Наследственные болезни

Понятие «геном» исторически возникло как обозначение совокупности всех генов конкретного организма. В слове «геном» корень «ген» был объединен с частицей «ом», взятой от слова «хромосома». Впоследствии частица «ом» стала играть роль суффикса, с его помощью были образованы такие слова, как «транскриптом», «протеом» и даже «лигандом», обозначающие соответственно совокупность всех транскриптов, белков и лигандов в клетке. После того как была открыта роль ДНК в передаче наследственной информации, под геномом организма стали понимать нуклеотидную последовательность ДНК, достаточную для возникновения и поддержания нормальной жизнедеятельности организма.

Полная нуклеотидная последовательность генома человека была определена в результате работы международного исследовательского проекта, ставшего кульминацией совместной работы генетиков многих стран. Первая, так называемая «черновая», версия генома человека была опубликована в 2001 г. в журнале «Nature». Эта версия впервые дала представление о почти 90% последовательности генома размером 3,2 млрд пар нуклеотидов. Оказалось, что геном человека содержит намного меньше генов, чем было предсказано экспертами, - менее 30 000. Полная версия генома человека, ставшая доступной в 2003 г., содержала около 20 500 генов. В настоящее время структурная организация каждого из этих генов подробно описана, однако функции многих из них остаются неизвестными. Человечеству еще предстоит выяснить, как именно кодируемые генами белки объединяются, образуя биологический портрет организма. На это потребуется по меньшей мере столетие.

Тем не менее Фрэнсис Коллинз (Francis S. Collins), руководитель американской программы «Геном человека», уже сравнил опубликованную последовательность генома человека с книгой, в которой каждый читатель находит что-то интересное для себя. Историк читает ее как отчет о длительном путешествии нашего вида по реке времени. Инженер - как руководство по эксплуатации с подробными чертежами каждой клетки. А клиницист получает объяснение, как предотвращать болезни и лечить их.

В работе по секвенированию и сборке генома человека участвовали ученые из многих стран мира. Наибольший вклад внесли три команды: американская государственная (Human Genome Project), британская государственная (Wellcome Trust Sanger Institute), а также частная корпорация Celera Genomics из штата Мериленд. Немало работы было проделано также генетиками из Германии, Франции, Японии, Китая и России. Важно отметить, что соавторами статьи, описывающей результаты работы, выполненной международным консорциумом по секвенированию человеческого генома (IHGSC) и опубликованной в журнале «Nature», стали около 2800 человек, которые работали по всему миру (табл. 1-1). В программе «Геном человека» участвовало более 400 российских исследователей из 30 научных учреждений, ими были опубликованы сотни научных работ, описывающих различные участки генома человека и модельных животных. В базах данных российскими учеными были зарегистрированы более миллиона нуклеотидных пар фрагментов ДНК человека и многие сотни генетических маркеров, имеющих большое значение для детального анализа генома человека. Российская программа изучения генома была поддержана Министерством науки и технологий РФ и президиумом РАН. Российский академик А.Д. Мирзабеков (1937-2003 гг.) в течение нескольких лет был вице-президентом Международной организации по изучению генома человека (HUGO).

Таблица 1-1. Научные центры, в результате объединенных усилий определившие полную последовательность генома человека

По официальным данным, на определение полной нуклеотидной последовательности генома человека было затрачено 300 млн долларов. Но эта цена ничтожна по сравнению с выгодой для человечества - бесценной информацией о молекулярных основах существования и новыми технологиями, разработанными в ходе проекта «Геном человека». Уже в 2006-2009 гг. цена определения полной нуклеотидной последовательности индивидуального генома снизилась более чем на два порядка, что привело к публикации полных нуклеотидных последовательностей генома несколькими известными учеными, в том числе одного из первооткрывателей структуры ДНК Джеймса Уотсона и основателя компании Celera Genomics Крейга Вентера. В настоящее время цена секвенирования и сборки индивидуального генома составляет примерно 10 000 долларов.

Результаты первого исследования индивидуального генома, выполненного в рамках медицинского обследования, были опубликованы в мае 2010 г. в британском журнале «Lancet». У больного с наследственным заболеванием сосудов, в семье которого встречались сравнительно ранние смерти, было взято для анализа всего 2 мл венозной крови. Секвенирование было проведено с помощью платформы Heliscope (Helicos BioSciences, Cambridge, MA). Ученые также провели дополнительную верификацию некоторых важных полиморфных участков с помощью другой секвенирующей платформы Illumina Bead Array (San Diego, CA, USA). В результате полного генетического анализа было выявлено несколько новых мутаций и генных вариантов, ответственных за моногенные заболевания (во всех случаях такие варианты присутствовали только в одной копии), а также целый ряд однонуклеотидных полиморфизмов и генных вариантов, влияющих на особенности фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных средств. Были сделаны выводы о высокой степени генетической предрасположенности пациента к развитию ишемической болезни сердца и аневризмы аорты, а также о риске устойчивости к терапии клопидогрелом и опасности высоких доз варфарина в случае, если в будущем будет принято решение о проведении соответствующего лечения еще не развившихся заболеваний.

Возможно, что в ближайшем будущем стоимость секвенирования индивидуального генома человека должна упасть до 1000 долларов. Такая цена вполне доступна для обычных людей, которые будут привлечены возможностями своевременного выявления наследственной предрасположенности к тому или иному заболеванию и индивидуального подхода к лечению. Доступность геномного секвенирования приведет к тому, что отсутствие подробной генетической информации перестанет лимитировать развитие клинической генетики. Первый обнадеживающий пример такого рода исследования - работа, выполненная в 2008 г., по изучению вызываемой статинами миопатии. Статины относятся к числу самых распространенных на сегодняшний день препаратов, понижающих уровень холестерина в крови, ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы. У этой группы препаратов имеется довольно редкий, но серьезный побочный эффект - миопатия, которая может привести к тяжелой почечной недостаточности. Из 6031 человека, обследованных в рамках программы SEARCH, после приема обычной дозы статина (80 мг) выявлено 85 пациентов с признаками миопатии. Полногеномное исследование ДНК этих пациентов (GWAS) и 90 пациентов из той же выборки, но не проявляющих признаков миопатии, позволило обнаружить один полиморфизм, связанный с появлением миопатии. Им оказался однонуклеотидный полиморфизм в гене SLCO1B1, кодирующем белок анионного транспорта OATP1B1, расположенном в хромосоме 12. Примерно 60% вызванной статинами миопатии оказались связанными с аллельным вариантом С SNP rs4363657. Таким образом, генотипирование по соответствующему SNP позволит дать высоковероятный прогноз наличия или отсутствия у данного пациента побочной реакции на терапию статинами. Надо отметить, что широкое распространение персонифицированной медицины потребует создания медицинских учреждений нового типа, под эгидой которых будут вместе работать как врачи и консультанты-генетики, так и ученые, в частности специалисты в области функциональной геномики, а также представители системы медицинского страхования. Для того чтобы такая интеграция стала возможной, необходимо преодолеть ряд препятствий (табл. 1-2).

Таблица 1-2. Препятствия на пути развития геномной персонифицированной медицины

История перехода от дорогостоящего международного проекта до возможности определения последовательности индивидуального генома по доступной цене была такова.

Первые методологические статьи, создавшие техническую основу для будущего проекта «Геном человека», были опубликованы в 1977 г. Ф. Сэнгером (Fred Sanger) и А. Коулсоном (Alan Coulson). Разработанный ими метод был значительно менее трудоемким, чем ранее существовавший метод химического секвенирования Максама-Гилберта, и исключал работу с опасными химическими веществами. Технология Сэнгера получила свое дальнейшее развитие после создания роботов, осуществляющих сборку реакционных смесей, системы автоматизированного электрофореза продуктов реакции секвенирования в тонких капиллярах, машинсеквенаторов, позволяющих одновременное проведение 4-96 реакций секвенирования. Но данная технология имела и свои ограничения. Несмотря на предельную автоматизацию, для определения последовательности генома человека потребовалось создание огромных лабораторий, плотно заполненных сотнями секвенаторов, круглые сутки работающих под чутким контролем высококвалифицированных лаборантов, которые трудились в три смены. Первая («черновая») и полная версии генома человека были получены с помощью этой технологии, требовавшей огромных усилий. К счастью, на смену технологии Сэнгера вскоре пришла так называемая технология нового поколения (NextGen) - и не одна, а целых три.

Впервые технология NextGen была применена на практике в 2005 г., ознаменовавшемся выходом на рынок первой секвенирующей машины нового поколения - длинноцепочечного пиросеквенатора GS20, разработанного компанией 454 Life Sciences (Брэнфорд, Коннектикут), впоследствии купленной Roche Diagnostics. В мае 2007 г. именно эта технология была использована для воплощения в жизнь проекта Jim, определившего первую последовательность генома отдельно взятого человека. Эта последовательность была торжественно вручена первооткрывателю структуры ДНК - Джеймсу Уотсону (James Watson).

Другая технология NextGen, созданная в лаборатории Джоржа Чарча (George Church) в Гарварде, заключается в секвенировании «полоний» - клональных амплификатов, полученных на индивидуальных молекулах-матрицах, выращиваемых внутри капель геля, налитого на предметное стекло, или взвешенных в составе эмульсии. Эта технология была коммерчески освоена весьма известной компанией Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) и продается под названием SOLiD. Еще одна технологическая платформа, Solexa, разработанная компанией Illumina, также основана на клональной амплификации отдельных молекул ДНК, но использует специальные адаптерные ДНК-фрагменты, облегчающие детекцию амплифицированных кластеров.

На этих трех технологиях история секвенирования нового поколения не закончилась. В настоящее время разрабатывается целый ряд новых технологий, основанных на гибридизации, электронной микроскопии, масс-спектроскопии, маркировании отдельных молекул ДНК-полимеразы и даже протаскивании молекулы ДНК через специально созданную нанопору. Один из методов NextNextGen уже воплощен в доступном для приобретения оборудовании - к августу 2010 г. компания Helicos продала 12 аппаратов, позволяющих секвенировать отдельные молекулы ДНК со скоростью несколько миллиардов нуклеотидов в день.

Таким образом, в течение последнего десятилетия в индустрии секвенирования произошла настоящая революция. Цена расходных материалов, необходимых для определения последовательности тысячи нуклеотидных пар (1 kb), упала с одного доллара по методу Сенгера в 1990-х до 5 центов с технологией 454 в 2005-м, затем в том же году - до 0,2 цента с технологией Illumina и, наконец, 0,05 цента - с технологией Helicos. Цена чтения ДНК с новейшими секвенаторами компаний, еще не вышедших на рынок, но уже запатентовавших свои разработки, еще неизвестна. Прогнозы весьма оптимистичны.

В догеномную эпоху каждое открытие, касающееся генетики человека, давалось с огромным трудом. Даже кариотип человека не был однозначно описан вплоть до середины 50-х годов. В настоящее время мы знаем, что геном человека заключен в составе 23 пар хромосом, двадцать две из которых являются аутосомами, а оставшаяся пара - определяет половую принадлежность человека. Важно помнить, что в каждой соматической клетке каждая из аутосом представлена в двух экземплярах. Так, хромосомный набор мужчин представлен 44 аутосомами и двумя разными половыми хромосомами - Х и Y. Хромосомный набор женщин также представлен 44 аутосомами, половые хромосомы женщин одинаковы - это две Х-хромосомы. Таким образом, кариотип мужчин 44ХY, женщин - 44ХХ.

Размер гаплоидного генома человека составляет 2858 млн нуклеотидных пар. Он содержит примерно 22 585 генов, кодирующих разнообразные белки. Эта цифра несколько завышена, так как среди открытых рамок считывания, предсказанных компьютерными программами, могут встречаться и псевдогены. Если мы удалим из этого множества генов все транскрипты псевдогенов, в которых ученые уверены не полностью, останется 18 349 кодирующих участков. Такая оценка несколько занижена, поскольку некоторые предсказанные транскрипты могут оказаться еще не описанными генами, которые встречаются только у человека. Таким образом, мы пришли к выводу, что у человека настоящих генов от 18 000 до 22 000. Интересно, что это число оказалось намного меньше, чем считалось в догеномные времена. По первоначальным оценкам, число генов у человека было в пределах от 50 000 до 150 000 (рис. 1-1).

Рис. 1-1. Содержание различных нуклеотидных последовательностей (НП) в геноме человека. НП, кодирующие белки (~20 000 генов), занимают менее 1,5% генома

Точная оценка числа генов у человека пока невозможна по многим причинам. Гены, расположенные в некоторых хромосомных участках, трудно поддаются учету. К числу таких участков относятся псевдоаутосомные районы - гомологичные локусы, расположенные на концах Х- и Y-хромосом и способные к конъюгации и кроссинговеру. По одним методам подсчета гены, находящиеся в этих районах, учитываются один раз, а по другим - два. Подобные трудности представляют собой дуплицированные гены и тандемные генные кластеры. Длина таких кластеров может различаться у разных людей, и рекомбинация между ними приводит к появлению кластеров с измененным числом тандемных генных повторов, что вызывает появление дополнительных копий того или иного гена. В зависимости от давности такой дупликации последовательность новообразовавшейся копии может несколько отличаться от предыдущего генного варианта, это вносит дополнительные неясности в определение числа генов у человека.

В результате анализа генома человека было выявлено, что некоторые довольно протяженные участки генома вообще отсутствуют у целого ряда вполне здоровых людей. Длина таких «необязательных» участков может составлять от нескольких тысяч до нескольких миллионов нуклеотидных пар. В настоящее время описано около 2000 таких участков, получивших название «вариации числа копий» (copy number variation, или CNVs). При этом на каждый индивидуальный геном приходится более 100 таких вариаций со средним размером 250 000 пар нуклеотидов каждая. Для сравнения: ген человека в среднем занимает около 60 000 пар нуклеотидов. Нередко внутрь такого вариантного участка попадают цельные гены, это означает, что у отдельно взятого человека какой-либо ген может быть представлен не двумя, а одной или, наоборот, тремя копиями, что приводит к изменению количества данного гена. В некоторых случаях ген вообще может быть полностью утрачен без существенного изменения фенотипа. Как вариации числа копий, так и другие непатологические геномные особенности вносят свой вклад в уникальность и каждого генома, и каждого человека.

Но не все вариации числа копий абсолютно безвредны. Только для заболеваний нервной системы в настоящее время описано 17 CNV, приводящих к возникновению различной патологии, в том числе к болезни Альцгеймера или Паркинсона , аутизму, шизофрении . Для учета новой информации, касающейся вариаций числа копий в норме и в патологии, создана специальная база данных DECIPHER (http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/).

Все кодирующие участки ДНК составляют не более 1,5% длины всего генома. Остальное пространство заполнено некодирующими РНК, роль которых до сих пор не ясна, регуляторными последовательностями, а также повторяющимися участками ДНК, многие из которых являются производными различных вирусов и эндогенных самореплицирующихся молекул. Стоит отметить, что, несмотря на малую долю, занимаемую кодирующими участками, примерно 80% всего генома с той или иной скоростью транскрибируется, просто многие транскрипты не транслируются в белки. В первую очередь, это - последовательности интронов, вырезаемых при сплайсинге, множественные рибосомные РНК, транспортные РНК, а также многочисленные малые функциональные РНК, такие как микроРНК. Некодирующие РНК явно потеснили белки на их пьедестале главных молекул, обеспечивающих жизнедеятельность клеток. Скорее всего, мир некодирующих РНК только начал открываться исследователям, и в полной мере значение таких РНК можно будет оценить лишь в будущем.

Большую часть некодирующих РНК человека составляют РНК «домашнего хозяйства» клетки, непосредственно участвующие в синтезе белка. К таким РНК относят структурные рибосомные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК), 7SK РНК, РНК, входящие в состав сплайсосом, и другие. В геноме человека гены, кодирующие рРНК и тРНК, представлены многочисленными копиями - около 500 генов, кодирующих тРНК, и около 200 копий для рРНК. Гены, кодирующие рРНК, расположены на коротких плечах 5 акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21, 22).

Важным открытием последнего времени стало обнаружение в геноме человека «нетрадиционных» РНК-транскриптов, не способных кодировать белок, но способных модулировать функции белковых продуктов, считываемых с других генов, а также их пространственное распределение в клетке. Такие РНК называют риборегуляторами. Например, некодирующая РНК H19 имеет отношение к целому ряду процессов, протекающих в клетках, в том числе к запуску клеточного цикла, а также играет важную роль при злокачественном перерождении клеток. Локус HFE, участвующий в метаболизме железа и отвечающий за наследственное заболевание гемохроматоз , кодирует не только мРНК для белка HFE, но и антисмысловую РНК, образующуюся на другой нити ДНК и регулирующую мРНК. Этот антисмысловой (комплементарный) РНК-продукт способен взаимодействовать с основной мРНК HFE, образуя РНК-РНК гибриды, неспособные транслироваться в рибосомах с образованием белка. Еще один интересный ген - SRA, кодирующий РНК-активатор стероидного рецептора. Он обеспечивает активность стероидных рецепторов за счет образования комплекса с этим белком. Важность клеточных функций некодирующих РНК подтверждается наблюдением, что их промоторы более консервативны, чем промоторы генов, кодирующих белки.

В клетках человека также выявлены короткие двунитевые РНК (микроРНК) размером 21-32 нуклеотидные пары, участвующие в процессе регуляции экспрессии генов путем РНК-интерференции. Этот механизм впервые был обнаружен в 1998 г. у низших животных, в том числе нематоды C. elegans. Оказалось, что микроРНК человека также способны уменьшать работу строго определенных генов путем воздействия на процесс синтеза кодируемых ими белков. Подавление экспрессии может происходить как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно. У человека число экспериментально подтвержденных микроРНК превышает 700. По разным оценкам, от 10 до 30% всех генов белков регулируется микроРНК.

Около 45% генома человека составляют мобильные генетические элементы, большая часть которых является ретротранспозонами, использующими РНК в жизненном цикле, и только меньшая часть (3%) представлена ДНК-транспозонами. Ретротранспозоны делятся на короткие (SINE), длинные (LINE) и длинные концевые повторы (LTR). Элементы SINE занимают 13% длины генома, основным типом этих элементов являются специфические для человека ALU-повторы, они составляют 10% общей длины человеческого генома. Следующий класс транспозонов - LINE-повторы, составляет 21% длины генома, в этом классе также выделяется преобладающий элемент - L1, он занимает 17% длины генома. LTRтранспозоны - самые малочисленные, они занимают только 8% общей длины генома. Известно, что многие ретротранспозоны способны транскрибироваться, в том числе в различные малые РНК. При стрессовых воздействиях (тепловой шок , вирусная инфекция и др.) уровень малых РНК, транскрибирующихся с SINE, разбросанных по геному, увеличивается многократно. Эти малые РНК важны для выживания клеток в неблагоприятных условиях.

Кроме ретротранспозонов и ДНК-транспозонов, в геноме представлены и другие типы повторяющихся последовательностей. Примерно 0,1% общей длины генома занимают простые повторы, например ЦАЦАЦАЦАЦАЦАЦА. Псевдогены также считаются повторами. Псевдогенами называют последовательности, родственные генам, но лишенные способности кодировать белки. Как правило, псевдогены не имеют промотора и интронов. Псевдогены, в которых отсутствуют интроны генапредшественника, называют процессированными псевдогенами. Предполагается, что процессированные псевдогены возникают путем интеграции в геном комплементарной ДНК (кДНК), образовавшейся в результате обратной транскрипции соответствующей мРНК, перед этим претерпевшей полный сплайсинг. Встраивание такой кДНК может быть обеспечено с помощью белковых продуктов, кодируемых автономными ретротранспозонами. Многие псевдогены человека сохраняют очень большое сходство с функциональными родственниками. Сходство между псевдогенами и родственными им генами может достигать от 40 до 100%. Некоторые псевдогены весьма похожи на гены: они имеют промотор, ГЦ-островки, интроны и сайты сплайсинга, однако функционировать не могут. Нарушение функции такого псевдогена, как правило, происходит в результате мутации, в частности вводящего стоп-кодон в середину открытой рамки считывания или сдвиг рамки. Иногда эти псевдогены утрачивают и способность к транскрипции, но чаще их мРНК считывается, но не транслируется.

Разные хромосомы человека содержат различное количество генов. Эта величина зависит не только от размера хромосомы, но и от плотности генов на ней. Самое большое число генов находится на первой хромосоме (2316 генов), самое маленькое - на Y-хромосоме (94 гена). Первая хромосома - самая длинная, но плотность генов самая большая не на ней, а на 19-й хромосоме - в среднем 26 генов на каждый миллион пар оснований длины (табл. 1-3). Плотность генов в каждом конкретном участке ДНК зависит от содержания гуанина и цитозина: чем больше на участке ГЦ-пар, тем больше на нем генов.

Как и у всех эукариот, гены человека состоят из экзонов и интронов . Экзонами называют участки ДНК, остающиеся в составе мРНК после завершения сплайсинга, а интронами - участки ДНК, транскрибируемые в РНК, но вырезаемые при сплайсинге, а значит, отсутствующие в составе зрелой информационной РНК, служащей матрицей для биосинтеза белка. Интроны, как правило, начинаются с последовательности ГУ и заканчиваются на АГ.

Таблица 1-3. Средняя плотность генов в каждой из хромосом человека

Один и тот же первичный РНК-транскрипт может быть сплайсирован в целый ряд зрелых мРНК, различающихся по своему экзонному составу. Таким образом, один и тот же участок ДНК может служить экзоном или входить в состав интрона, в зависимости от того, какой именно сценарий сплайсинга реализуется в данной клетке. Процесс реализации различных тканеспецифичных сценариев сплайсинга называют альтернативным сплайсингом (рис. 1-2). Доказано, что у человека 92-94% генов подвержено альтернативному сплайсингу; при этом у 86% генов дополнительные изоформы составляют не менее 15% общего количества мРНК, синтезируемой с данного гена. Интересно, что геном круглого червя Caenorhabditis elegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному сплайсингу подвергаются пре-мРНК только 15% генов этой нематоды. Видимо, основное назначение альтернативного сплайсинга - увеличение разнообразия белковых продуктов, считываемых с генов, без пропорционального увеличения числа самих генов и размера генома. Альтернативный сплайсинг также позволяет осуществлять сложную тканеспецифичную систему регуляции экспрессии генов человека.

Рис. 1-2. Пример альтернативного сплайсинга гена CALC1, кодирующего два разных гормона - кальцитонин и пептид, родственный кальцитонину. Кодирование двух разных белков достигается путем использования альтернативных экзонов 4 и 5. Экзон 4 остается невырезанным только в изоформе мРНК, кодирующей кальцитонин и экспрессирующейся в щитовидной железе, а экзон 5 только в изоформе мРНК, кодирующей пептид, родственный кальцитонину, и экспрессирующейся в гипоталамусе

У большинства генов, не подверженных альтернативному сплайсингу, интронов вообще нет - они представляют собой единый цельнотранскрибируемый экзон. Таких генов у человека 751, при этом длина этого единственного экзона значительно выше средней длины экзона для многоэкзонных генов. В среднем на один ген человека приходится по 9 экзонов и 8 интронов. Более 80% экзонов на каждой хромосоме не превышают в длину 200 пар азотистых оснований, средняя длина экзона - 170 пар. Интроны также редко бывают менее 20 пар оснований, таковых меньше 0,01% всех интронов. Менее 10% интронов превышают в длину 11 000 пар. Возможно, это связано с трудностями сплайсинга слишком коротких и слишком длинных фрагментов. Интересно, что чем длиннее хромосома, тем длиннее на ней интроны и межгенные участки ДНК, коэффициент корреляции составляет 0,95 для интронов и 0,97 для межгенных участков.

Обнаружены отдельные локусы, где внутри одного гена целиком содержится другой, «вложенный» ген. Как правило, при этом типе организации один белоккодирующий ген располагается в интроне другого белок-кодирующего гена. Но встречаются и другие варианты. В качестве примера можно привести митохондриальный ген одной из рибосомных РНК. Ген, кодирующий данную рРНК, обеспечивает ею рибосомы митохондрий в качестве структурного компонента (т.е. не кодирует белок). Но вместе с тем небольшой участок, расположенный внутри этого гена, кодирует короткий белок, получивший название «гуманин» (от англ. human - человек), который принимает участие в процессе программированной клеточной гибели. В этом случае белок-кодирующий ген заключен внутри РНКкодирующего гена. Другой вариант - уже упоминавшийся выше ген H19. Здесь, наоборот, ген IGF2, кодирующий белок, содержит внутри своей кодирующей части другой более короткий ген, кодирующий только РНК, которая принимает участие в регуляции работы этого гена.

Средняя длина типичного белок-кодирующего гена составляет 16 995 нуклеотидов, если же не учитывать транскрипты, предсказанные компьютером, длина среднего белок-кодирующего гена составит 21 461 нуклеотид. Очень длинные гены, длиннее 250 000 пар оснований, составляют всего 4% набора генов человека. Некоторые из этих генов приведены в табл. 1-4.

Таблица 1-4. Самые длинные гены человека

Многие гены человека объединены в генные семейства. Гены объединяют в семейства в случае, если их экзоны родственны между собой, т.е. похожи по нуклеотидной последовательности. В геноме человека присутствует около 1500 таких семейств генов. Причем только около сотни из них специфичны для человека и других позвоночных животных, тогда как основная масса генных семейств намного более консервативны - они имеются и у человека, и у других многоклеточных. Гены, принадлежащие к одному семейству и встречающиеся у одного организма, называют паралогичными, одинаковые гены, присутствующие у разных видов, - ортологичными. Как правило, паралогичные гены эволюционировали путем дупликации и последующего расхождения (дивергенции ) копий одного гена-предшественника. Одна из дуплицированных копий гена может приобретать новые функции, в то время как другая обеспечивает поддержание исходных. Такие дупликации в процессе эволюции происходили неоднократно. Подсчитано, что в геноме человека в сумме дуплицировано около 3,6% нуклеотидных последовательностей размером в 1000 пар нуклеотидов и более. Разные копии одного семейства генов могут располагаться в геноме рядом и следовать друг за другом (это называют тандемной дупликацией) или находиться в разных хромосомах.

Функции ортологичных генов консервативны. Например, ген Pax6 имеет одинаковую функцию у человека, дрозофилы, головоногих моллюсков и нематоды. Этот транскрипционный фактор необходим для развития органов зрения у всех билатерально-симметричных животных, включая человека и других млекопитающих. Если ген Pax6 человека эктопически экспрессировать в организме дрозофилы, это приведет к появлению у нее дополнительных глаз, что указывает на эволюционную консервативность всей нижележащей генной сети. Сходны и фенотипические эффекты мутаций Pax6 у различных организмов, они всегда проявляются повреждением органов зрения. У человека гетерозиготы по мутации в Pax6 страдают аниридией. У мыши этот же фенотип был описан как «small eyes» - уменьшенные и упрощенные глаза. Гомозиготы по мутации Pax6 не доживают до рождения ни у мыши, ни у человека, такие эмбрионы страдают серьезным дефектом развития головного мозга, носа и ушей. Как правило, ортологичные транскрипционные факторы более сходны между собой, чем структурные белки. Этот феномен и называют эволюционной консервативностью. Однако консервативность не мешает транскрипционным факторам образовывать крупные генные семейства, например семейство генов Hox.

Функции дивергировавших генов одного семейства чаще всего остаются сходными, но экспрессия членов такого семейства, как правило, осуществляется на разных стадиях развития организма человека или в разных типах клеток. Так, в геноме человека обнаружено 22 гена, кодирующих родственные факторы роста фибробластов, - все они структурно сходны друг с другом и подразделяются на 6 подсемейств. При этом у низших организмов число таких генов существенно меньше, например у дрозофилы их всего два. Другой пример - гены, кодирующие кератины - белки наружного слоя кожи и ее производных (волосы, ногти). Их у человека 54. Правда, большинство из этих генов сконцентрировано в составе генных кластеров на хромосомах 12 и 17. Интересно, что некоторые генные семейства у человека представлены меньшим числом генов, чем у низших животных. Например, геном нематоды C. elegans содержит 25 генов, кодирующих белки-иннексины, образующие щелевые каналы, а геном человека - только три родственных иннексинам гена паннексинов. Подобным примером могут послужить обонятельные рецепторы, представленные в геноме человека более чем 1000 копий. Но примерно 60% из них являются псевдогенами, что может объяснять относительно плохо развитое чувство обоняния у человека. У мыши примерно из такого же числа генов, кодирующих рецепторы обоняния, работает не менее 80%. Считается, что массовая потеря функциональности генов обонятельных рецепторов у вида Homo sapiens произошла за последние 6 млн лет, прошедших с момента обособления семейства гоминид от их ближайших родственников - человекообразных обезьян. У человекообразных обезьян доля функциональных генов в семействе обонятельных рецепторов выше, тем не менее и у них около 30% данных генов представлены псевдогенами. Такую потерю функциональности генов обонятельных рецепторов связывают со снижением роли обоняния в жизни человека и человекообразных обезьян по сравнению с другими млекопитающими и переходом роли ведущего анализатора к зрительному, после появления у приматов трехмерного цветного зрения.

Завершение работы над последовательностью генома человека прояснило многие вопросы эволюции. Например, оказалось, что геномы человека и шимпанзе различаются примерно на 1,23%. Около 0,25% пар нуклеотидов, различающих геномы человека и шимпанзе, приходятся на полиморфные состояния ДНК, часто встречающиеся в популяциях человека. Значит, на долю истинных различий между обезьяной и человеком остается менее 1%. Но на проблему сходства и различия человека и шимпанзе можно посмотреть и по-другому - учитывая не общую длину последовательности генома и процент от нее, а отдельные гены. Такое сравнение показало, что примерно 6% всех функциональных генов уникальны либо для человека, либо для шимпанзе. Другими словами, наиболее значимая разница между этими видами заключается не в точечных мутациях ДНК, а в геномных перестройках, приведших к изменению числа генов в составе генных семейств, а также изменению функции и спектра экспрессии некоторых генов. В среднем ген человека отличается от ортологичного гена шимпанзе на две аминокислотных замены. Примерно треть генов человека и шимпанзе на уровне белка вообще неотличимы. Самое главное различие между двумя родственными геномами - это человеческая хромосома 2, образовавшаяся в результате слияния 12-й и 13-й хромосом шимпанзе, впоследствии переименованных в хромосомы 2А и 2В.

Большое значение расшифровка генома человека имела и для понимания эволюции человека как вида. Международная программа HapMap, в которой принимают участие исследовательские группы и фонды из США, Великобритании, Канады, Японии, Китая и Нигерии, создала базу данных по гаплотипам, встречающимся в популяциях европейского, азиатского и африканского происхождения. Гаплотип - совокупность генетических маркеров, расположенных рядом и наследующихся вместе на одной хромосоме. В качестве таких маркеров, благодаря возросшей эффективности секвенирования, стало возможным использовать SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) - однонуклеотидные полиморфизмы.

Большинство однонуклеотидных полиморфизмов нейтральны, поэтому их распространение в популяциях не подвержено влиянию естественного отбора и позволяет проследить, в частности, миграции своих носителей - людей, составляющих популяции.

Благодаря успехам программы HapMap была подтверждена гипотеза общей африканской прародины человечества, причем Африка оказалась более разнообразной по гаплогруппам Y-хромосомы, чем весь остальной мир. Подобные результаты дали и работы по митохондриальной ДНК - разнообразие митотипов в Африке оказалось существенно больше, чем во всем остальном мире. Таким образом, гипотеза замещения евразийских популяций архаичного сапиенса популяциями современного человека, пришедшими из Африки, получила мощную поддержку. Поскольку человеческий вид распространился за пределы Африки относительно небольшой группой, средний размер гаплогруппы у неафриканских популяций оказался значимо длиннее, чем у африканских. Оставшаяся в Африке популяция современного человека имела гораздо большее разнообразие древних гаплогрупп и соответственно гораздо больше времени для того, чтобы процессы рекомбинации привели к их укорочению.

По мере расселения человека за пределы Африки частоты древних гаплогрупп изменялись благодаря генному дрейфу, эффекту основателя, естественному отбору и другим причинам, в результате чего в разных популяциях современного человека частоты гаплогрупп также различаются. Постепенно в результате мутаций появлялись и новые гаплогруппы, однако их небольшой возраст пока не дал им возможности широко распространиться за пределы области своего возникновения. В этих областях такие «молодые» гаплогруппы часто ассоциированы с различными генетическими заболеваниями, встречающимися в популяции, что позволяет проводить их относительно быструю диагностику. Например, с помощью маркерных SNP, характерных для каждого гаплотипа, и базы данных проекта HapMap по одному полиморфизму исследователь теперь может определить, с каким именно гаплотипом он имеет дело. Другими словами, нередко для поиска мутации не требуется типирование всего генома пациента. Для каждой гаплогруппы, статистически ассоциированной с тем или иным распространенным заболеванием, достаточно определение одного маркера. Такой подход, предполагающий наличие часто встречающегося предрасполагающего генетического варианта, получил название CDCV (common decease-common variant). Именно он послужил основой проекта HapMap.

Стоит заметить, что на настоящий момент гипотеза CDCV пока не смогла окончательно победить конкурирующую концепцию CDRV (common decease-rare variant), которая предполагает, что распространенные заболевания, такие как ожирение, сердечно-сосудистые заболевания или сахарный диабет, возникают благодаря множеству редких аллелей, каждая из которых увеличивает шанс возникновения той или иной болезни. Теоретически аллели, предрасполагающие, например, к диабету, ничем не отличаются от других аллелей, также вносящих свой вклад в выраженность классического количественного признака - чувствительности к избытку сахара или устойчивости к действию инсулина. Другими словами, можно предположить, что в популяции частоты этих аллелей распределены по нормальному закону, на основании чего легко понять, что различия между CDCV и CDRV не так велики. Возможно существование как нескольких распространенных гаплотипов, вносящих небольшой вклад в развитие диабета, так и большого количества редких аллелей, по отдельности вносящих гораздо больший вклад.

Клиническое значение данных, полученных в проекте HapMap, пока меньше теоретических, однако разработанные в ходе этого проекта новые подходы, такие как полногеномный анализ ассоциаций, внушают сдержанный оптимизм.

Первыми практическими результатами реализации программы «Геном человека» явились новые знания о природе многих моногенных заболеваний человека, прежде всего знания о гене, ответственном за то или иное заболевание, и о спектре мутаций, повредивших этот ген в той или иной популяции. Эти знания помогли разработать принципиально новые подходы к диагностике и лечению моногенных заболеваний. Например, знание конкретных мутаций позволяет выявлять их практически на любой стадии развития организма еще до появления первых признаков заболевания. Ранняя диагностика, в свою очередь, позволяет провести профилактическое лечение и предупредить проявление болезни. Например, при заболеваниях обмена веществ, таких как фенилкетонурия , профилактикой является специальная диета. При наличии однотипных мутаций генов семейной гиперхолестеринемии доказано влияние курения на выраженность заболевания. Если болезнь неизлечима, в частности миодистрофия Дюшенна, то дородовая ДНК-диагностика позволяет дать выбор относительно прерывания беременности на ранних сроках или продолжения беременности.

Важно понимать, что клонирование генов, отвечающих за моногенные заболевания, было возможно и в догеномную эру, например с помощью позиционного клонирования или таких методов «прямой» генетики, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) с вырожденных праймеров. Однако определение полной геномной последовательности человека позволяет достичь результатов намного быстрее, например ускорить исследование от хромосомного локуса размером несколько миллионов пар нуклеотидов, сцепленного с геном болезни, до конкретного гена, служащего ее причиной. Именно таким способом в «геномную эру» были впервые клонированы многие гены, ответственные за развитие моногенных синдромов, сопровождающихся высокой вероятностью развития опухолей.

К сожалению, генетическая природа наиболее распространенных заболеваний оказалась гораздо сложнее, чем представлялось в начале геномной эры. Такие болезни, как сердечно-сосудистые заболевания, ожирение или болезнь Альцгеймера, имеют не однозначную, а только статистическую ассоциацию с определенными вариантами определенных генов. Некоторые работы принесли большие разочарования. Так, медики из Бостонского Бригемского госпиталя исследовали 101 генетический вариант, носители которого имеют, согласно различным исследованиям, повышенный риск развития заболеваний сердца. Ученые попытались решить обратную задачу - в группе, состоящей из 19 000 женщин, предсказать развитие у них сердечно-сосудистых заболеваний, основываясь на генотипе. Их наблюдали в течение 12 лет. К сожалению, ни один из опробованных генетических маркеров не дал статистически достоверных предсказаний, прежний метод изучения семейного анамнеза оказался более надежным.

Похожим образом обстоят дела и в лечении ожирения. Несмотря на то что многие генетические варианты ассоциированы с ожирением, однозначных соответствий между каждым идентифицированным вариантом и ожирением до сих пор не обнаружено. Конечно, нет правил без исключений, которым является мутация в гене лептина. Однако эта мутация препятствует половому созреванию, а следовательно, не может распространяться в популяции, поэтому является весьма редкой. Тем не менее обнаружено большое количество генных вариантов, в той или иной степени предрасполагающих к ожирению. Каждый из них более часто встречается у тучных, нежели у худых. Оказалось, что многие худощавые люди являются носителями одной или даже двух копий гена, предрасполагающего к ожирению, однако не набирают вес. Очевидно, сложные фенотипы, такие как ожирение, определяются взаимодействием множества генов и генных вариантов, и проблема не может быть решена, пока все эти варианты не будут описаны и учтены.

Одним из наиболее перспективных современных методов, применяемых для идентификации локусов, контролирующих сложные признаки, является метод полногеномного анализа ассоциаций GWA (Genome Wide Association). Разработка этого метода была бы невозможной без знания полной нуклеотидной последовательности генома человека, а также всех аллельных вариантов этой последовательности. При проведении полногеномного анализа ассоциаций сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов SNP, распределенных по всему геному, типируют в группах больных и здоровых людей. При этом отпадает необходимость собирать большие коллекции ядерных семей, так как в этих исследованиях используются просто большие группы больных и здоровых индивидуумов - по нескольку тысяч людей в каждой группе. Анализ ассоциации между распределением генотипов и фенотипов позволяет установить связь между аллельной вариацией в некотором регионе генома и исследуемым заболеванием. В частности, полногеномный анализ ассоциаций позволил выявить ряд новых аллельных вариантов, вносящих вклад в развитие сахарного диабета 1-го и 2-го типа, а также воспалительного заболевания кишечника и некоторых опухолей.

Теоретическое и практическое значение расшифровки генома человека невозможно переоценить. Обнаружение большого количества однонуклеотидных полиморфизмов (как нейтральных, так и ассоциированных с различными медицинскими проблемами) показало, что человечество гораздо более разнообразно на молекулярном уровне, чем представлялось в догеномную эру. Классический взгляд на геном вида как на совокупность большого числа «хороших» аллелей и небольшого числа «плохих» «мутантных» оказался не полон, и теория нейтральности Мотоо Кимуры (Motoo Kimura) получила окончательное экспериментальное подтверждение. Более того, разнообразие встречающихся в популяциях человека генетических вариантов стерло границу между понятиями «полиморфизм» и «мутация». Полиморфизм, который по определению должен быть нейтральным, в другом генетическом окружении может вносить вклад в приспособленность организма и эту нейтральность утрачивать. Классическим примером такого полиморфизма является мутация, обусловливающая серповидноклеточную анемию .

Оказалось, что доля кодирующей белки ДНК в геноме необычайно мала - не более 1,5%, вся остальная ДНК или транскрибируется в некодирующую РНК, или не транскрибируется вовсе. Геном оказался сложной системой со своей внутренней жизнью, большую роль в которой играют некодирующая ДНК и некодирующие РНК. Было показано, что большинство генов человека подвержено альтернативному сплайсингу, повышающему разнообразие белков по сравнению с разнообразием генов. Более того, многие гены оказались удивительно эволюционно консервативными: за всю историю существования всех многоклеточных организмов они почти не изменились.

Расшифровка генома человека позволила перейти от изучения индивидуальных генов, определяющих развитие заболеваний, к изучению генных ансамблей и сетей, связанных с развитием тех или иных клинически значимых фенотипических признаков. Несомненно, технологии секвенирования нового поколения, позволяющие получать полную последовательность генома индивидуума, в самом ближайшем будущем окажут мощное революционное воздействие как на теорию медицины, так и на клиническую практику. Для наиболее полного использования новых возможностей необходимо обеспечение самого тесного взаимодействия ученых разных специальностей с практикующими врачами, гармоничной интеграции новых технологий и подходов в существующую клиническую практику, что позволит резко повысить эффективность лечения распространенных заболеваний.

Макарова Ю.А., Крамеров Д.А. Некодирующие РНК // Биохимия. - 2007. - Т. 72, № 11. - С. 1427-1448.

Николас Уэйд. Геном человека бесполезен для медицины// «Новая газета» от 18.06.2010.

Патрушев Л.И., Минкевич И.Г. Проблемы размера генома эукариот // Успехи биол. химии. -2007. - Т. 47. - С. 293-703.

Тарантул В.З. Геном человека: Энциклопедия, написанная четырьмя буквами. Языки славянской литературы. - М., 2003. - 396 с.

Margulies M., Egholm M., Altman W.E. et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors // Nature. - 2005, Sep. 15. - N 437(7057). - P. 376-80.

Ormond K.E., Wheeler M.T., Hudgins L. et al. Challenges in the clinical application of whole-genome sequencing // Lancet. - 2010, May 15. - N 375(9727). - P. 1749-1751.

Paynter N.P., Chasman D.I., Paré G. et al. Association between a literature-based genetic risk score and cardiovascular events in women // JAMA. - 2010, Feb. 17. - N 303(7). - P. 631-637.

Samani N.J., Tomaszewski M., Schunkert H. The personal genome - the future of personalised medicine? // Lancet. - 2010, May 1. - N 375(9725). - P. 1497-1498.

Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. et al. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA // Nature. - 1977, Feb. 24. - N 265(5596). - P. 687-695.

Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977, Dec. - N 74(12). - P. 5463-5467.

Shendure J., Porreca G.J., Reppas N.B. et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome // Science. -2005, Sep. 9. - N 309(5741). - P. 1728-1732.

The SEARCH Collaborative Group. SLCO1B1 variants and statin-induced myopathy - a Genomewide Study // N. Engl. J. Med. - 2008 - Vol. 359. - P 789-799.

Wang E.T., Sandberg R., Luo S. et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes // Nature. - 2008, Nov. 27. - N 456(7221). - P. 470-476.

Yoav Gilad, Victor Wiebe, Molly Przeworski, Doron Lancet, Svante Pääbo. Loss of Olfactory Receptor Genes Coincides with the Acquisition of Full Trichromatic Vision in Primates // PLoS Biol. - 2004, Jan. - N 2(1). - P. 0120-0125.

Практически вся история развития биологии проходит под знаком огромного интереса к человеку как биологическому объекту. В большинстве случаев после разработки новых методов они сразу находили применение в исследованиях, посвященных изучению человека. В этом отношении цитогенетика до 1956 г. представляла редкое исключение. Первые описания хромосом датированы еще 70-ми годами XIX в. Хромосомы были обнаружены в виде окрашиваемых структур, образующихся при клеточном делении. Их первые описания, представленные в литературе, были сделаны Страсбургером и Флемингом. Вскоре после этого было замечено, что при слиянии гамет число хромосом удваивается, а в ходе клеточного деления они расщепляются продольно и расходятся в дочерние клетки. Уже в 1882 г. Флеминг пришел к выводу о постоянстве числа хромосом в клетках одного вида. Годом спустя Ру, наблюдая за их особенностями, высказал предположение об участии этих образований в передаче наследственных признаков.

Дальнейшее развитие этой идеи Вейсманом, опиравшимся на полученные к тому времени данные об организации и поведении хромосом, легло в основу хромосомной теории наследственности. На этом этапе развития биологии изучение морфологии и поведения хромосом явно опережало развитие генетики как науки. Годом рождения последней считают 1866 г., когда Грегор Мендель опубликовал главный труд своей жизни. К сожалению, он не был достойно оценен современниками, и законы наследственности были открыты заново де Фризом, Корренсом и Чермаком только в 1900 г.

Имея такую многолетнюю фору, цитологи оказались хорошо подготовленными к моменту принятия научным сообществом основных законов передачи наследственной информации. Им потребовались лишь один-два года для проведения необходимых исследований и наглядной демонстрации соответствия поведения хромосом ожидаемому от гипотетических частиц наследственности. Учитывая очевидное различие в числе генов и хромосом, Саттон в 1903 г. дал структурно-морфологическое объяснение феномену сцепления генов, ранее открытому Корренсом. Описание непарной хромосомы и ее правильная идентификация как половой хромосомы показала значение последней в определении пола. Это обеспечило материальную базу для объяснения феномена сцепления генов с полом, открытого в 1906 г.

Прогресс в исследованиях и анализе полученных в те годы результатов поражает и сегодня. Уже в 1904 г. в гипотезе Саттона- Бовери достаточно полно и точно была определена связь хромосом с элементами наследственности. Вероятно, именно представление этой гипотезы можно считать той точкой в развитии биологии, начиная с которой изучение хромосом неразрывно связано с генетическими исследованиями, а цитогенетика стала отдельной, самостоятельной областью биологии.

В последующие годы успешное развитие цитогенетики было во многом обусловлено удачным выбором объектов исследования, в число которых человек, к сожалению, не входил. Многочисленные работы проводили на политенных хромосомах плодовой мушки Drosophila melanogaster, которая к тому времени уже стала одним из излюбленных объектов исследований генетиков. Активному изучению подверглись мейотические хромосомы амфибий. Несмотря на большой интерес к хромосомам млекопитающих, исследования в этой области в течение длительного времени были менее интенсивными и успешными, что связано с отсутствием полноценных методов анализа.

Путь, пройденный цитогенетикой млекопитающих к настоящему времени, условно можно разделить на четыре этапа.

Первый этап был посвящен главным образом поиску адекватных подходов к разработке соответствующих методик для исследования морфологии хромосом. Значительный вклад в развитие цитогенетики на этом этапе внесли такие выдающиеся отечественные исследователи, как П.И. Живаго, А.Г. Андрес и М.С. Навашин.

Началом второго этапа заслуженно считают 1956 г. - год опубликования работ, в которых были впервые представлены метафазные хромосомы человека. Это позволило правильно подсчитать их число и дать детальное описание их морфологии. Оно оказалась равно 46, а не 48, как полагали ранее. Это исследование было выполнено в Институте генетики г. Лунда (Швеция). Joe-Hin Tjio и Albert Levan провели его на клетках культуры, полученной из эмбриональной печени человека, благодаря усовершенствованию метода приготовления препаратов метафазных хромосом. Следует отметить, что работы в этом направлении со сходными результатами выполняли и ранее. В 1954 г. Eva и Yngve Melander, также работавшие в Институте генетики г. Лунда, определили число хромосом человека как 46. Joe-Hin Tjio и Albert Levan упоминают эти результаты в своей знаменитой статье. Eva и Yngve Melander работали с давлеными препаратами ткани эмбриональной печени, и полученные ими результаты были недостаточно убедительными. Фотография метафазной пластинки с 46 хромосомами человека, представленная в качестве решающего аргумента в вопросе о числе хромосом человека, была сделана Joe-Hin Tjio 22 декабря 1955 г. в 2 ч ночи по местному времени. В те годы днем Институт генетики был активно функционирующим учебным институтом. Исследовательскую работу начинали вечером и часто заканчивали поздно ночью. Эту фотографию с пометкой в нижнем левом углу «Human cell with 46 chromosomes observed 1955 on December 22nd at 2.00 am» Joe-Hin Tjio разослал своим друзьям и коллегам по всему миру. Сегодня в память об этом факте у главного входа в институт висит мемориальная доска (рис. 2-1). Статья, подготовленная Joe-Hin Tjio и Альбертом Леваном, была представлена в журнал «Hereditas» 26 января 1956 г. и опубликована в апрельском номере этого журнала. Высокое качество препаратов и фотографий, анализ 265 метафаз, из которых лишь в четырех число хромосом отличалось от 46, устранили всякие сомнения в том, что более 30 лет число хромосом человека, определенное как 48, было ошибочным. В том же году Чарльз Е. Форд и Джон Л. Хамертон подтвердили полученный их коллегами результат. Этот этап развития цитогенетики характеризуется интенсивными исследованиями морфологии митотических и мейотических хромосом млекопитающих и началом работ, посвященных изучению структурно-функциональной организации хромосомы. В это же время были проведены первые исследования репликации хромосом и их отдельных районов, разработаны методы введения в ДНК хромосом радиоактивных предшественников, а также методы радиографии хромосомных препаратов. Были описаны первые примеры хромосомных нарушений у человека, показано значение изменений хромосомного баланса и возник такой раздел науки, как медицинская цитогенетика.

Рис. 2-1. Мемориальная доска у входа в Институтгенетики г. Лунда

Начало следующего этапа (конец 60-х-начало 70-х годов) было обусловлено созданием методов идентификации хромосом и их отдельных районов. Дифференциальное окрашивание хромосом принципиально изменило ситуацию не только в цитогенетике, но и в генетике человека в целом. Немного раньше разработки методов дифференциального окрашивания хромосом были получены первые гибриды соматических клеток, а затем и клоны клеток, содержащих наряду с полным набором хромосом мыши отдельные хромосомы человека. Описание хромосомного состава линий гибридных клеток и определение присутствующих в них генов человека положило начало картированию его генома. Развитие лазерной микротехники в 70-х годах позволило приступить к изучению принципов организации хромосом человека в интерфазном ядре не на модельных объектах, а в прямых экспериментах. В первых исследованиях для индукции микроповреждений хромосом в интерфазе использовали микролуч лазера. Изучение изменений проводили спустя несколько часов, анализируя метафазные хромосомы. Полученные результаты привели к формированию представлений о существовании внутри интерфазного ядра территорий, занятых материалом отдельных хромосом. В дальнейшем при изучении принципов пространственной организации хромосом в интерфазном ядре успешно использовали гибриды соматических клеток, но настоящий прорыв в этой области стал возможен лишь благодаря огромным успехам в развитии молекулярной биологии и микроскопической техники в конце XX и начале XXI в.

Четвертый этап характеризуется широким внедрением в практику хромосомного анализа молекулярно-цитогенетических методов. Во многом его успешное развитие оказалось обусловлено разнообразным использованием гибридизации нуклеиновых кислот. В настоящее время можно выделить три основных направления в развитии современной цитогенетики.

?- Визуализация и распознавание в составе хромосомы конкретных последовательностей ДНК, РНК и белков. Имеющийся спектр ДНК-проб, используемых для флюоресцентной гибридизации in situ, поразительно широк. Он варьирует от небольших, размером несколько десятков пар оснований, фрагментов ДНК до ДНК-проб, содержащих в своем составе ДНК всего генома человека. В первые годы гибридизацию нуклеиновых кислот in situ использовали главным образом для анализа распределения в хромосомах млекопитающих различных повторенных последовательностей, а затем для определения локализации конкретных генов и уникальных анонимных последовательностей ДНК. В настоящее время она превратилась в мощный инструмент анализа хромосомных аномалий и определения гомологии хромосомных районов у близкородственных и давно дивергировавших видов. Следует отметить, что во многом такой прогресс оказался возможен лишь благодаря созданию систем цифровой регистрации микроизображений и их компьютерной обработки.

?- Пространственная организация хромосомы и клеточного ядра. Быстрое развитие лазерной сканирующей микроскопии и фантастические успехи генной инженерии определили начало нового этапа изучения хромосомы - исследования трехмерной и прижизненной организации хромосомы, анализа архитектоники всего интерфазного ядра, пространственного взаимодействия хромосомных районов и макромолекулярных комплексов. Изыскания, проводимые в этом направлении, варьируют от одновременной визуализации в ядре всех хромосом человека до наблюдения за организацией и локализацией индивидуальных локусов в ядре живой клетки.

?- Развитие технологии биочипов и высокопроизводительных методов секвенирования легли в основу анализа хромосомных аномалий человека с помощью детального анализа геномной ДНК пациента. Таким образом, обнаружение хромосомных нарушений стало возможным в отсутствие препаратов хромосом пациента.

Секвенирование генома человека и дальнейшие работы в этом направлении, включающие исследования по проекту, предполагающему секвенирование 100 тыс. персональных геномов, создало уникальную ситуацию: целый ряд задач уже не требует использования модельных объектов, так как хромосомы человека превратились в один из наиболее удобных объектов исследования. Принципиально, а часто и технически, стало возможным получение любой информации, касающейся организации практически любого хромосомного района или целой хромосомы у конкретного человека. Это поставило вопрос об определении нормы и патологии в составе и организации хромосомы. Вариабельность качественного и количественного состава повторенных последовательностей ДНК С-положительных районов хромосом, районов, которые остаются несеквенированными до настоящего времени, требует разработки принципиально новых подходов к их изучению. Уже показано огромное значение для формирования фенотипа вариабельности по числу копий определенных последовательностей ДНК. Загадочным остается значение различий по локализации и размерам кластеров дуплицированных последовательностей. Несмотря на многочисленные исследования метилирования ДНК и модификации гистонов, мы и в этой области находимся лишь в начале пути. Стремительный рост знаний позволяет детализировать и расширять представления о структурно-функциональной организации хромосом, но с еще большей скоростью он вскрывает новые проблемы, ставит новые вопросы и открывает новые направления исследований.

Сегодня цитогенетика человека - не только область биологии, в которой исследователи заняты решением фундаментальных проблем структурнофункциональной организации генома человека и принимают непосредственное участие в разработке и использовании новых методов анализа в диагностических целях. Она служит неотъемлемым элементом современной медицины, без которого уже невозможно представить пре- и постнатальную диагностику и диагностику онкологических заболеваний.

Развитие любой области науки всегда связано с формированием и развитием ее специального языка, возникновением новых терминов и правил их использования. Эта проблема особо остро встала перед цитогенетикой в связи с необходимостью описания хромосом человека. К ее решению приступили сразу после разработки методов приготовления препаратов метафазных хромосом человека. Результаты, полученные в 1956 г., вызвали резкое увеличение числа исследований, посвященных хромосомам человека. Уже к 1959 г. были предложены различные классификации хромосом, но их многообразие только осложнило общение исследователей, работающих в этой области. Разработка общей системы описания хромосом стала насущной необходимостью. По предложению Чарльза Форда в г. Денвере (Колорадо, США) собрались 14 исследователей и трое консультантов, представлявших все лаборатории, которые к тому времени опубликовали результаты анализа кариотипа человека. На этом собрании, более известном как Денверская конференция (1960), была предложена система описания хромосом, озаглавленная «A Proposed Standard System of Nomenclature of Human Mitotic Chromosomes». Заложенные принципы описания хромосом, несмотря на многочисленные дополнения, обусловленные интенсивным развитием новых методов хромосомного анализа, до настоящего времени остались неизменными.

Спустя три года, на лондонской встрече (1963), организованной по инициативе С. Пенроуза, было официально введено разделение хромосом человека на семь групп, обозначенных буквами от A до G. Ранее оно было предложено К. Патау еще в 1960 г. Следующее значительное событие произошло в 1966 г. в г. Чикаго на III Международном конгрессе по генетике человека. Анализ результатов исследований хромосом человека, накопившихся к этому времени, позволил сформулировать правила краткого описания набора хромосом человека в норме и при патологических изменениях. Эти правила прошли проверку временем и для хромосом человека при рутинной окраске остались неизменными до настоящего момента.

В 1968 г. произошло событие, определившее развитие цитогенетики на долгие годы. Торнбьерн Касперсон и соавт. показали, что окраска растительных хромосом акридиновым оранжевым дает дифференциальное окрашивание по длине хромосомы. Этот способ немедленно применили для хромосом человека, и уже в 1970 г. был опубликован первый кариотип дифференциально окрашенных хромосом, в котором каждая из них получила свой номер. Вскоре был предложен еще ряд методов дифференциальной окраски хромосом, дающих сходные результаты. Анализ и обобщение результатов дифференциального окрашивания требовали систематической работы, поэтому в 1971 г. в Париже на IV Международном конгрессе по генетике человека пришли к заключению о необходимости создания комитета для разработки номенклатуры хромосом человека. Его первое заседание под председательством Джона Хамертона состоялось в Эдинбурге в январе 1972 г. В результате был принят документ, имеющий огромное значение для дальнейшего развития цитогенетики человека. В нем были сформулированы принципы описания не только целых хромосом человека, но и их отдельных районов. В 1976 г. в Мехико на V Международном конгрессе по генетике человека был избран первый международный постоянно действующий комитет по номенклатуре хромосом человека (International Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature). Это был первый постоянно действующий орган с широким международным и географическим представительством. Он работал под председательством Яна Линдстена. Результатом его работы стало создание первой официальной номенклатуры хромосом человека - An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN, 1978).

Следующим шагом в развитии номенклатуры хромосом стала ее адаптация к результатам исследований хромосом человека, выполненных на высоком уровне разрешения. Если ISCN (1978) описывала в хромосомах человека около 400 сегментов, то номенклатура, предложенная комитетом под председательством Бернарда Дютрилё, давала возможность описания хромосом с разрешением в 550 и 850 сегментов на гаплоидный набор (1981). Следующая версия ISCN (1985) была подготовлена в 1984 г. комитетом под председательством Дэвида Хардена. В дальнейшем она была усовершенствована для более точного и однозначного описания хромосомных перестроек, обнаруживаемых при онкологических заболеваниях (ISCN, 1991). Следующая номенклатура была принята 9-13 октября 1994 г. на заседании комитета в Мемфисе (ISCN, 1995). В отличие от предыдущих вариантов, в ней были учтены проблемы описания результатов, полученных при использовании флюоресцентной гибридизации in situ. Десять лет она успешно служила цитогенетике, и лишь в декабре 2004 г. на конференции в Ванкувере были уточнены некоторые ее положения. В ISCN (2005) были представлены G- и R-дифференциально окрашенные хромосомы на высоком уровне разрешения, добавлены новые идиограммы на уровне 300 и 700 бэндов, расширен раздел, касающийся гибридизации in situ, включены дополнительные примеры редких вариантов хромосомных перестроек и введена базовая номенклатура хромосом для сравнительной геномной гибридизации.

Последняя версия номенклатуры хромосом человека была рассмотрена и принята в октябре 2008 г. и опубликована в 2009 г. В ней произошли следующие изменения:

В настоящее время номенклатура ISCN (2009) обязательна для использования исследователями и сотрудниками медицинских учреждений, работающими в области цитогенетики человека.

Хромосомы человека, несомненно, представляют особый случай, что связано с тем вниманием, которое было уделено созданию их номенклатуры. Разработанные принципы рекомендованы для построения номенклатур других видов млекопитающих. Сегодня ISCN (2009) представляет собой и словарь, и грамматику языка цитогенетика. Изложить ее в настоящей главе даже в кратком варианте не представляется возможным. В ISCN (2009) представлены все многочисленные разделы, в которых приведены правила описания кариотипа, хромосом и хромосомных районов, различных хромосомных аномалий и клеточного полиморфизма. В настоящей главе будет представлена только та минимальная информация, без которой будет очень сложно говорить об организации хромосомы и диагностике хромосомных нарушений.

В номенклатуре все хромосомы человека рассматривают как непрерывные серии бэндов. Бэндом считают участок хромосомы, отличающийся от соседних по интенсивности окраски при использовании соответствующего метода дифференциального окрашивания. Согласно ISCN (2009), «бэнды отражают структурнофункциональную организацию генома, обусловливающую регуляцию репликации ДНК, репарацию, транскрипцию и генетическую рекомбинацию. Бэнды - крупные структуры размером 5-10 Mb, которые могут включать сотни генов. Молекулярная основа дифференциального окрашивания хромосом - нуклеотидный и белковый состав, а также функциональная организация участков генома, соответствующих бэндам. G-позитивные бэнды (R-негативные) содержат АТ-богатую, поздно реплицирующуюся ДНК, бедную генами, тогда как G-негативные бэнды (R-позитивные) GC-богаты, обогащены генами, их ДНК рано реплицируется.

Центромерная ДНК и ДНК прицентромерного гетерохроматина состоят из альфоидной ДНК и ДНК, представляющей различные семейства повторенной сателлитной ДНК, легко обнаруживаемые с помощью С-бэндинга. Теломеры состоят из 5-20 kb тандемов гексануклеотидных сателлитных повторенных единиц TTAGGG и интенсивно окрашиваются методом Т-бэндинга. 18S и 28S гены рибосомной РНК собраны в большие кластеры, содержащие около 40 копий каждого гена. Они локализованы в коротких плечах акроцентрических хромосом в районах ядрышковых организаторов и их обнаруживают при окрашивании серебром».

Важные элементы в номенклатуре хромосом - четко видимые ориентиры, представленные постоянными и отчетливыми морфологическими особенностями хромосом и делящие их на районы. К таким ориентирам относят концы хромосомных плеч, центромеры и определенные, наиболее четко видимые бэнды. Нумерацию бэндов и районов осуществляют в направлении от центромеры к теломере. Районы хромосом состоят из бэндов. Бэнды, используемые в качестве ориентиров, полностью входят в состав дистального района. Перечень и описание бэндов, используемых в номенклатуре хромосом человека в качестве ориентиров, приведены в ISCN (2009).

Для обозначения коротких и длинных плеч хромосом, а также районов и бэндов, расположенных в них, используют следующие символы: p - короткое плечо хромосомы, q - длинное плечо. Центромеру обозначают символом «cen», но для обозначения ее части, прилежащей к р-плечу, применяют символ «р10», а прилежащей к q-плечу - символ «q10». Район хромосомного плеча, ближайший к центромере, обозначают цифрой 1, следующий - цифрой 2 и т.д. Для обозначения индивидуального бэнда используют четырехзначную символику:

GTG-дифференциально окрашенные хромосомы человека и идиограмма GTGдифференциально окрашенных хромосом с обозначением номеров бэндов представлены на рис. 2-2. Для описания суббэндов в составе бэнда после номера последнего ставят точку, а затем номер соответствующего суббэнда. Суббэнды в пределах бэнда также нумеруют в направлении от центромеры к теломере. Так, в бэнде 1р31 выделяют три суббэнда: 1р31.1, 1р31.2 и 1р31.3, из которых 1р31.1 - проксимальный, а 1р31.3 - дистальный. Если суббэнды подразделяются на части, то их также нумеруют цифрами, но уже без использования пунктуации. Например, 1р31.11 означает проксимальный элемент суббэнда 1р31.1.

Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом человека позволило выделить в них около 400 бэндов и суббэндов. Использование прометафазных и профазных хромосом привело к значительному увеличению разрешающей способности метода. Число идентифицируемых в гаплоидном наборе хромосом элементов достигает почти двух тысяч, но максимальное число надежно идентифицируемых элементов, которые легли в основу создания идиограмм, не превысило 850. ISCN (2009) включает идиограммы пяти уровней разрешения, соответствующих 300, 400, 550, 700 и 850 элементам в гаплоидном наборе хромосом (см. рис. 2-2). Изменения ISCN (2009) относительно ISCN (2005) были подробно описаны в 2009 г. Бротманом и соавт. В табл. 2-1 приведены только изменения идиограмм хромосом, введенные в ISCN (2009).

Рис. 2-2. Идиограмма хромосом человека согласно ISCN (2009) (400, 550, 700, 850 бэндов на гаплоидный набор хромосом)

Таблица 2-1. Изменения идиограммы хромосом человека, внесенные в ISCN (2009) относительно ISCN (2005)

Рассмотрение вопросов, связанных со структурно-функциональной организацией хромосом человека, требует обсуждения укладки ДНК. На стандартной иллюстрации обычно демонстрируется пространственная организация ДНК, начиная с двойной спирали и заканчивая формированием хроматид метафазной хромосомы (рис. 2-3, см. цв. вклейку). Эта схема, несомненно, полезна для создания первых представлений о строении материала хромосомы, но крайне упрощена и показывает один из ее элементов в какой-либо момент клеточного цикла. Это относят даже к классической двойной спирали ДНК и нуклеосомной организации. Известно, что ДНК не всегда располагается в этой форме, и не везде сохраняется нуклеосомная организация хроматина. При завершении секвенирования генома человека, когда определена последовательность нуклеотидов в ДНК большей части генома и частично расшифрован язык, на котором записана генетическая информация, приходится признать, что часто наши представления ограничены понятиями об одномерном геноме - длинной строке, содержащей четыре символа. Кроме того, в лучшем случае учтены сайты метилирования. Информация о пространственной организации генома, ее изменении во времени, при дифференцировке, модификации гистонов и взаимодействии ДНК с различными белками существенно менее полная и более сложна для анализа.

Исходно центромерой считали место первичной перетяжки хромосомы. В на стоящее время это положение входит во многие определения, которые можно найти в статьях, словарях и в интернете («место первичной перетяжки в хромосоме»; www.mhhe.com). Кроме того, можно найти множество других определений.

Центромера - специализированный район конденсированного хроматина в каждой из хромосом, в котором во время митоза сохраняется контакт хроматид, создающий Х-образную форму хромосомы. Центромеру сложно секвенировать (www.wordnetweb.princeton).

Центромера - обычно расположенный недалеко от центра хромосомы район ДНК, в котором сестринские хроматиды находятся в контакте. Он вовлечен в клеточное деление и выступает в качестве места прикрепления митотического веретена (www.en.wikipedia.org).

Центромера - район эукариотической хромосомы, где собирается кинетохор .

Центромера - район первичной перетяжки, включающий микротрубочки веретена и ответственный за движение хромосом во время митоза и мейоза (www. biology.usgs).

Центромера - перетяжка в хромосоме, делящая ее на плечи и служащая местом соединения сестринских хроматид и прикрепления нитей веретена (www. biologylessons.sdsu).

Центромера - место на хромосоме, где соприкасаются хроматиды и крепятся микротрубочки (www.knowledgerush.com).

Центромера - район перетяжки, соединяющий две сестринские хроматиды и обусловливающий Х-форму хромосомы; место формирования кинетохора (www. biology-online.org).

Большинство этих определений вызывают улыбку, некоторые - грустную, например утверждение, что центромера обычно располагается около центра хромосомы. Тем не менее следует признать, что дать полное и точное определение центромеры не так просто. Очень коротко понятие «центромера» сформулировали Шулер и Салливан (2006): «центромера - локус, состоящий из хроматина, необходимого для правильной сегрегации хромосом». Более подробное определение: «центромера - место сборки кинетохора - белковой структуры, присутствующей на всех хромосомах, координирующей их прикрепление и движение вдоль микротрубочек». В 2009 г. Подгорная и соавт. описали центромеру более развернуто: «центромера - структура, обеспечивающая удержание хромосом, правильность их выстраивания в метафазной пластинке и прикрепление к веретену; участок, ответственный за контроль наступления анафазы». Вероятно, было бы правильнее сказать, что центромера участвует во всех этих процессах. Кроме того, в этом определении сохраняется большая свобода в трактовке того, какие элементы входят в состав этой структуры, а какие взаимодействуют с центромерой. Наглядно проблемы определения центромеры демонстрирует ее описание, приведенное в словаре на сайте www.academic.ru. В нем центромера определена как «участок хромосомы, характеризующийся специфической последовательностью нуклеотидов и структурой. Центромера играет важную роль в процессе деления клеточного ядра и контроле экспрессии генов». Далее сообщается, что «у большинства эукариот центромера не имеет определенной, соответствующей ей нуклеотидной последовательности».

Вероятно, наиболее просто было бы определить центромеру как участок ДНК, на котором происходит сборка кинетохора. При этом следует отметить, что последовательность нуклеотидов этого участка не является ни достаточным, ни необходимым элементом для проявления активной центромеры. Во избежание затруднений с терминологией ниже приведены несколько определений, предложенных Шулером и Салливаном, связанных с центромерой или описывающих часть ее элементов.

Кинетохор - белковая структура, собранная на центромерном хроматине и связывающая ДНК центромеры с протеинами, которые управляют движением хромосомы и определяют ее прикрепление к микротрубочкам веретена.

Центромерный район - район, включающий различные домены, которые располагаются рядом с центромерным локусом и имеют соответствующие функции.

α-Сателлит - семейство сателлитной ДНК, основанное на повторении единицы размером 171 пар нуклеотидов, которая представлена в центромере у всех изученных видов приматов.

Мономер - наименьшая по размеру единица повторенной сателлитной ДНК.

Повтор более высокого порядка - единица повторенной сателлитной ДНК, состоящая из набора копий сателлитных мономеров.

Центромерный хроматин - специализированный хроматин в центромерном районе, служащий основой кинетохора.

В результате многочисленных исследований было показано, что центромерный район имеет сложную структурную и функциональную организацию и представлен мультидоменным локусом. Примечательно, что наряду с высоким консерватизмом белков кинетохора, последовательности нуклеотидов в центромере эволюционно лабильны. Общая черта ДНК центромер разных видов - присутствие в них тандемных повторов соответствующих семейств. Мономерный α-сателлит был идентифицирован в 21 из 24 хромосом человека. Во всех хромосомах он входил в состав повтора более высокого порядка, который в центромерном локусе мог вопроизводиться сотни и тысячи раз, распространяясь на 0,3-5 Mb. Секвенирование генома человека показало различие последовательностей центромерных локусов в разных хромосомах. Последовательности мономеров α-сателлитов часто прерываются вставками LINE-ов, SINE-ов и LTR-(long terminal repeat) ретротраспозонов. Такие разрывы тандемно повторенных α-сателлитов могут сопровождаться изменениями их ориентации. Схема организации центромерной ДНК представлена на рис. 2-4 (см. цв. вклейку). Последовательность α-сателлитной ДНК у человека варьирует от хромосомы к хромосоме. Источником разнообразия, вероятно, служит неравный кроссинговер. В результате неравных обменов возникают 4-6-кратные различия гомологичных участков повторенной ДНК по протяженности.

Центромерный район включает функционально значимые белковые домены, определяющие кинетохорную функцию и формирование гетерохроматина. У эукариот нить ДНК взаимодействует с гистонами Н2А, Н2В, Н3 и Н4, формируя нуклеосомы. В центромерном хроматине гистон Н3 заменен на CENP-A, идентичный гистону Н3 в его центральной части и отличающийся по N- и С-концам. Центромерный хроматин также содержит CENP-В и CENP-С - обязательные компоненты кинетохора. Они формируют прекинетохорный комплекс, служащий предшественником зрелого метафазного кинетохора. Блоки гетерохроматина фланкируют центромерный хроматин с одной или двух сторон. Несмотря на то что центромерный хроматин и гетерохроматин формируются независимо, оба играют важную роль в организации правильной сегрегации хромосом и поддержании хромосомной стабильности.

Центромерный хроматин , содержащий специализированные протеины, отвечает за формирование кинетохора. Следует отметить, что у высших эукариот оно не зависит от последовательности нуклеотидов. В этот процесс вовлечены эпигенетические механизмы, детали которых остаются неизвестными и сегодня. Несмотря на значительную дивергенцию центромерной ДНК, центромерные протеины (CENP-А, CENP-В и CENP-С) или их гомологи представлены у большинства эукариот. Как было сказано выше, для них характерно сходство центральной коровой части и различия по N- и С-концам. Центральным в сборке центромеры считают CENP-А, так как именно он инициирует формирование центромеры в месте своей локализации. Он необходим для вовлечения в структуру организации центромерного района других белков центромеры и кинетохора. Исключением служат белки, специфичные для гетерохроматинового домена, например НР1 (heterochromatin protein 1). Кроме того, CENP-А в противоположность гистону Н3, который входит в состав хроматина в S-фазе, во время репликации, наследуется полуконсервативно. Нуклеосомы, содержащие CENP-А, в дальнейшем не удаляются и не замещаются. Вновь синтезированный CENP-А включается в нуклеосомы центромер в G2-фазе, используя механизм, не зависящий от репликации. Одна из гипотез предполагает, что в G2-фазе, когда начинается конденсация хроматид, гистон Н3, находящийся в хроматине центромеры, замещается CENP-А. «Старый» CENP-А используется как маркер для определения позиций, в которые должен встать CENP-А, заменив гистон Н3. Сходный процесс замещения коровых гистонов происходит в местах специализированного активного хроматина по замене гистона Н3 на гистон Н3.3.

Рассмотрению вопроса о составе ДНК центромерного района и формированию белкового комплекса центромеры посвящены многочисленные обзоры. В них описана сборка на нуклеосомах, содержащих CENP-А проксимального протеинового комплекса (NAC). Последний состоит из шести компонентов (CENP-С, CENP-М, CENP-N, CENP-T, CENP-U, CENP-H), которые вместе с CENP-I формируют внутреннюю пластину кинетохора (рис. 2-5, см. цв. вклейку). Комплекс (CENP-А)- (NAC) служит для присоединения следующего протеинового комплекса внутренней части кинетохора, включающего CENP-K, CENP-L, CENP-O, CENP-Q, CENP-R, CENP-S (комплекс CAD). Комплекс CAD не связывается непосредственно с CENP-А. Детально взаимодействие этих и других белков кинетохора описано в 2009 г. Валдивиа и соавт. Именно поэтому в этой главе не имеет смысла анализировать данную проблему более подробно. Стоит напомнить, что антитела, специфичные к CENP-А, позволяют легко и надежно детектировать центромеру, а благодаря присутствию в центромерных районах хромосом человека комбинаций различных типов альфоидной ДНК, FISH с соответствующими ДНК-пробами позволяет идентифицировать центромеры индивидуальных хромосом человека. В последние годы этот способ практически не используют, так как были получены ДНК-пробы, специфичные последовательностям прицентромерной ДНК индивидуальных хромосом. Они показали свою высокую эффективность при анализе как численных, так и структурных хромосомных аномалий.

На фоне разнообразной информации о сложной организации центромеры, требующей рассмотрения специфических взаимодействий ДНК-белок, белок-белок и целых белковых комплексов, вызывает удивление организация неоцентромер. Неоцентромеры - эктопические центромеры, возникающие вне центромерных районов хромосом. Описаны неоцентромеры различных районов более двух третей хромосом человека. Их число приближается к сотне. Несмотря на отсутствие центромерной α-сателлитной ДНК, неоцентромеры способны формировать функционально активный кинетохор и первичную перетяжку. Возникновение в хромосомах человека неоцентромер часто связано с задержками и аномалиями развития. Кроме того, их обнаруживают при некоторых формах онкологических заболеваний. Возникновение конституционных неоцентромер обычно ассоциировано с такими хромосомными перестройками, как инвертированные дупликации, интерстициальные делеции и маркерные хромосомы. Предпочтительные места локализации неоцентромер - С-негативные, G-позитивные и AТ-богатые районы. В интерфазном ядре они локализованы на поверхности хромосомных территорий. Последовательности нуклеотидов в разных неоцентромерах различаются и сходны с таковыми в ДНК этих районов до формирования неоцентромеры. Митотическая стабильность неоцентромерных хромосом несколько снижена, вероятно, в связи с неоптимальным функционированием кинетохора и отсутствием фланкирующего неоцентромеру гетерохроматина.

Анализ эволюции центромерной ДНК, проведенный путем сравнения различных видов ее последовательностей, дал неожиданные результаты. Несомненно, что без правильного функционирования центромеры невозможно нормальное клеточное деление, но последовательности ДНК в центромере эукариот оказались очень разными. Этот удивительный факт нашел свое отражение в выражении «центромерный парадокс ». Пока не удалось дать ему полноценного объяснения.

В заключение стоит отметить, что, согласно номенклатуре хромосом, любой фрагмент последней остается фрагментом независимо от его размера, если в нем отсутствует активная центромера. Существует только одно исключение - двойные микрохромосомы (DM-хромосомы - double minute chromosomes) - парные экстрахромосомные элементы, не имеющие центромеры. DM-хромосомы - результат амплификации генетического материала, ответственного за возникновение лекарственной устойчивости, либо хромосомные фрагменты, содержащие онкогены (например, 8р24, содержащие онкоген С-myc). Происхождение названия этих элементов имеет исторические корни и только подтверждает, что не бывает правил без исключений, даже при разработке номенклатуры хромосом.

Основная функция теломер - сохранение целостности хромосомы и обеспечение ее полной репликации. Стабильность генома во многом зависит от способности клеток поддерживать размер теломерного района в необходимых пределах. Структурно-функциональная организация теломеры позволяет обеспечить защиту конца хромосомы, замаскировав имеющийся двунитевой «разрыв». Нарушения организации в теломерных районах приводят к хромосомным перестройкам. Они могут возникать при репликативном старении клеток, клеточной трансформации и апоптозе. Феномен репликативного старения клеток, вызванного концевой недорепликацией ДНК, был предсказан Алексеем Оловниковым в 1971 г. За биохимическое доказательство и развитие его идеи американские исследователи Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак в 2009 г. получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

У человека, как и у других видов млекопитающих, теломеры представлены в основном двунитевыми некодирующими повторами (ТТАГГГ)n, заканчивающимися 3?-однонитевым участком. Размер двунитевого участка варьирует от 4 до 12 kb, однонитевого - от 100 до 200 пар оснований.

Необходимые компоненты теломеры - белки, связаные с теломерной ДНК, - TRF1/TRF2 (ТТАГГГ Repeat binding Factor 1/ТТАГГГ Repeat binding Factor 2) и POT1, и ассоциированные с ними белки RAP1, TPP1 и TIN2 (рис. 2-6, см. цв. вклейку). TRF1 и TRF2 связываются с двунитевой теломерной ДНК, а РОТ1 - с одиночной нитью, которая выступает за пределы двунитевой ДНК. TIN2 связывает TRF1 и TRF2 и через TPP1 вовлекает в формирующийся комплекс POT1. RAP1 включается в белковый комплекс через связь с TRF2. Сформированная таким образом нуклеопротеиновая структура защищает конец хромосомы от его соединения с концами других хромосом или двунитевыми разрывами и воздействия экзонуклаз. Помимо кэпирования конца хромосомы, белки теломеры участвуют в формировании t-петли (см. рис. 2-6). Теломерные протеины также участвуют в контроле размера теломеры. Так, TRF1 вовлечен в этот контроль через «счетный механизм». Кроме того, взаимодействие РОТ1/TPP1 с TRF1 позволяет устанавливать взаимодействие двунитевой ДНК, теломеразы с 3?-однонитевым участком ДНК теломеры. Фермент теломераза, обеспечивающий репликацию теломерной ДНК, был выделен в 1984 г. Теломераза - РНК-зависимая ДНКполимераза. Используемая ею в качестве матрицы РНК входит непосредственно в состав ферментативного комплекса. Для осуществления теломеразной активности в клеточном лизате достаточно присутствия каталитического компонента теломеразы (hTERT) и теломеразной РНК (hTR). Поскольку hTR есть в большинстве соматических клеток, то для демонстрации теломеразной активности в стареющих клетках обычно достаточно введения в них hTERT. Это может приводить к увеличению числа делений до достижения барьера Хэйфлика либо к иммортализации клеток. Резкое уменьшение активности теломеразы и укорочение теломер обычно сопутствуют клеточной дифференцировке. Часто отмечают зависимость размера теломеры от возраста человека.

Кроме регуляции активности теломеразы, существуют и другие, альтернативные способы контроля размера теломер. Исследования, проведенные на трансформированных и опухолевых клеточных линиях человека, показали, что более чем в трети активно пролиферирующих in vitro клеточных линий и в 10-15% опухолей теломеразная активность отсутствует. Теломеры в таких клетках значительно различаются по размеру. Чаще всего они достаточно длинные - от 20 до 80 kb, но в некоторых случаях в одних и тех же клетках описаны как длинные, так и очень короткие теломеры, размер которых не превышает 2 kb, т.е. он меньше, чем длина теломер стареющих клеток. Установлено, что изменение размера теломер в таких линиях происходит одномоментно или, по крайней мере, достаточно быстро. Обнаруженные альтернативные механизмы поддержания размера теломер получили название ALT - Alternative Lengthening of Telomeres. Кроме вышеперечисленных, характерными признаками ALT-клеток считают присутствие в них специальных ядерных структур - ALT-ассоциированных промиелоцитных лейкемических телец (APB). Для этих клеток характерны пострепликативные межхроматидные теломерные обмены. Как правило, APB содержат кольцевую теломерную ДНК, PML-белок, теломеро-ассоциированные белки TRF1 и TRF2, а также ряд факторов репарации и рекомбинации ДНК. В некоторых клеточных линиях, кроме изменений в самих теломерах, наблюдают модификации субтеломерных районов. Например, последовательности ДНК субтеломерных районов одной хромосомы могут присутствовать в терминальных районах других хромосом. Несмотря на существующие различия в биологии теломер человека и дрожжей, данные о структуре теломер последних в клонах, выживших в условиях отсутствия теломеразной активности, оказались важными для понимания происхождения ALT-теломер у человека. Альтернативные механизмы поддержания размера теломер наиболее детально были изучены на примере нескольких видов дрожжей: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis и Candida albicans. У Saccharomyces cerevisiae было показано существование двух возможных путей поддержания размера теломер в отсутствие теломеразы, основанных на гомологичной и негомологичной рекомбинации ДНК. У дрожжей выделяют два типа поддержания размера теломеры. Удлинение теломер по типу I проходит в основном в результате амплификации Y?-субтеломерных элементов, представленных несколькими субтеломерными повторами размером 6,7 kb. В этом случае Y?-элементы оказываются разделенными короткими вставками теломерных повторов размером от 50 до 150 пар оснований. Следует отметить, что для поддержания размера теломерного района по типу I требуется активность факторов Rad54, Rad51, Rad55, Rad57, Rad52 и Exo1. Молекулярный механизм их взаимодействия друг с другом и с ДНК хорошо согласуется с данными, полученными при изучении рекомбинации, индуцированной двунитевыми разрывами на границе теломерных и субтеломерных повторов. Удлинение теломер по типу II приводит к амплификации в основном теломерных повторов. Как и в первом случае, для этого требуется рекомбинация, на что указывает потребность в постоянной активности Rad52. Показано, что консервативный и многофункциональный комплекс протеинов MRX, включающий Mre11, Rad50 и Xrs2, связывается с теломерой, где взаимодействует с одной из трех протеинкиназ: ATM, Tel1 или Mec1. Комплекс MRX действует как нуклеазно-геликазный комплекс, который вместе с 5?-3?-экзонуклеазой Exo1 формирует одиночную 3?-нить, которая может обеспечивать организацию репликации в варианте «катящегося кольца» либо «катящейся петли». Оба гипотетических механизма ALT включают рекомбинацию ДНК, причем она может быть как гомологичной, так и негомологичной, приводить как к увеличению, так и к уменьшению размера теломер, в основном за счет изменения числа копий теломерного повтора. В процессе поддержания размеров теломер как по I, так и по II типу в результате гомологичной рекомбинации может формироваться кольцевая теломерная ДНК.

Заметно сходство между структурой АLT-теломер в клетках человека и клонах дрожжей, дефицитных по активности теломеразы. Хотя точный механизм формирования теломер и субтеломерных последовательностей в ALT-клетках человека пока не выяснен, в настоящее время предполагают, что ALT-теломеры у человека могут образовываться по механизмам, сходным с вышеописанными. Предполагают, что может существовать несколько вариантов реализации ALT, в том числе и те, которые не описаны у дрожжей, а также дополнительные механизмы, связанные с межхромосомными и межхроматидными сестринскими теломерными обменами (T-SCE). T-SCE сейчас рассматривают как надежный маркер ALT-клеток.

В ряде исследований было показано, что в условиях отсутствия теломеразной активности у гомозигот по мутации в гене теломеразной РНК соматические и даже стволовые клетки мыши оказались способны после этапа некоторого укорочения теломер решить проблему стабилизации их размера. В процессе формирования новых теломер отмечали признаки хромосомной нестабильности, выражающиеся в слияниях хромосом, амплификации теломерных и нетеломерных последовательностей. В результате были сформированы функционирующие теломеры особой структуры, в которых теломерные повторы перемежались с нетеломерными. Такие теломеры имели признаки теломер хромосом Saccharomyces cerevisiae, сформированных в отсутствие теломеразной активности. В таких хромосомах трудно провести границу между собственно теломерой и субтеломерным районом.

Проблема нестабильности теломер непосредственно связана со слияниями хромосом, присутствием в них интерстициальных теломерных повторов и выяснением роли последних в эволюции хромосом. Предполагают, что районы локализации интерстициальных теломерных повторов могут быть местами эволюционных слияний и разделений. Число и локализация теломерных повторов, вероятно, могут во многом определять направление хромосомной изменчивости и оказывать большое влияние на структурно-функциональную организацию интерфазного ядра клеток человека.

Дисфункцию теломер, связанную в том числе с их укорочением и выражающуюся в нарушение «кэппинга», в настоящее время рассматривают как механизм, запускающий теломерные слияния хромосом. Неоднократно было показано, что нарушение кэппинга теломер приводит к распознаванию конца хромосомы как разрыва, который должен быть репарирован. Это ведет к теломера-теломерному слиянию хромосом, образованию дицентрических хромосом или мостов. Разрывы в дицентриках, как правило, приводят к новым хромосомным перестройкам, при этом в сайтах слияния сохраняются блоки теломерной ДНК. Такой цикл обозначают как «разрыв-слияние-мост». Как правило, он сопровождается амплификацией ДНК и крупными терминальными делециями. Образование даже одного конца хромосомы без теломеры либо с предельно укороченной теломерой может послужить причиной длительной геномной нестабильности и генерировать разнообразные типы хромосомных аберраций .

Важный момент стабилизации генома - формирование в районах разрывов полноценных теломер. В настоящее время установлено множество факторов, влияющих на «кэппинг» теломер. Среди них можно назвать фактор TRF2, а также компоненты, необходимые для гомологичной и негомологичной рекомбинации при репарации двунитевых разрывов ДНК, в том числе комплекс Rad50/Mre11, который, связываясь с TRF2, помогает образованию Т-петли. В ряде случаев механизм влияния факторов репарации и рекомбинации на стабильность хромосом не совсем ясен. Например, показано, что белок Ku86 играет большую роль в функционировании теломер, предотвращая их слияния независимо от длины теломерного повтора и наличия одноцепочечного 3?-конца молекулы ДНК. У Ku86-дефицитных мышей отсутствует укорочение теломер или деградация одноцепочечного 3?-конца, но происходят теломерные слияния с сохранением в сайтах последнего крупных блоков теломерной ДНК.

Изучение распределения теломерных повторов в хромосомах показало, что они могут находиться не только в теломерных районах. Теломерная ДНК была обнаружена в интерстициальных районах хромосом (ITS - interstitial telomeric sites) более чем у 100 видов позвоночных разных классов и отрядов. В хромосомах человека было обнаружено более 50 ITS, причем в гомологичных районах хромосом других видов приматов их обычно также обнаруживали. Показано, что локализация значительной части ITS совпадала с районами слияний или разрывов хромосом, случавшихся в эволюции хромосом млекопитающих. Известно, что хромосомы индийского мунтжака образовались в результате тандемных слияний конец в конец предковых хромосом. В районах слияний были обнаружены теломерные и субтеломерные сателлитные повторы.

Клонирование интерстициальных теломерных последовательностей из хромосом человека позволило идентифицировать в них два типа кластеров теломерных повторов. Один из них состоял из прямых теломерных повторов, другой - из повторов, ориентированных голова к голове. Предполагают, что возникновение первого типа кластеров связано с участием теломеразы в репарации двунитевых разрывов в процессе реорганизации хромосом. Сходным способом, по-видимому, возникли ITS, расположенные в районах конститутивного гетерохроматина и в ядрышкообразующих районах. Было показано, что для образования новых кластеров теломерных последовательностей с участием теломеразы в местах разрывов достаточно последовательности из 3-4 нуклеотидов, гомологичных теломерному мотиву. Кластеры второго типа, вероятно, связаны с теломерными слияниями хромосом. Они обнаружены у человека в районе 2q13, представляющем собой место слияния двух предковых хромосом. Дополнительное доказательство теломерного слияния в этом районе - данные о локализации в нем последовательностей гомологичных ДНК субтеломерных районов соответствующих хромосом человекообразных обезьян. Такое же происхождение, возможно, имеет ITS в бэнде q41 хромосомы 1 человека.

Детальное исследование состава других ITS и их фланкирующих последовательностей в геноме человека, а также их ортологов в геномах приматов показало, что большинство из них образовалось 5-40 млн лет тому назад в результате репарации двунитевых разрывов вследствие негомологичной рекомбинации, которая, вероятно, происходила с участием теломеразы. Возможно, эти ITS представляют «рубцы», маркирующие места двунитевых разрывов ДНК в ломких сайтах хромосом герминальных клеток. В большинстве ITS теломерная ДНК, вероятно, не несет какой-то определенной функции, но она, как и любые другие микросателлиты, может способствовать увеличению частоты негомологичной рекомбинации в этих районах и, таким образом, способствовать возникновению хромосомных аномалий. К схожему выводу пришли исследователи ITS хромосом китайского хомячка. Они установили, что у него блоки теломерных последовательностей размером 29-126 kb фланкированы АТ-обогащенными последовательностями. Известно, что последние нестабильны и присутствуют в ломких сайтах хромосом млекопитающих, служащих «горячими точками» спонтанных и радиационных разрывов, а также сайтами с повышенной частотой рекомбинаций. Независимо от того, каким образом сформировались ITS, они могут быть не только «горячими точками» разрывов в эволюции хромосом, но, что важно, и основой для возникновения новых теломер. При разрывах в области ITS или субтеломер интактные и дегенерированные теломерные последовательности могут способствовать теломеризации разорванных концов хромосом. Описан случай образования в клетках культуры индийского мунтжака новых хромосом в результате фрагментации хромосом по районам локализации ITS и последующей амплификации находящихся там теломерных повторов. Эти данные могут иметь значение при изучении хромосомной нестабильности в малигнизированных клетках человека.

Если структуру и функцию теломер в настоящее время исследуют интенсивно, и этой проблеме посвящено множество экспериментальных и теоретических работ, то структура и назначение субтеломерных районов пока остаются в тени. С очень большим упрощением можно сказать, что классическая организация конца хромосомы включает район теломерных повторов, за которым следует район субтеломерных повторов, и, наконец, эухроматиновый район, в состав которого входят транскрипционно активные участки ДНК.

В действительности концы хромосом организованы намного сложнее. В большинстве случаев не существует четких границ между теломерными, субтеломерными и эухроматиновыми районами хромосом. На границе теломерных и субтеломерных районов обнаруживают чередование теломерных и субтеломерных повторов, а последние присутствуют в эухроматиновых прителомерных районах, для которых характерно присутствие кластеров дуплицированных последовательностей. Следует отметить некоторые особенности эухроматиновых районов, прилежащих к терминальным районам хромосом. Для них характерны повышенное содержание CpG-островков, более высокая концентрация генов и частота рекомбинации. Вполне возможно, что это имеет отношение не к структурнофункциональной организации теломеры как отдельного элемента хромосомы, а к принципам строения и функционирования хромосомы как таковой, или даже связано с оптимизацией пространственной организации всего интерфазного ядра.

У человека и приматов субтеломеры насыщены интактными и дегенерированными теломерными последовательностями, короткими прямыми и инвертированными повторами, получившими название «теломеро-ассоциированные повторы», и AТ-богатыми участками. Особенность субтеломерных районов человека - высокая концентрация сегментных дупликаций. Они содержат около 40% всех сегментных дупликаций генома, половина из которых образовались относительно недавно. Примером сегментных дупликаций, локализованных в субтеломерах, могут служить дупликации, содержащие члены семейства генов обонятельных рецепторов. Блоки, содержащие по три гена из этого семейства, обнаружены в субтеломерах 14 хромосом человека.

Молекулярный анализ сегментных дупликаций показал, что большинство из них образовалось в результате повторных актов негомологичной и гомологичной рекомбинации, а также транслокаций в терминальных районах хромосом. Субтеломерные районы - наиболее быстро эволюционирующие участки генома, для которых характерна высокая скорость нуклеотидных замен и дупликаций небольших районов. Предполагают, что циклы изменения степени полиморфизма в субтеломерах чередуются с крупными геномными перестройками в них. Сравнение результатов секвенирования геномов человека и мыши показало, что 53% сайтов, в которых нарушена синтения, содержат сегментные дупликации, что в 3 раза превышает среднюю частоту нарушения таковой в других районах генома. Такая организация субтеломерных районов хромосом может иметь большое значение в структурно-функциональной организации всей хромосомы.

Неудивительно, что ее изменения могут приводить к различным нарушениям развития. Наиболее интригующий пример - одна из форм аутосомной доминантной мышечной дистрофии (FSHD), ассоциированной с районом 4qter. Этот участок у нормальных индивидуумов содержит кластер полиморфного повтора D4Z4 размером от 11 до 150 kb. У больных он не превышает 11 kb. В датской популяции он был также обнаружен при 10qter-анализе. Для этой популяции была продемонстрирована высокая частота мейотических (20%) и митотических обменов между 4qter и 10qter.

Возможно, что причиной высокой частоты мейотических обменов в субтеломерах негомологичных хромосом служит участие терминального хромосомного домена в формировании хромосомного букета на стадии перехода из лептотены в зиготену. Известно, что с теломер начинается конъюгация хромосом в мейозе. Обычно мейотическая рекомбинация происходит позже, после конъюгации гомологов, но незаконная рекомбинация, вероятно, начинается на более ранних этапах - при возникновении пространственного сближения и установлении контактов между хромосомными районами. Это может приводить к расселению субтеломерных последовательностей по негомологичным хромосомам и обмену материала негомологичных плеч хромосом. Косвенный аргумент в пользу такой возможности - вышеприведенные данные о структуре субтеломер у человека. Кроме того, такой взгляд находит подтверждение в модели организации субтеломер хромосом человека, предложенной Флинтом и соавт. Согласно этой модели, субтеломерный район разделяется дегенерированными теломерными повторами на два субдомена. Дистальный субдомен содержит повторенные последовательности, которые взаимодействуют с концами всех хромосом, тогда как проксимальный - только те, которые взаимодействуют с последовательностями гомологичных хромосом. Несмотря на явную упрощенность таких представлений, они отражают тот факт, что чем ближе субтеломерный сайт расположен к теломере, тем чаще в нем могут происходить рекомбинационные события между негомологичными хромосомами.

Ядрышкообразующие районы хромосом (ЯО-районы) локализованы в коротких плечах акроцентрических хромосом человека 13, 14, 15, 21 и 22. На препаратах метафазных хромосом активные ЯО-районы представлены вторичными перетяжками, окрашиваемыми азотнокислым серебром. Наряду с генами 5,8S, 18S и 28S рРНК, ЯО-районы содержат межгенные спейсеры и различные микросателлитные последовательности. Транскрипция генов рРНК - необходимое условие поддержания нативности ядрышек, которое может служить маркером здоровья клетки. Ингибирование синтеза рРНК ведет к деградации ядрышка, повышению количества р53 и индукции апоптоза. В ряде работ полуколичественную оценку активности ЯО-районов используют в качестве показателя состояния клетки и прогностического критерия. В среднем на геном человека приходится около 400-500 копий генов рРНК (по 40-50 на один ЯО-район). Их общее число в геноме разных индивидуумов может значительно варьировать (от 200 до 700). Количество копий генов рРНК в ЯО-районах разных хромосом также может значительно меняться. Редкий вариант - акроцентрические хромосомы с двумя ЯО-районами в коротком плече. Неравномерна и транскрипционная активность генов рРНК в разных кластерах. В настоящее время неизвестно, чем определяется функциональный статус каждого конкретного гена. Возможным фактором, влияющим на транскрипционную активность генов рРНК, может быть вариабельность регуляторных участков, входящих как в состав повторяющихся единиц рДНК, так и участков ЯО-районов, примыкающих к кластерам рДНК. Собственно ЯО-районы фланкированы участками хромосом, обогащенным повторенными последовательностями.

На примере белков, характерных для ядрышка, была продемонстрирована функция хромосом в качестве перевозчиков ядерных белков во время митоза . При вхождении клетки в метафазу, по крайней мере, некоторые белки ядрышка переходят на поверхность хромосомы, а после телофазы при формировании ядер участвуют в образовании новых ядрышек. Такое использование хромосом в качестве клеточных извозчиков значительно упрощает решение проблемы сборки новых ядер после клеточного деления, обеспечивая правильную исходную пространственную локализацию ядерных белков.

Секвенирование генома человека позволило взглянуть на хромосомы под новым углом зрения. Анализ распределения дуплицированных последовательностей показал, что более чем половина пограничных участков, разделяющих эухроматиновые районы и прицентромерный гетерохроматин, содержит дуплицированные сегменты. Индивидуальные дупликации происходят из различных участков генома и включают фрагменты известных генов, в которых могут присутствовать как экзоны, так и интроны. Многочисленные дуплицированные последовательности в этих и в подобных им районах собираются вместе конец к концу, формируя большие блоки, которые по размерам могут превышать миллион пар оснований. Вероятно, они играют роль буферных зон между участками хромосом, состоящих из плотно упакованных тандемных сателлитных повторов и районов, содержащих транскрипционно активную ДНК. Сравнительный анализ близкородственных видов приматов указывает, что формирование таких кластеров дуплицированных последовательностей проходило в течение последних 30 млн лет. При этом паралогичные сегменты, содержащие дуплицированные последовательности и варьирующие по размеру, оказались распространенными вдоль всех хромосом, от прицентромерных до субтеломерных районов (рис. 2-7, см. цв. вклейку). Например, в хромосоме 21 размер проксимального кластера, локализованного в прицентромерном районе, достигает 1 Mb, а самого дистального в субтеломерном районе - 130 kb. В хромосоме 22 размеры этих кластеров составляют 1,5 Mb и 50 kb соответственно. Следует отметить, что крупные кластеры обычно содержат преимущественно межхромосомные дупликации. Отдельные дуплицированные последовательности, входящие в них, значительно варьируют по размерам (от менее 1 kb до 85 kb). Обычно дуплицированные последовательности ДНК представлены в нескольких кластерах. Например, дуплицированные фрагменты гена NF1, локализованного в 17q11.2, также были обнаружены в 14q11, 15q11, 22q11, 2q21, 18q11, 21q11, 12q12, 1q32 и 20q11. Большинство дупликонов в прицентромерных районах не вовлечены в транскрипцию. Они представлены лишь фрагментами исходных транскриптомов, и в этих кластерах отсутствуют необходимые регуляторные последовательности. Тем не менее было обнаружено несколько примеров мРНК и EST-последовательностей, соответствующих копиям дупликонов из прицентромерных районов. Правда, в большинстве случаев транскрипция была ограничена стволовыми и трансформированными клетками, а также эмбриональными тканями.

Анализ последовательностей, фланкирующих прицентромерные дупликации, показал, что они представлены несовершенными полипиримидиновыми или полипуриновыми (CAGGG, GGGCAAAAAGCCG, GGAA) последовательностями и HSREP522-элементами. Многие из них имеют сходство с теломерными повторами, субтеломерными последовательностями и последовательностями, определяющими перестройку иммуноглобулиновых генов. Кластеры повторяющихся CAGGG, GGGCAAAAAGCCG и HSREP522 могут способствовать формированию особой конфигурации ДНК, стимулирующей негомологичные обмены, и, таким образом, приводить к интеграции дупликонов в районы, граничащие с прицентромерным гетерохроматином. Вероятно, такой механизм не единственный при формировании сегментных дупликаций, так как известны примеры дупликаций, не имеющих на своих границах подобных повторенных структур.

Сравнение сегментных дупликаций из разных хромосом (2p11, 10p11, 16p11 и 22q11) обнаружило их сходство, позволившее предложить двушаговую модель формирования сегментных дупликаций (рис. 2-8, см. цв. вклейку). На первом этапе предполагается внедрение дубликатов различных уникальных последовательностей в прицентромерный район. На втором этапе происходят дупликация фрагмента из протяженного комплекта ранее дуплицированных последовательностей и его встройка в новое положение. Существование сегментных дупликаций в хромосомах человека имеет ряд последствий. Одно из них - возникновение нового фактора геномной нестабильности. Спаривание в мейозе паралогичных сегментов может приводить к неравному кроссинговеру и в результате - к микродупликациям и микроделециям. Действительно, многие из районов, для которых характерна повышенная частота внутрихромосомных перестроек, приводящих к различным заболеваниям или обнаруживаемых при онкологических болезнях, активно участвуют в процессе формирования прицентромерных сегментных дупликаций. Паралогичные сегментные дупликации, находящиеся на одной хромосоме, могут быть причиной или следствием инверсий. Это относится к перицентрической инверсии в хромосоме 9 - одному из наиболее распространенных вариантов хромосомного полиморфизма у человека. Результаты FISH-анализа указывают на высокую степень гомологии в бэндах 9р12 и 9q13, соответствующих точкам разрыва при инверсии. Инверсия в хромосоме 2 имеет границы в 2р11 и 2q13. В этих районах присутствуют протяженные участки сегментных дупликаций со степенью гомологии 98%.

Завершая рассмотрение сегментных дупликаций, следует отметить, что их существование и полиморфизм в районах локализации могут усложнять молекулярноцитогенетическую диагностику хромосомных нарушений человека вследствие обнаружения гомологичных последовательностей, представленных в различных сегментных дупликациях.

В 70-х годах XX в. в культуре клеток некоторых индивидуумов был обнаружен феномен повышенной ломкости хромосом. Он существовал либо в клетках обычной культуры, либо возникал только при определенных воздействиях на нее. Для него характерна повышенная частота хромосомных разрывов. Как правило, последняя или пробелы хроматид в конкретных хромосомных участках не связаны с какими-либо заболеваниями, но существование ломких сайтов может сопровождаться развитием различных аномалий. Так, в 1969 г. у больных с синдромом Мартина-Белл, сопровождающимся умственной отсталостью, был обнаружен специфический цитогенетический маркер-ломкий сайт в дистальной части длинного плеча хромосомы Х, позже локализованный в суббэнде Xq27.3 (FRAXA). Основные диагностические признаки заболевания: умственная отсталость, прогнатизм, широкое лицо с чертами акромегалии, большие оттопыренные уши, макроорхидизм в постпубертатном периоде, аутизм, гиперкинезы, плохая концентрация внимания и дефекты речи, более выраженные у детей. Отмечают также аномалии соединительной ткани с повышенной растяжимостью суставов и пролапсом митрального клапана. Относительно полный спектр клинических признаков обнаруживают только у 60% мужчин с ломкой хромосомой Х; 10% больных не имеют лицевых аномалий, у 10% присутствует только умственная отсталость без других признаков, а у 30% пациентов отсутствует макроорхидизм.

Синдром ломкой хромосомы Х имеет высокую частоту встречаемости (один случай на 1500-3000 человек) и необычное наследование. Клинические признаки заболевания обнаруживают только у 80% мужчин-носителей мутантного гена. Остальные 20% пациентов как клинически, так и цитогенетически нормальны, но могут иметь внуков, рожденных от дочерей-носителей мутантного гена, с клиническими симптомами синдрома. Мужчины-носители мутации, не имеющие клинических признаков, служат передатчиками неэкспрессированного мутантного гена (трансмиттеры), который может манифестировать в последующих поколениях. Среди женщин, гетерозиготных по мутантному гену, выделяют два типа:

Молекулярный механизм наследования и передачи мутации был выяснен в 1991 г. Было установлено, что развитие синдрома связано с мутацией в гене FMR1 (Fragile site Mental Retardation 1 - ломкий участок хромосомы, связанный с развитием умственной отсталости первого типа). В первом экзоне гена FMR1 отмечают многократное увеличение числа копий простого тринуклеотидного повтора CGG. В норме оно варьирует от 5 до 52. У пациентов с синдромом Мартина-Белла их число составляет 200 и более. Феномен резкого увеличения числа копий CGGповторов (экспансии числа тринуклеотидных повторов) зависит от пола потомка. Такая экспансия - постзиготическое событие, происходящее на ранних стадиях эмбриогенеза у эмбрионов женского пола.

В настоящее время в дистальном районе длинного плеча хромосомы Х найдено еще несколько ломких участков: FRAXE, FRAXF и RFAXD. FRAXE и FRAXF не связаны с аномалиями развития. RFAXD располагается рядом с FRAXA. Его обнаруживают у нормальных индивидуумов с частотой около 1-2%, что создает затруднения при диагностике синдрома Мартина-Белла. Возможно, что ломкие районы хромосом также вовлечены в процесс клеточной трансформации, возникающий при онкологических заболеваниях.

Впервые сестринские хроматидные обмены (СХО) были описаны много лет назад. Несмотря на огромные успехи современной цитогенетики и широкое использование СХО в оценке мутагенности и онкогенности различных факторов, их механизм остается неизвестным. Одно из наиболее полных определений СХО включает следующие положения: «Обмен гомологичных сегментов генетического материала между сестринскими хроматидами хромосомы: между сестринскими хроматидами мейотических тетрад или между сестринскими хроматидами дуплицированных соматических хромосом. Частота обменов увеличивается в результате повышенной хромосомной ломкости. Она обусловлена наследственными факторами или влиянием окружающей среды, таким как ультрафиолетовое, ионизирующее облучение и другие мутагенные агенты. Особенно высока частота СХО при синдроме Блюма». Метод обнаружения и подсчета СХО в большинстве хромосомных районов достаточно прост и описан выше. К делящимся клеткам добавляют 5-бромдезоксиуридин. После двух клеточных циклов в одной из хроматид он присутствует в обеих нитях ДНК, а в другой - только в одной. Отличать их позволяют специальные методы окрашивания. Более сложен учет СХО в терминальных районах хромосом. Последние известны как горячие точки (ГТ) мейотических рекомбинаций и двунитевых разрывов. Проведенные оценки показали, что 17% всех СХО приходится на теломерные и субтеломерные районы, представляющие лишь 0,1% материала всех хромосом. Частота встречаемости СХО в них в пересчете на нуклеотиды (один СХО на 1600 пар оснований) в 160 раз выше, чем где-либо еще в геноме человека. Для оценки частоты в теломерных районах были использованы специальные методы, такие как CO-FISH (chromosome orientation fluorescence in situ hybridization).

Невысокую частоту СХО в клетках человека (от трех до восьми СХО на метафазу при использовании стандартных методов) считают нормой. Она может значительно увеличиваться при воздействии некоторых мутагенов, что делает определение частоты СХО эффективным тестом на мутагенность. Она также значительно повышена при ряде наследственных заболеваний человека. При синдроме Блюма число СХО на метафазу может достигать 100-160. Частота СХО зависит, как минимум, от двух факторов - частоты возникновения двунитевых разрывов ДНК и эффективности репарационной системы клетки. В связи с этим связь наследственных нарушений, снижающих эффективность репарационной системы, и мутагенных воздействий с увеличением частоты СХО кажется очевидной. Простая логика говорит, что если часть двунитевых разрывов после репарации приводит к СХО, то воздействие мутагенов, вызывающее образование разрывов ДНК, должно приводить к увеличению числа СХО. С другой стороны, увеличение количества сбоев при репарации разрывов также должно вызывать повышение частоты обменов гомологичными участками сестринских хроматид. Снижение эффективности репарационной системы ограничено традиционными представлениями об увеличении времени репарации разрыва двойной нити ДНК в одной хроматиде, и, как следствие, увеличением вероятности разрыва ДНК второй хроматиды с последующим лигированием ДНК разных хроматид. В этом случае приходится допустить рост вероятности возникновения неравных СХО, приводящих к мутациям.

В результате даже такого поверхностного рассмотрения проблемы возникает ряд вопросов. Отличаются ли СХО, возникающие при нормальном клеточном делении, от индуцированных мутагенами или служащих следствием различных наследственных нарушений? Каким образом клетка решает проблему нескольких СХО, в норме возникающих в каждом клеточном цикле? Чтобы попытаться найти ответы на эти вопросы, полезно рассмотреть процесс конденсации хроматина хромосом в митозе. После репликации ДНК сестринские хроматиды, удерживаемые когезиновым комплексом, расположенным с интервалом около 10 kb, остаются рядом. При переходе клетки в митоз когезин уходит, а с ДНК связываются конденсины, что приводит к компактизации хроматина. На этом этапе начинается разделение материала хроматид. Сложно представить, что две нити ДНК могут без затруднений сформировать две отдельные хроматиды. Считают, что сестринские хроматиды на ранних стадиях митоза удерживаются за счет районов, из которых еще не ушли молекулы когезина, но можно предположить, что наряду с этим хроматиды удерживаются рядом и за счет «перепутывания» ДНК сестринских хроматид в некоторых участках хромосом. В этих местах должно возникать дополнительное напряжение. Похоже, что решение проблемы завершения полного разделения сестринских хроматид невозможно без разрывов (энзиматической рестрикции) ДНК в них и их последующей репарации. Высокой эффективности восстановления целостности ДНК в ее исходном виде можно достичь посредством участия в формировании разрыва рестриктаз, под действием которых образуются липкие концы ДНК. Пространственная близость гомологичных участков ДНК сестринских хроматид позволяет допустить возможность возникновения разрывов в гомологичных сайтах двух хроматид с последующим лигированием нитей ДНК, принадлежащих разным хроматидам. Таким образом, обеспечивается успешное расхождение хромосом с небольшим побочным эффектом - возникновением нескольких СХО на геном, при этом абсолютная точность при проведении обменов практически гарантирована. Это только гипотеза. Механизм формирования СХО остается неизвестным.

Тем не менее стоит рассмотреть возможные следствия из приведенных выше предположений. Если увеличение числа СХО обусловлено множеством разрывов двунитевой ДНК, возникших под воздействием мутагенов, естественно предположить, что они будут происходить не точно в гомологичных сайтах сестринских хроматид. В этих случаях возникновение СХО должно сопровождаться формированием мутаций. Таким образом, СХО, возникающие под воздействием мутагенов, могут принципиально отличаться от СХО, вызванных нормальным расхождением хроматид.

Механизмы увеличения числа СХО при различных наследственных нарушениях, вероятно, различаются, при этом могут быть затронуты различные этапы процесса репликации или репарации ДНК. Так, например, при синдроме Блюма мутации возникают в гене, кодирующем геликазу. Известно более десятка мутаций, характерных для анемии Фанкони. Продукты большинства генов, на которые влияют мутации, участвуют в формировании комплекса, осуществляющего лигазную активность. Таким образом, подобные мутации могут значительно увеличивать время лигирования ДНК при репарации двунитевого разрыва. Увеличение времени лигирования повышает вероятность пространственного разобщения концов ДНК, возникших при двунитевом разрыве, и, как следствие, последующего лигирования концов, исходно принадлежащих ДНК разных хроматид или даже различных хромосом. Действительно, у пациентов с анемией Фанкони увеличивается не только частота СХО, но и количество межхромосомных обменов.

Разнообразие механизмов формирования СХО, вероятно, одна из основных причин того, что они остаются неизвестными до настоящего времени.

При анализе реорганизации хромосом человека были обнаружены районы, в которых разрывы и воссоединения происходят с более высокой частотой, чем в среднем в геноме. Анализ ДНК в ГТ хромосомных перестроек при врожденных хромосомных аномалиях и канцерогенезе показал присутствие в них различных типов повторенных последовательностей. Особое значение имеют районоспецифичные низкокопийные повторы (Low Copy Repeats - LCRs) и дупликоны, которые часто фланкируют сайты ДНК, вовлеченные в перестройки. Реорганизация хромосом, опосредованная рекомбинацией между разными копиями таких повторов, в зависимости от их ориентации приводит к делециям, дупликациям, инверсиям или U-образным обменам. В проксимальной части q-плеча хромосомы 15 обнаружено четыре ГТ. ГТ1, ГТ2 и ГТ3 задействованы более чем в 95% микроделеций в этом районе. Обычно точками разрывов служит дистальная (ГТ3) и одна из проксимальных ГТ (ГТ1 или ГТ2).

Делеции в проксимальном участке длинного плеча q11-q13 хромосомы 15 представляют классический пример вовлечения в реорганизацию хромосомных районов, подвергнутых импринтингу. В зависимости от того, какой из гомологов хромосомы 15 (матери или отца) несет делецию, у носителя формируется либо синдром Прадера-Вилли, либо синдром Ангельмана. Синдром Прадера-Вилли впервые описали в 1956 г. в Швейцарии. Частота встречаемости составляет один случай на 12 000-15 000 живорожденных. При этом синдроме делеция располагается на отцовской хромосоме. Делеция в материнской хромосоме приводит к развитию синдрома Ангельмана. Гены этого района в зависимости от происхождения хромосомы экспрессируются в разных тканях и в разное время: в одних - только отцовские, в других - только материнские. В результате и делеция выражается по-разному. Лишь около 70% случаев синдрома Прадера-Вилли обусловлено делецией в отцовской хромосоме. В остальных случаях его причиной служит материнская дисомия хромосомы 15, при этом, как и при делеции 15q11-q13 в отцовской хромосоме, в клетках индивидуума отсутствуют отцовские гены этого района.

Синдром Ангельмана впервые описали в 1965 г. Гарри Ангельман представил истории болезни трех пациентов с выраженной умственной отсталостью. Учитывая своеобразие поведения и фенотипа пациентов, он назвал этот синдром «puppet children» - «дети-куклы». Окончательное название он получил в 1982 г. Помимо делеции 15q11-q13 в материнской хромосоме, к развитию синдрома Ангельмана приводит отцовская дисомия хромосомы 15. Всего в настоящее время описано четыре механизма возникновения заболевания: делеция de novo в локусе 15q11-q13 (70-80% всех случаев), отцовская дисомия (5% случаев), дефект центра импринтинга (5%) и мутация материнской копии гена, кодирующего убиквитинпротеинлигазу (ген UBE 3A).

Поскольку в структурные перестройки обычно вовлекаются участки ДНК, обогащенные повторенными последовательностями, достаточно типичными считают перестройки с точками разрывов в районах прицентромерного гетерохроматина. Примерами таких перестроек могут быть робертсоновские транслокации акроцентрических хромосом и изохромосомы по плечам хромосом. Формирование двуплечей хромосомы из длинных плеч акроцентриков при сохранении их нормального числа практически не сказывается на фенотипе носителя. Из изохромосом, состоящих из плеч аутосом, совместимой с жизнью считают только изохромосому по короткому плечу хромосомы 18.

Первые результаты диагностики хромосомных нарушений были получены вскоре после определения числа хромосом человека. Уже в 1958 г. была опубликована статья, содержащая описание нарушения числа хромосом при синдроме Дауна (Lejeune et al., 1958), а на следующий год были описаны изменения при синдроме Клайнфелтера (Jacobs, Strong, 1959) и Тернера (Ford et al., 1959). Уже в следующем году была обнаружена первая структурная аномалия хромосом: в клетках периферической крови у больных с хронической миелолейкемией описана филадельфийская хромосома. Ситуация принципиально изменилась после внедрения методов дифференциального окрашивания. Благодаря последним стало возможным описание структурных хромосомных аномалий. В то же время диагностика нарушений, связанных с небольшими хромосомными районами, оставалась проблематичной и ненадежной. Это особенно касалось хромосомного анализа при онкологических заболеваниях. Хромосомы раковых клеток были и остаются печально известными своей отвратительной морфологией. Основные трудности удалось решить введением в практику диагностики методов молекулярной цитогенетики: определение числа хромосом, делеций и транслокаций конкретных районов стало возможно при анализе, проводимом не только на метафазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах. Мощным инструментом обнаружения хромосомных транслокаций стала 24-цветная FISH. Нарушение баланса хромосомных районов CGH можно определить даже на архивном материале. Получение ДНК-проб из аномальных хромосом с последующим FISH-анализом c нормальными хромосомами и многоцветным бэндингом дает возможность разобраться с самыми сложными случаями комплексных хромосомных перестроек, возникающих при онкологических заболеваниях (рис. 2-9, см. цв. вклейку).

Показательным является прогресс в диагностике малых сверхчисленных маркерных хромосом (достаточно распространенный вариант хромосомных аномалий). Частота их встречаемости варьирует от 0,65 до 1,5 случая на 1000 человек. Она несколько ниже, если учитывать результаты только постнатальной диагностики (0,14-0,72 случая на 1000 человек). Многие из них не влияют на формирование фенотипа. По некоторым оценкам, семейные маркерные хромосомы составляют до 40% всех обнаруженных маркерных хромосом. Отсутствие клинических признаков подобного нарушения кажется вполне логичным, так как такие хромосомы не содержат эухроматиновых сегментов и функционально активных генов. Тем не менее формирование маркерных хромосом может указывать на повышенную хромосомную нестабильность и необходимость проведения более тщательного цитогенетического анализа. Обнаружение множественных маркерных хромосом разного происхождения хорошо согласуется с этим предположением.

Около 80% маркерных хромосом представлены изохромосомами по коротким плечам акроцентриков и некоторых двуплечих хромосом. Наиболее высокой частотой встречаемости (около 40% случаев) среди них характеризуется inv dup(15). На втором месте стоит хромосома inv dup(22). В их образовании участвуют те же ГТ хромосомных перестроек, которые участвуют в возникновении делеций. Так, inv dup(15) могут быть результатом перестройки по ГТ1, ГТ2, ГТ3, а также ГТ, локализованной дистальнее последней (дистальная горячая точка). Предполагают, что она содержит другой тип повторенных последовательностей. Таким образом, конкретная inv dup(15) может представлять один из четырех вариантов изохромосомы. Различие маркерных хромосом по составу входящих в них эухроматиновых районов определяет разнообразие клинических признаков.

Перестройки в районе 22q11, подобно перестройкам в 15q11→q13, обусловлены рекомбинациями, связанными с районоспецифичными низкокопийными повторами. Микроделеции в районе 22q11 обнаруживают с частотой один случай на 4000 новорожденных. Хромосомы inv dup(22): 22pter→cen→q11.2::q11.2→cen→22pter обнаруживают несколько реже. Низкокопийные повторы хромосомы 22 варьируют по размеру от 40 до 350 kb с уровнем гомологии 97-98%. Они были обнаружены в районах локализации трех ГТ хромосомных перестроек в 22q11, а также еще в шести локусах, расположенных в пределах 6,5 Mb от основных ГТ. Микроделеции и дупликации в районе 22q11 связаны с дистальной и проксимальной ГТ. Около 90% делеций имеют размер 3 Mb, а 7% - 1,5 Mb. Они же задействованы в формировании большинства хромосом inv dup(22). Различие маркерных хромосом по составу входящих в них эухроматиновых районов определяет различные клинические признаки.

Из-за более низкой частоты встречаемости других маркерных хромосом детальное изучение механизма их формирования затруднительно. Тем не менее стоит рассмотреть случаи возникновения множественных маркерных хромосом. В одном из них число последних варьировало от одной до шести. Все они имели разное происхождение (хромосомы 2, 5, 6, 12, 14 и 22). Одновременное образование нескольких маркерных хромосом указывает на нестабильность хромосом у пациента. Механизм ее формирования неизвестен.

Отдельную проблему представляют маркерные хромосомы с неоцентромерой. Механизм перестроек, приводящих к их образованию, неясен. В связи с относительно небольшим числом исследований маркерных хромосом с неоцентромерами сложно говорить о молекулярной организации районов, входящих в их состав. Следует лишь отметить, что некоторые такие хромосомы включают материал хромосомных сегментов, содержащих низкокопийные повторы, например сегмент 15q26. Возможно, последние участвуют в формировании и этого типа маркерных хромосом.

Большинство маркерных хромосом, ассоциированных с врожденными пороками развития, характеризуются существованием эухроматиновых сегментов, независимо от того, представляют ли они бисателлитные, кольцевые или другие варианты хромосом. Таким образом, в этих случаях обнаружение эухроматиновых сегментов и идентификация их состава - основная задача цитогенетической диагностики. Идентификация относительно крупных маркерных хромосом, таких как i(5p), i(9p), i(12p), i(18p), благодаря их значительным размерам не представляет особых затруднений даже для традиционных методов хромосомного анализа. Их присутствие приводит к тетрасомии по большому числу генов и, как следствие, к формированию многочисленных аномалий развития. Из них совместимой с рождением живого ребенка оказалась только i(18p).

Значительно более сложной считают оценку клинического значения маркерных хромосом, содержащих небольшие эухроматиновые сегменты. В случае их формирования из прицентромерных районов и прилежащих к ним эухроматиновых сегментов значение имеет не только определение происхождения маркерной хромосомы, но и идентификация материала сегментов, входящих в ее состав. Задача диагностики сводится к обнаружению локализации точек разрывов, происходящих при образовании маркерной хромосомы. Именно ее решение позволяет дать достаточно обоснованный прогноз. К сожалению, и в этом случае он носит вероятностный характер, что может быть обусловлено присутствием различных аллелей генов, входящих в состав маркерной хромосомы, ее мозаицизмом и однородительской дисомией по хромосоме, из которой возникла маркерная хромосома.

Важный фактор формирования маркерной хромосомы - момент ее возникновения. Если перестройка произошла в клетках эмбриона или взрослого организма, то несущие ее клетки могут составлять лишь небольшую долю всех клеток организма. Формирование маркерной хромосомы на предмейотических стадиях или во время мейоза может привести к присутствию такой хромосомы уже в зиготе. Тем не менее мозаицизм по маркерной хромосоме нельзя рассматривать как доказательство ее постзиготического происхождения. Известны примеры семейных маркерных хромосом, которые и у матери, и у ее потомства были обнаружены лишь в части исследованных клеток. Механизм потери маркерных хромосом в соматических клетках неизвестен.

Формирование маркерной хромосомы в результате U-образного обмена приводит к возникновению и последующей потере ацентрического фрагмента, т.е. один из гомологов хромосомы должен быть замещен маркерной хромосомой. Такие примеры известны только для половых хромосом (46,X,+mar, где mar - дериват хромосомы Х или Y). Моносомия по большей части районов аутосомы невозможна, так как она приводит к гибели плода уже на ранней стадии развития. Все конститутивные маркерные хромосомы, дериваты аутосом, считают сверхчисленными. Было предложено несколько возможных механизмов их возникновения. В случае хромосомных перестроек в ходе гаметогенеза возможно формирование гамет, содержащих маркерные хромосомы либо вместо, либо в дополнение к нормальной хромосоме. Для объяснения коррекции числа нормальных хромосом при формировании маркерной хромосомы были предложены следующие механизмы.

Функциональная коррекция трисомии. В результате ошибки в мейозе одна из гамет несет две копии хромосомы. При образовании зиготы это приводит к трисомии по данной хромосоме. К этому же результату может приводить нарушение митоза на постзиготической стадии. Реорганизация одной из трех копий хромосомы завершается образованием маркерной хромосомы и переходом полной трисомии в частичную.

Постзиготическая редупликация . Возникновение маркерной хромосомы происходит в процессе гаметогенеза или непосредственно в мейозе . Одна из гамет несет маркерную хромосому вместо нормальной. Зигота, полученная при слиянии с такой гаметой, - моносомик по большей части соответствующей хромосомы. Редупликация нормальной хромосомы переводит частичную моносомию в частичную трисомию, ассоциированную с однородительской дисомией.

Комплементация гамет. Одна из гамет несет две копии нормальной хромосомы, вторая - маркерную хромосому.

Следует отметить, что функциональная коррекция трисомии может с высокой вероятностью приводить к однородительской дисомии, а постзиготическая редупликация - к однородительской дисомии в 100% случаев. Действительно, исследования носителей сверхчисленных маркерных хромосом показали, что их возникновение часто сочетается с однородительской дисомией. Это обусловливает некоторые дополнительные проблемы, связанные с хромосомным импринтингом, возникновением гомозиготности по аутосомным рецессивным мутациям, а также с их комбинациями. Из 19 случаев однородительской дисомии, обнаруженной у пациентов с маркерными хромосомами, описанных к настоящему времени, четыре были эпизодами отцовской однородительской дисомии, остальные - материнской однородительской дисомии. По одному случаю однородительской дисомии было найдено для хромосом 1, 6, 7, 9, 10, 12, 20 и 22. Одиннадцать случаев было описано для хромосомы 15. У восьми пациентов с однородительской дисомией по хромосоме 15 был обнаружен синдром Прадера-Вилли, у трех - синдром Ангельмана. В одном из случаев однородительской дисомии по хромосоме 15 маркерная хромосома возникла из хромосомы Х. Суммарный анализ организации различных маркерных хромосом указывает на существование различных механизмов формирования сверхчисленных маркерных хромосом.

До разработки методов молекулярной цитогенетики из всех маркерных хромосом было возможно идентифицировать только i(18p). В остальных случаях просто констатировали факт существования маркерной хромосомы, иногда - с уточнением ее возникновения из одного из акроцентриков. Затем анализ состава альфоидной ДНК центромерного района маркерной хромосомы, FISH-исследование ДНК-проб, специфичных прицентромерным и прителомерным районам хромосом, и PRINS прицентромерных и теломерных последовательностей ДНК позволили определять их происхождение. CISS-гибридизация WCP c метафазными хромосомами пациента, включая 24-цветную FISH, и CGH открыли путь к анализу эухроматиновых районов маркерных хромосом. Их чувствительность и точность значительно увеличились в связи с использованием в диагностике метода микродиссекции метафазных хромосом и FISH клонированных фрагментов ДНК. В последних работах использовали высокоразрешающие чипы CGH или гибридизацию ДНК-проб маркерных хромосом с соответствующими микрочипами. При этом определение локализации точек разрыва, возникающих при образовании маркерной хромосомы, проводят с точностью, близкой к таковой методов молекулярной биологии.

Длительное время хромосомы человека были доступны для прямого наблюдения только в митозе и мейозе. В ходе этих исследований сложились представления, что в митозе конденсация хромосом приводит к уменьшению их длины в несколько раз. Они верны, если уточнить, что меняется длина хромосом на цитологическом препарате, а не в клетке. Аккуратное сравнение размеров хромосомы в метафазе и G₂ интерфазы показало, что значительные изменения не происходят, и едва ли стоит говорить об изменении длины хромосомы (рис. 2-10, см. цв. вклейку). Если кратко описать пространственную организацию хромосом человека в интерфазе, то можно сказать, что каждая из них занимает в ядре свою территорию, которая не перекрывается с территориями других хромосом. Это утверждение верно для плеч хромосом и, в определенной степени, для хромосомных районов. Указания на существование отдельных хромосомных территорий возникли несколько десятилетий назад на основании данных по индукции хромосомных аберраций тонким лучом лазера. Затем были разработаны методы, позволяющие обнаруживать материал индивидуальной хромосомы непосредственно в интерфазном ядре. Чаще всего для этого используют 3D-FISH с последующей трехмерной микроскопией. Многочисленные эксперименты в этой области позволили обнаружить некоторые закономерности локализации хромосом в интерфазном ядре. Хромосомы, содержащие больше активно работающих генов, имеют тенденцию располагаться во внутреннем компартменте ядра, в отличие от хромосом, несущих больше транскрипционно неактивного материала. Тем не менее далеко не всегда в ядре просто выделить внутренний компартмент. Например, в плоских ядрах фибробластов большинство хромосомных территорий находится в контакте и с нижней, и с верхней ядерной мембраной. В связи с этим более правильно будет провести анализ локализации в ядре транскрипционно активного и транскрипционно неактивного хроматина.

Изучение локализации рано и поздно реплицирующейся ДНК показало, что в контакте с ядерной пластиной находится поздно реплицирующаяся ДНК, т.е. хроматин, не несущий активно работающих генов. Материал хромосом с активно работающими генами всегда находится на некотором расстоянии от ядерной пластины. Обобщая гипотезы, рассматривающие пространственную организацию хромосом в качестве фактора, участвующего в регуляции транскрипционной активности генов, можно сказать, что транскрипционно активный материал должен располагаться в той части хромосомной территории, где он доступен для ферментов, осуществляющих транскрипцию и сплайсинг. Очевидно, что такие условия существуют на границе хромосомной территории и в ее приграничной части, характеризующейся низкой степенью компактизации хроматина. Результаты определения положения активных и неактивных генов в хромосомных территориях хорошо согласуются с такими представлениями о локализации активно работающих генов у поверхности интерфазной хромосомы. Логичным следствием, вытекающим из этого правила, служит предположение о более высокой концентрации таких генов в терминальных районах хромосом и микрохромосомах. Именно такое увеличение числа генов показано в Т-бэндах хромосом человека. В норме микрохромосомы у человека отсутствуют. Они характерны для кариотипов птиц, и именно там находится ДНК, гомологичная ДНК Т-бэндов хромосом человека. Организация хромосомы в интерфазе имеет еще ряд особенностей, связанных с локализацией транскрипционно активного и транскрипционно неактивного хроматина. ДНК С-позитивных районов хромосом обычно находится в контакте с ядерной оболочкой, G-бэндов - либо в контакте с оболочкой ядра, либо с инвагинациями ядерной пластины, либо располагается на границе ядрышка. ДНК R-бэндов локализована на некотором расстоянии от этих структур (рис. 2-11, см. цв. вклейку).

Сегодня рассмотрение вопросов об организации интерфазного ядра невозможно без использования таких понятий, как хромосомная территория и межхроматиновое пространство. Именно поэтому стоит подробнее рассмотреть, что означают эти термины. Простое заключение о том, что, так как материал разных хромосом в ядре не перемешан, пространство, которое занимает хромосома, считают хромосомной территорией, а пространство, свободное от него, - межхроматиновым пространством, оказывается не совсем верным. Существует различие между семантическим определением и тем, что имеют в виду современные биологи, используя эти термины. Термин «хромосомная территория» сегодня относят к той части интерфазного ядра, которая окрашивается 3D-FISH хромосомоспецифичной ДНК-пробой. Рассмотрение этого определения приводит к двум выводам:

Это наглядно продемонстрировали исследования по локализации в интерфазном ядре конкретных фрагментов ДНК из короткого плеча хромосомы 11 человека. Часть ДНК, как и следовало ожидать, оказалась в пределах территории 11р, определенной по результатам 3D-FISH соответствующей ДНК-пробы, но часть располагалась за ее пределами (рис. 2-12, см. цв. вклейку). Объяснить эти результаты очень просто: отдельная петля ДНК в интерфазном ядре не может быть обнаружена, если для 3D-FISH используют хромосомоспецифичную ДНК-пробу, в то время как ДНК-проба, приготовленная на базе клонированного фрагмента ДНК, в интерфазном ядре дает четкий сигнал. Таким образом, из хромосомных территорий в межхроматиновое пространство выходят отдельные петли ДНК. Показано, что их размер может достигать нескольких миллионов пар оснований. В состав ДНК такой петли входят гены, часть которых активно транскрибируется. Уходя за пределы хромосомной территории в межхроматиновое пространство, они попадают в идеальные условия для взаимодействия с ферментами транскрипции и сплайсинга. Именно здесь находятся макромолекулярные комплексы, обеспечивающие синтез новой иРНК. Есть еще одно большое преимущество в проведении такого синтеза в межхроматиновом пространстве. Оно служит не только местом локализации таких фабрик синтеза иРНК, но может функционировать и в качестве магистральных путепроводов, позволяющих генным продуктам быстро добраться до оболочки ядра, а затем через ядерную пору перейти в цитоплазму, где они будут использованы по прямому назначению. Петер Фрезер предложил называть такие макромолекулярные комплексы «фабриками транскрипции». Было показано, что одна такая «фабрика» может одновременно работать с ДНК из разных районов одной хромосомы или разных хромосом (рис. 2-13, см. цв. вклейку), причем расстояние между генами, локализованными в одной хромосоме, может превышать 20 Mb.

Районы хромосом, материал которых локализован на периферии хромосомных территорий или в межхроматиновом пространстве, - места локализации функционально активных генов. Подобное их расположение не обеспечивает включение гена, но дает шанс на это. Правдоподобно выглядит гипотеза о том, что при дифференцировке клеток формируется необходимый вариант пространственной организации хромосомных территорий, определяющий спектр генов, которые могут быть допущены к работе. Окончательная настройка и определение того, какие из этих генов будут активными, зависит от других, привычных для молекулярного биолога механизмов. Возможно, для полного описания структурно-функциональной организации хромосомы ее рассмотрения даже в четырехмерном пространстве (трехмерное пространство + время) окажется недостаточно. Значение имеет и отдаленная история хромосомы, выражающаяся в импринтинге соответствующих хромосомных районов. При абсолютно идентичных геномах (с точки зрения нуклеотидных последовательностей) возможно возникновение различных нарушений в развитии их обладателей. Примером может служить небольшая делеция в проксимальном районе длинного плеча хромосомы 15 человека, которая приводит либо к синдрому Прадера-Вилли, либо к синдрому Ангельмана.

Клеточный цикл включает четыре фазы: G₁, S, G₂ и М. G₁-фаза - интервал между митозом и началом репликации ДНК. Для нее характерны высокая метаболическая активность и увеличение размера клетки. В S-фазе происходит основная репликация ДНК. G₂ - фаза подготовки к митозу, продолжения синтеза белков и роста клетки. В М-фазе происходят непосредственная подготовка и собственно деление клетки. Митоз включает начальную стадию конденсации хроматина (профаза), ее продолжение, разборку ядерной оболочки, начало формирования клеточного веретена и прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом (прометафаза), выстраивание хромосом в экваториальной части клетки, завершение прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом (метафаза), расхождение сестринских хроматид (анафаза), формирование ядерных оболочек и цитокинез, что обеспечивает деление клетки (телофаза). Клетка может выйти из этого цикла и надолго задержаться в G₀-фазе. Возвращение в клеточный цикл требует прохождения R-точки (restriction point). Это событие зависит в основном от присутствия в окружении клетки специальных индукторов - факторов роста. Например, фибробласты кожи могут выйти из стадии покоя под действием тромбоцитарного фактора роста (PDGF), образующегося в зоне повреждения кожи при свертывании крови.

Регуляцию клеточного цикла в основном осуществляют циклинзависимые киназы (Cdk) и циклины. У человека Cdk1, Cdk2, Cdk4 и Cdk6 непосредственно участвуют в регуляции клеточного цикла, поэтому их называют Cdk-активирующими киназами. Сdk - каталитические субъединицы протеинового комплекса. Для их активации требуется присутствие соответствующих циклинов. Регуляция активности Сdk происходит путем изменения количества в определенные фазы клеточного цикла. В активной форме комплексы циклин-Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие течение этой фазы.

Чтобы обеспечить надежную передачу генетической информации дочерним клеткам, в процессе участвует целый набор контролирующих механизмов, определяющих прохождение клетки через контрольные точки клеточного цикла (checkpoints - сверочные точки). Такая система контроля предотвращает размножение клеток, в которых произошли или могут произойти хромосомные нарушения, вследствие чего клетка не готова к корректному прохождению очередного этапа. В настоящее время описано четыре контрольные точки во всех фазах клеточного цикла.

Поскольку основное требование к клетке для перехода в S-фазу - целостность ее ДНК, то в контрольной точке в G₁ происходит проверка интактности ДНК. Показано, что клетки, подвергшиеся воздействиям, вызывающим разрывы ДНК, останавливаются в G₁. Вход в S-фазу для них запрещен, так как до того, как начнется репликация ДНК, должна завершиться репарация всех имеющихся к этому моменту повреждений. Необходимо отметить, что остановку в фазе G₁ вызывают не только повреждения ДНК, но и другие нарушения, в дальнейшем приводящие к нарушению числа хромосом и образованию микроядер. Остановка в G₁ может быть как временной (до момента решения возникшей проблемы), так и необратимой. В контрольной точке в S-фазе проверяется правильность и полнота репликации ДНК. Клетка может задержаться в S-фазе, например, при снижении эффективности репликации в результате недостатка предшественников синтеза ДНК. В контрольной точке в G₂-фазе клеточного цикла также идет проверка ДНК на интактность, но, кроме этого, оценивается и завершенность ее репликации. Клетки, в которых репликация не завершена, не могут войти в митоз. Контрольная точка сборки веретена деления обеспечивает прикрепление всех кинетохоров к микротрубочкам веретена. До завершения этого процесса клетка остается в метафазе. Контроль осуществляется по присутствию в клетках кинетохоров, не прикрепленных к микротрубочкам веретена. В экспериментах, в ходе которых лучом лазера разрушали такие кинетохоры, клетки переходили из метафазы в анафазу, что приводило к отставанию хромосом и формированию микроядер. Основную роль в контроле перехода клетки из метафазы в анафазу играют изменения во взаимодействии белков BUB1, BUBR1, MAD1 и MAD2, ассоциированных с кинетохорами . Задержка клетки в контрольных точках дает ей возможность завершить репарацию ДНК, ее репликацию или обеспечить нормальное прохождение клеточного деления. Если клетке не удается завершить необходимые для прохождения контрольной точки процессы и устранить существующие нарушения, то включается механизм программируемой клеточной гибели - апоптоз.

В случае успешного прохождения всех контрольных точек хромосомы демонстрируют удивительное постоянство своей организации и положения относительно друг друга. Даже миграция в экваториальную часть клетки в метафазе и последующее расхождение в дочерние клетки не приводит к их глобальному перемешиванию в новом ядре, хотя некоторые изменения все-таки происходят. В клеточном цикле также происходит некоторая трансформация пространственной организации индивидуальных хромосом, причем она связана не только с их компактизацией в митозе. Как было упомянуто выше, в интерфазной хромосоме хроматин рано реплицирующихся и транскрипционно активных районов хромосом тяготеет к межхроматиновому пространству и внутреннему компартменту ядра, тогда как хроматин поздно реплицирующихся и транскрипционно неактивных районов локализован преимущественно у ядерной оболочки, инвагинаций ядерной пластины и на границе ядрышка. Таким образом, относительно своей оси хромосома организована несимметрично. Можно сказать, что в сферических ядрах на хромосомной территории материал С- и G-бэндов локализуется у ядерной оболочки, далее располагается материал R-бэндов, а еще дальше в межхроматиновое пространство выходит наиболее активно транскрибируемый материал.

Такое распределение материала хромосомы в ядре может нарушаться в S-фазе, когда происходит репликация ДНК С- и G-бэндов. Перемещение материала хромосомного района, связанного с репликацией его ДНК, было наглядно продемонстрировано на клетках китайского хомячка. Ганг Ли и соавт. удалось проследить за положением в ядре 90 Mb гетерохроматинового района на протяжении всего клеточного цикла. Большую часть времени в интерфазе этот район хромосомы находился на периферии ядра рядом с ядерной мембраной. Лишь на время репликации ДНК он перемещался во внутренний компартмент ядра, и в это же время происходила деконденсация его хроматина. После завершения репликации ДНК хроматин этого района опять становился компактно организованным и возвращался на периферию ядра. Происходят ли подобные перемещения материала нормальных С- и G-бэндов, неизвестно, но с уверенностью можно сказать, что во время репликации их ДНК степень компактизации хроматина уменьшается.

Репликация ДНК в хромосомах человека, как и у других высших эукариот, начинается сразу во множестве мест. В них формируется протеиновый комплекс (ORC - origin recognition complex), что приводит к формированию репликативного комплекса. Происходит это следующим образом. Два дополнительных протеина (Cdc6p и Cdt1p) и сложный протеиновый комплекс MCM2-7 связываются с ORC, формируя пререпликативный комплекс (pre-RC). Его созревание происходит после привлечения дополнительных факторов, включая Cdc45 и Sld3. Затем подключаются ДНК-полимеразы и начинается синтез нитей ДНК, который протекает в двух направлениях. Этот процесс запускается соответствующей комбинацией Cdk и циклина. Кроме инициации репликации, циклинзависимые киназы ингибируют начало повторной репликации участка ДНК, предотвращая формирование нового pre-RC. После репликации ДНК сестринские хроматиды плотно удерживаются друг с другом, вплоть до расхождения в митозе. Этот феномен, называемый когезией сестринских хроматид, осуществляет когезиновый комплекс протеинов.

Когезин содержит основной комплекс гетеродимеров, состоящий из двух протеинов семейства SMC (Structural Maintenance of Chromosomes): Smc1 и Smc3. SMC-протеины оказались очень консервативным семейством. У прокариот был обнаружен только один SMC-протеин, тогда как у эукариот их было найдено шесть (SMC1-SMC6). Вступая во взаимодействия с другими протеинами, они участвуют в самых разных процессах в хромосомах. SMC-протеины состоят из 1000-1500 аминокислот и имеют на N- и С-конце глобулярные домены. N-конец содержит мотив Walker A, С-конец - Walker B. Соединяясь вместе, они формируют сайт с АТФазной каталитической активностью. Взаимодействие Smc1 и Smc3 происходит через петлевой домен (рис. 2-14, см. цв. вклейку). Этот димер через свои глобулярные домены связывается с протеином Scc1, который соединен с четвертой субъединицей когезина Scc3. Сформированный таким образом когезиновый комплекс связан либо с нереплицированной хроматидой (от телофазы до момента репликации ДНК), либо с сестринскими хроматидами (от момента репликации ДНК до разделения ДНК хроматид в митозе, когда протеолиз открывает кольцо, позволяя ДНК сестринских хроматид разойтись). На рис. 2-15 (см. цв. вклейку) приведены гипотетические модели его связи с ДНК. Когезин принимает участие в работе контрольной точки, определяющей переход клетки в S-фазу. В ней происходит проверка целостности ДНК. Так, ее повреждение при облучении активирует ATM-киназу, которая фосфорилирует SMC1 в когезине, что приводит к формированию нового комплекса, отличающегося от когезина присутствием в нем протеинов NBS1, BLM и BRCA1. Последние связаны с ответом на повреждение ДНК (рис. 2-16, см. цв. вклейку). Фосфорилирование SMC1 в когезине - принципиальный момент для запуска механизма контрольной точки, которая задерживает репликацию ДНК до завершения репарации возникших повреждений.

Другой интригующий момент реорганизации хромосом в клеточном цикле - разделение материала сестринских хроматид и формирование типичных метафазных хромосом. Для этого необходимо освобождение сестринских хроматид от когезина и решение топологических проблем в локализации их ДНК. В профазе основная часть когезина удаляется его фосфорилированием Polo-подобной киназой, которое, вероятно, снижает аффинность когезина к ДНК. На хромосоме его остается около 5% с преимущественной локализацией в прицентромерном районе. Этот когезин участвует как в удержании вместе сестринских хроматид, так и в биполярной ориентации хромосом. После прикрепления всех кинетохор к веретену посредством деградации циклина В запускается переход к анафазе. Освобождение от остатков когезина происходит в результате расщепления сепаразой Scc1. До начала анафазы вследствие связи с секурином она остается неактивной.

Решение топологических проблем связано с компактизацией материала индивидуальных хроматид. Выяснение механизма этого процесса шло одновременно с изучением роли негистоновых протеинов в поддержании структурнофункциональной организации хромосомы. Хромосома приблизительно на треть состоит из нуклеиновых кислот, на треть - из гистонов и на треть - из негистоновых протеинов. Эксперименты по количественному удалению из хромосомы гистонов показали, что именно негистоновые протеины ответственны за структурную организацию митотических хромосом. Она представлена каркасом и отходящими от него петлями ДНК. Выделяют два основных компонента хромосомного каркаса, получивших название ScI- и ScII-протеины. ScI был идентифицирован как топоизомераза II, а ScII оказался членом семейства SMC-протеинов. Белки хромосомного каркаса - SMC2 и SMC4. Проведенные исследования показали, что функционально активен комплекс, включающий, кроме SMC2/SMC4, еще три протеина (CAP-D2, CAP-H, CAP-G), не относящихся к семейству SMC. Он способен поддерживать конденсированное состояние хроматина и был назван конденсином (конденсином I). Позже у позвоночных был открыт второй комплекс конденсина (конденсин II). В его состав входят те же SMC2/SMC4, а также CAP-D3, CAP-H2 и CAP-G2. Гипотетическая модель организации двух конденсиновых комплексов приведена на рис. 2-17а (см. цв. вклейку). Анализ взаимодействия конденсина с ДНК показал, что он вызывает ее суперспирализацию , а в присутствии топоизомеразы II формируются хиральные узелки. В настоящее время предложено несколько моделей взаимодействия конденсина с молекулами ДНК (рис. 2-17б, см. цв. вклейку), суть которых заключается либо в суперспирализации ДНК, либо в формировании ее специфического сворачивания.

Детальный анализ локализации конденсина I и конденсина II показал, что в интерфазе первый локализуется преимущественно в цитоплазме, а второй - в ядре. Взаимодействие конденсина I с хромосомным материалом становится возможным только после разборки ядерной оболочки. Начиная с метафазы, комплексы конденсина I и II располагаются вдоль оси хромосом, вероятно, сменяя один другого. Хромосомным районом, в котором явно преобладает конденсин II, считают район центромеры. Недостаток конденсина приводит к нарушению структурнофункциональной организации кинетохора и, как следствие, к нарушениям расхождения хромосом. До настоящего времени широко распространено представление, что когезин связан с ДНК хромосом с телофазы до метафазы, обеспечивая когезию сестринских хроматид. С начала прометафазы он начинает вытеснять когезин, приводя к компактизации хроматина. Ранее считали, что сохранение связи его небольшого количества с ДНК сестринских хроматид, вплоть до метафазы, достаточно для удержания рядом в основном сформированных хроматид. Лишь после расщепления сепаразой Scc1 хроматиды оказывались полностью свободными и могли быть разведены в дочерние клетки. Открытие конденсина II заставляет частично пересмотреть эти представления. Он присутствует в интерфазном ядре и, возможно, участвует в частичной компактизации неактивного хроматина уже в интерфазе. В профазе количество конденсина II, связанного с хроматином, должно возрастать, что позволяет при фиксации клеток на этой стадии видеть неоднородно окрашенное ядро с многочисленными точечными вкраплениями более ярко окрашенного материала, а профазные хромосомы - с компактно расположенными G-позитивными суббэндами. После разборки ядерной оболочки хроматин становится доступным конденсину I, и в результате его взаимодействия с ДНК начинается активное вытеснение когезина и компактизация хроматина. Последняя - следствие изменения конформации ДНК в результате суперспирализации и формирования хиральных узелков. Возможно, конденсины имеют большее сродство к АТ-обогащенной ДНК, что определяет порядок компактизации ДНК элементарных структурных элементов хромосомы и последовательное формирование прометафазных, ранних метафазных и поздних метафазных хромосом, отличающихся по степени компактизации их индивидуальных участков. К сожалению, динамика связи конденсинов с различными районами хромосом пока не изучена, и вышеизложенный механизм формирования метафазной хромосомы остается гипотетическим. Результаты некоторых исследований указывают, что конденсины необходимы для поддержания конформации компактного хроматина, но сама компактизация может происходить и без их участия. Насколько это справедливо и существуют ли другие факторы, необходимые для перехода интерфазной хромосомы в метафазную, предстоит выяснить в будущем.

Отдельный интерес представляет сравнение результатов исследований хромосом непосредственно в живой клетке, предварительно фиксированных и хромосом in silico. Характерно то, что во всех типах исследований хромосому удается представить в виде набора структурно-функциональных единиц. Теломерные, центромерные и районы ядрышкового организатора уже были рассмотрены выше. В настоящем разделе будут подробнее проанализированы эухроматиновые районы хромосом. Важный момент в формировании представлений о принципах организации хромосом человека - определение ее базовых элементов. При попытках установления размера такого элемента учитывали самые разные параметры: дифференциальное окрашивание хромосомных районов, время их репликации, соотношение АТ- и ГЦ-пар, обогащение различными типами повторов, концентрацию и состав генов, а также организацию хроматина. В результате исследований было показано, что размер такой единицы близок к 1 млн пар оснований, а хромосому можно представить как их последовательность. В ряде работ по изучению структурно-функциональной организации хромосомы для этого базового элемента используют термин «1 Mb субструктура». Эти элементы имеют общую регуляцию репликации, степень конденсации хроматина и, как следствие, некий общий уровень организации, определяющий возможности транскрипционной активности генов, входящих в их состав.

Секвенирование генома человека открыло возможности контекстного анализа последовательности нуклеотидов в различных районах хромосом. Казалось бы, надо только взять известную последовательность нуклеотидов, определить границы, разделяющие ДНК R- и G-бэндов, и in silico будет получен вариант чередования R- и G-бэндов в анализируемой хромосоме. Исследования были проведены, и полученные данные наглядно показали, что хромосома, построенная in silico, при использовании простых критериев обогащенности ДНК ГЦ-парами имеет очень мало общего с хромосомой in vitro. На рис. 2-18 (см. цв. вклейку) приведены результаты такого анализа, выполненного для хромосомы 1 человека. Несмотря на тенденции обогащения R-бэндов ГЦ-парами и короткими диспергированными повторами, представленные данные едва ли можно считать убедительным подтверждением распространенных представлений об АТ/ГЦ составе ДНК R- и G-бэндов. Такое несоответствие можно объяснить несколькими причинами. Одна из них заключается в далеко не полном соответствии R- и G-бэндов на схеме хромосомы и данных по секвенированию ДНК. Тем не менее оказалось, что даже этой информации достаточно, чтобы на основании результатов секвенирования построить схему расположения R- и G-бэндов внутри хромосомы. Для этого потребовалось правильно сформулировать критерии для определения ГЦ-богатых участков хромосом. Попытки определить пограничное значение процента ГЦ-пар для всех R- и G-бэндов хромосомы не дали положительного результата (рис. 2-19а, см. цв. вклейку). Схема R- и G-бэндов, полученная на основании анализа процента ГЦ-пар, совпала с таковой из номенклатуры хромосом человека, когда обогащенность ГЦ-парами оценивали относительно соседних районов. Процент ГЦ-пар определяли для участка хромосомы размером 2,5 Мb и сравнивали с относительным числом ГЦ-пар в участке размером 9,3 Мb, внутри которого он находится. На рис. 2-19б (см. цв. вклейку) черная линия показывает процент ГЦ-пар в участке 2,5 Мb, а красная линия - в участке 9,3 Мb. При построении графиков центр этих районов перемещали с шагом 10 kb. Районы, в которых процент ГЦ-пар в участке 2,5 Mb был выше, чем в участках размером 9,3 Мb, считали ГЦ-богатым и относили к R-бэндам. Районы, в которых процент ГЦ-пар для участка 2,5 Mb был ниже, чем для участков размером 9,3 Мb, считали ГЦ-бедными и относили к G-бэндам. В этом случае in silico окраска хромосом совпадала со схемами, основанными на результатах дифференциального окрашивания (см. рис. 2-19в на цв. вклейке). Вероятно, необходимо объяснить выбор исследователями районов размером 2,5 Mb и 9,3 Мb. Он объясняется достаточно просто: сравнение окраски хромосом in silico проводили с идиограммой хромосом человека, содержащей 750 бэндов. Таким образом, средний размер бэнда близок к 4 Мb. В этом случае анализ участков размером 2,5 Mb должен давать достаточно хорошее представление о среднем значении процента ГЦ-пар в отдельных бэндах, а участок размером 9,3 Mb должен включать, кроме этого бэнда, либо соседний бэнд, либо большие участки двух соседних бэндов. Такой анализ, по мнению авторов, позволяет провести сравнение ГЦ-состава в соседних бэндах. Вывод: важна не просто степень обогащения бэнда ГЦ-парами, а обогащение относительно соседних районов. Авторы полагают, что их данные достаточно хорошо согласуются с очень популярной гипотезой организации метафазной хромосомы, предложенной Saitoh и Laemmli в 1994 г.

В 1994 г. с помощью специфического окрашивания им удалось обнаружить последовательно расположенные матрикс/скэфолд-ассоциированные районы (MAR/SAR) в метафазной хромосоме индийского мунджака. В результате такой обработки было показано, что существует чередование районов, в которых MAR/ SARы формируют спираль, и в которых они расположены почти параллельно оси хромосомы. На основании этого была предложена модель, в которой G-бэнды представляют районы хромосом с плотно упакованным хроматином, расположением MAR/SARов по спирали и уменьшенным размером петель 30 нм хроматина (рис. 2-20), в то время как в R-бэндах петли хроматина больше по размеру, а MAR/ SARы расположены в линию практически параллельно оси хромосомы. Таким образом, плотность материала хромосомы в G-бэндах выше, чем в R-бэндах.

Рис. 2-20. Модель организации хроматина в метафазной хромосоме (по статье Saitoh and Laemmli, 1994, Cell. 1994 25; 76(4):609-22)

Известно, что MAR/SARы, несмотря на отсутствие конкретного мотива в их последовательностях, обогащены АТ-парами (около 70%), поэтому можно ожидать существования связи между ГЦ/АТ-составом ДНК хромосомных районов и обнаружением G- и R-бэндов в митотической хромосоме. Многие факты, касающиеся организации хромосомы, согласуются с этой гипотезой, рассматриваемой в качестве наиболее правдоподобной в большинстве учебников и монографий. К сожалению, всю сложную картину структурно-функциональной организации хромосомы и формирования ее имиджа на цитологическом препарате едва ли возможно объяснить в рамках таких простых представлений. Даже в самой работе Saitoh и Laemmli (1994) участки хромосомы индийского мунджака, в которых MAR/SARы располагались почти параллельно оси хромосомы и были рассмотрены в качестве R-бэндов, вероятно, соответствовали местам эволюционных слияний предковых хромосом, которые привели к образованию огромных хромосом у индийского мунджака.

Эффективность анализа хромосомных районов in silico во многом зависит от того, насколько точно можно отнести определенные последовательности нуклеотидов к конкретным элементам структурно-функциональной организации хромосомы. Многочисленные данные указывают на то, что размер базового элемента хромосомы близок к 1 Мb, в то время как точность локализации конкретного района или события на препаратах митотических хромосом значительно превышает эту величину. Тем не менее результаты некоторых исследований позволяют провести детальное сравнение индивидуальных соседних бэндов и пограничного района. Это можно сделать на примере района хромосомы, прилежащего к гену NF1. На рис. 2-21 представлены результаты исследования Клаудии Шмегнер и соавт., показывающие процент ГЦ-пар на участке хромосомы человека размером 500 kb, в состав которого входит ген NF1. Этот район хромосом человека представляет часть G-бэнда, переходную зону и часть R-бэнда. Часть G-бэнда соответствует ГЦ обедненной ДНК, а часть R-бэнда - ГЦ богатой ДНК, а переходная зона размещается в участке размером 5 kb. Доказательство того, что переход от ГЦ бедной к ГЦ богатой ДНК служит границей между G- и R-бэндами, было получено в тщательно выполненных экспериментах, показавших, что именно в этом месте происходит задержка репликации ДНК. Действительно, можно считать доказанным, что, по крайней мере, некоторые соседние G- и R-бэнды отличаются по содержанию АТ- и ГЦ-пар. Исследование Клаудии Шмегнер и соавт. наглядно показало, что в настоящее время можно провести корректное сравнение структурно-функциональной организации конкретного выбранного района на всех уровнях - in vivo, in vitro и in silico. К сожалению, такой район составляет менее 1/10 000 гаплоидного генома человека и около 1/100 самой маленькой хромосомы. Именно поэтому еще предстоит пройти большой путь от гипотез, описывающих структурно-функциональную организацию хромосомы, до надежной теории, без которой секвенирование даже 100 000 персональных геномов человека не даст завершенной картины и оставит множество острых вопросов, стоящих перед медицинской генетикой, открытыми.

Рис. 2-21. Процент ГЦ-пар на участке хромосом человека (черная линия) и мыши (серая линия) размером 500 kb, в состав которого входит граница G- и R-бэндов (указана стрелкой).

Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научнопрактические аспекты. - М., 2007. - 640 с.

Бочков Н.П., Пузырев В.П., Смирнихина С.А. Клиническая генетика. - М.: ГЭОТАРМедиа, 2011. - 544 с.

Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Гетерохроматированные районы хромосом человека: клинико-биологические аспекты. - М.: Медпрактика, 2008. - 300 с.

Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Медицинская цитогенетика. - М.: Медпрактика, 2006. - 300 с.

Гинтер Е.К. Медицинская генетика. - М.: Медицина, 2003. - 1997 с.

Ридли М. Геном: автобиография вида в 23 главах. - М.: Эксмо, 2008. - 432 с.

Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих. Федеральное агентство по образованию, Новосибирский государственный университет, Институт цитологии и генетики СО РАН. - Новосибирск, 2006. - С. 1-147.

Рубцов Н.Б. Хромосомы человека: описание хромосомных патологий. Учебное пособие. - Федеральное агентство по образованию, Новосибирский государственный университет, 2006.

Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Матвеева В.Г. и др. Обратная in situ гибридизация ДНК-зондов аномальных хромосом в диагностике хромосомных патологий // Генетика. - 2001. - № 11. - С. 1545-1552.

Смирнов В.Г. Цитогенетика. - М.: Высшая школа, 1991. - 248 с.

Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека: история хромосомы человека, формальная генетика. - М.: Мир, 1989.

Bain B.J. The role of cytogenetics in the assessment of haematological disorders // Human Cytogenetics. Vol. II. Malignancy and acquired abnormalities. A practical approach. - Oxford; New York; Tokyo: Oxford University Press, 1992. - P. 121-154.

Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Application Guide. - Berlin; Htidelberg: Springer-Verlag, 2009.

Graf M.D., Schwartz S. Molecular approaches for delineating marker chromosomes // Methods Mol. Biol. - 2002. - Vol. 204. - P. 211-218.

Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J. ISCN 2009 An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2009) Recommendations of the International Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature. 2009. Published in collaboration with «Cytogenetic and Genome Research».

Shaffer L.G., Lupski J.R. Molecular mechanisms for constitutional chromosomal rearrangements in humans // Annu Rev. Genet. - 2000. - Vol. 34. - P. 297-329.

Несмотря на кажущуюся простоту термина, на сегодняшний день существует множество определений гена, но ни одно из них не может полностью удовлетворить всех и быть приемлемым во всех случаях.

Наиболее допустимым кажется определение, данное М. Сингером и П. Бергом. Оно основано на молекулярном строении генов. Ген определяют как совокупность сегментов ДНК, которые составляют экспрессируемую единицу, обусловливающую образование специфического функционального продукта - молекулы РНК или полипептида. Ниже перечислены сегменты ДНК, составляющие ген.

Единица транскрипции, которая представлена протяженным участком ДНК, кодирующим последовательность первичного транскрипта. В нее входят:

Минимальные последовательности, которые необходимы для начала правильной транскрипции (промоторы) и образования правильного 3?-конца зрелой РНК.

Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции.

Закон гомологичных рядов Н.И. Вавилова гласит, что одинаковые мутации возникают в одинаковых генах. Ортологичными называют гомологичные гены в геномах разных организмов, служащие продуктом эволюции одного и того же гена в геноме их общего предка. Гомологичные последовательности называют паралогичными, если к их разделению привело удвоение гена; если оно случилось в пределах одного организма в результате хромосомной мутации, то его копии называют паралогами.

Ортологи обычно выполняют идентичные или сходные функции. Это не всегда справедливо в отношении паралогов. Ввиду отсутствия давления отбора на одну из копий гена, подвергшегося удвоению, она получает возможность беспрепятственно мутировать далее, что может привести к возникновению новых функций.

Так, например, гены, кодирующие миоглобин и гемоглобин, обычно считают древними паралогами. Сходным образом, известные гены гемоглобинов (α, β, γ и др.) - паралоги друг друга. В то время как каждый из них выполняет одну и ту же основную функцию (транспорт кислорода), их функции уже несколько дивергировали: гемоглобин зародыша (фетальный гемоглобин со структурой α2γ2) имеет большее сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого человека (α2β2).

Один из методов, применяемых в современной биоинформатике для исследования гомологии генов, - выравнивание аминокислотных последовательностей белков, кодируемых ими. Такой анализ позволяет не учитывать мутации, которые в результате вырожденности генетического кода не приводят к изменению аминокислотной последовательности и соответственно к изменению функции белка. Суть подхода заключается в поиске с помощью различных алгоритмов наиболее консервативных участков в белковых последовательностях разных видов, которые обычно являются ключевыми для выполнения одной или нескольких функций белка. Кроме того, выполняют исследование доменной структуры белка с помощью поиска известных структурных мотивов и доменов (рис. 3-1).

Рис. 3-1. Гомология последовательности белка MFN2 (FZO, HRP) у различных организмов, построенная с помощью программы AliBee - Multiple Alignment (www.genebee.msu.su)

Молекулярно-генетические данные, полученные в результате исследования геномов различных организмов, показали, что у разных видов высокогомологичны гены «домашнего хозяйства», к которым относят гены гистонов, рРНК и белков теплового шока.

В то же время высокогомологичные гены у разных видов располагаются в различных участках генома, на разных хромосомах, но часто совпадает их генетическое окружение. Например, ген krt1 мыши, лежащий на хромосоме 15, гомологичен человеческому гену KRT1, локализованному на хромосоме 12. Оба гена окружены кластерами кератиновых генов - krt 80, 84, 82, 6, 5 71, 72, 73, 77, 76, 8, 18 в геноме мыши и KRT 80, 81, 83, 75, 6, 71, 76, 4, 79 в геноме человека.

С информационной точки зрения гены человека, как и всех эукариот, представлены, как правило, более короткими кодирующими участками - экзонами и более протяженными некодирующими - интронами. Все интроны транскрибируются в составе первичного транскрипта и впоследствии удаляются в процессе разрыва- соединения нити РНК, называемого сплайсингом. Процесс превращения предшественника мРНК в зрелую РНК, содержащую только кодирующие области гена и специальным образом модифицированную на 5?- и 3?-концах, называют процессингом.

Размеры интронов варьируют от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Экзоны существенно короче - от нескольких единиц до нескольких тысяч оснований. Средний размер экзона человека - около 400 пар нуклеотидов. Лишь 6% генов человека одноэкзонные (у дрозофилы - 17%, у дрожжей - 95%), и примерно 1% генов состоит более чем из 60 экзонов (например, гены коллагенов). Среднее количество экзонов - восемь.

У человека средняя доля кодирующей ДНК в гене составляет около 10%, при этом ряд генов - одноэкзонные (например, гены тРНК, гистонов, интерферона α), а ряд, наоборот, имеет незначительную долю кодирующей ДНК (3% - у гена фактора VIII, 2,4% - у гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза, 0,6% - у гена дистрофина). Таким образом, на кодирующие области в геноме человека приходится примерно 3% всего генома.

Промотор - регуляторная последовательность в 5?-области гена, часто состоящая из нескольких блоков, - определяет место прикрепления РНК-полимеразы к ДНК и интенсивность (частоту) считывания.

Промотор РНК-полимеразы II напоминает бактериальный. Его первая часть - ТАТА-бокс - расположена на расстоянии -34-26 нуклеотидов от начала синтеза молекулы РНК. Формула этой консенсусной последовательности - T₈₂A₉₇T₉₃A₈₅T₆₃A₈₈t₅₀ (заглавными буквами обозначены основания, встречающиеся более чем в 50% случаев, цифры внизу - процент встречаемости). ТАТА-бокс важен для точного указания точки начала транскрипции. Существуют гены без ТАТА-бокса (например, гены «домашнего хозяйства»). Далее следуют домены СААТ (5?-GGCCAATCT-3?) и GC (5?GGCCGG-3?). Промоторы могут содержать различные комбинации элементов, но ни один из них не присутствует во всех промоторах.

В 3?-некодирующей области гена находятся сигнальные последовательности для полиаденилирования и сам сайт, к которому присоединяется поли(А)-«хвост». Такой поли(А)-«хвост» синтезируется на 3?-последовательности РНК специальной PolyA-полимеразой, причем синтез происходит без участия ДНК-матрицы. Длина «хвоста» составляет в среднем 150 нуклеотидов. Она определяет период жизни мРНК, так как «хвост» защищает саму мРНК от деградации. Дело в том, что поли(А) постепенно «откусывается» деаденилирующей нуклеазой. В некоторых клетках (например, в ооцитах) хвост постоянно ресинтезируется, что значительно увеличивает период жизни мРНК. Другие мРНК (например, кодирующие гистоновые белки) вообще не имеют поли(А)-«хвоста», поэтому их период жизни значительно меньше (около 1 ч). Вместо поли(А)-«хвоста» гистоновая мРНК имеет петлю (stem-loop) на 3'-конце.

Половина белок-кодирующих генов обладает более чем одним сайтом полиаденилирования . Выбор сайта последнего происходит в зависимости от белков, участвующих в нем. Например, экспрессия CstF-64 (субъединица CstF) в макрофагах повышается в ответ на липосахариды клеточной стенки бактерий, инициирующие иммунный ответ. Повышение экспрессии CstF-64 - результат выбора слабых поли(А)-сайтов и соответственно синтеза коротких транскриптов и устранения регуляторных элементов в 3'-нетранслируемой области мРНК таких компонентов защиты, как лизоцим и TNF-α. Альтернативное полиаденилирование для одного и того же гена носит тканеспецифичный характер. Более того, оно изменяется в течение жизни клетки. Например, ткани глаза, сетчатка и плацента используют сайты полиаденилирования, редко активные в других тканях. При сравнении областей генома, окружающих поли(А)-сайты в тканях мозга, с таковыми в других тканях были идентифицированы некоторые цис-регуляторные последовательности, специфически ассоциированные с поли(А)-сайтами, используемыми в тканях мозга.

Кроме поли(А)-сайтов, в 3'-нетранслируемой области есть сайты связывания микроРНК. Последняя подавляет трансляцию и запускает деградацию мРНК, с которой она связывается.

Транскрипция - процесс синтеза РНК на матрице ДНК. Результат этого процесса - РНК, представляющая копию одной из нитей последовательности ДНК, называемой кодирующей. Вторая нить - матрица для синтеза новой молекулы ДНК.

РНК отличается от ДНК тем, что она содержит 2?-OH-группу, которая делает рибозу более химически нестойкой по сравнению с дезоксирибозой, служащей основой ДНК. Чувствительность РНК к пероксидам и щелочам повышена вследствие присутствия двух гидроксильных групп в 2?- и 3?-положении. Вместо азотистого основания тимина молекула РНК содержит урацил. Существует РНК в однонитевой форме, хотя внутри своей последовательности она может образовывать участки двунитевой структуры.

В клетке, кроме мРНК, несущей информацию о структуре белков, существует множество разных типов РНК: транспортная, рибосомная, малая ядерная и малая цитоплазматическая. Все эти виды РНК - результат транскрипции определенных генов.

Таким образом, транскрипция - не только первый, но и наиболее важный с точки зрения регуляции этап экспрессии генов.

Процесс транскрипции - ферментативный, и его контролирует фермент РНКполимераза. Кроме нее, в процессе синтеза молекулы РНК принимает участие множество белков-регуляторов транскрипции, которые своей работой увеличивают или уменьшают вероятность синтеза РНК с определенного фрагмента ДНК.

У человека, как и у остальных эукариот, есть три разные РНК-полимеразы, которые транскрибируют РНК с трех разных типов генов. РНК-полимераза I синтезирует 18, 28 и 5,8S-рРНК. РНК-полимераза III транскрибирует гены 5S рРНК, тРНК и большинства малых ядерных РНК. РНК-полимераза II считывает мРНК с генов, кодирующих белки и некоторые малые ядерные РНК.

Каждый ген имеет в своем составе регуляторную часть, с которой начинается транскрипция, кодирующую и терминирующую часть. Транскрипция начинается с денатурации двойной спирали ДНК в области промотора под действием транскрипционного комплекса. Она заканчивается, когда молекула РНК-полимеразы достигнет терминирующей последовательности, которая содержит шпилечную структуру и последовательность из нескольких уридинов.

Распознавание матрицы начинается с присоединения РНК-полимеразы к молекуле ДНК. Последовательность ДНК, необходимую для этого, называют промотором. После локальной денатурации в месте присоединения фермента начинается процесс инициации транскрипции - синтез первых девяти нуклеотидов, при этом РНК-полимераза остается присоединенной к промотору и не продвигается вдоль ДНК. Далее следует элонгация - процесс синтеза молекулы РНК с продвижением фермента вдоль последовательности ДНК. Процесс терминации транскрипции включает распознавание точки ДНК, после которой не следует присоединять нуклеотиды. В процессе терминации различают следующие стадии: коллапс участка локальной денатурации и отсоединение фермента и вновь синтезированной молекулы РНК. Схематично процесс транскрипции, трансляции и синтеза белка представлен на рис. 3-2 (см. цв. вклейку).

После синтеза РНК следует процессинг, в ходе которого удаляются интроны, сшиваются экзоны и добавляется 5?-кэп (короткий фрагмент) и поли(А)⁺-«хвост» на 3?-конце.

Транскрипционные факторы можно разделить на основные и регуляторные. Все основные факторы транскрипции очищены и выделены. Их обозначают первыми буквами слов «transcription factor»: TF - с добавлением римской цифры I, II или III (в зависимости от типа РНК-полимеразы). Далее следует обозначение белковой молекулы. На сегодняшний день описано семь транскрипционных факторов: TFIIA, TFIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH и TFIIJ. Каждый из факторов транскрипции, в свою очередь, состоит из нескольких полипептидов.

В простейшем случае конститутивного синтеза, где задействованы только базальные факторы, процесс инициации транскрипции выглядит следующим образом. Первым к ДНК присоединяется единственный из факторов, способный распознавать последовательность ДНК-TBP (TATA-binding protein). Далее присоединяется фактор TFIIA, состоящий из трех субъединиц, который предохраняет TBP от действия репрессоров, а следующим - TFIIB, который защищает последовательность -10-+10. TFIF, состоящий из двух субъединиц, присоединяется следующим. Одна его субъединица имеет хеликазную активность и денатурирует молекулу ДНК, другая - гомологична σ-фактору бактерий и соединяется с РНКполимеразой. В дальнейшем присоединяется РНК-полимераза. Транскрипционные факторы TFIIH и TFIIJ, которые фосфорилируют хвостовой фрагмент РНКполимеразы и вызывают отсоединение некоторых транскрипционных факторов, позволяют РНК-полимеразе перейти к фазе элонгации.

Кроме промоторов, существуют и другие элементы геномa, регулирующие эффективность транскрипции.

Энхансеры - регуляторные последовательности, которые усиливают транскрипцию, а сайленсеры ослабляют ее. В отличие от промоторов, энхансеры и сайленсеры могут находиться на различном, не строго фиксированном и нередко большом расстоянии от точки начала транскрипции и располагаться не только в 5?-, но и в 3?-области, а также в середине самого гена.

На рис. 3-3 (см. цв. вклейку) представлены схематичное расположение и специфические сайты взаимодействия регуляторных элементов. Элементы подразделяют на экзонные энхансеры (exon splicing enhancers - ESEs) и сайленсеры сплайсинга (exon splicing silencers - ESSs), интронные энхансеры (intron splicing enhancers - ISEs) и интронные сайленсеры (intron splicing silencers - ISSs). Энхансер активирует рядом расположенные сайты сплайсинга или противодействует сайленсерам. Сайленсеры могут репрессировать сайты сплайсинга или энхансеры.

Энхансеры и сайленсеры содержат специфические участки связывания регуляторных белков, активирующих или замедляющих процесс транскрипции. Наиболее простой пример такой работы - регуляция транскрипции стероидными гормонами. Они оказывают действие, проникая внутрь клетки и связываясь с внутриклеточными рецепторами, локализованными в различных клеточных структурах. Рецептор глюкокортикоидов находится в цитоплазме и после связывания с лигандом продвигается к ядру. Рецепторы эстрогенов локализованы преимущественно в ядре, а рецепторы гормона щитовидной железы - исключительно в ядре. Все рецепторы после связывания с лигандами претерпевают структурные изменения, способствующие присоединению лиганд-рецепторного комплекса к специфическим участкам ДНК, называемым гормон-акцепторными элементами (HRE). HRE обладают свойствами энхансеров, влияющих на активность промоторов.

Согласно самой простой модели, механизм дистанционного действия энхансеров и сайленсеров основан на пространственном взаимодействии вследствие образования петли ДНК на участке между энхансером (сайленсером) и промотором. Благодаря этому белковые комплексы, соединенные с энхансером (сайленсером), могут взаимодействовать с одним из факторов транскрипции или РНКполимеразой, усиливая или репрессируя активность транскрипции.

Инсуляторы (англ. insulate - изолировать, отделять от окружения) - последовательности ДНК, которые разграничивают соседние гены, блокируя взаимодействие энхансеров (сайленсеров) с неподходящим геном. Если бы не существовало инсуляторов, то любой энхансер (сайленсер) за счет механизма петли был бы способен соединиться с любым, даже сколь угодно далеким, промотором и регулировать интенсивность транскрипции.

Последовательности инсуляторов замыкают с двух сторон активные гены. Только в пределах участка между двумя инсуляторами энхансерные последовательности, связавшись с белками-активаторами, могут образовать петлю и воздействовать на промотор.

Введение одного из таких элементов между энхансером и промотором регулируемого гена приводит к функциональной изоляции энхансера и подавлению экспрессии гена. Фланкирование гена пограничными последовательностями предохраняет его от инактивирующего действия окружающего конденсированного гетерохроматина, т.е. устраняет эффект положения.

Сплайсинг - процесс удаления из РНК-предшественника некодирующих последовательностей (интронов) и соединения между собой в большинстве случаев кодирующих фрагментов зрелой мРНК (экзонов).

Сплайсинг ядерных про-мРНК происходит в ядре. Первый этап этого процесса - сборка комплекса сплайсинга. Самые ранние продукты сплайсинга - молекулы РНК, одни из которых содержат 5?-экзон, а другие - интрон и 3?-экзон. Расщепление в 5?-сайте (донорном) всегда предшествует таковому в 3?-сайте (акцепторном). В результате интроны вырезаются, а экзоны лигируются друг с другом. Комплекс, катализирующий сплайсинг и состоящий из множества субъединиц, называют сплайсингосомой. Сплайсингосома собирается на интроне перед расщеплением на 5?-сайте сплайсинга и состоит из интрона, связанного с белками и рибонуклеопротеидными комплексами. Нуклеотидная последовательность концов рибонуклеопротеидов комплементарна канонической последовательности 5?-сайтов сплайсинга всех интронов. U1-рибонуклеопротеиды специфически связываются с экзон-интронными соединениями, защищая последовательность интрона примерно из 17 нуклеотидов от расщепления РНКазой, и с областью из 40 нуклеотидов, содержащей нуклеотид аденин, участвующий в образовании разветвленной петлеобразной структуры. Этот процесс необходим для правильного формирования петлеобразных структур вследствие внутримолекулярного спаривания нуклеотидов интрона и точного вырезания некодирующих последовательностей.

Схематически процесс сплайсинга представлен на рис. 3-4 (см. цв. вклейку). Показаны формирование сплайсингосомы, процесс вырезания интронов и конечные продукты сплайсинга: мРНК, вырезанный интрон и отсоединившиеся компоненты сплайсингосомы.

Нуклеотидные последовательности в местах соединения экзонов и интронов высококонсервативны. Донорный или 5?-сайт сплайсинга фланкирует последовательность CRG (R-пурин), а 3?-сайт - остаток G. Нуклеотидные последовательности экзонов на границе с интроном могут быть весьма разнообразными, а изменения в них не всегда препятствуют процессу сплайсинга. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие интрон изнутри, напротив, отличаются большим постоянством. Первые два нуклеотида на 5?-конце интрона в РНК - GU. Далее последовательность может немного варьировать. Канонической последовательностью считают A или G и далее AGU. Эти шесть нуклеотидов на 5?-конце интрона определяют специфическую функцию донорного сайта сплайсинга. Замена остатков G или U в месте сочленения экзона и интрона полностью блокирует сплайсинг. Даже скрытые или критические сайты сплайсинга, которые используются только в случае, когда основные сайты повреждены или пропущены, содержат нуклеотиды GU на 5?-вырезаемой последовательности.

На 3?-конце интрона всегда находится пара AG, перед которой в интронах человека, как и других млекопитающих, располагается богатый пиримидином участок (YnNYAG).

Еще один важный регуляторный элемент сплайсинга - так называемая точка ветвления, которая представлена аденином, расположенным ближе к 3?-концу интрона, на расстоянии 18-37 нуклеотидов от экзона. В интронах человека этот остаток не находится в фиксированном положении и не окружен какой-то определенной последовательностью. В экспериментах in vitro было показано, что мутации, затрагивающие соседствующие с аденином последовательности, приводят к существенному снижению эффективности сплайсинга.

Можно полагать, что введение мутаций в сайты сплайсинга может приводить к нарушению сплайсирования и, следовательно, к фатальным последствиям для кодируемого белка. Действительно, практически для каждого наследственного заболевания человека, гены которого известны, описаны такие мутации. Более того, существуют мутации, приводящие к образованию новых сайтов сплайсинга, которые также ведут к тяжелым последствиям. Такие мутации значительно более редки. Один из генов, где они, очевидно, происходят достаточно часто, - ген дистрофина, где интронная часть (материал для создания новых сайтов сплайсинга) составляет примерно 2 200 000 пар нуклеотидов.

Некоторые интроны имеют несколько 5?- и 3?-сайтов сплайсинга. В этих случаях возникает явление, называемое альтернативным сплайсингом. В результате прохождения процесса сплайсинга по различным сайтам с одного первичного транскрипта образуются несколько зрелых мРНК и в результате - несколько протеиновых последовательностей с одного гена

Альтернативный сплайсинг - эффективный способ продукции мРНК, кодирующих структурно родственные белки. Эти изоформы могут выполнять как одинаковые, так и разные функции. Например, иммуноглобулины человека представлены двумя изоформами - мембраносвязанной и секретируемой. Кроме того, благодаря альтернативному сплайсингу возникает тканеспецифичность различных изоформ белка: в щитовидной железе синтезируется кальцитонин, а в мозге - его изоформа. На рис. 3-5 (см. цв. вклейку) приведен пример тканеспецифичного альтернативного сплайсинга гена α-тропомиозина человека.

Иногда альтернативный транскрипт кодирует абсолютно бесполезный для клетки белок. Бывают и курьезные случаи. Например, у одного из пациентов, страдающих миодистрофией Беккера, обнаружили небольшую делецию в гене дистрофина, которая должна была приводить к сдвигу рамки считывания и соответственно к полной неактивности белка. Такие мутации вызывают более тяжелую форму заболевания - миодистрофию Дюшенна . Оказалось, что, кроме РНК, соответствующей такому делеционному варианту, у больного присутствует альтернативно сплайсированная форма, в которой отсутствует еще один экзон. Несмотря на больший размер делеции, этот вариант значительно более благоприятен, поскольку в нем восстанавливалась рамка считывания, и образующийся белок мог выполнять свои функции, по крайней мере, частично.

Регуляция альтернативного сплайсинга происходит на уровне использования разных промоторов (ген легкой цепи миозина) полиаденилированием про-мРНК в различных местах и, следовательно, разницей длин 3?-последовательностей (легкая и тяжелые цепи иммуноглобулинов).

Выделяют следующие типы альтернативного сплайсинга (рис. 3-6, см. цв. вклейку):

Первый элемент процессинга - создание кэп-сайта, которое происходит вскоре после транскрипции. На первом этапе от 5'-концевого нуклеотидтрифосфата с помощью фосфогидролазы отщепляется монофосфат. Затем с помощью гуанилилтрансферазы к нему присоединяется гуанидинтрифосфат с отщеплением двух фосфатов от гуанидинтрифосфата. С помощью гуанин-7-метилтрансферазы метилируется гуанин, а затем и последующие два основания. Создание такого кэп-сайта делает структуру РНК более прочной, предохраняя ее от деградации со стороны 5'-конца.

Полиаденилирование - присоединение аденина к 3'-концу мРНК - один из вариантов посттранскрипционного процессинга (модификации) мРНК, имеющий значение, в том числе, и в регуляции экспрессии генов. Процессинг 3'-конца - важный этап в созревании мРНК у всех эукариот. Полиаденилирование необходимо для транспорта мРНК из ядра, повышения стабильности молекулы (защищает мРНК от деградации нуклеазами) и инициации трансляции. Полиаденилирование - двухэтапная реакция. На первом этапе происходит сайт-специфичное разрезание пре-мРНК, а на втором - синтез поли-А-«хвоста» определенной длины (в среднем - 150 нуклеотидов) на 3'-конце порезанного продукта. Синтез происходит с участием поли-А-ДНК-полимеразы, которая не нуждается в молекуле ДНК-матрицы. Для реакции полиаденилирования необходимы цис-активные сигнальные последовательности в нетранслируемом регионе пре-мРНК и транс-активные белковые факторы.

Генетический материал обладает двумя различными функциями. Первая из них - наследственная, т.е. обеспечение наследования признаков из поколения в поколение. Эту функцию генетического материала обеспечивает репликация и, в определенном смысле, репарация. Другая функция - экспрессия заложенной в геноме информации, ее реализация в структуры и функционирование клеток, органов и всего организма в целом. Различают две стадии экспрессии генетического материала - транскрипцию и трансляцию. Стадия транскрипции - ключевая для регуляции активности генов. Трансляция - процесс прочтения генетического кода и реализация информации, записанной в нуклеиновых кислотах, в последовательность аминокислот или первичную структуру полипептидной цепи.

Так как нуклеиновые кислоты и белки имеют различную структуру и составляющие элементы (нуклеотиды и аминокислоты соответственно), синтез белков непосредственно на матрице РНК невозможен. Для этого процесса необходим посредник или адаптер, в качестве которого выступает молекула тРНК. Размер этой молекулы составляет 70-90 нуклеотидов. Строение тРНК достаточно специфично и имеет форму кленового листа. Один тип молекул тРНК может представлять только один тип аминокислоты. Каждый тип тРНК содержит антикодоны - последовательности трех нуклеотидов, комплементарных кодону нуклеотидов мРНК и кодирующей цепи ДНК. Антикодон размещается в центральном «лепестке» молекулы тРНК. Таким образом, соответствие молекулы тРНК определенному кодону достигается в результате комплементарного взаимодействия двух молекул РНК. Взаимодействие тРНК с аминокислотой происходит вследствие специфического ферментативного присоединения определенной аминокислоты к определенному типу тРНК. Таким образом, в целях обеспечения специфичности для каждой аминокислоты требуются различные ферменты - аминоацилсинтетазы.

Синтез белковой цепи, т.е. трансляция, происходит на специфических органеллах - рибосомах. Размер рибосом исчисляют в единицах Сведберга (скорость седиментации). У человека он составляет 80S, а размеры субъединиц рибосомы - 60S и 40S. Рибосомы состоят из рибосомальной РНК (рРНК) и более 80 различных белков. В большей субъединице рибосом существует два сайта для присоединения аминокислот на расстоянии, обеспечивающем возможность реакции конденсации между ними. Один из сайтов присоединяет новую аминокислоту (акцепторный карман), а другой - предыдущую, входящую в состав вновь синтезированной полипептидной цепи (пептидильный карман).

У эукариот процессы транскрипции и трансляции физически разделены: синтез РНК происходит в ядре, а белка - в цитоплазме.

В процессе трансляции выделяют три этапа: инициацию, элонгацию и терминацию (рис. 3-7, см. цв. вклейку).

В процессе инициации, кроме мРНК и рибосом, принимают участие дополнительные белки, называемые факторами инициации, - IF1, IF2 и IF3. Первый этап инициации - присоединение малой субъединицы рибосомы к особому сайту в мРНК, предшествующее началу считывания. В нем принимают участие факторы инициации. Стартовый кодон для всех белков человека - AUG (ATG в ДНК), кодирующий аминокислоту метионин. Инициирующая аминоацил-тРНК отличается от других подобных ферментов, участвующих в элонгации. Вторая субъединица рибосомы присоединяется только после отсоединения факторов инициации, после чего начинается следующая фаза - элонгация. Вторая тРНК присоединяется к рибосоме в районе акцепторного сайта, и происходит реакция конденсации между двумя аминокислотами, в результате которой высвобождается молекула воды. Энергия, необходимая для продвижения полученного дипептида, высвобождается при переходе ГТФ в ГДФ с высвобождением фосфата. Для отщепления тРНК необходим фактор элонгации. Сигналом терминации трансляции служит стоп-кодон. Его не распознает ни одна из тРНК, но узнают белки-факторы высвобождения, что приводит к диссоциации всей системы синтеза полипептида на составляющие. Фактор высвобождения R1 распознает кодоны UAG и UAA, R2-UAA и UGA.

Вновь синтезированные полипептидные цепи подвергаются посттрансляционной модификации: разрезанию протеолитическими ферментами по специфическим последовательностям, фосфорилированию, гликозилированию и другим химическим модификациям.

Протеолитически удаляется сигнальный пептид, а во многих белках отщепляется начальный N-концевой метионин. Так называемому ограниченному постсинтетическому протеолизу подвергаются некоторые проферменты (трипсиноген, химотрипсиноген) и предшественники гормонов (препроинсулин, пре-β-липотропин). В ряде случаев происходит С-концевая модификация синтезированного белка.

Если белок состоит из нескольких (более одного) полипептидов, то после трансляции происходит сборка его субъединиц. Например, инсулин синтезируется в виде единственной полипептидной цепи препроинсулина, который после ферментативного гидролиза превращается сначала в неактивный предшественник проинсулин, а затем в активный гормон инсулин, содержащий две полипептидные цепи разных размеров и последовательностей.

Посттрансляционная химическая модификация белков затрагивает радикалы отдельных аминокислот.

Одна из таких модификаций - ковалентное присоединение простетической группы к молекуле белка. Например, только после присоединения пиридоксальфосфата к апоферменту - ε-аминогруппе остатка лизина белковой части - образуется биологически активная трехмерная конфигурация аминотрансфераз, катализирующих реакции трансаминирования аминокислот.

Некоторые белки подвергаются гликозилированию, присоединяя олигосахаридные остатки (образование гликопротеинов), и тем самым обеспечивают доставку белков к клеткам-мишеням.

Кроме того, присутствуют химические модификации белков, возникшие в результате реакции гидроксилирования остатков пролина, лизина (при формировании молекул коллагена), метилирования (остатки лизина, глутамата), ацетилирования ряда N-концевых аминокислот, карбоксилирования остатков аспартата и глутамата (например, в протромбине, который содержит ряд γ-карбокси глутаматных остатков на N-конце).

Фосфорилирование-дефосфорилирование ОН-группы серина абсолютно необходимо для множества ферментов (например, для гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы).

Известны также реакции окисления двух остатков цистеина и образования внутри- и межцепочечных дисульфидных связей при формировании третичной структуры (фолдинг). Это обеспечивает не только защиту от внешних денатурирующих агентов, но и образование специфической конформации.

Генетический код - способ преобразования информации, содержащейся в нуклеиновых кислотах (ДНК и РНК), в аминокислоты (рис. 3-8, см. цв. вклейку).

Важнейшие свойства генетического кода:

Триплетность генетического кода позволяет, используя всего четыре нуклеотида (четыре буквы алфавита), кодировать 20 необходимых аминокислот. Три буквы необходимы и достаточны для кодирования всех аминокислот: двоичный код обеспечивает лишь 16 возможных комбинаций, а троичный - уже 64. Одно из доказательств триплетности состоит в том, что мутации - делеции и инсерции, кратные трем нуклеотидам, - наиболее «мягкие», так как не приводят к сдвигу рамки считывания и позволяют синтезировать практически полноценный белок. Многие подходы к генотерапии миодистрофии Дюшенна направлены именно на восстановление рамки считывания белка дистрофина путем введения делеций, делающих повреждение гена кратным трем нуклеотидам.

Под неперекрываемостью генетического кода подразумевают, что каждый кодон состоит из трех нуклеотидов, и каждый последующий кодон представлен следующими тремя нуклеотидами. Так как генетический код неперекрываем, существует только три возможности транслировать нуклеотидную последовательность в аминокислотную в зависимости от стартовой точки. Кодирующая последовательность РНК человека начинается с кодона AUG, который распознается особенной, отличной от всех других аминоацил-тРНК и терминируется одним из стоп-кодонов. Расстояние между точкой инициации трансляции и стоп-кодоном называют открытой рамкой считывания.

Так как возможных комбинаций оснований больше необходимых 20, генетический код считают вырожденным, т.е. одну и ту же аминокислоту могут кодировать несколько различных кодонов. Вырожденность генетического кода затрагивает последнюю букву кодона, реже - вторую, и только две аминокислоты - лейцин и аргинин - кодируются триплетами с различным первым основанием.

Под универсальностью генетического кода понимают, что определенному кодону во всех организмах соответствует определенная аминокислота. Как и в любом правиле, бывают исключения. У человека они связаны с геномом митохондрий, возможно, вследствие его долговременной, независимой от ядерного генома эволюции. В геноме митохондрий кодон UGA, соответствующий сигналу терминации в ядерном геноме, кодирует аминокислоту триптофан. Кодоны AGA и AGG, кодирующие в ядерном геноме аргинин, считают терминирующими. Триплеты, кодирующие изолейцин в ядерном геноме (AUU, AUC, AUA), служат стартовыми для генома митохондрий. Исключения из универсальности генетического кода обнаруживают в митохондриях других видов и даже в ядерных геномах микоплазмы, цилиатов и гриба кандида цилиндрика.

Информация о структуре генетической информации, знание последовательностей генов и путей регуляции их экспрессии уже сегодня позволяют успешно диагностировать различные моногенные заболевания и мультифакторные состояния.

Знание белковых продуктов различных генов позволяет успешно лечить многие болезни обмена посредством введения в организм недостающих ферментов (лечение болезни Помпе) или недопущения поступления тех веществ, метаболический путь которых нарушен. Например, основа лечения фенилкетонурии, причиной которой служат мутации гена фенилаланин-гидроксилазы, - диетотерапия, исключающая поступление в организм с продуктами питания аминокислоты фенилаланина.

Болезнь Помпе (гликогеноз II типа) - наследственное состояние, развивающееся вследствие отсутствия лизосомальной α-1,4-глюкозидазы (кислой мальтазы), функция которой заключается в деградации гликогена. В результате последний накапливается в тканях и органах больного и начинает оказывать на них повреждающее действие. Наиболее уязвимы печень, скелетные и сердечная мышцы. В настоящее время Агентство по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA) одобрило препарат Lumizyme (альглюкозидаза альфа; производитель - компания Genzyme) для лечения пациентов с болезнью Помпе. Это лекарственное средство замещает недостаток необходимого фермента и предназначено для лечения юношеской и взрослой формы болезни Помпе. Его применение разрешено у пациентов в возрасте старше 8 лет.

Разработаны и проходят различные фазы клинических испытаний средства для генотерапии тяжелых наследственных заболеваний. Они основаны не только на возмещении (введении в клетку) неповрежденных генов, но и на изменении регуляторных последовательностей гена, благодаря чему синтез белка может происходить и с поврежденного гена.

Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. - Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2002. - 479 с.

Инге-Вечтомов С.Г. Трансляция как способ существования живых систем, или в чем смысл «бессмысленных» кодонов // Соросовский науч. журн. - 2006. - № 12. - С. 2-10.

Льюин Б. Гены. - М.: Мир, 1987. - 544 с.

Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - М.: Мир, 1998. - 373 с.

Birney E., Stamatoyannopoulos J.A., Dutta A. et al. ENCODE Project Consortium, Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project // Nature. - 2007. - Vol. 447, N 7146. - P. 799-816.

Costa V., Angelini C., De Feis I., Ciccodicola A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq // J. Biomed. Biotechnol. - 2010. - P. 853-916.

Dietz H.C. New therapeutic approaches to mendelian disorders // N. Engl. J. Med. - 2010. - Vol. 363, N 9. - P. 852-863.

Dunn E.A., Rader S.D. Secondary structure of U6 small nuclear RNA: implications for spliceosome assembly // Biochem. Soc. Trans. - 2010. - Vol. 38, N 4. - P. 1099-1104.

Gerstein M. В., Bruce С., Rozowsky J.S. et al. What is gene, post-ENCODE? History and updated definition // Genome Res. - 2007. - Vol. 17. - P. 669-681.

Jawdekar G.W., Henry R.W. Transcriptional regulation of human small nuclear RNA genes // Biochim. Biophys. Acta. - 2008. - Vol. 1779, N 5. - P. 295-305.

Kuhn E.J., Geyer P.K. Genomic insulators: connecting properties to mechanism // Curr. Opin. Cell Biol. - 2003. - Vol. 15, N 3. - P. 259-265.

Matlin A.J., Clark F., Smith C.W. Understanding alternative splicing: towards a cellular code // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2005. - Vol. 6, N 5. - P. 386-398.

Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci. Am. - 1990.

Ohler U., Wassarman D.A. Promoting developmental transcription // Development. - 2010. - Vol. 137, N 1. - P. 15-26.

Regenerative Medicine. Department of Health and Human Services. - 2006.

Russel P.J. Genetics. - Menlo Park, California: Addison Wesley Longman Inc., 1998.

Struhl K. Transcriptional noise and the fidelity of initiation by RNA polymerase II // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2007. - Vol. 14, N 2. - P. 103-105.

Struhl K. Analysis of DNA-protein interactions using proteins synthesized in vitro from cloned genes // Curr. Protoc. Mol. Biol. - 2001. - Ch. 12.

Williams A., Spilianakis C.G., Flavell R.A. Interchromosomal association and gene regulation in trans // Trends Genet. - 2010. - Vol. 26, N 4. - P. 188-197.

Проблема реализации генетической информации на разных стадиях онтогенеза занимает центральное место в современной биологии. Расшифровка генома человека и других млекопитающих, включая излюбленные экспериментальные биологические модели (аскарида, дрозофила, мышь), разработка новых высокоразрешающих методов идентификации генов и анализа тонких механизмов регуляции их экспрессии открывают новые, ранее недоступные возможности для таких исследований. Они особенно актуальны для изучения вклада генома в патологию ранних стадий онтогенеза, в возникновение пороков развития и мультифакторных заболеваний.

Наиболее драматичные события в индивидуальном развитии происходят на самых ранних стадиях онтогенеза, начиная с оплодотворения и формирования всех основных тканей и органов во время эмбриогенеза, и охватывают весь период внутриутробного развития. Неслучайно современную эмбриологию нередко называют биологией развития. Действительно, именно на этих стадиях после слияния гамет формируется индивидуальный геном, обеспечивающий всю дальнейшую программу развития нового организма. Именно на начальных стадиях эмбриогенеза происходит наиболее жесткая селекция генетически неполноценных особей. Репрограммирование генома половых клеток, включение генетической программы индивидуального развития, сложные механизмы взаимодействия продуктов генома зародыша с материнским организмом, включая процессы имплантации и плацентации, и, наконец, реализация собственной программы построения сложного организма - вот основные этапы раннего онтогенеза человека, в изучении которых за последние 10 лет были достигнуты значительные успехи. Их краткое рассмотрение и составляет основную задачу настоящей главы. При этом, наряду с изложением современных представлений о контролирующих механизмах ранних стадий эмбриогенеза человека, в главе приведены новые данные о роли дефектов генетического аппарата и мутаций отдельных генов в патологии развития человека, в возникновении врожденных аномалий и наследственных болезней. Кроме того, уместно кратко рассмотреть современные подходы, некоторые важные открытия, принципиально новые методы и гипотезы последних лет, позволяющие наметить новые пути дальнейших исследований в генетике развития человека, значение которых для фундаментальной науки о человеке и прикладное для медицинской генетики трудно переоценить.

Прогресс любой науки - это прогресс ее методов и подходов, с помощью которых можно получить новые факты, выдвинуть новые гипотезы и сформулировать новые теории. В полной мере данное обобщение справедливо и для генетики развития человека. Бурное развитие генетики, ознаменовавшееся в 2003 г. полной расшифровкой первичной нуклеотидной последовательности генома, активное развитие функциональной геномики, направленное на идентификацию новых генов и исследование продуктов их экспрессии (протеомика ), а также взаимодействия этих продуктов (метаболомика) имели решающее значение для медицинской генетики в плане изучения роли дефектов генетического аппарата в патологии человека. Подобные исследования особенно актуальны во время внутриутробного периода, когда активно происходят процессы морфогенеза, а ошибки генома особенно часто подвергаются естественному отбору.

Несомненный прогресс в понимании сложных механизмов развития достигнут благодаря новым подходам к исследованию зародышей человека на разных стадиях развития и разработке высокоэффективных методов молекулярно-генетического анализа. Так, благодаря программам вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и методу ультрасонографии высокого разрешения появилась реальная возможность непосредственно исследовать гаметы и зародыши человека на доимплантационных стадиях развития, а после имплантации - анализировать динамику развития всего плода и его отдельных органов. Ценная информация по биологии и генетике развития человека получена и в исследованиях на эмбриональных стволовых клетках, а также в экспериментах на биологических моделях наследственных болезней.

Существующие в некоторых странах законодательные акты (Human Fertilization and Embryology Act, 1990, UK) позволяют проводить прямые исследования зародышей человека, вплоть до 14-го дня развития. К сожалению, такие важнейшие этапы эмбриогенеза человека, как гаструляция (II фаза), нейруляция и закладка осевого комплекса органов, по времени совпадают с периодом имплантации и потому до сих пор практически недоступны для прямого исследования. Минимально травмированные зародыши человека ранних постимплантационных стадий развития могут быть получены либо хирургической аспирацией, либо с помощью медикаментозных средств, используемых для прерывания беременности (мифепристон, RU486, простагландины).

Благодаря программам ВРТ можно не только получать и исследовать гаметы человека на любой стадии их развития, но и изучать биохимические, молекулярные и цитологические особенности самих эмбрионов. Особенно важный прогресс в этой области достигнут благодаря разработкам и внедрению методов предимплантационной генетической диагностики (preimplantation genetic diagnosis, PGD) и методов доимплантационного генетического скрининга (preimplantation genetic screening, PGS). Конечная цель в обоих подходах - выяснение генетической полноценности эмбрионов, используемых для последующей трансплантации, в отношении хромосомных аберраций или генных мутаций. PGD проводят в семьях высокого риска, диагностика направлена на поиск генетически полноценных эмбрионов, в дальнейшем используемых для пересадки. PGS в настоящее время ограничивается цитогенетическим анализом 7-9 хромосом, наиболее часто вовлекаемых в анеуплоидию. Исследования проводят на полярных тельцах, отдельных бластомерах дробящихся зародышей и клетках трофобласта, полученных на стадии бластоцисты с помощью микроманипулятора. Как показывает многолетний опыт, именно биоптаты трофобласта наиболее удобны для молекулярных и цитогенетических исследований, и именно после такой операции приживаемость зародышей особенно велика. Более того, установленная в этих исследованиях высокая частота аномалий кариотипа, в том числе и мозаицизм хромосом, послужили основанием дополнять анализ единичных бластомеров на стадии морулы исследованием полярного тельца. Детальный морфологический анализ доимплантационных зародышей, дополненный специальными методами исследования (метод FISH, CGH, молекулярные методы, метод биочипов и др.), позволяет получить новую информацию о влиянии генных и хромосомных мутаций на процессы индивидуального развития, уточнить критерии включения или исключения для пересадки зародышей в матку.

Еще больше возможностей в плане генетики (цитогенетики) развития открывают методы постимплантационной пренатальной диагностики. Как в I, так и во II триместрах беременности возможны ультразвуковые прижизненные исследования плода с аномальным кариотипом, установленным методами инвазивной пренатальной диагностики. В дальнейшем, после прерывания беременности, такие плоды могут быть использованы для детального патоморфологического и гистохимического анализа.

С использованием современных методов молекулярно-генетического анализа на этих стадиях возможно и детальное изучение экспрессии генов. В настоящее время уже создано много «экспрессионных» баз данных как всего зародыша, так и его отдельных органов и тканей, например трехмерная модель развивающегося мозга. Экспрессию отдельных генов исследуют на гистологических срезах с использованием меченой РНК. Широко применяют с этой целью и методы первичных культур органов и тканей (кардиомиоциты, клетки печени, поджелудочной железы и др.).

Особого внимания в плане изучения генетических механизмов клеточной пролиферации и дифференцировки заслуживают стволовые клетки, выделяемые из различных органов и тканей. Так, фетальные нейробласты в культуре дифференцируются в нейроны, секретирующие допамин; стволовые клетки сердца - в кардиомиоциты; поджелудочной железы - в инсулин-секретирующие β-клетки. С помощью метода клеточных культур реально проследить закладку и дифференцировку первичных половых клеток и зачатков гонад, выяснить тонкие механизмы геномного импринтинга мужских и женских гамет и таким образом получить новую информацию о генетической регуляции этих процессов. Анализируя экспрессионные профили эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКЧ), идентифицируя гены, поддерживающие состояния плюрипотентности и направляющие дифференцировку ЭСКЧ в тот или иной тип ткани, удается получить важную информацию о генетических механизмах раннего эмбриогенеза человека.

Еще один принципиально важный подход к анализу контролирующих механизмов эмбриогенеза человека касается исследований на модельных объектах, прежде всего на мышах. О принципиальном сходстве программ развития человека и мыши a priori свидетельствуют секвенированный геном и практически тождественное человеку число структурных генов (21-22 тыс.), большое генетическое разнообразие линий, естественные модели многих наследственных болезней человека (иммунодефициты, миодистрофия Дюшенна, гемоглобинопатии), возможности направленного выключения генов (нокаутные мыши), создание трансгенных животных-носителей генных конструкций с управляемой экспрессией геновмаркеров. В пользу сходства программ говорит и выраженная синтения генов человека и мыши (более 340 фрагментов ДНК размером от 300 т.п.о. до 65 м.п.о. со сходным или тождественным расположением генов). Принято считать, что около 90,2% генома человека и 93,3% генома лабораторной мыши включают высококонсервативные синтенные (тождественные по расположению) сегменты. Степени синтенности хромосом мыши и человека сильно варьируют. Единый синтенный блок генов представляет Х-хромосома, вся хромосома 20 человека полностью включена в часть хромосомы 2 у мышей, а значительная часть генов хромосомы 21 человека представлена на хромосоме 16 мышей. У двух видов отмечено также большое сходство последовательностей экзонов при значительной вариабельности регуляторных межгенных и интронных последовательностей. Учитывая эти обстоятельства, нет сомнения в том, что кардинальные процессы морфогенеза, особенно в течение высококонсервативных ранних стадий развития, у мышей и человека протекают одинаково. Таким образом, данные, полученные на мышах, с достаточным основанием могут быть экстраполированы на человека, несмотря на то что в эволюционном масштабе эти виды отстоят друг от друга не менее чем на 75 млн лет. Действительно, как будет показано в дальнейшем, основные метаболические пути у мышей и человека очень похожи или идентичны, а их отдельные звенья контролируются одними и теми же генами, экспрессия которых завершается появлением функционально близких белковых продуктов.

Не менее важны в исследовании генетических механизмов контроля онтогенеза новые методы исследования, и прежде всего методы молекулярноцитогенетического анализа. Многие из таких методов широко применяются и в настоящее время для изучения структурно-функцио нальной организации хромосом человека (активность рибосомных генов, активность структурных генов, выявляемая методом ник-трансляции, исследование спектра метилирования метафазных хромосом - MеС-ban ding).

В последние годы появились новые, более эффективные и универсальные методы, позволяющие быстро идентифицировать кандидатные гены, в том числе гены-регуляторы (факторы транскрипции), улавливать небольшие, вплоть до одного нуклеотида, изменения в последовательности ДНК, четко регистрировать и визуализировать экспрессионные геномные профили и профили метилирования генов в различных органах и тканях, а при необходимости - и всего организма. Знакомство с этими методами доказывает быстрое стирание грани между молекулярными и цитогенетическими исследованиями. Исследования на стыке молекулярной генетики и цитогенетики проводят с использованием как методов направленного поиска микроперестроек хромосом (мультиплексная гибридизация с амплифицированными зондами, Multiplex Amplifiable Probe Hybridisation - MAPH и мультиплексная опосредованная лигазой амплификация зондов, Multiplex Ligase-dependent Probe Amplification - МLPA), так и методов общегеномного скрининга (поиска) (сравнительная геномная гибридизация, Сomparative Genome Hibridisation - CGH; различные варианты биочиповой сравнительной геномной гибридизации - array-CGH, оligonucleotide-CGH, SNP-CGH), а также методов полногеномного скрининга ассоциаций, Genome Wide Association Studies - GWAS. Методы позволяют не только определять все структурные изменения ДНК, связанные с числовыми и структурными аномалиями хромосом (делеции, дупликации), но выявлять и картировать обнаруженные сравнительно недавно структурные вариации генома, так называемое варьирование числа копий (СNV). Последние, как стало известно, варьируют размерами от нескольких сотен до 40-50 млн пар оснований. В настоящее время существуют данные о более 11 000 CNV, причем у каждого человека их число может составлять от 500 до 700 на геном. Считается, что CNV увеличивают межиндивидуальную вариабельность генома человека почти в 10 раз [от 0,1% за счет однонуклеотидных замен (SNP) до 0,9-1% с учетом CNV]. Основная причина возникновения CNV - неаллельная гомологичная рекомбинация во время мейотической фазы созревания гамет. Большинство таких вариаций располагается преимущественно в межгенных промежутках, однако нередко встречаются CNV, захватывающие эухроматиновые районы. Типичные места их локализации в геноме - локусы 8p23.1; 9p12; 9q12; 15p11.2; 16p11.2. Эухроматиновые CNV нередко включают структурные гены и могут служить причиной разных «геномных» болезней. В настоящее время известно их участие в возникновении многих наследственных синдромов, связанных с микрохромосомными перестройками и нарушением архитектоники ядра.

По мере быстрого совершенствования и существенного удешевления методов секвенирования ДНК, появления вариантов «глубокого» или «параллельного» секвенирования очевидно, что уже в обозримом будущем именно этот метод, скорее всего, станет основным и наиболее универсальным методом общегеномного скрининга. Кстати, в 2011 г. предполагается завершение продолжающейся уже несколько лет программы «1000 геномов», которая позволит детально сравнить межрасовые, этнические и популяционные особенности первичной последовательности ДНК разных индивидуумов. В плане решения задач медицинской генетики, в частности проблемы идентификации и картирования генов редких болезней, особенно эффективно секвенирование не всего генома, а только его экспрессирующей части - так называемого экзома, на долю которого приходится только около 1,2% всей молекулы ДНК генома человека.

Таким образом, за последние десять лет генетики не только получили расшифрованный геном человека, но и существенно обогатили науку целым арсеналом новых методов и подходов, позволяющих проводить углубленный анализ сложных морфогенетических процессов раннего эмбриогенеза человека.

Собственно индивидуальное развитие человека начинается с момента оплодотворения - слияния яйцеклетки и сперматозоида. Каждая из этих гамет является продуктом длительных и сложных морфогенетических процессов (соответственно оогенеза и сперматогенеза ), которые начинаются еще во время внутриутробного развития будущих родителей и продолжаются вплоть до их полового созревания. При этом созревание женских половых клеток начинается еще внутриутробно, тогда как сперматогонии вступают в мейоз только с наступлением половой зрелости. Контролирующие генетические механизмы сперматогенеза и оогенеза у человека изучены достаточно подробно, и их рассмотрение не входит в нашу задачу.

Доимплантационное развитие у человека занимает в среднем около 6-7 сут и начинается с формирования мужского и женского пронуклеусов (рис. 4-1, см. цв. вклейку). Первый возникает из головки проникшего в ооплазму сперматозоида, второй - из хромосом ооцита, оставшихся после отделения 2-го полярного тельца. При этом мужской пронуклеус формируется несколько раньше женского (в течение 8 ч после оплодотворения). Деконденсация его хромосом выражена в большей степени, чем женского. В результате мужской пронуклеус по размеру несколько превосходит женский. Формирование обоих пронуклеусов завершается через 12 ч после оплодотворения.

Уже через 9 ч в обоих пронуклеусах начинается синтез ДНК, т.е. происходит репликация хромосом. Через 20 ч оба пронуклеуса встречаются примерно в центре ооплазмы. Хромосомы конденсируются, и примерно через 30 ч после оплодотворения, когда растворяются ядерные оболочки, хромосомный материал обоих пронуклеусов объединяется в одной метафазной пластинке (сингамия ). Наступает первое деление дробления. Дальнейшие деления дробления происходят примерно каждые 18 ч. В течение трех первых делений дробления все бластомеры имеют округлую форму, идентичны по морфологии и ростовым потенциям. На стадии морулы (3-5-й день развития, когда зародыш состоит из 8-16 бластомеров) начинается процесс компактизации, сопровождающийся поляризацией бластомеров. При этом бластомеры, расположенные снаружи, приобретают свойства эпителиальных клеток, между ними возникают тесные межклеточные контакты (десмосомы), а внутри зародыша начинает накапливаться жидкость. Через 4,5-5 дней после оплодотворения возникает бластоциста - небольшой пузырек, заполненный жидкостью, стенка которого состоит из одного слоя крупных клеток трофобласта (трофэктодермы, ТЭ), изнутри к которому в одном месте прилежит небольшая группа клеток эмбриобласта (внутренняя клеточная масса, ВКМ). Общее число клеток на этой стадии - более 60. Образование двух типов клеток (ТЭ и ВКМ) называют первичной эмбриональной дифференцировкой, а сам процесс - первичной эмбриональной индукцией. Генетические механизмы, контролирующие этот процесс, будут рассмотрены ниже.

Клетки ВКМ активно размножаются и при дальнейшем развитии дают начало всем тканям и органам собственно эмбриона, а также мезенхимным производным внезародышевых частей плодного яйца (хорион, плацента, желточный мешок, аллантоис, амнион ).

Клетки трофобласта (ТБ) сохраняются на протяжении всей беременности. Они обеспечивают непосредственный контакт зародыша с клетками матери, играют важную барьерную и трофическую роль, активно участвуют в процессах имплантации и плацентации.

В ходе дробления зародыш продвигается по маточной трубе в направлении матки как за счет тока жидкости, так и вследствие перистальтических сокращений мускулатуры и движения эпителиальных ресничек. На 5-6-й день зародыш на стадии бластоцисты попадает в матку.

Известно, что первые деления дробления у человека, как и у других млекопитающих, осуществляются за счет генетической информации, накопленной ооцитом еще в период оогенеза. Зародыш человека обладает достаточным запасом готовых рибонуклеопротеиновых комплексов, необходимых для синтеза новых белков, а также питательных веществ и энергетических ресурсов, чтобы полностью обеспечить начальные этапы эмбриогенеза. Первоначально синтез белков происходит на матрицах РНК, синтезированных еще в оогенезе, т.е. на хромосомах ооцита. Отсюда ее название - материнская РНК. Переключение индивидуальной генетической программы с материнской РНК на геном самого зародыша происходит постепенно. Принято считать, что геном зародыша человека начинает контролировать индивидуальное развитие со стадии 4-8 бластомеров, т.е. после 2-3 делений дробления. Именно после третьего деления дробления впервые зарегистрирована активность ядрышкообразующих районов метафазных хромосом человека.

События, происходящие в пронуклеусах, а затем и в ядрах бластомеров дробящегося зародыша, можно рассматривать как процессы эпигенетического репрограммирования генома (ЭРГ), связанные в первую очередь с изменениями характера метилирования ДНК. Следует отметить, что начальные этапы ЭРГ приурочены к процессам гаметогенеза , во время которого на хромосомах гамет возникают кластеры импринтированных генов, спектр которых имеет выраженные гендерные различия. ЭРГ ранних зародышей включает две последовательные фазы: деметилирование и реметилирование ДНК. Процессы деметилирования в мужском пронуклеусе запускаются сразу после замены протаминовых белков хроматина на гистоновые и идут особенно активно. Деметилирование цитозина хроматина женского пронуклеуса происходит пассивно, без участия специфических ферментов (метилаз). Процесс ЭРГ у зародышей человека, начиная с зиготы и до стадии бластоцисты, изучали с помощью антител, специфичных к 5-метилцитозину. Характерной особенностью метафазных хромосом при таком способе окраски было их гемиметилированное состояние (отсутствие флюоресцентного сигнала на одной хроматиде), свидетельствующее о продолжении в течение первых трех делений процесса деметилирования хроматина, нередко сопровождавшегося хроматидными обменами (рис. 4-2, а-в; см. цв. вклейку). Однако, начиная со стадии 8 бластомеров, появлялись единичные хромосомы с типичной дифференциальной МеС-окраской (рис. 4-2, г; см. цв. вклейку). Это указывало на завершение процесса деметилирования и начало активного метилирования хроматина. На стадии бластоцисты большинство метафазных хромосом имели такую же яркую дифференциальную МеС-исчерченность, как и хромосомы в клетках взрослых тканей (рис. 4-2д, е, см. цв. вклейку). Таким образом, активность рибосомных генов и завершение процесса деметилирования хроматина свидетельствуют о том, что, начиная со стадии 8 бластомеров, генетическая программа онтогенеза уже включена.

Важная информация о генетической регуляции доимплантационного развития получена при анализе профилей генной экспрессии в эмбриональных стволовых клетках человека. С помощью современных молекулярно-генетических методов (экспрессионные кДНК-микрочипы, глубокое параллельное/последовательное секвенирование коротких кДНК с последующей идентификацией продуктов в соответствующих экспрессионных библиотеках) были изучены для 10 различных линий ЭСК человека. В результате были идентифицированы гены, общие для всех изученных линий ЭСК, экспрессия которых происходит уже на самых ранних стадиях эмбриогенеза человека и белковые продукты которых необходимы как для поддержания плюрипотентного состояния таких клеток, так и для осуществления первичной эмбриональной индукции. В общей сложности было идентифицировано около 100 генов, которые активно экспрессируются в ЭСК и, по-видимому, необходимы для сохранения плюрипотентности и пролиферации. Эти гены получили название stemness genes (гены «стволовости»). Главные гены «стволовости» - гены OCT4, Nanog, SOX2, DNMT3B, TDCF1, PODX1, LEFTB, UTF1, Galanin, TERT, DPPA5, GJA1, причем экспрессия первых трех генов во всех изученных линиях ЭСК была максимальной. Используя различные комбинации всех или только 4 генов (c-Myc, Oct-4, Klf4 и Sox2), а в дальнейшем - даже их белковые продукты, удалось добиться превращения дифференцированных соматических клеток разных тканей (печени, желудка, поджелудочной железы, кишечника и клеток крови) в стволовые плюрипотентные клетки, получившие название «индуцированные плюрипотентные СК» (induced pluripotent stem cells-ip SC). Это великое открытие, которому сегодня предсказывают большое будущее, было сделано в 2006 г. американским ученым Ш. Яманака (Sh. Yamanaka). Идентифицированные им гены плюрипотентности получили название факторов Яманака. Синтезируются ли продукты факторов Яманака геномом самого зародыша, или их синтез обеспечивается материнскими копиями этих генов еще в оогенезе, пока неясно. Принимая во внимание, что экспрессия генов и формирование рибосомных комплексов зародыша человека приурочены к стадии 8 бластомеров, можно предполагать, что, по крайней мере, некоторые гены из серии Яманака экспрессируются с предсуществущих в ооцитах рибонуклеиновых матриц (РНП-комплексов). В пользу такого предположения свидетельствуют фенотипические признаки ранней дифференцировки уже на стадии 4-8 бластомеров. Так, уже на стадии 8 бластомеров гистохимически выявляют клетки, богатые РНК, и клетки, где содержание РНК заметно снижено. Бластомеры этих зародышей различаются и по скорости деления. Существуют данные о различиях гистоновых модификаций в разных бластомерах уже на стадии 4 клеток. Все эти изменения непосредственно предшествуют процессам компактизации, которые происходят на стадии морулы (8-16 бластомеров) и знаменуют начало первичной эмбриональной дифференцировки, т.е. образование клеток ТЭ и выделение ВКМ.

Генетический контроль этих процессов детально изучен в экспериментах на мышах и схематически показан на рис. 4-3.

Рис. 4-3. Иерархия транскрипционных факторов, обеспечивающих специализацию, коммитирование и первичную дифференцировку бластомеров дробящихся зародышей мышей на трофэктодерму и внутреннюю клеточную массу. Эпигенетическая фиксация проспективной судьбы клеток завершается на стадии бластоцисты, когда происходит метилирование гена Elf5 (по Hemberger M., 2010). ICM - внутренняя клеточная масса; TE - трофэктодерма; РЕ - первичная эктодерма; EPI - эпибласт; ЕхЕ - экстраэмбриональная эктодерма

Эксперименты на модельных объектах (мыши) и исследования нативных и вступивших в дифференцировку эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) позволяют предполагать, что реальное включение отдельных генов самого зародыша происходит еще раньше.

Так, ранее в экспериментах на мышах был установлено, что белковые продукты, контролируемые генами отцовского генома, могут быть выявлены уже на стадии двух бластомеров (β₂-микроглобулин, гипоксантин-фосфорибозил трансфераза) и даже на стадии пронуклеусов (некоторые гены H2 локуса - гены Ped, контролирующие время наступления 1-го деления дробления). К сожалению, сведений о начале экспрессии этих генов у зародышей человека нам обнаружить не удалось. Однако сам факт возможности транскрибирования отцовского генома уже на стадии пронуклеусов был впоследствии подтвержден и заслуживает особого внимания.

На стадии морулы (8-16 бластомеров) экспрессируется фактор транскрипции (ФТ) Tead4. Он активирует гомеодомен каудального типа ФТ Cdx2, индуцирующий совместно с ФТ Gata3 экспрессию Т-бокса гена Eomes, продукты которого регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток трофобласта (трофэктодермы). Однако их основная роль, по-видимому, заключается в индукции гена Elf5, который оказывается гипометилированным и активным в клетках ТЭ, но метилированным и инактивированным в клетках ВКМ. Таким образом достигается первая эпигенетическая канализация онтогенеза, предсказанная еще К. Уоддингтоном (C. Waddington) - основателем эпигенетики. В итоге зародыш оказывается разделенным на два морфологически, функционально и проспективно различных клона клеток - ТЭ и ВКМ. При этом эпигенетическая асимметрия метилирования промоторной области гена Elf5 в ТЭ и ВКМ четко сохраняется в этих клетках и их производных. Следует отметить, что продукты ключевого гена этой цепочки Elf5 не только потенцируют экспрессию генов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток ТЭ (Eomes), но и по принципу положительной обратной связи влияют на активность генов первичного звена этой цепочки (Cdx2). Другие ФТ в клетках ТЭ (Ets2, Tcfap2c, Esrrb) также усиливают и модифицируют экспрессию генов основного каскада (Cdx2-Eomes-Elf5) в клетках ТЭ. При этом промоторы эмбриоспецифических генов (Oct4, Nanog) в клетках ТЭ быстро метилируются, что ведет к их репрессии. Окончательная эпигенетическая фиксация клеток ТЭ и ВКМ происходит на стадии бластоцисты. В экспериментах на мышах недавно было показано, что направленное выключение синтеза ФТ Cdx2 приводит к нарушению процессов поляризации и компактизациии бластомеров, блокирует дифференцировку клеток ТЭ.

Включение каскада ФТ Cdx-Eomes-Elf5 на стадии компактизации (8-16 клеток) является первым и, по-видимому, основным сигналом к дифференцировке изначально тотипотентных бластомеров в клетки ТЭ и ВКМ. Становление двух клеточных линий происходит в результате сложных взаимодействий генетических и эпигенетических факторов, зависит от взаимоположения клеток относительно друг друга в моруле [гипотеза «снаружи-внутри» А. Мак-Ларен (A. McLaren) и А. Тарковского], их поляризации и числа предшествующих делений (пространственно-поляризационная теория Джонсона). Гипометилированное состояние генов трофэктодермы и гиперметилированное - клеток ВКМ сохраняется при дальнейшем развитии и в настоящее время рассматривается как важнейший фактор успешной имплантации и плацентации зародыша человека. В дальнейшем при рассмотрении процессов имплантации и функции гетерохроматина мы вернемся к проблеме эпигенетической асимметрии клеточных клонов эмбриобласта (ВКМ) и трофобласта (ТЭ).

Нарушения доимплантационого развития могут быть следствием генетической неполноценности гамет, нарушений процесса оплодотворения либо экспрессии генов, контролирующих раннее развитие. Такие мутации многочисленны у лабораторных мышей, но пока неизвестны у человека, хотя опыт работы клиник ВРТ позволяет предполагать их наличие.

Наиболее частые нарушения развития на доимплантационных стадиях - отсутствие или задержка дробления, полиспермное оплодотворение, фрагментация и гибель бластомеров. Есть основания предполагать, что основной вклад в патологию доимплантационного развития человека вносят хромосомные аномалии (Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007).

Частота спонтанных хромосомных аномалий у эмбрионов человека доимплантационного периода (1-6-й день развития) достаточно велика и варьирует от 5 до 100%. При этом среди морфологически неполноценных эмбрионов частота гетероплоидии достигает 86,6%. Прослеживается заметная зависимость гетероплоидии от возраста матери. У 20-34-летних женщин частота гетероплоидных эмбрионов с нормальной морфологией составляет 16%, у 35-39-летних - 37%, а у 40-45-летних -53%. Некоторое увеличение частоты гетероплоидии (53-54%) отмечено при привычном невынашивании. Немаловажно, что при ICSI (инъекция сперматозоида или сперматиды в цитоплазму яйцеклетки) частота гетероплоидных эмбрионов также может возрастать, что, по-видимому, обусловлено увеличением частоты диплоидных мужских гамет при олигозооспермии.

Опубликованные данные свидетельствуют о высокой частоте гетероплоидии у ранних зародышей человека. Однако во многих случаях гетероплоидия на стадии 8-12 клеток представлена мозаичной формой, что, возможно, является особенностью нормального эмбриогенеза человека. Следует также отметить, что аномальные эмбрионы, в том числе и гетероплоидные, могут оказаться неспособными к развитию после трансплантации и погибнуть до или в процессе имплантации (средняя частота имплантации в программе ЭКО колеблется в пределах 25-40%).

Для зародышей человека на стадии бластоцисты характерно появление большого числа (30-40%) диплоидно-тетраплоидных мозаиков. Высказано предположение, что мозаицизм 2n/4n отражает процесс полиплоидизации в клетках трофобласта, предшествующий его активной инвазии в эндометрий в период имплантации зародыша в стенку матки.

Предполагают, что такие характеристики «качества» эмбриона, как скорость дробления, степень фрагментации, наличие многоядерных бластомеров, диссоциация их размеров, могут отражать его хромосомный статус. Так, до 89% зародышей с высокой степенью фрагментации оказываются мозаичными и около 71% эмбрионов, остановившихся в развитии на стадии нескольких бластомеров, обнаруживают хромосомные аномалии. При этом и у морфологически нормальных зародышей частота анеуплоидных бластомеров достаточно высока и составляет около 20%.

Есть основания считать, что моносомия большинства аутосом несовместима с формированием бластоцисты, и такие эмбрионы погибают до имплантации. Вместе с тем моносомия по крайней мере некоторых аутосом совместима с имплантацией и развитием провизорных органов, однако развитие тканей самого эмбриона прекращается уже во время имплантации или вскоре после нее. Методами сравнительной геномной гибридизации (CGH) и интерфазного FISH-анализа, позволяющими анализировать кариотип даже при отсутствии митотически делящихся клеток, было показано, что более половины спонтанных абортусов имеют численные аномалии кариотипа (моносомии, трисомии, тетраплоидию и др.) (Лебедев И.Н., Назаренко С.А., 2004).

Особенностью доимплантационных зародышей человека является высокая частота мозаичной гетероплоидии (варьирование числа хромосом в бластомерах). Число гетероплоидных бластомеров может составлять от нескольких клеток до половины всего эмбриона (Edwards R.G., Beard H.B., 1997). Экстраполируя результаты исследования анеуплоидии по четырем парам хромосом (X, Y, 13, 18, 21), общая частота которой у морфологически нормальных эмбрионов на стадии 8 клеток с тремя и более аномальными бластомерами составляет 38-46% на весь набор, можно ожидать, что частота мозаичных эмбрионов составит до 80% (Edwards R.G., Beard H.B., 1997). Если это предположение подтвердится при дальнейших исследованиях, то хромосомный мозаицизм до 10-12-клеточной стадии, по всей видимости, следует признать особенностью нормального развития зародыша человека. Действительно, метод масштабного скринирования генома подтвердил хромосомные аберрации более чем у 80% зародышей человека, полученных в программах ЭКО (Vanneste Е., 2009).

Имплантация - сложный морфогенетический процесс, во время которого устанавливается тесный контакт между маточным эндометрием (децидуальными клетками) и клетками трофобласта, зародыш погружается вглубь маточной стромы, развивается гемохориальная плацента ворсинчатого типа, которая в дальнейшем обеспечивает все метаболические и иные связи между матерью и плодом.

Как уже упоминалось, зародыши человека периода имплантации практически недоступны для исследования. Именно поэтому основные сведения о генетических механизмах этого процесса были получены в исследованиях, выполняемых в рамках программ ВРТ, на материале спонтанных и индуцированных (медицинских, социальных) абортов, а также в экспериментах на лабораторных животных (мыши, обезьяны). В последние годы важные сведения на эту тему стали доступны благодаря использованию в качестве экспериментальной модели эмбриональных стволовых клеток (Schultz L.C. et al., 2008).

Зародыш человека попадает в матку на стадии морулы (ранней бластоцисты) примерно на 4-5-й день после оплодотворения. Непосредственный контакт бластоцисты с клетками эндометрия, выстилающими полость матки, служит сигналом к «хэтчингу» - выходу (вылуплению) бластоцисты из окружающей ее блестящей оболочки, началу активной экспрессии многих генов как в клетках ТЭ, так и в клетках децидуального слоя эндометрия матки для подготовки так называемого окна имплантации (Due-Gorian P. et al., 1999). Клетки ТБ вступают в непосредственный контакт со слизистой оболочки матки и с помощью литических ферментов разрушают вначале эпителий, а затем и несколько подлежащих слоев децидуальных клеток (рис. 4-4). Постепенно зародыш оказывается полностью погруженным в стенку матки. Продолжительность имплантации у человека от момента прикрепления плодного яйца до ее полного погружения в эндометрий составляет около 40 ч.

Рис. 4-4. Имплантирующаяся бластоциста человека на седьмой с половиной день внутриутробного развития (по Hertig et al., 1956): 1 - энтодерма; 2 - наружный слой зародышевого щитка (первичная эктодерма); 3 - амниотическая полость; 4 - трофэктодерма; 5 - внезародышевая энтодерма; 6 - разрастающийся трофобласт в слизистой матки; 7 - регенерирующий эпителий матки; 8 - маточная крипта; 9 - соединительная ткань матки

Сам процесс имплантации требует строгой синхронизации программ развития клеток зародыша и стенки матки, регулируемых с помощью половых гормонов. Любые нарушения в самом зародыше или связанные с дефектами эндометрия, а также с десинхронизацией ритмов развития зародыша и стенки матки, неминуемо ведут к нарушению имплантации и прерыванию беременности. Сложные, скоординированные во времени и пространстве морфогенетические процессы, находящиеся под взаимным контролем многих генов ТЭ и материнского организма (гены гормонального контроля, воспалительной реакции, пролиферации и инвазии ТЭ), объясняют высокую чувствительность имплантации к повреждающему действию как эндогенных, так и экзогенных факторов. Это дало основание рассматривать процесс имплантации как первый критический период развития зародыша человека.

После разрушения блестящей оболочки клетки ТЭ превращаются в клетки трофобласта и начинают активно синтезировать гормон - хорионический гонадотропин, а также различные лизирующие ферменты, вызывающие гибель прилежащих к ним клеток эндометрия, что провоцирует локальную воспалительную реакцию. Клетки ТБ приобретают инвазивные свойства, обеспечивают гистиотрофное питание зародыша и сам процесс имплантации, т.е. проникновение зародыша вглубь стенки матки.

Различают два типа трофобласта:

Как было отмечено выше, становление клеток ТЭ и их превращение в клетки ТБ, ограничивающие полость бластоцисты (бластоцель), находится под контролем ФТ основного каскада Cdx2-Eomes-Elf5 и сопровождается быстрым угнетением активности ключевых генов плюрипотентности (ФТ) OKT4 и SOX2, которые включают каскад новых ФТ, таких как FGF4 (ростовой фактор фибробластов) и ВМР-4 - ростовой фактор, необходимый для дифференцировки клеток ТЭ. Он также индуцирует экспрессию генов (ФТ) GATA2, GATA3, AP2 (TFAP2), включает гены (ФТ), ответственные за синтез хорионического гонадотропина (hCG), HLA-G, а также гены прогестерона, эстрадиола (ETS2) и цитохрома CYP11. Главные генетические факторы дифференцировки и становления клеточных линий ТБ показаны на рис. 4-5 (см. цв. вклейку).

Основные исследования по изучению генетических механизмов имплантации до 2000 г. были выполнены in vitro, путем анализа образцов питательных сред, в которых культивировали доимплантационные зародыши человека. Показано, что экспрессия генов зародыша, контролирующих имплантацию, происходит уже после первых делений дробления (4-8 бластомеров), т.е. значительно раньше «хэтчинга ». Несколько условно, в связи с многообразием и наличием сходных или даже перекрывающихся функций, гены «имплантации» и контролируемые ими продукты можно разделить на несколько групп.

У зародыша человека уже со стадии 8 бластомеров активируются гены и синтезируются ростовые факторы, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и его рецептор (EGF-R), фактор роста фибробластов (FGF4), трансформирующий ростовой фактор-α (TGF-α) и ростовой тромбоцитарный фактор (PDGF-A) и его рецептор. На стадии морулы-бластоцисты активируется и ген инсулиноподобного ростового фактора-II (IGF-II). Продукты этих генов контролируют пролиферацию и дифференцировку клеток ТБ, они особенно активны при формировании ворсин хориона. Кроме того, они стимулируют экспрессию генов гелатиназы A (одного из типов матриксной металлопротеазы - ММР-2) и гена TIMP-1 - ингибитора металлопротеаз, ферментов, регулирующих инвазивные свойства ТБ. Пролиферацию клеток вневорсинчатого ТБ хориона активно стимулирует также васкулярный эндотелиальный ростовой фактор (VEGF), продуцируемый децидуальными макрофагами, в то время как синтез мембранных рецепторов к этому ростовому фактору контролируется геном цитотрофобласта (VEGF-R).

Следует отметить, что гены рецепторов плацентарных ростовых факторов (EGF-R) и цитокинов (с-fms и LIF-R - рецептор фактора ингибирования лейкемии) активируются одновременно или даже раньше, чем гены соответствующих им продуктов. Так, ген рецептора протоонкогена с-fms функционирует уже на стадии двух клеток и относится к числу самых «ранних» экспрессирующихся генов у зародышей мышей и, по-видимому, у человека.

В клетках ТБ, контактирующих непосредственно с децидуальными клетками эндометрия, важную роль играют гены интегринов, продукты которых обеспечивают контакт зародыша с внеклеточным матриксом. В зависимости от расположения в бластоцисте клеток ТБ и их функций спектр интегринов может меняться. Так, клетки проксимальных отделов ТБ начинают экспрессировать ген антигена гистосовместимости G (HLA-G) - мажорный антиген 1-го класса, который обеспечивает толерантность матери по отношению к плоду. Показано, что HLA-Gпозитивные клетки ТБ секретируют больше ферментов гелатиназ (матриксных металлопротеиназ) и меньше фибронектина, чем HLA-G-негативные клетки. Нарушение экспрессии интегриновых генов ведет к поверхностной имплантации, что в конечном счете может быть причиной преэклампсии (гестоза ).

Уже через 48 ч после оплодотворения in vitro (стадия 2-8 бластомеров) отмечена экспрессия ряда цитокиновых генов, таких как интерлейкины (IL-II, IL-VI), TGF-β, а также фактора некроза опухоли α (TNF-α). При этом высокая концентрация продукта IL-1α, как показывает опыт работы клиник ВРТ, является прогностически благоприятным признаком удачной трансплантации после оплодотворения in vitro. Другой благоприятный признак - активация генов простагландинов (Prostaglandin E2 и PAF). Важна для имплантации и поддержания беременности на всем ее протяжении активация в клетках ФТ сцепленного с Х-хромосомой гена хорионального гонадотропина, который стимулирует продукцию прогестерона желтым телом.

Продукты цитокиновых генов принимают активное участие в процессах инвазии эндометрия. Так, IL-1β «включает» гены семейства матриксных металлопротеаз (MMP 1-9) - ферментов, обладающих выраженными лизирующими свойствами. Последние синтезируются в виде проферментов, которые активируются только на поверхностной мембране клеток ТБ и разрушают коллагеназу IV внеклеточного матрикса базальной эндометриоидной мембраны, облегчая процесс инвазии. Помимо интерлейкинов, к генам «инвазии» относят также инсулиновый ростовой фактор-II (IGF-II), гены семейства связывающих белков (ген BPs), ген эндотелиина (ET-1), активно стимулирующего инвазию ТБ в I триместре беременности.

Активация в ТБ гена сериновой протеазы (плазминогенного активатора урокиназного типа uPA) включает протеиназный каскад (uPA-плазмин-гены семейства матриксной металлопротеиназы-ММЗ 1-9), следствием чего является дальнейшее локальное разрушение межклеточного матрикса и лизис децидуальных клеток.

Учитывая агрессивный, опухолеподобный характер инвазии эндометрия клетками ТБ, эволюционно оправдана система генетических механизмов, противодействующих такой экспансии. Данная система включает как гены самого зародыша, так и гены децидуальных клеток эндометрия.

Единственный ген ТБ, который препятствует процессам инвазии, - ген TIMP-3, продукт которого в ТБ блокирует действие матриксных металлопротеиназ (ММР 1-9), разрушающих межклеточный матрикс.

Другие гены этого семейства (TIMP-1, TIMP-2) экспрессируются клетками эндометрия. Их продукты полностью блокируют процесс инвазии, формируя стабильные комплексы с активными формами коллагеназ (ММР 1-9). Пролиферация клеток ТБ и его инвазия полностью блокируются ферментом гена TGF-β, а также цитокином LIF, блокирующим протеиназную активность клеток ТБ.

Отчасти они уже были упомянуты ранее. Включают в себя ген фактора активации тромбоцитов (PAF), ген простагландина Е2, ген колониестимулирующего фактора (CSF), а также провоспалительные цитокины IL1 и IL6.

Следует отметить, что все вышеприведенные сведения о генетических механизмах имплантации были получены главным образом путем анализа продуктов экспрессии соответствующих генов в образцах питательной среды, в которой культивировали оплодотворенные яйцеклетки человека. Однако неясно, образуются ли продукты соответствующих генов под контролем генома самого зародыша, или они синтезируются на матрицах РНП-комплексов, синтезированных еще в процессе оогенеза, т.е. имеют материнское происхождение. Этих недостатков лишена новая экспериментальная модель - эмбриональные стволовые клетки человека. Такие клетки свободны от продуктов экспрессии материнских генов, поскольку их получают при культивировании ВКМ или ТЭ. Их неограниченное количество в культуре позволяет проводить прямой молекулярно-генетический анализ работающих генов.

Важные успехи последних лет, связанные с пониманием генетических механизмов дифференцировки клеток ТБ, были достигнуты в опытах со СК из ТБ (Schuiz L.S. et al., 2008). При культивировании in vitro такие клетки агрегируют с образованием полых пузырьков («эмбриоидных телец»), напоминающих размерами и формой бластоцисты. Введение в такие пузырьки специфических малых РНК (siRNA) позволяет направленно выключать определенные гены соответствующих метаболических цепей и изучать их влияние на дифференцировку.

Установлено, что выключение генов тотипотентности OCT4, SOX2, NANOC и одновременная активация генов BMP4, CDX2, CGA, CGB, EOMES, GCM1, GATA2, ID2 в ЭСК человека определяет начало их дифференцировки в клетки ТЭ (Babaie Y. et al., 2007; Schulz L.S. et al., 2008). Важную роль в выборе «трофобластического» пути дифференцировки ЭСК отводят гену ростового фактора BMP4.

Другим критическим геном дифференцировки клеток ТБ, определяющим их пролиферацию и тотипотентность, оказался ген ростового фактора фибробластов (FGF2), который также индуцирует включение генов инсулиноподобных ростовых факторов IGF2 и IGFβ. Последовательность включения генов ТБ зависит от содержания кислорода в среде для культивирования.

Для эмбриогенеза человека характерно очень раннее обособление провизорных органов. Уже во время имплантации возникает внезародышевая мезодерма, выстилающая полость бластоцисты и участвующая в образовании хориона. Многочисленные ворсинки хориона покрывают поверхность плодного яйца и глубоко проникают в толщу стенки матки, разрушая сосуды эндометрия. Это ведет к появлению лакун с материнской кровью, в которых плавают трофобластические тяжи, образующие первичные ворсинки. Врастание в трофобластические тяжи внезародышевой мезодермы приводит к образованию вторичных ворсин (13-14-й день развития). Клетки наружного слоя ТБ образуют синцитий, а внутренний слой представлен камбиальными клетками цитотрофобласта (клетки Лангханса). Именно эти клетки, длительное время сохраняющие митотическую активность, используются для цитогенетического анализа при необходимости кариотипирования зародыша.

Таким образом, у человека развитие хориона существенно опережает развитие производных эмбриобласта. Более того, до определенной степени оно не зависит от развития самого зародыша. Хорошо известно, что ворсинки хориона могут оставаться в матке жизнеспособными в течение нескольких недель после резорбции самого зародыша. Образование ворсин хориона, их васкуляризацию и ветвление контролирует эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF) и близкий ему по структуре ДНК ген ростового фактора плаценты (PLGF). Первый функционирует преимущественно на ранних сроках беременности с пиком активности на 12-13-й неделе, тогда как второй - во II триместре беременности. Для ангиогенеза ворсин важно также наличие факторов ангиопоэтина и ангиостатина. Первые васкуляризованные ворсинки хориона появляются на 5-6-й неделе гестации, что по времени совпадает с появлением зоны диастолической плотности, соответствующей месту локализации будущего плацентарного диска, которое визуализируется при УЗ-обследовании матки. Транскрипция генов VEGF и PLGF индуцируется кислородным голоданием.

Методами полногеномного скрининга в сочетании с методом экспрессионных чипов идентифицированы новые гены и изучены на разных стадиях эмбриогенеза экспрессионные профили генов плаценты человека (Sood R. et al., 2006; Rawn S.M., Cross J.S., 2008). Так, при сравнении экспрессионных профилей клеток плаценты с таковыми 20 других тканей организма были выявлены 54 гена, резко отличающихся по своей активности от других тканей либо экспрессирующихся преимущественно в плаценте (CDKN1L; PAPP-A; SPARC; CAV1; TIMP3; HIF2x; IGF2; GPC3) (Sood R. et al., 2006). Дальнейшие исследования позволили существенно расширить и уточнить «репертуар» плацентарных генов. В частности, были идентифицированы такие плацентоспецифичные гены, как Tpbp, Plac1, Syncytin, целые семейства плацентарных генов (Gcm1, Mash2, Rhox, Esx1б, Cathepsin, PAG, TKDP, Psg, Siglec), гены плаценты, экспрессия которых тесно связана с активностью входящих в их структуру или в регуляторные области ретротранспозонов (Peg10, Rtl1, Endothelin B receptor, Leptin, Insl4, Midline1, Pleiotrophin). Показано, что функция этих генов в плаценте аналогична таковой при их экспрессии в тканях самого эмбриона, либо их продукты участвуют в других, не характерных для плаценты метаболических путях и реакциях (развитие нервного гребня, конечностей, сердца).

Идентифицирован X-сцепленный ген (PLAC1), определяющий синтез специфического мембранного белка плаценты (Plac1). Белок накапливается в клетках цитотрофобласта и в апикальной части клеток синцитиотрофобласта. Функция белка неизвестна, предполагается его участие в дифференцировке клеток ТБ и в сигнальном пути гена фактора роста фибробластов (FGF7). Его экспрессия была зарегистрирована и в других органах. Широко представлены в плаценте продукты всех 11 катепсиновых генов.

Интересен тот факт, что ретротранспозоны и эндогенные ретровирусы, индуцирующие экспрессию многих генов плаценты, не метилированы в клетках ТБ, но всегда метилированы в клетках крови. Особый интерес среди генов этой группы вызывают гены семейства Syncytin (Syncitin 1/HERV-W & Syncitin2/HERV-FRD). Обладая фузогенными свойствами, продукты этих генов способствуют слиянию клеток цитотрофобласта с образованием синцитиотрофобласта, а также контакту последних с клетками эндометрия матки.

Среди других генов плаценты с транспозон-регулируемой экспрессией особый интерес представляют ген PEG10 с пиком экспрессии на 11-12-й неделе развития и ген ароматазы (СYP19), регулирующий обмен эстрогенов. Плацентоспецифический промотор этого гена представлен терминальным ретротранспозоном.

Метилом - метилированная часть генома, включающая структурные гены, их промоторные СpG богатые участки, а также межгенные ДНК-последовательности. Метилирование (присоединение метильной группы в 5´-положение цитозина) ведет к выключению экспрессии гена. Метилирование ДНК - основной, но не единственный способ эпигенетической регуляции функций генома (Голубовский М.Д., 2000).

Как было отмечено ранее, первичным актом дифференцировки дробящейся яйцеклетки человека является метилирование гена ELF5 в клетках презумптивной ВКМ и сохранение его активного, гипометилированного состояния в будущих клетках ТЭ. Напротив, промоторы генов тотипотентности (OCT4, SOX3, NANOG) в клетках презумптивной ТЭ подвергаются метилированию, и их транскрипция вскоре прекращается. Эпигенетическая асимметрия метилирования многих генов ТЭ и ВКМ сохраняется и при дальнейшем развитии.

Характерная особенность клеток ТБ - выраженная гипометилированность межгенных областей, в частности ДНК-повторов и районов перицентромерного гетерохроматина. Гипометилированное состояние этих районов приводит к активации находящихся в них ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Продуцируемые ими малые РНК поступают из ТЭ во ВКМ, где блокируют экспрессию генов клеточной дифференцировки, поддерживая, наряду с другими ФТ (OCT4, SOX3, NANOG), тотипотентное состояние клеток эмбриобласта (Hemberger М., 2010). Принято считать, что гипометилированный геном клеток ТБ важен для нормальной плацентации, стимулирует экспрессию генов, определяющих инвазивные свойства ТБ, его полиплоидизацию и формирование синцитиотрофобласта .

Многие гены, экспрессия которых зависит от их гендерного происхождения (т.е. от того, передаются они зародышу сперматозоидом или яйцеклеткой), оказываются выключенными (импринтированными) в тканях плода, но активно экспрессируются в плаценте. Нарушения нормального паттерна импринтированности генов вследствие ошибок эпигенетического репрограммирования генома (так называемых эпимутаций) во время гаметогенеза и на ранних доимплантационных стадиях развития играют важную роль и в патологии развития плаценты (Лебедев И.Н., Саженова Е.А., 2008). При этом патология развития может быть следствием как выключения (импринтинга) генов, которые должны быть в норме функционально активными, так и, наоборот, активации вследствие гипометилирования генов, которые при нормальном развитии должны оставаться импринтированными. Так, гипометилирование дифференциально метилированных генов плаценты PLANGL1 и KCNQ10T1 на материнских хромосомах в клетках цитотрофобласта и мезенхимы ворсин плаценты зарегистрировано почти в 10% всех случаев невынашивания беременности ранних сроков (Саженова Е.А., Лебедев И.Н., 2006). А причиной грозных осложнений беременности типа биродительского полного пузырного заноса (БППЗ) и хориокарциномы является соответственно аберрантное гипометилирование генов плаценты NLRP7 и PEG3.

Известные импринтированные гены плаценты и их локализация на хромосомах приведены на рис. 4-6 (см. цв. вклейку). Следует обратить внимание, что импринтированными могут быть как гены, полученные от матери (через яйцеклетку), так и от отца (через спермий). При этом многие из них (PEG10, MEST, PEG3, IGF2, IGF2R), как уже упоминалось ранее, обеспечивают пролиферацию клеток цитотрофобласта, рост и формирование ворсинок комплекса «хорион-плацента».

Важно отметить, что нарушения экспрессии генов плаценты напрямую связаны с такими частыми осложнениями беременности, как преэклампсия (гестоз) и задержка внутриутробного развития (ЗВУР). Сравнительный анализ паттернов метилирования более 800 генов плаценты позволил обнаружить различия метилирования в 34 локусах при раннем гестозе, в 5 локусах при ЗВУР и не обнаружил различий в метилировании генов плаценты контрольной группы и генов плацент с поздним гестозом. Наиболее четкая корреляция с ранним гестозом обнаружена для гена TIMP-3, гипометилированный промотор которого указывал на сохранение его экспрессии в плаценте. Напомним, что продукты гена TIMP3 ведут к угнетению ферментов семейства металлопротеиназ, определяющих инвазивные свойства ТБ, и соответственно препятствуют нормальной имплантации и плацентации, что приводит к гипоперфузии плаценты. Другие гены, мутации или гипометилированное состояние которых ассоциированы с развитием раннего гестоза, включали гены STOX1 и ген ингибитор плацентарной сериновой протеазы SERPINA3. Достоверные различия метилирования CpG-островков отмечены также для генов CAPG, GL12, KRT13, однако их действие на экспрессию генов металлопротеиназ и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) значительно менее выражено, чем продукта гена TIMP-3. Важно отметить, что гипометилированное состояние промоторных районов генов SERPINA3 и особенно гена TIMP-3 можно определить при исследовании ДНК плода в крови матери. В настоящее время идет поиск ответа на вопрос: в какой мере анализ метилирования промоторной области гена TIMP-3 в крови матери может найти клиническое применение в качестве прогностического неинвазивного теста развития раннего гестоза у женщин групп высокого риска данной патологии. Следовательно, наряду с увеличением содержания ДНК плода в плазме крови беременной, анализ состояния метилирования гена TIMP3, который всегда метилирован в материнских клетках, может стать перспективным досимптоматическим маркером развития раннего гестоза (Yuen R.K.C. et al., 2010).

Нарушение метилирования СpG-островков в промоторной области Н19/IGF ассоциировано с ЗВУР (Borque D.K. et al., 2010). Имеются данные об ассоциации позднего гестоза с метилированием промоторной области гена TUSC-3 (Yuen R.K.C. et al., 2010).

Нарушения функций генов, ответственных за процессы пролиферации клеток ТБ, его инвазивные свойства, деградацию внеклеточного матрикса, за синтез молекул клеточной адгезии и иммунного ответа, а также дефекты генов ангиогенеза лежат в основе многообразных нарушений процессов имплантации и плацентации, следствием которых могут быть различные тяжелые осложнения при беременности, включая гестоз (преэклампсию), ЗВУР, привычное невынашивание беременности и преждевременные роды. Соответствующие гены и их функции кратко рассмотрены в разделе «Транскрипционный профиль дифференцирующихся стволовых клеток ТФБ».

Так, при исследовании экспрессионного профиля плацент в случае ЗВУР отмечены сниженная экспрессия генов IGF1, MEST, PG3, GATM, GNAS, PLAGL1 и достоверно повышенная экспрессия генов CDKMc и PHLD2 (Tycko B. et al., 2006).

Отметим только некоторые из них, ассоциированные преимущественно с развитием гестоза (преэклампсии). Помимо упомянутого выше гена ТIMP-3, важную роль в генезе гестоза играет ФТ HIF1α, повышенная экспрессия которого в условиях гипоксии индуцирует активацию гена TGF-β. Последний переключает клетки ТБ с процессов инвазии обратно на процессы пролиферации. Отмечена также ассоциация с гестозом генa α3 катепсина CTNNA3 (Tycko B. et al., 2006).

Установление тесного контакта между клетками ТЭ и клетками эндометрия матки (имплантация), развитие хориона, появление хориальных ворсин и формирование сложного многофункционального органа (плацентация) представляют собой цепь взаимосвязанных морфогенетических процессов, находящихся под контролем как генов ТЭ (ТБ зародыша), так и генов клеток эндометрия (децидуальной ткани) материнского организма. При помощи современных цитогенетических и молекулярно-генетических методов, методов экспериментальной эмбриологии и ВРТ на экспериментальных моделях, в том числе на ЭСК, а также материале спонтанных и медицинских абортов, подробно изучены генетические механизмы и идентифицированы многочисленные гены и генные семейства, контролирующие процессы имплантации и плацентации у человека.

Установлено, что геном зародыша человека становится функционально активным и начинает контролировать развитие на стадии 4-8 бластомеров. Однако в последние годы появляется все больше данных, позволяющих предполагать экспрессию отдельных генов на более ранних стадиях. Выделены и частично охарактеризованы семейства генов, контролирующих дробление, первичную дифференцировку на ТЭ и ВКМ, имплантацию (факторы пролиферации ТБ, воспалительной реакции, дифференцировки ТБ на цито- и синцитиотрофобласт, факторы инвазии ТБ и факторы децидуальных клеток, препятствующих экспансии клеток ТБ) и плацентацию (рост и ветвление ворсин хориона, ангиогенез). Методами анализа экспрессионных профилей и паттерна метилирования идентифицированы многие гены, специфичные для ткани плаценты и обеспечивающие многообразные функции этого органа.

В частности, идентифицированы гены, критичные для процессов имплантации и плацентации, гены, определяющие тотипотентное состояние клеток зародыша (OCT4, Nanog, SOX2), первичной дифференцировки (ELF5), процесса инвазии ТБ (гены металлопротеиназ - ММР), цитокиновые гены (IL-II, IL-VI, ТGF-β), пролиферации клеток ТБ (ВРМ-4), роста и ветвления ворсин и ангиогенеза (VEGF, PLGF).

Установлено, что индивидуальная программа активации или репрессии этих генов реализуется в соответствии с более общей программой эпигенетического репрограммирования генома зародыша, которая включается вскоре после оплодотворения и продолжается, как показывает анализ динамики процессов деметилирования-реметилирования метафазных хромосом дробящихся зародышей, вплоть до бластоцисты. При этом для нормальной имплантации и плацентации важно гипометилированное состояние генома клеток ТБ и гиперметилированное - клеток эмбриобласта. Гипометилированными в клетках ТБ оказываются не только плечи хромосом, но и их околоцентромерные районы, что косвенно свидетельствует в пользу их функциональной активности. Асимметричность метилирования ДНК в клетках ТБ и ВКМ возникает уже на стадии 8-16 бластомеров и сохраняется в клонах этих клеток на более поздних стадиях эмбриогенеза (так называемые трофобластический и эмбриональный эпигенетические ландшафты по К.Уоддингтону).

Хромосомные аномалии, генные мутации, неблагоприятные сочетания функционально разных аллелей генов, нарушения процессов импринтинга (эпимутации) нередко являются причиной гибели зародышей человека (привычное невынашивание, неудачи ЭКО), либо приводят к тяжелым осложнениям беременности (хорионэпителиома , биродительский полный пузырный занос , преэклампсия, синдром задержки внутриутробного развития плода и др.).

Во время имплантации и раннего постимплантационного периода главные морфогенетические процессы разворачиваются в ВКМ. Основные этапы дифференцировки клеток ВКМ и ее производные на ранних стадиях развития приведены на рис. 4-7.

Рис. 4-7. Схема дифференцировки зародыша человека на ранних стадиях развития (от 3 до 16 дней развития; стадии III-VIII преэмбрионального периода развития по классификации Карнеги)

Путем деляминации (расслоения) ВКМ на эктодерму и энтодерму вначале образуется двуслойный, а затем, после формирования первичной полоски, гензеновского узелка и появления мезодермы - трехслойный эмбриобласт, возникают желточный мешок и амнион , появляются амниотическая полость и полость желточного мешка. Зародыш человека во время имплантации представлен мощно развитыми внезародышевыми частями (ТБ, внезародышевая мезенхима, амнион, желточный мешок, амниотическая ножка) и лишь небольшой полоской клеток (дно амниотического пузыря и крыша желточного пузырька), из которой в дальнейшем образуется тело собственно зародыша (рис. 4-8). Согласно классическим представлениям, формирование первичной полоски (II фаза гаструляции) происходит на 15-17-й день развития, главный осевой орган будущего скелета - хорда - закладывается на 17-20-й день развития, тогда же возникает и зачаток будущей центральной нервной системы - нервная пластинка.

Как было отмечено, зародыши человека на этих стадиях малодоступны для исследований. Основные исследования генов, контролирующих эти процессы, проведены на мышах. Удивительное сходство раннего развития человека и лабораторных грызунов, большое (96%) сходство кодирующей части их геномов при практически идентичном наборе генов, их зачастую синтенное расположение на хромосомах служит веским основанием для экстраполяции данных, полученных в эксперименте, на человека.

Рис. 4-8. Имплантирующийся зародыш человека 5-го дня развития (по Кнорре, 1967): 1 - первичная эктодерма (наружный слой зародышевого щитка, дно амниотической полости); 2 - эктодерма амниона; 3 - эмбриональная энтодерма (внутренний слой зародышевого щитка, крыша желточного мешка); 4 - желточная энтодерма; 5 - экзоцелом; 6, 7 - цитотрофобласт; 8 - плазмодиотрофобласт; 9 - лакуны с материнской кровью, амниотическая полость; 10 - полость желточного мешка; 11 - амниотическая ножка (зачаток аллантоиса); 12 - амниотическая полость

Решающая роль в процессах раннего морфогенеза принадлежит генам, обеспечивающим синтез сигнальных молекул (их также называют индукторами дифференцировки или цитокинами) и генам транскрипционных факторов. Эти гены, по предложению известного шведского молекулярного биолога Я.Э. Эндстрема, можно рассматривать как гены-«господа», которые «руководят» работой многих структурных генов (генов-«рабов»). Такая иерархия обеспечивает включение каскада метаболических путей, необходимых для дифференцировки определенных тканей и органов (Корочкин Л.И., 2002).

Гены сигнальных молекул представлены пятью основными семействами: SHH, TGF-β, FGF, EGF и IGF.

Ген SHH (Sonic Hedgehog - «шумный ежик») первоначально обнаружен у дрозофилы (Нh). Причиной необычного названия послужила мутация, которая приводит к появлению личинок дрозофилы, покрытых кутикулярными выростами - колючками. У млекопитающих и человека семейство генов Hedgehog играет важную роль в регуляции процессов гаструляции, нейруляции и закладки осевого комплекса органов. Продукты экспрессии этих генов встречаются уже в клетках гензеновского узелка и в первичной полоске, участвуют в дифференцировке нервной системы, внутренних органов (легкие, гонады) и почек конечностей.

Гены семейства трансформирующих ростовых факторов (всего около 30, включая основные TGF-β1, TGF-β5) контролируют процессы дифференцировки как до, так и после рождения. В частности, они ответственны за индукцию мезодермы на стадии гаструлы, пролиферацию миобластов, формирование зачатков сердца. Для продуктов экспрессии генов этого семейства характерны сходная первичная молекулярная структура и посттрансляционный процессинг, в результате которого возникают биоактивные дисульфидные димерные белки. К этому суперсемейству относят гены, контролирующие такие сигнальные белки, как activin (индукция мезодермы), антимюллеровский фактор (регрессия мюллеровых каналов), Vg1 (индукция мезодермы и первичной полоски), BMP1-BMP4 (индукция нервной пластинки, развитие скелета), Nodal (образование мезодермы, первичной полоски, асимметрии тела), GCNF (нейротрофический фактор глиальных клеток), Lefty (фактор асимметрии тела).

Гены cемейства FGF (более 10) - факторы роста фибробластов, контролируют индукцию зачатка печени (FGF-1, FGF-8), рост апикальной части (эктодермальной шапочки) почек конечностей (FGF2, FGF-4, FGF-8, FGF10), формирование извитых почечных канальцев (FGF-2), развитие органов чувств, зубов, половых желез (FGF-3, FGF-4, FGF-5).

Гены эпидермального ростового фактора (EGF) контролируют гены, ответственные за дифференцировку эпидермального слоя кожи. Гены инсулиноподобного фактора роста (IGF) регулируют уровень энергетического обмена, являются важнейшим компонентом сигнального пути обмена глюкозы (hGH-INS/IGF-r IGF), определяющего не только активность пролиферативных процессов, но и продолжительность жизни человека (Баранов В.С. и др., 2009).

Для контроля ранних стадий эмбриогенеза млекопитающих и человека наиболее важна группа так называемых гомеобоксных генов, в структуре которых присутствует консервативная последовательность из 180 нуклеотидов (гомеобокс), кодирующая консервативную пептидную последовательность (гомеодомен) из 60 аминокислот, пространственно организованную по типу спираль-петля-спираль (helix-loop-helix). Выделяют несколько групп гомеобоксных генов: HOX, PAX, SOX, а также группу генов гомеодоменных белков, относящихся к ФТ.

Семейство HOX включает 38 генов, сгруппированных в 4 кластера (A, B, C, D), расположенных на разных хромосомах (у человека это хромосомы 7, 17, 12 и 2 соответственно). Каждый кластер имеет сходную организацию и включает 13 идентичных позиций (рис. 4-9, см. цв. вклейку).

Характерная функциональная особенность генов HOХ в том, что в пределах каждого кластера гены экспрессируются строго в направлении от 3´- к 5´-концу. При этом существует прямая зависимость между положением генов в кластере и расположением зон их экспрессии по оси тела: активность генов НОХ вдоль переднезадней оси тела зародыша соответствует последовательности этих генов в кластере (рис. 4-10, см. цв. вклейку). Так, ареал экспрессии гена НОХ-1 находится в области передней части головы, НОХ-5 - в грудном отделе, НОХ-7 - в поясничном, НОХ 9-12 - в задних отделах туловища.

Семейство РАХ насчитывает 9 генов, белковый продукт которых, помимо гомеобокса и консервативной октапептидной последовательности, содержит парный домен из 128 аминокислот, связывающийся с ДНК. Гены PAX контролируют развитие органов чувств, играют важную роль в закладке осевого комплекса органов, развитии мозга, мезенхимы, производных нервного гребня. Основные характеристики генов семейства РАХ приведены на рис. 4-11 (см. цв. вклейку).

Семейство SOX насчитывает свыше 20 генов. Первый ген этого семейства, SRY, детерминирующий развитие организма по мужскому типу, был открыт в 1990 г. Характерная особенность белковых продуктов генов SOX - наличие однотипного домена HMG (high mobility group), благодаря которому эти ФТ связываются с ДНК не по большой бороздке, как большинство ФТ, а по малой. Следствием этого являются выраженные конформационные изменения спирали ДНК в месте связывания, которые существенно влияют на работу близко расположенных генов. Еще одна особенность генов SOX - формирование комплексов с другими ФТ при индукции экспрессии специфических структурных генов дифференцировки. Например, комплекс двух ФТ SOX2-OCT3/4 важен для развития ВКМ; SOX2/EF3 контролирует развитие хрусталика глаза; SOX/Collagen II factor - развитие хряща; SOX9/Steroidogenetic Factor 1 - развитие половых валиков.

Другие ФТ эмбрионального развития включают гены семейства POU, которые, помимо гомеобокса, cодержат другую последовательность ДНК (75 аминокислот), связывающуюся с ДНК по типу спираль-петля-спираль. Примером такого ФТ являются гены OCT3-4, контролирующие состояние тотипотентности, гены большого семейства гомеодоменных Lim-белков, гены T-box (содержат консервативную последовательность T-box, контролируют развитие конечностей), гены DLX, функционально тесно связанные с генами семейства НОХ.

Итог первичной дифференцировки - формирование зародышевого пузырька (бластоцисты). Генетические факторы, контролирующие образование бластоцисты и первичную дифференцировку зародыша на две дивергентные при дальнейшем развитии группы клеток ТЭ и ВКМ, изучены достаточно подробно. Стадия бластоцисты соответствует I фазе гаструляции - стадии двух зародышевых листков (первичная эктодерма и первичная энтодерма).

II фаза гаструляции знаменуется появлением 3-го зародышевого листка - мезодермы, возникновению которой предшествует формирование первичного (гензеновского) узелка и первичной полоски (ПП), положение которых, вместе с зачатком хорды (нотохорды), маркирует переднезаднюю ось зародыша. Зачаток хорды, находящийся непосредственно под первичной полоской, представляет собой первичный организатор, клетки которого продуцируют ФТ, обеспечивающие дифференцировку собственно зародыша (рис. 4-12).

Рис. 4-12. Сагиттальные срезы зародыша человека ранних стадий: А - стадия VIII (18-20-й день развития); Б - стадия IX (20-21-й день развития), ранних этапов формирования сердечно-сосудистой системы; В - стадия XI (22-26-й день развития) (по Кнорре, 1967): 1 - кожная эктодерма; 2 - нервные валики; 3 - эктодерма амниона; 4 - мезодерма амниона; 5 - кишечная энтодерма; 6 - желточная энтодерма; 7 - хорда; 8 - аллантоис; 9 - эндотелиальный зачаток сердца; 10 - перикардиальная полость; 11 - кровяные островки в стенке желточного мешка; 12 - амниотическая ножка; 13 - хориальная пластинка; 14 - ворсинка хориона; 15 - мандибулярные жаберные дуги; 16 - слуховая ямка; 17 - амнион; 18 - желточный мешок; 19 - сердечный выступ

Сигнальные молекулы и ФТ, принимающие участие в контроле II фазы гаструляции, и места экспрессии соответствующих им генов приведены на рис. 4-13 (см. цв. вклейку). К генам сигнальных молекул, определяющих начало формирования первичной полоски, относят Chordin, Nodal иVG1 . По мере удлинения ПП за счет пролиферации и миграции клеток эпибласта (первичная эктодерма) на ее переднем конце обособляется группа клеток, дающая начало первичному (гензеновскому) узелку, который рассматривают в качестве главного первичного организатора.

В клетках гензеновского узелка экспрессируется много разных генов. Помимо вышеупомянутых генов ПП, отмечена экспрессия генов Shh, activina, а также Goosecoid и HNF-3β (hepatic nuclear factor). Продукт гена HNF-3β индуцирует рост нотохорды, индуктора нервной пластики и закладки всего осевого комплекса органов. Функция гомеодоменного ФТ Goosecoid до конца не ясна, но его экспрессия показана в области первичного организатора у разных позвоночных. Предполагается, что как и ФТ, HNF-3β принимает участие в активации синтеза сигнальных молекул Chordin и Noggin, которые совместно с продуктом генов SHH вовлечены в становление право-левой асимметрии тела.

Два гена - T и Nodal - играют важную роль в генезе мезодермальных клеток ПП. Экспрессия этих генов активируется генами ФТ HNF-3β и Goosecoid. Продукты генов T и Nodal регулируют миграцию мезодермальных клеток через ПП и гензеновский узелок. Мигрировавшие через гензеновский узелок клетки мезодермы, смещаясь в область передней висцеральной энтодермы (гипобласта), дают начало прехордальной пластинке и нотохорде (рис. 4-13, см. цв. вклейку). Под действием ФТ HNF-3β в клетках нотохорды активируются гены сигнальных молекул Noggin и Chordin, которые блокируют экспрессию гена ФТ BMP4 и вместе с продуктами генов SHH индуцируют превращение расположенных над нотохордой клеток дорсальной эктодермы в клетки нервной пластинки. Те же гены контролируют образование и прехордальной пластинки, состоящей из мезодермальных клеток и прилежащих к ним клеток висцеральной энтодермы (гипобласта). Прехордальная пластинка играет важную роль в развитии лицевого черепа, и ее рассматривают в качестве «организатора» головы (head organizer). Ее образованию предшествуют репрессия в клетках прехордальной пластинки ФТ BMP-4 и активация генов Lim1 и Cereberus-related 1, мутации которых, как показывают опыты на мышах, приводят к рождению потомства без головы. В центре «организации» головы экспрессируется и много других генов, в частности ген Otx2, контролирующий развитие передних отделов мозга. Идентификация ФТ и сигнальных молекул, направляющих сложные процессы дифференцировки клеток прехордальной пластинки, продолжается.

Помимо головы, клетки прехордальной пластинки совместно с клетками передней висцеральной энтодермы задействованы и в формировании парных зачатков сердца.

Важным морфогенетическим процессом на стадии ПП является формирование право-левой асимметрии тела. До стадии гаструляции (фаза II) зародыш сохраняет билатеральную симметрию. Однако уже на стадии ПП срабатывают генетические механизмы, приводящие к последующей асимметрии тела и внутренних органов (сердце, кишечник, селезенка, печень, доли легких). Установлено, что источником асимметрии служит неслучайное левостороннее колебание микроворсинок клеток гензеновского узелка, направляющее поток его главных ФТ (SHH и FGF-8) в левую часть зародышевого щитка, где создается их более высокая концентрация по сравнению с правой (рис. 4-14, см. цв. вклейку). Именно поэтому в левой части зародыша отмечается повышенная активация генов сигнальных молекул семейства TGFβ, Nodal и Lefty-1. Первый из них активирует ФТ Pitx-2, продукты которого ответственны за последующее асимметричное развитие вышеуказанных органов. Функции гена Lefty-1 направлены на предотвращение поступления сигнальных молекул асимметрии в правую часть зародыша.

Появление нервной пластинки и закладка осевого комплекса органов указывают на завершение гаструляции (преэмбрионального периода) и начало стадии нейруляции, которая открывает собственно эмбриональный период развития (горизонт IX по Стритеру). На этой стадии происходят обособление зародыша от его внезародышевых частей, образование нервных валиков, их смыкание в нервную трубку, возникают первые сомиты, начинаются сегментация и дифференцировка осевой мезодермы (рис. 4-15). Процессы образования нервной пластинки и смыкания нервной трубки контролируются многими семействами ФТ и сигнальных молекул, экспрессирующихся в клетках нотохорды. В самих клетках нейроэктодермы важная роль в процессах формирования нервной трубки принадлежит генам семейства кадхеринов E-CAM и N-CAM, мембранные белки которых обеспечивают адгезию клеток.

Четким критерием начала этого периода служит появление первых сомитов и нервного желобка, располагающихся по переднезадней оси нервной пластинки.

Рис. 4-15. Последовательные поперечные срезы зародышей человека на VIII (А, Б), IX (В) и X (Г) стадиях развития. Формирование и дифференцировка нервной трубки и ганглиозной пластинки (по Кнорре, 1967): А - нервный желобок и нервные валики; Б - замыкание желобка в трубку и срастание нервных валиков; В - нервная трубка, ганглиозная пластинка с выселяющимися клетками; Г - начало дифференцировки спинного мозга и формирования спинальных ганглиев. 1 - нервный желобок; 2 - нервные валики; 3 - кожная эктодерма; 4 - хорда; 5 - мезодерма (сомиты); 6 - ганглиозная пластинка; 7 - нервная трубка; 8 - мезенхима; 9 - зачаток спинного мозга; 10 - зачаток спинального ганглия; 11, 12 - корешки спинномозговых нервов; 13 - смешанный нерв; 14 - эпендимный слой; 15 - плащевой слой; 16 - краевая вуаль; 17 - белая соединительная ткань; 18 - зачаток ганглия пограничного ствола; 19 - эпителий целома; 20 - аорта

Уже на Х стадии развития (21-26-й день после овуляции/5-6-я неделя гестации) определяют от 1 до 12 пар сомитов. Их число быстро нарастает и уже к ХII стадии (28-32-й день после овуляции/6-8-я неделя гестации) достигает 21-29 пар, а размеры плодного яйца составляют 3-5 мм. К 30-му дню после овуляции насчитывают 30 пар сомитов, а у 7-8-недельного зародыша их 43-44 пары. В среднем в сутки прибавляется по 2-3 сомита. Сегментация (метамеризация) сомитов происходит постепенно, в направлении спереди назад, начиная с 3-й пары. Решающая роль в процессах сегментации и возникновении первичной метамерии тела, как было отмечено, принадлежит гомеобоксным генам (Корочкин Л.И., 2002; Carlson В.М., 2004). Из центральных, крупных частей сомитов (миотомов) развивается вся скелетная мускулатура тела, тогда как из их более рыхлых парных периферических участков - боковых пластинок (спланхнотомов) - зачатки почек конечностей, канальцев первичной (нефротомы), а также вторичной почки, эпителиальные выстилки брюшной, плевральной и перикардиальной полостей, вся гладкая мускулатура и зачаток сердца. Из других частей сомитов - склеротома (медиовентральная часть) и дерматома (дорсолатеральная часть) развиваются соответственно осевой скелет и кожа (Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007).

Смыкание нервной трубки начинается в будущем шейном отделе и постепенно распространяется в каудальном и краниальном направлениях. На 6-й неделе гестации нервная трубка полностью закрыта.

Гены, контролирующие процессы смыкания нервной трубки, формирование и дифференцировку сомитов, приведены на рис. 4-16 (см. цв. вклейку). Важная роль в процессах сегментации параксиальной мезодермы, образовании сомитов и их дифференцировки принадлежит ФТ SHH, PAX-1, PAX-9. Под действием продуктов гена WNT-1, секретируемых клетками нервных валиков, и генов SHH клеток хорды дорсальная часть эпителиальных клеток сомитов дифференцируется в дерматомиотом, клетки которого начинают экспрессировать собственные ФТ - РАХ1 и РАХ7, paraxis и Noggin. Медиальная часть дерматомиотома вскоре обособляется в миотом, дающий в дальнейшем начало мышцам спины. Развитие миотома, пролиферация и дифференцировка миобласта направляются генами MyoD, Mef5, Desmin, Mef2.

Часть клеток миотомов в результате экспрессии ФТ РАХ3, рецепторного гена c-met, а также гена ростового фактора печени (HGF) мигрирует из миотомов в сторону будущих почек конечностей. Наконец, внутренний сегмент эпителиальных клеток сомитов под действием ФТ SHH, РАХ1 и РАХ9, а также гена ВМР-4 (Bone morphogenetic Protein-4) дифференцируется в клетки склеротома, дающего начало костной ткани позвоночника.

Сложные морфогенетические процессы, связанные со II фазой гаструляции, нейруляцией и закладкой осевого комплекса органов, по продолжительности занимают около недели и соответствуют VII-Х стадиям развития (горизонтам по Карнеги). Развитие зародыша на этих в высшей степени ответственных стадиях эмбриогенеза находится под контролем многих тысяч генов. Однако решающая роль в осуществлении индивидуальной программы раннего онтогенеза принадлежит генам, контролирующим синтез сигнальных молекул (индукторов дифференцировки) и генам ФТ. К уже известным генам сигнальных молекул относят гены следующих семейств: Hedgehog (SHH); трансформирующих ростовых факторов (TGF-β1-TGF-β5, BMP1-BMP4, Nodal, GCNF, Lefty); факторы роста фибробластов - FGF-1-FGF-8; эпидермального ростового фактора (EGF); инсулиноподобного фактора роста (IGF). Транскрипционные факторы гаструляции и нейруляции включают семейства многочисленных гомеобоксных генов (HOX, PAX, SOX). Все эти гены включаются уже на стадии ранней гаструлы и, в зависимости от различных комбинаций сигнальных молекул и ФТ, а также локальной концентрации их белковых продуктов, направляют процессы дифференцировки, связанные с появлением дорсовентральной (эпибласт-гипобласт), переднезадней (первичная полоска, гензеновский узелок, нотохорда) и латеральной (право-левая асимметрия) осей тела, а также с образованием мезодермы, прехордальной и нервной пластинок. Естественно, что нарушения этих кардинальных процессов, вызванные эндогенными (генетическими) и экзогенными повреждающими факторами, как правило, ведут к гибели зародыша во время имплантации и появлению пустых плодных пузырей, не содержащих материал самого эмбриона. Вместе с тем наличие многих сходных по структуре и функциям паралогичных генов в каждом семействе нередко позволяет отчасти компенсировать функции мутантного гена. В этом случае зародыш сразу не погибает, а способен к дальнейшему развитию, хотя зачастую обнаруживает серьезные наследственные болезни и аномалии в постнатальном периоде. Примеры вышесказанного будут рассмотрены в следующем разделе.

Основы любой наследственной патологии закладываются и нередко реализуются еще во внутриутробном периоде развития. В настоящее время накоплен обширный материал по генетике развития каждой ткани, системы и органа. Для многих из них установлены главные гены и выявлены сигнальные пути, которые определяют и контролируют процессы морфогенеза и функциональное состояние. Высокоэффективными современными молекулярно-генетическими методами идентифицированы тысячи генов, экспрессирующихся в различных тканях на разных стадиях развития. Созданы специальные базы данных по экспрессии генов в мозге, других органах и тканях (Gene Expression Omnibus). Детально изучают спектры метилирования генома и отдельных генов в эмбриогенезе человека. Подробная сводка результатов таких исследований с акцентом на их генетическую составляющую приведена в многочисленных монографиях, посвященных нормальному и патологическому эмбриогенезу человека. Генетические механизмы контроля этих процессов представлены в следующих изданиях: Guraya S.S., 2008; Ferretti P. et al., 2006; Stevenson R.E., Hall J.G., 2006. Последняя и наиболее полная сводка этих данных приведена в недавно опубликованном и существенно дополненном 4-м издании фундаментального руководства по генетике человека под ред. В. Фогеля и А. Мотульского. В данном разделе сделана попытка обобщить известные данные о генетическом контроле процессов раннего органогенеза, выделить, насколько это возможно, главные (ключевые) морфогены, рассмотреть особенности их фенотипического проявления в норме, а также привести данные о связи мутаций этих генов с некоторыми наследственными болезнями и синдромами.

Эмбриональный период развития (20-90-й день развития, XI-XXIII горизонты по классификации Карнеги) включает периоды раннего (20-35-й день развития) и позднего (35-90-й день развития) органогенеза. Его начало совпадает с завершением периода нейруляции и закладки осевого комплекса органов, рассмотренного в предыдущем разделе (стадии VII-X), и завершается на XXIII стадии. К этому времени у зародыша уже сформированы все внутренние органы и системы, имеются 4-камерное сердце, почки, зачатки гонад, глаз, внутреннего уха, хорошо развиты верхние и нижние конечности, дифференцированы основные отделы мозга, в коре мозга появляются первые извилины, возникают непроизвольные сокращения мускулатуры. Хронология этих событий и особенности эмбрионального развития различных тканей, органов и систем зародыша человека досконально изучены (Кнорре А.Г., 1967; Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007; Lafond J.,Vaillancourt C., 2009). Их детальное рассмотрение не входит в задачу авторов.

В настоящее время быстро накапливается информация о генетических механизмах контроля развития человека. В значительной мере это связано с тем, что благодаря пренатальной диагностике плод человека на этих стадиях становится доступным для детального изучения как прямыми, так и непрямыми методами. Это позволяет не только установить точный диагноз, но и сопоставить нарушения генома с их фенотипическими проявлениями у плода (Айламазян Э.К., Баранов В.С., 2006; Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007). Кроме того, важная информация о генетическом контроле данных стадий получена и методами экспериментальной эмбриологии (Корочкин Л.И., 2002). В исследованиях последних лет установлено, что основные сигнальные пути генетического контроля эмбрионального развития человека действительно повторяют таковые у лабораторных моделей, прежде всего мышей, что позволяет экстраполировать данные экспериментальной эмбриологии на человека (Carlson В.М., 2004; Ostrer Н. et al., 2006; Mundlos S., 2010).

Далее рассмотрены некоторые наиболее изученные в плане генетики развития органы и системы эмбриона человека, а также результаты генетических исследований ряда врожденных аномалий и наследственных болезней.

Гены факторов транскрипции и гены сигнальных молекул (СМ), рассмотренные в предыдущем разделе, продолжают выполнять ведущую роль по реализации общей программы онтогенеза, канализации путей развития тканей и органов, процессов индукции и дифференцировки. Например, в результате экспрессии генов семейства НОХ образуются генопродукты, направляющие процессы дифференцировки по переднезадней оси тела, контролирующие формирование осевого скелета и многих внутренних органов. В частности, гены кластера НОХА активно экспрессируются в задних отделах мозга, нервной трубке и тканях мезодермы, регулируют процессы гемопоэза, а также развитие костей конечностей, почек, сердца и мочеполовой системы (Di-Poi N. et al., 2010). Однако мутации гомеобоксных генов у человека, в отличие от дрозофилы, не вызывают перемещения частей тела по типу гомеозисных мутаций, но приводят к задержке развития и к многочисленным аномалиям дыхательной, сердечно-сосудистой, костной и гемопоэтической систем. Так, мутация гена НОХD13 была зарегистрирована у пациента с синдактилией, нарушением развития костей стопы, мутация гена НОХА13 вызвала сложный синдром с поражением костей руки, ноги и нарушениями пола (hand-foot-genitalia syndrome), а мутация гена НОХА11 была найдена при синостозе лучевой и локтевой костей в сочетании с нарушениями гемопоэза (Zhao Y., Westphal H., 2002).

Столь же многообразна экспрессия гомеобоксных генов других классов и семейств (PAX, ZIC, SOX, ZNE, FOX иТВХ). Известны врожденные синдромы и аномалии развития в случае мутаций 27 различных гомеобоксных генов (Zhao Y., Westphal H., 2002). Характерно, что практически во всех случаях мутации были результатом дефицита дозы гена и наследовались по доминантному типу. Врожденные аномалии, ассоциированные с доминантными мутациями генов семейства Т-box, приведены в табл. 4-1.

Таблица 4-1. Нарушения развития и врожденные синдромы, ассоциированные с мутациями гомеобоксных генов семейства Т-box (Stanier Ph., Moore G., 2006)

Очень полиморфны в своем фенотипическом проявлении и гены сигнальных молекул, что можно проиллюстрировать на примере генов известного семейства Hedgehog. Ген SHH (Sonic Hedgehog) описан у человека в 1995 г., картирован в локусе 7q36 и до сих пор его рассматривают как один из самых важных регуляторов эмбрионального развития у млекопитающих и человека. Ген начинает экспрессироваться уже на стадии нейрулы в клетках хорды, в передней и средней частях будущей нервной пластинки и в клетках гипобласта (энтодермы). Его продукт (секретируемый белок) после процессинга N-концом образует комплекс с холестерином, соединяется с мембранами клеток-мишеней, в которых активирует ФТ Gli. Последний поступает в ядро и, связываясь с ДНК, индуцирует активность многих генов (Carlson В.М., 2004). Фенотипический эффект комплекса «SНН-холестерин» определяется его концентрацией в ткани-мишени, стадией развития и эффектами других ФТ. Важная роль SHH доказана в отношении дифференцировки нервной трубки, переднего мозга, нейронов радужки глаза, мезодермы и ее производных, конечностей, сердца (Mundlos S., 2010). Доминантные мутации гена SHH приводят к тяжелой аномалии - голопрозэнцефалии, при которой нарушается разделение переднего мозга на два полушария, отмечаются циклопия и другие аномалии развития головного отдела. Экспрессия SHH в зоне роста почек конечностей приводит к активации другого ФТ, Gli3 , нарушение которого служит причиной полидактилии (синдромы Крэйга и Паллистера-Холла). Продукт гена SHH активирует другой сигнальный белок семейства TGF - Nodal, запускает каскад генов, детерминирующих право-левую асимметрию зародыша. Нарушение этого процесса может быть причиной серьезных аномалий развития сердца.

Таким образом, в период активного органогенеза гены ФТ и СМ продолжают играть решающую роль в определении общего плана строения всего зародыша, его отдельных систем и органов. Фенотипический эффект их продуктов характеризуется исключительным разнообразием, обусловленным их концентрацией в тканях-мишенях, стадией эмбриогенеза, действием других ФТ и СМ.

Морфологически, структурно и функционально нервная система, безусловно, самая сложная из всех систем организма. Принято считать, что ее развитие и функции обеспечиваются экспрессией более 10% генов генома, т.е. в два раза большим числом генов, чем любого другого органа. Естественно, что иерархия генных цепей морфогенеза нервной системы достаточно сложна, а число генов ФТ и СМ, обеспечивающих программу развития нервной системы, велико.

Как было отмечено, нервная пластинка развивается из зародышевой эктодермы, лежащей непосредственно над нотохордой. Ее развитие становится возможным вследствие репрессии в этих клетках ФТ BMP-4 продуктами двух генов нейрональной индукции - Nоggin и Сhordin.

Принципиальную схему начальных стадий эмбрионального развития нервной системы см. на рис. 4-15.

Из нервной трубки развиваются головной и спинной мозг и спинальные ганглии. Из клеток нервного гребня - вся вегетативная нервная система. Дифференцировку переднего отдела нервной трубки и формирование мозговых пузырей контролируют гены Otx-2 (передний и средний мозг) и Gbx2 (задние отделы мозга). Дополнительные индукционные стимулы дифференцировки среднего и заднего отделов мозга создают диффундирующие в эти отделы ФТ FGF-8 и Wnt1 . Дифференцировку заднего отдела головного мозга на ромбомеры контролируют гомеобоксные гены семейств HOX . Главными генами нейральной индукции считают гены Noggin, Notch, Wnt, Dorsalin.

Нарушения процессов формирования нервной трубки, миграции нейробластов и клеток нервного гребня вызывают многочисленные аномалии ЦНС у 0,5-1% всех новорожденных.

Мутации трех ФТ (SIX3, ZIC2, TGIF) и четырех СМ (SHH, TGF β, GLI2, TDGF1) приводят к тяжелому нарушению развития переднего отдела нервной трубки - голопрозэнцефалии.

Наиболее известным геном, мутации которого вызывают дефект закрытия нервной трубки (ДЗНТ) у человека, является ген MTHF. Функционально ослабленный (термолабильный) Т-аллельный вариант этого гена встречается почти в 10% случаев ДЗНТ. Полиморфизм С677Т нарушает образование активных форм фолиевой кислоты и обнаруживает четкую ассоциацию с аномалиями заращения нервной трубки.

Большая группа болезней нервной системы обусловлена мутациями генов, контролирующих миграцию нервных клеток, формирующих нервные ганглии и вегетативную нервную систему (табл. 4-2).

Таблица 4-2. Гены, мутации которых ведут к нарушениям миграции нервных клеток

Зачатки костной системы появляются на стадии осевого комплекса органов, где они представлены склеротомом (мезенхимные клетки внутренней части сомитов, дают начало осевому скелету - позвоночный столб, ребра, грудина, череп), латеральным листком соматоплевры (кости конечностей и таза) и клетками эктодермального нервного гребня (лицевой череп) (рис. 4-17, см. цв. вклейку). Формирование костной ткани может включать промежуточную стадию - стадию хряща (эндохондральная оссификация), либо мезенхимные клетки трансформируются непосредственно в остеобласты, минуя превращение в хондроциты (интрамембранозная оссификация). Соответственно существуют два набора ФТ: TGF β-BNP-GDF-5 и CDFN1-RUNX2.

При остеогенезе через хрящевую ткань цепочка индукционных сигналов начинается с ФТ гомеобоксного гена SOX9. Ген SOX9 активирует ген CalIIA, экспрессия которого направляет дифференцировку мезенхимных клеток в сторону хондроцитов и стимулирует образование предхряща. Индукция пролиферации хондроцитов зависит от генов семейства ФТ FGF.

На следующем этапе ФТ Cbfa1 (Core binding factor 1) индуцирует дифференцировку таких клеток в остеобласты (клетки, продуцирующие коллаген). Центральную роль в дифференцировке хондроцитов в остеобласты отводят гомеобоксному гену IHOX (Indian Hedgehоg), который индуцирует в хондроцитах экспрессию гена рецептора паратиреоидного гормона PTHrP.

На разных этапах формирования костной ткани важную роль играют также ФТ семейства BMP (Bone morphogenetic protein): BMP2, BMP4, BMP7.

Мутации в гене SOX9 вызывают кампомелические дисплазии, летальные хондродисплазии. Мутации коллагеновых генов COL1A1 и COL1A2 могут быть причиной синдромов, связанных с несовершенным остеогенезом (osteogenesis imperfecta).

Мутации в гене рецептора фактора роста фибробластов (FGFr) вызывают ахондроплазию.

При мембранозном типе оссификации мезенхимные клетки непосредственно превращаются в остеобласты. Гены, контролирующие этот процесс: ФТ Cdfa1 и Runx2. Мутации гена RUNX2 вызывают челюстно-краниальные дисплазии, нарушения развития/отсутствие ключицы, рост дополнительных зубов в сочетании с маленьким ростом.

Решающая роль в эмбриогенезе осевого скелета человека принадлежит гомеобоксным генам семейства (класса) HOX. Схему контроля генами HOX разных отделов позвоночного столба см. на рис. 4-10. Обращает на себя внимание тот факт, что развитие каждого позвонка контролируется сразу несколькими различными генами HOX (от 2 до 9 генов). Такой «перекрывающийся» контроль обеспечивает высокую надежность программы развития. Тем не менее ошибки в ней встречаются, как, например, при синдроме Клиппеля-Фэйла, когда наблюдают уменьшение числа шейных позвонков. Такой дефект, скорее всего, является результатом сбоя в работе HOX-генов, обусловленного их мутациями или повреждающим действием внешних факторов, например действием ретиноевой кислоты.

Почки верхних конечностей появляются на 25-й день развития (стадия XII) на уровне шейных сомитов, а задних - на 1-2 дня позже, на уровне поясничных и первого сакрального позвонков. Их развитие происходит при тесном взаимодействии апикального эпидермального гребня (АЭГ, эктодермальная шапочка) и подлежащего скопления клеток мезенхимы. Мутации, нарушающие развитие АЭГ, приводят к многочисленным аномалиям конечностей различной степени тяжести, включая эктродактилию (ген TP63L).

Гены, контролирующие начальные этапы развития конечностей, и их локализация в почке конечности показаны на рис. 4-17. Под влиянием генов-ФТ FGF, экспрессирующихся в АЭГ, в клетках почек передних конечностей активируется гомеобоксный ген семейства T-box - Tbx5, а в задних - Tbx-4. Под влиянием продуктов генов FGF там же активируются ФТ PAX-1 и IGF-1, определяющие усиленную пролиферацию мезенхимных клеток АЭГ.

Важная роль в регуляции конденсации мезенхимных клеток в области почек конечностей и их превращении в хондроциты принадлежит также сигнальному пути других ФТ - TGFβ-BNP-GDF-5. Мутации этих генов вызывают укорочение пальцев (брахидактилию). Мутации, усиливающие активность гена GDF-5, ведут к синостозам (слиянию зачатков пальцев).

Совместное действие FGF и продукта нейрогенного ФТ Wnt-7a стимулирует образование в апикальной части почки конечности зоны поляризационной активности (ZPA), клетки которой начинают экспрессировать гены SHH и GLI3. Последний способствует созданию в почках конечностей градиента сигнальных молекул SHH. Нарушения этого градиента в связи с мутациями гена GLI3 приводят к полидактилии и гамартомам (синдромы Крэйга и Паллистера- Холла) (Mundlos S., 2010). Градиент СМ гена SHH устанавливает переднезаднюю (дистально-вентральную) ось почек конечностей, в соответствии с которой происходит экспрессия гомеобоксных генов НОХ9-13 (HOX9 проксимальная и НОХ13 - наиболее дистальная часть конечности).

Паттерн дифференцировки почек конечностей в дорсовентральном направлении определяется ФТ WNT7a, который индуцирует включение гомеодоменного гена Lmx1, различная концентрация продукта которого в дорсовентральном направлении определяет наличие градиента. Мутации гена WNT7a приводят к тяжелым аномалиям конечностей, крайним вариантом которых является фокомелия. Нарушения в гене LMX1B ведут к отсутствию или дисплазии коленной чашечки и укорочению ногтей (nail-patella syndrome). Мутации генов НОХ9-13 могут приводить к синполидактилии (слиянию нескольких пальцев при наличии лишнего пальца).

Зачатки сердца и магистральных сосудов определяются уже на 20-21-й день развития (стадия IX). Сердце закладывается на стадии первичной полоски в виде парных трубок по бокам гензеновского узелка (см. рис. 4-12), которые сливаются, образуя единую трубку эндокарда, окруженную более толстым слоем миокарда - производного висцерального листка спланхнотома и зародышевой мезенхимы. Сокращения сердца наступают еще до его иннервации, т.е. способность к сокращению и проведению импульса присуща самим кардиомиоцитам. На 5-й неделе сердце представляет собой парную трубку, состоящую из одного предсердия и камеры. Первые сердцебиения регистрируют уже на 6-й неделе гестации, точнее на стадии, соответствующей Х горизонту Стриттера (21-26-й день развития). Вместе с прилежащим зачатком печени сердце образует сердечно-печеночный выступ, сильно выпячивающийся в передней части вентральной стенки зародыша. Одновременно формируются крупные магистральные сосуды (дорсальная аорта, кардиальная вена). На тех же X-XI стадиях в мезодермальном слое желточного мешка появляются первые кровяные островки, формируются сосуды и начинается внутрисосудистое кроветворение; устанавливается замкнутое кровообращение через желточный мешок с магистральными сосудами зародыша. На 32-й день развития (XIII стадия) завершаются ранние стадии развития сердца и устанавливается однонаправленный ток крови.

Дифференцировка сердца представляет собой сложный многостадийный процесс, каждый этап которого контролируют разные гены. Так, еще до начала закладки сердца формируется лево-правая асимметрия зародыша, благодаря которой сердце человека изначально развивается асимметрично. Помимо уже упоминавшихся генов SHH и Nodal, становление лево-правосторонней асимметрии контролируют гены CRYPTIC, ZIC3, LEFTY (Henderson D. et al., 2006). Нарушение этого процесса вследствие неправильного транспорта продуктов перечисленных генов ведет к развитию синдрома Картагенера (situs viscerus inversus), нередко сочетающегося с транспозицией крупных магистральных сосудов и другой патологией сердца.

Гены, определяющие положение сердца (SHH, Nodal), в дальнейшем контролируют и основные сигнальные пути развития сердца и магистральных сосудов. На самых ранних стадиях развитие парных зачатков сердца контролируют и поддерживают продукты ФТ FGF-4 и FGF-8, а также BMP-2, экспрессируемые клетками передней энтодермы. Действие продуктов этих генов синергично (Henderson D. et al., 2006). Как и в развитии других эмбриональных зачатков, действие этих генов-индукторов уравновешивается продуктами генов-супрессоров. В случае зачатка сердца таким супрессорным эффектом обладают продукты гена Noggin (СМ), синтезируемого клетками нотохорды, и гена WNT1, синтезируемого клетками нервной трубки.

Развитие миокарда контролируют многие гены, главными из которых являются специфичные для сердца ФТ NKX2.5 и ФТ семейства GATA. Ген NKX2.5 контролирует преимущественно развитие левого желудочка, индуцируя экспрессию еще одного ФТ - Miocardin . Другие гены развития миокарда - гомеобоксы ФТ GATA (GATA 3-6 ) контролируют развитие эпителиальной выстилки сердца - эндокарда.

В миокарде предсердий главная роль принадлежит гомеобоксному гену Tbx-5 , а в развитии миокарда желудочков - генам Hand-2 и Hand-1 (соответственно правый и левый желудочки сердца). Данные гены идентифицированы в экспериментах на мышах, однако имеются данные о наличии аналогичных генов и у человека. Так, доминантные мутации гена NKX 2.5 были обнаружены у пациентов с дефектами предсердной и межжелудочковой перегородок, аномалиями трикуспидального клапана и тетрадой Фалло. Дефекты перегородок сердца были выявлены и у пациентов с мутациями гена GATA4.

Закладываются как парные зачатки мезенхимной ткани нефротомов сомитов еще на Х стадии развития и дифференцируются вначале в первичную почку (стадия XI), которая функционирует как орган выделения в течение антенатального периода, а затем (XII стадия, 28-й день развития) - во вторичную (окончательную) почку, которая формируется из несегментированных каудальных участков нефротомов. Развитие почки происходит в тесном взаимодействии с развитием мочеточников, мочевого пузыря и гонад.

Сложные процессы формирования первичной и вторичной почек контролируют множество генов, объединенных в несколько сигнальных путей ФТ: PAX/FLA/ SIX;LIM1/ODD1. Важную роль в развитии почки отводят генам ростовых факторов, в частности семейству трансформирующих ростовых факторов (TGF), нейротрофическому фактору глиальных клеток (GDNF), генам морфогенетических белков костной ткани, генам эпидермального фактора роста (EGF), фактору роста фибробластов (FGF), генам роста печени (HGF) и инсулиноподобному фактору роста (IGF) (Winyard P., 2006).

Рост мочеточников определяют ФТ RET/GDNF. Продукты генов Wtn1 и Wtn4 способствуют агрегации клеток метанефрогенной мезенхимы при образовании почечных канальцев. Гены FGF2 и BMP7 предотвращают апоптоз этих клеток и также способствуют их агрегации. Врастание в почку мочеточника контролирует ФТ WT1, мутации в котором вызывают опухоль Вильмса или приводят к синдрому Дениса-Драша. В последнем случае, помимо опухоли, развивается выраженный нефротический синдром, при котором пациент погибает в возрасте до 3 лет. Развитие мочевого пузыря и нижнего отдела мочеполовой системы контролируют гомеобоксные гены НОХ (НОХА13). Мутации этого гена приводят к синдрому Hand-foot-uterus, при котором отмечают укорочение больших пальцев рук и ног, урогенитальные пороки, аномалии мочеточников.

В настоящее время известно более 30 различных наследственных синдромов, в качестве постоянного компонента которых выступают те или иные аномалии почек и мочевыводящих путей (Winyard P., 2006).

Зачатки глаз появляются как парные образования (глазные пузырьки) на Х стадии эмбрионального развития (21-22-й день развития). До своего окончательного формирования они проходят сложную цепь морфогенетических превращений, включающих стадию глазного бокала, образование хрусталика, радужной оболочки, зрительного нерва. Эмбриогенез глаза подробно изучен как на клиническом материале, так и собственно в эксперименте (Кнорре А.Г., 1966; Sowden J.C., 2006; Carlson B.M., 2004). Генетический контроль формирования этого сложного органа осуществляют многочисленные гены и генные семейства, мутации которых приводят к потере зрения и тяжелым порокам развития. Так, мутации гомеобоксных генов PAX6, SOX2, RAX, SIX3, а также гена SHH нередко ведут к полному отсутствию глаза (анофтальмии); мутации генов, контролирующих формирование глазного бокала (CHX10, BCOR, MAF2, PAX2), вызывают микрофтальмию, врожденную катаракту или колобому. Мутации генов, контролирующих развитие тканей передней камеры глаза (радужки) - FOXC1, PITX2, PAX6, CYP1B1, а также определяющих развитие хрусталика (MAF, FOXE3, PITX3, EYA1), служат причиной доминантно наследуемого варианта синдрома Аксенфельда-Ригера, врожденной глаукомы или различных вариантов врожденной катаракты. Мутации генов, контролирующих развитие нейронов радужки глаза (GLUCY 2D, RPE65, AIPL1, RPGRIP, GRB1, CRX), а также собственно зрительного нерва (PAX6, HESX1), приводят к различным формам дегенерации сетчатки, атрофии зрительного нерва и к полной слепоте (Sowden J.C., 2006).

Зачатки внутреннего уха появляются, как и зачатки глаз, примерно на 20-21-й день развития (стадия Х) в виде парных ямочек (плакод), которые образуются из наружной эктодермы головного конца зародыша. К 4-й неделе развития под влиянием индукционных сигналов со стороны ромбовидного отдела мозга они погружаются под слой наружной эктодермы, превращаясь в слуховые пузырьки. Эти процессы находятся под контролем сигнального пути из трех ФТ (FGF19-Wnt8c-FGF3). Развитие полукружных каналов вестибулярного аппарата внутреннего уха контролируют ФТ Nkx5-1, Otx-1 иDlx-5. Учитывая сложность строения слуховой и вестибулярной частей органа слуха, число генов, координирующих процессы его морфогенеза, очень велико. Действительно, врожденная глухота и серьезные нарушения слуха встречаются со среднепопуляционной частотой 1/850 новорожденных. В настоящее время известно более 50 генов, мутации которых вызывают врожденные нарушения развития этого органа у человека, следствием чего являются тугоухость разной степени, вплоть до полного отсутствия слуха. При этом в случае синдромальной патологии однотипные варианты нарушения слуха могут быть спровоцированы мутациями разных генов. Так, нарушения слуха при синдроме Ушера могут быть вызваны мутациями генов MYO7A, кадхерина 23 (CDH23), PCDH15, USHI1C, SANS. Известно также около 120 локусов, сцепленных с несиндромальной глухотой, а в 38 случаях удалось идентифицировать кандидатный ген. Мутации ряда генов (MYO7A, USH1C, MYO6), как установлено, могут быть ассоциированы с ранней возрастной потерей слуха (Spiden S.L., Steel K.P., 2006).

Органогенез занимает практически весь период эмбрионального развития, вплоть до завершения I триместра беременности (90-й день развития). Особенно активные процессы морфогенеза происходят с 20-го по 35-й день развития (стадии XI-XIV по классификации Карнеги). Как и на предыдущих стадиях развития (гаструляция, нейруляция, закладка осевого комплекса), генетический контроль органогенеза осуществляют в первую очередь регуляторные гены, транскрипционные факторы и сигнальные молекулы. Особенно важную роль в дифференцировке органов по переднезадней оси тела, метамерной (сегментной) дифференцировке позвоночника, ребер, сомитов играют гены семейства НОХ и другие гомеобоксные гены, а также СМ, например SHH. Продукты этих генов определяют общий план строения организма, диспозицию и дифференцировку его отдельных систем и органов. Полиморфизм фенотипического эффекта регуляторных генов определяется градиентом концентрации их белковых продуктов в тканях-мишенях, стадией эмбриогенеза, взаимодействием с продуктами других ФТ и СМ. Так, главными генами нейральной индукции являются гены Noggin, Notch, Wnt, Dorsalin.

Мутации трех ФТ (SIX3, ZIC2, TGIF) и четырех СМ (SHH, TGF β, GLI2, TDGF1) приводят к тяжелому нарушению развития переднего отдела нервной трубки - голопрозэнцефалии. Четкая ассоциация с дефектами смыкания нервной трубки (гидроцефалия, spina bifida) показана для гена MTHFR. Идентифицированы многие гены, мутации которых приводят к различным болезням, связанным с нарушением миграции нервных клеток, формирующих нервные ганглии и вегетативную нервную систему. В плане генетических механизмов морфогенеза достаточно детально изучены гены, контролирующие развитие костной системы (почек конечностей, позвоночника, черепа), сердечно-сосудистой системы, мочевыделительной системы, а также глаз и органа слуха. Для многих аномалий этих органов и систем картированы соответствующие гены и идентифицированы мутации. Более детальная информация о генетическом контроле развития этих и других органов и систем, а также подробные списки мутаций, ведущих к наследственной патологии у человека приведены в соответствующих фундаментальных монографиях (например, Carlson B.M., 2004; Ferretti P. et al., 2006; Speicher M.R. et al., 2010), в обзорах (Ostrer Н. et al., 2006; Wigle J.T., Eisenstat D.D., 2008) и представлена в Интернете.

Реализация программы индивидуального развития осуществляется через процессы включения и выключения генов в строго определенном месте, т.е. на определенной стадии онтогенеза и в конкретных клетках тех или иных органов и тканей. Регуляция активности генов, как известно, возможна на любом этапе считывания наследственной информации, т.е. на уровне транскрипции ДНК, созревания ее первичного продукта (процессы сплайсинга, кэппирования, полиаденилирования), транспорта зрелой РНК в составе нуклеопротеиновых гранул в цитоплазму, считывания генетического кода мРНК на рибосомах (трансляция), процессинга полипептида и формирования функционально активной белковой молекулы. Все эти этапы реализации генетической информации хорошо изучены. Накоплено много данных и о молекулярно-генетических механизмах, обеспечивающих и контролирующих эти процессы. В частности, подробно исследованы структура гена и регуляторные последовательности ДНК, контролирующие включение и выключение гена в цис- и транс-положениях, ферментные системы, обеспечивающие процессы транскрипции, сплайсинга, созревания мРНК, ее трансляции и процессинга пептидного продукта гена. Рассмотрение этого важного раздела молекулярной генетики и функциональной геномики не входит в задачу авторов. Подробную информацию на эту тему можно найти во многих фундаментальных руководствах, учебниках и обзорах (Корочкин Л.И., 2002; Свердлов Е.Д., 2009; Инге-Вечтомов С.Г., 2008; Speicher M.R. et al., 2010).

Все вышеупомянутые канонические процессы, связанные с реализацией генетической информации, касаются механизмов контроля экспрессии индивидуальных генов, на долю которых, по современным оценкам, приходится не более 1,5-2% генома человека. Между тем факторы, контролирующие работу всего генома, в настоящее время представляются значительно более сложными и многообразными. К ним относят повторяющиеся последовательности ДНК, эпигенетические изменения (метилирование ДНК и «гистоновый код»), регуляторные интерферирующие (малые) РНК.

Повторяющиеся последовательности ДНК относят к так называемой факультативной части генома, на долю которой приходится более 50% всей ДНК клетки. Помимо дупликаций генов, псевдогенов и хромосомных сегментов (CNV, варьирование числа копий), значительная часть факультативной ДНК занята некодирующими повторяющими последовательностями (SINE, LINE, Alu, LTR) - ретротранспозонами, сходными по структуре с РНК-содержащими ретровирусами, а также различными по протяженности тандемными повторами сателлитной ДНК и короткими TTAGGG-повторами, расположенными как в теломерных районах всех хромосом, так и часто встречающимися в интерстициальных участках хромосом. Установлено, что ретровирусные элементы генома человека и октамерная коровая последовательность TTAGGG играют важную роль в регуляции экспрессии генов (Tomilin N.V., 2008). Так, ретроэлементы типа SINE (длина 500 п.о., число около 10 000 на геном) располагаются преимущественно в богатых генами областях хромосом, нередко вблизи промоторов генов (CpG-островки), имеют в своем составе сайты связывания для факторов транскрипции и для транскрипционного комплекса TFIIIC2. Известно, что все ретроэлементы генома (SINE, LINE, LTR, Alu), а также коровые октамерные повторы TTAGGG важны для обеспечения пространственной хромосомной структуры ядра, поддержания хромосомных территорий и экспрессии генов (Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007).

Таким образом, многие особенности экспрессии генов у человека определяются не только эффективностью самих механизмов транскрипции и трансляции, но зависят от их положения в геноме относительно различных повторяющихся последовательностей и ретротранспозонов.

В свете дальнейших рассуждений важно обратить внимание на такие характеристики ретроэлементов генома человека, как их высокая концентрация в области перицентромерного хроматина, способность к экспрессии с образованием собственных РНК-копий, а также их связь с процессами эволюции млекопитающих (Tomilin N.V., 2008).

Высокое содержание ретротранспозонов в области перицентромерного гетерохроматина хромосом млекопитающих и человека - хорошо установленный факт, который пока не имеет достаточно обоснованного научного объяснения (Eymery A. et al., 2009).

Есть данные, что на протяжении эволюции геномы человека, млекопитающих и других животных подвергались массовым заражениям ретровирусами, которые активно интегрировали в наследственный аппарат эукариот. Согласно результатам секвенирования геномов разных животных, такие эпидемии происходили несколько раз примерно 50, 20 и менее 5 млн лет назад (Romano C.M. et al., 2007). При этом ретровирусы не разрушали геном хозяина, но, интегрируясь в него, начинали выполнять определенные полезные функции. По некоторым данным, ретротранспозоны могут играть важную роль на начальных стадиях эмбриогенеза. Так, высокие концентрации ретротранспозонных последовательностей были обнаружены в транскриптоме ооцитов и в дробящихся мышиных зародышах первого дня развития. Эта удивительная находка сотрудников Джэксоновской лаборатории (США) позволила предположить, что эндогенные ретротранспозоны могут участвовать в репрограммировании генома оплодотворенной яйцеклетки и регулировать экспрессию многих генов на начальных стадиях эмбриогенеза мышей и, возможно, человека (Peaston A et al., 2004).

В настоящее время принято считать, что высокое содержание и большое разнообразие различных по длине и составу ДНК повторяющихся и ретровирусных последовательностей необходимо для обеспечения нормальной функции генома. Однако их роль в реализации программы индивидуального развития пока неясна.

Исследование эпигенетических (не связанных с первичной структурой ДНК) механизмов регуляции функций генома - одно из бурно развивающихся направлений современной генетики, тесно связанное с решением медицинских проблем (Лебедев И.Н., Саженова Е.А., 2008). Эпигенетическая регуляция может происходить путем метилирования цитозиновых нуклеотидов ДНК, модификаций хромосомных белков-гистонов, либо путем воздействия на транскриптом клетки различных видов регуляторных РНК.

Метилирование цитозина CpG-островков промоторных районов - наиболее универсальный способ эпигенетической регуляции генной экспрессии. Метилирование заключается в присоединении к цитозиновому нуклеотиду метильной группы СН₃, что делает ген недоступным для фермента РНК-полимеразы и, таким образом, блокирует его транскрипцию. Метилирование ДНК контролируется комплексом ферментов-метилтрансфераз DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L. Процесс репрограммирования генома (изменение паттерна метилирования) начинается еще в гаметах, продолжается на ранних стадиях эмбриогенеза (тотальное деметилирование генома зародыша), завершается на стадии морулы-бластоцисты, когда запускается процесс метилирования de novo и по мере дифференцировки клеточных клонов устанавливается свой, характерный для каждой ткани паттерн метилирования. Особенностью метилирования в эмбриогенезе человека, отмеченной выше, является выраженное гипометилирование генома цитотрофобласта хориона и плаценты по сравнению с геномом эмбриона. Считается, что такие эпигенетические различия, существенно влияющие на функции генов, важны для нормальной имплантации и плацентации.

Интригующим феноменом эпигенетической регуляции функции генома является геномный импринтинг - аллельные различия функций генов зародыша, связанные с их родительским происхождением, т.е. зависимость от того, получены они зародышем с геномом сперматозоида или яйцеклетки (Баранов В.С., 1988, 1991). Открытый экспериментально еще в 1970 г. феномен геномного импринтинга, как оказалось, играет важную роль в нормальном эмбриогенезе человека, а его нарушения (эпимутации импринтированных генов) приводят к многочисленным нарушениям эмбрионального развития, спонтанным абортам, наследственным болезням (синдром Прадера-Вилли, синдром Ангельмана, синдром Беквита- Видеманна и др.) и даже развитию опухолей (Немцова М.В., Залетаев Д.В., 2004; Лебедев И.Н., Саженова Е.А., 2008).

С процессом метилирования ДНК, как установлено, тесно связан и другой эпигенетический феномен изменения гистонов, простых по структуре белков, составляющих протеиновый остов хромосомы и формирующих глобулы (нуклеосомы), на которые наматывается двойная спираль ДНК (I уровень компактизации ДНК). Метилирование ДНК обычно предшествует метилированию гистона Н3, но в целом процесс метилирования обычно бимодальный, т.е. выключение работы гена может начинаться с метилирования CpG-островков ДНК, после чего метилируется гистон Н3 в промоторной области гена, либо процесс идет в обратной последовательности. При этом эпигенетические изменения гистонов более разнообразны, чем модификации ДНК. Помимо метилирования, аминокислотные остатки гистонов могут подвергаться ацетилированию, фосфорилированию, убиквитинированию. Ацетилирование гистонов характерно для активного состояния гена, а деацетилирование - для репрессированного. Известно более 50 маркеров аминокислотных остатков гистонов, что позволяет предполагать в клетках эукариот, наряду с эпигенетическим кодом (ДНК-метилирование), наличие и гистонового кода. Пока неизвестно, как работает этот код. Какова его структура? Каково место в иерархии контролирующих генетических механизмов онтогенеза?

Феномен РНК-интерференции, открытый почти 20 лет назад, в настоящее время привлекает большое внимание. Его основу составляют небольшие по размеру (20-40 п.о.) одноили двухцепочечные некодирующие молекулы РНК, вызывающие направленную деградацию мРНК генов-мишеней, содержащих комплементарную им последовательность нуклеотидов и, таким образом, блокирующих синтез соответствующих белков на уровне трансляции. Отсюда их второе название - короткие интерферирующие РНК (short interfering RNA - siRNA) (Свердлов Е.Д., 2009). В настоящее время известны сотни различных siRNA, многие из которых уже применяются в исследованиях, требующих направленного выключения генов. Некоторые siRNA в настоящее время проходят клинические испытания в качестве возможных противоопухолевых препаратов (Zilenska E., 2010). Следует отметить, что, согласно новым данным, siRNA могут не только блокировать, но и при определенных условиях стимулировать транскрипцию генов (Vasudevan S et al., 2007). Механизм РНК-интерференции в настоящее время рассматривают как главный регулятор экспрессии генов, определяющих ответ клетки на эндогенные и экзогенные воздействия (Lal А. et al., 2009). Роль siRNA в нормальном эмбриогенезе человека пока не изучена. Следует обратить внимание на то, что по конечному результату действия и многообразию фенотипических эффектов малые РНК напоминают продукты генов ФТ. Более того, получены данные о том, что siRNA, присоединяясь к ДНК, служат молекулярными маркерами для ДНК-метилирования de novo (РНК-зависимого метилирования ДНК).

Таким образом, экспрессия гена на уровне целого генома представляет собой сложный, многоэтапный и многоуровневый процесс, конечный результат которого зависит не только от эффективности транскрипции и трансляции, но и от модифицирующих воздействий на уровне всего генома, которые связаны с наличием ретровирусных последовательностей, эпигенетических изменений ДНК и гистонов, а также от действия главного регулятора генной экспрессии - интерферирующих микро-РНК. Существенно, что во многих точках онтогенеза эти надмолекулярные пути пересекаются или оказываются комплементарными, создавая глобальную общегеномную сеть регуляции генной активности.

Рассматривая геномные, в том числе надмолекулярные, механизмы регуляции генной экспрессии, нельзя не обратить внимание на такую сложную по структуре и малопонятную по функциям часть генома, как гетерохроматин (ГХ) (ПрокофьеваБельговская А.А., 1969). Принято различать конститутивный гетерохроматин (КГХ) и факультативный гетерохроматин (ФГХ). КГХ присутствует в центромерных районах всех хромосом человека и представлен особенно крупными блоками в прицентромерных районах длинных плеч хромосом 1, 9 и 16. Классическим примером ФГХ является инактивированная Х-хромосома. Молекулярную основу КГХ хромосом человека составляет α-сателлитная ДНК, состоящая из мономерных фрагментов размером 171 п.о. (Ugarkovic D., 2005). При рестрикционном анализе фракций сателлитной ДНК выделено три типа сателлитов. Сателлит 1 состоит из повторяющихся фрагментов по 42 п.о., сателлит 2 - из диспергированных коротких повторов по 17 п.о., сателлит 3 - пентануклеотид АТТСС, чередующийся с последовательностью AT/CTGGGTTG. В КГХ хромосом 1 и 16 присутствует в основном сателлит 2. Сателлит 3 находится в КГХ хромосом 1 и 9, а также в длинном плече Y-хромосомы. При этом в области центромеры выделяют две части КГХ. В первой, прилежащей непосредственно к центромере (ЦГХ), ДНК качественно и количественно сохраняется постоянной, тогда как во второй, расположенной более дистально перицентромерной области (ПЦГХ), размеры блоков сателлитной ДНК, а также состав гистонов могут существенно варьировать (Sullivan B.A. et al., 2004).

В последние годы произошел существенный прогресс в понимании роли гистоновых модификаций, РНК-интерференции и эпигенетических механизмов регуляции генной активности (Grigoriev S.A. et al., 2006).

Важное открытие последних лет - доказательство функциональной активности ПЦГХ. До недавнего времени отсутствие экспрессии считали отличительной характеристикой КГХ. Более того, характерный для КГХ эффект положения мозаичного типа (подавление активности структурных генов, перенесенных в область ГХ) также свидетельствовал против возможной транскрипционной активности КГХ. Однако начиная с 2002 г. появляется все больше данных, указывающих на присутствие РНК и транскрипционную активность КГХ у дрожжей, дрозофилы, мышей, в опухолевых клетках человека, клетках стареющих клеточных культур и клеточных культурах, подвергавшихся тепловому шоку (Ugarkovic D., 2005; Enukashvili N.I. et al., 2007; Eymery А. et al., 2009). Отмечено, что такие транскрипты размерами от 2000 до 5000 п.о. образуются во всех клетках зародыша мыши (особенно активно в закладках нервной системы на двенадцатый с половиной день развития). В тканях взрослых особей транскрипты ПЦГХ отсутствуют. Исключение составляют только семенники и печень, где в митотически делящихся клетках зарегистрированы транскрипты ПЦГХ (Eymery А. et al., 2009). Функциональное назначение этих транскриптов неизвестно. Их накопление в перицентромерной области рассматривают как показатель эпигенетических модификаций генома. Транскрипционная активность ДНК в ПЦГХ - один из решающих аргументов в пользу гипотезы «Главной программы развития», рассматриваемой в заключительной части данной главы.

В исследованиях, выполненных на материале медицинских абортов 6-12-й недели развития с помощью антител к метилцитозину, установлено, что ПЦГХ хромосом 1, 9 и 16 гипометилирован и, возможно, активен в клетках хориона и плаценты. Однако он сильно метилирован в клетках внутренних органов эмбриона и не отличается от ПЦГХ взрослых лимфоцитов (рис. 4-18, см. цв. вклейку) (Пендина А.А. и др., 2005; Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007).

На присутствие РНК в ПГХР хромосом 1, 9 и 16 косвенно указывает и характерное для одноцепочечной РНК окрашивание ПЦГХ хромосом акридиновым оранжевым в красный цвет. Исчезновение окраски после обработки препаратов РНКазами А и Н, наблюдаемое только в клетках цитотрофобласта хориона, возможно, обусловлено конформационными особенностями ГХР в разных клетках (рис. 4-19, см. цв. вклейку).

Таким образом, данные молекулярно-генетических и цитогенетических исследований однозначно свидетельствуют в пользу функциональной активности ПЦГХ. У человека транскрипционная активность показана для ГХР хромосом 1, 9 и 16 в условиях клеточных культур, опухолевого роста, а также в эмбриональных клетках.

Суммируя современные представления о КГХ хромосом человека, следует прежде всего обратить внимание на важность ПЦГХ в генетическом контроле индивидуального развития. В пользу данного тезиса свидетельствуют следующие факты:

*в отличие от белок-кодирующих генов первичная структура ДНК в ПЦГХ видоспецифична.

Эти и некоторые другие факты, касающиеся функций ПЦГХ, позволили американскому профессору Дж. Паррису (Тufts University School of Medicine) сформулировать в 2009 г. гипотезу «Главной программы развития»_ (Master Developmental Program)_.

Гипотеза основана на предположении, что вся программа индивидуального развития закодирована в ДНК ПЦГХ. Основная функциональная единица ГПР - специфические генерационные ключи развития (СГКР), протяженные последовательности ДНК, представляющие собой комплекс ДНК ретровирусных элементов и фрагментов кДНК первичных транскриптов геномных генов. По мнению Дж. Парриса, ПЦГХ - это набор многочисленных СГКР, обеспечивающий не только программу онтогенеза, но и сохранение уникальной информации о филогенезе каждого вида. Этапы реализации генетической информации согласно ГПР показаны на рис. 4-20.

Рис. 4-20. Гипотеза «Главной программы развития» (Parris, 2010). Пояснения в тексте

Как следует из приведенной схемы, при каждом делении клеток в результате транскрипции СГКР возникает протяженный транскрипт ядерной РНК, который распадается на несколько так называемых ядерных мРНК-последовательностей (nuclear mRNA). Последние, присоединяясь к соответствующим участкам ДНК, активируют главные регуляторные гены эмбрионального развития - гомеобоксные гены (HOX, PAX, SOX, T-box и др.), а также гены сигнальных молекул (SHH, Noggin и др.), которые, как было отмечено, включают экспрессию многих других генов дифференцировки. Белковые продукты этих генов во время митоза поступают в ядро, репрессируют экспрессию предыдущего СГКР и включают экспрессию следующего СГКР. Каждый клеточный клон, каждый акт дифференцировки требуют экспрессии отдельного СГКР. При необходимости увеличения пула клеточного клона исходный СГКР остается активным в течение нескольких раундов репликации. Смена СГКР регулируется, скорее всего, меняющимися физиологическими условиями (уровень глюкозы, кислотность, укорочения теломерных районов и др.).

Многие из этапов действия СГКР хорошо изучены и доказаны экспериментально (рис. 4-21). В частности, не вызывает сомнения наличие в ядре большого количества различных некодирующих РНК, многие из которых, как недавно установлено, имеют происхождение из ПЦГХ (Pezer Z., Ugarcovic D., 2009). Более того, выявлены новые типы РНК, обладающие регуляторными свойствами, такие как tiRNA - РНК, индуцирующая транскрипцию (transcription induced RNA), и ядерные информационные РНК (nmRNA - non-coding RNA) (Chen L.L. et al., 2009). Первые связываются с межгенными ДНК-последовательностями - link-DNA (линкерная ДНК), экспрессия которой приводит к хроматизации и стабильному выключению сразу больших генных кластеров. В настоящее время в геноме человека известно около 3300 регуляторных ДНК-последовательностей типа link-DNA. Вторые (nmRNA) под действием нуклеазы Dicer расщепляются до коротких РНК (sRNA) и регулируют функции генома, связываясь с особыми ДНК-последовательностями, так называемыми рyknons (Rigoutsos I. et al., 2006). Репрессия отдельных генов либо генных кластеров достигается действием коротких РНК (sRNA) и направляемого ими репрессивного комплекса Polycomb. Значительную часть регуляторных ядерных РНК составляют также РНК ретровирусных последовательностей, многие из которых присутствуют в ПЦГХ.

Рис. 4-21. Регуляция кодирующих и некодирующих генных кластеров специфическими генерационными ключами развития (Parris, 2010). Пояснения в тексте

Все эти данные с учетом ранее рассмотренных фактов свидетельствуют в пользу гипотезы ГПР. Дополнительным доказательством могут служить данные клинической генетики, указывающие на то, что причиной ряда синдромов и наследственных болезней могут быть мутации, затрагивающие область ПЦГХ и области повторяющихся ДНК. В частности, по мнению автора гипотезы, к таким болезням можно отнести синдром Townes-Brocks (16q12.1), синдром ICF (1q12), синдром Ди Джорджи (22q11.2), синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11-15q13), синдром микроделеции (16р11.2-16р12.12.2) (Parris D., 2010). Сравнительно небольшое число таких болезней, возможно, объясняется большой надежностью эволюционно закрепленной работы ПЦГХ как главного регулятора программы индивидуального развития.

Еще одно важное достоинство предлагаемой гипотезы - конструктивность ее основных положений не только как гипотетической программы эмбриогенеза (онтогенеза), но и как программы, объясняющей многие сложные проблемы эволюции. Так, сальтационный тип видообразования, согласно гипотезе ГПР, является результатом смены СГКР, происходящей вследствие ретровирусных эпидемий и массового внедрения их ДНК-копий в ПЦГХ. Следовательно, в соответствии с ГПР объектом естественного отбора являются не только и не столько сами гены или отдельные регуляторные последовательности, сколько сама программа развития. Гипотеза логично объясняет и удивительный феномен рекапитуляции процессов морфогенеза - биогенетический закон Геккеля-Мюллера: «Онтогенез есть краткое и быстрое повторение филогенеза». Транскрипция эволюционно древних СГКР обеспечивает повторение (рекапитуляцию) основных этапов эмбриогенеза у животных разных видов и у человека.

Наконец, следует отметить, что важную роль гетерохроматиновых блоков сателлитной кДНК и гетерохроматина в эволюции отводили и многие другие исследователи, в том числе и такие известные отечественные ученые, как Л.И. Корочкин, В.Н. Стегний, М.Б. Евгеньев (Корочкин Л.И., 2002).

Однако только достижения молекулярной биологии последних 10 лет сделали возможным рождение гипотезы ГПР. Однако и в настоящее время, несмотря на всю научную привлекательность и конструктивность для объяснения процессов онтогенеза и филогенеза, гипотеза ГПР все еще остается гипотезой, а потому нуждается в более четких прямых доказательствах. Прежде всего основным доказательством могла бы стать идентификация реальных СГКР, состоящих из ретровирусных последовательностей и фрагментов кДНК первичных РНК-транскриптов структурных или регуляторных генов. Дальнейшие исследования природы СГКР, классификация и выяснение молекулярно-генетических механизмов их действия помогут существенно дополнить и конкретизировать эту интересную гипотезу.

В заключение отметим, что по изяществу замысла и масштабности изложения гипотеза Дж. Парриса весьма напоминает первоначальный вариант гипотезы А.М. Оловникова о теломерных концах хромосом и их значении в процессах старения клетки, что, как известно, завершилось присуждением Нобелевской премии, правда, не самому автору, а ученым, получившим теломеразу и изучившим ее свойства. Тем не менее обе гипотезы, адресованные противоположным концам хромосомы, на наш взгляд, удачно дополняют друг друга: программа развития начинается с центромерного района хромосомы и завершается на ее теломерном конце, который при каждом делении клетки укорачивается. Таким образом, каждая хромосома благодаря активной роли ПЦГХ приобретает определенную функциональную целостность.

Конечно, уже сейчас эта гипотеза порождает много вопросов. Как распределены функции ГПР между хромосомами? Какова роль хромосомных территорий в ее реализации? Какое место в ГПР отведено интеркалярному ГХ?

Генетический контроль процессов онтогенеза реализуется на уровне как индивидуальных генов, так и всего генома. Основные этапы реализации генетической информации на уровне генов хорошо изучены. Они включают процессы транскрипции и трансляции, генетический контроль которых возможен практически на любой стадии.

Геномная регуляция онтогенеза значительно сложнее. Помимо факторов транскрипции и генов сигнальных молекул (индукторов), она представлена повторяющимися последовательностями ДНК, включая вирусоподобные последовательности-ретротранспозоны, эпигенетическими изменениями на уровне ДНК (метилирование цитозиновых нуклеотидов), модификациями гистонов («гистоновый код») и регуляторными интерферирующими (малыми) РНК. Кратко рассмотрены особенности действия каждого из перечисленных факторов геномной регуляции генной экспрессии. Подчеркивается, что механизм РНКинтерференции в настоящее время рассматривают как главный регулятор экспрессии генов, определяющий ответ клетки на внешние воздействия. Проведенный анализ позволяет заключить, что экспрессия гена на уровне целого генома представляет собой сложный, многоэтапный и многоуровневый процесс, конечный результат которого зависит не только от эффективности транскрипции и трансляции, но и от модифицирующих воздействий на уровне всего генома, обусловленных активностью ретровирусных последовательностей, наличием эпигенетических изменений ДНК и гистонов, а также от действия главного регулятора генной экспрессии - интерферирующих микро-РНК. Существенно, что во многих точках онтогенеза эти надмолекулярные пути регуляции пересекаются или оказываются комплементарными, создавая глобальную общегеномную сеть регуляции генной активности.

Айламазян Э.К., Баранов В.С. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней. - М.: МЕДпресс-информ, 2006. - 415 с.

Баранов В.С. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины. - СПб., 2009. - 527 с.

Баранов В.С. Хромосомный импринтинг и хромосомные взаимодействия в раннем развитии млекопитающих // Успехи совр. биол. - 1988 - Т. 105, № 3. - С. 393-405.

Баранов В.С. Хромосомный импринтинг и наследственные болезни // Биополимеры и клетка. - 1991. - Т. 7, № 2. - С. 73-79.

Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. - СПб., 2007. - 639 с.

Баранов В.С., Пендина А.А., Кузнецова Т.В. и др. Некоторые особенности статуса метилирования метафазных хромосом у зародышей человека доимплантацинных стадий развития // Цитология. - 2005. - Т. 47, № 8. - С. 723-730.

Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Гетерохроматиновые районы хромосом человека: клинико-биологические аспекты. - М.: Медпрактика, 2008. - 299 с.

Голубовский М.Д. Генетика - эволюция идей и понятий. - СПб.: Борей-Арт, 2000. - 262 с.

Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. - Л.: Наука, 1988. - 228 с.

Дыбан А.П., Баранов В.С. Цитогенетика эмбрионального развития человека. - М.: Наука, 1978. - 216 с.

Инге-Вечтомов С.Г. Общая генетика. - СПб., 2007. - 123 с.

Кнорре А.Г. Краткий очерк эмбриологии человека. - Л.: Медицина, 1967. - 268 с.

Корочкин Л.И. Взаимодействие генов в развитии. - М.: Наука, 1977. - 280 с.

Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития. - М.: Изд-во МГУ, 2002. - 264 с.

Лебедев И.Н., Назаренко С.А. Особенности фенотипической экспрессии аутосомных моносомий при патологии постимплантационного развития человека // Онтогенез. - 2004. - Т. 35, № 1. - С. 53-60.

Лебедев И.Н., Саженова Е.А. Эпимутации импринтированных генов в геноме человека: классификация, причины возникновения, связь с наследственной патологией // Генетика. - 2008. - Т. 44. - С. 1356-1373.

Немцова М.В., Залетаев Д.В. Эпигенетические нарушения экспрессии генов и наследственная патология у человека // Введение в молекулярную медицину. - М.: Медицина, 2004. - С. 94-146.

Оловников А.М. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов // Докл. АН СССР. - 1971. - Т. 34. - С. 1171-1184.

Паткин Е.Л. Эпигенетические механизмы распространенных заболеваний человека. - СПб.: Нестор-История, 2008. - 197 с.

Пендина А.А., Ефимова О.А., Каминская А.Н. и др. Иммуноцитохимический анализ статуса метилирования метафазных хромосом человека // Цитология. - 2005. - Т. 47, № 8. - С. 731-737.

Притчард Д.Д., Корф Б.Р. Наглядная медицинская генетика. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 196 с.

Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. - М.: Наука, 1986. - 431 с.

Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих. - Новосибирск: НГУ, 2006. - 147 с.

Свердлов Е.Д. Взгляд на жизнь через окно генома. - М.: Наука, 2009. - 515 с.

Babaie Y., Herwig R., Greber B et al. Ananlysis of Oct-4-dependent transcriptional networks regulating sel-renewal and pluripotency in human embryonic stem cells // Stem. Cells. - 2007. - Vol. 25. - P. 500-510.

Barber J.C.K. Chromosome copy number variation // ECA Newsletter. - 2008. - N 22. - P. 6-14.

Bhattacharya B., Puri S., Puri R.K. A review of gene expressing profiling of human embryonic stem cell lines and their differentiation progeny // Curr. Stem. Cell Res.Ther. - 2009. - Vol. 4. - P. 98-106.

Borque D.K., Avila L., Penaherrera M.S. et al. Decreased placental methylation in the H19/ IGF2 imprinting control regionis assotiated with normatensive intrauterine growth retardation but not preeclampsia // Placenta. - 2010. - Vol. 31. - P. 197-202.

Carlson B.M. Human embryology and developmental biology. 2nd ed. - USA: Mosby, 2004. - 528 р.

Chen L.L., Garmichael G.G. Altered nuclear retention of mRNA containing inverted repeats in human embryonic stem cells: functional role of nuclear noncoding RNA // Mol. Cell. - 2009. - Vol. 35. - P. 467-478.

Di-Poi N., Koch U., Radtke Fr. еt al. Additive and globak functions of HoxA cluster genes in mesoderm derivatives // Dev. Biol. - 2010. - Vol. 341. - P. 488-498.

Djuric U., Ellis J. Epigenetics of induced pluripotency, the seven-headed dragon // Stem Cell Res. Ther. - 2010. - Vol. 1. - Р. 3-10.

Due-Gorian P., Mignot T.M., Bourgeois C. Еmbrio and maternal interaction site: a delicate equilibrium // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 1999. - Vol. 83. - P. 65-100.

Dyban A.P., Baranov V.S. Cytogenetics of Mammalian Embryonic Development. - Oxford: Clarendon Press, 1987. - 362 p.

Edwards R.G., Beard H.B. Oocyte polarity and cell determination in early mammalian embryos // Mol. Hum. Reprod. - 1997. - Vol. 3, N 10. - P. 863-905.

Enukashvilly N.I., Donev R., Weisertreiger I.S-R., Podgornaya O.I. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is decondenced, demethylated and transcribed in senescent cells and in A341 epithelial carcinoma cells // Cytogenet. Genome Res. - 2007. - Vol. 118. - P. 42-54.

Eymery A., Callanan M., Vourch C. The secret message of heterochromatin: new insights into the mechanisms and function of centromeric and pericentric repeat sequence transcription // Int. J. Develop. Biol. - 2009. - Vol. 53. - P. 259-268.

Ferretti P., Copp A., Tickle Ch., Moore G. Embryos, Genes and Birth Defects. 2nd ed. - London: J. Wiley and Sons, 2006. - 550 p.

Grigoriev S.A., Bulynko Y.A., Popova E.Y. The ends adjust the means: heteochromatin remodeling during terminal cell differentiation // Chrom. Res. - 2006. - Vol. 14. - P. 53-69.

Hemberger M. Genetic-epigenetic intersection in trophoblast differentiation. Implications for extraembryonic tissue function // Epigenetics - 2009. - Vol. 5. - P. 24-28.

Henderson D., Hutson M.R., Kirby M.L. The heart // Embryos, Genes and Birth Defects. 2nd ed. - London: J. Wiley and Sons, 2006 - P. 341-372.

Khal A.M., Guttman M., Huarte M. et al. Many human intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression // Рroc. Natl Acad. Sci. USA. - 2009. - Vol. 106. - P. 11667-11672.

Lafond J., Vaillancourt C. Human Embryology. Methods and Protocols. - Heidelberg: Humana Press, 2009. - 312 p.

Lupsky J.R. Genomic disorders ten years on // Genome Med. - 2009. - Vol. 1. - P. 1-42.

Mundlos St. Gene action: developmental genetics // Vogel and Motulsky?s Human Genetics Problems and Approaches. 4th ed. - Heidelberg; Dordrecht; London; New York: Springer, 2010. - P. 417-450.

Ostrer H., Wilson D.I., Hanley N.A. Human embryo and early fetus research // Clin. Genet. - 2006. - Vol. 70. - P. 96-107.

Parris G.E. Developmental diseases and hypothetical Master Development Program // Med. Hypothesis. - 2009. - Vol. 74. - P. 564-575.

Parris G.E. A hypothetical master development program for multi-cellular organisms: ontogeny and phylogeny // Biosci. Hypothesis. - 2009. - Vol. 2. - P. 3-12.

Peaston A., Rossant J., Li L., Knowles B.B. Retrotransposons regulate host genes in mouse oocytes and preimplantation embryos // Dev. Cell. - 2004. - Vol. 7. - P. 597-606.

Pezer Z., Ugarcovic D. Transcription of pericentromeric chromatin in beetles-satellite DNA as active regulatory elements // Cytogenet. Genome Res. - 2009. - Vol. 124. - P. 768-676.

Rawn S.M., Cross J.C. The evolution, regulation and function of placenta-specific genes // Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. - 2008. - Vol. 24. - Р. 159-181.

Rigoutsos I., Huynth T., Miranda K. et al. Short blocks from the noncoding parts of the human genome have instances within nearly all known genes and relate to biologica; processes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. - P. 6605-6610.

Romano C.M., deMelo F.M., Corsini M.A. et al. Demographic histories of ERV-K in humans, shimpanzees and rhesus monkes // PLoS One. - 2007. - Vol. 2. - Р. 1026.

Sood R., Zehender J., Druzin M.L., Brown P.O. Gene expression pattern in human placenta // PNAS (USA). - 2006. - Vol. 103. - P. 5478-5483.

Sowden J.C. Birth defects affecting the eye // Embryos, Genes and Birth Defects. 2nd ed. - London: J. Wiley and Sons, 2006. - P. 199-230.

Spiden S.L., Steel K.P. The ear // Embryos, Genes and Birth Defects. 2nd ed. - London: J. Wiley and Sons, 2006. - P. 231-262.

Staerk J., Dowlaty M.M., Gao O. еt al. Programming of human peripheral blood cells in induced pluripotent stem cells // Cell. Stem Cell. - 2010. - Vol. 7. - P. 20-24.

Stevenson R.E., Hall J.G. Human Malformations and Related Anomalies. 2nd ed. - London: Oxford University Press, 2006. - 1488 p.

Sullivan B.A., Karpen G.H. Centromeric chromatin exhibits a histone modification pattern that is distinct from both euchromatin and heterochromatin // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2004. - Vol. 11. - P. 1076-1083.

Tomilin N.V. Regulation of mammalian gene expression by retroelements and non-coding tandem repeats // BioEssays. - 2008. - Vol. 30. - P. 338-348.

Tucker T. et al. Massive parallel sequencing. The Next big thing in genetic medicine // Am. J. Hum. Genet. - 2009. - Vol. 85. - P. 142-154.

Tyсko B. Imprinted genes in placental growth and obstetric disorders // Cytogenet. Genome Res. - 2006. - Vol. 113. - P. 271-278.

Ugarcovic D. Functional elements residing within satellite DNAs // EMBO Rep. - 2005. - Vol. 6. - P. 1035-1039.

Van Dijk M., Mulders J., Poutsma A. et al. Maternal segregation of the Dutch preeclampsia locus at 10q22 with a new member of the wingled helix gene family // Nat. Genet. - 2005. - Vol. 49. - P. 514-519.

Vasudevan S., Li L.C., Turunen M.P. et al. Switching from repression to activation: microRNAs can upregulate translation // Science. - 2007. - Vol. 318. - P. 1931-1934.

Verlinsky Y.S., Kuliv A.M. Preimplantation genetic diagnosis. - New York; London: The Parthenon Publishing Group, 2000. - 174 p.

Wigle J.T., Eisenstat D.D. Homeobox genes in vertebrate forebrain development and diseases // Clin. Genet. - 2008. - Vol. 73. - P. 212-223.

Winyard P.G.D. The kidney // Embryos, Genes and Birth Defects. 2nd ed. - London: J. Wiley and Sons, 2006. - P. 463-514.

Wolf D.P., Zelinski-Wooten M. Assistant fertilization and nuclear transfer in mammals. - Totowa, New Jersey: Human Press, 2001. - 287 p.

Yamanaka S. Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation // Nature. - 2009. - Vol. 460. - P. 49-52.

Yuen R.K.C., Penaherrara M.S., Daelszen P. et al. DNA methylation profiling of human placentas reveals promoter hypomethylation of multiple genes in early onset preeclampsia // Eur. J. Hum. Genet. - 2010. - Vol. 107. - P. 1-7.

Zhao Y., Westphal H. Homeobox genes and human development // Curr. Mol. Med. - 2002. - Vol. 2. - P. 13-23.

Основными понятиями при рассмотрении менделевского наследования признаков и болезней у человека являются «фенотип» и «генотип». Под термином фенотип принято понимать сумму всех внешних характеристик человека. Следует отметить, что когда говорится о внешних характеристиках, то следует подразумевать не только такие внешние признаки, как рост, цвет глаз или число пальцев на руках и ногах, но и различные физиологические, биохимические и даже молекулярные характеристики, которые могут измениться в результате действия генов. Фенотипические признаки, с которыми сталкивается медицинская генетика, - это наследственные болезни и их симптомы.

Под термином генотип понимают сумму всех генов организма. Однако нередко понятие «генотип» используют для описания состояния отдельного или нескольких генов. Генотип в значительной мере определяет фенотип, а гены - отдельные фенотипические признаки.

Фенотип в отличие от генотипа может меняться в течение жизни, генотип при этом остается постоянным, свидетельство этому наш собственный онтогенез. В течение жизни внешне человек меняется, старея, а генотип - нет. За одним и тем же фенотипом могут стоять разные генотипы и, напротив, при одном и том же генотипе фенотипы могут различаться. Последнее утверждение подкреплено изучением монозиготных близнецов. Их генотипы идентичны, а фенотипически они могут различаться по массе тела, росту, поведению и т.д. Из этого следует, что не существует в абсолютном большинстве случаев однозначной связи между генами и фенотипическими признаками, и проявление генов может изменяться как под действием факторов окружающей среды, так и в результате взаимодействия с другими генами. Очевидно, что между симптомами наследственного заболевания, такими как: отсутствие ушной раковины, судороги, умственная отсталость, кисты в почках и многими другими, и изменением одного белка в результате мутации в каком-то конкретном гене - дистанция огромного размера. Мутантный белок - продукт мутантного гена - должен каким-то образом взаимодействовать с сотнями, если не с тысячами других белков, кодируемых другими генами, чтобы в результате изменился какой-то нормальный признак или появился патологический. Кроме того, продукты генов, принимающих участие в становлении любого фенотипического признака, могут взаимодействовать и модифицироваться факторами окружающей среды. Вместе с тем, когда речь идет о моногенно наследуемых признаках (например, наследственных болезнях), то действие мутантного гена в этом случае не затушевывается многочисленными взаимодействиями его продукта с продуктами других генов или с факторами окружающей среды, и наличие мутантного гена(-ов) определяет изменение фенотипа. Это происходит как в сложном механизме, когда дефекта одной детали достаточно, чтобы при тысячах других нормальных деталях механизм не работал.

Моногенное наследование признаков у человека называют еще менделевским, так как правила, согласно которым оно происходит, установил Грегор Мендель еще в 1865 г. Ниже приведены правила, установленные Менделем в ходе выполненных им опытов.

Первое правило называется правилом доминирования, и его суть сводится к тому, что из двух копий каждого гена, называемых аллелями и содержащихся в каждой клетке организма, одна может подавлять или, правильнее, маскировать проявление второй копии (аллеля). В тех случаях, когда аллели гена одинаковы, особь с таким генотипом называют гомозиготной, а когда они разные - гетерозиготной. Доминантный аллель, следовательно, определяет характер признака, даже находясь в гетерозиготном состоянии, а рецессивный аллель определяет характер признака только тогда, когда он находится в гомозиготном состоянии. Соответственно все менделирующие признаки, включая наследственные болезни, делятся на доминантные и рецессивные. Если у гетерозиготной особи проявляются оба аллеля, т.е. нет доминирования одного аллеля над другим, то такие аллели называют кодоминантными. Хорошо известным примером кодоминирования являются аллели А и В группы крови АВ0. У людей с IV группой крови проявляются как А-, так и В-антигены.

Мендель также предположил (теперь это доказано), что в половые клетки родителей случайным образом попадает один из аллелей каждого гена, так что одна половина гамет несет один аллель, а вторая - другой. Это утверждение называется вторым правилом Менделя, или правилом расщепления. Если оба родителя являются гетерозиготами по какому-то гену, то в потомстве таких родителей будет наблюдаться расщепление, так что ³/₄ потомков будут иметь доминантный признак и только ¹/₄ рецессивный, что обусловлено случайным объединением гамет родителей, несущих разные аллели гена (следует отметить, что расщепление по генотипу будет иным, а именно 1:2:1). Соответственно, когда только один родитель гетерозиготен, а второй гомозиготен по рецессивному гену, то расщепление по наличию доминантного и рецессивного признаков будет 1:1. Если один родитель будет гомозиготен, а второй - гетерозиготен по доминантному гену, то фенотипически все потомство будет иметь только доминантный признак. Для понимания того, как действует правило расщепления, лучше всего воспользоваться решеткой Пеннета, которую этот английский генетик предложил для графического представления результатов различных скрещиваний (табл. 5-1, 5-2, 5-3).

Таблица 5-1. Решетка Пеннета, иллюстрирующая результаты расщепления в потомстве от брака двух гетерозиготных родителей

Таблица 5-2. Решетка Пеннета, иллюстрирующая результаты расщепления в потомстве от брака родителей, один из которых гетерозиготен, а второй гомозиготен по рецессивному гену

Таблица 5-3. Решетка Пеннета, иллюстрирующая результаты расщепления в потомстве от брака родителей, один из которых гетерозиготен, а второй гомозиготен по доминантному гену

Менделю было ясно, что наблюдаемые расщепления в потомстве от скрещиваний родителей с разными генотипами являются событиями вероятностными, и их можно выявить только на большом числе потомков. Из теории вероятностей следуют два правила - правило умножения и правило сложения вероятностей.

Правило умножения гласит, что если какие-то события наблюдаются независимо друг от друга, то вероятность того, что два события будут наблюдаться одновременно, равна произведению вероятностей этих событий. Вероятность образования гамет с рецессивным геном у родителей, гетерозиготных по этому гену, составляет ¹ /₂ для каждого родителя. Вероятность встречи таких гамет с рецессивным геном при образовании зигот будет равна произведению вероятностей образования таких гамет у каждого из родителей, т.е. ¹/₂ ×¹/₂ =¹/₄.

Правило сложения гласит: если необходимо узнать вероятность реализации либо одного, либо другого события, то вероятности каждого из этих событий складываются. Так, если необходимо вычислить вероятность гомозиготного потомства в браке гетерозиготных родителей, то нужно сложить вероятности рецессивных и доминантных гомозигот, т.е. ¹/₄ +¹/₄ =¹/₂.

Этими правилами приходится довольно часто пользоваться врачам-генетикам во время медико-генетического консультирования при расчете вероятностей тех или иных событий в семьях, имеющих ребенка с наследственным заболеванием.

Третье правило Менделя, или правило независимого комбинирования, которое формулируется так: гены, определяющие различные признаки, наследуются независимо друг от друга. Это правило относится не к наследованию альтернативных состояний одного признака, а к двум и большему числу признаков. Знание этого правила будет иметь значение при рассмотрении картирования генов с помощью анализа сцепления.

Ниже приведено расщепление в потомстве от брака родителей, гетерозиготных по двум генам одновременно (АаВв), причем каждый из этих генов влияет на разные признаки. Проще всего это сделать, использовав решетку Пеннета (табл. 5-4).

Таблица 5-4. Решетка Пеннета, иллюстрирующая результаты расщепления в потомстве от брака родителей, гетерозиготных по двум генам

Как следует из табл. 5-4, в потомстве от брака двойных гетерозигот наблюдается 4 фенотипа:

Соотношение между этими фенотипами в том порядке, как они записаны выше, составляет 9:3:3:1. Эти соотношения легко получить, перемножая вероятности соответствующих фенотипов при моногибридном расщеплении. Так, вероятность доминантного фенотипа для каждого признака в моногибридном скрещивании составляет ³/₄. При их независимости друг от друга вероятность их совместного проявления будет равна ³/₄ ׳/₄ =⁹/₁₆. Следует подчеркнуть, что соотношение генотипов при дигибридном скрещивании иное, чем соотношение фенотипов: 1ААВВ:2АаВВ:2ААВв:4АаВв:1ААвв:2Аавв:1ааВВ:2ааВв:1аавв.

У человека, по понятным причинам, невозможны контролируемые скрещивания. Кроме того, число детей в семье, как правило, бывает небольшим. Для того чтобы доказать аутосомно-доминантный или аутосомно-рецессивный характер наследования заболевания, необходимо собрать достаточно большое число семей с большим числом детей в них. Если учесть, что абсолютное большинство наследственных заболеваний встречается редко, то становится ясно, что чаще всего медицинскому генетику приходится пользоваться упрощенными требованиями к доказательствам определенного типа наследования. Эти упрощенные требования следуют из менделевских правил наследования. Правомерно будет сказать, что заключение при таком типе анализа сводится к тому, что в исследуемой родословной сегрегация того или иного заболевания не противоречит определенному менделевскому типу наследования.

Обычно в поле зрения медицинского генетика попадает семья, в которой есть больной или больные с предположительно наследственным заболеванием. Для такой семьи обычно собирается родословная, т.е. устанавливаются предки родителей и их родственники и описывается статус их здоровья, а также другие сведения. Принято представлять родословную графически, используя для этого определенные символы, изображенные на рис. 5-1.

Рис. 5-1. Некоторые символы, принятые при составлении родословных

Именно такая родословная становится предметом анализа медицинского генетика.

В 1966 г. появилось первое издание книги В. МакКьюсика «Менделевское наследование у человека. Каталог аутосомно-доминантных, аутосомно-рецессивных и Х-сцепленных фенотипов», в котором были собраны сведения о различных, нормальных и патологических, состояниях у человека, которые обнаруживают менделевское наследование. В абсолютном большинстве случаев установление типа наследования заболеваний, представленных в этом каталоге, основывалось на указанных выше принципах. В связи с нестрогостью этих принципов некоторые заболевания переходили из одного каталога в другой по мере накопления материала и появления новых изданий. В настоящее время в этой книге, которая перестала переиздаваться с 1994 г. и существует в постоянно пополняющейся версии в Интернете (адрес сайта: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/), представлены описание и библиография более 20 тыс. фенотипов, из них с установленным типом наследования считается около 5 тыс. Основную часть описанных фенотипов составляют те, что наследуются аутосомно-доминантно и аутосомно-рецессивно, их более 4,5 тыс. Стоит добавить, что заболевания с этими типами наследования составляют в соответствующих каталогах примерно половину списков. За 44 года, прошедших с момента первого издания книги МакКьюсика, число описаний менделирующих фенотипов у человека выросло более чем в 10 раз.

В настоящее время известно несколько тысяч аутосомно-доминантно наследующихся фенотипов. Мы остановимся на некоторых общих принципах их выявления с помощью генетического подхода.

На рис. 5-2 представлена родословная, в которой наследуется синдром Марфана - аутосомно-доминантное заболевание, ген которого FBN1 (ген фибриллина) картирован в хромосоме 15. Синдром Марфана проявляется системным поражением соединительной ткани, так как дефектный белок входит в состав межклеточного вещества соединительной ткани. Больные с синдромом Марфана обычно высокого роста, с длинными конечностями и арахнодактилией пальцев. Кроме того, у больных наблюдаются кифосколиоз, миопия высокой степени или подвывих хрусталика, расширение корня аорты.

В родословной три поколения. В первом поколении был болен отец (I₁), но к моменту исследования семьи он умер. Среди семи его детей двое больных (дочь - II₂ и сын - II₅) и пятеро здоровых. II₂ состоит в браке со здоровым мужчиной, у них семеро детей, из которых больны четверо (III₂, III₄, III₅, III₆) - три девочки и один мальчик, а трое здоровы. Здоровый сын первого больного (II₇) состоит в браке со здоровой женщиной (II₈). У них восемь детей, все они здоровы.

Приведенная выше родословная демонстрирует требования, предъявляемые к родословным с аутосомно-доминантным наследованием. Во-первых, один из родителей больных детей также должен быть болен. Во-вторых, болезнь должна встречаться у людей обоего пола. В-третьих, согласно менделевским правилам наследования, половина детей больного родителя должна быть больна, и риск, который составляет 50%, остается постоянным для каждого последующего ребенка. Однако данное требование не жесткое, поскольку при небольшом числе детей в семье могут случайным образом наблюдаться заметные отклонения от ожидаемого отношения больных детей к здоровым. В-четвертых, должна наблюдаться передача заболевания от отца к сыну, что исключает сцепленное с полом наследование. В-пятых, у здоровых потомков больного все дети должны быть здоровы.

В действительности даже в тех случаях, когда сталкиваются с аутосомнодоминантным заболеванием в семье, далеко не всегда удается наблюдать родословную, подобную той, что приведена на рис. 5-2. Для этого есть несколько причин.

Рис. 5-2. Родословная, в которой аутосомно-доминантно наследуется синдром Марфана

Одна из основных - это вновь возникающие мутации в отдельных половых клетках одного из родителей (при выполнении программы «Геном человека» установлено, что в абсолютном большинстве случаев новые мутации возникают в гаметогенезе у мужчин). При таком наследовании больной с аутосомно-доминантной патологией будет единственным случаем заболевания в семье. Очевидно, что для такого больного шанс передать мутацию своим детям будет обычным для аутосомно-доминантного типа наследования, т.е. равен 50%.

Вторая причина отклонения от правил аутосомно-доминантного наследования - мозаицизм зародышевых клеток (мозаицизм означает присутствие двух или более генетически различных линий клеток в одном организме). Такой мозаицизм возникает на ранних стадиях развития организма в результате появления мутации в одной из клеток зародышевого пути в момент его обособления. Поскольку клетки зародышевого пути клонируются, мутация может оказаться в большей или меньшей части зрелых половых клеток, и как результат возможно появление в семье здоровых родителей детей с аутосомно-доминантными заболеваниями. Именно поэтому соматическим мозаицизмом объясняются повторные случаи ахондроплазии, несовершенного остеогенеза и других аутосомно-доминантных заболеваний у детей, родители которых клинически совершенно здоровы.

По данным «Каталога наследственных признаков человека» (OMIM), известно несколько тысяч фенотипов с аутосомно-рецессивным типом наследования. Примерно 50% этих фенотипов представлено болезнями, наследующимися аутосомно-рецессивно. Как и аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные заболевания поражают все органы и системы человека и, следовательно, чрезвычайно разнообразны по своим проявлениям.

В силу редкости аутосомно-рецессивных заболеваний, а также тяжести течения многих из них в абсолютном большинстве случаев родители больных детей являются гетерозиготными носителями и клинически здоровы. То, как сегрегирует аутосомно-рецессивный признак, можно увидеть в табл. 4-1. ¹/₄ детей в браке гетерозиготных родителей должны быть гомозиготами по нормальному доминантному аллелю, ¹/₂ - гетерозиготами и ¹/₄ - гомозиготами по мутантному аллелю. Риск появления больного с аутосомно-рецессивным заболеванием в семье, где родители являются гетерозиготными носителями мутантного гена, составляет 25% и не меняется для любой беременности этой супружеской пары. Родословные больных с аутосомно-рецессивным заболеванием обычно невыразительны: родители и все ближайшие родственники больного здоровы, могут быть больны братья и сестры (оба пола поражаются одинаково часто). Если больной с рецессивным заболеванием вступает в брак, то его партнер в большинстве случаев является нормальной гомозиготой, и поэтому все дети в таком браке здоровы, но являются гетерозиготными носителями. Нередко в родословных с аутосомно-рецессивными заболеваниями родители больных оказываются близкими родственниками (рис. 5-3).

Рис. 5-3. Аутосомно-рецессивное наследование

На рис. 5-3 представлена родословная, в которой наследуется редкое аутосомнорецессивное заболевание - синдром Коккейна (OMIM 216400). Характерными признаками синдрома Коккейна являются карликовость, раннее старение, пигментная дегенерация сетчатки, атрофия зрительных нервов, тугоухость, умственная отсталость, повышенная чувствительность к свету и др. Ген синдрома картирован на хромосоме 5. Его белок участвует в репарации тиминовых димеров ДНК, возникающих после воздействия ультрафиолета.

Родители больных детей, как III₁ и III₂, так и III₃ и III₄, являются двоюродными сибсами. Кроме того, обе семьи с больными детьми родственны друг другу, так как II₁, II₄, II₅ и II₈ являются сибсами. Объяснение большей частоты близкородственных браков в семьях, где есть больные с аутосомно-рецессивным заболеванием, очень простое. Чем реже рецессивный ген встречается в популяции, тем меньше шансов, что оба родителя будут гетерозиготами по этому гену, так как вероятность такой супружеской пары равна произведению вероятностей возможности быть гетерозиготным носителем для каждого партнера. Так, при частоте гетерозиготного носительства гена фенилкетонурии, равной примерно 0,02, - вероятность брака гетерозиготных носителей составит 0,0004. Иными словами, одна из 2500 супружеских пар представлена гетерозиготными носителями (так как риск рождения больного ребенка для такой пары составляет ¹/₄, частота фенилкетонурии в популяции как раз и составляет 1:10 000). В том случае, когда один из супругов является гетерозиготным носителем гена фенилкетонурии (вероятность 0,02), а второй супруг является ему родственником, вероятность для второго супруга быть гетерозиготным носителем того же гена зависит от степени родства супругов. Для двоюродных сибсов она составляет, например, 25%, что в 12,5 раза выше, чем если бы супруги не были родственниками. Из приведенных расчетов также следует, что чем реже встречается рецессивный ген в популяции, тем большую долю среди семей с больными детьми будут составлять семьи, родители в которых являются близкими родственниками.

Итак, для аутосомно-рецессивного наследуемого признака характерно: носитель аутосомно-рецессивного признака является гомозиготой по мутантному аллелю соответствующего гена (если мутантные аллели у такого носителя являются разными, то его называют компаундной гетерозиготой), родители индивидуума с аутосомно-рецессивно наследуемым признаком (заболеванием) этого признака не имеют, но являются носителями мутантного гена. Признак могут проявить только братья и сестры (сибсы) этого индивидуума. Доля сибсов с рецессивным признаком в такой семье составляет 25%. Рецессивно наследуемый признак проявляется одинаково у сибсов разного пола. Для редких аутосомно-рецессивных заболеваний характерно, что родители больных детей значительно чаще, чем если бы это происходило случайно, являются близкими родственниками.

Гены, локализованные в Х-хромосоме, как и признаки, которые они контролируют, называются Х-сцепленными. Число известных Х-сцепленных заболеваний меньше, чем аутосомных, гены которых разбросаны по 22 аутосомам. Тем не менее известно около 300 генов, локализованных в Х-хромосоме, мутации в которых вызывают наследственные болезни. Всего же в Х-хромосоме выявлено более 600 генов, и, вероятно, это число не окончательное.

Прежде чем перейти к изложению наследования, сцепленного с Х-хромосомой, и особенностям родословных при этих типах наследования, следует напомнить, что у человека пол гетерогаметен. Женщины имеют во всех клетках две Х-хромосомы, а мужчины - одну Х- и одну Y-хромосому. Y-хромосома не гомологична Х-хромосоме, в ней содержится небольшое число генов. Мужчины являются гемизиготами по Х-хромосоме и большинству содержащихся в ней генов. Наследование половых хромосом происходит так же, как и простых менделевских признаков, схема которого представлена в виде решетки Пеннета (табл. 5-5).

Таблица 5-5. Схема наследования пола

Из табл. 5-5 видно, что при случайном объединении гамет должно образоваться равное количество зигот женского и мужского пола.

Поведение генов, которые расположены в половых хромосомах, строго соответствует поведению самих хромосом. Если мутантный ген находится в одной из Х-хромосом матери (например, в хромосоме Х₁), то эту Х-хромосому получат половина сыновей и половина дочерей матери-носительницы. Если ген отвечает за рецессивное заболевание, то сама мать должна быть здорова, так как у нее есть вторая нормальная Х-хромосома, но оно разовьется у той половины сыновей, которые получили хромосому Х₁ с мутантным геном, поскольку Y-хромосома не гомологична Х-хромосоме, и в ней просто не содержится пар абсолютному большинству генов Х-хромосомы. У дочерей, получивших от матери измененную хромосому, заболевание также не разовьется, так как они получат нормальную вторую Х-хромосому от отца. Таким образом, если мать является носительницей сцепленного с Х-хромосомой рецессивного гена, риск быть больным у ее сыновей составит ¹/₂, или 50%, а у ее дочерей - 0%. В то же время риск быть гетерозиготными носительницами у дочерей равен 50%.

Для рецессивных Х-сцепленных заболеваний характерно, что наследуют их мужчины - родственники друг другу по материнской линии. Это могут быть двоюродные братья, матери которых родные сестры, или дяди и племянники больного по материнской линии и т.д. (рис. 5-4).

Рис. 5-4. Х-сцепленное рецессивное наследование

В том случае, если отец болен, то все его сыновья будут здоровы, а все дочери - облигатными гетерозиготными носительницами Х-сцепленного гена. Такая ситуация бывает Рис. 5-4. Х-сцепленное рецессивное наследование тогда, когда Х-сцепленное рецессивное заболевание не очень резко снижает приспособленность больного. Примером подобного заболевания является Х-сцепленный рецессивный ихтиоз, или цветовая слепота к красному цвету, наследующаяся Х-сцепленно.

Любые Х-сцепленные рецессивные заболевания значительно чаще поражают мужчин, женщины болеют крайне редко, так как чтобы заболела женщина, должен болеть ее отец, а мать должна быть гетерозиготой по мутантному гену.

Для Х-сцепленных рецессивных, как и для аутосомно-доминантных заболеваний, свойственно возникновение части случаев в результате вновь возникших мутаций. Однако в отличие от аутосомно-доминантных заболеваний, когда при летальности этого заболевания на ранних этапах онтогенеза все его случаи объясняются вновь возникшими мутациями, при Х-сцепленных рецессивных заболеваниях такого не бывает, так как у женщин - гетерозиготных носительниц летального Х-сцепленного рецессивного гена - этот ген не проявляется, поскольку имеется его нормальная копия во второй Х-хромосоме. Еще в 1935 г. Холдейн показал, что при летальности Х-сцепленного рецессивного заболевания ¹/₃ больных появляется в результате вновь возникших мутаций, при условии одинаковой частоты мутирования в женских и мужских половых клетках. В настоящее время показано, что большая часть точковых мутаций в Х-хромосоме возникает во время сперматогенеза. В этом случае доля вновь возникших мутаций, обусловливающих Х-сцепленное рецессивное летальное заболевание (например, миопатию Дюшенна), будет меньше. Данная проблема чрезвычайно важна для медико-генетического консультирования, когда необходимо решить, является ли мать больного ребенка с Х-сцепленным рецессивным летальным заболеванием гетерозиготной носительницей мутантного гена или это случай вновь возникшей мутации. В первом варианте риск заболевания у ее следующего сына будет равен 50, а во втором - 0%.

Х-сцепленные рецессивные признаки обусловлены мутациями в Х-хромосоме. Такие мутации проявляются обычно только у мужчин, но не у женщин (за редкими исключениями). У ¹/₂ сыновей женщины, носительницы такой мутации, проявится рецессивный признак (заболевание), а ¹/₂ ее дочерей будут облигатными носительницами соответствующей мутации. Все дочери пораженного мужчины будут являться облигатными носительницами мутации.

Х-сцепленных доминантных признаков (в том числе и заболеваний) немного. Примером такого заболевания является D-резистентный гипофосфатемический рахит, при котором нарушена резорбция фосфатов в почечных канальцах и, как следствие, нарушена оссификация длинных трубчатых костей, в результате происходит их искривление, что особенно характерно для нижних конечностей. Еще одно Х-сцепленное доминантное заболевание - недержание пигмента (incontinentia pigmenti), проявляющееся нарушением пигментации кожи, а также глазными и неврологическими нарушениями и аномалиями зубов. Особенностью этого заболевания является то, что все гемизиготные мужчины, носители мутантного гена, поражаются настолько сильно, что погибают внутриутробно. В результате только женщины, имеющие это заболевание, попадают в поле зрения врачей, и возникает необходимость отличать Х-сцепленное доминантное наследование от аутосомно-доминантного наследования заболевания, ограниченного полом, такого, например, как рак молочной железы, обусловленный мутацией в гене BRCA1.

Если мутантный ген отвечает за Х-сцепленное доминантное заболевание, то будут больны ¹/₂ дочерей и ¹/₂ сыновей больной матери, т.е. как при аутосомнодоминантном заболевании, риск заболеть будет одинаковым для детей обоего пола - ¹/₂, или 50%. В этом случае родословная не позволяет различить два типа наследования. Заподозрить по родословной Х-сцепленное доминантное заболевание позволяет родословная, в которой болен отец. Поскольку отец передает свою Х-хромосому всем дочерям, то при достаточно большом числе больных девочек, а также большом числе здоровых мальчиков в семье предположение об Х-сцепленном доминантном заболевании, наследующемся в этой семье, может быть обоснованным.

В Y-хромосоме найдено небольшое число генов, основная масса которых вовлечена в детерминацию мужского пола, или имеет отношение к сперматогенезу. Наследование генов и соответственно признаков, сцепленных с Y-хромосомой, называется голандрическим. В этом случае ген (признак) от отца передается только всем сыновьям, но не дочерям.

При Y-сцепленном наследовании ген, локализованный в Y-хромосоме, передается только сыновьям, но не дочерям, т.е. наследование признака происходит исключительно по мужской линии.

Этот тип наследования называют еще частично сцепленным с полом. Так наследуются гены, которые расположены в псевдоаутосомных областях Х- и Y-хромо сом, т.е. на самых концах коротких плеч этих хромосом. Псевдоаутосомные области Х- и Y-хромосом гомологичны и спариваются в мейозе I. Гены, которые находятся в этих псевдоаутосомных областях, могут за счет кроссинговера переноситься из одной хромосомы в другую. В результате признаки, которые контролируют эти гены, в части родословной могут выглядеть как Y-сцепленные, а в другой - как Х-сцепленные. Так наследуется дисхондростеоз, или синдром Лери-Вейля, обусловленный мутациями в гене SHOX, который локализован в псевдоаутосомной области.

Еще 50 лет назад установление типа наследования для менделирующих признаков было практически конечным результатом исследования. После этого нормальные менделирующие, а значит, полиморфные признаки использовались в популяционной генетике человека для изучения генетической структуры популяций, а тип наследования для патологических признаков, или менделирующих заболеваний, служил основанием для расчета повторного риска в медико-генетических консультациях для семей с соответствующими заболеваниями. Употребленный термин «полиморфизм» обозначает, что в популяции ген может существовать в разных аллельных вариантах, а частота самого редкого варианта превышает 1%. В настоящее время понятие «полиморфизм» может относиться не только к разным аллелям гена, но и к другим последовательностям ДНК, в том числе некодирующим, если они встречаются в популяции в разной форме.

В международной программе «Геном человека» доминировали три основные задачи:

Создание генетической карты предполагало установление последовательности расположения генетических маркеров (в этом качестве использовались различные, преимущественно ДНК-полиморфизмы, т.е. наследуемые вариации в структуре ДНК) по длине всех хромосом с определенной плотностью - на достаточно близком расстоянии друг от друга. Такая генетическая карта должна была облегчить картирование всех генов человека, особенно генов наследственных болезней, что являлось одной из основных целей указанной программы. За короткое время было картировано несколько тысяч генов (рис. 5-5, см. цв. вклейку).

В качестве примера на рис. 5-5 представлена упрощенная модифицированная карта хромосомы 1, созданная специальной программой NCBI Map Viewer (www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search), из которой удалены некоторые столбцы. Она состоит из ряда частей, в том числе из цитогенетической карты хромосомы 1, контигов для этой хромосомы (что такое контиги - будет сказано ниже), кластеров экспрессирующихся последовательностей (EST), секвенированных участков, символов картированных генов и их названий. Показано только небольшое число генов из тех, что картированы на хромосоме 1.

В программе «Геном человека» успешно были решены и две другие задачи - создание физической карты генома и его сиквенс. Остались неотсеквенированными примерно 300 участков генома относительно небольшого размера, для которых существующие методы сиквенса неэффективны.

Установление локализации гена наследственной болезни, как, впрочем, и любого другого гена, возможно в том случае, когда удается установить или предположить фазу сцепления для исследуемого гена и полиморфного маркерного локуса. Это возможно при условии, что носитель гена наследственной болезни будет гетерозиготен по аллелям маркерного локуса. Таким образом, для анализа сцепления пригодны только те маркерные локусы, которые обнаруживают выраженный полиморфизм. Первый генетический полиморфный признак у человека был обнаружен Ландштейнером в 1900 г. Это была система группы крови АВО. До 1955 г. у человека было известно только несколько полиморфных генетических систем - преимущественно разные группы крови. В 1955 г. Смитис описал метод электрофореза в крахмальном геле, который позволял разделять белки по их заряду и молекулярной массе. Благодаря использованию этого метода Смитису удалось показать, что полиморфным является также сывороточный белок гаптоглобин. Было установлено, что электрофоретические варианты гаптоглобина наследуются как кодоминантные признаки. Вскоре генетический полиморфизм был обнаружен и для некоторых других сывороточных белков, а дополнение электрофореза методами определения ферментативной активности позволило установить, что полиморфизм свойствен также многим эритроцитарным, лейкоцитарным ферментам и ферментам плазмы крови. К 70-м годам было известно не менее 100 белковых полиморфизмов, которые можно было выявить с помощью различных вариантов электрофореза. К сожалению, большая часть белковых полиморфизмов оказалась мало пригодной для анализа сцепления с генами наследственных болезней, но сыграла исключительную роль в изучении генетической структуры популяций человека. Иные возможности для изучения сцепления и картирования генов открыли ДНК-полиморфизмы.

Одним из первых был обнаружен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Каждая рестриктаза разрезает молекулу ДНК, распознавая специфическую для нее последовательность нуклеотидов, которая называется сайтом рестрикции. Если в сайте рестрикции, независимо от того, где он находится, возникает мутация и происходит изменение последовательности нуклеотидов, то рестриктаза не узнает такой измененный сайт и не разрезает в этом месте молекулу ДНК. В то же время рестриктаза продолжает разрезать соседние неизмененные сайты рестрикции. В результате в мутантной ДНК один из фрагментов рестрикции оказывается длиннее, чем соответствующие фрагменты в немутантной ДНК. Для того чтобы выявить наличие полиморфного по рестрикции сайта в ДНК, ее после обработки рестриктазой подвергают электрофорезу. Во время электрофореза фрагменты ДНК распределяются в соответствии со своей молекулярной массой.

Обычно после рестрикции геномной ДНК образуются сотни тысяч фрагментов. Эти фрагменты денатурируются, т.е. превращаются в однонитевые и переносятся на нитроцеллюлозный фильтр, с которым прочно связываются, эта процедура называется блоттингом по Саузерну. Поскольку некоторые рестриктазы разрезают ДНК достаточно часто, то поиск полиморфизма можно вести с помощью различных ДНК-зондов, предварительно меченных радиоактивным фосфором, или флюоресцентной метки. Это могут быть зонды к участкам генов или любым другим последовательностям ДНК, локализация которых известна. Зонды соединяются с комплементарными последовательностями ДНК. В тех случаях, когда определенный зонд выявляет у разных людей разное количество меченых фрагментов или фрагментов с разной молекулярной массой, можно предполагать наличие рестрикционного полиморфизма в определенном локусе ДНК. Таким образом, можно обнаруживать мутации в генах, если эти мутации меняют сайт рестрикции для определенных рестриктаз (рис. 5-6).

В настоящее время известны сотни рестриктаз, которые распознают разные последовательности нуклеотидов. В распоряжении исследователей имеются тысячи ДНК-зондов к разным участкам генома. Использование этих возможностей привело к выявлению многих тысяч полиморфных сайтов в человеческом геноме. В абсолютном большинстве случаев ПДРФ представляет собой двухаллельную систему (наличие или отсутствие сайта рестрикции), тем не менее его высокая частота была успешно использована при картировании многих генов наследственных болезней, в том числе муковисцидоза, нейрофиброматоза I типа и многих других.

Значительно большее количество аллелей и, следовательно, большее генетическое разнообразие, а также информационная ценность у еще одного типа ДНКполиморфизма, который называется «варьирующее число тандемных повторов», или VNTR полиморфизм. В геноме человека встречаются различные типы ДНК, в том числе так называемые минисателлитные повторы. Эти повторы разбросаны по геному, их основная последовательность может включать до 80 нуклеотидов, а число повторов основной последовательности может варьировать в широких пределах. Выявление VNTR полиморфизма начинается так же, как и выявление ПДРФ, с разрезания геномной ДНК той или иной рестриктазой, электрофореза фрагментов, их денатурации и блоттинга по Саузерну. Отличие заключается в том, что для гибридизации используются ДНК-зонды, специфичные для определенного минисателлитного повтора.

Рис. 5-6. ПДРФ, обусловленный полиморфным сайтом рестрикции. А1 и А2 гомологичные хромосомы. Рестриктаза разрезает в сайте b хромосому А1, но не А2. В результате на Саузерн-блоте с зондом к определенному участку хромосомы А легко различаются все три генотипа (Из I.D. Young. Medical Genetics. - Oxford Univ. Press, 2005. - P. 142, модифицировано)

Еще более информативным ДНК-полиморфизмом являются микросателлитные тандемные повторы. Так же как и минисателлитные, микросателлитные повторы отличаются по числу повторяющихся последовательностей. Однако в случае микросателлитов базовая последовательность состоит всего из двух, трех или четырех нуклеотидов. Кроме того, они более часто встречаются в геноме и распределены по нему более равномерно. Отличается также способ их детекции. Микросателлитные повторы обычно выявляются с помощью ПЦР. Для этого необходимо знать последовательность нуклеотидов, предшествующих и следующих за повтором, чтобы выбрать подходящие праймеры, однако секвенирование генома так далеко продвинулось вперед, что найти такую последовательность не представляет особого труда ни для одного региона генома. Это очень удобный полиморфизм для изучения сцепления не только потому, что полиморфных сайтов в геноме очень много, но еще и потому, что во многих случаях полиморфизм проявляется большим количеством аллелей, и гетерозиготность при этом типе полиморфизма очень высокая.

В настоящее время часто для анализа сцепления используется так называемый однонуклеотидный полиморфизм (ОНП). ОНП могут представлять собой замещения, делеции или инсерции одного нуклеотида в последовательность нуклеотидов ДНК (рис. 5-7, см. цв. вклейку).

ОНП теоретически наблюдается с частотой 1 на 100-300 нуклеотидов и по форме представляют собой диаллельный полиморфизм. При такой частоте ОНП соответствуют всем требованиям, которые предъявляются к маркерам для широкомасштабного исследования сцепления. Кроме того, ОНП должен встречаться несколько раз даже в небольших по размеру генах. В этом случае ОНП может быть собственно мутацией, обусловливающей наследственное заболевание. Изучение распространенности ОНП в геноме человека шло под эгидой специально созданного консорциума. В настоящее время в геноме человека идентифицировано несколько миллионов ОНП. Вскоре после начала работы по выявлению ОНП стало ясно, что многие ОНП, расположенные в одной хромосоме, тесно сцеплены, образуя определенные блоки или гаплотипы. Для изучения этого феномена был организован специальный международный проект под названием HapMap. Стало ясно, что для идентификации такого блока тесно сцепленных ОНП, достаточно определить лишь несколько ОНП (более полную информацию о проекте можно получить на сайте http://snp.cshl.org). В настоящее время существуют коммерческие чипы, содержащие 500 тыс. и более картированных ОНП, которые используются для изучения сцепления генов с малым эффектом.

Для успешного картирования генов наследственных болезней выявления многочисленных и удобных для картирования ДНК-полиморфизмов различных типов было недостаточно. Эти маркеры надо было локализовать на генетической карте, установив их взаимное расположение, что стало возможным благодаря тому, что картирование ДНК-полиморфных маркеров было проведено большинством исследователей на одной и той же выборке семей. Эта выборка включает 61 многопоколенную семью, с большим числом членов в каждой семье, отобранных в исторических провинциях Франции Центром по изучению полиморфизма у человека (Centre d?Etude du Polymorhisme Humain - CEPH). Все исследователи, которые занимались картированием ДНК-полиморфизмов, могли получить ДНК от членов этих семей. Как только первые ДНК-маркеры были картированы по всем хромосомам, работа по картированию новых маркеров ускорилась, так как их надо было просто встроить в уже имевшуюся карту для каждой хромосомы. В очень короткий срок удалось создать генетическую карту для всего генома, в которой расстояние между ближайшими ДНК-маркерами не превышало в среднем 5 сантиморган (сМ). Были созданы коммерческие наборы для определения 300 и более ДНК-полиморфизмов в геноме, которые позволяли провести так называемый геномный скрининг и относительно легко картировать гены наследственных болезней. Кроме того, столь плотно заполненная маркерами генетическая карта позволила уменьшить количественные требования к семейному материалу, пригодному для изучения сцепления генов.

Параллельно с исследованиями по программе «Геном человека», имеющей глобальное значение, шло генетическое картирование локусов, ответственных за наследственные болезни. Эта работа значительно облегчалась благодаря созданию генетической карты ДНК-маркеров в рамках программы. Картирование генов наследственных болезней является принципиально важным для медицины, так как позволяет проводить непрямую диагностику соответствующих наследственных болезней. Кроме того, генетическое картирование является необходимым шагом в идентификации и последующем клонировании того или иного гена наследственной болезни, изучения его структуры, природы мутаций в этом гене и в перспективе открывает возможности манипуляций с этим геном, например в генотерапевтических целях.

Разные хромосомы в мейотических делениях ведут себя независимо друг от друга, что составляет хромосомную основу для выполнения менделевского правила независимого наследования признаков. В то же время гены, расположенные в одной хромосоме, наследуются преимущественно как одна группа, т.е. сцепленно, кроме тех случаев, когда происходит кроссинговер. В результате кроссинговера происходит обмен одинаковыми участками гомологичных хромосом, и в рекомбинантной хромосоме создается новая комбинация генов, часть из которых происходит из одной, а другая часть - из другой гомологичной хромосомы каждого из родителей. Следует помнить, что в среднем на хромосому приходится от одной до трех рекомбинаций. Рекомбинации происходят во время оогенеза и сперматогенеза (в мейозе I), так что ребенок получает рекомбинантные хромосомы как от матери, так и от отца.

Установить, есть ли сцепление между геном, вызывающим аутосомнодоминантное заболевание, и каким-либо генетическим полиморфным маркером, можно на примере семьи, в трех поколениях которой наследуется вульгарный ихтиоз. При обследовании членов этой семьи для выяснения генотипов каждого по выбранному генетическому маркеру получена родословная с описанием генотипов каждого члена семьи (рис. 5-8).

Судить о том, сцеплен ли избранный маркерный локус с геном ихтиоза, можно только по третьему поколению, но для этого необходимо сделать предположение, с каким аллелем маркерного локуса наследуется вместе ген ихтиоза у II₂, т.е. у больного отца. В трехпоколенной родословной это сделать просто. Как видно на рис. 5-8, ген ихтиоза наследуется вместе, т.е. находится в одной хромосоме, с аллелем 1 маркерного локуса (такое состояние называется фазой притяжения), с аллелем 2 маркерного локуса ген ихтиоза находится в фазе отталкивания. Если теперь проанализировать генотипы всех детей из поколения III, то становится ясно, что все дети, кроме III₆, являются не рекомбинантами, а III₆, напротив, рекомбинанта. В этом случае частота рекомбинаций (обозначается как θ) составляет 1 из 7, т.е. 0,14.

Рис. 5-8. Семья, в которой сегрегирует аутосомно-доминантный ихтиоз (пораженные обозначены черными кружочками и квадратами) и ДНК полиморфный маркер (генотипы каждого члена семьи указаны жирным шрифтом)

Анализ частоты рекомбинаций становится значительно сложнее в случаях с рецессивными заболеваниями или с двухпоколенными семьями. Тогда для установления сцепления используется метод, основанный на максимально правдоподобной оценке частоты рекомбинаций (θ). Такая оценка основывается на относительной вероятности наличия сцепления между изучаемыми локусами в каждой конкретной семье (P_R). P_R рассчитывается как отношение вероятностей сцепления изучаемых локусов в данной семье, с частотой рекомбинаций между этими локусами (θ), варьирующей от 0 до 0,5, к вероятности, что в этой семье нет сцепления по изучаемым локусам и, следовательно, θ=0,5. Для удобства P_R часто выражается через логарифм. Log₁₀ этой относительной вероятности называется логарифмом шансов (log of odds) или значением логарифма шансов (lod score). Максимально правдоподобная оценка частоты рекомбинации θ между двумя изучаемыми локусами может быть получена путем нанесения на график сумм логарифма шансов для всех семей, на которых проводилось исследование, при разных значениях θ от 0 до 0,5. Значение θ, соответствующее пику кривой на графике, будет максимально правдоподобным. Считается, что сцепление между локусами установлено, когда сумма логарифмов шансов для исследованных семей окажется равной 3 или более. Логарифм шансов, равный 3, означает, что сцепление в 1 тыс. раз более вероятно, чем его отсутствие. Напротив, при значении логарифма шансов, равном -2, сцепление между локусами в 100 раз менее вероятно, чем его отсутствие, и может быть отвергнуто.

Если сцепление между локусами установлено, то частота рекомбинаций может быть легко превращена в расстояние на генетической карте, которое разделяет исследованные локусы. Считается, что 1% рекомбинаций соответствует расстоянию в 1 сМ. Следует заметить, что такое соответствие выполняется, когда локусы достаточно тесно сцеплены и частота рекомбинаций невысока. В противном случае между локусами могут возникать двойные или даже тройные кроссинговеры, и вычисленная частота рекомбинаций фактически оказывается заниженной. Упрощая ситуацию, можно от генетических расстояний перейти к физическим расстояниям между сцепленными генами, так, 1 сМ генетической карты примерно соответствует 1 млн пар нуклеотидов (п.н.). Однако такие переходы надо делать с большой осторожностью, так как известно, что частота рекомбинаций зависит от многих факторов. В частности, она ниже у мужчин по сравнению с женщинами, частота рекомбинаций также разная для разных районов каждой хромосомы, являясь максимальной в теломерных районах. Кроме того, установлено, что по длине хромосом выявляются так называемые горячие точки рекомбинаций.

В тех случаях, когда устанавливается сцепление между двумя локусами, невозможно ответить на вопрос, каково взаимное расположение локусов. Ответ на этот вопрос может быть получен в эксперименте с мультилокусным сцеплением. Классический вариант такого анализа, когда изучалось сцепление между тремя локусами, был разработан еще в 20-е годы прошлого столетия Морганом и его сотрудниками. Суть этого эксперимента очень простая. Допустим, требуется установить взаимное расположение локусов А, В и С. Можно получить следующие результаты:

Если в распоряжении имеется достаточно большое количество локусов, расположенных в одной хромосоме, то, создавая последовательно комбинации по трем или большему числу локусов, можно построить генетическую карту целой хромосомы. Некоторым осложнением при выполнении такой процедуры создания генетической карты являются двойные кроссинговеры, которые происходят тем чаще, чем дальше расположены друг от друга изучаемые локусы. Если, однако, мы можем различать генотипически двойные кроссинговеры, то легко внести соответствующую поправку при определении генетического расстояния между изучаемыми генетическими локусами.

Для анализа сцепления гена наследственного заболевания, когда используются тысячи и даже сотни тысяч полиморфных генетических маркеров, плотно перекрывающих весь геном человека, широко используются различные компьютерные программы, существенно облегчающие эту работу. Наиболее известные из них LINKAGE и LIPED (эти и многие другие программы по анализу сцепления можно найти на сайте http://linkage.rockefeller.edu/soft/list2.html).

Многочисленные ДНК-полиморфизмы, обладающие высокой информативной ценностью, позволили использовать в ряде случаев для картирования генов наследственных болезней такой феномен, как неравновесность по сцеплению. Обычно генетические маркеры, обнаруживающие сцепление с генами наследственных болезней, встречаются в семьях с такой же частотой, как и в популяции, и инструментом для анализа сцепления является их сегрегация, зависимая или независимая от гена наследственного заболевания в конкретной семье. Однако в некоторых случаях, когда мутация в гене наследственного заболевания возникла относительно недавно и когда определенный аллель полиморфного генетического маркера очень тесно сцеплен с геном наследственного заболевания и находится с ним в фазе притяжения, это будет проявляться в том, что ген наследственного заболевания и какой-то аллель полиморфного генетического маркера будут встречаться в популяции всегда, или почти всегда, вместе. Неравновесие по сцеплению между разными ДНК маркерами и генами наследственных болезней найдено при муковисцидозе, хорее Гентингтона, фенилкетонурии, миотонической дистрофии и ряде других наследственных заболеваний.

Кроме генетического картирования, для локализации генов наследственных болезней человека используются разнообразные методы физического картирования генов. Самый простой подход физического картирования реализуется, когда тот или иной локус или ген заболевания оказывается ассоциированным с хромосомной аномалией - делецией, транслокацией или другой хромосомной аномалией, которая выявляется цитогенетически.

Если у больных с тем или иным наследственным заболеванием выявляются делеции примерно в одном и том же месте одной и той же хромосомы, это почти наверняка указывает, что ген наследственной болезни локализован в том районе хромосомы, который отсутствует во всех делециях, независимо от их размера. Таким образом было картировано, по крайней мере, несколько генов наследственных болезней, в том числе генов ретинобластомы, синдрома Ангельмана и др. Использование делеций для локализации генов было названо методом делеционного картирования. Сходным образом для установления локализации гена наследственной болезни могут быть использованы сбалансированные транслокации, когда у носителя такой транслокации диагностируется наследственное заболевание. Это позволяет предполагать, что один из разрывов хромосомы, предшествующий возникновению транслокации, нарушил структуру гена, локализованного в месте разрыва. Самым ярким примером, когда с помощью транслокации был картирован ген, является миопатия Дюшенна. Ген миопатии Дюшенна локализован в Х-хромосоме и обычно проявляется тяжелой миопатией у мальчиков. Было обнаружено несколько случаев типичной клинической картины миопатии у женщин. Они оказались связанными с транслокациями между Х-хромосомой и аутосомами, причем в Х-хромосоме разрыв всегда локализовался в районе хромосомы Хp21.2-p21.1. Это позволило резко сузить район поиска гена миопатии Дюшенна. Здесь необходимо подчеркнуть, что, кроме транслокации, у пораженных женщин должна была также наблюдаться преимущественная инактивация нормальной Х-хромосомы.

Картирование гена иногда может быть достигнуто за счет использования эффекта дозы гена. В случае делеции следует ожидать уменьшения продукта гена (это может быть прежде всего фермент) на 50%. Именно таким способом был картирован ген кислой фосфатазы эритроцитов в хромосоме 2. При дупликации, наоборот, можно ожидать увеличения на 50% активности ферментов, гены которых вовлечены в дупликацию. Самым известным примером картирования гена с помощью дупликации является супероксиддисмутаза, которая была картирована на хромосоме 21, так как ее уровень был постоянно повышен у больных с болезнью Дауна.

К физическим методам картирования относится также метод гибридизации in situ. В том случае, когда известна последовательность ДНК интересующего локуса (теперь такая ситуация возникает нередко), эту последовательность можно использовать для гибридизации с хромосомами in situ, и место гибридизации будет однозначно указывать на локализацию локуса в определенном районе определенной же хромосомы. Обычно гибридизации in situ предшествует выделение мРНК из какого-либо органа или ткани для характеристики функциональной дифференциальной активности генов в соответствующем органе. На основе этих мРНК с помощью обратной транскриптазы получают кДНК. Такие кДНК представляют собой экзоны тех генов, которые обнаруживают активность в исследуемом органе. Эти кДНК можно использовать как основу для создания ДНК-зондов. Их можно метить флюресцентными красителями и применять для флюоресцентной гибридизации с препаратами прометафазных хромосом, которые обработаны соответствующим образом, для того чтобы добиться денатурации нитей ДНК (FISH-анализ). В этом случае ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной последовательностью на хромосомах и по флюоресцентному свечению выявляется и локализуется ген, с которого транскрибировалась мРНК, послужившая исходным звеном всего анализа. Такую кДНК можно использовать также для скрининга геномной библиотеки, созданной на основе тотальной клеточной ДНК. После гибридизации кДНК с определенным районом в такой библиотеке можно получить и исследовать полную структуру гена, включая его экзоны, интроны и промотор.

Для физического картирования широко используются также методы гибридизации соматических клеток. Обычно для гибридизации с клетками человека используются соматические клетки грызунов, чаще всего мыши. Для того чтобы облегчить слияние клеток разных видов, в культуральную среду добавляют вирус Сендай, инактивированный ультрафиолетовым облучением, или полиэтиленгликоль. Для отбора слившихся исходных клеток человека и мыши, клетки выращивают на специальной селективной среде, которая позволяет размножаться только гибридным клеткам (для этого в опытах по слиянию использовали линии клеток мышей с недостаточностью по некоторым ферментам, чаще всего с недостаточностью по тимидинкиназе). В только что образовавшихся гибридных клетках ядра содержат оба набора хромосом человека и мыши. Однако последующее размножение гибридных клеток приводит к постепенной утрате хромосом человека у гибридов, так что в результате остается только одна или даже фрагмент одной из хромосом человека. Когда метод гибридизации соматических клеток был только создан, тестировалось присутствие в гибридных клетках, в которых осталась одна или несколько хромосом, ферментов и других белков человека, которые по своим характеристикам отличались от соответствующих белков мыши, или клетки мыши были дефицитны по каким-то ферментам. Обычно из гибридов соматических клеток создавались панели, в которых присутствовали хромосомы человека в минимальных количествах и в самых разных комбинациях. Именно поэтому для установления локализации гена соответствующего фермента или другого белка человека не было необходимости использовать только те гибриды соматических клеток, которые содержали лишь одну хромосому человека. Вместе с тем сначала можно было заниматься картированием только тех генов человека, которые проявлялись на клеточном уровне, и невозможно было работать с генами, имевшими сложное фенотипическое проявление, где первичный дефект оставался неизвестным. Методы молекулярной генетики позволили решить эту проблему, и сейчас с помощью ПЦР, блоттинга по Саузерну и иных молекулярно-генетических методов можно тестировать гибридные соматические клетки на наличие в оставшихся хромосомах человека любых генов, независимо от того, известен продукт этих генов или нет (рис. 5-9).

Рис. 5-9. Картирование генов человека с помощью гибридных клеток человек-мышь. Мышиные клетки, дефицитные по ГФРТ (гипоксантин-фосфорибозилтрансферазе), выращиваются в культуре in vitro вместе с нормальными клетками человека. С помощью вируса Сендай обеспечивается слияние мышиных и человеческих клеток. Образовавшиеся гибридные клетки через несколько десятков поколений теряют большую часть хромосом человека. Только в тех гибридных клетках, которые содержат Х-хромосому человека, выявляется активность ГФРТ. Из этого следует, что ген ГФРТ локализован в хромосоме Х человека

Недостатком метода картирования генов человека с помощью гибридных соматических клеток было то, что часто локализация генов устанавливалась с точностью до хромосомы. Разрешающие возможности в картировании генов таким путем были ограничены. Однако если в гибридных клетках осталась только одна хромосома человека, то, облучив такие гибридные клетки рентгеновскими или гамма-лучами, можно добиться фрагментации этой хромосомы и после получения новых гибридных клеток с помощью дополнительного слияния с клетками грызунов (после облучения гибридные клетки без дополнительного слияния с клетками грызунов погибают) уточнить локализацию интересующего исследователей гена, вплоть до небольшого фрагмента определенной хромосомы (картирование с помощью радиационных гибридов). Особенностью радиационных гибридов является то, что образующиеся после облучения фрагменты хромосомы человека не способны проходить митоз и теряются, если они не сливаются с хромосомами мыши. Эти фрагменты человеческих хромосом могут быть столь небольшими по размеру, что уже не обнаруживаются цитологически. Именно поэтому до проведения опытов по картированию необходимо специальными методами, в частности с использованием ДНК-полиморфных маркеров (обычно используется Aluполиморфизм, отсутствующий у мыши) уточнить, какие фрагменты определенной хромосомы человека сохранились в радиационных гибридах. Еще одной особенностью радиационных гибридов является то, что на них можно изучать сцепление между генами во фрагментах хромосом человека и даже оценивать генетическое расстояние между сцепленными локусами, исходя из того, насколько часто они присутствуют во фрагментах вместе или раздельно. При этом предполагается, что чем ближе расположены гены друг к другу на хромосоме, тем реже радиационноиндуцированные разрывы в хромосоме будут разделять сцепленные гены.

Установление локализации гена наследственной болезни теперь может рассматриваться как подготовительный этап для его идентификации, т.е. выделения, клонирования, изучения структуры гена и последовательности нуклеотидов, а также обнаружения мутаций в этом гене, которые, собственно, можно рассматривать как этиологический фактор для соответствующего менделирующего наследственного заболевания. Классическая молекулярная генетика идентификацию гена обычно начинала с его первичных продуктов - мРНК или белка. Эти продукты позволяли получить фрагменты гена либо как кДНК, либо как последовательности нуклеотидов, соответствующие последовательности аминокислот белка (такая последовательность может быть короткой, и для ее создания вовсе не надо определять всю последовательность аминокислот в соответствующем белке, достаточно определить последовательность 1-2 десятков аминокислот). Эти фрагменты гена превращали в ДНК-зонды и с их помощью идентифицировали мутантный ген в геномных библиотеках или с помощью гибридизации in situ на препаратах хромосом. Такой путь идентификации гена, когда все начинается с мутантного белка, принято называть функциональной геномикой. Он был успешно применен для изучения генов, кодирующих фенилаланингидроксилазу, гемоглобин, VIII фактор свертывания крови, и некоторых других генов. Однако таких примеров можно привести немного, так как для большинства наследственных болезней их молекулярный патогенез остается неизвестным. Именно поэтому с середины 80-х годов ХХ века на смену функциональному клонированию пришли методы позиционного клонирования, при котором сначала картируется и изолируется ген заболевания, а затем по его структуре идентифицируется белок, который этот ген кодирует. Позиционное клонирование принципиально состоит из двух этапов: картирование гена насколько возможно более точное в определенном локусе хромосомы и идентификация внутри этого локуса гена-кандидата. Под локусом в этом случае понимают генетически картированный участок хромосомы или отрезок ДНК. Обычно стремятся, чтобы размер локуса, в котором находится ген-кандидат, не превышал 1 сМ, что соответствует примерно 1 млн п.н., в таком локусе может находиться около 10 генов. Позиционное клонирование предполагает выявление всех генов, находящихся в картированном локусе, с последующей идентификацией гена, ответственного за развитие заболевания. Для этого используются различные подходы. Первый из них - это конструкция контига. Контиг - набор перекрывающихся фрагментов клонированной ДНК, представляющих обычно небольшую часть генома. Для физического картирования контиг должен включать не только ген заболевания, но и фланкирующие его сцепленные генетические маркеры, которые были использованы для картирования локуса и выполняют роль реперных точек в процессе выявления генов в локусе. Сначала контиги конструировались из библиотек клонированной в векторах ДНК. Векторы - структуры, включающие ДНК для клонирования, которые, попадая в клетку хозяина, автономно размножаются, одновременно размножая клонируемую ДНК. Известно большое число разнообразных векторов, но чаще всего в этом качестве использовали искусственные хромосомы бактерий или дрожжей (BACs и YACs), которые могут инкорпорировать отрезки ДНК большого размера (вплоть до 1 млн п.н.), в отличие от таких векторов, как космиды, фаги или плазмиды, в которые можно встроить только относительно небольшие по размеру отрезки чужеродной ДНК. Теперь готовые YAC-контиги, подходящие для поиска гена заболевания в любой части генома, могут быть получены из базы данных генома человека. Такая ДНК, включенная в YAC, используется как зонд. При скринировании библиотек кДНК-зонд позволяет выявить все гибридизующиеся с ним геномные кДНК и проанализировать их после селективной амплификации и клонирования.

Еще один подход, использующийся для выявления генов в контиге, - это поиск CpG-островков, которые рассматриваются как практически обязательная часть 5?-конца многих генов и которые, вероятно, являются местами связывания факторов транскрипции. Эти кластеры обычно неметилированы и выявляются с помощью рестрикционных ферментов, чувствительных к метилированию, таких, например, как HpaII. Для выявления генов в контиге используются и другие методы, в том числе так называемый «захват экзонов», при котором гибридизующиеся с зондом участки ДНК вводятся в экспрессионную систему, где они могут образовывать РНК. После сплайсинга такой транскрипт РНК с помощью обратной транскриптазы превращается в кДНК, соответствующую с высокой вероятностью экзонам гена, содержащегося в контиге. Еще одним методом, позволяющим предположительно выявлять гены в контиге, является так называемый зооблотинг. В этом случае ДНК-зонд гибридизируется с ДНК, полученной от филогенетически разных видов. Предполагается, что гибридизация ДНК-зонда с большим числом ДНК разных видов является указанием на консервативность определенных фрагментов зонда, и, следовательно, они содержат кодирующие последовательности одного или нескольких генов.

После того как в контиге идентифицировано несколько генов, появляется возможность установить, какой из них является геном заболевания. Прямой подход предполагает секвенирование всех выявленных генов или генов, структура и функция которых может иметь отношение к проявлениям соответствующего моногенного заболевания. Секвенирование позволяет выявить тот ген, в котором наблюдается мутация, присутствующая у больных, но отсутствующая у их здоровых родственников, или в достаточно большой контрольной выборке. Если эта мутация вызывает сдвиг рамки считывания или делецию, то, скорее всего, она играет патогенетическую роль. В противном случае могут понадобиться исследования функциональной активности мутантного гена (рис. 5-10).

Рис. 5-10. Подходы, которые используются для позиционного клонирования (см. объяснения в тексте)

Секвенирование генома человека и идентификация в нем более 13 тыс. генов позволяют в некоторых случаях значительно упростить процедуру поиска генакандидата определенного менделирующего заболевания. Это делается с помощью специальных компьютерных программ анализа генома человека, из которых наиболее используемая - Ensemble (www.ensemble.org). Программа позволяет выявить все экспрессирующиеся последовательности и гены в интересующей исследователя области (локусе) генома, результаты сиквенса и структуру генов, а также их гомологию. Иногда этого оказывается достаточно, чтобы определить наиболее вероятный ген-кандидат.

В последнее время достигнуты большие успехи в разработке новых высокопродуктивных методов сиквенса генома человека. Для идентификации генов менделирующих заболеваний при небольшом числе больных создан метод сиквенса всего экзома в комбинации с методологией фильтрации результатов (поиск двух несинонимичных замен, мутаций сплайсинга и indel-вариантов, исключение полиморфизмов и т.д.). Вскоре идентификация генов редких менделирующих заболеваний может стать только технологической задачей, даже при наличии в семье лишь одного больного.

Гинтер Е.К. Медицинская генетика. - М.: Медицина, 2003. - 447 с.

Ньюссбаум Р.Л., Мак-Иннес Р.Р., Виллард Х.Ф. Медицинская генетика: Пер. с англ. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 608 с.

Young I.D. Medical Genetics. - Oxford: Oxford University Press, 2005. - 304 p.

Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J., White R.L. Medical Genetics. 2nd ed. - Mosby, 1999. - 372 p.

Картирование и клонирование генов наследственных заболеваний сегодня стало технологической задачей, а частоту и спектр мутаций в них легко определить с помощью целого арсенала современных молекулярно-биологических методов. Именно поэтому интерес исследователей все больше привлекают патологические состояния, которые не связаны непосредственно со структурными нарушениями генов. Исследования функциональных нарушений генов, вовлеченных в развитие наследственных и онкологических заболеваний и обусловленных аномалиями регуляции на уровне ДНК и РНК, начинают занимать доминирующие позиции в молекулярной генетике человека.

Термин «эпигенетика» был предложен в 1942 г. эмбриологом Конрадом Уодингтоном, объединившим два других понятия - «эпигенез» и «генетика» с целью показать, что генотип реализуется в фенотип благодаря включению многих модифицирующих факторов. Термин «эпигенез» ранее применяли в эмбриологии для описания постепенного формирования органов и тканей из недифференцированной массы клеток, но он не учитывал всего разнообразия генетических факторов. Уодингтон подчеркивал, что «эпигенетический фон лежит в основе развивающегося организма и представлен всем комплексом взаимодействий между ДНК, белками, внешними и внутренними стимулами». В настоящее время совершенно очевидно, что геном человека содержит информацию двух видов - генетическую и эпигенетическую. Генетическая информация - руководство по созданию живого организма, а эпигенетическая - данные о том, как, где и когда она должна быть реализована. Эпигенетика исследует изменения в экспрессии определенных ДНК-последовательностей, которые нельзя объяснить классическими мутациями и (или) структурными нарушениями. Таким образом, эпигенетику можно рассматривать как более высокий уровень генетической организации и регуляции, который неподконтролен «центральной догме» молекулярной биологии.

В последнее время показано, что развитие патологического процесса могут определять не только генетические, но и эпигенетические факторы. Среди них - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидной последовательности. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов можно определить как наследственный код, отличный от геномной последовательности нуклеотидов. Он включает ДНК-метилирование цитозина в CpG-динуклеотидах, посттрансляционную модификацию гистонов, обмен гистонов и их вариантов, АТФ-зависимый ремоделлинг хроматина и различные типы малых РНК, участвующих в инактивации и экспрессии генов. Выделяют три краеугольных эпигенетических механизма регуляции экспрессии генов: метилирование ДНК, модификацию гистонов и РНК-интерференцию. Эти механизмы вовлечены в регуляцию экспрессии и инактивации генов на уровне транскрипции посредством плотности упаковки ДНК и гистонов в хроматин. Экспрессия генов тесно связана с состоянием хроматина. Для активного хроматина (эухроматина) характерны рыхлое расположение нуклеосом на ДНК, присутствие факторов ремоделирования хроматина, более свободный доступ эндонуклеаз к ДНК, репликация локуса ДНК в начале S-фазы и пространственное перемещение (выпетливание) хроматина в районах конститутивного гетерохроматина. Неактивный хроматин (гетерохроматин) обладает противоположными характеристиками.

Эпигенетические метки, такие как метилирование ДНК и модификации гистонов, могут быть скопированы в S-фазе, и, следовательно, эпигенетическую информацию можно передать через ряд последовательных клеточных делений. Не следует забывать, что эпигенетическая регуляция - крайне сложный комплексный процесс, во время которого все три основные составляющие работают во взаимодействии. Так, метилирование ДНК может вызвать деацетилирование и метилирование (деметилирование) гистоновых белков. Метилирование (деметилирование) гистонов может привести к метилированию ДНК. Малые РНК в составе сложных белковых комплексов могут вызывать метилирование ДНК и модификацию гистонов, а также напрямую инактивировать тот или иной ген посредством РНКинтерференции (блокирование трансляции или деградация мРНК).

Только одно основание ДНК - цитозин - можно модифицировать посредством энзиматического метилирования. Метилирование - обратимая ковалентная модификация ДНК, при которой цитозиновый остаток в CрG-динуклеотиде метилируется в позиции N5 пиримидинового кольца. Метилирование цитозиновых остатков происходит с помощью ДНК-метилтрансфераз, переносящих метильную группу S-аденозилметионина. Такая модификация - единственно допустимая в физиологических условиях химическая модификация ДНК у позвоночных, стабильно поддерживаемая в ряду клеточных делений. Последнее обеспечивает целое семейство ДНК-метилтрансфераз. Метилирование de novo осуществляют DNMT3a и DNMT3b. Поддерживающее метилирование выполняет DNMT1, которая метилирует СрG-динуклеотиды комплементарной неметилированной цепи ДНК, превращая гемиметилированную ДНК в гомометилированную. Остатки 5-метилцитозина удаляются из ДНК благодаря активности гликозилазы или ДНК-деметилазы.

Мишень метилирования в ДНК - цитозин, входящий в состав CpG-динуклеотидов. В геноме существует два типа распределения CpG-динуклеотидов: рассеянные CpG, присутствующие в нем в виде одиночных динуклеотидов и составляющие около 80% их общего числа, и районы обогащения CpG, называемые CpGостровками (рис. 6-1, см. цв. вклейку). Одиночные CpG чаще всего обнаруживают в межгенных и, реже, в транскрибируемых последовательностях. CpG-островки располагаются вблизи структурных генов, преимущественно в 5'-районах, и содержат регуляторные последовательности, характерные для промоторных областей. CpG-островки присутствуют в промоторных районах 60% генов и составляют от 0,5 до 1,5 тыс. пар нуклеотидов. Содержание С+G превышает 60%, а соотношение CpG/GpC не должно быть ниже 0,6. За редким исключением (импринтированные гены) CpG-островки промоторных районов в нормальных тканях не метилированы, что свидетельствует о функционально нормальном состоянии гена.

Тканеспецифические гены, как правило, не имеют в своих промоторах CpGостровков. В них присутствуют одиночные CG-динуклеотиды, степень метилирования которых варьирует в широких пределах в разных клетках и тканях и препятствует локальному связыванию факторов транскрипции.

Обнаружение зависимости между снижением (выключением) активности гена и метилированием его промоторной области - веский довод в пользу того, что такая модификация ДНК может служить эпигенетическим механизмом регуляции экспрессии генов. Метилирование включает и другие механизмы, способствующие более полной инактивации экспрессии гена.

Гистоновый код Основная структурная единица хроматина - нуклеосома. Она представлена белковым октамером, образованным двумя молекулами каждого из коровых гистонов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4), с которым связан участок ДНК длиной 147 пар нуклеотидов. Структура коровых гистонов эволюционно консервативна, но их N-концевые «хвосты», выходящие за пределы ядра нуклеосомы, могут претерпевать многочисленные посттрансляционные модификации, включая ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и др. (рис. 6-2, см. цв. вклейку). Тип ковалентной модификации гистонов может влиять на структурную динамику нуклеосомы, изменяя степень доступности ДНК. Ацетилирование гистонов ослабляет межнуклеосомное взаимодействие, а также взаимодействие нуклеосомы с линкерной ДНК, что приводит к большей доступности ДНК. Метилирование гистонов не изменяет суммарный заряд нуклеосомы, но обе эти модификации играют важную роль в привлечении белков, которые регулируют различные процессы, требующие доступа к ДНК. Следовательно, модификации гистонов, их качественный состав и специфический набор (гистоновый код) определяют экспрессию или инактивацию гена или создают дополнительный уровень регуляции экспрессии генов. Под гистоновым кодом подразумевают разнообразный набор модификаций гистоновых «хвостов», определяющий функциональное состояние гена. Гистоновый код - второй эпигенетический механизм, с помощью которого пишется программа каскадного включения-выключения генов, передающаяся по наследству от клетки к клетке. При этом информация о белках, записанная в самой ДНК, остается в сохранности.

Посттрансляционная модификация гистонов может модулировать структуру хроматина, ослабляя взаимодействие гистонов с ДНК, и тем самым активировать транскрипцию. Модификации гистонов могут происходить последовательно или в комбинации друг с другом и, таким образом, привлекают хроматинсвязывающие белки для выполнения специфических задач. Вместе с метилированием ДНК ковалентные модификации гистонов определяют эпигенетическое поддержание и контроль экспрессии.

Метилирование гистонов и ДНК создает основу для долговременного эпигенетического поддержания уровня экспрессии генов. Наиболее распространенный тип метилирования гистонов - метилирование лизина. Образование гетерохроматина происходит в результате одновременной работы гистонлизиновых метилтрансфераз (НК-МТ) и деацетилаз гистонов (HDAC) и включает модификацию лизина 9 гистона Н3 (H3K9). Метилирование Н3К9 коррелирует с инактивацией хромосомы Х и конденсированным состоянием хроматина (структурный и факультативный гетерохроматин). Кроме того, маркером факультативного гетерохроматина служит триметилированный лизин 27 гистона Н3 (Н3К27me3). Метилирование лизина 20 гистона Н4 (Н4К20) ингибирует ацетилирование лизина 16 гистона Н4 (Н4К16). Это свидетельствует о том, что метилирование Н4К20 действует как эпигенетическая метка репрессии. Таким образом, метилирование Н3К9, Н3К27 и Н4К20 - основная модификация гистонов, соответствующая гетерохроматину и крупномасштабной репрессии транскрипции. Кроме того, при согласованном метилировании Н3-К9 и ДНК может сохраняться долговременный статус негативной регуляции транскрипции.

Метилирование определенных остатков гистонов в эухроматиновых районах противодействует многочисленным механизмам инактивации генов в эукариотической клетке. Метилирование лизина 4 гистона Н3 (Н3К4) специфично нарушает опосредованное Suv39h1 метилирование Н3К9, закрывая, таким образом, основной путь образования гетерохроматина. Кроме того, двойное метилирование Н3К9me2, возможно, вовлечено в общий механизм отмены крупномасштабной инактивации генов, поскольку триметилированный Н3К4me3 служит глобальной эпигенетической меткой эухроматина, а триметилирование Н3К9me3 коррелирует с активной транскрипцией.

Образованию дополнительных гетерохроматиновых районов также препятствует метилирование лизина 79 гистона Н3 (Н3К79). Оно предотвращает ассоциацию инактивирующих белков Sir с активно экспрессирующимися генами. Таким образом, Н3К4 и Н3К79 участвуют в установлении эухроматинового состояния, поскольку их метилирование препятствует распространению гетерохроматиновых районов. Триметилирование Н3К4 сохраняется до 5 ч после элонгации транскрипции, создавая, таким образом, некую форму кратковременной транскрипционной памяти о недавно транскрибированных генах. Таким образом, метилирование определенных остатков гистонов участвует в кратковременном и долговременном поддержании транскрипционного статуса генов, а уровень метилирования может вносить вклад в их регуляцию.

Ацетилирование - обратимая модификация лизинов в N-концевых доменах коровых гистонов. Известно, что N-концевые домены гистонов участвуют в инактивации генов с образованием суперконденсированных нитей хроматина, тогда как их ацетилирование приводит к локальной деконденсации хроматина, необходимой для процессов, связанных с переупаковкой ДНК: транскрипции, репликации, репарации, рекомбинации и образования сперматозоидов. Например, ацетилирование Н4К16 регулирует структуру хроматина и его взаимодействие с белками. Усиление ацетилирования гистонов стимулирует транскрипцию, а деацетилирование приводит к полной инактивации генов. Ацетилирование (деацетилирование) может быть прямо связано с отдельными стадиями транскрипции генов через взаимодействие с комплексами, ремоделирующими хроматин. Совместное функционирование деацетилаз (HDAC) и ацетилаз (HAT) гистонов сопровождается динамическими переходами хроматина из одной структуры в другую и приводит к переключению активных и неактивных состояний.

При определенном паттерне распределения сайтов ацетилирования гистонов нарушается пространственная структура нуклеосомной нити, что увеличивает доступность хромосомных доменов для регуляторных белков. В результате белки системы транскрипции получают доступ к промоторам и могут инициировать транскрипцию. Показано, что транскрипция матриц с гиперацетилированными нуклеосомами происходит быстрее, чем на матрицах без таковых.

Фактором, в значительной степени определяющим структуру и функции хроматина, считают модификацию его компонентов: ацетилирование гистонов приводит к деконденсации и активации, а метилирование ДНК ведет, напротив, к конденсации и инактивации. Таким образом, характерные черты активного хроматина - гиперацетилирование гистонов и отсутствие 5-метилцитозина в ДНК, а неактивного - гиперметилирование цитозина и деацетилирование гистонов.

Реализация эффектов метилирования ДНК происходит через процесс ингибирования транскрипции клеточных генов. Ее можно объяснить следующими механизмами. Во-первых, метильные группы могут напрямую препятствовать связыванию транскрипционных факторов (например, таких как AP-2, E2F, c-Myc/ Myn, ATF/CREB-подобных белков, цАМФ-зависимого активатора и NF-kB) с их сайтами узнавания - цАМФ-зависимыми элементами. Другой механизм реализуется через связывание специфических репрессоров транскрипции (метилспецифических белков MeCP1, MeCP2, MBD1-4) с метилированной ДНК. МеСР2 способен связаться с ДНК, содержащей единичный метилированный CpG-динуклеотид. Кооперативное взаимодействие молекул МеСР2 обеспечивает распространение участка связывания МеСР2 за пределы сайта метилированных СрG в результате присоединения все новых молекул. В итоге возникают стерические препятствия к взаимодействию конденсированного хроматина с аппаратом транскрипции. Непосредственный механизм деацетилирования гистонов заключается в том, что МеСР2, связанный с метилированными основаниями, привлекает корепрессорный комплекс mSinЗА/НDАС, который и осуществляет деацетилирование гистонов. В результате последние приобретают положительный заряд и соответственно способность прочно взаимодействовать с витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы компактизуются и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции (рис. 6-3, см. цв. вклейку).

Таким образом, метилирование ДНК и деацетилирование гистоновых белков - взаимодополняющие процессы, участвующие в изменении структуры хроматина определенного хромосомного локуса и приводящие соответственно к отсутствию экспрессии генов без их структурных нарушений. Процессы метилирования и де ацетилирования могут происходить как последовательно, так и параллельно.

Обширный класс регуляторных РНК млекопитающих составляют очень короткие (21-25 нуклеотидов) молекулы, получившие название микроРНК (miРНК), и короткие интерферирующие РНК (siРНК). Предшественники miРНК - эндогенные короткие шпилечные структуры, а их мишени - другие локусы со сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью, где miРНК вызывают репрессию трансляции. siРНК образуются из более длинных двунитевых РНК или длинных шпилек, часто экзогенного происхождения. Их обычные мишени - гомологичные последовательности в том же локусе либо в другой части генома. siРНК разрушают мРНК этих последовательностей, переводя соответствующие гены в инактивированное состояние. Это явление называют РНК-интерференцией (РНКи). Различие между miРНК и siРНК несколько скрадывается вследствие того, что те и другие образуются посредством одних и тех же метаболических путей и имеют сходные механизмы действия. Получены убедительные данные о том, что miРНК и siРНК могут подавлять трансляцию мРНК (в случае неполной комплементарности) и расщеплять РНК-мишени (в случае полной комплементарности). Показано, что miРНК активно участвуют в процессах онтогенеза, метаболизма жира, секреции инсулина, гемопоэзе, развитии мышц, самообновлении и дифференцировке стволовых клеток, а также в канцерогенезе. Напротив, siРНК изначально рассматривали как систему противовирусной защиты и репрессии транспозонов, действующую при посредничестве РНКи. Результаты исследований позволяют предположить, что этот класс РНК принимает гораздо большее участие в регуляции генов и генома.

У млекопитающих miРНК имеют некоторые уникальные свойства. Около 50% их локализуется внутри интронов генов и транскрибируется совместно с того же промотора, остальные - из интронов и экзонов генов мРНК-подобной некодирующей РНК. Координированная экспрессия связана с тонкой регуляцией miРНК трансляции мРНК гена. Большинство miРНК кластерировано в геноме человека и экспрессируется совместно, что свидетельствует о необходимости более чем одной miРНК для регуляции экспрессии конкретного гена. Большинство miРНК консервативны и располагаются в районах, чаще всего вовлеченных в структурные перестройки хромосом, или в ломких сайтах. Установлено, что это имеет значение в развитии ряда генетических заболеваний и рака у человека.

Процессинг miРНК - двухступенчатый процесс расщепления более длинных первичных транскриптов (в том числе антисмысловых), представленных обычными пре-мРНК и некодирующими РНК (рис. 6-4, см. цв. вклейку). Было показано, что первичные транскрипты (длина - 100-1000 нуклеотидов), содержащие miРНК, синтезируются при участии РНК-полимеразы II, полиаденилируются и кэпируются. Процессинг этих транскриптов осуществляет белковый комплекс, состоящий из РНКазы III Drosha и белка DGCR8, связывающего двунитевую РНК. Он расщепляет шпильки РНК, содержащие большие (≥10 нуклеотидов) концевые петли, расположенные примерно на два витка спирали внутрь стебля, и вырезает предшественников длиной 65-75 нуклеотидов, называемых пре-miРНК. Затем пре-miРНК экспортируются из ядра переносчиком Exportin 5 и Ran-GTP и подвергаются процессингу цитоплазматической РНКазой III (эндонуклеазой Dicer), распадаясь на несовершенные дуплексы размером около 22 пар нуклеотидов с двунуклеотидными 3'-выступающими концами.

siРНК также образуются из двунитевых предшественников путем процессинга нуклеазой Dicer, но Drosha не участвует в этом процессе. Возможно, предшественники образуются эндогенно (например, из смысловых-антисмысловых транскриптов). Они могут быть и экзогенного происхождения, как было установлено при открытии РНК. siРНК могут катализировать разрушение эндогенных РНК с полностью комплементарной нуклеотидной последовательностью, что в настоящее время служит широко распространенным приемом изучения функций генов с помощью индуцированного siРНК адресного нокдауна гена.

После расщепления нуклеазой Dicer короткие дуплексы РНК встраиваются в рибонуклеопротеиновый комплекс RISC, в который входит один из белков семейства Argonaute. В RISC из прошедшего процессинг дуплекса всегда остается только одна цепь РНК. Выбор одной из двух цепей определяется относительной стабильностью разных концов дуплекса: предпочтение отдают той цепи, 5'-конец которой конъюгирован менее прочно. Затем RISC образует комплекс с РНКмишенью, что приводит либо к репрессии ее трансляции, либо, в случае полной или почти полной идентичности, к расщеплению РНК-мишени приблизительно в середине участка спаривания. Эндонуклеазная активность внутри комплекса RISC опосредована РНКаза-H-подобным доменом (piwi) в белке Argonaute. В качестве механизмов репрессии трансляции служит:

Были обнаружены miРНК, которые разрушают поли-А-хвост мРНК, тем самым нарушая физиологический процесс деаденилирования и созревания мРНК. Для siРНК характерен еще один способ инактивации экспрессии генов: они могут индуцировать метилирование CpG-островков промоторных районов генов.

Оба родителя передают потомкам совершенно идентичные гены, но в гаметогенезе они могут быть по-разному маркированы, вследствие чего их действие будет неодинаковым. Геномный импринтинг (ГИ) относят к эпигенетическим явлениям, подчеркивая этим наследуемость изменений генной активности, обусловленной родительским происхождением, а не структурной перестройкой генетического материала. Таким образом, ГИ можно определить как эпигенетический механизм регуляции экспрессии гомологичных генов в процессе развития организма в зависимости от родительского происхождения гена, хромосомы или генома. Импринтированные гены дифференциально экспрессируются в зависимости от материнского или отцовского происхождения, т.е. в диплоидной клетке млекопитающих они экспрессируются только с одного аллеля.

Нарушением, демонстрирующим импринтинг всего генома у человека, считают истинный пузырный занос - быстро малигнизирующуюся ткань хориона абортивного плодного пузыря. Цитогенетическими и молекулярно-генетическими методами было показано, что ткань пузырного заноса - продукт андрогенеза, т.е. возникает при оплодотворении яйцеклетки, лишенной хромосом матери, двумя сперматозоидами 22+X. Несмотря на существование полноценного диплоидного набора, ранний эмбриогенез таких андрогенетических зигот протекает аномально, ткани собственно эмбриона вообще не формируются, но бурно разрастается трофобласт. В случае двойного набора материнских хромосом (гиногенетическая зигота) развивается тератома - эмбриональная опухоль, включающая все три эмбриональных слоя и не содержащая плацентарную ткань. Следовательно, геном отца обеспечивает развитие плаценты, в то время как геном матери - раннее развитие эмбриональных структур. Будучи генетически импринтированным, только материнский или только отцовский геном не в состоянии обеспечить нормальное эмбриональное развитие.

Аномалии развития, свидетельствующие о ГИ, обнаружены в случаях триплоидии у человека. Триплоидный плод - андроид (2p+1m) - характеризуется большой головой, маленьким веретенообразным телом, синдактилией, отставанием в росте и развитии. Формируется большая кистозная плацента - частичный пузырный занос. У гиноида (2m+1p) плацента недоразвита, эмбрион не развивается и представлен недифференцированной клеточной массой. Это также подтверждает неэквивалентность функционирования мужского и женского генома.

На хромосомном уровне импринтинг был обнаружен при получении мышиных транслокационных гибридов, которые имели в хромосомном наборе фрагменты или целые хромосомы одного (материнского или отцовского) происхождения [однородительская дисомия (ОРД)]. Термины «однородительская дисомия» или «изодисомия » предложены Эриком Энжелом в 1980 г. и обозначают типы анеуплоидии в половых клетках млекопитающих, которые свидетельствуют о том, что у диплоидного потомка обнаруживают два локуса от одного родителя. ОРД по целым хромосомам или их фрагментам обнаружены при анализе наследственных нарушений у человека и будут описаны ниже. Сейчас в геноме человека известно около 90 импринтированных генов, имеющих тканеспецифическую моноаллельную экспрессию, хотя предполагают, что их может быть от 100 до 200.

Согласно современным представлениям, в основе геномного импринтинга у млекопитающих лежат специфические структурно-молекулярные изменения некоторых хромосомных участков, возникающие во время формирования мужских и женских половых клеток. Они приводят к стойким различиям экспрессии отцовских и материнских генов у потомства. Предполагают, что импринтинг модифицирует структуру гена так, что регуляторные факторы, действие которых манифестирует в клетке позднее, распознают импринтированные (меченые, видоизмененные каким-либо образом) материнские или отцовские аллели и избирательно их инактивируют.

Совокупность модификаций, которые по-разному маркируют родительские аллели и обеспечивают моноаллельный характер экспрессии импринтированных генов на хромосомах отцовского или материнского происхождения, называют эпигенотипом (импринтом).

При изучении механизмов импринтинга центральным считают вопрос о молекулярном происхождении тех эпигенетических модификаций, в которых записана информация (память) о функциональной активности генов на материнских и отцовских хромосомах. Существующие представления об эпигенетических модификациях были получены в результате поиска молекулярных различий между материнскими и отцовскими копиями импринтированных генов. Наиболее изученная эпигенетическая модификация, которой отводят основную роль в обеспечении процессов импринтинга, - специфическое метилирование цитозиновых остатков ДНК. Важнейшие особенности метилирования ДНК: стабильное сохранение в ряду многих поколений клеток и прямое или косвенное влияние на экспрессию генов.

В настоящее время установлено, что все известные импринтированные гены содержат области различного метилирования на двух родительских хромосомах, причем эти различия обязательны для их моноаллельной экспрессии. Необходимость процесса метилирования в обеспечении механизмов импринтинга была доказана в экспериментах на мышах с дефектным геном ДНКметилтрансферазы, у которых был утрачен моноаллельный характер экспрессии импринтированных генов H19, Igf2, Igf2r и Snrpn. У мышей, нокаутированных по гену метилтрансферазы, эмбриогенез останавливается на уровне восьми сомитов.

Гиперметилирование гена обычно подавляет его транскрипционную активность и в большинстве случаев происходит на неактивных аллелях. Дифференциальное метилирование родительских аллелей, как правило, случается внутри или рядом с CG-богатыми районами, которые нередко содержат разные типы прямых повторов. Установлены некоторые характерные особенности последних:

Дифференциально метилированные районы в некоторых случаях перекрываются с районами, с которых транскрибируются некодирующие и антисмысловые РНК, причем транскрипты включают блоки тандемных повторов. Предполагают, что эти РНК осуществляют регуляторные функции в импринтированных районах.

Функциональная активность импринтированных генов, помимо метилирования, в значительной степени определяется структурной организацией хроматина, что можно подтвердить явлениями асинхронной репликации и разной чувствительностью родительских аллелей к нуклеазной обработке. Исследование структуры хроматина в критическом районе хромосомы 15 показало, что промотор и первый экзон SNRPN гиперчувствительны к нуклеазам на отцовской хромосоме. Это свидетельствует о транскрипционно активном состоянии гена и о том, что эта часть центра импринтинга (ЦИ) контролирует отцовский эпигенотип. Район ЦИ, содержащий BD-экзоны и контролирующий переключение на материнский эпигенотип, оказался гиперчувствительным к нуклеазам на материнской хромосоме.

Одно из ведущих направлений в изучении механизмов импринтинга - наблюдение за изменением эпигенетических свойств отцовских и материнских аллелей на протяжении последовательных стадий онтогенетического развития и анализ влияния эпигенотипа на функциональную активность импринтированных локусов. В результате многочисленных экспериментов на мышах была подробно изучена динамика метилирования и деметилирования генома в ходе онтогенеза. В частности, было показано, что метилирование импринтированных, равно как и неимпринтированных, генов теряется («стирается») на самых ранних стадиях развития гамет, а именно в примордиальных герминальных клетках эмбриона (рис. 6-5, см. цв. вклейку). Во всех экспериментах с такими клетками зародышевого пути отмечена биаллельная экспрессия импринтированных локусов. Следовательно, на этом этапе эпигенетические различия между отцовскими и материнскими аллелями отсутствуют. Это подтверждают эксперименты, в которых после слияния зрелых лимфоцитов тимуса с клетками зародышевой линии на ранней стадии развития происходило массивное деметилирование всего генома лимфоцита, включая импринтированные и неимпринтированные локусы.

Установление метилирования в импринтированных локусах происходит на последующих этапах дифференцировки гамет. В овогенезе установление нового импринта происходит на стадии роста овоцита 1-го порядка. Срок установления мужского эпигенотипа в сперматогенезе окончательно не выяснен, но предполагают, что это происходит в сперматоцитах 1-го порядка до наступления (во время) профазы первого деления мейоза. Остается неясным механизм распознавания в отцовском и материнском гаметогенезе тех последовательностей, которые должны быть по-разному метилированы. В этом отношении представляет интерес обнаружение двух альтернативных способов сплайсинга 5?-экзонов гена DNMT1, один из которых реализуется в овогенезе, а второй - в сперматогенезе. Оказалось, что в сперматоцитах 1-го порядка на стадии профазы первого деления мейоза содержится та сплайс-форма DNMT1-мРНК, которая не транслируется и не дает белкового продукта. Овоцитспецифический сплайсинг гена DNMT1 сопровождается продукцией укороченных с N-конца молекул фермента, которые в большом количестве присутствуют в растущем овоците 1-го порядка и специфически метилируют будущие материнские аллели импринтированных генов. Возникает вопрос, каким образом в сперматогенезе происходит метилирование импринтированных локусов. Возможно, это происходит до наступления профазы первого деления мейоза с участием соматической изоформы DNMT1 или его осуществляют другие, пока неизвестные типы ДНК-метилтрансфераз или особая форма DNMT1.

После оплодотворения, между стадией 8-клеточного эмбриона и бластоцистой, у мыши происходит общее массивное деметилирование геномной ДНК, к которому устойчивы лишь некоторые импринтированные локусы. Метилирование ДНК начинается после имплантации эмбриона и продолжается в ходе гаструляции. Таким образом, аллельспецифический характер метилирования ДНК в ходе эмбриогенеза формируется постепенно, поэтому процессы импринтинга и метилирования могут носить многоступенчатый характер и приурочены к определенной стадии развития.

Хотя роль метилирования в обеспечении аллельспецифической экспрессии генов несомненна, остается неясным, служит оно первичным эпигенетическим сигналом, который стирается и устанавливается в гаметогенезе, или представляет некий вторичный процесс по отношению к более ранней стадии импринтинга и необходим лишь для поддержания ранее установленного импринта. Таким образом, механизмы геномного импринтинга, несмотря на значительное количество гипотетических моделей регуляции, во многом остаются неизученными.

Впервые синдром Прадера-Вилли (СПВ) (OMIM 176 270) был описан в 1956 г. Основные диагностические признаки: ожирение, мышечная гипотензия, низкий рост, гипогонадизм, умственная отсталость различной степени выраженности и признаки дизэмбриогенеза (долихоцефалия, миндалевидный разрез глазных щелей, гипертелоризм, эпикант, микрогнатия, рыбообразный рот, высокое нёбо, диспластичные ушные раковины, акромикрия, аномалии дерматоглифики и др.). Для пренатального периода характерна слабая подвижность плода, вследствие чего масса тела ребенка при рождении не превышает 2,8 кг. Неонатальному периоду свойственны гипорефлексия и скудное питание в результате ослабления сосательного и глотательного рефлексов. В результате глубокой гипотензии может возникнуть асфиксия. Затруднения при кормлении постепенно исчезают к возрасту 6 мес. В течение первых 12-18 мес развивается неконтролируемая гиперфагия, которая приводит к множеству соматических и физиологических нарушений, в частности к ожирению и сердечной недостаточности. Больные отстают в росте и развитии. Вторичные половые признаки, если и возникают, то слабо выражены у представителей обоих полов. Гипопигментацию обнаруживают у 75% больных. Продолжительность их жизни составляет 25-30 лет. Взрослым больным свойственны эмоциональная лабильность, сниженная моторная активность и познавательная способность, гиперфагия и умственная отсталость различной степени выраженности. Следует отметить, что СПВ характеризуется широким клиническим полиморфизмом. Регистрируют и неклассические формы заболевания. Именно поэтому необходимо дифференцировать СПВ с синдромом Коэна, Опица-Фриаса, Барде-Бидля, Олбрайта и умственной отсталостью, сцепленной с ломкой хромосомой Х. Частота обнаружения синдрома в различных популяциях составляет 1:10 000-20 000 новорожденных. Основная масса случаев возникает спорадически, но отмечают и семейные формы. Риск повторного рождения ребенка с СПВ зависит от генетической причины заболевания в каждом конкретном случае.

Синдром Ангельмана (СА) (OMIM 105 830) впервые был описан в 1965 г. и получил название синдрома «счастливой куклы». Основные диагностические признаки: микробрахицефалия с уплощенным затылком, большая нижняя челюсть, приоткрытый рот с выступающим языком, макростомия, редко растущие зубы, гипопигментация. Из неврологических нарушений наиболее характерны задержка умственного и моторного развития, атаксия, гипотензия, судорожная готовность, гиперрефлексия и гиперкинезия. Приступы неконтролируемого смеха, хлопанье в ладоши и специфическое выражение лица предопределили название синдрома. В 1982 г. он приобрел свое нынешнее название. Диагностика заболевания в первые годы жизни затруднена, а в дальнейшем его дифференцируют с синдромом Петерса-Пласа, Ретта, Смита-Магениса, Мартина-Белл и тригоноцефалией Опица. Гипопигментацию обнаруживают у 40% больных, и, как правило, она схожа с таковой при СПВ. Частота регистрации синдрома в популяции составляет 1:20 000.

Наиболее распространенный хромосомный дефект при СА и СПВ - интерстициальная делеция критического района 15(q11-q13) протяженностью 4 млн пар нуклеотидов, который содержит кластер импринтированных генов (2-3 млн пар нуклеотидов) и неимпринтированную область (1-2 млн пар нуклеотидов). Критическая для СПВ область занимает примерно половину района 15(q11-q13) и содержит четыре белок-кодирующих гена (ZNF127/MKRN3, MAGEL2, NDN, SNURF-SNRPN), ряд генов, кодирующих нетранслируемые РНК (ZNF127-AS / MKRN3-AS, IPW, C15orf2, UBE3A-AS), а также кластер генов, кодирующих малые ядрышковые РНК. Все перечисленные локусы экспрессируются моноаллельно на хромосоме отцовского происхождения. Моноаллельная экспрессия на материнской хромосоме показана для двух генов - UBE3A и ATP10C, расположенных в дистальной части района 15(q11-q13) (рис. 6-6, см. цв. вклейку).

Следует отметить, что для каждого из импринтированных генов в районе 15 (q11-q13) показана либо тканеспецифическая экспрессия (SNRPN, NDN, ZNF127), либо тканеспецифический импринтинг (UBE3A) в мозге.

Неимпринтированная область находится в дистальной части критического района и содержит несколько биаллельно функционирующих генов: локус Р/ OCA2 (отвечает за пигментацию кожи и глаз), гены GABRB3, GABRA3, GABRG3 (кодируют субъединицы рецептора γ-аминомасляной кислоты) и НЕRC2.

Существование генов, кодирующих нетранслируемую РНК, - общая характерная особенность всех известных импринтированных хромосомных доменов, в том числе и для района СА/СПВ. Некоторые из транскриптов синтезируются на антисмысловой цепи соответствующих генов, что обозначено аббревиатурой AS (antisense). Например, на антисмысловой цепи белок-кодирующего гена ZNF127 в противоположном направлении транскрибируется нетранслируемая РНК (ZNF127-AS), причем и ZNF127, и ZNF127-AS активны на отцовской хромосоме. Антисмысловая РНК обнаружена также для гена UBE3A, но, в отличие от ZNF127AS, транскрипция UBE3A и UBE3A-AS происходит на разных родительских хромосомах. UBE3A-AS экспрессируется на отцовской хромосоме лишь в тех тканях мозга, где UBE3A подвержен импринтингу и активен только на материнской хромосоме. В остальных тканях, где UBE3A экспрессируется биаллельно, UBE3A-AS транскрипт не обнаруживают.

Поскольку некодирующие и антисмысловые РНК часто служат продуктами импринтированных генов, высказывают предположение о том, что они участвуют в механизмах импринтинга и обеспечивают моноаллельную экспрессию некоторых генов. Антисмысловые РНК, благодаря образованию РНК-РНК-дуплексов, могут ингибировать трансляцию на смысловых РНК, стабилизировать смысловую РНК-цепь, участвовать в процессах экспорта мРНК из ядра, а также обеспечивать механизмы сплайсинга.

Подобно другим импринтированным кластерам, существуют значительные различия между отцовской и материнской копиями критического района 15 (q11-q13) в отношении ДНК-метилирования нескольких сайтов. Обнаружено несколько районов дифференциального метилирования (РДМ), основные из которых - локусы D15S63 (PW71), D15S9 (ZNF127) и SNRPN.

Наиболее детально аллельное метилирование изучено для гена SNRPN. Он содержит два РДМ: в промоторной области и интроне 7. Во всех исследованных соматических тканях промоторная область гена SNRPN метилирована на материнской хромосоме. На активной отцовской копии метилирование отсутствует. В интроне 7 обнаружен обратный характер аллельного метилирования.

Локусы критического района, характеризующиеся различным метилированием родительских аллелей, - важные диагностические маркеры при исследованиях ДНК у пациентов с СА и СПВ.

Наиболее распространенная причина возникновения СПВ и СА - протяженная делеция критического района 15(q11-q13). Ее обнаруживают у 70-75% пациентов, а в популяции - с частотой 0,67-1,0 на 10 000 новорожденных. Это позволяет считать ее одной из самых частых хромосомных перестроек у человека. Причиной СПВ становится делеция критического района на отцовской хромосоме 15, а СА возникает в случае делеции той же области на ее материнском гомологе.

Спорадический характер возникновения делеции критического района хромосомы 15(q11-q13) при СПВ и СА, ее стандартная протяженность в 95% случаев, строгая локализация точек разрыва и одинаковая частота развития обоих синдромов указывают на то, что возникновение делеции происходит в гаметогенезе родителей (одинаково часто в овогенезе и сперматогенезе) и объясняется мейотической нестабильностью этого хромосомного района.

Есть сообщения о вовлечении района 15(q11-q13), помимо делеций, в инвертированные дупликации (тетрасомия), дупликации (трисомия), несбалансированные (моносомия) и сбалансированные транслокации, а также в инверсии.

Известны некоторые особенности молекулярной организации критического района 15(q11-q13), которые способствуют процессу гомологической рекомбинации, что придает ему мейотическую нестабильность и объясняет высокую частоту аберраций в этой хромосомной области. Существует два кластера точек разрыва при делециях, картированных проксимальнее MKRN3 (см. рис. 6-6), причем на кластер, расположенный ближе к центромере, их приходится больше (около 65%). Дистальный кластер точек разрыва локализован теломернее гена OCA2, отвечающего за пигментацию организма. Молекулярными методами было показано, что делетируемый район фланкирован низкокопийными повторяющимися экспрессирующимися MN7 -последовательностями (относят к END -повторам), которые обеспечивают рекомбинационные события в мейозе и приводят к хромосомным перестройкам. Внутрихромосомные делеции происходят благодаря образованию большой (3-4 млн пар нуклеотидов) петли.

Вторая причина развития СПВ и СА - ОРД, т.е. наследование обоих гомологов хромосомы 15 от одного из родителей. Отцовская ОРД становится причиной заболевания у 3-5% пациентов с СА, а материнская ОРД - в 25% случаев СПВ. В силу функциональной неравнозначности отцовской и материнской хромосомы 15 существование у ребенка двух структурно полноценных хромосом материнского происхождения не обеспечивает нормального развития и, как в случае отцовской делеции, приводит к развитию СПВ. Аналогично этому отцовская ОРД приводит к развитию СА. У большинства больных с СПВ, имеющих ОРД, регистрируют гетеродисомию, возникающую вследствие нерасхождения материнских хромосом в первом делении мейоза. Отцовская ОРД при СА, как правило, манифестирует изодисомией и возникает путем коррекции моносомии до дисомии. Так как зиготы, несущие моно- и трисомию по хромосоме 15, нежизнеспособны, удвоение единственной хромосомы при моносомии и потерю лишней хромосомы при трисомии можно считать «аварийными» мерами, после которых становится возможным дальнейшее развитие эмбриона.

Несмотря на то что и материнская ОРД при СПВ, и отцовская ОРД при СА возникают вследствие нерасхождения хромосом в овогенезе, ОРД у пациентов с СПВ регистрируют значительно чаще. Это можно объяснить большей выживаемостью зигот с трисомией по хромосоме 15 и ранней гибелью моносомных зигот. Кроме того, потеря лишней хромосомы в трисомной клетке, по-видимому, более вероятное событие, чем удвоение хромосомы в моносомной клетке на ранней стадии развития.

Были описаны пациенты (не более 5%) с клиническим диагнозом СА и СПВ, у которых не было типичных делеций района 15(q11-q13) и ОРД, но, как и в случае ОРД, присутствовал одинаковый характер метилирования обеих родительских копий этой критической области. Следовательно, характер метилирования и экспрессии генов на одной из родительских хромосом у таких пациентов был изменен на обратный (инвертирован). Это объясняли нарушением переключения (заменой) эпигенотипа хромосом в гаметогенезе одного из родителей вследствие ошибок импринтинга. Если в сперматогенезе отца на его материнской хромосоме не происходит замены женского импринта на мужской, то в следующем поколении, после объединения с материнским геномом, возникнет состояние, аналогичное материнской ОРД и функционально равнозначное отцовской делеции, которое будет сопровождаться фенотипом СПВ. Нарушение установления женского эпигенотипа на отцовских хромосомах в овогенезе матери приведет к развитию СА у потомства.

Молекулярно-генетические исследования у таких пациентов показали, что ошибки импринтинга часто сопровождаются микроделециями особой регуляторной области, расположенной в пределах СА/СПВ-кластера импринтированных генов. Эта область протяженностью 100 тыс. пар нуклеотидов была названа ЦИ (см. рис. 6-6).

Поскольку наименьшие области перекрывания всех делеций ЦИ при СА и СПВ не совпадают, в составе ЦИ принято различать две компоненты. Микроделеции в проксимальной части этого района (ЦИ-СА), находящейся на 25-30 тыс. пар нуклеотидов центромернее промоторной области гена SNRPN, регистрируют у пациентов с СА. Минимальный район перекрывания всех делеций ЦИ при СА имеет длину 1,15 тыс. пар нуклеотидов и содeржит BD -экзоны, которые обнаруживают в составе одной из возможных сплайс-форм гена SNRPN. Они кодируют нетранслируемую РНК. Следует отметить, что экспрессия BD-экзонов, обеспечивающих установление женского эпигенотипа, происходит только в овогенезе и, подобно гену SNRPN, только на отцовской хромосоме. Гиперметилирование BD-локусов показано на обеих родительских хромосомах.

При СПВ обнаруживают микроделеции второго (дистального) компонента ЦИ (ЦИ-СПВ), который представлен промоторной областью и первым экзоном гена SNRPN. Наименьший район перекрывания микроделеций ЦИ при СПВ составляет 4,3 тыс. пар нуклеотидов.

Собственно делеции ЦИ не сопровождаются развитием патологического фенотипа и могут существовать у здоровых родителей и других родственников пациента. Анализ родословных тех семей с СПВ и СА, где есть делеции ЦИ, свидетельствует о том, что они могут наследоваться в семьях без фенотипических признаков через несколько поколений одного и того же пола (рис. 6-7, см. цв. вклейку). Например, делеция ЦИ-СА - области, ответственной за установление материнского эпигенотипа, - может наследоваться через несколько поколений (от отца к сыну) до тех пор, пока не будет передана дочери. В этом случае дочь будет здорова, но в ее овогенезе импринт отцовской хромосомы не заменится на материнский. Ребенок этой женщины (независимо от пола) с вероятностью 50% получит от матери хромосому с ошибочным отцовским эпигенотипом и будет иметь клиническую картину СА. Аналогично этому возможно скрытое наследование делеций ЦИ-СПВ в ряду поколений от матери к дочери, но риск рождения больного ребенка с СПВ у мужчины-носителя такого нарушения также составляет 50%.

Все случаи СПВ и СА вследствие ошибок импринтинга, но без делеций ЦИ, спорадические. Действительно, есть сообщения о том, что здоровые сибсы могут наследовать ту же хромосому, которая у больного брата или сестры несет ошибочный эпигенотип. Таким образом, риск повторного рождения больного ребенка в таких семьях крайне мал, а в случае делеции ЦИ он равен 50%. Целесообразность выделения двух групп пациентов на основе существования или отсутствия делеций ЦИ объясняют необходимостью расчета риска повторного рождения больных детей, от которого зависит тактика генетического консультирования семьи. Высказывают предположение о том, что спорадические случаи ошибок импринтинга без делеций ЦИ - результат случайных сбоев в многоэтапном процессе становления эпигенотипа, которые могут быть связаны со структурными нарушениями в других (помимо ЦИ) цис-регуляторных последовательностях или дефицитом пока неизвестных внехромосомных транс-действующих факторов.

Предложена следующая схема функционирования ЦИ (см. рис. 6-6). Непосредственный объект регуляции для ЦИ - лишь те гены, которые в норме активны на отцовской хромосоме, в том числе и локус, кодирующий антисмысловой транскрипт гена UBE3A. Экспрессия UBE3A регулируется через функцию антисмыслового транскрипта UBE3A-AS (antisense), т.е. активация UBE3A на материнской хромосоме - следствие подавления транскрипции антисмысловой цепи на этой же хромосоме. Согласно этой модели, прямое назначение ЦИ-СПВ - установление в гаметогенезе и поддержание в соматических тканях активной транскрипции генов на отцовской хромосоме. В случае наследования делеции ЦИ-СПВ от отца возникает фенотип СПВ и происходит биаллельная экспрессия UBE3A как следствие инактивации UBE3A -AS на отцовской хромосоме. В соответствии с этой схемой, роль ЦИ-СА сводится к отмене функции ЦИ-СПВ в овогенезе и сдерживанию тех процессов, которые реализуются под контролем последнего в сперматогенезе. Именно поэтому в результате делеции ЦИ-СА становится невозможной инактивация отцовских генов на материнской хромосоме (в том числе UBE3A-AS), а значит, и активация гена UBE3A. При наследовании такой делеции от матери возникают биаллельная экспрессия отцовских генов и «молчание» гена UBE3A.

Благодаря этой модели становится понятным тот факт, что делеции ЦИ при СА никогда не распространяются на область ЦИ-СПВ, но в то же время делеции ЦИ у некоторых пациентов с СПВ перекрывают район ЦИ-СА. Незаконная активация отцовских генов на материнской хромосоме в результате делеции ЦИ-СА возможна только при условии сохранности ЦИ-СПВ.

Таким образом, ЦИ имеет две основных функции:

Гены-кандидаты и их участие в формировании фенотипических признаков синдрома Прадера-Вилли и синдрома Ангельмана

СПВ сопровождается потерей функции генов критического района 15(q11-q13), которые в норме экспрессируются только на хромосоме отцовского происхождения. Точковых мутаций, приводящих к СПВ, ни в одном из этих генов обнаружено не было. На моделях животных показано, что отсутствие любого из этих генов приводит к определенным аномалиям, поэтому СПВ можно охарактеризовать как синдром последовательности импринтированных генов, имеющих отцовскую экспрессию, а сам критический район - как комплекс импринтинга (contiguous gene imprinting complex).

В то же время почти в 20% случаев СА мутации в основном обнаруживают в гене-кандидате UBE3A. Он состоит из 16 экзонов и кодирует фермент E6-AP убиквитинпротеинлигазу. Экспрессия этого белка существует во всех тканях человека, причем в ряде структур мозга ген UBE3A активен лишь на материнской хромосоме. У мышей моноаллельная экспрессия гена Ube3a была показана в клетках Пуркинье коры мозжечка, нейронах гиппокампа и обонятельной луковицы. В остальных отделах мозга и других органах установлен биаллельный характер экспрессии. Дефицит материнской копии гена UBE3A в клетках Пуркинье может объяснить атаксию и тремор, возникающие у пациентов с СА, а эпилептические припадки и невозможность обучения таких больных могут быть связаны с отсутствием экспрессии этого гена в нейронах гиппокампа.

Характерная особенность генов с тканеспецифичным импринтингом - существование нетранслируемых экзонов и нескольких промоторов. UBE3A транскрибируется с нескольких промоторов и имеет семь нетранслируемых экзонов в 5'-части гена.

Белок E6-AP (продукт гена UBE3A) входит в состав мультиферментного комплекса, обеспечивающего присоединение к цитоплазматическим белкам молекулы небольшого белка убиквитина, состоящего из 76 аминокислот. После этого они становятся мишенями для деградации в протеосомаx. Этот белок также служит транскрипционным коактиватором для рецепторов стероидных гормонов, т.е. функционирует одновременно в качестве убиквитинлигазы и транскрипционного фактора. Обе эти активности независимы друг от друга, поскольку регуляцию транскрипции опосредует N-концевой домен, а убиквитинирование сопряжено с C-концевой частью белка.

В 3?-нетранслируемом районе UBE3A обнаружен промоторный район другого гена, имеющего транскрипт длиной 3,5 тыс. пар нуклеотидов. Этот транскрипт экспрессируется с материнского аллеля в мозге, но мутации в нем не обнаружены. Кроме того, в этом же районе локализован антисмысловой транскрипт, включающий полностью смысловой транскрипт длиной 3,5 тыс. пар нуклеотидов и почти половину UBE3A. Он экспрессируется в мозге преимущественно с отцовского аллеля.

В результате обследования методом прямого секвенирования пациентов с клиническим диагнозом СА, у которых зарегистрирован нормальный статус метилирования локусов критического района, мутации были обнаружены в 75% семейных и 23% спорадических случаев заболевания. Во всех информативных семьях, где были обнаружены мутации, фенотип СА отмечен только в случае наследования мутации от матери. Мутации гена UBE3A на отцовской хромосоме фенотипически не манифестируют. Преобладают мутации со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутации. Миссенс-мутации, по-видимому, существенно не нарушают функцию белкового продукта, и фенотип у таких пациентов отличается от характерного для СА. Отсутствие молекулярного дефекта у части пациентов можно объяснить неточностью клинического диагноза в связи с вариабельностью фенотипических признаков и несовершенством диагностических критериев заболевания.

В 200 тыс. пар нуклеотидов дистальнее гена UBE3A расположен ген, кодирующий аминофосфолипидтранспортирующую АТФазу - ATP10C. Установлено, что он экспрессируется преимущественно с материнского аллеля в фибробластах и различных структурах мозга. Его функция состоит в поддержании контактов между клеточными мембранами и передаче сигналов в ЦНС. Вполне вероятно, что отсутствие экспрессии гена в мозге при СА может приводить к более тяжелым симптомам, связанным с тяжелым аутизмом у больных.

Патогенез эпилептических припадков при СА связывают с кластером ГАМКAрецепторных генов, которые располагаются между геном UBE3A и локусом P и поэтому попадают в область наиболее частых делеций. Один из этих генов - GABRB3 - кодирует β₃-субъединицу ГАМК-рецептора. У экспериментальных мышей, несущих гомозиготную делецию гена Gabrb3, отмечают нарушения памяти, неспособность к обучению, судорожные припадки и моторные нарушения, сходные с симптомами СА. Животные, гетерозиготные по этой делеции, имеют менее выраженные неврологические расстройства. Следовательно, клинические симптомы СА в случае протяженной делеции, по крайней мере частично, могут быть обусловлены гаплонедостаточностью гена GABRB3.

В область наиболее частых делеций при СА и СПВ также попадает OCA2, который функционирует биаллельно и располагается в дистальной части критического района. Потеря обоих аллелей этого гена у человека и мыши приводит к альбинизму, а у гетерозигот по мутациям отмечают незначительное снижение пигментации. Действительно, гипопигментация кожи при СПВ и СА возникает только в случае протяженных делеций критического района, но отсутствует у пациентов с ОРД, мутациями ЦИ и точковыми мутациями в гене UBE3A.

Поскольку непосредственной причиной СПВ и СА становится потеря функции генов критического района 15(q11-q13) на отцовской и материнской хромосомах соответственно, а экспрессия генов в этой области строго соотносится с характером метилирования ДНК, молекулярно-диагностический тест для СПВ и СА основан на определении статуса метилирования импринтированных генов. При СПВ, независимо от причины его возникновения (отцовская делеция, материнская ОРД или мутация ЦИ), присутствуют только метилированные аллели локусов D15S63, ZNF127 и промоторной области гена SNRPN. Случаи СА (кроме точковых мутаций в гене-кандидате UBE3A) характеризуются присутствием только неметилированных аллелей этих же локусов. В качестве основного используют метод метилспецифической ПЦР. Он прост, удобен, и его можно применять в качестве скрининговой ДНК-диагностики СПВ и СА. Тем не менее он не позволяет точно установить молекулярно-генетическую причину заболевания, что имеет большое значение для медико-генетического консультирования семьи.

Именно поэтому с целью определения делеций и однородительских дисомий можно использовать анализ микросателлитных локусов D15S11, D15S113 и GABRB3, характеризующихся большим количеством аллелей и высокой гетерозиготностью. Делеции стандартной протяженности обычно перекрывают все три локуса, а их изучение можно проводить методом мультилокусной ПЦР с тремя парами праймеров.

В случае отсутствия делеций и ОРД при подтвержденном с помощью анализа метилирования диагнозе СА или СПВ можно предполагать делеции или мутации в ЦИ. В случае СА, если результат анализа метилирования отрицательный, причиной наследственного нарушения могут служить мутации в гене-кандидате UBE3A.

Обнаружение мутаций в гене UBE3A и структурных аномалий ЦИ имеет большое значение для медико-генетического консультирования семьи и планирования рождения здорового потомства, поскольку именно эти генетические причины обусловливают максимальный риск повторного рождения ребенка с СПВ или СА. Кроме указанных молекулярных тестов, в диагностический протокол обязательно должен входить кариотипический анализ, так как при СА и СПВ возможны хромосомные перестройки, которые не всегда можно определить методами ДНКанализа.

Синдром Беквита-Видеманна (СБВ) (OMIM 130 650) - распространенное заболевание, регистрируемое с частотой один случай на 10 000-12 000 новорожденных. Наиболее важны для диагностики следующие клинические признаки: пупочная грыжа, макроглоссия и гигантизм (средняя масса тела при рождении - 3900 г). Отмечают гипоплазию средней трети лица и верхней челюсти, гемангиомы на лбу, прогнатизм, вертикальные складки или бороздки на мочках, небольшие полулунные вдавления на задней поверхности завитков ушных раковин, пигментные невусы на коже лица и затылка, а также долихоцефалию.

Характерна висцеромегалия, выражающаяся в увеличении печени, почек, селезенки, поджелудочной железы, надпочечников, гонад и предстательной железы. Предполагают, что клеточная гиперплазия и гипертрофия - следствие того, что часть эмбриональных клеток продолжает секретировать паракринные и (или) эндокринные факторы роста в пренатальной и постнатальной фазе онтогенеза. У большинства новорожденных регистрируют гипогликемию, что может приводить к неврологическим нарушениям. Умственную отсталость обнаруживают в 15% случаев. Важный признак синдрома - повышенная предрасположенность к возникновению опухолей: частота нефробластомы составляет 59%, карциномы надпочечников - 15%, гепатобластомы - 2%. Остальные формы опухолей возникают с меньшей частотой. Гемигипертрофию отмечают в 12,5% случаев, а у больных с новообразованиями - почти в 50%.

Клинические признаки синдрома достаточно разнообразны, и классическое сочетание трех основных диагностических симптомов не обязательно. В настоящее время общепринято, что синдром наследуется по аутосомно-доминантному типу с неполной пенетрантностью и вариабельной экспрессивностью, причем значительную компоненту в его наследование вносит импринтинг. Семейное накопление клинических признаков отмечено в 15% случаев СБВ.

Организация хромосомного района 11р15.5 напоминает таковую района 15q11.2. Он содержит кластер импринтированных генов, перемежающихся неимпринтированными (рис. 6-8, см. цв. вклейку). Можно выделить несколько импринтированных генов, которые чаще всего участвуют в формировании фенотипа СБВ.

Ген CDKN1C кодирует ингибитор циклинзависимой киназы, относящейся к CIPсемейству регуляторов клеточного цикла. Гиперэкспрессия гена, также известного как Р57^KIP2, может останавливать клеточный цикл на границе G₁. Это наиболее реальный ген-кандидат для синдрома, так как у отдельных больных в нем обнаруживают мутации. Мыши, мутантные по этому гену, имеют дефекты передней брюшной стенки, медуллярную дисплазию почек и цитомегалию надпочечников, хотя другие признаки СБВ отсутствуют. Ген служит негативным регулятором клеточного цикла и экспрессируется с материнской хромосомы.

Ген KCNQ1 кодирует заслонку калиевых каналов, экспрессируется биаллельно только в сердечной мышце, а обнаруженные точковые мутации сопровождаются либо доминантно наследуемым дефектом проводимости сердечной мышцы (выражается удлинением интервала Q-T и желудочковой аритмией, называемой LQT-синдромом), либо аутосомно-рецессивным синдромом Джеруэлла-ЛангеНилсена, при котором обнаруживают глухоту и аналогичные аномалии проводимости. Ген содержит 19 экзонов, занимает более 400 тыс. пар нуклеотидов геномной ДНК, экспрессируется практически во всех тканях с материнского аллеля и почти не экспрессируется в мозге и скелетных мышцах. Известны четыре изоформы его транскриптов. Первая форма транскрибируется только с материнского аллеля и обнаружена в большинстве тканей, вторая транскрибируется биаллельно в сердечной мышце, а третья и четвертая формы не транслируются. Роль этого гена в патогенезе СБВ на сегодняшний день не ясна, но поскольку он кодирует множество нетранслируемых транскриптов, нельзя исключить его роль в поддержании импринтинга. В интроне 10 гена KCNQ1 обнаружен ген KCNQ1OT1/LIT1, транскрибирующийся с антисмысловой цепи отцовской хромосомы. Индуцированные мутации или делеции, повреждающие CpG-островок Lit1, у мышей приводили к экспрессии Kcnq1 и p57 с отцовской хромосомы. В значительном числе случаев СБВ установлена биаллельная экспрессия гена LIT1, тогда как в нефробластомах обнаруживают только моноаллельную экспрессию гена.

IGF2 (инсулиноподобный фактор роста) кодирует фетальный ростовой фактор, и его аномальная экспрессия может вызывать органомегалию при СБВ. Он служит митогеном практически для всех типов клеток, но специфически модулирует рост и дифференциацию мышечных клеток. И в эмбриональных, и в зрелых тканях он экспрессируется только с отцовской хромосомы. Биаллельную экспрессию IGF2 часто обнаруживают в нефробластомах, рабдомиосаркомах, карциномах кортикального слоя надпочечников и других эмбриональных опухолях, характерных для СБВ. Его гиперэкспрессия у трансгенных мышей вызывает увеличение размеров тела, макроглоссию, органомегалию и опухоли.

Ген H19 экспрессируется с материнской хромосомы и кодирует нетранслируемую РНК с неизвестной функцией. Мыши с его делецией полностью имитируют эпигенетическое нарушение регуляции экспрессии гена IGF2 при СБВ, что выражается в увеличении размеров тела и экзомфалосе. При исследовании метилирования гена во время эмбриогенеза мыши установлено, что оба аллеля не метилированы в эмбриональных герминальных клетках. Метилирование отцовского аллеля происходит в середине плодного периода.

Гены H19 и IGF2 тесно сцеплены, противоположно импринтированы и их экспрессию регулирует общий энхансер, расположенный в 3?-области H19 (рис. 6-9). В нескольких тысячах пар нуклеотидов от 5?-области H19 был обнаружен дифференциально метилированный протяженный район, который, видимо, служит ключевым (СБВ-ЦИ1) и необходим для импринтинга обоих генов. В метилированном состоянии на отцовской хромосоме он требуется для выключения H19, а на материнской хромосоме, будучи неметилированным, он участвует в выключении IGF2. Этот СБВ-ЦИ1 содержит последовательность около 45 пар нуклеотидов, представленных гуанином и цитозином, которая соответствует В-повторам и гомологична гиперчувствительным к ДНКазе районам. Делеции этого участка на отцовской хромосоме приводят к активации H19, а на материнской хромосоме они не влияют на экспрессию гена. На материнской хромосоме неметилированный СБВ-ЦИ1 содержит гиперчувствительные к ДНКазе сайты, что свидетельствует о его активности, и сайты связывания белка CTCF, который, как известно, может блокировать энхансеры.

СБВ-ЦИ1 содержит элемент, напоминающий своими свойствами инсулятор, блокирующий или модулирующий доступ энхансера к промоторным районам генов. В активном состоянии СБВ-ЦИ1 эффективно блокирует взаимодействие энхансера с промоторным районом IGF2, который не может экспрессироваться на материнской хромосоме. На отцовской хромосоме СБВ-ЦИ1 метилирован, не способен связывать CTCF и не препятствует возможности активации IGF2 энхансером. В то же время, будучи метилированным, он вызывает инактивацию H19 на отцовской хромосоме. CTCF - первый обнаруженный белок, который необходим для нормального функционирования эпигенетической метки. Таким образом, СБВ-ЦИ1 выступает в качестве пограничного элемента или инсулятора, блокирующего взаимодействие IGF2 с энхансером, расположенным в 3?-области гена H19. Блокирующее действие полностью теряется, если район метилирован.

В 5?-районе IGF2 обнаружен еще один РДМ, метилированный на отцовской хромосоме. Он обладает свойствами сайленсера и в активном состоянии блокирует экспрессию IGF2 на материнской хромосоме в тканях мезодермального происхождения, но не в мышцах. Если делеция этого района унаследована от матери, то блокирующий IGF2 эффект отсутствует - ген экспрессируется биаллельно [потеря импринтинга (ПИ)]. Если делеция имеет отцовское происхождение, то транскрипция отцовского аллеля IGF2 не нарушена. В 3?-области IGF2 обнаружен еще один регуляторный элемент, обладающий свойствами сайленсера, но не имеющий дифференциального метилирования. У мышей при делеции сайленсера 2 на материнской хромосоме происходит биаллельная экспрессия IGF2 преимущественно в мышцах и, особенно, в языке, что приводит к макроглоссии. Делеция сайленсера 2 на отцовской хромосоме не изменяет степень экспрессии IGF2.

Рис. 6-9. Схема функционирования центра импринтинга 1 при синдроме Беквита-ВидеманнаМолекулярные нарушения, приводящие к синдрому Беквита-Видеманна

При СБВ часто обнаруживают как структурные, так и функциональные нарушения. Структурные изменения короткого плеча хромосомы 11 при СБВ составляют около 2% и представлены спорадическими дупликациями, частичной трисомией отцовской хромосомы либо унаследованными от матери сбалансированными транслокациями или инверсиями.

Среди семейных случаев СБВ почти в 40% обнаруживают мутации гена CDKN1C, а в спорадических - не более чем в 5%. Ген IGF2, экспрессирующийся с отцовской хромосомы, рассматривают как другой ген-кандидат для СБВ. В нем не обнаруживают мутации, но у больных с СБВ определяют биаллельную экспрессию гена, т.е. он начинает либо экспрессироваться с материнской хромосомы, либо биаллельная экспрессия является результатом отцовской ОРД. Такое явление называют ПИ и обнаруживают у 20% больных с СБВ. В случае отцовской ОРД биаллельная экспрессия IGF2 сопровождается биаллельным отсутствием экспрессии гена H19. В ряде случаев аномальная экспрессия этих двух генов происходит не в результате ОРД, что заставляет предполагать существование некоего регуляторного района, который может соответствовать ЦИ. Его патологическое изменение на материнской хромосоме вызывает активацию одного гена и инактивацию другого. В 5?-районе H19 расположен CpG-обогащенный район протяженностью более 700 пар нуклеотидов, метилированный на отцовской хромосоме. Его делеция или метилирование приводит к потере импринтинга IGF2 на материнской хромосоме и биаллельной экспрессии. СБВ-ЦИ1 контролирует моноаллельную экспрессию двух противоположно импринтированных генов, что заставляет предполагать присутствие в нем двух функционально различных регуляторных элементов.

У одного из больных с СБВ, имеющего унаследованную сбалансированную инверсию хромосомы 11p с точкой разрыва в СБВ-ХР1, была обнаружена ПИ IGF2 при нормальном эпигенотипе H19. Основная масса спорадических больных без хромосомных нарушений имеет именно такое состояние этих двух генов, что заставило предполагать существование еще одного регуляторного центра (СБВ-ЦИ2), патологические изменения которого приводят к СБВ. СБВ-ЦИ2, представленный РДМ и сайтом связывания CTCF, был обнаружен в интроне 10 гена KCNQ1 перед геном LIT1, который транскрибируется с антисмысловой цепи только отцовского аллеля. Показано, что экспрессия LIT1 в норме служит негативным регулятором активности генов KCNQ1 и Р57^KIP, которые в норме имеют материнскую экспрессию. Экспрессия гена LIT1 с материнской хромосомы приводит к инактивации этих нормально функционирующих генов, что отмечают при СБВ.

Было показано, что этот район метилирован в ооцитах и не метилирован в спермиях. Такие же различия обнаружены в зиготе и эмбриональных стволовых клетках, т.е. РДМ действительно имеет признаки СБВ-ЦИ2. Больные, у которых был установлен нормальный паттерн метилирования гена H19, в то же время имели потерю метилирования СБВ-ЦИ2 на материнском аллеле и экспрессию LIT1. Оказалось, что в большинстве случаев СБВ (до 58%) обнаруживают его биаллельную экспрессию, т.е. происходит ПИ, аналогичная IGF2. Показано, что ПИ IGF2 и LIT1 при СБВ может происходить и раздельно, и сочетанно. При молекулярном исследовании, проведенном у группы больных с СБВ, было установлено, что в 20% присутствует ОРД и ПИ генов IGF2 и LIT1. Изолированная ПИ IGF2 отмечена у 7% больных, а изолированная ПИ LIT1 зарегистрирована в 55% случаев. У последней группы больных опухоли не обнаружены, тогда как пациенты с ПИ IGF2 или ОРД в 33% случаев имели характерные для синдрома новообразования.

Таким образом, критический для СБВ импринтированный район хромосомы 11р15.5 содержит, по крайней мере, два ЦИ, находящихся на расстоянии 600 тыс. пар нуклеотидов, нарушения функционирования которых могут приводить к заболеванию; т.е. эпигенетические нарушения могут возникать в 70-80% случаев. Структурные и функциональные нарушения при СБВ определяют в 85-95% случаев.

Причины, приводящие к СБВ, могут быть как генетическими, так и эпигенетическими, поэтому для правильной оценки структурных и функциональных нарушений импринтированного локуса необходимо использовать комплекс молекулярных методов. В качестве первого диагностического шага следует охарактеризовать статус аллельного метилирования генов IGF2 и LIT1 c использованием метилчувствительной ПЦР. Поскольку анализ аллельного метилирования позволяет определить патологические изменения, но не дает ответа, что послужило причиной заболевания, необходимо определить ОРД при СБВ. Для этого используют анализ микросателлитного полиморфизма ДНК-маркеров D11S4088 и D11S922, расположенных в критическом районе. Обычно отцовскую дисомию определяют у больных с СБВ в 17-20% случаев. Описано несколько мозаичных случаев ОРД в культуре фибробластов. В частности, у двух больных была установлена дисомия, которая присутствовала только в фибробластах кожи, причем только с одной стороны тела. Вероятно, частота ОРД может быть несколько выше, но ее не всегда обнаруживают, так как анализ, как правило, проводят на образцах периферической крови.

У больных без определенного молекулярного дефекта можно предполагать, что причиной изменений служит изолированное нарушение метилирования гена Н19 или мутации гена Р57^KIP2. ДНК-диагностические подходы показывают значительную эффективность и могут быть использованы как скрининговые для подтверждения или исключения диагноза СБВ и поиска молекулярного дефекта в нефробластомах.

Синдром Сильвера-Рассела (СРС) (OMIM 180 860) относят к категории относительно распространенных наследственных болезней. По разным оценкам, его частота в различных популяциях составляет от 1:3000 до 1:100 000 новорожденных. Ведущий симптом СРС - задержка физического развития, по мере взросления человека реализующаяся в состояние, традиционно называемое в медицине карликовостью. Кроме того, фенотип СРС включает определенные особенности лица и тела, а также обмена веществ.

Обычно низкие показатели физического развития (рост и масса тела) у ребенка с СРС существуют уже на момент рождения, но могут возникать и в периоде постнатального развития. Весьма характерны низкие темпы линейного роста ребенка и плохая динамика набора массы тела, а также позднее закрытие родничков. Для классической формы СРС типичны внешние признаки: псевдогидроцефалия (визуальное преобладание мозговой части черепа над лицевой), треугольный контур лица с высоким лбом и мелкими чертами; асимметрия лица; опущенные углы рта; микрогнатия и микрогения; голубые склеры. Асимметрия может затрагивать не только лицевые структуры: нередко при СРС отмечают гемигипертрофию конечностей. Среди других признаков заболевания описывают повышенную потливость волосистой части головы и верхней части туловища в младенческом периоде, затруднение грудного вскармливания, склонность к гипогликемическим состояниям, клинодактилию мизинцев и синдактилию II и III пальца. В ряде случаев у пациентов с СРС были отмечены врожденные пороки развития (гипоспадия у мальчиков; задние клапаны мочеиспускательного канала; пороки сердца у детей обоих полов), а также тенденция к развитию злокачественных опухолей: гепатоклеточной карциномы, семиномы, краниофарингеомы и опухоли Вильмса.

Показатели нервно-психического развития ребенка при классической форме СРС также имеют тенденцию к задержке. Как правило, дети, страдающие указанным заболеванием, позже своих здоровых сверстников начинают сидеть, ползать и ходить. Примерно у половины детей с СРС возникают нарушения интеллектуального развития, преимущественно связанные с когнитивными способностями.

В основном регистрируют спорадические случаи заболевания, хотя описаны единичные семьи с аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным и Х-сцепленным наследованием. В ряде случаев были обнаружены различные хромосомные аномалии [частичные трисомии длинного плеча хромосомы 1q42, делеция 8(q11-q12), делеция 13(q22-q32) и делеция 18р]. Описано несколько случаев определения кольцевой хромосомы 15 с делецией района 15q26.3, в котором картирован ген IGF1R. Изолированные делеции этого гена сопровождаются сильным отставанием в росте, формированием треугольного лица, клинодактилией, микрогнатией, микроцефалией и умственной отсталостью, но мутации гена при СРС не обнаружены. У пациентов с СРС-подобным фенотипом описано несколько сбалансированных транслокаций с одной из точек разрыва в хромосоме 17(q24-q25). В этом районе расположен кластер генов гормона роста; их делеции обнаружены у индивидуумов без синдромальных нарушений.

На сегодняшний день установлено, что существуют две основные причины возникновения СРС:

В литературе описано более 60 случаев изодисомии (материнская дупликация) и гетеродисомии материнского происхождения. На хромосоме 7 расположены, по крайней мере, три района, содержащих импринтированные гены. Район короткого плеча 7(р11.2-р13) содержит импринтированный ген GRB10, кодирующий цитоплазматический адаптерный белок, который служит негативным регулятором тирозинкиназных рецепторов сигналинга (например, IGF1R). Мышиный ген импринтирован, экспрессируется с материнской хромосомы во всех тканях, кроме мозга, в котором экспрессируется отцовский аллель. Делеции материнского аллеля гена приводят к увеличению роста у потомства, свидетельствуя о его функционировании в качестве негативного регулятора роста. У человека отцовская экспрессия гена установлена в головном и спинном мозге, материнская - в скелетных мышцах, а во всех остальных тканях ген экспрессируется биаллельно. Поиск мутаций в гене GRB10 у больных с СРС не привел к находкам, как, впрочем, и попытка обнаружения аномалий метилирования в регуляторной области.

Длинное плечо хромосомы 7q32.2 содержит пять импринтированных генов, включая MEST, COPG2IT1 и MESTIT1, экспрессирующихся с отцовской хромосомы, и CPA4 и KLF14 (экспрессируются с материнской хромосомы).

Обнаружение сегментных материнских ОРД по участкам 7(q31-qter), 7(q21qter) и 7(q11.2-qter) у пациентов с СРС подтвердило ассоциацию длинного плеча хромосомы 7 с задержкой роста и СРС-подобным фенотипом, а также позволило ограничить район-кандидат до 35 млн пар нуклеотидов.

MEST имеет две изоформы, одна из которых экспрессируется с отцовского аллеля, а вторая, использующая альтернативный первый экзон, - биаллельно во всех тканях, кроме плаценты. Нокаут гена у мышей приводит к малому размеру потомства, но ни мутаций, ни аномального метилирования у пациентов с СРС не обнаружено. Импринтированная антисмысловая РНК MESTIT1, исследованная на предмет мутаций, таковых не показала. Они также не были обнаружены в генах CPA4 и KLF14.

Импринтированный локус на хромосоме 7q21.3 содержит гены PEG10 и SGCE, имеющие отцовскую экспрессию. PPP1R9A экспрессируется с материнского аллеля в эмбриональных скелетных мышцах и экстраэмбриональных тканях, а ген TFP12 - с материнского аллеля в плаценте. Мутации гена SGCE вызывают миоклональную дистонию, а делеции PEG10 у мышей приводят к ранней эмбриональной гибели. У пациентов с СРС структурные нарушения в указанных импринтированных генах не обнаружены. Именно поэтому на сегодняшний день сложно сказать, какой именно ген на хромосоме 7 вносит решающий вклад в формирование фенотипа СРС.

Хромосомный район 11р15.5 содержит протяженный кластер импринтированных генов, вовлеченных в патогенез СБВ. До тех пор пока не было обнаружено двух материнских дупликаций этого хромосомного района у больных, никто не предполагал, что его изменения могут вызывать развитие еще одного синдрома. Тщательный молекулярный анализ показал, что ряд пациентов имеет гипометилирование или потерю импринтинга гена Н19, имеющего материнскую экспрессию, т.е. ген начинает экспрессироваться и с отцовского аллеля. Это связано с тем, что ЦИ1 на отцовской хромосоме не подвергается метилированию и связывает белок CTCF, что приводит к биаллельной экспрессии Н19 и биаллельной инактивации IGF2 (см. рис. 6-8, 6-9). В частности, показано, что РДМ в 5?-районе IGF2 на отцовской хромосоме также гипометилирован. Второй центр импринтинга (KCNQ1OT1), расположенный в гене KCNQ1, не подвергается изменениям метилирования у больных с СРС.

В клетках пациентов с СРС аномалии метилирования Н19 регистрируют с частотой 0-35%. Это означает, что только часть клеток теряет метилирование Н19 на отцовской хромосоме. Мозаичная этиология аномалий импринтинга показывает, что нарушения возникают на уровне первых делений дробления, а значит, основная масса случаев заболевания имеет спорадический характер.

Таким образом, молекулярно-генетическая диагностика позволяет обнаружить причины возникновения СРС практически в 60% случаев (около 10% - в результате материнской ОРД по хромосоме 7, и 50% - вследствие гипометилирования гена H19). Причиной остальных 40% СРС могут быть другой, еще не установленный молекулярный дефект и сложности клинической диагностики синдрома.

Псевдогипопаратиреоидизм (ПГП) (OMIM 603 233) представлен группой фенотипов, которые возникают в результате гипопаратиреоидизма, несмотря на нормальное содержание паратиреоидного гормона. Пациенты просто резистентны к нему. Клинически гетерогенные фенотипы - результат структурных и функциональных изменений гена GNAS1, кодирующего α-субъединицу белка, связывающего гуанин (Gsα). Гетерозиготные инактивирующие мутации гена обнаружены у пациентов с ПГП 1а, у которых существует резистентность не только к паратиреоидному гормону, но и к другим гормонам, а также ряд признаков синдрома наследственной остеодистрофии Олбрайта (AHO): ожирение, низкий рост, участки эктопической оссификации в подкожной ткани, брахидактилия и умственная отсталость. Больных с признаками АНО, но без гормональной резистентности, относят к группе псевдопсевдогипопаратиреоидизма (ППГП). У них также обнаружены инактивирующие мутации гена. Их наследование от матери приводит к ПГП 1а (АНО + гормональная резистентность), а от отца - к ППГП (только фенотип АНО). Такой импринтированный вариант наследования гормональной резистентности объясняют преимущественной материнской экспрессией Gsα в определенных тканях, включая проксимальные почечные канальцы. ПГП 1в манифестирует гипокальциемией и гиперфосфатемией в результате резистентности к паратиреоидному гормону; признаки АНО отсутствуют. У этих пациентов, как правило, отсутствуют мутации Gsα, но существуют аномалии метилирования локуса GNAS1. Описаны как спорадические, так и семейные случаи заболевания, причем последние наследуются по аутосомно-доминантному типу с неполной пенетрантностью. Анализ больших семей показал, что резистентность к паратиреоидному гормону развивается только в том случае, если дефект наследуется по материнской линии, т.е. тип наследования подобен тому, который обнаруживают в семьях с ПГП 1а/ППГП.

Ген картирован на хромосоме 20q13.2. Локус GNAS1 имеет три альтернативных первых экзона (А/B, XL и NESP55), которые сплайсируются с экзонами 2-13. Это приводит к возникновению различных транскриптов (рис. 6-10). В непосредственной близости от альтернативных экзонов расположены РДМ, что приводит к тому, что NESP55 экспрессируется только с материнской хромосомы, хотя XL, экзон А/В и антисмысловой транскрипт NESP55АС экспрессируются с отцовской хромосомы.

Рис. 6-10. Экзон-интронная организация локуса GNAS и транскрипты, получаемые в результате альтернативного сплайсинга: Gsα-транскрипт экспрессируется биаллельно, за исключением проксимальных почечных канальцев, щитовидной железы, гонад и гипоталамуса. XL, A/B и AS (антисмысловой транскрипт) имеют отцовскую экспрессию, а NESP55 - материнскую. Промоторные районы указанных транскриптов имеют дифференциальное метилирование на отцовской (р+/-) и материнской хромосоме (м+/-). Звездочкой отмечены терминирующие кодоны. ДМР - дифференциально метилированные районы

Более протяженный вариант белка Gsα - XL - экспрессируется преимущественно в нейроэндокринных тканях и нервной системе. Оба белка различаются только по N-концу. Другой белок гена GNAS - NESP55 - хромогранинподобный нейроэндокринный секреторный белок. Так же как и в случае XL, альтернативный экзон сплайсируется с экзонами 2-13, но в результате существования в нем терминирующего кодона NESP55 не имеет гомологии с белком Gsα. Указанные транскрипты экспрессируются с отцовской или материнской хромосомы соответственно. Два других транскрипта - A/B и антисмысловой NESPAS, у которого есть свои собственные экзоны, - экспрессируются во всех тканях с отцовской хромосомы, но не транслируются. Промотор GNAS, кодирующий Gsα, не имеет дифференциального метилирования и экспрессируется биаллельно практически во всех тканях.

Если у пациентов с ПГП 1а, как правило, обнаруживают мутации в GNAS, то у пациентов с ПГП 1в таковых не обнаружено. В то же время у последних определяют потерю метилирования РДМ локуса GNAS, особенно в области альтернативного экзона А/В, что приводит к биаллельной экспрессии А/В -транскрипта.

Гетерозиготная делеция протяженностью 3 тыс. пар нуклеотидов обнаружена в 220 тыс. пар нуклеотидов центромернее экзона А/В как у пациентов со спорадическим, так и унаследованным от матери ПГП 1в. Эта делеция повреждает экзоны 4-6 гена STX16, кодирующего белок синтаксин 16, который вовлечен в межклеточные взаимодействия. Другой вариант делеции повреждает экзоны 2-4, т.е. наименьший район перекрывания делеций расположен в районе экзона 4 и содержит CpG-обогащенный участок, который не подвержен дифференциальному метилированию. Очевидно, что этот ген не может быть вовлечен в патогенез заболевания, но все пациенты с делецией имеют потерю метилирования в районе экзона А/В. Вероятно, она нарушает cis -действующий элемент, контролирующий импринтинг, который устанавливает или поддерживает метилированный статус РДМ экзона А/В на материнской хромосоме.

В двух семьях с заболеванием и аномалиями импринтинга локуса GNAS была обнаружена делеция РДМ экзона NESP55, которая одновременно повреждала экзоны 3 и 4 антисмыслового транскрипта. Делеции РДМ NESP55 полностью уничтожают материнский импринт локуса GNAS , приводя к биаллельной экспрессии XL , A/B и антисмыслового транскрипта. Видимо, в этом районе содержится еще один регуляторный элемент, необходимый для полноценного метилирования материнского аллеля GNAS.

В основной массе спорадических случаев ПГП 1в, сопровождающихся нарушением импринтинга как РДМ экзона А/В, так и всех РДМ локуса GNAS, но при отсутствии делеций в районе STX16 и РДМ NESP55, можно предполагать молекулярные нарушения в других отдаленных регуляторных районах, которые еще требуется определить. Все молекулярные изменения при ПГП 1в повреждают импринтинг экзона А/В. Поскольку при заболевании нарушается экспрессия Gs α, правильное метилирование на материнской хромосоме экзона А/В, располагающегося в непосредственной близости от промотора Gs α, - необходимое условие экспрессии этого белка, по крайней мере, в проксимальных почечных канальцах.

Несмотря на то что все молекулярно-генетические причины, приводящие к ПГП 1в, еще не выяснены, молекулярная диагностика может быть основана на анализе метилирования всех РДМ локуса, а РДМ экзона А/В - в первую очередь. Исследование можно проводить с использованием метилчувствительной ПЦР (подобно анализу потери метилирования гена IGF2 при СБВ) и метилспецифической ПЦР.

Транзиторный неонатальный сахарный диабет (ТНСД) (OMIM 601 410) - редкое заболевание (частота - 1:500 000 новорожденных), которое манифестирует в раннем неонатальном периоде гипергликемией, глюкозурией, выраженной дегидратацией организма и задержкой роста. Необходимость инсулинотерапии исчезает в течение дней или недель, но у пациентов остается предрасположенность к развитию инсулинзависимого сахарного диабета в течение взрослой жизни. Несколько спорадических случаев ТНСД с отцовской ОРД по хромосоме 6 позволили предположить, что либо это эффект экспрессии двойной дозы отцовских импринтированных генов, либо отсутствие экспрессии таковых на материнской хромосоме. В небольшом числе описанных семейных случаев наследование было исключительно от отца и ассоциировалось с дупликацией района хромосомы 6q24. Молекулярный анализ таких семей позволил определить наименьший район дупликаций, составляющий 500 тыс. пар нуклеотидов. В нем был обнаружен РДМ, метилированный на материнской хромосоме, и неметилированный район на отцовской хромосоме, регулирующий два импринтированных гена - ZAC и HYMAI. ZAC - ген-супрессор, так как он инактивирован в различных типах опухолей. HYMAI - импринтированный транскрипт, ассоциированный с пузырным заносом, не транслируется и, возможно, выполняет регуляторные функции. Оба гена активно экспрессируются в поджелудочной железе. Таким образом, ТНСД - результат двойной дозы отцовского эпигенотипа, который в 40% случаев возникает в результате отцовской дупликации, в 40% - вследствие отцовской ОРД по хромосоме 6 и в 20% случаев - в результате гипометилирования РДМ на материнской хромосоме.

Начиная с 1978 г. ВРТ стали широко использовать во всем мире, и сейчас рождение детей, зачатых «в пробирке», - не редкость и составляет 1-3% всех новорожденных. В 2002 г. появились первые сведения о новорожденных с болезнями импринтинга. Безусловно, интересен тот факт, что у таких пациентов, как правило, не обнаруживают структурных аномалий импринтированных районов (делеции, дупликации), а заболевания возникают в результате эпимутаций - нарушений метилирования РДМ и регуляторных последовательностей импринтированных генов. К эпигенетическим аномалиям может приводить целый ряд причин:

Эти критические манипуляции совпадают с очень тонкими эпигенетическими процессами стирания, установления и поддержания метилирования на ранних этапах формирования гамет, оплодотворения и раннего эмбриогенеза (см. рис. 6-5). Большинство случаев связано с нарушением метилирования материнского аллеля. Если исходить из процесса развития герминальных клеток, то ВРТ - маловероятная причина возникновения эпимутаций на отцовской хромосоме, так как импринт на отцовских аллелях в процессе гаметогенеза устанавливается раньше, чем на материнских. Отцовский импринт, видимо, устанавливается уже на стадии диплоидного сперматогония. Напротив, в ооците материнский импринт начинает устанавливаться в растущем ооците и продолжается на стадиях от примордиального до антрального перехода, а для ряда генов - только перед овуляцией (доказано в экспериментах на мышах). Именно поэтому механизмы материнского импринтинга могут быть уязвимы уже при стимуляции яичников. Кроме того, материнский геном может быть более подвержен дефектам импринтинга и метилирования в течение преимплантационного периода, когда эмбрион полностью зависит от условий культивирования in vitro.

В ряде случаев установлена материнская ОРД. Этот факт имеет логическое обоснование: нерасхождение хромосом характерно для женщин старшего возраста, которые чаще прибегают к ВРТ.

На сегодняшний день описано около 20 случаев СА, возникших в результате использования ВРТ и характеризующихся эпимутациями, но частота нарушений не превышает общепопуляционного показателя для этого синдрома. У 13 пациентов с СПВ, рожденных в результате ВРТ, эпимутации не обнаружены, но установлены делеции критического района. Их частота также не превышает популяционного уровня. Описаны пять пациентов с СРС, один из которых имел гипометилирование отцовского аллеля гена Н19, а другой - гиперметилирование отцовского аллеля гена MEST (хромосома 7q32). В трех случаях диагностику провести не удалось. Уже описано более 60 случаев СБВ, причем в подавляющем большинстве (83,3-100%) пациенты имели гипометилирование материнского аллеля в районе СБВ-ЦИ2, регулирующем гены СDKN1C и KCNQ1. Такая частота значительно превышает таковую (50-60%) эпимутаций этого района у пациентов, рожденных без использования ВРТ. Таким образом, риск рождения ребенка с СБВ в результате ВРТ возрастает в 14 раз.

С 2006 г. начали обсуждать вопрос о новой болезни импринтинга, являющейся результатом материнского гипометилирования различных импринтированных локусов. Описано более 10 пациентов с СБВ, у которых, помимо материнского гипометилирования СБВ-ЦИ2, обнаружена потеря метилирования по другим локусам. У шести пациентов с ТНСД кроме материнского гипометилирования РДМ на хромосоме 6q24 обнаружены и другие его локусы. Была описана семья (близкородственный брак), в которой две дочери имели фенотипические признаки ТНСД с некоторыми симптомами СБВ. При исследовании статуса метилирования импринтированных районов установлено, что потеря метилирования произошла не только в импринтированном районе ZAC (6q24), но и в районах KCNQ1OT1 (11p15.5), GRB10 (7p11.2-р12), PEG3 (19q13), PEG1 /MEST (7q32) и NESPAS (20q13). Авторы предполагают, что в семье существовал некий аутосомнорецессивный дефект, повреждающий механизмы метилирования у потомства, или был нарушен процесс установления импринтинга в ооцитах.

Поскольку уже описано около 90 импринтированных генов, а всего ожидают данные о 200 генах с моноаллельной экспрессией (возможно, в разных тканях и в различные периоды онтогенеза), справедливо полагать, что причиной ряда заболеваний, где молекулярный дефект еще неизвестен, станут эпигенетические нарушения, представленные аномальным метилированием ДНК и изменениями экспрессии микроРНК.

В качестве причин возникновения практически всех онкологических заболеваний все большую роль отводят эпигенетической регуляции активности генов, основанной на аномальном метилировании (деметилировании). Во всех без исключения исследованных неопластических клетках был определен дисбаланс метилирования. Он заключается, с одной стороны, в общем гипометилировании генома опухолевой клетки, а с другой, - в локальном гиперметилировании промоторов ряда генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, процессы дифференцировки и апоптоза (рис. 6-11, см. цв. вклейку).

Функциональный анализ определенных генов в злокачественной опухоли показал отсутствие экспрессии одних и гиперэкспрессию других генов, но механизмы, приводящие к этому, были не ясны. Одним из первых изменений, обнаруженных в опухолевых клетках, было гипометилирование единичных CpG-динуклеотидов. На экспериментальных моделях была показана несомненная связь снижения общего числа метильных групп с опухолеобразованием. Для опухолей молочной железы, яичников, шейки матки и мозга была доказана корреляция между снижением общего уровня метилирования генома и увеличением степени злокачественности опухоли (стадия заболевания, размер опухоли, инвазивность и метастазирование). Таким образом, гипометилирование может служить одним из маркеров, имеющих прогностическое значение. Тотальное гипометилирование генома опухолевой клетки может вызывать несколько эффектов, которые вносят существенный вклад в процессы злокачественной трансформации. Во-первых, гипометилирование может приводить к гиперэкспрессии клеточных онкогенов, в частности CMYC и HRAS, и многочисленных факторов роста. Кроме того, увеличивается транскрипционная активность большой группы генов семейств MAGE, GAGE, LAGE, SAGE, которые обычно экспрессируются на ранних этапах эмбрионального развития. Во-вторых, гипометилирование вызывает транскрипционную активацию мобильных генетических элементов, называемых ретротранспозонами. Это прямо подтверждает теорию о защитной функции метилирования генома от внутренних и внешних паразитических ДНК. Несметное количество мобильных элементов генома может интегрироваться в гены, регулирующие клеточный цикл, и вызывать их инактивацию. В частности, это показано для генов APC, BRCA1, BRCA2, MLH и др. В-третьих, гипометилирование определенных хромосомных районов может вызывать хромосомную нестабильность, которая приводит к изменению дозы определенных генов, т.е. к потере генов-супрессоров и гиперамплификации онкогенов, и (или) к образованию химерных генов с новыми онкогенными функциями. Так, для нормальных клеток в экспериментах in vitro было показано, что искусственно вызванное гипометилирование ДНК увеличивает число хромосомных перестроек. Кроме того, изменение общего профиля метилирования играет роль в создании мутантного фенотипа опухолевой клетки. Что касается механизма глобального деметилирования, то в настоящее время он остается неизученным.

В то же время в сочетании с гипометилированием генома происходит аномальное метилирование CpG-островков в промоторных районах генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, что приводит к их полной инактивации. К ним также относят гены, участвующие в апоптозе, ангиогенезе, дифференцировке, репарации ДНК, метастазировании, передаче сигнала, детоксикации, лекарственной резистентности и др. Таким образом, при отсутствии каких-либо структурных изменений нуклеотидной последовательности ген полностью теряет свою активность.

Исследования эпигенетической регуляции экспрессии генов в онкологии в последнее время приобрели особенно большое значение, причем как научное, так и практическое. Один из наиболее значимых механизмов канцерогенеза - аномальное метилирование в опухоли CpG-островков генов-супрессоров, расположенных в промоторной области и внутригенных. Метилирование с последующей инактивацией генов-супрессоров может выступать и как первая, и как вторая, но функциональная мутация. Для некоторых генов было показано, что именно метилирование одного или обоих аллелей служит причиной развития опухоли.

В связи с этим определение метилирования генов, одной из функций которых может быть регуляция клеточного цикла, в образцах различных опухолей - необходимый пункт в характеристике гена и ДНК-диагностике при определенном заболевании. Исследования эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов уже позволили в ряде случаев установить причины инактивации определенных генов в опухолях. Аномальное метилирование (деметилирование) может служить диагностическим и прогностическим маркером, а также позволяет дифференцировать определенные типы опухолей. Характеристика профиля метилирования генов в различных тканях и типах опухолей вносит существенный вклад в понимание процессов дифференцировки тканей и канцерогенеза.

В большинстве случаев лечение рака предстательной железы андрогенами вызывает положительный эффект, но часть опухолей оказывается нечувствительной к такой терапии, а они характеризуются агрессивностью и высоким метастатическим потенциалом. В таких опухолях промоторная область и первый экзон андрогенового рецептора, как правило, подвергаются метилированию, что приводит к его инактивации.

Гиперметилирование промоторной области рецептора эстрогена обнаруживают в опухолях толстой кишки в 40-70% случаев, молочной железы - в 20-30%, а при острых лейкозах - в 60-70% случаев. Ген N33 подвергается метилированию в этих же типах опухолей почти в 90% случаев.

Точковые мутации в генах, отвечающих за репарацию ДНК, достаточно редко обнаруживают в спорадических карциномах желудка и толстой кишки с нестабильностью микросателлитов. Оказалось, что причиной служит инактивация гена MLH1 в результате метилирования промоторного района почти в 100% случаев.

Метилирование промоторного района CDKN2A обнаружено во многих типах опухолей. В гепатокарциномах и аденокарциномах поджелудочной железы инактивация гена таким способом происходит почти в 70% случаев, при раке легких - в 20-60%, при опухолях толстой кишки - в 25-30%, а при лимфомах - в 5-25% случаев.

Тканевый ингибитор металлопротеиназы-3 (TIMP-3) может подавлять рост опухоли, ангиогенез, прорастание и метастазирование. Показано, что аномальное метилирование промотора гена происходит в различных опухолях: при немелкоклеточном раке легкого - в 19-26% случаев, при раке молочной железы - в 27%, при раке толстой кишки - в 27%, при карциноме почки - в 78% и при глиобластомах - в 26% случаев.

Метилирование промоторных районов генов RASSF1А и P16 достоверно чаще происходит в клетках уротелиальных карцином с инвазией в подслизистый слой (рТ1). Его можно рассматривать в качестве маркера инвазивного роста опухоли. Аномальное метилирование промоторного района гена P14 ассоциировано с мультифокальным ростом этой опухоли.

Метилирование RASSF1A, определенное в сыворотке крови у пациенток с раком молочной железы во время лечения тамоксифеном, свидетельствует о существовании метастазов, неэффективности лечения и неблагоприятном прогнозе заболевания.

Метилирование MGMT коррелирует с успешным лечением глиом кармустином. Метилирование других генов-супрессоров, в том числе PCDHB и BLU, ассоциировано с плохой выживаемостью пациентов с нейробластомой.

Аномальное метилирование CDH1 обнаруживают в 15-80% случаев рака гортани, молочной и предстательной железы, матки, желудка, печени, мочевого пузыря и почек, оно свидетельствует о присутствии метастазов на момент установления диагноза.

Подводя итоги, можно заключить, что метилирование ДНК - ценный биологический маркер, используемый для диагностики рака.

Целый ряд генов, вовлеченных в канцерогенез, подвергается инактивации посредством метилирования (P16, P14, RB1, LKB, ER, RAR2 β, VHL, DAP, MGMT, CDI и др.).

Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, отсутствует в ДНК, полученных из нормальных тканей.

Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, можно определить в сыворотке крови или других биологических жидкостях организма. Оно соответствует профилю метилирования ДНК, выделенной из соответствующей опухоли.

Лабораторные исследования подтверждают, что метилирование - одно из наиболее ранних событий канцерогенеза.

Многочисленные исследования показывают, что метилирование ДНК - высокоспецифичный и чувствительный биологический маркер.

Разработаны эффективные методы, позволяющие проводить качественный и количественный анализ метилирования ДНК.

Введение в молекулярную медицину / Под общ. ред. М.А. Пальцева. - М.: Медицина, 2004. - 496 с.

Биология стволовых клеток и клеточные технологии / Под общ. ред. М.А. Пальцева. - М.: Медицина, 2009. - 728 с.

Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований / Под общ. ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. - М.: Медицина, 2009. - 384 с.

Allis C.D., Jenuwein T., Reinberg D. Epigenetics. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2007.

Esteller M. Epigenetics in biology and medicine. - Boca Raton: CRC Press, 2009.

Tost J. Epigenetics. - Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2008.

Наследственность и изменчивость - базовые свойства всех живых организмов, обеспечивающие, с одной стороны, видовую целостность, с другой, в совокупности с естественным отбором - приспособленность и эволюционное развитие в меняющихся условиях окружающей среды.

Первично наследственная изменчивость является следствием мутагенеза, под которым принято понимать процесс возникновения мутаций (от лат. mutatio - изменение), образующихся спонтанно или под влиянием многих физических, химических, биологических факторов, называемых мутагенами. Мутационный процесс - это не только процесс возникновения мутаций (мутагенез), но также накопление, распространение и элиминация мутаций.

Присутствие мутагенов в среде обитания человека, потенциально способных повреждать генетические структуры клеток, рассматривается как негативная ситуация с тяжелыми медицинскими и биологическими последствиями.

Homo sapiens как биологический вид выведен из-под давления естественного отбора вследствие медицинских и гигиенических достижений, что делает его «восприимчивым» к накоплению генетического груза. Человечество отягощено огромным грузом патологических мутаций. Возникновение даже незначительных генетически обусловленных отклонений воспринимается как психотравмирующая ситуация, в более серьезных случаях представляет значительную медицинскую проблему, а также приводит к существенному снижению качества жизни и инвалидизации. По существующим оценкам, у 70% людей в течение жизни проявляется хотя бы один генетически обусловленный дефект, снижающий продолжительность и/или качество жизни (Peltonen L., McKusick V.A., 2001).

Мутационный процесс является первоосновой возникновения наследственных болезней, около 20% которых обусловлены мутациями de novo. До 60-х годов ХХ в. интерес к мутагенезу был сосредоточен на индукции мутаций в зародышевых клетках, поскольку именно они определяют формирование генетического груза популяции. Мутации в соматических клетках в тот период рассматривались как индикаторный показатель мутагенных воздействий. Сегодня становится все очевиднее, что повреждения ДНК и мутации в соматических клетках могут иметь самостоятельную патогенетическую значимость.

Современная экологическая ситуация характеризуется широким распространением мутагенов различной природы, подавляющее большинство из которых имеет антропогенное происхождение и введено в среду обитания на протяжении жизни 4-5 поколений. Это определяет необходимость повышенного внимания врачей к оценке мутагенных воздействий на пациента. Различные аспекты мутационного процесса разбираются в настоящей главе.

Со времен Г. Де Фриза, впервые введшего понятие «мутация» и определившего его как внезапное, скачкообразное и наследуемое изменение признака (фенотипа), этот термин стал употребляться более широко с иными смысловыми оттенками, определяемыми конкретной областью исследования. Например, в молекулярной биологии под мутацией понимают долговременное изменение в нуклеотидной последовательности ДНК, в цитогенетике - хромосомные аномалии, в клинической генетике - наследственные синдромы. С генетической точки зрения мутация - это изменение наследственных структур в геноме на генном, хромосомном или геномном уровне организации.

Первая и наиболее общая классификация мутаций была предложена Г. Меллером в 1932г., в которой он предложил выделять:

В дальнейшем, в зависимости от контекста и направлений исследований, мутации стали подразделять:

Все перечисленные классификационные термины широко используются до настоящего времени. Однако по мере развития представлений о структурной организации генома наибольшее распространение получила классификация, подразделяющая мутации на генные, хромосомные и геномные, т.е. в зависимости от уровня организации генетического материала.

Генные мутации традиционно рассматриваются как субмикроскопические изменения структуры ДНК, затрагивающие последовательность нуклеотидов одного гена. Они могут быть однонуклеотидными, т.е. затрагивающими одну пару оснований, или быть представлены делециями, дупликациями, инверсиями и инсерциями групп нуклеотидных пар.

Однонуклеотидные замены лежат в основе широкого генетического полиморфизма (SNP - single nucleotide polymorphisms). Речь идет о заменах, для которых в популяции имеются различные варианты аллелей, с частотой редкого аллеля не менее 1%. Именно с этой категорией генных мутаций связывают многообразие индивидуальных реакций на средовые факторы различной природы.

Биологическое значение генных мутаций существенно зависит от того, каким образом мутация сказывается на точности трансляции генетической информации. Принято выделять несколько типов изменений в экзоне.

Нонсенс-мутации останавливают трансляцию за счет преобразования кодирующего триплета в стоп-кодон.

Миссенс-мутации приводят к искажению информации в кодоне и включению в белок аминокислоты, отличной от типичной для данной белковой молекулы в данном положении.

Сеймсенс-мутации не меняют кодирующей способности триплета в рамках выраженности генетического кода, а следовательно, не приводят к замене аминокислоты в структуре белка.

Сплайсинг-мутации возникают на стыке экзона и интрона, они изменяют донорный и/или акцепторный сайты сплайсинга и нарушают его реализацию.

Помимо однонуклеотидных замен, могут происходить вставки или потери отдельных нуклеотидов, приводящие к мутациям сдвига рамки считывания (frameshift). Данная форма молекулярного повреждения приводит к изменению структуры кодируемого пептида и/или остановке его синтеза.

Наконец, в отдельную категорию генных мутаций относят так называемые «динамические» мутации, выражающиеся в увеличении числа триплетных повторов в промоторных и кодирующих областях генов. Предполагается, что они возникают за счет эффекта «проскальзывания» при репликации.

К этой категории относят мутации, нарушающие целостность хромосом в пределах разрешающей способности светового микроскопа (около 1 млн пар нуклеотидов). Различают следующие варианты хромосомных мутаций: делеции, дупликации, реципрокные и нереципрокные транслокации, пери- и парацентрические инверсии, инсерции (вставочный вариант транслокации). Таким образом, формат хромосомных мутаций практически совпадает с форматом генных мутаций, а различия между ними характеризуются разной длиной перемещаемых нуклеотидных участков, что определяет принципиально разное «поведение» мутантных локусов или участков хромосом в мейозе. Наличие хромосомной мутации ведет к нарушениям конъюгации в мейозе и образованию новых «перестроек» хромосом.

В экспериментальной генетике in vitro и in vivo хромосомные мутации называют хромосомными аберрациями. Современные представления о механизме возникновения и классификации хромосомных аберраций, а также сведения, раскрывающие взаимосвязь мутагенного воздействия на разных стадиях клеточного цикла с образованием хромосомных аберраций разного типа, были подробно описаны (Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989). Возникновение хромосомных аберраций всегда связано с индукцией молекулярных нарушений, которые приводят к разрывам двух цепей ДНК. Агенты, вызывающие аберрации хромосом (хромосоморазрывающие агенты), часто называют кластогенами.

В результате хромосомных мутаций возникает генетический дисбаланс, в подавляющем большинстве случаев приводящий к гибели клеток. В отличие от стабильных хромосомных аберраций (реципрокные транслокации и инверсии), способных к воспроизводству в ряду поколений клеток, такие события объединяются в группу нестабильных хромосомных аберраций. Достоверно установлено, что инверсии и транслокации вносят существенный вклад в формирование генетически аномальных гамет и нежизнеспособных зигот. В отдельных случаях генетический дисбаланс может служить причиной хромосомной болезни.

Согласно классическим представлениям, повреждения ДНК в G₁- и S-периоды приводят к появлению аберраций хромосомного типа, в G₂-периоде клеточного цикла - к индукции аберраций хроматидного типа. Трансформация первичного повреждения ДНК в хромосомную аберрацию может происходить только в делящейся клетке.

Изменение числа хромосом в клетке - это геномные мутации. Выделяют две категории геномных мутаций:

Механизм возникновения геномных мутаций, связанный с нарушением расхождения хромосом за счет факторов (анеугенов), влияющих на ахроматическое веретено деления, принципиально отличается от механизма возникновения генных и хромосомных мутаций.

В общем виде можно выделить два этапа становления генных и хромосомных мутаций.

Первый этап - возникновение первичных повреждений ДНК, выражающихся в изменении нуклеотидной последовательности, химической модификации азотистых оснований, разрывах цепей ДНК под действием тех или иных событий или агентов.

Второй этап - репарация первичных повреждений ДНК, итогом которой может быть либо восстановление целостности ДНК, либо закрепление первичного повреждения в форме мутационного изменения. Возникновение геномных мутаций связано с нарушением процесса расхождения хромосом в клеточных делениях или при гаметогенезе.

Эти классические представления, сложившиеся в области исследования мутагенеза к 70-м годам прошлого века, вполне современны и к настоящему времени в достаточной степени детализированы. В частности, выявлены варианты первичных повреждений ДНК, в ряде случаев показана их специфичность по отношению к действующему фактору, существенно расширены знания о процессах репарации ДНК в клетках млекопитающих, установлены механизмы нарушения функции ахроматического веретена.

Сведения об известных предмутационных первичных повреждениях ДНК суммированы на рис. 7-1 (см. цв. вклейку).

В качестве основных источников мутагенеза, вызывающих указанные первичные повреждения ДНК, наиболее известны ошибки процесса репликации ДНК.

В процессе репликации одна из нитей ДНК наращивается непрерывно, другая прерывисто собирается из так называемых «фрагментов Оказаки». Этот сложно синхронизированный процесс является источником двух типичных ошибок: неправильного включения нуклеотидов и «проскальзывания по цепи», что приводит к неправильному спариванию оснований и может служить источником возникновения генных мутаций, преимущественно типа замены одиночных пар нуклеотидов.

В ходе нормального функционирования генома возникает еще несколько возможностей появления мутаций.

Первая связана с перемещением мобильных элементов генома, в результате которых возникают дупликации и инсерции в молекуле ДНК.

Вторая обусловлена ошибками мейотической или митотической (сестринские хроматидные обмены) рекомбинации. В результате может происходить потеря или приобретение дополнительных фрагментов ДНК, что приводит к возникновению дупликаций и делеций.

Третья возможность связана с воздействиями случайных тепловых флуктуаций, приводящих к депуринизации.

Важно отметить, что, несмотря на высокую частоту первичных повреждений, наблюдающихся в клетке (например, до 5 тыс. депуринизаций в день на клетку), лишь очень незначительная часть (менее 0,001%) из них остается нерепарированой. Именно поэтому в каком-то смысле спонтанный мутагенез - это не столько ошибки репликации, ретротранспозиции или рекомбинации, сколько ошибки системы репарации. Все более очевидно, что основным источником первичных, в том числе плохо репарабельных, поражений ДНК является атака этой молекулы свободнорадикальными метаболитами, возникающими при окислительном стрессе.

Повреждения ДНК следует рассматривать не только как предмутационные события, но и как самостоятельный патогенетический фактор. Это направление исследований находится в самом начале развития и базируется на следующих аргументах.

Даже временные функциональные сбои генетической программы за счет интенсификации процесса первичного повреждения ДНК могут сказываться на функционировании «белковой машины» клетки. Умозрительно можно предложить не один сценарий, приводящий к нарушению, например, альтернативного сплайсинга белков.

Индукция разрывов может быть эпигенетическим инструментом регуляции клеточной дифференцировки, апоптоза, гибели клетки.

Накоплено большое количество сведений, указывающих на повышение уровней повреждений ДНК при различных заболеваниях. Первичны они по отношению к заболеванию или возникают как вторичное звено патогенеза - вопрос дискуссионный, но их наличие бесспорно.

Выявлены корреляции между химической индукцией повреждений ДНК в эмбриональных клетках и тератогенезом.

Таким образом, можно предположить, что под действием первичных повреждений ДНК может системно изменяться или нарушаться регуляция функционирования генома клетки. Имеются прямые указания на повреждения ДНК в атеросклеротических бляшках. У пациентов с факторами повышенного риска атеросклероза (курение и сахарный диабет) наблюдается существенное повышение уровней повреждений ДНК.

Репарация генетических повреждений - свойство клеток живых организмов исправлять повреждения, возникшие в ДНК, и, таким образом, сохранять генетическую информацию в ряду клеточных делений и поколений организмов. Важность этого процесса подчеркивается тем, что оценочная частота повреждений ДНК в каждой клетке за сутки составляет 10⁴-10⁶ событий (Schärer O.D., 2003).

Изучение различных аспектов репарации ДНК является одним из наиболее интенсивно развивающихся разделов современной молекулярной биологии. К настоящему моменту имеются сведения о более чем 130 генах репарации у человека, которые были клонированы и секвенированы, однако функции многих из них остаются неясными.

Репарация реализуется по одному из возможных механизмов:

Реверсионная репарация протекает без деградации и последующего репаративного синтеза ДНК. Она приводит к исправлению алкилированных оснований, а также однонитевых разрывов ДНК посредством ДНК-полинуклеотидлигаз.

Эксцизионная репарация рассматривается как ведущий и, вероятно, наиболее древний механизм репарации ДНК. Она протекает в несколько последовательных стадий:

Эксцизионная репарация оснований (BER) устраняет поврежденные (окисленные, восстановленные, алкилированные, дезаминированные) основания, апуриновые/апиримидиновые сайты (АП), неспаренные основания, неканонические пары оснований, однонитевые разрывы ДНК.

Объектом эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) служат их аддукты с ксенобиотиками, пиримидиновые димеры, а также, возможно, внутринитевые сшивки и сшивки ДНК-белок. В этом случае, в отличие от BER, происходит выщепление не отдельных оснований, а существенных фрагментов ДНК размером до 103 пар оснований.

Репарация неправильно спаренных оснований (mismatch repair, MMR) устраняет ошибочно спаренные основания, возникающие как ошибки репликации ДНК либо в результате окисления или метилирования оснований. В процессе MMR эффективно восстанавливаются пары GT, AC, CG, AA, делеции и инсерции от одной до трех пар оснований. Пары TT, CT, CC, GA, делеции и инсерции из четырех пар оснований репарируются плохо, а из пяти и более оснований не распознаются белками этой системы репарации, которые принято обозначать как MutSα-комплекс (MSH2-MSH6-белки).

Рекомбинационная репарация обеспечивает восстановление целостности ДНК при двунитевых разрывах. Они лежат в основе образования хромосомных аберраций. Согласно современным представлениям, репарация двунитевых разрывов возможна в эукариотической клетке двумя основными путями: гомологической рекомбинацией (HR) и негомологичным соединением концов ДНК (non-homologous end-joining, NHEJ), которое может быть ошибочным и безошибочным.

Нарушения репарации двунитевых разрывов (дефекты белков репарации Nbs, Wrn, Blm, RecQL4) наблюдаются у больных с синдромами Блума, Вернера, Неймегена. Сводку заболеваний, при которых обнаруживаются дефекты репарации, можно найти в литературе.

Таким образом, мутационный процесс в существенной степени зависит от эффективности работы систем репарации ДНК, которые либо осуществляют, либо не осуществляют исправления первичных предмутационных изменений в процессе безошибочной или, в некоторых случаях, ошибочной репарации ДНК. Регистрируемый уровень мутирования по любому генотоксикологическому маркеру всегда отражает баланс между интенсивностью генотоксического воздействия и эффективностью деятельности систем репарации. При этом часть клеток, имеющих массированные генотоксические поражения, может элиминироваться.

Нет сомнения, что полиморфизмы отдельных генов репарации и «репарационные фенотипы», определяющие согласованную, взаимодополняющую и взаимоперекрывающуюся деятельность элементов «репарационной сети», могут играть определяющую роль в формировании индивидуальной чувствительности человека к действию мутагенных факторов различной природы.

Для учета мутаций в зародышевых клетках человека применяются методы, позволяющие оценивать частоту мутантов по генным мутациям (наследственные болезни, видимые или биохимические мутации), хромосомным и геномным мутациям (хромосомные болезни), доминантным леталям (сборная группа), аномальным спермиям (генные мутации).

Интенсивность мутационного процесса у человека на генном уровне можно оценивать двумя подходами: на основе учета фенотипов или популяционных эффектов (событий).

Фенотипический подход позволяет оценивать частоту мутаций в определенных локусах прямым или непрямым путем. Прямой метод используется в оценках признаков или болезней с доминантным или кодоминантным наследованием. В сферу этого подхода попадают клинически хорошо диагностируемые, видимые, летальные и некоторые биохимические признаки. Регистрируемые признаки должны иметь полную проявляемость в гетерозиготном генотипе. Сущность метода сводится к определению частоты рождения детей с мутантным фенотипом у здоровых родителей (изолированные или спорадические случаи). Поскольку мутации относительно редки, то, во-первых, можно объединить события в одну группу «сторожевых фенотипов», а во-вторых, надо предусматривать, чтобы выборки обследованных статистически соответствовали таким частотам. При этом речь идет о сотнях тысяч детей.

Для прямой оценки частоты генных мутаций в зародышевых клетках применяются биохимические методы. Мутации по мономерным белкам легко обнаруживаются электрофоретически. Проведены большие исследования с анализом более 30 локусов (электрофоретические варианты белков, эритроцитарные ферменты). Эта методика вполне приемлема для массовых исследований и может быть включена в систему учета генных мутаций.

Регистрация генных мутаций на уровне ДНК возможна, и она точнее других, но из-за трудоемкости и дороговизны применять ее в популяционных исследованиях вряд ли под силу даже в больших программах.

Популяционный подход основан на оценке летальных эффектов от инбредных браков, соотношения полов, элиминации мутаций в стационарных или изолированных популяциях. При этом можно провести суммарный учет мутаций в целом геноме или в отдельных локусах. Непрямой метод основан на принципе равновесия между мутационным процессом и элиминацией мутантов, имеющих пониженную жизнеспособность. Зная частоту мутантов в популяции и их плодовитость относительно плодовитости немутантных особей, можно определить интенсивность мутационного процесса.

При использовании и прямого, и непрямого методов необходимо принимать во внимание возможные ошибки, которые подробно разобраны в литературе (Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989).

Методы оценки частоты возникновения хромосомных и геномных мутаций сходны с прямым методом учета доминантных мутаций, т.е. определяется число мутантов в изучаемой популяции. В большинстве случаев хромосомные болезни являются следствием вновь возникших мутаций на геномном и хромосомном уровнях. Для установления факта «новой» или «унаследованной» родителями мутации достаточно исследовать их кариотипы. Необходимо отметить, что для большинства хромосомных болезней методы оценки их частот трудоемки. Они требуют тотального кариотипирования больших групп населения. Исключение составляют трисомия по хромосоме 21 (клиническая диагностика) и аномалии в числе хромосом (определение полового хроматина). Основная трудность оценки частот возникновения хромосомных болезней состоит в том, что при многих этих формах организм погибает на разных стадиях онтогенеза, начиная с раннего эмбриогенеза. Именно поэтому кариотипирование необходимо проводить в материалах спонтанных абортов, мертворожденных и живорожденных.

Широкое внедрение метода экстракорпорального оплодотворения позволило более точно, чем раньше, оценивать частоту хромосомных и геномных мутаций на ранних стадиях эмбрионального развития.

Современные методы с использованием флюоресцентной гибридизации in situ (FISH-метод) позволяют прямым подходом оценивать частоту анеуплоидии в спермиях.

Мутационный процесс интенсивно протекает в зародышевых клетках на генном, хромосомном и геномном уровнях. Несмотря на многочисленные методы оценки частот мутаций, все результаты показывают существенный размах колебаний (для генных болезней в 10-100 раз). Связано это, в первую очередь, с тем, что вновь возникшая мутация может влиять на созревание гамет, оплодотворение и развитие в раннем эмбриональном периоде. Однако методические возможности, позволяющие оценить интенсивность отбора мутантных гамет, зигот и эмбрионов, очень затруднены.

Несмотря на большое число работ, посвященных изучению частоты возникновения генных мутаций у человека, пока еще нельзя сформулировать выводы о темпе и общих закономерностях спонтанного мутагенеза. По частоте генных мутаций имеются данные по 25 наиболее четко клинически диагностируемым наследственным болезням (Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989). Эти обобщенные данные показывают колебания от 2 до 120 мутантов на 1 млн гамет. Трудно ответить на вопрос, действительно ли разница в частоте мутаций/локус/поколение связана с разной частотой в разных локусах или это обусловлено методическими особенностями исследований? Например, частоту мутаций в локусе миопатии Дюшенна оценили как 1×10^-4, нейрофиброматоза - 2×10^-5, а в большинстве локусов - 1×10^-6.

Обобщенные данные, включая электрофоретические, позволяют предполагать, что частота спонтанных мутаций у человека (на локус/гамету/поколение) находится в пределах 10^-5-10^-7. Оценки сделаны по канонам классической генетики. Примерно такой же диапазон колебаний наблюдается у лабораторных животных.

Более точную расшифровку интенсивности мутагенеза предстоит сделать на молекулярно-генетическом уровне, как это выполнено с оценкой частоты мутаций в микросателлитах (Eckert K.A., Hile S.E., 2009). Прямые наблюдения изменения длины аллелей между родителями и потомками позволяют оценить частоты мутаций в микросателлитах у человека. Частоты мутаций в ди- и тетрануклеотидных повторах составляют 10^-2-10^-6 на локус/гамету/поколение. Наблюдаемые вариации связаны со структурой аллеля как такового, включая размер мотива, длину и нуклеотидные композиции. Ясно, что вариации частот мутаций составляют несколько порядков, и более точные данные вряд ли можно получить по многим локусам, ответственным за синтез белков.

Интенсивность мутагенеза можно рассчитывать на 1 пару оснований/поколение. Этот темп мутаций составляет 2,2×10^-9. Мутации возникают в кодирующих и некодирующих регионах, и частота их колеблется в зависимости от многих внутренних факторов: нуклеотидной последовательности, локусов, регионов хромосом, отдельных хромосом. Такие выводы сделаны на основе сопоставления сиквенсов геномов человека и млекопитающих (Ellegren H., Smith N.G.С., Webster M.T., 2003).

Частота спонтанных мутаций не является абсолютно стабильной величиной. В многочисленных исследованиях выявлена зависимость спорадических случаев, т.е. в основном новых мутаций, ряда аутосомно-доминантных заболеваний от возраста родителей (ахондроплазия, нейрофиброматоз, синдром Апера, синдром Марфана и др.). Природу этой закономерности объяснить однозначно пока не удалось.

В литературе не раз затрагивался вопрос о различиях в темпах спонтанного мутирования у мужчин и женщин. Хотя выводы не по всем изученным заболеваниям совпадают, все же можно сделать заключение, что генные мутации у мужчин возникают чаще, чем у женщин. Эту разницу объясняют непрерывным обновлением сперматогенного эпителия в постнатальном онтогенезе.

Методические условия для оценок хромосомного и геномного мутагенеза позволяют адекватно судить о частотах событий, которые происходят чаще, чем генные мутации, что облегчает составление репрезентативных выборок. Однако для объективной оценки необходимо выполнять два условия: 1) цитогенетически обследовать родителей мутантов, чтобы исключить унаследованные случаи; 2) обследовать материал абортов или индивидуумов на разных стадиях онтогенеза в связи с большой летальной компонентой хромосомных и геномных мутаций.

Многочисленные цитогенетические исследования живо- и мертворожденных, материала спонтанных абортов, полярных телец, бластоцист, спермиев позволяют сделать обобщение о темпах и структуре мутагенеза в зародышевых клетках:

Еще в 30-х годах ХХ в. Г. Меллер и Н.В. Тимофеев-Ресовский обратили внимание на возможность радиационного мутагенеза у человека, исходя из его универсальности. Прямых данных о радиационно-индуцированном мутагенезе в зародышевых клетках у человека на генном уровне мало, но на основании экстраполяций, полученных в опытах на животных, в возможности таких эффектов не приходится сомневаться. Вопрос заключается только в количественной оценке эффектов, которая была сделана на основе изучения потомства облученных в Японии людей.

Проанализировано более 70 тыс. исходов беременности в Хиросиме и Нагасаки с расчетом удваивающей дозы облучения. В целом не выявлено связи между здоровьем детей и облучением родителей, кроме небольшого повышения частоты врожденных пороков развития у детей супружеских пар, облученных в дозе 100 сЗв и более. Эти данные представлены в табл. 7-1.

Таблица 7-1. Повторная оценка мутагенных эффектов ионизирующих излучений в Хиросиме и Нагасаки (% от общего числа)

Анализ показал, что доза облучения, удваивающая число мутаций для разных показателей, колеблется от 69 до 252 сЗв, а в среднем составляет не менее 150 сЗв.

Данные о генетических последствиях радиоактивных выбросов в Уральском регионе весьма противоречивы (Бочков Н.П. и др., 1996; Ижевский П.В., 2006), что вполне понятно, поскольку речь идет о суммарной гонадной дозе обоих супругов в 4,5 сЗв. Расчеты показывают (табл. 7-2), что повышение числа детей с наследственными болезнями у облученных родителей составляет не более 0,48%. Такую долю повышения трудно уловить в выборке из 8-9 тыс. новорожденных в год на всей территории Восточно-Уральского следа.

Таблица 7-2. Генетические последствия радиоактивных выбросов в Уральском регионе (по расчетам UNSCEAR)

Что касается генетических последствий облучения в результате аварии на Чернобыльской АЭС, то убедительных данных по повышению генных мутаций или хромосомных болезней не получено, включая анализ новорожденных по Европейскому регистру. Лишь в одной работе (Дуброва Ю.Е., 2006) обнаружили повышение числа мутаций в локусах варьирующих тандемных повторов у потомства облученных людей. Однако подтверждения этих находок не получено. Расчеты возможных генетических эффектов облучения от аварии на Чернобыльской АЭС в популяциях представлены в табл. 7-3 и 7-4.

Таблица 7-3. Возможные генетические последствия от аварии на Чернобыльской АЭС (ликвидаторы, эвакуированные, жители «загрязненных» зон)

Таблица 7-4. Всего генетических последствий от аварии на Чернобыльской АЭС в первых двух поколениях (% к спонтанному уровню)

Как видно из данных табл. 7-3 и 7-4, число индуцированных радиацией случаев составит не более 0,2%, а число тяжелых форм - 0,001-0,002%.

Причинная связь между облучением родителей и рождением детей с хромосомными болезнями в течение почти 50 лет не дали однозначного ответа. Все-таки больше можно склоняться к тому, что такая связь не выявлена.

Генетические последствия в потомстве от действия химических веществ изучены менее подробно, чем от действия радиации. В основном эффекты оценивались путем учета внутриутробной смертности и врожденных пороков развития при действии анестезирующих газов, винилхлорида и хлоропрена. Полученные немногочисленные данные свидетельствуют о возможности мутагенных эффектов от действия химических веществ на зародышевые клетки, но строгих доказательств их наличия у экспонированных людей не получено. Нельзя еще говорить о конкретных дозовых зависимостях. Вместе с тем из года в год накапливаются наблюдения, настораживающие в отношении мутагенеза в зародышевых клетках и указывающие на необходимость более детального генетического мониторинга в группах, подвергающихся воздействию химических факторов (производственных, пищевых, лекарственных, бытовых, коммунальных).

Границы знаний о мутационном процессе в зародышевых клетках у человека существенно расширились, и многие ранние представления о нем принципиально изменились. В то же время перед современными исследователями стоят «старые вопросы». Не обоснованы еще правила экстраполяции количественных закономерностей с in vitro на in vivo как при радиационном, так и при химическом мутагенезе. Предстоит расшифровка «вмешательства» процессов биотрансформации ксенобиотиков в эффекты мутагенеза. Экстраполяции мутационных последствий с соматических на зародышевые клетки еще не разработаны, в том числе не оценены барьерные функции семенников и яичников для химических мутагенов.

Наследственная изменчивость не ограничивается только мутационной изменчивостью. Новые исследования в области генетики человека показывают, что есть еще индуцированные факторами окружающей среды эпигенетические процессы (Dolinoy D.C., Jirtle R.L., 2008). Вся суть учения о мутационном процессе и генетическом грузе приобретает новое звучание.

О наличии мутагенеза в соматических клетках известно с начала развития генетики как научной дисциплины. Описано явление мозаицизма у многочисленных видов растений и животных, которое является следствием мутаций в соматических клетках. В последние 15-20 лет уделяется большое внимание мозаичным формам наследственных болезней, роли мутаций в соматических клетках в канцерогенезе, иммунодефицитных состояниях, старении, лучевой болезни и других патологических состояниях (Бочков Н.П. и др., 2011). Серьезная значимость мутагенеза в соматических клетках определила выделение группы наследственных болезней, названных «приобретенные наследственные болезни» (McKusick, 2006).

Количественная оценка спонтанного уровня генных мутаций в соматических клетках in vivo изучена еще недостаточно, хотя эти данные важны для прогнозирования потери гетерозиготности в клетках по онкогенам и развития опухолей, а также для выяснения связи соматических мутаций с нормальными и патологическими процессами в организме. Имеются данные по оценке спонтанного уровня мутаций в двух локусах: гипоксантинфосфорибозил-трансферазы (лимфоциты) и гликофорин А (эритроциты). Средняя частота мутаций равна 2-4×10^-6. На первый взгляд, это не очень высокая частота, но исходя из огромного количества соматических клеток и примерно 20 тыс. генов в каждой клетке, нетрудно представить весь объем соматической наследственной изменчивости. Таким образом, в организме постоянно поддерживается высокий уровень изменчивости, а мутантные клетки или погибают путем апоптоза, или успешно размножаются, или просто выключаются из функции органа.

Экспериментальные данные на культурах клеток показывают, что спонтанная частота, или базовый уровень генных мутаций, составляет 1×10^-4-10^-5 клеток, т.е. выше, чем in vivo, что можно объяснить «стрессом » на условия культивирования.

Закономерностям и количественной оценке мутагенеза в соматических клетках посвящено большое количество работ (Бочков Н.П. и др., 2001; Srám R.J. et al., 1998; Anderson D., 2010), главным образом по учету хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови. Помимо этого показателя, об интенсивности хромосомного мутагенеза можно судить по частоте сестринских хроматидных обменов и микроядер, хотя последние являются суммарным показателем хромосомных (ацентрические фрагменты) и геномных (отставшие хромосомы) мутаций.

В результате методически сходных исследований, включающих цитогенетический анализ сотен тысяч метафаз, установлено, что уровень спонтанного мутирования человека, выражаемый через число клеток с хромосомными аберрациями, составляет 1-3% и не зависит от половой принадлежности. При этом спектр хромосомных аберраций преимущественно представлен одиночными, реже парными, фрагментами хромосом. Аберрации обменного типа чрезвычайно редки и, как правило, свидетельствуют о воздействии каких-то неучтенных мутагенных факторов. Иногда встречающиеся в литературе оценки, превышающие указанные показатели, могут быть объяснены особенностями культивирования клеток, малым объемом экспериментальных выборок или недостаточно строгим отбором добровольцев, вовлекаемых в исследование. В пользу этого свидетельствуют данные об изменении спонтанного выхода клеток с хромосомными аберрациями в зависимости от витаминной обеспеченности доноров и состава культуральных сред.

Анализ большой базы данных, полученных на протяжении 30 лет (1,2 тыс. человек, 330 тыс. клеток) показал, что спонтанный уровень колеблется в зависимости от времени года, а его частота снижается и повышается в периоды изменений магнитного поля Земли с периодом 4,5 года (Бочков Н.П. и др., 2001; Чеботарев А.Н. и др., 2002). За последний 20-летний период спонтанный уровень хромосомных аберраций в г. Москве увеличился в два раза, что можно объяснить ухудшением экологической обстановки.

В костном мозге частота хромосомных аберраций составляет 1,5%. Можно полагать, что хромосомная изменчивость в лимфоцитах и клетках костного мозга, а возможно, и в других клетках, примерно одинакова.

Оценки сестринских хроматидных обменов (СХО), полученные разными авторами в разные годы (1970-2000 гг.), составляют 7-8 обменов на 1 клетку в контрольных культурах лимфоцитов периферической крови (Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 1998, Landi S. et al., 2000).

Таким образом, обобщая вышесказанное, можно заключить, что уровень спонтанного мутирования в соматических клетках является достаточно консервативным показателем, колеблющимся в незначительных пределах. На это указывают данные цитогенетических исследований, проводимых в разных странах в течение последних 50 лет: частота лимфоцитов периферической крови человека с нестабильными аберрациями хромосом лежит в пределах 1-3%, микроядер 3,6-7 на 1 тыс. клеток и СХО примерно 7-8 на клетку.

Особый интерес представляет исследование зависимости спонтанного мутирования от возраста, что связано как с необходимостью методической оптимизации эпидемиологических цитогенетических исследований, так и дальнейшим развитием фундаментальных представлений о причинах и механизмах старения (мутационная теория старения). Одни авторы указывают, что в детском и юношеском возрасте частота аберраций значительно ниже, чем у взрослых (Merlo D.F. et al., 2007), другие не находят принципиальных различий в частоте выхода клеток с хромосомными аберрациями у молодых, взрослых или пожилых пациентов (Бочков Н.П. и др., 2001). Анализ данного вопроса затрудняется тем, что возраст - это не только физиологическое состояние организма, но еще и стиль жизни: вредные привычки, диета, место жительства, стрессогенные нагрузки, сопутствующие заболевания и еще ряд факторов, которые, по экспериментальным данным, могут отражаться на уровне спонтанного мутирования. Если пренебречь этими факторами, тогда увеличение спонтанного мутирования при старении выглядит очевидным и подтверждается не только учетом нестабильных хромосомных аберраций, но также транслокаций сестринских хроматидных обменов, микроядер, анеуплоидий, мутаций по устойчивости к 6-тиогуанину и гипоксантину, разрывов ДНК и может быть объяснено общим падением адаптационных возможностей организма, в частности снижением ДНК-репарирующей способности клеток.

Спонтанная частота геномных мутаций в соматических клетках (полиплоидии, анеуплоидии) изучалась меньше, чем хромосомных мутаций. Обусловлено это тем, что метод кариотипирования для учета геномных мутаций имеет большие методические недостатки. В процессе приготовления цитогенетических препаратов происходит разброс хромосом, ведущий к искусственно вызванной моносомии. В последнее время для учета анеуплоидии стали использовать FISH-метод применительно к интерфазным клеткам. Эта достаточно строгая методика позволяет избегать ошибок.

Работы, выполненные на лимфоцитах периферической крови, культурах стволовых клеток из костного мозга и жировой ткани, показывают, что частота анеуплоидных клеток по каждой хромосоме составляет 1-2%. Следовательно, общая частота анеуплоидии по всем хромосомам составляет 25-40% клеток. Большая часть анеуплоидных клеток погибает при делении, потому что повышение частоты анеуплоидии в ряду клеточных поколений не отмечается. В характеристике спонтанного мутагенеза на геномном уровне больше вопросов, чем ответов. Например, нет ответа на вопросы: одинакова ли частота нерасхождения и отставания разных хромосом; какова частота геномных мутаций у людей разного возраста и пола; зависит ли частота анеуплоидии от типа клеток, и т.п.

В заключение настоящего раздела следует отметить, что изучение спонтанного уровня мутирования является одним из фундаментальных направлений генотоксикологических исследований, необходимость которых определяется потребностью реальных представлений о спонтанном мутагенезе и факторах, приводящих к его вариабельности. Без их учета невозможны экстраполяция результатов, полученных при экспериментальной оценке генотоксичности ксенобиотиков в модельных тест-системах, и генетический мониторинг человеческих популяций.

Индуцированный мутагенез является предметом интенсивных исследований с 20-х годов ХХ в. В целом его изучение в соматических клетках относилось к трем главным направлениям в генетике: как модели для изучения организации генома; как модели изучения индуцированного мутагенеза в зародышевых клетках; как индикатора генетических эффектов факторов окружающей среды. Последнее из названных направлений будет подробно разобрано в данной главе.

Индуцированный мутагенез - это универсальное явление или всеобщее свойство живых организмов, которые отличаются только видовыми характеристиками чувствительности к факторам, усиливающим мутагенез. Живых существ, абсолютно толерантных к мутационной индукции, среди эукариот не обнаружено.

Закономерности индуцированного мутагенеза на генном уровне в соматических клетках изучались мало, и никаких обобщений по этому вопросу сделать нельзя.

Основное внимание к закономерностям индуцированного мутагенеза было проявлено на хромосомном уровне при радиационных и химических воздействиях.

Основные параметры индуцированного мутагенеза следующие: доза-эффект (мощность дозы или фракционирование для ионизирующих излучений), время- эффект, время после воздействия, специфичность мутагена, комбинированное действие, межиндивидуальные вариации.

Доза-эффект. Кривые доза-эффект получены в многочисленных экспериментах с радиационными источниками и химическими мутагенами in vitro (разные культуры) и in vivo (лимфоциты). Хотя характер кривых и количественные закономерности радиационного мутагенеза отличаются друг от друга у разных авторов, все же основные выводы не вызывают сомнений. Частота хромосомных аберраций возрастает с увеличением дозы облучения или химического мутагена. Эта закономерность проявляется in vitro и in vivo. Характер дозовых зависимостей для разных типов аберраций не одинаков: количество фрагментов возрастает по линейной зависимости, а остальные аберрации - нелинейно. Количество разрывов хромосом, индуцируемых на единицу дозы мутагена, неодинаково при разных дозах. Из-за большого разнообразия химических соединений количественные закономерности индукции хромосомных аберраций чрезвычайно многообразны. Действие химических веществ осуществляется не только при прямом взаимодействии со структурными компонентами хромосом, но и при влиянии их на клеточный метаболизм или эффективность репарации повреждений. Закономерность «доза или концентрация-эффект» во всех случаях сохраняется. На эффективность действия химических мутагенов при одной и той же концентрации влияет температура.

Время-эффект (мощность дозы) и время после воздействия. Частота хромосомных аберраций зависит от мощности дозы облучения клеток. При уменьшении мощности дозы облучения или ее фракционирования снижается двухударный компонент хромосомных аберраций. Влияние мощности дозы проявляется в уменьшении аддитивного эффекта на 20-30%. Хроническое облучение менее эффективно, чем острое, что объясняется репарационными процессами. Что касается химических мутагенов, то, безусловно, длительность воздействия влияет на цитогенетический эффект. Концентрация и время экспозиции определяют дозу воздействия химических мутагенов. Характер экспозиционных зависимостей во многом обусловлен типом мутагена.

Значение отсроченности в реализации мутагенного воздействия не вызывает сомнений. Однако «следы» индуцированного мутагенеза сохраняются, и поэтому различают даже такие формы, как трансмиссивный, отсроченный и задержанный мутагенез в соматических клетках, определяемый нестабильностью генома.

Специфичность мутагенных факторов и эффект. Эта закономерность выявлена и для радиационного, и для химического мутагенеза. Частота и характер хромосомных аберраций зависят от типа ионизирующих излучений (α-, β-, γ-излучения, нейтроны). Быстрые нейтроны наиболее эффективны в отношении индукции хромосомных аберраций. Существует количественная и качественная специфика действия химических мутагенов. Вещества, содержащие несколько активных (алкилирующих) групп, более эффективны, чем монофункциональные соединения. По типу образуемых хромосомных аберраций, дозовым зависимостям, типу распределения аберраций по клеткам химические мутагены можно подразделить на два класса: одноцентровые и многоцентровые. В первом случае все активные группы присоединены к одному атому молекулы, во втором - они находятся в разных местах молекулы.

Комбинированное действие мутагенов. Совместное действие разных мутагенов может в принципе давать аддитивный (суммированный), синергичный (усиливающий) и антагонистичный (ослабляющий) эффект. Основной вывод по этому вопросу следующий: радиация и истинные химические мутагены, а также разные химические мутагены обладают аддитивным эффектом в реальных дозах экспозиции. Это правило не является абсолютным, потому что имеются вещества - модификаторы мутагенеза - антимутагены и комутагены (о данных веществах будет рассказано ниже).

Индивидуальные колебания индуцированного уровня хромосомных аберраций. Индивидуальные вариации частоты хромосомных аберраций при радиационных воздействиях имеют место, но они нечасто встречаются и нерезко выражены. Скорее, они обусловлены генетическими вариациями репаративных процессов. В химическом мутагенезе вариации выражены значительнее. Колебания химически индуцированного мутагенеза обусловлены не только вариациями репаративных процессов, но и генетически детерминированными процессами биотрансформации ксенобиотиков (мутагенов). Описаны протективные и предрасполагающие сочетания аллелей ряда генов для спонтанного и химически индуцированного мутагенеза.

Значение индуцированного мутагенеза в подверженности болезням. Мутагены могут вести к плохо репарируемым повреждениям ДНК и вызывать различные типы мутаций, экспрессия которых в клетке ведет к новым характеристикам клеточного фенотипа и, следовательно, к ранней или прогрессивно развивающейся патологии. Это справедливо для хронических дегенеративных болезней (рак, сердечно-сосудистые болезни, диабет). Мутагенез может также ускорять негативные эффекты процессов старения или повышать вероятность возникновения болезней, которые ассоциированы с преждевременным старением и возрастной патологией, например болезни Альцгеймера.

Основные сведения о медицинской значимости мутагенеза представлены в табл. 7-5.

Таблица 7-5. Медицинские и биологические последствия мутагенеза

Канцерогенез. Имеются доказательства, что мутации играют ключевую роль в канцерогенезе. Инициация опухоли начинается с точковых мутаций в соматических клетках. Более поздние стадии развития рака основываются на таких процессах, как быстрая пролиферация клеток, амплификация генов, хромосомные перестройки. Важны также эпигенетические изменения, включая метилирование ДНК, модификацию гистонов, микро-РНК.

На рис. 7-2 представлено развитие генерализованного рака и атеросклероза с ключевыми точками взаимодействия генотоксичных химических веществ. Мутационные исследования традиционно фокусируются на ДНК-реактивных канцерогенах, которые взаимодействуют с ДНК в связи с метаболической активацией. Однако важна также роль не только активных соединений, непосредственно повреждающих ДНК, но и патологических процессов (хронического воспаления). Как возможный потенциальный альтернативный источник образования активных соединений идентифицирована и третья группа мутагенов, ингибирующая топоизомеразу II, чей первичный мутагенный эффект проявляется на хромосомном уровне.

Рис. 7-2. Роль генотоксикантов в канцерогенезе и атерогенезе (АФК - активные формы кислорода, ЛПНП - липопротеиды низкой плотности)

Сердечно-сосудистые заболевания. Некоторые атеросклеротические бляшки имеют моноклональное происхождение. Предположительно соматические мутации играют роль на ранних стадиях атеросклероза. ДНК-аддукты, окислительные повреждения ДНК и другие типы генетических повреждений обнаруживаются в атеросклеротических бляшках, а именно - потеря гетерозиготности, микросателлитная нестабильность, варьирующее число повторов, структурные хромосомные изменения.

Исходя из реальной отрицательной значимости индуцированного мутагенеза, возникает вопрос о его профилактике, которую логично проводить на основе широкого генетического скрининга, направленного на выявление мутагенов и предотвращение их контакта с людьми. Однако, несмотря на все усилия, предпринимаемые в этом направлении, не менее 10% населения систематически контактируют с промышленными мутагенами. Мутагены широко представлены среди экотоксикантов, пищевых контаминантов и лекарств некоторых групп, они возникают при термической обработке пищи, сгорании табака, углеводородов, являются естетвенными метаболитами ряда растений и образуются в организме человека.

Таким образом, строить профилактику индуцированного мутагенеза только на основе генетического скрининга недостаточно. В этой связи внимание привлекает явление модификации индуцированного мутагенеза, которое может выражаться в усилении (комутагенная модификация) или ослаблении (антимутагенная модификация) эффектов мутагенов.

Индукция мутаций - многоэтапный процесс, составляющими которого являются поступление, распределение, биотрансформация и выведение ксенобиотика, его накопление в клетках-мишенях, взаимодействие с ДНК, действие репарационных и других защитных систем. Очевидно, что влиянием на любой из перечисленных этапов становления мутаций можно модифицировать действие мутагена.

Каждое звено становления мутаций может рассматриваться как биологическая мишень для модификации мутагенеза, что выводит исследования в этой сфере за рамки эмпирических подходов, позволяет вести направленный поиск и изучение модификаторов мутагенеза. Важно, что одно и то же соединение может оказывать воздействие не на одну, а сразу на несколько мишеней и разнонаправленно модифицировать мутагенные эффекты, в одних случаях проявляя антимутагенные, в других комутагенные свойства. Последние типичны для многих природных и синтетических антиоксидантов, особенно фенольных производных.

Многие мутагены реализуют повреждающее действие через индукцию окислительного стресса и связанного с ним образования эндогенных мутагенов: свободных радикалов, перекисей, альдегидов. В этом случае мутагенез может быть модифицирован влиянием на эффективность антиоксидантной защиты.

Имеется два бесспорных классификационных термина, отражающих возможную разнонаправленность модификации мутагенеза, - антимутаген и комутаген, соответственно вещества, ослабляющие и усиливающие генотоксическое действие мутагенов. Соединения, обладающие собственным мутагенным потенциалом, не могут рассматриваться как модификаторы мутагенеза. Все варианты их взаимодействия с другими мутагенами удовлетворительно описываются в рамках общебиологических представлений о синергизме, аддитивности или антагонизме действия биологически активных веществ.

Комутагенез - увеличение повреждающего действия заведомых мутагенов под действием немутагенных соединений. Комутагены не обладают собственной мутагенной активностью, поэтому беспрепятственно проникают через сито генетического скрининга, но могут играть существенную роль в увеличении популяционного генетического груза, усиливая эффекты слабых средовых мутагенов. Работ по выявлению возможных комутагенов немного, тем не менее можно уверенно указать на комутагенную активность фенольных и полифенольных соединений синтетического и природного происхождения, а также некоторых других антиоксидантов. Пищевым комутагеном является краситель «желтый солнечный закат» (E 110), широко распространенный в безалкогольных напитках. Показаны комутагенные эффекты некоторых красных вин, что, вероятно, связано с высоким содержанием в их составе полифенольных соединений. Имеются сообщения о комутагенных эффектах кофеина и ванилина. Продемонстрирована повышенная чувствительность клеток крови здоровых доноров, принимавших витаминные комплексы определенного количественного и качественного состава, к действию ряда мутагенов (Voronina E.S. et al., 2008; Durnev A.D. et al., 2009).

Среди фармакологических средств комутагенная активность в экспериментах на млекопитающих установлена у гипотензивных средств - представителей всех трех известных химических групп блокаторов кальциевых каналов.

Антимутагенная модификация мутагенеза рассматривается как биологическая основа защиты наследственности человека. Механизмы антимутагенеза очень разнообразны. Их основные варианты представлены в табл. 7-6.

Таблица 7-6. Механизмы антимутагенеза

В настоящее время опубликованы сведения о нескольких сотнях соединений, проявивших антимутагенную активность в экспериментальных условиях. Однако многие из них основаны на результатах, полученных в экспериментах на микроорганизмах, дрожжах и насекомых, что затрудняет экстраполяцию на высших животных и человека.

Современные исследования в области антимутагенеза развиваются в двух направлениях: фармакологическом и нутрициологическом.

Фармакологические исследования направлены на поиски путей купирования эффектов соединений, в первую очередь лекарств, обладающих заведомой мутагенной активностью, но применяемых в силу медицинской необходимости, а также для купирования аномально высокого уровня мутирования, наблюдающегося при некоторых заболеваниях и у людей с вредными привычками.

Эти работы базируются на детальном изучении механизмов мутагенного действия и предполагают создание специфических фармакологических корректоров мутагенеза.

По своим задачам разработка корректора мутагенеза принципиально не отличается от разработки любого фармакологического средства на основе синтетического или природного соединения. Предполагаемый корректор не только должен обладать высокой специфической антимутагенной активностью к избранному мутагену или группе мутагенов, обладающих сходными механизмами повреждающего действия, но также отвечать всем требованиям, предъявляемым к безопасности лекарственных средств. Правильно сконструированный фармакологический антимутаген способен полностью устранять эффект мутагена.

В ряде работ установлены и всесторонне исследованы in vivo антимутагенные свойства ряда лекарств и лекарств-кандидатов. Особенно перспективным в качестве фармакологического антимутагена является отечественный анксиолитик афобазол^♠, проявивший защитные свойства в широком диапазоне доз, а также в разных тканях по отношению к широкому кругу химических мутагенов.

Основываясь на изучении механизма действия мутагена, профилей фармакокинетики и распределения мутагена, а также возможных модификаторов его эффектов, можно добиться полного устранения мутагенного эффекта. Особое значение этот подход имеет для коррекции мутагенных эффектов незаменимых лекарств.

Так, этилтиобензимидазол (бемитил) полностью устраняет мутагенный эффект диоксидина^♠ без влияния на эффективность этого антимикробного лекарства.

Нутрициологическое направление ведет поиски путей увеличения устойчивости к мутагенным воздействиям за счет использования пищевых веществ или продуктов. Наиболее ярким примером исследований в этом направлении является изучение роли эссенциальных нутриентов в формировании устойчивости к мутагенным воздействиям. В частности, в наших исследованиях было показано, что некоторые витаминно-минеральные комплексы определенного количественного и качественного состава могут значимо увеличивать устойчивость клеток человека ex vivo к цитогенетическим воздействиям разных химических мутагенов, добавляемых in vitro (Voronina E.S. et al., 2008; Durnev A.D. et al., 2009).

Большой интерес вызывают работы, направленные на создание антимутагенных функциональных продуктов и биологически активных добавок. Их развитие базируется на широком скрининге антимутагенных свойств пищевых соединений. В наших исследованиях на млекопитающих антимутагенные свойства были выявлены у каротиноидных и антоциановых красителей, подсластителя аспартама, природных метаболитов (убихинона, бетаина, липидовита, экстракта древесины дуба, экстракта березовой коры, байколинатов) и ряда других. На их основе были разработаны и успешно апробированы ряд антимутагенных функциональных продуктов и биологически активных добавок.

Большинство известных антимутагенов относится к растительным пищевым веществам, но антимутагенные свойства выявлены также у некоторых синтетических пищевых соединений, например у подсластителя аспартама. Как правило, эффективность пищевых антимутагенов относительно невысока. Под их влиянием эффекты тех или иных мутагенов снижаются не более чем на 25-40%. Кроме того, в пищевой биомассе антимутагенный эффект отдельных привнесенных пищевых соединений в большинстве случаев нивелируется, что создает дополнительные сложности при создании пищевых функциональных антимутагенных продуктов.

В целом проблема защиты генома с помощью фармакологических и нутрициологических антимутагенов далека от окончательного решения, несмотря на очевидные перспективы развития и первый положительный опыт их практического использования. Для подавляющего большинства известных антимутагенов не раскрыто их влияние на зародышевые клетки, не освещена проблема возможных комутагенных эффектов, особенно применительно к «вторичным» тканям, не разработаны подходы к индивидуальной и популяционной оценке антимутагенной профилактики негативных медицинских последствий мутагенеза. Кроме того, неясны этические и деонтологические вопросы назначения фармакологических антимутагенов и применения антимутагенных пищевых продуктов для профилактики вероятностных и отдаленных эффектов мутагенеза. Вместе с этим антимутагенная профилактика и предупреждение контакта человека с мутагенными и комутагенными веществами - это путь для реального ослабления мутагенной нагрузки на человека.

Генетика человека прошла большой путь в оценке и понимании сущности мутационного процесса. В 20-30-х годах ХХ в. первоначальная постановка вопроса сводилась к доказательству наличия «свежих» мутаций в популяциях человека и разработке методов оценки частоты мутаций (Девенпорт Ч., Холдейн Дж., Меллер Г., Пенроуз Л.).

В 50-е годы ХХ в. Г. Меллер снова привлек внимание к грузу мутаций у человека в связи с повышением радиационного фона Земли. Открытие хромосомных болезней послужило новым толчком для изучения груза мутаций. Цитогенетические методы дали возможность изучать самым подробным образом интенсивность мутационного процесса на хромосомном и геномном уровнях.

К 70-м годам ХХ в. резко возросло внимание к изучению мутационного процесса в связи с пониманием серьезности последствий химического мутагенеза не только в зародышевых, но и в соматических клетках. Накопленный огромный материал позволяет сделать следующие выводы.

Мутагенез является универсальным и фундаментальным свойством всех живых организмов, включая человека. Мутации возникают в зародышевых и соматических клетках, на генном, хромосомном и геномном уровнях. Частота спонтанных мутаций в соматических клетках выше, чем в зародышевых клетках.

Мутагенез - многоэтапный процесс. Первым этапом является нарушение химической структуры ДНК. Предмутационные или первичные повреждения ДНК - это изменение нуклеотидной последовательности, химическая модификация азотистых оснований, образование аддуктов, разрывы цепей ДНК. Вторым этапом мутагенеза является высокоэффективная система репарации первичных повреждений. При этом либо восстанавливается целостность ДНК, либо первичное повреждение закрепляется в форме мутации.

Интенсивность мутагенеза существенно повышается под действием многих физических, химических и биологических факторов (индуцированный мутагенез). Изучены общие закономерности индуцированного мутагенеза: зависимость эффекта от дозы или концентрации, времени воздействия и послевоздействия, специфики мутагенного фактора, комбинированного действия мутагенов.

Проникновение к ДНК является необходимым условием мутагенеза только для ДНК-реактивных мутагенов, другие действуют опосредованно через индукцию образования эндогенных мутагенов (ДНК-нереактивные мутагены). Большинство мутагенов имеют смешанный характер действия и реализуют оба механизма. Доминирующий механизм может меняться от дозы, пути поступления и др.

Интенсивность спонтанного и индуцированного мутагенеза зависит от генотипических особенностей организма, определяющих активность репарационных систем и биотрансформацию ксенобиотиков-мутагенов.

Мутагены «наводняют» среду обитания человека. Известно более тысячи доказанных на клетках человека химических мутагенов. Они встречаются в пище, лекарствах, производственных факторах, коммунальной среде, атмосфере городов, воде.

Индуцированный мутагенез может быть модифицирован как в сторону уменьшения (антимутагенез), так и в сторону увеличения (комутагенез) под действием лекарственных и пищевых факторов.

Медицинская значимость мутагенеза определяется ведущей ролью индуцированных мутаций в увеличении генетического груза, уровней врожденных пороков развития, наследственных, онкологических и сложно наследуемых заболеваний, снижении общей приспособленности человека.

Среда обитания человека постоянно меняется. С коммерческими целями только в западных странах производится ежегодно около 60 тыс. видов химических веществ. Общее их производство из года в год экспоненциально увеличивается, составляя миллиарды тонн. Не вызывает сомнений, что многие факторы нашей среды являются потенциальными мутагенами. Это широкий спектр естественных и синтетических химических веществ в воздухе, которым мы дышим, в воде, которую мы пьем, в пище, которую мы едим, на рабочем месте, где мы работаем, в больнице, где мы лечимся, в коммунальной среде, где мы живем.

Наш груз мутаций складывался десятками тысячелетий. Все, что человечество накопило в популяциях, - это наше прошлое. С ним мы живем в настоящем. С генетической точки зрения мы живем в резко меняющихся условиях, повышающих мутационный процесс. Одним из существенных факторов динамики генетического груза является индуцированный мутагенез, которым можно управлять. От этого зависит будущее груза мутаций в популяциях человека.

В проблеме «груз мутаций» как в фокусе концентрируются наиболее важные теоретические и прикладные проблемы генетики человека. Чем точнее они будут решаться, тем меньше для общества будет весить этот груз.

Феноменальные успехи в молекулярной биологии в последние несколько десятилетий существенно увеличили список новых технологий и подходов, основанных на реализации проекта генома человека. Во всех областях биомедицинских исследований сделан огромный рывок, и генетическая токсикология - не исключение.

Две главные задачи генотоксикологии на сегодняшний день:

Анализ литературы по мутагенезу в историческом аспекте высвечивает факт, что стержневые экспериментальные протоколы в генотоксикологии оставались неизменными более 40 лет, а генетика в этот период преобразовалась. Следовательно, тестирование веществ на вредные эффекты для человека и окружающей среды необходимо пересмотреть с учетом современных генетических технологий, поскольку речь идет об охране здоровья и генетической безопасности человечества в XXI веке.

Бочков Н.П., Аклеев А.В., Балева Л.С. Генетические последствия Челябинских и Чернобыльских радиоактивных загрязнений // Вестн. РАМН. - 1996. - № 6. - С. 64-72.

Бочков Н.П., Пузырев В.П., Смирнихина С.А. Клиническая генетика. 4-е изд. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 554 с.

Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. - М.: Медицина, 1989. - 272 с.

Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., Катосова Л.Д. и др. База данных для анализа количественных характеристик частоты хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека // Генетика. - 2001. - Т. 37, № 4. - С. 549-559.

Дуброва Ю.Е. Нестабильность генома среди потомков облученных родителей. Факты и их интерпретация // Генетика. - 2006. - Т. 42, № 10. - С. 1335-1347.

Дурнев А.Д. Токсикология наночастиц // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2008. - Т. 145, № 1. - С. 78-80.

Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. - М.: Медицина, 1998. - 328 с.

Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Комутагенез - новое направление исследований в генотоксикологии // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т. 135, № 6. - С. 604-612.

Дурнев А.Д., Сиднева Е.С., Жанатаев А.К. и др. Защитное действие витаминов при индуцированном мутагенезе // Вестн. РАМН. - 2007. - № 7. - С. 6-13.

Ижевский П.В. Генетические последствия облучения // Мед. генетика. - 2006. - № 3(45). - С. 3-12.

Чеботарев А.Н., Бочков Н.П., Ораевский В.Н. и др. Влияние изменения магнитного поля Земли на частоту спонтанных хромосомных аберраций в соматических клетках человека // Докл. РАН. - 2002. - Т. 384, № 4. - С. 566-568.

Altieri F., Grillo C., Maceroni M., Chichiarelli S. Antioxid DNA damage and repair: from molecular mechanisms to health implications // Redox Signal. - 2008. - Vol. 10(5). - P. 891-937.

Anderson D. A European perspective on the role of EMS societies. How do they help public health and research and the development of regulations? // Environ. Mol. Mutagen. - 2010. - May 5.

Andreassi M.G., Botto N. Genetic instability, DNA damage and atherosclerosis // Cell Cycle. - 2003. - Vol. 2(3). - P. 224-227.

Dolinoy D.C., Jirtle R.L. Environmental epigenomics in human health and disease // Environ. Mol. Mutagen. - 2008. - Vol. 49(1). - P. 4-8.

Eckert K.A., Hile S.E. Every microsatellite is different: Intrinsic DNA features dictate mutagenesis of common microsatellites present in the human genome // Mol. Carcinog. - 2009. - Vol. 48(4). - P. 379-388.

Elespuru R.K., Sankaranarayanan K. New approaches to assessing the effects of mutagenic agents on the integrity of the human genome // Mutat. Res. - 2007. - Vol. 616. - P. 83-89.

Ellegren H., Smith N.G., Webster M.T. Mutation rate variation in the mammalian genome // Curr. Opin. Genet. Dev. - 2003. - Vol. 13(6). - P. 562-568.

Ferguson L.R., Philpott M. Nutrition and mutagenesis // Annu. Rev. Nutr. - 2008. - Vol. 28. - P. 313-329.

Kocsis A., Molnar H. Genotoxicity: Evaluation, Testing and Prediction. - New York: Nova Science Publishers, 2009. - P. 157-187.

Landi S., Iazzolino E., Barale R. Are baseline frequencies of SCEs, CAs, and MN in human lymphocytes related to hematological values? // Mutat. Res. - 2000. - Vol. 469(1). - P. 159-166.

McKusick V.A. A 60-year tale of spots, maps, and genes // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. - 2006. - Vol. 7. - P. 1-27.

Merlo D.F., Ceppi M., Stagi E. еt al. Baseline chromosome aberrations in children // Toxicol. Lett. - 2007. - Jul. 30. - P. 60-67.

Neel J.V., Schull W.J., Awa A.A. еt al. The children of parents exposed to atomic bombs: estimates of the genetic doubling dose of radiation for humans // Am. J. Hum. Genet. - 1990. - Vol. 46(6). - P. 1053-1072.

Peltonen L., McKusick V.A. Genomics and medicine. Dissecting human disease in the postgenomic era // Science. - 2001. - Vol. 291(5507). - P. 1224-1229.

Schärer O.D. Chemistry and biology of DNA repair // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2003. - Vol. 42. - P. 2946-2974.

Srám R.J., Rössner P., Peltonen K. et al. Chromosomal aberrations, sister-chromatid exchanges, cells with high frequency of SCE, micronuclei and comet assay parameters in 1,3-butadieneexposed workers // Mutat. Res. - 1998. - Vol. 419(1-3). - P. 145-154.

Yoshida T. Micronutrients and Health Research. - New York: Nova Science Publishers, 2008. - P. 279-291.

Большинство глав руководства написаны с точки зрения индивидуального уровня организации - в них рассматриваются индивидуумы с их заболеваниями и геномами. При анализе генетической изменчивости на популяционном уровне организации материи индивидуум перестает быть единицей наблюдения: вместе с другими людьми он составляет популяцию, в которой действуют уже иные, популяционно-генетические процессы: мутации, отбор, миграции и дрейф генов. Изучение этих процессов помогает ответить на вопросы: «Отчего наследственные болезни чаще возникают в одних популяциях и отсутствуют в других? Как, исходя из знания особенностей популяции, прогнозировать груз наследственной патологии в ней?» Для ответа на эти вопросы необходимо обратиться к истории популяций и их географической изменчивости. Это позволит понять закономерности распространения всех генов, составляющих генофонд, в том числе и генов, определяющих наследственные болезни человека.

Популяционная генетика человека изучает структуру генофонда, его внутри- и межпопуляционное разнообразие, генетические процессы, приводящие к изменениям популяционных генофондов, историю их формирования и пространственные закономерности в их изменчивости.

Генофонд популяции можно определить как совокупность индивидуальных геномов, входящих в состав популяции.

Генофонд обладает свойством изменяться в поколениях. Даже одно и то же поколение в период своего рождения и в период ухода из жизни по генетическому составу не тождественно само себе. Причина этого состоит в связи жизнеспособности людей с их генотипами: обладатели разных генотипов при прочих равных условиях имеют неравную вероятность дожить до одного и того же возраста. Лишь в случае внутриутробной гибели и ранней детской смерти эта связь становится зримой, но чаще ее регистрируют лишь статистически. Именно поэтому методы одномерной и многомерной статистики столь важны в популяционной генетике, а понятие вероятности является в ней базовым: например, исходный параметр - популяционная частота гена - означает вероятность, с которой ген можно встретить в популяции.

Еще большие изменения в структуру генофонда вносит неравная рождаемость - разная вероятность для различных генотипов воспроизвести себя в поколениях. По параметрам рождаемости отличаются разные семьи даже в одной популяции, отличается городское население от сельского, отличаются разные районы страны друг от друга, отличаются разные народы. Различия в интенсивности урбанизации, миграций, в экономических условиях, образе жизни, традициях культуры и структуре браков вызывают неравный прирост разных частей генофонда и тем самым меняют общие характеристики генофонда от поколения к поколению. Изменения в составе генофонда следуют за всеми другими, в том числе за изменениями в социально-экономической и культурной сфере жизни населения.

Поэтому важно подчеркнуть, что хотя генофонд популяции несет на себе печать исторического процесса, но генофонд сам не направляет и не детерминирует этот исторический процесс. Гены как щепки, несущиеся в потоке истории генофонда, указывают, где находится ее основное русло, водовороты и заводи, но они сами не определяют ход истории, как щепки не задают направление реки. Изменения частот генов, соотношения гомозигот и гетерозигот - лишь очевидная поверхность тех глубинных генетических процессов, которые приводят к становлению, развитию или гибели генофонда.

Основная цель популяционной генетики - изучение структуры, истории, пространственной изменчивости и динамики генофонда.

Структура генофонда - это генетические характеристики популяции: частота генов, соотношения гетерозигот и гомозигот, различия между субъединицами подразделенной популяции и наиболее общие закономерности изменчивости генофонда в пределах его ареала, возникшие под давлением факторов популяционной динамики (миграции, дрейф генов, мутации и отбор).

Для описания генетической структуры популяции используют два основных инструмента:

Распределение частот полиморфного гена в популяциях несет важную информацию о суммарном действии факторов популяционной динамики. Анализ различий генных частот (дополненный расчетами генетических расстояний, главных компонент и других мер многомерной статистики) - основной инструмент, используемый в большинстве работ по популяционной генетике. Соотношение гомозигот и гетерозигот - это проявление генетического разнообразия популяций и интенсивности инбридинга в ней. Это соотношение важно для прогноза груза наследственной патологии. Генетическое разнообразие популяций описывают с помощью двух дополняющих друг друга характеристик - внутрипопуляционного (гетерозиготности популяций) и межпопуляционного разнообразия (генетических различий между популяциями).

Мерой генетического разнообразия популяции служат не характеристики отдельных генетических маркеров, а показатели, усредненные по их множеству. Средний показатель дифференциации генофонда (F_ST) позволяет количественно оценить суммарное действие двух важнейших факторов популяционной динамики - дрейфа генов и давления миграций. Сравнение средней дифференциации F_ST(i) с дифференциацией по отдельным генам F_ST помогает оценить направление и интенсивность действия на конкретный ген третьего фактора популяционной динамики - отбора. Изучение распределения частот генов и генотипов, генетического разнообразия и генетических процессов, протекающих в популяции, позволяет обнаружить наиболее общие черты в структуре и изменчивости генофонда и в дальнейшем перейти к прогнозу груза наследственной патологии. Е.К. Гинтер отмечал: «Зная особенности генетической структуры популяции, можно надежно предсказать величину груза наследственных болезней. Генетическая структура влияет не только на количественную характеристику груза наследственных болезней, но и на качественную, представленную спектром наследственных болезней».

Факторы популяционной динамики можно рассматривать как механизмы, запускающие такие генетические процессы в популяции, которые могут привести к изменению структуры генофонда - изменению частот генов и генотипов, увеличению или уменьшению разнообразия и, следовательно, к изменению груза наследственной патологии. К основным факторам популяционной динамики относят мутации, дрейф генов, миграции и отбор. Поскольку каждый из них подробно рассмотрен в специальных разделах этой главы, здесь будут приведены лишь краткие определения.

Мутации - события, приводящие к возникновению нового варианта фрагмента ДНК, - создают основу всего генетического полиморфизма популяций. Это первый шаг для возникновения как генетического разнообразия внутри популяций, так и между ними. Мутационные события обычно скрыты от глаз исследователя. Исключение составляют доминантные мутации, например доминантные наследственные нарушения, сразу подставляющие мутации de novo под действие отбора. Мутации, вызывающие рецессивные наследственные болезни, скрыты от отбора и манифестируют лишь тогда, когда по воле случая встречаются с такими же мутациями в генотипе одного индивидуума. До такого печального события могут пройти многие поколения, в течение которых велика вероятность потери мутации. Поскольку для изучения популяций используют полиморфные генетические маркеры (с частотой не менее 1%), то становится очевидным: чтобы мутантный маркер достиг такой частоты, ему должны помочь три других, много более мощных фактора популяционной динамики, - дрейф генов, отбор и миграции.

Дрейф генов - случайные изменения частоты гена в популяциях - процесс, не имеющий направления. С равной частотой он может увеличить или уменьшить частоту генетического маркера. Интенсивность дрейфа генов полностью зависит от размера популяции: чем меньше ее размер, чем меньше гамет передается следующему поколению, тем больше вероятность, что у потомков пропорции частот генов будут отличаться от пропорций в родительском поколении. Наиболее яркие проявления дрейфа генов - «эффект основателя» и «бутылочного горлышка». Они оба связаны с резким сокращением и последующим ростом численности популяции. Разница между ними состоит в том, что «эффект основателя» предполагает малую численность популяции в период ее возникновения, поэтому большинство ее современных членов - потомки небольшой группы предков («основателей»). При эффекте «бутылочного горлышка» сокращение численности происходит уже в течение жизни популяции, но приводит к тому же результату: большинство членов современной популяции являются потомками нескольких предков, которые уцелели во время резкого сокращения численности популяции. Оба варианта приводят к сокращению генетически эффективного размера популяции N_e (см. «Факторы популяционной динамики: дрейф генов и миграции») и мощному действию дрейфа генов. Своеобразие ситуации состоит в том, что хотя современная популяция может быть очень большой по общей численности, но ее генетически эффективный размер будет немногим больше размера в период резкого сокращения ее численности. Именно поэтому обнаруживаются последствия дрейфа генов: в результате сокращения численности популяции в тот или иной исторический период современные популяционные частоты генов могут резко отличаться от частот как в предковых, так и в родственных популяциях.

Миграции - второй мощный фактор популяционной динамики, но по эффекту он противоположен дрейфу генов. Например, если рассмотреть несколько небольших дочерних популяций, произошедших от одной предковой, то дрейф генов будет создавать различия между ними, а обмен генами в результате миграций будет сокращать возникающие межпопуляционные различия, и тогда степень генетических различий между популяциями будет зависеть от соотношения интенсивности этих двух противодействующих факторов - дрейфа генов и миграций. Как и в случае размера популяции, важны не тотальные, а генетически эффективные миграции М_е (см. «Факторы популяционной динамики: дрейф генов и миграции»). Например, если массовая миграция, зафиксированная историей или демографией, не оставила потомков в популяции, то генетически эффективная миграция М_е будет равна нулю. Именно поэтому популяционная генетика рассматривает только те миграции, которые оставляют свой генетический след в популяции. Точно так же генетическая эффективность (М_е) интенсивных миграций между генетически сходными популяциями невелика, в то время как даже для небольших миграций из далеких или своеобразных популяций она может оказаться значительной.

Оба противодействующих фактора - дрейф генов и миграции - действуют на все гены одинаково, безотносительно к их адаптивной ценности. Именно поэтому дрейф генов и миграции называют селективно-нейтральными факторами в противовес отбору - селективно-значимому фактору.

Отбор - третий мощный фактор популяционной динамики, приводящий к изменению генофонда популяции и созданию ее адаптивной (селективной) структуры. В отличие от селективно-нейтральных факторов (миграций и дрейфа генов), отбор действует не на все гены сразу, а избирательно на каждый ген в зависимости от его адаптивной ценности. На индивидуальном уровне отбор приводит к снижению или повышению приспособленности индивидуума, что выражается в том, сколь многочисленное потомство он может оставить. На популяционном уровне отбор выражается в изменении генетических различий между популяциями по конкретному гену F_ST(i). При действии дифференцирующего отбора размах межпопуляционных различий по гену F_ST(i) выше, чем среднее по всем генам межпопуляционное разнообразие F_ST (F_ST(i) > F_ST). При действии стабилизирующего отбора размах межпопуляционных различий по конкретному гену F_ST(i) ниже, чем среднее межпопуляционное разнообразие F_ST (F_ST(i) < F_ST). Таким образом, по характеру отклонения F_ST(i) от F_ST можно судить о типе отбора (дифференцирующий или стабилизирующий) и интенсивности его действия на данный ген. Совокупность оценок интенсивности и типа отбора, полученная для репрезентативной выборки генов, позволяет оценить селективную структуру генофонда.

Ген и генофонд. Полное изучение даже одного индивидуального генома все еще становится событием мирового значения. Именно поэтому нереально напрямую изучить весь генофонд, т.е. всю совокупность индивидуальных геномов популяции. Однако для описания структуры генофонда, к счастью, можно использовать не весь геном, а сравнительно небольшие, но репрезентативные наборы генов. Их называют генетическими маркерами, а краткое описание дано в разделе «Генетические маркеры». С помощью панелей (совокупностей) тех или иных генетических маркеров исследуют структуру всего генофонда.

Реально существующая, но недоступная непосредственному наблюдению структура генофонда проецируется во множество картин изменчивости отдельных генов, поэтому по отдельному гену нельзя судить о генофонде в целом: описание отдельного гена дает лишь одну из частных проекций - своеобразную точку зрения на генофонд. Для описания структуры генофонда необходимо изучить изменчивость многих генов (генетических маркеров), обобщить эти данные во избежание случайностей и искажений частного видения и получить общие характеристики генофонда. Такие общие параметры можно получить по той или иной панели генетических маркеров, если их выборка из генома репрезентативна.

Поскольку каждая такая панель маркеров описывает один и тот же генофонд, то обобщенные показатели самого важного параметра структуры генофонда - межпопуляционного разнообразия - по любым панелям аутосомных маркеров

должны быть одинаковы. Благодаря этому феномену исследователи получают инструмент для верификации оценок изменчивости генофонда - полисистемный подход: если показатели межпопуляционного разнообразия по двум и более независимым системам маркеров оказываются одинаковыми, это означает, что обобщенные характеристики этих систем маркеров дают правильное описание структуры генофонда (см. «Генетические маркеры»).

Ясное понимание соотношения изменчивости отдельных генов и генофонда в целом - ключевой момент в популяционной генетике. Изучая полиморфизм отдельных генов, популяционная генетика определяет характеристики генофонда популяции и познает генетические процессы, его сформировавшие. Такое знание позволяет перейти к пониманию особенностей формирования груза наследственной патологии.

Популяция человека - относительно обособленная группа населения, которая исторически сложилась на определенной территории и воспроизводит себя в границах этого исторического ареала из поколения в поколение.

Это определение подчеркивает, что популяция - не эфемерная группа людей, а особый, исторически сложившийся и стабильный суперорганизм, живущий в рамках конкретного времени и географического пространства. В них же существует и генофонд популяции, и если жизнь индивидуума измеряют в числе прожитых лет, то жизнь популяции и ее генофонда - в числе прошедших поколений (длина одного поколения - около 25-30 лет). Для того чтобы констатировать рождение новой популяции, должно смениться, как минимум, три-четыре поколения, т.е. век: только в таких временных масштабах - веках, а не годах - можно изучать популяции.

Единственный критерий, который может претендовать на точность, - относительная обособленность популяции. Этот критерий определяет, что большая часть браков (более 50%) должна быть заключена в ее пределах (между ее членами). Именно поэтому не только выражение «популяция роддома № 6» с точки зрения популяционной генетики абсурдно, но и Москву нельзя считать в строгом смысле популяцией, поскольку из всех браков, заключаемых в ней, менее половины заключаются между людьми, рожденными в этом городе. Лишь при включении Подмосковья и даже близлежащих областей эту огромную совокупность населения можно будет рассматривать как популяцию. В то же время небольшой горный аул в Дагестане, где традиционно разрешены близкородственные браки, и поэтому практически все они заключаются между уроженцами этого селения, является популяцией.

Важнейший атрибут популяции - ее ареал.

Ареал популяции - жизненное пространство популяции и важный фактор ее изменчивости. Ареал либо создает условия для формирования генетических различий, либо фиксирует их, если они возникли по иным причинам.

Например, ареал московской популяции включает территорию всего Подмосковья, а ареал горного аула - не только сам аул, но и его жизненное пространство, т.е. территории, на которых выше вероятность встретить его жителей, а не жителей соседних аулов.

Практически все популяции человека очерчены в пространстве и имеют свой географический ареал, географические и историко-культурные границы. Они, конечно же, не представляют непроходимые заборы - сквозь них проходят миграционные потоки генов, но они не столь интенсивны, как внутри ареала популяции. Эти границы плывучи, текучи и неоднозначны, но при этом абсолютно реальны: их можно обнаружить и зафиксировать, например, изучая структуру брачных миграций. Оказывается, даже генофонд Москвы, где огромные массы населения перемешиваются на небольшом участке земли, не только в прошлом, но и сейчас обладает географической подразделенностью (Курбатова, 2004). Тем более она была характерна для сельского русского населения, где брачные традиции («хоть за курицу, но на соседнюю улицу») приводили к генетическим различиям даже между географически близкими популяциями.

Геногеографические карты. Поскольку ареал - неотъемлемый атрибут популяции, геногеографическая карта, показывающая пространственное распределение параметров генофонда, становится важным источником информации о популяциях. Она представляет собой компьютерную географическую карту, в каждой точке которой указано значение того или иного генетического показателя: частоты генетического маркера в конкретной точке пространства; внутриили межпопуляционного разнообразия; корреляции с широтой, долготой, параметрами среды или другими маркерами; генетического расстояния от значения в указанной точке карты до заданного параметра (например, региональной частоты); обобщенных характеристик генофонда (например, значения главных компонент изменчивости генофонда) и целого ряда других. При этом карта служит не просто иллюстрацией, а инструментом количественного анализа. Серии карт можно складывать и находить среднее значение между ними, проводить с картами, как с обычными цифровыми матрицами, любые статистические преобразования и расчеты.

Поскольку карты создают с помощью компьютерного моделирования, это позволяет избежать субъективности, создать математически точный образ пространства и передать его без искажений всем читателям карты. Именно поэтому геногеографические карты - универсальный канал передачи информации между специалистами разных областей науки. Такие карты демонстрируют различия между популяциями и помогают реконструировать основные генетические процессы, которые эти различия сформировали. В каждом разделе этой главы можно встретиться с геногеографическими картами, позволяющими наиболее просто продемонстрировать основные феномены популяционной генетики. Например, карты генетических расстояний от средних этнических частот до каждой точки ареала этноса оказались одинаковыми и для полиморфных генетических маркеров, и для наследственных заболеваний.

Ареал некорректно представлять лишь в двухмерном пространстве географической карты. Популяционный ареал, как правило, содержит и иные измерения. Это может быть не только третье измерение физического пространства (высотное). В качестве иных измерений могут выступать любые факторы культуры (конфессиональные, лингвистические, этнографические и др.) или среды. Например, в характеристике хозяйственно-культурных типов (степные кочевники, охотникиоленеводы, охотники на морского зверя и др.) звучит то дополнительное измерение ареала, которое свойственно этой популяции и обусловливает устойчивость ареала. Весь исторически сложившийся облик обрядности, одежды, норм морали, пищи, домостроительства, множества этнографических, лингвистических, конфессиональных особенностей создает границы между популяциями, географически занимающими один и тот же ареал.

Подразделенные популяции и демы. Возникновение генетических различий между популяциями приводит к тому, что исходно единая популяция подразделяется на несколько дочерних. Большинство крупных популяций являются подразделенными и состоят из множества популяций разных иерархических уровней, вложенных друг в друга, как матрешка в матрешку. Ареалы этих субпопуляций также следуют «принципу матрешки». Например, ареал популяции далекого села Суры, родины св. праведного Иоанна Кронштадтского, входит в ареал пинежских популяций, тянущихся лентой вдоль реки Пинеги. Они входят в ареал популяций Архангельской области, вместе с ними - в ареал популяций Русского Севера, затем - в ареал русского народа, и далее - восточных славян, Восточной Европы, Европы, Евразии и мира.

Именно подразделенные популяции - основной объект изучения популяционной генетики, поскольку подразделенность - наиболее распространенное состояние популяций человека. Элементарные популяции, далее не делимые, называют локальными или, реже, демами. Они служат «атомами» популяционной системы, несмотря на то что их размеры могут чрезвычайно различаться - от небольшого аула до огромного мегаполиса. Тем не менее именно элементарные популяции с наибольшей вероятностью могут соответствовать понятию идеальной популяции, в которой действует один из базовых законов популяционной генетики - закон равновесия Харди-Вайнберга.

Генетические процессы в популяциях. Закон Харди-Вайнберга гласит, что в бесконечном ряду поколений популяционные частоты генов и генотипов не будут меняться, если на популяцию не действует ни один из факторов популяционной динамики. Например, для двуаллельного гена неизменные частоты аллелей p и q (p+q=1) будут задавать неизменные частоты генотипов: для гомозигот - p² и q², для гетерозигот - 2pq, причем p²+2pq+q² =1. Такая идеальная популяция - столь же полезная абстракция, как, например, понятие идеального газа в физике. Идеальная популяция Харди-Вайнберга обладает бесконечно большим размером, иначе в ней начнет действовать фактор дрейфа генов. Она панмиксна, т.е. браки в ней заключаются случайно по отношению к генотипам. В ней не возникают новые мутации, не влияют миграции и не действует отбор. Иными словами, в идеальной популяции все факторы популяционной динамики - дрейф генов, мутации, миграции и отбор - бездействуют. Понятие идеальной популяции дает инструмент для обнаружения генетических процессов в популяции. В идеальной популяции Харди-Вайнберга действует лишь один процесс - передача генов в поколениях. Если же обнаруживают, что в реальной популяции частоты генотипов отклоняются от ожидаемых из равновесия Харди-Вайнберга (p², 2pq, q²), это указывает на то, что в популяции действуют иные мощные генетические процессы. По направлению и степени отклонений можно судить о том, какие именно генетические процессы и с какой интенсивностью протекают в популяции.

Интенсивность этих процессов должна быть довольно велика для того, чтобы сместить равновесие Харди-Вайнберга. В большинстве популяций человека генетические процессы не столь мощны, чтобы достичь достоверных отклонений наблюдаемых частот генотипов от ожидаемых в идеальной популяции. Именно поэтому современная популяционная генетика использует целый арсенал иных методов, позволяющих определить структуру генофонда и происходящие в ней генетические процессы. В него входят такие эффективные и наглядные методы многомерной статистики, как многомерное шкалирование (демонстрирует взаимное расположение популяций в генетическом пространстве), дендрограммы (обнаруживают кластеры генетически близких популяций), главные компоненты (выявляют ведущие закономерности в изменчивости популяций), оценки различий между популяциями на разных уровнях иерархической популяционной системы (Nei, AMOVA), филогеография (родство популяций, определяемое с помощью нерекомбинирующих признаков) и др. В дальнейших разделах главы некоторые из этих методов будут использованы для демонстрации действия генетических процессов в популяциях, но основной технологией будет геногеография, позволяющая оценивать изменчивость генофондов в географическом пространстве.

Подразделенные популяции и инбридинг. Степень различий между популяциями в пределах общей (подразделенной) популяции можно измерить несколькими способами, причем они позволят перейти к оценке инбридинга, играющего столь важную роль в манифестации рецессивно наследуемой патологии.

Во-первых, можно сравнить различия между популяциями, т.е. насколько субпопуляции генетически отличаются друг от друга. Для этого используют два показателя, которые в большинстве случаев примерно равны друг другу (F_ST ≈G_ST).

Чтобы их рассчитать, нужно лишь знать частоты генов в каждой из субпопуляций и вычислить величину генетических различий между ними, т.е. определить нормированную дисперсию частоты гена в субпопуляциях:

F_ST=σ²_q/q(1-q),

где σ²_q =k^-1Σ (q_j-q)², а среднюю частоту аллеля q в подразделенной популяции, состоящей из k субпопуляций (j=1,2, ?, k), рассчитывают как q=k-¹Σq_j. Понятно,что если популяция значительно подразделена, то ее субпопуляции изолированы друг от друга (между ними заключается мало браков и поток генов невелик), частота гена в них значительно варьирует и дисперсия частот будет велика. Второй способ измерить подразделенность состоит в расчете гетерозиготности, т.е. измерении различий внутри субпопуляций и популяций (H_T, H_S). Как известно из правила Харди-Вайнберга, в панмиксной популяции с частотой аллеля q гетерозиготность H_T составляет 2q(1-q). В подразделенной популяции с той же средней частотой аллеля q гетерозиготность всегда будет меньше (эффект Валунда), причем ее снижение тем больше, чем выше степень подразделенности популяции. Именно поэтому, сравнивая среднюю гетерозиготность субпопуляций (H_Sfootnote:note1[Подстрочные индексы имеют свой смысл: S обозначает субпопуляцию (Subpopulation), T - тотальную популяцию (Total population), а индекс ST - соотношение субпопуляции и тотальной популяции. Например, гетерозиготность обозначают буквой H, тогда H_S означает гетерозиготность субпопуляции. H_T - гетерозиготность тотальной популяции, а F_ST - изменчивость (F) субпопуляций в пределах тотальной популяции.]) с теоретически ожидаемой гетерозиготностью тотальной популяции (H_T), можно вычислить степень подразделенности популяции, обозначаемой как G_ST. Формула расчета очень проста:

G_ST=(H_T-H_S)/H_T.

Показатель H_T оценивает общее генетическое разнообразие, накопленное всей тотальной популяцией. Он включает различия между популяциями (D_ST) и индивидуумами внутри популяций (H_S). Показатель H_S оценивает различия внутри популяции, потому его называют показателем гетерозиготности популяции. Он оценивает, насколько генетически похожи друг на друга индивидуумы из одной популяции. Все показатели связаны между собой следующими соотношениями:

H_T=D_ST+H_S;

G_ST≈F_ST= D_ST / H_T =(H_T-H_S)/H_T;

H_T =1-Σq²_i;

H_S =1-Σq²_ij;

D_ST =(k-1)^-1 (q -q)²,

где q_ij - частота аллеля i в субпопуляции j (j=1,2, ?, k); k - число субпопуляций; q_i - средняя частота аллеля i в тотальной популяции.

Оба способа расчета - и через дисперсию, и через снижение гетерозиготности - измеряют одну и ту же подразделенность. Именно поэтому при условии использования корректного математического аппарата эти две величины оказываются равны друг другу.

Третий и самый очевидный способ оценки генетических различий между популяциями - с помощью генетических расстояний. Есть множество мер генетических расстояний, и все они сравнивают, насколько различаются частоты аллелей в двух популяциях. Если необходимо сравнить не две, а сразу несколько популяций, то надо просто рассчитать генетические расстояния между каждой парой популяций и затем усреднить все попарные различия. В результате будет получена общая характеристика всей рассматриваемой системы популяций, т.е. то, насколько все входящие в нее популяции генетически отличаются друг от друга. Легко заметить, что по смыслу это та же степень подразделенности, которая была описана для первого случая с помощью других мер различий (F_ST ≈G_ST). Этот - уже третий - способ расчета подразделенности приведет к получению того же числа, той же величины подразделенности, что и два других способа расчета (через дисперсию частоты аллеля в субпопуляциях и снижение гетерозиготности). Именно поэтому разные меры генетических расстояний часто служат одновременно и мерами подразделенности.

Четвертый способ расчета генетических различий между популяциями (использован в разделах «Генетические маркеры» и «Время и пространство генофонда») напрямую связывает подразделенность популяции с генетическим дрейфом и миграциями. Популяционный смысл этой связи в том, что генетические различия между субпопуляциями возникают и растут за счет дрейфа генов, но уменьшаются за счет миграций между субпопуляциями. Подразделенность (F_e) рассчитывают по формуле:

F_e=1/(1+4N_e M_e),

где N_e - генетически эффективный размер популяции, задающий интенсивность дрейфа, а M_e - генетически эффективные миграции.

Пятый способ позволяет выразить то же разнообразие, но в терминах, более привычных для медицинской генетики, - инбридинга и эндогамии.

Эндогамия - доля браков, заключаемых внутри популяции. В определении популяции было указано, что ее эндогамия должна быть больше 0,5. Эндогамия ниже этой критической величины свидетельствует о коллапсе популяции, т.е. если более половины браков заключают вне популяции, то она растворяется в иной, более крупной популяции. Например, среди изученных в 2010 г. эвенков Забайкалья не удалось обнаружить ни одного (!) брака между ними, так как все эвенкийские женщины предпочли мужчин иных этносов. Это означает, что их эндогамия равна нулю, и популяция этой группы эвенков сошла с исторической сцены. В табл. 8-1 приведены показатели эндогамии и инбридинга для народов Кавказа - от самых западных (шапсуги, абхазы, черкесы) до самых восточных (народы Дагестана). Таблица демонстрирует, что на Кавказе сохраняется традиционная брачная структура, поддерживающая высокую степень эндогамии и, как следствие, высокий уровень инбридинга. Например, кубанские казаки проживают среди шапсугов и черкесов, ходят в одни школы и магазины, но при этом остаются разными популяциями: у кубанских казаков инбридинг в 10 раз меньше, чем у черкесов, и в 50 раз меньше, чем у шапсугов. Из табл. 8-1 следует, что даже в горном изоляте Швейцарии (F_r =0,51) и религиозном изоляте мормонов (F_r =0,19), служащими классическими примерами изолированных популяций, инбридинг значительно ниже, чем в среднем среди популяций Кавказа.

Инбридинг - эффект близкородственных браков в пределах одной популяции. Общий показатель инбридинга (F_IT) складывается из двух составляющих - случайного (F_ST) и неслучайного инбридинга (F_IS), которые соотносятся следующим образом:

F_IT=F_ST+(1-F_ST)F_IS,

где F_IT - общий коэффициент инбридинга индивидуума (I) относительно тотальной (T) популяции; F_IS - коэффициент неслучайного инбридинга индивидуума (I) относительно субпопуляции (S), к которой он принадлежит; F_ST - коэффициент случайного инбридинга субпопуляции (S) относительно тотальной (T) популяции.

Неслучайный инбридинг составляют браки между близкими и дальними родственниками, которые можно обнаружить с помощью изучения родословных. Случайный инбридинг возникает вследствие ограниченности размера популяции, при этом со временем все ее члены становятся в какой-то степени родственниками, не подозревая о своем родстве.

В зависимости от традиционной брачной структуры ведущей является либо одна, либо другая составляющая инбридинга. Например, в популяциях Западного Кавказа (шапсуги, черкесы, абхазы) тщательно, вплоть до восьмого поколения избегающих родственных браков, основную роль играет случайный инбридинг (в табл. 8-1 он рассчитан на основе данных о фамилиях с помощью коэффициента изонимии). В популяциях же Дагестана (кубачинцы, даргинцы, аварцы, ботлихцы, андийцы, тиндалы, лакцы, л езгины), традиционно практикующих близкородственные браки, основную роль играет неслучайный инбридинг (в табл. 8-1 рассчитан на основе родословных).

Таким образом, показатель F_ST, который с пяти разных точек зрения оценивает подразделенность популяции, одновременно служит оценкой случайного инбридинга.

Таблица 8-1. Оценка эндогамии и инбридинга^[1]

* Оценки эндогамии для этнической группы.

** Средние оценки эндогамии для административных районов.

*** Средние оценки эндогамии для аулов (деревень).

Популяционная генетика оперирует полиморфными генами, т.е. такими, которые распространены в популяциях не в одном, а в разных вариантах (аллелях), причем каждый аллель встречается с заметными частотами. Каждый из аллелей является результатом мутаций гена, обычно произошедших в далеком прошлом и передающихся в цепи поколений. При этом если варианты гена, определяющие наследственные заболевания, как правило, очень редки, то для целей популяционной генетики важно, чтобы аллельные варианты были достаточно частыми: согласно разным критериям полиморфизма, аллели гена должны встречаться в популяции с частотой не менее 1 или даже 5%.

Генетический маркер - любой полиморфный признак, по характеру проявления которого у конкретного индивидуума можно однозначно опознать определенный вариант определенного участка ДНК. Такой признак не обязательно является геном, но он должен нести точную информацию о конкретном фрагменте ДНК. Только в этом случае признак рассматривают как генетический маркер, поскольку он однозначно маркирует конкретный участок ДНК. Если такая связь неоднозначна, то признак не относят к генетическим маркерам.

В современной популяционной генетике генетические маркеры принято делить на два класса - классические и ДНК маркеры.

Первоначально термин «генетический маркер» обозначал признаки, которые сейчас чаще называют классическими маркерами. Гены тогда можно было изучать только через анализ их внешних (фенотипических) проявлений, и было важно различать, какие из них маркируют гены, а какие - нет.

Например, свертывание крови в присутствии определенных антител однозначно свидетельствует о присутствии в ней антигена, а его существование - о наличии у индивидуума определенного аллеля этого гена. Влажная или сухая консистенция ушной серы однозначно указывает на существование соответствующего аллеля другого гена. Множество других особенностей внешнего облика человека (например, кожные узоры пальцев или цвет глаз), несмотря на их высокую наследуемость, не имеют однозначной связи с конкретным вариантом того или иного гена и поэтому не могут быть генетическими маркерами.

Среди классических маркеров выделяют три основных подтипа, которые перечислим в историческом порядке их применения.

Физиологические маркеры - физиологические признаки, проявление которых контролирует один ген (например, цветовая слепота, вкусовая чувствительность к фенилтиокарбамиду или тип ушной серы).

Иммунологические маркеры - белки иммунной системы, определяемые иммунологическими (серологическими) методами (например, группы крови AB0 и резус-фактор).

Биохимические маркеры - ферменты (обычно сыворотки или эритроцитов крови), определяемые такими биохимическими методами, как электрофорез и изоэлектрофокусирование.

Анализ ДНК маркеров - прямой анализ собственно генов, а точнее - самой ДНК. Именно поэтому практически все ДНК маркеры служат генетическими маркерами. Однако можно привести пример мультилокусной пробы (ДНК фингерпринт), где гены, соответствующие полосам фореграммы, остаются неизвестными, поэтому ДНК фингерпринт не относят к генетическим маркерам.

ДНК маркеры, используемые в популяционной генетике, имеют несколько разных критериев классификации, а сами классификации частично перекрывают друг друга.

Диаллельные и мультиаллельные ДНК маркеры. Среди диаллельных ДНК маркеров обычно выделяют три типа: точечные замены SNP (single nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм), обычно называемые снипами, инсерции (например, вставки мобильных элементов - Alu-повторы) и делеции (см. «Факторы популяционной динамики: мутации и отбор», где описано распространение делеции в гене CCR5, определяющей устойчивость к СПИДу).

В популяционной генетике из мультиаллельных ДНК маркеров, помимо таких общеизвестных генетических систем, как HLA (гистосовместимости), самой природой нацеленных на максимальный полиморфизм, обычно изучают минисателлитные и особенно микросателлитные (STR - short tandem repeats) маркеры.

У STR маркеров аллели отличаются друг от друга количеством повторов одного и того же мотива. У минисателлитных маркеров мотив относительно длинный, а у микросателлитных он состоит из сочетания всего нескольких нуклеотидов (обычно - 2, 3 или 4), но оно многократно и монотонно повторяется. Аллели STR-маркеров обозначают по числу повторов. Мутации в таких маркерах накапливаются быстро, и у ребенка становится на один повтор больше или меньше, чем у родителей. Именно благодаря повышенной скорости мутаций эти маркеры и важны для популяционной генетики. Так, например, их используют как «минутную» стрелку при датировке происхождения гаплогрупп Y хромосомы, а медленно мутирующие SNP маркеры - как «часовую» стрелку.

Вторая важная для популяционной генетики человека классификация подразделяет ДНК на аутосомные маркеры и на «однородительские» (uniparental).

К однородительским маркерам относятся маркеры митохондриальной ДНК (мтДНК), передающиеся в цепи поколений только по материнской линии, и маркеры нерекомбинирующей части Y хромосомы (NRY), передающиеся в цепи поколений только по отцовской линии. К аутосомным относят все остальные маркеры, содержащиеся у индивидуума в двух вариантах - один получен от отца, другой - от матери, поэтому они подвержены рекомбинации. У однородительских маркеров отсутствует рекомбинация, ведь дети получают генетическую информацию только от одного из родителей. Именно поэтому весь генетический текст, записанный в мтДНК или нерекомбинирующих участках Y хромосомы, целиком и без перемешивания передается в цепи поколений. Генетический текст, целиком переданный либо от матери (мтДНК), либо от отца (NRY), называют соответственно гаплотипами мтДНК и гаплотипами Y хромосомы.

Если бы гаплотипы всегда передавались неизменными во всей череде поколений, то все дочери Евы были бы одинаковы по мтДНК, а сыновья Адама - по Y хромосоме. Тем не менее время от времени происходят мутации. Каждая из них, благодаря отсутствию рекомбинации, создает новый гаплотип, причем можно указать, какой гаплотип был предковым, а какой - дочерним. Группы родственных гаплотипов, восходящих к общему предку, но уже накопивших некоторые различия между собой, называют гаплогруппами. Знание того, какие гаплогруппы предковые, а какие относительно них дочерние, позволяет воссоздать всю цепь генетических преобразований на протяжении всей истории человека, реконструировав «родословные» мтДНК и Y хромосомы для всего человечества.

В целом картина похожа на генеалогическое древо древнего и знатного рода (рис. 8-6), но есть два отличия. Во-первых, это генеалогия всего человеческого рода, а во-вторых, она проще обычных генеалогий, поскольку на этом древе отражается происхождение либо только по материнской линии (мтДНК от Евы ко всем ее нынешним дочерям), либо только по отцовской линии (Y хромосома от Адама ко всем его нынешним сыновьям). Много проще она и тем, что на таком генеалогическом древе записаны не имена, а только мутации, а они случаются нечасто. Зато корни древа уходят на огромную глубину - на все время существования человечества. Знание таких иерархических классификаций мтДНК и Y хромосомы, а также скоростей мутаций позволяет определить время происхождения гаплотипов и отдельных популяций (см. «Время и пространство генофонда»).

Подтипы классических и ДНК маркеров различаются лишь техническими параметрами - методом тестирования гена, способом наследования или мутирования. Суть анализа генетических маркеров по мере развития технологий оставалась неизменной - необходимо установить, какой именно вариант конкретного фрагмента ДНК присутствует у определенного индивидуума.

Полногеномные панели ДНК маркеров. Параллельно с внедрением новых методов увеличивалась и пропускная способность анализа, чему в последние годы особенно способствовало развитие ДНК-технологий.

Десять лет назад секвенирование гипервариабельного участка мтДНК длиной около 400 нуклеотидов на выборке около 100 человек считали большой работой, заслуживающей отдельной публикации, а проект «Геном человека» потребовал объединения усилий всего научного сообщества. В настоящее время секвенируют всю молекулу (16 000 нуклеотидов) на нескольких сотнях образцов, а полные геномы разных людей секвенируют один за другим: запущен проект «Тысяча геномов».

Это стало возможным благодаря переходу от классического метода секвенирования по Сэнгеру к новому поколению секвенаторов (платформы SOLiD, SOLEXA и Roche 454). В настоящее время интенсивно разрабатывают и внедряют спектр различных по реализованным технологиям секвенаторов третьего поколения, которые должны еще больше увеличить пропускную способность и снизить затраты на секвенирование протяженных участков ДНК. Тем не менее стоимость полного прочтения одного генома человека (3 млрд нуклеотидов) еще долго будет слишком велика, чтобы секвенировать хотя бы по сто человек из каждой популяции земного шара.

Альтернативой полного прочтения индивидуального генома становится анализ тысяч или сотен тысяч SNP-маркеров - так называемый полногеномный анализ» (genome-wide genotyping). Действительно, панели в сотни тысяч снипов покрывают весь геном как плотной сеткой, но ими геном не исчерпывается: между снипами, входящими в панель, остаются фрагменты генома, информацию о которых этот метод не позволяет получить. Чтобы отличать этот метод от полного прочтения генома (whole genome sequencing), точнее было бы называть его широкогеномным анализом. Технологии чипов достаточно развиты и, хотя тоже дорогостоящи, позволяют анализировать сотни и тысячи образцов.

Важно при этом помнить специфику популяционной генетики. Анализ одного генома ничего не дает, и, чтобы получить характеристику одной популяции, нужно проанализировать примерно сто геномов. Необходимо также изучить такое же число геномов из многих других популяций: ведь чтобы понять особенности и происхождение интересующей популяции, нужно сравнивать ее с другими. Простое увеличение количества генов, анализируемых для каждого человека из конкретной популяции, приводит лишь к необходимости закупки все более мощных компьютеров для обработки растущего массива данных. Чтобы это количество начало переходить в качество или хотя бы позволило получать более точные и интересные результаты, чем при классическом анализе немногих генов, надо научиться собирать многомерную картину генофонда из ее множества проекций - отдельных генетических маркеров. О том, как этого достичь, пойдет речь в следующих разделах главы.

Наряду с генетическими маркерами, популяционная генетика использует целый ряд иных типов признаков, которые несут информацию о структуре генофонда, но не маркируют определенный участок ДНК (например, фамилии, кожные узоры, археологические, лингвистические, антропологические или демографические признаки).

Для большинства перечисленных признаков генетическая предрасположенность вообще отсутствует (например, фамилии, названия рода, демографические параметры). Они не имеют не только генетической, но и биологической природы, поэтому их и называют квазигенетическими (псевдогенетическими). Тем не менее, несмотря на такое название и то, что они не определяются генами (фамилия - явление языка и культуры, а не биологии), квазигенетические маркеры порой ведут себя почти так же, как и настоящие гены. Благодаря исторически возникшей связи «псевдогены» обнаруживают высокую корреляцию с настоящими генами и потому позволяют анализировать структуру генофонда.

Наиболее популярный квазигенетический маркер - фамилии, каждая из которых служит аналогом одного из многих тысяч аллелей. Показано, что даже для русских фамилий, исторически возникших недавно, связь с ДНК маркерами Y хромосомы, рассчитанная на популяционном уровне изменчивости, велика (r =0,6). Еще больше она для тех народов, где фамилии унаследовали знаки родовой принадлежности (Кавказ, Центральная Азия, Сибирь). При этом фамилии обладают важным преимуществом: в отличие от настоящих генетических маркеров - это «бескровный» и дешевый маркер, который можно изучать не для малой выборки из популяции, а для всей популяции в целом. Эти достоинства и существование высокой корреляции с истинно генетическими маркерами делает фамилии незаменимым инструментом для анализа структуры генофонда, случайного инбридинга и груза наследственной патологии.

Если изучается не весь геном, а только выборка генов из него, то неизбежно возникает вопрос: сколько и каких маркеров надо включить в анализ, чтобы получить надежные характеристики генофонда? Как убедиться, что по данным о нескольких маркерах можно делать обоснованные выводы о генофонде в целом?

Сравнение показателей разнообразия генофонда F_ST. Такие доказательства дает сравнение разных выборок генов. Принцип доказательства следующий: если при проведении нескольких исследований, каждое из которых основано на независимой выборке генов, будут получены одинаковые характеристики генофонда, то можно утверждать, что каждая из этих выборок характеризует основные черты генофонда. Было проведено множество таких сравнительных исследований, позволивших утверждать, что для классических маркеров достаточно собрать случайную выборку из 20-30 генов (в сумме - около 50 полиморфных аллелей), чтобы получить достоверную характеристику межпопуляционного разнообразия генофонда (F_ST≈G_ST).

Классические маркеры определяются не прямо по фрагментам ДНК, а по их белковым продуктам, которые подвержены более интенсивному отбору, чем просто последовательности ДНК. Именно поэтому с наступлением эры ДНК маркеров широко распространилось утверждение, что ДНК маркеры, свободные от давления отбора, будут фиксировать большее генетическое разнообразие генофонда, чем классические маркеры. Однако такое утверждение может быть справедливо лишь в том случае, если на все классические маркеры будет действовать только один вид отбора - стабилизирующий (уменьшающий различия между популяциями), но это предположение не соответствует действительности. Еще до получения результатов исследования ДНК маркеров теоретически было показано, что оценки дифференциации генофонда по классическим и ДНК-маркерам должны быть одинаковыми, если выборка маркеров случайна и достаточно велика. Первые же результаты подтвердили этот прогноз.

В табл. 8-2 приведены четыре ряда независимых оценок разнообразия мирового генофонда, различающихся по всем исходным параметрам (число изученных народов мира и их состав, число генных маркеров и их состав), и даже сами меры межпопуляционного разнообразия различны. Общими для этих работ были лишь охват всего мирового разнообразия в целом и проведение исследования на едином (этническом) уровне популяционной системы. При этом оценки межпопуляционного разнообразия F_ST оказались чрезвычайно устойчивыми и индифферентными к методическим расхождениям авторов. Характер маркеров - белковые продукты генов или ДНК-полиморфизм - также не сказался на показателях разнообразия F_ST и H_s.

Таблица 8-2. Устойчивость средних характеристик разнообразия генофонда: межпопуляционного F_ST и внутрипопуляционного H_S

* Levontin, 1972.

** Latter, 1980.

*** Рычков, Балановская, 1990.

**** Bowcock et al., 1987.

Полученный результат - важнейшее свидетельство устойчивости средних оценок разнообразия генофонда. Множество аналогичных сравнительных исследований других генофондов также обнаружило совпадение оценок F_ST по классическим и ДНК маркерам, при условии, что их выборки достаточно велики и случайны по отношению к отбору.

Например, для максимальной корректности сравнения народов Восточной Европы для анализа были отобраны только те этносы, которые изучены по обширным панелям как классических, так и аутосомных ДНК маркеров. В результате были получены следующие оценки межпопуляционного разнообразия: по классическим маркерам F_ST=2,69, по аутосомным ДНК маркерам F_ST=2,58. Совпадение оценок F_ST свидетельствует о том, что обе системы признаков - классических и ДНК маркеров - дают объективную картину генофонда народов Восточной Европы: его важнейшая характеристика - межпопуляционная изменчивость (F_ST) - составляет около 2,6.

Таких примеров много. Многочисленные исследования подтвердили сходство оценок разнообразия по аутосомным генетическим маркерам - ДНК и классическим. Это позволило сделать следующий вывод: когда исследование проведено корректно, результаты старой классической генетики и современной молекулярной генетики совпадают - классические и ДНК маркеры создают идентичный образ генофонда. Расхождения возникают тогда, когда использованы неадекватные выборки, популяции и маркеры. Именно поэтому можно ожидать, что и полногеномные исследования дадут ту же оценку дифференциации популяций, что и анализ классических маркеров.

Еще более убедительно тождество оценок, полученных, с одной стороны, по генетическим маркерам, а с другой - по данным, не имеющим отношения к биологии: о фамилиях (коэффициент изонимии) или демографических показателях миграций Me и размера популяции Ne. Теоретическое равенство популяционной генетики F_ST≈F_e =1/(4N_eM_e+1) утверждает, что оценки разнообразия по данным генетики и демографии должны совпадать. Они действительно оказываются очень близкими (табл. 8-3), вопреки всем допущениям и погрешностям оценок N_e и M_e. Такое же совпадение обнаруживают при сравнении генетических и исторических дат (см. «Время и пространство генофонда»). Все эти сравнения подтверждают возможность анализа генофонда по относительно небольшой случайной выборке генетических маркеров.

Таблица 8-3. Сравнение двух оценок дифференциации генофонда: эмпирических F_ST (получаемых по генетическим маркерам) и прогнозируемых F_е (получаемых из небиологической информации)*

* Данные, источники информации, методы, доверительные интервалы и характеристика генных маркеров (наборы которых существенно отличаются друг от друга) приведены в цикле работ, выполненных коллективом под руководством Ю.Г. Рычкова, и кратко сведены в разных работах (Рычков, 1984; Рычков, 1986; Рычков, Балановская, 1990).

** Данные по адыгейцам (Балановская и др., 1999).

Оставался нерешенным вопрос: если перейти от среднестатистических оценок разнообразия F_ST к конкретным популяциям и их ареалам, сохранится ли сходство между классическими и ДНК маркерами? Ответить на этот вопрос позволяют обобщенные карты генофонда.

Например, в первом варианте картографирования аутосомных ДНК маркеров карта первой компоненты изменчивости генофонда Восточной Европы по своему общему паттерну соответствовала картам антропологии и классической генетики, но с одним существенным отличием: экстремум на ДНК карте был явно смещен на северо-восток. Когда и число изученных аутосомных ДНК маркеров, и число изученных популяций возросло почти вдвое, новый вариант карты по ДНК маркерам значительно приблизился к картам антропологии. Можно надеяться, что когда по ДНК маркерам будут изучены не 30 популяций, как сейчас, а те же 600 популяций, что и по антропологии, то их карты совпадут полностью. Таким образом, молекулярная генетика не меняет картину мира, а лишь по мере собственного совершенствования постепенно приближается к картине, уже известной по данным антропологии и классическим маркерам.

Наиболее надежные результаты дает комплексное применение картографического и статистического (F_ST) анализа одного и того же генофонда. При этом F_ST анализ позволяет получить характеристику лишь одного, хотя и самого важного параметра генофонда, в то время как картографический анализ позволяет дать целый ряд характеристик генофонда, причем обнаруживая их изменчивость во всем ареале популяции. Благодаря этому картографический анализ оказывается более тонким и точным инструментом для определения структуры генофонда, чем анализ F_ST. Более того, компьютерные карты генофонда позволяют проводить любые виды статистического анализа: каждая из карт представляет матрицу, позволяющую использовать их в любых видах одно- и многомерной статистики. В том числе они позволяют не только оценить F_ST генофонда (как в статистическом анализе), но и картографировать изменчивость этого важнейшего показателя в пределах ареала генофонда.

Геногеографические карты не только выявляют основные тенденции в пространственной изменчивости населения, но и позволяют обойти основное препятствие - различную изученность населения по разным типам признаков. Иными путями это препятствие непреодолимо, так как набор изученных популяций просто несопоставим. Например, для населения Восточной Европы не оказалось ни одной популяции, изученной по всему спектру классических маркеров. В еще большей степени такие расхождения характерны для разных систем признаков - фамилий, антропологии или ДНК маркеров. Поскольку многомерные методы статистики требуют, чтобы все популяции были изучены по всем признакам, только картографический подход позволяет максимально полно сравнивать разные системы признаков и оценивать основные параметры генофонда.

Следует подчеркнуть, что при сравнительном анализе межпопуляционного разнообразия F_ST используют только аутосомные маркеры. Это связано с тем, что ДНК маркеры с «однородительским наследованием» (по материнской линии - мтДНК; по отцовской линии - Y хромосома) отличаются своеобразными показателями межпопуляционного разнообразия.

Генетически эффективный размер (N_e) по однородительским генам в 4 раза меньше, чем для аутосомных маркеров, поэтому однородительские маркеры подвержены значительно большему влиянию дрейфа генов, что приводит к возрастанию F_ST. С другой стороны, однородительские маркеры также более подвержены

особенностям миграционных потоков. Межпопуляционные различия по маркерам Y хромосомы отражают миграции мужской части населения, а по маркерам мтДНК - миграции женской части населения. Именно поэтому для популяций с патрилокальной традицией, когда жены переезжают в популяцию мужа, F_ST Y хромосомы намного (на порядок) выше, чем F_ST аутосомных маркеров, а F_ST мтДНК лишь незначительно превышает изменчивость аутосомных маркеров. Благодаря значительным различиям между популяциями (F_ST) возможности Y хромосомы вреконструкции миграций значительно выше, чем мтДНК и аутосомных маркеров.

Например (рис. 8-1), при расчете строго для одних и тех же популяций изменчивость украинцев по Y хромосоме (G_ST =1,1) оказалась в 2-3 раза выше, чем по мтДНК (G_ST =0,5) и аутосомным ДНК-маркерам (G_ST =0,4). Изменчивость восточных славян по Y хромосоме (G_ST =1,4) почти в 5 раз выше, чем по мтДНК (G_ST =0,3) и аутосомным ДНК-маркерам (G_ST =0,3). Изменчивость славян по Y хромосоме (G_ST =5,0) уже в 20 раз выше, чем по мтДНК (G_ST =0,2) и аутосомным ДНКмаркерам (G_ST =0,2).

Рис. 8-1. Генетическое разнообразие Ffootnote:note1[]_ST=G_ST по маркерам Y хромосомы, митохондриальной ДНК и аутосомным ДНК маркерам на трех уровнях иерархии популяций: столбцы накапливают величину G_ST на трех уровнях иерархии популяций. К ним относят: разнообразие внутри этноса (украинцы - серый цвет); языковой подгруппы (восточные славяне - белый цвет) и языковой группы (славяне - черный цвет). Для максимальной сопоставимости результатов представлено разнообразие только тех популяций, которые изучены по всем трем типам маркеров

ДНК и аутосомным ДНК маркерам на трех уровнях иерархии популяций: столбцы накапливают величину G_ST на трех уровнях иерархии популяций. К ним относят: разнообразие внутри этноса (украинцы - серый цвет); языковой подгруппы (восточные славяне - белый цвет) и языковой группы (славяне - черный цвет). Для максимальной сопоставимости результатов представлено разнообразие только тех популяций, которые изучены по всем трем типам маркеров

Однако для популяций с матрилокальной традицией (мужья переезжают в популяцию жены) или традицией кровнородственных браков (и женщины, и мужчины остаются в популяции) межпопуляционная изменчивость мтДНК также оказывается высокой. Именно поэтому по оценкам F_ST однородительских маркеров нельзя судить о межпопуляционной изменчивости генофонда в целом. Тем не менее однородительские маркеры служат уникальным инструментом для решения иной задачи - выявления миграционных потоков.

Именно поэтому, исходя из знания особенностей изменчивости каждого класса генетических маркеров, выбирают и стратегию анализа популяций. Например, для измерения изменчивости генофонда в целом можно опираться только на аутосомные маркеры. При реконструкции миграций наиболее эффективны однородительские маркеры Y хромосомы и мтДНК. Они позволяют не только фиксировать время и источники миграций, но и отличать события мирного взаимодействия генофондов (отражающегося в патрилинейных популяциях, главным образом через миграции женщин и, следовательно, в паттерне мтДНК) от влияния военных походов (отраженных в паттерне Y хромосомы).

Картографический анализ позволяет использовать однородительские маркеры для определения разнообразия генофонда: обобщенные карты и однородительских, и аутосомных маркеров демонстрируют одну и ту же пространственную изменчивость генофонда. Иными словами, различия в размахе межпопуляционной изменчивости не сказываются на «картографическом портрете» генофонда. Этот вывод крайне важен для медицинской генетики, поскольку, несмотря на крайне низкие показатели F_ST, для наследственной патологии обнаруживают тот же основной паттерн географической изменчивости, что и для полиморфных генетических маркеров (и аутосомных, и однородительских). Именно поэтому картографическое исследование генофонда имеет столь большое значение для генетической эпидемиологии: исследуя полиморфные генетические маркеры, можно получить прогноз географической изменчивости груза наследственных болезней.

Приведенный обзор генетических маркеров и их анализа позволяет ответить на вопрос: будут ли столь различные системы маркеров (физиологические, иммунологические, биохимические, ДНК аутосомные, однородительские, STR, SNP и др.) давать одну и ту же характеристику генофонда? Ведь если каждая система генетических маркеров будет описывать свою долю генома и генофонда, то получаемые «портреты» генофонда будут не похожи один на другой, и исследователи не смогут узнать, какова же истинная структура генофонда.

Вопрос объективности «портрета» генофонда, получаемого по той или иной системе признаков, - решающий для популяционной генетики. Все системы признаков - классические и ДНК маркеры генетики, антропологические признаки, фамилии и даже археологические характеристики - несут в своей изменчивости ту или иную информацию о генофонде. Именно поэтому основным средством определения объективного «портрета» генофонда является полисистемный подход - параллельный анализ одного и того же генофонда по разным системам признаков.

Он состоит в прямом - статистическом и картографическом - сопоставлении тех картин, которые дают разные системы признаков. Статистическое сравнение проводят через анализ показателей межпопуляционного разнообразия F_ST, картографическое - через анализ обобщенных карт генофонда.

Хотя полисистемный подход может опираться на сравнение показателей межпопуляционного разнообразия F_ST, он наиболее информативен при использовании следующей стратегии картографического изучения генофонда.

На первом этапе одним и тем же методом строят карты для каждого признака.

На втором этапе создают обобщенные карты для каждого типа признаков (физиологические, иммунологические, биохимические, квазигенетические, антропологические, ДНК аутосомные, однородительские, STR, SNP и др.). Каждая такая карта претендует на отражение структуры генофонда.

На третьем этапе проводят сравнительный анализ обобщенных карт. Его итогом служит геногеографический синтез данных разных наук: выявление искомой «общей модели» генофонда, т.е. тех структурообразующих элементов, которые обнаружены на картах большинства типов признаков.

После выявления «общей модели» можно перейти к следующим этапам и, например, рассмотреть, что нового внес каждый тип признаков в описание структуры населения и каковы особенности отдельных признаков при описании различий между популяциями.

Важный шаг на этом пути - одновременное использование данных по мтДНК и Y хромосоме. Обе эти системы очень похожи: они гаплоидны, не рекомбинируют, их анализируют с помощью одних и тех же филогеографических методов, обе наиболее уязвимы для действия дрейфа генов и чувствительны к различиям в миграции мужчин и женщин. Это может привести к одинаковым искажениям реконструируемой картины миграций. Именно поэтому следующий шаг - расширение спектра анализируемых генетических систем за счет аутосомных ДНК и классических маркеров, а также включения информативных квазигенетических систем - фамилий, антропологических, археологических и лингвистических признаков. Когда картины мира совпадают вопреки тому, что они обрисованы совершенно разными свидетелями, можно быть уверенным, что генетические следы миграций и других событий в истории формирования генофонда реальны и достоверны.

По этим причинам для интерпретации географического распределения ДНК фрагментов, связанных с наследственными нарушениями, желательно иметь данные по всем трем типам генетических маркеров (аутосомные, мтДНК и Y хромосома), что позволит дать объемную картину формирования популяций и наиболее корректно объяснить географическое распределение наследственных заболеваний.

Использование многих систем - полисистемный подход - не только позволяет достичь нового уровня надежности результатов генетических исследований, но и открывает путь к реальному синтезу знаний об истории популяций человека, полученных самыми разными науками.

В настоящее время твердо установлено, что все человечество восходит к единому корню, единому генофонду. Каким же образом возникла многоликость современного человечества? Факторы популяционной динамики во всех популяциях человека одинаковы (мутации, отбор, дрейф генов и миграции), но их удельный вес различен и в разных популяциях человека, и для разных генов.

Исходный запускающий механизм - мутации, благодаря которым возникают новые варианты фрагментов ДНК. Дальнейшее увеличение частоты нового варианта или его элиминацию может контролировать отбор. Частота возникшей мутации может случайно возрасти под действием дрейфа генов. Кроме того, миграции могут занести новые варианты ДНК из других популяций (см. «Факторы популяционной динамики: дрейф генов и миграции»).

Мутации изменяют сами гены (любые фрагменты ДНК), в то время как остальные факторы популяционной динамики (отбор, миграции и дрейф генов) изменяют только их частоты. Тем не менее эффект мутаций оказывается настолько слабее дрейфа генов и миграций, что на популяционном уровне его уловить очень сложно. Исключение составляют однородительские маркеры мтДНК и Y хромосомы, именно поэтому ставшие ведущими генетическими маркерами в современной популяционной генетике человека. Восстановление исторической последовательности мутаций мтДНК и Y хромосомы создает уникальную возможность установления исторической последовательности мутационных и миграционных процессов.

Отбор и мутации действуют на каждый ген в отдельности, в отличие от дрейфа и миграций, которые влияют на все гены одинаково.

Селективно-значимый процесс, в котором участвует естественный отбор (natural selection), и селективно-нейтральный процесс различаются не только по силе воздействия на генофонд человека, но и по характеру воздействия на его гены. В исторический процесс все гены населения вовлечены в равной степени, независимо от их функции в организме (если, например, некоторые популяции ирландцев переселяются в Америку, то они несут туда всю совокупность своих генов, т.е. весь генофонд переселяющейся популяции). В микроэволюционный процесс отбора гены вовлекаются «индивидуально», и лишь в меру своей значимости для адаптации популяции к условиям среды. Именно поэтому для селективно-значимых генов на действие исторических сил накладывается влияние эволюционной силы отбора.

Проявление отбора на популяционном уровне можно зафиксировать по отличиям уровня генетических различий между популяциями по конкретному гену F_ST(i) (i - селективно-значимый ген) от селективно-нейтрального уровня F_e= F_ST. Такое сравнение позволяет распределить гены по классам селективной структуры генофонда (табл. 8-4).

По сравнению с одинаковым для всех генов селективно-нейтральным уровнем F_e = F_ST(i) размах изменчивости селективно-значимого гена F_ST(i) может увеличиться (F_ST(i)> F_e), если на него действует дифференцирующий отбор (например, в разных частях ареала имеют селективное преимущество разные аллели). В этом случае ген попадает в класс DIFF селективной структуры (см. табл. 8-4). Если же размах изменчивости селективно-значимого гена F_ST(i) меньше селективно-нейтрального (_FST(i)< F_e), то можно предполагать действие стабилизирующего отбора, выравнивающего частоты во всех популяциях. В этом случае ген попадает в класс STAB селективной структуры (см. табл. 8-4). Поскольку оба селективно-значимых класса и селективно-нейтральный класс NEUTRAL имеют свои доверительные интервалы, между ними для большей корректности анализа выделяют буферные зоны N-DIFF и N-STAB, которые при менее строгом анализе объединяют с селективнонейтральным классом NEUTRAL. Ниже изложены рекомендации для быстрого определения характера и интенсивности действия отбора на исследуемый ген.

Находят значение F_ST(i) ≈F_e (по репрезентативной выборке генов) или непосредственно F_e (по демографическим данным - N_e и M_e, или по квазигенетическим маркерам, или через прямую оценку по селективно-нейтральным ДНК маркерам).

Определяют границы селективных классов по формулам:

F₁=Δ_F1×F_e =0,56 F_e;

F₂=Δ_F1×F_e =0,86 F_e;

F₃=Δ_F1×F_e =1,04 F_e;

F₄=Δ_F1×F_e =1,67 F_e.

Всю анализируемую выборку генов располагают по оси F_ST(i) (от F_ST(min) до F_ST(max)) и распределяют по классам и межклассовым областям селективной структуры генофонда. Гены относят к классам STAB (F_ST(i)<0,56 F_e), NEUTRAL(0,86 F_e< F_ST(i)<1,04 F_e) и DIFF (F_ST(i)>1,67 F_e) только в том случае, если оценка F_ST(i) входит в них целиком со своим доверительным интервалом вследствие выборочной ошибки. В противоположных случаях такие гены относят к межклассовым областям.

Расчет количественного показателя интенсивности отбора:

R_S(i)=N_e S_(i)=1/4(1/ F_ST(i)-1/F_e),

где N_e - среднегармонический эффективный размер элементарных популяций генофонда; S_(i) - величина давления отбора на маркер i; F_ST(i) - его межпопуляционное разнообразие, F_e≈ F_ST(i) ≈(4N_eM_e +1)^-1 - селективно-нейтральная дифференциация генофонда.

Таблица 8-4. Пропорции генов в классах селективной структуры генофондов мира и России

Примечания. STAB - действие стабилизирующего и других видов отбора, приводящих к достоверному снижению межпопуляционной дифференциации i гена F_ST(i). NEUTRAL - селективно-нейтральная изменчивость i гена F_ST(i). DIFF - действие дифференцирующего и других видов отбора, приводящих к достоверному увеличению межпопуляционной дифференциации i гена F_ST(i). Исследование селективной структуры во всех регионах мира (см. табл. 8-4) обнаружило, что соотношение доли генов, находящихся в классах селективной структуры, очень устойчиво.

Поскольку в каждой главе этого руководства рассмотрены те или иные мутации, подверженные действию отбора (селективно-значимые мутации), рассмотрим картографический анализ распространения селективно-значимой мутации лишь на одном примере - мутации, обусловливающей устойчивость к СПИДу (CCR5del32).

В последние десять лет делеция 32 нуклеотидов в гене рецептора хемокинов (CCR5del32) привлекает большое внимание. Причина очевидна: гомозиготы по делеции CCR5del32 практически полностью устойчивы к инфицированию ВИЧ-1. Вирус использует хемокиновый рецептор для проникновения в клетку. Мутация приводит к отсутствию рецептора на поверхности клетки, а это препятствует проникновению вируса. Гомозиготные носители делеции обладают почти полной устойчивостью. У гетерозиготных носителей СПИД все-таки развивается, но медленнее, на 2-3 года позже, чем обычно. Кроме del32, в генах семейства хемокинов (CCR5, CCR2, SDF1) обнаружены и другие мутации, снижающие темпы инфицирования и относящиеся к СПИД-протекторным генам, но их влияние слабее, чем CCR5del32.

Известно, что мутация CCR5del32 встречается главным образом у европейцев (в среднем - 10%). Ее частота в Европе снижается по направлению с севера на юг. За пределами Европы ее регистрируют с низкими частотами в смежных регионах (Северная Африка, Ближний Восток, Средняя Азия), но она полностью отсутствует в более отдаленных от Европы регионах: в Африке южнее Сахары, в Восточной и Юго-Восточной Азии и у коренного населения Америки.

Такой простой и четкий тренд необычен для популяций человека: для большинства аутосомных генов их распространение на геногеографических картах представлено причудливым узором из пятен высоких и низких частот. Особенно интригующим этот тренд стал, когда появились данные о возрасте мутации. Основываясь на изменчивости микросателлитных маркеров, сцепленных с геном CCR5, одна группа исследователей оценила возраст мутации в 2000 лет, другая - всего в 700 лет. В любом случае мутация возникла лишь однажды в Европе и относительно недавно. Следовательно, частота мутации у населения Европы возросла от нуля до 10% за очень короткое для жизни популяций время (около 700-2000 лет), т.е. всего за 25-80 поколений.

Согласно законам популяционной генетики, такое резкое изменение частоты в столь большой популяции и в столь большом ареале не может быть вызвано случайным дрейфом генов. Поэтому можно предполагать действие естественного отбора в пользу указанной мутации. Гипотеза отбора была подтверждена математическим моделированием. Но какие именно факторы внешней среды сыграли решающую роль при действии отбора? Эпидемия СПИДа началась слишком недавно, чтобы изменить частоты генов. Следовательно, нужно найти иные векторы естественного отбора, действовавшие в историческое время. Опираясь на тот факт, что хемокиновые рецепторы взаимодействуют не только с ВИЧ-1, но и с другими патогенами, было выдвинуто предположение, что мутация может определять устойчивость сразу к нескольким инфекционным заболеваниям. Были выдвинуты следующие гипотезы влияния отбора на быстрое распространение мутации по Европе.

«Гипотеза чумы» постулирует, что частота мутации возросла в результате эпидемий чумы. В средневековой Европе от чумы погибала заметная часть населения. Это должно было привести к заметному действию естественного отбора в пользу любого фактора, определяющего устойчивость к болезни. Эта гипотеза, хотя и получила самое широкое распространение, никогда не имела прямых доказательств. Более того, недавно было показано, что мутации в гене CCR5 не влияют на течение чумы у мышей.

«Гипотеза оспы» постулирует, что инфекционным заболеванием, приведшим к распространению мутации, была оспа. Хотя ее эпидемии и не были столь драматичными, как эпидемии чумы, но они поражали европейцев непрерывно, причем жертвами обычно были дети, что могло ускорить изменение частоты аллеля в поколениях. Тем не менее и эта гипотеза основана не на клинических или молекулярно-генетических данных, а на статистическом анализе возможного действия эпидемий оспы.

«Гипотеза климата». Кроме гипотез, связанных с инфекционными заболеваниями, предпринимались и другие попытки объяснить закономерности пространственного распространения мутации. Было изучено возможное действие отбора, связанное с климатическими факторами, и обнаружена высокая корреляция между частотой мутации и рядом температурных факторов среды.

Таким образом, установить механизмы действия отбора пока не удалось. Одной из причин этого может быть слишком схематичное представление о распространении мутации, сложившееся на первых этапах ее изучения. Для понимания факторов, повлиявших на распространение мутации del32, необходимо прежде всего иметь точную картину ее распространения среди населения мира. Объединив данные по популяциям Восточной Европы и Южной Сибири с информацией из опубликованных источников, была составлена общемировая сводка данных по частотам мутации del32, позволившая построить наиболее точную на данный момент карту распространения мутации в Евразии (рис. 8-2; вариант, созданный с помощью новой оригинальной программы GeneGeo, см. также на цв. вклейке). Благодаря ей были обнаружены два новых феномена в распространении СПИДпротекторной мутации CCR5del32 в Евразии.

Рис. 8-2. Геногеографическая карта распространения СПИД-протекторной мутации CCR5del32 в Евразии: карта построена по данным о 185 популяциях, из них 35 - неопубликованные данные авторов

Беломоро-Балтийский мировой максимум. Оказалось, что максимальные значения частоты мутации находятся не в Скандинавии, как считали авторы предыдущих исследований, а на Русском Севере: во всех трех изученных популяциях Архангельской области частоты достигают мировых максимумов (16, 18, 19%). На рис. 8-2 видна четкая закономерность: частота максимальна на побережьях Балтийского и Белого морей, а во всех направлениях от этой зоны она плавно снижается.

Южно-Сибирский мировой максимум. Второй мировой максимум частоты мутации CCR5del32 обнаружен в Западной Сибири. Пока он основан только на данных по шорцам (156 человек), у которых частота мутации достигает 17%. Однако эти данные отражают несколько выборок, собранных по всему этническому ареалу шорцев. В одной из популяций хантов Западной Сибири также обнаружена высокая частота мутации (12%; выборка - 61 человек). Существование второго мирового максимума усложняет ранее столь простой паттерн с максимумом в Скандинавии, но позволяет провести более точную проверку гипотез действия отбора на распространение мутации CCR5del32.

Для проверки гипотезы воздействия климатических факторов на распространение мутации CCR5del32 для каждой из 185 исследованных популяций были определены характеристики восьми основных климатогеографических параметров: широты, долготы, общего годового количества солнечной радиации, годового радиационного баланса, годового уровня осадков, средней январской температуры, средней июльской температуры и высоты над уровнем моря. На основе этих данных были построены климатические карты. При расчете коэффициентов корреляций между картами климата и картой распространения мутации CCR5del32 в Старом Свете обнаружена очень высокая корреляция с радиационным балансом (r =-0,66), что может свидетельствовать об опосредованном влиянии климатических факторов на особенности географического распределения мутации ССR5del32 (Балановская, Балановский, 2007).

Ни один из факторов популяционной динамики не действует в одиночку, поэтому и в распространении мутации ССR5del32 в Старом Свете (см. рис. 8-2) также отражено воздействие не только мутаций и отбора, но и двух других факторов микроэволюции популяций человека - миграций и дрейфа генов. Именно поэтому в следующем разделе, посвященном этим факторам, вновь будет рассмотрена карта распространения мутации ССR5del32, но уже с точки зрения эффекта миграций и дрейфа генов.

Наиболее известный закон популяционной генетики (равновесие Харди- Вайнберга) гласит, что если ни один из факторов популяционной динамики (мутации, отбор, миграции и дрейф генов) в популяции не действует, то частоты генов и генотипов во всей череде поколений неизменны. Первые три фактора очевидны, но пояснения требует фактор, называемый в мировой литературе дрейфом генов, а в российской науке также генетико-автоматическим процессом.

Одно из условий существования идеальной популяции Харди-Вайнберга - бесконечно большой размер популяции. Если он ограничен, то случайные события могут легко исказить популяционную частоту гена при передаче из поколения в поколение. Чем меньше размер популяции N_е, тем больше вероятность того, что в поколении потомков возникнут отклонения от родительского генофонда по частотам генов. Когда такие отклонения накапливаются не в одном или двух, а в долгой цепи поколений, то ее крайние звенья становятся не похожими друг на друга. Процесс случайных отклонений в частотах генов, происходящих при передаче из поколения в поколение и связанных с ограниченным размером популяции, называют случайным дрейфом генов. Это название говорит и о том, что изменения происходят случайным образом (частота «дрейфует», как льдина), и о том, что в результате таких чисто случайных отклонений генофонды постепенно удаляются друг от друга. Они, как осколки льдины, «отдрейфовывают» и друг от друга, и от материнской льдины, от которой они откололись, т.е. от прапопуляции. Генетически эффективный размер популяции N_е в рамках этих понятий - аналог размера льдины. Понятно, что популяции малого размера быстро отдрейфуют от предкового генофонда, а популяции очень большого размера будут мало чем отличаться по частотам генов от предкового генофонда. Если когда-то две популяции разделились, а затем под действием дрейфа генов генетически удалились друг от друга, то генетическое расстояние между ними (расстояние, на которое они отдрейфовали) будет зависеть от двух величин - генетического размера популяций (N_е) и времени их раздельного существования (t). Значит, в генетических различиях между популяциями в скрытом виде присутствует время (возможность определения генетических дат показана в разделе «Время и пространство генофонда»).

Как представить дрейф генов? Предположим, что исходная частота обоих аллелей равна p=q=0,5, тогда генофонд можно представить как огромный кувшин с разноцветными горошинами, где половина горошин - красная, половина - белая. Эти частоты p=q=0,5 сохранятся и в следующем поколении, если N_e велико, т.е. если почти все горошины пересыпают в следующий кувшин (следующее поколение). Если же N_e мало, и зачерпывают лишь пригоршню горошин из генофонда, то случайно может оказаться, что в ней нет красных горошин (частота «красного» аллеля равна нулю, q=0), или, напротив, все горошины красные (частота «красного» аллеля равна единице, q=1). Если изучают не идеальную популяцию Харди-Вайнберга (см. «Основные термины популяционной генетики»), не панмиксный мегаполис, а обычную небольшую популяцию, из которых и состояло человечество на протяжении тысячелетий своей истории, то в ней в следующее поколение передается лишь горстка гамет. Значит, в следующем поколении частота аллеля будет уже не 0,5, а случайно изменится в ту или иную сторону.

Этот процесс иллюстрируется компьютерным экспериментом, проведенным Ю.П. Алтуховым и его сотрудниками для панмиксных популяций (рис. 8-3), т.е. таких популяций, которые не подразделены внутри себя: все члены популяции имеют равную вероятность заключить брак друг с другом. На старте - десять одинаковых панмиксных популяций с одной и той же частотой гена (q=0,5), которые можно представить и как десять вариантов эволюции одной популяции, т.е. варианты изменения частоты от одной и той же стартовой частоты гена (q=0,5) в некой «прапопуляции». Рис. 8-3 демонстрирует, что от поколения к поколению частота гена резко меняется («дрейфует») в пределах от 0 до 1. На финише (в тысячном поколении) лишь в одном случае из десяти популяций сохранился полиморфизм. Все остальные популяции либо содержат только «красные горошины», либо навсегда потеряли их.

Рис. 8-3. Быстрые изменения частоты гена в панмиксных популяциях (Алтухов Ю.П., 1983)

Это означает, что в результате дрейфа генов панмиксные (бесструктурные) популяции резко отличаются от исходной популяции. Именно поэтому по современным популяциям (состояние в конце графика) нельзя восстановить генетический облик исходной популяции. Это судьба панмиксных изолированных популяций: многие предковые аллели утрачены, а частоты других непредсказуемо изменились. Однако параметры подразделенной популяции, представляющей иерархическую систему панмиксных популяций, устойчивы во времени и сохраняют генетическую память об истории генофонда подразделенной популяции.

Итак, дрейф генов - ошибка выборки из генофонда, совершаемая не исследователем, а самой историей в ряду поколений. Ошибка тем больше, чем меньше генетически эффективный размер N_e - та часть популяции, которая должна передать генофонд следующему поколению. Чем меньше размер популяции N_e, тем больше ошибка, тем сильнее случайный разброс в частотах гена от поколения к поколению, тем мощнее дрейф генов. Важно подчеркнуть, что дрейф генов - процесс ненаправленный, так как колебания частот аллелей в поколениях случайны и хаотичны.

Теперь, зная о дрейфе генов, можно ответить на вопрос, естественно возникавший при анализе карты распространения мутации CCR5del32 (см. рис. 8-2). Мировые максимумы были обнаружены на Русском Севере (в популяциях Архангельской области). Известно, что генетически эффективный популяционный размер N_e на этих территориях особенно мал. Именно поэтому возникает вопрос: нельзя ли объяснить эти необычно высокие частоты CCR5del32 генетическим дрейфом? Теперь можно уверенно дать отрицательный ответ на этот вопрос: три архангельские популяции географически и генетически изолированы друг от друга, а их значения отклонились от среднерусской частоты в одну и ту же сторону увеличения частоты мутации и примерно на одинаковую величину, тогда как действие дрейфа предполагает случайное по направлению и силе отклонение.

Поскольку каждый аутосомный ген содержится у индивидуума в двух копиях, то, казалось бы, генетический размер популяции, т.е. общее число генов в ней, можно считать в 2 раза большим, чем число людей в популяции. Но для изучения популяции важно знать не просто ее численность, а то, сколько генов будет передано следующему поколению. Следовательно, в подсчет уже нельзя включать гены стариков (генетического прошлого популяции) и детей (генетического будущего популяции): их или учитывали поколение назад, или они будут учтены в следующем поколении. Однако и оставшиеся гены людей репродуктивного возраста различны по своим судьбам. С точки зрения популяционной генетики важно, что они оставляют разное число потомков. Это означает, что одни половозрелые члены популяции передадут меньшее, а другие - большее число копий своих генов следующему поколению. Чем больше в популяции семьи различаются по своему размеру, тем меньше будет генетически эффективный размер популяции N_e. Но и это еще не все: необходимо, чтобы дети (носители родительских генов) достигли репродуктивного возраста, обзавелись своими семьями и оставили потомков, т.е. чтобы не прервалась передача генов по цепи поколений. Для оценки генетически эффективного размера популяции важно учесть еще и соотношение полов в популяции. Неравное соотношение означает, что гены не всех мужчин и женщин будут переданы следующему поколению:

N_e =(4N_mN_f)/(N_m+N_f),

где N_m - численность мужчин репродуктивного возраста, N_f - численность женщин репродуктивного возраста.

Представим гипотетическую «гаремную» популяцию, в которой лишь малая часть всех мужчин передает свои гены следующему поколению. Предположим, что каждый из десяти гаремов популяции содержит по 50 женщин. Тогда в этой популяции 500 женщин и 10 мужчин (510 человек репродуктивного возраста) передают свои гены следующему поколению. Таким образом, генетически эффективный размер N_e такой популяции будет менее 40, а вовсе не 510, как было бы, если бы равное число мужчин и женщин (по 255) участвовали в передаче генов следующему поколению. Иными словами, генетически эффективный размер N_e «гаремной» популяции с 510 репродуктивно активными членами окажется меньше генетически эффективного размера крошечной популяции с 20 мужчинами и 20 женщинами, но заключающими браки свободно и равноправно.

Это связано и с тем, что в ряду популяций генетически эффективный размер N_e определяется для k популяций (с размером каждой N_k) не как простая арифметическая средняя (ΣN_k/k), а как гармоническая средняя [(Σ1/N_k)/k]. Так, например, если тотальная популяция состоит из шести субпопуляций с численностью N_k 10, 100, 1000, 10 000, 100 000 и 1 000 000 человек, то средняя гармоническая величина N_e будет равна лишь 50, а не 185 000, как было бы в случае арифметической средней.

Иными словами, генетически эффективный размер N_e задают самые малые составляющие: в примере с неравным соотношением полов его задавала наименьшая (мужская) часть популяции; для ряда субпопуляций в пределах подразделенной популяции N_e определяется популяциями наименьшего размера; для ряда поколений одной популяции - поколениями с наименьшей численностью.

Тогда становится понятным эффект «бутылочного горлышка»: если популяция прошла даже через краткий период, когда численность ее половозрелых членов сократилась до величины N_kmin (например, как в вышеприведенном примере с субпопуляциями до N_k =10 человек), то, хотя в каждом следующем поколении ее численность увеличится на порядок и в шестом поколении достигнет 1 млн человек, ее генетически эффективный размер все еще будет задаваться «бутылочным горлышком»: через шесть поколений генетически эффективный размер популяции тотальной численностью 1 млн человек будет равен всего лишь N_e =50 человек. Это тем более важно, что рост численности населения главным образом связан с увеличением числа популяций, а не их среднего размера. Именно поэтому, хотя тотальный размер популяции резко возрастает, но за счет увеличения числа популяций генетически эффективный размер N_e по-прежнему остается малым.

Все эти и многие другие обстоятельства интегрированы в показателе генетически эффективного размера популяции N_е.

Обычно в генетически стабильной популяции (с равной численностью полов и небольшими различиями между семьями по числу потомков) генетически эффективный размер популяции N_е составляет около 30% общего числа генов в популяции. Это значит, что из всех генов популяции на каждый момент времени лишь треть связана с формированием генофонда следующего поколения. Генетические свойства нового поколения начинают зависеть от того, насколько полно (или неравномерно) были представлены в этой трети гены родительского поколения.

Рассмотрим динамику генофонда одного из народов, для которых роль дрейфа генов оказалась решающей - саамов (лопарей), на протяжении многих десятилетий представлявших загадку для антропологов и генетиков. Происхождение их генофонда важно и для медицинской генетики, поскольку своеобразие спектра «финских» наследственных болезней может быть связано с включением в финский генофонд древнего пласта саамского населения.

Ареал саамов охватывает север Европы (Скандинавия, Финляндия, Мурманская область), но их чрезвычайное расовое и генетическое своеобразие давно породило гипотезу зауральского происхождения (Западная Сибирь или сибирский сектор циркумполярной зоны). Вслед за физической антропологией совокупность генетических данных подтверждала факт особости генофонда саамов, и при анализе популяций Европы они возглавили список «генетических чужаков». Несмотря на многолетние генетические исследования и по классическим, и по аутосомным ДНК маркерам, вопрос о происхождении саамов оказался неразрешимым: вызвано ли их генетическое своеобразие особым, внеевропейским происхождением, или же является результатом долговременной изоляции от других популяций Европы и порождено дрейфом генов.

Лишь благодаря анализу географического распространения однородительских маркеров оказалось возможным верифицировать эти две гипотезы. Оказалось, что митохондриальный генофонд саамов составлен из обычных западно-евразийских гаплогрупп, типичных для других популяций Европы, но их соотношение - совершенно особое, резко отличает саамов от всех прочих популяций западной и, тем более, восточной Евразии. Был сделан вывод, что саамы происходят не от восточно-евразийских (зауральских) популяций, а от верхнепалеолитического населения Европы. Длительная изоляция небольших популяций у границ ледника и интенсивный дрейф генов в них привели к тому, что из широкого спектра европейских (западно-евразийских) гаплогрупп у саамов сохранились лишь несколько, и потому их частоты стали необычными для остальной Европы.

Рассмотрим эти результаты подробнее. При изучении четырех популяций саамов из Швеции, Норвегии, Финляндии и России обнаружены следующие гаплогруппы мтДНК: гаплогруппа U5b с частотой 48%, гаплогруппа V с частотой 42%, гаплогруппа H с частотой 3%, гаплогруппа D5 с частотой 3% и гаплогруппа Z с частотой 1%. Другие гаплогруппы редки и не достигают 1% уровня полиморфизма. Таким образом, генофонд саамов на 90% составлен лишь двумя гаплогруппами - V и U5b. Гаплогруппы являются западно-евразийскими и распространены в Европе и Юго-Западной Азии, но чаще всего встречаются в Восточной Европе (Балановская, Балановский, 2007). Эти гаплогруппы могли быть принесены на освобождающийся от ледникового покрова в начале голоцена север Скандинавии первыми поселенцами, вероятно, пришедшими из Восточной Европы. Можно предположить, что первоначально генофонд предков саамов включал большое число гаплогрупп, как это и сейчас наблюдается по всей Европе. Но за время длительного существования небольших популяций саамов на северной окраине Европы, при ограниченных брачных контактах с другими европейцами, частоты многих гаплогрупп случайно снижались, пока большинство из них не было утеряно, а две оставшиеся гаплогруппы - U5b и V - поделили между собой девять десятых генного пула популяции.

Но каково происхождение оставшейся одной десятой части генофонда, составленной, как было указано ранее, из трех редких для саамов гаплогрупп H, D5 и Z? Гаплогруппа H - типичнейшая западно-евразийская гаплогруппа: у любого народа Европы более трети всех вариантов мтДНК относится именно к ней. Низкая частота H у саамов объясняется той же случайной немилостью к ней дрейфа генов, который повысил частоты двух других гаплогрупп. Возможно, первоначально дрейф даже полностью искоренил гаплогруппу H у саамов, и ее присутствие в современных популяциях саамов вызвано лишь исторически недавним потоком генов со стороны финнов, шведов и норвежцев, в генофонде которых эта гаплогруппа доминирует (соответственно частота H равна 42, 44 и 47%).

Следует отметить, что столь высокая интенсивность дрейфа генов в популяциях саамов объясняет, почему более ранние исследования обнаруживали генетическое своеобразие саамов, но затруднялись прояснить их происхождение. Эти классические работы опирались преимущественно на частоты генов, которые у саамов меняются кардинально и непредсказуемо из-за значительной силы дрейфа генов. Именно поэтому неудивительно, что саамы оказывались далеки и от европейских, и от сибирских популяций, обнаруживая порой небольшое случайное сходство то с теми, то с другими. Ведь, в отличие от мтДНК, большинство других генов распространены по всему миру, и народы Европы и Сибири различаются не по спектру (он почти одинаков), а лишь по частотам этих генов.

Возвращаясь к гаплогруппам мтДНК, столь по-разному распределенным между Европой и Азией, рассмотрим две оставшиеся гаплогруппы Z и D5. Гаплогруппа Z распространена в Сибири и отдельными анклавами - в Центральной Азии, но в Европе она чрезвычайно редка. Можно предполагать, что гаплогруппа Z была принесена миграциями из Сибири, влившимися в генофонд саамов. Удельный вес этого вклада крайне мал: гаплогруппа Z встречается у саамов с частотой 1%. Другая редкая гаплогруппа - D5 - может происходить как от населения Восточной Европы, так и Сибири. Дело в том, что хотя D5 - типичнейшая восточно-евразийская гаплогруппа (как H - типичная западно-евразийская), однако встреченный у саамов ее особый вариант обнаружен у коренных народов и Алтая, и Урала, и северовостока Европы.

Схема на рис. 8-4 суммирует представления о составе митохондриального генофонда саамов и происхождении его отдельных компонентов. Иллюстрация из работы Tambets и соавт. (2004) уточнена благодаря новым знаниям о географии мтДНК. В частности, геногеографический атлас (Балановская, Балановский, 2007) однозначно указывает именно на Восточную (а не Западную) Европу как на зону максимальных частот гаплогруппы V, причем и ее разнообразие также максимально именно в Восточной Европе. Именно поэтому происхождение гаплогруппы V у саамов связано с Восточной Европой. Итак, генофонд саамов (см. рис. 8-4) имеет на 99% восточноевропейское происхождение. Эти данные получены по мтДНК, но анализ другой системы однородительских маркеров - Y хромосомы - приводит к сходным выводам.

Таким образом, в результате интенсивного дрейфа генов в изолированных популяциях Северо-Восточной Европы возник своеобразный современный генофонд саамов.

Рис. 8-4. Карта-схема формирования митохондриального генофонда саамов (Tambets et al., 2004) с изменениями, соответствующими новым данным по Восточной Европе. Латинские буквы обозначают различные варианты митохондриальной ДНК, обнаруженные у саамов. Стрелки показывают вероятные пути, по которым носители этих вариантов - предки саамов - могли достичь севера Скандинавии. Толщина стрелок соответствует частоте того или иного варианта в современном генофонде саамов

Саамы - пример народа, для которого эффекты дрейфа генов выражены столь существенно, что преобладают над действием других факторов популяционной динамики. Однако при этом был учтен не только малый размер, но и изолированность популяций прасаамов - небольшая величина миграционного потока. Если бы он был большим, то снижал бы эффекты дрейфа генов. Таким образом, в действительности были учтены оба самых мощных фактора популяционной динамики - и дрейф генов, и миграции. Дело в том, что разделить эти факторы чрезвычайно сложно: именно на их взаимодействии основаны практически все модели популяционной генетики. Более того, на примере саамов наряду с дрейфом генов были рассмотрены и миграции, сформировавшие их генофонд: мощные древние миграции палеоевропейцев из Восточной Европы, заложившие основу генофонда саамов, случайные миграции из Зауралья и возможные небольшие поздние влияния генофонда шведов и норвежцев. Поэтому рассмотрим, пожалуй, самый яркий фактор популяционной динамики - миграции.

Обмен генами между популяциями называют миграцией генов, независимо от того, что привело к проникновению «чужих» генов в популяцию: веками устоявшаяся структура брачных связей между соседними популяциями (поток генов через брачные миграции), случайные браки с пришельцами из других популяций или же массовые перемещения целых групп населения.

Количественной характеристикой фактора миграций служит скорость притока генов за поколение, обозначаемая М_е. При оценке М_е учитывают не только общее количество «прибывших» генов, но и степень их новизны для популяции, несхожести с ее собственным генофондом: чем «неожиданней» прибывший с миграцией вариант гена, тем больше генетическая эффективность миграции. «Новизну» прибывшего гена может определять не только географическая, но и культурноисторическая разобщенность популяций.

Представим, что в русской глубинке поселилась небольшая группа приезжих эфиопов и столь же немногочисленная группа переселенцев-белорусов. Поначалу и к тем, и к другим будут относиться как к чужакам, но потом с ними станут заключать браки, и со временем обе приезжие группы растворятся в местном населении. Однако будущим популяционным генетикам будет куда легче обнаружить миграцию эфиопов, чем след переселения белорусов: за счет резкого отличия мигрантов и принимающей популяции генетический эффект миграции эфиопов будет намного сильнее. Следовательно, генетическая эффективность миграции эфиопов значительно больше, чем родственного народа - белорусов.

Миграция генов - социальный по своей первопричине процесс, который противостоит дрейфу генов и предотвращает утрату генетического сходства между популяциями в результате дрейфа генов. Любая популяция, таким образом, оказывается вовлеченной в оба противодействующих процесса - дрейф генов (N_е) и миграцию генов (M_е). Их устойчивое противодействие задает предел для генетического расхождения популяций:

F_ST ≈F_e =1/(1+4N_eM_e).

Благодаря потоку генов предел различий между популяциями F_e оказывается гораздо меньше единицы (ожидаемый предел при дрейфе генов в условиях полной изоляции). Конкретную величину предельного значения F_e определяет соотношение интенсивности дрейфа генов и интенсивности миграций между популяциями. Это справедливо для взаимодействия не только разных популяций, но и между частями одной популяции, особенно если она расселена на большой территории.

Оценить величину M_e непросто. Для этих целей разработаны математические модели, с которыми можно ознакомиться в основных монографиях по популяционной генетике.

Островная модель рассматривает два варианта миграций M_e, не зависящих от расстояния между популяциями:

множество панмиксных популяций («островов») одинакового размера N_e, каждая из которых с равной вероятностью и интенсивностью M_e (за поколение) обменивается генами с каждой другой популяцией;

одна популяция неограниченного размера («материк») окружена множеством панмиксных популяций («островов») одинакового размера N_e, каждая из которых получает гены с «материка» с равной интенсивностью M за поколение (обмена генами между «островами» нет, и их миграциями на ^e«материк» можно пренебречь).

Модель изоляции расстоянием предполагает существование огромной популяции, индивидуумы которой непрерывно и равномерно распределены в столь большом ареале популяции, что расстояние, в пределах которого заключаются браки, намного меньше ареала. Рассматривают два варианта модели - одномерный (линейный, например, миграции вдоль побережья моря или реки) и двухмерный (миграции равновероятны в любом направлении на плоскости). В такой популяции, в отличие от островной, интенсивность миграций M_e зависит от расстояния.

Ступенчатая модель (Stepping stone) - промежуточная между островной и изоляцией расстоянием:

Реально существующие миграции в популяциях M обычно промежуточны между этими моделями. ^e

Реконструкция миграций по аутосомным маркерам затруднительна. Использование однородительских маркеров (мтДНК и Y хромосома) воплотило, казалось бы, несбыточную мечту - «адресно» выявлять следы давних миграций в современных генофондах. Выше были показаны возможности мтДНК, решившей давний спор: саамы - европейцы или азиаты? Возможности Y хромосомы на порядок шире, чем мтДНК, поскольку изменчивость популяций по Y хромосоме на порядок больше, чем по мтДНК и аутосомным маркерам. Эти возможности продемонстрированы ниже при отслеживании миграций на примере поиска в современном генофонде Ливана генетических следов крестоносцев. Выявление миграций, оставивших след в генофонде, важно для медицинской генетики, поскольку позволяет сформулировать ожидаемый спектр наследственных нарушений.

Крестоносцы: генетический след в Леванте. Как известно, по призыву папы рыцари из большинства западноевропейских государств, отмеченных на врезке (см. рис. 8-5 на цв. вклейке) красным, синим, желтым и зеленым цветом, отправились в Палестину, где оставались более 100 лет. Вопрос о генетических последствиях этих событий оставался открытым: по историческим данным нельзя определить, какая часть населения христианских государств Леванта вернулась в Европу, а какая осталась в Леванте.

Геногеография выявила неожиданно четкую картину (рис. 8-5, см. цв. вклейку): у заметной части современного населения Ливана обнаруживают специфический гаплотип гаплогрупп R1b Y хромосомы, который распространен в большинстве западноевропейских стран-участниц крестовых походов (красные кружки), но полностью отсутствует в других странах Ближнего Востока (синие кружки). Так был найден явный генетический отпечаток исторических миграций крестоносцев.

Это означает, что в населении Ливана можно ожидать встретить наследственные болезни, распространенные в Западной Европе, но не характерные для Ближнего Востока.

Однако ни один из факторов популяционной динамики не действует в одиночку, и это убедительно показано уже на примере распространения мутации CCR5del32 в Евразии (см. рис. 8-2). Одна из гипотез обращает внимание на удивительное сходство ареала европейского максимума CCR5del32 с ареалом северной европейской малой расы. Можно предполагать, что мутация CCR5del32 возникла на севере Европы (первый фактор - мутации). Затем ее частота в небольших изолированных северных популяциях под действием дрейфа генов возросла до столь заметной величины (второй фактор - дрейф генов), что была подхвачена климатическим отбором и достигла в этом ареале с его дефицитом инсоляции высоких значений (третий фактор - отбор). Позднее мутация CCR5del32 распространилась во всех направлениях за счет миграционных потоков (четвертый фактор - миграции).

Наиболее поздние потоки миграций можно фиксировать. Например, недавно проведенные исследования популяций юга России обнаружили неожиданное повышение частоты мутации CCR5del32 в двух районах Орловской и Белгородской областей. С большой степенью уверенности можно утверждать, что повышенная частота мутаций именно в этих районах связана с хорошо документированными миграционными потоками заселения их в середине XVI в. преимущественно из центральных (Москва, Тула, Калуга) и восточных (Рязань) областей Московского государства.

Таким образом, на примере CCR5del32 последовательно рассмотрено действие всех факторов популяционной динамики: мутаций, отбора, дрейфа генов и миграций.

При рассмотрении характеристик отдельных генетических маркеров для любых популяций необходимо учитывать все четыре фактора популяционной динамики. В том случае, когда рассматривают не отдельные гены, а генофонд в целом, его динамику полностью определяют только два селективно-нейтральных фактора - дрейф генов и миграции:

F_e =1/(1+4N_e M_e).

Рассмотренные примеры таких событий, как этногенез саамов или миграции крестоносцев, кроме географического пространства, ввели еще одно измерение популяции - время. Время, в котором протекают генетические процессы в популяциях, исчисляется поколениями. От поколения к поколению накапливаются генетические изменения, и популяции, имеющие единое происхождение, начинают генетически удаляться друг от друга.

Понятно, что проследить ход генетических процессов во времени весьма затруднительно для исследователя: вся его исследовательская жизнь слишком коротка и укладывается между двумя-тремя взмахами маятника, отмеряющего время жизни популяции.

Тем не менее благодаря принципу эргодичности - взаимозаменяемости времени и пространства - можно вести отсчет от обратного: регистрировать ход генетического процесса по тем его итогам, которые оказались запечатленными в географическом пространстве. По словам Э. Реклю (1906), «География по отношению к человеку есть не что иное, как История в пространстве, подобно тому, как История является Географией во времени». Это ясное и элегантное выражение взаимозаменяемости пространства и времени как нельзя лучше отражает особенность популяционной генетики, где геногеография свидетельствует об истории и структуре генофонда.

«однородительским наследованием» (по материнской линии - мтДНК; по отцовской линии - Y хромосома) отличаются своеобразными показателями межпопуляционного разнообразия. Именно этот подход был использован во всех примерах: при анализе мутации CCR5del32, генофонда саамов и генетического влияния крестоносцев на генофонд Ливана. Почти все происходящее на Земле во времени оставляет свой след в географическом пространстве, и изменения в генофонде популяций - не исключение: их след остался в неоднородном распределении генов в ареале генофонда.

Рассмотрим возможности генетики в реконструкции расселения человека по планете. Для этого используем одно из самых важных для понимания изменчивости генофонда равенство:

F_ST ≈F_e =1/(4N_eM_e+1).

Для расчета времени t, за которое возникло ныне наблюдаемое разнообразие генофонда (F_ST), генохронология использует простую формулу:

F_t = (4N_еМ_е +1)-1(1-е-t/2N_e).

Левая часть равенства рассчитывается по генетическим маркерам: F_t=F~ST ~ оценивается нами как средняя F_ST =L^-1 Σ F_ST по данным о L множестве i-х генов, каждый из которых может быть подвержен тому или иному типу отбора. Это означает, что генофонд исследуемой группы населения был изучен по широкому спектру (i) генетических маркеров. Для каждого из них были получены свои оценки (F_ST(i)) дифференциации популяций в пределах генофонда данной группы населения. Далее оценки F_ST(i) были усреднены по всей совокупности i-х генов и для этого генофонда получена средняя оценка F_ST, которая селективно-нейтральна, т.е. уже не зависит от действия отбора.

Правую часть равенства рассчитывают по демографическим данным. Она содержит искомое время t, размер популяций N_е и миграции генов М_е (см. «Факторы популяционной динамики: мутации и отбор»).

На основании этого равенства рассчитывают время в поколениях t, прошедшее от исходного исторического события до времени изучения генофонда. Если время в поколениях t умножить на среднюю величину поколения (25 лет), то можно перейти к более привычным датам, измеряемым в годах.

Исторические события, которые были подвергнуты генохронологическому изучению (табл. 8-5), рассеяны почти по всему мыслимому диапазону времени человеческой истории - от десятков (хотоны) до десятков тысяч лет (коренное население Сибири и Америки). Сопоставление исторических дат, полученных по данным истории и археологии (левый столбец), с генетическими датами, полученными по данным об изменчивости современного генофонда (правый столбец), показывают, что все генетические даты для самых разных народов соответствуют историческим.

Таблица 8-5. Историческая и генетическая хронология событий в истории генофондов

* По данным на 80-е годы XX в. (Рычков, 1984, 1986).

Столь полное совпадение датировок на всем временном диапазоне открывает возможность анализа древней истории населения по данным о его современном генофонде и генетической дифференциации ныне живущих популяций. Приведенные в табл. 8-5 результаты получены по классическим маркерам, когда приходилось анализировать каждый маркер в отдельности. При современном переходе к полногеномному анализу использование подходов генохронологии создает совершенно новые возможности в датировке событий истории (конечно, в том случае, когда оно сопровождается тщательными оценками демографических параметров генетически эффективных размера популяции N_е и миграций М_е).

Результаты как генохронологии, так и изучения этапов становления генофондов коренного населения столь разных регионов, как Европа, Сибирь и Америка, свидетельствуют о том, что генофонд представляет не хаотическую массу генов, а исторически стратифицированную систему, в слоях которой содержится память о событиях и этапах развития генофонда на протяжении всей его истории.

Проверим вышеуказанное утверждение с помощью филогеографии - датировки и отслеживания событий генетической истории с помощью однородительских маркеров.

Только что рассмотренный метод вычисления времени расхождения популяций по накопившимся между ними генетическим различиям в частотах генов (генохронология) применим к аутосомным маркерам. Поскольку они подвержены рекомбинации, сцепление между ними отсутствует, и расчет межпопуляционных различий проводят для каждого маркера в отдельности, а затем величины изменчивости F_ST(i) усредняют.

Для однородительских маркеров (мтДНК и Y хромосома) благодаря отсутствию рекомбинации возможна совершенно иная технология датировки событий в истории генофондов - филогеография, основанная на анализе гаплотипов. В этом случае через накопившееся разнообразие также оценивают время, полагая, что чем большее разнообразие накопилось, тем большее время должно было пройти. Но если при анализе аутосомных маркеров рассчитывается разнообразие в частотах генов, накопившееся под действием факторов дрейфа генов и миграций, то при анализе однородительских маркеров в первую очередь оценивают разнообразие в спектре вариантов гена, накопившееся под действием фактора мутаций.

Отсутствие рекомбинации делает однородительские маркеры (всю мтДНК или нерекомбинирующую часть Y хромосомы) как бы одним огромным маркером.

Именно поэтому можно увидеть каждую мутацию на ветвящемся древе гаплотипов мтДНК или Y хромосомы и подсчитать время, прошедшее между анализируемыми мутациями. Исключение составляют лишь мутационные события, утраченные в результате дрейфа генов или иных событий истории, - ветви древа, не оставившие потомков в современности, невозможно восстановить по современному генофонду.

OUT-OF-AFRICA. Обратимся к самым первым шагам в развитии популяционной системы анатомически современного человека. Если окажется, что с помощью филогеографии можно реконструировать самые древние этапы, это даст уверенность в возможности исследования и более близких к нам событий, приведших к формированию и разнообразия современного генофонда, и груза наследственной патологии в популяциях.

Обнаружив в Африке наибольшее (по сравнению с другими континентами) разнообразие генетических вариантов однородительских маркеров и зная вслед за Вавиловым, что на прародине сохраняется наибольшее генетическое разнообразие, современная генетика утверждает, что именно Африка была колыбелью человечества. На чем же основано это утверждение?

На рис. 8-6 (см. цв. вклейку) представлены основные ветви родословного древа человечества, полученного по данным о мтДНК: они отражают самые первые шаги в микроэволюции Номо sapiens sapiens. Приведены генетические датировки ветвления древа мтДНК: на шкале слева указана временная шкала (тысяч лет) от современности (0 - наше время, 200 - 200 тыс. лет назад). Очевидно, что 140 тыс. лет назад произошло важное событие: разделение древа на два крупных ствола - койсанов (также известных в российской литературе как бушмены и отмеченных голубым цветом, - Khoisan) - и все остальное человечество. Независимые данные лингвистики тоже противопоставляют койсанские языки языкам всего остального человечества. Антропология также выделяет койсан в особый расовый тип, объединяющий в себе зародыши всех будущих крупных рас - негроидов, европеоидов, монголоидов - и свои собственные неповторимые черты. Таким образом, и другие науки подтверждают выводы генетики о необычайно древнем отделении койсан от всего остального человечества.

Как же дальше росло древо популяций человечества? Рисунок показывает, что практически все крупные ветви гаплогрупп мтДНК и ныне живут в Африке. На рис. 8-6 они обозначены сине-фиолетовым цветом и обозначены Out-of-Africa. Но где же все остальное человечество? Видны лишь две тощие веточки на африканском стволе, обозначенные красным: это и есть гаплогруппы населения всех остальных континентов - Евразии, Австралии и обеих Америк. В эти две скромные веточки и уместилось все остальное человечество. Получается, что очень немногие африканцы покинули свою родину, чтобы заселить остальной мир.

Это древо хорошо иллюстрирует общий принцип филогеографии: расселяющиеся популяции, оторвавшиеся от исходного массива, забирают с собой в путь лишь малую часть ветвей, т.е. имеющегося генетического разнообразия. Дальнейшая микроэволюция приводит к росту новых вторичных ветвей (субгаплогрупп) в разных регионах, позволяя прослеживать все более поздние миграции.

Выше отмечено, что мутационные события, утраченные в результате дрейфа генов или иных событий истории (ветви древа, не оставившие потомков в современности), невозможно восстановить по современному генофонду. Воссоздать всю полноту истории человечества помогает анализ палеоДНК.

Идея анализа древней ДНК (палеоДНК) проста: вместо того чтобы на основании данных о современных популяциях догадываться, какими были генофонды их предков в былые эпохи, можно изучать генофонд древности напрямую, проанализировав ДНК из древних костных останков. При этом для исследования древней ДНК используют те же методы и статистического анализа, и осмысления результатов, что и в палеоантропологии: изучают те же самые останки древних людей, сравнивают их друг с другом и современным населением и делают выводы о миграциях популяций.

Особенность анализа древней ДНК состоит в необходимости решения трех проб лем:

Таким образом, преимущества и ограничения при анализе древней ДНК и при анализе современных генофондов противоположны. При анализе современной ДНК доступно множество данных, но неизвестно, в какую эпоху сформировались те ли иные черты генофонда. А для анализа древней ДНК доступны прямые данные о генофонде конкретных эпох, но на первый план выходит проблема ограниченности исходных данных. Именно поэтому необходим комплексный анализ современной и древней ДНК, позволяющий взаимно компенсировать их недостатки.

Поскольку проблема формирования населения европейского севера была затронута уже дважды - при анализе генофонда саамов (см. рис. 8-4) и распространения СПИД-протекторной мутации (см. рис. 8-2) - возможности палеоДНК будут рассмотрены также на примере заселения Северной Европы.

Заселение Северной Европы: мезолит. Оленеостровский могильник, расположенный в южной Карелии, - ведущий памятник мезолита лесной зоны Восточной Европы. Не утихают споры о степени монголоидности оставившего этот памятник населения и соответственно о силе, направлении и географическом размахе миграций в Северной Евразии 8000-6000 лет тому назад. По результатам прямого исследования древней ДНК у мезолитического населения обнаружены следующие гаплогруппы мтДНК: U4, C, U2, U5, J и H. Наиболее частая гаплогруппа - U4 - сейчас распространена по всей Западной Евразии, достигая максимальных частот в Уральском регионе, причем по обе стороны хребта - как в Приуралье, так и в Западной Сибири. Обнаружение гаплогруппы U4 в древних образцах свидетельствует, что примерно та же география была свойственна ей и 7 тыс. лет назад. С другой стороны, высокую частоту U4 можно рассматривать как косвенное указание на генетическую связь мезолитического населения Карелии с современным населением Уральского региона. Вторая по частоте гаплогруппа С - типичная сибирская гаплогруппа, и обычно ее наличие рассматривают как свидетельство потока генов из-за Уральского хребта. Остальные четыре гаплогруппы мезолитического могильника (U2, U5, J, H) характерны для современного населения Восточной и Западной Европы. Таким образом, анализ древней ДНК показывает промежуточное положение населения, оставившего Оленеостровский могильник. Принадлежа в целом к западно-евразийскому генетическому стволу, оно несет в своем генофонде следы миграций с Урала и из Сибири. Карта генетических расстояний демонстрирует степень генетического родства этой древней популяции с современным населением Евразии. Популяции, генетически сходные с оленеостровцами, обнаружены только в Западной Сибири. Это позволяет (хотя весьма гипотетически) говорить о Западной Сибири как о возможной прародине мезолитического населения Восточной Европы.

Заселение Северной Европы: неолит. Вторая веха - население, оставившее около 3,5 тыс. лет назад могильник на севере Кольского полуострова. Для него характерен совсем иной профиль гаплогрупп мтДНК: C, U5, D, Z, U4 и T (в порядке убывания частоты). Как и у мезолитического населения, в этом перечне мирно соседствуют типичные европейские и сибирские варианты, но в неолите Кольского полуострова именно последним принадлежат лидирующие места, причем, кроме С, появляются и другие, отсутствовавшие в мезолите, типично сибирские гаплогруппы D и Z. Все это заставляет сделать вывод о том, что в популяции, оставившей могильник на Кольском полуострове, сибирский генетический компонент преобладал над европейским. Это предполагает новую, более позднюю миграционную волну с востока, причем, вероятно, не из ближайших к Уралу регионов, а из более отдаленных внутренних областей Сибири.

Однако эта миграция из Сибири угасла, не оставив значимого следа в современном генофонде: ни в одной из современных популяций Европы (за исключением тундровых ненцев - недавних пришельцев из Сибири) не обнаружены столь высокие частоты сибирских гаплогрупп. Не установлена и генетическая преемственность между неолитической популяцией Кольского полуострова и современными саамами, проживающими на той же территории.

Результаты исследований мезолитического и неолитического населения заставляют с большим вниманием отнестись к наличию сибирских гаплогрупп D и Z у саамов. Сейчас они встречаются у саамов с очень низкими частотами, но их распространенность у древнего населения позволяет выдвинуть гипотезу, что сибирские гаплогруппы были более часты у предков саамов, но затем утеряны в результате дрейфа генов. Однако по аутосомным маркерам интенсивность дрейфа генов намного меньше (см. «Генетические маркеры»), и, следовательно, в аутосомном генофонде коренного населения Северной Европы можно ожидать более явное влияние миграций из-за Урала. Таким образом, и спектр наследственных нарушений у северных европейцев может нести черты влияния древнего населения Сибири.

Еще один пример анализа древней ДНК - изучение одной из первых неолитических (земледельческих) популяций Европы - культуры линейно-ленточной керамики. Вопрос о том, было ли это население мигрантами с Ближнего Востока (родина земледелия) или же местными популяциями, усвоившими навыки земледелия от соседей без значительной миграции, является одним из наиболее широко обсуждаемых в популяционной генетике человека. Он составляет суть давнего спора между сторонниками теории демической диффузии Аммермана и Кавалли-Сфорца и приверженцами гипотезы культурной диффузии. Карта генетических расстояний от древнего генофонда этой популяции (рис. 8-7, см. цв. вклейку) показывает, что генетически наиболее сходные популяции расположены на Ближнем Востоке. Это позволяет сделать вывод, что имела место миграция ранних земледельцев с Ближнего Востока в Европу.

Неслучайно при анализе любых факторов популяционной динамики и даже древних генофондов всегда - прямо или косвенно - обращаются к ареалу, к географическому пространству. Геногеография, изучая географическое распределение генетической изменчивости, устанавливает как общие закономерности в структуре генофондов, так и конкретные пути их формирования.

Возможности геногеографии далее рассмотрены на примере созданного авторами этой главы картографического атласа изменчивости гаплогрупп Y хромосомы в населении Европы (рис. 8-8), позволившего обнаружить основные черты как европейского генофонда, так и русских популяций.

Рис. 8-8. География основных европейских гаплогрупп Y хромосомы: а - R1a, R1b, N1c1, N1b; б - I1, 12a, E-M35, J2

Гаплогруппа R1a. В русских популяциях эта гаплогруппа самая распространенная: ее обнаруживают почти у каждого второго (частота - 47%). В глобальном масштабе ее основной ареал - Восточная Европа, хотя она также распространена в Западной Европе, Южной Сибири и Индостане. Карта показывает приуроченность этой гаплогруппы к ареалам балтов, западных и восточных славян. Если бы ее частота не была резко снижена у южных славян, что может быть связано со значительными включениями в их генофонд дославянского населения Южной Европы, то можно было бы сказать, что в Европе эта гаплогруппа четко приурочена к балто-славянской языковой общности. В пределах изученного ареала русских популяций (область, очерченная на карте серой линией) видны различия в широтном направлении: на юго-западе и юге частота R1a превышает 50% и лишь местами снижается до 40%. На северо-востоке частота R1a ниже 40%.

Гаплогруппа N1с1. Эта вторая по частоте гаплогруппа в русском генофонде вбирает в себя пятую часть (19%) фонда Y хромосом. Основной ареал N1с1 - Сибирь (до 90% в отдельных популяциях) и Восточная Европа. Такая общность по маркерам Y хромосомы неожиданна, поскольку по другим системам признаков генофонды Восточной Европы и Сибири резко различаются. Любопытно, что балтоязычные популяции (латыши и литовцы), которые по R1a решительно объединялись со славянами, по гаплогруппе N1c1 еще более решительно от них отмежевываются: карта показывает резкий перепад частот (более чем на 20%) примерно по границе балтов и славян. В пределах русского ареала для N1с1 обнаруживается более четкая картина широтной изменчивости, чем для R1a, только значения обратны предыдущей карте: высокие частоты N1с1 - на севере, низкие - на юге. Удивительны довольно резкий перепад в частотах N1с1 между севером и югом русского ареала и строго широтная граница между зонами высоких и низких частот. Данные по смежным народам подтверждают, что N1с1 приурочена к северной половине Восточной Европы. Таким образом, русский генофонд полностью подчиняется восточно-европейской закономерности. Учитывая редкость N1с1 у белорусов и украинцев, можно обсуждать существование финно-угорского пласта в русском генофонде и его залегание преимущественно на севере.

Гаплогруппы I1 и I2a. Эти две сестринские гаплогруппы по зонам их максимальных частот можно назвать «скандинавской» и «балканской». Их распространение в русском ареале может обнаружить связи русского населения с этими двумя регионами. Частота I1 максимальна в Скандинавии и постепенно снижается к югу. Напротив, I2a распространена главным образом на Балканах, и ее частота постепенно снижается к северу. Вся центральная полоса Европы оказывается зоной интерференции этих гаплогрупп. У русских преобладает балканская гаплогруппа, хотя частота скандинавского варианта также существенна: соотношение I1:I2a составляет 1:2. При этом у белорусов и украинцев скандинавская гаплогруппа, по сравнению с балканской, практически незаметна: соотношение I1:I2a составляет 1:5 для украинцев и 1:15 -для белорусов, хотя для украинцев, казалось бы, более естественна генетическая близость с географически соседним населением Балкан. Внутри русского ареала распространение «балканской» гаплогруппы I2a закономерно: частота плавно падает с юга (более 13%) на север (0%). Вновь виден широтный тренд, но только изменение частоты I2a не резкое, как для N1c1, а постепенное. Тренд, обнаруженный в русском генофонде, полностью встраивается в более общий европейский тренд распространения гаплогруппы I2a.

Но ее сестринская «скандинавская» гаплогруппа I1 уже не подчиняется европейской закономерности: ее генетический рельеф в русском ареале оказывается неожиданным. Казалось бы, высокие значения I1 должны быть вблизи Скандинавии, на северо-западе русского ареала. Там, а также по западной границе можно ожидать «варяжское» влияние в виде повышенных частот I1. Однако компактный локальный максимум I1 (11-12%) вырисовывается совсем в другой области - на северовостоке. Это ядро ясно выделяется на фоне окружающих низких частот (менее 6%), свойственных всему остальному русскому ареалу. Реальность этого ядра повышенных значений опирается на данные по трем русским популяциям, изученным по обширным выборкам. Конечно, по сравнению с частотами в Скандинавии (25-40%) этот локальный максимум второстепенен, но его удаленность от основной зоны высоких частот гаплогруппы I1 в Скандинавии требует объяснений. Трудно предположить тесные связи Скандинавии именно с Заволжьем и бассейном Вычегды, помимо прочих русских территорий. Видимо, популяционная история гаплогруппы I1 сложнее, чем простая экспансия из Скандинавии, и, возможно, включает древние связи между финно-угорскими племенами Восточной Европы и предками германоязычных скандинавов.

Гаплогруппа R1b характерна для населения Западной Европы, что четко видно на карте (см. рис. 8-8). Ее присутствие у русских выражено в той же небольшой степени, что и в целом в популяциях Восточной Европы (например, 6% у украинцев и 3% у белорусов). В русском ареале R1b встречается с частотой от 0 до 13% (в среднем - 6%). В отличие от предыдущих гаплогрупп, в ее распределении по русскому ареалу четкой географической закономерности нет, и для большинства популяций характерны средние частоты. Повышение частоты отмечено в трех популяциях на востоке, а снижение - в одной на северо-востоке. Учитывая, что основная зона R1b - Западная Европа, неожиданно, что ее частота в русском ареале возрастает к востоку, а не к западу. Такая изменчивость подчеркивает отсутствие заметных влияний на русский генофонд из Западной Европы, которые должны были бы выразиться на карте в клинальной изменчивости частоты «западноевропейской» гаплогруппы.

Гаплогруппа E-M35 характерна для Северной Африки (до 80%) и Средиземноморья. В Европе наибольшие частоты отмечены на Балканах (10-20%). До русского ареала доходит лишь «затуханье сахарской волны» (Н. Гумилев). Внутри русского ареала генетический ландшафт состоит в повышении частоты в центральной полосе, снижении к северу и югу (подобные ландшафты характерны для многих признаков генетики, фамилий, антропологии) и лишь отчасти согласуется с европейским трендом для этой гаплогруппы (снижение к северу).

Гаплогруппа J2 преобладает на Ближнем Востоке и Кавказе. В русский генофонд она могла прийти не только со стороны Кавказа, но и из Южной Европы (включая Балканы), где J2 также нередка. В европейском масштабе J2 следует тому же генетическом рельефу, что E-M35: максимум - в Средиземноморье и снижение к северу. Однако «русский» ландшафт гаплогруппы J2 оказывается гомогенным в пятипроцентной шкале карты. Для анализа географии таких редких признаков нужно либо существование очень четкого тренда, либо очень большие выборки и обилие изученных популяций.

Гаплогруппа N1b. Гаплогруппа N1b как раз характеризуется таким очень четким трендом. Хотя ее средняя частота столь же невелика, как и E-M35, и J2, но распространение географически четко приурочено. Гаплогруппа N1b обнаружена только на русском Севере, в трех популяциях Архангельской области. Учитывая, что основной ареал N1b - угорские народы Западной Сибири, а в Европе ее регистрируют только среди волго-финских народов, финно-угорский отпечаток на генофонде русского Севера виден по N1b рельефнее, чем по любому другому маркеру.

Казалось бы, изученные селективно-нейтральные гаплогруппы Y хромосомы могут быть важны для прогноза наследственных заболеваний только косвенно, через общую структуру генофонда. Тем не менее показано, что геногеография гаплогрупп Y хромосомы позволяет перейти к прямому прогнозу.

Примером служит тесная ассоциация делеций, вызывающих мужское бесплодие, и гаплогруппы Y хромосомы N1c1, распределение которой в Европе приведено на рис. 8-8. Пилотное исследование, проведенное совместно с лабораторией проблем нарушений репродукции Медико-генетического научного центра РАМН (руководитель - профессор Л.Ф. Курило), показало, что среди мужчин Восточной Европы (главным образом русских), страдающих бесплодием в результате делеции b2/b3 AZF региона Y хромосомы, около 80% - носители гаплогруппы N1c1, около 10% - гаплогруппы N1b, и лишь 5% - носители гаплогруппы R1a1 (еще 5% приходится на остальные гаплогруппы). При этом в русских популяциях наблюдается совершенно иное распределение этих гаплогрупп: популяционная частота R1a1 в 10 раз выше и составляет 50%, а не 5%, как у носителей делеции; популяционная частота N1c1 составляет 15%, а не 80%; частота N1b - 1%, а не 10%. Если учесть, что большинство больных происходят из средней полосы и южных районов России, где значительно выше плотность населения и ниже частоты N1c1 и N1b, то различия между выборкой больных и популяционными частотами окажутся еще разительнее. Таким образом, геногеографические карты гаплогрупп N1c1 и N1b могут стать основой для оценки риска отягощенности населения Европы микроделециями AZF региона.

Установленная зависимость частоты встречаемости микроделеций AZFc региона Y хромосомы (вызывающих мужское бесплодие) от гаплогруппы Y хромосомы подводит к одной из фундаментальных проблем генетики развития: связи между ключевыми генами, генетическим окружением (контекстом) и мужской фертильностью. Дальнейшие исследования позволят оценить вклад генетического контекста гаплогрупп Y хромосомы в возникновение ее микроструктурных перестроек в одном из наиболее сложных участков генома человека - AZFc-регионе. Он отвечает за мужскую фертильность и подвержен наиболее высокой частоте мутационных изменений, вызывающих нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин. Следует учитывать обе стороны этой связи.

Во-первых, делеции, вызывающие частичное бесплодие, стабильно наследуются в составе одного или нескольких гаплотипов Y хромосомы, время возникновения и географическое распространение которых хорошо известны из популяционно-генетических работ (см. рис.8-8).

Во-вторых, мутации возникающие de novo, в том числе вызывающие полное бесплодие, и следовательно, не наследуемые, также в ряде случаев возникают у носителей определенных гаплотипов Y хромосомы. Это может пролить свет на механизм возникновения делеций в зависимости от генетического контекста.

Важно подчеркнуть, что отсутствие рекомбинации на большей части Y хромосомы приводит к тому, что происхождение обнаруживаемых ассоциаций принципиально отлично от таковых в классическом понимании. Речь идет не столько о «функциональных» ассоциациях (зависимость фенотипа от гена может свидетельствовать о причинной связи между ними), сколько об ассоциациях «по происхождению», когда фенотип (делеция) возник на той Y хромосоме, которая уже имела некоторые отличительные черты, функционально никак не связанные с этой делецией. Некоторое исключение могут составлять лишь мутации de novo, где о причинной связи можно говорить в терминах повышения мутабильности в данном контексте Y хромосомы.

Эта особенность Y хромосомы открывает перспективу использования для изучения генетических факторов бесплодия новых методов филогеографии и обширных данных, полученных этим бурно развивающимся направлением, не только о русском генофонде, но практически обо всех народах России и сопредельных стран.

Итак, по спектру гаплогрупп Y хромосомы и их средним частотам русский генофонд укладывается в более крупный регион Восточной Европы (доминирование восточно-европейских гаплогрупп R1a и N1c1). Видны связи практически со всеми смежными регионами: Западной Европой (наличие R1b), Скандинавией (I1), Балканами (I2a, J2, E-M35), Западной Сибирью и Уралом (N1b). Лишь с Кавказом генетическая общность проявляется слабо. Это связано с тем, что гаплогруппа G, наиболее распространенная среди северокавказских народов, практически не встречается у русских и лишь чуть более часто обнаруживается у украинцев.

Картографический атлас позволил увидеть огромную внутреннюю гетерогенность русского генофонда, занимающего большую часть Восточной Европы с десятками миллионов обитателей. По трем самым частым гаплогруппам (R1a, N1c1, I2a) и редкой гаплогруппе N1b в русском ареале обнаружена широтная изменчивость, согласующаяся с общеевропейскими трендами. Распространение в русском ареале умеренно частых гаплогрупп R1b и I1 носит сложный характер и не согласуется с европейскими закономерностями. Наконец, редкие для русских гаплогруппы J2 и E-M35 распределены в русском ареале мозаично.

Полученные результаты важны для анализа груза наследственной патологии. Во-первых, столь значительная гетерогенность русского народа не позволяет оперировать понятием средней частоты патологии для русских популяций, а требует отдельного анализа северных и южных популяций, для которых можно прогнозировать резкие различия в спектре наследственных заболеваний.

Обнаруженное в целой серии исследований региональное деление русского генофонда должно стать основой для научного прогнозирования распределения отдельных наследственных заболеваний. Полученные карты инбридинга (гаплотипического разнообразия), как будет показано ниже, указывают на ожидаемую величину общего груза наследственной патологии в ареале русского народа и Восточной Европы в целом.

На примере генофонда саамов (см. рис. 8-4) видно, что мтДНК оказалась самым чувствительным маркером, обнаружив и действие дрейфа генов, и историю генофонда. Еще более информативна карта гаплотипического (внутрипопуляционного) разнообразия мтДНК для населения всей Восточной Европы (рис. 8-9): она выявляет закономерное убывание степени разнообразия с юга на север - от южных популяций Причерноморья до берегов Северного Ледовитого океана.

Данные по мтДНК согласуются с данными по другим системам генетических маркеров: сходное убывание внутрипопуляционного разнообразия к северу и востоку показано и по аутосомным маркерам. Для популяционной генетики снижение внутрипопуляционного разнообразия - важный индикатор действия дрейфа генов, особенно сильного в небольших по размеру и частично изолированных популяциях. По однородительским маркерам картина четче, что связано с их большей чувствительностью к эффектам дрейфа генов.

Как показано в разделе «Основные термины популяционной генетики», уменьшение внутрипопуляционного разнообразия прямо связано с увеличением инбридинга в популяциях и ростом генетических различий между ними.

Исследование русского генофонда подтвердило эту закономерность: на юге обнаружены небольшие различия между генофондами разных районов, в то время как генетические отличия между районами Архангельской области очень велики. Дополнительный аргумент - сходство тренда гаплотипического разнообразия с картой плотности населения: оба показателя имеют максимальные значения в южных областях, промежуточные - в центральных, минимальные - в северных областях Восточной Европы.

Таким образом, возникает единая и закономерная картина взаимосвязанных изменений от юга к северу сразу нескольких параметров: географической широты (возрастает), продуктивности среды (падает), плотности населения (убывает), эффективного размера популяции (убывает), изоляции субпопуляций (возрастает), дрейфа генов (возрастает) и гаплотипического разнообразия мтДНК (снижается). Эти параметры перечислены в порядке предполагаемой причинноследственной цепи.

Для медицинской генетики важным аспектом служит добавление в ту же цепь еще одного показателя: заболеваемости населения. Работами научной школы под руководством академика РАМН Е.К. Гинтера убедительно показана взаимосвязь груза наследственных нарушений (следствие) с генетической структурой популяции, в частности уровнем случайного инбридинга (причина). Поскольку инбридинг прямо связан с действием дрейфа генов, который резко уменьшает гаплотипическое разнообразие мтДНК, можно ожидать связь между уровнем гаплотипического разнообразия мтДНК и величиной груза наследственных болезней.

Для оценки величины этой связи были сопоставлены величины обоих показателей в одних и тех же популяциях (табл. 8-6). К настоящему времени методом тотального скрининга населения определены величины генетического груза для одиннадцати популяций России (Зинченко, Гинтер, 2008). Из них для семи популяций есть данные об изменчивости мтДНК. В анализ была включена также восьмая популяция (Брянская область), в качестве генетической пары к которой были взяты данные по популяциям юга Смоленской области (районы, пограничные с Брянской областью).

Таблица 8-6. Уровни генетического груза и гаплотипического (внутрипопуляционного) разнообразия митохондриальной ДНК*

* Оценки генетических нарушений приведены по Зинченко, Гинтер (2008).

Как и следовало ожидать, коэффициент корреляции гаплотипического разнообразия мтДНК оказался наибольшим для аутосомно-рецессивной патологии (r =0,4), поскольку наиболее прямая связь с инбридингом и генетическим дрейфом характерна именно для рецессивных генов (сочетание которых в гомозиготе в результате инбредного брака обусловливает манифестацию наследственного заболевания).

Величина корреляции (r =0,4) значима, хотя и не очень высока. Она служит нижней оценкой существующей связи, поскольку реальный уровень наследственной патологии чрезвычайно трудно поддается количественному определению: интенсивность скрининга, неизбежно различная в разных областях, обусловливает разную частоту обнаружения имеющихся в популяции больных с наследственными заболеваниями. При статистических сравнениях это приводит к повышенному уровню информационного шума, снижающего величину коэффициента корреляции. Более того, корреляции такого уровня (r =0,4) при сравнениях связи между признаками различной природы традиционно рассматривают как информативные. Например, положение об информативности фамилий в качестве квазигенетического маркера, общепризнанное в настоящее время, первоначально было обосновано А.А. Ревазовым и соавт. на коэффициенте корреляции r =0,3. Вывод Rosser и соавт. о зависимости распределения гаплогрупп Y хромосомы в Европе от географических факторов основывался на той же величине корреляции r =0,3.

Важно подчеркнуть, что гаплотипическое разнообразие мтДНК оказывается весьма информативным инструментом для изучения связи между генетической структурой популяций и грузом наследственной патологии и (совместно с другими генетическими и квазигенетическими маркерами) может использоваться для прогноза груза наследственной патологии в популяциях, по которым нет прямых генетико-эпидемиологических данных.

Знание факторов популяционной динамики (мутаций, отбора, миграций и дрейфа генов) и анализ механизмов их взаимодействия важны для понимания пространственного распределения груза наследственных заболеваний и прогнозирования регионов с повышенным риском их возникновения.

Многочисленные работы научной школы академика Е.К. Гинтера убедительно показали связь между уровнем инбридинга и грузом наследственной патологии. Самый чувствительный инструмент - геногеография - обнаружил удивительное сходство в распределении «нормальных» генов и наследственных заболеваний. Карты генетических расстояний (удаленность генофондов районов от средних показателей генофонда народа) оказались почти тождественны по обеим системам признаков: коэффициент корреляции составил r =0,7. Различия касались лишь абсолютной величины расстояний: по грузу наследственной патологии они, как и следовало ожидать из низких частот заболеваний, были на три порядка ниже, чем расстояния для генофонда в целом. Однако при этом пространственные распределения «нормального» генофонда и наследственных заболеваний оказались практически идентичными.

Это означает, что исследование генофонда позволяет дать прогноз распределения общего груза наследственной патологии. Изучение роли отдельных факторов - миграций, дрейфа генов и отбора - позволяет строить модели распределения отдельных наследственных заболеваний. В этом и состоит роль популяционной генетики в рамках медицинской генетики: помогать пониманию механизмов распределения и накопления генов наследственной патологии, прогнозировать регионы повышенного риска.

Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. Т. 3. - М.: Мир, 1988. - 336 с.

Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. - М: Академкнига, 2003. - 432 с.

Балановская Е.В., Балановский О.П. Русский генофонд на русской равнине. - М.: Луч, 2007. - 416 с.

Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / Под ред. Ю.П. Алтухова. - М.: Наука, 2004. - 619 с.

Кучер А.Н., Ондар Э.А., Спепанов В.А. и др. Тувинцы: гены, демография, здоровье. - Томск: Печатная мануфактура, 2003. - 232 с.

Ли Ч. Введение в популяционную генетику. - М.: Мир, 1978. - 355 с.

Лимборская С.А., Хуснутдинова Э.К., Балановская Е.В. Этногеномика и геногеография народов Восточной Европы. - М.: Наука, 2002. - 261 с.

Наследственные болезни в популяциях человека / Под ред. Е.К. Гинтера. - М.: Медицина, 2002. - 303 c.

Степанов В.А. Этногеномика населения Северной Евразии. - Томск: Печатная мануфактура, 2002. - 242 с.

Федорова С.А. Генетические портреты народов Республики Саха (Якутия): анализ линий митохондриальной ДНК и Y хромосомы. - Якутск: ЯНЦ СО РАН, 2008. - 235 с.

Хрисанфова Е.Н., Перевозчиков И.В. Антропология. - М., 2005. - 400 с.

Cavalli-Sforza L.L., Bodmer W.F. The Genetics of Human Population. - San Francisco, 1971. - 965 p.

Cavalli-Sforza L.L., Menozzi P., Piazza A. History and Geography of Human Genes. - Princeton: Princeton University Press, 1994. - 1059 p.

Nei M. Molecular Population Genetics and Evolution. - Amsterdam: North-Holland Publ. Co., 1975. - 290 p.

Термин «экология» в настоящее время многими воспринимается не как научная дисциплина, а приобретает смысл разрушающего воздействия человеческой деятельности на природу в целом и на самого человека. Между тем это научное направление сложилось более века назад, когда было введено в обращение понятие экологии, определяющее науку о взаимоотношениях организмов и среды. Экология человека как предмет, анализирующий системы связи H. sapiens с окружающим миром, охватывает такие проблемы, как его адаптация к условиям естественной природной и искусственной (антропогенной) среды, демографические эффекты социальноэкономического развития, условия сохранения равновесия в системе «человек-среда».

Основным подходом к познанию экогенетических закономерностей служит использование информации о наследственном полиморфизме человека, который является первоисточником индивидуального и личностного многообразия. Генетический полиморфизм представляет собой особое реактивное состояние наследственности человека, чувствительное к различным изменениям в окружающей среде. Степень такой восприимчивости связана с наличием многообразия генотипов. Однако среди них неминуемо оказываются и более или менее адаптированные к данному состоянию окружающей среды - природной или социальной.

Каждая из достаточно крупных человеческих общностей характеризуется своим специфическим генофондом. Такая генетическая структурированность человечества в целом, несмотря на высокую интенсивность миграционных процессов и эффектов смешения, может обеспечить ему выживание даже при возникновении внезапных экологических катаклизмов, например в случае пандемий или ядерных катастроф.

Таким образом, именно при экологическом подходе к человеку могут быть сформулированы проблемы большой общественной значимости, в том числе проблема генетических последствий научно-технического прогресса.

Экологическая генетика принципиально имеет дело с изучением наследственных различий между людьми в ответ на воздействие внешнесредовых факторов, включая физические, химические, атмосферные климатические, биологические и некоторые другие составляющие.

Следует заметить, что одной из наиболее злободневных проблем современной биомедицинской науки в целом является установление причин возникновения и развития болезней человека. В специальной литературе широко рассматривается роль микроорганизмов, химических и физических факторов в понимании формирования патологических процессов. Результаты таких исследований должны способствовать выработке превентивных мероприятий, направленных против возникновения мультифакториальных заболеваний, а также развитию соответствующей профилактики и терапевтических мер в их лечении.

Подчас, невзирая на идентичность средовых условий, в которых живут и трудятся люди, реально доказана их дифференциальная чувствительность к токсическим и канцерогенным агентам. Данные факты неизбежно наводят на мысль о неоднородной восприимчивости людей к воздействию внешнесредовых агентов.

В 1938 г. Дж.Б.С. Холдейн сделал небезуспешную попытку обосновать гипотезу о возможной роли генетической конституции в интенсивности развития бронхита среди рабочих гончарных мастерских. Позднее тот же исследователь в 1954 г. отмечал, что необычные реакции на лекарственные препараты и пищевые продукты могут объясняться биохимической индивидуальностью людей. Оказалось, что ряд аномальных реакций, обусловленных применением медикаментозных препаратов, обусловлен недостаточной активностью таких ферментов, как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6PD), псевдохолинэстераза 1-го локуса (СНЕ1) и N-ацетилтрансфераза (NAT). В этой связи А. Мотульски высказал предположение, что аномальная реакция на лекарственные препараты может быть связана с наследственной ферментативной недостаточностью. Наконец, суммируя предшествующие наблюдения, Ф. Фогель впервые предложил термин «фармакогенетика », который объясняет дифференциальную индивидуальную чувствительность в ответ на применение того или иного лекарственного средства.

Изменчивость времени метаболизма для подавляющего большинства медикаментозных веществ может быть представлена в виде колоколообразной гауссовской кривой (рис. 9-1). После введения средней дозы препарата у определенного числа представителей популяции (по обе стороны от моды) в организме устанавливается либо весьма высокая, либо слишком низкая концентрация препарата. Очень высокий уровень лекарства в организме может приводить к токсическому эффекту, тогда как существенно пониженная его концентрация обусловливает отсутствие терапевтического действия.

Концепция экогенетики была впервые сформулирована Бревером при анализе дальнейшего развития фармакогенетического направления. Лекарственные препараты составляют лишь небольшую долю химических факторов, воздействию которых подвергается человеческое сообщество. Существует множество других токсичных веществ, которые могут поражать людей с генетически обусловленной предрасположенностью. Экологическая генетика расширяет первоначальную концепцию фармакогенетики о различных генетически обусловленных реакциях на медикаментозные препараты, объясняя подобным образом реакции на другие внешнесредовые воздействия. Задачи экогенетики сводятся как к объяснению причин различной чувствительности отдельных индивидуумов к действию потенциально опасных агентов, так и изучению индивидуальных и групповых особенностей адаптации к окружающей среде в целом. Подобно рассмотренным явлениям фармакогенетики некоторые экогенетические реакции определяются действием редких мутантных генов и обусловливают выраженный аномальный ответ или идиосинкразию. Причиной разнообразия реакций во многих случаях является полиморфизм генов, контролирующих ферментные и другие белки. Предварительно можно предположить, что экогенетические реакции детерминируются множеством генов. Необычные биологические отклики на внешний раздражающий фактор проявляются у некоторых представителей той или иной группы населения, которые по своему генетическому статусу дифференцируются от среднепопуляционного распределения.

Рис. 9-1. Постоянная концентрация препарата в плазме и биологический эффект

Следующим - сравнительно независимым по отношению к только что описанному - направлением в экогенетических исследованиях явился геногеографический принцип анализа мирового распределения аллелей полиморфных генов в результате гипотетического воздействия факторов естественной среды. В результате такого анализа были обнаружены географические градиенты аллельных частот по целому ряду полиморфных генов. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области экологической генетики, многие вопросы в рамках этого научного направления остаются недостаточно разработанными, а то и вовсе не рассматривались.

Факторы среды, с позиции индивидуальных ответных реакций, оказывают на организм влияния двоякого рода. Во-первых, контакт с внешнесредовым фактором может вызвать генотоксические повреждения, в результате чего соматические мутации во многом приводят к развитию злокачественных новообразований. Мутации, возникающие в половых клетках, обусловливают весь спектр патологических состояний - от бесплодия до проявления врожденных пороков развития, различных наследственных заболеваний. Анализ механизмов генотоксических повреждений входит в сферу исследований по мутагенезу.

Во-вторых, реально доказано также существование дифференциальной чувствительности различных людей к средовым факторам в зависимости от индивидуальных наследственных особенностей, уже сформировавшейся нормальной генетической изменчивости - обычно регистрируемого генетического полиморфизма. Такое взаимодействие будет выражаться, в частности, в различиях метаболизма внедряющихся в организм и трансформирующихся в нем внешнесредовых агентов. Адаптивный процесс или, напротив, дезадаптация, сопровождающаяся проявлением мультифакториальных или профессиональных заболеваний, возникающих в результате таких контактов, - все это представляется звеньями единой цепи экогенетических взаимодействий. Такие механизмы в упрощенной форме иллюстрируются на схеме, указанной ниже (см. рис. 9-2). Из рассмотрения этой схемы следует, что факторы внешней среды, воздействующие на человека, можно дифференцировать на естественные и искусственные. В свою очередь, давления средовых факторов подразделяются на абиотические и биотические. Каждая из выделенных категорий, в зависимости от продолжительности действия, сопряженного со степенью длительности адаптивного процесса, определяется, во-первых, на уровне эволюционной адаптации, т.е. на уровне наиболее длительного процесса приспособления к среде обитания, от которого зависит накопление новой, а также перераспределением уже имеющейся генетической информации, что определяет образование новых адаптивных признаков. Реализация такого процесса требует большого числа поколений. Во-вторых, адаптационный процесс может происходить на уровне акклиматизации в течение одного или нескольких поколений.

Рис. 9-2. Схематическое представление экогенетических механизмов

К сожалению, методологические подходы в области экогенетики не нашли своего отражения в соответствующей литературе, за возможным исключением анализа фармакологического направления.

В отличие от разработок в области мутагенеза, где исследователь имеет дело с дефектными генами, отвечающими за наследственные заболевания, экологическая генетика базируется на сравнительном исследовании частот обычных генотипов и аллелей полиморфных генов - естественного генетического полиморфизма в разных человеческих группах. Поэтому методы, применяемые в популяционной генетике, применимы и в экологической генетике человека. Полученные результаты основываются на вероятностном сравнении выборок из соответствующих групп населения. Очевидно, что сопоставляемые выборки должны быть репрезентативными по своей численности.

Поиск пространственных закономерностей в географическом распределении генетических факторов в зависимости от климатических характеристик должен быть основан на изучении большого числа популяций в каждой из гомогенных антропологических общностей, локализованных в контрастных экологических нишах ойкумены.

В любом случае весьма желательно, а подчас и крайне необходимо, одновременно с изучением дискретного генетического полиморфизма осуществлять исследование физиологической непрерывно варьирующей изменчивости. Например, исследование интенсивности транспортной функции того или иного белка, его концентрации, ферментативной активности в зависимости от соответствующей генотипической принадлежности. Почти всегда количественная физиологическая изменчивость оказывается связанной с соответствующим дискретным генетическим полиморфизмом. Экогенетические разработки при решении тех или иных задач требуют специфического подбора комплекса генетических маркеров. Строго говоря, применение как можно большего рандомизированного числа полиморфных генетических локусов, отвечающих за экспрессию белков различной функциональной нагрузки, представляется оптимальным решением. Данный подход можно считать желательным в случае сравнительного экогенетического анализа внутрипопуляционной изменчивости в обычных, например сельских, популяциях.

Специально поставленные экогенетические задачи требуют для своего решения и конкретного подбора комплекса генетических маркеров. Например, при изучении вклада наследственных факторов, обусловливающих стрессовые явления, следует заведомо осуществлять подбор генетических полиморфизмов, связанных с развитием сердечно-сосудистой патологии (АРОВ, АРОЕ, АСЕ), рецепторных генов и генов-переносчиков нейромедиаторов, наследственных факторов, обусловливающих иммунную защиту организма (HLA, TNF, IL и др.).

Корректное решение экогенетических вопросов, связанных с антропогенным воздействием на человека, его профессиональной деятельностью, профессиональными болезнями, связано с применением специфических методологических подходов. В данном случае необходим исключительно строгий подход к сбору медико-статистической информации, дабы не допустить получения и накопления псевдоположительных результатов. При экогенетическом изучении того или иного профессионального контингента сравниваемые группы должны быть однородными по этническому составу. Из всей массы обследованных обосабливается весьма важная группа высокостажированных производственников, не страдающих специфическим профессиональным заболеванием. Необходимым является анализ представительной по численности когорты больных с соответствующей профессиональной патологией. В качестве адекватной контрольной группы должна быть обследована рандомизированная выборка из соответствующей популяции.

Изучение многопрофильных предприятий совершенно не разработано с экогенетических позиций. Когда контингент работающих на предприятии испытывает давление антропогенной среды, включающей целый комплекс вредоносных химических, физических и других факторов, правильно оценить ответную реакцию со стороны генотипа оказывается чрезвычайно трудоемкой задачей. Такие разработки следует отнести к будущим перспективным задачам в области профессиональной генетики. Тем не менее при экогенетических исследованиях на предприятиях с относительно гомогенной профессиональной вредностью уже сейчас получена важная научно-практическая информация. Наконец, однотипность и достоверность полученных результатов должны быть подтверждены на основании экогенетических исследований на других, аналогичных по профилю предприятиях.

Экологическая генетика обнаруживает свою аналогию с популяционной генетикой в рамках рассмотрения задач, связанных с изучением динамики популяционной структуры в пространстве и времени. Такие проблемы, как теория эволюции человечества в связи с различными изменениями окружающей среды, планирование мероприятий по предупреждению неблагоприятного воздействия внешнесредовых факторов на генетический аппарат, издавна оцениваются с помощью методов, разработанных в области популяционной генетики.

Именно триединая природа человека как биологического, социального и духовного единства обусловливает преимущество популяций человека как «объектов» популяционно- и эколого-генетических исследований. Методологические разработки как в области популяционной генетики в целом, так и в области экологической генетики подразделяются на два этапа. Первый этап базируется на генетическом описании популяций или других различных групп человека. Вторая стадия касается анализа причин изменения генофонда популяций или рассмотрения обнаруженных наследственных особенностей любой другой человеческой группы.

Источником первичных данных, необходимых для описания любой группы населения и поиска межгрупповых различий, служит определение частот аллелей и гаплотипов полиморфных генов. Полиморфизм может быть генетическим субстратом, воздействие отбора на который формирует восприимчивость или устойчивость к заболеваниям.

Существуют два преимущественных подхода в оценке роли генетических факторов в процессе адаптации популяций человека к различным условиям естественной среды обитания:

Формально-генетический подход в оценке роли генетических факторов в адаптации человеческих популяций к различным условиям среды основан на определении гетерогенности межпопуляционного разнообразия F_ST-статистик. Использование такого подхода дает возможность установить действие балансирующего отбора и подразделить его на два подтипа:

Применение этого метода в качестве лишь единственного для определения давления систематических факторов в процессе эволюции человека не позволяет ответить на основополагающие вопросы, а именно: какие конкретные факторы внешней среды могли привести к современному состоянию географической изменчивости аллельных частот, которое мы наблюдаем при рассмотрении мирового их распространения. Ассоциация распределения аллельных концентраций, особенно с географической широтой, подчас оказывается столь очевидной, что напрашивается естественная необходимость осуществления корреляционного анализа частот аллелей множества генов с различными климатическими характеристиками.

Подчеркнем существование функциональных различий между аллелями в пределах одного и того же локуса. Эти различия обусловливают аллельную дифференциацию в экспрессии уровня белка, эффективности транспортной функции, активности, термостабильности фермента, иммунного ответа и т.д.

Прародиной человека, как известно, были тропические и субтропические области Старого Света. В течение последующих десятков тысяч лет исторического развития человек современного вида адаптировался к разнообразным климатическим зонам, сумел освоить все экологические ниши и приспособиться к существованию в различных, подчас весьма экстремальных, условиях среды.

Но, несмотря на огромный социально-экономический прогресс, организм человека по-прежнему остается чувствительным ко многим явлениям природы, которые в совокупности определяют климат того или иного региона нашей планеты. Некоторые геофизические факторы, такие как температура воздуха, инсоляция, суточные и сезонные перепады температур, естественный фон радиации, влажность, атмосферное давление и ряд других климатических особенностей, оказывают не только прямое воздействие на человеческий организм. Отдельно действующие или в комбинации, они могут усугубить течение имеющихся у человека заболеваний, а также способствовать условиям размножения возбудителей инфекционных болезней. Так, в холодное время года в связи с резкими колебаниями погодных условий обостряется течение сердечно-сосудистых заболеваний.

Напротив, кишечные инфекции, такие как дизентерия, брюшной тиф, преимущественно поражают людей в жаркое время года.

Адаптация к среде обитания проявляется на всех уровнях иерархически структурированной биологической организации. С позиций скорости адаптивного процесса различают три типа адаптации к внешнесредовым условиям.

Эволюционная адаптация - наиболее длительный процесс приспособления к среде, в результате чего происходит приобретение новой генетической информации, определяющей качественно новые фенотипические признаки. Реализация такого процесса требует многих поколений.

Акклиматизация - тип адаптации, для осуществления которой в онтогенезе необходимо время от нескольких часов до нескольких месяцев. Этот процесс касается многих сезонных изменений.

Адаптивный процесс, происходящий мгновенно, рассматривается как немедленная адаптация.

В основе эволюционной адаптации лежат механизмы изменения последовательности оснований в ДНК. При более быстрой адаптации, происходящей в течение жизни отдельного организма, он располагает меньшими приспособительными возможностями. В его геном уже не может быть введена информация для синтеза новых видов макромолекул или для перестроек в системе управления транскрипцией. Однако избирательная активация генов позволяет синтезировать новые макромолекулы из числа тех, которые уже закодированы в геноме.

При непрерывности видового ареала частоты генов обычно изменяются клинально, в основном параллельно географическим градиентам. Обсуждение факторов, обусловливающих клинальную изменчивость аллельных частот, принципиально важно, поскольку существуют разные гипотезы, объясняющие их направленную географическую изменчивость. Сторонники гипотезы селективной нейтральности аллелей считают, что при длительной изоляции и тенденции аллелей к фиксации в разных популяциях последние связаны между собой зонами промежуточных частот. Такой тип распределения генных частот напоминает клинальную изменчивость, обусловленную отбором, однако его вполне можно объяснить положениями гипотезы селективно нейтральных аллелей. Когда популяции вследствие случайных причин генетически дифференцированы и различаются по частотам определенных аллелей, может возникнуть направленная изменчивость частот в результате волны миграции или трансгрессии популяций. Одним из наиболее ярких примеров зависимости пространственной изменчивости генетических факторов от климатогеографических условий в системе человеческих популяций является широтный градиент аллелей фермента кислой фосфатазы (АСР1) (рис. 9-3).

Рис. 9-3. Мировое распределение частот аллеля ACP1*A системы эритроцитарной кислой фосфатазы: 1 - европеоиды; 2 - монголоиды; 3 - американские индейцы; 4 - эмпирическая линия регрессии; 5 - теоретическая линия регрессии

Из всех климатогеографических факторов первостепенную роль играют те из них, которые оказывают прямое воздействие на интенсивность теплового обмена. Поэтому для изучения взаимосвязи распределения фенотипических и аллельных частот различных генов с климатическими показателями используются:

Результаты расчета коэффициента корреляции частоты аллеломорфа ACP1*А кислой фосфатазы с широтой местообитания популяций свидетельствуют о том, что между сопоставляемыми параметрами имеется выраженная положительная связь (r =0,786). Подчеркнем сходство уравнений регрессии для европеоидов, монголоидов, американских индейцев, локализованных в широком географическим пространстве (см. рис. 9-3). Наличие ярко выраженной связи распределения аллеля ACP1*А с широтой местообитания человеческих групп указывает на возможное влияние одного или нескольких климатических факторов на изменчивость частоты аллеля ACP*А (в равной мере частоты альтернативного аллеломорфа ACP1*В) кислой фосфатазы.

Частота аллеля ACP1*А оказывается связанной с амплитудой температурных колебаний и, в большей мере, с интенсивностью солнечной радиации. Пропорция этого фактора возрастает с уменьшением суммарной солнечной радиации. Обнаруживается тенденция к увеличению частоты ACP1*А и частоты гетерозигот АВ с возрастанием амплитуды температурных колебаний. В равной мере концентрация альтернативного аллеля ACP1*В, определяющего продукцию изоферментов большей активности и термостабильности, представлена с наибольшей частотой в популяциях, живущих в условиях жаркого климата, где температурные колебания минимальны, интенсивность солнечной радиации выше.

Учитывая, что во многих группах населения экваториальной и тропических зон земного шара аллель ACP1*В близок к фиксации либо представлен в 100% концентрации, можно говорить о преимуществе гомозигот АСР1*ВВ в условиях тропического пояса.

Важная функция кислой фосфатазы, заключающаяся в регуляции внутриклеточной концентрации флавиновых коферментов и таких флавоферментов, как глутатион редуктаза, косвенным образом может свидетельствовать в пользу зависимости распределения типов АСР1 от факторов среды, оказывающих воздействие на интенсивность теплового обмена.

Функциональная роль фосфоглюкомутазы в гликолизном цикле велика. Фермент катализирует перенос фосфатной группы из положения 1 в положение 6 молекулы глюкозы.

При рассмотрении закономерностей сезонных изменений температур по земному шару и характера мирового распределения концентраций аллелей фосфоглюмутазы-1 обращает на себя внимание выраженный параллелизм между изменчивостью частот гена PGM1*2 и средней температурой января над уровнем земной поверхности. Такая взаимосвязь прослеживается как в широтном направлении по тихоокеанскому побережью Азиатского материка от тропических областей Индонезии и Индокитая до Чукотки, так и по долготе всей циркумполярной зоны. Закономерность в географической изменчивости аллельных концентраций PGM1 заключается в том, что частота аллеля PGM1*2 постепенно снижается от популяций тропических широт до побережья Северного Ледовитого океана. Причиной является то, что в группах, издревле живущих в районах с наиболее низким температурным режимом (-35?-40 ?С), аллеломорф PGM1*2 почти элиминирован, а альтернативный аллель PGM1*1 близок к фиксации (рис. 9-4).

Рис. 9-4. Распределение частот аллеля PGM1*2 фосфоглюкомутазы-1 среди популяций тихоокеанского побережья Азии в зависимости от средней температуры воздуха в январе над уровнем земной поверхности

В циркумполярной зоне взаимосвязь среднеянварской температуры c распределением факторов PGM1 проявляется в еще более выраженной форме (рис. 9-5). Лишь в группах, живущих в западных районах Cеверного полярного круга, находящихся под влиянием североатлантического течения, в условиях сравнительно мягкого климата и повышенных среднезимних температур, наблюдаются частоты PGM1*2, приближающиеся к уровню мирового максимума. Напротив, в популяциях наиболее экстремальных районов Приполярья, Северо-Восточной Азии аллель PGM1*2 близок к исчезновению.

Рис. 9-5. Распределение частот аллеля PGM1*2 среди циркумполярных популяций

Связь между распределением частот аллеля PGM1*2 и среднеянварской температурой вдоль тихоокеанского побережья по широте велика, о чем свидетельствует величина коэффициента корреляции r =0,6634.

В циркумполярной области коэффициент корреляции между частотой аллеля PGM1*2 и среднеянварской температурой характеризуется величиной r =-0,6973.

Зависимость частоты PGM1*2 от изменений среднеянварской температуры можно аппроксимировать параболической функцией.

При сопоставлении частот встречаемости вариантов РР1 и РР2 щелочной фосфатазы среди различных популяций наблюдается тенденция к увеличению пропорции типа РР1 в группах населения тропических и экваториальных зон, независимо от их этноантропологической принадлежности (рис. 9-6). Учитывая, что проявление типа РР2 коррелирует с повышенным потреблением жиров в пищевом рационе, можно предположить, что выявленный градиент в распределении вариантов РР обусловлен различиями в статусе питания. Фактор диеты может служить индуктором либо самого синтеза кишечного изофермента, либо «включает в работу» регуляторный механизм в ответ на изменение средовых воздействий, что влияет на увеличение его активности.

Рис. 9-6. Мировое распределение частоты фенотипа PР1 щелочной сывороточной фосфатазы в зависимости от широты местности

Анализ мирового распределения аллеля TF*D1, контролирующего синтез медленно мигрирующего типа TF*D1, показал, что частота этого фактора оказывается выше в антропологических общностях тропических зон. Статистический анализ распределения этого аллеля в зависимости от географической широты местности выявил своеобразный градиент изменчивости TF*D1 в пространстве. Распределение его отличается от линейной клинальной изменчивости. Скорее всего, здесь имеет место экспоненциальная квадратичная зависимость частоты гена от широты местности с экстремумом в области 6? ю.ш. (рис. 9-7).

Рис. 9-7. Мировое распределение частоты аллеля TF*D1 в зависимости от широты местности

Варианты трансферрина обладают неодинаковой способностью к связыванию и переносу железа в организме, что может свидетельствовать о различиях в адаптивных ценностях генотипов этого белка в определенных районах земного шара.

Анализ показал зависимость изменения частоты гена TF*D1 от динамики суммарной солнечной радиации и годовой суммы атмосферных осадков. В графической форме такая связь иллюстрируется частью поверхности эллипти ческого параболоида (рис. 9-8). Фрагмент параболоида, очерченный линией ββ, определяет область возможных колебаний частот гена TF*D1 при изменении реально существующих величин влажности и солнечной радиации.

Рис. 9-8. Эллиптический параболоид, иллюстрирующий зависимость между распределением частот аллеля TF*D1 гена трансферрина, годовой суммой атмосферных осадков и интенсивностью суммарной солнечной радиации

Ярко выраженный географический градиент обнаруживается не только для фактора TF*D1, но и для других аллелей системы трансферрина.

Показана связь между распределением частот аллелей группоспецифического компонента, с одной стороны, а также статусом питания, степенью ультрафиолетового излучения, широтой местности, высотой над уровнем моря - с другой. Известные молекулярные формы GС в разной степени связывают и транспортируют витамин D. У людей, принадлежащих к GС1-1, уровень общего группоспецифического компонента в сыворотке оказался выше, чем у людей с фенотипом GС2-2. В сыворотке крови людей с фенотипом GC*2-2 концентрация этого белка ниже, чем у людей с другими фенотипами.

Максимальная частота аллеля GС*1 наблюдается в популяциях, живущих в тропической зоне земного шара, причем этот аллель близок к фиксации в наиболее темнопигментированных группах населения (рис. 9-9).

Рис. 9-9. Ориентация различных популяций мира в пространстве аллельных частот гена группо-специфического компонента GC: I - европеоиды; II - монголоиды; III - негроиды; IV - американские индейцы (суммарно); V - южноамериканские индейцы; VI - группы Индии; VII - меланезийцы; VIII - папуасы; 1 - баски; 2 - финны; 3 - туареги; 4 - саамы; 5 - бушмены; 6 - эскимосы; 7 - аборигены Австралии; 8 - русские; 9 - буряты

Географическое распределение факторов группоспецифического компонента зависит от воздействия всей совокупности климатических условий. Пространственное распределение частот аллеля GС*2 зависит от суммарного воздействия среднегодовой температуры, амплитуды температурных колебаний, сочетания этих климатических параметров между собой, а также от интенсивности солнечной радиации.

Закономерности мирового распределения генетических разновидностей кислого α-2-HS-гликопротеина зависят от климатических факторов. Установлена ярко выраженная климатогеографическая зависимость в распределении частот аллелей α-2-HS гликопротеина в мировом народонаселении.

В табл. 9-1 демонстрируются парные коэффициенты корреляции между частотой аллеля AHSG*2 и каждым из климатогеографических факторов.

Таблица 9-1. Коэффициенты корреляции (по Спирману) между частотами аллеля AHSG*2 и климатогеографическими параметрами

Частота аллеля AHSG*2 значительно скоррелирована с широтой местности для популяций, локализованных в различных географических точках. Частота AHSG*2 в равной степени отрицательно коррелирует с такими климатическими факторами, как интенсивность суммарной солнечной радиации и среднегодовая температура (r =-0,683 и r =-0,658 соответственно).

Наиболее весомый вклад в географическую изменчивость аллелей α-2HSгликопротеина вносит воздействие интенсивности ультрафиолетовой радиации в пределах определенных величин при коэффициенте корреляции -0,826.

АРОЕ принадлежит к белкам плазмы, которые играют важную роль в транспорте и метаболизме холестерина и триглицеридов. Популяционно-генетическое изучение нескольких десятков выборок из разных групп населения показало отчетливый градиент падения частоты аллеля АРОЕ*4 с севера на юг на территории Европы. Установлена также обратная направленная изменчивость пропорции аллеля АРОЕ*3 по отношению к APOE*4 (рис. 9-10). Симметрия между градиентами изменчивости АРОЕ*4 и АРОЕ*3 определяется высоким отрицательным коэффициентом корреляции (r =-0,89). Весьма высокая зависимость прослеживается между частотами аллелей АРОЕ*4 и АРОЕ*3 от широты местообитания популяций при r =0,904 и r =0,809 соответственно. Обнаруженная клинальная изменчивость рассматриваемых аллельных частот может быть обусловлена действием таких эволюционных факторов, как генный поток или естественный отбор. Что касается выявленного градиента АРОЕ*4 в Европе, то он с эволюционных позиций может объясняться различиями в статусе питания разных европейских популяций, в частности в потреблении продуктов, содержащих разный уровень холестерина. Аллель АРОЕ*4 ассоциируется с увеличением уровня общего холестерина и липопротеина низкой плотности в организме по сравнению с аллелем АРОЕ*3. Недавние исследования, проведенные в Северной Азии, проливают свет на возможную селективную значимость полиморфизма АРОЕ. Так, несмотря на высокую частоту фактора АРОЕ*4 среди ряда сибирских народностей, например у эвенков, связи между уровнем холестерина и данным аллелем в этой популяции выявить не удалось. Поскольку эвенки отличаются гораздо более низким уровнем холестерина в организме по сравнению с урбанизированными европеоидными популяциями, наблюдаемый эффект, по-видимому, отражает адаптивный механизм в рамках специфического статуса питания аборигенов Северной Азии.

Рис. 9-10. Градиенты частот аллелей APOE*4 и APOE*3 гена аполипопротеина E в Западной Европе

Столь же выраженную закономерную изменчивость можно наблюдать также между распределением аллеля q системы ацетилирования изониазида от широты местности в некоторых регионах ойкумены.

Несмотря на существенный объем информации по антропологической генетике среди жителей высокогорных регионов мира, до сих пор остается невыясненным, существуют ли в популяциях горцев характерные особенности в распределении частот аллелей разных генов. Трудоемкость поставленной задачи заключается в том, что области высокогорья стали заселяться человеком в относительно недавнем прошлом по сравнению с другими территориями ойкумены. В этой связи можно полагать, что с эволюционной точки зрения минуло немного поколений для достижения генетических особенностей обитателей высокогорий.

Но материалы акушерского анамнеза и биодемографические данные, полученные в результате нашей работы на Памире, позволили установить градиент изменчивости максимально возможного потенциального отбора по Д. Кроу. Результаты анализа представлены на рис. 9-11. Становится очевидным, что величина индекса Кроу закономерно увеличивается с возрастанием высоты местности локализации этнотерриториальных групп этого горного района, что свидетельствует о воздействии экстремальности среды на генетическую структуру популяций.

Рис. 9-11. Возрастание величины максимально возможного потенциального отбора I (индекс Д. Кроу) среди коренного населения Памира в зависимости от широты местности

В будущем физиологическая информация может дать ответ на вопросы о природе установленных корреляций. К настоящему времени накапливается все больше информации о полифункциональности одного и того же белка. В связи с рассматриваемой проблемой важным представляется установленная связь локусов гаптоглобина, трансферрина, группоспецифического компонента, ингибитора протеиназ, α-2HS-гликопротеина, других генетических систем с иммунным статусом. Данные факты, безусловно, подчеркивают дифференциальную адаптивную значимость генетически полиморфных систем, что отражается в клинальном характере географической изменчивости в человеческих популяциях. Установление конкретных механизмов связи генетических полиморфизмов с климатогеографическими факторами - задача последующих исследований.

Таким образом, клинальная географическая изменчивость частот аллелей множества генов в широтном направлении может отражать преимущественное влияние климатогеографических факторов как селективных моментов на те или иные признаки, определяемые конкретными генетическими факторами. Напротив, закономерная географическая изменчивость аллелей ряда генов в меридиональном направлении в большей мере будет свидетельствовать о миграционных процессах при перемещениях человеческих группировок в историческом прошлом.

Представленные выше материалы свидетельствуют о том, что множество независимых генов, локализованных на разных хромосомах, обнаруживают однотипную географическую направленность в распределении аллельных концентраций. Это лишний раз подчеркивает, что генотип организма в целом нельзя рассматривать как простую сумму генов, каждый из которых выполняет свою, не связанную с действием других генов, функцию. Генотип является не суммой, а системой взаимосвязанных генов. В обозримом будущем теоретические исследования в области эволюционной адаптации, учитывающей давление естественных абиотических и биотических факторов внешней среды на человека и его сообщества, могут оказаться полезными для решения практических вопросов превентивной медицины, эпидемиологии, планирования размещения трудовых ресурсов для работы в специальных условиях, профессионального отбора и профориентации.

Наблюдаемая дифференциальная чувствительность разных людей к средовым факторам в зависимости от индивидуальных наследственных особенностей сводится к адаптивному процессу или, напротив, к дезадаптации, которая сопровождается проявлением профессиональных или мультифакториальных болезней, возникающих в результате таких контактов. Систематические наблюдения исследователей наводят на мысль, что возможность того или иного человека заниматься определенными формами трудовой деятельности определяется, в частности, наследственными особенностями.

Множество внешнесредовых агентов, с которыми соприкасаются люди, можно считать новыми, если принять во внимание весь огромный предшествующий период исторического развития H. sapiens. К относительно «новым» средовым факторам следует отнести ксенобиотики - инородные для нормального метаболизма вещества с потенциальным биологическим эффектом (десятки тысяч химических соединений, включая лекарственные препараты). Нельзя при этом не учитывать воздействия разнообразных физических нагрузок, таких как температурный режим, электромагнитные поля и др.

Обширная информация о вкладе пропорций генного разнообразия на разных уровнях иерархической структуры групп мирового народонаселения свидетельствует, что основная его доля приходится на внутрипопуляционный уровень. Этим фактом объясняются столь существенные различия в реакции отдельных людей на давление одной и той же среды. Следовательно, внутригрупповой уровень изменчивости представляется оптимальным для определения генетической дифференциации населения в зависимости от влияния средовых факторов.

Аллели ряда локусов, обнаруживающие нормальный полиморфизм в естественной среде обитания человеческих популяций, могут стать «патологическими» в иных, резко меняющихся окружающих условиях, а также при контакте людей с продуктами производственной деятельности. Возможность человека эффективно заниматься определенными формами труда определяется наследственными особенностями.

В процессе экогенетических разработок коллективом сотрудников лаборатории экогенетики МГНЦ РАМН проведено сравнительное исследование генетических особенностей групп больных с такими формами профессиональной патологии, как асбестоз и флюороз, по отношению к генетической структуре работающих, но устойчивых к воздействию асбеста и соединений фтора, а также с привлечением контрольных выборок из популяций. Полученные данные показали следующее.

Пропорция редких аллелей по многим изученным локусам среди больных с профессиональной патологией, как правило, превышает таковую среди клинически здоровых производственников с высоким стажем работы на соответствующем предприятии (рис. 9-12).

Рис. 9-12. Соотношение частот редких аллелей систем ингибитора протеиназ (PI) и трансферрина (TF) в группах больных с асбестозом и производственников с высоким стажем работы (свыше 10 лет) на предприятии «Ураласбест»

Каждая из групп характеризуется своим сочетанием генотипических и аллельных концентраций (рис. 9-13 и 9-14).

Рис. 9-13. Локализация изученных групп (○) из города Егорьевск Московской области в пространстве двух первых главных компонент: I - контроль; II - малостажированные рабочие; III - высокостажированные рабочие; IV - больные с асбестозом; • - локализация аллелей

Рис. 9-14. Локализация изученных групп (○) из города Асбест Уральского региона в пространстве двух первых главных компонент: I - контроль; II - малостажированные рабочие; III - высокостажированные рабочие; IV - больные с асбестозом; (•) - локализация аллелей

Обнаруживается однотипный комплекс генетических особенностей для групп больных с той же патологией на однопрофильных предприятиях разных регионов, и при этом отмечается аналогия в генетической структуре разных групп рабочих с высоким стажем производства (рис. 9-15 и 9-16). При этом в обоих случаях заметно падение величин индекса фиксации F, определяющее увеличение гетерозиготности по совокупности локусов, в группах здоровых рабочих со стажем на предприятиях «Ураласбеста» и подмосковного Егорьевска и столь же однотипное возрастание индекса F для обеих групп больных с асбестозом (рис. 9-17).

Рис. 9-15. Изменение частоты аллеля HP*1 системы гаптоглобина в изученных группах городов Егорьевск и Асбест: P - больные с асбестозом; С - контроль; Ws - малостажированные рабочие; Wg - высокостажированные рабочие

Рис. 9-16. Изменение частоты аллеля PGM1*1 системы фосфоглюкомутазы-1 в изученных группах городов Егорьевск и Асбест: P - больные с асбестозом; C - контроль; Ws - малостажированные рабочие; Wg - высокостажированные рабочие

Рис. 9-17. Сравнительные величины индекса фиксации Райта (F) в изученных группах городов Егорьевск (Е) и Асбест (А): Б - больные с асбестозом; К - контроль; Е - малостажированные рабочие; В - высокостажированные рабочие

На основании всего ряда независимых исследований впервые установлено явление поляризации генотипических и аллельных частот. Эффект поляризации заключается в противоположном расхождении концентрации одного и того же аллеля для групп больных с профессиональной патологией, с одной стороны, и для соответствующих резистентных по отношению к данным заболеваниям групп людей - с другой. Рис. 9-15 и 9-16 демонстрируют явление поляризации по частотам отдельных аллелей, а также по всему комплексу генов в отношении дифференциальной восприимчивости к асбесту в городах Асбест и Егорьевск, а также по четырем аллелям трех независимых локусов в отношении чувствительности к соединениям фтора на предприятии по производству алюминия (г. Новокузнецк) (рис. 9-18).

Рис. 9-18. Разнонаправленное изменение аллельных частот (поляризация) в ряду: больные с фрюорозом II стадии → больные c флюорозной симптоматикой → популяционный контроль → незаболевшие работники

Явление поляризации частот аллелей оказалось также широко распространенным в случае предрасположенности к мультифакториальным болезням. Такой эффект поляризации аллельных частот по нескольким независимым локусам нами отмечался для групп больных с скуамоидным раком легкого и хронической пневмонией и в зависимости от эффективности течения послеоперационного периода: гладкого или осложненного. Процесс биотрансформации, включающий ферментативное превращение чужеродных включений или ксенобиотиков, обычно подразделяется на три фазы (табл. 9-2). Фаза I обусловливает присоединение к ксенобиотикам новых или модифицирующих функциональных групп (т.е. OH, SH, NH₃). Таким образом, чужеродные для организма вещества активируются посредством цитохромов Р-450 (семейства ферментов цитохромов). При этом в первой фазе трансформации также могут принимать участие и некоторые другие ферменты классов оксидаз, редуктаз и дегидрогеназ. Промежуточные метаболиты соединяются с эндогенными лигандами в процессе II фазы биотрансформации, усиливая гидрофильную природу соединения и тем самым способствуя его выведению из организма. Образующиеся короткоживущие электрофильные метаболиты обладают токсическими свойствами. К ферментам, вовлеченным во II фазу биотрансформации, относятся N-ацетилтрансферазы (NAT), глутатионS-трансферазы (GST), глюкуронозилтрансферазы (UDF), эпоксидгидролазы и метилтрансферазы. Реакции I и II фазы катализируются ферментами, известными как ферменты, метаболизирующие ксенобиотики (ФМК). Большая часть этих ферментов сосредоточена в печени, хотя активность ФМК также проявляется и в других органах и тканях. Равновесие между ферментами фаз I и II представляется необходимым для осуществления детоксикации и элиминации ксенобиотиков. Тем самым осуществляется защита организма от повреждений, вызываемых внешнесредовыми воздействиями. Позднее было показано существование специфических переносчиков экзогенных соединений - Р-гликопротеинов, обеспечивающих перемещение ксенобиотиков в организме. Эти переносчики содействуют экскреции ксенобиотиков в желчь или кровь, что представляет собой III фазу биотрансформации - фазу эвакуации.

Таблица 9-2. Основные этапы биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков (модифицировано из кн. Баранова и соавт., 2000 г.)

Тот или иной полиморфизм не всегда связан с проявлением функционального эффекта, т.е. он может быть «сайлентным» («молчащим»). Функциональные полиморфизмы включают:

Полиморфизмы в регуляторных районах генов могут приводить к изменчивости степени экспрессии так же, как и мутации в других некодирующих районах, что будет оказывать влияние на стабильность мРНК или сплайсинг мРНК. Предполагается, что большинство генетических полиморфизмов отвечают за продукцию ферментов и других белков в пределах нормальных колебаний количественной изменчивости. Реально установленные различия людей при воздействии разных средовых факторов в зависимости от конкретных полиморфных генов представлены в табл. 9-3 и табл. 9-4.

Таблица 9-3. Гены, ответственные за предрасположенность/резистентность к воздействию некоторых производственных факторов (модифицировано по Kelada et al., 2003 г.)

Окончание табл. 9-3

Таблица 9-4. Гены, продукты генов, аллели и эффекты полиморфизма (модифицированная версия таблицы из работы Kelada et al., 2003 г.)

Окончание табл. 9-4

К настоящему времени весьма полная информация посвящена экологогенетическому изучению полиморфизма в гене δ-аминолевулинатдегидратазы (ALAD).

Свыше 40 лет назад было показано, что свинец является ингибитором δ-аминолевулинатдегидратазы. В наибольшей мере исследовалось дифференцированное вредоносное воздействие свинца и его соединений на организм в зависимости от наследственно обусловленной межиндивидуальной изменчивости фермента дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты (δ-ALAD). ALAD, К.Ф. 4.2.1.24 является вторым ферментом в процессе биосинтеза гема. Попадая в организм, металл депонируется во многих органах в виде нерастворимого трехосновного фосфата свинца. Большая его часть откладывается в трабекулах костей, что способствует вытеснению солей кальция из костной ткани. Из депо свинец элиминируется медленно, подчас в течение нескольких лет после прекращения контакта с ним. В организме происходит также накопление δ-аминолевулиновой кислоты. У людей с недостаточностью фермента развивается подострая двигательная невропатия с проявлением абдоминальных и психических симптомов. Дифференциальная роль генетического полиморфизма в гене ALAD в подверженности свинцовой интоксикации была установлена на уровне дискретной изменчивости самого фермента. Полипептид ALAD2 более прочно и эффективно связывает свинец. Поэтому субъекты с аллелем ALAD*2 оказываются более чувствительными к отравлению свинцом и его соединениями.

Сейчас аллели ALAD*1 и ALAD*2 идентифицируются на уровне молекулярного анализа амплификацией фрагмента ДНК 916 п.о. и рестрикцией с помощью эндонуклеазы MspI, что приводит к образованию продуктов 582 и 511 п.о. соответственно. Аллели ALAD*2 характеризуются трансверсией G → C. Этой же группой исследователей была обнаружена однонуклеотидная замена тимина на цитозин в 168-м положении в том же 4-м экзоне, которая идентифицируется по наличию сайта для рестриктазы RsaI. Все эти результаты открывают обширную молекулярную основу для дальнейших популяционных исследований при определении людей, чувствительных к воздействию свинца и его соединений.

В табл. 9-5 представлены результаты исследований полиморфизма ALAD в лаборатории экологической генетики МГНЦ РАМН.

Таблица 9-5. Распределение частот генотипов и аллелей в локусе ALAD (MspI полиморфизм) в выборке преимущественно русских

Полиморфизм MspI характеризуется тремя сайтами рестрикции. В большинстве случаев в популяциях регистрируется основной, так называемый «дикий» генотип ALAD1-1. Образование дополнительного сайта рестрикции приводит к проявлению генотипа ALAD2-2.

Следует подчеркнуть, что именно MspI ALAD полиморфизм ассоциируется с эффектом свинцовой интоксикации. Данные, полученные в нашей лаборатории, служат тому подтверждением. При исследовании 207 образцов контрольной выборки здоровых индивидуумов были получены следующие частоты аллелей: ALAD*1 =0,9565 и ALAD*2 =0,0435. Сравнительная информация о распределении пропорций аллелей среди 50 больных со свинцовой интоксикацией показала следующие результаты: ALAD*1 =0,9000 и ALAD*2 =0,1000. Сопоставление двух выборок на гетерогенность в отношении аллельных частот демонстрирует статистически значимые различия при величине χ² =4,99 при 1 ст.св., что свидетельствует о достоверном возрастании частоты аллеля ALAD2 среди больных со свинцовой интоксикацией.

Другой полиморфизм - RsaI ALAD идентифицируется по проявлению сайта для эндонуклеазы RsaI и имеет два генотипа RsaI -/- и RsaI +/+ (табл. 9-6). Генотип RsaI -/- характеризуется отсутствием сайта рестрикции и после электрофоретического анализа определяется фрагментом в 916 п.н. (т.е. амплифицированным фрагментом), RsaI +/+.

Таблица 9-6. Распределение частот генотипов и аллелей ALAD (RsaI полиморфизм) в выборке преимущественно русских

Результаты проведенного нами сравнительного исследования больных со свинцовой интоксикацией и контрольной группы здоровых подтверждают, что пациенты с генотипом Msp1+/+ (ALAD2-2), определяемые аллелем MspI+ (ALAD*2), оказываются более восприимчивыми к неблагоприятному воздействию свинца.

Последующие достижения в области экологической генетики будут зависеть от поиска новых полиморфных генов, непосредственно связанных с трансформацией ксенобиотиков. При этом представляется необходимым учитывать функциональные различия между аллелями, особое внимание уделяя аллеломорфам, определяющим дефицит ферментативной активности. Углубленное исследование межлокусных и межаллельных взаимодействий представляет в дальнейшем исключительное значение для понимания изменений, происходящих в метаболических путях. При поиске генетических маркеров того или иного профессионального заболевания особенно перспективно исследовать полиморфные гены, связанные с полифункциональной нагрузкой, а также полиморфизмы, отвечающие за иммунный статус. Учитывая популяционный подход, традиционно важным моментом является сопоставление дискретной изменчивости генотипических и аллельных частот с количественной оценкой средовых факторов.

Системы ферментов, эволюционно сформировавшиеся десятки тысяч лет назад и первоначально выполнявшие жизненно важные функции в метаболизме пищевых продуктов, детоксикации естественных эндогенных и экзогенных соединений, в дальнейшем стали испытывать мощный антропогенный прессинг, связанный с биотрансформацией современных ксенобиотиков и лекарств.

Биологически важным представляется факт взаимодействия большого числа ферментов с широким спектром веществ (широкая субстратная специфичность - полифункциональность).

Полиморфным генам свойственны относительно редкие аллели, возникшие в более поздний период филогенеза и определяющие синтез соответствующих ферментов и других белков пониженной активности, концентрации, отличающихся атипичными функциональными характеристиками.

До последнего времени исследования в области фармакогенетики касались преимущественно рассмотрения связи между эффективностью действия медикаментозных препаратов и особенностью их метаболизма у отдельных индивидуумов, но не на популяционном уровне.

Современные базы данных подтверждают высокую межэтническую гетерогенность в частотах аллелей генетических систем, участвующих в метаболизме ксенобиотиков и лекарств.

С расширением знаний об экогенетической конституции представителей разных этнотерриториальных групп дифференциальная наследственная предрасположенность/устойчивость к болезням, провоцируемым средовыми факторами, становится все более очевидной.

Множество лекарств с окислительными свойствами обладает гемолитическим эффектом в случае их использования пациентами с врожденной недостаточностью фермента (табл. 9-7).

Таблица 9-7. Лекарственные средства, вызывающие гемолиз у людей с наследственной недостаточностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Анализ генетической структуры популяций и изучение пространственных закономерностей генетических процессов, происходящих в естественных группах населения, является основной задачей геногеографии, что позволяет также проследить фармакогенетические эффекты на популяционном уровне. Любое значение геногеографической карты, полученное в результате интерполяционной процедуры, является своего рода прогнозом. В результате сконструированная генокарта в статическом виде отражает результат сложных эволюционных процессов, предшествующих настоящему времени на протяжении десятков и сотен поколений.

Недостаточность Г-6-ФД наблюдается преимущественно в популяциях тропических и субтропических широт как косвенное доказательство защитного свойства клеток с недостаточностью Г-6-ФД против тропической малярии.

Обнаруживается ярко выраженный широтный градиент увеличения плотности встречаемости признака Г-6-ФД в тропических зонах Старого Света, в особенности среди населения Африки к югу от Сахары, Аравийского полуострова, Индонезии, полуострова Малакка. Можно обратить внимание также на тенденцию проникновения этого признака в северном направлении между 50? и 90? восточной долготы, что, по-видимому, объясняется путями древних миграций (рис. 9-19).

Система ацетилирования может быть вовлечена в развитие большого спектра различных патологических состояний. Биотрансформация широкого спектра ксенобиотиков под воздействием N-ацетилтрансфераз предполагает также непосредственное участие этих ферментов в процессе возможного превращения природных биотических и абиотических соединений (пищевых и других веществ), с которыми человечество соприкасалось в процессе своей продолжительной эволюции. Полиморфизм в системе ацетилирования важен при изучении метаболизма серотонина, поскольку этот амин является естественным субстратом для N-ацетилтрансферазы.

Среди монголоидов Восточной и Северо-Восточной Азии частота аллеля, определяющего медленное ацетилирование Ac*S, оказывается в 2 раза ниже, чем в других группах мирового народонаселения. Кроме того, наблюдается градиент возрастания пропорции аллеля Ac*S к югу в широтном направлении. Жители Восточной Азии преимущественно характеризуются быстрым типом ацетилирования абиотических и биотических субстратов (табл. 9-8).

Рис. 9-19. Мировое распределение частоты фактора недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД) в популяциях человека

Таблица 9-8. Распределение частоты аллеля Ac*S медленного ацетилирования изониазида в различных популяциях

Примечание: сводки популяционных данных извлечены из работ H.W. Goedde, C. Lenther, 1986, и H.W.Goedde, H.-G. Benkmann, 1991. Для каждой из этнотерриториальных групп представлены средние величины частоты аллеля Ac*S.

Даже не столь многочисленные данные указывают на ярко выраженную этногеографическую дифференциацию в рамках генетического полиморфизма системы ацетилирования. Среди монголоидного населения Восточной и Северо-Восточной Азии частота аллеля медленного ацетилирования Ac*S оказывается в среднем в 2 раза ниже, чем в остальных группах мирового народонаселения. Наблюдается также тенденция возрастания пропорции аллеля Ac*S к югу в широтном направлении. Таким образом, жители Восточной Азии преимущественно характеризуются быстрым типом ацетилирования абиотических и биотических субстратов в их организме.

Фермент ВСНЕ участвует, в частности, в метаболизме липидов. Частоты встречаемости атипичных аллелей псевдохолинэстеразы (Е1*а) значительно варьируют атипичной сывороточной эстеразы 1-го локуса в популяциях человека в мировом народонаселении. На рис. 9-20 представлена информация о распределении частот Е1*а. Пропорция атипичных аллелей в разных европеоидных популяциях, как правило, на порядок превышает частоту соответствующих аллелей в других популяциях мира. Определяется широкий пояс высокой частоты встречаемости Е1*а от циркумполярных широт Северной Европы до тропических широт Юго-Западной Азии, Аравийского полуострова, Северо-Восточной Африки. Население этого пояса (ойкумены), включая Центральную и Восточную Европу, характеризуется наиболее высокой пропорцией фактора Е1*а, резкое падение плотности которого отмечается к востоку от Урала (табл. 9-9).

Рис. 9-20. Географическое распределение частот аллеля E1*a

Таблица 9-9. Частоты встречаемости атипичного аллеля Е1*а псевдохолинэстеразы в различных популяциях

На рис. 9-21 представлена геногеографическая карта мирового распределения частоты гомозиготного варианта параоксоназы низкой активности PON*A. Наибольшая концентрация людей с генетическим вариантом параоксоназы низкой активности наблюдается в европеоидных популяциях, особенно среди населения Западной Европы. Обнаруживается ярко выраженный градиент падения частоты аллеля низкой активности PON*A в меридиональном направлении в Евразии.

Рис. 9-21. Географическое распределение частоты гомозиготного фенотипа параоксоназы (PON A) низкой активности (в %) среди мирового народонаселения

Отмечается парадоксальный факт преобладающего распространения в популяциях в целом неблагоприятного с экогенетической точки зрения генотипа GSTМ1*0/0 и соответствующего аллеля GSTM1*0, отвечающего за потерю ферментативной активности. Так, наибольшие частоты фактора GSTM1*0 характерны для населения Восточной Азии. Карта (рис. 9-22) демонстрирует вероятностное распределение частот генотипа GSTM1*0/0 в обширном пространстве популяций Старого Света. Вырисовываются две полярные зоны в концентрации этого фактора, локализованные в относительной близости друг от друга. Наибольшая плотность этого фактора присуща населению Центрального Китая (>50%). Напротив, наименьшие значения частот GSTM1*0/0 (<30%) свойственны населению СевероВосточного Индостана - группам из индоевропейской и дравидской лингвистических семей. Труднопреодолимый в течение тысячелетий барьер - географический массив Гималайских гор - явился наиболее вероятной причиной резкого расхождения по частоте встречаемости генотипа GSTM1*0/0 среди населения, проживающего в относительно близком географическом пространстве. Дифференциальное своеобразие систем жизнеобеспечения способствовало формированию особенностей метаболизма монголоидных и южно-европеоидных групп по разные стороны от Гималаев.

Рис. 9-22. Распределение частоты генотипа GSTM1*0/0 глутатион-S-трансферазы в различных этнотерриториальных группах Старого Света

Особенности этнотерриториального распределения генетически обусловленного дефицита ALDH показаны на рис. 9-23.

Рис. 9-23. Мировое распределение фенотипа недостаточности ALDH1 альдегиддегидрогеназы

Высокая плотность в распределении этого признака связана с населением Восточной и Юго-Восточной Азии. Частота дефицита по ALDH резко падает в западном и северном направлениях от этого центра. По-видимому, мутация в гене ALDH, приведшая к дефициту соответствующего фермента, первоначально имела место в Юго-Восточной Азии и в дальнейшем распространилась исключительно среди монголоидных групп населения.

В целом, в отличие от применения всего комплекса популяционной генетикобиохимической информации, эко- и фармакогенетические полиморфизмы значительно отличают народонаселение Восточной и Юго-Восточной Азии от других популяций мира. Своеобразие экогенетической конституции восточно-азиатских популяций объясняется специфическими особенностями системы жизнеобеспечения в течение многотысячелетней истории в этом регионе ойкумены.

До сих пор в фармакогенетике используются преимущественно полиморфизмы отдельных генов, ассоциирующихся с особенностями метаболизма тех или иных медикаментозных препаратов. Учитывая, что процессы метаболизма организованы в цепи соответствующих реакций, целесообразно проследить влияние множества генов, продукты которых являются звеньями этих цепей - аддитивный эффект комбинации метаболических генов.

Каждая из карт главных компонент отражает динамику новых обобщенных факторов генофонда, имеет свой генетический ландшафт и отражает особый исторический статус. Карты главных компонент представляют собой отображение трехмерного пространства, включающее два географических измерения, а третье измерение - генетический ландшафт главной компоненты. Первые три главных компоненты включают в себя наибольшую часть общей дисперсии и аккумулируют основную информацию об основных параметрах изменчивости большей части включенных в анализ генов.

В анализ главных компонент эко- и фармакогенетических генов были включены следующие локусы: G6PD, ALDH, E1, E2, LAC, PON, DRD2, GSTM1.

Первая главная компонента «фармакогенетического» генофонда ойкумены включает 29% общей изменчивости по разновидностям 8 генов (рис. 9-24). Карте первой главной компоненты присущ большей частью долготный характер изолиний. При этом все западное полушарие ойкумены отчетливо подразделяется на две географические территории - западную, включающую Европу, Ближний Восток, Юго-Западную Индию и Африку, и восточную, объединяющую все группы населения Восточной, Юго-Восточной Азии и Северной Америки. Наиболее резко контрастируют между собой, с одной стороны, население Европы и Ближнего Востока, а с другой стороны, вся совокупность монголоидных популяций Восточной и Юго-Восточной Азии. Эта картина четко отражает формирование крупных антропологических общностей. Учитывая функционально значимые специфические особенности используемых в анализе экологически проявляющихся полиморфных генов, можно полагать, что формирование крупных антропологических общностей, включая морфологическую специфику, происходило в неразрывной связи с особенностями их жизнеобеспечения. Специфическое воздействие на человека в различных географических областях ойкумены оказывали естественные биотические и абиотические факторы среды, включая характер питания, давление бактериальных и вирусных агентов и др., что способствовало формированию неравнозначной дифференциальной структуры метаболизма, иммунной специфичности в популяциях человека разных географических зон.

Рис. 9-24. Первая главная компонента изменчивости генофонда народонаселения ойкумены по эко- и фармакогенетическим маркерам

Вторая главная компонента «фармакогенетического» генофонда ойкумены включает 21% общей изменчивости 8 генов (рис. 9-25). Для карты второй главной компоненты, особенно в тропических и субтропических областях, характерен ярко выраженный широтный градиент изолиний. Комплексная геногеографическая картина в данном случае отчетливо иллюстрирует давление климатогеографических факторов (естественных экологических факторов среды), которые способствовали формированию особенностей генофонда современного человека в пространстве и во времени. Можно полагать, что влияние таких систематических факторов среды, как интенсивность солнечной радиации, ультрафиолетового излучения, высокая влажность, специфические патогены в тропических регионах, способствовало формированию климатически зависимого градиента полиморфных генов в антропологически различающихся общностях в широтном пространстве между 0? (экваториальная зона) и 50? с.ш.

Рис. 9-25. Вторая главная компонента изменчивости генофонда народонаселения ойкумены по эко- и фармакогенетическим маркерам

Третья главная компонента аккумулирует 9% общей дисперсии из 9 эко- и фармакогенетически проявляющихся генов (рис. 9-26). Ее картина характеризуется дизруптивной («разорванной») изменчивостью. Центральный регион ойкумены, включающий Юго-Западную, Центральную, Восточную и Юго-Восточную Азию, расчленяет географически отдаленные регионы Африки, с одной стороны, и Северо-Восточной Азии и Америки - с другой, вклиниваясь между ними.

Рис. 9-26. Третья главная компонента изменчивости генофонда народонаселения ойкумены по эко- и фармакогенетическим маркерам

Такую картину генетической изменчивости можно объяснить демографическим взрывом среди народонаселения в азиатском географическом пространстве в исторических рамках становления H. sapiens. Возможно, экстремальное возрастание плотности населения в этом обширном регионе изначально оказалось связанным в популяциях с традициями нерегулируемой рождаемости и выработанными в поколениях оптимальными показателями дифференциальной плодовитости и смертности. Возможна также связь с эффектами репродуктивной компенсации - возрастанием репродуктивной функции при увеличении здесь концентрации относительно редких аллелей таких генов, как α-AT, GC, ADA, AK, 6-PGD, GSTM1. Наконец, Н.И. Вавиловым было показано, что Азия является первичной родиной подавляющего большинства культурных растений, домашних животных и птиц. Наибольший потенциал видов и сортовое разнообразие культурных растений сосредоточены в Южной и тропической Азии. Все эти обстоятельства стали благоприятными для развития человечества и привели к резкому росту численности населения в этом регионе ойкумены, что могло способствовать его дальнейшей диффузии в северном и северо-западном направлениях.

Применение лекарственных средств требует не только индивидуализации фармакотерапии с учетом генотипической принадлежности того или иного человека. Популяционные аспекты генетического разнообразия по ферментным и другим эко- и фармакогенетически значимым полиморфным системам целесообразно учитывать при формировании групп высокого риска для предупреждения болезней, провоцируемых влиянием естественных и новых факторов среды.

Проблема экогенетики питания принадлежит к мало разработанному, но весьма интригующему и перспективному направлению в области генетики человека. Пища для человека является носителем энергии и «строительным материалом» организма. Генетическая оценка статуса питания обычно основывается на негативных последствиях индивидуальной или групповой диеты, когда пища становится источником опасности. Между тем современные успехи в области генетического изучения сенсорных систем позволят в ближайшем будущем по-новому взглянуть на проблему экогенетики питания. Внешний вид, вкус и запах пищи всегда играли и играют основную роль в статусе диеты. Пока достаточно хорошо известно лишь о генетических различиях во вкусовой чувствительности к горечи фенилтиокарбамида (ФТК), химически подобного соединения пропилтиоурацила (ПТУ); появляются сведения о дифференциальной восприимчивости сладкого вкуса, запаха солей цианистоводородной кислоты. К сожалению, в настоящее время можно рассматривать проблемы экогенетики питания, лишь принимая во внимание негативные эффекты проявления статуса диеты.

В процессе своего эволюционного развития группы людей были вынуждены в течение продолжительного времени приспосабливаться к естественным биотическим условиям среды, в том числе к системе питания, включающей продукты растительного и животного происхождения. Можно полагать, что эволюционное становление сбалансированности системы питания связано с функциональным генетическим полиморфизмом ферментных систем, транспортных и других белков в человеческих популяциях, сопровождавшимся естественным отбором на протяжении десятков и сотен поколений.

Происходящее повсеместно изменение структуры питания в разных группах мирового народонаселения, особенно среди коренного населения отдаленных районов Земли, может весьма неблагоприятно сказываться на здоровье людей. Неадекватность статуса питания особенностям метаболизма может приводить к проявлению сахарного диабета, заболеваний желудочно-кишечного тракта и других форм патологических состояний. Это связано с тем, что трансформация пищевых продуктов в организме зависит от индивидуальных генетических особенностей метаболизма.

Особое значение эти проблемы приобретают в Российской Федерации, где в разных географических зонах проживают множество этнотерриториальных групп, антропологических общностей, отличающихся традиционными системами хозяйства и характерными особенностями статуса питания для каждой из них. Эти проблемы становятся еще более острыми в связи с усилением направленных миграций, особенно в восточные и северные районы страны. Столь же выраженные изменения в социально-экономическом статусе населения диктуют прогнозирование и учет изменений системы питания, с одной стороны, индивидуальных и популяционных особенностей метаболической трансформации пищевых продуктов - с другой. Существует обширная литература о генетическом полиморфизме таких важнейших ферментных систем, как лактаза, амилаза, липаза, пепсиноген, различные пептидазы и аполипопротеины, которые участвуют в трансформации пищевых продуктов растительного и животного происхождения. Важно заметить, что наследственно обусловленные полиморфизмы этих и других систем, как правило, сопровождаются функциональными различиями аллелей в ферментативной активности и транспортной динамике. В связи с этим генетика питания в изменяющихся экологических условиях является важным фактором сохранения здоровья людей. Установление связей индивидуального генетического статуса с конкретными системами питания имеет большое значение для рационального использования пищевых ресурсов и профилактики заболеваний, связанных с нарушением баланса метаболических особенностей и статуса питания.

Наиболее ярким примером генетических различий в реакции на пищевые продукты является гиполактазия у взрослых. У всех детей в кишечнике функционирует фермент лактаза (лактазо-флоризингидролаза - ЛФГ), необходимая для всасывания молочного сахара (лактозы). ЛФГ участвует в расщеплении дисахарида лактозы на моносахариды - глюкозу и галактозу, которые легко всасываются в кишечнике. У большинства детей ЛФГ кишечника инактивируется после прекращения вскармливания грудным молоком. Поэтому большинство взрослых не усваивают лактозу. При употреблении в пищу нативного молока и ряда других продуктов, содержащих молочный сахар, люди, не способные к его усвоению, страдают расстройством пищеварения, диареей (Sahi T., 1978). Более того, у детей, страдающих галактоземией, при питании молоком увеличивается печень, развивается катаракта и может проявляться умственная отсталость. Однако ребенок будет развиваться нормально при диете, лишенной галактозы или лактозы. В то же время существует мутация, при которой способность усваивать лактозу сохраняется у взрослых. Можно предположить, что она имеет селективное преимущество в животноводческих районах, где молоко является обычным продуктом питания. В Центральной и Северной Европе большое число людей имеет мутантный ген LAC*R в количестве одной или двух копий. Мутация, при которой всасывание лактозы сохраняется, часто встречается также в некоторых регионах Африки и Азии, где различные группы людей издавна практиковали молочное животноводство. А.И. Козлов (1996) выделяет в отношении распространения первичной гиполактазии три обширные группы на территории Старого Света:

При исследовании генетического диморфизма кишечной лактазы среди оленеводов селькупов Северо-Западной Сибири нами было показано, что из 70 обследованных только 7 человек обладали нормальным уровнем активности кишечной лактазы. Таким образом, встречаемость аллеля гиполактазии LAC*R среди них оказалась весьма высокой (0,949). Геногеографическая карта распределения аллеля недостаточности лактазы LAC*R в Северной Евразии свидетельствует о ярко выраженном меридиональном градиенте изменчивости этого фактора, направленном с запада на восток (Козлов А.Н., 1996). При изучении девяти обширных финских семей с использованием метода неравновесия по сцеплению и анализа гаплотипов рассмотрен локус лактазы размером 47 кб в интервале 2q21. Сиквенс-анализ этого района при изучении ассоциаций продемонстрировал, что вариант ДНК С/Т_-13910 примерно в области 14 кб перед геном ЛФГ полностью ассоциируется с биохимически подтвержденной лактазной недостаточностью в изученных семьях. Другой вариант G/A_-22018 8 кб теломернее от С/Т_-13910 также ассоциируется с этим признаком (Enattah N.S., 2002). Проанализированы микросателлитные маркеры, фланкирующие ген ЛФГ. Локус CT_-13910 имеет три генотипа: СС, СТ и ТТ. При этом недостаточная активность лактазы ассоциируется только с генотипом СС. Локус G/A_-22018 также характеризуется тремя генотипами: GG, GA и АА; при этом лактазная недостаточность ассоциируется исключительно с генотипом GG.

Следующим известным примером влияния генетической изменчивости на характер питания является полиморфизм по эритроцитарному ферменту глюкозо6-фосфат-дегидрогеназе (Г-6-ФД). Известно, что зрелый эритроцит получает энергию в результате анаэробного расщепления глюкозы до лактата (гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа). Г-6-ФД действует на боковой петле (гексозомонофосфатный шунт) этого основного пути. Г-6-ФД катализирует превращение глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат в присутствии кофермента НАДФ, который в процессе реакции восстанавливается до НАДФ^. H. Данная реакция сопровождается восстановлением глутатиона, что, в свою очередь, важно для стабилизации мембраны эритроцитов. Именно поэтому наследственная недостаточность активности Г-6-ФД часто сочетается со склонностью к гемолизу (разрыву мембраны эритроцитов) под воздействием ряда веществ. У некоторых людей с мутантными аллелями Г-6-ФД при употреблении в пищу так называемых конских бобов (Vicia faba L.) развивается гемолитическая анемия - фавизм (Flatz G., Xitotiris N., 1976). Для больных с фавизмом, столь частым в популяциях Средиземноморья, характерно снижение уровня α-глутаровой кислоты, выводимой с мочой (Cassimos C., Malaka-Zefiru K., Tsiures J., 1974). Этот эффект может быть связан с биологическим превращением токсичного вещества, содержащегося в бобах. Генетический механизм, лежащий в основе экскреции глутаровой кислоты, до сих пор остается невыясненным.

Целианическая болезнь является генетическим дефектом, при котором повышенная чувствительность к клейковине приводит к нарушению всасывания в кишечнике (Stokes P.L., Asquith P., Cooke W.T., 1973). Тем не менее при подборе диеты без содержания клейковины патологические симптомы исчезают.

У жителей Севера зачастую имеет место дефицит фермента трегалазы, расщепляющей углеводы грибов. Возможно, поэтому представители ряда этнических групп не употребляют грибы в пищу.

В тропических странах Африки широко используют в пищу растение кассаву (маниок), корневая часть которого богата крахмалом. Однако кассава содержит также цианогенный гликозид (линамарин), при употреблении в пищу выделяющий сублетальное количество цианида. Оказалось, что частота встречаемости аномального гемоглобина S (HbS) высоко коррелирует с количеством ежедневно потребляемого с пищей CN (r=-0,89; P=0,001). Клинически идентифицируемая малярия, вызываемая Plasmodium falciparum, в наибольшей степени представлена среди жителей районов, где традиционно потребляется низкое количество продуктов, содержащих цианогенные органические вещества. Употребление в пищу маниока, богатого цианидами, тиоцианатами и цианатами, может непосредственно воздействовать на малярийного паразита Plasmodium falciparum. Низкие дозы цианогенного гликозида (0,3 мг CN¯ на 1 кг массы тела в день) ассоциируются с повышенными региональными частотами гена HbS (11%) (при фенотипическом проявлении 20%), с низкими положительными титрами антител к Plasmodium (861,6?102,4) и повышенной частотой заболеваемости малярией (3,04 случая за год). Напротив, высокие дозы потребления цианогенного гликозида (1,5 мг CN¯ на 1 кг массы тела в день) ассоциируются с низкой частотой гена HbS (2%) (при фенотипическом проявлении 4%), повышенными положительными титрами Plasmodium- антител (968,7?160,5) и пониженной частотой заболеваемости малярией (1,73?0,11 случая за год) (Jackson L.C. et al., 1988). Представляется весьма целесообразным в дальнейшем провести подробное исследование полиморфизма фермента роданезы (RDN), катализирующего превращение цианида в менее токсичный тиоцианат.

С точки зрения экогенетики питания представляет интерес изучение продуктов питания, содержащих сою. Установлено, что потребление напитков, содержащих сою, значительно уменьшает концентрацию триглицеридов и липопротеинов холестерина очень низкой плотности, но способствует существенному увеличению концентрации липопротеинов холестерина высокой плотности (HDL-C и HDL₃-C) (Laurin D. et al., 1991). Эти результаты свидетельствуют о том, что белки сои могут вызывать клинический эффект у детей с семейной гиперхолестеринемией.

Различные этнотерриториальные группы в разной степени реагируют на потребление глюкозы. В течение ряда лет проводилось лонгитудинальное исследование эффекта переносимости глюкозы в микронезийской популяции науру (King H. et al., 1984). Оказалось, что представители этой популяции характеризуются выраженной чувствительностью к глюкозе. За 6-летний период наблюдения среди людей, наиболее восприимчивых к глюкозе, в 26% случаев установлен сахарный диабет. В контрольной группе диабет идентифицирован лишь в 7% случаев. Таким образом, меланезийцы, обладающие повышенной чувствительностью к глюкозе, имеют более высокий риск развития диабета.

Финские авторы проанализировали изменчивость гена аполипопротеина В на уровне XbaI ПДРФ: инсерционно-делеционного полиморфизма сигнального пептида 3?VNTR и антигенного полиморфизма АВ - в финской популяции среди здоровых людей и субъектов, страдающих коронарным склерозом. При этом установлена корреляция между двумя изученными видами полиморфизма. Это связано с тем, что разные полиморфные варианты гена АВ модифицируют спектр липидов плазмы крови в ответ на поступление липидов с пищевыми продуктами. Результаты показывают, что АВ-полиморфизм играет роль в регуляции транспорта липидов в плазме крови за счет определенных особенностей структуры АВ, неравновесно сцепленных с XbaI ПДРФ (Tikkanen M.J., 1990). XbaI-полиморфизм может модифицировать ответ статуса диеты. В результате исследования установлена также ассоциация между полиморфизмом сигнального пептида (ins/del) и уровнем триглицеридов. При постоянном потреблении жирной пищи, т.е. при высокохолестериновом статусе питания, уровень сывороточного триглицерида оказался связанным с тем или иным Apo B ins /del генотипом. Более высокий уровень триглицерида наблюдался в случае генотипа ins/ins, наиболее низкая его концентрация имела место в случае генотипической принадлежности del/del, а промежуточный уровень - у гетерозигот ins/del. Изменение содержания холестерина в диете значительно коррелирует с изменчивостью сывороточного холестерина у пациентов с генотипом XbaI X- /X-, но не у субъектов, относящихся к X +/X +.

Метилентетрагидрофолатредуктаза (МТГФР) катализирует редукцию 5,10-метилентетрагидрофолата до 5-метилтетрагидрофолата. Острая гипергомоцистеинемия (ГГЦ), обусловленная недостаточностью МТГФР, приводит к развитию нейрологических нарушений, умственной отсталости, атеросклероза и тромбоза . Незначительная гипергомоцистеинемия является фактором риска развития сердечно-сосудистой патологии, включая инфаркт миокарда (Faure-Delane L. et al., 1997). ГГЦ ассоциируется с термолабильным вариантом МТГФР, что обусловлено С677Т мутацией в гене МТГФР. Эффект генотипа МТГФР +/+ в определении уровня гомоцистеина в значительной степени связан с уровнем фолата. Подчеркивается, что люди, отличающиеся гипергомоцистеинемией, чаще встречаются среди долгожителей. Этот эффект ассоциируется с экстремально низким содержанием фолата в системе питания (табл. 9-10).

Таблица 9-10. Средние величины и ?SD гомоцистеина плазмы и уровни фолата у долгожителей (людей, достигших 100-летнего возраста) и в контроле

Сравнительно недавно были картированы локусы, отвечающие за восприимчивость к фенилтиокарбамиду (ФТК) и пропилтиоурацилу (ПТУ). Локус ФТК картирован на хромосоме 5р15, а ПТУ расположен близ локуса групп крови Kell на хромосоме 7 T2R1. При секвенировании гена ФТК идентифицированы два однонуклеотидных полиморфизма. Обнаружены также значительные различия между субъектами в их восприимчивости к сладкому вкусу таких веществ, как сахароза и сахарин. У человека ортолог гена, отвечающий за восприимчивость к сладкому, обнаружен на хромосоме 1р36 (Reed D.R., 2000).

Особое место в экогенетике питания должно уделяться генетическим системам, связанным с транспортом и метаболизмом витаминов. Установлено, что различия в эффективности связывания и транспорта витаминов D и B₁₂ связаны с определенными аллелями полиморфных генов группоспецифического компонента (GC) и транскобаламина (ТС) соответственно. Позднее было установлено, что концентрация сывороточного витамина С также ассоциируется с определенным типом генетически полиморфного гемоглобин-транспортирующего антиоксиданта - гаптоглобина (НР) (Longlois M.R., 1977). Наименьшая концентрация витамина С обнаружена в сыворотке крови пациентов с генотипом НР 2-2. Эксперименты in vitro показали низкую стабильность L-аскорбиновой кислоты в крови пациентов с генотипом НР 2-2. Истощение L-аскорбиновой кислоты in vitro оказалось обратно сопряженным с концентрацией гаптоглобина (r =-0,738). Результаты исследования свидетельствуют о повышенном уровне окисления L-аскорбиновой кислоты у носителей варианта НР 2-2.

Локус PGM4 фермента фосфоглюкомутазы-4 проявляет активность лишь в период лактации, и его изоферменты присутствуют в женском молоке. Наши данные изучения связи аллелей PGM4, экспрессирующихся в женском молоке, с размерами тела новорожденных приведены в табл. 9-11 (Спицын В.А. и др., 1997).

Таблица 9-11. Точечно-биссериальные связи между фенотипами PGM4, экспрессирующимися в женском молоке, и размерами тела новорожденных

Примечание. * - p <0,01; ** - p <0,001.

Результаты свидетельствуют, что у новорожденных существует достоверная корреляция между размерами их тела и фенотипами PGM4 матери. Принадлежность к более распространенному фенотипу PGM4 2-2 связана с увеличением всех четырех размеров тела у новорожденных мальчиков. Напротив, фенотип PGM4 1-2 отрицательно коррелирует с длиной и массой тела всех новорожденных. Присутствие фенотипа PGM4 2-2 у матерей положительно коррелирует со всеми размерами тела новорожденных девочек. Таким образом, на рост и развитие детского организма в период раннего онтогенеза может влиять серия генетических факторов, среди которых немаловажная роль принадлежит полиморфизму фосфоглюкомутазы-4 женского молока. Возможно, эта связь реализуется через систему питания за счет различной функциональной активности аллелей, определяющих изоферменты PGM4.

α-Амилазы (КФ 3.2.1.1) принадлежат к эндогликозидазам, гидролизующим молекулы крахмала путем атак в случайных точках, расположенных в отдалении от концов полисахаридной цепи, с образованием олигосахаридных цепей (декстринов) и простых сахаров. Одни α-амилазы обнаруживаются в слюне человека, тогда как другие вырабатываются поджелудочной железой. В лаборатории экологической генетики МГНЦ РАМН впервые установлен и изучен спектр α-амилазы женского молока методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) (Бычковская Л.С., 1998). При сравнительном анализе спектров α-амилазы молока и используемых в качестве контроля спектров α-амилазы образцов слюны наблюдалась идентичность электрофоретических зон обоих экскретов. При суммарном исследовании 180 образцов женского молока в градиенте рН 6,5-7,0 удалось выявить три фенотипа амилазы: Amy1 1-1, Amy1 1-2 и Amy1 2-2. В случае ИЭФ в градиенте рН 7,3-7,5 обнаруживалась специфическая исключительно для женского молока зона активности Amy. Это наблюдение позволило предположить, что молочная железа продуцирует особую тканеспецифическую амилазу, которая контролируется еще одним дополнительным локусом Amy.

Таблица 9-12. Распределение фенотипических и аллельных частот α-амилазы женского молока (Amy1)

Сходство распределения фенотипических и аллельных частот α-амилазы женского молока в группе женщин из г. Москвы с аналогичным распределением частот генетических разновидностей слюнной амилазы в европейских популяциях свидетельствует о гомологии этих систем.

В табл. 9-13 показано соотношение дискретного генетического полиморфизма α-амилазы с уровнем лактации.

Таблица 9-13. Соотношение дискретного генетического полиморфизма системы Amy1 с уровнем лактации

Примечание. ² - величина, описывающая достоверность связи; φ - коэффициент, отражающий характер и направление этой связи; * - достоверность.

Для определения связей между факторами Amy1 и таким качественным признаком, как уровень лактации, применялось стандартное вычисление по четырехпольной таблице сопряженности с определением критерия χ², описывающего достоверность связи, и коэффициента φ, отражающего величину и направление этой связи. Достоверная связь при вероятности ошибки, равной 1%, с уровнем лактации для женщин, родивших девочек, обнаруживается только у фенотипа Amy1 1-1, причем эта зависимость имеет отрицательный характер.

Наконец, перспективным представляется исследование идиосинкразии. В данном случае можно обратить внимание на так называемый синдром запаха рыбы - FOS (fish odor syndrome). FOS является примером вариабельности в чувствительности человека к пищевым веществам. Этот признак принадлежит к идиосинкразическому ответу (генетически обусловленной повышенной чувствительности организма к определенным веществам), определяющему присутствие триметиламина - продукта деградации пищевого холина, карнитина и оксида триметиламина.

Несмотря на значительное количество приведенных выше примеров из области экогенетики питания, полученные к настоящему времени результаты оказываются фрагментарными и разрозненными, вследствие чего их трудно сгруппировать в одну логическую систему. В итоге сейчас наблюдается лишь процесс накопления фактов, тем не менее реально свидетельствующих о роли генетической изменчивости в статусе диеты.

Следует обратить внимание еще на один возможный - популяционный - подход, повествующий о роли естественных биотических факторов в эволюции человеческих популяций. При анализе всемирного распределения частот гаплотипов и гаплогрупп высокоинформативных для дифференциации популяций генетических маркеров, таких как Gm, HLA, mtDNA, Y-хромосомы, можно заметить, что хозяйственно-культурные типы отдельных человеческих общностей отчетливо коррелируют с распределением конкретных гаплотипов этих маркерных систем. Так, при рассмотрении географического распределения частот гаплотипа системы иммуноглобулинов Gm*a,f;b^*;n (или Gm*1,3;5^*;23 в цифровой номенклатуре, где b^* =5^* включает в себя также 11,13,14) можно обратить внимание на его преимущественную концентрацию в населении Юго-Восточной Азии. Плотность его чрезвычайно велика среди народов Индокитая, Филиппин, Индонезии и резко падает во всех направлениях от этого центра (Спицын В.А., 1985). Эта южная группа монголоидов принадлежит к территориально обширному единому комплексу населения, относящемуся к сино-тибетской и австронезийской языковым семьям. В этой же связи рассматриваемый нами регион в рамках исследования Н.И. Вавилова, установившего несколько автономных центров происхождения культурных растений, соответствует индомалайскому центру (Вавилов Н.И., 1926). Из археологических источников известно, что в относительно недавнее время в масштабах истории формирования Homo sapiens, примерно 10-12 тыс. лет назад, в Юго-Восточной Азии возникла и существовала хорошо очерченная своеобразная агрокультура. Возникновение и распространение культур растений этой области тесно связаны с ареалом становления южно-азиатского антропологического типа. В свою очередь, именно представители южноазиатского типа характеризуются специфическим гаплотипом Gm*1,3:5*;23. Таким образом, можно предполагать существование взаимоотношения генетической структуры населения этого региона с особенностями его статуса диеты.

Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину). - СПб.: Интермедика, 2000. - 272 с.

Писарик В.М. Антропогенетическое исследование предрасположенности к многофакторным заболеваниям и моделирование индивидуального риска: Дис. ? канд. биол. наук / Институт искусствоведения, этнографии и фольклора. Нац. Акад. Наук Беларуси. - Минск: 2000. - 106 с.

Спицын В.А. Биохимический полиморфизм человека. - М.: Изд-во МГУ, 1985. - 214 с.

Спицын В.А. Экологическая генетика человека. - М.: Наука, 2008. - 503 с.

Спицын В.А., Агапова Р.К., Цыбикова Э.Б. и др. Возможная связь между уровнем гетерозиготности по биохимическим маркерам генов у больных с легочной патологией // Генетика. - 1996. - Т. 32, № 7. - С. 990-995.

Спицына Н.Х. Демографический переход в России. - М.: Наука, 2006. - 211 с.

Brewer G.J. Annotation: Human Ecology, an expanding role for the human geneticist // Am. J. Hum. Genet. - 1971. - Vol. 23. - P. 92-94.

Goedde H.W., Benkmann H.G. Ecogenetic and pharmacogenetic phenomena (ch. 8) // Genetic of the Hungarian Population. - Budapest: Acad. Kiado; Heidelberg: Springer-Verlag, 1991. - 334 p.

Goedde H.W., Lenther C. Pharmacogenetics and Ecogenetics. CIBA-GEIGY // Ltd Basle. 8th ed. - 1986. - Vol. 4. - P. 288-300.

Haldane J.B.S. Heredity and Politics. - London: Allen and Unwin, 1938. - 179 p.

Haldane J.B.S. The Biochemistry of Genetics. - London: Allen and Unwin, 1954. - 235 p.

Kelada S.N., Eaton D.L., Wang S.S. et al. The role genetic polymorphisms in environmental health // EHP (Environmental health perspectives). - 2003. - Vol. 111, N 8. - P. 1055-1064.

Lichtman Hc., Feldman F. In vitro pyrrole and porphyrin synthesis in lead poisoning and iron deficiency // J. Clin. Invest. - 1963. - Vol. 42. - P. 830-839.

Lucotte G., Loirat F. and Hazout S. Pattern of gradient of apolipoprotein E allele*4 frequencies in Western Europe // Hum. Biol. - 1997. - Vol. 69, N 2. - P. 253-262.

Motulsky A. Drug reactions, enzymes, and biochemical genetics // JAMA. - 1957. - Vol. 165. - P. 835-837.

Mourant A.E., Kopec A.C., Domanievska-Sobczak K. Blood Groups and Diseases. A study of associations of diseases with blood groups and other polymorphisms. - London: Oxford University Press, 1978. - 328 р.

Nei M. The theory of genetic distance and evolution of human races // Jpn J. Hum. Genet. - 1978. - Vol. 23, N 4. - P. 341-369.

Spitsyn V.A., Kravchuk O.I., Nurbaev S.D. et al. Climate-Dependent Variation of Alpha-2HSGlycoprotein // Hum. Biol. - 1988. - Vol. 70, N 74. - Р. 463-475.

Vessel E.S. Pharmacogenetics: multiple interactions between genes and environmental as determinant of drug response // Am. J. Med. - 1979. - Vol. 66, N 2. - P. 183-187.

Vogel F. Moderne Probleme der Humangenetik // Ergeb. Inn. Med. Kinderheilk. - 1959. - Vol. 12. - P. 52-125.

Wetmur J.G., Kaya A.H., Plewinska M., Desnick R.J. Molecular characterization of the human delta-aminolevulinic acid dehydratase 2 (ALAD*2) allele: implications for molecular screening of individuals for genetic susceptibility to lead poisoning // Am. J. Hum. Genet. - 1991. - Vol. 49. - P. 757-763.

Фармакогенетика - наука, изучающая место и роль генетических факторов в формировании ответа организма человека на лекарственные средства (ЛС). Закономерности, обнаруживаемые фармакогенетикой, позволяют врачу в некоторых случаях индивидуально подходить к выбору как собственно ЛС, так и их доз у конкретного пациента, обеспечивая максимально эффективную и безопасную фармакотерапию.

Предмет изучения фармакогенетики - особенности генетической конституции, которые ассоциированы с изменениями фармакологического ответа (генетически детерминированный фармакологический ответ). Фармакогенетика - смежная дисциплина, располагающаяся на стыке фармакологии и генетики. Хотя роль наследственности в формировании индивидуального ответа на ЛС известна давно, понимание механизмов, связывающих генетические особенности пациента с изменением эффективности и безопасности фармакотерапии, стало возможным лишь к настоящему времени. Это связано с развитием соответствующих методов молекулярной генетики и реализацией международной программы «Геном человека».

Генетические факторы, а по сути генетические особенности пациента, как правило, представлены полиморфными участками генов, продукты которых участвуют в осуществлении различных фармакокинетических и фармакодинамических процессов. Термин «полиморфные» означает, что в конкретных местах генома нуклеотидная последовательность может отличаться у различных людей (если участок находится внутри гена, то говорят о существовании альтернативных аллелей или аллельных вариантов). Подобные альтернативные варианты могут быть ассоциированы с различными нарушениями работы гена (например, с отсутствием синтеза белка, синтезом белка со сниженной или повышенной активностью, снижением или повышением уровня экспрессии и др.). Таким образом, с изменением фармакологического ответа могут быть ассоциированы альтернативные аллельные варианты генов, продукты которых принимают участие в фармакокинетике и фармакодинамике ЛС.

К первой группе относят гены, кодирующие ферменты биотрансформации и транспортеры, которые осуществляют всасывание, распределение и выведение ЛС из организма. В настоящее время активно изучают роль генов, контролирующих синтез и работу ферментов биотрансформации ЛС, в частности изоферментов цитохрома Р-450 (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19) и ферментов второй фазы биотрансформации (N-ацетилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы). Особый интерес вызывает изучение взаимосвязи аллельных вариантов генов-транспортеров с изменением фармакокинетики соответствующих ЛС.

Во вторую группу входят гены, кодирующие молекулы-мишени ЛС или функционально связанные с этими структурами белки (рецепторы, ферменты, ионные каналы). В нее включены также гены, продукты которых участвуют в различных патологических процессах (факторы свертывания крови, аполипопротеины и др.), против которых направлена соответствующая фармакотерапия (рис. 10-1).

Рис. 10-1. Некоторые гены, аллельные варианты которых могут быть ассоциированы с изменением фармакологического ответа

Врач, ознакомившись с инструкцией по медицинскому применению ЛС или его типовой клинико-фармакологической статьей (ТКФС) Государственного реестра лекарственных средств (www.regmed.ru), может самостоятельно прогнозировать, полиморфные варианты каких генов могут быть ассоциированы с изменением фармакологического ответа и, следовательно, с изменением эффективности и безопасности ЛС. Для этого необходимо обращать внимание на:

Стоит отметить, что некоторые полиморфные маркеры, связанные с изменением фармакологического ответа на ЛС, зачастую бывают ассоциированы с различными заболеваниями (онкологические болезни, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, атеросклероз и др.), поэтому фармакогенетические исследования способствуют более широкому пониманию их этиологии и патогенеза.

Генетически детерминированные изменения фармакологического ответа с клинических позиций можно классифицировать следующим образом (Скакун Н.П., 1981):

Все фармакокинетические процессы (всасывание, распределение, биотрансформация или метаболизм, а также выведение) - результат скоординированной работы соответствующих генов, кодирующих ферменты биотрансформации ЛС, транспортеры ЛС, транспортные белки плазмы крови и др.

Генетический полиморфизм характерен как для генов, кодирующих ферменты первой фазы биотрансформации (изоферменты цитохрома Р-450, дигидропиримидиндигидрогеназа, бутирилхолинэстераза, параоксоназа), так и второй фазы метаболизма (N-ацетилтрансфераза, тиопурин-S-метилтрансфераза, эпоксидгидролаза). Генетический полиморфизм может обусловливать синтез ферментов с измененной активностью, что, в свою очередь, способно послужить причиной изменения скорости биотрансформации ЛС. Генетически детерминированные различия в скорости биотрансформации ЛС, которую можно оценить по отношению концентрации ЛС-субстрата к содержанию его метаболита в плазме крови или моче (метаболическое отношение), позволяют выделить группы индивидуумов, различных по активности того или иного фермента биотрансформации.

Экстенсивные метаболизаторы ( extensive metabolizers - ЕМ) - люди с нормальной скоростью биотрансформации определенных ЛС. Как правило, такие люди гомозиготны по нормальным (в функциональном плане) аллелям гена, кодирующего соответствующий фермент. К экстенсивным метаболизаторам принадлежит большинство населения.

Медленные метаболизаторы ( poor metabolizers - РМ) - люди со сниженной скоростью биотрансформации определенных ЛС. Обычно такие люди гомозиготны по функционально-дефектному аллелю гена, кодирующего соответствующий фермент. Иногда выделяют промежуточных метаболизаторов (intermedium metabolizers - IM), к которым относят гетерозигот по функционально-дефектному аллелю. У таких индивидуумов происходит синтез дефектного фермента либо вообще отсутствует соответствующий фермент биотрансформации, в результате чего ферментативная активность снижается или отсутствует. У этой категории пациентов регистрируют высокое отношение концентрации ЛС к содержанию его метаболита. При этом у медленных метаболизаторов ЛС накапливается в организме в высокой концентрации, что приводит к возникновению выраженных НПР, вплоть до интоксикации. Именно поэтому для медленных метаболизаторов необходим тщательный подбор дозы ЛС, которая должна быть меньше, чем для экстенсивных метаболизаторов. Если в качестве ЛС выступает пролекарство, т.е. действует не само ЛС, а его активный метаболит, образующийся из исходного препарата в ходе биотрансформации, то у медленных метаболизаторов образуется меньше активного метаболита, что может привести к неэффективности лечения. В таких случаях требуется увеличение дозы.

Сверхактивные, или быстрые, метаболизаторы ( ultraextensive metabolizers - UM) - люди с повышенной скоростью биотрансформации определенных ЛС. Часто в их генотипе присутствуют аллели, кодирующие изоформу соответствующего фермента с аномально высокой активностью, либо аллельные варианты, образованные дупликацией (амплификацией) функционально нормальных аллелей. У этой категории пациентов регистрируют низкое значение отношения концентрации ЛС к содержанию его метаболита. Вследствие этого формируется недостаточная для достижения терапевтического эффекта концентрация ЛС в крови. Для сверхактивных метаболизаторов доза препарата должна быть выше, чем для активных метаболизаторов. Если в качестве ЛС применяют пролекарство, то у сверхактивных метаболизаторов образуется больше активного метаболита, что может привести к развитию НПР. Таким пациентам требуется меньшая доза ЛС-пролекарства, чем экстенсивным метаболизаторам.

Если ген, кодирующий соответствующий фермент биотрансформации, обладает полиморфизмом, то распределение индивидуумов по скорости метаболизма ЛС-субстратов фермента приобретает бимодальный (при двух типах метаболизаторов) или тримодальный (при трех типах метаболизаторов) характер (рис. 10-2).

На основании знаний о том, каким изоферментом метаболизируется ЛС, а также какой транспортер участвует во всасывании, распределении или выведении ЛС (такая информация часто содержится в инструкциях по медицинскому применению и ТКФС), можно предполагать, что присутствие в генотипе пациента аллелей генов, кодирующих эти структуры, будет ассоциировано с изменением фармакокинетики ЛС, а значит, с его эффективностью и безопасностью.

Ниже перечислены наиболее значимые полиморфные маркеры, ассоциированные с изменением фармакокинетики соответствующих ЛС и располагающиеся в генах, кодирующих ферменты первой (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, дигидропиримидиндигидрогеназа, бутирилхолинэстераза) и второй фазы биотрансформации (ацетилтрансфераза, глюкуронилтрансфераза, тиопурин-S-метилтрансфераза), а также транспортеры ЛС (Р-гликопротеин, транспортеры органических анионов и катионов).

Рис. 10-2. Распределение индивидуумов по скорости метаболизма, оцененной по отношению концентрации лекарственного средства в плазме крови к содержанию его метаболита (объясненияв тексте)

Цитохром Р-450 CYP2D6 метаболизирует около 20% всех известных ЛС, в том числе антипсихотические препараты, антидепрессанты, β-адреноблокаторы, антиаритмические, некоторые противоопухолевые (тамоксифен), противорвотные β, блокаторы Н₁-рецепторов и некоторые другие ЛС. Ген CYP2D6 обладает высоким полиморфизмом. Еще в 1977 г. некоторые авторы обращали внимание на различие гипотензивного эффекта у больных с артериальной гипертензией, применявших дебризохин^ρ, - препарат из группы α-адреноблокаторов. Тогда же было сформулировано предположение о различии в скорости метаболизма (гидроксилирования) дебризохина^ρ у разных индивидуумов. У медленных метаболизаторов препарата его гипотензивный эффект был наиболее выражен. Позднее было показано, что у медленных метаболизаторов дебризохина^ρ медленнее протекает метаболизм и некоторых других ЛС, в том числе фенацетина^¤, нортриптилина^¤, фенформина^¤, L-спартеина сульфата^♠, энкаинида^ρ, пропранолола, гуаноксана^ρ и амитриптилина. Дальнейшие исследования показали, что медленные метаболизаторы по CYP2D6 имеют в своем генотипе функционально-дефектные аллели гена CYP2D6. Это приводит к:

С каждым годом число обнаруженных аллельных вариантов гена CYP2D6, которые ассоциированы с изменением активности CYP2D6, растет. Медленные метаболизаторы по CYP2D6 среди представителей европеоидной расы часто имеют в генотипе функционально-дефектный аллельный вариант CYP2D6*4, среди монголоидов - CYP2D6*10, среди представителей негроидной расы - CYP2D6*17. У пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена CYP2D6 за счет снижения скорости биотрансформации ЛС-субстратов CYP2D6 отмечают более высокую максимальную концентрацию и площадь под кинетической кривой (AUC) ЛС, что может иметь клинические последствия (табл. 10-1). Так, например, частота аллельного варианта CYP2D6*4 среди пациентов, у которых регистрировали НПР трициклических антидепрессантов (гипотензия, седативный эффект, тремор, кардиотоксичность), была почти в 3 раза выше (20%) по сравнению с пациентами, у которых лечение этими препаратами протекало без осложнений (7%). Кроме того, известно, что некоторые функционально-дефектные аллельные варианты гена CYP2D6 ассоциированы с развитием индуцированных нейролептиками экстрапирамидных нарушений.

Обнаружена ассоциация функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6 с развитием НПР при лечении атомоксетином детей с синдромом дефицита концентрации внимания с гиперактивностью. Результаты генотипирования позволяют прогнозировать развитие НПР и более тщательно контролировать безопасность терапии при обнаружении функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6, соответствующем контроле концентрации препарата в плазме крови и коррекции его дозы в соответствии с последней.

Существование в генотипе пациента функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6 может сопровождаться не только увеличением риска развития НПР при применении ЛС, метаболизируемых этим изоферментом. Как было указано выше, в случае если в качестве ЛС используют пролекарство, а активный метаболит образуется именно под действием CYP2D6, эффективность препарата у больных будет низкой. Так, у пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена CYP2D6 менее выражен аналгетический эффект кодеина. Этот феномен объясняют ослаблением О-деметилирования препарата, во время которого образуется морфин. Обезболивающее действие трамадола также обусловлено активным метаболитом О-деметилтрамадолом, образующимся под действием CYP2D6. У пациентов с функционально-дефектными аллельными вариантами гена CYP2D6 образование О-деметилтрамадола снижено, что приводит к недостаточному аналгезирующему эффекту. Гомозиготы по функционально-дефектным аллельным вариантам гена CYP2D6 не отвечают на лечение трамадолом в 2 раза чаще, чем пациенты, не имеющие этих аллелей (46,7% против 21,6% соответственно).

Обнаруженные ассоциации функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6, сопровождающиеся изменениями фармакологического ответа на различные ЛС, представлены в табл. 10-1. Следует отметить, что в настоящее время определение функционально-дефектных аллельных вариантов гена CYP2D6 рекомендовано в некоторых странах (США, Великобритания) для выбора трициклических антидепрессантов (рис. 10-3), антипсихотических ЛС (рис. 10-4), а также режимов их дозирования.

Рис. 10-3. Алгоритм выбора антидепрессантов в зависимости от генетически детерминированной скорости биотрансформации CYP2D6 (Савельева М.И., 2009): БM - сверхактивные, или быстрые, метаболизаторы; ЭM - экстенсивные метаболизаторы; ММ - медленные метаболизаторы; ПМ - промежуточные метаболизаторы; N - нормальный эффект; АД - антидепрессанты; ТЦА - трициклические антидепрессанты

Рис. 10-4. Алгоритм выбора антипсихотических лекарственных средств в зависимости от генетически детерминированной скорости биотрансформации CYP2D6 (Савельева М.И., 2009): БM - сверхактивные, или быстрые, метаболизаторы; ЭM - экстенсивные метаболизаторы; ММ - медленные метаболизаторы; ПМ - промежуточные метаболизаторы; N - нормальный эффект

У быстрых метаболизаторов CYP2D6 (дупликация функциональных аллелей CYP2D6) при применении ЛС-субстратов CYP2D6 отмечают снижение терапевтической эффективности последних за счет ускорения биотрансформации, приводящей к уменьшению концентрации этих препаратов в плазме крови (см. табл. 10-1). Например, противорвотное ЛС ондансетрон у больных, являющихся быстрыми метаболизаторами по CYP2D6, не предотвращает рвоту во время химиотерапии. Именно поэтому таким пациентам необходимо назначение ЛС-субстратов CYP2D6 в больших дозах.

Следует отметить, что для множества ЛС-субстратов CYP2D6 ассоциация полиморфных маркеров гена CYP2D6 с изменением их фармакокинетики и развитием соответствующих фармакологических эффектов (развитие НПР или неэффективность лечения) нехарактерна или полученные в различных исследованиях результаты носят противоречивый характер. Например, есть данные об ассоциации функционально-дефектных аллелей CYP2D6 с высокими значениями максимальной концентрации β-адреноблокаторов бисопролола, карведилола и небиволола (метаболизируются CYP2D6), но неизвестно, существует ли связь между какимилибо полиморфными маркерами гена CYP2D6 и изменением частоты развития НПР или изменением параметров эффективности этих препаратов у пациентов с артериальной гипертензией. Аналогичную ситуацию отмечают и для некоторых других ЛС-субстратов CYP2D6, таких как блокатор Н₁-рецепторов хлорфенирамин^ρ, трициклический антидепрессант дезипрамин^¤, антипсихотические препараты хлорпромазин, зуклопентиксол, тиоридазин и антидепрессант из группы ингибиторов обратного захвата серотонина венлафаксин.

В настоящее время в ряде стран разрешено использовать генотипирование по CYP2D6 для персонализации применения антидепрессантов, антипсихотических ЛС, атомоксетина (препарата для лечения дефицита внимания и гиперактивности у детей), пергексилина^ρ (антиангинального препарата метаболического действия, зарегистрированного только в Австралии и Новой Зеландии).

CYP2С9 - основной фермент метаболизма антикоагулянтов (варфарина, аценокумарола), принимаемых внутрь, многих нестероидных противовоспалительных средств (за исключением ацетилсалициловой кислоты), в том числе селективных ингибиторов циклооксигеназы-2, ингибиторов ангиотензиновых рецепторов (лозартана и ирбесартана), сахароснижающих ЛС (производных сульфонилмочевины), фенитоина, флувастатина и др.

CYP2С9 обладает генетическим полиморфизмом. В настоящее время наиболее хорошо изучены однонуклеотидные полиморфизмы гена CYP2C9 - функционально-дефектные аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3. У пациентов, имеющих их в своем генотипе, отмечают уменьшение активности CYP2C9, что приводит к снижению скорости биотрансформации ЛС, метаболизируемых этим изоферментом, и повышению их концентрации в плазме крови. Именно поэтому гетерозиготы CYP2C9*1/*2, CYP2C9*1/*3 и гомозиготы CYP2C9*2/*2, CYP2C9*3/*3, CYP2C9*2/*3 фактически являются медленными метаболизаторами по CYP2C9. У этой категории пациентов чаще всего регистрируют НПР при применении ЛС, метаболизируемых CYP2C9. У них отмечают также снижение общего клиренса оральных антикоагулянтов варфарина и аценокумарола, что способствует увеличению риска развития чрезмерной гипокоагуляции и кровотечений при длительном применении этих ЛС по стандартному режиму дозирования. Таким пациентам для достижения терапевтического уровня гипокоагуляции, как правило, необходимы более низкие дозы вышеуказанных препаратов. Существует предположение, что генетический полиморфизм CYP2C9 в большей степени ассоциирован с изменением фармакокинетики и профиля безопасности варфарина, чем аценокумарола, что связано с различиями в биотрансформации этих двух средств. В настоящее время разработаны алгоритмы выбора режима дозирования варфарина на основе результатов генотипирования пациентов по CYP2C9 и ряду других генов (в частности, гену VKORC1). Индивидуальный режим дозирования варфарина в соответствии с результатами фармакогенетического тестирования можно рассчитать с помощью on-line-калькулятора (www.warfarindosing.org; рис. 10-5) или по аналогичному алгоритму с помощью модуля «Фармакогенетика» российской программы PharmSuite (бесплатно скачать программу можно на сайте www. pharmsuite.ru). Подобный подход к дозированию варфарина может способствовать ускорению подбора дозы для достижения целевых значений Международного нормализованного отношения, снижению риска возникновения геморрагических осложнений и частоты эпизодов чрезмерной гипокоагуляции.

Полиморфизм гена CYP2C9 также ассоциирован с изменением фармакокинетики нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), метаболизируемых этим изоферментом (диклофенак, ибупрофен, пироксикам, лорноксикам, теноксикам, флурбипрофен, целекоксиб). Есть данные о связи полиморфизма генов CYP2C9 и CYP2C8 с развитием желудочно-кишечных кровотечений при применении НПВС (за исключением ацетилсалициловой кислоты), но также известны результаты других исследований, не подтверждающие ее существование. Ряд авторов показали, что у здоровых добровольцев с генотипами CYP2C9*1/CYP2C9*2 и CYP2C9*1/CYP2C9*3 замедлен метаболизм таких сахароснижающих ЛС, как глибенкламид, толбутамид, натеглинид, глимепирид, что манифестирует снижением клиренса, увеличением AUC этих препаратов и в конечном итоге приводит к повышению риска развития гипогликемии. Это было продемонстрировано и у больных сахарным диабетом 2-го типа. Известно об ассоциации полиморфизма гена CYP2C9 с изменением фармакокинетики гиполипидемического средства из группы статинов флувастатина. У пациентов, имеющих в генотипе функционально-дефектные аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3, отмечают снижение общего клиренса петлевого диуретика торасемида^ρ. Это приводит к более интенсивному выведению калия, натрия и хлора с мочой. Обнаруженные ассоциации аллельных вариантов гена CYP2C9 с изменениями фармакологического ответа при лечении различными ЛС представлены в табл. 10-1. Полиморфизм гена CYP2C9 ассоциирован с изменением фармакокинетики антагониста ангиотензиновых рецепторов ирбесартана, что выражается в более выраженном снижении диастолического артериального давления при применении этого препарата у пациентов с артериальной гипертензией, являющихся медленными метаболизаторами по CYP2C9. Очевидно, что для повышения безопасности лечения таким больным необходимо либо подобрать ЛС, в метаболизме которых не принимает участие CYP2C9, либо назначить меньшую дозу соответствующего препарата. Исключением служит антагонист ангиотензиновых рецепторов лозартан (пролекарство), который под действием CYP2C9 превращается в печени в активный метаболит Е3174, обладающий антигипертензивным действием. Именно поэтому у таких пациентов регистрируют менее выраженный антигипертензивный эффект при применении лозартана.

Рис. 10-5. Панель ввода данных пациента on-line-калькулятора, представленного на сайте www.warfarindosing.org, для расчета дозы варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования

CYP2С19 метаболизирует 8,3% всех известных ЛС, в том числе антидепрессант имипрамин, транквилизатор диазепам, барбитураты, вальпроевую кислоту и противомалярийные препараты. Кроме того, CYP2C19 - основной фермент метаболизма ингибиторов H^{^, K^}-АТФазы, антиагреганта клопидогрела. Он участвует в метаболизме тамоксифена, фенитоина, тиклопидина и некоторых психотропных средств (трициклические антидепрессанты).

Для CYP2C19 характерен генетический полиморфизм. Медленными метаболизаторами среди представителей европеоидной расы чаще всего бывают люди, в генотипе которых присутствует функционально-дефектный аллель CYP2C19*2. Распространенность медленного метаболизма по CYP2С19 среди европеоидов составляет 2-5%, а среди представителей монголоидной расы - 15-20%. Применение у медленных метаболизаторов по CYP2С19 препаратов-субстратов этого изофермента может приводить к более частому возникновению НПР. Это особенно справедливо при применении таких ЛС с узкой терапевтической широтой, как трициклические антидепрессанты, диазепам и некоторые барбитураты (мефобарбитал^ρ, гексобарбитал). У медленных метаболизаторов по CYP2С19 применение противомалярийного препарата прокванила^ρ неэффективно, поскольку он превращается в активную форму при участии CYP2С19. Существуют данные о более высоком риске развития злокачественных новообразований головы и шеи у больных с медленным метаболизмом по CYP2С19. Кроме того, при применении тамоксифена у больных раком молочной железы длительность периода ремиссии заболевания больше у пациентов, в генотипе которых присутствует аллель CYP2C19*2. Был продемонстрирован более выраженный антиагрегантный эффект при применении тиклопидина у медленных метаболизаторов по CYP2C19, но различий в фармакокинетике препарата найдено не было.

Наибольшее число исследований посвящено связи полиморфизма гена CYP2C19 с изменением фармакокинетики и фармакодинамики блокаторов ингибиторов H⁺, K⁺-АТФазы. Фармакокинетические исследования у здоровых добровольцев показали, что AUC, значения максимальной концентрации омепразола, лансопразола и рабепразола достоверно выше у гетерозигот, и особенно гомозигот, по функционально-дефектному аллелю гена CYP2C19. Кроме того, обнаружено, что более выраженное подавление желудочной секреции при применении этих препаратов отмечено у больных с язвенной болезнью и рефлюкс-эзофагитом, являвшихся гетерозиготами и гомозиготами по этому же аллелю. Вместе с тем частота возникновения НПР при использовании ингибиторов H⁺, K⁺-АТФазы не зависела от генотипа по CYP2C19. В настоящее время разработан алгоритм выбора режима дозирования лансопразола на основе генотипирования пациентов по CYP2C19: при генотипе CYP2C19*1/*1 препарат рекомендуют назначать по 30 мг 3 раза в сутки, CYP2C19*1/*2 - по 15 мг 3 раза в сутки, CYP2C19*2/*2 - по 15 мг 2 раза в сутки. Подобный подход может способствовать повышению эффективности эрадикационной антихеликобактериальной терапии с применением лансопразола у больных с язвенной болезнью до 96%.

Полиморфизм гена CYP2C19 связан с изменением фармакокинетики и антиагрегантного действия пролекарства клопидогрела (активный метаболит 2-оксаклопидогрел образуется из клопидогрела под влиянием CYP2C19). У пациентов, в генотипе которых присутствовал функционально-дефектный аллельный вариант CYP2C19*2, отмечают угнетение образования активного метаболита клопидогрела, следствием чего служит менее выраженный антиагрегантный эффект. Есть данные, что у больных с острым коронарным синдромом и у пациентов после стентирования коронарных артерий аллельный вариант CYP2C19*2 ассоциируется с более плохим прогнозом развития тромботических осложнений, в том числе и фатальных. В настоящее время в инструкции по медицинскому применению клопидогрела указана необходимость при решении вопроса о начале лечения препаратом принимать во внимание полиморфизм гена CYP2C19. Некоторые авторы рекомендуют при обнаружении у больного аллельного варианта CYP2C19*2 использовать специальный режим дозирования клопидогрела, отличный от стандартного: по 600 мг в первые сутки с последующим переходом на поддерживающую дозу 150 мг/сут. Применение такого режима дозирования препарата разрешено только в США и пока не регламентировано в российской инструкции по медицинскому применению. Ожидают, что назначение подобного подхода будет способствовать преодолению генетически детерминированной резистентности к клопидогрелу у указанной категории пациентов.

Недавно был обнаружен аллельный вариант CYP2C19*17, ассоциированный с ускорением метаболизма ЛС-субстратов CYP2C19 (аллельный вариант повышенной активности). Его частота у шведов и эфиопов составляет 18%, а у китайцев - 4%.

Физиологическая функция бутирилхолинэстеразы - гидролиз ацетилхолина. Кроме того, этот фермент катализирует реакцию гидролиза деполяризующего миорелаксанта суксаметония йодида, широко применяемого в анестезиологии. С начала 50-х годов XX в. были получены сообщения о повышенной чувствительности к препарату, которая обусловлена сниженной активностью бутирилхолинэстеразы. Такой фермент в литературе часто называют атипичной псевдохолинэстеразой. В те же годы были описаны случаи продолжительной остановки дыхания (апноэ) при применении суксаметония йодида: вместо апноэ в течение 2-3 мин у пациентов с парадоксальной реакцией оно продолжалось 2 ч и более. В начале 70-х годов ХХ в. было высказано предположение о возможности аутосомнорецессивного моногенного наследования низкой активности бутирилхолинэстеразы. Генетические исследования последних лет позволили обнаружить ряд альтернативных аллелей гена бутирилхолинэстеразы. Повышенную чувствительность к суксаметония йодиду регистрируют только у гомозигот. Наиболее распространен аллельный вариант, кодирующий фермент со сниженной активностью. Он образован однонуклеотидной заменой, в результате которой синтезируется фермент атипичная бутирилхолинэстераза 1. У него в положении 70 аспарагинат заменен глицином. Гомозиготы по этому аллелю демонстрируют повышенную чувствительность к суксаметония йодиду. Распространенность подобных людей среди белого североамериканского населения составляет 1:3000. Другой аллель, приводящий к синтезу бутирилхолинэстеразы с резко сниженной активностью, образован инсерцией нуклеотидной последовательности в положении 117, в результате чего при транскрипции синтезируется укороченный белок, состоящий только из 22% длины аминокислотной последовательности нормальной бутирилхолинэстеразы. Подобную изоформу в литературе называют тихой бутирилхолинэстеразой. Гомозиготы по этому аллелю также обладают повышенной чувствительностью к суксаметония йодиду. Распространенность гомозигот среди белого североамериканского населения - 1:100 000. Еще один аллель кодирует фермент с активностью, сниженной вследствие замены Thr243Met. В литературе такую изоформу называют фторрезистентной бутирилхолинэстеразой 1. Гомозиготы по этому аллелю демонстрируют повышенную чувствительность к суксаметония йодиду, но период апноэ у них меньше - около 30 мин. Распространенность гомозигот среди белого североамериканского населения - 1:150 000. Частота обнаружения гетерозигот и гомозигот по аллелям, кодирующим различные изоформы бутирилхолинэстеразы со сниженной активностью, среди европейского населения составляет 2-4%. Фенотипирование фермента для определения его сниженной активности осуществляют с помощью так называемого дибукаинового теста, основанного на подавлении активности бутирилхолинэстеразы дибукаином в стандартных условиях. Результат теста представляют в виде дибукаинового числа - степени подавления фермента, выраженной в процентах. У людей с нормальной активностью бутирилхолинэстеразы оно равно 80%. У гомозигот по аллелям, кодирующим бутирилхолинэстеразу со сниженной активностью, дибукаиновое число равно 20%, у гетерозигот - 60%. Генотипирование по бутирилхолинэстеразе пока используют только в научных исследованиях. Более широкое внедрение этого метода в клиническую практику позволит точнее обнаруживать пациентов с повышенной чувствительностью к суксаметония йодиду и, таким образом, обеспечит высокую безопасность применения препарата.

Ассоциации аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты первой фазы биотрансформации, с неблагоприятными фармакологическими ответами представлены в табл. 10-1.

Таблица 10-1. Ассоциации аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты первой фазы биотрансформации, с неблагоприятными фармакологическими ответами

Изоферменты глюкуронилтрансферазы также обладают генетическим полиморфизмом. Давно известно о существовании наследственных нарушений глюкоуронирования билирубина. К ним относят синдром Жильбера и синдром Криглера-Найара. Синдром Жильбера - наследственное заболевание, наследуемое по аутосомно-рецессивному типу. Его распространенность среди населения составляет 1-5%. Причина развития синдрома Жильбера - существование в генотипе функционально-дефектных аллелей гена UGT1, образованных точечными мутациями (как правило, однонуклеотидными заменами), при этом образуется УДФглюкуронилтрансфераза, активность которой составляет 25-30% нормальной. Изменение глюкуронирования лекарственных препаратов у больных с синдромом Жильбера недостаточно изучено. Есть данные о снижении у них клиренса толбутамида, парацетамола и рифампицина. Была изучена также зависимость частоты возникновения побочных эффектов цитостатического препарата иринотекана от синдрома Жильбера. Иринотекан (СТР-11) - высокоэффективный цитостатик, ингибирующий топоизомеразу I и применяемый при колоректальном раке, резистентном к лечению фторурацилом. В печени под действием карбоксиэстераз он превращается в активный метаболит 7-этил-10-гидроксикамптотецин (SN-38). Основной путь метаболизма SN-38 - глюкуронирование с помощью UGT1A1. Показано, что частота развития НПР иринотекана, в частности диареи, достоверно выше у больных с синдром Жильбера. В настоящее время доказано, что аллельные варианты UGT1А1*1В, UGT1А1*26 и UGT1А1*60 ассоциированы с более частым возникновением гипербилирубинемии при применении иринотекана, что сопровождается низкими значениями AUC глюкуронида SN-38. В настоящее время определение аллельных вариантов гена UGT1А1 для выбора режима дозирования иринотекана одобрено FDA. При обнаружении аллельного варианта UGT1A*28 рекомендовано начинать лечение с минимальных доз препарата.

Есть данные о связи функционально-дефектных аллельных вариантов других генов, кодирующих изоферменты глюкуронилтрансферазы, с изменением фармакокинетики и фармакодинамики различных ЛС. У пациентов, в генотипе которых присутствует аллельный вариант UGT2B15*2, отмечают снижение клиренса лоразепама, что сопровождается более выраженным седативным эффектом. Генотип СС по полиморфному маркеру С802Т гена UGT2B7 ассоциирован с низкой скоростью глюкуронирования морфина, что сопровождается снижением концентраций морфин-6-глюкуронида и морфин-3-глюкуронида у больных с выраженным болевым синдромом. Тем не менее изменения обезболивающего действия морфина в зависимости от генотипа не описаны. Есть данные о том, что у пациентов с хронической сердечной недостаточностью и стенокардией напряжения, в генотипе которых присутствуют аллельные варианты UGT1A1*6, UGT2B7*3, отмечено ослабление глюкуронирования карведилола. Описано также уменьшение клиренса фуросемида у здоровых добровольцев с генотипом СС по С/Т полиморфизму в 3 интроне гена UGT1A1 и генотипом ТТ по полиморфному маркеру А-276Т гена UGT1A9.

N-ацетилтрансфераза катализирует реакцию ацетилирования ряда ЛС, в том числе изониазида, сульфаниламидов, прокаинамида, гидралазина и др. Выделяют два изофермента N-ацетилтрансферазы:

Изофермент NAT1 ацетилирует небольшое количество ариламинов, и для него не описано каких-либо альтернативных изоформ. Таким образом, основной фермент ацетилирования в организме человека - изофермент NAT2. Полиморфизм ацетилирования описан в 1960 г. в виде различия между пациентами по скорости ацетилирования противотуберкулезного ЛС изониазида. Тогда же было отмечено, что у людей с медленным ацетилированием в связи с накоплением (кумуляцией) изониазида чаще регистрируют полиневриты и гепатотоксичность. У пациентов с медленным ацетилированием период полувыведения препарата составляет 3 ч, в то время как при быстром ацетилировании - 1,5 ч. Развитие полиневритов связано с тем, что изониазид тормозит переход пиридоксина в активный кофермент дипиридоксинфосфат, который, в свою очередь, необходим для синтеза миелина. Индивидуальная скорость ацетилирования существенно не влияет на режимы дозирования ЛС при ежедневном приеме, но может уменьшать эффективность лечения при прерывистом применении изониазида. При его назначении в составе комбинированной терапии для лечения туберкулеза у больных с медленным ацетилированием закрытие полостей в легких происходит быстрее. Позднее было показано, что полиморфизм ацетилирования характерен не только для изониазида, но и для гидралазина, сульфаниламидов (в том числе сульфасалазина) и левосимедана^ρ. В дальнейшем было установлено, что в этот список входят несколько десятков других ЛС. Применение прокаинамида и гидралазина у больных с медленным ацетилированием значительно чаще вызывает поражение печени (гепатотоксичность). Есть данные о том, что у людей с быстрым и медленным ацетилированием ряд заболеваний протекает по-разному. У больных с медленным ацетилированием течение пневмонии и дизентерии более тяжелое и длительное, чем при быстром ацетилировании, что предполагает различный подход к проведению фармакотерапии. Подобные различия отмечают и при некоторых заболеваниях сердечно-сосудистой системы, гинекологических и глазных болезнях. Распространенность медленного ацетилирования варьирует от 10-15% у монголоидов до 50% у представителей европеоидной расы. Только с конца 80-х годов начали идентифицировать функционально дефектные аллельные варианты гена NAT2, ассоциированные с медленным ацетилированием. На сегодняшний день известно около 15 функционально дефектных аллелей гена NAT2.

Тип ацетилирования определяют как методами фенотипирования, так и генотипированием пациентов по NAT2. В качестве маркерных субстратов ацетилирования широко используют дапсон, сульфадимидин и изониазид. Отношение концентрации моноацетилдапсона к концентрации дапсона в плазме крови через 6 ч после введения препарата менее 0,35 характерно для больных с медленным ацетилированием, а более 0,35 - для пациентов с быстрым ацетилированием. Если в качестве маркерного субстрата используют сульфадимидин, то присутствие менее 25% сульфадимидина в плазме через 6 ч и менее 70% в моче, собранной через 5-6 ч после введения препарата, свидетельствует о фенотипе медленного ацетилирования.

В настоящее время определение типа ацетилирования в некоторых странах рекомендовано больным с туберкулезом и высоким риском развития НПР при использовании противотуберкулезных ЛС (гепатотоксичность, нейротоксичность). При обнаружении фенотипа медленного ацетилирования или соответствующего ассоциированного с ним генотипа рекомендуют более тщательно контролировать безопасность лечения изониазидом и пиразинамидом, начиная его с минимальных доз указанных ЛС (для изониазида начальная доза не должна превышать 200 мг/сут).

ТРМТ (тиопурин-S-метилтрансфераза) - фермент, катализирующий реакцию S-метилирования производных тиопурина - основного пути метаболизма цитостатических средств из группы антагонистов пурина: меркаптопурина, тиогуанина и азатиоприна. Меркаптопурин широко используют в составе комбинированной химиотерапии миелобластного и лимфобластного лейкозов, хронического миелолейкоза, лимфосаркомы и саркомы мягких тканей. Тиогуанин применяют в основном при острых лейкозах. Активность ТРМТ довольно вариабельна: 88,6% людей имеют высокую активность фермента, 11,1% - промежуточную, а у 0,3% активность ТРМТ весьма низкая или вовсе отсутствует. При этом известно, что у людей с низкой активностью ТРМТ обнаруживают повышенную чувствительность к меркаптопурину, тиогуанину и азатиоприну, которая манифестирует опасными для жизни гематотоксическим (лейкопения, тромбоцитопения, анемия) и гепатотоксическим эффектами. В условиях низкой активности ТРМТ метаболизм меркаптопурина идет по альтернативному пути - до высокотоксичного соединения тиогуанина нуклеотида. Чем меньше активность ТРМТ, тем больше концентрация последнего в плазме крови и тем сильнее выражены НПР меркаптопурина. Низкую активность ТРМТ наследуют по аутосомно-рецессивному типу, причем гомозиготы обладают низкой активностью фермента, а гетерозиготы - промежуточной. Обнаружен ряд функционально-дефектных аллельных вариантов гена ТРМТ, кодирующих изоформы с низкой активностью. Распространенность гомозигот по аллельным вариантам гена ТРМТ среди европеоидов составляет 3,7%, а среди представителей негроидной расы - 4,6%. Повышенная чувствительность к тиопуринам отмечена не только у гомозигот, но и у гетерозигот по функциональнодефектным аллельным вариантам гена ТРМТ. Таким образом, для обеспечения безопасности проводимой химиотерапии перед назначением тиопуринов необходимо определять активность фермента в эритроцитах пациента (фенотипирование ТРМТ) или определять генотип пациента по ТРМТ. Проведение фенотипирования и генотипирования пациентов по ТРМТ уже рекомендовано в некоторых странах. Разработана коррекция дозирования меркаптопурина в зависимости от активности ТРМТ или генотипа, при этом безопасные дозы для пациентов с низкой активностью фермента должны быть в 10-15 раз ниже среднетерапевтических. Аналогично этому рекомендована коррекция режима дозирования азатиоприна (применяют в качестве базисного противовоспалительного ЛС для лечения больных с системными заболеваниями соединительной ткани).

Ассоциации функционально-дефектных аллельных вариантов других генов, кодирующих ферменты второй фазы биотрансформации, с неблагоприятными фармакологическими ответами представлены в табл. 10-2.

Таблица 10-2. Ассоциации функционально-дефектных аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты второй фазы биотрансформации, с неблагоприятными фармакологическими ответами

Активность Р-гликопротеина зависит от множества факторов, основной из которых - полиморфизм кодирующего его гена MDR1. В настоящее время активно изучают клиническое значение нескольких однонуклеотидных замен в этом гене. Исследования последних лет показали, что наибольшее клиническое значение имеет полиморфный маркер С3435Т. Частота аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С3435Т значительно варьирует в различных этнических группах. Так, генотип ТТ обнаруживают с частотой от 4% у кенийцев до 36% у португальцев (у русских - 24%). Подобная однонуклеотидная замена не изменяет структуру белка, но снижает стабильность мРНК. Показано, что у индивидуумов с генотипом ТТ отмечено снижение концентрации Р-гликопротеина в двенадцатиперстной кишке, CD56 Т-лимфоцитах и почках. Очевидно, что это может приводить к более полному всасыванию и замедленному выведению ЛС-субстратов Р-гликопротеина и повышению частоты развития НПР. В результате у пациентов с ТТ-генотипом можно обнаружить более высокие концентрации ЛС-субстратов Р-гликопротеина в плазме крови. Показано, что у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий и генотипом ТТ, длительно принимавших дигоксин, его равновесная концентрация в плазме крови повышена, что сопровождается увеличением риска развития дигиталисной интоксикации.

В настоящее время проходят исследования по изучению связи полиморфного маркера С3435Т гена MDR1 с изменением фармакокинетики и фармакодинамики иммуносупрессоров циклоспорина и такролимуса. Некоторые авторы обнаружили, что после пересадки сердца у пациентов с генотипом ТТ AUC циклоспорина была достоверно выше, чем у больных с генотипами СТ и СС. Циклоспорин и такролимус, обладающие иммунодепрессивным действием, применяют в трансплантологии для профилактики отторжения трансплантата и реакции «трансплантат против хозяина» после пересадки почки, печени, костного мозга и сердца. Известно, что особенность фармакокинетики циклоспорина и такролимуса - значительная инидивидуальная вариабельность биологической доступности и узкий терапевтический индекс. Гликопротеин-Р принимает участие в процессах всасывания и выведения этих препаратов. Именно поэтому в настоящее время идут интенсивные исследования клинического значения полиморфного маркера С3435Т гена MDR1 при лечении циклоспорином и такролимусом. Было показано, что у пациентов с генотипом ТТ AUC циклоспорина была достоверно выше, чем у пациентов с генотипами СТ и ТТ, поэтому именно у первых больных доза циклоспорина, необходимая для поддержания оптимальной концентрации препарата в плазме крови (1000 мкг/л), должна быть снижена в 2 раза, по сравнению с пациентами, имеющими генотип СС. Аналогичные данные были получены и для такролимуса.

Субстрат Р-гликопротеина - лоперамид. Основное показание для применения этого препарата - симптоматическое лечение острой и хронической диареи. Механизм действия лоперамида связан с возбуждением опиатных рецепторов гладких мышц кишечника. Фармакокинетику препарата характеризует низкая биодоступность, связанная с плохим всасыванием (Р-гликопротеин энтероцитов способствует выведению лоперамида в просвет кишечника) и эффектом первого прохождения через печень (активная секреция Р-гликопротеином в желчь и биотрансформация). Проникновение препарата через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) затруднено функционированием Р-гликопротеина эндотелиоцитов, выкачивающим его обратно в просвет сосуда. Тем не менее НПР лоперамида (сонливость, головокружение, миоз и др.) связаны именно с его проникновением в ЦНС. Оказалось, что у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с индивидуумами с генотипами СТ и СС максимальная концентрация лоперамида достоверно выше. Кроме того, авторами было обнаружено, что именно у пациентов с генотипом ТТ был зарегистрирован более выраженный миоз при применении препарата (морфиноподобный эффект). Усиление проникновения ЛС через ГЭБ у носителей определенных генотипов по полиморфным маркерам гена MDR1 может приводить не только к повышению риска развития НПР со стороны ЦНС, но и, в случае если мишени ЛС расположены в головном мозге, - к повышению эффективности лечения. Показано, что эффективность терапии шизофрении при применении нейролептика бенперидола выше у пациентов, имеющих генотип ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, что, по-видимому, связано с более эффективным проникновением препарата через ГЭБ. Этим же феноменом, а не только изменениями фармакокинетики, объясняют большую эффективность противосудорожных и противорвотных ЛС у больных c генотипом ТТ, а также большую частоту развития НПР со стороны ЦНС при применении антидепрессантов (ортостатическая гипотензия) и антипсихотических препаратов (экстрапирамидные расстройства) у этой категории пациентов. Есть данные, что у пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 отмечают более высокую степень проникновения ЛС-субстратов Р-гликопротеина через плацентарный барьер, что может объяснить более высокий риск развития врожденных аномалий челюстно-лицевой области (волчья пасть, заячья губа) у детей матерей с генотипом ТТ, которым в ранние сроки беременности назначали ЛС-субстраты Р-гликопротеина.

В последние годы большое внимание уделяют роли полиморфизма гена MDR1 в изменении эффективности противовирусных ЛС из группы ингибиторов ВИЧпротеиназы, применяемых при ВИЧ-инфекции. Показано, что генотип ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 ассоциирован с более выраженным снижением числа вирусных частиц при применении нелфинавира.

Следует отметить, что результаты ассоциативных исследований по изучению полиморфизма гена MDR1 противоречивы и неоднозначны, поэтому генотипирование по MDR1 не регламентировано в инструкциях по медицинскому применению ЛС и ТКФС. Выяснение значения полиморфизма гена MDR1 для индивидуализации фармакотерапии требует проведения дополнительных клинических исследований. Тем не менее на основании результатов уже проведенных испытаний можно предположить, что при обнаружении функционально-дефектных аллельных вариантов гена MDR1:

Таким образом, изучение генетического полиморфизма Р-гликопротеина может оказаться перспективным методом индивидуализации фармакотерапии.

В настоящее время наиболее хорошо изучена связь генетического полиморфизма ОАТР-С (SLCO1B1) с изменением фармакокинетики и фармакодинамики гиполипидемических ЛС из группы статинов. В связи с угнетением захвата гепатоцитами статинов у пациентов с аллелями С и G по полиморфным маркерам A388G, Т521С и Т1628G соответственно при их применении отмечают ослабление гиполипидемического эффекта и одновременно увеличение риска поражения поперечнополосатой мускулатуры (рабдомиолиза). Кроме того, доказано, что определенные аллельные варианты гена ОАТР-С, кодирующего полипептид С (транспортер органических анионов ОАТР-С или SLCO1B1), ассоциированы со снижением его активности, приводящим к увеличению периода полувыведения, AUC и снижению клиренса ряда статинов (питавастатина^ρ, правастатина, розувастатина), сахароснижающего препарата репаглинида, а также нового гиполипидемического ЛС эзетимиба и его глюкуронида (активный метаболит).

Обнаруженные ассоциации аллельных вариантов генов транспортеров ЛС с неблагоприятным фармакологическим ответом представлены в табл. 10-3.

Таблица 10-3. Ассоциации функционально-дефектных аллельных вариантов генов, кодирующих транспортеры лекарственных средств, с неблагоприятными фармакологическими ответами

В настоящее время происходит активное изучение связи полиморфизма генов, кодирующих транспортеры органических анионов и катионов, с профилями эффективности и безопасности противоопухолевых ЛС.

Полиморфные маркеры в генах, кодирующих белки, которые служат фармакологическими мишенями для ЛС (рецепторы, ферменты, ионные каналы и др.), часто ассоциированы с изменением фармакодинамики этих препаратов. В качестве примера можно указать полиморфизм генов, кодирующих β₁- и β₂-адренорецепторы, ионные каналы, и генов, ответственных за синтез компонентов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, - АПФ и ангиотензиногена. К этой же группе фармакогенетических феноменов относят развитие гемолиза при применении некоторых ЛС у пациентов с недостаточностью глюкозо-6фосфатдегидрогеназы и так называемую злокачественную гипертермию при применении средств для наркоза и миорелаксантов.

Хорошо изучен полиморфный маркер Gly16Arg гена β₂-адренорецептора. По сравнению с гомозиготами GlyGly, у гомозигот ArgArg в 5 раз, а у гетерозигот GlyArg в 2 раза чаще отсутствует бронхолитический эффект при применении короткодействующих агонистов β₂-адренорецепторов (альбутерол^¤, сальбутамол) для устранения бронхоспазма. Это объясняют связью этого маркера с предрасположенностью к снижению плотности β₂-адренорецепторов в бронхах на фоне применения их короткодействующих агонистов. Распространенность гомозигот по этому полиморфному маркеру высока и в некоторых европеоидных популяциях достигает 40%, поэтому лечение бронхообструктивного синдрома у таких пациентов представляет серьезную проблему. Показано, что препараты выбора у таких больных - длительно действующие (пролонгированные) агонисты β₂-адренорецепторов (салметерол, формотерол), с изменением бронхолитического эффекта которых полиморфный маркер Gly16Arg гена β₂-адренорецептора не ассоциирован.

Полиморфизм гена, кодирующего β₁-адренорецептор (ADRB1), ассоциирован с изменением фармакодинамики β-адреноблокаторов. В настоящее время подобного рода исследования проведены у пациентов с артериальной гипертензией и хронической сердечной недостаточностью. Существуют две неравноценные замены в кодирующем регионе гена ADRB1.

Замена А145G в нуклеотидной последовательности гена ADRB1, приводящая к замене Gly49Ser в аминокислотной последовательности β₁-адренорецептора.

Замена G1165C в нуклеотидной последовательности гена ADRB1 , приводящая к замене Gly389Arg в аминокислотной последовательности β₁-адренорецептора.

Полиморфный маркер Gly49Ser локализован во внеклеточной части β₁-адренорецептора, а полиморфный маркер Gly389Arg - во внутриклеточной части, т.е. в центре связывания с G-белком. Частота обнаружения аллеля 49Gly приблизительно равна 15% и не имеет расовых различий.

Активно изучают связь полиморфного маркера Gly389Arg с изменением гипотензивного действия β-адреноблокаторов у больных с артериальной гипертензией. У пациентов, имеющих в генотипе аллель Arg389, отмечено более интенсивное снижение систолического и диастолического артериального давления как при однократном, так и при длительном применении β-адреноблокаторов. У больных с хронической сердечной недостаточностью присутствие в генотипе аллеля 389Arg ассоциировано с изменением эффективности β-адреноблокатора метопролола. У таких больных в большей степени повышается фракция выброса левого желудочка, уменьшается конечный систолический и диастолический объем, а также снижается смертность.

Полиморфизм гена ACE связан с присутствием [вставка - insertion (I)] или отсутствием [выпадение - deletion (D)] фрагмента из 287 пар нуклеотидных оснований и получил название I/D полиморфизма. Наибольшая активность ACE в плазме крови отмечена у людей с генотипом DD, наименьшая - у пациентов с II -генотипом. Пациенты с ID -генотипом занимают промежуточное положение. Данные об ассоциации I/D полиморфизма с изменением антигипертензивного действия ингибиторов АПФ и блокаторов ангиотензиновых рецепторов противоречивы, как и информация об ассоциации I/D полиморфизма с изменением эффективности ингибиторов АПФ у больных с хронической сердечной недостаточностью. Есть данные о том, что ингибиторы АПФ не оказывают положительного влияния на функцию почек (нефропротективный эффект) при недиабетических заболеваниях почек у больных с DD-генотипом, но эффективны у больных с II- и ID-генотипом. Известно также об ассоциации I/D полиморфизма с изменением эффективности ЛС других групп. Установлено, что достоверное увеличение фракции выброса левого желудочка, а также снижение конечного систолического и диастолического объема у больных с хронической сердечной недостаточностью на фоне длительного лечения с включением спиронолактона происходит только у пациентов с генотипами II и ID, но не DD. В другом исследовании было показано, что в группе больных, не принимающих β-адреноблокаторы, смертность была выше у пациентов с генотипом DD. В группе пациентов с хронической сердечной недостаточностью, принимающих β-адреноблокаторы, смертность была ниже по сравнению с группой пациентов, не принимающих эти препараты, и не различалась в зависимости от генотипа по ACE. У больных с ИБС с генотипами II и ID флувастатин достоверно лучше вызывал регресс коронарографических изменений по сравнению с пациентами с генотипом DD. У больных с эректильной дисфункцией и генотипом DD эффективность силденафила достоверно ниже, чем у пациентов с генотипами ID и II. Окончательное значение I/D полиморфизма для фармакотерапии требует серьезного уточнения.

Идиопатический синдром удлиненного интервала Q-T - моногенное наследственное заболевание. В его основе лежит генетический полиморфизм ионных каналов, характеризующийся удлинением интервала Q-T на ЭКГ и случаями внезапной смерти вследствие развития пируэтной желудочковой тахикардии, которая часто может быть спровоцирована приемом некоторых ЛС. В зависимости от наличия или отсутствия глухоты и типа наследования в настоящее время различают две наследственные формы синдрома удлиненного интервала Q-T: синдром Романо-Уорда и Джеруэлла-Ланге-Нильсена. Синдром Романо-Уорда не сопровождается нарушением слуха и характеризуется аутосомно-доминантным типом наследования. Для синдрома Джеруэлла-Ланге-Нильсена характерны двусторонняя нейросенсорная тугоухость и аутосомно-рецессивный тип наследования. Распространенность синдрома Романо-Уорда составляет 1:10 000-1:15 000. Синдром Джеруэлла-Ланге-Нильсена регистрируют крайне редко; точных данных о его распространенности в литературе не обнаружено. Синдром удлиненного интервала Q-T ассоциируется с функционально-дефектными аллельными вариантами генов, кодирующих калиевые каналы и некоторые другие белки, а также регулирующих трансмембранные токи ионов калия и натрия (KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1, NOS1A5, NDRG4, GINS3, PLN, RNF207, LITAF, LIG3, RFFL).

ЛС, перечисленные в табл. 10-4, способны удлинять интервал Q-T и, таким образом, вызывают повышение риска возникновения опасных для жизни аритмий у больных с синдромом удлиненного интервала Q-T. Именно поэтому они абсолютно противопоказаны таким пациентам. По-видимому, особенно опасно применять отдельные ЛС только при определенных вариантах синдрома удлиненного интервала Q-T. Показано, что применение у больных с синдромом Джеруэлла-Ланге-Нильсена хинидина, цизаприда^¤ и терфенадина^¤ достоверно повышает риск возникновения пируэтной желудочковой тахикардии. К факторам риска развития полиморфной желудочковой тахикардии при применении ЛС у этой категории пациентов относят:

Таблица 10-4. Лекарственные средства, способные вызвать удлинение интервала Q-T и спровоцировать развитие полиморфной желудочковой тахикардии

В настоящее время активно изучают связь полиморфизма генов системы HLA с развитием аллергических реакций при использовании различных ЛС. Аллельный вариант HLA-B*1502 в монголоидных этносах ассоциируется с развитием синдрома Стивенса-Джонсона при применении противосудорожного препарата карбамазепина. В США в инструкции по медицинскому применению карбамазепина указано: больным, принадлежащим к монголоидной расе, рекомендовано фармакогенетическое тестирование, направленное на обнаружение аллельного варианта HLA-B*1502. Его результаты позволяют идентифицировать больных с очень высоким риском развития синдрома Стивенса-Джонсона при использовании препарата, что служит основанием для отказа от его применения.

Другой аллельный вариант HLA-B*5701 ассоциируется с развитием гиперчувствительности замедленного типа при применении ингибитора ВИЧ-протеиназы абакавира. Результаты фармакогенетического тестирования позволяют идентифицировать больных с очень высоким риском развития гиперчувствительности замедленного типа при применении абакавира, что служит основанием для отказа от применения этого ЛС. Все это регламентировано в инструкции по медицинскому применению препарата. Кроме того, есть данные, что аллельный вариант HLA-B*5701 также связан с развитием аллергического гепатита при применении антибиотика пенициллинового ряда флуклоксациллина^¤.

С точки зрения фармакогенетики наибольшее клиническое значение имеет полиморфный маркер G1691A гена, кодирующего фактор свертывания V (мутация типа Лейден), который ассоциирован с высоким риском тромбозов и тромбоэмболий (в том числе тромбоэмболии легочной артерии) при применении комбинированных оральных контрацептивов. Есть основания полагать, что женщинам с тромботическими осложнениями в анамнезе и (или) отягощенным семейным анамнезом по тромбозам рекомендовано проведение фармакогенетического тестирования с целью определения генотипа по полиморфному маркеру G1691A гена фактора свертывания V. Его результаты позволяют обнаружить женщин с очень высоким риском развития тромботических осложнений при применении комбинированных оральных контрацептивов, что служит основанием для отказа от их применения.

Злокачественная гипертермия - заболевание, возникающее при применении местных анестетиков, средств для ингаляционного наркоза и суксаметония йодида. Для нее характерен аутосомно-доминантный тип наследования. Клиническая картина злокачественной гипертермии складывается из лихорадочного синдрома, сопровождаемого нарушениями ритма сердца и острой почечной недостаточностью, а также некротических изменений поперечнополосатой мускулатуры. В основе патогенеза заболевания лежит увеличение концентрации внутриклеточного кальция, индуцированное вышеперечисленными ЛС. В последнее время стало известно, что с возникновением злокачественной гипертермии связаны некоторые аллельные варианты гена, кодирующего рианодиновые рецепторы первого типа (RYR1) и расположенного в локусе 19q13.1. На сегодняшний день обнаружено более 40 аллельных вариантов гена RYR1, ассоциированных с развитием злокачественной гипертермии. Обсуждается вопрос о целесообразности идентификации этих аллелей у всех пациентов, у которых предполагают применение местных анестетиков, средств для ингаляционного наркоза или суксаметония йодида.

Еще одна задача клинической фармакогенетики - изучение изменений фармакологического ответа при генетических (наследственных) заболеваниях. Характерные примеры последних - недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, порфирия и врожденные метгемоглобинемии.

Полиморфные маркеры генов, кодирующих ферменты, ответственные за защиту от окисления сульфгидрильных групп белков клеточных мембран (например, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу) под действием некоторых ЛС, могут приводить к изменению фармакодинамики этих препаратов. У пациентов с функциональнодефектными аллельными вариантами гена в результате дефицита глюкозо-6фосфатдегидрогеназы при применении некоторых ЛС возникает гемолиз эритроцитов (табл. 10-5). Для понимания этого явления необходимо представлять физиологическую роль глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Этот фермент катализирует переход глюкозо-6-фосфата в фосфоглюконат. Коферментом реакции выступает НАДФ, превращающийся в восстановленный НАДФН^{^. НАДФН^} - важный донор электронов в реакции превращения окисленного глутатиона в восстановленный под действием глутатионредуктазы. Образующийся восстановленный глутатион - активный антиоксидант, защищающий белки клеточных мембран от окисления. В условиях недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы образование НАДФН⁺ снижено, и следовательно, возникает дефицит восстановленного глутатиона. В связи с этим при применении ЛС, обладающих окислительными свойствами (см. табл. 10-5), вследствие отсутствия защиты от окисления сульфгидрильных групп белков клеточных мембран эритроцитов происходит их гемолиз. У больных с недостаточностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы он возникает не только при использовании ЛС, но и при употреблении некоторых продуктов питания, в частности конских бобов (Vicia faba). Именно поэтому подобное заболевание называют фавизмом. Наследование функционально-дефектных аллелей гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, обусловливающих ее недостаточность, сцеплено с полом. Обнаружено более 50 подобных аллелей, но можно выделить две основные формы недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы:

Негроидная форма характеризуется ускоренным разрушением глюкозо-6фосфатдегидрогеназы, поэтому гемолизу подвергаются только старые эритроциты (возраст более 55 дней). Острый гемолиз отмечают только при первом применении ЛС длительностью несколько дней. При продолжении его использования возникает лишь хронический слабовыраженный гемолиз эритроцитов. Средиземноморская форма характеризуется существованием дефектной глюкозо6-фосфатдегидрогеназы со сниженной активностью. В этом случае гемолизу подвергаются как молодые, так и старые эритроциты. При этой форме заболевания отмечают выраженный гемолиз эритроцитов, возникающий при первом приеме ЛС и продолжающийся в течение всего периода его применения. Распространенность недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы варьирует в различных популяциях от 1-15 до 30-40% (Азербайджан). В европейских популяциях недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы регистрируют крайне редко.

Таблица 10-5. Лекарственные средства, провоцирующие гемолиз эритроцитов при недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Порфирия - наследственное заболевание, в основе которого лежит повышение активности синтетазы δ-аминолевуленовой кислоты, что сопровождается избыточной продукцией этой кислоты и порфобилиногена. Различают три формы порфирии, которые наследуются по аутосомно-доминантному типу. Клиническая картина обострения заболевания складывается из резких абдоминальный болей, полиневрита, психических нарушений и эпилептических припадков. Некоторые ЛС могут провоцировать обострение порфирии (табл. 10-6). Механизм этого феномена, по-видимому, связан с повышением активности синтетазы δ-аминолевуленовой кислоты под действием таких препаратов, как барбитураты, сульфаниламиды, эстрогены и гризеофульвин. Именно поэтому фармакотерапию больных с порфирией следует проводить с особой осторожностью.

Таблица 10-6. Опасные и безопасные лекарственные средства для больных с порфирией

Фармакогенетический тест - идентификация конкретных генотипов, ассоциированных с изменением фармакологического ответа. В основе таких тестов лежит ПЦР. В качестве источника ДНК (генетического материала) используют кровь больного или соскоб буккального эпителия. Сбор биологического материала у больного не требует предварительной подготовки. Результаты фармакогенетического теста представлены идентифицированными генотипами больного по тому или иному полиморфному маркеру. Как правило, врач-клинический фармаколог интерпретирует результаты фармакогенетического теста, т.е. формулирует рекомендации по выбору ЛС и его режима дозирования для конкретного пациента. Применение таких тестов позволяет заранее прогнозировать фармакологический ответ на применение препарата. Это позволяет подойти к выбору ЛС и режима его дозирования индивидуально, а иногда и выбрать тактику ведения пациентов. Предполагают, что внедрение новых технологий тестирования, основанных на микрочипах (ДНК-чипы), позволит определять не отдельный полиморфизм конкретного гена, а проводить тотальный скрининг всех или почти всех аллельных вариантов в геноме человека, ассоциированных с изменением фармакологического ответа на прием ЛС, что, собственно, и является задачей фармакогеномики. При этом станет возможным составление так называемого генетического паспорта пациента. С этих позиций фармакогенетику, а в будущем и фармакогеномику, в литературе рассматривают как перспективные направления персонализированной медицины будущего.

В настоящее время фармакогенетическое тестирование в клинической практике целесообразно проводить в следующих ситуациях:

В настоящее время фармакогенетика - активно развивающаяся наука: примерно на 50% всех применяемых в клинической практике ЛС уже есть генетическая информация; в отношении них проведены исследования ассоциаций. Создан крупнейший интернет-ресурс по клинической фармакогенетике (www.pharmgkb.org), на котором собраны результаты всех проведенных фармакогенетических исследований. Их удобный поиск возможен как по международному непатентованному названию ЛС, так и по названию гена.

Тем не менее далеко не всякая генетическая информация о ЛС может лечь в основу фармакогенетического теста, который можно будет применять в клинической практике. Для этого тест должен отвечать нижеперечисленным требованиям.

Существование выраженной связи обнаруженного аллельного варианта того или иного гена с изменением фармакологического ответа (развитием НПР, недостаточной или высокой эффективностью).

Фармакогенетический тест должен с высокой чувствительностью и специфичностью прогнозировать фармакологический ответ (развитие НПР, недостаточная или высокая эффективность).

Должен быть разработан алгоритм применения ЛС в зависимости от результатов фармакогенетического тестирования (выбор ЛС и режима его дозирования).

Обнаруженный аллельный вариант должен встречаться в популяции с частотой не менее 1% (по мнению ряда авторов - не менее 10%).

Должны быть доказаны преимущества применения ЛС с использованием результатов фармакогенетического теста по сравнению с традиционным подходом (повышение эффективности, безопасность фармакотерапии и экономическая рентабельность подобного подхода).

Фармакогенетический тест должен быть доступен в лабораторной практике.

В настоящее время этим требованиям удовлетворяет очень малое число фармакогенетических тестов, применение которых в клинической практике разрешено в большинстве странах мира и регламентировано в инструкциях и ТКФС, описанных выше.

Формирование у врачей (в том числе и медицинских генетиков) знаний в области фармакогенетики позволит им использовать результаты фармакогенетических исследований или тестирования в будущей профессиональной деятельности для проведения эффективной и безопасной фармакотерапии. Преимущества использования некоторых фармакогенетических тестов перед традиционными подходами доказаны в рандомизированных исследованиях, т.е. можно говорить о доказательной фармакогенетике. Применение в клинической практике индивидуального подхода к выбору ЛС и режимов их дозирования - не только возможность увеличения эффективности и безопасности фармакотерапии. Это реальный инструмент для повышения приверженности больного лечению и, в какой-то степени, доверия к лечащему врачу.

Крысюн В.И., Бажора Ю.И. Фармакогенетические основы взаимодействия организма и лекарств. - Одесса: Одесский медуниверситет, 2007. - 164 с.

Середенин С.Б. Лекции по фармакогенетике. - М.: МИА, 2004. - 303 с.

Скакун Н.П. Основы фармакогенетики. - Киев: Здоровье, 1981. - 259 с.

Соради И. Основы и педиатрические аспекты фармакогенетики. - Будапешт: Издательство Академии наук Венгрии, 1984. - 248 с.

Сычев Д.А., Игнатьев И.В., Раменская Г.В., Кукес В.Г. Клиническая фармакогенетика. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 248 с.

Cohen N. Pharmacogenomics and Personalized Medicine Nadine. - Humana Press, 2010. - 528 p.

Innocenti F. Pharmacogenomics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). - Humana Press, 2005. - 224 p.

Rothstein M.A. Pharmacogenomics. - New Jersey: Willyliss, 2003.- 368 p.

Weber W.W. Pharmacogenetics. - Oxford: Oxford University Press, 1997.

Yan Q. Pharmacogenomics in Drug Discovery and Development. - Humana Press, 2010. - 504 р.

Иммуногенетика - наука, изучающая генетические основы иммунной системы организма. Иммунная система предназначена для защиты организма от внешней (инфекционные агенты) и внутренней (онкологическое перерождение клеток) биологической агрессии. Для этого на протяжении эволюции сформировались структуры и механизмы, обеспечивающие распознавание чужеродных и собственных измененных макромолекул (антигенов), удаление антигенов и содержащих их клеток из организма и запоминание контакта с определенными антигенами, что обусловливает их ускоренное удаление при повторном проникновении в организм.

Изложить генетические основы иммунитета невозможно, не остановившись на особенностях организации и функционирования иммунной системы у человека. Структурно она представлена комплексом специализированных лимфоидных органов и диссеминированных клеток, выполняющих иммунологические функции. Защитная реакция организма на присутствие не свойственных ему макромолекул складывается из воспалительной реакции, неспецифичной в отношении конкретных агентов (открытой Мечниковым - естественный иммунитет), и специфического иммунного ответа, направленного против конкретных антигенов. Последний формируется только в ответ на агрессию, поэтому его называют адаптивным иммунным ответом.

Важная роль воспалительной реакции состоит в привлечении к месту внедрения чужеродного агента клеток иммунной системы и их активации (реакция воспаления). Макрофаги, моноциты и другие клетки естественного иммунитета блокируют, поглощают посредством фагоцитоза и разрушают микробные и опухолевые клетки. В ходе воспалительной реакции активируются некоторые гуморальные системы защиты, среди которых особенно важна система комплемента. Ее белки могут разрушать микроорганизмы, перфорируя их мембраны. Кроме того, как следует из названия этой системы защиты, она обеспечивает привлечение фагоцитов и других клеток, покрывающих собой поверхность микробной клетки.

Неспецифические факторы иммунитета обусловливают включение адаптивной реакции лимфоцитов, особенность которой состоит в вовлечении в иммунный ответ только тех клонов лимфоцитов, которые несут рецепторы, распознающие не свойственные организму антигены. Нативный антиген распознают только иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов. Т-лимфоциты, составляющие наряду с ними основу адаптивного иммунного ответа, определяют только антиген или его фрагменты, встроенные в специализированные молекулы поверхности клеток или молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC - Major Histocompatibility Complex) I класса. Эти молекулы присутствуют на поверхности почти всех клеток организма. В норме молекулы МНС связываются с небольшими пептидами длиной 8-10 аминокислотных остатков. Такой комплекс мигрирует к поверхности клетки и представляет пептид вовне. Если последний происходит из собственных белков организма, то он не индуцирует развитие иммунного ответа, но если пептид образуется в результате распада чужеродного антигена, он стимулирует реакцию иммунной системы и в первую очередь Т-лимфоцитов. Таким образом, В-лимфоциты - предшественники антителообразующих клеток - распознают свободный антиген, а предшественники Т-лимфоцитов - антиген, связанный с молекулами МНС (рис. 11-1).

В ходе иммунного ответа В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, которые секретируют антитела. Антитела - молекулы иммуноглобулинов, представленные растворимой формой антигенраспознающего рецептора В-лимфоцитов. Главная часть мембранного рецептора для антигена В-лимфоцитов - молекула иммуноглобулина. Она состоит из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) цепей, которые построены из гомологичных участков, называемых доменами. N-концевые домены цепей обоих типов, называемые V-доменами, отличаются высокой вариабельностью. Другие домены (один в легкой цепи и несколько - в тяжелых цепях) называют константными (С). Они отвечают за связывание с компонентами комплемента и рецепторами на клеточных мембранах, а также выполняют другие функции. Константные домены также определяют основные типы тяжелых и легких цепей.

Существует пять типов тяжелых цепей - γ, μ, α, δ и ε, определяющих соответственно пять основных классов иммуноглобулинов - IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Незрелые В-лимфоциты продуцируют только IgM, но во время их созревания происходит перестройка генов тяжелых цепей, в результате которой образуются четыре оставшихся класса иммуноглобулинов. Все они отличаются аминокислотной последовательностью, зарядом и содержанием углеводных остатков. Каждый из классов иммуноглобулинов в основном локализуется в определенных частях тела и реагирует на определенный тип инфекционного агента. Гены, кодирующие Н-цепи, локализованы на хромосоме 14.

Для легких цепей иммуноглобулинов характерны два типа - κ и λ, гены которых находятся в хромосомах 2 и 22 соответственно.

Перед изложением событий, происходящих с генами иммуноглобулинов при созревании В-лимфоцитов, необходимо сделать два замечания. Во-первых, перестройка и другие изменения этих генов происходят в соматических клетках организма и не затрагивают клетки зародышевого пути (генетика соматических клеток). Во-вторых, в процессе этих превращений происходит количественное и качественное изменение генома лимфоцитов, что отличает их от других соматических клеток организма человека, геном которых на протяжении индивидуального развития количественно не изменяется.

Рис. 11-1. Участие клеток иммунной системы в иммунном ответе: антигенпредставляющие клетки (АПК) обрабатывают антиген (АГ) и презентируют Т-лимфоцитам с участием молекул МНС АПК и корецепторов CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов. Рецепторы В-лимфоцитов способны связывать свободный АГ и презентировать его Т-хелперам. Для активации лимфоцитов, помимо связывания АГ, требуется дополнительная стимуляция, которая осуществляется в процессе контактных взаимодействий с АПК (в случае В-лимфоцитов с Т-хелперами), а также при действии цитокинов. Активированные лимфоциты пролиферируют и дифференцируются в эффекторные клетки. CD4⁺ Т-лимфоциты дифференцируются в два типа хелперов - Th1 и Th2, которые секретируют наборы цитокинов, указанные на рисунке. Th1 активируют макрофаги, что выражается в усилении фагоцитоза бактерий, разрушении измененных клеток организма и секреции цитокинов. Th2 способствуют дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки, секретирующие антитела. Антитела связывают свободные и связанные с мембранами АГ, способствуя их расщеплению. CD8⁺ Т-лимфоциты при участии ИЛ-2 пролиферируют и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты, которые разрушают клетки, несущие на поверхности антиген. При дифференцировке лимфоцитов в процессе иммунного ответа, кроме эффекторных клеток, образуются Т- и В-клетки памяти

Как уже отмечено, в геноме человека обнаружено три пучка (кластера) генов, определяющих структуру иммуноглобулинов. Два кластера детерминируют κ- и λ-цепи, а третий кластер - тяжелые цепи иммуноглобулинов. Каждый кластер включает несколько групп генов: серию V (вариабельных) генов (несколько сотен для Н- и κ-цепей), серию D (разнообразных) генов в кластере генов для Н-цепей, которая находится на расстоянии примерно 10 тыс. пар нуклеотидов от 3?-конца серии V-генов, серию J (соединяющих) генов и, наконец, С (постоянные) гены.

В кластерах генов для κ- и λ-цепей присутствует по одному С-гену, а в кластере генов для Н-цепей - серия С-генов, определяющих основные классы иммуноглобулинов.

Все три кластера генов содержатся в соматических клетках и не способны обеспечить синтез иммуноглобулинов, прежде чем не произойдет их перестройка, которая приведет к созданию зрелых генов иммуноглобулинов. В норме она происходит только при созревании лимфоцитов. На рис. 11-2 представлена схема перестройки в кластере генов иммуноглобулинов, приводящей к созданию зрелых V-генов.

Рис. 11-2. Принципиальная схема перестройки (реаранжировки) генов антигенраспознающих рецепторов лимфоцитов. Линии между верхними и нижними рядами генов (отражающими рецепторные гены в зародышевом и перестроенном виде) обозначают сближение ранее пространственно разобщенных генетических сегментов

Во время перестройки для легких цепей отбирается специфическая комбинация из отдельных V- и J-сегментов, а для тяжелых цепей иммуноглобулинов - из V-, J- и D-сегментов кластеров. Это сопровождается делецией последовательностей ДНК, разделяющих отдельные V-, J- и D-сегменты, прежде чем они транскрибируются в мРНК. Делетирование, по крайней мере частично, обеспечивают рекомбиназы. Их кодируют гены RAG1 и RAG2. Они инициируют разрывы в двойной нити ДНК в специфических последовательностях, которые фланкируют V- и D-сегменты. После делеции остается по одному V-, J- и D-сегменту, которые соединяют лигазы. Процесс вырезания и соединения сегментов генов иммуноглобулинов называют соматической рекомбинацией. Последовательность событий перестройки генов иммуноглобулинов показана на рис. 11-3. Перестройка генов сначала идет в одной хромосоме. Если она прошла успешно, то во второй хромосоме процесс блокируется, благодаря чему достигается аллельное исключение, т.е. присутствие в одной клетке только одного типа иммуноглобулинов. В том случае, когда в результате перестройки образуются V-гены с неправильной рамкой считывания, перестройка генов происходит в другой хромосоме. Поскольку возможны различные комбинации отдельных V-, J- и D-сегментов, в результате перестройки возникает большое число различных зрелых V-генов и соответственно молекул антител. В процессе сборки V-, J- и D-генов возникают небольшие вариации в позициях соединяемых генов. Кроме того, возможна делеция некоторого числа нуклеотидов или, наоборот, их добавление в местах соединения сегментов. Это еще больше увеличивает разнообразие аминокислотных последовательностей антител.

Рис. 11-3. Перестройка (реаранжировка) рецепторных зародышевых генов. V,J - генетические участки. Цифры на двух верхних схемах - число нуклеотидов в отрезках генома, вовлекаемых в формирование петли, на 3-й и 4-й схемах - участки, прилегающие к V- и J-генам, которые вовлекаются в формирование Р-последовательностей. Стрелками указаны места нематричной подстройки нуклеотидов (N-вставок), катализируемой терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазой (ТdТ)

После того как чужеродный антиген простимулирует В-лимфоциты, происходит их вторичная дифференциация за счет возникающих с высокой частотой соматических мутаций в генах иммуноглобулинов в каждом митотическом делении лимфоцитов. Это вызывает небольшие вариации в последовательности нуклеотидов ДНК, кодирующей иммуноглобулины, и следовательно, в их способности связывать пептиды. Разнообразие антител, продуцируемых зрелыми В-лимфоцитами, возрастает еще больше.

Дальнейшее увеличение разнообразия происходит в результате случайного комбинирования тяжелых и легких цепей в процессе сборки иммуноглобулинов. Все перечисленные механизмы увеличения спектра антител суммарно обеспечивают существование 10¹⁰-10¹⁴ разных типов антител, продуцируемых В-лимфоцитами.

Если гуморальный иммунитет обеспечивают В-лимфоциты, то клеточный - Т-лимфоциты. Как и В-лимфоциты, эти клетки проходят начальные этапы дифференцировки в костном мозге. Для дальнейшей дифференцировки они должны попасть в тимус. Т-лимфоциты отличаются заметным разнообразием. Как было сказано ранее, для образования цитотоксических Т-лимфоцитов необходимо, чтобы фрагмент антигена, связанный антигенпредставляющими клетками с молекулой МНС (макрофаги, В-лимфоциты, дендритные клетки), был представлен Т-лимфоцитам. Распознавание антигена обеспечивает клоноспецифический рецептор неиммуноглобулинового происхождения, который экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов. В результате распознавания чужеродного антигена последние активируются и дифференцируются в регуляторные (два типа хелперов и супрессоры) или эффекторные (киллеры, эффекторы гиперчувствительности замедленного типа) клетки. Основные структуры Т-лимфоцитов, распознающие чужеродный антиген, - их рецепторы. Во многом они сходны с иммуноглобулинами В-лимфоцитов. Рецепторы Т-лимфоцитов должны связываться с разно образными чужеродными пептидами. Приблизительно в 90% случаев они представлены гетеродимерами α- и β-цепей, в 10% - гетеродимерами γ- и δ-цепей. Гены, кодирующие α- и δ-цепи, локализованы на хромосоме 14, а гены β- и γ-цепей - на хромосоме 7. Образование рецепторов Т-лимфоцитов во многих отношениях сходно с таковым тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Для каждой цепи рецепторов в зародышевых клетках существуют множественные копии V-, D- и J-генов, между которыми при созревании Т-лимфоцитов происходит соматическая рекомбинация. В результате вариации позиций, занимаемых генами, и дополнительного синтеза коротких нуклеотидных последовательностей в местах соединения сегментов также возникает изменчивость. Во время митотических делений Т-лимфоцитов гипермутабельность генов, кодирующих рецепторы, отсутствует. Вероятно, это следствие требования к Т-лимфоцитам, состоящего в том, чтобы их рецепторы не реагировали на пептиды собственного организма, представленные молекулами МНС.

С рецептором Т-лимфоцитов нековалентно связан комплекс CD3⁺, участвующий в передаче внутрь клетки сигнала о связывании рецептора с антигеном. Кроме того, при действии антигена с рецептором устанавливает связь комплекс CD4⁺ или CD8⁺, который обладает сродством к МНС II класса и МНС I класса соответственно. CD4⁺-комплекс более характерен для Т-хелперов, а CD8⁺ - для Т-киллеров.

На начальных этапах иммунного ответа антигенпредставляющие клетки взаимодействуют с Т-хелперами. Последние, распознав антигенсодержащий комплекс, входят в контактное взаимодействие с антигенпредставляющими клетками. Это обеспечивает дополнительную стимуляцию Т-хелперов. Кроме того, антигенпредставляющие клетки выделяют ряд цитокинов. Все это обусловливает активацию Т-лимфоцитов, их активную пролиферацию и созревание в эффекторные клетки. Т-киллеры для созревания должны получить стимуляцию от Т-хелперов и цитокинов. Цитотоксические лимфоциты способны распознать чужеродные или собственные измененные клетки и осуществить их иммунный цитолиз. Следует подчеркнуть, что после специфического распознавания чужеродного антигена немногочисленная группа неактивных лимфоцитов активируется, размножается и дифференцируется в эффекторные клетки, способные убивать или удалять клеткиносители антигена.

Различают несколько типов наследственных иммунодефицитных состояний. Один из них связан с нарушением функций фагоцитоза иммунокомпетентными клетками. Пример нарушения подобного рода - хроническая гранулематозная болезнь, наследуемая по Х-сцепленному или аутосомно-рецессивному типу. При этом заболевании фагоциты захватывают микроорганизмы, но не могут их переварить, в связи с чем образуются гранулемы, а больные страдают частыми повторными инфекционными заболеваниями.

Самый известный пример наследственного нарушения функций компонентов комплемента - наследственный ангионевротический отек. Это заболевание, наследуемое по аутосомно-доминантному типу, обусловлено недостаточностью ингибитора первого компонента системы комплемента (C1-INH). Оно манифестирует повторными приступами отека кожи, дыхательных путей и кишечника и плохо поддается лечению. Ряд других примеров первичных иммунодефицитных состояний, а также иммунодефицитов, служащих частью наследственных синдромов, приведен в табл. 11-1.

Таблица 11-1. Наследственные первичные иммунодефицитные состояния

Примечание. XP - Х-сцепленный, АР - аутосомно-рецессивный.

Гены МНС играют важную роль в иммунной системе, кодируя трасплантационные антигены, которые имеют непосредственное отношение к реакции отторжения трансплантата.

Система HLA. Первый антиген системы HLA (HLA - human leucocyte antigene, локус А) был открыт в 1958 г. Ж. Доссе (J.Dausset) с помощью антител, образовавшихся в сыворотке крови пациентов, получивших многократные переливания крови, он соответствует антигену, имеющему современное обозначение HLA-A2. Номенклатурная комиссия ВОЗ рекомендовала использовать следующую номенклатуру антигенных детерминант системы HLA:

Система HLA охватывает приблизительно одну тысячную часть генома и включает в себя ряд тесно сцепленных между собой локусов. С помощью цитогенетических исследований и путем гибридизации in situ была установлена хромосомная локализация генных локусов этой системы между участками 6p21.1 (HLA-Dрегион) и 6p21.3 (HLA - A, B, C) на коротком плече хромосомы 6. На коротком плече хромосомы 6 располагаются также генные локусы других генетически полиморфных систем, которые тесно сцеплены с генным локусом (локусами) системы HLA: GLO1 (глиоксалаза 1) и F13A (субъединица А фактора XIII свертывания крови). Третий генный локус ферментной системы фосфоглюкомутазы-3 (PGM3), который также тесно коррелирован с генным локусом системы HLA, находится на длинном плече хромосомы 6.

Система HLA подразделяется в зависимости от биохимической структуры и биологической функции аллоантигенов, являющихся продуктами соответствующих аллелей, на несколько генных локусов:

Генные локусы A, B, C и D представлены сериями множественных аллелей. В этой связи система HLA обладает, по-видимому, таким колоссальным генетическим полиморфизмом, каким не обладает ни одна другая генетическая система организма человека.

На поверхности субпопуляции T-лимфоцитов или же на активированных T-клетках могут быть найдены и другие аллоантигены, которые по своей структуре соответствуют аллоантигенам системы HLA-ABC.

Антигены HLA-D обнаруживаются не во всех клетках организма; они находятся на B-лимфоцитах, активированных T-лимфоцитах, моноцитах, а также на некоторых эпителиальных и эндотелиальных клетках. На основе молекулярногенетического анализа регион HLA-D можно подразделить на серию субрегионов: HLA-DR, HLA-DQ и ряд других.

Система или комплекс HLA, безусловно, играет значительную роль в проявлении защитных механизмов организма человека. Подтверждением этому служит тот факт, что индивидуумы, у которых ослаблена или же полностью отсутствует выраженность аллоантигенов HLA региона ABC или D, страдают тяжелыми иммунными заболеваниями.

Аллоантигены системы HLA генных локусов HLA-A-, B-, C- и D- представляют собой достоверно известные антигены гистосовместимости организма человека. Для того чтобы избежать сверхострого отторжения пересаженных органов или тканей, необходимо, чтобы реципиент имел ту же группу крови системы AB0, что и у донора, а также не имел антител на аллоантигены HLA генных локусов ABC донорского организма. Поскольку антитела к алломорфным антигенным детерминантам системы HLA-ABC являются иммунными антителами, то перед каждой трансплантацией органов или тканей необходимо установить, не обладает ли реципиент цитотоксичными антителами к донорским лимфоцитам, поэтому в данном случае обязательно проводят перекрестную лимфоцитотоксическую пробу. Ввиду исключительно широкого генетически обусловленного полиморфизма системы HLA становится очевидным создание специальных международных программ по трансплантации, в которых регистрируются соответствующие аллоантигенные детерминанты системы HLA определенных генных локусов у большого числа предполагаемых реципиентов.

Огромное число работ посвящено ассоциациям между отдельными аллоантигенами системы HLA генных локусов A, D, C и DR и некоторыми наследственными заболеваниями в различных группах населения мира. Биологическая функция аллоантигенных детерминант системы HLA-ABC, являющихся мишенью для цитотоксичных T-лимфоцитов, может играть роль для ассоциации этих рецепторов с заболеваниями вирусного генеза. Несмотря на то что между теми или иными аллоантигенными детерминантами системы HLA и заболеваниями имеются многочисленные ассоциации, использование системы HLA в аспекте рутинной диагностики этих заболеваний ограничено, поскольку степень выраженности ассоциаций чаще всего недостаточно высока. Исключением представляется обнаружение аллоантигена HLA-B27, являющегося достаточно весомым аргументом при диагностике болезни Бехтерева. Благодаря различным ассоциациям системы HLA с теми или иными патологическими процессами стало возможным также дифференцировать некоторые проявления заболеваний. Так, например, тип I сахарного диабета имеет ассоциацию с аллоантигенной детерминантой HLA-DR4, тогда как тип II этого заболевания абсолютно не коррелировал с системой HLA. Аналогично этому хронический активный гепатит типа А (аутоиммунный тип) ассоциирован с аллоантигенным рецептором HLA-DR3, а другая форма гепатита - гепатит типа В, или HB_S -антигенный гепатит, гораздо чаще наблюдался у пациентов, являющихся носителями аллоантигена HLA-B35

Компонентами иммунной системы также считают антигены, располагающиеся на поверхности эритроцитов. Они могут обусловливать иммунную реакцию при переливании крови, несовместимость матери и плода и, как следствие, развитие гемолитической анемии у ребенка.

Известно четыре основные группы крови системы АВ0: А, В, АВ и 0. Они представляют продукты трех кодоминантных аллелей одного гена - Н, А и В (I⁰, I^A, I^B). Продукты аллелей А и В - химические модификации антигена Н. Фенотип 0 соответствует экспрессии на поверхности эритроцитов антигена Н и отсутствию экспрессии антигенов А и В, фенотип А - экспрессии антигена А (у гетерозигот А0 экспрессируются антигены А и Н), фенотип В - экспрессии антигена В (у гетерозигот В0 экспрессируются антигены В и Н). У людей с группой крови АВ экспрессируются антигены А и В, а у людей с определенным антигеном на поверхности эритроцитов синтезируются антитела против всех остальных антигенов системы АВ0. Они, вероятно, образуются в результате представления антигенов различных микроорганизмов, идентичных антигенам А и В. У лиц с группой крови 0 эритроциты не содержат антигенов А и В, но в их крови присутствуют антитела против этих антигенов. Именно поэтому переливание им крови трех остальных групп (А, В и АВ) вызовет агглютинацию эритроцитов перелитой крови, которая может быть фатальной. Аналогичным образом пациентам с группой крови В нельзя переливать кровь А и АВ, пациентам с группой крови А - кровь В и АВ. Больным с группой крови АВ можно переливать кровь любой группы, так как у них нет антител против антигенов А и В. Таких людей считают универсальными реципиентами, в то время как людей с группой крови 0 - универсальными донорами. Обычно переливают относительно небольшое количество крови по сравнению с объемом циркулирующей крови у реципиента, поэтому реакцией антител перелитой крови с антигенами эритроцитов реципиента можно пренебречь, но если количество переливаемой крови велико, то следует прибегнуть к переливанию только одногруппной крови.

Группы крови АВ0 - типичная полиморфная генетическая система. Ее одной из первых стали использовать для изучения межиндивидуальной и популяционной генетической изменчивости у человека.