличением риска заболеваний у людей. Относительное количество NK-клеток и их активность существенно изменяются не только при опухолевых процессах и вирусной инфекции, но и при гнойном воспалении, нарушении функций ЦНС, аутоиммунных заболеваниях и т.д. Вероятно, что в результате применения более тонких и точных методов, таких как проточная цитометрия и многопараметрический анализ, будут выявлены и другие изменения в субпопуляциях этих клеток при различных патологиях.

Таблица 3-4. Примеры отклонений в активности и количестве NK-клеток, связанные с проявлением клинических признаков или увеличенным риском заболеваний у людей

Для локализации NK-клеток среди других лимфоцитов используют моноклональные антитела, распознающие различные маркеры, экспрессируемые на их поверхности. Однако многие поверхностные молекулы NK-клеток представлены и на других субпопуляциях лимфоцитов, что накладывает свои особенности на идентификацию этих клеток. Для их выявления среди других лейкоцитов используют уникальную комбинацию из нескольких маркеров, таких как CD56 и CD16. В то же время NK-клетки не экспрессируют такие линейные маркеры, как CD3, CD14 и поверхностные Ig, и это также используется при их локализации.

Одним из основных маркеров, используемых для выявления NK-клеток, является молекула CD16. Антиген CD16 представляет собой низкоаффинный рецептор для IgG (FcγRIII). Данный антиген существует в двух различных формах, кодируемых двумя различными генами: FcγRIIIA (или III-2) и FcγRIIIB (или III-1). Генетическая разнородность CD16 приводит к альтернативным путям ассоциации молекул с мембраной клеток. Первая, трансмембранная форма (FcγRIIIA, 50-65 кДа) экспрессируется на NK-клетках, моноцитах и макрофагах. Другая форма (FcγRIIIB, 48 кДа), ассоциированная с мембраной за счет гликозилфосфатидилинозитола (GPI), экспрессируется только на нейтрофилах. Антиген CD16 на мембране NK-клеток может быть нековалентно связан с гомоили гетеродимерами, состоящими из CD3ξ-цепи и FcεRIγ-цепи, которые, в свою очередь, связаны между собой дисульфидными мостиками.

Другим антигеном является молекула CD56. Данный антиген представляет собой изоформу N-CAM (Neural Cell Adhesion Molecule) с молекулярной массой 140 кДа. Посттрансляционные модификации полипептида N-CAM включают N- и O-гликозилирование, ацилирование, сульфатирование и фосфорилирование. Различные изоформы N-CAM имеют молекулярную массу в пределах 135-220 кДа. CD56-антиген умеренно экспрессируется на субпопуляциях клеток периферической крови, таких как большие гранулярные лимфоциты, и всех клетках с NK-активностью. Молекула CD56 также экспрессируется отдельными субпопуляциями T-лимфоцитов.

Циркулирующие зрелые NK-клетки имеют фенотип CD3^- CD56⁺ CDl6⁺ CD2^dim и отличаются от T-клеток отсутствием T-клеточного рецептора и CD3. Отличие от B-клеток заключается в том, что NK-клетки никогда не экспрессируют мембранные Ig, но за счет экспрессии FcγRIII они могут быть позитивными при окрашивании антителами. Поверхностные маркеры, экспрессируемые активированными NK-клетками, включают ряд молекул, таких как CD25, другие типы Fc-рецепторов, β1 (CD29)- и β2 (CDl8)-интегрины, различные активационные антигены, включая HLA-DR, CD71 и CD69. В зависимости от степени активации NK-клеток поверхностные рецепторы могут менять свою экспрессию за счет повышения или понижения.

Популяция NK-клеток обладает достаточной гетерогенностью по составу. Выделяют несколько подтипов этих клеток, а именно пре-NK-клетки, зрелыеNK-клетки и активированные NK-клетки, у которых различна экспрессия маркеров клеточной поверхности. Среди популяции циркулирующих NK-клеток выделяют две основные субпопуляции: первая экспрессирует CD16 и низкий уровень CD56 (CDl6+^(orhigh)CD56^dim), вторая экспрессирует cD56, но CD16 на них представлен в низкой плотности или полностью отсутствует (CDl6^-(orlow) CD56^bright). Последняя субпопуляция составляет приблизительно 10-20% общего количества NK-клеток. Они секретируют интерферон γ и другие цитокины, имеют меньшую цитолитическую активность. В свою очередь, субпопуляция CDl6^highCD56^dimсоставляет приблизительно 80-90% NK-клеток периферической крови, они слабо секретируют цитокины, но обладают высокой цитолитической активностью.

NK-клетки экспрессируют на своей поверхности многочисленные маркеры: CD2, CD5, CD7, CD8, CD94, CD96, CD158, CD159 и др. Однако для локализации и характеристики NK-клеток наиболее широко используют двухпараметрический анализ экспрессии CD16 и/или CD56 на CD3-негативных клетках. Данная комбинация моноклональных антител позволяет локализовать общую популяцию NK-клеток и количественно охарактеризовать ее, но не подтипы клеток.

Достаточно часто NK-клетки экспрессируют на поверхности α-цепи CD8, но в более низкой плотности, чем цитотоксические Т-клетки. Показано, что субпопуляции NK-клеток человека, экспрессирующие α/α гомодимер CD8, обладают большей цитотоксичностью, чем CD8^- NK-клетки. Соединение CD8 α-цепей в гомодимер индуцирует быстрое повышение внутриклеточных ионов Ca²⁺ и инициированное этим увеличение экспрессии CD69. Хотя секреция цитолитических ферментов инициирует апоптоз NK-клеток, приток экзогенных ионов Ca²⁺ защищает CD8α⁺ NK-клетки от этого. Эта защита от апоптоза может быть снята преинкубацией NK-клеток с антителами против MHC класса I. Таким образом, данный механизм позволяет CD8α⁺ NK-клеткам сохранять жизнеспособность и участвовать в лизисе клеток-мишеней.

Большое внимание уделяют экспрессии CD38 на поверхности NK-клеток. Молекула CD38 - мембранный гликопротеин, представляющий собой фермент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция. Кроме того, данный фермент обладает рядом других активностей: аденозиндифосфат-рибозил-циклазной, циклической аденозиндифосфат-рибозил-гидролазной и NAD-гликогидролазной. Данная молекула также выполняет роль рецептора, модулируя межклеточные взаимодействия, и является переносчиком трансмембранных сигналов. Молекула CD38 экспрессируется на активированных Т-, В-, NK-клетках и других типах клеток.

Вызванный NK-клетками цитотоксический эффект на клетки-мишени сопровождается тесным контактом между ними, причем этот контакт предшествует выбросу цитотоксических гранул. Таким образом, ведущую роль в установлении этого контакта выполняют молекулы клеточной адгезии. Данные молекулы также вовлечены в сигнальную систему, приводящую к выбросу цитотоксических гранул. Молекулы LFA-1 на лимфоцитах и ICAM-1 на клетках-мишенях представляют собой основу для межклеточных взаимодействий цитотоксических лимфоцитов и реализации их функции. LFA-1 - гетеродимерный рецептор, формирующийся в результате ассоциации цепи α_L-интегрина (CD11a) с цепью β₂-интегрина CD18. Антитела, взаимодействующие с молекулами LFA-1, блокируют цитотоксичность, вызываемую NK-клетками. У пациентов с заболеванием, связанным с дефицитом адгезии лейкоцитов, отмечается недостаток как в LFA-1, так и в активности NK-клеток. Данная аномалия является генетически обусловленным дефектом CD18. Для выявления NK-клеток, обладающих цитотоксической активностью и способных ее реализовать, необходима локализация NK-клеток, экспрессирующих молекулы CD11a, причем необходимо оценивать не только наличие CD11a на NK-клетках, но и плотность экспрессии данных молекул.

Таким образом, для наиболее полной характеристики NK-клеток необходимо определить на CD3-негативных клетках следующие поверхностные маркеры: CD16, CD56, CD38, CD8 и LFA-1. При этом CD38, CD8 и LFA-1 позволяют оценить цитотоксическую активность NK-клеток пациента и, как следствие этого, более корректно представлять картину, происходящую на данном этапе развития иммунного ответа. Для этих целей рекомендуют использовать следующие комбинации моноклональных антител: CD3/CD16/CD56/CD45, CD3/CD8/CD38/CD45 и CD3/CD11a/CD56/CD45.

Применение двухцветового окрашивания лимфоцитов с использованием комбинации антител CD3, CD56+CD16 позволяет локализовать NK-клетки и оценить их абсолютное и относительное количество. Однако в этом случае отсутствует возможность определить их подтипы.

Другим вариантом окрашивания лимфоцитов для выявления NK-клеток является использование комбинации антител CD16 и CD56. Но в этом случае результат получается несколько завышенным, поскольку дополнительный вклад вносят Т-клетки, так как они могут экспрессировать на своей поверхности CD56 и CD16. Это особенно ярко проявляется при различных заболеваниях, когда резко возрастает количество Т-клеток, экспрессирующих данные структуры. Задачу разделения этих типов клеток позволяет решить применение многоцветового анализа и комбинации моноклональных антител CD3/CD16/CD56/CD45. CD45 используют для локализации всей популяции лимфоцитов, что является более корректным по сравнению с гейтированием по морфологическим параметрам FS и SS. В свою очередь, CD3 позволяет исключить из анализа Т-клетки.

CD38⁺ CD8⁺ NK-клетки обладают высокой цитолитической активностью, поэтому знание о наличии данной субпопуляции, относительном и абсолютном ее количестве имеет важное диагностическое значение. Для локализации CD38⁺ CD8⁺ NK-клеток возможно использование двухпараметрического анализа, но более корректно применять трех- и четырехцветовой анализ (CD3/CD8/CD38 и CD3/CD8/CD38/CD45).

В случае использования комбинации CD3/CD8/CD38 для выделения лимфоцитов используют морфологические параметры, однако существует вероятность исключения из анализа части больших гранулярных лимфоцитов, которые могут просто не попасть в выделенную зону при гейтировании. Использование CD45 для локализации всей популяции лимфоцитов является более корректным.

Комбинация моноклональных антител CD3/CD8/CD38/CD45 и многоэтапное позитивное и негативное гейтирование позволяют четко выделить активированные NK-клетки.

Дальнейший анализ проводят на отдельных гистограммах с использованием логических ограничений по зонам позитивных и негативных по CD3 клеток. На гистограмме, полученной с использованием гейтирования по CD3⁺, находят активированные цитотоксические Т-клетки с фенотипом CD8^brightCD38⁺.

Аналогичная процедура, но с гейтированием по зоне CD3-негативных клеток, позволяет выявить активированные NK-клетки с фенотипом CD8^dimCD38⁺. Данное утверждение правомерно, поскольку CD8 экспрессируется не только на Т-клетках, но и на части популяции CD3-негативных клеток, а именно NK-клетках.

Таким образом, используя комбинации моноклональных антител, можно в одном образце выявить активированные цитотоксические Т-клетки и активированные NK-клетки.

В последние годы становится весьма очевидной необходимость при типировании NK-клеток выявлять общее количество и содержание отдельных их субпопуляций.

NK-клетки и их цитотоксическая функция имеют ведущее значение при опухолевых и вирусиндуцированных процессах.

Регуляторная функция у отдельных субпопуляций NK-клеток ставит вопрос об их клиническом и патогенетическом значении.

Данные о наличии активационных рецепторов NK-клеток позволяют по-новому оценить их функциональную активность, не осуществляя трудоемких и весьма затратных экспериментов по киллингу клеток-мишеней.

Появилась возможность оценить степень воздействия медикаментозной терапии на собственно NK-клетки как в норме, так и при патологии, как in vivo, так и in vitro. Это позволяет значительно расширить возможности клинической фармакологии по поиску средств, влияющих непосредственно на данную группу клеток (химиотерапия опухолей, противовирусная терапия и др.).

Изучение субпопуляций NK-клеток и их функциональной активности может повлиять на представления о природе патологических процессов. Это весьма важно как для известных патологий, где значение NK-клеток уже определено, так и для других процессов, при которых значимость врожденных механизмов иммунитета недостаточно изучена. Как следствие, новые данные могут способствовать более корректной иммунотерапии различных патологических состояний с учетом ее влияния на данные клетки.

Использование возможностей современной проточной цитометрии позволяет получить более точные данные о протекающих в организме изменениях в короткие сроки. В свою очередь, применение 3, 4 и более флюоресцентных меток позволяет более корректно интерпретировать клинико-лабораторные результаты обследования пациентов с различными патологиями, в основе которых лежат механизмы нарушений количества и активности NK-клеток.

Для оценки показателей иммунограммы разработана многоцветовая панель моноклональных антител (табл. 3-5).

Таблица 3-5. Панель моноклональных антител для анализа основных и малых популяций лимфоцитов периферической крови

Анализ В-1-, В-2-лимфоцитов и В-клеток памяти в периферической крови человека с использованием этой комбинации моноклональных антител позволил определить интервалы распределения относительного и абсолютного количества этих субпопуляций у практически здоровых доноров, результаты представлены в табл. 3-6. Использование дополнительного логического ограничения по CD19⁺-клеткам позволило получить дополнительную информацию по интервалам распределения В-1, В-2-клеток и В-клеток памяти внутри популяции В-лимфоцитов практически здоровых доноров (табл. 3-7).

Таблица 3-6. Интервалы распределения популяций лимфоцитов в зависимости от их фенотипов практически здоровых доноров

Таблица 3-7. Интервалы распределения содержания малых субпопуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых, практически здоровых доноров относительно основных популяций лимфоцитов

Для наиболее полной фенотипической характеристики T-лимфоцитов проводили анализ не только линейно-специфического маркера T-клеток CD3, но и определяли субпопуляционный состав T-клеток по экспрессии Т-клеточного рецептора, а именно γδ- и αβ-TcR (см. табл. 3-5). В случае анализа αβ-T-клеток и γδ-T-лимфоцитов использование дополнительного логического ограничения по CD3⁺-клеткам позволило получить дополнительную информацию по интервалам распределения этих клеток в основной популяции T-клеток (см. табл. 3-7).

Количество наивных Т-лимфоцитов было проанализировано с помощью комбинации моноклональных антител CD4/CD45RA/CD45R0/CD45. Применение многоцветового анализа и комбинации моноклональных антител CD3/CD16/CD56/CD45 позволило локализовать не только популяции NK- и T-NK-клеток, но и отдельные малые субпопуляции NK-клеток, имеющие фенотип CD16^{+(or high)}CD56^dim и CD16^{(or low)}CD56^bright. Результаты анализа общих NK-клеток, малых субпопуляций NK-клеток и T-NK-клеток взрослых, практически здоровых доноров представлены в табл. 3-6 и 3-7.

Литературные источники свидетельствуют о близости референтных интервалов распределения основных субпопуляций клеток иммунной системы практически здоровых людей в разных местах проживания (табл. 3-8). Однако остается открытым вопрос о нормах, связанных с региональными особенностями отдельных областей и этническими группами населения Российской Федерации. Развитие проточной цитометрии в России привело к широкомасштабному применению оценки основных субпопуляций лейкоцитов и их активационных маркеров в клинической практике, причем не только в целях выявления количественных дефектов этих клеток, но и для диагностических целей (диагностики аутоиммунных процессов, септических состояний и др.). Учитывая насущную необходимость в формировании референтных интервалов нормативных показателей различных клеточных субпопуляций, была предпринята попытка регламентации нормативных показателей популяций и субпопуляций лимфоцитов по их фенотипу. Подобранная оптимальная комбинация моноклональных антител и использование многоцветового цитометрического анализа с многоэтапным гейтированием могут служить основой для исследователей и врачей-иммунологов при трактовке результатов у пациентов с той или иной иммунопатологией.

Таблица 3-8. Сравнение полученных авторами интервалов распределения основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых здоровых людей с литературными данными

Клеткам иммунной системы присущи определенные функции, которые они выполняют в ответ на внешние раздражители. Наличие или отсутствие такого ответа может о многом сказать специалисту, например нейтрофилы как эффекторы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе для обеспечения резистентности организма, индуцируют и регулируют деятельность различных клеток иммунной системы. Нарушение фагоцитарной активности как одной из основных функциональных характеристик нейтрофилов является индикатором снижения устойчивости организма к инфекционным заболеваниям.

Наиболее часто используемые приложения метода проточной цитометрии для данного рода исследований - измерение фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов, мониторинг септического состояния пациентов, измерение количества клеток, находящихся на различных стадиях программируемой клеточной гибели, а также определение пролиферативной активности клеток.

Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов может стать результатом разнообразных клинических расстройств. Известны врожденные дефекты, такие как дисфункция актина и дефицит рецептора комплемента C3bi. В результате сниженного фагоцитоза нейтрофилов эти дефекты могут привести к повышенной восприимчивости к инфекциям. Приобретенные дефекты, связанные с изменением фагоцитарной активности, обнаруживают при травмах, сахарном диабете, почечной недостаточности и инфекциях. Так, снижение фагоцитарной активности было обнаружено у пациентов с текущими бактериальными инфекциями кожи и легочного синуса, при инфицировании ран от ожогов, у пациентов со СПИДом.

Процесс фагоцитоза разделяют на несколько стадий: хемотаксис (перемещение фагоцитов к воспаленным участкам), адгезию (прилипание частиц к поверхности фагоцитов), собственно фагоцитоз и внутриклеточное уничтожение фагоцитированных объектов. Использование метода проточной цитометрии и флюоресцентно меченных частиц (бактерий, дрожжей, латексных частиц) для измерения стадии собственно фагоцитоза значительно облегчило анализ этой важной функции нейтрофилов. Однако данный метод не обеспечивал регистрацию различий между частицами, находящимися внутри клеток, и теми частицами, которые могли прикрепиться к их поверхности. Эту проблему удалось преодолеть путем подавления флюоресценции прикрепившихся снаружи частиц за счет использования витальных красителей, таких как трипановый синий и кристаллический фиолетовый.

Для регистрации фагоцитарной активности нейтрофилов рядом компаний были разработаны коммерческие наборы, которые с успехом применяются в настоящее время. В частности, к ним относится PHAGOTEST^® компании ORPEGEN Pharma (Германия), который позволяет количественно определить фагоцитарную активность нейтрофилов. Измеряется процент фагоцитов, поглотивших бактерии, и их активность (количество бактерий в клетке).

Анализ кислородного взрыва. Нейтрофилы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе и резистентности организма, нейтрализуя чужеродные объекты. Поглощенные микроорганизмы уничтожаются за счет как зависимых, так и не зависимых от кислорода механизмов. Свободные радикалы кислорода убивают поглощенные бактерии в фагосомах и частично высвобождаются в окружающую среду, с одной стороны, усиливая уничтожение микроорганизмов, а с другой - повреждая окружающие ткани. Этот эффект получил название окислительного, или кислородного, взрыва. Данный процесс усиленно протекает при остром воспалении и в меньшей степени при хроническом течении болезни. Уничтожение микроорганизмов также возможно за счет белков в азурофильных гранулах, таких как катепсин G, лизоцим, интерфероны и др.

Снижение или отсутствие кислородного взрыва наблюдается при врожденных дефектах, например хроническом гранулематозе. Данное заболевание обычно проявляется в течение первых двух лет жизни и характеризуется клинически повторяющимися и опасными для жизни инфекциями, вызванными бактериальными и грибковыми микроорганизмами. Эти инфекции клинически проявляются как пневмонии, лимфадениты или абсцессы, которые затрагивают лимфатические узлы, легкие и печень. Одну из ведущих ролей при этом играет НАДФН⁺-оксидаза, которая представляет собой систему ферментов, ответственных за продукцию супероксид-анионов, которые быстро преобразуются в перекись водорода и гидроксильные радикалы. Нарушения структуры основных пептидов НАДФН⁺-оксидазы являются главной причиной дисфункций при хроническом гранулематозе, так как нейтрофилы у данных пациентов не могут осуществить значительный окислительный взрыв после активации. Данные нарушения наблюдаются также при трансплантациях и у пациентов со СПИДом.

Коммерческие наборы для измерения кислородного взрыва, так же как и для измерения фагоцитарной активности, присутствуют на рынке. Процедура измерения фагоцитоза представляет собой многоэтапный и многофакторный процесс, специалист должен контролировать его на всех этапах. Высокая производительность современных цитометров и большие выборки анализируемых клеток делают этот метод более достоверным по сравнению с микроскопией.

Мониторинг септического состояния. Достаточно часто нарушения фагоцитарной активности и окислительного взрыва наблюдаются при септическом шоке. Исследование его патогенеза все более сосредоточивается на роли иммунной системы, поскольку изменения ее функций являются главным фактором риска для развития серьезных инфекций у пациентов, которые подвергались хирургическому вмешательству. Так, многочисленные отклонения механизмов иммунной защиты возникают у тяжелобольных пациентов в послеоперационном периоде. К ним относятся понижение экспрессии макрофагами антигенов главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DR), измененная активация T-клеток, пониженный хемотаксис и фагоцитоз нейтрофилов. Данные нарушения были описаны также при раневой инфекции и травмах. Снижение экспрессии HLA-DR связывают с усилением продукции IL-10, поскольку сыворотка пациентов с сепсисом снижает экспрессию HLA-DR, а моноклональные антитела к IL-10 блокируют этот эффект. Активно влияют на снижение экспрессии HLA-DR-антигенов и глюкокортикоиды. Таким образом, снижение экспрессии моноцитами HLA-DR-антигенов, которые играют критическую роль в представлении антигена T-хелперам, является признаком развивающейся инфекции в послеоперационном периоде, а анализ экспрессии HLA-DR в течение первых двух дней после операции может служить основанием для применения более раннего терапевтического вмешательства.

Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что пациенты с низкой экспрессией HLA-DR на моноцитах должны получать терапию с использованием иммуномодуляторов, таких как интерферон γ, растворы, обогащенные глутамином, гликопептиды, содержащие мурамил, и другие препараты для стимуляции иммунной системы.

Все перечисленные выше данные привели к тому, что была предложена методика мониторинга септического состояния пациентов с открытыми травмами в послеоперационном периоде.

Принцип оценки септического состояния заключается в измерении экспрессии HLA-DR-антигенов на поверхности моноцитов, для этого используют цельную периферическую кровь (рис. 3-23). Анализ проводят на двух окрашенных образцах, один из которых является контрольным. Для локализации моноцитов применяют CD14, рецептор эндотоксина липополисахарид (LPS), являющийся одним из основных маркеров для моноцитов. Экспрессию HLA-DR измеряют с помощью многопараметрического анализа и сравнивают с контрольным образцом, где вместо моноклональных антител к HLA-DR применяют неспецифические антитела того же изотипа.

Рис. 3-23. Гистограмма распределения моноцитов в зависимости от экспрессии HLA-DR-антигенов: а - гистограмма пациента с нормальной экспрессией молекул HLA-DR на моноцитах периферической крови; б - гистограмма больного с сепсисом на 10-е сутки от начала заболевания

Критерием оценки состояния пациента при сепсисе служит относительное количество моноцитов, экспрессирующих HLA-DR; прогноз благоприятен, если количество позитивных клеток превышает 40% на 5-й день после госпитализации и проведения соответствующей терапии. Данный критерий был получен на госпитализированных пациентах с септическим шоком. В первые 48 ч госпитализации экспрессия HLA-DR на моноцитах значительно снижена у пациентов с сепсисом (25±4%) по сравнению со здоровыми донорами (89±1%). Экспрессия HLA-DR на моноцитах выживших пациентов в первые 48 ч после госпитализации не отличается от этого показателя у больных, впоследствии погибших. Однако экспрессия HLA-DR на моноцитах у оставшихся в живых пациентов на 5-й день госпитализации более выраженная (выше 40%), что свидетельствует о восстановлении иммунного статуса.

Таким образом, в период разгара септического состояния более 50% популяции моноцитов не экспрессируют HLA-DR-молекулы на своей поверхности. В период клинической ремиссии заболевания экспрессия данных молекул восстанавливается практически до нормальных значений. Данный показатель может служить дополнительным критерием диагностики сепсиса и оценки эффективности проводимых лечебных мероприятий. Процедура оценки дефекта презентации антигена доступна для использования практически в любой клинической лаборатории, оборудованной проточным цитометром.

Таким образом, использование метода проточной цитометрии для оценки функционального состояния фагоцитов, включая их отдельные субпопуляции, не имеет технических препятствий в клинической практике. Метод применим для оценки функций клеток при различных патологиях, в основе которых лежат механизмы нарушения фагоцитоза.

Оценка апоптоза методом проточной цитометрии. Апоптоз является проявлением физиологического процесса - генетически запрограммированной клеточной смерти, естественной, закономерной. Апоптоз включает несколько этапов: во-первых, получение клеткой экзогенного (внешнего, рецепторного) или эндогенного (нерецепторного) сигнала, запускающего процесс апоптоза; во-вторых, характерную для многих биологических процессов каскадную активацию внутриклеточных белков, реализующих программу апоптоза (инициирующих и эффекторных каспаз), которая регулируется множеством про- и антиапоптогенных белков; в-третьих, деструктуризацию жизненно важных для функционирования клетки белковых субстратов, «запуск» ядерных эндонуклеаз, деградацию ДНК до олигонуклеосомных фрагментов и формирование «апоптозных телец» с последующим их удалением путем фагоцитоза.

В базовых руководствах по иммунологическим методам выделяют следующие цитометрические методы документации апоптоза: идентификацию характерных для апоптотирующих клеток изменений мембраны; идентификацию изменений структуры и содержания ДНК. К сожалению, большинство этих методов не позволяют использовать цельную кровь, что важно при клинических исследованиях.

Развитие апоптоза уже на ранних этапах сопровождается снижением активности Mg²⁺-зависимой аминофосфолипидтранслоказы, что приводит к нарушению фосфолипидной асимметрии мембраны и появлению фосфатидилсерина на наружном слое мембраны. Использование меченного флюорохромами (как правило, FITC) антикоагулянта аннексина V (An V), который специфически связывается с фосфатидилсерином в присутствии ионов Ca²⁺, и последующая цитометрия обеспечивают четкую идентификацию клеток, уходящих в апоптоз. Использование многопараметрического анализа и одновременное докрашивание клеток красителями для нуклеиновых кислот, которые не проникают в живые клетки, например йодидом пропидия (PI), позволяют дифференцировать клетки, находящиеся в ранней фазе апоптоза (An V⁺PI⁺), позднем апоптозе (An V⁺PI⁺), и мертвые клетки (An V^-PI⁺) (рис. 3-24). Весьма ценной является возможность одновременной оценки экспрессии мембранных маркеров и окрашивания An V, что позволяет охарактеризовать популяцию апоптотирующих клеток.

Довольно распространенными являются методы, основанные на окрашивании клеток ДНК-флюорохромами, что связано с простотой выполнения, невысокими затратами и возможностью длительного хранения клеток. Чаще всего используют йодид пропидия и 7-аминоактиномицин D (7-AAD). В этом случае клетки фиксируют этанолом, что обеспечивает, с одной стороны, вымывание низкомолекулярных фрагментов ДНК, с другой - фиксацию клеток. Затем клетки окрашивают флюорохромом в присутствии РНКазы и в процессе цитометрии выявляют так называемый гиподиплоидный (суб-G1) пик на гистограммах. Существенным недостатком данного подхода является довольно низкая точность идентификации апоптоза, однако он оптимален для скрининговых исследований, требующих анализа большого количества проб и характеризуется хорошей воспроизводимостью.

Рис. 3-24. Гистограмма распределения клеток при одновременном окрашивании PI и AnV: квадрант Е1 - некротические клетки; квадрант Е2 - некротические клетки и поздние стадии апоптоза; квадрант Е3 - живые клетки; квадрант Е4 - ранние стадии апоптоза

Тест на аллергическую реакцию. Продолжительное время работы по локализации и анализу базофилов находились вне области применения проточной цитометрии, что было связано с незначительным содержанием этих клеток в периферической крови (до 0,5%). Однако существует целый ряд специфических параметров, которые можно измерить на базофилах. Это прежде всего мембранный IgE и экспрессия CD63-молекулы. Анализ мембранного IgE представляет достаточно сложную задачу вследствие значительных различий его экспрессии у отдельных индивидуумов. В связи с этим недавно описанные маркеры базофилов заняли важное положение среди используемых параметров для анализа аллергической реакции in vitro - это CD203c и CD294 (CRTH2).

Существенное место в процессе активации базофилов занимают такие антигены, как CD63 и CD203c. Они отличаются своей экспрессией и местоположением в клетке. CD63 находится внутри клеток на мембране гранул, которые содержат гистамин, лейкотриены и цитокины. После стимуляции аллергеном происходит дегрануляция клеток и CD63 оказывается на поверхности базофилов. Напротив, CD203c является мембранным антигеном. При активации базофилов аллергеном экспрессия CD63-молекул увеличивается на 100%, тогда как экспрессия CD203c-рецепторов возрастает на 350%. Таким образом, определение CD203c-рецептора является наиболее информативным маркером для анализа активации базофилов.

CD294 может экспрессироваться на базофилах и одновременно на Th2-клетках, поэтому, если локализовать путем гейтирования зону мононуклеаров, фенотип базофилов можно описать как CD294⁺CD3^-, тогда как активированные базофилы будут иметь фенотип CD3^-CD294⁺CD203c⁺.

При активировании базофилов in vitro в многопараметрическом анализе можно увидеть значительное повышение экспрессии молекулы CD203c на их мембране относительно контрольных образцов.

Для активации базофилов in vitro, как правило, используют агенты, активирующие максимальное количество базофилов, - это анти-IgE, анти-FceRI или синтетический пептид FMLP (Formyl Methionyl-Leucyl Phenylalanine). В ходе анализа в дальнейшем используют различные аллергены. В настоящее время разработаны наборы, предназначенные для идентификации покоящихся и активированных базофилов. Они содержат все компоненты, необходимые для проведения анализа, за исключением аллергенов (исследователи, как правило, сами подбирают необходимый набор аллергенов в зависимости от аллергического анамнеза пациента).

Использование данного подхода предоставило недоступную ранее возможность определять сенсибилизацию к аллергенам, например лекарственным препаратам, выявлять не связанные со специфическим IgE-ответом аллергические состояния, диагностировать и дифференцировать псевдоаллергические реакции.

Таким образом, появление методов, позволяющих объективно оценивать функциональные параметры клеток в процессе их активации и пролиферации, выделяя среди совокупности всех лейкоцитов отдельные субпопуляции, значительно расширяет возможности лабораторного анализа в клинической практике. Эти возможности способствуют появлению надежного инструмента для диагностики заболеваний, в основе которых лежат механизмы повреждения иммунного гомеостаза организма. Формирование же нового подхода к диагностике дефектов иммунной системы влечет за собой и изменение обоснований для этиотропной и патогенетической иммунокорригирующей терапии.

Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение / Под ред. С.В. Хайдукова, А.В. Зурочки. - Челябинск: Челябинская государственная медицинская академия, 2008. - 196 с.

Клиническая аллергология и иммунология: Руководство для практикующих врачей / Под ред. Л.А. Горячкиной, К.П. Кашкина. - М.: Миклош, 2009. - 432 с.

Клиническое руководство по лабораторным тестам: Пер. с англ. / Под ред. Н. Тица. - М.: ЮНИМЕД-пресс, 2003. - 960 с.

Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов. - М.; Тверь: Триада, 2005. - 168 с.

Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Расширение возможностей метода проточной цитометрии для клинико-иммунологической практики // Мед. иммунология. - 2008. - № 10 (1). - С. 5-13.

Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А., Черешнев В.А. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа) // Мед. иммунология. - 2009. - № 11 (2-3). - С. 227-238.

Clinical Immunology: Principls and Practice. 3rd ed. / Ed. R.R. Rich et al. - MOSBY, 2008. - 1578 p.

Janevays, Immunobiology. 7th ed. / K. Murphy, P. Travers, M. Valport. - Garland Science, 2008. - 887 p.

Practical Immunology. 4th ed. / F.C. Hay, O.M.R. Westwood. - Blackwell, 2003. - 400 p.

WHO Scientific Group: Primary immunodeficiency diseases // Immunodeficiency Rev. - 1992. - Vol. 3. - P. 195-236.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины. Индикация образующегося комплекса «антиген-антитело» может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физикохимическим методом. Удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флюоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз. Иммунохимические методы анализа можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринной и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии - для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

Иммуноферментный анализ (ИФА) - вид иммунохимического анализа, основанный на высокоспецифической иммунологической реакции антигена с соответствующим антителом с образованием иммунного комплекса, для выявления которого используют в качестве метки фермент или ферментзависимое вещество.

В основе метода ИФА лежит оценка результатов иммунной реакции антигена с антителом. Полученный комплекс определяется следующим образом: в реакционную смесь вводят конъюгат, который включает ферментную метку, а также добавляют специальный хромогенный субстрат. Фермент, взаимодействуя с субстратом, изменяет его окраску. Учет результатов проводят фотометрически.

В современной лаборатории исследования методом ИФА проводят с использованием коммерческих тест-систем. Основными характеристиками тестов являются чувствительность и специфичность.

Под чувствительностью понимается процент выявленных тест-системой позитивных образцов из массива положительных образцов, где все результаты были подтверждены, например сероконверсионные панели позитивных контрольных сывороток. Таким образом, чувствительность тест-системы является показателем вероятности появления ложноотрицательного результата. Ложноотрицательный результат - отрицательный результат, полученный в данной тест-системе для образца, являющегося на самом деле положительным.

Под специфичностью понимается процент выявленных негативных образцов из панели негативных контрольных сывороток. Таким образом, специфичностью тест-системы является показатель вероятности появления ложноположительного результата, т.е. положительный в данной тест-системе результат, полученный для образца, являющегося на самом деле отрицательным.

Кроме подразделения тест-систем по исследуемому показателю (инфекционной диагностике, исследованию эндокринной системы, определению онкомаркеров и др.), тесты делятся на группы по своему целевому назначению. Так, например, применительно к диагностике инфекционных заболеваний тест-системы подразделяются:

Неправильное выполнение этих процедур является одним из основных источников (до 20%) ошибок на преаналитическом этапе, поэтому процедура взятия крови и других образцов в инструкции для персонала должна быть описана всесторонне, включая идентификацию образца, детальное описание технологии и биологическую безопасность. Условия подготовки пациента удобно отражать в виде памятки в направлении на анализ, где следует указать ошибки и рекомендации при взятии венозной крови - основного материала для ИФА-исследований.

В инструкции по качеству проведения преаналитического этапа необходимо четко прописать условия взятия биологического материала для исследования. Следует учитывать, что на результаты исследования влияет набор биологических факторов, которые описывают состояние организма.

Рекомендации по условиям взятия крови и других биожидкостей для лабораторного исследования методом ИФА следующие.

Полученная кровь должна быть своевременно доставлена в лабораторию. Согласно рекомендациям практически всех компаний - производителей иммуноферментных тест-систем, необходимо не позже 1 ч после взятия крови отобрать из нее сыворотку. В табл. 3-11 приведены временные интервалы, рекомендованные при проведении процедуры пробоподготовки.

Таблица 3-11. Требования ко времени выполнения некоторых преаналитических этапов для иммунологических исследований

Рекомендации по условиям хранения и транспортировке биологического материала для иммунологических исследований следующие.

ИФА-набор, как правило, включает все необходимые для анализа реагенты, обычно на 96 определений.

В набор, как правило, входят следующие реагенты.

В набор могут дополнительно входить реагенты для разведения образцов, конъюгата, субстрата, стандарта.

Объектом исследования в формате ИФА могут быть как антигены, так и антитела. В схемах ИФА для определения антигенов в качестве последнего могут выступать антиген возбудителя инфекции, регуляторный белок или гормон, онкомаркер или другое соединение, обладающее иммуногенной активностью, которое должно быть определено в образце. Существует множество модификаций метода ИФА, но наибольшее распространение получил гетерогенный (твердофазный) ИФА в микропланшетном формате. В качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистиролового микропланшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антигены или антитела. Антиген или антитело, иммобилизованное на поверхности твердого носителя, принято называть иммуносорбентом. В ходе высокоспецифической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются иммунные комплексы, которые также оказываются фиксированными на твердой фазе. Субстанции, не участвующие в реакции, и избыточное количество реагентов удаляются при многократной промывке. Такая схема позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции.

В настоящее время получили распространение тест-системы с использованием стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител. В этом случае стандарты, контроли и пробы пациентов сначала добавляют в микроячейки, покрытые стрептавидином. Стрептавидин отдаляет реакцию от поверхности плашки, создавая эффект взаимодействия «антиген-антитело» в объеме, а не на поверхности, тем самым увеличивая чувствительность диагностической системы. Затем добавляют биотинилированные антитела (смесь высокоочищенных специфических моноклональных антител к различным эпитопам), меченные ферментом антитела (конъюгат), реагенты перемешивают. Результатом реакции между различными антителами и определяемым антигеном становится образование «сэндвич»-комплекса, который связывается со стрептавидином в ячейках. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. После инкубации с субстратным раствором и остановки реакции фотометрически определяют оптическую плотность растворов в лунках. Тест-системы с использованием стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител являются тестами II поколения, обладают повышенной чувствительностью.

Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний. Как правило, для диагностики инфекций используют два вида серологических реакций:

В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

В тест-системах для качественного анализа результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности (ОП_крит). Для обозначения ОП_крит могут быть использованы другие термины - «Cut-off» или «пороговое значение оптической плотности». Формулу для расчета ОП_крит указывают в инструкции к тест-системе. В расчете Cut-off могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца - контроля уровня среза.

Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается положительным на специфические антитела.

Очень часто в расчетах необходимо учитывать серую зону. Серая зона - это диапазон концентраций специфических антител, в который с равной вероятностью могут попадать как положительные, так и отрицательные пробы (рис. 3-25). Границу серой зоны указывают в инструкции к тест-системе, как правило, это 10% пороговой величины. Результаты анализа, попавшие в серую зону, не могут быть однозначно интерпретированы, для уточнения результата необходимо повторить исследование с новой сывороткой, полученной через 1-2 нед.

Рис. 3-25. Серая зона (качественный анализ)

Для контроля эффективности лечения важно использовать тест-системы, которые позволяют получать результаты в полуколичественном или количественном вариантах. Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off. Образцы рассматриваются как:

Радиоиммунный анализ (РИА) - метод количественного определения биологически активных веществ (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Для метки антител или антигенов чаще всего используют изотоп йода ¹²⁵I, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Для РИА выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Радиоиммунный анализ обладает высокими чувствительностью и специфичностью. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Иммунофлюоресценция - комплекс методов флюоресцентного анализа, применяемых в иммунологии, главным образом в гистохимии, а также в вирусологии, бактериологии, микологии, паразитологии и т.п. Сочетание иммунохимических реакций и флюоресцентной микроскопии позволяет выявлять тканевые и клеточные антигены, в том числе при аутоиммунных заболеваниях и злокачественном перерождении клеток, изучать закономерности синтеза антител и идентифицировать возбудителей многих вирусных и микробных заболеваний.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. В настоящее время в этой реакции используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела, меченные флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для уменьшения неспецифического свечения фона применяют обработку мазка бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином или голубым Эванса.

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой РИФ сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливают набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

Наибольшее распространение получили наборы, основанные на прямой реакции иммунофлюоресценции, однако имеются тест-системы, где используется реакция непрямой иммунофлюоресценции.

Если прямую РИФ можно использовать только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для серодиагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими критериями специфичности этой реакции являются:

При исследовании крупных объектов (трихомонад, гарднерелл, клеток, пораженных вирусами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же время элементарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Оставшихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вышесказанным субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалификации персонала, проводящего исследования.

Трактуя результаты лабораторных исследований у беременных, необходимо учитывать срок беременности в момент взятия пробы. При физиологической беременности средний объем плазмы возрастает примерно от 2600 до 3900 мл, причем в первые 10 нед прирост может быть незначительным, а затем происходит нарастающее увеличение объема к 35-й неделе, когда достигается указанный уровень.

Объем мочи также может физиологически увеличиваться до 25% в III триместре. В последнем триместре наблюдается 50% физиологическое повышение скорости клубочковой фильтрации. Хорошо известные свойственные беременности изменения выработки и концентрации в плазме половых гормонов сопровождаются изменениями различных аналитов, например тиреоидных гормонов.

Некоторые компоненты подвержены влиянию суточных колебаний. Так, содержание кортизола возрастает в течение дня и снижается ночью (табл. 3-9).

Таблица 3-9. Суточные колебания содержания некоторых аналитов в сыворотке крови

Циркадный ритм может изменяться под влиянием индивидуальных ритмов - еды, сна, физической активности. Эти влияния не следует путать с действительно циркадными колебаниями.

Статистически значимые изменения концентрации могут быть вызваны колебаниями гормонального фона при менструации. Так, концентрация альдостерона в плазме определяется в два раза выше перед овуляцией, чем в фолликулярной фазе. Подобным образом ренин может проявить предовуляторное повышение.

При подготовке обследуемых к биохимическим исследованиям приняты следующие подходы:

Таблица 3-10. Препараты, оказывающие существенное влияние на результаты лабораторных исследований

Загрязнение лабораторных проб инфузионными растворами является самой обычной и часто встречаемой формой преаналитической интерференции в больницах. Рекомендуют информировать лабораторию, когда и какое вливание было проведено пациенту и когда была взята проба крови.

Пробу крови никогда не следует брать из сосуда, расположенного проксимально месту инфузии. Пробы следует брать из вены другой руки, в которую не проводили вливание.

После приема пищи содержание отдельных продуктов обмена в крови может повышаться или подвергаться изменениям в результате постабсорбционных гормональных эффектов. Определение других аналитов может затрудняться вследствие мутности, вызванной хиломикронемией в послеобеденных пробах крови. Для того чтобы исключить влияние данных факторов, рекомендуют соблюдать 8-12-часовой период голодания перед взятием проб для лабораторного исследования.

Степень влияния психического стресса (страха перед взятием крови, предоперационного стресса и т.д.) на лабораторные результаты часто недооценивается. Между тем под его влиянием может наблюдаться увеличение секреции гормонов (альдостерона, ангиотензина, катехоламинов, кортизола, пролактина, ренина, соматотропина, ТСГ, вазопрессина), а также повышение других показателей (альбумина, фибриногена, глюкозы, инсулина, лактата и холестерина).

Состояние физической активности обследуемого оказывает большое влияние на результаты. При длительном строгом постельном режиме и ограничении физической активности повышается экскреция с мочой норадреналина, кальция, хлора, фосфатов, аммиака, повышается активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

Таким образом, для объективного лабораторного анализа необходимо добиваться стандартизации подготовки пациента перед взятием клинического материала.

Методологическое развитие ИФА позволило создать системы, в которых разные виды захваченных молекул-мишеней проецируются в разных точках твердой фазы, что и привело к созданию мультиплексных технологий, позволяющих одновременно определять большое количество (около 100) параметров в одном биологическом образце. В качестве твердой фазы стали использовать не поверхность лунок полистироловых планшетов, а разнообразные дискретные шарики - микрочастицы.

Впервые флориметрическая технология на шариках была разработана еще в 1977 г. для определения различных антигенов в одном биологическом образце. В настоящее время такую оценку часто используют для определения α-фетопротеина, β₂-микроглобулина, иммуноглобулинов и иммунных комплексов.

Технология мультиплексного анализа на шариках постоянно совершенствуется. Изначально мультиплексный анализ выполняли в разных сочетаниях.

В настоящее время распространенными методами мультиплексного анализа являются мультиплексные, в основе которых лежит «сэндвич»-метод - ИФА в разных комбинациях: FAST Quant, Search Light и xMAP. Каждый из этих методов имеет некоторые различия по ряду параметров: определению доступных анализируемых веществ, возможности использования новых аналитов, динамическому ряду оценки, чувствительности метода, стоимости оборудования, цене расходных материалов.

Поскольку результаты определения биологически активных веществ в каждом методе могут существенно различаться, считают, что проводить статистический анализ данных, полученных с помощью разных методов, нецелесообразно. Для каждого отдельного исследования следует выбирать только одну технологию, для того чтобы полученные данные и выводы были репрезентативными и соответствовали требованиям доказательной медицины. Так, в анализе, основанном на микрошариках, в качестве твердой фазы используют микрочастицы (рис. 3-26).

Рис. 3-26. хМАР-технология: а - 100 различных типов микрочастиц с точным количеством красного и инфракрасного красителя составляют основу хМАР-технологии мультиплексного анализа; б - каждый тип микрочастиц покрывают антителами против конкретного антигена, после этого проводят классический «сэндвич»-ИФА; в - с помощью проточного цитофлюориметра (Luminex или Bio-Plex) проводят регистрацию результатов: красным лазером (630 нм) идентифицируют тип микрочастицы (1), а зеленым (532 нм) измеряют количество связавшегося антигена (2)

Их кодируют одинаковыми или разными (красными и оранжевыми) флюоресцентными метками. В хМАР-системе, например, используют шарики одного размера, внутри меченные в разных сочетаниях красными и близкими к инфракрасным флюорофорами: 658 и 712 нм. На шариках адсорбированы антитела разной специфичности, созданные к разным молекулам-мишеням, присутствующим в биологическом образце, причем возможны варианты: на разных типах шариков могут быть адсорбированы антитела к разным молекулам-мишеням либо к одной молекуле-мишени, при этом образуются ковалентные связи. Таким образом, при этом типе оценки сами шарики (их поверхность) представляют собой твердую фазу, на которой и происходят реакции «антиген-антитело» (в ИФА такие реакции осуществляются на поверхности пластика). После захвата соответствующих молекул-мишеней из биологической пробы различные окрашенные места на шариках заполняются, при этом оценка разных мишеней осуществляется одномоментно в одной биопробе. Детекция интенсивности захвата осуществляется с помощью считывающей системы, принцип действия которой основан на оценке интенсивности флюоресценции. Сигнал усиливается и измеряется на флюоцитометре, при этом каждая отдельная молекула-мишень определяется с помощью цветового кода, измеряемого с помощью вторичного флюоресцентного сигнала. В результате обеспечивается подсчет количества захваченных молекул-мишеней в каждом отдельном локусе шариков.

Метод позволяет проводить комплексный учет множества различных молекул-мишеней в одном биологическом образце. Чувствительность, специфичность и точность анализа при таком мультиплексном определении на шариках превышают соответствующие характеристики ИФА. В отличие от ИФА, мультиплексный анализ на микрочастицах позволяет одновременно учитывать до 100 параметров в одном образце, при этом не требуется проводить этапы отмывок. Согласно методике проведения мультиплексного анализа, биологический образец инкубируется вместе с меченными флюоресцеином антителами, а после образования иммунного комплекса по типу «сэндвича» проводится детекция только тех флюорофоров, которые связаны с поверхностью шариков.

Как в ИФА, так и в мультиплексном иммунном анализе (МИА) в тест-системах используется принцип «сэндвича». Если биологические образцы содержат гетерофильные антитела (такие как у больных с аутоиммунными заболеваниями), неспецифическое связывание может приводить к ложноположительным результатам.

В условиях патологии уровни таких аналитов, как, например, цитокины при воспалении, могут быть существенно повышены в разных биологических жидкостях и существенно превышать динамические возможности тест-системы. Анализ стандартных кривых в мультиплексных данных является критичным для правильной интерпретации полученных данных. Классический иммуноферментный анализ очень удобен для измерения уровней одного какого-либо цитокина в биологических образцах. Однако измерение уровня одного цитокина для характеристики различных процессов, протекающих в организме, является абсолютно недостаточным, так как не позволяет получить более или менее объективную информацию о комплексных биологических взаимодействиях на клеточном уровне как в норме, так и при патологии. В последнее время возрастает интерес к интегральному изучению биологических процессов. Вследствие этого все более широкое распространение приобретают методы мультиплексного анализа. Роль повышения или понижения уровня одного какого-либо цитокина в межклеточных взаимодействиях необходимо рассматривать с учетом изменения уровней других цитокинов, присутствующих в этом же исследуемом биологическом образце.

Ниже приведен ряд сравнительных характеристик xMAP- и ИФА-методов определения цитокинов (табл. 3-12).

Таблица 3-12. Сравнительные характеристики ИФА- и МИА-методов определения цитокинов

В большинстве так называемых home-made ИФА-тест-системах планшеты, покрытые антителами, используют в тот же день либо их хранят в течение непродолжительного времени (несколько дней) при температуре +4 °С или замораживают и хранят при температуре -20 °С (до 2-3 мес). В хМАР-технологии покрытые антителами микрочастицы остаются стабильными в течение 2 лет. При этом срок хранения тест-систем скорее ограничивается не этапом напыления антител, а интенсивностью свечения люминофоров.

С помощью xMAP-тест-системы можно одновременно определять до 100 различных протеинов с широким спектром молекулярной массы - от 6 до 150 кДа всего лишь в 50 мкл биологической жидкости. ИФА-тест-система позволяет определить только один белок, причем объем биологической пробы варьирует от 100 до 200 мкл, а в дублях - от 200 до 400 мкл. Нетрудно рассчитать, какое количество биологического материала необходимо для определения уровней, например, 10 или 20 цитокинов.

В ИФА для определения нескольких цитокинов каждый раз следует обращаться к изначальному образцу биологической жидкости. Обычно аликвоты замораживают и хранят при температуре -20 °С в течение ограниченного срока (до 3 мес). Недопустимо повторное размораживание и замораживание образцов. Сроки хранения биообразцов до момента постановки ИФА-тест-систем для определения цитокинов могут существенно различаться и, поскольку определение цитокинов с помощью этого метода проводят с временным интервалом, невозможно с уверенностью считать, что все условия проводимого анализа и соответственно полученные результаты адекватны и сопоставимы.

xMAP-технология, в отличие от ИФА, позволяет определять целый ряд молекул одновременно, что снижает вероятность ошибок, связанных с условиями хранения биологических проб. И, наконец, все антитела, используемые в xMAP-технологии, в отличие от ИФА, сопоставимы друг с другом.

Если использовать МИА-технологии для определения многих цитокинов, стоимость одного определения в мультиплексной технологии становится в целом ниже, чем в ИФА.

Успехи молекулярной и клеточной биологии привели к возникновению новой клинической дисциплины - молекулярной клинической диагностики, область интересов которой включает лабораторную диагностику инфекций и многих патологических состояний человека путем детекции генных вариантов, присущих тому или иному виду организмов.

Молекулярную клиническую диагностику определяют в настоящее время как науку, занимающуюся выявлением патологий, изучением их причин и механизмов развития на молекулярном уровне. Преимущество такого подхода заключается в том, что он дает возможность выявить склонность к тому или иному заболеванию задолго до его клинических проявлений, вовремя принять профилактические меры, предотвратив его развитие или облегчив течение, и с учетом индивидуальных особенностей применять терапию. При этом молекулярный уровень исследований включает не только гены и мРНК, но и соответствующие белки, поэтому исследования в области молекулярной диагностики принято разделять на геномику и протеомику (рис. 3-27). Используемые в исследованиях современные молекулярные технологии представлены в табл. 3-13.

Рис. 3-27. Структура молекулярного уровня исследований: процессы репликации, транскрипции и трансляции

Таблица 3-13. Основные методы современных молекулярно-диагностических исследований

На основе успехов в исследовании молекулярных основ патологии, в частности достижений программы «Геном человека», и с помощью рекомбинантных ДНК, ПЦР, новейших методов анализа ДНК удается многое узнать о генотипе при минимальных затратах. Возможности молекулярно-биологических исследований определяются универсальностью принципов анализа ДНК и РНК любого происхождения, высокими чувствительностью и специфичностью применяемых методов. Объектом молекулярно-генетического исследования могут служить практически любые биологические образцы. Проводимое исследование включает подготовку проб, состоящую из стандартизированного выделения нуклеиновых кислот, детекции искомой генной последовательности, учета результатов исследования и формулирования заключения с установлением (или подтверждением) нозологической формы в соответствии с принятыми клиническими классификациями. Комплексы молекулярно-биологических методов позволяют:

Генную диагностику используют при решении задач скрининга (профилактическом обследовании), для установления (уточнения) диагноза, ранней диагностики заболеваний. На основе генной диагностики проводят:

Это эффективный метод уточняющей диагностики, а во многих случаях - основной диагностический метод (например, в выявлении наследственных заболеваний и прогнозе развития лейкозов).

Значение результатов генной диагностики отражено в федеральном законе от 05.07.1996 № 86-ФЗ (ред. от 30.12.2008) «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности».

Среди молекулярно-генетических технологий наиболее широко применяются в рутинной диагностической практике методы для выявления уже известных эндогенных и экзогенных ДНК-последовательностей, которые можно разделить на два класса: гибридизационный анализ нуклеиновых кислот и амплификационные методы.

В последние годы в практику клинико-лабораторных исследований активно внедряется метод секвенирования генов, т.е. определения последовательности нуклеотидов в целевом участке гена.

В основе всех молекулярно-биологических методов лежит представление о том, что универсальным носителем генетической информации, исключая РНК-вирусы, является ДНК. ДНК представляет собой двойную цепь, скрученную в спираль. Каждая цепочка состоит из соединенных последовательно нуклеотидов (рис. 3-28). Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5'-концу одной нити соответствует 3'-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс развивается следующим образом: с помощью специальных ферментов - гираз происходит расплетание спирали в том ее участке, где должна наблюдаться репликация. При этом водородные связи между азотистыми основаниями разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5'-конца к 3'-концу. Данный процесс осуществляется по принципу комплементарности. Это строгое соответствие соединения азотистых оснований, занимающих положение в двух цепях ДНК напротив друг друга и соединенных водородными связями, в котором: аденин соединяется с тимином (А-Т) и гуанин соединяется с цитозином (Г-Ц).

Рис. 3-28. Структура цепи ДНК. Последовательное соединение нуклеотидов

Исторически метод ДНКили РНК-гибридизации был внедрен раньше, чем метод ПЦР. В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации - образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных последовательностей нуклеотидов. В 1970-е гг. для выявления инфекционного возбудителя или мутации использовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации специфических олигонуклеотидных зондов, меченных радиоактивным изотопом (или флюорохромом) с образцом выделенной ДНК. Олигонуклеотидные зонды были синтезированы таким образом, что содержали последовательности нуклеотидов, коплементарные участку цепи ДНК-мишени с известной структурой.

Различают два типа гибридизационного анализа:

Последние получили более широкое распространение в связи с тем, что имеют большие аналитическую чувствительность и специфичность, являются более технологичными, их проще стандартизировать и автоматизировать.

Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерную нейлоновую мембрану.

Протокол анализа состоит из следующих стадий:

Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур при пробоподготовке проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола.

Фиксацию ДНК-образца на твердом субстрате осуществляют в два этапа: вначале ДНК денатурируют с помощью щелочи, затем образец нуклеиновой кислоты фиксируют на носителе - нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 °С в вакууме. Для того чтобы олигонуклеотидный зонд не взаимодействовал с мембраной, свободные точки связывания на мембране инактивируются. На стадии гибридизации искомые фрагменты ДНК (РНК) комплементарно связываются со специфическим зондом, меченным флюорофором, радиоактивной меткой или ферментом. Избыток зонда удаляется в процессе промывки. Далее осуществляют детекцию одним из возможных методов (авторадиографическим, ферментативно-гибридизационным или флюориметрическим).

Критическим этапом в данном протоколе является неспецифическая фиксация ДНК-мишени на мембране с последующей нейтрализацией свободных точек связывания. Эффективность этой стадии в большой степени зависит от длины и структуры нуклеотидной последовательности мишени, поэтому в настоящее время, преимущественно в научных исследованиях, используют разновидности данного протокола (саузерн-блот, нозерн-блот).

В лабораторно-клинической практике метод прямого связывания мишени с твердой фазой уступил место так называемой «сэндвич»-технологии. Протокол, основанный на принципе «сэндвича», отличается от описанного тем, что участвуют два зонда, гомологичных различным участкам нуклеотидной цепи ДНК-или РНК-мишени. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать искомую мишень, присутствующую в исследуемом образце. После гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который представляет собой конъюгат олигонуклеотида и какойлибо метки. Процесс гибридизации проводят повторно, при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК). Дальнейший процесс детекции проводят стандартным методом в зависимости от природы метки (ферментно-гибридизационным, радиографическим, авторадиографическим, флюоресцентным, хемилюминесцентным).

В настоящее время ведутся интенсивные разработки по совершенствованию методов гибридизации в следующих направлениях:

Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены к минимуму подготовка клинического материала и очистка нуклеиновых кислот. Описанная схема реализована в нескольких коммерческих тест-системах. В современных наборах реагентов применяется хемилюминесценция в качестве процесса, обеспечивающего чувствительную детекцию результатов гибридизации. Технология автоматизирована, время выполнения анализа составляет 2,5-3 ч.

По мере миниатюризации соответствующих носителей-подложек для гибридизации в практику вошли микрочипы (microarrays) с сотнями и тысячами ДНК-зондов для выявления практически любых известных генов, их вариантов и мутаций. Часто для гибридизации применяют не исходные нуклеиновые кислоты, а продукты амплификации целевых генов. Учет результатов гибридизации на биочипах осуществляется посредством оптических устройств, обычно предлагаемых фирмой-разработчиком.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - молекулярно-биологический метод исследования, получивший широкое распространение в современных лабораториях и используемый для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний, а также для исследования состава условно патогенной флоры.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем денатурацию двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное удвоение обеих. Ценность метода заключается в многократном копировании (амплификации) определенных, специфических только для данной мишени участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение концентрации специфических для данной мишени фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.

Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Taq-полимераза - термостабильный фермент [максимальная активность фермента проявляется при температуре 70-74 °С (хотя фермент может работать и при более низких температурах)] массой приблизительно 94 кДа. Источник происхождения этого фермента - микроорганизм Thermus aquaticus, время полужизни которого при 94 °С составляет около 45 мин. Taq-полимераза обеспечивает достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности, осуществляя синтез ДНК в направлении 5'→3' в присутствии ионов Mg²⁺ и при соответствующем значении рН, а также обладает 5'→3'-экзонуклеазной активностью. Наличие 5'→3'-экзонуклеазной активности делает фермент пригодным для использования его в ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ): дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены следующие дополнительные компоненты.

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (рис. 3-29). Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси.

Рис. 3-29. Схема реакции и принцип амплификации ДНК-мишени в ПЦР

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера.

Таким образом, в идеальных условиях проведения реакции за 35 циклов ПЦР синтезируется несколько миллиардов копий ампликона определенной длины.

Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции фрагмента, например, с помощью флюориметрии или методом электрофореза в геле.

Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом плато.

Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1,0 пмоль (ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции).

В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации на момент достижения эффекта плато влияют: утилизация субстратов (дНТФ и праймеров); стабильность реагентов (дНТФ и фермента); количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы; неспецифические продукты или праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу; концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации. Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем раньше происходит выход реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточным, чтобы их можно было проанализировать.

ПЦР в диагностической лаборатории является достаточно сложной, многоступенчатой методикой, требующей правильного выполнения всех процедур. Ниже изложены основные специфические требования к процессам взятия образцов, выделения наследственного материала, выполнения амплификации и регистрации результатов, т.е. преаналитической, аналитической и постаналитической стадии исследования.

Клиническим материалом для исследования методом ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты. Однако в большинстве анализов в качестве образца используют соскоб эпителиальных клеток и сыворотку крови пациента. К особенностям метода следует отнести то, что материал, необходимый для исследования, должен потенциально содержать искомую ДНК (например, в абсолютном большинстве случаев невозможно детектировать в крови микроорганизм Chlamydia trachomatis, так как это внутриклеточный паразит эпителиальных клеток урогенитального тракта).

В зависимости от поставленных задач используют различные методики для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. Суть методик заключается в экстракции из исследуемого образца нуклеиновых кислот и нейтрализации ингибиторов ПЦР.

В настоящее время существуют экспресс-методики выделения ДНК, позволяющие за сравнительно небольшое время обрабатывать много образцов с минимальными трудозатратами. Если перед лабораторией стоит задача получить более чистый препарат ДНК или детектировать низкокопийный образец, существуют методики, позволяющие провести очистку с высокой чистотой, но требующие больших трудозатрат.

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции.

Регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении реакции («по конечной точке»), либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). Классическая ПЦР предполагает анализ результатов реакции по «конечной точке». Для этого используют методы электрофореза в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГИФА), флюоресцентную детекцию после ПЦР (FLASH) и др. Различные методы детекции результатов ПЦР имеют свои преимущества и недостатки (табл. 3-14), и, как правило, их выбирают в зависимости от задач, решаемых лабораторией. Для выявления количества ДНК в исходной пробе и наблюдения за кинетикой процесса в современных лабораториях используют метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

Таблица 3-14. Сравнение методов детекции результатов ПЦР (Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др., 2009)

В процессе ПЦР (при наличии в биопробе искомой ДНК) в геометрической прогрессии происходит увеличение копий ее специфического фрагмента. По окончании реакции (30-50 циклов) количество таких копий достигает значений, при которых становится возможной надежная регистрация результатов реакции. Регистрацию результатов ПЦР «по конечной точке» проводят несколькими способами:

В последние годы ПЦР широко используется в лабораторной практике для идентификации таких инфекций, как трихомониаз, гонорея, ВИЧ и т.д.

Преимуществом метода является то, что он универсален для диагностики любых микроорганизмов и поэтому лишен недостатков культивационных методов, связанных с высокими требованиями ряда микроорганизмов к условиям культивирования.

К достоинствам также следует отнести возможность тестирования большого количества любых клинических образцов.

Диагностическая ценность метода ПЦР признана во всем мире. В соответствии с данными Европейских стандартов диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем (2004), чувствительность ПЦР в диагностике хламидийной инфекции составляет 70-95%, специфичность - 97-99% (Рэдклиф К., 2004).

Метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предусматривает автоматическую регистрацию увеличения флюоресцентного сигнала, пропорционального количеству синтезированных в ходе реакции специфических фрагментов ДНК (микроорганизмов, человека, животных и т.д.).

Реакция выполняется и автоматически регистрируется специализированными приборами для осуществления ПЦР в режиме реального времени. Программное обеспечение оборудования может автоматически переводить полученные данные в удобный для чтения врача-лаборанта формат.

В зависимости от исходной концентрации специфических нуклеиновых кислот (микроорганизмов, человека и т.д.) в исследуемом образце переход из стадии инициации в экспоненциальную стадию происходит на разных циклах (рис. 3-30). Чем больше в образце искомой ДНК, тем на более раннем цикле прибор начнет регистрировать флюоресценцию; чем меньше искомой ДНК, тем на более позднем цикле начнется автоматическая регистрация флюоресценции.

Рис. 3-30. Стадии реакции ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

Метод ПЦР с детекцией результатов в процессе амплификации предоставляет возможность количественно оценивать ДНК микроорганизмов в исходном материале, а также использовать мультиплексный анализ (анализ результатов по нескольким каналам детекции), что дает возможность выявлять большее количество микроорганизмов в каждой пробирке.

Теоретическая чувствительность метода ПЦР - 1 копия искомого гена в исследуемом образце (5-10 мкл раствора ДНК). Такой результат в идеале можно получить при минимальных потерях ДНК в процессе выделения, отсутствии факторов, разрушающих ДНК, и оптимальном режиме амплификации. Однако на практике максимальная чувствительность метода ПЦР составляет от 5 до 50 генокопий в образце, что является пороговым значением для обычной (качественной) реакции с электрофоретическим учетом результатов. На чувствительность метода могут влиять следующие факторы.

Несмотря на то что методики real-time PCR в целом являются намного более чувствительными, нежели обычные (электрофоретические) способы детекции (в силу суммирования сигналов на протяжении всей реакции), на их чувствительность влияют те же факторы, связанные с подготовкой проб, сохранностью ДНК и принятым режимом ПЦР. Считается, что минимальное количество генокопий, выявляемое при real-time PCR, составляет от 2 до 10 в исследуемом образце в зависимости от оптимальности реакционной смеси и режима ПЦР. В такой ситуации основной проблемой становится возникновение сигнала в отрицательных контрольных пробах, который может быть сравним с минимальными значениями сигнала в испытуемых образцах.

Прямое секвенирование ДНК основано на синтезе in vitro исследуемого участка гена с применением ДНК-полимеразы, меченых дНТФ и праймеров, после чего устанавливается позиция меченого нуклеинового основания. Метод определения последовательностей (сиквенсов) РНК, считываемых с матрицы ДНК, основан на использовании радиоактивных фрагментов ДНК. Короткие полинуклеотидные участки подвергаются полимеразной реакции в присутствии или отсутствии каждого из 4 дНТФ (так называемый плюс-минус метод). При отсутствии того или иного нуклеотида рост цепочки прерывается перед соответствующей позицией его в цепочке исходной ДНК, а при их наличии идет далее. Продукты реакции фракционируют путем электрофореза, сравнивают по длине и делают выводы о позициях каждого из 4 нуклеотидов в коротких фрагментах. Этот подход применим для секвенирования ДНК в небольших участках генов фагов и вирусов.

Современный, более эффективный и быстрый способ секвенирования ДНК основан на копировании изучаемого участка ДНК посредством ДНК-полимеразы. Главное отличие от прямого секвенирования состоит в том, что в реакционную смесь добавляют один из нуклеотидов в форме дидезоксиНТФ (ддНТФ). При включении его в ДНК рост цепочки прекращается, т.е. тот или иной ддНТФ служит в качестве «терминатора» синтеза. С изучаемым образцом ДНК ставятся одновременно четыре реакции с каждым из 4 ддНТФ. Затем продукты реакций наносят на полиакриламидный гель, оценивают их относительную длину (т.е. место прерывания синтеза) и позицию данного нуклеотида в последовательности участка гена. Именно этот метод в 1980-х гг. получил применение в клинических исследованиях, в частности при анализе тонких генетических различий (генных вариантов), что оказалось крайне важным для идентификации индивидуальных молекулярно-генетических признаков. Данный способ лег в основу углубленного (high-resolution) типирования генов гистосовместимости (генов системы HLA) у доноров и реципиентов по мере широкого внедрения в клинику аллогенной трансплантации костного мозга.

Основным преимуществом метода ПЦР при диагностике инфекционных агентов по сравнению с классическими микробиологическими методами (культивированием и идентификацией клинических изолятов) является быстрота исполнения (5-6 ч). В сравнении с иммунологическими определениями (например, иммуноферментными или иммунофлюоресцентными методами выявления антигенов) ПЦР ДНК во многих случаях является более чувствительным и экономичным методом (по крайней мере, на отечественном рынке соответствующих реагентов). В частности, при диагностике вирусных инфекций, особенно гепатита С, вирусную РНК в плазме больных обнаруживают с первых дней заболевания, тогда как специфические антитела (основной объект иммунологического скрининга при гепатите С) - только спустя 2-7 нед после заражения. При диагностике папилломы молекулярно-биологические методы позволяют дифференцировать онкогенные и менее патогенные типы вируса, а также идентифицировать вирус, интегрированный в хромосомы человека, т.е. предраковые состояния.

При идентификации генетических заболеваний (инактивации белка из-за генной мутации) ДНК-диагностика стала более практичным методом выявления больных и членов семей - носителей мутантного гена по сравнению с биохимическими методами определения соответствующих метаболитов. Молекулярно-биологические методы особенно важны для диагностики наследственных заболеваний, для которых неизвестен четкий биохимический субстрат или соответствующая биохимическая диагностика весьма дорога. Прогресс генной диагностики связан с успешным завершением проекта «Геном человека», в результате которого стала известна нормальная последовательность нуклеотидов в 99,9% генов человека. При подозрении на наличие редких мутаций гена проводят амплификацию и последующее секвенирование выделенного сегмента. Медико-генетические исследования касаются в первую очередь наиболее распространенных генетических заболеваний - муковисцидоза, фенилкетонурии, миодистрофий.

При выявлении онкогенов, специфичных для различных злокачественных заболеваний, особенно лейкозов и лимфом, ПЦР-диагностика (при необходимости с последующим секвенированием продукта ПЦР) становится методом диагностики, превосходящим иммунохимические способы диагностики (иммуногистологические, проточно-флюориметрические) по чувствительности и часто по экономичности исследования.

Для проведения ПЦР используют амплификаторы, или термоциклеры. В основе устройства прибора для проведения ПЦР лежит принцип циклическогонагревания-охлаждения. Эти термальные процессы обычно проходят в диапазоне температур от 95 °С (верхняя граница) до 4 °С (температура хранения проб после завершения ПЦР). В настоящее время используют приборы для амплификации, которые имеют матрицу с лунками для стандартных ПЦР-пробирок (на 200 или 600 мкл) и электрический термоэлемент типа Пельтье для последовательного нагревания-охлаждения этой матрицы. Приборы для ПЦР разных моделей различаются главным образом емкостью (количеством загружаемых проб), конструктивными материалами (сталь, алюминий, пластик и др.), элементами дизайна и интерфейса.

С помощью термоциклеров можно осуществлять размножение нужных участков молекул ДНК (или кДНК, полученных из РНК) в тысячах копий. Амплификаторы ДНК можно отнести к специализированным термостатам с температурой, изменяющейся во времени согласно заданной программе. В зависимости от количества ПЦР-программ, проводимых одновременно, амплификаторы можно разделить:

В зависимости от задач и методов учета амплификации современные термоциклеры можно классифицировать:

Для многих моделей амплификаторов предусмотрена возможность программирования и управления посредством компьютера.

Классический метод детекции результатов ПЦР - разделение ее продуктов (ампликонов) методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Этот способ незаменим при детекции продуктов ПЦР с малыми различиями по молекулярной массе. Однако приготовление ПААГ достаточно трудоемко, что ограничивает его использование при массовых исследованиях. В настоящее время сепарацию продуктов амплификации чаще всего проводят в 1,5-2% агарозном геле. Учет результатов проводят в гелях, содержащих бромистый этидий, образующий химические комплексы с ДНК, которые интенсивно флюоресцируют при подсветке ультрафиолетовым излучением. Для учета результатов реакции применяют трансиллюминатор. В настоящее время используют системы видеодокументации изображений, которые включают трансиллюминатор, видеокамеру с высоким разрешением, персональный компьютер с соответствующим программным продуктом для записи и хранения изображений.

Практическими недостатками такого способа детекции являются:

Приборы для оценки ПЦР в режиме реального времени представляют собой своеобразный гибрид амплификатора и флюориметра и позволяют оценивать динамику ПЦР прямо в закрытых пробирках по мере накопления продукта амплификации и проводить количественный ПЦР-анализ. Специфичность сигнала при ПЦР в реальном времени обусловлена применением специальных ДНК-зондов с флюоресцентной меткой. В процессе ПЦР по мере синтеза новых и новых копий искомого участка гена происходят специфическое связывание этой меченой цепочки нуклеотидов и ее разрушение с выходом красителя в окружающую среду. По мере протекания ПЦР светочувствительные элементы снимают показатели с каждой из пробирок и вводят эти данные в память компьютера. При этом строится динамическая кривая накопления ПЦР-продукта по отдельным пробам.

Объемы анализируемых проб, время анализа и температура измерений соответствуют таковым для обычной ПЦР. Тем не менее в этом режиме не требуется дополнительное время на процедуры, связанные с электрофорезом, так как кривые накопления продуктов реакции доступны сразу по окончании real-time PCR. Калибровка зависит от типа имеющегося прибора. Она требуется для оптимизации параметров оптического блока и выравнивания показателей по отдельным лункам, осуществляется с теми флюорохромами, которыми помечены применяемые ДНК-зонды.

Количественная оценка ДНК или РНК патогенного микроорганизма в клинических образцах бывает исключительно важна для прогноза заболевания и контроля терапии. Эта технология активно внедряется в российские клинико-диагностические лаборатории.

Кроме возможности количественного учета результатов реакции, к несомненным достоинствам real-time PCR следует отнести высокую технологичность исследования и снижение вероятности загрязнения помещений лаборатории продуктами амплификации.

Автоматическое секвенирование в большинстве приборов для клинических исследований сводится к использованию метода терминирующих ddNTP. На первом этапе проводятся терминирующие полимеразные реакции, затем - разделение продуктов реакций методом капиллярного микроэлектрофореза. Современное приборное обеспечение позволяет автоматизировать процесс разделения флюоресцентно-меченых фрагментов ДНК в полиакриламидном геле, получение типа и распределения эмиссии флюорофоров, последующий анализ собранных данных и выдачу готового результата.

Помимо оптимизации полимеразной реации, важнейшим моментом является мечение определенных нуклеотидов для реакции. Это делают, включая метку в состав праймера или в нуклеотид, который терминирует реакцию. Например, каждый из четырех терминирующих НТФ метят «своим» флюорофором, что позволяет проводить все четыре реакции в одной пробирке и анализировать продукты реакции в пределах одной зоны электрофореза. В автоматическом секвенировании используют флюорофоры, абсорбция и излучение у которых происходят в диапазоне длин волн 450-650 нм (видимая область спектра) или 650-825 нм (ближняя инфракрасная область спектра). Оптические системы и аппаратура для обработки данных должны минимизировать возможное наложение спектров лучевой эмиссии для отдельных флюорофоров. При анализе данных следует учитывать, что некоторые флюорофорные молекулы могут изменять заряд (и соответственно подвижность) продуктов реакции в электрофорезе, что может быть причиной артефактов.

Ферменты, применяемые для секвенирующих процедур, относятся к рекомбинантным ДНК-полимеразам, не обладающим экзонуклеазной активностью и толерантностью к включению меченых дезоксинуклеотидов. Выбор термочувствительных или термостабильных полимераз определяется режимами реакции (обычной или циклической, т.е. типа ПЦР) в зависимости от задач секвенирования в конкретном случае.

Аппаратура для секвенирующего гель-электрофореза должна обладать достаточно высоким разрешением, чтобы разделять фрагменты, различающиеся по длине лишь на один нуклеотид. Разделяют фрагменты в денатурирующем режиме (5-8% ПААГ с 7М мочевиной). Обычно электрофорез проводится в трис-боратном буфере. Важным условием при проведении электрофореза является однородность температуры геля и заключающих стекол. Прекрасным решением для автоматического секвенирования является капиллярный электрофорез в стеклянной трубке длиной 30-100 см при небольшом диаметре капилляра (50-100 мкм), что значительно ускоряет процедуру разделения.

Современные секвенаторы можно разделить по типу проводимого электрофореза на капиллярные и с гелевыми пластинами. Последние могут различаться по количеству детектируемых красителей - один, два или четыре. Капиллярные секвенаторы выпускаются только в варианте, использующем детекцию четырех флюоресцентных красок, возбуждаемых излучением аргонового лазера. Разделение фрагментов проводится в геле толщиной 0,4 мм. Возбуждение флюорофора и следующая за этим эмиссия флюоресценции происходят при прохождении меченым фрагментом ДНК зоны сканирования. Для уменьшения эффекта перекрывания спектров эмиссии получаемый сигнал пропускается через колесо с 4 последовательно заменяемыми фильтрами. В результате первичные данные представляют собой наборы из четырех чисел (в соответствии с сигналом, прошедшим через каждый из фильтров) для каждой точки сканирования (по ширине геля), собранные через равные интервалы времени в течение всего электрофореза.

Секвенаторы на гелевых пластинках обнаруживают флюоресценцию от одного до нескольких красителей. Имеется несколько модификаций в зависимости от типа лазера, направления луча возбуждающего света. В частности, у секвенатора MicroGene разделение происходит в одноразовых MicroCel-кассетах, заполняемых фотополимеризуемым акриламидом. Высота кассет варьирует от 140 до 280 мм, что позволяет секвенировать от 300 (MicroCel 300 Cassette) до 700 (MicroCel 700 Cassette) нуклеотидов. В качестве источника излучения используют гелиево-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм. Луч лазера направляют поперек геля. Это позволило отказаться от любых движущихся частей и, следовательно, значительно повысить надежность прибора и уменьшить его размеры.

Высоким качеством отличаются секвенаторы, работающие на красителях инфракрасной области спектра. Как известно, естественное инфракрасное излучение несвойственно биологическим макромолекулам и компонентам акриламидных гелей, поэтому регистрируется исключительно сигнал от красителя. Двухканальная система позволяет избежать перекрывания спектров эмиссии (они разнесены) и проводить одновременное двунаправленное секвенирование (сразу с двух праймеров, каждый из которых мечен своим красителем). За один прогон секвенатор IR2 DNA Sequencer способен определять более 1000 нуклеотидов. В секвенаторе ABI Prism 377 основное новшество заключается в замене оптической фильтрации флюоресценции на «виртуальную» фильтрацию. В процессе сканирования эмиссия флюоресценции отделяется от отраженного света лазера посредством дифракционной решетки и фиксируется CCD-камерой. В итоге кванты света преобразуются в пиксели на всем промежутке спектра от 514 до 680 нм, анализ выполняется. Максимально возможный размер определяемых фрагментов - 800-900 нуклеотидов.

Схожая технология записи и обработки данных применяется в некоторых капиллярных секвенаторах.

Уникальным преимуществом молекулярно-биологических методов является возможность динамического наблюдения за присутствием и содержанием определенных генов, что позволило ввести их в соответствующие диагностические панели. Основным требованием на скрининговом этапе исследований является высокая чувствительность при достаточной специфичности диагностики. В частности, сочетанное применение иммунологических методов и ДНК-диагностики позволяет проводить серийные обследования на наличие гепатитов В, С и ВИЧ-1 в особых группах риска. На следующем этапе возможно повторное проведение диагностики уточняющего характера в отобранных во время скрининга группах с сомнительными или положительными результатами.

Уточняющая диагностика требует не только достаточной чувствительности, но и высокой степени специфичности определений. Задачей цитологического анализа в этих ситуациях является не только подтверждение диагноза, но и при возможности определение специфического генотипа в целях прогнозирования течения заболевания и планирования оптимальных схем лечения.

Ценность молекулярно-биологических методов наиболее высока при проведении специфической терапии из-за их высокой чувствительности и возможности отслеживать минимальные уровни патологических генных мишеней, будь то гены инфекционных патогенных микроорганизмов или онкогены при злокачественных заболеваниях. Разработка методов полуколичественной и количественной оценки количества генокопий в образце (ПЦР в реальном времени) дает уникальную возможность отслеживать динамику концентраций патологических генов (вирусов, микробов при лечении инфекций или онкогенов при терапии лейкозов) в биологических пробах. Особое значение имеет количественная ПЦР-диагностика при гепатитах и ВИЧ-инфекции, так как сроки назначения и интенсивность специфического лечения в этих случаях во многом зависят не только от клинического статуса, но и от содержания вируса в периферической крови, а также от генотипа вируса. Ответ на терапию определяется наряду с улучшением клинической картины по снижению содержания количества копий вируса в плазме крови.

Другая важная область применения генной диагностики в динамике заболеваний - определение остаточных специфических онкогенов при интенсивном лечении лейкозов и лимфом. Особую роль имеет количественная диагностика минимальной остаточной болезни после трансплантации костного мозга больным с лейкозами, когда критерием излечения считается молекулярная ремиссия (содержание клеток с патогенным онкогеном менее 1 на 1 000 000 лейкоцитов костного мозга или периферической крови). Такой же важной частью динамического наблюдения является регулярное качественное или количественное определение целевых патологических генов для оценки качества, продолжительности достигнутой клинической ремиссии и раннего выявления рецидивов болезни.

Учитывая многообразие генетических маркеров, определяемых методами молекулярной диагностики, и большое количество тест-систем, доступных на рынке лабораторных реагентов, правильность получаемых результатов зависит от стандартности выполнения основных этапов диагностики, а именно от заготовки и хранения биологических образцов, процесса подготовки проб, выделения нуклеиновых кислот, составления ПЦР-смесей, режима амплификации ДНК и учета результатов. В связи с этим следует обращать внимание на следующие факторы:

Генную диагностику в большинстве лабораторий проводят с помощью коммерческих тест-систем для ПЦР и/или гибридизации ДНК. Во многих из этих систем предусмотрен так называемый ген внутреннего контроля (ВК), т.е. данный ген должен выявляться в любом клиническом биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты. Присутствие четкого сигнала ВК свидетельствует о том, что подготовка проб и выделение нуклеиновых кислот из данного клинического образца проведены успешно. К каждому диагностическому набору прилагается образец положительного контроля с образцом целевого гена (в форме ДНК, кДНК, плазмиды или специфического ампликона), а также отрицательный контроль (им может служить буферный раствор, применяемый для растворения ДНК). Эти контрольные образцы подвергают той же обработке и амплификации, что и исследуемые клинические пробы ДНК. Правильность проводимого исследования подтверждается специфическим сигналом в положительном контроле и отсутствием сигнала в отрицательном. Это свидетельствует о достаточной активности компонентов тест-системы и об отсутствии существенных загрязнений реактивов, использованных на этапе подготовки проб и выделения ДНК.

Пробы ДНК и РНК, выделенные для рутинной клинической генной диагностики, должны храниться, по крайней мере, до 1-2 мес в глубоком холоде на случай необходимости повторных или дополнительных исследований. Внутрилабораторный контроль качества проводят регулярно путем повторных анализов положительных проб и сравнения с результатами текущих серий. Такие сравнения особенно важны при переходе с реагентов одного производителя к тест-системам другой фирмы. В мероприятиях по внутрилабораторному контролю качества особое значение имеет видеоаппаратура для фиксации и хранения результатов исследований. Помимо обычного оснащения, для учета результатов ПЦР (трансиллюминатора, видеокамеры) необходимо иметь компьютер для сохранения полученных изображений, возможности их сопоставления и контроля в разные сроки и с разными тест-системами.

В качестве средств межлабораторного контроля в молекулярной диагностике периодически или при необходимости проводят следующие мероприятия:

По мере расширения сети лабораторий, использующих методы молекулярной диагностики, возникли проблемы стандартизации соответствующих исследований. В последние годы в различных странах создаются системы внешнего контроля качества молекулярно-биологических исследований. Учитывая многообразие генов, определяемых методами ПЦР, и большое количество диагностических продуктов, предлагаемых на рынке лабораторных тестов, задачи системы внешнего контроля качества представляются вполне рациональными и обоснованными.

Контроль качества молекулярно-биологических исследований является одним из новых направлений работы Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) РФ. Основной задачей этой контрольной системы является оценка традиционных лабораторных показателей. Так, на 2007 г. ФСВОК включала 121 раздел с участием более чем 7000 лабораторий по России. В программах по оценке качества ПЦР в 2007 г. участвовали более 200 лабораторий, от которых было сделано более 400 заказов на контрольные образцы. Большая часть лабораторий проявила интерес к диагностике урогенитальных инфекций [Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Neisseria gonorrhoeae (около 70% контрольных образцов)], около 25% - к контролю ПЦР-диагностики гепатита С и лишь около 5% - к диагностике туберкулеза. Это свидетельствует, с одной стороны, о достаточно ограниченном круге ПЦР-диагностикумов, предлагаемых ФСВОК, а с другой - об узкой специализации молекулярно-диагностических исследований в большинстве клинических лабораторий.

Аналогичные системы контроля качества генной диагностики созданы в ряде европейских стран (Великобритании, Финляндии, Франции), они пока ограничиваются небольшим ассортиментом контрольных образцов. Так, система Labquality (Университет Хельсинки) в основном занимается оценкой качества диагностики Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae. Контроль качества количественной ПЦР пока не приобрел распространения на уровне национальных систем, хотя соответствующие тест-системы, особенно наборы для диагностики ВИЧ-1, гепатитов В и С и контрольные образцы к ним, выпускаются рядом фирм в России и за рубежом. Проблема состоит в том, что в количественной ПЦР-диагностике пока не выработаны общепризнанные стандарты для количественного контроля, которые могли бы служить в качестве референтных. Количественные тест-системы от крупных фирм-производителей (Roche, Chiron и др.) после получения разрешений от своих надзорных органов (FDA в США и др.) могут использоваться для неофициальных референтных оценок результатов другими лабораториями с иными тест-системами.

Методы клинической молекулярной диагностики получили широкое распространение в нашей стране и применяются в различных областях медицины, таких как: