Иммуногеномика и генодиагностика человека

Одним из достижений человечества в XX в. стала расшифровка генома человека. Однако эту работу никак нельзя считать законченной. Более того, основная часть практических результатов будет, по-видимому, получена в течение не одного десятка лет. Это связано с тем, что сама по себе расшифровка отдельных участков генома далеко не всегда дает возможность применить эти знания на практике. Необходимы установление и изучение функции белковых продуктов тех или иных генов, поскольку именно они принимают непосредственное участие в осуществлении различных функций организма. Этот этап изучения геномики человека называется «протеомикой», и, в целом, эта наука находится на начальной стадии исследований. Разумеется, достижения и прорывы в различных областях протеомики неоднозначны. Однако есть много оснований для того, чтобы считать, что наибольшие знания не только геномики, но и протеомики имеются сегодня в области исследований главного комплекса тканевой совместимости человека - системы HLA. Последнее объясняется тем, что, как было сказано выше, уже с конца 1950-х годов интенсивно исследовались именно белковые продукты системы HLA и на основании их анализа судили об HLA-генах. Таким образом, как было отмечено ранее, к началу периода изучения именно геномики HLA протеомика данной генетической системы была изучена достаточно полно. При этом следует напомнить, что и начало исследований геномики HLA (1980-е годы) значительно опередило начало интенсивных исследований в области геномики человека в целом. Результатом этого стал факт наиболее полного и широкого понимания не только структур, но и функции (т.е. протеомики) системы HLA.

Тем не менее при изложении современного состояния знаний в области геномики и протеомики системы HLA мы сочли целесообразным представление данных не в порядке их получения, т.е. начиная с протеомики, а с геномики. Это связано с тем, что именно такая последовательность является, на наш взгляд, более логичной для освещения современных знаний о функции системы HLA.

Традиционно гены HLA и их продукты разделяют на 3 класса - I, II, III. Причем в клеточном взаимодействии и регуляции иммунного ответа участвуют в основном HLA-антигены I и II классов - продукты соответствующих генов (класс I и II).

Гены HLA класса I, которые иногда также по традиции называют генами, кодирующими трансплантационные антигены, первоначально были подразделены на 3 локуса, называемые А, В и С. Однако сегодня кроме генов этих локусов в класс I системы HLA включаются еще 18 генов класса I HLA, 11 из которых являются псевдогенами, а 7 - ассоциированы с продуктами транскрипции [87, 68].

Расположение генов А, В и С на хромосоме следующее: крайний к центромере локус HLA-B на 0,2 сМ (1 cM соответствует 1х10⁶ п.н. ДНК); в сторону теломеры расположен локус HLA-C и на 0,8 сM в сторону теломеры расположен HLA-A [58].

«Соседом» кластера генов класса I HLA является ген, относящийся к классу III - C2, расстояние до которого от HLA-B составляет 0,65х10⁶ п.н. Всего же размер кластера генов HLA класса I составляет 1,4х10⁶ п.н.

Организация генов HLA класса I имеет высокую степень гомологии. В них содержится 8 экзонов (рис. 2.2, см. цв. вклейку). Первый экзон кодирует сигнальную последовательность; второй, третий и четвертый - домены α1, α2 и α3 соответственно, молекулы HLA. Пятый экзон кодирует трансмембранный участок цепи, цитоплазматический участок кодирует экзоны 6 и 7. 3'-Нетранслируемый участок кодирует экзон 8 (3’UTR).

Межэкзонные различия между генами локусов А, В и С состоят в том, что HLA-A и -B гены содержат втрое больше нуклеотидов (1080) в 5-м экзоне по сравнению с генами локуса HLA-C.

В дополнение к «классическим» локусам HLA-A, -B и -C к первому классу относятся также гены HLA-E, -F, -G (рис. 1.4, см. цв. вклейку). Гены Е локализованы между HLA-B и -C, а картируемые ими антигены экспрессируются на покоящихся (зрелых) периферических Т-лимфоцитах и клетках карциномы человека [58].

Гены HLA-F и -G картированы в сторону от теломеры на расстояние 80 сМ [58] (рис. 1.4, см. цв. вклейку).

Благодаря использованию метода ДНК-генотипирования с применением сиквенс-специфических олигонуклеотидов в 1994 г. при секвенировании HLA-E установлено 5 аллельных вариантов, хотя соответствующие белки еще не выявлены [16].

Антигены, кодируемые генами HLA-F, также еще не установлены.

Экспрессия антигенов, кодируемых локусом HLA-G, впервые была установлена на клетках хориокарциномной клеточной линии, а также на мембране клеток при хроническом цитотрофобластозе [35]. Их физиологическая функция связана в первую очередь с репродукцией (подробнее см. гл. 5).

Методом PCR-RFLP был установлен аллельный полиморфизм HLA-G в экзонах 2 и 3 [71]. Всего к настоящему времени установлено 14 аллельных вариантов HLA-G. Следует отметить, что вопрос о степени полиморфизма у описанных выше «неклассических» генов остается открытым, как остается открытым и вопрос о биологической функции их самих и их продуктов.

Несколько новых генов с необычной периодической структурой идентифицированы на расстоянии 250 kb от HLA-A гена в центромерном направлении. Анализ нуклеотидных последовательностей этих генов показал, что они относятся к псевдогенам. В этом же субрегионе HLA-комплекса идентифицирован экспрессирующий ген, обозначенный как CD12 и расположенный на расстоянии 50 kb от гена HLA-A. Кодируемый им белок по своей структуре отличается от классических антигенов I класса [33].

Также к HLA-антигенам класса I относятся гены локуса MIC (MIC-A и MIC-B). Аббревиатура MIC расшифровывается как MHC class I Chain-related genes. Эти гены локализуются на 6-й хромосоме в непосредственной близости от HLA-B [52]. Молекула MIC-A состоит из 383 аминокислотных полипептидов и имеет массу 43 кД. Антигены MIC обладают способностью связывать пептиды и другие короткие лиганды. В настоящее время не ясно, являются ли MIC-антигены более древними либо, напротив, происходящими от классических антигенов класса I [11]. При нуклеотидном сиквенсе установлено 17 аллельных вариантов генов МICA и MICB, в геноме MICA обнаружено 5 различных аллельных вариантов, полиморфных по микро-сателлитным участкам [68]. Установлена взаимосвязь между микросателлитным полиморфизмом MICA и болезнью Бехчета. Данная ассоциация оказалась более выраженной, чем известные ранее ассоциации болезни Бехчета с классическими HLA-антигенами.

В последнее время обнаружено, что антигены MICA участвуют в активации взаимодействия TCR с молекулой МНС и принимают участие в развитии Т-клеточно-опосредованной цитотоксичности и активности НК-клеток; тем самым, в частности, играя роль в обеспечении противоракового иммунитета [12]. Таким образом, по-видимому, антигены MIC по своей физиологической значимости приближаются к таковой, установленной для классических антигенов HLA.

Молекулярно-генетический анализ позволяет разделить регион HLA класса II на отдельные локусы (рис. 1.4, см. цв. вклейку). Внутри локуса HLA-DR кодируются относительно неполиморфный ген α-цепи - DRA (2 аллельных варианта) и несколько генов β-цепи - DRB1-DRB9. Из данных генов β-цепи экспрессируются DRB1, DRB3, DRB4 и DRB5. Интересно, что количество DRB-генов на данной хромосоме зависит от DR-специфичности гаплотипа. Внутри HLA-DQ и -DP-региона кодируются два гена α- и два гена β-цепи. Однако экспрессированы только DQA1, DQB1 и DPA1, DPB1.

Каждая HLA-молекула несет только одну антигенсвязывающую бороздку, которая, тем не менее, должна обеспечить представление всего разнообразия пептидов. Это обеспечивается за счет экстремально высокого уровня HLA-аллельного полиморфизма. Помимо этого двум из генов HLA класса II - HLA-DQ и HLA-DP присуща еще одна особенность: продукты этих генов имеют различные функционально активные молекулы, в зависимости от cis- и trans-положения при ассоциации α- и β-цепей.

Для идентификации аллельных вариантов генов HLA Номенклатурный комитет ВОЗ ввел новую официальную номенклатуру, отличную от ранее существовавшей для идентификации HLA-антигенов [16]. Естественно, что количество аллельных вариантов HLA значительно превосходит количество ранее известных соответствующих HLA-антигенов. Более того, в отношении ряда HLA-локусов имеются уже не количественные, а качественные отличия, поскольку серологическими или клеточно-опосредованными методами продукты ряда генов не выявляются.

Для сопоставления возможностей выявления HLA-специфичностей на уровне антигенов с таковыми на молекулярно-генетическом уровне приведена табл. 2.1.

Таблица 2.1. Два уровня определения HLA-полиморфизма, общее число специфичностей

Действительно, из табл. 2.1 следует, что молекулярно-генетическое HLA-генотипирование не только позволяет идентифицировать почти на порядок большее количество HLA-cпецифичностей, чем серологические и клеточно-опосредованные методы, но и идентифицировать новые гены как в классе I, так и в классе II. Помимо этого в классе II в локусах HLA-DQ и -DP идентифицируются аллельные варианты, определяемые полиморфизмом отдельных цепей, например DQA1 и DQB1.

На наш взгляд, было бы целесообразным для понимания реализации роли системы HLA более подробно осветить вопрос о роли полиморфизма отдельных генов HLA в осуществлении иммунных функций.

Так, гены DR-локуса включают один низкополиморфный регион, кодирующий альфа-цепь. До настоящего времени полиморфизм HLA-DRA установлен относительно наличия серина или валина в положении 217 [36]. Таким образом, имеются два аллельных варианта гена DRA.

Напротив, в высокополиморфном HLA-В-регионе полиморфизм проявляется как на уровне экспрессирующих генов, так и псевдогенов. Наиболее полиморфным из генов HLA-DRB является HLA-DRB1, насчитывающий к настоящему времени более 300 аллельных вариантов.

DQ-локус содержит по 2 пары генов А и В (рис. 1.4, см. цв. вклейку), однако хотя DQA-2 и B2 гены транскрибированы, их белковые продукты еще не установлены, и поэтому в настоящее время принято считать, что единственным экспрессирующим геном DQ является А1 и В1, при этом, в отличие от DR-локуса, полиморфизм DQ-локуса связан с генами HLA-DQ-A и -В. DQ-полиморфизм в значительной степени связан с DRB-полиморфизмом, причем эта связь значительно более выражена для DQA по сравнению с DQB.

Третьим из хорошо изученных локусов HLA класса II является DP-регион, в котором экспрессирующим являются также два гена DPA1 и DPB1, в то время как гены DPA2 и DPB2 являются псевдогенами [85].

Исследования последовательности DPA-генов позволило установить к 1989 г. наличие 8 аллелей, в DPB1 -регионе было установлено 38 аллелей. Эти аллели идентифицируются методом SSO, и для части из них установлено соответствие с определенными HLA-DP-антигенами [15], выявленными в тесте примированной смешанной культуры лимфоцитов (PLT).

Следует отметить, что для антигенов локуса HLA-DP установлен значительно более низкий уровень полиморфизма (на уровне аминокислотных последовательностей) по сравнению с генами локусов HLA-DR и -DQ.

Помимо хорошо изученных генов HLA класса II, в регионе HLA-D установлены новые гены HLA (рис. 1.4, см. цв. вклейку), среди них в первую очередь стоит остановиться на генах HLA-DOB; HLA-DNA и особенно HLA-DM (DMA и DMB), LMP и ШР.

Три последних локуса обеспечивают такую важнейшую функцию, как процессинг и экспрессию HLA-антигенов на поверхности клеток [24, 27].

HLA-DOB выявлены в ДНК-библиотеке, полученной из В-лимфобластоидных линий, и при этом была установлена 70% нуклеотидная гомология с генами DRB, DQB и DPB. Гены HLA-DOB картированы между DQ и DP, их экспрессия установлена на уровне мРНК в В-клеточных линиях и в Т-клеточных линиях, стимулированных γ-интерфероном [87].

Гены HLA-DNA были получены из геномной ДНК, гибридизированной с HLA-DRA, и они открываются на уровне РНК, выделенной из В-клеточных линий [87]. Гены локализированы в непосредственной близости от HLA-DQB в сторону центромеры (рис. 1.4, см. цв. вклейку). Гены HLA класса III занимают на хромосоме пространственное положение между генами HLA класса I и II и выполняют целый ряд важнейших биологических функций. До последнего времени этот регион был изучен по сравнению с генами класса I и II сравнительно мало.

Помимо генов HLA, принадлежащих классу I и II, на рис. 1.4 (см. цв. вклейку) представлена также локализация генов класса III, которым также принадлежит значительная физиологическая роль.

Так, одним из генов HLA класса III, привлекающих наибольшее внимание исследователей, работающих как в области изучения структуры системы HLA, так и по проблеме «HLA и болезни», является ген CYP21. Продукт этого гена - HLA-антиген HLA-B42, но основная его функция - контроль активности энзима цитохрома Р450.

Дефицит этого энзима приводит к развитию синдрома конгениальной адренальной гиперплазии, частота которой составляет в популяции европеоидов 1/10000.

«Нормально» функцию энзимов кодирует ген CYP21; в то время как CYP21A является псевдогеном.

Дефицит 21-гидроксилазы (21-ОН) в 25% обусловлен делецией не только CYP21B, но и гена C4B в результате генной конверсии [46].

Гены С4 (С4А и С4Б) кодируют 4-й компонент комплемента. Этот сывороточный белок в 200 кД синтезируется как молекула-прекурсор, которая при созревании образует белок, состоящий из 3 цепей - альфа, бета и гамма (с мол. массой 75, 95 и 30 кД) соответственно.

Компоненты С4А и С4В различаются как по физическим свойствам, так и по биологической эффективности. Так, С4А в 100 раз эффективнее, чем С4В, связывает аминовые группы.

Анализ сиквенса С4А и С4В позволил установить различия в последовательности 6 аминокислотных остатков в α-цепи. Исследование полиморфизма С4 в различных популяциях представляет значительный интерес для изучения проблемы «HLA и болезни».

Так, в популяциях европеоидов наличие «нулевого аллеля С4А» в большинстве случаев ассоциировано с делецией сегмента региона HLA класса III, включающего гены С4А и CYP21A. Помимо этого наличие «нулевого аллеля» в гаплотипе ассоциировано с предрасположенностью к системной красной волчанке (СКВ) и другим аутоиммунным патологиям. Следует отметить, что только полное отсутствие С4 (результат гомозиготности в обоих локусах) также имеет выраженную ассоциацию с СКВ. Что касается ассоциации СКВ и HLA-гаплотипом в целом, то наиболее сильная связь с предрасположенностью к СКВ установлена для гаплотипа HLA-A1-B8-DR3-C4.

Непосредственно к С4А примыкает ген G11 в сторону теломеры [83] (рис. 2.2, см. цв. вклейку).

Ген G11 экспрессирован в моноцитах, макрофагах, Т- и В-лимфоцитах и клетках печени. Ген G11 кодирует белок с мол. массой 28 кД, но его функция неизвестна.

Ген В (Bf) функционирует в значительной степени совместно с геном С2, принимая участие в «запуске» каскада комплемента, включая активацию С3- и С5-компонента комплементов, кодирующихся генами, находящимися вне HLA-системы. Дефицит В-фактора описан только в гетерозиготе [89]. В гомозиготе дефицит В-фактора не описан и, по-видимому, является летальным.

Как С2-, так и Bf-гены полиморфны. Среди аллелей гена С2 наиболее часто встречается вариант С2С. При этом наиболее частотными в Bf-генах являются аллели F и S.

Дефицит С2 - наиболее частая форма недостаточности системы комплемента у человека (частота отсутствия С2 в гомозиготе 1:10000). У 40% больных СКВ обнаружен дефицит С2 [82]. Отсутствие С2 связано не с делецией участка ДНК, а с нарушением транскрипции мРНК [81].

На расстоянии 92 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) от С2 в сторону от центромеры, в пределах локуса MHC класса III, находится кластер генов теплового шока 70 (HSP70 - 70 kilodalton Heat Shock Proteins), включающий 3 гена - HSP70-1 (HSPA1A в соответствии с номенклатурой HGNC), HSP70-2 (HSPA1B) и HSP70-HOM (HSPA1L). Первые два гена имеют сходную последовательность и кодируют практически идентичные белковые продукты [67]. Третий ген теплового шока, из расположенных на 6-й хромосоме, локализован на 4 т.п.н. дальше в сторону теломеры и также характеризуется высокой степенью гомологии с другими генами кластера. Белки, кодируемые данными генами, включают 641 аминокислотный остаток. Усиление экспрессии генов кластера HSP70 происходит в ответ на повышение температуры до 42°С.

Продукты HSPO-локуса играют определенную роль в интрацеллюлярном транспорте пептидов и вызывают развертывание белка перед преципитацией антигена [67].

Установлен также полиморфизм гена HSPO70-1 на уровне промоторного региона и HSP70-HOM на уровне кодирующего участка [67].

Крайним в сторону теломеры среди генов HLA класса III является локус TNF, отстоящий на 600 кД от локуса HLA-B [88]. В локус входят 2 гена А, кодирующие белок из 156 аминокислот, и TNF-B, кодирующий белок, включающий 171 аминокислоту.

Сиквенс генов TNF свидетельствует о 35% гомологии TNFa и ΤΝΡβ. Оба белка секретируются активированными макрофагами и Т-лимфоцитами и оказывают плейотропное действие на различные клеточные типы, включая различные субпопуляции лимфоцитов, нейтрофилы и эпителий сосудов [54].

Указанные механизмы действия белков TNF, а также их влияние на воспалительный процесс, опосредованный ими цитолитический и цитотоксический эффект против раковых клеток обеспечивают важнейшую биологическую функцию TNF [73].

Помимо этого белки TNF участвуют в регуляции экспрессии антигенов HLA класса I на эндотелии сосудов [61], что свидетельствует об участии TNF в развитии аутоиммунных патологий и при развитии отторжения трансплантации.

Представления о функции TNF в последние годы значительно расширились за счет появления работ, посвященных биологической роли отдельных полиморфизмов генов TNF. Так, в частности, было установлено [3], что наличие аллеля (-308)А в промоторе гена TNF связано с увеличенной продукцией белка TNFa клетками иммунной системы. Поэтому носители генотипа АА могут характеризоваться неадекватно увеличенной продукцией этого цитокина и, как следствие, более сильными воспалительными реакциями. Для этого же аллеля установлена ассоциация с повышенным риском развития аномалий центральной нервной системы. Установлено также, что женщины с бактериальным вагинозом - носители генотипа АА гена TNF (rs1800629) - имели высокий риск преждевременных родов [48, 63]. Найдены ассоциации аллеля (-308)F гена TNF с развитием эндотелиальной дисфункции у женщин при гестозе [5], а также с системным проявлением гестационной гипертензии во время беременности [26].

Недавно установленный ген G1, кодирующий полипептид, состоящий из 93 аминокислот, имеющий 35% идентичность с внутриклеточным Са²⁺ -связывающим белком кальмодулином и, по-видимому, выполняющий аналогичную кальмодулину функцию. Ген G картирован в центромере TNF (рис. 1.4, см. цв. вклейку). Гены HLA класса III, относящиеся к группе G, распределены в регионе HLA класса III дискретно. И часть их (ВАТ-гены) в настоящее время рассматриваются как отдельный локус.

Ген G13 кодирует белок 77 кД [56], принимающий участие в транскрипции HLA. Ген картирован на ближайшем к DRA конце региона HLA класса III (рис. 1.4, см. цв. вклейку).

В регионе генов HLA класса III большое количество новых генов, причем экспрессирующих, выявлено при изучении структурной организации комплекса МНС человека в рамках программы международных рабочих совещаний по изучению HLA. К ним следует отнести гены ВАТ1-9 (В-ассоциированные транскриптеры). Авторы, открывшие эти гены, ссылаясь на литературные данные и свои собственные результаты, не исключают возможности идентификации в этом регионе более чем 19 генов. К настоящему времени установлены белковые продукты двух генов, входящих в локус ВАT, - ВАТ2 и ВАТ3, это богатые пролином белки с мол. массой 228 и 110 кД соответственно [56].

Изучение биологической роли белков этих генов предполагает выполнение таких этапов, как отбор полноразмерных генов из библиотеки кДНК, секвенирование генов и их трансфекция, затем получение микробиальных продуцентов, синтезирующих полноразмерные белки, что, безусловно, требует достаточно много времени. В ближайшее время можно ожидать опубликования материалов, определяющих биологическую значимость этих генов и кодируемых ими белковых продуктов, в том числе и в патогенезе заболеваний.

Безусловно, обнаружение новых генов как в составе МНС, так и во фланкирующих его фрагментах ДНК имеет большую значимость. До сих пор не исключается возможность развития заболеваний человека, обусловленных нарушениями в структуре генов, локализованных рядом с генами главного комплекса тканевой совместимости I и II классов, или функциональной активностью кодируемых ими белковых продуктов. Кандидатами на эту роль могут быть в первую очередь гены серии ВАТ. Вполне возможно, что их белковые продукты участвуют во внутриклеточном процессинге антигенов, их транспорте и других событиях, в которых также участвуют МНС-молекулы I, II и III классов. Но в то же время это нисколько не противоречит данным, убедительно свидетельствующим о том, что аминокислотные замены в полиморфных эпитопах молекул тканевой совместимости II класса играют ключевую роль в нарушении физиологического иммунного гомеостаза и в запуске таких аутоиммунных заболеваний, как инсулин-зависимый сахарный диабет, псориаз и целиакия.

Для того чтобы лучше представить соотношение белковых молекул системы HLA и кодирующих их генов, нам представлялось целесообразным привести схему, предложенную R. Wassmuth, удачно сочетающую взаимоотношения указанных параметров [94]. Как следует из этой схемы (рис. 2.3, см. цв. вклейку), молекулы HLA класса I состоят из полиморфной α-цепи с мол. массой приблизительно 45 кД, а неполиморфная - β2-микроглобулин с мол. массой 11,5 кД, кодируемый геном, локализованным на 15-й хромосоме. Гликозилированная α-цепь состоит из трех экстрацеллюлярных доменов (α₁ , α₂ и α₃ ), трансмембранного домена и интрацеллюлярного якоря (рис. 2.3, а, см. цв. вклейку). Экзонинтронная структура генов класса I в общем отражает деление на функциональные домены (рис. 2.3, б, см. цв. вклейку). Как правило, гены HLA класса I состоят из 8 экзонов, общей протяженностью 3500 п.н. Основной полиморфизм локализован в доменах α₁ и α₂, кодируемых экзонами 2 и 3. Пространственная структура HLA-антигенов класса I была определена на примере антигена HLA-A2 исследователями из группы П. Бъеркман [13, 14], использовавшими для анализа растворимый антиген HLA-А2, полученный отщеплением с помощью папаина надмембранного участка молекулы. Проведенный рентгеноструктурный анализ позволил построить пространственную модель HLA-A2 с точностью до 2,6 ангстрема. Антиген HLA-A2 состоит из 2 наборов структурно гомологичных доменов: один набор образуется за счет α3- и β2-m-доменов, расположенных по соседству с мембраной; другой набор формируется α1- и α2-доменами, расположенными в отдалении от поверхности клетки.

Как видно из общего вида молекулы, представленного на рис. 2.3 (см. цв. вклейку), α3- и β2-m-домены имеют структуру β-складчатого листа и, таким образом, напоминают константный участок иммуноглобулина. Молекула образуется за счет двух антипараллельных β-складок, соединенных внутренним дисульфидным мостиком. Одна складка состоит из 4, а вторая - из 3 β-последовательностей. Общая укладка α1- и α2-доменов не имеет ничего общего с константными и вариабельными участками иммуноглобулинов, хотя α2-домен и содержит дисульфидную связь, напоминающую связь подобного рода в иммуноглобулиновых доменах. Между доменом β2-m и доменами α1 и α2 наблюдают более плотный контакт, чем между α1- и α2- и наиболее близким к поверхности клетки α3-доменом, а β2-микроглобулин как бы поддерживает пространственно ориентированные α1- и α2-домены. Кроме того, β2-m-домен является стержневым для укладки α3-домена. Наибольший интерес представляет, безусловно, организация α1- и α2-доменов, так как именно эта часть молекулы ответственна за рестриктированное распознавание антигенов Т-клеточными рецепторами [41, 64]. Несмотря на то что гомология между такими доменами менее выражена, они имеют общую структурную организацию и происхождение, так как они появились вследствие дупликации генов.

Каждый из доменов состоит из антипараллельных β-тяжей, сформированных 4 фрагментами молекулы, дающими в итоге N-концевую часть. Далее у каждого из доменов имеется С-концевой α-спиральный район. При объединении доменов формируется «платформа» из β-тяжей двух доменов. α-Спирали располагаются по бокам этой сформированной «платформы» под углом 40° к ее оси, т.е. α1- и α2-домены образуют желоб или «корзину», дно которой образовано β-структурой, а боковые части - α-спиралями. Размер данного региона приблизительно составляет 25х10х11А. Он может связывать иммунодоминантные пептиды длиной 8-11 аминокислот.

Спиральные участки α1- и α2-доменов состоят из двух α-спиралей. Первая спираль α1-домена более короткая (1,5 оборота, аминокислотных остатков 50-55), за ней следует более длинная вторая α-спираль (7,5-8 оборотов, аминокислотных остатков 57-85); угол между ними 110°. Спиральный район а2-домена также начинается с короткой α-спиральной последовательности (около 3 оборотов, аминокислотных остатков 138148), затем следует длинная спираль (аминокислотных остатков 150-175); угол между ними 130°. Глубокий «желоб» между α-спиралями а1- и а2-доменов является антигенсвязывающим участком. На дне его имеются углубления - «карманы», принимающие непосредственное участие в связывании пептидов, обеспечивая надежность связи между пептидом и участвующим во взаимодействии с ним участком молекулы HLA. Размер всей молекулы составляет 70 А в длину, а ее экстрацеллюлярная часть - от 50 до 40 А в поперечнике [87].

Вслед за кристаллографическим анализом молекулы HLA-A2-антигена «в целом» был выполнен анализ молекул HLA-антигенов класса I, кодируемых уже аллельными вариантами HLA-A*68:01, HLA-A*02:01 и HLA-B*27:05 [41, 64].

Хотя сравнительный анализ пространственной структуры этих антигенов выявил их принципиальную близость, оказалось, что аминокислотные остатки α1- и α2-доменов варьируют между изученными аллельными вариантами молекул HLA класса I. Так, при сравнении трех молекул HLA-A*02:01, HLA-A*68:01 и HLA-B*27:05 было установлено, что различие между ними касается 11 аминокислот, находящихся в антигенсвязывающей бороздке. Эти различия при кристаллографическом анализе, в свою очередь, меняют очертания карманов антигенсвязывающего сайта [41, 64], что, естественно, отражается на характере связи.

Как указывалось, размер желоба таков, что в нем может разместиться пептид, состоящий из 9-11 аминокислотных остатков. При этом концы желоба у антигенов гистосовместимости класса 1 закрыты в результате взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатков, α-спиральных участков и крайних β-тяжей.

Исследование структуры пептидов, способных взаимодействовать с продуктами определенных аллельных вариантов антигенов тканевой совместимости, позволило установить, что они имеют общие структурные черты, а именно наличие 2-3 консервативных участков последовательностей аминокислотных остатков. Боковые цепи этих аминокислот располагаются в карманах дна корзины, обеспечивая достаточно прочное связывание пептида. Как правило, пара карманов находится на участках, где располагаются N- и С-концевые фрагменты пептида, в то время как его центральная часть располагается свободно, что позволяет размещаться в бороздке пептидам разного размера и различной структуры. Профиль и характер (ионный, гидрофильный, гидрофобный) карманов варьируют от аллеля к аллелю, что также обеспечивает разнообразие взаимодействий в зависимости от аллельных специфичностей антигенов тканевой совместимости [87].

По данным рентгеноструктурного анализа [22], пространственная структура пептидсвязывающего участка антигена HLA класса II (HLA-DR1) имеет те же основные черты, что и у антигенов I класса HLA (рис. 2.3, а и б, см. цв. вклейку). Молекулы HLA класса II (рис. 2.3, а, см. цв. вклейку) состоят из тяжелой α- и легкой β-цепи с приблизительной молекулярной массой 33-35 кД и 29 кД соответственно. Обе цепи имеют два экстрацеллюлярных домена (α₁, α₂ и β₁, β₂), трансмембранный регион и интрацеллюлярный якорь (рис. 2.3, б, см. цв. вклейку). N-концевые α₁- и β₁-домены вместе образуют антигенсвязывающую бороздку молекул класса II. Трехмерная структура молекул HLA класса II имеет выраженное сходство со структурой молекул класса I [13, 90]. Это относится, в частности, и к антигенсвязывающей бороздке, которая также состоит из восьмиполосного β-складчатого листочка и двух α-спиралей.

В отличие от HLA-молекул класса I, антигенсвязывающая бороздка HLA-молекул класса II «открыта» с двух сторон, поэтому она может связывать более длинные фрагменты белков (15-30 аминокислот). При этом они могут выступать за пределы антигенсвязывающей бороздки. Ген α-цепи класса II состоит из 5 экзонов. Ген β-цепи несет добавочный экзон, кодирующий последовательности цитоплазматического домена. Наибольшим полиморфизмом отличаются N-концевые α₁- и β₁-домены, кодируемые экзоном 2. При этом связывающие сайты αβ-димеров имеют противоположную направленность. Пептид располагается в желобе в вытянутом положении [87].

Модель комплекса, образуемого пептидами с антигенами HLA, основана на представлении о том, что вариабельные аминокислотные остатки антигена, расположенные внутри желоба, ответственны за связывание с пептидами, а аминокислотные остатки, локализованные на находящихся внутри желоба участках α-спиралей или на их наружной поверхности, взаимодействуют с Т-клеточным рецептором. Именно это и является субстратом двойного распознавания, при котором Т-клеточный рецептор распознает чужеродный иммунодоминантный пептид только в контексте молекулы HLA.

Структурные исследования комплексов пептид-молекула HLA свидетельствуют о том, что один и тот же аллельный вариант антигена HLA может связывать целый ряд пептидов, обладающих общими структурными чертами (якорными аминокислотными остатками, обеспечивающими надежную связь с HLA-молекулой). Благодаря этому антигены, кодируемые различными аллелями HLA класса I и II, могут связывать тысячи различных пептидов [49]. При этом еще раз следует напомнить, что антигены HLA, серологически выявляемые как один антиген, но включающие в свой состав различные аллельные варианты, имеют различающийся профиль связи с этими пептидами. Понимание этого принципиально важно, поскольку, хотя речь идет о белковых молекулах HLA, осуществляющих презентацию тех или иных пептидов, прогнозировать то, как они будут представлены или будут ли они представлены вообще, можно уже на основании HLA-генотипирования, т.е. геномного анализа [72]. Таким образом, следует понимать, что различия, выявляемые на аллельном уровне, реализуются в возможности связывания конкретных пептидов внутри пептид-связывающей бороздки [80].

Следует также отметить, что имеется достаточно выраженный межаллельный полиморфизм в отношении связывания и презентации не только чужеродных, но и собственных пептидов, происходящих из HLA-молекул.

Последняя функция, роль которой, по-видимому, состоит в распознавании «свое-чужое», может также реализоваться и в патологическом процессе в случае нарушения количественного уровня представляемых аутопептидов, что бывает, например, при развитии аутоиммунных заболеваний [49, 60, 37]. Говоря о разнообразии в связывании и представлении пептидов, которое обеспечивает аллельный полиморфизм системы HLA, следует также отметить, что не все из молекул HLA, различающихся по кодирующему их аллельному варианту, имеют равные возможности в количестве связываемых ими тех или иных пептидов. Так, например, одна лишь специфичность - молекула HLA-A-2, кодируемая аллельным вариантом HLA-A*02:01, имеет 258 уже охарактеризованных лигандов, в то время как для большинства (двух третей) из числа молекул HLA-A различных специфичностей (учитывая все их аллельные варианты) эта цифра не превышает 10 [84]. При этом часть этих молекул может связывать только один конкретный пептид.

Такого рода различия не могут не сказаться на определенных преимуществах или, напротив, «изъянах» как в плане обеспечения развития специфического противовирусного иммунитета, так и в отношении выявления злокачественно трансформированных клеток и, соответственно, предотвращения развития онкологических заболеваний [43]. Таким образом, наличие в HLA-генотипе человека определенных аллельных вариантов тех или иных молекул HLA значительным образом влияет на реализацию иммунного ответа против факторов, существенно определяющих выживание данного индивида. В частности, не случаен поэтому тот факт, что HLA-A*02:01 является одним из высокочастотных аллельных вариантов, во всяком случае в большинстве европеоидных популяций. Этот факт - еще одно подтверждение важнейшей роли системы HLA в обеспечении выживаемости человека как биологического вида.

В большинстве случаев отдельно взятая молекула антигена тканевой совместимости способна связывать ограниченный круг пептидов. Поэтому для того чтобы отдельные чужеродные белки не могли избежать иммунологического распознавания, необходимо присутствие на клеточной мембране целого набора антигенов тканевой совместимости, включающих в гетерозиготном состоянии по 2 антигена каждого из локусов системы HLA. Отсюда же ясно, что HLA-гомозиготность организма по HLA-антигенам того или иного локуса является чрезвычайно невыгодным для него с физиологической точки зрения.

Помимо того что в генотипе конкретных лиц могут отсутствовать HLA-специфичности, способные связывать и представлять конкретные пептиды, в ряде случаев Т-клеточный рецептор не способен распознать пептид, представляемый конкретными антигенами класса II [78]. Результатом является ассоциированная с конкретным HLA-аллелем «неотвечаемость» организма на какой-то конкретный агент.

Следует также отметить, что подобная ситуация известна для антигенов HLA класса I, когда среди HLA аллелей класса I (локусы А и В), представляющих пептиды вируса инфлюэнцы, были выявлены аллельные варианты, при которых не происходило Т-клеточного распознавания в HLA-рестриктированном ответе [34].

В настоящее время анализ HLA-генотипов на уровне установления аллельного полиморфизма в сопоставлении с данными об иммуногенных эпитопах конкретных возбудителей заболеваний позволяет объяснять факты резистентности отдельных индивидов к тем или иным инфекциям [47, 23] и предсказывать, каким образом та или иная вакцина, и в первую очередь построенная на пептидной основе, будет «работать» среди представителей конкретной этнической группы в зависимости от HLA-профиля последней [9, 75, 86].

Естественно, что обязательным компонентом для реализации указанного достижения молекулярной генетики является необходимость знания HLA-профиля этнических групп, населяющих ту или иную страну или регион. Это особенно важно для такой многонациональной страны, как Россия, в которой HLA-профиль населяющих ее этнических групп весьма различен [4].

Что же касается вопроса о возможности оценки способности развивать иммунный ответ на конкретный иммунодоминантный пептид, в том числе определяющий защиту того или иного организма от патогенов, включая особо опасные инфекции, то такая возможность в последние годы появилась также благодаря дальнейшему развитию исследований, проводимых в области изучения молекулярных основ участия антигенов HLA в развитии иммунного ответа.

Был разработан принципиально новый метод, основанный на использовании мультимерных комплексов молекул HLA с представляемыми ими пептидами. Этот метод, используемый сегодня в тетрамерных и пентамерных вариантах, позволяет на молекулярном уровне оценивать как саму способность, так и эффективность Т-клеточного иммунного ответа человека с тем или иным генотипом на конкретный иммунодоминантный пептид. Более того, появилась принципиально новая возможность прогнозировать эффективность (по проценту населения, способного эффективно отвечать на иммунизацию) вновь создаваемых вакцин в определенной популяции людей в зависимости от HLA-генетического профиля. Одновременно с этим появляется возможность осуществлять на основании проведения мультимерного анализа образцов крови HLA-генотипированных лиц ретроспективную оценку состояния иммунологической защиты у лиц, иммунизированных в предыдущее время.

Естественно, что все сказанное выше относится только к группам населения, для которых заранее установлен характерный для них HLA-генетический профиль. Несмотря на то что подобные исследования на территории России ведутся уже более 20 лет, в том числе в рамках международной программы «HLA и антропология», в силу чрезвычайно выраженного этнического разнообразия населения страны, до настоящего времени на ее территории имеется еще целый ряд необследованных регионов.

Таким образом, следует еще раз подчеркнуть, что выполнению всего многообразия функций системы HLA способствует ее крайне выраженный полиморфизм, который определяется как наличием различных классов антигенов HLA, так и достаточно сложной их организацией. Этому же способствует кодоминантный тип наследования HLA-антигенов, при котором каждый человек получает по половине своего HLA-генотипа от каждого из родителей, т.е. из каждого локуса, кодирующего два антигена, один генотип наследует от отца и один от матери.

Как показано на рис. 1.5 (см. цв. вклейку), одной из важнейших функций системы HLA, реализуемой на ранних этапах развития иммунного ответа и лежащей в основе его регуляции, являются процессинг и презентация иммунодоминантных пептидов - продуктов внутриклеточного протеолиза чужеродных антигенов, против которых и будет индуцирован, а затем и разовьется иммунный ответ [21, 49, 45]. Этой функции антигенов системы HLA способствует само строение ее молекул, которое, несмотря на выраженное различие в структуре молекулы HLA-антигенов класса I и II, позволяет образовать на внешнем ее конце так называемую пептид-связывающую бороздку, в которой и удерживается представляемый для распознавания пептид.

Принципиальная схема представления пептидов антигенами HLA класса I и класса II приведена ранее. Общим для антигенов класса I и II является следующее. Антигенпредставляющая клетка осуществляет свое специфическое взаимодействие, представляя пептид в контексте собственной HLA-молекулы, идентичной таковой на клетке, воспринимающей информацию. Именно за установление этого феномена, названного феноменом двойного распознавания, Р.М. Цинкернагель и П.С. Доэрти получили Нобелевскую премию. Действительно, установление этого феномена стало ключевым моментом в понимании основ регуляции иммунного ответа. В то же время видны и существенные различия между взаимодействием, обеспечиваемым в процессе иммунного ответа антигенами HLA класса I и II. Во-первых, антигены HLA класса II обеспечивают взаимодействие антигенпрезентирующей клетки с Т-хелпером, а антигены HLA класса I - c Т-эффектором-киллером. Во-вторых, помогают им в этом различные молекулы-корецепторы: CD4 для Т-хелперов и CD8 для Т-киллеров. Естественно, что различным будет и эффект этого взаимодействия. Так, распознавание пептидов в контексте молекулы HLA класса II ведет к формированию популяции клеток Тh₁ и Тh₂, одни из которых индуцируют развитие гуморального иммунного ответа, а другие являются необходимым компонентом в индукции Т-киллеров. Что же касается антигенов гистосовместимости класса I, то Т-киллер, индуцированный против иммунодоминантного пептида, экпрессированного на поверхности клеток-мишеней в контексте HLA-антигенов класса I, идентичного таковым, экспрессированным на Т-киллере, уничтожит их. Следует еще раз подчеркнуть, что оба эти важнейших звена «нормального», т.е. физиологического, иммунного ответа строго ограничены набором HLA-антигенов, кодируемых конкретным аллельным вариантом, характерным для конкретного человека. В том случае, если пептид был бы представлен для распознавания клеткой, отличающейся по HLA-антигенам от распознающих клеток, то иммунный ответ развивался бы против этих представляющих клеток, т.е. в этом случае речь будет уже идти о развитии трансплантационного иммунитета.

Как указывалось выше, большое значение для формирования современных представлений о физиологической роли HLA-антигенов имело установление роли новых HLA-генов: DM, LMP и TAP. Это, в свою очередь, позволило конкретизировать представление о реализации функции HLA-антигенов. Их функция хорошо видна на рис. 1.5 (см. цв. вклейку).

Так, из числа антигенов, кодируемых системой HLA, первыми в систему процессинга антигенов, имеющих эндогенное происхождение (вирусы, собственные измененные и даже неизмененные антигены), включаются продукты локуса LMP (гены LMP2 и LMP7), активируемые γ-интерфероном и затем инкорпорируемые в протеосомы [20, 92]. Ген LMP2 также известен, как RING12, а LMP7 - как RING10. Аббревиатура LMP расшифровывается как Large Multifunctional Protease, а аббревиатура RING - как Really Interesting New Genes. Ген LMP2 находится в неравновесном сцеплении с геном ТАР1. Впервые данные гены были описаны и картированы в регионе 6-й хромосомы, находящемся между генами ТАР [44, 55]. Четыре входящих в систему HLA гена - LMP2 LMP7 и RING4, RING11- составляют кластер генов, ответственный за индукцию интерферонов [33, 34, 39], и именно с этим связан механизм действия генов LMP2 и LMP7 в плане активации протеосом. Возможным механизмом действия продуктов генов LMP2 и LMP/является замена ими, под влиянием индукции γ-интерферона, двух протеосомных субъединиц Y и X [8, 38].

Молекулы МНС класса I синтезируются в цитозоле клетки, где до появления соответствующего пептида находятся в связи с так называемым тирозин-калретикулиновым комплексом. После связывания с пептидом происходят высвобождение молекул HLA и транспорт на поверхность клеток также кодируемых МНС «пептидных насосов» ТАР (от транспортеров, ассоциированных с антигенным процессингом) [19, 91]. Данные гены известны так же как RING4 и -12 и PSF1 и 2 соответственно (PSF - Peptide Supply Factor). Последнее название отражает функцию данных молекул, которая в целом состоит в том, что они регулируют размер и специфичность пептидов, приводя их в «соответствие» со связывающими сайтами молекул МНС класса I [49]. Эти гены аналогичны Haml и Ham2, открытым ранее у мышей.

В 1993 г. было установлено, что гетеродимеры ТАР-1 и ТАР-2 участвуют в окончательной сборке молекул антигенов класса I и презентации ими эндогенных пептидов [70]. Молекулы, кодируемые геном ТАР2, находятся в неравновесном сцеплении с антигенами HLA-DR, и между генами ТАР1 и ТАР2 имеется высокая частота рекомбинаций [28, 53]. Установлено, что некоторые мутации в районе генов HLA-TAP ведут к потере презентирующей функции антигенов тканевой совместимости класса I [6]. Вполне возможно, что с нарушением антигенпрезентирующей функции ТАР-антигенов может быть связан высокий уровень ассоциации между аллелями гена ТАР1 и предрасположенностью к развитию такого аутоиммунного заболевания, как инсулинзависимый сахарный диабет [50]. В то же время имеется исследование о том, что один из аллелей ТАР1-локуса, а именно R659Q, для которого характерен дефект транскрипции РНК, выявляется на клетках мелкоклеточного рака легких [25, 7]. Наконец, имеются данные [31, 32] о том, что при синдроме Луи-Бар, характеризуемом наличием «голых Т-лимфоцитов», нарушение экспрессии антигенов HLA класса I связано именно с гомозиготным состоянием аллелей гена ТАР2.

Несмотря на то что данная работа посвящена изложению представлений о физиологической функции системы HLA, мы сочли целесообразным обсудить как вышеизложенные, так и некоторые последующие данные в связи с тем, что они иллюстрируют то, к чему приводят нарушения или полная утрата функции молекул HLA.

В отличие от молекулы класса I, обе цепи молекулы МНС класса II синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме, откуда после их временного соединения с третьей инвариантной цепью они транспортируются в эндоцитарный компартмент, где они или встречаются и затем связываются с пептидом, имеющим экзогенное происхождение, или же (если этого не произошло) деградируют в лизосомах. После связи с пептидом, заменяющим инвариантную цепь, молекулы МНС класса II переходят на клеточную мембрану [20, 44]. Вытеснение пептидом инвариантной цепи молекул HLA класса II обеспечивают белки, также кодируемые системой HLA и названные HLA-DM. Эти белки катализируют замену «временного» пептида инвариантной цепи на специфический пептид [20, 59].

В систему DM входят 2 гена - DMA и DMB. Анализ последовательности аллелей, входящих в DMA- и DMB-гены, привел к заключению [76, 55, 74, 91], что они являются более древними, чем классические молекулы генов HLA класса II. T.R. Mosmann и соавт. [69] на основании мутационного анализа картировали DMA- и DMB-гены между локусами DP и DQ (рис. 1.4, см. цв. вклейку).

Роль антигенов HLA-DM является решающей в презентации экзогенных пептидов молекулами класса II [69]. Механизм их действия состоит в удалении временно связывающей пептид молекулы CLIP (см. рис. 1.5, см. цв. вклейку) и освобождении связывающего сайта молекулы HLA класса II для его замещения пептидом, происходящим из экзогенного агента. Дефект функции HLA-DM ведет к нарушению замены молекулы CLIP на пептид и отмене антигенпрезентирующей функции молекул класса II [95].

В целом следует отметить, что, хотя данные о новых системах HLA-LMP, -TАР и -DM являются еще далеко не окончательными, уже сейчас ясно, что они выполняют в иммунном ответе важнейшую роль, обеспечивая физиологическую презентацию процессированных пептидов для дальнейшего развития иммунного ответа.

По-видимому, с нарушениями их функций связаны некоторые формы иммунодефицитных состояний человека, в основе которых лежит потеря возможности экспрессии HLA на иммунокомпетентных клетках [62].

Потеря способности к экспрессии молекул HLA на мембранах клеток является также одним из основных патогенетических звеньев развития онкологических заболеваний. Во всяком случае, в пользу этого свидетельствуют данные, приведенные в табл. 2.2.

Таблица 2.2. Полная или частичная потеря экспрессии антигенов HLA на онкологически перерожденных клетках различного типа

Как указывалось выше, в целом связь между молекулами HLA и пептидами имеет много общего для антигенов HLA класса I и II. Однако и здесь имеются серьезные отличия. Так, пептид удерживается в связывающей складке молекулы HLA класса I, за счет связи его N- и C-окончаний с определенным мотивом «аллель-специфического» участка МНС, а также за счет связи боковых цепей пептида с боковыми карманами молекулы МНС. Длины пептидов, связывающихся с молекулой HLA класса I, - 8-10 аминокислот [19].

Пептиды, связывающиеся с молекулой HLA класса II, более гетерогенны - 9-25 аминокислот. Связывающая бороздка молекул HLA класса II, в отличие от класса I, «открыта» для связывания с двух сторон, что создает возможность большего полиморфизма в связях HLA-пептид. Более того, в молекуле класса II зоны связывания могут выходить даже за связывающую складку. Все это дает возможность «аккомодации» более широкого спектра пептидов к молекулам HLA класса II по сравнению с классом I [20].

Переход исследований HLA на молекулярно-генетический уровень позволил по-новому взглянуть на физиологическую функцию системы HLA. Так, молекулы МНС приобретают стабильную форму и соответствующую трехмерную конфигурацию только после того, как в связывающий сайт ее складки встраивается пептид. Только после этого молекула МНС способна мигрировать на поверхность клетки, где она готова выполнить свои функции. Удаление пептида из пептид-связывающей структуры МНС, экспрессированной на клеточной мембране, нарушает ее трехмерную конфигурацию, лишая ее возможности функционировать, и ведет к ее гибели [52, 79]. Комплекс МНС-пептид является чрезвычайно стабильным, очищается и кристаллизируется в единой структуре. Этот комплекс остается на поверхности клетки в течение нескольких недель, что позволяет многим «проходящим» Т-клеткам сканировать представляемый собственной молекулой МНС-пептид. Наконец, каждый пептид связывается (и удерживается в складке) с инвариантным участком, характерным для каждого из аллелей молекулы МНС и имеющим определенный мотив аминокислотных остатков, участвующий в таком связывании. Таким образом, в связь с конкретным пептидом вовлекаются конкретные же участки антигенов - аллельные варианты молекул МНС, что, по сути, и является основой генетического контроля иммунного ответа. Это положение хорошо иллюстрируют данные о том, что пептид вируса герпеса связывается с гаплотипом HLA-DQA1*05:01-DQB1*20:01, но не HLA-DQA1*02:01-DQB1*201. Различие между ними в цепи DQA1 составляет 15 аминокислотных остатков [58].

Установление этого факта и имеющаяся в настоящее время возможность анализировать аминокислотные последовательности всех аллельных вариантов антигенов HLA, включая участки, определяющие их специфичность, а также структуру пептидов, определяющих специфичность различных чужеродных агентов, включая болезнетворные, позволяют заранее предсказать соответствие тех или иных иммунодоминантных пептидов тем или иным участкам молекулы МНС. Таким образом, можно заранее предсказать генетическую отвечаемость или неотвечаемость на тот или иной агент.

В свою очередь, это дает возможность не только заранее решить вопрос о том, ответит ли данный индивидуум на вакцинацию против того или иного болезнетворного агента, а также - насколько этот ответ будет физиологичен. Это, в свою очередь, позволит прогнозировать возможность развития ряда заболеваний аутоиммунного генеза (например, ревматоидный артрит и инсулинзависимый сахарный диабет), в генезе которых, возможно, лежит идентичность иммунодоминантных пептидов, имеющихся в структуре конкретных инфекционных агентов и конкретных эпитопов молекул HLA, кодируемых теми или иными аллельными вариантами генов HLA [42, 10].

Хотя описанный выше механизм распознавания пептидов в контексте антигенов тканевой совместимости является в целом универсальным, из него, по видимому, есть отдельные исключения, и в первую очередь это может относиться к распознаванию чужеродных (аллогенных) антигенов тканевой совместимости. Такая ситуация бывает, по крайней мере, в двух случаях: во-первых, при пересадке органов и тканей; а во-вторых, при беременности.

Как указывалось, одной из основных функций молекул HLA класса II является презентация иммунодоминантных пептидов для их распознавания Т-клеточным рецептором (TCR - T Cell Receptor).

Именно благодаря этому распознаванию TCR контролируют весь спектр различных комплексов HLA-пептид, которые постоянно презентируются на клеточной поверхности [40]. Имеется два различных семейства генов, кодируемых либо αβ-, либо γδ-Т-клеточными рецепторами. αβ-Т-клеточные рецепторы экспрессируются на 95% всех Т-клеток и проявляют большую вариабильность по сравнению с γδ-Т-клеточными рецепторами. Поэтому далее вопрос о взаимодействии Т-клеточных рецепторов будет сфокусирован на αβ-рецепторах. Вариабельность в αβ-Т-клеточных рецепторах определяется случайной генной реорганизацией, комбинаторикой, удалениями (делециями) или добавлениями N-региона, возникающими в различных сегментах генов Т-клеточных рецепторов, которые реорганизуются во время развития в тимусе [30]. Гены β-цепи TCR составляют кластер множественных V-регионов, разнообразных сегментов (D) и примыкающих областей (J), которые беспорядочно создают различные VDJ-комбинации. Гены α-цепи TCR также составляют кластер множественных V-регионов и примыкающих областей (J), которые создают различные VJ-комбинации. Предположительный потенциальный репертуар уникальных Т-клеточных рецепторов (10¹⁵) намного превосходит реальное количество человеческих Т-клеток (10¹¹-10¹²) [30].

TCR сами по себе являются чрезвычайно неустойчивой полиморфной структурой со сложным молекулярным механизмом генерации гигантского репертуара αβ-TCR. Разумеется, это позволяет адаптивной Т-клеточной системе предоставлять значительное число возможных рецепторов для распознавания сравнительно большого ряда чужеродных антигенов (в том числе возбудителей широкого спектра инфекционных заболеваний, как в нативной форме, так и в составе вакцин). Однако, несмотря на видимый прогресс в понимании структурно-функциональных отношений между молекулами и Т-клеточными рецепторами, существует достаточно спорных вопросов в Т-клеточном распознавании комплексов HLA-пептид, которые еще не решены. Неясно, как организованы корецепторы CD4 и CD8 при совместном распознавании комплексов МНС-пептид, и недостаточно изучены механизмы, с помощью которых сигналы передаются внутрь Т-клетки. В самом деле более высокая организация трехмерной структуры антигенспецифического Т-клеточного рецептора в комплексе с инвариантными сигнальными компонентами CD3 пока не установлена, несмотря на все усилия. Видимо, решение данных и многих других проблем способно осветить не только работу иммунной системы, но и более общие принципы, управляющие комплексами клеточных взаимодействий. Когда появятся молекулярные решения так часто встречаемых проблем распознавания, можно будет разработать стратегии вмешательства в предсказуемые отрицательные последствия такого распознавания, например аутоиммунитет или иммунная дисфункция, или же напротив - разработать стратегии вмешательства в целях преодоления «неотвечаемости» на конкретный иммунодоминантный эпитоп, что особенно важно при разработке эффективных вакцин.

В целом, можно сказать, что уникальное строение генома и протеома HLA обеспечивает выполнение важнейших регуляторных механизмов в организме человека. Из числа наиболее важных следует отметить следующие.

Способность распознавать антиген является важнейшим свойством лимфоцитов и обеспечивается присутствием на их поверхности специализированных антигенраспознающих рецепторов (исключение составляют ЕКК, не имеющие такого рецептора) [51].

Именно молекулы HLA ответственны за осуществление отрицательной селекции клонов, которая состоит в «выбраковке» клонов, специфичных комплексам аутологичных пептидов с аутологичными молекулами HLA (т.е. потенциально аутоагрессивных клонов), которые подвергаются «программированной гибели» или апоптозу [93].

Выжившие в результате селекции клоны Т-лимофоцитов несут рецепторы, способные распознавать чужеродные пептиды в комплексе с аутологичными молекулами HLA [57]. Специфичность этих клонов определяет «вторичный антигенраспознающий репертуар» лимфоцитов, т.е. специфику реакций зрелых лимфоцитов на антигены [29].

Таким образом, система HLA закладывает и осуществляет контроль и регуляцию иммунного ответа человека, с одной стороны, препятствуя аутоагрессии, а с другой - осуществляя надзор за появлением в организме чужеродных клеток (включая собственные перерожденные).

Наиболее хорошо изученным аспектом регуляторной роли HLA в иммунном ответе является его адаптивный компонент, что объясняется тем, что само развитие проблемы биологической роли HLA началось с клинической трансплантологии, где, естественно, превалирует адаптивный иммунитет, а также тем, что всю вторую половину XX в. внимание исследователей было сосредоточено на адаптивном иммунитете. Тем не менее уже в 1980-х годах, в рамках исследования регуляторной роли HLA, большое внимание уделялось направлению «HLA и качество иммунного ответа». С современных позиций это направление следует рассматривать как «HLA и врожденный иммунитет», поскольку основными объектами изучения иммунного ответа были классические факторы врожденного иммунитета, как то: фагоцитоз, активность ЕКК-ответа на поликлональные митогены и уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К настоящему времени удалось не только установить выраженную взаимосвязь между конкретными HLA-генотипами и активностью указанных показателей врожденного иммунитета, но и получить данные о том, что этот вид HLA-ассоциированной регуляции врожденного иммунитета имеет выраженное различие на межэтническом уровне.

Важнейшую биологическую роль, так же как и генетический полиморфизм HLA, выполняет популяционный полиморфизм этой генетической системы. Более того, именно он сыграл и продолжает играть первостепенную роль в сохранении человечества как вида в неблагоприятных условиях окружающей среды, оказывающих все более выраженное воздействие на человека в процессе развития цивилизации.

Суть популяционного или, как его иногда называют, межэтнического полиморфизма HLA состоит в том, что частота встречаемости тех или иных специфичностей HLA на расовом или этническом уровне имеет выраженные различия. Так, отдельные специфичности HLA, присутствие которых в большинстве этнических групп европеоидов превышает 10% и более, во многих этнических группах монголоидного происхождения не превышают процента или даже составляют его доли. Другим фактором, имевшим порой решающее значение для судеб отдельных этнических групп или даже целых народов, является уровень популяционного HLA-полиморфизма, показателем которого является количество HLA-специфичностей, встречаемых в той или иной популяции. Так, если в большинстве популяционных групп, населяющих Западную и Центральную Европу, с той или иной частотой встречаются практически все установленные на сегодняшний день HLA-специфичности, то на территории Южной Америки, Азии и Северо-Востока Европы по настоящее время проживают отдельные этнические группы, HLA-полиморфизм которых ограничивается 5-10% от числа известных HLA-специфичностей. Естественно, что в этих популяциях резко повышена частота HLA-гомозигот. Последнее, в свою очередь, снижает возможности противоинфекционной защиты у представителей данных популяций. Наиболее ярким проявлением последствий негативного влияния низкого уровня HLA-полиморфизма на судьбу отдельных этнических групп населения стало, безусловно, их практическое исчезновение во времена завоевания Южной Америки. В настоящее время, в эпоху развитой медицины, расширение контактов представителей подобных этнических групп при промышленном освоении новых труднодоступных ранее территорий (в том числе в России) несет для них определенную инфекционную опасность. Для предотвращения такой опасности необходимо не только тщательное медицинское обследование подобных групп населения, но и исследование их HLA-генетического профиля в целях установления вероятности такого рода опасности.

Таким образом, экстремальный аллельный полиморфизм системы HLA служит мощным механизмом вариабильности и естественного отбора человека как вида и позволяет ему противостоять постоянно эволюционирующему множеству патогенов.

На территории России, которая является многонациональным государством, проживает множество этнических групп, относящихся либо к европеоидной, либо к монголоидной расе, что определяет высокую полиморфность генофонда российских популяций и этносов. Свидетельством выраженного полиморфизма на уровне межэтнических различий являются данные о частоте встречаемости 3 выбранных нами специфичностей HLA-DRB1 (типированных на уровне низкого разрешения) в 10 этнических группах, относящихся по расовой принадлежности или к европеоидам, или к ориентам (рис. 3.1, см. цв. вклейку). Выбор в качестве примера для исследования именно гена HLA-DRB1 определен тем, что он сам и кодируемые им антигены играют особую роль, как было сказано выше, в осуществлении физиологической регуляции иммунного ответа. Естественно, нужно понимать, что представленная на данном рисунке информация является лишь малой частью информации об этническом полиморфизме HLA. Однако представление полной информации невозможно из-за ее объема. Так, если на представленном рисунке содержатся данные о 3 HLA-специфичностях, можно легко представить, какое место заняла бы информация о 2000 HLA-специфичностей.

На рис. 3.1 (см. цв. вклейку) представлены данные о распределении спе-цифичностей HLA-DRB1*01; -DRB1*04 и -DRB1*09 в следующих этнических группах: 2 группы русских (одна - жители Москвы, вторая - поморы, коренные жители побережья Белого моря, Архангельской области); мари (республика Мари-Эл), татары (республика Татарстан). Перечисленные выше группы относятся к европеоидной расе. Удмурты (жители Среднего Урала); ненцы (Ямало-Ненецкий автономный округ); тувинцы (республика Тыва); буряты (республика Бурятия); калмыки (Калмыкия) - эти перечисленные группы относятся к монголоидной расе. Что касается саамов (Карелия), то их расовая принадлежность является объектом дискуссий среди антропологов. Как следует из представленных данных, 3 этнические группы европеоидов (2 русских и татары) имеют сходное по своему характеру распределение исследованных специфичностей: наиболее высокий уровень HLA-DRB1*04, несколько ниже -DRB1*01 и наиболее низкий уровень -DRB1*09. В количественном отношении частоты всех указанных специфичностей наиболее высоки у поморов, вслед за ними идут москвичи, а затем татары. В целом же и характер этого распределения, и абсолютные частотные значения укладываются в характерные для всех других популяций Центра и Севера Европы. У мари же имеются выраженные отличия, а именно: чрезвычайно высока частота специфичности DRB1*01, и, напротив, частота HLA-DRB1*04 является наиболее низкой по сравнению с другими европеоидными группами. Более выражены различия по изученным специфичностям внутри групп ориентов: частота HLA-DRB1*01 - наиболее высокая среди удмуртов и наиболее низкая среди тувинцев и бурят; частота HLA-DRB1*04 высока у всех изученных групп, за исключением удмуртов, у которых она является самой низкой среди всех изученных групп в целом. Что же касается HLA-DRB1*09, то частота данной специфичности практически одинакова, за исключением ненцев, у которых она более чем в 3 раза выше по сравнению с остальными группами. Наиболее вероятным объяснением этому является тот факт, что в отличие от других этнических групп ориентов, связанных между собой азиатским происхождением, группа ненцев связана с американскими ориентами (индейцами). Для последних также характерна высокая частота специфичности HLA-DRB1*09.

Что же касается саамов, как расовая принадлежность, так и происхождение которых спорно, то и по распределению HLA им присуща определенная особенность. Она характеризуется тем, что частота специфичности HLA-DRB1*04 у них чрезвычайно высока и не имеет аналога по сравнению с другими исследованными популяционными группами мира. Распределение же других специфичностей является промежуточным между ориентами и европеоидами и при этом обнаруживает большее сходство с последними. Возможно, саамы, которых чаще всего относят к реликтовым группам Северо-Западной Европы, могли оказать влияние на формирование HLA-профиля европеоидных популяций.

Приведенные данные достаточно красноречиво свидетельствуют о наличии межрасового и межэтнического различия по HLA-специфичностям, которое весьма четко проявляется среди этнических групп, населяющих в течение многих столетий Россию. Примечательно, что имеется принципиальное сходство HLA-профиля у групп ориентов (тувинцы, буряты), проживающих в течение исторических эпох в окружении других групп ориентов, и ориентов (калмыки), проживающих в окружении европеоидных групп.

Следует отметить следующее. Сами по себе различия между HLA-профилем представленных популяций русских (европеоидов) и 5 популяций ориентов закономерны. Однако результаты широкомасштабного исследования, выполненного сотрудниками Института иммунологии [7], выявили достаточно существенные различия в HLA-профиле, имеющиеся у представителей групп русского населения, проживающих в различных регионах европейской части России. В данной работе были исследованы 7 групп русских, случайным образом отобранных здоровых лиц, из которых 5 групп - жители сельских районов (в третьем поколении живущие в одной местности) и 2 группы - горожане. Сельские жители были из Архангельской (n=82), Костромской (n=126), Вологодской (n=121) и Смоленской областей (n=156), а также из районов Удмуртии (n=159). Горожане были из Москвы (n=300) и Астрахани (n=82).

На основании вычисленных частот гена DRB1 и гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 были посчитаны генетические расстояния и построены соответствующие матрицы генетических расстояний. Был проведен кластерный анализ, графически представленный на рис. 3.2 и 3.3 (см. цв. вклейку) в виде дендрограмм и многомерного шкалирования, представленного в виде двухмерных графиков на рис. 3.4 и 3.5 (см. цв. вклейку).

Дендрограммы, построенные на основе кластерного анализа, демонстрируют, что при использовании для анализа частот гена DRB1 и частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 все исследованные группы делятся на два кластера, один из которых состоит из русских г. Москвы, г. Астрахани и Смоленской области и второй, который включает все остальные исследованные группы. Структура кластеризации московско-смоленско-астраханской группы, построенная на основе частот гена DRB1, не отличалась от таковой, построенной на основании частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1. Другая картина наблюдается для кластера, в который входят все остальные исследованные группы. Если при расчетах генетических расстояний на основе частот гена DRB1 из общей группы выделяются русские из Удмуртии, то при расчетах генетических расстояний на основе частот гаплотипов из общей группы выделяются жители Архангельской области. Следует также отметить, что величина шкалы генетических расстояний при использовании HLA-гаплотипов больше, чем при использовании частот конкретного гена. Это связано, скорее всего, с тем, что число возможных (и выявленных) вариантов трехлокусных гаплотипов значительно больше, чем число вариантов одного гена. Так, в данном исследовании были определены 40 вариантов гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 по сравнению со всеми возможными 13 вариантами одного гена DRB1 (типированного на уровне низкого разрешения). Поэтому, вероятно, использование гаплотипов, в которые входят несколько генов, позволяет выявлять более «тонкие» различия между популяционными группами.

Те же закономерности наблюдаются и на графиках многомерного шкалирования. Использование частот гаплотипов для расчета генетических расстояний дает более четкую картину кластеризации исследованных групп, хотя основные, «грубые» закономерности вполне отражают и графики, построенные на основе частот одного гена DRB1.

Наиболее полные данные по европейским русским были добыты в ходе «Русской антропологической экспедиции». Она была организована Институтом этнографии АН СССР и продолжалась 5 лет, с 1955 по 1959 г. В ходе этой экспедиции антропологи обследовали более 100 групп русских [10]. Антропологи используют для исследований такие методы, как оценка антропоскопических признаков, описывающих рост бороды, горизонтальный профиль лица, форму носа, губ и т.д., дерматоглифику, географию фамилий и т.д. В последние годы набирает силу такое направление исследований различных популяций, как геногеография, которая использует для анализа различные генетически наследуемые факторы, в частности систему AB0, некоторые биохимические маркеры. В настоящее время в банке данных «ГЕНОФОНД» Института общей генетики РАН содержатся сведения о частотах 100 аллелей 36 генных локусов из 170 опубликованных с 1885 по 1995 г. литературных источников, характеризующих генофонд населения Восточной Европы [23]. Трудно проводить сравнение результатов типирования генов HLA в качестве генетической основы с антропологическими данными, полученными в таких масштабных, многолетних исследованиях. Это связано прежде всего с огромной разницей в количестве обследованных групп из разных регионов России по сравнению с данными, полученными специалистами Института иммунологии. Однако следует все же отметить, что основные закономерности по географическому взаиморасположению исследованных групп можно проследить даже на таком небольшом их количестве.

Представители городского населения, особенно Москвы, вряд ли могут иметь значение для популяционных исследований, так как представляют собой сильно смешанную группу населения из разных регионов страны. Группа москвичей была использована для анализа в качестве смешанной группы русских, однако русские жители Москвы оказались в одном кластере с жителями Смоленской области и г. Астрахани, что, вероятно, свидетельствует о том, что исследованная группа москвичей в большей мере генетически связана с южными и западными областями России, чем с северными. Интересно также, что жители такого крупного города, как С.-Петербург [16], в большей мере оказались похожими на жителей северных областей России, так как на графике многомерного шкалирования (рис. 3.5, см. цв. вклейку) из всех исследованных групп ближе всего к ним оказались жители Костромской и Вологодской областей. Жители Архангельской области существенно удалены от основной группы популяций, что, вероятно, отражает их значительно более северное проживание и генетическую близость к таким североевропейским популяциям, как норвежцы и финны [72]. Группа русских из Удмуртии также удалена от основной группы популяций, что отражает ее более восточное географическое расположение и влияние на ее генофонд популяционных групп, принадлежащих к уральской расе, в непосредственном соседстве с которыми проживает эта группа русских.

Следует отметить, что представленная выше часть исследований, проведенных сотрудниками Института иммунологии, была проиллюстрирована HLA-генотипированием на уровне низкого разрешения. Для того чтобы показать возможности HLA-генотипирования на уровне высокого разрешения, т.е. на уровне выявления аллельных вариантов генов HLA, нами были приведены данные о межэтническом HLA-разнообразии специфичности HLA-DRB1*04. Выбор именно этой специфичности не случаен, поскольку при проведении данного исследования впервые были установлены выраженные различия в HLA-полиморфизме на уровне отдельных аллельных вариантов одного гена, не только на межэтническом, но и на внутриэтническом уровне [37, 38].

В табл. 3.1 представлены данные по исследованию частот аллельных вариантов гена HLA-DRB1*04 в 7 популяционных группах России. Выбор для анализа аллельных вариантов именно данного гена связан с тем, что с отдельными его аллелями - HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*04:04 и HLA-DRB1*04:05 - ассоциирована предрасположенность к такому аутоиммунному заболеванию, как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД, СД1). В то же время с другим - HLA-DRB1*04:03 - ассоциирована устойчивость к развитию заболеваний.

Таблица 3.1. Частота встречаемости аллельных вариантов гена HLA-DRB1*04 в различных популяционных группах России

* Ассоциация с предрасположенностью к ИЗСД (СД1).

** Ассоциация с устойчивостью к ИЗСД (СД1).

Из представленных в табл. 3.1 данных видно, что во всех популяциях, за исключением ненцев, высока частота аллеля HLA-DRB1*04:01, но в трех из популяций: саамы, тувинцы, ненцы, в отличие от других популяций, высока и частота аллеля-протектора (8,38, 5,35 и 7,16 соответственно). И именно в этих популяциях практически отсутствует заболеваемость ИЗСД. Аналогичная ситуация имеет место и в отношении двух других аллелей *04:04 и *04:05, частота первого из них является достаточно высокой у саамов и ненцев (5,33 и 10,14 соответственно), а частота аллеля *0405 повышена у тувинцев (5,75). Таким образом, протективный эффект является превалирующим по отношению к предрасполагающему.

Эта же таблица служит наглядным доказательством внутриэтнических различий по распределению аллелей HLA. Так, внутри русской популяции между москвичами и жителями Архангельской области имеются выраженные различия по аллелям HLA-DRB1*04:01 и *04:04. Причем оба аллеля имеют выраженную ассоциацию с предрасположенностью к ИЗСД, его частота достаточно высока в обеих указанных группах.

Таким образом, ясно, что полиморфизм системы HLA, характерный для каждой конкретной группы населения, оказывает существенное или даже определяющее влияние на биологическую стабильность данной этнической группы. В данной главе обсуждался вопрос о том, каким образом этот эффект реализовался (и продолжает реализовываться в настоящее время) в способности к противостоянию инфекционным заболеваниям различной этиологии на уровне тех или иных популяций. При этом особое внимание было обращено на роль HLA-полиморфизма и гетерозиготности в этом процессе, являющимся по сути одним из важнейших компонентов биобезопасности на уровне той или иной этнической группы, нации и страны в целом.

Система HLA обладает еще одним уникальным свойством. Это обеспечение на физиологическом уровне высокого полиморфизма и гетерозиготности популяций и человечества как вида. Эта функция реализуется в активном участии системы HLA в репродуктивном процессе.

Как указывалось выше, главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA) играет чрезвычайно важную роль в регуляции иммунного ответа, а также обеспечивает целый ряд других важнейших физиологических функций организма (гены иммунного ответа являются составной частью HLA), обеспечивая поддержание постоянства генетического состава организма [36].

Благодаря своему чрезвычайно выраженному полиморфизму, HLA обеспечивает успешное выживание человека в условиях непрерывного воздействия факторов внешней среды, прежде всего инфекционного и паразитарного окружения. При этом следует напомнить, что HLA-полиморфизм носит выраженный межрасовый и межэтнический характер [36].

В то же время установлено, что скорость мутационного процесса, являющегося основой для возникновения новых вариантов генов, для генов MHC и генов других локусов существенно не различается [86, 106]. Каким же образом происходит поддержание такого высокого уровня полиморфизма именно в системе генов главного комплекса тканевой совместимости и зачем это необходимо организму? Анализ накопленных к настоящему времени данных в различных областях биологии и медицины, где так или иначе исследовались функция и биологическая роль HLA, позволили сегодня хотя бы частично ответить на этот вопрос.

В процессе эволюции иммунная система позвоночных, и в частности человека, развивалась и совершенствовалась под действием инфекционного окружения. Поэтому открытие Р.М. Цинкернагелем и П. Доэрти иммунного распознавания вирусных антигенов Т-лимфоцитами «в контексте» белков главного комплекса тканевой совместимости хозяина, за которое они были удостоены Нобелевской премии [133], позволило предположить, что генетические различия индивидуумов в локусе, кодирующем MHC-белки, могут влиять на интенсивность и эффективность ответа хозяина на инфекцию [88], определяя тем самым результат этого взаимодействия.

Изучение ассоциаций между HLA и факторами врожденного иммунитета (с учетом возможности межэтнических различий) тем более перспективно, поскольку уже сейчас накоплено достаточно данных о наличии ассоциаций между конкретными аллельными вариантами HLA и предрасположенностью или устойчивостью к тем или иным инфекционным заболеваниям человека.

Так, установлено, что специфичность HLA-DRB1*01 ассоциирована с устойчивостью к HIV-1, а HLA-DRB1*04 и сцепленные с ней варианты генов DQA1 и DQB1, а также DRB1*01 и *03 [98, 104] ассоциированы со спонтанным очищением организма от HCV. По результатам анализа эпидемии малярии в Кении и Габоне показано, что с наличием в HLA-генотипе DRB1*01 связана защита против развития тяжелых форм этого заболевания [82, 83].

Специфичности генов DR3 и DR4 связаны с сильным иммунным ответом, а специфичность гена DR2 со слабым ответом против энтеровирусных антигенов (вирусы Коксаки) [117].

Специфичность гена DRB1*13 ассоциирована с чувствительностью к HIV-1 [97], DR2 и DR11(5) - к гепатиту В [111, 126], DR2 - к лепре [29, 32], DRB1*07 является генетическим маркером предрасположенности к развитию легочного туберкулеза [32], а частота аллеля DRB1*15(2) значительно увеличена среди больных вирусом папилломы (HPV16) [93].

Для наглядности состояние вопроса об исследовании ассоциаций HLA с чувствительностью или устойчивостью к различным инфекционным заболеваниям представлено в табл. 3.2.

Таблица 3.2. HLA-DRB1 -маркеры чувствительности и устойчивости к различным инфекционным заболеваниям

Подобные данные имеются в литературе и в отношении ассоциаций вариантов гена DRB1 с эффективным или неэффективным ответом на вакцинацию [52].

Помимо того, что эффективность противоинфекционной защиты связана с конкретными HLA/MHC-специфичностями, находящимися в генотипе, эффективность иммунного ответа зависит также и от того, в каком состоянии, гетерозиготном или гомозиготном, эта HLA-специфичность присутствует.

Дело в том, что поскольку каждая специфичность, входящая в HLA- (или в МНС- в целом) генотип, обеспечивает возможность реагировать на определенный набор пептидов, гетерозиготность по MHC может обеспечивать эффективный иммунный ответ на более разнообразный спектр антигенов по сравнению с MHC-гомозиготами по соответствующему аллелю, где указанный спектр заведомо в 2 раза ниже [67].

Экспериментальные исследования на инбредных мышах обеспечили более четкие доказательства, что MHC-гетерозиготность усиливает иммунную резистентность к инфекциям [112].

Разумеется, эффект большего разнообразия в иммунном ответе на тот или иной патоген, обусловленный HLA-гетерозиготностью по сравнению с гомозиготностью по соответствующему аллелю, более трудно проверить у человека как вида, поскольку он имеет значительно более широкий спектр вариантов генов MHC по сравнению с инбредными линиями животных. Поэтому в работах, посвященных подобному анализу у человека, чаще используется метод сравнения по специфичностям генов HLA в различных популяционных группах при тех или иных инфекциях [94].

Результатом этих работ стали данные об ассоциациях между HLA-гетерозиготностью и резистентностью к ряду инфекционных заболеваний [84], а также установление факта более длительного выживания больных СПИДом - HLA-гетерозигот по сравнению с гомозиготами [53].

Можно констатировать, что на сегодняшний день общепринята точка зрения о преимуществе HLA-гетерозигот в процессе борьбы за выживание организма в инфекционном окружении. В частности, существует точка зрения, что МНС-гетерозиготность, усиливая резистентность к инфекционным заболеваниям, обеспечивает исключение или, по крайней мере, снижение вероятности инбридинга [94, 112].

Однако такого рода отбор, осуществляемый под влиянием инфекционных агентов, не является единственным в природе. Другой вариант направленного поддержания полиморфизма генов MHC обеспечивается системой репродукции и, в частности, не случайным выбором партнера для воспроизведения потомства.

В настоящее время хорошо известно, что гены MHC, и в том числе HLA, играют главную роль в развитии адаптивного иммунного ответа на инфекционные патогены. Как обсуждалось выше, эти гены кодируют

MHC-молекулы I и II классов, которые представляют пептиды чужеродных антигенов Т-клеткам, инициируя тем самым иммунное распознавание антигенов [74] и обеспечивая межклеточные взаимодействия в процессе иммунного ответа.

Естественно, что человек как биологический вид на протяжении всей своей истории, вплоть до того времени, когда были разработаны и внедрены подходы к борьбе с инфекционными болезнями (вакцинация, антибиотики, сульфаниламиды и т.д.), мог противостоять инфекциям только за счет активности своего иммунитета. При этом уровень этой активности у конкретных индивидуумов в значительной степени зависел от его иммуногенетического статуса, т.е. от генотипа HLA. Отражением этого является сам иммуногенетический профиль не только отдельных групп, но и целых рас.

Еще в начале 1970-х годов, когда были накоплены первые данные об особенностях иммуногенетического профиля представителей различных рас и популяционных групп по HLA-антигенам класса I, выдающиеся иммуногенетики Жан Доссе и Вальтер Бодмер обратили внимание на то, что уровень частоты ряда HLA-антигенов и гаплотипов никоим образом не соответствует теоретически прогнозированному. Так, в частности, была установлена необычно высокая частота антигенов HLA-A1, -В8 и -DR3 (а также этого гаплотипа) среди представителей обследованных к этому времени европейских популяций. С этого времени указанные антигены принято называть HLA-генетическими маркерами европеоидов. Вальтер Бодмер выдвинул гипотезу, объясняющую этот факт. Он предположил, что во времена пандемий чумы, оспы и холеры шанс выжить был выше у предков современных жителей большинства европейских стран, имевших в своем генотипе именно эти HLA-антигены.

Позже это было подтверждено на примере вспышек брюшного типа в Суринаме, когда среди выживших европеоидов значительный процент составили лица с гаплотипом HLA-A1, -В8, -DR3.

Таким образом, система HLA явилась фактором, обусловливающим естественный отбор и формирование «нового» генетического профиля европеоидной расы в целом. Последующие исследования подтвердили это предположение. В частности, уже в 1980-е годы было установлено, что HLA-генетический профиль некоторых этнических групп европеоидов, чьи предки не сталкивались с пандемиями, не несет столь высокой частоты указанных HLA-антигенов и гаплотипов по сравнению с абсолютным большинством других европеоидных популяций. Так, в частности, к таким этническим группам относятся популяции высокогорной Грузии - менгрелы и сваны, которые до настоящего времени не только проживают в труднодоступных районах, но и сохранили свои древние дома-крепости, которые во времена эпидемий полностью прекращали общение с внешним миром [1, 2, 19, 22].

Примечательно, что HLA-генетический профиль представителей других этнических групп грузин практически не отличается от генетического профиля, характерного для большинства других европеоидов. Вслед за этим появились и новые доказательства, свидетельствующие о правомочности гипотезы, высказанной Ж. Доссе и В. Бодмером. Так, была установлена взаимосвязь между наличием в гаплотипе европеоидов антигенов HLA-A1 и -В8, а также -DR3 и особенностями иммунного статуса, позволяющими более эффективно реализовать противоинфекционную защиту вне зависимости от природы возбудителя [36].

При сравнительном изучении HLA-полиморфизма представителей коренного населения Европейского Севера России и особенностями иммунного статуса была установлена адаптивная значимость связей параметров иммунного статуса с HLA-генетическими маркерами [7, 13, 14, 72].

Учитывая тот факт, что с одними и теми же гаплотипами HLA связана устойчивость к самым различным инфекционным агентам, логично было предположить, что подобного рода ассоциации с HLA могут быть связаны не только с самой генетически обусловленной отвечаемостью к конкретному инфекционному агенту, но и с теми звеньями иммунного ответа, которые принимают участие в его реализации, т.е. в его конечном эффекте; этот тезис получил первоначальное название «качество иммунного ответа». Направление было включено в качестве раздела в программу XII Международного рабочего совещания и конференции по изучению HLA [63]. Следует отметить, что в данном направлении исследований отечественные иммунологи имеют несомненный приоритет [42], хотя само это направление ранее входило в состав исследований ассоциации между HLA и иммунным статусом человека [41, 43].

К настоящему времени достаточно хорошо известно, что между отдельными HLA-специфичностями и HLA-гаплотипами существуют положительные и отрицательные ассоциации с теми или иными показателями иммунного статуса, а именно количественная и функциональная активность CD4⁺, CD8⁺ клеток, фагоцитирующая функция нейтрофилов и ЕКК. Эти показатели в настоящее время относят к основным факторам врожденного иммунитета. Следует, однако, отметить, что абсолютное число работ в этом направлении выполнялось при изучении представителей различных этнических групп, относящихся к европеоидной расе [43, 44, 91, 95, 96, 102].

В работах, выполненных отечественными исследователями, было показано, что ассоциированные с HLA показатели иммунного статуса могут отличаться в различных этнических группах и расах [5]. Примером может служить исследование ассоциаций между отдельными параметрами иммунного статуса и HLA-специфичностями в двух этнических группах: русские (европеоиды) и буряты (монголоиды) [5, 21]. Данные приведены в табл. 3.3.

Таблица 3.3. HLA-антигены, связанные со сходными параметрами иммунного статуса в бурятской и русской популяциях

Условные обозначения:

↓ - сниженный уровень исследованного параметра, маркируемый данным антителом;

↑ - повышенный уровень исследованного параметра, маркируемый данным антителом;

прочерк - отсутствие связи параметра с антигенами системы HLA;

РБТЛ-сп - спонтанная реакция бласттрансформации лимфоцитов;

РБТЛ-ФГА - реакция бласттрансформации лимфоцитов, индуцированная фитогемагглютинином (ФГА).

Анализ полученных результатов свидетельствует о целесообразности дальнейшего межэтнического подхода к изучению ассоциированного с HLA качества иммунного ответа.

Несмотря на то что исследование этой функции системы HLA стало развиваться относительно недавно, данное направление является весьма перспективным как в фундаментальном аспекте - установление молекулярных механизмов указанных ассоциаций, так и в практическом, поскольку имеет значение для прогноза возможных неблагоприятных воздействий (включая техногенные) окружающей среды на представителей различных этнических групп.

Помимо данных, представленных в табл. 3.3, установлены ассоциации между HLA-специфичностями и таким важнейшим элементом врожденного иммунитета, как естественные клетки-киллеры - ЕКК [11, 12]. Данной популяции клеток, как известно, принадлежит весьма существенная роль в обеспечении противоинфекционной, в первую очередь противовирусной, защиты организма. Они также несут ответственность и за обеспечение элиминации из организма мутирующих, в том числе раковых, клеток, которые распознаются ЕКК по отсутствию или даже снижению на их поверхности МНС-антигенов [71, 103].

При этом следует отметить, что роль в запуске активности ЕКК играет не только уровень экспрессии HLA-молекул, но и их специфичность. Существуют данные о том, что в организме имеет место своего рода «приспособление» популяции ЕКК к генотипу HLA. Это приспособление происходит в процессе дифференцировки ЕКК, когда из их популяции элиминируются клетки, рецепторы которых не связываются с HLA-антигенами, входящими в генотип организма [71, 103]. Таким образом, исключается возможность повреждения собственных «нормальных» клеток, несущих генотип хозяина, и активность ЕКК реализуется по отношению к клеткам с потерянной или ослабленной способностью экспрессии HLA-антигенов.

Таким образом, можно заключить, что сам факт наличия ассоциаций между конкретными HLA-специфичностями, гаплотипами и генотипами, с одной стороны, и определенными показателями иммунного статуса человека, с другой стороны, является непреложной истиной.

Многие иммунологические параметры, в отношении которых установлены эти ассоциации, относятся как к показателям адаптивного, так и естественного или врожденного иммунитета человека, изучению которого современная иммуногенетика уделяет пристальное внимание.

Врожденный иммунитет осуществляет первую и самую быструю реакцию на вторгающиеся микроорганизмы, такие как бактерии, вирусы и грибы. Эффекторные клетки, реализующие естественный ответ, разнообразны, но имеют общую способность распознавать чужеродные агенты, осуществляющие агрессию, и тем самым инициировать эффективную защиту [77].

К факторам естественного иммунитета относятся фагоцитоз, ЕКК и ответ Т- и В-лимфоцитов на поликлональные митогены.

Что же касается возможных механизмов ассоциаций HLA и факторов врожденного иммунитета, то следует принять во внимание следующие соображения. Во-первых, существуют данные об определенной взаимосвязи между функцией семейства молекул CD1, относящихся к факторам естественного иммунитета, и антигенпрезентирующей функцией [73]. Во-вторых, известно, что такой фактор врожденного иммунитета, как γ-интерферон, принимает активное участие в процессинге пептидов и их презентации молекулами HLA [36]. И наконец, в-третьих, гены такого важнейшего фактора врожденного иммунитета, как TNF, относятся к генам системы HLA класса III [92].

Имеются данные о неслучайной сегрегации HLA-гаплотипов от родителей с высоким или низким уровнем ЕКК к их детям, т.е. о сцепленном с HLA-генетическим контролем уровня ЕКК [12].

Эти представления подтверждают, в частности, данные, полученные при изучении взаимосвязи маркеров предрасположенности и устойчивости к «классическому» инфекционному заболеванию - лепре [3, 29].

Лепра является одним из инфекционных заболеваний, известных человечеству еще с библейских времен и носивших характер эпидемий в средние века. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в XX в. при внедрении комбинированной антибактериальной терапии, проблема лепры остается до настоящего времени весьма актуальной в 55 странах мира. Ежегодно в мире регистрируется от 300000 до 500000 новых случаев заболевания лепрой [78].

Лепра - одна из первых инфекционных болезней, при которой была установлена роль наследственного фактора в развитии заболевания. Так, еще до открытия А. Hansen в 1874 г. возбудителя лепры, D.C. Danielssen, W. Boeck [62] относили проказу к наследственным заболеваниям. Позднее исследования, выявившие конкордантность по типу заболевания у однояйцовых близнецов [55], роль эритроцитарных изоантигенов, проявившуюся в преимущественном поражении лепрой лиц с 0- и А-групповыми факторами крови, а также изучение типов пальцевых узоров у больных лепрой [6], подтвердили эту точку зрения.

Представление о генетической предрасположенности к лепре нашли свое подтверждение и развитие при проведении исследований, посвященных ассоциации HLA с этим заболеванием. При этом были установлены ассоциации предрасположенности к развитию лепры с продуктами этих генов - антигенами HLA I класса, а именно: В7, В8, В40, А11, А18 и др. [32, 57], а затем и с антигенами HLA II класса: DR3, DR2, DQ1 [32, 80, 110, 118, 119]. С внедрением молекулярно-генетических методов генотипирования ассоциации с лепрой генов HLA и их аллельных вариантов были выявлены в различных этнических группах и популяциях [26, 27, 30, 51, 113].

Благодаря санитарно-эпидемиологическим и лечебным мероприятиям, проведенным на территории СССР, распространенность лепры в значительной степени сократилась. В настоящее время на территории СНГ очаги лепры сохранились только в некоторых регионах, включая низовья реки Волги (Астраханская область), территорию Средней Азии (Республика Каракалпакстан) и Казахстана [15, 20].

Следует отметить, что лепра, которая еще 10-15 лет назад рассматривалась как «практически побежденное» заболевание (во всяком случае в абсолютном большинстве государств мира), в последние годы становится все более значимым для мирового здравоохранения. Это связано с несколькими причинами: в первую очередь с возрастанием политической, социальной и экономической нестабильности в ряде государств Африки и Азии, в том числе сопредельных с РФ. Помимо этого за последние годы резко возрос уровень межнациональных и межэтнических контактов за счет миграции значительных групп населения и с территории сопредельных государств. Нельзя забывать и о все возрастающем объеме туристических поездок, особенно в «экзотические» страны. Несмотря на то что лепра на территории России имеет ограниченный ареал встречаемости, нельзя исключить тот факт, что она может стать серьезной проблемой для отечественного здравоохранения.

Дело в том, что, учитывая географическое положение России и бывших стран СНГ, можно ожидать появления на их территориях носителей лепры, принадлежащих к различным этническим группам, которые несут в своем генотипе с разной частотой HLA-гаплотипы, в том числе ассоциированные с чувствительностью к данному заболеванию.

Необходимо также отметить, что лепра, в отличие от большинства других инфекционных болезней, имеет чрезвычайно продолжительный инкубационный период, и пик развития клинически манифестированной лепры может проявиться через несколько лет после инфицирования.

Сотрудниками Института иммунологии (г. Москва) и ФГБУ «НИИ по изучению лепры» Минздрава РФ (г. Астрахань) проведено уникальное исследование, целью которого было решение вопроса о том, имеются ли выраженные различия в наличии генетических маркеров предрасположенности к лепре (включая ее различные формы) у представителей этнических групп, компактно проживающих в Каспийском регионе [25, 39].

В ходе работы обследовано 255 больных лепрой в стадии клинического регресса, бактериоскопически негативных, находящихся на стационарном и амбулаторном лечении в ФГБУ «НИИЛ» (г. Астрахань) и Каракалпакском республиканском лепрозории (п. Крантау, г. Нукус) [24]. Среди больных лепрой: 149 русских, 66 казахов и 40 каракалпаков. Среди обследованных: 139 мужчин и 116 женщин.

В качестве контроля использовались образцы крови, полученные от 254 здоровых доноров-добровольцев, не связанных кровным родством, различной этнической принадлежности: русские (n=108), казахи (n=70) - жители Астрахани и Астраханской области и каракалпаки (n=76) из Каракалпакстана.

Из обследованных больных лепрой 163 человека входили в группу многобактериальных (МВ - MultiBacillary) больных (LL_p, LL_s BL, BB по классификации Ridley-Jopling [114]): русские (100), казахи (29), каракалпаки (34), и 92 в группу малобактериальных (PB - PauciBacillary) больных (TT, BT): русские (49), казахи (37), каракалпаки (6).

В исследовании был использован метод анализа трехлокусных HLA-гаплотипов, позволяющий выявить глубокие закономерности ассоциаций генов HLA с предрасположенностью к лепре. Было проведено изучение распределения гаплотипов HLA-DRB1-DQA1-DQB1 по всем изучаемым этническим популяциям. При этом у больных лепрой казахов установлено достоверное увеличение частоты встречаемости гаплотипов DRB1*17-DQA1*05:01-DQB1*02:01 (RR=2,90; p<0,05) и DRB1*01-DQA1*01:01-DQB1*05:01 (RR=2,30; p<0,01). У больных лепрой русской и каракалпакской популяционных групп обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости гаплотипа DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04 (в группе русских больных RR=3,8; p<0,001, у каракалпаков RR=9,9; p<0,05). У больных лепрой каракалпаков также определялось достоверное увеличение частоты встречаемости гаплотипа DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08 (RR=2,30; р<0,05).

Отрицательная ассоциация (устойчивость) установлена у больных лепрой русской популяционной группы с гаплотипами DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301 (RR=0,62; р<0,05) и DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201 (RR=0,50; р<0,01), у казахов - с гаплотипом DRB1*13-DQA1*01:03-DQB1*06:02/08 (RR=0,14; р<0,01), у каракалпаков - с гаплотипом DRB1*09-DQA1*03:01-DQB1*03:03 (RR=0,29; р<0,05). Таким образом, сравнительный анализ обобщенных данных по всем обследованным этническим популяциям свидетельствует, что для русских и каракалпаков характерно увеличение частоты встречаемости одних и тех же аллелей и гаплотипа, а именно HLA-DRB1*16-DQA1*01:02-dQb1*05:02/04, с которым ассоциирован и самый высокий относительный риск. Гаплотип DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04 имеет низкую частоту встречаемости как в обследованных, так и в большинстве других популяционных групп здорового населения [7, 9], что подчеркивает значение увеличения его частоты у больных лепрой. Наличие такого гаплотипа может играть решающую роль в возникновении заболевания.

Р.Р. де Вриз [66] высказал предположение, что если существуют гены предрасположенности к лепре, сцепленные с HLA, то можно ожидать, что гаплотипы, чаще встречаемые у больных лепрой, будут редко выявляться у здоровых лиц. Низкая частота встречаемости данного гаплотипа у здоровых лиц, возможно, результат влияния процесса, имевшего место еще в средние века, когда лепра носила характер эпидемий. В этом отношении имеет смысл провести параллель между предположением, сделанным В. Бодмером, о формировании HLA-профиля европеоидной популяции под влиянием эпидемий, уносивших значительную часть населения в античную эпоху, эпохи Средневековья и Возрождения и результатами данного исследования. Хотя в средние века лепра не была так распространена, как чума, оспа, холера, лепрозории существовали не только в каждом городе, но и в сельской местности около каждой кафедральной церкви [35].

В отличие от чумы, оспы и холеры, лепра имеет длительный инкубационный период и хроническое течение, т.е. больные доживали до детородного возраста. Однако их изолировали от общества в лепрозориях, и им в большинстве случаев запрещалось иметь детей. Можно предположить, что лица с гаплотипом DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04 имели более высокую вероятность заболевания лепрой и вследствие этого пониженную возможность оставления потомства. Такое предположение может быть одним из объяснений того обстоятельства, что лепра практически исчезла из Европы в конце XIX столетия. Таким образом, это привело к тому, что лепра, пусть не столь явно, как чума или оспа, оказала влияние на HLA-профиль европеоидной популяции. Система HLA, являясь объектом естественного отбора, сформировала новый иммуногенетический профиль европеоидной расы, устойчивый не только к чуме, оспе и холере, но и к лепре, что проявилось в значительном уменьшении количества лиц, восприимчивых к ней.

Исходя из выдвинутых предположений об эволюционных процессах формирования генофонда популяций, следует признать вероятность того, что в настоящее время круг лиц, «восприимчивых» к лепре, невелик. В то же время лепра, являясь инфекционным заболеванием, продолжает распространяться в мире. У подавляющего большинства лиц, контактирующих с возбудителем лепры, развивается соответствующий эффективный клеточный иммунный ответ без клинических признаков болезни. В то же время полиморфизм генов иммунного ответа человека, определяющий уровень активности тех или иных факторов иммунитета, может оказаться решающим фактором для устойчивости или восприимчивости к лепре.

Чем определяется сдерживание болезни или ее развитие по лепроматозному (многобактериальному) или туберкулоидному (малобактериальному) типу, остается пока до конца неясным. Одно из объяснений данного феномена состоит в том, что развитие клинической симптоматики при лепре тесно связано со степенью напряженности клеточного компонента иммунитета, включая врожденный иммунитет [3, 31, 79], что во многом определяется иммуногенетическими факторами.

В целях установления HLA-ассоциаций с различными вариантами клинического течения лепрозного процесса проведены анализ и сравнение данных о распределении аллелей и гаплотипов HLA II класса у больных с много- и малобактериальными формами лепры.

В результате проведенного исследования установлена положительная ассоциация многобактериальной лепры у больных русской популяционной группы с гаплотипом HLA-DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08 (RR=1,5; р<0,05), а отрицательная - с HLA-DRB1*07-DQA1*02:01-DQB1*02:01 (RR=0,56; р <0,01).

В то же время повышение частоты встречаемости гаплотипов DRB1*01-DQA1*01:01-DQB1*05:01 (RR=2,01; р <0,05) и DRB1*04-DQA1*03:01-DQB1*03:02 (RR=3,14; р <0,01) характерно для больных с малобактериальной формой лепры. С низкой частотой в этой группе больных встречался гаплотип DRB1*11-DQA1*05:01-DQB1*03:01 (RR=0,50; р <0,05). Для больных многобактериальной лепрой казахов, жителей Астраханской области, также характерно повышение частоты встречаемости гаплотипа DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08 (RR=2,24; р <0,05). Развитие малобактериальной формы заболевания ассоциируется с гаплотипом DRB1*01-DQA1*01:01-DQB1*05:01 (RR=2,90; р <0,05). Кроме того, у больных лепрой каракалпаков достоверно повышена частота встречаемости гаплотипа DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08, а так как около 90% обследованных больных каракалпакской популяционной группы составляют больные многобактериальной лепрой, можно заключить, что повышение частоты данного гаплотипа характерно в первую очередь для многобактериальной лепры. Таким образом, в результате проведенных иммуногенетических исследований выявлены HLA-маркеры предрасположенности к развитию различных клинических форм лепры. Эти маркеры характерны для каждой конкретной этнической популяции, хотя существуют и маркеры, определяющие клиническое течение лепры независимо от этнической принадлежности больного. В этом смысле гаплотип DRB1*01-DQA1*0101-DQB1*0501 ассоциирован с малобактериальной формой, а гаплотип DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08 - с развитием более тяжелой многобактериальной формы болезни.

При разделении больных по формам заболевания на многобактериальных и малобактериальных, в соответствии с рекомендациями ВОЗ при проведении химиотерапии, H. Soebono и колл. [121], изучая индонезийско-японскую этническую группу, обнаружили ассоциацию DRB1-02 специфичности с развитием многобактериальной формы лепры, отрицательная ассоциация была найдена для специфичности DRB1-12 с обеими формами. R. Rani и соавт. в Северной Индии [113], объединив больных по формам заболевания, нашли достоверное увеличение частоты встречаемости DRB1*15:01, DRB5*01:01 аллелей и снижение DQB1*02:01 аллели у больных многобактериальной лепрой по сравнению с малобактериальной.

Следует отметить, что ассоциация между HLA и формами лепры установлена не во всех исследованиях. Так, у больных лепрой японцев хотя и отмечались достоверное увеличение частоты встречаемости HLA-DRB1*15:01, DQA1*01:02, DQB1*06:02/08 и снижение частоты DQA1*03 и DQB1*04:01 аллелей, однако при анализе больных по формам заболевания достоверных различий не выявлено [85].

Несмотря на все многообразие и противоречивость данных по выявлению иммуногенетических маркеров чувствительности к различным клиническим формам лепры, в большинстве популяций превалируют ассоциации со специфичностью HLA-DRB1*02 и ее аллельными вариантами [99, 113, 121]. При этом следует учитывать, что в подавляющем большинстве работ акцент делался на поиске ассоциаций между отдельными аллелями локусов DR и DQ и восприимчивостью к различным формам лепры. Однако более выраженные (и, вероятно, точные) различия можно найти при использовании трехлокусных гаплотипов HLA-DRB1-DQA1-DQB1, так как число возможных (и выявленных) вариантов трехлокусных гаплотипов значительно больше, чем число вариантов одного гена. Так, специфичность DRB1*15 и гаплотип DRB1*15-dQA1*01:02-DQB1*06:02/08 встречаются практически во всех популяционных группах с умеренной или достаточно высокой частотой. Кроме того, эта специфичность и гаплотип ассоциированы не только с лепрой, но и с другими инфекционными заболеваниями [28, 70, 111]. Учитывая тот факт, что с одними и теми же гаплотипами HLA ассоциирована чувствительность к различным инфекционным агентам, логично предположить, что подобного рода ассоциации могут быть связаны не только с самой генетически обусловленной отвечаемостью на конкретный инфекционный агент [36], но и с теми звеньями (как адаптивного, так и врожденного иммунного ответа), которые принимают участие в его реализации.

При этом наиболее выраженные ассоциации установлены для врожденного иммунитета [4, 42]. При исследовании взаимосвязи генов HLA класса II с иммунологическими показателями у больных лепрой были обнаружены ассоциации маркерных HLA-гаплотипов с различными параметрами как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Выявлено, что у больных лепрой с HLA-маркерами предрасположенности, а именно гаплотипами DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04 и DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08, выявляется низкий уровень фагоцитоза, пролиферативной активности лимфоцитов и активности ЕКК [24, 33, 40].

Установленная в данном исследовании повышенная восприимчивость к лепре у лиц, имеющих в генотипе гаплотипы HLA-DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04 и HLA-DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08, позволяет пролить свет на неясные ранее вопросы о механизмах заражения, развития клинических форм болезни и путей эволюции заболеваемости. Базирующаяся на этих фактах концепция о решающей роли иммуногенетических факторов в патогенезе лепры позволяет выдвинуть предположение, что в наиболее древних очагах этой болезни в течение многих столетий в популяциях шла естественная селекция в сторону выживаемости лиц, резистентных к этому заболеванию. Очевидно, что преимущественное поражение инфекцией и более тяжелое течение лепры наблюдались у лиц с гаплотипом HLA-DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04, сцепленным с низким уровнем активности естественных клеток-киллеров [24, 33]. Кроме того, с позиций этой теории и с учетом роли всех остальных патогенетических факторов многобактериальная лепра чаще развивается у лиц с гаплотипом HLA-DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08, которому сопутствует повышение антителогенеза на фоне недостаточности функции фагоцитов и снижения пролиферативной активности Т-лимфоцитов [3, 24, 33]. Дальнейшее расширение знаний в области иммуногенетических основ патогенеза лепры будет способствовать более глубокому пониманию патогенеза и других инфекционных болезней.

Получены данные о наличии двух типов HLA-генетических маркеров: общих для обследованных групп и специфических для конкретной этнической группы. При этом последний вариант HLA-маркеров в ряде случаев был характерен для представителей этнических групп, проживающих в сопредельных государствах [24, 25].

Естественно, что само по себе установление этого факта свидетельствует о возрастании риска инфицирования лепрой среди представителей популяций российских граждан, имеющих общие генетические маркеры предрасположенности к лепре с жителями сопредельных государств, в том числе эндемических по лепре.

Помимо возможности непосредственного использования результатов проведенного исследования этих данных в целях обеспечения биобезопасности России, их необходимо учитывать при составлении долговременного эпидемиологического прогноза инфицирования лепрой в конкретных регионах России.

Как было сказано выше (табл. 3.2), наличие HLA-генетических маркеров предрасположенности к целому ряду социально значимых заболеваний в ряде случаев имеет выраженные межэтнические различия. Ранее эпидемиологическая ситуация не рассматривалась с точки зрения общности и различий HLA-генетических маркеров того или иного инфекционного заболевания (в том числе особо опасного или социально значимого) в сопредельных государствах. Между тем направление исследований подобного рода является весьма перспективным, а возможно, и необходимым для эпидемиологического прогноза развития инфекционных болезней, а также послужить основой для формирования нового направления в эпидемиологии.

При этом следует принять во внимание следующее. Использование эпидемиологического подхода может оказаться эффективным не только при сравнении распределения HLA-генетических маркеров предрасположенности к заболеванию за счет инфицирования населения больными мигрантами из сопредельных государств, но и внутри одного многонационального и этнически неоднородного государства, каким является РФ. На территории России проживает максимальное количество этнических групп, HLA-иммуногенетический профиль которых к настоящему времени изучен далеко не полностью, хотя эти исследования проводит целый ряд учреждений России. Более того, в течение определенного времени советские исследователи занимали лидирующую позицию в этой области. Свидетельством этого является тот факт, что еще в 1991 г. на XI Международном рабочем совещании и конференции по изучению HLA (Йокогама, Япония) почетной медали за наибольший вклад в развитие направления «HLA и антропология» (межпопуляционный полиморфизм HLA) были удостоены отечественные исследователи из Института иммунологии.

Следует отметить, что эпидемиологический подход может также оказаться целесообразным не только в отношении хорошо изученных инфекционных заболеваний, но и в отношении «новых» инфекций, в том числе носящих характер эпидемий и пандемий, таких как птичий и свиной грипп.

Таким образом, при изучении HLA-ассоциированной генетической предрасположенности к лепре в популяциях больных, относящихся к различным этническим группам, выявлены как общие, так и индивидуальные HLA-специфичности и гаплотипы, ассоциированные с предрасположенностью и характером клинического течения болезни. Установлены ассоциации гаплотипа DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/04 с лепрой (вне зависимости от ее формы) в русской и каракалпакской популяционных группах. В казахской популяционной группе риск развития лепры ассоциирован с гаплотипами DRB1*17-DQA1*05:01-DQB1*02:01 и DRB1*01-DQA1*01:01-DQB1*05:01 . Риск развития малобактериальной формы лепры ассоциирован с гаплотипом DRB1*01-DQA1*01:01-DQB1*05:01, а гаплотип DRB1*15-DQA1*01:02-DQB1*06:02/08 - с развитием более тяжелой многобактериальной формы болезни независимо от этнической принадлежности больного. Одним из механизмов реализации HLA-ассоциированной генетической предрасположенности к лепре является ассоциация между маркерными гаплотипами и показателями врожденного иммунитета [24, 25, 39].

Вопрос о роли генов иммунного ответа (ГИО) в восприимчивости или устойчивости к инфекционным заболеваниям является краеугольным камнем в механизмах противостояния инфекциям различной этиологии на уровне тех или иных популяций. На формирование иммуногенетического полиморфизма популяций значительное влияние оказали различные эпидемии, имевшие место на протяжении всей истории человечества, что не могло не сказаться на формировании популяционных генотипов [50].

Полученные при исследовании лепры данные могут в определенной степени послужить еще одной моделью для изучения других, в том числе особо опасных и социально значимых, инфекционных заболеваний с учетом межэтнических особенностей распределения и различий в них иммуногенетических маркеров предрасположенности и устойчивости к той или иной инфекции. Кроме того, такого рода исследования могут быть использованы для прогнозирования эпидемиологической ситуации в различных регионах России в целях обеспечения биобезопасности государства.

Говоря о роли иммуногенетики в биобезопасности государства необходимо упомянуть одну из наиболее очевидных угроз настоящего времени - ВИЧ/СПИД. Несмотря на значительные успехи в диагностике ВИЧ-инфекции, нерешенными остаются такие задачи здравоохранения, как профилактика (разработка эффективных вакцин) и лечение заболевания [17].

До последнего времени недостаточно изученной оставалась и проблема генетической предрасположенности и устойчивости к ВИЧ-инфекции.

Перспективным путем решения этой задачи представляется изучение генетического полиморфизма рецепторов, используемых ВИЧ для проникновения в клетку. Среди них особое место принадлежит так называемым корецепторам ВИЧ, установлением роли которых в заболевании посвящены многочисленные исследования [21].

Известно, что помимо рецептора CD4, необходимого для проникновения ВИЧ в клетку, активность и специфичность вирусиндуцированной фузии определяется наличием корецепторов, относящихся к семейству 7TМ-рецепторов хемокинов (G-белок-связывающие рецепторы) [58].

Первым из открытых хемокиновых корецепторов для ВИЧ был фузин (fusin) - рецептор класса CXC [76]. Экспериментально доказано, что фузин служит корецептором только для Т-тропных, но не для М-тропных, штаммов ВИЧ. Лигандом фузина является SDF-1 (Stromal Derived Factor-1) - CXC-хемокин, регулирующий функции В-лимфоцитов и гемопоэтических клеток-предшественников [107]. Согласно принятой номенклатуре, корецептор фузин был переименован в корецептор CXCR4 [49]. Исследование молекулярной структуры гена SDF-1 показало, что мутация, приводящая к гиперэкспрессии хемокина, является важным фактором, влияющим на особенности течения ВИЧ-инфекции. Наличие замены A→G в позиции 801 в 3'-нетранслируемом регионе гена при гомозиготности по аллелю SDF1-3A достоверно ассоциировано с отсрочкой развития клинически манифестированного СПИДа. По-видимому, SDF1, связываясь с рецептором CXCR4, препятствует проникновению Т-тропных штаммов вируса, характерных для поздних стадий развития инфекции [68, 130]. Таким образом, данный полиморфизм может рассматриваться в качестве одного из основных факторов, препятствующих быстрой прогрессии СПИД.

Аллель SDF1-3A распространен достаточно широко. Наибольшая его частота наблюдается в странах Океании, где достигает 72%. Среди коренного населения Черной Африки данный аллель практически не встречается. Частота встречаемости аллеля SDF1-3A в прочих исследованных на настоящий момент группах весьма вариабильна и колеблется от 3 до 43% [123].

Основным корецептором для М-тропных изолятов ВИЧ является CCR5 [69]. Этот рецептор экспрессируется на дендритных клетках периферической крови [81], на поверхности CD34-гемопоэтических клеток-предшественников [116] и активированных клетках памяти фенотипа CD26^high, CD45RA^low, CD45R0 [56]. Рецептор CCR5 экспрессируется также на тимоцитах фенотипов CD4 и CD8 и на клетках Лангерганса [132]. Сообщалось и о наличии рецептора CCR5 на мембране нейронов, астроцитов, клеток капиллярного эндотелия, эпителиальных клеток и фибробластов, но функциональная роль рецептора CCR5 для этих клеток пока не выяснена.

Сейчас известно, что β-хемокиновый рецептор CCR5, в отличие от рецептора CXCR4, является единственным корецептором для ВИЧ, исчезновение которого с поверхности клеток (блок или делеция) никак не влияет на иммунные процессы организма. В экспериментах на мышах было показано, что делеция рецептора CXCR4 приводит к смерти животного [134]. Таким образом, инфицирование или другое повреждение CXCR4-позитивных клеток может оказаться более ощутимым воздействием на иммунную систему по сравнению с инфицированием клеток фенотипа CCR5.

Эпидемиологические исследования показали, что путь заражения не оказывает существенного влияния на степень прогрессии заболевания [90]. Конечно, это не относится к случаям, когда заражение происходит при попадании непосредственно в кровь большого количества вирусов фенотипа Х4. Такие ситуации наблюдаются при инфицировании лиц, употребляющих наркотики внутривенно (ПВН - потребители внутривенных наркотиков) и у больных гемофилией. В этих случаях происходит чрезвычайно быстрая прогрессия ВИЧ-инфекции в СПИД [131].

Как указывалось ранее, наличие или отсутствие полноразмерного и нормально функционирующего хемокинового рецептора CCR5 не влияет на осуществление важных процессов жизнедеятельности организма человека [109]. Таким образом, ингибиторы функциональной активности рецептора CCR5 могут быть использованы для подавления ВИЧ-инфекции in vivo без существенных побочных эффектов для организма человека.

Исследование нуклеотидной последовательности гена CCR5 привело к открытию дефектного аллеля CCR5D32, играющего значительную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции [64]. Обнаружено, что гомозиготный по этой мутации генотип распространен среди некоторых групп так называемых HEPs (лиц, контактировавших с ВИЧ, но не заразившихся) и не был обнаружен среди нескольких тысяч исследованных ВИЧ-инфицированных пациентов. Мононуклеары периферической крови (МПК, соотв. англ. PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cell) от HEPs с гомозиготной мутацией были восприимчивы к инфицированию штаммами вируса фенотипа Х4 и абсолютно устойчивы к инфицированию вирусами фенотипа R5 [48]. В дальнейшем было показано, что люди с генотипом D32/D32 практически резистентны по отношению к вирусам фенотипа R5 и обладают частичной устойчивостью к инфицированию вирусами фенотипа R5X4 [87]. Гетерозиготность по мутации CCR5D32 ассоциирована с медленной прогрессией заболевания. Все это может служить подтверждением того, что рецептор CCR5 ответствен за вирусную трансмиссию и репликацию ВИЧ-1 на ранних стадиях инфекции [100].

Наиболее часто эта мутация встречается у европеоидов, реже на Ближнем Востоке и в Индии и крайне редко среди коренного населения Азии, Африки, Дальнего Востока и среди американских индейцев. В Северной Европе частота мутаций по этому гену составляют 16% (Финляндия, Мордовия), в Южной Европе (на Сардинии) - 4%, т.е. имеется градиент с севера на юг [123].

При дальнейшем исследовании эпидемиологических когорт были обнаружены индивидуумы, гетерозиготные по мутации CCR5D32, но при этом демонстрирующие абсолютную устойчивость к R5-вирусам in vitro. Впоследствии было показано, что причиной этому явлению служит второй аллель, обозначенный как CCR5-m303. Этот вариант гена содержит одно-нуклеотидную замену Т-А в концевой позиции открытой рамки считывания гена CCR5, связанную с синтезом нефункционального рецептора [108]. Эта мутация наследовалась как несцепленный признак у 3 гетерозиготных по этому гену индивидуумов из 209 здоровых доноров, участвовавших в исследовании [47].

Мутация в гене другого хемокинового рецептора - CCR2, по данным некоторых источников, также обладает защитным эффектом в отношении ВИЧ/СПИД. Она приводит к замене валина на изолейцин в первом трансмембранном домене (полиморфизм CCR2-64I) и так же, как и в случае с гетерозиготами по аллелю CCR5D32, сопровождается продлением периода между сероконверсией и развитием симптомов СПИД [120].

Данный рецептор также выполняет функцию корецептора проникновения ВИЧ-1. Защитный эффект варианта CCR2-64I проявляется как у гомозигот, так и у гетерозигот. Принцип, на котором основан эффект данной мутации, до сих пор недостаточно понятен, в частности из-за того, что мутация расположена в трансмембранном домене и не может влиять на эффективность проникновения ВИЧ в клетку. Предполагается, что протективный эффект CCR2-64I носит опосредованный характер, т.е. в данном случае наблюдаемый признак не связан напрямую с изменениями свойств рецептора CCR2. Скорее всего, вариант CCR2-64I сцеплен с другим неизвестным в настоящее время генетическим фактором, ассоциированным с формированием устойчивого фенотипа. Таким образом, по существу данный мутантный вариант гена CCR2 может рассматриваться как генетический маркер определенной формы течения заболевания.

Аллель CCR2-64I является наиболее распространенным среди популяций, проживающих на территории континентальной Азии и Африки, где его частота превышает 35%. В странах Европы его частота несколько ниже, наиболее редко он встречается в странах Океании [123].

Для рассмотренных аллелей, действие которых в целом условно может быть обозначено как «протективное», характерен кумулятивный эффект, проявляющийся в повышенной устойчивости и/или торпидном течении заболевания, что, в свою очередь, позволяет использовать эти данные на уровне индивидуального прогноза и выборе адекватных методов терапии [130]. Помимо этого, данные о распространенности указанных полиморфизмов в той или иной расовой или популяционной группе могут быть использованы при разработке стратегии борьбы со СПИДом в рамках обеспечения биобезопасности на национальном и международном уровнях.

В рамках нескольких крупных исследований эпидемиологических когорт, состоящих из представителей различных рас [64, 123, 130], было оценено влияние рассматриваемых «протективных» аллельных вариантов на динамику развития симптомов СПИД и смертность в группах серопозитивных пациентов. На основании полученных данных были рассчитаны коэффициенты относительного риска, характеризующие относительный риск развития заболевания по тому или иному сценарию в зависимости от генотипа [130].

Современная Россия является одним из наиболее многонациональных государств мира, где проживают представители двух рас - европеоиды и ориенты, включающие большое количество этнических и субэтнических групп. Проведенные в течение последних 20 лет исследования в области межпопуляционного полиморфизма генов HLA - наиболее полиморфной генетической системы человека - свидетельствуют о том, что имеет место выраженный полиморфизм в распределении аллельных вариантов генов, контролирующих иммунный ответ человека не только на межрасовом и межпопуляционном, но и на внутрипопуляционном уровнях [21]. Имелись все основания предположить существование отличий и в отношении распределения аллельных вариантов CCR2-64I, SDF1-3’A и CCR5D32.

В связи с этим сотрудниками Института иммунологии была выполнена работа по выяснению особенностей распределения протективных аллелей на территории бывшего СССР [18].

В ходе исследования был проведен анализ образцов ДНК, полученных от 960 здоровых (не имеющих известной истории ВИЧ/СПИД), взрослых представителей 10 этнических групп, не связанных кровным родством: коренного населения Архангельской области (поморы), коренного населения Вологодской области, гагаузов, украинцев, татар, удмуртов, чеченцев, казахов, киргизов и тувинцев (по 96 человек для каждой группы). Для каждого из образцов определяли аллельный статус по трем полиморфным локусам, ассоциированным с формированием устойчивости к ВИЧ/СПИД.

Аллель CCR5D32 наиболее представлен в выборке поморов (рис. 3.6, см. цв. вклейку). Здесь высока доля гомозиготных генотипов, связанных с пониженным риском инфицирования ВИЧ, а также гетерозиготных генотипов, ассоциированных с положительной динамикой течения заболевания.

В изученных восточно-европейских популяциях частота аллеля CCR5D32 совпадает со средними значениями, характерными для центральной Европы. Аллель одинаково представлен в выборках украинцев, русских из Вологодской области и гагаузов.

Наименьшая частота «защитного» аллеля CCR5D32 была отмечена в популяциях тувинцев, казахов, киргизов и чеченцев (центрально-азиатская и северо-кавказская группы). Казахи и киргизы принадлежат южносибирской этнической группе, сформированной с участием европеоидной и монголоидной рас, а тувинцы являются представителями монголоидной расы. В этих случаях представленные данные соотносятся с результатами проводимых ранее исследований, демонстрирующих низкую распространенность варианта CCR5D32 в популяциях азиатского региона [123]. В выборках чеченцев, татар и удмуртов отмечены пониженные частоты аллеля CCR5D32 по сравнению с восточно-европейскими, что укладывается в общую картину распределения аллеля в популяциях Евроазиатского региона.

Таким образом, распределение аллеля CCR5D32 в изученных регионах, так же как и в изученных ранее популяциях Европы и Азии, характеризуется отрицательным градиентом в направлении с севера на юго-восток (рис. 1.6, см. цв. вклейку).

Гетерогенность в распределении протективного аллеля CCR5D32 на территории изученных регионов связана в первую очередь с участием европеоидного и монголоидного компонентов в этногенезе народов, проживающих на территории России. Полученные нами результаты подтверждают и дополняют существующие данные молекулярно-генетического анализа пространственной структуры генофонда восточно-европейских и центрально-азиатских народов.

В отношении аллеля CCR2-64I наиболее значимые отличия были обнаружены для казахов и киргизов (центрально-азиатская группа) относительно других рассмотренных групп (рис. 3.7, см. цв. вклейку). В популяции чеченцев частота аллеля ниже, чем в центрально-азиатской группе, однако выше относительно других рассмотренных выборок.

В пределах восточно-европейской и волго-уральской этнографических групп обнаружены достоверные отличия для гагаузов относительно других популяций. Эти данные коррелируют с данными о миграционных потоках со стороны южных (Греция, Болгария) регионов Европы, где частота аллеля CCR2-64I демонстрирует повышенные значения. Значимых отличий в других этнических группах Восточно-европейского региона не обнаружено.

Отдельного упоминания стоит рассмотренная выборка из популяции тувинцев. Здесь частота аллеля CCR2-64I зафиксирована на самом низком уровне. Причиной этому могла послужить как географическая изолированность республики, так и этническая близость к монголам (старое название региона - Бурято-Монголия). Полученные нами данные позволяют предположить, что формирование генофонда тувинской популяции находилось под влиянием миграционных потоков, проникавших на территорию Восточной Сибири из южных областей азиатского региона, где частота полиморфизма CCR2-64I ниже относительно Центральной Азии.

Аллель SDF1-3’A для всех исследованных популяций распространен равномерно (рис. 3.8, см. цв. вклейку). Обнаруженные отличия не достоверны и не позволяют выявить тенденций в его распространении. Единственное значимое отличие отмечено нами для популяции гагаузов, где частота аллеля несколько выше, чем у представителей других изученных популяций. К сожалению, в доступной литературе отсутствуют сведения о представленности варианта SDF1-3A на территории Европы и Ближневосточного региона, и мы не можем делать предположений о путях его распространения.

Однако если сопоставить данные по частоте аллелей CCR2-64I и SDF1-3A с основными путями миграции в Азиатском регионе, видно, что изменение частот аллелей совпадает с существующими представлениями о направлении миграционных потоков на территории Азиатского региона. По одной из существующих на сегодняшний день гипотез, предки проживающих в этом регионе людей попали на территорию Центральной Азии примерно 50000-70000 лет назад с юга, вероятно, из Юго-Восточной Азии (где частота аллеля SDF1-3A высокая), и в дальнейшем распространились на север Азии. Вместе с тем следующие 7000 лет миграции на территории Китая были направлены с севера на юг - из области с высокой частотой CCR2-64I. Противоположная направленность в распределении частот протективных аллелей CCR2-64I и SDF1-3’A на территории Азиатского региона отчасти подтверждает эту гипотезу [122].

На основе частот трехлокусных генотипов в изученных популяциях и значений коэффициентов относительных рисков нами были рассчитаны значения относительной опасности развития СПИДа (ООР) и относительной опасности смерти от СПИДа (ООС) у ВИЧ-инфицированных. Данные представлены на рис. 3.9 и 3.10 (см. цв. вклейку).

В рассмотренных нами выборках значения ООР и ООС попадают в интервал 0,79-0,94 и 0,76-0,93 соответственно. В целом они соответствуют данным, полученным для других европейских и азиатских популяций. Широкое распространение аллеля CCR2-64I в центрально-азиатской группе, а также высокая частота аллеля CCR5D32 в выборке русских из Архангельской области определили пониженные значения ООР и ООС в этих группах. Напротив, в выборке тувинцев и популяциях волго-уральской группы относительная опасность демонстрирует повышенные значения, что связано с низкой частотой протективных аллелей CCR5D32 и CCR2-64I. У восточно-европейских народов и выборки чеченцев выявлен средний уровень ООР и ООС. Можно предположить, что в первом случае оказывает влияние распространенность варианта CCR5D32, а во втором - CCR2-64I.

Как было многократно показано, частота встречаемости алеллей, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ/СПИД, в значительной степени варьирует в различных расах и популяциях, влияя тем самым на особенности эпидемического процесса в различных регионах мира. Гетерогенность в распределении «защитных» вариантов генов на территории России и сопредельных государств также может оказывать влияние на динамику развития эпидемии в различных популяционных группах. В связи с этим представляется важным дальнейшее изучение существующих и поиск новых генетических факторов устойчивости к ВИЧ/СПИД, а также расширение географии исследования. Целесообразность проведения таких исследований помимо фундаментального значения имеет и выраженный прикладной аспект, поскольку, как указывалось выше, их результаты открывают новые возможности в профилактике, повышении эффективности лечения и эпидемиологии СПИД, что в конечном итоге в значительной степени определяет биобезопасность государства.

Становлению клинической трансплантации органов как полноправной отрасли современного здравоохранения способствовал принципиально новый подход, разработанный в конце 1960-х годов [73] и используемый по настоящее время. Суть этого подхода состоит в том, что все больные, нуждающиеся в пересадке органов, т.е. потенциальные реципиенты, проживающие на территории того или иного крупного города, региона, отдельно взятой страны или объединения нескольких государств, проходят процедуру установления набора их HLA-генов (HLA-генотипов), определяющих их тканевую совместимость. Эти данные включаются в единый лист ожидания трансплантата потенциальных реципиентов, нуждающихся в трансплантации органов от тканесовместимых посмертных доноров органов. Таким образом, единый лист ожидания содержит данные, включающие индивидуальный набор тканесовместимых генов по всем потенциальным реципиентам, ожидающим трансплантацию органов в конкретном городе, регионе, стране или объединении государств. При этом следует отметить, что чем большее количество больных входит в лист ожидания, тем больше вероятность нахождения полностью тканесовместимой пары донор-реципиент. Минимальное количество пациентов в листе ожидания, при котором имеется вероятность для нахождения тканесовместимого донора органного трансплантата пациенту в листе ожидания, измеряется тысячами человек. Такая ситуация имеет место, в частности, в Московском регионе. Оптимальный вариант - это наличие в листе ожидания десятков и сотен тысяч человек, как это было, например, до конца 1980-х годов в объединении Соцтрансплант, включавшим в себя страны СЭВ (Совет экономической взаимопомощи). В настоящее время подобная ситуация наблюдается в таких объединениях, как Евротрансплант, объединяющий государства Западной и Центральной Европы.

Каждого потенциального посмертного донора, органы которого пригодны для трансплантации, а их изъятие может быть проведено лишь в соответствии с действующим национальным законодательством, также обследуют на предмет установления HLA-генотипа.

Вслед за этим данный HLA-генотип сопоставляют/скринируют через лист ожидания на предмет установления наиболее тканесовместимого с ним больного, входящего в лист ожидания [9]. Использование этого принципа обеспечивает как эффективность самой трансплантации, так и возможность контроля легитимности клинической трансплантации, поскольку в случае необходимости, например при подозрении на нарушение принципов безвозмездности и равнодоступности клинической трансплантации, в любое время может быть проведена повторная оценка тканевой совместимости (генотипирование) донора и реципиента. Такая возможность существует благодаря сохранению донорской ДНК, образцы которой сохраняются в течение длительного времени.

В целом следует сказать, что открытие генов тканевой совместимости и широкое использование тканесовместимых пар в клинической трансплантологии стали и являются в большинстве стран мира по настоящее время краеугольным камнем развития трансплантологии как клинической дисциплины. Так, поскольку к моменту открытия генов тканевой совместимости человека уже практически не существовало хирургических проблем в пересадке органов и тканей, очень быстро, в течение 5-10 лет в 1960-1970-е годы, из фундаментального направления медицины, когда каждая пересадка органов являлась не столько клиническим, сколько научным событием, трансплантология превратилось в полноценную и одну из наиболее передовых отраслей клинической медицины.

На этом пути одним из наиболее знаковых событий стала первая успешная клиническая пересадка сердца, выполненная южноафриканским хирургом Кристианом Барнардом в 1967 г. [39]. Это событие породило первую в истории клинической трансплантологии правовую и этическую дискуссию по тем вопросам, которые до настоящего времени остаются в центре внимания как специалистов-правоведов и врачей-трансплантологов, так и широких кругов общественности. И по сей день среди этих вопросов есть, в частности, вопросы о правах донора (в том числе посмертного), об ответственности врачей-трансплантологов, необходимости создания соответствующей правовой базы и, наконец, о проблеме торговли органами.

Принципиально важной вехой в истории трансплантологии, позволившей сделать прорыв в преодолении отторжения пересаженного органа у больного и продлении срока жизни пересаженного органа, стало открытие швейцарским ученым Д. Борелом в 1972 г. и введение в клиническую практику в 1979 г. Р. Kaлнэ [42, 44] лечебного препарата циклоспорина (сандиммуна), подавляющего развитие реакции отторжения за счет неспецифического угнетения иммунной системы реципиента. Применение данного лекарства в сочетании со стероидными гормонами в послеоперационном периоде дало возможность перейти от единичных, сенсационных по своей удаче трансплантаций почки, к серийным пересадкам органов, благодаря чему удается спасать жизни огромному числу людей, страдающих тяжелыми формами заболеваний различного генеза, обреченных до этого на неминуемую смерть. В последнее время главенствующее значение в мировой клинической трансплантологии, включая Россию, приобрела пересадка почек [34]. Сегодня в мире насчитывается более 700000 человек, которые живут уже более 10 лет с пересаженными почками.

В последние годы в мире возрастает количество и других видов трансплантаций - сердце, печень, легкие, эндокринные органы, но особое место приобретает пересадка костного мозга, точнее КСК. Данный вид трансплантаций занимает второе место в мировой практике после пересадки почки, но имеет все шансы выйти на первое место в будущем [47].

Клиническая трансплантация в своем развитии использует новейшие достижения молекулярной генетики, биотехнологии, фармакологии, биохимии и биоинформатики, а также других новых отраслей биологии и медицины. Таким образом, в результате развития клинической трансплантологии были созданы десятки и сотни новых препаратов, направленных на предотвращение и подавление реакции отторжения трансплантата. Многие из этих препаратов уже вторично нашли свое место в других областях медицины, в частности при лечении аутоиммунных заболеваний и аллергий.

Большое значение в развитии клинической трансплантации органов имели международные программы по обмену тканесовместимыми трансплантатами, в первую очередь почек, часть из которых существует и в настоящее время. Задачей данных программ было и есть безвозмездное сотрудничество по обмену органными трансплантатами для обеспечения пересадок органов тканесовместимым реципиентам вне зависимости от места нахождения реципиента. Для обеспечения эффективного сотрудничества были созданы международные листы ожиданий, включающие реципиентов, ожидающих появления тканесовместимых с ними донорских органов. Под понятием «тканесовместимые донор и реципиент» как в прошлый период, так и в настоящее время следует понимать в первую очередь совместимость по специфичностям HLA. Эти специфичности первоначально выявлялись так называемыми методами протеомного типирования, основанного на установлении специфичности молекул HLA-антигенов. В настоящее время основной метод - HLA-генотипирование [62].

Что касается пересадки КСК, то в период 1960-1970-х годов относительно эффективными оказались пересадки лишь от родственных доноров, и в первую очередь от братьев и сестер. Полное понимание причины указанной проблемы и далее ее решение начинаются в конце 1980-х годов и связаны с переходом с «классических» - протеомных методов HLA-типирования (серологических, клеточно-опосредованных), позволяющих идентифицировать не сами гены HLA, а их продукты - HLA-антигены, - на молекулярно-генетические методы, позволяющие «прямо» идентифицировать аллели HLA. Практическим результатом этого перехода стало то, что вместо 138 HLA-специфичностей, идентифицируемых до этого перехода, появилась возможность уже к 2012-му году выявлять более 8000 аллельных вариантов специфичностей (см. табл. 2.1, глава 2). На настояший момент их число превышает 10000 (рис. 2.1, см. цв. вклейку). Эти два уровня HLA-генотипирования в клинической трансплантологии принято обозначать как уровни низкого и высокого разрешения. В настоящее время генотипирование осуществляется и для выявления тех специфичностей, которые ранее выявлялись в протеомных тестах (т.е. типирование на низком уровне разрешения).

В табл. 2.1 (см. гл. 2) приведены данные о современной номенклатуре главного комплекса гистосовместимости человека в сравнении с данными, имевшимися на момент использования лишь «классических» - протеомных методов HLA-генотипирования. Приведенные в таблице данные свидетельствуют о том, что благодаря переходу на молекулярно-генетические методы типирования были открыты не только новые HLA-специфичности (аллельные варианты), входящие в уже известные локусы и гены, но и выявлены новые гены, многие из которых кодируют белки, принимающие непосредственное участие в развитии реакции отторжения или иных физиологических функциях организма. При этом надо помнить, что при трансплантации органов и тканей отторжение является физиологическим процессом, а преодоление реакции отторжения трансплантата - напротив, отнюдь не физиологический процесс. Следует отметить, что изучение роли вновь открытых генов HLA в развитии реакции отторжения трансплантата активно продолжается и в настоящее время. Практическим результатом этого является тот факт, что постоянно совершенствуется представление о том, какие из генов HLA необходимо учитывать при селекции совместимых пар донор-реципиент. Особенно актуально это направление исследований для повышения эффективности пересадки КСК [30].

Переход на уровень селекции пар донор-реципиент при подборе органных трансплантатов иммунокомпрометированным реципиентам органных трансплантатов и реципиентам КСК, полученных от неродственных доноров-добровольцев, сделал эффективным и этот вид клинической трансплантации (подробнее см. ниже). Естественно, что установленный на сегодняшний день уровень генетического полиморфизма (разнообразия) системы HLA потребовал огромного количества доноров-добровольцев КСК, объединенных в регистры безвозмездных неродственных доноров. Данная проблема решена на уровне международного сотрудничества. Общее количество таких доноров в мире превышает 19 млн, что обеспечивает возможность подбора полностью совместимых КСК для 80% больных, нуждающихся в их трансплантации.

Существенно более сложной является ситуация с подбором полностью совместимых пар донор-реципиент при органных трансплантациях.

Дело в том, что главная проблема трансплантации органов - нехватка аллогенных неродственных трансплантатов, основным источником которых служат посмертные доноры [9]. Решение этой проблемы состоит в создании многотысячных (в основном международных) листов ожидания трансплантатов.

Учитывая это обстоятельство, в странах, не участвующих в программах обмена органными тканесовместимыми трансплантатами, в ряде случаев трансплантологи вынуждены снижать требования к уровню тканевой совместимости органного донора и реципиента и пытаться «компенсировать» тканевую несовместимость контролируемой иммунодепрессивной терапией.

Открытие препаратов, подавляющих иммунный ответ реципиента на чужеродные HLA-антигены, стало вторым (после открытия системы HLA) важнейшим достижением биомедицинской науки.

Развитие данного направления иммунотерапии привело к усовершенствованию препаратов, относящихся к группе иммунодепрессантов, и снизило вероятность развития побочных эффектов и осложнений, возникающих даже при проведении поддерживающей терапии. Вместе с тем необходимо отметить, что использование высоких доз даже современных иммунодепрессантов - необходимое и основное средство купирования кризов отторжения пересаженных органов - зачастую ведет к глубокому угнетению противоинфекционного иммунитета и к развитию инфекционных осложнений, в том числе вызванных условно-патогенной флорой организма. Последнее в ряде случаев заканчивается гибелью реципиента даже при функционирующем трансплантате [17].

Другой причиной гибели реципиента при функционирующем трансплантате является смерть от сердечно-сосудистых осложнений, также вызванных использованием высоких доз иммунодепрессантов, назначаемых в целях подавления кризов отторжения трансплантата [35]. Основной причиной кризов отторжения является HLA-несовместимость донора и реципиента, и чем ниже уровень HLA-совместимости, тем выше вероятность возникновения криза.

Следует отметить, что реципиентов органных трансплантатов необходимо подразделить на 2 основные группы по степени HLA-совместимости с донором, которая может обеспечить снижение вероятности развития кризов отторжения (в том числе некупируемых - ведущих к потере функции трансплантата).

Первая группа (серонегативная) - соответственно около 90% реципиентов листа ожидания для России и около 30% для стран, входящих в международные объединения трансплантологов, - не несут такие антитела или имеют их в незначительных количествах. Подбор тканесовместимого донора в этой группе может быть ограничен подбором лишь по HLA-специфичностям класса II (HLA-DRB1) на уровне низкого разрешения - всего 18 специфичностей, благодаря чему для эффективного подбора достаточно листа ожидания, включающего 500-1000 реципиентов. Возможность такого рода эффективного подбора впервые была установлена отечественными исследователями [66], а затем подтверждена работами ряда зарубежных исследователей.

Вторая группа объединяет так называемых серопозитивных или иммунокомпрометированных реципиентов, в крови которых выявляются высокие титры предсуществующих антител, образовавшихся вследствие гемотрансфузий, гемодиализов или предшествующих трансплантаций. Число таких реципиентов составляет около 5-10% листа ожидания Московского региона. В этом случае из-за резко возрастающей угрозы потери трансплантата необходим тщательный подбор пар донор-реципиент, соответствующий таковому при трансплантации кроветворных стволовых клеток или костного мозга (КСК/КМ). Вероятность нахождения HLA-совместимой пары донор-реципиент составляет 1 на 1 000000, т.е. она приближается к требованиям, предъявляемым к подбору пар донор-реципиент при пересадке КСК.

Естественно, что при органных пересадках, в отличие от пересадок КСК/ КМ, где подбор может проводиться из контингента живых доноров-добровольцев (более 18 000000 добровольцев, входящих во Всемирный регистр), такая ситуация при трансплантации органов трупного происхождения нереальна. Это объясняется тем, что для нахождения HLA-совместимой пары донор-реципиент HLA-генотип каждого донора сопоставляется (скринируется) с HLA-генотипами потенциального реципиента из листа ожидания. Для Москвы лист ожидания не превышает 1000 человек, а международные регистры насчитывают не более 50000 человек.

Для стран, участвующих в таких объединениях, имеющих программы международного сотрудничества со значительными объемами международных листов ожидания, подбор тканесовместимых пар донор-реципиент, основанный на использовании HLA-генотипирования низкого уровня разрешения, вполне реален. Например, программа «Евротрансплант» объединяет все страны ЕС. Естественно, что на территории крупных стран, например США, обмен осуществляется на уровне взаимодействия отдельных штатов. Благодаря этому обмену реальный лист ожидания исчисляется тысячами и десятками тысяч реципиентов, что позволяет эффективно осуществлять подбор тканесовместимых трансплантатов не только по DRВ1, но и по специфичностям класса I (HLA-A и -B). Схожая ситуация была и в СССР, когда обмен трансплантатами осуществлялся не только на уровне региональных трансплантационных центров, но и на уровне стран СЭВ, в рамках существовавшей программы. Для стран, которые, как и Россия, не объединены в международные регистры, может быть предложен другой подход.

В настоящее время, в первую очередь вследствие экономической ситуации, на территории РФ практически отсутствует возможность обмена трансплантатами и максимальные объемы листов ожидания не превышают 400-500 потенциальных реципиентов, что исключает возможность эффективного подбора тканесовместимых трансплантатов органов по HLA-специфичностям I и II классов (HLA-DRB1 и HLA-A, -B).

Предлагающийся для трансплантологических центров с ограниченными листами ожидания переход селекции пар донор-реципиент на основе лишь совместимости по HLA-DRB1 имеет и теоретическое обоснование. Если реципиент не сенсибилизирован HLA-антигенами, представленными в HLA-генотипе донора, что устанавливается на основании отсутствия соответствующих антител, то иммунный ответ против чужеродных HLA-специфичностей донора (отсутствующих в HLA-генотипе реципиента) развивается по первичному типу против непроцессированной молекулы HLA-DRB1 [69].

В том случае, если донор и реципиент идентичны по генотипу HLA-DRB1, не развиваются ни клеточный, ни гуморальный ответы против HLA-специфичностей как II, так и I классов. Именно поэтому снижается актуальность селекции по классу I. Это служит объяснением того, что, как было показано в работе А.В. Сечкина [66], в подобных ситуациях несовместимость донора и реципиента по специфичностям HLA класса I при наличии полной совместимости по HLA-DRB1 не оказывает негативного влияния на результат трансплантации.

Еще раз следует повторить, что это относится к случаям, когда в организме реципиента отсутствуют предсуществующие антитела к HLA-антигенам класса I и II, имеющимся в генотипе донора [69].

На рис. 4.1 (см. цв. вклейку) представлены данные о взаимосвязи между HLA-DRB1-совместимостью донора и реципиента, частотой развития некупированных кризов отторжения и 5-летней выживаемости трансплантата. Материалом являются результаты трансплантаций почек в Московском регионе. HLA-селекция осуществлялась в Московском координационном центре органного донорства Московского департамента здравоохранения.

Как следует из представленных данных, в группе, где донор и реципиент полностью совместимы по специфичностям HLA-DRB1, 5-летняя выживаемость на 25% превышает таковую в группе, несовместимой по специфичностям HLA-DRB1. Так, в отношении ранних кризов их частота в группах сравнения различается на 23%. Что же касается некупированных кризов, то они вообще не были зарегистрированы в группе совместимых по HLA-DRB1 пар, но были зарегистрированы у 22,6% несовместимых с донором реципиентов. При этом следует отметить, что интенсивность иммунодепрессивной терапии в последней группе значительно превосходит таковую в первой группе. Последнее обусловлено тем, что количество кризов отторжения значительно выше в несовместимой группе реципиентов по сравнению с совместимой.

Таким образом, использование HLA-DRBl-генотипирования на уровне низкого разрешения позволяет добиться эффективности трансплантаций, соответствующей таковой в передовых трансплантологических центрах мира, где уровень пятилетней выживаемости аллогенных трансплантатов почки составляет 75-85%.

С другой стороны, использование такого подхода позволяет осуществлять подбор HLA-тканесовместимых доноров на уровне ограниченного листа ожидания, имеющегося в настоящее время в московском регионе (400-600 пациентов в листе ожидания). Следует еще раз подчеркнуть, что речь идет о первичных, несенсибилизированных реципиентах, в крови которых предсуществующие антитела либо отсутствуют, либо имеют низкие титры.

Необходимо отметить, что используемые в настоящее время методы молекулярно-генетического типирования, сменившие метод серологического типирования, применявшийся до 1990-х годов для селекции пар донор-реципиент, открыли принципиально новые возможности поиска тканесовместимого органного донора. Одной из них, в частности, стала возможность учитывать при селекции приоритетность использования HLA-DRB1-гомозиготных доноров.

Переход на использование молекулярно-генетического метода HLA- DRB1-селекции совместимых пар донор-реципиент позволил создать в посттрансплантационный период оптимальные условия для обеспечения эффективного функционирования тканесовместимого трансплантата, когда достаточной является доза иммунодепрессантов, не вызывающих существенного угнетения противоинфекционного иммунитета, но при которой развитие кризов отторжения маловероятно.

Разумеется, сегодняшняя ситуация с донорством в мире и особенно в России накладывает определенные ограничения на количество проводимых трансплантаций. Решение данной проблемы, как и в случае с трансплантациями КСК/КМ, связано с расширением листов ожидания реципиентами тканесовместимых трансплантатов, в первую очередь за счет объединения региональных и национальных регистров в международные организации, наиболее известной из которых является Евротрансплант, включающий в себя страны ЕС. В СССР в 1970-1980-е годы обмен трансплантатами проводился на территориях Советского Союза и стран СЭВ [34]. Таким образом, актуальным является создание системы с максимальными возможностями подбора тканесовместимых пар донор-реципиент в условиях ограниченных листов ожидания. При этом необходимо исходить из того, что реально такая возможность имеется лишь для реципиентов с отсутствием или низким уровнем предсуществующих антител, составляющих, по данным Московского координационного центра органного донорства, около 10% листа ожидания [9].

Как указывалось ранее, в этой ситуации (т.е. для 90% реципиентов) достаточным может быть подбор лишь по специфичностям HLA-DRB1, выявляемым на групп-специфическом уровне (т.е. на уровне низкого разрешения). При таком подходе для эффективной селекции тканесовместимых пар донор-реципиент в листе ожидания достаточно около 500 потенциальных реципиентов.

Тем не менее необходимо использовать хотя бы реально имеющиеся в настоящее время возможности, позволяющие осуществлять селекцию HLA-совместимых пар донор-реципиент в целях повышения эффективности органных трансплантаций.

Хотя механизм распознавания иммунодоминантных пептидов в контексте антигенов тканевой совместимости является в целом универсальным, из него, по-видимому, есть отдельные исключения, и в первую очередь это может относиться к распознаванию чужеродных (аллогенных) антигенов тканевой совместимости. Такая ситуация бывает, по крайней мере, в двух случаях: во-первых, при пересадке органов и тканей; а во-вторых, при беременности.

Что касается первой из указанных возможностей, то по первоначально сформировавшемуся представлению, наиболее полно изложенному в начале 1970-х годов [38], Т-клетки реципиента распознавали непосредственно целую молекулу чужеродного антигена (донорского происхождения) тканевой совместимости. Причем Т-хелперы распознавали чужеродные молекулы класса II, а Т-киллеры - чужеродные молекулы класса I. Такого рода распознавание целой непроцессированной молекулы чужеродных антигенов тканевой совместимости принято называть прямым [38].

В последующие годы, в связи с формированием представлений о роли иммунодоминантных пептидов, происходящих из целых антигенных молекул, естественно, возник вопрос о том, не имеет ли место и в случае трансплантационнного иммунитета описанный выше общий механизм антигенного процессинга и экспрессии. При этом были получены данные о реальной возможности распознавания процессированных пептидов чужеродных антигенов тканевой совместимости. Одной из наиболее значимых работ в данной области стала работа S. Khoury et al. [54], выполненная в лаборатории профессора Ch. Carpenter.

Суть данной работы состоит в том, что авторы показали в изящной экспериментальной системе, основанной на индукции иммунного ответа к пептидам класса II, возможность непрямой индукции иммунного ответа отдельными пептидами «донорских» антигенов тканевой совместимости класса II, индуцирующими ответ CD4⁺ клонов. Более того, авторам удалось показать, что эти клоны, способные продуцировать γ-интерферон, относятся к ThI клонам, и высказали обоснованное предположение о возможной роли непрямого распознавания антигенов тканевой совместимости (т.е. прошедших стадию процессинга), как в реакции отторжения, так и в индукции толерантности.

При этом следует принять во внимание, что эти данные целесообразно рассматривать, учитывая и то, что непрямой путь распознавания может касаться не только чужеродных, т.е. отличающихся от собственных (хотя бы на уровне отдельных пептидов) [36, 53, 58, 72], но и полностью идентичных HLA-антигенов. В пользу последнего свидетельствуют данные о возможности представления HLA-молекулами «собственных» пептидов [30].

Точка зрения о том, что молекулы HLA класса II «представляются» антигенпрезентирующими клетками «хозяина» без предварительного процессинга, не является достоянием истории 1970-1980-х годов. L.A. Sherman и S. Cattopadhyan [69] подтвердили наличие этого механизма уже в 1993 г. Причем эти авторы показали, что непроцессированные HLA-молекулы распознаются в период развития кризов отторжения в реакции смешанной культуры лимфоцитов - MLC (Mixed Lymphocyte Culture).

И наконец, уже в последующие годы появился целый ряд сообщений, авторы которых, используя современные методы исследования, также пришли к выводу о наличии прямого распознавания целой непроцессированной молекулы HLA в клинике трансплантации органов и тканей [40, 65].

Таким образом, дискуссия о том, какой путь распознавания - прямой или непрямой - обусловливает развитие реакции отторжения трансплантата, является незаконченной, и есть основания считать, что истина находится посередине.

Не подвергая сомнению принципиальную возможность участия в развитии реакции отторжения обоих путей распознавания продуктов генов HLA класса II, следует принять во внимание данные исследования Z. Lui et al. [57], которые показали, что бластогенный ответ в культуре лимфоцитов реципиентов с кризом отторжения могут индуцировать не только «целые» молекулы HLA, но и HLA-пептиды донорского генотипа. Вслед за этим A. Segers et al. [68] на международном конгрессе по трансплантации в Монреале в 1998 г. впервые предоставили данные о том, что только часть «чужеродных» HLA-эпитопов, представляемых собственными HLA-молекулами класса II, вызывает развитие иммунного ответа. Авторы отстаивают точку зрения о том, что только эта часть HLA-эпитопов, относящихся как к первому, так и ко второму классу аллелей HLA, вызывает развитие реакции отторжения трансплантата. Естественно, только в том случае, если данный эпитоп отсутствует у реципиента.

Казалось бы, противоположные точки зрения на роль в распознавании и индукции трансплантационного иммунного ответа целых молекул HLA и HLA-пептидов нашли общее решение. Так, исследователями, работающими в коллективе, возглавляемом профессором Дж. ван Руудом, были получены прямые доказательства того, что оба типа распознавания - прямое и непрямое - могут реализовываться одновременно [64]. Во всяком случае было установлено, что индукция цитотоксических Т-киллеров, активность которых направлена против антигенов класса I HLA-A и HLA-B, осуществляется в прямом распознавании, в то время как специфические Т-киллеры, реагирующие в цитотоксическом тесте, индуцируются только при распознавании иммуногенных сайтов пептидов HLA-C-антигенов. Так, в реакции отторжения органного трансплантата антигены HLA-C практически не принимают участия. Именно это объясняет известный трансплантологам факт, что селекция по антигенам HLA-C в клинической практике трансплантации органов не используется уже более 20 лет.

В целом можно констатировать, что на сегодняшний день точка зрения об одновременном участии в развитии реакции отторжения механизма прямого распознавания и ответа на процессированные HLA-пептиды донорского происхождения, представляемые молекулами HLA-реципиента, является наиболее распространенной [65].

Следует также напомнить, что все вышесказанное относится к органной трансплантации. При пересадке костного мозга селекция по всему набору HLA, включая аллели HLA-C, является абсолютно необходимой, и, более того, она имеет большее удельное значение по сравнению с аллелями HLA-А и -B. При этом полная селекция (на уровне аллельных вариантов) по HLA при трансплантации кроветворных стволовых клеток необходима уже при первичных трансплантациях.

Возвращаясь к вопросу об органной трансплантации реципиентам с отсутствием или низким уровнем предсуществующих антител, следует отметить следующее. Ведущую и определяющую роль в селекции пар донор-реципиент играют HLA-специфичности класса II, а не класса I [67]. В этих работах было убедительно показано, что совместимость донора и реципиента по HLA-специфичностям класса I в группе, где у реципиентов не имелось пресенсибилизации, практически не влияла на выживаемость трансплантатов в течение пятилетнего периода при условии идентичности донора и реципиента по специфичностям HLA класса II. При этом речь идет о специфичностях DRB1, выявляемых при генотипировании методом низкого разрешения (общее количество таких специфичностей - не более 18). Следует также отметить, что такой подход к селекции тканесовместимых пар донор-реципиент позволяет решить проблему «короткого листа ожидания», которая является характерной для ситуации, имеющейся на сегодняшний день в России. Так, наиболее обширный для России лист ожидания, имеющийся в Московском регионе, не превышает 2-3 тыс. больных. Однако даже эта цифра достаточна для эффективного подбора полностью DRB1-совместимых пар донор-реципиент [25].

Данные об эффективности селекции аллогенного почечного трансплантата в зависимости от степени совместимости донора и реципиента по специфичностям HLA-DRB1 представлены на рис. 4.1 (см. цв. вклейку). HLA-генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров - метод SSP (Sequence Specific Primers). Применяли тест-системы производства ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва.

Как следует из представленных данных, в группе полностью совместимых по HLA-DRB1 специфичностям пар донор-реципиент 5-летняя выживаемость на 25% выше по сравнению с группой, несовместимой по специфичностям HLA-DRB1. При этом следует отметить, что интенсивность иммунодепрессивной терапии в последней группе значительно превосходит таковую в первой группе. Последнее обусловлено тем, что количество некупированных кризов отторжения значительно выше в несовместимой группе реципиентов по сравнению с совместимой. Естественно, что данное обстоятельство существенным образом влияет на дальнейший прогноз выживаемости.

Таким образом, использование HLA-DRB1 -генотипирования на уровне низкого/среднего разрешения, позволяет добиться эффективности трансплантаций, соответствующей передовым трансплантологическим центрам мира, где уровень 5-летней выживаемости аллогенных трансплантатов почки равен 75-85%. Также показано, что при наличии HLA-DRB1-совместимости пар донор-реципиент [25, 67] HLA-совместимость по локусам I класса (HLA-A, -B) влияет на эффективность трансплантации почки, т.е. не имеется выраженных различий в группах, где при наличии HLA-DRB1-совместимости имелась или не имелась совместимость по HLA-A, -B. Таким образом, эффективность определяется в первую очередь именно HLA-DRB1-совместимостью.

Причем существует реальная возможность повышения процента подбора совместимых по двум HLA-DRB1 -специфичностям пар донор-реципиент. Эта возможность основана на перспективном использовании высокого процента HLA-DRB1 -гомозигот среди реципиентов, ожидающих трансплантацию почки (табл. 4.1) в клиниках Московского региона.

Таблица 4.1. Процент HLA-DRB1 -гомозигот в 3 группах сравнения

Как следует из табл. 4.1, процент HLA-DRB1 -гомозигот среди реципиентов в листе ожидания достигает 32,3%, что практически в 2 раза превышает этот уровень среди здоровых жителей г. Москвы и потенциальных доноров органных трансплантатов.

Наиболее вероятным объяснением этого феномена является тот факт, что среди реципиентов Московского региона более 80% больны хроническим гломерулонефритом - тяжелым аутоиммунным заболеванием, ведущим к потере функции почки [67]. Существенное место принадлежит также реципиентам, для которых причиной потери функции стал диабет, в том числе СД1, тоже являющийся аутоиммунным заболеванием. Как известно, HLA-DRB1-гомозиготность является фактором, обусловливающим высокий уровень предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний [3].

В целях увеличения вероятности подбора пар донор-реципиент, совместимых по HLA-DRBl-специфичностям, отечественные исследователи еще в 1997 г. предложили модифицировать компьютерную программу подбора тканесовместимых пар донор-реципиент на основе выделения из общего листа ожидания реципиентов, гомозиготных по HLA-DRB1- специфичностям. Обоснованием этому послужил установленный отечественными исследователями факт двукратного превышения в группе потенциальных реципиентов количества HLA-DRB1-гомозиготных больных (32,5% по сравнению с 16,2% по московской популяции) [67]. Программа подбора основана на том, что любой донор, гомозиготный по HLA-DRB1-специфичности, первоначально сопоставляется со списком HLA-DRB1-гомозиготных реципиентов, и в случае наличия HLA-DRB1-совместимой пары ей отдается предпочтение по сравнению с HLA-DRB1-гетерозиготами, входящими в основной список листа ожидания.

Использование данной программы позволяет решить следующую проблему, а именно: для HLA-DRBl-гомозиготных реципиентов (составляющих 1/3 листа ожидания) любой из HLA-DRB1-гетерозиготных доноров является несовместимым как минимум по одному HLA-DRB1-гаплотипу и только HLA-DRB1-гомозиготный донор может оказаться полностью тканесовместимым данному реципиенту. Таким образом, полная HLA-DRB1-совместимость может возрасти на 1/3 из числа выполняемых трансплантаций. Возможность использования такого подхода была подтверждена на основе анализа клинического материала трансплантаций аллогенных почек от 130 HLA-DRB1-гомозиготных доноров в г. Москве, выполненного Московским координационным центром органного донорства [10].

Данные представлены в табл. 4.2, содержащей как сведения об эффективности почечных трансплантатов от HLA-DRB1-гомозиготных доноров, так и о реальной ситуации их использования.

По результатам 130 трансплантаций аллогенных почек, полученных от HLA-DRB1-гомозиготных доноров, можно сделать следующее заключение. К сожалению, группа, в которой HLA-DRB1-гомозиготным реципиентам были трансплантированы тканесовместимые почки от HLA-DRB1-гомозиготных доноров, оказалась чрезвычайно незначительной - только 11 случаев. При этом выживаемость в данной группе превышала 90%. Близкие показатели - 82% выживаемости - были зарегистрированы в группе HLA-DRB1-гетерозиготных реципиентов (n=36), которым были трансплантированы почки от тканесовместимых HLA-DRB1-гомозиготных доноров, имеющих 1 общую с реципиентами HLA-DRB1-специфичность (гаплоидентичность).

Таблица 4.2. Реальное использование HLA-DRB1 -гомозиготных доноров

К сожалению, общий объем двух вышеописанных групп - 47 человек - составляет всего лишь 36,2%. И большая часть трансплантатов, полученных от HLA-DRB1-гомозиготных доноров, была трансплантирована HLA-DRB1-несовместимым реципиентам (т.е. без учета HLA-DRB1-совместимости). При этом 66 трансплантатов были пересажены HLA-DRB1-гетерозиготным реципиентам, в их генотипе отсутствовала HLA-DRB1-специфичность, идентичная донорской. Более того, в 17 случаях трансплантаты от HLA-DRB1-гомозиготных доноров были пересажены также HLA-DRB1-гомозиготным, но несовместимым реципиентам. Выживаемость в указанных группах была практически идентична (около 50%).

Таким образом, различие по 5-летней выживаемости между группами реципиентов, получивших трансплантаты от HLA-DRB1-гомозиготных доноров, с учетом и без учета HLA-DRB1-совместимости, превысило 30%. К сожалению, группа реципиентов с более низкой выживаемостью была значительно более многочисленной по сравнению с группой, где отмечалось эффективное использование трансплантатов от HLA-DRB1-гомозиготных доноров. Учитывая то, что данная группа оказалась весьма малочисленной (11 случаев), целесообразно было обследовать более многочисленную группу реципиентов.

К сожалению, в контингенте, обследованном в 2010 г., количество несовместимых пар донор-реципиент составило 148 случаев (около 50% от всех случаев), что значительно превысило группу, включающую HLA-DRB1-совместимые пары.

Таким образом, остается значительный «резерв» в увеличении количества HLA-совместимых пар донор-реципиент, в том числе за счет еще более рационального использования HLA-DRBl-гомозиготных доноров.

Анализируя в целом ситуацию с селекцией аллогенной почки, можно сделать вывод, что для достижения ее эффективности (тем более в формате короткого листа ожидания) достаточно использовать данный вид селекции доноров при пересадках реципиентам, в крови которых «предсуществующие» антитела отсутствуют или определяются в низком титре, что свидетельствует об отсутствии их сенсибилизации.

Именно такого рода подход позволяет надеяться на возможность быстрого и эффективного решения проблемы имеющегося в настоящее время отставания трансплантаций органов в России и выхода страны на лидирующие позиции в этой области клинической медицины.

Клиническая трансплантология, начавшая свое развитие в 1960-1970-х годах, на протяжении двух последних десятилетий играет роль наиболее высокотехнологичной, востребованной и радикальной в плане эффективности лечения в мировом здравоохранении [52]. Об этом, в частности, свидетельствует тот факт, что от момента, когда в мире были осуществлены первые десятки и сотни пересадок органов, до настоящего времени, когда только число пациентов с пересаженными почками превысило 700000, прошло всего лишь 30 лет. Таким образом, трансплантология, являясь одной из самых молодых отраслей клинической медицины, помогает спасти сотни тысяч жизней. В настоящее время в мире могут подлежать трансплантации следующие органы: почки, поджелудочная железа, комплекс «почка-поджелудочная железа», сердце, легкое, комплекс «сердце-легкое», печень, эндокринные железы. Количество трансплантационных центров, активно работающих в области пересадки указанных органов, измеряется уже не единицами и десятками и даже не сотнями, а тысячами, и это далеко не предел, поскольку ежегодно в мире в течение последних 5 лет количество таких центров и, соответственно, таких пересадок возрастает на 10-15%. Разумеется, такая динамика характерна не для всех стран в одинаковой степени. Лидируют в этом направлении США, Испания, Португалия и другие страны Западной Европы [32]. К сожалению, к странам, где количество клинических трансплантаций за последние 20 лет сократилось, относятся Россия и большинство независимых государств, входивших ранее в состав СССР. Однако страны Балтии (Латвия, Литва, Эстония) в настоящее время активно участвуют в международных программах обмена органными трансплантатами.

На сегодняшний день в клинической трансплантации как в Российской Федерации, так и в абсолютном большинстве стран с развитой клинической трансплантологией легитимно использование пересадок органов и тканей только от человека к человеку, т.е. аллотрансплантация. В то же время интенсивно ведутся фундаментальные исследования, целью которых является разработка методов использования трансплантатов альтернативного происхождения (т.е. не изъятых из тела сформировавшего человека). Последнее обусловлено острой нехваткой трансплантатов для обеспечения всех реципиентов, входящих в листы ожидания тканесовместимых трансплантатов.

Первое из направлений этих исследований - использование органов животного происхождения, так называемая ксенотрансплантация, имеет длительную историю своего развития, насчитывающую не одно десятилетие [33]. На первоначальном этапе работ, проводимых в этом направлении, основным препятствием для трансплантологов стал тот факт, что общий уровень несовместимости между человеком и животным несравненно выше такового между человеком и человеком и имеет большее количество своих проявлений по сравнению с реакцией несовместимости в аллогенных комбинациях [24]. Тем не менее в силу необходимости поиска новых путей решения проблемы, связанной с острой нехваткой донорских органов и существующей в той или иной степени во всех странах мира, ученые, работающие над фундаментальными проблемами трансплантологии, в определенной степени приблизились, в частности, к решению данной проблемы. Были созданы линии животных - свиней, имеющих относительно более высокий по сравнению с «обычными животными» уровень совместимости с человеком.

Однако в самые последние годы это направление утратило свою актуальность, во всяком случае для клинической трансплантации, в связи с тем, что на сегодняшний день одну из серьезнейших проблем биобезопасности человека представляют вирусы животного происхождения, т.е. обычно не передаваемые от животного к человеку и/или не опасные для человека. Есть все основания для опасения, что при ксенотрансплантации эти вирусы могут попасть прямо из трансплантата в кровоток человека, проникнуть с ним в органы и ткани и там мутировать. Это тем более вероятно, что на сегодняшний день уже зарегистрирован целый ряд возбудителей животного происхождения, которые в результате мутации стали смертельно опасными для человека. Установлено, что к таким заболеваниям относятся коровье бешенство, атипичная пневмония и птичий грипп. Имеет право на существование и точка зрения о том, что к таким заболеваниям относится СПИД. Следует также отметить, что в ряде случаев, например при атипичной пневмонии, мутация вируса происходит уже в организме человека и затем передается другим людям воздушно-капельным путем, что особенно опасно, поскольку может легко привести к развитию эпидемий и пандемий.

С учетом вышесказанного становится ясно, почему международные организации, занимающиеся обеспечением здравоохранения, высказались за введение моратория на клинические трансплантации органов и тканей животного происхождения, не ограничивая фундаментальных исследований в данной области. Отражением этого моратория является соответствующее запрещение трансплантаций органов и тканей животных в странах ЕС, что нашло отражение в международной «Конвенции о защите прав и достоинств человеческих существ в связи с использованием достижений биологии и медицины» [26]. Ведущие отечественные клинические трансплантологи, являющиеся признанными мировыми авторитетами в области ксенотрансплантации, также проявили озабоченность по этому поводу и поддержали эту международную инициативу.

Тем не менее следует отметить, что в ряде стран Южной Америки и Азии сохранилась практика клинических трансплантаций кроличьих клеток, вырабатывающих инсулин, людям, больным диабетом. К сожалению, в списке этих немногочисленных стран упоминается и Россия, где данный вид трансплантации нашел довольно широкое распространение, и в первую очередь в отдаленных регионах страны. Помимо того что данный факт представляет определенную опасность для отечественного и мирового здравоохранения, на международных биоэтических форумах, включая страны ЕС, трансплантация органов животного происхождения уже рассматривалась как одно из проявлений биотерроризма. В качестве борьбы с ним предлагались правовые меры и санкции против стран, допускающих на своей территории данный вид трансплантаций.

Поскольку Россия все больше интегрирует в мировое сообщество как в экономическом, так и в правовом отношении и является одним из активных участников противодействия любым видам терроризма, аналогичный мораторий на ксенотрансплантации был бы целесообразным (хотя бы на уровне подзаконных, а лучше законодательных актов), как это уже имело место в отношении моратория на клонирование человека, действующего на территории России и в настоящее время.

На сегодняшний день в Европе ксенотрансплантация законодательно разрешена только в Польше. Так, об этом говорится в ст. 15 национального закона Польши «Об изъятии и пересадке клеток тканей и органов» [13]. При этом указывается, что ксенотрансплантация может применяться только в лечебных целях. Скорее всего, в этот закон будут внесены соответствующие изменения для ликвидации его противоречий с положениями Конвенции «О защите прав и достоинства человеческих существ в связи с использованием достижений биологии и медицины», соблюдаемой в отдельных государствах ЕС.

Разумеется, этот запрет никоим образом не касается возможности проведения экспериментальных исследований по преодолению межвидового барьера.

Другая возможность появления реальной альтернативы для получения иного, чем органы, извлеченные из организма человека в качестве трансплантата, открылась в самые последние годы, благодаря развитию нового направления медицинской науки - клеточной биотехнологии. Речь идет о возможности искусственного выращивания из стволовых клеток, являющихся родоначальниками клеточных элементов и нормально функционирующих вне связи с организмом, органов и тканей человека, которые затем могут быть использованы для трансплантации. Несмотря на то что исследования, ведущиеся в этом направлении, через определенный период времени, исчисляемый годами или десятилетиями, могут привести к решению технической части этой проблемы, для внедрения этого достижения в практику клинической трансплантации потребуется также решение ряда этических и правовых вопросов. Последние в первую очередь связаны с источником необходимых стволовых клеток. Исходя из существующего в настоящее время в России законодательства, а именно Закона РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека», может быть законодательно обоснованным лишь использование для трансплантации аллогенного костного мозга, т.е. по существу аллогенных стволовых клеток. Вопрос об использовании аутологичных (т.е. собственных) костномозговых кроветворных стволовых клеток ни в Законе РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека», ни в аналогичных национальных законах других государств не рассматривается сейчас и, по-видимому, не будет рассматриваться и далее, поскольку речь о правовых вопросах не идет, а касается лишь медицинских и этических проблем.

Что же касается возможности использования эмбриональных стволовых клеток для выращивания из них тканей и органов, пригодных для трансплантации, то в этом случае вероятность преодоления этических и правовых проблем более чем сомнительна. Последнее объясняется не только резко отрицательной позицией большинства правоведов, представителей всех религиозных конфессий и мирового сообщества в целом, но также и законодательным запретом, существующим во многих отдельных странах и их объединениях, в частности в ЕС. Так, Парламентская ассамблея Совета Европы (рекомендация 1046) уже в 1986 г. ввела ограничения на использование эмбрионов в диагностических, терапевтических, научных, промышленных и коммерческих целях. Вслед за тем в «Конвенции о защите прав и достоинства человеческих существ в связи с использованием достижений биологии и медицины», разработанной в 1996 г. [26] и вступившей в силу 1 декабря 1999 г., и в резолюции Европейского парламента (от 7 сентября 2000 года) было указано, что «манипуляции с зародышевыми клетками человека, как и клонирование человека, является оскорблением публичного порядка и морали» (п.п.Ф преамбулы Резолюции о клонировании человека от 7 сентября 2000 года).

Ряд стран, и в первую очередь Германия, законодательно запретили использование тканей эмбрионов. Так, правовая защита эмбрионов в Германии осуществляется с 1990 г., когда был принят Закон о защите эмбрионов, разрешающий их использование исключительно в целях оплодотворения и на строго определенных условиях (п. 4-7 указанного закона). В параграфе 2 Закона о защите эмбрионов указано, что запрещены продажа эмбрионов и выделение из них стволовых клеток.

В настоящие время на территории стран ЕС действует мораторий на использование эмбриональных тканей человека, включая стволовые клетки, в медицинской практике. В 2004 г. в России при Государственной Думе была создана межведомственная комиссия по подготовке проекта аналогичного правового акта.

Наконец, следует отметить, что бесперспективным является и широко обсуждаемый в средствах массовой информации другой подход к получению полностью тканесовместимого трансплантата, а именно создание клонированного организма, органы и ткани которого были бы наилучшим трансплантатом для человека - источника клонирования. Однако сразу следует сказать, что само по себе клонирование человека запрещено Советом Европы и «в большинстве стран, подписавших Протокол о запрете клонирования человека, введены за такие эксперименты суровые наказания» [16]. В разных странах Европы виновные могут быть приговорены к тюремному заключению на срок от 5 до 20 лет.

В Российской Федерации законодательно введен мораторий на работы в области клонирования человека.

В целом можно сказать, что медико-биологические проблемы, стоящие на пути клонирования человека, а еще в большей степени этические, религиозные, а самое главное - правовые аспекты этой проблемы, вряд ли позволят создать полноценный в биологическом смысле клон человека, и еще менее вероятно, что этот путь окажется когда-либо основным или существенным в практике обеспечения потребностей легальной клинической трансплантологии. Что же касается вероятности того, что эта потребность может быть обеспечена органами и тканями, выращенными из стволовых клеток, то следует отметить следующее. С точки зрения биологии эта задача принципиально решаема только при использовании эмбриональных стволовых клеток, использование которых в России на сегодняшний день запрещено. Помимо этого следует принять во внимание, что трансплантат, выращенный из стволовых клеток эмбриона, должен быть тканесовместимым с реципиентом. Последнее требует создания банка и регистра эмбриональных стволовых клеток, насчитывающего, по крайней мере, десятки тысяч образцов.

Таким образом, можно констатировать, что вышеперечисленные альтернативные направления в области получения органных и тканевых трансплантатов ни в настоящие время, ни на период ближайших десятилетий не смогут, по-видимому, конкурировать с использованием трансплантатов, легально полученных от умерших или живых доноров. В свою очередь, учитывая значение клинической трансплантации для здравоохранения, необходимо преодоление препятствий, стоящих на пути развития этой наиболее передовой области медицинской науки, и в первую очередь это относится к оптимизации правовой базы российского законодательства.

Особенно это касается статей российского Закона РФ «О трансплантации органов и (или) тканей», относящихся к защите прав доноров. Помимо этого необходимо обратить внимание на то, что часть положений данного закона, принятого в 1992 г., а также его более поздних редакций, устарела или недостаточно отражает современное состояние клинической трансплантологии. В частности, это касается вопроса об установлении клинической смерти (Статья 9. Определение момента смерти). В ней отсутствует положение о том, что искусственно поддерживаемая (с помощью специальной аппаратуры) сердечная деятельность не может рассматриваться как признак жизни человека в том случае, если констатирована смерть мозга. Такого рода указание имеется во всех современных зарубежных, включая международные, законах о трансплантации. Именно отсутствие этого положения в Российском законе стало основой того, что в 2004 г. правоохранительными органами было возбуждено уголовное дело по «факту подготовки убийства человека» врачами бригады забора трупных органных трансплантатов. Хотя речь шла именно о ситуации, когда у потенциального донора была констатирована смерть мозга, а деятельность сердца поддерживалась аппаратом искусственного кровообращения. Последняя процедура является необходимым методом сохранения жизнеспособности трансплантата.

Данный случай мог бы рассматриваться как недоразумение, если бы процесс над врачами не длился более 3 лет. Это привело к снижению трансплантационной активности в России в период с 2004 по 2007 г. почти в 10 раз, и сотням больных, ожидающих трансплантаций органов, не было оказано необходимой медицинской помощи, что стало причиной смерти многих из них. Следует напомнить, что неоказание медицинской помощи является нарушением Основ законодательства РФ об охране здоровья от 22 июля 1993 года.

Положительная динамика, выражающаяся в стремительном росте трансплантаций в РФ, начиная с конца 2007 г. по настоящее время, произошла только после прекращения судебного преследования трансплантологов в связи с отсутствием состава преступления в их действиях. Между тем, к сожалению, это никак не отразилось на вышеуказанных положениях российского закона о трансплантации и в принципе подобные ситуации не исключены и в будущем.

В целом, представленные в данном разделе данные еще раз свидетельствуют о том, что от степени тканевой совместимости донора органа и реципиента напрямую зависит эффективность трансплантаций и имеется реальная возможность увеличения процента тканесовместимых пар донор-реципиент в условиях короткого листа ожидания. Таким образом, открывается возможность не только повысить выживаемость трансплантатов, но и реципиентов. Последнее обусловлено тем, что тканевая несовместимость донора и реципиента потенциально ведет к развитию кризов отторжения. Для их купирования требуется значительное усиление иммунодепрессивной терапии. Результатом этого в ряде случаев является развитие инфекционных осложнений, в том числе несовместимых с жизнью. Другим вариантом развития осложнений, несовместимых с жизнью, служат развитие сердечно-сосудистых осложнений, которые также зачастую являются причиной смерти реципиента. Такого рода неблагоприятные исходы относятся к категории так называемых «случаев смерти с функционирующим трансплантатом», т.е. они не рассматриваются как результат тканевой несовместимости донора и реципиента. В действительности это не так, поскольку причиной смерти стали осложнения, возникшие вследствие использования сверхвысоких доз иммунодепрессивных препаратов для купирования реакцией отторжения трансплантата, вызванного тканевой несовместимостью донора и реципиента.

Подводя итог всему вышесказанному, следует отметить следующее. Создается впечатление, что в России, в отличие от других стран, имеющих развитую клиническую трансплантологию, в последние десятилетия многие клинические трансплантологи уделяют все меньше внимания вопросам, связанным с тканевой совместимостью донора и реципиента. Можно также сказать, что прослеживается определенная взаимосвязь с развитием и совершенствованием иммунодепрессивной терапии и определенным пренебрежением к тканевой совместимости. Неизбежным следствием этого является высокая вероятность развития тяжелых осложнений, зачастую приводящих к гибели реципиента с «работающим» трансплантатом. Еще раз следует отметить, что эта ситуация характерна исключительно для России. Между тем приведенные выше данные свидетельствуют о несостоятельности такого подхода, который в конечном счете может еще раз привести к дискредитации клинической трансплантологии в России. При этом следует напомнить, что одним из основных аргументов, выдвигаемых в защиту клинической трансплантологии при обвинениях в ее адрес, в частности, выдвигаемых отечественными СМИ относительно торговли органами, является следующее. При торговле органами по определению невозможен тканесовместимый подбор трансплантата, поскольку эта задача может быть решена только на государственном уровне. Достаточно вспомнить, что так называемый трансплантационный туризм (покупка трансплантатов в странах Юго-Восточной Азии), распространенный в 1970-х годах в ряде стран Европы, полностью прекратился вследствие массовых отрицательных исходов трансплантаций несовместимых органов. Единственным примером торговли органами в Европе являются факты, установленные Парламентской комиссией ЕС на территории Косово в период Балканского конфликта. Однако в этом случае трансплантаты, изъятые у пленных, пересаживали на основании определения тканевой совместимости. Это стало возможным благодаря тому, что данный процесс был организован и осуществлялся под контролем руководства Косово.

Исходя из этого легко можно представить, что такая ситуация в России может трактоваться общественностью России и мировым сообществом трансплантологов, как полный отказ от подбора тканесовместимых органных трансплантатов и создание базы для торговли органами.

В качестве наиболее результативного способа решения данной проблемы представляется гармонизация Российского законодательства, регламентирующего органные трансплантации, с национальными и международными законодательными актами стран с развитой системой здравоохранения [2]. В первую очередь это касается Федерального закона Российской Федерации от 22 декабря 1992 г. № 4180-1 «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (с изм. от 20 июня 2000 г.). В Статье 1 данного Закона «Условия и порядок трансплантации органов и (или) тканей человека» указано: «Операции по трансплантации органов и (или) тканей реципиентам производятся на основе медицинских показаний в соответствии с общими правилами проведения хирургических операций» [19]. Таким образом, речь идет о медицинских показаниях, которые являются основой для проведения любых хирургических операций. Естественно, что при проведении «стандартных» хирургических операций речь о какой-либо роли тканевой совместимости не идет. Таким образом, из данного закона следует, что тканевая совместимость при трансплантации органов и/или тканей не является обязательным условием проведения трансплантации. Совершенно иная картина имеет место в законодательных актах, включая международные, регламентирующие трансплантации в абсолютном большинстве зарубежных стран. Так, в законодательном акте, регламентирующем трансплантацию органов и тканей в странах ЕС, указано следующее: «Органы и ткани должны распределяться согласно медицинским показаниям. Понятие это следует трактовать в самом широком смысле, в свете всех соответствующих профессиональных стандартов и обязательств; оно включает любое обстоятельство, способное повлиять на состояние здоровья пациента, качество трансплантируемого материала или получение трансплантата. Примерами могут служить соображения совместимости органа или ткани с организмом пациента, медицинской безотлагательности, времени, необходимого для транспортировки органа, времени нахождения реципиента на листе ожидания, особые трудности подбора соответствующего подходящего органа для некоторых пациентов (например, в случае высокой иммунной чувствительности или редких характеристик ткани пациента) и ожидаемого результата трансплантации» (Глава II - Общие положения, Статья 3. Система трансплантации. Пункт 37) [11].

Таким образом, из приведенного выше текста следует, что тканевая совместимость донора-реципиента является первоочередным условием среди медицинских показаний при трансплантации органов и/или тканей. Отсутствие указанного условия в Законе РФ «О трансплантации органов и/или тканей» фактически позволяет официально трансплантировать тканенесовместимые органы и/или ткани, что, как в частности, следует из данной работы, резко снижает выживаемость как трансплантата, так и реципиента. Следует также отметить следующее: именно необходимость тканевой совместимости между донором и реципиентом является основным препятствием для различных видов криминальных трансплантаций, в том числе для трансплантационного туризма. В целом ясно, что отказ от подбора тканесовместимых пар донор-реципиент должен быть законодательно запрещен, в том числе в связи с тем, что существующая в России ситуация может иметь коррупционную составляющую. Наиболее целесообразным является гармонизация Закона РФ «О трансплантации органов и (или) тканей» с международным законодательством.

Сотрудниками Института иммунологии совместно с Московским координационным центром органного донорства и Институтом государства и права РАН опубликована серия работ и разработаны представления для МЗ РФ по обоснованию необходимости использования тканесовместимых (в первую очередь по HLA-DRB1-специфичностям) трансплантатов. 31 августа 2012 г. МЗ г. Москвы приняло соответствующее решение, обязательное для исполнения в организациях здравоохранения г. Москвы.

Следует также отметить, что представленные в настоящей работе данные позволяют решить проблему поиска тканесовместимых пар донор-реципиент в условиях «короткого» листа ожидания, что чрезвычайно актуально для современного социально-экономического уровня России. Вместе с тем этот опыт может оказаться востребованным и для стран, в которых, в отличие от России, используются национальные и международные листы ожидания трансплантата.

Трансплантация КСК/КМ в настоящее время - одно из наиболее быстроразвивающихся направлений современной клинической медицины, которое вобрало в себя последние достижения гематологии, биотехнологии, иммунологии и фармакологии. Пересадка костного мозга помимо того, что она является радикальным методом лечения ряда онкогематологических заболеваний и иммунодефицитных состояний, в последние годы начинает применяться при лечении онкологических заболеваний различной локализации и тяжелых аутоиммунных заболеваний.

По количеству трансплантаций, выполненных в мире, пересадка кроветворных стволовых клеток (КСК) или, как было принято ранее называть данный вид трансплантации - пересадка костного мозга (КМ), вышла на второе место вслед за пересадкой почки, о чем, в частности, свидетельствуют данные анализа работы более 500 трансплантологических центров Европы [50]. Следует особо отметить, что пересадка КСК является на сегодняшний день в России единственным легитимным видом трансплантации чужеродных (аллогенных) стволовых клеток человека [14].

Трансплантация КСК, проведенная в целях восстановления функций иммунной и гемопоэтической систем - лечения неопластических заболеваний, является одним из основных достижений клинической медицины за последние 30 лет.

Уже в первых экспериментальных исследованиях было установлено, что пересадкой костного мозга может обеспечиваться противорадиационная защита, и далее было установлено, что протективный эффект опосредован пересадкой живых клеток и индукцией толерантности организма к ним. Следующий этап датируется с 1968 г., когда начались клинические трансплантации костного мозга. Первоначально трансплантация КМ была проведена в целях коррекции тяжелого комбинированного иммунодефицитного состояния (SCID - Severe Combined ImmunoDeficiency) и синдрома Wiscott-Aldrich [37]. Результаты исследований свидетельствовали о возможности восстановления иммунной системы посредством трансплантации клеток аллогенного гистосовместимого костного мозга у больных тяжелыми (смертельными) формами иммунодефицитов.

Первые обобщенные материалы в этом направлении были представлены Международным регистром трансплантатов костного мозга медицинского колледжа Висконсина, где с 1972 по 1995 г. были собраны данные из более 300 трансплантационных центров мира. Указанная база данных содержит информацию приблизительно о 40% трансплантаций аллогенного КМ (от неродственных доноров), проведенных в мире за период с 1970 по 1995 г. В соответствии с этими данными, в 1985 г. процент трансплантаций от неродственных доноров от общего числа трансплантаций КМ составил только 1-2%, тогда как в 1995 г. данный показатель возрос уже до 25%. Широкомасштабное использование этого подхода стало возможным в начале 1990-х годов после перехода метода селекции пар донор-реципиент при пересадках КСК на молекулярно-генетический уровень.

В последующие годы процент трансплантаций КСК от неродственных доноров неуклонно возрастал, и в настоящее время общее количество трансплантаций КСК/КМ от неродственных доноров в большинстве стран мира превышает таковой от родственных доноров, что обусловлено следующим.

В отличие от ситуации с органными трансплантатами, где в значительном проценте случаев достаточна селекция по HLA-DRB1-специфичностям на уровне низкого или среднего разрешения, при подборе доноров КСК/ КМ неродственного происхождения абсолютно необходим подбор донора на уровне отдельных аллельных вариантов генов HLA, общее количество которых в системе HLA превышает 10000 (рис. 2.1, см. цв. вклейку). Родственные трансплантации в большинстве случаев не могут обеспечить полной совместимости донора и реципиента. В то же время неродственные доноры, объединенные в многомиллионные регистры, позволяют по крайней мере в 80% случаев подобрать полностью HLA-совместимую пару донор-реципиент.

Это достижение обусловлено тремя взаимосвязанными обстоятельствами. Во-первых, благодаря переходу на молекулярно-генетические методы подбора пар донор-реципиент по генам главного комплекса гистосовместимости резко возросла эффективность возможности подбора тканесовместимых пар. Во-вторых, были организованы региональные, национальные и международные регистры неродственных доноров-добровольцев КСК/ КМ, что, в свою очередь, позволило реализовать саму возможность подбора тканесовместимых пар донор-реципиент. В-третьих, вышеуказанные обстоятельства позволили обеспечить более высокую эффективность трансплантаций (выживаемость больных) по сравнению с пересадками от родственных частично совместимых доноров КСК/КМ.

Вышеперечисленные достижения в области пересадки КСК/КМ от неродственных доноров, объединенных в многомиллионные национальные и международные регистры (общее количество неродственных доноров-добровольцев в них превышает 18 млн человек), позволяют сегодня государствам, являющимся членами международных регистров, не только решать такую животрепещущую проблему здравоохранения, как лечение онкогематологических заболеваний и тяжелых иммунодефицитных состояний, но и быть готовыми к проведению эффективных лечебных мероприятий в случае техногенных катастроф, террористических актов или военных действий, сопряженных с химическим и радиационным поражением кроветворной и иммунной систем организма среди значительных контингентов мирного населения или военнослужащих. При этом следует иметь в виду, что пересадка КСК/КМ может оказаться единственным способом спасения пострадавших как сразу после поражения, так и в отдаленные сроки, поскольку воздействие радиации или химических веществ в сублетальных дозах, тем не менее, может вести к развитию в отдаленные сроки сердечно-сосудистых, а также онкогематологических заболеваний, в первую очередь лейкозов, единственным эффективным способом лечения которых также является пересадка тканесовместимого КСК/КМ. В связи с этим существенным стимулом для развития клинической трансплантации КСК стали соображения государственной биобезопасности. Не случайно в США, где финансирование данных исследований осуществляется за счет военно-промышленных ведомств, имеется самый многочисленный в мире национальный регистр доноров-добровольцев КСК - более 8 млн человек, что позволяет осуществлять эффективный подбор тканесовместимых пар донор-реципиент не только на международном, но и на национальном уровне независимо от всемирного регистра КСК.

Естественно, что до конца 1980-х годов, т.е. до перехода на молекулярно-генетический уровень генотипирования, возможности HLA-селекции в принципе не позволяли осуществить подбор действительно HLA-совместимых неродственных доноров, и пересадка неродственных КСК для восстановления собственной системы кроветворения была малооправданным мероприятием.

В настоящее время в распоряжении клиницистов, работающих в гематологических центрах развитых стран, имеется возможность использования совместимого КСК/КМ из международных и национальных регистров КСК/ КМ. Естественно, что это в значительной степени повышает надежность и расширяет возможности использования КСК/КМ для 80% пациентов [49].

К сожалению, отечественные специалисты имеют ограниченный опыт трансплантации КСК/КМ от неродственных HLA-совместимых доноров. В большинстве случаев речь идет о пересадках КСК/КМ или от родственных доноров, или от частично совместимых неродственных доноров. Россия во Всемирном регистре доноров-добровольцев (ВАДКМ, англ. WMDA) представлена чисто формально, поскольку на территории России до настоящего времени не существует национального регистра неродственных доноров-добровольцев, соответствующего ВАДКМ, что исключает возможность прямого контакта с Всемирным регистром. В результате немногочисленные трансплантации неродственных КСК осуществляются на основании соглашений с национальными или частными регистрами, в первую очередь расположенными на территории Германии. Однако большая часть отечественных реципиентов неродственных КСК вынуждена осуществлять трансплантации за рубежом на коммерческой основе, в том числе за счет квот Минздрава России.

В целях решения проблемы организации службы трансплантации КСК/ КМ, полученных от неродственных доноров-добровольцев, основой является организация гематологических центров, участвующих в программах трансплантации неродственных КСК, для типирования доноров-добровольцев и лиц, нуждающихся в пересадке КСК/КМ по генам тканевой совместимости человека (HLA) на уровне, достаточном для обеспечения предотвращения развития реакций «трансплантат против хозяина» и «хозяин против трансплантата». Под достаточным уровнем понимается уровень, соответствующий стандартам Всемирной ассоциации доноров костного мозга (ВАДКМ). Регистр включает в себя только неродственных доноров-добровольцев, хотя на первый взгляд кажется естественным, что оптимальной должна быть трансплантация КСК/КМ от родственников.

Такого рода мнение имело право на существование до того момента, когда HLA-типирование перешло с серологического метода, позволявшего выявлять не более 138 HLA-специфичностей (что совершенно недостаточно для подбора донора) на молекулярно-генетический вариант, при котором выявляется уже более 8000 аллельных вариантов. Что касается принципиальной возможности использования для трансплантации КСК/КМ от родственных доноров, следует принять во внимание следующее. Тип наследования HLA-антигенов носит кодоминантный характер, при котором каждый человек получает по половине «своего» HLA-генотипа от каждого из родителей. Иначе говоря, из каждого локуса, кодирующего два HLA-антигена, один наследует от отца и один от матери, и поэтому в абсолютном большинстве случаев родители не могут быть полностью HLA-совместимыми со своими детьми. И речь может идти лишь о том, что донор и реципиент тканесовместимы на 50%, что недопустимо по стандартам ВАДКМ. Между сиблингами (братьями и сестрами) 100% вероятность совместимости может быть только в случае однояйцовых близнецов, а среди прочих она составляет 25%. Если же речь идет о многодетных семьях, то в этих случаях пересадка КСК/КМ может быть весьма перспективной. Однако в ряде стран, в том числе и в России, большие семьи имеются только в отдельных этнических группах. Основная же масса семей имеют только одного или двух детей.

Следует отметить, что по международным данным (анализ 605 трансплантологических групп Европы) в настоящее время в мире в 90% родственных трансплантаций КСК/КМ проводятся при полной HLA-совместимости между донором и реципиентом (табл. 4.3).

Таблица 4.3. Страны, имеющие наиболее объемные регистры неродственных доноров-добровольцев

Под полной HLA-совместимостью в настоящее время понимается минимально необходимый в соответствии со стандартами ВАДКМ уровень совместимости по генам HLA класса I (локусы A, B, C); HLA класса II, генов DR1, DQB1. Желательна совместимость по генам HLA-DPB1 (класс II) и -MICA (класс I). Вероятнее всего, совместимость по двум последним генам в ближайшее время будет также признана необходимой.

На первый взгляд цифра 90% идентичности между сиблингами (братья, сестры) маловероятна, но дело в том, что в действительности речь идет о том, что в ряде развитых стран Европы значительный процент населения составляют иммигранты, имеющие большие семьи, что и позволяет повысить вероятность нахождения полностью идентичных пар донор-реципиент. Эта ситуация не типична для большинства регионов России. Для нее, как и для коренного населения большинства европейских стран, наиболее приемлемым путем решения проблемы трансплантации КСК/КМ является использование трансплантатов неродственного происхождения.

На рис. 4.2 (см. цв. вклейку) представлены сравнительные данные об эффективности, оцениваемой по годовой и 5-летней выживаемости при родственных и неродственных трансплантациях, при различном уровне HLA-совместимости донора и реципиента (международные данные).

Как следует из представленных данных, эффективность пересадки в комбинации HLA-идентичных гомозиготных близнецов практически соответствует таковой при пересадке от HLA-идентичного КСК/КМ. В то же время пересадка КСК/КМ в неродственной комбинации с наличием 1-2 несовпадений при 18-19 совпадениях значительно превосходит эффективность при совместимости по HLA-специфичностям, расположенным на одной хромосоме (пересадка от родителей). Следует принять во внимание, что именно последний вид родственных трансплантаций, никоим образом не соответствующий стандартам ВАДКМ, является наиболее распространенным в России.

Что касается представленных на рис. 4.2 (см. цв. вклейку) данных о родственных и неродственных трансплантациях при 1-2 несовпадениях из 20, то в данном случае результаты практически аналогичны.

Таким образом, с учетом полиморфизма системы HLA вероятность совместимости двух неродственных индивидуумов по такому количеству генов варьирует от 1 на 3 000000 до 1 на 7 000000 в зависимости от этнической принадлежности донора и реципиента. Оптимальным является поиск внутри одной этнической группы. Решение проблемы поиска совместимого донора состоит в организации больших национальных и международных регистров.

Процесс организации международных регистров начался в 1986 г. Национальной программой донорства костного мозга (NMDP - National Marrow Donor Program, USA), утвержденной Конгрессом США. В настоящее время в эту программу вовлечены более 7 млн доноров-добровольцев (см. табл. 4.3), что позволяет осуществлять ежегодно более 10 тыс. пересадок КСК/КМ в США.

Всемирная ассоциация доноров костного мозга (ВАДКМ) объединяет:

20 423 865 - текущее число неродственных доноров-добровольцев и образцов пуповинной крови в базе:

Другим крупнейшим регистром КСК/КМ является Европейский регистр доноров-добровольцев КСК/КМ со штаб-квартирой в г. Лейдене (Нидерланды). Этот регистр объединяет национальные и иные центры и регистры стран Евросоюза. Под иными центрами подразумеваются независимые регистры КСК/КМ, созданные, как правило, государственными или международными научными центрами. Все эти центры участвуют в международных программах обмена КСК/КМ в рамках работы международных регистров. Общее количество доноров-добровольцев во всех центрах мира превышает 19 млн человек.

В ряде государств Восточной Европы (Чехия, Венгрия, Болгария, Польша) созданы регистры КСК/КМ, которые по своему уровню могут быть включены в международные регистры. (Данные о наиболее активно работающих национальных регистрах приведены в табл. 4.3.)

Следует отметить, что указанный выше объем международных регистров доноров-добровольцев не является окончательным и в течение каждого года имеет место его значительное пополнение (на миллион и более доноров-добровольцев). Столь эффективная деятельность международных регистров обеспечивается тем, что начиная с 1980-х годов была создана и к настоящему времени усовершенствована четкая и строгая организация как самих международных регистров, так и национальных, а также так называемых независимых регистров.

Как указывалось, руководящую роль выполняет Всемирная ассоциация доноров костного мозга (ВАДКМ) - международная некоммерческая организация, которая осуществляет разработку и стандартизацию этических, технических, медицинских и финансовых аспектов трансплантации кроветворных стволовых клеток от доноров-добровольцев в каждой из стран, безвозмездно предоставляющих КСК неродственным больным в других странах.

Регистр - это национальная или независимая организация, чьей обязанностью является обработка запросов из учреждений, расположенных внутри страны или присланных из зарубежных центров, на КСК, включая пуповинную кровь, от неродственных доноров больным. Регистр должен координировать деятельность трансплантационного центра и донорских служб в данной стране. Деятельность независимых регистров координирует национальный центр. Для участия в международном обмене в рамках ВАДКМ необходима соответствующая аккредитация регистра. Также необходима аккредитация генотипирующей лаборатории вне зависимости от того, является ли она составной частью регистра или независима от него. Национальный регистр должен гарантировать перед ВАДКМ неукоснительное соблюдение стандартов ВАДКМ нижеуказанными структурами, участвующими в обеспечении процесса трансплантации КСК (среди основных стандартов ВАДКМ выделяют безвозмездность и добровольность донорства).

В ВАДКМ входят следующие структуры.

Донорский центр, являющийся организацией, ответственной за привлечение волонтеров, координацию и обследование перспективного донора. Центр проводит краткосрочное и долгосрочное диспансерное наблюдение за здоровьем взрослого донора-добровольца, предоставившего КСК.

Банк пуповинной крови - это донорский центр, чьей единственной миссией является сбор и хранение КСК, выделенной из пуповинной крови.

Центр сбора включает в себя медицинские помещения и медицинское оборудование, с их помощью происходит сбор гематопоэтических стволовых клеток. Сбор может включать выделение КСК из крови и забор костного мозга. Центр сбора проводит медицинское обследование донора и предоставляет окончательное заключение о пригодности донора. Если пуповинная кровь собрана, Центр ответствен за обработку и хранение единиц пуповинной крови. Центр сбора упаковывает образцы КСК для перевозки в Трансплантационный центр.

Подразделение обработки клеток является частью медицинской лаборатории, где проводится работа с гематопоэтическими стволовыми клетками, предшествующая трансплантации, в целях создания необходимого клеточного состава и соответствующей концентрации в трансплантате.

Трансплантационный центр объединяет медицинские помещения и оборудование, в Трансплантационном центре больной (реципиент) получает трансплантат КСК, выделенный от неродственного донора или из пуповинной крови. Центр следит за оказанием немедленной медицинской помощи и обеспечивает долгосрочное наблюдение за реципиентом. Внутри Трансплантационного центра может существовать так называемое поисковое звено, которое предпринимает поиск неродственного донора для конкретных больных по критериям, разработанным и запротоколированным Трансплантационным центром в соответствии со стандартами ВАДКМ. Данное звено может функционировать отдельно от Трансплантационного центра. Если поисковое звено независимо, то оно может координировать поиск для одного или нескольких Трансплантационных центров.

Трансплантационный центр/поисковое звено осуществляет поиск донора за рубежом через регистр, находящийся в данной стране.

Генотипирующая и генодиагностическая лаборатория сертифицирована и аккредитована при ВАДКМ (WMDA) или Европейской Федерацией иммуногенетики (ЕFI), Американским обществом по тканевой совместимости и имммуногенетике (ASHI), Ассоциацией стран Юго-Восточной Азии (ASEATTA) или же агентством со схожими стандартами и процессом аккредитации.

Данные лаборатории проводят тесты на совместимость, группу крови, инфекционные заболевания и пр. перспективных доноров и больных. Они могут находиться под руководством Регистра или же быть независимыми.

Следует отметить, что в настоящее время в России существует большая часть требуемых структур. Исключением является отсутствие самого национального регистра, для создания которого, в соответствии с требованиями ВАДКМ, необходимо проведение существенной организационной работы, а также выделение значительных бюджетных средств, как на период создания регистра, так и на весь срок его существования в виде ассигнования определенных бюджетных средств.

Несмотря на то что, как указывалось выше, история развития пересадки костного мозга в клинических целях насчитывает уже не одно десятилетие, в последние годы произошли существенные изменения, связанные не только с новыми возможностями селекции тканесовместимых пар донор-реципиент, но и с новыми возможностями получения кроветворных стволовых клеток человека. При этом изменилась и сама терминология, и, как правило, в научных статьях, клинических протоколах и законодательных актах, регламентирующих клиническую трансплантацию, в большинстве стран употребляется термин «кроветворные стволовые клетки» с указанием (если требуется) их источника. Последнее обусловлено тем, что такого рода источником, помимо костного мозга, могут служить периферическая кровь и пуповина новорожденного. При этом еще раз следует подчеркнуть, что во всех трех случаях речь идет об одном и том же «действующем начале», обусловливающем клинический эффект трансплантации КСК.

Вследствие этого, как указывалось ранее, термин «трансплантация КСК» в большинстве соответствующих законодательных актов заменен на термин «трансплантат костного мозга». Необходимо также отметить, что, несмотря на это, по сути, терминологическое изменение, в абсолютном большинстве стран, где в законодательных актах используется термин КСК, данный вид пересадок регламентируется Законом «О трансплантации органов и (или) тканей человека», и именно так он сформулирован и в законодательстве России. Одним из немногих исключений является законодательство Германии, где трансплантация КСК регламентируется Законом о переливании крови. Это различие является достаточно принципиальным, поскольку в первом случае необходимо соблюдать принципы, принятые ООН и ВОЗ, о безвозмездности и добровольности донорства органов и тканей. Эти принципы неукоснительно соблюдаются международными регистрами безвозмездных доноров-добровольцев. В то же время Закон о переливании крови, регламентирующий трансплантацию КСК в Германии, является значительно более либеральным относительно безвозмездности данного вида донорства. В результате в Германии в настоящее время имеется входящий в ВАДКМ национальный регистр, который является одним из крупнейших в Европе (см. табл. 4.3). В то же время в Германии есть несколько регистров, полностью независимых от данного регистра и формально не сотрудничающих с ВАДКМ, поскольку они не выполняют основного стандарта ВАДКМ - безвозмездность доноров КСК. Естественно, эти регистры значительно уступают национальному регистру Германии по своему объему, их деятельность фактически носит коммерческий характер, причем основная часть доноров и реципиентов КСК, входящих в эти регистры, не является гражданами Германии. Наличие в Германии этих регистров никоим образом не влияет на деятельность национального регистра страны, сотрудничающего с ВАДКМ в обеспечении граждан Германии, нуждающихся в трансплантации, тканесовместимыми КСК от безвозмездных неродственных доноров-добровольцев.

К сожалению, в настоящее время некоторые руководители крупных гематологических центров России настаивают на изменении существующего национального законодательства, регламентирующего трансплантацию КСК в России. Предлагается исключить регламентирование трансплантаций КСК из Закона РФ «О трансплантации органов и/или тканей человека» в существующей редакции и включить данное регламентирование в Закон о крови (Федеральный закон «О донорстве крови и ее компонентов»). Результат такого изменения в законодательстве РФ очевиден. Поскольку в настоящее время в России, в отличие от Германии, отсутствует соответствующий стандартам ВАДКМ национальный регистр безвозмездных неродственных доноров-добровольцев, а под эгидой Закона о крови развитие получит как безвозмездное, так и возмездное донорство, что не позволит России участвовать в международном обмене тканесовместимыми трансплантатами КСК, проблема трансплантации КСК в нашей стране не сможет найти своего решения. Тем самым будет нанесен значительный ущерб как здравоохранению России, так и ее биобезопасности.

Примечательно, что сторонники включения регламентирования клинических трансплантаций КСК в Закон о крови вместе с тем настаивают на отсутствии необходимости создания национального регистра КСК, отвечающего требованиям ВАДКМ. Вместо этого предлагается создать в качестве регистра организацию, единственная функция которой сводится к сбору, объединению и хранению информации о донорах КСК, имеющейся в различных центрах, занимающихся клинической трансплантацией КСК. Последнее сделает невозможным сотрудничество по обмену тканесовместимыми трансплантатами, включая участие в ВАДКМ.

Что касается современной структуры источников КСК, наиболее наглядным, на наш взгляд, могут являться обобщенные данные, представленные 605 трансплантационными центрами Европы, входящими в ВАДКМ. Суммарные данные приведены в табл. 4.4.

Таблица 4.4. Обзор статистических данных по пересадкам костного мозга/стволовых клеток в 2006 г. Количество центров: 605.

Как следует из табл. 4.4, количество родственных пересадок превышало неродственные.

Количество идентичных родственных пересадок почти в 10 раз превышало количество HLA-неидентичных. На этот факт надо обратить особое внимание. Дело в том, что вероятность HLA-идентичности на уровне сиблингов (братьев, сестер) не превышает 25%.

Необходимо отметить, что представленные в табл. 4.4 данные свидетельствуют о весьма незначительном количестве пересадок в HLA-неидентичных комбинациях родственников. Это важно, поскольку именно данный вид трансплантаций КСК/КМ является распространенным в России.

Анализ структуры источников КСК свидетельствует о том, что во всех анализируемых комбинациях процент трансплантатов костного мозга не превышал 30% от количества трансплантатов КСК, выделенных из периферической крови.

Как следует из табл. 4.4, процент пересадок КСК, выделенных из пуповины, в обеих группах родственных трансплантаций не превышал единицы. Что касается неродственных трансплантаций, то в этом случае процент пересадок пуповинной крови не превышал 10. Несмотря на то что КСК, выделенные из пуповины, являются в настоящее время наименее востребованными в клинической практике, исследования в этом направлении имеют значительные перспективы. Что касается настоящего времени, то ограниченность использования данного подхода в клинической практике обусловлена следующим. На первый взгляд пуповинные КСК имеют определенные преимущества, и в первую очередь это простота получения кроветворных стволовых клеток как в техническом, так и в правовом отношении, поскольку процедура не требует рекрутирования добровольных безвозмездных доноров (во всяком случае на уровне существующих правовых норм). Однако следует иметь в виду, что количество КСК, выделяемых из пуповины, относительно ограничено. Для «полного замещения» собственных КСК реципиента и восстановления функций кроветворной и иммунной систем организма, количества КСК, выделенных из одной пуповины, достаточно лишь для детей в пределах 12-14 лет. Естественно, что при лечении детского контингента больных онкогематологическими заболеваниями и тяжелыми формами иммунодефицитных состояний, этот подход весьма перспективен. Однако он, по-видимому, не сможет в ближайшее время решить проблему трансплантации КСК для взрослых больных. Следует также отметить, что в настоящее время сам вопрос о сравнительной эффективности КСК, выделенных из периферической крови и костного мозга, с одной стороны, и пуповины, с другой, является предметом интенсивных исследований и научных дискуссий, проводимых в том числе на всех международных научных форумах, посвященных различным аспектам трансплантации КСК. Тем не менее целесообразность создания банков КСК, выделенных из пуповинной крови, представляется несомненной по двум причинам. О первой было сказано выше, второй является стремительный прогресс клеточных технологий в области изучения возможностей использования стволовых клеток, в том числе КСК, в различных областях клинической медицины.

Следует также отметить, что необходимым этапом в работе КСК банков является генотипирование хранящихся клеток, что позволит избежать случайных ошибок. Только контроль по генам главного комплекса тканевой совместимости реципиента и вводимых КСК может предотвратить данные ошибки, которые могут привести к летальному исходу и создать серьезные проблемы для администрации указанного банка.

Что же касается сегодняшних данных об интенсивности трансплантаций КСК, выделенных из пуповинной крови, можно констатировать следующее.

В группах трансплантаций от родственников их доля не превышала 1%. Среди неродственных трансплантаций их процент составил 10,8%. Таким образом, средний показатель количества проведенных трансплантаций КСК составил 5,27%. Это не позволяет говорить о существенном росте клинической активности в данном секторе трансплантаций КСК.

К сожалению, Россия до настоящего времени не только не имеет возможности активно участвовать в таком международном анализе, но и не может безвозмездно пользоваться, как это делают страны, входящие в Международный регистр, КСК/КМ. Это происходит потому, что в России до настоящего времени не создан национальный регистр, соответствующий стандартам ВАДКМ, включающий регистр генотипированных доноров-добровольцев, готовых безвозмездно предоставить в случае необходимости свой КСК/КМ в качестве трансплантата. Как результат в России практически не проводится пересадок от полностью совместимых неродственных доноров. И это имеет место при ситуации, когда онкогематологические заболевания, особенно детские, являются одной из самых серьезных проблем российского здравоохранения.

Заменой отсутствия полноценного национального регистра в России является так называемая квота на финансируемые государством трансплантации КСК за пределами России. Естественно, это не может решить проблему трансплантации КСК на уровне государства в целом.

Между тем в самые последние годы, благодаря развитию иммунобиотехнологии и внедрению ее последних достижений в практическую медицину, возможности использования трансплантации КСК/КМ в плане обеспечения биологической безопасности населения резко возросли. Дело в том, что в ведущих трансплантационных центрах мира удалось добиться блестящих результатов при трансплантациях тканесовместимого КСК/КМ совместно с органной трансплантацией. Таким образом, больным с различными формами и локализацией далеко зашедшего онкологического заболевания удается заменить пораженный орган или органы и одновременно с этим «заменить», благодаря пересадке КСК/КМ, неэффективную иммунную систему новой, способной активно бороться с раковыми клетками, но быть биобезопасной для организма реципиента. Такого рода операции, способные спасти жизнь безнадежным онкологическим больным, проводятся все чаще. Так, например, во Франции за 3 года выполнено около 100 операций пересадки легких с одновременной пересадкой КСК/КМ. Данное направление уже используется за рубежом при лечении рака желудка, почек, печени и других органов.

Таким образом, Россия является одним из немногих государств мира, где проблема трансплантации КСК/КМ никоим образом не может считаться разрешенной. Это связано с целым рядом проблем, в первую очередь социально-экономического и правового порядка, которые тормозят развитие этого важнейшего для биобезопасности России направления клинической медицины.

На сегодняшний день из всего многообразия стволовых клеток человека единственным легитимным и, соответственно, распространенным в лечебной практике большинства стран мира видом использования стволовых клеток является пересадка кроветворных стволовых клеток или, как ранее было принято называть данный вид трансплантации, пересадка костного мозга. Пересадка КСК/КМ - единственное лечебное мероприятие, позволяющее восстанавливать деятельность кроветворной и иммунной систем, утративших свою «нормальную» функцию в результате медикаментозного (при лечении онкогематологических заболеваний) или же техногенного (при химическом или радиационном поражении) воздействий [60]. Данный вид пересадок как за рубежом, так и в России законодательно регулируется соответствующими правовыми актами. Так, в Российской Федерации трансплантация КМ регулируется Законом РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (№ 4180-1, 1992 г.). При этом следует подчеркнуть, что, согласно отечественному и международному законодательствам, пересадка КСК/КМ является единственным видом трансплантации, для которой разрешены пересадки от генетически неродственных доноров-добровольцев (т.е. живых лиц) [14], в то время как органные трансплантации от генетически неродственных лиц, согласно российскому законодательству, допускаются лишь от посмертных доноров. Что касается пересадки других видов стволовых клеток (т.е. не относящихся к кроветворным клеткам), то на сегодняшний день, согласно российскому законодательству, она может осуществляться только в экспериментальных, но не клинических целях. При этом особо следует отметить, что даже если пересадка иных, чем КСК, стволовых клеток станет легитимной для клинического использования в Российской Федерации для диагностических и лечебных целей, наиболее значимой останется именно трансплантация КСК/КМ, как это имеет место в странах, активно занимающихся трансплантацией КСК. При этом следует отметить, что в данных странах проблема пересадки КСК/КМ рассматривается как одна из приоритетных проблем национальной биобезопасности [18].

Учитывая тот факт, что в настоящее время одним из приоритетных направлений развития медицинской науки является медицинская биотехнология, включая молекулярную медицину и клеточную терапию, есть все основания надеяться, что Россия наконец войдет в число стран, являющихся членами международных регистров безвозмездных доноров-добровольцев КСК, что позволит спасти жизни многих тысяч россиян.

Заключая данный раздел, следует отметить, что в настоящее время клиническая трансплантология во всем мире является одним из наиболее быстро развивающихся направлений клинической медицины. Данное направление вобрало в себя последние достижения молекулярной, клеточной медицины и иммуногенетики человека, благодаря которым более 700000 человек живут с пересаженными органами и около 100000 с полностью тканесовместимыми, но чужеродными кроветворными стволовыми клетками. Основой тканевой совместимости является подбор донора по генам главного комплекса тканевой совместимости человека (HLA). HLA является наиболее генетически полиморфной системой человека, поэтому вероятность случайной полной совместимости равна 1 на 3 000000.

Для России характерно отставание в указанной области медицины, это обусловлено не медицинскими, а правовыми, социальными и организационными проблемами безвозмездного донорства. Без преодоления этих проблем, решенных в большинстве стран более 20 лет назад, не может быть решен и вопрос подбора тканесовместимых доноров. Это, в свою очередь, делает Россию единственной из развитых стран мира, где этот вопрос, который является одним из ключевых не только для здравоохранения, но и для биобезопасности страны, не нашел своего решения.

Период работы над этой монографией совпал с началом официального обсуждения разработанного и представленного Минздравом РФ в Государственную Думу проекта нового законодательного акта, регламентирующего клиническую трансплантологию в России. В случае утверждения и принятия этого закона, поименованного как Федеральный закон «О донорстве органов, частей органов человека и их трансплантации (пересадке)», отменяется действие существующих на сегодняшний день законодательных актов, включая Закон РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека». Федеральный закон «О трансплантации органов и (или) тканей человека» от 22.12.1992 года в последней редакции от 29.11.2007 года по настоящее время является правовым актом, регулирующим в РФ клиническую трансплантацию как органов, так и костного мозга (КМ), точнее, кроветворных стволовых клеток (КСК) [14, 27-29].

В предлагаемом для обсуждения в Госдуме законодательном акте содержатся предложения и статьи, посвященные регулированию исключительно трансплантации органов и никоим образом не касающиеся правовых аспектов трансплантации КМ/КСК.

Таким образом, трансплантация костного мозга после принятия нового правового акта полностью исключается из правового поля здравоохранения, т.е. регламентируется только трансплантация органов, а трансплантация КМ/КСК становится юридически нелегитимной и должна быть запрещена в России, поскольку приостановление действия предыдущего законодательного акта, регулирующего трансплантацию КМ/КСК, лишает этот вид трансплантации правового обоснования.

В целом принятие представленного на обсуждение проекта ФЗ «О донорстве органов, частей органов человека и их трансплантации (пересадке)» обрекает на гибель тысячи больных из числа детского и взрослого контингента, нуждающихся в ургентной трансплантации КМ/КСК по жизненным показаниям [8, 20, 21] и отбрасывает российское здравоохранение на уровень наиболее отсталых стран третьего мира, единицы из числа граждан которых могут позволить себе данный вид лечения за рубежом [43, 46, 51, 63].

Иначе говоря, принятие проекта Федерального закона «О донорстве органов, частей органов человека и их трансплантации (пересадке)» может привести к серьезным проблемам в данной области клинической медицины в целом [1, 4, 5].

Что касается обоснованности содержащихся в проекте ФЗ «О донорстве органов, частей органов человека и их трансплантации (пересадке)» предложений, касающихся рассматриваемого в нем правового регулирования органных трансплантаций, то следует отметить следующее. Прежде всего, неясна сама по себе позиция авторов проекта закона - на каком из принципов донорства построен закон, а именно: идет ли речь о модели испрошенного или подразумеваемого согласия доноров [1, 6, 7].

Предлагаемый проект Федерального закона «О донорстве органов, частей органов человека и их трансплантации (пересадке)» помимо негативных последствий, связанных с правовой коллизией [31, 70, 71], в результате которой в России будут прекращены трансплантации КМ/КСК, нанесет существенный вред и органной трансплантации. Это объясняется следующими имеющимися в нем неясностями и противоречиями, которые также негативно скажутся на органных трансплантациях в России [18, 19, 39].

Прежде всего, это касается отсутствия в законе прямого указания на то, какая из моделей органного донорства лежит в основе клинической трансплантации в России. Как известно, существуют две модели. Первая модель - испрошенного согласия, подразумевающая наличие прямого прижизненного согласия донора (в том или ином виде) на использование его органов после его смерти. Вторая модель - подразумеваемого согласия донора, когда отсутствие запрета в том или ином виде на посмертное использование его органов подразумевает его прижизненное согласие [39, 52].

Клиническая трансплантология КМ/КСК лишается законодательного регулирования на уровне Федерального правового акта. Последнее является не только беспрецедентной ситуацией для современного международного права, но может на определенное время создать правовую коллизию, поскольку исчезнет сама правовая основа данного вида трансплантаций [45, 48, 59].

Все это может привести как к временному, так и к постоянному прекращению трансплантаций КМ/КСК в России.

Действующий в настоящее время в России закон, приятый в 1992 г., основан на модели подразумеваемого согласия, что является единственным приемлемым принципом для существования трансплантации органов в нашей стране [14]. Этот же принцип используется в настоящее время в целом ряде стран [41, 44, 51].

Использование модели испрошенного согласия требует тщательной подготовительной работы, в том числе разъяснения и пропаганды донорства среди широких масс населения и осуществления мероприятий, направленных на форму волеизъявления донора, которая сделала бы возможным получение информации о характере волеизъявления потенциального донора в кратчайшие сроки [19].

Так, например, каждый гражданин Австрии, который не согласен с тем, чтобы его органы были трансплантированы, должен заранее эту информацию поместить на определенном интернет-сайте.

В Статье 5 «Основные принципы донорства органов и их трансплантации» проекта ФЗ содержится тринадцать положений, только одно из которых имеет косвенное отношение к указанному вопросу. Это пункт 3 «Каждый имеет право на личную неприкосновенность». Можно лишь предположить, что авторы проекта закона имели в виду, и что тем самым они декларируют принцип испрошенного согласия.

Также косвенно о модели, на которой основываются авторы проекта закона, можно судить на основании Статьи 19 «Учет мнения супруга или близких родственников в случае отсутствия прижизненного волеизъявления совершеннолетнего дееспособного гражданина о согласии или несогласии на изъятие его органов после смерти». Анализ этой статьи позволяет сделать предположение о том, что авторы проекта закона базируются на основе модели подразумеваемого согласия. Однако это лишь предположения о том, что имели в виду авторы проекта закона. В действительности все положения и статьи любого закона должны иметь лишь одну, прямо высказанную трактовку.

Статья 21 «Приоритет волеизъявления умершего», к сожалению, не проливает свет на то, какой из двух моделей авторы отдают приоритет.

Статья 22 «Регистр прижизненных волеизъявлений граждан о согласии или несогласии на изъятие их органов после смерти для трансплантации потенциальному реципиенту» фактически представляет собой анкету для граждан, решивших высказать свою прижизненную волю «о согласии или несогласии на изъятие их органов после смерти для трансплантации потенциальному реципиенту». Однако, хотя сама по себе организация регистра, безусловно, имеет положительное значение и аналоги такого рода подходов использованы в других странах, следует отметить следующее: во-первых, неясно, какая из рассматриваемых моделей должна быть использована в том случае, если потенциальный органный донор не зарегистрирован в регистре; во-вторых, само по себе наполнение регистра займет достаточно длительный период времени и потребует проведения дополнительных агитационных и разъяснительных мероприятий.

От того, какая из моделей подразумеваемого согласия (используемого в настоящее время в соответствии с ФЗ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» 1992 года) или испрошенного согласия будет представлена в законодательном акте, регулирующем трансплантацию органов в РФ, зависит сама судьба клинической трансплантации. В том случае, если закон о трансплантации будет основан на принципе испрошенного согласия, то трансплантация органов от посмертных доноров (основной вид клинических трансплантаций) практически прекратит свое существование. Последнее обусловливается как особенностями современного социально-экономического состояния России, так и практически полным отсутствием пропаганды посмертного донорства в нашей стране.

Среди статей проекта ФЗ, регулирующих процесс трансплантации органов, имеется Статья 11 «Организация осуществления донорства органов человека и их трансплантации», пункт 2 которой посвящен роли в организации осуществления донорства органов человека и их трансплантации региональных координационных центров органного донорства. По существу на этих центрах лежит основная ответственность за организацию процесса поиска и подбора тканесовместимых пар донор-реципиент. В тексте данного пункта имеется ряд неточностей, которые могут осложнить или даже нарушить работу этих центров. В Статье 11 указано, что эти центры ведут листы ожидания и контролируют их. Неясно, кто создает листы ожидания. В действительности именно эти центры осуществляют создание единого листа ожидания донорских органов в определенном регионе на основе объединения листов ожиданий, представляемых отдельными медицинскими учреждениями, а также осуществляют их ведение. Указание о том, что они также осуществляют контроль ведения листа ожидания (т.е. сами себя контролируют), на наш взгляд, лишено смысла. Целесообразно было бы включить другую функцию контроля - контроль использования хирургами-трансплантологами рекомендованных пар донор-реципиент. Также эти центры осуществляют подбор тканесовместимых пар донор-реципиент на основании генотипирования реципиентов, входящих в единый лист ожидания, и потенциальных доноров, а также на основе определения индивидуальной иммунологической совместимости конкретных доноров и реципиентов на основе выявления в крови реципиента предсуществующих антител к антигенам донора [52].

Наиболее наглядным примером регионального координационного центра органного донорства является деятельность Московского координационного центра органного донорства, осуществляющего указанный вид деятельности в Московском регионе. Следует обратить особое внимание на Статью 9 «Запрещение изъятия и использования для трансплантации органов неопознанных трупов и неустановленных лиц». Согласно содержанию данной статьи, в целях трансплантации органов предлагается запретить изъятие и использование для трансплантации органов неопознанных трупов и неустановленных лиц. Следует отметить, что на сегодняшний день использование такого рода трансплантатов не противоречит действующему законодательству, и трансплантаты от данной категории доноров составляют около 20% от общего количества пересаженных трансплантатов. Следует принять во внимание, что сегодняшний уровень развития медицины позволяет оценивать инфекционный статус такого рода доноров в течение нескольких часов. Последнее позволяет исключить вероятность передачи реципиенту с трансплантатом опасных инфекционных заболеваний [18, 44].

Исключение данной группы доноров существенным образом скажется на снижении трансплантационной активности в России, которая и в настоящее время относится к странам с наиболее низкими показателями [47].

Необходимо еще раз обратить внимание на то, что практически все принятые и функционирующие в настоящее время в странах ЕС правовые акты, регулирующие клиническую трансплантацию, рассматривают как трансплантацию органов, так и КМ/КСК. Благодаря этому все главные принципы, и в первую очередь безвозмездность, т.е. запрещение купли-продажи, распространяются на оба вида трансплантаций [41, 70, 71]. Единственным исключением является ФРГ, где органная трансплантация регулируется Законом «О донорстве, изъятии и пересадке органов» от 5 ноября 1997 г., в то время как трансплантация КМ/КСК регулируется правовым актом, регламентирующим переливание крови. Последнее привело к постоянным дискуссиям, как на правовом уровне, так и на уровне здравоохранения. Результатом этого являются постоянно выдвигаемые обвинения в торговле КМ/КСК [12, 15, 55].

В условиях сдвига физиологического баланса, обусловленного действием радиации, особенную значимость приобретает иммунная система человека, в том числе процессы регуляции восстановления пула иммуно-компетентных клеток и поддержания разнообразия антигенраспознающих рецепторов, а следовательно, и защиты человека от внешних и измененных собственных антигенов. Длительные наблюдения за людьми, подвергшимися облучению, указывают на то, что иммунная система является одной из наиболее уязвимых к действию радиации. В целом, при радиоактивном облучении организма человека наблюдается сдвиг баланса в относительной представленности популяций Т-клеток на фоне общей лимфопении [8].

Так, проспективное исследование лиц, выживших после атомной бомбардировки городов Хиросима и Нагасаки (Япония), показало значительное уменьшение числа Т-клеток, в том числе CD4^^ CD45RA наивных клеток, на фоне увеличения активности NK-клеток [16].

Еще одной особенностью, характеризующей функциональное состояние иммунной системы наряду с лимфопенией и сдвигом иммунологического баланса, является повышение активности фагоцитов. На самом деле эти показатели взаимосвязаны. В результате разрушения лимфоцитов высвобождается значительное количество биологических молекул (РНК, ДНК, пептидов), за утилизацию которых отвечают фагоциты [4, 11, 25]. Врожденные нарушения в генах системы репарации ДНК на фоне разрушительной для нуклеиновых кислот ионизации приводит к накоплению мутаций, нарушениям процессов трансляции и посттрансляционного процессинга белков. Это, в свою очередь, приводит к образованию большого числа «новых» для распознающих молекул антигенов.

Изучению роли приобретенных и врожденных мутаций в развитии негативных эффектов облучения следует уделить особое внимание. Радиационно-индуцированное накопление мутаций в генах, продукты которых ответственны за презентацию антигенов и регуляцию развития иммунного ответа, может сыграть решающую роль в специфичности их связывания с антигеном [20, 28]. В неменьшей степени это относится к врожденным (наследуемым) мутациям. Замена всего одной аминокислоты может приводить к изменению конформации пептида, изменению стерических условий взаимодействия и аффинности связи. Это, в свою очередь, может запускать каскад дальнейших реакций и приводить к индивидуальным отклонениям в иммунологическом гомеостазе [15, 29].

Так, при рассмотрении базовых механизмов формирования иммунных реакций в ответ на радиационное воздействие отдельного внимания заслуживает процесс восстановления пула лимфоцитов после облучения. В ряде исследований показано, что у взрослых людей в условиях пониженной активности тимуса процесс репопуляции лимфоцитов осуществляется за счет периферических органов иммунной системы (гомеостатическая пролиферация). Увеличение пула олигоклональных клеток памяти, населяющих лимфатические узлы, приводит к снижению репертуара Т-клеточных рецепторов (TCR). Это, в свою очередь, может препятствовать взаимодействию Т-клеток с опухолевыми антигенами и повышать риск развития онкопатологий. Ключевыми цитокинами, регулирующими процесс репопуляции цитокинов, являются IL-15 и IL-7 [23, 30].

Таким образом, нарушение функций генов иммунного ответа и их продуктов ведет к развитию тяжелых форм иммунологической недостаточности и иммунозависимым заболеваниям. В связи с этим анализ генов иммунного ответа может иметь прогностическое значение в оценке риска развития осложнений радиационного воздействия. Именно поэтому, рассматривая особенности реакции организма человека на радиационное воздействие, особенное внимание мы уделяем именно регулирующей роли пептидов системы HLA и особенностям восстановления иммунной системы после стрессорного воздействия.

В рамках разработки аппаратно-диагностического комплекса созданы тест-системы и проведена работа по изучению частот 11 SNP-маркеров и 34 аллелей HLA класса II у лиц без известной истории облучения (как здоровых, так и с патологией), а также у лиц, проживающих на радиоактивно-загрязненных территориях (табл. 7.1).

Таблица 7.1. SNP-маркеры, включенные в исследование генетических основ индивидуальной реакции организма на радиационное воздействие

В исследование по установлению генетических основ развития отсроченных эффектов хронического радиационного воздействия были включены кандидатные маркеры, расположенные в четырех генах систем контроля клеточного цикла и репарации ДНК: ATM (2 маркера), TGFB1, XRCC1 и OGG1 [3].

Серин-протеиновая киназа ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) принимает участие в фосфорилировании белков репарации ДНК, регуляции механизма апоптоза в ответ на формирование двухцепочечных разрывов ДНК, а также в стабилизации супрессорного опухолевого белка p53. Трансформирующий фактор роста TGFB1 вовлечен в ответ клетки на стрессорное воздействие (цитотоксические препараты, ионизирующее излучение, температурный шок, окислительный стресс), а также является медиатором системы передачи сигнала между компонентами врожденного и приобретенного иммунитета. Оба гена являются важными компонентами систем репарации ДНК и регуляции клеточного цикла, нарушения в которых связаны с процессом канцерогенеза. Гены XRCC1 и OGG1 кодируют тесно связанные продукты, регулирующие процесс гомологичной рекомбинации и репарации одноцепочечных разрывов ДНК.

Для установления ассоциации вариантов генов иммунного ответа с формированием фенотипа, характеризуемого повышенной устойчивостью к радиационному воздействию, сотрудниками Института иммунологии были определены частоты аллелей генов IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135), а также 34 аллелей HLA-DRB1, DQA1 и DQB1. Кроме того, в панель было включено несколько маркеров, связанных с повышенным риском развития злокачественных новообразований по результатам GWAS (www.genome.gov/gwastudies) [5, 32]. Этот подход основан на статистической оценке ассоциации генотипа с фенотипическим признаком без учета экспериментальных данных. Для 4 исследованных маркеров из региона 8q24 на 8-й хромосоме ранее была установлена ассоциация с раком простаты, прямой кишки и молочной железы [9, 17, 26, 31].

Совместно с ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины» ФМБА России (УНПЦ РМ ФМБА России) (г. Челябинск) было обследовано взрослое население из когорты реки Теча, здоровье которых на момент исследования можно охарактеризовать как соответствующее возрастной норме. Когорта сформирована специалистами УНПЦ РМ ФМБА России на основании проспективного медицинского и радиобиологического обследования лиц, проживающих на радиоактивно загрязненных территориях [2]. В отношении когорты реки Теча можно говорить о тенденции к повышению встречаемости онкологических заболеваний по сравнению с популяционными данными и повышенной долей онкологических заболеваний в структуре смертности [18, 19]. Таким образом, большая часть людей, предрасположенных к развитию патологии, к настоящему моменту ушли из жизни, и среди условно здоровых лиц в пределах обследуемой когорты частота маркеров предрасположенности к радиационно-индуцированным нарушениям (в том числе и к онкопатологии) уменьшилась. Собрав контрольные группы, сотрудники Института иммунологии провели классическое клинико-статистическое исследование, целью которого было установление отличий в распределении выбранных маркеров.

В качестве биологического материала использовали коллекцию периферической крови (220 образцов), предоставленную Институтом иммунологии и УНПЦ РМ ФМБА России. Первую группу (группа 1) составили 70 образцов геномной ДНК из коллекции УНПЦ РМ ФМБА России (г. Челябинск), полученных от неродственных пациентов - жителей прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся длительному комбинированному облучению: внешнему γ- и внутреннему, обусловленному инкорпорацией ⁹⁰Sr в костную ткань. Радиационное облучение стало результатом регламентных и аварийных сбросов жидких радиоактивных отходов радиохимического производства в реку Теча. В исследование были включены образцы, полученные от индивидуумов, рожденных до 1951 г., когда произошел один из наиболее крупных сбросов радиоактивных отходов, определивший чрезвычайно высокие мощности дозы облучения [2].

В исследованной группе показатель медианы накопленной дозы на красный костный мозг составил 1,23 Зв. Выборка включала представителей русской популяции, а также объединенной группы татарской и башкирской популяций тюркской ветви алтайской языковой семьи (19 и 51 человек соответственно) 1933-1949 годов рождения. Обследованные лица не имели серьезной соматической патологии.

Вторую группу (группа 2) составили пациенты с клиническими признаками соматической патологии (50 человек), возраста 58-64 года, в том числе подвергшиеся профессионально-ассоциированному облучению. Образцы были предоставлены Институтом иммунологии и Российским онкологическим научным центром им. Н.Н. Блохина РАМН (РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН) [3, 6].

В третью группу (группа 3) вошли образцы ДНК, полученные от 100 здоровых представителей русской популяции - доноров крови из коллекции Института иммунологии, собранной на базе ФГБУ Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН. В состав группы вошли индивидуумы возраста 55-63 года, проживающие на территории Центрального, Волжского, Уральского и Северо-Западного федеральных округов РФ.

В основу исследования легли подтвержденные независимыми исследованиями данные о влиянии наследуемых факторов на риск развития онкопатологий в условиях хронического радиационного воздействия [10, 13, 24, 21]. Новизна предлагаемого подхода заключается в первую очередь в том, что до сих пор модели оценки риска радиационно-индуцированных осложнений учитывали лишь изменения в организме, произошедшие после облучения. Реализованный подход, помимо возможности прогнозирования негативных эффектов еще до облучения, создает принципиально новую возможность учета фактора индивидуальной изменчивости при оценке риска [3, 7]. Применение этих данных поможет оценить безопасность и целесообразность контактов с источниками радиации лиц, генетически предрасположенных к развитию радиационно-индуцированных осложнений, а также снизить заболеваемость в профессиональных областях, требующих длительного присутствия человека в условиях повышенной радиации.

Из 45 исследованных генетических маркеров для пяти (rs1801516, rs664677, rs1052133, rs1799782 и HLA-DRB1*11) в сравниваемых группах установлены различия в распределении (рис. 7.1, см. цв. вклейку) [5].

Минорный аллель T варианта Asp1853Asn гена ATM (rs1801516) встречается в группе 1 реже, чем в группе популяционного контроля (группа 3). В то же время частота минорного аллеля T варианта IVS22-77 (rs664677) того же гена в группе 1 выше, чем в группе популяционного контроля.

Еще одно отличие было обнаружено для минорного аллеля G варианта Ser326Cys, расположенного в 326 кодоне гена OGG1 (rs1052133). Наличие протективного эффекта для этого маркера описывалось ранее [1].

В группе 2 установлено единственное отличие в распределении аллеля А гена XRCC1 (rs1799782). Частота аллеля А в данной группе достоверно ниже, чем в двух других исследованных группах. Этот результат подтверждает установленную ранее ассоциацию маркера rs1799782 с онкозаболеваниями [14, 27]. Интересно то, что связь с онкозаболеваниями для большинства генетических маркеров, включенных в анализ, на данном этапе исследования не нашла подтверждения. В частности, в их число попали все SNP, ассоциация которых с различными типами злокачественных новообразований была установлена в нескольких независимых геномных ассоциативных исследованиях.

По всей видимости, это косвенно подтверждает гипотезу об эффекте «дозы гена» в развитии онкоассоциированных патологий. Иными словами, большая часть популяции является носителями мутаций, определяющих незначительное повышение риска развития онкопатологий, при этом сама патология развивается только в том случае, если число определенных мутаций превышает некое пороговое значение [5].

Из 34 аллелей HLA класса II единственная достоверная ассоциация с признаком устойчивости к радиационному воздействию установлена для группы аллелей HLA-DRB1*11 (рис. 7.1, см. цв. вклейку). Помимо этого установлены группы аллелей в генах HLA-DRB1 и HLA-DQB1, перспективные для дальнейшего исследования в более широких группах. Данные по распределению аллелей HLA класса II в группах индивидуумов с повышенной/пониженной устойчивостью к радиации получены впервые. Результаты настоящей работы открывают новые представления о роли молекул главного комплекса гистосовместимости в радиационной генетике. Результаты анализа позволяют говорить о влиянии генетического фактора на формирование индивидуальной радиочувствительности. Отличия в распределении маркеров, расположенных в генах репарации ДНК, подтверждают принципиальную роль компонентов этой системы в ответе тканей на радиационное воздействие. Наличие достоверных отличий даже на уровне десятков образцов определяет целесообразность дальнейших исследований.

Таким образом, полученные результаты имеют большое значение для развития фундаментальных и прикладных аспектов иммунологии, медицины и молекулярной биологии. Их значимость обусловлена созданием новых возможностей в объективизации процедуры медицинского обследования облученных лиц и подбора персонала объектов атомно-промышленного комплекса, а также важностью оценки радиационных рисков и создания научной базы для радиационного нормирования в диапазоне малых доз и малых мощностей доз. Данные могут быть использованы при создании новых средств и подходов к защите человека от вредных воздействий, разработке комплекса мер по снижению заболеваемости радиационно-ассоциированными заболеваниями и повышению биобезопасности.

Разработанный аппаратно-диагностический комплекс составил методологическую основу для изучения иммунного статуса и предрасположенности к развитию социально-значимых заболеваний у контингентов, задействованных в ликвидации последствий радиационных аварий, и населения радиоактивно загрязненных территорий. Универсальность комплекса определяется возможностью проведения широкого спектра биомедицинских исследований, в том числе:

Комплекс этих методов позволяет получать всестороннюю информацию о генетических особенностях исследуемого объекта, активности генов иммунной системы и функциональном состоянии противоинфекционного иммунитета. Данный подход представляется перспективным как с точки зрения реализации фундаментальных научных исследований, так и для практического здравоохранения. Особое значение имеет его ориентация на отечественную технологическую и приборную базу, что позволяет эффективно решать вопрос импортозамещения в области высокотехнологичной продукции научного и медицинского назначения.

Новые технологии и методы, основанные на отечественном детектирующем оборудовании с повышенными пропускными характеристиками, позволяют эффективно решить проблему доукомплектования профильных медицинских учреждений и внедрения молекулярно-генетических методов в медицинскую практику, не прибегая к закупкам дорогостоящего импортного оборудования. Разработанные методы могут быть использованы в широкой медицинской практике при иммунологическом и генетическом консультировании пациентов, а также в профильных медицинских учреждениях для оценки риска развития осложнений терапевтического радиационного воздействия. Созданные сертифицированные реагенты и приборы позволили усовершенствовать технологии ПЦР-РВ, повысить эффективность данного метода и нашли широкое применение как в прикладных, так и в фундаментальных исследованиях, выполняемых в научно-исследовательских и клинических учреждениях как в России, так и за рубежом. Простота постановки и доступность для использования разработанных Институтом иммунологии совместно с компанией НПО «ДНК-Технология» приборов, специализированных лабораторий и тест-систем вывела Россию уже в конце 1990 - начале 2000-х годов на второе место в мире по количеству выполняемых ПЦР-анализов.

Как было отмечено выше, прикладной уровень технологической платформы составляют технологии установления параметров, характеризующих здоровье человека и иммунную систему, в частности: генетические особенности (генотип), профиль экспрессии генов (текущее состояние, или фенотип) и взаимодействие организма с микробиологическим и вирусным окружением (нормофлора, патогенные и условно-патогенные инфекционные агенты).